UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

BRUNO RODRIGO MINOZZO

AÇÃO GASTROPROTETORA DA FRAÇÃO METANÓLICA DAS CASCAS DE Euphorbia umbellata (PAX) BRUYNS: ENVOLVIMENTO DE CICLOOXIGENASES, ÓXIDO NÍTRICO E SEU PAPEL ANTIOXIDANTE

PONTA GROSSA 2015

BRUNO RODRIGO MINOZZO

AÇÃO GASTROPROTETORA DA FRAÇÃO METANÓLICA DAS CASCAS DE Euphorbia umbellata (PAX) BRUYNS: ENVOLVIMENTO DE CICLOOXIGENASES, ÓXIDO NÍTRICO E SEU PAPEL ANTIOXIDANTE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas pela Universidade Estadual de Ponta Grossa. Orientador: Prof. Dr. Flávio Luís Beltrame Co-orientador: Prof. Dr. Daniel Fernandes

PONTA GROSSA 2015

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Associação Ampla entre a Universidade Estadual do Centro-Oeste e a Univesidade Estadual de Ponta Grossa

ATA DE DEFESA DE DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS– ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: FÁRMACOS, MEDICAMENTOS E BIOCIÊNCIAS APLICADAS À FARMÁCIA, NÚMERO DA ATA 08/2015, DO MESTRANDO BRUNO RODRIGO MINOZZO REALIZADO NO DIA 02 DE DEZEMBRO DE 2015, NA UNIVERSIDADE ESTADUALDE PONTA GROSSA.

Aos dois dias de dezembro de dois mil e quinze, às 14 h 00 min na sala 02, auditório NUTEAD, Central de salas de aula, da Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG) em seção pública sob a presidência do Professor Doutor Flávio Luís Beltrame reuniu-se a Banca Examinadora de defesa da Dissertação de Mestrado em Ciências Farmacêuticas do mestrando Bruno Rodrigo Minozzo na linha de pesquisa: Avaliação Química e Biológica de Produtos Naturais, constituída pelos demais Doutores (membros titulares): José Carlos Rebuglio Vellosa (UEPG/PR) e Rodrigo Rezende Kitagawa (UFES/ES). Iniciados os trabalhos, a presidência deu conhecimento aos membros da banca e ao candidato das normas que regem a defesa da dissertação de Mestrado e definiu-se a ordem a ser seguida pelos examinadores para argüição. O título do trabalho foi: ―Ação gastroprotetora da fração metanólica das cascas de Eurphorbia umbellata (Pax) Bruyns: envolvimento de ciclooxigenases, óxido nítrico e seu papel antioxidante‖. Encerrada a defesa, a banca pronunciou-se APROVANDO a dissertação, considerado como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. O aluno deverá entregar, no prazo de até 60 dias, a versão definitiva da dissertação de Mestrado, com as modificações sugeridas pelos membros da banca examinadora. Nada mais havendo a ser tratado, lavrou-se a presente ata que vai assinada pelos membros da Banca Examinadora. Observações (se necessário):______Alteração de título: sim □ não □x Novo título: ______

______Flávio Luís Beltrame1- Presidente (DEFAR – UEPG)

______José Carlos RebuglioVellosa 2- (UEPG) – Titular

______Rodrigo Rezende Kitagawa 3- (UFES) – Titular

Ponta Grossa, 02 de Dezembro de 2015.

Pró – Reitoria de Pesquisa e Pós- Graduação Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, Fármacos, medicamentos e biociências aplicadas à Farmácia – Fone (42) 3220-3337– [email protected] Av. Carlos Cavalcanti, 4748 – Ponta Grossa – Paraná – Brasil – CEP: 84030-900

Dedico este trabalho aos meus pais, Nelson e Zeneide, e a minha amada Camila,

inesgotáveis fontes de motivação

AGRADECIMENTOS Foram muitos os que fizeram parte da trajetória para que eu chegasse até aqui. Meus sinceros agradecimetos...... a Deus acima de tudo. Acreditar Nele foi a base para pensar que tudo poderia dar certo. A Ele todo bem, toda honra e toda graça; ...Aos meu pais Nelson e Zeneide Minozzo, meus anjos da guarda.O que se passou até esse momento não faz parte só da minha história, mas de longe também lhes pertence. Tenho noção de cada gota de suor derramada por vocês a meu favor. Serei eternamente grato. Amo vocês; ...A minha família, em especial, meu irmão C. Felipe, minha avó Teresa e minha tia Ana por estarem firmes comigo durante toda caminhada, em orações, conselhos, favores e carinho. Por me mostrarem que o respeito é formado dentro de casa e que grandes gestos não dependem de grandes plateias para serem vistos, mas de olhos verdadeiros que os saibam enxergar; ...A minha família Rita, Vinício,Thiago, Vó Estela e Vô Ângelo. Vocês foram pra mim tudo aquilo que deixei quando precisei sair de casa para iniciar a faculdade. Vejo em vocês exemplos de luta, persistência, solidariedade, fraternidade, acolhimento, boa edução e respeito ao próximo, a verdade viva de que o seio de uma família está no amor que sentimos uns pelos outros. Nunca esquecerei doutor Vinício, que é o trabalho que dignifica o homem; ...À minha namorada Camila. Sinceramente não sei se minha vida seria a mesma hoje sem você. Meus caminhos foram repletos de pontos de dúvida, mas você instanteamente soube me guiar pelo correto. Sua fragilidade misturada a sua grandeza se tranformaram no alvo principal da minha motivação. Fui por você incentivado, apoiado, abraçado e amado. Pretendo muito mais ainda retribuir-lhe tal afeto, zelar por sua integridade, fortalecer sua alma e amá-la dia após dia. Quero ser um dos homens da sua vida e dividir este posto com o nosso querido Edu, uma criança linda que graças a Deus tenho a oportunidade de ver crescer e se desenvolver. Um anjo que no seu puro e doce recado “Oi pai” me fez apreciar um dos melhores sentimentos da vida, o de ser o seu pai!; ...Aos mestres dos quais tive o prazer em ser aprendiz. Ao Prof.o Leandro pela confiança; Ao Prof.o Eduardo pelos ensinamentos e parceria firmada; Ao Prof.o Fábio André pela gentileza de ceder espaço em seu „frezeer‟ para o armazenamento de minhas amostas; Ao Prof.º Daniel pela co-orientação e suporte nos momentos precisos; Ao Prof.o José Vellosa pelo apoio, disponibilidade extra e interesse em tornar palpável o sonho de um aluno; À Prof.ª Joselia Daher pela motivação e incentivo depositados em mim em todos os momentos; Ao Prof.o Edmar por todas as oportunidades a mim oferecidas; Ao Prof.os Gilson pelo coleguismo; Ao Prof.º Sinvaldo por acreditar em minhas habilidades e fazer parte de minha formação profissional; Ao Prof.º Rodrigo pela ajuda e colaboração e por ter aceito fazer parte desta banca de defesa; ...Ao meu orientador Prof.o Flávio Luis Beltrame que tornou realidade os primeiros passos que firmei dentro daquilo que um dia espero ser a minha profissão. Já se vão mais de 5 anos desde que você plantou em mim a semente da paixão pelo meio acadêmico. Sua emoção,

dedicação e honestidade serão exemplos que levarei comigo em qualquer lugar. Obrigado talvez seja insuficiente para denotar a minha gratidão a você. Desejo-lhe, entre tantas coisas, o sucesso e muita sorte em sua estadia longe do Brasil. Lembre-se: o terei sempre como orientador e amigo, um modelo a ser seguido; ...Aos meus colegas de mestrado Amanda L., Amanda U., Ana Paula, Barbara, Clarissa, Cris, Flávia, Josyel, Leandro, Melissa e Paula. Obrigado pelos momentos de companheirismo frente aos desafios que a nós se apresentaram e aos que criamos também. Carol, foi bom ter você como vizinha de laboratório, parceira de experimentos e de discussões produtivas (outras nem tanto assim, que levavam nada a lugar algum, mas nos aliviavam o estresse e rendiam boas risadas), com certeza ganhei mais uma amiga; ... a você Bruna, amiga inestimável que sem hesitar topou as minhas ideias loucas, me ajudou e fez total parte para que tudo se concretizasse. Espero que seu futuro ainda se cruze com o meu e que tenhamos muitas histórias de sucesso pra contar um ao outro. Serei alguém com quem poderá contar sempre, Amiguinha! ...A todos os amigos do peito. Suas amizades não foram conquistadas, vejo como se as tivesse ganhado de presente. Guilherme, sou muito grato por ter emprestado sua câmera a mim em todos os dias que precisei usá-la, foi fundamental para que alcançasse muitos resultados. Rômulo, Seco, Zé, Jimi, Diogo, suas companhias sempre foram motivo de alegria e nossos encontros serviam para que minhas energias fossem recarregadas. Saibam que nem mesmo o tempo ou a distância serão capazes de enfraquecer o laço que fizemos. Desejo-lhes boa sorte em seus novos caminhos; ...Aos colegas de laboratório Luiza, Aline, Victor, Jheniffer, Cida e Profª Priscileila. Obrigado por toda ajuda e pelos momentos agradáveis de convivência; ...À Universidade Estadual de Ponta Grossa e todos os seus funcionários que contribuíram efetivamente para a realização deste Trabalho. Agradecimentos especiais ao Luiz da histologia e Maria e Marilene do Biotério. Minhas conquistas passam por vossas mãos; ...A CAPES pelo apoio financeiro; ...Às ratas que usei em todos os experimentos, sem as quais nada seria possível. Meu respeito a elas; ...A todos que de alguma maneira participaram da realização deste sonho. Obrigado!

Vento oportuno “Para ir da oportunidade ao êxito é preciso enfrentar os medos de mu- dança, romper com o mesmo e ter a capacidade de se antecipar.”

[Professor Mario Sergio Cortella]

RESUMO A mucosa gástrica é continuamente exposta a agentes lesivos endógenos (ácido clorídrico, pepsina, bile, espécies reativas de oxigênio) e exógenos (álcool, anti-inflamatórios, fumo, Helicobacter pylori) que estão envolvidos na patogênese das úlceras. De uma forma geral é aceito que a doença ocorre quando há um desbalanço entre os fatores de proteção e os de agressão. A espécie Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns, comumente conhecida como ―janaúba‖, possui indicações populares para o tratamento de inúmeras doenças, incluindo as úlceras do trato gastrintestinal. Até o momento são poucos os estudos que avaliam possíveis ações farmacológicas deste vegetal frente a esta patologia. Dessa forma, buscou-se nesse trabalho avaliar o potencial antiúlcera da fração metanólica (FM) das cascas de E. umbellata e estudar os mecanismos de ação envolvidos. O efeito gastroprotetor da fração metanólica foi testado frente a modelos agudos de úlcera induzidos por etanol e indometacina em ratos. As formas de ação foram investigadas pelo uso de inibidores farmacológicos como L-NAME (70 mg.Kg-1, i. p.), aminoguanidina (AMG, 100 mg.Kg-1, i. p.), azul de metileno (AZM, 20 mg.Kg-1, i. p.) e indometacina (30 mg.Kg-1, s. c.). Avaliou-se o envolvimento de compostos sulfidrílicos totais (SH-T) e não protéicos (SH-NP), assim como a atividade da enzima catalase de animais tratados com a FM. Analisou-se também a ação da FM sobre Helicobacter pylori e inibição da urease in vitro. Além disso, a ação antioxidante da FM foi verificada • •+ •- frente ao DPPH , ABTS , O2 , HOCl, TauCl e HRP. O potencial redutor do soro dos ratos foi testado na captura do ABTS•+. Alterações histológicas no tecido estomacal dos animais teste também foram averiguadas. O tratamento via oral com FM (200 mg.Kg-1) proporcionou gastroproteção de 89,7 % para o etanol e 88,5 % para a indometacina. Histologicamente a FM conferiu proteção ao epitélio, sem maiores danos a integridade da mucosa. O tratamento com L-NAME, AMG e AZM reverteu a ação antiúlcera apresentada pela FM nos modelos anteriores, bem como o uso de indometacina também minimizou os seus efeitos. As respostas obtidas nos testes antioxidantes mostram a habilidade de captura de radicais e espécies reativas de oxigênio pela FM, além de sua ação inibitória em modelo de peroxidase. Elevação dos níveis de SH-T foram vistos no soro de animais tratados, muito embora SH-NP e CAT não tenham sofrido alterações significativas. O soro de ratos tratados com a FM aumentou 7,46 % a captura de ABTS•+ comparado ao controle negativo. Para o teste antimicrobiano a FM alcançou 44,16 % de inibição do crescimento do H. pylori na concentração de 256 µg.mL- 1. No teste anti-urease a FM apresentou bloqueio enzimático de 78,62 % em 1024 µg.mL-1. As atividades biológicas da FM de E. umbellata podem estar associadas à presença de compostos fenólicos derivados de ácido gálico, elágico, flavonoides e taninos, detectados pela técnica de LC-MS pela primeira vez nessa espécies vegetal. Em conjunto os resultados obtidos permitem sugerir que o efeito gastroprotetor da FM possa estar relacionado à presença dos polifenólicos, bem como aliado ao seu potencial scavenger sobre espécies reativas, ativação da via óxido nítrico/monofosfato de guanosina cíclico e ciclooxigenases e ações anti-H. pylori e anti-urease Palavras-chave: etanol, indometacina, etnofarmacologia, polifenólicos, Helicobacter pylori

ABSTRACT The gastric mucosa is continuously exposed to harmful, endogenous agents (hydrochloric acid, pepsin, bile, and reactive oxygen species) and exogenous agents (alcohol, anti- inflammatory drugs, smoking and Helicobacter pylori) that are involved in the pathogenesis of ulcers. In general, it is accepted that disease occurs when there is an imbalance between protective and aggressive factors. The species Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns, which is commonly known in Brazil as ―janaúba‖, is popularly used for the treatment of a variety of diseases, including gastric ulcers. There have been few studies that have assessed the pharmacological action of this plant in relation to this pathology. Consequently, this study evaluated the antiulcerogenic potential of the methanolic fraction (MF) of E. umbellata bark and its mechanism of action. The gastro-protective effect of the MF was assessed in relation to acute ethanol and indomethacin-induced ulcer models in rats. The mechanisms of action were investigated using pharmacological inhibitors such as L-NAME (70 mg.Kg-1, i. p.), aminoguanidine (AMG, 100 mg.Kg-1, i. p.), methylene blue (MB, 20 mg.Kg-1, i. p.) and indomethacin (30 mg.Kg-1, s. c.). The involvement of total sulfhydryl (SH-T) compounds and non-protein (SH-NP) compounds, as well as the catalase activity of animals treated with MF, were evaluated. The antimicrobial action in relation to Helicobacter pylori and the in vitro inhibition of urease were also analyzed. Furthermore, the MF antioxidant potential was • •+ •- verified in relation to DPPH , ABTS , O2 , HOCl, TauCl and HRP. The reducing potential of the serum in rats was evaluated using the ABTS•+ test. Histological changes in the gastric tissue of the test animals were investigated. The oral treatment with MF (200 mg.Kg-1) exhibited 89.7% gastro-protection for ethanol and 88.5% for indometachin. Histologically, the MF demonstrated protection for the epithelium without damaging the mucosal integrity. The treatments with L-NAME, AMG and MB reversed the anti-ulcer potential obtained by MF in the previous models, and the use of indomethacin also minimized its effects. The results of the antioxidant tests showed the ability of MF to capture free radicals and reactive oxygen species, in addition to its inhibitory action in relation to the peroxidase model. Increased SH-T levels were seen in the serum of the treated rats, although SH-NP and CAT showed no significant differences. Serum from animals treated with MF enhanced the capture of ABTS•+ radicals by 7.46 % compared to negative control. In the antimicrobial assay, the MF showed 44.16 % growth inhibition in relation to H. pylori at 256 µg.mL-1. In the anti-urease test MF blocked 78.62 % of enzymes at 1024 µg.mL-1. These biological activities may be associated with the presence of phenolic compounds such as gallic acid, ellagic acid, flavonoids, and tannins, which were detected using LC-MS for the first time in this vegetal species. Taken together, the results make it possible to suggest that the gastro-protective effect of MF is possibly related to the presence of polyphenols, as well as its scavenging activity, the activation via the nitric oxide release pathway of cyclic guanosine monophosphate and cyclooxygenases, and anti-H. pylori and anti-urease actions. Keywords: ethanol, indomethacin, ethnopharmacology, polyphenols, Helicobacter pylori

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns no habitat...... 27

Figura 2 – Patofisiologia das úlceras induzidas por anti-inflamatórios não esteroidais (AINE)...... 36

Figura 3 – Vias de produção de espécies reativas em neutrófilos...... 39

Figura 4 – Papel antioxidante da GSH...... 44

Figura 5 – Fontes e respostas aos principais oxidantes presentes em sistemas biológicos...... 45

Figura 6 – Efeito gastroprotetor da fração metanólica de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (FM, 50, 100, 200 mg.Kg-1, via oral) e da ranitidina (RANI, 100 mg.Kg-1, via oral) sobre lesões gástricas induzidas por etanol absoluto (0,5 mL.100g-1) em ratos, comparado com o veículo salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), representado pela porcentagem de lesão ulcerativa...... 68

Figura 7 – Análise histopatológica do estômago de ratos tratados com ranitidina (RANI, 100 mg.Kg-1), salina (SAL, 0,5 mL.100g-1) e a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) em modelo de úlcera por etanol...... 69

Figura 8 – Visão macroscópica representativa do corte histológico do estômago de ratos tratados com etanol (0,5 mL.100g-1)...... 70

Figura 9 – Fotomicrografias representativas do estômago de animais tratados com etanol em modelo agudo de indução de úlcera...... 71

Figura 10 – Efeito gastroprotetor da fração metanólica de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (FM, 50, 100, 200 mg.Kg-1, via oral) e da ranitidina (RANI, 100 mg.Kg-1, via oral) sobre lesões gástricas induzidas por indometacina (30 mg.Kg-1) em ratos, comparado com o veículo salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), representado pela porcentagem de lesão ulcerativa...... 73

Figura 11 – Evidência do envolvimento das prostaglandinas no mecanismo protetor gástrico da FM das cascas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns...... 74

Figura 12 – Envolvimento da via NO/GMPc no mecanismo de ação da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) em lesão induzida por etanol (0,5 mL.100g-1) em ratos 77

Figura 13 – Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o DPPH• 60 µM em etanol

absoluto, λ = 531 nm...... 85

Figura 14 – Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o ABTS•+ 7 mM em persulfato de potássio (2,46 mM), λ = 734 nm...... 86

Figura 15 – Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia •- umbellata e da quercetina sobre o O2 , NBT 68,4 µM, PMS 9,67 µM, NADH 118,5 µM em tampão fosfato de potássio (100 mM), λ = 560 nm...... 87

Figura 16 – Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o HOCl (30 mM) em tampão fosfato de sódio (50 mM),pH 7,4, λ = 652 nm...... 89

Figura 17 – Reações de formação da TauCl pela combinação de HOCl proveniente de neutrófilos ativos e do aminoácido taurina, presente nessas mesmas células...... 89

Figura 18 – Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre a TauCl em tampão (50 mM) λ = 652 nm...... 90

Figura 19 – Inibição da HRP (7 nM) na presença da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e quercetina, guaiacol (2 nM) e H2O2 (0,1 mM), em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4, 37 °C, leitura a cada 15s por 40s em λ = 470 nm...... 92

Figura 20 – Efeito dos tratamentos via oral salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) e carbenoxolona (CARB, 200 mg.Kg-1) sobre a decomposição de H2O2 pela enzima catalase em amostras do estômago de ratos tratados previamento com etanol (0,5 mL.100g-1)...... 93

Figura 21 – Efeito dos tratamentos via oral salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) e carbenoxolona (CARB, 200 mg.Kg-1) sobre a decomposição de H2O2 pela enzima catalase em amostras de eritrócitos de ratos tratados previamento com etanol (0,5 mL.100g-1)...... 93

Figura 22 – Efeito dos tratamentos via oral salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) e carbenoxolona (CARB, 200 mg.Kg-1) sobre a quantidade de grupamentos antioxidantes sulfidrílicos não protéicos ou não enzimáticos (SH-NP) no tecido do estômago de ratos tratados previamento com etanol (0,5 mL.100g-1)...... 94

Figura 23 – Efeito dos tratamentos via oral salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) e carbenoxolona (CARB, 200 mg.Kg-1) sobre a quantidade de grupamentos sulfidrílicos totais (SH-T) no soro de ratos tratados previamento com etanol (0,5 mL.100g-1)...... 95

Figura 24 – Porcentagem de inibição do soro de ratos tratados com salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), fração metanólica das cascas Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) e carbenoxolona (CAR, 200 mg.Kg-1) sobre o radical ABTS•+...... 96

Figura 25 – Perfil cromatográfico representativo dos compostos fenólicos presentes na FM de E. umbellata em 254 nm obtido por UHPLC-QToF-MS de acordo com o tempo de retenção...... 98

Figura 26 – Estruturas das substâncias identificadas da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata...... 101

Figura 27 – Possíveis mecanismos inseridos na ação gastroprotetora da fração metanólica (FM) das cascas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (Euphorbiaceae) em modelos de úlcera in vivo induzidos por etanol e anti-inflamatório não esteroidal (AINE) e modelos in vitro (antioxidante, antimicrobiano e anti-urese)...... 106

LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Algumas substâncias isoladas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns...... 29

Tabela 2 – Receptores de prostaglandinas na mucosa gástrica e seus efeitos...... 41

Tabela 3 – Euphorbiaceae e substâncias isoladas testadas em modelos de úlcera...... 48

Tabela 4 – Organização dos grupos experimentais para determinação do envolvimento da via NO/GMPc na função gastroprotetora da FM das cascas de Euphorbia umbellata...... 57

Tabela 5 – Organização dos grupos experimentais para determinação do envolvimento das ciclooxigenases na função gastroprotetora da FM das cascas de Euphorbia umbellata...... 58

Tabela 6 – Efeito do uso de diferentes doses da fração metanólica (v. o.) das cascas de Euphorbia umbellata e ranitidina em modelo úlcera induzida por etanol (v. o.) em ratos...... 67

Tabela 7 – Efeito do uso de diferentes doses da fração metanólica (v. o.) das cascas de Euphorbia umbellata e ranitidina em modelo úlcera induzida por indometacina (s. c.) em ratos...... 72

Tabela 8 – Efeito da FM (200 mg.Kg-1, v. o.) das cascas de Euphorbia umbellata em modelo de lesão gástrica por etanol PA, com bloqueio da síntese de prostaglandinas por indometacina...... 75

Tabela 9 – Valores de inibição das isoformas de NOS pela aminoguanidina...... 76

Tabela 10 – Efeito do uso de inibidores farmacológicos na determinação do possível envolvimento do NO/GMPc nos mecanismos de ação da FM das cascas de Euphorbia umbellata (200 mg.kg-1, v. o.).. 77

Tabela 11 – Atividade inibitória da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata sobre o bacilo Helicobacter pylori...... 81

Tabela 12 – Atividade antioxidante da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata sobre diferentes modelos oxidativos...... 83

Tabela 13 – Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o DPPH•...... 84

Tabela 14 – Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o ABTS•+...... 85

Tabela 15 – Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia •- umbellata e da quercetina sobre o O2 ...... 87

Tabela 16 – Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o HOCl...... 88

Tabela 17 – Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre a TauCl...... 90

Tabela 18 – Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre a oxidação do guaiacol por peroxidase modelo (HRP)...... 91

Tabela 19 – Dados de espectrometria de massas obtidos a partir da FM de Euphorbia umbellata...... 98

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

AAS Ácido acetilsalicílico ABS Absorbância ABTS•+ 2,2‟-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) ADP Difosfato de adenosina AINE Anti-inflamatório não esteroidal AMG Aminoguanidina ARH2 Antagonista reversível do receptor de histamina subtipo 2 ATCC American Type Cultural Collection ATP Trifosfato de adenosina AZM Azul de metileno BHI Brain Heart Infusion CARB Carbenoxolona CAT Catalase CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina CIM Concentração inibitória mínima (CO(NH2)2) Ureia COX Ciclooxigenase CYP Enzima metabólica do citocromo P450 DMSO Dimetilsulfóxido DPPH• 2,2-difenil-1-picril-hidrazil DTNB (5,5‟ – dithiobis(2-nitrobenzoic acid) EB Extrato bruto das cascas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns EBL Extrato bruto liofilizado ECL Células enterocromafins EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético eNOS NOS primeiramente encontrada em tecido endotelial ERO Espécie reativa de oxigênio FM Fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns GC Guanilato ciclase GMPc Monofosfato de guanosina cíclico GSH Glutationa GPx Glutationa peroxidase GR Glutationa redutase GSSG Dissulfeto de glutationa GTP Trifosfato de guanosina HCl Ácido clorídrico H2O2 Peróxido de hidrogênio HOCl Ácido hipocloroso Horseradish peroxidase, ou peroxidase de rábano, ou peroxidase de HRP raiz forte HSP Heat Shock Protein IBP Inibidor irreversível da bomba de prótons IGF-1 Fator de crescimento dependente de insulina um NOS induzida em grande número de células e constitutiva de alguns iNOS tecidos K+ Cátion potássio KCl Cloreto de potássio

L-NAME Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride LPS Lipopolissacarídeo MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno N Número de unidades experimentais por grupo NADH β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide reduced NaHCO3 Bicarbonato de sódio NBT Nitro blue tetrazolium NH3 Amônia + NH4 Amônia iônica NH2Cl Monocloroamina NH4OH Hidróxido de amônio nNOS NOS predominante em tecido neuronal NO Óxido nítrico NO• Óxido nítrico radicalar NOS Óxido nítrico sintase 1 O2 Oxigênio singlete •- O2 Ânion superóxido OH•- Radical hidroxil OONO- Peroxinitrito P Nível de significância estatística PA Pro analyse, ou para análise PAF Fator ativador de plaquetas PG Prostaglandina PKG Proteinocinase dependente de GMPc PMS Phenazine methosulfate R-NHCl Cloramina S Score SAL Salina SH-NP Tiol não protéico SH-P Tiol protéico SH-T Tiol total TauCl Taurina cloramina TGF-α Fator de necrose tumoral alfa TGI Tratogastrintestinal TMB (3,3’,5,5’ – tetrametilbenzidina) TNF-α Fator de necrose tumoral – Alfa TXA2 Tromboxano A dois UHPLC- Ultra-High-Performance Liquid Chromatography quadrupole Time QToF-MS Of Flight Mass Spectrometry λ Lambda, comprimento de onda

