Giedrė Kontrimavičienė KRIAUŠIŲ (PYRUS COMMUNIS L

LIETUVOS ŢEMĖS ŪKIO UNIVERSITETAS

AGRONOMIJOS FAKULTETAS

Sodininkystės ir darţininkystės katedra

Giedrė Kontrimavičienė

KRIAUŠIŲ (PYRUS COMMUNIS L.) RIZOGENEZĖS TYRIMAI IN VITRO

Magistro baigiamasis darbas

Studijų sritis: Biomedicinos mokslai

Studijų kryptis: Agronomija

Studijų programa: Sodininkystė ir darţininkystė

LŢŪU, 2011 Magistro baigiamojo darbo valstybinė kvalifikacinė komisija: (Patvirtinta Rektoriaus įsakymu Nr. 98-KS)

Pirmininkas: Prof. habil. dr. Vidmantas Stanys LAMMC SDI Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyrius.

Nariai: Doc. dr. Viktoras Pranskietis LŢŪU Sodininkystės ir darţininkystės katedra.

Prof. habil. dr. Algirdas Motuzas LŢŪU Dirvotyros ir agronomijos katedra.

Doc. dr. Laimutė Štuopytė LŢŪU Sodininkystės ir darţininkystės katedra.

Doc. dr. Audronė Ţiebrauskienė LŢŪU Sodininkystės ir darţininkystės katedra.

Vadovas: Prof. habil. dr. Vidmantas Stanys LAMMC SDI Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyrius.

Konsultantas: Dr. Dalia Gelvonauskienė LAMMC SDI Sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyrius.

Recenzentas: Doc. dr. Laimutė Štuopytė LŢŪU Sodininkystės ir darţininkystės katedra.

Oponentas: Doc. Dr. Sonata Kazlauskaitė LŢŪU Biologijos ir augalų apsaugos katedra.

2 LIETUVOS ŢEMĖS ŪKIO UNIVERSITETAS

Agronomijos fakultetas Reg. Nr. 729 SD (pildo dekanatas) Sodininkystė ir darţininkystė (specialybė)

...... (specializacija)

...... (katedra) Magistro darbo uţduotį tvirtinu

...... (katedros vedėjo parašas)

2011m...... mėn...... d.

MAGISTRO DARBO UŢDUOTIS

Giedrė Kontrimavičienė prof. habil. dr. Vidmantas Stanys

Kriaušių (Pyrus communis) rizogenezės tyrimai in vitro

Dr. Dalia Gelvonauskienė

Darbų atlikimo kalendorius

Darbo pavadinimas Atlikimo terminas 1. Literatūros šaltinių rinkimas 2009 - 2011 2. Bandymų vykdymas 2009 - 2011 3. Analizių atlikimas 2009 - 2011 4. Magistro tezių parengimas 2011

...... (Magistranto parašas) (Darbo vadovo parašas)

...... (Konsultanto parašas)

Katedros išvada apie leidimą ginti darbą ...... Protokolo Nr...... Data...... (Katedros vedėjo parašas)

3 SANTRAUKA

2009 – 2011m. LAMMC Sodininkystės ir darţininkystės institute tirta kriaušių (P. communis) rizogenezė in vitro. Kriaušėms įšaknydinti in vitro sąlygomis buvo naudoti eksplantai – mikroūgliai. Kriaušės (P. communis) veislėms įšaknydinti in vitro gerausiai naudoti intensyviai augančius 1,5 cm dydţio ekslantus - mikroūglius, paimtus iš 4 savaičių amţiaus kultūros. Prieš sodinant į šaknydinimo terpę MS ½ + 20 gr/l sacharozės, tikslinga kriaušių eksplantus -mikroūglius 24 valandas pamirkyti 5 mg/l ISR tirpale. Tai paspartina kriaušių rizogenezės pradţią, padidina įsišaknijusių genotipų bei ekslplantų kiekį. Auksinai ISR, NAR ir IAR (koncentracijos po 0,5 mg/l) skatina kriaušių šaknijimąsi. Fitohormonas ISR didina įsišaknijusių genotipų kiekį. Tuo tarpu IAR didina įsišaknijusių mikroūglių ir susiformavusių šaknų kiekį, o ISR + IAR kompleksas – šaknų ilgį. Skirtingų kriaušių veislių šaknijimosi dinamika in vitro nevienoda. Dauguma tirtų veislių pasiţymi dideliu adaptyvumu, t.y sugebėjimu skirtingomis sąlygomis formuoti šaknis, tačiau daliai veislių įšaknydinti in vitro reikalingos specifinės sąlygos. In vitro sąlygomis šaknydinamas kriaušių veisles tikslinga kultivuoti ne trumpiau kaip 5 mėnesius. In vitro įšaknydintų kriaušių augalų prigijimas in vivo (durpių substrate) 44,5–74,0 %. Prigijusių augalų kiekis priklauso nuo kaliaus, susiformavusio ant eksplantų, dydţio. Reikšmingi ţodţiai: augimo reguliatoriai, genotipas, Pyrus communis , rizogenezė.

4 SUMMARY

Aim of the research – to investigate the process of pear (Pyrus communis L.) rhizogenesis in vitro. The process of pear (Pyrus communis) rhizogenesis in vitro was investigated in the period from 2009 to 2011 at the LAMMC Institute of Horticulture. Explants –microshoots were used for pear rooting under in vitro conditions. The research suggests that the use of actively growing 1,5 cm. explant– microshoots, which are taken from the 4 week cultivar for the rooting of pear (P. communis) cultivars in vitro conditions is the most beneficial. Moreover, before planting into the MS ½ + 20 gr/l sucrose rooting medium, it is appropriate to soak the pear explant–microshoots in the solution of 5 mg/l ISR for 24 hours as it accelerates the beginning of the pear rhizogenesis and increases the number of explants and rooted genotypes. According to the study results, the growth regulators IBA, NAA, IAA (concentration 0,5 mg/l) promote rooting of pears. The growth regulator IBA increases the number of rooted genotypes. The growth regulator NAA increases the number of rooted microshoots and formed roots whereas the complex of IBA and NAA increases the length of root. The dynamics of different pear cultivars in vitro is not the same. The bigger part of the investigated pear cultivars revealed to have quite big adaptability, this means they were able to form roots under different conditions, but the other part of the studied cultivars was forming roots (germs) in vitro only under some specific conditions. It is appropriate to cultivate pear plants rooted in vitro conditions not less than five months. The engraftment of in vitro rooted pear plants in vivo (in peat substrate) is 44,5 – 74 percent. The amount of the rooted plants depends on the callus size formed on the explants.

Key words: growth regulators, genotype, Pyrus communis, rhizogenesis.

5 TURINYS

TERMINŲ ŢODYNĖLIS ...... 6 1. NAGRINĖJAMOS PROBLEMOS APŢVALGA ...... 10 1.1 . Kriaušės istorija, gentinė sudėtis ...... 10 1.2. Kriaušių ūkinė reikšmė ir jų paplitimą sąlygojantys veiksniai ...... 10 1.3. Kriaušės genetiniai ištekliai ir jų reikšmė ...... 12 1.4. Augalų ex vitro atstatymo in vivo metodai ...... 13 1.4.1. Mikroskiepijimas ...... 13 1.4.2. Augalų rizogenezė in vitro ...... 13 1.4.2.1. Augalų fiziologinės būsenos įtaka augalų rizogenezei ...... 14 1.4.3. Eksplantų įtaka augalų rizogenezei in vitro ...... 14 1.4.4 Aplinkos faktorių įtaka augalų rizogenezei in vitro ...... 15 1.4.5. Terpių ir jų sudėties įtaka augalų rizogenezei in vitro ...... 15 1.4.6. Augimo reguliatorių ir jų derinių įtaka augalų rizogenezei in vitro ...... 16 1.5. Genotipo įtaka augalų rizogenezei in vitro ...... 18 2. SĄLYGOS IR METODAI ...... 20 3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS ...... 21 3.1. Fiziologinės būsenos įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro ...... 21 3.2. Makro druskų kiekio MS terpėje įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro ...... 24 3.3 Sacharozės kiekio MS ½ terpėje įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro ...... 25 3.4. Mikroūglių mirkymo skirtingos koncentracijos ISR tirpaluose įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro .. 27 3.5. Augimo reguliatorių ISR, IAR ir NAR įtaka kriaušių mikroūglių rizogenezei in vitro ...... 30 3.6 Kriaušių šaknijimosi dinamika ir veislių adaptyvumas in vitro...... 34 3.7. In vitro įšaknydintų kriaušių augalų prigyjimo daţnumas in vivo sąlygomis ...... 35 IŠVADOS ...... 36 PADĖKA ...... 37 LITERATŪROS SĄRAŠAS...... 38 PRIEDAI ...... 42

6 TERMINŲ ŢODYNĖLIS

BAP – 6-benzylaminopurinas IAR – -indolilacto rūgštis ISR – indolilsviesto rūgštis MS – Murashige ir Skoog maitinamoji terpė MS ½ – Murashige ir Skoog maitinamoji terpė su per pus sumaţintu makro druskų kiekiu NAR – -naftilacto rūgštis 2,4-D – 2,4-dichlorfenoksi acto rūgštis

7 ĮVADAS

Temos aktualumas. Lietuva pagal tarptautines sutartis yra įsipareigojusi sudaryti sąlygas sodo augalų rūšių genetinei įvairovei išsaugoti. 2001 m. LR Seimas priėmė Augalų nacionalinių genetinių išteklių įstatymą. Vyriausybės nutarimu 2004 m. prie Aplinkos ministerijos įsteigtas Augalų genų bankas. LAMMC SDI kartu su Augalų genų banku vykdo sodo ir darţo augalų nacionalinių genetinių išteklių kaupimą, tyrimą ir saugojimą. Genetinė augalų įvairovė yra svarbi ne tik gamtinių populiacijų evoliucijai, bet ir kultūrinių augalų naujom veislėm kurti. Iki 2005 m. LAMMC SDI buvo saugoma per 500 kriaušių veislių, formų ir numerių. 2005 metais Lietuvoje sėklavaisių soduose tame tarpe ir LAMMC SDI buvo nustatytas bakterinės degligės Erwinia amylovora pasireiškimas. SDI biotechnologijos metodais pavyko sukurti sterilią proliferuojančią kriaušių veislių, formų ir selekcinių numerių kultūrą. Šiuo metu kolekcijoje in vitro yra per 200 pavyzdţių. Dalis kolekcijos vienetų yra unikalūs, egzistuojantys tik šioje kolekcijoje: tai unikalios institute išvestos veislės 'Alka', 'Alva', 'Alnora', 'Alna', 'Alsa', 'Aluona', 'Alvita', 'Gaisra', 'Krėva', 'Liepona', 'Lukna', 'Nova' , ankščiau išvestos ar surastos vietinės kilmės veislės 'Bučiūno rastinukė', 'Ivanausko raudonoji' ir introdukuotos, kitose šalyse sukurtos veislės. Tai neįkainojamas valstybės turtas, pasiţymintis labai didele genetine įvairove. Kolekcija reikšminga moksliniams tyrimams, o joje saugomi pavyzdţiai, kaip atskirų genų donorai ar šaltiniai kriaušių selekcijai. Skirtingiems augalų genotipams būdinga individuali specifinė reakcija į saugojimo sąlygas. Dėl ilgalaikio kriaušių saugojimo, bei daţno rekultivavimo in vitro galimas augalų genetinio stabilumo praradimas. Kriaušių in vitro kolekcija yra selekcijos aspektu „pasyvi“. Siekiant panaudoti didelę genų įvairovę kriaušių selekcijai, būtina turėti „aktyvią“ t.y sode augančią, pilnai derančią kolekciją. Todėl kolekcijos in vivo atstatymas būtinas, siekiant išsaugoti kiekvieno konkretaus genotipo autentiškumą ir galimybės panaudoti kriaušių selekcijai. Kolekcijos atstatymas iš in vitro į in vivo galimas įšaknidinimo ir mikroskiepijimo in vitro metodais. Didelei ir genetiniu poţiūriu labai įvairiai kriaušių kolekcijai atstatyti, parankesnis įšaknydinimo in vitro metodas. Augalų šaknijimąsi in vitro sąlygoja daug faktorių. Pagrindiniai jų yra: augalo rūšis, genotipas, eksplanto parinkimas, eksplanto fiziologinė būsena, jo dydis, terpės sudėtis, kultivavimo sąlygos ir kt. Siekiant sąlyginai per kuo trumpesnį laiką ir maţesnėmis ekonominėmis sanaudomis kolekciją atstatyti in vivo,

8 pirmiausia reikia parinkti sąlygas, kurios būtų universalios t.y tiktų daugumai kriaušių veislių įšaknydinti. Tyrimo hipotezė. Augalų biotechnologijos pagalba galima atstatyti sveiką, nuo bakterinės degligės ir kitų patogeninių mikroorganizmų kriaušių (Pyrus communis L.) kolekciją in vivo. Tyrimo objektas. Paprastosios kriaušės P. communis veislės. Tyrimo tikslas. Nustatyti optimalias kriaušių rizogenezės in vitro ir įsišaknijusių mikroūglių perkėlimo in vivo sąlygas. Tyrimo uţdaviniai: 1. Nustatyti eksplantų fiziologinės būsenos, dydţio bei kultūros amţiaus įtaką kriaušių šaknijimuisi in vitro; 2. Parinkti optimalią terpę kriaušių veislių šaknijimuisi in vitro; 3. Nustatyti eksplantų - mikroūglių mirkymo fitohormono ISR tirpaluose įtaką kriaušių šaknijimuisi in vitro; 4. Nustatyti fitohormonų ISR, IAR, NAR ir įtaką kriaušių rizogenezei in vitro; 5. Nustatyti kriaušių šaknijimosi dinamiką in vitro; 6. Įvertinti kriaušių perkeltų in vivo prigijimo efektyvumą.

