Sarcocystidae Genus: Toxoplasma Species: Gondii Laboratory Diagnosis of Malaria Dr.Tabatabaie عالیم پاراکلینیک ماالریای شدید

Kingdom: Alveolata

Order: Eucoccidiorida

Family: Sarcocystidae Genus: Toxoplasma Species: gondii Laboratory diagnosis of Malaria Dr.Tabatabaie عالیم پاراکلینیک ماالریای شدید

• پارازیتمی بیشتر از 2% در الم خون محیطی ) بیش از 100 هزار انگل در میکرولیتر( • قند خون زیر 40mg/dl یا mmol/l 2.2 • کم خونی شدید نرموسیتیک )هموگلوبین زیر 7gr/dl در بزرگساالن و زیر 5gr/dl در کودکان( • اسیدوز ) بیکربنات زیر 15 میلی مول در لیتر( • افزایش الکتات خون )بیشتر از 5 میلی مول در لیتر( • نارسایی کلیه ) کراتینین باالی 3( • هموگلوبینوری • وجود شواهد رادیولوژیک ادم ریه • CRP,Fibrinogen,IgMباال-گاهی کاهش پالکت, و Tcellکاهش ،سدیم کمی پایین اما پتاسیم باال– TNFباال،آلبومین پایین گلوبولین باال مخصوصا گاما ،افزایش ترانس امینازها و بیلیروبین والکالین فسفاتاز کبدی ومیوگلوبین The periodicity of malaria fever Erythrocytic schizogony is the time taken for trophozoites to mature into merozoites before release when the cell ruptures. It is shortest in P. falciparum (36 hours), intermediate in P. vivax and P. ovale (48 hours) and longest in P. malariae (76 hours). Typical paroxysms thus occur every 2nd day or more frequently in P. • falciparum (“sub-tertian” malaria) 3rd day in P. vivax and P. ovale • (“tertian” malaria) Days 1 and 3 for P.v., P.o., (and P.f.) - tertian Note how the frequency of spikes of fever differ according to the Plasmodium species. In practice, spikes of fever in P. 4th day in P. malariae infections, • falciparum, occur irregularly - probably (“quartan” malaria) Days 1 and 4 because of the presence of parasites at for P.m. - quartian various stages of development. سه یک خوش خیم یعنی از هر سه روز یک روز لرز و تب بعبارتی 48 ساعت سالم 24 ساعت بیمار Information to Collect

Malaria is a multisystem disease. It presents with a wide variety of non-specific clinical features: there are no pathognomonic symptoms or signs. Many patients have fever, general aches and pains and malaise and are initially misdiagnosed as having “flu”. P. falciparum malaria can be rapidly progressive and fatal. Prompt diagnosis saves lives and relies on astute clinical assessment • Travel history (Time between bite & symptoms) in the preceding 3 months • History of prophylaxis or treatment of malaria • History of transfusion or shared needles • History of malaria in person (relapse?) • Knowledge of fever pattern,Non Specific sign • Physical examination • Identify signs consistent with malaria: fever, pallor, jaundice, splenomegaly • Exclude other possible causes of fever (e.g. signs of viral and bacterial infections) Investigations Blood Film ExaminationThick and thin blood films (or “smears”) have remained the gold standard for the diagnosis of malaria. The films are stained and examined by microscopy. Thick blood film - Used for detecting malaria: a larger volume of blood (10µl of blood) by osmotic lysis of the red blood cells releasing the parasites, is examined allowing detection of even low levels of parasitaemia. Also used for determining parasite density and monitoring ,the sensitivity is more than thin film. Thin blood film – Gives more information about the parasite morphology and, therefore, is used to identify the particular infecting species of Plasmodium, low sensitivity Smear examinations should be under oil immersion Negatives should not be reported until 200 oil immersion fields have been examined After fever,Additional specimens should be examined at 12-hour intervals for a subsequent 36 hours. Collection of Blood Smears

1. 4. The second or third Slide must always be finger is usually grasped by its edges. selected and cleaned.

2. 5. Puncture at the side Touch the drop of of the ball of the blood to the slide finger. from below.

3. Gently squeeze toward the puncture site. Preparing thick and thin films

1. 4. Touch one drop of Carry the drop of blood blood to a clean to the first slide and hold slide. at 45 degree angle.

2. 5. Spread the first Pull the drop of blood drop to make a 1 across the first slide in cm circle. one motion.

3. 6. Touch a fresh drop Wait for both to dry of blood to the edge before fixing and of another slide. staining. - Fixation Its may be achieved by heat and alcoholic solutions for 10-20 seconds . Methanol (methyl alcohol) is the most widely used fixative for malaria thin films. - staining -Giemsa staining procedure Is the most commonly used method for both thin and thick films all over the world for the quality of the stain and, of greater importance, because its stability in tropical climates. -Field staining procedure. Field staining is a good method to stain thick films but is not suitable for thin films. However, it has the remarkable advantage to be extremely quick (the smear may be stained in 1 minute). - Leishman staining procedure. Since Leishman staining solution uses methanol as a solvent, this method is only useful to stain thin films. کنترل کیفی گسترش از نظر ماکروسکوپی: 1-گسترش ضخیم :محل گسترش ضخیم –قطرگسترش وضخامت آن واینکه با گذاشتن روی یک صفحه روز نامه تقریباخطوط قابل خواندن باشد.

2-گسترش نازک :محل آن –حالت شعله شمعی –واینکه در شروع گسترش در تمام عرض الم باشد.