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO...... 19 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...... 25 2.1 Família Euphorbiaceae Juss. (JUSSIEU, 1789)...... 25 2.2 Gênero Euphorbia L. (LINNAEUS, 1752)...... 25 2.3 Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (BRUYNS; MAPAYA; HEDDERSON, 2006)……………………………………………………… 27 2.3.1 Descrição botânica macroscópica...... 28 2.4 Metabolismo secundário e biomoléculas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns...... 28 2.5 Trato gastrintestinal (TGI) e doença péptica...... 33 2.5.1 Fisiopatologia da úlcera péptica...... 34 2.5.2 Principais fatores agressores...... 34 2.5.2.1 Etanol...... 34 2.5.2.2 Anti-inflamatórios...... 35 2.5.2.3 Helicobacter pylori...... 36 2.5.2.4 Espécies reativas de oxigênio e radicais livres...... 38 2.5.3 Principais fatores protetores...... 39 2.5.3.1 Barreira de muco-bicarbonato-fosfolipídeos...... 39 2.5.3.2 Células epiteliais...... 40 2.5.3.3 Fluxo sanguíneo...... 40 2.5.3.4 Prostaglandinas...... 41 2.4.3.5 Óxido nítrico (NO)...... 42 2.5.3.6 Sistemas antioxidantes...... 43 2.6 Tratamento medicamentoso...... 46 2.6.1 Efeitos adversos...... 46 2.7 Produtos naturais na pesquisa de novos agentes gastroprotetores...... 47 3 OBJETIVOS...... 51 3.1 Objetivo geral...... 51 3.2 Objetivos específicos...... 51 4 METODOLOGIA...... 54 4.1 Coleta, identificação e processamento do material vegetal...... 54 4.2 Obtenção dos da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata ..... 54 Determinação do perfil químico da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata usando UHPLC-DAD-QToF-MS...... 55 4.3 Animais...... 55 4.4 Atividade antiulcerogênica da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata em modelo de úlcera aguda...... 56 4.4.1 Lesões gástricas induzidas por etanol...... 56 4.4.2 Lesões gástricas induzidas por indometacina...... 56 4.5 Estudo dos mecanismos gastroprotetores da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata...... 57 4.5.1 Avaliação da via óxido nítrico (NO)/ monofosfato cíclico de guanosina (GMPc)...... 57 4.5.2 Avaliação do envolvimento das ciclooxigenases...... 58 4.6 Cálculo da área das lesões ulcerativas...... 59 4.7 Perfil de ação da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata sobre radicais livres e espécies reativas de oxigênio...... 59

4.7.1 Ação scavenger sobre o DPPH•...... 59 4.7.2 Ação scavenger sobre o ABTS•+...... 60 •- 4.7.3 Ação scavenger sobre o O2 ...... 60 4.7.4 Ação scavenger sobre o HOCl...... 60 4.7.5 Ação scavenger sobre taurina cloramina...... 61 4.7.6 Ação inibitória sobre a oxidação do guaiacol por peroxidase (HRP)...... 61 4.8 Determinação do potencial antioxidante do soro de animais tratados com a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata contra o radical ABTS•+...... 61 4.9 Quantificação de grupos sulfidrílicos não-proteicos (SH-NP) no estômago de ratos tratados com a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata...... 61 4.10 Quantificação de grupos sulfidrílicos totais (SH-T) no soro de ratos tratados com a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata...... 62 4.11 Quantificação da catalase (CAT) no estômago e eritrócitos de ratos tratados com a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata...... 62 4.11.1 Determinação em amostras da região glandular estomacal...... 62 4.11.2 Determinação em amostras de eritrócitos...... 63 4.12 Avaliação histopatológica da região glandular do estômago de ratos tratados com a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata...... 63 4.13 Atividade anti-Helicobacter pylori da fração metanólica das cascas Euphorbia umbellata...... 63 4.14 Atividade inibitória da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata frente à urease...... 64 4.15 Análise estatística...... 64 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 67 6 CONCLUSÃO...... 108 7 REFERÊNCIAS...... 111

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INTRODUÇÃO 19

1 INTRODUÇÃO

As úlceras no trato gastrintestinal podem ser dividas em dois tipos comuns de acordo com a sua localização: a colite ulcerativa (uma doença de cunho inflamatório que afeta a mucosa colônica) e a úlcera péptica (que pode atingir desde o esôfago até o duodeno), sendo denominada úlcera gástrica quando atinge o estômago (AWAAD; EL-MELIGY; SOLIMAN, 2013). Trata-se de uma doença que acomete um número bastante expressivo de pessoas em todo o mundo. Nos Estados Unidos, aproximadamente 25 milhões são afetados, sendo a maioria homens. O custo associado ao tratamento, direta e indiretamente, subiu de 3,4 bilhões para 9 bilhões de dólares anuais de 2002 a 2012. Por estes e outros motivos é tida como uma das doenças mais comuns do século XXI (YUAN; PADOL; HUNT, 2006; HIRUMA-LIMA et al., 2006; PATEL et al., 2012; FARZAEI; ABDOLLAHI; RAHIMI, 2015). Historicamente, o entendimento da patofisiologia das úlceras pépticas estava focado nas anormalidades de secreção de ácido e pepsina. Atualmente a hipersecreção gástrica, associada à Síndrome de Zollinger-Ellison, a hiperplasia de células G antrais e um imbalanço fisiológico entre hormônios gástricos antagônicos (gastrina e somatostatina) são tidos como importantes causas de distúrbios pépticos. Além disso, fatores genéticos e ambientais são considerados no desenvolvimento da doença (YUAN; PADOL; HUNT, 2006; REYES- TREJO et al., 2008). Indenpendentemente do fator desencadeante assume-se que as úlceras ocorrem quando há um desequilíbrio entre os mecanismos protetores (muco, secreção de bicarbonato, aumento e manutenção de níveis antioxidantes, produção de prostaglandinas, óxido nítrico, aporte sanguíneo adequado, entre outros) e os lesivos (estresse oxidativo, fatores psico-sociais, exposição ao etanol, fumo, cocaína, uso abusivo de anti-inflamatórios e outros fármacos com potencial ulcerogênico, doenças de caráter crônico como cirrose hepática, doença renal crônica, doença de Crohn, isquemia mesentérica, diabetes mellitus, doenças infecciosas como tuberculose, sífilis, ou ainda aquelas causadas por citomegalovírus, herpes vírus e, principalmente, a presença do bacilo Helicobacter pylori) (HIRUMA-LIMA et al., 2001; MELO et al., 2003; HIRUMA-LIMA et al., 2006; TWARDOWSCHY, 2007; REYES- TREJO et al., 2008; LEITE et al., 2009; CORDEIRO et al., 2012; PATEL et al., 2012; SILVA et al., 2012; BONACORSI et al., 2013; KUMAR et al., 2013; SANDHYA et al., 2013; SHIMOYAMA, et al., 2013; JÚNIOR et al., 2014; KIM, 2015). 20

Os tratamentos padrões para úlcera péptica incluem a administração de antiácidos, antagonistas dos receptores de acetilcolina (M3), histamina (H2) e inibidores da bomba de prótons (IBP). Estes últimos são os mais potentes bloqueadores da secreção gástrica disponíveis hoje sendo amplamente usados para diversas condições como doença do refluxo gastro-esofágico, esôfago de Barret, dispepsia, doença ulcerosa péptica e síndrome de Zollinger-Ellison. Entretanto, apesar da segurança e eficácia da utilização dessas medicações, devido ao caráter crônico que os esquemas terapêuticos assumem aliado a uma duração excessiva de tratamento com doses inapropriadas, efeitos adversos de tais práticas podem surgir (CORLETO et al., 2014; PIANO et al., 2014; CALDAS et al., 2015; FARZAEI; ABDOLLAHI; RAHIMI, 2015, KOIKE et al., 2015). De forma geral a classe dos IBPs produz efeitos negativos na integridade óssea e também hipomagnesemia, neutropenia, nefrite intersticial e lúpus eritematoso cutâneo subagudo, sendo estas duas últimas condições já reportadas para o omeprazol, esomeprazol e pantoprazol. A severa hipocloridia gerada pode levar a um aumento da suscetibilidade a enteropatógenos como Salmonella, Campylobacter jejuni, cepas invasivas de Escherichia coli, Vibrio cholera, Clostridium difficile e Listeria. Uma pesquisa recente compilou as respostas para os efeitos adversos do uso de IBPs obtidas pelo buscador PubMed entre os anos de 1966 e 2013 para estudos em língua inglesa e os resultados mostraram que houve um aumento do risco de pneumonia de 27 – 39 %. Segundo esse mesmo trabalho a trombocitopenia, deficiência de ferro, vitamina B12 e rabdomiólise também foram observadas (VALUCK; RUSCIN, 2004; FLORENTIN; ELISAF, 2012; ALMEBAYADH et al., 2013; BOURNE et al., 2013; SAMPATHKUMAR et al., 2013; WILHELM; RJATER; KALE- PRADHAN, 2013; CORLETO et al., 2014; PIANO et al., 2014; HUNG et al., 2015). Ainda não se sabe muito sobre quais os mecanismos principais envolvidos nas manifestações adversas dos IBP. Sugere-se que estes estejam aumentados em organelas ácidas onde então são ativados sendo capazes de inibir V-ATPases e hidrolases ácidas, consequentemente bloqueando o processo de apresentação de antígenos, a síntese e secreção de citocinas, proteínas do sistema complemento e fatores de coagulação (WU et al., 2015). Entretanto, o uso dessas medicações trás consigo alguns efeitos colaterais importantes, tais como: trombocitopenia, nefrite intersticial aguda, nefro e hepatotoxicidade, ginecomastia e impotência em homens, galactorreia em mulheres, hipergastrinemia, enterites bacterianas e causa de deficiência na absorção de vitaminas e minerais. Além disso, importantes interações farmacocinéticas/farmacodinâmicas podem ser observadas, o que poderia potencializar ou reduzir o efeito terapêutico de outras drogas (SIERRA et al., 2007; HOEFLER; LEITE, 2009; 21

SWAMY et al., 2010; OGILVIE et al., 2011; CORDEIRO et al., 2012; ANTONIOU et al., 2015). Nesse sentido a pesquisa feita com produtos naturais, em destaque as plantas, se constitui numa alternativa satisfatória ao descobrimento e posterior desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento de doenças, sendo que se tem voltado a atenção para exemplares medicinais com ação gastroprotetora e com propriedades de cicatrização de úlceras estabelecidas. Dados da Organização Mundial da Saúde mostram que entre 65 % de 80 % da população de países em desenvolvimento usa plantas no tratamento de enfermidades, fundamentado no uso empírico e no acúmulo de informações das gerações subsequentes. Dessa forma, a avaliação farmacológica, toxicológica e bioquímica de amostras vegetais frente a diversos modelos experimentais pode ser desejável devido à grande variabilidade química existente entre as plantas (VALADARES, CASTRO, CUNHA, 2007; CARRENHO, 2009; BRANDÃO et al., 2010; WHO, 2011; DE LUCA et al., 2012; NEWMAN; CRAGG, 2012; PALHARES et al., 2015). Baseado no conhecimento etnofarmacológico para o tratamento de desordens gástricas, incluindo as ulceras pépticas, grupos de pesquisa têm revelado novas substâncias ativas que se apresentaram acessíveis, seguras e com mecanismos protetores distintos, mostrando-se também efetivos na recuperação do tecido lesionado evitando a sua recorrência. Paralelamente, tendo em vista que a patofisiologia das úlceras gástricas enquadra-se num processo complexo e multi-fatorial, uma abordagem de ação sinérgica baseada em mecanismos pluri-ativos pode se caracterizar como uma nova perspectiva para o tratamento desta doença (HIRUMA-LIMA et al., 2001; HIRUMA-LIMA et al., 2006; PERTINO et al., 2007; REYES-TREJO et al., 2008; RISHTON, 2008; SANTOS et al., 2008; LEITE et al., 2009; SHENOY; BRAZ FILHO, 2010; MOTHANA, 2011; PATIL et al., 2011; SHENOY; SHASTRY, 2011; ANSARI; AHMAD; JAMEEL, 2012, MAURY et al., 2012, PATEL et al., 2012; KUMAR et al., 2013; ROZZA et al., 2013; SILVA et al., 2015). Nesse contexto, Synadenium umbellatum Pax. (Euphorbiaceae) é uma planta conhecida popularmente como ―janaúba‖ ou ―leitosinha‖, utilizada tradicionalmente na região centro-oeste brasileira no tratamento empírico de doenças neoplásicas e uma gama de outras desordens como úlcera péptica, gastrite e processos inflamatórios. Similarmente, Synadenium grantii Hook f. (Euphorbiaceae) é conhecida, especialmente no leste do Paraná, sob os mesmos nomes populares, sendo usada para os mesmos propósitos. Dessa forma, um estudo farmacobotânico conduzido no intuito de caracterizar essas duas plantas revelou que se trata da mesma espécie, denominada Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns, que é a nomenclatura 22

científica aceita e confirmada por um taxonomista especialista em Euphorbia (MACHADO, 2008; MACHADO et al., 2011; LUZ et al., 2015; THE PLANT LIST, 2015). Entretanto, a espécie E. umbellata, em particular, possui poucas referências e estudos científicos que demonstrem as atividades biológicas de seus extratos e componentes isolados, especialmente em modelos de úlcera gástrica. Seu uso principal se dá na forma de um diluído do látex chamado de ―garrafada‖ (18 gotas de látex para 1 litro de água), sendo que diversos trabalhos já foram feitos acerca das potencialidades dessa matriz laticífera (ORTÊNCIO, 1997; YASUKAWA et al., 2000; COSTA et al., 2012; DUTRA et al., 2012; de OLIVEIRA et al., 2013). Somado a isso, estudos feitos sobre a composição do látex indicam a presença de compostos potencialmente irritantes e tóxicos, dentre os quais destacam-se os ésteres diterpênicos (KINGHORN, 1980; GOEL et al., 2007; HASSAN; MOHAMMED; MOHAMED, 2012; COSTA et al., 2012). Por outro lado, se tais substâncias tóxicas representam uma limitação de sua utilização, até o momento não se foi avaliado a ação de outras partes vegetais da planta, como extratos das cascas. Dessa maneira, propõem-se que seja feita uma avaliação do comportamento antiulcerativo da fração metanólica das cascas da espécie E. umbellata em modelos agudos de lesão gástrica induzidos por diferentes agentes necrotizantes, assim como uma investigação dos possíveis mecanismos envolvidos nesta ação, uma vez que extratos brutos da casca de E. umbellata já mostraram baixa toxicidade contra -1 Artemia salina (microcrustáceo de aplicação experimental) com LD50 778.6 µg.mL e em modelo animal de 5 dias de tratamento (300 mg.Kg-1/dia), incluindo ausência de alterações gástricas (formação de úlceras), hepáticas e renais (transaminase glutâmico-oxalacética, transaminase glutâmico-pirúvica, ureia e creatinina) (COSTA et al., 2012; MUNHOZ et al., 2014). Em ensaios biomonitorados, opta-se por trabalhar com frações mais polares uma vez reconhecidos os potenciais antiulcerogênicos proporcionados pela concentração de compostos (agliconas poli-hidroxiladas, auronas, chalconas, taninos, saponinas, ácidos orgânicos, compostos fenólicos) com características químicas semelhantes ao solvente utilizado na semi- purificação (metanol). Aliado a isso, também há grande interesse farmacêutico na pesquisa sobre os efeitos biológicos de compostos fenólicos como o ácido gálico, ácido elágico, catequinas, eugenol, ácido cafeico, ácido ferúlico, quercetina, campferol, resveratrol, rutina, entre outros, dado que estes possuem potente ação antioxidante que lhes confere diversos efeitos farmacológicos no trato gastrintestinal (CECHINEL FILHO; YUNES, 1997; SIMÕES et al., 2005; MOTA et al., 2009; SOUZA; MELLO; LOPES, 2012; FARZAEI et al., 2015). 23

Assim, estes fatos fomentam o interesse no desenvolvimento de pesquisas por novas moléculas biologicamente ativas, em especial contra úlcera gástrica, uma vez que são poucos os estudos que comprovam cientificamente as ações de E. umbellata e os resultados obtidos ainda são incipientes, carecendo-se de maior consideração, avaliação e aprofundamente técnico.

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REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 25

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Família Euphorbiaceae Juss. (JUSSIEU, 1789) A família Euphorbiaceae, pertencente à ordem das Malpighiales, possui cerca de 322 gêneros e 8900 espécies no mundo todo, sendo que a maioria encontra-se na América e na África tropical. São plantas de hábito variado, existindo ervas, subarbustos e árvores, com folhas alternadas inteiras ou partidas, em geral com estípulas, latescentes ou não, flores em geral pequenas dotadas de estames e frutos deiscentes ou não, entre outras características (JOLY, 1977; BITTNER et al., 2001). As plantas representantes desta família destacam-se pela sua importância econômica, ornamental, seu valor nutricional e social. Nesse âmbito podemos citar Hevea brasiliensis Müll. Arg., planta nativa da Amazônia da qual se extrai o látex para produção da borracha natural; Ricinus communis L., que produz um fruto denominado mamona, fonte do óleo de rícino e de lubrificantes aplicados em propulsores de ônibus espaciais; Manihot esculenta Crantz (mandioca, da qual se obtém o amido), base alimentar em boa parte do nordeste brasileiro e no Brasil de forma geral, complementando a diversa culinária do país (WATSON, DALLWITZ, 1992; SOFIATI, 2009; FELIU, 2011). Essa família tem sido pesquisada fitoquimicamente, em especial na determinação de novos compostos biologicamente ativos (MACHADO, 2008). Assim, já se revelou a presença de flavonoides, saponinas, terpenos (di e triterpenoides), ésteres, alcaloides, glicosídeos cianogênicos, taninos, lequitinas e glicoproteínas (BITTNER et al., 2001; SOUZA et al., 2005; RAJESH et al., 2006; ROGÉRIO et al., 2007; ZHANG et al., 2010, COSTA et al., 2012). Na medicina tradicional, o uso da família Euphorbiaceae é muito comum ao longo do desenvolvimento da própria humanidade (WATSON, DALLWITZ, 1992). Um exemplo é a espécie Euphorbia fischeriana Steud., que vêm sendo utilizada há mais de 2000 anos na China para o tratamento do câncer (DEI-JI et al., 1991). Outro gênero bastante conhecido e explorado desta família é o Croton, que apresenta acentuada ação anti-inflamatória, além de relevante atividade citotóxica in vitro e in vivo (VAISBERG et al., 1989; ITOKAWA et al., 1991; SUÁREZ et al., 2006).

2.2 Gênero Euphorbia L. (LINNAEUS, 1752) 26

O gênero Euphorbia é o terceiro maior dentro da família Euphorbiaceae. São mais de 2000 espécies catalogadas, sendo 1836 aceitas, com a mais rica variabilidade morfológica e de distribuição ampla em todo o mundo (HORN et al., 2012; ERNST et al., 2015). Esse fato somado ao rico conhecimento cultural sobre essas espécies desperta o interesse sobre as possíveis atividades biológicas relacionadas ao uso de plantas desse gênero. Nesse sentido, pesquisas vêm sendo feitas com diversas partes vegetais (raízes, sementes, látex, casca, flores, folhas) no intuito se obter maior clareza quanto à diversidade química e atividades biológicas atreladas a tais substâncias (SHI; SU; KIYOTA, 2008). Sobre isso já foram identificados em espécies de Euphorbia a presença de diterpenoides (compostos majoritários), triterpenos, sesquiterpenos, acetofenonas, polifenois (incluindo flavonoides e taninos), esteroides e outros. Os compostos isolados e seus extratos mostraram diferentes atividades em sistemas biológicos diversos, como por exemplo, ação antiproliferativa, imunomodulatória, citotóxica, antioxidante, antitumoral, antimicrobiana, anti-inflamatória, analgésica, contra desordens do sistema digestório, etc. Outras atividades como irritante da pele, promotor do crescimento tumoral e pró-inflamatório são atribuídos à presença de classes específicas de diterpenos policíclicos (ABDULLADZHANOVA; MAVLYANOV; DALIMOV, 2003; GOEL et al., 2007). Em 2012 a Agência Nacional de Vigilância Sanitária aprovou a comercialização no Brasil do medicamento Picato®, cujo princípio ativo é o mebutato de ingenol, um diterpeno isolado de Euphorbia peplus L. usado para o controle da queratose actínica (doença com potencial precursor para carcinoma espinocelular), baseado na medicina popular australiana para o tratamento do câncer de pele. Diante disso sabe-se que para que se chegue a um produto farmacêutico como este muitas espécies de Euphorbia foram investigadas por anos, contudo muitas outras ainda não foram estudadas (ÖZBİLGİN; SAL TAN CITOĞLU, 2012; ERNST et al., 2015). De acordo com um trabalho publicado recentemente, a principal indicação do uso medicinal de espécies de Euphorbia é em relação ao tratameto de desordens do trato gastrointestinal, com aproximadamente 18 % do registro de uso encontrado em literatura científica. As espécies mais citadas incluem Euphorbia hirta e Euphorbia lathyris L., sendo encontrados também trabalhos com Euphorbia cuneata Vahl e Euphorbia granuleta. Apesar disso, dispõe-se de escassa literatura científica que mostre as propriedades farmacológicas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns, sendo que esta última sequer é relacionada nos trabalhos citados (AWAAD et al., 2013a; AWAAD et al., 2013b; ERNST et al., 2015).

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2.3 Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (BRUYNS; MAPAYA; HEDDERSON, 2006) A espécie E. umbellata (Figura 1), popularmente conhecida no Brasil como ―janaúba‖, ―leitosinha‖, ‖cega-olho‖ ou ―cola-nota‖, vem sendo usada pela medicina popular há anos. Seu uso se dá pela ―garrafada‖, obtida através de diluição do látex da planta em água pura e fresca – 18 gotas do látex em 1 litro de água (ORTENCIO, 1997). Suas aplicações foram bastante difundidas para a cura de vários tipos de câncer, úlcera péptica, gastrite, processos inflamatórios e com finalidade analgésica (BAGAVATHI; SORG; HECKER, 1988; OLIVEIRA JR. et al., 2005). O látex dessa espécie é potencialmente tóxico e por tratar-se de uma planta difundida como ornamental é comum haver ocorrência de intoxicação e lesões em crianças e animais, tanto por ingestão como por contato com a pele e os olhos, demonstrando o risco da administração de extratos dessa planta (BAGAVATHI; SORG; HECKER, 1988; GRUPO, 1998; FRANCISCO; PINOTTI, 2000). Se por um lado foi demonstrado que E. umbellata possui em sua constituição compostos tóxicos, também ficou claro que há outros tantos compostos químicos interessantes com possível ação farmacológica, entre eles terpenos, alcaloides, flavonoides (COSTA et al., 2012).

Figura 1. Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns no habitat. Fonte: O autor. 28

2.3.1 Descrição botânica macroscópica Constitui-se num arbusto suculento ou árvore pequena de base espessa com 5 – 10 metros de altura, caule cilíndrico, hastes senescentes tornam-se cinza pálido, com cicatrizes foliares proeminentes em hastes verdes com látex abundante. Folhas dispostas em espiral, simples e completas; estípulas modificadas em pequenas glândulas marrons; pecíolo até 8 mm de comprimento; lâmina elíptica e oblanceolada até 15 cm x 6 – 8 cm, base longa cuneada obtusa, ápice curto-acuminado, carnuda, a margem enrolada para baixo, quase glabras, nervura central proeminente, arredondada, vermelho ou verde, por vezes, tingidas por baixo. Inflorescência em cimeira frouxa axilares, consistindo de cachos de flores; pedúnculo de até 5 cm de comprimento, ramos curto-peludos, 1 – 3 cm de comprimento, vermelho, cada um contendo uma flor feminina rodeada por flores masculinas. Flores unissexuais, sésseis, com flores masculinas bractéolas lineares, com franjas, as pontas vermelhas, perianto ausente, estame de 4 mm de comprimento; flores femininas com pedicelo de até 5 – 9 mm em frutas, ovário superior, estilos densamente curto, peludos (NICHOLSON, 2008).

2.4 Metabolismo secundário e biomeléculas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns A espécie Euphorbia umbellata apresenta vários compostos químicos com possível ação farmacológica identificados de diversas partes da planta, incluindo suas folhas, látex e caule, sendo eles: antocianinas, glicosídeos cianogênicos ou cianogenéticos, compostos fenólicos, saponinas, glicoproteínas, enzimas proteolíticas, trans e cis poli-isoprenos, ésteres de diterpenos e derivados do forbol, ácidos isobutírico, tíglico e fenilacético, carboxilesterases e colinesterases, triterpenoides (germanicol, friedelina, 3β-friedelinol, eufol, tirucalol, euforbol, isômeros do lanosterol), ionol, ácido benzoico, ácido fenilacético e lequitinas (Tabela 1) (NIELSEN et al., 1979; KINGHORN, 1980; HICKEY et al., 1981; PREMARATNA; SHADAKSHARASWAMY; NANJAPPA, 1981; LYNN; CLEVETTE- RADFORD, 1986; GOVINDAPPA et al., 1987; UZABAKILIHO; LARGEAU; CASADEVALL, 1987; BAGAVATHI; SORG; HECKER, 1988; JÄGER; HUTCHINGS; STADEN, 1996; MARINHO; MONTEIRO, 2000; MENON et al., 2002; RAJESH et al., 2006; MAHAJAN; BADGUJAR, 2008; ANDERSEN, 2010; COSTA et al., 2012; DASARI et al., 2012; HASSAN; MOHAMMED; MOHAMED, 2012; OLIVEIRA et al., 2013; MUNHOZ et al., 2014).

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Tabela 1. Algumas substâncias isoladas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (CONTINUA) Nome químico do Fórmula estrutural Referência componente

Andersen et Cianidina 3-glucosídeo al., 2010

Andersen et Cianidina 3,5-diglucosídeo al., 2010

R1: Cianidina 3-O-(2‖- (5‖’-(E-p-coumaroil)-b- apiofuranosil)-b- xilopiranosida)-5-O-b- glucopiranosida

R2: Cianidina 3-O-(2‖-(5‖'- (Ecafeoil)-b- apiofuranosil)-b- Andersen et xilopiranosida) al., 2010

R3: cianidina 3-O-(2‖-(5‖'- (E-p-coumaroil)-b- apiofuranosil)-b- xilopiranosida)

R4: cianidina 3-O-(2‖-(5‖'- (E feroil)-b-apiofuranosil)- b-xilopiranosida)

30

Tabela 1. Algumas substâncias isoladas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (CONTINUA)

Forbol 12,13,20-triacetato Costa et al., 2012

12-deoxiforbol-13-(2- Costa et al., metilpropionato) 2012

4-deoxiforbol-12,13- Hassan; Mohammed; ditiglato Mohamed, 2012

Hassan; 3,4,12,13-tetraacetilforbol- Mohammed; 20-fenilacetato Mohamed, 2012

31

Tabela 1. Algumas substâncias isoladas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (CONTINUA)

12-O-2Z-4E-Octadienoil Hickey et 4-deoxiforbol-13-acetato al., 1981

Hickey et 12-O-tigloil-4-deoxiforbol- al., 1981 13-isobutirato Kinghorn, 1980

Uzabakiliho ; Largeau; Casadevall, 1987

Eufol Oliveira et al., 2013

Munhoz et al., 2014

Uzabakiliho ; Largeau; Casadevall, Euforbol 1987

Munhoz et al. 2014

32

Tabela 1. Algumas substâncias isoladas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (CONTINUA)

Uzabakiliho ; Largeau; Tirucalol Casadevall, 1987

Nielsen et Lanosterol al., 1979

Friedelina Munhoz et al., 2014

3β-friedelinol Munhoz et al., 2014

Uzabakiliho; Largeau; Ácido isobutírico Casadevall, 1987

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Tabela 1. Algumas substâncias isoladas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (FINAL) Uzabakiliho ; Largeau; Ácido tíglico Casadevall, 1987

Casadevall, Ácido benzóico 1987

Uzabakiliho ; Largeau; Ácido fenilacético Casadevall, 1987

Uzabakiliho Ionol- 1,3-ditertiobutil-2- ; Largeau; hidroxi-5-metil-benzeno Casadevall, 1987

Fonte: O autor. 2.5 Trato gastrintestinal (TGI) e doença péptica Além de sua função primordial de digestão e absorção de nutrientes provenientes da alimentação, o TGI é um dos principais sistemas endócrinos e tem sua própria circuitaria neuronal, o sistema nervoso entérico (plexo mioentérico ou plexo de Auerbach, situado entre as camadas musculares longitudinal e circular, e o plexo de Meissner ou submucoso, localizado na submucosa), que controla funções motoras, secretoras e de manutenção da homeostase. Também é um local acometido por diversas patologias como uma simples dispepsia até uma complexa doença auto-imune, como a doença de Crohn. Não distante, os medicamentos usados para tratar esses distúrbios compreendem cerca de 8% das prescrições (GUYTON; HALL, 1997; RANG et al., 2011; BELLMANN et al., 2015). Um dos segmentos que constitui o TGI é o estômago. Este órgão é anatomicamente divido em fundo, corpo e antro. O fundo está localizado na porção superior próximo ao esôfago, o corpo constitui a maior parcela em área e o antro está na região mais distal, próximo ao piloro (POTRICH, 2009). Diversas células compõem o tecido do estômago, sendo as principais envolvidas nos processos fisiológicos as células mucosas (que secretam muco), as principais ou pépticas (que liberam pepsinogênio, ativado em pepsina pela ação do ácido clorídrico), as células parietais (produtoras de HCl), as células D (produtoras de somatostatina), as células enterocromafins (ECL, secretoras de histamina) e as células G (produtoras de gastrina). Dessa forma, o 34

estômago pode ser visto como um órgão resistente a uma grande variedade de fatores e, portanto, qualquer desbalanço na produção e na função dessas subtâncias pode gerar uma condição patológica (POTRICH, 2009; FORNAI et al., 2011). Em relação aos distúrbios pépticos, a úlcera gástrica é uma doença definida como uma alteração na integridade da mucosa gástrica que causa dano superficial e que se estende da camada muscular da mucosa à submucosa, ou mais profundamente, devido a uma complicação inflamatória (SILVA, 2012). Pequenas úlceras podem não apresentar sintomatologia, muito embora grandes úlceras possam causar sérios problemas, incluindo sangramento, e sintomas como: sensação de plenitude, incapacidade de ingerir líquidos suficientes à reposição hídrica, fome e sensação de vazio, mesmo logo após uma refeição (1 – 3 horas), náusea, vômitos que aliviam sintomas, dor ou desconforto na parte superior do abdômen, insônia devido ao incômodo abdominal, fezes escuras e com presença de sangue, dor no peito, fadiga, perda de peso e uma maçante sensação de queimação. Por outro lado é comum encontrar pacientes assintomáticos, principalmente entre os mais velhos (KLEIN- JÚNIOR et al., 2012; PATEL et al., 2012; AWAAD; EL-MELIGY; SOLIMAN, 2013). Dados epidemiológicos mostram que a úlcera gástrica é uma doença que cresce continuamente em todo o mundo. Aproxidamente 10% da população que vive em países industrializados é afetada em algum estágio da doença (1 em cada 10 americanos). Ela possui uma tendência em se tornar crônica perdurando por 20 anos ou mais, com episódios de cicatrização e re-exacerbação, sendo que alguns autores a classificam como a ―nova praga‖ do século XXI (HIRUMA-LIMA et al., 2006; YUAN; PADOL; HUNT, 2006; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012; ZAGHLOOL et al., 2015).

2.5.1 Fisiopatologia da úlcera péptica A etiologia das úlceras ainda não é totalmente compreendida, podendo inclusive ser um somatório de fatores genéticos, endógenos e ambientais, porém, indenpendentemente disso, o que se assume como resultado é um desequilíbrio entre os fatores agressores e os mecanimos de defesa da musoca gástrica. O entendimento dos eventos chave no desenvolvimento do processo de ulceração é crucial para a elaboração de novas drogas com ampla margem de segurança (WALLACE, 2008; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012; SZABO, 2014).

2.5.2 Principais fatores agressores 2.5.2.1 Etanol 35

O consumo de etanol é considerado um dos principais fatores para o desenvolvimento de úlceras gastroduodenais. Isto porque ele penetra na mucosa gástrica dissolvendo a matriz do muco, expõe a mucosa à ação proteolítica e hidrolítica do ácido e de enzimas como a pepsina, exerce efeito tóxico direto sobre o epitélio e diminui a secreção de bicarbonato, levando a formação de lesões com características necróticas. Além disso, o etanol estimula a produção de secreção ácida, reduz o fluxo sanguíneo e gera importante desbalanço no sistema redox das células (diminuição dos níveis de glutationa e aumento na atividade da xantino- oxidase), criando um ambiente bastante hostil repleto de espécies reativas e radicais livres que reagem com importantes estruturas, resultando em perda de função, como acontece na lipoperoxidação das membranas plasmáticas (detectado por altos níveis de malondialdeído) (GLAVIN; SZABO, 1992; CORDEIRO et al., 2012; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012).

2.5.2.2 Anti-inflamatórios Os anti-inflamatórios não esteroidais (AINE) estão entre os medicamentos mais prescritos nos Estados Unidos. Perto de 11% da sua população adulta faz uso regular dessas substâncias enquanto que uma parcela ainda muito maior de maneira intermitente. Nesse sentido, proximadamente 15 – 30% dos pacientes em uso de AINEs têm uma ou mais úlceras, quando examinado por endoscopia, e 3 – 4,5% tem sintomas clínicos significantes (YUAN; PADOL; HUNT, 2006; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012). Apesar se seus importantes efeitos anti-inflamatórios e analgésicos, os AINEs, em especial o ácido acetilsalicílico, aumentam significativamente a chance de eventos adversos gastrintestinais como erosão da mucosa, formação e complicação de úlceras e, de maneira mais drástica, sangramento, sendo esta última complicação dose dependente (YUAN; PADOL; HUNT, 2006). As lesões no TGI causadas por AINEs são parcialmente devido a sua inibição das ciclooxigenases (COX), bloqueando o papel das prostaglandinas em seus mecanismos de defesa da musoca gástrica, assim como na produção de tromboxano A2 (TXA2), impedindo a agregação plaquetária e o sangramento. Além disso, a maioria dos fármacos anti-inflamatórios são estruturas ácidas, e essa propriedade, em ambinte estomacal ácido, os mantém em sua forma lipofílica indissociável, podendo lesionar a barreira hidrofóbica de muco. Esta característica ácida também permite aos AINEs desestabilizar fosfolipídeos de membrana, especialmente a fosfatidilcolina, que está presente na superfície e dentro da camada de muco (WALLACE, 2008; FORNAI et al., 2011; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012). 36

Outro mecanismo explorado é de que os AINES conjugados aos fosfolipídeos penetram as membranas celulares e se acumulam no interior das células, onde o pH gira em torno do fisiológico, pH 7,4. Esse acúmulo aumenta a inibição da síntese de prostaglandinas e, no caso do ácido acetilsalicílico, este impede a fosforilação oxidativa mitocondrial. O resultado da perda de função desta organela é a redução na produção de trifosfato de adenosina (ATP), aumento de monofosfato de adenosina (AMP) e difosfato de adenosina (ADP), com incremento da liberação de Ca+2 intracelular, geração de espécies reativas e alterações no balanço Na+/K+, levando à lise celular e necrose do tecido (WALLACE et al., 2000; WALLACE, 2008; FORNAI et al., 2011). Hoje se sabe que tanto a isoforma 1 quanto a 2 das ciclooxigenases (COX-1 e COX-2) participam do processo de proteção da mucosa gástrica. Wallace et al. (2000) investigaram as funções de COX-1 e COX-2 na gastroproteção, evidenciando que as prostanglandinas derivadas de COX-1 estão envolvidas no mecanismo de produção de muco, bicarbonato e manutenção de aporte sanguíneo, enquanto que as prostaglandinas derivadas de COX-2 protegem a mucosa da adesão de leucócitos e suportam a renovação do epitélio. Esse mesmo estudo mostra que inibidores seletivos para COX-1 ou COX-2 não produziram lesão quando testados sozinhos, mas quando a combinação destes ou AINEs foi usada, houve marcada destruição gástrica (Figura 2). Figura 2. Patofisiologia das úlceras induzidas por anti-inflamatórios não esteroidais (AINE). Inibição simultânea de COX-1 e COX-2 e citotoxicidade tópica direta dobre a mucosa do estômago, dependente de estrutra molecular ácida. COXIBs são anti-inflamatórios seletivos para COX-2 e por esse motivo possuem menos efeitos colaterais, não afetando as funções protetivas exercidas pela atividade de COX-1. EROS são espécies reativas de oxigênio. Fonte: Adapatado de FORNAI, M. et al. Pathophysiology of gastric ulcer development and healing: molecular mechanisms and novel therapeutic options. Peptic Ulcer Disease. InTech, 2011.

2.5.2.3 Helicobacter pylori Trata-se de um bacilo espiral gram-negativo descrito pela primeira vez por B. J. Marshall e J. R. Warren em 1983. O isolamento do H. pylori nos anos 1980 foi um dos mais importantes avanços na história da úlcera péptica e tal fato mudou dramaticamente os 37

esquemas de tratamento então disponíveis (YUAN; PADOL; HUNT, 2006; SANDHYA et al., 2013). Dados epidemiológicos mostram que 50% da população mundial é colonizada pela bactéria. A infância, particularmente os cinco primeiros anos de vida, constitui o período de idade de maior aquisição de H. pylori, sendo o maior fator preditivo para infecção a condição socioeconômica. Sua prevalência varia em mais de 80% em países subdesenvolvidos e menos de 20% em sociedades desenvolvidas (GUIMARÃES; CORVELO; BARILE, 2008; KLEIN- JÚNIOR et al., 2012; CHERDANTSEVA et al., 2014). Sua presença no lúmen gástrico induz inflamação, infiltração e ativação de células imunes (com característica da forte presença de neutrófilos), acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ERO), dano oxidativo ao DNA, indução de apoptose de células epiteliais e desregulação do ciclo celular. Também foi relatado aumento da secreção ácida estimulada com deficiência no controle de produção e redução dos efeitos inibitórios da somatostatina na liberação de gastrina (KITAGAWA et al., 2012; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012; CHERDANTSEVA et al., 2014). Existem diversos fatores de virulência que tornam o H. pylori suficientemente preparado para resitir aos ataques do sistema imune e às próprias condições ácidas em que o estômago se encontra. Entre eles pode-se citar os flagelos, enzimas degradativas (fosfolipases e protease A), catalase e superóxido dismutase, que atuam na neutralização de moléculas oxidativas e na supressão da ação de macrófagos e polimorfonucleados, adesinas, LPS de baixa imunogenicidade, citotoxinas (codificadas pelos genes Cag A e Vac A), urease, enzima que hidrolisa ureia (presente no suco gástrico) em bicarbonato e amônia, que por sua vez eleva o pH circundante próximo a 7,0 e proteínas de choque térmico (HSPA e HSPB), responsáveis por aumentar a atividade da urease e reforçar a habilidade de sobrevivência em condições inóspitas (GUIMARÃES; CORVELO; BARILE, 2008). A infecção por H. pylori causa gastrite crônica associada ao desenvolvimento de úlcera péptica, muito embora haja uma discrepância entre o número de indivíduos colonizados e aqueles que apresentam sintomas clínicos. Dessa forma, ainda que fatores ambientais devam ser considerados na análise, parece haver evidências suficientes de um papel de virulência associado ao genótipo da bactéria. Pacientes infectados com o genótipo menos virulento são mais propensos a ter episódios de gastrite leve, ao passo que pacientes infectados com cepas mais virulentas têm grandes chances de desenvolver úlcera péptica, gastrite atrófica e eventualmente carcinoma gástrico. Por isso alguns trabalhos vêm mostrando a importância da genotipagem do hospedeiro e da cepa de H. pylori para a identificação de pacientes com alto 38

risco de desenvolvimento de câncer gástrico associado à colonização pela bactéria (NOGUEIRA et al., 2001; MACHADO et al., 2003; KITAGAWA et al., 2012). Acerca do tratamento, o 3º Consenso Brasileiro para estudo do Helicobacter pylori traz que a terapia tríplice convencional (inibidor da bomba de prótons em dose padrão, amoxicilina 1,0 g e claritromicina 0,5 g, administrado duas vezes ao dia por 7 dias) deve ser a primeira opção, sendo que este esquema deteve os melhores níveis de recomendação (COELHO et al., 2013).

2.5.2.4 Espécies reativas de oxigênio e radicais livres Há fortes evidências de que o estresse oxidativo tem importância capital nos processos de envelhecimento, transformação e morte celular, desenvolvimento de câncer e propagação da AIDS em pacientes soropositivos (HIV+), bem como na fisiopatologia de doenças crônicas, entre elas, doenças autoimunes, cardiopatias, diabetes, úlceras e processos inflamatórios em geral (VASCONCELOS et al., 2007). Entre as principais espécies reativas que acontecem em sistemas biológicos podemos •- elencar: o ânio superóxido (O2 ), que ocorre em quase todas as células aeróbias, sendo produzido na ativação de neutrófilos, monócitos, macráfagos e eosinófilos; o peróxido de hidrogênio (H2O2), um metabólito extremamente deletério, pois participa da reação que produz o radical hidroxil (OH•-); o ácido hipocloroso (HOCl), considerado o mais abundante oxidante gerado por leucócitos do sangue, uma substância capaz de reagir com biomoléculas (tióis, tioésteres, aminas, aminoácidos, nucleotídeos) e que apresenta função dual no organismo, a) protegendo-o, à medida que participa da destruição de microorganismos e b) agredindo-o, pois nem mamíferos nem bactérias possuem vias catalíticas enzimáticas para detoxificação de agentes clorados; Cloraminas (R-NHCl), oxidantes de vida longa e dependentes de lipossolubilidade, cujo representante, a monocloroamina (NH2Cl) é mais reativa que o próprio HOCl e está envolvida na lesão gástrica em presença de H. pylori, que por sua vez produz altos níveis de amônia que se combina com HOCl proveniente de neutrófilos ativados; óxido nítrico radicalar (NO•), um radical gasoso hidro e lipossolúvel, que •- - em meio aquoso reage com oxigênio (O2 ) para formar o peroxinitrito (OONO ), que é um potente oxidante de sistemas biológicos com propriedades similares ao radical hidroxil (Figura 3) (VASCONCELOS et al., 2007; VELLOSA, 2008; HAMID et al., 2010; SISEIN, 2014). 39

Figura 3. Vias de produção de espécies reativas em neutrófilos. Duas enzimas-chave estão envolvidas no oxidative-burst de fagócitos, com produção de derivados reativos de oxigênio: a) NADPH oxidase, um complexo • enzimático de membrana que catalisa a redução do oxigênio molecular a ânion superóxido (O2 ¯); b) a MPO ou - mieloperoxidase, que usa o H2O2 para oxidar o íon cloreto (Cl ) a ácido hipocloroso (HOCl). Por outro lado, a partir do momento que a sintase do óxido nítrico (NOS) torna-se ativa, uma molécula de L-arginina é oxidada a • • - óxido nítrico (NO) e L-citrulina. O NO pode combinar-se com O2 ¯ para formação de peroxinitrito (OONO ). O peroxido de hidrogênio, por meio da reação de Fenton que utiliza Fe+2 como oxidante, pode gerar um potente radical livre, o radical hidroxil (HO•), mais OH- e Fe+3. O HOCl formado pela ação da peroxidase pode ainda • 1 formar HO e O2, pela reação com peróxido de hidrogênio e ânion superóxido, respectivamente. As cloraminas (R-NHCl), como a monocloroamina (NH2Cl), formanda pela combinação de HOCl com aminas primárias e secundária biologicamente disponíveis, são moléculas extremamente lipossolúveis, ativas por maior tempo e mais reativas que o HOCl. O β-aminoácido taurina, de maior abundância em neutrófilos (células intimamente envolvidas no processo inflamatório), é um dos principais alvos do HOCl, formando taurina cloramina (TauCl). De forma geral, fagócitos como neutrófilos, eosinófilos e macrófagos, quando estimulados, aumentam sensivelmente sua taxa de consumo de oxigênio e consequentemente formação de radicais livres e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Fisiologicamente a geração de espécies químicas com alto poder de reatividade é essencial para a defesa contra micro-organismos invasores na fagocitose. A problemática se estende à medida que a taxa de produção é exacerbada a tal ponto que moléculas estruturais do hospedeiro são afetadas gerando perda de função, como na lipoperoxidação de membranas. Fonte: Adaptado de MACMIKING, J.; XIE, Q.; NATHAN, C. Nitric oxide and macrophage function. Annual Review of Immunology. v. 15, p. 323-350, 1997.

2.5.3 Principais fatores protetores

2.5.3.1 Barreira de muco-bicarbonato-fosfolipídeos É a primeira linha de combate aos agressores da mucosa. Esta camada consegue criar um microambiente neutro (pH em torno de 7,0), que também previne o ataque de pepsina e enzimas proteolíticas. Esse muco em forma de gel (constituído de 95 % de água e vários tipos de glicoproteínas polimerizadas) é coberto por fosfolipídeos surfactantes, que lhe conferem caracteres hidrofóbicos, sendo que é obervado que pacientes colonizados com Helicobacter pylori possuem diminuída hidrofobicidade, conferindo menor resistência à agressão. A 40

secreção é controlada por hormônios gastrintestinais, como gastrina e secretina, assim como prostaglandinas e acetilcolina (WALLACE, 2008; FORNAI et al., 2011). O muco serve ainda como ―armadilha‖ na captura de bactérias que serão destruídas pela ação do ácido clorídrico e lubrificante para reduzir o dano por atrito de materiais que passam pelo TGI. É importante salientar que o termo ―barreira‖ não deve ser entendido como impermeabilizante. Pequenas quantidades de HCl conseguem se difundir pela camada de muco até a superfície da mucosa, gerando, de fato, lesões que ocorrem regularmente num processo bastante dinâmico, embora não causem nenhum desfecho clinicamente relevante (WALLACE, 2008).

2.5.3.2 Células epiteliais A camada superficial de células epiteliais é naturalmente hidrofóbica e com isso apta a repelir ácido e moléculas nocivas solúveis em água. As células do epitélio são unidas por junções oclusivas, bem justapostas, formando um cordão que impede a penetração dos agentes lesivos (FORNAI et al., 2011). Outro fator de proteção presente nas células epiteliais são as Heat Shock Proteins (HSP70), que são ativadas mediante aumento de temperatura, estresse oxidativo e agentes citotóxicos. Essas proteínas são capazes de impedir a desnaturação de proteínas do epitélio impedindo injúrias ao tecido (FORNAI et al., 2011). Ainda, as células epiteliais sofrem um contínuo, bem coordenado e controlado processo de proliferação/renovação, que dura entre 3 – 7 dias, enquanto que a reposição de glândulas leva meses. Entretanto, a reposição do epitélio após lesão ocorre rapidamente (alguns minutos) e resulta da migração de células que estão adjacentes à injúria; tudo funciona num processo orquestado por fatores de crescimento ativados por mitógeno, em especial, o TGF-α (fator transformador de crescimento-α) e o IGF-1 (fator de crescimento dependente de insulina-1). Além disso, a prostaglandina E2 e a gastrina são capazes de ativar a via das proteínas quinases ativadas por mitógeno (proteína quinase ativada por mitógeno, MAPK), com consequente estimulação da proliferação celular (WALLACE, 2001; TWARDOWSCHY, 2007; FORNAI et al., 2011).

2.5.2.3 Fluxo sanguíneo Com a função de suprir nutrientes e oxigênio ao epitélio, a microcirculação também remove, dilui e neutraliza espécies tóxicas. Inclusive, a manutenção do pH na membrana luminal do epitélio é dependente da taxa de circulação sanguínea no local. Se o fluxo é 41

interrompido, o pH cai instantaneamente e lesões hemorrágicas são formadas. Isso por que o ácido se difunde profundamente na mucosa, causando extensiva necrose e hemorragia. Assim, a manutenção de uma irrigação sanguínea adequada regulada por prostaglandinas, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) e óxido nítrico (NO), via guanilato ciclase, é essencial. Tal fato é demonstrado pela proteção gástrica exercida pelo NO em diversos modelos experimentais induzidos por etanol e endotelina-1, enquanto que inibidores da NO sintase (NOS) aumentam as lesões gástricas (WALLACE; GRANGER, 1996; HOLZER, 2006; TWARDOWSCHY, 2007; WALLACE, 2008).

2.5.2.4 Prostaglandinas

As prostaglandinas (PG, principalmente PGE2 e a prostaciclina PGI2) são fundamentais na manutenção da integridade da musosa gástrica e na proteção contra agentes lesivos, podendo estimular a produção de diversos mecanismos de defesa, dentre eles, muco, bicarbonato, fosfolipídeos, aporte sanguíneo e aceleração da renovação epitelial. Também são responsáveis por inibir a ativação de mastócitos, leucócitos e a adesão de plaquetas. Suas funções são exercidas mediante ativação de receptores específicos (EP1, EP2, EP3 e EP4), dependente da dose, pois baixas concentrações são capazes de inibir e altas concentrações aumentam a produção ácida (Tabela 2) (POTRICH, 2009; FORNAI et al., 2011). Também as PG diminuiem a liberação de um grande número de outros mediadores inflamatórios que se sugere estarem relacionados à geração de injúria tecidual em determinadas condições. A PGE2, por exemplo, é um potente inibidor da liberação de histamina, fator de necrose tumoral-α (TNF- α), fator ativador de plaquetas (PAF), interleucinas 1 e 8 e leucotrieno B4. Dessa forma, as PG também colaboram na diminuição da adesão de leucócitos ao endotélio vascular, aumentando ainda mais a resistência da mucosa gástrica (WALLACE, 2008).

Tabela 2. Receptores de prostaglandinas na mucosa gástrica e seus efeitos (CONTINUA) Efeito Receptor

Inibição da secreção gástrica (rato) EP3

Inibição da secreção gástrica (camundongo) EP3

Estimulação da secreção gástrica (rato) EP4

Secreção de muco (coelho) EP4

Secreção de bicarbonato (camundongo) EP1 42

Tabela 2. Receptores de prostaglandinas na mucosa gástrica e seus efeitos (FINAL) Manutenção da hidrofobicidade da membrana (camundongo) EP2, EP4

Diminuição da permeabilidade da membrana ao ácido (rato) EP2, EP4

Aumento do fluxo sanguíneo da mucosa (rato) EP2, EP4

Cicatrização da úlcera (rato) EP4

Cicatrização da úlcera (camundongo) EP4

Aumento da permeabilidade vascular induzida por histamina (rato) EP1

Proteção (PGE2) contra dano gástrico induzido por etanol e indometacina (rato) EP1 Fonte: Adaptado de WALLACE, J. L. Prostaglandins, NSAIDs, and gastric mucosal protection: why doesn’t the stomach digest itself? Physiological Reviews. v. 88, p. 1547-1565, 2008.

2.5.2.5 Óxido nítrico (NO) A partir da descoberta do NO, em 1987, como um mediador biológico produzido em células de mamíferos houve grande interesse na investigação da sua função de proteção gástrica sendo que a partir daí o número de publicações na área cresceu exponencialmente (ALDERTON; COOPER; KNOWLES, 2001; KHATTAB; GAD; ABDALLAH, 2001; ARRIETA et al., 2003; PAN et al., 2005; TEIXEIRA et al., 2006; MEDEIROS et al., 2008; REYES-TREJO et al., 2008; CHAVEZ-PIÑA et al., 2009; GANEV, 2010; CHAVEZ-PIÑA et al., 2011; SILVA et al., 2011; CORDEIRO et al., 2012; DAMASCENO et al., 2013; ROZZA et al., 2013; JÚNIOR et al., 2014 ). Três diferentes isoformas de óxido nítrico sintase (NOS) foram identificadas, sendo produzidas por genes diferentes, com localização distinta, regulação, propriedades catalíticas e sensibilidade à inibição. As nomenclaturas mais comuns são nNOS (NOS-1), predominante em tecido neuronal; iNOS (NOS-2), induzida em grande número de células e tecidos sob certas condições; eNOS (NOS-3), primeiramente encontrada em células endoteliais. Muitos autores as classificam como constitutivas (eNOS e nNOS) e induzível (iNOS), muito embora outros condenem essa abordagem tendo em vista que todas elas podem ser induzidas por diferentes estímulos e todas possam ser constitutivamente expressas em algumas células e tecidos (ALDERTON; COOPER; KNOWLES, 2001; BRUNTON; LAZO; PARKER, 2006). Quando gerado o NO liga-se ao grupamento heme da guanilato ciclase solúvel que catalisa a conversão de GTP para GMPc intracelular (via NO/GMPc), que por sua vez ativa PKG (proteinocinase dependente de GMPc) promovendo a desfosforilação da cadeia leve de miosina e a redução do cálcio citosólico, o que leva ao relaxamento das células musculares lisas e vasodilatação no TGI (BRUNTON; LAZO; PARKER, 2006; POTRICH, 2009). 43

No trato gastrintetinal o NO apresenta múltiplas funções de proteção contra uma variedade de insultos, como o etanol, ácidos minerais e a ácidos biliares, isquemia/reperfusão e danos induzidos por endotoxinas. Seu principal papel está em manter níveis ótimos da microcirculação da mucosa e inibição do acúmulo de células inflamatórias (neutrófilos) pela diminuição da expressão de moléculas de adesão (TATEMICHI et al., 2003b) A eNOS sintetiza NO por curtos períodos de tempo em resposta dependente de Ca+2 intracelular, da mesma forma que nNOS, ao passo que, em geral, a iNOS tem sua expressão acentuada após a ativação celular por citocinas e endotoxinas bacterianas e, uma vez expressa, sintetiza NO por longos períodos de tempo. Esta forma de alto débito, independente de Ca+2, pode ser responsável pelas manifestações tóxicas do NO (BRUNTON; LAZO; PARKER, 2006). Helmer et al. (2003) observaram uma expressão basal de iNOS em amostras de tecido da mucosa gástrica de ratos. Estes relatam ainda que no restante do sistema gastrintestinal não foi vista expressão de quantidades de iNOS basal, sendo esta muito baixa ou indetectável. Nesse mesmo estudo, após a administração de lipopolissacarídeo (LPS), houve relevante aumento nas concentrações de iNOS em todos os tecidos pesquisados. Antígenos provenientes do H. pylori podem induzir o aumento da expressão de iNOS em macrófagos e linfócitos do infiltrado inflamatório celular em condições gastrintestinais patológicas crônicas. A urease, fator de patogenicidade dessa bactéria, pode inibir diretamente a atividade fagocítica de macrófagos e provocar o acúmulo de radicais livres, levando a alterações secundárias que agravam o processo inflamatório local com manifestações degenerativas (CHERDANTSEVA et al., 2014). Ainda sobre a expressão de iNOS, Tatemichi et al. (2003a) concluíram que a administração de solução de cloreto de sódio (NaCl) em ratos causou dano à mucosa do estômago, devido a indução da produção excessiva de NO por iNOS, que por sua vez mantém o pH do lúmen elevado por muito tempo, permitindo o desenvolvimento de bactérias, que, num círculo vicioso, ativam a expressão de iNOS, sendo este mecanismo fatalmente envolvido no processo de carcinogênese por NaCl.

2.5.2.6 Sistemas antioxidantes Os antioxidantes atuam em diferentes níveis para compor a proteção do organismo e manter o equilíbrio do ambiente redox no interior das células. O primeiro mecanismo de defesa é impedir a formação dos radicais livres, principalmente por reações com ferro e cobre. A segunda etapa seria capturar os radicais já formados, impedindo o ataque sobre moléculas 44

funcionais (lipídeos, aminoácidos, ácidos graxos poli-insaturados, bases do DNA). Outro mecanismo importante é o reparo das lesões causadas pelos radicais, processo envolvido na remoção de bases de DNA danificadas e reconstituição de membranas biológicas. Em algumas situações pode ocorrer adaptação do organismo com aumento da produção do arsenal antioxidante (enzimático, como exemplo a catalase (CAT); e não-enzimático, como exemplo a glutationa (GSH)) (Figura 5) (BIANCHI; ANTUNES, 1999; FLORA, 2009; POTRICH, 2009; HAMID et al., 2010). Sobre os exemplos dados acima, a catalase, cujo sítio ativo contém o grupamento heme, está enclausurada no peroxissoma, a principal organela responsável por desintoxicar a célula e pela oxidação de ácidos graxos de cadeia longa, fonte abundante de peróxidos 1 orgânicos, produtos carbonílicos e oxigênio singlete ( O2). Essa enzima também pode ser encontrada na mitocôndria de células cardíacas. Sua principal função é promover a conversão de H2O2 em água e oxigênio molecular (VASCONCELOS et al., 2007; FLORA, 2009). A glutationa (GSH) é um tripeptídeo (L-γ-glutamil-L-cisteinilglicina) que exerce funções primordiais nas células, destacando-se sua função como cofator das enzimas glutationa peroxidase (GPx), em que se oxida a dissulfeto de glutationa (GSSG). Além disso, a GSH é o único tiol não proteico presente em espécies aeróbias e seu papel intracelular inclui a desintoxicação por xenobióticos e espécies reativas (Figura 4) (VASCONCELOS et al., 2007; FLORA, 2009). Diferentes situações podem alterar as concentrações intracelulares de glutationa, incluindo a presença de metais pesados, altas concentrações de glicose e a formação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Além disso, a GSH é o tiol não proteico em maior quantidade presente na mucosa gástrica, um ambiente continuamente exposto às situções elencadas acima (DICKINSON; FORMAN, 2002; POTRICH et al., 2010). Figura 4. Papel antioxidante da GSH. Em A, a reção da glutationa com radical (R•) e a neutralização por combinação com outro radical tiol. Em B, dissulfeto de glutationa (GSSG) que é acumulado dentro das células e pode reagir com grupamentos sulfidrílicos de proteínas produzindo proteína-glutationa-dissulfeto. Em C, a função da GSH como cofator da GPx na decomposição de peróxidos ou alcoóis, gerando dissulfeto de glutationa. Fonte: Adaptado de FLORA, S. J. S. Structural, chemical and biological aspects of antioxidants for strategies against metal and metalloid exposure. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. v. 2, n. 4, p. 191-206, 2009. 45

Figura 5. Fontes e respostas aos principais oxidantes presentes em sistemas biológicos. A eficiência dos sistemas antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos define o controle da resposta ou a instalação do estresse oxidativo. Fonte: Adaptado de VASCONCELOS, S. M. L. et al. Espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo em sangue humano: principais métodos analíticos para sua determinação. Química Nova. v. 30, n. 5, p. 1323-1338, 2007. 46

2.6 Tratamento medicamentoso Inúmeras classes de agentes farmacologicamente ativos provaram suas efetividades no tratamento de distúrbios ácido-pépticos. Essas classes incluem: a) antiácidos (hidróxido de alumínio e magnésio); b) agentes supressores da produção ácida (antissecretores), que incluem b.1) inibidores da bomba de H+/K+ ATPase (IBP, omeprazol, lansoprazol, pantoprazol, rabeprazol, esomeprazol, dexlansoprazol, tenatoprazol); b.2) antagonistas reversíveis dos receptores H2 de histamina (ARH2, cimetidina, ranitidina, famotidina, nizatidina); c) anticolinérgicos (pirenzepina, via receptor M1 e M3); d) agentes citoprotetores (sucralfato e análogos de prostaglandinas) e e) antimicrobianos para a erradicação do Helicobacter pylori (HIRUMA-LIMA et al., 2001; ARRIETA et al., 2003; POTRICH, 2009; CORDEIRO et al., 2012; AWAAD; EL-MELIGY; SOLIMAN, 2013; SHIMOYAMA et al., 2013; JÚNIOR et al., 2014).

2.6.1 Efeitos adversos Apesar das diversas opções disponíveis no mercado para o tratamento de distúrbios pépticos, estas ainda trazem consigo algumas limitações.

Os ARH2, efetivos na cicatrização de úlceras gástricas e duodenais pela sua habilidade em suprimir a secreção ácida noturna, não são tão ativos em prevenir a recorrência da doença. Por esse motivo começaram a ser usados por longos períodos de tempo, como terapia mantida. Porém, após 7 dias de tratamento pode ser observada tolerância, seguida de 50% de redução na efetividade do tratamento. A cimetidina diminui a ligação da testosterona ao receptor de androgênio e inibe enzimas do citocromo P450 (CYP) responsáveis por hidrolisar o estradiol. Clinicamente esses efeitos podem produzir galactorreia em mulheres e ginecomastia, redução da contagem de espermatozóides e impotência em homens. Aos outros representantes da classe (ranitidina, famotidina e nizatidina) pouca ou nenhuma interferência com enzimas CYP é observada. Têm-se ainda outros estudos relacionando discrasias hematológicas aos ARH2, como a trombocitopenia. Ao bom tempo, também devem ser utilizados com cautela durante a gravidez, pois atravessam a placenta e são excretados no leite materno, mesmo que nenhum risco teratogênio significativo tenha sido observado (BRUNTON; LAZO; PARKER, 2006; POTRICH, 2009; GANEV, 2010; RANG et al., 2011; CORDEIRO et al., 2012; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012; SANDHYA et al., 2013).

Farmacologicamente os ARH2 são menos potentes que os IBPs, devido ao fato de que estes últimos se ligam covalentemente a grupos sulfidrila de resíduos de cisteína da bomba H+/K+ ATPase promovendo supressão da produção ácida por até 48 horas, que retorna 47

somente após a síntese e inserção de nova bomba no tecido luminal. Contudo, a hipocloridria ou acloridria mantida por muito tempo leva a situações indesejadas como diminuição da absorção de vitamina B12, redução na biodisponibilidade do cetoconazol, ésteres de ampicilina e sais de ferro e cria ambiente propício para o desenvolvimento de patógenos oportunistas. Nesse mesmo sentido, pode haver hipergastrinemia freqüente em pacientes que usam IBP de forma crônica, sendo observados níveis de gastrina maiores que 500 ng/L em cerca de 5 – 10% de usuários de omeprazol. A elevação da gastrina pode promover hipersecreção ácida de rebote com a interrupção abrupta do tratamento e promover o crescimento de tumores gastrintestinais. Em ratos a administração de longo prazo com IBP provocou hiperplasia de células semelhantes às células enterocromafins e desenvolvimento de tumores carcinóides gástricos. Além disso, diferentemente do que é visto para alguns dos ARH2, os IBPs sofrem metabolismo pelas CYP e podem interagir de forma relevante com outros fármacos como a varfarina (esomeprazol, omeprazol, lansoprazol e rabeprazol), diazepam (esomeprazol e omeprazol) e ciclosporina (omeprazol e rabeprazol). O omeprazol também inibe a CYP2C19, diminuindo a depuração do dissulfiram e fenitoína, e induz a CYP1A2, aumentando a depuração de imipramina e antipsicóticos, como a olanzapina (BRUNTON; LAZO; PARKER, 2006; YUAN; PADOL; HUNT, 2006; POTRICH, 2009; GANEV, 2010; RANG et al., 2011; KLEIN-JÚNIOR et al., 2012; KIM, 2015).

2.7 Produtos naturais na pesquisa de novos agentes gastroprotetores Segundo Szabo (2014) a gastroproteção continua sendo um assunto de relevante importância, sendo que há uma necessidade clínica crescente de se descobrir novos fármacos com propriedades gastroprotetoras que previnam ou acelerem a recuperação de úlceras induzidas por agentes anti-inflamatórios e as úlceras gastroduodenais H. pylori positivas e negativas. Nesse sentido os produtos naturais, em destaque as plantas, representam uma fonte em potencial no controle de várias doenças, incluindo a úlcera gástrica e a colite ulcerativa, sendo que um grande número de plantas e seus metabólitos secundários podem ser encontrados na literatura científica com poder gastroprotetor (Tabela 3) (AWAAD; EL-MELIGY; SOLIMAN, 2013; SANDHYA et al., 2013). Thirunavukkarasu; Ramkumar e Ramanathan (2009) estudaram o extrato aquoso liofilizado das cascas de Excoecaria agallocha L. (Euphorbiaceae) nas doses de 62,5 e 125 mg.Kg-1 em modelo de úlcera induzida por AINE em ratos. Os resultados revelaram que os extratos reduziram a acidez e aumentaram as defesas da mucosa gástrica. 48

Usando um modelo de indução de lesão por etanol em camundongos, Leite et al. (2009) encontraram boa resposta para o extrato etanólico de Croton zehntneri Pax & K. Hoffm. (Euphorbiaceae) nas doses de 200 e 400 mg.Kg-1. Atribui-se a atividade à função antiácida e citoprotetora, relacionando a presença de taninos, terpenos e ácidos graxos no extrato. Na úlcera induzida pelo modelo do etanol com omeprazol e ranitidina como controles positivos e água como controle negativo, Costa et al. (2012) demonstraram a gastroproteção exercida pelo látex de Euphorbia umbellata, que, quando em contato com o conteúdo estomacal pode gerar a formação de uma camada de proteção que impede o dano causado pelo agente agressor. Resultados semelhantes foram encontrados nesse mesmo trabalho para o modelo de indução de úlcera com a indometacina. Cabe ressaltar que uma análise feita sobre a origem dos fármacos da classe dos antitumorais desenvolvidos no período de 1981 a 2010 mostrou que os produtos naturais ou derivados destes representaram 48,6 % das novas entidades químicas lançadas no mercado. Esses dados contribuem para reforçar a importância dos produtos naturais na descoberta de novos medicamentos para o tratamento de doenças. Ainda segundo Chin et al. (2006), 84 substâncias prescritas nos Estados Unidos, de um total representativo de 150, é considerado como produto natural ou relacionado (DE LUCA et al., 2012; NEWMAN; CRAGG, 2012). Hoje, o mercado global de fitoterápicos movimenta aproximadamente US$ 83 bilhões, sendo que no Brasil não existem dados oficiais, porém as estimativas variam entre US$ 350 – 550 milhões. Além disso, o Brasil é o país com a maior diversidade genética vegetal do mundo com mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado em 350 a 550 mil espécies. Dessa forma não restam dúvidas quanto ao potencial botânico que o Brasil apresenta em relação à descoberta de novos princípios ativos e ao desenvolvimento de novos medicamentos a partir de plantas (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; WHO, 2011; BRASIL, 2012; PALHARES, et al., 2015).

Tabela 3. Euphorbiaceae e substâncias isoladas testadas em modelos de úlcera (CONTINUA) Substância Modelo Nome científico Parte usada isolada experimental Etanol/HCl, Alchornea castaneaefolia Folhas e - indometacina/beta- (Bonpl. ex Willd.) A.Juss. cascas necol, ácido acético Trans- Etanol/HCl, por Croton cajucara Benth. dehidrocrotonina Partes aéreas estresse (terpeno) 49

Tabela 3. Euphorbiaceae e substâncias isoladas testadas em modelos de úlcera (FINAL)

Etanol/HCl, Cordatina, indometacina/beta- Aparisthmium cordatum Baill. aparisthman Folhas necol, ácido acético, (terpenos) ligadura de piloro, por estresse

Etanol, Etanol/HCl, Croton campestris A. St-Hill - Raiz indometacina Taspina Croton lechleri Müll. Arg. Partes aéreas Ácido acetic (alcaloide) Ácido polialtico Croton reflexifolius H. B. K. Folhas Etanol, indometacina (terpeno) Isquemia/ Plaunotol, plaunol reperfusão, ligadura Croton sublyratus Kurz. Folhas B (terpenos) de piloro, indometacina Etanol, Croton urucurana Baillon - Cascas indometacina, ácido acético Óleo Croton zehntneri Pax & K. - essencial das Etanol Hoffm. folhas 1-heptacosanol, β-sitosterol (esteroides), Euphorbia granuleta Forssk. Partes aéreas Ácido acético campferol-3- galactosídeo (flavonoide) Excoecaria agallocha L. - Cascas Indometacina Jatropona, jatropolona A, Jatropha isabelli Muell. Arg. Raiz Etanol/HCl jatropolona B (terpenos) Phyllantus amarus Shum & Folhas e - Etanol Thonn cascas Phyllantus emblica L. - Frutas Indometacina Naringenina, aromadendrina, apigenina, 4’-O- Euphorbia cuneata Vahl methoxi-luteolin- Partes aéreas Etanol 7-O- rhamnoglucoside (flavonoides) Fonte: Adaptado de AWAAD, A. S.; EL-MELIGY, R. M.; SOLIMAN, G. A. Natural products in treatment of ulcerative colitis and peptic ulcer. Journal of Saudi Chemical Society. v. 17, p. 101-124, 2013.

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OBJETIVOS 51

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar o efeito antiúlcera da fração metanólica (FM) das cascas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns, estudar possíveis mecanismos de gastroproteção e sua atividade contra outros elementos envolvidos na patogênese da úlcera gástrica.

3.2 Objetivos específicos a) Obter a fração metanólica das cascas de E. umbellata; b) Determinar o perfil químico da FM das cascas de E. umbellata por técnica de QToF-LC- MS; c) Testar a proteção gástrica, in vivo, exercida pela fração metanólica das cascas de E. umbellata via oral em modelos agudos de úlcera induzidos por etanol e indometacina em ratos; d) Identificar os mecanismos envolvidos no efeito gastroprotetor da fração metanólica das cascas de E. umbellata via oral pelo uso de inibidores farmacológicos em modelos in vivo

(Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) e aminoguanidina para a síntese de óxido nítrico (NO), azul de metileno para a enzima guanilato ciclase (GC) e indometacina para prostaglandinas); e) Testar a atividade scavenger da fração metanólica das cascas de E. umbellata frente: i. Aos radicais livres 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH•) e 2,2′-azino-bis(3- ethylenebenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS•+); ii. Às espécies reativas de oxigênio ácido hipocloroso (HOCl), Taurina cloramina •- (TauCl) e ânion superóxido (O2 ); iii. À ação contra oxidação do guaiacol por inibição de peroxidase modelo (HRP ou horseradish peroxidase); f) Averiguar o status antioxidante do soro de animais tratados com a fração metanólica das cascas de E. umbellata contra o radical ABTS•+; g) Determinar o efeito da fração metanólica das cascas de E. umbellata na quantificação de grupamentos sulfidrílicos não proteicos do estômago de ratos tratados com etanol; h) Determinar o efeito da fração metanólica das cascas de E. umbellata na quantificação de grupamentos sulfidrílicos totais (proteicos e não-proteicos) no soro de ratos; i) Determinar o efeito da fração metanólica das cascas de E. umbellata na quantificação da atividade da catalase (CAT) no estômago e eritrócitos de ratos tratados com etanol; 52

j) Analisar alterações histopatológicas em estômagos de ratos submetidos à lesão aguda induzida por etanol; k) Avaliar o efeito da fração metanólica cascas de E. umbellata sobre o microogranismo Helicobacter pylori; l) Determinar a atividade inibitória da fração metanólica das cascas de E. umbellata sobre a enzima urease.

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METODOLOGIA 54

4 METODOLOGIA

4.1 Coleta, identificação e processamento do material vegetal A coleta do material vegetal foi realizada pela equipe integrante do projeto em 2013, durante a primavera, na região da Ponta Grossa, (Coordenadas: 22 J 0584216 UTM 7222790 ELEVAÇÃO 902), Paraná, Brasil. Uma exsicata com um ramo florido da espécie (Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns) foi preparada e posteriormente enviada ao Herbário do Museu Botânico Municipal de Curitiba para classificação sistemática. A identificação botânica foi realizada pelo curador Dr. Osmar dos Santos Ribas e catalogada sob o número 363509. Com o auxílio de uma lâmina, as cascas dos galhos coletados foram mecanicamente removidas e separadas. Após isso se realizou processo de secagem, que foi feito ao ar livre (temperatura ambiente), na sombra. O local de secagem foi bem ventilado, protegido da poeira e do ataque de insetos e animais.

4.2 Obtenção da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata As partes (334 g), após o processo de secagem, foram moídas e submetidas a uma extração completa, empregando-se a técnica de maceração fracionada a frio, com agitação do extrato. O líquido extrator foi constituído de uma mistura hidroalcoólica na porcentagem de 30:70 (água:etanol, v/v) e foi substituído a cada dois dias com reposição de mesma quantidade de nova porção. Este procedimento repetiu-se por quatro (4) vezes, totalizando oito (8) dias de extração dos constituintes químicos da espécie vegetal. Os extratos recolhidos foram concentrados empregando-se um rota-evaporador (Fisaton® 558 acoplado a uma bomba de vácuo Marconi® MA053) à temperatura de 40° C e os extratos secos foram reunidos, liofilizados (Terroni® LD1500A com câmara e árvore de vácuo) e armazenados em geladeira (± 4°C) até o momento do uso. Utilizando-se a técnica de extração em coluna cromatográfica, realizou-se o procedimento de partição do extrato bruto liofilizado (EBL). Inicialmente foram utilizados 8g do EBL, depositados numa coluna com aproximadamente 100g de sílica gel Kieselgel 60 (Korngröbe 0,2 – 0,5 mm, 35 – 70 mesh ASTM, Merck®), 3,3 cm de diâmetro e cerca de 23 mL de volume, em que foram eluídos 2 litros de metanol (Vetec®). A fração metanólica semi- purificada obtida foi rota-evaporada e mantida em geladeira (± 4°C) até o momento do uso.

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4.3 Determinação do perfil químico da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata usando UHPLC-DAD-QToF-MS Utilizou-se um cromatógrafo líquido de ultra eficiência (UHPLC Agilent 1290®, Agilent Technologies) acoplado a um espectrômetro de massas com interface de ionização eletrospray (ESI). Os parâmetros de operação do aparato LC-MS foram: obtenção dos espectros em modo ESI+ e ESI-, temperatura do gás 250 °C, vazão do gás 9 L.min-1, tensão capilar 3,0 kV e fragmentador 125 V. A separação cromatográfica foi obtida em coluna ZORBAX SB-C18 RRHD 1,8 µm (2,1 x 150 mm), vazão de 0,21 mL.min-1 com fase móvel (A) água e (B) acetonitrila, ambas contendo 0,1 % de ácido fórmico, sendo programado o seguinte modo de eluição: A 90 %: B 10 % por 10 minutos (isocrático), seguido dos gradientes A 80 %: B 20 % em 15 minutos e até 100 % de B nos últimos 10 minutos. A temperatura da coluna foi de 35 °C e o volume de injeção usado foi de 3 µL. Os espectros foram obtidos em modo scan 200-400 nm. Todas as operações, aquisições e análises foram controladas pelo programa Agilent MassHunter Acquisition Software® (Agilent Technologies), versão A.05.00 e processadas pelo programa MassHunter Qualitative Analysis Software® (Agilent Technologies), versão B.05.00. As amostras foram analisadas no modo positivo e negativo no intervalo de razão massa/carga (m/z) = 150-1500. A medida de exatidão das massas, para confirmação das substâncias obtidas, foi obtida pelo método de correção da média dos íons usando massas de referencia m/z 121,0509 (purina protonada) e m/z 922,0098 (1H,1H,3H-tetrafluoropropoxi, ou HP-921) em modo positivo, enquanto para o modo negativo foram usadas as massas referência m/z 112,9856 (ácido trifluoroacético protonado, TFA) e m/z 1033,9881 (TFA+HP21). As amostras foram injetadas no equipamento via junção do tipo T usando uma bomba isocrática MODELO G1310B (Agilent Technologies) numa taxa de vazão de 0,7 mL.min-1.

4.4 Animais Foram utilizados ratos (Rattus norvergicus albinus Wistar), fêmeas, de 3 meses de idade, pesando entre 180-250 g, fornecidos pelo Biotério da Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG). Os animais eram mantidos em ambiente com temperatura (22 ± 2 ºC) e ciclo de claro/escuro (12/12 h) controlados automaticamente. Os animais tinham livre acesso à alimentação (Novital®) e água até o momento do experimento. Todos os procedimentos foram submetidos e aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (protocolos n° 11741/2014 e n° 11743/2014). O número de animais e a intensidade dos agentes ulcerogênicos foram os mínimos necessários para demonstrar resultados consistentes. 56

4.5 Atividade antiulcerogênica da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata em modelo de úlcera aguda A avaliação da gastroproteção proporcionada pela fração metanólica das cascas de E. umbellata ou dos controles empregados em modelo de úlcera induzida por etanol (via oral) e indometacina (via subcutânea) foi feita segundo Cordeiro et al. (2012), em que: Proteção (%) = 100 - (lesão do tratado x 100 / lesão do controle negativo)

4.5.1 Lesões gástricas induzidas por etanol Os animais (n = 7) foram mantidos em jejum de 12-15 horas com livre acesso à água. Estes foram aleatoriamente tratados, via oral, com veículo (salina, 0,5 mL.100g-1), ranitidina (100 mg.kg-1, em salina) e a fração metanólica (FM) das cascas de E. umbellata (50, 100 e 200 mg.Kg-1, em salina). Uma hora após o tratamento via oral, foi administrado etanol (PA 99%, 0,5 mL.100g-1 – v.o) (Dinâmica®) (SZABO; BROWN, 1987). Uma hora após a administração do agente necrotizante, os animais foram anestesiados (quetamina 75 mg.Kg-1 e xilazina 15 mg.Kg-1, via intra-peritoneal) (Vetnil®; Rompun®, respectivamente). Depois de verificada a ausência de sinais de reflexo (pinçamento da pata, sensibilidade ocular ao toque), a caixa torácica do animal foi exposta, o sangue coletado (veia cava) e a eutanásia feita por sobredosagem da mistura anestésica. Os estômagos foram retirados, abertos em sua curvatura maior, gentilmente lavados com solução salina 0,9%, expostos, esticados e fotografados. Após, foram armazenados em freezer -80 °C. As amostras de sangue foram centrifugadas a 3500 rotações por minuto (RPM), por 15 minutos (HT® MCD-2000). O sobrenadante (soro) e o precipitado (células vermelhas) foram separados para congelamento em freezer -80 °C.

4.5.2 Lesões gástricas induzidas por indometacina Os animais (n = 5) foram mantidos em jejum de 12-15 horas com livre acesso à água. Estes foram aleatoriamente tratados, via oral, com veículo (salina, 0,5 mL.100g-1), ranitidina (100 mg.kg-1, em salina) e FM (50, 100 e 200 mg.Kg-1, em salina). Dez minutos depois receberam administração subcutânea de indometacina (agente ulcerogênico – 30 mg.Kg-1) (HAYDEN; THOMAS; WEST, 1978). Passadas 6 horas os animais foram anestesiados (quetamina 75 mg.Kg-1 e xilazina 15 mg.Kg-1, via i.p.). Depois de verificada a ausência de sinais de reflexo (pinçamento da pata, sensibilidade ocular ao toque), a caixa torácica do animal foi exposta, o sangue coletado (veia cava) e a eutanásia feita por sobredosagem da mistura anestésica. Os estômagos foram retirados, abertos em sua curvatura maior, gentilmente lavados com solução salina 0,9%, expostos, esticados e fotografados. Após, 57

foram armazenados em freezer -80 °C. As amostras de sangue foram centrifugadas a 3500 RPM, por 15 minutos. O sobrenadante (soro) e o precipitado (células vermelhas) foram separados para congelamento em freezer -80 °C.

4.6 Estudo dos mecanismos gastroprotetores da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata No intuito de se caracterizar as vias pelas quais a FM de E. umbellata exerce seus efeitos antiulcerogênicos, fez-se uso de inibidores enzimáticos de aplicação farmacológica que pudessem apontar o envolvimento do óxido nítrico/ monofosfato cíclico de guanosina e também a participação das ciclooxigenases no mecanismo de ação dessa fração.

4.6.1 Avaliação da via óxido nítrico (NO)/ monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) Esta análise foi feita segundo método descrito por Matsuda; Li; Yoshikawa (1999), com modificações. Os animais (n = 7) foram mantidos em jejum de 12-15 horas com livre acesso à água. Estes foram previamente tratados com veículo (salina, 0,5 mL.100g-1), L- NAME (70 mg.Kg-1), aminoguanidina (AMG, 100 mg.Kg-1) ou azul de metileno (AZM, 20 mg.Kg-1), todos via intra-peritoneal (Sigma-Aldrich®) (PERIMAL et al., 2010; CHÁVEZ- PIÑA et al., 2011, DAMASCENO et al., 2013). Após 30 minutos, os animais receberam tratamento via oral com salina (0,5 mL.100g-1), carbenoxolona (200 mg.Kg-1, em salina, Sigma-Aldrich®) e FM (200 mg.Kg-1, em salina), formando-se os seguintes grupos (Tabela 4) (DEMBINSKA-KIEC et al., 1991):

Tabela 4. Organização dos grupos experimentais para determinação do envolvimento da via NO/GMPc na função gastroprotetora da FM das cascas de Euphorbia umbellata Pré-tratamento Tratamento Salina Salina Carbenoxolona

FM de E. umbellata Salina L-NAME Carbenoxolona

FM de E. umbellata Salina AMG Carbenoxolona

FM de E. umbellata Salina AZM Carbenoxolona FM de E. umbellata Fonte: O autor. 58

Passados 60 minutos, etanol (PA 99%, 0,5 mL.100g-1 – v. o.) foi administrado. Depois de mais 60 minutos os animais foram anestesiados (quetamina 75 mg.Kg-1 e xilazina 15 mg.Kg-1, via i. p.) (CORDEIRO et al., 2012). Depois de verificada a ausência de sinais de reflexo (pinçamento da pata, sensibilidade ocular ao toque), a caixa torácica do animal foi exposta, o sangue coletado (veia cava) e a eutanásia feita por sobredosagem da mistura anestésica. Os estômagos foram retirados, abertos em sua curvatura maior, gentilmente lavados com solução salina 0,9%, expostos, esticados e fotografados. Após, foram armazenados em freezer -80 °C. As amostras de sangue foram centrifugadas a 3500 RPM, por 15 minutos. O sobrenadante (soro) e o precipitado (células vermelhas) foram separados para congelamento em freezer -80 °C.

4.6.2 Avaliação do envolvimento das ciclooxigenases Esta análise foi feita segundo método descrito por Reyes-Trejo et al. (2008), com modificações. Os animais (n = 6) foram mantidos em jejum de 12-15 horas com livre acesso à

água. Ratos controle receberam injeção subcutânea (s. c.) de bicarbonato de sódio (NaHCO3) 5mM (Vetec®) em solução salina estéril e os animais teste receberam injeção de indometacina -1 (10 mg.Kg , dissolvido em NaHCO3 5mM, s. c.). Após 75 minutos do pré-tratamento, cada animal recebeu, via oral, salina (0,5 mL.100g-1), carbenoxolona (200 mg.Kg-1, em salina) e FM (200 mg.Kg-1, em salina) (Tabela 5). Passados 30 minutos, etanol (PA 99 %, 0,5 mL.100g-1 – v. o.) foi administrado. Duas horas mais tarde os animais foram anestesiados (quetamina 75 mg.Kg-1 e xilazina 15 mg.Kg-1, via i. p.). Depois de verificada a ausência de sinais de reflexo (pinçamento da pata, sensibilidade ocular ao toque), a caixa torácica do animal foi exposta, o sangue coletado (veia cava) e a eutanásia feita por sobredosagem da mistura anestésica. Os estômagos foram retirados, abertos em sua curvatura maior, gentilmente lavados com solução salina 0,9%, expostos, esticados e fotografados. Após, foram armazenados em freezer -80 °C. As amostras de sangue foram centrifugadas a 3500 RPM, por 15 minutos. O sobrenadante (soro) e o precipitado (células vermelhas) foram separados para congelamento em freezer -80 °C.

Tabela 5. Organização dos grupos experimentais para determinação do envolvimento das ciclooxigenases na função gastroprotetora da FM das cascas de Euphorbia umbellata (CONTINUA) Pré-tratamento Tratamento Salina NaHCO3 5mM Carbenoxolona FM de E. umbellata 59

Tabela 5. Organização dos grupos experimentais para determinação do envolvimento das ciclooxigenases na função gastroprotetora da FM das cascas de Euphorbia umbellata (FINAL) Salina Indometacina (10 mg.Kg-1, em NaHCO 3 Carbenoxolona 5mM) FM de E. umbellata Fonte: O autor.

4.7 Cálculo da área das lesões ulcerativas As imagens capturadas dos estômagos (câmera fotográfica Olympus® evolt E-420 OUTFIT zuiko digital 14-42mm f 3.5-5.6) foram analisadas por meio do software Image J® versão 1.46r. No programa foi medida a área ulcerativa e a área glandular total dos estômagos, sendo os resultados expressos em porcentagem, visto que os estômagos dos animais diferem em tamanho, segundo a fórmula abaixo. Lesões ulcerativas (%) = (área ulcerativa [mm2]/área glandular total [mm2])× 100

4.8 Perfil de ação da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata sobre radicais livres e espécies reativas de oxigênio Para avaliação do potencial scavenger, as amostras da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM) e do padrão quercetina (Sigma-Aldrich®) foram solubilizadas em metanol na concentração inicial de 1 mg.mL-1 e realizadas diluições para as concentrações de -1 -1 • •+ •- 0,1 mg.mL e 0,01 mg.mL . A ação antioxidante foi testada frente ao DPPH , ABTS , O2 , HOCl, TauCl e HRP. As absorbâncias (ABS) foram lidas em espectrofotômetro de placas Bioteck® μQuant, e espectrofotômetro UV/Vis em sistema duplo feixe, com termostatização Perkin-Elmer® Lambda 25 e cubeta de quartzo. Os resultados foram adquiridos em triplicata e expressos como a porcentagem de inibição, pela seguinte fórmula:

Inibição (%) = ((ABScontrole - ABSamostra)/ABScontrole) x 100, em que ABScontrole é a absorbância lida da solução contendo apenas o oxidante e ABSamostra é a absorbância lida da mistura contendo a FM de E. umbellata ou o padrão quercetina adicionado do oxidante. A concentração que promoveu 50% da inibição dos radicais livres e espécies reativas

(CI50) foi obtida plotando-se os dados de inibição e a concentração final de cada amostra. Os cálculos e gráficos foram feitos usando o software GraphPad Prism® 5, versão 5.01.

4.8.1 Ação scavenger sobre o DPPH• A ação das amostras foi testada frente a 60 μM do radical estável DPPH• (2,2-difenil- 1-picril-hidrazil, Sigma-Aldrich®) solubilizado em etanol absoluto (SOARES et al., 1997). O 60

meio foi composto pelas amostras com concentração entre 0,1 e 50 μg.mL-1, solução de DPPH• e o meio reacional completado para 1000 μL com etanol absoluto. A mistura foi incubada por 15 minutos em temperatura ambiente e ao abrigo da luz. A ação scavenger foi observada pelo decréscimo da absorbância em λ = 531 nm.

4.8.2 Ação scavenger sobre o ABTS•+ O radical catiônico ABTS•+ (2,2‟-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico), Sigma-Aldrich®) foi preparado reagindo 5 mL de solução aquosa de ABTS•+ (7 mM) com 88 μL de persulfato de potássio (2,46 mM, Sigma-Aldrich®), deixando-se a reação ocorrer em temperatura ambiente, ao abrigo de luz, durante 12 a 16 horas antes do uso (PELLEGRINI et al., 1998). Antes do ensaio, a solução de ABTS•+ foi diluída com tampão fosfato de sódio 10 mM (relação 1:20). As amostras, em concentrações entre 0,1 e 50 μg.mL-1, foram adicionadas às placas juntamente com ABTS•+ e tampão fosfato de sódio 100 mM completando um volume final de 1000 μL de meio reacional. Procedeu-se uma incubação de 15 minutos ao abrigo da luz e então foi feita a leitura em λ = 734 nm.

•- 4.8.3 Ação scavenger sobre o O2 Neste ensaio, feito segundo medotologia descrita por Robak; Gryglewski, 1988, o ânion superóxido reage com o NBT (nitro blue tetrazolium, 68,4 μM, Sigma-Aldrich®) para formar o cromóforo (formazana), cuja intensidade de cor é diretamente proporcional à concentração do radical. As amostras, em concentrações entre 10 e 100 μg.mL-1, foram adicionadas às placas juntamente com NBT, PMS (phenazine methosulfate, 9,67 μM, Sigma- Aldrich®), NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide reduced, 118,5 μM, Sigma- Aldrich®) e tampão fosfato de sódio 100 mM completando um volume final de 1000 μL de meio reacional. Procedeu-se uma incubação de 2 minutos ao abrigo da luz e então foi feita a leitura em λ = 560 nm.

4.8.4 Ação scavenger sobre o HOCl As reações foram feitas em tampão fosfato de sódio 50,0 mM, pH 7,4, para um volume final de 1000 µL (COSTA; XIMENES; FONSECA, 2004, com modificações). As amostras, em concentrações entre 0,1 e 50 μg.mL-1, foram adicionadas ao meio juntamente com HOCl (30 µM, Polipur® 4442) e incubadas ao abrigo da luz por 10 minutos. Em seguida, o TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina, Sigma-Aldrich®) (2,8 mM) foi preparado e adicionado, seguido de mais 5 minutos de incubação. As leituras de absorbância foram efetuadas em λ = 652 nm. A concentração da solução de ácido hipocloroso (HOCl) foi determinada 61

espectrofotometricamente pelo seu coeficiente de extinção molar (ε) em comprimento de onda de 295 nm (1mM) (350 M-1 cm-1, ZGLICZYNSKI et al., 1971).

4.8.5 Ação scavenger sobre taurina cloramina As reações são realizadas segundo Costa; Ximenes e Fonseca (2004), com adaptações. A taurina cloramina (TauCl, Sigma-Aldrich®) é obtida através da reação do HOCl (30 μM) com taurina (Tau - 5mM) por 5 minutos em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4. As amostras, em concentrações entre 0,1 e 50 μg.mL-1 são adicionados à mistura seguindo-se incubação de 10 min e adição de TMB (2,8 mM) para formação do cromóforo. Nova incubação é procedida por mais 5 minutos. A leitura das absorbâncias é feita em λ = 652 nm.

4.8.6 Ação inibitória sobre a oxidação do guaiacol por peroxidase (HRP) A concentração da HRP em solução foi determinada através de seu coeficiente de extinção molar em 403 nm (1,02 x 105 M-1 cm-1, OHLSON; PAUL, 1976). A cinética de oxidação do guaiacol (2 mM, Sigma-Aldrich®) pela HRP (7 nM, Sigma-Aldrich®), em ® -1 presença de H2O2 (0,1 mM, Dinâmica ) e das amostras FM (5 e 100 μg.mL ) ou quercetina (1 e 15 μg.mL-1), foi feita em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4, 37 °C. Imediatamente após a adição do guaiacol a reação foi seguida por 40 segundos em 470 nm (KHALIL, 2002). Determinou-se a velocidade de reação em 10 segundos, quando o tempo tende a zero

(velocidade inicial - v0) na ausência e na presença das amostras.

4.9 Determinação do potencial antioxidante do soro de animais tratados com a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata contra o radical ABTS•+ A capacidade antioxidante total sérica foi determinada conforme procedimento descrito no item 4.7.2, usando o soro diluído 1:30, conforme padronização obtida em laboratório.

4.10 Quantificação de grupos sulfidrílicos não-proteicos (SH-NP) no estômago de ratos tratados com a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata O conteúdo de SH-NP foi estimado de acordo com o método descrito por Sedlak; Lindsay (1968). Para isso, aproximadamente 100 mg de tecido gástrico congelado, previamente submetido à lesão por etanol, foi homogeneizado em 1 mL de solução de EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético, Vetec®) 0,02 M. Alíquotas (400 µL) do homogenato foram misturados com 400 µL de água destilada (diluição 1:2). Novas alíquotas (400 µL) foram adicionadas de 320 µL de água destilada e 80 µL de ácido tricloroacético 50 % (p/v) (Vetec®), 62

para a precipitação de proteínas. Em seguida os tubos foram centrifugados a 3000 RPM, por 15 minutos a 4° C (Hermle® Z 326K). O sobrenadante (400 µL) foi misturado com 800 µL de tampão Tris/HCl (0,4 M, pH 8,9) e 20 µL de DTNB (5,5‟-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), Sigma-Aldrich®) (0,01 M). A mistura foi agitada e a absorbância lida em espectofotômetro (Biotek® Synergy H1 Hybrid Reader) a λ = 412 nm (as leituras foram feitas em triplicata). Uma curva de calibração foi obtida com padrão de glutationa reduzida 1 mM (GSH, Sigma- Aldrich®) e os resultados foram expressos como micrograma de SH-NP/ grama de tecido (µg SH-NP.g tecido-1).

4.11 Quantificação de grupos sulfidrílicos totais (SH-T) no soro de ratos tratados com a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata O conteúdo de SH-T foi estimado de acordo com o método descrito por Ellman (1959). Para isso, 25 µL de soro foram adicionados a 625 µL de tampão Tris/HCl (0,1 M, pH 8,2), 75 µL de água destilada e 25 µL de DTNB (5,5‟-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)) (0,124 mM). A mistura foi agitada, incubada por 15 minutos ao abrigo da luz e a absorbância lida em espectofotômetro a λ = 412 nm (as leituras foram feitas em triplicata). Os resultados foram expressos como micromol de SH-T/ mililitro de soro (µmol SH-T.mL soro-1).

4.12 Quantificação da catalase (CAT) no estômago e eritrócitos de ratos tratados com a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata

4.12.1 Determinação em amostras da região glandular estomacal Estômagos previamente submetidos à lesão por etanol foram usados na determinação da atividade da enzima catalase (CAT). Para isso, cerca de 100 mg de tecido foram homogeneizados em 1 mL de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4, KCl 150 mM (Dinâmica®) e EDTA 200 mM. As amostras foram centrifugadas a 15000 RPM , durante 30 minutos, a 4 °C. Após, 100 µL do sobrenadante foram adicionados a 100 µL de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4 (diluição 1:2) e armazenados em gelo até o momento do uso (TABEI et al., 2015). Em uma cubeta de quartzo foram adicionados 955 µL de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4, 10 µL de amostra diluída e 35 µL de H2O2 (10,5 mM), rapidamente homogeneizados e feita leitura em espectofotômetro a cada 15 segundos, durante 2 minutos, em λ = 240 nm (as leituras foram feitas em triplicata, com branco a cada 2 amostras) (AEBI,

1984). Os resultados foram expressos como µmol de H2O2 consumido/minuto/ miligrama de -1 -1 tecido (µmol H2O2.min .mg tecido ).

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4.12.2 Determinação em amostras de eritrócitos Esta análise seguiu procedimento descrito por Aebi (1984). Amostras de eritrócitos dos animais foram descongeladas lentamente, diluídas numa proporção 1:100, v/v, em água destilada (10 µL: 990 µL) e armazenadas em gelo até o momento do uso. Em uma cubeta de quartzo foram adicionados 955 µL de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4, 10 µL de amostra diluída e 35 µL de H2O2 (10,5 mM), rapidamente homogeneizados e feita leitura em espectofotômetro a cada 15 segundos, durante 2 minutos, em λ = 240 nm (as leituras foram feitas em triplicata, com branco a cada 2 amostras). Os resultados foram expressos como -1 -1 µmol de H2O2 consumido/minuto/mililitro de eritrócitos (µmol H2O2.min .mL eritrócitos ).

4.13 Avaliação histopatológica da região glandular do estômago de ratos tratados com a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata Para o processamento histológico foi utilizado o histotécnico (Leica® TP1020) em que as peças foram desidratadas em soluções de concentração crescente de álcool etílico (70%, 80%, 95% e 100%), diafanizadas em xilol e incluídas em blocos de parafina histológica. Com o uso de um micrótomo (Leica® RM2125) foram obtidos cortes de 5µm de espessura no sentido mésio-distal. Estes foram colocados em lâminas de vidro para microscopia, que foram coradas com Hematoxilina de Mayer e Eosina Puff, para serem analisadas e capturadas com auxílio de fotomicroscópio (Olympus® BX41 acoplado a uma câmera de captura Olympus® DP72). As imagens foram capturadas, salvas e analisadas por meio do software CellSens Standard (Olympus®). No programa, todo o perímetro dos cortes foi qualificado e quantificado em quatro níveis, sendo: a) nível 0 – sem alteração do tecido; b) nível 1 – alteração superficial; c) nível 2 – aproximadamente metade do tecido com alterações arquiteturais/celulares; d) nível 3 – avançada alteração em toda espessura do tecido. Este procedimento foi realizado por um avaliador ―cego‖ que não possuía informações sobre o tratamento prévio dado a cada animal. Os resultados foram expressos como percentual de lesões da mucosa gástrica.

4.14 Atividade anti-Helicobacter pylori da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata Para realização da atividade anti-H. pylori a FM de E. umbellata foi solubilizada em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 50 mg.mL-1 ou 100 mg.mL-1 e mantida à -20 ºC ao abrigo da luz. Antimicrobianos padrões (amoxicilina e metronidazol, Sigma-Aldrich®) também foram solubilizados em DMSO (50 mg.mL-1) para preparo das diluições usadas nos 64

ensaios. A porcentagem de inibição foi determinada através da técnica de microdiluição em caldo de acordo com a norma CLSI (M7-A6, 2003), com adaptações. A cada poço da microplaca foram adicionados 100 μL de meio de cultura líquido Brain Heart Infusion (BHI, HiMedia®) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma-Aldrich®) com diversas concentrações da FM obtida por diluição seriada 1:2 (1024 µg.mL-1 – 32 µg.mL-1), e o mesmo volume de uma suspensão de H. pylori (ATCC 43504, amoxicilina sensível e metronidazol resistente) (contendo cerca de 106-107 bactérias.mL-1). A microplaca foi submetida à leitura espectrofotométrica em 620 nm e, a seguir, incubada a temperatura de 36 ºC – 37 ºC, em atmosfera contendo 10 % de CO2, por 72 horas. Após esse período, a microplaca foi homogeneizada e nova leitura foi realizada. Os testes foram realizados em triplicata, acompanhados de crescimento controle e repetidos no mínimo 3 vezes. O resultado foi expresso como porcentagem de inibição do crescimento do H. pylori pela FM por meio da fórmula (1 – ABSamostra /ABScontrole) x 100, em que ABScontrole é a absorbância lida da mistura reacional sem a FM e ABSamostra é a absorbância lida da mistura reacional com a FM.

4.15 Atividade inibitória da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata frente à enzima urease A atividade de inibição da urease foi determinada pela produção de amônia catalisada pela urease de acordo com o método descrito por Tanaka; Kawase e Tani (2003). Em microplaca de 96 poços foram adicionados 25 μL de urease 4UI (Jack Bean urease tipo III, Sigma-Aldrich®) e 25 μL das amostras (FM das cascas de E. umbellata) em diferentes concentrações (1024 µg.mL-1 – 256 µg.mL-1), incubada por 2 horas em temperatura ambiente. Após esse período foram adicionados 25 μL de vermelho de fenol 0,02% (NEON®) e 200 μL de ureia 50 mM (Sigma-Aldrich®) em tampão fosfato 100 mM (pH 6,8). Ácido bórico 20 mM foi usado como padrão de inibição. A absorbância da mistura reacional foi medida em λ = 540 nm em leitora de microplacas (BioRad® iMark), após 20 minutos. A quantidade de amônia produzida é equivalente à hidrólise de ureia, sendo que altos valores de absorção indicarão alta atividade da urease na mistura reacional. A porcentagem de inibição foi calculada utilizando a seguinte fórmula (1 – ABSamostra /ABScontrole) x 100, em que ABScontrole é a absorbância lida da mistura reacional sem a FM e ABSamostra é a absorbância lida da mistura reacional com a FM.

4.16 Análise estatística 65

Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média. A normalidade dos dados foi verificada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov, sendo que, para dados não- paramétricos aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Dunns; assumindo- se distribuições paramétricas usou-se análise de variância (ANOVA) de uma via seguido do pós-teste de Newman-Keuls. Todas as análises foram feitas pelo software GraphPad Prism® 5, versão 5.01. Valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

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RESULTADOS E DISCUSSÃO 67

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO O etanol é um potente agente indutor de lesão gástrica e uma das principais causas de úlcera na atualidade, sendo que seu consumo crônico pode levar a hemorragia sub-epitelial, esfoliação celular, edema de mucosa e infiltração de células inflamatórias. O etanol ataca predominantemente a porção glandular do estômago, causando danos por várias vias, entre elas a redução dos níveis de glutationa, bloqueio de fatores protetores da mucosa gástrica, depleção de muco e inibição da síntese de prostaglandinas (MATSUHASHI et al., 2007, ROZZA et al., 2011). O modelo agudo de úlcera induzido por etanol é considerado etapa primária na pesquisa de substâncias com potencial antiulcerogênico, pois além de indicar a efetividade da droga teste frente a esse modelo, também determina a menor dose responsiva, a qual poderá ser mais bem investigada em outros modelos (sub-agudos ou crônicos) e também ter os mecanismos de ação envolvidos elucidados no comportamento gastroprotetor (MELO et al., 2003; POTRICH, 2009; GANEV, 2010; DAMASCENO et al., 2013). Para tanto, se testou a FM nas doses de 50, 100 e 200 mg.Kg-1. Todas as doses mostraram-se efetivas, sendo que dentro do parâmetro dose-efetividade a concentração de 50 mg.Kg-1 foi a que demonstrou menor proporcionalidade, apresentando 43,9 % de proteção gástrica. De forma paralela, a maior concentração testada foi a que obteve melhor resposta de proteção ao tratamento com etanol (89,78%) quando comparado ao controle negativo (salina 0,5 mL.100g-1). Ademais, essa maior concentração revelou diferença estatisticamente significante em relação a de 50 mg.Kg-1 e sua área de lesão foi aproximadamente 5 vezes menor que a do controle positivo ranitidina (100 mg.Kg-1) (Tabela 6).

Tabela 6. Efeito do uso de diferentes doses da fração metanólica (v. o.) das cascas de Euphorbia umbellata e ranitidina em modelo úlcera induzida por etanol (v. o.) em ratos Tratamento Dose Área de lesão Área de Gastroproteção (oral) (mg.Kg-1) total (mm2) lesão (%) (%) Salina 0,5 mL.100g-1 192,0 ± 41,5 22,73 ± 3,65 - Ranitidina 100 88,3 ± 22,3 10,54 ± 2,96** 53,62 50 112,1 ± 30,0 12,75 ± 3,65* 43,90 FM de E. 100 55,5 ± 7,8 7,18 ± 0,78** 68,38 umbellata 200 16,4 ± 2,4 2,32 ± 0,53***, # 89,78 Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=7). Os resultados foram comparados pelo teste de variância (ANOVA) de uma via seguido do pós-teste de Newman-Keuls. * P< 0,05 comparado ao controle negativo (salina); ** P< 0,01 comparado ao controle negativo (salina); *** P< 0,001 comparado ao controle negativo (salina); # P< 0,05 comparado ao grupo fração metanólica 50 mg.Kg-1. Fonte: O autor.

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Devido ao fato da pesquisa estar fundamentada na busca de substâncias oriundas de fontes naturais que proporcionem efeito superior ou equivalente ao registrado por fármacos sintéticos, a resposta da fração metanólica em relação à ranitidina também foi analisada, sendo que em doses iguais (100 mg.Kg-1) a fração metanólica exibiu comportamento de gastroproteção semelhante ao da ranitidina (53,62 % e 68,38 %, respectivamente) (Figura 6).

Figura 6. Efeito gastroprotetor da fração metanólica de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (FM, 50, 100, 200 mg.Kg-1, via oral) e da ranitidina (RANI, 100 mg.Kg-1, via oral) sobre lesões gástricas induzidas por etanol absoluto (0,5 mL.100g-1) em ratos, comparado com o veículo salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), representado pela porcentagem de lesão ulcerativa. As colunas e barras representam as médias ± erro padrão da média (n = 7). ANOVA de uma via seguido de Newman-Keuls. * significa P < 0,05; ** significa P < 0,01; *** significa P < 0,001, comparado ao controle negativo; # significa P < 0,05 comparado ao grupo 50 mg.Kg-1. Fonte: O autor.

Estes resultados vão de encontro aos apresentados por outras Euphorbiaceae, como aqueles obtidos por Júnior et al. (2014), em que o extrato hidroetanólico das raízes de Croton campestris (Euphorbiaceae) na dose de 750 mg.Kg-1 (v. o.) produziu 99,03 % de inibição na formação de úlceras por etanol. Já Reyes-Trejo et al. (2008) não observaram atividade antiúlcera pronunciada para a fração metanólica das folhas de Croton reflexifolius (Euphorbiaceae), sendo que a melhor resposta foi dada pelo extrato hexânico, com 64,38 % de inibição (100 mg.Kg-1). Awaad e colaboradores (2013) mostraram em seu estudo que o extrato n-butanólico das partes aéreas de Euphorbia cuneata (125 mg.Kg-1) exibiu redução de 49 % das lesões geradas por etanol em ratos. Segundo os autores os efeitos observados estão relacionados à ação antioxidante de seus extratos bem como à participação do óxido nítrico como mediador de eventos celulares que resultam em gastroproteção. 69

Os trabalhos citados acima, assim como outros, também fazem uso de etanol como agente indutor de lesão em ratos no que se consiste em uma avaliação preliminar de ação gastroprotetora de compostos e susbtâncias candidatos ao desenvolvimento de novas moléculas bioativas. Nesse sentido, complementariamente a avaliação da ação gastroprotetora da FM frente ao etanol, realizou-se análise microscópica de amostras do tecido glandular do estômago de ratos submetidos ao ensaio de dano por este agente lesivo a fim de se confirmar os resultados obtidos macroscopicamente. A análise foi feita mediante uma varredura quali e quantitativas das lâminas de cortes do tecido estomacal dos animais. Primeiramente as lesões foram classificadas de acordo com o grau de acometimento da espessura da mucosa gástrica, sendo classificadas em a) score 0, sem lesão epitelial; b) score 1, lesão superficial; c) score 2, aproximadamente 50% do tecido lesionado e d) score 3, lesão epitelial intensa. Paralalelamente, todo o perímetro do corte histológico foi medido (em µm) com o auxílio de um software específico (vide item 4.12). Segundo esta metodologia uma lâmina poderia ou não conter as quatro classificações de uma só vez. Por fim, as medidas de cada score foram relacionadas ao tamanho total do perímetro do corte e obtidas as porcentagens para melhor parâmetro de comparação (Figura 7).

Figura 7. Análise histopatológica do estômago de ratos tratados com ranitidina (RANI, 100 mg.Kg-1), salina (SAL, 0,5 mL.100g-1) e a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) em modelo de úlcera por etanol. As lâminas foram analisadas quanto ao grau de lesão, com scores variando de 0 a 3, sendo que estes foram quantificados e expressos como porcentagem em relação ao perímetro total do corte. As colunas e barras representam as médias ± erro padrão da média (n=6-8). Teste de Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Dunn. *** significa P < 0,001, ** significa P < 0,01, * significa P < 0,05,comparado ao grupo SAL; # significa P < 0,05 comparado ao grupo RANI. Fonte: O autor. Para os animais que receberam apenas salina puderam-se observar áreas com lesões de cunho hemorrágico em que o etanol dilacera acintosamente a integridade da superfície do 70

epitélio, rompendo com a arquitetura das células da mucosa num processo que envolve a formação de áreas edemaciadas. Nesse mesmo sentido Sikiric et al. (1997) relatam que o etanol quando administrado em altas doses causa danos cáusticos, que possibilitam que as lesões alcancem níveis profundos no plexo vascular ocasionando estase, ruptura da parede dos vasos o que favorece hemorragia e necrose da mucosa. Assim também Abdelwahab (2013) reforçam que a administração de etanol a ratos resulta em dano ao epitélio da mucosa gástrica com a formação de lesões hemorrágicas (Figura 8, Figura 9).

A D e

M

m

B E e M m

C F e M m

Figura 8. Visão macroscópica representativa do corte histológico do estômago de ratos tratados com etanol (0,5 mL.100g-1). Painéis A e D; ranitidina (100 mg.Kg-1), painéis B e E; fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (200 mg.Kg-1), painéis C e F. Coloração com hematoxilina/eosina. M representa a espessura da camada mucosa, e representa a superfície epitelial e m representa a camada muscular interna. Fonte: O autor.

As lâminas dos animais do grupo controle negativo apresentaram mais de 80% de sua mucosa com uma lesão bastante acentuada (score 3), da mesma forma que não tiveram grandes proporções de lesões suaves (score 1 e 0). Entretanto um comportamento oposto pode ser visto microscopicamente nas lâminas dos animais tratados com a FM (200 mg.Kg-1) e o controle positivo (ranitidina, 100 mg.Kg-1), nos quais se observam maiores quantidades do tecido com lesão superficial ou ainda sem dano aparente, sendo ainda que para esta última classificação a FM se mostrou em vantagem sobre a ranitidina (representado pela diferença significativa entre os parâmetros desses dois tratamentos). Nestes grupos ainda, os tecidos tiveram drásticas reduções na quantidade de lesões score 3, o que demonstra a capacidade da 71

ranitidina e da FM em manter a integridade das estruturas celulares quando do contanto destas com o etanol (Figura 7, Figura 9).

A D

e

e

h h B

E

C

F

Figura 9. Fotomicrografias representativas do estômago de animais tratados com etanol em modelo agudo de indução de úlcera. Em A representação do estômago de rato controle, tratado apenas com salina e etanol. A seta indica a linha em vermelho que mostra a quantificação das lesões. Em B mostrando a integridade do tecido propiciada pela fração metanólica (FM) das cascas de Euphorbia umbellata. A reta representa desde o epitélio (parte superior), até a camada muscular mais interna (parte inferior). Em C uma visão geral do corte histológico de animal tratado com a FM. Em D uma imagem ampliada de A, sendo que e significa áreas de edema e h áreas onde houve lesões hemorrágicas. E representa os animais tratados com ranitidina. Em F uma visão geral de um animal tratado com ranitidina (hematoxilina/eosina, A – 40x; B – 200x; C – 40x; D – 400x; E – 100x; F – 40x). Fonte: O autor. 72

Apoiado nos resultados de gastroproteção encontrados para a FM contra o etanol, outro modelo experimental foi usado no intuito de se caracterizar o poder de ação dessa fração em situação de injúria causada por outro agente ulcerogênico, a indometacina, um fármaco anti-inflamatório não esteroidal que tem seu uso limitado, em alguns casos, devido à sua própria ação pró-úlcera. Experimentalmente se tornou uma substância de escolha em resposta ao seu caráter ácido e por não possuir seletividade de inibição quanto às ciclooxigenases (COXs). Dessa forma, além de se ter o envolvimento de um agente indutor da lesão diferente do etanol, este apresenta modo de ação díspar que permite elucidar a possível função gastroprotetora da FM (KHATTAB; GAD; ABDALLAH, 2001; GANEV, 2010; SILVA, 2012). Pode ser vista importante redução na lesão provocada pelo AINE para o controle positivo (ranitidina, 100 mg.Kg-1), com uma proteção da mucosa gástrica de 97,34 %, da mesma forma que a FM também alcançou bons resultados, com 88,49 % de inibição da formação de lesão na sua menor concentração. Não foi observado aumento do efeito gastroprotetor da FM nas doses de 100 e 200 mg.Kg-1 (Tabela 7, Figura 10).

Tabela 7. Efeito do uso de diferentes doses da fração metanólica (v. o.) das cascas de Euphorbia umbellata e ranitidina em modelo úlcera induzida por indometacina (s. c.) em ratos Tratamento Dose Área de lesão Área de Gastroproteção (oral) (mg.Kg-1) total (mm2) lesão (%) (%) Salina 0,5 mL.100g-1 17,4 ± 8,0 2,26 ± 0,74 - Ranitidina 100 0,5 ± 0,2 0,06 ± 0,03*** 97,34 50 2,0 ± 0,8 0,26 ± 0,12* 88,49 FM de E. 100 4,1 ± 0,2 0,47 ± 0,20* 79,20 umbellata 200 2,0 ± 0,6 0,26 ± 0,08* 88,49 Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=5). Os resultados foram comparados pelo teste de variância (ANOVA) de uma via seguido do pós-teste de Newman-Keuls. * P < 0,05 comparado ao controle negativo (salina); *** P < 0,001 comparado ao controle negativo (salina). Fonte: O autor. Resultados semelhantes foram encontrados por Hiruma-Lima et al. (2006) que testaram a atividade do extrato bruto de Alchornea castaneaefolia (1000 mg.Kg-1) nesse mesmo modelo e mostraram resposta máxima de 62 % e 60 % de gastroproteção para as folhas e cascas, respectivamente. Para o extrato metanólico das cascas de Croton urucurana (250 mg.Kg-1), Cordeiro et al. (2012) obtiveram 98,71 % de redução da formação de lesões na mucosa gástrica de ratos tratados com a indometacina. Já Begum e colaboradores (2014) utilizando coelhos obtiveram uma porcentagem menor (67,43 %) de proteção do tecido gástrico empregando as partes aéreas de Euphorbia prostata (240 mg.Kg-1). Para a mesma dose usada no presente estudo (200 mg.Kg-1) , Rathnakumar et al. (2013) tiveram 62,27 % de 73

proteção para o extrato etanólico das partes aéreas de Euphorbia hirta, indicando a validade científica dos dados encontrados para a FM obtida a partir das cascas de E. umbellata.

Figura 10. Efeito gastroprotetor da fração metanólica de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (FM, 50, 100, 200 mg.Kg-1, via oral) e da ranitidina (RANI, 100 mg.Kg-1, via oral) sobre lesões gástricas induzidas por indometacina (30 mg.Kg-1) em ratos, comparado com o veículo salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), representado pela porcentagem de lesão ulcerativa. As colunas e barras representam as médias ± erro padrão da média (n = 5). ANOVA de uma via seguido de Newman-Keuls. * significa P < 0,05; *** significa P < 0,001, comparado ao controle negativo. Fonte: O autor.

Quando da aplicação subcutânea do AINE neste ensaio, este muito provavelmente atinge níveis sistêmicos durante a experimentação sugerindo que o mecanismo de lesão mais propriamente envolvido ocorra em resposta ao bloqueio das COXs, sendo que o efeito ácido local do fármaco não se torna tão essencial nesse momento. Como a FM mostrou bons níveis de proteção estomacal, sugere-se que esta possa manter níveis adequados de prostaglandinas (PG), que por sua vez tem papel fundamental na proteção da mucosa pelo aumento de defesas, diminuição da produção ácida, da aderência de leucócitos e aumento mantido do fluxo sanguíneo (REYES-TREJO et al., 2008; BESERRA et al., 2011; FORNAI et al., 2011). Pautado nisso, buscou-se então reforçar a possível participação das ciclooxigenases (COXs) no mecanismo de ação dessa fração. É importante destacar que como a dose de 200 mg.Kg-1 da FM apresentou melhor resposta para os modelos de indução de úlcera por etanol e também por indometacina, elegeu-se essa como concentração ótima nos testes subsequentes. Para isso, usou-se um modelo no qual os animais receberam injeção subcutânea de -1 NaHCO3 5mM em salina (controle) e também indometacina (10 mg.Kg em NaHCO3 5 mM, pela mesma via) para promover a inibição não-seletiva das COX. Setenta e cinco minutos 74

após os ratos receberam salina (0,5 mL.100g-1), FM e carbenoxolona (200 mg.Kg-1) via oral e depois de mais 30 minutos etanol PA via oral, mantido por 2 horas até o momento do sacrifício.

Para os animais tratados com o veículo (NaHCO3) e salina, percebe-se uma elevada porcentagem de áreas ulceradas (20,53 %), assim como o tratamento com indometacina manteve níveis altos de lesão (20,15 %), sem causar, por si só, aumento das áreas acometidas, demonstrando que sob efeito da dose usada, o AINE não foi capaz de gerar uma alteração perceptível nas lesões ulcerativas, porém certamente contribuiu para tornar deficiente os mecanismos de proteção proporcionados pela ação das PGs (Figura 11).

Figura 11. Evidência do envolvimento das prostaglandinas no mecanismo protetor gástrico da FM das cascas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns. Um pré-tratamento empregou injeção sub-cutânea de bicarbonato de sódio -1 (NaHCO3, 5 mM) e indometacina (10 mg.Kg ). Após 75 minutos foram administrados via oral salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), fração metanólica (FM, 200 mg.Kg-1) e carbenoxolona (CARB, 200 mg.Kg-1). Depois de 30 minutos foi dado etanol PA via oral e os animais mantidos por mais 2 horas até o momento do sacrifício. As colunas e barras representam as médias ± erro padrão da média (n=6). ANOVA de uma via seguido de Newman-Keuls. *** significa P < 0,001, comparado ao grupo NaHCO3-salina; # significa P < 0,01 comparado ao controle NaHCO3-FM; + significa P < 0,05 comparado ao controle NaHCO3-CARB. Fonte: O autor. O tratamento com a FM e o controle positivo renderam significativos valores de proteção ao estômago (80,00 % e 95,49 %, respectivamente), ao passo que mediante bloqueio das COXs houve também significativa diminuição das áreas sem lesão (131,2 ± 25,8 mm2 e 68,8 ± 18,2 mm2) e conseqüente queda da inibição da formação das lesões (35,8 % e 62,9 %) se comparado aos respectivos controles (39,9 ± 11,6 mm2 e 9,0 ± 1,6 mm2) (Tabela 8).

75

Tabela 8. Efeito da FM (200 mg.Kg-1, v. o.) das cascas de Euphorbia umbellata em modelo de lesão gástrica por etanol PA, com bloqueio da síntese de prostaglandinas por indometacina Tratamento Área de lesão Área de Gastroproteção 2 s.c. v.o. total (mm ) lesão (%) (%)

NaHCO3 Salina 200,3 ± 40,5 20,53 ± 4,05 - NaHCO3 FM de E. umbellata 39,9 ± 11,6 4,10 ± 1,31*** 80,00 NaHCO3 Carb 9,0 ± 1,6 0,92 ± 0,15*** 95,49 Indomet. Salina 187,8 ± 58,7 20,15 ± 6,10 - Indomet. FM de E. umbellata 131,2 ± 25,8 12,93 ± 2,47** 35,83 Indomet. Carb 68,8 ± 18,2 7,47 ± 1,87* 62,90 Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=6). Os resultados foram comparados pelo teste de variância (ANOVA) de uma via seguido do pós-teste de Newman-Keuls. *** P < 0,001 comparado ao controle negativo respectivo; ** P < 0,01 comparado ao controle negativo respectivo; * P < 0,05 comparado ao controle negativo respectivo. Fonte: O autor. Para este mesmo modelo, Chávez-Piña et al. (2009) também observaram que o bloqueio das ciclooxigenases pela indometacina aboliu completamente o efeito de proteção tido pela carbenoxolona (usada como controle positivo no teste) e pelo triterpeno pentacíclico β-lupeol (30 mg.Kg-1). Os resultados alcançados por a) Wada et al. (1997); b) Hiruma-Lima et al. (1999) e c) Silva et al. (2015) continuam por compor a importância das ciclooxigenases e das prostaglandinas, como um dos produtos da sua ação, na gastroproteção do a) plaunotol (obtido de Croton sublyratus); b) trans-dehidrocrotonina (obtida de Croton cajucara Benth.) e c) fração aquosa das folhas de Terminalia catappa L. (Combretaceae) contra lesão induzida por etanol sob bloqueio das COXs com indometacina. Diante disso os autores sugerem que as PGs possuem papel fundamental no efeito gastroprotetivo de suas amostras e os dados obtidos neste trabalho também reforçam a hipótese de que a FM atue de forma a manter níveis desses prostanoides necessários ao bom desempenho de suas ações no estômago. Estudos prévios também têm focado suas análises no envolvimento do óxido nítrico (NO) como via mediadora da ação antiúlcera, dado que este apresenta múltiplas funções de proteção contra uma variedade de insultos, como o efeito do etanol sobre a mucosa. Alinhado a isso, o uso de inibidores farmacológicos pode ser de extrema valia no entendimento do envolvimento do NO e seus alvos nos mecanismos de ação da FM (TATEMICHI et al., 2003b; CHAVEZ-PIÑA et al., 2009; ROZZA et al., 2011; PALACIOS-ESPINOSA et al., 2014). O L-NAME é um inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase, pois segundo Kawano; Tsuji (2000), o L-NAME é hidrolisado a L-nitroarginina (um análogo enantiomérico do 76

substrato L-arginina) que inativa as enzimas por competição ao sítio ativo (VASCONCELOS, 2011). No mesmo sentido a aminoguadina (AMG) também é um inibidor da NOS. Alguns autores a colocam como inibidora seletiva da enzima iNOS, porém outros contestam essa afirmação, reiterando que ela é considerada parcialmente seletiva frente a nNOS e praticamente sem seletividade pra eNOS (Tabela 9) (ALDERTON; COOPER; KNOWLES, 2001; DAMASCENO et al., 2013). Tabela 9. Valores de inibição das isoformas de NOS pela aminoguanidina

IC50 (µM) Inibidor iNOS nNOS eNOS Aminoguanidina 31 170 330

Fonte: Adapatado de ALDERTON, W. K.; COOPER, C. E.; KNOWLES, R. G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochemical Journal. v. 357, p. 593-615, 2001.

O azul de metileno (AZM) é frequentemente usado como um inibidor ―seletivo‖ da enzima guanilato ciclase solúvel (GC), previnindo a vasodilatação mediada pelo NO. Sua seletividade é relativa, pois o AZM é conhecido por afetar outras enzimas que contem ferro (grupamento heme da GC), como por exemplo, a xantino oxidase e também a própria NOS, via um mecanismo direto de inibição. No entanto diversos estudos fazem uso do AZM para determinar o envolvimento de subtâncias na via de ativação NO/GMPc (MAYER; BRUNNER; SCHMIDT, 1993; TEIXEIRA et al., 2006). Por meio do bloqueio enzimático da NOS/GC pode ser determinado o possível envolvimento do NO/GMPc na ação protetora da FM. Nesse modelo os animais foram pré- tratados, via intra-peritoneal, com salina (0,5 mL.100g-1), L-NAME (70 mg.Kg-1), AMG (100 mg.Kg-1) ou AZM (20 mg.Kg-1). Trinta minutos após receberam, via oral, os tratamentos salina (0,5 mL.100g-1), FM ou carbenoxolona (200 mg.Kg-1) e depois de mais 60 minutos etanol PA (0,5 mL.100g-1), também via oral, como agente ulcerogênico. O grupo de animais tratados com salina via oral (controle negativo) tiveram alta porcentagem de lesão gástrica (22,29 % em média), sendo que não foi observada diferença estatística usando os vários pré-tratamentos, o que mostra que nenhum deles (L-NAME, AMG ou AZM), nas doses usadas, foi o responsável pelo aumento da lesão observada nos grupos tratados (FM e carbenoxolona) (Figura 12). Tanto a FM quanto o controle positivo usado mostraram-se efetivos em diminuir a lesão causada pelo etanol (79,39 % e 94,79 %, respectivamente), quando comparado ao grupo salina. Entretanto, quando da administração de L-NAME ou AMG, nota-se um impedimento real na proteção contra lesões gástricas dos grupos da FM (178,8 ± 44,1 mm2 e 92,0 ± 22,2 77

mm2, na ordem) se comparado ao controle tratado com salina (39,1 ± 7,4 mm2). Essa mesma situação se repete para a carbenoxolona, em que sua ação gastroprotetora (94,79 %) é abolida com o uso desses bloqueadores (56,98 % e 56,21 %). O tratamento com AZM também anulou a proteção proporcionada pela FM (111,2 ± 18,6 mm2) para o modelo empregado, da mesma forma como o fez para a carbenoxolona (40,7 ± 9,1 mm2) (Tabela 10).

P < 0,05

n.s.

P < 0,05 P < 0,001 P < 0,05 P < 0,05 P < 0,05 n.s.

Figura 12. Envolvimento da via NO/GMPc no mecanismo de ação da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) em lesão induzida por etanol (0,5 mL.100g-1) em ratos. Salina (SAL, 0,5 mL.100g-1) e carbenoxolona (CARB, 200 mg.Kg-1) foram usados como controles negativo e positivo, respectivamente. L-NAME (70 mg.Kg-1) e aminoguanidina (AMG, 100 mg.Kg-1) foram usados no pré- tratamento, via intra-peritoneal, para bloqueio da NOS e o azul de metileno (AZM, 20 mg.Kg-1) no pré- tratamento, pela mesma via, para bloqueio da GC. Após uma hora os animais (n = 7) receberam administração via oral de etanol PA. As colunas e barras representam as médias ± erro padrão da média. ANOVA de uma via seguido de Newman-Keuls. ++ significa P < 0,01; +++ significa P < 0,001, comparado a salina-salina; ** significa P < 0,01; *** significa P < 0,001 comparado a salina-FM; # significa P < 0,01; ## significa P < 0,001 comparado a salina-CARB; n.s.: não significativo. Fonte: O autor.

Tabela 10. Efeito do uso de inibidores farmacológicos na determinação do possível envolvimento do NO/GMPc nos mecanismos de ação da FM das cascas de Euphorbia umbellata (200 mg.kg-1, v. o.) (CONTINUA) Tratamento Área de lesão Área de Gastroproteção 2 i.p. v.o. total (mm ) lesão (%) (%) Salina Salina 193,9 ± 50,7 18,25 ± 4,45 - Salina FM de E. umbellata 39,1 ± 7,4 3,76 ± 0,74** 79,39 78

Tabela 10. Efeito do uso de inibidores farmacológicos na determinação do possível envolvimento do NO/GMPc nos mecanismos de ação da FM das cascas de Euphorbia umbellata (200 mg.kg-1, v. o.) (FINAL) Salina Carb 9,3 ± 4,2 0,95 ± 0,44*** 94,79 L-NAME Salina 316,5 ± 65,2 30,83 ± 6,16 - L-NAME FM de E. umbellata 178,8 ± 44,1 18,16 ± 4,43*** 41,09 L-NAME Carb 134,2 ± 44,8 13,26 ± 4,42*** 56,98 AMG Salina 257,7 ± 20,6 23,66 + 1,64 - AMG FM de E. umbellata 92,0 ± 22,2 9,05 ± 2,17** 61,74 AMG Carb 107,4 ± 37,2 10,36 ± 3,4** 56,21 AZM Salina 175,5 ± 39,0 16,44 ± 3,87 - AZM FM de E. umbellata 111,2 ± 18,6 11,11 ± 1,84** 32,42 AZM Carb 40,7 ± 9,1 3,79 ± 0,86** 76,94 Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=7). Os resultados foram comparados pelo teste de variância (ANOVA) de uma via seguido do pós-teste de Newman-Keuls. ** P < 0,01 comparado ao controle negativo respectivo; *** P < 0,001 comparado ao controle negativo respectivo. Fonte: O autor. A literatura científica tem mostrado a importância do NO como agente gastroprotetor e seu envolvimento no mecanismo de ação de extratos vegetais e substâncias isoladas a partir destes. Reyes-Trejo et al. (2008) concluíram em seu trabalho que a atividade de inibição da formação de lesões estomacais tida pelo diterpeno ácido poliáltico não envolve a ação das prostaglandinas, mas em muito está associada ao NO endógeno. Já Rozza et al. (2011) e Cordeiro et al. (2012) sugerem que as funções protetivas do oléo essencial de Croton cajucara e do extrato metanólico de Croton urucurana não aconteçam devido ao envolvimento do NO. O NO deriva de três isoformas de enzimas sintase do óxido nítrico (NOS), as chamadas constitutivas cNOS (nNOS/eNOS) e a denominada induzível, ou iNOS. Entretanto o efeito do NO proveniente da iNOS em benefício ou detrimento da integridade da mucosa gástrica permanece sendo um tópico de bastante discussão entre pesquisadores. A atividade de iNOS exerce ação curativa na inflamação intestinal, mas também os peroxinitritos vindos da combinação do NO com o ânion superóxido podem provocar disfunção da barreira mucosa gastrintestinal (TATEMICHI et al., 2003b). Nesse sentido, muitos trabalhos são feitos no intuito de se entender as funções de iNOS, usando para isso inibidores dessa enzima. Porém a grande limitação desses estudos está justamente em encontrar inibidores que sejam seletivos para essa isoforma da NOS. A aminoguanidina (AMG) é postulada como sendo um inibidor seletivo, muito embora vários autores contestem essa informação argumentando sobre o fato de nenhum inibidor ser completamente seletivo para a iNOS, como já abordado anteriormente (MISKO et al., 1993; 79

ALDERTON; COOPER; KNOWLES, 2001; TATEMICHI et al., 2003b; DAMASCENO et al., 2013). Ainda sobre essa temática Pan et al. (2005) afirmam que o NO possui ação dúplice no organismo, sendo de caráter protetor aquele derivado das isoformas constitutivas (nNOS/eNOS) e danoso o proveniente da isoforma induzível (iNOS), intitulada pro- ulcerogênica. De forma oposta, Tatemichi et al. (2003b) mostram em seu trabalho que há um aumento na expressão da iNOS em úlcera induzida experimentalmente em ratos e camundongos, mas que a atividade da iNOS afeta a resposta cicatricial das úlceras formadas de maneira positiva, tendo um papel benéfico na recomposição do tecido. Helmer et al. (2003) revelaram por técnica de Western Immunoblot que tecidos de rato como duoedeno, jejuno, íleo, mucosa colônica e rim não possuem expressão ou expressam quantidades muito baixas, praticamente indetectáveis de iNOS. Já para o pulmão, fígado, baço e mucosa gástrica foi percebida uma expressão basal da enzima, o que significa que em condições normais exista um papel fisiológico do NO proveniente da iNOS e que esta não seja apenas uma forma induzível da enzima, mas que co-exista com as outras isoformas de maneira a manter a homeostase celular. O que se sabe também é que os efeitos tóxicos do NO estão associados a algum tipo de estímulo que favoreça o aumento de expressão da iNOS com produção exacerbada do mediador químico. O mesmo autor citado acima usou lipopolissacarídeo (LPS) para alterar o padrão de expressão da iNOS, sendo que em todos os tecidos citados houve um aumento enzimático pronunciado. Nessa mesma linha Cherdantseva et al. (2014) reportam que a presença do H. pylori é um estímulo favorável a ativação do sistema imune do hospedeiro, com aumento na expressão de iNOS em macrófagos e linfócitos e acúmulo de ERO que contribuem para alterações tissulares secundárias no desenvolvimento da gastrite crônica. Portanto, analisando o comportamento da FM frente ao L-NAME e AMG, pode-se inferir que óxido nítrico está envolvido nas ações gastroprotetoras desta fração. Além disso, os resultados obtidos a partir deste experimento permitem caracterizar o NO envolvido como sendo produzido principalmente pela isoforma eNOS, uma vez que a AMG produziu reversão parcial da gastroproteção. De forma semelhante, Farzei et al. (2015) reportaram que a ação protetora do ácido gálico em modelo de úlcera por indometacina também estava associada a ação da eNOS, indicando a importância do NO/eNOS na ação desse fenólico.

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Somado a isso se entende que o NO além de manter o fluxo sanguíneo na mucosa, este também pode protegê-la contra dano causado por AINE por promover a síntese de prostaglandinas. Uma interação mútua pode ser observada entre as enzimas NOS e COX. O NO é capaz de aumentar a atividade da COX, enquanto que inibidores da NOS bloqueiam a produção de prostaglandinas como a PGE2. Também a indometacina reduz os níveis de GMPc, que estariam aumentados na presença de NO (KHATTAB; GAD; ABDALLAH, 2001). Em seu trabalho Sakai et al. (1996) já mostravam a interação entre as prostaglandinas e a via NO/GMPc. Estes autores identificaram um canal de cloreto na membrana basolateral de células parietais gástricas de coelhos, o qual seria ativado pela prostaglandina E2 (via receptor +2 EP3), que levaria ao aumento da atividade das NOS dependentes de cálcio (Ca ) estimulando o débito nas concentrações de NO e consequentemente GMPc intracelular. Esse canal, segundo os pesquisadores, tem um papel fisiológico importante na manutenção do potencial de membrana e, portanto na integridade celular. Nesse sentido, a inibição de nNOS/eNOS pela AMG não foi capaz de reverter totalmente o efeito gastroprotetor apresentador pela FM (representado pela diferença estatística entre o grupo tratado com a fração e os aniamais que receberam salina via oral), reforçando a hipótese de que outros efetores, como as PGs, possivelmente mantenham comunicação ativa com a via do NO para a manutenção da integridade gástrica. Esta observação também pode ser considerada quando do pré-tratamento com o L-NAME, sendo que neste caso não houve diferença entre o grupo de animais que recebeu FM com aquele tratado com salina, mostrando que sob condição de bloqueio de todas as isoformas da NOS não há gastroproteção pela ação de NO ou mesmo pela interação deste com as PGs. Somado a isso, o AZM reverteu em quase 70 % a gastroproteção dada pela FM, sugerindo que o NO envolvido, ou pelo menos a maior parte deste, atue pela via NO/GMPc (Figura 12). De fato o NO possui papel fundamental na defesa da mucosa gastrintestinal associado ao seu poder de relaxamento da musculatura lisa de vasos por meio da estimulação da guanilato ciclase (GC) com consequente aumento na produção de GMPc. Sabe-se também que a via NO/GMPc protege as células parietais da citotoxicidade causada pela adminsitração do etanol e as células endoteliais contra danos em vários tecidos (ARRIETA et al., 2003; MEDEIROS et al., 2008, REYES-TREJO et al., 2008; CHAVEZ-PIÑA et al., 2009; GANEV, 2010; CHAVEZ-PIÑA et al., 2011; CORDEIRO et al., 2012; DAMASCENO et al., 2013; JÚNIOR et al., 2014). Outras pesquisas também têm evidenciado a importância de plantas e substância fitoativas e da via NO/GMPc na ação gástrica. Júnior et al. (2014) demonstraram que o 81

extrato hidroalcoólico das folhas de Croton campestris A. St.-Hill (Euphorbiaceae) possui efeito protetor contra úlcera induzida por etanol e indometacina que ocorre devido a potenciação da via NO/GMPc pelo extrato. De forma semelhante DalBó et al. (2008) concluíram que uma fração rica em proantocianidinas obtida das cascas de Croton celtidifolius (Euphorbiaceae) medeia o efeito vasorelaxante dependente do endotélio em aorta torácica de rato, envolvendo a via NO/GMPc. Além das úlceras provocadas pelo consumo de etanol e AINES (usados como indutores de lesão nos modelos utilizados), o Helicobacter pylori tem sido reconhecido como uma das principais causas de gastrite, úlcera péptica e mudanças morfológicas da mucosa gástrica (atrofia, metaplasia e displasia precedentes a processos neoplásicos) (KATO et al., 2002; POTRICH et al., 2010; CORDEIRO et al., 2012). Uma parte destes efeitos está ligada a enzima arginase do H. pylori, que é capaz de hidrolisar L-arginina em ornitina e ureia, sendo que esta última serve de substrato a outra enzima desse bacilo, a urease, na formação de amônia, sendo este um dos mecanismos responsáveis pela capacidade de sobrevivência dessa bactéria sob as condições ácidas do estômago (KIM et al., 2012). Soma-se ainda o fato de que a arginase e a iNOS compartilham do mesmo substrato, assim, em um ambiente de injúria ou inflamação há elevação nos níveis de arginase 2, resultando em competição por L-arginina e consequente redução na atividade bactericida de NO, bem como inibição da iNOS pela ornitina gerada (WROBLEWSKI; PEEK JUNIOR; WILSON, 2010; LUNDBERG; GLADWIN; WEITZBERG, 2015). Por essa razão o presente estudo também avaliou a atividade da FM contra o H. pylori, sendo observada redução de 44,16 % do crescimento bacteriano em 256 µg.mL-1 (Tabela 11).

Tabela 11. Atividade inibitória da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata sobre o bacilo Helicobacter pylori Inibição de H. pylori (%) µg.mL-1 FM 32 22,57 ± 1,95 64 12,41 ± 4,17 128 39,95 ± 1,70 256 44,16 ± 4,59 512 40,40 ± 0,52 1024 45,67 ± 1,08

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=3). Fonte: O autor. 82

A partir dos resultados obtidos é possível colocar que a FM possa desenvolver uma atividade suplementar aumentando a eficácia das terapias antibacterianas atuais dado que a resistência aos antimicrobianos é uma das principais causas de falha dos tratamentos com altas taxas de sobrevivência ao metronidazol (~39 %), claritromicina (~27 %) e amoxicilina, tetraciclina e trovafloxacino (~5 %) (ROMERO, 2007; PASTENE, 2010, KITAGAWA et al., 2012; SILVA et al., 2012; PALACIOS-ESPINOSA et al., 2014; MODOLO et al., 2015). Em seu trabalho Okeleye; Bessong e Ndip (2011) testaram os extratos acetato de etila e acetona das cascas do caule de Bridelia micrantha (Hochst., Baill., Euphorbiaceae) contra 31 cepas clínicas de H. pylori incluindo uma cepa padrão, mostrando que as concentrações inibitórias mínimia capazes de bloquear o crescimento do bacilo em 50 % variaram entre 4,8 e 156 µg.mL-1 e 4,8 e 313 µg.mL-1, respectivamente. Em outro estudo Siddaraju e Dharmesh (2007) relataram que os extratos compostos de fenóis livres (FLCA) e fenóis condensados (FCCA) de Curcuma amada foram responsáveis pela inibição de 88 % e 92 % do H. pylori, sendo que desses valores, 66 % da resposta tida para a FLCA estava relacionada ao somatório das ações dos ácidos gentísico, cafeico e ferúlico e 82 % da atividade da FCCA estava associada ao ácido ferúlico, cinâmico e p-cumárico. Além disso, o ácido gálico, presente em abundância na FLCA, também contribuiu significativamente para a atividade anti-H. pylori dessa fração. Segundo estes mesmos autores, compostos fenólicos podem causar efeito antimicrobiano pela hiperacidificação da membrana plasmática do micro-organismo, acidificação intracelular com prejuízo na produção energética ou ainda pela inativação de enzimas causando alterações na permeabilidade de membrana. Por este motivo a FM de Euphorbia umbellata foi testada frente à urease do H. pylori. Essa enzima é um dos principais fatores de virulência contra o hospedeiro e de sobrevivência para a própria bactéria. Esse bacilo expressa altos níveis desta enzima que hidrolisa a ureia - (CO(NH2)2), fisiologicamente presente no suco gástrico, em bicarbonato (HCO3 ) e amônia iônica (NH4+), elevando o pH da mucosa gástrica de 6,0 para 7,0, protegendo o bacilo dos efeitos deletérios do ambiente ácido do estômago. Aliás, como já comentado, o NH4OH disponível reage com o HOCl produzido pelos neutrófilos gerando as cloraminas, tão destrutivas e com alto poderio citotóxico (KATO et al., 2002; GUIMARÃES; CORVELO; BARILE, 2008; CHERDANTSEVA, et al., 2014; MODOLO et al., 2015). A atividade da urease pode ser controlada pela aplicação de inibidores da enzima como uma estratégia viável na erradicação da infecção por H. pylori e outras bactérias produtoras de urease. Acrescenta-se ainda que inibidores comercialmente disponíveis, como fosforodiamidatos, derivados do ácido hidroxâmico e imidazólicos são tóxicos e possuem 83

baixa estabilidade, características que limitam seus empregos na clínica. Portanto a busca por novos inibidores com maior estabilidade e menor toxicidade se faz necessária (AMIN et al., 2013; MINKARA et al., 2014; MODOLO et al., 2015). Como resultado a FM produziu inibição máxima de 78,62 ± 0,4 % na concentração de 1024 µg.mL-1. Após 20 minutos de incubação a inibição da urease foi de 26,81 ± 0,1 %. Amin et al. (2013) testaram o extrato metanólico das folhas de Calotropis procera W. T. Aiton (Apocynaceae) contra urease isolada de cultura de H. pylori, com inibição de 48,22 ± 0,24 % (256 µg.mL-1). Em outro estudo Pastene et al. (2009) encontraram que o extrato seco das cascas da maça enriquecido com polifenois (APPE) e suas frações de baixo e alto peso -1 molecular produziram inibição da urease com IC50 180, 594 e 103 µg.mL , respectivamente, em equivalentes de ácido gálico para o mesmo modelo usado neste trabalho, sugerindo que a atividade anti-urease da APPE esteja atrelada, primariamente, à presença de compostos polifenolicos de alto peso molecular. De fato, os polifenois, a exemplo dos flavonoides, são substâncias que vem demonstrando boa atividade contra a urease (XIAO et al., 2012). Aliado a isso, os polifenois são reconhecidamente substâncias com ação antioxidante que podem contribuir na atividade antiúlcera uma vez que a urease e a própria infecção pelo H. pylori, além da arginase, está diretamente relacionada à inibição da função fagocítica de macrófagos e estímulo da atividade de linfócitos e neutrófilos com extensiva produção de ROS, afetando a transdução de sinais do epitélio da mucosa gástrica, com perda de função e formação de massas neoplásicas (KITAGAWA et al., 2012; BONACORSI et al., 2013; CHERDANTSEVA et al., 2014; LUNDBERG; GLADWIN; WEITZBERG, 2015). Baseado nisso e sabendo que a capacidade scavenger de compostos fenólicos parece ser um fator importante para a atividade gastroprotetora, o presente trabalho buscou avaliar a FM frente a diversos modelos oxidativos. Os resultados são mostrados na Tabela 12.

Tabela 12. Atividade antioxidante da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata sobre diferentes modelos oxidativos -1 (CI50 µg.mL ) • •+ •- DPPH ABTS O2 HOCl TauCl HRP 8,91 ± 8,81 ± 33,61 ± 8,30 ± 5,22 ± 20,84 ± FM 1,767 0,391 0,382 0,254 0,206 0,380 3,68 ± 0,68 ± 21,84 ± 0,72 ± 2,99 ± 4,46 ± Quercetina 0,193 0,016 0,477 0,041 0,295 0,058

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=3). Fonte: O autor. 84

O comportamento scavenger de uma substância frente ao radical DPPH• é considerado preliminar para a investigação de uma ação antioxidante. A FM testada mostrou uma CI50 de 8,91 ± 0,0001 µg.mL-1 (Tabela 13, Figura 13), abaixo das encontradas por Ashraf et al. (2015) e Basma et al. (2011) para as frações metanólicas das folhas de Euphorbia royleana e -1 -1 Euphorbia hirta (CI50 580 µg.mL e 803 µg.mL , respectivamente). Resultados similares foram reportados por Haq et al. (2012) para o extrato metanólico das raízes de Euphorbia -1 wallichii (CI50 8,4 µg.mL ). Bonacorsi et al. (2011) encontraram valores de CI50 para os extratos metanólicos das folhas de outras duas espécies de Euphorbiaceae, Alchornea glandulosa e Alchornea triplinervia, sendo eles 10 µg.mL-1 e 5,9 µg.mL-1, nessa ordem e comparativamente similares a encontrada para a FM, reforçando que os resultados encontrados neste trabalho vão de encontro àqueles apresentados pela literatura. Na investigação do potencial redutor de produtos naturais ou xenobióticos, é muito comum se iniciar com radicais modelo não pertencetes a organismos vivos, como é o caso do DPPH• e do ABTS•+. Assim, baseado na boa resposta dada pela FM frente ao radical DDPH•, outras metodologias in vitro foram utilizadas (VELLOSA, 2008).

Tabela 13. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o DPPH• Inibição (%) Concentração (mg.mL-1) FM Quercetina 0,05 96,1± 0,392 97,5 ± 0,250 0,02 95,6 ± 0,121 97,5 ± 0,349 0,01 63,7 ± 1,148 97,1 ± 0,249 0,005 56,6 ± 1,810 79,6 ± 2,238 0,002 46,7 ± 1,921 49,1 ± 3,480 0,001 32,5 ± 2,721 47,6 ± 0,509 0,0005 21,9 ± 0,727 38,9 ± 1,613 0,0002 13,1 ± 1,013 39,5 ± 2,106 0,0001 4,86 ± 0,502 37,4 ± 1,050

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=3). Fonte: O autor. 85

100 FM 80 Quercetina

60

40 Inibição (%) Inibição 20

0 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Concentração (mg.mL-1)

Figura 13. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o DPPH• 60 µM em etanol absoluto, λ = 531 nm. Fonte: O autor.

Os ensaios feitos em triplicata contra o ABTS•+ mostram que a FM deteve a mesma • eficiência de captura apresentada para o DPPH , representada pelos valores de CI50 muito -1 próximos. A quercetina apresentou valor de CI50 (0,68 µg.mL ) aproximadamente 13 vezes menor que o CI50 da FM (Tabela 12). Entretando, apesar dessa diferença o valor de CI50 da FM (8,81 ± 0,0004 µg.mL-1) pode ser considerado um bom resultado se comparado aos -1 encontrados por Gadamsetty et al. (2013), que obtiveram valores de CI50 de 55,25 µg.mL e 67,05 µg.mL-1 para os extratos acetato de etila e metanólico das folhas de Drypetes sepiaria (Euphorbiaceae). Tal potência da FM se confirma ao compararmos seu efeito ao apresentado pelo extrato metanólico das folhas de Ricinus communis (Euphorbiaceae), que para alcançar 95% de inibição sobre o radical precisou de 2500 µg.mL-1, ao passo que a FM precisou de 20 µg.mL-1 para obter 99,4 % de captura (Tabela 14, Figura 14) (NEMUDZIVHADI; MASOKO, 2014).

Tabela 14. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o ABTS•+ (CONTINUA) Inibição (%) Concentração (mg.mL-1) FM Quercetina 0,05 99,4 ± 0,183 98,9 ± 0,440 0,02 99,4 ± 0,270 99,8 ± 0,133 0,01 57,8 ± 1,274 99,9 ± 0,045 86

Tabela 14. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o ABTS•+ (FINAL) 0,005 32,2 ± 2,787 99,7 ± 0,092 0,002 24,1 ± 2,502 98,6 ± 0,706 0,001 7,17 ± 1,158 74,4 ± 1,478 0,0005 6,59 ± 1,409 39,8 ± 0,698 0,0002 7,51 ± 1,267 14,7 ± 2,619 0,0001 4,69 ± 1,432 -

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=3). Fonte: O autor. Além dos radicais modelo é necessário também fazer uso de métodos que envolvam espécie reativas que ocorram de fato no ambiente biológico. Nesse sentido, foi testado a atividade de captura da FM e da quercetina sobre o ânion superóxido (Tabela 15, Figura 15). •- O ânion superóxido (O2 ) é uma importante espécie reativa envolvida no dano causado às células. Considerado como ERO primária, é capaz de gerar derivados reativos pela interação direta com outras moléculas ou por meio de processos catalisados por metais ou enzimas, sendo também produzido pela respiração celular na mitocôndria. Sua neutralização se torna interessante à medida que esta espécie, assim como os radicais hidroxil, possui poderoso efeito deletério sobre o organismo e, por conseguinte esteja associado a diversos processos fisiopatológicos, incluindo os distúrbios gástricos e na exacerbação do oxidative burst em processos inflamatórios (FÉLIX-SILVA et al., 2014, VELLOSA, 2008).

100 FM 80 Quercetina

60

40 Inibição (%) Inibição 20

0 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Concentração (mg.mL-1)

Figura 14. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o ABTS•+ 7 mM em persulfato de potássio (2,46 mM), λ = 734 nm. Fonte: O autor. 87

Tabela 15. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da •- quercetina sobre o O2 Inibição (%) Concentração (mg.mL-1) FM Quercetina 0,1 67,5 ± 0,147 87,7 ± 0,925 0,05 54,7 ± 0,740 85,7 ± 1,651 0,02 10,3 ± 0,406 37,8 ± 1,968 0,01 - 11,5 ± 1,622

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=3). Fonte: O autor. Nesse propósito, a resposta obtida pela FM frente ao ânion superóxido foi de mesma magnitude que a vista para a quercetina (33,61 µg.mL-1 e 21,84 µg.mL-1) (Tabela 12) e pode ser considerada como intermédia, por exemplo, quando comparada a encontrada por Félix- Silva et al. (2014) para o extrato bruto e a fração residual aquosa das folhas de Jatropha -1 -1 gossypiifolia (Euphorbiaceae), com CI50 de 118 µg.mL e 25 µg.mL , respectivamente. Para a espécie envolvida nesse estudo Munhoz et al. (2014) observaram que a concentração de •- extrato bruto (EB) necessária para provocar 50% do efeito de captura sobre o O2 foi de 158,1 µg.mL-1, com 143,1 µg.mL-1 para o resveratrol, usado como padrão de comparação.

100 FM 80 Quercetina

60

40 Inibição (%) Inibição 20

0 0.00 0.05 0.10 Concentração (mg.mL-1)

•- Figura 15. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o O2 , NBT 68,4 µM, PMS 9,67 µM, NADH 118,5 µM em tampão fosfato de potássio (100 mM), λ = 560 nm. Fonte: O autor. A diferença entre os valores obtidos nesse trabalho e aqueles achados por Munhoz et al. (2014) para E. umbellata pode ser justificada pela concentração dos metabólitos secundários com características químicas semelhantes aos solventes de diferentes polaridades usados na semi-purificação do EB. Nesse caso, e assim como sugerido por Cechinel Filho; 88

Yunes (1997) para a fração butanólica, a FM seria capaz de separar flavonoides glicosilados, taninos, saponinas, carboidratos e compostos fenólicos em geral, notadamente substâncias com ação scavenger e que segundo Farzaei; Abdollahi; Rahimi (2015) podem ter seu consumo associado a redução do risco de doenças cardiovasculares, neurodegenerativas, diabetes, câncer, osteoartrite e avarias gastrintestinais. O ácido hipocloroso (HOCl) é um dos mais potentes oxidantes capaz de destruir microorganismos invasores, assim como também o faz com células adjacentes a sua produção. Esta ERO está presente em processos inflamatórios, podendo danificar tecidos ou até mesmo formar outros radicais livres (BONACORSI et al., 2013; MUNHOZ et al., 2014). Em seu trabalho Vellosa et al. (2006) já sugeriram que a ação antiúlcera de Maytenus aquifolium Mart. (Celastraceae) pode estar relacionada à sua excelente capacidade scavenger -1 contra HOCl (CI50 de 1,9 µg.mL ), também mostrada por Munhoz et al. (2014) para o extrato -1 bruto da casca de E. umbellata (CI50 de 1,14 µg.mL ) e o obtido para essa mesma planta no -1 presente trabalho com a fração metanólica (CI50 de 8,30 µg.mL ) (Tabela 12). Para esse mesmo modelo Picot; Subratty; Mahomoodally (2014) encontração valores de CI50 de 203,5 µg.mL-1 e 161,14 µg.mL-1 para as frações metanólicas das folhas de Stillingia lineata Lam. (Euphorbiaceae) e Antidesma madagascariensis Lam. (Euphorbiaeceae), respectivamente. Também se nota a ação scavenger da amostra em estudo quando se compara a inibição proporcionada pela FM àquela obtida por Hazra; Biswas e Mandal (2008), que relataram um -1 CI50 de 235,95 ± 6,26 µg.mL para o ácido ascórbico (Tabela 16, Figura 16).

Tabela 16. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o HOCl (CONTINUA) Inibição (%) Concentração (mg.mL-1) FM Quercetina 0,05 99,4 ± 0,128 98,7 ± 0,254 0,02 97,7 ± 0,600 98,4 ± 0,217 0,01 61,2 ± 2,280 98,1 ± 0,089 0,005 48,5 ± 2,832 98,2 ± 0,294 0,002 16,8 ± 1,198 97,8 ± 0,833 0,001 14,5 ± 1,872 92,1 ± 0,536 0,0005 26,9 ± 2,951 54,5 ± 1,301 0,0002 18,1 ± 2,384 52,3 ± 2,823 89

Tabela 16. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o HOCl (FINAL) 0,0001 15,6 ± 2,820 44,7 ± 1,468

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=3).

Fonte: O autor.

100 FM 80 Quercetina

60

40 Inibição (%) Inibição 20

0 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Concentração (mg.mL-1)

Figura 16. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre o HOCl (30 mM) em tampão fosfato de sódio (50 mM),pH 7,4, λ = 652 nm. Fonte: O autor. Além do exposto, sabe-se que o HOCl proveniente da ativação de neutrófilos reage com aminas como a amônia (NH3), a qual está presente e altas quantidades no estômago de pacientes infectados com o H. pylori, para gerar monocloroamina (NH2Cl), e que esta possui tantos efeitos deletério quanto o seu precursor clorado, em especial na patogênese de úlceras gástricas, uma vez que provocam irritação da mucosa do estômago e dificultam o processo de cicatrização de úlceras estabelecidas (KATO et al., 2002). A taurina é um β-aminoácido abundantemente distribuído nos neutrófilos e, portanto um alvo fácil de ataque para o HOCl, formando o produto Taurina cloramina (TauCl) (Figura 17).

- - ClO + R-NH2 R-NHCl + HO (Taurina) (Cloramina)

HOCl + R-NH2 R-NHCl + H2O (Taurina) (Cloramina)

Figura 17. Reações de formação da TauCl pela combinação de HOCl proveniente de neutrófilos ativos e do aminoácido taurina, presente nessas mesmas células. Adaptado de VELLOSA, J. C. R. Estudo bioquímico do efeito de alguns flavonóides de Pterogyne nitens Tulasne (Fabaceae) em processos oxidativos: sistema modelo “químicos”, “enzimáticos” e “celulares”. 2008. p. 116. Tese (Doutorado). Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2008.

90

Nesse sentido, confrontou-se a capacidade scavenger da FM sobre a TauCl. Os resultados mostraram boa atividade dessa fração em comparação a do padrão quercetina (Tabela 12), de acordo com o que reportaram Vellosa et al. (2015) para este mesmo flavonoide. A concentração de 0,1 µg.mL-1 da FM foi capaz de inibir 35,3% das espécies TauCl e a maior concentração usada (50 µg.mL-1) inibiu 97,3% (Tabela 17, Figura 18).

Tabela 17. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre a TauCl Inibição (%) Concentração (mg.mL-1) FM Quercetina 0,05 97,3 ± 0,099 98,9 ± 0,038 0,02 96,1 ± 0,327 98,6 ± 0,135 0,01 84,1 ± 3,182 90,5 ± 1,404 0,005 65,8± 1,256 83,9 ± 0,585 0,002 43,6± 3,581 69,0 ± 5,012 0,001 38,8 ± 2,535 51,6 ± 2,150 0,0005 34,5 ± 5,265 60,6 ± 2,867 0,0002 35,3 ± 2,356 49,4 ± 2,408 0,0001 35,3 ±1,821 46,5 ± 1,794

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=3). Fonte: O autor.

100 FM 80 Quercetina

60

40 Inibição (%) Inibição 20

0 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Concentração (mg.mL-1)

Figura 18. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre a TauCl em tampão (50 mM) λ = 652 nm. Fonte: O autor.

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Também é importante salientar que o HOCl é produzido enzimaticamente por meio da - oxidação dos íons cloreto (Cl ) na presença de H2O2 pela enzima mieloperoxidase, localizada nos grânulos azurófilos dos neutrófilos. As enzimas peroxidases são encontradas tanto em animais como em vegetais, sendo que a peroxidase proveniente de raiz de rábano silvestre, ou simplesmente HRP, é frequentemente usada em modelos analíticos e bioquímicos por manter uma resposta estável por longos períodos de tempo a temperatura ambiente e em um amplo intervalo de pH, tendo ainda um custo financeiro relativamente baixo, sendo encontrada comercialmente em diversos graus de pureza (KHALIL, 2002; ULIANA; RICCARDI; YAMANAKA, 2008; VELLOSA, 2008). Por este motivo empregou-se o modelo enzimático de catálise da oxidação do guaiacol por HRP em presença de seu cofator H2O2 para testar o poder inibitório da FM sobre a enzima peroxidase. A metodologia apresenta como resposta a cinética de oxidação do fenólico em 10 segundos de reação. Esse tempo foi estimado laboratorialmente por se tratar do período onde há linearidade da velocidade com o tempo tendendo a zero. Para realização desse ensaio os parâmetros cinéticos de oxidação do guaiacol na ausência de inibidores foram: a = 0,01986 e b = 0,2499, com R2 de 0,999, sendo que o valor da tangente (y = ax + b) é usado então para o cálculo da porcentagem de inibição das amostras sobre a enzima. -1 A FM obteve CI50 20,84 µg.mL , valor este próximo ao apresentado pela quercetina (4,46 µg.mL-1) (Tabela 11), porém seu range de ação produziu menor inibição máxima, 65,6 % e 83,7 %, respectivamente (Tabela 18, Figura 19).

Tabela 18. Ação scavenger da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e da quercetina sobre a oxidação do guaiacol por peroxidase modelo (HRP) Inibição (%) Concentração Concentração FM Quercetina (mg.mL-1) (mg.mL-1) 0,100 65,6 ± 0,102 0,015 83,7 ± 0,430 0,070 65,5 ± 0,151 0,013 81,3 ± 1,097 0,050 64,5 ± 0,177 0,007 70,9 ± 1,235 0,020 35,9 ± 0,483 0,005 55,3 ± 0,436 0,010 21,1 ± 0,472 0,002 28,5 ± 1,125 0,005 10,5 ± 0,525 0,001 15,5 ± 1,295

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (n=3). Fonte O autor.

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80 FM

100 60 Quercetina 80

40 60

40 Inibição (%) Inibição Inibição (%) Inibição 20 20 0 0.000 0.005 0.010 0.015 0 Concentração (mg.mL-1) 0.00 0.05 0.10 Concentração (mg.mL-1)

Figura 19. Inibição da HRP (7 nM) na presença da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata e quercetina, guaiacol (2 nM) e H2O2 (0,1 mM), em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4, 37 °C, leitura a cada 15s por 40s em λ = 470 nm. Fonte: O autor. Em continuidade, o HOCl formado em sítios inflamatórios tem a capacidade de inativar as propriedades antioxidantes de enzimas como a catalase (CAT) através da quebra do grupamento prostético ativo, o que leva a caracterizar compostos com ação antioxidante como tendo boa empregabilidade em situações como esta. Além disso, a CAT também faz parte do sistema antioxidante de eritrócitos (encontrada principalmente nos peroxissomos) e sua ativação exagerada pode causar toxicidade (VASCONCELOS et al., 2007; HAZRA; BISWAS; MANDAL, 2008; FLORA, 2009). Dessa maneira buscou-se caracterizar o efeito da FM por meio da quantificação da atividade da CAT avaliada pelo consumo de H2O2 por minuto tanto no tecido do estômago como em eritrócitos de ratos tratados previamente com etanol. A atividade da enzima nas amostras da região glandular do estômago dos animais do grupo controle negativo (salina, 0,5 mL.100g-1) tratados previamente com etanol via oral foi -1 -1 -1 de 0,6743 ± 0,09 µmolH2O2.min .mg tecido . Os tratamentos com a FM (200 mg.Kg , -1 -1 -1 0,6032 ± 0,08 µmolH2O2.min .mg tecido ) e carbenoxolona (200 mg.Kg , 0,5802 ± 0,07 -1 -1 µmolH2O2.min .mg tecido ) não mostraram diferença significativa em relação ao grupo tratado com salina (Figura 20). Da mesma forma, para os eritrócitos não houve diferença -1 -1 relevante entre os tratamentos (FM, 14,61 ± 1,65 µmolH2O2.min .mL eritrócitos ; -1 -1 carbenoxolona, 16,31 ± 1,68 µmolH2O2.min .mL eritrócitos e salina, 15,26 ± 1,35 -1 -1 µmolH2O2.min .mL eritrócitos ) (Figura 21). 93

Figura 20. Efeito dos tratamentos via oral salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) e carbenoxolona (CARB, 200 mg.Kg-1) sobre a decomposição de H2O2 pela enzima catalase em amostras do estômago de ratos tratados previamento com etanol (0,5 mL.100g-1). Os resultados foram expressos como micromol de H2O2 por minuto por miligrama de tecido. As colunas e barras representam as médias ± erro padrão da média (n=7). ANOVA de uma via seguido de Newman-Keuls. Não houve diferença estatística. Fonte: O autor.

Figura 21. Efeito dos tratamentos via oral salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) e carbenoxolona (CARB, 200 mg.Kg-1) sobre a decomposição de H2O2 pela enzima catalase em amostras de eritrócitos de ratos tratados previamento com etanol (0,5 mL.100g-1). Os resultados foram expressos como micromol de H2O2 por minuto por mililitro de eritrócitos. As colunas e barras representam as médias ± erro padrão da média (n=7). ANOVA de uma via seguido de Newman-Keuls. Não houve diferença estatística. Fonte: O autor.

A administração aguda de etanol em altas concentrações causa aumento extensivo na produção de ERO, dentre eles o H2O2 que é decomposto pela CAT em H2O e O2 (VASCONCELOS et al., 2007). Dessa forma, assume-se a probabilidade de que compostos ou substâncias com potencial antioxidante possam atuar na captura das ERO geradas, diminuindo a atividade enzimática da CAT, como é mostrado pelos trabalhos de Potrich (2009) e Shimoyama et al. (2013) em modelos de indução de úlcera experimental . Por outro lado, Sravanthi et al. (2015) e Begum et al. (2014) demonstram que houve aumento na atividade da CAT após o tratamento com o extrato acetato de etila das flores de Euphorbia milli (200 e 400 mg.Kg-1) e com o extrato bruto das partes aéreas de Euphorbia prostrata (60, 120 e 240 mg.Kg-1), respectivamente. Nessa linha, a hipótese é de que a criação de um 94

ambiente de inflamação levaria ao acúmulo celular de espécies reativas que causaria prejuízo na função dessa enzima. Apesar disso, os resultados de atividade de CAT encontrados para o tratamento com a FM de E. umbellata não mostraram aumento ou diminuição de ação enzimática comparado ao grupo tratado com o veículo, apontando que o mecanismo principal da FM não envolve as ações da CAT nas matrizes biológicas estudadas. Outro aspecto importante e que vem ganhando destaque em ensaios antiúlcera diz respeito à manutenção de níveis de glutationa (GSH) favoráveis à ação antioxidante desse tiol não proteico encontrado em abundância nas células de mamíferos. A GSH parece ter papel mecanístico importante na gastroproteção, especialmente quando se mostra que seus quelantes (como o N-ethylmaleimide, NEM) são capazes de conter qualquer forma de proteção. Ademais, o etanol causa depleção dose-dependente dos níveis de glutationa da mucosa gástrica (SZABO, 2014). Seguindo essa proposta, dosaram-se os níveis de GSH, ou grupamentos sulfidrílicos não protéicos (SH-NP), da mucosa de ratos tratados com etanol via oral. A administração da FM (200 mg.Kg-1) não foi capaz de elevar os níveis de SH-NP do tecido estomacal de ratos se comparado ao grupo controle negativo (salina, 0,5 mL.100g-1), sendo que a média para os grupos foi de 178,8 ± 18,45 µg SH-NP.g tecido-1 e 172,4 ± 19,81µg SH-NP.g tecido-1, nessa ordem. A carbenoxolona (200 mg.Kg-1), por sua vez, aumentou expressamente as quantidades desse tiol (249,9 ± 10,68 µg SH-NP.g tecido-1), com elevação de 39% no conteúdo de SH-NP em relação aos outros grupos (Figura 22).

Figura 22. Efeito dos tratamentos via -1 oral salina (SAL, 0,5 mL.100g ), fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) e carbenoxolona (CARB, 200 mg.Kg-1) sobre a quantidade de grupamentos antioxidantes sulfidrílicos não protéicos ou não enzimáticos (SH-NP) no tecido do estômago de ratos tratados -1 previamento com etanol (0,5 mL.100g ). Os resultados foram expressos como micrograma de SH-NP por grama de tecido. As colunas e barras representam as médias ± erro padrão da média (n=7). ANOVA de uma via seguido de Newman -Keuls. * significa P < 0,05, comparado ao grupo controle negativo (SAL); # significa P < 0,05, comparado ao grupo tratado com FM. Fonte: O autor.

95

Dessa maneira, obteve-se que a FM não é capaz de produzir aumento sustentado desse antioxidante endógeno, diferentemente do que acontece com a carbenoxolona, já reportado por vários autores (REYES-TREJO et al., 2008; CHÁVEZ-PIÑA et al., 2009; SHIMOYAMA et al., 2013). Resultado semelhante foi encontrado por Rozza et al. (2011), mostrando que o efeito gastroprotetor do extrato clorofórmico das cascas de Croton cajucara Benth. não atua por esta via antioxidante. Já outros trabalhos relatam que outras espécies do gênero Euphorbia, como a E. tirucalli, são capazes de alterar os níveis de GSH, seja diretamente aumentando a proporção desse tiol, ou secundariamente por diminuir a produção de espécies oxidantes (JYOTHI et al., 2008; SHARMA et al., 2012; SRAVANTHI et al., 2015). Entretanto, deve-se levar em conta que tais estudos fizeram a quantificação em amostras de fígado (reservatório abundante, com mais de 10 mM de GSH por hepatócito), que não foi avaliado no presente trabalho (HUBER; ALMEIDA; FÁTIMA, 2008). Nessa mesma linha, o mecanismo antioxidante proporcionado pela glutationa envolve componentes proteicos, representados pela glutationa oxidase (GO), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GST). As duas primeiras catalisam a oxidação de GSH em dissulfeto de glutationa (GSSG) enquanto que a GR é responsável pela regeneração de GSH a partir de GSSH. As GSTs catalisam a ação de GSH sobre compostos como haletos de alquila, epóxidos, quinonas, aldeídos, cetonas, lactonas, ésteres, entre outros. (VASCONCELOS et al., 2007; HUBER; ALMEIDA; FÁTIMA, 2008). Desse modo, foi feita a determinação de grupos sulfidrílicos totais no soro de ratos tratados com etanol e FM ou carbenoxolona. Como resultado tanto a FM quanto o controle positivo usado causaram aumentos significativos (141% e 105%, respectivamente) na concentração total dos tiois quando comparados ao grupo tratado apenas com veículo (Figure 23).

Figura 23. Efeito dos tratamentos via oral salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) e carbenoxolona (CARB, 200 mg.Kg-1) sobre a quantidade de grupamentos sulfidrílicos totais (SH-T) no soro de ratos tratados previamento com etanol -1 (0,5 mL.100g ). Os resultados foram expressos como micromol de SH-T por mililitro de soro. As colunas e barras representam as médias ± erro padrão da média (n=5). ANOVA de uma via seguido de Newman-Keuls. * significa P < 0,05, comparado ao grupo controle negativo (SAL). Fonte: O autor.

96

A partir desses dados é possível inferir que o mecanismo da FM possivelmente esteja atrelado aos componentes proteicos da via catalítica da glutationa, já que na quantificação de NP-SH não foi visto aumento significativo para o grupo tratado com essa fração. É evidente que tal ação deva ser mais bem investigada, porém esse resultado traça um perfil promissor da FM sobre as defesas enzimáticas, reforçado pelo fato da isoforma GPx 2 ser encontrada especificamente no trato gastrintestinal (VASCONCELOS et al., 2007). Esse comportamento já foi observado por Sharma et al. 2012 e Sravanthi et al. 2015 para o extrato hidroetanólico das folhas de Euphorbia neriifolia e acetato de etila das flores de Euphorbia milii, repectivamente. Essas espécies foram capazes de recompor os níveis de GST e GPx em tecido hepático de camundongos. Em conjunto, todos os resultados acima discutidos permitem dizer que a FM das cascas de E. umbellata possui bons mecanismos antioxidantes que fundamentariam sua aplicação como tal. Ainda assim, o que se espera de um bom scavenger é que este seja capaz de neutralizar a maior quantidade possível de oxidantes para que se obtenha sucesso na esfera biológica de ação. Dessa forma, buscou-se verificar a influência do tratamento com a FM sobre o perfil antioxidante do soro de ratos que foram expostos ao etanol concentrado. Como já abordado anteriormente, esse álcool produz severo decaimento das reservas antioxidantes do organismo animal, reduzindo também assim sua capacidade de captura sobre o radical ABTS•+. De forma satisfatória, o grupo tratado com a FM produziu 60,42 % de inibição sobre o radical estável. Um aumento de 7,46 % comparado ao grupo que não recebeu tratamento (Figure 24).

Figura 24. Porcentagem de inibição do soro de ratos tratados com salina (SAL, 0,5 mL.100g-1), fração metanólica das cascas Euphorbia umbellata (FM, 200 mg.Kg-1) e carbenoxolona (CAR, 200 mg.Kg-1) sobre o radical ABTS•+. As colunas e barras representam as médias ± erro padrão da média (n=7). ANOVA de uma via seguido de Newman-Keuls. ** significa P < 0,01, comparado ao grupo controle negativo (SAL). Fonte: O autor.

97

Esse resultado deve ser considerado, por exemplo, ao lhe confrontarmos com os de Manente (2013) que não observou aumento do comportamento scavenger sobre o ABTS•+ a partir do soro de ratos tratados com hesperidina, anfotericina B ou a associação de ambas. Cabe dizer que o tratamento oral com a FM foi feito de forma aguda, em dose única, já aquele feito no estudo citado acima foi feito de forma sub-crônica, uma vez ao dia durante 5 dias. Begum et al. (2014) também observaram aumento da capacidade antioxidante total do soro de ratos tratados com o extrato bruto das partes aéreas de Euphorbia prostrata, utilizando modelo experimental de úlcera induzido por indometacina. Em outro estudo Hamauzu et al. (2006) reportaram que houve diminuição de hemólise do sangue coletado de ratos que foram tratados com fração rica em polifenois das frutas do marmeleiro (Cydonia oblonga). Com base nesses resultados e apoiado na boa resposta obtida pela FM nos modelos de úlcera, uma investigação foi feita no sentido de se caracterizar a composição química dessa fração, uma vez que diversos estudos têm mostrado a presença de compostos fenólicos em espécies de Euphorbia (AGATA et al., 1991; AMAKURA; YOSHIDA, 1996; ABDULLADZHANOVA; MAVLYANOV; DALIMOV, 2003; ANDERSEN et al., 2010; HAQ et al., 2012; AWAAD et al., 2013b; GU et al., 2013; NUGROHO et al., 2014; SHARMA; JANMEDA, 2014; SONG et al., 2014). Para esta análise utilizou-se um equipamento de cromatografia líquida de ultra eficiência acoplado a um detector de massas (Ultra-High-Performance Liquid Chromatography quadrupole Time Of Flight Mass Spectrometry, UHPLC-QToF-MS). Foi usado um modo gradiente de eluição para que a maior quantidade de picos em uma ampla faixa de polaridade pudesse ser detectada. Além disso, a adição de ácido fórmico 0,1 % às fases móveis aplicadas é desejável uma vez que auxilia na separação de substâncias com hidrogênios ionizáveis (ácidos carboxílicos, fenois, álcoois), proporcionando ganho na resolutividade das bandas cromatográficas. A escolha do comprimento de onda de 254 nm também se justifica por ser mais sensível que outros comprimentos de onda para a detecção de flavonoides, ácidos fenólicos e taninos de maneira simultânea (VASCONCELOS et al., 2010; MUNHOZ et al., 2014; NUGROHO et al., 2014). Após a separação, os diferentes compostos foram identificados por meio de um detector de massas com analisador QToF e interface de ionização eletrospray (ESI) de alta exatidão. Com isso as massas (m/z) das substâncias foram calculadas, sendo que a comparação ao valor obtido experimentalmente, com nível de precisão centesimal, permite a sua confirmação, assim como a correlação dos valores obtidos com litetura científica. Em 98

modo negativo (–)-ESI-MS o espectro de massas dos picos cromatográficos mostra moléculas desprotonadas [M – H]- e protonadas [M – H]+ em modo positivo (+)-ESI-MS. A partir da análise da FM por LC-MS foi possível a aquisição do perfil cromatográfico dessa fração (Figura 25). As substâncias identificadas e listadas na Tabela 19 são relatadas pela primeira vez na espécie Euphorbia umbellata. Trata-se de compostos derivados do ácido hidroxibenzóico, ácidos orgânicos e flavonoides (flavonol), bem como taninos hidrolisáveis (Figura 26), sendo que o etil-galato (pico nº 9, Figura 25) é o componente majoritário da FM. Apesar disso, a substância nº 16 não pode ser completamente caracterizada, pois seu perfil de fragmentação não gerou informações suficientes para sugestão de uma estrutura química.

*

Figura 25. Perfil cromatográfico representativo dos compostos fenólicos presentes na FM de E. umbellata em 254 nm obtido por UHPLC-QToF-MS de acordo com o tempo de retenção. Os números indicam as substâncias identificadas (ver Tabela 19).*A substância número 16 não pode ser identificada pelo método usado. Fonte: O autor.

Tabela 19. Dados de espectrometria de massas obtidos a partir da FM de Euphorbia umbellata (CONTINUA) Tempo m/z m/z de Fórmula Teórica Experimental Subtância Pico Fragmento retenção molecular [M+H]+ [M+H]+ identificada (min) [M-H]- [M-H]-

C13H16O10 333,0816 333,0817 1 2,2 - Glucogalina1 (332,0743) 331,0671 331,0667 99

Tabela 19. Dados de espectrometria de massas obtidos a partir da FM de Euphorbia umbellata (CONTINUA)

C26H32O20 333,0816 333,0817 2 2,3 - Glucogalina (dímero)1 (663,1487) 663,1414 663,1400

C7H6O5 171,0288 171,0288 3 3,1 - Ácido gálico2 (170,0215) 169,0142 169,0137

C34H24O22 785,0832 785,0837 4 6,6 633,0728 Casuarina3 (784,0759) 783,0686 783,0686

C8H8O5 185,0444 185,0444 5 8,8 183,0286 Metil-galato4 (184,0372) 183,0299 183,0291

C20H20O14 485,0926 485,0916 6 9,8 - 1,6-Di-O-galoil- (484,0853) 483,0780 483,0774 glucose4

C27H22O18 635,0879 n.d. 7 13,8 - Corilagina4 (634,0806) 633,0733 633,0732

C20H16O13 465,0664 465,0663 303,0135 8 15,3 Ácido elágico-glucose5 (464,0585) 463,0518 463,0508 197,0457

C9H10O5 199,0601 199,0601 9 15,7 - Etil-galato6 (198,0528) 197,0455 197,0455

C34H22O22 783,0675 783,0680 10 16,6 - Emblicanina A7 (782,0597) 781,053 n.d.

Geranina/ Granatina B/ C41H28O27 953,0891 953,0874 197,0445 11 16,8 Carpinusina/ Euphorscopina/ (952,0818) 951,0745 951,0737 300,9982 Ácido gerânico/ Helioscopinina A/ Plylantusina A8 100

Tabela 19. Dados de espectrometria de massas obtidos a partir da FM de Euphorbia umbellata (CONTINUA)

C14H6O8 303,0135 303,0135 12 21,0 - Ácido elágico4 (302,0063) 300,999 300,9962

C28H24O16 617,1137 617,1124 Quercetina-galoil- 13 21,2 193,0492 galactosídeo9 (616,1059) 615,0992 615,0975

Geranina/ Granatina B/ C41H28O27 953,0891 953,08792 14 21,7 - Carpinusina/ Euphorscopina/ (952,0817) 951,0745 951,0738 Ácido gerânico/ Helioscopinina A/ Plylantusina A8

C21H20O12 465,1028 465,1028 15 22,2 303,0488 Isoquercetrina4 (464,0955) 463,0882 n.d.

C41H24O17 789,1086 n.d. 16 22,5 300,9979 Não identificado (788,1013) 787,0941 787,0993

C21H18O12 463,0871 463,0849 17 23,3 - Ácido elágico- (462,0798) 461,0725 461,0708 dimetóxi-xilose4

C15H12O8 321,0605 321,0586 18 23,7 - Dihidromiricetina10 (320,0532) 319,0459 319,0447

C20H18O11 435,0922 435,0921 19 24,2 303,0485 Quercetina-3-O- (434,0844) 433,0776 n.d. arabinopiranose11

C17H20O14 449,0926 449,0947 Ácido málico-galoil- 20 24,8 303,0494 (448,0853) 447,0778 447,0789 hexose11

Geranina/ Granatina B/ C41H28O27 953,0891 953,0874 300,9983 Carpinusina/ Euphorscopina/ 21 25,7 (952,0818) 951,0745 951,0737 Ácido gerânico/ Helioscopinina A/ Plylantusina A8 101

Tabela 19. Dados de espectrometria de massas obtidos a partir da FM de Euphorbia umbellata (CONTINUA)

C21H20O11 449,1078 449,1071 22 26,1 303,0491 Quercetrina12 (448,1) 447,0933 447,0922

C21H20O10 433,1129 433,1120 23 28,2 287,0544 Campferol- (432,1051) 431,0984 n.d. ramnosídeo13

C22H20O12 477,1028 477,1016 Ácido elágico- 24 28,3 - (476,0949) 475,0882 n.d. dimetóxi-ramnosídeo14 m/z: razão massa/carga; n.d.: não determinado 1 AHN et al., 1995; 2 JAHAN et al., 2013; 3 LEE et al., 1990; 4 PFUNDSTEIN et al., 2010; 5 FRACASSETTI et al., 2013; 6 RAMANANDRAIBE et al., 2008; 7 NAZEEM et al., 2014; 8 ELENDRAN et al., 2015; 9 YANG et al., 2011; 10 CHATURVEDULA; HUANG, 2013; 11 ABU-REIDAH et al., 2015; 12 ZHANG et al., 2014; 13 SHARAF; EL-ANSARI; SALEH, 1997; 14 SIRAT; REZALI; UJANG, 2010. Fonte: O autor.

Figura 26. Estruturas das substâncias identificadas da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata. Parte 1.

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Figura 26. Estruturas das substâncias identificadas da fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata. Parte 2. Fonte: O autor. De acordo com os dados encontrados para as subtâncias números 11, 14 e 21 obtiveram-se as possíveis estruturas: Geranina/ Granatina B/ Carpinusina/ Euphorscopina/ Ácido gerânico/ Helioscopinina A/ Plylantusina A, sendo que todas possuem fórmula molecular C41H28O27 e pico do íon molecular com m/z 952,0818. Trata-se de isômeros, ou seja, são substâncias que apesar de terem a mesma fórmula molecular possuem organização 103

estrutural diferente. Assim sendo, outras técnicas como QToF-MS/MS seriam necessárias para a identificação mais precisa, uma vez que permitem um novo perfil de fragmentação a partir de fragmentos pré-selecionados. A literatura reporta que flavonoides, especialmente aqueles com grupo catecol como a quercetina e derivados, podem estar relacionados à atividade antiulcera. No mesmo sentido, não somente os flavonoides mostram-se ativos no combate à úlcera, mas também polifenólicos provenientes de ácido gálico são reconhecidos por sua capacidade antioxidante, que também pode estar relacionada a mecanismos de gastroproteção (HIRUMA-LIMA et al., 2006; MOTA et al., 2009; VASCONCELOS et al., 2007, FARZAEI; ABDOLLAHI; RAHIMI, 2015). Dessa forma, o ácido gálico e demais compostos derivados deste metabólito, que estão presentes na FM, previniu o dano e melhorou a cicatrização da mucosa gástrica em modelo induzido por indometacina, além de aumentar o débito de óxido nítrico (NO). No mesmo sentido, a quercetina possui diversos mecanismos de gastroproteção, muito baseado em suas propriedades antioxidantes, mostrando redução de marcadores de lipoperoxidação no estômago (50 mg.Kg-1, i. p.) como também ações dependentes de NO, sendo que na dose de 100 mg.Kg-1 (v. o.) foi capaz de estimular a atividade de nNOS, podendo se relacionar à inibição da proliferação celular observada. A quercetina-3-O-β-D-glucoropiranosídeo foi responsável em previnir a lesão induzida por indometacina de maneira dose dependente, sendo que segundo Min et al. (2009) o poder gastroprotetor, antisecretor e antioxidativo desse derivado glicosilado foi significativamente maior do que a sua aglicona. Outro flavonoide glicosilado, o campferol-3-glicosídeo (100 mg.Kg-1, v. o.), isolado de Euphorbia granuleta Forssk, apresentou 71,6 % de proteção em modelo de colite ulcerativa induzida por ácido acético em ratos. Esse efeito pode ser explicado pela diminuição da expressão de TNF-α (citocina pró-inflamatória), além da diminuição de malondialdeído, produto da oxidação de lipídeos. Song e colaboradores (2014) determinaram a concentração dos polifenólicos presentes na espécie Euphorbia supina (3352,9 ± 2,8 mg.Kg-1 de material vegetal fresco) sendo que os derivados glicosilados da quercetina e campferol compuseram 84,8 % desse total. Esse dado mostra que espécies de Euphorbia são ricas nesse tipo de composto, podendo ser efetivas no manejo de condições em que há formação excessiva de ROS, como na úlcera péptica (KLEIN-JÚNIOR et al., 2012; AWAAD et al., 2013; FARZAEI; ABDOLLAHI; RAHIMI, 2015). O ácido elágico tem recebido atenção especial devido a suas potencialidades na prevenção de doenças crônicas. Estudos mostram suas habilidades como antioxidante, 104

anticancer, antimutagênico, anti-inflamatório e antimicrobiano (VATTEM; SHETTY, 2005; AGGARWAL; SHISHODIA, 2006; DEVIPRIYA et al., 2007; ROGERIO et al., 2008). Também tem sido associado a essa substância uma potencial proteção contra lesão gástrica. Beserra et al. (2011) observaram que o tratamento com ácido elágico (3–30 mg.Kg-1, v.o.) foi capaz de preservar os níveis de NP-SH da mucosa gástrica de ratos submetidos ao tratamento com etanol, assim como os mecanismos protetores envolvem a participação do NO e modulação dos níveis de TNF-α (fator de necrose tumoral alfa) e LTB4 (leucotrieno B4). Os taninos hidrolisáveis compõem um grupo de susbtâncias formados por elagitaninos (ésteres de ácido elágico) e galotaninos (ésteres de ácido gálico). Estes compostos têm ganhado destaque em pesquisas devido à variabilidade de ações biológicas que desempenham (KIM et al., 2009; YANG; LIU, 2013). Como agentes gastroprotetores são capazes de agir diretamente na inibição da bomba de H+/K+ ATPase, atuam como antioxidantes, formam uma camada protetora por interação com mucina e são inibidores de enzimas como a pepsina (KHENNOUF et al., 2003). Sob este apecto, parte dos efeitos gastroprotetores observados para a FM de E. umbellata pode ser devido a presença dos taninos, em especial no modelo de injúria por etanol que envolve principalmente efeitos lesivos no local de contato do agente necrotizante. Além disso, condições ácidas como as encontradas no estômago (pH < 4) levam à precipitação de complexos formados por taninos pela diminuição da sua solubilidade quando estes encontram-se no trato gastrintestinal (OZDAL; CAPANOGLU; ALTAY, 2013; JAKOBEK, 2015). A interação de taninos com macromoléculas biológicas como carboidratos, lipídeos e proteínas também é importante, podendo tais complexos funcionar como inibidores da peroxidação lipídica, como proteção à inativação das propriedades antioxidantes dos derivados fenólicos e também como microcarreadores dessas substâncias ativas a porções menores do trato gastrintestinal. Além disso, a estabilidade térmica de enzimas como a superóxido dismutase é melhorada após interação com compostos fenólicos, como resultado do aumento da sua energia de ativação (OZDAL; CAPANOGLU; ALTAY, 2013; JAKOBEK, 2015). É verdade que para se obter ações sistêmicas as moléculas ativas devem ser absorvidas e metabolizadas. Nesse sentido a microflora presente no trato gastrintestinal exerce função importante ao degradar complexos poliméricos de alto peso molecular, que então podem ser absorvidos como moléculas menores de ácidos fenólicos. A absorção de derivados glicosilados é baixa devido à natureza hidrofílica que possuem, contudo as aglicona podem 105

ser liberadas pela clivagem feita pela microflora e assim flavonois como a quercetina e o campferol podem ser assimilados (GALATI et al., 2003; HAMAUZU et al., 2006). Dessa forma, a identificação dos polifenois e derivados ativos na FM bem como os bons resultados alcançados nos modelos de úlcera por indometacina e o aumento na capacidade antioxidante total do soro dos animais tratados com essa fração dão indicativos de que as propriedades gastroprotetoras de FM aconteçam não somente como um componente não-absorvível de alta capaxidade antioxidante de ação local, mas também o sejam por meio de efeitos sistêmicos pós-absorção. Apoiado nisso o presente trabalho propôs um screening da FM de tal forma que se pode assumir a possibilidade dessa fração contribuir positivamente na gastroproteção contra o dano produzido pelo etanol e a indometacina. Do mesmo modo, buscou-se elucidar quais os principais mecanismos antiulcerogênicos envolvidos, seu papel na manutenção do estado redox celular bem como abrir portas para novas investigações sobre tal importância que de fato se mostrou salutar. Por fim, conclui-se que a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata se apresenta com um espectro de alcance bastante amplo, interessante ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para a prevenção e tratamento de úlceras gástricas (Figura 27). 106

Figura 27. Possíveis mecanismos inseridos na ação gastroprotetora da fração metanólica (FM) das cascas de Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns (Euphorbiaceae) em modelos de úlcera in vivo induzidos por etanol e anti- inflamatório não esteroidal (AINE) e modelos in vitro (antioxidante, antimicrobiano e anti-urese). Os elementos em laranja significam os possíveis alvos da FM. O envolvimento de prostaglandinas (PG) é capaz de garantir a diminuição da aderência de polimorfonucleados (PMN), produzir vasodilatação, ativar canais de potássio (K+), aumentar defesas como a produção de muco e diminuir a produção de ácido pela bomba H+/K+ ATPase. As PG também diminuem a produção de citocinas e ativação dos PMN, com conseguente controle da produção excessiva de óxido nítrico (NO) pela óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e menor conversão de peroxinitritos - •- •- (ONOO ), catalisados pela reação entre NO em excesso e ânion superóxido (O2 ). Aliás, o O2 é usado na formação de peróxido de hidrogênio (H2O2), que por sua vez é o substrato da enzima glutationa peroxidase gastrintestinal (GPx2), na presença do cofator glutationa (GSH), para neutralização em água (H2O) e dissulfeto de glutationa (GSSG).O NO derivado da eNOS das células do trato gastrintestinal também pode estar envolvido na ativação da guanilato ciclase solúvel (GCs), com síntese de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP). Este último por sua vez, ativa canais de K+ que possuem, entre outras funções, gerar relaxamento da musculatura lisa de vasos e contribuir na vasodilatação. A FM também se mostrou eficiente em bloquear enzimas peroxidase, como a mieloperoxidase, que são responsáveis pela produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), como o - ácido hipocloroso (HOCl), na presença de íons cloro (Cl ) e H2O2. Além disso, o HOCl, em contato com amônia + iônica (NH4 ), produzida pela urease (bolas em laranja) da Helicobacter pylori, pela catálise de ureia (CO(NH2)2) biologicamente disponível no trato gastrintestinal (TGI), gera as cloraminas, como a monocloroamina (NH2Cl). Por fim, a FM quando administrada via oral também foi capaz de aumentar o status antioxidante do soro dos animais, obtido pelo aumento da captura do radical ABTS•+, assim como pode ter sido responsável pela formação de uma camada protetiva local de alto poder antioxidante, reforçado pelos resultados histológicos e pela análise química obtida de MF, a partir da qual foi possível a identificação de diveras classes de compostos fenólicos. Os desenhos e escalas são meramente ilustrativos. Fonte: O autor. 107

CONCLUSÃO 110809

6 CONCLUSÃO De acordo com os resultados obtidos nesse trabalho sugere-se que a fração metanólica das cascas de Euphorbia umbellata:

. Quando administrada via oral, mostrou-se capaz de proteger a mucosa gástrica de ratos tratados com os agentes lesivos avaliados;

. Apresentou melhor resposta na dose de 200 mg.Kg-1 para os modelos testados;

. Exerceu boa preservação da mucosa avaliada histologicamente, previnindo a formação de lesões mais severas que atingissem grandes porções do tecido glandular do estômago;

. Desenvolve suas ações mediante um mecanismo que parece estar envolvido com a ação de ciclooxigenases e da via do óxido nítrico/guanilato ciclase/GMPc, pois diante do uso de inibidores farmacológicos sua ação gastroprotetora foi minimizada;

. Revelou boa atividade antioxidante sobre os diversos métodos in vitro testados, sendo eles • •+ •- radicais como o DPPH e o ABTS , ou espécies reativas de oxigênio como o O2 , HOCl e Taurina cloramina;

. Mostrou potencial inibidor de enzimas peroxidases, testado em modelo in vitro sobre peroxidase modelo, HRP;

. Proporcionou boa capacidade scavenger ao soro de ratos sobre o radical ABTS•+;

. Não foi eficiente em aumentar os níveis de glutationa (GSH), fração não proteica (SH- NP), quantificada em amostras de tecido estomacal de ratos tratados via oral com etanol;

. Aumentou a quantidade de tióis totais (SH-T) do soro de ratos tratados com etanol via oral; 109

. Não alterou os níveis da enzima catalase quantificada no tecido estomacal e nos eritrócitos de ratos tratados com etanol via oral;

. Proporcionou 44,16 % de inibição sobre o crescimento do H. pylori em 256 µg.mL-1;

. Apresentou atividade inibitória máxima de 78,62 % frente à urease;

. É composta por derivados do ácido hidroxibenzoico, ácidos orgânicos e flavonoides, principalmente flavonois, sendo que o etil-galato é seu componente majoritário;

. Confirmou sua aplicação etnofarmacológica no tratamento de processos ulcerosos gástricos. Os dados apresentados nesse estudo ampliam o conhecimento sobre a utilização desta planta e contribuem para novas pesquisas que visem o aprofundamento do mecanismo de ação e identificação de substâncias ou fitocomplexos responsáveis pelas propriedades gastroprotetoras observadas. 110

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