Mtdna の D-Loop 領域の塩基配列より推定された日本におけるグッピー Poecilia Reticulata の起源

日本におけるグッピーの起源

〔原著論文〕

mtDNA の D-loop 領域の塩基配列より推定された日本におけるグッピー Poecilia reticulata の起源

佐藤龍星 1、中嶋正道 1

1：東北大学大学院農学研究科、仙台市青葉区荒巻字青葉 468-1

Origin of the guppy Poecilia reticulata in Japan by means of sequence of mtDNA D-loop region

Ryusei SATOU1 and Masamichi NAKAJIMA1

Laboratory of Fish Genetics and Breeding Science, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, Aoba, Sendai 980-0845, Japan

ABSTRACT The guppy（ Poecilia reticulata）is small freshwater fish native to South America from Venezuela to Brazil and has been introduced in Japan not only as ornamental fish but also as a biological control to mosquito. These introductions resulted some of populations colonized as an exotic species in Okinawa southern Island of Japan. The present study aimed to estimate introduction sources of the guppies in Japan by means of sequence analysis of 320 bp of mtDNA D-loop region. Sixteen wild populations and fourteen ornamental strains were examined. Six haplotypes (Hap1 ~ Hap6) were detected from the sequence analysis. All ornamental strains except Endrer's and populations collected in Singapore, Thailand and Venezuela had Hap1 which suggest the introduction sources of the haplotype from West Trinidad. Endrer's has Hap4 which suggest the introduction from East Venezuela and this haplotype was observed only in Endrer's in the present study. On the other hand, colonized populations collected from Okinawa Island have five types of haplotype, Hap1, Hap2, Hap3, Hap5 and Hap6. These haplotypes were originated from wide area of Northern South America. Hap2 was observed in North Guyana, Hap3 was observed in East Trinidad, Hap5 was observed in Suriname and East Guyana and Hap6 was observed in West Trinidad. Genetic variabilities in colonized populations of Okinawa Island were lower than that of original populations in South America. These results suggest that the origin of ornamental strain in Japan was originated from specific narrow area and small number of individuals, probably from West Trinidad. Meanwhile data of colonized populations in Okinawa Island suggested occurrence of multiple introduction or invasion from many origins from different area.

Key words: Guppy, Poecilia reticulata, mtDNA, D-loop, haplotype

要約グッピーは南米東北部原産の淡水魚で、観賞魚や蚊防除対策として世界各地で飼育あるいは放流されている。日本でも観賞魚として一般的である一方、沖縄や温泉地などで野生化した集団が総合対策外来種に指定されている。これらの日本におけるグッピーの導入起源や経路は不明である。そこで本研究では日本のグッピーの起源を連絡先：中嶋正道東北大学大学院農学研究科 mtDNA における D-loop 領域約 320bp の塩基配列を用仙台市青葉区荒巻字青葉 468-1 (e-mail: [email protected]) いて調べた。沖縄などで野生化しているグッピー 16 集 2020 年 1 月 7 日投稿団と観賞魚としてクローズドコロニーとして継代維持 2020 年 6 月12日受理

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されている 14 系統を分析の対象とした。また比較のため南米ベネスエラの野生集団と東南アジアで野生化した 2 集団（タイ、シンガポール）も分析した。その結果、6 ハプロタイプが得られ、このうち観賞魚系では Hap1 と Hap4 が観察され、Hap4 は Endrer's のみで観察された。Hap1 は西トリニダードで、Hap4 は東ベネズエラで報告されている。一方東南アジア野生化集団とベネズエラ集団でも Hap1 のみが観察されたのに対し、沖縄の野生化集団からは 5 種類のハプロタイプ（Hap1 ～ 3, 5, 6）が観察された。また、野生化集団における遺伝的変異性（ハプロタイプ数、ハプロタイプ多様度、塩基多様度）は起源となった南米各地での変異性よりも低かった。これらの結果から、日本における観賞魚系はトリニダード島のごく狭い範囲の少数個体、おそらくは西トリニダードを起源としている可能性が示された。また、沖縄の野生化集団の起源は南米各地を起源とする個体の複数回の導入が起源となっている可能性が示された。

キーワード：グッピー、ミトコンドリア DNA、D-loop、外来種、ハプロタイプ

緒言持つ導入である（Houde, 1997）。インドやオーストラグッピー（Poecilia reticulata）はカダヤシ目カダヤリアでは水路や井戸へのグッピーの導入により、ボウシ科グッピー属に分類される魚類で、南米北東部を原フラが駆除され、マラリア対策としての効果が挙げら産とする卵胎生の熱帯性淡水魚である。グッピーは、れている（Ghosh ら , 2005；Borthwick, 1923）。もう 1 2 ～ 4 ヵ月で成熟し、妊娠期間が約 1 ヵ月と世代交代つは、観賞用飼育個体の野外遺棄である（McKay, が早く、飼育が容易であり、観賞魚として高い人気が 1984）。この 2 つの経路がグッピーへ分布拡大につなある。また、雄は体色や模様、尾鰭の形が非常に多様がる導入の機会を与えている。また、グッピーは温度性に富み、主に雄の形質に関して選択された多くの系耐性（Kanda ら , 1991）、塩分耐性（鹿野と藤尾, 統が作出されている（岩松 , 1993）。 1994）といった高い環境適応性や、1 匹の雌が 60 匹観賞魚としてのグッピーの歴史は比較的浅い。1850 を超える仔魚を一度に産むなど高い繁殖能力（Deacon 年に南米トリニダード島に生息する小型の魚として報ら , 2011）を有しておりこれらの性質が分布拡大に影告されて以降、1920 年頃にはイギリスやアメリカ、響していると考えられている。ドイツなど一部の国で観賞魚として飼育されるように日本の沖縄地方の河川で野生化したグッピーが見らなったのが始まりとされている。その後 1960 年代後れるようになったのは 1970 年代の初め頃とされ（幸半までアメリカやドイツが中心となってグッピーの品地 , 1991）、主な導入経路は観賞用飼育個体の野外遺種改良が行われ、様々な系統が作出された。その後、棄と考えられている（石川ら , 2013）。 1973 年には、観賞用グッピーの市場の中心はシンガポールに移り、那覇市の天久や宜野湾市の伊佐など米軍基地周辺の溝シンガポールで養殖したグッピーが世界中に輸出されで見られる程度だったが、1979 年には中南部地域にている（岩崎 , 1997）。日本では 1930 年頃に観賞用と広くみられるようになった（幸地 , 1991）。そして、して輸入され、1960 年頃から一般的にも飼育される嶋津（ 2011）による沖縄県での外来種の分布調査では、ようになった（岩崎 , 1997）。このように、日本におグッピーは沖縄本島の 300 水系中 120 水系で確認され、ける観賞魚としてのグッピーの起源は南米トリニダー沖縄県の遊泳魚が分布する水系の 68% への侵入が明ド島と考えられるが遺伝的解析による起源の推定は行らかとなった。日本において、グッピーは越冬可能なわれていない。水温である沖縄県の河川や温泉地しか定着できないも一方、グッピーは外来種としても有名である。グッのの、定着可能な地域での広範な分布やその生態的影ピーの本来の生息域はベネズエラやガイアナ、スリナ響から、総合対策外来種に指定されている（環境省ム、トリニダード・トバゴを含む南米北東部とされて我が国の生態系等に被害を及ぼすおそれのある外来種いる（Rosen と Bailey, 1963）。しかし、人為的分散にリストより https://www.env.go.jp/press/files/jp/26594. より近年も生息域を拡大しており、自然生息域を除き pdf）。しかし、日本において定着した野生化グッピー最低でも 69 ヵ国における野外での定着が確認されての起源に関する研究は観賞魚の場合と同様行われていいる（Daecon ら , 2011）。グッピーの他地域への導入ない。経路は主に 2 通りに分けられる。1 つは、蚊の対策と一般的に、外来種の定着が生物多様性を脅かす脅威してグッピーを持ち込むという生物学的防除の意味をであることは広く知られている（Vitousek ら , 1997）。

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外来種がもたらす生物多様性への問題として捕食や競の異なる系統からの複数回の導入が明らかにされた合による他の在来生物の排除、近縁の在来種との交雑（Lindholm ら , 2005）。による遺伝的浸食、生息環境の破壊、病害の伝播があそこで本研究は、日本における観賞魚と野生化グッる（鷲谷と矢原 , 1996）。ブラックバス（青木ら, ピーの mtDNA の D-loop 領域（320bp）を用いて、日 2006）やブルーギル（河村ら , 2004）による食害など本に定着したグッピーの遺伝的起源の推定を目的としは日本でも見られ、非常に有名である。生態的な影響た。が大きいとされるブラックバスは分布調査のほか、遺伝学的な研究もおこなわれ、導入の起源や定着、分散材料と方法の過程について知見の蓄積が進んでいる（青木ら , 分析に用いたサンプル 2006；北川ら , 2005；高村 , 2005；Yokogawa, 1998）。グッ分析に用いたサンプルの情報を図１、表１に示す。ピーでは、分布調査（石川ら , 2013）による定着の現本研究では、観賞魚系統 14 系統 37 個体、海外野生化状についての知見は蓄積されているものの、遺伝学的集団 3 集団 42 個体、日本野生化集団 14 集団 277 個体な研究はほとんど行われていない。外来種の定着とそのサンプルを用いて、mtDNA の Dloop 領域 320bp のの後の影響の予防のためにも、予想される侵入経路を塩基配列を決定した。野生化集団は 2016 年に採集し事前に予測し、対策を取る必要がある。さらに、すでたサンプル（沖縄県内 7 か所）とそれ以前に採集し、に定着した生物についても、その導入の起源や定着過本研究室でクローズドコロニーとして飼育していたサ程を調査し、把握しておくことが未定着地域への侵入ンプル（沖縄県内 6 か所）を「日本野生化集団」、そ定着と定着地域への再導入防止のために重要であるれ以外を「海外野生化集団」とした。また、本研究室（高村 , 2005）。で継代飼育されているクローズドコロニーから、観賞グッピーは外来種として海外にも広く定着している魚系統としてD2、F、G、DY、BG、S、SC、S3、ため、原産地である南米北東部や導入された地域の集 S3HL、T、T1、Y2、Endrer's、Mozaic の 14 系統を用団に関する遺伝学的研究は多く報告されている。トリいた。これら 14 系統は全てペットショップから購入ニダードのグッピー集団の遺伝的集団構造に関して、した個体を起源とし、当研究室でクローズドコロニーアロザイム多型や mtDNA などの DNA 変異を用いたとして維持されている。S 系統は 1975 年に当研究室研究が行われている。これらの研究によると、トリニに導入されたスタンダードと呼ばれる野生型に近いとダードのグッピー集団は西部と東部の水系間で大きなされる系統、SC は 1983 年に S 系統の雌とキングコブ遺伝的分化が見られており、約 60 ～ 120 万年前に分ラの雄との交配個体を起源とする系統、S3 は 1983 年岐したと推定されている（Carvalho ら , 1991；Fajen とに S 系統から分離された系統、S3HL は 1990 年に S3 Breden, 1992）。また、他地域の集団を含む系統解析に系統から高温に強い個体を選抜し作成した系統であよると、ベネズエラ集団は西部トリニダード集団と系る。D2 系統は 1992 年にダイアモンド（D）として導統的に近縁であり、東部トリニダード集団とガイアナ入された個体の中から黄色素胞を有さない個体を選抜集団は単系統群をそれぞれ形成したという（Lindholm ら , 2005）。これらの結果は、グッピーは原産地であ Okuma R. る南米北東部において、いくつかの遺伝的に異なる集 Hanejioh R.

団が存在することを示している。また、オーストラリ Manna R. アでは 1910 年の生物学的防除を目的とした導入が最 Higashiyabe R. 初の導入とされ、以降複数回の導入報告がある（Vipan, Gabusoka R. 1910；Patrick 1987）。グッピーはオーストラリアにお Maeda R. いても観賞魚として有名なため、飼育個体の野外遺棄 Tengan R. による導入が行われた可能性があるという報告もある Ohyama （McKay, 1984）。こうした報告を受けて行われた Tokashiki mtDNA やマイクロサテライト DNA マーカーを用い Kochinda た遺伝的集団構造解析の結果、生物学的防除による導 Nishizaki Gushikami 入と飼育個体の野外遺棄による導入のそれぞれの遺伝 Fig. 1 的な証拠が示され、オーストラリアにおけるグッピー Fig.1 Sampled locations of wild guppy in Okinawa Island.

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Table 1 Fish specimen examined in this study. た。 Type Sampled Collected River Collected Year Examined DNA は各個体の尾鰭のサンプルより通常のフェ Region Number of individual ノール・クロロホルム法を用いて抽出した。抽出した Wild Okinawa Gabusoka(2016) 2016 24 DNA は 50µl の TE buffer（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA） Gabusoka(2011) 2011 8 に溶解し、－ 20℃で保存した。 Higashiyabe 2016 22 Hanejioh 2011 24 Okuma 2011 14 mtDNA（ D-loop 領域）の増幅と塩基配列の決定 Manna 2011 7 D-loop 領域の増幅用プライマーとして、L15926（ 5'- Maeda 2016 33 Tengan 2016 23 TCAAAGCTTACACCAGTCTTGTAAACC -3'; Kocher Ohyama 2016 24 ら , 1989）および H16498（ 5'- CCTGAACTAGGAACCA Nishizaki 2016 58 Kochinda 1999 23 GATG -3'; Shields と Kocher, 1991）を用いて PCR によ Gushikami 2016 34 り mtDNA の D-loop 領域を増幅した。PCR 反応液は、 Tokashiki 1999 22 1 サンプルにつき DW を 2.6µl、2 × Mighty Amp Buffer

Thailand Ayuthaya 2011 20 Ver.3（TaKaRa）を 5.0µl、各プライマー（10pmol）を 0.6µl Singapore Singapore 1999 3 ずつ、Mighty Amp® DNA Polymerase Ver.3（1.25U/µl Venezuera Venezuera 2002 20 Strain Origin Introduced Examined TaKaRa）を 0.2µl を加え、各鋳型 DNA サンプルを 1.0µl Year to our Number of 加えて総量 10µl の反応液とした。PCR 反応は 98℃ laboratory individual -10 秒、49℃ -20 秒、68℃ -30 秒を 1 サイクルとして Ornamental D2 Diamondo 1997 2 F Flamingo Red 1982 2 25 サイクル行った。 G Glass 1986 4 PCR によって増幅した遺伝子配列の塩基配列決定 S Standard 1975 2 SC Standard, Cobra 1982 3 は Cycle Sequence 法で行った。Cycle Sequence 反応液 S3 Standard 1983 3 の組成は、1 サンプルあたり DW 6.25µl、Big Dye 5 × S3HL Standard 1990 3 Sequencing Buffer v3.1 を 1.75µl、プライマー（10pmol/ T Taxido 1985 2 T1 Taxido 1985 2 µl） 0.5µl、Big Dye v3.1 Sequencing RT-100 0.5µl、精製 Y2 German Yellow 1996 2 後のPCR 産物1.0µl を加えて総量10µl の反応液とした。 DY German Yellow 2004 2 BG Blue Grass 2004 3 また、プライマーは L15926 を用いた。Cycle Sequence Mozaic Mozaic 2001 3 は、96℃ -10 秒、50℃ -5 秒、60℃ -2 分を 1 サイクル Endrer's Endre's 2004 4 として 25 サイクル行った。して作成した系統、F 系統は 1982 年に導入されたフ塩基配列の決定には 3500xl Genetic Analyzer（Applied ラミンゴレッドの系統、G 系統は 1987 年に導入され Biosystems）を使用した。たキングコブラ（当時はグラスと呼ばれていた）を起源とする系統、T は 1985 年に導入されたタキシードで、系統解析 T １は同年にタキシードから体色がゴールデンの個体塩基配列データを MEGA ver.6.06（Tamura ら , 2013）を分離して作成した系統。Y2 は 1996 年に、DY はに入力し、実装されている MUSCLE（Edgar, 2004）を 2004 年に導入されたそれぞれ異なるドイツイエロー用いて複合アライメントを行った。各集団で重複してを起源としている。BG は 2004 年に導入されたブルー見られたハプロタイプは 1 つのハプロタイプとして絞グラスを起源としている。Mozaic は 2001 年にシンガり、データセットに用いた。系統解析として本研究でポールから導入した系統。Endrer's は 2004 年に導入さ確認された 6 つのハプロタイプ、Genbank に登録されれた系統である。海外野生化集団としてシンガポール、ている 67 のハプロタイプ（表 2：Lindholm ら , 2005; アユタヤ、ベネズエラの 3 集団を用いた。海外野生化 Taylor と Breden, 2000; Alexander と Breden, 2004, 集団は現地の小川で繁殖していた個体を採集した。シ unpublished）、外群として Genbank に登録されているンガポールとアユタヤは現地の研究者に、ベネズエラ Poecilia parae（ Lindholm ら , 2005）の配列を加えた 74 は観賞魚の輸入業者（神畑養魚 ( 株 )）に採集を依頼の塩基配列（322bp）を用いて、近隣結合法に基づくした。それぞれの個体は採集後、DNA 抽出用に尾鰭系統樹（Saitou と Nei, 1987）を作成した。モデルはの一部を切り取り、99.5% エタノールに入れて保存し MEGA に実装されている Kimura 2- parameter model を

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Table 2 Sequence data of mtDNA D-loop region used for the comparison with the datas obtained in this study. Species Name Region Collected location Name of haplotype GenBankAccession No. Suriname Lelydorp LYD3 AF228605 North Guyana Patentia P2、P3 DQ097187‐88 Bartica BAR3 AF170257 East Guyana New Amsterdam NWA1、NWA2、NWA3 DQ102578、DQ102581、AF228609 Springlands SPL3、4 AF228608、DQ102560 West Venezuela Guanare River BTB2、BTB3、SUS3 AY135451、AF170255、AF228615 East Venezuela Isla de Margarita MAR3 AF228610 Rio San Miguel PV6-1B、PV8B、PV63B AF538280、AY135454、AY135465 AY373770、AY373767、AY373787、 Cumana WC60、WC77、WC78、CMARG69 AY373779 Yaguaracual YCUAL66、YCUAL67 AY373776、AY373777 GUAR45、GUAR104、YPARO72、 AY373765、AY373803、AY373782、 Paria Peninsula YPARO109 AY373808 Mira Flores/Arenas/Cumanocoa AREN81、AREN100、MF43 AY373792、AY373799、AY373764 West Trinidad Arima River ASA、ACR-9、ACR2 AF228623、AF170265、AY135450 Poecilia reticulata Aripo River APL182、RAP-3、RAP5 AY135470、AF170268、DQ102585 Guanapo River GUA6-1、GUA62、GUA63 AF170267、AY135449、AY135472 East Trinidad Turure River TCR-1、TCR2 AF327266、AY135469 Quare River QU6F-1、Quare 4、QMD9 AF170261、AF193897、AF529246 OCR-3、Oropuche 4、OVR5、 AF170259、AF193899、AF538279、 Oropuche River NOR3 AF529255 Aqui River AQI、AQUI6 AF170262、AF529248 Rio Grande RG5、RIOG1 AF170258、AF170269 North Trinidad Paria River Paria 4、JOR、PAU9710 AF193902、AF228624、AY135448 Marianne River MAU3、MAU4、MAU0050 AY135467、AY135456、AY135462 AF170263、AY135464、AF228625、 Yarra River LIM-2、LIM5、YAM、YAR2 AY135461 DQ097193、DQ097194、DQ097191、 Singapore GS、RT、TU、WT DQ097192 Australia AU1、AU2 DQ097189、DQ097190 Poecilia parae Poecilia parae DQ097186

選択した。各ノードについて、1000 回試行のブートと Lischer, 2010）を用いて、ハプロタイプ数（H）、ハストラップ値により評価した。作成した系統樹はプロタイプ多様度 Hd（Nei, 1973）、塩基多様度π（％） Figtree ver1.4.3（http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）（Nei と Tajima, 1981）をそれぞれ算出し、評価した。を用いて描写した。ハプロタイプ多様度はハプロタイプ頻度を反映し、塩基多様度はハプロタイプ頻度に遺伝的距離が反映されハプロタイプネットワークる。mtDNA D-loop 部分領域（320bp）を用いて、各集本研究で用いたサンプルで確認されたハプロタイプ団間における遺伝的分化の指標である pairwise Φ st 間の類縁関係を調べるため、TCS1.21（Clement ら , （Excoffier ら , 1992）を Arlequin ver.3.5.1.2 で算出し、 2000）に実装されている統計的最節約アルゴリズム遺伝的分化の程度を評価した。（Templeton ら , 1992）に基づいて、ハプロタイプネットワークを作成したネットワークを構築する際は、コ結果ネクションリミットを 50Step に固定し、塩基挿入 / 欠 1．検出されたハプロタイプ失を 5th state として扱った。決定した塩基配列データで複合アライメントを行った結果、全サンプル 356 個体からハプロタイプは 6 種遺伝的多様性と遺伝的分化の評価類検出され、それぞれ Hap1~6 とした。ハプロタイプ集団の遺伝的多様性は、Arlequin ver.3.5.1.2（Excoffier 間の塩基置換サイトは 19 サイトだった（表 3）。また、 Table 3 Observed haplotyps and its position of base substitution. Haplotype 33 36 37 44 52 109 133 157 158 205 209 210 278 283 286 287 301 302 308 Hap1 A A C G C G G G C G A G A A C T C A C Hap2 T ・ A ・・ A A ・・ A C T ・・・ G T ・ T Hap3 ・ T A A T A ・ A T A ・・ T ・ T G ・・ T Hap4 ・・ A ・・ A ・・・・・・Hap5 ・・ A ・・ A ・・・ A ・・・・・ G ・ G ・ Hap6 ・・ A ・・・・・・G ・・・・・

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Hap1、2、4、6 が既報のハプロタイプと一致し、プ名の右側にそれぞれの遺伝的起源とされる国名を示 Hap3、5 は既報のハプロタイプと一致せず、新規のハした。本研究で検出されたハプロタイプに注目すると、プロタイプだった。 Table 4 Detected haplotype and its observed number of individual in eacu collected location and strain. 2．各系統・集団内で検出されたハプロタイプ Population, Strain N Hap1 Hap2 Hap3 Hap4 Hap5 Hap6 各系統・集団内で検出されたハプロタイプとそのハ Gabusoka(2016) 24 24 Gabusoka(2011) 7 7 プロタイプを持つ個体数を表に示した。また、観賞 4 Higashiyabu 22 20 1 1 魚系統 14 系統について見てみると、全サンプル中エ Hanejioh 24 15 9 ンドラーズの系統のみ Hap4 であったが、それ以外の Okuma 14 14 Mannna 7 7 系統は全て Hap1 であった。海外野生化集団では、3 Maeda 30 30 集団全てが Hap1 であった。日本野生化集団は 5 つの Tengan 23 23 Ohyama 24 16 4 4 ハプロタイプ（Hap1、2、3、5、6）が確認された。 Nishizaki 58 58 Hap1 は Maeda、Nishizaki、Tokashiki で単型として見 Kochinda 3 2 1 られ、Gushikami、Higashiyabe、Ohyama、Hanejioh、 Gushikami 34 5 28 1 Tokashiki 4 4 Kochinda でも確認された。Hap2 は Gabusoka(2016)、 Ayuthaya 19 19 Gabusoka(2011)、Okuma で単型として見られ、 Singapore 20 20 Gushikami、Higashiyabe、Hanejioh、Kochinda でも確認 Venezuera 3 3 D2 2 2 された。Hap3 は Tengan、Manna で単型として見られ、 F 2 2 Gushikami、Higashiyabe でも確認された。Hap5、6 は G 4 4 DY 2 2 でのみ確認された。 Ohyama BG 3 3 S 2 2 3．mtDNA に基づくハプロタイプ間の系統類縁関係推 SC 3 3 S3 3 3 定 S3HL 3 3 本研究で検出されたハプロタイプの遺伝的起源を推 T 2 2 T1 2 2 定するために、GenBank の配列情報を加えて近隣結合 Y2 2 2 法に基づく系統樹を構築した（図 2）。各枝の上にブー Mozaic 3 3 トストラップ確率（2 桁の整数）を示す。ハプロタイ Endrer's 4 4

Hap4 CMARG69 East Venezuela WC78 61 Hap6 ACR2 63 RAP-3 RAP5 AU2 GUA62 Hap1 APL182 ACR-9 West Trinidad GUA63 GUA6-1 TCR2 TCR-1 TU WT 83 GS RT PV8B 67 MAU4 MAU3 WC60 MAU0050 MAR3 ASA Paria4 North Trinidad JOR PAU9710 YAR2 LIM5 73 LIM-2 YAM BTB3 SUS3 65 GUAR104 YPAR0109 East, West BTB2 YPARO72 Venezuela PV6-1B 65 PV63B Hap5 LYD3 NWA1 Suriname 55 NWA2 57 NWA3 SPL4 East Guyana SPL3 58 WC77 AREN81 68 MF43 AREN100 East Venezuela YCUAL66 YCUAL67 74 GUAR45 Hap3 67 Oropuche4 NOR3 0.02 RIOG1 RG5 94 QMD9 OVR5 51 QU6F-1 East Trinidad Quare4 65 OCR-3 AQI AQUI6 BAR3 94 Hap2 59 P2 North Guyana P3 AU1 Poecilia_parae Fig.2

Fig.2 Genetic relationship among haplotypes observed in this study and registered sequences in data base.

The Journal of Animal Genetics (2021) 49, 1–11 6 日本におけるグッピーの起源

観賞魚系統、海外野生化集団が含まれた Hap1 は West の Hap1 から 2 塩基置換で Hap4、6 が派生している。 Trinidad で見つかったハプロタイプに近い関係を示しさらに Hap4 から 3 塩基置換で Hap5 が派生し、8 塩基た。次に、日本野生化集団で多く見られた Hap2 は、置換で Hap2 が、9 塩基置換で Hap3 が派生しているこ North Guyana で見つかったハプロタイプのクレードにとがわかった。Hap2、3、5、6 は観賞魚系統で確認さ含まれた。Hap3 は East Trinidad で見つかったハプロれず、日本野生化集団でのみ確認された。タイプに近い関係を示した。観賞魚系統のエンドラーズだけで見つかった Hap4 は East Venezuela で見つかっ 5．mtDNA に基づく各集団の遺伝的多様性たハプロタイプに近い関係を示した。日本野生化集団 mtDNA の Dloop 領域（320bp）に基づく、各集団のの Ohyama だけで見つかった Hap5、6 はそれぞれ遺伝的多様性の指標となるハプロタイプ多様度 Hd、 Suriname・East Guyana と West Trinidad で見つかるハプ塩基多様度π（％）を日本野生化集団の集団毎に算出ロタイプに近い関係を示した。Hap1、Hap3、Hap4 でした（表 5）。集団中で 3 つのハプロタイプが検出さはブートストラップ値による支持は得られなかった。れたGushikami 集団ではHd=0.308、π=1.000、これは今回調べた D-loop 部分領域が 320bp と短かっ Higashiyabe 集団では Hd=0.178、π =0.612、Ohyama 集たことに起因すると考えられる。正確性を高めるため団では Hd=0.522、π =0.598 だった。集団中で 2 つのにはより長い領域を用いた分析を行う必要がある。ハプロタイプが検出されたHanejioh 集団では Hd=0.489、π=1.529、Kochinda 集団ではHd=0.667、 4．mtDNA に基づくハプロタイプ間の類縁関係推定 π =2.083 だった。それ以外の集団は単型だった。

mtDNA の Dloop 領域（320bp）に基づき、本研究で Table 5 Estimated genetic diversity obtained from the 検出されたハプロタイプについて統計的最節約法によ variations observed in mtDNA D-loop region. Sampled Observed No. of Haplotype Nucleotide るハプロタイプネットワークを構築した（図 3）。 N location Haplotype diversity diversity π (％ ) Hap1 が最も多くの系統・集団で共有されている。そ Gabusoka (2016) 24 1 0.000 0.000 Gabusoka (2011) 7 1 0.000 0.000 Higashiyabe 22 3 0.178 0.612 Hap4 Hanejioh 24 2 0.489 1.529 Okuma 14 1 0.000 0.000 Manna 7 1 0.000 0.000 Maeda 30 1 0.000 0.000 8 Hap1 Hap6 Hap5 Tengan 23 1 0.000 0.000 Ohyama 24 3 0.522 0.598 Hap3 Nishizaki 58 1 0.000 0.000 Kochinda 3 2 0.667 2.083 Gushikami 34 3 0.308 1.000 Tokashiki 4 1 0.000 0.000 6．mtDNA に基づく集団間の遺伝的分化 Hap2 D-loop 領域（320bp）の塩基配列に基づき、日本野

Fig. 3 生化集団間の遺伝的分化の指標 pairwise φ ST を算出 Fig.3 Relationship among 6 haplotypes observed in this study. した（表 6）。 φ ST 値は 0.086 ～ 1.000 の範囲をとった。 Table 6 Estimated genetic diﬀerences ( φ ST) among sampled locations. Gabusoka Gabusoka Higashiyabe Hanejioh Okuma Manna Maeda Tengan Ohyama Nishizaki Kochinda Gushikami Tokashiki (2016) (2011) Gabusoka (2016) ― *** *** *** *** *** *** *** *** * *** Gabusoka (2011) 0.000 ― *** ** *** *** *** *** *** ** Higashiyabe 0.903 0.849 ― *** *** *** *** * *** Hanejioh 0.609 0.478 0.188 ― *** *** *** *** *** *** *** Okuma 0.000 0.000 0.877 0.544 ― *** *** *** *** *** * *** Manna 1.000 1.000 0.872 0.706 1.000 ― *** *** *** *** *** ** Maeda 1.000 1.000 0.039 0.380 1.000 1.000 ― *** *** *** Tengan 1.000 1.000 0.916 0.793 1.000 0.000 1.000 ― *** *** *** Ohyama 0.899 0.848 0.040 0.207 0.874 0.873 0.205 0.915 ― *** *** Nishizaki 1.000 1.000 0.086 0.493 1.000 1.000 0.000 1.000 0.298 ― Kochinda 0.891 0.708 0.104 -0.225 0.828 0.849 0.706 0.946 0.141 0.826 ― *** Gushikami 0.097 0.013 0.682 0.341 0.063 0.784 0.804 0.839 0.683 0.854 0.363 ― *** Tokashiki 1.000 1.000 -0.122 0.152 1.000 1.000 0.000 1.000 1.000 0.000 0.111 0.693 ― ***：p<0.001, **：p<0.01, *：p<0.05

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個体数が少ない（N ≦ 4）集団のφ ST 値の多くは統に由来するハプロタイプ CMARG69 と WC78 は先行計的に有意ではない（p ＞ 0.05）場合が多かった。また、研究（Alexander と Breden, 2004）において P. wingei と各集団中で検出されるハプロタイプ数が少ない（H ≦ され別種とされている。本研究の結果では系統解析に 3）ため、集団内で確認されるハプロタイプが異なるおいて他の East Venezuela 起源のハプロタイプと近いと高い遺伝的分化を示す傾向にあった。関係を示した。P. wingei が別種となるかどうかに関してはさらに長い領域の比較や核 DNA を用いた解析が考察必要と考えられる。観賞魚系統のグッピーの遺伝的起源観賞魚系統 14 系統からは Hap1 と 4 が確認され、 2．海外野生化集団の遺伝的起源エンドラーズのみで Hap4 が観察された。系統解析で海外野生化集団は 3 集団全個体が Hap1 を示し、系は、Hap1 は West Trinidad と、Hap4 は East Venezuela 統解析では West Trinidad と遺伝的に近縁であることがと遺伝的に近縁であることが明らかになった。明らかになった。タイ、シンガポールはグッピーの本観賞魚系統は全て単一のハプロタイプを示し、異な来の生息地ではなく、蚊の生物学的防除などの理由でるハプロタイプの混成は見られなかった。理由として、グッピーの導入報告がある地域である（Deacon ら , 起源がごく限られた地域であったこと、おそらくは 2011; FAO, 2017; Herre, 1940）。アユタヤ、WS は集団グッピーの発見時に West Trinidad から持ち帰られた個内で単一のハプロタイプ（Hap1）しか検出されず、体が観賞魚としてのグッピーの起源となったためと考遺伝的起源は観賞魚と同様に West Trinidad であると考えられる。グッピーの本来の生息域はベネズエラやトえられる。導入の経緯などを考慮すると、東南アジアリニダード・トバゴを含む南米北東部である（Rosen に導入されたグッピーはグッピー飼育が一般的になっと Bailey, 1963）。観賞魚系統のグッピーは 1960 年代た初期の観賞魚起源の個体が用いられたと考えられ後半までアメリカやドイツを中心に生産されていたる。一方、Venezuela の野生化個体は他の地域の野生が、1970 年代以降はシンガポールに生産の中心が移っ化個体と同様に Hap1 であった。Venezuela をはじめとた。アメリカやドイツで作られた系統が元となりシンする原産地域では観賞魚由来の野良グッピーが問題とガポールにおいて生産されるようになった。そして、なっている。分析に用いた Venezuela が野良グッピーシンガポールが観賞魚系統のグッピーの世界的な産地であり、Venezuela においても観賞魚由来の野良グッとなり、日本を含む世界中にシンガポールで養殖したピーが蔓延していることを示している。グッピーを輸出している（Cheong, 1996）ことから単一起源のグッピーが観賞魚として世界中に広まったも 3．日本野生化集団の遺伝的起源のと考えられる。観賞魚系統のグッピーには様々な色日本野生化集団は 14 集団で Hap1、2、3、5、6 の 5 彩・体型・体模様の系統が存在する。このような特定つのハプロタイプが確認された。系統解析では、の形質を有する系統の作出には、選抜による遺伝的改 Hap1、6 は West Trinidad、Hap2 は North Guyana、Hap3 良が必要となる。特定の形質を有する少数の親魚を繰は East Trinidad、Hap5 は Suriname・East Guyana と遺り返し行うことにより特定の形質をそろえていくこと伝的に近縁であることが明らかになった。になる。グッピーの系統作成の過程でも同様の過程を日本における野生化グッピーの導入歴は 1960 年代経ているものと考えられ、そのために、系統内が単一に観賞用魚の野外遺棄とされており（石川ら , 2013）、のハプロタイプとなったと考えられる。その後、沖縄地方の河川や日本各地の温泉地などで野 Endrer’s は元々 Venezuela の一部地域にのみ生息して生化したグッピーがみられるようになった（山岸ら , おり、他地域の野生型グッピーと比較して、体の模様 1962）。しかし、日本野生化集団では複数のハプロタや体型など形態的特徴のほか、部分的な生殖的隔離がイプが確認され、14 集団中 5 集団でハプロタイプの認められていることから、Poecilia wingei と呼ばれ、混成が見られた。今回確認されたハプロタイプのうち、グッピーの亜種とされた（Poester ら , 2005）。 mtDNA Hap1、2、4、6 は既報のハプロタイプと一致したが、の cytochrome b 領域（953bp）を用いた North-eastern Hap3、5 は未報告のハプロタイプであった。一般的に、 Venezuela 集団の解析では、P. wingei を含む集団は同魚類のmtDNA の塩基置換率はおよそ100 万年にじ水系内の集団との遺伝的差異が認められたという 1~2% とされている（Near ら , 2003）ことから、導入（Herdegen ら , 2014）。系統解析に用いた East Venezuela 以前から元々遺伝的に異なっていた可能性が考えられ

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る。また、いくつかの集団で見られたハプロタイプのる際に生じたボトルネックと創始者効果によって、定混成は、集団への複数回の導入が行われたためと考え着の際にハプロタイプが減少したことが挙げられる。られる。導入によるハプロタイプの減少は、オーストラリアの系統解析により、各ハプロタイプの遺伝的起源を調グッピー導入集団でも確認されている（Lindholm ら , べてみると、観賞魚系統でも見られた Hap1 は West 2005）。また、ヨーロッパのカダヤシ（Gambusia Trinidad を遺伝的起源としたグループに含まれ、Hap2 holbrokki）導入集団（Vidal ら , 2010）やアメリカのコは North Guyana のグループに含まれた。Hap2 と同クイ科魚類Sacramento pikeminnow（Ptychocheilus レード内の AU1 は、オーストラリアで確認されたハ grandis）導入集団（Kinziger ら , 2014）でも同様の現プロタイプである。オーストラリア導入集団を対象に象が確認されるなど、多くの外来種で導入時のボトル mtDNA を用いて遺伝的起源を調査した先行研究で、ネックと創始者効果によるハプロタイプの減少が知ら AU1 は North Guyana を遺伝的起源とすることが明られている。πが高い値を示した理由として、ハプロタかにされ、これは、蚊の生物的防除を目的としたイプの遺伝的起源の違いが関係している。πはハプロ North Guyana からオーストラリアへの導入の報告と一タイプ頻度に遺伝的距離が反映されて算出されるが、致していた（Lindholm ら , 2005）。ほかにも、日本野本研究の日本野生化集団で見られた各ハプロタイプは生化集団でのみ確認されたHap3 は East Trinidad、遺伝的起源が異なる地域に由来することが示された。 Hap5 は Suriname・East Guyana、Hap6 は West Trinidad 同一地域内で確認されたハプロタイプで算出した先行のグループと近い関係を示した。研究（Alexander ら , 2006）に対し、異なる地域に由来公式の記録では沖縄県で蚊の生物的防除を目的としするハプロタイプを含む日本野生化集団のほうが、遺たグッピーの導入は行われていない。そのため、グッ伝的距離は高くなるため、日本野生化集団のほうが高ピーの導入経路は観賞用飼育個体の野外遺棄が主と考い値を示したと考えられる。えられていたが（石川ら , 2013）、本研究により、観中城湾における流れ藻の魚類相調査でグッピーが採賞魚以外の系統が、経緯は不明であるが、複数回の導集されており、台風や大雨で一時的に海に流された後、入が行われたことが明らかとなった。しかし、今回の周辺河川への遡上による分布域を拡大している可能性分析ではブートストラップ値から支持されない分岐がが指摘されている（立原ら , 2002）。今後、遺伝子流いくつか見られている。これは今回分析に用いた領域動が人為的なものか、自然によるものなのかを明らかが 320bp と短かったことによると考えられる。正確性にするため、水系内集団や河口の近い河川集団のサンを高めるためには今後より長い領域や他の領域を含めプルを増やすことやマイクロサテライトなどの両性遺た解析を行う必要がある。伝マーカーを用いることが、より詳細な遺伝的構造の把握が必要になると考えられる。 4．mtDNA の Dloop 領域に基づく遺伝的多様性 mtDNA の Dloop 領域の各集団における遺伝的多様謝辞性の指標は、ハプロタイプが3 つ確認できた実験の期間中、グッピーの維持管理に尽力していた Gushikami、Higashiyabe、Ooyama は Hd（ハプロタイだいた中嶋登代子技官に厚く感謝の意を表します。まプ多様度）が 0.178 ～ 0.522、π（塩基多様度）が 0.598 た、沖縄県でのサンプル採集に関して助言いただいた～ 1.000% となった。ハプロタイプが 2 つ確認できた琉球大学理学部海洋自然科学科の立原一憲准教授、ア Hanejioh、Kochinda は Hd が 0.489 ～ 0.667、πは 1.529 ユタヤ ( タイ ) のサンプルを提供いただいたラジャマ～ 2.083% となった。残りの集団は単型で、遺伝的多ンガラ工科大学アユタヤ校の T. Ngamsiri 博士、シン様性は Hd、πともに 0 だった。ガポールのサンプルを提供いただいたシンガポールポベネズエラやトリニダードを含む南米野生集団でのリテクニックの A. F. Yuen 博士に厚く御礼申し上げま mtDNA の Dloop 領域の遺伝的多様性は Hd が 0.783 ～す。 0.986、πが0.003 ～ 0.015 である（Alexander ら , 2006）。南米野生集団と日本野生化集団の遺伝的多様引用文献性を比較すると、日本野生化集団は Hd が低い値を示 Alexander HJ, Breden F. 2004. Sexual isolation and extreme したのに対し、πは非常に高い値を示した。Hd が低 morphological divergence in the Cumana guppy: a い値を示した理由として、日本へグッピーが導入され possible case of incipient speciation. Journal of

The Journal of Animal Genetics (2021) 49, 1–11 9 佐藤ら

evolutionary biology, 17: 1238-1254. Ghosh SK, Tiwari SN, SatHigashiyabeanarayan TS, Alexander HJ, Taylor JS, Wu SST, Breden F. 2006. Parallel Sampath TRR, Sharma VP, Nanda N, Subbarao SK. evolution and vicariance in the guppy (Poecilia 2005. Larvivorous fish in wells target the malaria vector reticulata) over multiple spatial and temporal scales. sibling species of the Anopheles culicifacies complex in Evolution, 60: 2352-2369. villages in Karnataka, India. 青木大輔 , 中山祐一郎 , 林正人 , 岩崎魚成 . 2006. 琵琶 Transactions of the ROhyamaal Society of Tropical 湖におけるオオクチバスフロリダ半島産亜種 Medicine and Higashiyabegiene, 99: 101-105. (Micropterus salmoides floridanus) のミトコンドリア Herdegen M, Alexander HJ, Babik W, Mavárez J, Breden F, DNA 調節領域の多様性と導入起源 . 保全生態学研 Radwan J. 2014. Population structure of guppies in 究 , 11, 53-60. north-eastern Venezuela, the area of putative incipient Borthwick T. 1923. An Anti-mosquito campaign in Adelaide. speciation. BMC evolutionary biology, 14: 28. Health, 1: 259-265. Herre AWCT. 1940. Additions to the fish fauna of Malaya Carvalho GR, Shaw PW, Magurran AE, Seghers BH. 1991. and notes on rare or little known Malayan and Bornean Marked genetic divergence revealed by allozymes fishes. Bulletin of the Raffles Museum, 16: 27-61. among populations of the guppy Poecilia reticulata Houde AE. 1997. Sex, color, and mate choice in guppies. (Poeciliidae), in Trinidad. Biological Journal of the Princeton University Press. Princeton Linnean ociety, 42: 389-405. 石川哲郎 , 高田未来美 , 徳永圭史 , 立原一憲 . 2013. 沖 Cheong L. 1996. Overview of the current international trade 縄島に導入された外来純淡水魚類の定着状況およ in ornamental fish, with special reference to Singapore. び分布パターン . 保全生態学研究 , 8, 5-18. Revue scientifique et technique (International Office of 岩崎登 . 1997. ブリーディング・テクニックグッピー Epizootics), 15: 445-481. 専科 , マリン企画 , 東京 . Clement M, Posada DCKA, Crandall KA. 2000. TCS: a 岩松鷹司 . 1993. メダカ学 , サイエンティスト社 , 東京 . computer program to estimate gene genealogies. Kanda N, Nakajima M, FujiOhyama. 1991. Strain Molecular ecology, 9: 1657-1659. differences at thermal resistance in the guppy, Poecilia Deacon AE, Ramnarine IW, Magurran AE. 2011. How reticulata. Tohoku journal of agricultural research, 42: reproductive ecology contributes to the spread of a 25-31. globally invasive fish. PLoS One, 6, e24416. 河村功一 , 米倉竜次 , & 石川正樹 . 2004. ミトコンドリ Edgar RC. 2004. MUSCLE: multiple sequence alignment ア DNA の制限酵素切断多型から見た日本・韓国 with high accuracy and high throughput. Nucleic acids 産ブルーギルの遺伝的特徴 . 水産育種 , 33: 93-100. research, 32: 1792-1797. Kinziger, A. P, Nakamoto RJ, Harvey BC. 2014. Local-scale Excoffier L, Lischer HE. 2010. Arlequin suite ver 3.5: a new invasion pathways and small founder numbers in series of programs to perform population genetics introduced Sacramento pikeminnow (Ptychocheilus analyses under Linux and Windows. Molecular ecology grandis). Conservation genetics, 15: 1-9. resources, 10: 564-567. 北川えみ , 北川忠生 , 能宗斉正 , 吉谷圭介 , 細谷和海 . Excoffier, L., Smouse, P. E., & Quattro, J. M. (1992). 2005. オオクチバスフロリダ半島産亜種由来遺伝 Analysis of molecular variance inferred from metric 子の池原貯水池における増加と他湖沼への拡 distances among DNA haplotypes: application to human 散 . 日本水産学会誌 , 71: 146-150. mitochondrial DNA restriction data. Genetics, 131(2), Kocher TD, Thomas WK, Meyer A, Edwards SV, Pääbo S, 479-491. Villablanca FX, Wilson AC. 1989. Dynamics of Fajen A, Breden F. 1992. Mitochondrial DNA sequence mitochondrial DNA evolution in animals: amplification variation among natural populations of the Trinidad and sequencing with conserved primers. Proceedings of guppy, Poecilia reticulata. Evolution, 46: 1457-1465. the National Academy of Sciences, 86: 6196-6200. FAO(2017) DIAS － Database on Introductions of Aquatic 幸地良仁 . 1991. トーイユからリュウキュウアユまで Species とっておきの話 . 沖縄の川魚 . 沖縄出版 . 那覇 http://www.fao.org/fishery/dias/en Lindholm AK, Breden F, Alexander HJ, Chan WK, Thakurta

The Journal of Animal Genetics (2021) 49, 1–11 10 日本におけるグッピーの起源

SG, Brooks R. 2005. Invasion success and genetic 高村健二 . 2005. 日本産ブラックバスにおけるミトコ diversity of introduced populations of guppies Poecilia ンドリア DNA ハプロタイプの分布 . 魚類学雑誌 , reticulata in Australia. Molecular Ecology, 14: 3671- 52: 107-114. 3682. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. McKay RJ. 1984. Introductions of exotic fishes in Australia. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics Distribution, biology, and management of exotic fishes. analysis version 6.0. Molecular biology and evolution, Johns Hopkins University Press, Baltimore, Maryland, 30: 2725-2729. pp. 177-199. Taylor JS, Breden F. 2000. Slipped-strand mispairing at Near TJ, Kassler TW, Koppelman JB, Dillman CB, Philipp noncontiguous repeats in Poecilia reticulata: a model DP. 2003. Speciation in North American black basses, for minisatellite birth. Genetics, 155: 1313-1320. Micropterus (Actinopterygii: Centrarchidae). Evolution, Templeton AR, Crandall KA, Sing CF. 1992. A cladistic 57: 1610-1621. analysis of phenotypic associations with haplotypes Nei M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided inferred from restriction endonuclease mapping and populations. Proceedings of the National Academy of DNA sequence data. III. Cladogram estimation. Sciences, 70: 3321-3323. Genetics, 132: 619-633. Nei M, Tajima F. 1981. DNA polymorphism detectable by Vidal O, García-Berthou E, Tedesco PA, García-Marín JL. restriction endonucleases. Genetics, 97: 145-163. 2010. Origin and genetic diversity of mosquitofish Patrick R. 1987. A history of health & medicine in (Gambusia holbrooki) introduced to Europe. Biological Queensland, 1824-1960. University of Queensland Invasions, 12: 841-851. Press. Brisbane. Queensland. Vipan JAM. 1910. Malaria and the‘ millions’ fish Poeser FN, Kempkes M, Isbrücker IJ. 2005. Description of (Girardinus poeciloides). In Proceedings of the Poecilia (Acanthophacelus) wingei n. sp. from the Paría Zoological Society of London, 146-147. Peninsula, Venezuela, including notes on Vitousek PMAEDA'antonio CM, Loope LL, Rejmanek M, Acanthophacelus Eigenmann, 1907 and other subgenera Westbrooks R. 1997. Introduced species: a significant of Poecilia Bloch and Schneider, 1801 (Teleostei, component of human-caused global change. New Cyprinodontiformes, Poeciliidae). Contributions to Zealand Journal of Ecology, 21: 1-16. Zoology, 74: 97-115. 山岸宏 , 中村譲 , 和田芳武 , 沖野外輝夫 , 中本信忠 , 落 Rosen DE, Bailey RM. 1963. The poeciliid fishes 合照雄 . 1962. 上山田・戸倉温泉地域に棲息する (Cyprinidontiformes), their structure, グッピーについて . 衛生動物 , 17: 48-58. zoogeograpHigashiyabe and systematics. Bull. Am. Yokogawa K. 1998. Morphological variabilities and genetic Mus. Nat. Hist. N.Y. 126: 1-176. structures of largemouth bass Micropterus salmoides in Saitou N, Nei M. 1987. The neighbor-joining method: a new Japanese fresh waters. Aquaculture Science, 46: 321- method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular 332. biology and evolution, 4: 406-425. 鷲谷いずみ , 矢原徹一 . 1996. 保全生態学入門－遺伝子 Shields GF, Kocher TD. 1991. Phylogenetic relationships of から景観まで－ , 文一総合出版 . 東京 North American ursids based on analysis of mitochondrial DNA. Evolution, 45: 218-221. 鹿野隆人 , 藤尾芳久 . 1994. グッピーにおける塩分耐性の系統差について . 水産育種 . 20: 47-53. 嶋津信彦 . 2011. 2010 年夏沖縄島 300 水系における外来水生生物と在来魚の分布記録 . 保全生態学研究 , 16: 99-110. 立原一憲 , 徳永桂史 , 地村佳純 . 2002 沖縄県の外来魚類 .（日本生態学会編）外来種ハンドブック . pp248 － 249. 地人書館 , 東京 .

The Journal of Animal Genetics (2021) 49, 1–11 11