تهیه نمونه خون از طریق خونگیری مویرگی و وریدی امکانپذیرمی باشد، ولی استفاده از خون مویرگی ارجح است، زیرا مواد ضد انعقاد موجب تغییرات مرفولوژیکی در انگل شده بنا بر این استفاده ازخون وریدی محدود به شرایطی است که تهیه گسترشهای مناسب با استفاده از خون مویرگی مسیر نباشد.در اینگونه موارد استفاده ازضد انعقاد EDTAبا رعایت نسبت دقیق با خون توصیه می گردد. در هر حال در موارد خونگیری وریدی بهتر است تهیه گسترش از خون داخل سرنگ و قبل از مخلوط شدن با ماده ضد انعقاد و در صورت عدم امکان حداکثر ۱ ساعت پس از نمونهگیری صورت گیرد. با گذشت یک ساعت از زمان نمونه گیری، تغییرات مرفولوژیکی در ساختمان انگل ایجاد شده و حالت منقوط شدن گلبولهای قرمز نیز از بین میرود ولی شکل کلی انگل حداکثر تا دو ساعت قابل تشخیص باقی میماند.در بعضی از آزمایشگاهها خون حاوی EDTA سانتریفوژ شده و پس از برداشتن پالسما و بافی کوت ، از الیههای فوقانی گلبولهای قرمز و پالسمای باقیمانده گسترش نازک تهیه میگردد. . از رنگ گیمسا با غلظتهای مختلف میتوان جهت رنگ آمیزی گسترش ها متناسب با شرایط بیمار و به منظور تشخیص سریع استفاده نمود بطور مثال در موارد اضطراری استفاده از رنگ با غلظت %۷/۵ به مدت ۱۵ دقیقه و در سایر موارد به منظور رنگآمیزی بهتر ساختمانهای داخلی انگل استفاده از غلظتهای %۲/۵ به مدت ۴۵ دقیقه و یا %۲ به مدت ۶۰ دقیقه توصیه می گردد. در پایان رنگ آمیزی ، شستشوی اسالیدها با بافر دارایPH 7 -7.2 کیفیت نهایی رنگ را بهتر مینماید. نکته مهم در امر تشخیص، افتراق انگل از مواردی مانند پالکت ، رسوب رنگ، قارچ و یا باکتریهایی است که بر روی گلبول قرمز قرار گرفتهاند. پارازیتمی:تعداد گلبول قرمز انگل دار در کل گلبولهای قرمز پارازیتمی بیش از105 در هر میکرولیتر خون خطرناک محاسبه تراکم انگل:تعداد انگل به نسبت تعداد گلبول سفید شمارش می شود و در یک میکرولیتر خون محاسبه می شود . تعداد انگل به نسبت تعداد گلبول قرمز شمارش می شود .در گسترش نازک در پارازیتمی باالاستفاده می شود در صد گلبول قرمزآلوده نسبت به کل گلبول قرمز در یک میکرولیتر از خون محاسبه می شود . محاسبه پارازیتمی در حجم خون:در گسترش ضخیم اشکال غیر جنسی مد نظر قرار می گیرند. تعداد انگل به ازای 200 گلبول سفید شمارش *40 =پارازیتمی در میلی لیتر خون

تعداد کل گلبول سفید /تعداد انگل *8000=پارازیتمی به ازای یک میکرولیتر اگر اشکال غیر جنسی کم باشد شمارش باید در 400 گلبول سفید انجام شود یک الم زمانی منفی است که در بررسی 100 میدان گسترش ضخیم اشکال غیر جنسی فالسیپارم مشاهده نشود . محاسبه پارازیتمی بصورت مطلق : گسترش نازک و تمام اشکال جنسی و غیر جنسی مد نظر قرار می گیرند.

PRBC/PRBC+URBC*100=میانگین در صد پارازیتمی تعیین میزان پارازیتمی به دو روش امکانپذیر می باشد.در روش اول که فقط در گسترشهای نازک قابل انجام بوده با حداقل مشاهده ۱۰ میدان میکروسکوپی درصد گلبولهای قرمز آلوده به ازای شمارش۱۰۰ گلبول قرمز گزارش میگردد.

در مواردی که تعداد انگلها در خون کم است می توان از روش دیگری استفاده نمود که بر روی هر دو گسترش ضخیم و نازک قابل انجام است .در این روش تعداد انگل برحسب شمارش ۱۰۰ گلبول سفید اعالم میگردد .همچنین میتوان مقدار انگل را در یک میکرولیتر خون نیز محاسبه نمود که برای اینکار تعداد انگل شمرده شده بر حسب ۱۰۰ گلبول سفید در تعداد کل گلبولهای سفید خون ضرب شده و نتیجه بر عدد ۱۰۰ تقسیم میگردد.

بررسی شیوع در مناطق آندمیک اندازه گیری طحال )TSSسندرم اسپلینومگالی گرمسیری(با پارازیتمی در الم محیطی در کودکان 2-9 سال هولواندمیک 75%به باال وهیپر50-75% مزو 11 تا 55 و هیپو اندمیک 0-10 انجام می شود Species Differentiation on Thin Films

Feature P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae

Enlarged infected RBC + +

Infected RBC shape round round, oval, round distorted fimbriated

Stippling infected RBC Mauer clefts Schuffner Schuffner none spots spots Trophozoite shape small ring, large ring, large ring, small ring, appliqu amoeboid compact compact Chromatin dot often double single large single

Mature schizont rare, 12-30 12-24 4-12 6-12 merozoites merozoites merozoites merzoites

Gametocyte crescent shape large, large, compact, round round round

Recognizing Malaria Parasites

Blue cytoplasm Inside a red blood cell

One or more red chromatin dots Recognizing Erythrocytic Stages: Schematic Morphology

Blue Cytoplasm

RING Red TROPHOZOITE Chromatin

Brown Pigment

SCHIZONT GAMETOCYTE Malaria Parasite Erythrocytic Stages

Ring form

Trophozoite Schizont

Gametocytes Plasmodium falciparum

Infected erythrocytes: normal size

M I

Gametocytes: mature (M)and immature (I) forms (I is rarely Rings: double chromatin dots; appliqué forms; seen in peripheral blood) multiple infections in same red cell

