Anna Przybylska

ANNA PRZYBYLSKA

CHROMATOGRAFICZNE METODY EKSTRAKCJI I OZNACZANIA PATULINY

W OWOCACH GŁOGU (CRATAEGUS SPP.) STANOWIĄCYCH SKŁADNIKI

ŻYWNOŚCI FUNKCJONALNEJ I SUPLEMENTÓW DIETY

CHROMATOGRAPHIC METHODS OF PATULIN EXTRACTION AND DETERMINATION IN HAWTHORN FRUITS (CRATAEGUS SPP.) AS COMPONENTS OF FUNCTIONAL FOOD AND DIETARY SUPPLEMENTS

Rozprawa doktorska wykonana w Katedrze i Zakładzie Bromatologii Wydziału Farmaceutycznego Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu i przedstawiona Radzie Wydziału Nauk o Żywności i Rybactwa Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie

Promotor: Prof. dr hab. n. farm. inż. Grzegorz Bazylak, Prof. UMK Kierownik Katedry i Zakładu Bromatologii Wydział Farmaceutyczny Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Szczecin, 2019

Serdeczne podziękowania dla mojego promotora, Prof. dr hab. inż. Grzegorza Bazylaka za dużą cierpliwość, zaangażowanie oraz bezcenną pomoc merytoryczną na każdym z etapów prowadzonych badań.

Szczególne podziękowania należą się mojemu mężowi Łukaszowi za wsparcie, cierpliwość i ogromną wyrozumiałość przy opracowywaniu niniejszej rozprawy doktorskiej.

Jednocześnie pragnę w tym miejscu podziękować rodzicom za nieustającą pomoc na każdym z etapów drogi zawodowej oraz bratu Marcinowi za wiarę, wsparcie oraz nieustającą motywację.

Specjalne podziękowania należą się również moim dzieciom, które każdego dnia dają ogromną siłę i motywację do realizacji celów.

SPIS TREŚCI

Wykaz skrótów ………………………………………………………………………………………… 7 Wykaz artykułów oryginalnych będących podstawą rozprawy doktorskiej …………………...... ……. 9 Streszczenie …………………………………….…………………………………………………….. 11 Summary ….…………………...………………………………………………………...…………… 13

I. Wstęp ……………………………………………………………………………………………….. 15 I.1. Zanieczyszczenia surowców zielarskich …………………………………………………….... 17 I.2. Charakterystyka głogu Crataegus spp. ………………………………………………………... 20 I.2.1. Taksonomia głogu Crataegus spp. ……………………………………………………... 21 I.2.2. Opis rośliny Crataegus spp. ……………………………………………………………. 22 I.2.3. Zastosowanie owoców głogu ………………………………………………………….. 23 I.2.4. Skład chemiczny owoców głogu ………………………………………………………. 23 I.3. Biosynteza, właściwości i występowanie patuliny …………………………………………… 26 I.4. Analiza patuliny w jabłkach oraz owocach głogu i ich produktach ………………………….. 30 I.4.1. Metody ekstrakcji patuliny …………………………………………………………….. 30 I.4.1.1. Ekstrakcja patuliny z produktów zawierających jabłka……………………... 30 I.4.1.2. Ekstrakcja patuliny z produktów zawierających owoce głogu…………….… 32 I.4.2. Metody oznaczania patuliny …………………………………………………………… 33 I.4.2.1. Oznaczanie patuliny w produktach zawierających jabłka………………….... 33 I.4.2.2. Oznaczanie patuliny w owocach głogu oraz ich produktach ……………….. 36 I.5. Właściwości i zastosowanie nanorurek węglowych w analizie mikotoksyn …………………. 37 II. Cel, hipotezy i zakres pracy ……………………………………………………………………… 39 III. Materiał badawczy ………………………………………………………………………...……… 40

IV. Wyniki …………………………………………………………………………………...……….. 42 IV.1. Optymalizacja metody SPE-HPTLC do oznaczania patuliny ……………………………….. 42 IV.1.1. Badanie rozdzielania patuliny w układzie HPTLC ……………………………..……. 42 IV.1.2. Badanie ekstrakcji patuliny metodą SPE z roztworu modelowego …………………… 43 IV.1.3. Badanie ekstrakcji patuliny metodą SPE z soków owocowych ………...... 49 IV.1.3.1. Badanie ekstrakcji patuliny metodą SPE z soku jabłkowego ……………… 49 IV.1.3.2. Badanie ekstrakcji patuliny metodą SPE z soku z owoców głogu ………… 58 IV.2. Oznaczenie wskaźników jakości higienicznej suplementów diety oraz mieszanek ziołowych zawierających suszone owoce głogu ……………………………. 61 IV.3. Analiza zawartości hydroksykwasów niskocząsteczkowych w wodnych naparach suplementów diety oraz mieszanek ziołowych zawierających suszone owoce głogu ……..…. 63 IV.4. Analiza zawartości naturalnych antyoksydantów i właściwości antyoksydacyjnych wodnych naparów suplementów diety oraz mieszanek ziołowych zawierających suszone owoce głogu ………………………………………..………………... 64 IV.5. Analiza wybranych mikroelementów (Mn, Fe, Cu, Zn) metodą ICP-MS/MS w suplementach diety i mieszankach ziołowych zawierających suszone owoce głogu …...…. 65 IV.6. Analiza zawartości patuliny metodą SPE-UHPLC-MS/MS w suplementach diety, mieszankach ziołowych i owocach głogu zebranych ze stanu naturalnego …………………… 70 IV.7. Analiza statystyczna uzyskanych wyników …………………………...…………………….. 71 V. Dyskusja ………………………………………………………………………………………….. 76 VI. Podsumowanie i wnioski ………………………….…………………………………………….. 85 VII. Piśmiennictwo ………………………………..…………………………………………………. 88

VIII. Oświadczenia współautorów publikacji oryginalnych ………………………….…….….……. 101

IX. Życiorys naukowy ……………………………………………………………………..……..…. 123

X. Publikacje oryginalne autora rozprawy …………………………………………….……………. 129 X.1. Artykuły opublikowane ……………………………...…………………………………….. 129

[P-1] A. Śliwińska, A. Przybylska, G. Bazylak, Chromatograficzne metody ekstrakcji i separacji stosowane do oznaczania patuliny w owocach i sokach owocowych, w: A. Voelkel & W. Wasiak (Red.), Chromatografia w praktyce, Wydawnictwo Politechniki Poznańskiej, Poznań 2011, Rozdział 1.5, 53-64 ...... 131

[P-2] A. Przybylska, G. Bazylak, A comparison of the selectivity of nano-HPTLC systems used for determination of patulin in fruit juices from the internet stores and pharmacies, Current Issues in Pharmacy and Medical Sciences, 2013, 26 (2), 155-159 …………………....…..…...... 149

[P-3] A. Przybylska, G. Bazylak, Ocena jakości mikrobiologicznej suszonych owoców i kwiatostanu głogu (Crataegus spp.) stosowanych jako suplementy diety, Zeszyty Naukowe Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Rolnictwo, 2017, 119 (626), 101-114 …………………………………………………...... 157

[P-4] A. Przybylska, G. Bazylak, Bioactive compounds in aqueous infusions of dietary supplements and herbal blends containing dried hawthorn fruits or hawthorn inflorescence (Crataegus spp.), Journal of Agriculture and Environmental Science, 2018, 7 (2), 131-142, doi: 10.15640/jns.v7n2a14 ……………………………………...…………………………. 173

[P-5] A. Przybylska, G. Bazylak, R. Kosicki, I. Ałtyn, M, Twarużek, J. Grajewski, A. Sołtys-Lelek, Adventageous extraction, cleanup and UHPLC-MS/MS detection of patulin mycotoxin in dietary supplements and herbal blends containing hawberry from Crataegus spp., Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2019, 2019, Article ID 2159097, 1-13, doi: 10.1155/2019/2159097 ………………………..………………………………………. 187

X.2. Komunikaty konferencyjne

[K-6] A. Śliwińska, A. Przybylska, G. Bazylak, Zastosowanie wielowarstwowych nanorurek węglowych do ekstrakcji patuliny z soków jabłkowych metodą SPE, Materiały Konferencyjne: Mikrobiologia w medycynie, przemyśle i ochronie środowiska - II Edycja. Łódź 22-23.10.2011, 111 . [K-7] G. Bazylak, A. Przybylska, Carbon nanotubes as the SPE packing material for isolation of patulin from functional food products, Materiały konferencyjne: Separation Sciences Asia 2012 - New horizons in separation and detection techniques, Kuala Lumpur, Malezja, 27-28.06.2012, 24

[K-8] A. Przybylska, W. Wieczorek, G. Bazylak, Zastosowanie nanorurek węglowych i polimerów z odwzorowaniem cząsteczkowym do ekstrakcji patuliny z soków jabłkowych metodą SPE, Materiały konferencyjne: XXII Naukowy Zjazd Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego – Farmacja - Nauka – Społeczeństwo, Białystok, 18–21.09.2013, 164 … [K-9] G. Bazylak, M. Siepak, A. Gryn, A. Przybylska, Oznaczanie wybranych składników mineralnych metodą ICP-MS w wodnych naparach suplementów diety zawierających owoce lub kwiatostan głogu, Materiały konferencyjne: XXIII Poznańskie Konwersatorium Analityczne – Nowoczesne metody przygotowania próbek i oznaczania śladowych ilości pierwiastków, Poznań, 8-9.05.2014, 62-63

[K-10] A. Przybylska, A. Gryn, M. Siepak, G. Bazylak, Pro-oxidant microelements of infusions from aerial parts of hawthorn (Crataegus spp.) consumed as cardiotonic and cardioprotective dietary supplements by middle aged subjects, Materiały konferencyjne: Nowoczesne techniki badawcze stosowane w analizie farmaceutycznej i biomedycznej. 30-lecie powołania Wydziału Farmaceutycznego Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

[K-11] G. Bazylak, M. Siepak, A. Gryn, A. Przybylska, Zawartość niektórych składników mineralnych w liściach morwy białej i owocach głogu jednoszyjkowego z obsadzeń ulicznych i terenów rekreacyjnych w Bydgoszczy, Materiały konferencyjne: III Ogólnopolska Konferencja Naukowa, Problemy ochrony roślin na terenach zurbanizowanych. Wrocław-Pawłowice, 13-14.06.2017, 22-24

[K-12] G. Bazylak, M. Twarużek, R. Kosicki, I. Ałtyn, J. Grajewski, A. Gryn-Rynko, A. Przybylska, M. Siepak, Patulin, trace elements and micronutrients in dried fruits and inflorescences of hawthorn (Crataegus spp.) used as components of cardiotonic dietary supplements for hypertensive subjects, Materiały konferencyjne: 39th Mycotoxin Workshop, Bydgoszcz, 19.06.2017, 69

Wykaz skrótów

ABI - aktywność antyoksydacyjna wobec kationorodnika ABTS·+ [%] ABmM - aktywność antyoksydacyjna wobec kationorodnika ABTS·+ [mM TE/100g s.m.] ABT - aktywność antyoksydacyjna wobec kationorodnika ABTS·+ [mg TE/100g s.m.] ABTS - 3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian AI - poziom wystarczającego spożycia [mg/os/dobę] (ang. Adequate Intake) AT - acetylotransferaza CAE - katechiny CN1 - wielościenne nanorurki węglowe typu CN1 (średnica 2 ÷ 6 nm, długość 0,1 ÷ 10 μm) CCVD - metoda katalityczno – chemicznego osadzania (ang. Catalytic Chemical Vapour Deposition) DAS - diacetoksyscirpenol DE - diatomit DH - dehydrataza DON - deoksyniwalenol DPmM - aktywność antyoksydacyjna wobec DPPH [mM TE/100g s.m.] DPI - aktywność antyoksydacyjna wobec rodnika DPPH· [%] DPPH - 2,2-difenyl-1-pikrylohydrazyl DPT - aktywność antyoksydacyjna wobec DPPH [mg TE/100g s.m.] DR - drożdże EP - (-)-epikatechiny GAE - kwas galusowy GMP - Dobra Praktyka Wytwarzania (GMP, ang. Good Manufacturing Practice) GN - gęstość nasypowa [g/mL3] 5-HMF - 5-hydroksymetylofurfural HPLC - wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. High-Performance Liquid Chromatography) HPTLC - wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (ang. High-Performance Thin-Layer Chromatography) IC50 - stężenie przeciwutleniacza powodujące obniżenie stężenie rodnika o 50% JECFA - Komitet Naukowy ds. Żywności KAS - kwas α-askorbinowy KC - kwas cytrynowy KCH - kwas chlorogenowy KJ - kwas jabłkowy KR - ketoreduktaza KSZ - kwas szczawiowy KW - kwasowość [mg/100 mL] LLE - ekstrakcja ciecz-ciecz (ang. Liquid-Liquid Extraction) MBTH - chlorowodorek 3-metylo-2-benzotiazolinonu MIP - polimer z odwzorowaniem cząsteczkowym (ang. Molecularly Imprinted Polymers) MWCNTs - wielościenne nanorurki węglowe (ang. Multiwalled Carbon Nanotubes) NIF - niwalenol PAT - patulina PCAd - złoże zawierające pierwszorzędowe i drugorzędowe grupy aminowe PCA - analiza głównych składowych (ang. Principal Component Analysis) PCB1 - procyjanidyny B1 PCB2 - procyjanidyny B2 PC1 - pierwsza główna składowa PC2 - druga główna składowa PJ - produkty jednoskładnikowe (zawierające wyłącznie suszony owoc głogu) PL - pleśnie PMTDI - tymczasowe maksymalne dzienne pobranie (ang. Provisional Maximum Tolerable Daily Intake) PSA - propylenodiamina PVPP - poliwinylopolipirolidon PW - produkty wieloskładnikowe (zawierające suszony owoc głogu wraz z częściami innych roślin leczniczych) SEM - skaningowa mikroskopia elektronowa (ang. Scanning Electrone Microscope) QW - kwercetyna r - współczynnik korelacji Pearsona RDA - poziom zalecanego spożycia [mg/os/dobę] (ang. Recommended Dietary Allowances) SPE - ekstrakcja do fazy stałej (ang. Solid Phase Extraction) TAMC - całkowita liczba drobnustrojów tlenowych [jtk/g] (ang. Total Aerobic Microbial Count) TE - kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylchroman-2-karboksylowy (Trolox) TEM - transmisyjna mikroskopia elektronowa (ang. Transmission Electron Microscopy) TFC - całkowita zawartość związków flawonoidowych [mg CAE/100g; mg CAE/100 mL] TLC - chromatografia cienkowarstwowa (ang. Thin Layer Chromatography) TPC - całkowita zawartość polifenoli [mg GAE/100g; mg GAE/100 mL] TYMC - całkowita liczba drożdży i pleśni [jtk/g] (ang. Total Yeast And Molds Count) UHPLC - ultra-wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. Ultra-High Performance Liquid Chromatography Coupled To Tandem Mass Spectrometry) WC - wielościenne nanorurki węglowe typu WC (średnica 110 ÷ 170 nm, długość 5 ÷ 9 μm) ZN - owoce głogu zebrane z drzew dziko rosnących (zbiór naturalny)

Wykaz artykułów oryginalnych będących podstawą rozprawy doktorskiej

[P-1] A. Śliwińska, A. Przybylska, G. Bazylak, Chromatograficzne metody ekstrakcji i separacji stosowane do oznaczania patuliny w owocach i sokach owocowych, w: A. Voelkel, W. Wasiak (Red.), Chromatografia w praktyce, Wydawnictwo Politechniki Poznańskiej, Poznań 2011, Rozdział 1.5, 53-64, Punktacja MNiSW = 4 pkt

[P-2] A. Przybylska, G. Bazylak, A comparison of the selectivity of nano-HPTLC systems used for determination of patulin in fruit juices from the internet stores and pharmacies Current Issues in Pharmacy and Medical Sciences, 2013, 26 (2), 155-159, doi:10.12923/J.2084-980X/26.2/a.08, Punktacja MNiSW = 4 pkt

[P-3] A. Przybylska, G Bazylak. Ocena jakości mikrobiologicznej suszonych owoców i kwiatostanu głogu (Crataegus spp.) stosowanych jako suplementy diety Zeszyty Naukowe Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, Rolnictwo, 2017, 119 (626), 101-114, doi:10.15640/jns.v7n2a14, Punktacja MNiSW = 9 pkt

[P-4] A. Przybylska, G. Bazylak Bioactive compounds in aqueous infusions of dietary supplements and herbal blends containing dried hawthorn fruits or hawthorn inflorescence (Crataegus spp.) Journal of Agriculture and Environmental Science, 2018, 7 (2), 131-142

[P-5] A. Przybylska, G. Bazylak, R. Kosicki, I. Ałtyn, M, Twarużek, J. Grajewski, A. Sołtys-Lelek Adventageous extraction, cleanup and UHPLC-MS/MS detection of patulin mycotoxin in dietary supplements and herbal blends containing hawberry from Crataegus spp. Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2019, 2019, 1 – 13, doi: 10.1155/2019/2159097, Punktacja MNiSW = 25 pkt IF = 1,262

Streszczenie

Celem niniejszej rozprawy doktorskiej było opracowanie nowych chromatograficznych metod mikroanalitycznych przydatnych do wiarygodnej oceny zawartości niewielkich (< 10 μg/kg) ilości patuliny w żywności funkcjonalnej uzyskiwanej z owoców głogu. Celem pracy była także ocena stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego suplementów diety i mieszanek ziołowych zawierających suszone owoce głogu oraz zawartości bioaktywnych metabolitów wtórnych i składu podstawowych mikroelementów w wodnych naparach uzyskanych z w/w produktów. W części doświadczalnej wykorzystano metody ekstrakcji do fazy stałej (SPE), wysokosprawną chromatografię cienkowarstwową (HPTLC), gradientową ultra-wysokosprawną chromatografię cieczową sprzężoną z tandemowym spektrometrem mas (SPE-UHPLC-MS/MS), skaningową (SEM) oraz transmisyjną (TEM) mikroskopię elektronową, spektrometrię mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP-MS/MS), metody spektrofotometryczne, miareczkowe, potencjometryczne, ale również metody płytkowe (analiza mikrobiologiczna). W pierwszej części pracy porównano selektywność oraz wydajność ekstrakcji SPE patuliny z mieszaniny modelowej, soku jabłkowego oraz z owoców głogu przy użyciu sześciu różnych komercyjnie dostępnych kolumienek SPE różniących się rodzajem adsorbentu i nowo opracowanej w badaniach własnych metody SPE, w której wykorzystano dwa rodzaje niemodyfikowanych wielościennych nanorurek węglowych różniących się morfologią i parametrami fizykochemicznymi. Stwierdzono, że najwyższy odzysk patuliny (75%) uzyskuje się stosując kolumienkę SPE zawierającą wielościenne nanorurki węglowe o średnicy 2 ÷ 6 nm i długości 0,1 ÷ 10,0 μm. Otrzymane ekstrakty SPE analizowano metodą HPTLC, co umożliwiało oznaczenie patuliny w zakresie od 40 do 500 μg/L. Istotnym osiągnięciem było oznaczenie nieznanej dotychczas zawartości patuliny w suplementach diety, mieszankach ziołowych i owocach głogu przy pomocy nowo opracowanej metody analitycznej z wykorzystaniem kolumienek SPE wypełnionych kompozytem polimerowym MycoSep®228AflaPat oraz techniki gradientowej UHPLC-MS/MS. Obecność patuliny (średnio 13,74 ± 19,58 μg/kg) stwierdzono w większości badanych produktów (90%), pomimo tego, że spełniały one kryteria czystości mikrobiologicznej określone wymaganiami Farmakopei Polskiej (X). W drugim etapie badań stwierdzono, że wodne napary uzyskane z analizowanych suplementów diety i mieszanek ziołowych są bogatym źródłem różnych hydroksykwasów, które prawdopodobnie przyczyniają się do ograniczenia zawartości patuliny w tego typu produktach. Uzyskane wyniki wskazują ponadto, że występuje zwiększona bioakumulacja Zn, Cu, Fe i Mn w owocach głogu, które stosowane są do produkcji suplementów diety i mieszanek ziołowych, co stanowi czynnik abiotyczny ograniczający tempo wzrostu endofitycznych szczepów Penicillium expansum i występowania patuliny w tych owocach. Wyznaczona za pomocą metod spektrofotometrycznych DPPH oraz ABTS znaczna aktywność antyoksydacyjna wodnych naparów uzyskanych z badanych produktów funkcjonalnych była istotnie skorelowana z zawartością związków polifenolowych, flawonoidowych oraz jonów Mn2+. Przeprowadzone badania wskazują na konieczność wykorzystania osiągnięć nanotechnologii platformowych (metagenomiki, proteomiki, nutreogenomiki) do opracowania nowych sposobów skutecznego zmniejszenia bądź eliminacji patuliny z suplementów diety i innych produktów zawierających owoce głogu, co pozwoliłoby na ograniczenie ryzyka negatywnych i odległych skutków zdrowotnych spowodowanych systematycznym lub przypadkowym spożyciem tej mikotoksyny, szczególnie przez ciągle zwiększającą się w Polsce grupę pacjentów kardiologicznych i osób starszych.

Summary

The aim of the doctoral thesis was to develop new microanalytical chromatographic methods useful for reliable assessment of the content of small (< 10 μg/kg) amounts of patulin in juices, dietary supplements and herbal blends obtained from hawthorn fruits. The aim of the study was also to assess the degree of microbial contamination of dietary supplements and herbal blends containing dried hawthorn fruits, as well as the content of bioactive secondary metabolites and the composition of basic micronutrients in aqueous infusions obtained from the aforementioned products. In the experimental section were used solid-phase extraction methods (SPE), high- performance thin-layer chromatography (HPTLC), ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS), scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscopy (TEM), inductively coupled plasma- tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS), spectrophotometric methods, titration methods, potentiometric methods and plates methods (microbiological analysis). The first section of the doctoral thesis compares the selectivity and efficiency of SPE extraction of patulin from a model mixture, apple juices and hawthorn fruits with use of six different commercially available SPE columns which differ in adsorbent type and the newly own developed SPE method in which we used two types of unmodified multiwalled carbon nanotubes differing in morphology and physicochemical parameters. It was found that the highest patulin recovery (75%) was obtained by use of SPE column which contains multiwalled carbon nanotubes with a diameter of 2 ÷ 6 nm and length of 0,1 ÷ 10,0 μm. The obtained SPE extracts were determined with use of the HPTLC method, which enabled patulin determination in the range of 40 ÷ 500 μg/L. An important achievement was the determination of the previously unknown patulin content in dietary supplements, herbal blends and hawthorn fruits using a newly developed analytical method with the use of SPE columns filled with a MycoSep®228AflaPat polymer composite and the UHPLC-MS/MS gradient technique. The presence of patulin (average 13,74 ± 19,58 μg/kg) was found in the majority of analysed products (90%), despite of the fact that they met the criteria of microbiological purity determined by the Polish Pharmacopoeia (X). In the second section of the doctoral thesis it was found that aqueous infusions obtained from analysed dietary supplements and herbal blends are rich source of various hydroxyacids, which probably contribute to a reduction in the amount of patulin in such products. The results also indicate that there is an increased bioaccumulation of Zn, Cu, Fe and Mn in hawthorn fruits , which are used in the production of dietary supplements and herbal blends, which is an abiotic factor limiting the growth rate of endophytic strains of Penicillium expansum and the presence of patulin in these fruits. The significant anti-oxidative activity of the aqueous infusions obtained from the functional products tested by DPPH and ABTS was significantly correlated with the content of polyphenols, flavonoids compounds and Mn2+ ions determined by means of spectrophotometric methods. The conducted research indicates the need to use the achievements of platform nanotechnologies (metagenomics, proteomics, nutrigenomics) to develop new ways to effectively reduce or eliminate patulin from dietary supplements and other products containing hawthorn fruits, which would reduce the risk of negative and distant health effects caused by systematic or accidental intake of this mycotoxin, especially by a constantly growing group of cardiac patients and elderly people in Poland.

I. Wstęp

W ostatnich latach szybko wzrasta wśród różnych grup ludności zainteresowanie żywnością funkcjonalną i suplementami diety jako jeden ze sposobów wykorzystania terapii naturalnych (naturopatii, naturolecznictwa, naturoleczenia) do wspomagania samouzdrawiających (ang. self-healing) możliwości ciała ludzkiego [Pizzorno & Murray, 2013]. Równocześnie w Polsce i innych krajach Unii Europejskiej ukształtował się silny trend prozdrowotny, co przyczyniło się do wydłużenia przeciętnego okresu życia kobiet i mężczyzn o ponad 7 lat w porównaniu do początku lat 90. ubiegłego stulecia. Permanentny marketing i powszechna dostępność suplementów diety spowodowała u wielu konsumentów przekonanie o ich szczególnych właściwościach zdrowotno-żywieniowych, co sprawia, że z roku na rok, coraz większa grupa osób systematycznie sięga po te produkty. Z raportu Najwyższej Izby Kontroli wynika, że w roku 2015 Polacy wydali na zakup suplementów diety 1,54 mld zł. Przewiduje się, że w 2020 r. wartość rynku suplementów diety będzie wynosić ponad 5 mld zł. Na tak gwałtowny wzrost zainteresowania konsumpcją i zwiększaniem produkcji suplementów diety duży wpływ mają intensywne kampanie reklamowe w rozmaitych mediach i przestrzeni publicznej. Według Instytutu Monitorowania Mediów reklama suplementów diety pochłonęła w 2014 r. w Polsce przeszło 370 mln zł [NIK, 2016]. Ustalenia kontroli NIK wykazały, że liczba powiadomień Głównego Inspektoratu Sanitarnego (GIS) o wprowadzeniu, bądź zamiarze wprowadzenia po raz pierwszy do obrotu suplementów diety wzrosła w ciągu 9 lat przeszło pięciokrotnie. W 2016 r. do GIS wpłynęło blisko 7,4 tys. takich powiadomień. Jednak zwraca uwagę fakt, że w 2015 r. tylko 5 próbek zostało zbadanych na obecność mikotoksyn w suplementach diety podczas weryfikacji powiadomień o pierwszym wprowadzeniu suplementów diety do obrotu na terytorium Polski [NIK, 2016]. Ustalenia przeprowadzonej kontroli NIK były jednoznaczne. W Polsce nie jest zapewniony właściwy poziom bezpieczeństwa suplementów diety [Kotynia i wsp., 2016]. Z kolei z raportu opublikowanego przez GIS, który dotyczy stanu sanitarnego w Polsce w roku 2017, wynika że laboratoria Państwowej Inspekcji Sanitarnej (PIS) dokonały analizy 4280 suplementów diety, w tym 470 pochodzących z importu, 662 z krajów członkowskich UE oraz 3148 produkcji krajowej. Badania w kierunku mikotoksyn wykonano zaledwie w 34 suplementach diety, co stanowiło tylko 0,79% wszystkich w/w próbek. Laboratoria PIS wykonały również analizy 6825 próbek żywności. Badania w kierunku oznaczania mikotoksyn obejmowały 674 próbki, co stanowiło 9,88% wszystkich próbek [GIS, 2018]. Oprócz chorób nowotworowych również choroby układu krążenia są najważniejszą przyczyną obserwowanego od kilku lat wzrostu liczby zgonów w Polsce, która w 2017 r. osiągnęła niemal 414 tys. osób i była największa od czasów zakończenia II wojny światowej [Cierniak i wsp, 2015]. Z innych raportów GUS wynika, że w 2013 r. zmarło z powodu chorób układu krążeniowo-oddechowego ponad 177 tys. osób, co stanowiło 45,8% wszystkich zarejestrowanych zgonów. Zachorowalność na schorzenia mięśnia sercowego i układu wieńcowego dotyczy głównie osób starszych. Wśród osób powyżej 65 roku życia, choroby układu krążenia w 2013 r. były przyczyną 53,1% zgonów. W grupie osób w wieku do 64 lat zgony spowodowane tymi chorobami plasowały się na drugim miejscu i sięgały 27,5% [Cierniak i wsp, 2015].

Obecny styl życia współczesnego społeczeństwa, w szczególności propagowany wśród nowych pokoleń jest spowodowany globalnymi zmianami kulturowymi, ekonomicznymi i socjalnymi. Współczesne szybkie tempo życia, stres z tym związany, pogarszający się stan środowiska oraz ograniczony dostęp do skomercjalizowanej służby zdrowia wpływają na wzrost ryzyka rozwoju chorób cywilizacyjnych, takich jak otyłość, cukrzyca, choroby układu krążenia oraz nowotwory. Istotną rolę w walce z otyłością i chorobami układu sercowo- naczyniowego ma odpowiednia dieta oraz prawidłowe nawyki żywieniowe. Zwiększenie udziału żywności funkcjonalnej w codziennej diecie może przyczynić się do poprawy stanu zdrowia oraz ogólnego samopoczucia, co w konsekwencji zmniejsza ryzyko zachorowalności na choroby cywilizacyjne. Do najczęściej kupowanych w Polsce produktów żywności funkcjonalnej należą jogurty (70%), soki oraz nektary owocowe (66%), płatki śniadaniowe (53%), herbatki owocowe, ziołowe oraz mieszanki ziół (52%) [Olejniczak, 2015]. Z badań Schlegel-Zawadzkiej & Barteczko (2009) wynika, że konsumenci najczęściej sięgają po suplementy diety w postaci herbatek (70,0 % osób), syropów (52,4%), naparów (48,5%), tabletek (42,7%), nalewek (32,0%), maści (29,1%), kompresów (25,2%) oraz kapsułek (23,3%). Wysokiej jakości surowce zielarskie dostępne pod postacią herbatek owocowych lub suplementów diety są bogatym źródłem związków bioaktywnych, które zmniejszają ryzyko zapadalności na choroby sercowo-naczyniowe [Koszowska i wsp., 2013]. W Polsce i Unii Europejskiej nie ma informacji na temat zanieczyszczenia patuliną suplementów diety oraz mieszanek ziołowych zawierających suszone owoce głogu. Jedyne, a zarazem nieliczne doniesienia na ten temat pochodzą z terenu Chin [Zhou i wsp., 2012]. Era globalizacji spowodowała, że dostęp do produktów żywnościowych jest coraz łatwiejszy. Eksport i import produktów żywnościowych z różnych kontynentów jest coraz powszechniejszy, co powoduje, że wzrasta zagrożenie migracji zanieczyszczeń z żywnością [Fritsche, 2018; Kendall i wsp., 2018]. W Chinach (prowincja Shaanxi) jest produkowanych 36% światowej produkcji soku jabłkowego, z czego aż 90% jest eksportowane do krajów Europy oraz USA i Kanady. Spośród 1987 skontrolowanych próbek skoncentrowanego soku jabłkowego w latach 2006 – 2010 w prowincji Shaanxi w Chinach, aż 98% próbek było zainfekowanych patuliną, z czego tylko cztery próbki powyżej dopuszczanego limitu 50 μg/kg [Guo i wsp., 2013]. Z kolei w badaniach Yuan i wsp. (2010) potwierdzono, że analizowane (n = 95) produkty z jabłek (w tym dla dzieci) były zainfekowane patuliną w szerokim zakresie stężeń < 1,2 ÷ 94,7 μg/kg. Niestety informacje dotyczące pochodzenia surowców zielarskich stosowanych do produkcji mieszanek ziołowych zawierających owoce głogu dostępnych w Polsce nie są ujawniane przez producentów. Przedstawiciele zakładów zielarskich przyznają jednak, że większość suszonych owoców głogu jest importowana z różnych krajów Europy (Białoruś, Litwa). Tak więc postępująca liberalizacja i szybki wzrost międzynarodowej wymiany handlowej powoduje, że istnieje potrzeba ciągłej kontroli produktów zielarskich dostających się na teren Polski ze względu na zawartość patuliny i innych zanieczyszczeń. Powyższe rozważania skłoniły mnie do podjęcia pionierskich badań dotyczących oceny stopnia zanieczyszczenia patuliną suplementów diety oraz mieszanek ziołowych zawierających suszone owoce głogu dostępnych w Polsce oraz sprawdzenia możliwości zastosowania wielościennych nanorurek węglowych jako innowacyjnego i selektywnego adsorbentu względem patuliny. Pomimo wielu doniesień potwierdzających zainfekowanie surowców zielarskich mikotoksynami, wciąż nieznany jest stopień zanieczyszczenia patuliną mieszanek

16 ziołowych zawierających suszone owoce głogu, które są dostępne w Polsce. Jednocześnie tempo w jakim rozwija się rynek suplementów diety oraz żywności funkcjonalnej w Polsce skłonił mnie do oceny jakości mikrobiologicznej surowców zielarskich zawierających owoce głogu oraz stężenia substancji bioaktywnych w wodnych naparach suszonych owoców głogu sprzedawanych jako suplementy diety oraz mieszanki ziołowe (herbatki owocowe) mających wpływ na właściwości antyutleniające tych naparów, które są powszechnie stosowane jako składniki codziennej diety przez osoby dotknięte rozmaitymi chorobami układu krążenia.

I.1. Zanieczyszczenia surowców zielarskich

Rośliny zielarskie wykorzystywane są w farmacji, kosmetologii, hodowli zwierząt, produkcji żywności funkcjonalnej i nutraceutyków. Uprawa roślin zielarskich w Polsce ma wieloletnią tradycję i często jest przekazywana z pokolenia na pokolenie. Surowce roślinne pozyskiwane są ze stanu naturalnego, wyspecjalizowanych plantacji oraz upraw ekologicznych. W Polsce plantacje zielarskie obejmują 30 tys. ha, w których uprawianych jest około 70 gatunków roślin zielarskich [Newerli-Guz, 2016]. Ocenia się, że w naszym kraju ponad 200 gatunków roślin leczniczych jest zbieranych ze stanu naturalnego [Bączek i wsp, 2016]. Surowce roślinne pozyskiwane z upraw oraz roślin dzikorosnących charakteryzują się także obecnością związków antyodżywczych. Obecność pozostałości pestycydów oraz metali ciężkich w materiale roślinnym spowodowana może być ich pozyskiwaniem z niewłaściwych obszarów leśnych lub miejskich. Według danych Urzędu Statystycznego z roku 2005 całkowity zbiór świeżych owoców głogu ze stanu naturalnego wynosił 157 ton, przy czym najwyższe zbiory pochodziły z Podlasia (86 t), Lubelszczyzny (25 t) i Podkarpacia (24 t) [GUS, 2005]. Dla porównania w 2005 r. zebrano w Chile z obszaru 1800 ha ogółem 93 tony owoców głogu (Crataegus monogyna) [Censkowsky i wsp., 2007]. Drzewa Crataegus × media Bechst. są miejscem bytowania kolonii mszyc oraz afidofagów. Dominującym gatunkiem jest mszyca jabłoniowa (Aphis Pomi De Geer) oraz mszyce z rodzaju Dysaphis Börn., co znacząco obniża dekoracyjność drzew. Spośród owadów drapieżnych najliczniejszą grupę stanowiły larwy bzygi (Syrphidae) oraz biedronkowate (Coccinellidae) [Sławińska & Jaśkiewicz, 2004]. Głóg jednoszyjkowy (C. monogyna) jest gospodarzem dla pasożytujących grzybów Podosphera clandestina (Wallr.) Lév. Var. clandestina (DPN, S, Z), Phyllactinia mali (Duby) U. Braun (GW) i Ampelomyces quisqalis (Ces) (GW) [Czerniawska & Adamska, 2007]. Ponadto głóg jest rośliną żywicielską dla gąsienic niestrzępa głogowca (Aporia crataegi), obecnie rzadko spotykanego motyla zaliczanego do rodziny bielinkowatych (Pieridae), który pojawia się na początku maja i kiedyś był traktowany jako zły omen określany jako „krwawy deszcz” [Świat Macro.com, 2014]. Obecność mszyc i innych owadów oraz grzybów pasożytniczych może spowodować zmiany chemiczne uszkodzonych organów roślinnych [Sławińska & Jaśkiewicz, 2004]. Dlatego tak ważne jest, aby zbierane owoce głogu stosowane do produkcji suplementów diety oraz mieszanek ziołowych były zdrowe i nie zainfekowane grzybami, aby zmniejszyć ryzyko zagrożenia zdrowia związanego ze spożyciem tych owoców.

Jednak w ostatnich latach zwraca się szczególną uwagę na zanieczyszczenia mikrobiologiczne surowców zielarskich [WHO guidelines, 2007; Steinka, 2011]. Mając na uwadze bezpieczeństwo pacjentów, Farmakopea Polska (X) określa maksymalne kryteria akceptacji dla mikroflory obecnej w produktach zielarskich przeznaczonych do przygotowania naparów i odwarów z użyciem wrzącej wody. Maksymalne dopuszczalne poziomy dla ogólnej liczby drożdży i pleśni (TYMC), ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych (TAMC), obecność Escherichia coli oraz Salmonella w suszach roślinnych opisane zostały w jednej z publikacji wchodzącej w skład niniejszej rozprawy doktorskiej [Przybylska & Bazylak, 2017]. Obecność drobnoustrojów w surowcach roślinnych jest spowodowana zróżnicowaną mikroflorą gleb, ale również czynnikami klimatycznymi. Namnażanie się szkodliwych mikroorganizmów w owocach głogu uwarunkowane jest także sposobem zbioru, wyborem metody suszenia zebranych części roślin oraz warunkami ich przechowywania i transportu [Steinka, 2011]. Liczne doniesienia literaturowe potwierdzają fakt, że zróżnicowane zanieczyszczenia mikrobiologiczne stanowią integralną część ekosystemu w trakcie uprawy bazylii, mięty, majeranku i rumianku [Tournas & Katsoudas, 2008; Wójcik-Stopczyńska i wsp., 2010]. Niedostateczna jest wciąż w Polsce liczba systematycznych badań oceniających stopień zanieczyszczenia mikrobiologicznego suplementów diety oraz mieszanek ziołowych zawierających suszone owoce głogu dostępne w aptekach, sklepach zielarskich oraz w supermarketach [GIS, 2017]. Wzrost ilości grzybów pleśniowych w produktach żywnościowych jest uwarunkowany temperaturą, wilgotnością, natlenieniem oraz odczynem środowiska. Do najczęściej występujących grzybów pleśniowych w surowcach roślinnych należą grzyby z rodzaju Alternaria, Cladosporium, Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus oraz Eurotium [Kong i wsp. 2014; Tournas & Katsoudas, 2008; Kunicka-Styczyńska & Śmigielski, 2011; Wójcik-Stopczyńska i wsp. 2010; Janda-Ulfig & Ulfig 2008]. Wrząca woda stosowana do zaparzania ziół służy nie tylko do wydobycia z suszy roślinnych najcenniejszych związków bioaktywnych, ale również do redukcji potencjalnych drobnoustrojów chorobotwórczych obecnych w materiale roślinnym [Haas i wsp., 2013]. Jednakże w surowcach roślinnych nieprawidłowo zbieranych, suszonych oraz przechowywanych może dojść do rozwoju zanieczyszczeń drobnoustrojami, ale także szkodliwymi toksynami, które są odporne na działanie wysokich temperatur [Kabak, 2009]. Mikotoksyny będące wtórnym metabolitem grzybów pleśniowych są dużym zagrożeniem dla zdrowia człowieka. Poszczególne grzyby pleśniowe mogą jednocześnie biosyntetyzować różne rodzaje mikotoksyn. Dane literaturowe potwierdzają występowanie mikotoksyn w produktach zielarskich. Badania Santos i wsp. (2009) potwierdziły obecność mikotoksyn w 84 leczniczych surowcach zielarskich zawierających m.in. głóg dwuszyjkowy/jednoszyjkowy Crataegus oxyacantha/monogyna, szałwię lekarską Salvia officinalis oraz bez czarny Sambucus nigra. Wszystkie zbadane próbki tych surowców były zainfekowane kilkoma mikotoksynami o różnych stężeniach, jednak nie zostało w nich określone stężenie patuliny. W liściach senesu (Sennae folium) oznaczono jednocześnie obecność ochratoksyny OTA (3,1 μg/kg), fumonizyny FBs (86,7μg/kg), aflatoksyny AFs (434,3 μg/kg), zearalenonu ZEA (7,1 μg/kg), toksyny T-2 (2,4 μg/kg) oraz womitoksyny DON (20,5 μg/kg). Natomiast w herbacie czerwonej stwierdzono obecność AFs, OTA, ZEA, toksyny T-2, DON oraz cytryniny na średnim poziomie odpowiednio 827,25; 3,85; 7,85; 41,70, 164,50 oraz 40,30 μg/kg [Santos i wsp., 2009]. Ledzion i wsp. (2011) zwracają uwagę na obecność ochratoksyny OTA w 244 analizowanych

18 produktach surowców zielarskich (w tym owocach głogu) pochodzących z obrotu detalicznego. Najwyższe stężenie OTA odnotowano w pieprzu mielonym (99,6 μg/kg). Suszone owoce głogu pochodzące z prowincji Jinan w Chinach są skażone patuliną na średnim poziomie 16,3 μg/kg (Xiang i wsp., 2012). Warto wspomnieć, że oprócz patuliny w owocach głogu Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br. oznaczono aflatoksynę B1 w 21,4 % analizowanych próbek na średnim poziomie 0,26 μg/kg [Kong i wsp., 2014]. Pomimo doniesień potwierdzających zainfekowanie wielu różnych surowców zielarskich mikotoksynami, wciąż niewiele wiadomo o stopniu zanieczyszczenia patuliną suszonych owoców głogu dostępnych w Polsce. Kumulowanie się mikotoksyn w surowcu zielarskim stwarza zagrożenie dla zdrowia konsumenta. Spożywanie mikotoksyn wraz z pożywieniem może być powodem ostrych zatruć o zróżnicowanym przebiegu lub zatruć przewlekłych, które występują wraz z długotrwałym narażeniem organizmu człowieka na działanie nawet małych stężeń mikotoksyn [Puel i wsp., 2010]. W celu zwiększenia jakości ochrony środowiska, poszukuje się biologicznych metod ochrony roślin, które w przyszłości zastąpią obecnie stosowane metody chemiczne. W ostatnich latach wzrasta zainteresowanie badaczy aspektem biokontroli. Do głównych mechanizmów wykorzystywanych w tym celu należą: 1) konkurencja o przestrzeń życiową oraz składniki pokarmowe, 2) biosynteza i sekrecja antygrzybowych metabolitów w tym białek oraz 3) indukcja mechanizmów obronnych i odpornościowych u roślin [Grzegorczyk i wsp., 2015]. W badaniach in vitro Cao i wsp. (2013) stwierdzono, że drożdże tlenowe Pichia caribbica powodują degradację patuliny nawet w 77,99%. Drożdże Metschnikowia pulcherrima MACH1, M. pulcherrima GS9 oraz M. fructicola AL27 wykazują działanie antagonistyczne wobec Penicillium expansum oraz patuliny. Najwyższą aktywność antagonistyczną wykazał szczep M. fructicola AL27 wobec P. expansum w czterech odmianach owoców jabłoni [Spadaro i wsp., 2013]. Innym ważnym aspektem zanieczyszczeń mikrobiologicznych obecnych w surowcach zielarskich jest rozkład związków odżywczych występujących w tkankach roślin, co znacząco wpływa na obniżenie aktywności farmakologicznej. Enzymy (lipazy, proteazy, amylazy) wytwarzane przez drobnoustroje mogą powodować rozkład związków flawonoidowych obecnych w suszach roślinnych [Asther i wsp., 2005; You i wsp., 2010]. W świetle powyższych rozważań istotne są rozwijane w ostatnich latach badania metagenomiczne przy użyciu technologii sekwencjonowania następnej generacji NGS [Bokulich i wsp., 2014] dotyczące bioróżnorodności endofitycznego mikrobiomu, interakcji gospodarz-patogen oraz warunków bytowania poszczególnych drobnoustrojów i danego mikrobiomu na surowcach roślinnych oraz ich wpływu na biosyntezę i bioakumulację związków toksycznych, a także badanie konkurencyjności pomiędzy różnymi gatunkami drobnoustrojów [Feng i wsp., 2017; Iqbal i wsp., 2017].

I.2. Charakterystyka głogu Crataegus spp.

W przeciwieństwie do przekonań biblijnych, w których uważa się że głóg jest bezużyteczną rośliną kolczastą [Kozłowski i wsp., 2007], w dawnych wierzeniach ludowych twierdzono, że głóg należy do świata magii, okultyzmu i ma potężne moce czynienia cudów. Wokół głogów do dzisiaj krąży również wiele legend. Z jednej strony w symbolice chrześcijańskiej głogi kwitnące oznaczają nadzieję, z drugiej zaś strony uważa się, że korona cierniowa Jezusa Chrystusa została wykonana właśnie z gałęzi głogowych ze względu na obecność na nich długich cierni [Tajemnice-swiata.pl]. Z kolei Józef z Arymatei, który przybył do Anglii, aby nawracać tamtejszych ludzi przywiózł z Palestyny laskę głogową, która w Glastonbury, gdzie wbił ją w ziemię, po pewnym czasie ukorzeniła się i zakwitła. W tym miejscu Józef zbudował kościół, a pielgrzymi czcili słynne drzewo głogowe aż do 1750 roku [Kowalewska-Pasek, 2006]. W południowych rejonach Polski gałązki głogu spalano w Wielką Sobotę w celu zwiększenia plonów. Z kolei w starożytnej Grecji wieszano gałązki głogowe na drzwiach domów uważając, że w ten sposób odstraszą duchy przynoszące choroby. W tym samym celu Buriaci zamieszkujący północną Azję zawieszali gałązki głogu nad kołyskami chorych dzieci [Karczmarczuk, 2011]. Ten sam efekt można było uzyskać nacierając klatkę piersiową dziecka owocami głogu. W województwie kieleckim twierdzono, że bogate owocowanie krzewów i drzew głogu przyniesie ostrą zimę, natomiast w województwie krakowskim mówiono, że krzew głogu ochrania ziemię przed uderzeniami piorunów [Kujawska i wsp., 2016]. Różne gatunki głogów były spożywane przez plemiona indiańskie. Irokezi zabierali na polowania ciasteczka z owoców głogu, a w plemieniu Czarnych Stóp podczas zbioru owoców Crataegus chrysocarpa obowiązywał ważny rytuał, który polegał na obdarowaniu tego drzewa miniaturowymi mokasynami z głogowych liści oraz łukiem i strzałami z jego cierni. Dopiero wtedy można było zrywać owoce głogu wierząc, że chronią one przed bólami brzucha [Łuczaj, 2014]. Słowiańska nazwa głóg pochodzi od greckiego słowa glóches co oznacza ostry koniec [Kujawska i wsp., 2016]. W różnych rejonach Polski stosuje się odmienne nazwy ludowe głogu. Ze względu na mączyste owoce, głóg jest czasami nazywany „babią mąką”, „bólimączką” lub „mącznikiem”. W rejonach Zamojszczyzny dla głogu stosuje się nazwę „kulasza”. Na terenach obecnego województwa podkarpackiego (dawniej woj. krośnieńskie) wciąż używana jest nazwa głogu „zajęcze gruszki”. We współczesnych czasach stosowane są fonetyczne modyfikacje nazwy głóg tj. „dług”, „głót”, „głuch”, „głuw” albo „góg”. W niektórych rejonach Polski owoce dzikiej róży (Rosa canina L.) są mylone z owocami głogu i oba te gatunki nazywane są powszechnie owocami głogu [Łuczaj i wsp., 2008].

I.2.1. Taksonomia głogu Crataegus spp.

Domena: Eucaryota (Jądrowce) Królestwo: Plantae (Rośliny) Podkrólestwo: Tracheobionta (Rośliny naczyniowe) Nadgromada: Spermatophyta (Rośliny nasienne) Gromada: Magnoliophyta (Rośliny okrytonasienne) Podgromada: Magnoliophytina Klasa: Rosopsida Podklasa: Rosidae (Ukęślowe) Nadrząd: Rosanae Rząd: Rosales (Różowce) Rodzina: Rosaceae (Różowate)

Podział Crataegus spp. został opracowany w oparciu o system klasyfikacji Reveala (1994 – 1999). Ze względu na dużą zmienność wewnątrzgatunkową i łatwość krzyżowania się na świecie istnieje ponad tysiąc gatunków Crataegus spp. rozprzestrzenionych przede wszystkim w Europie, Ameryce Północnej i Azji. Ze względu na intensywne krzyżowanie się poszczególnych gatunków Crataegus ich rozróżnienie bywa niezwykle trudne [Gostyńska- Jakuszewska, 1979]. Poliploidalność głogu była w ostatnich latach intensywnie badana w wyniku czego ustalono, że ilość jądrowego DNA dla różnych gatunków Crataegus mieści się w zakresie 2,74 ÷ 3,34 pg/2C, przy czym w przypadku nasion tetraploidalnego Crataegus coccinea, który rośnie w ogrodzie botanicznym UKW w Bydgoszczy, wynosiła 3,16 pg/2C [Jędrzejczyk & Śliwińska, 2010]. W Polsce występuje sześć gatunków głogu, w tym trzy pochodzenia mieszańcowego: Crataegus monogyna Jacq., C. laevigata (Poiret) DC, C. rhipidophylla Gandoger, który występuje w dwóch odmianach: C. curvisepala Lindm. oraz C. lindmanii Hrabetová. Do odmian krzyżowych należą: C. × pseudooxyacantha Cinovskis, C. × media Benchstein nothonvar. media, C. × subsphaericea Gandoger nothovar. subsphaericea [Sołtys-Lelek, 2012; Sołtys-Lelek & Gruszka, 2016]. W Parku Krajobrazowym Doliny Dolnej Wisły (obszar 33 500 ha od Pradoliny Toruńsko-Eberswaldzkiej w Bydgoszczy do delty w okolicach Gniewu) zostały zidentyfikowane trzy gatunki głogu: Crataegus monogyna Jacq., C. laevigata (Poiret) DC. oraz C. calycina Peterm. oraz jeden gatunek zagrożony C. curvisepala [Rutkowski & Krasicka- Korczyńska, 2003; Korczyński & Misiewicz, 2003]. Niemniej jednak dominującymi gatunkami głogu w Polsce są Crataegus monogyna Jacq. oraz C. laevigata (Poiret) DC [Zając & Zając, 2001].

I.2.2. Opis rośliny Crataegus spp.

Dojrzałe drzewa głogu mają wysokości nieco ponad 10 m oraz pień średnicy około 50 cm. Korę mają szarą, zwykle tarczkowatą lub łuskowatą. Głogi występują również w formie krzaków i niskich krzewów (Crataegus cuneata - 1,5 m). Korony głogów przybierają różne kształty. Charakterystyczną cechą większości głogów są ciernie występujące na długopędach. Mają one długość od około 0,5 cm do ponad 10 cm. Gatunek C. succulenta var. macracantha ma ciernie długości 14 cm. Pojedyncze liście głogu są skrętoległe oraz piłkowane. Najczęściej są one klapowane, których klapy mogą sięgać prawie do nerwu głównego (C. monogyna Jacq.). Gatunek głogu C. crus-galli posiada charakterystyczne liście, które są bez wcięć. Kwiaty głogu mają średnicy około 1 – 2 cm oraz są pięciopłatkowe. Pojedyncze kwiaty są najczęściej koloru białego (C. monogyna Jacq. oraz C. laevigata (Poiret) DC.). Kwiaty są zwykle zebrane w wielokwiatowe baldachogrony, które rozwijają się w kwietniu, maju lub na początku lata. Obupłciowe kwiaty posiadają 5 ÷ 25 pręcików oraz 1 ÷ 5 słupków. Owoce rzekome (pozorne) należą do typu głogowatego. Owoce te powstają z dna kwiatowego i zawierają wewnątrz twarde orzeszki, których ilość jest uzależniona od ilości słupków w kwiecie. Owoce głogu mają średnicy od około 0,5 cm do około 2,5 cm. Są one barwy czerwonej, ale również żółtej, pomarańczowej oraz czarnej (C. pentagyna). Owoce maja kształt kulisty lub elipsoidalny. Owoce głogu najwcześniej dojrzewają w sierpniu i szybko opadają [Seneta, 1994]. Na Rys. 1 przedstawiono fotografię drzewa Crataegus monogyna rosnącego w Bydgoszczy.

A B

Rys. 1. Fotografia drzewa Crataegus monogyna rosnącego w Bydgoszczy na Wysoczyźnie Świeckiej (A – fot. V 2014 r.) oraz gałązka głogowa z widocznymi dojrzałymi owocami (B – fot. X 2014 r.) (fotografia własna)

I.2.3. Zastosowanie owoców głogu

Ze względu na swój bogaty skład fitochemiczny, preparaty i środki lecznicze uzyskiwane z owoców głogu wykazują działanie kardioprotekcyjne, przeciwmiażdżycowe, przeciwdrobnoustrojowe ale również przeciwutleniające [Przybylska & Bazylak, 2017]. W celu produkcji preparatów farmakognostycznych zbiera się owoce rzekome zbierane przed pełnym dojrzeniem i kwiatostany zebrane w początkowym okresie kwitnienia Crataegus monogyna Jacq. (Lindm.) oraz Crataegus laevigata (Poir.) DC (syn. C. oxyacantha). Farmakopea Polska (wyd. X) dopuszcza również zbieranie krzyżówek ww. gatunków głogu lub ich mieszaniny. Owoce rzekome głogu nie mogą mieć mniej niż 0,06% procyjanidyn w przeliczeniu na chlorek cyjanidyny (C15H11ClO6). Zebrane owoce nie mogą mieć więcej niż 5% uszkodzonych owoców pozornych i nie więcej niż 2% innych zanieczyszczeń roślinnych, którymi mogą być inne gatunki Crataegus - C. nigra Waldst. et Kit., C. pentagyna Waldst. et Kit. ex Willd. oraz C. azarolus L. [Farmakopea Polska, wyd. X]. Na rynku polskim dostępne są produkty zawierające owoce głogu sprzedawane w postaci herbatek owocowych zawierających 100% owoc głogu oraz mieszanki ziołowe, w których suszone owoce zmieszano z innymi częściami roślin (kwiatostan głogu, owoce aronii, jabłko, kwiat hibiskusa). Dostępne są również pasteryzowane soki z owoców głogu, mieszanki soków głogu i jabłkowych, cukierki oraz tabletki powszechnie dostępne w aptekach lub sklepach zielarskich i ekologicznych. Na szczególną uwagę zasługuje również standaryzowany ekstrakt WS®1442 (Niemcy). Jest to etanolowy (45%) ekstrakt z owoców głogu zawierający 18,75% procyjanidyn, którym to właśnie przypisuje się najcenniejsze właściwości lecznicze [Zorniak i wsp., 2017]. Badania in vivo prowadzone na szczurach Wistar rodzaju męskiego dowodzą, że podawanie doustnej suplementacji szczurom w postaci ekstraktu WS®1442 w ilości 100 i 300 mg/kg/dzień przez 40 tygodni poprawia funkcję śródbłonka, który bierze udział w regulacji przepływu i ciśnienia krwi, a także kontroluje przepływ substancji odżywczych [Idris-Khodja i wsp., 2012; Tomczyk i wsp., 2013].

I.2.4. Skład chemiczny owoców głogu

Wiele badań potwierdza obecność w owocach głogu mikro- i makroelementów, witamin, związków polifenolowych oraz flawonoidowych, ale również cennych hydroksykwasów organicznych. Pomimo, że skład chemiczny miąższu owoców głogu został poznany to jednak brakuje informacji o stężeniu związków bioaktywnych w wodnych naparach sporządzonych z suszonych owoców głogu określających faktyczne spożycie hydroksykwasów organicznych, związków polifenolowych czy flawonoidowych w codziennej diecie. Owoce głogu są również źródłem dwóch podstawowych cukrów prostych: fruktozy i glukozy. Średnia zawartość fruktozy w owocach Crataegus pinnatifida wynosi 7,76 g/100g ś.m., a w C. brettschneideri 13,43 g/100g ś.m [Liu i wsp., 2010]. W tej samej pracy oznaczono zawartość sorbitolu w C. pinnatifida oraz w C. brettschneideri na średnim poziomie 7,69 g/100g ś.m. oraz 14,01 g/100g ś.m. Natomiast owoce C. germanica charakteryzują się niższym stężeniem glukozy (2,98 ÷ 9,99 mg/g) oraz fruktozy (1,97 ÷ 22,30 mg/g) w porównaniu z C. brettschneideri oraz C. pinnatifida [Edwards i wsp., 2012]. Natomiast owoce głogu są bardzo ubogie w lipidy. Wiele doniesień literaturowych wskazuje na obecność w owocach głogu

23 kwasów tłuszczowych, tj. trikozanowy (32,77%), linolowy (17,53%), oleinowy (13,92%) oraz palmitynowy (13,73%) [Kulczyński & Gramza-Michałowska, 2016]. Świeże, dziko rosnące owoce C. monogyna zawierają znaczne ilości potasu (4223 μg/g ś.m.), wapnia (3722 μg/g ś.m.), magnezu (987 μg/g ś.m.) oraz glinu (917 μg/g ś.m.) [Juranović Cindrić i wsp., 2015]. Z kolei zawartość wapnia, sodu oraz potasu w sokach sporządzonych z owoców C. oxyacantha spp. monogyna wynosi odpowiednio 399,1 ± 1,9; 406 ± 0,1 oraz 162,5 ± 1,9 mg/100g ś.m. Jednocześnie stwierdzono, że gatunek C. oxyacantha spp. monogyna charakteryzował się wyższym stężeniem analizowanych makroelementów w porównaniu z C. azarolus [Bahri-Sahloul i wsp., 2009]. W owocach C. oxyacantha L. zebranych ze stanowiska naturalnego w dawnym województwie kieleckim oznaczono Pb (2,12 μg/g), Cd (0,52 μg/g), Cu (8,35 μg/g), Mn (1,59 μg/g), Ni (2,07 μg/g), Co (1,99 μg/g) oraz Cr (2,51 μg/g) [Mirosławski i wsp., 1995]. W suplementach diety i mieszankach ziołowych zawierających suszone owoce głogu stwierdzono obecność mikroelementów w postaci Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, ale również metali toksycznych Pb oraz Hg [Arceusz i wsp., 2009; Przybylska i wsp., 2014; Bazylak i wsp., 2017 a, b; Przybylska i wsp., 2014] Owoce głogu są bogatym źródłem witaminy C oraz α, β, γ oraz δ-tokoferoli. Średnie stężenie α-tokoferolu wynosi 2,88 mg/100g ś.m., co stanowi jego największy udział procentowy - 85,45% [Morales i wsp., 2013]. Całkowite stężenie witaminy C Morales i wsp. (2013) oznaczyli na średnim poziomie 15,19 mg/100g ś.m. Podobne wyniki uzyskali Pande & Akoh (2010) analizując stężenie kwasu askorbinowego w owocach głogu (13,6 mg/100g ś.m.). Liczne prace wskazują na obecność hydroksykwasów organicznych w owocach głogu. Dominującym kwasem organicznym w owocach Crataegus spp. jest kwas jabłkowy (1460,0 mg/100g ś.m.), cytrynowy (17,1 mg/100g ś.m.) oraz bursztynowy (6,2 mg/100g ś.m.) [Pande & Akoh, 2010; Edwards i wsp., 2012]. Ponadto w dziko rosnących owocach C. monogyna stwierdzono obecność kwasu szczawiowego (57,40 mg/100g ś.m.) oraz kwasu fumarowego (0,31 mg/100g ś.m.) [Morales i wsp., 2013]. Z kolei w owocach C. aestivalis, C. opaca oraz C. rufula Chapman & Harvati (1991) zidentyfikowali również kwas chinowy. Nieliczne prace wskazują, że owoce głogu są źródłem kwasu szikimowego (0,23 mg/g s.m.) oraz kwasu winowego [Pereira i wsp., 2013; Edwards i wsp., 2012; Chapman & Horvat, 1991]. Z kolei wino sporządzone z owoców głogu jest również bogatym źródłem kwasu cytrynowego (3366,34 mg/L), bursztynowego (1791,17 mg/L), jabłkowego (646,74 mg/L), ale również kwasu mlekowego (0,28 mg/L) [Liang i wsp., 2009]. Owoce głogu są również bogatym źródłem związków polifenolowych oraz procyjanidyn [Mraihi i wsp., 2013; Froehlicher i wsp., 2009]. Zawartość antocyjanów w C. monogyna mieści się w zakresie 7,3 ÷ 16,2 mg/100g ś.m. wyrażonej jako ekwiwalent 3- glukozydu cyjanidyny [Plisza i wsp., 2016]. Antocyjany kumulują się w skórce owoców głogu (64,50 mg/100g) [Mraihi i wsp., 2013]. W owocach C. azarolus oraz C. monogyna rosnących na terenie Tunezji oznaczono również witeksynę w zakresie stężeń 4,83 ÷ 29,40 mg/100 ś.m. (C. azarolus) oraz w zakresie 6,60 ÷ 11,91 mg/100g ś.m. (C. monogyna) [Belkhir i wsp., 2013]. W owocach głogu zidentyfikowano również epikatechiny (105 mg/kg), hyperozyd (164 mg/kg), 3-glukozyd kwercetyny (408 mg/kg) oraz 3-glukozyd kamferolu (5,10 mg/kg) [Popovic-Milenkovic i wsp., 2014]. Ponadto w owocach głogu zidentyfikowano również związki triterpenowe oraz taniny [Chang i wsp., 2013]. Z kolei w skórce owoców C. monogyna Mraihi i wsp. (2015) zidentyfikowali 7-glukozyd apigeniny. Kumulowanie się związków

24 flawonoidowych w skórce owoców odgrywa istotną rolę ochronną komórek roślinnych przed promieniowaniem słonecznym UVB oraz gamma [Kovács & Keresztes, 2002]. Obecność licznych związków bioaktywnych w owocach głogu powoduje, że ekstrakty z nich uzyskiwane wykazują silne właściwości przeciwutleniające. Jednakże należy zaznaczyć, że liczne prace potwierdzające te właściwości prowadzone są przy użyciu świeżych owoców głogu, a następnie stopień wymiatania rodnika DPPH· oraz kationorodnika ABTS·+ był oznaczany w metanolowych lub acetonowych ekstraktach owoców głogu [Pliszka i wsp., 2016]. Brak jest jednak badań omawiających zawartość antyutleniaczy w wodnych naparach sporządzonych z suszonych owoców głogu oraz ich właściwości antyoksydacyjne przeznaczonych do spożycia przez osoby cierpiące na schorzenia układu sercowo-naczyniowego. Dzięki obecności związków polifenolowych, ekstrakty z owoców głogu wykazują silne właściwości przeciwdrobnoustrojowe. Hamowanie wzrostu bakterii Escherichia coli i Salmonella może być spowodowane obecnością w owocach głogu kwasu chlorogenowego, galusowego czy kawowego. Wiele prowadzonych badań sugeruje, że ekstrakty roślinne mają wyższą aktywność mikrobiologiczną przeciwko bakteriom Gram-dodatnim niż Gram- ujemnym [Przybylska & Bazylak, 2017]. Z kolei apigenina zawarta w owocach głogu wykazuje działanie przeciwgrzybiczne wobec Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae oraz Trichosporon beigelii (MIC 5 μg/mL) [Saleem i wsp., 2010]. Natomiast etanolowe ekstrakty z owoców Crataegus songrica wykazują wyraźne działanie przeciwko Aspergillus flavus, czy Fusarium solani [Tariq i wsp., 2014]. Kostić i wsp. (2012) zbadali aktywność etanolowego ekstraktu owocu głogu na działanie bakterii Gram-dodatnich (Streptococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633), Gram-ujemnych (Salmonella NCTC 6017, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027) oraz grzybów drożdżoidalnych i pleśniowych (Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404). Aktywność przeciwdrobnoustrojową oceniono na podstawie strefy hamowania wzrostu drobnoustrojów (mm). Największe aktywności uzyskano dla bakterii Pseudomonas aeruginosa (27 ± 0,2 mm) oraz Escherichia coli (22 ± 0,15 mm) stosując 50μL ekstraktu z owoców głogu o stężeniu 10 mg/mL. Nie wykazano aktywności przeciwdrobnoustrojowej dla Bacillus subtilis, Streptococcus aureus oraz Aspergillus niger. Podobne wyniki uzyskał Güven i wsp. (2006) analizując aktywność przeciwdrobnoustrojową dla Crataegus bornmülleri i Crataegus tanacetifolia stosując 50 μL ekstraktu z owoców głogu o stężeniu 10 mg/mL. W badaniach tych analizowano aktywność wyciągów wobec 28 różnych bakterii, 3 grzybów drożdżoidalnych oraz 9 grzybów pleśniowych. Dla 63% analizowanych drobnoustrojów aktywność przeciwdrobnoustrojowa była najwyższa dla Crataegus bornmülleri. Strefa zahamowania wzrostu szczepu bakterii Escherichia coli ATCC 25922 wyniosła 10 mm badając aktywność przeciwdrobnoustrojową dla owoców Crataegus tanacetifolia. Badania prowadzone przez zespół Benmalek i wsp. (2013) świadczą o braku aktywności przeciwdrobnoustrojowej Crataegus oxyacantha ssp monogyna wobec Escherichia coli (ATCC 25922) oraz Streptococcus aureus ATCC (43300). Ponadto stwierdzono, że owoce i liście C. oxyacantha ssp monogyna wykazują większą aktywność antybakteryjną wobec Pseudomonas aeroginosa (ATCC 25923) niż czerwona i biała cebula (Allium cepa).

I.3. Biosynteza, właściwości i występowanie patuliny

Patulina została wyodrębniona w 1943 r. z plesni Penicillium griseofulvum przez Birkinshaw i wsp. [Puel i wsp., 2010]. Początkowo związek ten był ceniony za właściwości antybiotyczne, gdyż hamuje on wzrost bakterii Gram dodatnich i Gram ujemnych [Ioi i wsp., 2017; Ciegler i wsp., 1971]. Dla jej określenia stosowane były nazwy: „penicydyna”, „klawiformina”, „klawatyna”, „klawacyna”, „miocyna”, „leukopina” oraz „kwas gigantowy” [Kolarzyk, 2016]. Po dwudziestu latach od odkrycia, patulinę będącą toksyną komórkową sklasyfikowano do grupy związków o nazwie mikotosyny [Ioi i wsp., 2017]. Termin „mikotoksyny” został wprowadzony w 1962 r. tuż po epidemii około 100 tysięcy indyków, które zatruły się paszą z orzeszków ziemnych zainfekowanych grzybami pleśniowymi Aspergillus flavus [Kolarzyk, 2016]. Patulina jest wtórnym metabolitem grzybów pleśniowych i pełni funkcję czynnika zwiększającego stopień agresywności danego szczepu czyli zdolności do zakażenia, kolonizowania i wykorzystywania pokarmów rośliny (jabłoni, głogu, dzikiej róży) [Puel i wsp., 2010]. Intensywność biosyntezy i bioakumulacji patuliny jest zdeterminowana przez czynniki biotyczne, określające relacje szczepu patulinotwórczego i zainfekowanej przez niego rośliny oraz czynniki abiotyczne takie jak wilgotność, temperatura, nasłonecznienie. W tym kontekście ilość patuliny może stanowić miarę agresywności danego szczepu grzybów pleśniowych, która jest zależna od: 1) progu infekcyjnego, 2) czasu trwania infekcji oraz 3) długości okresu inkubacji [Błaszkowski i wsp., 2010]. Patulina syntetyzowana jest przez strzępki grzybów z rodzaju Penicillium, Aspergillus, Byssochlamys, Peacilomyces [Abramson i wsp., 2009; Przybylska & Bazylak, 2013; Kolarzyk, 2016; Frisvad, 2018]. Najbardziej poznanym szczepem patulinotwórczym jest Penicillium expansum należące do rodziny Trichocomaceae. Grzyby strzępkowe namnażane są w szerokim zakresie temperatur (0 ÷ 42 °C) [Stępień i wsp., 2007]. Biosynteza patuliny przez grzyby strzępkowe Penicillium expansum jest kontrolowana przez zdelokalizowaną kasetę genową, która uruchamia kaskadę enzymatyczną, w której najważniejszą rolę odgrywają acetyloatransferaza (AT), dehydrataza (DH), ketoreduktaza (KR) [Puel i wsp., 2010]. Z punktu widzenia struktury chemicznej, patulina jest metabolitem poliketydowym. Patulinę klasyfikuje się jako polarny i silnie hydrofilowy dwupierścieniowy lakton, który bardzo dobrze rozpuszcza się w polarnych rozpuszczalnikach (Tabela 1). Wskutek tego prawdopodobnie prawie cała ilość patuliny występująca w surowcu roślinnym jest ekstrahowana do roztworu wodnego [Kadakal & Nas, 2003]. Mikotoksyna ta jest termostabilna w wysokich temperaturach, co powoduje, że pasteryzacja żywności oraz sporządzanie wodnego naparu nie eliminuje jej całkowicie. Okazuje się bowiem, że dopiero ogrzewanie produktu spożywczego w temp. 105 °C przez 29 h redukuje stężenie patuliny o 99%. Natomiast kilkusekundowa pasteryzacja powoduje jedynie obniżenie jej stężenia o około 18% [Kabak, 2009]. Patulina jest stabilna w środowisku kwaśnym (3,5 ÷ 5,5 pH) [Stępień i wsp., 2007], a przeprowadzone badania własne wykazały, że wodne napary uzyskane z suszonych owoców głogu charakteryzują się pH ~ 3,5. Zatem istotne jest, aby kontrolować zawartość patuliny w suplementach diety oraz mieszankach ziołowych, które mają w swoim składzie owoce głogu.

Tabela 1. Właściwości chemiczne i parametry molekularne patuliny [Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov; Chemicalbook.com; T3db.ca; Budavari, 1996]

Wzór Parametr C7H6O4

Nazwa systematyczna 4-hydroksy-4H-furo-(3,2-c)-piran-2-(6H)-on

Masa molowa 154,12 g/mol

Temp. topnienia 110,5 °C

Temp. wrzenia 197,5 °C OH Gęstość 1,20 g/mL

Współczynnik załamania światła 1,43 O Polaryzowalność 13,77 Å3 O Współczynnik podziału Kow - 2,40

logP - 1,0

pKa1 11,65

pKa2 - 4,3

Świeże produkty, na których widoczne są grzyby pleśniowe nie są zagrożeniem dla człowieka, ponieważ nie są one zjadane przez konsumentów. Sama obecność grzybów pleśniowych w żywności nie jest wystarczająca do biosyntezy i bioakumulacji patuliny. Sprzyjającymi warunkami do zainicjowania tych procesów są podwyższona temperatura otoczenia, zwiększona zawartość wody w surowcu roślinnym, mechaniczne uszkodzenie owoców przez owady lub osoby je zbierające, nieodpowiednie warunki ich przechowywania oraz transportu. Największe niebezpieczeństwo zdrowotne ze względu na zawartość patuliny stanowią przetworzone produkty spożywcze takie jak soki owocowe, żywność dla dzieci (przeciery) czy susze roślinne. Sposób transportu, metoda przechowywania, procesy suszenia lub mrożenia surowców wpływają nie tylko na obniżenie wartości odżywczej produktów, ale także na proces powstawania patuliny, która występuje głównie w jabłkach i ich przetworach (Tabela 2), ale również w owocach pigwy, soku pomarańczowym, wiśniowym, dżemie truskawkowym, marchewkach, oraz pomidorach [Cunha i wsp., 2009; Andersen i wsp., 2004]. Odsetek próbek badanych soków jabłkowych zanieczyszczonych patuliną w zależności od kraju może wynosić 10 ÷ 100%, natomiast maksymalne stężenia patuliny w tych produktach dochodzą nawet do 415 μg/kg (Tabela 2).

Oprócz drogi pokarmowej patulina może dostać się do organizmu poprzez drogi oddechowe, na przykład poprzez wdychanie pyłu przenoszonego wskutek silnych wiatrów znad obszarów leśniczych, rolniczych, winnic, sadów, plantacji, parków, terenów rekreacyjnych, rezerwatów przyrody lub wdychanie pyłów stanowiących zanieczyszczenie przechowywanych surowców roślinnych (zbóż, surowców zielarskich). Pomimo niskich ilości mikotoksyn w pyle, wchłanianie ich drogą oddechową może przyczynić się do zwiększenia ryzyka zatrucia nie tylko patuliną, ale także ochratoksyną A, deoksyniwalenonem oraz zearalenonem [Tangni & Pussemier, 2007].

Tabela 2. Występowanie patuliny w produktach otrzymywanych z jabłek w różnych krajach świata

Pozytywne Zakres stężenia Produkt Kraj Piśmiennictwo próbki* patuliny [μg/kg] 6/26 Funes & Resnik, jabłka (marmolada) 17 ÷ 39 Argentyna (23%) 2009 9/30 Kataoka i wsp., sok jabłkowy 1,35 ÷ 14,61 Japonia (30%) 2009 7/9 sok jabłkowy 3,2 ÷ 12,6 Portugalia Cunha i wsp., 2009 (78%) 28/64 Barreira i wsp., sok jabłkowy < LOQ ÷ 50,0 Portugalia (41%) 2010 sok jabłkowy dla dzieci 14/20 Murillo-Arbizu i 2,88 ÷ 27,09 Hiszpania powyżej 4. miesiąca (70%) wsp., 2010 15 sok jabłkowy < LOQ ÷ 90,3 (bd) Chiny Yuan i wsp., 2010 żywność przeznaczona dla 19/30 < LOQ ÷ 67,3 dzieci (63%) 2/25 sok jabłkowy 34,05 ÷ 36,81 Chiny Zhou i wsp., 2012 (8%) sok jabłkowy 7/25 10,0 ÷ 25,0 (sok konwencjonalny) (28%) Hiszpania Piqué i wsp., 2013 sok jabłkowy 14/22 (Katalonia) < LOQ ÷ 50,0 (sok ekologiczny) (64%) 11/30 sok jabłkowy < LOQ ÷ 167,0 Tunezja Zaied i wsp., 2013 (37%) 64/72 Forouzan & sok jabłkowy < LOQ ÷ 151,2 Iran (88,9%) Madadlou, 2014 sok jabłkowy 15/15 0,80 ÷ 12,50 (sok konwencjonalny) (100%) Polak-Śliwińska i Polska 7/7 wsp., 2014 sok jabłkowy (ekologiczny) 1,22 ÷ 2,17 (100%) 5/6 sok jabłkowy 3,8 ÷ 28,4 (83%) 1/3 Vaclavikova i wsp., świeże jabłka 415,2 Czechy (33%) 2015 2/20 żywność dla dzieci 2,1 ÷ 5,0 (10%) 27/42 sok jabłkowy 4 ÷ 122,36 (64%) Zouaoui i wsp., Tunezja 17/34 2015 wieloowocowy sok 10 ÷ 55,70 (50%) sok jabłkowy, pomarańczowy, 3/20 z owoców mango, 10,0 ÷ 24,9 Chiny Ji i wsp., 2017 (15%) z owoców borówki 20/20 sok jabłkowy 5,8 ÷ 82,2 (100%) Hammami i wsp., Katar 5/12 2017 jabłka < LOQ ÷ 17,3 (42%) sok jabłkowy 12/50 21,0 ÷ 1839,0 Indie Pal i wsp., 2017 skórka z jabłek 35/35 10,0 ÷ 2559,0 15/29 sok jabłkowy < LOQ ÷ 120,5 Pakistan Iqbal i wsp., 2018 (52%) * - bd- brak danych

Doniesienia z lat 2007 – 2017 z Chin wskazują, że patulina występuje również w produktach z owoców głogu (Tabela 3). Pomimo tego, że różne gatunki drzew głogu występują powszechnie w wielu krajach świata (Meksyk, Włochy, Chiny, Hiszpania), a ich owoce są stosowane do rozmaitych celów spożywczych i leczniczych, brak jest dostępnych doniesień naukowych o ich zanieczyszczeniu patuliną. Maksymalne stężenie patuliny w produktach z owoców głogu dochodzi nawet do 206,88 μg/kg, co znacznie przekracza dopuszczalne stężenie patuliny w sokach owocowych (50 μg/kg), a odsetek próbek zanieczyszczonych patuliną w Chinach może wynosić 7,2 ÷ 132 % (Tabela 3).

Tabela 3. Zawartość patuliny w produktach zawierających owoce głogu

Pozytywne Zakres stężenia Produkt Kraj Piśmiennictwo próbki patuliny [μg/L] Produkty zawierające owoce głogu

produkty z jabłek i głogu 7,2% - Chiny Lu i wsp., 2008 suszone owoce głogu 8/25 (32%) 4,56 ÷ 38,77 Chiny Xiang i wsp., 2012 suszone produkty 2/20 (10%) 10,0 ÷ 24,9 Chiny Ji i wsp., 2017 z owoców głogu Napoje i soki z owoców głogu

napój z owoców głogu 6/43 (14%) 19,8 ÷ 206,88 Chiny Li i wsp., 2007 sok z owocu głogu 1/13 (7,7%) 12,26 Chiny Zhou i wsp., 2012 sok z owoców głogu 5/10 (50%) 0,50 ÷ 3,72 Chiny Yang i wsp., 2017

Po spożyciu patuliny w układzie pokarmowym następuje szereg niekorzystnych zmian prowadzących do jego owrzodzenia oraz zapalenia jelit i żołądka. Podwyższona reaktywność patuliny względem glutationu i tioaminokwasów powoduje, że łatwo tworzy rozmaite kowalencyjne addukty z grupami tiolowymi występującymi w białkach i aminokwasach [De Champdoré i wsp., 2007]. Na przykład u myszy eksponowanych na patulinę przez 8 tygodni stwierdzono podwyższone stężenie disiarczku glutationu, reaktywnych form tlenu, karbonylowanych białek i substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym, przy czym obniżała się aktywność enzymów antyoksydacyjnych (peroksydazy glutationowej i reduktazy glutationowej), co zmniejszało zdolności obronne komórek przed wolnymi rodnikami [Pal i wsp., 2017]. W badaniach z użyciem mysich komórek zarodkowego nerwiaka współczulnego (ang. neuroblastoma) wykazano, że patulina wytworzona przez Penicillium roqueforti powoduje dysfunkcję lizosomów i mitochondriów oraz spadek stężenia komórkowego ATP [Malekinejad i wsp., 2015]. W 2004 r. na terenie Belgii stwierdzono, że patulina wytworzona przez szczepy Aspergillus flavus w kiszonkach i paszach z kukurydzą spowodowała wystąpienie masowego zjawiska degeneracji neuronalnej u cieląt [Pal i wsp., 2017]. Ze względu na właściwości genotoksyczne, neurotoksyczne oraz immunotoksyczne, Rozporządzenie Komisji Europejskiej Nr 1881/2006 z dnia 19 grudnia 2006 r. określa dopuszczalne stężenie patuliny w sokach owocowych, koncentratach soków owocowych po rozcieńczeniu wodą, w nektarach owocowych oraz napojach spirytusowych na poziomie 50 μg/kg. Natomiast w produktach z jabłek na poziomie 25 μg/kg oraz w produktach przeznaczonych dla niemowląt 10 μg/kg. Z kolei Komitet Naukowy ds. Żywności (JECFA) na posiedzeniu w dniu 8 marca 2008 r. zatwierdził najwyższe tymczasowe tolerowane dzienne

29 pobranie (PMTDI, ang. Provisional Maximum Tolerable Daily Intake) patuliny z żywnością na poziomie 0,4 μg/kg masy ciała. Mając na względzie limit dziennego pobrania patuliny z żywnością, należy kontrolować produkty spożywcze i surowce roślinne stosowane w lecznictwie oraz wprowadzać ograniczenia zawartości patuliny w środkach spożywczych, aby nie zwiększać dziennego spożycia patuliny z żywnością.

I.4. Analiza patuliny w jabłkach oraz owocach głogu i ich produktach

I.4.1. Metody ekstrakcji patuliny

Podczas ekstrakcji patuliny z próbek żywności, jednym z problemów jest jej występowanie na bardzo niskim poziomie (μg/kg). Dlatego metody ekstrakcji, jak również oznaczania patuliny powinny być proste, szybkie, powtarzalne, wydajne oraz przede wszystkim charakteryzować się niską granicą wykrywalności [Śliwińska i wsp., 2011]. Jednocześnie, kolejnym wyzwaniem podczas ekstrakcji patuliny z soków jabłkowych oraz z owoców głogu jest występowanie w analizowanych produktach związków o podobnej budowie chemicznej. Wysoka temperatura suszenia owoców głogu, pasteryzacja soków owocowych, środowisko kwaśne oraz długi czas przechowywania surowców przyspiesza reakcję cukrów redukujących występujących w owocach z aminokwasami, peptydami oraz białkami zawierających wolne grupy aminowe, co w konsekwencji prowadzi do powstania nowych związków chemicznych w soku owocowym [Polak-Śliwińska i wsp., 2013; Barreira i wsp., 2010]. Przykładem takiego związku jest 5-hydroksymetylofurfural (HMF), który jest produktem reakcji Maillarda (reakcje nieenzymatycznego brązowienia). Patulina i 5-HMF mają maksimum absorpcji przy długości fal λ = 270 nm) [Barreira i wsp., 2010]. Struktura chemiczna oraz zbliżona masa molowa 5- HMF (126,11 g/mol) i patuliny (154,12 g/mol) powodują, że rozdzielenie obu związków jest trudne w procesach ekstrakcji. Wiarygodne oznaczenie patuliny w owocach i sokach owocowych jest uwarunkowane dokładną separacją 5-HMF oraz patuliny.

I.4.1.1. Ekstrakcja patuliny z produktów zawierających jabłka

Na przestrzeni ostatnich kilku dziesięciu lat, najczęściej stosowaną metodą ekstrakcji patuliny z soków owocowych oraz jabłek i ich przetworów jest ekstrakcja w układzie ciecz- ciecz (LLE) za pomocą octanu etylu. Niewątpliwie ze względu na pracochłonność oraz konieczność stosowania dużych ilości toksycznych i łatwopalnych związków w ekstrakcji ciecz-ciecz, coraz więcej jest doniesień naukowych o wykorzystaniu w tym celu ekstrakcji w fazie stałej SPE. W Tabeli 4 przedstawiono przykładowe warunki ekstrakcji LLE stosowane do oznaczania patuliny z produktów zawierających jabłka. Proces pobierania oraz przygotowania próbek może stanowić nawet 2/3 czasu całej analizy. Wszelkie błędy wynikające z obu etapów mają niezwykle istotne znaczenie dla precyzyjnego wyniku [Namieśnik & Konieczka, 2009]. W związku z powyższym istotne jest, aby stosowane metody ekstrakcji były obarczone możliwie najmniejszym błędem analitycznym.

Tabela 4. Przykładowe metody ekstrakcji LLE patuliny z produktów zawierających jabłka

Poziom fortyfikacji Odzysk Produkt Rozpuszczalnik Kraj Piśm. [μg/kg] [%]

8 71 octan etylu/ 12 72 sok jabłkowy n-heksan, Portugalia Cunha i wsp., 2009 25 89 (95:5), v/v 50 88 sok jabłkowy, 10 95 żywność przeznaczona dla octan etylu Chiny Yuan i wsp., 2010 100 98 dzieci 10 sok jabłkowy dla dzieci Murillo-Arbizu i octan etylu 60 71,92 ÷ 83,4 Hiszpania powyżej 4. miesiąca wsp., 2010 120

sok jabłkowy 10 84,7 ± 7,6 Hiszpania (konwencjonalny, octan etylu 50 82,5 ± 2,4 Piqué i wsp., 2013 (Katalonia) ekologiczny) 100 90,5 ± 0,8 50 72 ± 7,2 sok jabłkowy octan etylu 100 77 ± 4,5 Tunezja Zaied i wsp., 2013 150 71 ± 8,1

Forouzan & sok jabłkowy octan etylu 50 86 Iran Madadlou, 2014

sok jabłkowy Polak-Śliwińska i (konwencjonalny, octan etylu bd bd Polska wsp., 2014 ekologiczny)

100 μg/mL sok jabłkowy, Zouaoui i wsp., octan etylu 150 μg/mL 86,46 Tunezja wieloowocowy sok 2015 300 μg/mL

sok jabłkowy Hammami i wsp., octan etylu bd bd Katar i jabłka 2017

50 sok jabłkowy octan etylu 100 85,5 ÷ 93,7 Pakistan Iqbal i wsp., 2018 200

W celu wyeliminowania problemów wynikających ze stosowania ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz, wielu badaczy zastępuje metodę klasyczną LLE ekstrakcją w fazie stałej SPE (Tabela 5). W pracy [Śliwińska i wsp., 2011] zostały omówione stosowane metody ekstrakcji patuliny z soków jabłkowych do roku 2011. W ostatnich latach coraz większą popularność w celu oznaczania patuliny z soków jabłkowych zyskały komercyjne kolumienki MycoSep®228AflaPat oraz MultiSep®228AflaPat (Tabela 5). Według deklaracji producenta wynika, że ze względu na ten sam rodzaj wypełnienia złoża (polarne i niepolarne wielofunkcyjne adsorbenty polimerowe), kolumienki MycoSep®228AflaPat oraz MultiSep®228AflaPat są dedykowane do oznaczania tej samej grupy związków, tj. aflatoksyn B1, B2, G1, G2 oraz patuliny. Różnice między opisywanymi kolumienkami wynikają jedynie z formatu kolumienki (MycoSep®228AflaPat – format przeciskania, MultiSep®228AflaPat – format strzykawki).

Tabela 5. Przykładowe metody ekstrakcji SPE patuliny z produktów zawierających jabłka

Poziom Produkt Kolumna SPE fortyfikacji Odzysk [%] Kraj Piśm. [μg/kg] 18 101 jabłka Funes & MultiSep®228AflaPat 30 99 Argentyna (marmolada) Resnik, 2009 60 99

1 92,5 ± 4,2 Kataoka sok jabłkowy SPME Japonia 10 94,4 ± 0,9 i wsp., 2009

Barreira sok jabłkowy Strata Si 20 53 ÷ 74 Portugalia i wsp., 2010

25 Catanâ i wsp., sok jabłkowy MycoSep®228AflaPat 50 88,40 ÷ 96,64 Rumunia 2011 100 25 93,7 ± 6,0/95,0 ± 3,0 PVPP Zhou i wsp., sok jabłkowy 50 89,4 ± 2,3/90,9 ± 1,9 Chiny MycoSep®228AflaPat 2012 250 96,7 ± 2,8/91,3 ± 1,5 Silici jabłka MycoSep®228AflaPat bd 96,4 Turcja & Karaman, 2014 sok jabłkowy, świeże jabłka, 10 Vaclavikova MycoSep®228AflaPat 70 ÷ 110 Czechy żywność dla 50 i wsp., 2015 dzieci 100 92 Anene i wsp., sok jabłkowy MIP®SPE 500 94 Tunezja 2016 1000 82 sok jabłkowy, pomarańczowy, z owoców I: PCAd+ MgSO4, 60 87,0 ± 1,8 mango, DE + MgSO4 120 86,5 ± 1,5 Chiny Ji i wsp., 2017 z owoców II: PriboFast®228 30 80,7 ± 6,7 borówki, sok cytrynowy

I.4.1.2. Ekstrakcja patuliny z produktów zawierających owoce głogu

W tabeli 6 przedstawiono zestawienie stosowanych metod ekstrakcji patuliny z produktów zawierających owoce głogu. Z prac dostępnych w naukowych bazach danych, wnioskować można że preferowaną metodą jest ekstrakcja SPE. W pracy Xiang i wsp. (2012) zastosowano klasyczną metodę w układzie ciecz-ciecz za pomocą octanu etylu, uzyskując odzysk na poziomie około 64%. Natomiast Zhou i wsp. (2012) oraz Li i wsp. (2007) w celu ekstrakcji patuliny z soków z owoców głogu wykorzystali komercyjne kolumienki MycoSep®228AflaPat uzyskując szeroki zakres odzysku patuliny 80,33 ÷ 104,44%. Natomiast w celu ekstrakcji patuliny z suszonych owoców głogu zastosowano mieszaninę dwóch adsorbentów: propyletylenodiamina (PSA) oraz diatomit (DE) z MgSO4, a następnie kolumienkę wypełnioną multifunkcyjnym adsorbentem (PriboFast®228) [Ji i wsp., 2017].

Tabela 6. Metody ekstrakcji patuliny z produktów zawierających owoce głogu

Poziom Produkt Ekstrakcja fortyfikacji Odzysk [%] Kraj Piśm. [μg/kg] Produkty zawierające owoce głogu produkty z brak Xu i wsp., owoców LLE (octan etylu) 95,2 ÷ 107,1 Chiny danych 2008 głogu produkty z brak Yang i wsp., owoców SPE (MycoSep®228AflaPat) 76,0 ÷ 95,3 Chiny danych 2009 głogu produkty z LLE (octan etylu) brak Zhou & Wu, owoców 70 ÷ 117 Chiny SPE (SLH) danych 2010 głogu 20 64,5 suszone Xiang LLE (octan etylu) 100 64,6 Chiny owoce głogu i wsp., 2012 400 63,9 suszone I: PCAd+ MgSO4, 60 90,5 ± 2,0 produkty Ji i wsp., DE + MgSO4 120 91,7 ± 3,1 Chiny z owoców 2017 II: (SPE: PriboFast®228) 30 118,5 ± 3,1 głogu Napoje i soki z owoców głogu napój z 10 80,33 ÷ 104,44 Li i wsp., owoców SPE (MycoSep®228AflaPat) 31,25 85,24 ÷ 91,06 Chiny 2007 głogu 62,50 86,41 ÷ 95,29 25 96,0 ± 2,2/96,1 ± 3,7 sok z owocu I: SPE (PVPP) Zhou 50 95,6 ± 2,1/90,7 ± 1,2 Chiny głogu II: SPE (MycoSep®228AflaPat) i wsp., 2012 250 100 ± 1,4/100,2 ± 1,4 sok z 5 95,7 ± 4,9 Yang i wsp., owoców Oasis MAX 96-well plate 25 94,2 ± 5,7 Chiny 2017 głogu 50 93,9 ± 3,6

I.4.2. Metody oznaczania patuliny

I.4.2.1. Oznaczanie patuliny w produktach zawierających jabłka

Wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HPTLC) stosowana do oznaczania patuliny z soków jabłkowych jest pomocną techniką służącą do monitorowania przebiegu retencji oraz doboru eluentu do chromatografii kolumnowej. W pracy [Przybylska & Bazylak, 2013] zostały omówione problemy oznaczania patuliny do roku 2013. W ostatnich latach metoda TLC jest nadal stosowana w celu oznaczeń ilościowych, jak również jakościowego wykrywania patuliny. Oznaczanie patuliny w sokach jabłkowych metodą TLC na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym SIL G-25HR opisano w pracy Welke i wsp. (2009), gdzie oprócz roztworu MBTH zastosowano roztwór woda-kwas mrówkowy (1:9, v/v) co zwiększało stopień wizualizacji patuliny w świetle UV (366 nm) i pozwoliło na uzyskanie granicy oznaczalności na poziomie 14 μg/L. Ismaiel & Papenbrock (2014) zastosowali metodę TLC w celu oznaczenia patuliny z próbki gleby pobranej na polu, na którym uprawiana była kukurydza. Autorzy zastosowali płytkę pokrytą żelem krzemionkowym GF-254 oraz mieszaninę toluen:octan etylu:kwas mrówkowy 98% (25:20:5, v/v) jako fazę ruchomą. Z kolei w celu jakościowego oznaczenia patuliny w orzeszkach piniowych zastosowano płytkę TLC pokrytą

33 adsorbentem o znanym charakterze oraz użyto w/w eluent [Sharma i wsp., 2015]. Płytki TLC spryskano 2,0% roztworem chlorowodorku fenylohydrazyny oraz ogrzewano w temp. 110 °C przez 5 min. w celu uzyskania zabarwionego produktu reakcji z patuliną. Jednak w celu ilościowego oznaczenia patuliny wykorzystano wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). Spośród 58 próbek orzeszków piniowych tylko 4 były zainfekowane patuliną w zakresie stężeń 62,09 ÷ 70,32 μg/kg, co stanowiło 6,89% wszystkich analizowanych próbek. Wright i wsp. (2014) zastosowali metodę TLC w celu opracowania testów monitorujących degradację patuliny z wykorzystaniem szczepu grzyba Rhodosporidium kratochvilovae LS11, który należy do środka kontroli biologicznej. W toku badań stwierdzono, że jednym z nietoksycznych produktów biodegradacji patuliny jest kwas dezoksypatulinowy. W badaniach wykorzystano płytkę TLC pokrytą żelem krzemionkowym 60 F254, a mieszaninę toluen:octan etylu:kwas mrówkowy 98% (25:20:5, v/v) jako fazę ruchomą. Po rozwinięciu chromatogramu i wysuszeniu, płytki TLC zostały spryskane 0,5% roztworem chlorowodorku 3-metylo-2- benzotiazolinonu (MBTH) oraz ogrzewano w temp. 120 °C przez 15 min. [Wright i wsp., 2014]. Obecnie w celu ilościowego oznaczenia patuliny stosuje się technikę wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z wykorzystaniem kolumny octadecylosilanowej C18. Przykładowe metody technik analitycznych stosowanych do oznaczania patuliny w jabłkach i sokach jabłkowych przedstawiono w Tabeli 7. Stosowane są również prekolumny, które powodują obniżenie stężenia związków przeszkadzających (zmniejszenie efektu matrycowego) [Da Silva i wsp., 2007]. W celu oznaczenia patuliny w sokach jabłkowych oraz suszonych TM owocach głogu Ji i wsp. (2017) zastosowali jako kolumnę rozdzielczą Waters Xbridge C18, TM a jako prekolumnę Xbridge C18. Podobnie Funes & Resnik (2009) jako kolumnę rozdzielczą ® zastosowali Zorbax SB-C18, a jako przedkolumnę BDS Hypersil-C18. W ostatnich latach poszukuje się nowych metod analitycznych służących do oznaczania patuliny w surowcach roślinnych.

Tabela 7. Przykładowe warunki analiz chromatograficznych stosowanych do separacji i oznaczania patuliny w produktach zawierających jabłka

LOD Technika Rodzaj kolumny Faza ruchoma Detektor Piśm. [μg/kg] ® Zorbax SB-C18 (150 × 4,6 mm, 5 μm), VWD Funes HPLC woda/acetonitryl 2,8 BDS Hypersil-C18 275 nm & Resnik, 2009 (10,0 × 4,0 mm, 5 μm) woda/acetonitryl ESI+ Kataoka LC-MS Synergy MAX-RP 80A 0,03 (80/20), v/v ESI- i wsp., 2009 Supelco SLB-5MS Cunha GC/MS gas nośny – hel MSD-5973N 0,53 (30 m × 0,25 mm, 0,25 μm) i wsp., 2009 tetraboran sodu (33,3/66,6 mM)/ 560 oraz 645 mm, 75 μm DAD MEKC dodecylosiarczan 0,7 (kapilara) 276 nm sodowy Murillo-Arbizu (5% acetonitryl) i wsp., 2010 Zorbax Eclipse XDB-C18 DAD HPLC (150 × 4,6 mm, 5 μm), brak danych 0,6 276 nm Tracer Extrasil ODS-2

Shim-pack VP-ODS C18 woda/acetonitryl UV Yuan i wsp., HPLC 1,2 (250 × 4,6 mm, 5 μm) (95/5), v/v 275 nm 2010 woda/acetonitryl/ Synergy Hydro-RP C18 PAD Barreira HPLC kwas nadchlorowy 0,82 (250 × 4,6 mm, 4 μm) 276 nm i wsp., 2010 (96/4/0,1), v/v acetonitryl/woda UV-VIS Catanâ i wsp., HPLC C18 (150 × 4 mm, 5 μm) 2,91 (5/95), v/v 276 nm 2011

Agela Venusil MP C18 acetonitryl/woda DAD Zhou i wsp., HPLC 3,99 (250 × 4,6 mm, 5 μm) (5/95), v/v 276 nm 2012

Spherisorb ODII C18 woda/acetonitryl UV Zaied i wsp., HPLC 100,0 (250 × 4 mm, 5 μm) (90/10), v/v 276 nm 2013

Nucleosil 100 C18 woda/acetonitryl UV/VIS Piqué i wsp., HPLC (250 × 4,6 mm, 5 μm), 1,0 (90/10), v/v 276 nm 2013 Teknokroma ODS Synergy Hydro RP 80A acetonitryl/woda SPD M20A brak Polak-Śliwińska HPLC (250 × 4,6 mm, 4 μm) (75/25), v/v 276 nm danych i wsp., 2014 Forouzan Synergy Hydro-RP C18 woda/acetonitryl UV HPLC 5,0 & Madadlou, (250 × 4,6 mm, 4 μm) (93/7), v/v 276 nm 2014 Zorbax SB Aq woda/acetonitryl DAD brak Silici & HPLC (250 × 4,6 mm, 5 μm) (96/4), v/v 276 nm danych Karaman, 2014

Spherisorb ODII C18 woda/acetonitryl UV Zouaoui i wsp., HPLC 17,0 (250 × 4 mm, 6 μm) (90/10), v/v 276 nm 2015 5mM octan UHPLC- HSS T3 Vaclavikova i amonu/woda (A) ESI- 0,5 MS/MS (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) wsp., 2015 metanol (B)

Nucleosil C18 acetonitryl/woda DAD Anene i wsp., HPLC 8,6 (250 × 4,0 mm, 5 μm), (90/10), v/v 276 nm 2016 TM Waters Xbridge C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm), acetonitryl/woda VWD HPLC TM 1,0 Ji i wsp., 2017 Xbridge C18 (90/10), v/v 276 nm (20 × 4,6 mm, 5 μm) metanol/woda/ LC- Nova-Pak C18 Hammami kwas octowy ESI- 1,0 MS/MS (150 × 3,9 mm, 4 μm) i wsp., 2017 (83,5/16/0,5), v/v acetonitryl/woda UV Iqbal i wsp., HPLC C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) 0,04 (10/90), v/v 276 nm 2018

I.4.2.2. Oznaczanie patuliny w owocach głogu oraz ich produktach

W literaturze nie ma wielu informacji dotyczących obecności patuliny w produktach z owoców głogu. Wszystkie dostępne publikacje opisujące ten problem pochodzą z terenu Chin (Tabela 8). Brak jest doniesień naukowych dotyczących zawartości patuliny w owocach głogu i produktach z nich przetworzonych w Europie oraz innych częściach świata, co stało się bezpośrednią przyczyną do podjęcia badań w tym kierunku. Obecnie najczęściej stosowaną metodą oznaczania patuliny z produktów zawierających owoce głogu jest HPLC. Stosując TM TM kolumnę rozdzielczą Waters Xbridge C18 oraz prekolumnę Xbridge C18 w celu oznaczania patuliny z suszonych owoców głogu uzyskano najniższy limit detekcji (1,0 μg/kg) [Ji i wsp., 2017]. W Tabeli 8 przedstawiono zestawienie wszystkich publikacji dostępnych w różnych bazach naukowych opisujących wykorzystywane techniki chromatograficzne służące do analizy patuliny z produktów zawierających owoce głogu.

Tabela 8. Przykładowe warunki analiz chromatograficznych stosowanych do separacji i oznaczania patuliny w owocach głogu oraz ich produktach

LOD Technika Rodzaj kolumny Faza ruchoma Detektor Piśm. [μg/kg] ® XTerra MSC18 UV Li i wsp., 2007 LC 0,8% tetrahydrofuran, v/v 3,0 (100 × 2,1 mm, 3,5 μm) 276 nm (a) brak HPLC brak danych brak danych 40,0 Xu i wsp., 2008 danych DAD HPLC brak danych brak danych 10,0 Lu, i wsp., 2008 276 nm brak Meng i wsp., HPLC brak danych 0,8% tetrahydrofuran, v/v 8,0 danych 2009

TM Yang i wsp., HPLC Atlantis dC18 brak danych ESI-MS 2,0 2009

Shiseido Capcell PAK C18 metanol (A) woda (B)/ Xiang i wsp., HPLC ESI-MS 3,0 MG III 5 mmol/L octan amonu 2010 Zhou & Wu, GC brak danych brak danych MS 9,6 2010

Agela Venusil MP C18 acetonitryl/woda (5/95), DAD Zhou i wsp., HPLC 3,99 (250 × 4,6 mm, 5 μm) v/v 276 nm 2012

TM Waters Xbridge C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm), acetonitryl/woda (90/10), VWD HPLC TM 1,0 Ji i wsp., 2017 Xbridge C18 v/v 276 nm (20 × 4,6 mm, 5 μm)

I.5. Właściwości i zastosowanie nanorurek węglowych w analizie mikotoksyn

Nanorurki węglowe jest to szczególny rodzaj cylindrycznych, nanometrycznych struktur węgla typu sp2. Pierwszy raz opisane zostały w 1991 r. przez Sumio Iijima w Japonii [Iijim, 1991]. Wyróżnia się jednościenne, dwuścienne oraz wielościenne nanorurki węglowe, które są zbudowane z pojedynczych zwiniętych warstw grafenu. Odległość między atomami węgla w nanorurce wynosi 0,144 nm, a w grafenie 0,141 nm. Średnica nanorurek węglowych wynosi od ułamka do kilkudziesięciu nm. Materiały te różnią się między sobą w zależności od sposobu uzyskiwania różnym stopniem rozwinięcia powierzchni, stopniem czystości, wymiarami i kątem skrętności powierzchni, co wpływa na ich właściwości mechaniczne, elektryczne oraz chemiczne [Ren i wsp., 2011]. Obecnie nanorurki węglowe uzyskuje się różnymi metodami. Jednościenna nanorurka węglowa powstaje poprzez wyładowanie w łuku elektrycznym czy laserowym parowaniu. Z kolei dwuścienne nanorurki węglowe są syntetyzowane przez otoczkowanie fulerenów C60 w środku jednościennej nanorurki węglowej. Umieszczone wewnątrz jednościennej nanorurki węglowej fulereny zostają poddane procesowi koalescencji, dzięki któremu powstaje wewnętrzna nanorurka. Wielościenne nanorurki węglowe składają się z koncentrycznych warstw grafenu, w których odległości pomiędzy warstwami wynoszą 0,34 nm. Poszczególne warstwy nanorurek oraz atomy węgla oddziałują między sobą siłami Van der Waalsa [Pietrzak & Jeszka, 2010]. Niezależnie od metody syntezy otrzymane nanorurki węglowe mogą przybierać postać skłębionych, poplątanych nanorurek węglowych zlepionych węglem amorficznym oraz w postaci rzędów równoległych nanorurek węglowych wyrośniętych na podłożu uprzednio pokrytym katalizatorem. Czystość nanorurek węglowych wynosi 50 ÷ 90%, co powoduje konieczność oczyszczenia nanomateriału z węgla amorficznego oraz resztek katalizatora przed dalszym ich zastosowaniem. Jednak czyszczenie nanorurek sprzyja powstawaniu defektów sieciowych: 1) topologicznych (tworzenie pięcio- lub siedmiokątnych pierścieni w strukturze nanorurki), 2) hybrydyzacyjnych (tworzenie wiązań o pośrednim stopniu hybrydyzacji) oraz 3) z brakiem atomu węgla w strukturze nanorurki [Mielcarek & Skupin, 2011], co zwiększa prawdopodobieństwo łączenia się niewysyconych atomów węgla nanorurki z atomami znajdującymi się w sąsiedztwie. Modyfikacja powierzchni nanorurki przez przyłączenie odpowiednich grup funkcyjnych, tj. -OH, -COOH oraz -NH2 pozwala na zwiększenie oddziaływań na granicy faz, co istotnie zmienia właściwości adsorpcyjne nanorurek węglowych w docelowym materiale [Mielcarek & Skupin, 2011]. Niemodyfikowane nanorurki węglowe mają charakter hydrofobowy, wykazują niewielką reaktywność i nie rozpuszczają się w rozpuszczalnikach polarnych i niepolarnych. Ze względu na porowatość i dużą powierzchnię właściwą, nanorurki węglowe są coraz częściej wykorzystywane do badania procesów adsorpcji na ich powierzchni jonów metali ciężkich (Pb, Ni, Cu) oraz związków organicznych stanowiących zanieczyszczenia środowiska [Ren i wsp., 2011]. W strukturze nanorurki węglowej wyodrębnia się dwa obszary, w których występują centra adsorpcji: 1) zwinięta płaszczyzna grafenu oraz 2) końcówki nanorurek węglowych (miseczki fulerenowe). Zamknięte zakończenia nanorurek węglowych, będące połową fulerenu, są bardziej reaktywne w porównaniu z powierzchnią boczną nanorurki węglowej. Natomiast w splątanej sieci nanorurek węglowych występują cztery miejsca, w których zachodzi proces adsorpcji zanieczyszczeń, znajdujące się: 1) na zewnętrznej powierzchni

37 zwiniętego grafenu, 2) na łączeniu się dwóch nanorurek, 3) wewnątrz kanalików nanorurek węglowych oraz 4) między poszczególnymi ściankami nanorurek (Rys. 2) [Ren i wsp., 2011].

1) zewnątrzpowierzchniowe

2) wśródbruzdowe

3) wewnątrzkanalikowe

4) międzyścienne

Rys. 2. Rozmieszczenie centrów adsorpcji na nanorurkach węglowych [Ren i wsp., 2011]

Dzięki swoim właściwościom elektrycznym, mechanicznym oraz znaczną odpornością chemiczną nanorurki węglowe znajdują coraz szersze zastosowanie. Nanomateriał ten coraz częściej jest stosowany w celu ekstrakcji pozostałości pestycydów [Du i wsp., 2008] antybiotyków w żywności [Lu i wsp., 2010] oraz związków organicznych w próbkach środowiskowych [Cai i wsp., 2003; Cai i wsp., 2005; Zhou i wsp., 2007]. Nieliczne prace wskazują na wykorzystanie nanorurek węglowych oraz funkcjonalizowanych nanorurek węglowych do oznaczania mikotoskyn w żywności. W celu analizy stężenia 21 mikotoksyn w kukurydzy oraz pszenicy wykorzystano MWCNTs. Oznaczono w/w próbkach toksyny trichotecynowe, pochodne zearalenonu, aflatoksyny oraz dwie ochratoksyny. Mieszanina 20 mg funkcjonalizowanych MWCNTs grupami karboksylowymi - COOH oraz 200 mg żelu krzemionkowego modyfikowanego oktadecylosilanem C18, stanowiąca wypełnienie kolumienki SPE umożliwiła uzyskanie odzysku analizowanych mikotoksyn w zakresie 84,0 ÷ 109,1% [Jiang i wsp., 2018]. W innych badaniach zastosowano wielościenne nanorurki węglowe funkcjonalizowane grupami karboksylowymi do ekstrakcji fumonizyny, aflatoksyny B1, ochratoksyny A i B, toksyny T-2 oraz zearalenonu w próbkach mąki kukurydzianej, mleka w proszku oraz piwie [Du i wsp., 2018]. Do tej pory wielościenne nanorurki węglowe nie zostały zastosowane do izolacji patuliny z soków owocowych. Celem niniejszej pracy jest zaprezentowanie możliwości analitycznych wielościennych nanorurek węglowych jako selektywnego adsorbentu względem patuliny. Dotychczas nie podjęto próby zastosowania wielościennych nanorurek węglowych do selektywnej ekstrakcji SPE patuliny z soków jabłkowych oraz z soków z owoców głogu.

II. Cel, hipotezy i zakres pracy

Produkty spożywcze zawierające surowe bądź przetworzone owoce głogu można przy obecnym stanie wiedzy z pewnością zaliczyć do nutraceutyków czyli do żywności, która przynosi korzyści terapeutyczne lub korzyści prozdrowotne. Ciągle zwiększające się wymagania dotyczące bezpieczeństwa zdrowotnego nutraceutyków i żywności funkcjonalnej spowodowały, że w swojej pracy doktorskiej podjęłam niezwykle istotny problem związany: 1) z opracowaniem nowych chromatograficznych metod mikroanalitycznych przydatnych do szybkiej oceny zawartości niewielkich ilości patuliny (< 10 μg/kg) w sokach, suplementach diety i mieszankach ziołowych uzyskanych z owoców głogu, a także 2) z poznaniem zmienności wybranych wskaźników higienicznych, profilu niektórych bioaktywnych metabolitów wtórnych i składu podstawowych mikroelementów w owocach głogu i ich produktach, co mogłyby stanowić łącznie użyteczne kryterium w procesie monitorowania i standaryzacji ich jakości, a także pozwoliłoby na ograniczenie stopnia bioakumulacji patuliny.

W szczególności celem podjętych badań było sprawdzenie: 1) czy nanorurki węglowe mogą być wykorzystane do selektywnej ekstrakcji patuliny metodą SPE z soków jabłkowych oraz z soków z owoców głogu, 2) czy metoda HPTLC może być wykorzystana do monitorowania i skriningu patuliny we wspomnianych sokach owocowych, 3) czy konwencjonalne wskaźniki jakości higienicznej, zmiany profilu antyoksydantów, kwasów niskocząsteczkowych oraz wybranych mikroelementów mogą mieć związek z obserwowaną ilością patuliny w suplementach diety oraz mieszankach ziołowych, 4) dziennego pobrania polifenoli, procentu realizacji zalecanego dziennego spożycia (RDA) dla cynku, miedzi i żelaza oraz wystarczającego dziennego spożycia (AI) dla manganu w wyniku konsumpcji naparów sporządzonych z badanych produktów, 5) jaka jest faktyczna, niepoznana dotychczas, zawartość patuliny w komercyjnych suplementach diety i mieszankach ziołowych w celu obliczenia potencjalnie maksymalnego tolerowanego dziennego spożycia PMTDI patuliny wraz z naparami wodnymi sporządzonymi z tych produktów, 6) jaki jest wpływ odmiany gatunkowej Crataegus na zawartość patuliny w owocach głogu zebranych ze stanu naturalnego.

III. Materiał badawczy

Materiał badawczy stanowiły łącznie 44 produkty w postaci:

1) suplementów diety lub produktów zielarskich zawierających w y ł ą c z n i e suszone owoce głogu (n = 14) określanych w treści rozprawy jako PRODUKTY JEDNOSKŁADNIKOWE (PJ),

2) mieszanek ziołowych, które zawierały suszone owoce głogu oraz rozdrobnione części innych roślin leczniczych (n = 6) określanych w treści rozprawy jako PRODUKTY WIELOSKŁADNIKOWE (PW) oraz

3) dojrzałych i nieuszkodzonych owoców zebranych z dziko rosnących drzew głogu należących do gatunku Crataegus monogyna (Bydgoszcz, Fordon i Bartodzieje) oraz C. laevigata i C. rhipidophylla (Ojcowski Park Narodowy) określanych w treści rozprawy jako owoce ze STANU NATURALNEGO (ZN) (n = 24).

Produkty jedno- i wieloskładnikowe, pochodzące z różnych rejonów Polski (Rys. 3) zostały zakupione w bydgoskich aptekach, sklepach zielarskich oraz supermarketach. Owoce z drzew dziko rosnących zerwano na przełomie IX/X 2016 r., które następnie przechowywano w temp. -20°C (C. monogyna) oraz suszono metodą napowietrzną (C. laevigata i C. rhipidophylla). Pełną charakterystykę i skład omawianych produktów PJ i PW oraz procedurę wykonania wodnych naparów, jakie zostały użyte w badaniach, przedstawiono w trzech publikacjach będących podstawą niniejszej rozprawy doktorskiej [Przybylska & Bazylak, 2017; Przybylska & Bazylak, 2018; Przybylska i wsp., 2019]. W Tabeli 9 przedstawiono symbole i nazwy badanych produktów stosowane w publikacjach wchodzących w skład niniejszej rozprawy.

Tabela 9. Symbole produktów użytych w badaniach własnych oraz ich oznaczenia stosowane w publikacjach wchodzących w skład niniejszej rozprawy

Publikacja [P-3] Publikacja [P-4] Publikacja [P-5]

Przybylska & Bazylak, 2017 Przybylska & Bazylak, 2018 Przybylska i wsp., 2019

Zeszyty Naukowe Journal of Agriculture and Journal of Analytical Methods Uniwersytetu Przyrodniczego Environmental Science, in Chemistry, 2019, 2019,

we Wrocławiu, Rolnictwo, 2018, 7 (2), 131-142, Article ID 2159097, 1-13, 2017, 119 (626), 101-114 doi: 10.15640/jns.v7n2a14 doi: 10.1155/2019/2159097

Ocena jakości Bioactive compounds in Adventageous extraction, mikrobiologicznej suszonych aqueous infusions of dietary cleanup and UHPLC-MS/MS owoców i kwiatostanu głogu supplements and herbal detection of patulin mycotoxin (Crataegus spp.) blends containing dried in dietary supplements and stosowanych jako hawthorn fruits or hawthorn herbal blends containing suplementy diety inflorescence hawberry from Crataegus spp. (Crataegus spp.) G1, G2, G3, G4, G5, G6, SUPLEMENTY DIETY G1, G2, G3, G4, G5, FG1, FG2, FG3, FG4, FG5, G14, G15, G27, K1, K17, K24, G6, G14, G15 FG6, FG14, FG15, I PRODUKTY ZIOŁOWE (PJ) K26, K28, MIESZANKI ZIOŁOWE (PW) G7, G13 FG7, FG13 K23, G7, G13, K14, K18, K19 OWOCE Z DRZEW G23, G24, G25, G26, G27, - - DZIKOROSNĄCYCH (ZN) G28, F1 – F15

Rys. 3. Regiony Polski, z których pochodził materiał badawczy zawierający owoce głogu

Klarowany sok jabłkowy (The Coca cola Company, Cappy, Georgia, USA, n = 3) oraz sok z owoców głogu (EkoMedica, JaRo-Pol, Kozy, Polska, n = 3) został zakupiony w supermarketach na terenie Bydgoszczy. Oba typy badanych soków były pasteryzowane oraz zostały wyprodukowane z soków zagęszczonych. Na Rys. 4 przedstawiono schemat analiz wykonanych w ramach badań objętych niniejszą rozprawą doktorską.

Rys. 4. Schemat analiz w ramach badań objętych niniejszą rozprawą doktorską

IV. Wyniki

IV.1. Optymalizacja metody SPE-HPTLC do oznaczania patuliny

IV.1.1. Badanie rozdzielania patuliny w układzie HPTLC

Metoda wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej HPTLC dzięki swojej prostocie i niewielkim kosztom jest chętnie wykorzystywana do jakościowej i ilościowej analizy składu ekstraktów roślinnych lub płynów fizjologicznych uzyskiwanych metodą SPE [Fecka i wsp., 2001; Bazylak i wsp., 2000 a, b; Pobłocka-Olech i wsp., 2007; Pobłocka-Olech & Krauze-Baranowska, 2008]. Zasadniczym celem badań przedstawionych w publikacji będącej podstawą rozprawy doktorskiej [Przybylska & Bazylak, 2013] było opracowanie skriningowej metody rozdzielenia mieszaniny patuliny (PAT), 5-HMF, kwasu α-askorbinowego (KAS) i kwercetyny (QW), które stanowiły roztwór modelowy imitujący skład soku jabłkowego, poprzez dobór odpowiedniego adsorbentu na płytce HPTLC. W warunkach analizy HPTLC zastosowano trzy różne rodzaje adsorbentów 1) NanoAdamant, 2) Nano-SIL-20 oraz 3) Nano-Durasil-20 produkcji firmy Macherey-Nagel (Niemcy) w postaci niemodyfikowanego żelu krzemionkowego o nieregularnym uziarnieniu (średnica 2 ÷ 10 μm, porowatość 60 Å, specyficzna objętość porów 0,75 mL/g) nałożonego na płytki chromatograficzne o wymiarach 10 × 10 cm. Omawiane płytki HPTLC różniły się rodzajem materiału polimerowego, który wiązał warstwę żelu krzemionkowego z powierzchnią płytki szklanej. Chromatogramy rozwijano w planarnej komorze chromatograficznej DS II (10 × 10, Chromdes, Lublin) na dystansie 8 cm [Dzido & Soczewiński, 1990]. Płytki HPTLC spryskiwano 0,5% roztworem chlorowodorku 3-metylo-2- benzotiazolinonu (MBTH) oraz ogrzewano w temp. 100 °C przez 30 min. w celu uzyskania zabarwionego na żółto produktu reakcji z patuliną. Pozostałe składniki badanej mieszaniny modelowej tworzyły w reakcji z MBTH barwne produkty, które umożliwiały ich identyfikację oraz oznaczenie ilościowe po rejestracji densytogramów przy użyciu programu ScionImage v. 4.0.2. (Frederick, MD, USA) [Zarzycki i wsp., 2009; Zarzycki i wsp., 2010]. Stwierdzono, że najwyższą selektywność (α = 1,13 ÷ 5,73) i stopień rozdzielenia (Rs = 1,43 ÷ 9,11) patuliny od trzech w/w analitów wykazywał układ chromatograficzny z użyciem płytki pokrytej adsorbentem i fazy stacjonarnej Nano-SIL-20 oraz fazy ruchomej w postaci mieszaniny toluen:octan etylu:kwas mrówkowy 98% (25:20:5, v/v) (Rys. 11). Niestety w tym zoptymalizowanym ze względu na jego sprawność rozdzielczą (N = 3760, Ha = 0,02) układzie HPTLC czas rozwijania chromatogramu był najdłuższy i wynosił 37min. Jednak okazało się, że tylko w tym układzie HPTLC krzywa kalibracyjna (y = 20×10-3x + 2,97) przedstawiająca zależność intensywności zabarwienia plamki patuliny (y) od jej stężenia (x) w mieszaninie 2 modelowej w zakresie od 20 do 800 μg/L wykazywała przebieg prostoliniowy (R = 0,98).

Rys. 5. Densytogramy obrazujące rozdzielenie ekstraktu z mieszaniny modelowej na płytce Nano-SIL- 20 metodą SPE-HPTLC (S – start, 1 - kwas α-askorbinowy, 2 – 5-HMF, P- patulina, 3 – kwercetyna)

Dlatego wyselekcjonowany w powyżej omówiony sposób układ HPTLC zastosowano w kolejnym etapie badań dotyczących optymalizacji procesu ekstrakcji patuliny metodą SPE: 1) z modelowej mieszaniny (patulina, 5-HMF, kwercetyna, kwas α-askorbinowy), 2) z klarowanego soku jabłkowego oraz 3) z soku z owoców głogu. W każdym z badanych układów SPE-HPTLC pomiary powtarzano trzykrotnie dla każdego z w/w roztworów.

IV.1.2. Badanie ekstrakcji patuliny metodą SPE z roztworu modelowego

Celem tego etapu badań było porównanie selektywności i wydajności ekstrakcji patuliny z modelowej mieszaniny w postaci metanolowego roztworu patuliny (40, 100, 500 μg/L), 5-HMF (200 μg/L), kwercetyny (500 μg/L) oraz kwasu α-askorbinowego (500 μg/L) przy użyciu różnych komercyjnie dostępnych kolumienek SPE różniących się rodzajem adsorbentu i nowo opracowanej w badaniach własnych metody SPE, w której wykorzystano dwa rodzaje wielościennych nanorurek węglowych różniących się parametrami fizykochemicznymi. Wykaz zastosowanych w tym etapie badań kolumienek SPE przedstawiono w Tabeli 10. Natomiast w Tabeli 11 przedstawiono charakterystykę wielościennych nanorurek węglowych zastosowanych w badaniach własnych.

Tabela 10. Charakterystyka komercyjnych kolumienek SPE i skład eluentów wykorzystanych w badaniach ekstrakcji patuliny z roztworu modelowego

Nazwa Producent Wypełnienie M Wys. Śr. K. Obj. Wlk Śr. Pow. Eluent [mg] [mm] [mm] [mL] [μm] [nm] [m2/g] hydrofilowo- Speedisc® Column J. T. Baker, lipofilowy polimer 1 mL eter 50 4 8 3 15 20 bd H2O-Philic DVB (PA, USA) diwinylo- dietylowy benzenowy 3 × 2,5 mL żel krzemionkowy heksan/octan J. T. Baker, Octadecyl C18 modyfikowany 500 16 8 3 40 6 489 etylu/aceton (PA, USA) oktadecylo-silanem (1:5:4, 1:4:5, 1:3:6, v/v) polimer z AFFINIMIP® Polyintell 2 mL octan nadrukiem 100 5 8 3 25-80 bd bd SPE (Francja) etylu cząsteczkowym Argonaut hydrofilowy 0,5 mL Evolute ABN Technologies 25 4 5 1 30 5 497 polimer metanol (CA, USA) mieszanina złoże analizowanego Puri-Fast® AFP Extra LIBIOS immunoafinitywne bd 62 8 bd bd bd bd soku Clean Up (Francja) (filtracja żelowa) i acetonitrylu (1:5) mieszanina mieszanina polarnych i analizowanego MultiSep® Romer Labs niepolarnych 3000 30 13 10 bd bd bd soku 228 AflaPat (DE, USA) wielofunkcyjnych i acetonitrylu adsorbentów (1:3) polimerowych Pow. – powierzchnia właściwa, Śr. – średnica porów, Wlk – wielkość cząstek, Obj. – objętość kolumienki, Ś. K. – średnica kolumienki, Wys. – wysokość złoża, M – masa wypełnienia, bd – brak danych

Tabela 11. Charakterystyka wielościennych nanorurek węglowych (CN1 oraz WC), kolumienek SPE i skład eluentów wykorzystanych w badaniach ekstrakcji patuliny z roztworu modelowego

Parametry nanorurek Parametry kolumienek SPE Eluent Nazwa Producent Dł Śr Pow Cz M Wys Śr k O [μm] [nm] [m2/g] [%] [mg] [mm] [mm] [mL] Nanorurki 2 mL Sigma Aldrich węglowe acetonitryl/ 677248-5G 0,1 ÷ 10,0 2 ÷ 6 200 90 50 6 8 3 wielościenne woda (MO, USA) (CN1) (1:1, v/v) Nanorurki 2 mL Sigma Aldrich 30 4 węglowe acetonitryl/ 659258-2G 5 ÷ 9 110 ÷ 170 200 90 8 3 wielościenne woda (MO, USA) (WC) 50 6 (1:1, v/v) Dł – długość, Śr – średnica, Pow – powierzchnia właściwa, Cz – czystość, M – masa wypełnienia, Wys – wysokość złoża, Ś k – średnica kolumienki, O – objętość kolumienki

Do wykonania procesu SPE stosowano wielostanowiskowy system Baker-SPE-12G (USA) oraz pompę próżniową KNF Neuberger (Niemcy). Końcowe ekstrakty uzyskane w każdej z badanych metod SPE były każdorazowo zatężane w strumieniu helu i kontrolowanej temperaturze przy użyciu wielostanowiskowego koncentratora MiniVap-6MV (Supelco, Bellofonte PA, USA) i mikropłaszcza grzejnego z regulatorem mocy (Chem-Land, Polska). Identyfikację patuliny oraz oznaczenie jej ilości w zatężonych ekstraktach wykonano metodą HPTLC z wykorzystaniem płytek szklanych Nano-Sil-20 według procedury opisanej poprzednio w punkcie IV.1.1. Warunki ekstrakcji patuliny SPE z modelowej mieszaniny w przypadku kolumienki Octadecyl C18 zostały dobrane na podstawie metody Li i wsp. (2007, b). W przypadku ® kolumienek Speedisc Column H2O-Philic DVB oraz Evolute ABN dobrano eluenty na podstawie pracy, odpowiednio, Gökmen i wsp. (2005) oraz Ito i wsp. (2004). Z kolei dla kolumienek MultiSep®228 AflaPat, AFFINIMIP®SPE oraz Puri-Fast® AFP Extra Clean Up stosowano warunki ekstrakcji zgodnie z zaleceniami producentów (Tabela 10). Schematy przebiegu czynności wykonywanych w trakcie analizy w danym układzie SPE zostały zaprezentowane na Rys. 7 ÷ 10, gdzie w miejscu próbki soku stosowano roztwór modelowy. Tabela 12 przedstawia odzysk patuliny oraz 5-HMF, kwercetyny i kwasu α- askorbinowego wraz z granicą wykrywalności poszczególnych analitów przy użyciu zastosowanych kolumienek SPE. W zastosowanych warunkach analizy każda z sześciu użytych w badaniach komercyjnych kolumienek SPE zatrzymywała na swoim złożu kwas α-askorbinowy, co było cechą korzystną ze względu na zwiększenie stopnia czystości końcowego ekstraktu. W przypadku kwercetyny pięć komercyjnych kolumienek SPE w zastosowanych warunkach analizy zatrzymywało całkowicie na swoim złożu ten analit. Jedynym wyjątkiem w tym ® przypadku były kolumienki Speedisc Column H2O-Philic DVB, na których kwercetyna była zatrzymywana jedynie w 25%. Zwiększona wartość odzysku 5-HMF uzyskana na kolumienkach MultiSep®288 AflaPat i AFFINIMIP®SPE, odpowiednio, 86 i 90%, w przeciwieństwie do deklaracji producentów [Affinimip application note, 2013, 2014], nie potwierdziła wysokiej selektywności zastosowanych w nich adsorbentów. Natomiast na ® kolumienkach Octadecyl C18, Speedisc Column H2O-Philic DVB i Evolute ABN stopień zatrzymywania 5-HMF był zwiększony, co spowodowało, że odzysk tego analitu zmieniał się

44 w zakresie od 63 do 72 %. Maksymalny stopień adsorpcji 5-HMF obserwowano w przypadku kolumienek Puri-Fast® AFP Extra Clean Up, gdzie stopień odzysku tego analitu wynosił 21%, co w połączeniu z wysokim stopniem odzysku patuliny (96%) na tych kolumienkach powoduje, że stanowią one prawdopodobnie optymalny wybór do ekstrakcji tej mikotoksyny z roztworów wodnych. W przypadku patuliny najniższy odzysk tego analitu, który wynosił ok. 63%, uzyskano na kolumienkach Evolute ABN (Tabela 12). Najwyższy odzysk tego analitu uzyskano stosując ® ® kolumienki Speedisc Column H2O-Philic DVB i Puri-Fast AFP Extra Clean Up wynoszący, odpowiednio, 99 i 96%. Zmniejszony do ok. 85% odzysk patuliny (przy poziomie fortyfikacji 500 μg/L) uzyskano w przypadku kolumienki AFFINIMIP®SPE, MultiSep®228 AflaPat i Octadecyl C18, odpowiednio, 86 i 82 i 78%. Odzysk patuliny w tym przypadku był zbliżony do wartości uzyskiwanych na kolumienkach wypełnionych nanorurkami węglowymi CN1 i WC (ok. 85%).

Tabela 12. Wartości odzysku (%), względnego odchylenia standardowego RSD (%) oraz granicy wykrywalności LOD (μg/L) uzyskane dla analitów ekstrahowanych różnymi metodami SPE z mieszaniny modelowej (n = 3)

Kwas 5-HMF Kwercetyna Patulina [μg/L] a α-askorbinowy Nazwa [μg/L] a [μg/L] a Parametr [μg/L] a kolumienki SPE 40 100 500 200 500 500

Speedisc® Odzysk (RSD) 99 (9) 99 (5) 98 (4) 72 (5) 75 (12) Column CZ H2O-Philic DVB LOD 55 100 100

Odzysk (RSD) 78 (6) 76 (6) 75 (1) 63 (6) b Octadecyl, C18 CZ CZ LOD 70 120

® Odzysk (RSD) 86 (10) 86 (2) 85 (3) 90 (8) AFFINIMIP CZ CZ SPE LOD 55 100

Odzysk (RSD) 63 (8) 63 (6) 61 (5) 66 (3) Evolute ABN CZ CZ LOD 65 120

® Odzysk (RSD) 95 (8) 95 (4) 96 (3) 21 (6) Puri-Fast AFP CZ CZ Extra Clean Up LOD 55 140

® Odzysk (RSD) 80 (10) 82 (4) 82 (3) 86 (2) MultiSep CZ CZ 228 AflaPat LOD 60 110

Wielościenne Odzysk (RSD) 80 (8) 83 (9) 85 (4) 75 (10) 74 (10) nanorurki CZ węglowe CN1 LOD 60 120 150

Wielościenne Odzysk (RSD) 81 (6) 80 (6) 83 (2) 51 (6) 65 (8) nanorurki CZ węglowe WC LOD 60 140 150 a - ilość dodanego wzorca, b - CZ – związek całkowicie zatrzymywany (zaadsorbowany) na złożu kolumienki SPE

Podjęte przeze mnie badania procesu ekstrakcji patuliny z modelowej mieszaniny, a w kolejnym etapie badań z soków owocowych, za pomocą kolumienek SPE wypełnionych wielościennymi nanorurkami węglowymi (Tabela 11) miały charakter całkowicie oryginalny [Śliwińska, Przybylska & Bazylak, 2011, Bazylak & Przybylska, 2012; Przybylska i wsp. 2013]. Celem tych badań było ustalenie czy uzyskiwany odzysk patuliny z modelowej mieszaniny zawierającej patulinę, 5-HMF, kwercetynę oraz kwas α-askorbinowy zależy od: 1) masy złoża wypełniającego kolumienkę, 2) parametrów nanorurek węglowych, 3) sposobu kondycjonowania, nanoszenia i przemywania kolumienki, 4) składu użytego eluenta i 5) prędkości wymywania. Niezależnie od rodzaju użytych nanorurek węglowych, gdy masa złoża w kolumience SPE zwiększyła się od 30 do 50 mg wówczas obserwowany odzysk patuliny wzrastał od 75 do 85% w przypadku nanorurek typu CN1 oraz od 75 do 83% dla nanorurek typu WC przy fortyfikacji roztworu modelowego patuliną na poziomie 500 μg/L. Zwiększony odzysk patuliny (85%) uzyskano na kolumience CN1, która była wypełniona złożem zawierającym nanorurki o średnicy 2 ÷ 6 nm i długości 0,1 ÷ 10,0 μm. Stwierdzono, że niezależnie od typu zastosowanych nanorurek najbardziej efektywnym sposobem kondycjonowania utworzonego przez nie złoża w kolumience SPE jest trzykrotne, naprzemienne przemywanie porcją acetonitrylu (1,0 mL) i wody dejonizowanej (1,0 mL). W toku moich badań okazało się, że odzysk patuliny niezależnie od typu zastosowanych nanorurek, zwiększał się, gdy na etapie nanoszenia próbki rozcieńczano badany sok wodą dejonizowaną w proporcji objętościowej 1:1. Najbardziej korzystne warunki rozdzielania patuliny od pozostałych analitów w kolumience SPE otrzymano gdy w etapie elucji (Rys. 13) użyto 2,0 mL mieszaniny acetonitrylu i wody w stosunku objętościowym 1:1. Efekt zmniejszającej się selektywności omawianego układu SPE ze wzrostem stężenia acetonitrylu w eluencie może być wyjaśniony przez wpływ tego rozpuszczalnika aprotycznego [Bosch i wsp., 1996; Espinosa i wsp., 2002; Herrador & Gonzalez, 2002; Roses & Bosch, 2002;] na kwasowość powierzchni nanorurek węglowych. Wzrost zawartości acetonitrylu w mieszaninie acetonitryl-woda prowadzi do zmniejszenia zasadowości tej powierzchni wskutek zmiany struktury warstwy hydratacyjnej i zjawiska tzw. preferencyjnej solwatacji acetonitrylu wokół cząsteczek patuliny. Ze wzrostem stężenia acetonitrylu w eluencie następuje prawdopodobnie wzrost deprotonizacji grupy hydroksylowej patuliny, co może zmniejszyć jej właściwości protonowo-donorowe podczas tworzenia wiązań wodorowych z powierzchnią nanorurek. W przypadku nanorurek typu WC o dużej średnicy wewnętrznej (ok. 40 ÷ 60 nm) cząsteczki patuliny o długości ok 2,4 nm mogą z dużym prawdopodobieństwem swobodnie dyfundować do ich wnętrza, co zwiększa stopień adsorpcji tego analitu na złożu omawianych nanorurek, które wypełniają kolumienkę SPE. Podobny efekt związany ze zjawiskiem interkalacji może występować dla cząsteczek 5-HMF (dł. ok. 2,2 nm) i kwasu α-askorbinowego (3,2 nm). W efekcie stopień odzysku wszystkich trzech analitów na kolumienkach SPE z nanorurkami typy WC jest znacznie mniejszy w porównaniu do odzysku omawianych związków z kolumienek SPE wypełnionymi nanorurkami typy CN1 (Tabela 11). Separacja hydrofilowej patuliny (logP = -1,0), 5-HMF (-0,6) i kwasu α-askorbinowego (-1,6) od hydrofobowej kwercetyny (+1,5) na omawianych kolumienkach SPE może być też spowodowana występowaniem różnych oddziaływań supramolekularnych tych związków z zewnętrznymi ściankami poszczególnych nici nanorurek, które tworzą wnęki hydrofobowe o

46 zmiennych rozmiarach. Wnęki te formują się w sposób spontaniczny w złożu kolumienki SPE między segmentami nanorurek wewnątrz ortogonalnej struktury statystycznego kłębka (nanorurki CN1) lub stosu (nanorurki WC). Występowanie podobnych niekonwalencyjnych oddziaływań międzycząsteczkowych zaobserwowano podczas spontanicznego wiązania patuliny z nanocząsteczkami białka albuminy ludzkiej HSA o długości od 5,0 do 15,2 nm, gdzie w hydrofobowej wnęce uformowanej przez reszty aminokwasowe w postaci alaniny, leucyny, argininy, histydyny (Ala291, Leu238, Leu219, Ark222, His242) tworzą się wiązania wodorowe z udziałem pierścienia piranowego i furanowego patuliny oraz stabilizujące wiązania elektrostatyczne i hydrofobowe. Wyznaczona na podstawie pomiarów fluorescencyjnych, dichroizmu kołowego i modelowania molekularnego energia wiązania patuliny z albuminą ludzką wynosi -26,68 kJ/mol w temp. 25°C [Yuqin i wsp., 2014]. Określone w ten sposób optymalne warunki ekstrakcji SPE umożliwiały bez względu na typ zastosowanej nanorurki węglowej uzyskanie odzysku patuliny z mieszaniny modelowej na zbliżonym poziomie, który przy maksymalnej fortyfikacji wynosił 85 i 83%. Natomiast 5- HMF oraz kwas α-askorbinowy był zatrzymywany w większym stopniu na złożu kolumienki SPE wypełnionym nanorurkami grubościennymi typu WC w porównaniu do nanorurek cienkościennych typu CN1, których średnica jest prawie 30 razy mniejsza. Natomiast kwercetyna w porównaniu do kolumienek komercyjnych, niezależnie od zastosowanego rodzaju nanorurek, była skutecznie adsorbowana z mieszaniny modelowej (Tabela 12). Podobny efekt silnej adsorpcji z metanolowego roztworu kwercetyny i jej pochodnych obserwowali Wang i wsp. (2015) w procesie dyspersyjnej mikroekstrakcji do fazy stałej (ang. Dispersive Solid Phase Extraction DSPE [Islas i wsp., 2017], effervescence microextraction) na równomiernie rozproszonej zawiesinie utworzonej z krótkich (1 ÷ 10 μm) wielościennych nanorurek węglowych o niskiej średnicy (3 ÷ 20 nm). W porównaniu do badanych sześciu komercyjnych kolumienek SPE, ekstrakcja patuliny metodą SPE z zastosowaniem nanorurek umożliwia uzyskanie porównywalnego, a nawet wyższego stopnia odzysku tego analitu z mieszaniny modelowej na poziomie na około 85%. Podobnie w przypadku 5-HMF odzysk tego analitu na kolumienkach wypełnionych nanorurkami jest zbliżony do odzysku uzyskanego na kolumienkach komercyjnych. Natomiast wadą kolumienek SPE wypełnionych nanorurkami jest to, że wyekstrahowana końcowa frakcja patuliny zawiera duże ilości kwasu α-askorbinowego (ok. 70%). Jednak związek ten, podobnie jak 5-HMF, nie jest czynnikiem przeszkadzającym w trakcie oznaczania patuliny proponowaną przeze mnie metodą HPTLC. Powinowactwo nanorurek węglowych do adsorbowanych cząsteczek jest determinowane głównie przez oddziaływania hydrofobowe, dyspersyjne typu π-π oraz elektrostatyczne [Zhang i wsp., 2009]. Zdolności adsorpcyjne nanorurek zależą od stopnia ich czystości, wskutek czego zmienia się na ich powierzchni ilość protonodorowych grup hydroksylowych, karbonylowych oraz karboksylowych. W przypadku użytych w badaniach własnych nanorurek węglowych typu CN1 oraz WC dane eksperymentalne adsorpcji patuliny, 5-HMF oraz kwasu α-askorbinowego z roztworu modelowego, przy niskim zakresie stężeń log 1,6 ÷ 2,7 ng/mL, były najlepiej opisywane za pomocą równania Freundlicha (1), które jest zwykle stosowane do opisu zachowań cząsteczek chemicznych na zróżnicowanych powierzchniach chropowatych [Wang i wsp., 2009]:

ଵ ܣ ൌ ܭ ൅ ݈݋݃ܥ (1) ௙ ௡

gdzie, A – ilość zaadsorbowanej patuliny [ng/g]; C – stężenie roztworu patuliny [ng/mL], Kf – stała Freundlicha dotycząca energii wiązania, n – stała intensywności adsorpcji.

Izotermy adsorpcji analizowanych związków na kolumnie SPE wypełnionej wielościennymi nanorurkami węglowymi (MWCNTs) typu CN1 oraz WC w temp. 25°C zostały przedstawione na Rys. 6. Ilość zaadsorbowanego analitu zmniejsza się w kolejności: kwas α-askorbinowy > 5-HMF > patulina dla cienkościennych nanorurek węglowych typu CN1, a dla grubościennych nanorurek typu WC w kolejności: 5-HMF > kwas α-askorbinowy > patulina. Analizując parametry obliczonych izoterm Freundlicha zestawione w Tabeli 13, zaobserwowano, że wartość parametru n z równania Freundlicha (1) jest mniejsza od jedności (n < 1) dla patuliny, 5-HMF oraz kwasu α-askorbinowego, co świadczy o tym, że adsorpcja analizowanych związków na MWCNTs ma charakter chemiczny oraz prawdopodobnie zachodzi na tlenowych centrach adsorpcji występujących na powierzchni nanorurek węglowych typu CN1 oraz WC. Można przypuszczać, że proces adsorpcji omawianych analitów najszybciej dochodzi do stanu równowagi na powierzchni bocznej nanorurki w porównaniu z powierzchnią wewnętrzną (por. Rys. 2).

ȟ ൌ െ௙ (2)

gdzie, ΔG – zmiana energii swobodnej [kJ/mol], R – stała gazowa [J/mol·K], T – temperatura [K], Kf – stała Freundlicha dotycząca energii wiązania.

Z kolei wartości energii swobodnej (ΔG < 0) obliczone przy użyciu równania (2) [Peng i wsp., 2003] wskazują, że samorzutna adsorpcja patuliny zachodzi najtrudniej na cienkościennych nanorurkach węglowych (CN1). W przypadku hydrofilowych cząsteczek patuliny (logP = -1,0), 5-HMF (-0,6) i kwasu α-askorbinowego (-1,6), zmiana energii swobodnej ΔG wynosiła odpowiednio -5,0; -11,4 oraz -11,2 kJ/mol dla nanorurek typu CN1 oraz -4,7; -11,5 oraz -11,0 kJ/mol dla nanorurek typu WC (Tabela 13). Z kolei w przypadku cząsteczki hydrofobowej (1,2-dichlorobenzen), dla której logP = 3,4, wartość energii swobodnej ΔG wynosiła -20,84 ÷ -23,00 kJ/mol w temp. 25°C [Peng i wsp., 2003], a dla kwasu 2-metoksy-3, 6-dichlorobenzoesowego (Dikamba) oraz 2, 4, 5-trichlorofenoksy-octowego, których wartości logP są równe 2,2 oraz 3,3, ΔG wynosiła odpowiednio -2,7 kJ/mol oraz -3,7 kJ/mol [Pyrzyńska i wsp., 2007].

wielościenne nanorurki węglowe CN1 wielościenne nanorurki węglowe WC

4,5 4,5

3,5 3,5

logA [ng/g] 2,5 logA [ng/g] 2,5

1,5 1,5 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3 log C [ng/mL] log C [ng/mL] patulina 5-HMF kwas L-askorbinowy patulina 5-HMF kwas L-askorbinowy

Rys. 6. Izoterma adsorpcji patuliny, 5-HMF oraz kwasu α-askorbinowego z roztworu modelowego na wielościennych nanorurkach typu CN1 oraz WC stanowiących wypełnienie kolumienki SPE

Tabela 13. Parametry izotermy Freundlicha dla procesu adsorpcji patuliny, 5-HMF oraz kwasu α- askorbinowego z metanolowego roztworu modelowego na wielościennych nanorurkach węglowych typu CN1 oraz WC stanowiących wypełnienie kolumienki SPE

kwas patulina 5-HMF α-askorbinowy OH OH HO O O O O OH Parametr O H O HO OH 154,12 [g/mol] 126,11 [g/mol] 176,12 [g/mol]

CN1 WC CN1 WC CN1 WC

Kf 7,67 6,71 104,71 107,15 95,90 89,13

log Kf 0,89 0,83 2,02 2,03 1,98 1,95 n 0,85 0,89 0,49 0,63 0,55 0,59 1/n 1,18 1,12 2,04 1,59 1,81 1,69 R2 0,99 0,98 0,98 0,99 0,99 0,99 energia swobodna (ΔG) [kJ/mol·K] - 5,0 - 4,7 - 11,4 - 11,5 - 11,2 - 11,0 hydrofilowość (logP) - 1,0 - 0,6 - 1,6 powierzchnia polarna [nm2] 5,58 5,04 10,7

2 Kf, n – stałe równania Freundlicha, R – współczynnik korelacji

IV.1.3. Badanie ekstrakcji patuliny metodą SPE z soków owocowych

IV.1.3.1. Badanie ekstrakcji patuliny metodą SPE z soku jabłkowego

Celem tego etapu badań było porównanie selektywności i wydajności izolacji patuliny z klarowanego soku jabłkowego oraz z soku z owoców głogu przy użyciu różnych komercyjnie dostępnych kolumienek SPE (Tabela 10) i nowo opracowanej w badaniach własnych metody SPE, w której wykorzystano dwa rodzaje wielościennych nanorurek węglowych, których parametry fizykochemiczne udostępnione przez producentów przedstawiono w Tabeli 11. Obydwa badane soki fortyfikowano patuliną na trzech poziomach stężeń 40, 100 oraz 500 μg/L i określano stopień odzysku patuliny w każdym z badanych układów SPE za pomocą wyselekcjonowanej, optymalnej metody HPTLC. W przypadku metod SPE, w których wykorzystano kolumienki wypełnione hydrofilowo-lipofilowym polimerem diwinylobenzenowym Speedisc H2O-Philic DVB (Rys. 7), żelem krzemionkowym modyfikowanym oktadecylosilanem Octadecyl C18 (Rys. 7) oraz polimerem z odwzorowaniem cząsteczkowym AFFINIMIP®SPE (Rys. 8) nakład czasu konieczny do wykonania wszystkich czynności podczas ekstrakcji był największy i wynosił, odpowiednio, 40, 25 oraz 20 min. W przeprowadzonych badaniach własnych stwierdzono, że gdy zastosowano ® kolumienkę SPE wypełnioną złożem hydrofilowo-lipofilowym Speedisc Column H2O-Philic DVB odzysk patuliny z klarowanego soku jabłkowego przy poziomie fortyfikacji 500 μg/L wynosił 98%, co stanowiło najlepszy wynik w porównaniu do pozostałych omawianych układów SPE, a ponadto był dwukrotnie większy od uzyskanego w badaniach Ito i wsp. (2004), którzy zastosowali do elucji patuliny metanol.

Rys. 7. Schemat ekstrakcji SPE z wykorzystaniem kolumienek Speedisc H2O-Philic DVB oraz Octadecyl C18

W trakcie badań własnych z użyciem kolumienki SPE wypełnionej hydrofobowym żelem krzemionkowym Octadecyl C18 do ekstrakcji patuliny krytycznym etapem ze względu na pracochłonność analizy okazała się konieczność zastosowania, zgodnie z sugestią Li i wsp. (2007 b), sekwencji trzech eluentów zawierających heksan, octan etylu i aceton w różnych stosunkach objętościowych, które oznaczono literami A, B, C na Rys. 7. Uzyskany przy użyciu tych kolumienek SPE odzysk patuliny z klarowanego soku jabłkowego w moich badaniach osiągnął 71, 65 oraz 61% przy poziomie fortyfikacji, odpowiednio, 500, 100 oraz 40 μg/L. Dla porównania, w badaniach Spadaro i wsp. (2007) odzysk patuliny z fortyfikowanych w zakresie 8 ÷ 50 μg/L soków jabłkowych wynosił od 92 ÷ 94%, pomimo tego, że ekstrakcja SPE następowała po wstępnym etapie wyodrębniania patuliny za pomocą octanu etylu, co mogło być przyczyną dodatkowych strat tego analitu. Ponadto autorzy tej pracy do kondycjonowania złoża kolumienki Octadecyl C18 zastosowali rozpuszczalnik niepolarny w postaci toluenu, a elucję patuliny prowadzili stosując mieszaninę toluenu z octanem etylu (1:1). W celu zwiększenia efektywności ekstrakcji patuliny metodą SPE wprowadzono do praktyki analitycznej adsorbenty z odwzorowaniem cząsteczkowym (ang. Molecularly Imprinted Polymers, MIP) [Anene i wsp., 2016]. Polimery tego typu charakteryzują się wysoką wytrzymałością mechaniczną, odpornością chemiczna, zdolnością do adsorpcji cząsteczek o ściśle zdefiniowanym kształcie i rozmiarach. Rozpoznawanie biocząsteczek w układzie polimer-analit odbywa się w trakcie procesu ekstrakcji w celowo ukształtowanych wnękach molekularnych i związanych z komplentarnością steryczną i selektywnymi oddziaływaniami hydrofobowymi oraz elektrostatycznymi. Khorrami & Taherkhami (2011) jako jedni z pierwszych zastosowali do ekstrakcji z soku jabłkowego kolumienkę SPE z wypełnieniem w postaci poli(dimetakrylanu glikolu etylenowego) z oksyindolową wnęką molekularną. Przy fortyfikacji patuliną badanego soku jabłkowego 50 i 100 μg/L uzyskali odzysk 62 do 108%. De Smet i wsp. (2011) zastosowali kolumienkę SPE gdzie wypełniający ją polimer z

50 odwzorowaniem cząsteczkowym zawierał 5-indanolową wnękę molekularną i uzyskali maksymalny odzysk patuliny na poziomie 66%. Natomiast w badaniach własnych przy użyciu kolumienki AFFINIMIP®SPE (Rys. 8) zastosowanej do analizy soku jabłkowego z dodatkiem patuliny w ilości 100 μg/L odzysk tego analitu wynosił 75%. Jednakże, w przeciwieństwie do deklaracji producenta tych kolumienek, stwierdzono, że końcowe frakcje wyekstrahowanej patuliny były znacznie zanieczyszczone 5-hydroksymetylofurfuralem (5-HMF), co świadczy o niedoskonałości rozpoznawania obu tych związków przez wnękę molekularną adsorbentu, co jest spowodowane niewielką różnicą ich struktury chemicznej. Pomimo wprowadzenia przez Catanâ i wsp. (2018) niewielkich zmian w procesie ekstrakcji SPE patuliny z musu jabłkowego z wykorzystaniem kolumienki AFFINIMIP®SPE, polegających na zastosowaniu do elucji patuliny mieszaniny 2,0 mL acetonitrylu i 0,1% kwasu octowego, uzyskano odzysk patuliny w zakresie 75,2 ÷ 91,4%. Natomiast w badaniach własnych do elucji użyto 2,0 mL octanu etylu i otrzymano odzysk 75% przy fortyfikacji soku jabłkowego na poziomie 500 μg/L.

Rys. 8. Schemat ekstrakcji SPE z wykorzystaniem kolumienek AFFINIMIP®SPE oraz Evolute ABN

Wykorzystane w badaniach własnych kolumienki SPE typu Evolute ABN wypełnione łatwo zwilżalnym polimerem poli(N-winylopirolidyno-diwinylobenzenowym) o zrównoważonej ilości grup polarnych (hydrofilowych) i niepolarnych (hydrofobowych) zastosowano do ekstrakcji patuliny z klarowanego soku jabłkowego prawdopodobnie po raz pierwszy. Dotychczas kolumienki tego typu wykorzystywano do ekstrakcji różnych leków (lewofloksacyny, albendazolu, naproksenu, fenylobutazonu, meloksykamu) z surowicy krwi, moczu, płynu mózgowo-rdzeniowego i próbek mleka [Dowling i wsp., 2009 a i b; Dominguez- Alvarez i wsp., 2013; Van Toi i wsp., 2017]. Związki ekstrahowane z dużą wydajnością za pomocą kolumienek Evolute ABN posiadają w swojej strukturze przynajmniej dwa skondensowane pierścienie bicykliczne lub połączone krótkim mostkiem metinowym pierścienie fenylowe, furanowe lub imidazolowe, co wskazywało na możliwość ich zastosowania do ekstrakcji patuliny, która posiada w swojej strukturze skondensowane pierścienie piranowy i furanowy. Drugą przesłanką zastosowania tych kolumienek w badaniach 51 własnych było podobieństwo struktury chemicznej wypełnienia kolumienek Evolute ABN z adsorbentem polimerowym stosowanym w kolumienkach Oasis HLB, których wykorzystanie do ekstrakcji patuliny jest dość często opisywane w literaturze [Gökmen i wsp., 2005; Tamura i wsp., 2012; De Clercq i wsp., 2016]. Zastosowanie omawianej kolumienki do oczyszczania ekstraktu skutkowało uzyskaniem najniższego odzysku patuliny spośród wszystkich analizowanych układów SPE, który wynosił 50% dla próbek soku wzbogaconych patuliną w ilości 100 oraz 500 μg/kg (Rys. 8). W porównaniu do poprzednio omawianych sposobów ekstrakcji patuliny z soków jabłkowych metodą SPE, użycie kolumienek Puri-Fast® AFP Extra Clean Up (Rys. 9) umożliwiało w trakcie krótkiej, jednoetapowej operacji uzyskanie wysokiej jakości końcowego ekstraktu w stosunkowo krótkim czasie ok. 10 min., a odzysk patuliny wynosił 92%, gdy dodatek wzorca wewnętrznego wynosił 100 μg/L. Zaletą tego typu kolumienek SPE jest możliwość pominięcia czasochłonnego etapu kondycjonowania przy równoczesnym połączeniu etapów przemywania i elucji (Rys. 9). Filtracja żelowa, która jest podstawowym mechanizmem rozdzielczym w omawianym układzie SPE, przy użyciu kolumn wypełnionych usieciowanym dekstranem lub usieciowaną agarozą (Sephadex LH-20, Sepharoze 4B) była jak dotąd sporadycznie stosowana jako metoda ekstrakcji patuliny, którą następnie oznaczano ilościowo metodą TLC [Joseffsson & Möller, 1977; Betina, 1993] lub metodą fluorescencyjną [De Champdoré i wsp., 2007].

Rys. 9. Schemat ekstrakcji SPE z wykorzystaniem kolumienki Puri-Fast® AFP Extra Clean Up

Innym typem układu SPE, który umożliwia pominięcie etapu kondycjonowania przy równoczesnym połączeniu etapów przemywania i elucji, jako obniżających odtwarzalność metody SPE są kolumienki typu MultiSep®228AflaPat (Rys. 10) wypełnione mieszaniną wielofunkcyjnych, polarnych i niepolarnych adsorbentów polimerowych, których dokładny skład nie jest ujawniany przez producenta. W toku badań własnych okazało się, że kolumienki te zapewniają skrócenie czasu uzyskania ekstraktu patuliny z soku jabłkowego do ok. 15 min i umożliwiały uzyskanie odzysku na poziomie 75% z soku jabłkowego wzbogaconego patuliną w ilości 500 μg/L. Wynik ten był w dobrej zgodności z wielkością odzysku patuliny ekstrahowanej analogiczną metodą SPE z musu jabłkowego [Funes & Resnik, 2009]. Z kolei w pracy Funes i wsp. (2013) odnotowano wysoki odzysk powyżej 95% dla soków jabłkowych wzbogaconych patuliną w ilości 10 ÷ 140 μg/L, co mogło być spowodowane zastosowaniem wstępnego trawienia badanego soku pektynazą wskutek czego zwiększał się stopień adsorpcji

52 nisko- i wysokocząsteczkowych oligomerów galaktouronianowych, które stanowią naturalne składniki soku jabłkowego, na wypełnieniu kolumienki SPE. Podobne efekty obserwowano podczas stosowania omawianych kolumienek SPE do ekstrakcji patuliny z soków jabłkowych oraz z soku z winogron [Ohmichi, 2015]. Kolumienki MultiSep®228AflaPat okazały się także przydatne do równoczesnej ekstrakcji śladowych ilości patuliny, niwalenolu (NIF) oraz womitoksyny (DON, deoksyniwalenol) z soku jabłkowego i piwa [Anonim, 2017]. Wyniki badań własnych oraz analiza doniesień literaturowych dotyczących zastosowania kolumienek MultiSep®228AflaPat wskazują, że istotny wpływ na wielkość odzysku patuliny ma stosunek objętości próbki soku do objętości acetonitrylu, które tworzą mieszaninę nanoszoną na złoże kolumienki. Gdy następował spadek proporcji objętości obu komponentów tej mieszaniny od 0,33 do 0,19 wówczas procent odzysku patuliny zwiększał się od 75 do 98%.

Rys. 10. Schemat ekstrakcji SPE z wykorzystaniem kolumienki SPE MultiSep®228AflaPat

Celem kolejnego etapu badań było określenie wydajności ekstrakcji patuliny z soku jabłkowego metodą SPE, w której zastosowano wielościenne nanorurki węglowe typu CN1 oraz WC różniące się cechami morfologicznymi, strukturą molekularną i średnicą nanoporów, co przedstawiono w Tabeli 11 oraz na Rys. 11 i 12. Na zdjęciach SEM widać wyraźnie, że nanorurki typu CN1 są poskręcane, mocno zdefektowane i pokryte węglem amorficznym (Rys. 11 A, B) podczas gdy typu WC są proste i często ułożone w równoległe wiązki (Rys. 12 A, B). Można stwierdzić, że wykorzystane w badaniach własnych nanorurki wykazują dwie podstawowe morfologie: kłębka (ang. coil) jak w przypadku nanorurek typu CN1 (Rys. 11 A, B) i przypominające pędy bambusa (ang. bambus like) jak w przypadku nanorurek typu WC (Rys. 12 A, B). Obserwowane różnice morfologiczne obu typów nanorurek wskazują, że do ich syntezy wykorzystano dwie różne metody syntezy albo tą samą metodę (na przykład katalityczno-chemicznego osadzania z fazy gazowej – ang. Catalytic Chemical Vapour Deposition, CCVD) lecz przy użyciu różnych katalizatorów (ferrocen lub sole glinu) i odmiennych parametrów syntezy (temperatura, czas, prędkość przepływu reagentów, rodzaj podłoża) [Dobrzańska-Danikiewicz i wsp., 2014]. Z tego powodu nanorurki typu CN1 wykazują dużą ilość struktur włóknistych (Rys. 11 C, D), a nanorurki typu WC w przeważającej ilości struktur wydłużonych (Rys. 12 C, D). W nanorurkach typu CN1 występują pojedyncze struktury włókniste, w których stosunek długości do średnicy (tzw aspect ratio) osiąga wysokie wartości od 50 do 1500.

A B

C D

Rys. 11. Zdjęcia wielościennych nanorurek węglowych typu CN1: panel A i B wykonane metodą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) za pomocą aparatu Zeiss EVO40 (napięcie przyspieszające wiązki elektronów 17kV, próżnia 10-5 Torr, warstwa Au 40 nm); panel C i D wykonane techniką transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) za pomocą aparatu Jeol JEM 1200 EX (napięcie przyspieszające wiązki elektronów 80kV)

Natomiast w przypadku nanorurek typu WC o nanostrukturze typu quasi- jednowymiarowym (pręta, pnia) stosunek długości do średnicy przyjmuje niezwykle niskie wartości poniżej jedności (od 0,1 do 0,05). Na zdjęciach SEM i TEM widać wyraźnie, że oba rodzaje nanorurek, zarówno CN1 jak i WC, są w dużym stopniu pokryte niejednorodną warstwą amorficznych cząstek sadzy, stanowiących produkt uboczny podczas procesu syntezy tych nanorurek. Deklarowany przez producenta stopień oczyszczenia omawianych nanorurek węglowych wynosił 90% (Tabela 11), dlatego można przypuszczać, że na ich powierzchni rozmieszczone są w dużej ilości grupy tlenowe, karbonylowe oraz karboksylowe, mogące stanowić centra adsorpcji. Dokładna analiza refleksów na zdjęciach SEM wskazuje, że nanorurki typu CN1 charakteryzują się dalekosiężnym uporządkowaniem, co oznacza, że mają one relatywnie mało defektów. Natomiast w przypadku nanorurek typu WC można zaobserwować na zdjęciach SEM charakterystyczne zaokrąglone zakończenia nanorurek, co może być spowodowane metodą ich syntezy, która sprzyja tworzeniu się nanorurek bardziej zdefektowanych [Szala, 2009]. Z kolei na zdjęciach TEM można zauważyć ułożone koncentrycznie sferoidalne nanocząstki sadzy wewnątrz osi kanału nanorurek typu WC, których zewnętrzna średnica wynosi od 110 do 170 nm (Tabela 11). W przypadku nanorurek typu WC na zdjęciach TEM jest widoczne, że na pewnym odcinku nanorurka ulega zwężeniu, a w miejscu gdzie ono się zaczyna narasta na niej kolejny rozgałęziający się człon nanorurki.

A B

C D

Rys. 12. Zdjęcia wielościennych nanorurek węglowych typu WC: panel A i B wykonane metodą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) za pomocą aparatu Zeiss EVO40 (napięcie przyspieszające wiązki elektronów 17kV, próżnia 10-5 Torr, warstwa Au 40 nm); panel C i D wykonane techniką transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) za pomocą aparatu Jeol JEM 1200 EX (napięcie przyspieszające wiązki elektronów 80kV)

Dotychczas wielościenne nanorurki węglowe były wykorzystywane do ekstrakcji SPE toksyn trichotecynowych typu A w próbkach kukurydzy, pszenicy oraz ryżu. Wzbogacając próbkę kukurydzy toksyną T-2 oraz diacetoksyscirpenolu (DAS) w ilości 50 μg/kg uzyskano odzysk, odpowiednio, 75,2 ± 3,5% oraz 80,3 ± 7,6% [Dong i wsp., 2015]. Nanorurki węglowe, które zostały wykorzystane w omawianych badaniach charakteryzowały się zbliżoną średnicą (8,0 nm) do nanorurek węglowych typu CN1 użytych w badaniach własnych (Tabela 11) oraz ponad dwukrotnie większą powierzchnią właściwą (500 m2/g). Zastosowanie w badaniach własnych kolumienek SPE wypełnionych wielościennymi nanorurkami węglowymi (50 mg) umożliwiało skrócenie nakładu czasu potrzebnego do wykonania wszystkich czynności podczas ekstrakcji patuliny metodą SPE do ok. 10 ÷15 min (Rys. 13).

Rys. 13. Schemat ekstrakcji SPE z wykorzystaniem nanorurek węglowych

W przeprowadzonych badaniach własnych stwierdzono, że gdy zastosowano kolumienkę SPE wypełnioną wielościennymi nanorurkami węglowymi typu CN1 oraz WC odzysk patuliny z klarowanego soku jabłkowego przy poziomie fortyfikacji 500 μg/L wynosił, odpowiednio, 75 oraz 67%, co stanowiło wyższy wynik w porównaniu do układu SPE zawierającego kolumienkę Evolute ABN (50%) oraz Octadecyl C18 (71%). W przeprowadzonych badaniach własnych wzrost wydajności ekstrakcji patuliny zaobserwowano dla układu SPE zawierającego cienkościenne nanorurki węglowe typu CN1 w porównaniu z układem zawierającym grubościenne nanorurki typu WC. Jednocześnie zaobserwowano najwyższy stopień oczyszczenia eluatu stosując nanorurki typu CN1 oraz WC wynoszący, odpowiednio, 65 oraz 85% w porównaniu z pozostałymi kolumienkami SPE. W Tabeli 14 przedstawiono wartości odzysku wraz z granicą wykrywalności (LOD) uzyskane dla patuliny ekstrahowanej różnymi metodami SPE z soków jabłkowych fortyfikowanych na poziomie 500 μg/L (n = 3) oraz czystość uzyskanego eluatu (%PEL), który został obliczony przy użyciu równania (3) [Stepnowski i wsp., 2010; Kosińska i wsp., 2015]:

ௌುಲ೅ Ψܲா௅ ൌ ൈ ݂ ൈ ͳͲͲΨ (3) σ ௌೌ೗೗

2 gdzie SPAT – powierzchnia pod pikiem patuliny [mm ]; Ʃ Sall – suma powierzchni pod wszystkimi pikami na densytogramie HPTLC analizowanego ekstraktu SPE [mm2]; f – współczynnik korekcyjny uwzględniający stopień rozcieńczenia objętości próbki soku przez sumaryczną objętość wszystkich rozpuszczalników użytych w poszczególnych etapach procesu SPE

Tabela 14. Wartości odzysku (%), względnego odchylenia standardowego RSD (%), granicy wykrywalności LOD (μg/L) uzyskane dla analitów ekstrahowanych różnymi metodami SPE z klarowanego soku jabłkowego (n = 3) oraz czystość uzyskanego eluatu (%PEL)

Nazwa Parametr Patulina Nazwa Parametr Patulina kolumienki SPE 500 [μg/L] kolumienki SPE 500 [μg/L]

Odzysk (RSD) 98 (6) Odzysk (RSD) 92 (3) Speedisc® Puri-Fast® AFP Column Czystość eluatu (%) 44 Czystość eluatu (%) 33 Extra Clean Up H2O-Philic DVB LOD 60 LOD 60 Odzysk (RSD) 71 (4) Odzysk (RSD) 75 (10) MultiSep® Octadecyl C18 Czystość eluatu (%) 48 Czystość eluatu (%) 52 228 AflaPat LOD 100 LOD 80 Odzysk (RSD) 75 (6) Odzysk (RSD) 75 (9) Wielościenne AFFINIMIP® Czystość eluatu (%) 18 nanorurki Czystość eluatu (%) 65 SPE LOD 90 węglowe CN1 LOD 70 Odzysk (RSD) 50 (2) Odzysk (RSD) 67 (8) Wielościenne Evolute ABN Czystość eluatu (%) 34 nanorurki Czystość eluatu (%) 85 LOD 80 węglowe WC LOD 70

Z uwagi na wysoką koncentrację związków o właściwościach prozdrowotnych soki jabłkowe można zaliczyć do grupy żywności o wysokiej wartości biologicznej [Oszmiański i wsp., 2007]. Podczas ekstrakcji patuliny metodą SPE z klarowanego soku jabłkowego zauważono istotny wpływ związków przeszkadzających obecnych w matrycy na wyniki odzysku patuliny na poszczególnych kolumienkach SPE (Rys. 14). Stwierdzono, że w trakcie procesu ekstrakcji patuliny z omawianego soku na kolumienkach SPE wypełnionych

56 wielościennymi nanorurkami węglowymi typu CN1 oraz WC efekt matrycowy może być głównie spowodowany wysokim stężeniem procyjanidyn B1 oraz B2, ale również kwasu chlorogenowego oraz (-)-epikatechin, które posiadają zdolność samoasocjacji i tworzenia struktur oligomerycznych, które analogicznie jak wysokocząsteczkowe związki o płaskiej strukturze, takie jak czerwień Kongo oraz błękit metylenowy wykazuje podwyższoną zdolność adsorpcji na powierzchni nanorurek węglowych [Choma i wsp., 2015]. Dlatego stopień oczyszczenia końcowego ekstraktu SPE uzyskanego stosując CN1 oraz WC jako wypełnienie kolumienki SPE wynosił, odpowiednio, 65 oraz 85 %, czyli uzyskano znacznie wyższe wartości ® w porównaniu z kolumienkami komercyjnymi Speedisc Column H2O-Philic DVB, Octadecyl ® ® ® C18, AFFINIMIP SPE, Evolute ABN, Puri-Fast AFP Extra Clean Up oraz MultiSep 228 AflaPat (Tabela 14).

® ® Speedisc Column H2O-Philic DVB Puri-Fast AFP Extra Clean Up

MultiSep®228 AflaPat Octadecyl C18

AFFINIMIP®SPE Wielościenne nanorurki węglowe CN1

Evolute ABN Wielościenne nanorurki węglowe WC

Rys. 14. Przykładowe reprezentatywne densytogramy obrazujące rozdzielenie składników ekstraktu z soku jabłkowego fortyfikowanego patuliną na różnych poziomach stężeń (▲ – 40 μ/L, ▲▲ – 100 μg/L, ▲▲▲ – 500 μg/L) metodą SPE-HPTLC (S – start, 1 – kwas α-askorbinowy, 2 – 5-HMF, P –patulina, 3 – kwercetyna)

Klarowany sok jabłkowy jest bogatym źródłem kwasu chlorogenowego (KCH), (-)- epikatechin (EP), procyjanidyn B1 (PCB1) i B2 (PCB2) oraz 3-glukozydów kwercetyny (GKW), których zawartość jest ściśle uwarunkowana odmianą jabłek stosowanych do produkcji soków jabłkowych. Średnia zawartość KCH w soku jabłkowym wyciśniętym z jabłek odmiany Champion, Golden Delicious, Idared wynosi, odpowiednio, 78; 110 oraz 150 mg/L, a średnie stężenie EP w omawianych sokach jest równe 117,8; 38,0 oraz 32,0 mg/L [Bizjat Bat i wsp., 2018; Oszmiański i wsp., 2007]. Z kolei najwyższe stężenie PCB2 (131,6 mg/L) stwierdzono w klarowanym soku jabłkowym sporządzonych z jabłek odmiany Champion, a najniższe z jabłek Idared (13,5 mg/L) [Oszmiański i wsp., 2007]. Natomiast Bizjat Bat i wsp. (2018) stwierdzili, że koncentracja PCB1 w sokach jabłkowych z jabłek Idared jest prawie 2. krotnie wyższa w porównaniu z sokami wyciśniętych z jabłkami odmiany Golden Delicious, których stężenie wynosi odpowiednio ok. 37 mg/L oraz 19 mg/L. Wyniki badań Oszmiańskiego i wsp. (2007) wskazują, że stężenie PCB1 w klarowanych sokach z jabłek odmiany Champion jest 3. krotnie wyższe (27,9 mg/L) w porównaniu z sokami z jabłek Idared, w których stężenie omawianej PCB1 wynosi 9,1 mg/L. Natomiast średnie stężenie GKW jest podobne dla soków wyciśniętych z jabłek odmiany Champion oraz Idaered i wynosi, odpowiednio, 1,7 oraz 1,0 mg/L [Oszmiański i wsp., 2007]. Uzyskany efekt matrycowy ukazano na Rys. 14, który przedstawia densytogramy obrazujące rozdzielenie składników ekstraktu z soku jabłkowego uzyskanego przy użyciu różnych układów SPE.

IV.1.3.2. Badanie ekstrakcji patuliny metodą SPE z soku z owoców głogu

Celem tego etapu badań było porównanie selektywności i wydajności izolacji patuliny z soku z owoców głogu przy użyciu kolumienki SPE MultiSep®228AflaPat (Tabela 10) i nowo opracowanej w badaniach własnych metody SPE, w której wykorzystano dwa rodzaje wielościennych nanorurek węglowych (Tabela 11). Sok fortyfikowano patuliną na trzech poziomach stężeń 40, 100 oraz 500 μg/L i określano stopień odzysku patuliny w każdym z badanych układów SPE za pomocą wyselekcjonowanej, optymalnej metody HPTLC. Wykorzystane w badaniach własnych kolumienki MultiSep®228AflaPat oraz kolumienki wypełnione wielościennymi nanorurkami węglowymi typu CN1 oraz WC (Tabela 11) zastosowano do ekstrakcji patuliny metodą SPE z soku z owoców głogu prawdopodobnie po raz pierwszy (Tabela 15). Dotychczas w celu ekstrakcji patuliny z napojów i soków z owoców głogu zostały wykorzystane kolumienki MycoSep®228 AflaPat [Li i wsp., 2007, a; Zhou i wsp., 2012] oraz Oasis MAX 96-well plate [Yang i wsp., 2017]. Spośród 43 analizowanych napojów zawierających sok z owoców głogu pochodzących z Chin tylko 14% z nich zawierało patulinę na średnim poziomie 116,34 μg/L przy zakresie 19,80 ÷ 206,88 μg/L [Li i wsp., 2007, a]. Natomiast spośród soków z owoców głogu zakupionych w supermarkecie w prowincji Beijing w Chinach zakres zawartości patuliny wynosił 0,50 ÷ 12,26 μg/L [Zhou i wsp., 2012; Yang i wsp., 2017], gdzie w badaniach Yang i wsp. (2017) aż 50% analizowanych soków z owoców głogu było zainfekowanych patuliną na średnim poziomie 1,45 μg/L. Spośród trzech zanalizowanych układów SPE różniących się typem zastosowanej kolumienki SPE, najwyższy średni odzysk patuliny sięgający 78% przy fortyfikacji soku z owoców głogu patuliną na poziomie 500 μg/L uzyskano dla kolumienki MultiSep®228 AflaPat wypełnionej polarnymi i niepolarnymi adsorbentumi polimerowymi (Tabela 15). Zastosowanie

58 kolumienek SPE wypełnionych wielościennymi nanorurkami węglowymi (50 mg) umożliwiało uzyskanie średniego odzysku patuliny na poziomie 72 oraz 65% dla nanorurek typu CN1 oraz WC, gdy wzbogacono próbki soku z owoców głogu patuliną w ilości 500 μg/L. Podobnie jak we wcześniej omawianych wynikach badań, wzrost wydajności ekstrakcji patuliny zaobserwowano dla układu SPE zawierającego cienkościenne nanorurki węglowe typu CN1 w porównaniu z układem zawierającym grubościenne nanorurki typu WC. W Tabeli 15 przedstawiono wartości odzysku (RSD) wraz z granicą wykrywalności (LOD) uzyskane dla patuliny ekstrahowanej różnymi metodami SPE z soku z owoców głogu fortyfikowanego na poziomie 500 μg/L (n = 3) oraz czystość uzyskanego eluatu (%PEL).

Tabela 15. Wartości odzysku (%), względnego odchylenia standardowego RSD (%), granicy wykrywalności LOD (μg/L) uzyskane dla patuliny ekstrahowanej różnymi metodami SPE z soku z owoców głogu fortyfikowanego patuliną na poziomie 500 μg/L (n = 3) oraz czystość uzyskanego eluatu (%PEL)

Parametr MultiSep®228 AflaPat Wielościenne nanorurki Wielościenne nanorurki węglowe CN1 węglowe WC

Odzysk (RSD) 78 (8) 72 (8) 65 (5) Czystość eluatu (%) 51 68 81 LOD 80 70 70

Soki z owoców głogu, w porównaniu do soków jabłkowych, są bogatszym źródłem kwasu chlorogenowego (KCH), (-)-epikatechiny (EP), procyjanidyny B2 (PCB2) oraz 3- glukozydów kwercetyny (GKW), których obecność może mieć istotny wpływ na efekt matrycowy podczas ekstrakcji SPE przy użyciu omawianych kolumienek SPE (Rys. 15). Nie jest znane dokładne pochodzenie zastosowanego w badaniach własnych soku z głogu, zatem nie wiadomo który gatunek owocu głogu zostały zebrany do jego produkcji. Niemniej jednak soki z owoców głogu są 2. krotnie oraz 20. krotnie bogatszym źródłem procyjanidyn B2 oraz (-)-epikatechin w porównaniu z sokiem jabłkowym, co mogło przyczynić się do efektu matrycowego, a w konsekwencji uzyskaniem odzysku patuliny 65 ÷ 72 % przy zastosowaniu nanorurek węglowych typu CN1 oraz WC (Tabela 15). Koncentracja KCH, EP, PCB2, oraz GKW w sokach z owoców głogu Crataegus oxyacantha (ogród Botaniczny Roślin Leczniczych Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu) wynosi, odpowiednio, 147,0; 2,5; 1,4; oraz 126,0 mg/L [Wojdyło & Oszmiański, 2009]. Natomiast napoje z owoców głogu Crataegus pinnatifida, zawierające 8g świeżego ekstraktu z owoców głogu w 100 mL wody są źródłem 50,2 mg/L KCH, 219,0 mg/L EP oraz 256,0 mg/L PCB2 [Chang i wsp., 2006]. Metanolowe ekstrakty owoców Crataegus pinnatifida zawierają PCB2 w zakresie 6,24 ÷ 29,52 mg/g, KCH w zakresie 0,77 ÷ 3,18 mg/g przy jednoczesnym stężeniu izokwercetyny w zakresie 0,19 ÷ 0,41 mg/g oraz EP w ilości 1,72 ÷ 12,77 mg/g [Park i wsp., 2010]. Uzyskany efekt matrycowy opisują densytogramy przedstawione na Rys. 15, które obrazują rozdzielenie metodą HPTLC składników ekstraktu z soku z owoców głogu uzyskanych przy użyciu trzech różnych układów SPE.

MultiSep®228 AflaPat

Wielościenne nanorurki węglowe (CN1)

Wielościenne nanorurki węglowe (WC)

Rys. 15. Przykładowe reprezentatywne densytogramy obrazujące rozdzielenie składników ekstraktu z soku z owoców głogu fortyfikowanego patuliną na różnych poziomach stężeń (▲ – 40, ▲▲ – 100, ▲▲▲ – 500 μg/L) metodą SPE-HPTLC (2 – 5-HMF, P –patulina)

Reasumując, zastosowanie w badaniach własnych wielościennych nanorurek węglowych typu CN1 oraz WC okazało się pod względem odzysku i czystości uzyskanego ekstraktu konkurencyjne, a w niektórych przypadkach korzystniejsze w porównaniu z komercyjnymi kolumienkami SPE. Wyniki wskazują, że parametry charakteryzujące proces ekstrakcji SPE są wyższe dla nanorurek cienkościennych CN1 w porównaniu z nanorurkami grubościennymi WC. Niemniej jednak na uzyskane wyniki w badaniach własnych mógł mieć wpływ stopień czystości zastosowanego nanomateriału (90%), który sprzyjał tworzeniu się na ich powierzchni specyficznych miejsc adsorpcji zawierających grupy hydroksylowe, karbonylowe oraz karboksylowe. Metoda HPTLC stosowana do analizy składu wyodrębnionych ekstraktów SPE może być z powodzeniem stosowana do oznaczania patuliny w ilości 40 ÷ 500 μg/L w sokach jabłkowych i sokach z owoców głogu.

IV.2. Oznaczenie wskaźników jakości higienicznej suplementów diety oraz mieszanek ziołowych zawierających suszone owoce głogu

Zasadniczym celem badań przedstawionych w publikacji będącej podstawą rozprawy doktorskiej [Przybylska & Bazylak, 2017] była ocena stanu mikrobiologicznego suplementów diety zawierających w swoim składzie suszone owoce i kwiatostany głogu (Crataegus spp.) oferowanych w aptekach, sklepach zielarskich i supermarketach. W ramach omawianej pracy, jakość badanych surowców zbadano na podstawie ogólnej liczby drożdży i pleśni (TYMC), ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych (TAMC), oznaczenia obecności bakterii Escherichia coli, bakterii z grupy coli, Salmonelli oraz Bacillus cereus. W celu oznaczenia TAMC zastosowano metodę płytkową z posiewem wgłębnym, wykorzystując jako pożywkę agar standardowy zgodnie z obowiązującą normą PN-EN ISO 4833:2004+Ap1:2005. Natomiast w celu oznaczenia TYMC wykorzystano metodę płytkową z posiewem powierzchniowym, wykorzystując do tego celu pożywkę z dichloranem i 18% dodatkiem glicerolu (DG18) zgodnie z normą PN-ISO 21527-2:2009. Z kolei do ilościowego oznaczenia bakterii Escherichia coli, Bacillus cereus oraz Salmonella użyto kompaktowe, komercyjne testy Compact Dry. Stwierdzono, że ogólna liczba drożdży i pleśni (TYMC) w produktach PJ zawierających wyłącznie suszone owoce głogu mieściła się w zakresie < 10 ÷ 2,2 × 104 jtk/g, co świadczy o spełnieniu aktualnych wymagań Farmakopei Polskiej (wyd. X) przez te produkty dotyczące stopnia zanieczyszczeń mikrobiologicznych w produktach roślinnych, które poddawane są działaniu wrzącej wody. Ustalono, że średnia zawartość grzybów drożdżoidalnych oraz pleśniowych (TYMC) w produktach PJ jest około 150 razy wyższa niż w produktach PW zawierających w swoim składzie suszony owoc głogu, owoc jabłoni, aronii, dzikiej róży, kwiat hibiskusa oraz kwiatostan głogu. Produkty PJ były zainfekowane grzybami drożdzoidalnymi oraz pleśniowymi na średnim poziomie 3,9 × 103 jtk/g, natomiast produkty PW były zanieczyszczone w/w drobnoustrojami na średnim poziomie 2,5 × 101 jtk/g. Wykonana analiza mikrobiologiczna wskazała, że tylko 10% wszystkich analizowanych produktów było zainfekowanych TYMC na najwyższym stopniu 104 jtk/g, a 40% z nich było zanieczyszczonych w niewielkim stopniu < 10 ÷ 101 jtk/g. Stwierdzono jednocześnie, że w analizowanych produktach PJ i PW zakres TAMC mieści się < 10 ÷ 6,3 × 105 jtk/g, co świadczy o tym, że wszystkie analizowane produkty spełniają wymogi Farmakopei Polskiej (wyd. X) dotyczące stopnia zanieczyszczeń mikrobiologicznych w produktach roślinnych, które poddawane są działaniu wrzącej wody. Stwierdzono nieznaczne różnice pomiędzy średnimi zawartościami TAMC w produktach PJ wynoszących 1,2 × 105 jtk/g i produktach PW wynoszących 1,1 × 105 jtk/g. Ustalono również, że 70% tych produktów było zanieczyszczonych drobnoustrojami tlenowymi na średnim poziomie 1,5 × 105 jtk/g. Nie wykazano skażenia bakteriami względnie beztlenowymi Escherichia coli oraz Salmonella w analizowanych produktach PJ i PW. W jednym z produktów PJ (FG3) stwierdzono obecność Gram-dodatniej bakterii Bacillus cereus na niskim poziomie 1,0 × 101 jtk/g.

Natomiast biorąc pod uwagę zalecenia WHO dotyczące czystości higienicznej surowców zielarskich wykorzystywanych do sporządzania naparów, które mówią o tym, że maksymalna ilość bakterii aerobowych powinna wynosić 107 jtk/g, liczba drożdży i pleśni 104 jtk/g, Escherichia coli 102 jtk/g, brak bakterii rodzaju Clostridium, Shigella i Salmonella w jednym gramie surowca [WHO guidelines, 2007, s. 27], to okazuje się, że próbka FG3, zawierająca suszone owoce głogu, nie spełnia w/w wymagań WHO ze względu na 2. krotne przekroczenie dopuszczalnej ogólnej liczby drożdży i pleśni. Na Rys. 16 przedstawiono fotografie wybranych oznaczeń mikrobiologicznych.

TYMC TAMC Escherichia coli Salmonella Bacillus cereus

Rys. 16. Fotografie wybranych wyników oznaczeń mikrobiologicznych

IV.3. Analiza zawartości hydroksykwasów niskocząsteczkowych w wodnych naparach suplementów diety oraz mieszanek ziołowych zawierających suszone owoce głogu

Celem kolejnej publikacji będącej podstawą rozprawy doktorskiej [Przybylska & Bazylak, 2018] było oznaczenie zawartości hydroksykwasów niskocząsteczkowych w wodnych naparach przygotowanych z suszonych owoców głogu i kwiatostanów głogu. Zawartość kwasu cytrynowego i L-jabłkowego oznaczono metodą enzymatyczną zgodnie z instrukcją producenta komercyjnych testów K-CITRIC i K-MALQR. Natomiast zawartość kwasu winowego zanalizowano metodą kolorymetryczną używając testu K-TART (Megazyme, Ireland), a zawartość kwasu szczawiowego metodą manganianometryczną. Kwasowość wodnych naparów surowców zielarskich zawierających suszone owoce głogu oznaczono metodą miareczkowania potencjometrycznego. Stwierdzono, że średnia zawartość kwasu cytrynowego w wodnych naparach produktów PJ i PW wynosiła 17,22 mg/100 mL, co odpowiada 861,48 mg/100g. Jednak w naparach produktów PW średnia zawartość tego kwasu była prawie 4 razy wyższa w porównaniu z produktami PJ. Stwierdzono istotną korelację pomiędzy gęstością nasypową produktów PJ, a zawartością kwasu cytrynowego w ich wodnych naparach (r = - 0,75; p < 0,05). Napary uzyskane z produktów G14 oraz G15 zawierały najwyższe stężenie kwasu cytrynowego (1917,62 mg/100g, co odpowiada 38,35 mg/100 mL oraz 1990,65 mg/100g, co odpowiada 39,81 mg/100 mL) spośród analizowanych produktów PJ pomimo, że owoce te nie były rozdrobnione. Odnotowano również wysokie stężenie kwasu L-jabłkowego oraz winowego w naparach produktów PW. Stężenie kwasu winowego w omawianych naparach wynosiło 12,55 mg/100 mL, co odpowiada 627,60 mg/100g, a w naparach uzyskanych z produktów PJ tylko 5,43 mg/100 mL, co odpowiada 271,68 mg/100g. Podobnie jak w przypadku kwasu cytrynowego, średnie stężenie kwasu winowego w naparach produktów G14 oraz G15 było wyższe (9,06 mg/100 mL, co odpowiada 452,75 mg/100g) w porównaniu z pozostałymi naparami produktów PJ, w których średnia zawartość kwasu winowego wynosiła 4,23 mg/100 mL, co odpowiada 211,32 mg/100g. Analiza stężenia kwasu szczawiowego została wykonana tylko dla naparów uzyskanych z suplementów diety oraz mieszanek ziołowych zawierających w swoim składzie wyłącznie suszone owoce głogu. Średnia zawartość tego kwasu wynosiła 7,84 mg/100 mL, co odpowiada 391,94 mg/100g. Średnia kwasowość ogólna wodnych naparów sporządzonych z produktów PW była wyższa (263,64 mg/100 mL) w porównaniu z naparami produktów PJ (86,29 mg/100 mL). Na obniżenie średniej kwasowości ogólnej naparów produktów PJ mają duży wpływ produkty nierozdrobnione, ponieważ ich średnia kwasowość ogólna wynosi 30,98 mg/100 mL. Po wykonaniu analizy korelacji pomiędzy analizowanymi hydroksykwasami w wodnych naparach, stwierdzono że stężenie kwasu cytrynowego było istotnie ujemnie skorelowane ze stężeniem kwasu szczawiowego (r = - 0,65; p < 0,05). Z kolei stężenie kwasu cytrynowego w omawianych naparach było istotnie skorelowane ze stężeniem w nich kwasu winowego (r = 0,82; p < 0,05). Natomiast kwasowość ogólna była istotnie dodatnio skorelowana ze stopniem rozdrobnienia analizowanych surowców zielarskich (r = 0,81; p < 0,05).

IV.4. Analiza zawartości naturalnych antyoksydantów i właściwości antyoksydacyjnych wodnych naparów suplementów diety oraz mieszanek ziołowych zawierających suszone owoce głogu

Wyniki analizy zawartości kwasu α-askorbinowego, całkowitej zawartości związków polifenolowych (TPC) oraz związków flawonoidowych (TFC) w wodnych naparach sporządzonych z suszonych owoców i kwiatostanów głogu oraz właściwości antyoksydacyjne tych naparów zostały omówione w publikacji będącej podstawą niniejszej rozprawy [Przybylska & Bazylak, 2018]. Zawartość kwasu α-askorbinowego została oznaczona metodą miareczkową przy użyciu 2,6-dichlorofenoloindofenolu. Natomiast całkowitą zawartość związków polifenolowych zanalizowano metodą kolorymetryczną z zastosowaniem odczynnika Folina-Ciocalteau, a całkowitą zawartość związków flawonoidowych metodą kolorymetryczną z chlorkiem glinu [Prior i wsp., 2005]. W celu oznaczenia pojemności przeciwutleniającej wodnych naparów owoców głogu wykorzystano metodę z wolnymi rodnikami DPPH· (2,2-difenyl-1-pikrylohydrazyl) oraz kationorodnikami ABTS·+ (3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian). Wyniki przedstawiono jako procent redukcji rodnika DPPH· po 60 min. inkubacji oraz procent redukcji kationorodnika ABTS·+, jak również w przeliczeniu na kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylchroman-2- karboksylowy (TE) jako mg TE/100 g s.m. i mM TE/100 g s.m. Po przeprowadzeniu analizy stwierdzono, że średnia zawartość kwasu α-askorbinowego w wodnych naparach produktów PJ wynosiła 0,44 mg/100 mL (22,02 mg/100g). Natomiast średnia zawartość TPC w analizowanych naparach PJ i PW wynosiła 9,34 mg/100 mL (467,19 mg/100g), a dla TFC 6,18 mg/100 mL (309,13 mg/100g). Stwierdzono ujemną korelację pomiędzy średnią wartością TPC, a TFC w wodnych naparach produktów PJ (r = 0,81; p < 0,05). Dla naparów uzyskanych z produktów PW całkowita zawartość polifenoli była 3-krotnie wyższa niż dla produktów PJ, a dla TFC prawie 1,5 razy wyższa. Średnia wartość TPC w wodnych naparach uzyskanych z produktów PJ wynosiła 0,45 mg/100 mL, co odpowiada 22,58 mg/100g (G14 oraz G15), a dla pozostałych naparów z produktów PJ 8,68 mg/100 mL (433,80 mg/100g). Średnia zawartość TFC w naparach sporządzonych z nierozdrobnionych produktów PJ sięgała 0,28 mg/100 mL (14,06 mg/100g), a w przypadku pozostałych naparów z produktów PJ 1,60 mg/100 mL (80,29 mg/100g). Uzyskane wyniki własne wskazują, że średni procent redukcji rodnika DPPH· oraz kationorodnika ABTS·+ dla wodnych naparów sporządzonych z owoców głogu wynosi, odpowiednio, 75,37% oraz 17,45%. Najsilniejsze właściwości przeciwrodnikowe w stosunku do rodnika DPPH· posiadały napary sporządzone z rozdrobnionych produktów PJ i PW (rI% = 0,75; p < 0,05). Zaobserwowano wysoką istotnie dodatnią korelację pomiędzy wartością TFC wodnych naparów uzyskanych z produktów PJ i PW, a zdolnością do zmiatania rodników DPPH· (rI% = 0,74, p < 0,05; rIC50 = - 0,85; p < 0,05) oraz zmiatania kationorodników ABTS·+ (rI% = 0,80; p < 0,05). Zaobserwowano również dobrą, ujemną korelację pomiędzy stężeniem kwasu cytrynowego w wodnych naparach sporządzonych z produktów PJ i PW, a właściwościami przeciwrodnikowymi w stosunku do kationorodnika ABTS·+ (r = - 0,67; p < 0,05). Z kolei dodatnią, istotnie skorelowaną zależność odnotowano dla stężenia kwasu L-jabłkowego w omawianych naparach uzyskanych z produktów PJ i PW oraz stopnia redukcji kationorodnika ABTS·+ (r = 0,63; p < 0,05).

IV.5. Analiza wybranych mikroelementów (Mn, Fe, Cu, Zn) metodą ICP-MS/MS w suplementach diety i mieszankach ziołowych zawierających suszone owoce głogu

W kolejnym etapie badań, celem było oznaczenie zawartości wybranych mikroelementów Mn, Fe, Cu oraz Zn w: 1) suplementach diety lub produktach zielarskich PJ (n = 8), 2) mieszankach ziołowych PW (n = 2) oraz 3) dojrzałych owocach głogu ze stanu naturalnego ZN (n = 3) i ich wodnych naparach (por. III. Materiał badawczy) [Bazylak i wsp., 2014; Bazylak i wsp., 2017 a, b]. Odważki 2,0 g produktu umieszczono w zlewkach szklanych i zalano 200,0 mL wody dejonizowanej o temp. 100°C (Hydrolab, Polska) i pozostawiono pod przykryciem przez 5 min. Uzyskany napar zdekantowano i studzono do temp. pokojowej. Następnie do 5,0 mL przesączonego naparu dodawano 3,0 mL st. HNO3 i poddawano mineralizacji mikrofalowej (MARS 5 Xpress) przez 60 min. Stosowano narost mocy generatora 0 ÷ 1200 W przez 20 min. aż do temp. 190 °C, a przez kolejne 40 min. utrzymywano stałą temp. 190 °C i moc 1200 W. Z kolei mineralizaty stałych, suszonych suplementów diety oraz mieszanek ziołowych uzyskiwano zalewając odważkę 0,25 g w naczyniu PTFE mieszaniną 2,0 mL 30% H2O2 i 6,0 mL st. HNO3. Uzyskany roztwór mineralizowano mikrofalowo jak zostało omówione poprzednio. Mineralizaty po ostudzeniu i filtracji rozcieńczono do 25,0 mL (napary) lub do 50,0 mL (suche zioła). Oznaczenie zawartości omawianych biopierwiastków oznaczono metodą ICP-MS/MS (Agilent 8800 Triple Quad z autosamplerem ASX-520). Do kalibracji spektrometru stosowano wzorcowy roztwór 24-pierwiastkowy do pomiarów ICP, a w procesie walidacji stosowano materiał certyfikowany w postaci liści herbaty INCT-TL-1 (IChTJ, Warszawa). Jako wzorzec wewnętrzny stosowano roztwór itru (89Y). Wszystkie pomiary wykonywano w trzech powtórzeniach. W Tabeli 16 zestawiono wyniki analizy zawartości Mn i Fe w suplementach diety lub produktach ziołowych (PJ) oraz mieszankach ziołowych (PW) oraz ich naparach, ale również średni procent ługowania (E %) tych mikroelementów do wodnego naparu oraz średni procent realizacji wystarczającego dziennego spożycia AI (ang. Adequate Intake) Mn [Jarosz i wsp., 2017] oraz średni procent realizacji zalecanego dziennego spożycia RDA (ang. Recommended Dietary Allowances) Fe [Jarosz i wsp., 2017] w wyniku dziennej konsumpcji naparu uzyskanego z produktów PJ lub PW w ilości rekomendowanej przez producenta (3 × 200 mL) przez kobiety dorosłe (19 ÷ 50 lat). Procent ługowania (E%) mikroelementów z produktów PJ lub PW do naparu został obliczony na podstawie równania:

஼ ܧሺΨሻ ൌ ೙ೌ೛ ൈ ݂ ൈ ͳͲͲΨ (4) ஼ೞǤ೘Ǥ

gdzie, Cnap – zawartość mikroelementu w wodnym naparze [μg/L]; Cs.m. – zawartość mikroelementu w produkcie PJ lub PW [mg/kg], f – współczynnik uwzględniający sposób przygotowania naparu (naważka – 2,0 g, objętość 200 mL)

Z kolei procent realizacji wystarczającego dziennego spożycia (AI) Mn obliczono na podstawie równania:

஼ ܣܫሺΨሻ ൌ ೙ೌ೛ ൈ ݂ ൈ ͳͲͲΨ (5) ஺ூ

gdzie, Cnap – zawartość Mn w wodnym naparze [μg/L]; AI – wystarczające dzienne spożycie Mn [1800 μg/osobę/dobę], f – współczynnik uwzględniający rekomendowane dzienne spożycie naparu (0,6 L)

Natomiast procent realizacji zalecanego dziennego spożycia (RDA) Fe, Cu oraz Zn obliczono na podstawie równania:

஼ ܴܦܣሺΨሻ ൌ ೙ೌ೛ ൈ ݂ ൈ ͳͲͲΨ (6) ோ஽஺

gdzie, Cnap – zawartość mikroelementu w wodnym naparze [μg/L]; RDA – zalecane dzienne spożycie mikroelementu [Fe = 18000; Cu = 900 oraz Zn = 800 mg/osobę/dobę], f – współczynnik uwzględniający rekomendowane dzienne spożycie naparu (0,6 L)

Wyniki wskazują istotnie wyższą (p < 0,05) zawartość Mn i Fe dla próbki G3 pochodzącej z województwa wielkopolskiego, które wynoszą, odpowiednio 21,80 oraz 47,90 mg/kg, w porównaniu z pozostałymi PJ (Tabela 16). Natomiast średnia zawartość Mn i Fe w PJ wynosi 12,63 oraz 33,08 mg/kg i jest ona niższa w porównaniu do surowca roślinnego zawierającym w swoim składzie Crataegus fructus i pochodzącym z województwa lubelskiego, gdzie koncentracja Mn sięga 11,05 mg/kg, a Fe 34,54 mg/kg [Ulewicz-Magulska, 2008]. Dla porównania, średnia zawartość Mn i Fe w jabłkach sięga 0,8 oraz 30,0 mg/kg [Kunachowicz i wsp., 2018]. W badaniach własnych stwierdzono również, że produkty PJ charakteryzowały się prawie 15. krotnie oraz 5. krotnie niższym stężeniem Mn oraz Fe w porównaniu z produktami PW, zawierającymi w swoim składzie oprócz owoców głogu również jabłko, owoc aronii, kwiat hibiskusa, kwiatostan głogu oraz dziką różę (G7 oraz G13), czyli surowce roślinne charakteryzujące się wysokim stężeniem Mn i Fe. W szczególności bogatym źródłem Mn i Fe jest kwiat hibiskusa oraz dzika róża. Brzezicha-Cirocka i wsp. (2015) oznaczyli zawartość Mn i Fe w suszach zawierających dziką różę na poziomie 130,0 oraz 180,0 mg/kg. Natomiast Wróbel i wsp. (2000) zanalizowali stężenie Mn i Fe w kwiatach Hibiscus sabdariffa na poziomie 390,0 oraz 111,0 mg/kg. Dla porównania, w owocach borówki czarnej oraz malinie właściwej średnia zawartość Mn wynosi 2,64 oraz 2,84 mg/kg, a Fe 5,95 oraz 11,85 mg/kg [Rusinek i wsp., 2008]. Oznaczona zawartość Mn oraz Fe we wszystkich analizowanych wodnych naparach mieściła się w zakresie 1,60 ÷ 567,40 μg/L oraz 27,20 ÷ 189,50 μg/L. Napary przygotowane z produktów PW charakteryzujące się najwyższym stężeniem Mn (649,55 μg/L) oraz Fe (160,30 μg/L) przygotowane były z surowca roślinnego zawierającego owoc jabłka, owoc aronii, kwiat hibiskusa. Wysoka zawartość Mn i Fe w kwiatach hibiskusa została potwierdzona w badaniach Wróbel i wsp. (2000). W badaniach własnych, stwierdzono że mikroelementem ługującym się w najwyższym stopniu był Mn (Śr E % = 15,03%). Podobne wyniki uzyskał w swoich badaniach Arceusz i wsp. (2009). W pracy tej odnotowano, że procent ługowania Mn do ekstraktu wodnego w przypadku herbatek owocowych wynosił 6,84 ÷ 43,34%, a dla liści ziół 3,21 ÷ 33,00%. Stopień ekstrakcji Mn do wodnego naparu był ściśle związany ze stopniem rozdrobnienia owoców głogu oraz składu mieszanki ziołowej. Wartości uzyskanego stopnia ługowania Mn do naparów wykazały istotnie (p < 0,05) wyższy stopień ekstrakcji tego biopierwiastka dla produktów rozdrobnionych (E % = 18,84%) w porównaniu ze stopniem ługowania Mn dla całych owoców (E % = 2,82%). Uzyskane wyniki wskazują, że w zastosowanych w warunkach sporządzania naparu średnio 13,02% całkowitej ilości Fe, która znajduje się w produktach, zostaje uwolniona do naparu wodnego przeznaczonego do spożycia. Z kolei procent ługowania Zn do naparów sporządzonych z produktów PJ wynosił 17,83, a do naparów uzyskanych z produktów PW sięgał tylko 5,89%.

Tabela 16. Średnia zawartość Mn oraz Fe w analizowanych produktach oraz ich wodnych naparach, średni procent ługowania mikroelementu (E %) oraz średni procent realizacji wystarczającego dla kobiet (19 ÷ 50 lat) dziennego spożycia (AI) Mn oraz zalecanego dziennego spożycia (RDA) Fe w wyniku konsumpcji naparu w ilości rekomendowanej przez producenta.

Mn (AI = 1,8 mg/os/dobę)* Fe (RDA = 18,0 mg/os/dobę)* s.m. napar E AI s.m. napar E RDA

[mg/kg] [μg/L] [%] [%] [mg/kg] [μg/L] [%] [%] G1 11,90 ± 0,24 20,30 ± 0,09 17,10 0,68 20,10 ± 0,17 50,50 ± 0,24 23,78 0,17 G2 9,60 ± 0,29 38,80 ± 0,09 40,42 1,29 28,20 ± 0,19 47,80 ± 0,28 16,95 0,16 G3 21,80 ± 0,11 32,30 ± 0,12 14,81 1,08 47,90 ± 0,09 102,30 ± 0,01 21,36 0,34 G4 14,20 ± 0,16 22,70 ± 0,10 15,99 0,76 30,30 ± 0,21 48,40 ± 0,20 15,97 0,16

PJ G5 15,30 ± 0,13 20,30 ± 0,15 13,27 0,68 32,90 ± 0,34 38,70 ± 0,24 11,76 0,13 G6 8,90 ± 0,24 10,20 ± 0,25 11,46 0,36 37,40 ± 0,39 84,40 ± 0,05 22,57 0,28 G14 8,70 ± 0,26 3,58 ± 0,29 4,14 0,12 33,40 ± 0,28 46,30 ± 0,17 13,86 0,15 G15 10,60 ± 0,17 1,60 ± 0,35 1,5 0,05 34,40 ± 0,19 56,30 ± 0,16 16,37 0,19 G7 184,20 ± 0,01 731,70 ± 0,01 39,72 24,39 266,90 ± 0,09 189,50 ± 0,10 7,10 0,63

PW G13 195,50 ± 0,02 567,40 ± 0,02 29,02 18,91 280,10 ± 0,15 131,10 ± 0,10 4,68 0,44 G16 18,90 ± 0,15 5,97 ± 0,35 3,16 0,03 132,50 ± 0,20 27,20 ± 0,30 2,05 0,09 G17 18,00 ± 0,08 4,18 ± 0,28 2,32 0,14 86,20 ± 0,10 85,10 ± 0,09 9,87 0,28 ZN G17A 19,60 ± 0,10 4,78 ± 0,33 2,44 0,16 178,80 ± 0,26 52,70 ± 0,18 2,95 0,18 SREDNIA 41,32 112,60 15,03 3,74 93,00 73,87 13,02 0,25 (n = 13) SRPJ 12,63 18,72 14,84 0,63 33,08 59,34 17,83 0,20 (n = 8) SRPW 189,85 649,55 34,37 21,65 273,50 160,30 5,89 0,54 (n = 2) SRROZDR 13,62 24,10 18,84 0,81 32,80 62,02 18,73 0,21 (n = 6) SRCALE 9,65 2,59 2,82 0,09 33,90 51,30 15,12 0,17 (n = 2) SRZN 18,83 4,98 2,64 0,11 132,50 55,01 4,96 0,18 (n = 3)

SREDNIA – wartość średnia dla wszystkich analizowanych produktów, SRPJ – wartość średnia dla produktów jednoskładnikowych PJ (G1 - G15), SRPW – wartość średnia dla produktów wieloskładnikowych PW (G7 - G13), SRROZDR – wartość średnia dla produktów rozdrobnionych jednoskładnikowych (G1 - G6), SRCALE – wartość średnia dla produktów nierozdrobnionych (G14 – G15), SRZN – wartość średnia dla owoców głogu zebranych ze stanu naturalnego (G16 – G17A), * - AI – wystarczające dzienne spożycie dla kobiet w wieku 19 ÷ 50 lat [Jarosz i wsp., 2017] * - RDA – zalecane dzienne spożycie dla kobiet w wieku 19 ÷ 50 lat [Jarosz i wsp., 2017] LOD – Mn (0,09 μg/L), Fe (0,40 μg/L)

W badaniach własnych stwierdzono, że spożycie naparów uzyskanych z produktów PJ przez dorosłe kobiety (19 ÷ 50 lat) w codziennych porcjach, których wielkość jest sugerowana przez producentów (3 × 200 mL), umożliwia tylko w niewielkim stopniu zrealizowanie wystarczającego dziennego spożycia (AI) na Mn (0,05 ÷ 1,29%) oraz zalecanego dziennego spożycia (RDA) na Fe (0,13 ÷ 0,34%). Wartości uzyskanej procentowej realizacji wystarczającego dziennego spożycia (AI) Mn jest istotnie (p < 0,05) wyższe w przypadku PW w porównaniu z PJ (Tabela 16).

Natomiast w Tabeli 17 zestawiono wyniki analizy zawartości Cu i Zn w suplementach diety lub produktach ziołowych (PJ) oraz mieszankach ziołowych (PW) oraz ich naparach, ale również średni procent ługowania (E %) tych mikroelementów do wodnego naparu oraz średni procent realizacji zalecanego dziennego spożycia (RDA) Cu i Zn dla kobiet (19 ÷ 50 lat) [Jarosz i wsp., 2017] w wyniku dziennej konsumpcji naparu w ilości rekomendowanej przez producenta (3 × 200 mL). Najwyższą zawartość Cu wśród PJ odnotowano dla produktu G3 pochodzącej z województwa wielkopolskiego, wynoszącą, 25,70 mg/kg, a w przypadku Zn najwyższą jego zawartość stwierdzono dla produktu G2, pochodzącą również z województwa wielkopolskiego, sięgającą 101,30 mg/kg. Warto zaznaczyć, że w przeciwieństwie do zawartości Mn oraz Fe, średnia koncentracja Cu i Zn w suchej masie produktów PJ była istotnie (p < 0,05) wyższa w porównaniu z PW. Średnia zawartość Cu w badanych PJ wynosiła średnio 21,89 mg/kg, przy zakresie 11,20 ÷ 25,70 mg/kg oraz 9,08 mg/kg w PW, przy zakresie 8,96 ÷ 9,20 mg/kg. Niższe wartości Cu uzyskała Ulewicz-Magulska (2008) analizując stężenie tego pierwiastka w surowcu roślinnym pochodzącym z województwa lubelskiego zawierającego Crataegus fructus (5,56 mg/kg). Dla porównania, stężenie Cu w owocu borówki czarnej (Vaccinium myrtillus L.) oraz maliny właściwej (Rubus ideaus L.) z województwa lubelskiego, było identyczne i wynosiło 0,17 mg/kg [Rusinek i wsp., 2008]. Natomiast, w badaniach własnych, średnie stężenie Zn w PJ (76,79 mg/kg) było istotnie (p < 0,05) wyższe w porównaniu z PW (27,70 mg/kg). Natomiast w Crataegus fructus, surowcu roślinnym pochodzącym z województwa lubelskiego, średnia koncentracja Zn wynosiła 35,54 mg/kg [Ulewicz-Magulska, 2008]. Z kolei w borówce czarnej i malinie właściwej stężenie tego mikroelementu wynosi, odpowiednio, 7,16 oraz 9,96 mg/kg [Rusinek i wsp., 2008]. Badane wodne napary charakteryzują się szerokim zakresem stopnia ługowania (E%) Cu oraz Zn wynoszącym, odpowiednio, 5,70 ÷ 23,44% oraz 1,13 ÷ 20,08%. Z kolei średnie wartości stopnia ługowania Zn (5,55%), uzyskane w badaniach własnych, są zbliżone do średniego stopnia ekstrakcji tego mikroelementu w przypadku herbatek owocowych (4,41%) [Arceusz i wp., 2009]. Istotnie (p < 0,05) wyższy procent ługowania Cu odnotowano dla PJ rozdrobnionych (13,51%) w porównaniu z PJ nierozdrobnionymi (5,93%). Z kolei w przypadku Zn, stwierdzono niewiele wyższy procent ekstrakcji tego mikroelementu dla PJ rozdrobnionych (4,64%), w porównaniu z PJ nierozdrobnionymi (2,42%). W badaniach własnych stwierdzono, że spożycie przez dorosłe kobiety (19 ÷ 50 lat) w codziennych porcjach, których wielkość jest sugerowana przez producentów (3 × 200 mL), umożliwia tylko w niewielkim stopniu zrealizowanie zalecanego dziennego spożycia (RDA) Cu w zakresie 0,54 ÷ 2,82% oraz Zn w zakresie 0,06 ÷ 0,40%. Pomimo stosunkowo wysokiej zawartości Mn, Fe, Cu oraz Zn w suszonych owocach głogu, które są wyższe od innych owoców leśnych (borówki czarnej i maliny właściwej), to stopień realizacji wystarczającego dziennego spożycia (Mn) oraz zalecanego dziennego spożycia (Fe, Cu oraz Zn) tych mikroelementów po spożyciu jest niewielki, co mogło być spowodowane sposobem sporządzonego wodnego naparu.

Tabela 17. Średnia zawartość Cu oraz Zn w analizowanych produktach oraz ich wodnych naparach, średni procent ługowania mikroelementu (E %) oraz średni procent realizacji zalecanego dla kobiet (19 ÷ 50 lat) dziennego spożycia (RDA) Cu oraz Zn w wyniku konsumpcji naparu w ilości rekomendowanej przez producenta.

Cu (RDA = 0,9 mg/os/dobę)* Zn (RDA = 8,0 mg/os/dobę)* s.m. napar E RDA s.m. napar E RDA

[mg/kg] [μg/L] [%] [%] [mg/kg] [μg/L] [%] [%] G1 23,80 ± 0,16 19,30 ± 0,25 8,11 1,29 68,40 ± 0,02 40,30 ± 0,08 5,89 0,30 G2 24,10 ± 0,19 36,60 ± 0,09 15,19 2,44 101,30 ± 0,02 52,00 ± 0,01 3,98 0,39 G3 25,70 ± 0,11 28,50 ± 0,29 11,09 1,90 76,20 ± 0,03 30,20 ± 0,11 3,96 0,23 G4 20,10 ± 0,31 42,30 ± 0,11 21,04 2,82 69,80 ± 0,01 26,80 ± 0,09 3,84 0,20

PJ G5 24,30 ± 0,29 22,30 ± 0,19 9,18 1,49 79,20 ± 0,05 53,70 ± 0,02 6,78 0,40 G6 11,20 ± 0,32 18,40 ± 0,17 16,43 1,23 54,70 ± 0,06 18,50 ± 0,21 3,38 0,14 G14 23,50 ± 0,22 13,40 ± 0,28 5,7 0,89 90,60 ± 0,14 33,50 ± 0,29 3,70 0,25 G15 22,40 ± 0,19 13,80 ± 0,29 6,16 0,92 74,10 ± 0,08 8,40 ± 0,18 1,13 0,06 G7 8,96 ± 0,20 21,00 ± 0,11 23,44 1,40 24,20 ± 0,16 48,60 ± 0,08 20,08 0,36

PW G13 9,20 ± 0,21 20,20 ± 0,09 21,96 1,35 31,20 ± 0,21 45,30 ± 0,10 14,52 0,34 G16 23,60 ± 0,19 17,51 ± 0,25 7,42 0,58 83,85 ± 0,05 10,10 ± 0,22 1,20 0,63 G17 15,85 ± 0,28 16,10 ± 0,21 10,18 0,54 77,80 ± 0,07 11,70 ± 0,23 1,50 0,09 ZN G17A 23,12 ± 0,15 23,40 ± 0,09 10,12 0,78 89,90 ± 0,08 20,10 ± 0,18 2,24 0,15 SREDNIA 19,68 21,22 12,77 1,36 70,87 30,71 5,55 0,27 (n = 13) SRPJ 21,89 24,33 11,61 1,62 76,79 32,93 4,08 0,25 (n = 8) SRPW 9,08 20,60 22,70 1,38 27,70 46,95 17,30 0,35 (n = 2) SRROZDR 21,53 27,90 13,51 1,86 74,93 36,92 4,64 0,28 (n = 6) SRCALE 22,95 13,60 5,93 0,91 82,35 20,95 2,42 0,16 (n = 2) SRZN 20,86 19,00 9,24 0,63 83,85 13,97 1,65 0,29 (n = 3)

SREDNIA – wartość średnia dla wszystkich analizowanych produktów, SRPJ – wartość średnia dla produktów jednoskładnikowych PJ (G1 - G15), SRPW – wartość średnia dla produktów wieloskładnikowych PW (G7 - G13), SRROZDR – wartość średnia dla produktów rozdrobnionych jednoskładnikowych (G1 - G6), SRCALE – wartość średnia dla produktów nierozdrobnionych (G14 – G15), SRZN – wartość średnia dla owoców głogu zebranych ze stanu naturalnego (G16 – G17A), * - RDA – zalecane dzienne spożycie dla kobiet w wieku 19 ÷ 50 lat [Jarosz i wsp., 2017] LOD – Cu (0,04 μg/L), Zn (μg/L)

IV.6. Analiza zawartości patuliny metodą SPE-UHPLC-MS/MS w suplementach diety, mieszankach ziołowych i owocach głogu zebranych ze stanu naturalnego

Wyniki analizy zawartości patuliny w suplementach diety lub produktach zielarskich (PJ) oraz mieszankach ziołowych (PW) zawierających suche owoce głogu, a następnie w mrożonych owocach głogu Crataegus monogyna oraz owocach suszonych metodą napowietrzną C. laevigata oraz C. rhipidophylla zostały omówione szczegółowo w publikacji będącej podstawą niniejszej rozprawy [Przybylska i wsp., 2019]. Zarówno z danych literaturowych [Li i wsp., 2007 a] oraz na podstawie wyników własnych dotyczących analizy soków jabłkowych (Rozdział IV. 1. 3.) wynika, że kolumienka MycoSep®228AflaPat [cereus.com.pl] wykazywała najlepszą selektywność esktrakcji patuliny, co wskazywało na możliwość jej zastosowania do ekstrakcji tej mikotoksyny z suplementów diety lub produktów zielarskich oraz mieszanek ziołowych, a także z owoców zebranych ze stanu naturalnego. Schemat przebiegu czynności wykonywanych w trakcie ekstrakcji patuliny metodą SPE został zaprezentowany na Rys. 17.

Rys. 17. Schemat ekstrakcji SPE kolumienki MycoSep®228AflaPat

Stosowane warunki ekstrakcji patuliny z wykorzystaniem kolumienki MycoSep®228AflaPat zostały zmodyfikowane w stosunku do zaleceń producenta (Romer Labs, DE, USA). Po przeprowadzeniu ekstrakcji patuliny, oczyszczony ekstrakt został wzbogacony roztworem patuliny znaczonej izotopowo (13C PAT). Oznaczenie patuliny wykonano metodą gradientowej ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej (UHPLC) wykorzystując chromatograf Nexera sprzężony z tandemowym spektrometrem mas (5500 Q- TRAP). W analizie zastosowano kolumnę Synergi Polar C18 (150 × 2 mm, 4 μm) oraz mieszaninę dwóch faz ruchomych: 10 mM octan amonu w wodzie oraz 10 mM octanu amonu w metanolu. Dobrane warunki analizy pozwoliły na uzyskanie krótkiego czasu retencji patuliny równym 6,17 min oraz wysokiego odzysku patuliny na poziomie 112,7% oraz 109,4% przy fortyfikacji próbki odpowiednio 50,0 oraz 100,0 μg/kg. Limit detekcji (LOD) patuliny wynosił 1,0 μg/kg. Przeprowadzone badania własne wykazały obecność patuliny w 47% we wszystkich analizowanych produktach (n = 41). Średnia zawartość tej mikotoksyny w zainfekowanym materiale badawczym wynosiła 29,5 μg/kg, przy zakresie 5,7 ÷ 93,2 μg/kg. Stężenie patuliny

< LOD odnotowano w owocach Crataegus monogyna zerwanych z drzew rosnących na terenie Bydgoszczy, a następnie mrożonych w temperaturze - 20°C, dwóch mieszanek ziołowych, pochodzących z województwa małopolskiego (K23) oraz lubuskiego (G13) oraz pięciu naturalnie suszonych owoców głogu Crataegus laevigata pochodzących z Ojcowa. PJ były zainfekowane patuliną na średnim poziomie 11,4 ± 5,5 μg/kg. Z kolei w grupie PW zawierających suszone owoce głogu oraz inne części roślin leczniczych zakres patuliny wynosił < LOD ÷ 93,2 μg/kg. Stężenie patuliny w analizowanych produktach różniło się dla poszczególnych regionów Polski. Najwyższe stężenie patuliny odnotowano dla produktu PJ z województwa łódzkiego (23,5 ± 34,2 μg/kg; n = 6), a najniższe dla produktu z województwa lubuskiego (4,9 ± 5,7 μg/kg; n = 2). Z wyników przedstawionych w pracy Przybylskiej i wsp. (2019) wynika, że tylko jedna próbka sklasyfikowana jako PW, zawierająca w swoim składzie owoc głogu, jabłko, owoc aronii, kwiat hibiskusa, koncentrat z owoców aronii oraz kwas cytrynowy przekraczała dopuszczalny limit zawartości patuliny ustalony na poziomie 50 μg/kg. W badaniach własnych zbadano również zawartość patuliny w owocach należących do trzech różnych gatunków głogów. Najniższą zawartość patuliny odnotowano w owocach głogu należących do Crataegus laevigata (< 1,0 μg/kg), a najwyższe dla Crataegus monogyna (13,7 μg/kg). Z kolei w owocach Crataegus rhipidophylla zerwanych w Ojcowskim Parku Narodowym, a następnie suszonych napowietrznie średnie stężenie patuliny wynosiło 3,8 μg/kg. Jednocześnie w owocach Crataegus monogyna zerwanych z drzew dziko rosnących w Bydgoszczy, a następnie mrożonych w temp. -20 °C nie stwierdzono obecności patuliny (< LOD).

IV.7. Analiza statystyczna uzyskanych wyników

Po wykonaniu analiz chemicznych omówionych w rozdziałach IV.2 – IV. 6 niniejszej rozprawy, wykonano analizę korelacji Persona przy użyciu programu Statistica ver. 13 (StatSoft, Kraków). W Tabeli 18 przedstawiono korelację pomiędzy wartościami wyznaczonych 24 parametrów fizykochemicznych oraz wskaźników jakości higienicznej (PAT, Mn, Fe, Cu, Zn, PL, DR, TAMC, GN, TPC, TFC, DPI, DPT, DPmM, IC50, ABI, ABT, ABmM, KA, KC, KJ, KSZ, KW, KWAS) dotyczących łącznie WSZYSTKICH DZIESIĘCIU ANALIZOWANYCH PRODUKTÓW PJ i PW (G1, G2, G3, G4, G5, G6, G14, G15, G7, G13) w przeliczeniu na SUCHĄ MASĘ (mg/100g). Z kolei w Tabeli 19 ukazano korelację pomiędzy w/w parametrami dotyczącymi ośmiu PRODUKTÓW JEDNOSKŁADNIKOWYCH PJ (G1, G2, G3, G4, G5, G6, G14, G15) w przeliczeniu na SUCHĄ MASĘ (mg/100g). Natomiast w Tabeli 20 przedstawiono korelację pomiędzy wartościami 20 parametrów fizykochemicznych (PAT, Mn, Fe, Cu, Zn, TPC, TFC, DPI, DPT, DPmM, IC50, ABI, ABT, ABmM, KA, KC, KJ, KSZ, KW, KWAS) dotyczących ośmiu PRODUKTÓW JEDNOSKŁADNIKOWYCH PJ (G1, G2, G3, G4, G5, G6, G14, G15) w przeliczeniu na μg/L WODNEGO NAPARU.

Tabela 18. Współczynniki korelacji (r) pomiędzy parametrami fizykochemicznymi charakteryzującymi SUCHĄ MASĘ DZIESIĘCIU PRODUKTÓW (mg/100 g) obejmujących suplementy diety i produkty zielarskie (PJ) oraz mieszanki ziołowe (PW) (por. III. Materiał badawczy)

PAT Mn Fe Cu Zn PL DR TAMC GN TPC TFC DPI DPT DPmM IC50 ABI ABT ABmM KA KC KJ KSZ KW PAT 1,00 Mn -0,43 1,00 Fe -0,43 1,00 1,00 Cu 0,07 -0,19 -0,23 1,00 Zn -0,75 0,05 0,02 0,54 1,00 PL -0,08 -0,20 -0,20 0,42 0,28 1,00 DR -0,08 -0,13 -0,11 0,33 0,24 0,94 1,00 TAMC -0,19 -0,13 -0,16 0,07 0,19 -0,13 -0,17 1,00 GN 0,34 0,41 0,40 0,33 -0,22 0,26 0,25 -0,05 1,00 TPC -0,20 0,69 0,69 0,33 0,17 0,45 0,49 -0,19 0,73 1,00 TFC 0,08 0,22 0,20 0,51 0,08 0,51 0,42 0,36 0,79 0,70 1,00 DPI 0,04 0,18 0,18 0,26 0,10 0,25 0,18 0,28 0,75 0,49 0,74 1,00 DPT 0,04 0,16 0,16 0,27 0,10 0,26 0,18 0,27 0,74 0,47 0,73 1,00 1,00 DPmM 0,04 0,17 0,17 0,26 0,10 0,26 0,18 0,27 0,74 0,48 0,73 1,00 1,00 1,00 IC50 -0,02 0,29 -0,29 -0,35 -0,12 -0,28 -0,21 -0,31 -0,82 -0,62 -0,85 -0,98 -0,97 -0,97 1,00 ABI 0,24 -0,18 -0,19 0,39 -0,05 0,78 0,73 0,21 0,58 0,43 0,80 0,54 0,55 0,55 -0,58 1,00 ABT 0,23 -0,18 -0,18 0,39 -0,04 0,79 0,74 0,21 0,57 0,44 0,80 0,54 0,54 0,54 -0,58 1,00 1,00 ABmM 0,27 -0,28 -0,24 0,48 -0,02 0,73 0,65 0,32 0,57 0,39 0,85 0,55 0,55 0,55 -0,60 0,98 0,98 1,00 KA 0,30 -0,94 -0,93 0,13 0,07 0,21 0,17 0,20 -0,36 -0,65 -0,21 0,01 0,02 0,02 0,14 0,17 0,17 0,20 1,00 KC -0,43 0,58 0,58 -0,10 0,21 -0,33 -0,23 -0,37 -0,28 0,23 -0,38 -0,56 -0,57 -0,57 0,45 -0,67 -0,66 -0,67 -0,65 1,00 KJ 0,02 0,17 0,15 0,49 0,11 0,74 0,58 -0,29 0,50 0,66 0,64 0,25 0,25 0,25 -0,36 0,63 0,64 0,62 -0,29 -0,06 1,00 KSZ 0,22 -0,54 -0,56 0,37 0,09 0,14 0,00 0,78 0,11 -0,24 0,45 0,38 0,39 0,39 -0,38 0,41 0,41 0,55 0,56 -0,65 -0,06 1,00 KW -0,21 0,45 0,45 0,23 0,24 -0,09 -0,03 -0,38 0,00 0,47 -0,04 -0,23 -0,24 -0,24 0,11 -0,37 -0,37 -0,36 -0,52 0,82 0,17 -0,44 1,00 KWAS -0,14 0,53 0,52 0,29 0,20 0,12 0,07 0,23 0,81 0,69 0,74 0,90 0,90 0,90 -0,95 0,36 0,36 0,38 -0,36 -0,20 0,29 0,19 0,03

PAT – zawartość patuliny [μg/kg], Mn – całkowita zawartość manganu w suchym produkcie [mg/kg], Fe - całkowita zawartość żelaza w suchym produkcie [mg/kg], Cu - całkowita zawartość miedzi w suchym produkcie [mg/kg], Zn - całkowita zawartość cynku w suchym produkcie [mg/kg], PL – ogólna liczba pleśni [jtk/g], DR – ogólna liczba drożdży [jtk/g], TAMC – ogólna liczba drobnoustrojów tlenowych [jtk/g], GN – gęstość nasypowa [g/mL], TPC – całkowita zawartość polifenoli [mg GAE/100g s,m,], TFC – całkowita zawartość związków flawonoidowych [mg CAE/100g s,m], DPI – procent redukcji rodnika DPPH· [%], DPT – aktywność antyoksydacyjna wobec DPPH· [mg TE/100g s,m,], DPmM - aktywność antyoksydacyjna wobec DPPH· [mM TE/100g s,m,], ABI - procent redukcji kationorodnika ABTS·+ [%], ABT – aktywność antyoksydacyjna wobec ABTS·+ [mg TE/100g s,m,], ABmM – aktywność antyoksydacyjna wobec ABTS·+ [mM TE/100g s,m,], KA – zawartość kwasu askorbinowego [mg/100g s,m,], KC – zawartość kwasu cytrynowego [mg/100g s,m,], KJ – zawartość kwasu jabłkowego [mg/100g s,m,], KSZ – zawartość kwasu szczawiowego [mg/100g s,m,], KW – zawartość kwasu winowego [mg/100g s,m,], KWAS – kwasowość ogólna [mg/100 mL], Wartości zaznaczone na szaro oznaczają korelacje statystycznie istotne (p < 0,05)

Tabela 19. Współczynniki korelacji (r) pomiędzy parametrami fizykochemicznymi charakteryzującymi SUCHĄ MASĘ OŚMIU PRODUKTÓW (mg/100 g) obejmujących suplementy diety i produkty zielarskie (PJ) (por. III. Materiał badawczy)

PAT Mn Fe Cu Zn PL DR TAMC GN TPC TFC DPI DPT DPmM IC50 ABI ABT ABmM KA KC KJ KSZ KW PAT 1,00 Mn -0,43 1,00 Fe -0,24 0,54 1,00 Cu 0,14 0,64 -0,07 1,00 Zn -0,85 0,71 0,24 0,34 1,00 PL -0,21 0,60 0,51 0,45 0,35 1,00 DR -0,17 0,66 0,75 0,36 0,30 0,94 1,00 TAMC -0,32 0,03 -0,30 0,13 0,33 -0,17 -0,20 1,00 GN 0,60 0,09 0,00 0,65 -0,20 0,41 0,36 0,00 1,00 TPC 0,19 0,47 0,39 0,63 0,09 0,88 0,85 -0,10 0,75 1,00 TFC 0,19 0,27 -0,08 0,72 0,13 0,59 0,47 0,40 0,80 0,81 1,00 DPI 0,13 -0,06 0,06 0,40 0,15 0,31 0,21 0,30 0,75 0,53 0,73 1,00 DPT 0,12 -0,06 -0,06 0,40 0,16 0,31 0,21 0,30 0,75 0,52 0,73 1,00 1,00 DPmM 0,12 -0,06 -0,06 0,40 0,16 0,31 0,21 0,30 0,75 0,52 0,73 1,00 1,00 1,00 IC50 -0,17 -0,02 0,08 -0,51 -0,14 -0,38 -0,27 -0,37 -0,82 -0,62 -0,84 -0,98 -0,98 -0,98 1,00 ABI 0,09 0,46 0,27 0,68 0,20 0,82 0,76 0,16 0,74 0,96 0,92 0,63 0,63 0,63 -0,73 1,00 ABT 0,08 0,47 0,28 0,67 0,20 0,83 0,78 0,15 0,73 0,96 0,92 0,63 0,62 0,62 -0,72 1,00 1,00 ABmM 0,13 0,42 0,11 0,72 0,18 0,74 0,66 0,27 0,76 0,91 0,97 0,64 0,64 0,64 -0,76 0,98 0,98 1,00 KA -0,28 -0,20 0,30 -0,34 0,22 -0,04 0,02 0,20 0,08 -0,09 -0,05 0,56 0,57 0,56 -0,43 -0,42 -0,04 -0,09 1,00 KC -0,13 0,07 0,08 -0,40 -0,14 -0,30 -0,21 -0,35 -0,75 -0,53 -0,75 -1,00 -1,00 -1,00 0,99 -0,64 -0,63 -0,66 -0,54 1,00 KJ 0,10 0,40 0,02 0,63 0,13 0,81 0,62 -0,28 0,49 0,79 0,63 0,23 0,23 0,24 -0,33 0,73 0,74 0,72 -0,46 -0,23 1,00 KSZ 0,01 -0,05 -0,43 0,35 0,13 0,01 -0,11 0,86 0,43 0,19 0,69 0,57 0,58 0,58 -0,67 0,40 0,40 0,54 0,18 -0,63 0,03 1,00 KW 0,40 0,09 0,09 -0,16 -0,56 0,02 0,10 -0,48 -0,20 0,06 -0,22 -0,62 -0,62 -0,62 0,56 -0,06 -0,07 -0,10 -0,73 0,61 0,21 -0,54 1,00 KWAS 0,13 0,05 -0,11 0,53 0,21 0,30 0,20 0,38 0,79 0,53 0,77 0,98 0,97 0,97 -0,98 0,64 0,63 0,67 0,49 0,98 0,25 0,67 -0,68

Tabela 20. Współczynniki korelacji (r) pomiędzy parametrami fizykochemicznymi charakteryzującymi WODNE NAPARY (μg/100 mL) uzyskane z produktów PJ (por. III. Materiał badawczy)

PAT Mn Fe Cu Zn TPC TFC DPI DPT DPmM IC50 ABI ABT ABmM KA KC KJ KSZ KW PAT 1,00 Mn 0,54 1,00 Fe -0,20 0,15 1,00 Cu 0,35 0,78 -0,03 1,00 Zn 0,50 0,63 -0,43 0,32 1,00 TPC 0,19 0,81 0,54 0,46 0,35 1,00 TFC 0,18 0,89 0,13 0,75 0,51 0,81 1,00 DPI 0,13 0,74 0,23 0,58 0,47 0,52 0,73 1,00 DPT 0,11 0,73 0,24 0,57 0,47 0,52 0,72 1,00 1,00 DPmM 0,11 0,73 0,23 0,57 0,47 0,52 0,72 1,00 1,00 1,00 IC50 0,19 -0,82 -0,20 -0,68 -0,49 -0,62 -0,84 -0,98 -0,98 -0,72 1,00 ABI 0,09 0,85 0,39 0,59 0,42 0,96 0,92 0,62 0,63 1,00 1,00 1,00 ABT 0,08 0,84 0,41 0,58 0,40 0,96 0,92 0,62 0,62 0,62 -0,73 1,00 1,00 ABmM 0,12 0,87 0,28 0,67 0,44 0,91 0,97 0,64 0,64 0,64 -0,76 0,98 0,98 1,00 KA -0,27 0,00 0,45 0,14 -0,21 -0,08 -0,75 0,57 0,56 0,56 -0,43 -0,04 -0,04 -0,09 1,00 KC -0,12 -0,75 -0,21 -0,61 -0,48 -0,53 0,63 -1,00 -0,98 -1,00 0,99 -0,60 -0,63 -0,65 -0,54 1,00 KJ 0,09 0,51 0,29 0,03 0,32 0,79 0,69 0,23 0,23 0,24 -0,33 0,73 0,74 0,72 -0,45 -0,22 1,00 KSZ 0,00 0,51 -0,20 0,80 0,18 0,19 0,69 0,59 0,58 0,58 -0,67 0,40 0,40 0,54 0,18 -0,62 0,03 1,00 KW 0,39 -0,06 -0,21 -0,24 0,25 0,06 -0,22 -0,62 -0,62 -0,62 0,56 -0,06 -0,07 -0,10 -0,73 0,61 0,22 -0,54 1,00 KWAS 0,12 0,75 0,21 0,64 0,39 0,53 0,77 0,98 0,97 0,97 -0,98 0,64 0,63 0,67 0,49 -0,98 0,25 0,67 -0,68

PAT – zawartość patuliny [μg/kg], Mn – całkowita zawartość manganu w wodnym naparze [μg/100 mL], Fe - całkowita zawartość żelaza w wodnym naparze [μg/100 mL], Cu - całkowita zawartość miedzi w w wodnym naparze [μg/100 mL], Zn - całkowita zawartość cynku w wodnym naparze [μg/100 mL], TPC – całkowita zawartość polifenoli [μg GAE/100 mL], TFC – całkowita zawartość związków flawonoidowych [μg CAE/100 mL], DPI – procent redukcji rodnika DPPH· [%], DPT – aktywność antyoksydacyjna wobec DPPH· [μg TE/100 mL], DPmM - aktywność antyoksydacyjna wobec DPPH· [μM TE/100 mL], ABI - procent redukcji kationorodnika ABTS·+ [%], ABT – aktywność antyoksydacyjna wobec ABTS·+ [μg TE/100 mL], ABmM – aktywność antyoksydacyjna wobec ABTS·+ [μM TE/100 mL], KA – zawartość kwasu askorbinowego [μg/100 mL], KC – zawartość kwasu cytrynowego [μg/100 mL], KJ – zawartość kwasu jabłkowego [μg/100 mL], KSZ – zawartość kwasu szczawiowego [μg/100 mL], KW – zawartość kwasu winowego [μg/100 mL], KWAS – kwasowość ogólna [mg/100 mL], Wartości zaznaczone na szaro oznaczają korelacje statystycznie istotne (p < 0,05)

Na Rys. 18 przedstawiono wyniki analizy głównych składowych (PCA), która uwzględnia wartości parametrów fizykochemicznych (Tabela 20) analizowanych produktów (n = 10) w przeliczeniu na μg/L WODNYCH NAPARÓW analizowanych produktóW (A) oraz wykres wartości ładunków głównych składowych

A B 1,2 1,2

G14 kwas L-askorbinowy G13 G15 0,8 0,8 kwas szczawiowy G7 PAT 0,4 0,4 Cu ABTS ABTS I%

0,0 0,0 DPPH I% G3 G6 G2 DPPH TFC G5 PC2 (30,22 %) PC2 (25,73%) kwas L-jabłkowy G4 G1 kwasowość -0,4 -0,4 Zn

kwas wi nowy kwas cytr ynowy TPC Fe -0,8 -0,8 Mn

-1,2 -1,2 0,0 0,4 0,8 1,2 -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 PC1 (52,27 %) PC1 (49,92%)

Rys. 18. Analiza głównych składowych (PCA) naparów wodnych analizowanych produktów (A) oraz zawartości patuliny, kwasów organicznych, mikroelementów, właściwości antyoksydacyjnych (B)

Dla badanych PRODUKTÓW JEDNO- I WIELOSKŁADNIKOWYCH dwie pierwsze składowe PC1 i PC2 (Rys. 18 A) opisują 82,49% całkowitej wariancji zestawu danych wziętych do analizy, przy czym PC1 uwzględnia 52,27% całkowitej wariancji, a PC2 30,22%. Nawyższe wartości pierwszej głównej składowej PC1 wyodrębniają produkty PJ, których średnia zawartość patuliny sięga 10,97 μg/kg. Natomiast najwyższe wartości PC2 wyróżniają produkty PJ (G14 oraz G15) oraz PW (G7 oraz G13), w których średnie stężenie patuliny wynosi 6,40 μg/kg. Z wyjątkiem produktów nierozdrobnionych G14 oraz G15, dwie pierwsze składowe, bardzo dobrze rozdzielają produkty jednoskładnikowe (PJ) od produktów wieloskładnikowych (PW). Produkty G14 i G15 charakteryzują się, podobnie jak produkty PW G7 oraz G13, wysokim stężeniem kwasu cytrynowego, ale za to niską zawartością analizowanych mikroelementów oraz niskim stężeniem całkowitej zawartości związków polifenolowych (TPC), flawonoidowych (TFC) oraz kwasu szczawiowego. Przedstawiona w Tabeli 20 wysoka korelacja pomiędzy TFC, a zawartością jonów Cu2+ (r = 0,75; r = p < 0,05) oraz korelacja pomiędzy TPC, a zawartością Mn2+ (r = 0,81; p < 0,05) wyjaśnia bliskie ich wzajemne położenie na Rys. 18B. Na wykresie ładunków głównych komponentów (Rys. 18B) dwie pierwsze składowe opisują 75,65% całkowitej wariancji zestawu danych, przy czym pierwsza składowa (PC1) uwzględnia 49,92%, a druga 25,73%. Przeprowadzona analiza korelacji (Tabela 20) oraz analiza PCA (Rys. 18) wskazuje, że oprócz związków polifenolowych, jony Mn2+ oraz Cu2+ przyczyniają się w znacznym stopniu do wysokich właściwości przeciwutleniających wodnych naparów sporządzonych z suszonych owoców głogu. Z kolei Ravipati i wsp. (2012) zaobserwowali istotny wpływ wysokiej zawartości Zn i Mn, przy jednoczesnym niskim stężeniu związków polifenolowych, na właściwości przeciwutleniające jemioły (Viscum coloratum).

V. Dyskusja

Wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HPTLC) była w przeszłości stosowana tylko do jakościowego oznaczania patuliny wyekstrahowanej z soków jabłkowych. W ostatnich latach metoda TLC i HPTLC okazała się jednak przydatna do oznaczeń ilościowych, jak również jakościowej kontroli obecności patuliny w różnych produktach roślinnych. Według danych literaturowych w celu identyfikacji patuliny najczęściej stosowane są płytki TLC pokryte warstwą szerokoporowatego żelu krzemionkowego GF-254 oraz 60 F254 [Sharma i wsp., 2015; Wright i wsp., 2014]. W badaniach własnych zastosowano płytki HPTLC pokryte warstwą żelu krzemionkowego o obniżonej średnicy ziarna (dp < 10 μm), co umożliwia analizę próbek zawierających patulinę w ilościach nanogramowych [Przybylska & Bazylak, 2013]. W przeciwieństwie do badań Sharma i wsp. (2015), w których do wizualizacji patuliny na płytkach TLC zastosowano 2,0% roztwór chlorowodorku fenylohydrazyny, w badaniach własnych, płytki HPTLC spryskiwano 0,5% roztworem chlorowodorku 3-metylo-2- benzotiazolinonu (MBTH) a następnie ogrzewano w temp. 100 °C przez 30 min [Wright i wsp., 2014]. Znaczącym osiągnięciem przedstawionym w publikacji własnej [Przybylska & Bazylak, 2013] jest wykazanie, że przy zastosowaniu komory chromatograficznej typu „sandwich” patulina rozdziela się na płytkach HPTLC typu Nano-SIL-20 z wysoką selektywnością od mieszaniny w postaci 5-hydroksymetylofurfuralu, kwercetyny oraz kwasu α-askorbinowego stanowiących składniki soku jabłkowego. Uzyskany w tych badaniach LOD patuliny wynosił 40,0 μg/L, co wskazuje, że metoda ta może być z powodzeniem wykorzystywana w analizie żywności do badań skriningowych, jakościowych i półilościowych, a zwłaszcza tam gdzie stężenie patuliny jest zbliżone lub gdy przekracza dozwoloną przepisami żywnościowymi maksymalną ilość tej mikotoksyny, która wynosi 50 μg/L [Rozporządzenie Komisji WE Nr 1881/2006]. Brak odtwarzalności i powtarzalności warunków ekstrakcji patuliny metodą LLE często powoduje, że wyniki analiz nie są zgodne, a rozdzielenie patuliny od związków przeszkadzających (zwłaszcza 5-HMF) staje się w wielu przypadkach niemożliwe, co utrudnia uzyskanie wiarygodnych wyników analitycznych. Na przykład gdy zastosowano octan etylu do ekstrakcji patuliny z suszonych owoców głogu w układzie ciecz-ciecz (LLE), uzyskano niski odzysk tego analitu na poziomie 64% [Xiang i wsp., 2012]. W warunkach ekstrakcji LLE odzysk patuliny jest nawet o 22% niższy, a całkowity czas tego procesu wydłuża się do ponad 1 h [Li i wsp., 2007, b]. W celu ekstrakcji patuliny z soków jabłkowych Murillo i wsp. (2008) wykorzystali ekstrakcję ciecz-ciecz, a do identyfikacji tego analitu po raz pierwszy zastosowali micelarną chromatografię elektrokinetyczną (MEKC). Zawartość patuliny w analizowanych dwudziestu sokach jabłkowych pochodzących z Hiszpanii wynosiła < LOQ ÷ 107,6 μg/L. Jednak sami autorzy podkreślają, że nie otrzymali dokładnej separacji patuliny oraz 5-HMF z analizowanych soków. Patulina jest związkiem o dużej polarności, co znacznie utrudnia jego ekstrakcję w układzie ciecz-ciecz i dlatego do izolacji tego analitu z materiału roślinnego zaleca się ekstrakcję w fazie stałej SPE [Li i wsp., 2007, a, b; Xiang i wsp., 2012]. W badaniach własnych, najlepszą separację patuliny i 5-HMF od pozostałych składników soku jabłkowego lub głogowego uzyskano dla kolumienki zawierającej mieszaninę polarnych i niepolarnych adsorbentów polimerowych MultiSep®228AflaPat. Natomiast najlepszą selektywność ekstrakcji SPE patuliny uzyskano dla układu SPE zawierającego

MultiSep®228AflaPat oraz wielościenne nanorurki węglowe typu CN1 o średnicy 2 ÷ 6 nm i długości 0,1 ÷ 10,0 μm (Tabela 11). Zastosowanie wielościennych nanorurek węglowych typu CN1, jako wypełnienie kolumienek SPE, umożliwiło uzyskanie wysokiego odzysku patuliny z soku jabłkowego 75% oraz z soku z owoców głogu 72% przy poziomie fortyfikacji próbek w zakresie 40 ÷ 500 μg/L (Tabela 14 oraz 15). Wyniki te spełniają kryteria określające dopuszczalne przez wymagania walidacji graniczne wartości odzysku dla tego analitu, które wynoszą 50 ÷ 120% przy stężeniu poniżej 20 μg/kg [Rozporządzenie Komisji WE Nr 401/2006; Namieśnik & Konieczka, 2009]. Z kolei wielkość odzysk patuliny (75 ÷ 105%), jaki uzyskano w badaniach obu rodzajów w/w soków podczas stosowania nanorurek typu CN1 spełnia kryteria walidacyjne dotyczące wiarygodnego oznaczania tego analitu przy stężeniach przekraczających 50 μg/kg [Rozporządzenie Komisji WE Nr 401/2006]. Rozmaite formy adsorbentów w postaci węgla aktywnego w ostatnich latach znajdują coraz szersze zastosowanie do obniżania zawartości patuliny w sokach i przetworach owocowych [Kadakal & Nas, 2002]. Użycie 3,0 g/L węgla aktywnego (Granucol FA, pow. właściwa 1600 m2/g) do usuwania patuliny oraz 5-HMF z soku jabłkowego, spowodowało obniżenie stężenia patuliny o 57%. Natomiast zawartość 5-HMF została obniżona w tych samych warunkach o 69% [Kadakal & Nas, 2002]. Do tej pory brak jest doniesień literaturowych dotyczących zastosowania wielościennych nanorurek węglowych do izolacji patuliny z soków owocowych metodą SPE lub metodą ekstrakcji dyspersyjnej. Natomiast ekstrakcja SPE z wykorzystaniem wielościennych nanorurek węglowych (MWCNTs) została wykorzystana przez Jiang i wsp. (2018) oraz Dong i wsp. (2015) do analizy mikotoksyn (neosolaniol NEO, diacetoksyscirpenol DAS, toksyna T-2) w ziarnach kukurydzy, pszenicy oraz ryżu. Z kolei Lei i wsp. (2018) wykonali syntezę magnetycznych wielościennych nanorurek węglowych, a następnie zastosowali je do ekstrakcji fungicydów (metalaksyl, tebukonazol oraz epoksyconazol) w jabłkach, sałacie oraz kapuście. Fortyfikując próbki za poziomie 8, 10 oraz 12 mg/kg uzyskali odzysk w zakresie od 73,4 ÷108,2%. Autorzy nie stwierdzili jednak obecności pestycydów w analizowanych próbkach.

Wykonane przeze mnie badania wykazały, że w analizowanych produktach PJ i PW stwierdzono obecność grzybów drożdżoidalnych oraz pleśniowych (TYMC), które potencjalnie mogły stanowić źródło patuliny w tych produktach. Zawartość grzybów drożdżoidalnych oraz pleśniowych w PJ zawierających wyłącznie suszone owoce głogu było 150. krotnie wyższe niż w PW zawierających mieszaninę kilku suszy roślinnych (kwiatostan głogu, jabłka, owoc dzikiej róży, owoc czarnego bzu) [Przybylska & Bazylak, 2017]. Produkty zielarskie zawierające suszone KWIATOSTANY głogu charakteryzowały się niższą ogólną liczbą drożdży i pleśni w porównaniu z produktami PJ, które zawierały wyłącznie suszone OWOCE głogu [Przybylska & Bazylak, 2017]. Mieszankę ziołową (FG13) zawierającą suszony owoc głogu, kwiat hibiskusa oraz 10% kwiatostanu głogu cechuje to, że paramter TYMC jest poniżej granicy wykrywalności metody zastosowanej przeze mnie metody płytkowej. Tak niskie stężenie grzybów drożdżoidalnych oraz pleśniowych w produkcie FG13 może wynikać z podwyższonego stężenia związków polifenolowych (1206,79 mg GAE/100g) oraz flawonoidowych (372,22 mg CAE/100g), ale również kwasu L-jabłkowego oraz winowego, które wynosiły odpowiednio 273,24 oraz 1204,58 mg/100g [Przybylska & Bazylak, 2018].

Badania Halt & Klapec (2005) dowiodły, że kwiaty Crataegus oxyacantha są źródłem bakterii tlenowych. Badane przez nich produkty spełniały ówczesne wymagania Farmakopei Polskiej (V) dotyczące ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych w suszach roślinnych (1,0×107 jtk·g-1). Podobne wyniki uzyskano we własnych badaniach, w których stwierdzono, że w 70% wszystkich analizowanych produktów PJ oraz PW zawierających suszone OWOCE GŁOGU wykazuje obecność drobnoustrojów tlenowych na średnim poziomie 1,1 × 105 jtk/g. Jednocześnie odnotowano, że produkty zielarskie zawierające KWIATOSTANY GŁOGU były zainfekowane drobnoustrojami tlenowymi na wyższym poziomie 1,4 × 106 jtk/g [Przybylska & Bazylak, 2017]. Dla porównania, w badaniach Kędzi (1999), które dotyczyły 695 próbek surowców zielarskich, stwierdzono, że 10% z nich zawierało bakterie tlenowe powyżej 1,0×107 jtk/g. Bakterie tlenowe Bacillus cereus, których przetrwalniki przeżywają ekstremalne warunki środowiskowe i wytworzają formy wegetatywne stanowią zagrożenie jakości żywności funkcjonalnej. Bakterie Gram-dodatnie Bacillus cereus należą do drobnoustrojów oportunistycznych, względnie patogennych, wytwarzających rozmaite enterotoksyny w odpowiednich warunkach [Murray i wsp., 2014]. W badaniach własnych stwierdzono obecność Bacillus cereus w jednym z produktów PJ o symbolu FG3 [Przybylska & Bazylak, 2017]. Z jednej strony bakterie Bacillus cereus wywołują zmiany chorobowe organizmu, z drugiej zaś strony, ostatnie doniesienia wskazują na możliwość zastosowania szczepu Bacillus cereus BC7 w celu skutecznego hamowania biosyntezy zearalenonu z paszy oraz w celu znormalizowania mikroflory jelitowej u samicy myszy [Wang i wsp. 2018]. W wykonanych przeze mnie badaniach stwierdzono brak istotnej korelacji pomiędzy zawartością patuliny w poszczególnych produktach PJ i PW, a ogólną liczbą pleśni. Prawdopodobnie biosynteza patuliny w owocach głogu jest cechą danego szczepu grzybów pleśniowych, a nie gatunku. W owocach głogu Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br. stwierdzono obecność grzybów z rodzaju Aspergillus i Penicillium [Kong i wsp., 2014]. Natomiast w badaniach Asther i wsp. (2005) udowodniono, że spośród 15 zbadanych szczepów, Aspergillus niger BRFM 131 posiada najwyższą aktywność hydrolazy, która rozkłada kwas chlorogenowy do kwasu kawowego. Z kolei rutyna, będąca dominującym flawonoidem występującym w żywności, może ulec w 99% biotransformacji do izokwercetryny (3-glukozyd kwercetyny) w ciągu 4 h poprzez działanie enzymów Aspergillus niger van Tieghem KCTC 6906. Poza tym udowodniono, że powstający 3-glukozyd kwercetyny Q3G posiada silniejsze właściwości hamujące zdolność rozmnażania się komórek nowotworowych niż kwercetyna oraz rutyna [You i wsp., 2010]. W badaniach własnych stwierdzono częściową korelację pomiędzy liczbą grzybów pleśniowych obecnych w produktach PJ, a parametrem TFC w ich wodnych naparach (r = 0,59; p = 0,11). Zwiększony stopień korelacji stwierdzono pomiędzy ogólną liczbą grzybów pleśniowych, a parametrem TPC oznaczonym w omawianych produktach PJ (r = 0,88; p < 0,05) (Tabela 19).

W badaniach własnych stwierdzono, że wodne napary z produktów zielarskich zawierających KWIATOSTANY GŁOGU są bogatszym źródłem kwasu szczawiowego w porównaniu do naparów uzyskanych w produktów, które zawierały owoce głogu [Przybylska & Bazylak, 2018]. Konsumpcja wodnych naparów uzyskanych z produktów PJ zawierających wyłącznie suszony owoc głogu w codziennych porcjach, których wielkość jest sugerowana przez producentów (3 × 200 mL) powoduje, że średnie spożycie kwasu szczawiowego sięga

47,04 mg. Dla porównania, w naparach herbatki ziołowej zawierającej m.in. ziele melisy, kwiat lawendy oraz owoc głogu zawartość kwasu szczawiowego wynosiła 102,45 mg/100 mL, a w naparze uzyskanym z produktu, który zawierał kłącze imbiru, anyż, liść melisy, mięty, herbatę zioloną oraz kwiatostan głogu 108,49 mg/100 mL [Sperkowska & Bazylak, 2010]. Ostatnie doniesienia naukowe wskazują, że kwas szczawiowy odgrywa istotną rolę w degradacji patuliny. Zhu i wsp. (2016) zastosowali kwas szczawiowy w ochronie owoców kiwi przed zakażeniem patuliną jako produktem wtórnym Penicillium expansum. Okazało się, że spryskanie kwasem szczawiowym przed zerwaniem owoców kiwi wpływa znacząco na zwiększenie stężenia całkowitej liczby związków polifenolowych oraz flawonoidowych w tych owocach, a tym samym przyczynia się do obniżenia stężenia patuliny. Z jednej strony obecność kwasu szczawiowego powoduje obniżenie stężenia wtórnych metabolitów pleśniowych w produktach owocowych, z drugiej zaś strony długotrwałe spożywanie diety bogatoszczawianowej może spowodować wytrącanie się szczawianów wapnia, magnezu oraz cynku w kłębuszkach nerkowych [Sperkowska & Bazylak, 2010]. W badaniach własnych nie stwierdzono istotnie statystycznej korelacji pomiędzy stężeniem kwasu szczawiowego w wodnych naparach produktów PJ zawierających wyłącznie suszone owoce głogu, a stężeniem patuliny w tych produktach (Tabela 20). Odnotowano istotny i wysoki stopień korelacji pomiędzy stężeniem kwasu szczawiowego, a ogólną liczbą drobnoustrojów tlenowych (TAMC) w produktach PJ (r = 0,86; p < 0,05) (Tabela 19), co może być spowodowane tym, że endofityczne aerobowe drobnoustroje oksalotropowe (Aspergillus spp, Pseudomonas sp., Streptomyces spp.), stanowiące endofityczną mikroflorę niektórych roślin na przykład tobołka alpejskiego (Thlaspi caerulescense), które bioakumulują duże ilości cynku i w niektórych fazach swojego cyklu rozwojowego biosyntyzują duże ilości kwasu szczawiowego [Sahin, 2003; Fones i wsp., 2016].

Nieliczne prace wskazują na obecność kwasu winowego w owocach głogu. Gundogdu i wsp. (2014) oznaczyli stężenie kwasu winowego w owocach Crataegus pseudoheterophylla na poziomie 2,22 ± 0,04 g/100g ś.m., podczas gdy w owocach Crataegus atrosanguinea na poziomie 0,61 ± 0,03 g/100g ś.m., co stanowiło wyższy wynik w porównaniu do rezultatów uzyskanych w badaniach własnych, w których stwierdzono, że średnia koncentracja kwasu winowego w naparach uzyskanych z analizowanych produktów PJ i PW zawierających suszone OWOCE GŁOGU wynosiła 6,86 mg/100 mL (342,86 mg/100g s.m.), co stanowiło 50% stężenia tego kwasu jakie stwierdzono w naparach z produktów zawierające suszone KWIATOSTANY GŁOGU [Przybylska & Bazylak, 2018]. Przypuszczalnie zastosowany przez producentów dodatek innych części roślin do produktu PW (kwiat hibiskusa, kwiatostan głogu oraz owoc dzikiej róży) przyczynił się do znacznego zwiększenia stężenia kwasu winowego w wodnym naparze produktu FG13 (24,09 mg/100 mL, co odpowiada 1204,58 mg/100g s.m.). Konsumpcja wodnych naparów uzyskanych z produktów PJ zawierających wyłącznie suszony owoc głogu w codziennych porcjach, których wielkość jest sugerowana przez producentów (3 × 200 mL) powoduje, że średnie spożycie kwasu winowego wynosi 32,60 mg. Dla porównania, spożycie 100 g owocu grejpfruta dostarcza średnio 437,00 mg tego kwasu [Zheng i wsp., 2016].

W badanej grupie naparów uzyskanych z produktów PJ i PW zawierających suszone OWOCE GŁOGU stwierdzono występowanie kwasu L-jabłkowego w szerokim zakresie stężeń, który wynosił 2,27 ÷ 8,02 mg/100 mL, co odpowiada zawartości 113,53 ÷ 400,85 mg/100g s.m. Natomiast nie stwierdzono istotnej statystycznie (p > 0,05) różnicy pomiędzy średnią zawartością kwasu L-jabłkowego w wodnych naparach z produktów PJ (4,38 mg/100 mL, co odpowiada 237,81 mg/100g s.m.) oraz z produktów PW (5,42 mg/100 mL, co odpowiada 270,83 mg/100g s.m.). Konsumpcja wodnych naparów uzyskanych z produktów PJ zawierających wyłącznie suszony owoc głogu w codziennych porcjach, których wielkość jest sugerowana przez producentów (3 × 200 mL) powoduje, że średnie spożycie kwasu L- jabłkowego sięga 28,56 mg. Dla porównania, spożycie jednego jabłka (200 g) dostarcza średnio 2400 mg kwasu L-jabłkowego [Ma i wsp., 2015]. Badania Khazanov i wsp. (2008) potwierdzają wysoką skuteczność synergicznego oddziaływania kwasu jabłkowego oraz bursztynowego w ochronie mięśnia sercowego przed niedokrwieniem w porównaniu z trimetazydyną, która jest lekiem cytostatycznym zapobiegającym występowaniu dysfunkcji komór mięśnia sercowego podczas niedokrwienia. Z kolei badania Tang i wsp. (2013) udowodniły, że równoczesne podawanie dorosłym samcom szczurów kwasu L-jabłkowego oraz kwasu cytrynowego wpływa na zmniejszenie wielkości zawału mięśnia sercowego oraz zmniejsza aktywność cytokiny TNF-α u tych zwierząt.

W badaniach własnych wykazano, że istotnie (p < 0,05) wyższe stężenie kwasu cytrynowego występuje w wodnych naparach uzyskanych z produktów PJ w porównaniu do naparów otrzymanych z produktów wieloskładnikowych PW. Jednocześnie należy podkreślić, że wytwórcy produktów zielarskich dodają do nich kwas cytrynowy w nieznanej konsumentom ilości jako naturalną substancję zakwaszającą, jak ma to miejsce na przykład w produkcie FG7 [Przybylska & Bazylak, 2018]. Zakwaszenie produktów zielarskich powoduje zwiększenie stopnia uwalniania związków bioaktywnych do sporządzanego z nich naparu, który może być trakowany jako postać żywności funkcjonalnej. Równocześnie wpływa to na wiązanie jonów metali (Mg2+, Cu2+) w postaci kompleksów, których trwałość jest zależna od pH naparu. Zatem obecność różnych niskocząsteczkowych hydroksykwasów (cytrynowego, winowego, jabłkowego) w wodnych naparach uzyskiwanych z produktów zawierających owoce głogu przyczynia się istotnie do zwiększenia stopnia wchłaniania jonów metali w przewodzie pokarmowym konsumentów, jak ma to miejsce w przypadku magnezu regulującego m.in. zaburzenia rytmu serca, a także stężenie glukozy we krwi [Iskra i wsp., 2013]. Stwierdzono, że średnie stężenie Mg2+ na poziomie 5,69 ppm występuje w wodnych naparach sporządzonych z produktów zawierających owoce głogu lub z produktów zawierających kwiatostany głogu [Bazylak i wsp., 2014]. Najwyższe stężenie kwasu cytrynowego odnotowano w przypadku wodnego naparu uzyskanego z produktu FG13, który jest mieszaniną kilku suszy roślinnych [Przybylska & Bazylak, 2018]. Dodatek innych części roślin, takich jak kwiat hibiskusa, kwiatostan głogu oraz owoców dzikiej róży prawdopodobnie przyczynił się do podwyższenia średniego stężenia tego kwasu w naparach uzyskiwanych z produktów PW (41,99 mg/100 mL, co odpowiada 2099,63 mg/100g s.m.) w porównaniu z naparami uzyskanymi z produktów PJ (11,04 mg/100 mL, co odpowiada 551,95 mg/100g s.m.). Koncentrację kwasu cytrynowego w analizowanych naparach z produktów PJ i PW odnotowano w szerokim zakresie 1,16 ÷ 67,10 mg/100 mL, co odpowiada 57,92 ÷ 3355,10 mg/100g s.m., co może być spowodowane

łatwością krzyżowania się głogów, a w konsekwencji tworzenia morfotypów hybrydowych i allelotetraploidalnych, co powoduje dużą zmienność wewnątrzgatunkową i niejednorodną zawartość związków bioaktywnych w owocach należących do Crataegus spp. hodowanych w różnych ekosystemach [Lo i wsp., 2009; Rahmani i wsp., 2015; Coughlan i wsp., 2017]. Należy podkreślić, że konsumując wodne napary uzyskane z produktów PJ zawierających wyłącznie suszone owoce głogu, których wielkość jest sugerowana przez producentów (3 × 200 mL) powoduje, że średnie spożycie w codziennej diecie kwasu cytrynowego wynosi 66,23 mg. Natomiast spożycie wodnych naparów sporządzonych z produktów PW przyczyna się do zwiększenia średniego spożycia w/w kwasu 4. krotnie.

Biodegradacja patuliny jest również uwarunkowana stężeniem kwasu α- askorbinowego. Dodanie tego kwasu w ilości 482 mg/L do modelowego roztworu imitującego sok jabłkowy powoduje obniżenie stężenia patuliny po 34 dniach przechowywania nawet o 70% [Drush i wsp., 2007]. W badaniach własnych nie stwierdzono korelacji pomiędzy zawartością kwasu α-askorbinowego w wodnych naparach sporządzonych z produktów PJ, a stężeniem patuliny w tych produktach, co może wynikać z utraty znacznej ilości tego kwasu podczas przyrządzania naparu w temp. 100 °C, a także tylko częściowym uwalnianiem kwasu α-askorbinowego z owoców głogu do naparu. W wodnych naparach uzyskanych z produktów PJ zawierających suszone OWOCE GŁOGU średnie stężenie kwasu α-askorbinowego wynosiło 0,44 mg/100 mL, co odpowiada 22,02 mg/100 g s.m. Jednocześnie odnotowano 15. krotnie wyższe stężenie kwasu α-askorbinowego w naparach uzyskanych z produktów zawierających suszone KWIATOSTANY GŁOGU, które wynosiło 0,59 mg/100 mL, co odpowiada 29,32 mg/100g s.m. [Przybylska & Bazylak, 2018]. Gryn i wsp. (2013, a) uzyskała niższe wyniki (0,30 mg/100 mL) analizując średnie stężenie kwasu α-askorbinowego w wodnych naparach liści Morus alba. Spożycie w nadmiarze witaminy C, która jest mieszaniną kwasu α-askorbinowego oraz α- hydroaskorbinowego może skutkować powikłaniami zdrowotnymi w postaci kamieni nerkowych oraz zaburzeń żołądkowo-jelitowych [Jarosz i wsp., 2017]. Wyniki te wskazują, że istnieje potrzeba umieszczania na opakowaniach suplementów diety oraz mieszanek ziołowych informacji na temat ilości tej witaminy i stopnia jej uwalniania do naparu. W badaniach własnych stwierdzono, że spożycie wodnych naparów uzyskanych z produktów PJ przez dorosłe kobiety (19 ÷ 50 lat) w codziennych porcjach, których wielkość jest sugerowana przez producentów (3 × 200 mL), umożliwia tylko w niewielkim stopniu zrealizowanie zalecanego dziennego spożycia (RDA) [Jarosz i wsp., 2017] witaminy C (3,52%). Dla porównania, spożycie jednego jabłka o masie 200 g pokrywa aż 24,53 % zalecanego dziennego spożycia tej witaminy [Kunachowicz i wsp., 2017].

Apigenina, która występuje w skórce owoców głogu Crataegus monogyna w ilości 3,86 mg/100g [Mraihi i wsp., 2015] wykazuje silne właściwości hamujące - indukowaną patuliną i wolnymi rodnikami - apoptozę w embrionalnych ludzkich komórkach nerek HEK293 [Zhong i wsp., 2017]. W badaniach tych apigenina powodowała wzrost potencjału błon mitochondrialnych w komórkach HEK293, który obniżał się w obecności samej patuliny. Jednocześnie dodanie apigeniny powodowało zmniejszenie w tych komórkach stężenia reaktywnych form tlenu, których nadmiar prowadzi do zmian chorobotwórczych. W badaniach własnych nie odnotowano istotnej korelacji pomiędzy całkowitą zawartością związków polifenolowych (TPC) oraz flawonoidowych (TFC) w wodnych

81 naparach sporządzonych z produktów zawierających suszone owoce głogu, a zawartością patuliny w poszczególnych produktach (Tabela 18 oraz 19). Brak korelacji może wynikać z różnorodności materiału badawczego oraz krótkim czasem sporządzenia naparów (5 min.). Należy zaznaczyć, że część materiału badawczego stanowiły komercyjne produkty, których dokładne pochodzenie jest nieznane, a tym samym nieznane są warunki zbioru owoców głogu użytych do ich produkcji. Stężenie związków bioaktywnych, jak np. kwas α-askorbinowy, mających znaczenie w hamowaniu wzrostu patuliny w owocach głogu, jest zmienne w zależności od warunków środowiska, takich jak miesiąca zbioru, pory dnia, stopnia nasłonecznienia [Przybylska & Bazylak, 2017; Li i wsp., 2013; Liu i wsp., 2011,], ale także od oddziaływania innych czynników biotycznych i abiotycznych na strukturę zmienności genetycznej, wpływu interakcji międzygenowych, oddziaływań genów i środowiska oraz eskpresji cech drzew głogu związanych z rozwojem rośliny i decydujących o ich zmienności [Yilmaz i wsp., 2010; MirAli i wsp., 2011]. Średnia całkowita zawartość polifenoli (TPC) w wodnych naparach uzyskanych z produktów zawierających owoce głogu wynosiła 9,34 mg GAE/100 mL, co odpowiada 467,19 mg GAE/100g s.m. Stwierdzono, że spożycie wodnych naparów uzyskanych z produktów PJ w codziennych porcjach, których wielkość jest sugerowana przez producentów (3 × 200 mL), wynosi 39,72 mg, co stanowi 4,02% dziennego średniego spożycia polifenoli wraz z żywnością, które w Polsce wynosi 989,3 mg/dzień [Witkowska i wsp., 2015]. Z kolei w metanolowym ekstrakcie owoców dzikiej róży (Rosa canina) średnia zawartość TPC wynosi 257 mg GAE/100g, a w acetonowym 509 mg GAE/100g [Su i wsp., 2007]. Natomiast badania własne dowodzą, że wodne napary uzyskane z produktów sporządzonych z produktów zawierających KWIATOSTANY GŁOGU są bogatszym źródłem TPC w porównaniu do naparów uzyskanych z produktów zawierające OWOCE GŁOGU [Przybylska & Bazylak, 2018]. Zatem można przypuszczać, że dodatek innych części roślin leczniczych do mieszanki ziołowej zawierającej suszone owoce głogu prawdopodobnie może hamować proces biosyntezy przez grzyby pleśniowe lub akumulację patuliny w takim produkcie [Tannous i wsp., 2018]. Średnia zawartość patuliny w mieszankach ziołowych PW wynosi 15,7 μg/kg, a eliminując skrajny wynik patuliny w próbce K19, średnie stężenie tej mikotoksyny w tych produktach jest 3. krotnie niższe (4,92 μg/kg) [Przybylska i wsp., 2019]. Stwierdzono wysoką korelację pomiędzy gęstością nasypową, a TPC, TFC oraz stopniem wygaszania rodnika DPPH· oraz kationorodnika ABTS·+ (Tabela 18 oraz 19). Zwiększony stopień rozdrobnienia materiału roślinnego korzystnie wpłynął na stopień uwolnienia do naparów polifenoli oraz związków flawonoidowych obecnych w produktach PJ i PW. Napary sporządzone z bardzo rozdrobnionych produktów PJ (G14 oraz G15) wykazywały większą zdolność do wymiatania rodników rodnika DPPH· oraz kationorodnika ABTS·+ [Przybylska & Bazylak, 2018]. Jednocześnie wodne napary uzyskane z produktów zawierających suszone KWIATOSTANY GŁOGU charakteryzowały się wyższym stopniem redukcji rodnika DPPH· oraz kationorodnika ABTS·+ w porównaniu z naparami uzyskanymi z produktów zawierających OWOCE GŁOGU [Przybylska & Bazylak, 2018]. Wodne napary sporządzone z produktów PJ charakteryzowały się wyższą aktywnością antyoksydacyjną (IDPPH = 92,64%) w porównaniu z wodnymi naparami liśći Morus alba, których średni procent inhibicji rodnika DPPH· wynosił 86,47% [Gryn i wsp., 2014]. W świeżych owocach głogu C. monogyna zerwanych w ogrodu w Olsztynie, procent redukcji rodnika DPPH· wynosił blisko

90%, a procent inhibicji kationorodnika ABTS·+ osiągał wartość około 50% [Pliszka i wsp., 2016]. Rutkowska i wsp. (2012) uzyskali niższy stopnień redukcji rodnika DPPH· (50%) dla owoców dzikiej róży suszonych metodą konwencjonalną (72 ± 1 °C, 37 h) w porównaniu z owocami liofilizowanymi (70%). Wyniki badań własnych świadczą również o tym, że silne właściwości przeciwutleniające wodnych naparów uzyskanych z produktów zawierających owoce głogu są spowodowane nie tylko obecnością związków polifenolowych i flawonoidowych, ale przede wszystkim zawartością jonów Mn2+ (112,60 μg/L) oraz Cu2+ (21,22 μg/L). W przypadku każdego z analizowanych naparów, jakie uzyskano z produktów PJ i PW, stwierdzono, że stężenie Mn było wysoko istotnie skorelowane ze stężeniem Fe (r = 1,00; p < 0,05) (Tabela 18). Z kolei stężenie Mn w PRODUKTACH JEDNOSKŁADNIKOWYCH (Tabela 19) było istotnie, dodatnio skorelowane ze stężeniem Zn (r = 0,71; p < 0,05). Wyniki te były przeciwne do rezultatów publikowanych w dostępnej literaturze. W pracy Ulewicz-Magulskiej (2008), w grupie owoców Crataegus fructus, istotne korelacje odnotowano pomiędzy zawartością Cu i Zn (r = 0,88, p < 0,05) oraz Fe i Zn (r = 0,51, p < 0,05).

W publikacji [Przybylska i wsp., 2019], stanowiącej ostatni etap przedstawionej rozprawy, stwierdzono że analizowane produkty PJ i PW były zainfekowane patuliną na średnim poziomie 11,4 μg/kg, a podczas gdy w suszonych owocach pochodzących z Chin średnie stężenie tej mikotoksyny wynosiło16,3 μg/kg [Xiang i wsp., 2012]. Wynik taki może być to spowodowane tym, że na terenach północno-zachodnich Chin występuje przede wszystkim odmiana Crataegus pinntafidia [Fang i wsp., 2011] i panują tam również odmienne warunki klimatyczne i wykorzystuje się całkowity inny sposób przetwarzania owoców. Z kolei w badaniach Ji i wsp. (2017) tylko 10% analizowanych próbek produktów zawierających suszone owoce z głogu Crataegus pinnatifida było zanieczyszczonych patuliną na średnim poziomie 8,1 μg/kg. Natomiast w 100% produktów PJ zawierających owoce głogu Crataegus monogyna/Crataegus laevigata pochodzących z Polski stwierdzono zainfekowanie patuliną w zakresie 5,7 ÷ 25,9 μg/kg [Przybylska i wsp., 2019]. Odnotowano częściową korelację pomiędzy stężeniem patuliny w produktach PJ, a stopniem rozdrobnienia surowca wyrażonego jako gęstość nasypową (r = 0,60; p < 0,10) (Tabela 19). W przypadku produktów PJ zaobserwowano również wysoką, ujemną korelację pomiędzy zawartością patuliny i Zn (r = -0,85; p < 0,05) (Tabela 19). W produktach PJ zawierających całe owoce głogu (G14 i G15) stwierdzono niższe średnie stężenie patuliny (8,9 μg/kg) w porównaniu do pozostałych produktów PJ (11,76 μg/kg). Wprowadzenie do produktów PW rozmaitych części roślin leczniczych może rawdopodobnie przyczyniać się do obniżenia ilości patuliny w tych produktach. Zauważono bowiem, że w produktach PW średnia zawartość patuliny (po odrzuceniu skrajnego wyniku) wynosiła 4,92 μg/kg, a w produktach PJ 11,4 μg/kg. Z kolei 50% obniżenie stężenia patuliny zanotowano po 48 h w soku jabłkowym, do którego dodano 2 mg/mL propolisu [Silici & Karaman, 2014]. Zawartość patuliny w produktach PW mieściła się w zakresie < 1,0 ÷ 93,2 μg/kg. W 1/3 analizowanych produktów PW stwierdzono zawartość patuliny < 1,0 μg/kg, który odpowiadał granicy detekcji LOD zastosowanej metody SPE-UHPLC-MS/MS [Przybylska i wsp., 2019].

Należy podkreślić, że tylko w jednym z badanych poduktów PW oznaczonym symbolem K19 i pochodzącym z Polski stwierdzono, że stężenie patuliny (93,2 μg/kg) przekroczyło poziom dopuszczalny określony w Rozporządzeniu Komisji Europejskiej WE 1881/2006, który wynosi 50 μg/kg. Natomiast w 1/3 wszystkich analizowanych produktów PJ i PW stężenie oznaczonej patuliny było wyższe niż 10 μg/kg określonych w/w Rozporządzeniu jako dopuszczalne w produktach owocowych przeznaczonych do spożycia dla dzieci [Przybylska i wsp., 2019].

VI. Podsumowanie i wnioski

Unikalnym osiągnięciem przedstawionej pracy jest oznaczenie nieznanej dotychczas zawartości patuliny w suplementach diety oraz mieszankach ziołowych zawierających suszone owoce głogu dostępnych w aptekach, sklepach zielarskich oraz supermarketach na terenie Polski. Oszacowane tymczasowe maksymalne dzienne spożycie patuliny z naparami uzyskanymi z analizowanych produktów wynosi 1,4 ng/kg masy ciała [Przybylska i wsp., 2019]. Uzyskane wyniki wskazują na zróżnicowanie przebiegu biosyntezy patuliny w owocach należących do różnych gatunków Crataegus oraz konieczność opracowania i zastosowania efektywnych sposobów detoksykacji suplementów diety oraz mieszanek ziołowych zawierających suszone owoce głogu. Rezultaty badań świadczą o wpływie stopnia rozdrobnienia owoców głogu na stężenie patuliny w produkowanych z nich suplementach diety i mieszankach ziołowych. (Rozdział IV.7.). Jednocześnie równie istotnym i znaczącym osiągnięciem pracy było opracowanie innowacyjnego sposobu ekstrakcji patuliny z soków owocowych (jabłko, głóg) z zastosowaniem niemodyfikowanych wielościennych nanorurek węglowych jako adsorbentu w metodzie kolumnowej SPE (Rozdział IV.1.). Wykazano, że stosowanie wielościennych nanorurek węglowych jako adsorbentu zwiększa selektywność ekstrakcji patuliny z w/w soków metodą SPE w porównaniu z wcześniej stosowanymi metodami (Rozdział IV.1.3.). Stwierdzono, że adsorpcja patuliny na wykorzystanych w badaniach nanorurkach węglowych przebiegała zgodnie z izotermą Freundlicha. Najwyższy odzysk podczas ekstrakcji SPE patuliny (75%) uzyskano w przypadku kolumienki wypełnionej złożem w postaci nieoczyszczonych wielościennych nanorurek węglowych typu CN1 o średnicy 2 ÷ 6 nm i długości 0,1 ÷ 10,0 μm. Zastosowanie nanorurek węglowych jako adsorbentu do ekstrakcji patuliny z soków jabłkowych pozwoliło na znaczne skrócenie oraz obniżenie kosztów wykonywanej analizy w porównaniu z powszechnie stosowanymi kolumienkami wypełnionymi silanizowanym żelem krzemionkowym Octadecyl C18, wielofunkcyjnymi polimerami Speedisc H2O-Philic DVB oraz polimerami z wnęką molekularną AFFINIMIP®SPE [Bazylak & Przybylska, 2012; Bazylak & Przybylska, 2013]. Niestety z powodu dotkliwych ograniczeń finansowo-organizacyjnych nie było możliwe podjęcie szczegółowych badań w celu ustalenia, które ze szczepów grzybów pleśniowych są odpowiedzialne za biosyntezę patuliny w owocach głogu. Podobnie nie było możliwe ustalenie jakie warunki zbioru, przechowywania i wykorzystywania w produkcji suplementów diety sprzyjają biosyntezie i akumulacji patuliny [Przybylska i wsp., 2017]. Polecane przez Farmakopeę Polską (X) metody oceny jakości mikrobiologicznej tych surowców nie pozwalają na stwierdzenie pogorszenia się jakości owoców głogu ze względu na obecność szczepów grzybów patulinotwórczych (Rozdział IV.2.). Wyznaczony profil i zawartość hydroksykwasów niskocząsteczkowych (cytrynowy, jabłkowy, winowy, szczawiowy) w badanych wodnych naparach uzyskanych z suplementów diety oraz mieszanek ziołowych wskazuje, że produkty te, w porównaniu do jabłek i przetworów jabłkowych, tylko w niewielkim stopniu są źródłem tych mikroskładników w codziennej diecie [Przybylska & Bazylak, 2018]. Natomiast prawdopodobnie wymienione kwasy organiczne przyczyniają się do ograniczenia stopnia zanieczyszczenia patuliną produktów zawierających owoce głogu (Rozdział IV.3. oraz IV.7.).

Uzyskane wyniki badań wskazują, że prawdopodobnie występuje zjawisko zwiększonej bioakumulacji cynku, miedzi i manganu w owocach głogu stosowanych do produkcji suplementów diety oraz mieszanek ziołowych. Natomiast parzone w krótkim okresie czasu (5 min.) napary wodne z takich suplementów i mieszanek, przy założeniu spożycia 600 mL dziennie, nie stanowią istotnego źródła cynku, miedzi, manganu i żelaza w codziennej diecie pacjentów (Rozdział IV.5.). Prawdopodobnie wysokie stężenia cynku i miedzi w owocach głogu przyczyniają się do ograniczenia tempa wzrostu Penicillium expansum oraz występowania patuliny w tych owocach, co było wcześniej obserwowane w przypadku winogron [Judet-Correia i wsp., 2011; He i wsp., 2011]. Oznaczona w badaniach zawartość kwas α-askorbinowego, całkowitej zawartości polifenoli oraz związków flawonoidowych w naparach uzyskanych z suplementów diety i mieszanek zawierających owoce głogu wskazuje, że ich właściwości antyoksydacyjne wyznaczone w testach DPPH oraz ABTS umożliwiają szybkie i efektywne zmniejszenie ilości rodników tlenowych i hydroksylowych (Rozdział IV.4.). Trzeba jednak zauważyć, że oprócz wyżej wymienionych związków właściwości antyoksydacyjne omawianych naparów są w dużym stopniu modyfikowane przez zawarte w nich jony manganu, żelaza i miedzi (Rozdział IV.7.).

Wyniki badań pozwalają na wyciągnięcie następujących wniosków:

1. Analizowane suplementy diety oraz mieszanki ziołowe zawierające suszone owoce głogu spełniały wymagania farmakopealne dotyczące czystości mikrobiologicznej. Wykazano jednocześnie, że produkty jednoskładnikowe zawierające wyłącznie suszony owoc głogu były około 150 razy bardziej zanieczyszczone grzybami drożdżoidalnymi oraz pleśniowymi niż produkty wieloskładnikowe, zawierające w swoim składzie jabłko, owoc aronii, kwiatostan głogu, kwiat hibiskusa oraz dziką różę.

2. Stwierdzono, że wodne napary analizowanych produktów są bogatym źródłem nieodżywczych hydroksykwasów niskocząsteczkowych. Dominującym hydroksykwasem jest kwas cytrynowy, którego średnie spożycie w codziennej diecie wraz z naparami uzyskanych z produktów zawierających wyłącznie suszone owoce głogu wynosi 66,23 mg, a z produktów stanowiących mieszaninę kilku roślin leczniczych spożycie tego kwasu jest 4. krotnie wyższe.

3. Wodne napary uzyskane z produktów zawierających wyłącznie suszone owoce głogu charakteryzują się wysokimi zdolnościami antyutleniającymi, które są spowodowane obecnością związków polifenolowych (rABI = 0,96; p < 0,05), flawonoidowych (rDPI = 2+ 0,73; p < 0,05) oraz zawartością jonów Mn (rABI = 0,85; p < 0,05). Stwierdzono również, że konsumpcja w/w naparów z produktów zawierających wyłącznie suszone owoce głogu w codziennych porcjach ok. 600 mL przyczynia się do spożycia związków polifenolowych w ilości około 39,72 mg, co stanowi 4,02% średniego dziennego spożycia polifenoli w Polsce.

4. Przeprowadzone badania wskazują, że suszone owoce głogu są bogatym źródłem Mn, Fe, Cu oraz Zn. Natomiast konsumpcja wodnych naparów uzyskanych z analizowanych produktów przyczynia się tylko w niewielkim stopniu do realizacji wystarczającego spożycia Mn (%AI = 3,74) oraz zalecanego dziennego spożycia Fe (%RDA = 0,25), Cu (%RDA = 1,36) oraz Zn (%RDA = 0,27) w codziennej diecie, co może być spowodowane sposobem przygotowania naparu.

5. Metoda ekstrakcji SPE patuliny z zastosowaniem kolumienki MycoSep®228AflaPat, a następnie identyfikacja patuliny wykorzystująca technikę UHPLC-MS/MS umożliwia oznaczanie patuliny na niskich poziomach (LOD = 1,0 μg/kg) oraz skrócenie czasu analizy (czas retencji 6,17 min.), co umożliwia stosowanie tej metody do rutynowej analizy patuliny w owocach głogu zanieczyszczonych patuliną.

6. Rezultaty badań wskazują, że suplementy diety oraz mieszanki ziołowe zawierające suszone owoce głogu dostępne na rynku są zainfekowane patuliną na średnim poziomie 13,74 μg/kg. Należy zaznaczyć, że w jednym z produktów stwierdzono znacznie przekroczony (93,2 μg/kg) dopuszczalny poziom patuliny, wynoszący 50 μg/kg. Zwraca uwagę fakt, że wszystkie produkty zawierające wyłącznie suszone owoce głogu były zanieczyszczone patuliną.

7. Przeprowadzone badania wskazują na potrzebę zwiększenia kontroli stopnia zanieczyszczenia suplementów diety patuliną w celu pełnego oszacowania zagrożenia szczególnie dla osób w podeszłym wieku, pacjentów kardiologicznych, rekonwalescentów, osób stosujących tzw dietę anti-aging, a następnie rewaluacji procedur związanych z Dobrą Praktyką Wytwarzania (GMP) suplementów diety jak i żywności funkcjonalnej oraz obecnej koncepcji ich kontroli celem zmniejszenia ryzyka zagrożenia związanego z regularnym spożyciem śladowych ilości patuliny przez różne grupy ludności.

8. Przedstawione wyniki badań wskazują na pilną potrzebę wprowadzenia rzetelnego systemu znakowania opakowań suplementów diety oraz mieszanek ziołowych przeznaczonych do spożycia w formie wodnych naparów w celu informowania konsumentów o ilości spożywanych związków bioaktywnych, takich jak kwas α-askorbinowy, kwas szczawiowy, kwas winowy oraz kwas jabłkowy.

9. Uzyskane wyniki badań dostarczają wielu dotąd nieznanych i cennych informacji dotyczących składu wodnych naparów uzyskanych z suszonych owoców głogu, które mogą być wykorzystane przez dietetyków, lekarzy oraz konsumentów w profilaktyce chorób cywilizacyjnych.

VII. Piśmiennictwo

Abramson D., Lombaert G., Clear R. M., Sholberg P., Trelka R., Rosin E., Production of patulin and citrinin by Penicilium expansum from Britich Columbia (Canada) apples, Mycotoxin Research, 2009, 25, 85-88, doi:10.1007/s12550-009-0012-4.

Affinimip application note: Determination of patulin in apple puree, 2013, https://www.affinisep.com/spe-kits- applications/spe-kit-for-sample-preparation/affinimip-spe---selectives-mip-spe-cartridges/affinimip-spe-patulin/, dostęp z dniem 01.04.2019.

Affinimip application notebook for Affinimip® SPE, Selective solid phase extraction Molecularly Imprinted Polymers for the selective extraction of trace analytes from complex matrices, 2014.

Andersen B., Smedsgaard J., Frisvad J. C., Penicillium expansum: consistent production of patulin, chaetoglobosins and other secondary metabolites in culture and their natural occurence in fruit products, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52, 2421-2428, doi:10.1021/jf035406k.

Anene A., Hosni K., Chevalier Y., Kalfat R., Hbaieb S., Molecularly imprinted polimer for extraction of patulin in apple juice samples, Food Control, 2016, 70, 90-95, doi:10.1016/j.foodcont.2016.05.042.

Anonim, Complete solution for mycotoxin analysis, Shimadzu News, 2017, 1, 16-17.

Arceusz A., Mieczkowska A., Radecka I., Wesołowski M., Zawartość żelaza i cynku w naparach i odwarach sporządzonych w roślinnych surowców leczniczych, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 2009, 42 (3), 808- 814.

Asther M., Estrada-Elvarado M. I., Haon M., Navarro D., Asther M., Lesage-Meessen L., Record E., Purification and characterization of a chlorogenic acid hydrolasa from Aspergillus niger catalysing the hydrolysis of chlorogenic acid, Journal of Biotechnology, 2005, 115, 47-56, doi:10.1016/j.jbiotec.2004.07.009.

Bahri-Sahloul R., Ammar S., Grec S., Harzallah-Skhiri F., Chemical characterisation of Crataegus azarolus L. fruit from 14 genotypes found in Tunisia, Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 2009, 84 (1), 23-28, doi:10.1080/14620316.2009.11512474.

Barreira M. J., Alvito P. C., Almeida C. M. M., Occurence of patulin in apple-based-foods in Portugal, Food Chemistry, 2010, 121, 653-658, doi:10.1016/j.foodchem.2009.12.085.

Bazylak G., Brózik H., Sabanty W. (a), Combined SPE and HPTLC as a screening asay of urinary cotinine from male adolescents exposed to environmental tobacco smoke, Polish Journal of Environmental Studies, 2000, 9 (2), 113-123.

Bazylak G., Brózik H., Sabanty W. (b), HPTLC screening assay for urinary cotinine as biomarker of environmental tobacoo smoke exposure among male adolescents, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2000, 24, 113-123.

Bazylak G, Przybylska A., Carbon nanotubes as the SPE packing material for isolation of patulin from functional food products, Materiały konferencyjne: Separation Sciences Asia 2012 - New horizons in separation and detection techniques, Kuala Lumpur, Malezja, 27-28.06.2012, 24

Bazylak G, Siepak M, Gryn A., Przybylska A., Oznaczanie wybranych składników mineralnych metodą ICP-MS w wodnych naparach suplementów diety zawierających owoce lub kwiatostan głogu, Materiały konferencyjne: XXIII Poznańskie Konwersatorium Analityczne - Nowoczesne metody przygotowania próbek i oznaczania śladowych ilości pierwiastków, Poznań, 8-9.05.2014, 62-63.

Bazylak G, Siepak M, Gryn A., Przybylska A. (a), Zawartość niektórych składników mineralnych w liściach morwy białej i owocach głogu jednoszyjkowego z obsadzeń ulicznych i terenów rekreacyjnych w Bydgoszczy, Materiały konferencyjne: III Ogólnopolska Konferencja Naukowa, Problemy ochrony roślin na terenach zurbanizowanych. Wrocław-Pawłowice, 13-14.06.2017, 22-24.

Bazylak G., Twarużek M., Kosicki R., Ałtyn I., Grajewski J., Gryn-Rynko A., Przybylska A., Siepak M. (b), Patulin, trace elements and micronutrients in dried fruits and inflorescences of hawthorn (Crataegus spp.) used as components of cardiotonic dietary supplements for hypertensive subjects. Materiały konferencyjne: 39th Mycotoxin Workshop, Bydgoszcz, 19.06.2017, 69.

Bączek K., Węglarz Z., Kosakowska O., Piór-Jabrucka E., Gniewosz M., Przybył J., Szymona J., Sprawozdanie z zadania pt. ”Warzywnictwo, w tym uprawa ziół, metodami ekologicznymi – badania w zakresie określenia źródeł oraz przyczyn niezamierzonego występowania w produktach ekologicznych środków niedopuszczonych do stosowania w rolnictwie ekologicznym. Określenie dobrych praktyk, standardów postępowania, opracowanie przewodnika oraz wytycznych w zakresie przeciwdziałania takim przypadkom”. Laboratorium Nowych Technologii Wytwarzania Produktów Zielarskich i Oceny ich Jakości w Katedrze Roślin Warzywnych i Leczniczych, SGGW, Warszawa 2016.

Belkhir M., Rebai O., Dhaouadi K., Congiu F., Tuberoso C. I. G., Amri M., Fattouch S., Comparative analysis of Tunisian wild Crataegus azarolus (Yellow azarole) and Crataegus monogyna (Red Azarole) leaf, fruit and traditionally derived syrup: phenolic profles and antioxidant and antimicrobail activities of the aqueous-acetone extracts, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61, 9594-9601, doi:10.1021/jf402874z.

Benmalek Y., Yahia O. A., Belkebir A., Fardeau M-L., Anti-microbial and anti-oxidant activities of Illicium verum, Crataegus oxyacantha ssp monogyna and Allium cepa red and white varietes, Bioengineered, 2013, 4 (4), 244-248, doi:10.4161/bioe.24435.

Betina V., Chromatography of mycotoxins, Journal of Chromatography Library, Elsevier, Amsterdam 1993, Vol. 54, Chapter 7, 224.

Bizjak Bat K., Mozetič Vodopivec B., Eler K., Ogrinc N., Mulič I., Masuero D., Vrhovšek U., Primary and secondary metabolites as a tool for differentiation of apple juice according to cultivar and geographical origin, LWT – Food Science and Technology, 2018, 90, 238-245, doi:10.1016/j.lwt.2017.12.026.

Błaszkowski J, Adamska I., Czerniawska B., Madej T., Zioło E., Przewodnik do zajęć z patofizjologii, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, Szczecin, 2010, http://www.zor.zut.edu.pl/Skrypt-web/Home.html.

Bokulich N. A., Thorngate J. H., Richardson P. M., Mills D. A., Microbial biogeography of wine grapes is conditioned by cultivar, vintage and climate, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111 (1), 139-148, doi:10.1073/pnas.1317377110.

Bosch E., Bou P., Allemann H., Roses M., Retention of ionizable compounds on HPLC. pH scale in methanol- water and the pK and pH values of buffers, Analytical Chemistry, 1996, 68 (20), 3651-3657. doi:10.1021/ac960104.

Brzezicha-Cirocka J., Grembecka M., Jezusek M., Szefer P., Ocena zawartości wybranych mikropierwiastków w herbatkach owocowych, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 48 (3), 274-277.

Budavari S., The Merck Index – an encyclopedia of chemicals, drug, and biologicals, Whitehouse Station, NJ: Merck, 1996.

Cai Y-Q., Jiang G-B., Liu J-F., Zhou Q-X., Multi-walled carbon nanotubes packed cartridge for the solid-phase extraction of several phthalate esters from water samples and their determination by high performance liquid chromatography, Analytica Chmica Acta, 2003, 494, 149-156, doi:10.1016/j.aca.2003.08.006.

Cai Y-q., Cai Y-e., Mou S-f., Lu Y-q., Multi-walled carbon nanotubes as a solid-phase extraction adsorbent for the determination of chlorophenols in environmental water samples, Journal of Chromatography A, 2005, 1081, 245-247, doi:10.1016/j.chroma.2005.05.080.

Cao J., Zhang H., Yang Q., Ren R., Efficacy of Pichia caribbica in controlling blue mold rot and patulin degradation in apples, International Journal of Food Microbiology, 2013, 162, 167-173, doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2013.01.007.

Catanâ M., Catanâ L., Lilios G., Negoita M., Iorga E., Belc N., Balea A., Determination of patulin in apple juice, Romanian Journal of Food Science, 2011, 1(1), 65-69.

Catanâ M., Catanâ L., Iorga E., Culetu A., Ionescu V., Belc N., Assesment of the Thermal Stability of patulin in apple puree and of possibilities for reduction of patulin contamination level through apple processing, Revista de Chimie, 2018, 69 (4), 809-814.

Censkovsky U., Helberg U., Nowack A., Steidle M., Overview of world production and marketing of organic wild collected products. International Trade Centre UNCTAD/WTO, Genewa, Szwajcaria, 2006, 1-96.

Cereus.com.pl, http://www.cereus.com.pl/produkt,40,kolumienki-oczyszczajace.html, dostęp z dniem 26.02.2019.

Chang Q., Zuo Z., Chow M. S. S., Ho W. K. K., Effect of storage temperaturę on phenolics stability in hawthorn (Crataegus pinnatifia var. major) fruits and a hawthorn drink, Food Chemistry, 2006, 98, 426-430, doi:10.1016/j.foodchem.2005.06.015.

Chang C. L., Chen H. S., Shen Y. C., Lai G. H., Wang C. M., Phytochemical composition, antioxidant activity and neuroprotective effect of Crataegus pinnatifida fruit, South African Journal of Botany, 2013, 88, 432-437, doi:10.1016/j.sajb.2013.08.017.

Chapman G. W. & Horvat R. J., The nonvolatile acid and sugar composition of mayhaw fruits (Crataegus aestivalis, C. opaca, C. rufula), Journal of Food Quality, 1991, 14, 435-439.

Chemicalbook.com, https://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_US_CB5780754.aspx, dostęp z dniem 17.03.2019.

Choma J., Czubaszek M., Jaroniec M., Adsorpcja barwników z roztworów wodnych na węglach aktywnych, Ochrona Środowiska, 2015, 37 (3), 3-14.

Ciegler A., Detry R. W., Lillehoj E. B., Patulin, Penicillic acid and other carcinogenic lactones, Microbial Toxins, 1971, 6, 409-434.

Cierniak-Piotrowska M., Marciniak G., Stańczak J., Statystyka zgonów i umieralności z powodu chorób układu krążenia, w: Strzelecki Z, Szymborski J. (Red.), Zachorowalność i umieralność na choroby układu krążenia a sytuacja demograficzna Polski, Rządowa Rada Ludnościowa, 2015.

Coughlan J. M., Han S., Stefanović S., Dickinson T. A., Widespread generalist clones are associated with range and niche expansion in allopolyploids of Pacific Northwest Hawthorns (Crataegus spp.), Molecular Ecology, 2017, 26 (20), 5484-5799, doi:10.1111/mec.14331.

Cunha S. C., Faria M. A., Fernandes J. O., Determination of patulin in apple and quince products by GC-MS using 13C5-7 patulin as internal standard, Food Chemistry, 2009, 115, 352-359, doi:10.1016/j.foodchem.2008.11.074.

Czerniawska B. & Adamska I., Grzyby pasożytnicze występujące na śnieguliczce, trzmielinie i głogu, Postępy w Ochronie Roślin, 2007, 47 (2), 78-80.

Da Silva S. J. N., Schuch P. Z., Bernardi C. R., Vainstein M. H., Jablonski A., Bender R. J., Patulin in food: state- of-the-art and analytical trends, Revista Brasileira de Fruticultura, 2007, 29 (2), 406-413.

De Champdoré M., Bazzicalupo P., De Napoli L., Montesarchio D., Di Fabio G., Cocozza I., Parracino A., Rossi M., D’Auria, A new competitive fluorescence assay for the detection of patulin toxin, Analytical Chemistry, 2007, 79 (2), 751-757, doi:10.1021/ac0618526.

De Clercq N., Van Pamel E., Van Coillie E., Optimization and validation of a method without alkaline Clean-Up for patulin analysis on apple puree agar medium (APAM) and apple products, Food Analytical Methods, 2016, 9 (2), 370-377.

De Smet D., Dubruel P., Van Peteghem C., De Saeger S., Development of a molecularly imprinted polimer for patulin in apple juice, World Mycotoxin, 2011, 4 (4), 1-9 doi:10.3920/WMJ2010.1276.

Dobrzańska-Danikiewicz A., Cichocki D., Wolany W., Łukowiec D., Synteza wielościennych nanorurek węglowych metodą katalityczno-chemicznego osadzania z fazy gazowej, Inżynieria materiałowa, 2014, 6, 477- 480.

Dominguez-Alavarez J., Mateos-Vivas M., Garcia-Gomez D., Capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry for the determination of anthelmintic benzimidazoles in eggs using a QuEChERS with preconcentration as sample treatment, Journal of Chromatography A, 2013, 1278, 166-174, doi:10.1016/j.chroma.2012.12.064.

Dong M., Si W., Jiang K., Nie D., Wu Y., Zhao Z., De Saeger S., Han Z., Multi-walled carbon nanotubes as solid- phase extraction sorbents for simulaneous determination of type A trichothecenes in maize, wheat and rice by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2015, 1423, 177-182, doi:10.1016/j.chroma.2015.10.068.

Dowling G., Gallo P., Regan L. (a), Confirmatory analysis of firocoxib in bovine milk by rapid resolution liquid chromatography tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography B – Anlalytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2009, 877 (5-6), 541-546, doi:10.1016/j.chromb.2008.12.059.

Dowling G., Gallo P., Malone E. (b), Rapid confirmatory analysis of non-steroid anti-inflamantory drugs in bovine milk by rapid resolution liquid chromatography tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2009, 1216 (46), 8117-8131, doi:10.1016/j.chroma.2009.05.004.

Drush S., Kopka S., Kaeding J., Stability of patulin in a juice-like aqueous model system in the presence of ascorbic acid, Food Chemistry, 2007, 100, 192-197, doi:10.1016/j.foodchem.2005.09.043.

Du D., Wang M., Zhang J., Cai J., Tu H., Zhang A., Application of multiwalled carbon nanotubes for solid-phase extraction of organophosphate pesticide, Electrochemistry Communications, 2007, 10, 85-89, doi:10.1016/j.elecom.2007.11.005.

Du L-J., Chu C., Warner E., Wang Q-Y., Hu Y-H., Rapid micrwave-assisted dispersive micro-solid phase extraction of mycotoxins in food using zirconia nanoparticles, Journal of Chromatography A, 2018, 1561, 1-12, doi:10.1016/j.chroma.2018.05.031.

Dzido T. H. & Soczewiński E., Modification of horizontal sandwich chumber for thin-layer chromatography, Journal of Chromatograpy A, 1990, 516 (2), 461-466.

Edwards J. E., Brown P. N., Talent N., Dickinson T. A., Shipley P. R., A review of the chemistry of the genus Crataegus, Phytochemystry, 2012, 79, 5-26, doi:10.1016/j.phytochem.2012.04.006.

Espinosa S., Bosch E., Rosés M., Acid-base constants of neutral bases in acetonitrile-water mixtures, Analytica Chimica Acta, 2002, 454 (1), 157-166, doi: 10.2016/S0003-2670(01)01541-0.

Fang J., Wang Z., Tang Z. (Eds.), Atlas of woody plants in China. Distribution and Climate, Springer, New York 2011, Vol 1, 511.

Farmakopea Polska wydanie X, Polskie Wydawnictwo Farmaceutyczne, Warszawa 2014

Fecka I, Cisowski W., Łuczkiewicz M., Determination of catechin and epicatechin in an extract from Uncaria tomentosa bark by TLC with chemically modified stationary phase, JPC Journal of Planar Chromatography- Modern TLC, 2001, 14 (6), 405-408.

Feng F., Ge J., Li Y., He S., Zhong J., Liu X., Yu X., Enhanced degradation of chlorpyrifos in rize (Oryza sativa L.) by five strains of endophytic bacteria and their plant growth promotional ability, Chemosphere, 2017, 184, 505-513 doi:10.1016/j.chemosphere.2017.05.178.

Fones H. N., McCurrach H., Mithani A., Smith J. A. C., Preston G. M., Local adaptation is associated with zinc tolerance in Pseudomonas endophytes of the metal-hyperaccumulator plant Noccaea caerulescens, Proceedings. Biological Sciences B, 2016, 283, 20160648, doi:10.1098/rspb.2016.0648.

Forouzan S. & Madadlou A., Incidence of patulin in apple juices produced in west Azerbayjan province Iran, Journal of Agricultural Science and Technology, 2014, 16, 1613-1622.

Frisvad J. C., A critical review of producers of small lactone mycotoxins: patulin, penicillic acid and moniliformin, World Mycotoxin Journal, 2018, 11 (1), 73-100, doi:10.3920/wmj2017.2294.

Fritsche J., Recent developments and digital perspectives in food safety and authenticity, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66 (29), 7562-7567, doi:10.1021/acs.jafc.8b00843.

Froehlicher T., Hennebelle T., Martin-Nizard F., Cleenewerck P., Hilbert J-L., Trotin F., Grec S., Phenolic profiles and antioxidative effects of hawthorn cel suspension, fresh fruits and medicinal dried parts, Food Chemistry, 2009, 115, 897-903, doi:10.1016/j.foodchem.2009.01.004.

Funes G. J. & Resnik S. L., Determination of patulin in solid and semisolid apple and pear products marketed in Argentina, Food Control, 2009, 20, 277-280, doi:10.1016/j.foodcont.2008.05.010.

Funes G. J., Gómez P. L., Resnik S. L., Alzamora S. M., Application of pulsed light to patulin reduction in McIlvaine buffer and apple products, Food Control, 2013, 30, 405-410, doi: 10.1016/j.foodcont.2012.09.001.

Główny Inspektorat Sanitarny, Stan Sanitarny Kraju w roku 2017, Warszawa 2018, https://gis.gov.pl/zdrowie/warunki-sanitarne/zlobki/raport-stan-sanitarny-kraju-w-roku-2017/, dostęp z dniem 12.06. 2018.

Główny Urząd Statystyczny, 2005, https://stat.gov.pl/obszary-tematyczne/rolnictwo- lesnictwo/lesnictwo/lesnictwo-2005,1,1.html; dostęp z dniem 15.09.2018.

Gostyńska-Jakuszewska M., Studia nad systematyką, rozmieszczeniem i zmiennością głogów występujących w Polsce, Rocznik Dendrologiczny, 1979, 32, 1-12.

Gökmen V., Acar J., Sarioğlu K., Liquid chromatographic method for the determination of patulin in apple juice using solid-phase extraction, Analytica Chemica Acta, 2005, 543, 64-69, doi:10.1016/j.aca.2005.04.017.

Gryn A., Sperkowska B., Bazylak G., Determination of vitamin C and selected low molecular weight organic acids in aqueous extract of mulberry leaves used as dietary supplements, Current Issues in Pharmacy and Medical Sciences, 2013, 26 (2), 221-224. doi:10.12923/j.2084-980X/26.2/a.22.

Gryn A., Tadeja A., Bazylak G., Oznaczanie aktywności antyoksydacyjnej naparów wodnych z liści morwy białej stanowiących składnik suplementów diety, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 2014, 47 (3), 425-431.

Grzegorczyk M., Szalewicz A., Żarowska A., Połomska X., Wątorek W., Wojtatowicz M., Drobnoustroje w biologicznej ochronie roślin przed chorobami grzybowymi, Acta Scientarium Polonorum, Biotechnologia, 2015, 14 (2), 19-42.

Guo Y., Zhou Z., Yuan Y., Tue T., Survey of patulin in apple juice concentrates in Shaanxi (China) and its dietary intake, 2013, 34, 570-573, doi:10.1016/j.foodcont.2013.05.029.

Gundogdu M., Ozrenk K., Ercisli S., Kan T., Kodad O., Hegedus A., Organic acids, sugars, vitamin C content and some pomological characteristics of eleven hawthorn species (Crataegus spp.) from Turkey, Biological Research, 2014, 47 (21), 1-5, doi:10.1186/0717-6287-47-21.

Güven K., Yücel E., Cetintaş F., Antimicrobial Activities of fruits of Crataegus and Pyrus Species, Pharmaceutical Biology, 2006, 44 (2), 79-83, doi:10.1080/13880200600591253.

Haas D., Pfeifer B., Reiterich C., Partenheimer R., Reck B., Buzina W., Identification and quantification of fungi and mycotoxins from Pu-erh tea, International Journal of Food Microbiology, 2013, 166, 316-322, doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2013.07.024.

Halt M. & Klapec T., Microbial populations in medicinal and aromatic plants and herbal teas from Croatia, Italian Journal of Food Science, 2005, 17 (3), 349-354.

Hammami W., Al. Thani R., Fiori S., Al.-Meer S., Atia A. F., Rabah D., Mighell Q., Jaoua S., Patulin and patulin producing Penicillium spp. occurence in apples and apple-based products including baby food, The Journal of Infection in Developing Countries, 2017, 11 (4), 343-349, doi:10.3855/jidc.9043.

He L., Liu Y., Mustapha A., Lin M., Antifungal activity of zinc oxide nanoparticles against Botrytis cinerea and Penicillium expansum, Microbiology Research, 2011, 166 (3), 207-2015, doi:10.1016/j.micres.2010.03.003.

Herrador M. A. & González A. G., Potentiometric titrations in acetonitrile-water mixtures: evaluation of aqueous ionisation constant of ketoprofen, Talanta, 2002, 56 (4), 769-775.doi:10.1016/S0039-9140(01)00607-5.

Idris-Khodja N., Auger C., Koch E., Schini-Kerth V. B., Crataegus special extract WS®1442 prevents aging- related endiothelial dysfunction, Phytomedicine, 2012, 19, 699-706, doi:10.1016/j.phymed.2012.04.005.

Iijim S., Helical microtubules of graphitic carbon, Nature, 1991, 354, 55-58.

Ioi J. D., Zhou T., Tsao R., Marcone M. F., Mitigation of patulin in fresh and processed foods and beverages, Toxins, 2017, 9 (157), 1-18, doi:10.3390/toxins9050157.

Iskra M., Krasińska B., Tykarski A., Magnez – rola fizjologiczna, znaczenie kliniczne niedoboru w nadciśnieniu tętniczym i jego powikłaniach oraz możliwości uzupełnienia w organizmie człowieka, Arterial Hypertension, 2013, 17 (6), 447-459.

Islas G., Ibarra I. S., Hernandez P., Miranda J. M., Cepeda A., Dispersive solid phase extraction for the analysis of veterinary drugs applied to food samples: A Review, International Journal of Analytical Chemistry, 2017, 2017, ID 8215271, 1-16, doi:10.1055/2017/8215271.

Ismaiel A. A. & Papenbrock J., The effects of patulin from Penicillium vulpinum on seedling growth, root tip ultrastructure and glutathione content of maize, European Journal of Plant Pathology, 2014, 139, 497-509, doi:10.1007/s10658-014-0406-9.

Ito R., Yamazaki H., Inoue K., Yoshimura Y., Kawaguchi M., Nakazawa H., Development of Liquid Chromatography-Electrospray Mass Spectrometry for the determination of patulin in apple juice: Investigation of its contamination levels in Japan, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52 (25), 7464-7468, doi:10.1021/jf049264l.

Iqbal A., Arshad M., Hashimi I., Karthikeyan R., Gentry T. J., Schwab A. P., Biodegradation of phenol and benzene by endophytic bacterial strains isolated from refinery wastwater-fed Cannabis sativa, Environmental Technology, 2017, 13, 1-10 doi:10.1080/09593330.2017.1337232.

Iqbal S. Z., Mali. S., Rafique Asi M., Selamet J., Natural occurence of patulin in different fruits, juices and smoothies and evaluation of dietary intake in Punjab, Pakistan, Food Control, 2018, 84, 370-374, doi:10.1016/j.foodcont.2017.08.024.

Janda-Ulfig K. & Ulfig K., Susze ziołowe i przyprawy jako źródło mikotoksyn, Przemysł Spożywczy, 2008, 3, 36-44.

Jarosz M. (Red.), Normy żywienia dla populacji Polski, Instytut Żywności i Żywienia, Warszawa, 2017.

Jędrzejczyk I. & Śliwińska E., Leaves and seeds as materials for flow cytometric estimation of the genome size of 11 Rosaceae woody species containing DNA-staining inhibitors, Journal of Botany, 2010, ID 930895, 1-9, doi:10.1155/2010/930895.

Ji X., Li R., Yang H., Qi P., Xiao Y., Qian M., Occurence of patulin in various fruit products and dietary exposure assesment for consumers in China, Food Control, 2017, 78, 100-107, doi:10.1016/j.foodcont.2017.02.044.

Jiang D., Wei D., Wang L., Ma S., Du Y., Wang M., Multiwalled carbon nanotube for one-step cleanup of 21 mycotoxins in corn and wheat prior to ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis, Toxins, 2018, 10 (409), 1-16, doi:10.3390/toxins10100409.

Josefsson B. G. E. & Möller T. E., Screening method for the detection of aflatoxin, ochratoxin, patulin, sterigmatocysin and zeatalenone in cereals, Journal – Association of Official Analytical Chemists, 1977, 60 (6), 1369-1371.

Judet-Correia D., Charpentier C., Bensoussan M., Dantigny P., Modelling the inhibitory effect of copper sulfate on the growth of Penicillium expansum and Botrytic cinerea, Letteres in Applied Microbiology, 2011, 53 (5), 558- 564, doi:10.1111/j.1472-765X.2011.03149x.

Juranović Cindrić I., Zeiner M., Mihajlov D., Michajlov-Konanov D., Stingeder G., Metal characterization of white hawthorn organs and infusions, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63, 1798-1802, doi:10.1021/jf504474t.

Kabak B., The fate of mycotoxins during thermal food processing, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009, 89, 549-554, doi:10.1002/jsfa.3491.

Kadakal C. & Nas S., Effect of activated charcoal on patulin, fumaric acid and some other properties of apple juice, Nahrung/Food, 2002, 46 (1), 31-33.

Karczmarczuk R., Ponad tysiąc gatunków głogu?!, Wszechświat, 2011, 112, (10), 305-307.

Kataoka H., Itano M., Ishizaki A., Saito K., Determination of patulin in fruit juice and dried fruit samples by in- tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography-mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2009, 1216, 3746-3750, doi:10.1016/j.chroma.2009.03.017.

Kendall H., Naughton P., Kuznesof S., Raley M., Dean M., Clark B. i wsp., Food fraud and the perceived integrity of European food import sinto China, PloS One, 2018, 23, 13 (5):e0195817, doi:10.1371/journal.pone.0195817

Kędzia B., Badania nad zanieczyszczeniem surowców zielarskich drobnoustrojami, Rozprawa habilitacyjna, Poznań 1999.

Khazanov V. A., Kiseliova A. A., Vasiliev K. Yu., Chernyschova G. A., Cardioprotective effects of trimetazidine and a combination of succinic and malic acids in acute myocardial ischemia., Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2008, 146 (2), 218-222, doi:10.1007/s10517-008-0259-3.

Khorrami A. R. & Taherkhami T., Synthesis and evaluation of a Molecularly Imprinted Polymer for pre- concentartion of patulin from apple juice, Chromatographia, 2011, 73 (1), 151-156, doi:10.1007/s10337-010- 1892-3.

Kolarzyk E. (Red.), Antyodżywcze i antyzdrowotne aspekty żywienia człowieka. Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2016.

Kong W., Wei R., Logrieco A. F., Wei J., Wen J., Xiao X., Yang M., Occurence of toxigenic fungi and determination of mycotoxins by HPLC-FLD in funcional foods and spices in China markets, Food Chemistry, 2014, 146, 320-326, doi:10.1016/j.foodchem.2013.09.005.

Korczyński M. & Misiewicz J., Flora synantropijna Parku Krajobrazowego Doliny Dolnej Wisły, 2003 Krasicka- Korczyńska E. (Red.), Flora i fauna Pomorza i Kujaw, Polskie Towarzystwo Botaniczne, Bydgoszcz, 2003, Tom I.

Kosińska J., Gałęzowska G., Zalewski S., Kamiński M., Chromatografia cienkowarstwowa i technika TLC-FID w badaniach składu grupowego, szczególnie tłuszczów i produktów ich konserwacji, Camera Separatoria, 2015, 7 (1), 1-18.

Kostić D. A., Velicković J. M., Mitić S. S., Mitić M. N., Randelović S. S., Phenolic content and antioxidant and antimicrobial activities of Crataegus oxyacantha L (Rosaceae) fruit extract from Southeast Serbia, Tropical Journal of Pharmaceutical Research February, 2012, 11 (1), 117-124, doi:10.4314/tjpr.v11i1.15.

Koszowska A., Dittfeld A., Puzoń-Brończyk A., Nowak J., Zubelewicz-Szkodzińska B., Polifenole w profilaktyce chorób cywilizacyjnych, Postępy fitoterapii, 2013, 4, 263-266.

Kotynia Z., Szewczyk P., Tuzikiewicz-Gnitecka G., Dopuszczanie produktów do obrotu w Polsce. Bezpieczeństwo stosowania suplementów diety, Ustalenia kontroli NIK, 4, 07-08. 2017.

Kovács E. & Keresztes Á, Effect of gamma and UV-B/C radiation on plant cells, Micron, 2002, 33 (2), 199-210.

Kowalewska-Pasek U. (Red.), Drzewa przyjazne, drzewa lecznicze. Studio Astropsychologii, Białystok 2007.

Kozłowski J., Forycka A., Szczyglewska D., Buchwald W., Rośliny w Piśmie Świętym, Panacea, 2007, 1 (18), 28-31, https://panacea.pl/articles.php?id=246, dostęp z dniem 14.03.2019.

Kujawska M., Łuczaj Ł., Sosnowska J., Klepacki P., Rośliny w wierzeniach i zwyczajach ludowych. Słownik Adama Fischera, Polskie Towarzystwo Ludoznawcze, Wrocław 2016.

Kulczyński B. & Gramza-Michałowska A., Potencjał prozdrowotny owoców i kwiatów głogu, Problemy Higieny i Epidemiologii, 2016, 97 (1), 24-28.

Kunachowicz H., Przygoda B., Nadolna I., Iwanow K., Tabele składu i wartości odżywczej żywności, wyd. II zmienione, PZWL Wydawnictwo Lekarskie, Warszawa 2018.

Kunicka-Styczyńska A. & Śmigielski K., Bezpieczeństwo mikrobiologiczne surowców zielarskich, Przemysł Spożywczy, 2011, 65, 50-53.

Ledzion E., Rbińska K., Postupolski J., Kurpińska-Jaworska J., Szczęsna M., Badania i ocena bezpieczeństwa surowców zielarskich w zakresie zanieczyszczenia aflatoksynami, Roczniki Państwowego Zakładu Higieny, 2011, 62 (4), 377-381.

Lei S., Li X., Wang Y., Sun L., Liu H., Zhao L., Synthesis of magnetic multiwall carbon nanotubes for enantioseparation of three pesticide residues in fruits and vegetables by chiral liquid chromatography, Chirality, 2018, 30, 1321-1329, doi:10.1002/chir.23029.

Li F., Zaho S., Chin L., Li Y., Wu D., Zhao X., Han C., Zhang H., Ji R. (a), Determination of patulin in apple and hawthorn beverages by solid-phase filtration column and liquid chromatography, Journal of AOAC International, 2007, 90 (1), 167-172.

Li J-k., Wu R-n., Hu Q-h., Wang J-h. (b), Solid-phase extraction and HPLC determination of patulin in apple juice concentrate, Food Control, 2007, 18, 530-534, doi:10.1016/j.foodcont.2005.12.014.

Li Y-H., Chen F., Wang J-F., Wang Y., Zhang J-Q., Guo T., Analysis of nine compounds from Alpinia oxyphylla fruit at different harvest time using UFLC-MS/MS and an extraction method optimized by orthogonal design, Chemistry Central Journal, 2013, 7 (134), 1-9, doi:10.1186/1752-153X-7-134.

Liang G-w., Xu L., Zhang B-r., Li Y., Study on the Production Techniques of hawthorn fruit wine & measurement of organic acids in hawthorn fruit wine by HPLC, Liquor-Making Science & Technology, 2009-07.

Liu P., Kallio H., Lü D., Zhou C., Ou S., Yang B., cids, sugars and sugar alcohols in Chinese hawthorn (Crataegus spp.) fruits, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58, 1012-1019, doi:10.1021/jf902773v.

Liu P., Kallio H., Yang B., Phenolic compounds in hawthorn (Crataegus grayana) fruits and leaves and changes during fruit ripening, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59, 11141-11149, doi:10.1021/jf202465u.

Lo E. Y., Stefanović S., Christensen K. I., Dickinson T. A., Evidence for genetic association between East Asian and western North American Crataegus L. (Rosaceae) and rapid divergence of the eastern North American lineages based on multiple DNA sequences, Molecular Phylogenetics and Evolution, 2009, 51 (2), 157-168, doi:10.1016/j.ympev.2009.01.018.

Lu L., Gao Y., Xu X., Huang X., Li H., Determination and result analysis of patulin in apple and hawthorn products in Guangdong Province from 2005 to 2007, Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2008-08.

Lu Y., Shen Q., Dai Z., Zhang H., Multi-walled carbon nanotubes as solid-phase extraction adsorbent for the ultra- fast determination of chloramphenicol in egg, honey and milk by fused-core C18-based high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010, 398, 1819-1826, doi:10.1007/s00216-010-4095-8.

Łuczaj Ł., Oklejewicz K., Nowak K. A., Pirożnikow E., Ludowe nazwy głogów (Crataegus) i róż (Rosa) w Polsce od końca XIX w. do czasów obecnych., Rocznik Dendrologiczny, 2008, 56, 115-129.

Łuczaj Ł., Dzikie rośliny jadalne Polski. Przewodnik survivalowy, Chemigrafia, Krosno 2014.

Ma B., Chen J., Zheng H., Fang T., Ogutu C., Li S., Han Y., Wu B., Comparative assessment of sugar and malic acid composition in cultivated and wild aplples, Food Chemistry, 2015, 172, 86-91, doi:10.1016/j.foodchem.2014.09.032.

Malekinejad H., Aghazadeh-Attari J., Rezabakhsh A., Sattari M., Ghasemsoltani-Momtaz B., Neurotoxicity of mycotoxins produced in vitro by Penicillium roqueforti isolated from maize and grass silage, Human & Experimental Toxicology, 2015, 34 (10), 997-1005, doi:10.1177/0960327114565493.

Meng J., Huang F., WU R., Han Y., Determination of patulin in apple and hawthorn products by HPLC, Acta Agriculture Shanghai, 2009-01.

Mielcarek J. & Skupin P., Funkcjonalizacja nanorurek węglowych jako potencjalnych nośników leków. Przegląd lekarski, 2011, 68 (3), 167-170.

MirAli N., Al.-Odat M., Haider N., Nabulsi I., The genus Crataegus L., an ecological and molecular study, Genetika, 2011, 47 (1), 32-40.

Mirosławski J., Wiechuła D., Kwapuliński J., Rochel R., Loska K., Ciba J., Występowanie Pb, Cd, Cu, Mn, Ni, Co i Cr, w wybranych gatunkach roślin leczniczych na terenie Polski, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 1995, 28 (4), 363-368.

Morales P., Ferreira I. C. F. R., Carvalho A. M., Fernández-Ruiz V., Sánchez-Mata M. C., Cámara M., Morales R., Tardío J., Wild edible fruits as a potentail source of phytochemicals with capacity to inhibit peroxidation, European Journal of Lipid Science and Technology, 2013, 115, 176-185, doi:10.1002/ejlt.201200162.

Mraihi F., Journi M., Chérif J. K., Sokmen M., Sokmen A., Trabelsi-Ayadi M., Phenolic contents and antioxidant potential of Crataegus Fruits Grown in Tunisia as determined by DPPH, FRAP and β-carotene/linoleic acid assay, Journal of Chemistry, 2013, 2013, ID 378264, 1-6, doi:10.1155/2013/378264.

Mraihi F., Hidalgo M., de Pascual-Teresa S., Trabelsi-Ayadi M., Chérif J. K., Wild grown red and yellow hawthorn fruits from Tunisia as source of antioxidants, Arabian Journal of Chemistry, 2015, 8, 570-578, doi:10.1016/j.arabjc.2014.11.045.

Murillo M., González-Peñas E., Amézqueta S., Determination of patulin in commercial apple juice by micellar electrokinetic chromatography, Food and Chemical Toxicology, 2008, 46, 57-64, doi:10.1016/j.fct.2007.06.024.

Murillo-Arbizu M., González-Peñas E., Amézqueta., Comparison between capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography for the study of the occurence of patulin in apple juice intended for infants, Food and Chemical Toxicology, 2010, 48, 2429-2434, doi:10.1016/j.fct.2010.06.003.

Murray P. R., Rosenthal K. S., Pfaller M. A., Enterobacteriaceae, Przondo-Mordarska A., Martirosian G., Szkaradkiewicz A., Mikrobiologia, Wrocław 2014, 293-299.

Najwyższa Izba Kontroli, Informacja o wynikach kontroli, Dopuszczenie do obrotów suplementów diety, 2016, Nr ewidencyjny 195/2016P/16/078/LLO.

Namieśnik J. & Konieczka P., Ocena i kontrola jakości wyników pomiarów analitycznych, WNT, Warszawa 2009.

Newerli-Guz J., Uprawa roślin zielarskich w Polsce. Roczniki Naukowe Stowarzyszenia Ekonomistów Rolnictwa i Agrobiznesu, 2016, 18 (93), 268-274.

Ohmichi K., Analysis of patulin in apple and grape fruit, Bull. Tokyo Healthcare University, 2015, 10 (1), 29-34.

Olejniczak M., Ryzyko konsumenckie w procesie zakupu żywności funkcjonalnej, Zeszyty Naukowe Wyższej Szkoły Bankowej we Wrocławiu, 2015, 15 (3), 417-423.

Oszmiański J., Wolniak M., Wojdyło A., Wawer I., Comparative study of polyphenolic content and antiradical activity of cloudy and clear apple juices, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2007, 87, 573-579, doi:10.1002/jsfa.2707.

Pal S., Singh N., Ansari K. M., Toxicological effects of patulin mycotoxin on the mammalian system: an overview, Toxicology Research, 2017, 6, 764, doi:10.1039/c7tx00138j.

Pande G. & Akoh C. C., Organic acids, antioxidant capacity, phenolic content and lipid characterisation of Georgia-grown underutilized fruit crops, Food Chemistry, 2010, 120, 1067-1075, doi:10.1016/j.foodchem.2009.11.054.

Park Y. K., Hwang S. I., Lee M. H., Jang Y. S., Fruit characteristic and variation of phenolic compounds in the fruit of hawthorn (Crataegus pinnatifida Bunge) selected from Korea and chinese cultivars, Korean Journal of Plant Resources, 2010, 23 (3), 223-227.

Peng X., Li Y., Luan Z., Di Z., Wang H., Tian B., Jia Z., Adsorption of 1, 2-dichlorobenzene from water to carbon nanotubes, Chemical Physics Letters, 2003, 376, 154-158, doi:10.1016/S0009-2614(03)00960-6.

Pereira C., Barros L., Carvalho A. M., Use of UFLC-PDA for the analysis of organic acids in thirty-five species of food and medicinal plants, Food Analytical Methods, 2013, 6, 1337-1344, doi:10.1007/s1216-012-9548-6.

Pietrzak Ł. & Jeszka J., Nanokompozyty polilaktyd/wielościenne nanorurki węglowe – otrzymywanie i właściwości elektryczne. Polimery, 2010, 55, 7-8.

Piqué E., Vargas-Murga L., Gómez-Catalán J., de Lapuente J., Llobet J. M., Occurence of patulin in organic and conventional apple-based food marketed in Catalonia and exposure assessment, Food and Chemical Toxicology, 2013, 60, 199-204, doi:10.1016/j.fct.2013.07.052.

Pizzorno J. & Murray M. (Eds), Textbook of Natural Medicine, 4th Edition, Churchil Livingstone/Elsevier, St. Louis, MO, 2013, 1-1944.

Pliszka B., Huszcza-Ciołkowska G., Wierzbicka E., Effects of solvents and extraction methods on the content and atiradical activity of polyphenols from fruits Actinidia arguta, Crataegus monogyna, Gaultheria Procumbens and Schisandra chnensis, Acta Scientiarium Polonorum Technologia Alimentaria, 2016, 15 (1), 57-63, doi:10.17306/J.AFS.2016.1.6.

Pobłocka-Olech L., Krazue-Baranowska M., Wiwart M., HPTLC determination of catechins in different clones of the genus Salix, JPC Journal of Planar Chromatography-Modern TLC, 2007, 20 (1), 61-64.

Pobłocka-Olech L. & Krauze-Baranowska M., SPE-HPTLC of procyanidins from the barks of different species and clones of Salix, Journal of Pharmaceutical and Biomedical analysis, 2008, 48 (3), 965-968.

Polak-Śliwińska M., Łamejko Ł., Kubiak M. S., Zawartość patuliny i 5-HMF w sokach owocowo-warzywnych z produkcji ekologicznej i komercyjnej, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 2013, 46 (1), 80-88.

Polak-Śliwińska M., Smoczyński S. S., Kuncewicz A., Borejszo Z., Zastosowanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) do oceny zanieczyszczenia patuliną soków owocowo-warzywnych z upraw ekologicznych i konwencjonalnych, Inżynieria Przetwórstwa Spożywczego, 2014, 1/4 (9), 30-34.

Popovic-Milenkovic M., Tomovic M. T., Brankovic S. R., Ljujic B. T., Jankovic S. M., Antioxidant and anxiolytic activities of Crataegus nigra Wlad. Et kit. Berries, Acta Poloniae Pharmaceutica – Drug Research, 2014, 71 (2), 279-285.

Prior R. L., Wu X., Schaich K., Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in food and dietary supplements, Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53, 4290-4302.

Przybylska A, Wieczorek W., Bazylak G., Zastosowanie nanorurek węglowych i polimerów z odwzorowaniem cząsteczkowym do ekstrakcji patuliny z soków jabłkowych metodą SPE, Materiały konferencyjne: XXII Naukowy Zjazd Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego - Farmacja - Nauka - Społeczeństwo, Białystok, 18– 21.09.2013, 164

Przybylska A. & Bazylak G., A comparison of the selectivity of nano-HPTLC systems used for determination of patulin in fruit juices from the internet stores and pharmacies, Current Issues in Pharmacy and Medical Sciences, 2013, 26 (2), 155-159.

Przybylska A., Gryn A., Siepak M., Bazylak G., Assessment of heavy metals, organic acids and microbial quality in aerial parts of hawthorn used as ingredients of cardiotonic dietary supplements, Materiały konferencyjne: The International Young Scientists Symposium – Plants in Pharmacy & Nutrition 2014, Wrocław UM, 30.05.2014, 104.

Przybylska A., Gryn A., Siepak M., Bazylak G, Pro-oxidant microelements of infusions from aerial parts of hawthorn (Crataegus spp.) consumed as cardiotonic and cardioprotective dietary supplements by middle aged subjects, Materiały konferencyjne: Nowoczesne techniki badawcze stosowane w analizie farmaceutycznej i biomedycznej. 30-lecie powołania Wydziału Farmaceutycznego Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Bydgoszcz, 10-12.09.2014.

Przybylska A. & Bazylak G., Ocena jakości mikrobiologicznej suszonych owoców i kwiatostanu głogu (Crataegus spp.) stosowanych jako suplementy diety, Zeszyty Naukowe Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Rolnictwo, 2017, 119 (626), 101-114.

Przybylska A. & Bazylak G, Bioactive compounds in aqueous infusions of dietary supplements and herbal blends containing dried hawthorn fruits or hawthorn inflorescence (Crataegus spp.), Journal of Agriculture and Environmental Science, 2018, 7 (2), 131-142, doi:10.15640/jns.v7n2a14.

Przybylska A., Bazylak G., Kosicki R., Ałtyn I., Twarużek M., Grajewski J., Sołtys-Lelek A., Adventageous extraction, cleanup and UHPLC-MS/MS detection of patulin mycotoxin in dietary supplements and herbal blends containing hawberry from Crataegus spp., Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2019, 2019, Article ID 2159097, 1-13, doi:10.1155/2019/2159097.

Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/54670067#section=Taste, dostęp z dniem 08.04.2019.

Puel O., Galtier P., Oswald I. P., Biosynthesis and toxicological effects of patulin, Toxins, 2010, 2, 613-631, doi:10.3390/toxins2040613.

Pyrzyńska K. Stafiej A., Biesaga M., Sorption behawior of acidic herbicides on carbon nanotubes, Microchimica Acta, 2007, 159, 293-298, doi:10.1007/s00604-007-0739-6.

Rahmani M. S., Shabanian N., Khadivi-Khub A., Woeste K. E., Badakhshan H., Alikhani L., Population structure and genotypic variation of Crataegus pontica inferred by molecular markers, Gene, 2015, 572 (1), 123-129, doi:10.1016/j.gene.2015.07.001.

Ravipati A. S., Zhang L., Koyyalamudi R., Jeong S. C., Reddy N., Barlett J., Smith P. T., Shanmugam K., Münch G., Wu M. J., Satyanarayanan M., Antioxidant and anti-inflammatory activities of selected Chinese medicinal plants and their relations with antioxidant content, BMC Complementary & Alternative Medicine, 2012, 12 (173), 1-14, doi:10.1186/1472-6882-12-173.

Ren X., Chen C., Nagatsu M., Wang X., Carbon nanotubes as adsorbents in environmental pollution management; A review, Chemical Engineering Journal, 2011, 170, 395-410, doi:10.1016/j.cej.2010.08.045.

Rosés M. & Bosch E., Influence of mobile phase acid-base equilibria on the chromatographic behaviour of protolytic compounds, Journal of Chromatography A, 982 (1), 1-30, doi:10.1016/S0021-9673(02)01444-9.

Rozporządzenie Komisji WE Nr 401/2006 z dnia 23.02.2006 r.

Rozporządzenie Komisji WE Nr 1881/2006 z dnia 19.12.2006 r.

Rusinek E., Sembratowicz I., Ognik K., Zawartość wybranych metali w owocach leśnych w zależności od miejsca pozyskania, Roczniki Państwowego Zakładu Higieny, 2008, 59 (2), 155-161.

Rutkowski L. & Krasicka-Korczyńska E., Gatunki chronione, rzadkie i zagrożone Parku Krajobrazowego Doliny Dolnej Wisły. Krasicka-Korczyńska E. (Red.), Flora i fauna Pomorza i Kujaw, Polskie Towarzystwo Botaniczne, Bydgoszcz, 2003, Tom 1.

Rutkowska J., Adamska A., Pielat M., Białek M., Porównanie składu i właściwości dzikiej róży (Rosa Rugosa) utrwalanych metodami liofilizacji i suszenia konwencjonalnego, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2012, 4 (83), 32-43.

Sahin N., Oxalotrophic bacteria., Research in Microbiology, 2003, 154, 399-407, doi:10.1016/S0923- 2508(03)00112-8.

Saleem M., Nazir M., Ali M. S., Hussain H., Sup Lee Y., Riaz N., Jabbar A., Antimicrobial natural products: an update on future antibiotic drug candidates, Natural Product Reports, 2010, 27, 238-254, doi:10.1039/b916096e.

Santos L., Marín S., Sanchis V., Ramos A. J., Screening of mycotoxin multicontamination in medicinal and aromatic herbs sampled in Spain, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009, 89, 1802-1807, doi:10.1002/jsfa.3647.

Schlegel-Zawadzka M. & Barteczko M., Ocena stosowania suplementów diety pochodzenia naturalnego w celach prozdrowotnych przez osoby dorosłe. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2009, 4 (65), 375-387.

Seneta W., Drzewa i krzewy liściaste Tom II, PWN, Warszawa 1994, Tom II.

Sharma S., Gupta D., Sharma Y. P., Natural incidence of aflatoxins, ochratoxin A, patulin and their co-occurence in Chilgoza pine nuts marketed in Jammu, India, Proceedings of the National Academy of Sciences, India Sekcja B: Biological Sciences, 2015, 85 (1), 45-50, doi:10.1007/s40011-014-0326-7.

Silici S. & Karaman K., Inhibitory effect of propolis on patulin production of Penicillium expansum in apple juice, Journal of Food Processing and Preservation, 2014, 38, 1129-1134, doi:10.1111/jfpp.12072.

Sławińska A. & Jaśkiewicz B., Aphids (Homoptera, Aphidodea) inhabiting the trees Crataegus × media Bechst. in urban green area. Part II. Domination and frequency of aphids, their enemies and the damage caused by aphids, Acta Agrobotanica, 2004, 57 (1-2), 157-167.

Sołtys-Lelek A., Crataegus and Rosa genera in the Solec Basin and southern part of the Pińczów Hummock (Southern Poland), Biodiversity Research and Conservation, 2012, 25, 55-66.

Sołtys-Lelek A. & Gruszka W., Wild roses and hawthorns of urban area: a case study of Piła in Poland, Biodiversity Research and Conservation, 2016, 43, 27-40.

Spadaro D., Ciavorella A., Frati S., Garibaldi A., Gullino M. L., Incidence and level of patulin contamionation in pure and mixed apple juices marketed in Italy, Food Control, 2007, 18, 1098-1102, doi:10.1016/j.foodcont.2006.07.007.

Spadaro D., Lorè A., Garibaldi A., Gullino M. L., A new strain of Metschnikowia fructicola for postharvest control of Penicillium expansum and patulin accumulation on four cultivars of apple, Postharvest Biology and Technology, 2013, 75, 1-8, doi:10.1016/j.postharvbio.2012.08.001.

Sperkowska B. & Bazylak G., Zawartość szczawianów w preparatach ziołowych o działaniu uspokajającym, odstresowującym i wspomagającym leczenie skutków stresu, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 2010, 43 (3), 240-248.

Steinka I., Mikrobiologia żywności i materiałów przemysłowych, Akademia Morska w Gdyni, Gdynia 2011.

Stepnowski P., Synak E., Szafranek B., Kaczyński Z., Techniki separacyjne, 2010, Wydawnictwo Uniwersytetu Gdańskiego, Gdańsk 2010, 150-151.

Stępień M., Sokół-Leszczyńska B., Łuczak M., Mykotoksyny, pordukty spożywcze a zdrowie człowieka, Postępy Mikrobiologii, 2007, 46 (2), 167-177.

Su L., Yin J-J., Charles D., Zhou K., Moore J., Yu L. (L.), Total phenolic contents, chelating capacities and radical- scavening properties of black peppercorn, nutmeg, rosehip, connamon and oregano leaf, Food Chemistry, 2007, 100, 990-997, doi:10.1016/j.foodchem.2005.10.058.

Szala M., Spaleniowa synteza wielościennych nanorurek węglowych, Biuletyn WAT, 2009, 58 (2), 27-36.

Śliwińska A., Przybylska A., Bazylak G., Chromatograficzne metody ekstrakcji i separacji stosowane do oznaczania patuliny w owocach i sokach owocowych, w: A. Voelkel & W. Wasiak (Red.), Chromatografia w praktyce, Wydawnictwo Politechniki Poznańskiej, 2011, Rozdział 1.5, 53-64.

Śliwińska, Przybylska A., Bazylak G., Zastosowanie wielowarstwowych nanorurek węglowych do ekstrakcji patuliny z soków jabłkowych metodą SPE, Materiały Konferencyjne: Mikrobiologia w medycynie, przemyśle i ochronie środowiska - II Edycja., Łódź 22-23.10.2011, 111.

Świat Makro.com, 2014, https://swiatmakrodotcom.wordpress.com/2015/06/18/niestrzep-glogowiec-aporia- crataegi-zly-omen/, dostęp z dniem 15.03.2019.

Tajemnice Świata.pl, https://www.tajemnice-swiata.pl/rosliny-biblijne/, dostęp z dniem 19.03.2019.

Tamura M., Takahashi A., Uyama A., A method for multiple mycotoxin analysis in wines by solid phase extraction and multifunctional cartridge purification and Ultra-High-Performance Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry, 2012, 4 (6),476-486, doi:10.3390/toxins4060476.

Tang X., Liu J., Dong W., Li P., Lin C., Zheng Y., Hou J., Li D., The cardioprotective effects of citric acid and L- malic acid on myocardial ischemia/reperfusion injury, Evidence-based complementary and Alternative Medicine, 2013, 2013, 1-11, doi:10.1155/2013/820695.

Tangni E. K. & Pussemier L., Ergosterol and mycotoxins in grain dusts from fourteen Belgian cereal storages: A preliminary screening survey, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2007, 87, 1263-1270, doi:10.1002/jsfa.

Tannous J., Keller N. P., Atoui A., El Khoury A., Lteif R., Oswald I. P., Puel O., Secondary metabolism in Penicillium expansum: Emphasis on recent advances in patulin research, Critical reviews in Food Science and Nutrition, 2018, 58 (12), 2082-2098, doi:10.1080/10408398.2017.1305945.

Tariq S. A., Nisar M., Khan H., Shah M. R., The biological performance of Crataegus songarica against certain infectious fungal and bacterial diseases, Biology and Medicine, 2014, 6 (1), 1-4, doi:10.4172/0974-8369.1000194.

Tomczyk M., Nowak W., Jaźwa A., Śródbłonek w fizjologii i patogenezie chorób, Postępy biochemii, 2013, 59 (4), 1-6.

Tournas V. H. & Katsoudas E. J., Microbiological quality of various medicinal herbal teas and coffee substitutes, Microbiology Insights, 2008, 1, 47-55.

T3db.ca, http://www.t3db.ca/toxins/T3D3661, dostęp z dniem 17.03.2019.

Ulewicz-Magulska B., Selen w roślinnych surowcach leczniczych, zawartość, rozmieszczenie i wzajemne relacje z innymi pierwiastkami, Rozprawa doktorska, Akademia Medyczna w Gdańsku, Gdańsk 2008.

Vaclavikova M., Dzuman Z., Lacina O., Fenclova M., Veprikova Z., Zachariasova M., Hajslova J., Monitoring survey of patulin in a variety of fruits-based products using a sensitive UHPLC-MS/MS analytical procedure, Food Control, 2015, 47, 577-584, doi:10.1016/j.foodcont.2014.07.064.

Van Toi P., Pouplin T., Nguyen Duc K T., High-performance liquid chromatography with time-programmed fluorescence detection for the quantification of Levofloxacin in human plasma and cerebrospinal fluid in adults with tuberculous meningitis, Journal of Chromatography B – Analaytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2017, 1061, 256-262, doi:10.16/j.jchromb.2017.07.032.

Wang X., Tao S., Xing B., Sorption and competition of aromatic compounds and humic acid on multiwalled carbon nanotubes, Environmental Science & Technology, 2009,43,6214-6219, doi:10.1021/es901062t.

Wang S-L., Pang X-Q., Cao J., Cao W., Xu J-J., Zhu Q-Y., Effervescence and graphitized multi-walled carbon nanotubes assisted microextraction for natural antioxidants by ultra high performance liquid chromatography with electrochemical detection and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2015, 1418, 12-20, doi:10.1016/j.chroma.2015.09.043.

Wang Y., Zhang J., Wang Y., Wang K., Wei H., Shen L., Isolation and characterization of the Bacillus cereus BC7 strain, which is capable of zearalenone removal and intestinal flora modulation in mice, 2018, 155, 9-20, doi:10.1016/j.toxicon.2018.09.005.

Welke J. E., Hoeltz M., Dottori H. A., Noll I. B., Effect of processing stages of apple juice concentrate on patulin levels, Food Control, 2009, 20, 48-52, doi:10.1016/j.foodcont.2008.02.001.

WHO guidelines for assessing quality of herbal medicines with references to contaminants and residues, WHO Press., Genewa 2007, 1-106.

Witkowska A. M., Zujko M. E., Waśkiewicz A., Terlikowska K. M., Piotrowski W., Comparison of various databases for estimation of dietary polyphenol intake in the population of polish adults, Nutrients, 2015, 7, 9299- 9307, doi:10.3390/nu7115464.

Wojdyło A & Oszmiański J., Bioactive compounds of selected fruit juices, Natural Product Communications, 2009, 4 (5), 671-676.

Wójcik-Stopczyńska B., Jakowienko P., Jadczak D., Ocena mikrobiologicznego zanieczyszczenia świeżej bazylii i mięty, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2014, 4 (71), 122-131.

Wright S. A. I., de Felice D. V., Ianiri G., Pinedo-Rivilla C., de Curtis F., Castoria R., Two rapid assays for screening of patulin biodegradation, International Journal of Environmental Science and Technology, 2014, 11, 1387-1398, doi:10.1007/s13762-013-0325-x.

Wróbel K., Wróbel K., Colunga-Urbina E. M., Determination of total aluminium, chromium, copper, iron, manganese and nickel and their fractions leached to the infusions of black tea, green tea, Hibiscus sabdariffa and Ilex paraguariensis (Mate) by ETA-AAS, Biological Trace Element Research, 2000, 78, 271-280.

Xiang L., Gao Y. H., Liu D. Y., Yang M. H., Rapid determination of patulin in medicinal hawthorn fruits by HPLC-MS/MS, World Mycotoxin Journal, 2012, 5 (1), 31-36, doi:10.3920/WMJ2011.1336.

Xu C., Ye Q., Wu Y., Jiang M., Determination of patulin in apple and hawthorn products by high performance liquid chromatography, Physical Testing and Chemical Analysis (Part B: Chemical Analysis), 2008-10.

Yang J., Wei W., Zhu W., Liu Y., High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for determination of patulin in apple, hawthorn and tomato products, Food Science, 2009-04.

Yang Y., Yang Y., Shao B., Zhang J., A simple and rapid method for determination of patulin in juice by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry, Food Analytical Methods, 2017, 10, 2913- 2918, doi:10.1007/s12161-017-0859-5.

Yilmaz K. U., Yanar U., Ericisli S., Sahiner H., Taskin T., Zengin Y., Genetic relationships among some hawthorn (Crataegus spp.) species and genotypes, Biochemical Genetics, 2010, 48 (9-10), 873-878,

You H., Ahn H. J., Ji G. E., Transformation of rutin to antiproliferative quercitin-3-glucoside by Aspergillus niger, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58, 10886-10892, doi:10.1021/jf102871g.

Yuan Y., Zhuang H., Zhang T., Liu J., Patulin content in apple products marketed in Northeast China, Food Control, 2010, 21, 1488-1491, doi:10.1016/j.foodcont.2010.04.019.

Yuqin L., Guirong Y., Zhen Y., caihong L., Baoxiu J., Jiao C., Yurong G., Investigation of the interaction between patulin and human serum albumin by a spectroscopic method, atomic force microscopy and molecular modeling, BioMed Research International, 2014, 2014, ID 734850, 1-9, doi:10.1155/2014/734850.

Zaied C., Abid S., Hlel W., Bacha H., Occurence of patulin in apple-based-foods largely consumed in Tunisia, Food Control, 2013, 31, 263-267, doi:10.1016/j.foodcont.2012.10.005.

Zając A & Zając M., Atlas rozmieszczenia roślin naczyniowych w Polsce, Kraków 2001.

Zarzycki P. K., Zarzycka M. B., Głód B., K., Oszacowanie ilości pasm możliwych do rozdzielenia na mikropłytkach TLC w procesie rozwijania jedno oraz dwu kierunkowego próbek wieloskładnikowych, Pomiary, Automatyka, Kontrola, 2009, 55 (4), 276-279.

Zarzycki P. K., Baran M. J., Harasimiuk F. B., Ślączka M. M., Spectrometric study of interaction between selected bile acids and cyclodextrins, Pomiary, Automatyka, Kontrola, 2010, 56 (4), 355-359.

Zhang S., Shao T., Sule Kaplan Bekaroglu S., Karanfil T., The impact of aggregation and Surface chemistry of carbon nanotubes on the adsorption of synthetic organic compounds, Environmental Science & Technology, 2009, 43, 5719-5725, doi:10.21/es900453e.

Zheng H., Zhang Q., Quan J., Zheng Q., Xi W., Determination of sugars, organic acids, aroma components and carotenoids in grapefruit pulps, Food Chemistry, 2016, 205, 112-121, doi:10.1016/j.foodchem.2016.03.007.

Zhong Y., Jin C., Gan J., Wang X., Shi Z., Xia X., Peng X., Apigenin attenuates patulin-induced apoptosis in HEK293 cells by modulating ROS-mediated mitochondrial dysfunction and caspase signal pathway, Toxicon, 2017, 137, 106-113, doi:10.1016/j.toxicon.2017.07.018.

Zhou Q., Ding Y., Xiao J., Simultaneous determination of cyanazine, chlorotoluron and chlorbenzuron in environmental water samples with SPE multiwalled carbon nanotubes and LC, Chromatographia, 2007, 65, 25- 30, doi:10.1365/s10337-006-0111-80009-5893/07/01.

Zhou J. & Wu P., Determination of patulin in apple juice and hawthorn products by gas chromatography-mass spectrometry, Chinese Journal of Healt Laboratory Technology, 2010-02.

Zhou Y., Kong W., Li Y., Logrieco A. F., Xu J., Yang M., A new solid-phase extraction and HPLC method for determination of patulin in apple products and hawthorn juice in China, Journal of Separation Science, 2012, 35, 641-649, doi:10.1002/jssc.201100919.

Zhu Y., Yu J., Brecht J. K., Jiang T., Zheng X., Pre-harvest application pf oxalic acid increases quality and resistance to Penicillium expansum in kiwifruit during postharvest storage, Food Chemistry, 2016, 190, 537-543, doi:10.1016/j.foodchem.2015.06.001.

Zorniak M. Szydlo B., Krzemiński T. F., Crataegus special extract WS®1442: up-to-date review of experimental and clinical experiences, Journal of physiology and pharmacology, 2017, 68 (4), 521-526.

Zouaoui N., Sbaii N., Bacha H., Abid-Essefi S., Occurence of patulin in various fruits juice marketed in Tunisia, Food Control, 2015, 51, 356-360, doi:10.1016/j.foodcont.2014.09.048.

100

X. Publikacje oryginalne autora rozprawy

X.1. Artykuły opublikowane

129

130

[P-1]

131

132

[P-2]

149

150

Formerly ANNALES UNIVERSITATIS MARIAE CURIE-SKLODOWSKA, SECTIO DDD, PHARMACIA on-line: www.umlub.pl/pharmacy

A comparison of the selectivity of nano-HPTLC systems used for determination of patulin in fruit juices from the internet stores and pharmacies

ANNA PRZYBYLSKA, GRZEGORZ BAZYLAK*

Department of Bromatology, Faculty of Pharmacy, Collegium Medicum, Nicolaus Copernicus University, Bydgoszcz, Poland

AB STRACT The new nano-HPTLC method was proposed for improved separation of patulin from the admixture of the three naturally occurring natural components of fruit juices, which in last years could be often obtained from the internet functional food stores and pharmacies. Separation of patulin (P) from quercetin (Q), ascorbic acid (A) and 5-hydroxymethylfurfural (H) was performed using three different ready-for-use plates NanoAdamant (NA), Nano-SIL-20 (NSIL) and Nano-Durasil-20 (ND) covered with the non-modified silica gel layer. After development on the 8.0 cm distance, the nano-HPTLC plates were sprayed with 0.5% aqueous solution of the 3- methyl-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate (MBTH). Most satisfactory separation of patulin from the each mentioned compounds was obtained using the Nano-SIL-20 plates and toluene-ethyl acetate-98% formic acid (25:20:5, v/v/v) as the mobile phase. In this best nano-HPLTC method the limit of detection of patulin was near 2.5 times lower (4 ng/spot) in comparison to other used here chromatographic systems. Thus, this optimized nano-HPTLC mode could be used for analysis of the solid-phase extracts of patulin from the fresh apples, clarified apple juices and other fruit products.

Keywords: HPTLC, normal-phase chromatography, patulin, apple juice

IN TRO DUC TION Most common problem during patulin analysis in apple Patulin, chemically named as (4-hydroxy-4 H-furo[3,2 juices is phenome non of its coex trac tion with quercetin -c]pyran-2(6H)-one), is a micotoxin biosythesized by (abbre vi ated as Q), ascorbic acid (A) and 5-hydroxy- certain genus of fungi classified to the Penicillium, methylfurfural (H) as the common natural compo nents of Aspergillus, Byssochlamys and Paecilomyces species (see these products. Table 1) which growing on a fruits as a brown rot [2]. Table 1. Occur rence of specific species of fungi produc ing Patulin was recognized as compound indicating a neuro-, patulin. immuno- and genotoxic action and probably can be car - No Genus Species Ref. P. expansum, P. carneum, P. clavigerum, cinogenic [11]. Patulin has been found in apples, apple P. concentricum, P. coprobium, P. dipodo- myicola, P. clandicola, P. roqueforti, juices and tinned apples, tomatoes, apricots, cherries, 1 Penicillium P. sclerotigenum, P. vulpinum, P. cyclopium, [2,11,14] P. chrysogenum, P. cyaneo-falvum, blackcurrants, quinces and blue cheeses [9,3]. P. brevicompactum, P. crustosum, In the EU coun tries the maxi mum ac cept able concen - P. olsonii, P. griseofulvum 2 Aspergillus A. clavatus, A. giganteus, A. terreus [2] tra tion of patu lin in ap ple prod ucts should not be greater 3 Byssochlamys B. fulva, B. nivea [2] than 50 μg/kg, but in apple products for young children – 4 Paecilomyces P. variotii [2] below 10 μg/kg [2]. Fruits with brown rot do not present direct danger to people because their eating is usually Patulin is still often determined by using the standard avoided. Un for tu nately, such dam aged fruits are used in thin-layer chromatography (TLC) method. Scott and some instances to produce juices and tinned fruits [9]. Kennedy [8] determined patulin, as metabolite of Penicillium expansum, in apples with TLC system using the wide pore Corresponding author and high particle size silica gel deposited (layer 0.25-0.30 * Department of Bromatology, Faculty of Pharmacy, Collegium Medicum, Nicolaus Copernicus University, 13 Jagiellońska, 85-067 Bydgoszcz, mm thick) on the glass plates [8]. Recently this method Poland has been modified by Elhariry et al. [2] by using the e-mail: [email protected] Whatman TLC aluminum-backed Kieselgel 60 plates and DOI: 10.12923/j.2084-980X/26.2/a.08 Anna Przybylska, Grzegorz Bazylak toluene-ethyl acetate-formic acid (25:20:5, v/v/v) as the rich and pre pared at a con cen tration of 0.5% by dis solv ing mobile phase. Martins et al. [6] determined traces of in the freshly deionized water. All these solu tions were patulin in seven varietes of apples with use of the silica gel stored in the temp. of 4°C. Deionized water (0.06 μS/cm) based SIL G-25 HR TLC plates from Macherey Nagel used for analy sis was ob tained from the HLP Smart 2000 [13]. The highest concentration of this mycotoxin (80.5 pu ri fi ca tion sys tem (Hy dro lab, Gdańsk, Po land). mg/kg) was identified with this approach in the Richared TLC analy sis. Nano-HPTLC were performed on the 10 variety of apples [2]. Welke et al. [14] used analogous × 10 cm sil ica gel 60 coated glass plates: 1) Nano Ada mant TLC method to isolate patulin produced by range of (NA) – cat. no. 821140, 2) Nano-SIL- 20 (NSIL) – cat. no. Penicillium expansum and Penicillium griseofulvum 811012 and 3) Nano- Durasil- 20 (ND) – cat. no. 812010 strains from apples during storage. The purpose of our (Macherey Nagel, Duren, Germany). These plates pos - study was to optimize separation conditions of listed sessed 0.2 mm ir regu lar, un modi fied, nano- silica gel above compounds with use of the nano-HPTLC method. layers of parti cles size 2-10 μm, mean pore size 60 C and The nano-HPTLC systems using identical polar-acidic spe cific pore vol ume 0.75 mL/g. Ac cord ing to the pro- mobile phase but the three various commercial stationary ducer data these types of the nano-HPTLC plates differed phases in form of glass plates covered with layers of the only by the type of polymeric mate rial which binding silica low particle size, irregular, unmodified, non-wettable gel layer with glass sup port plate [13]. Chro ma tograms silica gel as the stationary phase have been compared in were de veloped to the dis tance 8.0 cm in the hori zon tal this study. teflon-glass chambers DS-II (Chromdes, Lublin, Poland)

Table 2. Typi cal scans and pho tos of the nano- HPLTC plates with sepa ra tion ef fects of ascor bic acid (A), 5- hydroxymethylfurfural (H), patulin (P) and quercetin (Q). PI – photo after 30 min, PII – photo after 2 hours , PIII – photo after 10 months of stor age. nano-HPTLC system NanoAdamant Nano-SIL-20 Nano-Durasil-20

Scans

PII

PIII

MATERIALS AND METHODS in the tempera ture of 20°C with toluene-ethyl acetate- formic acid (25:20:5, v/v/v) as the mo bile phase. On the Chemi cals. Patu lin (≥ 98%), quercetin dihy drate (≥ 98%) sam ple ap pli ca tion po si tion (1.0 cm from the bot tom edge were pur chased from Sigma Ald rich (Poznań, Po land) of the HPTLC plate) they were put on 1.0 μL prepared and 5- hydroxymethylfurfural (≥ 98%), L(+)-ascorbic acid earlier standard solu tions (patulin – 50 ng/spot, quercetin, (extra pure) were obtained from POCh (Gliwice, Poland). 5-hydroxymethylfurfural and ascorbic acid – 300 ng/spot) Stan dard so lu tions of patu lin, quer cetin, 5- hydroxymethyl- with use of Ham il ton type 701 (Bon aduz, Swit zer land) furfural and ascorbic acid were prepared in the HPLC mi cro sy ringe. Af ter de vel op ment of chro ma tograms to grade metha nol (POCh) to ob tain a fi nal con centra tion of the distance of 8.0 cm, the HPLTC plates were sprayed μ μ 300 g/mL (patulin – 50 g/mL). The compo nents of mo- with freshly pre pared aque ous 0.5% so lu tion of MBTH. bile phase: toluene, ethyl acetate and formic acid (98%, After spraying, the HPTLC plates were dried in air by extra pure) were from POCh. The 3-methyl- benzothia- 5 min and next heated for 30 minutes at 100°C. Next, the zolinone hydrazone hy dro chlo ride hy drate (MBTH) used HPTLC plates were scanned with use of the HP LaserJet as visu al iz ing rea gents was pur chased from Sigma Ald - 3055 (Hewlett- Packard, Po land) 600 dpi flat bed scan ner

156 Current Issues in Pharmacy & Medical Sciences A comparison of the selectivity of nano-HPTLC systems used for determination of patulin in fruit juices from the internet stores and pharmacies in the visi ble light. The ob tained digi tal im ages of chro - and b is migra tion distance of the mobile phase front up to ma tograms were ana lyzed den sitomet ri cally with use of 8.0 cm from the sam ple ap pli ca tion po si tion. The ob - the ScionImage v. 4.0.2. for Windows software [12]. served Rf values of patulin were as follows: 0.500, 0.566 and 0.480 on the NA, NSIL and ND plates, re spec tively RESULTS AND DISCUSSION (see Table 4). In studied HPTLC systems the highly ion - ized ascor bic acid (A) was ad sorbed stronger (see Ta ble In Ta ble 2, the typi cal view of the ob tained chro ma - 3,4,5) fol lowed by 5- hydroxymethylfurfural (H), patu lin tograms and their scans in the each stud ied nano- HPTLC (P) and quercetin (Q). This fact was confirmed by the system has been shown. The time of chroma togram devel - high est R values for ascorbic acid, i.e. 1.28, 0.91, 1.28 on opment was the longest (37 min) on the Nano-SIL- 20 m the NA, NSIL and ND plates, re spec tively. The zones for (coded as NSIL) plates, but the little shorter (22 min) on the criti cal pair of ana lytes as patu lin (P) and quer cetin (Q) the Nano-Durasil- 20 (coded as ND) plates as compared to were overlapped (no separa tion) in case of the plates the NanoAda mant (coded as NA) plates where it was Δ equal to 25 min. The mean val ues of char acter is tic data Nano Ada mant (Rf Q-P = 0.51/0.50 and Rf P-Q = 0.01) and Δ (zone col our, di men sion and symme try Φ) for these chro- Nano- Durasil- 20 (Rf Q-P = 0.48/0.48 and Rf P-Q = 0.00). matograms (n = 3 each) have been summa rized in Table 3. This effects give a false positive results during qualita tive Densi tomet ric analysis of the HPTLC chroma tograms and quan ti ta tive de ter mi na tion of patu lin by cur rently ap- gives ob jec tive pos si bil ity to calcu late re tention pa rame - plied TLC or HPTLC methods [2,6,8,14] after its ters of each analyte with better preci sion [7]. For each pre limi nary iso la tion with use of the solid- phase ex trac - tion (SPE) step from the vari ous ap ple juice sam ples [11]. ana lyzed com pound, the high est zone symme try Φ was The re sults in Ta ble 5 showed that each of stud ied ob served on the Nano- SIL- 20 plates. Sin gle zones of nano-HPTLC system would be useful for good separa tion ascorbic acid (A) and 5-hydroxymethylfurfural (H) was of patulin (P) from 5-hydroxymethylfurfural (H) and sym met ri cal and oval (Φ = 1), but the spots of patulin and ascor bic acid (A). As in di cat ing the val ues of cal cu lated quer cetin were oval in hori zon tal di rec tion (Φ< 1) [4]. se lec tiv ity fac tor α (Ta ble 5) in case of the Nano- SIL- 20 Next, the set of pa rame ters char acter izing reten tion (re- plates a sharp separa tion of patulin (P) from quercetin (Q) ten tion fac tor R , re tar da tion fac tor R , ca pacity fac tor k’) f m (α = 1.13) and patulin (P) from 5-hydroxymethylfurfural and separa tion ef fi ciency (number of theo reti cal plates N, (H) (α = 1.17) have been observed. The desired separa tion height equiva lent of theo reti cal plate H , dif fer ence in re- a of patu lin (P) from quer cetin (Q) was only achieved on the ten tion fac tor ΔRf, reso lu tion Rs, se lec tiv ity fac tor α) were Nano- SIL- 20 plate where ΔRf P-Q pa rame ter was equal to cal cu lated for the each ana lyte in stud ied nano- HPTLC 0.07. Thus, using the Nano-SIL- 20 plates the most precise system [1,4,5,7] and summa rized in Table 4 and 5. The R f and ac cu rate sepa ra tion of patu lin (P) from quercetin (Q) val ues were cal cu lated us ing equation Rf = a/b, where a is could be obtained. On the Nano-SIL- 20 plates Rf value for migra tion distance of the center of analyte zone from the ascor bic acid (A) was the high est (0.11) as com pared to sam ple ap plica tion po si tion on the HPTLC plate (mm) other stud ied here HPTLC plates (0.05). In case of NA

Table 3. Char ac ter is tic data (n = 3) of ana lytes zones on each stud ied nano- HPTLC sys tem for ascor bic acid (A), 5- hydroxymethylfurfural (H), patulin (P) and quercetin (Q) Compound HPTLC Parameter AHPQ NA Color of the spot in NSIL orange green yellow yellow visible light ND NA dimension 2.0 × 2.0 4.0 × 4.0 4.0 × 2.0 3.0 × 1.0 NSIL [width × height] 3.0 × 3.0 5.0 × 5.0 4.0 × 3.0 4.0 × 2.0 ND (mm) 3.0 × 3.0 4.0 × 4.0 4.0 × 1.0 1.5 × 1.0 NA 1.00 1.00 0.50 0.33 NSIL Φ = d1 / d2 1.00 1.00 0.75 0.50 ND 1.00 1.00 0.25 0.67 d1 – height and d2 – width of each compound zone (mm) on the HPTLC plate

Table 4. Reten tion parame ters (n = 3) of ascorbic acid (A), 5-hydroxymethylfurfural (H), patulin (P) and quercetin (Q) on diff er ent HPTLC plates: Nano Ada mant (NA), Nano- SIL- 20 (NSIL) and Nano- Durasil- 20 (ND) Compound Compound HPTLC Parameter Parameter AHPQ AHPQ NA 0.05 0.43 0.50 0.51 1280 3120 3360 6116 NSIL Rf = a / b 0.11 0.48 0.56 0.63 N=[16 × l× z] / w2 1565 1997 3760 4160 ND 0.05 0.44 0.48 0.48 569 2880 3200 23324 NA 1.28 0.12 0.00 -0.02 0.06 0.03 0.02 0.01 2 NSIL Rm= logk’ 0.91 0.03 -0.10 -0.23 Ha=[(0,25 × w) ] / z 0.05 0.04 0.02 0.01 ND 1.28 0.10 0.03 0.03 0.10 0.03 0.02 0.003

Vol. 26, 2, 155–159 157 Anna Przybylska, Grzegorz Bazylak

and ND sys tems, the low Rf value was a con se quence of ter ac tions of the mo bile phase com po nents with ana lyzed the in creased ad sorp tion of ionized ascor bic acid on the here com pounds in the chro ma tographic sys tem could sam ple appli ca tion po si tion. As seen from Ta ble 5, the lead to the high est ob served de velop ment time and in - best se lec tiv ity of each pair of ana lyzed com pounds was creased Rf values (Table 4), as well as to increased observed on the Nano-SIL- 20 plate. Graphical rela tion di men sion of the each ana lyte spot in com pari son to the between changes in the calcu lated Rf values of studied other stud ied here nano- HPTLC plates (see Ta ble 3 and ana lytes and type of ap plied here nano- HPTLC sys tem in 4). All of the parame ters of the silica gel layers in applied the same mobile phase were shown in Figure 1. here three HPTLC sys tems and the com po si tion of mo bile

Figure 1. Changes in Rf values of studied compounds in three studied nano-HPTLC systems

As is seen in Ta ble 5, for the most pairs of stud ied com- phase, were iden ti cal. Thus, our re sults clearly in di cate pounds the reso lu tion Rs values were higher then 1.5 which that the special binder(s) system used in the each of stud- means that com plete sepa ra tions were ob tained [7]. Ex - ied here nano-HPTLC plates to connect the support ing ception to this rule were noted the two critical pairs of glass plate sur face with the sil ica gel layer strongly in flu- com pounds: 1) patu lin (P)/quercetin (Q): Rs P-Q = 0.80 (in enced the observed separa tion of patulin from the other the NA sys tem), Rs P-Q = 1.43 (in the NSIL system) and Rs ana lyzed com pounds. Un for tu nately, the ex act chemi cal P-Q = 0.50 (in the ND sys tem) and 2) 5- hydroxymethyl- name, struc ture and prop er ties of these bind ers was not furfural (H)/quercetin (Q): Rs H-P = 0.88 in the ND system. enabled by the producer to the public [13]. For the Nano- Values of Rs show that in the case of criti cal pair of com - SIL- 20 plates the producer used “the highly polymeric pounds patulin (P)/quercetin (Q) the change of applied prod uct” [13] as a binder, which is re sis tant to ag gres sive nano- HPTLC plate en abled the highly im proved sepa ra - reagents, but in case of the Nano-Durasil- 20 plates manu- tion of those com pounds. Se lectiv ity fac tor α was the facturer used a “special binder system” [13] which gives high est for the pair of quer cetin (Q) and asor bic acid (A): the “water-resistant and wetta ble silica gel layers” [13]. α = 10.00 (NA sys tem); α = 5.09 (NSIL system) and α = Due to modifi ca tion of this binder system, the separa tion 9.60 (ND sys tem) be cause, in given polar- acidic mo bile of analyzed here compounds varied signifi cantly. In the phase, the specific adsorp tion of the mostly ionized ascor- NSIL system the Rf value for ascor bic acid was the high est bic acid molecules on the surface hydroxyl groups present (0.11) and for the other plates Rf value for this com pound in the surface layer of applied here silica gel type HPTLC did not ex ceed 0.05. In case of the NSIL sys tem we ob - plates, was the highest as compared to quercetin. served a clear separa tion (α = 1.13) of patulin (P) from The results of our study suggest that in case of the quercetin (Q) and patulin (P) from 5-hydroxymethyl- Nano- SIL- 20 plate de creased mo bil ity and en hanced in - furfural (H) (α = 1.17). Conse quently, in this best nano-

Table 5. Separa tion parame ters (n = 3) obtained for ascorbic acid (A), 5-hydroxymethylfurfural (H), patulin (P) and quercetin (Q) in stud ied nano- HPTLC sys tems NA, NSIL and ND Pair of compounds HPTLC Parameter H - A H - P P - Q Q - H Q - A P - A NA 0.38 0.07 0.01 0.08 0.46 0.45 NSIL ΔR = Rf1 - Rf2 0.37 0.08 0.07 0.15 0.52 0.45 ND 0.39 0.04 0.00 0.04 0.43 0.43 NA 5.11 1.67 0.80 5.33 12.33 7.78 NSIL Rs(b)=(2× d) / (wb1+ wb2 ) 4.83 1.60 1.43 2.67 9.11 6.20 ND 5.33 0.88 0.50 1.67 9.00 7.00 NA 8.60 1.16 1.02 1.19 10.20 10.00 NSIL α = Rf2 / Rf1 4.36 1.17 1.13 1.31 5.73 5.09 ND 8.80 1.09 1.00 1.09 9.60 9.60 d – distance and wb1,2 – width of two neigh bour ing peaks on the scan of ob tained HPTLC chro ma togram.

158 Current Issues in Pharmacy & Medical Sciences A comparison of the selectivity of nano-HPTLC systems used for determination of patulin in fruit juices from the internet stores and pharmacies

HPLTC sys tem NSIL, the minimal de tectable amount of 3. Er dogan A., Gurses M, Sert S.: Iso la tion of moulds ca pa ble of patulin as 4.0 ± 1.0 ng/spot after its deposi tion from the di - pro duc ing my co tox ins from blue mouldy Tu lum cheeses produced in Turkey. Int. J. Food Mi cro biol., 85(1), 83, 2003. luted stan dard metha nolic so lu tion have been observed 4. Halk ina T., Sherma J.: Com para tive evalua tion of the per- (data not shown). This amount was near 2.5 times lower in formance of silica gel TLC plates and irregu lar and com pari son to re ported ear lier TLC modes [2,6,8,14] and spherical- particle HPTLC plates. Acta Chro ma tographica, described here two other nano-HPTLC systems. Thus, the 17(3), 261, 2006. 5. Kas perek R., Czar necki W., Januszek M.: Sepa ra tion of hy- use of Nano- SIL- 20 plates should be as sumed as rec om - dro cor ti sone ace tate and phenyl sali cy late from the phar ma- mend able for de ter mi na tion of trace amounts of patulin ceuti cal solid dosage forms by the thin-layer (e.g. 50 μg/kg) in real samples of apple juices, follow ing chroma tog ra phy. Ann. UMCS Sect. DDD, 20(1), 1, 2007. its se lec tive SPE iso la tion and precon cen tra tion steps, in 6. Martins M.L., Gimeno A., Martins H.M. et al.: Co- view of in creased se lec tiv ity, sen si tiv ity, pre ci sion and re - occurance of patulin and citrinin in Portu guese apples with rot ten spots. Food Addit..Con tam ., 19(6), 568, 2002. pro duci bil ity of chro ma tographic process offered by this 7. Naga raju P.M., San ganal math P.U., Kem paraju K., et al.: Nano- SIL- 20 plates. Evaluation of separa tion parame ters for selected organo - phospho rus fungi cides of foren sic impor tance by RP-HPTLC. Acta Chro ma tographica, 24(2), 253, 2012. CONCLUSIONS 8. Scott P.M., Ken nedy B.P.C.: Im proved method for the Thin The best selec tiv ity of patulin separa tion from the three Layer Chro ma tographic de ter mi na tion of patu lin in ap ple com monly ac com pa ny ing compounds was obtained using juice. J. AOAC., 56(4), 813, 1973. 9. Stępień M., Sokół-Leszczyńska B., Łuczak M.: Myko- the Nano-SIL- 20 type plates. Results of our study suggest toksyny, pro dukty spożywcze a zdrowie człow ieka. Post. that the choice of this nano- HPTLC plate could lead to Mik ro biol., 46(2), 167, 2007. achieve a more re pro duci ble, ac curate and re liable de ter - 10. Sul li van C., Sherma J.: Com para tive evalua tion of TLC and mina tion of trace amounts of patulin in apple juices. HPTLC plates con tain ing stan dard and enchanced UV in di- cators for effi ciency, resolu tion, detec tion and densi tomet - ACKNOW LEDGE MENT ric quanti fi ca tion using fluores cence quenching. J. Liq. Chroma togr. Rel. Technol ., 27(13), 1993, 2004. This study was fi nanced by Col le gium Me di cum Ni co- 11. Śliwi ńska A., Przybyl ska A., Bazy lak G. In: Chro ma tografia laus Co per ni cus Uni ver sity, project DS-UPB-407/2013. w praktyce . A. Voelkel, W. Wasiak (Red.), Wyd. Polit. Poznańskiej, Poznań 2001, Ch. 1.5, p. 53-64. REFERENCES 12. Tolivia J., Navarro A., del Valle E., et al.: Appli ca tion of Pho- toshop and ScionImage analy sis to quan ti fi ca tion of sig nals 1. Ba zy lak G., Brózik H., Sa banty W.: Com bined SPE and i n h i s t o c h e m i s t r y , i m m u n o c y t o c h e m i s t r y a n d h y b r i d o c y t o- HPTLC as a screening assay of urinary cotinine from male chem is try. Anal. Quant. Cy tol. His tol., 28(1), 43, 2006. adoles cents exposed to envi ron mental tabacco smoke. Pol. J. 13. Web homepage of the Macherey Nagel GmbH (Duren, Ger- En vi ron. Stud ies, 9(2), 113, 2000. many): http://www.mn-net.com/ta bid/5569/de fault.aspx, 2. El hariry H., Ba ho bial A.A., Gher bawy Y.: Geno typic iden ti- Ac cessed: 15 Feb. 2013. fica tion of Penicil lium expan sum and the role of process ing 14. Welke J.E., Hoeltz M., Dot to rii H.A., et al.: Patu lin ac cu mu- on patulin presence in juice. Food Chem. Toxicol. , 49(4), 941, lation in apple during storage by Penicil lium expan sum and 2011. Penicil lium griseoful vum strains. Braz. J. Micro biol ., 42(1), 172, 2011.

Vol. 26, 2, 155–159 159

[P-3]

157

158

ZESZYTY NAUKOWE UNIWERSYTETU PRZYRODNICZEGO WE WROCŁAWIU 2017 ROLNICTWO CXXIII NR 626

1 Anna Przybylska, Grzegorz Bazylak

OCENA JAKOŚCI MIKROBIOLOGICZNEJ SUSZONYCH OWOCÓW I KWIATOSTANU GŁOGU (CRATAEGUS SPP.) STOSOWANYCH JAKO SUPLEMENTY DIETY ASSESSMENT OF MICROBIOLOGICAL QUALITY OF HAW- THORN (CRATAEGUS SPP.) DRIED FRUITS AND INFLORE- SCENCES USED AS DIETARY SUPPLEMENTS

Katedra i Zakład Bromatologii, Wydział Farmaceutyczny, Collegium Medicum, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Department of Bromatology, Faculty of Pharmacy, Collegium Medicum, Nicolaus Copernicus University in Toruń

Celem pracy była ocena stanu mikrobiologicznego oferowanych w aptekach, sklepach zielarskich i supermarketach suplementów diety zawierających w swoim składzie suszone przez producenta owoce i kwiatostan głogu (Crataegus spp.) W szczególności sprawdzono, czy badany surowiec farmakognostyczny spełniał wymogi X Farmakopei Polskiej (2014). Badania obejmowały 10 produktów zawierających suszone owoce głogu oraz 5 produktów z suszonym kwiatostanem głogu. Próbki użyte w badaniach pochodziły z czterech regionów Polski: zachodnio-południowe- go WER (47% wszystkich próbek), centralnego CER (27%), północno-wschodniego NER (13%) oraz wschodnio-południowego EER (13%). W każdym produkcie oznaczono ogólną liczbę droż- dży i pleśni (TYMC), ogólną liczbę drobnoustrojów tlenowych (TAMC), bakterie z grupy coli, Escherichia coli, Bacillus cereus oraz Salmonella. Oznaczenia wykonywano zgodnie z obowią- zującą normą PN-ISO 21527-2:2009, PN-ISO 4833:2004+Ap1:2005 oraz przy użyciu szybkich testów płytkowych CompactDry. Stwierdzono, że najwyższa ogólna liczba drożdży i pleśni TYMC w badanych próbkach wynosiła 2,2×104 jtk·g-1. W przypadku 67% zbadanych próbek odnotowano wysoką ogólną liczbę drobnoustrojów tlenowych TAMC (od 1,0×105 jtk·g-1 do 1,0×106 jtk·g-1). Wszystkie badane próbki suszonych owoców i kwiatostanu głogu spełniały wymagania farmakopealne dotyczące maksymalnej dopuszczalnej liczby drożdży i pleśni TYMC (<5,0×105 jtk·g-1) oraz ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych TAMC (<5,0×107 jtk·g-1). W żadnej z badanych próbek nie stwierdzono obecności bakterii E. coli i Salmonella powyżej granicy wykrywalności

Praca wykonana w ramach projektu badań statutowych CM UMK UPB-407/2013-17.

Do cytowania – For citation: Przybylska A., Bazylak G., 2017. Ocena jakości mikrobiologicznej suszonych owoców i kwiatostanu głogu (Crataegus spp.) stosowanych jako suplementy diety. Zesz. Nauk. UP Wroc., Rol. CXXIII, 626: 101–114. 102 Anna Przybylska i Grzegorz Bazylak metody, czyli 10 jtk·g-1. Jakość mikrobiologiczna badanych produktów była bardzo zróżnicowana i zależna od miejsca pochodzenia z rejonu Polski. Obecność przetrwalnikujących bakterii B. cereus w analizowanych próbkach może wskazywać na wpływ czynników środowiskowych, gdyż pozytywne próbki pochodziły tylko z regionu WER, CER i EER. Laseczki B. cereus stwierdzono w 80% badanych próbek kwiatostanów głogu. Natomiast 93% badanych próbek owoców głogu nie wykazywało obecności bakterii B. cereus, co może mieć związek z naturalnie wysoką zawartością w tych owocach związków polifenolowych, które powodują hamowanie rozwoju mikroﬂory. Wy- niki te wskazują, że w celu zwiększenia bezpieczeństwa mikrobiologicznego podczas stosowania surowców roślinnych istnieje potrzeba podjęcia szczegółowych badań metagenomicznych endoﬁ- tycznych prokariontów, które zasiedlają drzewostany głogu w różnych rejonach Polski. SŁOWA KLUCZOWE: suplementy diety, głóg, Crataegus monogyna Jacq., Crataegus leavigata (Poiret.), bakterie tlenowe, czystość mikrobiologiczna, Escherichia coli, Bacillus cereus, Salmonella

WSTĘP

Polska jest od wielu lat na czołowym miejscu w rankingu krajów, które produkują surowce zielarskie. Rocznie w naszym kraju przetwarza się 15–20 tys. ton surowców zielarskich i roślin leczniczych, a na całym świecie ok. 100 tys. ton (Janda-Ulfig i Ulfig, 2008). Przewiduje się, że w najbliższych latach zmiany w skali produkcji leków roślin- nych będą miały największy wpływ na rozwój polskiego zielarstwa (Olewnicki i wsp. 2015). Do celów leczniczych wykorzystuje się ok. 20 tys. gatunków roślin. Jedną z nich jest głóg, który zalicza się do najstarszych roślin leczniczych stosowanych w etnomedy- cynie ludowej (Łuczaj i Szymański 2007, Neves i wsp. 2009) i współczesnej fitoterapii z użyciem standaryzowanych wyciągów (Koch i Malek 2011). Surowce farmakogno- styczne pochodzące z głogu (suszony kwiatostan, owoce, liście) wykorzystywane są do otrzymywania wielu bezpiecznych i skutecznych leków przydatnych w profilaktyce i terapii chorób układu krążenia (Nowak 2009). Ze względu na swój skład fitochemiczny preparaty i środki lecznicze uzyskiwane z głogu wykazują właściwości przede wszystkim kardioprotekcyjne, przecimiażdzycowe, przeciwdrobnoustrojowe, ale również immuno- modelujące oraz przeciwutleniające. Prozdrowotne własności owoców głogu wynikają m.in. z występowania związków polifenolowych takich jak monomery flawan-3-oli, (-)-epikatechina i (+)-katechina, kwas chlorogenowy czy kwas prokatechowy, których średnia zawartość w suchej masie owoców Crataegus pinnatifida z terenu prowicji He- bei w Chinach wynosiła, odpowiednio, 1,78; 0,64 i 0,032 mg kg-1 (Zhang i wsp. 2001). W świeżych owocach głogu jednoszyjkowego (Crataegus monogyna Jacq.) zebranych w północnej Francji zawartość (-)-epikatechiny wynosiła średnio 1,36 g·kg-1 s.m., podczas gdy w owocach suszonych wynosiła tylko 0,32 g·kg-1 s.m. (Froehlicher i wsp. 2009). Te same świeże owoce głogu zawierały 0,138 g·kg-1 s.m. kwasu chlorogenowego, ale po wysuszeniu ich ilość zmniejszała się prawie pięciokrotnie (Froehlicher i wsp. 2009). Bardzo cenne są również zawarte w owocach głogu znaczne ilości pochodnych apigeniny (witeksyna), flawon-3,4-dioli (leukocyjanidyna) oraz pochodnych kempferolu (Kul- czyński i Gramza-Michałowska 2016, Yang i Liu 2012). Udowodniono, że podawanie ekstraktów z owoców lub kwiatostanu głogu pacjentom przyczynia się do zmniejszenia w surowicy krwi poziomu cholesterolu całkowitego, lipidów frakcji o niskiej gęstości LDL oraz ma wpływ na zwiększenie stężenia cholesterolu związanego z frakcją lipidów o wysokiej gęstości HDL (Kulczyński i Gramza-Michałowska 2016). Ocena jakości mikrobiologicznej suszonych owoców... 103

Farmakopea Polska X (2014) dopuszcza wykorzystywanie w Polsce w celach leczniczych suszonych kwiatostanów i owoców głogu jednoszyjkowego (Crataegus monogyna Jacq.), dwuszyjkowego (C. leavigata (Poiret)) oraz ich krzyżówki. Z najnowszych badań wynika, że w Polsce występuje sześć rodzimych odmian głogu, w tym trzy pochodzenia mieszańcowego: C. monogyna Jacq., C. laevigata (Poiret) DC., C. rhipidophylla Gand., Crataegus × macrocarpa Hegetschw., Crataegus × media Bechst. oraz C. pedicellata Sarg. (Sołtys-Lelek 2008, 2012, Sołtys-Lelek i Gruszka 2016). Najliczniej w Polsce wy- stępuje głóg jednoszyjkowy (C. monogyna) oraz głóg dwuszyjkowy (C. laevigata). Głóg jednoszyjkowy występuje powszechnie na terenie całego kraju, natomiast obecność gło- gu dwuszyjkowego jest największa w paśmie północno-zachodnim, aż do południowych krańców kraju. Na wschodnich terenach Polski głóg dwuszyjkowy występuje rzadko (Za- jąc i Zając 2001). W ostatnich latach zwiększa się liczba prac ukazujących problem występowania za- nieczyszczeń mikrobiologicznych w produktach zielarskich używanych w lecznictwie i produkcji suplementów diety. Czystość mikrobiologiczna produktu zielarskiego lub ro- ślinnego jest uzależniona od wielu czynników. Głównym źródłem zanieczyszczeń roślin jest zróżnicowana mikroflora gleb (Przetaczek-Rożnowska i Kuźniak 2016). W glebie żyje wiele bakterii Gram-dodatnich, tj. przetrwalnikujące bakterie Bacillus cereus, czy chorobotwórcze bakterie Gram-ujemne, tj. Escherichia. Dane literaturowe potwierdzają występowanie w surowcach roślinnych chorobotwórczych bakterii z rodzaju Salmonella. Obecność bakterii Salmonella w końcowym produkcie jest spowodowana działalnością człowieka poprzez krzyżowe zanieczyszczenie ziół, ponieważ nie występuje ona naturalnie w materiale roślinnym (Przetaczek-Rożnowska i Kuźniak 2016). Od momentu zbioru cały proces technologiczny i charakter obróbki surowca roślinnego ma istotne znaczenie w przypadku jakości końcowego produktu. Bardzo istotne są warunki same- go zbioru (temperatura, ilość opadów, strefa klimatyczna, jakość gleby). W Polsce dużą część roślin zielarskich, w tym głogu, pozyskuje się ze stanu naturalnego. Jest to naj- prostszy sposób zbierania surowców na potrzeby przemysłu zielarskiego. Dotyczy to jednak roślin, które występują w środowisku naturalnym w znacznej ilości. Rozporządzenie Ministra Ochrony Środowiska, Zasobów Naturalnych i Leśnictwa z dnia 28 grudnia 1998 r. (Dz.U. 1999 Nr 6, poz. 42) reguluje dokładne zasady prowadzenia zbiorów płodu runa leśnego. Zbieracze zobowiązani są do zbierania owoców ręcznie. Używanie narzędzi niszczących lub uszkadzających rośliny jest karalne. Rozporządzenie to ma na celu ochronę równowagi fitocenotycznej użytkowanego terenu. Drugim ważnym warunkiem jest staranność i wysoka selektywność zbiorów. Każde najdrobniejsze uszkodzenie części rośliny podczas zbioru może być miejscem zainfekowania produktu przez drobnoustroje. Wybór procesu suszenia materiału roślinnego ma znaczenie w przypadku obecności mikroorganizmów takich jak grzyby pleśniowe. Enzymy (lipazy, proteazy czy amylazy), które są produkowane przez grzyby występujące w suszach roślinnych, powodują roz- kładanie związków organicznych zawartych w materiale roślinnym odpowiadających za właściwości lecznicze rośliny (Janda i Ulfig 2005). Najbardziej popularną metodą jest suszenie konwekcyjne, które jednak powoduje utratę wielu składników odżywczych i bioaktywnych fitozwiązków z suszonego materiału. Z tego powodu Jałoszyński i wsp. (2011) zaproponowali metodę obniżonego ciśnienia z nagrzewaniem mikrofalowym w celu suszenia owoców głogu. 104 Anna Przybylska i Grzegorz Bazylak

Tabela 1 Table 1 Wymagania FP X dotyczące zanieczyszczeń mikrobiologicznych w produktach roślinnych poddawanych działaniu wrzącej wody Requirements of FP X concerning microbiological contamination of herbal medicinal products intended for the preparation of infusions and decoctions using boiling water

Ogólna liczba Ogólna liczba drob- drożdży i pleśni noustrojów tlenowych Escherichia (TYMC) (TAMC) Salmonella Wymagania coli (jtk·g-1) (jtk·g-1) (jtk·g-1) Requirements (jtk·g-1) Total yeasts and Total aerobic microbial (CFU·g-1) (CFU g-1) molds count count (CFU·g-1) (CFU·g-1) Maksymalna dopusz- Niedopusz- czalna liczba 500 000 50 000 000 czalne Maximum acceptable Not accepted Nieobecne count Absence Kryterium akceptacji 105 107 103 Acceptance criterion

Ze względu na bezpieczeństwo pacjentów Farmakopea Polska X (2014) określa maksymalne kryteria akceptacji w przypadku mikroﬂory występującej w produktach roślin- nych przeznaczonych do przygotowania naparów i odwarów z użyciem wrzącej wody (tab. 1). Celem pracy była ocena stanu mikrobiologicznego suplementów diety zawierają- cych w swoim składzie suszone owoce i kwiatostan głogu (Crataegus spp.) oferowanych w aptekach, sklepach zielarskich i supermarketach oraz sprawdzenie, czy wykorzystany do ich produkcji suszony surowiec farmakognostyczny spełniał wymogi X Farmakopei Polskiej (2014).

MATERIAŁ I METODY

Materiał badawczy stanowiło 15 suplementów diety, które zawierały w swoim składzie wysuszone owoce głogu (67% ogółu próbek) lub wysuszone kwiatostany głogu (33% próbek) oraz różniły się stopniem rozdrobnienia. Produkty te zostały zakupione w 2013 i 2014 r. w aptekach, supermarketach i sklepach zielarskich na terenie Bydgoszczy. Wszystkie produkty pochodziły od krajowych producentów specjalizujących się od wielu lat w produkcji mieszanek ziołowych oferowanych jako suplementy diety. Ozna- czenia mikrobiologiczne wykonywano natychmiast po zakupie i przed upływem terminu ważności podanego przez producenta. Zakupione produkty przechowywano w oryginalnych opakowaniach, w temp. pokojowej, w suchym pomieszczeniu i bez dostępu światła. Nie dokonywano żadnych dodatkowych operacji suszenia badanych produktów. Do oznaczeń użyto 3 próbki materiału roślinnego (o masie 1,0 g) losowo pobrane z ory- ginalnego opakowania każdego suplementu diety w saszetkach lub tzw. opakowania lu- zem. Następnie obliczono średnią z tych trzech oznaczeń dla każdego badanego produktu (tab. 4 i 5). W przeciwieństwie do pozostałych suplementy diety o symbolach G7 i G13 były to wieloskładnikowe mieszanki ziołowe, które zawierały, odpowiednio, 40 i 51% suszonych owoców głogu. Pełen wykaz materiału użytego w badaniach przedstawia ta- Ocena jakości mikrobiologicznej suszonych owoców... 105 bela 2. Produkty użyte w badaniach pochodziły z czterech regionów Polski: zachodnio- -południowego WER (G1, G2, G3, G13, G14, G9, G12), centralnego CER (G4, G5, G7, G8), północno-wschodniego NER (G6, G15) oraz wschodnio-południowego EER (G10, G11). Najliczniejszą grupę stanowiły produkty z rejonu WER. Ocenie poddano poziom zanieczyszczeń mikrobiologicznych w badanych suplementach diety uwarunkowany lo- kalizacją produkcji surowców farmakognostycznych zebranych z krzewów głogu.

Tabela 2 Table 2 Charakterystyka materiału użytego do badań Characteristic of materials used in analysis

Gęstość Data Symbol Stopień Rejon Polski nasypowa ważności Województwo produktu rozdrobnienia Region of Bulk Expira- Province Symbol Degree of frag- Poland density tion of product mentation (g cm-3) date Wielkopolskie częściowy G1 – owoc – fruit 0,41 01-2014 Wielkopolska partly fragmented Wielkopolskie b. duży G2 – owoc – fruit 0,56 09-2013 Wielkopolska fine grounded Wielkopolskie b. duży G3 – owoc – fruit 0,48 11-2013 WER Wielkopolska fine grounded zachodnio- Lubuskie b. duży -południowy G13 – owoc – fruit 0,46 11-2014 Lubuskie fine grounded south-we- Dolnośląskie całe owoce stern G14 – owoc – fruit 0,22 12-2014 Lower Silesia whole fruit Wielkopolskie G9 – kwiat – częściowy 0,22 11-2013 Wielkopolska inflores partly fragmented Wielkopolskie G12 – kwiat – częściowy 0,16 11-2013 Wielkopolska inflores partly fragmented Łódzkie częściowy G4 – owoc – fruit 0,38 12-2013 Łódzkie partly fragmented Łódzkie częściowy G5 – owoc – fruit 0,38 10-2013 CER Łódzkie partly fragmented centralny Łódzkie b. duży central G7 – owoc – fruit 0,51 12-2014 Łódzkie fine grounded Łódzkie G8 – kwiat – częściowy 0,19 10-2013 Łódzkie inflores partly fragmented Podlaskie słaby G6 – owoc – fruit 0,37 01-2014 NER Podlasie little fragmented północno- Warmińsko-ma- -wschodni całe owoce zurskie G15 – owoc – fruit 0,29 10-2014 north-eastern whole fruit Warmia-Masuria Lubelskie G10 – kwiat – b. duży EER 0,23 08-2013 wschodnio- Lubelskie inflores fine grounded -południowy Lubelskie G11 – kwiat – b. duży 0,28 11-2013 south-eastern Lubelskie inflores fine grounded

106 Anna Przybylska i Grzegorz Bazylak

Jakość mikrobiologiczną suszonych owoców i kwiatostanów głogu w badanych suplementach diety oceniono na podstawie: 1) ogólnej liczby drożdży i pleśni (TYMC), 2) ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych (TAMC), 3) obecności bakterii Escherichia coli, 4) bakterii z grupy coli, 5) bakterii Salmonelli oraz 6) bakterii Bacillus cereus (tabela 4 i 5). W celu oznaczenia TYMC wg normy PN-ISO 21527-2:2009 metodą płytkową (posiew powierzchniowy) zastosowano pożywkę agarową z dichloranem i 18% dodatkiem glicerolu (DG18). Płytki poddano inkubacji przez 5 dni w temperaturze 25°C. Limit detekcji wynosił 10 jtk·g-1 produktu. W celu oznaczenia TAMC według normy PN-ISO 4833:2004+Ap1:2005 metodą płytkową (posiew wgłębny) jako pożywkę zastosowano agar standardowy (ang. plate mount agar). Płytki poddano inkubacji przez 3 dni w temperaturze 30°C. Limit detekcji wynosił 10 jtk·g-1 produktu.

Tabela 3 Table 3 Parametry oznaczeń bakterii Escherichia Coli, Bacillus cereus oraz Salmonelli przy użyciu testów CompactDry (t – czas, T – temperatura) Bacterial parameters Escherichia Coli, Bacillus cereus and Salmonella with use of CompactDry tests (t – time, T – temperature).

Zabarwienie wyhodowanych Nazwa testu Bakteria t T kolonii po inkubacji Test name Bacteria (h) (°C) Color of the cultivated colony niebieskie Escherichia coli blue CompactDry EC 36–38 Bakterie z grupy Coli niebieskie i czerwone Total coli form group blue and red 20–24 czarno-zielone CompactDry SL Salmonella 41–43 black-green zielono-niebieskie CompactDry XBC Bacillus cereus 33–37 green-blue

Do ilościowego oznaczenia bakterii E. coli i z grupy coli, Salmonelli oraz Bacillus cereus użyto kompaktowych, komercyjnych testów Compact Dry (HyServe, Niemcy). Limity detekcji metod oznaczania ilości bakterii Escherichia coli, Salmonelli oraz Ba- cillus cereus wynosiły 10 jtk·g-1. Wszystkie oznaczenia wykonywano zgodnie z instruk- cją producenta. Parametry oznaczeń zestawiono w tabeli 3. Gęstość nasypową badanych produktów wyznaczono metodą wagowo-objętościową (Frączek i wsp. 2003, Ogrodow- ska i wsp. 2011). Analizę statystyczną wykonano za pomocą programu Statistica ver. 13 (StatSoft, Kraków).

WYNIKI I DYSKUSJA

Otrzymane wyniki oceny stanu mikrobiologicznego badanych suplementów diety przedstawione są w tabelach 4 i 5. Należy zaznaczyć, że brak jest doniesień literaturowych dotyczących analizy stopnia zanieczyszczeń mikrobiologicznych w suplementach diety zawierających owoce i/lub kwiatostany głogu. Zakres ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych TAMC w badanym materiale wynosił od 2,1×103 jtk·g-1 (region NER) do Ocena jakości mikrobiologicznej suszonych owoców... 107

3,6×106 jtk·g-1 (region WER). Podobny zakres liczby mezofilnych bakterii tlenowych obserwowały Markowska i Libudzisz (2003) – od 2×107 jtk·g-1 w przypadku ziela szanty do 2,3×103 jtk·g-1 dla ziela rzepiku. Średnia liczba drożdży TYMC w badanych produktach z owocami głogu wynosiła 1,9×103 jtk·g-1, a w przypadku kwiatostanu głogu 1,8×102 jtk·g-1. Wartości średniej liczby pleśni dla owoców i kwiatostanu były istotnie wyższe od liczby drożdży i wynosiły odpowiednio 0,4×104 jtk·g-1 oraz 0,3×103 jtk·g-1. Najwyższą liczbę drożdży i pleśni TYMC oznaczono w próbce G3 (2,2×104 jtk·g-1). Janda i Ulfig (2005) oznaczyli najwyższą całkowitą liczbę grzybów w suszu liści mięty pieprzowej na poziomie 7,8×106 jtk·g-1 (Janda i Ulfig, 2005). Steinka i wsp. (2011) uzyskali niższe wyniki TYMC w badanych herbatach, uwzględniając ich stopień rozdrobnienia. Najwyższy poziom grzybów TYMC odnotowano w przypadku herbat liściastych na poziomie 0,6×105 jtk·g-1 (Steinka i wsp. 2011). Należy stwierdzić, że wszystkie badane próbki suplementów diety z owocami lub kwiatostanem głogu spełniały wymagania farmakopealne dotyczące maksymalnej dopuszczalnej liczby drożdży i pleśni TYMC (<5×105 jtk·g-1) oraz ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych TAMC (<5×107 jtk·g-1). Ponadto w badanych próbkach nie stwierdzono obecności bakterii Escherichia coli oraz Salmonella. Markowska i Libudzisz (2003) w swojej pracy również nie stwierdziły obecności bakterii Salmonelli w siedemnastu surowcach zielarskich (rzepik, kozieradka, bobrek, dziurawiec, lukrecja, szałwia, serdecznik, rumianek, rzewień, kruszyna, mięta, lubczyk, kozłek, prawoślaz, krwawnik, szanta i melisa). Natomiast bakterie Escherichia coli zostały oznaczone przez Markowską i Libudzisz (2003) w liściach mięty oraz szał- wii, które pochodziły z terenu województwa mazowieckiego. Wynik negatywny w przypadku bakterii Salmonelli w badanych suplementach diety z owocami lub kwiatostanem głogu może świadczyć o zachowaniu wymagań dotyczących wysokiego stopnia higieny podczas procesu produkcji wyrobów zielarskich. Wielu autorów w swoich badaniach podkreśla silne właściwości antybakteryjne, jak również przeciwutleniające suplementów diety pochodzenia roślinnego (Silici i wsp. 2010, Salmanian i wsp. 2014). Na przykład obecność kwasu chlorogenowego, galusowego oraz kawowego w owocach głogu przyczynia się znacząco do hamowania wzrostu bakterii. Inne wyniki badań wskazują, że ekstrakty roślinne wykazują przede wszystkim zwiększoną zdolność hamowania wzrostu bakterii Gram-dodatnich w porównaniu z bakteriami Gram-ujemnymi (Salmanian i wsp. 2014). Kostic i wsp. (2012) sugerują, że ak- tywność antybakteryjna flawonoidów przeciwko bakteriom Gram-dodatnim (np. Bacillus cereus) jest spowodowana głównie przez związki, które zawierają grupy hydroksylowe w pierścieniu B, ale najbardziej aktywne są 3’,4’-trihydroksyflawonoidy. Przeciwko bakteriom Gram-ujemnym (np. E. coli) aktywne są tylko związki flawonoidowe zawierające grupy hydroksylowe w pozycji C-5 oraz C-7. Aktywność antybakteryjna naparów i ekstraktów C. oxyacantha przeciwko bakteriom Gram-ujemnym (E. coli) jest wysoka dzięki obecności takich flawonoidów jak pochodne apigeniny (witeksyna) oraz luteoliny (saponaryna) (Kostic i wsp. 2012). Jednak stęże- nie związków polifenolowych w surowcach ziołowych i roślinnych jest zależne od wielu czynników agrotechnicznych. Bahorun i wsp. (2003) uważają, że całkowite stężenie związków flawonoidowych w owocach głogu jest początkowo niskie i zwiększa się wraz z czasem uprawy lub hodowli, osiągając najwyższe stężenie między 25. a 35. dniem hodowli kalusowej (Bahorun i wsp. 2003). Peschel i wsp. (2008) ocenili, że ogólna za- wartość związków flawonoidowych w liściach, owocach i kwiatostanie głogu różni się 108 Anna Przybylska i Grzegorz Bazylak w zależności od miesiąca ich zbioru, jak również od stopnia nasłonecznienia drzewa. W przypadku liści głogu zerwanych od południowej strony drzewa zawartość flawono- idów w lipcu okazała się najwyższa, a podczas zbioru w sierpniu stężenie flawonoidów było najwyższe w owocach zerwanych z drzew głogu od strony południowej (Peschel i wsp. 2008).

Tabela 4 Table 4 Średnie wyniki oznaczania (n = 3) TYMC oraz TAMC w badanych suplementach diety Mean results of determination (n = 3) TYMC) and TAMC) in studied dietary supplements Ogólna liczba drożdży Ogólna liczba Symbol i pleśni TYMC drobnoustrojów tleno- Rejon Polski próbki (jtk·g-1) wych TAMC (jtk·g-1) Region of Poland Symbol Total yeasts Total aerobic micro- of sample and molds count bial count (CFU·g-1) (CFU·g-1) G1 – owoc – fruit 6,9×103 1,5×105 G2 – owoc – fruit 4,3×102 6,0×102 WER G3 – owoc – fruit 2,2×104 1,8×103 zachodnio-południowy G13 – owoc – fruit <10 <10 south-western G14 – owoc – fruit <10 <10 G9 – kwiat – infolres 5,3×102 3,6×106 G12 – kwiat – infolres 4,2×102 2,4×106 Średnia – Mean 4,5×103 1,2×106 G4 – owoc – fruit 1,1×103 6,3×105 CER G5 – owoc – fruit 3,4×102 1,6×105 centralny 1 5 central G7 – owoc – fruit 4,0×10 1,1×10 G8 – kwiat – infolres <10 7,0×104 Średnia – Mean 4,1×102 2,4×105 NER G6 – owoc – fruit 1,9×102 2,1×103 północno-wschodni north-eastern G15 – owoc – fruit <10 <10 Średnia – Mean 4,1×102 2,1×103 EER G10 – kwiat – infolres 3,6×102 7,8×105 wschodnio-południowy south-eastern G11 – kwiat – infolres < 10 1,9×105 Średnia – Mean 3,6×102 7,8×105

Stwierdzono, że 80% wszystkich badanych próbek suplementów diety z kwiatostanem głogu było zainfekowanych przetrwalnikującymi tlenowymi laseczkami Bacillus cereus na średnim poziomie 7,6×101 jtk·g-1. Natomiast tylko w 7% badanych przez nas produk- tów z owocami głogu stwierdzono obecność tych ciepłoodpornych bakterii. Obecność laseczek tlenowych z gatunku B. cereus stwierdzano w rumianku, lipie, mięcie, liściach z drzewa pomarańczowego i olejku szałwiowym w ilościach od 103 do 107 jtk·g-1, a także w suszonych śliwkach, morelach, rodzynkach i kandyzowanych owocach, stosowanych jako dodatki smakowe do wyrobów cukierniczych (Steinka 2011). Uzyskane w naszych badaniach wyniki oznaczania laseczek bakterii B. cereus mogą świadczyć o występo- Ocena jakości mikrobiologicznej suszonych owoców... 109 waniu w badanych suplementach z owocami głogu, podobnie jak w łodygach fagonii indyjskiej (Fagonia indica Burm.), rosnącej w Pakistanie rośliny leczniczej (Rahman i wsp. 2017), znacznych ilości związków polifenolowych, które silnie hamują rozwój tych bakterii. Markowska i Libudzisz (2003) oznaczyły liczbę przetrwalników laseczek B. cereus w ziele szanty na poziomie 8,2×106 jtk·g-1. W tej samej pracy wyznaczony poziom przetrwalników bakterii B. cereus w przypadku ziela rzepiku wynosił ok. 100 jtk·g-1 (Markowska i Libudzisz 2003), co było porównywalne z nieznaczną ilością prze- trwalników B. cereus (maks. 2,5×103 jtk·g-1) izolowanych z papryki, kiełków cieciorki i innych warzyw, ryżu, kaszy, mąki oraz pieprzu białego, czarnego i zielonego (Steinka 2011). Obecność względnie patogennych laseczek B. cereus znacząco zmniejsza bezpie- czeństwo zdrowotne żywności i produktów zielarskich, gdyż jako czynniki wirulencji wytwarzają one enzymy degradujące tkanki (np. fosfolipazy) oraz termostabilne (toksyna „wymiotna”) i termolabilne (toksyna „biegunkowa”) enterotoksyny odpowiedzialne za objawy zatruć pokarmowych, które pojawiają się, odpowiednio, od 15 min do 12 godz. po spożyciu zakażonego pokarmu (Szewczyk 2010). Ponadto laseczki B. cereus mogą być niekiedy czynnikiem etiologicznym tzw. zakażeń oportunistycznych związa- nych z zapaleniem płuc, infekcyjnym zapaleniem wsierdzia, zapaleniem opon mózgowo- -rdzeniowych i zapalenia gałki ocznej (Szewczyk 2010). Wysoki stopień zróżnicowania ilości laseczek B. cereus oraz bakterii tlenowych z grupy coli w analizowanych przez nas próbkach (por. tab. 5) może być konsekwencją różnego terminu i warunków pogodowych podczas zbioru kwiatostanu z drzew głogu. Różnice w ilości drobnoustrojów tlenowych B. cereus mogą wynikać z wpływu wielu czynników środowiskowych, w tym tzw. skażeń doraźnych (Steinka 2011), a także wpły- wu miejsca zbioru, sposobu suszenia i przetwarzania, gdyż pozytywne próbki pochodziły tylko z ograniczonego obszaru Polski położonego wzdłuż województw wielkopolskiego, łódzkiego oraz lubelskiego. Bakterie B. cereus mogą spełniać także pozytywną rolę w ekosystemie roślinnym. Dzięki zastosowaniu sekwencjonowania metagenomowego opartego na genie kodującym 16s rRNA stwierdzono, że laseczki B. cereus wchodzą w skład endofitycznej mikroflory liści, bulw i korzeni pinelii trójlistkowej (Pinellia ternata (Thunb.) Makino), azjatyckiej rośliny leczniczej z której pozyskuje się duże ilości alkaloidów purynowych o znaczeniu terapeutycznym (Liu i wsp. 2015). Podobnie, stosując analizę metagenomiczną, stwierdzono, że bakterie B. cereus stanowią składnik prokariotycznej biocenozy bakteryjnej zasiedlającej liście drzew mangostanu indyjskiego (Garcinia xanthochymus L.), które stosowane są w tradycyjnej medycynie ajurwedyjskiej (Sunkar i Nachiyar 2012). Na podstawie analizy metagenomicznej stwierdzono, że wchodzące w skład mikroflory endofitycznej roślin uprawnych laseczki B. cereus stymulowały biodegradację herbicydów fosforoorganicznych stosowanych w hodowli ryżu (Oryza sativa L.) (Feng i wsp. 2017). Endofityczne bakterie B. cereus przyspieszały fitoremedację gleby poprzez rozkład benzenu i fenolu w odpadach rafineryjnych stosowanych do nawożenia plantacji konopii uprawnych (Cannabis sativa L.) (Iqbal i wsp. 2017). 110 Anna Przybylska i Grzegorz Bazylak

Tabela 5 Table 5 Średnie wyniki oznaczeń (n = 3) bakterii Escherichia coli, bakterii z grupy coli, Bacillus cereus oraz Salmonelli w badanych suplementach diety Mean results of determination (n = 3) of Escherichia coli, bacteria coli group, Bacillus cereus and Salmonella in studied dietary supplemets Bakterie z gru- Bacillus Rejon Polski Escherichia py coli Salmonella Symbol próbki cereus Region of coli (jtk·g-1) (jtk·g-1) (jtk·g-1) Symbol of sample (jtk·g-1) Poland (CFU·g-1) Total coli form (CFU·g-1) (CFU·g-1) group (CFU·g-1) G1 – owoc – fruit < 10 < 10 < 10 < 10 2 WER G2 – owoc – fruit < 10 3,6×10 < 10 < 10 zachodnio- G3 – owoc – fruit < 10 1,2×102 1,0×101 < 10 -południowy G13 – owoc – fruit < 10 0,6×102 < 10 < 10 south-we- G14 – owoc – fruit < 10 < 10 < 10 < 10 stern G9 – kwiat – inflores < 10 5,3×103 1,6×102 < 10 G12 – kwiat – inflores < 10 4,1×103 1,5×102 < 10 Średnia – Mean < 10 2,0 × 103 1,1×102 < 10 G4 – owoc – fruit < 10 1,8×102 < 10 < 10 CER G5 – owoc – fruit < 10 1,0×103 < 10 < 10 centralny 2 central G7 – owoc – fruit < 10 1,2×10 < 10 < 10 G8 – kwiat – inflores < 10 < 10 0,5×102 < 10 Średnia – Mean < 10 4,3×102 0,5×102 < 10 NER G6 – owoc – fruit < 10 1,6×102 < 10 < 10 północno- -wschodni north-eastern G15 – owoc – fruit < 10 < 10 < 10 < 10 Średnia – Mean < 10 1,6×102 < 10 < 10 EER wschodnio- G10 – kwiat – inflores < 10 0,1×103 1,0×101 < 10 -południowy south-eastern G11 – kwiat – inflores < 10 < 10 < 10 < 10 Średnia – Mean < 10 0,1×103 0,1×102 < 10

Natomiast priokariotyczne laseczki B. cereus, wchodzące w skład endofitycznej mikroflory korzeni kapusty polnej (Brassica campestris L.), wykazywały silne efekty antagonistyczne w stosunku do eukariotycznych pleśni chorobotwórczych Fusarium oxyspo- rum, Phythium ultimum, Phytophthora capsici i Rhizoctonia solani, co przyczynia się do wzrostu plonów tych warzyw (Haque i wsp. 2016). Metodą statystyki wielowymiarowej przeprowadzono analizę skupień (ang. cluster analysis), co pozwoliło na wyodrębnienie podzbiorów próbek o podobnym stopniu rozdrobnienia i zbliżonym profilu zanieczyszczeń mikrobiologicznych, uwzględniając przy tym rejon Polski, z którego pochodził badany materiał (por. rys. 1). W skład skupienia I wchodziły próbki G1, G5, G7, G2, G6, G3, zawierające owoce głogu. Pochodziły one głównie z regionu zachodnio-południowego WER (próbki G1, G3), centralnego CER (G5, G7) i północno-wschodniego NER (G6). Pary wiązań zostały utworzone na naj- niższym poziomie dla próbek G1-G5-G7, które charakteryzowały się wysoką wartością ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych TAMC (śr. 1,3×105 jtk·g-1). Ocena jakości mikrobiologicznej suszonych owoców... 111

G1 G5 G7 G2 G6 G3 G10 symbol próbki

symbol of sample G9 G12 G4

0 3000000 6000000 stopień podobieństwa degree of similiraty Rys. 1. Dendrogram przedstawiający relację między stopniem zanieczyszczenia mikrobiologicznego badanych próbek Fig. 1. Dendrogram from Cluster Analysis indicating relation between degree of microbial contamination of analyzed samples

Skupienie II obejmowało dwie próbki G9 i G12, które w swoim składzie zawiera- ły wyłącznie kwiatostan głogu pochodzący z regionu zachodnio-południowego WER. Wspomniane próbki G9 i G12 charakteryzowały się wysoką ogólną liczbą drobnoustro- jów tlenowych TAMC (śr. 3,0×106 jtk·g-1), jak również zwiększoną obecnością bakterii z grupy coli (śr. 4,7×104 jtk·g-1) i bakterii B. cereus (sr. 1,1×102 jtk·g-1). Na dendrogramie zwraca uwagę izolowane położenie próbki G10, zawierającej kwiatostan głogu z regionu wschodnio-południowego EER, w której odnotowano niższe wartości TAMC, TYMC oraz kilkasetkrotnie mniejszą zawartość bakterii z grupy coli (śr. 0.1×103 jtk·g-1) i bakterii B. cereus (śr. 1,1 ×102 jtk·g-1) w porównaniu z próbami kwiatostanu zgromadzonymi w skupieniu II. Próbki produktu G4 (z owocami głogu z regionu centralnego CER), które tworzą izolowane jednoelementowe skupienie, charakteryzowały się niską zawartością bakterii z grupy coli (1,8×102 jtk·g-1) oraz wysoką ogólną liczbą drożdży i pleśni TYMC (1,1×103 jtk·g-1).

WNIOSKI

1. Wszystkie analizowane próbki suplementów diety spełniają wymogi Farmako- pei Polskiej X dotyczące maksymalnej, dopuszczalnej ogólnej liczby drożdży i pleśni (TYMC) oraz ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych (TAMC) w owocach i kwiato- stanach głogu. 2. Najwyższą liczbę drobnoustrojów tlenowych odnotowano w przypadku rejonu zachodniego Polski WER (woj.: wielkopolskie, lubuskie, dolnośląskie) na poziomie 3,6×106 jtk·g-1. 3. Bakterie B. cereus stwierdzono w 80% próbek badanych produktów komercyjnych (suplementach) zawierających kwiatostan głogu, co może stwarzać zagrożenie zdrowotne dla konsumentów, którymi są najczęściej osoby osłabione, chore i w pode- 112 Anna Przybylska i Grzegorz Bazylak szłym wieku. Brak bakterii B. cereus w produktach, które zawierały suszone owoce gło- gu, może świadczyć o tym, że owoce te posiadały duże ilości związków polifenolowych odpowiedzialnych za hamowanie rozwoju tej bakterii. 4. Różnice w obecności tlenowych laseczek B. cereus mogą wynikać z różnych czynników środowiskowych (np. brak higieny), jak również miejsca pochodzenia badanych produktów, gdyż pozytywne próbki pochodziły tylko z pasma Polski rozciągające- go się wzdłuż województw wielkopolskiego, łódzkiego oraz lubelskiego, co wskazuje na konieczność wdrożenia systematycznej kontroli na zawartość bakterii B. cereus we wszystkich zebranych i przetwarzanych partiach kwiatostanu głogu, które stosowane są do produkcji suplementów diety. 5. W celu zwiększenia bezpieczeństwa mikrobiologicznego podczas stosowania su- rowców roślinnych pozyskiwanych z głogu oraz wyjaśnienia źródła pochodzenia i roli bakteri B. cereus w ekosystemie różnych odmian głogu istnieje potrzeba podjęcia szcze- gółowych badań ekologicznych i ekotoksykologicznych dotyczących struktury mikroﬂo- ry endoﬁtycznej, która zasiedla drzewostany głogu w różnych rejonach Polski.

PIŚMIENNICTWO

Bahorun T., Aumjaud E., Ramphul H., Rycha M., Luximon-Ramma A., Trotin F., Aruoma O., 2003. Phenolic constituents and antioxidant capacities of Crataegus monogyna (Hawthorn) callus extracts. Nahrung/Food, 47 (3): 191–198. Farmakopea Polska, 2014. Wydanie X, Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne, Warszawa. Feng F., Ge J., Li Y., He S., Zhong J., Liu X., Yu X., 2017. Enhanced degradation of chlorpyrifos in rize (Oryza sativa L.) by five strains of endophytic bacteria and their plant growth promotional ability. Chemosphere, 184: 505–513. Frączek J., Kaczorowski J., Ślipek Z., Horabik J., Molenda M., 2003. Standaryzacja metod pomia- ru właściwości fizyczno-mechanicznych roślinnych materiałów ziarnistych. Acta Agrophysica, 92: 94–95. Froehlicher T., Hennebelle T., Martin-Nizard F., Cleenewerck P., Hilbert J.L., Trotin F., Grec S., 2009. Phenolic profiles and antioxidant effects of hawthorn cell suspension, fresh fruits, and medicinal dried parts. Food Chemistry, 115: 897–903. Haque M.A., Yun H.D., Cho K.M., 2016. Diversity of indigenous endophytic bacteria associated with the roots of Chinese cabbage (Brassica campestris L.) cultivars and their antagonism to- ward pathogens. Journal of Microbiology, 54 (5): 353–363. Iqbal A., Arshad M., Hashimi I., Karthikeyan R., Gentry T.J., Schwab A.P., 2017. Biodegradation of phenol and benzene by endophytic bacterial strains isolated from refinery wastewater-fed Cannabis sativa. Environmental Technology, 13: 1–10. Janda K., Ulfig K., 2005. Badania składu ilościowego i jakościowego grzybów w suszach roślin leczniczych. Roczniki Państwowego Zakładu Higieny, 56 (4): 331–338. Janda-Ulfig K., Ulfig K., 2008, Susze ziołowe i przyprawy jako źródło mikotoksyn. Przemysł Spo- żywczy, 3: 36–44. Jałoszyński K., Szarycz M., Surma M., Pasławska M., 2011. Analiza suszenia owoców głogu w warunkach obniżonego ciśnienia z nagrzewaniem mikrofalowym. Kinetyka suszenia i skurcz su- szarniczy. Inżynieria Rolnicza, 5 (130): 91–97. Koch E., Malek F.A., 2011. Standarized extracts from hawthorn leaves and flowers in the treatment of cardiovascular disorders – preclinical and clinical studies. Planta Medica, 77 (11): 1123–1128. Kostic D., Velickovic J.M., Mitic S., Mitic M., Randelovic S., 2012. Phenolic Content and Antio- xidant and Antimicrobial Activities of Crataegus Oxyacantha L (Rosaceae) Fruit Extract from Southeast Serbia. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 11 (1): 117–124. Ocena jakości mikrobiologicznej suszonych owoców... 113

Liu Y., Liu W., Liang Z., 2015. Endophytic bacteria from Pinellia ternata, a new source of purine alkaloids and bacterial manure. Pharmaceutical Biology, 53 (10): 1545–1548. Łuczaj Ł., Szymański W.M., 2007. Wild vascular plants gathered for consumption in the Polish countryside: a review. Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine, 3: 7. Kulczyński B., Gramza-Michałowska A., 2016. Potencjał prozdrowotny owoców i kwiatostanów głogu. Problemy Higieny i Epidemiologii, 97 (1): 24–28. Markowska J., Libudzisz Z., 2003. Stan mikrobiologiczny surowców ziołowych w Polsce. III Kon- ferencja Naukowa „Rozkład i korozja mikrobiologiczna materiałów technicznych. Wyd. Poli- techniki Łódzkiej, Łódź, 306–309. Neves J.M., Matos C., Moutinho C., Queiroz G., Rebelo Gomes L., 2009. Ethnopharmacological notes about ancient uses of medicinal plants in Tras-os-Montes (northern of Portugal). Journal of Ethnopharmacology, 124: 270–283. Nowak G., 2009. Surowce roślinne stosowane w chorobach układu krążenia i serca., Herba Polo- nica, 55 (2):100–120. Olewnicki D., Jabłońska L., Orliński P., Gontar Ł., 2005. Zmiany w krajowej produkcji zielarskiej i wybranych rodzajach przetwórstwa roślin zielarskich w kontekście globalnego wzrostu popy- tu na te produkty. Zeszyty Naukowe Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Problemy Rolnictwa Światowego, 15 (1): 68–76. Peschel W., Bohr C., Plescher A., 2008. Variability of total ﬂavonoids in Crataegus – Factor evaluation for the monitored production of industrial starting material. Fitoterapia, 79: 6–20. Ogrodowska T., Zadernowski R., Tańska M., Czaplicki S., 2011, Właściwości ﬁzyczne nasion ama- rantusa (Amaranthus cruentus) pochodzących z różnych rejonów upraw w Polsce. Żywność Nauka Technologia Jakość, 6 (79): 91–104. Polska Norma, PN-ISO 21527-2:2009. Mikrobiologia żywności i pasz – Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni. Polska Norma, PN-ISO 4833:2004+Ap1:2005. Mikrobiologia żywności i pasz – Horyzontalna metoda oznaczania liczby drobnoustrojów – Metoda płytkowa w temperaturze 30°C. Przetaczek-Rożnowska I., Kuźniak M., 2016. Źródła zanieczyszczeń mikrobiologicznych ziół leczniczych i przypraw oraz metody ich dekontaminacji. Postępy Fitoterapii, 17 (1): 59–62. Rahman L., Shinwari Z.K., Iqrar I., Rahman L., Tanveer F., 2017. An assessment on the role of endophytic microbes in the therapeutic potential of Fagonia indica. Annals of Clinical Micro- biology and Antimicrobials, 16: 53–63. Rozporządzenie Ministra Ochrony Środowiska, Zasobów Naturalnych i Leśnictwa z dnia 28 grudnia 1998 r. (Dz.U. 1999 Nr 6, poz. 42). Salmanian S., Sadeghi Mahoonak A. R., Alami M., Ghorbani M., 2014. Phenolic Content, Antira- dical, Antioxidant and Antibacterial Properties of Hawthorn (Crataegus elbursensis) Seed and Pulp Extract. Journal of Agricultural Science and Technology, 16: 343–354. Silici S., Sagdic O., Ekici L., 2010. Total phenolic content, antiradical, antioxidant and antimicrobial activities of Rhododendron honeys. Food Chemistry 121: 238–243. Sołtys-Lelek A., 2008. Rodzaj Crataegus L. w Ojcowskim Parku Narodowym, Prądnik. Prace i ma- teriały Muzeum im. Prof. Władysława Szafera, 18: 7–36. Sołtys-Lelek A., 2012. Crataegus and Rosa genera in the Solec Basin and southern part of the Piń- czów Hummock (Southern Polan)., Biodiversity: Research and Conservation., 25: 55–66. Sołtys-Lelek A., Gruszka W., 2016. Wild roses and hawthorns of urban area: a case study of Piła in Poland Biodiversity: Research and Conservation, 43: 27–40. Steinka I., 2011. Mikrobiologia żywności i materiałów przemysłowych. Akademia Morska w Gdy- ni, Gdynia, 59–118. Steinka I., Misiewicz Ł., Kukułowicz A., Ćwikliński M., Dmowski P., Sznajdrowska A., 2011. Pró- ba oceny mikrobiologicznej wybranych suszy roślinnych stosowanych jako używki i preparaty o znaczeniu leczniczym. Zeszyty Naukowe Akademii Morskiej w Gdyni, 68: 13–20. 114 Anna Przybylska i Grzegorz Bazylak

Sunkar S., Nachiyar C.V., 2012. Biogenesis of antibacterial silver nanoparticles Rusing the endophytic bacterium Bacillus cereus isolated from Garcinia xanthochymus. Asian Paciﬁc Journal of Tropical Biomedicine, 2 (12): 953–959. Szewczyk E.M. (red.), 2010, Ćwiczenia z mikrobiologii dla studentów farmacji, Uniwersytet Me- dyczny w Łodzi, Łódź 2010: 162–163. Yang B., Liu P., 2012. Composition and health effects of phenolic compounds in hawthorn (Cra- taegus spp.) of different origins. Journal of the Science of Food and Agriculture, 92: 1578– 1590. Zając A., Zając M., 2001. Atlas rozmieszczenia roślin naczyniowych w Polsce. Pracownia Chrolo- gii Komputerowej Instytutu Botaniki, Uniwersytet Jagielloński, s. XII + 716. Zhang Z., Chang Q., Zhu M., Huang Y., Ho. W.K.K., Chen Z.-Y., 2001. Characterization of antioxidants prezent in hawthorn fruits. Journal of Nutritional Biochemistry, 12: 144–152.

ASSESSMENT OF MICROBIOLOGICAL QUALITY OF HAWTHORN (CRATAEGUS SPP) DRIED FRUITS AND INFLORESCENCES USED IN PRODUCTION OF DIETARY SUPPLEMENTS

Summary

The aim of the our research was microbiological quality assessment of 15 commercial dietary supplements containing dried hawthorn fruit or dried hawthorn inflorescences (Crataegus spp.) offered in drug stores and hypermarkets in Bydgoszcz (Poland). These products came from the four different regions of Poland: south-western WER (G1, G2, G3, G13, G14, G9, G12), central CER (G4,G5,G7,G8), north-eastern NER (G6, G15) and south-eastern EER (G10, G11). In all studied samples were examined: 1) total yeasts and molds count (TYMC), 2) total aerobic microbial count (TAMC), 3) bacterias Escherichia coli, 4) total coliform group, 5) Bacillus cereus and 6) Salmo- nella. These analyses were performed in accordance with the valid standard PN-ISO 21527-2:2009 (TYMC) and PN-ISO 4833:2004+Ap1:2005 (TAMC). All other microbes were determined using the CompactDry tests (HyServe, Germany). The highest TYMC were obtained for the sample G3 with the dried hawthorn fruits – 2.2×104 CFU·g-1. In the 67% of studied samples the high TAMC from 1.0×105 to 1,0×106 CFU g-1 were found. However, the all analyzed dietary supplements with hawthorn fruit (10 products) and inflorescences (5 products) fulfilled sanitary requirements formulated by the X Polish Pharmacopoeia (10th edition, 2014) concerning acceptable level of TYMC (<5.0×105 CFU·g-1) and TAMC (<5.0×107 CFU·g-1). No E. coli and Salmonella were found in each analyzed product. The microbiological quality of analyzed products was very varied to a certain extent depending on the region of Poland. Differences in presence of aerobic B. cereus in analyzed products may be due to the different environmental factors as well as the origin of the samples, because of positive samples came only from the WER, CER and EER regions of Poland. Aerobic B. cereus were observed in the 80% of studied samples with hawthorn inflorescences. Contrary, B. cereus was not determined in the 93% of analyzed samples of dried hawthorn fruit products. The- se results may suggest that some antibacterial endophenolic compounds or endophytic biocontrol effect could be responsible for inhibiting the growth of this bacteria in studied dietary supplements with hawthorn fruit. Thus, extended future metagenomic studies should be developed to examine detailed microbial composition of endophytic microflora on the hawthorn trees and to explain the functional status and significance of the B. cereus bacteria in the different ecosystems of variable genus of this plant in Poland. KEY WORDS: dietary supplements, hawthorn, Crataegus monogyna, aerobic bacteria, microbial contamination, Escherichia coli, Bacillus cereus, Salmonella

[P-4]

173

174

Journal of Agriculture and Environmental Sciences December 2018, Vol. 7, No. 2, pp. 131-142 ISSN 2334-2404 (Print) 2334-2412 (Online) Copyright © The Author(s). All Rights Reserved. Published by American Research Institute for Policy Development DOI: 10.15640/jns.v7n2a14 URL: https://doi.org/10.15640/jns.v7n2a14

Bioactive compounds in aqueous infusions of dietary supplements and herbal blends containing dried hawthorn fruits or hawthorn inflorescences (Crataegus spp.)

Anna Przybylska1, Grzegorz Bazylak

Abstract

The aim of this study was the preliminary analysis of micronutrient and phytochemical composition as well as antioxidant activity of aqueous extracts obtained from dietary supplements and herbal blends containing dry hawthorn fruits (HF) and hawthorn inflorescences (HI). The study included 15 samples. Total phenols (TPC) and flavonoids content (TFC) of aqueous extracts were determined using colorimetric assay. The antioxidant activity was analyzed by using DPPH and ABTS methods. To analyze the concentration of citric and L-malic acid were used enzymatic analysis, while to analyze of tartaric acid was used colorimetric method. Ascorbic acid and oxalic acid were determined using titration method. Mean TPC and TFC for aqueous extracts with dry HI is nearly 2.5 and 4.0 times higher than in extracts with dry HF, respectively. Results shows that TPC, TFC is positively and highly correlated with fragmentation degree of dry HF. High correlation was observed between TFC and DPPH and ABTS values, while no correlation observed between TPC and antioxidative activity with DPPH and ABTS assays of HF. The analysis of principal component analysis demonstrates different clusters based on the chemical composition separating aqueous extracts with HF from the HI.

Keywords: Crataegus monogyna, hawthorn fruits, hawthorn inflorescences, leaves, PCA

Introduction

Hawthorn (Crataegus spp.) is comonly used as medicinal and food materials in China and European countries in the prevention of cardiovascular and hepatic diseases. It was proved that administration of hawthorn extracts to patients contributes to the reduction of total cholesterol, LDL and has an effect on increasing HDL cholesterol (Przybylska et al. 2018). The results of Liu et al. (2018 a) suggests that hawthorn polyphenol extract can be prevent UVB radiation-induced skin photoaging. According to data from the GUS-State Statistics Office of Poland, 157 tons of fresh hawthorn fruit are collected by local people and sold for herbal raw materials in Poland. The largest amount of fresh hawthorn fruit is gathered in the Podlaskie (86 tons), Lubelskie (25 tons) and Podkarpackie (24 tons) voivodeship (GUS-State Statistics Office). In Latin America (Chile), in 2005 hawthorn (Crataegus monogyna) was collected in a quantity of 93 tons from 1800 ha area (Censkowsky et al. 2007). Referring to recommendation of European Pharmacopaeia dietary supplements may contain dried hawthorn fruits (HF) of Crataegus monogyna Jacq. (Lindm.) or Crataegus laevigata (Poir.) DC. (syn. C. oxyacantha L.) or their hybrids or a mixture of these all fruit (Przybylska & Bazylak 2017). In Poland, the most numerous group of Crataegus spp. is Crataegus monogyna and Crataegus laevigata. In China the major species are C. pinnatifida, C. brettschneideri or C. scabrifolia while in Finland is C. grayana (Yang & Liu 2012). A subject of many studies are antioxidant properties and the content of bioactive compounds in fresh hawthorn fruits broken from wild trees (Pliszka et al. 2016, Liu et al. 2011). Plant material used for the production of dietary supplements and herbal blends is characterized by high variability due to climatic conditions, harvest time and storage conditions. Technological processes (drying, packaging, transport, crushing) used for the production of dietary supplements and herbal blends can change the content of the active compounds in hawthorn fruits (HF) and hawthorn inflorescences (HI) (Przybylska et al, 2018).

1 Nicolaus Copernicus University, Collegium Medicum, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmaco-Bromatology & Molecular Nutrition, Jagiellońska 13, PL-85067 Bydgoszcz, POLAND. Email : [email protected] 132 Journal of Agriculture and Environmental Sciences, Vol. 7(2), December 2018

From the point of view of the consumer, information on the content and chemical composition of bioactive compounds in aqueous extracts of dietary supplements containing hawthorn fruits and hawthorn inflorescences are still very limited.

The aim of this study was to analysis the total phenols (TPC) and total flavonoids content (TFC), antioxidant activity and ascorbic, citric, malic, tartaric and oxalic acid content in aqueous extracts of commercial dietary supplements and herbal blends containing dry HF and HI purchased in Poland. The purpose of this study was to assess the impact of the degree of fragmentation of dry hawthorn fruits (HF) and hawthorn inflorescence (HI) on the content of analyzed chemical compounds in water infusions.

Materials and methods

Chemicals

Sodium carbonate, sodium nitrate, aluminium chloride hexahydrate, sodium hydroxide, methanol, potassium persulphate, oxalic acid, potassium permanganate, calcium chloride dihydrat, acetone, sulfuric acid were purchased from POCH (Gliwice, Poland). DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical), ABTS (2,2’azinobis-(3- ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid), phosphate-buffered saline (PBS), 2,6-dichloroindophenol sodium salt hydrate, (±)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid (Trolox), (+)-catechin hydrate, gallic acid, Folin- Ciocalteu’s phenol reagent came from SigmaAldrich (Steinheim, Germany). Purified water used to prepare the solution was conductivity of 0.10 μS cm-1 (HLP Smart 2000, Hydrolab, Poland). Samples

Commercial dietary supplements and herbal blends containing dry HF and HI were purchased from supermarkets, pharmacy stores in Bydgoszcz (Poland) and purchased online. Products (n = 15) came from organic farming (n = 1) and conventional farming (n = 14) located in various regions of Poland. The analyzed products contained dry HF (100%), products containing HF and different part of medicinal plants i.e. hawthorn inflorescence, hibiscus flower, apple fruit, chokeberry fruit, rosehip and products containing only dry HI. The material differed in the degree of fragmentation. In the study was used a representative sample taken from each of the analyzed products (Table 1).

Table 1. Characteristics of the analyzed samples.

Sample BD*** Manufacturer Voivodeship **** Form Hawthorn fruits (HF) FG1 0.41 Kawon Wielkopolskie single package (50.0 g) FG2 0.56 Kawon Wielkopolskie sachets (3.0 g) FG3 0.48 Kawon Wielkopolskie sachets (3.0 g) FG4 0.38 Flos Łódzkie single package (50.0 g) FG5 0.38 Flos Łódzkie single package (50.0 g) FG6 * 0.37 Dary Natury Podlaskie single package (100.0 g) FG14 0.22 Skarby Natury Lubuskie single package (50.0 g) FG15 0.29 Internet supplier No data single package (150.0 g) FG7 ** 0.51 Bifix Łódzkie sachets (2.0 g) FG13 ** 0.46 Malwa Lubuskie sachets (2.0 g) Hawthorn inflorescence (HI) IG8 0.19 Flos Łódzkie single package (50.0 g) IG9 0.22 Kawon Wielkopolskie single package (50.0 g) IG10 0.23 Herbapol Małopolskie sachets (2.0 g) IG11 0.28 Herbapol Małopolskie sachets (2.0 g) IG12 0.16 Kawon Wielkopolskie single package (50.0 g)

Przybylska & Bazylak 133

Analytical procedure

The conditions of extraction were similar to the conditions used by the consumer at home. For water extraction, one gram of the sample was infused with 50.0 mL freshly boiled deionized water for 5 min (under cover). Next, the extract was filtered with use of a filter paper and a Chromafil PES-45/25 syringe filter (Macherey-Nagel, Germany). The bulk density (BD) of the tested dietary supplements and herbal blends containing dry HF and HI was determined according to the method of Ogrodowska et al. (2011). The results were expressed in g mL-1.

The total phenols content (TPC) in the aqueous extract of dietary supplements and herbal blends containing HF and HI was determined with Folin-Ciocalteu reagent according to the method of Turkmen et al. (2007). One milliliter of the aqueous extraction was mixed with 1.0 mL of 3-fold-diluted Folin-Ciocalteu reagent and 2.0 mL 35 % Na2CO3. The mixture was shaken thoroughly and 2.0 mL of deionized water was added. The mixture was allowed to stand for 30 min. The absorbance was measured at λ = 700 on UV-VIS spectrophotometer type 1300 (Zeiss, Jena, Germany). The determination of TPC was carried out in a triplicates and calculated from the calibration curve obtained with gallic acid GAE. The results were expressed as mg GAE eq. 100 g dry weight (DW). The total flavonoid content (TFC) in the aqueous extracts prepared from dry HF and HI was measured with aluminum chloride colorimetric assay according to the method of Atanassova et al. (2011). One milliliter of aqueous extraction was mixed with 4.0 mL deionized water, 0.3 mL 5% NaNO2 and 0.3 mL 10% AlCl3 after five min. At the sixth minute, 2.0 mL 1 M NaOH was added and the total volume was made up to 10.0 mL with deionized water. The absorbance was measured at λ = 510 nm on UV-VIS spectrophotometer. The determination of TFC was carried out in a triplicates and calculated from the calibration curve obtained with (+)-catechin (CE). The results were expressed as mg of (+)- catechin (CE) eq. 100 g DW. The antiradical activity (DPPH) was determined by the Atanassova et al. (2011) method. One mililiter of aqueous extracts and Trolox (TE) standard solution were mixed with 4.0 mL 0.004% methanol stock solution of DPPH in. After vortex and 60 min. incubation in a dark place in room temperature the absorbance was read against a blank at λ = 517 nm on UV-VIS spectrometer. The DPPH assay was done as carried out in a triplicates and calculated from the calibration curve obtained with Trolox (TE). The results were expressed as mg of TE eq. per 100 g (DW) and mM of TE eq. per 100 g DW. The percent inhibition of the DPPH· or ABTS·+ radical was calculated using the following formula:

IDPPH· % or IABTS·+ %= [(A blank - A sample)/A blank] × 100

where: A sample - the mean absorbance values in the presence in the extract, A blank - absorbance of the control solution (DPPH or ABTS stock solution respectively). The extract concentration inducing 50% of DPPH radicals inhibition (IC50) was calculated from the graph plotting inhibition percentage against extract concentration. For the ABTS assay, the procedure followed the method of Re et al. (1999) with some modification. ABTS stock solution (7.0 mM) was prepared by adding 3.3 mg potassium persulfate (K2S2O8), 19.5 mg of ABTS (2,2’-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) and 7.0 mL phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4). The mixture was kept in the dark at room temperature for 12 - 16 h. The ABTS radical cation (ABTS·+) was prepared by diluting the stock solution using deionized water so that the absorbance at λ = 734 nm was measured A = 1.0. Next, 0.03 mL of aqueous extracts and TE standard solution were added to 0.97 mL stock solution and absorbance was measured on UV-VIS spectrophotometer. The ABTS assay was done as carried out in a triplicates and calculated from the calibration curve obtained with TE. The results were expressed as mg of TE eq. per 100 g DW and mM of TE eq. per 100 g. To analyze the concentration of citric acid (citrate, CIAC) and L-malic acid (L-malate, MAAC) in aqueous extracts prepared from dry supplements and herbal blends containing HF and HI, an enzymatic analysis was performed using the K-CITRIC and K-MALQR diagnostic kits were used respectively obtained from Megazyme (Brey, Ireland). To analyze of tartaric acid content (tartrate, TAAC) in aqueous extracts colorimetric method using the K-TART kit (Megazyme, Ireland) was used. All steps of the analysis were carried out in accordance with the manufacturer's assay procedure. The absorbance of analyzed solution was measured at λ = 340 nm for citric acid and L-malic acid and λ = 505 nm for tartaric acid on UV-VIS spectrophotometer type 1300 (Zeiss, Jena, Germany). The results were expressed as mg per 100 g DW. Ascorbic acid (ASAC) content in aqueous extracts was determined using the 2,6-dichlorophenol-indophenol titration method (Tillmans method) followed the method Kabaskalis et al. (2000). The concentration of the titrant (Tillmans reagent) was 0.005 mg mL-1. Five milliliters of the aqueous extract of dry dietary supplements and herbal blends was dissolved in 45.0 mL of the 3.0% oxalic acid (C2H2O4) in 50.0 mL volumetric flask. 134 Journal of Agriculture and Environmental Sciences, Vol. 7(2), December 2018

After that, the solution was vortexed and 10.0 mL of solution was collected three times for analysis. Oxalic acid (OXAC) content in aqueous extracts was determined by manganometric titration using 0.002 M KMnO4 standard solution (titrant) followed to the method Sperkowska & Bazylak (2010). After filtration, 2.5 mL of aqueous extract was poured into a centrifuge tube with 1.0 mL 25% CaCl2 and 2.0 mL acetone in centrifuge tube. The mixture was vortexed and frozen for 30 min. at -20 °C. After this time, the solution was centrifuged at 3500 × g for 5 min. The washed precipitate was dissolved in 5.0 mL of 10% H2SO4. The results were expressed as mg per 100 g dry DW. Total acidity (ACID) in aqueous extracts was measured by potentiometric titration with use of a semi-automatic analyzer DL-22 (Mettler Toledo, Switzerland). The analyze solution was prepared by dissolving 5.0 mL of aqueous extract of dietary supplements and herbal blends containing HF and HI in 50.0 mL of deionized water (HLP smart 2000, Hydrolab, Poland). The results were expressed as citric acid eq. per 100 mL. Statistical analysis The result was presented as mean ± standard deviation and three replicate of each sample. Parametric t- Student test was used to compare differences of means (α = 0.05). Significance was assumed for p < 0.05. In order to describe the relationships of multidimensional data arrays between values of variables the correlation matrix and principal component analysis (PCA) were calculated. All statistical analyses were performed using STATISTICA v.13 (StatSoft, USA). Results and discussion Total phenols content (TPC) and total flavonoids content (TFC). According to the results, the range of TPC in aqueous extracts prepared from HF and HI was 15.91 ÷ 1206.79 mg GAE 100g-1 DW and 937.13 ÷ 1444.12 mg GAE 100g-1 DW, respectively (Figure 1). Mean TPC for aqueous extracts with HI is nearly 2.5 times higher compared with an extracts from HF.

Figure 1. Total phenols content (TPC) and total flavonoids content (TFC) of aqueous extracts obtained from dry HF (FG1 – FG15) and HI (IG8 – IG12). The small letters indicate the no statistically significant differences (p > 0.05) between samples tested.

In the group of products containing hawberries, the highest TPC were determined in multi-component sample FG7 and FG13 (817.16 and 1206.79 mg GAE 100g DW-1). This is probably related to the addition parts of different plants to herbal blends (apple fruit, chokeberry fruit, hibiscus flower) by the manufacturer. According to Mak et al. (2013) aqueous extract of Hibiscus flower have high phenolic concentration (5436.23 ± 168.6 mg GAE 100g-1). The chokeberry fruit are rich source of poliphenols compounds. The range of total polyphenols in the four cultivars of chokeberry fruit is 1845.00 ÷ 2340.00 mg GAE 100g-1 (Ochmian et al. 2012). Mean TPC in apple (Malus pumila) is 126.20 mg GAE 100g-1 FW (Srivastava et al. 2013). The result of Leja et al. (2007) confirm a higher concentration of total phenols in the rosehip (Rosa canina L.) and elderberry fruits (Sambucus nigra L.) compared with HF (Crataegus monogyna Jacq.). In fresh HF of Crataegus monogyna total phenols was determined at level of 62.00 mg 100g-1 FW (Leja et al. 2007). C. monogyna fruits are characterized by about 2.0 times higher concentration of total phenolics than yellow fruits of C. azarolus and about 5.0 times higher concentration of total flavonols (Mraihi et al. 2013, Mraihi et al. 2015). Total amount of total phenolics in peel of C. monogyna fruits collected in Tunisia is between 45.70 ÷ 123.35 mg GAE 100g-1 DW (Mraihi et al. 2013). Pliszka et al. (2016) obtained higher concentration of TPC with use of exraction with citric acid were (913.0 ± 41.8 mg GAE 100-1 FW) compared with extraction with 80% methanol (602.7 ± 17.0 mg GAE 100g-1 FW) for C. monogyna fruits. Przybylska & Bazylak 135

In our results, aqueous extracts prepared from dry HI were richer source of total flavonoids content (TFC) than aqueous extracts from dry HF. Mean TFC in aqueous extracts from HI was nearly 4.0 times higher compared with aqueous extracts from HF. The TFC in aqueous extracts from HF and HI was analyzed in the wide range of 9.56 ÷ 457.18 and 909.26 ÷ 1795.83 mg CAE 100g-1 DW, respectively. Liu et al. (2011) described that the TFC in Chinese HF (0.2 – 1.0 mg g-1 DM) was diminished than or close to the content in the C. grayana (1.0 mg g-1 DM). Mraihi et al. (2013) obtained a higher TFC (160.35 ± 0.10 and 60.45 ± 0.06 mg rutin 100g-1 DW, respectively) compared to TPC (122.26 ± 0.16 and 60.89 ± 0.04 mg GAE 100g-1 DW, respectively) for pulp of C. monogyna and C. azarolus. A higher TFC (198.53 ± 0.11 mg eq. rutin 100g-1 DW) was analyzed in the red variety of C. monogyna than in yellow variety of C. azarolus (155.40 ± 0.23 mg rutin 100g-1 DW) in the peel of HF (Mraihi et al. 2013). Especially significant for the TPC and TFC in aqueous extracts from HF is time when fruits has been harvested. In the Barros et al. (2010) research, authors proved that unriped HF (C. monogyna) are the richest in phenolics and flavonoids compounds which significantly affects antioxidant properties (Barros et al. 2010). In our results the wide range of TPC may also be caused by the storage of fruits. Research of Liu et al. (2018 b) suggests that during storage of the hawthorn wine, the TPC gradually decreased. After 180 days of storage of hawthorn wine, the TPC decreased from 1.8 to 1.1 mg mL-1.

In Poland, the estimated consumption of total polyphenols intake is 989.3 mg day-1 (Witkowska et al. 2015). Daily intake of total polyphenols compounds in the daily diet increases in contribiuton to the consumption of two glasses of dietary supplements and herbal blends containing dried hawthorn fruit a day. The consumption of studied here aqueous infusions from HF and HI covers the estimated daily intake of total polyphenols in approximately 4.7% (46.58 mg day-1) and 15.12% (149.56 mg day-1), respectively.

Antioxidative effects. Referring to the results, aqueous extract prepared from HI contained higher radical scavenging activity compared to HF (Table 2). The percentage of inhibition of DPPH radicals (IDPPH%) of aqueous extracts from HF and HI was found in the range of 11.48 ÷ 94.95% and 92.37 ÷ 93.08% respectively. Alike, the inhibition percentage of ABTS radicals (IABTS%) showed higher antiradical activity of aqueous extracts from HI (55.61%) compared with HF (17.45%). Pliszka et al. (2016) obtained slightly higher results in fresh hawthorn fruits of Crataegus monogyna from the Experimental Garden of the University of Warmia and Mazury in Olsztyn (Poland). In this study the IDPPH% and IABTS% was about 85% and 55% respectively for citric acid extract of HF. The results of Ishiwata et al. (2004) also shows that the radical scavenging activity of dried fruits was diminished than corresponding fresh fruits.

Table 2. Antioxidant activities of aqueous extracts of dry and commercial HF and HI as determined using DPPH and ABTS method.

DPPH *** ABTS *** Sample [mg TE/100g [mM TE/100g IC50 [mg TE/100g [mM TE/100g I [%] I [%] DW] DW] [mg/mL] DW] DW] Hawthorn fruits (HF) FG1 94.17 ± 0.06 414.68 ± 0.11 1.66 ± 0.01 0.93 ± 0.01 a 23.53 ± 1.31 a 106.09 ± 7.58 a 0.42 ± 0.01 a FG2 89.79 ± 0.06 a 390.10 ± 0.19 a 1.56 ± 0.02 a 1.03 ± 0.05 b 24.47 ± 1.08 ab 107.84 ± 5.61 ab 0.43 ± 0.01 FG3 92.00 ± 0.12 b 403.06 ± 0.44 b 1.61 ± 0.01 b 0.53 ± 0.01 44.77 ± 1.29 215.52 ± 4.08 0.86 ± 0.02 b FG4 89.49 ± 0.12 c 387.48 ± 0.80 c 1.55 ± 0.03 0.86 ± 0.04 c 22.33 ± 1.53 abc 99.38 ± 7.64 abc 0.40 ± 0.01 FG5 94.95 ± 0.06 418.96 ± 0.20 d 1.67 ± 0.01 c 2.65 ± 0.20 20.13 ± 0.87 cd 85.83 ± 4.24 d 0.34 ± 0.01 FG6 * 95.46 ± 0.06 420.81 ± 1.74 d 1.68 ± 0.02 c 4.84 ± 0.20 5.90 ± 0.66 e 17.55 ± 3.35 e 0.07 ± 0.01 FG14 11.73 ± 0.01 51.53 ± 0.12 0.21 ± 0.02 22.88 ± 0.30 5.13 ± 0.80 e 12.27 ± 3.68 eg 0.05 ± 0.01 FG15 11.48 ± 0.01 50.12 ± 0.14 0.20 ± 0.01 21.92 ± 0.20 3.03 ± 0.15 2.73 ± 0.73 e 0.02 ± 0.01 22.17 ± 2.43 FG7 ** 89.76 ± 0.06 ac 388.12 ± 2.05 ac 1.56 ± 0.01 a 1.21 ± 0.01 97.58 ± 12.05 abcd 0.40 ± 0.02 a abcd FG13 ** 84.88 ± 0.12 364.49 ± 2.88 1.46 ± 0.01 0.44 ± 0.01 3.03 ± 0.29 2.95 ± 1.49 eg 0.02 ± 0.01 Mean 75.37 328.94 1.32 5.73 17.45 74.77 0.30 Hawthorn inflorescence (HI) IG8 93.08 ± 0.05 d 406.89 ± 1.23 e 1.63 ± 0.02 d 0.52 ± 0.01 b 41.50 ± 1.35 f 191.43 ± 6.63 f 0.76 ± 0.02 c IG9 92.95 ± 0.06 de 407.27 ± 1.44 ef 1.63 ± 0.01 de 0.62 ± 0.01 36.87 ± 2.71 f 175.53 ± 13.81 f 0.70 ± 0.01 cd IG10 92.37 ± 0.10 b 404.59 ± 1.25 befg 1.62 ± 0.01 bdef 0.36 ± 0.04 d 66.37 ± 1.60 319.57 ± 8.02 1.28 ± 0.02 bcde IG11 92.98 ± 0.10 def 406.38 ± 2.82 befg 1.62 ± 0.01 befg 0.30 ± 0.02 d 79.67 ± 0.71 389.93 ± 3.58 1.56 ± 0.02 bcdef 0.84 ± 0.03 IG12 92.98 ± 0.08 def 407.02 ±1.28 efg 1.63 ± 0.01 dfg 53.63 ± 0.47 255.89 ± 2.36 1.02 ± 0.02 cdef ac Mean 92.87 406.43 1.63 0.53 55.61 266.47 1.06

* products with an ecological certificate, ** FG7 – hawthorn fruit (40 %), apple fruit, chokeberry fruit, hibiscus flower, citric acid and FG13 – hawthorn fruit (51 %), hibiscus flower, hawthorn inflorescence (10 %), rosehip, *** - TE – Trolox, DW – dry weight. The small letters indicate the no statistically significant differences (p > 0.05) between samples tested. 136 Journal of Agriculture and Environmental Sciences, Vol. 7(2), December 2018

In our results, mean values of the antioxidative activities of DPPH radicals for HF and HI was 1.32 mM TE 100g-1 DW and 1.63 mM TE 100g-1 DW, respectively. Similarly results was shown by Froehlicher et al. (2009). In this study, for extracts of C. monogyna the decreasing order efficiencies in the DPPH system as follows: red cell > flowering tops > flowers > dry fruits > fresh fruits > yellow cell suspension. The higher values of ABTS and DPPH were calculated for dry flowers and dry flowering tops compared to dried fruits or fresh fruits (Froehlicher et al. 2009). After the tests, it was also found that the antioxidant activity of aqueous extract of dry HF and HI was more -1 significant for HI with lowest IC50 values (mean values 0.53 mg mL ). An aqueous extracts prepared from uncrushed -1 dry HF (FG14 and FG15) revealed very low antioxidant activity with high IC50 values – 22.88 ± 0.32 mg mL and 21.92 ± 0.25 mg mL-1, respectively. In our results, aqueous extracts prepared from uncrushed dry HF (FG14 and FG15) characterized by the lowest radical scavenging activity from all of the samples of HF. Fragmentation degree of medicinal plant raw material and high temperature extraction conditions can affect the degradation of thermolabile compounds, the formation of pro-oxidants and complex compounds, which may contribute to the reduction of antioxidant content and antioxidant potential. On the other hand, high temperature of extraction can lead to the disruption of the cell structure, which may result an increased bioavailability of compounds present in it. (Bąk-Sypień et al. 2017).

Ascorbic acid (ASAC), organic acids content. Similarly to the previous our results, aqueous extracts prepared from HI characterized by the higher content of ascorbic acid, malic, oxalic and tartaric acid (Table 3). The mean content of ascorbic acid in aqueous extracts from HI is slightly higher (29.32 mg 100g-1 DW) compared with extracts from HF (22.02 mg 100g-1 DW). Pereira et al. (2013) obtained similar results. In this study ascorbic acid was not found in C. monogyna fruits, but in flowers and flowering shoots ascorbic acid was analyzed at the level of 2.14 ± 0.21 mg g-1 DW. Barros et al. (2010) analyzed ascorbic acid in flowers of Crataegus at the mean level of 408.37 mg 100g-1 DW and 130.33 mg 100g-1 DW in unripe fruits, 220.24 mg 100g-1 DW in ripened fruits and only 28.40 mg 100g-1 DW in over ripened fruits of C. monogyna. It should be noted, that the drying method used for the production of herbal blends and high-temperature extraction used in our studies (100°C) can decrease content of ascorbic acid in aqueous extract of HF and HI (Przybylska et al. 2018). In turn, Ishiwata et al. (2004) claims that contribution of ascorbic acid in dried HF purchased from markets in Japan is negligible and suggests that the radical scavenging activity may originate from other active compounds, such as polyphenols.

Table 3. Content of ascorbic acid and organic acids in the aqueous extracts of dry HF and HI.

Organic acid [mg/100g DW] *** Total acidity **** Sample ascorbic citric malic oxalic tartaric [mg/100mL] Hawberries (hawthorn fruits) (HF) FG1 25.20 ± 3.35 A 50.77 ± 1.15 381.24 ± 7.75 a 756.02 ± 8.50 175.38 ± 14.50 a 108.07 ± 0.25 a FG2 24.37 ± 1.69 B 134.97 ± 3.06 267.52 ± 11.38 b 603.99 ± 9.87 414.56 ± 10.60 b 105.07 ± 0.65 381.75 ± 9.31 FG3 27.61 ± 3.68 C 118.84 ± 2.81 400.85 ± 14.43 a 320.57 ± 36.23 c 102.87 ± 0.75 b a 1217.23 ± FG4 29.90 ± 3.70 D 57.92 ± 3.20 a 141.41 ± 16.97 c 90.07 ± 4.69 108.60 ± 0.56 a 3.08 379.24 ± 9.47 FG5 29.31 ± 1.81 BE 58.72 ± 2.10 a 202.81 ± 8.95 d 227.64 ± 3.08 d 102.30 ± 0.20 bc ab 36.79 ± 3.75 FG6 * 86.11 ± 3.18 113.53 ± 8.23 c 332.00 ± 9.89 39.72 ± 5.05 101.47 ± 0.61 bcd ABCEF

23.80 ± 2.80 d e FG14 DEFH 1917.62 ± 1.90 190.66 ± 2.39 70.91 ± 9.45 611.92 ± 2.11 19.03 ± 0.21

23.25 ± 2.71 d cf FG15 DEFH 1990.65 ± 4.10 204.42 ± 2.73 178.30 ±14.71 293.57 ± 4.41 42.93 ± 0.35 FG7 ** nd 844.15 ± 1.20 268.42 ± 9.71 be nd 50.62 ± 1.75 124.67 ± 0.65 FG13 ** nd 3355.10 ± 4.44 273.24 ± 12.38 be nd 1204.58 ± 1.02 138.97 ± 0.25 Mean 22.02 861.48 244.41 391.94 342.86 95.40 Hawthorn inflorescence (HI) 1593.52 ± IG8 26.44 ± 3.10 FG 641.90 ± 5.62 298.75 ± 3.86 gf 588.19 ± 17.17 e 95.17 ± 0.15 e 4.81 IG9 28.89 ± 3.30 258.33 ± 1.20 a 314.08 ± 5.98 485.38 ± 5.22 252.26 ± 47.38 acdf 95.17 ± 0.40 ef 29.97 ± 3.21 1053.30 ± IG10 449.10 ± 3.17 247.06 ± 3.36 431.72 ± 35.85 b 95.10 ± 0.10 ef BFGH 5.05 660.00 ± IG11 30.80 ± 3.11 ABH 271.52 ± 11.60 bc 276.14 ± 2.85 bef 1645.02 ± 19.53 89.97 ± 1.06 25.98 415.84 ± IG12 30.50 ± 3.05 BF 270.88 ± 2.07 c 297.73 ± 0.83 g 515.75 ± 13.24 100.43 ± 0.31 d 25.72 ab Mean 29.32 378.34 286.75 841.61 686.59 95.17 Przybylska & Bazylak 137

* - products with an ecological certificate, ** - FG7 – hawthorn fruit (40 %), apple fruit, chokeberry fruit, hibiscus flower, citric acid and FG13 – hawthorn fruit (51 %), hibiscus flower, hawthorn inflorescence (10 %), rosehip, *** - nd - not detected, DW – dry weight, **** - expressed as the mg of citric acid per 100 mL. The big and small letters indicate the statistically significant differences (p < 0.05) and no statistically significant differences (p > 0.05) between samples tested.

In our results the highest citric acid content analyzed for sample FG13 (3355.10 ± 4.44 mg 100g-1 DW). It should be emphasized that this value is not commensurate with the naturally occurring concentration of this acid in the HF, due to the addition different part of medicinal plants, i.e. hawthorn inflorescence, hibiscus flower and rosehip. The high citric acid content was found in aqueous extracts prepared from uncrushed dry HF in samples FG14 and FG15 (1917.62 ± 1.90 mg 100g-1 DW and 1990.65 ± 4.10 mg 100g-1 DW respectively), while the citric acid content in the extracts from crushed HF was in the range of 50.77 ÷ 134.97 mg 100g-1 DW (Table 3). The aqueous extracts from HF is richer in citric acid content than HI over 2.0 times. Pande & Akoh (2010) obtained similar results. The whole fruits and leafs of Crataegus sp. characterized by citric acid content at the level 17.1 ± 3.8 mg 100g-1 FW and 8.5 ± 3.0 mg 100g-1 FW. In turn Pereira et al. (2013) described citric acid content in C. monogyna fruits at the level of 0.73 ± 0.03 mg g-1 DW, while in the flowers and flowering shoots at the level 8.33 ± 0.07 mg g-1 DW. Gundogdu et al. (2014) demonstrated that the highest citric acid content is in C. pseudoheterophylla fruits at level of 25.69 ± 0.04 g 100g-1 FW. In another study, the citric acid content was the richest in C. pinnatifida fruits compare with C. brettschneideri and C. scabrifolia (Liu et al. 2010). The mean malic acid concentration in aqueous extracts prepared from dry HF (244.41 mg 100g-1 DW) is comparable with extracts from dry HI (286.75 mg 100g-1 DW). See Table 3 and Figure 2. In turn, Pande & Akoh (2010) described the malic acid content in whole fresh fruit at the level of 1460.00 ± 45.30 mg 100g-1 FW, while in the leafs at the level only 658.00 ± 22.40 mg 100g-1 FW. Among eleven analyzed HF species, C. pseudoheterophylla characterized by the highest malic acid content (2.67 ± 0.05 g 100g-1 FW) (Gundogdu et al. 2014). In C. pinnatifida malic acid was not found (Liu et al. 2010).

Figure 2. Malic acid, oxalic acid and tartaric acid content in aqueous extracts obtained from dry HF (FG1 – FG15) and HI (IG8 – IG12). As shown in Figure 2 and Table 3, the oxalic acid content was determined at the of level 841.61 mg 100g-1 DW in aqueous extracts prepared from dietary supplements containing HI, while in the extracts from HF 391.94 mg 100g-1 DW. In the other study, oxalic acid was absent in whole HF but present in the hawthorn leafs at the level 18.6 ± 3.90 mg 100g-1 FW (Pande & Akoh 2010). In the study of Gundogdu et al. (2014), the highest oxalic acid content was measured in C. monogyna subsp. azarella fruits at the level of 3.28 ± 0.15 g 100g-1 FW, while the lowest in the C. szovitsii at the level of 0.54 ± 0.00 g 100g-1 FW. The decreased results were calculated for C. monogyna fruits obtained from western and central Spain. Mean oxalic acid content was at the level of 57.40 ± 26.94 mg 100g-1 FW (Morales et al. 2013). In turn higher oxalic acid concentration was found in C. monogyna fruits at the level of 2.10 mg g-1 DW and C. monogyna flowers and flowering shoots 9.15 ± 0.88 mg g-1 DW (Pereira et al. 2013).

138 Journal of Agriculture and Environmental Sciences, Vol. 7(2), December 2018

The content of tartaric acid in aqueous extract of dry HI is about 2.0 times higher than extract from HF (Figure 2). According to the data, organic acid content of fruits vary depending on the species (Gundogdu et al. 2014). Chinese HF have higher organic acid content compare with variety of Crataegus fruits originated from Europe (Jurikova et al. 2012). According to results of Gundogdu et al. (2014) C. pseudoheterophylla fruits had the highest tartaric acid content (2.22 ± 0.04 g 100g-1 FW), while C. atrosanguinea had the diminished tartaric acid content (0.61 ± 0.03 g 100g-1 FW). Edwards et al. (2012) described content of tartaric acid in cultivars of C. scabrifolia, C. sanguinea, C. cuneata and C. pinnatifida at the level of 21.9, 16.9, 11.2 and 16.3 mg g-1, respectively.

Correlation analysis for aqueous extracts prepared from dry hawthorn fruits (HF). In the present study, the positive correlation was observed between TPC and TFC (r = 0.70, p < 0.05). See Figure 3. García-Mateos et al. (2013) obtained the lower Pearson’s correlation between phenolic and flavonoid content in HF (Crataegus spp.) of Mexico, commonly name tejacote (r = 0.53, p < 0.05).

Results showed that TPC, TFC is positively and highly correlated with fragmentation degree expressed as bulk density (r = 0.73, p < 0.05 and r = 0.79, p < 0.05 respectively). Dmowski et al. (2014) did not found any statistical significance between content of total polyphenols and fragmentation degree of infusions of selected black teas regardless of the time of extraction (3 and 15 minutes).

Figure 3. The relationship (p < 0.05) between parameters of the tested aqueous extracts prepared from dry HF (●) and HI (▲). In our results, no correlation was observed between TPC and antioxidative activity with DPPH and ABTS radicals in aqueous extracts prepared from dry hawthorn fruits. Similar effects was observed in Mraihi et al. (2013) study. In this study correlation between TE equivalent antioxidant capacity (TEAC) and total phenolic contents of C. monogyna had a coefficient varied between 0.32 ÷ 0.97 while the high correlation coefficient was calculated of C. azarolus was 0.99 and 0.82. In turn, high correlation was observed between TFC and DPPH (r = 0.74, p < 0.05) and ABTS values (r = 0.85, p < 0.05). No correlation between ascorbic acid content and antioxidative activities with DPPH and ABTS radicals may indicate that the ascorbic acid has no effect on radical scavenging activity (Ishiwata et al., 2004). The study of correlation relationships suggested that fragmentation degree and flavonoid compounds are responsible for antioxidant properties of aqueous extract of dietary supplements and herbal blends containing dry HF. Also, very strong correlations was found between total acidity and antioxidant capacity with DPPH assay (r = - 0.95 ÷ 0.90, p < 0.05), while no correlation was observed between total acidity and ABTS values. Przybylska & Bazylak 139

The high correlation coefficient was found between citric and oxalic content (r = - 0.65, p < 0.05), while correlation between citric and tartaric acid was r = 0.82 (p < 0.05). A slightly decreased correlation coefficient was calculated between citric and tartaric acid for pomegranate (r = 0.68, p < 0.01) (Fawole & Opara 2013).

Correlation analysis for aqueous extracts prepared from dry hawthorn inflorescences (HI). The analysis of Pearson’s correlation coefficients of HF showed the very strong correlation between TPC and TFC (r = 0.96, p < 0.05) in aqueous extracts prepared from dry hawthorn inflorescences (Figure 3). Also, the very high correlation coefficients was measured between TPC and fragmentation degree of dietary supplements and herbal blends containing only HI (r = 0.91, p < 0.05). The high negative correlations was observed between TPC, TFC and antioxidative activities with DPPH (r = - 0,94 and r = - 0,98, p < 0.05), while strong positive correlation between TPC, TFC and antioxidative activities with ABTS (r = 0,80 and r = 0,83, p > 0.05). There were also very strong and negative correlation between malic acid content and TFC (r = - 0.89, p < 0.05), DPPH value (r = 0.97, p < 0.05). Similarly, the significant positive high correlation was observed between oxalic acid and citric acid content in aqueous extracts from dry HI (r = 0.98, p < 0.05).

Principal component analysis (PCA). The first two principal components (P1 and P2) explained 82.26% of the variance of collected data (Figure 4A). The results of PCA showed that two distinct groups were separated with line. The first two principal components performs almost a perfect separation of dietary supplements and herbal blends containing HF and HI with exception of the FG3 sample characterized by very high TPC (1066.97 ± 24.48 mg GAE 100g-1 DW), TFC (548.41 ± 0.40 mg CAE 100g-1 DW) and the highest malic acid content (400.85 ± 14.43 mg 100g-1 DW). These features may explain the proximity of the FG13 sample to HI on the PCA plane. The high concentration of TPC, TFC and malic acid in FG3 may indicate that the unripe fruit of HF were harvested. Unripe C. monogyna fruits characterized by the highest phenolics content and flavonoids content compare with ripened and over ripened fruits (Barros et al. 2010, Bahorun et al. 2003). Similarly properties was shown by Fawole & Opara (2013) analyzing polyphenols, flavonoids and malic acid contents at five different maturity stages of pomegranate. The position of the sample FG13 is probably conditioned the highest concentration of citric acid (3355.10 ± 4.44 mg 100g-1 DW) and TPC (1206.79 ± 18.30 mg GAE 100g-1 DW) in all analyzed samples. This properties can be related by the addition of parts of different medicinal plants to herbal blends (51% HF, hibiscus flower, 10% HI and rosehip) by the manufacturer. The similarity of samples belonging to group I (FG5, FG6, FG14 and FG15) characterized by the least fragmented HF and the diminished TPC, TFC, malic and oxalic acids contents, compared to the other groups. A B 1,2

0,8 ascorbic acid IG11 IG10 0,8 IG8 oxalic acid IG9 0,4 ABTS mM TE/100g FG3 IG12 0,4 ABTS mg TE/100g FG13 ABTS I% DPPH mM TE/100g IC50 DPPH I% 0,0 FG4 0,0 FG1 FG2 DPPH mg TE/100g FG7 P2 (22,35 %)P2 P2 (24,92 %)P2 flavonoids

-0,4 malic acid acidity -0,4 bulk density

FG5 citric acid FG6 -0,8 FG14 tartaric acid phenols -0,8 FG15 I

-1,2 -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 -1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 P1 (57,34 %) P1 (55,32 %)

Figure 4. Principal component analysis (PCA) of the first two principal components (P1 and P2). PCA biplot of the TPC, TFC, antioxidative effects with DPPH and ABTS radicals, organic acids contents and total acidity of aqueous extracts of dietary supplements and herbal blends containing HF and HI (A) and samples containing only HF (B).

In the Figure 4B, the first two principal components (P1 and P2) explained 77.67% of the variance of data. The PCA showed that TFC have short distance to the antioxidant activity in DPPH assay, what suggest the significant contribution these compounds to the antioxidant capacity aqueous extracts of dry HF. The high correlation between TFC and DPPH assay confirms this data (Figure 3). 140 Journal of Agriculture and Environmental Sciences, Vol. 7(2), December 2018

Ruiz-Rodrigez et al. (2014) used PCA to classify the wild C. monogyna fruits according to their active compounds. Significant strong correlation were found between TPC with antioxidant capacity measured by FRAP and ABTS assay. Authors indicated that phenolic compounds are the main contributor to the antioxidant capacity of HF and blacktorn (Ruiz-Rodrigez et al. 2014). In our study, bulk density and total acidity lie close to each other indicating a positive strong correlation (r = 0.81, p < 0.05) between this two trait in dry HF. Similarly, bulk density and DPPH assay lie close to each other (r = 0.75, p < 0.05), while IC50 value lies on the opposite diagonal corner (r = - 0.82, p < 0.05).

Conclusions

The results of this study demonstrated clear differences between biochemical composition and antioxidant activity of aqueous extracts of dietary supplements and herbal blends containing dry hawthorn fruits and hawthorn inflorescences. The total phenols and flavonoids content increased with the increasing degree of dry hawthorn fruits fragmentation. The present study shows that the addition the parts of other medicinal plant to herbal blends may contribute to the increase of total phenols content in aqueous extract of dry hawthorn fruits. An aqueous extracts containing dry hawthorn inflorescences are a richer source of active compounds compare with extracts with dry hawthorn fruits. We can speculate that dry hawthorn inflorescences have higher health prevention potential compare with hawthorn fruits. The principal component analysis (PCA) shows clear differences between the chemical composition of aqueous extracts of hawthorn fruits and hawthorn inflorescences.

Acknowledgement

The support from the Nicolaus Copernicus University, Collegium Medicum (Bydgoszcz, Poland) by internal grant UPB-407 and UPB-449 is kindly acknowledged.

References

Atanassova, M., Gerogieva, S. & Ivancheva, K. (2011). Total phenolic and total flavonoid contents, antioxidant capacity and biological contaminants in medicinal herbs. Journal of Chemical Technology and Metallurgy, 46(1), 81-88. Bahorun, T., Aumjaud, E., Ramphul, H., Rycha, M., Luximon-Ramma, A., Trotin, F. & Aruoma, O. (2011). Phenolic constituents and antioxidant capacities of Crataegus monogyna (Hawthorn) callus extracts, Nahrung/Food 47(3), 191-198. Barros, L., Carvalho, A. M. & Ferreira, I. C. F. R. (2011). Comparing the composition and bioactivity of Crataegus monogyna flowers and fruits used in folk medicine. Phytochemical Analysis, 22, 181-188. Bąk-Sypień, I. I., Karmańska, A., Kubiak, K. & Karwowski B. T. (2017). Antioxidant activity of fresh and thermal processed green and red cultivares of curly kale (Brassica oleracea L.). Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 50(3), 246-251. Censkowsky, U., Helberg, U., Nowack, A. & Steidle, M. (2007). Overview of world production and marketing of organic wild collected products. International Trade Centre UNCTAD/WTO, Geneva, Switzerland, 1-96. Dmowski, P., Śmiechowska, M. & Sagan, E. (2014). Effect of brewing time and fragmentation degree of black tea on colour of infusion and its antioxidant properties. Food. Science. Technology. Quality, 5(96), 206-216. Edwards, J. E., Brown, P. N., Talent, N., Dickinson, T. A. & Shipley P. R. (2012). A review of the chemistry of the genus Crataegus. Phytochemistry, 79, 5-26. Fawole, O. A. & Opara, U. L. (2013). Changes in physical properties, chmical and elemental composition and antioxidant capacity of pomegrante (cv. Ruby) fruit at five maturity stages. Scienta Horticulturae, 150, 37-46. Froehlicher, T., Hennebelle, T., Martin-Nizard, F., Cleenewerck, P., Hilbert, J-L., Trotin, F. & Grec, S. (2009). Phenolic profiles and antioxidative effects of hawthorn cel suspensions, fresh fruits and medicinal dried parts. Food Chemistry, 115, 897-903. García-Mateos, R., Ibarra-Estrada, E. & Nieto-Angel, R. (2013). Antioxidant compounds in hawthorn fruits (Crataegus spp.) of Mexico. Revista Mexicana de Biodiversidad, 84, 1298-1304. Gundogdu, M., Ozrenk, K., Ercisli, S., Kan, T., Kodad, O. & Hegedus, A. (2014). Organic acids, sugars, witamin C content and some pomological characteristics of eleven hawthorn species (Crataegus spp.) from Turkey. Biological Research, 47(1), 1-5. GUS-State Statistics Office in Poland. (2005). https://stat.gov.pl/obszary-tematyczne/rolnictwo- lesnictwo/lesnictwo/lesnictwo-2005,1,1.html; accession: 15.09.2018. Przybylska & Bazylak 141

Ishiwata, K., Yamaguchi, T., Takamura, H. & Matoba, T. (2004). DPPH Radical-scavenging activity and polyphenols content in dried fruits. Food Science and Technology Research, 10(2), 152-156. Jurikova, T., Sochor, J., Rop, O., Mlcek, J., Balla, S., Szekers, L., Adam, V. & Kizek, R. (20120. Polyphenolic profile and biological activity of Chinese hawthorn (Crataegus pinnatifida BUNGE) fruits. Molecules, 7, 14490-14509. Kabasakalis, V., Siopidou, D. & Moshatou, E. (2000). Ascorbic acid content of commercial fruit juices and its rate of loss upon storage. Food Chemistry, 70, 325-328. Leja, M., Mareczek, A. & Nanaszko, B. (2007). Antioxidant properties of fruits of certain wild tree and bush species. Roczniki Akademii Rolniczej w Poznaniu, 41, 327-331. Liu, P., Kallio, H., Lü, D., Zhou, C., Ou, S. & Yang, B. (2010). Acids, sugars and sugar alcohols in Chinese Hawthorn (Crataegus spp.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 1012-1019. Liu, P., Kallio, H. & Yang, B. (2011). Phenolic compounds in hawthorn (Crataegus grayana) fruits and leaves and changes during fruit repening. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59, 11141-11149. Liu, S., You, L., Zhao, Y. & Chang, X. (2018, a). Hawthorn polyphenol extract inhibits UVB-Induced skin photoaging by regulating MMP Expression and type I procollagen production in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 66(32), 8537-8546. Liu, S., Zhang, X., You, L., Guo, Z. & Chang, X. (2018, b). Changes in anthocyanin profile, color and antioxidant capacity of hawthorn fruit wine (Crataegus pinnatifida) during storage by pretreatments. LWT – Food Science and Technology, 95, 179-186. Mak, Y., W., Chuah, L., O., Ahmad, R. & Bhat, R. (2013). Antioxidant and antibacterial activities of hibiscus (Hibiscis rosa-sinensis L.) and Cassia (Senna bicapsularis L.) flower extracts. Journal of King Saud University, 25, 275-282. Morales, P., Ferreira, I. I. F. R., Carvalho, A. M., Fernández-Ruiz, V., Cortes Sánchez-Mata, M., Cámara, M., Morales, R. & Tardio, J. (2013). Wild edible fruits as a potential source of phytochemicals with capacity to inhibit lipid peroxidation. European Journal of Lipid Science and Technology, 115, 176-185. Mraihi, F., Journi, M., Chérif, J-K., Sokmen, M., Sokmen, A. & Trabelsi-Ayadi, M. (2013). Phenolic contents and antioxidant potential of Crataegus fruits grown in Tunisia as determined by DPPH, FRAP and β- carotene/linoleic acid assay. Journal of Chemistry, 2013, 1-6. Mraihi, F., Hidalgo, M., Pascual-Teresa, S., Trabelsi-Ayadi, M. & Chérif, J-K. (2015). Wild grown red and yellow hawthorn fruits from Tunisia as source of antioxidants. Arabian Journal of Chemistry, 8, 570-578. Ochmian, I., Grajkowski, J. & Smolik, M. (2012). Comparison of some morphological features, quality and chemical content of four cultivars of chokeberry fruits (Aronia melanocorpa). Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj- Napoca, 40(1), 253-260. Ogrodowska, D., Zadernowski, R., Tańska, M. & Czaplicki, S. (2011). Physical properties of Amaranthus cruentus seeds from different cultivation regions in Poland. Food. Science. Technology. Quality, 6(79), 91-104. Pande, G. & Akoh, C. C. (2010). Organic acids, antioxidant capacity, phenolic content and lipid characterization of Georgia-grown underutilized fruit crops. Food Chemistry, 120, 1067-1075. Pereira, C., Barros, L., Carvalho, A. M. & Ferreira, I. C. F. R. (2013). Use of UFLC-PDA for the analysis organic acids in thirty-five species of food and medicinal plants. Food Analytical Methods, 6, 1337-1344. Pliszka, B., Huszcza-Ciołkowska, G. & Wierzbicka, E. (2016). Effects of solvents and extraction methods on the content and antiradical activity of plyphenols from fruits Actinidia arguta, Crataegus monogyna, Gaultheria procembens and Schisandra chinensis. Acta Scientarium Polonorum Technologia Alimentaria, 15(1), 57-63. Przybylska, A. & Bazylak G. (2017). Assessment of microbiological quality of hawthorn (Crataegus spp.) dried fruits and inflorescences used as dietary supplements. Zeszyty Naukowe Naukowe UP Wrocław Seria Rolnictwo, 123(626), 101-114. Przybylska, A., Bazylak, G., Kosicki, R., Ałtyn, I., Twarużek, M. & Grajewski, J. (2018). The content of patulin in dietary supplements and herbal blends comprising of dried hawthorn fruits. Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 51(3), 161-168. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M. & Rice-Evans, C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology & Medicine, 26, 1231-1237. Ruiz-Rodrigez, B. M., de Ancos, B., Sánchez-Moreno, C., Fernández-Ruiz, V., Sánchez-Mata, M., C., Cámara, M. & Tardio, J. (2014). Wild blackthorn (Prunus spinosa L.) and hawthorn (Crataegus monogyna Jacq.) fruits as valuable sources of antioxidants. Fruits, 69, 61-73. Sperkowska, B. & Bazylak, G. (2010). Effects of extraction conditions on the soluble oxalate content in water infusions of green and herbal teas. Food. Science. Technology. Quality, 4(71), 107-121. 142 Journal of Agriculture and Environmental Sciences, Vol. 7(2), December 2018

Srivastava, M. P., Tiwari, R. & Sharma, N. (2013). Assessment of phenol and flavonoid content in the plant materials. Journal on New Biological Reports, 2(2), 163-166. Turkmen, N., Sari, F. & Velioglu, Y. S. (2006). Effects of extraction solvents on concentration and antioxidant activity of black and black mate tea polyphenols determined by ferrous tartrate and Folin-Ciocalteu methods. Food Chemistry, 99, 835-841. Witkowska, A., Zujko, M. E., Waśkiewicz, A., Terlikowska, K. M. & Piotrowski, W. (2015). Comparison of various databases for estimation of dietary polyphenol intake in the population of polish adults. Nutrients, 7, 9299- 9308. Yang, B. & Liu, P. (2012). Composition and health effects of phenolic compounds in hawthorn (Crataegus spp.) of different origins. Journal of the Science of Food and Agriculture 92, 1578-1590.

[P-5]

187

188

Hindawi Journal of Analytical Methods in Chemistry Volume 2019, Article ID 2159097, 13 pages https://doi.org/10.1155/2019/2159097

Research Article Advantageous Extraction, Cleanup, and UHPLC-MS/MS Detection of Patulin Mycotoxin in Dietary Supplements and Herbal Blends Containing Hawberry from Crataegus spp.

Anna Przybylska ,1 Grzegorz Bazylak ,1 Robert Kosicki,2 Iwona Altyn ,2 Magdalena Twaruzek ,2 Jan Grajewski ,2 and Anna Soltys-Lelek3

1Department of Pharmaco-Bromatology and Molecular Nutrition, Faculty of Pharmacy, Collegium Medicum, Nicolaus Copernicus University, Jagiellonska 13, PL-85067 Bydgoszcz, Poland 2Department of Physiology and Toxicology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Natural Sciences, Kazimierz Wielki University, Chodkiewicza 30, PL-85064 Bydgoszcz, Poland 3Ojcow National Park, Ojcow 9, PL-32045 Suloszowa, Poland

Correspondence should be addressed to Grzegorz Bazylak; [email protected] Received 14 October 2018; Revised 21 December 2018; Accepted 13 January 2019; Published 6 February 2019

Academic Editor: N´uria Fontanals

Copyright © 2019 Anna Przybylska et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Patulin (PAT) is a highly genotoxic mycotoxin still found as the common contaminant of various kinds of spoiled fruits and related commodities which are often endorsed as the health-enhancing products. Thus, a fast and convenient liquid-solid extraction followed by a solid-phase cleanup with the MycoSep 228 AflaPat multifunctional column was used for the highly efficient isolation of PAT with an average recovery of 112.7%® from commercial dietary supplements and herbal blends formulated with dried hawberry. Analysis of the PAT content was carried out using gradient elution with a Synergi Polar C18 column (150 × 2 mm, 4 μm) and UHPLC system equipped with a mass spectrometer. PAT was detected in all (n 14) commercial single- component dietary supplements formulated with dried hawberry belonging to Crataegus monogyna and/or Crataegus laevigata. Similarly, PAT was detected in 67% of the studied multicomponent commercial herbal blends (n 6) that contained—in addition to hawberry—different amounts of apple, chokeberry, elderberry, hibiscus, or mallow. Moreover, the PATcontent was determined in the hawberry collected from the mature wild hawthorn trees belonging to three botanical species, Crataegus monogyna Jacq., Crataegus laevigata (Poiret) DC, and Crataegus rhipidophylla Gand, growing in the recreational forest areas and in the law- protected state national forest park in Poland. In conclusion, to prevent PAT accumulation and reduce the health risk of consumers in globalizing markets, the implementation of improved cultivation/processing practices of hawthorn trees and hawberry as well as increased analytical control related to the presence of PAT in dietary supplements and herbal blends formulated with fresh, dried, or frozen hawberry should be urgently recommended.

1. Introduction supplements and herbal blends can be mainly formulated with use of dried hawberry, commonly described as the The use of hawthorn fruit (also called hawberry) and “false fruit” of hawthorn trees belonging to Crataegus hawthorn inflorescences in folk and official medicine hasa monogyna Jacq. (Lindm.) or Crataegus laevigata (Poir.) DC long tradition in many European countries, and currently, (syn. C. oxyacantha L.), as well as a mixture of hawberry hawberry-derived dietary supplements, herbal medicines, collected from both mentioned Crataegus spp. species or, and pharmaceuticals are commonly used by people with alternatively, hawberry from the hybrids of these species. In cardiovascular problems [1]. According to the recommen- addition, the European Pharmacopaeia [2] recommends a dation of the European Pharmacopaeia [2], dietary minimum concentration of 0.06% of procyanidines, 2 Journal of Analytical Methods in Chemistry

expressed as cyanidin chloride (C15H11ClO6), in such studies have described immunotoxic, neurotoxic, dermo- hawthorn-based therapeutic products. toxic, or teratogenic effects of PAT on animals and humans Traditionally, hawberry is harvested by many citizens [19, 20]. However, recently, according to the International and village inhabitants for their own needs and used in folk Agency for Research on Cancer (IARC), PAT was classified medicine for treatment of hypertension, obesity, and as a mycotoxin without carcinogenic properties [21]. menopause and improving memory in Mexico [3], Poland The major sources of PAT in the common human diet [4], and Portugal [5]. Numerous studies have confirmed that are apples, apple juice, pears, grapes, and strawberries [22]. standardized Crataegus spp. extract WS 1442 obtained The World Health Organization (WHO) recommends from carefully planted, harvested, and stored® hawberry is limiting the maximal PAT content in apple to 50 μg/kg, in healthy and safe and has highly beneficial effects in various apple juice to 25 μg/kg, and in baby food to 10 μg/kg. The groups of patients [6]. The review by Zorniak et al. [7] Joint Expert Committee on Food Additives of the World suggested that standardized extract WS 1442 can be suc- Health Organization (JECFA) recommended that daily cessfully used as an addition to optimal treatment® of chronic human exposure to PATshould be reduced to 0.4 μg/kg body heart failure in clinical conditions. Research conducted by weight per day [20, 23]. In Europe, in addition to being Veveris et al. [8] confirmed that the oral treatment of male found in apples, PAT has been found in tomatoes, pears, Wistar rats with the standardized Crataegus spp. extract quinces, apricots, cherries, black currants, and blue cheeses WS 1442 protects against the cardiovascular side effects [20, 24]. In previous years, the number of studies describing following® arrhythmias and heart reperfusion and can pre- the occurrence of PAT in products containing hawberry is vent myocardial dysfunction. still limited. However, some recent data on PAT de- The numerous beneficial outcomes of hawberry and termination in hawberry-derived beverages [25], hawberry their hot water extracts and infusions are due to the presence juice [26], hawberry slices, including dried, baked, and of active compounds such as flavonoids, especially the charred [27], and dried hawberry products in circular flakes, oligomeric proanthocyanidins [9]. The composition of rolls, strips, and dessert forms [28], have been reported from procyanidins in hawberry from each of the Crataegus spp. is China. To our best knowledge, for Europe, there are still no very characteristic, and it has been suggested that these papers describing the content of PAT in freshly harvested or compounds are more bioactive with an increased degree of stored hawberry or in dietary and medicinal products polymerization [8]. containing dried or frozen hawberry. In many European countries, the most common species The aim of this study was to evaluate the PAT contentin of hawthorn trees are Crataegus monogyna Jacq., Crataegus a series of typical, available-in-Poland, commercial dietary laevigata (Poiret) DC, Crataegus × macrocarpa Hegetschw, supplements and herbal blends containing dried hawberry and Crataegus rhipidophylla Gand. [10, 11], while in Asia, that have been used by subjects suffering from cardiovas- the species of Crataegus azarolus L., Crataegus pentagyna cular diseases and hypertension. In addition, the content of Willd., and Crataegus pinnatifida Bunge have been most PAT in representative samples of wild freshly harvested and frequently harvested [12]. The hawberries from each of the naturally dried or frozen hawberry have been determined. species of the Crataegus genus differ in their content of active compounds, e.g., flavonol-O-glycoside and vitexin-2″-O- 2. Materials and Methods rhamnoside. Edwards et al. [13] found that the content of flavonol-O-glycoside was in the range of 0.29–0.76 mg/g in 2.1. Samples. Twenty commercially available therapeutic the fruit of species Crataegus cuneata compared to 1.29– products and 21 harvested samples (batches) containing 3.45 mg/g in the fruit of species Crataegus monogyna. hawberry were analyzed in this study. Commercial products Similarly, the content of vitexin-2″-O-rhamnoside was in in the form of dietary supplements (n 14) and herbal the range of 0.021–0.023 mg/g in the hawberry of Crataegus blends (n 6) were purchased from supermarkets and pinnatifida, and this compound was not detected in the pharmacies in Bydgoszcz (Poland) in September 2016. These hawberry from the species Crataegus aronia var. aronia. medicinal products contained hawberry originating from However, in Crataegus monogyna, the content of these organic farms (n 3) and commercial plantations (n 17) flavonoids was up to 0.148 mg/kg [13]. located in various regions of Poland, as shown in Table 1. Patulin (4-hydroxy-4,6-dihydrofuro[3,2-c]pyran-2-one) The dietary supplements contained exclusively dried haw- is a secondary polyketide metabolite produced as a myco- berry (group I), while herbal blends (group IA) contained a toxin by several species of mold such as Penicillium, As- mixture of dried hawberry and different dried parts of pergillus, and Byssochlamys [14–17]. It has been postulated various medicinal plants, i.e., hawthorn inflorescence, hi- that the fungal biosynthesis of PAT takes place in an en- biscus flower, apple fruit, chokeberry, elderberry, rosehip, zymatic cascade involving 10 steps in which individual lavender flower, horsetail herb, or mallow flower. The weight enzymes could be activated consecutively as the newly content of the dried hawberry in these kinds of commercial synthesized product is being metabolized [18, 19]. Re- herbal blends was in the range of 40–60%. Dietary sup- gardless of the exact fungal mechanism of PAT biosynthesis, plements and herbal blends studied here are commonly studies on the cytotoxicity of PAT on a variety of animal consumed in Poland in the form of home-prepared water organisms showed it causes mitochondrial dysfunction, infusions where portion of 2.5 g of these hawberry-derived activates apoptotic signaling pathways, and induces reactive products with 200 mL of boiling water (100°C) in time of oxygen species-mediated oxidative cell damage [17]. Many 10 min is used [15, 20]. Journal of Analytical Methods in Chemistry 3

Table 1: Characteristic data of the studied 41 products and samples containing hawberry (hawthorn fruit). No. Sample Species of Crataegus spp. Producer Province of Poland Composition Group I: single-component commercial dietary supplements 1K1 Flos Lodzkie 2 K17 Dary natury Podlaskie 3 K24 Natur-vit Swietokrzyskie 4 K26 Kawon Wielkopolskie 5 K28 Dary natury Podlaskie 6 G1 Kawon Wielkopolskie 7 G2 Kawon Wielkopolskie C. monogyna/C. laevigata Hawberry (hawthorn fruit) 8 G3 Kawon Wielkopolskie 9 G4 Flos Lodzkie 10 G5 Flos Lodzkie 11 G6 Dary natury Podlaskie 12 G27 Flos Lodzkie 13 G14 Skarby natury Lubuskie 14 G15 Internet sale No data Group IA: multicomponent commercial herbal blends Hawberry (40%), lemon balm leaf (30%), lavender 15 K23 Herbapol Malopolskie flower (15%), horsetail herbx Hawberry (40%), apple fruitx, chokeberry fruitx, 16 G7 Bifix Lodzkie hibiscus flowerx, citric acidx Hawberry (51%), hibiscus flowerx, hawthorn 17 G13 Malwa Lubuskie inflorescencex, rose hipx C. monogyna/C. laevigata Hawberry (60%), elderberry fruit (18%), hibiscus 18 K14 Herbapol Malopolskie flower (17%), mallow flower (5%) Hawberry (61%), elderberry fruit (18%), hibiscus 19 K18 Herbapol Malopolskie flower (17%), mallow flower (4%) Hawberry (40%), applex, chokeberry fruitx, hibiscus 20 K19 Bifix Lodzkie flowerx, concentrate of chokeberry fruitx, citric acidx Group II: naturally dried at 20°C, freshly harvested hawberry 21 G23 C. laevigata Ojcówa Malopolskie Hawberry 22 G24 C. laevigata Ojcow´ a Malopolskie Hawberry 23 G25 C. laevigata Ojcówa Malopolskie Hawberry 24 G26 C. rhipidophylla Ojcow´ b Malopolskie Hawberry 25 G27 C. rhipidophylla Ojcówa Malopolskie Hawberry 26 G28 C. rhipidophylla Ojcow´ a Malopolskie Hawberry Group III: frozen at −20°C, freshly harvested hawberry 27 F1 Fordon 1c 28 F2 Fordon 1c 29 F3 Fordon 1c 30 F4 Fordon 1c 31 F5 Fordon 1c 32 F6 Fordon 1c 33 F7 Fordon 1c 34 F8C. monogyna Fordon 1c Kujawsko-Pomorskie Hawberry 35 F9 Fordon 1c 36 F10 Fordon 1c 37 F11 Fordon 1c 38 F12 Fordon 2d 39 F13 Fordon 2e 40 F14 Fordon 2f 41 F15 Bartodziejeg Notes. xNot defined content. a–gGeographical coordinates for location: a,b50°12′37.4″N, 19°48′49.0″E (radius of 2 km); c53°09′52.7″N, 18°09′07.3″E (radius of 200 m); d53°09′46.1″N, 18°09′50.4″E; e53°09′36.9″N, 18°09′59.9″E; f53°09′22.9″N, 18°09′13.2″E; g53°07′29.5″N, 18°02′29.4″E.

Manufacturers provided information about the genus stored at +20°C from the mature wild hawthorn trees located species of hawthorn trees from which the hawberry was used in the Ojcow National Park located in south part of Poland. to produce their commercial dietary supplements and herbal Fifteen batches of hawberry (group III in Table 1) were blends (Table 1). The six different samples (batches) of harvested from the mature wild hawthorn trees identified as hawberry Crataegus laevigata and Crataegus rhipidophylla the Crataegus monogyna species and located in two different (group II in Table 1) were collected, air-dried naturally, and places in the Fordon and Bartodzieje districts of Bydgoszcz 4 Journal of Analytical Methods in Chemistry

(north part of Poland). All of these hawberry batches from was 1.0 mL/min, and the injection volume of the analyzed Bydgoszcz were stored at −20°C prior to the PAT content sample was 5.0 μL. Curtain- and collision-induced dissoci- analysis performed in December 2016. Healthy and un- ation gas flow was set at 80 and 30 psi, respectively. Theion damaged hawberry were harvested in Ojcow and Bydgoszcz source temperature was 600°C. The ion spray voltage was set in September/October 2016. The genus and species of the to 4500 V. Declustering and cell exit potential were set to mature wild hawthorn trees and their fruits were identified −85 V and −7/−9 V for nonlabeled PAT and −95 V and −13/ using a set of specific morphological data with the kind −13 V for 13C-labeled PAT. Collision energy was set at −12 expertise support of Dr. Anna Sołtys-Lelek from Ojcow´ and −16 V for, respectively, PAT and 13C-PAT. The multiple National Park, Poland. reaction monitoring (MRM) was operated with dwell time 200 ms at m/z 153/109.1 and 153/81 for PAT and m/z 160/ 115 and 160/86.1 for 13C-PAT in the electrospray ionization 2.2. Chemicals andReagents. Internal standards of the (ESI) negative ion mode. nonlabeled patulin (PAT) and the isotopically labeled 13C patulin (13C-PAT) were obtained from, respectively, Sigma- 13 Aldrich (St. Louis, MO, USA) and Biopure (Guntramsdorf, 2.5. Fragmentation Pathways of PAT and C-PAT. The Austria). The crude methanolic solutions (0.5 mg/mL) of probable fragmentation path of the nonlabeled PAT was each of these standards were stored at 4°C. Ultrapure ace- determined from the ESI-MS/MS mass spectrum, as pre- tonitrile, methanol, and ammonium acetate were obtained sented in Figure 1, by identifying differences of the m/z values. The mass spectra consists of deprotonated molecular from Merck (Darmstadt, Germany). Deionized water − (80 MΩ) used in the analysis was prepared using a Simplicity ion [M-H] of PAT at m/z 153.0 and gives much structural information. The outstanding intensity of the pseudomo- 185 water purification system (Millipore, Bedford, MA, − USA). lecular ion [M-H] of PAT may indicate the high stability of this compound. Among the eliminated groups, we could identify water 2.3.ExtractionProcedureofPAT. Four grams of each studied (−18 Da), carbon monoxide (−28 Da), carbon dioxide product with hawberry were carefully milled and homog- (−44 Da), acetaldehyde (−44 Da), and fragments of ions enized to a fine powder with the final fineness of approxi- with a mass of 72 Da corresponding to compounds with a mately 10 μm using a mortar grinder. Next, this powdered molecular formula C2O3 or C3H4O2. The ion at m/z 109 sample was dissolved in 16.0 mL of acetonitrile : water (80 : indicates loss of carbon dioxide (CO2) or acetaldehyde − 20, v/v) mixture, vigorously shaken for 45 min, and (C2H4O) by the parent ion [M-H] of PAT. Due to being centrifuged at 3500 × g for 10 min. Then, 8.0 mL of this the same molecular weight, it is difficult to separate these obtained sample extract (supernatant) was passed over two compounds. These results are in good agreement with 30 sec by the push-through-type solid-phase cleanup/ previously published research on the PATmass spectra and filtration column MycoSep®228 AflaPat (Romer, Newark, earlier studies on the fragmentation of PAT [17, 29, 30]. DE, USA). The 4.0 mL of purified eluate was transferred into The observed path of fragmentation ofthe 13C-labeled a conical vial and evaporated to dryness under a gentle PAT, as presented in Figure 2, was very similar to the stream of nitrogen at 45.0°C. The residue was redissolved in fragmentation of the nonlabeled PAT. 1.0 mL of a methanol : water (1 : 4, v/v) mixture by sonication and then filtered by a 0.22 μm PTFE syringe filter (Macherey-Nagel, Duren,¨ Germany). To the total volume of 2.6. Method Validation. The analytical procedure developed 180.0 μL of this purified extract was added 20.0 μL of isotopic here was validated according to the ICH guidelines for its 13C-labeled PAT (13C-PAT) (or, alternatively, nonlabeled specificity, linearity, accuracy, precision, limit of detection PAT) as the internal standard solution at a concentration of (LOD), limit of quantification (LOQ), and robustness [31]. 0.5 mg/mL. Then, this final sample solution was placed ina Quantification of UHPLC results was performed bycom- conical vial for the automatic sampler to perform the paring peak areas for each analyzed sample to calibration analysis. curves of PAT standards [32]. Recovery and precision of the method was evaluated by analyzing fortified samples at different PAT or 13C-PAT concentrations in triplicate. 2.4. UHPLC-MS/MS Analysis of PAT. A Shimadzu Nexera Correlation coefficients (R) were calculated to estimate LC system (Shimadzu, Kyoto, Japan) equipped with a 5500 linearity of peak areas relative to the PATstandards. Internal Q-TRAP triple quadrupole mass spectrometer (Sciex, Fra- standards (13C-PAT or PAT) were used to correct for an- mingham, MA, USA) was used in the analysis. Separation of alytical recovery and for matrix effects in time of MS/MS PAT was done with the use of a Synergi Polar C18 column detection. In this SPE-UHPLC-MS/MS procedure, the ex- (150 × 2 mm, 4 μm) supplied by Phenomenex (Torrance, CA, traction recovery for the spiked PAT at concentrations of USA). The binary mobile phase was a combination of solvent 50.0 and 100.0 μg/kg was 112.7 and 109.4%, respectively. The A (10 mM ammonium acetate in water) and B (10 mM concentration linearity range for PAT was 2.0 to 100.0 μg/kg ammonium acetate in methanol), applying the following (R 0.9987). Limits of detection (LOD, signal-to-noise ratio gradient program: 0.0–1.0 min, linear from 0.0 to 10.0% B; of 3) and quantification (LOQ 3 × LOD) for PAT were, 1.0–7.0 min, linear from 10.0 to 90.0% B; 7.0–8.0 min, 90.0% respectively, 1.0 and 3.0 μg/kg. LOD and LOQ were calcu- B; 8.1–12.0 min, 10.0% B. The flow rate of the mobile phase lated by spiking samples at low concentrations with PAT (1, Journal of Analytical Methods in Chemistry 5

153.0 1.24e7 (M–H)– (M–H–CO2) (M–H–C2H4O) 1.0e7 109.0 – (M–H–CO2–CO) – (M–H–C2H4O–CO) 7.5e6

81.0 5.0e6 Intensity (cps) Intensity

(M–H–CO)– (M–H–H O)– 2.5e6 69.0 2 79.0 83.0 135.0 67.0 107.0 125.0 123.0 151.1 0.00 65 80 95 110 125 140 155 m/z (Da) − Figure 1: Mass spectrum showing the deprotonated molecular ion [M-H] of PAT at m/z 153.0.

160.0 9.0e6 (M–H)– 8.0e6 13 – (M–H– CO2) 13 – (M–H– C2H4O) 13 13 – (M–H– CO2– CO) 115.0 6.0e6 13 13 – (M–H– C2H4O– CO)

4.0e6 86.0

Intensity (cps) Intensity (M–H–H O) (M–H–13CO) 2 2.0e6 72.0 84.0 87.0 142.0 112.9 131.0 157.7 70.0 129.0 0.00 65 80 100 120 140 165 m/z (Da) − Figure 2: Mass spectrum showing the deprotonated molecular ion [M-H] of 13C-labeled PAT at m/z 160.0.

5, 10, 20, 50, and 100 μg/kg) and subjecting them to all steps 3. Results and Discussion of sample preparation. The intradayn ( 6) and interday (n 15) precision (% RSD) of this method of PAT de- 3.1. UHPLC-MS/MS Analysis. The representative chro- termination were, respectively, in the range of 5.2–10.6% and matograms obtained during UHPLC-MS/MS analyses of 7.8–12.4%. PAT content in the dietary supplements, herbal blends, and fresh samples are shown in Figure 3. The identity of PAT was confirmed by comparing the electrospray ionization (ESI) 2.7. Statistical Analysis. All analyses were carried out in MS/MS spectrum of the peak eluting at the retention time triplicate. The obtained results were evaluated with Statistica observed earlier for the nonlabeled and isotope-labeled PAT v.9 (StatSoft, Tulsa, OK, USA). The results are presented as standards (Figures 1 and 2). Reference negative ion mode the mean ± standard deviation (Table 2). In all of these ESI MS/MS spectra of PAT standards were acquired and analyses, we examined the outcome of the mean content of interpreted as described Section 2.5. In addition, PAT was PATusing Student’s t-test and p value ≤ 0.05 was considered confirmed in the contaminated hawberry products after as significant. In hierarchical clustering calculation, the spiking the extract with an equivalent amount of PAT and Ward agglomeration procedure as a grouping method and checking the symmetry of the parent eluting peak at the Euclidean distance as a function of the distance was applied, exact retention time of this compound. and results are displayed graphically using a dendrogram Compared to the work of Li et al. [25] on determination (classification tree). Differences in profile among subclusters of PAT in the hawberry products with the Xterra C18 were verified with the nonparametric Mann–Whitney U test column and isocratic elution using tetrahydrofuran-water at p ≤ 0.05 as significant. (0.8 : 92.2, v/v) as the mobile phase, the retention time of 6 Journal of Analytical Methods in Chemistry

Table 2: Content of patulin (PAT) in the 41 analyzed products and samples with hawberry from Poland. Percentage of PAT Average PAT Median PAT Range of PAT Products type Groupx positive samples content (μg/kg) content (μg/kg) content (μg/kg) Commercial single-component I 14/14 (100%) 11.4 ± 5.5a 9.5 5.7/25.9 dietary supplements (n 14) Commercial multicomponent IA 4/6 (67%) 15.7 ± 31.6b 6.8

6.0e4

PAT (6.17 min) 3.0e4 Signal intensity Signal

1.0 6.0 11.0 Time (min) (a)

3.0e4

G27 1.5e4 Signal intensity Signal

1.0 6.0 11.0 Time (min) (b)

3.0e4

1.5e4 G6 Signal intensity Signal

1.0 6.0 11.0 Time (min) (c)

Figure 3: (a) Chromatograms of the standard solution of PAT referring to concentration of 30 μg/kg; (b) dietary supplement G27 with an average PAT content of 15.6 μg/kg; (c) dietary supplement G6 with an average PAT content of 9.1 μg/kg.

PAT in the gradient UHPLC conditions was practically the moreover, the LOD for PAT reported in the former method same (i.e., 5.80 vs. 6.17 min); however, the LOD for the PAT with diode array detection was 3.99 μg/kg compared to achieved in the former method, operating with UV detection 1.0 μg/kg found using our procedure. The separation effi- at 276 nm, was only 8.0 μg/kg compared to 1.0 μg/kg offered ciency of the gradient UHPLC method proposed in our by our method. Similarly, compared to the retention time of study is also superior to the isocratic HPLC procedure re- PATobserved in the isocratic HPLC method used to analyze ported by Ji et al. [28] for the study of hawberry products hawberry products reported by Zhou et al. [26] with a using an Xbridge C18 column and acetonitrile-water (10 : 90, Venusil C18 column and acetonitrile-water (5 : 95, v/v) as v/v) mobile phase, in which the retention time of PAT was the mobile phase, we found in our gradient HPLC condi- 8.18 min and the LOD for PAT with UV detection at 276 nm tions a nearly sevenfold shorter retention time for PAT, and was in the range 2.6 to 7.5 μg/kg. In addition, the retention Journal of Analytical Methods in Chemistry 7 time of PAT in our gradient UHPLC procedure was nearly slightly lower content of PAT was found in 10% of com- twofold higher than that obtained using the gradient HPLC mercial, dried hawberry products purchased from various method reported by Xiang et al. [27] for determination of supermarkets in Hangzhou (China). The range of concen- PAT in dried hawberry-derived medicinal products, where a tration of PAT in these products was 5.1/11.1 μg/kg [28]. In Shiseido Capcell PAK C18 MGIII column was used with the hawberry beverages, PAT was found in 14% of the 5.0 mmol/L ammonium acetate in methanol as the mobile analyzed samples, and the average content of PAT was phase. In the same report by Xiang et al. [27], the use of the 116.3 μg/kg, with a range of 19.8 to 206.9 μg/kg [25]. The ESI MS/MS detection mode offered an LOD of PAT of lower content of PAT at 12.3 μg/kg was determined in the 3.0 μg/kg. one sample of hawberry juice purchased in a supermarket in Replacement of the acetonitrile used in the cleanup/ Beijing (China) [26]. filtration step with a MycoSep 228 AflaPat multifunc- Our results showed that only in the one studied product, tional column by Li et al. [25] and® Zhou et al. [26] and with i.e., herbal blend K19, was the average concentration of PAT a ProboFast 228 multifunctional column applied by Ji nearly twofold higher than the WHO acceptable limit of et al. [28] with® acetonitrile-water (80 : 20, v/v) in our PAT for apples, i.e., 93.2 versus 50.0 μg/kg. Next, in the procedure resulted in an improved average recovery of dietary supplement G2 and the herbal blend K19, the PAT up to 112.7% at a spiked level of 50.0 μg/kg, and the content of PATexceeded the WHO acceptable upper limit of extraction method accuracy and precision of PAT de- 25 μg/kg that is recommended for clear and cloudy apple termination in hawberry products was quite comparable to juices. Our results also showed that, in the set of seven these three mentioned earlier reports. The satisfactory analyzed dietary supplements and herbal blends (K17, K24, average extraction recovery of PAT observed in our study K28, G2, G27, G14, and K19), the content of PAT was (112.7%) was highly improved compared to the rather low significantly higher than 10 μg/kg, which is the acceptable average recovery of PAT (i.e., 64.0%) from hawberry upper limit determined by WHO for baby food, which could products as reported by Xiang et al. [27] after use of the also be used as the reference upper limit for hawberry- ultrasonically supported water-ethyl acetate liquid-liquid derived therapeutic products consumed by older humans extraction. and convalescent subjects. The content of PAT in the studied dietary supplements, Considering the place of origin, i.e., the province of Poland herbal blends, and wild hawberry is shown in Table 2 and specified in Table 1, we observed that the average contentof Figure 4. PAT was found in 47% of the 41 studied products PAT in the PAT-contaminated samples (n 19) was signif- and samples, which means that PAT was identified in 19 icantly different and decreased in this order: Lodzkie Province analyzed items, with an average PAT concentration of (23.5 ± 34.2 μg/kg, n 6), Podlaskie Province (13.9 ± 4.3 μg/ 14.9 ± 19.5 μg/kg (range 5.7/93.2 μg/kg, median concentra- kg, n 3), Wielkopolskie Province (11.9 ± 9.4 μg/kg, n 4), tion of PAT was 9.10 μg/kg). The highest average content of Swietokrzyskie Province (11.4 ± 1.4 μg/kg, n 1), Malopolskie PAT was found in the herbal blend numbered K19 (Table 1), Province (5.2 ± 4.1 μg/kg, n 3), and Lubulskie Province where it reached the value of 93.2 μg/kg, while the lowest (4.9 ± 5.7 μg/kg, n 2). These data suggest that hawberry concentration of PAT was below the limit of detection harvested and processed by manufacturers located in central (LOD 1.0 μg/kg) in all of the samples of frozen wild and northeast parts of Poland (Lodzkie Province and Pod- hawberry from Bydgoszcz (samples F1–F15 in Table 1 and laskie Province, respectively) had nearly 3- to 4-fold higher group III in Table 2), the five naturally dried wild hawberry concentrations of PAT than the hawberry grown and pro- from Ojcow (G23, G24, G25, G27, and G28 in Table 1), and cessed in the south and southwest parts of Poland (Malo- the two herbal blends K23 and G13 (Table 1 and Figure 4). polskie Province and Lubuskie Province). In dietary The results showed that 100% of the commercial dietary supplement G15 supplied from an Internet store, the average supplements (n 14, group I in Table 1) formulated with content of PAT was 7.7 μg/kg (Figure 4 and Table 2). hawberry from C. monogyna/C. laevigata trees were con- Our results also suggested that noncontrolled addition of taminated by PAT with an average concentration of apple (Malus domestica Borkh.), chokeberry, (Aronia mel- 11.4 ± 5.5 μg/kg and a range of 5.7 to 25.9 μg/kg. However, in anocarpa (Michx.) Elliott), and elderberry (Sambucus nigra the group of studied herbal blends (n 6, group IA, Table 1), L.) accompanied by flowers of ethnoveterinary plant hi- only 67% of products were contaminated by PAT with an biscus (Hibiscus sabdariffa L.) or garden plant mallow average concentration of 15.7 ± 31.6 μg/kg and a range of (Althaea rosea L.) by manufacturers to the hawberry-derived

100 93.2 Group I: single-component commercial dietary supplements Group IA: multicomponent commercial herbal blends 75 Group II: fresh hawberries naturally dried Group II Group IA g/kg) μ 50

Patulin ( Patulin 25.9 25 Group I 17.5 15.2 15.6 9.9 11.4 10.1 9.5 5.7 8.3 7.8 6.6 8.1 9.1 7.7 7.8 9.0 5.8 <1.0 <1.0 <1.0 0 K1 K17 K24 K26 K28 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G27 G14 G15 K23 G7 G13 K14 K18 K19 G25 G26

Symbol of sample Figure 4: Comparison of average content of PAT in the hawberry-derived commercial products and freshly harvested samples. The all frozen hawberry harvested in Bydgoszcz, Poland (group III), and the four hawberry samples collected in Ojcow, Poland (group II), where the PAT content was below 1.0 μg/kg have been omitted for clarity (Tables 1 and 2). increase in PAT concentration up to 93.2 μg/kg (Figure 1). mature trees in Ojcow, located in the southern part of Our finding could be quite reasonable since the PAT pro- Poland, the maximum PAT content was 9.5 μg/kg. In this ducing Penicillium expansum isolates, as confirmed by special case of samples, the average PAT content was in- detecting the patN gene coding the key enzyme isoepoxydon creased to 3.8 μg/kg in spite of the fact that both of these dehydrogenase involved in the PAT metabolic pathway, has kinds of hawberries were processed and stored under the been recently identified in fresh chokeberry (Aronia mela- same drying conditions at +20°C (Figure 5). nocarpa (Michx.) Elliott) harvested in Bulgaria [33] and Considering the accumulation of PAT in the hawberries from the same pome fruit cultivated in Italy [34]. In ad- obtained from the various hawthorn genus species, it can be dition, some Penicillium commune strains producing seen that PAT was probably not biosynthesized in the patulin-like compounds have been isolated from endophytic hawberry obtained from the species of Crataegus laevigata fungi of the semimangrove flowering tree of the beach hi- (samples G23, G24, and G25; Tables 1 and 2 and Figure 5). biscus (Hibiscus tiliaceus L.) distributed in the tropical and Barad et al. [18] suggested that cultivars of apple trees (which subtropical coastal regions of China [35]. Recently, both like the hawthorn tree belong to the rose family, Roseacea) Penicillium sp. and Aspergillus sp. mold strains were re- are an important factor influencing the inhibition of PAT ported in the endopytic flora of the Krosor and Samyl in- biosynthesis. The Golden Supreme variety of apples can dustrial cultivars of elderberry (Sambucus nigra L.) freshly become completely rotten, showing visible mold growth in harvested in northern regions of Poland [36]. the exterior and interior of the fruit (incubated for 59 days at Depending on the type of apple variety and place of 20.5°C), but there were was no PAT accumulation detected harvest, the content of PAT was in a range from 1.0 to during the analysis. On the contrary, the Fuji variety of apple 70.6 μg/kg in Portugal and from to 8.8 to 417.6 μg/kg in the analyzed after 80 days of incubation at 20.5°C resulted in a USA [37]. In Portugal, samples of apples and quinces have PATconcentration at a level of 5.9 μg/kg. Additionally, in the been examined for the presence of PAT using a GC-MS McIntosh variety of apples, PAT was not detected after method by Cunha et al. [30], who determined PAT in stored 80 days of incubation at 11.0°C [23]. These data and some apples covered with 25% brown areas had an average content results from our present study indicate that there is a need to of 3.2 μg/kg, but in apples covered with 75% brown areas, the extend future research to the content of PATand the specific PAT content was increased to 1500.0 μg/kg. The same report fungal species producing this mycotoxin in the hawberry of showed that 100% of organic apple juice was contaminated every individual genus species of the Crataegus genus. with PAT at an average level of 8.9 μg/kg, and 50% of Patulin (PAT) was not detected in the frozen hawberry conventional apple juice had 9.9 μg/kg of PAT. In turn, the harvested from the Crataegus monogyna mature hawthorn quinces with 25% and 75% brown areas were infected by trees located in Fordon and Bartodzieje districts in PAT at an average level of, respectively, 4.9 and 118.3 μg/kg Bydgoszcz (n 15, group III, Tables 1 and 2). It is well [30]. For comparison, the average concentration of PAT in known that temperature has a principal influence on PAT pineapples and seedless grapes in Pakistan were the highest, biosynthesis and its production. A refrigeration temperature respectively, at 254.1 and 286.1 μg/kg [14]. of +4.0°C does not prevent PAT accumulation in apple fruit, In the samples of naturally dried hawberry G23, G24, but dropping the temperature to +1.0°C reduces PAT pro- and G25 harvested from Crataegus laevigata mature trees duction significantly [38]. However, an increase in the PAT located in Ojcow (Poland, Malopolskie Province), the av- concentration with a temperature drop from +20.0 to +4.0°C erage PAT concentration was below the limit of detection was not observed for all strains of Penicillium expansum (LOD 1.0 μg/kg), while in the samples G26, G27, and G28 [38]. Similar results were obtained by McCallum et al. [39] with hawberry harvested from the Crataegus rhipidophylla who observed that PAT concentration in apples was Journal of Analytical Methods in Chemistry 9

10 13.7

g/kg) μ

5 Patulin ( Patulin <1.0 3.8 0 Crataegus monogyna Crataegus laevigata Crataegus rhipidophylla Figure 5: Distribution average content of PAT (μg/kg) in the 41 studied commercial dietary supplements, herbal blends, and freshly harvested hawberry in relation to the identified genus species of Crataegus spp. (Tables 1 and 2). decreased with a temperature drop from +25.0 to +4.0°C. of analyzed products was very closely classified; i.e., dietary The results of Murillo-Arbizu et al. [40] indicated that PATis supplements G5, G4, and K1 were characterized by a slightly stable over a period of 6 months at −20.0°C and there was no increased PAT content in the range 6.6–9.9 μg/kg, and it protein denaturation effect on the PAT content. These ref- originated from the same province (Lodzkie, central Poland) erence data suggest that, before the freezing process applied but a different manufacturer (Flos) (Poland). to hawberry is collected from the Crataegus monogyna trees, In Figure 7, an additional separate dendrogram was PAT production had not been initiated and that storage calculated and constructed for the analyzed six multicom- conditions of −20.0°C as applied in our study to the frozen ponent herbal blends (group IA, Table 1) considering the hawberry successfully enabled the avoidance of biosynthesis observed average PAT content, manufacturer, province of of PAT in this kind of fruit. origin, genus, and species of Crataegus spp., and type of In Figure 6, the results of the hierarchical cluster analysis additional ingredients. A separate single element cluster is in the form of a dendrogram is presented in which the PAT- visible in this dendrogram in which herbal blend K19 with contaminated 19 products and samples with hawberry from the highest content of PAT (93.2 μg/kg) was included. In groups I, IA, and II (Table 1) were classified into the three cluster A, were classified the three herbal blends K18, K14, separate clusters: A, B, and C. In fact, an additional separate and G7, which contained the highest whole fraction of single element cluster is visible in Figure 6 in which the various fruits such as the hawberry (up to 61%), elderberry dietary supplement G2 with the highest average content of (up to 18%), and apple fruit (Table 1). The average content of PAT (25.9 μg/kg) was included. In clusters A and B, three PAT in these three herbal blends was 7.5 μg/kg, with a range studied hawberry products were included, while cluster C of 5.8 to 9.0 μg/kg (Figure 4). Flowers and leaves of various included fourteen products. Cluster A includes the analyzed medicinal plants constituted a smaller proportion of the hawberry products G13, G25, and K23 in which PAT was analyzed herbal blends (group IA, Table 1), but the herbal below the limit of detection, and all of these products blends K18, K14, and G7 containing the addition of hibiscus originated from Malopolskie and Lubuskie provinces (Ta- and mallow flowers have been included in cluster A ble 1). The hawberry-derived products K23 and G13 belong (Table 1). to the multicomponent herbal blends containing, re- Cluster B in Figure 7 included herbal blends G13 and spectively, 40 and 51% hawberry harvested from Crataegus K23 in which the average PATcontent was below the limit of monogyna and/or Crataegus laevigata trees but in unknown detection. The composition of these two herbal blends, in proportions in the final product. Sample G25 contained only addition to hawberry, included hawthorn inflorescence the hawberry harvested from the wild tree of Crataegus (which is probably free of PAT), hibiscus flower, lemon balm laevigata (Table 1). leaf, lavender flower, horsetail herb, and small amounts of Cluster B in Figure 6 included three hawberry-derived dog rose flower. We suggest that the high content ofmel- products G27, K28, and K17 with nearly the same con- atonin, selenium, and ascorbic acid and low-weight organic centration of PAT, 15.7, 15.2, and 17.2 μg/kg, respectively acids in these additional ingredients of both herbal blends (Figure 4), and originated from Podlaskie and Lodzkie G13 and K23 could protect them from the patulin- Provinces. These three commercial one-component dietary producing fungal strains [41, 42]. supplements were formulated exclusively with dried haw- Until now, to our best knowledge, no study has reported berry collected from the hawthorn tree species Crataegus on the content of PAT in commercial herbal blends con- monogyna and/or Crataegus laevigata (Table 1). taining hawberry harvested from the hawthorn trees species The third main cluster C in Figure 6 contained fourteen of Crataegus monogyna and/or Crataegus laevigata, which hawberry-derived products characterized by a lower average are used in the form of infusions and herbal teas in the content of PAT in the range of 5.1 to 10.1 μg/kg. In this prevention of hypertension and other cardiovascular dis- cluster C, the dietary supplements G3, G1, and K26 char- eases [25–28]. Consumption of apple fruit and apple juices acterized by their relatively low PAT contents in the range and infusions of dietary supplements containing dried 5.7–8.3 μg/kg originated in Wielkopolskie Province (western hawberry by adult humans could lead cumulatively to an part of Poland) and were produced by the same manufac- increased risk of an excessive daily patulin intake (DPI) that turer Kawon (Poland). In this cluster C, a second subgroup can then be compared with the JECFA-WHO recommended 10 Journal of Analytical Methods in Chemistry

8E +00

A C 4E +00 Similarity B

0E –01 G2 G13 G25 K23 G27 K28 K17 G7 K24 G26 G14 K18 K14 G15 G3 G1 K26 G6 G5 G4 K1

Symbol of sample Figure 6: Dendrogram (classification tree) showing similarity of the studied commercial dietary supplements, herbal blends, andfreshly harvested hawberries (groups I, IA, and II; Table 1) in view of determined PAT content, producer, province of origin, genus species of Crataegus spp., and composition (single-component versus multicomponent commercial products).

6E +01

Similarity A B

0E –01 K19 K18 K14 G7 G13 K23 Symbol of sample Figure 7: Dendrogram (classification tree) showing similarity of studied commercial multicomponent herbal blends (group IA, Table1)in view of determined PAT content and individual ingredients. provisional maximum tolerable daily intake (PMTDI) of With these criteria, the calculated average DPI was PAT [22, 23]. Thus, the following criteria were adopted here equal to 0.0014 μg PAT (i.e., 1.4 ng PAT) per kg of body for estimation of this DPI value by adult subjects suffering weight. This value represents 0.35% of the PMTDI rec- from cardiovascular diseases in Poland: mean body weight ommended by JECFA-WHO as 0.4 μg PAT per kg of body 70 kg, portion of 2.5 g of dried hawberry for preparation of weight [23]. More than 70-fold higher values of daily infusion with 200 mL of boiling water (100°C) in time of patulin intake (DPI) have been reported for consumption 10 min, and consumption of three 200 mL glasses of men- of apple juices by infants, i.e., 26% of the PMTDI rec- tioned earlier infusion per day as the quantity specified ommended by JECFA-WHO [40], and in cases of apple frequently by producers of hawberry-derived dietary sup- juice consumption by children, 24% of this PMTDI was plements [41, 42] with an average content of PAT at 14.9 μg/ reported by Baert et al. [22]. However, the overall chronic kg (as calculated from the 19 samples analyzed here that intake assessment of PAT in a Chinese population revealed were contaminated by this mycotoxin). PAT is classified as that only 0.00004% of the abovementioned PMTDI the noncharged, polar, and strongly hydrophilic lactone- (i.e., 16 pg per kg of body weight) was consumed via dried − − type compound (log Kow 2.40, log P 1.0) which in- hawberry products [28]. This means that estimated average dicates a very good solubility in water and common polar DPI for hawberry-derived products from Poland indicated solvents [43], and thus near-complete 100% extraction of the near ten thousand-fold increased the value compared to PAT from hawberry-derived products to their water in- DPI calculated for the same Chinese hawberry products. fusions could be hypothesized. However, PAT is classified Thus, despite the relatively low content of PAT inthe rather as the heat-resistant mycotoxin, especially in solu- hawberry-derived products from Poland and the protective tions with pH range 3.5/5.5, and its degradation levels of 18.8 action of dietary supplied green tea polyphenols, vitamin E, and 26.0% after heat treatments for 20 min at 90 and 100°C, and apigenin against deleterious effects of PAT in humans respectively, have been reported [44–47]. Similarly, pas- [17], it is necessary to pay more attention to the fact that, in teurization at 60/90°C for 10 s resulted in 18.8% reduction in older humans, aging causes progressive degenerative PAT concentration observed in apple cider, but heating for changes in all cells and organs, thus reducing the tolerance 20 min at 70/80°C during the evaporation process resulted, of microbial toxins by the human body [48–50]. Especially, respectively, in 9.4 and 14.06% degradation levels of PAT regular consumption of PAT-contaminated dietary sup- [45–47]. Thus, based on results of these previous reports plements and foodstuffs by humans with reduced cell [44–47], during home preparation of considered hawberry concentration of glutathione caused by inflammation, infusion, an approximate degradation level of PAT equal to hypoxia, or enzyme polymorphism could lead to the in- 15% could be reasonably hypothesized. creased risk of PAT-related genotoxicity and severe Journal of Analytical Methods in Chemistry 11 damage of key organs like kidney, intestinal tissue, and References immune system [51]. [1] S. Rastogi, M. M. Pandey, and A. K. S. Rawat, “Traditional herbs: a remedy for cardiovascular disorders,” Phytomedicine, 4. Conclusions vol. 23, no. 11, pp. 1082–1089, 2016. [2] European Pharmacopaeia, European Directorate for the A sensitive, reproducible, and rapid UHPLC-MS/MS Quality of Medicines, Council of Europe, Strasburg, France, method was described in this paper for determination 9th edition, 2017, https://www.edqm.eu/. of patulin (PAT) concentration in commercial dietary [3] B.-T. Jose´ Antonio, C.-R. Margarita, and M.-I. Daniel, “Bi- supplements and herbal blends containing dried hawberry ological properties and antioxidant activity of hawthorn (n 20). The results show that an alarming proportion of Crataegus mexicana,” Journal of Pharmacogenomics and 90% (n 18) of the analyzed commercial products from Pharmacoproteomics, vol. 6, no. 4, pp. 1–8, 2015. Poland was contaminated with PAT. One of the studied [4] L. Luczaj, K. Oklejewicz, K. A. Nowak, and E. Piroznikow, herbal blends (K19) exceeded by almost twice the ac- “Folk names of hawthorns (Crataegus) and roses (Rosa)in ceptable maximal limits for PAT in fruit products rec- Poland from the end of the 19th century up to the present,” ommended by the WHO, i.e., 93.2 vs 50.0 μg/kg. It could Rocznik Dendrologiczny, vol. 56, no. 1, pp. 115–129, 2008. be hypothesized that alone or combined with apple, [5] J. M. Neves, C. Matos, C. Moutinho, G. Queiroz, and chokeberry, elderberry, or hibiscus flower while not L. R. Gomes, “Ethnopharmacological notes about ancient uses sufficiently controlling the microbial quality in these of medicinal plants in Tr´as-os-Montes (northern of Portu- hawberry-based herbal blends could lead to an increased gal),” Journal of Ethnopharmacology, vol. 124, no. 2, pp. 270–283, 2009. content of PAT in these types of commercial marketed [6] C. J. F. Holubarsch, W. S. Colucci, and J. Eha, “Benefit-risk medicinal products. Moreover, PAT was found at an ± assessment of Crataegus extract WS 1442: an evidence-based average concentration of 11.4 5.5 μg/kg and range of 5.7 review,” American Journal of Cardiovascular Drugs, vol. 18, to 25.9 μg/kg in every analyzed dietary supplement no. 1, pp. 25–36, 2017. (n 14) containing only dried hawberry collected from [7] M. Zorniak, B. Szydlo, and T. F. Krzeminski, “Crataegus the hawthorn species C. monogyna and/or C. laevigata.In special extract WS 1442: up-to-date review of experimental our study, PAT was not found in the naturally dried and clinical experiences,”® Journal of Physiology and Phar- hawberry at +20.0°C that was harvested from Crataegus macology, vol. 68, no. 4, pp. 521–526, 2017. laevigata (samples G23, G24, and G25 in Table 1), while an [8] M. Veveris, E. Koch, and S. S. Chatterjee, “Crataegus special average content of PAT of 3.8 μg/kg was found in the extract WS 1442 improves cardiac function and reduces in- naturally dried hawberry obtained from Crataegus rhi- farct size in a rat model of prolonged coronary ischemia and pidophylla (samples G26, G27, and G28) harvested in the reperfusion,” Life Sciences, vol. 74, no. 15, pp. 1945–1955, national park area of Ojcow (Poland). Similarly, PAT was 2004. not detected in the frozen hawberry at −20.0°C(n 15) [9] W.-T. Chang, J. Dao, and Z.-H. Shao, “Hawthorn: potential collected from the mature wild hawthorn trees Crataegus roles in cardiovascular disease,” American Journal of Chinese Medicine, vol. 33, no. 1, pp. 1–10, 2005. monogyna in the recreational forest area of Bydgoszcz [10] A. Soltys-Lelek, “Genus Crataegus L. in the Ojcow national park,” (Poland). In conclusion, we suggest that there is an urgent Pradnik Prace i Materialy Muzeum im. Prof. Wl. Szafera, vol. 18, need to intensify and extend the analytical control related no. 1, pp. 7–36, 2008, http://www.ojcowskiparknarodowy.pl/ to the presence of PAT in freshly harvested, stored, and main/pradnik.html. processed hawberry and other fruit components used as [11] A. Soltys-Lelek, “Crataegus and Rosa genera in the Solec Basin ingredients in dietary supplements and herbal blends that and southern part of the Pinczow Hummock (southern are commonly consumed by a broad range of adult Poland),” Biodiversity Research and Conservation, vol. 25, subjects with serious cardiovascular disorders. no. 1, pp. 55–66, 2012. [12] A. Soltys-Lelek and W. Gruszka, “Wild roses and hawthorns of urban area: a case study of Pila in Poland,” Biodiversity Data Availability Research and Conservation, vol. 43, no. 1, pp. 27–40, 2016. [13] J. E. Edwards, P. N. Brown, N. Talent, T. A. Dickinson, and The data used to support the results of this study arein- P. R. Shipley, “A review of the chemistry of the genus Cra- cluded within the article. taegus,” Phytochemistry, vol. 79, no. 7, pp. 5–26, 2012. [14] S. Z. Iqbal, S. Malik, M. R. Asi, J. Selamat, and N. Malik, Conflicts of Interest “Natural occurrence of patulin in different fruits, juices and smoothies and evaluation of dietary intake in Punjab, Paki- The authors declare that they have no conflicts of interest. stan,” Food Control, vol. 84, no. 2, pp. 370–374, 2018. [15] A. Przybylska and G. Bazylak, “Microbiological quality, organic acids and patulin content in dried inflorescences and Acknowledgments fruits of hawthorn (Crataegus spp.) used as components of functional food products,” Postepy Mikrobiologii, vol. 52, The support from the Nicolaus Copernicus University, no. s1, p. 116, 2013. Collegium Medicum (Bydgoszcz, Poland), by the internal [16] A. Przybylska and G. Bazylak, “A comparison of the selectivity grants DS-UPB-407/2016-18 and DS-UPB-449/2016-18 is of nano-HPTLC systems used for determination of patulin in kindly acknowledged. fruit juices from the internet stores and pharmacies,” Current 12 Journal of Analytical Methods in Chemistry

Issues of Pharmacy and Medical Sciences, vol. 26, no. 2, [32] A. Blajet-Kosicka, R. Kosicki, M. Twaruzek, and J. Grajewski, pp. 155–159, 2013. “Determination of moulds and mycotoxins in dry dog and cat [17] X. Wang, C. Jin, Y. Zhong et al., “Glutathione reduction of food using liquid chromatography with mass specrometry and patulin-evoked cytotoxicity in HEK293 cells by the prevention fluorescence detection,” Food Additives & Contaminats: Part of oxidative damage and the mitochondrial apoptotic path- B Surveillance, vol. 7, no. 4, pp. 302–308, 2014. way,” Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 66, [33] R. Genchev, G. Angelova, I. Laskova, V. Gotcheva, and no. 29, pp. 7775–7785, 2018. A. Angelov, “Mycoflora of fresh chokeberryAronia ( mela- [18] S. Barad, E. Sionov, and D. Prusky, “Role of patulin in post- nocarpa) and ochratoxin-producing ability of Penicillium harvest diseases,” Fungal Biology Reviews, vol. 30, no. 1, isolates,” Quality Assurance and Safety of Crops & Foods, pp. 24–32, 2016. vol. 7, no. 2, pp. 123–131, 2015. [19] O. Puel, P. Galtier, and I. Oswald, “Biosynthesis and toxi- [34] S. M. Sanzani, A. Susca, S. Mastrorosa, and M. Solfrozzo, cological effects of patulin,” Toxins, vol. 2, no. 4, pp. 613–631, “Patulin risk associated with blue mould pome fruit marketed 2010. in southern Italy,” Quality Assurance & Safety Crops & Foods, [20] A. Przybylska and G. Bazylak, “Microbiological quality vol. 9, no. 1, pp. 23–29, 2016. assesment of dried hawthorn fruit and hawthorn in- [35] H.-J. Yan, S.-S. Gao, X.-M. Li, B.-G. Wang, and B. G. Wang, florescences (Crataegus spp.),” Zeszyty Naukowe UP Wroclaw “Chemical constituents of a marine-derived endophytic Seria Rolnictwo, vol. 123, no. 626, pp. 101–114, 2017. fungus Penicillium commune G2M,” Molecules, vol. 15, no. 5, [21] V. Ostry, F. Malir, J. Toman, and Y. Grosse, “Mycotoxins as human carcinogens—the IARC Monographs classification,” pp. 3270–3275, 2010. Mycotoxin Research, vol. 33, no. 1, pp. 65–73, 2016. [36] B. Pliszka, “Polyphenolic content, antiradical activity, stability [22] K. Baert, B. De Meulenaer, A. Kamala, C. Kasase, and and microbiological quality of elderberry (Sambucus nigra L.) F. Devlieghere, “Occurrence of patulin in organic, conven- extracts,” Acta Scientiarum Polonorum Technologia Ali- tional, and handcrafted apple juices marketed in Belgium,” mentaria, vol. 16, no. 4, pp. 393–401, 2017. Journal of Food Protection, vol. 69, no. 6, pp. 1371–1378, 2006. [37] J. D. Ioi, T. Zhou, R. Tsao, and M. F. Marcone, “Mitigation of [23] B. C. M. Salomão, G. M. F. Aragão, J. J. Churey, O. I. Padilla- patulin in fresh and processed foods and beverages,” Toxins, zakour, and R. W. Worobo, “Influence of storage temperature vol. 9, no. 5, p. 157, 2017. and apple variety on patulin production by Penicillium [38] K. Baert, F. Devlieghere, H. Flyps et al., “Influence of storage expansum,” Journal of Food Protection, vol. 72, no. 5, conditions of apples on growth and patulin production by pp. 1030–1036, 2009. Penicillium expansum,” International Journal of Food Mi- [24] B. Andersen, J. Smedsgaard, and J. C. Frisvad, “Pen- crobiology, vol. 119, no. 3, pp. 170–181, 2007. icilliumexpansum: consistent production of patulin, chaeto- [39] J. L. McCallum, R. Tsao, and T. Zhou, “Factors affecting globosins, and other secondary metabolites in culture and patulin production by Penicillium expansum,” Journal of Food their natural occurrence in fruit products,” Journal of Agri- Protection, vol. 65, no. 12, pp. 1937–1942, 2002. cultural and Food Chemistry, vol. 52, no. 8, pp. 2421–2428, [40] M. Murillo-Arbizu, E. Gonzalez-Peñas,´ and S. Amezqueta,´ 2004. “Comparison between capillary electrophoresis and high [25] F. Li, S. Zhao, L. Chin et al., “Determination of patulin in performance liquid chromatography for the study of the apple and hawthorn beverages by solid-phase filtration col- occurrence of patulin in apple juice intended for infants,” umn and liquid chromatography,” Journal of the Association Food and Chemical Toxicology, vol. 48, no. 8-9, pp. 2429–2434, of Official Agricultural Chemists International, vol. 90, no. 1, 2010. pp. 167–172, 2007. [41] G. Bazylak, M. Siepak, A. Gryn, and A. Przybylska, “Inorganic [26] Y. Zhou, W. Kong, Y. Li, A. F. Logrieco, J. Xu, and M. Yang, anions content in fresh aqueous infusions of dried hawthorn “A new solid-phase extraction and HPLC method for de- fruits and inflorescences used as ingredients of dietary sup- termination of patulin in apple products and hawthorn juice plements for hypertensive subjects,” Planta Medica, vol. 80, in China,” Journal of Separation Science, vol. 35, no. 5-6, no. 16, pp. 1470-1471, 2014. pp. 641–649, 2012. [42] G. Bazylak, M. Siepak, A. Przybylska, A. Gryn, and [27] L. Xiang, Y. Gao, D. Liu, and M. Yang, “Rapid determination B. Sperkowska, “Melatonin and selenium content in dried of patulin in medicinal hawthorn fruits by HPLC-MS/MS,” white mulberry leaves, hawthorn inflorescences and multi- World Mycotoxin Journal, vol. 5, no. 1, pp. 31–36, 2012. herbal blends used as functional dietary supplements,” Planta [28] X. Ji, R. Li, H. Yang, P. Qi, Y. Xiao, and M. Qian, “Occurrence of patulin in various fruit products and dietary exposure Medica, vol. 81, no. S1, pp. S1–S381, 2016. assessment for consumers in China,” Food Control, vol. 78, [43] S. Budavari, The Merck Index—An Encyclopedia of Chemicals, no. 8, pp. 100–107, 2017. Drugs, and Biologicals, Merck and Co., Inc., Whitehouse [29] V. Sewram, J. J. Nair, T. W. Nieuwoudt, N. L. Leggott, and Station, NJ, USA, 12th edition, 1996. G. S. Shephard, “Determination of patulin in apple juice by [44] M. P. Doyle, R. S. Applebaum, R. E. Brackett, and E. H. Marth, high-performance liquid chromatography-atmospheric pres- “Physical, chemical and biological degradation of mycotoxins sure chemical ionization mass spectrometry,” Journal of in foods and agricultural commodities,” Journal of Food Chromatography A, vol. 897, no. 1-2, pp. 365–374, 2000. Protection, vol. 45, no. 10, pp. 964–971, 1982. [30] S. C. Cunha, M. A. Faria, and J. O. Fernandes, “Determination [45] J. L. Wheeler, M. A. Harrison, and P. E. Koehler, “Presence of patulin in apple and quince products by GC-MS using and stability of patulin in pasteurized apple cider,” Journal of 13C5-7 patulin as internal standard,” Food Chemistry, Food Science, vol. 52, no. 2, pp. 479-480, 1987. vol. 115, no. 1, pp. 352–359, 2009. [46] C. Kadakal and S. Nas, “Effect of heat treatment and evap- [31] EMEA, International Conference on Harmonization, Vali- oration on patulin and some other properties of apple juice,” dation of Analytical Procedures, Text and Methodology Q2 Journal of the Science of Food and Agriculture, vol. 83, no. 9, (R1), EMEA, Hoofddorp, Netherlands, 2006. pp. 987–990, 2003. Journal of Analytical Methods in Chemistry 13

[47] B. Kabak, “The fate of mycotoxins during thermal food processing,” Journal of the Science of Food and Agriculture, vol. 89, no. 4, pp. 987–990, 2009. [48] G. Bjorklund, M. Dadar, N. Martins et al., “Brief challenges on medicinal plants: an eye-opening look at ageing-related disorders,” Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, vol. 122, no. 6, pp. 539–558, 2018. [49] S. Langley-Evans, Nutrition: A Lifespan Approach, Wiley- Blackwell, Chichester, UK, 2009. [50] M. Twaruzek, E. Soszczynska, P. Winiarski, A. Zwierz, and J. Grajewski, “The occurrence of molds in patients with chronic sinusitis,” European Archives of Oto-Rhino-Laryn- gology, vol. 271, no. 5, pp. 1143–1148, 2014. [51] N. Glaser and H. Stopper, “Patulin: mechanism of genotoxicity,” Food and Chemical Toxicology, vol. 50, no. 5, pp. 1796–1801, 2012. NanomaterialsJournal of

Journal of International Journal of Analytical Methods The Scientiﬁc Journal of in Chemistry World Journal Applied Chemistry Photoenergy Hindawi Hindawi Hindawi Publishing Corporation Hindawi Hindawi www.hindawi.com Volume 2018 www.hindawi.com Volume 2018 http://www.hindawi.comwww.hindawi.com Volume 20182013 www.hindawi.com Volume 2018 www.hindawi.com Volume 2018 Nanoma

Advances in International Journal of Physical Chemistry Medicinal Chemistry

Hindawi Hindawi www.hindawi.com Volume 2018 www.hindawi.com Volume 2018

Submit your manuscripts at www.hindawi.com

Bioinorganic Chemistry Journal of and Applications Materials Hindawi Hindawi www.hindawi.com Volume 2018 www.hindawi.com Volume 2018

Advances in Journal of BioMed International Journal of International Journal of Tribology Chemistry Research International Spectroscopy Electrochemistry Hindawi Hindawi Hindawi Hindawi Hindawi www.hindawi.com Volume 2018 www.hindawi.com Volume 2018 www.hindawi.com Volume 2018 www.hindawi.com Volume 2018 www.hindawi.com Volume 2018

Journal of Journal of Enzyme Biochemistry Spectroscopy Nanotechnology Research Research International Hindawi Hindawi Hindawi Hindawi www.hindawi.com Volume 2018 www.hindawi.com Volume 2018 www.hindawi.com Volume 2018 www.hindawi.com Volume 2018