Maria Isabel Galbiatti Estudo Da Anatomia, Morfologia E Perfil

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Instituto de Biologia

Maria Isabel Galbiatti

Estudo da anatomia, morfologia e perfil químico do óleo essencial de Plectranthus neochilus Schltr. (Lamiaceae)

Study of the anatomy, morphology and chemical profiles of the essential oils of Plectranthus neochilus Schltr. (Lamiaceae)

Campinas 2019

Maria Isabel Galbiatti

Estudo da anatomia, morfologia e perfil químico do óleo essencial de Plectranthus neochilus Schltr. (Lamiaceae)

Study of the anatomy, morphology and chemical profiles of the essential oils of Plectranthus neochilus Schltr. (Lamiaceae)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Biologia Vegetal da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Biologia Vegetal.

Dissertation presented to the Graduate Program in Plant Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master, in the area of Plant Biology.

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA MARIA ISABEL GALBIATTI E ORIENTADA PELA PROF.ª DRA. ALEXANDRA CHRISTINE HELENA FRANKLAND SAWAYA E COORIENTAÇÃO DE PROF.ª DRA. JULIANA LISCHKA SAMPAIO MAYER.

Orientadora: Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya Co-orientadora: Juliana Lischka Sampaio Mayer

Campinas 2019

COMISSÃO EXAMINADORA

Profª. Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya

Profª. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques

Profª. Dra. Sara Adrián López de Andrade

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica da aluna.

AGRADECIMENTOS

O presente trabalho foi realizado com apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Código de Financiamento 001, processo 132849/ 2018-6. Ao Universo e a todo o sagrado existente. A mim, pela coragem de mudar a direção da minha vida profissional e me dedicar ao mestrado nesse momento. À minha família que me incentivou e contribuiu para que eu pudesse realizar o sonho de fazer o mestrado. À professora Dra. Alexandra Sawaya por toda orientação, dedicação, ensinamentos e principalmente pela paciência com minhas dificuldades. À professora Dra. Juliana Mayer por toda orientação, pelo carinho, ensinamentos e prontidão em me auxiliar. Á UNICAMP por toda infraestrutura, em especial ao Instituto de Biologia e Instituto de Química. Ao laboratório ThoMSon do IQ pelo uso do GC-MS com injetor automático, pois sem essa ferramenta seria impossível realizar as análises de metabolômica. Ao David, José e Vinicius por terem me ensinado sobre o GC-MS e ajudado nos momentos finais. À pesquisadora Márcia Ortiz pela parceria, conversas científicas e uso do laboratório de Fitoquímica do Instituto Agronômico de Campinas para as extrações do óleo essencial. A técnica Daniela e os alunos queridos da Márcia, Dayane, Ana Paula e Júlio, que juntos trocamos muitas informações. Ao Herbário da UNICAMP (UEC) pelo estágio e pelos ensinamentos. À querida taxonomista Julie Dutilh que carinhosamente e pacientemente sentou comigo para discutir taxonomia e confirmou características da espécie. Á Amanda Mesquista pela parceria na citogenética. Aos colegas do departamento de Biologia Vegetal (Botânica e Fisiologia Vegetal) pelas conversas nos corredores, nos cafés, pelos momentos de diversão e por todo o apoio. Ao Luciano pela ajuda no uso de equipamento e ao Carlão pelo auxílio gentil prestado no campo. Aos colegas de laboratório LabMetaMass: Vanessa, Mara, Guilherme e Elisa por toda ajuda, pelas dúvidas discutidas, pelos socorros e pelo mais especial, nossa amizade. Aos amigos da Anatomia Vegetal: Fábio, Elimar, Edimar, Mariana, Gleyce, Deni, Lais, Thainá, Marília que me ajudaram com as dificuldades do laboratório, me ensinaram do zero as técnicas pacientemente e, além disso, pelas conversas e convivência especial que tivemos nesse período. Ao técnico do laboratório Tião, pelo suporte técnico, auxílio nas preparações de reagentes e companheirismo, sempre disposto a ajudar. A todos que fizeram parte dessa jornada, agradeço de coração! RESUMO

Lamiaceae é uma família que abriga um dos maiores gêneros, Plectranthus L'Hér., que possui espécies ornamentais, comestíveis, medicinais, de interesse econômico e diversos usos etnobotânicos. Plectranthus neochilus Schltr. é uma espécie introduzida, mas amplamente cultivada no Brasil, popularmente conhecido como boldo gambá, boldinho e boldo miúdo. A revisão bibliográfica apontou certa dificuldade em identificar a espécie devida às semelhanças morfológicas com Plectranthus ornatus. O óleo essencial da espécie apresenta monoterpenos e sesquiterpenos com atividades biológicas pouco exploradas. Além disso, há uma variação entre os compostos químicos identificados para a espécie. Por isso, o objetivo do trabalho foi utilizar quatro indivíduos em dois ambientes de cultivo, ao sol pleno no campo e na estufa, com coletas ao longo de um ano nos períodos manhã e tarde e verificar, com bases em estudos anatômicos e citogenéticos, possíveis características para a identidade da espécie; avaliar o perfil químico do óleo essencial e suas atividades biológicas; e, através da análise metabolômica untargeted, avaliar os voláteis da espécie nos dois ambientes ao longo de um ano e verificar se há variação mensal entre eles. Os estudos anatômicos e citogenéticos forneceram características que confirmam que os indivíduos utilizados nesse trabalho são todos da mesma espécie, Plectranthus neochilus e características para a identidade da espécie. O óleo essencial apresentou como composto majoritário o trans-cariofileno e -tujeno, e atividade antimicrobiana, porém sem potencial antioxidante quando avaliado por DPPH. A análise metabolômica untargeted apontou que não há variação mensal dos voláteis estatisticamente significantes mesmo em meses de altas temperaturas e ausência de chuva, mas que há diferenças estatisticamente significantes entre os ambientes de cultivo. O composto 1-octen-3-ol se apresentou mais intenso no cultivo na estufa e no período da tarde quando cultivada a sol pleno. Tal fato pode ser devido a um provável estresse ambiental sofrido pela espécie nessas condições.

Palavras-chave: Plectranthus neochilus, análise metabolômica untargeted, cromatografia gasosa, headspace por SPME, óleo essencial, anatomia vegetal.

ABSTRACT

Lamiaceae is a family that houses one of the largest genera, Plectranthus L'Hér., which has ornamental, edible, medicinal species of economic interest and various ethnobotanical uses. Plectranthus neochilus Schltr. is an introduced species, but widely cultivated in Brazil, popularly known as boldo gambá, boldinho and small boldo. A review of the literature pointed out a certain difficulty in identifying the species due to the morphological similarities with Plectranthus ornatus. The essential oil of the species presents monoterpenes and sesquiterpenes with little explored biological activities. In addition, there is a variation between the chemical compounds identified for the species. Therefore, the objective of the study was to use four individuals in two growth environments, in full sun on the field and in the greenhouse, with yeal-long collections in the morning and afternoon, and to verify, based on anatomical and cytogenetic studies, possible characteristics for the identity of the species; to evaluate the chemical profile of the essential oil and its biological activities; and, through untargeted metabolomic analysis, to evaluate the volatiles of the species in the two environments over a year and to verify if there is monthly variation between them. The anatomical and cytogenetic studies provided characteristics that confirm that the individuals used in this work are all of the same species, Plectranthus neochilus and characteristics to identify the species. The essential oil had, as main compounds, trans-caryophyllene and -tujene, presented antimicrobial activity but no antioxidant potential when evaluated by DPPH. The untargeted metabolomic analysis indicated that there is no statistically significant monthly variation of volatiles even in months of high temperatures and absence of rain, but that there are statistically significant differences between the growth environments. The 1-octen-3-ol compound was more intense in the greenhouse and in the afternoon when grown in full sun. This fact may be due to a probable environmental stress suffered by the species under these conditions.

Keywords: Plectranthus neochilus, untargeted metabolomic analysis, gas chromatography, SPME headspace, essential oil, plant anatomy.

LISTA DE FIGURA

Figura 1. Plectranthus ornatus. A – Parte vegetativa da espécie. B – Inflorescência. Fonte: Dissertação de mestrado de Fernanda Rodrigues Nascimento, 2014 – UFV...... 26

Figura 2. Plectranthus neochilus. A – Parte vegetativa da espécie. B – Inflorescência. Casa de vegetação do Instituto de Biologia da Unicamp. Arquivo pessoal...... 26

Figura 3. A- Plectranthus caninus. B – Plectranthus neochilus. C - Plectranthus orntus. Imagens extraída de Codd, 1961, 1975...... 28

Figura 1.1. A – Indivíduos provenientes da UNICAMP, CPQBA, Guará e Nova Odessa quando plantados no canteiro. B – Indivíduos já adultos...... 33

Figura 1.2. Perfil das folhas de Plectranthus neochilus coletadas para microscopia eletrônica de varredura. A – Folha jovem coletada entre o primeiro e segundo entrenó. B- Folha madura coletada entre o quarto e quinto entrenó...... 34

Figura 1.3. Secções transversais do caule (A, B), pecíolo (C, D), folha (E, F, G, H e I) de Plectranthus neochilus cultivado a sol pleno. A - Secção quadrangular do caule; B - felogênio, epiderme, colênquima angular e parênquima cortical. C - Secção reniforme do pecíolo – Esfera: vasos colaterais nas extremidades. D – epiderme, colênquima angular e parênquima cortical do pecíolo. E – nervura central. F – margem (*) câmeras subestomática. G - mesofilo, epiderme e parênquima cortical. (*) câmeras subestomática. H – estômato. (seta) cutícula estriada; I – estômato diacítico. (seta) células subsidiárias; Fe = felogênio; Ep = epiderme; Co = colênquima; Pa = parênquima. Barras de escalas: A = 500 m; B = 200 m; C= 500 m; D = 200 m; E= 500 m; F = 200 m; G = 200 m; H e I = 20 m...... 39

Figura 1.4. Dissociação do mesofilo de Plectranthus neochilus pelo método Franklin (1946), tecido corado com safranina. A e C: Células arredondadoas e alongadas. B: Células alongadas com cloroplastas próximos a parede celular. Escala: A e B: 100 m, C: 50 m...... 40

Figura 1.5. Presença de antocianina do caule de Plectranthus neochilus. A e B – Corte transversal a mão livre do caule...... 41 Figura 1.6. Eletromicrografias de varredura da folha de Plectranthus neochilus. A – Margem jovem face adaxial. B- Margem jovem face abaxial. C- Nervura jovem face adaxial. D – Nervura jovem face abaxial. E – Margem madura face adaxial. F- Margem madura face abaxial. G- Nervura madura face adaxial. H – Nervura madura face abaxial. TNG: tricoma não glandular. TGP: tricoma glandular peltado. TGC: tricoma glandular capitado. Barras: A a D= 200 m; E= 100 m. F, G e H=200 m .42

Figura 1.7. Eletromicrografias de varredura dos tricomas Plectranthus neochilus. A – Margem jovem face adaxial. B – Margem madura face abaxial. C – Nervura jovem face abaxial. D – Nervura madura face abaxial. Barras: A, C e D= 50 m; B= 100 m...... 43

Figura 1.8. Folha jovem de Plectranthus neochilus. A – Face abaxial com tricomas glandulares peltados alaranjados visíveis a olho nu. B – Face adaxial...... 43

Figura 1.9. Tricomas não glandulares de Plectranthus neochilus. A e B – Microscopia eletrônica de varredura. C – Corte a mão livre, sem reagente. Barras: A e B= 50 m; C= 20 m...... 44

Figura 1.10. Coloração do conteúdo secretado pelo tricoma peltado de Plectranthus neochilus (A, B, C e D). A – Limbo corado com reagente de NADI. B – Limbo corado com Sudan IV. C e D – Corte a mão livre do limbo, sem reagente. Número de células do tricoma peltado de Plectranthus neochilus (E e F). E – Dissociação da epiderme corada com safranina. F – Microscopia eletrônica de varredura. Barras: A e C= 100 m; B, D e F= 50 m; E= 20 m...... 45

Figura 1.11. Comparação do tamanho entre os tricomas peltado e o capitado de Plectranthus neochilus. A e B – Corte a mão livre do limbo, sem reagente. C – Microscopia eletrônica de varredura. Barras: A e B= 20 m; C= 100 m...... 46

Figura 1.12. Tricomas short-stalked capitados de Plectranthus neochilus. A- Microscopia eletrônica de luz do limbo corada com azul de toluidina. B- Corte a mão livre do limbo, sem reagente. C- Microscopia eletrônica de varredura. D - Corte a mão livre do limbo, sem reagente, mostrando o tricoma sem cutícula, com cutícula rompendo e com cutícula. Barras: A e C= 50 m; B= 20 m e D= 200 m...... 47

Figura 1.13. Tricoma long-stalked capitados de Plectranthus neochilus. A- Corte a mão livre do limbo, sem reagente. Tricoma com a cutícula rompida. B - Microscopia eletrônica de luz do limbo corada com azul de toluidina. Tricoma com a cutícula rompida. C- Microscopia eletrônica de varredura com mostrando a diferença de tamanho entre long e short-stalked, e a cutíla ainda íntegra. D- Microscopia eletrônica de varredura com os tricomas long e short-stalked capitados mostrando os tricomas com e sem a cutícula. Barras: A e B= 20 m e C= 50 m...... 48

Figura 1.14. Testes histoquímicos realizados nas folhas de Plectranthus neochilus. Sudan black em A, B, C evidenciando lipideos totais. Sudan IV em D e E em tricomas e em F no mesofilo evidenciando lipídeos. NADI em G, H em tricomas e I e J no mesofilo, evidenciando terpenos. Sulfato azul do nilo em L, M em tricomas e em N no mesofilo, evidenciando lipídeos neutros. Barras de escalas: A, D, J, G, H, L e M= 20 m; B, E, I= 50 m, C, F= 100 m; N= 200 m...... 51

Figura 1.15. Cromossomos dos indivíduos de Plectranthus neochilus. A – CPQBA. B – Guará. C – UNICAMP. D – Nova Odessa. Barra: 10 m...... 52

Figura 2.1. A – Extração de óleo essencial de Plectranthus neochilus por hidrodestilação em aparelho de Clevenger. B- Extração de óleo essencial de Plectranthus neochilus por destilação por arraste a vapor. (Foto: Arquivo pessoal, Instituto Agronômico de Campinas – Fitoquímica)...... 58

Figura 2.2. Reação de oxirredução do DPPH na presença de quercetina ...... 61

Figura 2.3. Cromatogramas emitidos pelo GC-MS destacando o tempo de retenção dos picos. A - Cromatograma do óleo essencial das folhas de Plectranthus neochilus obtido pela hidrodestilação em aparelho de Clevenger. B - Cromatograma do óleo essencial das folhas de Plectranthus neochilus obtido pela destilação por arraste a vapor...... 62

Figura 2.4. A - Atividade antioxidante do óleo essencial de Plectranthus neochilus avaliada em placa de sílica revelada com DPPH, Pn= Plectranthus neochilus e Q= quercetina. B – Fases móveis testadas em placa de sílica e reveladas com anisaldeído. Pn= Plectranthus neochilus e Pa= Plectranthus amboinicus. C - Fases móveis testadas em placa de sílica e reveladas com vanilina.....68

Figura 2.5. Cromatografia de camada delgada, revelada com DPPH (A) e revelada com anisaldeído (B). Em ambas as figuras a sequência utilizada foi de 1: 1, 1: 4 e 1: 9 de óleo essencial diluído em etanol, e 5,2 mg/ mL de quercetina em solução. ( ) destacam as bandas brancas identificadas na placa revelada com DPPH e setas pretas destacam as bandas que também foram identificadas na placa revelada com DPPH...... 69

Figura 3.1. Esquema do processo de adsorção e dessorção dos voláteis da fibra de SPME (Adaptado de Labsphere), no qual o vial com amostra é aquecido, a fibra é introduzida, os analitos orgânicos volatilizados são concentrados no revestimento da fibra, esta é retirada do vial e introduzida no instrumento analítico para dessorção e análise...... 77

Figura 3.2. A – Indivíduos provenientes da UNICAMP, CPQBA, Guará e Nova Odessa quando plantados no canteiro. B e C – Indivíduos já adultos. D- Indivíduos plantados no vaso no ambiente de estufa...... 80

Figura 3.3. A - Cromatograma com de Plectranthus neochilus com fibra PDMS/ CAR. B - Cromatograma com de Plectranthus neochilus com fibra PDMS/ DVB. C - Cromatograma com de Plectranthus neochilus com fibra DVD/ PDMS/ CAR. D- Cromatograma com de Plectranthus neochilus com fibra PDMS (vermelha)...... 130

Figura 3.4. Cromatograma de P. neochilus do método cromatográfico definido: 65 ºC seguindo a 150 ºC em uma taxa de 3 ºC / min, com Split 1:3, num total de 28,34 minutos de duração...... 89

Figura 3.5. Cromatogramas dos compostos voláteis de Plectranthus neochilus dos grupos de estudo Sol, QC e Estufa capturas por SPME e analisado em GC-MS...... 92

Figura 3.6. Total Usefull Signal (TUS) da análise metabolômica. Em azul estão às amostras, em vermelho a média mais duas vezes o desvio padrão, em verde a média menos duas vezes o desvio padrão, o eixo Y é a soma das intensidades e o eixo X é a quantidade de amostras...... 95

Figura 3.7. A - PCA com as scores das coletas mensais de Plectranthus neochilus cultivadas ao sol (verde), estufa (azul) e os QC (vermelho) – B- PCA biplot, gráfico exploratório no qual as features se apresentam como vetores...... 97

Figura 3.8. PLS VIP scores com as 15 features de maior relevância dentre as 22 mais intensas da análise metabolômica. A legenda de cores à direita apresenta os compostos que estão mais intensos no grupo (vermelho), menos intensos (verde), e à esquerda do gráfico estão os compostos em ordem de intensidade...... 99

Figura 3.9. A - Análise estatística dos grupos Sol (azul) e Estufa (vermelho) apresentando a significância do composto 1-octen-3-ol para o grupo estufa. B – Relação entre sol e estufa nos messes coletas em comum...... 100

Figura 3.10. PCA de scores das amostras coletadas nos períodos manhã (SLM – vermelho) e tarde (SLT – verde) ...... 101

Figura 3.11. Análise estatística dos grupos sol manhã (azul) e sol tarde (vermelho)...... 101

Figura 3.12. Variação média da temperatura e precipitação do período de coleta (Fonte: CEPAGRI, 2018). T. máx.: temperatura máxima; T. min.: temperatura mínima...... 102

Figura 3.13. A - PCA de scores das amostras coletadas ao longo do ano, iniciando em junho de 2017 e finalizando em junho de 2018. B - PCA biplot, gráfico exploratório no qual as features se apresentam como vetores...... 104

Figura 3.14. PCA de scores das amostras coletadas ao longo do ano, iniciando em junho de 2017 e finalizando em junho de 2018 para cada indivíduo...... 105

Figura 3.15. PCA biplot de cada individuo para as amostras coletadas ao longo do ano. Neste gráfico exploratório as features se apresentam como vetores...... 106

Figura 3.16. PLS VIP scores com as 15 features de maior relevância para cada indivíduo ao longo do ano...... 107

Figura 3.17. Esquema proposto por Akakabe (2005) para elucidar a biogeração do composto 1- octen-3-ol através dos cogumelos Lentinula edoles e Tricholoma matsutake de scores das amostras coletadasna estufa por quatro meses ao longo do ano...... 109

Figura 3.18. PCA de scores das amostras coletadasna estufa por quatro meses ao longo do ano. A – Scores de amostras da estufa coletas nos períodos da manhã e da tarde. B – Scores das amostras pelos meses de coleta...... 131

Figura 3.19. PCA biplot das amostras coletadasna estufa. Neste gráfico exploratório as features se apresentam como vetores...... 131 Figura 3.20. PLS VIP scores com as 15 features de maior relevância para o grupo estufa nos períodos manhã e tarde (A) e ao longo do ano (B)...... 132

Figura 3.21. Gráfico com as intensidades dos voláteis pelos meses de coleta com média e desvio padrão...... 133

LISTA DE TABELA

Tabela 1.1. Tricomas identificados na literatura para Plectranthus neochilus e Plectranthus ornatus 49

Tabela 2.1. Proposta de identificação do óleo essencial de Plectranthus neochilus obtido por hidrodestilação em aparelho de Clevenger e destilação por arraste a vapor...... 126

Tabela 2.2. Composição química do óleo essencial de Plectranthus neochilus obtido por GC-M .....63

Tabela 2.3. Ação antimicrobiana do óleo essencial de Plectranthus neochilus...... 66

Tabela 2.4. Porcentagem de neutralização do radical DPPH do óleo essencial de Plectranthus neochilus e quercetina (como controle positivo) em Ensaio de DPPH ...... 70

Tabela 3.1. Parâmetros avaliados no método cromatográfico otimizado...... 82

Tabela 3.2. Análise metabolômica de Plectranthus neochilus...... 84

Tabela 3.3. Análise da variação mensal dos voláteis de Plectranthus neochilus...... 85

Tabela 3.4. Parâmetros do XCMS verificados para melhor obtenção de features...... 129

Tabela 3.5. Compostos obtidos por GC-MS pelas fibras de SPME avaliadas...... 87

Tabela 3.6. Parâmetros definidos para o método cromatográfico otimizado...... 88

Tabela 3.7. Proposta de identificação dos compostos obtidos por GC-MS pelo método otimizado com fibra PDMS/ DVB por SPME...... 90

Tabrela 3.8. Proposta de identificação dos compostos voláteis dos grupos Sol, QC e Estufa obtidos por SPME. E em GC-MS. O número do sinal se refere à Figura 3.5...... 93

Tabela 3.9. Features mais intensas fornecidas pelo software XCMS Online...... 96

LISTA DE QUADRO

Quadro 1. Características que distinguem as espécies do complexo Plectranhus caninus...... 28

Quadro 1.1. Estudos desenvolvidos com os indivíduos de Plectranthus neochilus...... 32

Quadro 1.2. Testes histoquímicos realizados em Plectranthus neochilus...... 35

Quadro 3.1. Composição química e porcentagem do óleo essencial das folhas de Plectranthus neochilus identificada por GC-MS...... 74

Quadro 3.2. Estudos desenvolvidos com os indivíduos de Plectranthus neochilus...... 79

Quadro 3.3. Fibras de SPME avaliadas...... 81

LISTA DE FÓRMULAS E EQUAÇÕES

Equação 2.1. Fórmula para cálculo do índice de retenção dos compostos voláteis do óleo essencial obtidos pela hidrodestilação, no qual IR= índice de retenção do composto de interesse, i= composto volátil analisado, n= número de carbono do alcano que elui antes de i, m= número de carbono do alcano que elui depois de i, tri= tempo de retenção de i, trn= tempo de retenção do carbono que elui antes de i, trm= tempo de retenção do alcano que elui depois de i...... 59

Equação 2.2. Equação para cálculo da porcentagem de redução do DPPH, no qual A amostra= absorbância da reação entre a solução do radical DPPH e a amostra antioxidante, Abranco= absorbância da solução de solvente utilizado para preparar a amostra antioxidante, Acontrole= absorbância do radical DPPH com uma pequena alíquota do solvente utilizado para preparar a amostra, em substituição à solução da própria amostra em estudo...... 62

Equação 3.1. Fórmula para cálculo do índice de retenção dos compostos voláteis, no qual IR= índice de retenção do composto de interesse, i= composto volátil analisado, n= número de carbono do alcano que elui antes de i, m= número de carbono do alcano que elui depois de i, tri= tempo de retenção de i, trn= tempo de retenção do carbono que elui antes de i, trm= tempo de retenção do alcano que elui depois de i...... 81

Equação 3.2. Equação para cálculo do coeficiente de variação, no qual CV= coeficiente de variação, s= desvio padrão e x= média...... 85

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2n: Célula vegetal diploide ABTS: 2,2'-azino-bis ANOVA: Análise de Variância cm: Centímetro ºC: Graus Celcius CAR: Carboxen CCD: Cromatografia em Camada Delgada

CE50: Concentração Eficiente em 50 %

CE25: Concentração Eficiente em 25 % CEPAGRI: Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas à Agricultura

CI50: Concentração Inibitória em 50 %

CO2: Dióxido de carbono CPQBA: Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas CQ: Classe química do composto CV: Coeficiente de Variação DPPH: 2,2-difenil-1-picril-hidrazila DVB: Divinilbenzeno eV: Eletrovolt FAA50: Formaldeído, Ácido Acético Glacial e Etanol 50 % g: Gramas GC-MS: Cromatografia a Gás acoplada a Espectrometria de Massas (do inglês: Gas Chromatography with Mass Spectrometry) h: Horas

H2O: Água HS: Headspace IAC: Instituto Agronômico de Campinas IB: Instituto de Biologia IQ: Instituto de Química IR: Índice de Retenção Kg: Quilogramas kV: Quilovolt m: Metros MEV: Microscipia eletrônica de Varredura mg: Miligramas min.: Minutos mL: Mililitros mm: Milímetros Mo: Monoterpenos m/z: Relação massa/ carga µg: Microgramas µL: Microlitros µM: Micromolar µmol: Micromol nm: Nanômetro nº picos: Número de picos do cromatograma NIST: National Institute of Standards and Technology PAR: Porcentagem de Radiação Fotossinteticamente Ativa (do inglês: Percentage of Photosynthetically Active Radiation) PCA: Análise de Componentes Principais (do inglês: Principal Components Analysis) PC: Componente Principal (do inglês: Principal Component) PDB: Paradiclorobenzeno PDMS: Polidimetilsiloxano PLS: Mínimos Quadrados Parciais (do inglês, Partial Least Squares Discriminant Analysis) QC: Controle de Qualidade (do inglês: Quality Control) Se: Sesquiterpenos Sim.: Porcentagem de similaridade SPME: Microextração em Fase Sólida (do inglês: Solid Phase Micro Extraction) SOM_M:Estufa manhã SOM_T: Estufa tarde SL: Sol SLM: Sol manhã SLT: Sol tarde TBARS: Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (do inglês: Thiobarbituric Acid Reactive Substances) T. min.: Temperatura mínima T. máx.: Temperatura máxima TR: Tempo de retenção TUS: Do inglês, Total Usefull Signal UEC: Herbário da Universidade Estadual de Campinas UFC: Unidade Formadora de Colônia UI: Unidade Internacional UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas VIP: Importância Variável na Projeção (do inglês: Variable Importance in the Projection)

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ...... 5 RESUMO ...... 6 ABSTRACT ...... 7 LISTA DE FIGURAS ...... 8 LISTA DE TABELAS ...... 14 LISTA DE QUADROS ...... 15 LISTA FÓRMULAS E EQUAÇÕES ...... 16 LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS ...... 17 SUMÁRIO ...... 20 INTRODUÇÃO GERAL ...... 24 JUSTIFICATIVA DOS CAPÍTULOS ...... 28 OBJETIVO GERAL ...... 29 Objetivos específicos ...... 29

CAPÍTULO 1 – IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA DE PLECTRANTHUS NEOCHILUS...... 30 1. INTRODUÇÃO ...... 30 1. 1 Plectranthus neochilus Schltr...... 30 2. OBJETIVO ...... 31 3. MATERIAL E MÉTODOS ...... 31 3.1 Material vegetal ...... 31 3.2 Produção de mudas ...... 32 3.3 Descrição anatômica ...... 33 3.3.1 Microscopia eletrônica de luz ...... 33 3.3.2 Dissociação de tecido ...... 33 3.3.3 Microscopia eletrônica de varredura ...... 34 3.3.4 Proposta de identificação de tricomas ...... 34 3.4 Histoquímica ...... 35 3.5 Citogenética ...... 35 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 36 4.1 Descrição anatômica ...... 36 4.1.1 Microscopia eletrônica de luz, Dissociação de tecido e Microscopia eletrônica de varredura ...... 36 4.1.2 Proposta de identificação de tricomas ...... 44 4.2 Histoquímica ...... 49 4.3 Citogenética ...... 52 5. CONCLUSÃO ...... 53

CAPÍTULO 2 – PERFIL QUÍMICO DO ÓLEO ESSENCIAL DE PLECTRANTHUS NEOCHILUS E SUA ATIVIDADE BIOLÓGICA ...... 54 1. INTRODUÇÃO ...... 54 1.1 Uso popular ...... 54 1.2 Óleo essencial ...... 54 1.3 Extração de óleo essencial ...... 56 1.4 Atividade biológica do óleo essencial ...... 56 2. OBJETIVO ...... 57 3. MATERIAL E MÉTODOS ...... 57 3.1 Material vegetal ...... 57 3.2 Produção de mudas ...... 57 3.3 Extração de óleo essencial ...... 57 3.4 Identificação dos compostos ...... 59 3.5 Atividade biológica do óleo essencial ...... 59 3.5.1 Atividade antimicrobiana ...... 59 3.5.2 Atividade antioxidante ...... 60 3.5.2.1 Cromatografia em camada delgada ...... 60 3.5.2.2 Ensaio de DPPH ...... 60 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 62 4.1 Extração de óleo essencial de Plectranthus neochilus ...... 62 4.2 Identificação dos compostos ...... 63 4.3 Atividade biológica do óleo essencial ...... 65 4.3.1 Atividade antimicrobiana ...... 65 4.3.2 Atividade antioxidante ...... 67 4.3.2.1 Cromatografia em camada delgada ...... 67 4.3.2.2 Ensaio de DPPH ...... 69 5. CONCLUSÃO ...... 71

CAPÍTULO 3 – ANÁLISE METABOLÔMICA DE PLECTRANTHUS NEOCHILUS ...... 72 1. INTRODUÇÃO ...... 72 1.1 Metabolômica ...... 72 1.2 Compostos voláteis ...... 73 1.2.1 Headspace por microextração em fase sólida ...... 76 2. OBJETIVO ...... 78 Objetivo geral ...... 78 Objetivos específicos ...... 78 3. MATERIAL E MÉTODOS ...... 78 3.1 Material vegetal ...... 78 3.2 Produção de mudas ...... 79 3.3 Desenvolvimento do método cromatográfico e extração de voláteis de P. neochilus ...... 80 3.3.1 Avaliação de fibras de HS-SPME e identificação dos compostos ...... 80 3.3.2 Otimização do método cromatográfico ...... 82 3.3.3 Análise cromatográfica ...... 82 3.4 Análise metabolômica e variação mensal dos voláteis ...... 83 3.4.1 Obtenção de dados meteorológicos ...... 83 3.4.2 Análise metabolômica de Plectranthus neochilus ...... 83 3.4.3 Análise da variação mensal dos voláteis ...... 84 3.4.4 Análise estatística dos dados ...... 85 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 88 4.1 Desenvolvimento do método cromatográfico e extração de voláteis de P. neochilus ...... 86 4.1.1 Avaliação de fibras de HS-SPME e identificação dos compostos ...... 86 4.1.2 Otimização do método cromatográfico ...... 88 4.2 Análise metabolômica e variação mensal dos voláteis ...... 91 4.2.1 Análise metabolômica ...... 91 4.2.2 Análise estatística metabolômica ...... 94 4.2.3 Análise da variação mensal dos voláteis ...... 100 4.2.3.1 Dados meteorológicos ...... 102 4.2.4 Análise estatística da variação mensal dos voláteis ...... 102 4.2.5 Composto 1-Octen-3-ol ...... 108 4.2.6 Análise estatística da variação mensal de cada volátil ...... 109 5. CONCLUSÃO ...... 110

CONCLUSÃO GERAL ...... 111 REFERÊNCIAS ...... 112 ANEXOS ...... 125 Capítulo 2 – Resultados e Discussão ...... 125 Capítulo 3 – Material e Métodos ...... 129 Capítulo 3 – Resultados e Discussão ...... 130 Declaração de Bioética e Biossegurança ...... 135 Declaração de Direitos Autorais ...... 136

INTRODUÇÃO GERAL

No século passado, o uso das plantas medicinais foi à base para o tratamento de enfermidades entre populações carentes. Porém, mesmo com a grande disponibilidade de medicamentos sintéticos no mercado, algumas populações mantêm o consumo de plantas medicinais por motivos financeiros e culturais. E assim, o uso tradicional destas espécies é passado de gerações a gerações, embora em menor escala (MARCHESE et al., 2009). Para a ciência, o consumo popular de plantas se torna um alvo para a investigação de novas drogas, embora ainda haja carência de estudos e ensaios clínicos para essa área, como também estudos que avaliem a segurança no consumo de plantas medicinais (MARCHESE et al., 2009; BALBINO e DIAS, 2010). Entretanto, a busca constante por novos compostos bioativos, principalmente advindos do metabolismo secundário, vem despertando o interesse em estudar as plantas medicinais de forma pluridisciplinar e/ ou quimissistemática, ou seja, unindo conhecimentos químicos, farmacológicos, botânicos e socioantropológico. Desta forma, se espera gerar um produto de baixo custo à população e comercialmente viável à indústria, que atualmente vem se apresentando mais diversificada (ASCENSÃO, 2007; RODRIGUES et al., 2016). Lamiaceae é uma família amplamente distribuída na região do Mediterrâneo, Ásia Central e Sudeste, África do Sul, China, Austrália, América do Sul, América do Norte e México, o que mostra sua capacidade de se adaptar a diversos habitats, exceto regiões frias de alta latitude ou altitude (KUBITZKI, 2004; RAJA, 2012). Entre os 236 gêneros da família, destacam-se Mentha, Salvia, Ocimum, Clorodendrum e Plectranthus explorados por suas flores ornamentais, pelo potencial para extração de óleos essenciais aromáticos e o seu vasto uso culinário. São mais de 7200 espécies que compreendem arbustos, árvores, folhagens, herbáceas aromáticas e algumas trepadeiras lenhosas. Além disso, São características compartilhadas entres as espécies da família inflorescências verticiladas, geralmente brácteas, flores simetricamente bilaterais com 5 sépalas e pétalas, um lábio inferior e superior, e folhas que emergem de forma oposta (HUSAIN et al., 1989; KUBITZKI, 2004; RAJA, 2012; PEREIRA et al., 2015). A maioria das plantas possuem bioativos voláteis responsáveis pelos aromas que as tornam tão conhecidas, utilizadas e consumidas (RAJA, 2012). Esse fato faz com que Lamiaceae apareça nos levantamentos etnobotânicos como a segunda família com maior número de espécies utilizadas ornamentalmente ou consumidas na culinária (HUSAIN et al., 1990; DI STASI et al., 2002; FUCK et al., 2005; ZENI e BOSIO, 2006; PINTO et al., 2006; VENDRUSCOLO e MENTZ, 2006). Plectranthus é um dos dez gêneros que abriga 50% das espécies conhecidas da família. Distribuídas pela África, Ásia e Austrália, as 300 espécies do gênero compreendem arbustos,

25 herbáceas, espécies ornamentais, comestíveis, com propriedades medicinais, de interesse econômico e de diversos usos etnobotânicos. São espécies de crescimento rápido, fácil adaptação, geralmente tolerantes a luz e a seca, o que as faz desenvolver rápidas respostas as condições ambientais, como exemplo, apresentar folhas suculentas (ABDEL-MOGIB et al., 2002; KUBITZKI, 2004; GRAYER et al., 2010; WALDIA et al., 2011; RICE et al., 2011, 2012; KHALIK e KARAKISH, 2016). Há um importante potencial medicinal do gênero, segundo Lukhoba et al. (2006) tais propriedades representam mais de 85% dos usos etnobotânicos. Esse fato está relacionado à composição química dessas espécies. Embora em contínuo estudo, os principais constituintes são os óleos essenciais (mono e sesquiterpenos) que fornecem uma variedade de aromas, diterpenoides com ação antimicrobiana, antifúngica, antiplasmodial, antitumoral e resistência a insetos, como também compostos fenólicos, todos armazenados nos tricomas das plantas. Um gênero a explorar por conta de seus compostos de potencial farmacológico (ABDEL-MOGIB et al., 2002; GRAYER et al., 2010; RIJO et al., 2010, 2012; RICE et al., 2011; WALDIA et al., 2011). Entretanto, o gênero possui questões taxonômicas ainda em discussão. A inserção do gênero Coleus é um ponto discutido por autores desde 1962, pois inicialmente acreditava-se que ambos apresentavam características morfológicas distintas. Com estudos posteriores, as espécies de Coleus foram aceitas e agregadas à Plectranthus, embora ainda haja certa dificuldade para distinguí-las (MORTON, 1962, 1998; VAN JAARSVELD e EDWARDS, 1997; ABDEL-MOGIB et al., 2002). Ainda sim, depois desse fato, Plectranthus continuou com a questão de delimitação, mas de espécies, pois novas espécies foram descritas ao longo do tempo (FORSTER, 1992; LUKHOBA e PATON, 2003). Tal questão taxonômica de identificação de gêneros e espécies ocorre devido à ausência de critérios morfológicos que auxiliem na diferenciação, gerando dificuldades taxonômicas na nomeação de espécies (KHALIK, 2016). O gênero abriga os chamados falsos boldos, são eles Plectranthus barbatus, Plectranthus grandis, Plectranthus amboinicus, Plectranthus neochilus e Plectranthus ornatus todos cultivados no Brasil. Porém, o verdadeiro boldo, Peumus boldus (Monimiaceae), é uma árvore originária do Chile e que não é cultivado no Brasil. Além dos citados, a Vernonia condensata, da família Asteraceae, é outra espécie também conhecida e utilizada no país como boldo (LORENZI e MATOS, 2002, 2008). Com relação ao óleo essencial, este apresentou potencial esquistossomicida e antimicrobiano (CAIXETA et al., 2011; MOTA et al., 2014). Além disso, a planta tem atividade contra o nematoide Meloidogyne spp., o extrato metanólico apresentou atividade contra leishmania e contra a levedura Candida krusei (TEMPONE et al., 2008; BAIDA et al., 2011; ANTINARELLI et al., 2015). O extrato acetônico apresentou atividade contra bactérias Gram positivas, porém com pouca atividade frente a bactérias Gram negativas e leveduras (PEREIRA et al., 2015). A revisão bibliográfica

26 apontou que dentre os falsos boldos há um recente interesse por P. neochilus e uma escassa produção científica. Portanto, Plectranthus neochilus foi o foco deste trabalho. Ao realizar a revisão, foi observado um conflito entre os artigos com relação à descrição e identificação da espécie utilizada. Os pesquisadores Lorenzi e Matos possuem duas edições do livro “Plantas Medicinais no Brasil: nativas e exóticas”. A primeira edição (2002) apresenta foto com o nome da espécie Plectranthus neochilus, já a segunda edição (2008), apresenta uma errata e o nome da espécie foi alterado para Plectrathus ornatus. Ao pesquisar fotos das duas espécies verificou-se que morfologicamente não há como distingui-las como apresentam as Figuras 1 e Figura 2.

A B Figura 1. Plectranthus ornatus. A – Parte vegetativa da espécie. B – Inflorescência. Fonte: Dissertação de mestrado de Fernanda Rodrigues Nascimento, 2014 – UFV.

A B Figura 2. Plectranthus neochilus. A – Parte vegetativa da espécie. B – Inflorescência. Casa de vegetação do Instituto de Biologia da Unicamp. Arquivo pessoal.

A questão é que os artigos publicados após o ano de 2008, mesmo depois da errata de Lorenzi e Matos (2008), ainda utilizam a referência de 2002 para descrever a planta como P. neochilus. Não obstante, ao utilizar a chave de identificação de espécies, o grupo de pesquisa junto a taxonomistas do Instituto de Biologia, ficou em dúvida na identificação, uma vez que apenas um dos quatro

27 indivíduos utilizados no estudo estava com inflorescência. Diante desses fatos ficou claro que há uma dificuldade em diferenciar ambas as espécies. Em revisões taxonômicas de Cood (1961, 1975) foi citado que P. neochilus pertence a um complexo de três espécies que possuem características morfológicas muito próximas. Segundo Zheng et al. (2017) um complexo é formado por espécies que compartilham características intimamente relacionadas, o que gera a dificuldade em diferenciá-las. Para verificar as diferenças dessas espécies é necessário estudos com uma grande amostragem populacional e o uso de diferentes critérios operacionais, que podem ser análises genéticas, moleculares e químicas, diferenciação morfológica e de habitat, entre outras. Caso o resultado desses critérios esteja em comum acordo é possível reconhecê-las como mesma espécie ou espécies diferentes (ZHENG et al., 2017). O complexo em questão é formado por Plectranthus caninus, P. ornatus e P. neochilus, que juntos constituem o complexo P. caninus (Figura 3). Estas espécies foram distinguidas pelos botânicos da época de acordo com a forma da folha e comprimento da inflorescência, como apresenta o Quadro 1. Dentre as características abordadas, a que foi escolhida como um fator decisivo para separar as espécies foi o comprimento da inflorescência. Desta forma, nota-se que o estudo morfológico foi o único critério operacional utilizado na época, sendo necessária uma nova revisão (CODD, 1975). A maior dificuldade atualmente reside em distinguir P. ornatus de P. neochilus. Diante da existência de um complexo de espécies e da dificuldade que autores apresentaram para identificar P. neochilus surgiram às dúvidas, “Com qual espécie o estudo estava sendo conduzido? Todos os indivíduos pertencem a mesma espécie?”. Portanto, outros critérios precisam ser estudados para se conhecer as características que podem ser utilizadas como identidade para P. neochilus, como também novas discussões na comunidade científica a fim de revisar se há relevância em separá-las em duas espécies.

Quadro 1. Características que distinguem as espécies do complexo Plectranhus caninus.

Plectranthus caninus Roth, Plectranthus ornatus Plectranthus neochilus Características Referência 1871. Codd, 1894. Schltr., 1896. Ovada-lanceolada, elíptica Obovada para elíptica-ovada, ápice longa ou oblanceoladas Obovada, ápice arredondado arredondado ou obtuso pouco Morfologia folha moderadamente recortada na pouco recortado recortado e estreitamente cuneado metade superior, ápice agudo na base para obtuso De 2,5 – 6 cm, raramente até 9 De 4 a 6 cm, raramente acima CODD, Inflorescência cm de comprimento, denso na De 7 a 15 cm de comprimento de 9 cm de comprimento 1961, 1975 base Estames: unidos na base por Estames: unidos na base por 3 Estames: unidos na base por 2 – 3 1,5 mm e de 5 - 6 mm – 4 mm e de 12 -14 mm mm e de 8 -11 mm comprimento; Morfologia flor comprimento; Corola: 8 – 10 comprimento; Corola: 2 – 2,5 Corola: 1,2 – 2 cm de mm de comprimento; Cálice: 2 cm de comprimento; Cálice: 3 comprimento; Cálice: 3 mm mm de comprimento mm comprimento comprimento Fonte: Codd, 1961, 1975

Figura 3. A- Plectranthus caninus. B – Plectranthus neochilus. C - Plectranthus orntus. Imagens extraída de Codd, 1961, 1975.

JUSTIFICATIVA DOS CAPÍTULOS

Devido à dificuldade em identificar a espécie, percebeu-se que o estudo metabolômico não poderia ser iniciado sem a identificação dos indivíduos utilizados. Além dos fatos apontados com relação à dificuldade de identificação da espécie por alguns autores, no presente estudo apenas um dos indivíduos utilizados no trabalho estava com inflorescênia no momento em que foi utilizada a chave de identificação com taxonomistas. Por isso, este estudo foi dividido em três capítulos, dedicando o primeiro a questão da identificação dos indivíduos, bem como a verificação de características que pudessem fornecer a identidade da espécie. O segundo e o terceiro capítulo foram atribuídos ao perfil químico do óleo essencial e sua atividade biológica, e a análise metabolômica dos

29 voláteis, respectivamente.

OBJETIVO GERAL

Análise da variabilidade da composição dos voláteis de Plectranthus neochilus ao longo de um ano.

Objetivos específicos

Identificar os indivíduos utilizados e verificar características anatômicas e citogenética como possíveis identidades da espécie. Avaliar o perfil químico óleo essencial e suas atividades biológicas. Realizar análise metabolômica dos voláteis por headspace.

CAPÍTULO 1 IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA DE PLECTRANTHUS NEOCHILUS

1. INTRODUÇÃO

1.1 Plectranthus neochilus Schltr.

Plectranthus neochilus é uma planta exótica, originária do sul da África e introduzida no Brasil durante o período colonial (BRITTEN, 1896; CODD, 1961 e 1975; LIMA et al., 2017). Popularmente é conhecida como boldo gambá, boldo miúdo, boldinho ou boldo rasteiro (TOMAZZONI, 2004; BOCARDI, 2008; BORGES et al., 2011). Devido à reestruturação taxonômica do gênero, P. neochilus apresenta sinônimos, são eles: Coleus neochilus e Coleus schinzii, que ainda são utilizados (MOTA et al., 2014). P. neochilus é uma planta perene, de hábito herbáceo possuindo de 12 a 50 cm de altura, podendo ser encontrada sob árvores em florestas e entre rochas (BRITTEN, 1896; CODD, 1961 e 1975). Apesar de ser conhecida como boldo a espécie é cultivada em jardins como planta ornamental (VAN JAARSVELD e KIRSTENBOSCH, 1997), atraindo um número considerável de polinizadores como abelhas, borboletas e moscas das famílias Megachilidae, Anthophoridae, Syrphidae, Bombyliidae, Sphingidae e Apidae (STIRTON, 1977). Não foi encontrado na literatura o hábitat que a espécie ocupa, porém é citado que as espécies de Plectranthus se distribuem por vários hábitats e desta forma desenvolvem adaptações como caules ascendentes com estolões ou rizomas especializados. Além disso, muitas espécies são adaptadas a condições xéricas apresentando folhas suculentas como resposta (KADEREIT, 1956). Morfologicamente, a planta possui folhas suculentas, opostas, com cerca de 2,5 cm de comprimento, e 1,5 a 3,5 cm de largura. As folhas são pouco pubescentes, em sua face abaxial apresentam glândulas laranja espalhadas pelo limbo, visíveis a olho nu. Tais glândulas se concentram na margem foliar, que é crenada da metade até a parte superior. Seu ápice é obtuso, podendo se apresentar de forma arredondada (CODD, 1961, 1975). Os pecíolos são pubescentes e possuem de 5 a 15 mm de comprimento. Os caules geralmente são ascendentes medindo de 30 a 50 cm de altura e visivelmente vilosos. A inflorescência é em forma de espiga floral, com um racemo terminal de 7 a 15 cm de comprimento e de coloração azulada ou violeta. A inflorescência possui brácteas embricadas em estágio jovem com 6 a 10 mm de comprimento, 4 a 6 mm de largura, coloração branca esverdeada e púrpura, com ráquis (eixo)

31 glandular tomentosa e densa (CODD, 1961, 1975). Duarte e Lopes (2007) realizaram o primeiro estudo sobre a anatomia do caule, pecíolo e folha do boldo, descrevendo seus tecidos, epiderme, estômato e numerosos tricomas: glandulares capitados e peltados, e não glandulares. Realizaram alguns testes histoquímicos que revelaram elementos lignificados e presença de amido, substâncias lipofílicas e compostos fenólicos. Além disso, comparou algumas características anatômicas de P. neochilus com a dos outros boldos conhecidos popularmente, P. barbatus, Pemus boldus e Vernonia condensata. Outro estudo inédito para Plectranthus neochilus foi de Nani (2011), que realizou as primeiras análises cariotípicas da espécie, análises de conteúdo de DNA nuclear e palinologia, técnicas que auxiliam na identificação de espécies, como também na confirmação de indivíduos da mesma espécie. Outra vantagem dessa análise é de contribuir para as revisões de grupos com problemas taxonômicos, como ocorre no gênero Plectranthus. Para o autor, tais estudos se tornam imprecendíveis, visto que poucas espécies foram citogenéticamente avaliadas e destas poucas o número cromossômico encontrado foi muito diverso (NANI, 2011).

2. OBJETIVO

Verificar se todos os indivíduos utilizados no estudo pertencem à mesma espécie, Plectranthus neochilus, através das técnicas de citogenética e microscipia eletrônica de luz. Avaliar se as características anatômicas verificadas no estudo auxiliam em uma possível identidade para espécie.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material vegetal

Este estudo foi realizado com quatro indivíduos de P. neochilus provenientes de diferentes localidades: Atibaia, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da UNICAMP (CPQBA), do bairro Guará do distrito de Barão Geraldo, Campinas e de Nova Odessa. O indivíduo coletado na cidade de Atibaia foi nomeado de indivíduo UNICAMP. As matrizes de cada indivíduo encontram-se no campo experimental do Instituto de Biologia da UNICAMP. As respectivas exsicatas foram depositadas no Herbário da Universidade Estadual de Campinas (UEC)

32 sob os seguintes números de acesso: UEC 150953, UEC 1938817, UEC 193819, UEC 193818, respectivamente. As atividades realizadas com os indivíduos estão descritas no Quadro 1.1.

Quadro 1.1. Estudos desenvolvidos com os indivíduos de Plectranthus neochilus cultivados a sol pleno em canteiro. Indivíduos Técnicas utilizadas Atividades UNICAMP CPQBA Guará Nova Odessa para identificar espécie Sol Sol Sol Sol Microscopia eletrônica x x x x de luz x Dissociação de tecido x Microscopia eletrônica x de varredura Proposta de identificação de x x x x x tricomas Histoquímica x Citogenética x x x x x

3.2 Produção de mudas

Foram feitas mudas por propagação vegetativa e o material foi preparado de acordo com a técnica usual de estaquia, no qual o corte na extremidade inferior em forma de bisel. As estacas, com aproximadamente 10 cm de comprimento, foram cultivadas em substrato de vermiculita de granulação média em casa de vegetação. A irrigação foi automática por nebulização, quatro vezes ao dia durante dois minutos cada. Na região superior da estaca foi deixado um par de folhas inteiras. Após o período de enraizamento de 45-60 dias as mudas foram plantadas no canteiro para o cultivo em sol pleno. Foi utilizada a mistura de matéria orgânica: areia, terra vermelha e vermiculita na proporção de 1: 1: 1 (v: v: v) inserida nas covas do canteiro. Nele, as mudas não foram irrigadas, como também não receberam nenhum tipo de recobrimento como mostra a Figura 1.1.

Figura 1.1. A – Indivíduos provenientes da UNICAMP, CPQBA, Guará e Nova Odessa quando plantados no canteiro. B – Indivíduos já adultos.

3.3 Descrição anatômica

3.3.1 Microscopia eletrônica de luz A análise da microscopia de luz foi realizada para todos os indivíduos cultivados nos canteiros a sol pleno. Foram coletadas três plantas (triplicata) de cada indivíduo e realizados cortes nos 4º e 5º entrenó de caules, pecíolos e limbos de P. neochilus, e fixados em FAA50 (formaldeído, ácido acético glacial, etanol 50%, 1:1:18 (v/v)) (JOHANSEN, 1940) por 48 horas e, posteriormente, desidratados em série etílica (50%, 70%, 80%, 96%, 100%, 100%) permanecendo por 1 hora em cada solução. Tanto para a fixação quanto para a desidratação o material foi colocado em dessecador acoplado à bomba de vácuo. As amostras foram infiltradas em resina plástica (Leica Historesin®), emblocadas, seccionadas longitudinal e transversalmente com navalha descartável em micrótomo rotativo manual (Leica®), na espessura de 7 μm, e coradas com azul de toluidina a 0,05% em tampão fosfato pH 4,5 (SAKAI, 1973). As secções foram montadas entre lâmina e lamínula em resina sintética Entellan® (Merck®). As lâminas foram analisadas em microscópio óptico Leica DM 750 e fotografadas com auxílio da câmera de vídeo Leica DFC/295.

3.3.2 Dissociação de tecido A dissociação de tecido é uma técnica de maceração que separa as células do tecido vegetal possibilitando a individualização dos elementos. A dissociação foi utilizada para visualizar o formato das células do mesofilo e verificar se as mesmas possuem ou não formatos diferentes (KRAUS e ARDUIN, 1997). A dissociação foi realizada por duas técnicas, a de Jeffrey (JOHANSEN, 1940) e a de Franklin, 1946 (modificado segundo KRAUS e ARDUIN, 1997). A primeira consiste na imersão dos cortes em uma mistura de ácido nítrico (10 %) e ácido crômico (10 %) de 12 a 48 h para isolar as epidermes foliares, e a segunda consiste na imersão dos cortes em água oxigenada (30 %) e ácido

34 acético (30 %), manter a mistura com os cortes em estufa de 60 °C. Em ambos os procedimentos, depois de lavados os cortes em água destilada, o frasco pode ser agitado ou dissociado com a ajuda de um estilete e corados com safranina.

3.3.3 Microscopia eletrônica de varredura A análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi realizada apenas com o indivíduo UNICAMP, dele foram coletados folhas jovens entre o primeiro e segundo entrenó e maduras entre o quarto e quinto entrenó. As folhas coletadas foram medidas em seu comprimento e largura, como apresenta a Figura 1.2. Foram feitos cortes da margem e nervura central de ambas as folhas coletadas. O material botânico foi fixado em solução FAA50 (formaldeído, ácido acético glacial, etanol 50%, 1:1:18 (v/v)) (JOHANSEN, 1940), desidratado em série etílica e seco pelo método do ponto crítico com CO2 no equipamento Balzers, modelo CPD 030. Em seguida, o material foi montado em suportes metálicos e recoberto com ouro coloidal por 170 segundos no equipamento Bal-Tec modelo SCD 050. A análise e o registro eletromicrográfico foram realizados no microscópio eletrônico de varredura LEO, modelo VP 435, operado a 20 kV, no Departamento de Microscopia Eletrônica do IB - UNICAMP.

3.3.4. Proposta de identificação de tricomas Os tricomas da espécie foram observados com base em todos os estudos de anatomia realizados (microscopia eletrônica de luz, microscopia eletrônica de varredura e histoquímica) e comparados com as descrições de tricomas da literatura já realizadas para a espécie e para o gênero. Este trabalho não realizou análises dos tipos de tricomas nem de secreção, por isso apresenta uma proposta de identificação dos tricomas observados na anatomia da espécie.

3.4 Histoquímica

Para a realização das análises histoquímicas, foram colhidas de três a quatro folhas maduras e realizados cortes transversais à mão livre do limbo e caule, ambos frescos, do indivíduo UNICAMP em cultivo a sol pleno. As análises foram executadas aplicando-se os reagentes descritos no Quadro 1.2. Para a documentação dos resultados, foi realizada a captura de imagens usando câmera de vídeo Olympus DP71 acoplada ao microscópio Olympus BX 51 e Leica DM 750, fotografadas com auxílio da câmera de vídeo Leica DFC/295.

Quadro 1.2. Testes histoquímicos realizados em Plectranthus neochilus.

Reagentes Grupos metabólitos Coloracão Referência Cloreto de CHARRIÈRE- Compostos fenólicos: flavonoide Fluorescência LADREIX, Alumínio 1976 Cloreto Férrico Compostos fenólicos: geral Negro-azulada ou verde escuro JOHANSEN, III 1940 Reagente de Terpenoides: óleos essênciais e Essências de azul; ácidos resiníferos de vermelho; DAVID e Nadi ácidos resiníferos mistura de ambos de violeta a púrpura CARDE, 1964 Sudan IV Lipídeos Laranja a Vermelho MILLE, 1968 Sudan Black B Lipídeos: totais Azul marinho a preto PEARSE, 1968 Lipídeos neutros em rosa; lipídeos ácidos de azul - Sulfato Azul do Lipídeos: neutros Para algumas plantas: terpenos neutros de rosa e CAIN, 1947 Nilo ácidos resiníferos de violeta a azul

3.5 Citogenética

O estudo citogenético da espécie foi realizado no Laboratório de Biossistemática e Polinização do Instituto de Biologia da UNICAMP sob supervisão da professora Eliana Regina Forni Martins. Para realizar a contagem do número cromossômico de P. neochilus foram feitas estacas de todos os indivíduos e enraizadas em água para a coleta das extremidades radiculares, local de intensa atividade meristemática. Após a coleta, o material foi tratado com solução saturada de paradiclorobenzeno (PDB), que atua no bloqueio do ciclo celular, por 2 horas em temperatura ambiente. Para a fixação do material, as raízes de todos os indivíduos foram colocadas em solução Farmer 3:1 (etanol: ácido acético, v: v) por no mínimo 12 horas em temperatura ambiente sob agitação e armazenadas a -10 ºC até o preparo das lâminas. As lâminas foram preparadas segundo (GUERRA e SOUZA, 2002) com modificações. Os materiais fixados foram lavados em água destilada por 3 vezes de 10 minutos e em seguida, realizada a digestão enzimática (1 % macerozima, 2 % celulase e 20 % pectinase) por 10 minutos a 37 ºC em banho seco. As regiões meristemáticas das raízes foram isoladas e maceradas sobre uma lâmina, em

ácido acético 45 %. Em seguida, foi realizado esmagamento com uma lamínula de vidro de 18x 18 mm. O conjunto lâmina/lamínula foi colocado em nitrogênio líquido por no mínimo 15 minutos para a remoção da lamínula e adesão permanente do material à lâmina. Para a coloração cromossômica, as lâminas foram colocadas em uma cuba contendo solução Giemsa 2 % (GUERRA, 1983) por 10 minutos e lavadas em água destilada por 2 vezes para a realização da secagem ao ar, em temperatura ambiente por 24 horas. Por fim, as lâminas foram montadas com Entellan® e lamínula de vidro 20x 20 mm e armazenadas a -10 ºC. Serão selecionadas pelo menos 10 metáfases por indivíduo para a contagem cromossômica. As melhores lâminas serão selecionadas e fotografadas em microscópio Olympus® BX51, com câmera DP72 acoplada utilizando programa Olympus® DP2 BSW (Olympus Corporation).

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Descrição anatômica

4.1.1 Microscopia eletrônica de luz, dissociação do tecido e microscopia eletrônica de varredura. Com relação às análises realizadas em todos os indivíduos para cada corte observou-se: Caule: em secção transversal pode-se observar a epiderme uniestratificada, tricomas glandulares e tricomas não glandulares em abundância. O córtex é composto por três a quatro camadas de cordões de colênquima angular e de cinco a oito camadas de parênquima cortical, com poucos espaços intercelulares (Figura 1.3A). Nos entrenós analisados, o caule apresenta os feixes vasculares colaterais e início de câmbio. No cilindro vascular, os feixes formam um cilindro delimitando o parênquima cortical e o medular. Nas camadas subepidérmicas, observou-se a instalação de algo semelhante a felogênio não contínuo. A medula é composta de células parenquimáticas com pouquíssimos espaços intercelulares (Figura 1.3B). Pecíolo: em secção transversal pode-se observar um formato reniforme, epiderme uniestratificada, com tricomas não glandulares e poucos tricomas glandulares. O córtex é composto de duas a três camadas de colênquima angular e de oito a dez camadas de parênquima cortical com poucos espaços intercelulares (Figura 1.3C e 1.3D). Há dois feixes vasculares colaterais de grande porte no centro do tecido e dois menores, cada um em uma extremidade. Limbo: em secção transversal pode-se observar epiderme uniestratificada em ambas as faces, cutícula fina e estriada (Figura 1.3G). Há tricomas glandulares peltados, tricomas glandulares capitados e tricomas não glandulares. O mesofilo apresentou células parenquimáticas irregulares

(Figura 1.3E, 1.3F e 1.3G), de diferentes tamanhos e formatos, que também se dispõem alinhadas em série. Há espaços intercelulares, principalmente próximos as câmeras subestomáticas (Figuras 1.3G). Em visão paradérmica, os estômatos são diacíticos e estão presentes em ambas as faces, abaxial e adaxial (Figura 1.3 H e 1.3 I). Com relação ao mesofilo, ao analisar as células e seus formatos houve dúvida se ele seria um mesofilo homogêneo como Duarte e Lopes (2007) descreveram. Segundo Glória e Guerreiro (2006), o mesofilo é considerado homogêneo quando não se distingue dois tipos de parênquima, ou seja, quando há apenas um tipo de célula presente na lâmina foliar. Esse fato não foi possível de comprovar (Figura 1.3 E e 1.3 F). Por isso, foi realizada a dissociação do tecido para verificar se as células apresentam um único tipo. Entre as duas técnicas utilizadas para dissociar o tecido, o método de Franklin (1946) se mostrou mais compatível com as células do mesofilo da espécie. Com essa técnica foi possível observar que as células do mesofilo não apresentam um único formato. A Figura 1.4 apresenta células alongadas com cloroplastos próximos à parede celular dispostos em camada uniforme, o que caracteriza um parênquima clorofiliano (GLÓRIA e GUERREIRO, 2006). Diante disso, as células da Figura 1.3 A e 1.3 C que se apresentam arredondadas e alongadas se assemelha às células do parênquima lacunoso e paliçádico, respectivamente. Pelas Figuras 1.3 E, 1.3 F e 1.3 G, observa-se que na face adaxial do mesofilo há tanto células alongadas quanto arredondadas dispostas em série e poucos espaços intercelulares. Já na face abaxial, observam-se células mais arredondadas, porém de diferentes formatos e tamanhos, não dispostas em série. Nessa face são visualizados mais espaços intercelulares que a face adaxial. Em ambas as faces o mesofilo não apresenta um perfil contínuo de células. Embora não seja o objetivo em realizar a dissociação, mas os diferentes tipos celulares da espécie dificultam a identificação da classe de parênquima que a espécie possui. Os resultados adquiridos através da dissociação dão subsídeos para discordar de Duarte e Lopes (2007), pois o mesofilo da espécie não é homogêneo. Com a MEV foram analisados os estágios jovens e maduros de ambas as faces da margem e nervura central das folhas da espécie. O estágio jovem foi coletado entre o primeiro e segundo entrenó com uma média de tamanho de 1,6 cm de comprimento e 1,1 cm de lagura. E o estágio maduro foi coletado entre o quarto e quinto entrenó com uma média de tamanho de 4,3 cm de comprimento e 2,3 cm de largura, como mostra a Figura 1.2 A e 1.2 B. As Figuras 1.6 A a 1.6 D revelam que em estágio jovem a folha já apresenta uma concentração abundante de tricomas. É possível notar a presença de tricomas não glandulares, dos gladulares capitados afundados na epiderme, dos capitados short e long stalked, como também dos peltados. A margem abaxial tanto jovem quanto madura (Figura 1.6 B, 1.6 F) apresentou uma concentração muito maior de tricomas glandulares peltados do que quando comparada à face adaxial (Figura 1.6 A) e nervura (Figura 1.6 C e 1.6 D). Essa concentração de tricomas peltados é visível a olho nu (Figura

1.8A e 1.8B). Nas eletromicrografias da folha madura observou-se que com o limbo expandido há mais espaços entre os tricomas (Figura 1.6G e 1.6H). Na margem foi possível visualizar a presença de hifas entrelaçadas aos tricomas (Figura 1.7B). Foi possível notar também que na margem jovem a cutícula dos tricomas glandulares permanece aderida ao pedúnculo (Figura 1.6A e 1.6B), assim como a estrutura do tricoma não glandular que permanece íntegra. Já a nervura, tanto jovem como madura (Figura 1.6C, 1.6D, 1.6G e 1.6H) os tricomas apresentam-se danificados e cutículas rompidas. Todos os tricomas encontrados para a espécie são apresentados em tópico posterior. De modo geral, tanto em secção transversal quanto em paradérmico dos tecidos, foram visualizados tricomas glandulares capitados, glandulares peltados e tricomas não glandulares. Entretanto, não foram observados tricomas conoidais, como ocorre em P. ornatus (Tabela 1.1) (ASCENSÃO et al., 1999). Os mais abundantes são os tricomas não glandulares, distribuídos por todo o vegetal. Em menor abundância encontram-se os capitados e peltados. A presença de tricomas capitados e peltados é uma característica compartilhada entre as espécies de Lamiaceae e podem ser observadas, por exemplo, em P. madagascariensi, P. ornatus, P. barbatus, P. grandis, Leonitis leonurus, Rosmarinus officinais, Ocimum basilicum, Melissa officinalis, podendo haver algumas variações no tipo de tricoma dependendo da espécie. Tais variações geram alterações nas funções, o que geralmente ocorre entre os tricomas capitados que possui vários tipos, ao contrário dos tricomas peltados que apresentam uma morfologia uniforme (ASCENSÃO et al., 1995, 1998, 1999; MARTINS e PASTORI, 2004; MILANEZE-GUTIERRE et al., 2007; BOIX et al., 2011). Assim como em espécies de Mentha notou-se nas microscopias realizadas que há predominância de tricomas capitados em relação aos tricomas peltados (MARTINS, 2002). Embora Plectranthus possua um número expressivo de espécies, poucas foram estudadas quanto aos tipos de tricomas e suas funções. Esse estudo é de grande relevância, uma vez que os tricomas e suas classes de metabólitos são muito importantes como ferramenta taxonômica e o gênero apresenta um potencial aromático considerável (ASCENSÃO, 2007; KHALIK, 2016). Devido à dificuldade de identificação de P. ornatus e P. neochilus observada na literatura, percebeu-se a importância de analisar as características anatômicas de todos os indivíduos utilizados. As características discutidas nesse tópico foram observadas em todos os indivíduos, revelando que todos eles se tratavam da mesma espécie, P. neochilus. Os resultados obtidos corroboram com algumas características descritas por Duarte e Lopes (2007), principalmente nos quesitos: cutícula estriada e estômatos diacíticos no limbo (Figura 1.3H e 1.3I), o que a difere de P. ornatus que possui epiderme com cutícula lisa e estômatos anomocíticos (Tabela 1.1) (MAURO et al., 2008). Porém, com relação ao tipo de mesofilo o presente estudo discorda da descrição anatômica da espécie identificando um mesofilo heterogêneo.

Figura 1.3. Secções transversais do caule (A, B), pecíolo (C, D), folha (E, F, G, H e I) observadas em todos os indivíduos de Plectranthus neochilus cultivado a sol pleno. A - Secção quadrangular do caule; B - felogênio, epiderme, colênquima angular e parênquima cortical. C - Secção reniforme do pecíolo –

Esfera: vasos colaterais nas extremidades. D – epiderme, colênquima angular e parênquima cortical do pecíolo. E – nervura central. F – margem (*) câmeras subestomática. G - mesofilo, epiderme e parênquima cortical. (*) câmeras subestomática. H – estômato. (seta) cutícula estriada; I – estômato diacítico. (seta) células subsidiárias; Fe = felogênio; Ep = epiderme; Co = colênquima; Pa = parênquima. Barras de escalas: A = 500 m; B = 200 m; C= 500 m; D = 200 m; E= 500 m; F = 200 m; G = 200 m; H e I = 20 m.

Algumas características anatômicas observadas em P. neochilus são comuns ao gênero, como a secção transversal quadrangular do caule, que ocorre em P. barbatus, P. pseudomarrubioides, P. tenuiflorus e P. ornatus, e o colênquima angular, que está presente nas citadas anteriormente e em P. arabicus, P. asirensis, P. hijazensis e P. fruticosus (KADEREIT, 1959; MAURO et al., 2008; LEROUX, 2012; KHALIK e KARAKISH, 2016). Em P. neochilus foi observada a presença de algo semelhante a um felogênio não contínuo. Pela presença de câmbio, xilema e floema secundário o caule encontrava-se em fase madura. Talvez fosse possível visualizar um felogênio estabelecido em entrenós posteriores ao selecionado. Em P. ornatus, os autores relataram a presença de periderme com súber desenvolvido (MAURO et al., 2008). Segundo Kadereit (1959) o pecíolo de muitas espécies de Lamiaceae apresenta em secção transversal um arco de feixe vascular amplo, como mostra a Figura 1.3 C com o feixe vascular central. Ao realizar os cortes transversais a mão livre do caule e folha foi verificada a presença de uma coloração roxa na epiderme, mais presente no caule do que na folha (Figura 1.5 A). Acredita-se que seja antocianina. A coloração arroxeada é visualizada a olho nu nos caules maduros (Figura 1.5 B). Não foi possível avaliação com testes bioquímicos tampouco aprofundar os estudos, porém a substância foi observada na espécie. Nenhum relato a respeito foi encontrado na literatura.

A B

Figura 1.5. Presença de antocianina do caule de Plectranthus neochilus. A e B – Corte transversal a mão livre do caule.

A presença de folhas suculentas, com alta umidade e abundantes tricomas tectores pode indicar alguma adaptação xerofítica no percurso de algumas espécies. Já foi citado que as espécies da família apresentam fácil adaptação, que são tolerantes a luz e a seca favorecendo rápidas respostas as condições ambientais (KUBITZKI, 2004; MAURO et al., 2008). Hipótese que pode se aplicar a P. neochilus.

Figura 1.6. Eletromicrografias de varredura da folha de Plectranthus neochilus. A – Margem jovem face adaxial. B- Margem jovem face abaxial. C- Nervura jovem face adaxial. D – Nervura jovem face abaxial. E – Margem madura face adaxial. F- Margem madura face abaxial. G- Nervura madura face

43 adaxial. H – Nervura madura face abaxial. TNG: tricoma não glandular. TGP: tricoma glandular peltado. TGC: tricoma glandular capitado. Barras: A a D= 200 m; E= 100 m. F, G e H=200 m.

Figura 1.8. Folha jovem de Plectranthus neochilus. A – Face abaxial com tricomas glandulares peltados alaranjados visíveis a olho nu. B – Face adaxial.

4.1.2 Proposta de identificação dos tricomas Com relação aos tricomas observados na anatomia de todos os indivíduos, MEV, nos testes histoquímicos e dissociação de tecido, foram encontrados: tricomas não glandulares, tricomas glandulares peltados e tricomas glandulares capitados short e long-stalked. Para cada classe de tricoma foi realizado uma descrição com base na literatura da espécie e do gênero. Tricomas não glandulares: De acordo com Duarte e Lopes (2007) P. neochilus possui tricoma multicelular e unisseriado, com aproximadamente de 3 a 10 células e revestido por uma cutícula granular. Possui células epidérmicas que circundam a base desses tricomas (de 2 a 8 células) e apresentam formato levemente poligonal. E de acordo com Ascensão et al. (1999) P. ornatus apresenta tricoma multicelular e unisseriado, com 3 a 7 células suportados por um pedestal celular que consiste em um grupo de 6 a 12 células epidérmicas dispostas em círculo ao redor da base. Esses tricomas tendem a desenvolver uma superfície verrugosa. No presente estudo foi observado tricoma multicelular e unisseriado, de aproximadamente 3 a 7 células (Figura 1.9 B), revestido por uma cutícula granular (Figura 1.9 A) e com pedestal celular de 2 a 5 célular da epiderme (Figura 1.9 C). Através das imagens e características observadas para este tricoma não foi possível discernir a espécie.

Figura 1.9. Tricomas não glandulares de Plectranthus neochilus. A e B – Microscopia eletrônica de varredura. C – Corte a mão livre, sem reagente. Barras: A e B= 50 m; C= 20 m.

Tricomas glandulares – Peltados: De acorodo com Duarte e Lopes (2007) em P. neochilus os tricomas estão presentes nas duas faces, abaxial e adaxial, são levemente afundados na epiderme, apresentando pedúnculo curto e cabeça ovóide com 8 células. E de acordo com Ascensão et al.

(1999) P. ornatus apresenta tricoma de cor característica, de laranja a acastanhada (in vivo) e um formato de “balão”. O tricoma consiste de uma célula epidérmica basal, uma célula curta de pedúnculo com paredes laterais cutinizadas e uma grande cabeça redonda de 8 células secretoras dispostas em um único disco. O tricoma está presente apenas na face abaxial das folhas. No presente estudo foi observado tricoma com 8 células secretoras na cabeça dispostas em uma única camada circular (Figura 1.10 E e 1.10 F). A secreção tem coloração alaranjada à acastanhada, embora tenha encontrado alguns tricomas com a cutícula expandida, mas sem coloração (Figura 1.10 A a 1.10 D), o que pode estar relacionado ao estágio de desenvolvimento em que se encontram. Acredita-se que os tricomas peltados possuam secreção na coloração citada quando maduros secretando as substâncias lipofílicas características deste tipo. Os peltados foram observados em ambas as faces das folhas, porém em abundância na face abaxial. Os peltados não foram os únicos tricomas observados levemente afundados na epiderme. Foi observado um tricoma capitado de menor tamanho em relação aos peltados com um curto espaço entre as células secretoras e uma cutícula externa (Figura 1.11 A a 1.11 C).

Barras: A e C= 100 m; B, D e F= 50 m; E= 20 m.

Tricomas glandulares – Capitados: Existem vários tipos de classificação para os tricomas capitados na literatura. Werker (1985) descreve três tipos (i.e. tipos I, II e II) que se baseiam na forma como as células secretam as substâncias. Sugere-se que o tricoma capitado afundado na epiderme (Figura 1.11 A e 1.11 C) seja do tipo I devido ao pequeno espaço entre as células secretoras e a cutícula externa. Contudo, nenhum registro realizado nesse estudo comprova a presença de gotículas de secreção, característica deste tipo de capitado. Portanto, como o objetivo não foi identificar os tricomas pela secreção, a proposta de identificação seguiu os parâmetros similares aos estabelecidos por Ascenção et al. (1999) para Plectranthus ornatus. Short-stalked capitados: Esse tricoma possui uma célula basal, uma célula peduncular curta, cabeça uni ou bicelular de formato ovóide a globóide com espaço subcuticular é reduzido. No presente estudo observou-se que alguns deles apresentavam-se levemente afundados na epiderme (Figura 1.12 A a 1.12 C ) e outros não (1.12 D).

Long-stalked capitados: Esse tricoma possui uma célula basal, duas a três células pedunculares de comprimento variável e cabeça unicelular em formato de bulbo. Esse tricoma desenvolve um grande espaço subcuticular para acúmulo das substâncias secretadas e o destacamento da cutícula ocorre na base da célula secretora da cabeça, na qual quando rompida libera a secreção acumulada. Nesse presente estudo foi observado que os tricomas capitados long-stalked apresentaram tamanho diferente do relatado por Ascensão et al. (1999). Pelas escalas das imagens fornecidas na literatura percebeu-se que o tricoma do presente estudo é relativamente menor do que o tricoma apresentado para Plectranthus ornatus. Com relação à cutíla, foi observado nos registros desse tricoma que grande parte deles apresentou-se com a mesma rompida (Figura 1.13).

A Tabela 1.1 apresenta um resumo das diferenças anatômicas entre as espécies Plectranthus neochilus e P. ornatus encontradas na literatura. Em Plectranthus neochilus não foram encontrados tricomas digitiformes e conoidais, e as descrições realizadas para os tricomas não glandulares, glandulares peltados e short e long-stalked capitados de Duarte e Lopes (2007) corroboram com as observações realizadas no presente estudo.

Tabela 1.1. Tricomas identificados na literatura para Plectranthus neochilus e Plectranthus ornatus. Plectranthus neochilus Plectranthus ornatus Tipos de Características Schltr. (DUARTE e Codd (ASCENÇÃO et tricoma LOPES, 2007) al., 1999) Número de células 3-10 3-7 Não glandulares Células do pedestal celular 2-8 6-12 8 células iguais em uma Peltados Células da cabeça 8 células em uma camada camada Ovóide a globóide, 1-2 Short-stalked Cabeça do tipo I 1-2 células células capitados Cabeça do tipo II Não informado Ausente Long-stalked Células da cabeça 1-2 células Unicelular bulb-shaped capitados 2-3 células iguais em uma Digitiformes Número de células Não informado fileira longitudinal Fonte: Adaptado de Kalicharan et al., 2015.

4.2 Histoquímica

Dos testes histoquímicos propostos para o limbo foi constatada a presença de terpenos e lipídeos totais e neutros. Esse resultado direciona os estudos químicos para análise desses compostos, pois os testes são uma ferramenta para localizar as principais classes químicas de metabólitos presentes nas secreções das espécies vegetais (ASCESÃO et al., 1997). Nos tricomas pôde-se observar a presença de lipídeos por três reagentes, sudan blak B propiciou pela coloração preta nos tricomas (Figura 1.14A a C), sudan IV na coloração alaranjada tanto no tricoma (Figura 1.14D e 1.14E) como no interior das células parenquimáticas, evidenciando gotas de lipídeos (1.14F), e a coloração azul para a presença lipídeos ácidos com o sulfato azul do nilo nos tricomas (Figura 1.14L e 1.14M) e mesofilo (Figura 1.14N). O sulfato azul do Nilo permite diferenciar os lipídeos neutros dos ácidos devido à presença de uma oxazona (cor vermelha) e uma oxazina (cor azul). A primeira dissolve lipídeos neutros (gorduras) e a segunda reage com os resíduos de ácido dos fosfolipídeos (FIGUEIREDO et al., 2007). O reagente de Nadi reagiu com o tricoma e epiderme corando-os de azul (Figuras 1.14G e 1.14H). O mesofilo foi corado de azul na região dos vasos condutores e de violeta em algumas gotas no interior das células do parênquima (Figura 1.14 I e 1.14 J), semelhante ao resultado evidenciado pelo sudan IV no mesofilo. A coloração violeta indica uma mistura de óleos essenciais (terpenos) e ácidos resiníferos na planta. A reação de identificação de compostos fenólicos não foi positiva. A coloração resultando nos tricomas foi sutil, não podendo evidenciar presença de compostos fenólicos. Embora Duarte e Lopes (2007) tenham relatada a presença desses compostos, não foram publicadas imagens que comprove a presença.

O resultado positivo para tricomas capitados também foi observado em outras espécies da família como Lavandula pinnata, Ocumum basilicum, Origanum vulgare, Salvia aurea, P. zuluensis, P. ornatus (WERKER et al., 1985, 1993; VALENTI et al., 1997; ASCENSÃO et al., 1999; KHALICHARAN et al., 2015). Entretanto, foi observado que apenas os tricomas capitados foram corados nas reações. É possível visualizar nas Figuras 1.14B, 1.14E e 1.14N que quando o tricoma peltado está com secreção na cor acastanhada em seu espaço subcuticular a substância química não penetra, mesmo seu conteúdo sendo lipofílico. Já quando está com secreção transparente, suas células basais coram. Não foi encontrado na literatura informação sobre a coloração desse tricoma e a razão dele não corar. O desenvolvimento do tricoma peltato é realizado em três estágios. Na fase secretora ocorre o desenvolvendo do espaço sobre as células glandulares, o afrouxamento da parede e acúmulo de secreções que fornece a forma esférica ao tricoma, característico de uma glândula peltada madura. O reforço da parede da cutícula confere resistência à cavidade secretora quando grandes quantidades de secreção são armazenadas. Outra questão ainda não compreendida é a eliminação do produto secretor no espaço subcuticular. Em Leonotis leonurus foi observado que os tricomas peltados não apresentaram ruptura espontânea da cutícula (ASCENSÃO et al., 1997). Talves seja essa uma das possíveis causas de alguns reagentes, mesmo lipofílicos, não penetraram a cutícula do tricoma. Porém, com os resultados obtidos no presente estudo nada pode ser afirmado, pois não foram realizados estudos que relacionassem, por exemplo, a composição da secreção, suas colorações e as fases de maturação. Alguns estudos indicaram que em um determinado período da maturação do tricoma peltado haja uma relação entre plastídeos e a razão de monoterpenos no óleo essencial, como também a relação entre a extensão do retículo endoplasmático com a taxa de sesquiterpênicos, e que estes compostos podem atuar como componentes internos da membrana (ASCENSÃO et al., 1997). Porém, os estudos publicados sugerem hipóteses. Com relação aos resultados obtidos para presença de lipídeos e terpenos eles são consistentes com a composição química do óleo essencial de P. neochilus como pode ser observado no Capítulo 2.

4.3 Citogenética

Segundo a literatura, as espécies de Plectranthus apresentam número cromossômico variado, de 2n= 14 a 84, sendo que a maior delas ocorre em Plectranthus barbatus. Já para P. neochilus, até o desenvolvimento do estudo de Nani (2011) não se conhecia seu cariótipo. Nani (2011) verificou o cariótipo de P. barbatus, P. neochilus e P. amboinicus e identificou um número somático comum para as duas primeiras espécies, 2n= 30 e 2n= 34 para P. amboinicus. Em P. neochilus os 30 cromossomos foram identificados em todos os diferentes genótipos utilizados e a morfologia dos pares cromossômicos também foi a mesma, apresentando menor assimetria cromossômica entre as espécies de Plectranthus estudadas (NANI, 2011). A citogenética realizada no presente estudo identificou 2n= 30 para todos os indivíduos de Plectranthus neochilus utilizados (Figura 1.15). Tal resultado corrobora com Nani (2011), que também identificou 30 cromossomos para todos seus indivíduos. Em contrapartida, De Wet (1958) identificou para Coleus comosus, sinonímia de Plectranthus ornatus, 2n= 32, cariótipo diferente do encontrado por Nani (2011) e o presente estudo para Plectranthus neochilus. Portanto, a citogenética foi mais uma ferramenta utilizada que auxiliou na obteção das características de identificação da espécie objeto deste estudo.

Figura 1.15. Cromossomos dos indivíduos de Plectranthus neochilus. A – CPQBA. B – Guará. C – UNICAMP. D – Nova Odessa. Barra: 10 m.

5. CONCLUSÃO

De acordo com as observações dos tipos nomenclaturais, com a chave de identificação, com discussões com taxonomistas, a microscopia de luz que apresentou estômatos diacíticos, ausência de tricoma digitiforme, distribuição dos tricomas peltados em ambas as faces das folhas e presença de estrias nos estômatos, e a citogenética que apresentou o número cromossômico de 2n= 30, foi identificado que a espécie em estudo é Plectranthus neochilus e que todos os indivíduos utilizados também pertencem à mesma espécie. Além disso, através da anatomia da espécie foi verificado que o mesofilo não é homogêneo e que no mesmo não há presença de compostos fenólicos bem como foi descrito por Duarte e Lopes (2007). Portanto, tanto as características utilizadas para confirmar a identificação da espécie quanto às encontradas em contraposição a descrição de Duarte e Lopes (2007), podem ser utilizadas como identidade para espécie.

CAPÍTULO 2 PERFIL QUÍMICO DO ÓLEO ESSENCIAL DE PLECTRANTHUS NEOCHILUS E SUA ATIVIDADE BIOLÓGICA

1. INTRODUÇÃO

1.1 Uso popular

Estudos etnobotânicos apresentam informações a respeito das espécies vegetais com potencial medicinal utilizada por comunidades. Ainda que elas estejam próximas às florestas de grande biodiversidade nativa, a maioria das espécies utilizadas é exótica e de hábito herbáceo. De todos os sintomas relatados nos estudos, as doenças relacionadas a distúrbios gastrointestinais são as mais comuns, e geralmente as indicações terapêuticas são realizadas oralmente por amigos. Para facilitar o acesso à planta, a maioria dos moradores as colhe no jardim de casa, recorrendo raramente à farmácia ou a ajuda médica (DI STASI et al., 2002; PINTO et al., 2006; BOCARDI, 2008; BORGES et al., 2011). Embora o consumo popular de plantas medicinais seja grande, a composição e atividade de muitas ainda é pouco conhecida (ZENI e BOSIO, 2006). O boldo, por exemplo, é utilizado como digestivo, antiespasmódico e analgésico, sendo que, na maioria das vezes, é consumido quando não encontram o boldo do chile (P. boldus) ou do boldo brasileiro (P. barbatus) (TOMAZZONI, 2004; BOCARDI, 2008). O consumo é feito através da infusão (chá) ou pela maceração das folhas frescas, procedimentos estes que preservam os compostos voláteis. O chá é a forma mais comum de consumo, geralmente ingerido para combater problemas relacionados aos distúrbios gastrointestinais (PINTO et al., 2006; BOCARDI, 2008). Porém, até o momento o chá tem sido consumido sem o devido conhecimento da composição química e toxicidade.

1.2 Óleo essencial

Óleos essenciais são compostos voláteis lipofílicos produzidos em diferentes órgãos do vegetal, como folhas, flores, caules, raízes, frutos ou sementes, geralmente para a defesa contra herbívoros, como também para atrair visitantes para a polinização. As substâncias voláteis são provenientes de três vias biossintéticas: a via mevalonato levando a sesquiterpenos, a via metil- eritritol levando à mono e diterpenos, e a via do ácido chiquímico originando fenilpropenos, sendo estes os principais constituintes. Devido a diferentes locais de produção do óleo no vegetal é comum

55 uma grande variação na composição química. Geralmente há a presença de um composto majoritário e de compostos em menores e em baixíssimas quantidades (traços), sempre em diferentes concentrações. Os compostos voláteis são extraídos do vegetal através de técnicas de destilação e microextração (COSTA, 2008; BIZZO e REZENDE, 2009; BASER e BUCHBAUER, 2010). Lamiaceae é uma das famílias dicotiledôneas mais importantes quanto à produção de óleo essencial. Nela são comuns os tricomas glandulares peltados e capitados que realizam a produção dos voláteis pelas células secretoras e estes se acumulam no espaço subcuticular das estruturas. A maioria das espécies produzem mono e sesquiterpenos, e em algumas a biossíntese de monoterpenos aumenta nos quinze primeiros dias de desenvolvimento foliar, estabiliza-se e em seguida permanece estável (BASER e BUCHBAUER, 2010). Quanto à composição química do óleo essencial da espécie, pesquisadores constataram por volta de trinta e seis compostos, com diversas propriedades farmacológicas (CREVELIN et al., 2015; BOCARDI, 2008; OYEDEJI et al., 2011; ROSAL et al., 2011), como também potencial esquistossomicida contra adultos do verme Schistosoma mansoni com uma diminuição do número de ovos, e potencial antimicrobiano no controle de Bacillus cereus, Listeria monocytogenes e Helicobacter pylori (CAIXETA et al., 2011; MOTA et al., 2014). Além disso, pesquisadores realizaram os primeiros estudos sobre o potencial da planta como repelente. Tanto o extrato aquoso quanto o óleo essencial reduziram a colonização e oviposição de Bemisia tabaci (mosca branca) em culturas de tomate. Também foi constatado que o uso do óleo essencial não causou fitotoxicidade ao tomateiro (BALDIN et al., 2013; 2015; FANELA et al., 2016). Embora a planta apresente um potencial repelente contra a mosca branca, Krinski e Godoy (2015) alertam que esses voláteis poderiam ser mais estudados para o combate da lagarta Helicoverpa armigera, inseto que tem causado grande prejuízo às culturas de soja, milho e algodão, porém não há estudos comprovando se o óleo essencial detém a oviposição da lagarta. No campo da agricultura, estudos mostraram que o uso de adubos orgânicos como o esterco bovino e avícola, promoveu uma maior produção de biomassa e elevou o rendimento dos princípios ativos do óleo, podendo obter uma composição química significativamente alterada conforme o adubo orgânico empregado (ROSAL et al., 2009, 2011). As pesquisas apontaram a importância do uso do óleo essencial da espécie na área agrícola, como também que o mesmo pode ser mais utilizado para diminuir prejuízos. Porém, ainda pouco explorada a relação da composição química com seus efeitos e aplicações (BALDIN et al., 2013; 2015; FANELA et al., 2016).

1.3 Extração de óleo essencial

Dois métodos de destilação são muito utilizados para extração de óleo essencial: a destilação por arraste a vapor e a hidrodestilação em aparelho de Clevenger. Na destilação por arraste a vapor, o material vegetal é colocado sobre uma placa perfurada e ambos dentro de uma dorna. Abaixo da placa há água destilada, que é aquecida e eleva a pressão de vapor da mistura óleo-água. O vapor atravessa o material „arrastando‟ os voláteis, ou seja, destilando os componentes do óleo essencial (KOKETSU e GONÇALVES, 1991). E na hidrodestilação, o óleo volátil é carregado com o vapor de água advindos da fervura da planta em água destilada em balão de vidro, ambos condensam e separam-se em camadas (CLEVENGER, 1928). A obtenção do óleo essencial de P. neochilus é realizada pela hidrodestilação das folhas frescas e picadas, e delas obtêm-se um óleo de cor amarelada e de odor característico, porém com baixo rendimento em relação ao material fresco. Os autores sugerem que a alta umidade presente nas folhas, 94%, possa explicar o baixo teor de óleo (BOCARDI, 2008; ROSAL et al., 2011; MOTA et al., 2014).

1.4 Atividade biológica do óleo essencial

Poucos estudos foram desenvolvidos para avaliar o potencial biológico do óleo essencial desta espécie. Em relação à ação antimicrobiana, foram encontrados apenas dois trabalhos que apontam que o óleo essencial apresentou potencial no controle de bactérias patogênicas transmitidas por alimentos, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes, bactéria causadora de distúrbios gastrointestinais, Helicobacter pylori, e bactériaa cariogênicas, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Enterococcus faecalis entre outras (MOTA et al., 2014; CREVELIN et al., 2015). Sobre a relação dos compostos com a atividade antimicrobiana, alguns se destacam como o germacreno D, -humuleno, -pineno e o óxido de cariofileno. E Rosal et al. (2011) relatam que há ação antibacteriana de sesquiterpenos. Desta forma, pode ser que tais compostos tenham um papel importante na atividade biológica, porém não se sabe se atuam igualmente para bactérias Gram positivas e Gram negativas (BOCARDI, 2008; VIEIRA et al., 2009). Outro teste ainda pouco explorado para o óleo essencial do boldo é o antioxidante. A literatura apresenta apenas um estudo para o óleo essencial, pois os demais foram realizados para os diferentes extratos da planta. Mota et al. (2014) utilizaram dois métodos, o DPPH e TBARS, ambos os métodos apresentaram atividade.

2. OBJETIVO

Analisar o perfil químico do óleo essencial das folhas de Plectranthus neochilus e seu potencial antimicrobiano e antioxidante.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material vegetal

Este estudo foi realizado com o indivíduo de P. neochilus proveniente do bairro Guará do distrito de Barão Geraldo. A matriz encontra-se no campo experimental do Instituto de Biologia da UNICAMP. A exsicata foi depositada no Herbário da Universidade Estadual de Campinas (UEC) sob o número de acesso: 193819. As atividades realizadas com o indivíduo estão descritas no Quadro 2.1.

3.2 Produção de mudas

Foram feitas mudas por propagação vegetativa e o material foi preparado de acordo com a técnica usual de estaquia como abordado no Capítulo 1.

3.3 Extração de óleo essencial

Diante do baixo rendimento do óleo reportado na literatura foram avaliados dois métodos de extração de óleo essencial, a hidrodestilação por aparelho de Clevenger e a destilação por arraste a vapor. Para essa avaliação, foi utilizado o indivíduo Guará cultivado a sol pleno. As extrações do óleo essencial foram realizadas no Instituto Agronômico de Campinas – Setor de Fitoquímica coordenado pela pesquisadora Márcia Ortiz. Para a hidrodestilação (Figura 2.1A), precisou por volta de 500 g de folhas frescas e picadas, 500 mL de água destilada em um balão de 2000 mL com duração de 4 horas. A destilação por arraste a vapor (Figura 2.1B), precisou de 1000 g de folhas frescas e picadas e aproximadamente 5000 mL de água destilada com duração de 1 hora e 30 minutos. O teor de óleo foi calculado com base nas folhas frescas, considerando o resultado da liofilização de 100 g de amostra a partir da fórmula:

Teor de óleo essencial (%) = 100 x massa do óleo essencial (g)/ massa fresca das folhas (g)

A B

As amostras foram analisadas no Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas do Instituto de Química da Unicamp sob supervisão do prof. Marcos Eberlin. O equipamento utilizado foi um cromatógrafo a gás (modelo 7890A, Agilent Technologie, CA, USA) acoplado a um espectrômetro de massas do tipo Quadrupolo (modelo 5975C, Agilent Technologies, CA, USA) com injetor automático (modelo MPS 2, Gerstel). A separação dos metabólitos foi realizada em coluna capilar de sílica fundida HP-5ms (30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e filme de 0,25 μm diâmetro). O gás hélio de alta pureza (99,999 %) foi utilizado como fase móvel (gás de arraste) na vazão de 1 mL/ min. A fonte de ionização por impacto de elétrons utilizou uma energia de 70 eV. O espectrômetro de massas foi operado em modo full scan na faixa de 40 a 500 m/z Foi diluído 10 μL dos óleos essenciais em 90 μL diclorometano na proporção 1: 10, e transferidos 1 μL dessa diluição para inserts, e estes inseridos nos vials de 2 mL. Ambas as amostras foram submetidas às mesmas condições cromatográficas. Foi utilizado um método cromatográfico de longa duração, 68 minutos, já utilizado no grupo de pesquisa, que possui programação de temperatura de 60 ºC a 300 ºC em uma taxa de 5ºC/ min, um fluxo de divisão (split) de 1: 10. Os dados gerados foram analisados e os espectros dos compostos foram comparados com os espectros fornecidos pela biblioteca NIST (National Institute of Standards and Technology) a fim de propor a composição química da espécie. Foram considerados os picos com área relativa a três vezes a área do ruído, como também compostos com porcentagem de similaridade acima de 90. A similaridade é gerada por um algoritmo do software do equipamento que compara qualitativamente tanto os fragmentos gerados quanto as intensidades destes. Essa compração foi realizada com a biblioteca NIST (2008) acoplado ao equipamento.

3.4 Identificação dos compostos

O óleo essencial de P. neochilus obtido pela hidrodestilação foi utilizado para identificação dos compostos, e para tanto submetido ao método cromatográfico segundo Adams (2007), 60 ºC a 246 ºC em uma taxa de 3 ºC/ min com 62 minutos de duração e splitless. Os dados gerados foram analisados comparando os espectros gerados com os da literatura de Adams (2007). Foram considerados os picos com área relativa a três vezes a área do ruído. Os compostos foram identificados com o uso da biblioteca NIST 2008 acoplada ao equipamento, como também com o uso da literatura de Adams (2007) através do cálculo do índice de retenção (IR). Foi utilizando um padrão de n-alcanos C8-C20 e injetado nas mesmas condições cromatográficas utilizada, o que permitiu o cálculo do IR realizado pela Equação 2.1.

3.5 Atividades biológicas do óleo essencial

3.5.1 Atividade antimicrobiana Foi realizado um ensaio biológico in vitro e a atividade antimicrobiana foi avaliada pelo método em ágar em camada dupla frente às bactérias Gram-positivas: Staphylococcus aureus Rib1, S. aureus ATCC25922, e S. aureus BEC9393, S. epidermidis ATCC12228, e contra Gram-negativas: Escherichia coli ATCC25923, Klebsiella pneumoniae KP230, K. pneumoniae ATCC4352, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 e P. aeruginosa 31NM. Para esta atividade foram utilizados os óleos essenciais obtidos pelos métodos de hidrodestilação e destilação por arraste a vapor do indivíduo Guará. A atividade antimicrobiana foi realizada no Departamento de Microbiologia da Faculdade de Farmácia – UNICAMP, no laboratório do Prof. Dr. Marcelo Lancellotti. No plaqueamento, a camada base foi obtida pela adição de 20 mL de Müller HintonMedium (Difco), em placas de 20 x 150 mm. Após a solidificação adicionaram-se 5,0 ml de caldo Müller Hinton contendo os microrganismos na concentração 5 x 106 UFC/ mL (Unidades Formadoras de Colônia) obteve-se assim a camada seed. A

60 seguir, foram confeccionados poços com 5,0 mm de diâmetro e em cada poço aplicados 20 L das soluções controle (positivo e negativo) e dos óleos essenciais (concentração de 0,50 mg/ mL). Como controle positivo foi usado bacitracina (0,20 UI/ mL) e como controle negativo o solvente usado, etanol. As placas-testes foram incubadas durante 24 horas a 37 ºC. Decorrido o período de incubação, as zonas de inibição do desenvolvimento microbiano foram observadas em termos de diâmetro (halo), sendo considerados positivos os halos maiores que 10 mm de diâmetro.

3.5.2 Atividade antioxidante A atividade antioxidante foi avaliada através do ensaio de DPPH (2,2-difenil-1-picril- hidrazila). Inicialmente foi realizada uma análise preliminar qualitativa da atividade antioxidante do óleo essencial em cromatografia de camada delgada (CCD).

3.5.2.1 Cromatografia de camada delgada A técnica consiste na separação dos componentes do óleo essencial para análise qualitativa da capacidade de sequestro de radical do memso. A CCD foi realizada em placas de alumínio recoberta por sílica (25TLC – Silica Gel60 F254, Merck). Uma gota de óleo essencial de Plectranthus neochilus e uma gota de solução etanólica de quercetina 0,1 % (v/v) (controle positivo) foram aplicadas sobre a placa de sílica e reveladas com solução etanólica de DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) 90 μM. Outros testes foram conduzidos para escolha da fase móvel com diclorometano P.A., hexano P.A., e acetato de etila nas proporções 90: 10, 70: 30, 50: 50, 30: 70 e 10: 90 (v/v), sendo posteriormente testadas as proporções 97: 3, 95:5, 93: 7 (v/v). As placas foram reveladas com solução etanólica de vanilina 6 % (v/v) e solução etanólica de ácido sufúrico 0,5 % (v/v) com posterior aquecimento em estufa a 100 °C. O revelador p-anisaldeído preparado com ácido acético glacial e ácido sulfúrico 97 % na proporção 1: 100: 2 (v/v), respectivamente, também foi testado e selecionado para as revelações finais.

3.5.2.2 Ensaio de DPPH Após análises preliminares, as análises de DPPH foram realizadas no Departamento de Genética e Biologia Molecular do Instituto de Biologia – UNICAMP, no laboratório do Prof. Dr. Marcelo Menossi. O ensaio de DPPH se baseia na medida do decaimento da absorbância em 517 nm da solução de 2,2-difenil-1-picril-hidrazila contendo substâncias antirradicalares. O DPPH é um radical livre estável que apresenta a coloração violeta e sendo utilizada a faixa de comprimento de onda de 515 a 520 nm para analisá-lo. Quando esse composto está na presença de uma substância

61 antioxidante, o elétron desemparelhado do átomo de nitrogênio do DPPH recebe um elétron do hidrogênio do antioxidante, e é então reduzido formando difenil-picril-hidrazina. Essa reação provoca uma mudança na coloração do DPPH, que passa a ser amarelo e sua absorbância nesses comprimentos de onda diminui com conseqüente desaparecimento da absorção, podendo a mesma ser monitorada pelo decréscimo da absorbância (BRAND-WILLIAMS et al., 1995; SOUSA et al., 2007). A Figura 2.2 ilustra a reação de oxirredução do DPPH em presença da quercetina, substância utilizada como padrão positivo.

Figura 2.2. Reação de oxirredução do DPPH na presença de quercetina.

O teste foi realizado em uma placa de micro diluição de 96 poços de acordo com Bozin et al. (2006) modificado. Para cada amostra de óleo essencial foram feitas diluições seriadas iniciando em 10 000 μg/ mL para obter uma concentração final de amostra nos poços de 19, 53 μg/ mL. Foram adicionados 65 mL de uma solução etanólica de DPPH (90 μM) e quercetina como controle positivo. Como controle negativo, o solvente utilizado e como branco os reagentes do ensaio. O progresso da reação foi medido pela absorbância (λ= 515 nm) usando um espectrofotômetro (Molecular Devices, SpectraMax M3) realizando medidas a cada 10 minutos durante um total de 60 minutos. A porcentagem de redução do DPPH foi calculada de acordo com a fórmula apresentada pela Equação 2.2 (ESPÍN et al., 2000). Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

% DPPH = 100 – [ (A amostra – A branco) x 100/A controle ] Equação 2.2. Equação para cálculo da porcentagem de redução do DPPH, no qual A amostra= absorbância da reação entre a solução do radical DPPH e a amostra antioxidante, Abranco= absorbância da solução de solvente utilizado para preparar a amostra antioxidante, Acontrole= absorbância do radical DPPH com uma pequena alíquota do solvente utilizado para preparar a amostra, em substituição à solução da própria amostra em estudo.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Extração de óleo essencial de Plectranthus neochilus

Com relação aos métodos de extração do óleo essencial avaliados, o cromatograma do óleo essencial obtido por hidrodestilação (Figura 2.2A) apresentou 74 picos entre mono e sesquiterpenos, a maioria com proposta de identificação. Poucos compostos apresentaram-se oxidados. Dos 74 picos obtidos foram considerados apenas 37 compostos devido à baixa porcentagem de área. Já o cromatograma da destilação por arraste a vapor (Figura 2.2B) apresentou 14 compostos com propostas de identificação, todos eles sesquiterpenos. Percebeu-se que o segundo método de extração resultou na perda dos mais voláteis. A composição química obtida através dos métodos avaliados, os tempos de retenção, porcentagem de área e a similaridade dos compostos obtidos se encontram na Tabela 2.1 (Anexo).

Figura 2.3. A - Cromatograma do óleo essencial das folhas de Plectranthus neochilus obtido pela hidrodestilação em aparelho de Clevenger. B - Cromatograma do óleo essencial das folhas de Plectranthus neochilus obtido pela destilação por arraste a vapor. O teor de óleo essencial da hidrodestilação foi de 0,012 % (m/ m) e da destilação por arraste a

63 vapor de 0,018 % (m/ m), menor do que o encontrado na literatura, 0,024% com relação à massa fresca do vegetal. Para confirmar a informação da alta umidade, foi realizada a liofilização das folhas e verificou 89,66% de umidade. Esse dado justificou o baixo rendimento dos óleos essenciais obtido em ambos os métodos de extração assim como relata a literatura (BOCARDI, 2008; BARBOSA et al., 2011).

4.2 Identificação dos compostos

A Tabela 2.2 apresenta a composição química do óleo essencial das folhas de Plectranthus neochilus cultivadas em sol pleno coletadas em abril de 2018 no período da manhã. A extração do óleo essencial foi realizada por hidrodestilação. Os tempos de retenção, o índice de retenção calculado e o índice da literatura, ambos com base em ADAMS (2007), e o nome do composto identificado estão representados na Tabela 2.2.

Tabela 2.2. Composição química do óleo essencial de Plectranthus neochilus obtido por GC-MS.

nº TR IR cal. IR lit. Área % Composto

1 2.59 766 - 0.32 m/z 41 2 3.28 854 846 1.64 trans-2-Hexenal 3 4.78 938 924 14.94 α-Tujeno 4 4.93 944 932 7.36 α-Pineno 5 5.82 982 969 6.31 Sabineno 6 5.91 986 - 3.24 m/z 93 7 6.04 992 974 15.99 1-Octen-3-ol 8 6.64 1013 988 1.24 3-Octanol 9 6.93 1022 - 0.39 m/z 121 10 7.16 1029 1020 0.42 ρ-Cimeno 11 7.29 1033 1025 0.82 Silvestrene 12 7.54 1040 1032 0.34 cis-β-Ocimeno 13 7.92 1052 1044 1.67 trans-β-Ocimeno 14 8.23 1062 1054 0.71 γ-Terpineno 15 9.17 1091 1085 0.21 ρ-Ment-2,4(8)-diene 16 9.62 1104 1095 0.22 Linalol 17 10.18 1118 1102 0.12 Perilene 18 10.36 1123 - 0.17 m/z 109 19 11.26 1146 1140 0.1 trans-Verbenol 20 12.63 1181 1174 1.43 4-Terpineol 21 13.06 1193 1186 0.14 α-Terpineol 22 13.67 1208 1201 0.23 Decanal 23 19.53 1349 1348 0.39 α-Cubebeno

24 20.62 1375 1374 0.8 α-Copaeno 25 21.22 1389 1387 0.78 β-Cubebeno 26 20.97 1384 1387 0.6 β-Bourboneno 27 23.03 1434 1417 20.11 trans-Cariofileno 28 23.93 1456 1452 1.35 α-Humuleno 29 24.10 1461 1458 0.21 Alloaromadendreno 30 25.12 1486 1480 3.71 Germacreno D 31 25.51 1496 - 0.32 m/z 207 32 26.04 1509 1502 1.97 trans-β-Guaieno 33 26.31 1516 1514 0.79 Cubebol 34 26.70 1526 1522 1.25 δ-Cadineno 35 28.42 1570 1561 0.78 trans-Nerolidol 36 28.98 1585 1582 2.8 Óxido de cariofileno 37 29.80 1606 1607 0.18 m/z 43 38 30.04 1612 1618 0.12 1.10-Di-epi-Cubenol 39 30.54 1626 1627 0.27 1-epi-Cubenol 40 30.68 1630 1639 0.1 Cariofila-4(12),8(13)-dien-5α-ol 41 30.86 1635 1639 0.29 Cariofila-4(12),8(13)-dien-5β-ol 42 31.12 1642 1644 1.39 α-Muurolol 43 31.68 1658 1652 1.42 α-Cadinol 44 32.17 1671 1666 0.27 m/z 91 45 32.69 1685 1685 0.27 Germacra-4(15),5,10(14)-trien-1-α-ol 46 58.55 2773 - 1.13 m/z 95 Legenda: nº: número de picos; RT: Tempo de retenção; IR cal.: Índice de retenção calculado com base em Adams, 2007; IR lit.: Índice de retenção com base na literatura (Adams, 2007); (-): composto não identificado na literatura.

Monoterpenos: 44, 68 % Sesquiterpenos: 41, 30 %

Compostos não identificados: IR=766: m/z 41[M+], 51, 56, 63, 69, 83, 98; IR= 986 m/z 93[M+], 41, 50, 57, 69, 79, 86, 100, 107, 121, 136; IR= 1022 m/z 121[M+], 41, 51, 57, 65, 77, 86, 105, 121, 136; IR= 1123: m/z 109[M+], 41, 55, 69, 81, 91, 121, 139, 154; IR= 1496 m/z 207[M+], 43, 55, 67, 79, 93, 105, 121, 135, 147, 161, 179, 189; IR= 1606 m/z 43[M+], 55, 67, 79, 99, 109, 121, 138, 150, 162, 177, 220; IR= 1671 m/z 91[M+], 41, 55, 67, 79, 107, 123, 135, 149, 159, 177, 187, 205; IR= 2773 m/z 95[M+], 43, 59, 79, 121, 145, 161, 191, 207, 227, 243, 269, 303;

A Tabela 2.2 apresenta o total de 46 compostos, com 39 identificados e 7 não identificados, porém com m/z e fragmentos conhecidos, como apresenta a legenda. Foi identificado um total de 41,30 % de sesquiterpenos e 44,68 % de monoterpenos, sendo este o grupo mais representativo da composição química do óleo essencial. Representatividade próxima foi observada quando a composição química do óleo essencial da espécie foi cultivada em seu país nativo, a África (OYEDEJI et al., 2011). Porém, a maioria dos estudos da literatura apresentaram sesquiterpenos.

Embora a maior concentração na amostra seja de monoterpenos, o composto majoritário foi o trans- cariofileno com 20,11 % da composição química da espécie, seguido de 1-octen-3ol com 15, 99 %, -tujeno com 14,94 % e -pineno com 7,36 %. Quando a espécie está sob cultivo em outros países, os principais constituintes são diferentes. Por exemplo, na África, país considerado nativo da espécie, foram obtidos para o óleo essencial das folhas: citronelol (29 %), formato de citronelila (11 %), linalol (9,8 %) e isomentona (9,2 %) (OYEDEJI et al., 2011); e em Portugal para o óleo essencial de folhas e caules: acetato de terpenila (48 %), ɑ-tujona (28 %) e β-cariofileno (28 %) (MOTA et al., 2014). Os compostos relatados não foram encontrados no indivíduo cultivado no Brasil e os estudos aqui dirigidos apresentaram o cariofileno como seu composto majoritário, como é observado em Bocardi (2008) (19,96 %), Barbosa et al. (2011) (25,5 %), Rosal et al. (2011) (15,06 %), Caixeta et al. (2011) (28,23 %) e Crevelin et al. (2015) (29,80 %) com concentrações próximas a obtidas nesse momento. Em espécies do gênero não cultivadas na África também obtiveram cariofileno em altas porcentagens como P. madagascariensis, P. rugosus, P. fruticosus, P. coleoides, P. tenuiflorus, P. incanus e P. defoliatus (ASCENSÃO et al., 1998). Em outras famílias botânicas, o composto apresentou atividade antiinflamatória, inibição da irritação da mucosa gástrica e atividade anestésica local. Talvez seja essa uma das causas pelas quais comunidades utilizem este boldo para questões gástricas (BOCARDI, 2008). E por fim, Rosal et al. (2011) identificaram que o cariofileno só foi obtido como majoritário quando a espécie não esteve sob tratamento com adubos bovino e avícola, evidenciando que a presença ou ausência de adubação influencia a composição química do óleo essencial da espécie. Os tricomas glandulares apresentam funções importantes nas plantas, podendo desempenhar vários papéis como defensivo contra predadores, atrativo para os polinizadores e desta forma produzindo substâncias lipofílicas, como os óleos essenciais. Embora a literatura relate que existe uma forte relação entre esses tricomas e a produção de óleo essencial, a alta umidade da espécie não favorece um alto rendimento do óleo essencial. A produção de óleo essencial para cada espécie vegetal ainda permanece como motivo de estudo (WERKER et al., 1985; ASCENSÃO et al., 1998).

4.3 Atividades biológicas do óleo essencial

4.3.1 Atividade antimicrobiana A Tabela 2.3 apresenta o sinal positivo (+) para as formações de halo com diâmetro maior do que 10 mm indicando que houve inibição microbiana, e o sinal negativo (-) indicando que não houve inibição ou que o halo formado foi menor do que 10 mm.

Tabela 2.3 Ação antimicrobiana do óleo essencial de Plectranthus neochilus. Destilação por arraste a Hidrodestilação Microrganismos Coloração Gram vapor 20 % concentração Klebsiella pneumoniae ATCC4352 Negativa - - Klebsiella pneumoniae KP230 Negativa - - Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 Negativa + - Pseudomonas aeruginosa 31NM Negativa + + Escherichia coli ATCC25923 Negativa + - Staphylococcus aureus Rib1 Positiva + - Staphylococcus aureus ATCC25922 Positiva + - Staphylococcus aureus BEC9393 Positiva + - Staphylococcus epidermidis Positiva + - ATCC12228

Plectranthus possui um número expressivo de espécies com potencial medicinal (ABDEL- MOGIB, 2002; MOTA et al., 2014). Embora haja um interesse recentemente em avaliar os óleos essenciais frente a microrganismos, apenas 79 espécies de Plectranthus tiveram sua composição química estudada e desse total poucas apresentaram atividade antimicrobiana, são elas P. glandulosus, P. incanus, P. cylindraceus e P. laxiflorus frente a E. coli, S. aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. Aureus, S. epidermidis, Streptococcus mutans e Streptococcus viridans. A atividade desses óleos essenciais para essas espécies pode ser devida aos monoterpenos oxigenados, hidrocarbonetos monoterpênicos e ao germacreno D, compostos esses também encontrados em Plectranthus neochilus (ISCAN et al., 2002; JIROVETZ e BUCHBAUER, 2002; MARWAH et al., 2007; VAGIONAS et al., 2007). Com relação a P. neochilus a literatura também apresenta poucos trabalhos. Mota et al. (2014) confirmaram a atividade antimicrobiana do óleo essencial de folhas e caules frente a S. aureus, E. coli e P. aeruginosa, microrganismos também avaliados neste estudo. Os óleos essenciais avaliados foram efetivos contra P. aeruginosa, microrganismo que confere resistência a antimicrobianos devido às barreiras em sua membrana externa tornando-a tolerante a difusão do óleo (MANN et al., 2000; GUTIERREZ et al., 2008). A destilação propiciou a obtenção apenas de sesquiterpenos, porém estes compostos não apresentaram atividade frente aos outros microrganismos. Os óleos obtidos pela hidrodestilação, não apresentaram atividade contra as cepas de Klebsiella pneumoniae, até mesmo os extratos orgânicos e aquosos apresentaram baixo potencial para essa Gram negativa (YORK et al., 2012). Entretanto, esta é uma bactéria considerada multirresistente e possui resistência a antibióticos como penicilinas, cefalosporinas, aminoglicosídeos e quinolonas (SPANU et al., 2002). Atualmente, produtos naturais como os óleos essenciais que podem não apresentar risco a saúde, têm sido utilizados como alternativas, principalmente frente a S. aureus e S. epidermidis, pois a eliminação dos estafilococos nem sempre é

67 possível devido à sua capacidade de formar biofilmes. E o boldo apresentou atividade frente a esses microorganismos (NOSTRO et al., 2007). Crevelin et al. (2015) identificaram α-pineno, β-pineno, trans-cariofileno e óxido de cariofileno como constituintes majoritários no óleo essencial de P. neochilus, e avaliaram a atividade de cada um frente a bactérias cariogênicas. Isoladamente, eles foram pouco efetivos e a mistura dos quatro compostos apresentou atividade moderada, porém menos efetiva que o óleo essencial. Esse estudo revela que os compostos minoritários também têm seu papel frente aos microrganismos e podem exercer certa influência sobre os compostos majoritários, ou seja, há uma interação sinérgica entre os compostos que favorece a atividade (BOTELHO et al., 2007; VIEIRA et al., 2009; CREVELIN et al., 2015). Os compostos majoritários obtidos para a espécie foram parecidos aos relatados por Crevelin et al. (2015): -tujeno, -pineno, 1-octen-3-ol e trans-cariofileno. A literatura aponta que -pineno contido em outras espécies vegetais apresentou efeito contra as bactérias S. aureus, S. epidermidis, S. pneumoniae, S. pyogenes e Helicobacter pylori. O -pineno junto ao cariofileno apresentou atividade anti-inflamatória e diminuiu a irritação da mucosa gátrica (BOCARDI, 2008). Desta forma, pode ser que apenas sesquiterpenos não sejam eficientes como antimicrobianos. Já a sinergia do óleo essencial, com mono e sesquiterpenos, e seus compostos majoritários e minoritários, tenham favorecido a atividade antimicrobiana apresentada. As bactérias Klebsiella pneumoniae e S. epidermidis até o momento não foram avaliadadas para Plectratnhus neochilus. Neste estudo, os óleos essenciais foram testados pela primeira vez frente a elas. Pouco foi produzido com relação à atividade antimicrobiana da espécie. Pelos resultados obtidos e os verificados na literatura, a espécie atua contra microrganismos Gram positivos e Gram negativos. Por isso, novos estudos com diferentes concentrações do óleo essencial precisam ser desenvolvidos para verificar a atuação dos compostos e sua sinergia frente a microrganismos.

4.3.2 Atividade antioxidante

4.3.2.1 Cromatografia em camada delgada Qualitativamente, o óleo essencial apresentou atividade devido à formação da mancha amarelada na placa (Figura 2.4A), porém com uma coloração mais clara que a apresentada pelo controle positivo. Com relação às fases móveis, aquela que apresentou melhor separação dos compostos do óleo foi a 93: 7 de hexano para acetato de etila revelada com anisaldeído, pois a vanilina não permitiu a visualização das bandas (Figura 2.4B, C e D).

Após testes realizados, a CCD final foi realizada com os solventes hexano e acetato de etila na proporção 93: 7. Foi utilizado 5,2 mg/ mL de quercetina (controle positivo) e o óleo essencial da espécie nas proporções 1: 1, 1: 4 e 1: 9, como apresenta a Figura 2.5. A CCD revelada com DPPH apresentou de uma a duas bandas brancas. Duas bandas foram visíveis nas proporções 1: 1 e 1: 4 (Figura 2.5 A), com o óleo mais concentrado, e uma banda foi visível na proporção 1: 9. A CCD revelada com anisaldeido apresentou bandas de separação dos compostos (Figura 2.5 B), porém devida à baixa separação não foi possível afirmar se há um ou mais compostos responsáveis pela atuação antioxidante. Poderiam ser usadas outras CCD com outras fases móveis e técnicas analíticas para a determinação dos compostos antioxidantes, entretanto o objetivo foi realizar apenas um screening da capacidade antioxidante dos componentes do óleo essencial. Quando comparadas ambas as CCD, as duas bandas presentes na placa revelada com DPPH também se mostrou na revelada na CCD por anisaldeíso, como mostram os parênteses e setas pretas da Figura 2.5 A e B. As cromatografias realizadas apresentaram que o óleo essencial de Plectranthus neochilus possui pouca atividade antioxidante, assim como o teste preliminar em placa de sílica já havia mostrado com bandas brancas bem claras (Figura 2.4) quando comparada com a quercetina. Além disso, é possível que haja compostos responsáveis pela atividade, no entando não é possível afirmar se são um ou mais compostos os responsáveis.

4.3.2.2 Ensaio de DPPH O resultado do ensaio permite o cálculo da porcentagem de redução do DPPH, que corresponde à quantidade de DPPH reduzido pelo antioxidante, sendo a quantidade de antioxidante necessária para reduzir a concentração inicial de DPPH em 50% denominada concentração eficiente

(CE50) ou concentração inibitória (CI50). Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra, menor será a sua CE50 e maior a sua atividade antioxidante (SOUSA et al., 2007). Em primeiro momento foi realizado o ensaio de DPPH com concentração inicial de 200 a 6 g/ mL. Como essa faixa de concentração não foi capaz de reduzir o radical em 50 % foi realizado um segundo ensaio iniciando em 1000 g/ mL, que também não foi obtida a CE50. Por isso, foi necessário aumentar a concentração inicial para 10 000 g/ mL. A Tabela 2.4 apresenta a concentração eficiente do ensaio de DPPH. A tabela apresenta os cálculos em porcentagem das médias das triplicatas das amostras e as concentrações utilizadas para atingir o CE50 tanto para quercetina quanto para Plectranthus neochilus. Para quercetina foi obtida a

CE50 de 2,95 g/ mL, já a CE50 do óleo essencial não foi alcançada. Por isso, realizou-se o cálculo da

CE25 do óleo essencial, que foi de 6320,5 µg/ mL valor elevado quando comparado ao CE50 de outras

espécies Lamiaceae como Ocimum basilicum L. (manjericão), Origanum vulgare L. (orégao), Thymus vulgaris L. (tomilho) e Melissa officinalis L. (erva cidreira): 0,17 µg/ mL, 0,19 µg/ mL, 0,39 µg/ mL e 7,58 µg/ mL respectivamente (MIMICA-DUKIC et al., 2004; BOZIN et al., 2006). Ou seja, a avaliação da atividade antioxidante realizada através do ensaio de DPPH apresentou que o óleo essencial de Plectranthus neochilus não apresenta atividade antioxidante.

Tabela 2.4 Porcentagem de neutralização do radical DPPH do óleo essencial de Plectranthus neochilus e quercetina (como controle positivo). Concentração e % de redução

[g/mL] 10000 5000 2500 1250 625 312,5 156,25 78,125 39,0625 19,53125 CE50 CE25 Plectranthus 33,75 22,91 15,86 10,6 12,13 8,76 10,15 7,97 7,99 7,41 - 6320,5 neochilus

[g/mL] 200 100 50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,78125 0,390625 CE50 - Quercetina - - - - - 88,68 57,9 34,32 21,26 14,17 2,95 -

Para a espécie há apenas um trabalho de atividade antioxidante. Mota et al. (2014) utilizaram dois métodos com diferentes mecanismos de ação, o DPPH e TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, do inglês, thiobarbituric acid reactive substances). Para o DPPH foi utilizado 1000 g/ mL e o óleo apresentou capacidade menor que 15 % em reduzir o radical. Já para o ensaio de TBARS os melhores resultados de inibição também foram obtidos em alta concentração (1000 g/ mL), apresentando 60% de capacidade de prevenção de oxidação lipídica. Diversos estudos demonstram a atividade antioxidante dos monoterpenos -terpineol,- tujona, 1,8-cineol, -pineno, -terpineno, carvona e outros (COSTA, 2012). Embora esse tenha sido o grupo mais representativo não foram obtidos compostos fenólicos na composição química do óleo essencial, como eugenol, carvacrol, timol, compostos presentes em muitas espécies do gênero e que desempenham um importante papel na redução e neutralização de radicais livres (DEGÁSPARI e WASZCZYNSKYJ, 2004). Diante do resultado de Mota et al. (2014) para TBARS, outros metodologias antioxidantes podem avaliar a atividade do óleo essencial de P. neochilus como o ORAC (Capacidade de Absorbância Antioxidante do Radical Oxigênio) método de captura do radical 2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) e ABTS (sistema -caroteno/ ácido linoleico) entre outros (BOZIN et al., 2006; GONÇALVES, 2008; SINGH et al., 2009; COSTA et al., 2012).

5. CONCLUSÃO

O óleo essencial da espécie é composto principalmente por monoterpenos e sesquiterpenos (com 41,30 % e 44,68 % da área total do cromatograma, respectivamente). Na sua composição química, quando extraído através da hidrodestilação por aparelho de Clevenger, apresentou trans- cariofileno, 1-octen-3ol, -tujeno e -pineno como compostos majoritários. E quando extraído por destilação por arraste a vapor apenas sesquiterpenos foram obtidos. A atividade antimicrobiana foi avaliada e a diferença da composição química do óleo essencial obtida pelos dois métodos de extração impactou no potencial antimicrobiano. O óleo essencial extraído por destilação por arraste a vapor apresentou atividade apenas frente à Pseudomonas aeruginosa, e o óleo obtido por hidrodestilação apresentou atividade frente às bactérias Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli (Gram negativas) e Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis (Gram positivas), e em contra partida, não apresentou atividade antioxidante pelo mecanismo de ação avaliado, ensaio de DPPH.

CAPÍTULO 3 ANÁLISE METABOLÔMICA DE PLECTRANTHUS NEOCHILUS

1 INTRODUÇÃO

1.1 Metabolômica

O surgimento das chamadas "ômicas" (proteômica, genômica, transcriptômica, metabolômica) alterou o rumo de pesquisas das últimas décadas. Diferentemente dos genes, transcritos e proteínas, os metabólitos, produto final de processos celulares, são caracterizados por uma enorme diversidade química e estrutural, podendo atuar como marcadores de atividade bioquímica. Por isso, a metabolômica visa identificar e quantificar os metabólitos dentro de um organismo vivo (metaboloma), tanto qualitativa quanto quantitativamente, fornecendo uma imagem metabólica do organismo em determinadas condições. Além de auxiliar na interpretação de fenótipos que se mostram resultantes de doenças genéticas, ambientais e toxicológicas (KIM et al., 2010; BAKER, 2011; PATTI, 2011; MONTEIRO et al., 2014). Desta forma, para a área farmacêutica, a metabolômica se mostrou um método efetivo para identificar o modo de ação de drogas e sua farmacocinética. Quando as drogas são oriundas de vegetais, é preciso compreender que seus metabólitos possuem várias características como polaridade, comportamento químico, estabilidade, concentração, e isso torna a metabolômica vegetal complexa, longa e trabalhosa (KIM et al., 2010; PATTI, 2011). Há duas abordagens na metabolômica, a targeted e untargeted. A metabolômica targeted ou análise alvo analisa uma lista específica de metabólitos pré-estabelecidos. Já na abordagem untargeted, o objetivo é investigar o maior número de metabólitos posíveis para uma determinada amostra, sem conhecimento prévio do que encontrar e das vias envolvidas. A estratégia untargeted ou análise global se tornou uma plataforma de grande relevância para elucidar biomarcadores (PATTI, 2011; CANUTO, 2016). Os estudos na área de metabolômica seguem uma mesma sequência de fluxo de trabalho independente da aborgaem adotada. Ela inicia com a definição do problema biológico com perguntas a serem respondidas, em seguida é realizado o planejamento experimental, preparo da amostra, análise, processamento dos dados, identificação dos metabólitos obtidos, interpretação dos resultados e análises estatísticas. As etapas que exigem mais atenção e tempo de avaliação são o preparo de amostra, análise e tratamento de dados (CANUTO, 2016).

O prepraro de amostra exige estudo sobre o método de extração, técnica de extração e o equipamento de leitura, pois é preciso selecionar os procedimentos que forneceram o máximo de metabólitos da amostra. A espectrometria de massas é a técnica mais utilizada na metabolômica, favorece análises rápidas e seletivas e pode ser acoplada a técnicas de separação. Os dados da análise são muito complexos, por isso é necessário o uso de ferramentas de tratamento específicas. O processamento de dados transforma a relação massa/ carga (m/z), tempo de retenção e intensidade em features, realiza o alinhamento dos picos, normaliza e assim os dados podem seguir para as análises estatísticas, ferramentas eficientes para a análise e modelagem de dados metabolômicos (CANUTO, 2016). As análises de métodos não supervisionados como PCA (Principal Component Analysis) e supervisionados como PLS (Partial Least Squares), representam uma base sólida para a análise metabolômica, pois permitem extrair, exibir e manter o máximo de variação possível dos dados, além de fornecerem uma visão geral das amostras e realizarem uma melhor separação entre as classes. Além das análises multivariadas também são necessárias as univariadas como ANOVA (análise de variância) (TRYGG et al., 2006). Diante do exposto, o presente capítulo apresenta o primeiro estudo de metabolômica untargeted realizada para Plectranthus neochilus em GC-MS. Para tanto, foram utilizados quatro indivíduos de diferentes localidades com a finalidade de verificar os voláteis da espécie e também verifica-los em dois ambientes de cultivo (a sol pleno e na estufa). O fluxo de trabalho descrito foi utilizado em todas as suas etapas.

1.2 Compostos voláteis

Quanto à composição química do óleo essencial de Plectranthus neochilus, pesquisadores obtiveram entre trinta a trinta e seis compostos com diferenças nas composições de voláteis reportados, como pode ser observado no Quadro 3.1. Esses voláteis são provenientes do óleo essencial de folhas da espécie coletas no Brasil, nos estados do Paraná, São Paulo e Minas Gerais, e na África (BOCARDI, 2008; OYEDEJI et al., 2011; ROSAL et al., 2011; CAIXETA et al., 2011; BALDIN et al., 2013, CREVELIN et al., 2015; FANELA et al., 2016). No Quadro 3.1 pode-se observar que as coletas realizadas na mesma localidade apresentam, na maioria, os mesmos voláteis. Como é o caso dos estudos realizados Baldin et al. (2013), Crevelin et al. (2015) e Fanela et al. (2016) realizados na cidade de Franca, São Paulo. Estes apresentaram composição próxima a de Bocardi (2008), que realizou as coletas na cidade de Curitiba, Paraná. Já Rosal et al. (2011) realizou as coletas das folha da espécie na cidade de Lavras, Minas Gerais, e pode-se observar na sua composição química uma maioria de compostos sesquiterpenos. Caixeta et al. (2011) não informou o estado de coleta na publicação, apenas o país, Brasil, como referência.

Em contrapartida, a composição química obtida por Oyedeji et al. (2011) na África apresentou poucos voláteis semelhantes aos encontrados nas composições obtidas no Brasil. Tal fato revela que as diferenças observadas podem estar relacionadas com fatores ambientais, condições de crescimento, genética e geografia, e que também as espécies apresentam épocas específicas em que concentram seu princípio ativo, podendo haver variação, por exemplo, entre os órgãos vegetais e florais, diferenças pela idade da planta, o estágio de desenvolvimento, a época de colheita e métodos de extração (OLIVEIRA et al., 2005; SIMÕES et al., 2007; BOCARDI, 2008; ROSAL et al., 2011; MOTA et al., 2014; CREVELIN et al., 2015; OYEDEJI et al., 2011). Além dos fatores apresentados, destacam-se as interferências que os horários de coleta e as variações de temperatura podem gerar no teor e composição química do óleo essencial produzido pelo vegetal ao longo do dia e ao longo do ano. Isso pode ocorrer porque as oscilações climáticas diárias geram respostas rápidas no metabolismo secundário do vegetal (FILHO et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2012). Porém, não foram encontrados para Plectranthus neochilus estudos de sazonalidade para avaliar a variação da composição química ou estudos com tratamentos que alterem sua fisiologia.

Quadro 3.1 Composição química e porcentagem do óleo essencial das folhas de Plectranthus neochilus identificada por GC-MS. ROSAL BALDIN BOCARDI, OYEDEJI CAIXETA CREVELIN FANELA Compostos et al., et al., 2008 et al., 2011 et al., 2011 et al., 2015 et al., 2016 2011 2013 α-Tujeno 9.05 12.22 11.70 6.3 11.70 α-Pineno 9.78 12.63 15.02 14.1 15 Tuja-2,4(10)-dieno 0.19 0.2 Canfeno 0.13 0.1 Sabineno 4.75 2.70 2.15 1.9 2.1 β-Pineno 2.73 6.19 8.32 7.1 8.3 β-Mirceno 0.28 0.3 Octan-3-ol 0.20 0.2 α-Terpineno 0.69 0.56 0.5 0.6 p-Cimeno 3.2 o-Cimeno 0.33 0.27 0.3 Limoneno 0.82 1.9 0.32 0.26 0,2 0.3 cis-β-Ocimeno 0.3 0.41 0.4 trans-β-Ocimeno* traço 0.4 2.66 2.17 8.50 2.2 cis-Óxido de linalol 0.9 Linalol 0.55 9.8 cis-Óxido de rosa 0.8 trans-Óxido de rosa 3.3 Mentona 1.2

Isomentona 9.2 γ-Terpineno 1.32 1.07 8.94 1.1 α-Terpinoleno 0.7 0.28 0.2 Terpinen-4-ol 4.86 1.78 1.45 1.2 1.4 Mentol 0.97 p-Cimen-8-ol traço α-Terpineol traço 4.5 Metil chavicol 1,02 Citronelol 29.0 Geraniol 3.1 Formato de citronelil 11.0 Formato de geranil 0.7 Acetato de citronelil 0.7 α-Cubebeno 1.27 0.43 0.65 0.5 α-Copaeno* 2.3 0.1 1.01 1.20 0.98 1.2 1 β-Bourboneno* 1.86 0.6 1.06 1.32 1.08 1.1 β-Cubebeno traço 0.70 0.50 0.3 β-Elemeno 0.1 cis-Cariofileno traço trans-Cariofileno 20 30.67 29.8 30.7 β-Cariofileno 0.4 15.06 28.23 β-Gurjuneno traço 0.23 α-Guaieno 0.1 Propianato de citronelil 3.4 Aromadendreno 0.2 α-Himachaleno traço α-Humuleno* 1.3 0.1 0.99 1.49 1.21 1.5 1.2 Allo-aromadendreno traço 0.1 γ-Muuroleno traço 0.48 Germacreno D* 3.5 0.5 9.44 5.36 7.13 6.2 7.1 Iedeno 0.4 trans-Muurola-4(14)dieno 0,24 Epi-Cubebol 1.68 Isobutirato de geranil 0.3 α-Muuroleno 1.21 0.44 γ-Cadineno 1.38 3.81 Eremofileno 4.50 3.55 3.9 3.6 β-Bisaboleno 0,22 Butirato de citronelil 1.3 α-Amorfeno 0.37 0.38 0.4 0.4 Cubebol 2.66 δ-Cadineno* traço 0.4 7.38 2.50 2.03 1.9 2 cis-Calameno 0.75 Calameneno traço Butirato de geranil 0.8 2-Feniletil tiglato 1.9

trans-Nerolidol traço 5.71 0.59 0.48 0.3 Espatulenol traço 1.12 Óxido de cariofileno* 15.54 9.83 5.37 7.55 12.8 7.6 Valerato de citronelila 0.2 β-Oplopenona 0.34 Iso-α-cedreno 0.1 Epóxido de humuleno II 0.47 1-Epi-cubenol 2.60 1.5 Epi-α-cadinol 2.02 1.5 T-muurolol 0.5 4(14)8(15)dien-cariofila5- 1.73 α-ol Cubenol 7.43 α-Muuorolol 1.75 1.66 δ-Cadinol 0.68 0.8 α-Cadinol 2 8.14 2.42 1.97 1.3 2 cis-α-Santalol 0.68 trans-14-Hidroxi-9-epi- 1.76 cariofileno Tiglato de geranil 1.5 4(15)7-Dien-Eudesma-1- 1.54 β-ol Neocembreno traço Comunato de metila 4.46 *Compostos que aparecem em seis dos sete autores pesquisados ou em todos eles.

1.2.1 Headspace por microextração em fase sólida A microextração em fase sólida (SPME) é uma técnica que se baseia em um bastão de fibra ótica de sílica fundida que possui uma região recoberta com um polímero, polidimetilsiloxano (PDMS), por exemplo, que realiza a extração ao penetrar no vial contendo amostra, espaço também chamado de headspace (HS). Nesse momento, depois de aquecido a certa temperatura no agitador em banho seco, por afinidade, os analitos orgânicos volatilizados migram para o revestimento da fibra e depois de saturada é inserida no injetor do cromatógrafo gasoso para dessorção e análise. A técnica é pouco dispendiosa, de fácil manipulação e livre de solvente (ZHANG; PAWLISZYN, 1993; VALENTE e AUGUTSO, 1999; BELLIARDO et al., 2006; NOGUEIRA, 2012). Esse procedimento está representado na Figura 3.1.

O HS-SPME desempenhou um papel importante na caracterização das composições da fração volátil. A técnica reúne uma série de vantagens, como diminuição da manipulação e do tempo para o preparo da amostra, diminuição também nos tempos de amostragem quando comparados a hidrodestilação, pois os analitos podem ser concentrados na fibra devido à afinidade com o revestimento. Além disso, preserva os compostos voláteis originais da planta, menos parâmetros são precisos para maximizar a recuperação do analito e é utilizada com sucesso em GC-MS, requer pouca quantidade de amostra (miligramas) e não há utilização de solventes orgânicos. Essa técnica é considerada um método econômico e reutilizável, uma vez que cada fibra pode ser utilizada por 100 extrações, em média. (BELLIARDO et al., 2006; PRAKASH et al., 2012; NOGUEIRA, 2012; ZHANG et al., 2016). Para que análises de metabolômica tenham sucesso, a espessura e o tipo de revestimento de fibra de polímero têm de ser avaliados, pois a torna ainda mais eficaz como uma técnica de análise rápida das frações voláteis de plantas medicinais e aromáticas. Por outro lado, a capacidade de concentração limitadade de componentes traços, o tempo de condicionamento mais longo do que os recomendados pelo fabricante para eliminar picos “fantasmas”, a fragilidade da sílica fundida e a falta de proteção do revestimento são algumas das limitações da técnica (BELLIARDO et al., 2006). Segundo Belliardo et al. (2006), os voláteis são misturas de compostos que foram vaporizados espontaneamente e o óleo essencial é a mistura de compostos obtidos por destilação hídrica ou a vapor. Diante disso, tem sido comum encontrar em publicações a comparação equivocada das composições do óleo essencial e HS. Equivocada, pois as porcentagens de áreas dos compostos são

78 obtidas por processos de extração diferentes, o que influencia na captura dos compostos e na composição quantitativa e qualitativa do vegetal.

2. OBJETIVO

2.1 Objetivo geral Analisar a metabolômica dos voláteis de Plectranthus neochilus ao longo de um ano.

2.2 Objetivos específicos Avaliar, através da metabolômica untargeted, se há variação dos compostos voláteis da espécie em dois ambientes de cultivo, ao sol pleno e na estufa, e nos períodos da manhã e da tarde. Avaliar, através da metabolômica untargeted, se há variação dos compostos voláteis da espécie a sol pleno ao longo de um ano de coleta.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material vegetal

Este estudo foi realizado com quatro indivíduos de P. neochilus provenientes de diferentes localidades do estado de São Paulo: Atibaia, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da UNICAMP (CPQBA), do bairro Guará do distrito de Barão Geraldo, Campinas e de Nova Odessa. O indivíduo coletado na cidade de Atibaia foi nomeado de indivíduo UNICAMP, os demais seguem com o nome do local de coleta. As matrizes de cada indivíduo encontram-se no campo experimental do Instituto de Biologia da UNICAMP. As respectivas exsicatas foram depositadas no Herbário da Universidade Estadual de Campinas (UEC) sob os seguintes números de acesso: 150953, 1938817, 193819, 193818, respectivamente. As atividades realizadas com os indivíduos estão descritas no Quadro 3.2.

Quadro 3.2. Estudos desenvolvidos com os indivíduos de Plectranthus neochilus.

Indivíduos

Atividades UNICAMP CPQBA Guará Nova Odessa

Sol Estufa Sol Estufa Sol Estufa Sol Estufa Desenvolvimento do método cromatográfico: avaliação das fibras de x

SPME e identificação de compostos Análise metabolômica x x x x x x x x Variação mensal dos voláteis x x x x

3.2 Produção de mudas

Para todos os indivíduos foram feitas mudas por propagação vegetativa. O material foi preparado de acordo com a técnica usual de estaquia, no qual o corte na extremidade inferior em forma de bisel. As estacas, com aproximadamente 10 cm de comprimento, foram cultivadas em substrato de vermiculita de granulação média em casa de vegetação. A irrigação foi automática por nebulização, quatro vezes ao dia durante dois minutos cada. Na região superior da estaca foi deixado um par de folhas inteiras. Após o período de enraizamento de 45-60 dias, algumas mudas foram destinadas para montar dois vasos por indivíduo e mantidas na estufa, já as demais mudas foram plantadas no canteiro para o cultivo em sol pleno. Tanto nos vasos quanto nas covas dos canteiros foi utilizado a mistura de matéria orgânica: areia, terra vermelha e vermiculita na proporção de 1:1:1 (v:v:v). Quanto à distribuição do material entre sol pleno e na estufa, as amostras foram cultivadas em maior número nos canteiros para garantir uma quantidade necessária para as coletas mensais e estudo da anatomia, pois o campo não é um ambiente controlado. As mudas plantadas no canteiro não foram irrigadas, como também não receberam nenhum tipo de recobrimento como mostra a Figura 3.2.

Figura 3.2. A – Indivíduos provenientes da UNICAMP, CPQBA, Guará e Nova Odessa quando plantados no canteiro. B e C – Indivíduos já adultos. D- Indivíduos plantados no vaso na estufa.

3.3 Desenvolvimento do método cromatográfico e extração de voláteis de Plectranthus neochilus

3.3.1 Avaliação de fibras de HS- SPME e identificação dos compostos O Quadro 3.3 apresenta os tipos de fibras avaliadas, composição do revestimento, compatibilidade com compostos e polaridade. As fibras foram previamente condicionadas conforme instruções do fabricante (introduzidas no injetor do cromatógrafo a gás com temperatura de injeção de 250° C e mantidas por 30 minutos) e submetidas às mesmas condições cromatográficas. O método utilizado foi segundo Adams (2007): 60 ºC a 246 ºC em uma taxa de 3 ºC/ min, sem fluxo de divisão (splitless) e 62 minutos de duração.

Quadro 3.3. Fibras de SPME avaliadas. Cor Composição Compatibilidade Polaridade Carboxen/Polidimetilsiloxano Gases e compostos de baixo peso Preta Apolar (CAR/PDMS) molecular (MM 30-225)

Divinilbenzeno/Carboxen/Polidimetils Voláteis e semivioláteis (C3-20 - Moderada Cinza iloxano (DVB/CAR/PDMS) MM 40-275) polaridade Polidimetilsiloxano/Divinilbenzeno Voláteis, aminas e nitroaromáticos Baixa a alta Azul (PDMS/DVB) (MM 50-300) polaridade Apolar a Vermelha Polidimetilsiloxano (PDMS) Voláteis (MM 60-275) moderada polaridade Fonte: VALENTE e AUGUSTO, 1999; ZHANG et al., 2016

Os dados gerados foram analisados comparando os espectros de massas gerados com os da literatura de Adams (2007). Foram considerados os picos com área relativa a três vezes a área do ruído. Os compostos foram identificados com o uso da biblioteca NIST 2008 (National Institute of Standards and Technology) acoplada ao equipamento, como também com o uso da literatura de Adams (2007) através do cálculo do índice de retenção (IR). Foi utilizando um padrão de n-alcanos

C8-C20 e injetado nas mesmas condições cromatográficas utilizada, o que permitiu o cálculo do IR realizado pela equação:

Foi escolhido trabalhar com o método cromatográfico da literatura segundo Adams (2007), pois além de ser um método convencional utilizado para cromatografia gasosa o autor disponibiliza uma biblioteca de compostos estabelecidos com IR.

3.3.2 Otimização do método cromatográfico Devido ao grande número de amostras que são utilizadas em análises metabolômicas, as condições cromatográficas e a seleção do método de extração são necessárias. Desta forma, a princípio foram avaliados alguns parâmetros para o HS-SPME como também avaliado o método cromatográfico segundo a literatura de Adams (2007). Tal avaliação foi realizada a fim de otimizar o tempo de análise de cada amostra sem interferir na obtenção dos voláteis da espécie. O método cromatográfico otimizado foi utilizado na análise metabolômica e análise da variação mensal dos voláteis.

Tabela 3.1. Parâmetros avaliados no método cromatográfico otimizado. Parâmetros Otimizado Folha triturada em nitrogênio Preparo da amostra líquido e folha sem triturar Temperatura do agitador 50 °, 60 ° e 70 °C Tempo de incubação do vial no agitador 2, 5 e 6 minutos Tempo de extração dos voláteis: exposição da fibra 3, 5 e 8 minutos no vial Fluxo de divisão Splitless, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5

As avaliações dos parâmetros e do método cromatográfico segundo Adams (2007) foram realizadas em um cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massa (GC-MS). Para a identificação dos compostos obtidos pelo HS-SPME foi utilizada a comparação com a biblioteca NIST (Mass Spectral Library, 2008) acoplada ao equipamento e com a biblioteca NIST on-line (NIST, 2018).

3.3.3 Análise cromatográfica As análises por GC-MS foram realizadas no Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas do Instituto de Química da Unicamp sob supervisão do prof. Marcos Eberlin. O equipamento utilizado foi um cromatógrafo a gás (modelo 7890A, Agilent Technologie, CA, USA) acoplado a um espectrômetro de massas do tipo Quadrupolo (modelo 5975C, Agilent Technologies, CA, USA) com injetor automático (modelo MPS 2, Gerstel). A separação dos metabólitos foi realizada em coluna capilar de sílica fundida HP-5ms (30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e filme de 0,25 μm diâmetro). O gás hélio de alta pureza (99,999 %) foi utilizado como fase móvel (gás de arraste) na vazão de 1 mL/ min. O injetor foi mantido na temperatura de 240 ºC e a interface de 220 ºC. A fonte de ionização por impacto de elétrons utilizou uma energia de 70 eV. O espectrômetro de massas foi operado em modo full scan na faixa de 40 a 500 m/z

3.4 Análise metabolômica e variação mensal dos voláteis

3.4.1 Obtenção de dados meteorológicos

Os dados meteorológicos da relação do índice pluviométrico (mm de H2O), temperaturas máxima e mínima verificados durante o período de estudo foram fornecidos pelo Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas à Agricultura (CEPAGRI da UNICAMP, 2018). A intensidade luminosa da estufa foi medida por um sensor quântico LI-190R que fornece a radiação fotossinteticamente ativa (PAR, em µmol de fótons m-2. s-1). Esse sensor fornece medições precisas, em espaços abertos e estufas.

3.4.2 Análise metabolômica de Plectranthus neochulis Foram utilizadas como amostras as folhas de P. neochilus coletadas de todos os indivíduos entre o período de junho de 2017 a junho de 2018 totalizando 13 meses de coleta. Cerca de 200 g de folhas frescas foram coletadas com nitrogênio líquido, para cessar seu metabolismo, duas vezes em um mesmo dia, às 8:00 da manhã e às 14:00 da tarde toda a terceira semana do mês. As amostras foram armazenadas em freezer -80°C até as análises. Este procedimento totalizou 104 coletas (13 meses x 2 coletas por dia x 4 indivíduos). Com a quantidade de folhas coletadas foi possível a análise metabolômica com 2 repetições para cada grupo e período de coleta. Foi plantado um número maior de estacas dos indivíduos a sol pleno devido às adversidades do ambiente desprotegido. Porém, os indivíduos cultivados na estufa não apresentaram o mesmo tempo de desenvolvimento, uma vez que plantadas em vaso o espaço limitou o crescimento e por isso não houve quantidade suficiente de folhas dos indivíduos para coletas mensais. Foi acordado das coletas do grupo estufa serem realizadas em meses que representassem uma estação climática. Desta forma, os grupos de análise foram às amostras coletadas a sol pleno pela manhã e a tarde ao longo dos 13 meses, e as amostras coletadas na estufa pela manhã e pela tarde nos meses de junho e setembro de 2017, e fevereiro e junho de 2018. A Tabela 3.2 apresenta os meses de coleta de ambos os grupos. Além dos grupos sol e estufa, na análise metabolômica foram incluídos os controles de qualidade (QC, do inglês Quality Control).

Tabela 3.2. Análise metabolômica de Plectranthus neochilus. Grupo Sol Grupo Estufa Meses de coleta Manhã Tarde Manhã Tarde JUN_17 x x x x JUL_17 x x AGO_17 x x SET_17 x x x x OUT_17 x x NOV_17 x x DEZ_17 x x JAN_18 x x FEV_18 x x x x MAR_18 x x ABR_18 x x MAIO_18 x x JUN_18 x x x x

Os QC são amostras utilizadas com a finalidade de monitorar o desempenho do método analítico, como também para acompanhar a regularidade do cromatógrafo a gás. Por isso, são geralmente inseridos em um determinado intervalo de amostras de uma sequência analisada ou distribuídos aleatoriamente entre as sequências de amostras (SANGSTER et al., 2006). Os QC também servem de referência para as análises estatísticas e de agrupamento. Para compor os QC é pesada uma mistura (pool) de um mesmo volume de todas as amostras que serão analisadas, e é por isso que se espera que o QC contenha todos os compostos das amostras utilizadas. Nesta análise, foi considerado um intervalo de 16 amostras, portanto a cada 16 amostras um QC foi inserido, e isso gerou um total de 272 amostras (256 dos grupos sol e estufa em duplicata e 16 QC). Para o preparo das amostras, todas foram trituradas em almofariz com auxílio de um pistilo e nitrogênio líquido e armazenadas no freezer. Após trituração, foram pesados 0,5 g de cada amostra e inseridas nos vials de 20 mL, devidamente identificados, e armazenadas no freezer até a semana de análise. No caso dos QC, alíquotas das amostras foram pesadas para compor 0,5 g do pool. Foi realizada uma randomização das amostras em Excel que forneceu uma sequência de amostras para injeção no cromatógrafo a gás.

3.4.3 Análise da variação mensal dos voláteis A análise da variação mensal dos voláteis foi realizada com o grupo Sol, pois este foi coletado ao longo dos 13 meses nos períodos manhã e tarde, conforme apresenta a Tabela 3.3. Com a intenção de analisar a variação mensal dos compostos provenientes da análise metabolômica, as análises estatísticas foram realizadas por composto e o mesmo analisado ao longo dos meses de coleta.

Tabela 3.3. Análise da variação mensal dos voláteis de Plectranthus neochilus. Grupo Sol Meses de coleta Manhã Tarde JUN_17 x x JUL_17 x x AGO_17 x x SET_17 x x OUT_17 x x NOV_17 x x DEZ_17 x x JAN_18 x x FEV_18 x x MAR_18 x x ABR_18 x x MAIO_18 x x JUN_18 x x

3.4.4 Análise estatística dos dados A análise cromatográfica ocorreu entre os dias 07 de julho e 15 de julho de 2018 em um total de 9 dias de análise. Os dados fornecidos pelo GC-MS foram inseridos na plataforma de dados online XCMS. O XCMS Online é um software que processa dados metabolômicos untargeted, ou seja, conjuntos de dados de espectrometria de massas baseados em metabolômica. Tal software fornece algumas ferramentas para tratamento os dados como correção do tempo de retenção, alinhamento, análise estatística, visualização de dados e outros (SMITH et al., 2006). Os dados do XCMS foram processados usando os parâmetros padrão para GC/ Single Quad no método matched filter. Todos os parâmetros fornecidos pelo software foram testados para as amostras, os que se apresentam na Tabela 3.4 (Anexa) são aqueles que foram alterados e definidos para análise dos dados metabolômicos. Para alguns parâmetros não foram encontradas traduções e mantidos seus nomes originais. O termo “feature” se refere aos vários íons fornecidos pelo software em uma relação m/z por tempo de retenção. Com os dados fornecidos pelo XCMS foi utilizada uma ferramenta do Excel chamada Total Useful Signal (TUS), na qual utiliza a ordem de injeção das amostras no equipamento (randomizadas) e a soma das intensidades das features, permitindo verificar se houve ou não variação analítica do equipamento durante a análise. Após verificação, e ainda com os dados brutos, foi realizado o cálculo do coeficiente de variação (CV) com base nos QC. O CV é definido como a razão do desvio padrão dividido pela média das amostras, como apresenta a fórmula da Equação 3.2.

CV = 100 . (s / x) (%) Equação 3.2. Equação para cálculo do coeficiente de variação, no qual CV= coeficiente de variação,

86 s= desvio padrão e x= média.

O CV foi utilizado por quantificar a precisão da análise e possibilitar o estabelecimento de faixas de valores que orientem sobre sua validade. Quando as amostras se encontram nas mesmas condições a análise se torna mais precisa com a adoção de um menor coeficiente de variação (MOHALLEM et al., 2008). Desta forma, sendo os QC um pool de todas as amostras, foi calculado seu CV e o das features, e considerado um CV de até 30 %. As features que apresentaram uma porcentagem acima desta não correspondiam com os QC e, portanto, foram excluídas. Os dados metabolômicos fornecidos pelo XCMS permitem que sejam analisados por métodos de projeção estatística (quimiometria) como a PCA e a PLS (SMITH et al., 2006), e assim foram realizados em sequência. Outro software específico para análise e interpretações de dados metabolômicos foi utilizado, o Online MetaboAnalyst. Com ele foram realizadas as análises estatísticas multivariadas. Para obter o p value, foi utilizado o software GraphPad Prism 6.01 para as análises estatísticas univariadas como análise de variância, ANOVA, seguido do Teste Tukey e/ ou Sidak (p< 0,05 - como critério de significância estatística) da variação dos voláteis ao longo dos meses.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Desenvolvimento do método cromatográfico e extração de voláteis de Plectranthus neochilus

O método cromatográfico teve de ser desenvolvido por algumas razões. A análise metabolômica demanda um grande número de amostras e por isso a necessidade de um método cromatográfico de curta duração, além disso, como o objetivo é investigar os voláteis da espécie em um determinado período, é preciso selecionar a fibra com um revestimento que capture a maior quantidade de compostos da espécie vegetal. Por isso, primeiro selecionou-se a fibra e em seguida otimizou-se o método cromatográfico da literatura.

4.1.1 Avaliação de fibras de HS- SPME e identificação dos compostos O momento de avaliação das fibras é algo muito relevante para análises com HS-SPME e metabolômica untargeted. A seleção da fibra é realizada pelo número de voláteis identificáveis da amostra e área total dos picos detectados, indicando sua eficiência de extração, levando em

87 considerando a polaridade e volatilidade dos analitos, as características do revestimento e afinidade com o analito (BELLIARDO et al., 2006; MONTEIRO et al., 2014; DURANT et al., 2014; MESQUITA et al., 2017). Com esses quesitos, foi possível verificar a fibra que possui o revestimento de maior eficiência de extração de voláteis para essa espécie. Para essa avaliação foi utilizado o indivíduo UNICAMP, o método cromatográfico segundo Adams (2007) e os parâmetros definidos na Tabela 3.6. Os cromatogramas das fibras avaliadas (Figura 3.3) encontram-se anexo e os compostos voláteis capturados por HS-SPME estão apresentados na Tabela 3.5, com tempo de retenção, o IR calculado e a % de área total do cromatograma para cada composto identificado.

Tabela 3.5. Compostos obtidos por GC-MS pelas fibras de SPME avaliadas. Fibra Fibra Fibra Fibra nº TR IR cal. IR lit. Composto Preta Cinza Azul Verm. 2 2.89 825 801 7.15 0.5 0.31 0.64 Hexanal 3 3.55 854 846 11.29 - 3.17 1.19 trans-2-Hexenal 4 3.85 897 863 1.11 3.58 - - 1-Hexanol 5 5.12 944 932 19.75 19.5 23.19 25.25 α-Pineno 6 5.27 966 - - 3.54 1.22 - m/z 93a 7 6.58 992 974 25.63 40.08 24.89 9.41 1-Octen-3-ol 8 6.19 998 - 2.62 2.94 5.58 5.53 m/z 93b 9 6.25 1002 - 2.72 - 5.36 5.05 m/z 93c 10 6.89 1013 988 5.52 4.85 3.59 1.94 3-Octanol 11 7.36 1029 1020 2.38 0.61 0.41 0.4 ρ-Cimeno 12 7.80 1048 1024 2.47 1 1.13 0.46 Limoneno 13 7.94 1040 1032 0.92 1.01 1.22 0.5 cis-β-Ocimeno 14 8.44 1052 1044 1.56 1.77 2.39 1.83 trans-β-Ocimeno 15 8.57 1062 1054 0.83 0.3 - - γ-Terpineno 16 17.18 1349 1348 - 0.39 0.57 0.45 α-Cubebeno 17 20.15 1375 1374 0.67 0.71 0.99 1.37 α-Copaeno 18 21.58 1403 1387 0.62 1.36 2.28 2.76 β-Bourboneno 19 23.35 1434 1417 12.63 12.41 17.22 29.87 trans-Cariofileno 20 24.37 1456 1452 0.44 0.42 0.65 1.13 α-Humuleno cis-Cadina-1(6),4- 21 25.05 1499 1461 - - 0.91 3.23 diene 9-epi-trans- 22 26.24 1524 1464 1.03 1.23 3.33 5.48 Cariofileno 23 27.31 1541 - - 0.18 - - m/z 161 24 29.52 1598 - - 0.16 - - m/z 41 Monoterpenos 83.95% 79.68% 72.46% 52.20% Sesquiterpenos 15.39% 16.86% 25.95% 44.29%

Legenda: nº: número de picos; RT: Tempo de retenção; IR cal.: Índice de retenção calculado com base em Adams, 2007; IR lit.: Índice de retenção com base na literatura (Adams, 2007); espaço em branco: composto não identificado na literatura. Total: 18 pela fibra preta; 20 pela fibra cinza; 19 pela fibra azul; 18 pela fibra vermelha; 5 não identificados. Compostos não identificados: IR= 966: m/z 93[M+], 41, 53, 67, 77, 105, 121, 136; IR= 998 m/z 93[M+], 41, 53, 63, 69, 77, 105, 121, 136; IR= 1002 m/z 93[M+], 41, 50, 57, 69, 79, 107, 121, 136; IR= 1541 m/z 161[M+],119, 134, 105, 91, 204, 81, 41; IR= 1598 m/z 41[M+], 79, 91, 93, 55, 69, 95, 107, 121.

Ao analisar a Tabela 3.5, percebeu-se que o número de voláteis capturados por todas as fobras foi muito próximo. A fibra preta e vermelha capturaram 18 voláteis, azul 19, e a cinza 20. Embora a fibra preta tenha apresentado a maior área de pico detectada (99, 34 %), oo picos de maiores áreas eram prediminantemente monoterpenos. A fibra cinza, que apesar de ter apresentado um número maior de voláteis e possuir um revestimento considerado de moderada polaridade, apresentou áreas de picos menores e poucos sesquiterpenos. A fibra azul apresentou oito picos de maior área distribuídos entre mono e sesquiterpenos e porcentagem total de picos detectados de 98, 41 %. E por fim, a fibra vermelha apresentou maior área de picos para sesquiterpenos (44, 29 %), porém menor porcentagem de área total de voláteis capturados. Diante da análise de cromatograma, número de voláteis capturados, área total de picos detectados e grupos de compostos, a fibra azul (PDMS/ DVB) foi selecionada. A partir desse momento, o método cromatográfico para as análises já pôde ser otmizado.

4.1.2 Otimização do método cromatográfico Segundo Valente e Augusto (1999), o desenvolvimento do método de extração por SPME tem de ser analisado desde o preparo de amostras até a análise, verificando o tempo de retenção dos analitos, revestimento de fibra, condições de extração (agitação, temperatura, tempo, volume de amostra), entre outros. Por isso, com relação aos parâmetros avaliados estes ficaram definidos conforme Tabela 3.6.

Tabela 3.6. Parâmetros definidos para o método cromatográfico otimizado. Parâmetros Otimizado

Preparo da amostra Folha triturada em nitrogênio líquido

Temperatura do agitador 50 °C Tempos de: incubação do vial no agitador 5 minutos e extração dos voláteis (exposição da fibra no vial)

Analisando o cromatograma da fibra azul (Figura 3.3 B, anexo), verificou-se que após 30 minutos não se obtinha nenhum volátil e que o pico que sai a 180 ºC, além de pequeno, não permitiu identificação. A Tabela 3.5 mostra que o último pico identificável saiu em 26 minutos. Outra verificação foi a temperatura de início, o primeiro pico identificável surge próximo de 3 minutos, permitindo um aumento da temperatura inicial. O uso de splitless não favoreceu a separação dos monoterpenos, por isso foram testadas as razões de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, e a melhor separação foi obtida com split de 1:3, pois menores razões diminuiram a intensidade dos picos e houve perda de sesquiterpenos de menores picos, uma vez que estes já se apresentavam separados. Devido a essas verificações, o método foi adaptado para os voláteis de P. neochilus: iniciando a 65 ºC seguindo a 150 ºC em uma taxa de 3 ºC / min, na razão split de 1:3, com 28,34 minutos de duração, como mostra a Figura 3.4 e os compostos capturados na Tabela 3.7. Foram consideradas as similaridades acima de 90, abaixo disso foi dado como nome do composto a m/z do íon mais intenso.

Figura 3.4. Cromatograma de Plectranthus neochilus do método cromatográfico definido: 65 ºC seguindo a 150 ºC em uma taxa de 3 ºC / min, com Split 1:3, num total de 28,34 minutos de duração.

Tabela 3.7. Proposta de identificação dos compostos obtidos por GC-MS pelo método otimizado com fibra PDMS/ DVB por SPME.

nº TR % Área Sim. Compostos 1 2.614 0.4 50* Hexanal 2 3.207 1.29 94 trans-2-Hexenal 3 3.233 1.94 92 cis-3,1-Hexenol 4 3.381 0.51 59 m/z 56 5 4.414 8.01 94 α-Tujeno 6 4.568 4.85 96 α-Pineno 7 4.774 0.44 90 Biciclo[3.1.0]hex-2-ene, 4-metilene-1-(1-metiletil)- 8 5.409 7.4 91 α-Sabineno 9 5.568 37.78 90 1-Octen-3-ol 10 5.69 0.38 17 m/z 57 11 5.791 0.57 90 β-Mirceno 12 5.902 6.49 83* 3-Octanol 13 6.198 0.25 83* Acetato cis-2,1-hexenol 14 6331 0.15 91 3-Carene 15 6.723 0.41 91 o-Cimeno 16 6.776 1.42 59 m/z 109 17 6.839 0.74 90 Limoneno 18 7.062 0.84 90 trans-β-Ocimeno 19 7.379 2.83 97 Ocimeno 20 7.999 0.46 86 m/z 71 21 9.063 0.18 74 m/z 70 22 9.662 0.2 50 m/z 110 23 18.075 0.19 83* Dodecametil-Ciclohexasiloxano 24 18.738 0.46 98 α-Cubebeno 25 19.786 0.95 93 α-Copaeno 26 20.141 1.46 91 β-Bourboneno 1H-Ciclopenta[1,3]ciclopropa[1,2]benzeno, octahidro-7-metil- 27 20.379 0.34 91 3-metilene-4-(1-metiletil)-, [3aS-(3aα,3bβ,4β,7α,7aS*)]- 28 21.55 14.65 99 trans- Cariofileno 29 22.863 0.63 97 α-Humuleno 30 23.97 2.48 98 Germacreno D 1H-Cicloprop[e]azuleno, 1a,2,3,4,4a,5,6,7b-octahidro-1,1,4,7- 31 24.939 3 91 tetrametil-, [1aR-(1aα,4α,4aβ,7bα)]- 32 25.648 0.23 52 m/z 161 33 27.867 0.38 38 m/z 79 Legenda: RT: Tempo de retenção; Sim.: Similaridade; (*) Compostos nomeados, pois tiveram seus espectros de massa comparados com os compostos identificados da Tabela 3.5. Total: 33 compostos com 8 identificados pela m/z do íon mais intenso. Monoterpenos: 77, 73 % Sesquiterpenos: 24, 58 %

A Tabela 3.7 apresenta que os monoterpenos foram o grupo mais representativo, com 1-octen- 3-ol como composto majoritário, representando 37,78 % da área total do cromatograma seguido do trans-cariofileno, α-tujeno e α-pineno. Na literatura há apenas um trabalho de extração de voláteis por SPME para P. neochilus, que analisou em GC-MS as partes aéreas da espécie cultivada no Egito. Os resultados apresentados por El-Sakhawy et al. (2018) são diferentes dos adquiridos nesse estudo. Foi utilizada a fibra PDMS/ DVB/ CAR e obtido 85 compostos com 47 deles variando entre 0,01 a 0,09 % da área total. Dentre eles estão α-tujeno, α-pineno, -cimeno, -cimeno, compostos estes também capturados com a fibra PDMS/ DVB com áreas superiores a 0,40 % chegando a 8,0 % em α-tujeno, por exemplo. Os compostos majoritários que eles identificaram foram allo-aromadendreno com 19,35 % e aromadendreno 18,30 %, compostos que só foram encontrados no óleo essencial. Além disso, o método cromatográfico que foi utilizado possui três rampas de temperatura, os voláteis foram extraídos das folhas e caules, e a espécie foi cultivada em outras condições climáticas.

4.2 Análise metabolômica e variação mensal dos voláteis

4.2.1 Análise metabolômica A captura de voláteis com o método otimizado por HS-SPME e fibra azul (PDMS/DVB) foi utilizada para as amostras dos três grupos, sol, estufa e os QC. Através do HS-SPME foram detectados 29 compostos para o grupo sol, 30 compostos para os QC e 32 compostos para o grupo estufa (Tabela 3.8). Os cromatogramas apresentados na Figura 3.6 para os grupos sol e estufa se referem às coletas realizadas no mês de junho de 2018.

Figura 3.5. Cromatogramas dos compostos voláteis de Plectranthus neochilus dos grupos de estudo Sol, QC e Estufa capturas por SPME e analisado em GC-MS.

A Tabela 3.8 apresenta todos os compostos obtidos em cada grupo, os tempos de retenção, a porcentagem de área do cromatograma e a similaridade. Foram consideradas as similaridades acima de 90 com o banco de dados NIST, abaixo disso foi dado como nome do composto a m/z do íon mais intenso. Nos cromatogramas da Figura 3.5, cada número discriminado representa um composto apresentado na Tabela 3.8 para cada grupo de estudo.

Tabela 3.8. Proposta de identificação dos compostos voláteis dos grupos Sol, QC e Estufa obtidos por HS-SPME em GC-MS. O número do sinal se refere à Figura 3.5. % Área nº TR Sim. Compostos Sol QC Estufa 1 2.614 0.32 0.15 - 90 Hexanal 2 3.207 1.1 0.5 0.6 95 trans -2-Hexenal 3 4.43 18.08 17.63 14.6 94 α-Tujeno 4 4.58 12 12 8.55 96 α-Pineno Biciclo[3.1.0]hex-2-ene, 4-metilene- 5 4.75 0.2 0.26 0.15 90 1-(1-metiletil)- 6 5.42 9.1 10.03 8.03 91 α-Sabineno 7 5.52 16.7 10.03 13.8 50 m/z57 8 5.57 - 5.13 15.61 90 1-Octen-3-ol 9 5.68 - 0.25 0.23 78* 3-Octanona 10 5.48 1.16 1.69 0.96 78* β-Mirceno 11 5.89 2.6 2.65 3.61 97 3-Octanol 12 6.17 0.6 0.44 0.5 86* Acetato cis-2,1-hexenol 13 6.32 0.41 1.44 0.18 90 3-Careno 14 6.71 0.63 0.95 0.81 92 o-Cimeno 15 6.77 0.65 0.49 0.75 80 m/z109a 16 6.83 1.37 1.45 1.07 92 Limoneno 15 7.05 1.5 1.49 1.39 95 trans-β-Ocimeno 16 7.38 4.4 4.65 4.29 97 cis-β-Ocimeno 17 7.73 0.25 - - 96 γ-Terpineno 18 7.98 0.3 0.32 0.4 94 cis β-Terpineol 19 9.63 0.15 0.23 0.3 38 m/z69 22 9.75 - - 0.17 46 m/z109b 23 11.07 - - 0.18 83* Dodecametil-Ciclohexasiloxano 24 12.97 - - 0.14 72* Dodecanal 25 18.72 0.5 0.48 0.43 99 α-Cubebeno 26 19.77 1.25 0.92 0.7 98 α-Copaeno 27 20.13 1.6 1.05 0.98 97 β-Bourboneno 28 20.36 0.46 0.5 0.55 99 β-Cubebeno 29 21.58 16.13 15.8 13.37 99 trans-Cariofileno 30 22.86 0.79 0.71 0.5 99 α-Humuleno 31 23.96 2 2.06 2 98 Germacreno D 32 24.92 3 1.61 1.37 91 α-Gurjuneno

33 25.63 0.1 0.2 0.2 91 δ-Cadineno 34 27.84 0.5 0.34 0.5 76 m/z 79 Monoterpenos: 71, 52 % 71, 78 % 76, 32 %

Sesquiterpenos: 26, 33 % 23, 67 % 20, 6 %

Legenda: nº: número de picos; RT: Tempo de retenção; Sim.: Similaridade; QC: Controle de qualidade; espaço em branco: composto não detectado. (-) Composto não detectado; (*) Compostos nomeados, pois tiveram seus espectros de massa comparados com os compostos identificados da Tabela 3.5. Total: Sol 29 compostos, QC 30 e Estufa 32; Total de 34 compostos e 5 não identificados.

Ao analisar os relatórios gerados pelo software do equipamento, percebeu-se que os grupos sol e estufa apresentaram os mesmos compostos, porém com intensidades diferentes, como também compostos ausentes em alguns meses. Por isso, a composição química apresentada na Tabela 3.8 é uma média de todos os compostos que foram obtidos por cada grupo ao longo dos meses. Os QC são a mistura de todas as amostras analisadas, por conta disso deveriam apresentar todos os compostos de ambos os grupos de estudo. Porém, como há mais amostras de sol do que de estufa alguns compostos da etufa não se detectaram na composição dos QC, como é o caso dos compostos de tempos de retenção 9.7, 11 e 12.9 minutos. Com relação aos compostos majoritários, na análise metabolômica do sol o α-tujeno se apresenta como o composto de maior área total seguido do m/z 57, trans-cariofileno e α-pineno. Ena estufa, 1-octen-3-ol, α-tujeno, m/z 57 e trans cariofileno. O composto 1-octen-3-ol apresentou-se como o composto majoritário no momento em que o método foi otimizado. Acredita-se que o íon m/z 57 seja o composto 1-octen-3-ol, apesar de apresentar baixa similaridade com o banco da NIST, pois os picos de número 6, 7 e 8 dos cromatogramas (Figura 3.5) apresentaram-se muito próximos, o que dificultou a identificação do 1-octen-3-ol, do íon m/z 57 e da 3-octanona. Caso seja considerado como 1-octen-3ol a área do pico aumenta nas amostras de estufa. Podendo ser ele uma diferença entre os ambientes de cultivo. Além do íon m/z 57, há suspeita de que o íon de m/z 79 seja o óxido de cariofileno devido à comparação dos espectros obtidos pelo GC-MS com a literatura. Poucas diferenças foram verificadas entre as composições químicas dos grupos sol e estufa, mas somente a análise estatística forneceu indícios se as diferenças foram significativas e da presença de algum composto marcador que diferencie a composição da espécie nesses ambientes de cultivo.

4.2.2 Análise estatística metabolômica Para compor o gráfico do TUS, as amostras foram inseridas de acordo com a ordem de injeção como apresenta a Figura 3.6, na qual a soma das intensidades dos fragmentos está representada no eixo Y, e a quantidade de amostras injetadas no eixo X. As barras (vermelha e verde) representam o cálculo da média mais duas vezes o desvio padrão e a média menos duas vezes o

95 desvio padrão das amostras. Percebe-se que um número muito pequeno de amostras (azul), cerce da 5,15 % do total, se apresentou fora do perfil, o que pode estar relacionado ao tempo de espera dos vials no freezer ou ao tempo de espera dos vials no autosampler. Não foi verificada variação analítica relevante no equipamento.

Figura 3.6. Total Usefull Signal (TUS) da análise metabolômica. Em azul estão as amostras, em vermelho a média mais duas vezes o desvio padrão, em verde a média menos duas vezes o desvio padrão, o eixo Y é a soma das intensidades e o eixo X é a quantidade de amostras.

Com os dados brutos obtidos pelo XCMS foi realizado o cálculo de coeficiente de variação, filtradas as features que se apresentaram mais intensas nas amostras e obtido um total de 22 features, conforme apresenta a Tabela 3.9. Nesta tabela, foi inserido o nome que o XCMS fornece para cada feature, que é a m/ z e o tempo de retenção em minutos, além disso, foram inseridas as m/ z mais intensas de cada feature e o nome do composto identificado. Destaque para os compostos não identificados como MM=109, que acredita-se ser o composto orto, para-cimeno ou o composto m/z109a (Tabela 3.8), como houve dúvida foi mantido nas análises estatísticas seu nome M109 fornecido pelo XCMS; e MM=69 que acredita-se que seja o composto β-tujona, porém o XCMS forneceu a m/ z 110 como mais intensa (M110T10_1) e por isso foi mantido nas análises como M110. A relação de features fornecidas pelo XCMS está de acordo com os compostos de maior área de cromatograma apresentado na Tabela 3.8, bem como seus íons mais intensos.

Tabela 3.9. Features mais intensas fornecidas pelo software XCMS Online. XCMS TR m/z Composto M44T1 2.6132 56, 44, 41 Hexanal M91T4 4.4507 93, 91, 77 α-Tujeno M93T5_2 4.5036 93, 91, 92 α-Pineno M93T5_1 5.499 93, 91, 77 Sabineno M57T6_2 5.557 57, 93, 41 1-Octen-3-ol M83T6_2 5.891 59, 83, 55 3-Octanol M67T6_1 6.166 67, 43, 82 Acetato cis-2,1-hexenol M109T7_3 6.759 109, 91, 43 M109 (m/z 109a) M68T7_1 6.838 93, 68, 67 Limoneno M93T7_1 7.061 93, 91, 92 trans-β-Ocimeno M77T7 7.363 93, 91, 79, 80, 77 cis-β-Ocimeno M71T8 7.972 71, 93, 43 cis-β-Terpineol M110T10_1 9.64 69, 81, 110 M110 (m/z 69) M105T19 18.732 161, 105, 119 α-Cubebeno M119T20 19.764 119, 161, 105 α-Copaeno M81T20_1 20.114 81, 123, 80 β-Bourboneno M161T20_2 20.341 161, 105, 91 β-Cubebeno M93T22 21.58 93, 133, 91 trans-Cariofileno M93T23 22.841 93, 80, 121 α-Humuleno M161T24 23.947 161, 105, 91 Germacreno D M119T25 24.916 119, 105, 204 α-Gurjuneno M134T26 25.621 161, 134, 119 δ-Cadineno

Com as features mais relevantes foi possível realizar as análises multivariadas através do software online MetaboAnalyst e os teste estatísticos de ANOVA, Teste Sidak e Teste Tukey utilizando o software GraphPad 6.

98 apresentam como vetores.

Através do gráfico de scores (Figura 3.7 A) é possível observar que não há agrupamento entre as amostras e que só é possível visualizar os grupos devido às cores da legenda, pois não se apresentam totalmente separados. A maioria das amostras de estufa se sobrepõe às amostras de sol, e isso pode ocorrer devido ao menor número de amostras coletadas de estufa ou por não haver diferença na composição química entre sol e estufa. Outro ponto a observar é que os QC (vermelho) se encontraram próximo ao centro das amostras, deslocados para as amostras de sol, e isso pode ser devido tanto pelo fato de que as amostras de estufa não foram coletadas na mesma quantidade que as de sol quanto pela proporção maior de amostras de sol presentes nos QC. A componente principal 1 (PC 1), conseguiu explicar 22, 9 % das variações dos dados e a PC 2 18,1 %. O gráfico exploratório biplot (Figura 3.7 B), apresenta as features como vetores e desta forma é possível visualizar que alguns sesquiterpenos como cubebeno, cubebeno, germacreno D, humuleno, trans-cariofileno e copaeno tendenciam para o lado esquerdo do gráfico onde há mais amostras de sol. Alguns mais voláteis como o monoterpeno cis-terpineol, o aldeído hexanal, os não identificados M109, M110, e os álcoois 1-octen-3-ol e 3-octanol, tendenciam para o lado direito do gráfico onde há algumas amostras de estufa. Essa disposição dos compostos aponta que talvez os compostos mais voláteis se mantenham mais intensosna estufa e os menos voláteis no sol, como é visto com relação à porcentagem total de monoterpenos entre os grupos, a estufa apresenta 76, 32 % e o sol 71, 52 % (Tabela 3.8). Talvez os sesquiterpenos sejam mais intensos no sol devido a uma evaporação dos monoterpenos e estes mais intensosna estufa. Porém, tal fato não pode ser afirmado porque muitas amostras de sol e estufa encontram-se sobrepostas, por isso apenas relatar uma tendência. Outro gráfico utilizado para interpretar os dados foi o PLS, uma análise de regressão multivariada que transforma as variáveis de resposta (Y) em um número reduzido de combinações lineares, e desta forma auxilia na identificação de um conjunto reduzido de variáveis relevantes, ou seja, destaca as variáveis de maior importância (CONCEIÇÃO, 2006; ZIMMER e ANZANELLO, 2014). O gráfico do PLS utilizado foi o VIP (Importância Variável na Projeção), na qual são fornecidas as intensidades relativas das features correspondente em cada grupo de estudo. Nesse caso, o PLS VIP forneceu 15 features de relevância entre as 22 (Figura 3.8), e as comparou entre os dois grupos de estudo. A legenda à direita fornece uma escala de concentração, na qual os quadrantes vermelhos mostram que o composto está mais intenso e em verde menos intenso no grupo.

Figura 3.8. PLS VIP scores com as 15 features de maior relevância dentre as 22 mais intensas da análise metabolômica. A legenda de cores à direita apresenta os compostos das amostras do grupo SL (sol) e do grupo SM (estufa), sendo a cor vermelha representando os compostos mais intensos e na cor verde os menos intensos, e à esquerda do gráfico estão os compostos em ordem de intensidade.

As 15 features de maior relevância são, na maioria, monoterpenos. O PLS VIP scores apresenta 8 features em maior intensidade da estufa e 7 em maior intensidade no sol. O grupo do sol apresentou mais sesquiterpenos intensos e o da estufa ha mais monoterpenos intensos. Além disso, os compostos de maiores áreas do cromatograma como, o tujeno e o trans-cariofileno, são mais intensos no sol, como mostrou a Tabela 3.8 com a maior área para estes compostos no sol. Para confirmar os resultados obtidos pelas PCA, foi realizada uma análise estatística de ANOVA entre os grupos sol e estufa (Figura 3.9). A análise apresentou diferença significativa entre eles (p < 0,0001). Foi realizado o teste Sidak (também chamado de Dunn-Sidak) que revelou que entre os compostos há um que possui significância para o grupo estufa, o composto 1-octen-3-ol. É possível visualizar na PCA biplot (Figura 3.7 B) a influência do 1-octen-3-ol nas amostras de estufa, trazendo-as para o lado direito do gráfico, como também a composição dos voláteis através da Tabela 3.8 apresentando o composto com maior área do cromatograma de estufa. Outro ponto a observar no gráfico (Figura 3.9) é a confirmação estatística da representação dos monoterpenos na composição química da espécie.

100

ESTUFA SOL

Figura 3.9. Análise estatística dos grupos Sol (azul) e Estufa (vermelho) apresentando a significância do composto 1-octen-3-ol para o grupo Estufa.

4.2.3 Análise da variação mensal dos voláteis Para analisar a variação mensal dos voláteis de P. neochilus, como também a variação dos voláteis entre os períodos manhã e tarde, foi utilizado apenas o grupo sol, uma vez que foi coletado ao longo de um ano. As PCA do grupo estufa encontram-se anexo. Desta forma, foi realizada uma PCA para verificar diferenças entre coletas no período da manhã e no período da tarde. A PCA de scores (Figura 3.10) com PC 1 explicando 21,2 % e PC 2 17,6 %, apresenta que as amostras da manhã (SLM – vermelho) e da tarde (SLT – verde) se sobrepõem, não havendo agrupamento discernível. As análises de ANOVA e Sidak revelaram diferenças significativas entre os períodos (p< 0,0001) (Figura 3.11). A diferença está também no composto 1-octen-3-ol. Esse fato mostra que o período de coleta interfere na intensidade de um composto (Figura 3.9) e que para a análise metabolômica realizada ele se apresentou como um marcador para a espécie com relação ao ambiente de cultivo. O composto é citado por El-Sakhawy et al. (2018), que identificaram o 1-octen-3-ol como o quarto composto mais intenso das partes aéreas analisadas.

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Figura 3.10. PCA de scores das amostras coletadas nos períodos manhã (SLM – vermelho) e tarde (SLT – verde)

Figura 3.11. Análise estatística dos grupos sol manhã (azul) e sol tarde (vermelho).

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4.2.3.1 Dados meteorológicos A intensidade luminosa da estufa foi medida ao meio dia obtendo uma média de radiação fotossinteticamente ativa (PAR) de 763,6 µmol de fótons m-2. s-1. Em relação ao sol pleno, o ambiente de etufa estava 46 % de sombra. Os dados meteorológicos do período de coleta foram fornecidos pela Estação Meteorológica CEPAGRI (2018) (22° 48´ 56" S, 47° 03´ 28" W, 664 m), e os dados da temperatura máxima e mínima, e pluviosidade foram plotados no gráfico com as médias mensais (Figura 3.13). De acordo com os dados meteorológicos, outubro de 2017 e fevereiro de 2018 foram os meses com maior pluviosidade, cerca de 600 e 360 mm de água, respectivamente. As temperaturas mais altas foram observadas de outubro de 2017 a março de 2018, já as temperaturas mais baixas registradas de junho a setembro de 2017, sendo que em julho não foi registrado dias de chuva.

Dados metereológicos 35.00 700.00

30.00 600.00 C

25.00 500.00

20.00 400.00

15.00 300.00

Temperatura Temperatura Pluviosidade mm Pluviosidade 10.00 200.00

5.00 100.00

- - jun/17 jul/17 ago/17 set/17 out/17 nov/17 dez/17 jan/18 fev/18 mar/18 abr/18 mai/18 jun/18

Meses de coleta

Precipitação T. min T. máx.

Figura 3.12. Variação média da temperatura e precipitação do período de coleta (Fonte: CEPAGRI, 2018). T. máx.: temperatura máxima; T. min.: temperatura mínima.

4.2.4 Análise estatística da variação mensal dos voláteis Com relação à variação mensal dos voláteis, uma PCA foi realizada para verificar variação mensal dos voláteis, como apresenta a Figura 3.13 com PC 1 explicando 22 % e PC 2 15,5 % das amostras. A PCA scores (Figura 3.13 A) não apresentou agrupamento, os meses se concentram em um único grupo. Pela PCA biplot (Figura 3.13 B) percebe-se que os compostos sesquiterpênicos, em

103 sua maioria, encontram-se direcionados para o lado direito do gráfico e os monoterpenos do lado esquerdo. Porém, não se visualiza nenhuma tendência de separação dos meses. As condições climáticas não apresentaram oscilação na temperatura, as médias das estações foram de 12 a 25 °C nos meses de inverno, e de 16 a 30 °C nos demais. Porém, acredita-se que, embora não haja estações definidas na cidade de Campinas e durante o período de coleta não ter havido meses com condições climáticas características da estação, não seja este o único fator levando a este resultado. Como não foi observada variação mensal da composição química de P. neochilus quando analisada com quatro indivíduos, a mesma foi estudada separadamente. Com a análise por indivíduo pode-se verificar se plantas de localidades diferentes, em mesma condição climática e de plantio, apresentam mesmo perfil de voláteis.

104

105

UNICAMP CPQBA

GUARÁ NOVA ODESSA

Figura 3.14. PCA de scores das amostras coletadas ao longo do ano dos indivíduos UNICAMP, CPQBA, Guará e Nova Odessa iniciando em junho de 2017 e finalizando em junho de 2018 para cada indivíduo.

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UNICAMP CPQBA

GUARÁ NOVA ODESSA

Figura 3.15. PCA biplot dos indivíduos UNICAMP, CPQBA, Guará e Nova Odessa para as amostras coletadas ao longo do ano. Neste gráfico exploratório as features se apresentam como vetores.

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UNICAMP CPQBA

GUARÁ NOVA ODESSA

Figura 3.16. PLS VIP scores com as 15 features de maior relevância para cada indivíduo ao longo do

108 ano.

As PCA de scores dos indivíduos (Figura 3.14) não apresentaram variação na composição química, não há agrupamento entre as amostras dos indivíduos, pelo contrário, as amostras se apresentaram de forma distribuída pelo gráfico. Além disso, ao compará-las, nota-se que cada indivíduo se apresenta de forma diferente ao longo do ano. As PCA biplot (Figura 3.15), não mostraram nenhuma tendência dos compostos com relação às amostras, e cada indivíduo também se apresentou diferente um do outro. E os PLS VIP, ao comparar as features mais relevantes de cada nota-se que, em sua maioria, os indivíduos apresentam às mesmas features, a diferença é a intensidade, por exemplo, o indivíduo UNICAMP tem limoneno como mais intenso, CPQBA tem cis- ocimeno, Guará o 1-octen-3-ol e Nova Odessa cubebeno. A análise estatística ANOVA mostrou que os indivíduos não possuem diferença significativa (p= 0,4087). As análises realizadas indicam que os voláteis dos quatro indivíduos se apresentam de formas diferentes ao longo do ano. Em sua maioria, os indivíduos apresentam os mesmos compostos voláteis, mas com intensidades diferentes. O resultado do estudo da variação mensal dos voláteis de Plectranthus neochilus sugere que a espécie possa ter a capacidade plástil estabelecida. Além de sugerida no Capítulo 1, tal fato pode ser verificado neste Capítulo pela utilização de quatro indivíduos provenientes de localidades diferentes, que ao serem cultivados em mesmas condições adaptaram sua fisiologia e metabolismo, embora mantenham características individuais na sua composição volátil (Figura 3.15 e 3.16).

4.2.5 Composto 1-Octen-3-ol O composto 1-octen-3-ol, conhecido como "odor de cogumelo cru ou álcool de cogumelo", está presente em todos os tipos de cogumelos e é considerado o composto principal no sabor dos cogumelos comestíveis (AKAKABE et al., 2005). Como exemplo de cogumelos comestíveis, Lentinula edodes, conhecido como "cogumelo shiitake", é altamente consumido no Japão e na China.

Nele, os compostos aromáticos C8 identificados foram: 1-octen-3-ol, 1-octen-3-ona e 3-octanona. Em outros cogumelos comestíveis também foram identificados o 1-octen-3-ol, 2-octen-1-ol e cinamato de metila (CHITARRA et al., 2004). Estudos da década de sessenta propuseram a biossíntese do composto, que ainda não foi confirmada. Entretanto, o que é aceito é que a biogeração do 1-octen-3-ol ocorre através da oxigenação regio e estereoseletiva do ácido linoleico por uma lipoxigenase em um ácido hidroperoxioctadecadienoico (HPODE). Essa oxigenação é então seguida de uma clivagem enzimática por uma hidroperóxido liase gerando o 1-octen-3-ol como apresenta a Figura 3.17. Porém,

109 até o momento é desconhecida a relação estereoquímica entre os HODEs e o 1-octen-3-ol (AKAKABE et al., 2005).

Figura 3.17. Esquema proposto por Akakabe (2005) para elucidar a biogeração do composto 1- octen-3-ol através dos cogumelos Lentinula edoles e Tricholoma matsutake.

O composto é principalmente estudado para fungos. Em plantas há poucos relatos. Sabe-se que ele é emetido pelos vegetais quando infectados por fungos, e diante desse fato pesquisadores o avaliaram em Arabidopsis thaliana. O composto foi aplicado nas folhas da espécie e verificado uma ativação da resposta defensiva diminuindo a lesão necrótica causada por fungo. Essa diminuição ocorreu devida à ativação dos genes de defesa do ácido jasmônico e etileno, aumentando a resistência contra o fungo. Além disso, foi observado que essa resposta foi semelhante à realizada por outros vegetais que, quando submetidos a estresse biótico ou abiótico, formam compostos como aldeídos, álcoois e monoterpenos (KISHIMOTO et al., 2007).

4.2.6 Análise estatística da variação mensal de cada volátil Para cada volátil foi realizada a análise por ANOVA e o teste Tukey, porém a Figura 3.21 (Anexo) apresenta apenas o gráfico com as intensidades dos voláteis pelos meses de coleta. Dos 22 voláteis apresentados 8 não apresentaram variação estatística significativa ao longo dos meses, são eles: tujeno, 3-octanol, acetato cis 2,1 – hexenol, trans ocimenogermacreno D, gurjuneno ecadineno. Já as alterações significativas com p< 0,05 foram no hexanal, pineno, sabineno, 1-octen-3-ol, M109, cis ocimeno, cis terpineol, M110, cubebeno, copaeno, bourboneno,

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cubebeno, trans cariofileno e humuleno. O hexanal apresentou maior intensidade no mês de agosto e cis ocimeno apresentou em janeiro. O restante dos voláteis apresentou maiores intensidades nos meses de junho, julho e outubro de 2017, e junho de 2018. Os voláteis 1-octen-3-ol, cis terpineol e humuleno apresentaram mudanças significativas pela ANOVA, mas o teste Tukey não identificou o (os) mês (es). Pelo gráfico é possível observar que para o composto mais intenso da espécie, 1-octen-3-ol, os meses de julho, agosto, setembro de 2017 e março de 2018 ele se encontra mais intenso. De modo geral, pouca variação é percebida nos voláteis de Plectranthus neochilus. Quando comparado esse resultado com os dados meteorológicos observa-se que entre os meses citados não há relação, junho de 2017 teve baixa pluviosidade, com temperaturas máximas de 25 °C, julho de 2017 não foi registrado chuva e apresentou mesma temperatura máxima. Já outubro de 2017 apresentou a maior pluviosidade e temperaturas acimas de 25 °C, e junho de 2018 registraram a menor pluviosidade e temperatura máxima de 27 °C. Isso aponta a adaptabilidade que a espécie apresenta às adversidades ambientais, e isso é percebido pelos gráficos, pois cada volátil mantém certa linearidade ao longo dos meses, não sendo visíveis quaisquer alterações atreladas às mudanças climáticas. Por fim, não há variação de voláteis nessa espécie e isso pode estar relacionado com a capacidade de plasticidade e fácil adaptação ao ambiente que ocupa como foi comentado na revisão bibliográfica com relação aos vários hábitats que espécies de Plectranthus conseguem ocupar.

5. CONCLUSÃO

Portanto, diante dos resultados apresentados para a análise da metabolômica untargeted de Plectranthus neochilus conclui-se que há diferença estatística entre os cultivos a sol pleno e estufa e entre os períodos de coleta manhã e tarde quando em sol pleno. Provavelmente tenha havido uma condição de estresse para Plectranthus neochilus quando submetida ao cultivo na estufa e no período da tarde quando em cultivo a sol pleno, pois em ambas as condições o composto 1-octen-3-ol apresentou-se estatisticamente mais intenso. Porém, não há variação mensal dos voláteis da espécie.

111

CONCLUSÃO GERAL

Diante dos resultados apresentados nos três Capítulos, os estudos de anatomia e de citogenética confirmaram que todos os indivíduos do presente estudo são da espécie Plectranthus neochilus. O óleo essencial da espécie não possui atividade antioxidante quando analisado pelo método de DPPH, mas possui atividade antimicrobiana quando obtido por hidrodestilação contendo monoterpenos e sesquiterpenos em sua composição. O estudo metabolômico untargeted mostrou que não há variação mensal dos compostos voláteis, mas que há diferença estatística entre os cultivos a sol pleno e na estufa, e nos períodos manhã e tarde quando em sol pleno. O composto, 1-octen-3ol, provavelmente se apresenta intenso nessas condições devido a estresse ambiental.

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REFERÊNCIAS

ABDEL-MOGIB, M.; ALBAR, H. A.; BATTERJEE, S. M. Chemistry of the genus Plectranthus. Molecules. v. 7, p. 271-301, 2002.

ADAMS, R. P. Identification of essential oils components by gas chromatography/ mass spectroscopy. p. 469, 2007.

AKAKABE, Y.; MATSUI, Y. K.; KAJIWARA, T. Stereochemical Correlation between 10- Hydroperoxyoctadecadienoic Acid and 1-Octen-3-ol in Lentinula edodes and Tricholoma matsutake Mushrooms. Bioscience Biotechnologt Biochemistry. v. 69, n. 8, p. 1539–1544, 2005.

ANTINARELLI, L. M. R.; PINTO, N. C.; SCIO, E.; COIMBRA, E. S. Antileishmanial activity of some Brazilian plants, with particular reference to Casearia sylvestris. Anais da Academia Brasileira de Ciências. v. 87, n. 2, 2015.

ASCENSÃO, L.; MARQUES, N.; PAIS, M. S. Glandular trichomes on vegetative and reproductive organs of Leonotis leonurus (Lamiaceae). Annals of Botany. v. 75, n. 6, p. 619–626, 1995.

ASCENSÃO, L.; MARQUES, N.; PAIS, M. S. Peltate glandular trichomes of Leonoti leonurus leaves: Ultrastructure and histochemical characterization of secretion. International Journal of Plant Sciences. v. 158, n. 3, p. 249–258, 1997.

ASCENSÃO, L. FIGUEIREDO, A C.; BARROSO, J. G.; PEDRO, L. G.; SCHRIPSEMA, J.; DEANS, S. G.; SCHEFFER, J. J. C. Plectranthus madagascariensis: morphology of the glandular trichomes, essential oil composition, and its biological activity. International Journal of Plant Sciences. v. 159, n. l, p. 31–38, 1998.

ASCENSÃO, L.; MOTA, L.; CASTRO, M. Glandular trichomes on the leaves and flowers of Plectranthus ornatus: morphology, distribution and histochemistry. Annals of Botany. v. 84, n. 4, p. 437–447, 1999.

ASCENSÃO, L. Estruturas secretoras em plantas: uma abordagem morfo-anatómica. In: FIGUEIREDO, A.C.; BARROSO, J. G.; PEDRO, L. G. Potencialidades e Aplicações das Plantas Aromáticas e Medicinais. Curso Teórico-Prático – 3a ed. Edição da Faculdade de Ciências da

113

Universidade de Lisboa - Centro de Biotecnologia Vegetal, Lisboa, Portugal. 2007 p. 19-28.

BAIDA, F. C.; SANTIAGO, D. C.; VIDAL, L. H. I.; BAIDA, L. C.; STROZE, C. T. Medicinal plants‟ hosting ability for nematode Meloidogyne javanica and M. Incognita. Nematropica. v. 41, n. 1, p. 150–153, 2011.

BALBINO, E. E.; DIAS, M. F. Farmacovigilância: Um passo em direção ao uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos. Brazilian Journal of Pharmacognosy. v. 20, n. 6, p. 992–1000, 2010.

BASER, K. H. C.; BUCHBAUER, G. Handbook of essential oils science, technolog and applications.

BAKER, M. Metabolomics : from small molecules to big ideas. Nature Methods, v. 8, n. 2, p. 117– 121, 2011.

BANDEIRA, J. M.; BARBOSA, F. F.; BARBOSA, L. M. P.; RODRIGUES, I. C. S.; BACARIN, M. A.; PETERS, J. A.; BRAGA, E. J. B. Composição do óleo essencial de quatro espécies do gênero Plectranthus. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. v. 13, n. 2, p. 157–167, 2011.

BELLIARDO, F.; BICCHI, C.; CORDERO, C.; LIBERTO, E.; RUBIOLO, P.; SGORBINI, B. Headspace–solid-phase microextraction in the analysis of the volatile fraction of aromatic and medicinal Plants. Journal of Chromatographic Science. v. 44, p. 416–429, 2006.

BIZZO, H. R.; HOVELL, A. M. C.; REZENDE, C. M. Óleos essenciais no Brasil: aspectos gerais, desenvolvimento e perspectivas. Química Nova. v. 32, n. 3, p. 588–594, 2009.

BOCARDI, J. M. B. Etnofarmacologia das plantas medicinais de céu azul e composição química do óleo essencial de Plectranthus neochilus schltr. 2008. 101f. Dissertação (Mestrado em Química Aplicada) Universidade Estadual de Ponta Grossa, Ponta Grossa, Paraná, 2008.

BOIX, Y. F.; VICTÓRIO, C. P.; DEFAVERI, A. C. A.; ARRUDA, R. C. O.; SATO, A.; LAGE, C. L. S. Glandular trichomes of Rosmarinus officinalis L.: Anatomical and phytochemical analyses of leaf volatiles. Plant Biosystems. v. 145, n. 4, p. 848–856, 2011.

BORGES, A. M.; ALMEIDA, C.; LOPES, C. V.; HECK, R. M.; BARBIERI, R. L. Plantas medicinais no campo educacional: saberes relacionados ao boldo-gambá. Revista Internacional de

114

Cuidados de Salud Familiar y Comuniaria. v. 7, n. 2, p. 1–6, 2011.

BOTELHO, M.; NOGUEIRA, N. A. P.; BASTOS, G. M.; FONSECA, S. G. C.; LEMOS, T. L. G.; MATOS, F. J. Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and thymol against oral pathogens. Brazilian journal of medical and biological research, v. 40, n. 3, p. 349– 356, 2007.

BOZIN, B.; MIMICA-DUKIC, N.; SIMIN, N.; ANACKOV, G. Characterization of the volatile composition of essential oils of some Lamiaceae spices and the antimicrobial and antioxidant activities of the entire oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 54, n. 5, p. 1822–1828, 2006.

BRAND-WILLIAMS, W.; CUVELIER, M. E.; BERSET, C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Food Science and Technology, v. 28, n. 1, p. 25–30, 1995.

BRITTEN, J. F. L. S. The Journal of botany, british and foreign. Library of the new york botanical garden, v. XXXXIV, p. 530, 1896.

CAIN, A. J. The use of Nile Blue in the examination of lipids. Quarterly journal of microscopical science. v. 88, p. 383 – 392, 1947.

CAIXETA, S. C.; MAGALHÃES, L. G.; MELO, N. I.; WAKABAYASHI, K. A. L.; AGUIAR, G. P.; AGUIAR, D. P.; MANTOVANI, A. L. L.; ALVES, J. M.; OLIVEIRA, P. F.; TAVARES, D. C.; GROPPO, M.; RODRIGUES, V.; CUNHA, W. R.; VENEZIANI, R. C. S.; FILHO, A. A. S.; CROTTI , A. E. M. Chemical composition and in vitro schistosomicidal activity of the essential oil of Plectranthus neochilus grown in southeast Brazil. Chemistry & Biodiversity. v. 8, p. 2149-2157, 2011.

CANUTO, G. A. B. Avaliação metabolômica comparativa in vitro de fármaco candidato ao tratamento de leishmaniose. 2016. 130f. Tese (Doutorado em Ciências (Química) Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016.

CEPAGRI, Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas aplicada à Agricultura, UNICAMP, Campinas/SP. 2018. CHARRIÈRE-LADREIX, Y. Repartition intracellulaire du sécrétat flavonique de Populus nigra L.

115

Planta. v. 129, n. 2, p. 167–174, 1976.

CLEVENGER, J. F. American pharmaceutical association apparatus for the determination of volatile oil. American Pharmaceutical Association, v. XVII, n. 4, p. 345–349, 1928.

CODD, L. E. South African Labiatae. The Coleus Caninus Complex. Bothalia. V VII, n. 3, p. 432 – 434, 1961.

CODD, L. E. Plectranthus (Labiatae) and allied genera in southern Africa. Bothalia. v. 11, p. 371- 442, 1975.

CONCEIÇÃO, P. R. N. Utilização de análise multivariada de dados na otimização de misturas de minerais industriais para a formulação de tintas. 2006. 166f. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Minas, Metalúrgica e de Materiais) Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2006.

COSTA, L. C. D. B. Condições culturais, anatomia foliar, processamento e armazenamento de Ocimum selloi em relação ao óleo essencial. 2008. 161f. Tese (Doutorado em Agronomia), Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2008.

COSTA, D. A.; ANTONIO, G.; OLIVEIRA, L. DE.; SOUSA, D. P. DE.; DE, R. M. Avaliação do potencial antioxidante in vitro do composto ciano-carvona. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. v. 33, n. 4, p. 567–575. 2012.

CREVELIN, E. J.; CAIXETA, S. C.; DIAS, H. J.; GROPPO, M.; CUNHA, W. R.; MARTINS, C. H. G.; CROTTI, A. E. M. Antimicrobial activity of the essential oil of Tetradenia riparia against cariogenic bacteria. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Journal. 6p. 2015.

DAVID, R.; CARDE, J. P. Coloration différentielle des inclusions lipidique et terpeniques des pseudophylles du Pin maritime au moyen du reactif Nadi. Comptes Rendus de L’ Academie des Sciencies, v. 258, p. 1338–1340, 1964.

DEGÁSPARI, C. H.; WASZCZYNSKYJ, N. Propriedades antioxidantes de compostos fenólicos antioxidants properties of phenolic compounds. Visão Acadêmica. v. 5, n. 1, p. 33–40, 2004.

116

DE WET, J. M. J. Chromosome numbers in Plectranthus and related genera. Soulh African Journal of Science. 1958.

DI STASI, L.C.; OLIVEIRA, G.P.; CARVALHAES, M.A.; QUEIROZ-JUNIOR, M.; TIEN, O.S.; KAKINAMI, S.H.; REIS, M.S. Medicinal plants popularly used in the Brazilian Tropical Atlantic Forest. Fitoterapia. v. 73, n. 1, p. 69–91, 2002.

DUARTE, M. R.; LOPES, J. F. Stem and leaf anatomy of Plectranthus neochilus Schltr., Lamiaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia. v. 17, n 4, p. 549-556, 2007.

DURANT, A. A.; RODRÍGUEZ, C.; HERRERA, L.; ALMANZA, A.; SANTANA, A. I.; SPADAFORA, C.; GUPTA, M. P. Anti-malarial activity and HS-SPME-GC-MS chemical profiling of Plinia cerrocampanensis leaf essential oil. Malaria Journal. v. 13, n. 18, p. 1–9, 2014.

EL-SAKHAWY, F. S.; KASSEM, H. A.; EL-GAYED, S. H.; MOSTAFA, M. M. Headspace solid phase microextraction analysis of volatile compounds of the aerial parts and flowers of Plectranthus neochilus Schltr. and Salvia farinacea Benth. Journal of essential oil bearing plants. v. 21, n. 3, p. 674–686, 2018.

ESPÍN, J. C.; SOLER-RIVAS, C.; WICHERS, H. J. Characterization of the total free radical scavenger capacity of vegetable oils and oil fractions using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical. Journal of Agricultural & Food Chemistry, v. 48, n. 3, p. 648–656, 2000.

FANELA, T. L. M.; BALDIN, E. L. L.; PANNUTI, L. E. R.; CRUZ, P. L.; CROTTI, A. E. M.; TAKEARA, R.; KATO, M. J. Lethal and inhibitory activities of plant-derived essential oils against Bemisia tabaci gennadius (hemiptera: aleyrodidae) biotype B in tomato. Neotropical Entomology. v. 45, p. 201–210, 2016.

FIGUEIREDO, A. C. D. S.; BARROSO, J. M. G.; PEDRO, L. M. G.; ASCENSÃO, L. Histoquímica e citoquímica em plantas: princípios e protocolos. 1 ed. Edição: Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Centro de Biotecnologia Vegetal. Lisboa, 2007.

FILHO, J. L. S. C.; BLANK, A. F.; ALVES, P. B.; EHLERT, P. A D.; MELO, A. S.; CALVACANTI, S. C. H.; SILVA-MANN, R. Influence of the harvesting time, temperature and

117 drying period on basil (Ocimum basilicum L.) essential oil. Revista Brasileira de Farmacognosia. v. 16, n. 1, p. 24–30, 2006.

FORSTER, P. I. Five new species of Plectranthus L. Herit (Lamiaceae) from Queensland. Austrobaileya, Queensland Herbarium. v. 3, n. 4, p. 729–740, 1992.

FUCK, S. B.; ATHANÁZIO, J. C.; LIMA, C. B.; MING, L. C. Plantas medicinais utilizadas na medicina popular por moradores da área urbana de Bandeirantes, PR, Brasil. Semina: Ciências Agrárias. v. 26, n. 3, p. 291–296, 2005.

GLÓRIA, B. A,; GUERREIRO, S. M. C. Anatomia Vegetal. 2ed. Ed. UFV, Viçosa, 2006.

GRAYER, R. J.; ECKERT, M. R.; LEVER, A.; VEITCH, N. C.; KITE, G. C.; PATON, A. J. Distribution of exudate flavonoids in the genus Plectranthus. Biochemical Systematics and Ecology. v. 38, p 335–341, 2010.

GUERRA M. O uso do Giemsa na citogenética vegetal: comparação entre a coloração simples e o bandamento. Ciência & Cultura. v. 35, p. 190-193, 1983.

GUERRA M, SOUZA, M. J. Como observar cromossomos: um guia de técnicas em citogenética vegetal, animal e humana. Ribeirão Preto: FUNPEC, 2002.

GUTIERREZ, J. C.; BARRY-RYAN, P. B. The antimicrobial ef fi cacy of plant essential oil combinations and interactions with food ingredients. International Journal of Food Microbiology. v. 124, p. 91–97, 2008.

HUSAIN, S. Z.; MARIN, P. D.; SILIĆ, C.; QAISER, M.; PETCOVIĆ, B. A micromorphological study of some representative genera in the tribe Saturejeae (Lamiaceae). Botanical Journal of the Linnean Society. v. 103, n. 1, p. 59–80, 1990.

ISCAN, G.; KIRIMER, N.; KURKCUOGLU, M.; HUSNU CAN BASER, K.; DEMIRCI, F. Antimicrobial screening of Mentha piperita essential oils. Journal of Agricultural & Food Chemistry. v. 50, p. 3943–3946, 2002. JIROVETZ, L., BUCHBAUER, G., NGASSOUM, M. B., ESSIA-NGANG, J. J., TATSADJIEU, L. N., & ADJOUDJI, O. Chemical composition and antibacterial activities of the essential oils of

118

Plectranthus glandulosus and Cinnumomum zeylrrnicum from Cameroon. Scientia Pharmaceutica. v. 70, 93–99, 2002.

JOHANSEN, D. A. Plant microtechnique. 1. ed. Londres: MacGraw-Hill Book, 1940.

KADEREIT, J.W. Flowering plants, dicotyledons: Lamiales (except Acanthaceae including Avicenniaceae) – Volume 7: The families and genera of vascular plants. Alemanha, eBook, 2004.

KALICHARAN, B.; NAIDOO, Y.; HENEIDAK, S.; BHATT, A. Distribution, morphological and histochemical characteristics of foliar trichomes of Plectranthus zuluensis (Lamiaceae). Revista Brasileira de Botanica. v. 38, n. 4, p. 961–971, 2015.

KHALIK, A. K. N. A Systematic revision of the genus Plectranthus L. (Lamiaceae) in Saudi Arabia based on morphological, palynological, and micromorphological characters of trichomes. American Journal of Plant Sciences, v. 7, n. 10, p. 1429–1444, 2016.

KHALIK, K. N. A.; KARAKISH, E. A. Comparative anatomy of stems and leaves of Plectranthus L. (Lamiaceae) in Saudi Arabia and systematic implications. Microscopy Research and Technique. v. 79, n. 7, p. 583–594, 2016.

KIM, H. K.; CHOI, Y. H.; VERPOORTE, R. NMR-based metabolomic analysis of plants. Nature Protocols, v. 5, n. 3, p. 536–549, 2010.

KISHIMOTO, K.; MATSUI, K.; OZAMA, R. Volatile 1-octen-3-ol induces a defensive response in Arabidopsis thaliana. Journal of General Plant Pathology. v. 73, p. 35 – 37, 2007.

KOKETSU, M.; GONÇALVES, S. L. Óleos essenciais e sua extração por arraste a vapor, 1991.

KRAUS, J. E.; ARDUIM, M. Manual básico de métodos em morfologia vegetal. Ed. Universidade Rural, 1997.

KRINSKI, D.; GODOY, A. F. First record of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) feeding on Plectranthus neochilus (Lamiales: Lamiaceae) in Brazil. Florida Entomologist. v. 98, n. 4, p. 1238–1240, 2015.

119

LIMA, R., N.; SODRÉ, W.; ROLAND, G, A.; LIMA, H.; SOARES, R.; DELOU, S. C. The efficacy of a practical activity in the construction of knowledge of the concepts of species and phenotypic plasticity using the boldo mirim (Plectranthus neochilus Schltr.). Scientific Research Publishing - Creative Education. v. 8, 2036–2048, 2017.

LEROUX, O. Collenchyma: A versatile mechanical tissue with dynamic cell walls. Annals of Botany. v. 110, n. 6, p. 1083–1098, 2012.

LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas cultivadas. 1. ed. Nova Odessa, SP: Instituto Plantarum, 2002.

LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas cultivadas. 2. ed. Nova Odessa, SP: Instituto Plantarum, 2008.

LUKHOBA, C. W.; PATON, A. J. A new species and new variety in Plectranthus L‟ Hér. (Labiatae) from Eastern Africas. Kew Bulletin. v. 58, n. 4, p. 909–917, 2003.

LUKHOBA, C. W.; SIMMONDS, M. S. J.; PATON, A. J. Plectranthus: A review of ethnobotanical uses. Journal of Ethnopharmacology. v. 103, n. 1, p. 1–24, 2006.

MANN, C. M.; COX, S. D.; MARKHAM, J. L. The outer membrane of Pseudomonas aeruginosa NCTC 6749 contributes to its tolerance to the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). Letters in Applied Microbiology. v. 30, p. 294–297, 2000.

MARCHESE, J.A.; MING, L.C.; FRANCESCHI, L.; CAMOCHENA, R.C.; GÔMES, G.D.R.; PALADINI, M.V.; CAPELIN, D.; MARCHESE, C. Medicinal plants used by “Passo da Ilha” rural community in the city of Pato Branco, southern Brazil. Anais Da Academia Brasileira de Ciencias. v. 81, n. 4, p. 691–700, 2009.

MARTINS, M. B. G.; PASTORI, A. P. Anatomia foliar com ênfase nos tricomas secretores e análise cromatográfica do óleo essencial de Melissa officinalis L. (Lamiaceae). Revista Brasileira de Planta Medicinal. v. 6, n.21, p. 77- 82, 2004.

MARWAH, R. G.; FATOPE, M. O.; DEADMAN, M. L.; OCHEI, J. E.; AL-SAIDI, S. H. Antimicrobial activity and the major components of the essential oil of Plectranthus cylindraceus.

120

Journal of Applied Microbiology. v. 103, n. 4, p. 1220–1226, 2007.

MAURO, C.; Silva, C. P.; MISSIMA, J.; OHNUKI, T.; RINALDI, R.; FROTA, M. Artigo Estudo anatômico comparado de órgãos vegetativos de boldo. Revista Brasileira de Farmacognosia. v. 18, n. 4, p. 608–613, 2008.

MESQUITA, P. R. R.; NUNES, E. C.; SANTOS, F. N. DO.; BASTOS, L. P.; COSTA, M. A. P. C.; RODRIGUES, DE M. F.; DE ANDRADE, J. B. Discrimination of Eugenia uniflora L. biotypes based on volatile compounds in leaves using HS-SPME/GC–MS and chemometric analysis. Microchemical Journal. v. 130, p. 79–87, 2017.

MILANEZE-GUTIERRE, M. A. et al. Caracterização morfológica dos tricomas foliares e caulinares de duas espécies de Lamiaceae conhecidas popularmente como “falso-boldo”. Acta Scientiarum - Biological Sciences. v. 29, n. 2, p. 125–130, 2007.

MILLER, L. Microtécnica e fotomicrografia. Piracicaba: Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 1968.

MIMICA-DUKIC, N.; BOZIN, B.; SOKOVIC, M.; SIMIN, N. Antimicrobial and antioxidant activities of Melissa officinalis L. (Lamiaceae) essential oil. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 52, n. 9, p. 2485–2489, 2004.

MOHALLEM, D.F.; TAVARES, M.; SILVA, P.L.; GUIMARÃES, E.C.; FREITAS, R. F. Avaliação do coeficiente de variação como medida da precisão em experimentos com frangos de corte. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. v. 60, n. 2, p. 449–453, 2008.

MONTEIRO, M.; CARVALHO, M.; HENRIQUE, R.; JERÔNIMO, C.; MOREIRA, N.; BASTOS, M. L.; PINHO, P. G. Analysis of volatile human urinary metabolome by solid-phase microextraction in combination with gas chromatography – mass spectrometry for biomarker discovery : Application in a pilot study to discriminate patients with renal cell carcinoma. European Journal of Cancer. v. 50, p. 1993–2002, 2014.

MOTA, L.; FIGUEIREDO, A. C.; PEDRO, L. G.; BARROSO, J. G.; GRAÇA, M. G.; FALEIRO, L.; ASCENSÃO, L. Volatile-oils composition, and bioactivity of the essential oils of Plectranthus

121 barbatus, P. neochilus, and P. ornatus grown in Portugal. Chemistry & Biodiversity. v. 11, p. 719- 732, 2014.

MORTON, J. K.; F. L. S. Cytotaxonomic studies on the West African Labiatae. J. Linn. LSOC. (Bot.). v. 58, n. 372, p. 121–131, 1962.

MORTON, J. K.; F. L. S. New names in Plectranthus (Lamiaceae) and allied genera from the Ethiopian region. Novon. v. 8, n. 3, p. 265–266, 1998.

NANI, T. F. Aspectos morfopolínicos e cromossômicos em espécies de Plectranthus L’ Heritier. 2011. 89f. Dissertação (Mestrado em Genética e melhoramento de plantas) Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais, 2011.

NOGUEIRA, J. M. F. Extração sortiva em barra de agitação (SBSE): uma metodologia inovadora para microextração estática. Scientia Chromatographica. v. 4, n. 4, p. 259–269, 2012.

NOSTRO, A.; ROCCARO, A. S.; BISIGNANO, G.; MARINO, A.; CANNATELLI, M. A.; PIZZIMENTI, F. C.; BLANCO, A. R. Effects of oregano, carvacrol and thymol on Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms. Journal of Medical Microbiology. v. 56, 519– 523, 2007.

OLIVEIRA, A. R.; JEZLER, C. N.; OLIVEIRA, R. A.; MIELKE, M. S., & COSTA, L. C. Determinação do tempo de hidrodestilação e do horário de colheita no óleo essencial de menta. Horticultura Brasileira, v. 30, n. 1, 155–159. 2012.

OYEDEJI, O.; LAWAL, O. A.; A. H. Hutchings. Chemical composition of the leaf oil of Plectranthus neochilus schltr. Journal of Essential Oil Research. v. 22, n. 6, p. 546-547, 2011.

PATTI, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. Journal of Separation Science, v. 34, p. 3460–3469, 2011. PEARSE, A. G. E. Histochemistry, theoretical and applied. 4ª ed. Edimburgo: Livingston, 1985.

PEREIRA, M.; MATIAS, D.; PEREIRA, F.; REIS, C. P.; SIMÕES, M. F.; RIJO, P. Antimicrobial screening of Plectranthus madagascariensis and P. neochilus extracts. Biomedical and Biopharmaceutical Research. v. 12, n. 1, p. 127-138, 2015.

122

PINTO, E. P. P.; AMOROZO, M. C. M.; FURLAN, A. Conhecimento popular sobre plantas medicinais em comunidades rurais de Mata Atlântica – Itacaré, BA, Brasil. Acta Botânica Brasileira. v. 20, n. 4, p. 751-762, 2006.

PRAKASH, O.; ROUT, P. K.; CHANOTIYA, C. S.; MISRA, L. N. Composition of essential oil, concrete, absolute and SPME analysis of Tagetes patula capitula. Industrial Crops & Products. v. 37, n. 1, p. 195–199, 2012.

RICE, L. J.; BRITS, G. J.; POTGIETER, C. J.; VAN STADEN, J. Plectranthus: A plant for the future? South African Journal of Botany. v. 77, n. 4, p. 947–959, 2011.

RICE, L. J.; SOOS, V.; ASCOUGH, G. D.; BALAZS, E.; ORDG, V.; WHITEHEAD, C. S.; FINNIE, J. F.; VAN STADEN, J. Screening of Plectranthus species for antibacterial activity. South African Journal of Botany. v. 64, n. 1, p. 62–65, 2013.

RAJA, R. R. Medicinally potential plants of Labiatae (Lamiaceae) family: An overview. Research Journal of Medicinal Plant. v. 6, n. 3, p. 203-213, 2012.

ROSAL, L. F.; PINTO, J. E. B. P.; BRANT, R. S. Produção de biomassa e óleo essencial de Plectranthus neochilus Schlechter cultivado no campo sob níveis crescentes de adubo orgânico. Pesquisa Aplicada & Agrotecnologia. v. 2, n. 2, 2009.

ROSAL, L. F.; PINTO, J. E. B. P.; BERTOLUCCI, S. K. V.; BRANT, R. S.; NICULAU, E. S.; ALVES, P. B. Produção vegetal e de óleo essencial de boldo pequeno em função de fontes de adubos orgânicos. Revista Ceres. v. 58, n. 5, p. 670-678, 2011.

SAKAI, W. S. Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O. Stain Technology. v. 48, 247-249, 1973.

SANGSTER, T.; MAJOR, H.; PLUMB, R.; WILSON, J.; WILSON, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. The Royal Society of Chemistry, v. 131, p. 1075, 2006. SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6ª ed. Porto Alegre, Florianópolis:

123

Editora UFRGS/Editora UFSC, 2007. p. 467-496.

SMITH, C. A.; WANT, E. J.; MAILLE, G. O.; ABAGYAN, R.; SIUZDAK, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching and identification. Analytical Chemistry. v. 78, n. 3, p. 779–787.

SOUSA, C. M. M,; ROCHA, H.; VIEIRA-JR, G. M.; AYRES, M. C.C.; COSTA, L. S.; ARAÚJO, D. S.; CAVALCANTE, L. C. D.; BARROS, E. D. S.; ARAÚLO, P. B. M.; BRANDÃO, M. S.; CHAVES, M. H. Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Química Nova. v. 30, n. 2, p. 351–355, 2007.

SPANU, T.; LUZZARO, F.; PERILLI, M.; AMICOSANTE, G.; TONIOLO, A.; FADDA, G. Occurrence of extended-spectrum -lactamases in members of the family Enterobacteriaceae in Italy - Implications for resistance to -lactams and other antimicrobial Drugs. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. v. 46, n. 1, p. 196–202, 2002.

SULTAN, S. E. Phenotypic plasticity for plant development , function and life history. Elsevier Science. v. 5, n. 12, p. 537–542, 2000.

STIRTON, C. H. Broad-spectrum pollination of. Bothalia. v. 12, n. 2, p. 229–230, 1977.

TEMPONE, A. G.; SARTORELLI, P.; TEIXEIRA, D.; PRADO, F. O.; CALIXTO, I. A. R. L.; LORENZI, H.; MELHEM, M. S. C. Brazilian flora extracts as source of novel antileishmanial and antifungal compounds. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 103, n. 5, p. 443–449, 2008.

TOMAZZONI. M. I. Subsídios para a introdução do uso de fitoterápicos na rede básica de saúde do município de Cascavel/PR. 2004. 113f. Dissertação (Mestrado em Enfermagem) Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Paraná, 2004.

TRYGG, J.; HOLMES, E.; LUNDSTEDT, L. Chemometrics in Metabonomics. Journal of Proteome Research. v. 6, p. 469–479, 2007.

VAGIONAS, K.; NGASSAPA, O.; RUNYORO, D.; GRAIKOU, K.; GORTZI, O.; CHINOU, I. Chemical analysis of edible aromatic plants growing in Tanzania. Food Chemistry. v. 105, p. 1711– 1717, 2007.

124

VALENTE, A. L. P.; AUGUSTO, F. Microextração por fase sólida. Química Nova. v. 23, n. 4, p. 523–530, 2000.

VALENTI, G. S.; BISIO, A.; CORNARA, L.; CIARALLO, G. C. Structural and histochemical investigation of the glandular trichomes of Salvia aurea L. Leaves, and chemical analysis of the essential oil. Annals of Botany. v. 79, n. 3, p. 329–336, 1997.

VAN JAARSVELD, E. J.; EDWARDS, T. J. Notes on Plectranthus (Lamiaceae) from southern Africa. Bothalia. v. 27, n. 1, p. 1-6, 1997.

VAN JAARSVELD, E. J; KIRSTENBOSCH. The bushveld garden. Veld S’ Flora. v. 88, p. 91, 1997.

VENDRUSCOLO, G. S.; MENTZ, L. A. Estudo da concordância das citações de uso e importância das espécies e famílias utilizadas como medicinais pela comunidade do bairro Ponta Grossa, Porto Alegre, RS, Brasil. Acta Botânica Brasileira. v. 20, n. 2, p. 367-382, 2006.

VIEIRA, G. D. V.; SOUZA, O. V.; YAMAMOTO, C H.; KAPLAN, M. A.C. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oils of Ageratum fastigiatum (Asteraceae). Records of Natural Products. v. 3, n. 1, p. 52–57, 2009.

ZENI, A. L.; BOSIO, F. Medicinal plants used in the Nova Russia, Brazilian Atlantic Rain Forest. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. v. 8, n. esp., p. 167–171, 2006.

ZHANG, Z.; PAWLISZYN, J. Headspace Solid-Phase Microextraction. Analytical Chemistry. v. 65, n. 14, p. 1843–1852, 1993.

ZHENG, H.; FAN, L.; MILNE, R. I.; ZHANG, L.; WANG, Y.; MAO, K.. Species delimitation and lineage separation history of a species complex of Aspens in China. Frontiers in Plant Science. v. 8, n. 375, 2017.

ZIMMER, J.; ANZANELLO, M. J. Um novo método para seleção de variáveis preditivas com base em índices de importância. Production. v. 24, n. 1, p. 84–9, 2014.

125

YORK, T.; WET, H.; VUUREN, S. F. V. Plants used for treating respiratory infections in rural Maputaland, KwaZulu-Natal, South Africa. Journal of Ethnopharmacology. v. 135, n. 3, p. 696– 710, 2011.

WALDIA, S.; JOSHI, B. C.; PATHAK, U.; JOSHI, M. C. The Genus Plectranthus in India and Its Chemistry. Chemistry & Biodiversity. v. 8, 2011.

WERKER, E.; PUTIEVSKY, E.; RAVID, U. The essential oils and glandular hairs in different chemotypes of Origanum vulgare L. Annals of Botany, v. 55, p. 793–801, 1985.

WERKER, E.; PUTIEVSKY, E.; RAVID, U.; DUDAI, N.; KATZ IR, I. Glandular hairs and essential oil in developing leaves of Ocimum basilicum L. (Lamiaceae). Annals of Botany. v. 71, p. 43–50, 19

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ANEXOS

Capítulo 2 - Resultados e Discussão

Tabela 2.1 Proposta de identificação do óleo essencial de Plectranthus neochilus obtido por hidrodestilação em aparelho de Clevenger e destilação por arraste a vapor.

Destilação por Hidrodestilação nº arraste a vapor Composto Sim. TR % Área TR % Área Biciclo[3.1.0]hexane, 4-metil-1-(1-metiletil)-, 1 5.85 10.63 - - 94 didehidro deriv. 2 6.07 8.23 - - α-Pineno 96 Biciclo[3.1.0]hex-2-ene, 4-metileno-1-(1- 3 6.31 0.42 - - 91 metiletil)- 4 7.33 4.03 - - α-Tujeno 91 5 7.41 2.38 - - β-Pineno 97 6 7.73 7.19 - - 1-Octen-3-ol 90 7 7.93 0.46 - - Não identificado 74 8 8.11 0.78 - - Não identificado 78 9 8.47 0.13 - - Não identificado 72 10 8.74 0.80 - - 4-Careno 96 11 9.01 0.91 - - o-Cimeno 95 12 9.16 0.78 - - Limoneno 91 13 9.51 0.58 - - trans-β-Ocimeno 96 14 9.89 2.11 - - trans-β-Ocimeno 97 15 10.21 1.27 - - γ-Terpineno 94 16 11.16 0.42 - - Terpinoleno 97 17 11.58 0.19 - - Linalool 96 18 12.08 0.13 - - Tujona 95 19 12.23 0.21 - - Não identificado 50 20 12.53 0.11 - - trans-allo-Ocimeno 95 21 12.83 0.2 - - cis-2-Ciclohexen-1-ol, 1-metil-4-(1-metiletil)- 93 22 13,00 0.11 - - Não identificado 47 23 13.73 0.12 - - Não identificado 52 24 13.81 0.10 - - Não identificado 64 25 14.09 1.90 - - Terpinen-4-ol 95 26 14.46 0.24 - - Não identificado 87 27 14.62 0.15 - - Não identificado 53 28 14.93 0.20 - - Decanal 90 29 16.31 0.14 - - Não identificado 46 30 19.09 0.94 19.07 1.04 α-Cubebeno 99 31 19.82 1.63 19.78 2.31 α-Copaeno 99 32 20.08 1.97 20.02 3.11 β-Bourboneno 94

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33 20.20 1.43 20.16 0.73 6-epi-β-Cubebeno 98 34 20.65 0.22 20.95 45,2 cis-Cariofileno 98 35 21.20 16.58 - - Cariofileno 99 36 21.29 0,4 - - Não identificado 95 37 21.38 0.14 - - Não identificado 47 38 21.64 0.27 - - Não identificado 89 39 21.89 1.89 21.81 2.48 Humuleno 98 40 22.04 0.35 - - Alloaromadendreno 99 41 22.18 0.15 - - Não identificado 87 42 22.37 0.22 22.52 9.76 Não identificado 81 43 22.63 4.43 - - Germacreno D 95 1H-Ciclopenta[1,3]ciclopropa[1,2]benzeno, 44 22.83 0.22 - - octahidro-7-metil-3-metileno-4-(1-metiletil)-, 93 [3aS-(3aα,3bβ,4β,7α,7aS*)]- 1H-Ciclopropa[a]nafitaleno, 1a,2,3,5,6,7,7a,7b- 45 22.92 0.40 - - octahidro-1,1,7,7a-tetrametil-, [1aR- 91 (1aα,7α,7aα,7bα)]- 46 23.06 0.24 - - α-Muurolene 98 1H-Cicloprop[e]azuleno, 1a,2,3,4,4a,5,6,7b- 47 23.29 4.51 23.16 9.21 octahidro-1,1,4,7-tetrametil-, [1aR- 91 (1aα,4α,4aβ,7bα)]- 48 23.37 0.84 23.34 1.08 γ-Muurolene 96 49 23.39 2,3 Não identificado 42

Nafitaleno, 1,2,3,5,6,8a-hexahidro-4,7-dimetil- 50 23.62 2.29 23.55 2.88 93 1-(1-metiletil)-, (1S-cis)- Nafitaleno, 1,2,3,4,4a,7-hexahidro-1,6-dimetil- 51 23.80 0.17 - - 99 4-(1-metiletil)- Nafitaleno, 1,2,4a,5,6,8a-hexahidro-4,7-dimetil- 52 23.92 0.10 - - 96 1-(1-metiletil)-, [1S-(1α,4aβ,8aα)]- 53 24.29 0.13 - - Não identificado 72 54 24.34 0.14 - - Não identificado 22 55 24.56 0.51 - - Nerolidol 91 56 24.90 0.18 - - Não identificado 52 57 25.10 3.79 25 5.96 Óxido de cariofileno 94 58 25.28 0.10 - - Não identificado 62 59 25.39 0.10 - - Não identificado 55 60 25.64 0.58 - - Não identificado 60 61 25.76 0.32 - - Não identificado 83 62 26.07 0.51 - - Não identificado 46 63 26.19 0.26 - - Não identificado 83 10,10-Dimetil-2,6- 64 26.28 0.60 - - 99 dimetilenebiciclo[7.2.0]undecan-5β-ol 65 26.39 1.67 - - Não identificado 83 65 26.49 0.25 - - Não identificado 97 66 26.70 1.66 - - α-Cadinol 99

128

67 27.06 0.77 - - Não identificado 45 68 27.25 0.21 - - Não identificado 38 69 27.39 0.65 - - Não identificado 38 70 27.57 0.15 - - Não identificado 68 71 29.60 0.16 - - Não identificado 27 72 29.95 6.95 Não identificado 49

73 31.88 0.10 - - Não identificado 46 74 37.73 0.19 - - Não identificado 58 75 39.08 0.05 - - Octadecano 91 76 43.09 6.95 Não identificado 38

77 43.11 1.33 - - Não identificado 32 Legenda: nº: número de picos; TR: Tempo de retenção; % Área do pico; Sim.: similaridade em porcentagem; (-) compostos não detectados Total: Hidrodestilação com 74 compostos obtidos, 37 não identificados pela biblioteca do cromatógrafo, 45, 68 % de monoterpenos e 54, 28 % de sesquiterpenos - Destilação por arraste a vapor com 14 compostos obtidos, 3 não identificados pela biblioteca do cromatógrafo e 99, 96 % de sesquiterpenos.

129

Capítulo 3 - Material e Métodos

Tabela 3.4. Parâmetros do XCMS verificados para melhor obtenção de features. Parâmetros XCMS formato do tempo de retenção minutos Geral polaridade positiva método matched filter step: etapa 0.1 fwhm: largura do pico 2 Detecção de recursos snthresh: relação sinal/ ruído 2 max: número máximo de picos por 100 cromatograma de íon extraído mzdiff 0.5 método Obiwarp Correção do tempo de retenção profstep 1 bw: agrupamento com correção de 10 largura de banda minfrac: fração mínima de amostras necessárias em ao menos um grupo para Alinhamento ser considerada válida mzwid: largura das faixas sobrepostas 0.1 minsamp 1 max 100

130

Capítulo 3 - Resultados e Discussão

Figura 3.3. A - Cromatograma com de Plectranthus neochilus com fibra PDMS/ CAR. B -

Cromatograma com de Plectranthus neochilus com fibra PDMS/ DVB. C - Cromatograma com

131 de Plectranthus neochilus com fibra DVD/ PDMS/ CAR. D- Cromatograma com de

Plectranthus neochilus com fibra PDMS (vermelha).

A B

Figura 3.19. PCA biplot das amostras coletadas na estufa. Neste gráfico exploratório as features se apresentam como vetores.

132

A B

Figura 3.20. PLS VIP scores com as 15 features de maior relevância para o grupo estufa nos períodos manhã e tarde (A) e ao longo do ano (B).

133

134

Figura 3.21. Gráficos com as intensidades dos voláteis pelos meses de coleta com média e desvio padrão.

135

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