Schizonts: 8-24 merozoites (rarely seen in peripheral blood) Trophozoites: compact (rarely seen in peripheral blood) Plasmodium vivax

Infected erythrocytes: enlarged up to 2X; deformed; (Schüffner’s dots)

Rings Trophozoites: ameboid; deforms the erythrocyte Schizonts: 12-24 merozoites Gametocytes: round-oval Plasmodium ovale

Infected erythrocytes: moderately enlarged (11/4 X); fimbriated; oval; (Schüffner’s dots) “malariae - like parasite in vivax - like erythrocyte”

Trophozoites: compact Rings

Schizonts: 6-14 merozoites; Gametocytes: round-oval dark pigment; (“rosettes”) Plasmodium malariae

Infected erythrocytes: size normal to decreased (3/4X)

Trophozoite: Trophozoite: Schizont: Gametocyte: compact typical 6-12 merozoites; round; coarse, band form coarse, dark pigment dark pigment Species Differentiation on Thin Films

P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae

Rings

Trophozoites

Schizonts

Gametocytes

a) which developmental erythrocytic stages are present; b) the size of the parasitized RBCs- whether they’re enlarged, normal (or smaller ) c) the morphology of the RBCs and the parasites Appearance of P. falciparum in thin blood films

Ring forms or trophozoites; many red cells infected – some with more than one parasite

Gametocytes (sexual stages); After a blood meal, these forms will develop in the mosquito gut

http://phil.cdc.gov/phil/quicksearch.asp

کشت انگل )بررسی مقاومت دارویی –واکسن سازی و نگهداری انگل ( در شرایط بیرون تنی p.f در گلبولهای قرمز، تنها 10% مروزورئیت ها تکامل جنسی را آغاز نموده اند تا گامتوسیت ها را تولید كنند وحدود 10روز طول می کشد تا آنها به بلوغ برسند. اگرچه مكانیزم دقیق گامتوسیتوژنزیس خیلی قابل درک نسیت. اغلب تصورمی شود که ایجاد گامتوسیت به علت پاسخ انگل به استرس درخون آلوده میباشد. به دلیل اینکه محیط کشت قدیمی فاکتور های القائ گامتوسیتوژنزیس را دارد، مقدار کمی از آن را به محیط کشت جدید اضافه میکنیم وبا اضافه کردن قند های مختلف مانند سوربیتول ، گلوکزآمین و هپارین مراحل غیر جنسی کاهش می یابد . مکانیزم عمل این قندها اثر روی دیواره سلول ها می باشد. سوربیتول بطور انتخابی فقط مرحله ترفوررییت را لیز کند و قادر نیست تمام مراحل غیر جنسی را ازبین ببرد. تا کنون بيشترین متد مورد استفاده برای حذف مراحل غبر جنسی اضافه نمودن Nاسيتل گلوکز آمين 50ميلی موالر به محيط کشت گامتوسيت به مدت پنج روز است. طبق یافته های اخير هپارین در طی حمله پالسمودیم فاليسپارم به گلبولهای قرمز با پروتئين سطح مروزئيت واکنش می دهد وبا عث مهار تهاجم انگل می شود.هپارین برای از بين بردن پارازیتها ی مرحله غير جنسی بکار گرفته می شود تا گامتوسيت ها را در کشت p.f بدست آوریم . طبق تحقيقات نشان داده شده که با اضافه کردن20واحد در ميلی ليتر هپارین برای 4روز پس از القاء گامتوسيتوژنزیس می توان انگل های غير جنسی را کامال از بين برد. روش کشت انگل ماالریا: در فالسک 25 ميلی ليتری انگل ها را در محيط کشت کامل حاوی 10%سرم انسانی و RPMI1640 که یک ميلی گرم درميلی ليترجنتامایسين و5%هماتوکریت،PH7.2ودمای37 درجه سانتی گرادوگازحاوی1%الیCO2 %3کشت می دهيم. روش کار تولید گامت : انگل ها رادر مرحله رینگ باپارازیتمی1 % وهماتوکریت باال استرس می دهيم. محيط فالسکها را به مدت شش روز روزانه تعویض می کنيم وهر روزبه آن 40 ميکرو ليترهپارین می زنيم .پس از شش روز گامتوسيت توليد می شود. تغيير در زمان تعویض روزانه محيط روی تعداد گامتوسيت های اثرمنفی دارد و مشکالت بسياری ایجاد نماید از جمله روی تعداد گامتوسيت های اثردارد. استفاده از محيط قدیمی به دليل فاکتورهای تحریک کننده برای توليد گامتوسيت ها الزم است، به همين جهت در هر تعویض محيط 20%تا 30%از محيط کشت قدیمی به محيط جدید اضافه ميکنيم .سپس شمارش پارازیتمی گامتوسيت ها به دو روش انجام ميگردد، 1.رنگ آميزی 2GIEMSA. کيت pLDH. سپس با رنگ آميزی گيمسا تعداد گامتوسيت و مراحل بلوغ تعيين می شود. گامتوسيت های مطلوب با ید پارازیتمی 2%و4% داشته باشند. بطور خالصه پالسمودیوم فالسيپاروم در محيط کشت مداوم که حاوي گلبولهاي قرمز گروه خونیO انسان در محيط کشت RPMI 1640 باضافه 10 درصد سرم AB انسانی و با استفاده از گاز ترکيبی 3 درصد دي اکسيد کربن، 6 درصد اکسيژن و 19 درصد نيتروژن در 37 درجه سانتيگراد نگهداري می شود. انگلهاي پالسمودیوم فالسيپاروم شروع به توليد مثل غير جنسی طی 48 ساعت پس از کشت دادن رشدخواهند کردند اما مدت کوتاهی پس از این توليد مثل اوليه شروع به توليد مرحله هاي یکسان مثل شيزونت می کنند . براي ایجاد فرمهاي مرحله رینگ از 5 درصد سوربيتول استفاده می کنيم. کليه مراحل انجام کار در زیر هود انجام می شود و همه وسایل و تجهيزات مورد استفاده استریل شده و محيطهاي کشت با استفاده ازفيلترهاي0.22ميکرومتر قبل از استفاده استریل می شوند. فالسکها در یک حالت ایستا به گونه اي نگهداري می گردند تا یک الیه سلول در سطح تحتانی آن تشکيل شود و هر روز محيط کشت آنان عوض می شود .محيطها به مدت 60 ثانيه هوادهی شده و هر 3 الی 4 روز یکبار با استفاده از RBC تازه رقيق می شود .براي چک کردن پارازیتمی هر روز گسترش خونی تهيه و پارازیتمی ثبت می گردد. شستشوی خون به مقدار 8 ميلی ليتر خون با گروه O+ که قبالً از بانک خون تهيه شده، 5 ميلی ليتر سرم فيزیولوژی 0/9 افزوده و در دمای 25 درجه سانتيگراد با سرعت 3000 دور بر دقيقه برای مدت 10 دقيقه سانتریفيوژ می کنيم. محتوای لوله را به سه الیه تقسيم کرده، الیه ی باالیی پالسما، الیه ی ميانی گلبول های سفيد و پالکت ها، الیه ی پائينی شامل گلبول های قرمز می باشد. الیه ی باالیی و ميانی را خارج کرده و مجدداً 5 ميلی ليتر سرم به الیه ی گلبول قرمز افزوده و سانتریفيوژ کرده و تا سه بار این کار را تکرار می کنيم. سپس به ميزان برابر به آن محيط کشت غيرکامل اضافه کرده و در یخچال نگهداری می کنيم. این گلبول های قرمز جهت استفاده در محيط کشت سه بار شستشو شده است.

