Universidad De Guayaquil Facultad De Ciencias Químicas

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MODALIDAD: INVESTIGACION

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUIMICOS Y FARMACEUTICOS

TEMA:

EVALUACIÓN FITOQUIMICA Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS EN HOJAS Y FLORES DE Chuquiraga jussieui JF Gmeil (ASTERACEAE).

AUTORES:

CASTRO CASTRO LISSETTE JOHANNA SOSORANGA VALENCIA SILVANA LETICIA

TUTOR:

QF. CARLOS VITERI POVEDA MSc.

ASESOR EXTERNO

Lic. MIGDALIA MIRANDA PhD.

GUAYAQUIL – ECUADOR

AÑO 2020

FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA UNIDAD DE TITULACIÓN

REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

TÍTULO Y SUBTÍTULO: EVALUACION FITOQUIMICA Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS HIDROALCOHOLICOS EN HOJAS Y FLORES DE Chuquiraga jussieui J.F. Gmel (Asteraceae).

AUTOR(ES) (apellidos/nombres): CASTRO CASTRO LISSETTE JOHANNA y SOSORANGA VALENCIA SILVANA LETICIA

REVISOR(ES)/TUTOR(ES) Dra. QUESADA DELGADO ALEXANDRA (REVISORA) (apellidos/nombres): Dr. VITERI POVEDA CARLOS MSc. (TUTOR)

INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

UNIDAD/FACULTAD: FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MAESTRÍA/ESPECIALIDAD: QUIMICA Y FARMACIA

GRADO OBTENIDO: TERCER NIVEL –QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

FECHA DE PUBLICACIÓN: No. DE PÁGINAS:

ÁREAS TEMÁTICAS: CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

PALABRAS CLAVES/ KEYWORDS: Palabras claves: Chuquiraga jussieui, Tamizajes fitoquímicos, Metabolitos secundarios, Parámetros fitoquimicos.

Keywords: Chuquiraga jussieui, Phytochemical screening, Secondary metabolites, Phytochemical parameters

RESUMEN/ABSTRACT (150-250 palabras):

El presente trabajo tiene como objetivo estudiar las características fitoquimicas y actividad antioxidante Chuquiraga jussieui J.F.Gmel. Procedente de los Andes ecuatorianos, El Lirio, Cantón Colta, Chimborazo es una especie botánica de planta siempre verde con flor que pertenece a la familia Asteraceae que tiene varias propiedades beneficiosas. Los ensayos se realizaron en el laboratorio de investigación de la ESPOL; obteniendo como resultado de informar por primera vez las características macro y micromorfológica, así como los parámetros fitoquimicos y su actividad antioxidante de flores y hojas de la especie Chuquiraga jussieui.

The present work aims to study the phytochemical characteristics and antioxidant activity Chuquiraga jussieui J.F.Gmel. from the Ecuadorian Andes, El Lirio, Cantón Colta, Chimborazo is a botanical species of evergreen flowering plant belonging to the family Asteraceae that has several beneficial properties. The tests were carried out in the ESPOL research laboratory; obtaining as a result of reporting for the first time the macro and micromorphological characteristics, as well as the phytochemical parameters and its antioxidant activity of flowers and leaves of the species Chuquiraga jussieui.

ADJUNTO PDF: x SI NO CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono: 0991525453 Castro Lissethe Johana E-mail: [email protected]. 0982789861 Sosoranga Silvana Leticia [email protected]

CONTACTO CON LA INSTITUCIÓN: Nombre: SEDE CIENCIAS QUIMICAS

Teléfono: 042293680

E-mail: www.fcq.ug.edu.ec

DEDICATORIA

Lissette Johanna Castro Castro El presente trabajo investigativo se lo dedico principalmente a Dios por la guía y fortaleza con la que me ha mantenido en todo este proceso universitario, a mis padres que aunque no estén físicamente sé que estarían orgullosos por todo el esfuerzo y sacrificio con el que me he mantenido para alcanzar este logro.

A mi hermana que me apoyo en todo el transcurso de mi carrera, quien ha sido como una madre, a mi cuñado por alentarme a ser mejor profesional, a mis sobrinos por estar pendiente de mí en todo momento.

A mi amiga y compañera de tesis por saber comprenderme, apoyarnos mutuamente, a mis amigos por estar al pendiente de todo este proceso de ante mano muchas gracias por todo y cada uno de sus consejos.

DEDICATORIA

Silvana Leticia Sosoranga Valencia El presente trabajo está dedicado a Dios por darme vida, salud y fuerzas para perseverar y culminar mis estudios universitarios convirtiéndome en una profesional.

A mis padres que están orgullosos por todo el esfuerzo y sacrificio con el que me he mantenido para alcanzar este logro siendo mis mejores aliados, ayudándome con el sustento emocional, y económico durante el proceso de mis estudios.

A toda mi familia y amigos que con su apoyo e incentivación emocional me animaron a luchar por mi sueño.

A mis docentes universitarios que fueron mis guías durante el proceso de la carrera se los recuerda por su enseñanza e incentivación a ser mejores profesionales.

A mi compañera de tesis por saber comprenderme, apoyarme mutuamente durante la realización del trabajo.

AGRADECIMIENTO

Agradecemos a Dios por ser el guía de nuestra vida, por brindarnos salud para poder llegar a cumplir nuestra meta a nuestra familia por fortalecernos, quienes han sido pilar fundamental en el transcurso de todos estos años de estudio.

Expresamos nuestro más sincero agradecimiento a nuestros docentes por formar parte de todo este ciclo, impartiendo conocimientos que serán utilizados en nuestra vida laboral.

Destacando a una persona especial que se mantuvo firme en este trayecto llamado proceso de titulación siendo una persona con grandes conocimientos que nos sirvieron para hoy poder compartir esta tesis ante ustedes dándole un agradecimiento a nuestra asesora externa a la Lcda. Migdalia Miranda PhD.

Agradecemos a la Universidad de Guayaquil en especial a la Facultad de Ciencias Químicas por ser la sede de todo el conocimiento adquirido en estos años.

INDICE

RESUMEN ...... xxx

ABSTRACT ...... xxxi

INTRODUCCIÓN ...... 1

CAPITULO I ...... 2

1. El PROBLEMA ...... 2

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...... 2

1.1.1 Formulación del problema ...... 4 1.2 Justificación ...... 4

1.3 HIPOTESIS ...... 5

1.4 OBJETIVOS ...... 5

1.4.1 Objetivo General...... 5 1.4.2 Objetivos específicos...... 5 1.5 Operacionalización de las Variables...... 5

CAPITULO II ...... 6

I. Marco teórico ...... 6

I.1. Familia Asterácea ...... 6

I.1.1. Género Chuquiraga ...... 7 1.1.2. Distribución geográfica...... 8 1.1.3. Clasificación taxonómica ...... 8 1.1.4. Descripción botánica del género ...... 8 1.1.5. Estructura vegetativa ...... 9 1.1.6. Usos en medicina tradicional ...... 10 1.1.7. Composición química...... 10 1.1.8. Actividad farmacológica ...... 11 I.2 Algunos métodos de extracción y caracterización de productos naturales...... 11

I.2.1 Métodos de extracción ...... 12

I.2.1.1. Técnicas clásicas de extracción...... 12 I.2.1.2. Extracción sucesiva...... 14 I.2.2. Métodos de caracterización ...... 14 I.2.2.1. Métodos cromatográficos ...... 14 CAPITULO III ...... 17

METODOLOGÍA ...... 17

III.1. Tipo de investigación ...... 17

III. 2 Materiales y equipos...... 17

III.2.1. Equipos ...... 17 III.2.2. Aparatos ...... 17 III.2.3 Materiales...... 17 III.2.3. Reactivos ...... 18 III.3. Muestra ...... 18

III.4. Metodología Experimental ...... 18

III.4.1 Secado y trituración: ...... 18 III.4.2 Evaluación macro y micromorfológicas ...... 18 III.4.2.1 Evaluación macromorfológica de las flores y hojas de Chuquiragua . 18 III.4.2.2 Evaluación micromorfológica de las flores y hojas, ...... 19 III.4.3 Métodos fisicoquímicos de control de la calidad: ...... 19 III.4.3.1 Humedad residual ...... 19 III.4.3.2 Sustancias solubles o extraíbles ...... 20 III.4.3.3 Cenizas totales, cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 % ...... 20 III. 5. Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico ...... 21

III.6 Obtención de extractos y parámetros físico-químicos de calidad ...... 23

III.6.1 Parámetros de calidad de los extractos ...... 24 III.6.1.1 Análisis de la composición química de los extractos ...... 26 III.6.2.2 Determinación de flavonoides totales ...... 27 III.7 Determinación de la actividad antioxidante ...... 28

III.7.1 Actividad antioxidante por el método de FRAP (capacidad ferro-reductora) ...... 28 III.7.2 Capacidad secuestradora del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) 29 III.7.3 Ensayo del ABTS●+ (ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina)-6- sulfónico) ...... 30 III. 8 Análisis estadístico ...... 31

CAPÍTULO IV ...... 32

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 32

IV.1 Evaluación macro y micromorfológica de las flores y hojas...... 32

IV.2 Parámetros fisicoquímicos de las drogas crudas ...... 34

IV.3 Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico ...... 36

IV.4 Obtención de extractos y parámetros físico-químicos de calidad ...... 37

IV.5. Técnicas espectrofotométricas ...... 40

IV.5.1. Determinación de fenoles totales y flavonoides totales ...... 40 IV.6 Actividad antioxidante de flores y hojas de Chuquiragua ...... 42

IV.6.1 Actividad antioxidante por el método de FRAP (capacidad ferro-reductora) ...... 42 IV.6.2 Capacidad secuestradora del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) 44 IV.6.3 Ensayo del ABTS●+ (ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina)-6- sulfónico) ...... 46 CAPÍTULO V...... 49

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...... 49

V.1. CONCLUSIONES ...... 49

V.2 RECOMENDACIONES ...... 50

VI. BIBLIOGRAFÍA ...... 51

GLOSARIO ...... 59

ÍNDICE DE FIGURAS. Figura 1 Chuquiragua (Chuquiraga jussieui J. Gmelin) ...... 7

Figura 2 Esquema del tamizaje fitoquímico ...... 22

Figura 3 Esquema de las reacciones de tamizaje fitoquímico a realizar a los extractos ...... 23

Figura 4 Detalle macromorfológico de las flores y hojas ...... 32

Figura 5 Detalles micromorfológicos de la flor de Chuquiragua ...... 33

Figura 6 Detalles micromorfológicos de la hoja de Chuquiragua ...... 34

Figura 7 Análisis capilar de los extractos hidroalcohólicos de Chuquiragua ...... 39

Figura 8 Curvas de calibración del ácido gálico y la quercetina para la determinación de fenoles y flavonoides, respectivamente...... 41

Figura 9 Curvas de calibración del ácido ascórbico y el FeSO4 para la determinación de la capacidad antioxidante por FRAP...... 43

Figura 10 Curvas de concentración-respuesta de la prueba DPPH de los extractos de chuquiragua y las sustancias de referencia ...... 46

Figura 11 Curvas de concentración-respuesta de la prueba ABTS de los extractos de chuquiragua y las sustancias de referencia ...... 47

ÍNDICE DE TABLAS.

