Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitetas Medicinos

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

RUGILĖ OKULEVIČIŪTĖ

LIETUVOJE AUGINAMŲ NAMINIŲ SLYVŲ (PRUNUS DOMESTICA L.) VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Dr. Mindaugas Liaudanskas

KAUNAS, 2019 2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanė: prof. dr. Ramunė Morkūnienė

Data

LIETUVOJE AUGINAMŲ NAMINIŲ SLYVŲ (PRUNUS DOMESTICA L.) VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Dr. Mindaugas Liaudanskas

Data

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė

Rugilė Okulevičiūtė

Data Data

KAUNAS, 2019

TURINYS

SANTRAUKA...... 7 SUMMARY ...... 8 SANTRUMPOS ...... 9 ĮVADAS ...... 8 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA ...... 10 1.1 Slyvų (Prunus L.) genties augalų apibūdinimas, kilmė, paplitimas ir morfologiniai požymiai ...... 10 1.2 Naminių slyvų (Prunus domestica L.) vaisių ir lapų cheminės sudėties tyrimai ..... 11 1.3 Slyvų vaisių fenolinių junginių ir antocianinų ekstrakcijos, kokybinės ir kiekinės analizės metodai ...... 14 1.4 Slyvų vaisiuose kaupiamų junginių biologinio poveikio tyrimai ...... 17 1.5 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ...... 19 2. TYRIMO METODIKA ...... 20 2.1. Tyrimo objektas ...... 20 2.2. Naudoti reagentai ...... 20 2.3. Naudota aparatūra ...... 21 2.4. Slyvų vaisių ėminių ištraukų paruošimas ...... 21 2.5. Tyrimo metodai ...... 22 2.5.1. Bendro antocianinų kiekio nustatymas ...... 22 2.5.2. Antocianinų nustatymas taikant efektyviąją skysčių chromatografiją...... 23 2.5.3. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu...... 23 2.5.4. Fenolinių junginių nustatymas taikant ultra–efektyviąją skysčių chromatografiją ...... 24 2.5.5. Antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas ...... 24 2.5.6. Tyrimo duomenų analizė ...... 25 3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS...... 27 3.1. Slyvų vaisių ėminių antocianinų ekstrakcijos sąlygų nustatymas ...... 27 3.2. Antocianinų kiekinės sudėties slyvų vaisių ėminiuose įvairavimas ...... 28 3.2.1. Slyvų vaisių bendro antocianinų kiekio įvairavimo tyrimas ...... 29 3.2.2. Slyvų vaisių antocianinų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo tyrimas ..... 30 3.3. Slyvų vaisių proantocianidinų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimas ...... 33 3.4. Slyvų vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinės ir kokybinės sudėties įvairavimas 36

3.5. Slyvų vaisių ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas UV– regimosios šviesos spektrofotometriniu metodu ...... 40 3.6. Slyvų vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties ir ištraukų antioksidantinio aktyvumo in vitro koreliacinių ryšių įvertinimas ...... 43 3.7. Slyvų vaisių ėminių sudėties palyginimas naudojant klasterinę analizę ...... 46 3.8. Poskiepio įtakos skirtingų veislių slyvų vaisių ėminiuose kaupiamų fenolinių junginių kiekiui tyrimas ...... 49 3.9. Rezultatų apibendrinimas ...... 51 4. IŠVADOS ...... 52 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ...... 54 6. LITERATŪRA...... 55 7. PRIEDAI...... 8

SANTRAUKA

R. Okulevičiūtės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr. Mindaugas Liaudanskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas. Pavadinimas - Lietuvoje auginamų naminių slyvų (Prunus domestica L.) vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo tyrimas. Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų naminių slyvų (Prunus domestica L.) vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir nustatyti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro. Darbo uždaviniai: Nustatyti tinkamiausias antocianinų ekstrakcijos sąlygas. UV–regimosios šviesos spektrofotometriniu ir ESC metodais nustatyti slyvų vaisių ėminių antocianinų kiekinę ir kokybinę sudėtį. UESC–MS metodu nustatyti slyvų vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinę ir kokybinę sudėtį. Nustatyti slyvų vaisių ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp slyvų vaisių fenolinių junginių kiekio ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro. Įvertinti poskiepio įtaką slyvų vaisiuose kaupiamų fenolinių junginių kiekinei sudėčiai. Tyrimo objektas ir metodai: tirti naminių slyvų (Prunus domestica L.) šių veislių vaisių ėminiai: 'Čačanska najbolje' (Prunus cerasifera Ehrh. ir 'Vangenheimo vengrinė' poskiepių), 'Čačanska Rana', 'Dambrovicų vengrinė', 'Edinburginė' (skirtingų poskiepių), 'Favorita del Sultano', 'Herman', 'Jubileum' (skirtingų poskiepių), 'Kijevo vėlyvoji', 'Kometa' ,'Opal', 'Rausvė', 'Stanley', 'Uleno renklodė', 'Valor' (skirtingų poskiepių), 'Viktorija', 'Violeta', 'Zarechnaya Rannyaya'. Bendras antocianinų ir proantocianidinų kiekis, antioksidacinis aktyvumas buvo vertintas UV–regimosios šviesos spektrofotometriniu metodu, individualių fenolinių junginių kiekiai nustatyti UESC–MS metodu. Tyrimo rezultatai ir išvados: Didžiausias bendras antocianinų kiekis buvo išgautas, taikant atitinkamai šias sąlygas: naudojant 50 proc. (v/v) etanolį, 678 W ultragarso galią 73 minutes ir naudojant 83,64 proc. (v/v) etanolį, 678 W ultragarso galią 40 min. UESC–MS metodu slyvų vaisiuose identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti šie fenoliniai junginiai: cianidin-3-O-gliukozidas, cianidin-3-O- rutinozidas, peonidin-3-O-gliukozidas, peonidin-3-O-rutinozidas, procianidinai A2 ir C1, katechinas, avikuliarinas, hiperozidas, izokvercitrinas, izoramnetin-3-O-rutinozidas, rutinas, kvercetinas, chlorogeno rūgštis. Stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu, įvertinus ABTS, FRAP ir CuPRAC metodais, pasižymėjo 'Čačanska najbolje' (abiejų poskiepių), 'Kometa', 'Opal' ir 'Zarechnaya Rannyaya' veislių slyvų vaisių ištraukos. Nustatytas stiprus koreliacinis ryšys tarp bendro antocianinų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo, nustatyto ABTS ir FRAP metodais. Poskiepis turi įtakos kai kurių veislių slyvų vaisiuose kaupiamų tam tikrų fenolinių junginių kiekiui.

SUMMARY

The title of the master thesis. Qualitative and quantitative composition variability of phenolic compounds in European plum (Prunus domestica L.) fruits. The aim of the research. To determine qualitative and quantitative composition variability of phenolic compounds in fruits of European plum, which grow in Lithuanian climatic conditions and to evaluate their extracts antioxidant activity in vitro. The objectives of the research. To ascertain the most appropriate extraction conditions of anthocyanins from samples of European plum fruits. To determine qualitative and quantitative composition of anthocyanins in European plum fruit samples suing UV–Vis spectrophotometric and HPLC methods of analysis. To determine qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in European plum fruit samples using UHPLC–MS method. To investigate antioxidant activity in vitro of European plum fruit extracts. To evaluate correlation between quantities of identified phenolic compounds of plum fruits and antioxidant activity of their extracts in vitro. To investigate the impact of rootstock on quantities of identified phenolic compounds in plum fruits. The object and methods of the research. The samples of these cultivars of European plum fuits were investigated: 'Čačanska najbolje' (grafted on Prunus cerasifera Ehrh. and 'Vangenheimo vengrinė' rootstocks), 'Čačanska Rana', 'Dambrovicų vengrinė', 'Edinburginė' (grafted on two different rootstocks), 'Favorita del Sultano', 'Herman', 'Jubileum' (grafted on two different rootstocks), 'Kijevo vėlyvoji', 'Kometa' ,'Opal', 'Rausvė', 'Stanley', 'Uleno renklodė', 'Valor' (grafted on two different rootstocks), 'Viktorija', 'Violeta', 'Zarechnaya Rannyaya'. Total anthocyanin and proanthocyanin content and antioxidant activity were determined by UV – VIS spectrophotometric analysis method. The quantities of individual phenolic compounds were determined by UHPLC–MS method. The results and conclusions of the research. The highest amount of total anthocyanin quantity was obtained by using 50 % (v/v) ethanol, 678 W ultrasound power for 73 minutes and by using 83,64 % (v/v) ethanol, 678 W ultrasound power for 40 minutes, respectively. By HPLC and UHPLC–MS methods these phenolic compounds were determined and their quantities were evaluated in plum fruits: cyanidin-3-O-glucoside, cyanidin-3-O-rutinoside, peonidin-3-O-glucoside, peonidin-3-O- rutinoside, procyanidins A2 and C1, catechin, avicularin, hyperoside, isoquercitrin, isorhamnetin-3-O- rutinoside, rutin, quercetin, chlorogenic acid. The strongest antioxidant capacity by ABTS, FRAP and CuPRAC methods was determined in extracts of cultivars 'Čačanska najbolje' (grafted on both rootstocks), 'Kometa', 'Opal' and 'Zarechnaya Rannyaya'. Strong correlations were determined between quantity of total anthocyanin content and antioxidant activities, measured by ABTS and FRAP methods. The effect of rootstock origin on amounts phenolic compounds depends on plum cultivar and structure of individual phenolic compound.

SANTRUMPOS

ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); ANOVA (angl. analysis of variance) – dispersinė analizė; CGE – cianidin-3-O-gliukozido ekvivalentai; CuPRAC – vario jonų redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Cupric ion reducing antioxidant capacity); CV – variacijos koeficientas; DNR – deoksiribonukleorūgštis; EE – (-)-epikatechino ekvivalentas; ESC – efektyvioji skysčių chromatografija; FRAP – geležies redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Ferric reducing antioxidant power); Kauk. – Prunus cerasifera Ehrh. poskiepis; TE – trolokso ekvivalentas; TFPH – trifluorperazino dihidrochloridas; TPTZ – 2,4,6-tripiridil-s-triazinas; UESC–MS – ultra–efektyvioji skysčių chromatografija su masių spektrometrijos detekcija; UV – ultravioletiniai spinduliai; Vengr. – 'Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepis;

ĮVADAS

Pasaulio ir Lietuvos sveikatos organizacijos bei ministerijos rekomenduoja vaisius ir daržoves valgyti kasdien. Europos Sąjungoje vykdomos vaisių vartojimo skatinimo mokyklose programos, kuriomis siekiama ugdyti sveikos gyvensenos principus ir užkirsti kelią lėtinių ligų vystymuisi. Nustatytas ryšys tarp vaisių ir daržovių vartojimo bei degeneracinių ligų pasireiškimo dažnio [1]. Šis ryšys siejamas su augaliniame maiste esančiais antioksidantais. Ypač didelis dėmesys skiriamas antioksidantinio poveikio tyrimams dėl juose esančių biologiškai aktyvių junginių. Šių medžiagų poveikio spektras žmogaus organizmui labai platus: antioksidantai pasižymi alergines reakcijas, uždegimą, trombocitų agregaciją slopinančiu, antibakteriniu poveikiu [2]. Augalai kaupia skirtingus kiekius šių medžiagų, todėl mokslininkai siekia ištirti skirtingų augalų fitocheminę sudėtį ir išanalizuoti jų naudą žmogaus organizmui. Slyvos – vieni populiariausių vaisių, kurių pramoninio auginimo mastai pasaulyje kasmet auga [3]. Juose kaupiami įvairūs fenoliniai junginiai (antocianinai, flavonoliai, flavan–3–oliai, fenolinės rūgštys), vitaminai (askorbo rūgštis, tokoferoliai, filochinonas, karotenoidai), organinės rūgštys pasižymi antioksidaciniu poveikiu [1, 4]. Antocianinai yra vieni svarbiausių biologiškai aktyvių junginių, kaupiamų slyvų vaisiuose. Jie gali būti naudojami pramonėje kaip natūralūs dažikliai, pasižymintys žmogaus sveikatą gerinančiomis savybėmis. Slyvų vaisiuose kaupiamos biologiškai aktyvios medžiagos pasižymi kognityvines funkcijas gerinančiu, širdies ir kraujagyslių sistemos susirgimų riziką mažinančiu, laisvinamuoju, antimikrobiniu poveikiais [4]. Biologiškai aktyvių medžiagų kiekiai slyvų vaisiuose labai varijuoja priklausomai nuo veislės, todėl svarbu ištirti skirtingų veislių slyvų vaisių fitochemines sudėtis. Naminių slyvų vaisių fitocheminės sudėties tyrimų stoka paskatino ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų slyvų kokybinę ir kiekinę sudėtį ir įvertinti jų ištraukų antioksidantinį aktyvumą in vitro. Gauti rezultatai suteiks naujos informacijos apie Lietuvos klimato sąlygomis auginamų naminių slyvų vaisių fitocheminės sudėties įvairavimą, leis išsiaiškinti perspektyviausias veisles, kurių vaisiuose sukaupiama daugiausiai fenolinių junginių, poskiepio įtaką vaisiuose kaupiamų junginių kiekiui. Gauti duomenys galės būti pritaikyti naujų veislių selekciniam kūrimui, slyvų vaisių panaudojimui biologiniu poveikiu pasižyminčių junginių išskyrimui, maisto produktų ar papildų su antioksidantais, slyvų vaisių ekstraktais kūrimui. Šio mokslinio darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų naminių slyvų (Prunus domestica L.) vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir nustatyti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų naminių slyvų (Prunus domestica L.) vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir nustatyti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro. Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti tinkamiausias slyvų vaisių ėminių antocianinų ekstrakcijos sąlygas. 2. UV–regimosios šviesos spektrofotometriniu ir efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodais nustatyti slyvų vaisių ėminių antocianinų kiekinę ir kokybinę sudėtį. 3. Ultra–efektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrine detekcija (UESC– MS) metodu nustatyti slyvų vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinę ir kokybinę sudėtį. 4. Nustatyti slyvų vaisių ėminių ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro. 5. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp slyvų vaisių fenolinių junginių kiekio ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro. 6. Įvertinti poskiepio įtaką slyvų vaisiuose kaupiamų fenolinių junginių kiekinei sudėčiai.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Slyvų (Prunus L.) genties augalų apibūdinimas, kilmė, paplitimas ir morfologiniai požymiai

Karalystė: Augalai – Plantae; Skyrius: Magnolijūnai – Magnoliophyta; Klasė: Magnolijainiai – Magnoliopsida; Poklasis: Erškėčiažiedžiai – Rosidae; Eilė: Erškėtiečiai – Rosales; Šeima: Erškėtiniai – Rosaceae Juss; Gentis: Slyva – Prunus L.[5]. Slyvų genčiai (Prunus L.) priklauso virš 200 visžalių ir vasaržalių medžių ir krūmų rūšių, tarp jų ir persikai (Prunus persica (L.) Batsch), abrikosai (Prunus armeniaca L.), migdolai (Prunus dulcis D. A. Webb) ir trešnės (Prunus avium (L.) L.) [6]. Ši gentis yra plačiai paplitusi šiauriniame pusrutulyje ir tropiniuose ir subtropiniuose Azijos, Afrikos, Pietų Amerikos ir Australijos miškuose [6]. Plačiausiai paplitusi šios genties klasifikacija į pogenčius (pagal Rehder) skirsto gentį į penkis pogenčius:  Migdolas – Amygdalus L. (persikai ir migdolai)  Vyšnia – Cerasus L. (vyšnios)  Slyva – Prunus L. (slyvos)  Laurocerasus L. ( Prunus laurocerasus – visžalė vyšnios rūšis)  Ieva – Padus Mill. (ievos) [6]. Yra kelios slyvų rūšys: Prunus domestica L. (naminė slyva), Prunus cerasifera Ehrh. (skėstašakė (kaukazinė) slyva), Prunus cocomilia Ten., Prunus simonii Carr., Prunus spinosa L. (dygioji slyva), Prunus insitita L. (aitrioji slyva, naminės porūšis), Prunus americana Marsh., Prunus mexicana S. Watson, Prunus nigra (Aiton) ir kitos [7]. Slyvų rūšys nustatomos pagal augalo genomą [7]. Naminė slyva (P. domestica L.) yra dygiosios (Prunus spinosa L.) ir kaukazinės (Prunus cerasifera Ehrh.) slyvų hibridas, susidaręs natūraliai susikryžminus šioms augalo rūšims [8]. Manoma, kad šios slyvos yra kilusios iš vietovės, esančios tarp pietų Europos ir Mažosios Azijos (Anatolijos). Atliekant archeologinius kasinėjimus aptinkama P. insititia L., P. domestica L., P. spinosa L., P.

11 cerasifera L. slyvų kauliukų, kurių amžius siekia net neolito laikotarpį (4000–2500 metų prieš Kristų). XVII a. pabaigoje šių slyvų sodinukai pasiekė Amerikos žemyną [9]. Pomologiškai naminės slyvos klasifikuojamos:  P. domestica L. porūšis insititia, atmaina pomariorum – priklauso geltonos spalvos slyvos;  P. domestica L. porūšis syriaca, atmaina cerea – priklauso mirabelė tipo slyvos;  P. domestica L. porūšis italica atmainos claudiana (apvalios renklodės) ir ovoidea (kiaušinio formos (ovalios) renklodės);  P. domestica L. porūšis oeconomica atmainos pruneauliana ir mammilaris [10].

1 pav. Skirtingų veislių ('Uleno renklodė', 'Viktorija', 'Stanley') slyvų vaisiai [11] Priklausomai nuo augalo rūšies ir veislės, skiriasi tiek paties augalo (tai įvairaus dydžio ir formos krūmai ar medžiai, skiriasi žydėjimo laikas), tiek vaisiaus (skiriasi dydis, forma, spalva, tekstūra, kvapas, cheminė sudėtis) charakteristikos [9, 12]. Slyvų medžių augumą, derlingumą, augalo gebėjimą pasisavinti maistines medžiagas nulemia ir poskiepis [13, 14]. Naminės slyvos – žemi ar vidutinio aukščio savidulkiai medžiai [9]. Vaisius – ovalus ar kiaušiniškas kaulavaisis, su nedidele išilgine šonine vagele (tuo slyvos yra panašios į vyšnias) [9, 15]. Vaisius subręsta per 2–6 mėnesius [9]. Priklausomai nuo veislės, vaisius gali būti geltonas, violetinis, raudonas, mėlynas, su melsvu apnašu, sultingu geltonu ar žalsvu minkštimu (1 pav). Kaulavaisis 20–40 mm ilgio ir 25–30 mm skersmens. Kauliukas – kiaušiniškas, iš šonų suplotas, smailiais galais, ypač viršūne, nelygiu paviršiumi, dažniausiai lengvai atsiskiria nuo minkštimo. Kauliuko ilgis 22–25 mm, plotis – 13– 15 mm, storis – 7–9 mm [15].