مرحله تخمین سطح پارازیتمی 5/0 تاااا 1 میلااای لیتااار از محااای )بعاااد از 48 سااااع ( را باااه مااادت 3 دقیقاااه باااا دور 1200 دور بااار دقیقاااه در دماااای اتاااا ساااانتریفیوژ کااارد و سوپ رویی را خارج کرد و 2 تا 3 میکرولیتار از نن را باا اساتفاد از پیرا روی یاک الم تمیاک مای کاانیم. نن را روی ساط الم گساترش مای دهیم سرس نن را قبل از رنگ نمیکی در دمای اتا قرار داد تا خشک شود. رنگ آمیزی گسترش خونی جه رنگ نمیکی گسترش خونی از رنگ گیمسا مطابق مراحل زیر استفاد خواهد شد : ابتدا گسترش خونی را با استفاد از متانول برای ند ثانیه تثبی می کنیم. سرس سط الم را به طور کامل با رنگ گیمسا 3% به مدت 30 تا 45 دقیقه می پوشانیم. در صورتی که از رنگ 10% استفاد شود می توان به مدت 5 تاا 8 دقیقاه رناگ نمیاکی را ان اام داد. در ایا مرحله الم را با نب مقطر شستشو داد و پس از اطمینان از خشک شدن الم نن را زیر میکروسکوپ مشاهد می نماییم. تعویض محیط کشت پس از گذشت 48 ساعت، نمونه ای را از انکویاتور خارج کرده، )در این شرایط انگل ها در مرحله ی رینگ بوده و حدود 10% پارازیتمی آن تخمين زده شده است(. در این هنگام، زمان تعویض محيط کشت است. انگل ها را به یک فالسک 150 ميلی ليتری محتوی محيط کشت تازه منتقل کرده و در دمای 37 درجه در معرض گاز دی اکسيد کربن 5% قرار می دهيم. پس از 18 تا 24 ساعت انگل ها به مرحله ی تروفوزئيت می رسند. هنگامی که انگل ها به مرحله ی تروفوزئيت پير رسيدند افزودن گلبول های قرمز الزامی است. پس از گذشت 24 ساعت مجدداً درصد پارازیتمی مطابق روش شرح داده شده محاسبه شده، تعویض محيط کشت و افزودن گلبول قرمز صورت می گيرد. انطباق زمانی با استفاده از سوربیتول سوربيتول را به مدت 5 دقيقه در دمای 37 درجه گرم کرده و با استفاده از پمپ، محيط کشت را از فالسک ها خارج می نمایيم. سپس با دقت محتویات فالسک ها را به لوله های 15 ميلی ليتری منتقل می نمایيم. پس از آن محيط محتوی انگل را در دمای 37 درجه به مدت 5 دقيقه با دور 1200 دور بر دقيقه سانتریفيوژ کرده، سوپ رویی را خارج کرده و به نسبت 1 به 9 سوریيتول 5% به آن می افزایيم. مرحله شستشو تخلیص مرحله ی رینگ انگل پالسمودیوم فالیسپاروم محتویات فالسک کشت را با دور 1500 دور بر دقيقه به مدت 5 دقيقه، سانتریفيوژ کرده و سوپ رویی را خارج نموده پس از تخمين پارازیتمی، در صورتيکه باالتر از 10% باشد، کار را ادامه می دهيم. سپس به ميزان چهل برابر حجم انگل به محيط ساپونين افزوده و محيط را به مدت 30 دقيقه روی یخ قرار می دهيم. در ادامه محلول را به مدت 20 دقيقه در دمای 4 درجه با دور 4000 دور بر دقيقه سانتریفيوژ کرده و با استفاده از محلول PBS1x شستشو می دهيم. این عمل را سه بار تکرار کرده و انگل ته نشين و تخليص شده را در اپندورف با دور 12000 دور بر دقيقه در دمای 4 درجه سانتيگراد به مدت 5 تا 6 دقيقه سانتریفيوژ می کنيم. سوپ رویی را خارج کرده و نمونه ها را در دمای 20- نگهداری می کنيم.الزم به ذکر است که تمام مراحل فوق روی یخ صورت می گيرد. نکته: ساپوتين غشاء گلبول های قرمز و واکوئل انگل را نسبت به ماکرومولکولها نفوذپذیر کرده، ولی غشاء پالسمایی انگل در معرض ساپونين دست نخورده باقی می ماند. Plasmodium falciparum Culture

Strains of 3D7 provided by the late Dr. Walliker were cultured using the method of Trager and Jensen. Briefly, the parasites were cultured in 7 mL RPMI 1640 medium with 5% serum, 10% hematocrit, hypoxanthine, and gentamicin (complete medium) in 75 mL flasks. The medium was changed every 48 h and flasks were incubated at 37°C with 5% CO2, 5% O2, and 90% N2 .

