Kingdom: Alveolata Phylum: Apicomplexa Class: Coccidia Order: Eucoccidiorida Family: Sarcocystidae Genus: Toxoplasma Species: gondii Laboratory diagnosis of Malaria Dr.Tabatabaie عﻻیم پاراکلینیک ماﻻریای شدید • پارازیتمی بیشتر از 2% در ﻻم خون محیطی ) بیش از 100 هزار انگل در میکرولیتر( • قند خون زیر 40mg/dl یا mmol/l 2.2 • کم خونی شدید نرموسیتیک )هموگلوبین زیر 7gr/dl در بزرگساﻻن و زیر 5gr/dl در کودکان( • اسیدوز ) بیکربنات زیر 15 میلی مول در لیتر( • افزایش ﻻکتات خون )بیشتر از 5 میلی مول در لیتر( • نارسایی کلیه ) کراتینین باﻻی 3( • هموگلوبینوری • وجود شواهد رادیولوژیک ادم ریه • CRP,Fibrinogen,IgMباﻻ-گاهی کاهش پﻻکت, و Tcellکاهش ،سدیم کمی پایین اما پتاسیم باﻻ– TNFباﻻ،آلبومین پایین گلوبولین باﻻ مخصوصا گاما ،افزایش ترانس امینازها و بیلیروبین والکالین فسفاتاز کبدی ومیوگلوبین The periodicity of malaria fever Erythrocytic schizogony is the time taken for trophozoites to mature into merozoites before release when the cell ruptures. It is shortest in P. falciparum (36 hours), intermediate in P. vivax and P. ovale (48 hours) and longest in P. malariae (76 hours). Typical paroxysms thus occur every 2nd day or more frequently in P. • falciparum (“sub-tertian” malaria) 3rd day in P. vivax and P. ovale • (“tertian” malaria) Days 1 and 3 for P.v., P.o., (and P.f.) - tertian Note how the frequency of spikes of fever differ according to the Plasmodium species. In practice, spikes of fever in P. 4th day in P. malariae infections, • falciparum, occur irregularly - probably (“quartan” malaria) Days 1 and 4 because of the presence of parasites at for P.m. - quartian various stages of development. سه یک خوش خیم یعنی از هر سه روز یک روز لرز و تب بعبارتی 48 ساعت سالم 24 ساعت بیمار Information to Collect Malaria is a multisystem disease. It presents with a wide variety of non-specific clinical features: there are no pathognomonic symptoms or signs. Many patients have fever, general aches and pains and malaise and are initially misdiagnosed as having “flu”. P. falciparum malaria can be rapidly progressive and fatal. Prompt diagnosis saves lives and relies on astute clinical assessment • Travel history (Time between bite & symptoms) in the preceding 3 months • History of prophylaxis or treatment of malaria • History of transfusion or shared needles • History of malaria in person (relapse?) • Knowledge of fever pattern,Non Specific sign • Physical examination • Identify signs consistent with malaria: fever, pallor, jaundice, splenomegaly • Exclude other possible causes of fever (e.g. signs of viral and bacterial infections) Investigations Blood Film ExaminationThick and thin blood films (or “smears”) have remained the gold standard for the diagnosis of malaria. The films are stained and examined by microscopy. Thick blood film - Used for detecting malaria: a larger volume of blood (10µl of blood) by osmotic lysis of the red blood cells releasing the parasites, is examined allowing detection of even low levels of parasitaemia. Also used for determining parasite density and monitoring ,the sensitivity is more than thin film. Thin blood film – Gives more information about the parasite morphology and, therefore, is used to identify the particular infecting species of Plasmodium, low sensitivity Smear examinations should be under oil immersion Negatives should not be reported until 200 oil immersion fields have been examined After fever,Additional specimens should be examined at 12-hour intervals for a subsequent 36 hours. Collection of Blood Smears 1. 