1. NAGRINĖJAMOS PROBLEMOS APŢVALGA

1.1 . Kriaušės istorija, gentinė sudėtis

Kriaušė (Pyrus L.) priskiriama erškėtinių (Roseaceae) šeimos obelinių (Maloideae) pošeimiui. Pyrus gentyje yra apie 60 rūšių, savaime augančių Azijoje, Šiaurės Afrikoje, Europoje, Amerikoje. Šiuo metu pasaulyje priskaičiuojama apie 5000 kriaušių rūšių ir veislių. Lietuvoje auga 3 rūšys (Tuinyla, Lukoševičius ir kt., 1990). Jau VIII a. prieš Kristų, kriaušės buvo ţinomos kaip kultūriniai sodo augalai. Homeras "Odisėjoje" mini karaliaus Alkinojaus sodus, kuriuose buvo auginamos kriaušės. Graikų filosofas ir botanikas Teofrastas (370–286 pr. Kr.) pateikė augalų klasifikaciją. Jis mini tris kriaušių veisles, kurių arealas iš Graikijos ir Italijos pasislinko į šiauresnius Europos rajonus. IX a. kriaušės buvo ţinomos Vokietijoje, XII a. – Anglijoje, XVII – XIX a. Prancūzijoje ir Belgijoje. Į Šiaurės Ameriką kriaušių atveţė anglai XVI a., o į Vakarinę Kanadą – prancūzai (Βиткобский, 2003). Lietuvoje, pirmą kartą kultūrinės kriaušės minėtos 1678 m. Vilniaus apskrities Pavytinės dvaro inventoriaus sąrašuose. Iki XIX a. pabaigos kriaušės buvo auginamos vienuolynų bei dvarų soduose, o nuo XX a. pradţios ir ūkininkų soduose. Lietuvoje kultūrinių kriaušių daugiausiai buvo auginama pietryčių, pietvakarių ir vidurio lygumos pietinės dalies rajonuose (Bulavienė, Butkus ir kt., 1974).

1.2. Kriaušių ūkinė reikšmė ir jų paplitimą sąlygojantys veiksniai

Kriaušių vaisiai vartojami švieţi ir perdirbti. Ţmogaus organizmui vertingos kriaušių vaisiuose esančios medţiagos: vitaminai, angliavandeniai, organinės rūgštys, aromatinės medţiagos ir kt. (Tuinyla, Lukoševičius ir kt., 1990). Pasaulyje kriaušių vaisių suvartojama keliolika kartų maţiau, nei obuolių. Kriaušių pasiūla vis dar yra maţesnė uţ paklausą, nors jų kaina pasaulinėje rinkoje lenkia obuolių kainą net 30–50 proc. Pasaulinės kriaušių rinkos lyderė yra Kinija, išauginanti apie 60 proc. visos produkcijos. Europoje uţauginama per 3 milijonus tonų kriaušių vaisių, tai sudaro 16 proc. visos kriaušių produkcijos (Kviklys, 2007). Europoje daugiausiai paplitę Pyrus communis, o Azijoje - Pyrus pyrifolia arba Pyrus sinensis rūšių kriaušės. Kriaušių auginimas sukoncentruotas pietinėse šalyse, kur yra palankesnės klimato sąlygos joms augti. Pagrindinės šalys, auginančios europines kriaušes (Pyrus communis), yra

10 Italija, JAV ir Ispanija. Kriaušių sodai sparčiai plečiami Vakarų Europoje – ypač Olandijoje ir Belgijoje. 2005 metais Lietuvoje buvo 4361 hektarų verslinių sodų, iš jų kriaušės augo 134 hektaruose. Pagrindinės biologinės savybės, lemiančios kriaušių auginimo galimybes bei plotų mąstą yra veislių kompleksinis adaptyvumas biotiniams ir abiotiniams veiksniams. Pabaltijo regionas yra arealo pakraštys kriaušėms auginti. Iš pietinių regionų introdukuotų veislių adaptyvumas yra nepakankamas, kad šiaurinių regionų agroklimatinėmis sąlygomis galėtų augti, derėti, sunokinti aukštos kokybės vaisius. Kriaušių sodai labai nukenčia nuo ligų, kurias sukelia virusai – tokie kaip Pyrus virus 7, ACLSV, ASP, grybai - Venturia, Mycosphaerella, Taphrina ir bakterijos - Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas (Agrios, 2004). Bakterinė degligė yra pavojingiausia erškėtinių (Roseaceae) šeimos gentims: Pyrus, Malus, Sorbus, Crataegus, Cydonia (Bellis De Palmira et al., 2007). Ligą sukelia bakterija Erwinia amylovora (Burrill) Winslow., kurią platina vėjas, lietus, kruša, vabzdţiai, paukščiai. Ji gali būti pernešta su sodinamąja ir skiepijimo medţiaga (Dondini, Prierantoni et al., 2004 . Bakterinė degligė pirmą kartą buvo pastebėta JAV 1780 m. (Bellis De Palmira et al., 2007). Šiuo metu E. amylovora nustatyta 43-ose pasaulio šalyse. Esant palankioms sąlygoms bakterijos sukelta infekcija išplinta 15–30 cm šakos ilgiu, o paţeisti augalai ţūva per 1-2 metus (Bellis De Palmira, Schena et al., 2007). Dėl bakterinės degligės patiriami nuostoliai yra milţiniški: 1998 metais JAV šiaurės-vakaruose jie siekė 68 mln. JAV dolerių (Bonn, 2000), o Italijoje buvo sunaikinta 500 tūkst. vaismedţių (Calzolari, Finelli, et al., 1999). Austrijoje bakterinės degligės padaryti nuostoliai 2003 m sudarė 1,8 mln. eurų. Dauguma valstybių skiria didelį dėmesį ir lėšas bakterinės degligės tyrimams ir prevencijai. Slovėnijoje 2003 m. tyrimams buvo skirta 152 tūkst. o vaismedţių sunaikinimui - 426 tūkst. eurų (Baranauskaitė, 2006). Siekiant apsaugoti medelynus ir sodus nuo bakterinės degligės, kai kurios šalys arba jų atskirtos teritorijos turi saugomos zonos statusą: Ispanija, Portugalija, Suomija, Airija, Estija, Latvija, Lietuva, Slovakija ir Slovėnija (išskyrus kai kurias jų provincijas), kai kurios Austrijos ir Italijos provincijos, dalis teritorijų Jungtinėje Karalystėje ir Prancūzijoje (Ţemės ūkio ministerija, 2007). Saugomoje zonoje nustatyti ligos ţidiniai turi būti visiškai sunaikinti, sudeginant ne tik uţkrėstus augalus, bet ir augalus šeimininkus 10–20 m spinduliu aplink uţkratą (Ţemės ūkio ministerija, 2007). Augalams nuo bakterinių ligų apsaugoti tenka naudoti apsaugos priemonių kompleksą: atsparių rūšių ar veislių auginimas; agrotechninės ir organizacinės priemonės, sveikos sodinamosios medţiagos naudojimas, kova su bakterijų pernešėjais, biologinė apsauga, karantinas. Augalams išgydyti nuo patogenų naudojami įvairūs metodai: krioterapija, termoterapija, apikalinė meristema ir mikrodauginimas in vitro

11 (Pileckis, Repšienė ir kt., 1994; Sliesaravičius, Stanys ir kt., 2005; Dapkevičius, Brazauskienė ir kt., 2007). Efektyviausias ir ekologiškiausias kovos su ligų sukėlėjais būdas sukurti ir auginti veisles, pasiţyminčias stabiliu kompleksiniu atsparumu keletui patogenų. Augalų selekcijos sėkmę lemia turimų genetinių išteklių įvairovė.

1.3. Kriaušės genetiniai ištekliai ir jų reikšmė

Daugelis valstybių yra sukaupę ir saugo genetiniu poţiūriu labai vertingas sodo augalų kolekcijas (Maggioni, Fischer et al., 2002; Ikase, 2008; Postman, 2008 . Sodo augalų, tame tarpe ir kriaušės, genetiniai ištekliai daţniausiai saugomi lauko kolekcijose. Iškilus realiai bakterinės degligės grėsmei, lauko kolekcijų pavyzdţius pradėta dubliuoti: kuriami kriobankai, kolekcijos in vitro sistemose Sedlak, Paprštein et al., 2001; Bell, 2002; Ahmed, Anjum et al., 2010 . Lietuvoje pirmą kriaušių kolekciją pasodino prof. A. Hrebnickis XX a. pradţioje. 1910 m. joje augo 154 veislių kriaušės. Po labai šaltos 1928–1929 metų ţiemos sode liko 23 kriaušių veislės (Gelvonauskis, Gelvonauskienė ir kt., 2005). J. Proškevičiaus, P. Kalkio, I.Štaro, V. Tuinylos, A. Lukoševičiaus (Bulavienė, Butkus 1974) vėliau B. Gelvonauskio dėka buvo surinkta Pabaltijo valstybėse didţiausia kriaušių veislių, klonų kolekcija, saugoma LAMMC Sodininkystės ir darţininkystės institute. Kriaušių lauko kolekcijoje (pasodintoje 1999-2005 metais) augo per 306 veislių, formų ir hibridų (Gelvonauskis, Gelvonauskienė ir kt., 2005). Kolekcijoje augo ir veislės – biologinių - ūkinių poţymių genetiniai šaltiniai. Jos buvo sėkmingai naudojamos kriaušių selekcijai. LAMMC SDI buvo sukurtos kriaušių veislės: 'Alka', 'Alva', 'Alnora', 'Alna', 'Alsa', 'Aluona', 'Alvita', 'Gaisra', 'Krėva', 'Liepona', 'Lukna', 'Nova' (Lukoševičius, 1994; Lukoševičius, 2003). Kolekcijoje augo 64 unikalios, tik kolekcijoje egzistuojančios, anksčiau išvestos ar surastos vietinės kilmės veislės ir formos tokios kaip 'Bučiūno rastinukė', 'Ivanausko raudonoji', 'Vandenė' ir kt. Likusi kolekcijos dalis – introdukuotos, kitose šalyse sukurtos veislės. Dėl bakterinės degligės 2005-2007 metais kriaušių lauko kolekcija buvo sunaikinta. Per 200 kriaušių kolekcijos pavyzdţių pavyko perkelti į in vitro sistemą. Pastaruoju metu siekiama atstatyti in vivo nuo bakterinės degligės ir kitų patogenų išgydytą kriaušių kolekciją ir tęsti jų selekciją. Dalis kolekcijoje saugomų pavyzdţių yra svarbūs kriaušių selekcijai, kaip atsparumo ligoms ir ištvermingumo ţiemą genetiniai šaltiniai.

12 1.4. Augalų ex vitro atstatymo in vivo metodai

Esant poreikiui augalų kolekcijos ar atskiri jų pavyzdţiai, saugomi kriobankuose ar in vitro sistemose, gali būti atstatyti in vivo. Augalų atstatymo procesas yra sudėtingas. Šiam tikslui pasiekti taikomi skirtingi biotechnologijos metodai. Augalams saugomiems in vitro sistemoje atkurti in vivo daţniausiai naudojami mikroskiepijimo ir savašaknių augalų išauginimo in vitro metodai.

1.4.1. Mikroskiepijimas

Vienas iš būdų in vitro sistemoje pašalinus virusus ar kitas ligas atnaujinti vaismedţius. Mikroskiepijimu siekiama in vitro sąlygomis gauti greitą augalų prigijimo ir įsišaknijimo rezultatą Ahmed Obeidy, Smith, 1991). Augalų mikroskiepijimas yra sudėtinga, reikalaujanti daug darbo sąnaudų, ekonominiu aspektu brangi procedūra, o gaunami rezultatai ne visada pateisina lūkesčius. Siekiant sumaţinti procedūrą apsunkinančius faktorius, buvo sukurtas unikalus aparatas augalų mikroskiepijimui in vitro. Jis pritaikytas sujungti įskiepį su poskiepiu. Atlikti tyrimai įrodė, kad sėkmingai įskiepyti augalai prigyja ir juos galima perkelti in vivo šiltnamio sąlygomis Ahmed Obeidy, Smith, 1991). Sėkmingą mikroskiepijimą sąlygoja daug faktorių: įskiepio ir poskiepio auginimo sąlygos in vitro, jų fiziologinės būsenos atitikimas, įskiepių ir poskiepių savisuderinamumas, įskiepytų augalų kultivavimo sąlygos (temperatūra, drėgmė ir kt.). Rafail S. Toma ir Mosleh M. S. (2010) atliko skirtingų kriaušių veislių mikroskiepijimą in vitro, naudodami poskiepį Pyrus calleryana. Gauti rezultatai parodė, kad daugiausiai (90 ) prigijusių augalų buvo gauta, kai veislė kilusi iš P. calleryana buvo įskiepyta į poskiepį P. calleryana. Taip pat buvo parodyta, kad skirtingų veislių prigijimo procentas esminiai skyrėsi: veislės 'Aly-Sur' prigijo 70%, o 'Leconte‘- 60% įskiepių.

1.4.2. Augalų rizogenezė in vitro

Augalo ląstelės pasiţymi totipotentiškumu, tai reiškia, kad turi potencinę galimybę realizuoti savo vystymosi programas. Dėka šių programų ląstelės geba organizuoti atitinkamą meristeminių audinių struktūrą, o iš šių audinių išsivysto augalo organai Darginavičienė, Novickienė, 2002; Sliesaravičius, Stanys, 2005). Biotechnologinėmis priemonėmis, siekiant konkrečių tikslų, galima keisti, ląstelės ar organo vystymosi programas. 13 Šaknų formavimasis in vitro gali būti gan lengvai indukuotas ţolinių augalų rūšims, kita vertus, jis gali būti labai sudėtingas sumedėjusių augalų rūšims Thakur, Kanwar, 2008). Visa tai kontroliuoja daugybė tarpusavyje susijusių veiksnių: svarbiausi jų yra aplinkos veiksniai (šviesa, drėgmė, temperatūra ir kt.), augalo ir eksplanto fiziologinė būsena, egzogeninė hormoninė reguliavimo sistema, genotipas.

1.4.2.1. Augalų fiziologinės būsenos įtaka augalų rizogenezei

Ne visada augalai auga vienodu intensyvumu. Tai būdinga ne tik natūraliai augantiems augalams, bet ir augalams in vitro kultūroje. Priklausomai nuo sąlygų augalai gali intensyviai augti arba būti ramybės būsenoje Sliesaravičius, Stanys, 2005). Eksplanto ir augalo (iš kurio izoliuojamas eksplantas) fiziologinė būsena nulemia eksplanto atsaką į kultivavimo in vitro sąlygas. Siekiant tikėtis pageidaujamų rezultatų, egzogeninių sąlygų ir veiksnių pasikeitimas turi atitikti eksplanto fiziologinės būsenos pasikeitimus. Augalo fiziologinė būsena keičiasi priklausomai nuo augalo amţiaus, dėl aplinkos sąlygų kitimo bei sezoniškumo. Keičiant aplinkos sąlygas temperatūrą, apšviestumą, drėgmę, aprūpinimą maisto medţiagomis arba veikiant įvairiais faktoriais ir jų deriniais galima iš dalies reguliuoti augalo fiziologinę būseną Sliesaravičius, Stanys, 2005 . Bandymams daţniausiai naudojami aktyviai augantys mikroūgliai. Priklausomai nuo augalo eksplantai imami iš 3–6 savaičių amţiaus kultūros (Fotopoulos, Sotiropoulos, 2005). Bandymų rezultatus gali įtakoti ir mikroūglio dydis, kuris susijęs ir su eksplanto amţiumi. Skirtingi tyrimų autoriai naudoja įvairaus dydţio mikroūglius (nuo 0,5 iki 3,5 cm). Tyrimais parodyta, kad daugeliu atvejų tikslinga naudoti 1,5–2 cm dydţio eksplantus (Naghmouchi, Khouja, 2008).

1.4.3. Eksplantų įtaka augalų rizogenezei in vitro

Priklausomai nuo siekiamo tikslo, in vitro sąlygomis naudojami skirtingi eksplantai. Įšaknydinti galima lapus, jų fragmentus, mikroūglius (Stanys, 1997; Sliesaravičius, Stanys, 2005). Kinų mokslininkai (Tang, Luo et al., 2008) tyrė kriaušių (P. communis) lapų bazalinės, vidurinės ir viršūninės dalių šaknijimąsi MS terpėje. Gauti rezultatai parodė, kad lapų įsišaknijimui geriausiai tinka bazalinė lapo dalis (įsišaknijo 70,12% eksplantų). Tuo tarpu eksplantų, paimtų iš vidurinės lapo dalies, su šaknimis rasta 18,2%, o eksplantai paimti iš viršūninės lapų dalies nesišaknijo. O'Connor-Sanchez su bendraautoriais (2010) taip pat tyrė eksplantų iš skirtingų lapo dalių šaknijimąsi. Tam naudojo

14 skirtingas terpes ir augimo reguliatorius. Gauti tyrimų rezultatai buvo panašūs, kaip ir aukščiau minėtų autorių. Daugiausia tyrimų in vitro sąlygomis yra atlikta siekiant įšaknydinti mikroūglius. Tiriamos aplinkos faktorių, skirtingų maitinamųjų terpių, augimo reguliatorių, vitaminų, įtaka mikroūglių šaknijimąsi (Hennayake, Dissanayake et al., 2003; Antonopoulou, Dimassi et al., 2004);

1.4.4 Aplinkos faktorių įtaka augalų rizogenezei in vitro

Skirtingi tyrėjai įrodė, kad šviesos ir tamsos rėţimai, bei temperatūra turi didelę įtaką augalų rizogenezės procesui. Daţniausiai bandymai in vitro sąlygomis vykdomi esant 16 val. šviesos (liuminescencinėmis lempomis įšviečiant 40–60 μM m-2s-1 tankio fotonų srautą), ir 8 val. tamsos trukmei (Hennayake, Dissanayake et al., 2003; Sedlak, Paprštein, 2007). Aplinkos temperatūra turi nenukristi ţemiau 21 oC ir nepakilti aukščiau 25 oC (Antonopoulou, Dimassi et al., 2004; Fotopoulos, Sotiropoulos, 2005). Tamsa skatina augalų mikroūglių šaknijimąsi in vitro. Zanol C. su bendraautoriais (1997) nustatė, kad 3 parų tamsos laikotarpis buvo optimaliausias tirtų obelų mikroūglių šaknijimuisi indukuoti in vitro. Stanys tyrė tamsos trukmės įtaką obelų regenerantų (gautų iš sėklaskilčių) įsišaknijimui in vitro. Gauti rezultatai parodė, kad optimali tamsos laikotarpio trukmė yra 7 paros (įsišaknijo 81,5% tirtų regenerantų). Esant trumpesniam ar ilgesniam nei 7 paros tamsos laikotarpiui įsišaknijusių regenerantų kiekis maţėjo: naudojant 5 parų tamsos laikotarpį gauta 67,9%, o 9 parų - 62,9% įsišaknijusių regenerantų (Stanys, 1997). Tuo tarpu slyvų mikroūglių šaknijimąsi efektyviausiai veikia 12 parų tamsos laikotarpis (Fotopoulos, Sotiropoulos, 2005). Kriaušių šaknijimąsi in vitro sąlygoja eksplantų, pasodintų į šaknijimosi terpę aeracija. El-Rahman A, ir bendraautoriai (2007) parodė, kad aeracija padidino įsišaknijusių eksplantų kiekį.

1.4.5. Terpių ir jų sudėties įtaka augalų rizogenezei in vitro

Eksplantų šaknijimosi efektyvumas priklauso nuo maitinamosios terpės. Daţniausiai tyrimams naudojamos MS, QL, DKW ir WPM terpės. Kairo mokslininkai (Kassim, Rayya et al., 2010) atliko kriaušių šaknydinimo bandymus, naudodami MS, WPM ir DKW terpes. Geriausi kriaušių rizogenezės rezultatai buvo gauti naudojant MS terpę. Analogiškus tyrimų rezultatus publikuoja ir kiti autoriai (Fotopoulos, Sotiropoulos, 2005;

15 Sedlak, Paprštein, 2007; O'Connor-Sanchez, Dominguez et al., 2010; Kassim, Rayya et al., 2010). Buvo tirta makro druskų koncentracijos MS terpėje įtaka kriaušių šaknijimuisi. Hennayake K. C. ir kiti mokslininkai (2003) lygino MS bazinės ir MS ½ terpės įtaką Pyrus pyrifolia ir Pyrus communis mikroūglių šaknijimuisi. Gauti rezultatai parodė, kad MS bazinė terpė darė didesnę įtaką Pyrus communis, o MS ½ Pyrus pyrifolia veislių eksplantų šaknijimuisi in vitro. Sun Q. ir kiti (2009) tyrė MS bazinės, MS ½, MS ¼ terpių įtaką kriaušių (P. communis) skirtingo ploidiškumo klonų rizogenezei in vitro. Gauti rezultatai parodė, kad tirti diploidai, tetraploidai ir miksaploidai geriausia šaknijosi MS ¼ terpėje. Jų eksplantų įsišaknijimo efektyvumas priklausė nuo klonų ploidiškumo. Įsišaknijusių eksplantų gauta diploidams – 31,2%, tetraploidams – 18,7% ir miksoploidams 15,6%. Anglies šaltiniai, esantys maitinamojoje terpėje turi įtakos sodo augalų šaknijimuisi in vitro. Kriaušių šaknydinimo terpėse, kaip anglies šaltinis paprastai naudojama sacharozė (20mg/l) (Yaseen, Ahmad et al., 2009). Obelų ir persikų poskiepių mikroūgliams šaknydinti geriausiai naudoti 30–35mg/l sorbitolio. Šis sorbitolio kiekis terpėje padidino ne tik įsišaknijusių eksplantų kiekį, bet ir šaknelių, tenkančių vienam įsišaknijusiam eksplantui kiekį Touqeer, Nadeen et al., 2007; Yassen, Ahmad et al., 2009). Terpės konsistencija taip pat sąlygoja įsišaknijusių eksplantų ir jų šaknų kiekį. Skystoje terpėje papildytoje 0,25 mg/l NAR įsišaknijusių kriaušių P. pyrifolia šaknų kiekis buvo didesnis nei kietoje terpėje. Tuo tarpu naudojant ISR ir NAR kompleksą geriau šaknijosi kietoje terpėje (Haq, Kaloo, 2010).

1.4.6. Augimo reguliatorių ir jų derinių įtaka augalų rizogenezei in vitro

Fitohormonai – tai augale sintetinami junginiai, kurių dėka vyksta biocheminiai pakitimai ląstelių, audinių bei organų lygmenyje ir kurių labai maţos koncentracijos būtinos fiziologinėms ir morfologinėms programoms realizuoti (Stanys, 1998; Jakienė, Venskutonis, 2008). Stipriausias morfogenezės induktorius, kurį priimta vadinti morfogenezės signalu, yra citokininų ir auksinų santykio pakeitimas terpėje. Viršijant citokininams daţniausiai prasideda stiebo organogenezė, o esant daugiau auksinų – šaknų organogenezė Sliesaravičius, Stanys, 2005). Visi fitohormonai pasiţymi daugybiniu veikimu augale. Pagal pagrindines funkcijas jie skirstomi į grupes: auksinų grupei priklauso natūraliai augaluose sutinkama -indolilacto rūgštis IAR , tiek sintetinės medţiagos – indolilsviesto rūgštis ISR , -naftilacto rūgštis NAR , 2,4-dichlorfenoksi acto rūgštis 2,4-D auksinai skatina ląstelių tysimą ir augimą, dalinai 16 ląstelių dalijimąsi, indukuoja pridėtinių šaknų susidarymą, stabdo viršutinių pumpurų vystymąsi. citokininų grupei priklauso natūraliai sutinkamas fitohormonas zeatinas, 2iP bei sintetiniai citokininai kinetinas ir BAP. Citokininai indukuoja viršutinių ir pridėtinių pumpurų vystimąsi, skatina ląstelių dalijimąsi, jie silpnina apikalinį dominavimą. giberelinų grupės fitohormonai turi įtakos augalų augimui ir vystymuisi bei sėklų dygimui, tarpubamblių tįsimui. Augaluose plačiausiai paplitęs GA3. Giberelinai rečiau naudojami izoliuotų ląstelių ir audinių kultūroje. abscizo rūgštis ir etilenas priskiriami augimo inhibitorių grupei. Abscizo rūgštis yra augimo inhibitorius. Ji modifikuoja citokininų sintezę, yra giberalinų antagonistas, o etilenas paprastos struktūros dujos slopina kultūros augimą, skatina audinių senėjimą, vitrifikaciją. Adeninas, kaip citokininų pirmtakas naudojamas kultūroje in vitro ūglių regeneracijai paskatinti (Sliesaravičius, Stanys, 2005; Auškalnienė, 2005). Augalų rizogenezei indukuoti naudojami skirtingi fitohormonai ir jų deriniai. Tyrimais buvo nustatyta, kad skirtingos ISR koncentracijos nevienodai inicijuoja kriaušių šaknijimąsi. Sharma T., Modgil M. ir Thakur M. (2007) tirdami obelų poskiepių M7 ir MM106 rizogenezę, naudojo 0,5 mg/l, 1,0 mg/l, 1,5 mg/l, 2,0 mg/l, 2,5 mg/l, 3,0 mg/l, 3,5 mg/l ir 4,0 mg/l ISR koncentracijas. Maksimalus mikroūglių šaknijimosi procentas (89,63%) buvo gautas naudojant 2,5 mg/l ISR koncentraciją. Šaknijimo bandymuose ISR naudojama ne tik kaip papildomas veiksnys terpėje, bet ir eksplantų mirkymui, prieš juos perkeliant į šaknidinimo aplinką. Sharma T. ir kiti (2007) obelų M7 ir MM106 poskiepių mikroūglius mirkė skirtingos ISR koncentracijos tirpaluose (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, ir 1000 mg/l) 10, 20, 30 min. ir 1, 2, 3, 4, 5 valandas. Geriausi rizogenezės rezultatai buvo gauti, kai mikroūgliai buvo mirkomi 90 mg/l – 1 valandą 86,00%) arba 80 mg/l – 2 valandas 80,00%). Skirtingų fitohormonų įtaką kriaušių šaknijimuisi in vitro yra nevienoda. Dennis Y. Yeo Y. D. (1995) Oregono universitete 1995m. tyrė fitohormonų ir jų kombinacijų įtaką kriaušių veislių Pyrus calleveryana Oregon Pear 157, P. betulifolia OPR 260 ir P. communis Old Home x Farnningdale 230) šaknijimuisi. Tyrimai parodė, kad naudojant vienodas ISR ir NAR koncentracijas (0,5 mg/l) didesnę teigiamą įtaką kriaušių šaknijimuisi turėjo ISR, negu NAR. Thakur A. ir Kanwar J. S. 2008m. (2008) tyrę laukinių kriaušių Pyrus pyrifolia 'Wild pear') šaknijimąsi in vitro nustatė, kad papildţius šaknidinimo terpę fitohormonų kompleksu ISR ir NAR (kiekvieno po 0,25 mg/l) gautas geriausias šaknijimosi rezultatas (81,47%). Tą patvirtino ir Haq Z. ir Kallo Z. A. (2010) atlikti Pyrus pyrifolia tyrimai. Terpėje MS ½

17 papildytoje ISR+NAR (po 0,25mg/l ), įsišaknijusių eksplantų gauta 70,0%. Tirti fitohormonai sąlygojo ne tik įsišaknijusių eksplantų, bet ir šaknų kiekį. Šaknų, tenkančių įsišaknijusiam eksplantui kiekį labiau didino NAR, negu ISR. Didţausias šaknų kiekis (7,2) buvo terpėje papildytoje 0,25 mg/l NAR. Hannayake K. C. ir kiti autoriai (2003 tyrė BAP įtaką dviejų rušių Pyrus pyrifolia 2 veislės) ir Pyrus communis 3 veislės) kriaušėms. Remiantis tyrimų duomenimis buvo konstatuota, kad įsišaknijo P. pyrifolia 20%, o P. communis 60% eksplantų. P. communis veislių Comice, Conference, Devoe) mikroūgliai geriausiai šaknijosi variante su 5 mg/l BAP. Kiti autoriai nustatė, P. pyrifolia geriau šaknijasi, kai terpė papildyta 2 mg/l BAP Haq, Kaloo, 2010). 1.5. Genotipo įtaka augalų rizogenezei in vitro

Augalų kultūros in vitro sėkmė labai priklauso nuo augalo genotipo. Genotipo skirtumai gali būti susiję su skirtingų endogeninių hormonų kiekiu. Netgi izoliuoti eksplantai iš to paties genotipo nevienodai reaguoja kultūroje in vitro, matyt tai sąlygoja endogeninių hormonų kiekio skirtumas. Šis disbalansas gali būti eliminuotas auginant donorinius augalus optimaliomis sąlygomis, keičiant augimo reguliatorių ir maitinamųjų terpių komponentų sudėtį (Duncan, Williams et al., 1985). Baralti R. ir kiti autoriai 1995 tyrė fitohormonų ISR (15 mg/l.) ir IAR (15 mg/l.) įtaką kriaušių P. communis veislių Conference ir Doyenne d'Hiver šaknijimuisi in vitro kultūroje. Gauti rezultatai parodė, kad įsišaknijusių mikroūglių, šaknų kiekis tenkantis vienam įsišaknijusiam mikroūgliui ir šaknų ilgis priklausė nuo naudojamo fitohormono ir nuo genotipo. Terpėje su ISR veislės Conference įsišaknijo 95 , o su IAR – 72 mikroūglių, tuo tarpu veislės Doyenne d'Hiver atatinkamai – 83 ir 67 mikroūglių. Veislės Conference šaknų kiekis tenkantis vienam įsišaknijusiam mikroūgliui terpėje su ISR buvo 6,3 vnt., o su IAR – 5,3 vnt, tuo tarpu veislės Doyenne d'Hiver atatinkamai 5,9 vnt. ir 3,2 vnt. Veislės Doyenne d'Hiver mikroūgliai formavo ilgesnes šaknis (77,8 mm), negu veislės Conference (18,9 mm.) mikroūgliai. Analogiškus tyrimus su tomis pačiomis veislėmis atliko Bertazza G. su kolegomis 1995 ir patvirtino aukščiau minėtų autorių gautus tyrimų rezultatus. Vienodomis sąlygomis ištyrus šešių skirtingų kriaušių genotipų 'Meskawi', 'W.T1', 'Abu-satel', 'W.T2', 'W.T3', 'Romi' šoninių ūglių formavimąsi, mikroūglių ilgį ir lapų indeksą, nustatyta, kad ţenkliai intensyviau šoninius ūglis formavo 'Meskawi', 'W.T2', 'W.T3, negu 'W.T1', 'Abu-satel', 'Romi' genotipai, ilgesnius mikroūglius formavo 'Abu-satel' ir

18 'Meskawi' genotipai. Didţiausiu lapų indeksu pasiţymėjo 'Abu-Satel' (0,78) ir 'Romi' (0,71) veislės Elshihy, Sharaf et al., 2004 . Rafail S. T. ir Mosleh M. S. 2010 tyrė kriaušių genotipų įtaką mikroskiepijimo rezultatams. Trijų skirtingų veislių 'Calleryana', 'Aly-Sur', 'Leconte' įskiepiai buvo skiepyti į tą patį poskiepį Pyrus calleryana. Tyrimai parodė, kad P. calleryana ir 'Calleryana' įskiepio ir poskiepio kombinacijoje gauta 90 prigijusių skiepų. Tuo tarpu P. calleryana ir 'Aly-Sur' kombinacijoje gauta 70 , o P. calleryana ir 'Leconte' – 60 skiepų. Dziedzic E. ir Malodobry M. 2006 atlikdami mikroskiepijimą, nagrinejo vyšnių poskiepių ir įskiepių suderinamuną. Sėkmingiausias skiepijimas gautas poskiepio Damil ir veislės Regina kombinacijoje – prigijo 66,7 skiepų. Į Damil poskiepį įskiepijus veislę Van gauta patikimai maţiau prigijusių skiepų (60,0 ). Pateikti duomenys rodo skirtingą genotipų sąveiką su tuo pačiu poskiepiu. Iš pateiktų nagrinėtų autorių duomenų galima teigti, kad genotipas įtakoja augalų kultūros in vitro morfogenezės (rizogenezė, kaliogenezė, adventyvinių ūglių formavimąsi) galimybes. Mikroskiepijimo in vitro efektyvumą taip pat sąlygoja genotipas.

19 2. SĄLYGOS IR METODAI

Tirtos kriaušių veislės saugomos Lietuvos agrarinių ir miškų mokslo centro Sodininkystės ir darţininkystės institute, in vitro kultūroje. Kriaušėms įšaknidinti in vitro sąlygomis buvo naudoti eksplantai – mikroūgliai. Kriaušių mikrovegetatyvinio dauginimo in vitro sąlygos. Kriaušių mikrovegetatyviniam dauginimui buvo naudota MS terpė papildyta 0,75 mg/l BAP. Terpės pH 5,78–5,8. Padauginta kriaušių kultūra in vitro buvo laikoma fitotrone (21–25 C temperatūra ir 16 val. fotoperiodas per parą, liuminescencinėmis lempomis įšviečiant 50 μM m-2s-1 tankio fotonų srautą). Kriaušių šaknijimosi in vitro tyrimams buvo naudoti ramybės būsenos ir augantys mikroūgliai. Augantys eksplantai buvo imti iš 4, 6, ir 12 savaičių kultūros. Tyrimams naudoti 0,5, 1,0, ir 1,5 cm dydţio mikroūgliai. Eksplantų – mikroūglių mirkymo ISR tirpaluose sąlygos. Mikroūgiams mirkyti buvo naudojami 2,5 mg/l ir 5 mg/l ISR tirpalai. Jie buvo mirkomi 8, 24 ir 48 valandas (tamsoje). Po to mikroūgliai buvo susodinti į atatinkamą šaknydinimo terpę ir 7 paras kultivuojami tamsoje, po to fitotrono sąlygomis. Kriaušių šaknydinimo in vitro sąlygos. Kriaušių šaknydinimui naudotos bazinė MS ir MS ½ (per pus sumaţintas makro druskų kiekis) terpės. Terpės buvo modifikuojamos, papildant 10 ir 20 gr/l sacharozės ir augimo reguliatoriais: ISR (0,5 mg/l), IAR (0,5 mg/l), NAR (0,5 mg/l) bei ISR (0,5 mg/l) + IAR (0,5 mg/l) deriniu. Terpių pH 5,78–5,8. Eksplantai pasodinti į šaknydinimo terpes 7 paras buvo kultivuojami tamsoje – termostate, po to fitotrone. Kriaušių morfogenezė (šaknų ir kaliaus formavimasis) buvo registruojami kas mėnesį. Šaknijimosi dinamika buvo sekama 8 mėnesius. Bandymų variantuose buvo tirta 5– 34 veislės, kiekvienai tirtai veislei sodinta po 5–12 eksplantų. Kriaušių perkėlimo in vivo sąlygos. Įsišakniję in vitro kriaušės buvo pasodintos į durpių substratą ir augintos šildomame šiltnamyje. Augalų prigyjimas vertintas po 6 mėnesių nuo pasodinimo. Duomenų statistinis įvertinimas. Duomenų vidurkių skirtumų statistinis patikimumas įvertintas kompiuterio programomis ANOVA ir STAT_ENG iš programų paketo SELEKCIJA ir IRRISTAT (Tarakanovas, Raudonius, 2003). Esminiai reikšmių skirtumai apskaičiuoti pagal Dunkano kriterijų.

20 3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS

Literatūroje duomenų apie kriaušės Pyrus communis šaknijimąsi sutinkama nedaug. Daugiau tyrimų atlikta su Pyrus pyrifolia, Pyrus syriana, Pyrus calleveryana, Pyrus betulifolia (Dennis, 1995; Thakur, Kanwar, 2008; Haq, Kaloo, 2010). Augalų rizogenezę sąlygoja labai daug veiksnių. Siekiant surasti kuo universalesnes rizogenezei sąlygas tinkamas daugumai kolekcijoje in vitro auginamų kriaušių genotipų būtina ištirti įvairių veiksnių įtaką jų šaknijimuisi.

3.1. Fiziologinės būsenos įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro

To paties augalo izoliuoti eksplantai, turintys identišką genetinę informaciją, pasiţymi skirtinga morfogenetine reakcija. Ji priklauso nuo augalo amţiaus ir eksplanto audinių diferenciacijos. Geriausiai in vitro vystosi juvenilinės fazės sumedėjusių augalų eksplantai (Sliesaravičius, Stanys, 2005) Tikėtina, kad skirtingos fiziologinės būsenos kriaušių eksplantai – mikroūgliai pasodinti į šaknidinimo terpę gali skirtis rizogenezės daţnumu. Ištyrę augančių ir ramybės būsenos eksplantų – mikroūglių šaknijimąsi in vitro nustatėme, kad 58,3% augančių mikroūglių formavo šaknis. Tuo tarpu ramybės būsenoje esantys eksplantai - mikroūgliai nesišaknijo (3.1.1 lentelė).

3.1.1 lentelė. Kriaušių mikroūglių fiziologinės būsenos įtaka jų šaknijimuisi in vitro LAMMC SDI, 2010 m.

Tirta Mikroūglių, Mikroūglių, Mikroūglių Kaliaus dydis mikroūglių formavusių formavusių kalių, fiziologinė būsena mm vnt. šaknis, kiekis % kiekis %. Augantys 31 58,3 91,7 4,8

Ramybės būsenoje 31 0 100 8,5

R05 6,36 2,61

Kriaušių mikroūgliai rizogenezės metu regeneruoja šaknis tiesiogiai iš mikroūglio bazalinės dalies, arba iš pradţių suformuoja kalių ir šaknis regeneruoja iš kaliaus. Iš kaliaus regeneruotos šaknys daţnai neuţtikrina augalo gyvybinių funkcijų persodinus į nesterilias sąlygas. Todėl tiriant kriaušių rizogenezę svarbu įvertinti eksplantų, formavusių kalių, daţnumą ir kaliaus dydį. Siekiant sukurti palankias sąlygas kriaušių šaknijimuisi in vitro bei

21 jų prigijimui in vivo, kaliaus formavimasis yra nepageidaujamas veiksnys. Iš tyrimo rezultatų pateiktų 3.1.1 lentelėje matyti, kad kaliaus formavimosi daţnumas yra aukštas. Augantys ir ramybės būsenoje esantys eksplantai kalių formavo atitinkamai 91,7 % ir 100% daţnumu. Mikroūglių, esančių skirtingose fiziologinėse būsenose, kaliaus dydis iš esmės skyrėsi. Patikimai maţesnį kalių formavo augantys mikroūgliai. Kriaušės pasodintos į dauginimo terpę (MS + 0,75 mg/l BAP) po mėnesio suformavo naujus adventyvinius mikroūglius. Pastarieji kaip eksplantai buvo naudojami kriaušių rizogenezei in vitro. Iškilo klausimas, kokią įtaką kriaušių rizogenezei turi kultūros, iš kurios imami eksplantai - mikroūgliai dydis. Fotopoulos S. ir Stripolos E. T. (2005) atlikę tyrimus su P. communis parodė, kad geriausiai šaknijosi mikroūgliai paimti iš 3–6 savaičių amţiaus kultūros. Mūsų atliktuose tyrimuose buvo naudoti mikroūgliai paimti iš 4, 6 ir 12 savaičių amţiaus kultūros. Gauti rezultatai parodė, kad kriaušių šaknydinimui naudojant mikroūglius paimtus iš 4 ir 6 savaičių amţiaus kultūros įsišaknijusių veislių ir įsišaknijusių mikroūglių procentas buvo esminiai didesnis, nei naudojant mikroūglius iš 12 savaičių amţiaus kultūros (3.1.2 lentelė).

3.1.2 lentelė. Kriaušių mikroūglių amţiaus įtaką jų šaknijimuisi ir kaliaus formavimuisi in vitro LAMMC SDI, 2010 m. Kultūros Tirta Įsišaknijusių Veislių, Tirta Įsišaknijusių Mikroūglių, amţius veislių veislių formavusių mikroūglių mikroūglių formavusių sav. vnt. % kalių % vnt. % kalių % 4 12 58,3 41,7 102 16,7 15,7

6 15 60 100 74 18,9 87,8

12 15 20 100 87 5,7 73,6

R05 22,61 33,65 7,07 38,19

Nustatėme, kad kultūros amţius turėjo įtakos ne tik kriaušių rizogenezei bet ir kaliogenezei. Veislių ir mikroūglių formavusių kalių maţiausiai (atitinkamai 41,7 ir 15,7%) rasta variante, kai įšaknydinami eksplantai buvo paimti iš 4 savaičių amţiaus kultūros (3.1.2 lentelė). Iš pateiktų tyrimo rezultatų matyti, kad kriaušių eksplantų paimtų iš 4 savaičių amţiaus kultūros morfogenezė vyksta šaknų ir kalio formavimo kryptimi. Tokie eksplantai turi patikimai didesnes potencines galimybes rizogenezei nei kaliogenezei. Publikacijose yra duomenų, kad skirtingiems augalams įšaknydinti, naudojami skirtingo dydţio mikroūgliai. Naghmouchi S. su bendraautoriais (2008) tyrimuose naudojo 22 1,5–2 cm, o kitų straipsnių autoriai 0,5-3,5 cm dydţių eksplantus (Fotopoulos, Sotiropoulos, 2005) . Minėti autoriai parodė, kad šaknijimuisi in vitro tinkamiausi 1,5–2 cm dydţio eksplantai. Norėdami įsitikinti mikroūglių dydţių įtaka P. communis veislių šaknijimuisi, tyrėme 0,5, 1 ir 1,5 cm dydţio eksplantus. Gauti tyrimo rezultatai parodė, kad patikimai daugiausiai (55,6%) P. communis veislių įsišaknijo naudojant 1,5 cm eksplantus (3.1.1 pav. A). Mikroūglių, kurių dydis buvo 1 arba 1,5 cm šaknijimosi daţnumas buvo patikimai didesnis, nei 0,5 cm dydţio mikroūglių. Veislių formavusių kalių maţiausiai 66,7% buvo rasta, kai buvo naudoti 0,5 ir 1 cm dydţio eksplantai. Tirtuose variantuose mikroūglių formavusių kalių daţnumas esminiai nesiskyrė (3.1.1 pav. B).

3.1.1 pav. Eksplantų – mikroūglių dydţių įtaka kriaušių šaknijimosi (A) ir kaliaus susidarymo (B) daţnumui in vitro LAMMC SDI, 2010 m.

23 Augalų rizogenezės in vitro efektyvumą parodo ne tik įsišaknijusių veislių bei eksplantų kiekis, bet ir įsišaknijusių eksplantų šaknų kiekis ir ilgis. Suskaičiavus kriaušių įsišaknijusių mikroūglių šaknų kiekį išaiškėjo, kad daugiausiai šaknų tenkančių vienam įsišaknijusiam mikroūgliui gauta, kai kriaušių šaknijimuisi buvo naudoti 1 ir 1,5 cm dydţio eksplantai (atitinkamai 3,3 ir 4,2 vnt.). Minėtų ilgių eksplantai formavo ilgiausias šaknis (3.1.3 lentelė). 3.1.3 lentelė. Eksplantų - mikroūglių dydţių įtaka kriaušių šaknų kiekiui ir jų ilgiui in vitro LAMMC SDI, 2010 m. Vidutinis šaknų kiekis, Tirta mikroūglių Vidutinis šaknų Mikroūglų dydis cm įsišaknijusiam mikroūgliui vnt. ilgis cm vnt. 0,5 72 1,6 2,1

1 69 3,3 4,7

1,5 70 4,2 4,6

R05 1,32 1,49

Apibendrinus skyriuje pateiktus rezultatus, galima teigti, kad kriaušių P. communis veislių rizogenezei in vitro tikslinga naudoti 1,5 cm dydţio augančius mikroūglius, paimtus iš 4 savaičių amţiaus kultūros.

3.2. Makro druskų kiekio MS terpėje įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro

Terpės atlieka dvejopą paskirtį: 1) maitinimą, t.y. pateikia eksplanto išgyvenimui reikalingas mineralines druskas, vandenį ir kitas medţiagas, kurių jis pats negali pasigaminti; 2) sudaro fizikinę terpę, tinkamą eksplanto augimui (Sliesaravičius, Stanys, 2005). Augalų šaknijimui in vitro naudojama bazinė MS terpė (Murashige, Skoog, 1862). Daţnai ji modifikuojama, siekiant pritaikyti konkrečiai augalų rūšiai ar genotipui. Kriaušių P. pyrifolia rizogenezė in vitro buvo tirta naudojant MS terpę su nevienodu makro druskų kiekiu (Hennayake, Dissanayake et al., 2003). Tyrimais nustatyta, kad P. pyrifolia rizogenezei tinkamiausia MS ½ terpė. Mūsų tyrimai parodė, kad skirtingi makro druskų kiekiai turi nevienodą įtaką tirtų veislių ir jų mikroūglių šaknijimosi daţnumui. Iš 3.2.1 lentelėje pateiktų tyrimo rezultatų matyti, kad geresnius P. communis veislių šaknijimosi rezultatus įtakojo MS ½ terpė. Joje gauta 72,7% įsišaknijusių veislių ir 34,5% įsišaknijusių mikroūglių, kurie formavo vidutiniškai po 2 šaknis.

24 3.2.1 lentelė. Makro druskų kiekio MS terpėje įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro LAMMC SDI, 2010 m. Tirta Įsišaknijusių Tirta Vidutinis šakų Įsišaknijusių Terpė veislių veislių mikroūglių kiekis, vienam mikroūglių kiekis % vnt. kiekis % vnt. mikroūgliui vnt.

MS 11 63,6 50 20 1,6

MS½ 11 72,7 55 34,5 2,1

R05 6,43 10,25 0,35

Atlikto tyrimo rezultatai parodo, kad kriaušių P. communis kaip ir P. pyrifolia rizogenezei tinkamesnė MS ½ terpė.

3.3 Sacharozės kiekio MS ½ terpėje įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro

Augalams in vitro kultūroje reikalingas egzogeninis energijos šaltinis. Daţniausiai naudojamos terpės papildomos sacharoze, bet galima naudoti ir maltozę, gliukozę, galaktozę bei kitus angliavandenius (Sliesaravičius, Stanys, 2005). Skirtingi angliavandeniai ir jų kiekiai skirtingai įtakoja augalų morfogenezės procesus in vitro kultūroje. Moksliniuose straipsniuose daţniausiai nurodoma, kad Pyrus ir Malus rizogenezę palankiau veikia sacharozė, nei fruktozė ir gliukozė (Touqeer, Nadeen et al., 2007; Yassen, Ahmad et al., 2009,). Kriaušės Pyrus syriaca augalai geriau šaknijasi terpėje su 15 g/l sacharozės (Shatnawi, Shibli et al., 2006). Mūsų tyrimo rezultatai, pateikti 3.3.1 lentelėje rodo, kad tirtų P. communis veislių šaknijimosi daţnumas buvo patikimai didesnis MS ½ terpėje, papildytoje 20 g/l sacharozės. Įsišaknijo 76,9% tirtų veislių. Įsišaknijusių mikroūglių, patikimai buvo daugiau (26,9%) MS ½ terpėje su 20 g/l sacharozės. Šaknų kiekis (2,2 vnt.), tenkantis vienam mikroūgliui, ir vidutinis jų šaknų ilgis (5,7 cm) minėtame variante buvo didesnis nei naudojant MS ½ terpę su 10 g/l sacharozės.

25 3.3.1 lentelė. Sacharozės kiekio MS ½ terpėje įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro LAMMC SDI, 2010 m.

Šaknų kiekis Sacharozės Tirta Įsišaknijusių Tirta Įsišaknijusių vienam Vidutinis kiekis veislių veislių mikroūglių mikroūglių įsišaknijusiam šaknų g/l vnt. % vnt. % mikroūgliui ilgis cm vnt. 10 19 63,2 176 17,0. 1,4 3,1

20 13 76,9 63 26,9 2,2 5,7

R05 9,69 7,00 0,57 1,84

Ištyrę sacharozės kiekio terpėje įtaką kaliogenezei nustatėme, kad veislės ir mikroūgliai patikimai maţesniu daţnumu kalių formavo įtakoti 10 g/l sacharozės. Mikroūgliai pasodinti į MS ½ terpę su 10 g/l sacharozės formavo maţesnį kalių (3.3.2 lentelė).

3.3.2 lentelė. Sacharozės kiekio MS ½ terpėje įtaka kriaušių kaliogenezei in vitro

LAMMC SDI, 2010 m.

Tirta Kalių Tirta Mikroūglių Sacharozės Kalio dydis veislių formavusių mikroūglių formavusių kiekis g/l mm vnt. veislių % vnt. kalių % 10 19 31,6 176 21,6 3,1

20 13 84,6 63 47,6 3,5

R05 37,48 18,34 0,28

Apibendrinę tyrimo rezultatus, galime teigti, kad šaknydinimo MS ½ terpėje sacharozės kiekį padidinus nuo 10 g/l iki 20 g/l sacharozės kiekiu, kriaušės P. communis veislių šaknijimosi daţnumas padidėjo, įsišakniję eksplantai turėjo daugiau šaknų ir jos buvo ilgesnės. Minėtoje terpėje daugiau veislių ir mikroūglių formuoja sąlyginai nedidelį kalių.

26 3.4. Mikroūglių mirkymo skirtingos koncentracijos ISR tirpaluose įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro

Skirtingi fitohormonai, įvairūs jų deriniai bei skirtingos koncentracijos turi įtakos augalų morfogenezės krypčiai ir eigai in vitro (Stanys, 1997). Augalus dauginant ţaliaisiais auginiais, pastarieji prieš juos susmaigstant į šaknydinimo substratą mirkomi ISR tirpaluose. Al-Maarri K. (1994) ir bendraautoriai tyrė kriaušių veislę Williams bei veislės Passe Crassane sėjinukus ir parodė teigiamą mirkymo fitohormonų 2,0 mg/l tirpale įtaką jų šaknijimuisi. Mes tyrėme kriaušių eksplantų – mikroūglių mirkymo ISR tirpale įtaką kriaušių šaknijimuisi in vitro. Šiam tikslui kriaušių mikroūglius prieš juos sodinant į šaknydinimo terpę, 24 valandas mirkėme 2,5 ir 5,0 mg/l ISR tirpaluose. Tyrimo rezultatai parodė, kad mikroūglių mirkymas ISR tirpaluose duoda teigiamą efektą jų šaknijimuisi (3.4.1 pav.). Šis efektas buvo stebimas genotipų ir eksplantų lygmenyje. Lyginant su kontroliniu variantu, mikroūglių pamirkymas 2,5 ir 5,0 mg/l ISR tirpaluose ţenkliai padidino įsišaknijusių veislių ir mikroūglių kiekį. Variante, kai mikroūgliai buvo mirkyti 5,0 mg/l ISR tirpale, po 3 kultivavimo mėnesių buvo rasta net 82,3% įsišaknijusių veislių ir 37,3% mikroūglių. Kontroliniame variante šaknijimosi procentas buvo maţesnis (įsišaknijo 37,5% veislių ir 8,9% mikroūglių).

3.4.1 pav. Mikroūglių mirkymo skirtingos ISR koncentracijos tirpaluose įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro LAMMC SDI, 2010 m.

Tyrimo metu paaiškėjo, kad prieš sodinant į šaknijimosi terpę kriaušių mikroūglių pamirkymas ISR tirpale indukuoja ne tik šaknų, bet ir kaliaus formavimąsi (3.4.2 pav.).

27 Mikroūglių mirkymas didesnės koncentracijos ISR tirpale paskatino didesnį kriaušių veislių kiekį formuoti ne tik šaknis (3.4.1 pav.), bet ir kalių (3.4.2 pav.). Kontroliniame variante kalių formavo 12,5% tirtų veislių ir 4,4% mikroūglių. Mikroūglius pamirkius 2,5 ir 5,0 mg/l ISR tirpaluose kalių formavo atitinkamai 67,6 ir 82,3% veislių ir atitinkamai 73,7 ir 71,3% mikroūglių. Eksplantų mirkymas didesnės koncentracijos ISR tirpale ţenklesnę įtaką turėjo veislių, negu mikroūglių kaliogenezei.

3.4.2 pav. Mikroūglių mirkymo skirtingos ISR koncentracijos tirpaluose įtaka kriaušių kaliaus formavimuisi in vitro (tirtos 34 veislės) LAMMC SDI, 2010 m.

Siekiant sukurti kuo universalesnes šaknijimosi sąlygas, pritaikytas didelei genotipų įvairovei, pabandėme keisti mikroūglių mirkymo 5,0 mg/l ISR tirpale trukmę. Mikroūgliai prieš sodinant į šaknydinimo terpę 5,0 mg/l ISR tirpale buvo mirkomi 8, 24 ir 48 valandas. Gauti rezultatai pateikti 3.4.3 pav. rodo, kad tinkamiausia mikroūglių mirkymo 5,0 mg/l ISR tirpale trukmė yra 24 valandos: per 3 mėnesius įsišaknijo 80% tirtų veislių. Kriaušės P. communis veislių šaknijimosi dinamika priklausė nuo mikroūglių mirkymo trukmės. Kontroliniame (be mirkymo) variante per pirmą mėnesį įsišaknijo 20% veislių. Po 5 mėnesių įsišaknijusių veislių kiekis liko nepakitęs. Tuo tarpu variante, kai mikroūglių mirkymo trukmė buvo 24 valandos po mėnesio įsišaknijo net 60%, o po 3 mėnesių 80% tirtų veislių. Panašios šaknijimosi dinamikos tendencijos ir kituose mirkymo trukmės ISR tirpale variantuose, bet juose gauta patikimai maţiau įsišaknijusių veislių (3.4.3 pav.).

*48 valandų duomenys pateikti įvertinus juos po 3 mėn, dėl vėliau išplitusios infekcijos. 3.4.3 pav. Mikroūglių mirkymo ISR (5 mg/l) tirpale trukmės įtaka kriaušių skirtingų veislių šaknijimuisi in vitro (tirta 5 veislės) LAMMC SDI, 2010 m.

3.4.1 lentelėje pateikta mikroūglių šaknijimosi priklausomybė nuo jų mirkymo 5,0 mg/l ISR tirpale trukmės. Patikimai geriau šaknijosi mikroūgliai kai jų mirkymo trukmė buvo 24 valandos, įsišaknijo 20,7% tirtų mikroūglių (3.4.1 lentelė). Šaknų kiekis tenkantis vienam įsišaknijusiam mikroūgliui ir šaknų ilgiai visuose tirtuose variantuose buvo panašūs ir esminiai nesiskyrė.

3.4.1 lentelė. Eksplantų – mikroūglių mirkymo 5,0 mg/l ISR tirpale trukmės įtaka kriaušių šaknijimuisi in vitro (vertinta po 5 mėn.) LAMMC SDI, 2010 m.

Mirkymo Tirta Įsišaknijusių Šaknų kiekis Vidutinis trukmė mikroūglių mikroūglių įsišaknijusiam šaknų ilgis val. vnt. % mikroūgliui vnt. cm 0 45 11,1 1,6 4,7 8 48 18,8 1,6 4,8 24 82 20,7 1,5 4,4 48* 38 10 1,1 2,8

R05 5,39 0,24 0,93

*duomenų rezultatai po 3mėnesių.

Kaliogenezės rezultatai, priklausomai nuo mikroūglių mirkymo ISR tirpale trukmės pateikti 3.4.2 lentelėje. Maţiausiai veislių ir mikroūglių formavusių kalių rasta, 29 variante, kai jie mirkyti 5,0 mg/l ISR tirpale (6,3%) 8 valandas. Šiame variante mikroūglių suformuoto kalio dydis buvo maţiausias (2,7 mm).

3.4.2 lentelė. Eksplantų – mikroūglių mirkymo ISR tirpale (5,0 mg/l) trukmės įtaka kalio formavimuisi in vitro LAMMC SDI, 2010 m. Veislių Mirkymo Tirta Tirta Mikroūglių Mikroūglių kalio formavusių trukmė veislių mikroūglių formavusių kalių dydis kalių vnt. vnt. % mm val. % 0 8 45 50 11,1 2,6 8 8 48 25 6,3 2,7 24 10 82 50 37,8 3,7 48* 5 38 50 10,8 4,3

R05 12,5 14,37 0,82 *duomenų rezultatai po 3mėnesių (bandymas nutrauktas, dėl infekcijų)

Atlikti tyrimai rodo, kad kriaušių P. communis šaknijimosi in vitro efektyvumą galima padidinti mikroūglius prieš sodinant į šaknijimosi terpę pamirkius 5,0 mg/l ISR tirpale 24 valandas, o kriaušių rizogenezės tyrimo trukmė in vitro turėtų būti ne trumpesnė kaip 3 mėnesiai.

3.5. Augimo reguliatorių ISR, IAR ir NAR įtaka kriaušių mikroūglių rizogenezei in vitro

Daugelis augalo audinių fiziologinės būsenos pasikeitimų yra sąlygojami fitohormonų (Sliesaravičius, Stanys, 2005). Auksinai skatina augalų auginiuose esančių šaknų uţuomazgų susidarymą, šaknijimosi procesą. Skirtingų auksinų įtaka rizogenezės indukcijai gali būti nevienoda. Dennis Y. Yeo (1995) tyrė fitohormonu ISR ir NAR 0,5 mg/l įtaką kriaušių veislių Pyrus calleveryana Oregon Pear 157, P. betulifolia OPR 260 ir P. communis Old Home x Farnningdale 230) įsišaknijimui. Gauti rezultatai parodė, kad didesnę teigiamą įtaką kriaušių šaknijimuisi turėjo ISR, negu NAR. Kiti autoriai tyrę Pyrus pyrifolia 'Wild pear' šaknijimąsi in vitro. Šaknijimosi terpę papildţius ISR ir NAR (po 0,25 mg/l) deriniu gavo esminius šaknijimosi rezultatus, negu papildţius terpes 0,5 mg/l ISR ir NAR fitohormonais atskirai. (Thakur, Kanwar, 2008; Haq, Kaloo, 2010).

30 Mes tyrėme vienodos koncentracijos (0,5 mg/l) ISR, IAR ir NAR augimo reguliatorių esančių MS ½ terpėje įtaką kriaušių rizogenezei in vitro (3.5.1 lentelė). Po 6 mėnesių kultivavimo in vitro sąlygose patikimai daugiausiai veislių formavo šaknis naudojant 0,5 mg/l ISR. Šiame variante gauta 71,9% įsišaknijusių veislių. Variantuose su IAR ir su NAR įsišaknijusių veislių rasta apie 60%. MS ½ terpę papildţius ISR + IAR kompleksu (kiekvieno po 0,5 mg/l) įsišaknijusių veislių jau po mėnesio buvo 61,5%, o jų kiekis maţai pakito ir po 6 mėnesių kultivavimo. Tuo tarpu aukščiau minėtuose variantuose priklausomai nuo kultivavimo trukmės įsišaknijusių veislių tolygiai didėjo.

3.5.1 lentelė. Augimo reguliatorių ISR, IAR ir NAR įtaka kriaušių veislių šaknijimuisi in vitro LAMMC SDI, 2010 m.

Augimo Tirta veislių Įsišaknijusių veislių kiekis % reguliatoriai vnt. Po 1 mėn. Po 2 mėn. Po 3 mėn. Po 6 mėn. 0,5 mg/l ISR 15 40 60 70 71,9

0,5 mg/l IAR 15 40 53,5 60 62,3

0,5 mg/l NAR 15 20 40 60 60 0,5 mg/l ISR + 11 61,5 61,5 61,5 63,6 0,5 mg/l IAR

R 16,95 9,80 4,80 5,18 05

Įsišaknijusių mikroūglių daţnumas buvo didţiausias MS ½ terpėje papildytoje 0,5 mg/l IAR. Šioje terpėje kriaušių mikroūglių rizogenezės indukcijos trukmė buvo trumpesnė. Po pirmo mėnesio įsišaknijo 17,6%, po 2 mėnesių 32,4%, vėliau neţymiai kito. ISR fitohormono įtaka mikroūglių šaknijimuisi buvo maţesnė nei IAR (3.5.2 lentelė).

3.5.2 lentelė. Augimo reguliatorių ISR, IAR ir NAR įtaka kriaušių mikroūglių šaknijimuisi in vitro LAMMC SDI, 2010 m.

Tirta Įsišaknijusių mikroūgliu kiekis % Augimo mikroūglių reguliatoriai vnt. Po 1 mėn. Po 2 mėn. Po 3 mėn. Po 6 mėn. 0,5 mg/l ISR 74 9,5 16,2 24,3 25,7 0,5 mg/l IAR 74 17,6 32,4 33,8 34,2 0,5 mg/l NAR 74 5,4 13,5 22,9 22,9 0,5 mg/l ISR + 64 17,2 23,5 25 25 0,5 mg/l IAR

R05 5,98 8,46 4,94 4,98

31 Kriaušių mikroūgliai pasodinti į terpę su 0,5 mg/l IAR formavo patikimai didesnį šaknų kiekį, nei pasodinti į terpes su ISR, NAR ar su ISR + NAR kompleksu (3.5.3 lentelė). Terpėje su IAR įsišakniję mikroūgliai turėjo vidutiniškai po 3,3 šaknis. Išmatavus šaknų ilgius, nustatyta, kad mikroūgliai patikimai ilgesnes (3,2 cm) šaknis formavo paveikti fitohormonų ISR + IAR kompleksu (3.5.3 lentelė).

3.5.3 lentelė. Augimo reguliatorių ISR, IAR ir NAR įtaka kriaušių šaknų kiekiui ir jų ilgiui in vitro (po 6 mėn.) LAMMC SDI, 2010 m.

Tirta Vidutinis šaknų kiekis Vidutinis šaknų Augimo reguliatoriai mikroūglių įsišaknijusiam mikroūgliui ilgis vnt. vnt. cm 0,5 mg/l ISR 74 2,2 2,5 0,5 mg/l IAR 74 3,3 2,7 0,5 mg/l NAR 74 1,9 1,8 0,5 mg/l ISR + 0,5 mg/l IAR 64 2,4 3,2

R05 0,60 0,58

Kriaušės P. communis tirtos veislės formavo kalių veikiamos visų tyrime naudotų augimo reguliatorių. 3.5.1 A pav. pateikti duomenys rodo, kad maţiausiai veislių formavusių kalių buvo rasta variante, kai mikroūgliai buvo pasodinti į MS ½ terpę papildytą ISR + IAR fitohormonų kompleksu. Veislių, formavusių kalių, kiekio dinamika visuose tyrimo variantuose buvo panaši: po 2 mėn. daugumos veislių kalio formavimasis sustojo. Įvertinus mikroūglių kaliogenezę (3.5.1 pav.), nustatyta, kad maţiausiai mikroūglių formavo kalių, kai pastarieji buvo veikiami fitohormono IAR 0,5 mg/l. Šiame variante per visą tyrimo laikotarpį mikroūglių su kaliu kiekis išliko beveik nepakitęs. Kituose tirtuose variantuose per antrą kultivavimo mėnesį mikroūglių su kaliu kiekis patikimai padidėjo.

B 3.5.1 pav. Augimo reguliatorių ISR, IAR , NAR ir ISR + IAR įtaka kriaušių veislių (A) ir mikroūglių (B) kaliaus formavimuisi in vitro LAMMC SDI, 2010 m.

Apibendrinus gautus tyrimo rezultatus galime teigti, kad 0,5 mg/l ISR priedas šaknydinimno terpėje didina įsišaknijusių genotipų kiekį (3.5.1 B pav). Fitohormono IAR (0,5 mg/l) priedas sąlygojo įsišaknijusių mikroūglių ir susiformavusių šaknų kiekį, o ISR ir IAR kompleksas – šaknų ilgį.

33 3.6 Kriaušių šaknijimosi dinamika ir veislių adaptyvumas in vitro

Daugumos tirtų kriaušių veislių šaknijimosi dinamika in vitro individuali. Ištyrus 34 kriaušių veislių šaknijimosi dinamiką nustatyta, kad dalis tirtų veislių (47,1 %) įsišaknijo per pirmąjį mėnesį (3.6.1 pav.). Per 2 mėnesius šaknis regeneravo 64,7 % genotipų, o per 5 mėnesius – 88,2%. Vėliau įsišaknijusių veislių kiekis nekito. 12% tirtų veislių neįsišaknijo ir po 8 kultivavimo mėnesių. Tyrimų rezultatai rodo, kad in vitro šaknydinamas kriaušių veisles tikslinga kultivuoti ne trumpiau kaip 5 mėnesius.

3.6.1 pav. Kriaušių kultivavimo in vitro trukmės įtaka įsišaknijusių veislių kiekiui LAMMC SDI, 2010 m. Kai kurioms tirtoms veislėms reikalingos specifinės egzogeninės sąlygos jų rizogenezei indukuoti. 3.6.1 lentelėje pateikta 6 skirtingų veislių šaknijimasis MS ½ terpėje papildytoje skirtingais augimo reguliatoriais ir jų deriniu.

3.6.1 lentelė. Fitohormonų įtaka skirtingų kriaušių genotipų šaknijimuisi in vitro LAMMC SDI, 2010 m. ISR+ IAR 0,5 Veislė ISR 0,5 mg/l IAR 0,5 mg/l NAR 0,5 mg/l mg/l Ivanausko + + + + raudonoji Juozapinė + + + - President + + + + Rusa + + + + Santa Marija + + - - Ţiemos dekanka + - - - 34 Tirtos veislės nevienodai reagavo į tas pačias kultivavimo sąlygas. Veislės Ivanausko raudonoji, President ir Rusa šaknijosi visuose variantuose. Veislės Juozapinė, Santa Marija ir Ţiemos dekanka visiškai nesišaknijo terpėje su ISR+ IAR priedu. 'Santa Marija' ir 'Ţiemos dekanka' nesišaknijo terpėje su NAR ir ISR + IAR priedu, o 'Ţiemos dekanka' šaknijosi tik terpėje su ISR priedu. Tai įrodo, kad, in vitro saugoma kriaušių kolekcija genetiniu poţiūriu labai įvairi. Sun Q. su bendraautoriais (2009) parodė, kad tose pačiose sąlygose diploidinės kriaušės šaknijosi, o triploidinės ir tetraploidinės visai neformavo šaknų. Be to galima manyti, kad kriaušių skirtingų genotipų šaknijimuisi įtakos gali turėti ne tik egzogenių augimo reguliatorių poveikis, bet ir skirtingų genotipų endogeninių hormonų kiekis ir jų santykis.

3.7. In vitro įšaknydintų kriaušių augalų prigyjimo daţnumas in vivo sąlygomis

In vitro įšaknidinti augalai yra pripratę prie sterilių dirbtinių augimo sąlygų. Jų perkėlimas į nesterilią aplinką yra vienas iš kritiškiausių etapų. Mūsų tyrime in vitro įsišakniję mikroūgliai buvo pasodinti į durpių substratą ir auginami šildomame šiltnamyje. Prieš pasodinant į durpių substratą, augalai buvo įvertinti pagal susiformavusio kalio dydį ir sąlyginai suskirstyti į 3 grupes: maţas kalius (0 – 3 mm), vidutininis kalius (4–6 mm) ir didelis kalius (6–10 mm). Tyrimų rezultatai parodė, kad in vivo sąlygomis išgyvenusių augalų daţnumą sąlygoja kaliaus dydis. Augalų, kurie neturėjo kaliaus arba jis buvo maţas, išgyvenimo daţnumas buvo net 74%. Tuo tarpu vidutinį ir didelį kalių suformavusių augalų prigijimo daţnumas buvo atitinkamai 56,3% ir 44,5% (3.7.1 lentelė).

3.6.2 lentelė. In vitro įšaknydintų kriaušių augalų prigijimas in vivo LAMMC SDI, 2010 m. Pasodinta augalų Prigijusių augalų kiekis Prigijusių augalų Kalio dydis vnt. vnt. % maţas (0–3 mm) 77 57 74,0 vidutiniškas (4–6 mm) 64 36 56,3 didelis (7–10 mm) 36 16 44,5

R05 14,85

Remdamiesi gautais rezultatais galime teigti, kad in vitro įšaknydintų kriaušių augalų prigijimas in vivo (durpių substrate) 44,5–74,0 %. Prigijusių augalų kiekis priklauso nuo kaliaus, susiformavusio ant eksplantų, dydţio.

35 IŠVADOS

1. Kriaušės (P. communis) veislėms įšaknydinti in vitro gerausiai naudoti intensyviai augančius 1,5 cm dydţio eksplantus – mikroūglius, paimtus iš 4 savaičių amţiaus kultūros. 2. Prieš sodinant į šaknydinimo terpę MS½ + 20 gr/l sacharozės tikslinga kriaušių eksplantus – mikroūglius 24 valandas pamirkyti 5 mg/l ISR tirpale. Tai paspartina kriaušių rizogenezės pradţią, padidina įsišaknijusių genotipų bei eksplantų kiekį. 3. Augimo reguliatoriai ISR, NAR ir IAR (koncentracijos po 0,5 mg/l) skatina kriaušių šaknijimąsi. ISR didina įsišaknijusių genotipų kiekį, IAR didina įsišaknijusių mikroūglių ir susiformavusių šaknų kiekį, o ISR + IAR kompleksas – šaknų ilgį. 4. Skirtingų kriaušių veislių šaknijimosi dinamika in vitro nevienoda. Dauguma tirtų veislių pasiţymi dideliu adaptyvumu, t.y sugebėjimu skirtingomis sąlygomis formuoti šaknis, tačiau daliai veislių įšaknydinti in vitro reikalingos specifinės sąlygos. In vitro sąlygomis kriaušių mikroūglių rizogenezės procesas gali uţsitęsti iki 5 mėnesių. Todėl sunkiai besišaknijančių veislių eksplantus šaknidinimo terpėje tikslinga auginti ir stebėti iki 5 mėnesių. 5. In vitro įšaknydintų kriaušių augalų prigijimas in vivo (durpių substrate) 44,5–74,0 %. Prigijusių augalų kiekis priklauso nuo kaliaus, susiformavusio ant eksplantų, dydţio.

36 PADĖKA

Dr. Daliai Gelvonauskienei

Prof. habil. dr. Vidmantui Staniui

Uţ pagalbą ruošiantis baigiamajam magistriniui darbui.

37 LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. AHMED, M.; ANJUM, M. A.; SHAH, A. H. and HAMID A. In vitro preservation of Pyrus germplasm with minimal growth using diferent temperature regimes. Pak. J. Bot., 42 (3), 2010. p. 1639-1650. 2. AHMED, A. OBEIDY and SMITH, M. A. L. A. Versatile New Tactic for Fruit Tree Micrografting. American Society for Horticultural Science. Oct./Dec. 1991. p. 91-95. 3. AGRIOS, G. N. Plant pathology. California, 2004. p. 922. 4. ANTONOPOULOU, C.; DIMASSI, K.; THERIOS, I. and CHATZISSAVVIDIS, C. The influence of radiation quality on the in vitro rooting and nutrient concentration of rootstock. Biologia plantrum 48 (4), 2004. p. 549-553. 5. AL-MAARRI, K. Y.; ARNAUD, E. MIGINIAC. Micropropagation of Pyrus communis cultivar ‘Passe Crassane’ seedlings and cultivar ‘Williams’: factors affecting root formation in vitro and ex vitro. Scientia Horticulturae, 58 (3), 1994. p. 207-214. 6. AUŠKALNIĖNĖ, O. Augimo reguliatoriaus trineksapak-etilo ir jo mišinių įtaka ţieminių kviečių stiebų biometriniams rodikliams. Žembirbystė. Mokslo darbai, 1, 89, 2005. p. 81-92. 7. BARALDI, R.; BERTAZZA, G.; BREGOLI, A. M.; FASOLO, F.; et al. Auxins and Polyamines in Relation to Differential in Vitro Root Induction on Microcuttings of Two Pear Cultivars. J Plant Growth Regul 14, 1995. p. 49-59. 8. BARANAUSKAITĖ, L. Bakterinė degligė Erwinia amylovora). VAAT, 2006. 9. BELLIS, DE PALMIRA.; SCHENA, LEORANDO.; CARIDDI, CORRADO. Real- time Scorpion –PCR detection and quantification of Erwinia amylovora on pear leaves and

flovers. Eur J Plant Pathol 118, 2007. p. 11–22. 10. BERTAZZA, G.; BARALDI, R.; PREDIERI, S. Light effects on in vitro rooting of pear cultivars of different rhizogenic ability. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 41, 1995. p. 139-143. 11. BULAVIENĖ, D.; BUTKUS, V.; IVANAUSKAS, T.; LAPINSKAS, E. ir kt. Lietuvos pomologija. Vilnius, 1974. p. 184. 12. CALZOLARI, A.; FINELLI, F. and MAZZOLI, GL. A severe unforessen outbreak of fire blight in the Emilia-Romagna region. Acta. Horticulturae 489, 1999. p. 171-176. 13. DAPKEVIČIUS, Z.; BRAZAUSKIENĖ, I. Augalų patologija. Akademija, 2007. p. 493. 14. DARGINAVIČIENĖ, J.; NOVICKIENĖ, L. Augimo problemos šiuolaikinėje augalų fiziologijoje. Lietuvos mokslų akademijos leidykla, Vilnius, 2002. p. 42-45. 15. DENNIS, Y. YEO. Micropropagation of Tree Tyrus Rootstocks. Hort. Science 30 (3), 1995. p. 620-623. 38 16. DONDINI, L.; PRIERANTONI, L.; GAIOTTI, F.; CHIODIONI, R.; TARTARINI, S.; BAZZI, C. and SANSAVINI, S. Identifying QTLs for fire-blight resistance via a European pear (Pyrus communis L.) genetic linkage map. Kluwer Academic Publishers, Molecular Breeding 14, 2004. p. 407-418. 17. DUNCAN, D. R.; WILLIAMS, M. E.; ZEHR, B. E. et al. The production of callus apable of plant regeneration from immature embryos of numerous Zea mays genotypes. Planta 165, 1985. p. 322-332. 18. DZIEDZIC, E.; MALODOBRY, M. Vegetative cherry rootstochs in tissue culture. Sodininkysė ir daržininkystė. 25 3), 2006. p. 77-84. 19. EL-RAHMAN, A.; AL-ANYSARY, M. F.; RIZALLA, A. A. AND BADR-ELDEM, A. M. Micropropagation and Biochemical Genetic Markers detection for Drought and Salt tolerance of Pear Rootstock. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 1 (4), 2007. p. 625-636. 20. ELSHIHY, O. M.; SHARAF, A. N. and MUZHER, B. M. Morphological, anatomical and biochemical characterization of Syria pear Pyrus syriaca Boiss genotypes. Arab J. Biotech., Vol. 7, No. 2 , 2004. p. 209-218. 21. FOTOPOULOS, S.; SOTIROPOULOS, E. T. In vitro rooting of PR 204/84 rootstock (Prunus persica x P. amygdalus) as influenced by mineral concentration of the culture medium and exposure to darkness for a period. Agronomy Research 3 (1), 2005. p. 3-8. 22. GELVONAUSKIS, B.; GELVONAUSKIENĖ, D.; BANYTĖ, I. Kriaušių fenologija ir ţiedų atsparumas pavasario šalnoms. Lietuvos sodininkystės ir darţininkystės instituto ir Lietuvos ţemės ūkio universiteto mokslo darbai. Sodininkystė ir daržininkystė. 24 1), 2005. p. 9-15. 23. HAQ, Z.; KALOO, Z. A. In vitro micro propagation of "sand pear" Pyrus pyrifolia Burn. F.) Nakai. Front. Agric. China 4 3), 2010. p. 358-361. 24. HENNAYAKE, K. C.; DISSANAYAKE, K.; MATSUDA, N. et al. An Efficient and Reproducible in vitro Plant Regeneracion from Leaf Discs in Pear Cultivars (Pyrus spp.). Plant Biotechnology, 20 (4), 2003. p. 283-289. 25. IKASE, L. Malus/Pyrus genetic resources in Latvia. Latvian State Institute of Fruit Growing, 2008. p. 16. 26. YASEEN, M.; AHMAD, T.; ABBASI, N. A. and HAFIZ, I. A. Assessment of apple rootstocks M 9 and M 26 for in vitro rooting potential using different carbon sources. Pak. J. Bot., 41 2), 2009. p. 769-781.

39 27. YEO, Y. D.; REED, M. B. Micropropagation of Three Pyrus Rootstocks. HortScience 30 3), 1995. p. 620-623. 28. JAKIENĖ, E.; VENSKUTONIS, V. Augimo reguliatoriai augalininkystėje. Akademija, Kauno r.: Lietuvos ţemės ūkio universiteto Leidybos centras, 2008. p. 80. 29. KASSIM, N. E.; RAYYA, S. M. A.; ALI, E. A. M. Effect of explant types and different basal nutrient media on in vitro growth of bitter almond cutting during establishment and proliferation states. Journal or American Science 6(10), 2010. p. 408-411. 30. KVIKLYS, D. Kriaušių pasiūla maţesnė uţ paklausą. Mano ūkis, 7, 2007. [interaktyvus], nr. [ţiūrėta 2010 m. gruodţio 04 d.]. Prieiga per internetą: < http://www.manoukis.lt/?m=1&s=1317&z=63> 31. LIETUVOS RESPUBLIKOS ŢEMĖS ŪKIO MINISTERIJA. Lietuvoje – bakterinės degligės protrūkis, 2007. p. 12. 32. LUKOŠEVIČIUS, A. Kriaušių auginimas. Kaunas, 1994. p. 79. 33. LUKOŠEVIČIUS, A. Kriaušių veislės (katalogas). Lietuvos sodininkystės ir darţininkystės institutas, 2003. p. 174. 34. MAGGIONI, L.; FISCHER, M.; LATEUR, M.; LAMONT, e-J. and LIPMAN, E. Report of a Working Group on Malus/Pyrus. European Cooperative Programme for Crop Genetic Resources Networks, 2002. p. 312-320. 35. MURASHIGE, T.; SKOOG F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 1962. p. 473–479. 36. NAGHMOUCHI, S.; KHOUJA, L. M.; REBEJ, N. M.; BOUSSAID, M. Effect of growth regulators and explant origin on in vitro propogation of Ceratonia siliqua L. Via cuttings. Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 12 (3), 2008. p. 251-258. 37. O'CONNOR-SANCHEZ; AILEEN; DOMINGUEZ-MAY, V. ANGEL; KEB-LLANES, A. and another. Efficient plant regeneration from leaf explants of Solanum americanum. African Journal of Biotechnology Vol. 9 (36), 2010. p. 5830-5835. 38. PILECKIS, S.; REPŠIENĖ, D.; VENGELIAUSKAITĖ, A.; ŢUKLIENĖ, R.; ŢUKLYS, L. Sodo kenkėjai ir ligos. Vilnaius Mokslo ir enciklopedijų leidykla, 1994. p. 461. 39. POSTMAN, J. D. World Pyrus Collection at USDA Genebank in Corvallis, Oregon. U.S. Departament of Agriculture, 2008. p. 357-362. 40. RAFAIL, S. T. and MOSLEH, M. S. Factors involved in micropropagation and shoot-tip grafting of Apple Mallus domestica Borkh.) and Pear Pyrus sp.L. . World Food System – A Contribution ftom Europe. Departament of Horticulture, College of Agriculture University of Duhok, Iraq, 2010. p. 1-4.

40 41. SEDLAK, J.; PAPRŠTEIN, F. In vitro propogation of blue honeysuckle. Czech Republick. Hort. SCT (PRAGUE), 34(4), 2007. p. 129-131. 42. SHARMA, T.; MODGIL, M.; THAKUR, M. Factors affecting induction and developmentof in vitro rooting in apple rootstocks. Indian Journal of Experimental Biology Vol. 45, 2007. p. 824-829. 43. SHATNAWI, M. A.; SHIBLI, R. A. et al. Influence of Different Carbon Sources on Wild Pera (Pyrus syriaca) Growth and Sugar Uptake. World Journal of Agricultural Sciences 2 (2), 2006. p. 156-161. 44. SLIESARAVIČIUS, A.; STANYS, V. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Vilnius, 2005. p. 234. 45. STANYS, V. In vitro kultūra augalų selekcijoje. Kintamumas ir stabilumas. Babtai, 1997. p. 120. 46. STANYS, V. Sodo augalų mikrovegetatyvinio dauginimo metodiniai nurodymai. Babtai, 1998. p. 28. 47. SUN, Q.; SUN, H.; BELL, R. Effect of polyvinyl alcohol on in vitro rooting capacity of shoots in pear clones (Pyrus communis L.) of different ploidy. Plant Cell Tiss Organn Cult / 99, 2009. p. 299-304. 48. TANG, H.; LUO, Y.; LIU, C. Plant regeneration from in vitro leaves of foure commercial Pyrus species. P.R. China. Plant soil environ., 54 (4), 2008. p. 140-148. 49. TARAKANOVAS, P.; RAUDONIUS, S. Agronominių tyrimų statistinė analizė, taikant kompiuterines programas ANOVA, STAT, SPLIT-PLOT iš paketo SELEKCIJA ir IRRISTAT. Akademija, 2003. p. 56. 50. THAKUR, A.; KANWAR, J. S. Micropropagation of 'Wild pear' Pyrus pyrifolia Burm F.) Nakai. II. Not.Bot.Hort. Agrotot. Cluj 36 2), 2008. p. 104-111. 51. TOUQEER, A.; NADEEN, A. A.; ISHFAQAHMAD, H. A. and ANSAR, A. Comparison of sucrose and sorbitol as main carbon energy sources in micropagation of Peach rootstock GF-677. Pak. J. Bot., 39 4 , 2007. p. 1269-1275. 52. TUINYLA, V.; LUKOŠEVIČIUS, A.; BANDARAVIČIUS, A. Lietuvos pomologija 1. Vilnius, 1990. p. 336. 53. ZANOL, C.; FORTES, G.; SILVA, J.; CAMPOS, A.; CENTELLAS, A.; MULLER, N. & GOTTINARI, R. Influence of the darkness and the indol-3-butyric acid on in vitro rooting and peroxidase activity of the apple rootstock Marubakaido. Rev. Bras. Agr. 3, 1997. p. 23–30. 54. BИTKOBCKИЙ B. Л. Плоговые pacmeния мира. Красноград, 2003. c. 592.

PRIEDAI

1 PRIEDAS Jaunasis mokslininkas 2011

43 2 PRIEDAS KRIAUŠIŲ (PYRUS COMMUNIS L.) RIZOGENEZĖS TYRIMAI IN VITRO Giedrė KONTRIMAVIČIENĖ Vadovas prof. habil. dr. Vidmantas Stanys Lietuvos ţemės ūkio universitetas, Sodininkystės ir darţininkystės katedra, el. paštas: [email protected]

Įvadas LAMMC SDI kriaušių kolekcijoje in vitro yra saugoma per 200 pavyzdţių. Kolekcija reikšminga moksliniams tyrimams, o daugelis genotipų, kaip tam tikrų genų donorai ar šaltiniai kriaušių selekcijai. Vienas iš būdų kolekcijai in vivo atstatyti yra savašaknių augalų išauginimas in vitro, jų adaptavimas in vivo, vėliau padauginimas medelyne ir pasodinimas sode. Siekiant determinuoti norimos krypties augalų morfogenezę in vitro turi būti atitinkamai parenkami ją lemiantys veiksniai (Sliesaravičius ir Stanys, 2005). Augalų rizogenezę in vitro sąlygoja augalo genotipas, mikroūglio tipas ir fiziologinė būsena, kultivavimo sąlygos, maitinamųjų terpių sudėtis, fitohormonai ir jų deriniai (Sharma, 2007; Tang et al., 2008; Sun et al., 2009). Tyrimų tikslas – parinkti sąlygas kriaušių rizogenezei in vitro.

Metodai ir sąlygos Kriaušių rizogenezės in vitro bandymuose buvo tirta nuo 5 iki 34 veislių. Kriaušėms mikrovegetatyviškai dauginti buvo naudota MS terpėje (Murashige, Skoog, 1962), papildyta 1,5 mg/l BAP. Kriaušių kultūra in vitro buvo kultivuojama fitotrone (21–25 C temperatūra ir 16 val. fotoperiodas per parą, liuminescencinėmis lempomis įšviečiant 50 μM m-2s-1 tankio fotonų srautą). Kriaušių rizogenezei naudota bazinė MS (1/2 makro druskų + 20 gr/l sacharozės) terpė, papildyta fitohormonais ISR (0,25, 0,5, 1,25, 2,5, 12,5 mg/l); IAR (0,5 mg/l) ir NAR (0,5 mg/l). Kriaušių eksplantai - mikroūgliai buvo imti iš 1, 1,5 ir 3 mėnesius kultivuotos kultūros. Kriaušių morfogenezė in vitro buvo registruota kas mėnesį. Kriaušių rizogenezės dinamika buvo tirta 8 mėnesius. Duomenų statistinis įvertinimas atliktas naudojant programas ANOVA ir STAT_ENG iš programų paketo SELEKCIJA ir IRRISTAT (Tarakanovas, Raudonius, 2003).

Rezultatai ir jų aptarimas Tirtų kriaušių veislių rizogenezę in vitro sąlygojo mikroūglio fiziologinė būsena, dydis ir kultūros, iš kurios buvo paimti mikroūgliai, amţiaus. Tyrimų rezultatai parodė, kad naudojant ramybės būsenoje esančius mikroūglius nesišaknijo nei viena tirta veislė. Kriaušių šaknijimui naudojant intensyviai augančios 1 mėn. amţiaus kultūros mikroūglius, įsišaknijusių veislių ir mikroūglių buvo gauta atitinkamai 58,3% ir 16,7 procento. Kalių formavo patikimai maţiau veislių ir mikroūglių, nei naudojant 1,5 ir 3 mėn. amţiaus kultūros mikroūglius (1 lentelė).

1 lentelė. Kriaušių rizogenezės priklausomybė nuo kultūros in vitro amţiaus Table 1. Pears rhizogenesis dependence of culture in vitro age

Tirta Įsišaknijusių Veislių Įsišaknijusių Mikroūglių Kultūros Tirta veislių, veislių, formavusių mikroūglių, formavusių amţius mikroūglių, vnt. vnt. proc. kalių, proc. proc. kalių, proc. 1 mėn. 12 58,3 41,7 102 16,7 15,7 1.5 mėn 15 60,0 100,0 74 18,9 87,8 3 mėn. 15 20,0 100,0 87 5,7 73,6

R05 22,61 33,65 7,07 38,19

Skirtingi auksinai nevienodai sąlygojo įvairių genotipų rizogenezę. Patikimai daugiau įsišaknijo kriaušių veislių (80 proc.), kai šaknijimo terpė buvo papildyta 0,5 mg/l ISR priedu. Įsišaknijusių mikroūglių patikimai daugiau buvo rasta terpėje su 0,5 mg/l ISR priedu (2 lentelė). ISR priedas didino vidutinį šaknų kiekį, tenkantį vienam įsišaknijusiam mikroūgliui. Tai rodo, kad skirtingi fitohormonai skirtingai veikia ne tik genotipų, bet ir eksplantų lygmenyje, o genotipų rizogenezės indukcijai būtinas egzogeninio ISR priedas. Ištyrus ISR skirtingų koncentracijų įtaką kriaušių rizogenezei buvo nustatyta, kad tirtų veislių rizogenezę palankiau sąlygojo nedidelės ISR (0,25 - 2,5mg/l) koncentracijos. Skirtingi autoriai, tirdami vienodus auksinus bei vienodas ar panašias jų koncentracijas, augalų šaknijimosi efektyvumą gauna skirtingą. (Ruţić et. al., 2008).

44 2 lentelė. Fitohormonų ISR, IAR ir NAR įtaka kriaušių rizogenezei in vitro (tirta 14 veislių) Table 2. Fitohormones ISR, IAR and NAR influance on pears rhizogenesis in vitro (studied 14 varieties)

Tirta Įsišaknijusių veislių/mikroūglių kiekis, proc. Fitohormonai veislių/mikroūglių, vnt. Po 1 mėn. Po 2 mėn. Po 3 mėn. 0,5 mg/l ISR 14/74 40,0 /9,5 60,0/18,9 80,0/18,9 0,5 mg/l IAR 14/74 40,0/17,6 53,3/27,0 60,0/32,4 0,5 mg/l NAR 14/74 20,0/4,1 40,0/14,9 60,0/25,7

R05 11,54/6,79 10,17/6,16 11,54/6,75

Atlikus gautų rezultatų analizę, išaiškėjo, kad daugumos tirtų kriaušių veislių šaknijimosi dinamika in vitro individuali: 47,1 proc. tirtų veislių įsišaknijo per pirmąjį mėnesį. Po 2 mėnesių įsišaknijusių genotipų buvo 64,7 prc., o po 5 mėnesių - 88,2 proc. Tirtų veislių grupėje 12 proc. genotipų neįsišaknijo ir po 8 kultivavimo mėnesių. Tai rodo, kad, kriaušių kolekcija genetiniu poţiūriu labai turtinga, genotipai labai skiriasi prigimtimi, galbūt net ploidiškumu. Sun su bendraautoriais parodė, kad tomis pačiomis sąlygomis diploidinės kriaušės šaknijosi, o triploidinės ir tetraploidinės visai neformavo šaknų (Sun et all., 2009).

Išvados 1. Nedideli auksino ISR (0,25 - 2,5mg/l) priedai šaknijimo terpėje patikimai padidina įsišaknijusių genotipų daţnumą ir vidutinį šaknų kiekį, tenkantį vienam įsišaknijusiam mikroūgliui. 2. Įvairių kriaušių veislių rizogenezės dinamika in vitro skirtinga. Siekiant įšaknidinti kriaušių veisles in vitro sąlygomis tikslinga jų mikroūglius kultivuoti ne trumpiau kaip 5 mėnesius.

Literatūra 1. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962. 15: 473–479. 2. Ruţić D., T. Vujović, S. Milenković, Rcerović, R. Mitetić,. The influence of imidazole fungicides on multiplication in vitro of pyrodwarf pear rootstock./ Australia journal of crop science 2008. 1(2):63-68. 3. Sharma T., M. Modgil, M. Thakur Factor effecting induction and development of in vitro rooting apple rootstocks. Indian Journal of Experimental Biology. 2007. 824-829 4. Sliesaravičius A., V. Stanys. Ţemės ūkio augalų biotechnologija. Vilnius, Enciklopedija, 2005.- 234 p. 5. Sun Q., H. Sun, R. Bell. Effect of polyvinyl alcohol on in vitro rooting capacity of shoots in pear clones (Pyrus communis L.) of different ploidy. Plant Cell Tiss Organn Cult / 2009. 99: 299-304 6. Tang H., Y.Luo, C. Liu. Plant regeneration from in vitro leaves of four comercial Pyrus species. Plant Soil Environ., 54, 2008. (4): 140-148 7. Tarakanovas P., Raudonius S. Agronominių tyrimų duomenų statistinė analizė taikant kompiuterines programas ANOVA, STAT, SPILT-PLOT iš paketo SELEKCIJA ir IRRISTAT. Metodinė priemonė. Akademija 2003.: 57

Summary PEARS (PYRUS COMMUNIS) RHIZOGENESIS RESEARCHES IN VITRO Were studied varieties rhizogenesis in vitro. The results showed that pears rhizogenesis process depends from explants physiological state, culture in vitro age, solid media composition, explants mechanism of action by exogenous gold type and time. The part of investigated varieties had quite big adaptability and plasticity, this means they were able faster or slower to form germs in different conditions. Another part of studied varieties was forming germs just in some studied conditions and the other part was not forming germs in none of our reserches examined conditions. Apparently, this could be influenced not only by our investigated factors but also by differnets genotypes endogenous hormones quantity and proportion.

45 3 PRIEDAS

Bova kursai

46 4 PRIEDAS

1 lentelė. Tyrimuose naudotos kriaušių veislės.

Eil. Nr. Veislė Eil. Nr. Veislė 1. Aleksandrinė 18. Konferencinė 2. Alka 19. Krasnodarskaja 3. Alna 20. Maria Luiza 4. Alvita 21. Oranţevaja 5. Astrchanskaja raniaja 22. Orlovskaja krasavica 6. Besėklė 23. Orlovskaja letniaja 7. Butt 24. Platonovskaja 8. Cook starking delicious 25. President

9. Čiţovskaja 26. Princesė Dagmar 10. Fertiliti 27. Raudonoji bergamotė 11. Fragrante 28. Santa Maria 12. Hasselpeare 29. Senryo 13. Juozapinė 30. Star Bros New 14. Miško graţuolė 31. Tavričeskaya 15. Kiefer 32. Tem Bo Li 16. Kisaversei 33. Tiučevskaja 17. Koncentrat 34 Ţiemos dekanka

47 5 PRIEDAS 2 lentelė. Kriaušių veislės augančios šiltnamyje.

Eil. Nr. Veislė Eil. Nr. Veislė 1. Butt 6. Ivanausko raudonoji 2. Cook Starking Delicious 7. Juozapinė 3. Fertiliti 8. Koncentrat 4. Princesė Dagmar 9. Oranţovoje 5. Senryo 10. Tajuščiaja

48 6 PRIEDAS

Mikroūgliai suformavę šaknis