Large-scale cultivation of Plasmodium falciparum for metabonomics was carried out by the method modified by Radfar et al. with 24 h changes of 75 mL of complete medium enriched with 5% albumax and 0.5% hematocrit. Daily monitoring of the culture assisted in . Cultures grown without drugs increasing its parasitemia to 60% were used as negative controls. After 48 hours, they were harvested by centrifugation at 800 g for 5 min. روش دسیکاتور شمع دار روشTrager& Jensen 1976فالسیپاروم در محیط کشت سلولی حاوی 21 نوع امالح مختلف و معرف فنل سولفون فتالئین کشت داده می شود . قبل از کشت گلبول قرمز خون فرد سالم با گروه خونی Aکه دارای ماده ضد انعقاد و نگهدارنده ACD or CPDاست با محیط کشت به همراه کربنات دو سود شسته و بعداز سانتریفوژ، رسوب با محیط کشت که قبال با ده درصد سرم انسانی از گروه ABو یا +Aاست محلول کرده سپس با شمارش گلبولهای قرمز انگل دار و سالم میزان پارازیتمی معین می شود. 1.5 سی سی از محلول فوق با پارازیتمی 0.1 تا 0.2 را در پلیتهای کوچک پالستیکی کشت نسجی ریخته داخل دسیکاتور شیر دار قرار می دهیم . در وسط شمع سفید روشن می کنیم . برای وارد یا خارج نشدن هوا درب شیشه و محل اتصال با بدنه دسیکاتور را با وازلین چرب می کنیم . با خاموش شدن شمع شیر دسیکاتور بسته شود پس از خاموشی شمع گاز کربنیک دسیکاتور باال و و اکسیژن کمتر خواهد بود . قرار دادن در انکوباتور 37 درجه .انگل بدون افزودن گلبول قرمز شسته شده تکثیر یافته و6تا 7 روز باقی می ماند . عوض کردن محیط کشت به همراه سرم انسانی هر 24 ساعت و نمونه برداری برای تعیین پارازیتمی و پاساژ انگل یا افزودن گلبول قرمز شسته شده هر 48 ساعت روش ممتد برای کشت نگهداری و مطالعات بیولوژیکی فالسیپاروم یک الیه گویچه قرمز حاوی انگل بطور مداوم در جریان آرام محیط کشت مناسب مثل خون دفیبرینه که دکستروز به آن اضافه شده است ، قرار می گیرند. گلبول قرمز انسان برسطح لوله های مخصوص کشت سلولی کشت داده میشود. جهت چسبیدن از نوعی پروتئین مخصوص )نقش چسب بیولوژیک چسباننده( محلول پروتئینی در رقتهای معین تهیه داخل ظرف ریخته و اضافه ان خالی شود بعد رقتی از گلبول قرمز انسانی در محیط کشت با نسبت 6در صد هماتوکریت تهیه و همراه مواد مغذی مکمل داخل ظروف ریخته و اضافی خالی شود تا کشت یک الیه گلبول حاصل شود. این محیط کشت RBC توسط محلولی از گلبول انسانی 2در صد هماتوکریت و 0.1 درصد پارازیتمی برای کشت استفاده می شود . این محیط سه بار با محیط کشت فاقد سرم شسته می شوند و با حدود 3 سی سی محیط کشت پوشانده می شوند . لوله های کشت در جار شیشه ای که درب ان با وازلین پوشانده شده و از مخلوط گازی 5 در صد اکسیژن 5در صد دی اکسید کربن و 90در صد ازت پر شده است و به انکوباتور 37 درجه منتقل می شود. در پایان المها خارج رنگ شده هر روز مایع درون لوله کشت خالی شده و محلول گلبول قرمز با 2در صد هماتوکریت به ان اضافه می شود . روش دیالیز استفاده از یک فرمانتور اتوماتیک تنظیمPH 7-7.2 حذف ذرات کوچک و متابولیتهای انگل گازهای مختلف با هم ترکیب بعد از عبور از یک فیلتر وارد ظرف اب شده جهت ایجاد رطوبت وارد فرمانتور می شود . Other methods of diagnosis of malaria

These are not routinely used in clinical practice. They include : a) Antigen capture kits. Uses a dipstick and a finger prick blood sample. Rapid test - results are available in 10-15 minutes. Expensive and sensitivity drops with decreasing parasitaemia b) PCR based techniques. Detects DNA or mRNA sequences specific to Plasmodium. Sensitivity and specificity high but test is expensive, takes several hours and requires technical expertise. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Threshold of detection at CDC • 0.1 parasite/µl if whole blood in tube • 2 parasites/µl if using filter paper • Definitive species-specific diagnosis now possible • Can identify mutations – try to correlate to drug resistance • Parasitemia not quantifiable • May have use in epidemiologic studies • Requires specialized equipment, reagents, and training • Preventing Transfusion-Transmitted Malaria (TTM) Detection of Parasites/Parasite Products PCR (0.05 to 0.1 parasites/l) Microscopy (5 parasites/l) Antigen detection (10 to 100 parasites/ l)

