Epidemiology of the Hepatitis E Virus in Reservoir Hosts
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Epidemiology of the Hepatitis E Virus in Reservoir Hosts Inauguraldissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald vorgelegt von Paul Dremsek geboren am 13. April 1983 in Wien, Österreich Greifswald, August 2013 Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Klaus Fesser 1. Gutachter: PD Dr. rer. nat. Rainer G. Ulrich 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Beatrice Grummer Tag der Promotion: 2. Dezember 2013 Es hat alles zwei Seiten. Aber erst wenn man erkennt, daß es drei sind, erfasst man die Sache. Heimito von Doderer Repertorium, 1969 I Contents Summary 1 Zusammenfassung 3 1 Introduction 7 1.1 General introduction . .7 1.2 Virion structure and genome organization . .8 1.2.1 Structure . .8 1.2.2 Open reading frame 1 . .9 1.2.3 Open reading frame 2 . .9 1.2.4 Open reading frame 3 . 11 1.3 Replication cycle . 12 1.4 Human HEV infections . 13 1.4.1 Human-pathogenic genotypes . 13 1.4.2 Transmission in developing countries . 14 1.4.3 Transmission in developed countries . 16 1.4.4 Clinical features of hepatitis E . 19 1.5 HEV in animal hosts . 21 1.5.1 Species prone to infection . 21 1.5.2 HEV in domestic pig . 23 1.5.3 HEV in wild boar . 24 1.5.4 HEV in rodents . 25 1.5.5 Avian HEV . 26 1.5.6 Novel HEV strains and hosts . 27 1.6 Detection of HEV . 28 1.7 Prevention and therapy . 30 2 Aim of the thesis 33 3 Publication I 35 Key information of the publication . 35 4 Publication II 53 Key information of the publication . 53 5 Publication III 65 Key information of the publication . 65 II Contents 6 Results and discussion 73 6.1 Serological diagnostics . 73 6.1.1 General overview . 73 6.1.2 Development of the GT 3 in-house ELISAs . 76 6.1.2.1 Selection of antigens . 76 6.1.2.2 Validation of the novel assays . 78 6.1.3 Development of the rat HEV in-house ELISA . 80 6.1.4 Cross-reactivity and differentiation of antibodies specific for GT 3 and rat HEV . 81 6.2 HEV seroprevalence in human from Germany . 82 6.3 HEV seroprevalence in domestic pig in Germany . 89 6.4 Infection of rats with HEV in Germany . 92 6.5 Taxonomy . 94 6.6 Challenges and future prospects of HEV research . 95 References 97 Own contribution to publications 123 Publication I . 123 Publication II . 123 Publication III . 124 List of publications 125 Original articles . 125 Additional publications . 125 Miscellaneous publications and abstracts . 126 Presentations at scientific meetings and workshops . 126 Acknowledgements 129 1 Summary Background Hepatitis E virus (HEV) is the etiological agent of an acute self-limiting hepatitis in humans worldwide. The main route of infection is by ingestion of food or water contaminated with the virus. In Germany, several hundred human cases are reported each year, while preliminary studies suggest a high infestation rate of herds of domestic pig (Sus scrofa domesticus) and sounders of wild boar (Sus scrofa). Autochthonous cases are originating mainly from zoonotic transmission from domestic pig and wild boar, but other animals may also be involved. Recently, a novel strain of HEV (rat HEV) had been found in Norway rats (Rattus norvegicus) in Germany, that could contribute to human epidemiology. Therefore, the aim of this study was to assess the seroprevalence of both HEV and the novel rat HEV in human, domestic pig and rat. For each of the three mammal species, an indirect immunoglobulin G (IgG) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established, that based on an Escherichia coli-expressed carboxy-terminal segment (GT 3-Ctr, amino acid (aa) 326 – 608) of the capsid protein of the autochthonous genotype 3 (GT 3), derived from a wild boar from Germany. In parallel, a segment from rat HEV homologous to GT 3-Ctr was also expressed in E. coli (rat HEV-Ctr, aa 315 – 599) and was used in the ELISA. Hence, the established tests detect antibodies directed against HEV GT 3 when using GT 3-Ctr as antigen and rat HEV when using rat HEV-Ctr. Results The GT 3-based in-house human IgG test was validated using a commercial assay and showed high specificity and sensitivity. The average human popu- 2 Summary lation (represented by a panel of blood donors from Berlin and Brandenburg) reached a seroprevalence of 12.3 % (37 / 301) with the in-house ELISA. A panel of forestry workers from Brandenburg had an even higher seroprevalence of 21.4 % (119 / 555). Furthermore, rat HEV-specific antibodies could be detected in several sera of forestry workers. The novel rat HEV-based rat IgG ELISA could not be compared to similar tests, however, parallel testing with GT 3-Ctr and statistical inference allowed conclu- sion of a seroprevalence. Rats trapped from several sites in Germany had an overall seroprevalence of 24.5 % (36 / 147). The sera were reactive exclusively with rat HEV-Ctr. As with the in-house ELISA for human sera, the porcine IgG test was validated using a commercial assay, yielding high specificity and sensitivity. A panel of domestic pigs from ten federal states of Germany showed a seroprevalence of 42.7 % (383 / 898) when tested with the in-house ELISA. Reactivity with rat HEV was present, but seemed to be caused mostly by cross-reactivity to GT 3-Ctr. Conclusion The HEV seroprevalence observed for human sera of the average population of Germany is among the highest in Europe and has been confirmed recently by other authors. The high seroprevalence found in forestry workers suggests that they should be counted as a risk group for HEV infection. Populations of rats have been shown to be infested heavily with rat HEV, as rats from all trapping sites situated within cities had a high prevalence for rat HEV exclusively and no serum reacted exclusively with GT 3-Ctr. Seroprevalence in domestic pigs was demonstrated to be distributed evenly across federal states and districts. However, a vast difference of infestation could be detected in different herds, suggesting either differences in husbandry conditions, or an external source of infection that acts locally only. The rare but exclusive reactivity of human sera with rat HEV as well as the high cross-reactivity of swine sera with rat HEV suggests that viral strains other than the ones already known may contribute to cases of hepatitis E. 3 Zusammenfassung Grundlage Das weltweit vorkommende Hepatitis E virus (HEV) ist die Ursache für eine akut auftretende, selbstlimitierende Hepatitis beim Menschen. Hauptsächlich erfolgt die Infektion durch die orale Aufnahme von mit Virus kontaminierten Nahrungsmitteln und Wasser. In Deutschland werden jährlich mehrere hundert Fälle von Hepatitis E im Menschen gemeldet, auch von einer hohen Durch- seuchung der Haus- und Wildschweinpopulationen (Sus scrofa domesticus und Sus scrofa) wird berichtet. Autochthone Erkrankungen in Deutschland werden primär durch zoonotische Übertragung von Haus- und Wildschweinen verursacht, doch andere Übertäger könnten ebenfalls beteiligt sein. Ein 2010 beschriebener HEV-Stamm aus der Wanderratte (Rattus norvegicus), Ratten- HEV, könnte für die Epidemiologie der Hepatitis E ebenfalls von Bedeutung sein. Daher war das Ziel dieser Studie die Abschätzung der Seroprävalenz von HEV (sowohl Ratten-HEV als auch humanpathogenes HEV) in Mensch, Hausschwein und Wanderratte. Für jede der drei Säugetierspezies wurden indirekte Immunoglobulin G (IgG) En- zymimmunoassays (ELISAs) etabliert, die auf einem Escherichia coli-exprimier- ten carboxy-terminalen Segment des Kapsidproteins basieren (GT 3-Ctr, Ami- nosäureposition (aa) 326 – 608). Der dafür verwendete Stamm gehört dem in Deutschland autochthonen Genotyp 3 (GT 3) an und entstammt einem Wild- schwein aus Deutschland. Parallel dazu wurde für den ELISA auch ein zu GT 3-Ctr homologes und in E. coli exprimiertes Segment des Ratten-HEV ver- wendet (Ratten-HEV-Ctr, aa 315 – 599). Infolgedessen erfassen die etablierten serologischen Tests Antikörper gegen GT 3, wenn sie GT 3-Ctr als Antigen ver- 4 Zusammenfassung wenden, und Antikörper gegen Ratten-HEV beim Einsatz von Ratten-HEV-Ctr als Antigen. Ergebnisse Der auf GT 3 basierende in-house Human-IgG-Test wurde mithilfe eines kom- merziell erhältlichen Tests validiert und erwies sich als hoch spezifisch und sensitiv. Die Durchschnittsbevölkerung (repräsentiert durch eine Gruppe von Blutspendern aus Berlin und Brandenburg) zeigte mit dem in-house ELISA eine Seroprävalenz von 12,3 % (37 / 301). Eine Gruppe Waldarbeiter aus Branden- burg zeigte eine Seroprävalenz von 21,4 % (119 / 555). Desweiteren wurden Ratten-HEV-spezifische Antikörper in einigen Waldarbeitern gefunden. Der neuartige, auf Ratten-HEV basierende Ratten-IgG-ELISA konnte nicht mit ähnlichen Tests verglichen werden. Durch parallele Testung mit GT 3-Ctr-Antigen konnte jedoch auf eine Seroprävalenz geschlossen werden. Ratten von ver- schiedenen Fangorten innerhalb Deutschlands wiesen eine durchschnittliche Seroprävalenz von 24,5 % (36 / 147) auf. Die Seren zeigten ausschließlich Reak- tivität mit Ratten-HEV-Ctr. Wie beim Human-IgG-ELISA wurde auch der Schweine-IgG-ELISA mittels eines kommerziellen Tests validiert und erreichte eine hohe Sensitivität und Spezifität. Ein Serumpanel von Hausschweinen aus insgesamt zehn deutschen Bundeslän- dern erreichte im in-house-ELISA eine Seroprävalenz von 42,7 % (383 / 898). Wenige Seren reagierten auch mit Ratten-HEV-Ctr, was aber größtenteils auf eine Kreuzreaktivität mit GT 3-Ctr zurückgeführt werden kann. Schlussfolgerung Die beobachtete Seroprävalenz der deutschen Durchschnittsbevölkerung gehört zu den bislang höchsten in Europa und konnte von anderen Autoren bestätigt werden. Die höchste Seroprävalenz wurde für Waldarbeiter bestimmt und lässt vermuten, daß es sich bei diesen um eine Risikogruppe für HEV-Infektionen handelt. Deutsche Rattenpopulationen zeigten eine hohe Durchseuchung mit Ratten- HEV. Die Tiere von allen innerstädtischen Fangorten wiesen eine hohe Reakti- Zusammenfassung 5 vität ausschließlich mit Ratten-HEV-Ctr auf; kein Serum reagierte mit GT 3-Ctr allein.