Tabla I Clasificación taxonómica de Chuquiragua ...... 8

Tabla II Parámetros físico-químicos de las drogas crudas de Chuquiragua...... 34

Tabla III Tamizaje fitoquímico de las drogas crudas de Chuquiragua ...... 36

Tabla IV Parámetros físico-químicos de los extractos de Chuquiragua ...... 38

Tabla V Tamizaje fitoquímico de los extractos hidroalcohólicos de Chuquiragua . 40

Tabla VI Contenido de fenoles totales y flavonoides totales en los extractos de chuquiragua ...... 41

Tabla VII Actividad ferro-reductora de los extractos hidroalcohólicos ...... 44

Tabla VIII Capacidad secuestradora de DPPH de los extractos hidroalcohólicos de Chuquiragua y las sustancias de referencia ...... 45

Tabla IX Capacidad secuestradora del radical ABTS●+ de los extractos hidroalcohólicos de Chuquiragua y las sustancias de referencia ...... 47

ÍNDICE DE ANEXOS. Anexo A Cenizas totales ...... 60

Anexo B Extracción por método de Soxhlet ...... 60

Anexo C Tamizaje fitoquímico- Etéreo, Alcohólico y Acuoso ...... 61

LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOS μM: Micrometro ml: Mililitro conc: Concentración

°C: Grado centígrado

G: Gramo

HCL: Ácido clorhídrico

EVALUACIÓN FITOQUIMICA Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS DE HOJAS Y FLORES DE Chuquiraga jussieui JF Gmeil (ASTERACEAE).

Autores: Castro Lissette y Sosoranga Silvana Tutor: QF. Carlos Viteri Poveda MSc.

RESUMEN

Palabras claves: Chuquiraga jussieui, Tamizajes fitoquímicos, Metabolitos secundarios, Parámetros fitoquimicos.

Phytochemical evaluation and antioxidative activity of hydroalcoholic extracts from leaves and flowers of Chuquiraga jussieui JF Gmeil (ASTERACEAE).

Authors: Castro Lissette and Sosoranga Silvana Advisor: QF. Carlos Viteri Poveda MSc.

ABSTRACT

The extracts from leaves and flowers showed an appreciable antioxidant activity in the three methods evaluated.

Keywords: Chuquiraga jussieui, Phytochemical screening, Secondary metabolites, Phytochemical parameters

INTRODUCCIÓN

En los tiempos actuales se presentan una serie de enfermedades como, insuficiencia cardiaca, cirrosis hepática, insuficiencia renal, síndrome nefrótico, hipertensión arterial, entre otras, causadas por el empleo de medicamentos de síntesis, los cuales presentan múltiples efectos adversos que ocasionan daños al organismo, problema que se conoce como iatrogenia (Acosta & Piedra, 2011)

Estos efectos adversos de los medicamentos de síntesis han ocasionado un regreso a la medicina tradicional, buscando tratamientos menos agresivos y más efectivos. En diversos países los productos naturales son considerado sinónimo de inocuidad, ya sea en forma de medicamento vegetal o de materia prima para la industria farmacéutica.

El Ecuador cuenta con una gran diversidad de plantas medicinales, que pueden ser utilizadas como una medicina alternativa y/o medicina tradicional tales como: Lepidium virginicum L, (perejil de la tierra), Costus spicatus acq (jengibre espigado) y Chuquiragua jussieui (Chuquiragua), entre otros.

Chuquiragua jussieui, se encuentra en el páramo del Ecuador sobre los 3000 msnm, se le atribuyen diferentes propiedades medicinales, por ejemplo, la infusión de chuquiragua tiene propiedades diuréticas, tónicas y ayuda al hígado y al sistema digestivo, mientras que sus flores, hojas e incluso el tallo se los utiliza para cicatrices, inflamaciones, e incluso como antiséptico de las vías urinarias y próstata (Dueñas y col., 2014a).

En esta investigación se pretende realizar un estudio fitoquímico y farmacológico a las hojas y flores de esta especie, fundamentalmente evaluando su composición química y la actividad antioxidante, atribuida por la medicina tradicional.

CAPITULO I

1. El PROBLEMA

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En la actualidad las plantas constituyen un recurso valioso en los sistemas de salud de los países en vía de desarrollo. Aunque no existen datos precisos para evaluar la extensión del uso global de plantas medicinales, la organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que más del 80% de la población mundial utiliza diariamente la medicina tradicional para satisfacer sus necesidades en la salud, y que gran parte de los tratamientos tradicionales implica el uso de extractos de plantas o sus principios activos. (Molina, 2018)

El uso terapéutico de las plantas medicinales como sustitutas de las medicinas farmacéuticas o en combinación está fundamentada en la medicina herbolaria, empleando de las plantas sus extractos elaborados de diversas formas con el objetivo de mejorar el estado de salud. Para la OMS, los medicamentos herbarios comprenden las drogas vegetales, extractos elaborados de ellas y productos acabados, que contienen como principios activos partes de plantas u otros materiales vegetales, o combinaciones de esos elementos, y su uso está bien establecido y ampliamente reconocido como inocuo y eficaz. (Gallegos-Zurita, 2016)

La medicina herbaria se utiliza desde tiempos remotos para curar o aliviar las enfermedades, dando lugar a los fitofármacos, y es apreciada por su costo bajo y por los reducidos índices de toxicidad, en comparación con los productos de síntesis.

La chuquiragua (Chuquiraga jussieui J.F. Gmel) es considerada una planta con diferentes usos medicinales, sin embargo, son escasos los estudios realizados sobre su composición química y su actividad farmacológica. Las especies del género Chuquiraga se encuentran distribuidas en Los Andes, desde el suroeste de Colombia hasta el centro de Chile y en casi toda la Patagonia Argentina, donde se

encuentra el mayor número de estas especies y está principalmente diversificado en los desiertos y semidesiertos de América del Sur. En el Ecuador están representadas dos especies: Chuquiraga arcuata Harling y Chuquiraga jussieui J.F. Gmel, ambas se encuentran siempre sobre los 3000 m de altura sobre el nivel del mar (Dueñas y col., 2014a).

Es usada desde tiempos ancestrales, por la población nativa de Ecuador y de otros países de la región, donde tiene como nombre común: flor del caminante, flor de los Andes, chuquiraga y chuquiraguac. Es una especie botánica con flores de la familia Asteráceas, y es considerada la “Flor nacional de Ecuador” (Villagran y col., 2003).

Tradicionalmente de la planta se usan las hojas y tallos mantenidos en etanol, para tratar reuma, fiebre e inflamación. La resina como cataplasmas en heridas y el alivio de dolores producidos por luxaciones y fracturas. La infusión o decocción de partes aéreas también se utilizan para el tratamiento de enfermedades de la próstata, del estómago, quemaduras, heridas superficiales, úlceras y como un antipirético.

También se le han reportado en estudios experimentales, efectos tales como: antioxidante, antiinflamatorio y antibiótico, entre otros lo que sugiere su posible uso para una gran variedad de patologías (Alberto y col., 2009; Zampini y col., 2009; Casado y col., 2011; Dueñas y col., 2014b).

Como componentes químicos de la especie, se informa la presencia de compuestos fenólicos, flavonoides, alcaloides, saponinas, triterpenos y/o esteroides y taninos pirocatecólicos. Los extractos metanólicos de Chuquiraga straminea Sandwith, subfamilia Barnadesioidea (Asteraceae) mostraron la presencia de quercetina-3-O- glucósido, quercetina-3-Orutinósido, kaempferol, kaempferol-3-O-glucósido y kaempferol-3-O-rutinósido, y sus extractos totales demostraron actividad antioxidante por los métodos de DPPH y ABTS (SC50 14,5 a 34,9mg/ ml), se observó una correlación positiva significativa entre la actividad antioxidante y los fenoles totales (Barrera, 2015).

1.1.1 Formulación del problema

¿Qué componentes químicos justifican la actividad antioxidante en hojas y flores de Chuquiraga jussieui J.F. Gmel?

1.2 Justificación

En el Ecuador desde tiempos muy remotos el uso de las plantas medicinales ha sido el principal acceso a la salud de una gran parte de la población. Sin embargo, la falta de estudios relacionados con las plantas medicinales o medicina ancestral no ha permitido el crecimiento y avance en la farmacología. (Molina, 2018)

Todas las plantas contienen diferentes metabolitos responsables de sus propiedades terapéuticas, por lo que la fitoterapia es una parte de la terapéutica que emplea medicamentos cuya procedencia es a partir de las plantas medicinales. (Molina, 2018)

Cada metabolito dada su composición presenta diferentes actividades entre las que se citan: diurética, antioxidantes, hipotensoras, sedantes, antimicrobianas, etc.

El proyecto investigativo tiene como finalidad, realizar el estudio farmacognóstico, fitoquímico y de la actividad terapéutica de las hojas y flores de la especie Chuquiragua jussieui., debido al poco conocimiento que se tiene sobre las propiedades que presenta.

Los resultados que se lleguen a obtener podrían ser de gran utilidad para posteriores investigaciones, las mismas que se encuentran enfocadas en la formulación de productos de origen natural en las cuales se utilice como principio activo los metabolitos de las plantas en estudio, los mismos que podrían tener beneficios tanto en la salud como en el cuidado de las personas y tendría un impacto socioeconómico en las comunidades que se dedican a la recolección y venta de este tipo de plantas.

1.3 HIPOTESIS

Los componentes químicos presentes en las hojas y flores de Chuquiraga jussieui J.F. Gmel justifican la actividad antioxidante.

1.4 OBJETIVOS

1.4.1 Objetivo General.

Establecer los parámetros farmacognósticos y la actividad antioxidante de hojas y flores de Chuquiragua jussieu.

1.4.2 Objetivos específicos.

 Realizar el estudio farmacognóstico de las hojas y flores de Chuquiragua jussieui.  Determinar los parámetros de calidad y la composición química cualitativa de las hojas y flores.  Evaluar la actividad antioxidante de los extractos hidroalcohólicos de hojas y flores.