1.2 Naminių slyvų (Prunus domestica L.) vaisių ir lapų cheminės sudėties tyrimai

Vaisiai ir daržovės kaupia įvairius fenolinius junginius (flavonoidus, taninus, fenolines rūgštis ir jų darinius) ir vitaminus, kurie pasižymi antioksidacinėmis, sveikatą palaikančiomis savybėmis [16–18]. Dėl šios priežasties pastaruoju metu padidėjo susidomėjimas slyvų vaisių

sudėties tyrimais. Slyvų vaisiuose esantys fenoliniai junginiai (flavonoidai, taninai, antocianinai, flavonoliai, hidroksicinamono rūgšties dariniai, fenolinės rūgštys), alkaloidai, askorbo rūgštis taip pat pasižymi šiomis savybėmis, dėl to slyvų vaisiai ar jų dalys gali būti naudojami kaip funkcinio maisto komponentai [16, 18]. Naminių slyvų vaisiuose nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis svyruoja nuo 18,4 mg/100 g iki 495 mg/100 g [10, 19, 20]. Fenoliniai junginiai, esantys slyvose, skirstomi į tris pagrindines grupes: fenolinės rūgštys, flavonoliai ir antocianinai [19]. Slyvų vaisiuose vyrauja chorogeno rūgštis ir jos izomeras neochlorogeno rūgštis, rasta kriptochlorogeno rūgšties [20, 21]. Šių junginių kiekis slyvų vaisių minkštime svyruoja nuo 51 mg/100 g iki 158 mg/100 g (daugiau kaip 90 proc. bendro fenolinių junginių kiekio), luobelėse – 3–1220 mg/100 g [19]. Aptiktos šios fenolinės rūgštys: protokatecho (0,6–0,8 mg/kg), kavos (13,8–24,3 mg/kg), trans–p–kumaro (8,5–9,7 mg/kg), ferulo (8,5–10,4 mg/kg), chlorogeno (22,3–41,5 mg/kg), neochlorogeno (46,0–60,7 mg/kg) rūgštys [22]. Nustatyta, kad bendras flavonolių kiekis (2–3 proc. bendro fenolinių junginių kiekio) slyvų minkštime yra mažesnis nei antocianinų (4–9 proc. bendro fenolinių junginių kiekio) [19]. Identifikuoti šie flavonoliai: miricetinas (0,7–1,1 mg/kg), kvercetinas (19,6–30,2 mg/kg), kemferolis (0,6–1,7 mg/kg) [22]. Rutinas sudaro virš 50 proc. bendro flavonolių kiekio, o didžiąją dalį antocianinų kiekio (apie 60 proc.) sudaro cianidin-3-O-rutinozidas [19]. Slyvų luobelėse daugiausiai randama šių fenolinių junginių: dihidrobenzoinės rūgšties (27,0 mg/100 g) ir rutino (18,6 mg/100 g) [17]. Bendras antocianinų kiekis šviežiuose slyvų vaisiuose svyruoja nuo 0,41 mg/100 g iki 198,89 mg/100 g [23, 24]. Slyvų vaisių luobelėse bendras antocianinų kiekis yra didesnis nei minkštime ir svyruoja nuo 1 mg/100 g iki 2230 mg/100 g šviežios masės [21]. Vaisių luobelės, kurių spalva yra žalsvai gelsva, antocianinų neturi arba turi labai mažą kiekį [21]. Vyraujantis antocianinas daugelyje slyvų yra cianidin-3-O-rutinozidas, kurio kiekis sunokusiuose vaisiuose siekia 4,1– 23,4 mg/100 g (52,6–73,0 proc. antocianinų kiekio), vaisių luobelėse – 1,0–793,4 mg/100 g [19, 21, 24]. Slyvų vaisiuose rasta peonidin-3-O-rutinozido (2,2–6,1 mg/100 g), cianidin-3-O-gliukozido (0,2– 5,6 mg/100 g), cianidin-3-O-ksilozido (0,6–1,5 mg/100 g) ir peonidin-3-O-gliukozido (0,19 mg/100 g), kurių kiekis skiriasi priklausomai nuo veislės ir vaisiaus sunokimo laipsnio [24]. Slyvų vaisiuose identifikuoti šie proantocianidinai: procianidinas B1 (epikatechin-(4β→8)-katechinas, procianidinas B2 ((-)-epikatechin-(4β→8)-(-)-epikatechinas), procianidinas B3 (katechin-(4α→8)-katechinas), procianidinas B4 (katechin-(4α→8)-epikatechinas) [25]. Lakūs junginiai vaisiams suteikia būdingą aromatą, jų slyvų minkštime aptikta 2,54 mg/100 g [26]. Šį kiekį sudaro 148 lakūs junginiai, kurie chemine struktūra priskiriami rūgštims, alkoholiams, aldehidams, alkanams, esteriams, furanams, ketonams, laktonams, fenoliams, terpenams ir kitiems junginiams [26]. Didžiausia lakiųjų junginių grupė (58 junginiai) – esteriai, kurių kiekis sudaro

58,8 proc. bendro lakiųjų junginių kiekio [26]. Tarp šių junginių daugiausiai yra butilacetato (0,38 mg/100 g), heksilacetato (0,34 mg/100 g), propilacetato (0,1 mg/100 g), etilbutanoato (0,08 mg/100 g) ir heksilheksanoato 0,72 mg/100 g) [26]. Terpenai sudaro 6,0 proc. bendro lakiųjų medžiagų kiekio (0,15 mg/100 g) [26]. Pagrindiniai kvapą nulemiantys terpeniniai junginiai yra linalolis, limonenas ir α-terpineolis [26]. Cukrūs yra gyvybiškai svarbios medžiagos, atsakingos už vaisiaus saldumą, kvapą, skonį ir tekstūros savybes [27]. Bendras jų kiekis slyvų vaisiuose svyruoja nuo 67,17 g/kg iki 105,02 g/kg [27]. Pagrindiniai angliavandeniai, esantys slyvų vaisiuose yra gliukozė, fruktozė, sorbitolis ir cukrozė [28]. Cukrų kiekis vaisiaus minkštime ir luobelėje skiriasi (minkštime bendras cukrų kiekis didesnis) [28]. Vaisiui nokstant keičiasi individualių angliavandenių kiekis vaisiuose [28]. Slyvų vaisiuose nustatyti šie vitaminai: askorbo rūgštis (1,6–13,76 mg/100 g), α–tokoferolis (411–585 μg/100 g) ir γ–tokoferolis (vitaminas E) (7,2–11 μg/100 g), filochinonas (9,7– 12,6 mg/100 g) [18, 22, 27]. Šviežiuose slyvų vaisiuose yra karotenoidų. Jų bendras kiekis – 83– 2300 μg/100 g [18, 20, 29]. Vyraujantys karotenoidai yra β-karotenas ir liuteinas. Kai kuriose veislėse gali būti randama ir α-karoteno, β-kriptoksantino, zeaksantino, fitoeno [20]. Vaisiuose yra citrinų (25,2–27,0 mg/100 g) ir obuolių (1,98–2,02 g/100 g) organinės rūgštys [22]. Slyvų vaisiuose nustatytos įvairios mineralinės medžiagos: fosforas (11,9–15,6 mg/100 g), natris (1,0–1,46 mg/100 g), kalis (174–218 mg/100 g), magnis (4,9–5,8 mg/100 g), kalcis (4,16–4,85 mg/100 g), geležis (0,26– 0,29 mg/100 g), cinkas (40–90 μg/100 g), varis (50–60 μg/100 g), manganas (40–50 mg/100 g) [22]. Slyvų kauliukuose vyrauja amigdalinas (379,1 mg/100 g), kuris sudaro 90 proc. fenolinių junginių kiekio [17]. Nustatyta vanilino (10,2 g/100 g), neolignano dehidro-dikoniferil-aldehido (5,2 mg/100 g), dvi gvajacil-glicerin-koniferil aldehido izoformos (3,3 ir 5,4 mg/100 g), vanilino diglikozido (4,8 mg/100 g), vanilino rūgšties (2,9 mg/100 g), 3,4-dihidroksibenzoinės rūgšties (2,7 g/100 g), koniferil aldehido (1,1 mg/100 g) ir 3,5-dimetoksicinamaldehido (0,9 mg/100 g) [17]. Džiovintuose slyvų vaisiuose nustatyta 2,79 proc. skaidulinių medžiagų, įvairių mineralinių medžiagų (magnio, kalcio, geležies, cinko, vario, mangano, chromo, seleno), 1,05 mg/100 g fenolinių junginių, 0,583 mg/100 g flavonoidų [30]. Slyvų lapuose nustatyta 45,26 mg/100 g lipofilinių medžiagų (monoterpenų, seskviterpenų, riebiųjų rūgščių, angliavandenilių, tokoferolių ir steroidų) [31]. Didžiausią dalį šių medžiagų sudaro skvalenas (12,42 mg/100 g) ir α-tokoferolis (10,8 mg/100 g) [31]. Bendras tokoferolių kiekis – 11,12 mg/100 g [31]. Bendras eterinių aliejų kiekis slyvų lapuose sudaro 13,07 mg/100 g, pagrindinis eterinių aliejų komponentas – tujonas [31]. Fenolinių junginių slyvų lapuose nustatyta 5290 mg/100 g, hidroksicinamono rūgšties darinių – 3510 mg/100 g, flavonoidų – 1780 mg/g [32]. Daugiausiai lapuose yra chlorogeno rūgšties (2436,89 mg/100 g) ir rutino (926,32 mg/100 g) [32]. Nustatyti šie

14 junginiai: kavos rūgšties dariniai (413,36 mg/100 g), kvercetin-3-O-gliukozidas (176,18 mg/100 g), kemferol-3-O-gliukozidas (327,88 mg/100 g), izoramnetin-3-O-gliukozidas (311,2 mg/100 g) [32].

1.3 Slyvų vaisių fenolinių junginių ir antocianinų ekstrakcijos, kokybinės ir kiekinės analizės metodai

Dėl mažo stabilumo šarminiame pH antocianinai dažniausiai ekstrahuojami parūgštintais tirpikliais (rūgšti aplinka stabilizuoja antocianinus raudonos spalvos flavilio katijono formoje) [33–35]. Tirpiklio mišinį sudaro vanduo, 50–100 proc. polinių organinių tirpiklių (metanolis, acetonas, etanolis, acetonitrilas) ir iki 7 proc. rūgščių (trifluoracto rūgštis, druskos rūgštis, acto rūgštis, skruzdžių rūgštis, citrinų rūgštis) [34]. Druskos rūgštis gali paskatinti acilintų antocianinų skilimą, todėl dažniausiai naudojamos organinės rūgštys [35]. Kai kurie biologiškai aktyvūs junginiai yra kaupiami vakuolėse ar membranos dvisluoksnyje, todėl vykdant maceraciją šios medžiagos negali tiesiogiai sąveikauti su tirpikliu [36]. Siekiant pagerinti šių medžiagų ekstrakciją naudojamas metanolis, etanolis, acetonas ar acetonitrilas, nes šie tirpikliai denatūruoja ląstelių membranas, taip pagerindami antocianinų ir kitų į membranas įsiterpusių medžiagų tirpumą [37]. Ekstrakcijos metodai. Tradiciniai ekstrakcijos metodai yra ilgai trunkantys ir energiją eikvojantys procesai [36]. Ilgai trunkanti ekstrakcija gali paskatinti biologiškai aktyvių medžiagų degradaciją, sukeliamą šviesos, oro, temperatūros, oksiduojančių fermentų [38]. Tradicinę ekstrakciją galima pagreitinti šildant ekstrakcijos mišinį (padidėja difuzijos greitis) [36]. Tačiau šildymas gali paskatinti termolabilių medžiagų skilimą, pavyzdžiui, aukštesnė kaip 70 °C temperatūra gali sukelti staigią antocianinų degradaciją [36]. Dėl šios priežasties tradiciniai metodai (pavyzdžiui, maceracija) yra mažiau efektyvūs ir rečiau naudojami už šiuolaikinius ekstakcijos metodus (superkritinių skysčių ekstrakciją, ekstrakcija suslėgtais skysčiais, ekstrakciją naudojant mikrobangas, ultragarsą, pulsuojančio lauko ekstrakciją) [36, 38]. Ekstrakcija panaudojant mikrobangas populiarėja, nes tai yra metodas, padedantis taupyti laiką ir tirpiklius (galima iš karto išgauti didesnės koncentracijos ištrauką), lyginant su tradiciniais ekstrakcijos būdais [39]. Ekstrakcija pagrįsta selektyviu ir greitu lokalizuotu ekstrakcijos mišinio šildymu, dėl ko sudaromas slėgis ląstelėse ir pagreitėja medžiagų pernaša iš ląstelių į tirpiklį [39]. Reguliuojant šildymo trukmę, temperatūrą (gali būti naudojama temperatūra, didesnė nei 100 °C), tirpiklio kiekį ir koncentraciją bei galią galima sudaryti palankiausias sąlygas biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijai iš slyvų vaisių [38, 39]. Metodo trūkumas – aukštos temperatūros naudojimas gali paskatinti antocianinų ir tam tikrų fenolinių junginių, turinčių daug pakaitų (ypač hidroksilo grupių) aromatiniame žiede, degradaciją [38].

Dažnai fenolinių junginių ir antocianinų ekstrakcija yra vykdoma pasitelkiant ultragarsą, nes tai yra palyginus paprastas ir nebrangus metodas, nereikalaujantis sudėtingos aparatūros [40]. Ultragarsinė ekstrakcija pagrįsta temperatūros poveikiu difuzijos koeficientui ir ultragarso bangų mechaniniu poveikiu, ardančiu augalo ląsteles, padedančiu tirpikliui geriau prasiskverbti į mėginio pavyzdį bei padidinti pavyzdžio ir tirpiklio sąveikos paviršiaus plotą [40]. Ekstrakcija naudojant ultragarsą yra efektyvesnė už tradicinius ekstrakcijos metodus, nes sumažina cheminės degradacijos riziką ir sutrumpina ekstrakcijos laiką, aukštesnė temperatūra padidina medžiagų tirpumą tirpiklyje ir pagreitina difuziją [40]. Ekstrakcijai naudojant ultragarsą, pakanka žemesnės temperatūros (mažėja energijos sąnaudos šildymui ir sumažėja termolabilių medžiagų skilimas) [41]. Metodo trūkumas – didelio dažnio naudojimas gali sukelti hidroksilo radikalų susidarymą, kuris skatina fenolinių junginių degradaciją [40, 42]. Ekstrakcijos efektyvumui įtakos turi ultragarso galia (didinant galią didėja ekstrakcijos efektyvumas), dažnis (mažo dažnio didelės galios ultragarso naudojimas padidina ekstrakcijos efektyvumą), temperatūra ir geometriniai aparatūros parametrai [41]. Pulsacinio tipo ultragarso naudojimas gali pagerinti ekstrakciją, lyginant su nuolatine iradiacija ultragarsu [41]. 2016 metais mokslininkai tyrė antocianinų ekstrakcijos vandeniu iš slyvų luobelių efektyvumą lygindami ekstrakciją ultragarsu ir pulsuojančio lauko ekstrakciją su tradicine ekstrakcija [36]. Rezultatai parodė, kad ekstrakcija ultragarsu buvo žymiai efektyvesnė, o optimaliausia ekstrakcijos mišinio temperatūra yra šiltesnė už kambario temperatūrą (25 °C), bet žemesnė nei 70 °C [36]. Pulsuojančio lauko ekstrakcija galbūt būtų efektyvesnė, jei pulsacijos laikas būtų ilgesnis (tyrimo laikas truko iki 151,2 μs, kuomet ultragarsinė ekstrakcija truko 30 min). Pulsuojančio lauko ekstrakcijos būdu pavyko išekstrahuoti daugiau fenolinių junginių lyginant su kitais tirtais metodais [36]. Mokslininkų aprašomi slyvų vaisių ėminių ekstrakcijos naudojant ultragarsą metodai skiriasi. Pavyzdžiui, 2009 metais Slovėnijos mokslininkai ekstrakcijai naudojo metanolį su 1 proc. 2,6-di-tert- butil-4-metilfenolio ir 1 proc. druskos rūgšties, ekstrakciją vykdė ultragarso vonelėje (pritaikė obuolių, kriaušių, vynuogių, valgomųjų lešių ir daržinių pupelių ekstrakcijos metodiką) trimis etapais: su 10 ml tirpiklio 1 valandą, su 10 ml 30 min, galiausiai su 5 ml 30 min, vėliau visas tris porcijas sujungiant į vieną [24, 43]. O 2012 metais mokslininkai ekstrakcijai naudojo tą patį tirpiklį, tik pakeitė rūgštį: pridėjo 3 proc. skruzdžių rūgšties, ekstrakciją vykdė atvėsintoje (0 °C) ultragarso vonelėje valandą laiko (ultragarso galia ir dažnis nenurodytas) [28]. Vykdant ekstrakciją kartu su fenoliniais junginiais išekstrahuojami ir kiti junginiai (cukrūs, cukrų alkoholiai, pektinai, organinės rūgštys, amino rūgštys ir baltymai), kurie gali paskatinti antocianinų skilimą [35]. Dėl šios priežasties gaminant antocianinų turinčius produktus farmacijos pramonėje dažnai naudojama kietafazė ekstrakcija, kuria siekiama pašalinti ne fenolinės kilmės priemaišas [35]. Ištraukų valymui naudojami atvirkščių fazių silikageliai arba nejoniniai akrilo polimerų absorbentai [35].

UV–regimosios šviesos spektrofotometrija. Šis metodas plačiai taikomas antocianinų nustatymui, nes yra pigus ir paprastas [33]. Antocianinai turi jiems būdingą λmax, be to, jų cukrinės dalies prigimtis nekeičia junginio spektro [37]. Nustatant antocianinų kiekį, reikalingas kalibracijos grafikas, gaunamas naudojant standartus, arba žinomas molinis ekstinkcijos koeficientas [37]. Spektrofotometriniu metodų taikymą riboja standartų kalibracijos grafikams trūkumas [34]. Bendras antocianinų kiekis gali būti matuojamas validuotu ir AOAC asociacijos patvirtintu pH – diferenciniu metodu [37, 44]. Metodo esmė: matuojama skirtingo pH (1,0 ir 4,5) tirpalų absorbcija, kai bangos ilgis

λ=700 ir λmax, bendras antocianinų kiekis perskaičiuojamas naudojant dominuojančio antocianino molinį ekstinkcijos koeficientą [37]. Dažniausiai bendras antocianinų kiekis išreiškiamas cianidin-3-O- gliukozido ekvivalentu (naudojant šio junginio molinį ekstinkcijos koeficientą) dėl plataus šios medžiagos paplitimo gamtoje [44]. Šis metodas leidžia išmatuoti monomerinių antocianinų kiekį, kuomet polimerizuotų antocianinų ir rusvos spalvos pigmentų, susidariusių netinkamo laikymo metu, suteikiama šviesos absorbcija formulėje yra išskaičiuojama [45]. Efektyvioji skysčių chromatografija. Alternatyva pH diferenciniam metodui yra ESC su UV–regimosios šviesos detektoriumi ir išoriniu standartu naudojimas kiekybiniam nustatymui. Šis metodas geba atskirti polinių fenolinių rūgščių, diglikozilintų, antocianinų, monoglikozilintų antocianinų, anglikonų (antocianidinų) ir acilintų antocianinų frakcijas [46]. Naudojant ESC galima atskirti ir kiekybiškai įvertinti proantocianidinus, kurie sudaryti iš ne daugiau kaip 10 monomerų [46].

Dažnai naudojama atvirkščių fazių kolonėlė (C18) su binarine eliuavimo sistema judriai fazei (dažniausiai sudarytai iš vandens, acetonitrilo ir metanolio su 5–10 procentais skruzdžių ar acto rūgšties) [37, 46, 47]. Rūgščių naudojimas padidina chromatografinės smailės plotą dėl flavilio katijono susidarymo, dėl to naudojami didesni rūgščių kiekiai, atsižvelgiant į kolonėlės ir chromatografo galimybes [37, 48]. Nuo rūgšties prigimties ir tipo skiriasi analičių sulaikymo laikai, tokiu būdu galima reguliuoti sulaikymo laiką (skruzdžių rūgštis ir trifluoracto rūgštis didesnėmis koncentracijomis mažina sulaikymo laiką, druskos rūgštis – didina) [48]. Atvirkščių fazių ESC negali atskirti proantocianidinų, kurių polimerizacijos laipsnis didesnis už 3 [46]. Vienas metodo trūkumų – ESC taikymui reikalingi brangūs standartai, dažnai standartų ir tiriamų junginių spektrai nesutampa [33, 45]. Dėl to pastaruoju metu išpopuliarėjo tyrimai, kuomet antocianinų detekcijai naudojama masių spektrometrija [33]. Be anksčiau minėtų metodų, junginių detekcijai naudojami fluorescenciniai, branduolių magnetinio rezonanso (geba aptikti antocianinų reakcijos su cinamono rūgšties dariniais, peroskilo radikalais, katechinais, flavonoliais produktus) metodai [19, 33, 46]. Fotodiodų matricos detektorius naudojamas dažniau, nei UV–regimosios šviesos detektoriai, nes geriau geba įvertinti analites, kurių sulaikymo laikai yra arti vienas kito [47]. Norvegijos mokslininkai panaudojo atvirkščių fazių ESC su diodų matricos detektoriumi antocianinų ir fenolinių junginių nustatymui slyvų vaisiuose [49]. Skirstymui naudota Supelco Ascentis Phenyl kolonėlė, judri fazė, sudaryta iš vandens,

17 acetonitrilo ir skruzdžių rūgšties mišinio A (94,5:5:0,5) ir acetonitrilo, acto rūgšties, vandens mišinio B (90:5:5), tėkmės greitis 0,7 ml/min, taikytas gradientinis eliuavimas [49]. Taikant šį metodą buvo įvertintas cianidin-3-O-rutinozido kiekis naudojant kalibraciją su išoriniu standartu, junginiai identifikuoti pagal UV–regimosios šviesos spektrą [49]. Masių spektrometrija. Masių spektrometrijos naudojimas pagerina proantocianidinų atskyrimo galimybes (galima tirti net oligomerus), suteikia galimybę tirti antocianinų polimerizaciją ir reakcijas su kitais flavonoidams [33, 46]. Tiriant antocianinus svarbu taikyti švelnias jonizacijos sąlygas, tinkančias nelakiems ir termolabiliems junginiams [33]. Tam dažniausiai naudojami šie jonizacijos metodai: elektropurkštuvinė jonizacija (ESI), bombardavimas greitaisiais atomais (FAB), cheminė jonizacija atmosferos slėgyje (APCI), lazerinės desorbcijos jonizacija naudojant matricą (MALDI) [33, 46]. Šie metodai vadinami minkštąja jonizacija, nes padeda išvengti garinimo prieš jonizaciją, jonizacijos metu energija perduodama mėginiui kitokiais būdais, dėl to išgaunami paprasti spektrai, maža fragmentacija ir galima tiksliai nustatyti junginio molekulinę masę [33]. Analizatoriai, dažniausiai naudojami antocianinų nustatymui yra šie: orbitrap, jonų gaudyklė (IT), kvadrupolinis (QpQ), lėkio tėkmės (TOF) ir kvadrupolinis lėkio tėkmės (QTOF) [47]. 2009 metais Norvegijos mokslininkai slyvų vaisių antocianinus tyrė naudodami atvirkščių fazių ESC taikant gradientinį tirpiklių eliuavimą (tirpiklius sudarė vanduo, skruzdžių rūgštis ir acetonitrilas) su masių spektrometrija ir elektropukštuvine jonizacija [19]. 2013 metais Vokietijos mokslininkai tyrė slyvų vaisių proantocianidinus naudodami jonų gaudyklės masių spektrometrą su elektropukštuvine jonizacija [25]. Kapiliarinė elektroforezė. Šis metodas pastaruoju metu naudojamas dėl didelio antocianinų hidrofiliškumo šiems junginiams atskirti, identifikuoti ir įvertinti kiekybiškai [33]. Šis metodas yra ekonomiškesnis – reikalingi mažesni pavyzdžio kiekiai, suvartojama mažiau tirpiklių, analizės trukmė yra trumpesnė [37]. Detekcijai galima naudoti fotodiodų matricos ar UV–regimosios šviesos detektorių [33, 37].

1.4 Slyvų vaisiuose kaupiamų junginių biologinio poveikio tyrimai

Antocianinai pasižymi antioksidantiniu poveikiu – geba apsaugoti ląstelių DNR, lipidus, baltymus ir kitas makromolekules nuo oksidacinio streso [50]. Šie junginiai pasižymi dvigubu veikimu – gali veikti sistemiškai patekę į kraujotaką ir lokaliai žarnyne [50]. Antioksidantiniu poveikiu pasižymi ir flavonoidai, hidroksicinamono rūgšties dariniai, pektinai [29, 31]. Flavonoidų ir hidroksicinamono rūgšties darinių antioksidantinis poveikis siejamas su mobilių elektronų buvimu molekulėje [31]. Flavonoidų antioksidantinį veikimą lemia fenolinės hidroksilo grupės [31]. Lokalus poveikis svarbus storosios ir tiesiosios žarnos vėžio prevencijai [50]. Manoma, kad fenolinių junginių

18 antioksidacinis aktyvumas lemia slyvų priešuždegiminį, citoprotekcinį poveikį ir neurologinius reiškinius [29]. Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Bandymuose su gyvūnais nustatyta, kad antocianinai ir flavonoidai sukelia vazodilataciją ir tokiu būdu sumažina arterinį kraujo spaudimą [51]. Šie junginiai didina didelio tankio lipoproteinų ir mažina mažo tankio lipoproteinų žmogaus kiekį kraujyje, mažina hiperlipidemiją ir mažina baltojo riebalinio audinio kiekį bei auglių nekrozės faktoriaus-α, interleukino-6 kiekį, uždegiminių genų ekspresiją taip mažindami nutukimo ir širdies audinio uždegimo riziką [52, 53]. Širdies audinyje flavonoidai sumažina išemiją, miokardo infarkto dydį, pagerina širdies susitraukimą ir kraujotaką aortoje, sumažina aritmijų riziką [51]. Uždegimą slopinantis poveikis. Fenoliniai junginiai slopina uždegimą slopindami branduolio faktorių κ ir uždegime dalyvaujančius fermentus [54]. Slyvose esantys pektinai pasižymi antioksidaciniu, uždegimą slopinančiu poveikiu [29]. Pektinų poveikis priklauso nuo molekulės struktūros (šakų išsidėstymo) [29]. Nustatyta, kad slyvų vaisiuose esantis pektinas slopina spontanišką ir forobol-12-miristato-13-acetato sukeltą leukocitų adheziją in vitro [29]. Leukocitų adhezija yra pirma uždegiminio proceso stadija ir yra svarbus veiksnys, lemiantis imuninių ląstelių susikaupimą uždegimo židinyje [29]. Poveikis virškinamajam traktui. Fenoliniai junginiai esantys slyvų vaisiuose gali keisti žarnyno mikroflorą [55]. Pavyzdžiui, šeriant peles angliavandenių neturinčiomis slyvų sultimis, pastebėti šie žarnyno mikrofloros pokyčiai: Turicibacter, Faecalibacterium, Lactobacillus genties, Bacteroidetes tipo bakterijų padermių pagausėjimas, Akkermansia genties bakterijų padermių slopinimas [55]. Fenoliniai junginiai geba slopinti kasos fermentą lipazę, dėl to sumažėja žarnyno gebėjimas absorbuoti riebalus, mažėja kūno masė [55]. Slyvų vaisių ištraukos reikšmingai slopina reaktyviuosius deguonies junginius, susidarančius Helicobacter pylori bakterijų padermėms sąveikaujant su skrandžio epitelio ląstelėmis [56]. Tokiu būdu slyvos apsaugo skrandžio gleivinę nuo šių junginių sukeliamos DNR ir audinių pažaidos [56]. Džiovinti slyvų vaisiai ir jų sultys pasižymi vidurius laisvinančiu poveikiu, jose esanti chlorogeno rūgštis slopina gliukozės absorbciją virškinamajame trakte [57]. Poveikis nervų sistemai. Nustatyta, jog už kognityvinės funkcijos slopinimą yra atsakingi oksidacinis stresas ir uždegiminiai procesai [54]. Vartojant daug tamsios spalvos uogų, vaisių ir daržovių, turinčių daug natūralių antioksidantų, vyksta neurologiniai pokyčiai, gerėja kognityvinės funkcijos, lėtėja senėjimo procesų sukeliamų motorikos sutrikimų raida [54]. Atlikus in vivo tyrimą su pelėmis paaiškėjo, jog šviežių slyvų sulčių vartojimas pagerina atmintį [54]. Šis poveikis nebuvo pastebėtas peles šeriant džiovintomis slyvomis [54]. Tikėtina, kad taip yra dėl to, kad džiovinimo metu slyvų vaisiai praranda pusę flavonolių ir hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio bei visiškai netenka antocianinų ir flavan-3-olių [57]. Nustatyta tiesioginė priklausomybė tarp oksidacinio streso ir nerimo

[58]. Slyvose esanti chlorogeno rūgštis pelėms sukelia elgsenos pokyčius, panašius į diazepamo sukeliamus, veikia anksiolitiškai (malšina nerimą) [58]. Džiovintos slyvos vertinamos kaip puikus maisto šaltinis, turintis mažai riebalų, bet daug baltymų, skaidulinių medžiagų ir mineralų [30]. Jose esantis kalcis turi įtakos kaulų tvirtumui, kraujo krešumui, dalyvauja perduodant nervinį signalą raumenims ir dar daugelyje metabolinių procesų [30]. Magnis dalyvauja kaulinio audinio gamyboje ir energijos atpalaidavime raumenyse [30]. Džiovintuose ir šviežiuose slyvų vaisiuose esanti geležis dalyvauja hemoglobino ir raudonųjų kraujo kūnelių sintezėje, baltymų metabolizme [30]. Nustatyta, jog džiovintų slyvų ištraukos geba stabdyti Staphyloccocus epidermis, Proteus mirabilis ir Staphyloccocus aureus bakterijų parderimų augimą [30]. Šį poveikį nulemia džiovintuose slyvų vaisiuose esantys fenoliniai junginiai [30].

1.5 Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Moksliniuose straipsniuose aprašyta Prunus domestica L. augalų vaisių, jų luobelių, kauliukų ir lapų fitocheminės sudėties tyrimų. Slyvų vaisiuose nustatyti fenoliniai junginiai (daugiausiai chlorogeno ir neochlorogeno rūgštys), antocianinai (vyrauja cianidin-3-O-rutinozidas), proantocianidinai. Fenoliniai junginiai pasižymi įvairiapusiu biologiniu aktyvumu: veikia širdies ir kraujagyslių sistemą, virškinamąjį traktą, nervų sistemą, pasižymi antioksidaciniu ir priešuždegiminiu poveikiu. Slyvų vaisių ėminių ekstrakcijai dažniausiai naudojamas ultragarsas, tačiau moksliniuose straipsniuose metodikos yra aprašytos nepakankamai išsamiai, dažnai viena metodika naudojama kelių rūšių vaisiams tirti, todėl šių metodikų negalima atkartoti. Antocianinų kiekinei analizei dažniausiai naudojamas UV–regimosios šviesos spektrofotometrinis pH diferencinis metodas ir ESC su diodų matricos, UV–regimosios šviesos spektrofotometriniu ar masių spektrometrijos detektoriais. Prunus domestica L. vaisių fitocheminės sudėties tyrimų stoka paskatino ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų įvairių veislių slyvų vaisių fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį.

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrime tirti naminių slyvų (Prunus domestica L.) šių veislių slyvų vaisių ėminiai: 'Čačanska najbolje', 'Čačanska Rana', 'Dambrovicų vengrinė' ('Dąbrowicka Prune'), 'Edinburginė' ('Duke of Edinburgh'), 'Favorita del Sultano', 'Herman', 'Jubileum', 'Kijevo vėlyvoji' ('Kijevas Vēlā'), 'Kometa' ('Kubanskaya Kometa'), 'Opal', 'Rausvė', 'Stanley', 'Uleno renklodė' ('Oullins Reneklode'), 'Valor', 'Viktorija' ('Queen Victoria'), 'Violeta', 'Zarechnaya Rannyaya'. 'Čačanska najbolje', 'Edinburginė', 'Jubileum' ir 'Valor' veislių vaisių ėminiai buvo surinkti nuo Prunus cerasifera Ehrh. ir 'Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio augalų ir tiriami atskirai lyginant skirtingus poskiepius. Slyvos auginamos Lietuvoje, Babtuose, Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Sodininkystės ir daržininkystės instituto eksperimentiniame sode, vietos koordinatės (55°60'N, 23°48'E). Slyvų ėminiai surinkti 2016 metų liepos pabaigoje – rugsėjo viduryje, priklausomai nuo veislės.

2.2. Naudoti reagentai

Tyrimo metu tirpikliai, reagentai ir standartai buvo analitinio švarumo ir atitiko visus kokybės reikalavimus. Tyrimo metu naudota: etanolis 96 proc. (v/v) (AB „Vilniaus degtinė“, Vilnius, Lietuva), 4-dimetilaminocinamaldehidas, acto rūgštis, ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis), troloksas (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis), kalio persulfatas, vario (II) chloridas, neokuproinas, amonio acetatas, natrio acetatas („Scharlau“, Sentmenatas, Ispanija), TPTZ (2,3,5-trifenil-1,3,4-triaza-2-azoniaciklopenta-1,4-dieno chloridas) („Carl Roth“, Karlsrūjė, Vokietija), geležies (III) chlorido heksahidratas („Vaseline-Fabrik Rhenania“, Bona, Vokietija), cianidin-3-O-gliukozido chloridas, cianidin-3-O-rutinozido chloridas, peonidin-3-O- gliukozido chloridas, procianidinas A2 ((+)-epikatechin-(4β-8,2β-O-7)-epikatechinas), procianidinas C1, kvercetinas, chino rūgštis, hiperozidas, izoramnetin-3-O-rutinozidas, avikuliarinas, arbutinas, skruzdžių rūgštis, acetonitrilas, (+)-katechinas, (-)-epikatechinas, rutinas, izokvercitrinas, chlorogeno rūgštis, vandenilio chlorido rūgštis („Sigma-aldrich“, Steinheimas, Vokietija). Tyrimo metu naudotas išgrynintasis dejonizuotas vanduo, paruoštas Milli–Q ® („Millipore“, Bedfordas, JAV) vandens valymo sistema.

2.3. Naudota aparatūra

Slyvų vaisių žaliavos paruošimas vykdytas liofilizatoriuje „Zirbus“ („Zirbus technology GmbH“, Bad Grundas, Vokietija). Slyvų vaisių smulkinimas atliktas elektriniu malūnu Retsch GM 200“ („Retsch GmbH“, Hanas, Vokietija). Smulkintai žaliavai ir reagentams sverti buvo naudojamos elektroninės analitinės svarstyklės „Sartorius CP64–0CE“ („Sartorius AG“, Getingenas, Vokietija). Slyvų vaisių ėminių ekstrakcija buvo vykdoma „Bandelin Sonorex Digital 10 P“ („Bandelin Electronic GmbH & Co. KG” Darmštatas, Vokietija) ultragarso vonelėje. Mėginių centrifugavimas atliktas naudojant centrifugą „Heraeus Biofuge Stratos“ („Heraeus Holding GmbH“, Hanas, Vokietija). Pagamintos ištraukos buvo laikomos šaldytuve „Liebherr“ („Liebherr Group“, Krichdorfas, Vokietija). Žaliavos nuodžiūvis buvo matuojamas drėgnomačiu „Precisa 310 M“ („Precisa“, Dietikonas, Šveicarija). Spektrofotometriniams tyrimams naudotas UV–regimosios šviesos spektrofotometras „M550“ („Spectronic CamSpec“, Garfortas, Jungtinė Karalystė). Slyvų vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties analizė atlikta naudojant skysčių chromatografą Waters ACQUITY UPLC® H– Class“ („Waters“, Milfordas, Masačusetsas, Jungtinės Amerikos Valstijos) su kvadrupolio tandeminiu masių spektrometriniu „Xevo TQD“ („Waters“, Milfordas, Masačusetsas, Jungtinės Amerikos Valstijos) detektoriumi. Junginių skirstymui naudota YMC Triart C18 (100 Å, 100 × 2,0 mm; dalelių dydis 1,9 μm) kolonėlė („YMC“, Kiotas, Japonija) su prieškolonėle. Slyvų vaisių antocianinų kokybinės ir kiekinės sudėties analizė atlikta naudojant skirstymo modulį Waters e2695 („Waters“, Milfordas, MA, JAV) su 2998 diodų matricos detektoriumi („Waters“, Milfordas, MA Masačusetsas, JAV). Junginių skirstymui naudota „ACE C18“ (250 ×4,6 mm; dalelių dydis 5 µm) kolonėlė („ACT“, Aberdynas, Jungtinė Karalystė).

2.4. Slyvų vaisių ėminių ištraukų paruošimas

Žaliavos paruošimas. Tyrimams atrinkta po 20 sunokusių kiekvienos veislės slyvų vaisių. Iš slyvų vaisių pašalintos sėklos, likusi vaisiaus dalis su luobele supjaustyta iki 1 cm storio skiltelėmis ir užšaldyta (-35 °C) šaldytuve, kuriame įrengta oro cirkuliacija, ir laikoma 24 valandas. Vėliau ruošinys perkeltas į sublimacinę džiovyklą, kurioje palaikomas 0,01 mbar slėgis esant -85 °C kondensatoriaus temperatūrai. Liofilizuoti vaisiai sumalti elektriniu malūnu ir laikomi sandariai uždarytuose induose, tamsioje sausoje vietoje. Nuodžiūvio nustatymas. Visų veislių mėginių nuodžiūvio nustatymas atliktas drėgnomačiu: ant prietaiso svarstyklių pasveriamas tikslus kiekis žaliavos (1 g). Prietaisas šildo žaliavą ir skaičiuoja

22 drėgmės netektį, rezultatai parodomi procentais. Kiekviena žaliava tirta tris kartus, išvesti nuodžiūvio įverčių vidurkiai. Tyrimų duomenys perskaičiuoti absoliučiai sausai žaliavai. Tiriamųjų slyvų vaisių ištraukų paruošimas. 2,5 g liofilizuotų slyvų vaisių miltelių supilama į tamsaus stiklo buteliuką ir užpilama 50 ml 83,64 proc. (v/v) etanoliu, turinčiu 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgšties. Buteliukai sandariai uždaromi ir perkeliami į ultragarso vonelę. Ekstrakcija vykdoma 40 minučių esant 80 Hz dažniui ir 678 W galiai. Po ekstrakcijos ištraukos centrifuguojamos 5 min 9000 rpm greičiu kambario temperatūroje. Supernatantas nupilamas nuo nuosėdų, filtruojamas pro vatą į tikslaus tūrio 50 ml kolbą, skiedžiamas tirpikliu iki žymos ir supilamas į tamsaus stiklo buteliukus, kurie iki analizės laikomi šaldytuve, 4 °C temperatūroje. Prieš chromatografinę analizę ištraukos papildomai filtruojamos pro 0,22 μm porų dydžio membraninius filtrus.

2.5. Tyrimo metodai

2.5.1. Bendro antocianinų kiekio nustatymas

Bendras antocianinų kiekis nustatytas pagal modifikuotą Europos farmakopėjos metodiką bendram antocianinų kiekiui mėlynių vaisiuose nustatyti (Ph. Eur. 01/2008:1602). 1 ml pagamintos ištraukos praskiesta matavimo kolboje 83,64 proc. (v/v) etanoliu, turinčiu 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgšties, iki 25 ml žymos. Matuojamas UV–regimosios šviesos spektrofotometru, esant 528 nm bangos ilgiui, išmatuotas 10 mm tiriamojo tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis. Lyginamasis tirpalas – 83,64 proc. etanolis, turintis 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgšties. Bendras antocianinų kiekis išreiškiamas cianidin-3-O-gliukozido chloridu procentais:

, čia: x – bendras antocianinų kiekis, mg CGE/g; 718 – specifinė cianidin-3-O-gliukozido chlorido absorbcija, kai bangos ilgis yra 52 nm; A – absorbcijos dydis, kai bangos ilgis yra 528 nm; m – atsvertos žaliavos masė, g.

2.5.2. Antocianinų nustatymas taikant efektyviąją skysčių chromatografiją

Antocianinų nustatymas atliktas pagal Europos farmakopėjos metodiką antocianinų kiekiui sausame mėlynių ekstrakte nustatyti (Ph. Eur. 01/2006:2394). Individualūs junginiai apskaičiuoti pagal standartų (cianidin-3-O-gliukozido chlorido, cianidin-3-O-rutinozido chlorido, peonidin-3-O- gliukozido chlorido) kalibracines kreives. Peonidin-3-O-rutinozido kiekis paskaičiuotas pagal peonidin-3-O-gliukozido kalibracinę kreivę.

2.5.3. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu

Bendro proantocianidinų kiekio nustatymui buvo panaudota JAV mokslininkų straipsnyje aprašyta metodika ją nežymiai modifikavus [59]. Bendras proantocianidinų kiekis nustatytas naudojant 0,1 proc. parūgštintą etanolinį 4-dimetilaminocinamaldehido (DMAC) tirpalą. DMCA reagentas tirpintas tirpiklyje, pagamintame iš koncentruotos (36 proc.) vandenilio chlorido rūgšties, distiliuoto vandens ir 93 proc. etanolio mišinio, sumaišyto santykiu 1:1:6. 40 μl tiriamos ištraukos sumaišyta su 4 ml paruošto DMCA reagento. Po 15 min matuota šviesos sugertis, kai bangos ilgis yra 640 nm. Lyginamasis tirpalas – DMCA reagentas su 40 μl distiliuoto vandens. Bendras proantocianidinų kiekis išreikštas epikatechino ekvivalentais (EE) 1 g medžiagos. Šis kiekis apskaičiuotas pagal formulę:

, čia: c – epikatechino koncentracija kalibracinėje kreivėje (mg/ml); V – tiriamos ištraukos tūris (ml); M – medžiagos masė (g). Epikatechino koncentracija kalibracinėje kreivėje apskaičiuojama iš lygties y = 1,879 + 0,017, R2 = 0,999.

2.5.4. Fenolinių junginių nustatymas taikant ultra–efektyviąją skysčių chromatografiją

Fenoliniai junginiai slyvų vaisiuose nustatyti taikant ultra–efektyviosios skysčių chromatografijos (UESC) metodu, naudojant masių spektrometrinį metodą ir taikant Gonzalez – Burgos ir kt.(2018) straipsnyje aprašytą ir validuotą metodiką [60].

2.5.5. Antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas

ABTS•+ ir DPPH• antiradikaliniai metodai pagrįsti antioksidantų geba surišti laisvuosius radikalus [61]. ABTS•+ radikalų surišimo metodu galima nustatyti tiek lipofilinių, tiek hidrofilinių medžiagų antioksidacinį aktyvumą [61]. DPPH• radikalų surišimo metodo matavimai atliekami, kai bangos ilgis yra 520 nm [62]. Antocianinai nustatomi esant 510–540 nm bangos ilgiui, todėl DPPH radikalų surišimo metodo naudojimas slyvų vaisių tyrimams gali iškreipti rezultatus [46]. FRAP metodas pagrįstas geležies – TPTZ komplekso redukcija [61]. CuPRAC metodas pagrįstas vario(II) neokuproino komplekso redukcija į pagrįstas vario(I) neokuproino komplekso formą [61]. Ištraukos antioksidacinis aktyvumas apskaičiuojamas pagal trolokso kalibracinę kreivę. TE – trolokso koncentracija, kurios antioksidacinis aktyvumas atitinka 1 g sausos žaliavos antioksidacinį aktyvumą. Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS radikalų katijonų surišimo metodu. Šiam tyrimui naudota Mitic ir kt. (2015) straipsnyje aprašyta ABTS•+ radikalų surišimo metodika, ją nežymiai modifikavus [63]. Motininis tirpalas gamintas distiliuotame vandenyje ištirpinus 2 mmol/l

ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninės rūgšties) ir pridėjus 0,7 mM K2S2O8. Pagamintas motininis tirpalas laikomas 12–16 valandų tamsioje vietoje kambario temperatūroje. Darbinis tirpalas gautas motininį tirpalą skiedžiant distiliuotu vandeniu tol, kol esant 734 nm bangos ilgiui spektrofotometru išmatuotas 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis pasiekia 0,8 ± 0,03. 20 μl tiriamos ištraukos sumaišyta su 3 ml darbinio ABTS tirpalo. Po 60 minučių spektrofotometru matuotas mėginių šviesos absorbcijos sumažėjimas. Lyginamasis tirpalas – ekstrakcijos tirpiklis. Antiradikalinis aktyvumas ABTS metodu išreikštas pagal trolokso kalibracinės kreivės lygtį: y = 0,00005x+0,006, R2 = 0,964. UV–regimosios šviesos spektrofotometrinis CuPRAC metodas. Į mėgintuvėlį įpilta po 1 ml 10 mmol/l vario (II) chlorido, 7,5 mmol/l neokuproino etanolinio tirpalo ir 1,0 mol/l amonio acetato buferinio tirpalo bei 10 μl tiriamos ištraukos. Po 60 min matuota šviesos sugertis, kai bangos ilgis lygus 450 nm [64]. Antioksidacinis aktyvumas CuPRAC metodu išreikštas pagal trolokso kalibracinės kreivės lygtį: y = 0,00004x + 0,021, R2 = 0,999.

UV–regimosios šviesos spektrofotometrinis FRAP metodas. Šis metodas buvo atliktas pagal Benzie ir kt. (1995) straipsnyje aprašytą metodiką [65]. Darbinis FRAP tirpalas paruoštas sumaišius 300 mmol/l natrio acetato buferinį tirpalą (0,775 g natrio acetato, 4 ml ledinės acto rūgšties 250 ml vandeninio tirpalo), 10 mmol/l TPTZ (2,3,5-trifenil-1,3,4-triaza-2-azoniaciklopenta-1,4-dieno chlorido) tirpalą 40 mmol/l druskos rūgštyje ir 20 mmol/l FeCl3× 6H2O vandeninį tirpalą santykiu 10:1:1. 10 μl tiriamos ištraukos sumaišyta su 3 ml darbinio FRAP tirpalo. Po 60 minučių matuota tirpalo šviesos absorbcija, kai bangos ilgis lygus 593 nm. Lyginamasis tirpalas – darbinis FRAP tirpalas be tiriamos ištraukos. Antioksidacinis aktyvumas FRAP metodu išreikštas pagal trolokso kalibracinės kreivės lygtį: y = 0,000042x + 0,007721, R2 = 0,997). Antioksidacinio aktyvumo in vitro apskaičiavimas. Slyvų vaisių ėminių ištraukų antioksidacinis aktyvumas išreikštas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentu (μmol TE/g) absoliučiai sausai žaliavai. Trolokso ekvivalentas (TE) atitinka trolokso kiekį (μmol), tokiomis pačiomis tyrimo sąlygomis turintį tokį patį antioksidacinį aktyvumą, kaip 1 g augalinės žaliavos. Tiriamų ištraukų antioksidacinis aktyvumas in vitro apskaičiuotas pagal formulę:

, čia: A – tiriamojo tirpalo šviesos absorbcijos dydis; a – nuolydis (angl. slope) iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; b- nuokrypis (angl. intercept) iš trolokso kalibracinio grafiko lygties;

Vband. – tiriamos augalinės žaliavos ištraukos bandinio tūris (ml);

mband. – tiriamos augalinės žaliavos atsvertas kiekis (g).

2.5.6. Tyrimo duomenų analizė

Tyrimo duomenų statistinė analizė atlikta naudojant „Microsoft Office Excel 2013” („Microsoft”, Redmondas, JAV) ir „SPSS 20.0“ („SPSS Inc.“, Čikaga, JAV) kompiuterines programas. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimui naudota „Design Expert 7.0“ („Stat – Ease Inc.“, Mineapolis, JAV) kompiuterinė programa. Tyrimo metu apskaičiuoti trijų pakartojimų aritmetiniai vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai. Kiekinės sudėties įvairavimo įvertinimui apskaičiuotas variacijos koeficientas. Statistiškai reikšmingiems skirtumams tarp skirtingų slyvų veislių nustatyti taikytas vieno faktoriaus dispersinės analizės modelis (One – Way ANOVA), naudojant daugkartinio palyginimo Tjukio kriterijų. Statistiškai reikšmingiems poskiepių įtakos skirtingų veislių kaupiamų individualių fenolinių junginių kiekio efektai nustatyti taikant dalinio eta kvadrato kriterijų. Skirtumai laikomi

26 reikšmingais, kai p<0,05. Duomenų koreliacijai įvertinti buvo naudotas Pirsono koreliacijos koeficientas. Tirti slyvų vaisių ėminiai pagal cheminę sudėtį buvo palyginti klasterinės analizės metodu, naudojant kvadratinius Euklido atstumus.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Slyvų vaisių ėminių antocianinų ekstrakcijos sąlygų nustatymas

Atlikus literatūros apžvalgą pastebėta, jog nemažai mokslininkų tas pačias ekstrakcijos sąlygas naudoja tiek antocianinų, tiek kitų flavonoidų ir fenolinių junginių analizei [20, 21, 66]. Vienas dažniausiai naudojamų ekstrakcijos metodų yra sonifikacija. Šis metodas yra paprastas, greitas, tinka termolabiliems ir lakiems junginiams (antocianinai yra neatsparūs aukštai temperatūrai). Atsižvelgiant į tai, slyvų vaisių ekstrakcijai pasirinktas ekstrakcijos ultragarsu metodas. Ultragarso galia, dažnis, temperatūra, tirpiklių kiekiai turi įtakos individualių išekstrahuotų junginių kiekiui ir santykiui, todėl tiriant slyvų vaisius stengtasi optimizuoti ekstrakcijos sąlygas [41]. Antocianinų ekstrakcijai naudojami parūgštinti vandens ir organinių tirpiklių mišiniai. Kadangi slyvų vaisiai yra naudojami maisto pramonėje, nuspręsta vartoti mažiausiai toksišką organinį tirpiklį etanolį ir įvertinti jo kiekio įtaką antocianinų ekstrakcijos efektyvumui. Etanolio parūgštinimui naudota 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgšties. Ekstrakcijos trukmė ir ultragarso galia turi didelę reikšmę išekstrahuotų antocianinų kiekiui. Per ilga trukmė ir didelė galia gali paskatinti šių junginių skilimą, todėl būtina nustatyti optimalius ekstrakcijos parametrus. Ilgai vykdant ekstrakciją esant didelei ultragarso galiai, pakyla ekstrakcijos mišinio temperatūra ir termolabilios medžiagos gali greitai suskilti. Žaliavos ir ekstrahento santykis, ultragarso dažnis, vandenilio chlorido rūgšties kiekis fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų parinkimo tyrimo metu nekito. Ultragarso vonelės temperatūros kontroliuoti nebuvo galimybės. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas buvo atliktas naudojant „Design Expert 7.0“ kompiuterinę programą ir taikant paviršiaus atsako centrinės kompozicijos modelį (angl. Central Composite Design). Pasirinkti trys kintamieji: ultragarso galia (339–1130 W), etanolio koncentracija (16,36– 83,64 proc. v/v), ekstrakcijos trukmė (6–73 min). Atlikta 20 bandymų, kurių sąlygas suformulavo programa, nustatyta, kad modelis nėra statistiškai reikšmingas (p=0,227, F=1,64, p>F). Išanalizavus rezultatus buvo nustatytos tendencijos ir suformuota hipotezė, jog optimaliausios ekstrakcijos sąlygos yra naudojant 50 proc. (v/v) etanolį, ekstrakciją vykdant 678 W galios ultragarso vonelėje 60 minučių. Hipotezė buvo tikrinama duomenis lyginant su 6 kitomis sąlygomis, kuriomis pavyko išekstrahuoti daugiausiai antocianinų (daugiau kaip 1 mg/g).

2 pav. Bendro antocianinų kiekio įvairavimas slyvų vaisių ėminiuose, ekstrakcijai naudojant skirtingų koncentracijų etanolį, keičiant ultragarso galią ir ekstrakcijos trukmę; raidės žymi statistiškai reikšmingus bendro antocianinų kiekio skirtumus, ekstrahuojant slyvų vaisių ėminius skirtingomis ekstrakcijos sąlygomis (p<0,05)

Atlikus slyvų vaisių ėminių ekstrakcijos sąlygų parinkimo tyrimus, nustatyta, jog didžiausias bendras antocianinų kiekis (1,35±0,001 mg/g ir 0,14±0,07 mg/g, p<0,05) buvo išgautas, taikant atitinkamai šias sąlygas: naudojant 50 proc. (v/v) etanolį, 678 W ultragarso galią 73 minutes ir naudojant 83,64 proc. (v/v) etanolį, 678 W ultragarso galią 40 min (2 pav.). Siekiant taupyti laiką ir elektros energijos sąnaudas buvo parinktos sąlygos, reikalaujančios trumpesnės ekstrakcijos (ekstrakcijos trukmė 40 min, etanolio koncentracija 83,64 proc. (v/v), ultragarso galia 678 W). Šios sąlygos pritaikytos tolimesniems slyvų vaisių fitocheminiams tyrimams.

3.2. Antocianinų kiekinės sudėties slyvų vaisių ėminiuose įvairavimas

Slyvų vaisiuose esančių antocianinų kiekis labai varijuoja priklausomai nuo klimato sąlygų ir veislės. Siekiant iš slyvų vaisių pagaminti produktą, turintį kuo daugiau antocianinų, vertėtų pasirinkti veisles ne tik pagal derlingumą, atsparumą ir kitas augalo savybes, bet ir pagal subrandinamų vaisių fitocheminę sudėtį. Augalo poskiepio kilmė taip pat gali turėti įtakos slyvų vaisių antocianinų kiekio įvairavimui.

3.2.1. Slyvų vaisių bendro antocianinų kiekio įvairavimo tyrimas

Bendras antocianinų kiekis slyvų vaisių ėminiuose varijuoja nuo 0,093±0,005 mg CGE/g (p<0,05) 'Uleno renklodė' vaisių ėminiuose. Didžiausias kiekis, atitinkamai 5,94±0,13 mg CGE/g ir 5,81±0,06 mg CGE/g (p<0,05) nustatytas 'Čačanska Najbolje' (abiejų poskiepių) veislės slyvų vaisių ėminiuose (3 pav.). Antocianinų kiekio įvairavimo tarp skirtingų veislių slyvų ėminių įvertinimui apskaičiuotas variacijos koeficientas. Jis parodo bendro antocianinų kiekio variacijos amplitudę. Variacijos koeficientas lygus 55,84 proc., tai parodo didelį bendro antocianinų kiekio įvairavimą skirtingų veislių slyvose. Tai gali būti dėl to, kad slyvų vaisių spalvos labai varijuoja (nuo geltonos, iki rausvai violetinės, mėlynos), o antocianinai yra pigmentai, suteikiantys vaisiams raudoną ar mėlyną spalvą.

3 pav. Skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių bendro antocianinų kiekio įvairavimas; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių antocianinų kiekio įverčių (p<0,05)

Vidutiniškai slyvų vaisiuose sukaupta 2,73±1,52 mg CGE/g (sausos masės) antocianinų. 2009 metais Slovėnijos mokslininkai tyrė 4 slyvų veisles, bendras antocianinų kiekis svyravo nuo 0,074 mg CGE/g ('Čačanska rodna') iki 0,367 mg CGE/g ('Čačanska najbolje') šviežios masės [24]. 2012 metais publikuotame straipsnyje rašoma, jog liofilizuotose slyvose vidutiniškai nustatyta 13,80±5,93 mg CGE/g (sausos masės) antocianinų [67]. Liofilizuotuose persikuose antocianinų rasta šiek tiek mažiau 9,54±2,36 mg CGE/g sausos masės [67]. Vyšniose ir nektariniuose antocianinų rasta daugiausiai: atitinkamai 234,45±258,26 mg CGE/g ir 66,42±42 mg CGE/g sausos masės [67].

3.2.2. Slyvų vaisių antocianinų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo tyrimas

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu buvo nustatyti šie antocianinai: cianidin-3-O- gliukozidas, cianidin-3-O-rutinozidas, peonidin-3-O-gliukozidas, peonidin-3-O-rutinozidas (4 pav.). Cianidin-3-O-gliukozidas nustatytas visų veislių slyvų vaisių ėminiuose (5 pav.). Šis junginys sudaro 21,99 proc. bendro antocianinų kiekio. Mažiausias cianidin-3-O-gliukozido kiekis (atitinkamai 92,94 ± 4,65 µg/g, 78,07±3,90 µg/g ir 83,63±4,18 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Favorita del Sultano', 'Uleno renklodė' ir 'Viktorija'. Didžiausias šio junginio kiekis (atitinkamai 221,34±11,07 µg/g, 244,83±12,24 µg/g ir 222,99±11,15 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Čačanska najbolje' (Prunus cerasifera Ehrh. ir 'Vangenheimo vengrinė' poskiepių) ir 'Zarechnaya Rannyaya'. Vidutinis cianidin-3-O-gliukozido kiekis slyvų vaisių ėminiuose siekia 148,63±47,53 µg/g. Variacijos koeficientas (31,98 proc.) parodo gan didelį šio junginio įvairavimą skirtingų veislių slyvų vaisiuose. Lenkijos mokslininkai liofilizuotuose 'Valor' veislės vaisiuose nustatė šiek tiek daugiau (295,8±8,0 µg/g) cianidin-3-O-gliukozido [68].

4 pav. Slyvų vaisių ėminio ištraukos ESC chromatograma (veislė 'Zarechnaya Rannyaya', λ=525 nm): 1 – cianidin-3-O-gliukozidas, 2 – cianidin-3-O- rutinozidas, 3 – peonidin-3-O-gliukozidas, 4 – peonidin-3-O-rutinozidas

Cianidin-3-O-rutinozidas vyrauja visų veislių slyvų vaisių ėminiuose. Jis sudaro 48,21 proc. visų antocianinų kiekio. Mažiausias cianidin-3-O-rutinozido kiekis (92,82±4,64 µg/g ir 131,88±6,59 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Uleno renklodė' ir 'Viktorija'. Didžiausias šio junginio kiekis (662,07±33,10 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Čačanska najbolje' 'Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio ėminyje. Vidutinis cianidin-3-O-rutinozido kiekis slyvų vaisių ėminiuose yra 325,84±141,86 µg/g. Variacijos koeficientas (43,54 proc.) parodo gan didelį šio junginio įvairavimą tarp skirtingų veislių slyvų vaisių. Lenkijos mokslininkų publikuotame straipsnyje paskelbti duomenys (cianidin-3-O-rutinozidas vyrauja slyvų vaisiuose ir jo kiekis siekia 574,3±6,5 µg/g) patvirtina gautus rezultatus [68].

5 pav. Skirtingų veislių naminių slyvų ėminių individualių antocianinų kiekinė sudėtis, µg/g

Peonidin-3-O-gliukozidas nustatytas visų veislių slyvų ėminiuose, išskyrus 'Dambrovicų vengrinė', 'Favorita del Sultano' ir 'Uleno renklodė' veisles. Šis antocianinas vidutiniškai sudaro 15,23 proc. bendro antocianinų kiekio slyvų vaisių ėminiuose. Šio junginio kiekis svyruoja nuo 98,58±4,93 µg/g iki 112,24±5,61 µg/g. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp šio junginio kiekių skirtingų veislių slyvų vaisių ėminiuose nenustatyta (p<0,05). Vidutinis peonidin-3-O-gliukozido kiekis slyvų vaisių ėminiuose yra 102,95±3,55 µg/g. Variacijos koeficientas (3,45 proc.) parodo labai mažą šio junginio kiekio įvairavimą skirtingų veislių slyvų vaisiuose. Lenkijos mokslininkų publikuotame straipsnyje šis junginys neidentifikuotas, nors Lietuvos sąlygomis auginamose slyvose šio junginio buvo pakankamai, kad jis galėtų būti kiekybiškai identifikuotas [68]. Peonidin-3-O-rutinozidas nustatytas visų veislių slyvų vaisių ėminiuose, išskyrus 'Uleno renklodė'. Šis junginys sudaro 17,58 proc. visų antocianinų kiekio. Mažiausias šio antocianino kiekis (atitinkamai 114,34±5,72 µg/g, 115,91±5,80 µg/g, 110,00±5,50 µg/, 100,43±5,02 µg/g, 102,91±5,15 µg/g, 109,01±5,45 µg/g, 106,03±5,30 µg/g, 105,69±5,28 µg/g, 107,24±5,36 µg/g, 101,73±5,09 µg/g, 110,51±5,53 µg/g, 112,38±5,45 µg/g, 104,58±5,23 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų ėminiuose: 'Čačanska najbolje' (abiejų poskiepių), 'Čačanska Rana', 'Edinburginė' (abiejų poskiepių), 'Favorita del Sultano', 'Kijevo vėlyvoji', 'Kometa', 'Opal', 'Rausvė', 'Valor' (abiejų poskiepių) ir 'Viktorija'. Didžiausias šio junginio kiekis (atitinkamai 158,29±7,91 µg/g, 155,94±7,80 µg/g, 159,90±7,99 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Dambrovicų vengrinė', 'Stanley' ir 'Violeta'. Vidutinis peonidin-3-O-rutinozido kiekis slyvų vaisių ėminiuose 118,85±18,75 µg/g. Variacijos koeficientas (15,77 proc.) parodo mažą šio junginio

įvairavimą tarp skirtingų veislių slyvų vaisių. Lenkijos mokslininkai nustatė beveik penkis kartus mažesnį peonidin-3-O-rutinozido kiekį (22,1±0,7 µg/g) liofilizuotuose 'Valor' veislės slyvų vaisiuose. Mažiausias suminis antocianinų kiekis (170,89±8,54 µg/g, p<0,05), nustatytas taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą, nustatytas 'Uleno renklodė' veislės slyvų vaisių ėminyje. Didžiausias suminis antocianinų kiekis (1121,68±56,08 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Čačanska najbolje' veislės 'Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio slyvų vaisių ėminyje. Variacijos koeficientas (32,22 proc.) parodo gan didelį bendro antocianinų kiekio įvairavimą skirtingų veislių slyvų vaisiuose. Vidutinis suminis antocianinų kiekis yra 670,63±211,15 µg/g. Lenkijos mokslininkai ultra–efektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrine detekcija metodu nustatė, kad suminis antocianinų kiekis liofilizuotuose 'Valor' veislės slyvų vaisiuose yra 892,27 µg/g [68]. Lietuvoje auginamų 'Valor' veislės slyvų vaisiuose nustatyta 713,74±35,69–908,13±45,41 µg/g antocianinų (priklausomai nuo poskiepio), taigi paskelbti mokslininkų duomenys patvirtina gautus rezultatus. Suminis antocianinų kiekis nedaug skiriasi (tačiau skiriasi individualių antocianinų kiekiai), taip gali būti dėl skirtingų klimato sąlygų, kitokio dirvožemio. Straipsnyje rašoma, kad žaliava buvo pirkta turguje, todėl vaisių kilmė nėra tiksliai žinoma. Bendras ir suminis antocianinų kiekiai, nustatyti skirtingais metodais (ESC ir UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu), skiriasi. UV–regimosios šviesos spektrofotometriniu metodu nustatytas bendras antocianinų kiekis varijuoja (CV=55,84 proc.) nuo 0,09 mg CGE/g iki 5,94 mg CGE/g. ESC metodu nustatys suminis antocianinų kiekis varijuoja mažiau: nuo 0,17 mg/g iki 1,12 mg/g (CV=32,22 proc.). Šie skirtumai gali atsirasti dėl to, kad UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu aptinkami ir kiti junginiai, kurie sugeria šviesą ties tuo bangos ilgiu, kuriame vyksta matavimas (ruduojančios medžiagos, antocianinų skilimo produktai). Slyvų vaisiuose gali būti daugiau antocianinų, kurių tiriant ESC metodu nepavyko identifikuoti (pavyzdžiui, Slovėnijos mokslininkai be jau minėtų junginių dar identifikavo ir kiekybiškai nustatė cianidin-3-O-ksilozidą) [24]. Įtakos gali turėti tai, kad UV–spektrofotometrijos metodu bendras junginių kiekis yra išreiškiamas CGE ekvivalentais, kuomet ESC metodu individualių junginių kiekis buvo išreikštas pagal kiekvienam junginiui sudarytą standarto kalibracinę kreivę. Taigi, ECS metodu suminis antocianinų kiekis nustatomas tiksliau, be to, galima nustatyti individualių junginių kiekį. Apibendrinant gautus rezultatus, tirtų veislių slyvų vaisių ėminių ištraukose kiekybiškai nustatytus antocianinus kiekio mažėjimo tvarka galima išdėstyti taip: cianidin-3-O- rutinozidas>cianidin-3-O-gliukozidas>peonidin-3-O-rutinozidas>peonidin-3-O-gliukozidas. Peonidin- 3-O-gliukozido yra ne visų veislių slyvų vaisiuose. Peonidin-3-O-rutinozidas neaptiktas tik geltonos spalvos ('Uleno renklodė') vaisiuose, kuriuose antocianinų kiekis yra labai mažas. Šie rezultatai patvirtina Slimestad ir kt. (2009), Usenik ir kt. (2013) bei anksčiau paminėtų publikacijų duomenis [19, 28].

3.3. Slyvų vaisių proantocianidinų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimas

Mažiausias bendras proantocianidinų kiekis (atitinkamai 1,00±0,03 mg EE/g ir 1,22±0,03 mg EE/g, p<0,05) slyvų vaisių ėminiuose nustatytas 'Uleno renklodė' ir 'Čačanska Rana' veislių vaisių ėminiuose. Didžiausias proantocianidinų kiekis (5,33±0,27 mg EE/g, p<0,05) nustatytas veislės 'Kometa' vaisių ėminiuose (6 pav.). Proantocianidinų kiekio įvairavimui nustatytas variacijos koeficientas. Jis yra 38,56 proc., tai parodo gana didelį bendro proantocianidinų kiekio įvairavimą tarp skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių.

6 pav. Skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių bendro proantocianidinų kiekio įverčių (p<0,05)

Vidutiniškai slyvų vaisiuose sukaupta 2,51±0,97 mg EE/g proantocianidinų. 2009 metais suomių paskelbtame straipsnyje rašoma, kad slyvose nustatyta 1,05±0,10 mg/g proantocianidinų, nektarinų ir persikų vaisiuose mažiau: atitinkamai 0,22±0,02 mg/g ir 0,38±0,02 mg/g, šviežios masės [69]. Atlikus proantocianidinų analizę naudojant ultra–efektyviąją skysčių chromatografiją su masių spektrometrija (UESC–MS) identifikuoti du procianidinai: procianidinas A2 (epikatechin- (2β→7,4β→8)-epikatechinas) ir procianidinas C1 (epikatechin-(4β→8)-epikatechin-(4β→8)- epikatechinas) ir monomeras katechinas (7 pav.). Procianidino C1 kiekis svyruoja nuo

65,47±3,27 μg/g (slyvų veislės 'Viktorija' vaisių ėminiuose) iki 1484,15±71,21 μg/g (slyvų veislės 'Kometa' vaisių ėminiuose), p<0,05. Apskaičiuotas variacijos koeficientas (62,48 proc.), parodo didelį procianidino C1 kiekio įvairavimą tarp skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių.

7 pav. Skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių katechino, proantocianidinų A2 ir C1 kiekio įvairavimas

Procianidino A2 'Favorita del Sultano', 'Jubileum' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepis), 'Viktorija' ir 'Violeta' veislių slyvų vaisių ėminiuose nebuvo aptikta. Mažiausias šio junginio kiekis (atitinkamai 5,65±0,28 µg/g, 3,62±0,18 µg/g, 3,36±0,17 µg/g, 4,65±0,23 µg/g, 2,95±0,15 µg/g, 5,86±0,29 µg/g, 3,94±0,20 µg/g, 0,36±0,02 µg/g ir 0,03±0,002 µg/g, p<0,05) nustatytas šiose veislėse: 'Čačanska najbolje' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepyje), 'Čačanska Rana', 'Edinburginė' (abiejuose poskiepiuose), 'Herman', 'Jubileum' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepyje), 'Kijevo vėlyvoji', 'Opal' ir 'Stanley'. Didžiausias procianidino A2 kiekis (174,44±8,72 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Kometa' veislės slyvų vaisių ėminiuose. Apskaičiuotas variacijos koeficientas (205,24 proc.) parodo labai didelį procianidino A2 kiekio įvairavimą tarp skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių. Vidutinis katechino kiekis tirtų veislių slyvų vaisių ėminiuose siekia 477,17±210,24 µg/g. Mažiausias katechino kiekis (atitinkamai 136,17±6,81 µg/g ir 169,39±8,47 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Jubileum' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio) ir 'Rausvė'. Didžiausias šio junginio kiekis (999,92±50,00 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Edinburginė' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepio) veislės slyvų vaisių ėminyje. Apskaičiuotas variacijos koeficientas (44,06 proc.) rodo gan didelį katechino kiekio įvairavimą tarp skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių. 2012 metais mokslininkai Vokietijoje užaugintų slyvų luobelėse nustatė katechino kiekį: jis svyravo nuo 11±7 µg/g iki 290±101 μg/g (šviežios masės) [21]. Mūsų tyrime buvo tiriami vaisiai su luobelėmis, juose rasta daugiau katechino, todėl galima daryti prielaidą, jog minkštime yra daugiau

35 katechino nei žievelėse, tačiau siekiant patikrinti šią hipotezę vertėtų ištirti tomis pačiomis sąlygomis augančių vaisių luobeles ir minkštimus. 2014 metais publikuotame straipsnyje aprašoma, jog Liuksemburge augančių slyvų vaisiuose nustatyta nuo 1,11±0,11 μg/g iki 4,66±0,13 μg/g (šviežios masės) [20]. Mūsų tirtose slyvose nustatyta daugiau katechino, tačiau taip gali būti dėl to, kad mūsų tiriama žaliava buvo liofilizuota, todėl rezultatus lyginti sunku. Apskaičiuotas vidutinis suminis katechino ir procianidinų A2 ir C1 kiekis siekia 1037,18±438,16 µg/g. Mažiausias suminis šių junginių kiekis (atitinkamai 496,22±24,81 µg/g, 650,94±32,55 µg/g, 585,65±29,28 µg/g, 583,51±29,18 µg/g ir 613,09±30,65 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Čačanska Rana', 'Jubileum' (abiejų poskiepių), 'Valor' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio), 'Violeta'. Didžiausias suminis šių junginių kiekis (2210,04±110,50 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Kometa' veislės slyvų vaisių ėminyje. Variacijos koeficientas (42,25 proc.) parodo šių junginių įvairavimą tarp skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių. Bendras ir suminis proantocianidinų kiekiai, nustatyti skirtingais metodais, skiriasi: 1,00 – 5,33 mg EE/g (UV–regimosios šviesos spektrofotometrija) ir 0,49 – 2,21 mg/g (UESC–MS). Tai rodo, kad UESC–MS būdu identifikuoti ne visi junginiai. Ispanijos mokslininkai slyvų vaisiuose nustatė daugiau proantocianidinų. Jiems pavyko identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti procianidinus B1, B2, B4 ir A tipo dimerinius procianidinus [70]. Jų nustatytas s proantocianidinų kiekis yra mažesnis: slyvų vaisių luobelėse svyruoja nuo 662,2±133,1 μg/g iki 1650,6±19,6 μg/g, minkštime – nuo 179,0±39,7 μg/g iki 566,1±51,0 μg/g [70]. Persikuose bendras proantocianidinų kiekis svyruoja nuo 310,7±30,0 μg/g iki 1098,6±120,1 μg/g luobelėse ir nuo 87,4±15,6 µg/g iki 658,5±37,0 μg/g minkštime [70]. Nektarinuose bendras proantocianidinų kiekis svyruoja nuo 93,5±20,5 μg/g iki 744,5±143 μg/g luobelėse ir nuo 13,6±8,2 µg/g iki 551,0±30,2 μg/g vaisių minkštime [70]. Apibendrinant gautus rezultatus, daugiausiai proantocianidinų nustatyta 'Kometa' veislės slyvų vaisių ėminiuose. Tačiau ne visus proantocianidinus pavyko identifikuoti, o literatūros šia tema yra mažai. Slyvų vaisių individualių proantocianidinų profiliai yra gana skirtingi: ne visų veislių ėminiuose nustatytas procianidinas A2 (jo kiekis visuose ėminiuose yra mažiausias, tad galimai kai kurios veislės jo kaupia mažiau, nei galima kiekybiškai įvertinti), procianidino C1 ir monomero katechino santykinis kiekis labai varijuoja – vienose veislėse nustatyta daugiau monomero (9,25 karto daugiau už procianidino C1 'Viktorija' veislės vaisių ėminyje), kitose daugiau procianidino C1 (1,5 karto daugiau už katechino kiekį 'Edinburginė' veislės Prunus cerasifera Ehrh. poskiepio vaisių ėminyje).

3.4. Slyvų vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinės ir kokybinės sudėties įvairavimas

UV–regimosios šviesos spektrofotometrinis Folin – Ciocalteu metodu galima nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį. Todėl siekiant nustatyti individualius junginius buvo pasirinktas UESC–MS metodas. Tyrimo metu nustatyti šie flavonoliai: glikozidai: avikuliarinas, izoramnetin-3-O-rutinozidas, izokvercitrinas, hiperozidas ir rutinas bei aglikonas kvercetinas (8 pav.). Avikuliarinas nustatytas 8 iš 21 slyvų veislių. Mažiausias avikuliarino kiekis (atitinkamai 3,37±17 µg/g ir 14±0,70 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Edinburginė' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepio) ir 'Favorita del Sultano' veislės slyvų vaisių ėminiuose. Didžiausias avikuliarino kiekis (277,16±13,8 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Kometa' veislės slyvų vaisių ėminiuose. Vidutinis avikuliarino kiekis yra 63,24±90 µg/g. Treutter ir kt. (2012) identifikavo avikuliariną slyvų vaisių luobelėse, tačiau kiekybinio nustatymo duomenų nepaskelbė, nors paminėjo, jog avikuliarinas aptiktas ne visose slyvų veislėse [21]. Gauti rezultatai patvirtina šių mokslininkų paskelbtus rezultatus.

8 pav. Flavonolių kiekio įvairavimas slyvų vaisių ėminiuose (µg/g)

Izoramnetin-3-O-rutinozidas nustatytas visų veislių slyvų vaisių ėminiuose, išskyrus 'Kometa'. Didžiausias jo kiekis (65,96±3,30 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Jubileum' veislės ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio) slyvų vaisių ėminyje. Mažiausias kiekis (atitinkamai 3,16±0,16 µg/g, 0,07±0,003 µg/g ir 2,14±0,11 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Rausvė', 'Uleno renklodė' ir 'Zarechnaya Rannyaya'. Vidutinis izoramnetin-3-O-rutinozido kiekis –

21,66±18,4 µg/g. Mokslinėje literatūroje duomenų apie šio junginio kiekį slyvų vaisiuose trūksta, dažniausiai nustatinėjamas izoramnetin-3-O-gliukozido kiekis. Izokvercitrinas nustatytas visų tirtų veislių slyvų vaisių ėminiuose. Mažiausias izokvercitrino kiekis (atitinkamai 4,80±0,24 µg/g, 6,47±0,32 µg/g, 9,37±0,47 µg/g ir 5,7±0,28 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Čačanska najbolje' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepio), 'Favorita del Sultano', 'Uleno renklodė' ir 'Viktorija'. Didžiausias šio junginio kiekis (123,61±6,18 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Zarechnaya Rannyaya' veislės slyvų vaisių ėminyje. Vidutinis izokvercitrino kiekis slyvų vaisių ėminiuose yra 34,97±31,01 µg/g. Treutter ir kt. (2012) izokvercitriną identifikavo visose tiriamose slyvų veislėse [21]. Jo kiekis svyravo nuo 10±1 µg/g iki 249±113 µg/g slyvų vaisių luobelėse [21]. Hiperozidas nustatytas visų veislių slyvų vaisių ėminiuose, išskyrus 'Kometa'. Mažiausias hiperozido kiekis (atitinkamai 5,25±0,26 µg/g, 4,01±0,20 µg/g, 8,35±0,42 µg/g ir 5,22±0,26 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Jubileum' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepio), 'Favorita del Sultano', 'Viktorija' ir 'Violeta'. Didžiausias šio junginio kiekis (71,15±3,56 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Zarechnaya Rannyaya' veislės slyvų vaisių ėminyje. Vidutinis hiperozido kiekis slyvų vaisių ėminiuose yra 26,33±17,25 µg/g. Treutter ir kt. (2012) publikuotame straipsnyje rašoma, jog hiperozido kiekis Vokietijoje išaugintų slyvų vaisių luobelėse svyruoja nuo 8±1,1 µg/g iki 289±175 µg/g [21]. 2014 publikuotame straipsnyje paskelbta, jog Liuksemburge įsigytų slyvų vaisiuose hiperozido kiekis svyruoja nuo 3,88±1,21 µg/g iki 36,99±15,43 µg/g [20]. Tai patvirtina gautus rezultatus. Rutinas yra vyraujantis flavonolis slyvose (sudaro 52,19 – 89,93 proc. slyvose nustatytų flavonolių kiekio), jo yra visų tirtų veislių slyvų vaisių ėminiuose. Mažiausias rutino kiekis (atitinkamai 151,28±7,56 µg/g ir 121,61±6,08 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Uleno renklodė' ir 'Violeta'. Didžiausias šio junginio kiekis (atitinkamai 537,81±26,89 µg/g ir 565,85±28,29 µg/g ir, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Herman' ir 'Rausvė'. Vidutinis rutino kiekis slyvų vaisių ėminiuose yra 325,24±124,48 µg/g. Slovėnijos mokslininkų publikuotame straipsnyje rašoma, kad slyvų vaisių minkštime yra 2–4 µg/g rutino, luobelėse 1057–1867 µg/g [28]. Treutter ir kt. (2012) rutiną nustatė visose tirtose slyvų veislėse, jis sudaro apie 50 proc. visų flavonolių kiekio [21]. Jo kiekis Vokietijoje augančių slyvų vaisių luobelėse svyruoja nuo 55±27 µg/g iki 1194±313 µg/g [21]. Lenkijos mokslininkai liofilizuotuose slyvų vaisiuose nustatė mažiau (50,6±0,8 µg/g) rutino (veislė 'Valor') [68]. Kvercetino kiekis nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Čačanska najbolje' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio), 'Kometa' ir 'Zarechnaya Rannyaya'. Mažiausias kvercetino kiekis (atitinkamai 0,01±0,0003 µg/g ir 0,19±0,01 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Čačanska najbolje' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio) ir 'Zarechnaya Rannyaya'.

Didžiausias šio junginio kiekis (3,81±0,19 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Kometa' veislės slyvų vaisių ėminyje. Vidutinis kvercetino kiekis šių veislių slyvų vaisių ėminiuose yra 1,34±2,14 µg/g. Mokslinėje literatūroje duomenų apie šio aglikono kiekį slyvų vaisiuose trūksta, nes dažniausiai slyvų vaisiuose nustatinėjamas kvercetino glikozidų kiekis. Mažiausias suminis flavonolių kiekis (atitinkamai 181,07±9,05 µg/g ir 150,38±7,52 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Uleno renklodė' ir 'Violeta'. Didžiausias suminis šių junginių kiekis (atitinkamai 638,35±31,92 µg/g, 636,08±31,90 µg/g, ir 657,60±31,89 µg/g, p<0,05) nustatytas šių veislių slyvų vaisių ėminiuose: 'Herman', 'Rausvė' ir 'Zarechnaya Rannyaya'. Vidutinis flavonolių kiekis slyvų vaisių ėminiuose 430,29±178,74 µg/g. Variacijos koeficientas (41,54 proc.) parodo gan didelį flavonolių kiekio įvairavimą tarp skirtingų slyvų veislių. Apskaičiavus individualių flavonolių variacijos koeficientus tarp skirtingų slyvų veislių, nustatyta, jog labiausiai varijavo (CV=160,44 proc.) kvercetino kiekis, šiek tiek mažiau – avikuliarino (CV=142,44 proc.). Kiti junginiai varijavo dar mažiau: izokvercitrino variacijos koeficientas 88,69 proc., izoramnetin-3-O-rutinozido variacijos koeficientas 84,92 proc., hiperozido variacijos koeficientas 65,51 proc. Mažiausiai varijavo rutinas (jo variacijos koeficientas 38,26 proc.). Be minėtų antocianinų, proantocianidinų ir flavonolių slyvų vaisių ėminiuose nustatyti šie fenoliniai junginiai: chlorogeno rūgštis ir arbutinas (9 pav.). Chlorogeno rūgštis nustatyta visų tirtų veislių slyvų vaisių ėminiuose. Mažiausias chlorogeno rūgšties kiekis (0,22±0,01 mg/g, p<0,05) nustatytas 'Kometa' veislės slyvų vaisių ėminyje. Didžiausias šio junginio kiekis (3,13±0,16 mg/g, p<0,05) nustatytas 'Zarechnaya Rannyaya' veislės slyvų vaisių ėminyje. Vidutinis chlorogeno rūgšties kiekis slyvų vaisių ėminiuose yra 1,12±0,67 mg/g. Variacijos koeficientas (59,61 proc.) parodo gan didelį chlorogeno rūgšties įvairavimą tarp skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių. Šie rezultatai patvirtina Lenkijos mokslininkų publikacijų duomenis (Lenkijoje įsigytų liofilizuotų slyvų vaisių ėminiuose yra 1,16±0,006 mg/g chlorogeno rūgšties) [68].

9 pav. Arbutino ir chlorogeno rūgšties kiekių įvairavimas (mg/g); skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių fenolinių junginių kiekio įverčių (p<0,05)

Arbutinas nustatytas 'Jubileum' veislės Prunus cerasifera Ehrh. poskiepio vaisių ėminyje. Nustatytas kiekis siekia 0,44±0,02 mg/g. Mokslinėje literatūroje duomenų apie šių junginių kiekį slyvų vaisių ėminiuose nerasta. Tirtų veislių naminių slyvų vaisiuose identifikuotas ir kiekybiškai įvertintas fenoliniams junginiams nepriklausantis ciklitolis – chino rūgštis. Chino rūgštis nustatyta visų tirtų veislių slyvų vaisių ėminiuose (10 pav.). Mažiausias chino rūgšties kiekis (3,16±0,16 mg/g, p<0,05) nustatytas 'Dambrovicų vengrinė' veislės slyvų vaisių ėminyje. Didžiausias šio junginio kiekis (atitinkamai 8,88±0,44 ir 8,60±0,43 mg/g, p<0,05) nustatytas 'Jubileum' veislės abiejų poskiepių slyvų vaisių ėminiuose. Vidutinis chino rūgšties kiekis slyvų vaisių ėminiuose yra 5,85±1,45 mg/g. Variacijos koeficientas (24,74 proc.) parodo mažą chino rūgšties kiekio įvairavimą tarp skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių. Mokslinėje literatūroje duomenų apie šių junginių kiekį slyvų vaisių ėminiuose nerasta, tačiau chino rūgšties darinių kiekiai slyvų vaisiuose (chlorogeno rūgštis, neochlorogeno rūgštis) yra plačiai tyrinėjami.

10 pav. Chino rūgšties kiekių įvairavimas (mg/g) skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių fenolinių junginių kiekio įverčių (p<0,05)

Apibendrinant gautus rezultatus, iš flavonolių grupės slyvų vaisiuose vyrauja rutinas (sudaro 52,19–89,94 proc. visų nustatytų flavonolių kiekio). Kitų flavonolių procentinis kiekis įvairuoja priklausomai nuo veislės: antroje vietoje pagal kiekį gali būti avikuliarinas (pavyzdžiui, 'Kometa' veislės vaisių ėminiuose), izoramnetin-3-O-rutinozidas (pavyzdžiui, 'Dambrovicų vengrinė'), izokvercitrinas (pavyzdžiui, 'Čačanska najbolje', kurios poskiepis – 'Vangenheimo vengrinė' slyvos sėjinukas) arba hiperozidas (pavyzdžiui, 'Čačanska najbolje' Prunus cerasifera Ehrh. poskiepio). Kvercetinas sudaro mažiausią flavonolių dalį visų tirtų veislių slyvų vaisių ėminiuose. Kiti identifikuoti fenoliniai junginiai: chlorogeno rūgštis (nustatyta visų tirtų veislių slyvų vaisių ėminiuose) ir arbutinas (nustatytas tik 'Jubileum' veislės Prunus cerasifera Ehrh. poskiepio vaisių ėminyje). Flavonolių tyrimo rezultatai patvirtina kitų mokslininkų tyrimų duomenis, tačiau tam tikrų junginių kiekio vairavimo tyrimų duomenų trūksta.

3.5. Slyvų vaisių ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas UV–regimosios šviesos spektrofotometriniu metodu

Vaisių ir daržovių antioksidacinis aktyvumas šiuo metu yra plačiai tyrinėjamas, nes nustatyta, jog antioksidantai slopina oksidacinį stresą žmogaus organizme (apsaugo baltymus, DNR ir lipidus nuo laisvųjų radikalų sukeliamos pažaidos) ir tokiu būdu palaiko žmogaus sveikatą [71]. Kadangi augalai kaupia daug įvairių biologiškai aktyvių medžiagų ir jų kiekiai ir santykiai skiriasi, svarbu ištirti skirtingų genotipų augalų vaisius [72]. Teigiama, jog skirtingi junginiai, pasižymintys

41 antioksidacinėmis savybėmis, gali sąveikauti tarpusavyje sukeldami sinergistinius ar antagonistinius efektus ir taip paveikti vaisiaus antioksidacinį aktyvumą [72]. Dėl šios priežasties svarbu ištirti atskirų veislių slyvų ištraukų antioksidacinį aktyvumą. Mokslininkai taiko labai daug metodų antioksidaciniam aktyvumui nustatyti, tačiau jų mechanizmai ir atlikimo sąlygos (pH, tirpikliai) skiriasi, todėl dažnai tam pačiam tyrimo objektui tirti naudojami keli metodai [61]. Slyvų vaisių ėminių ištraukų antioksidacinis aktyvumas in vitro buvo nustatytas šiais metodais: ABTS•+ antiradikalinio aktyvumo nustatymo metodu, redukciniais FRAP ir CuPRAC metodais. Atlikus ištraukų antioksidacinio aktyvumo nustatymą skirtingais metodais gauti rezultatai skiriasi. Antiradikalinio aktyvumo, įvertinto ABTS•+ radikalų surišimo metodu, variacijos koeficientas 14,58 proc. Silpniausiu antiradikaliniu aktyvumu (156,00±1,93 mmol TE/G, p<0,05), surišant ABTS•+ radikalus, pasižymi 'Uleno renklodė' veislės slyvų vaisių ėminių ištraukos (11 pav.). Stipriausias antiradikalinis aktyvumas, surišant ABTS•+ radikalus, nustatytas 'Čačanska najbolje' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepio), 'Kometa', 'Opal' ir 'Zarechnaya Rannyaya' (atitinkamai 300,62±6,78 μmol TE/g, 313,03±4,88 μmol TE/g, 303,19±5,85 μmol TE/g ir 312,51±8,28 μg TE/g, p<0,05) veislių slyvų ėminių ištraukose. Nustatytas vidutinis antiradikalinis slyvų vaisių ėminių ištraukų aktyvumas yra 262,33±38,25 μmol TE/g. 2016 metais Lenkijos mokslininkų publikuotame straipsnyje paskelbti rezultatai rodo mažesnį antiradikalinį aktyvumą: liofilizuotų slyvų ('Valor' veislės) antiradikalinis aktyvumas yra 109,9±5,7 μmol TE/g [68].

11 pav. Skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių ištraukų antiradikalinio aktyvumo in vitro įvairavimas; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų slyvų vaisių ėminių ištraukų antiradikalinio aktyvumo įverčių (p<0,05)

Silpniausias redukcinis aktyvumas, įvertintas FRAP ir CuPRAC metodais, nustatytas 'Uleno renklodė' veislės slyvų vaisių ėminių ištraukose (atitinkamai 136,12±3,60 µmol TE/g ir 63,10±2,27 µmol TE/g, p<0,05) (12 pav.). Stipriausias redukcinis aktyvumas (atitinkamai 400,01±2,10 µmol TE/g ir 420,46±14,61 µmol TE/g, p<0,05), įvertintas FRAP metodu, nustatytas 'Čačanska najbolje' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio) ir 'Zarechnaya Rannyaya' veislių slyvų vaisių ėminių ištraukose. Stipriausias redukcinis aktyvumas (atitinkamai 182,86±7,98 µmol TE/g, 192,95±1,43 µmol TE/g ir 191,35±5,37 µmol TE/g, p<0,05), nustatytas CuPRAC metodu, nustatytas 'Čačanska najbolje' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio), 'Kometa' ir 'Opal' veislių slyvų vaisių ėminių ištraukose.

12 pav. Skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių ištraukų redukcinio aktyvumo in vitro įvairavimas; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus tarp tirtų slyvų vaisių ėminių ištraukų redukcinio aktyvumo įverčių (p<0,05)

Vertinant redukcinio aktyvumo įvairavimą skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių ištraukose, apskaičiuoti variacijos koeficientai: FRAP 22,55 proc., CuPRAC 24,60 proc. Vidutinis redukcinis aktyvumas, vertinant FRAP metodu, slyvų vaisių ėminių ištraukas yra 306,75±69,17 µmol TE/g. Lenkijos mokslininkų paskelbtame straipsnyje šis skaičius mažesnis ir siekia 87,2±7,1 µmol TE/g ('Valor' veislės slyvų) [68]. Vidutinis slyvų vaisių ėminių ištraukų redukcinis aktyvumas, nustatytas CuPRAC metodu, yra 138,59±34,1 µmol TE/g. Turkijos mokslininkų 2015 metais publikuotame straipsnyje paskelbta, kad raudonų slyvų vaisių redukcinis aktyvumas, nustatytas CuPRAC metodu, yra 23,4±0,8 µmol TE/g (šviežios masės) [73]. Tikėtina, kad šis skaičius būtų didesnis, jei rezultatai būtų apskaičiuoti absoliučiai sausai žaliavai.

Lyginant mūsų atliktų tyrimų duomenis su Lenkijos mokslininkų duomenimis, galima pastebėti, jog 'Valor' veislės antioksidacinis aktyvumas, nustatytas FRAP ir ABTS•+ radikalų surišimo metodais, mūsų tyrime yra didesnis, nors antocianinų ir flavonolių kiekiai yra panašūs. Skirtumą gali lemti skirtinga reakcijos mišinio laikymo trukmė (publikacijoje ji nenurodyta) arba kitų junginių buvimas Lietuvos slyvų vaisiuose. Lenkijos mokslininkų duomenimis, ABTS•+ radikalų surišimo metodo rezultatai 1,26 karto didesni už FRAP. Mūsų duomenimis, FRAP metodo rezultatai 1,15–1,43 (priklausomai nuo poskiepio) karto didesni už duomenis, gautus naudojant ABTS•+ radikalų surišimo metodą. Taigi, galima daryt prielaidą, kad šį skirtumą lemia kiti junginiai, kurių mes ir Lenkijos mokslininkai netyrėme: askorbo rūgštis, tokoferoliai, karotenoidai, hidroksicinamono rūgšties dariniai. Apibendrinant gautus rezultatus, galima teigti, kad skirtingais metodais nustatytas antioksidacinis aktyvumas skiriasi. ABTS metodu didžiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas 4 veislių slyvų vaisių ėminių ištraukose, FRAP ir CuPRAC metodais didžiausias redukcinis aktyvumas nustatytas atitinkamai 2 ir 3 veislių vaisių ėminių ištraukose. 'Uleno renklodė' veislės slyvų vaisių ėminių ištraukų antioksidacinis aktyvumas statistiškai reikšmingai silpniausias vertinant visais minėtais metodais.

3.6. Slyvų vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties ir ištraukų antioksidantinio aktyvumo in vitro koreliacinių ryšių įvertinimas

Siekiant įvertinti, kokie junginiai turėjo daugiausiai įtakos slyvų vaisų ėminių ištraukų antioksidaciniam aktyvumui, buvo vertinami koreliaciniai ryšiai. Ryšys tarp ištraukų antioksidacinio aktyvumo ir jose esančių fenolinių junginių buvo nustatytas apskaičiuojant Pirsono koreliacijos koeficientą. Koreliaciniai ryšiai tarp bendro antocianinų, proantocianidinų, flavonolių ir fenolinių junginių kiekio bei individualių junginių bei antioksidantinio aktyvumo nurodyti 1 lentelėje. Tyrimo metu statistiškai reikšmingų koreliacinių ryšių tarp antioksidacinio aktyvumo ir suminių fenolinių junginių bei flavonolių kiekių nenustatyta. Antioksidacinis aktyvumas statistiškai nereikšmingai koreliuoja su šių individualių junginių kiekiais: procianidino A2, katechino, avikuliarino, izoramnetin-3-O-rutinozido, rutino, kvercetino ir chlorogeno rūgšties. Arbutino rasta tik vienos veislės ėminyje, todėl koreliacijos tarp šio junginio kiekio ištraukoje ir ištraukos antioksidacinio aktyvumo vertinti neįmanoma. Avikuliarinas nustatytas 8 veislių ėminiuose, o kvercetinas – 3, todėl gali būti, kad dėl mažos imties koreliacijos nustatymas nėra toks tikslus. Visų kitų junginių kiekis vidutiniškai stipriai ar silpnai koreliuoja su bent vienu metodu nustatytu antioksidaciniu aktyvumu.

1 lentelė. Bendro antocianinų, proantocianidinų, flavonolių ir fenolinių junginių kiekio bei individualių junginių bei antioksidantinio aktyvumo (µmol TE/g) in vitro Pirsono koreliacijos koeficientai (p<0,05) Junginiai Antioksidantinis aktyvumas, µmol TE/g ABTS FRAP CuPRAC Bendras antocianinų kiekis, mg CGE/g 0,619 0,621 0,518

- Cianidin – 3 – O – gliukozidas, µg/g 0,662 0,610 0,611 - Cianidin – 3 – O – rutinozidas, µg/g 0,488 0,545 - - Peonidin – 3 – O - gliukozidas, µg/g 0,487 0,480 - - Peonidin – 3 – O - rutinozidas, µg/g 0,507 - 0,443 Bendras proantocianidinų kiekis, mg EE/g 0,503 - 0,556

- Procianidinas C1, µg/g 0,519 - 0,615 Suminis flavonolių kiekis, µg/g - - -

- Izokvercitrinas, µg/g 0,518 0,453 0,512 - Hiperozidas, µg/g - 0,490 - Suminis fenolinių junginių kiekis, µg/g 0,599 - 0,614

Chino rūgšties kiekis, µg/g - -0,457 -

Bendras antocianinų kiekis vidutiniškai koreliuoja su antiradikaliniu ir redukciniu aktyvumu (r=0,518 – 0,621). Tarp jų cianidin-3-O-gliukozido kiekiai vidutiniškai koreliuoja su antioksidaciniu ir antiradikaliniu aktyvumu. Cianidin-3-O-rutinozido kiekis vidutiniškai koreliuoja su FRAP metodu nustatytu redukciniu aktyvumu ir silpnai koreliuoja su ABTS metodu įvertintu antioksidantiniu aktyvumu. Peonidin-3-O-gliukozido kiekiai silpnai koreliuoja su ABTS ir FRAP metodais nustatytu antioksidaciniu aktyvumu. Peonidin-3-O-rutinozido kiekiai vidutiniškai koreliuoja su ABTS ir silpnai – su CuPRAC metodais nustatytu antioksidaciniu aktyvumu .Cianidin-3-O-rutinozido ir peonidin-3-O- gliukozido kiekiai su CuPRAC metodu nustatytu redukciniu aktyvumu nekoreliuoja, o peonidin-3-O- rutinozido kiekis nekoreliuoja su FRAP metodu nustatytu redukciniu aktyvumu. Cianidin-3-O- rutinozidas yra vyraujantis antocianinas slyvų vaisiuose, todėl tikėtina, kad jo kiekis labiausiai lemia antocianinų sąlygojamą antioksidacinį aktyvumą. FRAP metodu nustatytas redukcinis aktyvumas labiausiai koreliuoja su šių junginių kiekiu, nes šiuo metodu nustatomas tik hidrofilinių junginių antioksidantinis aktyvumas (antocianinai yra vandenyje tirpūs junginiai). CuPRAC ir ABTS metodai įvertina ir hidrofobinių junginių antioksidantinę galią, todėl koreliaciniai ryšiai su antocianinų kiekiu silpnesni. Bendras proantocianidinų kiekis vidutiniškai stipriai koreliuoja su ABTS ir CuPRAC metodais įvertintu antioksidaciniu aktyvumu. Tarp individualių proantocianidinų su ABTS ir CuPRAC

45 metodais įvertintu antioksidaciniu aktyvumu vidutiniškai koreliuoja procianidino C1 kiekis. Šis junginys daugelio veislių slyvų vaisiuose yra vyraujantis proantocianidinas. Suminis flavonolių kiekis statistiškai reikšmingai nekoreliuoja su antioksidaciniu aktyvumu, tačiau izokvercitrino ir hiperozido kiekiai vidutiniškai ar silpnai koreliuoja su antioksidaciniu aktyvumu (hiperozido kiekis silpnai koreliuoja tik su FRAP metodu nustatytu redukciniu aktyvumu). Izokvercitrino kiekis koreliuoja su cianidin-3-O-gliukozido kiekiu (koreliacijos koeficientas r=0,496 yra panašus į koreliacijos su antioksidaciniu aktyvumu koeficientais), todėl gali būti, kad izokvercitrinas neturi įtakos antioksidaciniam aktyvumui. Hiperozidas ir izokvercitrinas sudaro mažą dalį flavonolių kiekio, todėl tikėtina, jog koreliaciniai ryšiai su antioksidaciniu aktyvumu yra atsitiktiniai. Suminio fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo, nustatyto FRAP metodu, koreliaciniai ryšiai yra statistiškai nereikšmingi. Suminis fenolinių junginių kiekis vidutiniškai koreliuoja su antioksidaciniu aktyvumu, nustatytu ABTS ir CuPRAC metodais. Chino rūgšties kiekio ir antioksidacinio aktyvumo koreliaciniai ryšiai yra priešingi, koreliacijos su antiradikaliniu aktyvumu, nustatytu FRAP metodu, koeficientas neigiamas (r= –0,457). Vertinant koreliacinius ryšius galima manyti, jog chino rūgštis antioksidacinį poveikį mažina ir sąveikauja su kitais junginiais antagonistiškai antioksidantinio poveikio atžvilgiu. Šio junginio daugelyje veislių (išskyrus 'Zarechnaya Rannyaya') kiekis yra didesnis už suminį fenolinių junginių kiekį. Kadangi chino rūgštis pasižymi silpnu antioksidaciniu poveikiu, lyginant su hidroksicinamono rūgšties dariniais, ir jos kiekis koreliuoja su procianidino C1 kiekiu (r=–0,473), mažai tikėtina, kad chino rūgštis slopina ištraukos antioksidacinį aktyvumą [74]. Verta paminėti, jog į suminį fenolinių junginių kiekį neįeina hidroksicinamono rūgšties dariniai (išskyrus chlorogeno rūgštį), kurie yra plačiai žinomi kaip stiprūs antioksidantai. Gil ir kt. (2002) publikuotame straipsnyje paskelbti koreliacijos koeficientai tarp bendrų hidroksicinamono rūgšties darinių, flavonolių ir antocianinų kiekių ir FRAP metodu nustatyto antioksidacinio aktyvumo yra statistiškai nereikšmingi [18]. Statistiškai reikšmingas stiprus ryšys tarp yra tik tarp FRAP metodu nustatyto antioksidacinio aktyvumo ir bendro fenolinių junginių ir bendro flavan-3-olių kiekio [18]. Kitų užsienio mokslininkų publikacijose slyvų vaisių junginių koreliacijos su antioksidaciniu poveikiu koeficientai taip pat yra nedideli, fenoliniai junginiai labiau koreliuoja nei antocianinai [75, 76]. Vizzotto ir kt. (2007) straipsnyje skelbiama, kad koreliacinis ryšys tarp bendro antocianinų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo yra silpnas (koreliacijos koeficientas r=0,25, p<0,05) [75]. Lyginant mūsų tyrimo ir užsienio mokslininkų koreliacinių ryšių skirtumus galima įtarti, jog mūsų tyrimo metu nebuvo identifikuoti visi fenoliniai junginiai, kurie gali lemti nemažą dalį ištraukos antioksidantinio poveikio. Mūsų atveju antocianinų kiekis su antioksidaciniu aktyvumu koreliuoja labiau nei fenoliniai junginiai.

Antioksidacinio aktyvumo ir bendro antocianinų kiekio tyrimų rezultatai, tiriant 'Uleno renklodė' veislės slyvų vaisių ėminių ištraukas įrodo, jog antioksidantinis aktyvumas priklauso ne tik nuo antocianinų kiekio. Šios veislės vaisių ėminių ištraukoje nustatyta labai mažas kiekis antocianinų (šios veislės bendras antocianinų kiekis sudaro 3,41 proc. bendro antocianinų kiekio vidurkio, nustatyto UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu). Tuo tarpu šios ištraukos antioksidacinis aktyvumas sudaro 44,38–59,49 proc. visų veislių antioksidacinio aktyvumo vidurkio. Šioje ištraukoje katechino ir flavonolių (izoramnetin-3-O-rutinozido, izokvercitrino, hiperozido ir rutino) kiekiai didesni už visų veislių vidurkį, taigi tikėtina, kad šie junginiai suteikia vaisių ėminių ištraukoms antioksidacines savybes.

3.7. Slyvų vaisių ėminių sudėties palyginimas naudojant klasterinę analizę

Atlikus klasterinę analizę, naminių slyvų ėminiai pasiskirstė į penkis klasterius (13 pav.). I klasteriui priskirtų veislių slyvų vaisių ėminiuose nustatyti didesni už vidutinius izoramnetin-3-O- rutinozido ir chino rūgšties kiekiai. Chino rūgšties kiekis šio klasterio slyvų veislių vaisiuose yra didžiausias, o cianidin-3-O-gliukozido, procianidino C1, rutino ir izokvercitrino šio klasterio slyvų veislių vaisiuose kiekiai yra mažiausi lyginant su kitais klasteriais, o kvercetino neturi nei vienas šio klasterio veislių ėminys. Šiame klasteryje yra veislė (kaukazinio poskiepio 'Jubileum'), turinti arbutino. Kitų junginių kiekiai šio klasterio veislių slyvų vaisių ėminiuose yra mažesni už vidutinius. II klasteriui priskirtos dvi veislės: 'Herman' ir 'Edinburginė' (vengrinės slyvos poskiepis). Šiam klasteriui priskirtų veislių slyvų ėminiuose nustatyti didesni už vidutinius cianidin-3-O- gliukozido, peonidin-3-O-rutinozido, peonidin-3-O- gliukozido, avikuliarino, izokvercitrino, rutino, chlorogeno rūgšties kiekiai. Izoramnetin-3-O-gliukozido kiekis šio klasterio veislių slyvų ėminiuose yra didžiausias, o procianidino A2 ir hiperozido kiekiai yra mažiausi, lyginant su kitų klasterių slyvų veislėmis. Arbutinas ir kvercetinas neaptiktas nė viename šio klasterio slyvų veislių ėminyje. Kitų junginių kiekiai šio klasterio slyvų veislių vaisių ėminiuose yra mažesni už vidutinius. III klasteriui priskirtų veislių slyvų vaisių ėminiuose nustatyti didesni už vidutinius cianidin- 3-O-gliukozido, cianidin-3-O-rutinozido, peonidin-3-O-rutinozido, procianidino C1, izoramnetin-3-O- rutinozido, hiperozido, rutino ir chlorogeno rūgšties kiekiai. Katechino šio klasterio slyvų veislių vaisiuose kiekis yra didžiausias, o peonidin-3-O-gliukozido, avikuliarino, kvercetino ir chino rūgšties kiekiai yra mažiausi, lyginant su kitais klasteriais. Kitų junginių kiekiai šio klasterio slyvų veislių vaisių ėminiuose yra mažesni už vidutinius.

13 pav. Slyvų veislių panašumo pagal fenolinių junginių ir chino rūgšties sudėtį slyvų vaisių ėminiuose dendrograma

IV klasteriui priskirta tik viena slyvų veislė – 'Kometa'. Joje nustatyti peonidin-3-O- gliukozido, katechino, izokvercitrino ir rutino kiekiai yra didesni už vidutinius. Procianidino C1, procianidino A2, avikuliarino ir kvercetino kiekiai šios slyvų veislės vaisių ėminiuose yra didžiausi, o cianidin-3-O-rutinozido, peonidin-3-O-rutinozido kiekiai ir chlorogeno rūgšties – mažiausi, lyginant su kitų klasterių slyvų veislių vaisių ėminiais. Izoramnetin-3-O-rutinozido ir hiperozido šios veislės slyvų vaisių ėminiuose neaptikta. Kitų junginių kiekiai šios veislės slyvų vaisių ėminiuose yra mažesni už vidutinius. V klasteriui priskirta tik viena slyvų veislė – 'Zarechnaya Rannyaya'. Joje nustatyti procianidino C1 ir avikuliarino kiekiai didesni už vidutinius. Cianidin-3-O-gliukozido, cianidin-3-O- rutinozido, peonidin-3-O-gliukozido, peonidin-3-O-rutinozido, izokvercitrino, hiperozido, rutino, chlorogeno rūgšties kiekiai šios veislės slyvų vaisių ėminiuose yra didžiausi, o katechino ir izoramnetin-3-O-rutinozido kiekiai – mažiausi, lyginant su kitų klasterių slyvų veislių vaisių ėminiais. Hiperozido šios veislės slyvų vaisių ėminiuose neaptikta. Kitų junginių kiekiai šios veislės slyvų vaisių ėminiuose yra mažesni už vidutinius. Lyginant skirtingų poskiepių slyvų vaisių ėminius, naudojant klasterinę analizę, matomas skirtumas tarp slyvų veislės 'Edinburginė' skirtingų poskiepių – vengrinės slyvos poskiepis priskirtas II

48 klasteriui, o kaukazinės – III. 'Čačanska najbolje', 'Jubileum' ir 'Valor' veislių slyvų skirtingų poskiepių vaisių ėminiai buvo priskirti tiems patiems klasteriams. Atlikta tirtų slyvų veislių vaisių ėminių fenolinių junginių pagrindinių komponenčių analizė (14 pav.). Išsamiai analizei naudotos trys pagrindinės komponentės, kurios paaiškina 74,43 proc. bendrosios tiriamųjų duomenų sklaidos. Su pirmąja komponente, kuri aprašo 34,71 proc. bendrosios duomenų dispersijos, labai stipriai teigiamai koreliuoja procianidino A2 (0,924),avikuliarino (0,961) ir kvercetino (0,968) kiekiai, stipriai teigiamai koreliuoja procianidino C1 (0,737) kiekis, vidutiniškai teigiamai izokvercitrino (0,565) kiekis (15 pav.). Antroji komponentė, apibūdinanti 29,21 proc. bendrosios duomenų sklaidos, stipriai teigiamai koreliuoja su izokvercitrino (0,731), hiperozido (0,796) ir chlorogeno rūgšties (0,820) kiekiais. Trečioji komponentė, apibūdinanti 10,51 proc. bendrosios duomenų dispersijos, labai stipriai teigiamai koreliuoja su cianidin-3-O-rutinozido (0,927) kiekiu, stipriai teigiamai koreliuoja su cianidin-3-O-gliukozido kiekiu (0,819), vidutiniškai teigiamai – su peonidin-3-O-rutinozido (0,694) kiekiu.

14 pav. Tirtų slyvų vaisių ėminių fenolinių junginių pagrindinių komponenčių analizė. 1 – 'Čačanska najbolje' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepis), 2 – 'Čačanska najbolje' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepis), 3 – 'Čačanska Rana', 4 – 'Dambrovicų vengrinė', 5 – 'Edinburginė' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepis), 6 – 'Edinburginė' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepis), 7 – 'Favorita del Sultano', 8 – 'Herman', 9 – 'Jubileum' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepis), 10 – 'Jubileum' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepis), 11 – 'Kijevo vėlyvoji', 12 – 'Kometa', 13 – 'Opal', 14 – 'Rausvė', 15 – 'Stanley', 16 – 'Uleno renklodė', 17 – 'Valor' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepis), 18 – 'Valor' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepis), 19 – 'Viktorija', 20 – 'Violeta', 21 – 'Zarechnaya Rannyaya'

15 pav. Identifikuotų fenolinių junginių koreliacijų su pagrindinėmis komponentėmis koeficientai

Išanalizavus gautus duomenis galima teigti, kad labiausiai iš visų veislių slyvų vaisių ėminių fenolinių junginių kiekine įvairove išsiskiria 'Kometa' ir 'Zarechnaya Rannyaya' veislių vaisių ėminiai. 'Kometa' veislės slyvų vaisių ėminiuose nustatyta daugiausiai procianidinų A2 ir C1, avikuliarino ir kvercetino, mažiausiai chlorogeno rūgšties, neaptikta hiperozido ir izoramnetin-3-O-rutinozido. 'Zarechnaya Rannyaya' veislės slyvų vaisių ėminiuose nustatyta daugiausiai izokvercitrino, hiperozido ir chlorogeno rūgšties. Labiausiai iš visų veislių slyvų vaisių ėminių antocianinų kiekiu išsiskiria 'Čačanska najbolje' (abiejų poskiepių), 'Valor' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio) ir 'Violeta' veislių slyvų vaisių ėminiai – juose nustatytas didžiausias bendras antocianinų kiekis.

3.8. Poskiepio įtakos skirtingų veislių slyvų vaisių ėminiuose kaupiamų fenolinių junginių kiekiui tyrimas

Mokslinėje literatūroje skelbiama, jog poskiepis turi įtakos slyvų augalų (augumui, derlingumui, atsparumui šalnoms ir ligoms) ir vaisių (vaisiaus dydis) charakteristikoms [13, 14, 77, 78]. Vertinant bendrą antocianinų, proantocianidinų ir flavonolių kiekių įvairavimą skirtingų veislių slyvų vaisių ėminiuose taikant vienfaktorinę dispersinę analizę ANOVA buvo pastebėta, kad tam tikrų veislių skirtingų poskiepių slyvų vaisių ėminiuose tam tikrų fenolinių junginių kiekis statistiškai reikšmingai skiriasi. Dėl šios priežasties buvo nutarta plačiau ištyrinėti poskiepio įtaką skirtingų veislių slyvų vaisių ėminiuose kaupiamų fenolinių junginių kiekio įvairavimui. Šiam tikslui buvo apskaičiuotas dalinis eta kvadratas (η2) kiekvienai veislei. Rezultatai pateikti 2 lentelėje.

2 lentelė. Daliniai eta kvadratai (η2), nurodantys poskiepio įtakos kiekvienos veislės individualių fenolinių junginių kiekiu efekto dydį. Paryškintu šriftu pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai (p<0,05) 'Čačanska najbolje' 'Edinburginė' 'Jubileum' 'Valor' Cianidin-3-O- F=6,079, p=0,069, F=0,264, p=0,635, F=0,038, p=0,855, F=105,712, gliukozidas η2=0,603 η2=0,062 η2=0,009 p<0,05, η2=0,964 Cianidin-3-O- F=21,572, p<0,05, F=0,234, p=0,654, F=0,673, p=0,458, F=45,87, p<0,05, rutinozidas η2=0,844 η2=0,055 η2=0,144 η2=0,920 Peonidin-3-O- F=1,086, p=0,356, F=0,233, p=0,655, F=0,668, p=0,460, F=0,062, p=0,815, gliukozidas η2=0,214 η2=0,055 η2=0,143 η2=0,15 Peonidin-3-O- F=0,111, p=0,759, F=0,356, p=0,583, F=0,262, p=0,636, F=0,163, p=0,707, rutinozidas η2=0,027 η2=0,082 η2=0,062 η2 0,039 Procianidinas F=6,456, p=0,064, F=19,156, F=0,131, p=0,736, F=8,180, p<0,05, C1 η2=0,617 p<0,05, η2=0,827 η2=0,032 η2=0,672 Procianidinas F=395,819, p<0,05, F=60,518, F=1140,399, F=197,213, A2 η2=0,990 p<0,05, η2=0,938 p<0,05, η2=0,997 p<0,05, η2=0,980 F=79,425, p<0,05, F=458,679, F=745,702, F=127,907, Katechinas η2=0,952 p<0,05, η2=0,991 p<0,05, η2=0,995 p<0,05, η2=0,970 F=1200,00, F=228,431, Avikuliarinas p<0,05, η2=0,997 p<0,05, η2=0,983 Izoramnetin-3- F=15,753, p<0,05, F=20,525, F=209,678, F=20,530, p<0,05, O-rutinozidas η2=0,797 p<0,05, η2=0,837 p<0,05, η2=0,981 η2=0,837 F=1019,619, F=0,587, p=0,486, F=123,444, F=134,494, <0,05, Izokvercitrinas p<0,05, η2=0,996 η2=0,128 p<0,05, η2=0,969 η2=0,971 F=1,402, p=0,302, F=0,016, p=0,906, F=621,288, F=36,349, p<0,05, Hiperozidas η2=0,260 η2=0,004 p<0,05, η2=0,994 η2=0,901 F=52,559, <0,05, F=18,603, F=151,491, F=18,790, p<0,05, Rutinas η2=0,929 p<0,05, η2=0,823 p<0,05, η2=0,974 η2=0,824 Chlorogeno F=4,650, p=0,097, F=79,461 p<0,05, F=6,341, p=0,065, F=10,311, p<0,05, rūgštis η2=0,538 η2=0,952 η2=0,613 η2=0,720 F=1200,783, Arbutinas p<0,05, η2=0,997 F=1,104, p=0,353, F=0,034, p=0,862, F=0,638, p=0,469, F=0,296, p=0,615, Chino rūgštis η2=0,216 η2=0,009 η2=0,138 η2=0,069

Tyrimo duomenys parodo, jog poskiepio prigimtis neturi statistiškai reikšmingos įtakos visų veislių visų fenolinių junginių kiekiui. Tačiau kiekviena veislė jautri poskiepio įtakai. Priklausomai nuo poskiepio, 'Čačanska najbolje' veislės slyvų vaisiuose statistiškai reikšmingai skiriasi cianidin-3- O-gliukozido, procianidino A2, katechino, izoramnetin-3-O-rutinozido, izokvercitrino ir rutino kiekiai. 'Edinburginė' veislės slyvų vaisiuose kaupiami procianidino A2 ir C1, katechino, avikuliarino, izoramnetin-3-O-rutinozido, rutino ir chlorogeno rūgšties kiekiai statistiškai reikšmingai skiriasi, priklausomai nuo poskiepio prigimties. Priklausomai nuo poskiepio, 'Jubileum' veislės slyvų vaisiuose esančio procianidino A2, katechino, flavonolių ir arbutino kiekiai statistiškai reikšmingai skiriasi. 'Valor' veislės slyvų vaisiuose kaupiami cianidin-3-O-gliukozido, cianidin-3-O-rutinozido, proantocianidinų, flavonolių ir chlorogeno rūgties kiekiai statistiškai reikšmingai skiriasi, priklausomai nuo poskiepio prigimties. Visų keturių slyvų veislių vaisiuose kaupiamų procianidino A2, katechino, izoramnetin-3-O- rutinozido ir rutino kiekiai statistiškai reikšmingai skiriasi, priklausomai nuo poskiepio. Dalinis η2 tarp statistiškai reikšmingų rezultatų varijuoja nuo 0,672 iki 0,997. Tai nurodo didelį poskiepio efektą kaupiamų junginių kiekiui (dideliu efektu laikoma dalinio eta kvadrato reikšmė, didesnė už 0,14). Didžiausia poskiepio įtaka nustatyta 'Jubileum' veislės slyvų vaisiuose kaupiamų fenolinių junginių kiekiui (dalinis η2 tarp šios veislės ėminių statistiškai reikšmingų rezultatų varijuoja nuo 0,969 iki 0,997). Peonidin-3-O-gliukozido, peonidin-3-O-rutinozido ir chino rūgšties kiekiai visų keturių veislių slyvų vaisių ėminiuose skiriasi statistiškai nereikšmingai, priklausomai nuo poskiepio.

3.9. Rezultatų apibendrinimas

Atlikus skirtingų vaisių slyvų vaisių ištraukų sudėties ir antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymo tyrimus galima teigti, jog skirtingų veislių ir kai kurių poskiepių slyvų vaisių fenolinių junginių sudėtis ir antioksidacinis aktyvumas varijuoja gana plačiose ribose. Fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo koreliaciniai ryšiai silpni arba vidutiniški, nenustatyta stipraus ryšio tarp kurio nors junginio ar junginių grupės ir antioksidacinio aktyvumo. Įvertinus tyrimų rezultatus klasterinės analizės ir pagrindinių komponenčių analizės metodais, nustatyta, kad fenoliniai junginiai labiausiai varijuoja 'Kometa' ir 'Zarechnaya Rannyaya' veislių slyvų vaisių ėminiuose. Poskiepio įtaka kaupiamų junginių kiekiui priklauso nuo veislės ir paties junginio prigimties.

4. IŠVADOS

1. Nustatytos geriausios slyvų vaisių antocianinų ekstrakcijos sąlygos. Didžiausias bendras antocianinų kiekis (1,35±0,001 mg/g ir 0,14±0,07 mg/g, p<0,05) buvo išgautas, taikant atitinkamai šias sąlygas: naudojant 50 proc. (v/v) etanolį, 678 W ultragarso galią 73 minutes ir naudojant 83,64 proc. (v/v) etanolį, 678 W ultragarso galią 40 min. 2. ESC metodu identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti šie antocianinai: cianidin-3-O- gliukozidas, cianidin-3-O-rutinozidas, peonidin-3-O-gliukozidas, peonidin-3-O- rutinozidas. Didžiausias suminis antocianinų kiekis (1121,68±56,08 µg/g, p<0,05) ESC metodu nustatytas 'Čačanska najbolje' veislės 'Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio slyvų vaisių ėminyje. Didžiausias bendras antocianinų kiekis, atitinkamai 5,94±0,13 mg CGE/g ir 5,81±0,06 mg CGE/g (p<0,05) nustatytas 'Čačanska Najbolje' (abiejų poskiepių) veislės slyvų vaisių ėminiuose. 3. UESC–MS metodu identifikuoti šie proantocianidinai: procianidinai A2 ir C1, monomeras katechinas. UV–regimosios šviesos spektrofotometriniu ir UESC–MS metodais didžiausi bendras ir suminis proantocianidinų kiekiai (atitinkamai 5,33±0,27 mg EE/g ir 2,21±0,11 mg/g, p<0,05) nustatyti 'Kometa' veislės slyvų vaisių ėminiuose. Didžiausias suminis flavonolių (avikuliarino, hiperozido, izokvercitrino, izoramnetin-3-O-rutinozido, rutino ir kvercetino) kiekis (atitinkamai 181,07±9,05 µg/g ir 150,38±7,52 µg/g, p<0,05) UESC–MS metodu nustatytas 'Uleno renklodė' ir 'Violeta' veislių slyvų vaisių ėminiuose. Didžiausias chlorogeno rūgšties kiekis (3,13±0,16 mg/g, p<0,05) nustatytas 'Zarechnaya Rannyaya' veislės. 4. UV–regimosios šviesos spektrofotometriniu metodu nustatytas skirtingų veislių slyvų vaisių ištraukų antioksidacinis aktyvumas. Stipriausias antiradikalinis aktyvumas, surišant ABTS•+ radikalus, nustatytas 'Čačanska najbolje' (Prunus cerasifera Ehrh. poskiepio), 'Kometa', 'Opal' ir 'Zarechnaya Rannyaya' (atitinkamai 300,62±6,78 μmol TE/g, 313,03±4,88 μmol TE/g, 303,19±5,85 μmol TE/g ir 312,51±8,28 μg TE/g, p<0,05) veislių slyvų ėminių ištraukose. Stipriausias redukcinis aktyvumas (atitinkamai 400,01±2,10 µmol TE/g ir 420,46±14,61 µmol TE/g, p<0,05), įvertintas FRAP metodu, nustatytas 'Čačanska najbolje' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio) ir 'Zarechnaya Rannyaya' veislių slyvų vaisių ėminių ištraukose. Stipriausias redukcinis aktyvumas (atitinkamai 182,86±7,98 µmol TE/g, 192,95±1,43 µmol TE/g ir 191,35±5,37 µmol TE/g, p<0,05), nustatytas CuPRAC metodu, nustatytas 'Čačanska najbolje' ('Vangenheimo vengrinė' slyvos poskiepio), 'Kometa' ir 'Opal' veislių slyvų vaisių ėminių ištraukose.

5. Įvertinti koreliaciniai ryšiai tarp naminių slyvų vaisių ėminiuose identifikuotų individualių fenolinių junginių kiekių ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro. Stipriausi koreliaciniai ryšiai (atitinkamai r=0,619 ir r=0,621) nustatyti tarp bendro antocianinų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo, nustatyto ABTS ir FRAP metodais, taip pat tarp cianidin-3-O-gliukozido ir antioksidacinio aktyvumo, nustatyto ABTS, FRAP, CuPRAC metodais (atitinkamai r=0,662, r=0,610, r=0,611). Ryšiai tarp kitų junginių ir antioksidantinio aktyvumo yra vidutiniški, silpni arba statistiškai nereikšmingi. 6. Atliktas poskiepio įtakos slyvų vaisiuose kaupiamų fenolinių junginių kiekybinei sudėčiai tyrimas. Visų keturių slyvų veislių vaisiuose kaupiamų procianidino A2, katechino, izoramnetin-3-O-rutinozido ir rutino kiekiai statistiškai reikšmingai skiriasi, priklausomai nuo poskiepio (dalinis η2=0,672 iki 0,997). Peonidin-3-O-gliukozido ir peonidin-3-O- rutinozido kiekiai visų keturių veislių slyvų vaisių ėminiuose skiriasi statistiškai nereikšmingai, priklausomai nuo poskiepio. Kitų junginių kiekiui poskiepis turi arba neturi statistiškai reikšmingo skirtumo, priklausomai nuo veislės.

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Ištyrus Lietuvos klimato sąlygomis auginamų skirtingų veislių slyvų vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį ir jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą, rekomenduojama maistui, maisto papildų, funkcinio maisto ir kitų produktų kūrimui ir gamybai naudoti skirtingas veisles, kurių vaisiuose yra daugiausiai tam tikrų junginių (antocianinų, flavonolių, kitų fenolinių junginių). Norint pagaminti produktą, turintį daug antocianinų, rekomenduojama naudoti 'Čačanska najbolje', 'Valor' ir 'Violeta' veislių slyvas. Siekiant, kad produktas turėtų daug antioksidantų, rekomenduojama naudoti 'Čačanska najbolje', 'Kometa' (šios veislės slyvų vaisiai turi didžiausią bendrą flavonolių ir rutino kiekį) ar 'Zarechnaya Rannyaya' (šios veislės slyvų vaisiai turi didžiausius chlorogeno rūgšties, izokvercitrino ir hiperozido kiekius) veislių slyvas. Perspektyvu šių veislių slyvas auginti Lietuvos individualiuose ir pramoniniuose soduose, naudoti slyvų selekcijai.

6. LITERATŪRA

1. Díaz-Mula HM, Zapata PJ, Guillén F, Martínez-Romero D, Castillo S, Serrano M, et al. Changes in hydrophilic and lipophilic antioxidant activity and related bioactive compounds during postharvest storage of yellow and purple plum cultivars. Postharvest Biol Technol. 2009;51(3):354–63. 2. Durazzo A. Study Approach of Antioxidant Properties in Foods: Update and Considerations. Foods. 2017;6(3):17. 3. FAOSTAT. Production quantities of Plums and sloes in World. Prieiga per internetą: http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC/visualize 4. Igwe EO, Charlton KE. A Systematic Review on the Health Effects of Plums (Prunus domestica and Prunus salicina). Phyther Res. 2016;30(5):701–31. 5. Plants Profile for Prunus domestica (European plum). Prieiga per internetą: https://plants.usda.gov/core/profile?symbol=PRDO 6. Chin SW, Shaw J, Haberle R, Wen J, Potter D. Diversification of almonds, peaches, plums and cherries - Molecular systematics and biogeographic history of Prunus (Rosaceae). Mol Phylogenet Evol. 2014;76(1):34–48. 7. Halász J, Hegedûs A, Kurilla A. Preliminary characterization of the self- incompatibility genotypes of European plum (Prunus domestica L.) cultivars. 2014;20(3–4):23–6. 8. Glišić I, Cerović R, Milošević N, Dordević M, Radicević S. Initial and final fruit set in some plum (Prunus domestica L.) Hybrids under different pollination types. Genetika. 2012;44(3):583–93. 9. Callahan AM. Plums. In: Kole C, Hall TC, editors. Compendium of Transgenic Crop Plants. Kearneysville: Blackwell Publishing Ltd; 2009. p. 93–119. 10. Rop O, Jurikova T, Mlcek J, Kramarova D, Sengee Z. Antioxidant activity and selected nutritional values of plums (Prunus domestica L.) typical of the White Carpathian Mountains. Sci Hortic (Amsterdam). 2009;122(4):545–9. 11. Lanauskas J. Asmeninė informacija. 2016. 12. Kaufmane E, Gravite I, Trajkovski V. Results of Latvian plum breeding programme. Acta Hortic. 2012;968:55–60. 13. Rozpara E, Glowacka A, Grzyb ZS. The growth and yields of eight plum cultivars grafted on two rootstocks in central Poland. Acta Hortic. 2010;874:255–60. 14. Meland M. Performance of six European plum cultivars on four plum rootstocks growing in a northern climate. Acta Agric Scand Sect B Soil Plant Sci. 2010;60(4):381–7. 15. Grigas A. Naminė slyva - Prunus domestica L. In: Lietuvos augalų vaisiai ir sėklos. Vilnius:

Mokslas; 1986. p. 206. 16. El-Beltagi HS, El-Ansary AE, Mostafa MA, Kamel TA, Safwat G. Evaluation of the phytochemical, antioxidant, antibacterial and anticancer activity of Prunus domestica fruit. Not Bot Horti Agrobot Cluj-Napoca. 2019;47(2):395–404. 17. Khallouki F, Haubner R, Erben G, Ulrich CM, Owen RW. Phytochemical composition and antioxidant capacity of various botanical parts of the fruits of Prunus × domestica L. from the Lorraine region of Europe. Food Chem. 2012;133(3):697–706. 18. Gil M., Hess - Pierce B, Kader AA, Tomas - Barberan FA. Antioxidant Capacities, Phenolic Compounds, Carotenoids, and Vitamin C Contents of Nectarine, Peach, and Plum Cultivars from California. J Agric Food Chem. 2002;50(17):4976–82. 19. Slimestad R, Vangdal E, Brede C. Analysis of phenolic compounds in six norwegian plum cultivars (Prunus domestica L.). J Agric Food Chem. 2009;57(23):11370–5. 20. Kaulmann A, Jonville MC, Schneider YJ, Hoffmann L, Bohn T. Carotenoids, polyphenols and micronutrient profiles of Brassica oleraceae and plum varieties and their contribution to measures of total antioxidant capacity. Food Chem. 2014;155:240–50. 21. Treutter D, Wang D, Farag MA, Baires GDA, Rühmann S, Neumüller M. Diversity of phenolic profiles in the fruit skin of Prunus domestica plums and related species. J Agric Food Chem. 2012;60(48):12011–9. 22. Aguzzi A, Lombardi-Boccia G, Cappelloni M, Lucarini M, Lanzi S. Nutrients and Antioxidant Molecules in Yellow Plums (Prunus domestica L.) from Conventional and Organic Productions: A Comparative Study. J Agric Food Chem. 2004;52(1):90–4. 23. Ionica ME, Nour V, Trandafir I, Cosmulescu S, Botu M. Physical and chemical properties of some european Plum Cultivars (Prunus domestica L.). Not Bot Horti Agrobo. 2013;41(2):499– 503. 24. Usenik V, Štampar F, Veberič R. Anthocyanins and fruit colour in plums (Prunus domestica L.) during ripening. Food Chem. 2009;114(2):529–34. 25. Jaiswal R, Karako H, Ru S, Goldner K, Neumu M, Treutter D, et al. Identification of Phenolic Compounds in Plum Fruits ( Prunus salicina L. and Prunus domestica L.) by High-Performance Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry and Characterization of Varieties by Quantitative Phenolic Fingerprints. J Agric Food Chem. 2013;61(49):12020–31. 26. Pino JA, Quijano CE. Study of the volatile compounds from plum (Prunus domestica L. cv. Horvin) and estimation of their contribution to the fruit aroma. Food Sci Technol. 2012;32(1):76–83. 27. Nisar H, Ahmed M, Anjum MA, Hussain S. Genetic diversity in fruit nutritional composition , anthocyanins , phenolics and antioxidant capacity of plum (Prunus domestica) genotypes.

2015;14(1):45–61. 28. Usenik V, Stampar F, Kastelec D. Phytochemicals in fruits of two Prunus domestica L. plum cultivars during ripening. J Sci Food Agric. 2013;93(3):681–92. 29. Popov S V., Ovodova RG, Golovchenko V V., Khramova DS, Markov PA, Smirnov V V., et al. Pectic polysaccharides of the fresh plum Prunus domestica L. Isolated with a simulated gastric fluid and their anti-inflammatory and antioxidant activities. Food Chem. 2014;143:106–13. 30. Gupta RK, Mehta S, Satpathy G, Soni N. Evaluation of nutritional, phytochemical, antioxidant and antibacterial activity of dried plum (Prunus domestica). J Pharmacogn Phytochem. 2014;3(2):166–71. 31. Lenchyk L V. Determination of Content of Flavonoids, Hydroxycinnamic acids and Volatile compounds in Plum leaves. 2016;5(2):131–6. 32. Lenchyk L. Determination of Phenolic Compounds in Prunus domestica Leaves Extract. Sci Pharm. 2015;2(2):31–5. 33. Castañeda-Ovando A, Pacheco-Hernández M de L, Páez-Hernández ME, Rodríguez JA, Galán- Vidal CA. Chemical studies of anthocyanins: A review. Food Chem. 2009;113(4):859–71. 34. Barnes JS, Nguyen HP, Shen S, Schug KA. General method for extraction of blueberry anthocyanins and identification using high performance liquid chromatography-electrospray ionization-ion trap-time of flight-mass spectrometry. J Chromatogr A. 2009;1216(23):4728–35. 35. Kratchanova M, Ciz M, Yanakieva I, Denev P, Ambrozova G, Lojek A. Solid-phase extraction of berries’ anthocyanins and evaluation of their antioxidative properties. Food Chem. 2010;123(4):1055–61. 36. Medina-meza IG, Barbosa-cánovas G V. Assisted extraction of bioactive compounds from plum and grape peels by ultrasonics and pulsed electric fields. J Food Eng. 2015;166:268–75. 37. Turturică M, Oancea AM, Râpeanu G, Bahrim G. Anthocyanins: Naturally occuring fruit pigments with functional properties. Ann Univ Dunarea Jos Galati, Fascicle VI Food Technol. 2015;39(1):9–24. 38. Liazid A, Palma M, Brigui J, Barroso CG. Investigation on phenolic compounds stability during microwave-assisted extraction. J Chromatogr A. 2007;1140(1–2):29–34. 39. Haddadi-Guemghar H, Janel N, Dairou J, Remini H, Madani K. Optimisation of microwave- assisted extraction of prune (Prunus domestica) antioxidants by response surface methodology. Int J Food Sci Technol. 2014;49(10):2158–66. 40. Ghafoor K, Choi YH, Jeon JY, Jo IH. Optimization of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds, antioxidants, and anthocyanins from grape (Vitis vinifera) seeds. J Agric Food Chem. 2009;57(11):4988–94. 41. Esclapez MD, García-Pérez J V., Mulet A, Cárcel JA. Ultrasound-Assisted Extraction of

Natural Products. Food Eng Rev. 2011;3(2):108–20. 42. Chowdhury P, Viraraghavan T. Sonochemical degradation of chlorinated organic compounds, phenolic compounds and organic dyes - A review. Sci Total Environ. 2009;407(8):2474–92. 43. Escarpa A, González MC. Optimization strategy and validation of one chromatographic method as approach to determine the phenolic compounds from different sources. J Chromatogr A. 2000;897(1–2):161–70. 44. Lee J. Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines by pH differential method: collaborative study. J AOAC Int. 2005;88(5):1269–78. 45. Wrolstad RE, Durst RW, Lee J. Tracking color and pigment changes in anthocyanin products. Trends Food Sci Technol. 2005;16(9):423–8. 46. Oancea S, Oprean L. Anthocyanins, from Biosynthesis in Plants to Human Health Benefits. Acta Univ Cibiniensis Ser E FOOD Technol. 2011;15(1):3–17. 47. Ongkowijoyo P, Luna-Vital DA, Gonzalez de Mejia E. Extraction techniques and analysis of anthocyanins from food sources by mass spectrometry: An update. Food Chem. 2018;250:113– 26. 48. Sang J, Sang J, Ma Q, Hou X fang, Li C qin. Extraction optimization and identification of anthocyanins from Nitraria tangutorun Bobr. seed meal and establishment of a green analytical method of anthocyanins. Food Chem. 2017;218:386–95. 49. Vangdal E, Picchi V, Fibiani M, Lo Scalzo R. Effects of the drying technique on the retention of phytochemicals in conventional and organic plums (Prunus domestica L.). LWT - Food Sci Technol. 2017;85:506–9. 50. De Pascual-Teresa S, Sanchez-Ballesta MT. Anthocyanins: From plant to health. Phytochem Rev. 2008;7(2):281–99. 51. Kruger MJ, Davies N, Myburgh KH, Lecour S. Proanthocyanidins, anthocyanins and cardiovascular diseases. Food Res Int. 2014;59:41–52. 52. Qin Y, Xia M, Ma J, Hao Y, Liu J, Mou H, et al. Anthocyanin supplementation improves serum LDL- and HDL-cholesterol concentrations associated with the inhibition of cholesteryl ester transfer protein in dyslipidemic subjects. Am J Clin Nutr. 2009;90(3):485–92. 53. Hassellund SS, Flaa A, Kjeldsen SE, Seljeflot I, Karlsen A, Erlund I, et al. Effects of anthocyanins on cardiovascular risk factors and inflammation in pre-hypertensive men: A double-blind randomized placebo-controlled crossover study. J Hum Hypertens. 2013;27(2):100–6. 54. Shukitt-Hale B, Kalt W, Carey AN, Vinqvist-Tymchuk M, McDonald J, Joseph JA. Plum juice, but not dried plum powder, is effective in mitigating cognitive deficits in aged rats. Nutrition.

2009;25(5):567–73. 55. Noratto GD, Garcia-Mazcorro JF, Markel M, Martino HS, Minamoto Y, Steiner JM, et al. Carbohydrate-free peach (Prunus persica) and plum (Prunus domestica) juice affects fecal microbial ecology in an obese animal model. PLoS One. 2014;9(7):1–9. 56. Zaidi SF, Muhammad JS, Shahryar S, Usmanghani K, Gilani AH, Jafri W, et al. Anti- inflammatory and cytoprotective effects of selected Pakistani medicinal plants in Helicobacter pylori-infected gastric epithelial cells. J Ethnopharmacol. 2012;141(1):403–10. 57. Stacewicz-Sapuntzakis M, Bowen PE, Hussain EA, Damayanti-Wood BI, Farnsworth NR, Damayanti BI, et al. Chemical Composition and Potential Health Effects of Prunes: A Functional Food? Chemical Composition and Potential Health Effects of Prunes: A Functional Food? Crit Rev Food Sci Nutr. 2001;41(4):251–86. 58. Bouayed J, Rammal H, Dicko A, Younos C, Soulimani R. Chlorogenic acid, a polyphenol from Prunus domestica (Mirabelle), with coupled anxiolytic and antioxidant effects. J Neurol Sci. 2007;262(1–2):77–84. 59. Feliciano RP, Shea MP, Shanmuganayagam D, Krueger CG, Howell AB, Reed JD. Comparison of isolated cranberry (Vaccinium macrocarpon Ait.) proanthocyanidins to catechin and procyanidins A2 and B2 for use as standards in the 4-(dimethylamino)cinnamaldehyde assay. J Agric Food Chem. 2012;60(18):4578–85. 60. González-Burgos E, Liaudanskas M, Viškelis J, Žvikas V, Janulis V, Gómez-Serranillos MP. Antioxidant activity, neuroprotective properties and bioactive constituents analysis of varying polarity extracts from Eucalyptus globulus leaves. J Food Drug Anal. 2018;26(4):1293–302. 61. Alam MN, Bristi NJ, Rafiquzzaman M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharm J. 2013;21(2):143–52. 62. Filimon R, Niculaua M, Tabart J, Mihalache Arion C, Dommes J, Kevers C, et al. Antioxidant potential of different plum cultivars during storage. Food Chem. 2014;146:485–91. 63. Mitic V, Jovanovic VS, Ilic M, Ciric S, Dimitrijevic M, Cvetkovic J. Chemometric characterization of peach, nectarine and plum cultivars according to fruit phenolic content and antioxidant activity. Fruits. 2015;71(1):57–66. 64. Ozdemir Olgun FA, Demirata Ozturk B, Apak R. Determination of Synthetic Food Colorants in Powder Beverage Samples by On-line HPLC–Cupric Reducing Antioxidant Capacity (CuPRAC) Assay with Post-Column Detection. Chromatographia. 2016;79(3–4):199–208. 65. Benzie IFF, Strain JJ. Ferric reducing/antioxidant power assay: Direct measure of total antioxidant activity of biological fluids and modified version for simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration. Methods Enzymol. 1998;299(1995):15–27.

66. Turturicə M, Stənciuc N, Bahrim G, Râpeanu G. Effect of thermal treatment on phenolic compounds from plum (Prunus domestica) extracts - A kinetic study. J Food Eng. 2016;171:200–7. 67. Leong SY, Oey I. Effects of processing on anthocyanins, carotenoids and vitamin C in summer fruits and vegetables. Food Chem. 2012;133(4):1577–87. 68. Figiel A, Lech K, Łysiak GP, Wojdyło A, Michalska A. Physicochemical properties of whole fruit plum powders obtained using different drying technologies. Food Chem. 2016;207:223–32. 69. Hellström JK, Törrönen AR, Mattila PH. Proanthocyanidins in common food products of plant origin. J Agric Food Chem. 2009;57(17):7899–906. 70. Tomás-Barberán FA, Gil MI, Cremin P, Waterhouse AL, Hess-Pierce B, and Adel A. Kader. HPLC−DAD−ESIMS Analysis of Phenolic Compounds in Nectarines, Peaches, and Plums. J Agric Food Chem. 2001;49(10):4748–60. 71. Huang D, Ong CN, Isabelle M, Lee BL, Lim MT, Koh W-P. Antioxidant activity and profiles of common fruits in Singapore. Food Chem. 2010;123(1):77–84. 72. Jacobo-Velázquez DA, Cisneros-Zevallos L. Correlations of antioxidant activity against phenolic content revisited: A new approach in data analysis for food and medicinal plants. J Food Sci. 2009;74(9):107–13. 73. Başkan KS, Tütem E, Akyüz E, Apak R. Assessment of the contributions of anthocyanins to the total antioxidant capacities of plant foods. Eur Food Res Technol. 2015;241(4):529–41. 74. Meyer AS, Donovan JL, Pearson DA, Waterhouse AL, Frankel EN. Fruit Hydroxycinnamic Acids Inhibit Human Low-Density Lipoprotein Oxidation in Vitro. J Agric Food Chem. 1998;46(5):1783–7. 75. Vizzotto M, Cisneros-Zevallos L, Byrne DH. Large Variation Found in the Phytochemical and Antioxidant Activity of Peach and Plum Germplasm. J Am Soc Hortic Sci. 2007;132(3):334– 40. 76. Cevallos-Casals BA, Byrne D, Okie WR, Cisneros-Zevallos L. Selecting new peach and plum genotypes rich in phenolic compounds and enhanced functional properties. Food Chem. 2006;96(2):273–80. 77. Sitarek M, Grzyb ZS, Lis J. Performance of ‘Erunosid’ and ‘Wala’ - New polish seedling rootstocks for plum and Prune trees. Acta Hortic. 2010;874:289–92. 78. Grzyb ZS, Sitarek M, Rozpara E. Evaluation of vigorous and dwarf plum rootstocks in the high density orchard in central Poland. Acta Hortic. 2010;874:351–6.

7. PRIEDAI

Magistrinio darbo tema paskelbtų publikacijų sąrašas

Konferencijų tezės: 1. Rugilė Okulevičiūtė, Mindaugas Liaudanskas, Kristina Zymonė, Jonas Viškelis, Darius Kviklys, Pranas Viškelis, Valdimaras Janulis. Determination of anthocyanins and antioxidant activity in vitro in plum cultivars of Lithuania. 24th International Scientific- Practical Conference „Human and nature safety 2018“. 2018 m. gegužės 9 – 11 d., Kaunas. Žodinis pranešimas. 2. Rugilė Okulevičiūtė, Mindaugas Liaudanskas, Kristina Zymonė, Juozas Lanauskas, Jonas Viškelis, Pranas Viškelis, Darius Kviklys. Effect of two different rootstocks on the anthocyanin composition in fruits of different plum (Prunus domestica L.) cultivars. International conference „Contemporary pharmacy: issues, challenges and expectation“. 2019 gegužės 3 d., Kaunas. Žodinis pranešimas. 3. Rugilė Okulevičiūtė, Mindaugas Liaudanskas, Kristina Zymonė, Modestas Žilius, Juozas Lanauskas, Jonas Viškelis, Pranas Viškelis, Darius Kviklys. Determination of anthocyanins, proanthocyanidins and antioxidant activity in vitro in plum cultivars of Lithuania. 25th International Scientific-Practical Conference „Human and nature safety 2019“. 2019 m. gegužės 8 – 10 d., Kaunas. Žodinis pranešimas.

1 PRIEDAS

2 PRIEDAS

3 PRIEDAS