10-5 10-3 10-1 10 103 Parasite densities (parasites/l) C-Fluorescent techniques. Relatively low specificity and sensitivity. Cannot identify the parasite species. Expensive and requires skilled personnel. D-Serologic tests. Based on immunofluorescence detection of antibodies against Plasmodium species. Useful for epidemiologic and not diagnostic purposes. کاربردها

مهمترین آن مناطق روستایی که به آزمایشگاه ماالریا با تسهیالت میکروسکوپی دسترسی ندارند، می باشد. سایر كاربردها :  اپیدمي ماالریا  بیمارستانها  قرنطینه های مرزی  شک بالینی و الم منفی  مطب ها و کلینیکهای خصوصی BinaxNOW® Malaria Test

Performance

Plasmodium falciparum: • Sensitivity 95.3% • Specificity 94.2% • Plasmodium vivax: • Sensitivity 68.9% • Specificity 99.8% • Note: Publications report P. ovale as being harder to detect as it only • attacks young erythrocytes How the Test Works

• Histidine-rich protein II (HRP II) is specific to P. falciparum while aldolase is a pan-malarial agent. • Test has monoclonal antibodies directed against these proteins, which detects them in a modified lateral flow format. BinaxNOW® Malaria Test

• Procedure • Apply 15 µl of whole blood to the purple pad. • Venous or capillary whole blood. • EDTA collection tubes. • Mylar-coated capillary tubes included in kit. • Apply 2 drops of Reagent to the white pad below where the blood is applied. • Apply 4 drops of Reagent to the pad located at the top of the left side of the test device. • Close the device and read in 15 minutes. BinaxNOW® Malaria Test

TEST RESULTS DESCRIPTION / INTERPRETATION

T1 Positive Positive result for P. falciparum (P.f.)

Positive result for P. vivax (P.v.) or P. malariae (P.m.) or P. T2 Positive ovale (P.o.) In some cases the appearance of only the T2 Line may indicate a mixed infection with two or more of P.v., P.m., and P.o.

T1 + T2 Positive Positive result for P. falciparum (P.f.) In some cases the appearance of both the T1 and T2 Lines may indicate a mixed infection of P.f. with another species.

No T1 or T2 Lines Negative result (no malaria antigens were detected) Table 210-5 Methods for the Diagnosis of Malariaa Method Procedure Advantages Disadvantages Thick blood Blood should be uneven in Sensitive (0.001% Requires experience filmb thickness but sufficiently thin to parasitemia); species (artifacts may be read the hands of a watch through specific; inexpensive misinterpreted as low- part of the spot. Stain dried, level parasitemia); unfixed blood spot with Giemsa, underestimates true count Field's, or another Romanowsky stain. Count number of asexual parasites per 200 WBCs (or per 500 at low densities). Count gametocytes separately.c Thin blood Stain fixed smear with Giemsa, Rapid; species Insensitive (<0.05% filmd Field's, or another Romanowsky specific; parasitemia); uneven stain. Count number of RBCs inexpensive; in distribution of P. vivax, as containing asexual parasites per severe malaria, enlarged infected red cells 1000 RBCs. In severe malaria, provides prognostic concentrate at leading assess stage of parasite informatione edge development and count neutrophils containing malaria pigment.e Count gametocytes separately.c PfHRP2 A drop of blood is placed on the Robust and relatively Detects only Plasmodium dipstick or stick or card, which is then inexpensive; rapid; falciparum; remains card test immersed in washing solutions. sensitivity similar to positive for weeks after Monoclonal antibody captures the or slightly lower than infectionf; does not parasite antigen and reads out as a that of thick films quantitate P. falciparum colored band. (0.001% parasitemia) parasitemia Table 210-5 Methods for the Diagnosis of Malariaa Method Procedure Advantages Disadvantages Plasmodium A drop of blood is placed Rapid; Slightly more difficult LDH dipstick or on the stick or card, which sensitivity preparation than card test is then immersed in similar to or PfHRP2 tests; may washing solutions. slightly lower miss low-level Monoclonal antibodies than that of parasitemia with P. capture the parasite thick films for P. vivax, P. ovale, and P. antigens and read out as falciparum malariae and does not colored bands. One band is (0.001% speciate these genus specific (all malarias), parasitemia) organisms; does not and the other is specific for quantitate P. P. falciparum. falciparum parasitemia Microtube Blood is collected in a Sensitivity Does not speciate or concentration specialized tube containing similar or quantitate; requires methods with acridine orange, superior to that fluorescence acridine orange anticoagulant, and a float. of thick films microscopy staining After centrifugation, which (0.001% concentrates the parasitemia); parasitized cells around the ideal for float, fluorescence processing large microscopy is performed. numbers of samples rapidly Malaria Serology – antibody detection

Immunologic assays to detect host response • Antibodies to asexual parasites appear some days after invasion of • RBCs and may persist for months Positive test indicates past infection • Not useful for treatment decisions • Malaria Serology – antibody detection

• Valuable epidemiologic tool in some settings • Useful for • Identifying infective donor in transfusion-transmitted malaria • Investigating congenital malaria, esp. if mom’s smear is negative • Diagnosing, or ruling out, tropical splenomegaly syndrome Malaria Antigen Detection • Immunologic assays to detect specific antigens • Commercial kits now available as immunochromatographic rapid diagnostic tests (RDTs), used with blood • P. falciparum histidine-rich protein 2 (PfHRP-2) • parasite LDH (pLDH) • Monoclonal and polyclonal antibodies used in antigen (Ag) capture test • Species- and pan-specific Ab • Cannot detect mixed infections • Cross reactivity with rheumatoid factor Detection of Plasmodium antigens: pLDH (parasite lactate dehydrogenase) Detection of Plasmodium antigens

A: HRP-2 (histidine-rich protein 2) (ICT) B: pLDH (parasite lactate dehydrogenase)(Flow) C: HRP-2 (histidine-rich protein 2) (PATH) Malaria Antigen Detection - RDTs

Feature PfHRP-2 tests pLDH tests Test principle Use of monoclonal (Ab) Use of monoclonal and polyclonal Ab