1.5 Operacionalización de las Variables

TIPO VARIABLES CONCEPTUALIZACIÓN INDICADOR -Humedad -Cenizas totales Características - Cenizas insolubles en Porcentaje (%) farmacognósticas ácido - Sustancias solubles Metabolitos secundarios Tamizaje fitoquímico Pruebas positivas Obtención y caracterización Caracterización de extractos fisicoquímica del Dependientes extracto. Determinación Concentración cuantitativa de fenoles y flavonoides Actividad antioxidante y Ensayos de actividad antiinflamatoria reductora y antirradicalaria (DPPH y Porcentajes (%) ABTS) Ensayo de Carragenina Independiente Tipo de Muestra Flores Partes aéreas Hojas

CAPITULO II

I. Marco teórico

I.1. Familia Asterácea

La familia Asterácea (Asteraceae), antiguamente era denominada Compuesta (Compositae), reuniendo más de 23,000 especies (Rodríguez, 2005; Stevens, 2006; Jeffrey, 2007), siendo de las Angiospermas la de mayor riqueza y diversidad biológica. Esta familia está caracterizada por sus flores dispuestas en una inflorescencia compuesta denominada capítulo, la cual se halla rodeada de una o más filas de brácteas (involucro).

El nombre Asteraceae proviene del griego que significa estrella, y se le atribuyó por la forma de la inflorescencia. La denominación de Compuestas, hace referencia al tipo particular de inflorescencia compuesta característica de esta familia, y solo de muy pocas familias de Angiospermas (Royal Botanic Gardens, Kew, 2004, International Code of Botanical Nomenclature, 2006).

La familia presenta importancia ecológica y económica, los miembros se encuentran distribuidos desde las regiones polares hasta los trópicos, desde los desiertos secos hasta los pantanos y desde las selvas hasta los picos montañosos. En muchas regiones del mundo llegan a integrar hasta el 10 % de la flora vernácula (Watson y Dallwitz, 2007; Katinas y col., 2007).

La familia se ha clasificado en 11 subfamilias entre las cuales se encuentran (Panero y Funk, 2002):

Barnadesioideae: Suramérica Carduoideae: Cosmopolita Mutisioideae Suramérica y Asia Pertyoideae: Cosmopolita

Stifftioideae: Suramérica y Asia Cichorioideae: Cosmopolita Gochnatioideae: Cosmopolita Corymbioideae: Corymbium. Cosmopolita Asteroideae: Cosmopolita Hecastocleidoideae: Hecastocleis Gymnarrhenoideae: Gymnarrhena shockleyi. Suroeste de Estados Unidos micrantha. Norte de África

Los géneros más representativos son Senecio (1250 spp.), Vernonia (1000), Cousinia (650), Eupatorium (600), Centaurea (600), Artemisia (550), Hieracium (1000), Helichrysum (600), Baccharis (400), Mikania (400), Saussurea (300), Verbesina (300), Cirsium (250), Jurinea (250), Bidens (200), Crepis (200), Aster (180, excluyendo a segregados como Symphyotrichum, Sericocarpus), Gnaphalium (150), Tragopogon (110), y Solidago (100) (Bremer y Anderber, 1994).

I.1.1. Género Chuquiraga

El género Chuquiraga se estableció por A.L. Jussieui en el Perú. El nombre proviene del vernáculo “Chuquiragua”, utilizado en Colombia, Ecuador y norte del Perú para denominar a la especie coleccionada por J de Jussieui. Posteriormente Gmelin la denominó Chuquiraga jussieui en honor a su descubridor A.L Jussieui. De ahí su nombre científico de Chuquiraga jussieui J. Gmelin (Ezcurra, 1985) (fig.1).

Figura 1 Chuquiragua (Chuquiraga jussieui J. Gmelin) Fuente: Molina, (2018)

Todas las especies del género son arbustos leñosos, variando el porte desde erecto a achaparrado

1.1.2. Distribución geográfica.

El género consta de 20 especies distribuidas en los Andes desde el suroeste de Colombia hasta el centro de Chile y en casi toda la Patagonia, en Argentina, donde se encuentra el mayor número de especies. En el Ecuador están representadas 2 especies siempre sobre los 3000 msnm: Chuquiraga arcuata Harling y Chuquiraga jussieui J. Gmelin (Barrera, 2015).

1.1.3. Clasificación taxonómica

Pertenece a la familia Asteraceae, subfamilia Barnadesioideae, su clasificación se presenta en la tabla I (Barrera, 2015).

Tabla I Clasificación taxonómica de Chuquiragua Nombre: Chuquiraga jussieui Género: Chuquiraga Familia: Asteraceae Orden: Asterales Clase: Magnoliopsida División/Phylim: Tracheophyta Reino: Plantae Fuente: (Barrera, 2015).

1.1.4. Descripción botánica del género

Involucro acampanado a cilíndrico o turbinado, formado por varias series de filarias imbricadas, las exteriores menores, las interiores gradualmente más largas, a veces algunas series radiantes o reflejas, todas escariosas o escarioso-coriáceas, amarillas, anaranjadas o cobrizas, glabras a densamente seríceas, frecuentemente

espinosas o mucronadas, punzantes. Receptáculo alveolado, piloso. Flores numerosas amarillas, isomorfas, todas hermafroditas, con corola angostamente tubulosa, interiormente frecuentemente pilosa hasta la base, exteriormente pubérula a seríces, partida en el ápice en cinco segmentos lineales erectos, el interno generalmente separado de los demás por incisiones más profundas, todos agudos y densamente velludos hacia el ápice en su superficie externa. Estambres 5, con los filamentos planos, glabros, siempre insertos en la base de la corola. Anteras estrechas, sagitadas, con apéndices conectivales agudos a obtusos y tecas terminadas inferiormente en largas caudículas subuladas. Estilo glabro, redondeado y brevemente inciso en el ápice, muy cortamente papiloso en su parte superior. Aquenios turbinados, densamente seríceo-velludos, papus formado por una sola serie de cerdas plumosas, soldadas en un anillo en la base. Arbustos intrincado-ramosos, frecuentemente espinosos, erectos o achaparrados, o formando cojines chatos a hemisféricos. Hojas enteras, opuestas o alternas, sésiles o muy cortamente pecioladas, con lámina plana o marginalmente involutas hasta cilíndrico-acicular, de textura subcoriácea a rígidamente coriácea, con el ápice frecuentemente punzante. Espinas axilares presentes o ausentes; cuando presentes germinadas y a veces soldadas en la base excepcionalmente fascículos de 3 a 5. Cápulos grandes, medianos o pequeños, sésiles y solitarios en el ápice de las ramitas, a veces seudo-axilares por acortamiento de las mismas (Ezcurra, 1985). Esta clasificación es válida para 19 de las especies del género, todas exclusivamente austro americanas, principalmente andinas o patagónicas; siendo la especie tipo Ch. jussieui Gmelin

1.1.5. Estructura vegetativa

La raíz es una parte de la planta de estructura fibrosa y profunda esto le permite permanecer en zonas frías, y mantener su estructura vegetal. El tallo pueden alcanzar una altura de 1.8 m. contiene tallos cuadrangulares con ramas fisuradas. Las hojas de estructura, simples, imbricadas, lanceoladas-ovadas, cariáceas, alternas, uninervias y un ápice punzante. Las flores llegan a medir 20 mm de largo,

cáliz blanco plumoso, corola tubular, estilo largo, anaranjado, escarlata, estigma cortamente bifurcado (Palma, 2019)

1.1.6. Usos en medicina tradicional

Las especies de Chuquiraga son principalmente utilizadas como ornamentales, por sus cápulos grandes, y el color amarillo, naranja o rojo intenso de sus flores, lo cual unido a su textura escariosa y a la rigidez de las hojas, hace que las ramas sean especialmente aptas para arreglos florales secos. Como combustible se emplean fundamentalmente como leña en lugares desérticos. Se recoge su uso medicinal como tónico, reconstituyente, diurético y para combatir la malaria. (Ezcurra, 1985)

Padilla, (2008), señala que la infusión de toda la planta es utilizada en problemas de mal aliento, colerín, nervios alterados, dolor de riñones, limpieza de la sangre. La infusión de la flor se emplea para combatir: resfriado y el dolor de cabeza, ayuda a tratar las afecciones de la bilis, sarpullidos, reumatismo, dolencias hepáticas, dolor del corazón, dolor del vientre, infecciones de los riñones, cicatrizaciones, fiebre, tos y resfriados.

1.1.7. Composición química.

Son muy escasos los trabajos que se han realizado sobre la especie y en ninguno se informa el aislamiento y caracterización de compuestos de la especie.

Dueñas y col, (2014), realizaron un tamizaje fitoquímico de la especie colectadas en la Cordillera de los Andes en la Reserva Faunística del volcán Chimborazo, e informaron la presencia de flavonoides, saponinas, mucílagos, triterpenos y/o esteroides, taninos pirocatecólicos y fenoles.

Por su parte Barrera, (2015), también a través de tamizaje fitoquímico informó la presencia de: Compuestos grasos, coumarinas, alcaloides, triterpenos y esteroides, resinas, azùcares reductores, saponinas, taninos y fenoles, flavonoides, antocianidinas, mucilagos y principios amargos. Este autor cuantificó además los flavonoides presentes en el extracto acuoso de las hojas.

1.1.8. Actividad farmacológica

Para la especie Dueñas y col, (2014a) realizaron el ensayo de irritabilidad ocular y de sensibilización en curieles y demostraron que el extracto acuoso de las hojas y tallos no presentaban efectos irritantes ni sensibilizantes.

En el mismo año, estos autores informaron el efecto antioxidante en el ensayo de hemólisis (Dueñas y col., 2014b).

Barrera (2015), comprobó el efecto diurético del extracto de las partes aéreas de la especie e informó que el ensayo toxicológico a dosis repetidas no evidenció efectos colaterales para este extracto a una dosis de 400 mg/kg durante 14 días.

Ortíz-Pérez, (2017) planteó que diferentes extractos de las partes aéreas de Chuquiragua presentaban actividad antioxidante, antiinflamatoria y citotóxica in vitro.

Molina (2018) evaluó la actividad antioxidante de las flores y hojas de la especie utilizando el ácido ascórbico como patrón de referencia y encontró que el extracto con etanol 96% de las flores exhibió una actividad antioxidante similar al estándar presentando un porcentaje de inhibición de 78,17%, mientras la fracción con metanol de las hojas demostró un porcentaje de inhibición del 70,66%.

Palma (2019), evaluó la actividad antioxidante de las flores de la especie recolectadas en la localidad de Pichincha por el método del radical ABTS y encontró una actividad antioxidante del 49%.

I.2 Algunos métodos de extracción y caracterización de productos naturales.

El estudio fitoquímico generalmente comprende cuatro etapas de trabajo bien definidas (Lock de Ugaz, 1994):

 Recolección y clasificación botánica de la especie a estudiar,  Extracción, separación y purificación de los constituyentes químicos,  Determinación estructural y,

 Ensayos biológicos y farmacológicos. Los métodos de extracción y caracterización que generalmente se utilizan dependen de la composición química del material vegetal estudiado y son determinantes para la aplicación posterior de los ensayos biológicos. I.2.1 Métodos de extracción

La extracción en el campo farmacéutico, se define como la separación de las porciones medicinalmente activas a partir de los tejidos de las plantas y animales, mediante el uso de disolventes selectivos, utilizando procedimientos establecidos (Miranda y Cuéllar 2012). Estos procedimientos dependen, fundamentalmente, de los objetivos trazados en el estudio de la planta, pudiendo aplicarse métodos sólido- líquido o líquido-líquido, continuos o discontinuos y disímiles técnicas, a temperatura ambiente o con aplicación de calor (Marcano y col., 1991).

I.2.1.1. Técnicas clásicas de extracción.

La mayoría de las técnicas clásicas de extracción, presentan las desventajas de emplear grandes volúmenes de disolvente y un tiempo elevado de trabajo. De ellas las más empleadas en la extracción de productos naturales son la maceración y la extracción por Soxhlet.

 MACERACIÓN

La maceración es una técnica de extracción muy utilizada, basada en el método de extracción sólido-líquido. Consiste en poner en contacto la droga con la cantidad de disolvente preestablecida, a temperatura ambiente, en recipiente cerrado, durante un tiempo entre 2 y 14 días. Es un proceso no selectivo que da como resultado un equilibrio de concentración entre la droga y el disolvente, y está influenciado por factores que dependen de la droga (naturaleza, tamaño de partícula, contenido de humedad y cantidad) y del disolvente (selectividad y cantidad). La velocidad con que se obtiene el equilibrio está en función del tamaño de partícula, así como del

grado de hinchamiento de las células y de la viscosidad y polaridad del disolvente (Farmacopea Brasilera, 2010).

Es un método de extracción de elección cuando los principios activos pueden sufrir alteración por el calor o por el aire y son solubles a temperatura ambiente, en un disolvente que no debe ser volátil (Miranda y Cuéllar, 2012).

Dentro de las desventajas del proceso están la lentitud, la imposibilidad de extraer totalmente los principios activos de la droga y la posibilidad de contaminaciones, cuando se emplean disolventes de altos contenidos de agua. La operación de maceración (estática o dinámica) puede repetirse varias veces, siendo el proceso conocido como maceración múltiple. Este proceso es bastante utilizado para la extracción en pequeña escala, tanto desde el punto de vista químico como farmacéutico (Bombardelli, 1991; Sharapin, 2000).

 SOXHLET

La extracción con el equipo Soxhlet es un método continuo y es considerado un caso particular de la lixiviación.

Aunque es un método muy utilizado en la extracción de compuestos orgánicos, presenta restricciones que están ligadas al elevado tiempo de extracción, el cual puede variar de 1 a 72 horas (Nuñez, 2008). En este proceso el disolvente extrae el material orgánico retenido en la muestra, a temperatura cercana a la ambiente más, el material extraído permanece en contacto con el disolvente en ebullición durante todo el tiempo que dura el proceso, lo cual puede en ocasiones, provocar transformaciones químicas en los componentes extraídos.

En la mayoría de los casos, el proceso de extracción no es selectivo y, básicamente, lo que controla el poder de disolución es la temperatura de extracción y la naturaleza del disolvente (Vale, 1997, Nuñez 2008).

I.2.1.2. Extracción sucesiva.

Mediante esta técnica es posible fraccionar una droga, según la solubilidad de sus componentes en una secuencia de disolventes, de menor a mayor polaridad, basándose en el poder eluotrópico y la polaridad de éstos (Fifield et al, 1995). Este proceso puede ser realizado por cualquiera de las técnicas de extracción. Tiene la ventaja de que mediante su aplicación se pueden obtener fracciones de composición más sencillas, aunque presenta el inconveniente de que requiere un mayor tiempo para efectuar todos los pasos experimentales (Caramão, 1991).

I.2.2. Métodos de caracterización

Los principales instrumentos empleados hoy en día para la separación y caracterización de moléculas orgánicas, incluyendo la diferenciación de isómeros son los métodos cromatográficos y los espectroscópicos.

La cromatografía gaseosa y liquida, la espectroscopia en las regiones del ultravioleta-visible (UV-VIS), infrarrojo (IR), resonancia magnética nuclear (RMN) y la espectrometría de masas (EM), son los métodos que más se emplean, existiendo innumerables referencias de cada uno de ellos en el trabajo con productos naturales. (Marcano y col., 1991; Fischer y col.,1991; Cordell, 1995; Phillipson, 1995; Günther, 1995; Baldwin, 1995; Braun y col., 1996; Bocker, 1997; Rucker y col., 1998 ; Silverstein y col., 2005).

I.2.2.1. Métodos cromatográficos

Disímiles han sido los procedimientos cromatográficos que se han desarrollado con vistas a la separación de moléculas orgánicas. Los mismos difieren entre sí por el tipo de interacción con las fases estacionarias (adsorción, partición, intercambio iónico, etc.), por el tipo de condiciones operacionales (columna abierta, alta presión, etc.) y por los cambios de eluentes o fases móviles (Caramão, 1991).

Algunos autores han empleado las técnicas cromatográficas después de la etapa de extracción selectiva o sucesiva y tradicionalmente han sido ejecutados por cromatografías líquidas en separaciones secuenciales, utilizadas para el aislamiento de un componente específico o para el fraccionamiento por clase química (Wolfender y col., 1995).

 Cromatografía de gases

Los avances en las técnicas instrumentales analíticas, unidos a la simplicidad y precisión de la cromatografía gaseosa, han hecho que sea una de las técnicas más utilizadas el análisis químico, ya sea a nivel industrial como en los laboratorios de investigación científica. Algunos autores señalan que la cromatografía de gases es una herramienta analítica de extrema utilidad en la separación de mezclas complejas (López, 1999); también es muy empleada en el análisis ambiental, ya que es la técnica más rápida y eficiente para la separación de los componentes de un sistema dado.

Como método de separación, la cromatografía gaseosa es rápida (usualmente en el orden de algunos minutos por muestra) y es muy sensible, alcanzando niveles de nano gramos (10-9 g) a pico gramos (10-12 g), en su detección. Como la mayoría de los método analítico, no es capaz por si sola de resolver la identificación de una determinada sustancia, sin embargo, brinda una importante contribución en el análisis de una sustancia desconocida o de una mezcla compleja de sustancias, ya que, ofrece un medio acelerado y fácil para determinar el número de componentes de una mezcla, la presencia de impurezas en una sustancia y, muchas veces, el esclarecimiento en una primera aproximación, de la identidad de un compuesto (González y col., 2007; Gutiérrez y col., 2011).

 Cromatografía gaseosa–espectrometría de masa

Cuando la cromatografía gaseosa se acopla a la espectrometría de masas (CG- EM), se convierte en una poderosa herramienta para la separación e identificación de compuestos.

La conexión directa de las columnas capilares del cromatógrafo de gas al espectrómetro de masas, permite varias barreduras de masas en puntos diferentes de un pico cromatográfico, con la finalidad de establecer su homogeneidad. De este modo, es posible resolver picos cromatográficos parcialmente superpuestos (Reeve, 1994; Silverstein y col., 2005). El pico con la mayor relación masa/carga es normalmente (más no siempre) de un ion no fragmentado, lo cual puede ser usado para confirmar la masa molecular relativa del compuesto. El modelo fragmentado puede dar una indicación de los grupos químicos en la molécula.

Bajo condiciones favorables, el método más simple, es comparar el espectro obtenido con el de una muestra pura, o de biblioteca de referencia (Fifield y col., 1995). Usando el espectrómetro de masa como detector universal del cromatógrafo gaseoso, pueden ser identificados casi la totalidad de los picos cromatográficos de una mezcla, y puede ser confirmada, la pureza de una sustancia, por la producción de un espectro completo de masas para cada pico o parte de pico que se registre (Silverstein y col., 2005). Resulta un método favorable para el análisis de aceites esenciales y para la separación e identificación de ésteres de ácidos grasos, entre otros (Marriott y col., 2001; Schalley, 2003; Sparkman y col., 2011)

CAPITULO III

MATERIALES Y MÉTODOS

METODOLOGÍA

III.1. Tipo de investigación

Esta investigación de carácter descriptivo experimental, tiene como propósito determinar las propiedades o bondades de los metabolitos presentes en Chuquiraga jussieui JF Gmeil., a su vez evaluar la propiedad antioxidante de los extractos.

Se refiere a una investigación descriptiva en la cual consisten en especificar propiedades importantes, en la cual se ha sometido el análisis, evaluando diversos aspectos a investigar, usando métodos que sean cualitativos y cuantitativos. De los datos obtenidos de métodos, cromatográficas y espectrofotométricos, con un enfoque específico de los metabolitos presentes.

Lugar: Laboratorio de investigaciones Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas y Centro de Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador ESPOL.

III. 2 Materiales y equipos.

III.2.1. Equipos

 Estufa  Balanza analítica  Soxleth  Mufla III.2.2. Aparatos

 Cromatógrafo gaseoso acoplado a espectrometría de masa III.2.3 Materiales

 Espátula

 Vaso precipitado  Embudo  Soporte universal  Pipetas  Ampolla de decantación  Papel de filtración III.2.3. Reactivos

 Hexano  Diclorometano  Acetato de etilo  Metanol  Agua destilada  Etanol al 95%

III.3. Muestra

Recolección del material vegetal: Planta Chuquiragua jussieui JF Gmeil, procedente de los Andes ecuatoriano, El Lirio, Cantón Colta, Chimborazo a una altitud promedio de 3.212 msnm., con las siguientes coordenadas 1°42′S 78°45′O.

III.4. Metodología Experimental

III.4.1 Secado y trituración:

La planta se secó en estufa de recirculación de aire a 50 °C durante 5 días.

III.4.2 Evaluación macro y micromorfológicas

III.4.2.1 Evaluación macro morfológica de las flores y hojas de Chuquiragua

Se realizó una valoración de las características macro morfológicas de la especie, considerándose la disposición de las hojas sobre el tallo, forma y borde, las características de las flores (cáliz, pistilo, pétalos). Las observaciones se realizaron

a simple vista y con ayuda de un microscopio estéreo NTB-2B, de fabricación china, empleando cámara modelo HDCE-50B (Miranda y Cuéllar, 2000).

III.4.2.2 Evaluación micro morfológica de las flores y hojas,

Para el análisis histológico se trabajó con las drogas en polvo de cada órgano vegetal, las que fueron aclaradas con hipoclorito de sodio al 1 % y posteriormente coloreadas con safranina al 1 % en agua. Las muestras se fijaron con gelatina glicerinada, según los procedimientos descritos por Arnol (1973) y Gattuso M y Gattuso S (1999).

Para visualizar los diferentes caracteres anatómicos internos del vegetal se empleó un microscopio NOVEL (lente 10X) con cámara acoplada modelo HDCE-50B.

III.4.3 Métodos fisicoquímicos de control de la calidad:

Se realizaron de acuerdo a lo establecido por Miranda y Cuéllar, 2000 y WHO, 2011: humedad residual (método gravimétrico), contenido de sustancias solubles o extraíbles (agua mezclas hidroalcohólicas al 80%), cenizas totales, cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10%.

III.4.3.1 Humedad residual

Se empleó el método gravimétrico, a partir de 2 g de muestra. Se basa en la determinación gravimétrica de la pérdida en masa que muestra una droga después de ser desecada en la estufa a 105º C durante 3h. Los resultados se obtuvieron a partir de la expresión:

M2 - M1 Hg = x 100 M2 - M

Donde: Hg: pérdida en peso por desecación (%). M2 = masa de la cápsula con la muestra de ensayos (g) M1 = masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g)

M = masa de la cápsula vacía. 100 = factor matemático.

III.4.3.2 Sustancias solubles o extraíbles

El ensayo se realizó a partir de 5 g de droga. Los disolventes utilizados fueron agua, mezclas hidroalcohólicas al 80%. Las muestras se agitaron en una zaranda por un tiempo de 6 horas. Cada extracto obtenido se filtró por un embudo de vidrio utilizando papel Watman de filtración rápida. Los cálculos se efectuaron según:

R x 500 x 100 Ss = M (100-H) Donde: Ss: sustancias solubles (%) R: residuo de la muestra (g) M: masa de la muestra (g) H: humedad residual (%) 500 y 100: factores matemáticos para el cálculo.

III.4.3.3 Cenizas totales, cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 %

Para las determinaciones se empleó una mufla modelo SX2-12TP, procedencia China. Las pesadas se realizaron en balanza analítica marca Sartorius. Cada determinación se efectuó por triplicado a partir de 2 g de material.

Cenizas totales

Los cálculos se efectuaron por la expresión siguiente:

M2 - M CT = x 100 M1 - M

Donde:

Ct: cenizas totales (%) M: masa del crisol vacío (g)

M1: masa del crisol con la muestra (g)

M2: masa del crisol con la ceniza (g) 100: factor matemático para el cálculo.

Cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 %

Se determinaron a partir de las cenizas totales, después de tratar las mismas con ácido clorhídrico al 10 %. Los resultados se obtuvieron según:

M2 - M B = x 100 M1 - M

Donde: B: cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base hidratada (%)

M2: masa del crisol con la ceniza (g) M: masa del crisol vacío (g)

M1: masa del crisol con la porción de ensayo (g) 100: factor matemático para el cálculo.

III. 5. Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico

El tamizaje fitoquímico se le realizó a la droga cruda (flores, hojas), según procedimiento descrito por Miranda y Cuéllar (2000). Se utilizó un sistema de extracción con una batería de disolventes, de menor a mayor polaridad, sobre el mismo material vegetal, para lograr que cada metabolito fuera extraído adecuadamente según su selectividad por el disolvente empleado. La droga cruda se extrajo sucesivamente con éter etílico (30-40º C), etanol absoluto y agua, para obtener los extractos correspondientes.

30 - 50 g MATERIAL VEGETAL

EXTRAER CON 90 -150 mL DE ÉTER ETÍLICO POR MACERACION DURANTE 48 HORAS A TEMPERATURA AMBIENTE

FILTRAR

EXTRACTO ETÉREO Medir volumen y calcular concentración RESIDUO SÓLIDO Secar y pesar

EXTRAER CON 3 VECES EL PESO DEL RESIDUO EN VOLUMEN CON ETANOL POR MACERACIÓN DURANTE 48 HORAS. FILTRAR

EXTRACTO ALCOHÓLICO Medir volumen y calcular concentración RESIDUO SÓLIDO Secar y pesar

EXTRAER CON 3 VECES EL PESO DEL RESIDUO EN VOLUMEN CON AGUA DESTILADA POR MACERACIÓN DURANTE 48 HORAS.

FILTRAR

EXTRACTO ACUOSO Medir volumen y calcular concentración

RESIDUO SÓLIDO Secar, pesar y desechar Figura 2 Esquema del tamizaje fitoquímico

A cada extracto se les realizan los ensayos que se plantean a continuación (Fig 3):

Figura 3 Esquema de las reacciones de tamizaje fitoquímico a realizar a los extractos

III.6 Obtención de extractos y parámetros físico-químicos de calidad

A partir del material vegetal se elaboraron extractos, a razón de 20 g de droga/100 ml de disolvente, por el método de maceración con agitación esporádica, durante un periodo de siete días, a una temperatura de 30 °C ± 2 °C, utilizando como disolvente una mezcla hidroalcohólica al 30% (por ser el de mayor poder extractivo). Se siguió el procedimiento descrito en la norma cubana NRSP 312 (1992) y por Miranda y Cuéllar (2000).

Las determinaciones de calidad se llevaron a cabo mediante el procedimiento descrito en la NRSP 312 (1992) y por Miranda y Cuéllar (2000), se realizaron tres réplicas para cada experimento, siendo evaluados los parámetros siguientes:

III.6.1 Parámetros de calidad de los extractos a) Requisitos organolépticos

 Determinación del olor: se toma una tira de papel secante de aproximadamente 1 cm de ancho por 10 cm de longitud y se introduce un extremo en la muestra de ensayo. Se huele y se determina si corresponde con la característica del producto.

 Determinación del color: se toma un tubo para ensayos, bien limpio y seco, se llena hasta las tres cuartas partes con la muestra de ensayo y se observa el color, la transparencia, la presencia de partículas y la separación en capas. Se informa el resultado.

a) pH

Para la determinación del pH se utilizó un pH-metro modelo Basic 20 Crizon, previamente ajustado con soluciones buffer a pH = 4,01 y 7.

b) Sólidos totales

Se realizó a partir de 5 ml de extracto, los cuales se transfirieron a una cápsula de porcelana previamente tarada. Se sometió la muestra a 105 0C hasta evaporación del disolvente y peso constante. La cantidad de sólidos totales (St), expresados en %, se calculó por la expresión siguiente: P  P S  r  100 t V

Donde:

Pr = masa de la cápsula más el residuo (g) P = masa de la cápsula vacía (g) V = volumen de la porción de ensayo (ml) 100 = factor matemático

c) Densidad relativa

Se realizó por picnometría y se utilizó una balanza analítica monoplato marca Sartorius. De la muestra de ensayo se tomó la cantidad necesaria de acuerdo con la capacidad del picnómetro y se enfrió a 25 °C. La densidad relativa a 25 °C se calculó mediante la fórmula siguiente:

M1 - M D25 = M - M 2

Donde: M = masa del picnómetro vacío (g) M1= masa del picnómetro con la muestra de ensayo (g) M2= masa del picnómetro con agua (g) D= densidad relativa (g/ml)

d) Índice de refracción

La determinación se realizó a una temperatura de 25 °C con un refractómetro ABBE digital.

e) Análisis capilar

Este ensayo se desarrolló según lo descrito en la NRSP 312 (1992) y por Miranda y Cuéllar (2000), a partir de 20 ml de extracto, empleando papel Whatman # 1. El tiempo de corrida fue de 2 horas y la temperatura de trabajo de 25 °C (± 1). Para el análisis e interpretación de la imagen capilar se tuvieron en cuenta los aspectos siguientes:  Color  Altura  Descripción de las diferentes partes (franja, sub-franja, banda y sub-banda)  Cambios de coloración con vapores de amoníaco

III.6.1.1 Análisis de la composición química de los extractos

 Tamizaje fitoquímico

Se desarrolló el tamizaje fitoquímico de acuerdo al procedimiento descrito por Miranda y Cuéllar (2000), donde se efectuaron los ensayos correspondientes al extracto alcohólico (Figura 3).

III.6.2. Técnicas espectrofotométricas III.6.2.1. Determinación de fenoles totales

El contenido de fenoles totales se determinó por el método de Folin-Ciocalteu (Pourmorad y col., 2006; Memnune y col., 2009; Chlopicka y col., 2012).

Muestras  Extractos hidroalcohólico de flores, hojas, tallos y raíces de chuquiragua.  Sustancia de referencia: ácido gálico (Sigma-Aldrich)

Procedimiento:  Solución diluida de Folin-Ciocalteu: se tomó 10 ml del reactivo Folin-Ciocalteu y se diluyó a 100 ml con agua destilada.

 Solución de carbonato de sodio 7,5%: se pesó 75 g de Na2CO3 anhidro y se disolvió en un litro de agua destilada.

En tubos de ensayos de aproximadamente 50 ml de capacidad se adicionaron:  200 µL de la muestra (extractos y solución de referencia de ácido gálico)  10 ml de solución diluida de Folin-Ciocalteu  1,8 ml de agua destilada  Se agitó y esperó cinco minutos

 Se adicionaron 8 ml de solución 7,5% de Na2CO3. Se agitó nuevamente  Se dejó en reposo durante dos horas  Se leyó la absorbancia a 765 nm (espectrofotómetro Rayleigh UV-1601, China)

 El blanco estuvo constituido por las soluciones señaladas anteriormente sin las muestras de ensayos.

Se pesó 500 mg de ácido gálico y se disolvió en 20 ml de etanol al 96%. Se transfirió cuantitativamente a matraz aforado de 50 ml y se enrasó con agua destilada. De esta solución concentrada de ácido gálico se tomaron alícuotas de 1, 2, 3, 4 y 5 ml y se diluyeron a 100 ml. Estas diluciones correspondieron a las concentraciones de 10, 20, 30, 40 y 50 mg/100 ml de ácido gálico, con las que se construyó una curva de calibración de absorbancia contra concentración. El contenido de fenoles totales se expresó en mg/ml.

III.6.2.2 Determinación de flavonoides totales

Se llevó a cabo por el método colorimétrico del tricloruro de aluminio, según lo referido por Chang y col. (2002) y Pourmorad y col. (2006).

Muestras  Extractos hidroalcohólico de flores, hojas, tallos y raíces de chuquiragua.  Sustancia de referencia: quercetina (Sigma-Aldrich)

Procedimiento  Solución de tricloruro de aluminio (AlCl3) al 10% en etanol al 96%

 Solución de acetato de potasio (CH3CO2K) diluida en agua (1 M)  A partir de una solución madre de quercetina (100 µg/ml) en etanol al 96% se realizaron diluciones a 5, 20, 50, 60 y 80 µg/ml.

En tubos de ensayos se adicionaron:  0,5 ml de extracto o solución patrón de quercetina  1,5 ml de etanol al 96%  0,1 ml de tricloruro de aluminio al 10%  0,1 ml de acetato de potasio 1 M  2,8 ml de agua destilada

 Esperar 30 minutos y leer a 415 nm (espectrofotómetro Rayleigh UV-1601, China)  El blanco fue etanol al 96%

Con las concentraciones del patrón anteriormente señaladas, se construyó una curva de calibración de absorbancia contra concentración. El contenido de flavonoides totales se expresó en base a quercetina (mg/ml).

III.7 Determinación de la actividad antioxidante

III.7.1 Actividad antioxidante por el método de FRAP (capacidad ferro- reductora) La capacidad de reducción de los extractos hidroalcohólicos fue medida acorde al procedimiento descrito por Benzie y Strain (1996). Las determinaciones fueron de carácter espectrofotométrico, se empleó un espectrofotómetro UV- visible a una absorbancia de 593 nm.

Muestras: Extractos hidroalcohólicos de flores y hojas de Chuquiragua a las concentraciones de 20, 30, 40, 50 y 60 μg/ml. Procedimiento: Para conformar el reactivo de FRAP, se mezcló buffer acetato de sodio 300 mM (pH 3,6), 10 mM de TPTZ (2, 4, 6-tripiridil-s-triazina) y 20 mM de cloruro férrico (25:2,5:2,5 v:v:v). Se tomaron 30 μL de cada dilución de los extractos (a las concentraciones de 20, 30, 40, 50 y 60 μg/ml) y se mezclaron con 900 μL de la disolución FRAP y 90 μL de agua destilada. Una vez realizada la mezcla, la reacción que ocurre mide la reducción del complejo férrico-TPTZ, en la cual el hierro férrico (Fe3+ - TPTZ) se reduce a ión ferroso a bajo pH, causando la formación de un complejo ferroso-tripiridiltriazina (Fe2+ - TPTZ) de color azul intenso con un máximo de absorción a una longitud de onda de 593 nm. El blanco consistió en 120 μL de agua y 900 μL de reactivo. Cada determinación se llevó a cabo por triplicado.

Los resultados fueron expresados como µmol equivalentes de ácido ascórbico

(EAA) y como μmol equivalentes de FeSO4, a partir del cálculo interpolando la densidad óptica (D.O) de las muestras en las curvas de calibración de ambas sustancias de referencia a las concentraciones de 100, 200, 400, 800 y 1000 μM. Las lecturas se realizaron por triplicado a los cuatro minutos.

III.7.2 Capacidad secuestradora del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)

Para la determinación cuantitativa se utilizó el método del radical libre DPPH (radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo). Se empleó un espectrofotómetro UV- visible y las determinaciones fueron medidas a 517 nm al cabo de los 30 min. (Brand-Williams y col., 1995; Kedare y Singh, 2011).

Muestras:

Extractos hidroalcohólicos de flores y hojas a las concentraciones de 20, 30, 40, 50 y 60 μg/ml.

Procedimiento: Se tomaron 10 µL de cada concentración de los extractos (20, 30, 40, 50 y 60 μg/ml) y de las sustancias de referencia a las mismas concentraciones, se mezclaron con 900 µL del reactivo DPPH (0,075 mg/ml) y 90 µL de etanol absoluto. El blanco consistió en una mezcla de 900 µL de DPPH y 100 µL de etanol absoluto. La reacción se dejó en la oscuridad durante 30 minutos en un espectrofotómetro y posteriormente se leyeron las muestras a una longitud de onda de 517 nm. Cada determinación se llevó a cabo por triplicado. Los resultados fueron expresados como porcentaje de inhibición del radical DPPH según la fórmula siguiente:

% de inhibición del radical DPPH = [(Ab - Am)/Ab] x 100

Donde: Ab: absorbancia del blanco (nm) Am: absorbancia de la muestra (nm)

Se determinó la concentración inhibitoria media (IC50) con ayuda del programa estadístico Graphprism 5.0.

III.7.3 Ensayo del ABTS●+ (ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina)-6- sulfónico)

El ensayo se realizó según la metodología de Re y col. (1999), Agudo (2010) y Arnao y col. (2001)

Muestras:

Extractos hidroalcohólicos de flores y hojas de Chuquiragua a las concentraciones de 100, 200, 300, 500 y 700 μg/ml.

Procedimento

El ensayo fue basado en la habilidad de diferentes sustancias de secuestrar el radical catiónico ABTS●+, el cual fue preparado mezclando una solución de ABTS 7mM y per sulfato de potasio 2,45 mM (1/1, v/v). La mezcla se mantuvo en la oscuridad por 16 horas para la formación del radical. La solución ABTS●+ fue diluida con etanol al 96% hasta lograr una absorbancia de 0,700 ± 0,05 a 734 nm.

Se mezcló 980 µL de la solución de ABTS radicálico con 20 µL de los extractos ensayados y las sustancias de referencia (ácido ascórbico y trolox) a las concentraciones de 100, 200, 300, 500 y 700 μg/ml. Se incubó por 30 min para su posterior lectura a 734 nm en un espectrofotómetro UV- visible. Cada determinación se llevó a cabo por triplicado. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición del radical ABTS●+ según la fórmula siguiente:

% de inhibición = [A734 (ABTS)-A734 (antioxidante)]/A734 (ABTS) x 100

Se determinó la concentración inhibitoria media (IC50) con ayuda del programa estadístico Graphprism 5.0.

III. 8 Análisis estadístico

Para el procesamiento y análisis estadístico de los resultados se empleó el programa estadístico SPSS para Windows versión 8.0. Los valores experimentales se expresaron como la media / desviación estándar (DE). Los datos de los ensayos de DPPH y ABTS se analizaron por ANOVA de una sola vía, seguido y una prueba de comparaciones múltiples de medias de Tukey con una p ≤ 0,05.

CAPÍTULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

IV.1 Evaluación macro y micromorfológica de las flores y hojas.

La evaluación macromorfológica permitió observar flores diapétalas, con pétalos agudos en los extremos (A, B) y con abundantes pelos (D); los pistilos (B) fueron prominentes (B). En el cáliz de la flor, uno de los dos verticilos que conforman el periantro de las flores estuvo formado por un cojunto de sepalos muy pilosos. En la disección longitudinal de la flor (E) se visualizó en su parte central el estilo, rodeado de un conjunto de filamentos muy pilosos.

Las hojas (F) fueron sésiles o sentadas, dispuestas de forma decusadas sobre el tallo, forma lanceolada, bordes lisos que terminan en espinas.

Figura 4 Detalle macro morfológico de las flores y hojas

En el análisis micro morfológico de la droga en polvo de las flores se observó una sección de las celulas epidermicas de los petalos con abundantes triocomas en forma pelos; se puedo distinguir un pequeño fragmento de un elemento del sistema vascular (A). Una ampliación de una sección de la imagen anterior mostró células epidérmicasde forma variable, y en la parte central se observó un nervio secundario (B), así como abundantes tricomas del tipo pluricelular (C). En la figura 5 se detallan algunas características microscópicas de la droga en polvo de la flor.

Figura 5 Detalles micro morfológicos de la flor de Chuquiragua

En una sección planar de la epidermis de la hoja (D) se pudieron observar células epidérmicas, hexagonales de formas irregulares, numerosos estomas del tipo anomocítico (estoma rodeado de cuatro o más células que no difieren del resto de las células epidérmicas) (Mitra y col., 2015) y acompañados de pequeñas estructuras circulares que pudieran ser cloroplastos, que debido al proceso de decoloración no pueden ser observadas las tonalidades verdes. En una imagen ampliada de un estoma (E) se observaron las células oclusivas del estoma, la apertura y las células epidérmicas acompañantes. En la figura 6 se visualizan algunos elementos.

Figura 6 Detalles micro morfológicos de la hoja de Chuquiragua

IV.2 Parámetros fisicoquímicos de las drogas crudas

En la tabla II se presentan algunos de los parámetros que le fueron evaluados a las drogas crudas de Chuquiragua.

Tabla II Parámetros físico-químicos de las drogas crudas de Chuquiragua Resultados _ Parámetros (%) X/DS Flores Hojas Humedad residual 8,09/0,07a 7,79/0,03b Sustancias solubles en agua 8,10/0,12a 17,20/0,05b Sustancias solubles en etanol 30% 9,48/0,07e 17,41/0,10f Sustancias solubles en etanol 50% 8,75/0,05i 15,24/0,05j Sustancias solubles en etanol 80% 7,91/0,13m 14,11/0,06n Cenizas totales 3,37/0,19a 5,03/0,03b Cenizas solubles en agua 1,28/0,03e 1,45/0,04f Cenizas insolubles en HCl al 10% 1,93/0,03i 2,39/0,06j _ Leyenda: X/ DS : valor medio de las determinaciones / desviación estándar Letras iguales en una fila muestran que no existen diferencias significativas (p>0,05) y letras diferentes que si existen diferencias significativas (p<0,05) para un 95% de confianza, según Duncan

Las farmacopeas y algunas normas instauran un valor de humedad residual que no supere al 14%, en dependencia del órgano vegetal (Lou-Zhi-cen, 1980; WHO, 1998; Miranda, 2012). En el estudio efectuado el valor de humedad estuvo por debajo del límite máximo admitido para plantas medicinales.

El índice de cenizas totales es considerado por algunas Farmacopeas de hasta el 5% (Lou Zhi-cen, 1980; WHO, 1998) y para otras de hasta un 15% (Commission, 2015). En el estudio realizado el porcentaje se encontró por debajo del límite máximo admitido, además las cenizas insolubles en ácido y solubles en agua también fueron pequeñas, en su mayoría inferiores al 2%.

Para el contenido de sustancias solubles, el mayor poder extractivo se logró con la mezcla hidroalcohólica al 30% para las hojas y flores.

Los valores de humedad residual obtenidos 8,09/0,07 para las flores y 7,79/0,03 para las hojas son menores a los informados por Barrera (2015), pero superiores a los planteados por Molina, (2018), pero dentro de los rangos informados por la literatura.

Las cenizas totales presentaron valores de 3,37/0,19 para las flores y 5,03/0,03 para las hojas, valores que fueron inferiores para las hojas respecto a lo planteado por Molina (2018), sin embargo, este autor señala valores de cenizas inferiores para las flores. Estos valores fueron también superiores a los planteados por Barrera (2015), aunque en este trabajo no especifica si estudio hojas y flores unidas o sólo hojas, por otra parte lo consideramos erróneo pues las cenizas solubles en agua, resultaron superiores a las totales.

En las cenizas insolubles en ácido clorhídrico los valores obtenidos fueron superiores a los planteados por Barrera (2015), sin embargo se encuentran dentro de los rangos planteados en la literatura.

IV.3 Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico

Por medio del tamizaje fitoquímico se pueden establecer de forma cualitativa y preliminar, la composición de metabolitos en un extracto. En este caso se realizó el tamizaje a los extractos etéreo, alcohólico y acuoso de las flores y hojas.

En la tabla III se muestran los resultados de los tres extractos ensayados para cada órgano vegetal.

Tabla III Tamizaje fitoquímico de las drogas crudas de Chuquiragua Ensayos Metabolitos Extracto Extracto Extracto etéreo alcohólico acuoso F H F H F H Aceites y Sudan compuestos ++ ++ grasos Dragendorff alcaloides - - ± ± - - Mayer alcaloides - - ± ± - - Wagner alcaloides - - ± ± - - Baljet lactonas/ - - - + coumarinas Liebermann- triterpenoides/ ++ ++ + + Burchard esteroides Vi Vi R V Resina resina - - Cloruro de ++ ++ ++ ++ hierro III taninos/fenoles Vi Vi Vi Vi Espuma saponinas + + + + Ninhidrina aminoácidos ± ± - - Börntrager quinonas Shinoda flavonoides ++ ++ ++ ++ Ac Ai Ac Ai cardiotónicos - - Antocianidina antocianidinas + ++ Catequinas catequinas - - Fehling sustancias + ++ + + reductoras Mucílago mucílagos - - Leyenda: + ensayo positivo; ++ ensayo muy positivo; - ensayo negativo; ± ensayo dudoso, F:flores, H: hojas, T: tallos, R: raíces, Vi: verde intenso, Vc: verde claro, Ai: amarillo intenso, Ac: amarillo claro, R: rojizo, V: verde, Ri: rojizo intenso

En los extractos etéreos la presencia de compuestos grasos y triterpenoides/esteroides, fue significativa para hojas y flores.

En los extractos hidroalcohólicos se observaron algunas diferencias en el ensayo de Baljet (coumarinas) el cual solo fue positivo para el extracto de hojas. En el ensayo de Ninhidrina el resultado fue dudoso para hojas y flores. El resto de los ensayos no presentaron diferencias de magnitud en la composición química ensayada a través del tamizaje fitoquímico, aunque en las tonalidades de las coloraciones se apreciaron diferencias para algunos, poniéndose de manifiesto de manera significativa, la presencia de compuestos fenólicos.

En los extractos acuosos también la presencia de compuestos fenólicos, fue evidente, dando tonalidades muy intensas para las hojas y flores.

Los resultados presentan coincidencia con lo planteado por Barrera (2015).

IV.4 Obtención de extractos y parámetros físico-químicos de calidad

A partir de las flores y hojas secas, se elaboraron extractos maceración (siete días), empleando etanol al 30%, ya que fue el disolvente donde se obtuvo el mayor porcentaje de sustancias solubles.

A estos extractos se les determinaron los parámetros físico-químicos para poder proponer los parámetros de calidad que garanticen su seguridad y eficacia (tabla IV).

Los extractos presentaron organolépticamente, consistencia líquida ligeramente traslúcida, de color amarillento a carmelita amarillento y olor característico el extracto de hojas presentó coloración más intensa.

El valor de pH fue débilmente ácido, producto de la presencia de compuestos fenólicos detectados en el tamizaje fitoquímico.

En los sólidos se encontraron diferencias, siendo mayor el porcentaje para el extracto de hojas, seguido del extracto de flores.

Tabla IV Parámetros físico-químicos de los extractos de Chuquiragua Resultados Parámetros _ X/DS Flores Hojas pH 5,02/0,02a 4,99/0,005a Sólidos totales (%) 0,91/0,02d 1,85/0,03e Índice de refracción 1,3570/0,005g 1,3545/0,0001g Densidad relativa (g/ml) 0,9187/0,0173h 0,9420/0,0001i 12,15/0,21j 12,70/0,28j Imagen alta Imagen alta (> 8cm), franja (> 8cm), franja Análisis capilar regularmente dentada, regularmente dentada, (altura en cm y sub-franja crema claro, sub-franja crema claro, descripción de la banda crema oscura y banda crema oscura y imagen) sub-banda crema sub-banda crema claro. NH3 ( +) [se claro. NH3 ( +) [se intensifica el color de la intensifica el color de la imagen hacia color imagen hacia color amarillento] amarillento] _ Leyenda: X/ DS : valor medio de las determinaciones ± desviación estándar Letras iguales en una fila muestran que no existen diferencias significativas (p>0,05) y letras diferentes que si existen diferencias significativas (p<0,05) para un 95% de confianza, según Duncan

En la figura 7 se presenta el análisis capilar donde los dos extractos mostraron un perfil similar en cuanto a la franja, la principal diferencia estuvo en la intensidad de la imagen, la que fue más intensa en los extractos de hojas que de flores y fue posible detectar las diferentes zonas de la imagen (sub-franja, banda y sub-bandas).

Figura 7 Análisis capilar de los extractos hidroalcohólicos de Chuquiragua

Análisis de la composición química de los extractos hidroalcohólicos. Tamizaje fitoquímico de los extractos hidroalcohólicos al 30%

Sólo se observaron algunas diferencias de intensidad comparados con los ensayos realizados a las drogas crudas, en lo cual puede haber influido el disolvente de extracción, en el que se logró una mayor extracción de metabolitos, entre ellos, de los compuestos fenólicos (taninos, flavonoides, antocianinas, coumarinas).

Tabla V Tamizaje fitoquímico de los extractos hidroalcohólicos de Chuquiragua Extractos Ensayos Metabolitos F H Dragendorff alcaloides + + Mayer alcaloides + + Wagner alcaloides + + Baljet lactonas/ coumarinas + + Liebermann-Burchard triterpenoides/esteroides + + R V Resina resina - - ++ ++ Cloruro de hierro III taninos/fenoles Vi Vi Espuma saponinas + + Ninhidrina aminoácidos + + - - Börntrager quinonas Shinoda flavonoides ++ ++ Ai Ai Kedde cardiotónicos - - Antocianidina antocianidinas ++ ++ Catequinas catequinas - - Fehling sustancias reductoras + ++ Leyenda: + ensayo positivo; ++ ensayo muy positivo; - ensayo negativo, F: extracto de flores, H: extracto de hojas, Vi: verde intenso, Ai: amarillo intenso, R: rojizo, V: verde.

IV.5. Técnicas espectrofotométricas

IV.5.1. Determinación de fenoles totales y flavonoides totales

En los extractos de hojas y flores se cuantificaron los fenoles y flavonoides, considerando los resultados del tamizaje fitoquímico.

El método de Folin-Ciocalteu, fue el empleado para la determinación de fenoles totales, en el cual estos compuestos dan un complejo de color azul que presenta un máximo de absorción a 765 nm, permitiendo su cuantificación por espectroscopia UV/visible. Como patrón se emplea el ácido gálico y los resultados se expresan en equivalentes de ácido gálico (Martínez, 2007).

El método colorimétrico del tricloruro de aluminio, fue el empleado para la determinación cuantitativa de flavonoides, ya que estos compuestos reaccionan con

el reactivo, produciendo un complejo de color amarillo que posee un pico de absorción de luz a 415 nm.

Las curvas de calibración logradas en las dos cuantificaciones mostraron una buena correlación entre las concentraciones ensayadas de las sustancias de referencias (ácido gálico y quercetina) y las absorbancias. El coeficiente de correlación (R2) fue ≥ 0,99, con buen ajuste de la ecuación del modelo a los datos experimentales (figura 8).

Figura 8 Curvas de calibración del ácido gálico y la quercetina para la determinación de fenoles y flavonoides, respectivamente.

El análisis estadístico de los resultados estableció diferencias significativas en el contenido de ambos metabolitos, siendo mayor la concentración en el extracto de hojas, seguido del extracto de flores. En la tabla VI se exponen los resultados. Tabla VI Contenido de fenoles totales y flavonoides totales en los extractos de chuquiragua Fenoles totales Flavonoides totales Extractos (mg/ml) (mg/ml) _ X / DS Flores 1,33/0,01a 0,46/0,01e Hojas 2,92/0,04b 1,29/0,01f _ Leyenda: X/ DS : valor medio de las determinaciones / desviación estándar Letras iguales en una columna muestran que no existen diferencias significativas (p>0,05) y letras diferentes que si existen diferencias significativas (p<0,05) para un 95% de confianza, según Duncan

IV.6 Actividad antioxidante de flores y hojas de Chuquiragua

IV.6.1 Actividad antioxidante por el método de FRAP (capacidad ferro- reductora)

El ensayo FRAP se fundamenta en la habilidad que tienen los compuestos fenólicos de reducir el hierro (Fe3+ a Fe2+). Si el extracto se encuentra en presencia del 2, 4, 6-tripiridil-s-triazina, la reducción se produce con la formación de un complejo coloreado de Fe2+ de color azul, la cual absorbe a una longitud de onda de 593 nm e indica un poder de reducción alto del extracto, o lo que es lo mismo, una actividad antioxidante alta (Roginsky y Lissi, 2005).

A las cinco concentraciones ensayadas, el extracto mostró cualitativamente un cambio de color a azul intenso, lo cual demuestra la presencia de sustancias antioxidantes en el mismo.

Los resultados expresaron la capacidad reductora del extracto como μM equivalentes de ácido ascórbico y μM equivalentes de FeSO4, que fueron las sustancias de referencia utilizadas, además de ser reconocidas por poseer un elevado valor antioxidante, Esto se determinó a partir de las curvas de calibración (obtenidas por regresión lineal) de los patrones con sus respectivas ecuaciones, donde Y es la absorbancia y X la concentración (figura 9).

Se obtuvo una buena correlación entre las concentraciones de las sustancias de referencia ensayadas y las densidades ópticas, el coeficiente de correlación estuvo cercano a 0,99; que indicó un buen ajuste de la ecuación del modelo a los datos experimentales.

Figura 9 Curvas de calibración del ácido ascórbico y el FeSO4 para la determinación de la capacidad antioxidante por FRAP.

La actividad ferro-reductora de los extractos evaluados, se presenta en la tabla VII. Se apreció una actividad antioxidante concentración-dependiente y se logró en todas las concentraciones de los extractos ensayados, valores superiores (en equivalentes de ácido ascórbico y FeSO4), a la menor concentración de cada sustancia de referencia ensayada (100 μM).

Esto permite sugerir que el extracto hidroalcohólico de hojas y flores presentan una elevada actividad antioxidante, lo cual implica valores de μM equivalentes altos expresados en función de las sustancias de referencias ensayadas, no se encontraron diferencias significativas en la concentración 60 μg/ml.

Tabla VII Actividad ferro-reductora de los extractos hidroalcohólicos

μM equivalentes de ácido ascórbico / DE Concentraciones Extractos (μg/ml) Flores Hojas 20 310,3/11,63a 400,22/10,48b 30 415,72/12,80d 483,94/16,49e 40 672,31/12,81g 845,18/12,94h 50 739,75/10,48k 948,28/19,36l 60 923,47/6,71n 938,97/10,48n Concentraciones μM equivalentes de FeSO / DE (μg/ml) 4 20 236,58/10,87a 320,64/9,79b 30 335,13/11,97d 398,90/15,42e 40 585,85/9,80g 736,58/12,10h 50 638,03/9,80k 832,96/18,10l 60 809,77/6,27n 824,26/9,80n Se indica la media (n=3)/desviación estándar (DE) Letras diferentes en un mismo μM equivalente para los cuatro extractos a la misma concentración indica diferencias significativas y letras iguales que no existen diferencias significativas (p≤ 0,05), según Tukey.

Si se comparan los resultados con algunos informes de la literatura se puede inferir el buen poder ferro- reductor de los extractos comparados con plantas cuyos valores en μM equivalentes fueron inferiores al menor valor obtenido los extractos ensayados, entre ellas: Achyranthes bidentata, Allium macrostemon, Angelica sinensis, Cortex Dictamni, (Li y col., 2018).

IV.6.2 Capacidad secuestradora del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)

En este ensayo se valora la capacidad de un antioxidante para reducir el radical DPPH. El 1,1-difenil-2-picrilhidracilo (DPPH) es un radical que presenta una coloración violeta intensa y que en presencia de un antioxidante produce un cambio a amarillo, que se mide espectrofotométricamente a 517 nm (Azlim y col., 2010; Sunitha y col., 2018).

Cualitativamente se apreció cambio de coloración de púrpura a amarillo en los extractos de flores y hojas, a medida que aumentaba la concentración. Esto justifica la presencia de sustancias antirradicalarias en los extractos que provocaron la

reducción del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) y la disminución de la absorbancia en la disolución.

En la tabla VIII, se observa que desde la menor concentración evaluada, se apreciaron porcentajes de inhibición superiores al 50%, siendo superior en orden las sustancias de referencia y los extractos de hojas y flores. A la concentración máxima, el extracto de hojas tuvo un comportamiento similar a la vitamina C y el Trolox sin diferencias significativas, con porcentajes de inhibición superiores a 89%, evidenciándose un elevado poder secuestrador del radical DPPH.

Tabla VIII Capacidad secuestradora de DPPH de los extractos hidroalcohólicos de Chuquiragua y las sustancias de referencia

Porciento de secuestro del radical DPPH (%) ± DE Muestras IC μg/ml Concentración μg/ml 50 20 30 40 50 60 Flores 53,87/0,43a 60,07/0,54f 66,91/0,50l 76,78/0,34r 84,07/0,72w 40,60/5,99 Hojas 55,69/0,31b 61,12/0,55g 70,59/0,60m 82,68/0,73s 89,10/0,38x 40,57/4,37 Vitamina C 78,43/0,76d 84,58/0,39j 86,29/0,49p 88,92/0,25v 89,76/0,51x 31,07/8,70 Trolox 82,72/0,60e 85,97/0,38k 87,79/0,43q 88,63/0,50v 89,39/0,49x 31,45/8,32 Se indica la media (n=3) ± desviación estándar (DE). Letras diferentes en una columna indica diferencias significativas y letras iguales que no existen diferencias significativas, a una misma concentración (p≤ 0,05), según el test de comparación múltiple de Tukey

La IC50 (concentración a la cual se alcanza el 50 % de inhibición del efecto máximo de secuestro de DPPH), presentó el menor valor para la sustancia de referencia, lo que indica una mayor actividad; los extractos manifestaron buena actividad antirradicalaria con valores similares, aunque mayores que las sustancias de referencia. Los resultados se consideran buenos ya que la concentración de los metabolitos responsables de la acción antioxidante en los extractos es muy inferior a la concentración de los compuestos puros (vitamina C y Trolox). En la figura 10 se exponen las curvas de concentración-respuesta de la prueba DPPH.

Figura 10 Curvas de concentración-respuesta de la prueba DPPH de los extractos de chuquiragua y las sustancias de referencia

Si se comparan los resultados de IC50 alcanzados para los dos extractos con los de otras plantas medicinales reportadas en la literatura, se destaca que el valor obtenido es comparable a los reportados para diferentes extractos de Datura alba (hojas) a las concentraciones de 30, 40 y 50 μg/ml, con los que se logró IC50 menores a 50 μg/ml (Khan y col, 2019) y otras como Portulaca oleracea (41,18 μg/ml), Solanum nigrum (42,89 μg/ml), Ipomoea aquatica (42,43 μg/ml) (Aryal y col., 2019).

Entre otras especies reconocidas como antioxidantes pero con IC50 muy superiores a los obtenidos para los extractos de Chuquiragua se pudieran citar las semillas de

N. sativa (IC50 de 624,7 ± 12,77 μg/ml), N. damascena (IC50 de 177,6 ± 3,71 μg/ml) (Toma y col., 2015), extractos de semillas y hojas de A. ampeloprasum subsp. persicum (IC50 de 315 a 792 μg/ml) (Feghhi-Najafabadi y col., 2019) .

IV.6.3 Ensayo del ABTS●+ (ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina)-6- sulfónico)

Debido a la capacidad de los extractos y las sustancias de referencia de neutralizar este radical, se observó durante el desarrollo de este método, una decoloración del radical catiónico ABTS•+ a todas las concentraciones evaluadas, lo que se refleja en el descenso de la absorbancia y la disminución del color azul-verde intenso hasta su decoloración.

Ambos extractos mostraron porcentajes de inhibición del radical ABTS superiores al 50% a la mínima concentración ensayada (100 μg/ml), incluso mayores al Trolox,

el extracto de hojas superó además a la vitamina C. A las concentraciones de 200 y 300 μg/ml los extractos de hojas y flores superaron al Trolox en el porciento de secuestro. En la tabla IX se ilustran los resultados. Tabla IX Capacidad secuestradora del radical ABTS●+ de los extractos hidroalcohólicos de Chuquiragua y las sustancias de referencia

Porciento de secuestro del radical ABTS (%) ± DE Muestras IC μg/ml Concentración μg/ml 50 100 200 300 500 700 Flores 54,87/0,77a 61,31/0,70f 72,34/0,49k 85,48/0,51q 87,64/1,06u 286,0/2,73 Hojas 63,98/0,80b 70,15/0,62g 83,65/0,78l 87,36/0,49r 89,10/0,90v 242,2/3,69 Vitamina C 56,14/0,49a 72,67/0,64i 90,70/0,74o 91,87/0,58t 94,92/0,64y 210,60/3,79 Trolox 43,04/0,72e 56,61/0,75j 62,81/0,50p 91,31/0,80t 94,36/0,92 306,50/7,91 Se indica la media (n=3) ± desviación estándar (DE). Letras diferentes en una columna indica diferencias significativas y letras iguales que no existen diferencias significativas, a una misma concentración (p≤ 0,05), según el test de comparación múltiple de Tukey

De las muestras evaluadas, la que presentó menor IC50 (valor de concentración al cual se alcanza el 50 % de inhibición del efecto máximo de secuestro de ABTS) y por tanto mayor actividad antioxidante, fue la vitamina C, seguida de los extractos de hojas y flores. En la figura 11 se muestran las curvas de concentración-respuesta de la prueba ABTS.

Figura 11 Curvas de concentración-respuesta de la prueba ABTS de los extractos de chuquiragua y las sustancias de referencia Diversos ensayos son utilizados para determinar la actividad antioxidante de los extractos de plantas, algunos de ellos se basan en la eliminación de ciertos radicales como el ensayo de DPPH y ABTS y otro como el ensayo de FRAP mide el potencial de actividad de reducción férrica. Muchos emplean la combinación de varios ensayos para la detección de la actividad de las plantas, suponiendo que la

combinación de los datos proporcionaría una mejor descripción de la actividad antioxidante que la obtenida de un único ensayo (Clarke y col., 2013).

Los métodos ABTS y DPPH se correlacionan entre si ya que se basan en una de las estrategias más aplicadas para medir in vitro la capacidad antioxidante total de un compuesto, al aplicar el cambio de la intensidad del color que ocurre de forma proporcional a la concentración de antioxidantes de la muestra (Kuskoski y col., 2005).

La ocurrencia de sinergismo entre varios compuestos con propiedades antioxidantes de una mezcla, provoca que la actividad no solo dependa de sus concentraciones sino también de la interacción entre ellos. Por lo que la capacidad antioxidante de un extracto no solamente viene dada por la suma de las capacidades antioxidantes de cada uno de sus componentes, sino que también depende del microambiente en que se encuentran los mismos pudiendo producirse efectos sinérgicos o inhibitorios (Kuskoski y col., 2005).

Los estudios realizados por Dueñas, (2014); Barrera, (2015), Molina, (2018) y Palma, (2019), en diversos extractos de chuquiragua, demostraron también la actividad antioxidante de las hojas y/o las flores, empleando diferentes métodos in vitro e in vivo.

CAPÍTULO V.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

V.1. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos permiten arribar a las siguientes conclusiones:

 Se describieron las características macro y micro morfológicas de las hojas y flores para las cuales no se encontraron referencias anteriores.

 Los parámetros de control de calidad determinados cumplen con lo establecido en las normas y Farmacopeas y con lo establecido para la especie en la literatura.

 Los compuestos fenólicos fueron los principales metabolitos detectados cualitativamente tanto en hojas como en flores.

 Los extractos de hojas y flores presentaron una apreciable actividad antioxidante en los tres métodos evaluados.

V.2 RECOMENDACIONES

. Profundizar en los estudios químicos de la especie

. Realizar evaluaciones farmacológicas que permitan avalar las actividades atribuidas en medicina tradicional

VI. BIBLIOGRAFÍA

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GLOSARIO

1. Antioxidante. Es una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras moléculas. 2. Coumarinas. se consideran un grupo de metabolitos secundarios de las plantas 3. Fenólicos. son compuestos orgánicos en cuyas estructuras moleculares contienen al menos un grupo fenol, un anillo aromático unido a un grupo hidroxilo. 4. Fenoles. son compuestos que resultan de reemplazar un hidrógeno o más de su anillo aromático por uno o más OH. 5. Flavonoides. son metabolitos secundarios polifenólicos comúnmente con un grupo cetona y normalmente pigmentos de coloración amarilla. 6. Polifenoles. son un grupo de sustancias químicas encontradas en plantas caracterizadas por la presencia de más de un grupo fenol por molécula. 7. Resinas. Es una secreción orgánica que producen muchas plantas, particularmente los árboles del tipo conífera. 8. Radicales libres. son átomos que tienen un electrón desapareado o libre por lo que son muy reactivos ya que tienden a captar un electrón de moléculas estables con el fin de alcanzar su estabilidad electroquímica. 9. Taninos. son metabolitos secundarios de algunos vegetales, que resultan solubles en el agua y son astringentes. 10. Triterpenos. son un tipo de compuestos químicos compuestos de tres unidades de terpenos. También se les puede definir como la composición de 6 unidades de isopreno.

Anexo A Cenizas totales

Fuente: Autores Anexo B Extracción por método de Soxhlet

Fuentes: Autores

Anexo C Tamizaje fitoquímico- Etéreo, Alcohólico y Acuoso

Fuente: Autores

Anexo D Obtención de los extractos etéreo, alcohólico y acuoso

Fuente: Autores