4. The second or third Slide must always be finger is usually grasped by its edges. selected and cleaned. 2. 5. Puncture at the side Touch the drop of of the ball of the blood to the slide finger. from below. 3. Gently squeeze toward the puncture site. Preparing thick and thin films 1. 4. Touch one drop of Carry the drop of blood blood to a clean to the first slide and hold slide. at 45 degree angle. 2. 5. Spread the first Pull the drop of blood drop to make a 1 across the first slide in cm circle. one motion. 3. 6. Touch a fresh drop Wait for both to dry of blood to the edge before fixing and of another slide. staining. - Fixation Its may be achieved by heat and alcoholic solutions for 10-20 seconds . Methanol (methyl alcohol) is the most widely used fixative for malaria thin films. - staining -Giemsa staining procedure Is the most commonly used method for both thin and thick films all over the world for the quality of the stain and, of greater importance, because its stability in tropical climates. -Field staining procedure. Field staining is a good method to stain thick films but is not suitable for thin films. However, it has the remarkable advantage to be extremely quick (the smear may be stained in 1 minute). - Leishman staining procedure. Since Leishman staining solution uses methanol as a solvent, this method is only useful to stain thin films. کنترل کیفی گسترش از نظر ماکروسکوپی: 1-گسترش ضخیم :محل گسترش ضخیم –قطرگسترش وضخامت آن واینکه با گذاشتن روی یک صفحه روز نامه تقریباخطوط قابل خواندن باشد. 2-گسترش نازک :محل آن –حالت شعله شمعی –واینکه در شروع گسترش در تمام عرض ﻻم باشد. تهیه نمونه خون از طریق خونگیری مویرگی و وریدی امکانپذیرمی باشد، ولی استفاده از خون مویرگی ارجح است، زیرا مواد ضد انعقاد موجب تغییرات مرفولوژیکی در انگل شده بنا بر این استفاده ازخون وریدی محدود به شرایطی است که تهیه گسترشهای مناسب با استفاده از خون مویرگی مسیر نباشد.در اینگونه موارد استفاده ازضد انعقاد EDTAبا رعایت نسبت دقیق با خون توصیه می گردد. در هر حال در موارد خونگیری وریدی بهتر است تهیه گسترش از خون داخل سرنگ و قبل از مخلوط شدن با ماده ضد انعقاد و در صورت عدم امکان حداکثر ۱ ساعت پس از نمونهگیری صورت گیرد. با گذشت یک ساعت از زمان نمونه گیری، تغییرات مرفولوژیکی در ساختمان انگل ایجاد شده و حالت منقوط شدن گلبولهای قرمز نیز از بین میرود ولی شکل کلی انگل حداکثر تا دو ساعت قابل تشخیص باقی میماند.در بعضی از آزمایشگاهها خون حاوی EDTA سانتریفوژ شده و پس از برداشتن پﻻسما و بافی کوت ، از ﻻیههای فوقانی گلبولهای قرمز و پﻻسمای باقیمانده گسترش نازک تهیه میگردد. از رنگ گیمسا با غلظتهای مختلف میتوان جهت رنگ آمیزی گسترش ها متناسب با شرایط بیمار و به منظور تشخیص سریع استفاده نمود بطور مثال در موارد اضطراری استفاده از رنگ با غلظت %۷/۵ به مدت ۱۵ دقیقه و در سایر موارد به منظور رنگآمیزی بهتر ساختمانهای داخلی انگل استفاده از غلظتهای %۲/۵ به مدت ۴۵ دقیقه و یا %۲ به مدت ۶۰ دقیقه توصیه می گردد. در پایان رنگ آمیزی ، شستشوی اسﻻیدها با بافر دارایPH 7 -7.2 کیفیت نهایی رنگ را بهتر مینماید. نکته مهم در امر تشخیص، افتراق انگل از مواردی مانند پﻻکت ، رسوب رنگ، قارچ و یا باکتریهایی است که بر روی گلبول قرمز قرار گرفتهاند. پارازیتمی:تعداد گلبول قرمز انگل دار در کل گلبولهای قرمز پارازیتمی بیش از105 در هر میکرولیتر خون خطرناک محاسبه تراکم انگل:تعداد انگل به نسبت تعداد گلبول سفید شمارش می شود و در یک میکرولیتر خون محاسبه می شود . تعداد انگل به نسبت تعداد گلبول قرمز شمارش می شود .در گسترش نازک در پارازیتمی باﻻاستفاده می شود در صد گلبول قرمزآلوده نسبت به کل گلبول قرمز در یک میکرولیتر از خون محاسبه می شود . محاسبه پارازیتمی در حجم خون:در گسترش ضخیم اشکال غیر جنسی مد نظر قرار می گیرند. تعداد انگل به ازای 200 گلبول سفید شمارش *40 =پارازیتمی در میلی لیتر خون تعداد کل گلبول سفید /تعداد انگل *8000=پارازیتمی به ازای یک میکرولیتر اگر اشکال غیر جنسی کم باشد شمارش باید در 400 گلبول سفید انجام شود یک ﻻم زمانی منفی است که در بررسی 100 میدان گسترش ضخیم اشکال غیر جنسی فالسیپارم مشاهده نشود . محاسبه پارازیتمی بصورت مطلق : گسترش نازک و تمام اشکال جنسی و غیر جنسی مد نظر قرار می گیرند. PRBC/PRBC+URBC*100=میانگین در صد پارازیتمی تعیین میزان پارازیتمی به دو روش امکانپذیر می باشد.در روش اول که فقط در گسترشهای نازک قابل انجام بوده با حداقل مشاهده ۱۰ میدان میکروسکوپی درصد گلبولهای قرمز آلوده به ازای شمارش۱۰۰ گلبول قرمز گزارش میگردد. در مواردی که تعداد انگلها در خون کم است می توان از روش دیگری استفاده نمود که بر روی هر دو گسترش ضخیم و نازک قابل انجام است .در این روش تعداد انگل برحسب شمارش ۱۰۰ گلبول سفید اعﻻم میگردد .همچنین میتوان مقدار انگل را در یک میکرولیتر خون نیز محاسبه نمود که برای اینکار تعداد انگل شمرده شده بر حسب ۱۰۰ گلبول سفید در تعداد کل گلبولهای سفید خون ضرب شده و نتیجه بر عدد ۱۰۰ تقسیم میگردد. بررسی شیوع در مناطق آندمیک اندازه گیری طحال )TSSسندرم اسپلینومگالی گرمسیری(با پارازیتمی در ﻻم محیطی در کودکان 2-9 سال هولواندمیک 75%به باﻻ وهیپر50-75% مزو 11 تا 55 و هیپو اندمیک 0-10 انجام می شود Species Differentiation on Thin Films Feature P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae Enlarged infected RBC + + Infected RBC shape round round, oval, round distorted fimbriated Stippling infected RBC Mauer clefts Schuffner Schuffner none spots spots Trophozoite shape small ring, large ring, large ring, small ring, appliqu amoeboid compact compact Chromatin dot often double single large single Mature schizont rare, 12-30 12-24 4-12 6-12 merozoites merozoites merozoites merzoites Gametocyte crescent shape large, large, compact, round round round Recognizing Malaria Parasites Blue cytoplasm Inside a red blood cell One or more red chromatin dots Recognizing Erythrocytic Stages: Schematic Morphology Blue Cytoplasm RING Red TROPHOZOITE Chromatin Brown Pigment SCHIZONT GAMETOCYTE Malaria Parasite Erythrocytic Stages Ring form Trophozoite Schizont Gametocytes Plasmodium falciparum Infected erythrocytes: normal size M I Gametocytes: mature (M)and immature (I) forms (I is rarely Rings: double chromatin dots; appliqué forms; seen in peripheral blood) multiple infections in same red cell Schizonts: 8-24 merozoites (rarely seen in peripheral blood) Trophozoites: compact (rarely seen in peripheral blood) Plasmodium vivax Infected erythrocytes: enlarged up to 2X; deformed; (Schüffner’s dots) Rings Trophozoites: ameboid; deforms the erythrocyte Schizonts: 12-24 merozoites Gametocytes: round-oval Plasmodium ovale Infected erythrocytes: moderately enlarged (11/4 X); fimbriated; oval; (Schüffner’s dots) “malariae - like parasite in vivax - like erythrocyte” Trophozoites: compact Rings Schizonts: 6-14 merozoites; Gametocytes: round-oval dark pigment; (“rosettes”) Plasmodium malariae Infected erythrocytes: size normal to decreased (3/4X) Trophozoite: Trophozoite: Schizont: Gametocyte: compact typical 6-12 merozoites; round; coarse, band form coarse, dark pigment dark pigment Species Differentiation on Thin Films P.