Detects a parasite enzyme, lactate Detects a histidine rich protein of P.f. dehydrogenase

Water-soluble protein is released from pLDH is found in sexual and asexual parasitized RBCs forms

Not present in mature gametocytes Differentiation between malarial species is based on antigenic differences between pLDH isoforms Malaria Antigen Detection - RDTs Feature PfHRP-2 tests pLDH tests Advantages Threshold for parasite detection as low as Threshold for parasite detection ≥ 100 10 parasites/µl (but sensitivity drops at < parasites/µl 100 parasites /µl) Can detect all species which infect humans

Does not cross react with other species – Can differentiate between P.f. and non- P.v., P.o., P.m. falciparum malaria

Does not cross react with human LDH

Positive only in viable parasites, potentially useful for monitoring success of treatment Malaria Antigen Detection - RDTs Feature PfHRP-2 tests pLDH tests Disadvan-tages Some tests only detect P.f. Cannot differentiate between non- falciparum species

Cannot detect mixed infections Cannot detect mixed infections

Sensitivity and specificity decreases < Sensitivity and specificity decreases < 100 100 parasites/µl parasites/µl

Can remain positive up to 14 days post treatment, in spite of asexual and sexual parasite clearance, due to circulating antigens (B ) Quantitative Buffy Coat (QBC ®) and the direct acridine orange staining Is a sensitive microscopic test based on the ability of acridine orange to stain nucleic acid containing cells A direct acridine orange (fluorochrome) staining This method recently proposed of thin and thick film to provide an economically convenient alternative to the QBC ® technique for use in the field by using specially designed interference filters that may be connected to conventional light (even sunlight) microscopes (D) Detection of P. falciparum antigen The production of histidine rich protein II (HRP-II) antigen by blood stages of Plasmodium falciparum forms the basis for the development of ELISA antigen test and more recently, of the dipstick Becton Dickinson ParaSight ®-F test, ( E) Other direct diagnostic methods The determination of blood levels of parasite-specific lactate dehydrogenase (pLDH) has been evaluated as indirect method of quantifying parasitaemia and also drug resistance 2- Indirect diagnosis (immunodiagnosis) Detection of Plasmodia specific antibodies by: 1-Immunofluorescene (IFAT) The first serological test to be used for malaria antibodies was immunofluorescence (IFAT), which may give quantitative results for both G and M specific immunoglobulins. Its specificity and sensitivity largely rely on the laboratory technician’s expertise. 2- Indirect haemoagglutination test (IHA) : Is simple and suitable for field studies, but its sensitivity and specificity are poor

3- Radioimmunoassay (RIA) : is sometimes used but needs well equipped research laboratories and personnel.

Precipitation Test Complement Fixation Test Agglutination Teat Haemagglutination Test Ag Capture Ab Capture Auramin Phenol Flurescence Immuno Chromato graphy Test Loop mediated isothermal amplification (LAMP) is a single tube technique for the amplification of DNA روشهاي سرولوژي: استتادا ا ار روشتتهاي ستترولوژ )در پایااان هفتااه اول( بخصتتور رو فلئورسانت آناي با ي غ ر مساق م و رو هماگلوا ناست و غ ر مساق م ب شار ر برنامه هاي كناتر و بررستي هتاي اپ م ولوژي ماالر ا اسادا ا مي شون . ر سالهاي اخ تر روشتتهاي ستتر ار جملتته Dipstick ر اشتتخ ر ماالر تتاي فالس پارم اسادا ا شت ا استت كته استا آ بتر پا ت ا مونوكرومتتتتتتااوگرافي و اه تتتتتته و ثابتتتتتتت كتتر مونوكلونتتا آناتتي بتتا ي بتتر يل تته آناتتي ژ ( Histidine-Rich Protein-2 ( HRP-2 و تتا آنتتر م Lactate Dehydrogenase بر روي نوارهاي ن اروسلولر مي باش .

براي اشخ ر ب ماري ر افرا كه به اارگي چار ب ماري

ش ا و ا اراي يالئم بال ني ب ماري هسان ب ل افت

ش انگ ر نمونه هاي خو احا اجي به اسادا ا ار موار مور لروم آرما شات سرولوژي به جاي آرما م كروسكپي :

1- ر موار ي كه ب ماري م اها طو كش ا باش و اع ا انگ ر ختو به ح ي كم باش كه ر آرما معمولي ا نشو . 2- ر افرا كه قب ار اشخ ر آرما شگاهي ماالر تا احتت رمتا قترار گرفاه باشن . 3- ر ب ماراني كه اراي طحا بررگ بو ا و مشكو به اباال به ماالر ا مي باشن . 4- براي پ ا كر حامل ماالر ا. 5- ر اررش ابي برنامه هاي كنار و ر شه كني ب ماري ماالر ا روشهای تعیین مقاومت دارویی Invivo Test درمان استاندارد بیمار)کلروکین 25 میلی گرم در کیلوگرم وزن بدن در سه روز(با داروی مورد نظرو تعیین زمان پاک شدن انگل از خون با تست استاندارد7 روزه و برای تعیین اثرقطعی دارو تست 28 روزه

شرایط انتخاب بیمار عغونت ماالریای مختلط نداشته باشد در دو هفته گذشته از داروهای ضد ماالریا استفاده نکرده باشد Dill Glazko,Saker-Solomons urine تعداد انگل بین 500تا 500000عدد در میلیمتر مکعب در خون بیمار

قبل از دادن دارو گسترشها تهیه ورنگ آمیزی انجام و شمارش اشکال انگل در گسترش ضخیم در برابر 2000 گلبول سفید وزن بیمار و مقدار دارو تعیین می شود . در کلروکین در ابتدا 10 میلیگرم برای هر کیلو وروز بعد همین مقدار و روز دوم 5 میلیگرم کلروکین تجویز می شود . در مورد فنسیدار از سه قرص خوراکی 1500 میلیگرم سولفادوکسین بعالوه 75 میلیگرم پریمتامین استفاده می شود . اگر انگل از بین برود و در 28 روز دیده نشود سویه حساس اگر اشکال غیر جنسی موقت حذف ولی دوباره ظاهر شود مقاومت ضعیف R1 اگر اشکال غیر جنسی حذف اما در 7 روز دوباره دیده شود R2یا متوسط اگر کاهش قابل مالحظه ای دیده نشود و یا حتی تعداد انگل زیادشود R3 در نظر گرفته می شود . Invitro Test ماکرو اثر دارو روی رشد تروفوزوئیت پالسمودیوم فالسیپاروم در داخل شیشه های کوچک درپیچ دار در محیط گلوکزدار،میزان اثر دارو بعد از 24 ساعت با شمارش شیزونتها در برابر تعداد معینی گلبول سفید در گسترش ضخیم و مقایسه با تعداد شیزونت در شیشه های فاقد کلروکین )شاهد( حدود 15 سی سی خون بیمار در ارلن پرل دار و حرکت دورانی 5 دقیقه جهت دفیبرینه کردن خون 10 شیشه کوچک درب پیچ دار با غلظتهای مختلف کلروکین فسفات )0و.0.25و0.5و0.75و1و1.25و1.6و2و3نانومول(که حدود 1 سی سی خون بیمار داخل آن ریخته سپس آنها در حرارت 38.5تا 39.5 بمدت 24 ساعت قرار دهیم . درب شیشه یک و نیم دور باز شود . دو عدد الم بعد از 24 ساعت و رنگ آمیزی انجام شود . تعداد شیزونت در برابر 1000یا 300گلبول سفید شمرده شود . میانگین شیزونتها در شیشه بر شیزونتهای شیشه شاهد تقسیم و در 100 ضرب شود .

هدف : جلوگیری از تبدیل تروفوزوئیت به شیزونت است که اگر رشد انگل و تقسیم هسته در حضور کلروکین از یک میکروگرم به باال ادامه داشته باشد سوش به دارو مقاوم است . میکرو اثر دارو روی خون بیمار که از سر انگشت گرفته شده است در داخل میکرو پلیت در محیط کشت سلولی انجام می شود . تروفوزوئیتها رشد کرده به شیزونت تبدیل می شوند . اثر دارو با شمارش تعداد شیزونت در حفره های کلروکین دار محاسبه می شود و تعداد نسبت به حفره بدون کلروکین )شاهد(تعیین می شود . در این روش اشکال غیر جنسی از 500عدد کمتر و از 100000 بیشتر نباید باشد . 0.1خون بیمار همراه با 0.9 سی سی محیط کشت استریل ریخته و اهسته تکان تا مخلوط شود .استفاده از میکروپلیت ته صاف 96 خانه ای که در هر حفره خون رقیق شده با محیط کشت همراه با دارو درون دسیکاتور شیر دار قرار داده شمع پارافینی در ان روشن بالفاصله بعد از خاموش شدن شمع شیر دسیکاتور بسته تا مخلوط مناسب از اکسیژن نیتروژن و گاز کربنیک برای رشد انگل مهیا شود وبعد دسیکاتور درداخل بن ماری 37 درجه بمدت 24 ساعت سپس محلول رویی خارج و از ته حفره گسترش ضخیم تهیه ، تعداد شیزونت در گسترش ضخیم در 200 انگل شمرده می شود .اگر تعداد انگل کم بود 100 عدد انگل می شماریم بر تعداد شیزونت شاهد تقسیم در 100 ضرب شود . مقاومت دارو برای مقادیر 1 تا 32 پیکومول کلروکین فسفات )1و2و4و5.7و8و16و32( تعیین می شود . هدف اشکال غیرجنسی انگل است حتی پایان دوره درمان اشکال جنسی هم اگر دیده شود دلیل مقاومت به دارو نیست . مزایا و محدودیت روشها درون تنی سادگی نسبی و عدم نیاز به امکانات پیچیده و گران طوالنی مدت 7تا 28 روزه ، دردسترس بودن بیمار و مداخله ایمنی بیمار و عدم مصرف دارو ، قی و..

برون تنی نیاز به بیمار نیست و مداخله ایمنی مطرح نیست در ماکرو خون زیاد مشکل در کودکان و افراد ضعیف تامین امکانات انکوباتور و..تکنسین الزم

روش مولکولی خون کم استفاده از کاغذ صافی انتقال با زنجیره سردبا پست و...با بدست اوردن DNAانگل مطالعات مختلف مولکولی در جنبه های مختلف ماالریا و بررسی پاسخ بیمار به انواع دیگر داروهای ضد ماالریا با تغییرات الزم در نوع پرایمر و تنظیم سیستم برای آن عدم اشنائی کامل همه محققین که البته این مسئله تقریبا حل شده است نكاه مهم ر آرما شات احق قتااي ماالر تا ر مناطق ماالر اخ ر: ر بعضي ار مناطق ماالر اخ ر جهتا ب مار هتاي خطرناكي چو اب هاي خونر ري هن ا مث ابتوال ( Ebola ) ، متاربورگ ) ( Marburg ، الستا ( Lasa ) و اتب خونر ري هن ا كر مه كنگو Crimean-Congo hemorrhagic ) ( fever ن ر اناشار ار كه موجب ابتاال محققت و پرسن مراكر احق قااي و آرما شگاهي ماالر ا مي گر . اوص ه مي گتر قبت ار انجتام هرگونته آرما شي بر روي نمونه هاي خو ا نمونته هتا اوسط سه رو ر ر متور يمل تات و ترو ر ا تي قرار گ رن : 1- ااب اشعه گاما  - Irradiation 2- اسادا ا ار Triton X100 3- اسادا ا ار Methanol

اشخ ر افاراقي ماالر ا: