INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA DE LAS PLANTAS
SISTEMAS DE INMERSIÓN TEMPORAL, ELICITACIÓN Y TRANSFORMACIÓN GENÉTICA EN Digitalis purpurea L.
Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas
Naivy Lisbet Pérez Alonso
Santa Clara
2013
UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU” DE LAS VILLAS INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA DE LAS PLANTAS
SISTEMAS DE INMERSIÓN TEMPORAL, ELICITACIÓN Y TRANSFORMACIÓN GENÉTICA EN Digitalis purpurea L.
Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas
Autor: Ing. Naivy Lisbet Pérez Alonso, MSc
Tutor: Inv. Tit., Ing. Elio Antonio Jiménez González, Dr. C
Santa Clara
2013
CITACION CORRECTA
Sistema apellido‐año
Pérez Alonso, Naivy Lisbet. 2013. Sistemas de inmersión temporal, elicitación y transformación genética en Digitalis purpurea L. [Tesis presentada en opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias Agrícolas] Santa Clara, Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Instituto de Biotecnología de las plantas. 97 p.
Sistema numérico
1. Pérez Alonso, Naivy Lisbet. Sistemas de inmersión temporal, elicitación y transformación genética en Digitalis purpurea L. [Tesis presentada en opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias Agrícolas] Santa Clara, Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Instituto de Biotecnología de las plantas, 2013. 97 p.
Agradecimientos
Soy de pocas palabras pero para aquellos que lo merecen va todo mi esfuerzo
-A ti, amigo entrañable y tutor que hace más de 18 años, me diste la oportunidad de conocerte, aprender y amar la biotecnología. De ti recibí grandes consejos en lo profesional y en lo personal y sobre todo, recibí siempre tu apoyo. No olvides que sigo pensando que cuando sea grande quiero ser como tú
- Gracias a ti, Rul, por ser también mi maestro y amigo, te quiero con la vida y te agradezco, incluso, los malos momentos que nos hacen ser mejores
-Al Dr André Gerth por permitirme realizar las investigaciones en BioPlanta y a la vez agradecerle a todos los que hicieron mi estancia allí más agradable. Al Dr Gerhard Kerns, Dr Horst-Michael
Nitzsche, Dr Dirk Wilken y mi querida amiga Annet Jähn un millón de gracias
-A aquellos que revisaron minuciosamente cada detalle de este manuscrito y que aportaron valiosas ideas y cuyos nombres quisiera mencionar pero sería imposible, especialmente le agradezco a los
Doctores Gil Enríquez y Miguel Ramos que pusieron toda su energía y entrega para hacer de este, un mejor documento. A Kosky por las horas de revisión y discusión
-A Marta y Osmildo por permitirme mantener temporalmente una biblioteca personal y que no han escatimado esfuerzos para ayudarme siempre. A Yeny y Lourdes por quitarme tantas preocupaciones burocráticas
-A Marisol por todo el apoyo de la subdirección de investigaciones y a la dirección del IBP en la persona de Osvaldo por facilitarme todo lo necesario para la preparación y presentación de la tesis.
-A ti Migue, mi viejito por cuidar de mi y ayudarme siempre así como a todo el personal de investigación, producción y servicios que han seguido de cerca cada avance de la tesis
-A los amigos de siempre, Leo, Mariela, Daimy, que aún sin saberlo me han hecho crecer y llegar al final de esta carrera. A Maricarmen y Andrés, con los que viví experiencias inolvidables en la lejana
Europa y de los que recibí ayuda profesional. A otros como Diego que forman parte de aquella etapa diferente en mi vida… hazte Doctor ya y te sentirás ligero
Agradecimientos
-A uds amigas del alma, Alina y Elisa, con quienes he compartido momentos alegres otros tristes, pero momentos al fin y de las que he aprendido el valor de la amistad. A uds que me conocen y aceptan tal como soy les agradezco estar siempre...Ellas por aparecer antes en mi vida, pero a uds,
Neyda, Gre, Anabel, Ida mil gracias por la amistad.
-A tía Yoly, tía Reina, abuela Yolanda, Bellito, gracias por cuidar siempre de mi hija y de mi chino con la mayor dedicación
-A mis padres que me enseñaron la grandeza de estudiar y hacer el bien, a mi hermana que es mi sostén, mis tías, primos y primas, que no me pierden de vista, a mi familia entera…. A mi sobrina
Adriana, que no es la única ni la más querida, porque a todos los quiero igual, pero que el nacimiento de este proyecto me impidió estar en el suyo
-A ti, mi amor y amor de todas por tu apoyo, comprensión aún cuando me recuerdas lo tarde que he finalizado este proyecto y en el cual has puesto todo tu conocimiento. Por estar a mi lado, a veces despierto otras dormido, mientras las ideas iban y venían… , a ti que me diste tu fuerza cuando me sentí desfallecer, a ti que me diste la mayor alegría de mi vida, nuestra Lia
-Y por supuesto, a ti, mi Lia amada, amor de mis amores, que me has visto sacrificar horas junto a ti para dedicárselas a la tesis. A ti que has sido paciente con solo 5 años y has sabido esperar, a ti que aprenderás que en la vida hay sacrificios tan grandes como estos pero que valen la pena
A todos los que están y ya no están en cuerpo y alma pero sí en mi corazón, gracias
Abreviaturas Descripción completa
6-BAP 6-Bencilaminopurina ACN Acetonitrilo ADN Ácido desoxirribonucleico ADN-T Ácido desoxirribonucleico de transferencia AIA Ácido indol-3-acético ARN Ácido ribonucleico AS Acetosiringona ChP ChitoPlant® EROs Especies reactivas de oxígeno gMF Gramos de masa fresca gMS Gramos de masa seca HPLC Cromatografía Líquida de Alta Resolución (del inglés High-Performance Liquid Chromatography) KAc Acetato de potasio kb kilopares de bases MDA Malondialdehido MJ Metil jasmonato MFC Medio de cultivo de formación de callos MMb Medio de cultivo de multiplicación de brotes MS Sales inorgánicas propuestas por Murashige y Skoog (1962) pb pares de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa (del inglés Polimerase Chain Reaction) Rif Rifampicina RITA® Recipientes de inmersión temporal automatizados SDS Sulfato duodecilo de sodio SiP SilioPlant® SIT Sistemas de inmersión temporal Spm Espectinomicina (del inglés Spectinomycin) Str Estreptomicina (del inglés Streptomycin)
SÍNTESIS
Digitalis purpurea L. es una de las dos únicas especies de interés económico del género Digitalis. Su importancia radica en que constituye una de las principales fuentes de cardenólidos, fármacos irreemplazables en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. El presente trabajo se realizó con el objetivo de estudiar diferentes estrategias biotecnológicas en Digitalis purpurea L. que permitirán disponer de la base metodológica para el desarrollo de una tecnología para la producción in vitro de cardenólidos. Para su cumplimiento se desarrolló un método de producción de biomasa en sistemas de inmersión temporal (SIT), se determinó el efecto de elicitores en el contenido de cardenólidos y se desarrolló un protocolo para la transformación genética mediado por Agrobacterium tumefaciens. La mayor producción de biomasa por SIT (104,03 gMF y 5,74 gMS) se obtuvo cuando se inocularon 12 explantes. La frecuencia de inmersión influyó en la producción de biomasa y de cardenólidos en los brotes. En el tratamiento con inmersiones cada 4 horas se obtuvo la mayor producción de biomasa y producción neta de cardenólidos por SIT (digitoxina 167,6 µg y digoxina 119,9 µg). La renovación adicional de la atmósfera interna en los SIT, como otro factor evaluado, indujo un mayor estrés oxidativo asociado a un aumento de la síntesis de digitoxina. Estos resultados permitieron realizar el escalado en SIT de 5L de capacidad y diseñar un esquema de producción como estrategia para la obtención de cardenólidos in vitro. Por otra parte, se demostró que la elicitación es una estrategia posible para el incremento de cardenólidos en brotes de D. purpurea. El SilioPlant® (0,01 g.L-1) incrementó la síntesis de cardenólidos en los brotes multiplicados in vitro en 3,6 y 6,9 veces el contenido de digoxina y digitoxina respectivamente, en comparación con el control. Se desarrolló un protocolo para la transformación genética con la cepa de A. tumefaciens C58C1RifR (pMP90) con el vector de transformación pTJK136. La presencia de los transgenes fue detectada mediante PCR y la hibridación por Southern en las líneas regeneradas. El número de insertos del nptII osciló entre una y dos. En el futuro, se requerirá de estudios relacionados con los mecanismos de síntesis de cardenólidos e identificación de enzimas específicas que permitan un incremento en la eficiencia de las alternativas estudiadas.
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………. 1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA………………………………………………………………. 6
2.1 Digitalis purpurea L………………………………..………………………………………. 6
2.1.1 Origen, distribución y clasificación taxonómica…………………………..…………… 6
2.1.2 Descripción botánica……………………………….…………………………………… 6
2.1.3 Importancia farmacológica…………………………………………………………..…. 7
2.2 Cardenólidos .…………………………………………………………………...……..…….. 7
2.2.1 Estructura de los cardenólidos ………………………………………………..…….…… 7
2.2.2 Biosíntesis de cardenólidos………………………………………………………………. 8
2.2.3 Cultivo in vitro de Digitalis spp. y producción de cardenólidos………………………… 10
2.3 Producción in vitro de metabolitos secundarios………………………………………………. 11
2.3.1 Cultivo in vitro para la producción de metabolitos secundarios…………………………. 11
2.3.2 Escalado de la producción………………………………………………………………… 13
2.3.3 Sistemas de inmersión temporal……….……….…………………………………………. 15
2.3.4. Empleo de elicitores para la producción de metabolitos secundarios....…………………. 19
2.4 Transformación genética………………..…………………………..…………………………. 20
2.4.1 Ingeniería metabólica………..…….……………………………..……………………….. 20
2.4.2 Transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens….…………...………. 21
2.4.3 Transformación genética en Digitalis spp. …………………..…………………………… 24
3. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………..…………. 26
3.1. Producción de biomasa de Digitalis purpurea en sistemas de inmersión temporal ..………... 30
3.1.1 Efecto de la densidad de inóculo……………….…………………………………………. 32
3.1.2 Efecto de la frecuencia de inmersión……………….……………………..……………… 32
3.1.3 Efecto de la renovación de la atmósfera…………………………….…………………….. 32
3.1.4 Escalado de la producción de biomasa …………………...... ……………………………. 33
3.2 Efecto de elicitores en el cultivo de brotes de D. purpurea en medio de cultivo semisólido …….………………………………………………………………………..…... 33
3.3 Transformación genética de D. purpurea mediada por Agrobacterium tumefaciens………... 34
3.3.1 Determinación de la concentración mínima letal del agente selectivo….…….…...... 35
3.3.2 Transformación genética…………………………………………………………………. 36
3.3.3 Análisis moleculares de las líneas regeneradas…...……………………………………… 39
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………………….. 44
4.1. Producción de biomasa de Digitalis purpurea en sistemas de inmersión temporal.……... 44
4.1.1 Efecto de la densidad de inóculo……………….…………………………….…………. 44
4.1.2 Efecto de la frecuencia de inmersión……………….………………..……………….… 48
4.1.3 Efecto de la renovación de la atmósfera………………………….…………………….... 55
4.1.4 Escalado de la producción de biomasa ………………...... ……………………………. 60
4.2 Efecto de elicitores en el cultivo de brotes de D. purpurea en medio de cultivo semisólido.. …….………………………………………………………………………..…... 65
4.3 Transformación genética de D. purpurea mediada por Agrobacterium tumefaciens………... 80
4.3.1 Determinación de la concentración mínima inhibitoria del agente selectivo….…….…... 80
4.3.2 Transformación genética…………………………………………………………………. 82
4.3.3 Análisis moleculares de las líneas regeneradas…...……………………………………… 90
5. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………...... …. 97
6. RECOMENDACIONES……………………………………………………………………...... … 98
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
8. ANEXOS
Introducción
1. INTRODUCCIÓN
Las plantas son consideradas una fuente valiosa para la producción de compuestos de interés farmacéutico (Fischer et al., 2007). Entre ellas se destacan las pertenecientes al género Digitalis, siendo Digitalis purpurea L. una de las dos únicas especies de interés económico de dicho género como fuente de cardenólidos (Sales et al., 2011). Estos compuestos muestran propiedades farmacodinámicas similares pero la digitoxina y la digoxina son los más relevantes para la industria farmacéutica (Hornberger et al., 2000). En medicina, estos compuestos son fármacos irreemplazables en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca (Piñol et al., 2008), pero en los últimos años se han descrito también sus efectos en el control del cáncer de riñón, de próstata y leucemia (Lewis, 2009).
Además, el extracto de las hojas es utilizado para la elaboración de preparados homeopáticos (Sales et al., 2011).
D. purpurea es nativa de Europa occidental, el mediterráneo y el noroeste de África, aunque se ha naturalizado en otras regiones subtropicales y templadas del planeta (Warren, 2005). Según Roig
(1974) algunas especies del género Digitalis se cultivaron en Cuba y su crecimiento en condiciones naturales se producía de manera rápida en época de seca. Sin embargo, la ocurrencia de altas temperaturas y abundantes lluvias ocasionó la extinción de las plantas.
Actualmente, la Empresa cubana Químico-Farmacéutica (QUIMEFA) produce 24 millones de tabletas de digoxina anualmente (Olivera, 2012 Comunicación personal). Para esto, se importa la materia prima (polvo activo) proveniente de plantas de Digitalis de la India, por lo que su producción en el país pudiera dar respuesta a la política de sustitución de importaciones como uno de los mayores retos actuales.
El cultivo de plantas en condiciones naturales es hasta el momento la única fuente comercial para la producción de cardenólidos (Kuate et al., 2008), pues la síntesis química de estos compuestos no es económicamente viable.
La variación de las condiciones ambientales que ocurre durante el crecimiento de las plantas en el campo, provoca cambios en la calidad de las plantas y consecuentemente en la fluctuación y
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Introducción
heterogeneidad de las sustancias activas y su concentración en los extractos obtenidos a partir de ellas (Roca-Pérez et al., 2004). A esta problemática se une otro factor y es que las dosis terapéuticas
(0,125-0,25 mg/día) son muy bajas y a la vez muy cercanas a la dosis letal por lo que es fácil exceder las dosis seguras (Dharmadhikari y Dhavse, 2006). Por las razones anteriormente expuestas, es prioritario el desarrollo de estrategias biotecnológicas para la producción de estos compuestos activos
(Vanisree y Tsay, 2007).
En consecuencia, varios métodos de cultivo in vitro de Digitalis spp. han sido descritos en la literatura científica. Tal es el caso del cultivo de suspensiones celulares (Kreis et al., 1986), cultivos embriogénicos (Lindemann y Luckner, 1997), cultivo de raíces (Yoshimatzu et al., 1990) y cultivo de brotes (Erdei et al., 1981; Hagimori et al., 1983). Además, el cultivo in vitro ha brindado una excelente oportunidad para el desarrollo de investigaciones bioquímicas encaminadas al conocimiento de las rutas que rigen la biosíntesis de los cardenólidos (Gavidia et al., 2007).
No obstante, los bajos rendimientos de cardenólidos obtenidos en estas investigaciones han impedido su aplicación a escala comercial. En este sentido han sido ensayadas diversas alternativas con el objetivo de incrementar la producción de cardenólidos en el género Digitalis, tales como cambios en la composición nutricional de los medios de cultivo, la biotransformación, la adición de precursores y la modificación genética (Hagimori et al., 1983; Saito et al., 1990; Gurel et al., 2010).
En el caso específico de D. purpurea, por su importancia en la industria farmacéutica, existe una demanda creciente de tecnologías de producción alternativas al cultivo en condiciones naturales. El cultivo in vitro de células y tejidos permitiría contar con sistemas de producción definidos, en condiciones controladas, así como obtener rendimientos constantes del metabolito de interés (Paek et al., 2005; Vanisree y Tsay, 2007).
Del análisis de la literatura internacional sobre el tema, se puede concluir que el desarrollo de la biotecnología para la obtención de compuestos activos comprende dos pasos cruciales (Wang et al.,
2012). El primero es el desarrollo de métodos eficientes para la producción de biomasa que permitan obtener grandes cantidades de materia prima en cortos períodos de tiempo, en espacios reducidos y al
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Introducción
menor costo posible. El segundo paso es lograr una concentración elevada del compuesto de interés en la biomasa producida. Para esto, existen dos posibilidades; una primera es la activación transitoria de las rutas que regulan la biosíntesis de estos compuestos mediante la variación de las condiciones y del medio de cultivo como la adición de elicitores, entre otras variantes que pueden ensayarse. Una segunda posibilidad es la modificación genética mediante la sobre-expresión de genes que codifican para enzimas importantes en la ruta metabólica del compuesto de interés, más conocida como ingeniería metabólica, que permita generar líneas transgénicas sobre-productoras de dicho compuesto.
La producción de biomasa en biorreactores es una etapa indispensable para la producción comercial de metabolitos secundarios (Karuppusamy, 2009). Diferentes configuraciones de biorreactores se emplean con el objetivo de implementar los procesos a escala comercial, tales como biorreactores con nebulizadores, con suministro externo e interno de aire, biorreactores tipo tanque con agitación y otros (Wu et al., 2011; Wang et al., 2012). Sin embargo, es necesario tener en cuenta factores que influyen en su empleo exitoso tales como el genotipo, el sistema de cultivo y otras especificidades como el sitio de biosíntesis y acumulación de los compuestos de interés a nivel celular.
En Digitalis, se describe la producción de biomasa en biorreactores a partir del cultivo de suspensiones celulares (Alfermann et al., 1985), pero los resultados obtenidos demostraron que la biosíntesis de cardenólidos no ocurre en cultivos indiferenciados. Según Eisenbeiβ et al. (1999) este proceso es básicamente dependiente de la diferenciación morfológica, lo que indica que es necesario desarrollar métodos basados en el cultivo de brotes. Los sistemas de inmersión temporal, ya descritos con anterioridad para la propagación masiva de plantas (Teisson et al., 1996), han sido empleados con éxito para la producción de biomasa en plantas de interés farmacéutico mediante la multiplicación de brotes (Quiala et al., 2006; Schumann et al., 2012). Estos sistemas además de permitir una mayor facilidad para el escalado, se destacan por incrementar la eficiencia biológica y productiva del material vegetal propagado (Escalona et al., 1999; Jiménez et al., 1999).
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Introducción
El empleo de elicitores bióticos y abióticos constituye una estrategia para estimular la síntesis de metabolitos secundarios de plantas cultivadas in vitro (Zhang y Memelink, 2009). La elicitación se ha descrito, mayormente, en el cultivo de suspensiones celulares, en cambio existen muy pocos ejemplos de su aplicación en brotes cultivados in vitro (Liu et al., 2007; Orlita et al., 2008; Coste et al., 2011). Hasta el momento, en la literatura consultada sólo existe un precedente del empleo de elicitores en el género Digitalis (Ghanem et al., 2010). En su investigación, estos autores compararon el efecto de la adición de ácido salicílico, extracto de levadura y cloruro de calcio en brotes de
Digitalis lanata Ehrh. propagados en medio de cultivo semisólido, obteniendo los mayores contenidos de cardenólidos con 200 mM de cloruro de calcio.
La ingeniería genética ha hecho posible la modificación de rutas metabólicas y la regulación genética del metabolismo secundario (Sato et al., 2007). Es en este contexto, donde la ingeniería metabólica ofrece un mayor potencial para la producción de metabolitos de interés. La transformación genética con el objetivo de obtener plantas sobre-productoras de cardenólidos ha sido ensayada en D. minor
(Sales et al., 2007). Sin embargo, según la literatura consultada no existe ningún protocolo para la transformación genética en D. purpurea basado en Agrobacterium tumefaciens y la posterior regeneración de plantas genéticamente modificadas.
Teniendo en cuenta estos antecedentes se estableció la siguiente hipótesis de trabajo:
“El desarrollo de un método para la producción de biomasa mediante el cultivo de brotes en sistemas de inmersión temporal, la activación metabólica por elicitación y la obtención de un protocolo de transformación genética mediado por Agrobacterium tumefaciens, permitirán disponer de la base metodológica necesaria para el desarrollo de una tecnología para la producción in vitro de cardenólidos en Digitalis purpurea L, como alternativa al cultivo de plantas en campo.”
Para validar esta hipótesis de trabajo, se propusieron los siguientes objetivos:
Desarrollar un método de producción de biomasa de D. purpurea mediante la multiplicación de brotes
en sistemas de inmersión temporal.
Determinar el efecto de la adición de elicitores bióticos y abióticos sobre el contenido de cardenólidos
y la respuesta morfológica en brotes de D. purpurea.
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Introducción
Desarrollar un protocolo para la transformación genética mediado por Agrobacterium tumefaciens en
D. purpurea.
Novedad científica: Se describe el empleo de los sistemas de inmersión temporal para la producción de biomasa y de cardenólidos en Digitalis purpurea L., el cual constituye el primer informe hasta el momento a nivel internacional para el género. Además, se informa por primera vez resultados acerca del empleo de elicitores para estimular la síntesis de cardenólidos en brotes cultivados in vitro de esta especie. Se desarrolla el primer protocolo para la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens, resultados sin precedentes en la literatura científica para la especie D. purpurea.
Aporte práctico: Se abordaron tres estrategias básicas que combinadas podrán ser empleadas para el desarrollo de tecnologías para la producción in vitro de cardenólidos a escala comercial. En el plano nacional, el cultivo in vitro de Digitalis purpurea L. para la obtención de cardenólidos pudiera tenerse en cuenta para la sustitución de importaciones, la cual tiene mayor importancia en fármacos que influyen de manera determinante en la calidad de vida de la población.
Aporte metodológico: Se estableció un método para la producción de biomasa a partir de brotes de Digitalis basado en sistemas de inmersión temporal que servirá de base para los procesos de síntesis y acumulación de metabolitos de interés farmacéutico. También constituye una herramienta útil como modelo experimental para el estudio de la biosíntesis de cardenólidos. El protocolo para la transformación genética mediado por
Agrobacterium tumefaciens descrito puede emplearse en estudios funcionales de genes específicos de la ruta.
Este aspecto contribuirá a un mayor conocimiento de las rutas metabólicas e identificación de nuevos genes y enzimas que la regulan y por consiguiente lograr un mayor incremento de la producción in vitro de cardenólidos. A su vez, las estrategias desarrolladas pudieran combinarse para lograr un incremento en la producción de cardenólidos en el género Digitalis.
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Revisión Bibliográfica
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Digitalis purpurea L.
2.1.1 Origen, distribución y clasificación taxonómica
La especie de mayor importancia dentro de la sección Digitalis es la Digitalis purpurea L. (Sales et al., 2011). Es nativa de Europa occidental, el mediterráneo y el noroeste de África, aunque se ha naturalizado en otras regiones subtropicales o templadas de Europa, Asia, África, América del Sur,
Nueva Zelanda, Canadá y Estados Unidos (Warren, 2005). Debido a sus propiedades medicinales, se introdujo en Cuba junto a otras especies del género. Sin embargo, las altas temperaturas y la incidencia de lluvias provocaron la muerte de las plantas (Roig 1974).
La planta es conocida en español con nombres comunes como dedalera, digital o calzones de zorra.
La ubicación taxonómica de D. purpurea fue dada a conocer por Carl Linnaeus. En la actualidad se acepta de la siguiente forma (según NCBI taxonomy, disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov):
Reino: Viridiplantae Phylum: Streptophyta División: Magnoliophyta Subclase: Asterids Orden: Lamiales Familia: Plantaginaceae Tribu: Digitalideae Género: Digitalis
2.1.2 Descripción botánica
D. purpurea es una planta bianual de hasta 2,5 m de altura. Las hojas son alternas, las basales reunidas en una roseta, pecioladas con limbo ovado-lanceolado y margen dentado. Estas son densamente pilosas sobre todo por el envés de coloración grisácea. Presenta una inervación reticular muy saliente por el envés e inflorescencia en un largo racimo terminal.
Las flores son pedunculadas y algo péndulas, muy vistosas. El cáliz es pentámero y verde, la corola de 40-55 mm de longitud, en forma de tubo ancho apenas lobulado en la porción distal, de color en el
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Revisión Bibliográfica
rango desde el púrpura hasta el blanco con manchas oscuras en su interior. El fruto es una cápsula que al madurar se abre desprendiendo numerosas semillas de 0,1 a 0,2 mm de diámetro. En el primer año de crecimiento produce únicamente las hojas basales, ovales, dentadas y de peciolo largo mientras que durante el segundo año se desarrolla un tallo largo y cubierto de hojas sésiles y rugosas
(http://plants.usda.gov,%20march%202010/).
2.1.3 Importancia farmacológica
D. purpurea ha sido empleada desde la antigüedad en el tratamiento de enfermedades cardíacas de manera empírica. Sin embargo, no fue hasta 1785 que W. Withering describió las propiedades medicinales de D. purpurea en el tratamiento de la hidropesía, que en la medicina moderna es reconocida como una consecuencia de la insuficiencia cardíaca. Estudios posteriores demostraron que la digitalis contiene una serie de sustancias cardiotónicas muy activas de naturaleza esteroideo- glicosídica conocidas comúnmente como glicósidos cardiotónicos. Además, las plantas de Digitalis producen otros compuestos no glicósidos como la digitoflavina, el ciclohexanol, taninos, ácidos málico y succínico, los cuales complementan la acción de aquellos (Melero et al., 2000).
La digoxina aumenta la fracción de eyección del ventrículo izquierdo, mejora la sintomatología de los pacientes con insuficiencia cardíaca y reduce las hospitalizaciones (Feussner y Feussner, 2010).
La digitoxina se utiliza en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva y para controlar el ritmo ventricular en la fibrilación auricular crónica (Galiano, 2005). La importancia de estos cardenólidos en la medicina es reconocida a tal punto que no han podido ser sustituidos (Kreis y
Müller-Uri, 2013). En los últimos años se ha descrito la acción de la digoxina y otros glicósidos cardiotónicos como anticancerígenos (Newman et al., 2008; Lewis, 2009).
2.2 Cardenólidos
2.2.1 Estructura de los cardenólidos
Los cardenólidos son moléculas caracterizadas por un núcleo esteroideo (genina o aglicona) que presenta un grupo hidroxilo en la posición C14β del anillo esteroideo y un anillo lactónico insaturado de cinco miembros en la posición C17β (Figura 1).
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Revisión Bibliográfica
Figura 1. Estructura química de los cardenólidos. La digoxina (I) está formada por un núcleo esteroideo (aglicona) y tres unidades de digitoxosa. Las variaciones en el patrón de glicosilación de la aglicona dan lugar a los núcleos esteroideos de la digitoxina (II) y la gitoxina (III).
Varias de las demás posiciones de la fracción genina pueden tener además sustituyentes como grupos hidroxilo, formilo o acetilo (Kreis et al., 1998; Herl et al., 2006). Finalmente, el hidroxilo del C3β se encuentra glicosilado por una cadena de oligosacáridos de hasta cinco unidades dentro de las cuales es usual encontrar azúcares poco comunes como la digitoxosa (Piñol et al., 2008).
2.2.2 Biosíntesis de cardenólidos
Debido al potencial farmacológico de los cardenólidos, se han hecho consistentes esfuerzos por dilucidar sus rutas de biosíntesis y posterior degradación. Sin embargo, las limitaciones técnicas derivadas de la escasez de datos genómicos de esta especie combinadas con la complejidad de la red metabólica en la que se encuentran inmersos los cardenólidos, ha provocado que el conocimiento de dichas vías metabólicas sea aún incompleto.
La biosíntesis de los cardenólidos puede decirse que comienza a partir de la degradación oxidativa de la cadena lateral de los fitoesteroles como el colesterol, campesterol, sitosterol, estigmasterol (Figura
2). El producto de esta reacción es la pregnenolona, la cual es oxidada reversiblemente a pregn-5- eno-3,20-diona por la enzima Δ5-3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (EC 1.1.1.145) (3β-HSD, siglas en inglés), la cual tiene una función en el metabolismo general de los esteroides en células vegetales
(Seidel et al., 1990). Este último compuesto se transforma rápidamente en su isómero pregn-4-eno-
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Revisión Bibliográfica
3,20-diona (progesterona). La próxima reacción de la ruta es la reducción del doble enlace de la progesterona para dar 5β-pregnano-3,20-diona, primer compuesto en el que aparece la conformación
5β característica de los cardenólidos y que por consiguiente se considera el primer paso comprometido absolutamente con la producción de estos compuestos (Gavidia et al., 2007). La reacción es catalizada por la progesterona-5β-reductasa, actividad codificada por al menos dos genes en D. purpurea (Pérez-Bermúdez et al., 2010). A continuación, la 5β-pregnano-3,20-diona es reducida en su posición C3 a 5β-pregnano-3β-ol-20-ona por la propia 3β-HSD (Finsterbusch et al.,
1999). La ruta continúa por derivados de pregnano a partir de las hidroxilaciones en C14 y C20 hasta la condensación en esta última posición con Acetil-CoA y la formación del anillo lactónico (Kreis et al., 1998).
Figura 2. Primeros pasos en la ruta biosintética de cardenólidos y las enzimas relacionadas en el proceso. Tomado de Pérez-Bermúdez et al. (2010) con modificaciones. 3βHSD: Δ5-3β- hidroxiesteroide deshidrogenasa; P5βR: progesterona 5β reductasa; 3βHS-5βOR: 3β- hidroxiesteroide-5β-oxidoreductasa.
La sucesión de enzimas en esta porción de la ruta, sin embargo, no se encuentra descrita. Kreis y
Müller-Uri (2013) realizaron una amplia revisión del estado del arte concerniente a la biosíntesis de cardenólidos en el género Digitalis (incluyendo Isoplexis). Los autores reflejan que la formación de los cardenólidos no ocurre como un proceso sencillo sino que pueden ser sintetizados a través de una red metabólica muy compleja, donde intervienen enzimas con sustratos altamente inespecíficos.
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Revisión Bibliográfica
En general se asume que la adición de azúcares a la posición C3 se produce luego de la formación de la aglicona, aunque no existen evidencias definitivas acerca de la secuencia relativa de los eventos de glicosilación y hidroxilación. La glicosilación de los glicósidos secundarios a primarios es catalizada por la enzima citosólica y soluble UDP-glucosa: digitoxina 16'-O-glucosiltransferasa (DGT, EC
2.4.1.-) en Digitalis lanata Ehrh. (Kreis et al., 1986). Otra enzima relacionada con la biosíntesis tardía de los cardenólidos es la también soluble y citosólica Acetil-CoA: digitoxina 15'-O-acetil transferasa (DAT, EC 2.3.1.-) que cataliza la formación de los lanatósidos a partir de sus precursores no acetilados (Sutor et al., 1990).
2.2.3 Cultivo in vitro de Digitalis spp. y producción de cardenólidos
El cultivo in vitro comenzó a desarrollarse en especies de Digitalis desde hace varias décadas, por el entusiasmo que representaba la posibilidad de utilizar sus facilidades de automatización para la producción de cardenólidos. Sin embargo, dentro de los métodos de producción de biomasa, los intentos de producción mediante cultivos celulares en biorreactores fracasaron (Hagimori et al.,
1980). El estudio de las condiciones necesarias para incrementar la producción de cardenólidos se convirtió, por tanto, en una prioridad.
A principios de los 80, Hagimori y colaboradores realizaron una serie de trabajos en los que desarrollaron diferentes etapas del cultivo in vitro de D. purpurea. Este mismo grupo de investigadores, en 1982, determinaron que el cultivo de brotes verdes acumuló la mayor cantidad de digitoxina, aunque su biosíntesis no está ligada al contenido de clorofila en el tejido. En 1983, teniendo en cuenta sus resultados anteriores, evaluaron el efecto de sales minerales, el pH inicial del medio de cultivo, la adición de precursores en el desarrollo de brotes y la biosíntesis de digitoxina y su liberación al medio de cultivo. En su investigación, determinaron que ninguna de las condiciones evaluadas provocó un incremento en el contenido de digitoxina en el medio de cultivo.
Para otras especies del género también han sido desarrollados protocolos de regeneración in vitro.
Pérez-Bermúdez et al. (1984) estudiaron la morfogénesis a partir de explantes foliares de Digitalis obscura L. y en 1985 describieron factores que influyen en la formación de callos, la inducción de la
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embriogénesis somática y la regeneración de plantas a partir del cultivo de anteras. Arrillaga et al.
(1986) desarrollaron la embriogénesis somática y la regeneración de plantas de D. obscura a partir del cultivo de hipocotilos mediante el estudio de reguladores de crecimiento. Posteriormente, Cacho et al. (1991) estableció el potencial morfogenético in vitro de explantes de hojas, hipocotilos y raíces de Digitalis thapsi L. Mientras, en D. lanata han sido establecidos protocolos tanto por embriogénesis somática (Kuberski et al., 1984) como por organogénesis (Ghanem et al., 2010.
2.3 Producción in vitro de metabolitos secundarios
2.3.1 Cultivo in vitro para la producción de metabolitos secundarios
La enorme demanda de productos naturales que tiene el mercado internacional le ha concedido gran importancia al cultivo in vitro como fuente de metabolitos secundarios y a su vez ha permitido desarrollar nuevas investigaciones en los procesos metabólicos que rigen su producción (Parsaeimehr et al., 2011).
Sin embargo, no es sólo la importancia comercial de estos lo que ha permitido el desarrollo investigativo en este campo. La producción de compuestos químicos regulada por el cultivo in vitro brinda una excelente oportunidad para el estudio de las rutas metabólicas bajo un ambiente controlado (Karuppusamy, 2009).
Las principales ventajas del cultivo in vitro sobre el cultivo convencional de plantas para la producción de metabolitos secundarios radican en la posibilidad de controlar las condiciones ambientales así como obtener un incremento considerable en el rendimiento de los metabolitos específicos (Vanisree y Tsay, 2007). El cultivo in vitro brinda la posibilidad de obtener nuevas moléculas que no son producidas por las plantas en su hábitat natural (Oksman-Caldentey e Inze,
2004). Además, es posible reducir los costos e incrementar la productividad; contar con sistemas de producción definidos, así como la posibilidad de establecer sistemas estrictos de control de la calidad del producto (Paek et al., 2005). El cultivo in vitro ofrece también la posibilidad de sintetizar proteínas foráneas en determinadas situaciones que incluyen proteínas terapéuticas y antigénicas
(Doran, 2000). El proceso de extracción puede ser más simple, rápido y eficiente comparado con la
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extracción a partir de plantas completas. Por otra parte, olores o sabores desagradables asociados con el cultivo convencional de plantas pueden ser modificados o eliminados con el cultivo in vitro
(Karuppusamy, 2009).
Diversos ejemplos corroboran el empleo del cultivo in vitro para la producción de metabolitos secundarios de plantas en laboratorios de investigación (Tabla 1).
Tabla 1. Metabolitos secundarios obtenidos mediante el cultivo in vitro de células y tejidos de plantas en laboratorios de investigación. Especies Compuesto activo Cultivo Referencia Digitalis purpurea L. Cardenólidos Suspensiones celulares Hagimori et al., 1982 Camptotheca acuminata Decne Camptotecina Callos, plántulas Wiedenfeld et al., 1997 Panax ginseng C. A. Meyer Saponinas Raíces Choi et al., 2000 Taxus chinensis Rehd Taxoides Suspensiones celulares Dong y Zhong, 2002 Catharanthus roseus L. Ajmalicina Brotes Satdive et al., 2003 Centella asiatica L. Triterpenos Plántulas Kim et al., 2004 Hypericum perforatum L. Hipericina Brotes Liu et al., 2007 Artemisia annua L. Artemisina Callos Baldi y Dixit, 2008 Ruta graveolens L. Alcaloides Brotes Orlita et al., 2008 Mentha spicata L. Monoterpenos Plántulas Tisserat y Vaughn, 2008 Morinda royoc L. Antraquinonas Raíces Borroto et al., 2008 Panax ginseng C. A. Meyer Ginsenósidos Raíces Kim et al., 2009 Pueraria tuberosa DC. Isoflavonoides Hojas, raíces Rathore y Shekhawat, 2009 Pueraria candollei Wall ex Benth Isoflavonoides Suspensiones celulares Korsangruang et al., 2010 Przewalskia tangutica Maxim Alcaloides Raíces Lan y Quan, 2010 Morinda citrifolia L. Antraquinonas, Suspensiones celulares Deshmukh et al., 2011 flavonoides Hypericum perforatum L. Hipericina Brotes Baggio et al., 2012 Atropa belladona L. Alcaloides Raíces Yang et al., 2011 Mentha piperita L. Ácido rosmarínico suspensiones celulares Krzyzanowska et al., 2012 Panax quinquefolium L. Ginsenósidos Suspensiones celulares Wang et al., 2012
A pesar del gran número de investigaciones que se han llevado a cabo para incrementar las aplicaciones comerciales de las técnicas del cultivo de células en la producción de metabolitos secundarios, existen todavía pocos ejemplos exitosos. Entre ellos se destacan la shikonina, la berberina, el ácido rosmarínico, los ginsenósidos (obtenidos de Lithospermum erythrorhizon Siebold
& Zucc., Coptis japonica (Thunb.) Makino, Coleus bluemi, P. ginseng, respectivamente). Estos son el resultado (tres primeros ejemplos) de la producción a gran escala que combina el cultivo de células
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con la tecnología de los biorreactores y el cuarto ejemplo a partir del cultivo de raíces (Bourgaud et al., 2001; Vanisree y Tsay, 2007). Varios grupos de investigación han desarrollado nuevas estrategias para la obtención de compuestos antitumorales como el paclitaxel a partir de especies de Taxus
(Ketchum et al., 1999), camptotecina de C. acuminata (Wiedenfeld et al., 1997) así como vinblastina y vincristina de C. roseus (Verpoorte et al., 1997).
Una vez estudiado y establecido el sistema de cultivo para la producción del metabolito de interés se deben desarrollar estrategias que permitan aumentar su rendimiento. Casi la totalidad de las investigaciones realizadas culminan en un proceso que integra varias de estas estrategias lo que permite un incremento en los rendimientos de los metabolitos de interés. Estas han sido: la selección de líneas celulares (George et al., 2000); la optimización de la composición del medio y condiciones de cultivo (El Tahchy et al., 2011); la inmovilización celular (Nartop et al., 2012); la adición de precursores (Perassolo et al., 2011); la elicitación (Krzyzanowska et al., 2012); la recuperación del producto in situ (Neelwarne y Thimmaraju, 2009); la biotransformación (Alfermann et al., 1985); el empleo de biorreactores (Wu et al., 2011); la transformación genética (Sales et al., 2003); la ingeniería metabólica (Liu et al., 2011). En los siguientes epígrafes solo se abordarán las estrategias de mayor interés para la investigación.
2.3.2 Escalado de la producción
La producción de metabolitos secundarios en biorreactores a gran escala es un método alternativo y valioso para la producción de sustancias de gran interés con la posibilidad de controlar la producción según la demanda del producto (Kraus y Reinhard, 1989).
Las razones para explicar el poco éxito comercial se derivan de los retos asociados con aspectos de la producción a gran escala (Verpoorte et al., 2002). Varios trabajos científicos muestran que el cultivo de órganos a pesar de ser una mejor fuente de obtención de metabolitos secundarios ha presentado serios problemas (propiedades físicas de los órganos) en el escalado en biorreactores convencionales de altos costos. Autores como Ziv (2005) han señalado que el cultivo de órganos en comparación con el cultivo de suspensiones celulares, muestra generalmente una baja sensibilidad al estrés por daños
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mecánicos. Así, Baldi et al. (2007) hacen referencia a los cambios que ocurren en el ambiente in vitro cuando se realiza el escalado de cultivos en agitación en biorreactores y que generalmente la productividad disminuye. Esto ha llevado al desarrollo de numerosas modificaciones en biorreactores
(Tabla 2) con el objetivo de implementar los procesos a escala comercial.
Tabla 2. Producción de metabolitos secundarios en plantas cultivadas en biorreactores con diferentes configuraciones. Especies Sistema de Tipo de biorreactor Referencia regeneración Artemisia annua L Brotes Biorreactor simple Fulzele et al., 1995 Artemisia annua L Raíces adventicias Biorreactor con suministro Liu et al., 1998 interno de aire Taxus cupidata Siebold & Zucc. Suspensiones Biorreactor airlift Son et al., 2000 celulares Morinda elliptica L. Suspensiones Biorreactor tipo tanque con Abdullah et al., 2000 celulares agitación Catharanthus roseus L. Raíces adventicias Biorreactor airlift Tikhomiroff et al., 2002 Eleutherococcus senticosus Embriones Biorreactor tipo tanque Choi et al., 2002 Maxim. somáticos Panax ginseng C. A. Meyer Raíces adventicias Biorreactor airlift Ali et al., 2006 Beta vulgaris L. Raíces adventicias Biorreactor de columna con Neelwarne y Thimmaraju, tanque para aireación 2009 constante Azadirachta indica A. Juss Suspensiones Biorreactor tipo tanque con Prakash y Srivastava, 2008 celulares agitación Echinacea purpurea (L.) Raíces adventicias Biorreactor airlift Jeong et al., 2009 Moench Hypericum perforatum L. Raíces adventicias Biorreactor Cui et al., 2010 Astragalus membranaceus Raíces adventicias Biorreactor airlift Wu et al., 2011 (Fisch.) Bge. Panax quinquefolium L. Suspensiones Biorreactor tipo tanque con Wang et al., 2012 celulares agitación
El empleo de los medios de cultivo en estado líquido es un aspecto primordial en la automatización de la micropropagación y en el desarrollo de técnicas para la producción a gran escala (Ziv, 2005;
Coste et al., 2011). Sus ventajas incluyen la facilidad de preparación, esterilización y manipulación, mayor rapidez en la absorción de sustancias nutritivas y la difusión de sustancias tóxicas producidas por el metabolismo de las plantas. Además, la productividad de los operarios de cabina de flujo laminar aumenta debido a que los explantes sólo deben ser colocados en contacto con el medio de cultivo sin necesidad de manipularlos de forma individual. El cambio en la composición del medio de cultivo puede efectuarse por simple transferencia. Esto brinda grandes posibilidades para la
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automatización y la reducción de los costos de producción así como una mayor eficiencia en la transferencia de las plantas a condiciones ex vitro (Berthouly y Etienne, 2005; Baggio et al., 2012).
Sin embargo, en condiciones estáticas provoca un efecto depresivo sobre el crecimiento del tejido en el cultivo in vitro, ya sea por hipoxia o por hiperhidricidad (Debergh, 1983). La hiperhidricidad, anteriormente nombrada vitrificación y redefinida por Debergh et al. (1992), ha sido descrita con mayor frecuencia y es el término empleado para caracterizar las malformaciones hiperhídricas que afectan tanto a las plantas herbáceas como las leñosas durante su propagación vegetativa in vitro.
2.3.3 Sistemas de inmersión temporal
La técnica de inmersión temporal se desarrolló con el objetivo de reducir los problemas de asfixia e hiperhidricidad, los daños mecánicos, la complejidad del equipamiento así como lograr un aumento en la eficiencia de la micropropagación dado por el incremento de los ritmos de producción y la calidad de los propágulos (Teisson y Alvard, 1995; Escalona et al., 1999). El sistema permite el contacto del medio de cultivo líquido con el material vegetal de manera intermitente y por un corto período de tiempo y una disminución de los costos de producción, en comparación con las formas convencionales de micropropagación (Berthouly y Etienne, 2005). La renovación de la atmósfera y el medio de cultivo reducen la humedad relativa e incrementa la asimilación de agua y nutrientes
(Teisson y Alvard, 1995). Por otra parte, producto de las inmersiones los explantes quedan recubiertos por una fina película de medio de cultivo líquido que evita la desecación sin obstaculizar la difusión de los gases (Escalona et al., 1999, 2003a; Yang y Yeh, 2008). Además es de fácil manejo y uso.
Steward et al. (1952) describieron una técnica donde los explantes estaban inmersos en el medio de cultivo líquido alternado con períodos en los que estaban en contacto con el aire y modificado por
Steward y Shantz (1956). Más tarde, en 1983, Harris y Mason describieron un sistema en el que se combinó la aireación y el medio de cultivo líquido en Vitis vinifera L. Aunque estos primeros sistemas tuvieron diferentes nombres, el principio básico de funcionamiento es el de inmersión temporal. A partir de estos, numerosos sistemas con dicho principio fueron desarrollados (Tisserat y
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Vandercook, 1985; Krueger et al., 1991; Teisson y Alvard, 1995). En Cuba se desarrolló un sistema semi-automatizado de inmersión temporal (Escalona et al., 1999) y se registró la correspondiente patente por el Centro de Bioplantas (Escalona et al., 2003b).
Varias investigaciones se desarrollan con el objetivo de estudiar los principales parámetros de cultivo en los sistemas de inmersión temporal que posibilitan una mejor respuesta fisiológica. La duración del tiempo y la frecuencia de inmersión tienen gran importancia tanto para la asimilación de los nutrientes como para controlar la hiperhidricidad. Además, permiten el control de la atmósfera interna del vaso de cultivo (Berthouly y Etienne, 2005). La ventilación forzada, la composición y volumen de los medios de cultivo así como el volumen de los frascos son algunas de las variables que se pueden controlar para evitar la hiperhidricidad (Wu et al., 2009; Ivanova y Van Staden, 2011).
La ventilación forzada es un aspecto que genera ventajas desde el punto de vista de calidad morfológica de las plantas (Lai et al., 2005).
Estos sistemas por su relación costo-beneficio y por la posibilidad de cultivar tejidos diferenciados con probada capacidad para la síntesis de metabolitos secundarios, pueden ser empleados para la producción de biomasa y metabolitos secundarios en plantas (Tabla 3).
Tabla 3. Empleo de los sistemas de inmersión temporal para la producción de biomasa y metabolitos secundarios en plantas. Especies Sistema de Tipo Referencia regeneración Crescentia cujete L. Brotes Inmersión temporal Murch et al., 2004 Fabiana imbricata Ruiz et. Pav. Brotes Inmersión temporal Schmeda-Hirschmann et al., 2004 Lavandula officinalis Chaix Brotes Inmersión temporal Wilken et al., 2005 Cymbopogon citratus (DC) Stapf Hypericum perforatum L. Fabiana imbricata Ruiz et. Pav. Ruta graveolens L. Brotes Inmersión temporal Gontier et al., 2005 Panax ginseng C. A. Meyer Raíces RITA® Vaněk et al., 2005 Cymbopogon citratus (DC) Stapf Brotes Inmersión temporal Quiala et al., 2006 Mentha spicata L. Brotes Inmersión temporal Tisserat y Vaughn, 2008 Saccharum officinarum L. Brotes Inmersión temporal Yang et al., 2010 Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Brotes Inmersión temporal Yan et al., 2010 Jeffrey Camptotheca acuminata Decne Brotes Inmersión temporal y Sankar-Thomas y Lieberei, 2011 RITA® Panax quinquefolius L. Brotes Inmersión temporal Uchendu et al., 2011 Leocojum aestivum L. Brotes Inmersión temporal Schumann et al., 2012
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Además, brindan la posibilidad de regular o manipular el ambiente in vitro, así como otros parámetros primordiales de cultivo que pueden influir sobre la producción de biomasa y la acumulación de los metabolitos (Wilken et al., 2005).
No todas las investigaciones en SIT en especies de interés medicinal han abordado la producción de los metabolitos secundarios. Algunas de ellas solo se han centrado en la producción de biomasa. Al respecto, Murch et al. (2004) encontraron un incremento significativo en la biomasa, número de hojas, altura y eficiencia de trasplante en plantas de Crescentia cujete L. que se desarrollaron en
RITA®. Por su parte, Quiala et al. (2006) emplearon los SIT por primera vez para la micropropagación de C. citratus y estudiaron diversos factores como la frecuencia de inmersión con el objetivo de incrementar la producción de biomasa.
El efecto de los SIT en el crecimiento y la calidad de las plantas de Siraitia grosvenorii (Swingle) C.
Jeffrey, fue investigado por Yan et al. (2010). Estos autores describen un incremento en la producción de biomasa y calidad de las plantas en los SIT, significativamente superior a los resultados obtenidos en medios de cultivo semisólidos y líquidos en condiciones estáticas. Recientemente, Uchendu et al.
(2011) describieron la propagación de plantas de P. quinquefolius en SIT con el objetivo de incrementar la producción de biomasa mediante la adición de reguladores de crecimiento y aditivos químicos como carbón activado, melatonina y ácido ascórbico.
Otras investigaciones contemplan la producción de biomasa y a su vez la obtención de metabolitos secundarios en sistemas de inmersión temporal. Con este objetivo se han desarrollado diferentes diseños con igual principio de funcionamiento que permitan la manipulación de las condiciones ambientales para la acumulación de los metabolitos de interés (Wilken et al., 2005). Estos autores describieron que el incremento de la biomasa varió considerablemente entre las diferentes especies aunque el número de brotes obtenidos en los sistemas de inmersión temporal fue superior comparado con el cultivo de brotes en medios de cultivo semisólidos. Las concentraciones de las sustancias activas en las especies F. imbricata, H. perforatum y C. citratus, excepto para L. officinalis, fueron superiores en brotes cultivados en sistemas de inmersión temporal. Sin embargo, solo en L. officinalis
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se alcanzaron niveles de sustancias activas superiores a los obtenidos en plantas en condiciones naturales.
Gontier et al. (2005) desarrollaron un sistema de bajo costo para la producción de biomasa de brotes de R. graveolens y la obtención de furanocumarinas, basado en la inmersión temporal. Se obtuvieron
1,6 g de masa seca por día y una productividad de 3,8 mg de furanocumarinas, valores superiores a los que se obtuvieron mediante el cultivo de brotes en agitación y en biorreactores clásicos.
Posteriormente, autores como Tisserat y Vaughn (2008) evaluaron el efecto de la frecuencia de inmersión, entre otros factores, en un sistema automatizado para el cultivo de plantas con igual principio que los sistemas de inmersión temporal. Ellos demostraron que los aceites esenciales de M. spicata pueden incrementarse considerablemente. Esto fue posible mediante cambios físicos en el ambiente in vitro en los sistemas automatizados. Sus resultados sugieren la aplicación comercial de las plantas desarrolladas en estos sistemas automatizados para la producción de metabolitos.
Por su parte, Sankar-Thomas y Lieberei (2011) describieron diferencias en el contenido de camptotecina en brotes de de C. acuminata en varios genotipos cultivados en RITA® y en sistemas de inmersión temporal de doble frascos. Estos autores encontraron un incremento significativo en el contenido de camptotecina cuando emplearon 8 inmersiones diarias en ambos sistemas de cultivo comparado con 4 inmersiones diarias después de 8 semanas de cultivo.
Recientemente, Schumann et al. (2012) describen la influencia de diferentes factores, entre ellos la densidad de inóculo y los nutrientes del medio de cultivo en la producción de biomasa y contenido de alcaloides en L. aestivum en sistemas de inmersión temporal. En su investigación obtuvieron el mayor rendimiento (19,4 mg) en SIT de 1,0 L con una densidad de 10 gMF y 12 aireaciones diarias.
Por otra parte, estos autores realizaron un escalado en biorreactores de 5,0 y 10 L de capacidad pero encontraron una reducción en los parámetros evaluados tanto referidos a la producción de biomasa como al contenido de alcaloides en los brotes.
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2.3.4 Empleo de elicitores para la producción de metabolitos secundarios
La elicitación es uno de los métodos más efectivos establecidos en procesos a gran escala para inducir la expresión de genes asociados con enzimas responsables de la síntesis de metabolitos secundarios como mecanismo de defensa contra el ataque de patógenos o daños en plantas (Baldi et al., 2007).
El término “elicitor” se utiliza comúnmente para denominar los factores físicos y químicos que son responsables de las respuestas fisiológicas y morfológicas de las plantas. Según su origen y estructura molecular han sido clasificados como físicos o químicos, abióticos o bióticos y dentro de este grupo como elicitores de composición química compleja o definida (Radman et al., 2003).
Entre los elicitores abióticos se agrupan las sustancias que no son de origen biológico como factores físicos y sales inorgánicas que incluyen los iones de cobre, cadmio, calcio, variaciones del pH, temperaturas extremas, luz ultravioleta, químicos con actividad fungicida, herbicida, detergentes. Los elicitores bióticos son aquellos de origen biológico que incluyen los polisacáridos derivados de la pared celular como pectina y celulosa y de microorganismos (quitinas y glucanasas) y glicoproteínas
(Namdeo, 2007; Shilpa et al., 2010).
Los elicitores que son usados con más frecuencia en el cultivo in vitro con el objetivo de incrementar la producción de metabolitos secundarios incluyen al metil jasmonato (Ketchum et al., 1999; Kim et al., 2004; Roat y Ramawat, 2009), los oligosacáridos (Prakash y Srivastava, 2008; Korsangruang et al., 2010); extractos de hongos u otros microorganismos (Kim et al., 2004; Arora et al., 2010; Pawar et al., 2011).
En el género Digitalis solo se describen en la literatura científica un estudio relacionado con el efecto de los elicitores en la producción de cardenólidos en brotes de la especie D. lanata. Ghanem et al.
(2010) refieren el empleo de ácido salicílico, extracto de levadura y el cloruro de calcio. Los mayores contenidos de digoxina y digitoxina se obtuvieron con 200 mM de cloruro de calcio. Sin embargo, este resultado no tuvo aplicación en la producción de biomasa, solo en plántulas cultivadas en medio de cultivo semisólido.
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En otros géneros se describe el efecto de elicitores en la activación metabólica. Al respecto, Liu et al.
(2007) refirieron la regulación de metabolitos secundarios en el cultivo de brotes de H. perforatum en medios de cultivo líquidos mediante la adición del metil jasmonato. Estos autores observaron que la adición del mencionado elicitor (100 µM) junto al triptófano como precursor estimuló la producción de biomasa y a la vez incrementó en 1,81 veces la producción de hiperforina.
De igual manera, Orlita et al. (2008) encontraron que todas las concentraciones estudiadas de benzotiadiazol (función química análoga al ácido salicílico) indujeron un incremento en el contenido de furanocumarinas y alcaloides en brotes de R. graveolens.
Estudios realizados en el cultivo de brotes de Hypericum hirsutum L. y Hypericum maculatum Crantz mostraron el efecto del ácido jasmónico y el ácido salicílico en la producción de biomasa y la acumulación de hipericinas y hiperforina (Coste et al., 2011). En su investigación, estos autores encontraron que el ácido salicílico fue más efectivo en la acumulación de hipericinas en ambas especies estudiadas.
2.4 Transformación genética
2.4.1 Ingeniería metabólica
La ingeniería metabólica es una ciencia en desarrollo y cada vez genera mayor interés en la comunidad científica. Este interés se sustenta en la importancia económica de los metabolitos secundarios por su aplicación en las industrias química, farmacéutica y alimenticia. Sin embargo estos compuestos se producen en muy bajas cantidades en las plantas. Esta problemática ha conllevado al desarrollo de las bases de la biología molecular y las técnicas de la ingeniería genética con el objetivo de incrementar la cantidad y calidad de los metabolitos secundarios (Li y Vederas,
2009; Yang et al., 2011).
Las aplicaciones de la ingeniería metabólica son numerosas. A través de esta se puede sobre-expresar una o varias enzimas que limiten uno o varios pasos en la biosíntesis del compuesto deseado, disminuir la expresión de enzimas en rutas competitivas, incrementar una ruta completa a través de la expresión de factores de regulación y la introducción de nuevas enzimas utilizando una ruta
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intermedia para la generación de un metabolito secundario diferente (Khan et al., 2009; Liu et al.,
2011).
Algunas de sus aplicaciones han tenido mucho éxito, otras menos exitosas y otras sin éxito alguno.
Las razones de este fracaso están relacionadas con las dificultades en los procesos biológicos básicos según describe Verpoorte (2007). Estas involucran la regeneración de plantas transgénicas y la estabilidad de las líneas celulares o plantas transgénicas. Actualmente, existe un mayor conocimiento de las herramientas empleadas para la transformación genética, por lo que el número de transformaciones exitosas se ha incrementado (Takagi et al., 2011; Shi et al., 2012). Sin embargo, la mayor dificultad radica en el poco conocimiento de las rutas biosintéticas (Oksman-Caldentey et al.,
2007). Esto se debe a la arquitectura de las rutas, la interacción entre varias de ellas en la red metabólica, los mecanismos de transporte, compartimentación y almacenamiento, las enzimas complejas, la inhibición de reacciones así como la regulación de los procesos (Verpoorte, 2007). Por tanto, un mayor conocimiento de la biosíntesis de metabolitos y su regulación incrementará la sostenibilidad y la eficiencia en la producción de metabolitos de interés. En este contexto, el desarrollo de la genómica funcional abre nuevas oportunidades para impulsar la interrelación entre la genómica, transcriptómica y metabolómica (Oksman-Caldentey et al., 2007). Esto a su vez, permitirá el uso más eficiente de la capacidad bioquímica de las plantas para producir metabolitos secundarios conocidos y novedosos a través de la ingeniería metabólica.
2.4.2 Transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens
La transformación genética de plantas mediada por Agrobacterium tumefaciens, es el método más usado para la introducción de génes foráneos en células vegetales (Deo et al., 2010). Este sistema satisface requerimientos básicos para la aplicación comercial como es que se obtiene una mayor eficiencia de transformación, mayor control de la expresión de genes y una integración más precisa del transgen (Komari et al., 2004). Sin embargo, la principal limitante radica en la necesidad de transformar un gran número de explantes con el objetivo de obtener plantas transgénicas que satisfagan los criterios comerciales.
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En los sistemas de transformación un paso crítico es la selección de células o tejidos transformados, pues incluso en los sistemas más eficientes, solo una pequeña cantidad de células es transformada
(Rosellini, 2011). Por lo tanto, se hace imprescindible la identificación de las células transformadas de las no transformadas utilizando sistemas de selección. Hasta el momento, la mayoría de los sistemas de selección se basan en la adición de antibióticos o herbicidas a los medios de cultivo y la transferencia a las células vegetales de genes que confieren resistencia a estos (Miki y McHugh,
2004). La determinación de la concentración mínima letal del agente selectivo hace más efectivo el sistema de transformación (Sreeramanan et al., 2006; Deo et al., 2010).
Entre los genes marcadores de selección más usados se encuentra el neo (nptII) aislado del transposón Tn5 en Klebsiella pneumonia. Este codifica para la enzima neomicina fosfotransferasa II
(NPTII) la cual detoxifica a antibióticos aminoglucósidos (neomicina, kanamicina, paramomicina y geneticina o G-418) (Bevan et al., 1983; Fraley et al., 1983; Padilla y Burgos, 2010).
Existe una serie de factores que influyen en la eficiencia de la transformación de tejidos vegetales por
A. tumefaciens (Dutt et al., 2011; Kumar et al., 2011). Uno de los más importantes es la virulencia de la cepa bacteriana utilizada (Chetty et al., 2012). De manera general existen cepas con virulencia baja, moderada o alta (Hellen et al., 2000). Varios autores refieren las ventajas de cepas altamente virulentas en cuanto a la eficiencia de la transformación (Komari et al., 2004). Por otro lado, otros trabajos demuestran la ventaja del uso de cepas menos virulentas cuando la planta desarrolla naturalmente una respuesta necrótica cuando es atacada por Agrobacterium (Wroblewski et al.,
2005).
La utilización de genes reporteros es una forma de selección visual, lo que significa que bajo determinada condición o ensayo sencillo pueda observarse su presencia por expresión de alguna característica fenotípica o actividad enzimática (Miki y McHugh, 2004). Dentro de los más utilizados se encuentra el gen uidA, también conocido por gusA. El gen uidA codifica para la β-glucuronidasa que al actuar sobre el sustrato ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucurónico (X-Gluc) forma un producto azul fácilmente visible (Jefferson et al., 1987). Los métodos de selección fenotípica son
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muy útiles ya que constituyen un primer y rápido tamizaje de las plantas regeneradas. Sin embargo, es necesario además verificar la inserción de la construcción transgénica en el genoma hospedero. La técnica más utilizada para esto es la amplificación de los transgenes basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, siglas en inglés) sobre ADN de la planta transformada (Gachet et al., 1998).
Otras técnicas, que además permiten saber el número de copias insertadas, son la hibridación del
ADN por Southern y el PCR cuantitativo (Anand et al., 2003).
Ejemplos exitosos de transformación genética mediante Agrobacterium tumefaciens han sido descritos en especies de Digitalis, Taxus, Artemisia, Catharanthus entre otros géneros (Canter et al.,
2005; Gómez-Galera et al., 2007). Recientemente, se han descrito sistemas de transformación en otras especies como Centella montana L. (Abou-Alaiwi et al., 2011) y Bacopa monnieri L.
(Mahender et al., 2012). Los autores refieren la contribución de estos protocolos a los estudios moleculares y bioquímicos que controlan la biosíntesis de los compuestos activos de interés farmacológico.
En especies modelos de mayor importancia para la industria farmacéutica como C. roseus se describe la aplicación de dichos sistemas de transformación para el incremento de metabolitos de interés (Van der Frits y Memelink, 2000). Esta investigación constituye un ejemplo interesante de la identificación de un gen regulatorio en la ruta biosintética y cómo usar factores de transcripción para regular varios genes activos e incrementar la biosíntesis de alcaloides.
En Artemisia annua L. fue descrita la sobre-expresión del farnesil difosfato sintasa (Han et al., 2006).
Como resultado, se informó un incremento en la artemisina, compuesto antitumoral. No obstante, los autores especularon que la formación de la artemisina es aún limitado por el desconocimiento de factores regulatorios.
Gatica-Arias et al. (2012) describen la transformación genética en Humulus lupulus L. para la sobre- expresión del factor de transcripción PAP1/AtMYB75 de A. thaliana, el cual permite la modificación de la ruta biosintética de flavonoides incrementando su contenido en las plantas transgénicas.
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Revisión Bibliográfica
2.4.3 Transformación genética en Digitalis spp.
En el género Digitalis el conocimiento de las rutas de biosíntesis de cardenólidos ha incrementado el interés por incluir la transformación genética dentro de las alternativas de mejoramiento genético.
Los trabajos más sostenidos de transformación en este género han sido realizados en la especie D. minor. En un primer intento, Sales et al. (2002) describieron la regeneración eficiente de la planta a partir de explantes de hojas infectadas con la cepa 82.139 de A. tumefaciens. Durante el proceso de infección, el transgén reportero codificante para la subunidad A de la glucuronidasa (gusA) fue detectado en los tumores inducidos por la bacteria. Sin embargo, ni los brotes, ni raíces regenerados, ni las plantas obtenidas resultaron transformadas. Posteriormente este mismo grupo de investigadores publicó un sistema de transformación mediado por A. tumefaciens en esta misma especie, pero esta vez utilizando las cepas EHA105 y AGL1 que contenían el gen reportero gusA y genes marcadores de selección. En esta ocasión, una vez más los explantes de partida utilizados fueron discos de hojas de plantas cultivadas in vitro empleando acetosiringona como estimulante de la virulencia de
Agrobacterium en las fase de cocultivo (Sales et al., 2003). Dicho sistema de transformación fue utilizado para obtener plantas de D. minor que sobre-expresaban el dominio catalítico de la enzima 3- hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa (HMGR1S) de A. thaliana (Sales et al., 2007). Algunas de las líneas obtenidas presentaron un mayor contenido de cardenólidos (hasta un 40%) tanto in vitro como en condiciones de invernadero.
Yoshimatzu et al. (1990) transformaron raíces aéreas de plantas de D. lanata con Agrobacterium rhizogenes. La producción de cardenólidos fue directamente correlacionada con el contenido de clorofila en las células. El cultivo de raíces en la oscuridad acumuló pequeñas cantidades de cardenólidos (0,02-0,07 µg.gMS-1) mientras que el cultivo en condiciones de iluminación incrementó el contenido de cardenólidos a 16,5 µg.gMS-1.
En cuanto a D. purpurea, en 1990 Saito et al. lograron la transferencia de genes quiméricos al genoma de esta especie a través de la transformación de discos de hojas de la planta con A. rhizogenes. Esta bacteria es capaz de inducir la rizogénesis por lo que estos investigadores lograron
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Revisión Bibliográfica
el cultivo de raíces transgénicas, sin embargo no lograron la regeneración de plantas completas a partir de estas (Saito et al., 1990). Similarmente, Koga et al. (2000) describieron un sistema de transformación en D. purpurea mediante A.rhizogenes. Estos autores inocularon discos de hojas con la cepa bacteriana y lograron la formación de raíces sin el uso de reguladores del crecimiento.
Posteriormente lograron regenerar plantas en las cuales se verificó la presencia del gen rolC de A. rhizogenes. Sin embargo, a pesar de que estos trabajos fueron publicados hace más de 10 años, no se ha descrito en la literatura científica ninguna aplicación de estos, lo cual pone en duda su efectividad.
El estudio en el campo de la ingeniería metabólica así como en el desarrollo de estrategias a disposición de la comunidad científica, sin duda será un gran avance en el incremento de los rendimientos de metabolitos secundarios y en el conocimiento de las rutas biosintéticas de los mismos.
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Materiales y Métodos
3. MATERIALES Y MÉTODOS
La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Metabolitos Secundarios del Instituto de
Biotecnología de las Plantas (IBP) de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. En la empresa BioPlanta GmbH, en el Instituto de Química No Clásica (INC) y en el Instituto de
Biotecnología Aplicada de Sajonia en Leipzig, Alemania. Los experimentos se desarrollaron en el período comprendido entre septiembre del 2005 y diciembre del 2011.
Procedimientos generales
Medios de cultivo
Para el desarrollo de los experimentos, se empleó el medio de cultivo basal compuesto por las sales inorgánicas propuestas por Murashige y Skoog (1962), el cual a partir de este momento se nombrará
MS. En cada acápite se aclararán las modificaciones realizadas al medio de cultivo basal. Como agente gelificante se utilizó Gelrite® (Merck & Co., Inc.), a razón de 3,0 g.L-1. El pH de los medios de cultivo fue ajustado a 5,7 antes de la esterilización, con KOH 0,5 N y HCl 0,5 N, excepto en los experimentos de transformación donde se especifican estos valores.
Los medios y frascos de cultivo se esterilizaron en autoclave vertical (Raypa) a 121ºC y 1,2 kg.cm-2 de presión. El tiempo de esterilización varió en dependencia del volumen de medio de cultivo a esterilizar, según información técnica de la compañía SIGMA (1991).
Material vegetal
En esta investigación se utilizó como material vegetal plantas in vitro obtenidas a partir de semillas de Digitalis purpurea L. var. Roter Berggold (Figura 3). Las semillas fueron adquiridas en la empresa Pharmasaat GmbH (Alemania). Estas fueron desinfectadas según el protocolo propuesto por
Erdei et al. (1981). Las mismas fueron colocadas para su germinación en cámara de crecimiento con un fotoperíodo de 16 h con lámparas fluorescentes de luz blanca, con una intensidad de flujo de fotones fotosintéticos de 40 µmol.m-2.s-1 a 27±2 ºC de temperatura. Se empleó el medio de cultivo propuesto por Erdei et al. (1981) en estado semisólido, con las siguientes modificaciones: sales MS
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Materiales y Métodos
suplementadas con 1,0 mg.L-1 de tiamina y 30 g.L-1 de sacarosa. Se utilizaron frascos de policarbamato de 500 mL de capacidad a los cuales se añadieron 50 mL de medio de cultivo.
Figura 3. Semillas (A) y plantas in vitro (B) de Digitalis purpurea L. var. Roter Berggold.
Las plántulas obtenidas crecieron hasta alcanzar una altura aproximada de 4,0 cm. Las hojas y raíces de estas fueron cortadas. Los brotes con una altura aproximada de 2,0 cm fueron transferidos a un medio de cultivo propuesto por Erdei et al. (1981) modificado compuesto por sales MS (100%) suplementado con 1,0 mg.L-1 de tiamina; 100 mg.L-1 de mio-inositol; 1,0 mg.L-1 de 6- bencilaminopurina (6-BAP); 0,1 mg.L-1 de ácido indol-3-acético (AIA) y 30 g.L-1 de sacarosa, el cual a partir de este momento se denominará MMb (Medio de cultivo de Multiplicación de brotes). Se emplearon frascos de policarbamato de 500 mL de capacidad a los cuales se le añadieron 70 mL de medio de cultivo semisólido y en cada frasco se colocaron cinco explantes. Los brotes se cultivaron en cámara de crecimiento con un fotoperíodo de 16 h con lámparas fluorescentes de luz blanca, con una intensidad de flujo de fotones fotosintéticos de 40 µmol.m-2.s-1 y ocho horas de oscuridad, a 27±2
ºC de temperatura. Para los experimentos se utilizaron como material vegetal brotes de 2,0 a 3,0 cm de altura que se encontraban en el segundo subcultivo, realizando estos cada 28 días.
Evaluaciones realizadas
Determinación de indicadores morfológicos de crecimiento y producción de biomasa
Los indicadores morfológicos de crecimiento que se evaluaron fueron la altura de las plántulas (cm) y el número de brotes desarrollados. La biomasa producida se evaluó mediante la masa fresca,
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Materiales y Métodos
expresada en gramos de masa fresca (gMF) y masa seca, expresada en gramos de masa seca (gMS), por frasco de cultivo. La biomasa obtenida fue lavada con agua destilada para eliminar los restos de medio de cultivo. Posteriormente se colocó en papel de filtro para eliminar el exceso de agua sobre los tejidos y se pesó empleando una balanza analítica (Sartorius AG). Para la masa seca, las muestras fueron colocadas en una estufa (HS 62A) a 60 ºC hasta mantener el peso constante. A partir de los valores de masa fresca y seca se calculó el contenido de agua (CA) en la biomasa producida por SIT. Para el cálculo del contenido de agua (%), se utilizó la siguiente fórmula descrita por Bandyopadhyay et al. (2004):
Para evaluar la hiperhidricidad, los brotes fueron individualizados y clasificados en brotes hiperhídricos o normales según su aspecto morfológico. Se consideraron como brotes hiperhídricos aquellos que presentaron apariencia turgente, translúcidos y que se quiebran fácilmente en comparación con los brotes normales. Para determinar el color de los brotes se utilizó el código hexadecimal de colores (http://www.cwp.linet.edu/cwis/cwp.html).
Determinación del contenido de cardenólidos
Protocolo de extracción
El protocolo de extracción que se empleó para la determinación de cardenólidos fue el propuesto por
Wichtl et al. (1982) con algunas modificaciones, el cual consistió en:
Tomar 1,5 g de masa seca pulverizada y medir el contenido de agua en las muestras mediante
un analizador de humedad (Sartorius AG) para determinar la masa seca real
Añadir 15 mL de etanol al 70% (v/v) y mantener durante 15 minutos en baño ultrasónico
(1510 Branson) a 70 ºC
Dejar enfriar a temperatura ambiente y añadir 25 mL de agua bidestilada
Añadir 10 mL de una solución de acetato de plomo dihidratado al 15% (p/v)
Centrifugar a 3000 g durante 5 minutos (5810R, Eppendorf AG)
Filtrar por gravedad con papel de filtro Whatman 1
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Materiales y Métodos
Añadir 12 mL de una solución de fosfato disódico al 10% (p/v)
Centrifugar a 3 000 g durante 5 minutos
Filtrar por gravedad con papel de filtro Whatman 1
Realizar tres extracciones con mezcla de cloroformo/isopropanol (3:2, v/v), una primera con
30 mL de la mezcla y dos extracciones sucesivas con 20 mL de la mezcla. Unir las fracciones
Rotoevaporar a 40 ºC (Heidolph 94200, Bioblock Scientific)
Resuspender el residuo en 1,0 mL de etanol absoluto para el análisis por HPLC (solución
final)
Cuantificación de cardenólidos mediante HPLC
La detección de cardenólidos se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC,
Agilent 1100) equipado con un detector de arreglo de diodos y una columna Inertsil ODS-3 (150x4,6 mm, 5µm). Se inyectaron 10 µL de la solución final. Como solvente fue utilizado una mezcla de acetonitrilo (ACN)/agua (25:75) con un flujo de 1,5 mL.min-1. El gradiente varió de la siguiente forma: inicio (25% ACN), 4 min (25% ACN), 34 min (37% ACN), 45 min (50% ACN), a partir de
60 min (25% ACN) hasta 65 min que termina el análisis. Todas las determinaciones fueron realizadas a una temperatura de 40 ºC. Los cardenólidos fueron detectados a una longitud de onda de 220 nm.
Digitoxina y digoxina fueron identificados según el tiempo de retención y comparados con los estándares obtenidos de una fuente comercial (SIGMA).
Determinación del contenido de peróxido de hidrógeno
Los niveles de peróxido de hidrógeno (H2O2) fueron determinados según el método descrito por
Sergiev et al. (1997). Las muestras de hojas frescas fueron homogenizadas con 2,0 mL de ácido tricloroacético al 0,1% (p/v). El homogenizado fue centrifugado a 12 000 g durante 15 min.
Posteriormente 0,5 mL del sobrenadante fue añadido a una mezcla de 0,5 mL tampón de fosfato de potasio 10 mM (pH 7,0) y 1,0 mL de ioduro de potasio 1,0 M. El blanco fue preparado de la misma manera, en lugar de la muestra fue utilizado 0,5 mL de ácido tricloroacético al 0,1% (p/v). La absorbancia fue determinada a 390 nm mediante un espectrofotómetro (UV 1800, Shimadzu, Japón).
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Materiales y Métodos
El contenido de H2O2 fue calculado mediante una curva de calibración realizada a partir de concentraciones conocidas de peróxido de hidrógeno.
Determinación de la peroxidación lipídica
La peroxidación lipídica fue estimada mediante la determinación de los niveles de malondialdehido
(MDA) en las hojas mediante la reacción del ácido tiobarbitúrico (SIGMA) (Sivanesan et al., 2011).
El extracto fue preparado según describen Heath y Packer (1968). La absorbancia fue medida a 532 nm y corregida a una absorbancia específica de 600 nm (Ɛ, 155 mM-1.cm-1) mediante un espectrofotómetro (UV 1800, Shimadzu, Japón). La cantidad total de MDA fue calculada acorde a
Heath y Packer (1968) mediante la fórmula:
Total MDA vol tampón de extracción (mL) x vol sobrenadante (mL) x (Abs 532 - Abs 600)/155 x103 -1 ( nmol.gMF )= m (muestra) (g)
Análisis estadísticos
Para el análisis estadístico de los datos experimentales se utilizó el programa SPSS ver. 18.0, para el sistema operativo Windows. Para la elaboración de ficheros de datos y gráficos se utilizó el programa
EXCEL del paquete Microsoft Office 2007. Para comprobar los supuestos de normalidad se aplicaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov para muestras grandes y Shapiro-Wilk para muestras pequeñas y Levene para determinar la homogeneidad de varianza. Se aplicaron análisis no paramétricos en todos los datos puesto que no cumplieron los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza. Se realizó la prueba de Kruskal-Wallis para p<0,05 de significación y las diferencias estadísticas entre los tratamientos fueron determinadas mediante la prueba de Mann
Whitney con la penalización de Bonferroni.
3.1 Producción de biomasa de D. purpurea en sistemas de inmersión temporal
Para la producción de biomasa a partir de brotes se emplearon sistemas de inmersión temporal (SIT) según describen Jiménez et al. (1999). Cada sistema estuvo conformado por dos frascos de cristal de
1000 mL de capacidad, uno para el crecimiento de los explantes y otro como reservorio del medio de
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Materiales y Métodos
cultivo. En el frasco utilizado para el crecimiento de los explantes se le colocaron en el fondo esferas de cristal para evitar que los brotes quedaran en contacto directo con el medio de cultivo líquido remanente después de cada inmersión (Figura 4). Se añadieron 250 mL de medio de cultivo MMb por SIT y en cada experimento fueron inoculados cuatro SIT por tratamiento. Los brotes se cultivaron en la cámara de crecimiento con las condiciones de cultivo descritas en procedimientos generales.
Figura 4. Sistemas de inmersión temporal empleados en los diferentes experimentos para la multiplicación de brotes de Digitalis purpurea L.
A los 28 días de cultivo se cosechó la biomasa producida. Se evaluaron en 40 plántulas por tratamiento la altura (cm) y el número de brotes. El número de brotes hiperhídricos, masa fresca
(gMF) y masa seca de los brotes por SIT (gMS) se determinó en el material vegetal proveniente de los cuatro SIT de cada tratamiento. Además se determinó la dinámica de producción de biomasa durante el cultivo mediante el monitoreo de la masa fresca por SIT, para lo cual se pesó el frasco de cultivo de los brotes previo a la inoculación, valor que fue restado al peso total del frasco con los explantes cada 7 días. Previo a la inoculación en los SIT, los brotes se pesaron para conocer la masa fresca inicial. Se determinó el contenido de los cardenólidos (digoxina y digitoxina) expresado en
µg.gMS-1 y se calculó la producción neta de cardenólidos (µg de cardenólidos por SIT) teniendo en cuenta la masa seca obtenida por SIT.
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Materiales y Métodos
A continuación se describen los experimentos realizados con el objetivo de desarrollar un método de producción de biomasa mediante la multiplicación de brotes de Digitalis purpurea L. en sistemas de inmersión temporal.
3.1.1 Efecto de la densidad de inóculo
El objetivo de este experimento fue determinar el efecto de la densidad de inóculo sobre el desarrollo morfo-fisiológico de los brotes y por consiguiente en la producción de biomasa en los SIT. Para ello, se evaluaron tres densidades de inóculo: 6, 12 y 18 brotes por SIT. Antes de la inoculación en los SIT se determinó la masa fresca correspondiente a cada densidad de inóculo. El medio y las condiciones de cultivo son las descritas en procedimientos generales y se predeterminó realizar las inmersiones cada cuatro horas de dos minutos de duración. A los 28 días de cultivo se evaluaron las variables morfológicas (altura y número de brotes) y de producción de biomasa (masa fresca y seca).
3.1.2 Efecto de la frecuencia de inmersión
Se estudió el efecto de cuatro frecuencias de inmersión (inmersiones cada 2, 4, 6 y 12 horas) sobre la producción de biomasa y de cardenólidos. Se tuvieron en cuenta los resultados del acápite 3.1.1 para la densidad de inóculo. El medio de cultivo y las condiciones de cultivo fueron las descritas en procedimientos generales. Las variables evaluadas fueron las descritas en el acápite 3.1.
3.1.3 Efecto de la renovación de la atmósfera
Este experimento se desarrolló con el objetivo de estudiar el efecto de la renovación de la atmósfera gaseosa en los SIT sobre la producción de biomasa y de cardenólidos. Se tuvieron en cuenta los resultados obtenidos en los experimentos anteriores en cuanto a la densidad de inóculo y la frecuencia de inmersión. Los recipientes de cultivo que contenían los explantes fueron aireados de forma periódica (dos veces) durante un minuto en los intervalos entre cada inmersión para un total de
12 aireaciones adicionales. El diseño de los SIT no se modificó, solo se programó el canal de entrada de aire a este recipiente y se tuvieron en cuenta las posibilidades del temporizador para la programación. Como control se empleó igual frecuencia sin aireaciones adicionales.
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Materiales y Métodos
El medio y las condiciones de cultivo fueron las descritas en procedimientos generales. Las variables morfológicas y de producción de biomasa evaluadas fueron las descritas en el acápite 3.1.
Los cardenólidos analizados fueron digoxina, y digitoxina y expresado su contenido en µg.gMS-1.
Además se determinó el contenido de H2O2 y MDA como marcadores de estrés oxidativo según se describe en procedimientos generales.
3.1.4 Escalado de la producción de biomasa
Sobre la base de los resultados obtenidos en los acápites 3.1.1, 3.1.2 y 3.1.3 se realizó el escalado de la producción de biomasa en D. purpurea, con el objetivo de valorar la potencialidad de los SIT para este propósito y a la vez determinar el contenido de cardenólidos en la biomasa producida.
Se emplearon SIT según se describen en el acápite 3.1 con la diferencia que los frascos de cultivo utilizados fueron de 5000 mL de capacidad, a los que se añadieron 1250 mL de medio de cultivo líquido MMb. Para la densidad de inóculo se tuvo en cuenta la relación volumen de medio de cultivo por explante. Para el escalado se utilizaron 10 SIT y las condiciones de cultivo son las descritas anteriormente en procedimientos generales.
La biomasa se cosechó a los 28 días de cultivo y se evaluaron las variables referentes a la producción de biomasa (masa fresca, masa seca y la dinámica de producción de biomasa en el tiempo). Se determinó en la biomasa producida el contenido de digoxina y digitoxina según se describe en procedimientos generales.
3.2 Efecto de elicitores en el cultivo de brotes de D. purpurea en medio de cultivo semisólido
Con el objetivo de incrementar el contenido de cardenólidos en la biomasa producida a partir de brotes de D. purpurea, se estudió el efecto de la adición de elicitores en medio de cultivo semisólido.
Este es el paso previo, según la literatura científica, para el empleo de elicitores en medios de cultivos líquidos (Schumann et al., 2013).
Se ensayaron tres elicitores: metil jasmonato (MJ) (Duchefa NV, Holanda), ChitoPlant® (ChP®)
(Quitosana, Chipro GmbH, Bremen, Alemania) y SilioPlant® (SiP®) (dióxido de silicio al 35% (p/v),
Chipro GmbH, Bremen, Alemania) en las concentraciones que se describen en la tabla 4. Los mismos
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Materiales y Métodos
fueron añadidos al medio de cultivo MMb descrito anteriormente en procedimientos generales. Para el MJ se preparó una solución en etanol a 100 mM y se esterilizó por filtración con una membrana de filtración ANALIPORE® (OSI) de celulosa estéril, con una porosidad de 0,22 µm. El MJ fue añadido al medio de cultivo en las concentraciones referidas cuando este tenía una temperatura aproximada de
50 ºC. Los demás elicitores fueron añadidos previos a la esterilización del medio de cultivo.
Tabla 4. Compuestos y concentraciones aplicadas en los experimentos de elicitación. Elicitores Tratamientos ChitoPlant® SilioPlant® Metil jasmonato Control - - - -1 ChP1 0,001 g.L - - -1 ChP2 0,01 g.L - - -1 ChP3 0,1 g.L - - -1 SiP1 - 0,01 g.L - -1 SiP2 - 0,1 g.L - -1 SiP3 - 1,0 g.L - -1 MJ1 - - 0,014 g.L -1 MJ2 - - 0,018 g.L -1 MJ3 - - 0,022 g.L
Se utilizaron frascos de policarbamato de 500 mL de capacidad a los cuales se añadieron 70 mL de medio de cultivo semisólido. En cada tratamiento se utilizaron 10 frascos de cultivo con cinco explantes cada uno. Los brotes se cultivaron en la cámara de crecimiento con las condiciones descritas en procedimientos generales.
A los 28 días de cultivo se cosecharon las plántulas y se realizaron las evaluaciones morfológicas, de producción de biomasa y el contenido de cardenólidos según se describen en procedimientos generales. Para la altura y el número de brotes se evaluaron 40 plántulas, la masa fresca y la masa seca se determinó por frasco de cultivo (correspondiente a cinco explantes cada réplica) y se replicó
10 veces. Mientras que el contenido de cardenólidos se determinó en cuatro muestras para cada tratamiento.
3.3 Transformación genética de D. purpurea mediada por Agrobacterium tumefaciens
El presente experimento se diseñó con el objetivo de desarrollar un protocolo para la transformación genética de D. purpurea mediada por Agrobacterium tumefaciens. Esta estrategia es una herramienta
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Materiales y Métodos
de particular interés en el mejoramiento genético de plantas productoras exclusivas de compuestos de interés farmacéutico tales como los cardenólidos (Giddings et al., 2000).
Formación de callos y regeneración de plántulas
La formación de callos fue inducida a partir de segmentos de hojas de 1,0 cm2 de área, obtenidos a partir de las plantas multiplicadas in vitro entre el cuarto y quinto subcultivos. Se colocaron cuatro explantes sobre la superficie adaxial en 30 mL de medio de cultivo semisólido por frasco de cultivo de 250 mL de volumen total.
El medio de cultivo estuvo compuesto por las sales MS suplementado con 1,0 mg.L-1 de ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D); 4,0 mg.L-1 de tiamina; 100 mg.L-1 de mio-inositol; 30 g.L-1 de sacarosa y 3,0 g.L-1 de Gelrite® (Occeguera, 2008) (en lo adelante Medio de cultivo de Formación de Callos,
MFC). A las ocho semanas, los callos obtenidos fueron divididos y transferidos a MFC fresco para su multiplicación. Todo el proceso de formación y multiplicación de callos (subcultivo cada 28 días) se realizó en condiciones de oscuridad total y a 27±2 ºC de temperatura.
Para la regeneración de plántulas, cuatro fracciones de callos (aproximadamente 0,7 gMF/frasco) fueron transferidos a 30 mL de medio de cultivo MS suplementado con 0,1 mg.L-1 de AIA y 1,0 mg.L-1 de 6-BAP en estado semisólido según Cacho et al. (1991). Los cultivos fueron colocados en la cámara de crecimiento con luz natural con una intensidad de flujo de fotones fotosintéticos de 68-
72 µmol.m-2.s-1 y temperatura de 27±2 ºC. Después de 28 días de cultivo los brotes obtenidos fueron transferidos a frascos con 70 mL de MMb.
3.3.1 Determinación de la concentración mínima letal del agente selectivo
Este experimento se desarrolló con el objetivo de determinar la concentración del agente selectivo geneticina (G-418) en la cual los tejidos o las células no transformadas mueren. Las concentraciones de G-418 estudiadas fueron 0, 30, 40, 50, 60, 70 y 80 mg.L-1 durante la fase de formación de callos.
La solución stock del antibiótico se preparó a una concentración de 50 mg.mL-1 en agua destilada.
Esta solución se esterilizó por filtración con una membrana de filtración ANALIPORE® (OSI) de
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Materiales y Métodos
celulosa estéril, con una porosidad de 0,22 µm. El antibiótico fue adicionado posterior a la esterilización del medio de cultivo a una temperatura entre 40-45 ºC.
Se utilizaron placas de Petri de 10 cm de diámetro estériles, a las cuales se les añadió 25 mL de MFC con el agente selectivo. Por cada tratamiento se utilizaron 100 explantes (segmentos de hojas según se describe en el acápite 3.3 para la formación de callos). Se colocaron cinco explantes por placa de
Petri y fueron subcultivados cada dos semanas a medio de cultivo fresco con antibiótico durante ocho semanas en condiciones de oscuridad a una temperatura de 27±2 ºC. A las cuatro semanas se evaluó el número de explantes que formaron callos (expresado en porcentaje) y el número de callos por explante en las diferentes concentraciones del agente selectivo. Para la evaluación del número de explantes que formaron callos, el total de explantes se agruparon cada 50 explantes formando dos grupos para cada tratamiento y el experimento fue realizado por triplicado correspondiendo a seis el número de muestras para dicha variable.
3.3.2 Transformación genética
Cepas bacterianas y plasmidio empleados
Se utilizaron dos cepas de A. tumefaciens para evaluar su capacidad de transformación: EHA105
(Hood et al., 1993) y C58C1RifR (pMP90) (Koncz y Schell, 1986) (Tabla 5). En ambas cepas se introdujo el plasmidio pTJK136 (Kapila et al., 1997) como vector de transformación (Anexo 1).
El ADN-T del pTJK136 contiene el gen de la neomicina fosfotransferasa II (nptII) (EC 2.7.1.95) bajo el control del promotor de la nopalina sintetasa (nos) y el terminador de la octopina sintetasa
(ocs). Además, la construcción contiene el gen de la β-glucuronidasa de Escherichia coli (uidA)
(Jefferson et al., 1987) con el intrón st-ls1 de la papa (Solanum tuberosum L.), lo cual permite que este gen se exprese sólo en células eucariotas (Vancanneyt et al., 1990). El gen uidA se encuentra bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el terminador del gen nos.
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Materiales y Métodos
Tabla 5. Detalles de las cepas EHA105 y C58C1RifR (pMP90) de Agrobacterium tumefaciens, tomado de Hellen et al. (2000). Cepas Cromosomal Plasmidio Ti Agrobacterium Gen Opina Background Gen marcador tumefaciens marcador EHA105 C58 Rifampicina pEHA105 (pTiBo542ΔT-DNA) No presente Succinamopina R C58C1Rif C58 Rifampicina pMP90 (pTiC58ΔT-DNA) Gentamicina Nopalina (pMP90)
Las células competentes de las cepas de A. tumefaciens EHA105 y C58C1RifR (pMP90) fueron transformadas con el vector de transformación pTJK136 según se describe en el anexo 2.
Infección y Co-cultivo
Previo a la transformación del material vegetal, las células de A. tumefaciens conservadas a -80 ºC en glicerol, fueron cultivadas en medio de cultivo semisólido LB que contenía 100 mg.L-1 de espectinomicina (Spm), 300 mg.L-1 de estreptomicina (Str) y 100 mg.L-1 de rifampicina (Rif) durante
16-24 h. Se tomaron colonias aisladas y cada una se inoculó en 3 mL de medio de cultivo YEP en estado líquido (10 g.L-1 de extracto de levadura, 10 g.L-1 de bactopeptona, 5 g.L-1 de NaCl, pH 7,0) con los mismos antibióticos (pre-cultivo). Se incubaron los pre-cultivos durante 24 a 48 h a 28±2 ºC y luego se inocularon 100 µL del cultivo por separado en 50 mL de medio de cultivo líquido YEP con el mismo suplemento de antibióticos, excepto la Rif. Los cultivos se mantuvieron a 28±2 ºC toda la noche en agitador orbital (INFORS) a 150 rpm. Después de 20 a 24 h, las células fueron colectadas por centrifugación a 3000 g a 4 ºC por 10 min y el precipitado fue resuspendido en medio de cultivo de inoculación (sales MS al 100%; sacarosa al 2% (p/v); 1,98 g.L-1 de D(+)-glucosa; 3,9 g.L-1 de
ácido 2-[N-morfolino]etano sulfónico (MES) con pH 5,5. Previo a la infección, se adicionó 200 µM de acetosiringona (AS) según Pérez-Hernández et al. (2006). La densidad óptica (DO) a 600 nm fue ajustada a 0,7 aproximadamente, según se determinó en estudios previos.
Los segmentos de hojas recién cortados fueron sumergidos en la suspensión de A. tumefaciens por 15 min en condiciones de luz natural con una intensidad de flujo de fotones fotosintéticos de 68-72
µmol.m-2.s-1 a 25±2 °C con agitación manual cada dos minutos (según estudios previos).
Posteriormente, los explantes se secaron por contacto con papel de filtro (Whatman 1). A
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Materiales y Métodos
continuación fueron transferidos a placas de Petri que contenía medio de cultivo de formación de callos (MFC con 200 µM de AS, pH 5,6). Todas las placas de Petri fueron selladas con Parafilm® y colocadas en la oscuridad a 21±2 ºC durante cinco días.
Selección y regeneración de plántulas
Los explantes co-cultivados fueron lavados en MFC en estado líquido con 500 mg.L-1 de cefotaxima y 200 mg.L-1 de timentina (antibióticos específicos para Agrobacterium que no afectan los tejidos vegetales) a fin de disminuir los remanentes de la bacteria. Luego fueron secados por contacto con papel de filtro. Posteriormente fueron transferidos a MFC en estado semisólido con G-418 como agente selectivo y 200 mg.L-1 de timentina para eliminar las células de Agrobacterium remanentes en los explantes. El cultivo se mantuvo en la oscuridad a 27±2 ºC, durante ocho semanas con subcultivos a medio de cultivo fresco cada dos semanas. Los callos formados fueron transferidos individualmente al medio de cultivo de regeneración descrito en el acápite 3.3. Las plántulas regeneradas, cada una de las cuales fue considerada una línea, fueron mantenidas en medio de cultivo de multiplicación como fue descrito en el acápite 3.3.
Los tratamientos considerados durante el proceso de transformación fueron: la inoculación y co- cultivo con ambas cepas de A. tumefaciens, un control no inoculado en MFC sin el agente selectivo
(control positivo) y un control no inoculado en MFC con el agente selectivo (control negativo). La formación de callos fue evaluada a las cuatro semanas del inicio de esta fase en medio selectivo. Para ambos controles se emplearon 20 explantes; mientras que, para la transformación con cada cepa se utilizaron 50 explantes. Se colocaron cinco explantes por placa de Petri y el experimento se realizó por triplicado.
Determinación histoquímica de la β-glucuronidasa (Ensayo GUS)
A partir del ensayo histoquímico GUS (Jefferson et al., 1987) se determinó la actividad transitoria de la β-glucuronidasa en los segmentos de hojas luego del co-cultivo (cinco días) y la actividad estable de esta enzima en los callos y líneas regeneradas. Los tejidos analizados fueron incubados a 37 ºC en
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Materiales y Métodos
una solución tampón para la tinción GUS (Anexo 3) durante 24 h. Simultáneamente se sometieron al mismo tratamiento explantes no transformados utilizados como control negativo.
Posterior a la incubación todas las muestras fueron sumergidas en etanol al 70% (v/v) durante 2 h para eliminar las clorofilas y otros pigmentos foliares. Para determinar la actividad transitoria de la β- glucuronidasa se seleccionaron 20 explantes al azar por cada tratamiento, excepto para los controles que se utilizaron cinco explantes. En cada explante se contaron por separado los puntos azules y las manchas bien definidas con más de 2 mm de diámetro (De Clercq et al., 2002). Para el análisis se utilizó un microscopio estereoscópico (Olympus), 10x. La actividad estable se determinó de forma cualitativa, clasificándose como positiva si se observaba alguna porción del tejido teñida de azul. En este estudio se analizaron 10 fracciones de callos elegidos al azar y una muestra de hojas de las líneas regeneradas.
Para analizar el proceso de transformación se evaluaron para cada tratamiento, la cantidad de explantes que formaron callos, el número de callos por explante y el número de líneas regeneradas por explante inoculado, valor que representa la eficiencia de transformación del protocolo desarrollado.
3.3.3 Análisis moleculares de las líneas regeneradas
Las soluciones empleadas en este acápite se describen en el anexo 4.
Extracción de ADN plasmídico
El plasmidio pTJK136, utilizado como control positivo para la reacción en cadena de la polimerasa y la hibridación del ADN, fue extraído a partir de cultivos de la cepa de Escherichia coli DH5α- pTJK136, donada por Profesor Geert Angenon (IMOL, Universidad Libre de Bruselas). Las células fueron cultivadas toda la noche en tubos de ensayo con 3,0 mL de medio de cultivo LB (pre-cultivo), a 37 °C y en condiciones de agitación. El plasmidio se purificó utilizando el kit de purificación
Wizard plus SV Minipreps (Promega).
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Materiales y Métodos
Extracción de ADN genómico vegetal
Fragmentos de tejidos de las líneas regeneradas, obtenidas a partir de los explantes inoculados con las dos cepas, fueron sometidos a la extracción de ADN genómico. La metodología de extracción de
ADN descrita a continuación se basó en la propuesta por Dellaporta et al. (1983) con algunas modificaciones.
Por cada línea regenerada, se maceró 1,0 g de material vegetal en nitrógeno líquido en un mortero con pistilo hasta lograr un polvo fino. El macerado fue transferido a un tubo de centrífuga de 35 mL de volumen pre-enfriado para evitar la descongelación, se le añadieron 5 mL de tampón de extracción frío y se agitó vigorosamente. A la mezcla se añadieron 330 μL de sulfato duodecilo de sodio (SDS) al 20% (p/v), se volvió a agitar vigorosamente y se colocó en un baño termostatado a 55 ºC por 10 min. A continuación se transfirió a otro baño termostatado a 37 ºC y se trató con RNasa (200 µg.µL-1 de concentración final) durante 20 min. Transcurrido este tiempo se añadieron 1,6 mL de acetato de potasio (KAc) 5M, se agitó fuertemente la mezcla y se centrifugó por 10 min a 10 000 g. Se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se repitió la centrifugación y colección de la fase líquida para eliminar completamente las partículas precipitadas. Al sobrenadante obtenido se adicionó igual volumen de isopropanol frío, se mezcló suavemente y se colocó a -20 ºC por cinco minutos para precipitar el ADN. La precipitación se completó por centrifugación a 10 000 g por 10 min. El precipitado se lavó por adición de 2,0 mL de etanol frío al 70 % (v/v) y agitación enérgica. Se repitió la centrifugación por cinco minutos a la misma velocidad para colectar el precipitado, el cual fue secado en campana por 15 min y resuspendido en 50 μL de H2O desionizada. Luego de obtenido el
ADN genómico, su integridad fue comprobada mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%
(p/v) y como criterio de pureza se determinaron las razones A 260/230 nm y A 260/280 nm mediante un espectrofotómetro (Biophotometer, Eppendorf, Alemania).
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La transformación de las líneas regeneradas fue comprobada por PCR empleando ADN genómico extraído de las mismas. Como control positivo de las reacciones de PCR se utilizó el plasmidio
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Materiales y Métodos
pTJK136. En el caso del control negativo se utilizó ADN de plántulas sin transformar. En el control de contaminación se sustituyó el ADN por un volumen equivalente de agua.
Se realizaron reacciones de PCR para amplificar fragmentos de los genes nptII y uidA. Las secuencias de los cebadores empleados se relacionan en la tabla 6.
Tabla 6. Cebadores utilizados en la detección por PCR de los genes nptII y uidA. Las secuencias están escritas en el sentido 5‟ a 3‟ (leído de izquierda a derecha). Gen Secuencia Talla del Amplicón Directo Reverso (pb) nptII ATGATTGAACAAGATGGATTGCA TGATGCTCTTCGTCCAGATCATC 488 CGC uidA AACGGCAAGAAAAAGCAGTC GAGCGTCGCAGAACATTACA 1031
La amplificación fue realizada en un volumen de reacción final de 25 µL, que contenía 100 ng de
ADN genómico; 0,4 µM de cada cebador; 1,5 mM de cloruro de magnesio (MgCl2); 200 µM de cada desoxirribonucleótido; 0,25 unidades de Taq polimerasa (Fermentas, Alemania) y tampón de reacción de esta enzima (Fermentas, Alemania). Los ciclos de amplificación se llevaron a cabo en el equipo de control térmico programable Mastercycler (Eppendorf, Alemania). La secuencia de reacciones para amplificación del fragmento del gen nptII comenzó con cinco minutos de desnaturalización a 94 ºC, seguida por 35 ciclos del bloque siguiente: 94 ºC por 45 s, 66 ºC por 45 s y
72 ºC por 45 s. Luego se realizó un paso final de extensión a 72 ºC por 7 min. Para la amplificación del fragmento del gen uidA se siguió una secuencia similar a la de nptII, pero con las siguientes modificaciones en el bloque de 35 ciclos: 94 ºC por 30 s, 58 ºC por 45 s y 72 ºC por 1,5 min.
Los productos de la reacción fueron analizados mediante electroforesis a 100 V durante 40 min en gel de agarosa al 0,8% (p/v) con tampón Tris-Borato-EDTA (TBE) 1x (0,09 M Tris-borato, 0,002 M
EDTA, pH 8). Como marcador de peso molecular se usó el GeneRuler™ DNA Ladder Mix,
(Fermentas, Alemania). Luego se realizó la tinción con 5,0 µg.L-1 de bromuro de etidio (Sambrook y
Russell, 2001) por 10 minutos y se observó en un transiluminador MacroVue (Pharmacia LKB) mediante la incidencia de luz ultravioleta (UV).
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Materiales y Métodos
Hibridación de ADN
La hibridación de ADN se realizó según la técnica descrita por Southern (Southern, 1975). Esta fue realizada para confirmar la integración estable del ADN-T y el número de insertos del transgen. Los fragmentos resultantes de la digestión de 20 µg de ADN con la enzima de restricción SacII
(Fermentas, Alemania) fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 0,8% con tampón
Tris-Acetato-EDTA durante 12 h a 25 V. El gel fue posteriormente tratado con soluciones de depurinación (0,25 M de HCl), de desnaturalización (0,5 M de NaOH; 1,5 M NaCl) y de neutralización (1,5 M NaCl; 1,0 M Tris-HCl; pH 7,0). A continuación, el ADN fragmentado fue transferido desde el gel hacia una membrana de nylon Hybond (RPN203B; GE Healthcare) por fuerzas de capilaridad ascendentes usando tampón SSC 20x (NaCl 3,0 M; citrato de sodio 0,3 M; pH
7,0) toda la noche a temperatura ambiente.
Se realizó la pre-hibridación de la membrana para bloquear sitios de unión no específicos del ADN sobre la membrana, que puedan resultar en uniones inespecíficas de la sonda. Para lograrlo, se colocó la membrana en un frasco de hibridación que contenía 20 mL de tampón de prehibridación (DIG
Easy Hyb, Roche, Alemania) y se dejó durante 30-45 min a 50 ºC en un horno de hibridación (Stuart
Scientific) en condiciones de agitación (45 rpm).
El fragmento de 488 pb del gen nptII amplificado a partir del plasmidio pTJK136 con los cebadores descritos anteriormente en la tabla 6 fue marcado con la digoxigenina unida a la deoxiuridina trifosfato (DIG-dUTP) mediante el kit PCR DIG Probe Synthesis (Roche Applied Science,
Alemania) y usado como sonda para la hibridación.
La sonda se desnaturalizó por inmersión durante 10 min en agua con una temperatura de 90-100 ºC y luego se colocó inmediatamente en hielo. Posteriormente se procedió a su dilución en 6,0 mL de tampón de hibridación (el mismo utilizado para la prehibridación) previamente calentada a 50 ºC hasta una concentración final de 20 ng.mL-1. La solución de hibridación así preparada se añadió al frasco de hibridación con la membrana y se dejó hibridar durante toda la noche.
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Materiales y Métodos
Luego de la hibridación, la membrana fue lavada dos veces durante cinco minutos mediante inmersión en 100 mL de solución de lavado que contenía SSC 1x (poco restringente) y SDS al 0,1%
(p/v) y agitación a 70 rpm en una bandeja de cristal esterilizada. El proceso se repitió, pero esta vez utilizando solución de lavado SSC 0,1x (restringente) y SDS al 0,1% (p/v) precalentada a 50 ºC para eliminar el exceso de sonda no enlazada.
Luego de la eliminación de la solución de lavado se adicionaron 20 mL de tampón 1 (descrito en el anexo 4) con Tween 20 al 0,3% (v/v) para equilibrar la membrana. Posteriormente, esta fue transferida hacia otra bandeja de cristal con 120 mL de tampón 2 (Anexo 4) en la que se sometió a agitación por 60 min a 30 rpm en el horno de hibridación. Paralelamente, el anticuerpo conjugado
FAB-anti-digoxina/fosfatasa alcalina (Roche) fue diluido 10 000 veces en un volumen final de 30 mL de tampón 2. Se descartó el tampón 2 de la bandeja con la membrana, y en su lugar se añadieron 30 mL de solución del anticuerpo conjugado. La membrana se dejó en contacto con esta solución exactamente 30 min. Posteriormente fue lavada tres veces durante 45 min cada una en 75 mL de tampón 1 con Tween 20 al 0,3 % (v/v).
Luego de los lavados, la membrana fue equilibrada durante dos minutos en 20 mL de tampón 3
(Anexo 4). Paralelamente, se diluyó el reactivo de detección, fosfato de disodio 3-(4- metoxispiro{1,2-dioxetano-3,2‟-(5‟-cloro) triciclo[3.3.1.13,7] decan}-4-il) fenilo (CSPD), a razón de
50 μL en 4,95 mL del mismo tampón.
A continuación se esparcieron 2,0 mL de CSPD diluido en una lámina plástica y encima se colocó la membrana de manera que la cara donde se adsorbió el ADN estuviese en contacto con la solución.
Luego de cinco minutos se escurrió la membrana y rápidamente se selló en una bolsa plástica, la cual se incubó a 37 ºC por 30 min y luego se autorradiografiaron en películas de rayos X (Kodak, Japón).
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Resultados y Discusión
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Producción de biomasa de D. purpurea en sistemas de inmersión temporal
4.1.1 Efecto de la densidad de inóculo
Los resultados obtenidos mostraron que hubo un efecto de la densidad de inóculo en el desarrollo morfo-fisiológico de los brotes y la biomasa obtenida por SIT (Tabla 7). Las plántulas obtenidas en el tratamiento con 12 explantes (aproximadamente 20 mL de medio de cultivo por explante) alcanzaron una mayor altura (10,93 cm) y un mayor número de brotes por explante (5,85). De igual manera, en este tratamiento se obtuvieron los mayores valores en la masa fresca y masa seca por SIT y un menor contenido de agua en la biomasa producida por SIT respecto al tratamiento con una densidad de inóculo de 18 explantes. Todos estos factores indican una mayor calidad de las plántulas obtenidas en el tratamiento con 12 explantes. El incremento de la producción de biomasa como índice biológico está directamente relacionada con la disponibilidad de nutrientes, la cual está influenciada por el volumen de medio de cultivo por explante (Gárate y Bonilla, 2008).
Tabla 7. Efecto de la densidad de inóculo en el desarrollo de los brotes de Digitalis purpurea L. cultivados durante 28 días en sistemas de inmersión temporal (SIT). Densidad de inóculo/SIT Indicadores evaluados **6 explantes ***12 explantes ***18 explantes Media RM Media RM Media RM Altura (cm) 3,58 12,50 c 10,93 79,61 a 8,71 49,39 b Número de brotes/explante 1,00 12,50 c 5,85 78,51 a 4,2 50,49 b *Brotes hiperhídricos/SIT (%) 0 2,50 c 3,93 6,50 b 20,1 10,50 a *Masa fresca/SIT (g) 6,7 2,50 c 104,03 10,50 a 88,46 6,50 b *Masa seca/SIT (g) 0,36 2,50 c 5,74 10,50 a 2,57 6,50 b *CA en biomasa producida (%) 94,7 5,50 b 94,5 3,50 b 97,1 10,50 a Leyenda: CA Contenido de agua, RM Rangos medios. Rangos medios con letras no comunes dentro de una misma fila difieren según prueba no paramétrica de Kruskall- Wallis/Mann-Whitney para p<0,05 (*n=4; **n=24 y *** n=40 para Altura y Número de brotes/explante).
En el tratamiento con menor densidad de inóculo (6 explantes/SIT) se determinaron los menores valores en las variables evaluadas y en los brotes se observaron afectaciones morfológicas a los 28 días de cultivo como muestra la figura 5. La densidad de inóculo como variable tiene su fundamento en la cantidad de volumen de medio de cultivo disponible por explante, además del espacio físico
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Resultados y Discusión
para su desarrollo. Es posible que el poco desarrollo morfo-fisiológico y la afectación en los explantes sea debido a un insuficiente inóculo, influenciado a su vez por la disponibilidad del medio de cultivo (aproximadamente 40 mL disponibles por explante) y el ambiente in vitro. Estos factores, según Piqueras y Debergh (1999), influyen directamente en el desarrollo de los brotes y los procesos morfo-genéticos.
Figura 5. Brotes de Digitalis purpurea L. cultivados durante 28 días en sistemas de inmersión temporal con diferentes densidades de inóculo, A: 6 explantes; B:12 explantes; C:18 explantes/SIT.
En el tratamiento con 18 explantes por SIT (aproximadamente 13 mL de medio de cultivo por explante) hubo una reducción considerable del valor de la masa seca (2,57 g), con el mayor contenido de agua en la biomasa producida (97,1%). En este tratamiento pudo haber una mayor competencia por los nutrientes lo que afectó los valores de masa fresca y masa seca. Además, esta reducción de la masa seca en el tratamiento con 18 explantes puede estar asociada a la presencia de brotes hiperhídricos (20,15%), valor que difiere significativamente con el porcentaje de brotes hiperhídricos obtenidos en las densidades menores.
La figura 6 muestra la morfología de los brotes normales con hojas verdes (código hex: #008000) expandidas y los hiperhídricos obtenidos en el tratamiento con 18 explantes. En las densidades de inóculo de 12 y 18 explantes/SIT, el 100% de los brotes normales desarrollaron raíces.
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Resultados y Discusión
A B
Figura 6. Morfología de brotes hiperhídricos (A) y normales (B) de Digitalis purpurea L. obtenidos a los 28 días de cultivo en los sistemas de inmersión temporal con una densidad de inóculo de 18 explantes.
La hiperhidricidad descrita como severos desórdenes fisiológicos y anatómicos (Debergh et al., 1992;
Ivanova y Van Staden, 2011) se caracteriza por la presencia de grandes cantidades de agua residual en los espacios apoplásticos de los tejidos. Las hojas y los tallos de los brotes hiperhídricos muestran una apariencia turgente y superficie acuosa, sus órganos son translúcidos y se quiebran con facilidad
(Franck et al., 2004; Jausoro et al., 2010; Baggio et al., 2012). Según Kevers et al. (2004), la hiperhidricidad implica problemas de diferenciación celular, por lo que los brotes no pueden tener un desarrollo morfo-fisiológico normal. Este fenómeno aunque no ha sido dilucidado completamente se describe como un desorden multicausal (Quiala et al., 2012) pero que en las condiciones experimentales pudo ser resultado de una mayor concentración de etileno en la atmósfera interna según Wu et al. (2009). Preil (2005) refiere que los brotes de especies dicotiledóneas tienden a ser más hiperhídricos cuando las densidades de inóculo son altas en los cultivos en medios líquidos.
Hasta el momento, no existe en la literatura científica consultada referencias sobre el empleo de los sistemas de inmersión temporal en el género Digitalis; mientras que, varias investigaciones refieren su empleo en la producción de biomasa en especies de interés medicinal (Sankar-Thomas y Lieberei,
2011; Schumann et al., 2012). Sin embargo, a pesar de que la densidad de inóculo es una variable básica para establecer métodos de cultivo en SIT, existe limitada información acerca de su efecto sobre la proliferación y calidad de los brotes.
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Resultados y Discusión
Schumann et al. (2012) describen la influencia de diferentes factores, entre ellos la densidad de inóculo en la producción de biomasa en brotes de Leucojum aestivum L. en sistemas de inmersión temporal. En su investigación refieren resultados muy similares donde el incremento de biomasa varió en dependencia de la densidad de inóculo. Los autores obtuvieron el mayor coeficiente de multiplicación (6,09) en SIT de 1,0 L con una densidad de 10 gMF y una reducción con la menor densidad de inóculo pero no refieren una explicación al fenómeno.
Contrario a los pocos ejemplos relacionados con el estudio de la densidad de inóculo en el cultivo de
órganos en plantas de interés farmacológico, la literatura científica refleja investigaciones en los procesos de micropropagación de diferentes especies en medios de cultivo líquidos.
Al respecto, Hahn y Paek (2005) indicaron que la evaluación de este factor incrementó la eficiencia de multiplicación pues es posible obtener un gran número de propágulos al mismo tiempo. Sus investigaciones se desarrollaron en el cultivo de brotes de Dendranthema grandiflorum Kitam en biorreactores de 10 L de capacidad y observaron que en las etapas iniciales la multiplicación de brotes se incrementó en el tratamiento donde se empleó la mayor densidad (80 explantes). Sivakumar et al. (2005) en el cultivo de brotes de Chrysanthemum grandiflorum L. en biorreactores compararon diferentes densidades de inóculo en el crecimiento y la calidad de las plantas. En su investigación obtuvieron el menor desarrollo de los brotes y de la biomasa con la menor densidad de inóculo, pero no encontraron una explicación a este resultado.
Por otra parte, autores como Lorenzo et al. (1998) en el cultivo de Saccharum spp., sugirieron que bajas densidades en los SIT tienen una influencia negativa en el desarrollo morfo-fisiológico de los brotes. Al respecto, Escalona et al. (1999) informaron de igual manera dicha influencia negativa en el desarrollo y crecimiento de los brotes de Ananas comosus (L.) Merr. en SIT.
El estrés que sufren las plantas durante el cultivo in vitro es un estrés abiótico. Es por esto que es posible controlarlo potencialmente mediante la manipulación de los parámetros de cultivo (Cassells y
Curry, 2001). De esta afirmación se deriva el especial interés en el estudio de la densidad de inóculo en el desarrollo de métodos para la producción de biomasa. Además, el manejo de la densidad de
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Resultados y Discusión
explantes, nos permite según Jiménez (2005) definir el aprovechamiento del volumen del frasco de cultivo, así como la capacidad productiva en las cámaras de crecimiento.
A partir de los resultados obtenidos, se definió como densidad de inóculo 12 explantes para la multiplicación de brotes de D. purpurea que servirá de base para el resto de los experimentos de producción de biomasa en SIT.
4.1.2 Efecto de la frecuencia de inmersión
Se determinó el efecto de la frecuencia de inmersión sobre el desarrollo de los brotes y la producción de biomasa con el empleo de 12 explantes/SIT como densidad de inóculo. Los mayores valores de altura, número de brotes por explante y masa seca se lograron cuando se empleó una frecuencia de inmersión cada 4 horas con diferencias significativas del resto de los tratamientos (Tabla 8). Estos resultados indican que bajo estas condiciones se favorece el intercambio gaseoso del frasco con el medio exterior así como la eliminación de gases como el etileno y el CO2 que se producen durante el cultivo y pueden llegar a ser tóxicos para el material vegetal. Por otra parte permitió una mejor asimilación de nutrientes lo que favoreció el incremento en los valores de las variables evaluadas. La biomasa obtenida con una inmersión cada 2 h presentó un mayor contenido de agua con diferencias significativas al resto de los tratamientos y a su vez el menor valor de masa seca.
Tabla 8. Efecto de la frecuencia de inmersión en la producción de biomasa a partir de brotes de Digitalis purpurea L. cultivados durante 28 días en sistemas de inmersión temporal (SIT). Frecuencia de inmersión Indicadores evaluados 2 h 4 h 6 h 12 h Media RM Media RM Media RM Media RM *Altura (cm) 10,84 104,94b 11,1 121,23a 10,31 75,34c 7,81 20,50d *N. de brotes/explante 4,4 70,16bc 6,03 106,94a 4,93 81,22b 4,05 63,68c **Masa seca/SIT (g) 2,06 2,50c 5,82 13,50a 4,98 9,25b 4,82 8,75b **CA (%) 97,8 14,50a 94,5 7,50b 94,5 7,75b 93,7 4,25b Leyenda: RM Rangos medios, CA Contenido de agua. Rangos medios con letras no comunes en una misma fila difieren estadísticamente según pruebas no paramétricas Kruskal- Wallis/Mann-Whitney para p<0,05 (*n=40; **n=4).
La masa fresca de los brotes se incrementó durante los 28 días de cultivo en todos los tratamientos según muestra la dinámica de producción de biomasa en la figura 7. Durante los primeros siete días
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Resultados y Discusión
se observa un crecimiento lento y solo el menor valor obtenido con la menor frecuencia de inmersión difiere significativamente del resto de los tratamientos. Esta etapa está asociada con una menor incorporación de materia según Barceló et al. (2007). Estos autores plantean que a medida que aumenta la masa fresca en el tiempo, aumenta el número de brotes y el área de las hojas, por lo que se hace mayor el potencial de crecimiento y se activa una etapa de desarrollo rápido. Los brotes cultivados con una inmersión cada 4 h mostraron una mayor producción de biomasa durante los 28 días de cultivo. Mientras que, los brotes cultivados con una inmersión cada 2 y cada 6 h mostraron un desarrollo muy similar durante todo el cultivo sin diferencias significativas entre sí. La menor producción de biomasa durante los 28 días se obtuvo con una frecuencia de inmersión cada 12 h.
Puntos con letras no comunes en igual día de cultivo difieren estadísticamente según pruebas no paramétricas Kruskal- Wallis/Mann-Whitney para p<0,05 (n=4).
Figura 7. Dinámica de producción de biomasa a partir de brotes de Digitalis purpurea L. cultivados durante 28 días en sistemas de inmersión temporal (SIT) con diferentes frecuencias de inmersión.
Es preciso señalar que el valor de la masa fresca de los brotes cultivados con inmersiones cada 2 h pudiera sugerir un buen desarrollo de los mismos. Sin embargo, es necesario tener en cuenta que en dicha biomasa se obtuvo el mayor contenido de agua como se mencionó anteriormente. Además, se
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Resultados y Discusión
observó un desarrollo morfológico inusual de las hojas, las cuales tenían una forma alargada y estrecha (Figura 8A). En otros cultivos, estos cambios morfológicos en las hojas han sido indicadores tempranos de problemas de diferenciación y de la hiperhidricidad. En la propagación de brotes de
Tectona grandis L. en SIT descrita por Quiala et al. (2012) obtuvieron brotes con hojas en forma lanceolada lo que coincidió con un mayor contenido de agua en la biomasa a la vez que observaron desórdenes a nivel anatómico y fisiológico. Las hojas de los brotes obtenidos en el tratamiento con una frecuencia cada 4 h tuvieron un desarrollo morfológico normal (Figura 8B).
A B
Figura 8. Brotes de Digitalis purpurea L., A: con hojas alargadas y estrechas obtenidos con una inmersión cada 2 h, B: hojas normales obtenidos con una inmersión cada 4 h durante 28 días de cultivo en SIT.
La hiperhidricidad ha sido una variable importante a evaluar en el cultivo de brotes en SIT pues esta, entre otros factores, indica la calidad de los brotes desarrollados y por su implicación en la masa seca. Aunque en todos los tratamientos no se manifestó marcadamente este fenómeno (entre 3 y 4% de brotes hiperhídricos por SIT), solo en el tratamiento con una mayor frecuencia de inmersión es posible relacionar la hiperhidricidad con el mayor contenido de agua y la menor masa seca. De acuerdo a Debergh et al. (1992) pueden existir varios niveles de hiperhidricidad. De manera, que los desórdenes morfo-anatómicos y fisiológicos pueden estar presentes en el material vegetal a medida que el agua se acumula en los tejidos, sin que exista una manifestación típica en la morfología de los brotes como la apariencia turgente, translúcidos y quebradizos.
La acumulación de agua en los tejidos como resultado de una mayor frecuencia de inmersión y contacto de los mismos con el medio de cultivo, pudiera limitar la disponibilidad del O2 y el CO2
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Resultados y Discusión
intercelular necesarios para los procesos metabólicos como la fotosíntesis y la respiración. El CO2 pudiera solubilizarse con el medio de cultivo que se encuentra sobre y en los tejidos foliares en forma
2- - de aniones CO3 o hidrogenocarbonato (HCO3 ), incrementándose la posibilidad de reacción con cationes Mg2+ y Ca2+. Esto provoca la basificación del pH intracelular y conduce a problemas en la diferenciación celular y un incompleto desarrollo estructural de los brotes según describen Barbón et al. (2008). Por tanto, es posible que la acumulación de masa seca se afectara por el poco desarrollo estructural de los brotes y la mayor acumulación de agua en los tejidos.
Los explantes con menor contacto con el medio de cultivo, con inmersiones cada 12 h, mostraron una reducción en la masa fresca obtenida por SIT. Esta pudo afectarse por una pobre renovación de la atmósfera interna que implica una menor concentración de oxígeno y a la vez una mayor acumulación de CO2 y etileno. Los explantes estuvieron menor tiempo en contacto con el medio de cultivo líquido y por tanto se reduce la entrada de agua a los tejidos. A la vez, hay una menor absorción de nutrientes lo cual limita la producción de biomasa.
Los resultados confirman las ventajas del empleo de los SIT para la producción de biomasa mediante la multiplicación de brotes de D. purpurea. Son varios los autores que han descrito las ventajas de los
SIT como un método eficiente para la propagación de diferentes especies. Se le atribuye un efecto muy marcado en el aumento de los coeficientes de multiplicación y la obtención de plantas con calidad en corto período de tiempo (Berthouly y Etienne, 2005; Quiala et al., 2006; Schumann et al.,
2012).
De igual manera, se han descrito en los últimos años investigaciones realizadas en SIT para la propagación de plantas de interés medicinal (Murch et al., 2004; Yan et al., 2010), pero solo existen algunos trabajos que muestran el efecto de la frecuencia de inmersión mediante el cultivo de órganos.
Al respecto, Sankar-Thomas y Lieberei (2011) evaluaron la frecuencia de inmersión en el cultivo de brotes de Camptotheca acuminata Decne en SIT y determinaron que cuatro inmersiones diarias aumentó el número de brotes por explante comparado con ocho inmersiones diarias. Entre las frecuencias evaluadas no se encontraron diferencias significativas para la altura de los brotes y la
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Resultados y Discusión
masa fresca; sin embargo, los brotes cultivados con una mayor frecuencia diaria mostraron síntomas de hiperhidricidad.
La frecuencia de inmersión es uno de los parámetros más críticos para la producción de biomasa en
SIT. Esta afecta el suministro de nutrientes, la composición de la atmósfera interna en el frasco de cultivo y la presencia de la hiperhidricidad (Teisson et al., 1996). Según Berthouly y Etienne (2005) la principal razón que favorece la eficacia de los SIT es la ventilación del tejido, además de mantener un contacto intermitente entre el tejido y el medio de cultivo que resulta en un incremento en la tasa de crecimiento y la producción de biomasa. Conjuntamente se le atribuye otra ventaja y es que después de la inmersión los explantes permanecen cubiertos por una fina película de medio de cultivo que previene la desecación durante el período en que no ocurren inmersiones (Sankar-Thomas y
Lieberei, 2011).
Los análisis de HPLC revelaron la presencia de digitoxina y digoxina en muestras de todas las frecuencias de inmersión estudiadas (Tabla 9). Los valores de digoxina variaron según las frecuencias de inmersión empleadas. Sin embargo, los contenidos de digitoxina no mostraron diferencias significativas entre las frecuencias de inmersión estudiadas.
Tabla 9. Contenido de cardenólidos en plántulas de Digitalis purpurea L. a los 28 días de cultivo en sistemas de inmersión temporal (SIT) con diferentes frecuencias de inmersión. Frecuencia de inmersión Producción de 2 h 4 h 6 h 12 h cardenólidos Media RM Media RM Media RM Media RM Digitoxina (µg.gMS-1) 32,5 9,88a 28,8 8,63a 24,5 6,0a 28,0 9,5a Digoxina (µg.gMS-1) 8,0 7,80bc 20,6 17,60a 6,4 4,40c 12,0 12,20b PN digitoxina (µg) 67,0 2,75b 167,6 11,75a 122,0 8,75a 135,0 10,75a PN digoxina (µg) 16,5 3,50c 119,9 14,50a 31,87 6,25bc 57,84 9,75b Leyenda: PN Producción neta por SIT, RM Rangos medios. Rangos medios con letras no comunes en una misma fila difieren estadísticamente según pruebas no paramétricas Kruskal- Wallis/Mann-Whitney para p<0,05 (n=4)
El contenido de digitoxina fue mayor que el contenido de digoxina en los brotes cultivados in vitro en los SIT. De igual manera ocurre en condiciones naturales, donde la concentración de la digoxina,
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Resultados y Discusión
con mayor aplicación farmacológica, es menor que la concentración de la digitoxina en las plantas de
D. purpurea (Giri et al., 2001).
El contenido de cardenólidos en plantas en condiciones naturales se ve afectado por el genotipo
(Gavidia et al., 1996; Nebauer et al., 1999), la nutrición mineral, CO2, estrés hídrico y varios factores ambientales como la iluminación (Gavidia y Pérez-Bermúdez, 1997; Roca-Pérez et al., 2004). Esto sugiere que durante el cultivo in vitro las diferentes condiciones ambientales a las que están expuestas los brotes debido a las frecuencias de inmersión estudiadas, pudieron variar el contenido de cardenólidos mediante la activación de mecanismos relacionados con su síntesis que hasta la fecha no están elucidados.
Aunque el contenido de digitoxina (µg.gMS-1) no mostró diferencias significativas en los tratamientos estudiados, se notó una variación en la producción neta de digitoxina debido a los valores alcanzados en la masa seca por SIT. La producción neta de digoxina por SIT fue mayor en el tratamiento donde se empleó una inmersión cada 4h. De igual manera resultó para la producción neta de digitoxina, aunque para esta, solo difirió significativamente con la mayor frecuencia de inmersión coincidiendo con el tratamiento donde se obtuvo el menor valor de masa seca. Por tanto, es necesario enfatizar la importancia de la masa seca en la selección de un método de producción de cardenólidos basado en el cultivo de brotes en SIT. Estos resultados confirman que es necesario obtener un incremento en la masa seca lo que determinará en gran medida la producción de los compuestos.
La literatura científica refiere la producción de cardenólidos en D. purpurea en diferentes sistemas de cultivo in vitro. Tal es la investigación desarrollada por Hagimori et al. (1982) quienes obtuvieron un contenido similar de digitoxina (20 µg.gMS-1) en brotes de D. purpurea obtenidos por organogénesis indirecta en condiciones de luz, pero no describen resultados acerca de la digoxina. Seitz y Gärtner
(1994) en el cultivo de brotes con la adición de precursores al medio de cultivo obtuvieron entre 100 y 200 µg.gMS-1 de cardenólidos totales. Esto quiere decir que incluyeron el análisis de las geninas y no mostraron el contenido de digoxina y digitoxina de forma independiente, por lo que estos datos no son realmente comparables con los obtenidos en este estudio. Además, esta es la primera vez que se
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Resultados y Discusión
informa el contenido de cardenólidos en brotes del género de Digitalis cultivados en SIT. Estos resultados pudieran permitir la aplicación potencial de un método para la producción de biomasa en los SIT y a su vez para la producción de cardenólidos.
Con el objetivo de obtener una producción efectiva de compuestos bioactivos es necesario combinar una elevada tasa de multiplicación de biomasa con un alto contenido de los cardenólidos en la biomasa producida. Teniendo en cuenta, que la síntesis de los cardenólidos a nivel celular ocurre principalmente en las hojas y son almacenados en vacuolas y posteriormente transportados por el floema a raíces y flores (Kreis y Müller-Uri, 2010), el incremento de la producción de la biomasa foliar puede favorecer el incremento del contenido de los mismos. Por tanto, es notable, que el tratamiento con inmersiones cada 4 h (seis inmersiones por día) simultáneamente provocó una mayor producción de biomasa y un mayor incremento en el contenido de los cardenólidos detectados.
Similares resultados fueron descritos para diferentes especies de Digitalis, los que muestran que la producción de estos compuestos parece estar relacionada directamente con la producción de biomasa.
Al respecto, Roca-Pérez et al. (2004) mostraron una relación positiva entre la biomasa y el contenido de cardenólidos en poblaciones de Digitalis obscura L. cultivadas en condiciones naturales.
En relación al efecto de la frecuencia de inmersión en la producción de metabolitos secundarios, autores como Pavlov y Bley (2006) refirieron el incremento de la biomasa y el contenido de betalainas en el cultivo de brotes de B. vulgaris en SIT (18,8 mg.gMS-1) con 15 min de inmersión cada 60 min.
Por su parte, Tisserat y Vaughn (2008) estudiaron la influencia de varios parámetros físicos ambientales en el crecimiento de plantas de Mentha spicata L. así como la morfogénesis de los mismos y la producción de metabolitos secundarios de interés. Los autores informaron que el incremento del número de inmersiones por día (4, 8, 12, 16 inmersiones por día) favoreció el crecimiento de las plantas y la respuesta morfogenética en un sistema automatizado para el cultivo de plantas.
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Resultados y Discusión
Resultados similares fueron obtenidos en el cultivo de brotes de Camptotheca acuminata Decne en varios genotipos cultivados en SIT por Sankar-Thomas y Lieberei (2011). Estos autores encontraron un incremento significativo en el contenido de camptotecina cuando emplearon ocho inmersiones diarias en ambos sistemas de cultivo comparado con cuatro inmersiones diarias después de ocho semanas de cultivo, por lo que determinaron que la frecuencia de inmersión está asociada al incremento en el contenido de camptotecina.
Por otro lado, existen otros factores involucrados en los SIT que permiten un empleo más eficiente de los mismos, como son: la composición de la atmósfera gaseosa así como el tiempo de inmersión, el volumen del frasco de cultivo. Estos estudios pueden incrementar los contenidos de cardenólidos en la biomasa producida, aspecto necesario si se tiene en cuenta que aún los valores obtenidos en condiciones in vitro son bajos con respecto a los valores que se describen a partir de plantas en condiciones de campo (4-10 mg.gMS-1, como valor total de cardenólidos) (Sales et al., 2011).
Los resultados demuestran que con una inmersión cada 4 h (seis inmersiones diarias) se obtuvo la mayor producción de biomasa con el contenido más alto de cardenólidos por SIT.
4.1.3 Efecto de la renovación de la atmósfera
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, se determinó que hay influencia de la renovación de la atmósfera al emplear una frecuencia de inmersión cada 4h. La renovación adicional de la atmósfera, la cual consistió en 12 aireaciones diarias, provocó una reducción significativa en las variables evaluadas (Tabla 10). Durante los primeros 7 días (Figura 9) se observó un incremento similar de biomasa en ambos tratamientos y a los 14 días se determinó un menor crecimiento en el tratamiento con renovación adicional. En ambos tratamientos la presencia de brotes hiperhídricos fue baja y los valores no difirieron significativamente (2,0 y 3,25 brotes por SIT con y sin renovación adicional respectivamente) por lo que no representó una variable importante.
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Resultados y Discusión
Tabla 10. Efecto de la renovación adicional de la atmósfera en la producción de biomasa a partir de brotes de Digitalis purpurea L. cultivados durante 28 días en sistemas de inmersión temporal (SIT). Frecuencia de inmersión (4 h) Indicadores evaluados Sin renovación Con renovación Media RM Media RM *Altura (cm) 12,38 51,39a 10,42 29,61b *N. de brotes/explante 5,98 51,03a 4,65 29,98b **Masa seca/SIT (g) 5,09 6,38a 4,68 2,63b **CA (%) 95,0 6,50a 93,7 2,50b Leyenda: PN Producción neta por SIT, RM Rangos medios. Rangos medios con letras no comunes en una misma fila difieren estadísticamente según pruebas no paramétricas Mann- Whitney para p<0,05 (*n=40; **n=4). La renovación adicional de la atmósfera consistió en 12 aireaciones diarias.
Puntos con letras no comunes en igual día de cultivo difieren estadísticamente según pruebas no paramétricas de Mann- Whitney para p<0,05 (n=4).
Figura 9. Efecto de la renovación adicional de la atmósfera en la dinámica de producción de biomasa a partir de brotes de Digitalis purpurea L. cultivados durante 28 días en sistemas de inmersión temporal. La renovación de la atmósfera consistió en 12 aireaciones diarias.
La ventilación forzada es una estrategia que puede tenerse en cuenta para incrementar la producción de biomasa y la obtención de metabolitos secundarios, pues influye en la asimilación de nutrientes, eliminación de gases como son el etileno y el CO2, los cuales pueden llegar a ser tóxicos y la renovación de la atmósfera interna del frasco de cultivo (Lai et al., 2005). Estos aspectos aplicados a
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Resultados y Discusión
los resultados obtenidos pudieran parecer contradictorios; sin embargo, una mayor ventilación debido a la renovación adicional de la atmósfera interna mediante 12 aireaciones diarias pudo ser excesiva e inhibir el desarrollo de la biomasa en los SIT.
En ambos tratamientos producto del principio de funcionamiento de los SIT ya existe una renovación de la atmósfera que reduce la humedad relativa dentro del frasco (Berthouly y Etienne, 2005) y las concentraciones de CO2 recobran los valores de concentración ambiental en el momento de la inmersión (Roels et al., 2006). Estas condiciones ambientales pudieron ser suficientes para el desarrollo de la biomasa de D. purpurea como se corrobora en el tratamiento con inmersiones cada
4h (control). Sin embargo, una renovación adicional elevada de 12 aireaciones diarias pudo haber favorecido la transpiración excesiva y de esta manera afectar la producción de la masa fresca y seca.
Mills et al. (2004) en la multiplicación de brotes de Simmondsia chinensis (Link) C. K. Schneid describen resultados similares como resultado de una elevada ventilación. Los resultados obtenidos, coinciden además con los informados por Ziv (2000) quienes describieron que una elevada aireación redujo el desarrollo de la biomasa de Dianthus caryophyllus L. En este mismo cultivo pero en condiciones estáticas Fal et al. (2002) describieron que un incremento en la ventilación provocó un incremento en la desecación, la cual de acuerdo a estos autores pudiera ser la causa principal de la disminución de la biomasa de D.purpurea. Otra hipótesis señalada por Sallanon y Maziere (1992) que justificaría esta reducción del crecimiento, pudiera ser que la evaporación del medio de cultivo conduce a una concentración de las sales e induce estrés en las plántulas y como consecuencia el crecimiento es menos vigoroso.
De igual manera, Lai et al. (2005) durante el cultivo de brotes de Scrophularia yoshimurae
Yamazaki, describieron que el incremento del intercambio gaseoso provoca una reducción considerable en el número de brotes por explante sin atribuirle explicación a dicha disminución.
Autores como Yesil-Celiktas et al. (2010) refieren que el suministro de aire determina el grado de aireación durante el cultivo así como la producción de biomasa. Los cultivos con ventilación forzada favorecen el normal desarrollo morfológico y fisiológico de las plantas (Zobayed et al., 2001; Jo et
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Resultados y Discusión
al., 2002; Park et al., 2004). A diferencia de estos sistemas de cultivo estáticos descritos donde la ventilación ha sido favorable, en los SIT, existe un intercambio gaseoso y una ventilación de la atmósfera interna como ya se ha explicado con anterioridad. Por tanto, los resultados demostraron que la renovación adicional, al menos con 12 aireaciones diarias que fue la estudiada, no mejoró las condiciones de cultivo creadas en los SIT.
La renovación adicional también influyó en el contenido de cardenólidos. La digoxina no se detectó en el tratamiento con renovación adicional, mientras que el contenido de digitoxina se incrementó hasta 111,0 µg.gMS-1 (Figura 10A).
Medias con letras no comunes dentro de cada figura difieren estadísticamente según prueba no paramétrica de Mann- Whitney para p<0,05 (n=4)
Figura 10. Efecto de la renovación adicional de la atmósfera sobre: (A) contenido de digoxina y digitoxina y (B): contenido de peróxido de hidrógeno y malondialdehído (MDA) en brotes de Digitalis purpurea L. cultivados en sistemas de inmersión temporal (SIT) con una frecuencia de inmersión cada 4 horas. La renovación de la atmósfera consistió en 12 aireaciones diarias.
Se observó un incremento en el contenido de ambos marcadores de estrés oxidativo en el tratamiento con renovación de la atmósfera, donde también se manifestó un aumento de la concentración de digitoxina (Figura 10B). La biosíntesis de metabolitos secundarios puede asociarse con la respuesta de defensa de las plantas cuando son sometidas a condiciones de estrés. Entre las respuestas bioquímicas tempranas de la planta, está la generación de las especies reactivas de oxígeno. En el tratamiento sin renovación adicional, el contenido de peróxido de hidrógeno fue muy bajo y se obtuvo un incremento de su contenido en los brotes desarrollados bajo el efecto de la renovación
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Resultados y Discusión
adicional de la atmósfera. En células vegetales, el estrés oxidativo se origina por una descompensación entre la tasa de formación de especies reactivas de oxígeno (EROs) y la capacidad defensiva antioxidante. Por otra parte, en el proceso metabólico de las EROs, el MDA es un marcador apropiado de la peroxidación lipídica (Wu et al., 2009). Su incremento en el tratamiento con renovación adicional de la atmósfera indica según Niknam et al. (2011) un daño oxidativo bajo condiciones de estrés.
Los resultados apuntan a que posiblemente el estrés asociado a la renovación adicional de la atmósfera provocara una activación en las enzimas específicas que regulan la síntesis de la digitoxina en detrimento de aquellas que rigen la síntesis de la digoxina, la cual no fue detectado en las muestras analizadas.
En la literatura científica se describen algunos estudios que relacionan la biosíntesis de metabolitos secundarios con el estrés oxidativo. Al respecto, Chong et al. (2004) refiere que los mayores niveles de antraquinonas en el cultivo de suspensiones celulares de Morinda elliptica L. podrían estar asociados con un incremento en los niveles de H2O2.
Desafortunadamente, los mecanismos de producción de cardenólidos en plantas del género Digitalis no han sido elucidados completamente y es necesario profundizar en el estudio de los mismos.
Enzimas específicas que regulan la síntesis de digitoxina pudieron ser activadas, en detrimento de aquellas que rigen la síntesis de digoxina, debido a condiciones de estrés causadas por una mayor frecuencia de renovación de la atmósfera gaseosa en los vasos de cultivo. De igual manera, puede ser que haya ocurrido una alteración de la localización o la solubilidad de las enzimas. Esto por supuesto es un tema que debe ser objeto de futuras investigaciones.
Los resultados hasta aquí descritos permitieron concluir que la renovación adicional de la atmósfera interna en los SIT provocó cambios notables en el contenido de cardenólidos, específicamente en la digitoxina. Los contenidos de H2O2 y MDA fueron superiores, lo que corrobora que un incremento en la frecuencia de renovación de la atmósfera indujo un mayor estrés oxidativo en los brotes asociado a un aumento en la síntesis de digitoxina.
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Resultados y Discusión
4.1.4 Escalado de la producción de biomasa
El escalado se realizó sobre la base de los mejores resultados obtenidos en los acápites anteriores. La densidad de inóculo fue de 60 explantes teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el acápite
4.1.1 donde se determinó 12 explantes por SIT (20 mL de medio de cultivo por explante) como densidad de inóculo. La figura 11 muestra la dinámica de producción de biomasa durante los 28 días de cultivo de brotes de D. purpurea donde se observa un incremento sostenido durante este período.
Figura 11. Dinámica de producción de biomasa a partir de brotes de Digitalis purpurea L. cultivados durante 28 días en sistemas de inmersión temporal (SIT) de 5 L de capacidad.
Los resultados obtenidos en los parámetros productivos evaluados se muestran en la Tabla 11. A modo de comparación es posible señalar que, durante el escalado, para la densidad de inóculo, medio de cultivo así como capacidad del frasco de cultivo se mantuvo una relación proporcional de 1:5 con relación a los frascos de 1,0 L que se utilizaron para los experimentos anteriores. Los resultados mostraron que para las variables masa fresca, masa seca, y contenido de digoxina se obtienen igual relación 1:5 (Tablas 8, 9, 11 y Figura 7). Sin embargo para el contenido de digitoxina este fue de
1:10. Esta relación nos indica que el escalado no resultó negativo en cuanto a la producción de biomasa ni cardenólidos. Es preciso señalar, que aún cuando los SIT constituyen un buen sistema
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Resultados y Discusión
para la producción de biomasa, el contenido de cardenólidos es bajo en comparación con los obtenidos en plantas en condiciones de campo (Sales et al., 2011).
Tabla 11. Parámetros productivos determinados en el escalado de la producción de biomasa y cardenólidos a partir de brotes de Digitalis purpurea L. cultivados durante 28 días en sistemas de inmersión temporal de 5,0 L de capacidad. Producción de cardenólidos Masa Masa -1 Producción neta (µg.gMS ) Parámetros fresca/SIT (g) seca/SIT (g) por SIT (mg) Digitoxina Digoxina Total productivos 573,4 30,9 55,7 20,5 76,2 2,4
Estos resultados permiten realizar una estimación teórica de la producción de biomasa D. purpurea en SIT para la obtención de cardenólidos con el objetivo de medir las potencialidades del método desarrollado a mayor escala. Para realizar el cálculo estimado de la producción en un laboratorio comercial de 100 m2, es necesario tener en cuenta algunos parámetros que se relacionan a continuación:
En las cámaras de cultivo, existe un 70% de aprovechamiento efectivo del área
Cada SIT de 5,0 L de capacidad ocupa 0,3 m2 de estante
Cada estante tiene cinco pisos
De estos parámetros reales se infiere que en un laboratorio comercial de 100 m2 es posible instalar aproximadamente 1170 SIT y que en un año, para la especie en estudio, es posible realizar 10 cosechas, teniendo en cuenta el ciclo de cultivo que es de 28 días y el tiempo necesario para la cosecha, lavado, esterilización e inoculación de los SIT. Sobre la base del rendimiento en biomasa obtenido en el escalado en SIT de 5,0 L es posible calcular el estimado de la producción en un laboratorio comercial durante un año (Tabla 12).
Tabla 12. Estimado de la producción de biomasa y cardenólidos de Digitalis purpurea L. a escala comercial en un laboratorio de 100 m2 en un año. Producción de cardenólidos (g) Masa fresca Masa seca por año Parámetros (ton) (kg) Digitoxina Digoxina Total productivos 7,0 360 20,0 7,4 27,4
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Resultados y Discusión
En cuanto a la producción de biomasa, el estimado de masa fresca indica que los SIT constituyen un método apropiado para este fin. El cultivo en condiciones naturales, según datos informados por
Grieve (2003) se obtiene un rendimiento a la cosecha de las plantas a los dos años en un área 100 m2 de 50 kg de masa fresca y 12,5 kg de masa seca. Comparando estos resultados podemos apreciar que con el uso de los SIT se obtiene 140 veces más masa fresca y 28,8 veces más masa seca en un período de tiempo más corto y sin las afectaciones que podrían producirse en condiciones naturales.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos se diseñó un esquema de producción de biomasa D. purpurea en los SIT para la síntesis de cardenólidos (Figura 12), el cual constituye el primer informe para el género Digitalis.
La producción de biomasa a partir del cultivo de órganos para la obtención de metabolitos secundarios a gran escala es un método valioso que posibilita controlar la producción según la demanda del producto (Kraus y Reinhard, 1989). A pesar de las ventajas que presenta el cultivo de
órganos para el escalado en biorreactores (estabilidad genética, baja sensibilidad a daños mecánicos y menos riesgos de contaminación que el cultivo de células), una de las debilidades que se describe es la inherente heterogeneidad de la biomasa y por consiguiente un alto grado de heterogeneidad espacial (Yesil-Celiktas et al., 2010). Dicha heterogeneidad en la morfología de los brotes no fue observada pues no hubo cambios en la coloración de la biomasa, forma de las hojas ni un crecimiento desigual de los brotes dependiendo de la ubicación de estos dentro del SIT.
Otros factores como los altos costos del equipamiento, la complejidad del equipamiento, la deficiente iluminación en los grandes vasos de cultivo, las deficiencias en los métodos de inoculación, transferencia y cosecha de la biomasa han limitado el uso de biorreactores a escala comercial
(Verpoorte et al., 2002; Berthouly y Etienne, 2005; Ziv, 2005). A la vez, han conducido al desarrollo de biorreactores modificados tales como los sistemas de inmersión temporal (SIT) mejor adaptados a estos propósitos.
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Resultados y Discusión
Figura 12. Esquema propuesto para la producción de biomasa de Digitalis purpurea L. en sistemas de inmersión temporal para la síntesis de cardenólidos a partir del cultivo de brotes.
En la literatura consultada algunas investigaciones describen el empleo de los SIT con diferentes diseños pero el mismo principio con el objetivo de incrementar la producción de biomasa así como la acumulación de metabolitos secundarios de plantas de interés comercial (Wilken et al., 2005; Quiala et al., 2006).
Al respecto, Gontier et al. (2005) desarrollaron un sistema de bajo costo para la producción de biomasa de brotes de Ruta graveolens L. y la obtención de furanocumarinas, basado en la inmersión temporal. Se obtuvieron 1,6 g de masa seca por día y una productividad de 3,8 mg de
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Resultados y Discusión
furanocumarinas, valores superiores a los que se obtuvieron mediante el cultivo de brotes en agitación y en biorreactores clásicos.
Autores como Tisserat y Vaughn (2008) demostraron que los aceites esenciales de M. spicata pueden incrementarse considerablemente mediante cambios físicos en el ambiente in vitro en sistemas automatizados en comparación con sistemas convencionales de cultivo.
Recientemente, Sankar-Thomas y Lieberei (2011) establecieron un protocolo eficiente y económico para la multiplicación de brotes de C. acuminata en SIT, el cual es aplicable para la producción de biomasa a gran escala.
Los resultados en el escalado no siempre son positivos. Al respecto, Schumann et al. (2012) obtuvieron similar producción de biomasa de L. aestivum en SIT de 5 y 10 L comparado con la producción obtenida en SIT de 1 L de capacidad. Sin embargo, los valores alcanzados en el contenido de alcaloides fueron inferiores significativamente a los obtenidos en SIT de menor tamaño, por lo que proponen nuevas estrategias a desarrollar con el objetivo de maximizar la productividad.
Los resultados obtenidos en el escalado demuestran que el cultivo de brotes de D. purpurea en SIT como método de producción de biomasa pudiera permitir su aplicación comercial, con una producción de 7,0 ton de masa fresca que equivalen a 360 kg de masa seca por año en 100 m2 de laboratorio. Sin embargo, la producción neta de cardenólidos podría aumentarse para hacerla economicamente más atractiva. En consecuencia, nuevas estrategias deben ser estudiadas con el objetivo de inducir o activar los mecanismos relacionados con la síntesis de estos compuestos y por tanto incrementar su contenido en la biomasa producida. Una vez que se logre dicho objetivo, se requiere realizar un análisis económico que permita validar su empleo.
No obstante, existen otras potencialidades de los SIT que justifican su aplicación para la producción de biomasa con fines farmacológicos. Las mismas, están dadas por la posibilidad de producir grandes cantidades de biomasa en condiciones ambientales controladas en cualquier época de año; mientras que, la cosecha en condiciones de campo se realiza en el segundo año del ciclo de vida de la planta antes de la floración. Además la biomasa producida está libre de contaminantes externos y se obtiene
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Resultados y Discusión
una producción uniforme que garantiza la calidad del compuesto. También el proceso de extracción puede ser más simple, rápido y eficiente comparado con la extracción a partir de plantas cultivadas en condiciones de campo.
Los SIT pueden ser considerados como un sistema modelo para el estudio biosintético de los cardenólidos. Los aspectos que soportan esta afirmación se basan en que proveen un material homogéneo, una producción de biomasa en cantidades considerables y es fácil la adición de precursores o sustancias al medio de cultivo que permitan su estudio.
4.2 Efecto de elicitores en el cultivo de brotes de D. purpurea en medio de cultivo semisólido
A partir de los resultados obtenidos se determinó que la elicitación es una estrategia que influyó en la producción de biomasa y en el contenido de cardenólidos. La adición de elicitores al medio de cultivo de multiplicación, en dependencia de la concentración aplicada, provocó cambios en el crecimiento y el desarrollo de los brotes de D. purpurea. Por su parte, los análisis por HPLC del contenido de cardenólidos revelaron la presencia de compuestos bioactivos en brotes de D. purpurea cultivados en medio de cultivo semisólido. Los elicitores indujeron cambios significativos en la síntesis de cardenólidos con respecto al cultivo sin elicitar y se describen a continuación.
ChitoPlant®
La adición de ChitoPlant® en las concentraciones evaluadas produjo una disminución en la altura de los brotes con respecto al tratamiento control sin elicitar (Figura 13A). Sin embargo, no provocó afectaciones en el número de brotes por explante ni en la masa fresca por frasco, al no observarse diferencias significativas respecto al control sin elicitar ni entre las diferentes concentraciones ensayadas. Contradictoriamente, se observó en la variable masa seca un incremento significativo al emplearse la mayor concentración de ChP (0,1 g.L-1) (Figura 13B), lo que evidencia un mejor desarrollo morfo-fisiológico.
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Resultados y Discusión
Leyenda: control se refiere al cultivo sin elicitar Medias con letras no comunes dentro de cada variable difieren estadísticamente según prueba de Kruskal-Wallis/Mann- Whitney para p<0,05 (n=40 para número de brotes/explante; n=10 para masa seca por frasco)
Figura 13. Efecto del ChitoPlant® en la producción de biomasa de Digitalis purpurea L. (A: altura; B: masa seca/frasco) durante 28 días en medios de cultivo semisólidos.
La adición de ChP en cualquiera de las tres concentraciones ensayadas incrementó el contenido tanto de digoxina como de digitoxina con respecto al control sin elicitar (Figura 14). Sin embargo, entre las concentraciones de ChP evaluadas no se observaron diferencias significativas para el contenido de digoxina ni digitoxina.
Leyenda: control se refiere al cultivo sin elicitar Medias con letras no comunes para cada cardenólido difieren estadísticamente según prueba de Kruskal-Wallis/Mann- Whitney para p<0,05 (n=4)
Figura 14. Efecto de la concentración de ChitoPlant® en el contenido de digoxina y digitoxina (µg.gMS-1) en brotes de Digitalis purpurea L. en medios de cultivos semisólidos a los 28 días de cultivo.
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Resultados y Discusión
El ChP contiene como ingrediente activo la quitosana, un derivado de la quitina, componente que se encuentra en la pared celular de hongos, en insectos y crustáceos (Mathew y Sankar, 2012). La quitosana activa mecanismos de defensa en las plantas estrechamente relacionados con la inducción de resistencia sistémica al ataque de microorganismos (Agrawal et al., 2002). Sin embargo, su efecto en la inducción de metabolitos secundarios no ha sido ampliamente investigado, lo que dificulta la comparación de resultados en otras especies. En el cultivo de órganos, pocos resultados muestran el efecto del ChP en la producción de biomasa y síntesis de metabolitos secundarios.
Como efectos se describe que forma una película semipermeable alrededor de los tejidos de las plantas (El Ghaouth et al., 1994). A su vez, los oligosacáridos como el ChP, han sido descritos como potentes moléculas señales que regulan el crecimiento y desarrollo de las plantas (Sudha y
Ravishankar, 2002). Al respecto, Ait Barka et al. (2004) describieron que a una concentración de
1,75% (v/v) en el medio de cultivo induce un incremento en el desarrollo de los explantes en Vitis vinifera L., pero una concentración de 2,0% (v/v) tuvo un efecto negativo en el cultivo. De manera similar, Kim et al. (2005) observaron un incremento en la altura y la masa fresca de plantas de
Ocimum basilicum L. (17 y 12% respectivamente) así como en el contenido de fenoles y terpenos con concentraciones de quitosana hasta 1,0 g.L-1. Estos resultados muestran que la quitosana provoca un incremento en la biosíntesis de los isoprenoides, aspecto que aplicado a los resultados del presente trabajo, corrobora el incremento del contenido de los cardenólidos ante el ChP como respuesta de defensa de la planta.
En el cultivo de raíces y suspensiones celulares también se describe su efecto aunque con poca frecuencia. Al respecto Cui et al. (2012) refieren el uso de la quitosana en concentraciones desde 10 hasta 200 mg.L-1 en el cultivo de raíces adventicias de Valeriana amurensis Smir. ex Kom. Ninguna de estas concentraciones ejerció un efecto positivo en el incremento de la masa fresca respecto al control. Mientras, una concentración de 50 mg.L-1, provocó un ligero incremento en el contenido de de iridoides. Por su parte, Cai et al. (2011) informaron que el ChP incrementó el contenido de antocianinas y ácidos fenólicos respecto a los niveles detectados en el control sin la inhibición o
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Resultados y Discusión
estimulación del crecimiento celular en V. vinífera. Sin embargo, en el cultivo de suspensiones celulares de varias especies del género Ocimum se informa del efecto positivo sobre el incremento de la biomasa a concentraciones entre 50 y 200 mg.L-1 (Mathew y Sankar, 2012).
SilioPlant®
El aumento de las concentraciones de SilioPlant® afectó el desarrollo de los brotes. El tratamiento donde se empleó la menor concentración del SiP muestra un comportamiento similar al control sin elicitar sin diferencias significativas en las variables evaluadas, excepto para la altura. Esta variable disminuyó con el incremento de las concentraciones ensayadas (Figura 15A). En cuanto al número de brotes por explante, la mayor concentración del SiP provocó una disminución con respecto a los tratamientos evaluados y fue la única que mostró diferencias significativas (Figura 15B). Para las variables masa fresca (Figura 15C) y masa seca por frasco (Figura 15D) se observó un detrimento en las concentraciones de 0,1 y 1,0 g.L-1.
Leyenda: control se refiere al cultivo sin elicitar Medias con letras no comunes dentro de cada variable difieren estadísticamente según prueba de Kruskal-Wallis/Mann- Whitney para p<0,05 (n=40 para altura y número de brotes/explante; n=10 para masa fresca y seca por frasco)
Figura 15. Efecto del SilioPlant® en la producción de biomasa de Digitalis purpurea L. (A: altura; B: número de brotes/explante; C: masa fresca/frasco; D: masa seca/frasco) durante 28 días en medios de cultivo semisólidos.
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Resultados y Discusión
Leyenda: control se refiere al cultivo sin elicitar Medias con letras no comunes para cada cardenólido difieren estadísticamente según prueba de Kruskal-Wallis/Mann- Whitney para p<0,05 (n=4)
Figura 16. Efecto de la concentración de SilioPlant® en el contenido de digoxina y digitoxina (µg.gMS-1) en brotes de Digitalis purpurea L. en medios de cultivos semisólidos a los 28 días de cultivo.
Es de destacar, que a pesar de que todos los tratamientos con SiP incrementaron el contenido de digitoxina en los brotes, se observó una disminución de su contenido con concentraciones mayores que 0,01 g.L-1.
Existen pocos antecedentes sobre la utilización de este elicitor en el cultivo in vitro, aunque el efecto beneficioso del silicio en la nutrición en plantas ha sido extensamente estudiado en condiciones naturales (Epstein, 2001). El silicio es un elemento bioactivo con un marcado efecto positivo en el desarrollo de las plantas, mejora las propiedades mecánicas de los tejidos, reduce la transpiración y además incrementa la resistencia de las plantas frente a organismos patógenos (Fauteux et al., 2005;
Hammerschmidt, 2011). Sin embargo, como reflejan los resultados ninguna de las concentraciones ensayadas provocaron una mejor respuesta que el tratamiento control sin elicitar en cuanto a la producción de biomasa.
En la actualidad se desconoce la naturaleza exacta de la interacción del silicio con las rutas bioquímicas relacionadas con la resistencia en plantas y por consiguiente en la acumulación de metabolitos secundarios asociados a esta. Al respecto, Fauteux et al. (2005) encontró que el silicio
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Resultados y Discusión
actúa en mecanismos comunes para todas las especies de plantas así como en aquellos relacionados con la expresión de genes. Bonilla (2008) refiere que el óxido de silicio se acumula en la pared celular e incrementa su impermeabilidad y resistencia al ataque de patógenos, no solo por constituir una barrera física, sino también por configurar compuestos silico-orgánicos que son muy estables frente a las enzimas de los patógenos.
El efecto positivo del SiP sugiere que este elicitor puede estar asociado con la acumulación de metabolitos secundarios relacionados con los mecanismos de defensa en plantas como los cardenólidos. Resultados similares han sido descritos por Fawe et al. (1998) en la acumulación de fitoalexinas en Cucumis sativus L. Sin embargo, no existen ejemplos alentadores que contribuyan a dilucidar su acción en el incremento de cardenólidos.
Metil jasmonato
El metil jasmonato provocó un marcado efecto negativo en todas las variables evaluadas independientemente de las concentraciones estudiadas con diferencias significativas respecto al control (Figura 17). Al respecto, Howe (2004) afirma que uno de los efectos más notables de los jasmonatos exógenos es la inhibición del crecimiento. Crozier et al. (2000) describe al MJ como un promotor de la senescencia o retardador del crecimiento en diversas especies como Artemisia absinthium L., Vicia faba L. y Phaseolus vulgaris L.
Además, en los primeros días de cultivo en los tratamientos con MJ los ápices de los brotes tenían una coloración violeta rojo pálido (código hex: #DB7093) y a los 28 días las hojas mostraban una coloración verde pálido (código hex: #98FB98) similar al color de plantas con clorosis (Figura 18).
Esto indica, según Howe (2004) y Zacarías y Lafuente (2008), que la aplicación del MJ provoca una disminución en la expresión de los genes involucrados en la fotosíntesis y una reducción en el contenido de clorofila en las hojas de las plantas.
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Resultados y Discusión
Leyenda: control se refiere al cultivo sin elicitar Medias con letras no comunes dentro de cada variable difieren estadísticamente según prueba de Kruskal-Wallis/Mann- Whitney para p<0,05 (n=40 para altura y número de brotes/explante; n=10 para masa fresca y seca por frasco)
Figura 17. Efecto del metil jasmonato en la producción de biomasa de Digitalis purpurea L. (A: altura; B: número de brotes/explante; C: masa fresca/frasco; D: masa seca/frasco) durante 28 días en medios de cultivo semisólidos.
Figura 18. Efecto del metil jasmonato en el cambio de coloración de brotes de Digitalis purpurea L. en medio de cultivo semisólido a los 28 días de cultivo.
Los metabolismos primario y secundario comparten rutas y precursores, en los cuales la utilización de fuentes nutricionales disponibles como el carbono y el nitrógeno dependen en parte de la
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Resultados y Discusión
presencia de un grado de estrés que afecten a las plantas (Tisserat y Vaughn, 2008). Este estrés puede ser ocasionado por elicitores, los cuales pueden activar rutas metabólicas que dan origen a los metabolitos secundarios, por lo que la planta desvía parte del material del metabolismo primario para estos fines. Por esta razón, las plantas bajo tratamiento con elicitores pueden mostrar cambios morfológicos como disminución o detención del crecimiento. Este efecto supresor en el metabolismo primario ha sido descrito para el ácido jasmónico por Coste et al. (2011) en el cultivo de brotes de
Hypericum hirsutum L. e Hypericum maculatum Crantz. De igual manera, Hu et al. (2011) informaron de la reducción de la biomasa por el efecto del MJ en el cultivo de suspensiones celulares de Fagopyrum esculentum L.
La adición de MJ en las concentraciones ensayadas indujo variaciones en el contenido de digoxina y digitoxina (Figura 19). La mayor concentración (0,022 g.L-1) provocó un incremento en el contenido de ambos cardenólidos con diferencias significativas respecto al control. El incremento de la digitoxina fue más notable (37 µg.gMS-1) y difirió significativamente con el resto de las concentraciones evaluadas. No obstante, este incremento no es marcado si se tiene en cuenta que los restantes elicitores evaluados mostraron un incremento mayor. Mientras, el mayor valor de digoxina se alcanzó en el tratamiento con 0,018 g.L-1 (9,4 µg.gMS-1) con diferencias significativas respecto al resto de los tratamientos, que equivale a un aumento de 3,3 veces con respecto al control. Estos resultados indican que el MJ podría influir diferencialmente en las enzimas asociadas a la producción de cardenólidos.
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Resultados y Discusión
Leyenda: control se refiere al cultivo sin elicitar Medias con letras no comunes para cada cardenólido difieren estadísticamente según prueba de Kruskal-Wallis/Mann- Whitney para p<0,05 (n=4)
Figura 19. Efecto de la concentración de Metil jasmonato en el contenido de digoxina y digitoxina (µg.gMS-1) en brotes de Digitalis purpurea L. en medios de cultivos semisólidos a los 28 días de cultivo.
El efecto de los jasmonatos en el incremento de un metabolitos y el detrimento de otro, aspecto observado en la investigación, ha sido señalado por Coste et al. (2011). Los autores observaron un incremento en la acumulación de hipericina y una disminución de hiperforina en el cultivo de brotes de H. hirsutum.
La inducción de metabolitos secundarios es uno de los efectos del MJ comúnmente observado (Kim et al., 2007; Hu et al., 2011; Mathew y Sankar, 2012). Autores como Gundlach et al. (1992) demostraron el papel del ácido jasmónico y sus derivados en la señalización en cascada intracelular que comienza con la interacción del elicitor con la superficie del tejido y que finalmente resulta en un incremento en la acumulación de metabolitos secundarios. En su investigación, estos autores describen que la inducción por el jasmonato no parece ser específica para un tipo de metabolito, sino que influye de manera general en un amplio espectro de sustancias de bajo peso molecular tales como flavonoides, antraquinonas y varias clases de alcaloides. Al respecto Choi et al. (2005) y Bae et al.
(2006) han descrito su efecto positivo en la biosíntesis de ginsenósidos.
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Resultados y Discusión
Por su parte, Kim et al. (2009) indujeron cambios en el contenido de ginsenósidos en el cultivo de raíces de Panax ginseng C.A. Meyer, mediante la elicitación con el MJ y analizaron la expresión de los genes relacionados con la ruta biosintética de estos metabolitos. Estos autores concluyeron que la elicitación con el MJ permitió el estudio del metabolismo de los ginsenósidos y que en el futuro será posible manipular la ruta de los mismos si se esclarecen los genes asociados con los procesos de hidroxilación y glicosilación.
Similar a estos resultados, Chong et al. (2005) lograron una respuesta marcadamente distinta entre las suspensiones celulares de M. elliptica elicitadas con ácido jasmónico y el control sin elicitar independientemente de las concentraciones evaluadas. Concentraciones hasta 100 µM de MJ han sido empleadas frecuentemente para el incremento de metabolitos de interés (Korsangruang et al.,
2010). Mientras Veerashree et al. (2012) mostró resultados negativos en la producción de biomasa y metabolitos secundarios a 200 µM de MJ en suspensiones celulares de Gymnema sylvestre R.Br. En su investigación obtuvieron un alto contenido de ácido gymnémico después de 15 días de elicitación con 50 µM de MJ. En investigaciones previas, Hu y Zhong (2008) informaron un incremento en el contenido total de saponinas en el cultivo de suspensiones celulares de Panax notoginseng elicitadas con MJ.
Haciendo un análisis general, tanto de la producción de masa seca como del contenido de cardenólidos (digoxina y digitoxina) (Tabla 13), los mejores resultados integrales en cuanto a producción neta de estos compuestos se alcanzaron en el tratamiento con 0,01 g.L-1de SiP, en el cual se logra un rendimiento neto por frasco de cultivo de 4,72 µg de digoxina y 88,27 µg de digitoxina.
El segundo mejor resultado se obtuvo en el tratamiento con 0,1 g.L-1 de ChP, que alcanzó una producción neta por frasco de cultivo de 4,95 µg de digoxina y 36,88 µg de digitoxina.
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Resultados y Discusión
Tabla 13. Efecto de elicitores en la producción neta por frasco de cultivo de digoxina y digitoxina en brotes de Digitalis purpurea L. cultivados en medios de cultivo semisólidos durante 28 días. Tratamientos Digoxina (µg) Digitoxina (µg) Control sin elicitar 1,12 10,84 ChitoPlant® 0,001 g.L-1 2,92 18,55 ChitoPlant® 0,01 g.L-1 2,46 28,55 ChitoPlant® 0,1 g.L-1 4,95 36,88 SilioPlant® 0,01 g.L-1 4,72 88,27 SilioPlant® 0,1 g.L-1 2,86 29,20 SilioPlant® 1,0 g.L-1 1,14 24,70 Metil Jasmonato 0,014 g.L-1 1,12 5,38 Metil Jasmonato 0,018 g.L-1 2,92 5,94 Metil Jasmonato 0,022 g.L-1 2,12 11,83
Estos resultados muestran claramente que el tipo y el contenido de los cardenólidos dependen de la concentración y del elicitor utilizado en el cultivo de brotes de D. purpurea. Este aspecto ha sido señalado por autores como Ruiz-May et al. (2009) quienes describieron que el tipo de alcaloides y su acumulación en el cultivo de raíces de Catharanthus roseus L. estuvieron relacionados con ambos factores.
La acumulación de metabolitos secundarios en plantas es considerada como una respuesta de defensa al ataque de patógenos, la cual es activada por elicitores que actúan como compuestos de señalización de las respuestas de defensa en plantas (Namdeo, 2007; Pawar et al., 2011). En Digitalis se conoce que la síntesis de cardenólidos ocurre como un mecanismo de defensa de la planta ante el ataque de insectos (Wink, 2010). Esto hace que sea posible incrementar la biosíntesis de cardenólidos mediante ciertos factores que causen estrés e induzcan mecanismos de defensa como los elicitores.
Los elicitores han sido efectivos para el incremento de la biosíntesis de metabolitos secundarios en varias especies de plantas en diferentes sistemas de cultivo, como suspensiones celulares
(Korsangruang et al., 2010; Pawar et al., 2011; Veerashree et al., 2012); raíces (Kim et al., 2009;
Sakunphueak y Panichayupakaranant, 2010) así como en brotes y plantas (Kim et al., 2004; Orlita et al., 2008; Coste et al., 2011).
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Resultados y Discusión
Las investigaciones realizadas para evaluar el efecto de los elicitores en la producción de metabolitos secundarios han sido realizadas, principalmente, en cultivos de suspensiones celulares y con menor frecuencia el cultivo de callos y órganos, por lo que este constituye uno de los pocos trabajos en que se ha aplicado la elicitación en el cultivo de brotes para la producción de metabolitos secundarios.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo demuestran que con la adición de 0,1 g.L-1 ChP y 0,01 g.L-1 SiP en el medio de cultivo es posible incrementar la síntesis y acumulación de cardenólidos en brotes de D. purpurea.
En la ruta biosintética de los cardenólidos se han descrito enzimas y genes que codifican para estas.
Sin embargo, aún no se han descrito todos los pasos que rigen esta ruta. La progesterona 5β reductasa es la primera enzima estereoespecífica en la posible ruta biosintética de los cardenólidos según estudios realizados por Gärtner et al. (1990). Hasta el momento, es la única enzima de las descritas que aparece exclusivamente en el cultivo de brotes. Sin embargo, estudios recientes demostraron la existencia de un segundo gen que codifica para una proteína con esta actividad enzimática en D. purpurea: P5βR2 con patrones de expresión diferentes (Pérez-Bermúdez et al., 2010). En su investigación, estos autores demostraron que es un gen relacionado con los mecanismos de defensa en plantas y que además está involucrado en la biosíntesis de cardenólidos. Contrario al P5βR que muestra expresión constitutiva en hojas de D. purpurea, el gen P5βR2 es altamente inducible ante estrés térmico (altas y bajas temperaturas), estrés salino y daños mecánicos. Estos autores lograron la mayor expresión del gen P5βR2 en plantas dañadas mecánicamente y fue correlacionada con el incremento en la biosíntesis de cardenólidos. Sus resultados les permitieron sugerir que su expresión parece estar regulada por el etileno puesto que encontraron la mayor acumulación de transcriptos en plantas tratadas con el 1-aminociclopropano-1-ácido carboxílico, mientras que la expresión de P5βR2 fue independiente del MJ.
Por otra parte, otros trabajos señalan que VEP1 (del inglés: vein patterning 1), el gen ortólogo de
P5βR y P5βR2 en Arabidopsis thaliana L., está asociado con la morfogénesis de los tejidos foliares
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Resultados y Discusión
(Jun et al., 2002), lo cual sugiere que esta actividad enzimática pudiera también estar asociada a otros procesos fisiológicos en Digitalis, en adición a su papel en la biosíntesis de cardenólidos.
Teniendo en cuenta las valoraciones realizadas por Pérez-Bermúdez et al. (2010) sobre el efecto del
MJ en genes relacionados con la ruta biosintética de los cardenólidos, es posible que el incremento de estos con el MJ pudo deberse a la interacción sinérgica entre el etileno y el jasmonato y no como resultado del efecto aislado del MJ. Para ambos se ha descrito su contribución significativa a la resistencia contra herbívoros (Onkokesung et al., 2010). Los mecanismos de defensa en plantas están interconectados por una compleja red de rutas de señalización de hormonas (ácido jasmónico, etileno, ácido salicílico) (Pieterse et al., 2009; Mejía-Teniente et al., 2010). Estas rutas responden a condiciones de estrés o a elicitores, que modulan la biosíntesis de compuestos de defensa como un resultado combinado de las acciones múltiples de señalización (Zhao et al., 2005).
Aunque se han considerado muchas hipótesis sobre los mecanismos de acción de los elicitores, aún es necesario el estudio de los mismos. Los elicitores, a una concentración apropiada, pueden actuar como moléculas de señalización, las cuales son percibidas por un receptor presente en la membrana plasmática y que inicia la señal de transducción. De esta manera, involucra la expresión de genes y la activación de rutas metabólicas involucradas en la biosíntesis del compuesto deseado. Al respecto,
Orlita et al. (2008) consideraron que debido al poco conocimiento de las rutas de biosíntesis de los metabolitos secundarios, el efecto de un elicitor en el cultivo de células o de tejidos no es predecible.
Por su parte, Vasconsuelo y Boland (2007) plantearon que la biosíntesis de compuestos puede estar relacionada con los niveles de estrés en el cultivo, incluyendo la efectividad de cada elicitor. Sin embargo, la elicitación depende de varios efectos como la concentración del elicitor, el tiempo y momento de la elicitación (Coste et al., 2011). Al respecto, Bhagwath y Hjortso (2000) utilizaron un diseño factorial donde incluyeron la concentración del elicitor, la edad del cultivo y el tiempo de exposición para la producción de metabolitos secundarios en el cultivo de raíces de Ambrosia artemissifolia L. y notaron que la mayoría de los métodos de elicitación son empíricos.
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Resultados y Discusión
En el caso específico de las especies de Digitalis, hay limitada información acerca de la acumulación de cardenólidos mediante el uso de elicitores en el cultivo in vitro. En la literatura científica consultada solo existe una investigación desarrollada en D. lanata. Ghanem et al. (2010) describe el estudio de elicitores como el ácido salicílico, el extracto de levadura y el cloruro de calcio. Este
último elicitor incrementó el contenido total de cardenólidos 2,9 veces comparado con las plantas no elicitadas. Los autores además, determinaron el perfil proteico y encontraron diferencias mediante el análisis de electroforesis entre las plantas tratadas con los elicitores estudiados y el control.
La mayoría de las investigaciones con el objetivo de incrementar el contenido de cardenólidos han estado encaminadas al empleo de estrategias como las variaciones de las condiciones de cultivo y la composición del medio de cultivo. Tal es el caso de Hagimori et al. (1983) y Gavidia y Pérez-
Bermúdez (1997) que desarrollaron extensas investigaciones en la influencia de los nutrientes minerales en la producción de cardenólidos. Ohlsson y Berglund (1989) refirieron que altos niveles de sulfato de magnesio en el cultivo de células de D. lanata incrementaron el contenido de cardenólidos en la oscuridad. De igual manera, Cacho et al. (1999) mediante la eliminación del calcio en el medio de cultivo provocaron el mayor incremento de cardenólidos con el empleo de la luz contínua. Por su parte, Gurel et al. (2010) obtuvieron un alto contenido de digoxina en brotes regenerados de D. davisiana en el medio de cultivo descrito por Linsmaier y Skoog (1965) y obtuvieron 12 µg.gMS-1 de digoxina.
Un aspecto crítico a tener en consideración es el almacenamiento en vacuolas de los metabolitos secundarios (Peters y Croteau, 2004). Es posible que estos elicitores modulen la expresión de moléculas del metabolismo primario involucrado en el transporte a vacuolas y de esta manera regule los niveles de cardenólidos. Por otra parte, las acetiltransferasas y glucosiltransferasas (Kreis et al.,
1986; Kandzia et al., 1998) juegan importantes roles en la ruta biosintética de los cardenólidos y podría especularse que el ChP y en mayor medida el SiP, promovieran la glucosilación y la acetilación provocando un incremento en el contenido de los cardenólidos, aunque se requiere de nuevos experimentos para probar esta hipótesis.
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Resultados y Discusión
En cuanto a la efectividad de la elicitación en el tiempo se requieren nuevos estudios. La optimización del elicitor y demás condiciones de cultivo pueden incrementar la producción de cardenólidos. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos hasta el momento es posible pensar en la combinación de un elicitor y el empleo de los SIT con el objetivo de incrementar la producción de cardenólidos. Como estrategia para estimular la síntesis de metabolitos secundarios, la elicitación ha tenido una marcada aplicación comercial en los últimos años (Savitha et al., 2006). A esto se le adiciona, las ventajas de los SIT que son obvias para este propósito además de permitir la variación de las condiciones de cultivo y que los elicitores sean añadidos fácilmente al medio de cultivo.
Además podría permitir el estudio de genes relacionados con la biosíntesis de cardenólidos mediante la evaluación de la expresión de los mismos ante el efecto del elicitor. El simultáneo empleo de estas dos estrategias, puede ser una variante muy atractiva para la biosíntesis y acumulación de cardenólidos en brotes de D. purpurea, la cual deberá ser objeto de estudio en el futuro.
A pesar de los incrementos obtenidos, específicamente con el SiP, aún los mecanismos que regulan la síntesis de cardenólidos y que evidentemente son alterados mediante la elicitación se desconocen. Es por esto, que se requieren nuevos estudios relacionados con la ingeniería genética y metabólica, para lo cual es imprescindible un protocolo de transformación genética para la especie, que hasta la fecha no existe.
4.3 Transformación genética de D. purpurea mediada por A. tumefaciens
4.3.1 Determinación de la concentración mínima letal del agente selectivo
Se observó una respuesta diferencial de los explantes cultivados en las distintas concentraciones de geneticina (G-418) estudiadas. En las primeras 48 horas comenzaron a aparecer los primeros síntomas en los tratamientos con 50, 60, 70 y 80 mg.L-1, con pequeñas zonas cloróticas en los bordes externos y después de una semana esta decoloración se extendió, cubriendo todo el explante en las mayores concentraciones. En estos tratamientos los explantes tenían aspecto necrótico al cabo de las cuatro semanas de cultivo. En el control no tratado con G-418 y en 30 mg.L-1, todos los explantes formaron callos transcurrido este tiempo. El número de explantes con callos y el número de callos
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Resultados y Discusión
por explante se redujo al 53,3% y 2,13 respectivamente cuando se empleó una concentración de 40 mg.L-1 (Figura 20) pero solo en las mayores concentraciones (70 y 80 mg.L-1) no se observó la formación de callos.
Medias con letras no comunes para cada variable difieren estadísticamente según prueba de Kruskal-Wallis/Mann-Whitney para p<0,05 (n=6 para % explantes que formaron callos y n=300 para la variable número de callos por explante)
Figura 20. Efecto de la concentración de G-418 en los segmentos foliares de Digitalis purpurea L. durante la formación de callos a los 28 días de cultivo.
Los protocolos descritos para la transformación genética de plantas generalmente incluyen el uso de genes marcadores de selección (Deo et al., 2010). Tal es el caso del gen nptII que codifica para la neomicina fosfotransferasa II. Esta enzima detoxifica los antibióticos aminoglicósidos como la geneticina (G-418) por fosforilación, permitiendo el crecimiento celular en presencia del antibiótico.
La geneticina ha sido empleada como agente selectivo en diferentes sistemas de transformación genética. Su estructura le confiere mayor efectividad como inhibidor de la síntesis de proteínas en eucariotas comparado con otros aminoglicósidos como las kanamicinas A y B y la gentamicina B
(Padilla y Burgos, 2010). En la literatura se describe su empleo en especies como Saccharum officinarum L. (Elliott et al., 1998); Sorghum bicolor L. (Tadesse et al., 2003); Castanea dentata
(Marshall) Borkh (Andrade et al., 2009); Triticum aestivum L. (Fahim et al., 2010; Xue et al., 2011);
Brassica napus L. (Boszoradova et al., 2011); Musa spp. (Chong-Pérez et al., 2012) y Oryza sativa
L. (Nandy y Srivastava, 2012).
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Resultados y Discusión
Concentraciones bajas de G-418 (10 mg.L-1) fueron efectivas para inhibir la regeneración de brotes no transformados de Citrus aurantifola Swing (Peña et al., 1997). Además este antibiótico ha sido utilizado para la selección de células transformadas de Musa spp. en concentraciones de 50 mg.L-1
(Pérez-Hernández et al., 2006; Chong-Pérez et al., 2012). También en el género Musa, Sreeramanan et al. (2006) informan el empleo de G-418 en brotes, logrando el 100% de mortalidad de los brotes con 100 mg.L-1 en medio de cultivo semisólido y 50 mg.L-1 en medio de cultivo líquido como concentraciones mínimas letales.
Dichas investigaciones muestran la diversidad en las concentraciones mínimas letales de la G-418 donde la susceptibilidad del tejido al antibiótico está en dependencia de las especies, genotipos empleados así como del tipo de explante, estado físico del medio y las etapas de cultivo que se desarrollan en un protocolo para la transformación genética (Padilla y Burgos, 2010).
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos se determinó que, para el proceso de formación de callos a partir de segmentos de hojas de plantas de D. purpurea cultivadas in vitro, la concentración mínima letal de geneticina (G-418) es 70 mg.L-1.
4.3.2 Transformación genética
A los cinco días después de la inoculación con ambas cepas A. tumefaciens, se observó en los segmentos foliares de D. purpurea la actividad transitoria de la β-glucuronidasa. No se detectaron diferencias significativas entre ambas cepas en cuanto a la cantidad de puntos y manchas azules
(Tabla 14). Para ambas cepas se detectaron amplias zonas del tejido vegetal teñidas de azul y pequeños puntos (Figura 21). Este patrón mostrado es atípico, quizás sea resultado de una super- infección o una respuesta propia de la especie ante la infección. Además, se observaron explantes que mostraron puntos en las zonas de corte (bordes del segmento foliar), un patrón comúnmente observado en protocolos de transformación genética que utilizan este tipo de explante. Contrario a estos resultados, Akbulut et al. (2008) informaron que explantes inoculados con la cepa C58C1RifR
(pMP90) mostraron mayor actividad transitoria que aquellos inoculados con la EHA105 en la transformación genética de Cicer arientinum L.
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Resultados y Discusión
Tabla 14. Actividad transitoria de la β-glucuronidasa en segmentos de hojas de Digitalis purpurea L., cinco días después de la inoculación con dos cepas de Agrobacterium tumefaciens. Se relaciona el promedio de puntos y manchas azules en cada caso. Puntos Manchas*
Cepas-plasmidio Medias Rangos Medias Rangos medios medios EHA105-pTJK136 14,5 65,93 4,8 56,57 C58C1RifR (pMP90)-pTJK136 9,5 55,07 5,7 64,43
*Se definen como manchas las zonas mayores de 2 mm de diámetro Resultados no muestran diferencias significativas para p<0,05
Figura 21. Actividad transitoria de la β-glucuronidasa en segmentos de hojas de Digitalis purpurea L. a los cinco días de la inoculación con dos cepas de A. tumefaciens, ambas con el plasmidio pTJK136.
La evaluación de la actividad transitoria es un parámetro que difiere en cuanto a la manera en la que se realiza. En otras investigaciones, esta se ha evaluado mediante el conteo de puntos y manchas azules (De Clercq et al., 2002), por conteo de zonas teñidas en general (De Bondt et al., 1994) u otros métodos (Charest et al., 2004). En este caso, además, resulta imposible comparar la eficiencia de transformación mediante la evaluación de la actividad transitoria descrita en otros trabajos en el género Digitalis debido a que esta no fue determinada en el protocolo de transformación de D. minor, el único publicado hasta la fecha (Sales et al., 2003). De los resultados obtenidos puede concluirse que los niveles de actividad transitoria observados son aceptables.
La expresión transitoria de los transgenes durante un protocolo para la transformación genética mediado por A. tumefaciens es un indicativo de la eficiencia del sistema. Esto se debe a que este implica la transferencia del ADN-T al núcleo, la conversión de la simple cadena del ADN-T a la
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Resultados y Discusión
forma de doble cadena competente para la transcripción y la expresión de los transgenes a partir de las moléculas de ADN-T no integradas (Gelvin y Kim, 2007). Por tanto, la expresión transitoria del gen uidA no siempre implica la integración del ADN-T al genoma de la planta (Gelvin y Kim, 2007).
Durante las dos primeras semanas en el proceso de selección con G-418 en los explantes no transformados no se observó formación de callos, lo que corrobora la efectividad de la concentración mínima letal determinada para dicho antibiótico. Los segmentos de hojas no transformados cultivados sin presión de selección formaron callos confirmando los resultados del acápite anterior.
Sin embargo, en los explantes inoculados con ambas cepas se observó la formación de callos aislados o en pequeños grupos.
A las cuatro semanas, los controles no transformados mantuvieron la respuesta observada a las dos semanas. Un mayor porcentaje de explantes inoculados con la cepa C58C1RifR (pMP90) formaron callos respecto a los inoculados con la EHA105 con diferencias significativas (Tabla 15). Al mismo tiempo, un resultado similar se obtuvo al analizar la cantidad de callos formados por explante inoculados con cada cepa. Estos resultados contrastan con los obtenidos en la evaluación de la actividad transitoria de la β-glucuronidasa.
Para evitar posibles escapes se mantuvo la selección durante cuatro semanas más, aunque en ese momento no fue posible evaluar el número de callos por explante debido al solapamiento que se produce por el crecimiento de los mismos (Figura 22A). Además, se observó la efectividad del proceso de selección con G-418 (Figura 22B) y de las cepas en el proceso de transformación de D. purpurea a partir de segmentos de hojas (Figura 22C y D).
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Resultados y Discusión
Tabla 15. Formación de callos a partir de segmentos de hojas de Digitalis purpurea L. en el proceso de transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens, a los 28 días de inoculados. Explantes con callos N. callos/explante N. de (%) evaluado Tratamientos explantes Medias Rangos Medias Rangos evaluados medios medios Control + 40 100 11 a 43,4 216,50 a Control - 38 0 2 d 0 58,50 d EHA105-pTJK136 83 33,7 5 c 1,0 82,79 c C58C1RifR (pMP90)-pTJK136 75 69,3 8 b 10,7 136,15 b Leyenda: Control +: explantes no transformados, Control -: explantes no transformados en medio de cultivo selectivo con 70 mg.L-1 de G-418. Medias con letras no comunes para cada variable difieren estadísticamente según prueba de Kruskal-Wallis/Mann-Whitney para p<0,05 (El valor del número de explantes evaluados representa el total de tres repeticiones)
Figura 22. Segmentos foliares de Digitalis purpurea L. a las ocho semanas de cultivo. A: explantes no inoculados (Control +), B: explantes no inoculados cultivados en medio de cultivo selectivo con 70 mg.L-1 de G-418 (Control -), C y D: explantes inoculados con las cepas EHA105-pTJK136 y C58C1RifR(pMP90)-pTJK136 respectivamente en medio de cultivo selectivo.
En el ensayo histoquímico de la β-glucuronidasa en callos se observó la expresión estable del gen uidA (Figura 23) en los 10 fracciones de callos evaluados para cada cepa. Este resultado es un indicador de la inserción estable del ADN-T en el genoma de las células de D. purpurea.
Figura 23. Actividad estable de la β-glucuronidasa en callos de Digitalis pupurea L. formados a las ocho semanas en selección con 70 mg.L-1 de G-418 a partir de segmentos foliares inoculados con la cepa C58C1RifR (pMP90)-pTJK136.
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Resultados y Discusión
Respecto a las diferencias entre eficiencias transitoria y estable, De Bondt et al. (1994) encontraron diferencias entre estas durante la transformación del manzano (Malus x domestica Borkh.). Los autores las atribuyen a que ambos fenómenos dependen de condiciones esencialmente diferentes. La expresión transitoria depende de la adquisición del ADN-T donde se encuentra el gen codificante para la β-glucuronidasa como se explicó anteriormente, mientras que la estable depende de la integración funcional del ADN-T en el genoma hospedero. Sin embargo, Song et al. (2012) no encontraron diferencias significativas en la actividad transitoria ni en la estable entre las cepas de A. tumefaciens evaluadas (nopalina, succinamopina y octopina) en la transformación genética de
Brassica napus L.
Teniendo en cuenta que la densidad de inóculo de cada cepa de A. tumefaciens para la transformación de los explantes fue la misma, es posible asegurar que la diferencia en el número de explantes que formaron callos debe estar relacionada con la virulencia de las cepas y la interacción específica con el hospedero, aspectos que han sido referidos por varios autores (Maheshwari et al., 2011; Chetty et al.,
2012).
Las cepas de A. tumefaciens empleadas en la investigación tienen el mismo fondo genético cromosomal correspondiente a la cepa ambiental C58, por lo que la diferencia de virulencia entre ambas está determinada por el plasmidio auxiliar pTiBo542 que contiene los genes vir (Lee y Gelvin
2008). Esto le atribuye la condición de súper-virulenta a la cepa EHA105.
En algunas especies, cepas más virulentas incrementan la eficiencia de la transformación (Nadolska-
Orczyk y Orczyk, 2000). Al respecto, Tiwari y Tuli (2012) informaron la alta eficiencia de transformación de Arachis hypogaea L. obtenida con la cepa EHA101 en comparación con cepa menos virulenta LBA4404. Mientras, en otros procesos de transformación ocurre lo contrario como muestran los resultados obtenidos en la presente investigación con la cepa EHA105. Liu et al. (2012) informaron la baja eficiencia de transformación obtenida en el protocolo descrito para Camelina sativa L. con la cepa EHA105. En general, este último efecto puede ocurrir debido a la muerte de la célula vegetal por la infección con cepas “súper-virulentas” que inducen una respuesta necrótica en
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Resultados y Discusión
algunas especies de plantas, como se ha observado en A. thaliana y Nicotiana tabacum L.
(Wroblewski et al., 2005).
Estas variaciones son causadas por las diferencias en la habilidad que poseen las células bacterianas de adherirse a las células de la planta. Además podría deberse a las diferencias en los mecanismos de transferencia del ADN-T de la bacteria o a la respuesta del hospedero ante la infección bacteriana
(Deo et al., 2010).
Regeneración de plántulas
En cuanto a la regeneración de plántulas se observó una marcada diferencia a favor de C58C1Rif R
(pMP90). Sólo 24 líneas fueron regeneradas a partir de los explantes inoculados con la EHA105, en comparación con las 518 líneas regeneradas a partir de los inoculados con la C58C1RifR (pMP90).
Esto representa una diferencia significativa de acuerdo a la cantidad de líneas regeneradas por explante inoculado con las cepas EHA105 y C58C1RifR (pMP90) (0,29 y 6,91 respectivamente)
(Tabla 16). Estos valores muestran la eficiencia de transformación obtenida con ambas cepas de A. tumefaciens. En el control no transformado sin presión de selección la regeneración se evaluó a partir de 20 callos seleccionados al azar y se obtuvo un promedio de 18 líneas por explante. Sales et al.
(2003) obtuvieron 22 líneas transgénicas a partir de 178 explantes inoculados en el primer y único protocolo descrito para el género Digitalis (especie D. minor L.). Este protocolo se desarrolló a partir de discos de hojas inoculados con A. tumefaciens con la cepa EHA105-p35SGUSINT.
Tabla 16. Efecto de las cepas EHA105-pTJK136 y C58C1RifR (pMP90)-pTJK136 de A .tumefaciens en la regeneración y eficiencia de transformación en líneas de Digitalis purpurea L. Líneas regeneradas/ Ensayo GUS N. de Total líneas explante inoculado Líneas + (%) Tratamientos explantes regeneradas inoculados Medias Rangos Medias Rangos medios medios EHA105-pTJK136 83 24 0,29 56,41 b 58,5 2,67 a
C58C1RifR 75 518 6,91 105,05 a 62,3 4,33 a (pMP90)-pTJK136 Medias con letras no comunes para cada variable difieren estadísticamente según prueba de Mann-Whitney para p<0,05
En cuanto al ensayo histoquímico GUS, no hubo diferencias significativas para el número de líneas regeneradas que mostraron expresión del gen uidA (expresado en %). Como se observa, no todas las
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Resultados y Discusión
líneas regeneradas mostraron actividad de la β-glucuronidasa y esto pudo deberse a diversas razones
(i) las plántulas no son transgénicas, (ii) el ADN-T insertado está truncado (iii) el gen uidA está silenciado. La figura 24 muestra la expresión estable del gen uidA en brotes regenerados a partir de callos y plántulas completas.
Figura 24. Actividad estable de la β-glucuronidasa en brotes regenerados a partir de callos (A) y plántulas regeneradas (B) obtenidas del proceso de transformación genética de D. purpurea con la cepa C58C1RifR (pMP90) de Agrobacterium tumefaciens.
La regeneración de líneas a partir de los callos se realizó en medio de cultivo sin agente selectivo para que este no interfiera en el proceso, por lo que las células no transformadas presentes en los callos pudieron dar lugar a plántulas durante el proceso de regeneración. Es posible, que las células transformadas contribuyan a la degradación del agente selectivo permitiendo que las células no transformadas adyacentes se expongan a niveles subletales del mismo y por tanto puedan proliferar
(Padilla y Burgos, 2010). Teniendo en cuenta este fenómeno, pudiera ser conveniente emplear el agente selectivo durante la regeneración.
Otro aspecto al cual pudo deberse que aproximadamente el 40% de las líneas regeneradas a partir de los explantes inoculados con ambas cepas no mostraran actividad estable de la β-glucuronidasa, es la ocurrencia de inserciones incompletas del ADN-T en los protocolos de transformación mediados por
Agrobacterium descritos por Gelvin (2003). Un último aspecto se refiere al efecto del silenciamiento de los transgenes. Entre las causas que lo originan está la alta homología de las secuencias
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Resultados y Discusión
reguladoras (Li et al., 2012); el sitio de integración del ADN-T en el genoma de la planta, por ejemplo la heterocromatina; la configuración del ADN-T integrado que incluye la repetición de transgenes que crean localmente una heterocromatina y la disposición de transgenes que pueden inducir los procesos secuencia-específicos de degradación del ARN de genes endógenos o de transgenes (Domínguez et al., 2002). El silenciamiento puede ocurrir a nivel transcripcional o post- transcripcional. En el primer caso, está asociado a promotores metilados e inactivos así como a las estructuras de cromatina condensadas (Vaucheret y Fagard, 2001; Melander et al., 2006). En el segundo, el gen es apropiadamente transcripto pero el ARNm es rápidamente degradado en una manera dependiente de la homología (Melander et al., 2006). Estos factores pueden anular la expresión de los transgenes reporteros en líneas transformadas.
Por otra parte, se ha relacionado la expresión transitoria con la obtención de transformantes estables.
Al respecto, Komari et al. (2004) refiere que los transformantes estables nunca se han obtenido eficientemente bajo condiciones en los que la expresión transitoria ha sido limitada. En Oryza sativa
L., las condiciones que favorecen un alto nivel de expresión de los marcadores después del co-cultivo están generalmente asociadas con una alta frecuencia en la obtención de transformantes estables
(Hiei et al., 1994). En el caso del maíz (Zea mays L.) se determinaron con gran facilidad condiciones favorables para un alto nivel de expresión transitoria, sin embargo, se obtuvo un bajo número de transformantes estables (Ishida et al., 1996).
De cualquier manera, la incidencia de líneas GUS-positivas es un indicativo del porcentaje de líneas transformadas con transgenes funcionales, dentro del total de líneas regeneradas. En relación a esto,
Tripathi et al. (2012) informaron que todas las líneas de Musa spp. regeneradas mostraron expresión estable del gen uidA y a su vez corroboraron la no presencia de escapes en su proceso de transformación genética mediado por A. tumefaciens. Tiwari y Tuli (2012) señalan al ensayo histoquímico GUS como un análisis simple pero eficiente para la identificación de plántulas transgénicas de A. hypogaea.
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Resultados y Discusión
4.3.3 Análisis moleculares de las líneas regeneradas
A partir de los resultados anteriores, se seleccionaron al azar 14 líneas regeneradas de la transformación con la cepa EHA105 de A. tumefaciens. De ellas, 10 líneas habían resultado positivas al ensayo GUS y cuatro negativas. De igual manera se seleccionaron 86 líneas provenientes de la transformación con la cepa C58C1RifR (pMP90), de ellas 65 GUS positivas y 21 negativas. En el
ADN genómico de cada una de ellas se determinó la presencia de los transgenes uidA y nptII por
PCR.
En la figura 25 se observa una muestra de los resultados alcanzados en el PCR. En las 14 líneas transformadas con la cepa EHA105 se detectó la presencia de los genes uidA y nptII. En las 65 líneas
GUS-positivas transformadas con la cepa C58C1RifR (pMP90) se detectó la presencia de ambos genes y de las 21 GUS-negativas solo en cuatro líneas no se detectó la presencia de ninguno de los genes, lo que representa un 4,6% de escapes del total de líneas analizadas para la C58C1RifR
(pMP90). De las GUS-negativas, en una de ellas (Figura 25, carril 5) se detectó la presencia de nptII y no del gen uidA. Este resultado indica que el ADN-T insertado en esta línea está truncado dando lugar a una transgénesis incompleta.
Se confirmó mediante el análisis de hibridación de Southern la presencia del gen nptII en nueve líneas positivas al PCR seleccionadas al azar (Figura 26). Además se determinó el número de copias insertadas en estas líneas. De ellas, siete dieron lugar a una sola banda de hibridación mientras que dos líneas dieron lugar a dos bandas.
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Resultados y Discusión
Figura 25. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (p/v) del producto de PCR realizado a los extractos de ADN de líneas regeneradas de Digitalis purpurea L. seleccionadas al azar. (A) Amplificación de fragmento del gen nptII (B) Amplificación de fragmento del gen uidA. Carriles 1 al 3 corresponden a líneas transformadas con la cepa EHA105, carriles 4 al 16 corresponden a C58C1RifR (pMP90). (+): ADN plasmídico de pTJK136. (-): Planta no transformada. (M): Patrón de peso molecular. En cada caso se señalan las bandas del patrón de peso molecular más cercanas al fragmento amplificado.
Sac II st-lsI
A Pnos uidA 3´nos 3´OCS nptII P35S BI BD
B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (-) (+) M
8,576 kb 6,106 kb 4,899 kb 3,639 kb 2,799 kb
1,953 kb
1,515 kb 992 pb
Figura 26. Análisis de hibridación de Southern. A: Representación esquemática de la región ADN-T del plasmidio pTJK136. B: Autorradiografía del análisis de hibridación de Southern practicado al ADN extraído de líneas de Digitalis purpurea L. PCR-positivas, seleccionadas al azar. La hibridación se realizó con una sonda de fragmento del gen nptII (indicado en A). Carriles 1 al 3 corresponden a líneas transformadas con la cepa EHA105. Carriles 4 al 9 corresponden a líneas obtenidas a partir de explantes inoculados con la cepa C58C1RifR (pMP90). (+): ADN plasmídico de pTJK136 linealizado. (-): Planta no transformada. (M): Patrón de peso molecular MWM VII (Roche). Al margen, algunos valores de peso molecular de las bandas del patrón.
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Resultados y Discusión
Usualmente cada banda corresponde a una inserción del vector, sin embargo pueden ocurrir ocasionalmente inserciones de más de un elemento en tándem donde alguno de ellos pierda el sitio de corte de la enzima de restricción utilizada en el análisis de hibridación de Southern, en cuyo caso puede subestimarse la cantidad de casetes integrados.
Es conocido que la transformación por A. tumefaciens genera mayoritariamente transformantes con bajo número de inserciones (Komari et al., 2004). Estos resultados concuerdan con los obtenidos en
D. minor (Sales et al., 2003). Además, son consistentes con los resultados obtenidos en otros cultivos como T. aestivum (Cheng et al., 1997), Z. mays (Ishida et al., 1996), O. sativa (Hiei et al., 1997) y especies modelo como A. thaliana (Akama et al., 1992).
Por lo general es deseable la inserción de una sola copia debido a que se minimiza así la probabilidad de que el inserto interrumpa alguna secuencia funcional y por tanto afecte alguna función vital de la planta. Por otra parte, cuando la integración de múltiples copias se combina con perfiles complejos de integración puede ocasionar silenciamiento del transgen (De Buck et al., 2007) y su expresión volverse inestable (Kutty et al., 2011). Estos aspectos confirman la preferencia por líneas transformadas con el mínimo de transgenes insertados en su genoma (Mußmann et al., 2011; Liu et al., 2012b). Además, el número de copias del transgén es un parámetro importante si tenemos en cuenta que las agencias regulatorias prefieren plantas transgénicas con una simple inserción del gen
(Chetty et al., 2012).
A modo de resumen, el protocolo propuesto para la transformación de D. purpurea mediada por A. tumefaciens se muestra en la figura 27.
Hasta el momento los trabajos de transformación genética mediada por A. tumefaciens en este género se realizaron en la especie D. minor. En un primer intento, Sales et al. (2002) describieron la regeneración de líneas a partir de explantes de hojas infectadas con la cepa 82.139 de A. tumefaciens.
Durante el proceso de infección, el transgén reportero codificante para la subunidad A de la glucuronidasa (uidA) fue detectado en los tumores inducidos por la bacteria. Sin embargo, ni los brotes, ni raíces regenerados, ni las plántulas obtenidas resultaron transformadas. Un segundo intento
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Resultados y Discusión
de este grupo de investigadores, (Sales et al., 2003) publicó un sistema de transformación mediado por A. tumefaciens en esta misma especie, al cual se ha hecho referencia anteriormente. En dicho protocolo, diversos aspectos coinciden con el propuesto en esta investigación en D. purpurea. Estas coincidencias se circunscriben al tipo de explante (discos de hojas de plantas cultivadas in vitro), así como al empleo de la acetosiringona como estimulante de la virulencia de Agrobacterium en la fase de co-cultivo. Sin embargo, a la vez que obtuvieron una menor eficiencia de transformación informaron una alta frecuencia de escapes, aspectos que contrastan con los obtenidos en el presente trabajo.
Hasta el momento, los esfuerzos por transformar genéticamente D. purpurea habían sido infructuosos
(Saito et al., 1990). Este es, por tanto, el primer protocolo para la transformación genética de D. purpurea mediada por A. tumefaciens. El éxito en el protocolo desarrollado puede estar dado por la interacción entre varios factores, como el empleo de la cepa C58C1RifR (pMP90) en las condiciones de inoculación desarrolladas. Además, es notable un método de selección eficiente, que incluye la efectividad de la geneticina en la concentración utilizada así como el tiempo de duración de esta etapa y por último cabe mencionar la importancia de un buen método de regeneración para lograr una alta eficiencia de transformación.
Los sistemas de transformación eficientes en plantas son esenciales en el análisis funcional de genes involucrados en los diferentes mecanismos fisiológicos, bioquímicos y moleculares de las rutas metabólicas (Verpoorte, 2007). Al respecto, Sales et al. (2007) informaron del empleo del sistema de transformación descrito en el 2003 para obtener plantas de D. minor que sobre-expresaban el dominio catalítico de la 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa (HMGR1S) de A. thaliana. Algunas de las líneas obtenidas presentaron un mayor contenido de cardenólidos (hasta un 40%) tanto in vitro como en condiciones de invernadero.
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Resultados y Discusión
Figura 27. Protocolo para la transformación genética de Digitalis purpurea L. mediada por Agrobacterium tumefaciens.
De igual manera, otros sistemas de transformación en especies de interés farmacológico han sido descritos en la literatura. Zhu et al. (2009) establecieron un sistema de transformación mediado por
A. tumefaciens para Dioscorea zingiberensis Wright a partir de callos, el cual puede favorecer la introducción y expresión de genes que incrementen la producción de la diosgenina. Este metabolito es un precursor para la síntesis de varias drogas esteroidales de actividad androgénica, antiinflamatoria, anticonceptiva.
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Resultados y Discusión
Otros autores como Abou-Alaiwi et al. (2011) señalaron que la producción de plántulas transgénicas de Centella montana L. puede contribuir definitivamente a los avances en el estudio de los mecanismos moleculares y bioquímicos para el control de la biosíntesis de compuestos biológicamente activos.
A pesar de las ventajas de las diferentes estrategias biotecnológicas desarrolladas, es necesario incrementar la eficiencia en la producción de cardenólidos. Esto será posible únicamente a través del estudio de los mecanismos de síntesis de cardenólidos y la identificación de enzimas que regulan pasos específicos de la biosíntesis de los compuestos de interés (digoxina, digitoxina). Además será imprescindible la aplicación de las técnicas de ingeniería metabólica mediante la sobre-expresión de secuencias que rigen la síntesis de cardenólidos. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos por
Pérez-Bermúdez et al. (2010) es posible sugerir los genes P5βR y P5βR2 como candidatos para la obtención de plantas sobre-productoras de cardenólidos. Por otra parte, al considerar la regulación específica a la que está sometido P5βR2 además de sus bajos niveles de expresión basal detectados por dichos autores, hacen de este gen el candidato más promisorio para la transformación genética hacia lo cual deben encaminarse las futuras investigaciones.
De igual manera, pudiera considerarse el estudio de nuevas secuencias relacionadas con la biosíntesis de cardenólidos descritas recientemente por Wu et al. (2012). Esto se facilitaría con el uso del protocolo para la transformación genética de D. purpurea desarrollado en este trabajo. Además, este protocolo podría ser utilizado en la introducción de genes ortólogos en el genoma de D. purpurea que puedan influir en la síntesis de cardenólidos. Por ejemplo, se ha demostrado que el gen VEP1 de A. thaliana codifica una proteína con actividad progesterona 5-β reductasa (Herl et al., 2009), por lo que este pudiera ser un candidato para el incremento de la síntesis de cardenólidos.
La integración de los resultados obtenidos permitirán disponer de la base metodológica necesaria para el desarrollo de una tecnología para la producción in vitro de cardenólidos. Los SIT constituyen un método efectivo para la producción de biomasa aún cuando la producción de cardenólidos alcanzada es baja. Por tanto, una vez que se determinó el efecto del SilioPlant® en la producción de
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Resultados y Discusión
cardenólidos pudiera combinarse el empleo de este elicitor durante el cultivo de brotes en los SIT.
También estos sistemas semi-automatizados, podrían ser utilizados para la propagación masiva de líneas transformadas genéticamente que sobre-expresen genes específicos de la síntesis de cardenólidos, evitando los problemas asociados al cultivo de organismos genéticamente modificados, al no tener que llevar las plantas a condiciones de casas de cultivo y campo. Por último, la transformación para la sobre-expresión de genes relacionados con la biosíntesis de cardenólidos unida a la elicitación de brotes cultivados en SIT podría permitir la producción de biomasa con alto contenido de cardenólidos. Además, la combinación de estas dos últimas estrategias permitiría el estudio de rutas biosintéticas y la elucidación de genes y enzimas asociadas a la producción de cardenólidos, lo cual se revertiría en un incremento de la producción de estos metabolitos.
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Conclusiones
5. CONCLUSIONES
1. Fue posible con los SIT lograr un método de producción de biomasa de Digitalis purpurea L. mediante la multiplicación de brotes y su escalado en sistemas de inmersión temporal de 5L de capacidad.
2. Con una densidad de inoculación de 12 explantes, una frecuencia de inmersión cada 4 h y sin renovación de la atmósfera en los sistemas de inmersión temporal se logró la multiplicación de brotes de Digitalis purpurea L.
3. Se demostró que la elicitación es una estrategia posible para el incremento de cardenólidos en brotes de D. purpurea en medio de cultivo semisólido. El SilioPlant® a razón de 0,01 g.L-1 permitió incrementar en 3,6 y 6,9 veces el contenido de digoxina y digitoxina respectivamente.
4. Se desarrolló un protocolo para la transformación genética de D. purpurea mediado por
Agrobacterium tumefaciens a partir de segmentos de hojas de plantas in vitro. Se confirmó la integración estable de los transgenes mediante PCR y la hibridación de ADN por Southern.
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Recomendaciones
6. RECOMENDACIONES
1. Considerar el empleo combinado de las estrategias desarrolladas como otra alternativa para la
producción de cardenólidos en brotes de D. purpurea. Se requiere realizar un análisis económico
del mismo que permita validar su empleo.
2. Evaluar el efecto de la elicitación en la multiplicación de brotes cultivados en sistemas de
inmersión temporal.
3. Emplear el protocolo obtenido para la transformación genética de D. purpurea con los genes
P5βR y P5βR2 para incrementar el contenido de cardenólidos y el estudio de las rutas
biosintéticas.
4. Realizar estudios relacionados con los mecanismos de síntesis de cardenólidos y la identificación
de enzimas que regulan pasos específicos de la biosíntesis de los compuestos de interés
(digoxina, digitoxina) sobre la base de las tres estrategias desarrolladas (SIT, elicitación,
transformación genética).
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Referencias Bibliográficas
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Anexos
Anexo 1. Vector de transformación pTJK136. nptII: gen de la neomicina fosfotransferasa II (marcador de selección); Pnos: promotor de la nopalina sintetasa; 3‟OCS: terminador y señales de poliadenilación del gen de la octopina sintetasa. Gus: gen reportero uidA que codifica para la β- glucuronidasa de E. coli; P35S: promotor del virus del mosaico de la coliflor; 3‟nos: terminador y señales de poliadenilación de la nopalina sintetasa; gusint: intrón st-ls1(Solanum tuberosum). LB y RB: bordes izquierdo y derecho, respectivamente, del ADN-T.
Anexos
Anexo 2. Protocolo para la transformación de cepas de Agrobacterium tumefaciens.
La transformación se realizó a partir de células competentes preparadas según la metodología de
Hofgen y Willmitzer (1988).
A 500 μl de cultivo de células competentes se añadieron 100 μl de agua y 10 μl del plasmidio (1,0
μg). Luego de homogenizar con cuidado se sometió la mezcla a la siguiente secuencia de choques térmicos: 5 min en hielo, 5 min en N2 (l) y 5 min a 37 °C. Este procedimiento se realizó por duplicado.
El cultivo se dejó enfriar por 10 min en hielo, se le añadió 1,0 mL de medio de cultivo Luria- Bertani
(LB, 10 g.L-1 de triptona, 5 g.L-1 de extracto de levadura, 10 g.L-1 de NaCl) y se incubó a 28 °C durante 4 h. Posteriormente, de 100 a 600 μL del cultivo se inocularon en placas con medio de cultivo semisólido LB con los antibióticos adecuados. Se incubaron a 28 °C toda la noche y se seleccionaron colonias aisladas al azar para chequear la transformación mediante el aislamiento de
ADN plasmídico y la digestión con enzimas de restricción.
Anexos
Anexo 3. Solución de tinción GUS.
a- Stock de soluciones aa- 100mM NaEDTA (3,7 g/100mL de agua) II ab- 50mM potassium ferriyanide (amarillo) K4[Fe(CN)6], Fe (2,1 g/100 mL agua) III ac- 50mM potassium ferrocyanide (anaranjado) K3[Fe(CN)6], Fe (1,65/100 mL agua) ad- 1% triton X-100 (100 µl/10 mL agua) ae- 0.5M Na2HPO4 (44,5g/500 mL agua) af- KH2PO4 (34 g/500 mL agua) ag- Para alcanzar pH 7,0 adicionar 0,36 vol. de (af) a 0,64 vol de (ae), si es necesario, adicionar ae o af. aa, ae, af, ag: pueden ser esterilizados por autoclave para almacenar a temperatura ambiente ad: esterilizar por filtración ab, ac: almacenar alicuotas a -20ºC en la oscuridad (no esterilizar en autoclave)
b- Solución de teñido ba- sales y detergentes Concentración final Adicionar volumen (del stock)
0.1 M K/Na PO4 buffer pH 7.0 5,0 mL (ag) 10 mM Na-EDTA 2,5 mL (aa) 5 mM K-ferricyanide 2,5mL (ab) 5 mM K-ferrocyanide 2,5 mL (ac) 0.1 % Triton X-100 2,5 mL (ad)
H2O 10 mL Total 25 mL bb) Substrato Disolver 25 mg de Sal ciclohexilamonio ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucorónico (X-Gluc) en 25 mL de dimetilformamida en frasco de vidrio pipeteando varias veces hasta que quede completamente transparente. bc) Adicionar (bb) a (ba) y rápidamente mezclar bien. Esterilizar por filtración. Almacenar en alícuotas a -20ºC. Antes de usar descongelar a temperatura ambiente.
Anexos
Anexo 4. Soluciones empleadas en el análisis molecular
En extracciones de ADN
Tris-EDTA 0,01 M Tris-HCl, 0,001 M EDTA, pH 8.
Tampón de extracción: 0,1 M Tris-HCl, 0,05 M EDTA, 0,5 M NaCl, β-mercaptoetanol 0,07% (añadido justo antes de usarse el tampón) pH 8
SDS alcalino: SDS 1%, NaOH 0,04 M
KAc 5/3 M 3 M KAc, 2 M HAc
En hibridación por Southern blot
SSC:0,15 M NaCl, 0,015 M Citrato de sodio, pH 7,0
Tampón de prehibridación: 5X SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sodio, pH 7,0), 1% (m:v) agente bloqueador, 0,1 % Na-lauroilsarcosina, 0,02 % SDS.
Agente bloqueador (stock 10%): 10 g de Reactivo bloqueador (Roche) en 100 mL de tampón 1 por sucesiones de calentamiento y agitación sin llegar a bullir.
Tampón de hibridación: Tampón de prehibridación con 50 μg/mL de ARN-t de levadura
Solución de lavado 2 X: 2 X SSC, 0,1 % SDS.
Solución de lavado 0.1 X: 0.1 X SSC, 0,1 % SDS.
Tampón 1: 100 mM ácido maleico, 150 mM NaCl, pH 7,5
Tampón 2: 1 % reactivo bloqueador disuelto en tampón 1
Tampón 3: 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl