ÉCOLE NATIONALE VÉTÉRINAIRE D’ALFORT

Année 2008

INFECTIONS À PLASMODIUM CHEZ LES OISEAUX SPHÉNISCIFORMES (MANCHOTS)

Synthèse bibliographique, analyse rétrospective de cas et étude épidémiologique au zoo de La Palmyre

THÈSE Pour le

DOCTORAT VÉTÉRINAIRE Présentée et soutenue publiquement devant

LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE CRÉTEIL

le…………… par Antoine, Alexandre LECLERC

Né (e) le 26 avril 1982 à PARIS (XVIème arrondissement)

JURY Président : M. Professeur à la Faculté de Médecine de CRETEIL

Membres Directeur : Pascal ARNÉ Maître de conférences à l’École Nationale Vétérinaire d’Alfort Assesseur : René CHERMETTE Professeur à l’École Nationale Vétérinaire d’Alfort Invité : Thierry PETIT Dr Vétérinaire au zoo de La Palmyre Invité : Irène LANDAU Professeur emeritus au Muséum National d’Histoire Naturelle

03 novembre 2007 LISTE DES MEMBRES DU CORPS ENSEIGNANT Directeur : M. le Professeur MIALOT Jean-Paul Directeurs honoraires : MM. les Professeurs MORAILLON Robert, PARODI André-Laurent, PILET Charles, TOMA Bernard Professeurs honoraires: MM. BUSSIERAS Jean, CERF Olivier, LE BARS Henri, MILHAUD Guy, ROZIER Jacques, CLERC Bernard

DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES ET PHARMACEUTIQUES (DSBP) Chef du département : Mme COMBRISSON Hélène, Professeur - Adjoint : Mme LE PODER Sophie, Maître de conférences -UNITE D’ANATOMIE DES ANIMAUX DOMESTIQUES - UNITE D’HISTOLOGIE , ANATOMIE PATHOLOGIQUE Mme CREVIER-DENOIX Nathalie, Professeur M. CRESPEAU François, Professeur M. DEGUEURCE Christophe, Professeur* M. FONTAINE Jean-Jacques, Professeur * Mme ROBERT Céline, Maître de conférences Mme BERNEX Florence, Maître de conférences M. CHATEAU Henri, Maître de conférences Mme CORDONNIER-LEFORT Nathalie, Maître de conférences

-UNITE DE PATHOLOGIE GENERALE , MICROBIOLOGIE, - UNITE DE VIROLOGIE IMMUNOLOGIE M. ELOIT Marc, Professeur * Mme QUINTIN-COLONNA Françoise, Professeur* Mme LE PODER Sophie, Maître de conférences M. BOULOUIS Henri-Jean, Professeur -DISCIPLINE : PHYSIQUE ET CHIMIE BIOLOGIQUES ET -UNITE DE PHYSIOLOGIE ET THERAPEUTIQUE MEDICALES M. BRUGERE Henri, Professeur M. MOUTHON Gilbert, Professeur Mme COMBRISSON Hélène, Professeur* M. TIRET Laurent, Maître de conférences -UNITE DE GENETIQUE MEDICALE ET MOLECULAIRE M. PANTHIER Jean-Jacques, Professeur -UNITE DE PHARMACIE ET TOXICOLOGIE Mlle ABITBOL Marie, Maître de conférences Mme ENRIQUEZ Brigitte, Professeur * M. TISSIER Renaud, Maître de conférences -DISCIPLINE : ETHOLOGIE M. PERROT Sébastien, Maître de conférences M. DEPUTTE Bertrand, Professeur

-UNITE : BIOCHIMIE -DISCIPLINE : ANGLAIS M. MICHAUX Jean-Michel, Maître de conférences Mme CONAN Muriel, Ingénieur Professeur agrégé certifié M. BELLIER Sylvain, Maître de conférences DEPARTEMENT D’ELEVAGE ET DE PATHOLOGIE DES EQUIDES ET DES CARNIVORES (DEPEC) Chef du département : M. POLACK Bruno, Maître de conférences - Adjoint : M. BLOT Stéphane, Maître de conférences - UNITE DE PATHOLOGIE CHIRURGICALE - UNITE DE MEDECINE M. FAYOLLE Pascal, Professeur * M. POUCHELON Jean-Louis, Professeur* M. MAILHAC Jean-Marie, Maître de conférences Mme CHETBOUL Valérie, Professeur M. MOISSONNIER Pierre, Professeur M. BLOT Stéphane, Maître de conférences Mme VIATEAU-DUVAL Véronique, Maître de conférences M. ROSENBERG Charles, Maître de conférences Mme RAVARY Bérangère, Maître de conférences (rattachée au DPASP) Mme MAUREY Christelle, Maître de conférences M. ZILBERSTEIN Luca, Maître de conférences contractuel M. HIDALGO Antoine, Maître de conférences contractuel - UNITE DE CLINIQUE EQUINE M. DENOIX Jean-Marie, Professeur - UNITE DE RADIOLOGIE M. AUDIGIE Fabrice, Maître de conférences* Mme BEGON Dominique, Professeur* Mme MESPOULHES-RIVIERE Céline, Maître de conférences Mme STAMBOULI Fouzia, Maître de conférences contractuel contractuel Melle PRADIER Sophie, Maître de conférences contractuel - DISCIPLINE : OPHTALMOLOGIE Mlle CHAHORY Sabine, Maître de conférences contractuel -UNITE DE REPRODUCTION ANIMALE Mme CHASTANT-MAILLARD Sylvie, Maître de conférences* - UNITE DE PARASITOLOGIE ET MALADIES PARASITAIRES (rattachée au DPASP) M. CHERMETTE René, Professeur M. NUDELMANN Nicolas, Maître de conférences M. POLACK Bruno, Maître de conférences* M. FONTBONNE Alain, Maître de conférences M. GUILLOT Jacques, Professeur M. REMY Dominique, Maître de conférences (rattaché au DPASP) Mme MARIGNAC Geneviève, Maître de conférences contractuel M. DESBOIS Christophe, Maître de conférences Mlle HALOS Lénaïg, Maître de conférences Mlle CONSTANT Fabienne, Maître de conférences (rattachée au DPASP) -UNITE DE NUTRITION-ALIMENTATION Melle DEGUILLAUME Laure, Maître de conférences contractuel M. PARAGON Bernard, Professeur * (rattachée au DPASP) M. GRANDJEAN Dominique, Professeur

DEPARTEMENT DES PRODUCTIONS ANIMALES ET DE LA SANTE PUBLIQUE (DPASP) Chef du département : M. MAILLARD Renaud, Maître de conférences - Adjoint : Mme DUFOUR Barbara, Maître de conférences -UNITE DES MALADIES CONTAGIEUSES - UNITE DE ZOOTECHNIE, ECONOMIE RURALE M. BENET Jean-Jacques, Professeur* M. COURREAU Jean-François, Professeur Mme HADDAD/ HOANG-XUAN Nadia, Maître de conférences M. BOSSE Philippe, Professeur Mme DUFOUR Barbara, Maître de conférences Mme GRIMARD-BALLIF Bénédicte, Professeur Mme LEROY Isabelle, Maître de conférences -UNITE D’HYGIENE ET INDUSTRIE DES ALIMENTS M. ARNE Pascal, Maître de conférences D’ORIGINE ANIMALE M. PONTER Andrew, Maître de conférences* M. BOLNOT François, Maître de conférences * M. CARLIER Vincent, Professeur - UNITE DE PATHOLOGIE MEDICALE DU BETAIL ET DES Mme COLMIN Catherine, Maître de conférences ANIMAUX DE BASSE-COUR M. AUGUSTIN Jean-Christophe, Maître de conférences M. MILLEMANN Yves, Maître de conférences* Mme BRUGERE-PICOUX Jeanne, Professeur (rattachée au DSBP) - DISCIPLINE : BIOSTATISTIQUES M. MAILLARD Renaud, Maître de conférences M. SANAA Moez, Maître de conférences M. ADJOU Karim, Maître de conférences

Mme CALAGUE, Professeur d’Education Physique * Responsable de l’Unité Mme GIRAUDET Aude Clinique équine, Ingénieur de recherche

Remerciements

Thierry Petit, pour m’avoir donné l’opportunité d’effectuer ce travail, et surtout pour tout ce que j’ai appris à ses côtés. Veuillez trouver ici l’expression de ma reconnaissance.

Pascal Arné, pour son enthousiasme relatif à ce projet. Merci également pour votre soutien, vos encouragements, et votre disponibilité, depuis plusieurs années déjà.

René Chermette, pour sa gentillesse et ses précieux conseils. Je vous suis très reconnaissant pour l’intérêt que vous avez porté à mon travail.

Jean-Marc Chavatte, Irène Landau, et Georges Snounou, du M.N.H.N., sans qui tout le travail expérimental rapporté dans ce document aurait été impossible. Nous avons pu profiter de votre savoir-faire et avons trouvé en vous des partenaires motivés, disponibles, et renommés. Ce fut un véritable plaisir que de travailler dans de telles conditions.

Florence Bernex, pour son aide généreuse à la relecture des paragraphes relatifs à l’anatomo-histo- pathologie.

L’ensemble du personnel du zoo de La Palmyre, ainsi que son directeur, Patrick Caillé, pour m’avoir gentiment accueilli pendant une année. Cette thèse aurait été irréalisable sans vous tous. Merci à Florence et Douglas pour leur contribution iconographique, ainsi qu’à Gil pour les informations relatives à la démoustication.

Norin Chaï, pour m’avoir accueilli à deux reprises à la Ménagerie. Tout est parti de là… Merci pour tes nombreux coups de pouce et tout ce que tu m’as appris.

Yannick Roman, et Brice Lefaux, pour m’avoir accueilli en stage dans leurs zoos respectifs. Merci de m’avoir donné les moyens de réussir dans ce qui m’a toujours plu. Votre soutien, ainsi que votre sens du partage et de la pédagogie m’ont énormément touché. Je suis heureux d’avoir trouvé en vous, au-delà des excellents maîtres de stage que vous avez été, des amis, que j’ai toujours grand plaisir à revoir.

Mes parents, qui ont toujours veillé sur moi, m’ont toujours soutenu, et grâce à qui je ne manque de rien. Je vous dois énormément.

Mathieu, mon autre moi, et Francia, son autre lui. Le couple du siècle ! J’essaierai d’être un « beauf » à la hauteur !

DaFoL, ma folle de sœur… De frih ! De bih ! De huuuh !

Benoît, mon p’tit Chouchou. Merci pour ce mois « molto sessi » passé en ta palmyrienne compagnie. Je te dédie la dernière réplique de Casablanca : « I think this is the begining of a long friendship ! ».

Le groupe 4, pour tous ces moments inoubliables passés ensemble à l’école, de l’accueil aux cliniques de D3, en passant par les dissections d’anat’, les semaines de chenil, les autopsies (« S’il vous plaît, il faut respecter le protocole ! »), les séjours à Champi, etc…

La dream team alforienne (dans le désordre analphabétique) :

- Nico « El Nico ! » Albert, mon alter ego musical, celui qui n’a cessé de prendre de mes nouvelles pendant mon « exil » palmyrien… J’espère qu’on aura l’occasion de rejouer ensemble… Vive le rock !!

- Coucouille, ça commence à faire un p’tit moment qu’on traîne sur le même chemin tous les deux… Merci pour tout ce qu’on a pu partager, dans les bons moments, comme dans les mauvais.

- « Camarade » Nico Poly, l’homme qui a lancé Karim Benzéma (!). Merci de m’aider à porter haut et fort les couleurs de la gauche en terre hostile !

- J-C, reçois ici, cher collègue, l’expression du profond respect et de toute l’estime tactique que te porte le héros de Bristol. Les supporters de l’AJA, de la Juve et de Naples peuvent être fiers de tout ce que tu leur as apporté.

- K.O., sans qui j’aurais souvent galéré pour aller en garde ! ;-) Basse, violon, ou guitare… …c’est pareil : j’espère qu’on pourra également rejouer ensemble !

- Crust et Jam, pour avoir également participé à l’aventure « Sub ». La belle époque alforienne, c’était quand on se retrouvait en salle de répet’. Je n’oublierai jamais ces moments-là.

- Lagnôle, ma bavaroise préférée (après la Paul Aner !!). Ein prozit !!

- Mibou la championne, ma meilleure amie alforienne. Ne change rien, sauf le rose !

- Minh et François, pour leur gentillesse (le mot est très faible). Merci de m’avoir ouvert le chemin de la foi coturniste, moi qui croyais être un athée irrécupérable.

- Les autres : Pierrot, Édouard, Guillaume, Élodie & Émilie (les deux font la paire !), ainsi que tous ceux que j’oublie (pardonnez-moi !).

Les « extra-alforiens » : Sami le beau gosse, Juanito & Domino, Guillaume & Marie, Cyril (mon Curdent Killer !), Mélanie, Julie, Mathieu, Xavier L. & Xavier M, etc…

Tous les membres du M.G.V. Continuez à assumer vos idées politiques dans un monde de droite ! ;-)

L’ensemble de ma promo, pour avoir su rester unie. J’espère qu’il y aura encore de nombreux week-ends ou voyages à faire ensemble.

Mes parents et enfants de clinique.

Émilie et Mandoline, mes deux bizuthes adorées. Merci pour l’année géniale que l’on a passée ensemble à Saint-Louis, en formant un groupe de colle uni et soudé. Je ne pouvais mieux tomber, moi qui étais arrivé en retard ce fameux jour de rentrée, me privant du plaisir de vous « choisir »… J’espère que cette année fut agréable pour vous aussi (bien que parfois dure quand même). Gardons le contact.

Mon ancien, pour l’accueil qu’il m’a réservé, et pour l’importance qu’il attache à notre relation (mais pas pour ses idées politiques !). Tu m’avais écrit que tu regrettais qu’on ne se voie pas plus souvent et qu’on ne soit pas plus proches en dehors de l’école. Je le déplore également. On a de moins en moins l’occasion de se croiser… …j’espère que nos carrières respectives ne nous sépareront pas davantage.

Émilie et Nadège, mes deux poulottes. J’espère vous avoir bien accueillies, même si c’était un peu particulier cette année de transition. Une fois encore, je regrette de ne pas avoir été plus présent, et déplore qu’on ne se croise plus qu’occasionnellement.

Aux cailles, à l’éclat de liberté et d’infini qui brille dans leurs yeux…

Table des matières

Table des matières...... 1 Liste des tableaux...... 9 Liste des figures ...... 11 Liste des abréviations et acronymes utilisés dans le texte ...... 13 Introduction...... 17 I. Première partie : Synthèse bibliographique...... 21 A. Les infections à Plasmodium des oiseaux...... 21 1. Définition ...... 21 2. Historique...... 23 3. Importance ...... 24 a) Répartition géographique...... 24 b) Importance clinique – espèces atteintes...... 25 c) Importance chez les populations sauvages et captives ...... 26 d) Importance économique...... 26 e) Importance historique ...... 27 4. Étiologie...... 27 5. Cycle parasitaire...... 33 6. Spécificité d’hôte et co-évolution hôte - parasite...... 38 a) Chez l’hôte intermédiaire...... 38 b) Chez l’hôte définitif...... 40 7. Particularités de l’infection ...... 42 a) Phases de l’infection et variations de la parasitémie ...... 42 b) Variations saisonnières de l’infection...... 44 c) Influence de l’âge...... 46 d) Influence des facteurs biotiques...... 47 e) Particularités de l’immunité...... 48 f) Interactions de Plasmodium avec ses hôtes, et stratégies de transmission...... 50 8. Pathogénie...... 51 a) Les stades exoérythrocytaires ...... 51 b) Les stades sanguins...... 52 9. Étude clinique ...... 52 1 10. Données paracliniques ...... 52 11. Lésions ...... 53 12. Diagnostic et diagnose ...... 53 a) Mise en évidence directe des Plasmodium sur un frottis sanguin ...... 53 b) Mise en évidence des stades tissulaires sur un calque d’organes ...... 56 c) Mise en évidence des parasites sur une coupe histologique ...... 56 d) Utilisation des techniques de biologie moléculaire : la P.C.R...... 56 e) Utilisation de techniques immunologiques...... 60 (1) L’ELISA...... 60 (2) L’immunoblot...... 60 f) Bilan sur les outils diagnostiques ...... 61 13. Traitement ...... 62 14. Prophylaxie ...... 63 B. Importance et particularités des infections à Plasmodium chez les Sphénisciformes...... 64 1. Taxinomie, zoologie, et biologie...... 64 a) Systématique...... 64 b) Anatomie...... 65 c) Physiologie...... 66 d) Locomotion...... 66 e) Habitat...... 67 f) Comportement...... 67 2. Conditions d’hébergement, manipulation, et contention ...... 67 a) Hébergement des populations captives...... 67 b) Manipulation et contention...... 68 (1) Contention physique...... 68 (2) Contention chimique ...... 69 3. Historique des infections à Plasmodium...... 69 4. Impact des infections à Plasmodium chez les manchots...... 70 a) Au sein des populations captives ...... 70 (1) Bilan de l’infection au sein des zoos d’Amérique du Nord ...... 71 (a) Zoo de Washington (Washington D.C.) ...... 71 (b) Zoo de Baltimore (Maryland)...... 71 (c) Zoo de San Diego (Californie) ...... 73 2 (d) Blank Park Zoo de Des Moines (Iowa)...... 74 (e) Zoo de San Francisco (Californie)...... 74 (2) Bilan de l’infection au sein des populations captives d’Europe...... 74 (3) Bilan de l’infection au sein des populations captives de Nouvelle-Zélande...... 75 (4) Bilan de l’infection au sein des populations captives d’Afrique du Sud...... 75 (5) Bilan général de l’infection au sein des populations captives...... 76 b) Au sein des populations sauvages...... 77 (1) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots au Sud de l’Afrique...... 78 (2) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots en Nouvelle-Zélande...... 79 (3) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots en Australie.....81 (4) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots aux îles Galapagos ...... 81 (5) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots en Antarctique 82 (6) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots issues d’autres régions géographiques...... 82 (7) Bilan général de l’infection au sein des populations sauvages de manchots ...... 83 c) Dans les centres de sauvegarde...... 85 d) Conclusion sur l’importance des infections à Plasmodium chez les manchots...... 87 5. Description des espèces de Plasmodium recensées chez les manchots ...... 88 a) Plasmodium relictum ...... 88 (1) Trophozoïtes...... 90 (2) Mérontes érythrocytaires...... 91 (3) Mérontes exoérythrocytaires ...... 91 (4) Macrogamétocytes...... 92 (5) Microgamétocytes ...... 92 (6) Cas de la sous-espèce spheniscidae...... 92 b) Plasmodium elongatum ...... 93 (1) Trophozoïtes...... 96 (2) Mérontes érythrocytaires...... 96 (3) Mérontes exoérythrocytaires ...... 97 (4) Macrogamétocytes...... 97 3 (5) Microgamétocytes ...... 98 c) Plasmodium juxtanucleare...... 98 (1) Trophozoïtes...... 100 (2) Mérontes érythrocytaires...... 100 (3) Mérontes exoérythrocytaires ...... 101 (4) Macrogamétocytes...... 101 (5) Microgamétocytes ...... 102 6. Épidémiologie de l’infection chez les manchots...... 102 a) Populations atteintes ...... 102 b) Relations entre le parasite, le vecteur, et l’hôte...... 102 (1) Origine de l’infection ...... 102 (2) Virulence des espèces parasitaires impliquées...... 103 (3) Influence de la vaccination...... 103 c) Saisonnalité...... 103 d) Influence de l’âge ...... 104 e) Influence de la mue...... 104 f) Influence de l’espèce de manchot ...... 105 g) Immunologie...... 105 h) Pathogénie et sensibilité supposée des manchots ...... 108 7. Particularités de la lutte contre l’infection chez les manchots...... 110 a) Difficultés et nouveaux outils diagnostiques ...... 110 (1) Mise en évidence directe du parasite dans le sang ...... 110 (2) Diagnostic clinique...... 111 (3) Diagnostic paraclinique (autre que par la mise en évidence directe du parasite)....114 (4) Diagnostic post mortem...... 115 (a) Lésions du foie...... 116 (b) Lésions des poumons...... 117 (c) Lésions de la rate ...... 117 (d) Lésions des reins ...... 117 (e) Lésions de l’encéphale...... 118 (f) Lésions du cœur ...... 118 (g) Autres lésions ...... 118 (5) Nouveaux outils diagnostiques...... 118 4 (a) Tests sérologiques...... 119 (b) P.C.R...... 119 b) Protocoles thérapeutiques proposés...... 120 c) Prophylaxie médico-sanitaire...... 125 (1) Chimioprévention...... 125 (2) Lutte contre les vecteurs...... 126 (3) Immunoprophylaxie ...... 127 II. Deuxième partie : Exemple du zoo de La Palmyre, historique et gestion des épisodes de mortalité due à Plasmodium chez les Sphénisciformes...... 131 A. Présentation du zoo de La Palmyre...... 131 B. Bilan des infections à Plasmodium chez les manchots du parc ...... 131 1. Présentation des Sphénisciformes hébergés à La Palmyre ...... 131 2. Historique des infections à Plasmodium chez les manchots du parc...... 136 3. De l’existence supposée d’infections chez des espèces autres que les Sphénisciformes..144 C. Dispositif de lutte mis en place ...... 145 1. Prophylaxie médicale anti-paludéenne ...... 145 2. Lutte contre les moustiques...... 148 D. Évolution et perspectives ...... 150 III. Troisième partie : Étude expérimentale ...... 153 A. Intérêts et objectifs de l’étude ...... 153 B. Animaux, matériels et méthodes ...... 154 1. À La Palmyre ...... 154 a) Première expérience...... 154 b) Deuxième expérience...... 156 c) Troisième expérience...... 156 (1) Espèces nuisibles...... 156 (2) Espèces non nuisibles...... 159 d) Quatrième expérience ...... 159 2. Au M.N.H.N...... 160 a) Frottis sanguins ...... 160 b) Sang sur EDTA...... 160 c) Prélèvements d’organes ...... 162 C. Résultats ...... 162 5 1. Première expérience...... 162 2. Deuxième expérience...... 171 3. Troisième expérience ...... 172 a) Espèces nuisibles ...... 172 b) Espèces non nuisibles ...... 175 4. Quatrième expérience ...... 175 D. Discussion ...... 175 Conclusion ...... 185 Bibliographie...... 189 Annexe 1 : carte des zones zoogéographiques...... 199 Annexe 2 : position systématique et sous-genres de Plasmodium...... 201 Annexe 3 : distribution des espèces de Plasmodium dans les différents ordres d’oiseaux qu’ils peuvent infecter...... 203 Annexe 4 : lexique de protozoologie ...... 207 Annexe 5 : principales différences entre manchots et pingouins...... 209 Annexe 6 : classification des manchots ...... 211 Annexe 7 : taille et poids des différentes espèces de manchots...... 213 Annexe 8 : valeurs de référence en hématologie pour quatre espèces de manchots...... 215 Annexe 8’ : valeurs de référence en biochimie sanguine pour quatre espèces de manchots...... 217 Annexe 9 : plan de l’enclos des manchots du zoo de La Palmyre...... 219 Annexe 10 : liste des puisards inaccessibles au zoo de La Palmyre...... 221 Annexe 10’ : liste des regards accessibles et autres points d’eau au zoo de La Palmyre ...... 223 Annexe 11 : inventaire des spécimens de manchots présents au zoo de La Palmyre au cours de l’étude ...... 225 Annexe 12 : nature et dates des prélèvements effectués sur Spheniscus demersus dans le cadre de la première expérience ...... 235 Annexe 13 : nature et dates des prélèvements effectués sur divers oiseaux en présentation au zoo de La Palmyre, dans le cadre de la deuxième expérience ...... 237 Annexe 14 : extraits de textes réglementaires fixant les dispositions relatives au piégeage des animaux classés nuisibles...... 241 Annexe 15 : autorisation de piégeage pour l’année 2007 ...... 245 Annexe 16 : nature et dates des prélèvements effectués sur les pies bavardes (Pica pica) capturées au zoo de La Palmyre, dans le cadre de la troisième expérience...... 247 6 Annexe 17 : nature et dates des prélèvements effectués sur les corneilles noires (Corvus corone corone) capturées au zoo de La Palmyre, dans le cadre de la troisième expérience ...... 249 Annexe 18 : nature et dates des prélèvements effectués sur diverses espèces aviaires commensales (autres que Pica pica et Corvus corone corone) au zoo de La Palmyre, dans le cadre de la troisième expérience ...... 251 Annexe 19 : exemple de protocole d’extraction d’ADN utilisé au cours de l’étude ...... 255 Annexe 20 : protocole de purification d’ADN sur gel utilisé au cours de l’étude...... 257 Annexe 21 : schéma du plasmide utilisé lors du clonage ...... 259 Annexe 22 : résultats de la première expérience : recherche de Plasmodium chez Spheniscus demersus...... 261 Annexe 23 : séquences d’ADN parasitaire isolées chez trois Spheniscus demersus de La Palmyre ...... 263 Annexe 24 : résultats de la deuxième expérience : recherche de Plasmodium chez divers oiseaux en présentation au zoo de La Palmyre ...... 265 Annexe 25 : résultats de la troisième expérience : hémoparasites mis en évidence chez les pies bavardes (Pica pica) capturées au zoo de La Palmyre...... 269 Annexe 26 : résultats de la troisième expérience : hémoparasites mis en évidence chez les corneilles noires (Corvus corone corone) capturées au zoo de La Palmyre...... 271 Annexe 27 : séquences uniques et séquences consensus des différents types et sous-types de fragments isolés chez les pies bavardes et corneilles noires capturées au zoo de La Palmyre ...... 273 Annexe 28 : résultats de la troisième expérience : hémoparasites mis en évidence chez diverses espèces aviaires commensales (autres que Pica pica et Corvus corone corone) au zoo de La Palmyre...... 279

7 8 Liste des tableaux

Tableau 1 : prévalence des infections à Plasmodium chez les oiseaux dans différentes régions zoogéographiques...... 24 Tableau 2 : nombre d’espèces de Plasmodium isolées dans les différentes régions zoogéographiques...... 25 Tableau 3 : espèces connues de Plasmodium aviaires et leurs principaux hôtes...... 30 Tableau 4 : nombre d’espèces de Plasmodium aviaires par famille et genre de diptère...... 40 Tableau 5 : bilan des espèces de manchots infectées par Plasmodium en captivité, et espèces parasitaires impliquées...... 76 Tableau 6 : bilan des espèces de manchots infectées par Plasmodium à l’état sauvage, et espèces parasitaires impliquées...... 84 Tableau 7 : symptômes recensés chez les manchots infectés par Plasmodium ...... 113 Tableau 8 : protocoles thérapeutiques proposés pour la prévention ou le traitement des infections à Plasmodium chez les manchots...... 121 Tableau 9 : cas avérés d’infection paludéenne chez les manchots du zoo de La Palmyre ...... 138 Tableau 10 : différents types et sous-types de séquences obtenues avec les couples d’amorces rPLU1/rPLU2 et rPLU6/rPLU5, chez les pies bavardes et les corneilles noires capturées à La Palmyre ...... 174

9 10 Liste des figures

Figure 1 : arbre phylogénique des Hémosporidies...... 22 Figure 2 : classification phylogénétique des oiseaux, et nombre d’espèces de Plasmodium décrites par taxon ...... 29 Figure 3 : nombre de nouvelles espèces d’Hémosporidies décrites en fonction du temps...... 33 Figure 4 : cycle évolutif de Plasmodium relictum ...... 35 Figure 5 : variations de la parasitémie à Plasmodium chez les oiseaux en fonction du temps...... 43 Figure 6 : réalisation d’un frottis sanguin ...... 54 Figure 7 : schéma des différentes formes sanguines de Plasmodium relictum (dans le sang de Passer hispaniolensis)...... 89 Figure 8 : schéma de quelques formes tissulaires de Plasmodium relictum (chez des canaris infectés expérimentalement à partir de Passer hispaniolensis, par l’intermédiaire de Culex pipiens)...... 90 Figure 9 : schéma des différentes formes sanguines de Plasmodium elongatum ...... 94 Figure 10 : schéma de quelques formes tissulaires de Plasmodium elongatum ...... 95 Figure 11 : photo d’un frottis sanguin de Spheniscus demersus montrant un méronte immature de Plasmodium elongatum dans un érythrocyte polychromatophile (coloration de May-Grünwald-Giemsa, grossissement x 1 900)...... 95 Figure 12 : photo d’une empreinte de poumon de Spheniscus demersus montrant un méronte intra-histiocytaire de Plasmodium elongatum (coloration de May-Grünwald-Giemsa, grossissement x 1900)...... 96 Figure 13 : schéma des différentes formes sanguines de Plasmodium juxtanucleare...... 99 Figure 14 : schéma de phanérozoïtes matures de Plasmodium juxtanucleare...... 100 Figure 15 : photographie d’un Spheniscus demersus du zoo de La Palmyre...... 133 Figure 16 : plan légendé du zoo de La Palmyre...... 135 Figure 17 : photographie de l’enclos des manchots au zoo de La Palmyre...... 136 Figure 18 : photographie post mortem du manchot du Cap #1806, après ouverture de la cavité générale...... 141 Figure 19 : photographie de l’appareil respiratoire profond du Spheniscus magellanicus #562, une fois retiré de la cavité générale...... 142 Figure 20 : photographie d’une coupe histologique de la rate du Spheniscus magellanicus #562 (coloration de May-Grünwald-Giemsa, grossissement x 100) ...... 143 11 Figure 21 : photographies illustrant le traitement au MALOCIDE® des manchots du zoo de La Palmyre ...... 147 Figure 22 : photographies illustrant la réalisation des prélèvements chez Spheniscus demersus....155 Figure 23 : photographie du piège à pies, en présence de l’appelant...... 158 Figure 24 : schéma du gène ssrRNA 18S de Plasmodium, et localisation des amorces utilisées lors des P.C.R...... 161 Figure 25 : photographie du gel d’électrophorèse, après migration des produits P.C.R. obtenus à l’aide des amorces rPLU1/rPLU5 puis rPLU3/rPLU4, chez huit Spheniscus demersus.164 Figure 26 : photographie du gel d’électrophorèse, après migration des produits P.C.R. obtenus à l’aide des amorces rPLU1/rPLU5 puis rPLU3/rPLU4, chez trente-deux Spheniscus demersus...... 165 Figure 27 : photographie du gel d’électrophorèse, après migration des produits P.C.R. obtenus à l’aide des amorces rPLU1/rPLU5 puis rPLU3/rPLU4, rPLU3/rPLU2, rPLU3/rPLU5, et rPLU3/rPUN-IR chez six Spheniscus demersus...... 167 Figure 28 : photographie du gel d’électrophorèse obtenu lors du criblage des séquences clonées de six Spheniscus demersus ...... 168 Figure 29 : photographie du gel d’électrophorèse, après migration des produits P.C.R. obtenus à l’aide des amorces rPLU1/rPLU5 puis AvPl-AF/rPLU2, AvPl-BF/rPLU2, AvPl-CF/rPLU2, AvPl-DF/rPLU2, AvPl-EF/rPLU2, et AvPl-FF/rPLU2, chez cinq Spheniscus demersus...... 170 Figure 30 : exemples d’hémoparasites mis en évidence sur les frottis sanguins de la pie n°21...... 173

12 Liste des abréviations et acronymes utilisés dans le texte

• ADN : Acide Désoxyribonucléique.

• ALAT : Alanine AminoTransférase.

• A.M.M. : Autorisation de Mise sur le Marché.

• ARN : Acide RiboNucléique.

• ARNm : Acide Ribonucléique messager.

• ARNr : Acide Ribonucléique ribosomique.

• ASAT : Aspartate AminoTransférase.

• C.C.M.H. : Concentration Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine.

• C.K. : Créatine Kinase.

• C.M.H. : Complexe Majeur d’Histocompatibilité.

• EDTA : Ethylenediamine Tetraacetic Acid (acide-éthylène-diamine-tétraacétique).

• E.I.D. : Entente Interdépartementale de Démoustication.

• ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (dosage immunoenzymatique sur support solide).

• EPO : Érythropoïétine.

• γ-GT : Gamma-Glutamyl Transpeptidase.

• IFN-γ : Interféron gamma.

• IgG : Immunoglobulines de l’isotype G.

• IgY : Immunoglobulines de l’isotype Y.

• LDH : Lactate déshydrogénase.

• M.N.H.N. : Muséum National d’Histoire Naturelle.

• N.B. : Nota Bene.

• O.M.S. : Organisation Mondiale de la Santé.

• PAL : Phosphatase Alcaline.

13 • P.C.R. : Polymerase Chain Reaction (réaction de polymérisation en chaîne).

• RT-PCR : Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (transcription inverse et réaction de polymérisation en chaîne).

• SANCCOB : South African National foundation for the Conservation of Coastal Birds (Fondation sud-africaine nationale pour la conservation des oiseaux côtiers, située à Milnerton, Cape Town, Afrique du Sud).

• T.G.M.H. : Teneur Globulaire Moyenne en Hémoglobine.

• U.I. : Unités Internationales.

• U.T.I. : Unités Toxiques Internationales.

• V.G.M. : Volume Globulaire Moyen.

• V.L.D.L. : Very Light Density Lipoprotein.

14

INTRODUCTION

15 16 Introduction

D’un intérêt majeur à la fin du XIXième siècle et au cours des premières décennies du siècle suivant, époque à laquelle elles servaient de modèles expérimentaux pour l’étude de la malaria humaine, les infections à Plasmodium des oiseaux tombèrent peu à peu en désuétude, et rares sont les chercheurs qui y consacrent encore leur activité. Toutefois, l’existence d’infections pathogènes parfois très dévastatrices, notamment au sein des colonies captives de manchots, amena plus récemment d’autres personnes issues du monde scientifique à s’y intéresser, à commencer par les vétérinaires exerçant en parc zoologique.

Ainsi, au cours des années 1990, Thierry Petit, docteur vétérinaire au zoo de La Palmyre, fut confronté à un nombre important de morts subites de manchots, dont la cause fut attribuée à des infections paludéennes. À l’occasion d’un stage de longue durée au zoo de La Palmyre entamé en novembre 2006, nous avons profité de notre collaboration et des cas recensés au zoo pour consacrer une partie de notre travail à la synthèse et à l’approfondissement des connaissances sur cette affection.

En effet, souhaitant joindre une étude expérimentale au travail bibliographique sur un sujet qui m’a rapidement tenu à cœur, j’ai été mis en relation, par l’intermédiaire du service de parasitologie de l’École Nationale Vétérinaire d’Alfort, avec un groupe de chercheurs du Muséum National d’Histoire Naturelle qui consacrent leur activité à la protozoologie, et notamment aux infections paludéennes humaines et aux hémosporidioses aviaires. Cette coopération nous a permis de mettre en œuvre des techniques modernes de recherche parasitaire au cours de nos expérimentations, qui avaient pour objectif de dresser un bilan de l’infection des manchots présents au zoo, et de caractériser le cycle parasitaire à La Palmyre, prinicipalement en identifiant le réservoir aviaire. Par ailleurs, nous avons disposé d’une bourse de 1000 €, offerte par l’Association Française des Vétérinaires de Parcs Zoologiques, pour financer nos travaux.

Nonobstant le vif intérêt que nous placé dans ce travail expérimental, et le temps que nous y avons consacré, nous avons également voulu établir une synthèse bibliographique la plus complète possible sur le sujet, afin de proposer un document exhaustif et francophone, facilement utilisable par les praticiens amenés à travailler avec des manchots, ou désirant se renseigner sur les infections à Plasmodium des oiseaux.

C’est par cette synthèse bibliographique que s’ouvrira le compte-rendu de nos travaux. Nous y aborderons successivement les infections paludéennes au sein de la classe des oiseaux, puis l’importance et les particularités de ces infections lorsqu’elles touchent l’ordre des Sphénisciformes (i.e. les manchots). Nous poursuivrons notre exposé par un bilan sur les épisodes recensés jusqu’à présent au zoo de La Palmyre et une description des dispositifs de lutte qui y ont été mis en place. Enfin, nous achèverons ce document par la présentation de notre travail expérimental, et l’analyse des enseignements qu’il nous a apportés.

17 18 PREMIÈRE PARTIE : SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE

19 20 I. Première partie : Synthèse bibliographique

A. Les infections à Plasmodium des oiseaux

1. Définition

Les termes de « paludisme » et de « malaria » sont a priori sans grande ambiguïté en médecine humaine : il s’agit selon le site internet de l’O.M.S. (2007a, 2007b) d’une maladie affectant l’homme due à quatre espèces de Plasmodium et transmise par des moustiques du genre Anopheles. Leur utilisation s’avère en revanche beaucoup plus hasardeuse en médecine vétérinaire, certains auteurs ne restreignant pas la liste des agents étiologiques de la « malaria aviaire » au seul genre Plasmodium. Ainsi, de nombreuses définitions parfois contradictoires ont été données et publiées dans des revues ou ouvrages faisant référence :

• un certain nombre d’auteurs, que l’on pourrait qualifier de « puristes » (LEVINE, 1985 ; RAE, 1995 ; SPRINGER, 1997 ; VALKIUNAS, 2005 ;VAN DER HEYDEN, 1996) réservent le terme de « malaria » aux seules infections dues à des parasites du genre Plasmodium. RAE (1995) distingue ainsi parmi les principaux hémoprotozoaires des oiseaux (Plasmodium, Haemoproteus, Leucocytozoon, Atoxoplasma, Trypanosoma, Aegyptianella, et Akiba) ceux qui appartiennent aux hémosporidies (Plasmodium, Haemoproteus, Leucocytozoon, et Akiba) et ceux qui sont responsables de malaria aviaire (Plasmodium spp. uniquement).

• de leur côté, FALLON et al. (2003), RICHARD et al. (2002), RICKLEFS et al. (2004), WESTERDAHL et al. (2005), ainsi que WOOD & COSGROVE (2006) y adjoignent les infections à Haemoproteus, autre parasite du sous-ordre des Haemosporina, sur la base de données phylogénétiques.

• URQUHART et al. (1996), affirment quant à eux que les parasites responsables de malaria chez les oiseaux sauvages et domestiques appartiennent à trois genres de la classe Haemosporidia : Plasmodium, Haemoproteus et Leucocytozoon.

Dans un article récemment publié, PÉREZ-TRIS et al. (2005) reviennent sur ces problèmes de nosologie et déplorent en particulier le manque de connaissances sur la phylogénie et la pathogénicité des parasites responsables de malaria. Selon eux, si la définition typologique (c’est-à- dire restreinte aux seuls Plasmodium) présente un intérêt pratique et historique, plusieurs arguments invitent à considérer également les infections à Haemoproteus comme de la malaria :

• une étude de la phylogénie, basée sur le séquençage du gène du cytochrome b chez des espèces de Plasmodium de plusieurs mammifères (dont l’homme), d’oiseaux et de reptiles, ainsi que chez Haemoproteus et Leucocytozoon a montré que les Plasmodium d’oiseaux et de reptiles sont plus proches des espèces d’Haemoproteus parasites de ces mêmes hôtes que des Plasmodium humains (PÉREZ-TRIS et al., 2005). Les résultats de cette étude sont présentés dans la figure 1 ci-après.

21 Figure 1 : arbre phylogénique des Hémosporidies

(d’après PÉREZ-TRIS et al., 2005)

Phylogénie basée sur les séquences du gène du cytochrome b. La branche des 17 espèces de Plasmodium de mammifères comprend 3 espèces de parasites de l’homme (P. vivax, P.ovale et P.malariae). N.B. : « Changes » = variations dans la séquence du gène.

• cet argument trouve un écho chez BESCH et al. (2000) qui, dans une étude où ils séquencent le gène du cytochrome b chez plusieurs espèces de Plasmodium et Haemoproteus, s’étonnent de la très grande similitude de séquence chez 2 espèces spécifiques des oiseaux, Haemoproteus columbae et Plasmodium nucleophilum.

• le concept de « malaria » est intéressant car il renvoie à une entité clinique, or Haemoproteus au même titre que Plasmodium peut provoquer une anémie, des dépôts d’hémozoïne et de la mortalité chez son espèce hôte, symptômes typiques de malaria, même si, en général, les infections à Haemoproteus sont plus bénignes (PÉREZ-TRIS et al., 2005).

En conclusion, d’autres travaux de recherche sur la phylogénie et la pathogénie des hémosporidies des oiseaux seront nécessaires pour créer un consensus sur le sujet. En attendant, il est préférable de préciser à chaque fois à quelle espèce de parasite on se réfère, et ne pas hésiter – selon les cas – à utiliser les termes d’« hémoparasites » (désignant des parasites vivant dans le courant sanguin de leurs hôtes), ou d’« hémosporidies » (faisant référence à une classe de parasites) qui sont moins sujets à controverse. Pour notre part, nous limiterons notre étude aux Plasmodium, puisque, à l’exception d’une espèce de Leucocytozoon, ils sont les seules hémosporidies à infecter les manchots.

Dans la mesure où le terme de « plasmodiose » – qui désignerait les infections à Plasmodium – n’est pas utilisé (bien que logique d’après les recommendations du code de

22 zoologie), nous parlerons le plus possible d’ « infections à Plasmodium », et donnerons des précisions dans le texte à chaque fois qu’une information concernera un groupe plus large de parasites, dans un souci de rigueur et de précision.

2. Historique

(d’après VALKIUNAS, 2005)

Les premières découvertes sur les hémoparasites des oiseaux sont attribuées à un physicien russe, V.Ya. Danilewsky, qui, à la fin du dix-neuvième siècle, s’est consacré pendant 12 ans à l’étude de la morphologie et aux différents stades de développement des parasites sanguins intracellulaires des vertébrés. Ses dessins, très précis et détaillés pour l’époque, ont permis de mettre en évidence les principales caractéristiques des hémosporidies, même si Danilewsky lui- même n’a pas contribué à la classification du taxon. D’autre part, son travail s’est également révélé intéressant d’un point de vue pathologique : en disséquant des oiseaux infectés, il a montré que la maladie s’accompagnait d’une anémie prononcée, de spléno- et hépatomégalies, ainsi que de l’accumulation de pigments et de parasites dans les phagocytes de ces organes. Enfin, Danilewsky a suggéré le premier l’idée d’une transmission via un vecteur en remarquant la corrélation entre la parasitémie et la température de l’environnement. Il n’a pas hésité à souligner les ressemblances entre les parasites retrouvés chez l’homme et ceux retrouvés chez les autres vertébrés (oiseaux notamment), et les avancées majeures concernant le cycle parasitaire de Plasmodium ont été effectuées à l’aide de modèles qu’il avait lui-même découverts.

Le premier genre d’hémosporidies, Plasmodium, a été défini en 1885 par Marchiafava et Celli, qui y ont inclus les parasites responsables de malaria humaine. En 1887, Metchnikov précise la position taxinomique des hémosporidies, qui sont proches des coccidies, puis Kruse y ajoute en 1890 un nouveau genre, Haemoproteus, dont il décrit les trois premières espèces. Ce sont ensuite Grassi et Feletti qui réunissent dans un même genre les parasites responsables de malaria chez l’homme (découverts par Laveran) et chez les oiseaux avant que Schaudinn n’élabore en 1900 la terminologie des différents stades de développement des hémosporidies.

L’histoire retiendra également Labbé, qui a publié un résumé complet des données disponibles sur les hémosporidies des oiseaux, avant de soutenir son doctorat sur ce sujet ; Wasielewski et Coatney, pour leurs travaux en chimiothérapie ; ainsi que l’Université John Hopkins de Baltimore, à l’origine de nombreuses avancées dans l’étude des hémosporidies (distribution géographique, action des parasites sur les cellules, reproduction et dimorphisme des gamétocytes…). La « malariologie » a ensuite atteint son apogée lorsque Ronald Ross (qui a décrit le cycle parasitaire de Plasmodium relictum et confirmé la transmission par un moustique du genre Culex) reçut le Prix Nobel de Médecine en 1902. Les parasites des oiseaux furent dès lors les modèles de choix pour l’étude de la malaria humaine. En 1937, James et Tate ont confirmé l’existence d’une phase exo-érythrocytaire chez les Plasmodium d’oiseaux, avant que le même phénomène ne soit mis en évidence pour les parasites de l’homme. Puis des nouvelles familles d’hémosporidies ont été découvertes : les Leucocytozoïdés par Fallis et Bennett en 1961 et les Garniidés par Lainson et ses collaborateurs en 1971.

En 1968, la création, sous l’égide de l’O.M.S., d’un centre international de référence sur les parasites responsables de malaria aviaire (International Reference Centre for Avian Malaria Parasites) basé à St John, au Canada, a permis de rassembler une collection importante d’ouvrages sur le sujet et de favoriser le travail des chercheurs. Mais depuis la découverte, en 1950, des Plasmodium des rongeurs et l’infection, en 1966, d’un singe par un parasite humain, l’étude des 23 hémosporidies aviaires est tombée en désuétude, et peu nombreux sont ceux qui s’y intéressent de nos jours.

3. Importance

Le paludisme est bien connu en médecine humaine, où son importance est considérable (LEVINE, 1985) puisqu’il fait partie des maladies les plus prévalentes (URQUHART et al., 1996 VALKIUNAS, 2005), causant chaque année la mort de plus d’un million de personnes (O.M.S., 2007a). Si l’impact de cette parasitose sur les populations sauvages d’oiseaux est à ce jour très peu connu (WOOD & COSGROVE, 2006), son importance est vraisemblablement sous-estimée puisque pratiquement toutes les espèces d’oiseaux peuvent héberger des Plasmodium (PEIRCE, 2000 ; SMYTH, 1994).

a) Répartition géographique La distribution géographique des infections aviaires à Plasmodium est mondiale, à l’exception des régions aux climats extrêmes comme l’Antarctique, et l’on peut retrouver des hémosporidies à 3000 mètres d’altitude ou au-delà du cercle polaire arctique (JANOVY Jr, 1997 ; PEIRCE, 2000 ; SMYTH, 1994 ; VALKIUNAS, 2005). Ainsi, à la différence de la malaria humaine, l’incidence de l’infection à Plasmodium chez les oiseaux est aussi élevée dans les régions tempérées que tropicales et des études menées sur environ 7000 oiseaux font état d’un taux d’incidence variant de 1 à 19 % avec une moyenne de 5,8 % (SMYTH, 1994). Dans une synthèse plus complète, VALKIUNAS (2005) publie des taux plus faibles, mais souligne le fait que beaucoup d’espèces parasitaires n’ont été retrouvées qu’une seule fois et que leur distribution doit en réalité être beaucoup plus large. Il propose en outre un bilan par région zoogéographique (dont le découpage est illustré par une carte figurant en annexe 1 de ce document) de la prévalence de l’infection à Plasmodium et du nombre d’espèces isolées. Les résultats de ces travaux sont présentés dans les tableaux 1 et 2 suivants.

Tableau 1 : prévalence des infections à Plasmodium chez les oiseaux dans différentes régions zoogéographiques

(d’après VALKIUNAS, 2005)

Région Nombre d’oiseaux Infectés par Plasmodium spp. zoogéographique testés Nombre Taux de prévalence

Holarctique 102 590 2 981 2,9 %

Éthiopienne 11 507 368 3,2 %

Orientale 45 091 348 0,8 %

Néotropicale 54 101 865 1,6 %

N.B. : ces données reposent uniquement sur la lecture au microscope de frottis sanguins. Les informations concernant la région Australienne ne sont pas disponibles.

24 Tableau 2 : nombre d’espèces de Plasmodium isolées dans les différentes régions zoogéographiques

(d’après VALKIUNAS, 2005)

Région Nombre d’espèces de Nombre d’espèces d’hémosporidies (pour zoogéographique Plasmodium information)

Holarctique 19 (6) 123 (39)

Éthiopienne 13 (2) 108 (25)

Orientale 20 (8) 106 (20)

Australienne 3 (0) 22 (1)

Néotropicale 18 (8) 52 (18)

Antarctique 0 0

N.B. : entre parenthèses : le nombre d’espèces endémiques dans la zone en question.

C’est dans la région australienne que l’on trouve le moins d’espèces de Plasmodium. Toutefois ceci pourrait être dû au fait que cette région a été moins étudiée que les autres. Les régions holarctique, éthiopienne, orientale et néotropicale hébergent chacune à peu près autant d’espèces de Plasmodium et la riche faune parasitaire pourrait témoigner, selon VALKIUNAS (2005), d’une transmission active des parasites entre ces régions par l’intermédiaire des migrations hivernales d’oiseaux en provenance de l’holarctique.

Il faut également signaler des variations du niveau d’exposition des espèces d’élevage au risque d’infection en fonction de la localisation géographique. En effet, parallèlement au développement industriel de certains pays, la prévalence au sein des populations sauvages a diminué, rendant par la même occasion l’infection des espèces domestiques plus rare. En outre, dans certaines régions tropicales d’Afrique, le taux de prévalence de l’infection à Plasmodium atteint 20 à 50 % et des foyers endémiques ont été identifiés dans la région néotropicale (VALKIUNAS, 2005).

b) Importance clinique – espèces atteintes Les hémosporidies sont à l’origine d’affections pouvant entraîner un fort taux de mortalité et pratiquement toutes les espèces d’oiseaux peuvent héberger des Plasmodium, qui sont les hémosporidies possédant le spectre d’hôtes possibles le plus large (JANOVY Jr, 1997 ; PEIRCE, 2000 ; SMYTH, 1994 ; VALKIUNAS, 2005). Notons au passage que les lignées de Plasmodium infectant les oiseaux ne sont pas retrouvées chez les mammifères (dont l’homme), et que la possibilité d’un passage d’une classe de vertébrés à une autre est infime (RICKLEFS & FALLON, 2002). Parmi les espèces les plus fréquemment infectées par les Plasmodium aviaires, on retrouve en tête les passereaux (moineau notamment) qui sont souvent porteurs sains. Les espèces domestiques sont à l’inverse rarement le siège de l’infection, mais celle-ci, quand elle se produit, est fréquemment pathogène, de même que pour les canaris, les manchots et les faucons (RAE, 1995 ; 25 SMYTH, 1994 ; VAN DER HEYDEN, 1996). RAE (1995) cite également des infections chez les mésanges, les fringillidés, les fauvettes, les grives, les étourneaux, et les pies, ainsi que des cas de mortalité chez des mainates. Les psittacidés seraient rarement infectés mais, si l’infection est en général asymptomatique chez les cacatoès (Cacatua spp.), des cas de mortalité chez des kéas (Nestor notabilis) sont à déplorer dans certains parcs zoologiques (RAE, 1995 ; VALKIUNAS, 2005).

c) Importance chez les populations sauvages et captives FRENKEL (1980) rapporte que la transmission de Plasmodium (et des autres hémosporidies) par des diptères indigènes est possible en parc zoologique. PEIRCE (2000), affirme que les espèces vivant dans des zones indemnes, déplacées dans le cadre de programmes d’élevage, ou pour être exposées dans des parcs zoologiques, sont fortement prédisposées à l’infection, qui est dans ce cas souvent pathogène. VALKIUNAS (2005), lui aussi, revient sur l’importance des hémosporidioses, et plus précisément des infections à Plasmodium dans les parcs zoologiques : les oiseaux les plus souvent atteints sont ceux qui proviennent de régions où la transmission des parasites est quasi inexistante, ou qui sont exposés dans les zoos à de nouvelles espèces pathogènes de parasites. Selon l’auteur, il s’agit des espèces d’oiseaux qui ne se sont pas adaptées, physiologiquement et évolutivement, aux espèces locales de parasites. La prépondérance des infections à Plasmodium dans les parcs zoologiques, nettement plus fréquentes que celles à Haemoproteus et Leucocytozoon, s’explique par la large distribution géographique des Plasmodium, la variété des hôtes vertébrés (généralement des petits passereaux) présents sur un parc, et la présence de culicidés.

ABREY (1993) répertorie les Plasmodium de l’avifaune sauvage et démontre qu’on les retrouve chez de nombreuses familles d’oiseaux en Afrique du Sud, provoquant des infections souvent peu pathogènes chez les oiseaux sauvages en liberté, à la différence des individus maintenus en captivité, plus sévèrement affectés. Néanmoins, l’impact des parasites sanguins sur le taux de mortalité au sein des populations sauvages est difficile à estimer puisqu’il faudrait pour cela poser un diagnostic vétérinaire sur des animaux qui, une fois malades, deviennent rapidement la proie des prédateurs puis des charognards (PEIRCE, 2000 ; VALKIUNAS, 2005). La réintroduction d’espèces protégées dans leur milieu naturel est souvent menacée d’échec à cause de l’apparition d’hémosporidioses sévères. À l’inverse des observations d’ABREY (1993), il se pourrait aussi que des parasites qui donnent des infections inapparentes chez des oiseaux maintenus en captivité (donc très bien nourris et protégés) puissent provoquer un affaiblissement ou des symptômes plus marqués lorsque les oiseaux sont dans leur milieu naturel (VALKIUNAS, 2005).

Une étude de MERINO et al. (2000) a montré que des niveaux naturels d’infection (en terme de prévalence et d’intensité) par deux hémosporidies communes et largement distribuées dans la nature provoquaient, chez des mésanges bleues femelles (Cyanistes caeruleus) appartenant à une population sauvage, une diminution du nombre d’œufs éclos, et une altération de l’état corporel. Notons toutefois que cette étude portait sur des hémosporidies des genres Haemoproteus et Leucocytozoon, et non Plasmodium.

d) Importance économique Les effets d’une infection par une hémosporidie varient d’une simple baisse de productivité à un taux élevé de mortalité. En général, le parasite persiste pendant de nombreuses années chez les oiseaux, constituant un réservoir naturel à partir duquel les espèces domestiques s’infectent. Des pertes économiques importantes ainsi que l’échec de plusieurs projets d’élevage sont à déplorer

26 dans des régions où les infections aux hémosporidioses sont endémiques, et l’on estime que les affections dues à ces parasites sont sous-évaluées chez les espèces domestiques (VALKIUNAS, 2005).

e) Importance historique Nous renvoyons le lecteur à l’historique effectué un peu plus haut et qui souligne l’importance des modèles aviaires dans la recherche sur la malaria humaine et le développement de la chimiothérapie anti-paludéenne.

4. Étiologie

Les Plasmodium sont des protozoaires du phylum Apicomplexa appartenant à l’ordre des Hémosporidies et à la famille des Plasmodidés (BUSSIÉRAS & CHERMETTE, 1992 ; JANOVY Jr, 1997). Si environ 65 espèces ont été décrites chez les oiseaux, le nombre exact de taxons distincts est sûrement plus faible (SPRINGER, 1997). La compilation de données la plus récente est attribuable à VALKIUNAS (2005), qui en dénombre 38. Les Plasmodium aviaires ne semblent pas présenter de spécificité d’hôte marquée et peuvent de ce fait infecter plusieurs espèces d’oiseaux (LEVINE, 1985). En revanche, ces parasites n’ont jamais été transmis (même expérimentalement) à des mammifères et semblent donc spécifiques des oiseaux (VALKIUNAS, 2005).

Il n’est pas rare qu’un même oiseau soit infecté par plusieurs espèces de Plasmodium (PEIRCE, 2000). Plasmodium relictum est l’espèce la plus pathogène et l’une des plus représentée dans la nature (PEIRCE , 2005 ; SMYTH, 1994). C’est également la seule espèce de Plasmodium aviaire pour laquelle des sous-espèces ont été clairement identifiées : PEIRCE évoque ainsi Plasmodium relictum capistranoae qui a été retrouvé chez diverses espèces d’oiseaux en Afrique continentale et dans les îles Mascareignes (océan Indien). Cette sous-espèce a notamment infecté des flamants nains (Phoeniconaias minor), ce qui en fait le premier hématozoaire décrit chez les flamants. Si un seul individu (sur 31 pour lesquels des frottis ont été réalisés) s’est révélé être porteur, la parasitémie atteignait chez lui 20 % des hématies, avec mise en évidence de tous les stades évolutifs du parasite (PEIRCE 2005).

En 1985, LEVINE distingue deux groupes de Plasmodium en fonction de la forme (allongée ou ronde) des gamontes et ne parvient pas à classer Plasmodium lophurae dont les gamontes changent de forme (LEVINE, 1985). La sous-division aujourd’hui admise est celle qui reconnait cinq sous-genres (sur la base également de critères morphologiques) reprise par VALKIUNAS (2005) : Haemamoeba, Huffia, Giovannolaia, Novyella, et Bennettinia (sous-genre nouveau n’incluant qu’une seule espèce : Plasmodium juxtanucleare). Une classification simplifiée des protistes illustrant la position systématique et les sous-genres de Plasmodium figure en annexe 2 de ce document.

Selon VALKIUNAS (2005), on a recherché des hémosporidies chez environ 45 % des espèces d’oiseaux dont 30 % se sont avérées porteuses de Plasmodium. Ce travail reste encore à faire pour certaines espèces d’oiseaux exotiques ou trop difficiles à étudier à l’heure actuelle, comme de nombreux volatiles du paléarctique.

Il est donc intéressant de remarquer que le fait, évoqué par certains auteurs, que toutes les espèces d’oiseaux pourraient héberger des hémosporidies reste à ce jour une hypothèse théorique reposant sur la mise en évidence du parasite dans de nombreux ordres d’oiseaux et dans la quasi-

27 totalité des régions zoogéographiques. De nouvelles investigations sont donc nécessaires pour étayer ce postulat.

L’ensemble des espèces de Plasmodium retrouvées dans les différents ordres d’oiseaux est présenté en annexe 3.

La figure 2 ci-contre est un arbre phylogénétique des oiseaux (classification de LECOINTRE et LE GUYADER, 2006), qui précise le nombre d’espèces de Plasmodium décrites dans chaque taxon.

28 Figure 2 : classification phylogénétique des oiseaux, et nombre d’espèces de Plasmodium décrites par taxon

(d’après GRIM et al., 2003 ; LECOINTRE & LE GUYADER, 2006 ; PEIRCE, 2005 ; SPRINGER, 1997 ; VALKIUNAS, 2005)

Les Plasmodium se retrouvent dans 21 ordres différents d’oiseaux (sur 24), ceux qui abritent le plus d’espèces d’hémoparasites étant les Passériformes (30), les Galliformes (19 espèces), les Columbiformes (11), les Ansériformes (9), les Gruiformes (8), et les Piciformes (8) (CHAVATTE et al., 2007 ; GRIM et al., 2003 ; LANDAU et al., 2003 ; PEIRCE, 2005 ; SAVAGE et al., 2005 ; 29 VALKIUNAS, 2005 ; VALKIUNAS et al., 2007). En revanche, on ne les retrouve pas chez les Casuariiformes, les Apterygiformes, les Eurypygiformes, les Struthioniformes, les Coliiformes et les Trogoniformes, que ce soit en captivité, ou en à l’état sauvage∗ (PEIRCE, 2005 ; VALKIUNAS, 2005). L’arbre phylogénétique montre un regroupement intéressant de cinq ordres (Procellariformes, Pélécaniformes, Sphénisciformes, Podicipédiformes, et Gaviiformes) pour lesquels le nombre d’espèces de Plasmodium décrites est nettement plus faible que dans les autres ordres. Ceci pourrait suggérer l’existence d’une « barrière phylogénétique » au niveau du nœud commun à ces cinq ordres. Néanmoins, dans le cas des Sphénisciformes, l’isolement géographique d’un certain nombre d’espèces sur un continent vierge d’hémosporidies constitue un facteur de confusion (ou biais) important qui permettrait d’expliquer le faible nombre d’espèces de Plasmodium décrites et qui pourrait interférer avec les hypohèses phylogénétiques que nous venons de formuler.

Le tableau 3 récapitule l’ensemble des espèces de Plasmodium aviaires, en précisant pour chacune la principale famille d’oiseaux servant d’hôte au parasite. Notons que les descriptions des espèces de Plasmodium reposent sur des critères morphologiques et biologiques uniquement.

Tableau 3 : espèces connues de Plasmodium aviaires et leurs principaux hôtes

(1) (2) (3) (d’après VALKIUNAS, 2005 sauf LAUDAU et al., 2003 ; SAVAGE et al., 2005 ; CHAVATTE et al., 2007 ; (4) VALKIUNAS et al., 2007)

Espèce de Plasmodium Principaux hôtes (famille) Plasmodium relictum Passeridae Plasmodium subpraecox Strigidae Plasmodium cathemerium Passeridae Plasmodium gallinaceum Phasianidae Plasmodium matutinum Turdidae Plasmodium lutzi Rallidae Plasmodium giovanolai Turdidae Plasmodium griffithsi Meleagrididae Plasmodium tejerai Meleagrididae Plasmodium coturnixi Phasianidae Plasmodium fallax Strigidae

∗ (N.B. : dans l’arbre phylogénétique ci-dessus, la correspondance avec le nombre d’espèces de Plasmodium décrites dans chaque ordre a été réalisé à partir de données provenant d’un inventaire de VALKIUNAS (2005) – Cf. annexe 3 – qui avait utilisé une classification plus « conventionnelle » des oiseaux. Ainsi, il n’y a pas de correspondance parfaite entre les deux classifications, ce qui explique que certains ordres cités sur la figure 2 ne soient pas retrouvés en annexe 3 et inversement. Le passage d’une classification a une autre s’est fait par la fusion ou l’éclatement de certains ordres, et nous avons bien évidemment tenu compte de ces modifications lors du décompte des espèces de Plasmodium décrites.) 30 Espèce de Plasmodium Principaux hôtes (famille) Plasmodium circumflexum Turdidae Plasmodium polare Hirundinidae Plasmodium lophurae Phasianidae Plasmodium durae Meleagrididae Plasmodium pedioecetae Tetraonidae Plasmodium pinottii Ramphastidae Plasmodium formosanum Phasianidae Plasmodium gundersi Strigidae Plasmodium anasum Anatidae Plasmodium garnhami Upupidae Plasmodium hegneri Anatidae Plasmodium octamerium Estrildidae Plasmodium gabaldoni Columbidae Plasmodium leanucleus Passeridae Plasmodium vaughani Turdidae Plasmodium columbae Columbidae Plasmodium rouxi Passeridae Plasmodium hexamerium Turdidae Plasmodium nucleophilum Mimidae Plasmodium dissanaikei Psittacidae Plasmodium paranucleophilum Thraupidae Plasmodium bertii Rallidae Plasmodium kempi Meleagrididae Plasmodium juxtanucleare Phasianidae Plasmodium elongatum Passeridae Plasmodium huffi Ramphastidae Plasmodium hermani Meleagrididae (1) Plasmodium maior Passeridae

(1) Plasmodium bigueti Passeridae

(2) Plasmodium parvulum Vangidae

(3) Plasmodium ghadiriani Corvidae

(3) Plasmodium tranieri Corvidae

(3) Plasmodium lenoblei Corvidae

31 Espèce de Plasmodium Principaux hôtes (famille) (3) Plasmodium dherteae Corvidae

(3) Plasmodium valkiunasi Corvidae

(3) Plasmodium snounoui Corvidae

(3) Plasmodium golvani Corvidae

(3) Plasmodium dorsti Corvidae

(3) Plasmodium bioccai Corvidae

(3) Plasmodium beaucournui Corvidae

(4) Plasmodium ashfordi Sylviidae

Il existe donc 52 espèces de Plasmodium aviaires actuellement reconnues. Aux descriptions reprises par VALKIUNAS (2005) dans son ouvrage de référence, se sont ajoutées 13 nouvelles descriptions (CHAVATTE et al., 2007 ; LANDAU et al., 2003 ; SAVAGE et al., 2005 ; VALKIUNAS et al., 2007, ainsi que la réhabilitation d’une espèce – Plasmodium maior – autrefois confondue avec Plasmodium relictum (LANDAU et al., 2003)). Si ce tableau se veut exhaustif, il va de soi que – vu le nombre d’espèces oiseaux qui n’ont pas fait l’objet d’investigations dans ce domaine – d’autres espèces de Plasmodium (et plus largement d’hémosporidies) restent vraisemblablement à découvrir. Néanmoins, la courbe du nombre des nouvelles espèces décrites en fonction du temps (Cf. figure 3) se termine en plateau pour les plasmodidés ce qui suggère que le nombre d’espèces à ce jour inconnues n’est pas si grand. Les estimations de VALKIUNAS (2005) font état d’une augmentation possible du nombre d’espèces d’hémosporidies nouvellement décrites limitée à 10 à 15 % au cours des 10 à 20 prochaines années.

32 Figure 3 : nombre de nouvelles espèces d’Hémosporidies décrites en fonction du temps

(d’après VALKIUNAS, 2005)

1 : Toutes espèces, 2 : Haemoproteus spp., 3 : Plasmodium spp., 4 : Leucocytozoon spp.

Notons toutefois que l’apparition de nouvelles techniques pourrait modifier complètement la recherche et la caractérisation taxinomique de nouvelles espèces parasitaires.

5. Cycle parasitaire

(d’après JANOVY Jr, 1997 ; LEVINE, 1985 ; PEIRCE, 2000 ; RAE, 1995 ; SMYTH, 1994 ; SPRINGER, 1997 ; URQUHART et al., 1996 ; VALKIUNAS, 2005)

Afin de faciliter la lecture de ce paragraphe, un lexique (annexe 4) définit les termes (signalés en gras) relatifs à la biologie des protozoaires que nous allons utiliser. Tout d’abord, notons que, si les cycles de développement des différentes espèces de Plasmodium, et plus largement des hémosporidies, présentent de nombreuses caractéristiques communes ; il existe quelques variations en fonction du genre et de l’espèce parasitaires. D’autre part, les cycles de nombreuses espèces de Plasmodium n’ont pas été étudiés ou ne sont pas connus dans le détail ce qui rend parfois discutable la généralisation à une famille des caractéristiques décrites pour une espèce donnée. Ainsi, si les caractéristiques du développement des espèces du sous-genre Haemamoeba sont dans l’ensemble bien connues, les espèces du sous-genre Novyella nécessitent pour leur part d’être plus longuement étudiées. En conclusion, nous ne préciserons ici que les caractéristiques générales du cycle parasitaire des espèces de Plasmodium, en nous appuyant sur l’exemple illustré du cycle de Plasmodium relictum, espèce bien étudiée et retrouvée chez de nombreux oiseaux (Cf. paragraphe ci-dessus). Nous préciserons dans le texte quand une information concernera spécifiquement une espèce parasitaire particulière (à titre d’exemple : nombre de mérozoïtes produits, durée de chacune des phases, ou morphologie précise des différents stades…). Toutefois, à ces exceptions près, le cycle que nous allons développer sera valable pour tous les Plasmodium aviaires.

33 Le cycle de évolutif des espèces de Plasmodium est un cycle hétéroxène assez complexe : outre l’existence de plusieurs hôtes, les parasites se reproduisent selon différentes modalités et présentent plusieurs stades de développement morphologiquement distincts. Au cours du cycle, les Plasmodium se développent tour à tour chez un vertébré (en l’occurrence un oiseau dans le cadre de notre travail) et un vecteur arthropode appartenant à l’ordre des insectes diptères et à la famille des Culicidae (moustiques). Ce dernier appartient principalement aux genres Culex, Aedes, et Culiseta, mais aussi, pour certaines espèces de Plasmodium, à d’autres genres, comme par exemple Anopheles. Seules les femelles se nourrissent de sang et participent ainsi à la transmission de l’infection. La reproduction sexuée du parasite se fait chez le vecteur, ce qui en fait l’hôte définitif, tandis que l’oiseau est l’hôte intermédiaire.

Le cycle illustré de Plasmodium relictum est présenté sur la figure 4.

34 Figure 4 : cycle évolutif de Plasmodium relictum

(d’après VALKIUNAS, 2005)

I, II : mérogonie exoérythrocytaire primaire ; III : mérogonie érythrocytaire ; IV : mérogonie exoérythrocytaire secondaire ; 1 : sporozoïte dans une cellule réticulo-endothéliale ; 2, 3 : cryptozoïtes ; 4 : mérozoïte dans un macrophage ; 5, 6 : métacryptozoïtes ; 7 : mérozoïtes dans des érythrocytes ; 8 : gamétocytes ; 9 : mérozoïtes dans un érythrocyte ; 10, 11 : mérontes érythrocytaires ; 12 : mérozoïte dans une cellule endothéliale des capillaires ; 13, 14 : phanérozoïtes ; 15 : : mérozoïtes dans des érythrocytes ; 16 : gamétocytes ; 17 : macrogamète ; 18 : formation des microgamètes ; 19 : fécondation ; 20 : ookinète pénétrant dans la membrane péritrophique ; 21 : jeune ookyste ; 22, 23 : sporogonie ; 24 : sporozoïtes dans les glandes salivaires du vecteur.

35 • Chez l’oiseau

Lors de son repas, le culicidé femelle inocule des sporozoïtes dans la microcirculation sanguine et les tissus sous-cutanés de l’oiseau. Chez l’hôte intermédiaire, le développement se fait alors en plusieurs phases, que nous allons successivement détailler : une phase de mérogonie exoérythrocytaire pré-érythrocytaire (ou mérogonie exoérythrocytaire primaire), une phase de mérogonie érythrocytaire, une phase de mérogonie exoérythrocytaire post-érythrocytaire (ou mérogonie exoérythrocytaire secondaire), et une phase de formation des gamètes.

La mérogonie exoérythrocytaire primaire se déroule dans des cellules de l’hôte d’origine mésodermique, comme les cellules endothéliales des capillaires, ou les macrophages des tissus hématopoïétiques et lymphoïdes. Après leur inoculation par le vecteur, les sporozoïtes se développent dans les cellules réticulo-endothéliales∗ de nombreux tissus et organes, dont la peau. Les sporozoïtes se transforment en mérontes de première génération, les cryptozoïtes, que l’on retrouve fréquemment dans la rate. La mérogonie qui s’ensuit aboutit à la libération de mérozoïtes (moins de cent pour Plasmodium relictum) qui ne peuvent pas à ce stade infecter les cellules sanguines. Ils donnent donc une deuxième génération de mérontes exoérythrocytaires, les métacryptozoïtes, qui se développent dans les macrophages de nombreux organes. En général les métacryptozoïtes libèrent plus de mérozoïtes que les cryptozoïtes. Ces mérozoïtes sont cette fois- ci capables d’infecter les cellules de la lignée érythrocytaire et une partie d’entre eux est libérée dans le torrent sanguin, tandis qu’une autre donne de nouveaux métacryptozoïtes, entretenant un véritable « cycle » exo-érythrocytaire (différence notable avec la malaria des mammifères chez lesquels la mérogonie exoérythrocytaire ne constitue qu’une « phase », non répétitive). La période pré-patente, qui correspond au délai entre l’inoculation et la maturation de la première génération de métacryptozoïtes, n’excède en général pas 120 heures pour Plasmodium relictum.

Après leur invasion des globules rouges jeunes ou matures, les mérozoïtes prennent une forme plus ronde : on parle alors de trophozoïtes, qui acquièrent des pigments caractéristiques d’hémozoïne (issue du métabolisme de l’hémoglobine) et dont certains ont un aspect « en anneau » à cause de la présence d’une grande vacuole. Puis le noyau se divise (le trophozoïte devient méronte) et la multiplication asexuée (mérogonie érythrocytaire) aboutit à la formation de mérozoïtes dont le nombre varie en fonction de l’espèce parasitaire. La durée et la synchronisation de cette mérogonie peuvent également varier. Le cycle de mérogonie érythrocytaire se termine en général au bout de 24 à 36 heures. Certaines espèces ont une périodicité marquée, caractérisée par une importante synchronisation des mérogonies (Plasmodium cathemerium, Plasmodium gallinaceum, et Plasmodium matutinum), tandis que d’autres espèces ont des cycles moins synchronisés (Plasmodium relictum, Plasmodium rouxi, et Plasmodium vaughani). À noter

∗ Notons ici que la quasi totalité des auteurs utilise le terme un peu désuet de « système réticulo- endothélial » pour désigner les cellules dans lesquelles se développent les parasites. Les cellules de ce système sont de grande taille, d’aspect réticulaire, parfois agencées en réseau, mobiles, qui apparaissent exceptionnellement dans le sang, mais que l'on trouve normalement dans certains organes – comme la rate, les nœuds lymphatiques, ou encore la peau. Leur fonction de phagocytose est très importante. Toutefois, l’appellation de « système réticulo-endothélial » reste floue et englobe à la fois des cellules macrophagiques internes aux organes que nous venons de citer, des cellules endothéliales, et des cellules bordantes des nœuds lymphatiques. En raison de ces imprécisions et dans un souci de clarté, nous essaierons par la suite de citer le nom exact des cellules évoquées chaque fois que cette information sera disponible. 36 également que les Plasmodium aviaires peuvent exceptionnellement infecter des leucocytes ou des thrombocytes.

Une partie des mérozoïtes formés dans les globules rouges induit la poursuite de la mérogonie érythrocytaire puis la formation des gamétocytes, tandis qu’une autre pénètre dans les cellules endothéliales des capillaires de nombreux organes (dont le cerveau, la rate, les reins, et le foie) donnant lieu à la mérogonie exoérythrocytaire secondaire (apparition des phanérozoïtes). Il existe donc un échange de parasites entre le compartiment sanguin et les cellules endothéliales des vaisseaux. En outre, la mérogonie exoérythrocytaire secondaire peut également se faire à partir de mérozoïtes issus des métacryptozoïtes. Dans tous les cas, qu’elle se déroule à l’intérieur où à l’extérieur des globules rouges, la mérogonie aboutit toujours à une explosion de la charge infectieuse.

Selon les auteurs, l’apparition des gamétocytes se fait après plusieurs mérogonies érythrocytaires (SPRINGER, 1997), ou de façon concomitante à celle des stades agamiques (VALKIUNAS, 2005). Toujours est-il que les gamétocytes sont issus de la transformation intra- érythrocytaire d’un mérozoïte et aboutiront (après ingestion du sang par le moustique) à la formation des gamètes. Si les mérontes érythrocytaires peuvent se développer dans toutes les cellules de la lignée rouge, les gamétocytes sont eux retrouvés majoritairement dans les érythrocytes matures. On distingue les macrogamétocytes, (qui donneront un gamète femelle, ou macrogamète) et les microgamétocytes (qui donneront des gamètes mâles, ou microgamètes).

• Chez le vecteur

Peu de temps après le repas sanguin, la gamétogénèse débute dans l’intestin du moustique. Les gamétocytes sont alors libérés de leurs cellules-hôtes. La variation des concentrations en dioxygène et en dioxyde de carbone lors du passage du sang de l’oiseau au moustique est le principal stimulus induisant la formation des gamètes. Chaque macrogamétocyte donne un macrogamète, de forme ronde, tandis que chaque microgamétocyte donne huit microgamètes motiles munis de flagelles filiformes. La fécondation, par anisogamie, a lieu en milieu extracellulaire et aboutit à la formation d’un zygote (seule structure diploïde du cycle) qui se transforme en un ookinète allongé, motile et rapidement haploïde (la réduction chromosomique se fait par l’intermédiaire d’une méiose, dès les premiers stades de développement de l’ookinète). Chez Plasmodium relictum, l’apparition des ookinètes dans l’intestin du moustique se produit, à 24°C, au bout de 24 à 48 heures. Les ookinètes traversent alors une membrane péritrophique puis l’épithélium intestinal et viennent se loger sous la lame basale, où ils s’arrondissent et se transforment en ookystes, qui s’entourent chacun d’une paroi faite de tissus de l’hôte. C’est à ce moment que débute la sporogonie, au cours de laquelle des centaines de sporozoïtes (corps unicellulaires et de forme allongée) sont formés à l’intérieur de chaque ookyste. Lors de cette maturation, la taille des ookystes augmente notablement, pour atteindre un diamètre d’environ 40 µm, voire davantage. La lame basale est alors complètement étirée, ce qui rend les ookystes visibles en surface de l’intestin. Plusieurs centres germinatifs sont formés et la quantité des sporozoïtes libérés dépend des espèces du Plasmodium et du moustique, de la température entre autres facteurs identifiés. Toutefois, la température semble être le plus important des facteurs abiotiques avec des valeurs optimales varient selon les espèces de Plasmodium (dans le cas de Plasmodium relictum, il s’agit d’environ 25°C). À des températures plus élevées, la viabilité des sporozoïtes diminue et – à l’inverse – les ookystes dégénèrent si les moustiques sont maintenus dans un environnement à 4°C. Chez Culex pipiens et à 24°C, la sporogonie de Plasmodium relictum s’achève sept jours après l’ingestion des gamétocytes matures. La rupture des ookystes libère dans l’hémocoele les sporozoïtes, qui gagnent les glandes salivaires du moustique. On les retrouve d’abord à l’extérieur 37 des cellules, puis à l’intérieur, puis, après passage trans-cellulaire, dans les conduits de la glande. Ils y persistent plusieurs semaines, jusqu’à ce que l’infection de nouveaux oiseaux lors des repas sanguins boucle le cycle.

Comme nous l’avons déjà discuté un peu plus haut, le cycle décrit ci-dessus peut s’appliquer à toutes les espèces de Plasmodium, mais certaines espèces présentent quelques particularités, comme celles du sous-genre Huffia, pour lesquelles la mérogonie exoérythrocytaire se déroule majoritairement dans les cellules du système hématopoïétique et beaucoup plus rarement dans les cellules du système réticulo-endothélial.

6. Spécificité d’hôte et co-évolution hôte - parasite

a) Chez l’hôte intermédiaire Nous avons déjà vu que les Plasmodium aviaires ont une spécificité d’hôte peu marquée pour les espèces d’oiseaux (LEVINE, 1985). Le fait qu’un parasite ne soit retrouvé que chez une seule espèce hôte indique que ces espèces sont associées depuis longtemps (concept de co- évolution), tandis que le fait qu’un parasite ait un spectre d’hôtes large signifie au contraire qu’il y a eu beaucoup de changements d’hôtes. Ces changements d’hôtes intermédiaires étant souvent associés à des modifications de la virulence du parasite, on comprend l’importance du parasite dans l’évolution de l’espèce hôte (BENSCH et al., 2000).

L’étude par P.C.R. de séquences codantes chez diverses espèces de parasites, et leur comparaison entre elles d’une part et avec la phylogénie des espèces d’oiseaux chez lesquelles elles ont été retrouvées d’autre part, permet de mieux cernées les différentes interactions passées entre un parasite et son (ses) hôte(s). Si les arbres phylogénétiques des hôtes et des parasites sont superposables, cela indique une co-spéciation et une spécificité d’hôte marquées. À l’inverse, un manque de correspondances entre les arbres indique que les changements d’hôte ont été nombreux dans le passé, et que les hôtes potentiels courent le risque d’être infectés par de nouveaux parasites, ce qui pourrait avoir des conséquences sur la taille de la population et l’évolution de l’espèce hôte (BENSCH et al., 2000).

Une étude de BENSCH et al. (2000) montre une faible correspondance entre l’arbre phylogénétique des Plasmodium (obtenu par P.C.R. et séquençage du gène codant le cytochrome b) et celui des oiseaux chez lesquels ils ont été retrouvés (les auteurs se sont basés sur plusieurs classifications phylogénétiques des oiseaux, publiées par Richman & Price, Helbig & Seibold, Sibley & Ahlquist, et Sheldon & Gill). Ceci suggère donc l’existence de plusieurs changements d’hôtes par le passé et le risque potentiel pour les oiseaux d’être infectés par de nouveaux Plasmodium. Toutefois, les auteurs proposent d’autres explications à l’existence de dissemblances entre les arbres : on pourrait par exemple imaginer un hôte hébergeant (à la suite d’une duplication) plusieurs lignées d’un parasite et qui donnerait plusieurs lignées d’hôtes. Certaines lignées parasitaires pourraient ainsi manquer dans certaines lignées d’hôtes soit depuis le début (« missing the boat »), soit parce qu’elles s’y seraient éteintes. Par ailleurs, toujours dans la même étude, BENSCH et ses collaborateurs remarquent que si les séquences codantes varient de 7,2 % entre les différents haplotypes de Plasmodium, les séquences d’acides aminés sont elles identiques, ce qui montre que les variations touchent principalement les premières et dernières positions des codons, induisant des mutations silencieuses.

38 Dans une étude plus récente et plus complète, toujours basée sur une P.C.R. et un séquençage du gène codant le cytochrome b, RICKLEFS et al. (2004) évoquent eux aussi des changements d’hôtes, chacune des familles d’oiseaux sur lesquels l’étude a été réalisée abritant des espèces de Plasmodium situées dans de nombreuses branches de l’arbre phylogénétique du parasite. Ces changements d’hôtes seraient favorisés dans les zones où les vecteurs sont souvent retrouvés. Inversement, un même haplotype a été isolé chez 16 espèces différentes d’oiseaux, au sein de plusieurs familles, ce qui confirme que la spécificité d’hôte n’est pas importante chez les espèces de Plasmodium. De plus, l’analyse statistique de l’arbre montre que, malgré quelques associations significatives entre hôte et parasite, il existe des phénomènes de duplication et de disparition de clades, ce qui indique que la co-spéciation est ici un processus très limité, qui ne permet pas en tout cas d’expliquer la répartition des parasites du genre Plasmodium chez leurs hôtes intermédiaires (RICKLEFS et al., 2004), contrairement à ce que pouvaient suggérer les résultats d’une précédente étude (RICKLEFS & FALLON, 2002). Nous pouvons donc retenir, dans un premier temps, que le changement d’hôte est bien le phénomène le plus important dans la diversification évolutive des Plasmodium, bien que la duplication et la codivergence y jouent probablement un rôle important (RICKLEFS et al., 2004).

Le problème est en réalité plus compliqué que cela. En effet, la restriction de certaines lignées parasitaires à des clades d’hôtes plaide en faveur d’une cospéciation. Toutefois, le nombre élevé de changement d’hôtes observé entre des espèces aviaires parfois éloignées phylogénétiquement, pourrait rendre difficile la mise en évidence statistique d’un phénomène de codivergence entre les lignées parasitaires (RICKLEFS et al., 2004). D’autre part, des études génétiques, menées par les mêmes auteurs (RICKLEFS & FALLON, 2002), suggèrent que le gène du cytochrome b des parasites évolue – étonnamment – moins vite que celui de leurs hôtes, et pourrait ainsi se révéler trop peu discriminant pour pouvoir distinguer les parasites de manière fiable et précise. Il n’est donc pas exclu qu’un même haplotype, retrouvé ici chez des hôtes éloignés, corresponde en fait à des parasites différents et spécifiques de leur hôte. Inversement, il n’est pas exclu non plus, en considérant que le processus de spéciation (isolement reproductif) prend un certain temps, que plusieurs haplotypes puissent correspondre à une seule et même espèce de Plasmodium. [Rappelons ici que la définition d’une espèce uniquement sur des critères phylogénétiques est quelque peu arbitraire : des pourcentages de divergence de séquences d’ADN sont fixés au-dessus desquels on considère que deux haplotypes correspondent à deux espèces. Une valeur communément admise est celle de 3 % ; toutefois elle semble peu adaptée aux espèces de Plasmodium dont les séquences divergeraient de seulement 1% (RICKLEFS et al., 2004).] Une autre hypothèse recevable serait au contraire d’admettre que la formation de nouvelles espèces parasitaires puisse se faire immédiatement après le changement d’hôte, facilitée qu’elle serait par la sélection de mutations qui permettent au parasite d’échapper à la réponse immunitaire de l’hôte. Enfin, si la présence, chez un même hôte, de lignées parasitaires proches évoque en premier lieu l’existence de phénomènes de duplication, le fait que d’autres hôtes présentent eux aussi ces mêmes lignées parasitaires nous amène à envisager un autre scénario : on pourrait imaginer un premier changement d’hôte, suivi d’une période de spéciation du parasite, puis un retour fréquent à l’hôte d’origine (RICKLEFS et al., 2004).

Les relations entre les Plasmodium et leurs hôtes sont donc très complexes, et si quelques grandes interactions semblent avérées (nombreux changements d’hôtes), de plus amples études sur le séquençage des lignées parasitaires permettront certainement de préciser leur phylogénie et de mieux comprendre l’ensemble de ces phénomènes (RICKLEFS et al., 2004).

En ce qui concerne la variation de virulence lorsque le parasite passe d’une espèce hôte à une autre, plusieurs hypothèses sont là aussi envisageables. La plus conventionnelle consiste à 39 estimer que la virulence du parasite décroît au fur et à mesure qu’il se développe chez une même espèce sur plusieurs générations (et qu’elle est donc maximale peu après un changement d’hôte). Un exemple connu allant dans ce sens est celui des infections à Plasmodium chez les oiseaux de l’île d’Hawaï∗. La diminution de la pathogénicité résulterait d’une double sélection, à la fois sur le système immunitaire de l’hôte et sur le parasite lui-même (la perte de virulence permettant une meilleure transmission entre les hôtes). Toutefois, une autre hypothèse suggère, au contraire, que la virulence des parasites augmente en raison de la pression de sélection qui s’exerce sur plusieurs lignées parasitaires en compétition chez un même hôte. Dans le cas d’une transmission par l’intermédiaire d’un vecteur, comme c’est le cas pour Plasmodium, la virulence pourrait faciliter la transmission puisque les individus infectés sont souvent abattus, donc immobiles, et plus accessibles au vecteur (BENSCH et al., 2000). Notons d’ailleurs qu’au sens strict, le terme de virulence désigne la capacité à se multiplier chez l’hôte, ce qui signifie donc une production accrue d’éléments potentiellement infectants.

b) Chez l’hôte définitif Comme nous l’avons évoqué lors de la description du cycle, ce sont les vecteurs qui jouent le rôle d’hôte définitif des Plasmodium. Toutefois, leurs relations avec le parasite sont beaucoup moins connues que pour l’hôte intermédiaire. L’ensemble des genres de diptères pouvant héberger les parasites est repris par VALKIUNAS, dont les travaux ont servi de support au tableau 4 ci- après.

Tableau 4 : nombre d’espèces de Plasmodium aviaires par famille et genre de diptère

(d’après VALKIUNAS, 2005)

Famille et genre Nombre d’espèces de Plasmodium décrites

Simuliidae 0

Ceratopogonidae 0

Culicidae 37

Aedes 5

Anopheles 5

Armigeres 1

∗ Pour information, les oiseaux de l’île ont contracté la maladie au début du siècle dernier, suite à l’introduction, en provenance d’Asie, d’oiseaux infectés et des vecteurs, en l’occurrence Aedes albopictus et Culex quinquefasciatus. La malaria a causé l’extinction de plusieurs espèces puis les populations autochtones ont progressivement acquis une résistance à la maladie, même si les parasitémies y sont toujours plus élevées que chez les espèces introduites. Certains oiseaux, dont les populations avaient diminué voyaient au début des années 1990 leur nombre augmenter (TOFT et KARTER, 1990). 40 Famille et genre Nombre d’espèces de Plasmodium décrites

Culex 15

Culiseta 6

Mansonia 3

Psorophora 1

Wyeomyia 1

Hippoboscidae 0

Précisons tout d’abord que les vecteurs d’un certain nombre d’espèces de Plasmodium n’ont pas été déterminés et que – par conséquent – ce tableau ne donne que des informations partielles. Toutefois, nous pouvons remarquer que les Plasmodium ne se développent a priori que chez les espèces de la famille des culicidés (à la différence des autres hémosporidies). Pour la plupart d’entre eux, la transmission est assurée par des vecteurs du genre Culex, mais il n’est pas rare de les retrouver également chez Culiseta, Aedes, Anopheles, et Mansonia.

Par ailleurs, la large distribution géographique des espèces de Plasmodium implique – pour un même parasite – une grande variété de vecteurs exploitant des écosystèmes variés. En guise d’exemple, Plasmodium relictum peut se développer chez au moins 26 espèces de culicidés appartenant aux genres Aedes, Anopheles, Armigeres, Culex, Culiseta, et Mansonia, tandis que Plasmodium gallinaceum peut, lui, infecter pas moins de 40 espèces de moustiques. À l’inverse, il existe certaines espèces plus sélectives, comme Plasmodium juxtanucleare, dont la sporogonie ne peut être expérimentalement induite que chez les moustiques du genre Culex. En règle générale, les Plasmodium peuvent se développer chez 1 à 2 genres de culicidés (VALKIUNAS, 2005).

Une étude, parue en 2004, a montré que l’infection d’Aedes aegypti par Plasmodium gallinaceum compromettait l’efficacité de la réponse immunitaire d’encapsulation du moustique. Les auteurs suggèrent l’existence de mécanismes d’immunosuppression direct et indirect. L’immunosuppression directe pourrait ressembler à celle induite par Yersinia pestis, qui altère le cytosquelette des cellules hôtes et inhibe ainsi la phagocytose. L’existence de tels phénomènes suggèrerait un haut degré d’évolution convergente dans la relation hôte-parasite. Une autre possibilité pourrait être le blocage de l’expression d’un gène codant un peptide riche en leucines, dont l’inactivation empêche, chez Anopheles gambiae, la mélanisation∗ de Plasmodium berghei. L’immunosuppression indirecte pourrait être consécutive à une action de la réponse immunitaire de l’hôte intermédiaire sur celle de l’hôte définitif (l’ingestion de plasma de poulets infectés diminue l’efficacité de la réponse immune du moustique). Le transfert des IgY aviaires (équivalentes aux

∗ Le terme de « mélanisation » désigne un mécanisme imunitaire inné chez les arthropodes, caractérisé par une production et un dépôt de pigments de mélanine autour des agents infectieux et parasitaires. Ce phénomène d’encapsulation provoque la mort des pathogènes (limitation de leur accès aux nutriments, propriétés cytotoxiques de la mélanine) et protège les cellules de l’hôte (CHRISTENSEN et al., 2005). 41 IgG des mammifères) dans l’hémolymphe du vecteur pourraient expliquer le phénomène observé. De même, l’anémie induite par la lyse érythrocytaires diminuerait la réponse d’encapsulation (qui n’est efficace que chez les moustiques qui ont pris un repas sanguin complet), mais il ne s’agit là que d’hypothèses. Quoi qu’il en soit, l’ensemble de ces mécanismes implique des interactions complexes entre les systèmes immunitaires des deux hôtes, de même qu’entre le parasite et le vecteur. Par exemple, il serait inexact de conclure que les moustiques qui possèdent la réponse immunitaire d’encapsulation la plus marquée sont les mieux protégés, ce qui pourrait pourtant paraître trivial. En effet, la réponse immunitaire a un coût, et une plus grande mortalité a été constatée chez des moustiques possédant une réponse d’encapsulation intense. L’immunosuppression induite par Plasmodium pourrait donc – dans le cas d’une infection qui ne provoque pas trop de dommages directs – favoriser la survie du parasite, mais également celle du vecteur, en diminuant le coût de la réponse immunitaire. Enfin, un autre phénomène témoignant d’une évolution complexe entre Plasmodium et son hôte définitif avait déjà été établi par les auteurs de cette étude : le parasite a une influence sur le comportement alimentaire du moustique, se traduisant par une diminution de la mortalité du vecteur, et une amélioration de la transmission du parasite (BOËTE et al., 2004).

7. Particularités de l’infection

a) Phases de l’infection et variations de la parasitémie (d’après VALKIUNAS, 2005)

En général, les oiseaux infectés par un Plasmodium conservent longtemps le parasite (pendant plusieurs années ou durant toute la vie) et deviennent une source d’infection potentielle pour les vecteurs.

On distingue 5 phases dans l’infection d’un oiseau par un Plasmodium :

• la période pré-patente, pendant laquelle le parasite se développe en dehors du compartiment sanguin,

• la phase aiguë, qui se caractérise par l’apparition des parasites dans le sang et une hausse brutale de la parasitémie,

• la phase de crise, pendant laquelle la parasitémie atteint son paroxysme,

• la phase chronique, caractérisée par une parasitémie faible et persistante,

• la phase latente, au cours de laquelle la parasitémie, après avoir brutalement chuté devient nulle, sous l’effet de la réponse immunitaire de l’hôte. Le parasite disparaît alors complètement du sang périphérique, pour ne persister que dans les organes internes.

Un graphique, présentant l’évolution de la parasitémie suite à l’infection d’un oiseau par un Plasmodium est présenté sur la figure 5.

42 Figure 5 : variations de la parasitémie à Plasmodium chez les oiseaux en fonction du temps

(d’après VALKIUNAS, 2005)

I : période pré-patente (parasite présent dans les organes internes) ; II : parasitémie primaire ; III : phase de latence (parasites absents du compartiment sanguin, mais persistant dans les organes internes) ; IV : parasitémie secondaire ; a : phase aiguë de l’infection (comprenant la phase de crise) ; b : phase de chronicité ; c : phase de recrudescence.

La durée de la période pré-patente varie en fonction des espèces (SMYTH, 1994). Nous rappellerons ici qu’elle n’excède généralement pas 120 heures pour Plasmodium relictum (VALKIUNAS, 2005) en précisant toutefois que ces durées sont susceptibles de fortement varier en fonction de la taille de l’inoculum (SMYTH, 1994). La phase aiguë de l’infection peut durer de quelques jours à plusieurs semaines, voire plusieurs mois, en fonction de l’espèce et de la souche de parasite et de l’espèce d’oiseau entre autres facteurs. Chez les individus qui survivent à cette phase aiguë succède la phase chronique de l’infection, dont la durée est très variable. Très peu de parasites sont alors retrouvés dans le sang, mais l’affaiblissement des défenses immunitaires de l’hôte peut conduire fréquemment à une augmentation à court terme de la parasitémie (recrudescence). La phase latente fait souvent suite à la phase chronique : les parasites finissent par disparaître totalement du compartiment sanguin (ils persistent alors dans les organes internes). Enfin, une parasitémie secondaire, souvent brève, peut se produire au moment de la période de reproduction de l’oiseau, ce qui favorise le maintien et la propagation de l’infection.

L’apparition d’une parasitémie secondaire consécutive à une période de latence définit ce que l’on appelle le phénomène de rechute qui, pour les espèces de Plasmodium, est associé à une reprise de la mérogonie à la fois exoérythrocytaire et érythrocytaire. Ces rechutes peuvent être potentiellement fréquentes (PEIRCE, 2000). Lors d’augmentation de la parasitémie consécutive à la réactivation de la seule mérogonie érythrocytaire, on parle de recrudescence mais pas de rechute. Il peut donc être difficile de distinguer rechutes et recrudescences chez des oiseaux naturellement infectés puisque la parasitémie est basse lors de la phase de chronicité et qu’il n’est pas toujours 43 possible de retrouver les parasites dans le sang à cette période (risque de confusion avec une phase de latence) (SMYTH, 1994 ; VALKIUNAS, 2005).

Une des particularités du cycle de Plasmodium chez les oiseaux réside dans le fait que la mérogonie exoérythrocytaire peut se faire à partir de mérozoïtes issus des mérontes intra- érythrocytaires (à la différence des Plasmodium infectant les mammifères). Ainsi, a-t-on pu montrer expérimentalement que des oiseaux pouvaient présenter une rechute suite à l’inoculation de sang provenant d’autres oiseaux infectés, ce qui est impossible chez les mammifères (dont les rechutes ne font suite qu’à l’inoculation de sporozoïtes).

Le rôle des sporozoïtes dans l’apparition des rechutes chez les oiseaux n’est pas encore bien connu. Il est clair cependant qu’ils ne sont pas le seul stade du parasite à intervenir dans ces phénomènes, et que les mérozoïtes issus des mérontes érythrocytaires et exoérythrocytaires jouent également un rôle important. Il se pourrait aussi que les trophozoïtes et les mérontes exoérythrocytaires ralentissent leur développement pour constituer un réservoir permettant le maintien de la parasitémie chronique et les rechutes. Une fois encore, il est compliqué d’étayer ces hypothèses puisque ces stades inactifs sont difficilement retrouvés chez les oiseaux infectés naturellement, en raison de leur petite taille et de la faible intensité de l’infection. De plus, les variations, au sein d’un même genre parasitaire, de la forme et de la localisation des mérontes exoérythrocytaires responsables des rechutes, rendent l’étude de ces phénomènes encore plus délicate.

Enfin, signalons le rôle de la rate et du système réticulo-endothélial dans le contrôle des rechutes. Celui-ci a été mis en évidence par la réalisation de splénectomies, qui ont provoqué des rechutes à Plasmodium gallinaceum, Plasmodium juxtanucleare, et Plasmodium cathemerium.

b) Variations saisonnières de l’infection Plusieurs facteurs sont nécessaires au déroulement complet et productif du cycle parasitaire : citons la présence de vecteurs et d’hôtes réceptifs, ainsi que des conditions environnementales satisfaisantes, notamment au niveau de la température et de l’humidité, qui jouent un rôle dans la reproduction du vecteur et le développement du parasite chez le diptère influençant ainsi l’efficacité de transmission de l’infection.

Lorsque les changements climatiques sont peu marqués d’une saison à l’autre, et que les conditions citées ci-dessus sont réunies en permanence, les Plasmodium peuvent être transmis tout au long de l’année. C’est ce qui se produit dans certains pays au climat doux et humide, en général dans les régions tropicales et subtropicales, où les vecteurs sont toujours actifs et où les oiseaux sont sédentaires (le Vénézuela en est un bon exemple et la transmission de la malaria aviaire y a lieu toute l’année). Dans ce premier cas de figure, il peut y avoir des rechutes à n’importe quel moment de l’année, dont les mécanismes sont peu connus. Cela arrive notamment pour des espèces de Plasmodium qui, grâce aux conditions climatiques adéquates, peuvent être transmises pendant de très longues périodes. Le stress et des baisses de l’immunité pourraient favoriser ces rechutes.

À l’inverse, dans les régions où les changements saisonniers sont marqués, la transmission de Plasmodium s’interrompt en général pendant les périodes où l’activité des vecteurs diminue, et elle ne reprend que lorsqu’ils redeviennent actifs. Aux latitudes élevées, la période de transmission se situe pendant les saisons chaudes, tandis qu’aux latitudes plus faibles, elle a lieu pendant la saison humide qui suit les fortes précipitations. À ces périodes-là, les vecteurs réapparaissent, leur population augmente, et les oiseaux entrent dans leur saison de reproduction, d’où l’apparition de

44 jeunes, très réceptifs à l’infection, ce qui permet une diffusion rapide du parasite. Le pic de prévalence chez les oiseaux ne se situe pas au même moment dans les différents territoires en raison de tous les facteurs évoqués ci-dessus. En général, pour les régions situées au centre et au nord de l’holarctique (Cf. annexe 1), il a lieu dans la seconde moitié de l’été. Une fois encore, les rechutes jouent un rôle important dans la transmission de la maladie : elles sont dans ce cas de figure-ci synchronisées avec l’apparition des vecteurs et le début de la période de reproduction. Les rechutes saisonnières sont assez bien connues (notamment pour Plasmodium relictum), et sont caractéristiques de la plupart des espèces de Plasmodium transmises dans les pays au climat tempéré. Il arrive parfois qu’elles soient la seule source de parasite au moment où la période de transmission commence à peine. Au printemps, le pouvoir infectieux des gamétocytes vis-à-vis du vecteur augmente par rapport à la période de chronicité (ceci a été montré expérimentalement pour Plasmodium relictum) et la synchronisation des rechutes ne dépend pas du temps écoulé depuis la première infection des oiseaux, mais de facteurs abiotiques qui influencent indirectement leur organisme, comme l’augmentation de la durée des jours, dont il a été montré qu’elle provoquait une hausse de la quantité d’hormones sexuelles circulantes, elle-même responsable du déclenchement de la rechute. Ce phénomène peut être reproduit expérimentalement, en augmentant artificiellement la photopériode, ou en injectant des hormones sexuelles et de la corticostérone (VALKIUNAS, 2005).

Dans une étude reprise par WOOD & COSGROVE (2006), PÉREZ-TRIS & BENSCH (2005) s’intéressent aux relations qu’il pourrait y avoir entre les modalités de la transmission de Plasmodium et la prévalence locale de l’infection. Ils remarquent eux aussi des différences marquées dans les stratégies de transmission de parasites appartenant à des lignées pourtant proches : certains sont transmis tout au long de l’année et, grâce aux mouvements migratoires des oiseaux, ont une distribution géographique très large, tandis que d’autres ne sont transmis que pendant la saison de reproduction et ont une distribution géographique plus restreinte. En ce qui concerne les lignées transmises durant toute l’année, les auteurs évoquent le peu d’exigences de l’hémoparasite en matière de vecteurs et de conditions climatiques. Mais surtout, ils ont noté une différence significative dans la prévalence locale de l’infection en fonction du mode de transmission : la prévalence des infections dues aux parasites transmis à la fois l’été et l’hiver est significativement plus importante que celle des parasites transmis uniquement pendant la saison chaude. Il existe donc un lien entre la durée de transmission, la distribution géographique des parasites et la prévalence des infections. Une des hypothèses proposées est qu’une population de Plasmodium circonscrite à une seule population d'hôtes ne pourra exprimer une modification de son caractère infectieux qu'au moyen des mutations et des recombinaisons génétiques. En revanche, une population de Plasmodium dont la répartition géographique est large et qui est ainsi confrontée à des hôtes possédant différents niveaux de résistance à l'infection, sera davantage à même de donner une infection à prévalence locale élevée. Une autre hypothèse serait que la saisonnalité de la transmission des Plasmodium soit fonction de leur capacité à échapper à la réponse immunitaire de l’hôte. Ainsi, les parasites facilement reconnus par le système immunitaire ne pourraient se transmettre que lors d’épisodes d’immunodéficience de leur hôte (par exemple, pendant la période de reproduction), tandis que les parasites capables d’échapper à la réponse immunitaire pourraient produire des gamétocytes infectieux en grande quantité, et pendant des périodes beaucoup plus longues (y compris au moment où les oiseaux atteignent les territoires de migration, ce qui expliquerait à la fois la continuité de leur transmission, leur large répartition géographique (via les flux migratoires) et une prévalence locale plus élevée (plus de gamétocytes infectieux).

Une autre étude, de FALLON et al. (2004), a montré que la prévalence des infections par des hémosporidies aviaires sur les îles de St Lucia et Puerto Rico (Antilles) ne variait pas en

45 fonction de la saison. Les auteurs notent que ces résultats diffèrent de la théorie communément admise qui voudrait que la prévalence des infections augmente au cours de la saison de reproduction. Selon eux, ceci est dû au fait que la plupart des études précédentes utilisaient l’examen visuel des parasites pour estimer la prévalence, alors que, dans leur cas, c’est la P.C.R. qui a été préférée. La P.C.R. étant beaucoup plus sensible, elle révèlerait mieux la présence ou l’absence d’infection (les infections très faibles n’étant pas détectées à la lecture des frottis sanguins), tandis que les fluctuations de l’intensité de l’infection (parasitémie) seraient moins facilement mises en évidence que lors d’une inspection visuelle des parasites. De plus, les chercheurs de l’université de Saint-Louis (Missouri, États-Unis d’Amérique) rappellent que les variations spatio-temporelles de la prévalence des infections par les hémosporidies aviaires sont plus prononcées dans les régions tempérées que tropicales, rejoignant ainsi la théorie proposée par VALKIUNAS (2005, Cf. supra). FALLON et al. (2004) ont également utilisé le gène codant le cytochrome b pour caractériser plusieurs lignées parasitaires et estimer leur stabilité dans le temps. Si les lignées d’hémosporidies avaires présentes sur les deux îles se sont avérées relativement stables sur de courtes périodes (pratiquement pas de variations saisonnières de la prévalence des différentes lignées au cours d’une même année), des analyses réalisées à un intervalle de presque une décénie (8 à 9 ans) ont révélé la disparition d’une lignée parasitaire à St Lucia, et l’apparition d’une nouvelle lignée à Puerto Rico. Dans le deuxième cas, l’émergence de la nouvelle lignée a coïncidé avec une baisse significative de la prévalence de deux autres lignées, suggérant, selon les auteurs, qu’il existerait une limite maximale au nombre d’hôtes que les hémosporidies aviaires peuvent infecter. La composition des communautés parasitaires ainsi que la fréquence des lignées varieraient donc à la fois dans le temps et dans l’espace, tandis que certains parasites pourraient infecter de nouveaux hôtes suite à la disparition d’autres lignées. Toutefois, si les observations de FALLON et al. reflétaient la dynamique réelle des populations parasitaires sur les deux îles étudiées, la totalité des hémosporidies présentes sur ces îles se renouvellerait au bout d’un siècle environ. Ceci entrerait alors en contradiction avec les relations historiques qui existent entre les parasites et leurs hôtes, à l’origine de leur co-évolution. Il est donc plus probable que les populations parasitaires restent stables, les changements constatés n’intéressant que sporadiquement un nombre limité de lignées. Une autre hypothèse serait la persistence des lignées parasitaires au- dessous des seuils actuels de détection.

c) Influence de l’âge (d’après VALKIUNAS, 2005)

Généralement, les auteurs distinguent 2 catégories d’âge chez les oiseaux, que l’on différencie par leur plumage : les jeunes (oisillons, juvéniles et subadultes), qui correspondent dans la plupart des cas aux individus de moins d’un an, et les adultes. Les études portant sur l’intensité de la parasitémie au sein de ces deux tranches d’âge étant jusqu’à présent peu recevables (il n’a pas été tenu compte des variations cycliques de la parasitémie qui – comme nous l’avons vu plus haut – peuvent être considérables), nous ne nous intéresserons ci-après qu’à la prévalence de l’infection chez ces deux catégories d’animaux.

À ce propos, les données disponibles dans la littérature et reprises par VALKIUNAS (2005) sont pour le moins divergentes, pour ne pas dire contradictoires : certains auteurs indiquent que la prévalence des infections aux hémosporidies est plus importante chez les adultes, d’autres notent qu’elle est plus élevée chez les jeunes, tandis qu’un troisième groupe remarque, lui, qu’il n’y a pas de différence significative. Une telle discordance s’explique certainement par l’intervention de nombreux facteurs qui peuvent biaiser la comparaison des études : citons la biologie des différentes

46 espèces d’oiseaux et de moustiques, les facteurs abiotiques dont l’influence sur la prévalence de l’infection a déjà été évoquée, et enfin la qualité-même de chacune de ces études.

Toutefois, en dépit de ces désaccords, quelques informations peuvent être retenues : la survie des espèces de Plasmodium se fait essentiellement grâce à leur maintien dans l’organisme des oiseaux. En effet, les vecteurs ont une durée de vie limitée, et les parasites n’y persistent que pendant une courte période, au moment où la transmission est active. À l’inverse, un oiseau qui survit à la phase aiguë de l’infection peut abriter le parasite pendant une longue période (plusieurs mois à plusieurs années). Les petits passereaux, dont la faune de Plasmodium est la plus riche parmi les oiseaux, ont une espérance de vie d’un an et demi à deux ans et demi seulement, ce qui suggère que l’élaboration de mécanismes permettant une longue persistance des parasites chez l’adulte n’est pas suffisante pour assurer leur survie, et que, par conséquent, l’infection régulière des juvéniles est importante pour la survie du parasite. Ainsi, au sein d’une population d’oiseaux, il y a toujours certains adultes qui sont infectés ou réinfectés, et une partie des jeunes qui l’est aussi, inévitablement. En outre, les juvéniles sont fortement prédisposés à l’infection.

Néanmoins, il ne faut pas non plus négliger l’importance des adultes qui constituent une partie toujours stable des populations aviaires, sont eux aussi réceptifs à l’infection, et sont plus longtemps en contact avec les vecteurs que les jeunes. Ils ont de ce point de vue-là plus de chance d’être infectés et, surtout, de maintenir l’infection dans des périodes peu favorables à la transmission du parasite. La plupart d’entre eux sont porteurs chroniques et leur infection revêt en général une forme relativement bénigne.

d) Influence des facteurs biotiques (d’après VALKIUNAS, 2005)

Les particularités biologiques des différentes espèces d’oiseaux favorisent, ou au contraire freinent leur exposition aux vecteurs et ont donc une influence sur la prévalence de l’infection. Ces différents points sont récapitulés ci-dessous :

• les oisillons qui restent longtemps dans le nid (plus de 14 à 16 jours) sont plus souvent infectés que les autres. Ceci serait dû au fait que les oisillons un peu plus âgés sont plus facilement accessibles et plus attractifs vis-à-vis des vecteurs. Les oisillons qui restent –au contraire – moins de 14 jours dans leur nid n’ont en général pas le temps, pendant cette période, d’être infectés par le parasite, même dans les régions où la transmission est active. Ceci a été montré expérimentalement. Ainsi, VALKIUNAS distingue deux groupes d’oiseaux en fonction de la durée – courte ou longue – du séjour des jeunes dans le nid. Les espèces du premier lot présentent un risque moindre de voir les juvéniles contracter l’infection, mais après leur départ du nid, les individus des deux groupes sont tout aussi susceptibles de contracter l’infection lors de la saison de reproduction.

• la taille des oiseaux influence leur probabilité d’être infectés : dans des conditions identiques, un plus grand nombre de vecteurs vient se nourrir sur un oiseau de grande taille, ce qui augmente la probabilité de l’inoculation d’un sporozoïte. Néanmoins, l’importance de ce phénomène est à relativiser, en raison de l’influence de nombreux autres facteurs ; la prévalence des infections chez des espèces phylogénétiquement proches et de taille comparable peut varier significativement.

47 • les nids fermés, où encore situés au niveau du sol diminueraient la probabilité d’infection des oiseaux. Dans le premier cas, il existerait une protection mécanique des oisillons et des adultes en train de couver, tandis que dans le second, la localisation du nid correspondrait à une zone de moindre activité des vecteurs.

• la diminution de l’activité locomotrice des oiseaux lors de la période de nidification augmente la probabilité de leur infection (les individus immobiles sont plus facilement attaqués par les vecteurs). Au sein des espèces d’oiseaux pour lesquelles l’activité des deux sexes n’est pas la même à cette période, ce phénomène peut être responsable d’une différence de prévalence chez les mâles et les femelles.

• la probabilité d’infection est moindre chez les oiseaux marins et côtiers : l’activité des vecteurs y est plus réduite, et ils y passent moins de temps en raison d’un manque d’endroits permettant leur reproduction et d’un climat souvent froid ou venteux, particulièrement sur les îles. Cependant, il existe des exceptions à cette règle, et les oiseaux marins et côtiers peuvent être facilement infectés par un Plasmodium s’ils sont introduits dans une région enzootique (c’est notamment le cas des manchots, que nous allons détailler un peu plus loin).

• la présence de l’homme dans les régions où se trouvent les oiseaux est corrélée à une diminution de la probabilité de leur infection, en raison de l’élimination ou de la diminution de la densité des vecteurs due à la pollution et à l’utilisation des insecticides ou des pesticides.

• un mode de vie colonial des oiseaux dans les régions où les parasites sont activement transmis est responsable d’une augmentation de la prévalence de l’infection et de la survenue d’épisodes mortels chez les juvéniles. Toutefois, le seul mode de vie colonial ne suffit pas à assurer la propagation de l’infection, et l’intervention d’autres facteurs est nécessaire. Ainsi, il existe de nombreuses espèces d’oiseaux ayant un mode de vie colonial chez lesquelles les infections à Plasmodium n’ont pas, ou peu, été détectées.

En conclusion, retenons que, si les informations ci-dessus ont l’avantage d’être concises et de permettre une meilleure compréhension de certaines situations épidémiologiques, aucune d’elles ne joue un rôle majeur dans l’infection des oiseaux, que de nombreux autres facteurs interviennent, et qu’il existe plusieurs exceptions à ces règles générales.

e) Particularités de l’immunité Comme pour toutes les infections, on distingue une immunité innée et une immunité acquise. La première implique des interactions entre des facteurs physiologiques et biologiques, résultat d’une longue évolution qui influencent la résistance spontanée des hôtes aux parasites. Elle détermine les propriétés des parasites responsables de la spécificité des infections. L’immunité acquise se forme, elle, suite à une primo-infection de l’hôte, et se maintient pendant un certain temps, permettant de contrôler, de diminuer, voire de supprimer, la mise en place du processus pathologique lors des réinfections (VALKIUNAS, 2005).

Plusieurs facteurs, tels que la formation de complexes antigène-anticorps, ainsi que des hémagglutinines ont été largement étudiés à propos des infections à Plasmodium gallinaceum (SPRINGER, 1997).

48 Une étude parue en 2005 a permis de mettre en évidence le rôle déterminant des gènes du complexe majeur d’histocompatibilité (C.M.H.) au cours des infections dues aux hémosporidies des oiseaux.WESTERDAHL et al. (2005) ont en effet étudié une population suédoise de rousserolles turdoïdes (Acrocephalus arundinaceus), qui, selon une précédente étude, ont un C.M.H. très variable. Les auteurs ont remarqué qu’un allèle C.M.H. de classe I (baptisé B4b) variait de façon significative dans la population au cours du temps. Le but de l’étude était donc de rechercher une association entre la forte hétérozygosie constatée au niveau des loci C.M.H. de classe I (qui selon d’autres auteurs est un avantage permettant d’augmenter la probabilité de survie de la population) et la prévalence des infections, ainsi qu’entre l’allèle B4b et la présence des trois lignées d’hémospordies retrouvées le plus fréquemment. Les résultats font état d’une association positive entre le nombre d’allèles C.M.H. de classe I et la prévalence d’une lignée de Plasmodium. Un constat similaire a pu être établi pour l’allèle B4b, qui est associé positivement à la prévalence de la même lignée parasitaire (notons au passage que plus un individu porte d’allèles C.M.H., plus il est susceptible de porter l’allèle B4b ; les deux constats pourraient donc être liés). Ceci suggère que les individus possédant un nombre élevé d’allèles, ou l’allèle B4b peuvent plus facilement survivre aux infections dues à la lignée parasitaire en question. La protection conférée n’est pas totale, mais semble prémunir les oiseaux contre les effets létaux de l’infection. Une autre explication serait que les individus possédant de nombreux allèles de classe I, ou l’allèle B4b, soient plus susceptibles d’êtres infectés par le parasite. Cette dernière hypothèse semble moins probable puisqu’aucune étude n’a jusqu’à présent montré que porter très peu d’allèles du C.M.H. pouvait être un avantage, tandis que plusieurs travaux suggèrent le contraire. Par ailleurs, des études menées chez l’homme ont permis de mettre en évidence une association entre certains allèles du C.M.H. et une résistance à la malaria, tandis que d’autres chercheurs ont établi que les allèles en question étaient sélectionnés par les parasites eux-mêmes. Ainsi, les résultats mentionnés ci-dessus pourraient signifier que l’allèle B4b est selectionné par un ou plusieurs agents pathogènes, dont – probablement – la lignée de Plasmodium avec laquelle il est associé. L’analyse des données a également permis d’établir que la présence de six allèles C.M.H. ou plus constituerait un avantage vis-à-vis de la malaria aviaire.

Enfin, une étude récente (DONOVAN et al., 2007) s’est intéressée au rôle joué par le vecteur dans les processus d’immunisation de souris infectées par Plasmodium yoelii. Suspectant une activité immunogène de la salive du vecteur (en l’occurrence Anopheles stephensi), les auteurs ont comparé la charge parasitaire de deux groupes de souris exposés au moustique infecté, dont l’un avait été préexposé à des piqûres d’Anopheles stephensi non infectés. Des différences significatives ont ainsi été mises en évidence, les souris préexposées aux piqûres comptant beaucoup moins de Plasmodium yoelii dans leur foie quatre heures après l’infection. Une différence de charge parasitaire dans le sang a également été montrée. Suspectant la mise en œuvre de mécanismes faisant intervenir l’interféron gamma (IFN-γ), dont les taux étaient plus élevés chez les souris présensibilisées, les chercheurs de l’université de Notre-Dame (Indiana, Etats-Unis d’Amérique) ont ensuite utilisé des souris « knockout » déficientes en IFN-γ (souris « IFN-γ KO »). Ils ont ainsi pu montrer que la protection liée à la présensibilisation était abolie en absence d’IFN-γ et que le mécanisme de l’immunité faisait probablement appel à une destruction des parasites par l’intermédiaire de l’oxide nitrique, dont les quantités augmentent chez les souris de type sauvage après la présensibilisation, mais pas chez les souris « IFN-γ KO ». L’interleukine 12 pourrait également jouer un rôle puisque son ARNm est décelable en quantités significativement plus élevées chez les souris présensibilisées que chez les souris naïves. Par ailleurs, d’autres études avaient montré l’augmentation des quantités d’interleukines 4 et 10 chez des souris piquées par des moustiques Culex pipiens et Aedes aegypti non infectés.

49 Les enseignements de cette étude, relatifs à l’immunité anti-paludéenne, pourraient avoir des conséquences sur les modalités de lutte ou de prévention des infections à Plasmodium : il a déjà été démontré que l’interleukine 12 recombinante protégeait les souris vis-à-vis des infections à Plasmodium yoelii. Une prophylaxie à base d’interleukine 12 recombinante pourrait donc être une solution, de même qu’une « vaccination » avec de la salive de moustiques non infectés (qui provoquerait une augmentation de la concentration en interleukine 12 et permettrait d’éviter la toxicité secondaire à l’emploi de protéines recombinantes). De plus, les conclusions de cette étude pourraient aussi expliquer la perte rapide de l’immunité anti-paludéenne constatée lorsqu’une personne quitte une zone endémique de malaria. En effet, la perte d’immunité pourrait être due à une absence – ou à un nombre bien plus faible – de « rappels » provoqués par la salive du vecteur lors des piqûres (DONOVAN et al., 2007).

Si les conclusions, obtenues ici sur des modèles d’infection chez la souris, ne peuvent être d’emblée extrapolées au cas des infections à Plasmodium chez les oiseaux, il est intéressant de remarquer qu’une autre étude avait déjà souligné l’influence de la salive du vecteur sur la virulence du parasite chez les oiseaux : les auteurs avaient mis en évidence une augmentation des parasitémies à Plasmodium gallinaceum chez des poulets infectés par injection sous-cutanée de sporozoïtes et d’extraits de glandes salivaires d’Aedes fluviatilis par rapport aux poulets n’ayant reçu que les sporozoïtes (DA ROCHA et al, 2004 ; DONOVAN et al., 2007).

f) Interactions de Plasmodium avec ses hôtes, et stratégies de transmission Nous avons déjà évoqué les phénomènes d’immunosuppression directe et indirecte induits par Plasmodium chez le vecteur de l’infection. Nous renvoyons donc le lecteur au paragraphe correspondant (I.A.6.b.).

Deux études parues ces dernières années reviennent sur les phénomènes de détermination du sexe des gamétocytes, et de préférence du parasite en ce qui concerne les cellules hôtes (PAUL et al., 2000 ; REECE et al., 2005). La première d’entre elles montre que, pour deux espèces de Plasmodium infectant soit les rongeurs soit les oiseaux (Plasmodium vinckei et Plasmodium gallinaceum, respectivement), le sex ratio (au sens de proportion relative des microgamètes et des macrogamètes) varie au cours de l’infection, puisqu’il est initialement très en faveur des macrogamètes (seulement 10 à 20 % de microgamètes), puis tend vers l’équilibre au pic de parasitémie, la proportion de mâles augmentant au cours du phénomène infectieux. Après avoir exclu l’influence de facteurs immunitaires sur le déterminisme du sex ratio, les auteurs ont montré que celui-ci était une réponse à l’anémie provoquée chez l’hôte : lorsque les oiseaux infectés sont anémiés, leurs cellules hépatiques et rénales sont stimulées et produisent de l’érythropoïétine (EPO). Or, PAUL et al. (2005) ont montré que la quantité d’EPO était un signal utilisé par les parasites pour changer leur sex ratio. Par ailleurs, la stimulation de l’érythropoïèse par l’EPO provoque en quelques jours une apparition de réticulocytes dans le torrent sanguin (REECE et al., 2005), mais PAUL et al. (2000) ont également montré que l’augmentation du nombre de gamétocytes mâles n’était pas liée à celle du nombre de réticulocytes circulants, puisqu’aucune augmentation de l’infection des réticulocytes par Plasmodium gallinaceum n’a été notée suite à la stimulation de l’érythropoïèse. Les auteurs suggèrent que l’augmentation de la teneur en EPO serait corrélée à des changements hormonaux, ou à l’appartition de facteurs immunitaires de l’hôte qui diminueraient la probabilité de rencontre entre un gamète mâle et un gamète femelle (PAUL et al., 2000 ; REECE et al., 2005). Dans ce cas, produire moins de gamètes femelles serait une sorte de « garantie de fertilité », qui permettrait d’augmenter la probabilité que tous les gamètes femelles d’un repas sanguin soient fécondés (REECE et al., 2005).

50 Voulant confirmer les conclusions de PAUL et al. (2000) relatives à Plasmodium vinckei et les comparer aux stratégies reproductives de Plasmodium chabaudi (un autre parasite des rongeurs), REECE et al. (2005) ont étudié ces deux espèces et montré que la deuxième pouvait infecter les réticulocytes, ce que Plasmodium vinckei ne peut faire qu’à de très fortes parasitémies (PAUL et al., 2000). Ainsi, la population de cellules hôtes pour Plasmodium chabaudi n’est pas limitée lors d’anémie, et le parasite peut augmenter sa production de gamétocytes sans compromettre le développement des stades asexués (REECE et al., 2005). Rappelons néanmoins qu’il s’agit de modèles de parasites des rongeurs, et non des oiseaux. Les auteurs avertissent qu’il n’est probablement pas juste de généraliser les stratégies de transmission d’une espèce à l’autre (REECE et al., 2005)

Toutefois, les Plasmodium aviaires (ou au moins la seule espèce gallinaceum) auraient probablement une stratégie plus proche de celle de Plasmodium vinckei, pour laquelle le sexe des gamétocytes pourrait être déterminé par le temps passé dans la circulation sanguine avant de rencontrer une cellule sanguine mature dans laquelle le parasite puisse se développer (REECE et al., 2005).

8. Pathogénie

(d’après VALKIUNAS, 2005)

Si vers la fin du XXème siècle il était encore admis que les infections dues aux hémosporidies étaient en général bénignes (plusieurs publications allant dans ce sens à la fin des années 90), ceci est plus ou moins remis en question de nos jours, et les mécanismes pathogéniques sont de mieux en mieux connus. Nous allons les détailler ci-dessous, en nous intéressant tout d’abord aux stades exoérythrocytaires, puis aux stades présents dans le sang.

a) Les stades exoérythrocytaires La première génération de mérontes exoérythrocytaires ne cause généralement pas trop de dommages chez les oiseaux infectés. Leur nombre est – sauf exception – relativement faible, leur taille réduite, leur développement rapide, et la réaction inflammatoire souvent peu prononcée. En général, il faut attendre les autres générations de mérontes exoérythrocytaires pour voir apparaître des manifestations pathologiques de l’infection.

L’atteinte la plus sévère lors d’une infection à Plasmodium est causée par le blocage des capillaires du cerveau par des phanérozoïtes ou des métacryptozoïtes, ce qui provoque la mort de l’oiseau, après un épisode de paralysie. VALKIUNAS (2005) cite notamment les espèces de Plasmodium suivantes : Plasmodium gallinaceum, Plasmodium cathemerium, Plasmodium durae, Plasmodium lophurae, Plasmodium elongatum, et Plasmodium octamerium. SMYTH (1994) et SPRINGER (1997) reprennent l’exemple de Plasmodium gallinaceum, espèce potentiellement très pathogène pour les volailles, pouvant provoquer leur mort, suite à un dysfonctionnement du système nerveux central par ce mécanisme. En outre, le blocage des capillaires peut également avoir lieu dans d’autres organes dont la perfusion sanguine se retrouve altérée, ce qui provoque la mort, par anoxie ou infarctus, des tissus entourant le méronte. FRENKEL (1980) évoque des atteintes hépatiques et rénales La nécrose tissulaire peut également être précédée par la formation d’un œdème. Enfin, selon SPRINGER (1997), Plasmodium durae peut provoquer une fibrose extensive de nombreux tissus, et induire une mortalité élevée chez les dindes.

51 b) Les stades sanguins La conséquence la plus importante du développement des Plasmodium dans le sang est la destruction des globules rouges qui provoque une anémie. Cette destruction est, dans ce cas, directement liée au développement des mérontes érythrocytaires dont la rupture présente, chez les oiseaux, la particularité de ne pas provoquer d’épisode fébrile chez l’hôte.

Une autre cause – indirectement provoquée par le parasite cette fois-ci – de l’anémie est la suppression, par les cellules du système réticulo-endothélial situées dans la rate, le foie, la moelle osseuse et d’autres organes, des érythrocytes circulants infectés. On a alors une anémie aiguë, l’érythropoïèse et l’arrivée d’érythroblastes dans le sang ne parvenant pas à compenser les pertes de globules rouges.

Enfin, des changements observés dans la composition biochimique du plasma lors de malaria pourraient par ailleurs accentuer les effets de la lyse des érythrocytes : une hausse de la parasitémie s’accompagne d’une baisse du pH sanguin, et d’une augmentation de la concentration en protéines sériques, ce qui conduit à une diminution de la capacité de liaison de l’hémoglobine au dioxygène et de la circulation dans les capillaires.

9. Étude clinique

L’apparition de symptômes lors d’une infection à Plasmodium chez les oiseaux est plus fréquente chez les animaux qui sont infectés pour la première fois que chez les porteurs chroniques victimes de rechutes. Toutefois, l’intensité des symptômes n’est pas corrélée au niveau de parasitémie (RAE, 1995 ; VAN DER HEYDEN, 1996). La clinique peut être aussi bien inapparente que dramatique, avec une mortalité importante (SPRINGER, 1997). Nous renvoyons ici le lecteur aux paragraphes consacrés à l’importance clinique, aux espèces atteintes et à la pathogénie de l’affection pour y trouver les informations relatives aux espèces d’oiseaux les plus sensibles et aux parasites les plus pathogènes.

Lorsque l’infection n’est pas asymptomatique, les signes cliniques les plus fréquemment observés sont peu spécifiques : si l’anémie, l’abattement, et la léthargie peuvent être des indicateurs de l’infection, on peut également noter des vomissements, de l’anorexie, une dyspnée et des urates de couleur vert clair (PEIRCE, 2000 ; RAE, 1995 ; VAN DER HEYDEN, 1996).

L’anémie, hémolytique, est généralement peu prononcée jusqu’au stade terminal de la maladie, où l’hémolyse intravasculaire devient massive (RAE, 1995 ; VAN DER HEYDEN, 1996). La mort, lorsqu’elle survient, met un terme à un épisode clinique de 1 à 3 jours (VAN DER HEYDEN, 1996).

10. Données paracliniques

En plus des données cliniques évoquées ci-dessus, certaines modifications hématologiques et biochimiques peuvent être notées lors d’infections à Plasmodium chez les oiseaux. Outre l’anémie hémolytique, les analyses sanguines peuvent révéler une leucocytose et une lymphocytose (RAE, 1995 ; VAN DER HEYDEN, 1996). Une élévation de la concentration sérique en aspartate- amino-transférase (ASAT) et une hémoglobinurie peuvent également être notées (VAN DER HEYDEN, 1996).

52 11. Lésions

(d’après FRENKEL, 1980 ; RAE, 1995 ; VAN DER HEYDEN, 1996 ; VALKIUNAS, 2005)

Lors des examens nécropsique et histologique d’un oiseau victime d’une infection à Plasmodium, les principales lésions mises en évidence sont :

• une splénomégalie et une hépatomégalie. Dans certains cas, la taille du foie et de la rate peut être multipliée par 20, ce qui peut provoquer leur rupture. Microscopiquement, ces lésions sont associées à une hyperplasie des cellules lymphoïdes et des macrophages. En outre, une grande quantité de pigments insolubles s’accumule dans ces cellules, ce qui confère une teinte foncée au foie et à la rate. Des infarcti sont parfois visibles au niveau de la rate,

• des hémorragies,

• un épanchement péricardique et des signes de tamponnade cardiaque,

• un œdème pulmonaire. 12. Diagnostic et diagnose

Les techniques permettant de détecter les Plasmodium chez les oiseaux comprennent, outre la traditionnelle mise en évidence directe des parasites, des outils plus modernes tels que la biologie moléculaire, l’immunoblot, ou l’ELISA. Si ces deux dernières techniques ont déjà fait l’objet de plusieurs publications et s’avèrent prometteuses pour l’avenir, elles ne permettent pas pour l’instant l’identification des espèces parasitaires (JARVI et al., 2002 ; VALKIUNAS, 2005). Nous allons détailler ci-après chacune de ces techniques, en commençant par la mise en évidence directe des Plasmodium, qui reste, pour la grande majorité des auteurs, la technique de référence.

a) Mise en évidence directe des Plasmodium sur un frottis sanguin (d’après LEVINE, 1985 ; PEIRCE, 2000 ; RAE, 1995 ; VALKIUNAS, 2005)

La première étape de la démarche diagnostique est la réalisation du frottis, qui doit être de bonne qualité afin de permettre une identification correcte des espèces parasitaires.

Le sang doit être prélevé de préférence sur des oiseaux vivants (la réalisation de frottis post mortem rend difficile l’identification des parasites en raison du commencement de la gamétogénèse, qui modifie la morphologie des gamétocytes matures). Pour un gros oiseau, il est facile de prélever du sang en ponctionnant la veine métatarsienne , tandis que la veine brachiale, ponctionnée à l’endroit où elle croise l’humérus, s’avère souvent utile chez les petits oiseaux. La veine doit être perforée à l’aide d’une aiguille (ou d’un autre objet pointu), et une goutte de sang recueillie sur la lame servant à la réalisation du frottis. En cas de besoin, il est possible de réaliser une ponction intracardiaque même si, via cette méthode, des modifications morphologiques des parasites peuvent êtres notées sur le frottis. Les aiguilles utilisées ne doivent servir qu’une fois, en vue d’éviter les contaminations. Une autre méthode, très pratique lorsque l’on travaille sur beaucoup d’oiseaux, ou qu’un même oiseau est prélevé à plusieurs reprises (par exemple dans les laboratoires) consiste à couper aux ciseaux un bout de griffe au niveau du 3ème doigt, et à exercer une compression afin de faire sourdre une gouttelette de sang qui servira à la réalisation du frottis. Outre la simplicité et la rapidité de sa réalisation, cette méthode permet de prélever facilement du sang sur de petits oiseaux 53 (chez qui la ponction veineuse est difficile) ou d’étudier beaucoup d’oiseaux en peu de temps, et s’avère très utile lors des investigations « de terrain ».

Une fois la ponction sanguine réalisée, le frottis peut être effectué. Il faut pour cela disposer de lames microscopiques en bon état (ne présentant pas de traces de graisse ou d’égratignures) et soigneusement identifiées. La réalisation d’un frottis est illustrée sur la figure 6.

Figure 6 : réalisation d’un frottis sanguin

(d’après VALKIUNAS, 2005)

Une gouttelette de sang est déposée sur la lame. Elle ne doit pas être trop grosse (1). Une autre lame est ensuite placée sur la gouttelette, avec une inclinaison d’environ 45° (2). Sous l’effet de la force capillaire, la gouttelette s’étend le long du bord de la 2ème lame et forme un film fin et longiligne entre les deux lames. La 2ème lame est alors poussée du côté opposé à la gouttelette, en maintenant un angle de 45° tout au long de la manœuvre. Le mouvement doit être rapide mais pas trop brutal (3). Le sang se retrouve ainsi étalé en une fine couche sur la lame (4).

Les étapes décrites ci-dessus doivent être effectuées suffisamment vite après la ponction sanguine, afin de ne pas laisser au sang le temps de coaguler. Il est important que le film soit monocouche et que les cellules sanguines se répartissent régulièrement à la surface de la lame. En effet, les érythrocytes aviaires sont nucléés, et peuvent de ce fait masquer les parasites et rendre leur identification impossible si le film sanguin est trop épais, ou le frottis mal effectué. Notons au passage que c’est pour la même raison que la technique de la goutte épaisse – largement utilisée pour la mise en évidence des hémosporidies chez les mammifères – n’est pas applicable aux oiseaux et aux autres vertébrés.

Une fois le frottis effectué, il convient de le sécher et de le protéger de la poussière et des insectes. La fixation doit se faire au plus vite après la préparation, à l’aide, soit de méthanol à 100 % pendant une minute, soit, à défaut, d’éthanol à 96 % pendant 3 minutes. Les lames doivent ensuite être transportées soigneusement jusqu’au laboratoire, où elles seront colorées. Une exposition trop longue à l’air avant la fixation induit des modifications morphologiques chez les parasites, qui perdent leurs caractères propres et ne peuvent plus être identifiés.

La coloration peut se faire au plus tard un à deux mois après la fixation. Il est alors préférable de stocker à 4°C les lames qui ne seront colorées qu’au delà d’une semaine. Le colorant recommandé est celui de Giemsa. Les colorants rapides doivent être proscrits car ils sont moins stables, s’effacent plus rapidement, et ne conviennent pas pour l’identification des espèces. La

54 préparation du colorant doit se faire juste avant son utilisation, et consiste à diluer 10 mL de la solution mère de stockage dans 100 mL d’une solution aqueuse tamponnée au pH de 7,2 (obtenue en diluant 1 g de Na2HPO4 et 0,7 g de KH2PO4 dans un litre d’eau distillée). La coloration doit durer une heure environ, à une température de 20°C. Puis les lames sont rincées à l’eau du robinet et séchées avant d’être examinées au microscope. Si toutes les étapes ont été correctement effectuées, le cytoplasme des érythrocytes doit apparaître rose avec des miroitements violets, le noyau des parasites rouge, et leur cytoplasme bleu. De petites modifications de teinte peuvent toutefois être notées en fonction de la marque de colorant de Giemsa utilisée. Enfin, il peut être utile, pour une meilleure conservation des lames, de les recouvrir d’une lamelle soudée à l’aide d’un baume.

La lecture des lames peut se faire dans un premier temps avec un objectif x 40 (pour rechercher rapidement les Plasmodium) sur une surface d’environ 2 cm2. Il convient ensuite de passer à l’objectif x 100 à immersion et d’examiner 100 champs microscopiques pour réaliser la description et l’identification des espèces parasitaires. Le niveau de parasitémie peut être apprécié en comptant le nombre de parasites présents dans 1 000 ou 10 000 érythrocytes, dans des champs choisis au hasard. Des mesures de la taille des parasites peuvent également être effectuées à ce stade, en utilisant un micromètre oculaire ou un système informatisé.

En ce qui concerne l’identification des genres ou espèces parasitaires, elle peut s’avérer délicate, et est du ressort du spécialiste. En effet, la proximité morphologique des parasites sanguins (notamment Plasmodium et Haemoproteus) peut très facilement prêter à confusion et seule l’application de méthodes rigoureuses par une personne aguerrie permet d’obtenir des résultats satisfaisants. Les difficultés de diagnose existent aussi bien lors d’infections débutantes, où seuls les trophozoïtes et les schizontes sont présents dans le sang (ces stades étant peu spécifiques), que lors d’infections plus anciennes, au cours desquelles les gamétocytes peuvent être les seuls stades présents (ce qui prête à confusion, puisque les gamétocytes de certaines espèces de Plasmodium ressemblent beaucoup à ceux d’Haemoproteus). Les autres difficultés proviennent du fait que la spécificité d’hôte est peu marquée (on peut s’attendre à trouver beaucoup d’espèces parasitaires au sein d’une famille d’oiseaux donnée), que la morphologie des parasites peut varier selon leur hôte, que chez les espèces à cyclicité marquée (synchronisation marquée des mérogonies), le ratio entre les différents stades parasitaires varie au cours d’une journée, et que les infections à plusieurs espèces de Plasmodium chez un même oiseau ne sont pas rares. Toutefois, en dépit de ces difficultés, il existe quelques cas où la distinction entre Plasmodium et Haemoproteus peut être plus facilement réalisée : la mise en évidence de mérontes ou de mérozoïtes dans le sang, la présence des parasites dans les leucocytes ou les thrombocytes, ainsi qu’un déplacement marqué du noyau des érythrocytes infectés sont des critères qui reviennent souvent. En effet, à la différence de Plasmodium, les stades asexués de Haemoproteus ne sont pas retrouvés dans le sang (seuls les gamétocytes y sont mis en évidence), ces parasites ne peuvent pas infecter les plaquettes ou les cellules de la lignée blanche, et, lorsqu’ils déplacent le noyau des érythrocytes infectés, ce déplacement est toujours léger. Enfin, un autre outil intéressant pour le diagnostic est la possibilité – pour les manipulateurs expérimentés – d’induire in vitro la formation des gamétocytes dans le sang des oiseaux infectés.

Si, lorsqu’elle est bien menée et que les conditions évoquées ci-dessus sont respectées, la lecture d’un frottis permet en général d’aboutir à une diagnose de genre voire d’espèce, son intérêt semble en revanche plus limité lors d’études menées sur un grand nombre d’individus, dans le but d’estimer la prévalence de l’infection. En effet, il est commun de ne pas trouver de parasites au début du printemps et à la fin de l’automne chez des oiseaux infectés par Plasmodium. Ainsi, l’absence de parasite sur un frottis ne signifie pas forcément que l’oiseau étudié n’est pas infecté. 55 Ceci est d’autant plus vrai que, lors des infections à Plasmodium, la phase aiguë de parasitémie est courte, et suivie d’une phase chronique beaucoup plus longue au cours de laquelle peu de parasites sont présents dans le sang. La chronicité est donc un autre facteur qui peut poser problème : une lecture exhaustive des lames est nécessaire et, même lorsque des parasites sont repérés, il est souvent difficile, pour des experts, d’aboutir à une diagnose d’espèce (peu de stades sont mis en évidence et les infections peuvent être mixtes). La subinoculation expérimentale – qui consiste à transmettre le parasite à des oiseaux d’expérimentation (canaris, poulets, pigeons, canetons) en leur injectant du sang infecté, afin d’obtenir une parasitémie plus importante – peut être une solution à ce problème, mais elle reste onéreuse et plus délicate à mettre en œuvre.

La mise en évidence directe des parasites sur un frottis sanguin est donc un outil diagnostic fort intéressant car il permet d’aboutir – lorsqu’il est effectué par une personne compétente en la matière – à un diagnose de genre ou d’espèce. En ce qui concerne son utilisation dans le cadre d’études épidémiologiques, il s’avère en revanche beaucoup moins efficace (on notera néanmoins que dans la partie nord de l’holarctique, la période la plus propice à sa mise en œuvre sur des populations sauvages s’étend de mai à juillet) et il est conseillé de lui préférer les techniques immunologiques et moléculaires dans ce contexte.

b) Mise en évidence des stades tissulaires sur un calque d’organes (d’après VALKIUNAS, 2005)

Un outil post mortem de diagnostic des infections à Plasmodium chez les oiseaux consiste à réaliser des calques de différents organes, afin de mettre en évidence les stades tissulaires du parasite.

Pour ce faire, un petit bout (moins d’1 cm3) d’organe est découpé au scalpel puis la surface de coupe est délicatement tamponnée sur un morceau de papier filtre, afin d’absorber le sang en excès. Cette même face est ensuite appliquée contre une lame microscopique, de façon à y laisser une empreinte. Après séchage, fixation, et coloration (qui se font de la même façon que pour les frottis sanguins, à la différence près que la solution de coloration est obtenue par dilution de seulement 4 à 5 mL de solution mère dans 100 mL de solution tampon) la lame peut être lue.

Cette méthode peut être mise en œuvre en vue de « peaufiner » le diagnostic, mais les stades tissulaires de Plasmodium restent toutefois mal connus pour de nombreuses espèces et il n’est pas recommandé de les utiliser seuls pour une diagnose précise (diagnose de genre mais rarement d’espèce).

c) Mise en évidence des parasites sur une coupe histologique (d’après VALKIUNAS, 2005)

Des coupes de différents tissus et organes peuvent également être réalisées, en vue d’une analyse histologique.

d) Utilisation des techniques de biologie moléculaire : la P.C.R. Si la mise en évidence directe des parasites reste un examen fort intéressant lors de suspicion ou de dépistage des infections à Plasmodium chez les oiseaux, elle présente cependant plusieurs inconvénients, notamment le temps qu’il faut accorder à la lecture des lames, ainsi que la mauvaise capacité de détection des infections de faible intensité (RICHARD et al., 2002). Les 56 techniques de P.C.R. mises au point depuis 1995 représentent une bonne alternative puisqu’elles ont permis de répondre à la plupart de ces problèmes, grâce à leur meilleure sensibilité et à la rapidité de leur mise en œuvre (RICHARD et al., 2002). À ce jour, plusieurs jeux d’amorces permettant de détecter les infections à Plasmodium aviaires ont été étudiés (nous nous limiterons aux amorces spécifiques des hémosporidies – ou Plasmodium – des oiseaux, sans évoquer celles qui amplifient l’ADN de ces parasites chez d’autres hôtes) :

• Le premier a été défini en 1995 par Feldman et al. afin de dépister l’infection à Plasmodium relictum chez des oiseaux hawaiiens de la sous-famille des Drépanidinés ; elle cible le gène codant la petite sous-unité ribosomale 18 S, à la fois chez le parasite et chez l’hôte. La séquence du gène parasitaire comprenant un insert de 200 paires de bases, un résultat positif est facilement visible grâce à l’observation de deux bandes, à 380 et 580 paires de bases pour l’hôte et le parasite respectivement. Les amorces ont pour séquence: (90) 5’-GCA TGG CCG TTT TTA GTT CGT GAA T-3’ et (89) 5’-TAT CTT TCA ATC GGT AGG AGC GAC G-3’ (RICHARD et al., 2002). Leur emploi s’avère néanmoins limité car leur mise en œuvre dans une étude comparative menée par RICHARD et al. (2002) sur 29 espèces d’oiseaux issus des forêts tropicales africaines s’est soldée par l’obtention d’une multitude de bandes. Ceci pourrait être dû à des divergences significatives dans la séquence du gène codant la sous-unité 18 S entre les espèces de Plasmodium infectant les oiseaux hawaiiens et les oiseaux africains. Toutefois, dans une étude menée par JARVI et al. (2002) et portant sur les mêmes oiseaux hawaiiens (en l’occurrence l’amakihi d’Hawaï, Hemignathus virens, un drépanidiné) expérimentalement infectés par Plasmodium relictum, l’utilisation des amorces 89 et 90 aboutit aux mêmes résultats ininterprétables.

• Le deuxième a été publié en 1995 par LI et al. (1995). Il s’agit en fait d’une P.C.R. nichée faisant appel à deux jeux d’amorces qui amplifient, elles aussi, le gène 18 S rRNA. Après une première amplification à l’aide des amorces 570 (5’-CGA CTT CTC CTT CCT TTA AAA GAT AGG-3’) et 566 (5’-GGA TAA CTA CGG AAA AGC TGT AGC-3’), le produit est soumis à un nouveau cycle utilisant cette fois-ci les amorces 841 (5’-GAA CGA GAT CTT AAC CTG C-3’) et 844 (5’-TAI [I = inosine] TGA TAA AGA TTA CCT A-3’) (LI et al., 1995 ; RICHARD et al., 2002). Les deux premières amorces amplifient le gène dans sa quasi intégralité, tandis que les deux suivantes sont spécifiques du genre Plasmodium et ont pour finalité l’identification d’espèce et la taxinomie, puisqu’elles amplifient les deux régions (V7 et V8) les plus variables du gène (LI et al., 1995). Un résultat positif se traduit par la présence d’un produit d’environ 400 paires de bases (LI et al., 1995 ; RICHARD et al., 2002). Si l’on en croit l’étude comparative de RICHARD et al. (2002) ce jeu d’amorces permettrait de détecter les infections à Plasmodium falciparum, mais passerait souvent à côté d’infections dues à d’autres espèces de Plasmodium ou d’Haemoproteus, et ne ferait pas preuve d’une grande répétabilité dans l’obtention des résultats positifs.

• Le troisième jeu d’amorces est, lui, spécifique d’un segment du gène mitochondrial ‘cyt b’. On le doit à BENSCH et al. 2000, qui ont baptisé leurs amorces HAEMF (5’- ATG GTG CTT TCG ATA TAT GCA TG-3’) et HAEMR (5’-GCA TTA TCT GGA TGT GAT AAT GGT-3’). L’obtention d’un fragment de 478 paires de bases traduit un résultat positif et le test peut être utilisé pour détecter des infections à Plasmodium et à Haemoproteus. L’étude de RICHARD et al. (2002) a montré que ce jeu d’amorces était bien plus performant pour la détection des parasites que ceux précédemment décrits. Il a en outre permis, chez 138 oiseaux qui avaient donné des résultats négatifs à la lecture des 57 frottis sanguins, la détection de 20 faux négatifs. Néanmoins, il faut également signaler que, sur 51 oiseaux positifs à la lecture des frottis, 4 n’ont pas été détectés lors de l’utilisation de ces amorces.

• Le quatrième jeu d’amorces a été décrit par RICHARD et al. (2002) à partir de données alors non publiées de FALLON & RICKLEFS. Il amplifie lui aussi des régions conservées du gène codant le cytochrome b et comprend les amorces 543F (5’-AAA AAT ACC CTT CTA TCC AAA TCT-3’) et 926R (5’-CAT CCA ATC CAT AAT AAA GCA T-3’). Un résultat positif (obtenu aussi bien pour Haemoproteus que pour Plasmodium) correspond à un fragment de 341 paires de bases (RICHARD et al., 2002 ; RICKLEFS et al., 2005). La comparaison auvec les amorces évoquées ci-dessus a montré une plus grande sensibilité, ainsi qu’une meilleure répétabilité que les jeux utilisant le gène codant la sous-unité 18 S, tandis des protocoles de dilution n’ont pas permis de mettre en évidence une différence de seuil dans la détection de l’infection par rapport aux amorces HAEMF-HAEMR. Toujours dans la même étude, les amorces 621 et 983 permettent la détection de 9 faux négatifs (sur 138 oiseaux négatifs à la lecture des frottis) tandis que, sur 51 oiseaux chez lesquels le parasite a été mis en évidence dans le sang, 7 ont donné un résultat négatif à la P.C.R. (RICHARD et al., 2002). Ces amorces ont également été utilisées au cours d’une étude de STURROCK & TOMPKINS (2007) portant sur des manchots antipodes (Megadyptes antipodes).

• Les cinquième et sixième jeux d’amorces ont été décrits par JARVI et al. (2002). Il s’agit de deux tests P.C.R. basés sur les gènes codant la petite sous-unité ribosomale 18 S et une protéine baptisée ‘TRAP’ (pour « Thrombospondin-Related Anonymous Protein »). Le premier fait appel aux amorces 5’ PRNST5 (CGA GAT CTT AAC CTG C) et 3’ PRNST3 (GGG CAG GGA CGT AGT CAG C) ; et le second est une P.C.R. nichée utilisant les amorces P5 (5’-GAC CTT TAT ATA CTA ATG GAT GG-3’) et P6 (5’-CCT TCA CCA AGT ACA TCA TT-3’), puis P3 (5’-GCT CTT TGT GAG AAA CCA-3’) et P4 (5’-CCC CAG CAA TTT TAT ATT-3’). Dans le premier cas, on obtient un fragment d’environ 498 paires de bases, dans le second, un fragment d’environ 850 paires de bases. Selon les auteurs qui ont défini ces jeux d’amorces, la sensibilité des tests serait en moyenne de 84 % pour PRNST3/5 et 61 % pour TRAP (par comparaison, la lecture de frottis sanguins a, dans la même étude, une sensibilité de seulement 27 %, pour des parasitémies estimées le plus souvent à 1-3 érythrocytes infectés sur 50 000 érythrocytes). La meilleure sensibilité des amorces basées sur les séquences ribosomales pourrait s’expliquer par le fait que les gènes codant l’ARNr sont très conservés et présents en multiples copies dans l’ADN du parasite, tandis que les séquences TRAP sont plus variables et n’existent qu’en une seule copie. Si ces deux tests sont très efficaces pour la détection d’infections lorsque le diagnostic se fait sur plusieurs échantillons au cours du temps, ils pourraient en revanche ne pas détecter 20 à 40 % des infections chroniques, lorsque le diagnostic se fait sur un seul prélèvement sanguin. En conclusion, les auteurs recommandent leur utilisation pour des études au cours desquelles il est possible d’effectuer plusieurs prélèvements chez les hôtes.

• PERKINS & SCHALL (2002) ont eux aussi proposé des amorces de P.C.R. nichée. Baptisées DW1 (5’-TCA ACA ATG ACT TTA TTT GG-3’), DW2 (5’-TAA TGC CTA GAC GTA TTC CTG ATT ATC CAG-3’), DW4 (5’-TGT TTG CTT GGG AGC TGT AAT CAT AAT GTG-3’) et DW6 (5’-GGG AGC TGT AAT CAT AAT GTG-3’), elles sont basées sur des séquences codant le cytochrome b, qui sont très conservées chez les hémosporidies (à titre d’exemple, il n’existe que 15 % de différence entre les séquences 58 nucléotidiques de Plasmodium mexicanum, parasite des reptiles en Amérique du Nord, et de Plasmodium berghei parasites des rongeurs africains). Le test (qui se fait par une première amplification à l’aide des amorces DW2 et DW4, puis par la réaction nichée, faisant intervenir DW1 et DW6) a été utilisé dans le cadre d’une étude sur la phylogénie des hémosporidies (PERKINS & SCHALL, 2002). Notons toutefois que leur efficacité dans la détection des infections à Plasmodium sur des prélèvements sanguins d’oiseaux n’a jamais été évaluée (FALLON et al., 2003).

• Enfin, FALLON et al. (2003) ont proposé un nouveau test P.C.R. basé sur des régions conservées du génome mitochondrial qui contiennent des fragments des gènes codant les petite et grande sous-unités ribosomales (« SSU » pour Small SubUnit et « LSU » pour Large SubUnit). Ce test permet de détecter à la fois les infections dues à Plasmodium et celles dues à Haemoproteus. Les amorces utilisées ont été baptisées 292F (5’-CGG TAG ATA GGG AAC AAA CTG C-3’), 631R (5’-GCG AGA AGG GAA GTG TGT TTC-3’), 343F (5’-GCT CAC GCA TCG CTT CT-3’), et 496R (5’-GAC CGG TCA TTT TCT TTG-3’). La présence de bandes, dont l’intensité correspond grossièrement à l’intensité de l’infection, caractérise un résultat positif. Selon les auteurs, ces amorces seraient plus efficaces que celles basées sur le gène codant le cytochrome b en raison de leur contenu riche en cytosine et en guanine (40 % des séquences d’ARN sont constitués de ces 2 nucléotides contre seulement 27 % pour les séquences du cytochrome b). Lors de l’appariement de l’amorce au brin d’ADN à amplifier, l’adénine et la thymine ne contractent en effet que deux liaisons hydrogènes contre 3 pour la guanine et la cytosine, ce qui assure une meilleure stabilité. Un autre intérêt de ces amorces est que les séquences en question sont très conservées chez les hémosporidies : l’étude de FALLON et al. (2003), qui a été réalisée sur cinq espèces de Plasmodium et d’Haemoproteus aviaires a montré que les séquences utilisées sont pratiquement six fois plus conservées chez ces espèces que celles du cytochrome b. La comparaison directe avec les frottis sanguins et les amorces 621-983 et HAEMF/R met en évidence une meilleure efficacité des amorces LSU et SSU. Elles ont permis de détecter des infections chez des passereaux et d’autres oiseaux, dans des régions aussi variées que l’Europe, l’Amérique du Nord, l’Afrique et l’Australie. Toutefois, un petit nombre d’infections n’a pas pu être décelé, ce qui montre que ces amorces ne sont pas universelles. Les auteurs évoquent en outre un seuil de détection de 10-4 à 10-5 parasites par érythrocyte.

Notons par ailleurs qu’il est toujours possible de dessiner des amorces plus ou moins spécifiques d’un genre ou d’une expèce d’hémosporidie à partir des séquences d’ADN parasitaire publiées. C’est ainsi que BENTZ et al. (2006) ont pu élaborer des amorces fonctionnant sur toutes les hémosporidies dans le cadre d’une étude visant à apprécier l’intensité des parasitémies grâce à une PCR quantitative.Il s’agit à l’heure actuelle de la seule étude faisant appel à cette technique pour la mise en évidence d’infections à Plasmodium chez des oiseaux, mais il est probable que de nouvelles recherches aient recours à la PCR quantitative afin de mieux apprécier l’impact des hémosporidioses aviaires (notamment au niveau de la parasitémie).

59 e) Utilisation de techniques immunologiques

(1) L’ELISA La première réaction sérologique à visée diagnostique pour les infections à Plasmodium aviaires a été développée par GRACZYK et al (1993). Il s’agit d’un test ELISA développé à partir de 3 antigènes de la souche NF-54 de Plasmodium falciparum (parasite de l’homme) : R32tet32 (correspondant à la protéine circumsporozoïte, ou CS), P.F.R 27 (antigène des gamétocytes), et un extrait brut de globules rouges préparé à partir d’érythrocytes infectés in vitro (parasitémie de 65 %). Il peut être mis en œuvre aussi bien sur des échantillons de sang total que sur du sérum, ou même du sang séché sur papier filtre. Après la phase de fixation (coating) des 3 antigènes cités ci- dessus sur plaque, les puits sont vidés et remplis par le sérum à tester, dilué dans une solution tampon phosphate. L’incubation dure 3 heures, puis les plaques sont lavées plusieurs fois, avant l’ajout des anticorps, en l’occurrence des IgY anti-poulet couplés à la phosphatase alcaline. Après une nouvelle incubation et de nombreux lavages, du p-nitrophényl phosphate (p-NPP) est ajouté dans les puits, avant que la réaction ne soit arrêtée par ajout d’hydroxyde de sodium, une demi- heure plus tard. L’absorbance est enfin mesurée à 404 nm par un système informatisé. L’étude, portant sur des canetons Pékin infectés expérimentalement par Plasmodium relictum et Plasmodium elongatum, montre que l’absorbance est significativement plus importante que pour le lot témoin, et que tous les canetons infectés (par inoculation de sang provenant de canards infectés) présentent des anticorps dirigés contre R32tet32, sans avoir été exposés aux sporozoïtes (qui expriment la protéine CS). Ce dernier constat n’avait jamais été fait auparavant, en ce qui concerne les Plasmodium aviaires, mais concorde avec des phénomènes similaires observés lors de malaria simienne. Il pourrait signifier que la protéine CS n’est pas exprimée uniquement par les sporozoïtes. Enfin, ce test ELISA constitue la première preuve d’une réaction immunologique croisée entre Plasmodium falciparum et les espèces aviaires de Plasmodium. Les auteurs insistent sur sa simplicité, sa sensibilité, et sa reproductibilité. Il peut être utilisé pour diagnostiquer les infections à Plasmodium chez les canards et présente un grand intérêt pour les études de laboratoire ou autres enquêtes sérologiques.

(2) L’immunoblot Une autre technique immunologique de diagnostic des infections à Plasmodium a été décrite par ATKINSON et al. (2001) et a été mise au point dans le cadre de deux études portant sur des amakihis d’Hawaï (Hemignathus virens) (ATKINSON et al., 2001 ; JARVI et al., 2002). Il s’agit d’une analyse basée sur la migration des antigènes parasitaires placés sur un gel et soumis à l’action d’un champ électrique. Un extrait de globules rouges est obtenu à partir du sang de canetons expérimentalement infectés par les souches KV-115 et K-1 de Plasmodium relictum, au moment où la parasitémie atteint 10 à 20 % chez ces canetons. Les antigènes parasitaires sont ensuite isolés et subissent une migration à 175 V pendant une heure sur un gel de polyacrylamide, puis à 100 V pendant une heure sur une membrane de PVDF (PolyVinylidene DiFluoride), en même temps que des marqueurs de poids moléculaires connus. Le plasma des amakihis est ensuite ajouté au gel et incubé en présence d’anticorps de lapin anti-immunoglobuline d’amakihi, puis d’anticorps de chèvre anti-lapin liés à une phosphatase alkaline. Les molécules de poids connus sont elles aussi marquées et la révélation permet la mise en évidence de plusieurs bandes correspondant aux antigènes parasitaires sur lesquels se sont fixés les anticorps des amakihis. Les poids des antigènes sont – par ordre croissant – de 22, 34, 58, 66, 97, 112, et 170 kDa (les antigènes de 34 et 170 kDa sont les plus fréquemment retrouvés). Selon les auteurs, la technique permettrait de détecter les anticorps dirigés contre l’antigène de 34 kDa dès 8 jours post-infection, mais la plupart des bandes n’apparaîtrait que 40 jours après l’infection. Les anticorps dirigés contre l’antigène de 22 kDa ne 60 seraient, eux, pas visibles avant 180 jours post-infection. Un grand avantage de cette technique est la persistance des anticorps chez les individus infectés chroniques, qui pourrait durer 1 248 jours et permettre la détection de l’infection chez des individus présentant des parasitémies inférieures à 0,5 % (même si l’intensité des bandes diminue avec la chronicité de l’infection). Le développement de réactifs plus spécifiques, capables notamment de différencier les IgM des IgY, pourrait en outre améliorer la sensibilité du test dans les stades précoces de l’infection (ATKINSON et al., 2001).

Selon JARVI et al. (2002), qui ont comparé cette technique avec la lecture de frottis sanguins et différents tests de P.C.R., l’immunoblot aurait la meilleure sensibilité (97 % contre 84 % pour la P.C.R. PRNST3/5, 61 % pour la P.C.R. « TRAP », et seulement 27 % pour la lecture des frottis). Seuls 3 échantillons de sang infecté sur 103 auraient donné une réponse négative à l’immunoblot, vraisemblablement en raison du stade précoce de l’infection et de la préférence des réactifs pour les plutôt que pour les IgM. Cette technique semble donc être la plus sensible pour détecter les infections chroniques, mais elle présente l’inconvénient de ne pas permettre la distinction des espèces parasitaires.

f) Bilan sur les outils diagnostiques Nous venons d’évoquer plusieurs techniques dont l’utilité pour le diagnostic des infections à Plasmodium chez les oiseaux a été démontrée. Toutefois nous avons également souligné leurs inconvénients respectifs, qui font qu’il n’existe pas de test idéal. Si la mise en évidence directe de parasites sur un frottis sanguin permet souvent d’établir une diagnose d’espèce, il faut en revanche déplorer l’existence de faux-négatifs, qui font que l’absence de parasites sur une lame ne signifie pas que l’oiseau n’est pas infecté (VALKIUNAS, 2005).

En ce qui concerne les tests P.C.R., ils s’avèrent plus sensibles que la lecture des frottis (FALLON et al., 2003 ; JARVI et al., 2002 ; RICHARD et al., 2002), mais présentent plusieurs inconvénients :

• il existe malgré tout des faux-négatifs, même s’ils sont beaucoup moins nombreux que suite à la lecture de frottis sanguins (FALLON et al., 2003 ; JARVI et al., 2002 ; RICHARD et al., 2002),

• ils ne sont pas spécifiques d’un genre ou d’une espèce et ne permettent donc pas d’établir la distinction Plasmodium / Haemoproteus, d’où l’intérêt de développer des amorces plus spécifiques (RICHARD et al., 2002),

• ils ne sont pas universels, puisqu’aucun test n’a permis de détecter toutes les infections (FALLON et al., 2003), et il n’est pas sûr qu’une paire d’amorces étudiée chez une espèce d’hôte soit utilisable de façon fiable sur une autre espèce, puisque certains jeux d’amorces ont donné des résultats beaucoup moins bons lorsqu’ils ont été utilisés sur d’autres espèces d’oiseaux que celles pour lesquelles ils avaient été initialement développés (RICHARD et al., 2002).

Enfin, si les études montrent que la sérologie est plus sensible que la P.C.R. (ATKINSON et al., 2001 ; JARVI et al., 2002), il faut garder à l’esprit qu’elle reconnaît les anticorps et non les parasites eux-mêmes. Ainsi, elle ne permet pas de distinguer les infections en cours des épisodes passés à l’issue desquels l’oiseau aurait fini par se débarrasser des parasites, tout en demeurant séropositifs. Ceci expliquerait que la sérologie donne des valeurs de prévalence plus élevées que la

61 lecture des frottis ou la P.C.R., qui ne permettent de détecter que des infections actives (FALLON et al., 2003).

En conclusion, il est toujours difficile, de nos jours, de distinguer les oiseaux qui n’ont pas d’infection de ceux qui ont une infection limitée aux organes internes, sans parasitémie. La P.C.R. donne des résultats négatifs pour les deux, tandis que les tests sérologiques pourraient donner des réponses positives dans les deux cas. Les estimations de prévalence effectuées à l’aide de frottis sanguins ou de P.C.R. donnent donc des valeurs minimales, tandis que les estimations basées sur les méthodes sérologiques donnent des valeurs maximales correspondant à tous les animaux ayant été infectés à un moment ou à un autre (FALLON et al., 2003).

Ainsi, les tests évoqués ont des indications différentes (FALLON et al., 2003), qui peuvent être complémentaires. Il est recommandé de recourir à plusieurs outils diagnostiques pour obtenir un résultat fiable, comme par exemple un frottis pour identifier et quantifier l’infection, un test P.C.R. pour détecter les infections de faible intensité, et un test sérologique pour identifier les infections chroniques, en phase de latence, ou passées (ATKINSON et al., 2001 ; JARVI et al., 2002).

En ce qui concerne leur disponibilité, les P.C.R. et les tests sérologiques que nous venons d’évoquer ont été utilisés dans le cadre d’études bien précises, quasi exclusivement en milieu universitaire, et très fréquemment aux États-Unis. Ils ne sont donc pas proposés « en routine » par les laboratoires, notamment en France. Néanmoins, en connaissant les amorces dont nous venons de détailler les séquences, n’importe quel laboratoire habitué à travailler avec la P.C.R. devrait techniquement être en mesure d’utiliser cet outil pour des recherches de Plasmodium chez les oiseaux. De même, l’ELISA décrite ci-dessus est tout-à-fait « classique » et sa mise en œuvre ne nécessite aucune spécificité technique. En revanche la production des antigènes et anticorps spécifiques qu’elle requiert est un frein à son utilisation, et il est peu probable qu’un laboratoire français accepte de la mettre en œuvre à l’heure actuelle, faute de moyens et de demandes. Par ailleurs, on pourrait s’interroger sur l’efficacité de la fixation des anticorps anti-immunoglobulines de poulet sur les immunoglobulines d’autres oiseaux, malgré le succès constaté chez les canetons Pékin par GRACZYK et al. (1993).

13. Traitement

(d’après FRENKEL, 1980 ; LEVINE, 1985 ; RAE, 1995 ; SMITH, 1996 ; SPRINGER, 1997 ; VALKIUNAS, 2005 ; VAN DER HEYDEN, 1996)

Les traitements spécifiques des infections à Plasmodium chez les oiseaux ne sont pas suffisamment étudiés et il n’existe pas à l’heure actuelle de molécule sur le marché disposant d’une A.M.M. pour les espèces aviaires. Toutefois, plusieurs protocoles à base de molécules utilisées en médecine humaine ont été testés :

• le phosphate de chloroquine (à 5 mg/kg), la paludrine (à 7,5 mg/kg) et la pyriméthamine (à 0,3 mg/kg) sont efficaces contre Plasmodium gallinaceum,

• contre Plasmodium relictum et Plasmodium elongatum (qui sont les espèces de Plasmodium les plus largement représentées), VALKIUNAS (2005) recommande l’association, en suspension, du phosphate de chloroquine et du phosphate de primaquine dont l’efficacité a été démontrée chez les manchots. Nous renvoyons donc le lecteur à la partie correspondante dans le paragraphe I.B. ci-dessous, 62 • la plupart des auteurs s’accordent sur l’efficacité de la chloroquine [VAN DER HEYDEN (1996) propose une posologie de 15 mg/kg] et de la primaquine [0,75 à 1 mg/kg, toujours selon VAN DER HEYDEN (1996)]. Pour le traitement de la malaria chez les oiseaux de proie, SMITH (1996) propose le protocole suivant : une dose initiale à 25 mg/kg de chloroquine et 0,75 mg/kg de primaquine per os, puis trois doses de chloroquine à 15 mg/kg per os à 12, 24, et 48 heures,

• parmi les autres molécules évoquées, citons la quinacrine, qui mettrait un terme aux épisodes de mortalité chez les canaris, ainsi que la sulfadiazine.

À l’avenir, d’autres molécules utilisées chez l’homme pour le traitement des infections à Plasmodium falciparum pourraient être testées chez les oiseaux en raison de la proximité phylogénétique des agents des deux maladies. Le problème éthique lié au possible développement de résistances pourrait alors se poser.

VAN DER HEYDEN (1996) recommande de compléter le traitement étiologique ciblé par la mise en place, chez les oiseaux atteints, d’une fluidothérapie, d’une transfusion sanguine, d’une oxygénothérapie, ainsi que l’utilisation de stéroïdes et d’antibiotiques.

14. Prophylaxie

Selon plusieurs auteurs (RAE, 1995 ; SPRINGER, 1997 ; URQUHART et al., 1996 ; VALKIUNAS, 2005), la prévention des infections à Plasmodium chez les oiseaux passe par le contrôle ou l’éradication des vecteurs (Cf. paragraphe I.B.7.c. pour le cas des manchots en parc zoologique). URQUHART et al. (1996) considèrent même que cette étape est plus importante que le traitement médical. Le confinement des oiseaux et leur isolement vis-à-vis des vecteurs grâce à un logement approprié est donc recommandé, au moins pendant les périodes à risque (SPRINGER, 1997 ; VALKIUNAS, 2005). Les animaux peuvent être placés dans des bâtiments, ou dans des cages (ou volières) recouvertes de tissus à mailles suffisamment serrées pour empêcher les moustiques de pénétrer (VALKIUNAS, 2005). En outre les parasites aviaires ont servi de modèle dans une étude visant à produire des moustiques résistants à la malaria. Les auteurs ont réussi à faire exprimer par les moustiques Aedes aegypti des anticorps dirigés contre la protéine circumsporozoïte et à diminuer de 99,9 % l’excrétion salivaire du parasite (JAMES, 2002). Toutefois, les applications – s’il devait y en avoir – de cette étude concerneront le paludisme humain, et il est difficile de dire quel en serait l’impact sur la prévalence des hémosporidioses aviaires

Dans les régions enzootiques, il est souhaitable de procéder régulièrement à un dépistage de l’infection, d’isoler et si possible de traiter les oiseaux atteints, et d’examiner au moins une fois toutes les trois semaines les pigeonniers (VALKIUNAS, 2005).

La prévention des hémosporidioses dans les élevages industriels pose des problèmes. Les jeunes individus sont tout particulièrement prédisposés à l’infection. Ils la supportent moins bien que les adultes et périssent plus souvent. On peut réduire la probabilité de l’infection en élevant les jeunes à l’intérieur de bâtiments difficiles d’accès pour les vecteurs, et en utilisant des aérosols répulsifs. Si les oiseaux sont maintenus à l’extérieur, le contrôle des vecteurs s’avère plus complexe (VALKIUNAS, 2005).

Enfin, une autre solution pour diminuer les conséquences des infections à Plasmodium est la mise en place d’une chimiothérapie préventive. Celle-ci peut se dérouler au moment de l’année où se produit la transmission du parasite, mais il convient de garder à l’esprit que les Plasmodium 63 peuvent cumuler des résistances à certains composants, ce qui incite à trouver d’autres solutions préventives, comme le développement de vaccins (VALKIUNAS, 2005). À ce propos, notons qu’un vaccin utilisant des stades érythrocytaires de Plasmodium gallinaceum a été mis au point par McGHEE et al. (1977). Après l’injection sous-cutanée (à raison de 25x104 parasites/g de poids vif) d’une souche atténuée par 133 passages sur embryons de poulet, les poussins sur lesquels portait l’étude présentaient des parasitémies trop faibles pour être quantifiées par comptage, et avaient acquis une résistance à l’inoculation de stades érythrocytaires de Plasmodium gallinaceum (seuls quelques parasites avaient été observés sur les frottis après l’inoculation, et les poussins avaient récupéré, sans présenter le moindre signe d’anémie). La durée de protection n’a pas été clairement évaluée, mais sur deux oiseaux, il a été montré que l’immunité était encore effective plus d’un an après la vaccination. Une autre souche, obtenue après seulement 13 passages sur les embryons de poulet a également permis d’obtenir une protection satisfaisante chez les poussins, toutefois, la parasitémie consécutive à l’administration vaccinale a été jugée trop importante pour en faire un vaccin. Après 24 passages, les résultats ont été quasiment identiques à ceux obtenus après 133 passages. Le vaccin décrit semble donc efficace contre les stades sanguins de Plasmodium gallinaceum, mais il ne faut pas oublier que son action vis-à-vis des sporozoïtes, des autres stades exoérythrocytaires, ou d’autres souches voire d’autres espèces de Plasmodium n’a pas été étudiée. De même, son efficacité lors des phénomènes de rechute est inconnue. Aucune application pratique de cette vaccination n’a été retrouvée dans la littérature. En outre, plus récemment, un autre vaccin, développé cette fois-ci sur des manchots, a été mis au point par GRIM et al. (2004). Il sera étudié un peu plus bas dans notre étude (Cf. paragraphe I.B.7.c.). B. Importance et particularités des infections à Plasmodium chez les Sphénisciformes

1. Taxinomie, zoologie, et biologie

Les manchots sont des oiseaux appartenant à l’ordre des Sphénisciformes. En raison de fréquentes confusions avec des espèces en réalité bien distinctes voire assez éloignées (ordres différents) comme les pingouins (notons au passage le faux-ami anglais « penguin » qui désigne un manchot et non un pingouin !), il est utile de préciser ici quelques points importants de systématique. Les principales différences entre les manchots et les pingouins sont reprises sous forme synthétique dans un tableau figurant en annexe 5.

a) Systématique (d’après MARTÍNEZ, 1992)

L’ordre des Sphénisciformes ne contient qu’une seule famille, les Sphéniscidés, elle-même subdivisée en 6 genres et 17 ou 18 espèces (sujet de controverse), dont trois sont menacées d’extinction (Megadyptes antipodes, Spheniscus demersus, Spheniscus humboldti). Cette classification figure en annexe 6 de ce document.

Toutes les espèces de Sphénisciformes se caractérisent par leur incapacité à voler, leur inféodation au milieu aquatique, et leur localisation géographique, limitée au seul hémisphère Sud (l’archipel des Galapagos, qui héberge Spheniscus mendiculus, espèce la plus septentrionnale de manchots, est traversé par l’Équateur). Sur le plan évolutif, le vol, qui existait chez les ancêtres des manchots, a disparu au profit d’une adaptation à la vie en milieu amphibie.

64 Si les espèces aujourd’hui éteintes sont bien connues (on en dénombre 32, réparties en 21 genres) et montrent une importante diversité, les espèces actuelles semblent beaucoup plus difficiles à distinguer, ce qui pose de nombreuses questions relatives à leur classification :

• Eudyptes robustus, Eudyptes sclateri, et Eudyptes pachyrhynchus, que l’on considère maintenant comme trois espèces distinctes, ont parfois été classées par certains taxinomistes comme trois sous-espèces d’une même espèce (Eudyptes pachyrhynchus).

• toujours dans le genre Eudyptes, l’espèce E. chrysocome est généralement subdivisée en trois sous-espèces dont l’une (E.c. moseleyi) est parfois considérée comme une espèce distincte.

• la sous-espèce albosignata du manchot pygmée (Eudyptula minor) est souvent considérée comme une espèce à part entière, le manchot à ailerons blancs (E. albosignata), malgré les possibilités de reproduction observées avec une autre sous- espèce (E.m. variabilis).

• d’autres espèces très proches ont parfois été la source de polémiques relatives à leur classification : Eudyptes chrysolophus et Eudyptes schlegeli ; ainsi que trois espèces du genre Spheniscus (S. demersus, S. humboldti, et S. magellanicus).

b) Anatomie Les manchots ont un corps hydrodynamique, avec un cou très court, des ailes longues et plates, des membres postérieurs situés très en arrière du corps (leur conférant une stature verticale) et une queue courte et rigide. Le bec est long et fin chez les espèces piscivores, tandis qu’il est plus court et plus robuste chez celles qui se nourrissent de plancton. Les yeux sont adaptés à la vision sous-marine (bien que les manchots voient parfaitement bien en dehors de l’eau) et une glande supraorbitale permet d’éliminer sous forme d’une solution saline les excédents de sel dus à l’alimentation en milieu marin. Il existe des variations de taille inter et intra-spécifiques, la taille des individus augmentant (à l’exception de Pygoscelis papua) dans les régions les plus au Sud (et donc les plus froides). La plus petite espèce est Eudyptula minor, dont les représentants mesurent 40 à 45 cm, contre 122 cm en moyenne pour Aptenodytes forsteri, la plus grande espèce. Un tableau récapitulant les caractéristiques morphologiques de quelques espèces de manchots figure en annexe 7 de ce document. Le dimorphisme sexuel est très peu marqué, les mâles étant en général un peu plus grands que les femelles (surtout dans le genre Eudyptes).

Le plumage est typiquement bleu-gris à noir dorsalement, et blanc ventralement (les principales différences inter-spécifiques se notent au niveau de la tête et de la poitrine). Les plumes sont hautement spécialisées et permettent par leur recouvrement et leur implantation sur l’ensemble du corps (à l’exception des pattes) – ce qui est rare chez les oiseaux – une bonne isolation thermique et une imperméabilisation complète du corps. Elles sont plus longues chez les espèces les plus australes (MARTÍNEZ, 1992).

Le foie est attaché à une membrane ressemblant à un diaphragme, qui contient quelques fibres musculaires et vient s’ancrer au niveau des vertèbres. L’estomac est situé dans la partie la plus distale de la cavité générale, et les intestins sont longs, étroits, et enroulés autour d’une courte attache mésentérique (GRINER, 1983).

Enfin, à la différence des oiseaux capables de voler, les manchots ont des os lourds et solides. Leur cavité médullaire est très réduite (GRINER, 1983). Les os qui constituent l’aile sont 65 les mêmes que chez les autres espèces d’oiseaux, mais l’ensemble est beaucoup moins flexible puisque seule l’articulation de l’épaule est réellement mobile. Les ailes sont adaptées à la nage : aplaties et maintenues fermement par des tendons et des ligaments, elles forment de véritables nageoires (FOWLER, 1978; GRINER, 1983). En ce qui concerne le membre postérieur, le tarsométatarse est court et épais (long et fin chez les autres oiseaux) et a joué un rôle important pour la classification des espèces (notamment fossiles) (MARTÍNEZ, 1992).

c) Physiologie Lors de la mue, les nouvelles plumes poussent sous le rachis des anciennes, et finissent par les faire tomber tandis que, pour la plupart des autres oiseaux, la pousse des nouvelles plumes se fait secondairement à la chute des anciennes. Lors de cette période, les manchots perdent une partie de leur isolation thermique et de leur imperméabilité, ce qui les contraint à rester sur la terre ferme et donc – en préambule à la mue – à faire d’importantes réserves d’énergie au cours d’un long séjour dans les eaux. Ils possèdent pour cela un important tissu adipeux sous-cutané autorisant de longues périodes de jeûne. À l’exception du manchot des Galapagos (Spheniscus mendiculus) qui peut muer jusqu’à deux fois par an, les manchots ont une seule mue annuelle (MARTÍNEZ, 1992).

La capacité de thermorégulation des Sphénisciformes est exceptionnelle, notamment chez les espèces vivant dans les zones tropicales ou tempérées, qui subissent d’importantes variations de température entre l’eau souvent glaciale et le rivage exposé au soleil. L’isolation thermique est assurée par le maintien d’une couche d’air chaud entre le plumage très imperméable et l’importante couche de gras sous-cutanée tandis la vascularisation de l’aile permet (lorsque l’oiseau écarte les ailes et hérisse ses plumes) de dissiper la chaleur en excès (MARTÍNEZ, 1992). En effet, il existe un système d’échange de chaleur à contre-courant au niveau des nageoires, ainsi qu’au niveau des pattes (FOWLER, 1978). La couleur du plumage joue également un rôle, les parties foncées permettant d’absorber la chaleur des rayons solaires. Toutefois, cette formidable thermorégulation reste plus efficace dans l’eau, et lors de leurs passages à terre, les manchots peuvent avoir du mal à éliminer l’excès de chaleur et se mettre à haleter (MARTÍNEZ, 1992).

d) Locomotion Les manchots sont de très bons nageurs, qui se distinguent assez nettement des autres oiseaux aquatiques : ils n’utilisent pas leurs pieds comme des pagaies, mais s’en servent (en coordination avec la queue) pour diriger, tandis que l’impulsion est donnée avec les ailes. On distingue trois types de nages chez les Sphénisciformes :

• la nage de surface, qui est lente, et sert lors du repos et de la toilette,

• la nage sous-marine très similaire au vol aérien,

• le « marsouinage », sorte de nage de surface faite de mouvements ondulatoires (le corps se trouvant alternativement dans et en dehors de l’eau) et que seuls les manchots empereurs (Aptenodytes forsteri) n’utilisent pas. Cette nage présente plusieurs avantages : elle permet de diminuer les dépenses d’énergie, de faciliter la respiration et – probablement – d’échapper plus facilement aux prédateurs (MARTÍNEZ, 1992).

Lors de la nage, la vitesse de déplacement peut se maintenir à 7,5 km/h, avec des pointes de vitesse allant de 20,9 km/h à 27,4 km/h (FOWLER, 1978).

66 Les manchots peuvent également se déplacer à même le sol : ils marchent lentement, en partie sur la plante des pieds (sans toutefois poser le talon), et en faisant de petits pas ou de petits sauts, tout en gardant une posture très verticale dont l’avantage est de permettre la couvaison d’un œuf ou la protection d’un jeune entre les deux pattes. Certaines espèces peuvent également se déplacer en se laissant glisser ventralement sur la banquise (MARTÍNEZ, 1992).

e) Habitat (d’après MARTÍNEZ, 1992)

Toutes les espèces de Sphénisciformes sont marines et se trouvent dans l’hémisphère Sud. Néanmoins, elles ne se cantonnent pas au seul continent antarctique, le genre Spheniscus se rencontrant par exemple dans des zones équatoriales, voire sur l’Équateur même en ce qui concerne le manchot des Galapagos (Spheniscus mendiculus). Cette dernière espèce vit dans des eaux dont la température varie de 15 à 28°C tandis que le manchot empereur (Aptenodytes forsteri) fait face à des températures allant de -60 à 0°C. Il n’existe pas d’autre famille d’oiseaux dont les représentants affrontent des amplitudes de températures aussi larges.

S’ils passent beaucoup de temps dans l’eau (ne serait-ce que pour y chercher leur nourriture), les manchots sont contraints, deux fois par an, de revenir sur la terre, pour se reproduire et pour muer. La plupart du temps, il s’agit d’îles ou de côtes qui se trouvent à proximité des réserves de nourriture et dont l’accès est suffisamment facile. Une fois encore, il ne s’agit pas uniquement de banquise, certaines espèces s’installant sur des côtes en pente, d’autres dans des forêts humides, d’autres encore dans des grottes volcaniques ou des fissures dans la roche, certaines, enfin, dans des trous creusés à même le sable.

f) Comportement (d’après MARTÍNEZ, 1992)

Les manchots sont des animaux sociables et grégaires. Ils vivent en colonies de parfois plusieurs centaines à plusieurs milliers d’individus et sont pour la plupart territoriaux (même si le degré de territorialité dépend de la densité des colonies). La communication se fait essentiellement au moyen de signaux visuels ou vocaux.

2. Conditions d’hébergement, manipulation, et contention

a) Hébergement des populations captives L’état de santé des populations captives de manchots est étroitement lié à leurs conditions d’hébergement (CRANFIELD, 2003). Les points importants à contrôler lors du maintien de manchots en captivité sont repris par CRANFIELD (2003), qui donne également ces recommandations :

• les manchots doivent être hébergés en groupes d’au moins 6 individus (trois couples), dont la taille maximale dépend de la surface de l’enclos et des dispositifs de ventilation et d’assainissement de l’eau ;

• la surface au sol recommandée est de 1,7 m2 par manchot (de un à six individus) + 0,8 m2 par manchot (au delà de six individus) pour les espèces du genre Aptenodytes, et

67 0,7 m2 par manchot (de un à six individus) + 0,4 m2 par manchot (au delà de six individus) pour les autres espèces. L’enclos doit se rapprocher le plus possible de l’habitat naturel de l’espèce hébergée ;

• les espèces qui nidifient doivent avoir plusieurs nids de petite taille à leur disposition pour la reproduction et l’élevage des jeunes ;

• l’eau peut être salée ou douce, avec la nécessité dans le second cas de fournir du sel dans la ration alimentaire. La surface du plan d’eau doit être de trois à quatre fois celle de la surface au sol. La profondeur doit être d’au moins 1,3 m avec une pente douce jusqu’au sol, pour en faciliter l’accès. L’appareillage de filtration et de traitement de l’eau doit être suffisamment efficace, afin de ne pas perturber la thermorégulation et la flottabilité des manchots ;

• la température de l’air dépend grandement des espèces : il convient de maintenir à moins de 0°C les spécimens du genre Aptenodytes, et à moins de 9°C ceux des genres Pygoscelis, Eudyptes, Megadyptes, et Eudyptula (ce qui implique un hébergement dans un bâtiment réfrigéré). Eudyptes crestatus et les espèces du genre Spheniscus peuvent, elles, supporter des températures négatives (si de l’eau et des abris leur sont fournis) et allant jusqu’à 30°C (en présence de zones d’ombres, d’un plan d’eau leur permettant de nager, et de systèmes de vaporisation d’eau) ;

• la ventilation des enclos intérieurs est extrêmement importante en raison de la sensibilité des manchots à l’aspergillose ;

• les photopériodes doivent être respectées, surtout dans le cas des espèces les plus australes, en vue de favoriser la reproduction ;

• en raison de la sensibilité des manchots aux infections à Plasmodium l’exposition de l’enclos aux moustiques doit être réduite au maximum.

Invoquant les mêmes raisons de sensibilité marquée des manchots vis-à-vis du parasite, GRACZYK et al. (1994d) vont jusqu’à bannir leur exposition dans des enclos extérieurs en cas de présence du vecteur, au profit d’enclos intérieurs hermétiques aux moustiques.

b) Manipulation et contention Les manchots sont des animaux qui peuvent être dangereux en raison de leur puissant bec, qui peut infliger de sévères lacérations, et de leurs ailes modifiées en nageoires, qui peuvent (lors de battements rapides) blesser le manipulateur, notamment au visage (FOWLER, 1995 ; CRANFIELD, 2003).

(1) Contention physique Elle doit se faire dans un endroit sec de l’enclos, ne permettant pas l’accès au plan d’eau (FOWLER, 1995). Deux techniques d’approche sont possibles : simplement à l’aide d’une épuisette de taille idoine, ou en attirant l’attention du manchot avec une main, puis en l’attrapant vite à l’arrière du cou de l’autre main, afin de contrôler la tête et le bec (FOWLER, 1995 ; CRANFIELD, 2003). Les manchots pesant moins de 5 kg peuvent être contenus de la sorte, en les soulevant par le cou, pour de très courtes contentions ou de simples déplacements. En cas de contention plus longue, le manchot peut être assis sur l’avant-bras du manipulateur (CRANFIELD, 2003). Si l’on souhaite 68 réaliser un prélèvement sanguin, les pattes peuvent être prises en main une fois la tête contrôlée, et le manchot doucement étiré. Une autre personne peut intervenir pour bloquer les ailes, et la ponction sanguine peut s’effectuer aux veines brachiale, tarsométatarsienne, ou jugulaire (FOWLER, 1995).

En ce qui concerne la contention des manchots de grande taille, FOWLER recommande d’approcher doucement des animaux, puis de les recouvrir d’une poubelle en plastique dont le fond aura été coupé. La manipulation peut se faire par le fond ouvert de la poubelle, les mouvements du manchot restant limités. Afin d’éviter les blessures aux mains, il convient de bien cacher la tête des manchots les plus gros (FOWLER, 1995).

(2) Contention chimique Elle consiste en une anesthésie gazeuse. L’induction se fait en général à l’aide d’un masque, avec de l’isoflurane (de préférence) ou de l’halothane (FOWLER, 1995 ; CRANFIELD, 2003). Le maintien peut également se faire au masque, en raison de la difficulté à intuber les manchots (bifurcation très crâniale de la trachée) (CRANFIELD, 2003). Les anesthésies par voie injectable sont rares (FOWLER, 1995).

3. Historique des infections à Plasmodium

Le premier cas rapporté d’infection à Plasmodium chez un manchot est à mettre à l’actif de l’anglais SCOTT qui, en 1927, dresse, pour la Zoological Society de Londres, un état des lieux des causes de mortalité chez les espèces du parc Society’s Gardens, et mentionne un décès de manchot royal (Aptenodytes patagonicus) chez lequel Plasmodium praecox (aujourd’hui Plasmodium relictum) a été isolé. Selon l’auteur, la cause du décès est une mycose des sacs aériens associée à une entérite aiguë, mais toutefois, il s’étonne de la présence en très grand nombre du parasite, présent à tous les stades de son développement dans le sang périphérique (SCOTT, 1927).

En 1937, c’est au tour de RODHAIN, alors directeur de l’École de Médecine Tropicale Prince Léopold à Anvers (LEGOUT, 2006), de rapporter une infection à Plasmodium chez un manchot du Cap – Spheniscus demersus (RODHAIN, 1937). Laissant dans cette première description l’identification précise de l’espèce de Plasmodium en suspens, RODHAIN (1938a, 1938b, 1939 ; RODHAIN & ANDRIANNE, 1952) s’y consacrera activement dans les années suivantes, au cours desquelles il publiera plusieurs articles relatifs aux infections à Plasmodium chez les Sphénisciformes. En 1938, il « croit pouvoir affirmer » que le Plasmodium en cause appartient à l’espèce relictum, et rapporte 3 nouveaux cas d’infection par le parasite chez Spheniscus demersus. Dans le même article, il montre l’existence chez ces manchots d’un cycle schizogonique double, qu’il pressent être un phénomène général pour le « paludisme aviaire » (RODHAIN, 1938a). Toujours la même année, ses expériences d’inoculation de la souche isolée chez Spheniscus demersus à des manchots de Magellan (Spheniscus magellanicus) permettent de suspecter très fortement la réceptivité et la sensibilité de cette nouvelle espèce de manchot au parasite (les deux manchots de Magellan inoculés décèdent, le second ayant présenté une parasitémie trois jours avant son décès), et prouvent l’existence de formes de schizogonie sans pigment (RODHAIN, 1938b).

Un an plus tard, RODHAIN (1939) porte son bilan à 8 cas d’infections à Plasmodium chez les manchots, au cours de trois étés successifs (1936, 1937, et 1938) et rajoute Spheniscus humboldti parmi les espèces atteintes. Il note le caractère saisonnier des infections et met en cause Culex pipiens comme vecteur du parasite au zoo d’Anvers, où les cas ont été rapportés. Ses essais 69 d’immunité croisée, et la description morphologique des parasites confirment l’hypothèse d’une infection à Plasmodium relictum, tandis qu’il fait également part de ses premiers essais thérapeutiques (à base d’atébrine) efficaces sur les stades sanguins mais pas sur les stades réticulo- endothéliaux.

Puis RODHAIN & ANDRIANNE (1952) évoquent un peu plus tard deux nouveaux cas, chez des manchots à jugulaire (Pygoscelis antarctica), eux aussi pensionnaires du zoo d’Anvers, par un Plasmodium non identifié. Pour information, cet article rapporte de plus un cas d’infection par Plasmodium relictum chez un guillemot (Uria aalge, de la famille des alcidés) pour lequel l’autopsie a révélé une splénomégalie.

Parallèlement aux travaux de RODHAIN, FANTHAM & PORTER (1944) se sont intéressés aux Plasmodium des Sphénisciformes de la fin des années 1920 au début des années 1940. Mettant en évidence une espèce de Plasmodium à partir de frottis réalisés sur un manchot du Cap venu s’échouer sur les rochers de Saldanha Bay (Afrique du Sud) et mort très peu de temps après, les auteurs ont décidé de réaliser des frottis sur le plus grand nombre possible d’espèces de manchots (issus de différentes régions du globe), afin de rechercher les parasites. Un premier échantillon de 14 Spheniscus demersus a immédiatement été étudié à Saldanha Bay (soit 15 manchots si l’on compte le premier animal, décédé). FANTHAM & PORTER (1944) sont ensuite revenus à Saldanha Bay prélever 19 nouveaux manchots du Cap, puis se sont intéressés à 10 manchots antipodes (« Eudyptes antipodes » dans le texte) provenant de Forveau Strait (Nouvelle-Zélande), 5 gorfous sauteurs (« Eudyptes crestatus » dans le texte) provenant de l’île Gough (Atlantique sud), et au manchot royal (Aptenodytes patagonicus) étudié par SCOTT (1927). Les résultats font état d’infections chez deux manchots du Cap, un manchot antipode, un gorfou sauteur, et le manchot royal. De plus, les auteurs affirment que la même espèce de Plasmodium est présente chez tous ces manchots, et proposent d’en faire un variant de Plasmodium relictum, qu’ils baptisent Plasmodium relictum spheniscidae.

Enfin, REWELL (1948) rapporte un nouveau cas d’infection à Plasmodium chez un manchot royal (Aptenodytes patagonicus) dans son rapport sur les causes de mortalité à Regent’s Park. Sur les 24 manchots royaux accueillis par la Zoological Society of London en mai 1947, seuls trois ont survécu jusqu’à la fin de l’année (la plupart des décès étant dus à des mycoses respiratoires), et un Plasmodium a été mis en évidence dans le sang d’un individu qui présentait lui aussi des lésions mycosiques sévères.

Les bases de l’identification des Plasmodium des manchots étant posées, de nombreuses autres descriptions seront faites dans des parcs zoologiques, en parallèle d’études réalisées sur des populations sauvages de manchots. Les auteurs qui s’y consacrèrent, des années 1950 à nos jours, seront cités dans la prochaine partie de cette étude ; toutefois nous pouvons retenir quelques noms, comme STOSKOPF, BEIER, BROSSY, GRIM, CRANFIELD, et surtout GRACZYK, qui ont beaucoup publié à ce sujet, et dont les travaux plus ou moins reliés à notre étude sont incontournables.

4. Impact des infections à Plasmodium chez les manchots

a) Au sein des populations captives Le « paludisme» est une affection fréquente en parc zoologique, et est responsable d’un grand nombre de décès au sein des populations captives de manchots (CRANFIELD et al., 1994 ;

70 FIX et al., 1988 ; FLEISCHMAN et al., 1968a; GRACKZYK & CRANFIELD, 1996 ; GRACKZYK et al., 1994c, 1995a, 1995b ; GRIM et al., 2004 ; GRINER, 1974 ; HERMAN et al., 1968 ; HOOGESTEYN & CUNNINGHAM, 1996 ; PEIRCE, 2000 ; PENRITH et al., 1994 ; PETIT, 1998 ; VALKIUNAS, 2005). De nombreux cas ont été rapportés dans des zoos d’Amérique du Nord et d’Europe (CHITTY, 2006 ; CRANFIELD et al., 1994 ; DUIGNAN, 2001 ; FANTHAM & PORTER, 1944 ; FIX et al., 1988 ; FLEISCHMAN et al., 1968b; FOWLER, 1978 ; GRACZYK et al., 1994a, 1994d, 1995a ; GRIM et al., 2004 ; MCCONKEY et al., 1996 ; ROHAIN, 1937, 1938a, 1938b, 1939, 1952 ; SCOTT, 1927 ; VALKIUNAS, 2005), tandis que quelques auteurs évoquent l’infection chez des manchots vivant dans des parcs zoologiques en Afrique du Sud (PENRITH et al., 1994), ou en Nouvelle-Zélande (DUIGNAN, 2001).

Il s’agit de la première cause de mortalité chez les manchots maintenus dans des enclos extérieurs (CRANFIELD, 2003 ; CRANFIELD et al., 1990 ; GRACZYK et al., 1994d ; STOSKOPF & BEALL, 1980 ; STOSKOPF & BEIER, 1979) et au sein des populations captives de Spheniscus demersus (GRACZYK et al., 1994c. 1995c). L’infection est très souvent – et massivement – fatale chez les juvéniles (CRANFIELD et al., 1990 ; HOOGESTEYN & CUNNINGHAM, 1996 ; McCONKEY et al., 1996). La moitié ou plus des poussins, juvéniles et jeunes adultes exposés pour la première fois au vecteur peut succomber chaque année sans une surveillance intense et la mise en place d’une chimiothérapie (CRANFIELD et al., 1990 ; GRIM et al., 2004). La maladie peut donc anéantir les stratégies de reproduction (PETIT, 1998). Selon certains auteurs, l’infection serait même sous-estimée, en raison de difficultés à interpréter les analyses histologiques et de la confusion fréquente qui a été faite entre les schizontes de Plasmodium et ceux de Toxoplasma (JONES & SHELLAM, 1999a).

(1) Bilan de l’infection au sein des zoos d’Amérique du Nord Comme nous l’avons évoqué un peu plus haut, les colonies de manchots des zoos d’Amérique du Nord ont été fréquemment le siège d’infections à Plasmodium (CRANFIELD et al., 1994 ; DUIGNAN, 2001 ; FLEISCHMAN et al., 1968b ; FIX et al., 1988 ; FOWLER, 1978 ; GRACZYK et al., 1994a, 1994d ; GRIM et al., 2004 ; McCONKEY et al., 1996 ; VALKIUNAS, 2005).

(a) Zoo de Washington (Washington D.C.) Au début des années 1960, Plasmodium elongatum est isolé chez des manchots de Humboldt (Spheniscus humboldti) du National Zoological Park de Washington. Il s’agit du premier cas rapporté d’infection à Plasmodium elongatum chez des manchots (GRINER, 1974 ; HERMAN et al., 1968).

(b) Zoo de Baltimore (Maryland) À partir de 1967, le zoo de Baltimore va connaître plusieurs vagues de mortalités qui toucheront sa population de manchots du Cap (Spheniscus demersus), et pour lesquelles des Plasmodium seront mis en cause :

• Le 15 mai 1967, la collection de manchots du zoo de Baltimore s’élargit avec l’accueil de 34 Spheniscus demersus provenant, pour quatre d’entre eux, du National Zoological Park de Washington, et pour les trente autres de St Croix Island en Afrique du Sud. Après un mois passé en enclos intérieur pour les habituer à leur nouvel environnement, les manchots du Cap sont présentés au public en compagnie d’un spécimen de Spheniscus humboldti provenant du Pérou (FLEISCHMAN et al., 1968a). 71 • Entre le 4 août et le 13 décembre 1967, 18 décès de manchots du Cap sont rapportés, parmi lesquels 6 cas d’infection à Plasmodium ont été confirmés par analyse histologique. L’inoculation de sang et d’une émulsion d’organes d’un des manchots décédés à des canaris et à des canetons a permis de caractériser l’agent pathogène en cause : Plasmodium elongatum (FLEISCHMAN et al., 1968a, 1968b ; HERMAN et al., 1968). Il s’agit du premier cas d’infection à Plasmodium elongatum chez Spheniscus demersus (HERMAN et al., 1968).

• Quelques années plus tard, STOSKOPF et BEIER (1979) rapportent que 75 % des décès de manchots du Cap juvéniles, et 64 % des décès de manchots du Cap adultes entre 1969 et 1979 sont associés à des infections à Plasmodium. De plus, au cours d’une étude qu’ils mènent sur sept Spheniscus demersus juvéniles et trois Spheniscus demersus adultes, 7 parasitémies sont notées, sur 5 individus différents. Les Plasmodium en cause appartiennent essentiellement à l’espèce P. elongatum, Plasmodium relictum n’ayant été observé qu’une seule fois, au cours d’une infection mixte. Le diagnostic une fois confirmé par inoculation à des canards (10 confirmations sur 13 essais, 3 parasitémies détectées sur frottis n’ayant pas pu l’être après inoculation), quatre individus ont reçu un traitement. Un seul décès est finalement rapporté, chez l’individu, non traité, qui présentait une infection mixte. Un an plus tard, selon VALKIUNAS (2005), BEIER et STOSKOPF identifient la source de l’infection, à savoir les passereaux sauvages vivant en liberté dans le zoo (entre autres Cardinalis cardinalis, Melospiza melodia, Toxostoma rufum, et Turdus migratorius).

• CRANFIELD et al. (1990) dressent un bilan faisant état de 32 morts de jeunes manchots du Cap dues à des infections à Plasmodium, pour un total de 208 manchots élevés au cours des sept précédentes années, et ce en dépit des nouvelles techniques de diagnostic et de traitement, qui ont permis de diminuer le taux de mortalité. Au cours de l’été 1988, un dépistage a permis de mettre en évidence 32 épisodes de parasitémie chez 18 jeunes manchots (sur un total de 29 juvéniles). Quatorze de ces 18 manchots ont été infectés par Plasmodium elongatum, et 4 par Plasmodium relictum, tandis que 4 décès ont été notés (à chaque fois suite à une première infection par le parasite), trois d’entre eux étant dus à Plasmodium relictum, et un à Plasmodium elongatum. Ceci tend à montrer que Plasmodium relictum est la plus virulente des deux espèces parasitaires impliquées (CRANFIELD et al., 1990, 1994). Le taux de mortalité pour les juvéniles non traités s’élève à 50 % pour la période allant de 1980 à 1990 (CRANFIELD et al., 1990 ; GRACZYK et al., 1994d).

• Possédant au début des années 1990 la plus grande collection de Spheniscus demersus d’Amérique du Nord (CRANFIELD et al., 1990 ; GRACZYK & CRANFIELD, 1996 ; GRACZYK et al., 1994a, 1994c ; VALKIUNAS, 2005), le zoo de Baltimore va continuer à être frappé par des épisodes de « malaria » aviaire. En 1994, deux publications font le point sur l’infection des manchots du Cap : GRACZYK et al. 1994d) rapportent dans un premier temps un taux d’infection naturellement acquise similaire aux résultats de CRANFIELD et al (1990) : 62,1 % chez les juvéniles, 78,1 % des parasitémies étant dues à Plasmodium elongatum, 15,6 % à Plasmodium relictum, et 6,3 % à des Plasmodium non identifiés. Quatre décès sont notés (en dépit de l’instauration d’un traitement), dont trois sont dus à Plasmodium relictum, ce qui confirme la virulence particulière de cette espèce (GRACZYK et al., 1994d).

72 • CRANFIELD et al., (1994) démontrent ensuite l’existence d’infections subcliniques à Plasmodium relictum chez 4 manchots adultes sur 6 étudiés, grâce à la méthode d’inoculation à des canetons après l’instauration d’un traitement immunosuppresseur.

• En 1994, GRACZYK et al. (1994a) utilisent les frottis sanguins et – pour la première fois – l’ELISA pour détecter les parasitémies chez des Spheniscus demersus juvéniles. Afin d’éviter la détection d’anticorps d’origine maternelle, les manchots ont été maintenus un certain moment en enclos intérieur avant la mise en œuvre du protocole expérimental. Au total, 5 manchots sur 23 (22 %) développent une parasitémie visible sur les frottis, entre 4 et 15 semaines après leur transfert dans l’enclos extérieur. Parmi ces parasitémies, quatre sont dues à Plasmodium relictum (dont 2 seront fatales, soit 9 % de mortalité) et une à Plasmodium elongatum. Ces résultats sont très différents de ceux des précédentes études puisque la prévalence des infections visibles est sensiblement plus faible et la fréquence relative des 2 espèces de Plasmodium impliquées est inversée. La détection des anticorps montre l’existence d’une réponse humorale chez les 23 manchots étudiés, apparaissant entre 1 et 5 semaines après le transfert dans l’enclos extérieur. Tous les manchots ont donc été rapidement infectés par Plasmodium, et beaucoup ont présenté des infections subcliniques, non détectables avec les précédents outils diagnostiques.

• GRACZYK et CRANFIELD (1996) détectent des anticorps anti - « malaria » aviaire chez les 10 manchots femelles de leur étude, ainsi que dans leurs 59 œufs.

• La même année, McCONKEY et al. (1996) identifient deux espèces de moustique capables de transmettre le parasite dans l’enclos des manchots : Culex pipiens et Culex restuans, confirmant ainsi une hypothèse émise par BEIER et STOSKOPF en 1980 (McCONKEY et al., 1996 ; VALKIUNAS, 2005). Les auteurs utilisent la P.C.R. pour identifier trois « groupes » phylogénétiquement distincts de Plasmodium chez ces moustiques, dont un est retrouvé chez les manchots du parc et identifié morphologiquement comme Plasmodium relictum. De plus, la présence de ce parasite est directement reliée au décès d’un des manchots. Toutefois, la comparaison de la séquence ribosomale isolée avec les séquences de référence de Plasmodium relictum montre des différences significatives, ce qui prouve que P. relictum ne serait pas l’espèce responsable des décès de manchots, et que plusieurs espèces de Plasmodium pourraient être morphologiquement indiscernables (McCONKEY et al., 1996).

(c) Zoo de San Diego (Californie) En 1965, la population de manchots du zoo de San Diego connaît une importante vague de mortalité suite à des infections par un Plasmodium identifié morphologiquement comme appartenant à l’espèce P. relictum. Du 15 juillet au 15 septembre de cette année, treize manchots périssent, parmi lesquels cinq manchots de Humboldt (Spheniscus humboldti), trois manchots du Cap (Spheniscus demersus), trois manchots royaux (Aptenodytes patagonicus), un manchot pygmée (Eudyptula minor), et un manchot papou (Pygoscelis papua). De 1965 à 1974, le nombre total de décès de manchots dus à l’infection s’élève à trente-huit individus (GRINER, 1974).

Dix-huit ans plus tard, le même auteur estime à environ 40 % le nombre de décès de manchots dus à une infection par Plasmodium, sur une période de quatorze années. Quarante-six cas de « malaria » sont rapportés chez les manchots du parc, dont huit chez le manchot royal, trois chez le manchot papou, six (non confirmés) chez le gorfou sauteur (Eudyptes chrysocomme), un chez le manchot pygmée, dix-huit chez le manchot de Humboldt, et dix (non confirmés) chez le manchot 73 du Cap. Des frottis réalisés post mortem sur un manchot royal et sur un manchot papou malades ont permis d’identifier Plasmodium relictum, qui serait, selon l’auteur, responsable de tous les cas puisque les autres Plasmodium observés étaient morphologiquement identiques (GRINER, 1983).

(d) Blank Park Zoo de Des Moines (Iowa) Un autre cas d’infection à Plasmodium relictum chez des manchots maintenus en captivité en Amérique du Nord est rapporté par FIX et al. (1988). Il s’agit du premier cas d’infection naturelle à Plasmodium chez des manchots de Magellan (Spheniscus magellanicus) captifs. Cet épisode a touché le Blank Park Zoo à Des Moines (Iowa) qui a accueilli, le 26 avril 1986, 46 manchots de Magellan provenant de l’île de Noir, au large de la côte Sud du Chili. Trois vagues de mortalité ont été notées au zoo : au cours de la première (qui a commencé 48 heures après l’arrivée au parc des manchots et a duré 13 jours), 7 manchots ont péri ; au cours de la seconde (étalée sur 50 jours en juin et juillet 1986), 20 manchots ont trouvé la mort ; enfin au cours de la troisième (qui a duré 13 jours en septembre de la même année), 9 nouveaux décès ont été rapportés. Deux nouveaux décès sont survenus sporadiquement à la fin de l’automne, ce qui porte à 38 leur nombre total pour l’année 1986 (FIX et al., 1988 ; VALKIUNAS, 2005).

(e) Zoo de San Francisco (Californie) Le zoo de San Francisco héberge des manchots de Magellan (Spheniscus magellanicus) depuis la fin des années 1980. Depuis l’arrivée de la colonie, la principale affection rencontrée au parc a été l’infection à Plasmodium relictum ou Plasmodium elongatum, qui a notamment touché dix-sept manchots de 1997 à 2000, dont quatre sont décédés immédiatement, et trois (qui souffraient également d’aspergillose) après l’instauration d’un traitement médical (TOLLINI et al., 2000).

(2) Bilan de l’infection au sein des populations captives d’Europe La plupart des cas décrits de « paludisme » chez des populations captives de manchots en Europe a été évoquée dans l’historique des infections à Plasmodium chez les manchots. Nous renvoyons donc le lecteur au paragraphe correspondant.

Dans une synthèse sur les maladies parasitaires des animaux de zoo, GRINER (1974) évoque, en ce qui concerne les manchots, des infections graves à Plasmodium relictum au Schoenbrunn Zoo (à Vienne, en Autriche), ainsi que des infections fatales à Plasmodium dans plusieurs villes européennes : Anvers (Belgique), Londres (Royaume-Uni), Hambourg, et Berlin (Allemagne).

À l’occasion de la réunion de l’European Association of Zoos and Aquaria, PETIT (1998) dresse un état des lieux de l’infection au sein des parcs zoologiques européens en s’appuyant sur les résultats d’un questionnaire envoyé aux zoos hébergeant des manchots. Sur 52 parcs ayant renvoyé le questionnaire, 18 ont connu des cas avérés de « paludisme » et 4 autres des cas suspects. Géographiquement, des cas ont été rapportés dans des contrées septentrionales, comme le nord de l’Allemagne, et des anticorps ont été mis en évidence (sans signes cliniques associés) à Édimbourg (Écosse), ce qui suggère que l’infection peut avoir lieu partout sur le continent européen. Les espèces atteintes sont le manchot royal, le manchot papou, le gorfou sauteur, le manchot du Cap, le manchot de Humboldt, et le manchot de Magellan. Les enclos en question présentaient au moins un accès à l’extérieur, et aucun cas en enclos hermétique n’a été rapporté.

74 Depuis, de nouveaux cas ont été décrits, notamment au Royaune-Uni au cours de l’été 1999. Cette année-là, plus de 100 manchots auraient succombé à une infection paludéenne, principalement au zoo de Marwell, dans le Hampshire (décès de tous les manchots du parc, soit 21 Spheniscus demersus et 5 Eudyptes chrysolophus) et au Cotswold Wildlife Park, dans le Gloucestershire. Toutefois, l’infection par Plasmodium n’a pas pu être mise en évidence chez tous les manchots décédés à Marwell (HUGH-JONES, 1999, 2000 ; REDROBE, 1999).

Le zoo d’Édimbourg a également été atteint puisque quinze manchots y sont tombés gravement malades au cours du même été, mais aucun d’eux n’a succombé, grâce – selon les vétérinaires du parc – au traitement rapidement mis en place. En ce qui concerne le zoo de Londres, il aurait perdu 5 manchots parasités par Plasmodium entre 1984 et 1999 (HUGH-JONES, 1999, 2000 ; REDROBE, 1999).

Enfin, un nouvel épisode affectant le zoo de Marwell a été relaté beaucoup plus récemment par CHITTY (2006) : au cours de l’été 2006, le parc a perdu quatre de ses manchots de Humboldt en seulement cinq jours, malgré l’existence d’un traitement anti-paludéen hebdomadaire. Un seul individu a présenté des signes cliniques (une heure avant de décéder), et le diagnostic d’infection à Plasmodium a confirmé en quelques jours la suspicion clinique et post mortem. Apparemment, seuls les manchots en période de mue ont été touchés, tous les autres (dont deux juvéniles) ayant continué à bien se porter. Plasmodium relictum a été mis en évidence dans le sang de deux individus sous traitement qui n’ont pas péri suite à l’infection. En outre, l’auteur affirme que la collection du parc n’a pas été la seule victime du parasite, et que tout le Sud de l’Angleterre aurait été touché exactement à la même période.

(3) Bilan de l’infection au sein des populations captives de Nouvelle- Zélande Une séroprévalence élevée de « malaria » est rapportée chez des manchots pygmées (Eudyptula minor) maintenus en captivité à Napier, au Nord de la Nouvelle-Zélande (DUIGNAN, 2001).

(4) Bilan de l’infection au sein des populations captives d’Afrique du Sud Les infections à Plasmodium chez les manchots accueillis dans des centres de sauvegarde seront évoquées plus bas (Cf. infra).

En dehors de ces cas particuliers, une infection mixte à Plasmodium relictum et Clostridium perfringens de type B a été rapportée en 1994 chez un manchot royal (Aptenodytes patagonicus) hébergé aux National Zoological Gardens de Pretoria. L’animal, acquis dix-neuf mois auparavant avec cinq autres poussins en provenance de Marion Island, est décédé au cours de sa seconde mue, alors qu’il jeûnait depuis six jours. Cependant, imputer le décès du manchot à l’infection par Plasmodium est discutable, en raison de la faible charge en schizontes exo-érythrocytaires, mis en évidence uniquement dans le foie et la rate. À l’inverse, la plupart des lésions macroscopiques et microscopiques, notamment l’entérite nécrotique constatée à l’autopsie, semblent être dues chez ce manchot à l’infection par Clostridium perfringens (PENRITH et al., 1994).

75 (5) Bilan général de l’infection au sein des populations captives Le tableau 5 suivant récapitule les différentes espèces de manchots chez lesquelles l’infection à Plasmodium a été décrite en captivité, ainsi que les différentes espèces parasitaires impliquées.

Tableau 5 : bilan des espèces de manchots infectées par Plasmodium en captivité, et espèces parasitaires impliquées

Espèce parasitée Espèce parasitaire Sources Spheniscus demersus Plasmodium relictum CRANFIELD et al. (1990), FLEISCHMAN et al. (1968a), GRACZYK & CRANFIELD (1996), GRACZYK et al. (1994a, 1994b, 1994c, 1994d), GRINER (1974, 1983), JONES & SHELLAM (1999a), McCONKEY et al. (1996), PETIT (1998), RODHAIN (1938a, 1939), RODHAIN & ANDRIANNE (1952), STOSKOPF & BEALL (1980), STOSKOPF & BEIER (1979). Spheniscus demersus Plasmodium elongatum CRANFIELD et al. (1990), FIX et al. (1988), FLEISCHMAN et al. (1968a, 1968b), GRACZYK & CRANFIELD (1996), (suite) GRACZYK et al. (1994a, 1994b, 1994c, 1994d), HERMAN et al. (1968), JONES & SHELLAM (1999a), PETIT (1998), STOSKOPF & BEALL (1980), STOSKOPF & BEIER (1979). Non précisée HUGH-JONES (1999), REDROBE (1999). Spheniscus humboldti Plasmodium relictum CHITTY (2006), FLEISCHMAN et al. (1968a), GRINER (1974, 1983), PETIT (1998), RODHAIN (1939), RODHAIN & ANDRIANNE (1952). Plasmodium elongatum FIX et al. (1988), FLEISCHMAN et al. (1968a), HERMAN et al. (1968), JONES & SHELLAM (1999a), PETIT (1998), STOSKOPF & BEIER (1979). Spheniscus magellanicus Plasmodium relictum FIX et al. (1988), JONES & SHELLAM (1999a), PETIT (1998), TOLLINI et al. (2000). Plasmodium elongatum TOLLINI et al. (2000). Eudyptula minor Plasmodium relictum DUIGNAN (2001), GRINER (1974, 1983), JONES & SHELLAM (1999a). Aptenodytes patagonicus Plasmodium relictum FLEISCHMAN et al. (1968a), GRINER (1974, 1983), JONES & SHELLAM (1999a), PENRITH et al. (1994), PETIT (1998), REWELL (1948), SCOTT (1927). Pygoscelis antarctica Plasmodium relictum FLEISCHMAN et al. (1968a), JONES & SHELLAM (1999a), RODHAIN & ANDRIANNE (1952).

Pygoscelis papua Plasmodium relictum GRINER (1974, 1983), JONES & SHELLAM (1999a), PETIT (1998).

76 Espèce parasitée Espèce parasitaire Sources Eudyptes chrysocome Espèce non précisée GRINER (1983), JONES & SHELLAM (1999a), PETIT (1998). parmi P. relictum, P. elongatum et P. cathemerium Eudyptes chrysolophus Espèce non précisée HUGH-JONES (1999), REDROBE (1999), JONES & SHELLAM (1999a). parmi P. relictum, P. elongatum et P. cathemerium

Il convient toutefois de préciser que ce tableau ne peut être exhaustif puisque aucune recherche n’a été effectuée sur des populations captives pour un certain nombre d’espèces de manchots : Aptenodytes forsteri, Eudyptes pachyrhynchus, Eudyptes robustus, Eudyptes schlegeli, Eudyptes sclateri, Megadyptes antipodes, Pygoscelis adeliae, et Spheniscus mendiculus (JONES & SHELLAM, 1999a). Nous retiendrons néanmoins l’importance majeure des infections paludéennes au sein des populations captives de manchots : si la mise en cause du parasite dans de nombreux épisodes de mortalité est connue depuis des années, l’apparition de nouveaux outils de biologie moléculaire a permis d’apprécier non seulement la présence du parasite mais aussi l’intensité de l’infection au sein des colonies, révélant des taux d’infection parfois considérables. Par ailleurs, toutes les infections récapitulées dans le tableau 5 ci-dessus se sont avérées pathogènes et très souvent mortelles. Deux associations hôte-parasite pourraient toutefois faire exception : l'infection à Plasmodium elongatum chez Spheniscus humboldti – pour laquelle les auteurs évoquent simplement la mise en évidence du parasite, sans donner davantage de précisions sur la pathogénicité ou la mortalité – et l'infection à Plasmodium relictum chez Pygoscelis antarctica, qui a été retrouvé post mortem dans le sang et les tissus de deux individus, mais qui – selon RODHAIN & ANDRIANNE – ne serait pas la cause du décès, qui a été attribué à un téniasis.

b) Au sein des populations sauvages Si l’infection par Plasmodium des manchots maintenus en captivité a bien été étudiée, très peu d’études hématologiques ont en revanche été menées sur les populations sauvages, et les connaissances concernant l’infection de ces manchots par le parasite sont limitées (FIX et al., 1988 ; GRIM et al., 2003 ; MILLER et al., 2001).

Les manchots sont supposés être sensibles au parasite dans la nature, et c’est la possibilité d’une transmission par le moustique qui permet d’expliquer la répartition géographique des infections recensées au sein des populations sauvages (c’est-à-dire jusque dans les régions subantarctiques, où migrent certaines espèces pour se reproduire, mais pas sur le continent antarctique) et, par conséquent, les espèces de manchots affectées (BECKER & HOLLOWAY, 1968 ; DUIGNAN, 2001 ; GRINER, 1983).

77 (1) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots au Sud de l’Afrique Spheniscus demersus (le manchot du Cap) est la seule espèce de manchot vivant en Afrique : elle se reproduit sur la côte sud du continent et est menacée d’extinction en raison des marées noires, des maladies, de la diminution de ses ressources alimentaires (pêche intensive) et de la dégradation de son habitat (BROSSY, 1992 ; GRACZYK & CRANFIELD, 1996 ; GRACZYK et al., 1995a ; GRIM Et al., 2003 ; MARTÍNEZ, 1992).

Outre les travaux de FANTHAM & PORTER (1944) évoqués un peu plus haut (Cf. paragraphe I.B.3.) qui faisaient état de deux infections à Plasmodium sur 34 manchots du Cap sauvages prélevés à Saldanha Bay en 1927, plusieurs études de terrain ont été menées en Afrique depuis le début des années 1990 :

• En 1990, BROSSY (1992) effectue des frottis sanguins sur des manchots du Cap vivant à Dyer Island (île située à environ 100 km au sud-est du Cap). Sur les 143 individus prélevés, une seule infection (douteuse) a pu être décelée : une forme en anneau a été observée (à une seule reprise sur le frottis) chez un manchot qui semblait en bonne santé, et l’est resté avant d’être relâché. L’auteur conclut que l’infection « ne se produit normalement pas » chez les manchots vivant au large de la côte africaine (BROSSY, 1992). Une explication à cette prévalence faible (ou nulle) de Plasmodium chez les manchots sauvages avait été proposée par FANTHAM & PORTER (1944), qui évoquaient un plumage épais et protecteur vis-à-vis des moustiques, et un comportement de fuite dans l’eau en présence du vecteur (FANTHAM & PORTER, 1944 ; GRACZYK et al., 1995a).

• BENNETT et al. (1992) répertorient les associations hôte-parasite des hématozoaires d’oiseaux sub-sahariens. Les données (issues du Veterinary Research Institute, à Onderstepoort, Afrique du Sud) font état d’infections à Plasmodium relictum et Plasmodium spp. chez Spheniscus demersus.

• BROSSY (1993) évoque un cas d’infection à Plasmodium relictum chez un manchot vivant à Robben Island (île située juste au large du Cap, à proximité du continent) et – réaffirmant que l’infection ne se produit pas chez les populations sauvages – met en garde contre la gravité d’une éventuelle (bien qu’improbable) épizootie dans les colonies installées sur le continent ou à proximité (en l’occurrence à Robben Island et Simon’s Town).

• GRACZYK et al. (1995a) remettent implicitement en doute les résultats de BROSSY en rappelant que la prévalence des parasitémies pourrait ne pas refléter l’étendue réelle de l’infection au sein de la population de manchots, en raison des phénomènes de rechute et de recrudescence décrits chez de nombreuses espèces d’oiseaux, dont Spheniscus demersus. Ils proposent donc une étude basée sur l’utilisation de la technique ELISA qu’ils ont mise au point (Cf. paragraphe I.A.12.e.(1)) pour déterminer la prévalence de l’infection. Seize manchots du Cap sur 46 prélevés sont testés positifs à Robben Island (35 %), 10 sur 34 à Simon’s Town (29 %), et 10 sur 30 à Dassen Island (33 %). En outre, l’absorbance moyenne à 405 nm chez ces populations sauvages (0,70 +/- 0,04) s’est avérée significativement inférieure à celle d’une population captive de manchots du Cap utilisée comme témoin. Toutefois, la comparaison des titres d’anticorps entre population sauvage et groupe témoin est sujette à caution : les témoins vivent en Amérique du Nord 78 et reçoivent des traitements qui diminuent la mortalité et augmentent l’exposition au parasite (puisque les animaux ne meurent pas). D’autre part, les îles sur lesquelles a porté l’étude sont proches des centres de sauvegarde du continent, où des manchots blessés sont recueillis et peuvent être infectés (Cf. paragraphe I.B.4.c.). Les manchots relâchés peuvent alors retourner à leur colonie d’origine (c’est le cas pour 87 % des Spheniscus demersus) et les taux détectés pourraient donc ne pas refléter l’exposition réelle des manchots dans leur habitat naturel. Enfin, il existe également une immunité transmise par la mère (Cf. paragraphe I.B.6.g.) qui pourrait expliquer certaines séropositivités.

• BROSSY et al. (1999) effectuent une nouvelle étude sur des populations sauvages de manchots vivant dans huit localités différentes (principalement des îles) de la province du Western Cape, en Afrique du Sud. Utilisant le test ELISA évoqué précédemment, il rapporte la présence d’anticorps anti-Plasmodium chez 60 à 80 % des manchots sauvages étudiés. Les auteurs émettent également l’hypothèse de la présence, chez les manchots sauvages, d’une sous-espèce (Plasmodium relictum subsp. spheniscidae, déjà évoquée par FANTHAM & PORTER, 1944) endémique et peu pathogène, qui donnerait une réponse croisée au test ELISA, mais n’assurerait pas de protection immune suffisante contre les Plasmodium relictum présents sur le continent, ce qui expliquerait la morbidité et la mortalité notées chez les manchots recueillis dans les centres de sauvegarde (Cf. paragraphe I.B.4.c.) (BROSSY et al., 1999 ; LOMBARD et al., 1999). Ainsi, si la plupart des îles sur lesquelles vivent les manchots du Cap sont suffisamment éloignées du continent pour que les moustiques n’y séjournent que sporadiquement, et les oiseaux du continent n’y survivent que peu de temps, deux colonies font exception et restent exposées à un risque élevé d’épizootie à Plasmodium relictum. Elles sont surveillées attentivement, et des mesures visant à limiter les risques d’infection sont prises dans les centres de sauvegarde situés sur le continent (BROSSY et al., 1999 ; BROSSY, 1993).

• Dans un bilan sur les affections des manchots admis en 2001 et 2002 dans un centre de sauvegarde situé en Afrique du Sud, PARSONS & UNDERHILL (2005) rapportent que beaucoup de manchots présentent des parasitémies à Plasmodium au moment de leur admission, ce qui suggère que le parasite est présent dans les colonies sauvages.

(2) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots en Nouvelle-Zélande Rappelons succinctement que FANTHAM & PORTER (1944) ont mis en évidence un Plasmodium chez un manchot antipode (sur dix prélevés) à Foveaux Strait en 1944.

LAIRD (1950) identifie (sur des frottis sanguins) des infections de faible intensité à Plasmodium relictum var. spheniscidae chez un manchot antipode (sur deux individus prélevés à l’île Campbell) et trois gorfous de Fiordland (sur vingt-huit individus prélevés aux îles Snares).

En outre, Plasmodium relictum a également été mentionné en 1966 chez des manchots en Nouvelle-Zélande (GRACZYK et al., 1995b).

GRACZYK et al. (1995b) utilisent une nouvelle fois l’ELISA basé sur l’antigène R32tet32 de Plasmodium falciparum pour rechercher des anticorps anti-plasmodiaux chez des manchots sauvages. Une première recherche sur des Megadyptes antipodes de la péninsule Otago aboutit au résultat éloquent de 100 % de séropositivité. Des anticorps sont également retrouvés chez des individus de la même espèce sur la péninsule de Banks, la côte Catlins, l’île Codfish, l’île Enderby, 79 et l’île Campbell (GRACZYK et al., 1995b ; DUIGNAN, 2001). Pourtant, aucun hémoparasite n’avait été mis en évidence sur des frottis sanguins réalisés à partir de 83 manchots antipodes de l’île Campbell (DUIGNAN, 2001).

En outre, aucun anticorps n’a été mis en évidence chez les gorfous sauteurs de l’île Campbell (GRACZYK et al., 1995b ; DUIGNAN, 2001).

Un second dépistage, portant sur Megadyptes antipodes (145 prélèvements), Eudyptula chrysocome (9 prélèvements), et Eudyptula minor (8 prélèvements) conclut à une séroprévalence nulle pour E. chrysocome, contrairement aux autres espèces (63 % pour E. minor, et 23 % à 91 % pour les six populations de M. antipodes étudiées). Une fois encore (Cf. paragraphe précédent) les absorbances notées (1,13 +/- 0,01 en moyenne) sont inférieures à celles des manchots du Cap captifs utilisés comme témoins même si la comparaison de ces valeurs est, comme nous l’avons vu précédemment, discutable. Selon les auteurs, la séronégativité notée pour E. chrysocome, dont les individus ont été prélevés sur l’île subantarctique de Campbell résulterait d’un manque d’exposition au parasite. À l’inverse, les forts taux de séropositivité des autres populations étaient prévisibles, en raison de la présence – fréquemment rapportée – de Culex asteliae, Culex pervigilans, et Culex quinquefasciatus en Nouvelle-Zélande. Les deux dernières espèces peuvent se reproduire sur une zone territoriale très large et tolèrent très bien les variations de températures du pays (GRACZYK et al., 1995b).

Enfin, en 1989, 150 Megadyptes antipodes ont péri au cours de deux mois estivaux sur la péninsule Otago. Aucune cause de mortalité n’a été établie (aucun virus aviaire n’a été détecté et les analyses toxicologiques et microbiologiques ont permis d’exclure les intoxications aux métaux lourds et à de nombreux autres toxiques, les intoxinations par Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, et les dinoflagellés, et enfin la mort par famine). Les poussins n’ont pas été affectés et aucune vague de mortalité n’a été notée l’été suivant. Or, 11 prélèvements issus de carcasses décongelées d’individus touchés par cette vague de mortalité ont été intégrés à l’étude de GRACZYK et al. (1995b) qui ont noté 82 % de séropositivité chez ces individus. De plus le titre en anticorps s’est avéré significativement plus élevé chez les animaux touchés par la vague de mortalité que chez les autres Megadyptes antipodes vivant dans la même région. Ce constat, auquel s’ajoutent les observations effectuées à l’examen nécropsique (congestion et œdème pulmonaires), l’élévation de la température de l’eau au moment de l’épisode (15,4 °C contre 11,0 °C habituellement) favorisant l’augmentation de la population de Culex quinquefasciatus et la rapidité avec laquelle les décès se sont enchaînés (la majorité d’entre eux ayant eu lieu dans une période de quatre semaines) ont amené les auteurs à conclure que l’infection à Plasmodium était la cause des décès (GRACZYK et al., 1995b). Néanmoins, ces conclusions ont été récemment remises en cause dans une étude de STURROCK & TOMPKINS (2007) : si les auteurs évoquent un cas avéré d’infection paludéenne chez un Megadyptes antipodes juvénile retrouvé mort en 2001 (avec visualisation des parasites dans les tissus), ils restent sceptiques quant à la mise en cause de Plasmodium à une plus grande échelle, notamment en ce qui concerne des épisodes de mortalité massive pour cette espèce. Soulignant par ailleurs le décalage entre l’absence de détection du parasite lors d’études faisant appel à des lectures de frottis sanguins et la séroprévalence élevée notée au cours des enquêtes sérologiques, ils proposent d’utiliser la P.C.R. (amorces 543F et 926R, Cf. paragraphe I.A.12.d.) pour déterminer la prévalence de l’infection chez 143 manchots antipodes de la péninsule Otago. Tous leurs échantillons se sont avérés négatifs à la P.C.R. ce qui, compte- tenu de la sensibilité du test (évaluée à 90 %), signifie qu’il y a 95 % de chances pour que la prévalence ait été inférieure à 2,3 % dans la population étudiée, au cours de la période d’étude. Deux hypothèses ont été retenues pour expliquer ces résultats surprenants : soit les tests sérologiques surestiment beaucoup la prévalence de l’infection, soit l’infection est transitoire, et 80 restreinte à certains individus d’une période ou d’une tranche d’âge insuffisamment étudiées. Dans le premier cas, l’importance des séroprévalences pourrait signifier l’existence d’une infection des manchots par un ou des organisme(s) donnant des réactions croisées avec Plasmodium au cours des tests sérologiques. Dans le second, l’infection pourrait toucher principalement les poussins ou les juvéniles, qui n’ont pas été suffisamment bien étudiés : si la taille de l’échantillon de poussins de cette étude (57 individus) est suffisante pour détecter une prévalence de 6 % avec 95 % de confiance, les prélèvements ont été effectués entre novembre et mi-décembre, soit à une prériode où la plupart des poussins restent sous leurs parents, et pourraient être moins exposés aux moustiques. De plus, le nombre de juvéniles étudiés est trop faible (quatre individus seulement) alors qu’il pourrait s’agir d’une tranche d’âge à risque puisque les manchots antipodes peuvent parcourir jusqu’à 240 kilomètres vers le nord après leur première mue, et ainsi se retrouver en contact avec de nouveaux parasites. Si Plasmodium peut persister plusieurs années chez les oiseaux, seuls 7 % des manchots étudiés ici avaient moins de cinq ans. Les juvéniles survivant à l’infection pourraient se débarrasser du parasite, et donner des réponses négatives à la P.C.R. lorsqu’ils ont plus de cinq ans, tandis que la persistance d’anticorps, témoignant de l’infection passée, pourrait expliquer l’importance des séroprévalences notées. Quoi qu’il en soit, il est difficile d’estimer si Plasmodium a bien été à l’origine de la mortalité de masse à Otago en 1989, d’autant plus que seuls des manchots adultes auraient été affectés. Néanmoins, le fait que le parasite ait déjà été visualisé chez Megadyptes antipodes signifie que sa transmission est bien effective chez cette espèce. Son absence chez les adultes pourrait signifier l’existence d’un réservoir chez les nombreuses espèces aviaires sympatriques, et une transmission occasionnelle aux manchots antipodes. Ceci représenterait un danger non négligeable d’extinction pour cette espèce, dont la population totale est estimée à seulement 4 000 individus vivant au sud de la Nouvelle-Zélande, et qui est déjà menacée par la dégradation de son habitat et la prédation des poussins.

(3) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots en Australie Des mortalités causées par Plasmodium relictum chez des manchots pygmées (Eudyptula minor) sauvages sont rapportées an Australie (DUIGNAN, 2001).

En revanche, aucun hématozoaire n’a été mis en évidence sur des frottis sanguins réalisés à partir de manchots royaux, de manchots papous, et de gorfous de Schlegel vivant sur l’île Macquarie (île australienne proche de la Nouvelle-Zélande) (DUIGNAN, 2001). De même, les frottis réalisés sur des manchots royaux et des gorfous dorés de l’île Heard (île Australienne subantarctique) n’ont pas permis de mettre en évidence des Plasmodium (DUIGNAN, 2001), pas plus que ceux réalisés sur 70 et 30 manchots pygmées prélevés respectivement en Tasmanie et à Penguin Island (à l’ouest de l’Australie) (JONES & SHELLAM, 1999b).

(4) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots aux îles Galapagos Avant l’étude de MILLER et al. (2001), on ne savait rien de la présence, ou non, de Plasmodium aviaires sur les îles Galapagos. La seule espèce de moustique historiquement reconnue sur ces îles, Aedes taeniorhynchus, n’est pas considérée comme vecteur du parasite, mais l’installation plus récente de Culex quinquefasciatus pouvait laisser supposer que des Plasmodium se soient installés au sein de la faune aviaire locale. Quatre-vingt quatorze prélèvements de manchots des Galapagos, soit 2 à 10 % de la population totale de cette espèce, ont été testés par P.C.R. (à l’aide des amorces de LI et al., 1995 – Cf. paragraphe I.12.d.). Certains de ces manchots 81 provenaient des îles Floreana, Bartolomé et Santiago, qui sont soit habitées à l'année, soit massivement visitées. Tous les échantillons ont donné des résultats négatifs et, compte tenu de la taille importante de l’échantillon, de la sensibilité du test P.C.R., de l’arrivée récente (1989) de Culex quinquefasciatus sur le territoire, et de l’existence de réponses négatives même chez les individus susceptibles d’interagir avec l’homme, les auteurs concluent à une absence très vraisemblable de Plasmodium au sein de la population de manchots des Galapagos. Toutefois, Culex quinquefasciatus n’a été retrouvé que sur deux îles de l’archipel, dont l’île Santa Cruz, où aucun manchot n’a pu être mis en évidence au moment de l’étude. Ce constat amène les auteurs à émettre l’hypothèse d’une éventuelle corrélation entre l’installation du moustique et la disparition apparente des manchots sur cette île.

(5) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots en Antarctique Il y a quarante ans, BECKER & HOLLOWAY (1968) publiaient les résultats de leur recherche d’hématozoaires chez des oiseaux vivant en Antarctique. Sur 19 manchots étudiés (18 Pygoscelis adeliae et 1 Aptenodytes forsteri), aucun ne présenta d’hématozoaires après lecture des frottis sanguins (BECKER & HOLLOWAY, 1968). Il se pourrait tout de même qu’il existe une sensibilité de ces manchots à Plasmodium, mais que la transmission de l’infection par les moustiques (notamment les culicidés) soit impossible à des latitudes si basses, puisque ceux-ci sont absents du continent Antarctique (BECKER & HOLLOWAY, 1968 ; JONES & SHELLAM, 1999b).

Un peu moins de trente ans plus tard, GRACZYK et al. (1995b) apportent un argument de plus à cette théorie en constatant l’absence de moustiques et une séronégativité des manchots d’Adélie (test ELISA) présents sur l’île Antarctique de Ross (GRACZYK et al., 1995b ; DUIGNAN, 2001).

Une étude de JONES & SHELLAM (1999) aboutit au même constat : aucun des 50 manchots royaux et 26 manchots d’Adélie prélevés sur le territoire antarctique australien n’a présenté de Plasmodium après lecture des frottis sanguins. Les auteurs rappellent que le nombre total de manchots antarctiques examinés dans des études concluant à une absence de parasitémie est de 189 (pour 2 espèces étudiées) et que le fait de passer à côté d’infections de faible intensité (parasitémie basse) ou à faible prévalence est ainsi peu probable.

(6) Bilan de l’infection au sein des populations sauvages de manchots issues d’autres régions géographiques Rappelons ici la mise en évidence par FANTHAM & PORTER (1944) d’un Plasmodium chez un gorfou sauteur provenant de l’île Gough, dans le pacifique sud (FANTHAM & PORTER, 1944 ; JONES & SHELLAM, 1999a).

Par ailleurs, des anticorps ont été mis en évidence chez des manchots royaux et papous aux îles Kerguelen et Crozet (domaines des Terres Australes et Antarctiques Françaises), dans le sud de l’océan indien (DUIGNAN, 2001), et des Plasmodium ont été visualisés sur des frottis sanguins réalisés chez des manchots à jugulaire subantarctiques (MILLER et al., 2001).

À l’inverse, aucun des 18 manchots de Humboldt examinés par JONES & SHELLAM (1999b) sur l’île Cachagua (Chili) n’a présenté de Plasmodium sur frottis sanguin.

82 (7) Bilan général de l’infection au sein des populations sauvages de manchots Le tableau 6 récapitule les différentes espèces de manchots chez lesquelles l’infection à Plasmodium a été décrite à l’état sauvage, ainsi que les différentes espèces parasitaires impliquées.

L’absence d’infections à Plasmodium chez certaines colonies sauvages de manchots est probablement à relier à l’absence de vecteurs arthropodes dans ces régions (JONES&SHELLAM, 1999b).

Par ailleurs, des études plus larges des populations sauvages de manchots sont encore nécessaires, notamment en ce qui concerne les espèces que l’on retrouve sur le continent sud- américain, en Argentine et au Chili. L’absence apparente de Plasmodium au sein de ces colonies pourrait en effet être due à une insuffisance de recherche dans ce domaine (JONES & SHELLAM, 1999a, 1999b).

83

Tableau 6 : bilan des espèces de manchots infectées par Plasmodium à l’état sauvage, et espèces parasitaires impliquées

Espèce parasitée Espèce parasitaire Sources Spheniscus demersus Plasmodium relictum BENNETT et al. (1992), BROSSY (1993), BROSSY et al. (1999), DUIGNAN (2001), FANTHAM & PORTER (1944), (var. spheniscidae?) FIX et al. (1988), FLEISHMAN et al. (1968a), GRACZYK et al. (1995a), JONES & SHELLAM (1999a, 1999b), LOMBARD et al. (1999), MILLER et al. (2001), PARSONS & UNDERHILL (2005). Megadyptes antipodes Plasmodium relictum DUIGNAN (2001), FANTHAM & PORTER (1944), FIX et al. (1988), FLEISHMAN et al. (1968a), GRACZYK et al. (1995b), (var. spheniscidae?) JONES & SHELLAM (1999a, 1999b), LAIRD (1950), MILLER et al. (2001). Eudyptula minor Plasmodium relictum DUIGNAN (2001), GRACZYK et al. (1995b). Aptenodytes patagonicus Plasmodium relictum DUIGNAN (2001). Pygoscelis antartica Plasmodium relictum MILLER et al. (2001).

Pygoscelis papua Plasmodium relictum DUIGNAN, (2001). Eudyptes chrysocome Plasmodium relictum FANTHAM & PORTER (1944), FLEISHMAN et al. (1968a), GRACZYK et al. (1995a), JONES & SHELLAM (1999a, (var. spheniscidae?) 1999b), MILLERet al. (2001). Eudyptes pachyrhynchus Plasmodium relictum JONES & SHELLAM (1999a, 1999b), LAIRD (1950).

(var. spheniscidae?)

En conclusion, GRIM et al. (2003, 2004) affirment que les infections à Plasmodium pourraient affecter les populations sauvages de manchots. N’oublions pas, néanmoins, que la présence du parasite et son influence sur les populations sauvages de manchots sont plutôt mal connues (par rapport au cas des colonies vivant en parc zoologique) et sujet à diverses controverses entre les auteurs que nous avons cités. Les conditions d’étude sont plus contraignantes qu’elles ne le sont pour des populations captives, et certains diagnostics ont été posés par élimination, et non par confirmation de la présence de l’agent pathogène suspecté. La prudence quant à l’interprétation des résultats repris ci-dessus est donc de mise.

De nombreux manchots ont été victimes de la chasse au XIXème siècle et au début du siècle suivant. Aujourd’hui, la plupart des espèces de manchots sont protégées, et certaines populations voient même leur nombre augmenter. Toutefois, l’homme représente toujours une menace pour les manchots à l’état sauvage, notamment par le biais des maladies faisant intervenir un vecteur arthropode. Si, pour l’instant, les infections à protozoaires ont été exclues de l’étiologie d’un certain nombre d’épisodes de mortalité massive au sein des populations sauvages de manchots, le réchauffement climatique pourrait étendre vers le sud l’aire de répartition des vecteurs, et accroître leur densité. Ceci représente un danger pour les Sphénisciformes venant se reproduire sur la terre ferme (en l’absence de mer à franchir pour les moustiques). De plus, les parasites eux-mêmes se 84 reproduisent plus rapidement lorsque la température augmente. Ce risque concerne les colonies de manchots qui séjournent sur les côtes africaines et sud-américaines (GRIM et al., 2003 ; JONES & SHELLAM, 1999a, 1999b).

Par ailleurs, d’autres facteurs peuvent induire une immunosuppression et une sensibilité accrue aux infections, comme l’augmentation des radiations ultraviolettes (due aux trous de la couche d’ozone), l’exposition croissante des manchots aux polluants environnementaux (pétrole notamment), la disponibilité de leur nourriture qui diminue (notamment à cause d’El Niño et de la pêche intensive), ainsi que la destruction de leur habitat, ou sa perturbation au moment de la reproduction (par les touristes et les avions) qui engendre un stress pouvant faire d’une infection initialement bénigne une affection sévère et potentiellement fatale. Les manchots sont une composante majeure de la biomasse des régions océaniques australes et sont prédominants en Antarctique. Leur rôle écologique est donc central et il faut veiller à ne pas introduire de maladies auxquelles ils ne sont pas naturellement exposés, ou auxquelles ils sont particulièrement sensibles (GRIM et al., 2003 ; JONES & SHELLAM, 1999a, 1999b).

c) Dans les centres de sauvegarde Nous traitons à part le cas particulier des manchots recueillis dans les centres de sauvegarde (dont la situation est intermédiaire entre celle des populations sauvages et des populations captives), pour lesquels l’infection à Plasmodium est une maladie reconnue, à forte morbidité, qui constitue un obstacle à leur réinsertion (CRANFIELD, 2003 ; GRACZYK & CRANFIELD, 1996 ; GRIM et al., 2004).

De nombreuses études ont été effectuées au centre de sauvegarde du SANCCOB (South African Foundation for the Conservation of Costal Birds), plus grand centre de réhabilitation des manchots en Afrique du Sud (GRIM et al., 2003), situé au Cap, et qui recueille de nombreux manchots du Cap victimes – notamment – des dégazages d’hydrocarbures au large des côtes sud- africaines. Nous allons les évoquer dans l’ordre chronologique :

• En 1988 et 1989, BROSSY (1992) met en évidence Plasmodium relictum chez 8 des 36 manchots autopsiés au SANCCOB. L’auteur met en garde contre les risques d’une transmission de la maladie aux populations sauvages en rappelant que les manchots du centre sont relâchés à Robben Island où ils regagnent en général leur colonie d’origine. BROSSY (1992) donne également les raisons qui expliquent selon lui l’importante prévalence de l’infection au SANCCOB, alors que celle-ci n’existe a priori pas au sein des colonies sauvages : les manchots recueillis sont exposés aux moustiques, ce qui n’est pas le cas dans leur habitat naturel, et ne peuvent pas fuir dans l’eau, comme l’avaient déjà suggéré FANTHAM & PORTER (1944).

• BROSSY (1993) met en évidence Plasmodium relictum chez 20 % des manchots accueillis au SANCCOB pendant les mois d’été. La plupart des déversements d’hydrocarbures se déroulant (pour des raisons inconnues) l’hiver, la prévalence de l’infection retombe à 10 % sur l’ensemble de l’année.

• L’utilisation de l’ELISA par GRACZYK et al. (1995a) permet la mise en évidence d’anticorps anti-Plasmodium chez en moyenne 48 % des manchots prélevés après un séjour d’au moins deux semaines au SANCCOB (de 20 % à 68 % selon les groupes étudiés), pour une absorbance moyenne de 0,43 +/- 0,02. L’exposition des individus captifs au parasite y est donc plus importante que pour les populations sauvages (48 %

85 contre 33 %), mais la réponse en anticorps est en revanche plus faible chez les manchots de SANCCOB (qui – rappelons-le – sont pour la plupart affectés par les dégazages d’hydrocarbures). Deux explications sont proposées : tout d’abord, la contamination par les hydrocarbures immobiliserait les manchots et détériorerait l’étanchéité de leur plumage, les rendant plus vulnérables aux attaques des moustiques (les mues ne permettent pas l’élimination du pétrole). D’autre part, l’ingestion de pétrole a des effets néfastes sur les reins, le système endocrine (hypothyroxinémie, hypocorticostéronémie), les transports membranaires, et elle provoque l’apparition de lésions dans les érythocytes.

• BROSSY et al. (1999) publient les résultats d’une nouvelle étude : des parasitémies à Plasmodium relictum sont régulièrement notées pendant les mois estivaux, avec notamment un pic à environ 40 % au mois de décembre. L’utilisation de l’ELISA met en évidence des anticorps anti-Plasmodium chez la plupart des oiseaux du centre SANCCOB. L’hypothèse d’une sous-espèce de Plasmodium endémique aux manchots sauvages ne donnant pas d’infection cliniquement visible est reprise la même année, et l’acquisition d’une autre sous-espèce à partir des oiseaux capables de voler (via les moustiques) donnerait une infection plus pathogène (LOMBARD et al., 1999).

• GRIM et al. (2003) évaluent à 27 % la part annuelle des décès de manchots dus à une infection à Plasmodium au centre SANCCOB. En combinant des critères morphologiques (lecture de frottis sanguins) et des critères moléculaires (utilisation de la P.C.R. basée sur la petite sous-unité ribosomale mise au point par LI et al., Cf. paragraphe I.12.d.) sur cinq manchots du Cap décédés suite à une infection à Plasmodium (infection diagnostiquée à l’aide de signes cliniques évocateurs, de l’observation d’une parasitémie sur frottis sanguin, et de lésions caractéristiques à l’autopsie) les auteurs mettent en évidence Plasmodium juxtanucleare. Il s’agit de la première description de ce parasite chez un oiseau autre que les gallinacés. Plasmodium juxtanucleare a une large distribution géographique chez les oiseaux, de l’Amérique du Sud à l’Asie, en passant par l’Afrique du Sud. Certaines espèces de moustiques des genres Aedes et Anopheles ne le transmettent pas efficacement, mais plusieurs espèces de Culex peuvent assurer la transmission. Un tel vecteur n’a pas pu être mis en évidence dans les îles situées au large de la côte sud-africaine (GRIMetal., 2003). Les manchots du Cap n’auraient donc pas acquis d’immunité contre cette espèce parasitaire (SCHULTZ & WHITTINGTON, 2005).

• Enfin, PARSONS & UNDERHILL (2005) font un bilan des causes de mortalité des Spheniscus demersus accueillis au centre SANCCOB en 2001 et 2002. Des frottis sanguins y sont réalisés toutes les semaines, révélant que 34 % et 17 % des manchots accueillis ont présenté des parasitémies à Plasmodium, respectivement au cours des années 2001 et 2002 (PARSONS & UNDERHILL, 2005). La responsabilité de Plasmodium dans un décès est validée à au moins une des trois conditions suivantes : visualisation du parasite sur un frottis sanguin, examen nécropsique concluant (lésions retenues : splénomégalie, œdème pulmonaire, hydropéricarde), et observation de formes tissulaires dans le rein (PARSONS & UNDERHILL, 2005 ; GRIM et al., 2003). Cent neuf décès sur 467 (23 %) ont ainsi été attribués à une infection paludéenne (29 % pour 2001 et 19 % pour 2002). Cinquante sept pour cent des manchots chez lesquels le parasite a été mis en évidence entre novembre 2001 et mars 2002 sont morts, contre 10 % entre avril et octobre 2001, et 17 % entre avril et octobre 2002. Quatre-vingt trois pour cent des décès dus à Plasmodium en 2001 ont été notés chez des juvéniles, contre 68 % en 2002 (PARSONS & UNDERHILL, 2005). 86 L’infection des manchots accueillis dans les centres de sauvegarde d’Afrique du Sud a donc été bien étudiée, et le taux de mortalité s’y avère relativement important comparativement à celui noté au sein des populations sauvages. La question de l’existence de deux sous-espèces différentes de Plasmodium relictum soulevée par BROSSY et al. (1999) et LOMBARD et al. (1999) n’a toujours pas été clairement élucidée.

d) Conclusion sur l’importance des infections à Plasmodium chez les manchots Le petit nombre d’infections à Plasmodium décrites ou avérées au sein des populations sauvages de manchots contraste avec le nombre important de cas rapportés au sein des populations captives de Sphénisciformes, même s’il existe certainement un biais important lié à la difficulté d’étude des populations sauvages. La plupart des infections décrites en captivité sont d’une intensité modérée à élevée, tandis que la charge parasitaire des manchots sauvages infectés est en général faible (JONES & SHELLAM, 1999b). Par ailleurs, les séropositivités notées semblent également plus élevées en captivité, même si – comme nous l’avons vu – la comparaison directe avec des valeurs obtenues sur serum d’oiseaux sauvages est apparemment discutable (GRACZYK et al., 1995a, 1995b). Une explication pourrait être l’existence d’infections intenses mais passant inaperçues au sein des colonies de manchots sauvages, les individus atteints mourant rapidement ou disparaissant en mer. À l’inverse, les individus maintenus en captivité ne sont la plupart du temps examinés que lorsqu’ils sont malades, et des recherches n’ayant pas abouti à une mise en évidence de parasites sont moins susceptibles d’être publiées (JONES & SHELLAM, 1999b). En outre, RODHAIN (1939) soulignait que les zoos représentent un cadre de vie favorable aux moustiques, qui trouvent, dans les abreuvoirs des animaux ou les étangs des jardins, des endroits multiples favorables à la ponte des oeufs et l’éclosion des larves permettant leur multiplication.

La plupart des colonies de manchots situées en Afrique du Sud, en Australie, en Nouvelle- Zélande, en Amérique du Sud, ou sur les îles adjacentes à ces territoires, partagent leur habitat avec des vecteurs potentiels du parasite, et des oiseaux – notamment les passereaux – qui sont susceptibles d’être infectés par des hématozoaires. Ainsi, les cas rapportés d’infection à Plasmodium chez des manchots sauvages pourraient avoir pour origine un réservoir d’espèces aviaires sympatriques infectées par le parasite (JONES & SHELLAM, 1999b). L’existence supposée – et déjà évoquée plus haut – d’une sous-espèce de Plasmodium relictum adaptée et confinée aux manchots sauvages pourrait expliquer les faibles prévalence et intensité des infections chez ces oiseaux, mais, basée sur quelques critères uniquement morphologiques, elle n’a pas pu être établie avec certitude (BROSSY et al., 1999 ; FANTHAM & PORTER, 1944 ; JONES & SHELLAM, 1999b ; LAIRD, 1950 ; LOMBARD et al., 1999).

Un autre facteur à prendre en compte est le fait que beaucoup d’espèces de manchots passent de longues périodes (jusqu’à plusieurs mois) loin de la terre ferme. Ainsi, l’absence d’exposition au vecteur pourrait excéder l’espérance de vie des parasites, et rompre le cycle parasitaire. Il est vraisemblable que l’apparition ou non d’une infection dépende des trois facteurs que sont la spécificité d’hôte du parasite, les préférences du vecteur, et le comportement des manchots. La morbidité due aux infections à Plasmodium au sein des populations captives de manchots est bien connue, alors que les conséquences cliniques de l’infection au sein des populations sauvages n’ont jamais été clairement rapportées. Une insuffisance des recherches dans ce domaine, notamment sur le terrain, ou une adaptation des manchots à leurs parasites pourraient être des explications (JONES & SHELLAM, 1999b).

87 5. Description des espèces de Plasmodium recensées chez les manchots

Nous ne décrirons ici que les formes parasitaires visibles chez les manchots, qui présentent un intérêt diagnostique. Les formes présentes chez le vecteur (gamètes, ookinète, et ookyste) ne seront pas développées.

Sauf précision contraire dans le texte, toutes les descriptions faites ci-dessous l’ont été après utilisation du colorant de Giemsa.

Les Plasmodium sont le seul genre de parasites de la famille des plasmodiidés. Leur mérogonie se déroule dans les cellules sanguines de l’hôte vertébré et des pigments d’hémozoïne sont présents dans les mérontes (eux-mêmes situés dans les cellules sanguines) et dans les gamétocytes. Lors d’infection d’érythrocytes immatures, ces pigments peuvent être absents. La reproduction sexuée et la sporogonie ont lieu chez le vecteur arthropode (VALKIUNAS, 2005).

a) Plasmodium relictum N.B. : Les descriptions ci-dessous sont relatives à des données générales obtenues chez différents oiseaux. En dehors du cas particulier de l’hypothétique sous-espèce spheniscidae de Plasmodium relictum, aucune différence morphologique entre les parasites observés chez les manchots et ceux observés chez d’autres oiseaux n’a en effet été rapportée.

Cette espèce appartient au sous-genre Haemamoeba, qui se caractérise par la présence de gamétocytes matures bien ronds, de taille nettement supérieure à celle du noyau des cellules infectées à l’instar des mérontes érythrocytaires et l’absence d’ookystes pédonculés (VALKIUNAS, 2005).

L’espèce relictum se distingue des autres espèces du sous-genre Haemamoeba par les caractéristiques suivantes :

• en l’absence d’infection multiple d’une même cellule hôte, les jeunes trophozoïtes déplacent nettement le noyau des érythrocytes infectés,

• les gamétocytes matures occupent plus de la moitié, mais pas l’intégralité du cytoplasme des érythrocytes infectés,

• la taille des plus gros gamétocytes n’excède pas 10 µm,

• le nombre de mérozoïtes présents dans les mérontes érythrocytaires varie beaucoup selon la souche (de 6 à 32), mais est le plus souvent compris entre 10 et 24,

• les granules de pigment visibles dans les gamétocytes sont ronds, parfois ovales, et en général éparpillés dans le cytoplasme,

• il n’y a pas de grandes vacuoles à l’intérieur des mérontes, qu’ils soient érythrocytaires ou exoérythrocytaires (VALKIUNAS, 2005).

La figure 7 schématise les différentes formes sanguines de Plasmodium relictum.

88

Figure 7 : schéma des différentes formes sanguines de Plasmodium relictum (dans le sang de Passer hispaniolensis)

(d’après VALKIUNAS, 2005)

1,2 : trophozoïtes ; 3-9 : mérontes érythrocytaires ; 10-14 : macrogamétocytes ; 15,16 : microgamétocytes ; Me : mérozoïte ; Nc : nucléole ; Ne : noyau de l’érythrocyte ; Np : noyau du parasite ; Pg : granule pigmentaire.

La figure 8 schématise différentes formes tissulaires de Plasmodium relictum.

89

Figure 8 : schéma de quelques formes tissulaires de Plasmodium relictum (chez des canaris infectés expérimentalement à partir de Passer hispaniolensis, par l’intermédiaire de Culex pipiens)

(d’après VALKIUNAS, 2005)

1 : méronte exoérythrocytaire primaire en croissance ; 2 : méronte exoérythrocytaire secondaire mature ; 3 : phanérozoïte en croissance dans le cerveau ; N : noyau ; Me : mérozoïte.

(1) Trophozoïtes (Cf. figure 7)

On les trouve dans les érythrocytes matures et les érythrocytes polychromatophiles (VALKIUNAS, 2005).

Les stades les plus jeunes sont ronds ou ovales (PENRITH et al., 1994 ; VALKIUNAS, 2005), mais ont parfois une forme irrégulière (VALKIUNAS 2005). Les contours sont réguliers (VALKIUNAS, 2005).

Les trophozoïtes en croissance ont un volumineux noyau. Au cours du développement parasitaire, la quantité de cytoplasme augmente, avec l’apparition de granules pigmentaires en périphérie du parasite et la présence d’une ou plusieurs petites vacuoles intra-cytoplasmiques. Les stades dits « en anneau » ne sont pas caractéristiques (VALKIUNAS, 2005).

Les trophozoïtes matures possèdent de minuscules granules pigmentaires couleur or, marron, ou noir (PENRITH et al., 1994 ; VALKIUNAS, 2005) et ont un contour régulier (VALKIUNAS, 2005) ou irrégulier (FANTHAM & PORTER, 1944 ; VALKIUNAS, 2005). Leur taille est variable (FANTHAM & PORTER, 1944), mais ils déplacent les noyaux des érythrocytes infectés, et commencent déjà à plus ou moins déformer ces cellules (VALKIUNAS, 2005).

La présence de plusieurs trophozoïtes dans une même cellule est fréquente lors d’infections à forte parasitémie (VALKIUNAS, 2005).

90 (2) Mérontes érythrocytaires (Cf. figure 7)

On les trouve habituellement dans les érythrocytes matures (VALKIUNAS, 2005).

De taille très variable (FANTHAM & PORTER, 1944), ils sont ronds (FIX et al., 1988 ; VALKIUNAS, 2005) à ovales, mais peuvent avoir une forme irrégulière (VALKIUNAS, 2005), avec des pseudopodes (FANTHAM & PORTER, 1944) et présentent un cytoplasme abondant (VALKIUNAS, 2005). Ils déforment les érythrocytes qu’ils infectent, déplacent nettement leur noyau (FIX et al., 1988 ; PENRITH et al., 1994 ; VALKIUNAS, 2005) et peuvent même énucléer les cellules parasitées. Au cours de la maturation des mérontes, la taille de leurs noyaux diminue, et ceux-ci se répartissent de façon aléatoire (VALKIUNAS, 2005).

Les granules pigmentaires sont marrons (FANTHAM & PORTER, 1944) ou noirs (VALKIUNAS, 2005), en général rassemblés en un point, souvent au centre des mérozoïtes (FANTHAM & PORTER, 1944 ; RODHAIN, 1939), mais peuvent se répartir en plusieurs amas dont la position varie (VALKIUNAS, 2005). Ils peuvent également s’agréger en une ou plusieurs masses solides.

Le nombre de mérozoïtes par érythrocyte mature varie de 6 à 32 selon la souche parasitaire, mais est le plus souvent compris entre 10 et 24 (FANTHAM & PORTER, 1944 ; RODHAIN, 1939 ; VALKIUNAS, 2005). Les mérontes matures occupent plus de la moitié, mais pas la totalité du cytoplasme des érythrocytes infectés (VALKIUNAS, 2005).

Notons qu’ils ne sont pas toujours aisément mis en évidence chez les manchots puisque FIX et al. n’en ont visualisé que sur un seul des 38 manchots décédés à Des Moines (les stades tissulaires ont quant à eux été observés sur 13 des 20 manchots du zoo pour lesquels une analyse histologique a été effectuée) (FIX et al.).

(3) Mérontes exoérythrocytaires (Cf. figure 8)

Les mérontes exoérythrocytaires primaires se développent dans les cellules réticulo- endothéliales de nombreux organes, mais on les retrouve principalement dans le foie, la rate et plus rarement dans le cerveau. Les mérontes exoérythrocytaires secondaires se développent dans les cellules endothéliales des capillaires. Les phanérozoïtes sont visibles surtout dans les capillaires cérébraux et en faible nombre dans le foie (VALKIUNAS, 2005). FIX et al. (1988) en ont toutefois visualisé dans des endothéliums capillaires d’autres organes (poumon et cœur notamment).

Les mérontes exoérythrocytaires sont ronds à ovales dans tous les organes, sauf le cerveau, dans lequel ils prennent une forme allongée, ressemblant à un ver. Leur taille (quel que soit l’organe) n’excède pas 120 µ m (ils sont souvent plus petits) et le nombre de mérozoïtes qu’ils contiennent peut s’élever à 180 au maximum. Le cytoplasme des mérontes en cours de développement est bleu clair, sans vacuoles, et les mérozoïtes ovales, ou légèrement allongés (VALKIUNAS, 2005).

Les mérontes exoérythrocytaires ressemblent assez aux mérontes érythrocytaires, avec toutefois une absence de pigment (FANTHAM & PORTER, 1944).

91 (4) Macrogamétocytes (Cf. figure 7)

On les trouve habituellement dans les érythrocytes matures (VALKIUNAS, 2005).

De taille légèrement variable (FANTHAM & PORTER, 1944), ils sont ronds (CRANFIELD et al., 1990 ; RODHAIN, 1937, 1939 ; VALKIUNAS, 2005) à ovales (FANTHAM & PORTER, 1944 ; PENRITH et al., 1994 ; VALKIUNAS, 2005), mais peuvent avoir une forme irrégulière (VALKIUNAS, 2005), avec un ou plusieurs pseudopodes lobés (RODHAIN, 1937). Ils déforment les érythrocytes qu’ils infectent (VALKIUNAS, 2005), déplacent nettement leur noyau (PENRITH et al., 1994 ; VALKIUNAS, 2005), souvent à 90° par rapport à leur position initiale (CRANFIELD et al., 1990) et peuvent même énucléer les cellules parasitées (VALKIUNAS, 2005).

Le cytoplasme, fortement teinté en bleu au colorant de May-Grünwald-Giemsa (RODHAIN, 1939), contient parfois quelques petites vacuoles (diamètre inférieur à 1 µ m) (VALKIUNAS, 2005), et le noyau du parasite est compact, de taille et de position variables (VALKIUNAS, 2005), avec un nucléole généralement bien visible (RODHAIN, 1939 ; VALKIUNAS, 2005).

Les granules pigmentaires sont en général ronds (RODHAIN, 1939 ; VALKIUNAS, 2005), parfois ovales (VALKIUNAS, 2005), de taille petite (inférieure à 0,5 µm) à moyenne (de 0,5 µm à 1 µ m), de couleur marron foncé (VALKIUNAS, 2005) à noire (PENRITH et al., 1994 ; RODHAIN, 1939 ; VALKIUNAS, 2005), en nombre variable (mais en général inférieur à 30), en général clairsemés dans le cytoplasme (RODHAIN, 1939 ; VALKIUNAS, 2005). Ils sont parfois visualisables en amas lâches à la périphérie ou à un pôle du gamétocyte, mais ceci n’est pas caractéristique de cette espèce parasitaire (FANTHAM & PORTER, 1944 ; RODHAIN, 1939 ; VALKIUNAS, 2005).

Une fois matures, les macrogamétocytes occupent plus de la moitié de l’espace cytoplasmique des érythrocytes (VALKIUNAS, 2005) et leur taille varie de 5,25 µm (RODHAIN, 1939) à 7,20 µm (VALKIUNAS, 2005). Le diamètre moyen est de 6,90 +/- 0,3 µm (VALKIUNAS, 2005).

(5) Microgamétocytes (Cf. figure 7)

Ils sont globalement identiques aux macrogamétocytes, avec toutefois l’existence de caractères dimorphiques permettant de les identifier (VALKIUNAS, 2005) : teinte moins intense du cytoplasme (FANTHAM & PORTER, 1944 ; RODHAIN, 1939 ; VALKIUNAS, 2005), noyau moins compact, à chromatine plus lâche et au contour moins net (RODHAIN, 1939 ; VALKIUNAS, 2005), grains de pigments plus nombreux, qui ont tendance à s’agglomérer en de volumineux granules (RODHAIN, 1939), et absence de nucléole (RODHAIN, 1939 ; VALKIUNAS, 2005). Ceux mis en évidence par RODHAIN chez Spheniscus demersus ont un diamètre variant de 4,37 µm à 7 µm (RODHAIN, 1939).

(6) Cas de la sous-espèce spheniscidae FANTHAM & PORTER (1944) décrivent des Plasmodium relictum issus de quatre espèces de manchots et proposent la création d’une sous-espèce spécifique aux Sphénisciformes 92 (Plasmodium relictum spheniscidae). Les caractéristiques morphologiques justifiant, selon les auteurs, la création de cette nouvelle sous-espèce sont les suivantes : présence de vacuoles volumineuses dans les stades dits « en anneau », taille importante des schizontes, niveau élevé de schizogonie intra-érythrocytaire, nombre faible et taille réduite des gamétocytes, comparativement aux stades correspondants de Plasmodium relictum dans les autres espèces aviaires (FANTHAM & PORTER, 1944 ; LAIRD, 1950).

b) Plasmodium elongatum Cette espèce appartient au sous-genre Huffia, qui se caractérise par des mérontes érythrocytaires contenant un abondant cytoplasme, qui varient en forme et en taille une fois mûrs, ainsi que par une mérogonie exoérythrocytaire se déroulant dans les cellules des systèmes hématopoïétique et – pour certaines espèces – réticulo-endothélial (VALKIUNAS, 2005).

L’espèce P. elongatum se distingue des autres espèces du sous-genre Huffia par les caractéristiques suivantes :

• présence dans le sang périphérique des stades asexués principalement dans les jeunes érythrocytes et des gamétocytes principalement dans les érythrocytes matures;

• mérontes érythrocytaires matures contenant 6 à 12 mérozoïtes, qui sont souvent plus ou moins allongés;

• gamétocytes matures ne déplaçant pas (ou peu) le noyau et ne remplissant pas les 2 pôles des érythrocytes infectées;

• largeur maximale des gamétocytes matures inférieure à 3 µm (VALKIUNAS, 2005).

La figure 9 schématise les différentes formes sanguines de Plasmodium elongatum.

93 Figure 9 : schéma des différentes formes sanguines de Plasmodium elongatum

(d’après VALKIUNAS, 2005)

1-4 : trophozoïtes ; 5-13 : mérontes érythrocytaires ; 14-17 : macrogamétocytes ; 18-20 : microgamétocytes. N.B. : Il s’agit ici des formes « classiques » de Plasmodium elongatum. Chez les manchots, les mérozoïtes observés ont généralement une forme arrondie, et non allongée (Cf. infra).

La figure 10 schématise différentes formes tissulaires de Plasmodium elongatum.

94 Figure 10 : schéma de quelques formes tissulaires de Plasmodium elongatum

(d’après VALKIUNAS, 2005)

1, 2 : jeunes phanérozoïtes ; 3-6 : phanérozoïtes matures ; Me : mérozoïte ; Nhc : noyau de la cellule hôte (ici : cellule de la lignée érythrocytaire) ; Np : noyau du parasite. N.B. : Il s’agit ici des formes « classiques » de Plasmodium elongatum. Chez les manchots, les mérozoïtes observés ont généralement une forme arrondie, et non allongée. De plus, les phanérozoïtes s’y développent principalement dans les cellules du système réticulo-endothélial (cellules de la lignée érythrocytaire ici) (Cf. infra).

Les figures 11 et 12 illustrent l’aspect des mérontes et des mérozoïtes de Plasmodium elongatum chez Spheniscus demersus.

Figure 11 : photo d’un frottis sanguin de Spheniscus demersus montrant un méronte immature de Plasmodium elongatum dans un érythrocyte polychromatophile (coloration de May-Grünwald-Giemsa, grossissement x 1 900)

(d’après FLEISCHMAN et al., 1968a)

Noter la forme ronde (et non allongée) des mérozoïtes (flèche) chez le manchot 95 Figure 12 : photo d’une empreinte de poumon de Spheniscus demersus montrant un méronte intra-histiocytaire de Plasmodium elongatum (coloration de May-Grünwald-Giemsa, grossissement x 1900)

(d’après FLEISCHMAN et al., 1968a)

Noter la forme irrégulière de ce méronte et la forme ronde (et non allongée) des mérozoïtes chez le manchot.

(1) Trophozoïtes (Cf. figure 9)

On les retrouve dans tous les types d’érythrocytes, mais principalement dans les cellules jeunes, dont les érythroblastes.

Les jeunes trophozoïtes sont de forme ronde à ovale, et possèdent souvent une vacuole. Un stade en anneau est parfois visible. Lors de leur croissance, les trophozoïtes prennent une forme irrégulière, avec des excroissances et se retrouvent en position subpolaire à polaire dans les érythrocytes infectés.

Les pigments, en général minuscules et au nombre de un ou deux seulement, ne sont retrouvés que dans les gros trophozoïtes, qui se développent dans des érythrocytes matures.

L’influence des parasites sur les cellules infectées est habituellement peu marquée (VALKIUNAS, 2005).

(2) Mérontes érythrocytaires (Cf. figures 9 et 11)

On les retrouve dans tous les types d’érythrocytes, mais principalement dans les cellules jeunes, dont les érythroblastes.

Leur cytoplasme est basophile, en général sans vacuole, et les noyaux se rassemblent le plus souvent en périphérie dans les mérontes en croissance. La forme de ces derniers, ronds ou ovales dans la majorité des cas, peut varier. Les noyaux des mérontes matures s’agencent le plus fréquemment en forme d’éventail, ou de rosette, mais ils peuvent aussi s’aligner. Six à douze mérozoïtes sont en général présents. La forme classique des mérozoïtes de Plasmodium elongatum 96 est plus ou moins allongée, avec des extrémités pointues, mais ceux retrouvés chez les manchots peuvent être de forme ronde.

Les granules pigmentaires sont petits, noirs, amassés en point ou agrégés en une masse solide.

Les mérontes déforment les érythrocytes et déplacent leurs noyaux. Leur taille n’excède pas 7 µm (VALKIUNAS, 2005).

(3) Mérontes exoérythrocytaires (Cf. figures 10 et 12)

Les phanérozoïtes se développent habituellement dans les cellules du système hématopoïétique et sont en général très nombreux dans la moelle osseuse, la rate et le foie. Toutefois, chez des hôtes inhabituels et naïfs comme les manchots, un nombre colossal d’entre eux se développent dans les cellules du système réticulo-endothélial (VALKIUNAS, 2005). On les retrouve alors principalement dans les histiocytes (FLEISCHMAN et al., 1968a ; VALKIUNAS, 2005) des poumons, de la rate, du foie, et du cœur et plus rarement au niveau des reins, des muscles squelettiques, des intestins, du cerveau, et de la moelle osseuse (VALKIUNAS, 2005).

Leur forme est ronde (VALKIUNAS, 2005) à ovale (FLEISCHMAN et al., 1968a ; VALKIUNAS, 2005), pour une taille allant de 15 à 20 µ m (FLEISCHMAN et al., 1968a ; VALKIUNAS, 2005) et ils contiennent de nombreux (parfois plus de 100) mérozoïtes arrondis (la forme classique étant allongée pour Plasmodium elongatum) (VALKIUNAS, 2005). Les mérozoïtes ont un cytoplasme clair parfois rosé et un noyau basophile à la coloration de May-Grünwald- Giemsa (FLESCHMAN et al., 1968a), tandis que les phanérozoïtes ont un cytoplasme basophile et un noyau compact de couleur claire à la coloration de Giemsa (VALKIUNAS, 2005).

Le noyau des cellules infectées est en général légèrement déformé et plus ou moins déplacé (VALKIUNAS, 2005). Dans la description de FLEISCHMAN et al. (1968a), chez Spheniscus demersus, il ne forme plus qu’un corps comprimé et incurvé, adjacent au méronte (FLEISCHMAN et al., 1968a). Quelques phanérozoïtes peuvent être mis en évidence dans des cellules hôtes énuclées, particulièrement lors d’infection massive. Ils ressemblent alors à des formes extracellulaires (VALKIUNAS, 2005).

(4) Macrogamétocytes (Cf. figure 9)

On les retrouve dans les érythrocytes matures (VALKIUNAS, 2005).

Leur cytoplasme est homogène, avec parfois quelques petites vacuoles. Au début de leur développement, les gamétocytes sont minces et allongés et peuvent être distingués des trophozoïtes par leur contour régulier ou leurs granules pigmentaires, plus nombreux, éparpillés de façon aléatoire dans le cytoplasme. Les gamétocytes matures sont eux aussi allongés et minces et prennent une position latérale au noyau des érythrocytes infectés, sans occuper totalement les pôles de la cellule (VALKIUNAS, 2005). Ils ont une forme allongée (vermiforme) et viennent entourer le noyau érythrocytaire (CRANFIELD et al., 1990). Leurs extrémités sont en général rondes et leur noyau compact, de forme variable, en position submédiane à médiane (VALKIUNAS, 2005).

97 Les granules pigmentaires sont de forme ronde à ovale, de taille petite (inférieure à 0,5 µm) à moyenne (de 0,5 µ m à 1 µ m) et se répartissent de façon aléatoire dans le cytoplasme ou se rassemblent en plusieurs petits amas. Leur nombre est en général inférieur ou égal à vingt.

Les gamétocytes n’ont qu’une légère influence sur les érythrocytes infectés, dont la longueur est augmentée et le noyau discrètement déplacé latéralement. La taille des macrogamétocytes matures n’excède pas 17 µ m en longueur et 3 µ m en largeur (VALKIUNAS, 2005).

(5) Microgamétocytes (Cf. figure 9)

Ils présentent la même configuration que les macrogamétocytes, avec les caractères dimorphiques usuels (teinte moins intense du cytoplasme, noyau moins compact au contour moins net, absence de nucléole) auxquels viennent s’ajouter une plus grande tendance à l’agglomération des granules pigmentaires et un contour plus variable (VALKIUNAS, 2005).

c) Plasmodium juxtanucleare Cette espèce appartient au sous-genre Bennettinia, qui se caractérise par des mérontes érythrocytaires contenant peu de cytoplasme, dont la taille (une fois arrivés à maturité) ne dépasse pas celle du noyau des érythrocytes infectés et des gamétocytes matures de forme ronde, ovale, ou irrégulière, parfois allongés, dont la taille ne dépasse pas non plus celle du noyau des érythrocytes infectés. La mérogonie exoérythrocytaire se déroule dans les cellules du système réticulo- endothélial (VALKIUNAS, 2005).

L’espèce juxtanucleare se distingue des autres espèces du sous-genre Bennettinia par les caractéristiques suivantes :

• mérontes érythrocytaires nucléophiles produisant 2 à 6 mérozoïtes,

• gamétocytes matures de forme ronde fréquents (VALKIUNAS, 2005).

La figure 13 schématise les différentes formes sanguines de Plasmodium juxtanucleare.

98 Figure 13 : schéma des différentes formes sanguines de Plasmodium juxtanucleare

(d’après VALKIUNAS, 2005)

1, 2 : trophozoïtes ; 3-9 : mérontes érythrocytaires ; 10-14 : macrogamétocytes, 15, 16 : microgamétocytes.

La figure 14 schématise différentes phanérozoïtes de Plasmodium juxtanucleare.

99 Figure 14 : schéma de phanérozoïtes matures de Plasmodium juxtanucleare.

(d’après VALKIUNAS, 2005)

Me : mérozoïte ; Nhc : noyau de la cellule hôte ; Np : noyau du parasite ; Rb : corps résiduel.

(1) Trophozoïtes (Cf. figure 13)

On les retrouve dans les érythrocytes matures et polychromatophiles.

Les trophozoïtes les plus jeunes ont une forme variable, un contour régulier ou irrégulier, et un cytoplasme extrêmement réduit. Les trophozoïtes matures sont de forme ronde, ovale, ou irrégulière, adhèrent au noyau des érythrocytes infectés, et présentent parfois une petite vacuole dans leur cytoplasme.

Les granules pigmentaires sont minuscules, de couleur marron foncé, et présents au nombre de 1 à 2.

L’infection d’un même érythrocyte par plusieurs parasites est commune en cas d’infection massive, et les trophozoïtes ont un impact limité sur les cellules qu’ils parasitent.

(2) Mérontes érythrocytaires (Cf. figure 13)

On les retrouve habituellement dans les érythrocytes matures, mais parfois également dans les érythrocytes polychromatophiles. Les mérontes sont difficilement visualisables dans le sang périphérique au cours d’une infection chronique, puisqu’ils ont alors tendance à se concentrer dans les organes internes (VALKIUNAS, 2005). Ils ont toutefois été visualisés chez les 5 Spheniscus demersus autopsiés à partir desquels la seule description de Plasmodium juxtanucleare chez des manchots a été faite par GRIM et al. (2003).

100 Leur cytoplasme est peu abondant (GRIM et al., 2003 ; VALKIUNAS, 2005), pâle, et parfois même invisible dans le cas des mérontes matures (VALKIUNAS, 2005). En général, les mérontes érythrocytaires sont accolés au noyau des érythrocytes infectés, le plus souvent en position subpolaire à polaire. Cette adhérence des mérontes aux noyaux érythrocytaires, ainsi que leur petite taille les rend en général difficiles à visualiser en cas de faible parasitémie. Lors de la maturation, la taille des noyaux diminue de façon notable, et une fois arrivés à maturité, les mérontes ont une forme ronde ou irrégulière, avec des noyaux localisés à leur périphérie, et contiennent 2 à 6 mérozoïtes (3 à 5 en général) (VALKIUNAS, 2005). Les mérozoïtes observés par GRIM et al. chez Spheniscus demersus avaient des petits noyaux ronds et bleus (coloration Diff- Quick) adjacents au noyau érythrocytaire et aux gamétocytes matures et très peu de cytoplasme (GRIM et al., 2003).

Les granules pigmentaires peuvent être présents jusqu’au nombre de quatre. Ils sont minuscules, de couleur marron foncé, et forment une masse solide dans les mérontes matures (VALKIUNAS, 2005).

L’influence des mérontes sur leurs cellules hôtes est peu prononcée mais une infection multiple d’un même érythrocyte est banale en cas de forte parasitémie. Les mérontes matures ont une taille qui n’excède pas 5 µm (ils sont en général bien plus petits) et qui ne dépasse jamais celle du noyau des érythrocytes infectés (GRIM et al., 2003 ; VALKIUNAS, 2005). Le cytoplasme des mérontes matures de diamètre inférieur à 1 µm est invisible (VALKIUNAS, 2005).

(3) Mérontes exoérythrocytaires (Cf. figure 14)

Plusieurs souches se différencient par leur capacité à produire des phanérozoïtes après leur inoculation dans le sang et ces derniers ne sont pas toujours retrouvés chez les oiseaux infectés expérimentalement. On les a toutefois mis en évidence dans des cellules réticulo-endothéliales de la rate, du cerveau, de la moelle osseuse, du foie, des poumons, des reins, du myocarde, des ovaires, et du pancréas de poulets infectés expérimentalement (VALKIUNAS, 2005). Ils n’ont pas été visualisés chez les manchots puisque la seule description de Plasmodium juxtanucleare chez ces hôtes a été effectuée uniquement sur frottis sanguins (GRIM et al., 2003).

Leur forme est ronde à ovale dans tous les organes à l’exception du cerveau (où ils s’allongent le long des capillaires) et ils ne possèdent pas de vacuole. Un corps résiduel est visible en position centrale chez les phanérozoïtes matures, qui contiennent jusqu’à 50 mérozoïtes à leur périphérie, et mesurent environ 15 µm de longueur (VALKIUNAS, 2005).

(4) Macrogamétocytes (Cf. figure 13)

On les retrouve dans les érythrocytes matures ou polychromatophiles.

Leur cytoplasme est pâle, d’apparence homogène et peut contenir quelques petites vacuoles. Le contour est souvent régulier. Les jeunes gamétocytes sont de forme ronde ou légèrement allongée. Ils adhèrent souvent au noyau, mais peuvent être localisés n’importe où dans les érythrocytes infectés. Les gamétocytes matures sont de forme ronde, ovale, irrégulière, ou parfois légèrement allongée. On les retrouve le plus souvent en position subpolaire à polaire par rapport au noyau, mais ils ne touchent pas ce dernier. 101 Les granules pigmentaires sont de forme ronde, de taille réduite (inférieure à 0,5 µm), généralement en petit nombre (moins de 10) et amassés en un point à la périphérie du parasite.

Les gamétocytes matures sont moins gros que le noyau des érythrocytes infectés, qu’ils déplacent en général. Ils mesurent moins de 7 µ m de longueur et moins de 5 µ m de largeur (VALKIUNAS, 2005).

Dans le cas de la description chez le manchot du Cap, la plupart de ces caractères ont été retrouvés puisque les gamétocytes avaient une forme ronde, ovale ou en croissant, avec un cytoplasme épars de couleur rose ou bleue, un petit noyau bleu, et des granules pigmentaires grossiers situés en périphérie des parasites (coloration Diff-Quick). Ils déplaçaient les noyaux des érythrocytes et n’occupaient pas plus de 50 % du volume des cellules infectées (GRIM et al., 2003).

(5) Microgamétocytes (Cf. figure 13)

Ils présentent la même configuration que les macrogamétocytes, avec les caractères dimorphiques classiques (teinte moins intense du cytoplasme, noyau moins compact au contour moins net, absence de nucléole) (VALKIUNAS, 2005).

6. Épidémiologie de l’infection chez les manchots

a) Populations atteintes En dépit de l’influence de certains facteurs que nous allons évoquer un peu plus bas, n’importe quel manchot naïf vis-à-vis du parasite peut contracter la maladie (GRIM et al., 2003). PETIT (1998) rapporte que des manchots âgés de trois mois à vingt-et-un ans ont été affectés au sein de zoos européens.

b) Relations entre le parasite, le vecteur, et l’hôte

(1) Origine de l’infection Les Plasmodium se transmettent aux manchots à partir d’oiseaux jouant un rôle de réservoir et vivant à proximité. Les possibilités d’une transmission de manchot à manchot sont limitées. (CRANFIELD et al., 1990). Ainsi, il est communément admis que les manchots captifs infectés ont acquis le parasite en captivité, à partir d’oiseaux vivant dans l’environnement local et par l’intermédiaire des moustiques (CRANFIELD, 2003 ; FLEISHMAN et al., 1968a; GRINER, 1974, 1983). Un auteur soupçonne le rôle des pies, qui abritent le parasite (HUGH-JONES, 1999).

En ce qui concerne le zoo de Baltimore, CRANFIELD et al. (1990) évoquent un rôle des moineaux domestiques, des merles, et d’autres petits oiseaux chanteurs (réservoir), ainsi que des moustiques Culex pipiens et Culex restuans (vecteurs).

Dans une étude plus récente, McCONKEY et al. (1996) identifient les espèces de Plasmodium présentes chez les moustiques et les manchots du zoo de Baltimore en utilisant une méthode remplaçant l’identification visuelle par une comparaison des séquences génétiques avec les séquences d’ARNr de référence. L’analyse phylogénétique des séquences a permis de distinguer trois « groupes » phylogénétiquement distincts de parasites chez les moustiques du parc dont un 102 (identifié visuellement en tant que Plasmodium relictum) fut également retrouvé chez les manchots et directement associé au décès d’un Spheniscus demersus. Un lien a donc pu être établi entre un agent pathogène précis, un cas de mortalité chez les manchots et les moustiques présents au sein du parc zoologique. Toutefois, cette étude a également permis de mettre en évidence que la séquence génétique du parasite identifié visuellement comme Plasmodium relictum ne présentait que très peu de similitudes avec les séquences de référence de cette espèce parasitaire. En effet, il n’existe pas moins de différences entre ces deux séquences qu’entre celles de deux sous-genres distincts de Plasmodium. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que la nature ubiquiste de Plasmodium relictum aboutit inévitablement à un certain degré de spéciation- en relation avec les hôtes putatifs- et que de nombreuses souches du parasite finissent par s’établir. Une autre hypothèse serait qu’il s’agit en fait de deux espèces différentes impossibles à discriminer sur la base de simples critères morphologiques.

(2) Virulence des espèces parasitaires impliquées La virulence de Plasmodium relictum chez le manchot du Cap a toujours été plus élevée que celle de Plasmodium elongatum (GRACZYK et al., 1994, 1994d). Les infections dues à la deuxième espèce citée sont en effet moins prévalentes et provoquent en général moins de décès chez les manchots (CRANFIELD, 2003).

(3) Influence de la vaccination Dans leur étude sur l’efficacité d’un vaccin pour protéger les manchots du Cap des infections à Plasmodium, GRIM et al. (2004) détectent (par RT-PCR basée sur le gène 18S rRNA, Cf. paragraphe I.A.12.d. de ce document) Plasmodium relictum chez 50 % des moustiques étudiés un an avant la vaccination et chez 68 % d’entre eux l’année de la vaccination. Il n’y a donc pas de différence significative entre l’infection des vecteurs en présence ou en absence de vaccination.

c) Saisonnalité L’infection des manchots captifs par Plasmodium est saisonnière, avec – dans le cas des zoos américains – des décès rapportés de mai à octobre, avec un pic au mois d’août, correspondant à la densité maximale des populations locales du vecteur diptère (CRANFIELD et al., 1990 ; GRACKZYK et al., 1994c ; GRINER, 1974, 1983). Les populations accueillies provisoirement dans les centres de sauvegarde font face, elles aussi, à une plus grande incidence de l’infection pendant l’été, période à laquelle la plupart des décès sont rapportés (PARSONS & UNDERHILL, 2005).

La mortalité des manchots est en général rapportée à raison d’un seul épisode saisonnier, pendant l’été ou à l’automne (GRACZYK et al., 1994d). Un cas singulier mérite toutefois d’être rappelé : après l’arrivée de manchots de Magellan à Des Moines (États-Unis d’Amérique, et suite à leur infection par Plasmodium relictum, plusieurs vagues de mortalité (et non une seule) ont été observées au début du printemps (et non pendant l’été) (FIX et al., 1988 ; GRACZYK et al., 1994d). Les auteurs évoquent des températures nettement au-dessus de la moyenne en avril, ainsi que d’importantes précipitations (FIX et al., 1988).

En ce qui concerne les épisodes de parasitémie, ils sont en revanche présents tout au long de la saison et leur nombre augmente de la mi-août aux mois de septembre et octobre. Une différence significative a été mise en évidence entre le nombre de parasitémies enregistrées du 12 mai au 4 août et le reste de la saison. Lors d’infection à Plasmodium elongatum, il n’est pas rare (9,5 % des Spheniscus demersus selon GRACZYK et al. 1994d) de constater trois pics de parasitémie chez un 103 même manchot au cours de la saison, tandis que de telles observations n’ont jamais pu être effectuées dans le cas des infections à Plasmodium relictum. Un taux de 29 % est rapporté pour le phénomène de recrudescence parasitaire (GRACZYK et al., 1994d).

Plusieurs auteurs s’accordent pour constater un nombre important d’infections pendant l’été, ou pendant des périodes de forte chaleur (CHITTY, 2006 ; CRANFIELD et al., 1990 ; GRACZYK et al., 1994c, 1994d ; RODHAIN, 1939 ; GRINER, 1974, 1983). RODHAIN (1939) constate que 7 décès sur 8 notés au zoo d’Anvers se sont produits aux mois de juillet et août, qui sont selon lui les seuls mois à présenter des conditions de température favorables au développent des oocystes chez les Culex en Belgique. Sur 46 cas de malaria évoqués par GRINER (1974, 1983) au zoo de San Diego, 18 ont été rapportés pendant le mois d’août, 12 pendant le mois de juillet, 12 pendant le mois de septembre, 2 pendant le mois d’octobre, et 2 pendant le mois de février. De même, les pertes les plus importantes ont eu lieu aux périodes de grande chaleur pendant l’été, en général quelques jours après que des vents chauds venant des déserts situés à l’est des côtes californiennes sont venus s’ajouter à des températures élevées et à une humidité basse. GRINER (1974, 1983) émet l’hypothèse que les vagues de chaleurs pourraient représenter un stress pour les manchots et ainsi permettre de nouvelles infections ou révéler des infections préexistantes et les exacerber, au point de provoquer la mort des manchots. Enfin, CHITTY (2006) constate lui aussi que les décès de Spheniscus humboldti au zoo de Marwell se sont produits pendant un été chaud. Selon l’auteur, le parasite, endémique au Royaume-Uni, ne peut habituellement être transmis que pendant une courte période correspondant à la présence des vecteurs. Ainsi, même en cas de piqûre, le nombre de parasites transmis ne s’accumule pas et le système immunitaire de l’hôte parvient à enrayer l’infection. En revanche, lors de l’été 2006, la persistance de températures élevées a permis une activité prolongée des vecteurs.

d) Influence de l’âge Plusieurs auteurs s’accordent pour affirmer ou constater que les poussins de manchots et les manchots juvéniles naïfs sont plus sensibles à l’infection par Plasmodium (Cf. paragrapheI.B.6.g. ci-dessous) (GRIM et al., 2003 ; PARSONS & UNDERHILL, 2005 ; PETIT, 1998 ; STOSFKOPF & BEALL, 1980). Selon CRANFIELD (2003), c’est le fait d’être exposé pour la première fois au parasite (et non l’âge proprement dit) qui importe. À l’inverse, les manchots qui survivent à leur première saison d’exposition au moustique sont moins affectés par le parasite (STOSFKOPF & BEALL, 1980).

e) Influence de la mue Plusieurs rapports semblent indiquer une plus forte sensibilité vis-à-vis de l’infection par Plasmodium chez les manchots qui se trouvent en période de mue. Si CRANFIELD (2003) et TODD (1990) se contentent d’évoquer le fait que la mue pourrait augmenter le taux de mortalité des manchots, d’autres auteurs se montrent plus explicites dans leur argumentation :

• les quatre décès soudains de manchots de Humboldt au zoo de Marwell, rapportés par CHITTY (2006), n’ont touché que des individus en train de muer et, à l’inverse, tous les autres manchots du groupe (dont deux poussins) ont continué à bien se porter. L’auteur met en cause le fait que la mue est une période de stress pouvant induire une immunosuppression chez les oiseaux;

• le manchot royal mort aux National Zoological Gardens de Pretoria (Afrique du Sud) était en train de muer pour la seconde fois et jeûnait depuis le début de sa mue, soit 6

104 jours avant son décès. Ayant déjà été exposé au vecteur (et donc vraisemblablement au parasite) lors de la première saison, il est probable qu’il a alors contracté une infection de faible intensité et que l’immunité acquise à ce moment-là a été déprimée pendant la mue (stress une nouvelle fois mis en cause), ce qui aurait provoqué une recrudescence parasitaire ou permis une réinfection par les moustiques contaminés (PENRITH et al., 1994).

f) Influence de l’espèce de manchot Peu de données bibliographiques sont disponibles à ce sujet. Certaines espèces (Spheniscus demersus notamment) ont été beaucoup plus étudiées (en raison des épisodes de mortalité constatés en captivité) et ont fait l’objet de beaucoup plus de publications que d’autres.

FLEISHMAN et al. (1968a) remarquent que les manchots du Cap du zoo de Baltimore ont été victimes de l’infection par Plasmodium tandis que la population de manchots d’Adélie présentée dans le même parc n’a pas été affectée par le parasite. Ils évoquent une possible différence de sensibilité selon les espèces, même si le fait que les manchots d’Adélie de Baltimore soient – à la différence des manchots du Cap – maintenus dans un enclos fermé et réfrigéré pourrait être une autre explication à ce constat.

g) Immunologie Le simple fait que les infections à Plasmodium affectent principalement les manchots jeunes (moins d’un an) ou – au contraire – très âgés et soient rarement rapportées chez des individus ayant survécu à leur première saison d’exposition aux moustiques suggère l’implication d’une certaine forme d’immunité (STOSKOPFF & BEALL, 1980). En effet, CRANFIELD (2003) constate que les manchots ayant survécu à une infection naturelle continuent à héberger le parasite de façon subclinique et deviennent bien plus résistants aux infections ultérieures : s’il peut – à la faveur d’un stress – y avoir une recrudescence parasitaire chez ces individus, le taux de mortalité alors constaté est de l’ordre de 3 à 4 % seulement (contre jusqu’à 50 à 60 % lorque la malaria est non maîtrisée). Cette impression est renforcée par les travaux de HOOGESTYN & CUNNINGHAM (1996), qui remarquent que les titres en anticorps anti-Plasmodium sont significativement décroissants des manchots adultes aux juvéniles et enfin aux poussins. Par ailleurs, GRACZYK et al. (1994a) montrent que la réponse sérique est significativement plus faible chez deux manchots décédés au cours d’un épisode de parasitémie que chez les manchots parasitémiques qui ont survécu (GRACZYK et al., 1994a). Pour rappel, les taux d’anticorps rapportés sont également plus élevés chez les individus étudiés dans les parcs zoologiques qu’au sein des populations sauvages non captives. Pour expliquer cela, les auteurs évoquent la mise en place des traitements préventifs dans les zoos, qui pourraient diminuer la mortalité, et ainsi provoquer – pour un même individu – plusieurs expositions successives, qui agiraient comme un rappel et stimuleraient la réponse humorale (GRACZYK et al., 1995a, 1995b).

CRANFIELD et al. (1990) rappellent que des expérimentations menées sur des canaris dans les années 1920 et 1930 avaient permis de montrer que l’injection de trophozoïtes provoquait la mort des oiseaux, mais que si l’on traitait les canaris après une première inoculation avant de les « tester » par une nouvelle injection de trophozoïtes, les oiseaux survivaient sans présenter de signes cliniques et parvenaient à se débarrasser des parasites. Le sérum des oiseaux ainsi protégés ne permettant pas la survie des canaris naïfs chez lesquels il avait été injecté, l’hypothèse fut formulée que l’immunité anti-Plasmodium était essentiellement cellulaire et non humorale.

105 De nombreux travaux ont depuis été effectués afin de préciser le rôle de l’immunité anti- Plasmodium chez les manchots. L’implication de mécanismes à médiation humorale a ainsi clairement été démontrée. GRACZYK et al. (1994a) mettent tout d’abord en évidence des anticorps anti-Plasmodium, sans parasitémie associée, chez trois Spheniscus demersus juvéniles nés en mars 1993. Les taux d’anticorps ont diminué progressivement et persisté en tout pendant trois semaines, alors que les manchots se trouvaient dans un bâtiment intérieur qui les isolait des moustiques (GRACZYK et al., 1994a). Dans une autre étude, parue la même année, des résultats similaires sont obtenus, avec la présence d’anticorps chez tous les manchots nouveau-nés étudiés et hébergés dans un bâtiment vierge de tout moustique (GRACZYK et al., 1994b). Ceci constitue la preuve qu’il existe un transfert d’immunité maternelle anti-Plasmodium chez le manchot du Cap (GRACZYK et al., 1994a, 1994b). En outre, le titre en anticorps, élevé juste après l’éclosion, devient quasiment nul au bout de deux mois, ce qui signifie que les manchots sont exempts d’anticorps circulants au moment de leur exposition au vecteur au zoo de Baltimore (les naissances y ont lieu de décembre à février, et le passage en enclos extérieur se fait à la fin du mois d’avril, ou en mai). Cette période correspond pourtant au pic de parasitémie chez les oiseaux sauvages abondamment présents dans l’enclos extérieur des manchots (GRACZYK, et al., 1994b). Ainsi, 23 manchots étudiés sur 24 ont présenté des réponses humorales entre une et cinq semaines après leur transfert à l’extérieur (GRACZYK et al., 1994a).

Le transfert d’anticorps parentaux via le lait de jabot, parallèlement au transfert des anticorps présents dans la vésicule vitelline, est une caractéristique bien connue de certaines espèces aviaires présentant un jabot développé, à l’instar des colombidés. Les manchots possèdent un jabot simple et non compartimenté mais le taux élevé d’immunoglobulines dans la vésicule vitelline (titre significativement supérieur à celui des mères) et la corrélation significativement élevée entre les titres en anticorps des mères et de leurs poussins témoignent d’une transmission prénatale des immunoglobulines. Par ailleurs, plusieurs manchots nés d’une même mère (1 à 3 poussins par femelle au cours de l’étude) ont présenté des titres en anticorps significativement différents, ce qui pourrait témoigner d’une variation individuelle dans la capacité d’absorber les anticorps maternels de la vésicule vitelline (GRACZYK et al., 1994b).

Les manchots adultes étudiés par les auteurs, n’ont pas présenté de parasitémie au cours de l’hiver, mais tous avaient des anticorps anti-Plasmodium. Ces immunoglobulines sont générées par une infection exoérythrocytaire évoluant à un faible niveau et leur nombre diminue avec les années (GRACZYK et al., 1994b, 1994c). Toutefois, les titres en anticorps ne deviennent jamais nuls et des niveaux plus ou moins constants d’immunoglobulines anti-Plasmodium sont retrouvés chez des manchots âgés, ce qui témoigne du contrôle des formes persistantes du parasite (GRACZYK et al., 1994c).

D’une façon plus générale, les manchots du Cap acquièrent au cours de leur première saison en extérieur une immunité qui les protège – même en absence de traitement – des infections fatales au cours des autres saisons. Les titres sériques sont significativement plus élevés chez les manchots exposés pour leur première ou leur deuxième saison au parasite que chez les manchots plus âgés ce qui suggère que les manchots immunisés ne sont pas réinfectés par des piqûres de moustiques porteurs du parasite, ou qu’ils sont capables de se débarrasser de l’infection (GRACZYK et al., 1994c). Certains manchots immunisés peuvent néanmoins présenter un épisode de parasitémie à la faveur d’une immunosuppression induite par la libération de corticostéroïdes endogènes en réponse à un stimulus physique ou psychologique, mais ces infections ne sont pas fatales (FIX et al., 1988 ; GRACZYK et al., 1994c). FIX et al. (1988) mettent en cause des événements stressants tels qu’une capture, un transport, une quarantaine ou une surpopulation en captivité.

106 En outre, les travaux de GRACZYK et al. (1994a, 1994c) ont permis de montrer que la cinétique des titres en anticorps, ainsi que la magnitude des réponses sériques sont similaires chez les manchots parasitémiques et non-parasitémiques et non corrélées à l’intensité de la parasitémie lorsqu’elle existe. Chez les oiseaux parasitémiques, aucune corrélation entre la parasitémie et le moment où la réponse sérique est maximale n’a pu être mise en évidence . De même, la précocité de la première détection d’immunoglobulines anti-Plasmodium n’a pas pu être corrélée de façon significative à la parasitémie (GRACZYK et al., 1994a). Enfin, la mise en évidence d’une différence dans la réponse humorale des manchots en fonction de l’antigène de Plasmodium falciparum utilisé pour le test de dépistage indique qu’il existe une différence spécifique d’antigénicité de Plasmodium relictum et Plasmodium elongatum chez le manchot du Cap (GRACZYK et al., 1994c).

Selon CRANFIELD et al. (1990, 1994), lorsqu’un manchot survit à sa première infection par un Plasmodium, son système immunitaire devient capable de contrôler le nombre de parasites jusqu’à un niveau suffisamment faible pour que l’infection ne soit pas pathogène. Une étude parue en 1994 s’intéresse aux phénomènes de recrudescence parasitaire : 6 manchots du Cap adultes non parasitémiques (pas de Plasmodium mis en évidence sur frottis, directement ou par subinoculation de sang à des canetons de un jour), ont été expérimentalement immunodéprimés (par une injection de dexaméthasone). Suite à l’injection du glucocorticoïde, 4 de ces manchots ont donné des résultats positifs par la méthode de subinoculation (3 canetons parasitémiques à 7 jours post- infection, et un à 14 jours post-infection). Le phénomène de « recrudescence » parasitaire peut donc être expérimentalement induit chez Spheniscus demersus. Trois hypothèses ont été proposées pour expliquer cela :

• Les stades érythrocytaires pourraient persister et se multiplier dans des sites profonds, la population parasitaire émergeant lors d’une baisse de l’immunité ;

• les stades exoérythrocytaires pourraient libérer en permanence des mérozoïtes dans le sang circulant, permettant au parasite de se multiplier à nouveau lors d’un déclin des défenses de l’organisme ;

• des formes pré-érythrocytaires ou des sporozoïtes inactifs pourraient persister dans des tissus endothéliaux et provoquer la « recrudescence » parasitaire en réponse à un stimulus spécifique.

Toutefois, aucun Plasmodium n’a été mis en évidence sur des frottis réalisés à partir de manchots naturellement infectés et traités (à la primaquine et à la chloroquine). De même aucun parasite n’a été visualisé après passage de ce sang chez des canetons, ce qui amène les auteurs à conclure que la deuxième hypothèse serait moins probable que les deux autres. L’immunodépression induite chez les oiseaux par des injections de glucorticoïdes se traduit par une diminution des populations lymphocytaire et monocytaire et il a été montré que l’immunité anti- Plasmodium des poulets était à médiation cellulaire, ce qui suggère que l’effet des injections de dexaméthasone chez les manchots serait dû à une action débilitante de la molécule sur les effecteurs de la réponse cellulaire contrôlant les stades pré-érythrocytaires dans les tissus endothéliaux (CRANFIELD et al., 1994). Néanmoins, aucune étude n’a permis, jusqu’à présent, de préciser clairement le rôle et les mécanismes de l’immunité cellulaire anti-Plasmodium chez le manchot. Seuls CRANFIELD et al. (1990, 1994) ont souligné l’importance des mécanismes cellulaires, mais les modalités précises de ceux-ci restent inconnues. À l’inverse, en relation avec la mise au point des techniques ELISA, l’immunité humorale a été bien plus étudiée et ses mécanismes sont aujourd’hui mieux connus. 107 Afin de pouvoir estimer les titres en immunoglobulines anti-Plasmodium chez les femelles Spheniscus demersus, GRACZYK & CRANFIELD (1995, 1996) ont étudié deux procédés d’analyse des IgY maternelles, respectivement dans la vésicule vitelline des embryons (œufs embryonnés) et dans le vitellus des œufs (« jaune » des œufs non embryonnés).

La première étude – basée sur la recherche d’anticorps anti-Aspergillus – a permis de montrer que les titres en immunoglobulines du vitellus étaient corrélés à ceux du sang des mères, à la différence de ceux de la vésicule vitelline des embryons. De plus, la dissection d’embryons de quatre semaines a mis en évidence un transfert de la plupart des immunoglobulines maternelles dans le sang fœtal, 8 à 10 jours avant la date théorique d’éclosion (GRACZYK & CRANFIELD, 1995).

La seconde étude – portant sur la recherche d’IgY anti-Plasmodium – montre que 71 % de la variation de l’absorbance mesurée lors de l’ELISA pratiquée sur le jaune d’œuf pouvait s’expliquer par l’absorbance mesurée dans le sang des femelles pondeuses tandis qu’aucune corrélation n’a pu être mise en évidence entre les titres sériques de la vésicule vitelline embryonnaire et le sang des mères. La détection, par ELISA, des IgY du jaune d’œuf permet donc d’estimer un niveau relatif d’IgY dans le sang des femelles pondeuses. De plus, chez les embryons de 4 semaines, soit 6 à 8 jours seulement avant la date théorique d’éclosion, le fait que la plupart des immunoglobulines d’origine maternelle soit passée dans le sang fœtal pourrait expliquer l’absence de corrélation entre les titres sériques de la vésicule vitelline et du sang des mères. D’autres arguments en défaveur de l’utilisation des œufs embryonnés sont avancés, tels que le risque élevé d’endommager l’embryon ou la nécessité, coûteuse en temps, de disséquer le contenu de l’œuf. À l’inverse, l’utilisation des prélèvements de jaune d’œuf permet de rendre compte de l’exposition des adultes à l’agent pathogène concerné par une méthode simple à mettre en oeuvre et moins invasive que la ponction sanguine des poussins ou des juvéniles. Après la réalisation du prélèvement, l’œuf peut être remis dans le nid sans perturber davantage les parents. Une étude sur des colins de Virginie (Colinus virginianus) a en outre montré que les prélèvements de vitellus (50 µl suffisent) pendant l’embryogénèse ne perturbaient pas l’ovogénèse et les résultats de la reproduction. Dans le modèle basé sur Spheniscus demersus, l’absorbance y du sang maternel peut être estimée à partir de l’absorbance x du jaune de l’œuf selon l’équation suivante : y = 0,61 ± 1,46 x. La valeur ainsi obtenue sera juste à 0,15 unité près avec 95 % de certitude. En raison des différences significatives constatée entre les titres sériques de plusieurs poussins issus d’une même mère (et malgré l’homogénéité des niveaux d’IgY mesurés dans le jaune des œufs d’une même femelle), les taux en IgY des poussins ne peuvent en revanche pas être utilisés pour estimer ceux des mères. Enfin, si ces travaux ont été menés exclusivement sur le manchot du Cap, les auteurs estiment probable l’extrapolation de la relation mise en évidence à d’autres espèces de manchots (GRACZYK & CRANFIELD, 1996).

h) Pathogénie et sensibilité supposée des manchots Nous avons évoqué les lourdes conséquences des infections à Plasmodium sur les populations – notamment captives – de manchots.

De nombreux auteurs expliquent cela par une absence d’exposition des manchots au parasite dans leurs biotopes naturels (BROSSY, 1993 ; CRANFIELD, 2003 ; GRIM et al., 2003, 2004 ; PETIT, 1998 ; VALKIUNAS, 2005). En effet, la plupart des espèces de manchots vit dans des régions froides, venteuses, et souvent dépourvues d’eau douce, qui sont donc peu propices à la survie du vecteur et à la transmission du parasite (CRANFIELD, 2003 ; VALKIUNAS, 2005). Si, selon JONES & SHELLAM, certaines considérations écologiques (comme le fait que les manchots vivent pendant de longues périodes dans la mer) expliquent mieux l’absence d’exposition au 108 vecteur que les critères purement climatiques (puisque de nombreuses espèces de manchots vivent à des latitudes tempérées), les manchots sont dans leur ensemble probablement originaires des régions froides du Sud de notre globe, où les piqûres d’arthropodes – et donc l’exposition aux hématozoaires – sont improbables. (JONES & SHELLAM, 1999a).

Quoi qu’il en soit, il n’y aurait pas eu de co-évolution hôte-parasite et – n’ayant (à la différence des espèces jouant le rôle de réservoir) pas acquis de protection contre Plasmodium – les manchots pourraient s’infecter facilement et développer une maladie grave (BROSSY, 1993 ; FLEISCHMAN et al., 1968a ; HOOGESTEYN & CUNNINGHAM, 1996 ; PETIT, 1998 ; VALKIUNAS, 2005). Ceci expliquerait la clinique caractérisée par un taux élevé de mortalité lors de la première saison d’exposition au parasite des individus naïfs (CRANFIELD et al., 1990 ; GRIM et al., 2004 ; HOOGESTYN & CUNNINGHAM, 1996 ; PETIT, 1998). Ainsi, selon FIX et al. (1988), les décès notés au zoo de Des Moines seraient dus à une infection contractée après l’arrivée au zoo (où les conditions climatiques étaient très favorables au moustique) et leur rapidité s’expliquerait par un développement important, en l’espace de 2 jours, des formes pré- érythrocytaires. Néanmoins, l’existence d’une infection préalable, dans l’habitat naturel, n’a pas pu être exclue puisqu’il s’agissait de manchots issus d’une colonie sauvage.

À ce propos, plusieurs études font justement état d’une infection par Plasmodium au sein de colonies sauvages de manchots (BECKER & HOLLOWAY, 1968 ; BROSSY et al., 1999 ; DUIGNAN, 2001 ; FANTHAM & PORTER, 1944 ; GRACZYK et al., 1995a, 1995b ; JONES & SHELLAM, 1999a, 1999b ; LAIRD, 1950 ; MILLER et al., 2001 ; PARSONS & UNDERHILL, 2005). Le variant ou la sous-espèce de Plasmodium relictum mis en cause infecterait les manchots sauvages sans conférer une immunité protectrice contre les Plasmodium relictum présents chez les oiseaux sauvages continentaux (BROSSY et al., 1999 ; FANTHAM & PORTER, 1944 ; LOMBARD et al., 1999). Les parasites retrouvés de nos jours au sein des populations de manchots auraient été acquis à partir d’espèces aviaires éloignées phylogénétiquement, et auraient évolué pour devenir spécifiques des Sphénisciformes (ce qui serait en contradiction avec la première hypothèse, formulée un peu plus haut). Il est probable que les manchots n’ont jamais été confrontés à une exposition intense et continue aux parasites et aux vecteurs présents dans les climats tempérés, et donc qu’ils ne développent qu’une résistance limitée aux infections contractées après un transfert dans un environnement propice à la transmission (JONES & SHELLAM, 1999a). L’infection en captivité se traduirait ainsi par l’apparition de la maladie (LOMBARD et al., 1999). Les vecteurs de Plasmodium relictum étant communs dans la région du Cap, l’infection des manchots par le parasite présent chez les oiseaux sauvages (notamment les francolins à ailes grises, Francolinus africanus) pourrait se faire facilement dans les centres de sauvegarde et expliquer la morbidité et la mortalité rapportées au SANCCOB (BROSSY et al., 1999 ; GRIM et al., 2004 ; PARSONS & UNDERHILL, 2005 ; SCHULTZ & WHITTINGTON, 2005). L’existence de stades inactifs (hypnozoïtes, Cf. annexe 4) présents dans le foie, et réactivés à la faveur d’un stress de capture ou de manipulation est également proposée (BROSSY et al., 1999 ; FLEISCHMAN et al., 1968a ; PARSONS & UNDERHILL, 2005 ; SCHULTZ & WHITTINGTON, 2005).

Il convient finalement de distinguer les manchots qui ont été transférés dans un nouvel environnement, sans exposition préalable aux parasites, des manchots qui sont maintenus en captivité dans leur milieu naturel (cas des centres de sauvegarde) pour lesquels le stress serait responsable de l’apparition de la phase clinique (JONES&SHELLAM, 1999a).

En outre, aucune relation entre les titres en anticorps anti-Plasmodium et la résistance des manchots aux parasites n’a pu être mise en évidence (GRACZYK et al., 1994b).

109 En ce qui concerne la pathogénie de Plasmodium chez les manchots, elle serait due à la mérogonie endothéliale exoérythrocytaire massive, caractéristique du cycle parasitaire chez ces espèces (CRANFIELD et al., 1990, 1994 ; FIX et al., 1988 ; FLEISCHMAN et al., 1968a ; STOSKOPF & BEIER, 1979). En effet, en raison de la faible parasitémie notée chez les manchots (beaucoup meurent sans que des parasites ne soient visibles dans le sang), la destruction des globules rouges n’entraîne pas chez eux d’anémie clinique (CRANFIELD et al., 1990, 1994 ; FLEISCHMAN). La perturbation de l’intégrité de l’endothélium vasculaire, impliqué dans de nombreux phénomènes homéostatiques, pourrait provoquer les processus pathogéniques observés. Les lésions de l’endothélium, associées à l’occlusion mécanique des vaisseaux, due à la présence des mérontes endothéliaux, pourraient jouer un rôle prépondérant dans le dysfonctionnement des organes parenchymateux et provoquer la mort de l’hôte. De plus, les infiltrations de macrophages et l’œdème pulmonaire seraient responsables d’une insuffisance respiratoire (FIX et al., 1988).

En outre, des cas originaux de manchots décédés au Royaume-Uni au cours de l’année 1999 font état d’une atteinte du cerveau, dont les tissus auraient été détruits par le parasite, provoquant la mort (HUGH-JONES, 1999).

D’autres facteurs pourraient également expliquer la sensibilité des manchots à Plasmodium et les processus pathogéniques de l’infection : PETIT (1998) et FOWLER (1978) évoquent des infections concomitantes avec Aspergillus spp., tandis que McCONKEY et al. (1996) remarquent que certains manchots infectés par le parasite responsable d’un épisode de mortalité au zoo de Baltimore ont survécu sans présenter de parasitémie et sans avoir reçu de chimiothérapie. Ce dernier constat soulève la question de la présence – au sein d’un même site – de plusieurs lignées parasitaires, de virulences différentes ou de l’existence d’autres facteurs expliquant la pathogénie de l’infection (McCONKEY et al., 1996). Enfin, les conditions de vie en captivité étant souvent une source de stress pour les manchots, ce facteur pourrait également intervenir pour expliquer la sensibilité des Sphénisciformes aux infections paludéennes (HUGH-JONES, 2000).

7. Particularités de la lutte contre l’infection chez les manchots

a) Difficultés et nouveaux outils diagnostiques La prévention des épisodes de mortalité de manchots au sein des parcs zoologiques passe par l’immunisation naturelle des individus et la rapidité du diagnostic de l’infection, qui permet la mise en place d’un traitement avant l’apparition des signes cliniques (il est en général trop tard quand les premiers symptômes apparaissent) (CRANFIELD et al., 1990 ; GRACZYK et al., 1994d). Cependant, les manchots sont susceptibles de succomber à une infection à Plasmodium sans présenter de signes cliniques ou de parasitémie, ce qui rend parfois le diagnostic ante mortem difficile (CRANFIELD et al., 1994 ; GRACZYK et al., 1994d ; STOSKOPF & BEIER, 1979).

Le diagnostic de certitude est obtenu par la mise en évidence d’une parasitémie ou au cours de l’examen nécropsique (GRIM et al., 2004).

(1) Mise en évidence directe du parasite dans le sang Le diagnostic ante mortem des infections à Plasmodium chez les manchots peut se faire par la mise en évidence de trophozoïtes dans les érythrocytes sur un frottis sanguin (FOWLER, 1978).

Néanmoins, cette technique est peu fiable, en raison du développement érythrocytaire limité de Plasmodium chez les oiseaux, et plus particulièrement chez les manchots (MILLER et al., 2001 ; 110 PETIT, 1998 ; TOLLINI et al., 2000). En effet, les parasites peuvent abandonner les érythrocytes pour se développer dans les endothéliums ou les tissus hématopoïétiques (GRACZYK et al., 1994c). Les formes circulantes peuvent donc être peu nombreuses et difficiles à mettre en évidence sur un frottis sanguin (CRANFIELD et al., 1994 ; GRACZYK et al., 1994a, 1994c, 1994d, 1995c ; GRINER, 1974 ; PETIT, 1998 ; STOSKOPF & BEALL, 1980 ; STOSKOPF & BEIER, 1979). Il est souvent nécessaire d’examiner plus de 400 000 érythrocytes pour visualiser un seul parasite (STOSKOPF & BEALL, 1980) et STOSKOPF & BEIER (1979) rapportent des parasitémies allant de 0,001 % à 1,88 % d’érythrocytes infectés pour le manchot du Cap, les parasitémies inférieures à 0,01 % étant les plus fréquentes.

À titre d’exemple, RODHAIN (1939) évoquait déjà un manchot pour lequel des Plasmodium étaient visibles au niveau des poumons et du foie, mais pas dans le sang périphérique. Puis ce fut au tour de FIX et al. (1988) de ne rapporter qu’une seule parasitémie visible sur frottis sanguin pour un total de 38 manchots ayant succombé à une infection à Plasmodium et qui présentaient des formes tissulaires du parasite dans leurs organes internes (FIX et al., 1988 ; GRACZYK et al., 1995b).

Par conséquent, si l’observation d’un Plasmodium sur un frottis sanguin établit avec certitude une infection par le parasite (STOSKOPF & BEIER, 1979), un résultat négatif à la lecture d’un frottis ne permet pas d’exclure l’existence d’une forme exoérythrocytaire de l’infection (STOSKOPF & BEALL, 1980 ; STOSKOPF & BEIER, 1979). Une technique permettant d’augmenter la sensibilité du diagnostic via la lecture de frottis sanguins a toutefois été proposée : il s’agit d’un isodiagnostic, qui consiste à inoculer à des canetons de un jour le sang des manchots étudiés. Si les manchots sont infectés, les canetons amplifient l’infection, mais n’y succombent pas et présentent une parasitémie très élevée. Le parasite peut donc être plus facilement mis en évidence dans le sang des canetons que dans celui des manchots, mais cette technique présente plusieurs inconvénients (il faut 4 à 5 jours pour la mettre en œuvre, elle est onéreuse, et des faux-négatifs persistent toujours) qui n’en font pas un outil clinique performant (CRANFIELD et al., 1990 ; STOSKOPF & BEIER, 1979).

Enfin, la technique du « buffy coat » (utilisée en médecine humaine pour le diagnostic du paludisme) a été testée sur plusieurs manchots et canetons infectés par Plasmodium. Elle repose sur l’action néfaste des parasites au niveau des membranes érythrocytaires, qui provoque une entrée d’eau dans la cellule et rend les érythrocytes infectés plus légers. Après récolte de la partie supérieure de la couche d’érythocytes d’un tube à hématocrite, le parasite peut aisément être mis en évidence dans les globules rouges humains par coloration fluorescente, même en cas de faible parasitémie. Néanmoins, lors des essais réalisés sur les oiseaux, les parasites ont été trouvés à la fois sur les individus infectés et sur les témoins. De plus, le fait que les érythrocytes aviaires soient nucléés rend plus difficile la visualisation des parasites (CRANFIELD et al., 1990). Aucune publication récente ne mentionne cet outil diagnostic, qui semble donc avoir été délaissée.

(2) Diagnostic clinique Comme nous l’avons déjà évoqué, le diagnostic clinique est parfois difficile puisque les manchots sont susceptibles de succomber à une infection à Plasmodium sans présenter de signes cliniques (GRACZYK et al., 1994c, 1994d ; PETIT, 1998 ; STOSKOPF & BEIER, 1979). Exceptionnellement, quelques signes subtils et non spécifiques peuvent apparaître de façon aiguë, peu avant le décès du manchot (FLEISCHMAN et al., 1968a ; GRINER, 1983 ; PETIT, 1998 ; RODHAIN, 1939 ; STOSKOPF & BEALL, 1980 ; STOSKOPF & BEIER, 1979). Ces symptômes, peu caractéristiques, sont susceptibles d’orienter le diagnostic vers d’autres maladies des manchots, 111 comme l’aspergillose ou une gastroentérite bactérienne (STOSKOPF & BEIER, 1979). L’infection doit néanmoins être suspectée chez tous les manchots présentant des muqueuses pâles ou une quelconque difficulté respiratoire (STOSKOPF & BEALL, 1980), ainsi que chez les individus morts subitement, victimes d’une attaque, notamment au cours des mois estivaux (PETIT, 1998 ; STOSKOPF & BEALL, 1980). L’intervalle entre l’apparition des premiers symptômes et la mort peut n’être que de quelques heures (FLEISCHMAN et al., 1968a ; STOSKOPF & BEIER, 1979).

TOLLINI et al. (2000) distinguent deux phases dans l’évolution clinique de l’affection chez les Spheniscus magellanicus du zoo de San Francisco :

• la phase aiguë ou tissulaire, au cours de laquelle les signes rencontrés peuvent être un manque de coordination, une ataxie, des trébuchements ou une démarche en cercle. S’ensuit une détresse respiratoire supérieure sévère. Selon les auteurs, aucun traitement ne peut s’avérer efficace au cours de cette phase, à l’issue de laquelle les manchots peuvent succomber (en 24 à 36 heures) ou, pour la plupart d’entre eux, survivre et entrer dans la deuxième phase clinique.

• la phase sanguine, qui suit la phase tissulaire, se caractérise par des symptômes variés et inconstants : perte d’appétit, coloration verte des fientes, pâleur des muqueuses ou de la peau des pieds (l’anémie peut se traduire par un hématocrite parfois compris entre 10 et 20 %, pour une norme de 45 à 55 % chez Spheniscus magellanicus), léthargie, isolement, perte de poids. Le manchot malade peut également être retrouvé en surface du plan d’eau de son enclos, quasiment statique, les yeux à demi fermés.

Le tableau 7 récapitule les différents symptômes notés chez les manchots infectés par Plasmodium. Ils sont classés par ordre décroissant de fréquence dans la littérature.

112 Tableau 7 : symptômes recensés chez les manchots infectés par Plasmodium

Symptômes Sources

CRANFIELD (2003), CRANFIELD et al. (1990), FOWLER (1978), GRIM et al. (2003, 2004), Anorexie / inappétence GRINER (1974, 1983), PENRITH et al. (1994), PETIT (1998), STOSKOPF & BEALL (1980), STOSKOPF & BEIER (1979), TOLLINI et al. (2000), VAN DER HEYDEN (1996).

Abattement / CRANFIELD (2003), FOWLER (1978), GRIM et al. (2003, 2004), GRINER (1974, 1983), PETIT dépression / faiblesse / (1998), RAE (1995), STOSKOPF & BEALL (1980), STOSKOPF & BEIER (1979), TOLLINI et léthargie al. (2000), VAN DER HEYDEN (1996).

Régurgitations / CRANFIELD et al. (1990), FLEISCHMAN et al. (1968a), GRIM et al. (2003, 2004), RAE (1995), REDROBE (1999), STOSKOPF & BEALL (1980), STOSKOPF & BEIER (1979), VAN vomissements DER HEYDEN (1996).

Dyspnée / détresse CRANFIELD (2003), CRANFIELD et al. (1990), GRIM et al. (2003, 2004), PETIT (1998), REDROBE (1999), STOSKOPF & BEALL (1980), STOSKOPF & BEIER (1979), TOLLINI et respiratoire al. (2000).

Muqueuses pâles / CRANFIELD (2003), CRANFIELD et al. (1990), RAE (1995), STOSKOPF & BEALL (1980), anémie / anoxie STOSKOPF & BEIER (1979), TOLLINI et al. (2000).

Attaque / mort subite FOWLER (1978), GRIM et al. (2004), RAE (1995), VAN DER HEYDEN (1996).

Ataxie, manque de coordination, TOLLINI et al. (2000). trébuchements, et marche en cercle

Fientes de couleur TOLLINI et al. (2000). verte

Individu isolé, en train de flotter sur l’eau, quasiment sans TOLLINI et al. (2000). mouvements, les yeux à demi fermés

Perte de poids TOLLINI et al. (2000).

Somnolence PENRITH et al. (1994).

N.B. : le classement des symptômes, proposé ici par ordre décroissant de fréquence dans la littérature, est basé uniquement sur le nombre de références citant chaque symptôme. Il sert juste à donner une idée approximative des symptômes les plus fréquents chez les manchots infectés par Plasmodium, mais ne correspond à aucune réalité épidémiologico-clinique et aucune étude précise faisant la part de chacun de ces symptômes n’est disponible à l’heure actuelle.

113 Enfin, selon PARSONS & UNDERHILL (2005), la faiblesse, lorsqu’elle est présente chez les manchots, se traduit par un bec facile à ouvrir, chez un individu qui reste souvent couché et n’attaque pas lorsqu’on le manipule.

(3) Diagnostic paraclinique (autre que par la mise en évidence directe du parasite) Nous avons évoqué plus haut les difficultés du diagnostic ante mortem des infections à Plasmodium chez les manchots, en raison de la subtilité et de l’inconstance des signes cliniques, ainsi que de la faible prévalence des formes érythrocytaires du parasite chez les Sphénisciformes (CRANFIELD et al., 1994 ; GRACZYK et al., 1994d ; STOSKOPF & BEIER, 1979).

Plusieurs auteurs ont donc essayé de trouver de nouveaux indicateurs de l’infection, afin de permettre une détection plus précoce des manchots atteints. Nous renvoyons le lecteur aux annexes 8 et 8’ pour consulter les valeurs de référence en hématologie et en biochimie chez différentes espèces de manchots.

FLEISCHMAN et al. (1968a) réalisent un hémogramme sur un manchot du Cap qui succombera peu de temps après des suites d’une infection à Plasmodium elongatum. Quelques modifications hématologiques sont perceptibles : l’hématocrite n’est que de 27,5 % (pour des valeurs allant de 40 à 44 % chez des individus sains), la numération leucocytaire de 23.500 cellules/mm3, et la formule leucocytaire compte 50 % de granulocytes hétérophiles, 39 % de lymphocytes, 4 % de monocytes, 2 % de basophiles et 5 % de cellules non identifiées. En outre, un frottis sanguin réalisé sur ce manchot a permis de mettre en évidence une hyperplasie érythroïde, caractérisée par la présence dans le sang de nombreux érythrocytes immatures.

Dans une étude portant sur dix Spheniscus demersus, STOSKOPF & BEIER (1979) remarquent que la numération érythrocytaire, l’hématocrite ou les protéines sériques totales ne sont pas modifiées chez les individus infectés, ne confirmant pas l’existence d’une anémie, comme suggérée par FLEISCHMAN et al. (1968a). En revanche, la numération leucocytaire s’est avérée supérieure à la norme dans 5 cas sur 7. Ainsi, selon les auteurs, une numération leucocytaire supérieure à 19.000 cellules/mm3 est en faveur d’une infection à Plasmodium (ils donnent une valeur de référence de 11.566 ± 6427 cellules/mm3) (STOSKOPF & BEIER, 1979). Mieux encore, la leucocytose serait en fait due à une lymphocytose importante (STOSKOPF & BEALL, 1980). Une lymphocytose relative serait donc un critère diagnostique d’assez bonne valeur prédictive puisqu’une parasitémie a été mise en évidence chez 80 % des manchots présentant une lymphocytose relative supérieure à 50 % (normes : 33 % à 37 %), et seulement 4,6 % des parasitémies relevées au cours de l’étude se sont produites chez des individus présentant une formule lymphocytaire inférieure à 50 %. L’association des 2 critères (leucocytose et lymphocytose) pourrait orienter vers un diagnostic de malaria, même en l’absence de parasitémie visible (STOSKOPF & BEIER, 1979). En effet, leucocytose et lymphocytose peuvent être notées chez des individus victimes d’une infection exoérythrocytaire de faible intensité, qui ne présentent pas de parasitémie (CRANFIELD et al., 1990 ; GRACZYK et al., 1994d)

Néanmoins, ces affirmations ont été remises en cause à plusieurs reprises : si FIX et al. (1988) constatent en effet une leucocytose associée à une lymphocytose chez plusieurs manchots de Magellan décédés au zoo de Des Moines, ils n’ont en revanche pas pu mettre en évidence de corrélation entre ces modifications hématologiques et l’existence – ou non – de l’infection. CRANFIELD et al. (1990) notent que seulement 20 % des manchots infectés par Plasmodium présentaient à la fois une leucocytose supérieure à 20.000 cellules/mm3 et une lymphocytose 114 supérieure à 60 %. En ne prenant que l’un ou l’autre de ces critères (et non les deux en même temps), l’infection aurait pu être détectée chez 66 % des manchots infectés, mais cette sensibilité reste trop faible pour en faire un critère fiable. Enfin, GRACZYK et al. (1994d) confirment que les critères de STOSKOPFF & BEIER (1979) ne sont pas discriminants puisqu’ils n’auraient permis de détecter aucune des 4 infections fatales et seulement 21,9 % des manchots parasitémiques de leur étude. Les auteurs évoquent des variations individuelles très importantes dans les numérations leucocytaire et lymphocytaire. Les normes aujourd’hui disponibles pour Spheniscus demersus sont d’ailleurs très étendues, puisque CRANFIELD (2003) évoquait (16,09 ± 8,053) x 103 leucocytes/mm3 (Cf. annexe 8).

La présence des mérontes de Plasmodium dans l’endothélium de tous les organes internes, serait susceptible d’altérer le fonctionnement desdits organes et induire des modifications biochimiques décelables dans le sérum (GRACZYK et al., 1995c). CRANFIELD et al. (1990) remarquent dans un premier temps que les manchots infectés ne présentent aucune modification biochimique jusqu’à 72 h avant leur décès. En revanche, à 48 h de la mort, des élévations extrêmes des LDH, ASAT, ALAT et C.K. sont notées. Cette augmentation exponentielle (et non linéaire) s’expliquerait par la libération massive des mérozoïtes, qui donneront à nouveau des mérontes, à l’issue d’un cycle de 24 h. L’augmentation tardive des enzymes sériques n’en fait toutefois pas un bon outil diagnostic pour les animaux affectés (puisqu’il serait de toute façon trop tard pour mettre en place un traitement). GRACZYK et al. (1995c) montrent qu’il n’existe aucune relation entre les valeurs des protéines sériques totales, de l’albumine, des globulines, et du rapport albumine/globuline avec le statut clinique des manchots vis-à-vis de Plasmodium. Plus généralement, 68 % des paramètres biochimiques testés s’avèrent être non corrélés à une infection paludéenne. Seuls 8 paramètres sont donc retenus pour la prédiction des infections, même lorsqu’elles sont au stade exo ou pré-érythocytaire. Des différences significatives dans les valeurs des γ-GT, ALAT, PAL, créatinine, acide urique, triglycérides, phosphates et V.L.D.L. ont été associées à des infections à Plasmodium qui ne pouvaient pas être décelées par la simple lecture de frottis sanguins. Ainsi, une augmentation de la valeur de ces paramètres au-dessus de la norme devrait être interprétée comme un signal d’alerte pour une infection potentielle par Plasmodium. De plus trois de ces paramètres (ALAT, γ-GT, et créatinine) ont des valeurs prédictives positives très élevées (respectivement 57,1 %, 62,5 %, et 75,0 %) et devraient être recherchés lors de l’évaluation du statut clinique d’un manchot vis-à-vis de la malaria.

Enfin, pour information, l’examen radiographique ne montre aucune image permettant de caractériser une infection à Plasmodium chez les manchots, mais peut s’avérer utile pour exclure d’autres hypothèses diagnostiques, telles que la présence d’un corps étranger ou une aspergillose (TOLLINI et al., 2000).

(4) Diagnostic post mortem La mise en évidence histologique du parasite est en général permise par l’observation microscopique de nombreux organes, notamment le foie, la rate et les poumons, dans lesquels des mérontes sont souvent visualisables (CRANFIELD, 2003 ; CRANFIELD et al., 1990 ; FIX et al., 1988 ; GRACZYK et al., 1995c ; PETIT, 1998). Certains auteurs évoquent leur présence fréquente dans les cellules du système réticulo-endothélial (GRIM et al., 2003), à l'intérieur des histiocytes (FLEISCHMAN et al., 1968b), avec de nombreux pigments phagocytés (RODHAIN, 1939) en association avec un infiltrat inflammatoire constitué principalement de cellules mononucléées lymphoïdes et histiocytaires (FLEISCHMAN et al., 1968b). Néanmoins, les cellules hôtes peuvent également être des cellules endothéliales fixes, des monocytes, ou d’autres cellules propres à

115 chaque organe (par exemple : les cellules de Küpffer du foie) (RODHAIN, 1939). L'hyperplasie des cellules réticulo-endothéliales serait pathognomonique (FOWLER, 1978 ; GRINER, 1983).

Une alternative à la traditionnelle analyse histologique peut être la réalisation de simples empreintes du poumon, du foie ou de la rate qui, selon GRINER (1974), permettraient (après coloration au Giemsa) de visualiser fréquemment des mérontes exoérythrocytaires.

Dans son bilan sur l’importance de l’infection au sein des zoos européens, PETIT (1998) estime qu’il existe une uniformité dans les lésions macroscopiques observées et que – en dehors des hypertrophies hépatique et splénique – une lésion caractéristique serait la présence, à l'ouverture de la cavité générale, de poumons congestifs baignant au milieu d'un transsudat jaune pâle à verdâtre. Il va donc à l’encontre de certains auteurs, qui affirment que la plupart des lésions recensées sont non spécifiques.

L'examen de frottis sanguins réalisés post mortem est possible jusqu’à 72 heures après le décès de certains manchots, par section de la veine jugulaire (CRANFIELD, 2003), mais la mise en évidence des formes érythrocytaires du parasite peut faire défaut et le diagnostic se fait parfois à partir de la seule observation de mérontes exoérythrocytaires ou de lésions macroscopiques caractéristiques (GRINER, 1983).

Une source d’erreur diagnostique (par défaut) serait imputable aux difficultés d’interprétation des prélèvements histologiques, puisque selon JONES & SHELLAM (1999a), les mérontes tissulaires de Plasmodium ont souvent été confondus avec ceux de Toxoplasma.

L’ensemble des lésions rapportées dans la littérature est repris ci-dessous, en fonction de l’organe atteint.

(a) Lésions du foie La principale lésion rapportée pour le foie est – de très loin – l’hépatomégalie (CRANFIELD, 2003 ; CRANFIELD et al., 1990 ; FIX et al., 1988 ; FLEISCHMAN et al., 1968a, 1968b ; FOWLER, 1978 ; GRACZYK et al., 1995c ; GRIM et al., 2004 ; GRINER, 1974, 1983 ; PETIT, 1998 ; RODHAIN, 1939). Celle-ci est parfois associée à une congestion, mais sans pétéchies visibles (RODHAIN, 1939). À l'inverse, FOWLER (1978) évoque une couleur pâle de l'organe et GRINER (1983), la présence de multiples foyers de couleur pâle, visibles à travers la capsule sur des foies de couleur gris-brun. Le parenchyme peut être mou et friable.

L’examen au microscope permet l’observation de mérontes en grand nombre (CRANFIELD, 2003 ; FIX et al., 1988 ; GRACZYK et al., 1995c ; RODHAIN, 1939), souvent dans l'endothélium des capillaires (CRANFIELD, 2003 ; FIX et al., 1988) et les macrophages (FIX et al., 1988) D’autres auteurs mentionnent les cellules de Küpffer (PENRITH et al., 1994). Les capillaires sinusoïdes peuvent parfois être dilatés, leur lumière étant entièrement occupée par des masses schizogoniques qui hypertrophient à l’extrême les cellules de Küpffer (FLEISCHMAN et al., 1968a ; GRINER, 1983 ; RODHAIN, 1939). Le nombre de mérontes présents dans ces cellules est parfois tel qu’ils prédominent sur les formes érythrocytaires, pourtant nombreuses dans l’organe (RODHAIN, 1939). Les autres cellules parasitées sont les cellules étoilées des sinusoïdes (RODHAIN, 1939). FLEISCHMAN et al. (1968a) décrivent des infiltrats inflammatoires à distribution portale ou périportale. L’examen à un plus fort grossissement montre qu’ils sont constitués principalement de cellules mononucléées au cytoplasme basophile. De nombreux stades immatures de la lignée lymphocytaire sont visualisables, ainsi que plusieurs foyers de

116 minéralisation, d'origine indéterminée, mais probablement dus à des migrations parasitaires. Selon GRINER (1983), il existerait une hyperplasie des cellules réticulo-endothéliales sans distribution spécifique, des infiltrats lymphocytaires et une nécrose évidente des hépatocytes.

(b) Lésions des poumons Macroscopiquement, on observe en général une congestion et un œdème pulmonaires intenses (CRANFIELD et al., 1990 ; FIX et al., 1988 ; FLEISCHMAN et al., 1968a, 1968b ; FOWLER, 1978 ; GRIM et al., 2003, 2004 ; GRINER, 1974 ; PETIT, 1998 ; RODHAIN, 1937, 1939). Selon GRINER (1983) et FOWLER (1978), du liquide, jaunâtre à verdâtre, entoure typiquement les poumons (facilitant leur retrait du thorax) et remplit les sacs aériens. Une pneumonie interstitielle sévère associée à la présence de mérontes est également décrite (CRANFIELD et al., 1990).

Selon plusieurs auteurs, l’analyse microscopique révèle la présence, en grand nombre, de mérontes (CRANFIELD, 2003 ; FIX et al., 1988 ; GRACZYK et al., 1995c ; RODHAIN, 1939), souvent dans les macrophages (FIX et al., 1988) ou dans l’endothélium (CRANFIELD, 2003). La structure du poumon peut être complètement modifiée par l'abondance des formes exoérythrocytaires (RODHAIN, 1939). À une congestion vasculaire intense peut également s’ajouter un infiltrat de cellules réticulo-endothéliales et lymphocytaires, pour la plupart parasitées (GRINER, 1983 ; RODHAIN, 1939). Une hémosidérose pulmonaire est parfois notée (FIX et al., 1988).

(c) Lésions de la rate La principale lésion macroscopique observée est l’hypertrophie splénique, qui est très nettement marquée et parfois associée à une consistance molle (CRANFIELD, 2003 ; CRANFIELD et al., 1990 ; FIX et al., 1988 ; FLEISCHMAN et al., 1968a, 1968b ; FOWLER, 1978 ; GRACZYK et al., 1995c ; GRIM et al., 2003, 2004 ; GRINER, 1974, 1983 ; PETIT, 1998 ; PENRITH et al., 1994 ; RODHAIN, 1937, 1939) ou à une congestion (FLEISCHMAN et al., 1968a).

Une hémosidérose splénique (FIX et al., 1988 ; GRINER, 1983), une hyperplasie de la pulpe rouge (PENRITH et al., 1994) ou un infiltrat inflammatoire (FLEISCHMAN et al., 1968a) sont parfois notés. Des sections de la rate ont permis de montrer que la pulpe rouge contenait essentiellement des cellules réticulo-endothéliales. La lymphopoïèse ne semble pas être stimulée dans cet organe (GRINER, 1983). De nombreux mérontes sont observables au microscope (FIX et al., 1988 ; GRACZYK et al., 1995c,), particulièrement dans les macrophages (FIX et al., 1988 ; PENRITH et al., 1994), mais également dans l’endothélium (CRANFIELD, 2003). Une infection moins massive est rapportée par PENRITH et al. (1994) chez un manchot royal.

(d) Lésions des reins Macroscopiquement, les reins peuvent être de couleur claire et entourés d'un liquide œdémateux, mais ils sont rarement hypertrophiés (FOWLER, 1978).

Des infiltrats monocytaires (GRACZYK et al., 1995c), lymphocytaires et une hyperplasie réticulo-endothéliale (GRINER, 1983) ont également été observés. Des mérontes exoérythrocytaires peuvent être mis en évidence (FIX et al., 1988 ; FLEISCHMAN et al., 1968b ; GRACZYK et al., 1995c ; GRINER, 1983) en quantités très variables selon les études (FLEISCHMAN et al., 1968b ; GRACZYK et al., 1995c). D'après la description de FLEISCHMAN et al. (1968a), les mérontes se

117 retrouvent dans les cellules endothéliales et les histiocytes des glomérules ou dans les tissus interstitiels.

(e) Lésions de l’encéphale Plusieurs auteurs rapportent la présence de mérontes dans l'encéphale de manchots infectés (CRANFIELD, 2003 ; FIX et al., 1988 ; FLEISCHMAN et al., 1968a, 1968b ; GRINER, 1983 ; RODHAIN, 1939). Les principales cellules parasitées sont les cellules endothéliales (CRANFIELD, 2003 ; GRINER, 1983 ; RODHAIN, 1939) ou les cellules de la microglie (FLEISCHMAN et al., 1968a). Selon les sources, la mérogonie peut être limitée (FLEISCHMAN et al., 1968a, 1968b) ou d’une importance considérable (RODHAIN, 1939), pouvant conduire à une obstruction totale de la lumière des capillaires (GRINER, 1983 ; RODHAIN, 1939).

(f) Lésions du cœur Les lésions macroscopiques cardiaques provoquées par Plasmodium chez les manchots peuvent être un œdème (FLEISCHMAN et al., 1968a, 1968b ; GRINER, 1974) et des pétéchies (FOWLER, 1978) épicardiques, une péricardite (FIX et al., 1988), un hydropéricarde (FLEISCHMAN et al., 1968a, 1968b ; FOWLER, 1978 ; GRIM et al., 2003, 2004 ; GRINER, 1974 ; GRINER, 1983) et une cardiomégalie (FIX et al., 1988). Selon FIX et al. (1988), les manchots présentant des lésions cardiaques souffraient d'une dégénérescence myocardique consécutive à une mérogonie massive. Des mérontes exoérythrocytaires peuvent donc être vus dans le cœur (FIX et al., 1988 ; FLEISCHMAN et al., 1968b ; GRINER, 1983), parfois en grand nombre (FIX et al., 1988 ; FLEISCHMAN et al., 1968b), mais moins fréquemment que dans le foie, la rate, et les poumons (FIX et al., 1988).

(g) Autres lésions En plus des lésions précédemment décrites, certains auteurs rapportent un œdème localisé en région sous-cutanée (FLEISCHMAN et al., 1968a, 1968b ; GRINER, 1974), la collection d'un liquide (clair et jaunâtre à verdâtre selon GRINER, 1974) dans différents tissus, dans la cavité générale, ou dans les sacs aériens (FOWLER, 1978 ; GRINER, 1974), ainsi que la présence de mérontes dans les muscles squelettiques, les intestins et la moelle osseuse (FLEISCHMAN et al., 1968b). L'analyse histologique de cette dernière peut montrer une hyperplasie myéloïde (FLEISCHMAN et al., 1968a).

Par ailleurs, d'après GRINER (1983), la paroi abdominale et le mésentère peuvent être oedémateux.

Enfin, parmi les 20 manchots victimes de l'infection au zoo de Des Moines pour lesquels une analyse histologique avait été mise en oeuvre, 12 (60 %) ont présenté une entérite lymphoplasmocytaire (FIX et al., 1988).

(5) Nouveaux outils diagnostiques Rappelons ici que les tests sérologiques et les P.C.R. pour l’étude des Plasmodium aviaires ne sont pas proposés « en routine » par les laboratoires. Leur mise en œuvre se résume à des études menées en milieu universitaire, principalement aux États-Unis (Cf. paragraphe I.A.12.f.).

118 (a) Tests sérologiques Les différents tests sérologiques utilisables pour la détection de Plasmodium ont déjà été évoqués plus haut (Cf. paragraphe I.A.12.e.1). Nous ne reviendrons donc pas sur les principes fondamentaux de ces tests, mais évoquerons leur efficacité et tirerons les conclusions de leur utilisation chez les manchots.

Le test ELISA, mis au point par GRACZYK et al. (1994c), utilise trois antigènes de Plasmodium falciparum et tire profit des réactions croisées entre les anticorps dirigés contre différentes espèces du parasite. Les auteurs recommandent une concentration de 2 µg/mL pour chaque antigène, afin d'optimiser la sensibilité, la spécificité, et la rapidité du test. Il devient alors possible de détecter des anticorps anti-Plasmodium à une dilution de 10-4,11. Il s'agit de surcroît d'un test simple, qui utilise plusieurs antigènes d'un seul coup. Il peut se faire à partir de sang récolté sur papier filtre, ce qui facilite le stockage, la manipulation, ou l'envoi, et permet de tester simultanément un grand nombre d'échantillons.

Développé initialement pour Spheniscus demersus (GRACZYK et al., 1994c), ce test a montré sur le terrain une efficacité chez les espèces suivantes : Pygoscelis adeliae, Pygoscelis papua, Aptenodytes patagonicus, Eudyptula minor, Spheniscus magellanicus, Megadyptes antipodes et Eudyptes chrysocome, soit au total 8 des 17 (ou 18) espèces de manchots. L'utilisation sur Eudyptes chrysocome a permis de détecter des anticorps à une dilution de 1/6 400 (GRACZYK et al., 1995b). Toutefois, il convient de rappeler ici que l’ELISA ne témoigne que de l’exposition, ou non, d’un oiseau au parasite, et qu’il ne permet pas de faire la différence entre des infections passées ou encore actives (TOLLINI et al., 2000).

Enfin, HOOGESTEYN & CUNNINGHAM (1996) évoquent la mise au point d’un test I.F.A.T. (Indirect Fluorescent Antibody Test) validé chez Spheniscus demersus, Pygoscelis papua, Eudyptes crestatus et Spheniscus humboldti ; mais l’article (qui n’est en fait que le résumé d’une conférence présentée à l’occasion du congrès annuel de l’American Association of Zoo Veterinarians) ne donne pas plus de précisions quant à la nature exacte du test et aucune autre publication des auteurs à ce sujet n’est disponible.

(b) P.C.R. Mc CONKEY et al. (1996) utilisent le test P.C.R. de LI et al. (1995) – qui amplifie le gène 18S rRNA – pour détecter des séquences de Plasmodium chez des manchots du Cap du zoo de Baltimore. Certaines amorces ont toutefois été replacées par des amorces homologues : les produits de la première P.C.R. sont amplifiés après hybridation avec les amorces 877 (5'-ATA TAG TAT ATT ATG AAT GAC ATA T-3'), 875 (5'-GGT AAA AGT TAC GAT TAG GAG A-3'), 1027 (5'- GAT TGG ATA ATA AAT ATA ATG G-3') et 1100 (5'-GAT ATA ATT AAC ATT GAT AAA TA-3') en lieu et place des amorces 841 et 844. L'utilisation simultanée du test chez les moustiques du parc (par RT-PCR cette fois-ci, c'est-à-dire en partant de l'ARN, mais en utilisant les mêmes amorces) a permis de détecter le parasite quel que soit son stade de développement avec une très forte sensibilité puisque la RT-PCR est capable de détecter un simple ookyste chez le vecteur (McCONKEY et al., 1996).

CRANFIELD (2003) confirme l’intérêt de la P.C.R. pour la détection des parasitémies de faible intensité et l’étude de la prévalence de l’infection chez le vecteur. Le test serait si sensible que son utilisation en vue d’instaurer un traitement sur les animaux positifs se traduirait par un traitement de toute la colonie au cours d’une année. Or, selon l’auteur, les individus positifs à la

119 P.C.R., mais qui ne présentent pas de parasitémie détectable sur un frottis sanguin, n’ont pas besoin de recevoir de traitement, qui pourrait de plus interférer avec les processus naturels d’immunisation et rendre ces oiseaux plus sensibles lors des saisons suivantes.

Deux autres études ont également utilisé la P.C.R. pour détecter des Plasmodium chez des manchots (GRIM et al., 2003 ; STURROCK & TOMPKINS, 2007) en utilisant respectivement les amorces 841 et 844 de LI et al. (1995) et 543F et 926R décrites par RICHARD et al. (2002). Nous renvoyons le lecteur au paragraphe I.A.12.d. pour plus d’informations sur ces amorces. GRIM et al. (2003) s’en sont servis pour amplifier et séquencer de l’ADN de Plasmodium juxtanucleare chez cinq Spheniscus demersus morts au SANCCOB, tandis que les tentatives d’amplification de séquences parasitaires menées par STURROCK & TOMPKINS (2007) sur cent-quarante-trois Megadyptes antipodes prélevés dans leur milileu naturel se sont révélées infructueuses.

b) Protocoles thérapeutiques proposés Plusieurs molécules ont été utilisées pour le traitement (ou plus souvent pour la prévention) des infections à Plasmodium chez les manchots. RODHAIN (1939) constate que l'atébrine fait disparaître les Plasmodium de la circulation sanguine de deux manchots de Humboldt traités à la posologie de 100 mg par jour, pendant 5 et 6 jours. Néanmoins, si le premier manchot a guéri, des formes non pigmentées ont persisté dans les cellules réticulo-endothéliales du second, qui a fini par succomber à l'infection (traité du 27 août au 3 septembre, il mourut le 7 septembre). L'auteur affirme que les formes réticulo-endothéliales des Plasmodium aviaires résistent davantage à l'action de la quinine et de l'atébrine que les formes érythrocytaires et qu'elles seraient responsables de l'échec thérapeutique constaté au zoo d'Anvers.

De nouvelles molécules ont depuis prouvé leur efficacité sur les stades exoérythrocytaires du parasite et plusieurs protocoles thérapeutiques ont été élaborés.

Parmi les molécules les plus utilisées, citons la chloroquine, qui agit sur les stades sanguins du parasite, ainsi que la primaquine, qui agit sur les stades tissulaires (CRANFIELD et al., 1990 ; PETIT, 1998 ; TOLLINI et al., 2000 ). Ces deux molécules sont souvent associées.

L’ensemble des protocoles proposés pour la prophylaxie ou le traitement des infections à Plasmodium des manchots est repris dans le tableau 8.

120 Tableau 8 : protocoles thérapeutiques proposés pour la prévention ou le traitement des infections à Plasmodium chez les manchots

Molécule/Association Protocole/Posologie Remarques Sources

Protocole utilisé sur 12,5 à 15 mg/kg/jour de des Spheniscus chloroquine pendant 10 magellanicus présentant des signes jours. TOLLINI et al. cliniques de (2000). 0,75 à 1,0 mg/kg/jour de « malaria », et primaquine pendant 10 adapté à des jours. manchots pesant Chloroquine + entre 2,7 et 5,4 kg. primaquine

12,5 à 15 mg/kg de Protocole utilisé en chloroquine une fois par prophylaxie sur des Spheniscus semaine. TOLLINI et al. magellanicus, et (2000). 0,75 à 1,0 mg/kg de adapté à des primaquine une fois par manchots pesant semaine. entre 2,7 et 5,4 kg.

Chloroquine + Traitement des primaquine individus 0,3 mg/kg/jour de parasitémiques. primaquine pendant 3 jours. Forme galénique : suspensions salines STOSKOPF & 10 mg/kg de chloroquine contenant les BEIER (1979). le premier jour, puis 5 principes actifs et mg/kg 6, 18, et 24h plus administrées par tard. voie orale (intubation).

Protocole mis au 10 mg/kg de chloroquine point au zoo de CRANFIELD et al. immédiatement, puis 5 Baltimore. (1990, 1994), mg/kg de chloroquine et 1 Traitement des GRACZYK et al. mg/kg de primaquine au individus (1994d), PETIT bout de 6 heures et parasitémiques. (1998), STOSKOPF quotidiennement pendant & BEALL (1980). 10 jours. Forme galénique : comprimés.

121 Molécule/Association Protocole/Posologie Remarques Sources

10 mg de chloroquine Traitement des immédiatement, puis 6 et individus 18 h plus tard. parasitémiques.

Ensuite : 5 mg de Bonne efficacité si CRANFIELD chloroquine et 1 mg de traitement instauré (2003). primaquine, avant l’apparition quotidiennement pendant des premiers 10 jours. symptômes.

Protocole 3 mg de prophylactique primaquine/manchot/jour instauré sur et 30 mg de l’ensemble d’une chloroquine/manchot/jour. colonie de Au bout de 4 mois de Spheniscus FIX et al. (1988). traitement : passage à 7,5 magellanicus, une mg de fois le diagnostic primaquine/manchot/jour, post mortem établi et arrêt de la chloroquine. pour le premier individu décédé.

100 mg pour Aptenodytes Thérapie instaurée patagonicus, 50 mg pour per os, et ayant Spheniscus humboldti, et permis d’arrêter 25 mg pour Eudyptula l’apparition de FOWLER (1978). Chloroquine minor. nouveaux cas. Une fois par semaine Pas d’effets pendant six semaines. indésirables.

Non précisés. En prophylaxie. GRINER (1983).

Pas d’informations EEP PENGUIN Proguanil En prophylaxie. disponibles. TAG (1995).

1 à 2 mg/kg une fois par En prophylaxie, per Primaquine semaine à une fois par os, d’avril (ou mai) à PETIT (1998). jour. octobre.

En prophylaxie, per TOLLINI et al. 0,75 – 1,0 mg/kg/jour. os, au printemps et (2000). pendant l’été.

122 Molécule/Association Protocole/Posologie Remarques Sources

En prophylaxie.

Diminution du CRANFIELD (2003), EEP 1,25 mg/kg/jour. nombre de décès si administrée au PENGUIN TAG moment du pic (1995). habituel de mortalité.

En prophylaxie, per 10 à 12,5 mg/manchot une Pyriméthamine os, d’avril (ou mai) à PETIT (1998). à deux fois par semaine. octobre.

4 mg de pyriméthamine + En prophylaxie, per Pyriméthamine + 125 mg de sulfadiazine par TOLLINIetal. os, au printemps et Sulfadiazine manchot, une fois tous les (2000). pendant l’été. deux jours.

Traitement des Deux injections à 5 jours Doxycycline individus CHITTY (2006). d’intervalle. parasitémiques.

Doxycycline (ou Pas d’informations Pour la prophylaxie autres tétracyclines BROSSY (1992). disponibles. de longue durée. moins onéreuses)

Un autre protocole thérapeutique a été mis au point par l’équipe vétérinaire du parc américain de Sea World (San Diego, Californie) : il s’agit d’une préparation à base de pyriméthamine et de sulfadoxine appelée « Anti-M ». Les deux molécules sont associées à des compléments minéraux (fer notamment) et vitaminiques. Elle s’administre en prophylaxie, à raison d’un millilitre dans un poisson, deux fois par semaine et aurait diminué de façon significative l’incidence des infections à Plasmodium (autrefois cause majeure de décès) dans le parc (TODD, 1978).

En raison du nombre élevé de morts subites, le traitement en tant que tel ne peut que rarement être mis en place. Il est de plus fréquent de ne pas pouvoir poser de diagnostic sur les manchots vivants, c’est pourquoi les individus anorexiques doivent selon PETIT (1978) être considérés comme suspects et recevoir un traitement. Parfois, l’ensemble de la colonie peut être traité, suite à la déclaration d’un cas, avéré ou supposé (PETIT, 1978).

En ce qui concerne l’efficacité de la thérapeutique, STOSKOPF & BEIER (1979) constatent qu'aucun des manchots du Cap parasitémiques ayant reçu, au cours de leur étude, le traitement à base de chloroquine et de primaquine (Cf. tableau 8) n'a succombé à l'infection. De plus, aucun effet secondaire n'a été remarqué consécutivement à l'emploi des deux molécules sur les manchots. Les individus traités, ayant présenté des symptômes avant la mise en place du traitement, étaient considérés comme gravement malades, mais le traitement a fait disparaître les parasites de la circulation sanguine et tous ont finalement survécu. 123 Cependant, l'efficacité de ces molécules sur les manchots reste discutable : malgré les constations que nous venons de faire, deux individus de l'étude ont présenté un nouvel épisode de parasitémie et ont dû être traités une seconde fois. Le traitement pourrait donc ne pas supprimer toutes les formes du parasite présentes chez l'hôte, même si une autre explication serait que les deux individus en question aient été ré-infectés (STOSKOPF & BEIER, 1979). Plusieurs auteurs ont depuis fait des constats similaires et remettent en cause l’efficacité de l’association chloroquine- primaquine puisque de nouvelles parasitémies peuvent se produire malgré leur administration aux manchots (CRANFIELD et al., 1990 ; FIX et al., 1988 ; GRACZYK et al., 1995a). CRANFIELD (2003) considère d’ailleurs que les chances de succès du traitement sont faibles une fois les premiers signes cliniques apparus. Dans une étude précédente (CRANFIELD et al., 1994), 11 manchots sur 18 avaient présenté un nouvel épisode de parasitémie après un premier traitement à la primaquine et à la chloroquine (ils avaient pourtant été traités dès la détection de la première parasitémie, avant même l’apparition des symptômes). Les auteurs en ont conclu que la thérapie anti-Plasmodium basée sur les schémas thérapeutiques humains repris par STOSKOPF & BEIER (1979) ne permettait pas l'élimination des stades exoérythrocytaires du parasite chez les manchots (CRANFIELD et al., 1994). Moins défaitistes, STOSKOPF & BEIER (1979) y ont vu un avantage, puisque l'existence d'une infection chronique pourrait assurer l'immunisation des individus.

De leur côté, FIX et al. (1988) remettent en cause les posologies utilisées pour le traitement des manchots puisque la pharmacocinétique des molécules en question n’a jamais été étudiée avec précision chez les Sphénisciformes. Ils évoquent également une possible chimiorésistance acquise par les parasites, après avoir constaté l’échec d’une thérapie au long cours à base de primaquine et de chloroquine (FIX et al., 1988), mais cette hypothèse est rejetée par CRANFIELD (2003), qui considère que le risque de voir des résistances apparaître est faible car les oiseaux qui constituent le réservoir de l’infection ne sont jamais traités.

TOLLINI et al. (2000) présentent leur protocole de prévention et de traitement des infections à Plasmodium chez les manchots utilisé avec succès au zoo de San Francisco (le nombre de cas d’infections a diminué année après année suite à sa mise en place). Il consiste en une chimioprévention à base de pyriméthamine et de sulfadiazine (Cf. tableau 8) et une chimiothérapie à base de chloroquine et de primaquine (Cf. tableau 8). La chimioprévention est instaurée au printemps, mais doit être interrompue dix jours avant la saison de reproduction, en raison de la tératogénicité de la pyriméthamine. Il est envisageable de la reprendre une fois les œufs pondus, mais le personnel du zoo de San Francisco préfère ne pas donner de pyriméthamine aux parents qui élèvent des petits en raison de la régurgitation des principes actifs lors du nourrissage des jeunes, qui pourrait causer un surdosage chez ces derniers. Néanmoins, il reste possible de remplacer l’association pyriméthamine-sulfadiazine par la primaquine seule ou associée à la chloroquine (Cf. tableau 8). Dès l’apparition de signes cliniques évocateurs de « malaria » chez un des manchots, celui-ci reçoit immédiatement le protocole de traitement en lieu et place de la chimioprévention (les deux protocoles ne doivent jamais être instaurés en même temps chez un même individu). La qualité des observations quotidiennes et la bonne communication entre les soigneurs du parc sont donc des éléments de première importance à ce stade. Si jamais, pour une quelconque raison, le traitement n’a pas pu être donné, les auteurs recommandent de ne pas doubler la dose suivante, mais de prolonger le protocole thérapeutique. À la fin des dix jours de traitement, il convient de vérifier que le manchot n’est plus malade, puis de le réintégrer à la colonie. À une reprise, l’instauration d’un second traitement de dix jours a été nécessaire pour obtenir une réponse chez un manchot du parc et sur dix-sept cas cliniques déclarés, quatre individus sont décédés immédiatement (avant même l’instauration du traitement), trois sont décédés en dépit du traitement médical (mais ils souffraient tous également d’aspergillose) et dix ont guéri.

124 En cas de refus, de la part d’un manchot, de consommer un poisson contenant des comprimés, il faut l’attraper une fois par jour, afin de le traiter. S’il est compliqué de manipuler quotidiennement le manchot dans son enclos, il est recommandé de le retirer et de le séparer du reste du groupe pendant la durée nécessaire au traitement. Néanmoins, en raison du stress causé par l’isolement, il ne faut surtout pas laisser un manchot seul, c’est pourquoi on prendra soin de placer l’individu malade en compagnie du mâle, ou de la femelle, avec qui il formait un couple. En outre, il est préférable d’administrer des fluides aux malades à qui le traitement a été donné de force ou qui ont présenté des régurgitations. La dose recommandée est de 200 à 300 mL de solution par voie sous-cutanée, une à deux fois par jour, pour un manchot de 2,7 à 5,4 kg (TOLLINI et al., 2000). Une transfusion sanguine (à partir d’un donneur sain, il va de soi) est également envisageable pour les individus dont l’hématocrite est compris dans une fourchette allant de 10 à 20 % (norme de 38,7 à 55,6 % selon les espèces de manchots) et favorise dans ce cas une meilleure réponse au traitement (CRANFIELD, 2003 ; TOLLINI et al., 2000). Par ailleurs, il est parfois préconisé de traiter les individus atteints contre l’aspergillose, de façon concomitante (par exemple : 100 mg de fluconazole par jour et par manchot) en raison du risque accru de développer la maladie pour les individus affaiblis. Une fois le manchot guéri et réintégré au groupe, il faut à tout prix éviter de l’alimenter de force, au risque de le voir refuser tout nourrissage à la main pendant une longue période. Si la reprise de l’alimentation ne se fait pas correctement, il est préférable d’attendre 3 à 4 jours avant de le nourrir de force et de lui administrer des fluides sous-cutanés. Enfin, si le manchot guéri est amaigri ou a perdu du poids à la fin de son traitement, il peut être envisageable de le laisser un peu plus longtemps à l’écart du groupe, afin de s’assurer qu’il soit bien nourri et qu’il prenne du poids (TOLLINI et al., 2000).

c) Prophylaxie médico-sanitaire

(1) Chimioprévention La prophylaxie médicale des infections à Plasmodium des manchots est basée sur la mise en place de traitements préventifs, que nous venons de détailler ci-dessus.

En général, c’est l’existence de cas dans la collection (passés ou non) qui motive la mise en place de la prophylaxie médicale. Ainsi, PETIT (1998) remarque que sur trente zoos européens pour lesquels la maladie n’a jamais été rapportée, seulement quatre ont mis en place une prophylaxie, suite aux conseils d’un vétérinaire consultant. Selon BROSSY (1992), la décision de mettre en place une prophylaxie médicale est indispensable dans les centres de sauvegarde des manchots, tels que le SANCCOB, mais serait plus discutable dans les parcs zoologiques, en raison de contre- indications supposées au maintien, sur le long terme, de la chimioprévention.

D’un autre côté, certains auteurs vont jusqu’à instaurer un protocole ne se limitant pas au seul emploi des anti-paludéens : s’inspirant de constatations faites chez l’homme (pour lequel il semblerait qu’un apport en vitamine B1 diminue la probabilité de se faire piquer en rendant l’hôte plus « amer » aux moustiques), TOLLINI et al. (2000) recommandent de donner un supplément de 750 mg de thiamine aux manchots qui nourrissent des jeunes (aucun effet indésirable n’ayant été constaté avec cette dose).

Quoi qu’il en soit, la mise en place d’un protocole prophylactique ne peut se faire qu’à la seule condition que les manchots soient identifiés et nourris à la main de façon individuelle (PETIT, 1998 ; TOLLINI et al., 2000). Il convient en effet de traiter ces oiseaux comme des individus et non comme une colonie et l’utilisation de boucles posées au niveau des ailerons est recommandée. Pour le nourrissage, il est préférable d’ « entraîner » les manchots à venir manger du poisson tendu à la 125 main pendant la période qui suit la mue et précède la saison de reproduction puisqu’elle représente un moindre stress pour la colonie. Après avoir commencé par attirer les oiseaux les moins farouches, il convient en général de s’armer de patience et de gentillesse pour convaincre les manchots hésitants de venir manger à la main, en gardant à l’esprit qu’un manchot en bonne santé peut jeûner sans problème pendant une semaine. L’emploi de fiches individuelles récapitulant les quantités ingérées par jour, ainsi que les traitements administrés dans le poisson est vivement encouragé (TOLLINI et al., 2000). En outre, il est intéressant de noter que, si les manchots sauvages sont contraints de jeûner pendant leur période de mue, la poursuite d’une alimentation à la main et de la prophylaxie médicale associée est conseillée chez les manchots captifs en mue. En effet, le maintien de l’alimentation permet de garder les individus dans un bon état en limitant l’épuisement des réserves et la prophylaxie trouve tout son intérêt au cours d’une période pendant laquelle les manchots seraient plus sensibles aux infections paludéenne et aspergillaire (Cf. paragraphe I.B.6.e.) (TODD, 1978). Enfin, CRANFIELD (2003) ne préconise pas l’instauration d’un protocole de prophylaxie médicale (puisque les oiseaux ainsi protégés n’acquièrent pas de résistance au parasite), mais, si ce traitement était malgré tout mis en place, il proposerait de le maintenir tout au long de l’année. Tous les auteurs ne semblent pas partager cet avis (Cf. tableau 8).

Un autre moyen, un peu plus invasif, de contrôler l’état sanitaire d’un groupe de manchots vis-à-vis de Plasmodium peut être la réalisation systématique de prélèvements sanguins chez les individus, afin de rechercher le parasite (BROSSY, 1992 ; CRANFIELD, 2003 ; CRANFIELD et al., 1990). Au début des années 1990, un protocole de ce type a été utilisé au zoo de Baltimore, où des frottis sanguins étaient préparés toutes les deux semaines, puis toutes les semaines sur des Spheniscus demersus ne recevant pas de chimioprévention (CRANFIELD, 2003 ; CRANFIELD et al., 1990). Le but était d’obtenir des oiseaux relativement résistants en maintenant une exposition constante au parasite (CRANFIELD, 2003). Dès qu’une parasitémie était notée, l’oiseau recevait le traitement évoqué par CRANFIELD (2003), qui figure dans le tableau 8 de ce document. L’auteur évoque un taux de succès élevé lors de la mise en place de cette stratégie (CRANFIELD, 2003).

(2) Lutte contre les vecteurs Une part importante de la prophylaxie anti-Plasmodium repose sur la lutte contre les moustiques. Si, selon STOSKOPF & BEALL (1980), les manchots hébergés dans des enclos intérieurs (où les vecteurs sont absents) ne sont pas infectés par le parasite, le contrôle des moustiques – et donc de la maladie – s’avère plus difficile en enclos extérieur (BROSSY, 1992 ; STOSKOPF & BEALL, 1980). Une mesure de prévention des infections à Plasmodium serait donc de placer les manchots dans un bâtiment pendant les mois estivaux et de les maintenir dans un environnement frais et contrôlé (GRINER, 1974 ; PETIT, 1998). Néanmoins, PETIT (1998) remarque justement que les enclos dans lesquels sont hébergés les manchots des zoos européens ne sont jamais entièrement couverts. Des mesures environnementales destinées à diminuer les populations de moustiques sont donc nécessaires (BROSSY, 1992 ; PETIT, 1998). Tout d’abord, le choix de l’emplacement de l’enclos est important et il faut préférer un site plutôt frais (PETIT, 1998). Diverses actions peuvent ensuite être envisagées, comme la pulvérisation d’eau ou d’insecticides au-dessus de l’enclos, la limitation des points d’eau stagnante, l’utilisation d’insecticides dans les différents bassins du parc (l’eau de javel ne tue pas les larves de moustiques), la plantation de noyers (réputés pour repousser les moustiques), l’élimination des branches surplombant l’enclos (qui semblent à l’inverse favoriser la présence des moustiques), l’emploi de répulsifs, l’installation de filets à ombre et la mise en place de mesures visant à promouvoir la faune sauvage se nourrissant naturellement de diptères, comme par exemple l’installation de cages munies de perchoirs destinées aux chauves-souris insectivores ( BROSSY, 1992 ; BROSSY et al., 1999 ; PETIT, 1998 ; TOLLINI et al., 2000). En outre, le zoo de San Diego 126 a expérimenté différents systèmes de soufflerie à l’aide de volumineux ventilateurs ou de rideaux d’air mobiles, dont le but était de décourager les moustiques d’entrer dans l’enclos et de se poser sur une paroi ou un sur un manchot (GRINER, 1974).

(3) Immunoprophylaxie Tirant profit de leurs recherches en immunologie anti-paludéenne chez Spheniscus demersus, GRACZYK et al. (1994b) proposent pour leur part de constituer au zoo de Baltimore un groupe de femelles reproductrices sélectionnées pour leur capacité à produire des taux élevés en anticorps anti-Plasmodium, puis de diminuer l’intervalle de temps entre le bêchage des œufs et la première exposition en enclos extérieur, afin de déterminer les doses protectrices en immunoglobulines. L’obtention de poussins immunisés à partir de programmes de reproduction tirant profit des profils sérologiques des individus semblait donc être un objectif clairement affiché pour les auteurs, pourtant, aucune publication n’a dressé le bilan de ce projet et le zoo de Baltimore semble depuis avoir changé de stratégie dans sa lutte contre l’infection.

Un article paru en 2004 présente les premiers résultats d’un essai d’immunisation des manchots du parc à l’aide d’un vaccin obtenu par génie génétique (GRIM et al., 2004). La séquence d’ADN codant la protéine circumsporozoïte (protéine présente en surface des Plasmodium) de l’espèce P. gallinaceum a été isolée à l’aide des amorces 1101 (5’- ATGAAGAAATTAGCCATTTTATC-3’) et 1069 (5’-ATAGCTAAACCTAACGAATTGC-3’) basées sur la séquence publiée du gène chez cette espèce. Le fragment obtenu a ensuite été cloné et amplifié avant d’être inséré dans le vecteur plasmide pcDNAI. Les plasmides ont à leur tour été amplifiés, dans des cultures d’Escherichia coli DH10B transformées, pour obtenir un produit final titrant 0,5 mg d’ADN de plasmide par millilitre de solution phosphate tamponnée (GRIM et al., 2004 ; McCUTCHAN et al., 2004). L’injection du vaccin à ADN à six Spheniscus demersus du parc, à raison de 0,05 mL par voie intradermique (latéralement aux deux yeux) et de 0,05 mL par voie intramusculaire (dans les muscles quadriceps) n’a induit aucune réaction inflammatoire systémique ou locale et son utilisation chez cette espèce a donc été considérée comme sûre. De plus, la vaccination a permis de développer une réponse spécifique en anticorps et de réduire de façon significative l’importance des parasitémies à Plasmodium relictum chez les individus testés (pour lesquels un test ELISA avait préalablement montré qu’ils ne possédaient pas d’anticorps anti- Plasmodium avant la vaccination). Un seul des six manchots vaccinés a effectivement contracté une infection à Plasmodium relictum (contre 60 % des manchots avant l’utilisation du vaccin) et celle-ci n’a pu être détectée que par RT-PCR (et non sur frottis sanguin). L’individu en question n’a pas été traité, n’a présenté aucun signe clinique et l’infection n’a pas persisté plus d’une semaine (GRIM et al., 2004).

Chez les souris et les singes d’expérimentation, l’utilisation de vaccins anti-paludéens à base d’ADN a permis d’induire une réponse immune à la fois cellulaire et humorale, même si l’immunité induite chez les souris était limitée. L’utilisation de ce genre de vaccins représenterait donc un excellent moyen d’initier la réponse immune, avant que celle-ci ne soit relancée et renforcée par une infection naturellement acquise (McCUTCHAN et al., 2004).

Néanmoins, de nouveaux essais sont nécessaires avant la généralisation de l’utilisation du vaccin pour l’immunisation des populations captives de manchots. En effet, les auteurs ont choisi de le tester dans le cadre de vie habituel des manchots, afin de mieux apprécier son efficacité dans les conditions qui seront celles de son utilisation. L’idée était de s’affranchir des contraintes de l’expérimentation en laboratoire, qui – en diminuant toujours au maximum le nombre de variables pouvant influencer les résultats du protocole – ne permet pas de prendre en compte un certain 127 nombre d’éléments environnementaux (écologie des vecteurs, nature et degré de l’exposition à l’agent pathogène, dose infectante inoculée par le moustique, nature et nombre d’oiseaux réservoirs du parasite, génétique des animaux testés) (GRIM et al., 2004 ; McCUTCHAN et al., 2004). En conséquence, la taille de l’échantillon utilisé s’est avérée trop réduite pour une analyse statistique exploitable (GRIM et al., 2004).

De plus, une étude ultérieure fait part de résultats un peu moins probants suite à l’utilisation du même vaccin chez des canaris. En effet, deux des vingt-trois canaris vaccinés (soit 8,6 %) sont morts de « malaria » au cours de l’expérimentation (la mort a été attribuée au parasite lorsque celui- ci a pu être mis en évidence dans le sang périphérique, en association avec une splénomégalie apparente et en absence manifeste d’autres agents pathogènes). Bien que le taux de décès reste significativement inférieur à celui des lots témoins (où il se situe autour de 50 %) l’expérience montre que des décès peuvent se produire même chez des individus vaccinés. Un autre constat étonnant a été fait un an après l’expérimentation proprement dite, en plaçant tous les canaris ayant survécu (vaccinés et témoins) dans le même enclos (exposé aux moustiques). Tous les canaris décédés au cours de ce second été se sont avérés être des individus du lot vacciné l’année précédente, tandis que tous les canaris témoins, ayant naturellement acquis une immunité (un test ELISA l’a montré), ont été pleinement protégés. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que les vaccins à ADN induisent une réponse immunitaire de type cellulaire classe I-dépendante. Les érythrocytes aviaires étant nucléés, ils expriment à leur surface des molécules de classe I et l’on peut présumer que l’utilisation du vaccin provoque la mise en place d’une réponse faisant appel à des lymphocytes CD8+ anti-circumsporozoïte à l’origine de la disparition totale – ou au moins d’une diminution notable – des stades sanguins de l’infection. Cette hypothèse est renforcée par le fait que l’immunité induite chez la souris par les vaccins à ADN est principalement classe I-dépendante, par l’intermédiaire de cellules T CD8+. Une autre hypothèse consisterait à distinguer l’exposition aux sporozoïtes de la maladie symptomatique : les canaris vaccinés (exposés à 1 kilomètre des témoins la première année) pourraient avoir été confrontés au parasite sans avoir pour autant acquis d’immunité suffisamment protectrice en raison de l’absence possible de la « maladie » sur leur site d’hébergement (McCUTCHAN et al., 2004).

Les perspectives entrouvertes par ces premières études restent toutefois encourageantes et il est envisageable que la vaccination permette à terme de diminuer la quantité de Plasmodium présente chez les moustiques, de même que les quantités inoculées et le taux de mortalité, puisque la protéine circumsporozoïte est exprimée à la surface des stades sexués du parasite. Les anticorps anti-circumsporozoïte pourraient ainsi bloquer le développement du protozoaire chez le vecteur et la vaccination d’une seule partie de chaque colonie captive de manchots assurer une protection pour l’ensemble du groupe. Ceci est une conséquence bénéfique du concept d’« immunité troupeau » permis par l’utilisation d’un vaccin de ce type (GRIM et al., 2004 ; McCUTCHAN et al., 2004). Cependant la diminution de la charge parasitaire affectant l’acquisition d’une immunité naturelle, l’introduction du vaccin dans des zones d’endémie pourrait aggraver la situation la saison suivante (McCUTCHAN et al., 2004) ou nécessiter un rappel annuel (CRANFIELD, 2003).

128 DEUXIEME PARTIE : EXEMPLE DU ZOO DE LA PALMYRE, HISTORIQUE ET GESTION DES EPISODES DE MORTALITE DUE A PLASMODIUM CHEZ LES SPHENISCIFORMES

129

130 II. Deuxième partie : Exemple du zoo de La Palmyre, historique et gestion des épisodes de mortalité due à Plasmodium chez les Sphénisciformes

A. Présentation du zoo de La Palmyre

Le parc zoologique de La Palmyre est une structure privée créée en 1966 par Irène et Claude Caillé. En un peu plus de quarante ans, la petite entreprise familiale a su se développer pour devenir, avec plus de 700 000 visiteurs annuels, le zoo privé le plus visité de France. Profitant d’un site de 14 hectares, le zoo héberge actuellement 1600 animaux (mammifères, oiseaux, et reptiles) et emploie une cinquantaine de personnes à l’année, auxquelles s’ajoutent quarante-cinq saisonniers chaque été. En plus des soigneurs animaliers et du personnel administratif le parc compte un vétérinaire permanent, ainsi que des électriciens, des plombiers, des serruriers, et des jardiniers. Les saisonniers, eux, sont responsables des commerces et des points de restauration du parc.

En ce qui concerne les animaux hébergés sur le site, leur consommation annuelle est d’environ 250 tonnes de fourrage, 70 tonnes de paille, 50 tonnes de viande, 20 tonnes de poisson, 180 tonnes de fruits et légumes frais, 30 tonnes d’aliments composés, et 10 tonnes de graines diverses. La plupart de ces denrées alimentaires sont fournies par des exploitants ou négociants locaux et le zoo possède également des élevages de grillons, poussins, et rongeurs, afin de satisfaire l’appétit de certains oiseaux, primates, ou reptiles.

Notons également que la reproduction est bonne, voire excellente, puisque la quasi-totalité des espèces présentes sur le site se reproduit, pour une moyenne annuelle d’environ 250 naissances. C’est notamment le cas pour des espèces menacées, comme le guépard (Acinonyx jubatus) ou le tamarin lion doré (Leontopithecus rosalia) et seuls les rhinocéros blancs (Ceratotherium simum) font exception à cette règle, en dépit des efforts incessants mis en oeuvre pour faire reproduire cette espèce. En outre, le zoo possède une nurserie qui, en cas de besoin, peut prendre le relais des animaux pour l’incubation des œufs ou l’élevage des jeunes (COURCELLE, 2003). B. Bilan des infections à Plasmodium chez les manchots du parc

1. Présentation des Sphénisciformes hébergés à La Palmyre

Les premiers Sphénisciformes accueillis au zoo de La Palmyre furent un groupe de quatre gorfous sauteurs (Eudyptes chrysocome) arrivés en mars 1985 en provenance de Ravensden (Royaume-Uni). Quatre mois plus tard, la collection s’enrichissait d’une nouvelle espèce puisque dix manchots du Cap (Spheniscus demersus) originaires d’Amsterdam furent transférés à La Palmyre, avant d’être rejoints (en mars 1987) par vingt manchots de Magellan (Spheniscus magellanicus) et dix nouveaux gorfous sauteurs venus du Chili.

131 Dès lors, les arrivées n’ont plus concerné que les manchots du Cap et de Magellan. Les gorfous sauteurs, qui ne se sont jamais reproduits à La Palmyre, ont fini par disparaître de la collection. En revanche, des naissances ont pour la première fois été enregistrées chez les manchots du Cap le 2 janvier 1989, puis chez les manchots de Magellan le 27 mai 1991. Ces derniers ne figurent néanmoins plus dans la collection, suite au départ de huit individus en janvier 1995, et au décès des trois spécimens restant au cours des mois qui suivirent.

En tout et pour tout (chiffres arrêtés au 31 août 2007), le zoo de La Palmyre aura hébergé 14 gorfous sauteurs, 19 manchots de Magellan et 131 manchots du Cap, soit un total de 164 manchots. Le groupe, longtemps limité à une vingtaine de têtes, compte aujourd’hui une quarantaine de Spheniscus demersus (Cf. figure 15), depuis que la mortalité, principalement due à Aspergillus (cultures positives à A. fumigatus et A. flavus) et Plasmodium, a baissé au point de ne plus obérer la croissance de l’effectif. Les naissances, en effet, s’élèvent en moyenne à 8,2 par an entre 2002 et 2006 et sont en hausse au cours des trois dernières années (5 en 2004, 8 en 2005, et 12 en 2006).

132 Figure 15 : photographie d’un Spheniscus demersus du zoo de La Palmyre

(© Florence Perroux)

Pour ce qui est des conditions d’hébergement des manchots au zoo de La Palmyre, ceux-ci sont accueillis dans un enclos entièrement en extérieur, qui a pour objet de reproduire au mieux leur environnement naturel (cet enclos figure au numéro 7 du plan du zoo disponible sur la figure 16 ci- après). Ainsi, vingt nids y ont été creusés dans le sable, à l’abri du soleil, selon la forme et les dimensions des nids naturels (court couloir rectiligne, puis petite niche, d’un côté ou de l’autre du couloir). Bien évidemment, un plan d’eau est disponible afin que les manchots puissent nager (Cf. figure 17).

Un schéma de l’enclos faisant notamment figurer la position des nids est disponible en annexe 9 de ce document. Notons la présence d’un petit parc, séparé du reste de l’enclos par une grille, et qui sert à accueillir les juvéniles ou des individus malades devant être facilement identifiés et manipulés (Cf. figure 17 et annexe 9).

Par ailleurs, signalons également que tous les manchots de la collection sont identifiés individuellement par un implant électronique (généralement inséré au niveau des muscles de l’aile), et que Spheniscus demersus est une espèce pour laquelle il existe un programme européen d’élevage 133 (coordonné par Janos Szantho, du zoo d’Amsterdam), qui régit la reproduction au niveau continental et auquel le zoo de La Palmyre participe.

Les conditions d’hébergement permettent l’existence d’une reproduction annuelle depuis quelques années, mais certains nids n’ont cependant jamais été utilisés par les manchots (nids 1, 2, 14, 15, 16, 17, 18, et 19 du plan figurant en annexe 9).

134 Figure 16 : plan légendé du zoo de La Palmyre

(Les lettres L indiquent les points d’eau dans lesquels des larves de moustiques ont été retrouvées le 7 juin, Cf. infra.)

135 Figure 17 : photographie de l’enclos des manchots au zoo de La Palmyre

(© Florence Perroux)

2. Historique des infections à Plasmodium chez les manchots du parc

Il est intéressant de se plonger dans les registres des animaux du zoo de La Palmyre, puisque l’hypothèse d’une infection à Plasmodium pourrait être retenue – plus ou moins raisonnablement – pour plusieurs décès précis, survenus à la fin des années 1980, avant même la confirmation histologique des premiers cas d’infection paludéenne chez les Sphénisciformes du zoo et en dépit d’un certain nombre d’informations manquantes (les éléments de suspicion sont figurés en gras):

• un gorfou sauteur est mort le 30 septembre 1985 (soit à la fin de l’été, quelques mois seulement après son arrivée) sans que la cause du décès n’ait été déterminée.

• un rapport d’autopsie de manchot (espèce non précisée) par la Direction Départementale des Services Vétérinaires de La Rochelle daté du 10 octobre 1985 évoque des lésions d’hydropéricardite, d’hépatomégalie et de pleurésie bilatérale avec hépatisation des lobes pulmonaires.

• un manchot de Magellan et un gorfou sauteur sont décédés au cours du mois de mars 1987. Le registre évoque comme cause de la mort un « parasitage », sans donner plus de précisions.

136 • huit des vingt manchots de Magellan arrivés à La Palmyre en avril 1988 sont décédés au cours des mois de juillet et août de la même année. Une congestion pulmonaire a été rapportée dans les huit cas, mais seulement trois rapports d’autopsie détaillés sont disponibles. Ils signalent tous l’existence d’œdèmes sous-cutanés, d’une rate légèrement hypertrophiée et pulpeuse, ainsi qu’un œdème et un emphysème pulmonaires. Dans un cas, ces lésions sont associées à un œdème intra-thoracique.

• l’examen post mortem d’un manchot (espèce non précisée) a révélé une péricardite associée à une congestion pulmonaire, une hépatite, et un œdème sous-cutané. Le compte-rendu est daté du 11 août 1988 et l’examen portait sur un individu décongelé.

• deux manchots du Cap décédés au cours de l’été 1989 ont présenté des lésions compatibles avec une infection paludéenne à l’examen nécropsique. Le premier était né à La Palmyre le 2 janvier de la même année (première saison d’exposition) et présentait une péricardite exudative (associée à un amaigrissement et un abcès le long de l’intestin grêle). Le second, arrivé quelques mois plus tôt d’Amsterdam, était âgé de 17 mois (première saison d’exposition sur le site de La Palmyre) et présentait un hydropéricarde, une splénomégalie (rate pulpeuse) ainsi qu’un œdème sous-cutané.

L’arrivée de Thierry Petit au poste de vétérinaire en juin 1989 a toutefois permis d’améliorer le suivi individuel et d’instaurer un véritable archivage des données relatives à la mortalité des animaux du parc avec, pour chaque spécimen décédé, l’existence d’un rapport d’autopsie complet et détaillé. Le recours à des analyses histologiques quasi systématiques est un autre élément important qui a contribué à établir les premiers diagnostics d’infections à Plasmodium.

Le tableau 9 ci-dessous récapitule l’ensemble des décès de manchots pour lesquels le diagnostic de « paludisme » peut être considéré comme acquis, en raison de la mise en évidence directe des parasites, ou, à défaut, de la présence de lésions extrêmement caractéristiques à l’autopsie. Sont précisées quelques informations épidémiologiques, lésionnelles, et histologiques pertinentes. Notons l’absence fréquente de symptômes, ou, dans les autres cas, le caractère fruste de la phase clinique, souvent limitée à des épisodes d’anorexie.

137 Tableau 9 : cas avérés d’infection paludéenne chez les manchots du zoo de La Palmyre

Individu numéro Date Symptôme(s) d’identification Espèce du Traitement(s) Lésions / histologie Remarques interne à décès éventuel(s) l’établissement) Isolement de Œdème ± verdâtre des tissus Clostridium conjonctifs et de la cavité perfringens dans Spheniscus 11/04 Pas de symptômes générale. #539 le tissu demersus 1991 observés. Foie friable. conjonctif, le foie, les reins et Pneumonie. le poumon. Œdème sous-cutané jaunâtre à verdâtre ± coagulé. Œdème de la cavité générale et des sacs aériens. Trophozoïtes mis en évidence Hépatomégalie. sur un frottis Congestion et œdème (± sanguin post coagulé) pulmonaires. mortem. #562 Spheniscus 25/08 Pas de symptômes (Cf. figure 19) Manchot né au magellanicus 1991 observés. zoo et mort à Œdème péricardique. l’âge de trois Splénomégalie + rate boueuse. mois (première (Cf. figure 19) saison d’exposition). Cellules réticulo-endothéliales riches en Plasmodium dans le foie, le poumon, la rate, et le rein. Œdème verdâtre au niveau de La veille du décès : la cavité générale. refus de manger le soir, bec parfois Œdème pulmonaire sévère. Manchot mort ouvert au cours de la Liquide ± verdâtre dans la 29 jours après respiration. cavité péricardique. son arrivée au Traitement à la zoo, pour sa Spheniscus 27/07 Splénomégalie + rate friable. #1815 NIVAQUINE® sous première saison demersus 1995 forme de comprimés Parasites « compatibles avec d’exposition, à (25 mg de Plasmodium » visualisés dans l’âge de trois chloroquine par jour) le poumon et le foie. mois et vingt- depuis plus d’une Infiltration inflammatoire neuf jours. semaine au moment polymorphe mais du décès. essentiellement mononuclée de la rate.

138 Individu numéro Date Symptôme(s) d’identification Espèce du Traitement(s) Lésions / histologie Remarques interne à décès éventuel(s) l’établissement) Œdème thoracique. Décès après cinq (Cf. figure 18) jours consécutifs de Manchot mort traitement à la Œdème de l’ensemble du 36 jours après NIVAQUINE® sous tractus respiratoire. son arrivée au forme injectable (20 zoo, pour sa Œdème péricardique. Spheniscus 02/08 mg de chloroquine première saison #1806 demersus 1995 par jour) car retrouvé Splénomégalie + rate friable. d’exposition, à à l’écart de la l’âge de huit Nombreux parasites visualisés colonie. mois et vingt- dans le foie, la rate, et le deux jours. Anorexie le jour du poumon, en association avec

décès. une inflammation subaiguë marquée Œdème verdâtre dans la cavité Ne recevait pas générale. de NIVAQUINE®. Hépatomégalie + coloration Manchot mort 5 rose clair du foie. mois après son Spheniscus 10/08 Pas de symptômes #1731 Œdème verdâtre des poumons. arrivée au zoo demersus 1995 observés (première saison Liquide verdâtre dans la cavité d’exposition à péricardique. La Palmyre), à Splénomégalie sévère + rate l’âge d’un an et pulpeuse. huit mois. Décès après cinq Œdème cœlomique. Manchot mort jours consécutifs de Hépatomégalie + coloration 62 jours après traitement à la pâle du foie. son arrivée au #1804 Spheniscus 27/08 NIVAQUINE® sous zoo, pour sa demersus 1995 forme injectable (20 Œdème pulmonaire. première saison mg de chloroquine Œdème péricardique. d’exposition, à par jour) car épisode l’âge de neuf d’anorexie. mois et un jour. Épisode d’anorexie 27 jours avant le décès, apparemment Manchot mort résolu en neuf jours Œdème au niveau de la cavité 60 jours après suite à un traitement générale. son arrivée au d’au moins une zoo, pour sa Spheniscus 29/08 Foie rose pâle. #1809 semaine à la première saison demersus 1995 NIVAQUINE® (20 Œdème pulmonaire. d’exposition, à mg de chloroquine l’âge de dix Œdème péricardique. par jour). mois et quatre Anorexie à nouveau jours. notée la veille du décès.

139 Individu numéro Date Symptôme(s) d’identification Espèce du Traitement(s) Lésions / histologie Remarques interne à décès éventuel(s) l’établissement) Amaigrissement. Œdème thoracique. Entérite (muqueuse rouge et épaissie).

Foie de couleur pâle. Manchot né à La Congestion et œdème Palmyre l’année Spheniscus 28/06 Pas de symptômes précédente, et #2269 pulmonaires. demersus 1999 observés mort à l’âge de Épanchement péricardique. un an, sept mois, Splénomégalie + rate molle. et cinq jours. Présence de Plasmodium dans le poumon, le foie, la rate, le myocarde, le rein, et l’intestin. Confirmation par le service de parasitologie du M.N.H.N. Œdème sous-cutané ventral et verdâtre. Œdème de nombreux organes abdominaux, ainsi que des séreuses et des sacs aériens. Trachée contenant un liquide Manchot né au limpide. zoo et mort au cours de sa Spheniscus 10/07 Pas de symptômes Œdème verdâtre en surface, première saison #2717 demersus 2000 observés masquant un oeème aigü des d’exposition, à poumons. l’âge de sept Splénomégalie + rate molle. mois et vingt- deux jours. Présence de Plasmodium dans le poumon, le foie, la rate, les muscles squelettiques, le myocarde, et l’intestin. Confirmation par le service de parasitologie du M.N.H.N.. Œdème des sacs aériens et des séreuses. Mucus épais dans la cavité buccale. Œdème gélatineux et verdâtre Manchot né au en surface des poumons. zoo et mort au cours de sa Spheniscus 07/08 Pas de symptômes #2737 Épanchement péricardique. première saison demersus 2000 observés Splénomégalie + rate très d’exposition, à molle. l’âge de six mois et neuf jours. Présence de Plasmodium dans le poumon, le foie, la rate, et l’intestin. Confirmation par le service de parasitologie du M.N.H.N..

140 Comme précisé dans le tableau, certaines lames histologiques ont été relues par le personnel du service de « parasitologie comparée, modèles expérimentaux » du M.N.H.N., avec qui nous avons collaboré pour la partie expérimentale de nos travaux (Cf. troisième partie de ce document). En effet, les comptes-rendus des analyses histologiques concernées n’étaient pas toujours suffisamment précis (« protozoaires rappelant le genre Plasmodium », «éléments parasitaires rappelant des schizontes »), et le recours au M.N.H.N. a permis d’établir avec certitude la présence de parasites du genre Plasmodium chez les manchots concernés.

Figure 18 : photographie post mortem du manchot du Cap #1806, après ouverture de la cavité générale

(©Thierry Petit)

Notons la présence de l’œdème gélatineux et très légèrement verdâtre qui englobe le cœur et les poumons, et recouvre les parois des sacs aériens. Des lésions tout aussi caractéristiques ont été mises en évidence au cours de la plupart des examens nécropsiques pratiqués sur les manchots du parc ayant succombé à une infection paludéenne.

141 La figure 19 est un cliché réalisé lors de l’autopsie du manchot de Magellan #562, décédé en août 1991, et illustrant, après leur retrait de la cavité générale, l’aspect œdémateux des poumons.

Figure 19 : photographie de l’appareil respiratoire profond du Spheniscus magellanicus #562, une fois retiré de la cavité générale

(©Thierry Petit)

La figure 20 est un cliché réalisé à partir d’une coupe histologique de la rate du même manchot, et montre un méronte de Plasmodium.

142 Figure 20 : photographie d’une coupe histologique de la rate du Spheniscus magellanicus #562 (coloration de May-Grünwald-Giemsa, grossissement x 100)

(©Carole Xavier)

La flèche indique un méronte exoérythrocytaire de Plasmodium.

À l’ensemble des cas avérés que nous venons d’évoquer, se sont encore ajoutés deux cas suspects en juillet 1991. Ils ont concerné un manchot de Magellan et un manchot du Cap, âgés respectivement de 4 ans et 4 mois au moment de leur décès. Les deux individus ont succombé sans présenter de symptômes et quelques lésions ont été constatées à l’autopsie (congestion hépatique et muscles noirs pour le manchot de Magellan ; foie hypertrophié, mou et de couleur noire, reins clairs et friables pour le manchot du Cap). Les comptes-rendus des analyses histologiques réalisées à l’époque n’ont pas rapporté la présence du parasite, mais seulement l’existence d’un infiltrat inflammatoire lympho-plasmocytaire dans le foie du manchot de Magellan, ainsi que des pigments d’hémosidérine dans la rate et le foie du manchot du Cap. Néanmoins, après relecture des lames, les pathologistes ont admis dans un second temps que certaines images pouvaient évoquer la présence du parasite dans le foie du manchot de Magellan et que les pigments d’hémosidérine aperçus chez le manchot du Cap pouvaient être des schizontes de Plasmodium. Nous n’avons cependant pas pu nous procurer les lames ou les coupes d’organes en question pour les faire relire par le M.N.H.N., et – laissant une part au doute – nous considérerons ces cas comme suspects.

Il y a eu 10 cas avérés d’infection à Plasmodium chez les Sphénisciformes du parc, soit un taux de mortalité minimal (ne prenant pas en compte les cas suspects) de 6,1 % (10/164) pour

143 l’ensemble des manchots accueillis à La Palmyre. Toutefois, en raison du nombre élevé de cas suspects à fortement suspects, le taux réel de mortalité due à Plasmodium pourrait être bien plus élevé (en considérant les 17 cas suspects comme autant de cas avérés, on obtiendrait un taux de mortalité légèrement supérieur à 16 % pour la fourchette haute de notre estimation).

En ce qui concerne la létalité, il nous est impossible d’en donner ici une estimation précise, pour deux raisons :

• il n’existe pas à La Palmyre de recherche systématique de parasites ou d’anticorps anti-Plasmodium sur les individus apparemment sains (comme c’est notamment le cas au zoo de Baltimore).

• le diagnostic d’infection paludéenne a toujours été posé après le décès des animaux, en raison – notamment – de l’absence de signes cliniques chez tous les manchots décédés de paludisme. Un individu infecté par Plasmodium pourrait avoir survécu à l’épisode paludéen et récupéré sans montrer de signes de faiblesse (ou des signes trop discrets pour être perçus). Il aurait donc pu ne pas être comptabilisé parmi les manchots infectés.

Quoi qu’il en soit, les infections à Plasmodium demeurent une cause majeure de mortalité au sein des colonies de manchots hébergées depuis plus de vingt ans au zoo de La Palmyre. Comme l’illustre le tableau 9, les jeunes individus ont été touchés en masse (7 individus sur 10 avaient moins moins d’un an au moment de leur décès), très fréquemment au cours de leur première saison d’exposition au parasite (8 individus sur 10 sont morts au cours de leur première saison d’exposition à La Palmyre).

Les lésions mises en évidence au cours des autopsies effectuées par Thierry Petit se sont quasiment toujours avérées caractéristiques – voire pathognomoniques – de l’infection, notamment en ce qui concerne la présence d’un œdème jaune-verdâtre généralisé.

3. De l’existence supposée d’infections chez des espèces autres que les Sphénisciformes

Le 3 décembre 2004, un des flamants du Chili (Phoenicopterus chilensis) de la collection du parc décédait à l’âge de 3-4 mois. L’examen nécropsique ne révéla aucune lésion pouvant expliquer la mort de l’animal, mais le compte-rendu des analyses histologiques évoqua la présence, dans les cellules de Küpffer, de « petits corps basophiles, arrondis, qui peuvent soit résulter de la destruction des noyaux des hématies, soit correspondre à la présence de parasites intracytoplasmiques de type Malaria ». Par ailleurs, une hémosidérose marquée du foie et de la rate fut observée sur les lames, tandis qu’aucune image histologique ne permit d’apporter plus de renseignements quant à la cause possible du décès.

Quelques années auparavant, des éléments évocateurs de Plasmodium avaient déjà été visualisés chez un individu sain, suite à une recherche parasitaire de routine effectuée à la faveur d’une manipulation sur certains flamants (aucune trace de ces examens n’est disponible aujourd’hui).

Ces cas soulevèrent la question de l’existence d’infections à Plasmodium chez des oiseaux du parc autres que les Sphénisciformes. De plus, deux autres cas plus ou moins similaires – toujours chez Phoenicopterus chilensis – furent notés en 2006 :

144 • Le premier concernait un flamant né en juillet 2005, décédé le 18 avril suite à un bref épisode d’anorexie et d’affaiblissement. L’autopsie avait révélé une aérosacculite et une cholécystomégalie, tandis que l’analyse histologique évoquait la présence – dans le cytoplasme de certains hépatocytes et des cellules de Küpffer – d’éléments protozoaires cylindriques associés à une hémosidérose marquée et compatibles avec une « malaria » aviaire.

• Le second concernait un flamant né également en juillet 2005, décédé le 18 octobre, le lendemain d’une intervention chirurgicale orthopédique. L’autopsie avait révélé un œdème pulmonaire évocateur d’une infection paludéenne (poumons recouverts d’une masse gélifiée), hypothèse confirmée par l’analyse histologique, puisque des parasites évoquant le genre Plasmodium avaient été observés dans le cytoplasme des macrophages et des cellules endothéliales du poumon, en association avec une hémosidérose hépatique.

Il n’existe toutefois qu’une seule description – récente – d’infection à Plasmodium chez des phœnicoptériformes et il s’agit de la seule hémosporidie jamais décrite dans cet ordre (PEIRCE, 2005). Nous avons donc souhaité vérifier le diagnostic en profitant de notre collaboration avec le M.N.H.N., à qui nous avons fait parvenir les coupes histologiques réalisées par les deux laboratoires d’anatomie pathologique contactés au moment des trois décès suspects. L’avis des parasitologues du Muséum est sans appel : les flamants en questions n’étaient pas infectés par Plasmodium. L’hypothèse la plus probable serait une confusion de la part des anatomo-pathologistes avec des amas d’hémosidérine. Reste le cas du flamant qui aurait été infecté de façon bénigne par le parasite, pour lequel – répétons-le – il n’existe plus aucune trace des prélèvements effectués.

Aucun autre cas d’infection par le parasite n’ayant été suspecté – ou constaté – chez les espèces aviaires du parc, il est vraisemblable que les oiseaux autres que les Sphénisciformes ne sont pas infectés par Plasmodium à La Palmyre, ou le sont de façon totalement bénigne. C’est – entre autres - ce que nous avons voulu vérifier au cours de notre étude expérimentale. Nous renvoyons donc le lecteur à la partie correspondante pour plus d’informations à ce sujet (Cf. troisième partie : étude expérimentale). C. Dispositif de lutte mis en place

1. Prophylaxie médicale anti-paludéenne

Plusieurs protocoles de prophylaxie médicale ont été mis en place à La Palmyre, depuis les premières confirmations histologiques de cas d’infections à Plasmodium chez les manchots du parc.

La première molécule utilisée a été la chloroquine, à la posologie de 25 mg par manchot, sous forme de comprimés (NIVAQUINE®) que le zoo se procurait auprès de la pharmacie la plus proche. Néanmoins, la chloroquine a rapidement été abandonnée en raison de l’échec constaté lors de son emploi en prophylaxie. En outre, elle a également été utilisée sous forme injectable, dans un but thérapeutique cette fois-ci (seule, puis en association avec la primaquine – selon le protocole mis au point au zoo de Baltimore, Cf. tableau 8), mais la nécessité contraignante de se la procurer auprès d’un centre hospitalier et les résultats, une nouvelle fois décevants, expliquent que la chloroquine ne soit plus du tout utilisée aujourd’hui.

À partir du mois de juin 1999, une deuxième molécule, la primaquine, a été utilisée pour prévenir l’infection suite à de nouveaux décès de manchots infectés par Plasmodium. Tous les individus du groupe ont été traités à raison d’un tiers de comprimé à 15 mg de primaquine base 145 (26,3 mg de phosphate de primaquine) – soit 5 mg par manchot – une fois par semaine pendant tout l’été. Le protocole a ensuite dû être interrompu en raison de l’épuisement du stock de primaquine pour finalement reprendre au printemps suivant. Néanmoins, la primaquine présentait un inconvénient majeur, à savoir sa disponibilité : pour se la procurer, le zoo de La Palmyre devait en importer des Etats-Unis ou du Royaume-Uni. L’autre inconvénient de taille concernait son prix, surtout lorsqu’elle provenait d’outre-Manche (compter 161,70 £ hors taxes et hors frais de port pour une boîte de 100 comprimés). De plus, un nouveau constat d’inefficacité de la prophylaxie a été fait au cours de l’été 2000 et la primaquine a été délaissée, au même titre que la chloroquine, pour être remplacée en août 2000 par la pyriméthamine.

À l’heure actuelle, tous les manchots hébergés au zoo de La Palmyre sont donc systématiquement soumis à une prophylaxie médicale à base de cet inhibiteur de la dihydrofolate réductase. La pyriméthamine a été choisie en raison de sa disponibilité, de son faible coût, et de son efficacité pour prévenir les infections paludéennes. Les manchots la reçoivent sous forme de comprimés (MALOCIDE® 50) donnés deux fois par semaine (en général le mardi et le vendredi) au cours de la période à risque. Le protocole est instauré au début du mois d’avril, pour se terminer à la fin du mois de novembre.

Comme nous l’avons évoqué au cours de notre étude bibliographique (Cf. paragraphe I.B.7.c.) la mise en place d’une telle prophylaxie ne peut se faire sans l’existence d’un contact privilégié entre les soigneurs animaliers et les manchots, qui passe par un nourrissage à la main de tous les individus de la colonie.

Ainsi, les jeunes manchots nés au zoo de La Palmyre sont rapidement pris en charge par les soigneurs de la nurserie : dès l’âge de quarante à quarante-cinq jours, ils sont retirés du nid où ils étaient jusqu’alors élevés par leurs parents, pour être placés dans le petit parc qui leur est destiné (Cf. annexe 9), après avoir été pesés et identifiés (pose d’une puce électronique, ainsi que d’une bague de couleur s’il y a plusieurs jeunes à reconnaître). Les juvéniles isolés ne sont alors plus alimentés par les adultes et reçoivent une alimentation à base de poisson (les premiers jours, il s’agit de sprats -Sprattus sprattus- pesant une quinzaine de grammes). Néanmoins, ils peuvent garder un certain contact avec leurs parents puisque le petit parc n’est séparé du reste de l’enclos que par une petite barrière grillagée haute d’environ 55 cm. Par ailleurs, les nourrissages ne sont mis en place qu’une demi-journée après l’isolement des manchots, en raison du stress provoqué par la manipulation. La quantité administrée est ensuite adaptée au poids de l’animal :

• 15 % du poids en quatre repas quotidiens pour les individus qui pèsent moins de 2,2 kg,

• 15 % du poids en trois repas quotidiens pour les individus qui pèsent entre 2,2 kg et 2,6 kg,

• 10 % du poids en deux repas quotidiens pour les individus qui pèsent plus de 2,6 kg.

Parallèlement à l’apprentissage du nourrissage à la main, les jeunes manchots reçoivent un premier traitement dès leur arrivée dans le petit parc :

• enrofloxacine (BAYTRIL® 2,5 %) : 5 mg/kg per os par jour pendant cinq jours,

• itraconazole (ITRAFUNGOL® 10 mg/mL) : 10 mg/kg per os par jour pendant dix jours,

146 • compléments vitaminiques et minéraux : MAZURI ZOO FOODS® FISH EATER TABLETS 852000, à raison d’un demi-comprimé par jour.

Ce traitement a pour but de limiter l’apparition de maladies diverses plus ou moins ciblées (aspergillose et infections bactériennes notamment) suite au stress provoqué par la manipulation.

Dès le début du mois d’avril, et quel que soit leur âge, les manchots sont soumis au traitement anti-paludéen. Un quart de comprimé de MALOCIDE® 50 (soit 12,5 mg de pyriméthamine) est placé dans chaque poisson et les manchots sont nourris un par un avec un poisson (maquereau – Scomber scombrus – ou hareng – Clupea harengus), soit un dosage de 12,5 mg de pyriméthamine par manchot.

La figure 21 suivante est un montage des photographies illustant le traitement des manchots du parc, à l’aide de comprimés de MALOCIDE® donnés dans du maquereau.

Figure 21 : photographies illustrant le traitement au MALOCIDE® des manchots du zoo de La Palmyre

(©Antoine Leclerc)

Néanmoins, il faut préciser que tous les manchots de la colonie ne sont pas forcément traités lors de chaque nourrissage avec les poissons contenant la pyriméthamine. En effet, certains individus (en général une demi-douzaine) se trouvent dans les nids au moment où le soigneur arrive, et ils ne sont pas dérangés pour être nourris de force. Il s’agit principalement d’adultes qui reçoivent la plupart du temps la pyriméthamine lors du traitement suivant (il est rare qu’un manchot se trouve deux fois de suite dans un nid au moment où le soigneur arrive pour donner le traitement). 147 2. Lutte contre les moustiques

La lutte contre les moustiques au zoo de La Palmyre a été instaurée en 1991, suite à la confirmation des premiers cas d’infection paludéenne chez les manchots. Le 25 septembre de cette année, trois démoustiqueurs de L’Entente Interdépartementale de Démoustication (E.I.D.) sont venus dresser un bilan de la présence des diptères sur le site et ont instauré les premières mesures de lutte, dont certaines sont encore en vigueur actuellement.

Le premier protocole de lutte anti-moustiques reposait sur l’utilisation d’un insecticide à base de chlorpyriphos-éthyl, le PIRIDUR® 1g, sous forme de granulés à répandre dans l’eau des sanitaires, ainsi que sur deux préparations à base de bacilles, à pulvériser en surface des points d’eau : SPHERIMOS® (Bacillus sphaericus), pour le traitement des puisards et regards ainsi que VECTOBAC® (Bacillus thurigiensis) pour le traitement des sites présentant une certaine végétation (plans d’eau des ibis rouges, des pélicans et des cigognes, numéros 36 et 52 de la figure 16).

Ce protocole a ensuite été abandonné en 2006, au profit de la seule utilisation du VECTOBAC WG®.

La plupart des bassins du parc ne sont pas traités puisqu’ils sont régulièrement vidés (au moins une fois par semaine, et jusqu’à une fois par jour). En effet, la durée de développement des larves de moustiques est fonction de la température, mais s’avère rarement inférieure à sept jours.

À l’inverse, les puisards et regards sont régulièrement traités puisqu’ils représentent des points d’eau stagnante. Le produit utilisé (VECTOBAC® WG) se présente sous la forme de granulés dispersibles dans l’eau et contenant 37,4 % de Bacillus thurigiensis sérotype H14 ( = israelensis), une bactérie qui provoque la mort des larves de moustiques. Il titre 3 000 U.T.I. par milligramme et est utilisé toutes les deux semaines à raison de 200 g par puisard inacessible et 200 g pour 5 litres d’eau en pulvérisation sur les regards et autres points d’eau. Les sanitaires ainsi que les puisards situés à proximité des zèbres de Grévy et des grues Antigone (numéros 35 et 50 de la figure 16) sont eux traités avec un kilogramme de poudre. La liste complète des puisards et regards accessibles au zoo de La Palmyre figure aux annexes 10 et 10’ de ce document.

Par ailleurs, certains plans d’eau facilement accessibles sont beaucoup moins fréquemment (voire pas du tout) vidés, notamment en raison de leur taille. C’est le cas des bassins entourant les îles de certains primates (gibbons, gorilles, chimpanzés), de la mare des rhinocéros, du plan d’eau de la plaine africaine, du bassin des ibis rouges (numéros 12, 59, 35, 52, et 36 de la figure 16), ainsi que de trois plans d’eau situés en dehors du parcours actuel de visite. Pour empêcher le développement des larves de moustiques dans ces eaux, des gambusies (Gambusia affinis) ont été introduites en 2006. Ces poissons, originaires des Etats-Unis d’Amérique, ont en effet la particularité de se nourrir de larves de moustiques et présentent l’avantage de s’adapter facilement à différents milieux.

Deux cas particuliers font également exception. Le plan d’eau des perroquets, à proximité de l’enclos des macaques (numéro 62 de la figure 16) est vidé tous les 10 à 15 jours et n’est traité que lorsque des larves de moustiques sont visibles, tandis que la cascade des flamants, près du bar (numéro 69 de la figure 16) fonctionne en circuit fermé, est vidée tous les deux mois environ et n’est jamais traitée.

148 Enfin, les plans d’eau situés à l’extérieur du parc, mais à proximité de certains enclos, notamment ceux des rhinocéros et des macropodes (numéros 42 et 43 de la figure 16) sont régulièrement contrôlés et traités par l’E.I.D.

L’efficacité de la démoustication peut être estimée grâce à la recherche de larves de moustiques effectuée – suite à notre demande et en vue de recueillir des informations pour notre travail – par l’E.I.D. le 7 juin 2007. La technique est simple et consiste à recueillir un peu d’eau dans une petite bassine à fond blanc, afin de mettre facilement en évidence les larves ou les nacelles d’œufs. Une première visite – à l’origine de la mise en place du protocole de lutte – avait rapporté, le 25 septembre 1991, la présence de larves de plusieurs espèces, dont Culex pipiens et d’adultes du genre Aedes. En 2007, des stades larvaires ont pu être mis en évidence dans un des bassins non traités situé en dehors du parc proprement dit, mais près d’un parking et à ce titre propriété du zoo (3 à 4 larves par bassine). Pour ce qui est des bassins situés dans l’enceinte-même du parc, des larves – probablement du genre Culex – ont été visualisées dans les bassins des capucins à poitrine jaune (4 à 5 par bassine), et des makis vari (une cinquantaine par bassine), autour du bâtiment de la singerie (numéros 27 et 30 de la figure 16). Ces deux bassins avaient été vidés six ou sept jours avant l’inspection de l’E.I.D., qui a eu lieu après deux jours consécutifs de forte chaleur, et celui des capucins comportait également quelques nacelles de 200 à 400 œufs. À titre plus anecdotique, des stades peu évolués ont été mis en évidence en faible quantité dans le bassin des aras (numéro 62 de la figure 16). Les autres points d’eau accessibles du parc ont tous été inspectés, mais aucune larve n’a pu y être mise en évidence. Ceci est notamment surprenant en ce qui concerne le grand bassin entourant les îles des gibbons de Gabrielle, des gorilles, et des chimpanzés (numéro 12 de la figure 16), qui n’est jamais vidé, ni traité, et reçoit les eaux en provenance des bassins de la singerie (évoqués ci-dessus) lorsqu’ils sont vidés. Des prélèvements ont pourtant été effectués à l’endroit où l’eau des autres bassins vient s’y jeter. La présence des gambusies, ainsi que de jeunes tortues de Floride (en grand nombre dans ces eaux) pourrait expliquer l’absence de larves. En ce qui concerne la cascade des flamants (numéro 69 de la figure 16), l’absence de larves est probablement due au flot permanent des eaux.

En outre, nous avons également « capturé » quelques spécimens adultes de moustiques dans l’enceinte du parc, et les avons fait parvenir au M.N.H.N. pour une diagnose d’espèce. Si le nombre d’échantillons envoyés fut très faible (3-4 adultes et autant de larves), le résultat mérite toutefois d’être considéré avec intérêt. Toutes les larves sont du genre Culex (pas de détermination de l’espèce précise) et tous les adultes de l’espèce Culex pipiens. CRANFIELD et al. (1990) citent notamment cette espèce comme étant l’un des vecteurs de Plasmodium au zoo de Balimore.

Néanmoins, il convient de considérer les informations évoquées ci-dessus ainsi que les conclusions que nous avons formulées avec circonspection. En effet, les vecteurs de Plasmodium à La Palmyre n’ont toujours pas été identifiés de manière précise or la transmission du parasite dépend dans une large mesure de l’efficacité vectorielle du diptère qui varie selon l’espèce de moustique impliquée. Une identification précise de l’insecte en cause (via un protocole de capture et une recherche du parasite), croisée avec un certain nombre de données biologiques qui lui sont relatives (rayon d’action, conditions optimales de développement, espérance de vie, volume de sang absorbé lors d’un repas, intervalle entre les repas, nombre d’oiseaux piqués et/ou nombre de repas du vecteur au cours de son existence, quantité de sporozoïtes injectés lors d’une piqûre, etc…) permettrait de mieux apprécier le risque et de mettre en place les mesures les plus appropriées pour protéger les oiseaux hébergés sur le parc vis-à-vis de ce danger spécifique. Le constat apparent – mais néanmoins flagrant – que la population de moustiques vivant dans l’enceinte du parc est limitée ne suffit pas à garantir l’efficacité de la maîtrise du risque lié au vecteur, notamment si l’efficacité vectorielle de ce dernier est élevée. 149 D. Évolution et perspectives

Le protocole prophylactique actuellement en place au zoo de La Palmyre semble donner des résultats plutôt satisfaisants puisque la mortalité due aux infections à Plasmodium chez les manchots du parc a sensiblement diminué au cours de ces dernières années. Néanmoins, nous ne pouvons pas affirmer que le risque infectieux est réellement maîtrisé, notamment en raison de la prise plus ou moins aléatoire des comprimés de pyriméthamine, de l’absence de preuve scientifique de son efficacité chez les manchots de La Palmyre, du manque cruel d’informations sur la gestion du risque lié à la présence du vecteur, et de l’absence d’identification d’un réservoir aviaire.

L’efficacité de la transmission vectorielle est une notion qui a été bien étudiée, notamment dans une publication récente s’intéressant à l’arbovirose West Nile (FOPPA & SPIELMAN, 2007). Les auteurs y évoquent un certain nombre de paramètres pouvant influencer l’intensité de la transmission de l’agent infectieux, en s’appuyant sur un modèle mathématique initialement développé pour l’étude du paludisme humain. Selon ce modèle, le « nombre de reproduction » R0 (qui permet de caractériser la transmission, celle-ci étant d’autant plus efficace que R0 est supérieur m a2 d pn b b à 1) est égal à la fraction m h , où m représente le ratio moustique-hôte, a le taux de −ln p piqûres d’une femelle moustique, d la durée de l’infection chez l’homme, p la probabilité quotidienne de survie des moustiques, et n la durée de la période d’incubation extrinsèque (temps entre le repas sanguin contaminé et l’infection). Les paramètres de transmission bm et bh quantifient respectivement la €probabilité de transmission du parasite d’un moustique infecté à un être humain sensible, et d’une personne infectée à un moustique. Dans le cas du virus West Nile, les auteurs évoquent d’autres paramètres pouvant améliorer l’efficacité de la transmission : un taux de mortalité élevé (sous certaines conditions) des oiseaux constituant le réservoir de l’infection, l’existence d’une association spatiale stable entre le moustique et les réservoirs, l’absence d’autres sources de sang pour le moustique (la situation inverse ayant un effet prophylactique connu dans le cas du paludisme humain), et la possibilité pour le moustique d’augmenter le nombre de repas sanguins par oiseau lorsque le ratio moustique-hôte augmente. L’application de tels modèles aux infections à Plasmodium des oiseaux (et – pourquoi pas – au cas précis de La Palmyre) serait riche en enseignements et permettrait de mieux apprécier l’importance de la lutte contre les moustiques.

Ne disposant pas à l’heure actuelle de moyens plus performants pour limiter les infections et leurs conséquences, Thierry Petit ne voit pas, pour le moment, de raison de modifier le protocole déjà en place. Cependant, l’apparition de nouveaux outils prophylactiques pourrait changer la donne d’ici quelques années. Ceci pourrait être le cas du vaccin actuellement mis au point aux Etats-Unis (Cf. paragraphe I.B.7.c.), dans l’hypothèse d’une commercialisation de celui-ci et si des preuves de son efficacité venaient consolider les premières constatations, relativement encourageantes à court terme.

150

TROISIÈME PARTIE : ÉTUDE EXPÉRIMENTALE

151 152 III. Troisième partie : Étude expérimentale

A. Intérêts et objectifs de l’étude

Nous venons d’évoquer, au cours des deux premières parties de ce travail, l’importance considérable des infections à Plasmodium au sein des populations de manchots, notamment dans les parcs zoologiques, et plus précisément au zoo de La Palmyre, où le parasite a été incriminé dans un certain nombre de cas, avec plus ou moins de certitude.

Les manchots du Cap hébergés au zoo de La Palmyre appartiennent à une espèce dont les populations continuent à diminuer dans leur milieu naturel, et l’on comprend l’importance de la préservation des populations captives, au sein des parcs zoologiques.

Thierry Petit s’est vivement intéressé, dès son arrivée à La Palmyre, à la fin des années 1980, aux infections à Plasmodium, qui constituaient un véritable fléau pour les manchots de la collection. Au moment d’entamer notre collaboration sur ce sujet, nous avons donc jugé opportun de compléter le travail de synthèse bibliographique et notre étude rétrospective de cas par une étude expérimentale visant à mieux cerner l’épidémiologie de l’infection au sein du zoo. Nous avons également reçu le soutien des chercheurs du service de « Parasitologie comparée, modèles expérimentaux » du Muséum National d’Histoire Naturelle dont le rôle précis au cours de cette étude sera explicité au paragraphe III.B.2.

Les objectifs multiples de nos expérimentations ont nécessité la mise en œuvre de plusieurs protocoles expérimentaux.

• La première expérience a porté sur les manchots du parc. Le but était de rechercher le parasite chez tous les individus de la colonie, plusieurs fois au cours d’une même année, afin d’estimer qualitativement et quantitativement l’infection des manchots par Plasmodium et – éventuellement – de mettre en évidence des variations saisonnières. Pour ce faire, des frottis sanguins ainsi que des prises de sang sur EDTA ont été effectués à trois reprises, de novembre 2006 à juillet 2007. L’examen des frottis avait pour but la mise en évidence directe des hémosporidies, tandis que le sang récolté sur EDTA a permis de mettre en œuvre une recherche moléculaire de l’ADN parasitaire, via la P.C.R. Parallèlement à cela, des organes (foie, rate, poumon, rein, et cœur) ont été prélevés au cours des examens nécropsiques des manchots décédés pendant l’année, en vue de constituer un stock de prélèvements utilisable en cas de besoin pour étudier la phase tissulaire.

• La deuxième expérience a consisté à rechercher Plasmodium chez d’autres espèces d’oiseaux appartenant à la collection du parc, afin de dresser un état des lieux un peu plus large de l’infection au sein du zoo. Une fois encore, des frottis ont été réalisés, ainsi que des prises de sang sur EDTA. La recherche du parasite a été effectuée à l’aide des mêmes techniques que lors de la première expérience. Cependant nous avons été limités dans ce travail par la nécessité d’éviter au maximum le dérangement des oiseaux au moment de la saison de reproduction. Les prélèvements sanguins ont donc été restreints à quelques espèces. Pour certaines d’entre elles, les prélèvements n’ont été effectués qu’au cours d’examens nécropsiques suite au décès de certains individus. 153 • La troisième expérience s’est intéressée à des espèces aviaires sauvages et commensales, qui ont élu domicile dans l’enceinte du parc. L’objectif était de déterminer quelles espèces d’oiseaux pouvaient jouer le rôle éventuel de réservoir de l’infection à La Palmyre. Pour cela, des individus appartenant à des espèces considérées comme nuisibles ont été capturés, prélevés, puis sacrifiés, tandis que d’autres ont été prélevés soit de leur vivant (oiseaux retrouvés au sol, affaiblis ou agonisants), soit après leur décès (cadavres retrouvés dans le parc). Le choix de la nature des prélèvements (sang pour frottis ou sur EDTA, organes) s’est fait en fonction des cas de figure évoqués à l’instant et de l’état général des oiseaux (par exemple : pas de prise de sang sur des petits passereaux très affaiblis, voire en état de choc). Une analyse moléculaire des séquences parasitaires retrouvées chez les espèces fortement infectées a été conduite dans l’espoir de mettre en évidence des similitudes de séquence avec celles retrouvées chez les manchots du parc (première expérience).

• La quatrième expérience a été mise en œuvre suite à la découverte, par le personnel du parc, d’une portée abandonnée de 12 canetons Anas platyrhynchos au milieu du mois de mai 2007. Nous les avons recueillis, élevés, et avons profité de l’occasion pour prélever une fois par mois une goutte de sang pour effectuer un frottis jusqu’au milieu du mois d’août 2007. Le but était de suivre la parasitémie éventuelle chez les canetons (dans l’hypothèse d’une infection par Plasmodium) pour se faire une idée de l’âge auquel ils s’infectent ou des variations de la charge parasitaire au cours de la croissance, et, le cas échéant, de comparer leur taux de prévalence à celui des adultes prélevés dans le cadre de la troisième expérience. B. Animaux, matériels et méthodes

1. À La Palmyre

a) Première expérience Les prélèvements sanguins sur les manchots du Cap (Spheniscus demersus) ont été effectués aux cours de trois interventions échelonnées de novembre 2006 à juillet 2007. Dans le but de diminuer le nombre de manipulations et de limiter le stress dans la colonie, deux de ces interventions ont été couplées avec la vaccination contre l’influenza aviaire, le 16 novembre 2006 et le 4 mai 2007. La vaccination du 16 novembre 2006 ne concernant que cinq individus en bas âge, seuls ces animaux ont été prélevés à cette date. En revanche, l’ensemble des individus de la colonie a été prélevé au cours des deux manipulations suivantes, le 4 mai et le 25 juillet 2007. Par ailleurs, quelques prélèvements surnuméraires ont pu être effectués à d’autres dates, au cours d’interventions sur des individus malades qui ont finalement décédé. Les prélèvements ont été effectués par Thierry Petit et moi-même, avec – à l’occasion de la vaccination contre l’influenza – l’aide de quelques soigneurs animaliers du zoo et de Jean-Marc Chavatte, du M.N.H.N.

Quelques dixièmes de millilitre de sang ont été recueillis dans des seringues contenant environ 0,01mL d’EDTA, par ponction de la veine jugulaire droite, du plexus veineux coccygien, ou d’une veine de la patte (veine digitale ou veine métatarsienne plantaire) (Cf. figure 22). Ces prélèvements, destinés aux analyses de biologie moléculaire, ont été effectués le 16 novembre 2006 (5 individus), le 4 mai 2007 (ensemble de la colonie), et au cours d’interventions diverses sur des individus malades en 2007. Certains d’entre eux ont été directement acheminés au M.N.H.N. tandis

154 que d’autres ont été immédiatement congelés à -18°C, puis envoyés au M.N.H.N. de façon groupée, à une date ultérieure.

Les frottis sanguins, eux, ont été réalisés sur place, conformément à la technique décrite par VALKIUNAS (2005, Cf. paragraphe I.A.12.a. de ce document), en double exemplaire pour chaque individu, au cours des différentes séances d’intervention (i.e. le 16 novembre 2006, le 4 mai et le 25 juillet 2007, ainsi que lors des interventions ponctuelles sur les individus malades). Immédiatement séchés à l’air libre (par agitation pendant quelques minutes), ils ont été envoyés le plus rapidement possible au M.N.H.N., où ont été effectuées les étapes de fixation, coloration, et enfin lecture des lames (Cf. paragraphe III.B.2. ci-dessous).

Figure 22 : photographies illustrant la réalisation des prélèvements chez Spheniscus demersus

(© Florence Perroux)

(1) identification du manchot (lecture du transpondeur) ; (2), (3), (4), (5) réalisation des ponctions sanguines, au niveau du plexus veineux coccygien (3), ou d’une veine digitale (4) – le sang est recueilli dans des seringues contenant de l’EDTA (5) ; (6) boîtes de rangement pour les frottis sanguins, prélèvements sanguins sur EDTA ; (7) identification des frottis sanguins.

155 Enfin, des prélèvements d’organes (foie, rate, poumon, rein, et cœur) pour examen histologique ont été effectués lors des autopsies des individus décédés au cours de la période d’étude. Ces fragments d’organes ont été immédiatement fixés dans du fixateur de Carnoy (60 % d’éthanol absolu, 30 % de chloroforme, et 10 % d’acide acétique), et envoyés au M.N.H.N.

En tout et pour tout, 45 manchots figurent dans cette étude et tous ont été prélevés au moins à deux reprises (sang et/ou organes). 186 frottis sanguins ont été effectués (93 prélèvements en double exemplaire), et nous avons récolté 51 échantillons de sang sur EDTA, ainsi que 6 prélèvements d’organes. Un inventaire colligeant des informations relatives à chacun des manchots de l’étude est disponible en annexe 11. La nature et les dates des prélèvements effectués dans le cadre de la première expérience sont récapitulées dans l’annexe 12.

N.B. : au cours de cette étude, les manchots ont été identifiés à l’aide des quatres derniers chiffres (ou dernières lettres) de leur transpondeur, et non par leur numéro d’identification interne (système utilisé pour l’identification des manchots décédés à La Palmyre dans la deuxième partie de ce travail). Le document présenté en annexe 11 permet d’établir la correspondance entre les 2 systèmes d’identification.

b) Deuxième expérience Les prélèvements ont ici intéressé d’autres espèces d’oiseaux en présentation au zoo de La Palmyre. Comme nous l’avons déjà évoqué, nous avons été limités dans notre travail par la nécessité de respecter les oiseaux au moment de la saison de reproduction (qui correspondait en théorie à la période la plus intéressante pour conduire notre étude, puisque les vecteurs réapparaissent, leur population augmente, et l’apparition de jeunes, très réceptifs à l’infection, permet une diffusion rapide du parasite, Cf. pararaphe I.A.7.b.). Une fois encore, les manipulations ont parfois été calquées sur le protocole vaccinal contre l’influenza aviaire afin de limiter les interventions. Les prélèvements ont été effectués par Thierry Petit et moi-même, avec – à l’occasion de la vaccination contre l’influenza – l’aide de quelques soigneurs animaliers du zoo et de Jean- Marc Chavatte, du M.N.H.N. Seuls les flamants de Cuba (Phoenicopterus ruber), les flamants du Chili (Phoenicopterus chilensis), les ibis falcinelles (Plegadis falcinellus), les ibis de Ridgway (Plegadis ridgwayi), et les ibis rouges (Eudocimus ruber) ont pu être prélevés en nombre relativement important. Pour les autres espèces, quelques prélèvements ont été effectués, au cours d’interventions sur des animaux malades. La nature des prélèvements, leur réalisation, ainsi que leur conservation (sang sur EDTA) sont en tout point similaires à ce que nous avons décrit dans le cadre de la première expérience (Cf. paragraphe III.B.1.a.). L’annexe 13 récapitule l’ensemble des informations relatives aux prélèvements effectués dans le cadre de la seconde expérience.

95 oiseaux appartenant à 11 genres et 14 espèces ont été prélevés. 218 frottis sanguins ont été préparés (109 prélèvements en double exemplaire), et nous avons récolté 109 échantillons de sang sur EDTA, ainsi que 13 prélèvements d’organes.

c) Troisième expérience

(1) Espèces nuisibles Deux espèces déclarées nuisibles en Charente-Maritime ont été étudiées dans le cadre de la troisième expérience : la pie bavarde (Pica pica) et la corneille noire (Corvus corone corone). Conformément à la législation en vigueur (Cf. annexe 14), des dispositifs de capture faisant 156 intervenir des appelants ont pu être utilisés, sous la responsabilité d’un piégeur agréé (en l’occurrence Mr Marc Perrot), et suite à l’obtention d’une autorisation de piégeage pour l’année 2007 auprès de la mairie des Mathes (17570, Charente-Maritime), commune dont dépend le zoo (Cf. annexe 15).

Le principe de la technique de piégeage utilisée repose sur l’agressivité et la territorialité marquées des corvidés, surtout autour de la période de reproduction : un appelant (individu appartenant à l’espèce que l’on souhaite piéger) est placé dans une cage fermée adjacente à d’autres loges. Ces dernières sont ouvertes vers l’extérieur et possèdent un dispositif de balancier qui, lorsqu’un oiseau y pénètre, entraîne la chute d’un volet grillagé et la fermeture de la cage.

À la vue d’un appelant conspécifique, la plupart des pies ou corneilles (mâles ou femelles) réagissent par un comportement agoniste qui les pousse à chercher une porte d’entrée à sa cage. Les oiseaux finissent donc par pénétrer dans une des loges adjacentes (puisqu’elles seules sont ouvertes) et se retrouvent piégés. Dans le cas des pies, nous avons utilisé un piège circulaire formé de quatre loges de piégeage entourant celle de l’appelant (Cf. figure 23), tandis que dans le cas des corneilles, le piège utilisé possédait 2 loges de capture (plus grandes) situées de part et d’autre de celle de l’appelant. Le déplacement des pièges à différents sites dans l’enceinte du parc nous a permis d’accéder au territoire d’un nombre important de corvidés et d’optimiser le rendement de la capture. Par ailleurs, nous avons également veillé à placer le piège dans des endroits bien visibles par les oiseaux, souvent sur le toît des bâtiments.

157 Figure 23 : photographie du piège à pies, en présence de l’appelant

(©Antoine Leclerc)

Les captures ont eu lieu du 12 avril au 8 mai 2007 et du 13 mai au 20 juin 2007, respectivement pour les pies et les corneilles. Une fois piégés, les oiseaux ont été récupérés, identifiés (coupe de plumes et/ou pose de bagues) et placés pendant quelques jours dans une volière située entre les numéros 58 et 65 du plan présenté en figure 16, afin d’augmenter la probabilité de détecter chez eux une parasitémie à Plasmodium (la capture constitue un stress qui lui-même provoque en quelques jours une intensification de la parasitémie). Les prélèvements n’ont donc été effectués que 3 à 5 jours après la capture. Une goutte de sang récoltée à la patte (après section aux ciseaux de l’extrémité de la griffe) a permis la réalisation des frottis sanguins (toujours en deux exemplaires pour chaque individu), tandis que 0,2 à 1 mL de sang ont été systématiquement récoltés à la veine alaire ou au niveau du plexus veineux occipital, dans des seringues contenant quelques gouttelettes d’EDTA. Les pies et les corneilles ont ensuite été systématiquement sacrifiées par injection de quelques dixièmes de millilitre de T 61® (produit euthanasique à base d’embutramide, d’iodure de mébézonium, de chlorhydrate de tétracaïne, et de diméthylformamide). Des prélèvements d’organes (poumon, foie, rate, rein et cœur) ont été réalisés post mortem et conservés 158 dans du fixateur de Carnoy. La nature des prélèvements, leur réalisation, ainsi que leur conservation (sang sur EDTA congelé à -18°C) sont en tout point similaires à ce que nous avons décrit dans le cadre de la première expérience (Cf. paragraphe III.B.1.a.).

Notons ici que certaines pies ont réussi à ôter leur bague pendant leur séjour dans la volière, et qu’une pie a réussi à s’en échapper, ce qui a entraîné quelques incertitudes sur les identités et sur les dates de prélèvements. Les annexes 16 et 17 récapitulent l’ensemble des informations relatives aux prélèvements effectués sur les pies bavardes (Pica pica) et les corneilles noires (Corvus corone corone).

Les captures ont été interrompues lorsque leur rendement a chuté, en raison d’une diminution de la densité des oiseaux de l’espèce concernée sur le parc, et/ou d’une diminution du comportement territorial des corvidés, qui – rappelons-le – est saisonnier. Au total, les prélèvements effectués chez les pies et les corneilles correspondent à 94 frottis sanguins (47 prélèvements en double exemplaire), 34 échantillons de sang sur EDTA, ainsi que 36 prélèvements d’organes.

(2) Espèces non nuisibles En plus des pies et des corneilles, des oiseaux appartenant à d’autres espèces commensales ont pu être prélevés au zoo de La Palmyre pendant la période d’étude, soit de leur vivant (oiseaux retrouvés au sol, affaiblis ou agonisants), soit après leur décès (cadavres retrouvés dans le parc). Les oiseaux prélevés de leur vivant ont été relâchés immédiatement après la réalisation des prélèvements, ou au bout de quelques jours, en fonction de leur état général. La nature des prélèvements a varié selon les conditions dans lesquelles ils ont été effectués (notamment en fonction de l’état général et de la taille des oiseaux), mais les techniques utilisées, ainsi que les méthodes de conservation sont en tout point similaires à ce que nous avons décrit dans le cadre de la première expérience (Cf. paragraphe III.B.1.a.).

L’annexe 18 récapitule l’ensemble des informations relatives aux prélèvements effectués sur les espèces commensales autres que les pies et les corneilles.

Soixante-six individus appartenant à 21 genres et 21 espèces autres que Pica pica et Corvus corone corone ont donc été prélevés dans le cadre de la troisième expérience. 82 frottis sanguins ont été réalisés sur ces oiseaux (41 prélèvements en double exemplaire), ainsi que 22 échantillons de sang sur EDTA et 52 prélèvements d’organes. Notons la présence dans cette étude de 14 canards colverts (Anas platyrhynchos), 11 tourterelles turques (Streptopelia decaocto), 9 pigeons ramiers (Columba palumbus), 6 moineaux domestiques (Passer domesticus), 4 merles noirs (Turdus merula), et 4 poules d’eau (Gallinula chloropus). Les autres espèces sont moins représentées.

d) Quatrième expérience Les 12 canetons (Anas platyrhynchos) ont été recueillis le 11 mai 2007. Deux sont décédés rapidement (les 12 et 15 mai) sans que la cause de leur mort n’ait été identifiée Les dix autres ont été élevés un peu plus d’un mois dans un bâtiment (sous lampe chauffante), puis déplacés le 17 juin 2007 dans une volière située près du numéro 17 sur le plan présenté en figure 16. Des frottis sanguins ont été effectués à quatre reprises, à intervalles d’environ un mois (le 16 mai, le 15 juin, le 15 juillet, et le 17 août). Notons que deux canetons se sont échappés de la volière le 12 juillet, et n’ont été prélevés qu’à deux reprises. Comme précédemment, les frottis ont tous été effectués en double exemplaire, soit un total de 72 frottis pour cette expérience.

159 2. Au M.N.H.N.

Les travaux que nous allons décrire ci-après ont été effectués par Jean-Marc Chavatte (étudiant en Master), en collaboration avec le Pr Irène Landau – pour l’analyse morphologique – et Georges Snounou (directeur de recherche) – pour l’analyse moléculaire – au service de « Parasitologie comparée, modèles expérimentaux » du M.N.H.N.

a) Frottis sanguins Dès leur réception, les frottis sanguins ont été fixés (par immersion dans du méthanol à 100 %), puis immédiatement colorés (coloration de Giemsa à 10 % dans un tampon phosphate à pH = 7,2 pendant une heure). Les lames ont ensuite été lues au microscope optique (grossissement x 400, sans immersion, puis grossissement x 1000, sous immersion) et les parasitémies estimées sur un plan semi-quantitatif.

b) Sang sur EDTA Les érythrocytes aviaires étant nucléés, donc riches en ADN chromosomique, le sang des échantillons a été dilué pour réaliser une extraction de l’acide nucléique dans de bonnes conditions et selon un protocle classique. Dans un premier temps, les cellules ont été lysées, et les protéines dégradées par la protéinase K. Puis l’ADN a été isolé sur colonne et précipité par l’éthanol. Le kit d’extraction utilisé a été le QIAamp® DNA Mini Kit, selon deux protocoles (« Tissue Protocol », et « Blood and Body fluid Spin Protocol ») dont l’un est prétenté en exemple en annexe 19 de ce document.

L’ADN extrait a été polymérisé par P.C.R. Chacune des concentrations des éléments du mélange a été préalablement testée de manière obtenir des conditions optimales pour l’expérimentation. De même la température d’hybridation, définie en fonction de la température de fusion des oligomères, a été optimisée par plusieurs essais sur le thermocycleur. Une fois le mélange P.C.R. réalisé et aliquoté, 1 µL de la solution d’ADN extrait a été ajouté dans chaque tube, puis les tubes ont été placés dans le thermocycleur et le programme sélectionné (température, durée, et nombre de cycles adéquats) a été mis en route. En règle générale les P.C.R. ont comporté 25 à 30 cycles. Les amorces utilisées ont servi à amplifier le gène ssrRNA 18S (gène codant la petite sous- unité ribosomale) de Plasmodium. Elles sont représentées sur la figure 24 ci-après. Des P.C.R. nichées ont été effectuées, en amplifiant un premier segment à l’aide des amorces rPLU1 et rPLU5, puis d’autres fragments, plus petits, à l’aide des couples d’amorces rPLU1/rPLU2, rPLU3/rPLU4, et rPLU6/rPLU5. Notons qu’il s’agit là d’amorces amplifiant l’ADN de tous les Plasmodium, et qu’elles ne sont pas spécifiques des espèces du parasite à tropisme aviaire. Les autres amorces représentées sur la figure 24 n’ont pas (ou peu) été utilisées, à l’exception des oligonucléotides AvPl-AF, AvPl-BF, AvPl-CF, AvPl-DF, AvPl-EF, et AvPl-FF, qui sont des amorces spécifiques de certaines séquences parasitaires retrouvées chez les pies et les corneilles de la troisième expérience (Cf. paragraphe III.C.3.).

160 Figure 24 : schéma du gène ssrRNA 18S de Plasmodium, et localisation des amorces utilisées lors des P.C.R.

N.B. : « rc » = « reverse complement », en effet, toutes les séquences sont données en partant de la base 1, situé à gauche du schéma, soit de gauche à droite, même si elles polymérisent l’ADN de droite à gauche.

Par ailleurs, certains oligonucléotides ont été dessinés à partir de séquences obtenues chez les pies bavardes et corneilles noires capturées à La Palmyre (Cf. paragraphe III.C.3.).

L’électrophorèse sur gel d’agarose à 1 ou 2 % a ensuite permis de séparer les ADN en fonction de leur poids moléculaire, et de les comparer avec des marqueurs ADN de poids et de longueur connus.

L’ADN a ensuite été purifié à partir du gel, à l’aide du kit QIAquick® Gel Extraction Kit, dont le protocole d’utilisation est fourni en annexe 20. Les séquences amplifiées et purifiées ont été clonées, à l’aide du kit TOPO TA Cloning®. Afin d’obtenir des brins finalisés (c’est-à-dire possédant un A terminal, indispensable au clonage), la dernière étape d’élongation a été prolongée de 20 minutes, ou un nouveau cycle a été effectué. Une fois la finalisation des produits P.C.R. accomplie, ceux-ci ont été incorporés au vecteur (plasmide pCR®4-TOPO®, contenant un gène de résistance à l’ampicilline, Cf. annexe 21). Les bactéries Escherichia coli One Shot TOP10®,

161 fournies dans le kit pour réaliser la transformation par choc thermique, ont été transformées par le vecteur AmpiR, puis sélectionnées par culture sur un milieu contenant de l’ampicilline.

Le criblage (qui avait pour but de vérifier que les colonies sélectionnées grâce à l’ampicilline avaient bien intégré le plasmide contenant le gène d’intérêt) s’est fait par P.C.R. avec les oligonuclétotides M13 qui sont spécifiques du plasmide. Les souches positives ont été cultivées dans un milieu liquide contenant de l’ampicilline.

La purification des plasmides a ensuite été entreprise à l’aide du kit QIAprep® Spin Miniprep Kit Using a Microcentrifuge.

Une digestion enzymatique a été effectuée, dans le but de vérifier la présence du plasmide contenant le gène d’intérêt. Le plasmide utilisé possédait deux sites de restriction à l’enzyme EcoR I (Escherichia coli restriction I) de part et d’autre de la zone d’insertion (Cf. annexe 21). L’utilisation de cette enzyme a donc permis d’isoler les fragments insérés. Après migration de la préparation sur un gel, la taille des inserts a pu être appréciée.

La dernière étape, a consisté à séquencer l’ADN des plasmides purifiés (séquençage effectué à l’institut Cochin). Pour optimiser la fiabilité du séquençage, chaque fragment a été envoyé en double exemplaire, et la lecture effectuée dans les deux sens. L’obtention d’une zone de recouvrement du gène a permis d’effectuer les corrections nécessaires, sachant que la lecture de la séquence soumise est fiable jusqu’à environ 700 bases d’un seul tenant. Les logiciels utilisés pour la lecture du gène et les comparaisons ont été BioEDIT®, ApE®, SeqED® et Gene Jockey 2®. Une fois les séquences déterminées, celles-ci ont été comparées à d’autres séquences (à l’aide d’un « Basic Local Alignment Search Tool », ou ensemble d’algorithmes permettant de comparer la séquence obtenue aux séquences déjà publiées) de Plasmodium. Des zones spécifiques ont été repérées, dans le but de fabriquer de nouveaux oligonucléotides, et ainsi de déterminer facilement et rapidement si les séquences isolées étaient retrouvées chez d’autres individus (Cf. figure 24).

c) Prélèvements d’organes Les prélèvements utilisés pour une analyse histologique ont été inclus dans des blocs de paraffine et coupés en tranches de 5 µm d’épaisseur par un microtome. Les lames ont ensuite été déparaffinées, puis une différenciation a été effectuée selon le protocole acétone-toluène / colophane. La coloration des lames s’est faite avec du colorant de Giemsa (40 minutes à une heure), puis celles-ci ont été lues au microscope optique (grossissements x 20 et x 400, sans immersion, puis grossissement x 1000, sous immersion).

En raison d’une charge importante de travail liée à l’ensemble de cette étude, peu de lames histologiques ont été lues au M.N.H.N. (notamment en ce qui concerne des individus appartenant à des espèces chez lesquelles peu – ou pas – de parasites avaient été mis en évidence dans le sang). En conséquence certains oiseaux dont seuls les organes avaient été prélevés à La Palmyre ne figureront pas dans l’analyse des résultats de notre étude. C. Résultats

1. Première expérience

Tous les frottis sanguins effectués sur les manchots de La Palmyre ont été lus au M.N.H.N., et une analyse moléculaire par P.C.R. a été entreprise pour chacun des individus du groupe. 162 L’annexe 22 récapitule les résultats individuels et nominatifs obtenus dans le cadre de la première expérience.

Aucun Plasmodium n’a pu être visualisé chez Spheniscus demersus au cours de cette expérience, que ce soit sur les 186 frottis sanguins effectués sur l’ensemble de la colonie, ou dans les organes prélevés chez six individus.

En ce qui concerne la recherche moléculaire d’ADN de Plasmodium, elle avait dans un premier temps été entreprise à l’aide des amorces rPUN-S et rPUN-E, puis rPUN-S et rPUN-IR (Cf. figure 24), mais les résultats ainsi obtenus ne se sont pas avérés satisfaisants (nombreuses et volumineuses bandes, y compris dans la colonne « no template », témoin négatif correspondant à une P.C.R. sans ADN).

Les couples d’amorces rPLU1/rPLU5, puis rPLU1/rPLU2 et rPLU6/rPLU5 et rPLU1/rPLU5, puis rPUN-IF/rPLU5 (réactions nichées) ont donc été utilisés dans un second temps, mais les résultats obtenus ont été négatifs.

L’utilisation des amorces rPLU1/rPLU5, puis rPLU3/rPLU4 a donné des résultats négatifs pour sept manchots (5545, 5916, 4212, 28ED, 1532, 5952, et 5401). En revanche, leur utilisation ultérieure sur d’autres Spheniscus demersus (F142, BA14, 093E, 1597, 3817, 6373, 3071, et 041B) a donné trois réponses positives (manchots F142, 1597, 6373), ainsi que deux réponses douteuses (manchots 093E et 3817). La figure 25 est une photographie du gel d’électrophorèse après migration des produits de la P.C.R.

163

Figure 25 : photographie du gel d’électrophorèse, après migration des produits P.C.R. obtenus à l’aide des amorces rPLU1/rPLU5 puis rPLU3/rPLU4, chez huit Spheniscus demersus

Les bandes entourées par un trait continu correspondent aux résultats positifs des manchots, les bandes entourées par un trait discontinu aux résulats douteux. Les colonnes correspondant aux manchots sont étiquetées par les lettres « SD », suivies du numéro individuel (quatre derniers caractères du transpondeur). « Pf 300 » : Plasmodium falciparum à 300 parasites par microlitre (témoin positif), « NT1 » : No Template (témoin négatif sans ADN), « M » : marqueur – les bandes obtenues correspondent (de bas en haut) à des fragments de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200 et 1500 bases.

Les amorces rPLU1/rPLU5 puis rPLU1/rPLU2 et rPLU6/rPLU5 ont ensuite été utilisées sur les manchots ayant donné des réponses positives (F142, 1597, 6373) dans le but d’obtenir de plus longs fragments d’ADN (comme le montre la figure 24, le segment amplifié à l’aide des amorces rPLU3 et rPLU4 est petit). Les résultats obtenus ont été négatifs.

Les amorces rPLU1/rPLU5 et rPLU3/rPLU4 ont alors été testées sur un groupe beaucoup plus important de manchots (32 individus), comportant à nouveau les trois spécimens ayant déjà 164 donné des réponses positives. Trois réponses positives ont été notées (manchots 1597, 6373, et F142), ainsi que neuf réponses douteuses (manchots EC20, 7753, 6601, 2077, 7292, 8976, 3817, 3071, et E1CC). La figure 26 ci-dessous est une photographie du gel d’électrophorèse après migration des produits de la P.C.R.

Figure 26 : photographie du gel d’électrophorèse, après migration des produits P.C.R. obtenus à l’aide des amorces rPLU1/rPLU5 puis rPLU3/rPLU4, chez trente-deux Spheniscus demersus

Les bandes entourées par un trait continu correspondent aux résultats positifs des manchots, les bandes entourées par trait discontinu aux résulats douteux. Les colonnes correspondant aux manchots sont étiquetées par les lettres « SD », suivies du numéro individuel (quatre derniers caractères du transpondeur). La fraction « 3/4 » fait référence au couple d’amorces utilisé. « Plas A » : lire « Pf 300 » (erreur de saisie) : Plasmodium falciparum à 300 parasites par microlitre (témoin positif), « NT » : No Template (témoin négatif sans ADN), « M » : 165 marqueur – les bandes obtenues correspondent (de bas en haut) à des fragments de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200 et 1500 bases.

Enfin, une tentative de clonage et de séquençage des fragments obtenus chez les manchots ayant donné une réponse positive a été entreprise. Pour cela, de nouvelles réactions nichées ont été mises en œuvre à partir des échantillons congelés de six manchots (1597, 3071, 3377, 3817, 6373, et F142) obtenus après une première amplification positive par les amorces rPLU1 et rPLU5. Nous avons cherché à obtenir différents fragments, grâce à l’utilisation des couples d’amorces rPLU3/rPLU4 (fragment court, déjà amplifié avec succès), rPLU3/rPLU2, rPLU3/rPLU5, et rPLU3/rPUN-IR (fragments plus longs, pas encore amplifiés). Des fragments ont été obtenus pour quatre manchots (1597, 3071, 6373, et F142) avec les deux premiers couples d’amorces. En revanche, l’utilisation des couples d’amorces rPLU3/rPLU5, et rPLU3/rPUN-IR s’est révélée infructueuse dans tous les cas, comme l’illustre la figure 27.

166 Figure 27 : photographie du gel d’électrophorèse, après migration des produits P.C.R. obtenus à l’aide des amorces rPLU1/rPLU5 puis rPLU3/rPLU4, rPLU3/rPLU2, rPLU3/rPLU5, et rPLU3/rPUN-IR chez six Spheniscus demersus.

Les bandes entourées par un trait continu correspondent aux résultats positifs des manchots, les bandes entourées par un trait discontinu aux résulats a priori douteux. Les colonnes correspondant aux manchots sont étiquetées par les lettres « SD », suivies du numéro individuel (quatre derniers caractères du transpondeur). « Pf 300 » : Plasmodium falciparum à 300 parasites par microlitre (témoin positif), « NT » : No Template (témoin négatif sans ADN), « M » : marqueur – les bandes obtenues correspondent (de bas en haut) à des fragments de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200 et 1500 bases. Noter que pratiquement tous les fragments (y 167 compris ceux entourés en pointillés, à l’exception du seul fragment 3/2 du manchot 3071) ont pu être clonés. La plupart des résultats douteux peuvent donc a posteriori être considérés comme positifs.

Les fragments obtenus ont été clonés. Lors du criblage, seules quatre colonies bactériennes ont présenté des fragments de longueur souhaitée, deux d’entre elles correspondant au manchot 6373, une au manchot 1597, et une au manchot F142 (Cf. figure 28). Le fragment obtenu chez le manchot 3071 n’a donc pas pu être envoyé en séquençage.

Figure 28 : photographie du gel d’électrophorèse obtenu lors du criblage des séquences clonées de six Spheniscus demersus

Les bandes entourées par un trait continu correspondent aux fragments de longueur attendue (i.e. plasmides qui ont bien intégré le gène d’intérêt, Cf. colonne du marqueur « M »). Les colonnes correspondant aux manchots sont étiquetées par les lettres « SD », suivies du numéro individuel (quatre derniers caractères du transpondeur). La fraction « 3/2 » fait référence qu couple d’amorces utilisé. « NT » : No Template (témoin négatif sans ADN), « M » : marqueur – les 168 bandes obtenues correspondent (de bas en haut) à des fragments de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200 et 1500 bases.

Suite à la digestion par EcoR I, les quatre plasmides ont été digérés, et les fragments obtenus ont subi une nouvelle migration. Après contrôle de leur taille, ils ont pu être envoyés en séquençage.

En attendant les résultats du séquençage, une nouvelle P.C.R. a été effectuée sur les manchots 1597, 3071, 6373, et F142 (ainsi que le manchot 3377, pris comme témoin négatif) avec les amorces AvPl-AF, AvPl-BF, AvPl-CF, AvPl-DF, AvPl-EF, et AvPl-FF dessinées à partir de séquences isolées chez les pies et les corneilles (Cf. figure 24, paragraphe III.B.2.b., et paragraphe III.C.3.). Les résultats sont présentés sur la figure 29 ci-après.

169

Figure 29 : photographie du gel d’électrophorèse, après migration des produits P.C.R. obtenus à l’aide des amorces rPLU1/rPLU5 puis AvPl-AF/rPLU2, AvPl-BF/rPLU2, AvPl- CF/rPLU2, AvPl-DF/rPLU2, AvPl-EF/rPLU2, et AvPl-FF/rPLU2, chez cinq Spheniscus demersus

Les bandes entourées par un trait continu correspondent aux résultats positifs des manchots, les bandes entourées par un trait discontinu aux résulats douteux. Les colonnes correspondant aux manchots sont étiquetées par les lettres « SD », suivies du numéro individuel (quatre derniers caractères du transpondeur). Le manchot 3377 a servi de témoin négatif. Les fractions font référence aux couples d’amorces utilisés. « Plas A , B, C, D, E, F» : plasmides A, B, C, D, E, F, contenant respectivement les séquences des amorces AvPl-AF, AvPl-BF, AvPl-CF, AvPl-DF, AvPl-EF, AvPl-FF et utilisés pour leur fabrication (témoin positif), « NT » : No Template (témoin négatif sans ADN), « M » : marqueur – les bandes obtenues correspondent (de bas en haut) à des fragments de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200 et 1500 bases.

170 Un résultat positif a été obtenu pour le manchot F142 avec le couple d’amorces AvPl- BF/rPLU2, ainsi que des résultats douteux pour les manchots 1597 et 6373, avec les couples AvPl- BF/rPLU2 et AvPl-EF/rPLU2.

Par ailleurs, les quatre fragments précédemment obtenus avec les amorces rPLU3 et rPLU2 ont été séquencés. Les résultats figurent en annexe 23.

Trois séquences appartiennent au type B isolé chez les corvidés capturés dans le cadre de la troisième expérience (Cf. tableau 10 et annexe 27). Parmi les deux fragments obtenus chez le manchot 6373, l’un s’est avéré être une séquence d’un Plasmodium des rongeurs (probablement Plasmodium yoeli, espèce pour laquelle une correspondance de 98 % a été notée sur 100 % de la longueur séquencée).

La comparaison des fragments d’intérêt avec les séquences déjà publiées de Plasmodium a révélé :

• dans le cas des manchots F142 et 1597 : 95 % d’identité avec le gène ssrRNA 18S de Plasmodium cathemerium sur 99 % de la longueur séquencée, 94 % d’identité avec le gène ssrRNA 18S de Plasmodium gallinaceum sur 99 % de la longueur séquencée, et 93 % de d’identité avec le gène ssrRNA 18S de Plasmodium lophurae sur 99 % de la longueur séquencée ;

• dans le cas du manchot 6373 : 95 % d’identité avec le gène ssrRNA 18S de Plasmodium cathemerium sur 100% de la longueur séquencée, 94 % d’identité avec le gène ssrRNA 18S de Plasmodium gallinaceum sur 100 % de la longueur séquencée, et 93 % d’identité avec le gène ssrRNA 18S de Plasmodium lophurae sur 100 % de la longueur séquencée.

2. Deuxième expérience

L’annexe 24 présente les résultats individuels détaillés des recherches morphologique et moléculaire de Plasmodium chez diverses espèces aviaires en présentation au zoo de La Palmyre, dans le cadre de la deuxième expérience.

Aucun Plasmodium n’a pu être visualisé chez les 82 spécimens pris en compte dans cette expérience, que ce soit dans le sang (218 frottis), ou dans les tissus (observés chez 4 individus).

De même, l’analyse moléculaire, mise en œuvre chez onze flamants du Chili, une cigogne blanche, et un pélican blanc a toujours donné des résultats négatifs.

Enfin, des piroplasmes (espèce(s) non identifiée(s)) ont été visualisés chez 11 des 51 flamants du Chili testés (soit 22 %), un flamant de Cuba (sur 7), et une cigogne blanche (seule cigogne pour laquelle les prélèvements ont été analysés). Leur présence est également probable chez trente autres flamants du Chili (59 %) ainsi que trois autres flamants de Cuba (43 %), pour lesquels des formes évocatrices ont été visualisées dans les érythrocytes, sans qu’une identification plus certaine n’ait pu être établie.

171 3. Troisième expérience

a) Espèces nuisibles L’annexe 25 présente les résultats complets de la recherche morphologique de Plasmodium chez les pies bavardes (Pica pica) capturées au zoo de La Palmyre, dans le cadre de la troisième expérience.

L’analyse morphologique des prélèvements effectués sur les vingt-six pies bavardes a permis de révéler la présence de Plasmodium spp. chez 15 d’entre elles (58 %). D’autres hémoparasites ont pu être mis en évidence, notamment Haemoproteus spp. (20 pies, soit 77 %), mais également Leucocytozoon spp. (4 pies, soit 15 %) et Trypanosoma spp. (3 pies, soit 12 %). De plus, dans l’hypothèse où les frottis non identifiés proviendraient des pies 10 ou 11 pour le premier, et 15 ou 17 pour le second, ces chiffres pourraient s’élever à 17 pies infectées par Plasmodium spp. (65 %), et 22 pies infectées par Haemoproteus spp. (85 %).

Toutes les pies infectées par Plasmodium ont présenté plusieurs espèces du parasite dans leur sang. Dix espèces ont été retrouvées (rappelons que les critères de diagnose sont morphologiques et biologiques) : Plasmodium lenoblei (chez 11 pies), Plasmodium dorsti (9 pies), Plasmodium bioccai (9 pies), Plasmodium sp.1∗ (7 pies), Plasmodium dherteae (5 pies), Plasmodium beaucournui (5 pies), Plasmodium relictum (4 pies), Plasmodium tranieri (3 pies), Plasmodium sp.2∗ (3 pies), et Plasmodium snounoui (1 pie). La figure 30 illustre quelques hémoparasites mis en évidence sur les frottis sanguins de la pie n°21.

∗ Les espèces sp.1 et sp.2 de Plasmodium correspondent à des espèces nouvelles, pour lesquelles une description devrait faire l’objet d’une prochaine publication.

172 Figure 30 : exemples d’hémoparasites mis en évidence sur les frottis sanguins de la pie n°21

a : Trypanosoma sp., b : Plasmodium sp., c : Leucocytozoon sp., d : Haemoproteus sp.

En ce qui concerne les corneilles noires, les résultats de la recherche morphologique de Plasmodium sont présentés en annexe 26.

L’analyse morphologique des prélèvements effectués sur les neuf corneilles noires de l’étude a permis de révéler la présence de Plasmodium spp. chez 3 (ou 4) d’entre elles. Les autres hémoparasites mis en évidence, ont été Haemoproteus spp. (5 corneilles, soit 56 %), Leucocytozoon spp. (2 corneilles), Trypanosoma spp. (5 corneilles, soit 56 %), ainsi qu’une espèce parasitaire non identifiée avec précision, mais qui pourrait appartenir au genre Lankesterella (une corneille).

Toutes les corneilles infectées par Plasmodium ont présenté plusieurs espèces du parasite dans leur sang, avec cependant une incertitude pour la corneille 3, infectée par au moins un Plasmodium du sous-genre Haemamoeba, mais pour laquelle certaines formes parasitaires – pouvant correspondre à une seconde espèce – n’ont pas pu être identifiées. Six espèces de Plasmodium ont été observées : Plasmodium maior (chez 4 corneilles), Plasmodium relictum (4 corneilles), Plasmodium dorsti (3 corneilles), Plasmodium bioccai (2 corneilles), Plasmodium sp.1∗ (2 corneilles), et Plasmodium lenoblei (1 corneille).

∗ Il s’agit de la même espèce (pas encore décrite) que celle retrouvée chez certaines pies. 173 Parallèlement à l’analyse morphologique, l’analyse moléculaire a permis d’obtenir des séquences d’ADN parasitaire à l’aide des amorces rPLU1/rPLU5, puis rPLU1/rPLU2 et rPLU6/rPLU5 (réactions nichées). Toutes les pies et corneilles chez lesquelles des Plasmodium avaient été visualisés ont donné des réponses positives à la P.C.R., et, inversement, aucune pie ou corneille chez laquelle le parasite n’avait pu être observé n’a donné de réponse positive à la P.C.R. Soixante-dix-sept fragments d’ADN parasitaires ont été clonés et séquencés. Cinquante-sept séquences différentes ont été obtenues (42 pour le fragment amplifié par les amorces rPLU1/rPLU2, et 35 pour le fragment amplifié par les amorces rPLU6/rPLU5). Une analyse phylogénétique à l’aide de la méthode de calcul « neighbour joining » (via le module « Treeview » du logiciel BioEDIT®) a permis de les regrouper en différents types et sous-types, qui sont repris dans le tableau 10 ci-dessous. Par ailleurs, des séquences consensus ont pu être établies (Cf. annexe 27).

Tableau 10 : différents types et sous-types de séquences obtenues avec les couples d’amorces rPLU1/rPLU2 et rPLU6/rPLU5, chez les pies bavardes et les corneilles noires capturées à La Palmyre

Oiseau Fragment rPLU1/rPLU2 Fragment rPLU6/rPLU5

Espèce N° A B C D E F Total A B2 B3 C F5 C1? D? Total

Pica 4 0 1 4 0 0 0 5 0 2 0 3 0 0 0 5 pica Pica 9 1 0 3 0 0 1 5 1 1 0 2 0 1 0 5 pica Pica 12 0 2 2 0 0 0 4 0 1 0 2 0 0 0 3 pica Pica 14 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 pica Pica 18 2 1 2 0 0 0 5 1 0 0 2 1 0 0 4 pica Pica 21 0 1 1 1 0 0 3 0 3 1 3 0 0 1 8 pica Corvus 2 0 0 2 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 corone Corvus 3 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 2 0 0 0 3 corone Corvus 10 0 0 2 0 0 0 2 0 1 0 2 0 0 0 3 corone Total 2 9 3 5 16 1 1 1 27 2 10 1 16 1 1 1 31

Les différents types ont été identifiés par des lettres, et les sous-types par des chiffres. Deux fragments amplifiés par les amorces rPLU1/rPLU2 et rPLU6/rPLU5 appartenant au même type ont une séquence identique au niveau de leur zone de recouvrement. En effet, un recouvrement d’environ 400 bases existe entre les fragments amplifiés par rPLU1/rPLU2 et rPLU6/rPLU5 (Cf. figure 24). Les sous-types du fragment 6/5 ont des séquences identiques au niveau de la zone de recouvrement (qui correspond au même type sur le fragment 1/2), mais des séquences différentes entre les cibles des amorces rPLU2 et rPLU5.

Les séquences uniques ou consensus correspondant aux différents types et sous-types trouvés chez les pies et les corneilles ont été comparées aux séquences déjà publiées. Il s’agit de 174 séquences nouvelles et inédites, qui présentent de grandes similitudes avec les séquences des Plasmodium aviaires (à titre d’exemple : souvent 97 % d’identité sur 100 % de la longueur séquencée). Les trois séquences les plus proches ont toujours été celles du gène codant la sous-unité 18S de Plasmodium cathemerium, Plasmodium gallinaceum, Plasmodium lophurae, ou – plus occasionnellement – Plasmodium juxtanucleare.

De nouvelles amorces, spécifiques des séquences isolées, ont été dessinées. Elles correspondent aux six types (A, B, C, D, E, et F) mis en évidence chez les pies et les corneilles (Cf. figure 24) et ont été utilisées chez les manchots (Cf. paragraphe III.C.I.). Lors des essais effectués sur ces amorces, cinq d’entre elles (AvPl-AF, AvPlCF, AvPl-DF, AvPl-EF, et AvPl-FF) ont donné d’excellents résultats, tandis que l’amorce AvPl-BF a semblé moins efficace, notamment du point de vue de sa spécificité (elle avait donné des résultats positifs sur les séquences de type D, E, et F).

b) Espèces non nuisibles

L’analyse morphologique des prélèvements effectués sur des oiseaux commensaux autres que Pica pica et Corvus corone corone n’a révélé la présence de Plasmodium spp. que chez l’unique mésange bleue (Cyanistes caeruleus) de l’étude (Cf. annexe 28). Par ailleurs, de nombreux Haemoproteus ont été visualisés dans le sang du pigeon numéro 2.

Aucun Plasmodium n’a pu être mis en évidence sur les prélèvements effectués chez les autres espèces, notamment chez celles représentées par au moins quatre individus : pigeons ramiers (Columba palumbus), tourterelles turques (Streptopelia decaocto), moineaux domestiques (Passer domesticus) et merles noirs (Turdus merula).

Notons que quelques formes non identifiées ont été observées dans le sang des canards 1, 2, et 3. Dans le premier cas, il pourrait s’agir de piroplasmes ou de corps d’inclusions d’origine virale.

4. Quatrième expérience

Aucune parasitémie à Plasmodium n’a été notée sur les 72 frottis sanguins effectués au cours de cette expérience. De même, aucun autre genre d’hématozoaire n’a été visualisé lors de la lecture des lames. D. Discussion

Le but de notre travail était de dresser un état des lieux de l’infection à Plasmodium chez les manchots du zoo de La Palmyre, et de mieux cerner l’épidémiologie de cette affection au sein du parc en incluant l’avifaune indigène commensale.

La troisième expérience nous a permis d’identifier deux espèces de corvidés pour lesquelles le taux d’infection par les hémosporidies s’est avéré élevé : Pica pica (espèce pour laquelle 15 à 17 spécimens sur 26 étaient infectés par Plasmodium, et 20 à 22 par Haemoproteus) et Corvus corone corone (espèce pour laquelle 3 à 4 spécimens sur 9 étaient infectés par Plasmodium, et 5 par Haemoproteus).

En revanche, aucun hémoparasite n’a été mis en évidence chez les 9 canards colverts (Anas platyrhynchos), 8 tourterelles turques (Streptopelia decaocto), 4 moineaux domestiques (Passer domesticus), et 4 merles noirs (Turdus merula). Dans le cas du merle noir, cette conclusion peut paraître surprenante puisqu’une étude a récemment montré que 97 % des merles noirs étaient 175 infectés par des hémosporidies (Haemoproteus spp. ou Plasmodium spp.) et que, dans 66 % des cas, cette infection était détectable par lecture de frottis sanguins (BENTZ et al., 2006). De très nombreux Haemoproteus ont été observés dans le sang du pigeon ramier « Pal2 ». Il s’agit des seuls hémoparasites visualisés chez cette espèce dans le cadre de nos expérimentations. L’impact réel des infections par les hémosporidies chez Columba palumbus à La Palmyre peut donc sembler difficile à cerner compte tenu de nos résultats (seulement un individu infecté sur cinq, mais infection massive de celui-ci). Néanmoins, malgré la petite taille de l’échantillon, l’absence de Plasmodium chez les cinq spécimens étudiés est en défaveur d’une implication de l’espèce dans l’entretien du cycle parasitaire au zoo et dans les environs, et donc dans la transmission indirecte du parasite aux manchots.

Pour ce qui est des autres espèces, aucun parasite n’a été visualisé dans les prélèvements étudiés, à l’exception du sang d’une mésange bleue (Cyanistes caeruleus), qui hébergeait des Plasmodium. Compte tenu du faible nombre de représentants de chaque espèce, il nous est impossible de tirer des conclusions générales sur le rôle de ces espèces dans l’épidémiologie des infections paludéennes à La Palmyre, mais la présence de Plasmodium chez la mésange bleue pourrait suggérer l’implication de certaines espèces de passériformes. Une étude de SCHULTZ & WHITTINGTON (2005) s’est déjà intéressée à la prévalence des infections à Plasmodium chez des oiseaux capturés à proximité du SANCCOB (Le Cap, Afrique du Sud), où plusieurs cas d’infection chez des manchots du Cap avaient été recensés (Cf. paragraphe I.B.4.c.). Les oiseaux (essentiellement des passériformes) avaient été capturés au filet à Cape Receife, dans des zones humides favorables à l’activité vectorielle, et des frottis sanguins avaient systématiquement été préparés. Au total, 104 oiseaux de 29 espèces et 15 familles ont figuré dans cette étude. Des hémoparasites ont été visualisés chez 71 individus appartenant à 23 espèces (68,2 %) et les hémosporidies du genre Plasmodium (espèces P. relictum et polare) furent les plus fréquemment observées, chez 87,3 % des oiseaux infectés (59,6 % du nombre total d’oiseaux). Sur les 101 passériformes (27 espèces) de l’étude, 59 (58 %) ont présenté des Plasmodium visibles à la lecture de leurs frottis sanguins. L’espèce la plus touchée a été le bulbul importun (Andropadus importunus) dont 21 des 26 individus étudiés étaient infectés par des hémoparasites (81 %), et 17 par des hémosporidies du genre Plasmodium (65 %). Ces résultats suggèrent un rôle probable des passériformes dans l’entretien du cycle de Plasmodium, en tant que réservoir sur la côte sud du continent africain. Nous pourrions donc imaginer une situation similaire à La Palmyre. Néanmoins, d’autres ordres pourraient intervenir, en fonction, notamment, de l’espèce parasitaire. Ainsi, l’infection à Plasmodium juxtanucleare serait limitée aux galliformes dans la nature, et, pour reprendre l’exemple sud-africain, sa transmission aux manchots du Cap hébergés au SANCCOB serait probablement due aux francolins criards (Francolinus capensis) vivant à proximité, qui constitueraient le réservoir (SCHULTZ & WHITTINGTON, 2005).

L’étude de plusieurs espèces en présentation à La Palmyre devait compléter les conclusions de la troisième expérience, en cherchant à mettre en évidence d’autres espèces présentes sur le site qui pourraient héberger les parasites. Aucune hémosporidie n’a pu être visualisée dans les échantillons sanguins ou tissulaires étudiés, et les recherches d’ADN parasitaire par P.C.R. se sont révélées infructueuses. Le grand nombre de flamants et d’ibis étudiés (51 Phoenicopterus chilensis et 7 Phoenicopterus ruber, 7 Plegadis falcinellus, 7 Plegadis ridgwayi, et 10 Eudocimus ruber) rend très improbable l’existence d’infections paludéennes chez les Phoenicopteriformes et les Threskiornithidae à La Palmyre. Rappelons ici que l’infection des Phoenicopteriformes par Plasmodium est probablement très rare, puisque la première – et unique – description du parasite chez un flamant est à mettre à l’actif de PEIRCE (2005), qui avait mis en évidence une sous-espèce

176 de Plasmodium relictum chez un seul flamant nain (Phoeniconaias minor) sur 31 spécimens de cette espèce prélevés au lac Bogoria (Kenya), en juillet 2002.

Nos recherches ont également permis de mettre en évidence des hémoparasites de la sous- classe Piroplasmia chez de nombreux flamants (11 à 41 Phoenicopterus chilensis et 1 à 4 Phoenicopterus ruber), un pélican blanc, et une cigogne blanche. L’identification plus précise de ces piroplasmes n’a pas pu être effectuée. Peu de données sont disponibles sur les piroplasmoses aviaires. Il s’agit d’affections très rares, dues à des parasites du genre Babesia (RAE, 1995). Le cycle parasitaire des piroplasmes aviaires est mal connu, et la signification de leur présence chez les oiseaux parasités demeure difficile à apprécier (RAE, 1995 ; SMITH, 1996). La spécificité d’hôte serait marquée pour ces parasites, et si plusieurs familles d’oiseaux peuvent abriter de nombreuses espèces de Babesia (SKOTARCZAK et al., 2006), les passereaux seraient les hôtes les plus fréquents (RAE, 1995). Toutefois, l’étude de SKOTARCZAK et al. (2006), au cours de laquelle des Babesia ont été recherchés par P.C.R. chez 108 Passériformes capturés en Pologne (24 Turdus merula, 24 Turdus philomelos, 20 Sturnus vulgaris, 11 Parus major, 10 Fringilla coelebs, 6 Coccothraustes coccothraustes, 6 Erithacus rubecula, 6 Sitta europaea, et 1 Cyanistes caeruleus), ne rapporte aucune infection par le parasite. De même, les recherches d’hémoparasites sur des frottis sanguins effectués par BENNETT et al. (1992) chez de nombreux oiseaux sub-sahariens, ne révèlent la présence d’aucun piroplasme parmi les 18 ciconiidés de l’étude (qui ne comportait aucun phoenicopteridé et aucun pélécanidé). La mise en évidence des parasites chez les phoenicopteridés, ciconiidés et pélécanidés du parc semble donc singulière tant les infections aviaires à Babesia sont peu fréquentes. Notons qu’en outre, aucun piroplasme n’a été visualisé sur les nombreux frottis effectués chez les manchots du parc, alors que les Spheniscidae représentent l’une des rares familles d’oiseaux pour lesquelles les infections à Babesia – notamment par l’espèce B. peircei – sont bien connues et ont été plusieurs fois décrites (BROSSY, 1992, 1993 ; BROSSY et al., 1999 ; JONES & SHELLAM, 1999a). Elles seraient même endémiques chez les Spheniscus demersus sauvages.

Les P.C.R. effectuées à partir du sang d’un pélican blanc (Pelecanus onocrotalus) et d’une cigogne blanche (Ciconia ciconia) ont donné des résultats négatifs, ce qui exclut l’existence d’une infection à Plasmodium chez ces individus. Cependant, une fois encore, le faible nombre d’échantillons étudiés nous empêche de généraliser ce constat à l’ensemble des deux espèces.

L’absence de parasites sur tous les frottis sanguins effectués chez les canetons Anas platyrhynchos dans le cadre de la quatrième expérience ne nous a pas permis d’obtenir les informations que nous souhaitions (âge moyen à la primo-infection – si elle avait lieu, évolution de la parasitémie au cours des premiers mois…). Toutefois, l’absence d’infection notée au cours des trois premiers mois de vie de nos canetons s’accorde avec les résultats de la troisième expérience, qui laissaient fortement supposer l’absence d’infections à Plasmodium chez les canards colverts présents à La Palmyre. L’existence d’infections de faible intensité chez cette espèce ne peut toutefois pas être totalement exclue sur la base d’une simple recherche morphologique.

En ce qui concerne les quarante-cinq manchots, qui constituent la cible de notre travail, aucun parasite n’a été visualisé sur les 186 frottis sanguins et les 6 prélèvements d’organes effectués. L’ensemble de la colonie étant soumis au protocole prophylactique à base de pyriméthamine (Cf. paragraphe II.C.1.), nous ne pouvons exclure l’existence d’infections à bas bruit « masquées » par le traitement anti-paludéen, d’où l’intérêt de l’analyse moléculaire des échantillons sanguins, beaucoup plus sensible. Aucun des manchots décédés au cours de l’année n’a présenté de Plasmodium dans son sang ou dans ses organes, et les derniers cas avérés de mort par infection paludéenne chez des manchots du parc datent de l’été 2000, soit juste avant la mise en place de la prophylaxie à base de pyriméthamine (introduite en août 2000). Il semblerait donc que le 177 protocole de prophylaxie actuellement en place à La Palmyre soit assez efficace, même si nous ne disposons pas de preuve formelle de cette efficacité.

La recherche d’ADN parasitaire par P.C.R. devait nous permettre à la fois d’accroître la sensibilité de notre détection des oiseaux infectés par Plasmodium, et d’établir un éventuel lien entre les manchots et le réservoir probable de l’infection à La Palmyre.

Notre intérêt s’est notamment porté sur deux espèces aviaires (Pica pica et Corvus corone sous-espèce corone), pour lesquelles les résultats que nous avions obtenus – avec l’examen microscopique et les P.C.R rPLU1/rPLU5, puis rPLU1/rPLU2 et rPLU6/rPLU5 - suggéraient qu’elles pourraient jouer un rôle de réservoir d’hémoparasites à La Palmyre. La technique P.C.R ne nous a pas permis de détecter des infections chez des pies, ou corneilles, chez lesquelles aucun parasite n’avait été visualisé au cours de l’analyse morphologique. Inversement, tous les individus pour lesquels l’infection avait été détectée au microscope ont donné une réponse positive à la P.C.R. Les fragments d’ADN obtenus ont été clonés et séquencés, ce qui a permis de les regrouper en plusieurs types et sous-types (Cf. tableau 10). Il n’est pas encore possible, à l’heure actuelle, d’affirmer à quoi correspondent précisément ces types et sous-types en termes de taxinomie. En effet, la classification des hémosporidies repose sur des critères morphologiques ; il n’existe pas à ce jour de correspondance établie entre la « classification moléculaire » et la classification actuelle. Ceci étant, nous pouvons nous interroger sur la nature des séquences obtenues et la confiance à accorder aux amorces qui ont été utilisées : nous avons évoqué un peu plus haut le fait que nos amorces étaient spécifiques du genre Plasmodium. En réalité, s’il y a de fortes chances que ça soit effectivement le cas, certains sous-genres d’hémosporidies aviaires demeurent trop peu étudiés pour que l’on connaisse les conséquences de l’utilisation de telle ou telle amorce P.C.R. sur leur ADN. Ainsi, le genre Haemoproteus est divisé en deux sous-genres, Haemoproteus (sous-genre bien connu, présent chez les columbiformes), et Parahaemoproteus (sous-genre moins connu, présent chez les passériformes). Aucune séquence du gène ssrRNA 18S n’est disponible pour ces deux-sous genres et aucune publication ne rapporte l’utilisation de nos amorces sur ces parasites. Nous ne pouvons donc exclure, a priori, que certains fragments amplifiés chez les pies et les corneilles de la troisième expérience soient des séquences d’ADN d’un Parahaemoproteus présent dans leur sang. Toutefois, il existe d’importantes différences entre le genre Plasmodium et les deux sous-genres d’Haemoproteus dans les séquences (déjà publiées) de gènes mieux étudiés, par exemple celui codant le cytochrome b. Ceci pourrait nous amener à généraliser et à supposer que les autres régions conservées du génome (dont la séquence codant la petite sous-unité ribosomale) sont assez différentes entre les deux genres parasitaires. De plus, des essais de polymérisation d’ADN de Parahaemoproteus menés par l’équipe du M.N.H.N. avec les amorces amplifiant le gène ssrRNA 18S se sont révélés infructueux. Or, les Haemoproteus mis en évidence sur les frottis des pies et des corneilles sont très probablement du sous-genre Parahaemoproteus (puisque les pies et les corneilles sont des passériformes). Enfin, les séquences que nous avons obtenues sont très proches des séquences déjà publiées de Plasmodium. Il est donc très probable que nos produits P.C.R. correspondaient bien à de l’ADN de Plasmodium.

Chez les manchots, la P.C.R. a clairement permis de détecter de l’ADN parasitaire chez quatre individus, et potentiellement chez neuf autres (pour lesquels la lecture des gels de migration pouvait laisser un doute, Cf. figures 25, 26, 27) tandis qu’aucun des manchots de l’étude n’avait présenté de parasites visibles dans son sang (ou ses tissus). Ce test a donc permis d’augmenter la sensibilité de notre dépistage. Les infections à bas bruit ainsi détectées pourraient correspondre à des infections chroniques de faible intensité, ou être une conséquence de la prophylaxie médicale à base de pyriméthamine. Toutefois, deux des quatre manchots ayant donné des réponses positives à la P.C.R. (manchots 6373, et 1597, respectivement nés le 6 juillet, et le 2 septembre 2006) étaient 178 âgés de moins d’un an au moment où les prélèvements sanguins sur EDTA ont été effectués. L’existence d’une infection chronique, sur de jeunes manchots, dont la sensibilité particulière aux infections paludéennes a plusieurs fois été soulignée (GRIM et al., 2003 ; PARSONS & UNDERHILL, 2005 ; PETIT, 1998 ; STOSFKOPF & BEALL, 1980) semble peu probable. Ainsi, nous privilégierons la seconde hypothèse.

Contrairement à ce qui avait été observé pour les pies et les corneilles, aucune amplification n’a pu être obtenue chez les manchots à l’aide des couples d’amorces rPLU1/rPLU2 et rPLU6/rPLU5, même chez les individus ayant donné un résultat positif avec les amorces rPLU3 et rPLU4. Ceci pouvait suggérer que les séquences d’ADN parasitaire retrouvées chez les manchots d’un côté et chez les corvidés de l’autre n’étaient pas les mêmes, au moins au niveau des cibles de rPLU1, rPLU2, rPLU5, et rPLU6. Pour le vérifier, nous avons tenté d’amplifier l’ADN retrouvé chez les manchots avec des amorces spécifiques mises au point à partir des séquences isolées chez les pies et les corneilles (amorces AvPl-AF, AvPl-BF, AvPl-CF, AvPl-DF, AvPl-EF, et AvPl-FF). À notre grande surprise, un résultat positif et des résultats douteux ont été obtenus, ce qui signifie a priori que les séquences ADN retrouvées chez les pies, les corneilles, et les manchots en question sont quasiment identiques au niveau des cibles de ces amorces. En effet, des différences – même minimes – dans les séquences-cibles auraient empêché la polymérisation avec les amorces spécifiques des parasites des corvidés.

Toutefois, un doute pouvait subsister, en raison de la spécificité probablement moins marquée de l’amorce AvPl-BF par rapport aux autres amorces dessinées à partir des séquences isolées chez les pies et les corneilles. De plus, il fallait également expliquer l’échec constaté lors de l’emploi des couples d’amorces rPLU1/rPLU2 et rPLU6/rPLU5 chez les manchots et chercher à mettre en évidence une identité sur l’ensemble des fragments amplifiés, avant de pouvoir tirer de vraies conclusions.

Un clonage et un séquençage des fragments amplifiés chez les manchots avait été entrepris afin de les comparer aux séquences déjà publiées de Plasmodium, et – le cas échéant – d’apporter des explications à ces questions. Pour cela, de nouvelles amorces avaient été utilisées, dans l’espoir d’obtenir des fragments plus longs que le court segment amplifié par les amorces rPLU3 et rPLU4. L’utilisation des couples rPLU3/rPLU5, et rPLU3/rPUN-IR s’était révélée infructueuse, mais quatre fragments ont pu être obtenus avec les amorces rPLU3et rPLU2. Une fois encore, il semblerait que certaines amorces (rPLU3 et/ou rPLU2 et/ou rPLU4) donnent de meilleurs résultats sur l’ADN retrouvé chez Spheniscus demersus que d’autres (rPLU6, rPUN-IR, et/ou rPLU5 et/ou rPLU1).

Les séquences isolées chez les manchots F142, 1597, et 6373 sont du type B (isolé chez les corvidés), ce qui met clairement en relation les pies et les corneilles avec les manchots infectés. Une fois encore, nous ne pouvons affirmer à quelle(s) espèce(s), ou sous-espèce(s), de Plasmodium correspondent ces fragments. Leurs séquences sont très proches de celles de Plasmodium cathemerium, Plasmodium gallinaceum, Plasmodium lophurae, et Plasmodium juxtanucleare, mais il s’agit là des seules espèces du genre pour lesquelles des séquences ont été publiées. La présence de parasites génétiquement très proches (voire identiques) chez les corvidés et les manchots de La Palmyre reste cependant indiscutable.

Deux espèces d’oiseaux (Pica pica et Corvus corone corone) qui jouent un rôle de réservoir d’infections multiples à Plasmodium au zoo de La Palmyre ont donc été identifiées au cours de ce travail. Elles sont très vraisemblablement responsables de la transmission indirecte du parasite aux manchots. HUGH-JONES (1999) avait évoqué un possible rôle de réservoir des pies, qui selon lui hébergent le parasite, à propos des épisodes de mortalité de manchots décrits au zoo de Marwell au 179 cours de l’été 1999. Pour rappel, une séquence correspondant à Plasmodium yoeli avait été obtenue chez le manchot 6373 : il s’agissait là – bien évidemment – de la conséquence d’une contamination du prélèvement.

En outre, les informations fournies par le séquençage des fragments isolés permettent de discuter les raisons de l’efficacité plus ou moins marquée de certaines amorces P.C.R. chez les manchots : quatre oligonucléotides avaient leurs séquences cibles à l’intérieur des fragments obtenus. Les séquences correspondant aux amorces rPLU2, rPLU4 et AvPl-BF sont rigoureusement conservées, dans toute leur longueur, sur les quatre fragments envoyés en séquençage. Ceci laisse supposer une très bonne efficacité de ces amorces chez nos manchots. De même, les séquences correspondant aux amorces rPLU6 et rPLU3 sont plutôt bien conservées (délétion d’une adénine au milieu d’une série de cinq, et délétion de 8 à 9 bases en début de séquence, respectivement). Ainsi, la qualité supposée de l’appariement de ces amorces chez les manchots est également bonne (dans le cas de rPLU3, l’amorce a probablement été dégradée entre la première P.C.R. et le clonage, ce qui expliquerait que le début de sa séquence soit « rogné » sur tous les fragments obtenus). Il semblerait donc que les échecs des couples rPLU1/rPLU2, rPLU6/rPLU5, rPLU3/rPLU5, et rPLU3/rPUN-IR notés chez les manchots soient dus à des différences de séquence (potentiellement minimes) au niveau des cibles des amorces rPLU1, rPLU5, et rPUN-IR, qui ne figuraient pas sur les fragments séquencés. L’existence de telles différences (une ou deux bases peuvent suffire) par rapport aux cibles des amorces et aux fragments isolés chez les corvidés suffirait à expliquer l’échec des P.C.R. en question, sans remettre en cause la similitude de séquence et l’appartenance au type B isolé chez les pies et les corneilles.

On pourrait s’étonner, en raison de la présence en nombre plutôt élevé des pies et des corneilles porteuses de Plasmodium sur le parc, de la faible proportion de manchots infectés (quatre individus – potentiellement treize – pour une colonie d’une quarantaine de têtes). La réponse nous est probablement donnée par l’observation des frottis sanguins, dont la lecture n’a révélé la présence d’aucun Plasmodium chez les manchots de La Palmyre. Ceci signifie que les infections détectées par la P.C.R. étaient très faibles (d’ailleurs un certain nombre de résultats douteux ont été notés, en raison de bandes peu marquées après les migrations, même si, dans le cas des P.C.R. nichées, l’épaisseur des bandes obtenues ne peut être directement corrélée à la quantité d’ADN initialement présent). Ainsi, on pourrait supposer l’existence d’autres infections, encore plus faibles, qui pourraient ne pas être détectées, même lors de l’utilisation de techniques moléculaires. Néanmoins, cette première hypothèse – seule – serait surprenante compte tenu de la sensibilité marquée des manchots vis-à-vis des infections à Plasmodium. Une autre hypothèse serait l’infection par une espèce de Plasmodium peu pathogène pour les manchots, puisque la sensibilité particulière de ces derniers n’a été clairement montrée que dans le cas des infections par Plasmodium relictum, Plasmodium elongatum, et Plasmodium juxtanucleare. Or, il ne s’agit pas là des espèces les plus fréquemment observées chez nos corvidés (seul Plasmodium relictum a été observé, sur quatre pies et quatre corneilles). La virulence et la pathogénie d’une infection potentielle des manchots par Plasmodium dorsti (observé chez neuf pies et trois corneilles), Plasmodium lenoblei (observé chez onze pies et une corneille), ou encore Plasmodium bioccai (observé chez neuf pies et deux corneilles) sont totalement inconnues puisque ces espèces – récemment décrites – n’ont jamais été observées chez des Sphénisciformes. De même, deux espèces de Plasmodium jamais décrites ont été observées chez les pies et les corneilles. La question de leur présence et de leur virulence chez les manchots mérite donc d’être posée. Pour obtenir une identification morphologique et étayer – ou non – cette hypothèse, un protocole de subinoculation de sang de manchot infecté à des canaris pourrait être envisageable. Par ailleurs, une dernière hypothèse – tout aussi recevable a priori – serait de présumer que la prophylaxie à base de pyriméthamine diminue fortement l’intensité des

180 infections, au point de les rendre « invisibles » sur les frottis sanguins, et – potentiellement – indétectables par P.C.R. Une étude précise de la pharmacocinétique et de l’efficacité de la pyriméthamine chez les manchots serait donc un complément très intéressant à notre travail, qui permettrait probablement de répondre à certaines questions posées par l’analyse de nos résultats. De même, une étude sérologique de la colonie de manchots de La Palmyre – si les moyens de la mettre en œuvre étaient rassemblés – serait certainement riche en enseignements sur la nature précise des infections qui touchent la colonie. Un travail de ce type permettrait (comme ça a été le cas pour les études menées sur les manchots dans leur milieu naturel) de comparer la pertinence des outils sérologiques par rapport à la P.C.R., et de discuter l’intérêt de telle ou telle technique diagnostique chez les populations captives de manchots. Enfin, une analyse de l’activité du vecteur à La Palmyre permettrait de répondre à bon nombre de questions, et d’établir un lien quantifiable (en termes d’efficacité vectorielle) entre le réservoir et les manchots du parc. Il serait ainsi intéressant de rechercher une éventuelle préférence des moustiques de La Palmyre pour certains oiseaux (corvidés ou sphéniscidés), de chiffrer le comportement alimentaire des femelles (nombre de repas sanguins par jour, quantité de sang ingérée à chaque repas, durée de vie…) et d’estimer leur taux d’infection par Plasmodium (recherche de sporozoïtes dans les glandes salivaires).

181

182 CONCLUSION

183 184 Conclusion

Notre travail propose une synthèse bibliographique en français sur les infections à Plasmodium des oiseaux, et plus particulièrement des Sphénisciformes (manchots). Retenons que les infections à Plasmodium des oiseaux sont relativement peu étudiées à l’heure actuelle, mais avaient présenté un réel intérêt historique en tant que modèle d’étude du paludisme humain. Il s’agit d’infections très répandues à l’échelle du globe, le seul prérequis semblant être l’existence de conditions favorables à l’activité du vecteur arthropode. De nombreuses familles d’oiseaux peuvent héberger des Plasmodium aviaires (qui sont spécifiques à cette classe), et certains individus peuvent porter – de façon totalement bénigne – beaucoup de parasites, appartenant potentiellement à plusieurs espèces. La répartition des espèces de Plasmodium chez leurs hôtes respectifs (vecteurs ou oiseaux) est le fruit d’une longue co-évolution, dont les modalités sont sujettes à controverse, et mériteraient d’être précisées par de nouvelles recherches. Une des particularités les plus remarquables des Plasmodium aviaires concerne leur cycle de développement, caractérisé par la présence d’un cycle exoérythrocytaire inexistant chez les mammifères.

En ce qui concerne les caractéristiques de l’infection des Sphénisciformes par Plasmodium, leur importance au sein des colonies captives est bien connue puisque de nombreux cas, toujours très pathogènes, ont été rapportés, incriminant tout particulièrement deux espèces : Plasmodium relictum et Plasmodium elongatum. Le diagnostic ante mortem est quasiment impossible à poser, d’où l’intérêt de la mise en place d’une prophylaxie médicale et sanitaire.

L’impact des infections à Plasmodium sur les colonies sauvages de manchots est en revanche beaucoup plus délicat à apprécier. Des parasites ont été visualisés à plusieurs reprises sur des frottis sanguins effectués chez des manchots vivant dans leur milieu naturel, et il a été montré qu’une grande proportion de certaines populations présentait des anticorps contre Plasmodium, mais les conséquences (en termes de pathogénie notamment) de ces infections demeurent obscures.

L’exemple du zoo de La Palmyre, pour lequel nous avons mené une étude rétrospective de cas, et analysé les mesures de lutte mises en place, a permis d’illustrer les dégâts que peut occasionner le parasite au sein des zoos, ainsi que les difficultés à prévenir sa transmission, diminuer la mortalité, et éradiquer l’infection, même si aucun décès dû à une infection par Plasmodium n’a été rapporté au parc depuis l’emploi de la pyriméthamine.

Nous avons jugé intéressant de compléter cette étude rétrospective par un travail expérimental, qui nous a permis d’identifier deux espèces aviaires (Pica pica et Corvus corone corone) fortement infectées par Plasmodium (et les Hémosporidies en général) qui jouent probablement le rôle de réservoir de l’infection à La Palmyre. En effet, une analyse moléculaire de l’ADN parasitaire retrouvé chez ces corvidés d’une part, et chez les manchots du parc d’autre part, a montré que les séquences du gène codant la petite sous-unité ribosomale du parasite étaient quasiment identiques (à quelques bases près) chez les trois espèces hôtes. Le parasite présent chez les manchots a une séquence d’ADN appartenant à un type bien précis, défini à partir des séquences retrouvées chez les pies bavardes et les corneilles noires. Toutefois, comme nous l’avons évoqué en discutant nos résultats, ces travaux – s’ils se révèlent très intéressants et apportent des réponses à un certain nombre de questions – mériteraient d’être complétés par de nouvelles études, afin de préciser davantage les modalités de l’infection des manchots à La Palmyre, et de discuter l’efficacité de la prophylaxie actuellement en place.

185

186 BIBLIOGRAPHIE

187 188 Bibliographie

1. ABREY ANS. (1993) Diseases of free-ranging birds – Diseases of wild birds in Southern Africa. In : FOWLER ME, editor. Zoo & Wild Animal Medicine Current Therapy 3. Philadelphia : WB Saunders, 163-166. 2. ATKINSON CT, DUSEK RJ, LEASE JK. (2001) Serological responses and immunity to superinfection with avian malaria in experimentally-infected Hawaii Amakihi. J. Wildl. Dis., 37(1), 20-27. 3. AVIBASE. (2007) Search by family. Avibase – The world bird database [en-ligne], mise à jour le 29 octobre 2007 [http://www.bsc- eoc.org/avibase/avibase.jsp?pg=search&fam=15.0&lang=FR], (consulté le 12 novembre 2007). 4. BECKER CD, HOLLOWAY HL. (1968) A survey for haematozoa in Antarctic vertebrates. Trans. Amer. Microsc. Soc., 87(3), 354-360. 5. BENNETT GF, EARLÉ RA, DU TOIT H, HUCHZERMEYER FW. (1992) A host-parasite catalogue of the haematozoa of the sub-saharan birds. Onderstepoort J. Vet. Res., 59, 1-73. 6. BENSCH S, STJERNMAN M, HASSELQUIST D, ÖSTMAN Ö, HANSSON B, WESSTERDAHL H et al. (2000) Host specificity in avian blood parasites : a study of Plasmodium and Haemoproteus mitochondrial DNA amplified from birds. Proc. R. Soc. Lond., B267, 1583-1589. 7. BENTZ S, RIGAUD T, BARROCA M, MARTIN-LAURENT F, BRU D, MOREAU J et al. (2006) Sensitive measure of prevalence and parasitemia of haemosporidia from European blackbird (Turdus merula) populations : value of PCR-RFLP and quantitative PCR. Parasitology, 133, 685-692. 8. BOËTE C, PAUL REL, KOELLA JC. (2004) Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector. Proc. R. Soc. Lond., B271, 1611-1615. 9. BROSSY JJ. (1992) Malaria in wild and captive Jackass penguins Spheniscus demersus along the southern African coast. Ostrich, 63, 10-12. 10. BROSSY JJ. (1993) Haemoparasites in the African (Jackass) Penguin (Spheniscus demersus). Penguin Conservation, 11, 20-21. 11. BROSSY JJ, PLÖS AL, BLACKBEARD JM, KLINE A. (1999) Diseases acquired by captive penguins : what happens when they are released into the wild ? Marine Ornithology, 27, 185-186. 12. BUSSIÉRAS J, CHERMETTE R. (1991) Parasitologie Vétérinaire – Fascicule I : Parasitologie générale. Polycopié. École Nationale Vétérinaire d’Alfort, Service de Parasitologie. 75p. 13. BUSSIÉRAS J, CHERMETTE R. (1992) Parasitologie Vétérinaire – Fascicule II : Protozoologie. Polycopié. École Nationale Vétérinaire d’Alfort, Service de Parasitologie. 186p. 14. CHAVATTE JM, CHIRON F, CHABAUD A, LANDAU I. (2007) Fidélisation du couple hôte-vecteur facteur probable de spéciation : 14 espèces de Plasmodium de la pie. Parasite, 14, 21-37. 15. CHITTY J. (2006) Marwell zoo, U.K. International Zoo News, 53/8, 492-493. 16. CHRISTENSEN BM, LI J, CHEN CC, NAPPI AJ. (2005) Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends in Parasitol., 21(4), 192-199.

189 17. COURCELLE H. (2003) Zoo de La Palmyre – visite guidée. Gradignan (France) : Imprim’33 SA, 120p. 18. CRANFIELD MR. (2003) Sphenisciformes (Penguins). In : FOWLER ME, MILLER RE, editors. Zoo and Wild Animal Medicine. 5th ed. St. Louis : WB Saunders, 103-110. 19. CRANFIELD MR, SHAW M, BEALL F, SKJOLDAGER M, IALEGGIO D. (1990) A review and update of avian malaria in the African penguin (Spheniscus demersus). Proc. Amer. Assoc. Zoo Vet., 21, 243-248. 20. CRANFIELD MR, GRACZYK TK, BEALL FB, IALEGGIO DM, SHAW ML, SKJOLDAGER ML. (1994) Subclinical avian malaria infections in African black- footed penguins (Spheniscus demersus) and induction of parasite recrudescence. J. Wildl. Dis., 30(3), 372-376. 21. DA ROCHA ACVM, BRAGA EM, ARAÚJO MSS, FRANKLIN BS, PIMENTA PFP. (2004) Effect of the Aedes fluviatilis saliva on the developpement of Plasmodium gallinaceum infection in Gallus (gallus) domesticus. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 99(7), 709-715. 22. DONOVAN MJ, MESSMORE AS, SCRAFFORD DA, SACKS DL, KAMHAWI S, McDOWELL MA. (2007) Uninfected mosquito bites confer protection against infection with malaria parasites. Infection and immunity, 75(5), 2523-2530. 23. DUIGNAN PJ. (2001) Diseases of penguins. Surveillance, 28(4), 5-11. 24. EEP PENGUIN TAG. (1995) EEP Penguin TAG Annual Report 1995 In : EEP Yearbook 1994/1995 including the Proceedings of the 12th EAZA/EEP Conference, Poznan. Amsterdam : EAZA Executive Office, 295-297. 25. FALLON SM, RICKLEFS RE, SWANSON BL, BERMINGHAM E. (2003) Detecting avian malaria : an improved polymerase chain reaction diagnostic. J. Parasitol., 89(5), 1044-1047. 26. FALLON SM, RICKLEFS RE, LATTA SC, BERMINGHAM E. (2004) Temporal stability of insular avian malarial parasite communities. Proc. R. Soc. Lond., B271, 493- 500. 27. FANTHAM HB, PORTER A. (1944) On a Plasmodium (Plasmodium relictum var. spheniscidae n. var.) observed in four species of Penguins. Proc. Zool. Soc. Lond., 114, 279-292. 28. FIX AS, WATERHOUSE C, GREINER EC, STOSKOPF MK. (1988) Plasmodium relictum as a cause of avian malaria in wild-caught Magellanic penguins. J. Wildl. Dis., 24(4), 610-619. 29. FLEISCHMAN RW, SQUIRE RA, SLADEN WLJ, MELBY Jr EC. (1968a) Malaria (Plasmodium elongatum) in captive African penguins (Spheniscus demersus). J. Amer. Vet. Med. Assoc., 153(7), 928-935. 30. FLEISCHMAN RW, SQUIRE RA, SLADEN WLJ, MOORE J. (1968b) Pathologic confirmation of malaria (Plasmodium elongatum) in African penguins (Spheniscus demersus). Bull. Wildl. Dis. Assoc., 4, 133-135. 31. FRENKEL JK (1980) Protozoan diseases of zoo and captive mammals and birds. In : MONTALI RJ, MIGAKI G, editors. The Comparative Pathology of Zoo Animals. Washington D.C. : Smithsonian Institution Press, 329- 342. 32. FOPPA IM, SPIELMAN A. (2007) Does reservoir host mortality enhance transmission of West Nile virus ? Theoretical biology and medical modeling [en-ligne], mise à jour le 11 mai 2007 [http://www.tbiomed.com/content/4/1/17], (consulté le 14 décembre 2007). 33. FOWLER ME. (1978) Penguins, cranes, storks, and flamingos (Sphenisciformes, Gruiformes, Ciconiiformes, and Phoenicopteriformes) – Introduction and 190 identification, Penguins. In : Zoo and Wild Animal Medicine. Philadelphia : WB Saunders, 155-158. 34. FOWLER ME. (1995) Restraint and Handling of Wild and Domestic Animals. 2nd ed. Ames : Iowa State University Press, 383p. 35. GRACZYK TK, CRANFIELD MR. (1995) Maternal transfer of anti-Aspergillus spp. immunoglobulins in African black-footed penguins (Spheniscus demersus). J. Wildl. Dis., 31(4), 545-549. 36. GRACZYK TK, CRANFIELD MR. (1996) A model for the prediction of relative titers of avian malaria and Aspergillus spp. IgG in Jackass penguin (Spheniscus demersus) females based on maternal IgG in egg-yolk. International Journal for Parasitology, 26(7), 749-754. 37. GRACZYK TK, CRANFIELD MR, SHIFF CJ. (1993) ELISA method for detecting anti- Plasmodium relictum and anti-Plasmodium elongatum antibody in infected ducking sera using Plasmodium falciparum antigens. J. Parasitol., 79(6), 879- 885. 38. GRACZYK TK, CRANFIELD MR, McCUTCHAN TF, BICKNESE EJ. (1994a) Characteristics of naturally acquired avian malaria infections in naive juvenile African black-footed penguins (Spheniscus demersus). Parasitol. Res., 80, 634- 637. 39. GRACZYK TK, CRANFIELD MR, SHAW ML, CRAIG LE. (1994b) Maternal antibodies against Plasmodium spp. in African black-footed penguins (Spheniscus demersus) chicks. J. Wildl. Dis., 30(3), 365-371. 40. GRACZYK TK, CRANFIELD MR, SKJOLDAGER ML, SHAW ML. (1994c) An ELISA for detecting anti-Plasmodium spp. antibodies in African black-footed penguins (Spheniscus demersus). J. Parasitol., 80(1), 60-66. 41. GRACZYK TK, SHAW ML, CRANFIELD MR, BEALL FB. (1994d) Hematologic characteristics of avian malaria cases in African black-footed penguins (Spheniscus demersus) during the first outdoor exposure season. J. Parasitol., 80(2), 302-308. 42. GRACZYK TK, BROSSY JJ, PLOS A, STOSKOPF MK. (1995a) Avian malaria seroprevalence in Jackass penguins (Spheniscus demersus) in South Africa. J. Parasitol., 81(5), 703-707. 43. GRACZYK TK, COCKREM JF, CRANFIELD MR, DARBY JT, MOORE P. (1995b) Avian malaria seroprevalence in wild New Zealand penguins. Parasite, 2, 401- 405. 44. GRACZYK TK, CRANFIELD MR, BICKNESE EJ. (1995c) Evaluation of serum chemistry values associated with avian malaria infections in African black-footed penguins (Spheniscus demersus). Parasitol. Res., 81, 316-319. 45. GRIM KC, VAN DER MERWE E, SULLIVAN M, PARSONS N, McCUTCHAN TF, CRANFIELD M. (2003) Plasmodium juxtanucleare associated with mortality in black-footed penguins (Spheniscus demersus) admitted to a rehabilitation center. J. Zoo Wildl. Med., 34(3), 250-255. 46. GRIM KC, McCUTCHAN TM, LI J, SULLIVAN M, GRACZYK TK, McCONKEY GA, CRANFIELD M. (2004) Preliminary results of an anticircumsporozoite DNA vaccine trial for protection against avian malaria in captive African black-footed penguins (Spheniscus demersus). J. Zoo Wildl. Med., 35(2), 154-161. 47. GRINER LA. (1974) Some diseases of zoo animals. Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine, 18, 251-271.

191 48. GRINER LA. (1983) Pathology of zoo animals – A review of necropsies conducted over a fourteen-year period at the San Diego Zoo and San Diego Wild Animal Park. San Diego : Zoological Society of San Diego, 608p. 49. GROUPE D’ÉTUDE ET DE RECHERCHE DES ÉCOLOGISTES SAHARIENS (2003) Régions zoogéographiques. Site du Groupe d’Étude et de Recherche des Écologistes Sahariens [en-ligne], mise à jour le 04 avril 2003 [http://geres- asso.org/carte_regions_zoogeo.html], (consulté le 07 novembre 2007). 50. HERMAN CM, KOCAN RM, SNYDER EL, KNISLEY Jr JO. (1968) Plasmodium elongatum from a penguin. Bull. Wildl. Dis. Assoc., 4, 132. 51. HOOGESTEYN AL, CUNNINGHAM A. (1996) Development of an indirect immonufluorescent test for the detection of malaria antibodies in penguins (sphenisciformes). In : Proc. Amer. Assoc. Zoo Vet. Puerto Vallarta (Mexique), 3- 8 novembre 1996. A.A.Z.V., 584-585. 52. HUGH-JONES M. (1999) ProMED-mail – Malaria, zoo penguins – UK. In : 09-OCT-1999, 19991009.1805 [en-ligne], ISID [http://www.promedmail.org] (consulté le 07 novembre 2007). 53. HUGH-JONES M. (2000) ProMED-mail – Malaria, zoo penguins – UK. In : 21-JUN-2000, 20000621.1013??? [en-ligne], ISID [http://www.promedmail.org] (consulté le 07 novembre 2007). 54. ITIS. (2007) Integrated taxonomic information system. ITIS [en-ligne], mise à jour le 7 juin 2007 [http://www.itis.gov], (consulté le 12 novembre 2007). 55. JAMES AA. (2002) Engineering mosquito resistance to malaria parasites : the avian malaria model. Insect biochemistry and molecular biology, 32, 1317-1323. 56. JANOVY Jr J. (1997) Protozoa, helminths, and arthroppods of birds. In : CLAYTOON DH, MOORE J, editors. Host-Parasite Evolution – General Principles & Avian Models. Oxford : Oxford University Press, 303 - 337. 57. JARVI SI, SCHULTZ JJ, ATKINSON CT. (2002) PCR diagnostics underestimate the prevalence of avian malaria in experimenally-infected passerines. J. Parasitol., 88(1), 153-158. 58. JONES HI, SHELLAM GR. (1999a) Blood parasites in penguins, and their potential impact on conservation. Marine Ornithology, 27, 181-184. 59. JONES HI, SHELLAM GR. (1999b) The occurrence of blood-inhabiting protozoa in captive and free-living penguins. Polar Biol., 21, 5-10. 60. LAIRD M. (1950) Some blood parasites of New-Zealand birds. Zoology Publications, Victoria University College, 5, 1-20. 61. LANDAU I, CHABAUD AG, BERTANI S, SNOUNOU G. (2003) Taxonomic status and re-description of Plasmodium relictum (Grassi & Feletti, 1891), Plasmodium maior Raffaele, 1931, and description of P. bigueti n. sp. in sparrows. Parassitologia, 45, 119-123. 62. LECOINTRE G, LE GUYADER H. (2006) Classification phylogénétique du vivant. 3e ed. Paris : Belin, 559p. 63. LEGOUT S. (2006) Les membres de la société de pathologie exotique. Portail Institut Pasteur – Service des Archives [en-ligne], mise à jour le 10 mars 2006 [http://www.pasteur.fr/infosci/archives/f_spe2.html], (consulté le 07 novembre 2007). 64. LEVINE ND. (1985) Veterinary Protozoology. Ames : Iowa State University Press, 414p. 65. LI J, WIRTZ RA, McCONKEY GA, SATTABONGKOT J, WATERS AP, ROGERS MJ et al. (1995) Plasmodium : genus-conserved primers for species identification and quantitation. Experimental Parasitol., 81, 182-190. 192 66. LOMBARD E, BROSSY JJ, BLACKBEARD J. (1999) Malaria in an African penguin. British J. Heamatol., 106, 577. 67. MARTÍNEZ I. (1992) Family spheniscidae (penguins). In : DEL HOYO et al., editors. Handbook of the birds of the world – Volume 1 – Ostrich to Ducks. Barcelona : Lynx Edicions, 140 – 160. 68. McCONKEY GA, LI J, ROGERS MG, SEELEY DC, GRACZYK TK, CRANFIELD MR, McCUTCHAN TF. (1996) Parasite diversity in an endemic region for avian malaria and identification of a parasite causing penguin mortality. J. Euk. Microbiol., 43(5), 393-399. 69. McCUTCHAN TF, GRIM KC, LI J, WEISS W, RATHORE D, SULLIVAN M, et al. (2004) Measuring the effects of an ever-changing environnement on malaria control. Infection and Immunity, 72(4), 2248-2253. 70. McGHEE RB, SINGH SD, WEATHERSBY AB. (1977) Plasmodium gallinaceum : vaccination in chickens. Experimental Parasitology, 43(1), 231-238. 71. MERINO S, MORENO J, SANZ JJ, ARRIERO E. (2000) Are avian blood parasites pathogenic in the wild ? A medication experiment in blue tits (Parus caeruleus). Proc. R. Soc. Lond., B267, 2507-2510. 72. MILLER GD, HOFKIN BV, SNELL H, HAHN A, MILLER RD. (2001) Avian malaria and Marek’s disease : potential threats to Galapagos penguins Spheniscus mendiculus. Marine Ornithology, 29, 43-46. 73. NETTLESHIP DN. (1996). Family alcidae (auks). In : DEL HOYO et al., editors. Handbook of the birds of the world – Volume 3 – Hoatzin to Auks. Barcelona : Lynx Edicions, 678 – 722. 74. ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTÉ. (2007a) Paludisme – Aide-mémoire n°14. Site de l’Organisation Mondiale de la Santé [en-ligne], mise à jour le 12 mai 2007 [http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs094/fr/], (consulté le 07 novembre 2007). 75. ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTÉ. (2007b) Do all mosquitos transmit malaria ? – Ask the expert – On-line Q&A. Site de l’Organisation Mondiale de la Santé [en-ligne], mise à jour le 12 mai 2007 [http://www.who.int/features/qa/10/en/index.html], (consulté le 07 novembre 2007). 76. PARSONS NJ, UNDERHILL LG. (2005) Oiled and injured African penguins Spheniscus demersus and other seabirds admitted for rehabilitation in the Western Cape, South Africa, 2001 and 2002. African J. Marine Science, 27(1), 289-296. 77. PAUL REL, COULSON TN, RAIBAUD A, BREY PT. (2000) Sex determination in malaria parasites. Science, 287, 128-131. 78. PEIRCE MA. (2000) Hematozoa. In : SAMOUR J, editor. Avian medicine. London : Harcourt Publishers Limited, 245- 252. 79. PEIRCE MA. (2005) Pathogenic subspecies of Plasmodium relictum found in African birds. The Vet. Record, 156(10), 328. 80. PÉREZ-TRIS J, BENSCH S. (2005) Dispersal increases local transmission of avian malarial parasites. Ecology letters, 8, 838-845. 81. PÉREZ-TRIS J, HASSELQUIST D, HELLGREN O, KRIZANAUSKIENE A, WALDENSTRÖM J, BENSCH S. (2005) What are malaria parasites ? Trends Parasitol., 21(5), 209-211. 82. PENRITH ML, HUCHZERMEYER FW, DE WET SC, PENRITH MJ. (1994) Concurrent infection with Clostridium and Plasmodium in a captive king penguin, Aptenodytes patagonicus. Avian Pathology, 23, 373-380. 193 83. PERKINS SL, SCHALL JJ. (2002) A molecular phylogeny of malarial parasites recovered from cytochrome b gene sequences. J. Parasitol., 88(5), 972-978. 84. PETIT T. (1998) Penguin malaria survey. In : EEP Yearbook 1996/1997 including the Proceedings of the 14th EAZA/EEP Conference. Alphen a/d Rijn, 8-12 October 1997. Amsterdam : EAZA Executive Office, 481-482. 85. RAE MR. (1995) Hemoprotozoa of caged and aviary birds. Seminars in Avian and Exotic Pet Med., 4(3), 131-137. 86. REDROBE S. (1999) ProMED-mail – Malaria, zoo penguins – UK (02). In :11-OCT-1999, 19991011.1815 [en-ligne], ISID [http://www.promedmail.org] (consulté le 07 novembre 2007). 87. REECE SE, DUNCAN AB, WEST SA, READ AF. (2005) Host cell preference and variable transmission strategies in malaria parasites. Proc. R. Soc. Lond., B272, 511-517. 88. REWELL RE. (1948) Report of the pathologist for the year 1947. Proc. Zool. Soc. Lond., 118, 501-514. 89. RICHARD FA, SEHGAL RNM, JONES HI, SMITH TB. (2002) A comparative analysis of PCR-based detection methods for avian malaria. J. Parasitol., 88(4), 819-822. 90. RICKLEFS RE, FALLON SM. (2002) Diversification and host switching in avian malaria parasites. Proc. R. Soc. Lond., B269, 885-892. 91. RICKLEFS RE, FALLON SM, BERMINGHAM E. (2004) Evolutionary relationships, cospeciation, and host switching in avian malaria parasites. Syst. Biol., 53(1), 111- 119. 92. RICKLEFS RE, SWANSON BL, FALLON SM, MARTÍNEZ-ABRAÍN A, SCHEUERLEIN A, GRAY J et al. (2005) Community relationships of avian malaria parasites in southern Missouri. Ecological Monographs, 75(4), 543-559. 93. RODHAIN J. (1937) Une infection à Plasmodium chez Spheniscus demersus (Manchot du Cap). Annales de Parasitologie, 15(3), 253-258. 94. RODHAIN J. (1938a) Schizogonie sans pigment chez les pingouins infectés de Plasmodium praecox (relictum). C.R. de la Soc. de Biol., 127, 368-372. 95. RODHAIN J. (1938b) Schizogonie sans pigment chez un pingouin expérimentalement infecté de Plasmodium praecox (relictum). C.R. de la Soc. de Biol., 127, 838-841. 96. RODHAIN J. (1939) L’infection à Plasmodium relictum chez les pingouins. Annales de Parasitologie, 17(2), 139-157. 97. RODHAIN J, ANDRIANNE VF. (1952) Deux nouveaux cas d’infestation par Plasmodium chez les pingouins. Annales de Parasitologie, 27(6), 573-577. 98. SAVAGE AF, ARIEY F, GREINER EC. (2005) A new species of Plasmodium from Malagasy Vangas. J. Parasitol., 91(4), 926-930. 99. SCHULTZ A, WHITTINGTON P. (2005) High prevalence of avian malaria infection to avifauna at Cape Receife, Eastern Cape, South Africa. Ostrich, 76(1&2), 56-60. 100. SCOTT H. (1927) Report on the deaths occuring in the Society’s Gardens during the year 1926. Proc. Zool. Soc. Lond., 1927, 173-198. 101. SKOTARCZAK B, RYMASZEWSKA A, WODECKA B, SAWCZUK M, ADAMSKA M, MACIEJEWSKA A. (2006) PCR detection of granulocytic Anaplasma and Babesia in Ixodes ricinus ticks and birds in west-central Poland. Ann. Agric. Environ. Med., 13, 21-23. 102. SMITH SA. (1996) Parasites of birds of prey : their diagnosis an treatment. Seminars in Avian and Exotic Pet Med., 5(2), 97-105. 103. SMYTH JD. (1994) Introduction to animal parasitology. 3rd ed. Cambridge : Cambridge University Press, 569p.

194 104. SPRINGER WT. (1997) Protozoa – Other blood and tissue protozoa. In : CALNEK BW, editor. Diseases of poultry. 10th ed. Ames : Iowa State University Press, 900- 911. 105. STOSKOPF MK, BEALL FB. (1980) The husbandry and medicine of captive penguins. Proc. Amer. Assoc. Zoo Vet., 11, 81-96 106. STOSKOPF MK, BEIER BA. (1979) Avian malaria in African black-footed penguins. J. Amer. Vet. Med. Assoc., 175(9), 944-947. 107. STURROCK HJW, TOMPKINS DM. (2007) Avian malaria (Plasmodium spp) in yellow- eyed penguins : investing the cause of high seroprevalence but low observed infection. New Zealand Vet. J., 55(4), 158-160. 108. TODD FS. (1978) Penguin husbandry and breeding at Sea World, San Diego. International Zoo Yearbook, 18, 72-77. 109. TOFT CA, KARTER AJ. (1990) Parasit-host coevolution. Tree, 5(10), 326-329. 110. TOLLINI J, BROCKSEN A, SUREDA N. (2000) Prevention and treatment of avian malaria in a captive penguin colony. Penguin Conservation, 13(1), 28-31. 111. URQUHART GM, ARMOUR J, DUNCAN JL, DUNN AM, JENNINGS FW. (1996) Veterinary Parasitology. 2nd ed. Glasgow : Blackwell Publishing Professional, 320p. 112. VALKIUNAS G. (2005) Avian Malaria Parasites and Other Haemosporidia. Boca Raton : CRC Press, 934p. 113. VALKIUNAS G, ZEHTINDJIEV P, HELLGREN O, ILIEVA M, IEZHOVA TA, BENSCH S. (2007) Linkage between mitochondrial cytochrome b lineages and morphospecies of two avian malaria parasites, with a description of Plasmodium (Novyella) ashfordi sp. nov. Parasitol. Res., 100(6), 1311-1322. 114. VAN DER HEYDEN N. (1996) Hemoparasites. In : ROSSKOPF Jr WJ, WOERPEL RW, editors. Diseases of cage and aviary birds. 3rd ed. Baltimore : Williams & Wilkins, 627- 629. 115. WESTERDAHL H, WALDENSTRÖM J, HANSSON B, HASSELQUIST D, VON SCHANTZ T, BENSCH S. (2005) Associations between malaria and MHC genes in a migratory songbird. Proc. R. Soc. Lond., B272, 1511-1518. 116. WOOD MJ, COSGROVE CL. (2006) The hitchhiker’s guide to avian malaria. Trends Ecol. Evol., 21(1), 5-7.

Textes réglementaires : 117. MINISTÈRE DE L’ÉCOLOGIE ET DU DÉVELOPPEMENT DURABLE. (2003) Décrets, arrêtés, circulaires – Textes généraux – Arrêté du 4 novembre 2003 relatif à l'usage des appeaux et des appelants pour la chasse des oiseaux de passage et du gibier d'eau et pour la destruction des animaux nuisibles. Journal officiel de la République Française – Site de Légifrance [en-ligne], mise à jour le 9 décembre 2003 [http://legifrance.gouv.fr/WAspad/Visu?cid=632750&indice=1&table=JORF&lig neDeb=1], (consulté le 14 novembre 2007). 118. MINISTÈRE DE L’ÉCOLOGIE ET DU DÉVELOPPEMENT DURABLE. (2007) Décrets, arrêtés, circulaires – Textes généraux – Arrêté du 29 janvier 2007 fixant les dispositions relatives au piégeage des animaux classés nuisibles en application de l’article L. 427-8 du code de l’environnement. Journal officiel de la République Française [en-ligne], mise à jour le 18 avril 2007 [http://www.oncfs.gouv.fr/events/droit_jurisprudence/jo180407_31.pdf], (consulté le 14 novembre 2007).

195

196 ANNEXES

197 198 Annexe 1 : carte des zones zoogéographiques

Figure (i) (D’après le site internet du Groupe d’Étude et de Recherches des Écologistes Sahariens, http://geres-asso.org/carte_regions_zoogeo.html)

• N.B. (1) : la zone holarctique correspond à l’ensemble formé par les zones néarctique et paléarctique, c’est-à-dire les régions terrestres situées au Nord du tropique du Cancer. • N.B. (2) : une dernière zone, la zone Antarctique, ne figure pas sur cette carte.

199 200 Annexe 2 : position systématique et sous-genres de Plasmodium Figure (ii) (d’après VALKIUNAS, 2005)

N.B. : pour plus de lisibilité, un seul embranchement a été représenté (il en existe 7).

201 202 Annexe 3 : distribution des espèces de Plasmodium dans les différents ordres d’oiseaux qu’ils peuvent infecter Tableau (i) (d’après, VALKIUNAS, 2005 sauf (1) GRIM et al., 2003) ; (2) PEIRCE, 2005 ; (3) SPRINGER, 1997 ; (4) LANDAU et al., 2003 ; (5) SAVAGE et al., 2005 ; (6) CHAVATTE et al., 2007 ; (7) VALKIUNAS et al., 2007)

N.B. : l’auteur n’a pas précisé sur quelle classification il s’était appuyé pour la réalisation de ce tableau. Le lecteur ne manquera pas, toutefois, de remarquer des différences avec la classification phylogénétique proposée sur la figure 2 (certains ordres n’y figurent pas ou ont au contraire disparu). De plus, les ordres pour lesquels aucune espèce de Plasmodium n’a été décrite ne sont pas repris dans ce tableau, dans un souci de clarté et de concision.

Ordre Espèces de Plasmodium Sphénisciformes Plasmodium relictum Plasmodium elongatum (1) Plasmodium juxtanucleare

Tinamiformes Plasmodium relictum Plasmodium polare Plasmodium pedioecetae (2) Pélécaniformes Plasmodium relictum Plasmodium circumflexum Ciconiiformes Plasmodium relictum Plasmodium vaughani Plasmodium nucleophilum Plasmodium elongatum Ansériformes Plasmodium relictum Plasmodium circumflexum Plasmodium polare Plasmodium anasum Plasmodium hegneri Plasmodium gabaldoni Plasmodium vaughani Plasmodium nucleophilum Plasmodium elongatum Falconiformes Plasmodium relictum Plasmodium fallax Plasmodium circumflexum Plasmodium polare Plasmodium elongatum

203 Galliformes Plasmodium relictum (3) Plasmodium cathemerium Plasmodium gallinaceum Plasmodium griffithsi Plasmodium tejerai Plasmodium coturnixi Plasmodium fallax Plasmodium circumflexum Plasmodium polare Plasmodium lophurae Plasmodium durae Plasmodium pedioecetae Plasmodium pinottii Plasmodium formosanum Plasmodium rouxi Plasmodium kempi Plasmodium juxtanucleare (3) Plasmodium elongatum

Plasmodium hermani Turniciformes Plasmodium vaughani Gruiformes Plasmodium relictum Plasmodium cathemerium Plasmodium lutzi Plasmodium formosanum Plasmodium vaughani Plasmodium rouxi Plasmodium bertii Plasmodium elongatum Charadriiformes Plasmodium relictum Plasmodium circumflexum Columbiformes Plasmodium relictum Plasmodium cathemerium Plasmodium circumflexum Plasmodium polare Plasmodium lophurae Plasmodium gabaldoni Plasmodium vaughani 204 Plasmodium columbae Plasmodium nucleophilum Plasmodium dissanaikei Plasmodium elongatum Psittaciformes Plasmodium relictum Plasmodium circumflexum Plasmodium vaughani Plasmodium nucleophilum Plasmodium dissanaikei Cuculiformes Plasmodium relictum Plasmodium vaughani Musophagiformes Plasmodium vaughani Strigiformes Plasmodium subpraecox Plasmodium fallax Plasmodium gundersi Plasmodium hexamerium Plasmodium elongatum Caprimulgiformes Plasmodium relictum Plasmodium cathemerium Plasmodium polare Apodiformes Plasmodium relictum Plasmodium cathemerium Plasmodium rouxi Coraciiformes Plasmodium relictum Plasmodium circumflexum Plasmodium garnhami Plasmodium vaughani Piciformes Plasmodium relictum Plasmodium cathemerium Plasmodium circumflexum Plasmodium pinottii Plasmodium vaughani Plasmodium rouxi Plasmodium nucleophilum Plasmodium huffi Passériformes Plasmodium relictum Plasmodium cathemerium

205 Plasmodium matutinum Plasmodium giovannolai Plasmodium fallax Plasmodium circumflexum Plasmodium polare Plasmodium pinottii Plasmodium octamerium Plasmodium leanucleus Plasmodium vaughani Plasmodium rouxi Plasmodium hexamerium Plasmodium nucleophilum Plasmodium paranucleophilum Plasmodium elongatum (4) Plasmodium maior (4) Plasmodium bigueti (5) Plasmodium parvulum (6) Plasmodium ghadiriani (6) Plasmodium tranieri (6) Plasmodium lenoblei (6) Plasmodium dherteae (6) Plasmodium valkiunasi (6) Plasmodium snounoui (6) Plasmodium golvani (6) Plasmodium dorsti (6) Plasmodium bioccai (6) Plasmodium beaucournui (7) Plasmodium ashfordi (2) Phénicoptériformes Plasmodium relictum

206 Annexe 4 : lexique de protozoologie (d’après BUSSIERAS & CHERMETTE, 1991, 1992 ; VALKIUNAS, 2005)

N.B. : les renvois sont indiqués en gras.

Anisogamie : fusion de 2 gamètes très différents, ce qui permet de distinguer alors les gamètes femelles (macrogamètes) des gamètes mâles (microgamètes).

Cryptozoïte : nom donné à un méronte de première génération dans la mérogonie pré- érythrocytaire. (N.B. : l’utilisation du suffixe « -zoïte » est ici impropre, mais le terme a été consacré par l’usage.)

Cycle hétéroxène : cycle parasitaire à deux ou plusieurs hôtes. On définit un hôte définitif (qui héberge les formes adultes, sexuées du parasite) et un hôte intermédiaire (qui héberge des formes de développement et permet leur évolution). L’hôte intermédiaire peut être facultatif ou obligatoire.

Endodyogénie : bourgeonnement, observé chez les sporozoaires, de 2 cellules-filles à l’intérieur de la cellule-mère, qui est ensuite détruite.

Endopolygénie : bourgeonnement, observé chez les sporozoaires, de plus de 2 cellules-filles à l’intérieur de la cellule-mère, qui est ensuite détruite.

Gamète : produit de la gamétogonie. La fusion de 2 gamètes (syngamie) produit un œuf (ou zygote).

Gamétocyte : (= gamonte) produit de la transformation du trophozoïte au cours de la gamétogonie, qui donnera un ou plusieurs gamètes.

Gamétogonie : reproduction sexuée, au cours de laquelle le trophozoïte se transforme en un gamonte (ou gamétocyte), qui donnera un ou plusieurs gamètes.

Gamonte : (= gamétocyte) produit de la transformation du trophozoïte au cours de la gamétogonie, qui donnera un ou plusieurs gamètes.

Hypnozoïte : nom donné à une forme latente du protozoaire.

Isogamie : fusion de 2 gamètes identiques.

Kyste : élément de résistance formé par la production d’une épaisse coque entourant le protozoaire dans sa totalité, et élaborée par lui-même. Le kyste peut se former à partir d’un œuf (on parle alors d’ookyste ou oocyste) ou d’un trophozoïte (on parle alors de kyste végétatif).

Kyste végétatif : kyste formé à partir d’un trophozoïte.

Macrogamète : gamète femelle (lors d’anisogamie).

Mérogonie : (= schizogonie) division multiple consistant en de nombreuses divisions noyau, transformant le trophozoïte en méronte, suivies de divisions cytoplasmiques puis d’endodyogénies qui dédoublent les cellules-filles obtenues.

207 Méronte : (= schizonte) lors de la mérogonie, produit issu de la transformation du trophozoïte, contenant plusieurs noyaux en division. Le méronte donne (à la suite de divisions cytoplasmiques puis d’endodyognies) des cellules-filles appelées mérozoïtes.

Mérozoïtes (= schizozoïtes) cellules-filles issues de la mérogonie.

Métacryptozoïte : nom donné à un méronte de deuxième génération dans la mérogonie pré- érythrocytaire. (N.B. : l’utilisation du suffixe « -zoïte » est ici impropre, mais le terme a été consacré par l’usage.)

Microgamète : gamète mâle (lors d’anisogamie).

Œuf : (= zygote) produit de la fusion de 2 gamètes (syngamie).

Oocyste : (= ookyste) kyste formé à partir d’un œuf.

Ookinète : nom donné à l’œuf mobile des plasmodidés après sa tranformation.

Ookyste : (= oocyste) kyste formé à partir d’un œuf.

Phanérozoïte : nom donné à un mérozoïte issu de la mérogonie exoérythrocytaire secondaire.

Schizogonie : (= mérogonie) terme impropre désignant une division multiple consistant en de nombreuses divisions noyau, transformant le trophozoïte en schizonte (ou méronte), suivies de divisions cytoplasmiques puis d’endodyogénies qui dédoublent les cellules-filles obtenues. Préférer les termes de mérogonie, mérozoïte et méronte à ceux de schizogonie, schizozoïte et schizonte.

Schizonte : (= méronte) terme impropre désignant, lors de la schizogonie, le produit issu de la transformation du trophozoïte, contenant plusieurs noyaux en division. Le schizonte donne (à la suite de divisions cytoplasmiques puis d’endodyognies) des cellules-filles appelées schizozoïtes. Préférer les termes de mérogonie, mérozoïte et méronte à ceux de schizogonie, schizozoïte et schizonte.

Schizozoïtes : (= mérozoïtes) cellules-filles issues de la schizogonie. Préférer les termes de mérogonie, mérozoïte et méronte à ceux de schizogonie, schizozoïte et schizonte.

Spores : formes de résistance, à paroi épaisse, se formant à l’intérieur du protozoaire, voire à l’intérieur d’un kyste. Leur production peut se faire par sporogonie.

Sporogonie : série de divisions asexuées suivant la fécondation, et aboutissant à la formation de spores ou de sporozoïtes.

Sporozoïte : forme unicellulaire et allongée du parasite, obtenue par sporogonie à partir d’un ookyste, et constituant la forme infectieuse pour l’hôte définitif.

Syngamie : fusion de deux gamètes, aboutissant à la formation d’un œuf (ou zygote).

Trophozoïte : nom donné au stade adulte du protozoaire, hors reproduction. Il est souvent haploïde chez les sporozoaires.

Zygote : ( = œuf) produit de la fusion de 2 gamètes (syngamie).

208 Annexe 5 : principales différences entre manchots et pingouins Tableau (ii) (d’après MARTÍNEZ, 1992 ; NETTLESHIP, 1996)

Manchots Pingouins

Nom anglais Penguins Auks / Razorbill

Ordre Sphénisciformes Charadriiformes

Famille Sphéniscidae Alcidae

Répartition Hémisphère sud (+ îles Hémisphère nord géographique Galapagos sur l’Équateur) uniquement

Vol Non Oui

Marsouinage Oui Non

Propulsion lors de Ailes Pattes la nage

Taille 40 à 115 cm 12 à 43 cm

Cou Très court Plus marqué

209

210 Annexe 6 : classification des manchots Tableau (iii) (d’après AVIBASE, 2007 ; MARTÍNEZ, 1992 ; ITIS, 2007)

Nom courant Genre Espèce Nom courant (anglais) (français) Aptenodytes Manchot royal King penguin Aptenodytes patagonicus Aptenodytes Manchot Emperor penguin forsteri empereur Pygoscelis Pygoscelis papua Manchot papou Gentoo penguin Manchot Pygoscelis adeliae Adelie penguin d’Adélie Pygoscelis Manchot à Chinstrap penguin (ou Bearded/Ringed antarctica jugulaire penguin) Fiordland penguin (ou Thick- Eudyptes Gorfou de billed/Victoria/New-Zealand/Fiordland Eudyptes pachyrhynchus Fiordland crested penguin) Gorfou des Snares penguin (ou Snares crested Eudyptes robustus Snares penguin) Erect-crested penguin (ou Big-crested Eudyptes sclateri Gorfou huppé penguin) Eudyptes Gorfou sauteur Rockhopper penguin chrysocome Gorfou de Eudyptes schlegeli Royal penguin Schlegel Eudyptes Gorfou doré Macaroni penguin chrysolophus Megadyptes Manchot Yellow-eyed penguin Megadyptes antipodes antipode Little penguin (ou Fairy/Blue/Little blue Eudyptula minor Manchot pygmée Eudyptula penguin) Eudyptula (minor) Manchot à White-flippered penguin albosignata ailerons blancs Spheniscus Jackass penguin (ou African Black- Manchot du Cap Spheniscus demersus footed penguin, ou Cape penguin) Spheniscus Manchot de Humboldt penguin (ou Peruvian humboldti Humboldt penguin) Spheniscus Manchot de Magellanic penguin magellanicus Magellan Spheniscus Manchot des Galapagos penguin mendiculus Galapagos

211 212 Annexe 7 : taille et poids des différentes espèces de manchots Tableau (iv) (d’après CRANFIELD, 2003)

Espèce Hauteur (cm) Poids (kg)

Aptenodytes forsteri 100-130 30-38

Aptenodytes patagonicus 85-95 12-14

Eudyptes chrysocome 45-58 2,5-3,5

Eudyptes chrysolophus 71 5,0-6,0

Eudyptes pachyrhynchus 55 3,4-3,7

Eudyptes schlegeli 65-70 5,0-6,0

Eudyptes robustus 51-61 2,8-3,4

Eudyptes sclateri 67 4,0-6,0

Euduyptula minor 41-45 1

Pygoscelis adeliae 70 3,7-4,0

Pygoscelis antarctica 71-76 3,9-4,4

Pygoscelis papua 75-90 5-5,5

Megadyptes antipodes 56-78 4,5-6,0

Spheniscus demersus 70 3,0-3,5

Spheniscus humboldti 65 4

Spheniscus magellanicus 70 4

Spheniscus mendiculus 53 2,0-2,5

Eudyptula minor 40,6 1,8 – 2,7

213

214 Annexe 8 : valeurs de référence en hématologie pour quatre espèces de manchots Tableau (v) (d’après CRANFIELD, 2003)

Spheniscus Speniscus Pygoscelis Aptenodytes Paramètre Unité demersus humboldti papua patagonicus Numération x103/µ 16,09 ± 8,053 26,49 ± 11,43 14,35 ± 7,392 2,64 ± 4,429 (46) leucocytaire L (232) (812) (35) Numération x103/µ 1,86 ± 0,48 (186) 2,15 ± 0,54 (113) 2,92 ± 0,94 (6) 1,49 ± 0,36 (7) érythrocytaire L Taux d’ g/dL 13,7 ± 3,5 (176) 15,2 ± 2,2 (404) 17,3 ± 2,6 (27) 16,7 ± 1,4 (29) hémoglobine Hématocrite % 46,1 ± 7,4 (345) 48,9 ± 6,7 (875) 47,8 ± 5,2 (44) 47,8 ± 5,3 (35) T.G.M.H. pg 79,7 ± 16 (129) 81,4 ± 17,8 (69) 89,6 ± 45,1 (4) 103,9 ± 8,7 (5) C.C.M.H. g/dL 31,4 ± 5,1 (172) 30,9 ± 2,7 (401) 37,2 ± 4,2 (26) 35,3 ± 3,9 (29) 249,2 ± 50,2 241,5 ± 52,4 V.G.M. fL 185 ± 68,8 (6) 262,2 ± 36,1 (6) (178) (111) x103/µ 8,955 ± 4,927 14,85 ± 6,824 7,948 ± 3,776 5,455 ± 3,811 Hétérophiles L (229) (812) (46) (31) x103/µ 6,203 ± 4,716 9,578 ± 6,293 4,405 ± 1,678 6,766 ± 5,487 Lymphocytes L (230) (812) (46) (35) x103/µ 0,734 ± ,883 1,37 ± 1,282 0,632 ± 0,587 Monocytes 0,26 ± 0,196 (22) L (150) (668) (28) x103/µ 0,435 ± 0,366 0,644 ± 0,796 0,225 ± 0,121 Éosinophiles 0,226 ± 0,17 (21) L (103) (430) (19) x103/µ 0,422 ± 0,374 0,68 ± 0,533 0,746 ± 0,565 Basophiles 0,144 ± 0,051 (5) L (108) (455) (27) x103/µ Plaquettes 108 ± 71 (7) N.D. N.D. N.D. L N.D. : non déterminé

Entre parenthèses : nombre d’individus à partir desquels les valeurs ont été obtenues.

215 216 Annexe 8’ : valeurs de référence en biochimie sanguine pour quatre espèces de manchots Tableau (vi) (d’après CRANFIELD, 2003)

Spheniscus Speniscus Pygoscelis papua Aptenodytes Paramètre Unité demersus humboldti patagonicus Glucose mg/L 223 ± 40 (192) 245 ± 47 (1081) 250 ± 30 (39) 254 ± 35 (36) Urée mg/L 4 ± 2 (123) 4 ± 1 (926) 4 ± 1 (22) 4 ± 2 (26) Créatinine mg/L 0,4 ± 0,2 (73) 0,4 ± 0,2 (865) 0,1 ± 0,1 (36) 0,4 ± 0,1 (30) Acide urique mg/L 11,2 ± 8,2 (185) 7,9 ± 5,3 (1163) 10,4 ± 6,2 (39) 10,6 ± 6,3 (36) Calcium mg/L 10,7 ± 2,3 (187) 11,1 ± 2,3 (1142) 10,5 ± 0,8 (38) 10,8 ± 1,3 (35) Phosphore g/dL 3,9 ± 2,1 (141) 4 ± 2 (979) 10,1 ± 0 (1) 3,6 ± 1,9 (32) Sodium mg/L 150 ± 5 (114) 152 ± 6 (1150) 161 ± 5 (21) 157 ± 5 (30) mEq/ Potassium 4,5 ± 1,4 (111) 3,9 ± 1 (1026) 2,6 ± 1,3 (22) 3 ± 1,1 (31) L mEq/ Chlore 111 ± 4 (107) 112 ± 5 (914) 110 ± 6 (20) 110 ± 6 (29) L mEq/ HCO 31 ± 25 (3) N.D. 29,3 ± 6,5 (21) N.D. 3 L Fer Mg/L 45 ± 0,7 (5) 148 ± 56 (68) N.D. 213 ± 15 (2) Magnésium mg/L 2,38 ± 1,4 (2) 2,35 ± 0,53 (133) N.D. N.D. Cholestérol mg/L 307 ± 97 (123) 262 ± 77 (956) 359 ± 36 (20) 357 ± 110 (31) Triglycérides mg/L 288 ± 598 (65) 110 ± 221 (650) 119 ± 61 (21) 114 ± 45 (9) Protéines g/dL 5,3 ± 0,9 (210) 5,5 ± 0,7 (1059) 5,8 ± 0,9 (22) 5,2 ± 0,6 (33) totales (C) Albumine g/dL 2,1 ± 0,6 (144) 1,7 ± 0,3 (962) 0,6 ± 0 (1) 1,8 ± 0,3 (32) (C) Globulines g/dL 3,4 ± 0,6 (146) 3,8 ± 0,7 (954) N.D. 3,4 ± 0,6 (32) (C) ASAT UI/L 183 ± 103 (189) 191 ± 83 (1087) 208 ± 114 (37) 217 ± 52 (35) ALAT UI/L 127 ± 111 (123) 36 ± 21 (977) 117 ± 141 (20) 60 ± 31 (28) Bilirubine mg/d 0,3 ± 0,2 (63) 0,5 ± 0,6 (785) 0,8 ± 0,8 (21) 0,2 ± 0,3 (26) totale L Bilirubine mg/d 0 ± 0 (11) 0 ± 0,1 (450) 0,7 ± 0 (1) 0 ± 0 (8) conjuguée L Bilirubine mg/d 0,3 ± 0,2 (11) 0,6 ± 0,7 (437) 2,1 ± 0 (1) 0,2 ± 0,4 (8) libre L Amylase U/L 2384 ± 959 (18) 1359 ± 363 (8) N.D. 444 ± 83 (3) PAL UI/L 193 ± 253 (123) 168 ± 119 (980) 129 ± 71 (6) 148 ± 59 (29) LDH UI/L 400 ± 435 (125) 226 ± 168 (779) 476 ± 266 (17) 185 ± 188 (17) C.K. UI/L 455 ± 593 (132) 236 ± 219 (310) 522 ± 701 (21) 316 ± 231 (18) mg/d α1-globuline 0,4 ± 0,7 (7) 0 (16) N.D. 0,2 ± 0 (1) L mg/d α2-globuline 0,7 ± 0,4 (7) 0,6 ± 0,1 (16) N.D. 0,8 ± 0 (1) L

217 mg/d β-globuline 0,9 ± 0,3 (7) 0,8 ± 0,3 (16) N.D. 0,7 ± 0 (1) L mg/d Fibrinogène 293 ± 256 (14) N.D. N.D. N.D. L mEq/ CO 24,6 ± 5,3 (85) 26,7 ± 5,2 (121) N.D. N.D. 2 L γ-GT UI/L 7 ± 9 (25) 8 ± 5 (99) N.D. N.D. Plomb µg/dL 30 ± 0 (1) N.D. N.D. N.D. Lipase U/L 46 ± 63 (6) N.D. N.D. N.D. T4 totale µg/dL 0,9 ± 0,3 (7) N.D. N.D. N.D. Fixation protéique de % 38 ± 5 (5) N.D. N.D. N.D. la T3 3556 ± 1699 α-tocophérol µg/dL N.D. N.D. N.D. (208) γ-tocophérol µg/dL N.D. 98 ± 84 (35) N.D. N.D. Albumine g/dL 0,5 ± 0 (1) 2,5 ± 0,2 (4) 2,5 ± 0,5 (21) N.D. (E) γ-globuline g/dL 1,2 ± 0,7 (14) 0,6 ± 0,3 (6) N.D. N.D. N.D. : non déterminé

Entre parenthèses : nombre d’individus à partir desquels les valeurs ont été obtenues.

218 Annexe 9 : plan de l’enclos des manchots du zoo de La Palmyre Figure (iii)

3,9 m

m 9 7,3 m 5,

13,2 m

20,8m

219 220 Annexe 10 : liste des puisards inaccessibles au zoo de La Palmyre

221 222 Annexe 10’ : liste des regards accessibles et autres points d’eau au zoo de La Palmyre

223 224 Annexe 11 : inventaire des spécimens de manchots présents au zoo de La Palmyre au cours de l’étude

225

226

227

228

229

230

231

232

233 234 Annexe 12 : nature et dates des prélèvements effectués sur Spheniscus demersus dans le cadre de la première expérience Tableau (vii)

Identification Date du 1er Date du 2ème Date du Date du Date du (quatre Date de prélèvement prélèvement 1er 2ème 3ème Remarques derniers l’autopsie sanguin sur sanguin sur caractères du frottis frottis frottis transpondeur) EDTA EDTA 8976 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. D18C 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 3817 16/11/06 4/05/07 25/07/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. 3895 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. F142 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 1597 16/11/06 4/05/07 25/07/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. 5952 4/05/07 N.E. N.E. 12/07/07 4/05/07 12/07/07 Décédé. 4212 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 6373 16/11/06 4/05/07 25/07/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. 6CEO 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 2047 4/05/07 25/07/07 16/08/07 16/08/07 4/05/07 16/08/07 Décédé. 5401 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 4F26 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. F4F6 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. Octobre R.A.S. 041B 4/05/07 25/07/07 N.E. 4/05/07 N.E. 2007 OA1F 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 7307 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 8878 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 2077 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 28ED 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. EC20 4/05/07 N.E. N.E. 5/07/07 4/05/07 N.E. Décédé. 3130 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 3866 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. BA14 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 1532 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. F691 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 7292 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 2582 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 5545 16/11/06 4/05/07 25/07/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. 7753 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 86BB 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. OO16 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 093E 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 2759 4/05/07 25/07/07 N.E. 31/07/07 4/05/07 N.E. Décédé. CF51 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S.

235 Identification Date du 1er Date du 2ème (quatre Date du Date du Date du er ème ème Date de prélèvement prélèvement derniers 1 2 3 Remarques l’autopsie sanguin sur sanguin sur caractères du frottis frottis frottis transpondeur) EDTA EDTA 4624 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 2784 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 5916 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. E1CC 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 3071 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. OD69 4/05/07 25/07/07 N.E. N.E. 4/05/07 N.E. R.A.S. 7264 16/11/06 4/05/07 25/07/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. 9102 25/07/07 N.E. N.E. 1/09/07 25/07/07 N.E. Décédé. Crise convulsive 6601 25/07/07 20/08/07 26/08/07 26/08/07 25/07/07 N.E. le 20/08 puis décès le 26/08. N.E. : non effectué. R.A.S. : rien à signaler.

236 Annexe 13 : nature et dates des prélèvements effectués sur divers oiseaux en présentation au zoo de La Palmyre, dans le cadre de la deuxième expérience Tableau (viii)

Date du 1er Date du 2ème Spécimen Date du Remarques / (bague, ou er Date du Date de prélèvement prélèvement Espèce numéro 1 causes des 2ème frottis l’autopsie sanguin sur sanguin sur d’identification frottis décès interne) EDTA EDTA Anser Données Prédation par N.E. N.E. 24/06/07 N.E. N.E. indicus manquantes. un renard ? Anser Données Goutte N.E. N.E. 10/04/07 N.E. N.E. indicus manquantes. articulaire. Anser Données Goutte N.E. N.E. 29/01/07 N.E. N.E. indicus manquantes. articulaire. Ara Non Hépatite et N.E. N.E. 1/03/07 N.E. N.E. chloropterus identifié. péritonite. Données Prédation par Ara macao N.E. N.E. 19/04/07 N.E. N.E. manquantes. un renard. Balearica Données N.E. N.E. 28/04/07 N.E. N.E. R.A.S. regulorum manquantes. Ciconia V18 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. ciconia Ciconia Non N.E. N.E. 12/04/07 N.E. N.E. Péritonite. ciconia identifié. Ciconia Non N.E. N.E. 1/05/07 N.E. N.E. Intoxication. ciconia identifié. Eudocimus 3815 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ruber Eudocimus 3819 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ruber Eudocimus 3814 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ruber Eudocimus 3764 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ruber Eudocimus 3813 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ruber Eudocimus 3769 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ruber Eudocimus 2939 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ruber Eudocimus 3816 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ruber Eudocimus 3766 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ruber Eudocimus 4501 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. Juvénile. ruber Gyps Données N.E. N.E. 13/03/07 N.E. N.E. R.A.S. rueppellii manquantes. Musophaga Données N.E. N.E. 4/02/07 N.E. N.E. Pneumonie. rossae manquantes. Pelecanus Bague 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. Blessé. onocrotalus jaune Données Ph. chilensis N.E. N.E. 6/01/07 N.E. N.E. Noyade. manquantes. 237 Date du 1er Date du 2ème Spécimen Date du Remarques / (bague, ou er Date du Date de prélèvement prélèvement Espèce numéro 1 causes des 2ème frottis l’autopsie sanguin sur sanguin sur d’identification frottis décès interne) EDTA EDTA Ph. chilensis FXX N.E. N.E. 21/03/07 N.E. N.E. R.A.S. Ph. chilensis CAY R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis PRU R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AXY R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AKG V 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AXH B 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AFF R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis PGG R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis CFU B 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis NXT R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AYZ R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis XNN R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AYK B 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AYF R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis CAV R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AHV R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis CAP R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AYK R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis CST B 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis ARG V 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis ART V 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis FHW B 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis PHT R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AZS R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AXU V 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis CAU R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis NSK R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis AYG R 16/11/06 4/05/07 N.E. 16/11/06 4/05/07 R.A.S. Ph. chilensis ATG B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AHU B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis ARY V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis ACC B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis FHT B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis ACP B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AYP V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AGT R 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AWF B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AKV V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis FHZ B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AFR V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis FHX B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AWZ R 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AHC B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AKN V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AZV V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis ASV V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S.

238 Date du 1er Date du 2ème Spécimen Date du Remarques / (bague, ou er Date du Date de prélèvement prélèvement Espèce numéro 1 causes des 2ème frottis l’autopsie sanguin sur sanguin sur d’identification frottis décès interne) EDTA EDTA Ph. chilensis ARR V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis CAF R 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis FAU B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis ARV V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AUS V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. chilensis AAY V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. ruber AFP B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. ruber AHUB 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. ruber AGH V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. ruber AUC V 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. ruber ACV B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. ruber FHA B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Ph. ruber FFX B 16/11/06 N.E. N.E. 16/11/06 N.E. R.A.S. Plegadis 4111 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. Juvénile. falcinellus Plegadis 3807 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. falcinellus Plegadis 2776 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. falcinellus Plegadis 3808 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. falcinellus Plegadis 478 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. falcinellus Plegadis 2772 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. falcinellus Plegadis 477 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. falcinellus Plegadis 2775 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ridgwayi Plegadis 3810 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ridgwayi Plegadis 2774 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ridgwayi Plegadis 2777 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ridgwayi Plegadis 3809 16/08/07 N.E. N.E. 16/08/07 N.E. R.A.S. ridgwayi Psittacus Données N.E. N.E. 12/02/07 N.E. N.E. R.A.S. erithacus manquantes. Ph. : Phoenicopterus. N.E. : non effectué. R.A.S. : rien à signaler.

239 240 Annexe 14 : extraits de textes réglementaires fixant les dispositions relatives au piégeage des animaux classés nuisibles (d’après MINISTÈRE DE L’ÉCOLOGIE ET DU DÉVELOPPENT DURABLE, 2003, 2007)

En gras : quelques points importants dans le cadre de notre étude.

Arrêté du 4 novembre 2003 relatif à l'usage des appeaux et des appelants pour la chasse des oiseaux de passage et du gibier d'eau et pour la destruction des animaux nuisibles

Article 1

Au sens du présent arrêté, les termes : « appeau », « appelant artificiel » et « appelant » sont définis comme suit :

Appeau : instrument utilisé par l'homme pour attirer un animal par le bruit qu'il produit ;

Appelant artificiel, aussi désigné par les noms de forme ou blette : objet imitant plus ou moins fidèlement l'aspect d'un animal ;

Appelant : animal vivant destiné à attirer un animal.

Article 2

Sans préjudice des dispositions de l'article 7 de l'arrêté du 1er août 1986 susvisé, l'emploi des appeaux et des appelants artificiels est autorisé sur le territoire métropolitain :

- pour la chasse des oiseaux de passage et du gibier d'eau ;

- pour la destruction des animaux nuisibles, à l'exception du pigeon ramier.

Pour la chasse à tir de l'alouette des champs, est autorisé l'emploi du « miroir à alouette » dépourvu de facettes réfléchissantes.

Article 7

Est autorisé sur le territoire métropolitain, pour la destruction des corvidés, l'emploi d'appelants vivants non aveuglés et non mutilés des espèces suivantes :

- corneille noire ;

- corbeau freux ;

- pie bavarde.

241

Arrêté du 29 janvier 2007 fixant les dispositions relatives au piégeage des animaux classés nuisibles en application de l'article L. 427-8 du code de l'environnement

Chapitre Ier Catégories de pièges autorisés

Article 2 Seul est autorisé, sous réserve des prescriptions particulières qui leur sont applicables, l'emploi des pièges des catégories suivantes : 1. Les boîtes à fauves et tous autres pièges ayant pour objet de capturer l'animal par contention dans un espace clos sans le maintenir directement par une partie de son corps ; 2. Les pièges déclenchés par pression sur une palette ou par enlèvement d'un appât, ou tout autre système de détente, et ayant pour objet de tuer l'animal ; 3. Les collets munis d'un arrêtoir ; 4. Les pièges à lacet déclenchés par pression sur une palette, ou tout autre système de détente, et ayant pour objet de capturer l'animal par une partie de son corps, sans le tuer ; 5. Les pièges rustiques dits assommoirs perchés ; 6. Les pièges n'appartenant pas aux catégories précédentes et ayant pour effet d'entraîner la mort de l'animal par noyade.

Chapitre III Agrément des piégeurs

Article 5 Toute personne qui utilise des pièges doit être agréée à cet effet par le préfet du département où elle est domiciliée. Cet agrément fait l'objet d'une attestation numérotée et est valable pour l'ensemble du territoire national.

Article 6 L'agrément visé à l'article 5 ci-dessus est subordonné à la participation du piégeur concerné à une session de formation au piégeage organisée par l'Office national de la chasse et de la faune sauvage, une fédération départementale ou interdépartementale des chasseurs ou tout autre organisme habilité à cet effet par le préfet du département où se déroule la session. Les programmes de formation font l'objet de protocoles établis par les organismes qui la dispensent et soumis à l'approbation du préfet. La formation doit comporter au moins seize heures, avec la répartition horaire globale suivante : - connaissance des espèces recherchées : quatre heures ; - connaissance des différents types de pièges, de leurs possibilités et condition d'utilisation : deux heures ; - manipulation des pièges : quatre heures ; - connaissance des mesures propres à diminuer les souffrances des animaux capturés : deux heures ; - application des connaissances : quatre heures. Sont dispensés de l'obligation de participer à une session pour être agréés : - les lieutenants de louveterie ; - les agents de l'Office national de la chasse et de la faune sauvage ; - les agents assermentés de l'Office national des forêts ;

242 - les titulaires d'un brevet de technicien agricole, option aménagement de l'espace, spécialité gestion de la faune sauvage, délivré par le ministre de l'agriculture.

Article 7 Les piégeurs agréés sont tenus de marquer leurs pièges au numéro qui leur est attribué par le préfet. Ils peuvent également utiliser les pièges identifiés par la marque de leur employeur ; mention en est faite dans la déclaration prévue à l'article 11 ci-après. Il n'est pas exigé que la marque soit apparente lorsque le piège est tendu.

Article 8 Les piégeurs agréés doivent tenir un relevé quotidien de leurs prises. Tous les piégeurs agréés envoient au préfet du département du lieu du piégeage, avant le 30 septembre de chaque année, un bilan annuel de leurs prises au 30 juin, y compris s'ils n'ont pas pratiqué le piégeage au cours de l'année cynégétique écoulée. Ce bilan, établi par commune où des opérations de piégeage ont été réalisées, mentionne le nom et l'adresse du piégeur, son numéro d'agrément, l'espèce capturée et le nombre de prises. Le préfet établit le bilan des captures effectuées dans le département pour la commission départementale de la chasse et de la faune sauvage.

Chapitre IV Déclaration des opérations de piégeage

Article 11 La pose de pièges doit faire l'objet, de la part du titulaire du droit de destruction ou de son délégué ou du piégeur chargé des opérations, d'une déclaration en mairie de la commune où est pratiqué le piégeage. La déclaration en mairie est préalable et au moins annuelle. Elle est valable jusqu'au 30 juin de l'année cynégétique en cours. La déclaration doit indiquer l'identité, l'adresse et la qualité (propriétaire, possesseur, fermier) du déclarant détenteur du droit de destruction, l'identité, l'adresse et le numéro d'agrément du piégeur. Le maire fait publier un exemplaire de la déclaration à l'emplacement réservé aux affichages officiels et en remet un au déclarant, qui doit le présenter à toute demande des agents chargés de la police de la chasse.

Chapitre V Prescriptions générales pour le piégeage

Article 13 Tous les pièges doivent être visités tous les matins, par le piégeur ou un préposé désigné par lui et à cet effet. Pour les pièges des catégories 3 et 4 de l'article 2 ci-dessus, cette visite doit intervenir au plus tard dans les deux heures qui suivent le lever du soleil. La mise à mort des animaux capturés doit intervenir immédiatement et sans souffrance. En cas de capture accidentelle d'animaux non visés par l'article L. 427-8 du code de l'environnement, ces animaux sont relâchés sur-le-champ.

243 244 Annexe 15 : autorisation de piégeage pour l’année 2007

245 246 Annexe 16 : nature et dates des prélèvements effectués sur les pies bavardes (Pica pica) capturées au zoo de La Palmyre, dans le cadre de la troisième expérience Tableau (ix)

Date du Date de Date du 1er Autres prélèvement Date de Numéro Remarques capture frottis frottis sanguin sur l’autopsie EDTA 2 ou 2 ou 2 ou 12/04/07 1 16/04/07 R.A.S. 3/05/07 3/05/07 3/05/07 2 ou 2 ou 2 ou 12/04/07 2 16/04/07 R.A.S. 3/05/07 3/05/07 3/05/07 2 ou 2 ou 2 ou 12/04/07 3 16/04/07 R.A.S. 3/05/07 3/05/07 3/05/07 Le 14/04/07 : décès de l’appelant, 14/04/07 4 19/04/07 4/05/07 4/05/07 8/05/07 remplacé par la pie n°1, puis par la n°4. 16/04/07 5 20/04/07 2/05/07 2/05/07 2/05/07 R.A.S. 23/07/07 + 2 ou 2 ou A perdu sa bague le 17/04/07 6 20/04/07 2 ou 3/05/07 3/05/07 20/04/07. 3/05/07 2 ou 2 ou 2 ou 18/04/07 7 23/04/07 A perdu sa bague. 3/05/07 3/05/07 3/05/07 23/07/07 + 02 ou 2 ou A perdu sa bague le 19/04/07 8 20/04/07 2 ou 3/05/07 3/05/07 20/04/07. 3/05/07 20/04/07 9 24/04/07 3/05/07 3/05/07 3/05/07 R.A.S. 2 ou 2 ou 2 ou 22/04/07 10 N.E. R.A.S. 3/05/07 3/05/07 3/05/07 2 ou 2 ou 2 ou 22/04/07 11 N.E. R.A.S. 3/05/07 3/05/07 3/05/07 Le 24/04/07 : une 24/04/07 12 28/04/07 3/05/07 3/05/07 3/05/07 pie échappée. 2 ou 2 ou 2 ou 24/04/07 13 N.E. R.A.S. 3/05/07 3/05/07 3/05/07 25/04/07 14 29/05/07 3/05/07 3/05/07 3/05/07 R.A.S. 2 ou 2 ou 2 ou 25/04/07 15 N.E. R.A.S. 3/05/07 3/05/07 3/05/07 26/04/07 16 N.E. N.E. N.E. 2/05/07 Décès le 2/05/07. 2 ou 2 ou 2 ou 26/04/07 17 N.E. R.A.S. 3/05/07 3/05/07 3/05/07 26/04/07 18 2/05/07 N.E. 2/05/07 2/05/07 R.A.S. 27/04/07 19 2/05/07 N.E. 2/05/07 2/05/07 R.A.S. 27/04/07 20 2/05/07 N.E. 2/05/07 2/05/07 R.A.S. 30/04/07 21 3/05/07 N.E. 3/05/07 3/05/07 R.A.S. 247 Date du Date de Date du 1er Autres prélèvement Date de Numéro Remarques capture frottis frottis sanguin sur l’autopsie EDTA 1/05/07 22 3/05/07 N.E. 3/05/07 3/05/07 R.A.S. 4/05/07 23 8/05/07 N.E. 8/05/07 8/05/07 R.A.S. 04/05/07 24 8/05/07 N.E. 8/05/07 8/05/07 R.A.S. 07/05/07 25 11/05/07 N.E. 11/05/07 11/05/07 R.A.S. 08/05/07 26 12/05/07 N.E. 12/05/07 15/05/07 R.A.S. N.E. : non effectué. R.A.S. : rien à signaler.

248 Annexe 17 : nature et dates des prélèvements effectués sur les corneilles noires (Corvus corone corone) capturées au zoo de La Palmyre, dans le cadre de la troisième expérience Tableau (x)

Date du Date du prélèveme Date de Date de capture Numéro Remarques frottis nt sanguin l’autopsie sur EDTA 13/05/07 1 17/05/07 17/05/07 18/05/07 R.A.S. 16/05/07 2 20/05/07 20/05/07 20/05/07 R.A.S. 17/05/07 3 21/05/07 21/05/07 23/05/07 R.A.S. 17/05/07 4 21/05/07 21/05/07 23/05/07 Juvénile. 18/05/07 5 N.E. N.E. 20/05/07 Juvénile / décès le 20/05/07. 29/05/07 6 2/06/07 2/06/07 2/06/07 R.A.S. 29/05/07 7 2/06/07 2/06/07 2/06/07 R.A.S. 4/06/07 8 8/06/07 8/06/07 8/06/07 R.A.S. 9/06/07 9 13/06/07 13/06/07 13/06/07 R.A.S. 20/06/07 10 24/06/07 24/06/07 24/06/07 R.A.S. N.E. : non effectué. R.A.S. : rien à signaler.

249 250 Annexe 18 : nature et dates des prélèvements effectués sur diverses espèces aviaires commensales (autres que Pica pica et Corvus corone corone) au zoo de La Palmyre, dans le cadre de la troisième expérience Tableau (xi)

Date du Date du 1er Autres prélèvement Date de Espèce Numéro Remarques frottis frottis sanguin sur l’autopsie EDTA Alcedo atthis Aucun. 28/05/07 N.E. N.E. 3/06/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C1 17/05/07 N.E. 17/05/07 18/05/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C2 5/06/07 N.E. 5/06/07 5/06/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C3 12/06/07 16/06/07 16/06/07 16/06/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C4 17/06/07 N.E. N.E. 17/06/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C5 17/06/07 N.E. N.E. 17/06/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C6 14/06/07 18/06/07 18/06/07 18/06/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C7 14/06/07 18/06/07 18/06/07 18/06/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C8 14/06/07 N.E. 14/06/07 15/06/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C9 N.E. N.E. N.E. 14/06/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C10 N.E. N.E. N.E. 14/06/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C11 N.E. N.E. N.E. 20/06/07 Caneton. Anas platyrhynchos C12 N.E. N.E. N.E. 21/06/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C13 N.E. N.E. N.E. 3/07/07 R.A.S. Anas platyrhynchos C14 N.E. N.E. N.E. 31/07/07 R.A.S. Ardea cinerea H1 24/07/07 N.E. N.E. 24/07/07 R.A.S. Ardea cinerea H2 N.E. N.E. 12/08/07 12/08/07 R.A.S. Carduelis chloris V1 18/07/07 N.E. N.E. N.E. R.A.S. Carduelis chloris V2 6/08/07 N.E. N.E. N.E. R.A.S. Certhia sp. Aucun. 23/07/07 N.E. N.E. 23/07/07 R.A.S. Columba palumbus Pal1 14/05/07 N.E. 14/05/07 N.E. R.A.S. Columba palumbus Pal2 17/05/07 N.E. 17/05/07 N.E. R.A.S. Columba palumbus Pal3 6/06/07 N.E. 6/06/07 N.E. R.A.S.

251 Date du Date du 1er Autres prélèvement Date de Espèce Numéro Remarques frottis frottis sanguin sur l’autopsie EDTA Columba palumbus Pal4 11/06/07 N.E. 11/06/07 N.E. R.A.S. Columba palumbus Pal5 11/07/07 N.E. 11/07/07 N.E. R.A.S. Columba palumbus Pal6 N.E. N.E. N.E. 31/07/07 R.A.S. Columba palumbus Pal7 N.E. N.E. N.E. 7/08/07 R.A.S. Columba palumbus Pal8 N.E. N.E. N.E. 9/08/07 R.A.S. Columba palumbus Pal9 N.E. N.E. N.E. 10/08/07 R.A.S. Cyanistes caeruleus Aucun. 09/05/07 N.E. N.E. N.E. R.A.S. Erithacus rubecula Aucun. 23/06/07 N.E. 23/06/07 23/06/07 R.A.S. Fringilla coelebs Aucun. 29/06/07 N.E. N.E. N.E. R.A.S. Gallinula chloropus Pou1 4/05/07 N.E. N.E. 4/05/07 R.A.S. Gallinula chloropus Pou2 29/06/07 N.E. N.E. 29/06/07 Poussin. Gallinula chloropus Pou3 N.E. N.E. N.E. 1/07/07 R.A.S. Gallinula chloropus Pou4 23/07/07 N.E. 23/07/07 23/07/07 R.A.S. Garrulus glandarius Aucun. N.E. N.E. N.E. 2/07/07 R.A.S. Uniquement Hirundo rustica Aucun. N.E. N.E. N.E. le rein, le R.A.S. 21/06/07 Larus sp. Aucun. 23/07/07 N.E. N.E. 23/07/07 R.A.S. Melopsittacus undulatus Aucun. 3/05/07 N.E. N.E. 3/05/07 R.A.S. Motacilla alba Aucun. N.E. N.E. N.E. 18/06/07 R.A.S. Parus major Aucun. 23/06/07 N.E. 23/06/07 23/06/07 R.A.S. Passer domesticus Moi1 N.E. N.E. N.E. 6/06/07 R.A.S. Passer domesticus Moi2 29/06/07 N.E. N.E. N.E. R.A.S. Passer domesticus Moi3 29/06/07 N.E. N.E. N.E. R.A.S. Passer domesticus Moi4 29/06/07 N.E. N.E. N.E. R.A.S. Passer domesticus Moi5 29/06/07 N.E. N.E. N.E. R.A.S. Passer domesticus Moi6 N.E. N.E. N.E. N.E. R.A.S. Phoenicurus sp. Aucun. N.E. N.E. N.E. 14/07/07 R.A.S.

252 Date du Date du 1er Autres prélèvement Date de Espèce Numéro Remarques frottis frottis sanguin sur l’autopsie EDTA Streptopelia decaocto T1 N.E. N.E. N.E. 1/05/07 R.A.S. Streptopelia decaocto T2 13/05/07 N.E. 13/05/07 18/05/07 R.A.S. Streptopelia decaocto T3 13/05/07 N.E. 13/05/07 18/05/07 R.A.S. Streptopelia decaocto T4 13/05/07 N.E. 13/05/07 18/05/07 R.A.S. Streptopelia decaocto T5 N.E. N.E. N.E. 11/05/07 R.A.S. Streptopelia decaocto T6 13/05/07 N.E. 13/05/07 18/05/07 R.A.S. Streptopelia decaocto T7 6/06/07 N.E. 6/06/07 6/06/07 R.A.S. Streptopelia decaocto T8 N.E. N.E. N.E. 29/06/07 R.A.S. Streptopelia decaocto T9 12/07/07 N.E. 12/07/07 16/07/07 R.A.S. Streptopelia decaocto T10 30/07/07 N.E. 30/07/07 30/07/07 R.A.S. Streptopelia decaocto T11 N.E. N.E. N.E. 10/08/07 R.A.S. Sturnus vulgaris Aucun. N.E. N.E. N.E. 8/06/07 R.A.S. Turdus merula Mer1 N.E. N.E. N.E. 29/05/07 R.A.S. Turdus merula Mer2 N.E. N.E. N.E. 7/06/07 R.A.S. Turdus merula Mer3 N.E. N.E. N.E. 7/06/07 R.A.S. Turdus merula Mer4 N.E. N.E. N.E. 19/06/07 R.A.S. Poussin de passériforme Aucun. N.E. N.E. N.E. 18/06/07 R.A.S. N.E. : non effectué. R.A.S. : rien à signaler.

253 254 Annexe 19 : exemple de protocole d’extraction d’ADN utilisé au cours de l’étude

255

256 Annexe 20 : protocole de purification d’ADN sur gel utilisé au cours de l’étude

257 258 Annexe 21 : schéma du plasmide utilisé lors du clonage Figure (iv)

À noter également, l’existence d’un gène de résistance à l’ampicilline, sur lequel repose la technique de sélection des bactéries ayant incorporé le plasmide.

259 260 Annexe 22 : résultats de la première expérience : recherche de Plasmodium chez Spheniscus demersus Tableau (xii)

Identification Analyse moléculaire (quatre Grands fragments Petit fragment derniers Plasmodium Plasmodium (amorces (amorces chiffres, ou sanguins tissulaires rPLU1/rPLU5 puis lettres, du rPLU1/rPLU5 puis rPLU1/rPLU2 et transpondeur) rPLU3/rPLU4) rPLU6/rPLU5) 8976 - / - N.R. (+) - D18C - / - N.R. - - 3817 - / - / - N.R. (+) - 3895 - / - N.R. - - F142 - / - N.R. + - 1597 - / - / - N.R. + - 5952 - - - / - - / - 4212 - / - N.R. N.E. - 6373 - / - / - N.R. + - 6CEO - / - N.R. - - 2047 - / - / - N.R. - - 5401 - / - N.R. - - 4F26 - / - N.R. - - F4F6 - / - N.R. N.E. - 041B - / - / - N.R. - - OA1F - / - N.R. - - 7307 - / - N.R. - - 8878 - / - N.R. N.E. - 2077 - / - N.R. (+) - 28ED - / - N.R. N.E. - EC20 - - (+) - 3130 - / - N.R. - - 3866 - / - N.R. - - BA14 - / - N.R. - - 1532 - / - N.R. N.E. - F691 - / - N.R. - - 7292 - / - N.R. (+) - 2582 - / - N.R. - - 5545 - / - / - N.R. - - 7753 - / - N.R. (+) - 86BB - / - N.R. - - OO16 - / - N.R. N.E. - 093E - / - N.R. (+) - 2759 - / - - N.E. - CF51 - / - N.R. - -

261 Identification Analyse moléculaire (quatre Grands fragments Petit fragment derniers Plasmodium Plasmodium (amorces (amorces chiffres, ou sanguins tissulaires rPLU1/rPLU5 puis lettres, du rPLU1/rPLU5 puis rPLU1/rPLU2 et transpondeur) rPLU3/rPLU4) rPLU6/rPLU5) 4624 - / - N.R. N.E. - 2784 - / - N.R. - - 5916 - / - N.R. N.E. - E1CC - / - N.R. (+) - 3071 - / - N.R. + - OD69 - / - N.R. N.E. - 7264 - / - / - N.R. - - 9102 - - - - 6601 - / - / - - (+) - N.R. : non recherchés. N.E. : non effectué. + ou - : présence ou absence de parasites (analyse morphologique) ; résultat positif ou négatif (analyse moléculaire). Les résultats entre parenthèses sont douteux. Plusieurs résultats figurant dans une même cellule du tableau et séparés par le symbole « / » correspondent à autant de tests de l’échantillon en question (biologie moléculaire) ou à différents frottis sanguins pour le même individu.

262 Annexe 23 : séquences d’ADN parasitaire isolées chez trois Spheniscus demersus de La Palmyre

• pour le manchot F142 : AGGATAACTACGGAAAAGCTGTAGCTAATACTTGAACGATTGTTCTTCAATTCCCCAAAA AGGTTCTGTAGAACACGTATTTGTTAAGCCTTATAAGAAAAAAGTTATTAACTTAAGGAA TTATAACAAAGAAGTAACACATAATAAAACTTTGTTTTATTTAGTGTGTATCAATCGAGT TTCTGACCTATCAGCTTTTGATGTTAGGGTATTGGCCTAACATGGCTATGACGGGTAACG GGGAATTAGAGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAATAGCTACCACATCTAAGGAAG GCAGCAGGCGCGTAAATTACCCAATTCTAAAGAAGAGAGGTAGTGACAAGAAATAACAAG GTAAGGTCAAATTTTGGCTTTGCCATTGGAATGATAGGAATTTAAAAACTTCCTAAAGTA ACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATA TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACGCTCGTAGTTGAATTTCAAAGAATCAATTTTTAAGGTA ATGCTTTATCGGATACGTGTTAAATGGTGCTTCGGCGCGTATTTTTCACAATTCTGATAT TATGTATTCCTTAAAATAAAATAGGTTCTTTTTAAAAATTCTTCGTTGCTTTATGTGATG AGAATTTTTGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAAACAGTTTAAAACAGCTAA AACTGAGTTTGAATACTACAGCATGGAATAACAAAATTGAACAAGCTAAAATTTTTGTTC TTTTTTCTTATTTTGGCTTAGTTACGATTAATAGGAGTAGTTTGGGGACATTCGTATTCA GATGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT,

• pour le manchot 1597 : TAGGATAACTACGGAAAAGCTGTAGCTAATACTTGAACGATTGTTCTTCAGTTCCCCAAA AAGGTTCTGTAGAACACGTATTTGTTAAGCCTTATAAGAAAAAAGTTATTAACTTAAGGA ATTATAACAAAGAAGTAACACATAATAAAACTTTGTTTTATTTAGTGTGTATCAATCGAG TTTCTGACCTATCAGCTTTTGATGTTAGGGTATTGGCCTAACATGGCTATGACGGGTAAC GAGGAATTAGAGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAATAGCTACCACATCTAAGGAA GGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCGATTCTAAAGAAGAGAGGTAGTGACAGGAAATAACAA GGTAAGGTCAAATTTTGGCTTTGCCATTGGAATGATAGGAATTTAAAAACTTCCTAAAGT AACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTAT ATTAAAATTGTTGCAGTTAAAACGCTCGTAGTTGAATTTCAAAGAATCAATTTTTAAGGT AATGCTTTATCGGATACGTGTTAAATGGTGCTTCGGCGCGTATTTTTCACAATTCTGATA TTATGTATTCCTTAAAATAAAATAGGTTCTTTTTAAAAATTCTTCGTTGCTTTATGTGAT GAGAATTTTTGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAAACAGTTTAAAACAGCTA AAACTGTGTTTGAATACTACAGCATGGAATAACAAAATTGAACAAGCTAAAATTTTTGTT CTTTTTTCTTATTTTGGCTTAGTTACGATTAATAGGAGTAGTTTGGGGACATTCGTATTC AGATGTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT,

• pour le manchot 6373 : ATAACTACGGAAAAGCTGTAGCTAATACTTGAACGATTGTTCTTCAGTTCCCCAAAAAGG TTCTGTAGAACACGTATTTGTTAAGCCTTATAAGAAAAAAGTTATTAACTTAAGGAATTA TAACAAAGAAGTAACACATAATAAAACTTTGTTTTATTTAGTGTGTATCAATCGAGTTTC TGACCTATCAGCTTTTGATGTTAGGGTATTGGCCTAACATGGCTATGACGGGTAACGGGG AATTAGAGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAATAGCTACCACATCTAAGGAAGGCA GCAGGCGCGTAAATTACCCAATTCTAAAGAAGAGAGGTAGTGACAGGAAATAACAAGGTA AGGTCAAATTTTGGCTTTGCCATTGGAATGATAGGAATTTAAAAACTTCCTAAAGTAACA ATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTA AAATTGTTGCAGTTAAAACGCTCGTAGTTGAATTTCAAAGAATCAATTTTTAAGGTAATG CTTTATCGGATACGTGTTAAATGGTGCTTCGGCGCGTATTTTTCACAATTCTGATATTAT GTATTCCTTAAAATAAAATAGGTTCCTTTTAAAAATTCTTCGTTGCTTTATGTGATGAGA ATTTTTGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAAACAGTTTAAAACAGCTAAAAC

263 TGTGTTTGAATACTACAGCATGGAATAACAAAATTGAACAAGCTAAAATTTTTGTTCTTT TTTCTTATTTTGGCTTAGTTACGATTAATAGGAGTAGTTTGGGGACATTCGTATTCAGAT GTCAGAGGTGAAATTCTTAGAT.

264 Annexe 24 : résultats de la deuxième expérience : recherche de Plasmodium chez divers oiseaux en présentation au zoo de La Palmyre Tableau (xiii)

Analyse moléculaire Spécimen Grands (bague, ou Petit fragments Plasmodium Plasmodium Autres Espèce numéro fragment (amorces sanguins tissulaires hémoparasites (amorces rPLU1/rPLU5 d’identification rPLU1/rPLU5 puis interne) puis rPLU1/rPLU2 rPLU3/rPLU4) et rPLU6/rPLU5) Ciconia ciconia V18 - - Piroplasmes - - Eudocimus N.E. N.E. ruber 3815 - N.R. - Eudocimus N.R. N.E. N.E. ruber 3819 - - Eudocimus N.R. N.E. N.E. ruber 3814 - - Eudocimus N.R. N.E. N.E. ruber 3764 - - Eudocimus N.R. N.E. N.E. ruber 3813 - - Eudocimus N.R. N.E. N.E. ruber 3769 - - Eudocimus N.R. N.E. N.E. ruber 2939 - - Eudocimus N.R. N.E. N.E. ruber 3816 - - Eudocimus N.R. N.E. N.E. ruber 3766 - - Eudocimus N.R. N.E. N.E. ruber 4501 - - Pelecanus onocrotalus Bague jaune - - - - - Ph. chilensis CAY R - N.R. Piroplasmes - - Ph. chilensis PRU R - N.R. (Piroplasmes) - - Ph. chilensis AXY R - N.R. (Piroplasmes) - - Ph. chilensis AKG V - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis AXH B - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis AFF R - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis PGG R - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis CFU B - N.R. Piroplasmes N.E. N.E. Ph. chilensis NXT R - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis AYZ R - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis XNN R - N.R. Piroplasmes - - Ph. chilensis AYK B - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis AYF R - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis CAV R - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E.

265 Analyse moléculaire Spécimen Grands (bague, ou Petit fragments Plasmodium Plasmodium Autres Espèce numéro fragment (amorces sanguins tissulaires hémoparasites (amorces rPLU1/rPLU5 d’identification rPLU1/rPLU5 puis interne) puis rPLU1/rPLU2 rPLU3/rPLU4) et rPLU6/rPLU5) Ph. chilensis AHV R - N.R. Piroplasmes N.E. N.E. Ph. chilensis CAP R - N.R. (Piroplasmes) - - Ph. chilensis AYK R - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis CST B - N.R. - N.E. N.E. Ph. chilensis ARG V - N.R. Piroplasmes - - Ph. chilensis ART V - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis FHW B - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis PHT R - N.R. (Piroplasmes) - - Ph. chilensis AZS R - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis AXU V - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis CAU R - N.R. - N.E. N.E. Ph. chilensis NSK R - N.R. Piroplasmes N.E. N.E. Ph. chilensis AYG R - N.R. - N.E. N.E. Ph. chilensis ATG B - N.R. Piroplasmes N.E. N.E. Ph. chilensis AHU B - N.R. - N.E. N.E. Ph. chilensis ARY V - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis ACC B - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis FHT B - N.R. - N.E. N.E. Ph. chilensis ACP B - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis AYP V - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis AGT R - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis AWF B - N.R. - N.E. N.E. Ph. chilensis AKV V - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis FHZ B - N.R. (Piroplasmes) - - Ph. chilensis AFR V - N.R. - N.E. N.E. Ph. chilensis FHX B - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis AWZ R - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis AHC B - N.R. - - - Ph. chilensis AKN V - N.R. Piroplasmes N.E. N.E. Ph. chilensis AZV V - N.R. Piroplasmes N.E. N.E. Ph. chilensis ASV V - N.R. - N.E. N.E. Ph. chilensis ARR V - N.R. Piroplasmes - - Ph. chilensis CAF R - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. chilensis FAU B - N.R. Piroplasmes N.E. N.E. Ph. chilensis ARV V - N.R. - N.E. N.E. Ph. chilensis AUS V - N.R. (Piroplasmes) - - Ph. chilensis AAY V - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. ruber AFP B - N.R. Piroplasmes N.E. N.E. Ph. ruber AHUB - N.R. - N.E. N.E. Ph. ruber AGH V - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. 266 Analyse moléculaire Spécimen Grands (bague, ou Petit fragments Plasmodium Plasmodium Autres Espèce numéro fragment (amorces sanguins tissulaires hémoparasites (amorces rPLU1/rPLU5 d’identification rPLU1/rPLU5 puis interne) puis rPLU1/rPLU2 rPLU3/rPLU4) et rPLU6/rPLU5) Ph. ruber AUC V - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Ph. ruber ACV B - N.R. - N.E. N.E. Ph. ruber FHA B - N.R. - N.E. N.E. Ph. ruber FFX B - N.R. (Piroplasmes) N.E. N.E. Plegadis N.R. N.E. N.E. falcinellus 4111 - - Plegadis N.R. N.E. N.E. falcinellus 3807 - - Plegadis N.R. N.E. N.E. falcinellus 2776 - - Plegadis N.R. N.E. N.E. falcinellus 3808 - - Plegadis N.R. N.E. N.E. falcinellus 478 - - Plegadis N.R. N.E. N.E. falcinellus 2772 - - Plegadis N.R. N.E. N.E. falcinellus 477 - - Plegadis N.R. N.E. N.E. ridgwayi 2775 - - Plegadis N.R. N.E. N.E. ridgwayi 3810 - - Plegadis N.R. N.E. N.E. ridgwayi 2774 - - Plegadis N.R. N.E. N.E. ridgwayi 2777 - - Plegadis N.R. N.E. N.E. ridgwayi 3809 - - Ph. : Phoenicopterus. N.R. : non recherchés. N.E. : non effectué. + ou - : présence ou absence de parasites (analyse morphologique) ; résultat positif ou négatif (analyse moléculaire).

267 268 Annexe 25 : résultats de la troisième expérience : hémoparasites mis en évidence chez les pies bavardes (Pica pica) capturées au zoo de La Palmyre Tableau (xiv)

Haemoproteus Leucocytozoon Numéro Plasmodium spp. Trypanosoma spp. Autres spp. spp. 1 + ++ - - - 2 + ++ - - - 3 + ++ - - - 4 ++/+ +/+ - - - 5 +/+ ++/+ - - - 6 - ++ - - - 7 + ++ - - - 8 - ++ - - - 9 +/++ ++/++ - + - 10 - - - - - 11 - - - - - 12 ++/++ ++++++/+++ +/+ + - 13 - - - - - 14 ++/++ +/+ - - - 15 - - - - - 16 - - - - - 17 - - - - - 18 + ++ - - - 19 ++ + - - - 20 - ++++++ - - - 21 +++ ++ ++ + - 22 + ++ - - - 23 + + - - - 24 + ++ + - - 25 - ++ - - - 26 - + + - -

+ ou - : présence ou absence de parasites (analyse morphologique). Les parasitémies ont été appréciées semi-quantitatvement : le nombre de symboles « + » est proportionnel à l’intensité de la parasitémie. Plusieurs résultats figurant dans une même cellule du tableau et séparés par le symbole « / » correspondent à différents frottis sanguins pour le même individu.

N.B. : deux frottis ont été effectués chez des pies non identifiées de façon certaine (en raison des pertes de bagues constatées chez quelques individus). Les résultats (ne figurant pas dans le tableau) sont les suivants : + en Plasmodium spp. et ++ en Haemoproteus spp. pour le premier (pie n°2, 10, 11, ou 13) ; + en Plasmodium spp. et ++ en Haemoproteus spp. pour le second (pie n°1, 6, 7, 8, 15, ou 17). Les résultats sont négatifs pour les autres hémoparasites.

269 270 Annexe 26 : résultats de la troisième expérience : hémoparasites mis en évidence chez les corneilles noires (Corvus corone corone) capturées au zoo de La Palmyre Tableau (xv)

Haemoproteus Leucocytozoon Numéro Plasmodium spp. Trypanosoma spp. Autres spp. spp. 1 ? + - - ? 2 ++ + - + - 3 ++ + - + - 4 - ++++ + - - Lankesterella 6 - - - - sp. ? 7 - - - + - 8 - - - + - 9 - - + - - 10 + + - + -

+ ou - : présence ou absence de parasites (analyse morphologique). Les parasitémies ont été appréciées semi-quantitatvement : le nombre de symboles « + » est proportionnel à l’intensité de la parasitémie. Les points d’interrogation indiquent des résultats douteux.

271 272 Annexe 27 : séquences uniques et séquences consensus des différents types et sous-types de fragments isolés chez les pies bavardes et corneilles noires capturées au zoo de La Palmyre

- Fragment decoupé par rPLU1 et rPLU2 :

>1+2 Type A (consensus) TCAAAGATTA AGCCATGCAA GTGAAAGTAT ATATATATTA ATTATATAGA AACTGCGAAC GGCTCATTAA AACAGTTATA ATCTACTTGA CATTTTTTTA TATAAGGATA ACTACGGAAA ATCTGTAGCT AATACTTGAA CGATTGTAAT GTTTAAATAT CTTTAGATGT TTTTACATAT GCATGTATTT GTTAATCCTA TAAGAAAAAA GTTATCAAGT GATGAATTAC AACAAAGAAG CAACACATAA ATAATACTCT ATTTTATTTA GTGTGTATCA ATCGAGTTTC TGACCTATCA GCTTTTGATG TTAAGGTATT GGCCTAACAT GGCTATGACG GGTAACGGGG AATTAGAGTT CGATTCCGGA GAGGGAGCCT GAGAAATAGC TACCACATCT AAGGAAGGCA GCAGGCGCGT AAATTACCCA ATTCTAAAGA AGAGAGGTAG TGACAAGAAA TAACGATGCA AAGCCAAATT TTGGTTTTGC AATTGGAATG ATAGGAACTT AAAAACTTCC TAAAGAAACA ATTGGAGGGC AAGTCTGGTG CCAGCAGCCG CGGTAATTCC AGCTCCAATA GCGTATATTA AAATTGTTGC AGTTAAAACG CTCGTAGTTT AATATCAAAG AATCTATTTT AATAAGTAAT GCAATATCCA GAATTTCATT AATATACTAT AGTACTTCGG TTCTATAATT GTATTTCGTT AATCTGTGGT ATAATATATG CGTTCTTGTA AACAAATAAG ATACTTTTTA AAAATTCTTA ATTACATATT AATTTATAAT GTGATTAGAA TTTTTGTTAC TTTGAGTAAA TTAGAGTGTT CAAAGCAAAC AGTTTAAAAC AGCAAAACTG TGTTTGAATA CTACAGCATG GAATAACATA ATTGAACAAG CTAAAGTATG TTCTTTTTTC TTATTTTTGG CTTAGTTAAG ATTAATAGGA GTAGTTTGGG GACATTCGTA TTCAGATGTC AGAGGTGAAA TTCTTAGAT

>1+2 Type B (consensus) TCAAAGATTA AGCCATGCAA GTGAAAGTAT ATATATATTT ATTATATAGA AACTGCGAAC GGCTCATTAA AACAGTTATA ATCTACTTGA CATTTTTTTT ATAAGGATAA CTACGGAAAA GCTGTAGCTA ATACTTGAAC GATTGTTCTT CAGTTCCCCA AAAAGGTTCT GTAGAACACG TATTTGTTAA GCCTAATAAG AAAAAAGTTA TTAACTTAAG GAATTATAAC AAAGAAGGAA CACATAATAA AACTTTGTTT TATTTAGTGT GTATCAATCG AGTTTCTGAC CTATCAGCTT TTGATGTTAG GGTATTGGCC TAACATGGCT ATGACGGGTA ACGGGGAATT AGAGTTCGAT TCCGGAGAGG GAGCCTGAGA AATAGCTACC ACATCTAAGG AAGGCAGCAG GCGCGTAAAT TACCCAATTC TAAAGAAGAG AGGTAGTGAC AAGAAATAAC AAGGTAAGGT CAAATTTTGG CTTTGCCATT GGAATGATA GAATTTAAAA ACTTCCTAAA GTAACAATTG GAGGGCAAGT CTGGTGCCAG CAGCCGCGGT AATTCCAGCT CCAATAGCGT ATATTAAAAT TGTTGCAGTT AAAACGCTCG TAGTTGAATT TCAAAGAATC AATTTTTAAG GTAATGCTTT ATCGGATACG TGTTAAATGG TGCTTCGGCG CGTATTTTTC ACAATTCTGA TATTATGTAT TCCTTAAAAT AAAATAGGTT CTTTTTAAAA ATTCTTCGTT GCTTTATGTG ATGAGAATTT TTGTTACTTT GAGTAAATTA GAGTGTTCAA AGCAAACAGT TTAAAACAGC TAAAACTGTG TTTGAATACT ACAGCATGGA ATAACAAAAT TGAACAAGCT AAAATTTTTG TTCTTTTTTC TTATTTTGGC TTAGTTACGA TTAATAGGAG TAGTTTGGGG ACATTCGTAT TCAGATGTCA GAGGTGAAAT TCTTAGAT

>1+2 Type C (consensus) TCAAAGATTA AGCCATGCAA GTGAAAGTAT ATATATATTT ATTATATAGA AACTGCGAAC GGCTCATTAA AACAGTTATA ATCTACTTGA CATTTTTTTT ATAAGGATAA CTACGGAAAA GCTGTAGCTA ATACTTGAAC GATTGTTCTT CAGTTCCCCA AAAAGGTTCT GTAGAACACG TATTTGTTAA GCCTAATAAG AAAAAAGTTA TTAACTTAAG GAATTATAAC AAAGAAGGAA CACATAATAA 273 AACTTTGTTT TATTTAGTGT GTATCAATCG AGTTTCTGAC CTATCAGCTT TTGATGTTAG GGTATTGGCC TAACATGGCT ATGACGGGTA ACGGGGAATT AGAGTTCGAT TCCGGAGAGG GAGCCTGAGA AATAGCTACC ACATCTAAGG AAGGCAGCAG GCGCGTAAAT TACCCAATTC TAAAGAAGAG AGGTAGTGAC AAGAAATAAC AAGGTAAGGT CAATATTTTG GCTTTGCCAT TGGAATGATA GGAATTTAAA AACTTCCTAA AGTAACAATT GGAGGGCAAG TCTGGTGCCA GCAGCCGCGG TAATTCCAGC TCCAATAGCG TATATTAAAA TTGTTGCAGT TAAAACGCTC GTAGTTGAAT TTCAAAGAAT CAATAATTAG CGAATACAAT ATCAGATATG TGTTAAATAT AGTGCTTCGG CTTATATTTT CCACATTTCT GAATATATGT ATTGTTAAAA ATATAATAGG TTCTTTTATA AAAAATTCTT CGTTGCTTTA TGTGATGAGA ATTTTTTGTT ACTTTGAGTA AATTAGAGTG TTCAAAGCAG ACGGTTTATA AAACAGGTAA AACTGGGTTT GAATACTACA GCATGGAATA ACAAAATTGA ACAAGCTAAA ATTTTTGTTC TTTTTTCTTA TTTTGGCTTA GTTACGATTA ATAGGAGTAG TTTGGGGACA TTCGTATTCA GATGTCAGAG GTGAAATTCT TAGAT

>1+2 Type D TCAAAGATTA AGCCATGCAA GTGAAAGTAT ATACATTTTC GTAATGTAGA AACTGCGAAC GGCTCATTAC AACAGTTATA ATCTACTTGA CATTACAATC TTATAAGGAT ACCTACGGAA AAGCTGTAGC TAATACTTGC TCGATATACT AAATATATTT ATTTATATTT GGTATGGTAT TTGTTAGCTT TTTCAAGAAA AAGACAAGTG GGGAGTCCTA ACAAAGAAGC GACACGTATA AATTTTTTAT AAATTTATGA AGTGCGTATC AATCGAGTTT CTGACCTATC AGCTTTTGAT GTTAGGGTAT TGGCCTAACA TGGCTATGAC GGGTAACGGG GAATTGGAGT TCGATTCCGG AGAGGGAGCC TGAGAAATAG CTACCACATC TAAGGAAGGC AGCAGGCGCG TAAATTACCC AATTCTGACA AAGAGAGGTA GTGACAAGAA ATAACGATGT AAGGTCTATT TTTAGATTTT ACAATTGGAA TGGTGGGAAT CTAAACCCTT CCCAGAGTAG CAATTGGAGG GCAAGTCTGG TGCCAGCAGC CGCGGTAATT CCAGCTCCAA TAGCGTATAT TAAAATTGTT GCAGTTAAAA CGCTCGTAGT TGATCTTCAA AAGAATTTAT TAGAGAACTC TACACCACTT TAATGTGTTG TATGTAGAGA TCTCCTCGAA ATTCTTTTTT TATTCTAAAT ATATATTCGT ATGTATTTAG AATAGTTACT TTGAGTAAAT TAGAGTGTTC AAAGCAAGTG ACTTGCAAGG GGAAACCCGC TTGAATACTA CAGCATGGAA TAACATAATT GAAAAAGTCA AATGGTGTTT CTTTTTAAAG ATTTCGATCT TTAAAAACTT TTTCTTGATT TGGCTTAGTT ACGATTAATA GGAGTAGATT GGGGACCTTC GTATTCAGAT GTCAGAGGTG AAATTCTTAG AT

>1+2 Type E TCAAAGATTA AGCCATGCAA GTGAAAGTAT ATGCACATTT ATTGCAGAAA CTGCGAACGG CTCATTAAAA CAGTTATAAT CTACTTGACA TTTTATTATA AGGATAACTA CGGAAAAGCT GTAGCTAATA CTTGTTAAGT ACTTTTACTC CCCGGAGTAA TTGTATGTAT TTGTTAAGAC CCCTAAGAAA AAATGATATT AAAGGAATTA TAACAAAGAA GCAACACATA ATATAATTAT TCAGTGTGTA TCAATCGAGT TTCTGACCTA TCAGCTTTTG ATGTTAGGGT ATTGACCTAA CATGGCTTTG ACGGGTAACG GGGAATTAGA GTTCGATTCC GGAGAGGGAG CCTGAGAAAT AGCTACCACA TCTAAGGAAG GCAGCAGGCG CGTAAATTAC CCAATTCTAA ATAAGAGAGG TAGTGACAAG AAATAACAAT ATAAGGCCAA ATTTTGGTTT TATAATTGGA ATGATGGGAA TTTAAAACCT TCCCAAAAAT CAATTGGAGG GCAAGTCTGG TGCCAGCAGC CGCGGTAATT CCAGCTCCAA TAGCGTATAT TAAAATTGTT GCAGTTAAAA CGCTCGTAGT TGAACTTCAA GGGTATAATT ACTTTAAGCA ACTCACTTGG AAAGAATCAT GACTTCTGTC ACTGCTTTTA TCCTTGTTGC AGTTCTTTTA ATACAGGGCC CTTTGAGAGC CCATTAATTT ATGACTGGGT TTCTCGTTAC TTTGAGTAAA TTAGAGTGTT TAAAGCAAAC AGATAAAGCG TATTTTACTG TGTTTGAATA CTATAGCATG GAATAACAAC ATTGAATAGG TCAAAAGTTT TTGAAAAATT TTTCTTATTT TGGCTTAGAT ACAGTTAATA GGAGTAGCTT GGGGGCATTT GTATTCAGAT GTCAGAGGTG AAATTCTTAG AT

274

>1+2 Type F TCAAAGATTA AGCCATGCAA GTGAAAGTAT ATATATATTT ATTATATAGA AACTGCGAAC GGCTCATTAA AACAGTTATA ATCTACTTGA CATTTTTTTT ATAAGGATAA CTACGGAAAA GCTGTAGCTA ATACTTGAAC GACTGTTATA TAATAATCCT CGGATTTTTA TATAATATGT ATTTGTTAAG CCTTATAAGA AAAAAGTTAT TAATTTAAGG AATTATAACA AAGAAGCAAC ACATAATAAA ACTCTGTTTT ATTTAGTGTA TATCAATCGA GTTTCTGACC TATCAGCTTT TGATGTTAGG GTATTGGCCT AACATGGCTA TGACGGGTAA CGGGGAATTA GAGTTCGATT CCGGAGAGGG AGCCTGAGAA ATAGCTACCA CATCTAAGGA AGGCAGCAGG CGCGTAAATT ACCCAATTCT AAAGAAGAGA GGTAGTGACA AGAAATAACG ATGCAAGGCC AAATTTTGGT TTTGCAATTG GAATGATAGG AATTTAAAAA CTTCCTAAAG TAACAATTGG AGGGCAAGTC TGGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATTCCAGCTC CAATAGCGTA TATTAAAATT GTTGCAGTTA AAACGCTCGT AGTTGAATTT CAAAGAATCT ATTTTTAAAG CAACGCTTTA TTGGAACCTC ATTACTACGA TACTCAGTAT CATGTTTTGA GGATCCAATA TTATGTGTTC TTTAAAATAA AAGAGATTCT TTTTAAAAAT TCTTTATTGC ATTTTTATGT GATAAGAATT TTTGTTACTT TGAGTAAATT AGAGTGTTCA AAGCAAACAG TTTAAAACAG GAAACTGTGT TTGAATACTA CAGCATGGAA TAACAAAATT GAACAAGCTA AAATTTTGTT CTTTTTTCTT ATTTTGGCTT AGTTACGATT AATAGGAGTA GTTTGGGGAC ATTCGTATTC AGATGTCAGA GGTGAAATTC TTAGAT

- Fragment découpé par rPLU6 et rPLU5 :

>5+6_Type_A TTAAAATTGT TGCAGTTAAA ACGCTCGTAG TTTAATATCA AAGAATCTAT TTTAATAAGT AATGCAATAT CCAGAATTTC ATTAATATAC TATAGTACTT CGGTTCTATA ATTGTATTTC GTTAATCTGT GGTATAATAT ATGCGTTCTT GTAAACAAAT AAGATACTTT TTAAAAATTC TTAATTACAT ATTAATTTAT AATGTGATTA GAATTTTTGT TACTTTGAGT AAATTAGAGT GTTCAAAGCA AACAGTTTAA AACAGCAAAA CTGTGTTTGA ATACTACAGC ATGGAATAAC ATAATTGAAC AAGCTAAAGT ATGTTCTTTT TTCTTATTTT TGGCTTAGTT AAGATTAATA GGAGTAGTTT GGGGACATTC GTATTCAGTA GTCAGAGGTG AAATTCTTAG ATTTTCTGGA GACGAACAAC TGCGAAAGCA TTTGTCTAAA ATATGTTCAT TAATCAAGAA CGAAAGTTAA GGGAGTGAAG ACGATCAGAT ACCGTCGTAA TCTTAACCAT AAACTATGCC GACTAGGTGT TGGATTATAG AATAATAAAA TAAAAGATAC TCTTAATTAA ATAATTTTTA AGAGCTTTTA GATTACTTCC TTCAGTACCT TATGAGAAAT CAAAGTCTTT GGGTTCTGGG GCGAGTATTC GCGCAAGCGA GAAAGTTAAA AGAATTGACG GAAGGGCACC ACCAGGCGTG GAGCTTGCGG CTTAATTTGA CTCAACACGG GAAAACTCAC TAGTTTAAGA CAAGAGTAGG ATTGACAGAT TGATAGCTCT TTCTTGATTT CTTGGATGGT GATGCATGGC CGTTTTTAGT TCGTGAATAT GATTTGTCTG GTTAATTCCG ATAACGAACG AGATCTTAAC CTGCTAATTA GCGGTATATA CTATTTATTC TTATATAAGA AAAATATAGA TTGGATAATA AATATAATGG ATTAAAAAAA TATGGAATAT ATATTTCATA TATTCTTAAT TTTTAATAAT TGTTATATAT GTTATTTTTG GTTTTTGTTC TTTTTATGTA AGAACGTATT TATTCAATTC TAATGCTTCT TAGAGGAACA TTGTGTGTCT AACACAAGGA AGTTTAAGGC AACAACAGG

>5+6 Type B (consensus) TTAAAATTGT TGCAGTTAAA ACGCTCGTAG TTGAATTTCA AAGAATCAAT TTTTAAGGTA ATGCTTTATC GGATACGTGT TAAATGGTGC TTCGGCGCGT ATTTTTCACA ATTCTGATAT TATGTATTCC TTAAAATAAA ATAGGTTCTT TTTAAAAATT CTTCGTTGCT TTATGTGATG AGAATTTTTG TTACTTTGAG TAAATTAGAG TGTTCAAAGC AAACAGTTTA AAACAGCTAA AACTGTGTTT GAATACTACA GCATGGAATA ACAAAATTGA ACAAGCTAAA ATTTTTGTTC TTTTTTCTTA TTTTGGCTTA GTTACGATTA ATAGGAGTAG TTTGGGGACA 275 TTCGTATTCA GATGTCAGAG GTGAAATTCT TAGATTTTCT GGAGACGAAC AACTGCGAAA GCATTTGTCT AAAATACTTC CATTAATCAA GAACGAAAGT TAAGGGAGTG AAGACGATCA GATACCGTCG TAATCTTAAC CATAAACTAT GCCAACTAGG TGTTGGATGA AAGTGTAAAA AATAAAAGAT GATCTAATGT AACATTTAGA TTGTCTTTTA GCTTACTTCC TTCAGTACCT TATGAGAAAT CAAAGTCTTT GGGTTCTGGG GCGAGTATTC GCGCAAGCGA GAAAGTTAAA AGAATTGACG GAAGGGCACC ACCAGGCGTG GAGCTTGCGG CTTAATTTGA CTCAACACGG GAAAACTCAC TAGTTTAAGA CAAGAGTAGG ATTGACAGAT TAATAGCTCT TTCTTGATTT CTTGGATGGT GATGCATGGC CGTTTTTAGT TCGTGAATAT GATTTGTCTG GTTAATTCCG ATAACGAACG AGATCTTAAC CTGCTAATTA GCGGTAAATA CAACATATTC TTAAGTAAAT AAGAATATAG ATAAAAATAA CAAATAAGAG AAAATATTAG GATGTTATTA TATATAATAT CCTTTTCCCT TTTCTTCTTA TTTTGTTTTT TTATTCTATT TCTTTTTTTA CTTAAGAATG TATTTACTTG ATTGTAAAGC TTCTTAGAGG GACATTGTGT GTCTAACACA AGGAAGTTTA AGGCAACAAC AGG

>5+6 Type C (consensus) TTAAAATTGT TGCAGTTAAA ACGCTCGTAG TTGAATTTCA AAGAATCAAT AATTAGCGAA TACAATATCA GATATGTGTT AAATATAGTG CTTCGGCTTA TATTTTCCAC ATTTCTGAAT ATATGTATTG TTAAAAATAT AATAGGTTCT TTTATAAAAA TTCTTCGTTG CTTTATGTGA TGAGAATTTT TTGTTACTTT GAGTAAATTA GAGTGTTCAA AGCAGACGGT TTATAAAACA GGTAAAACTG GGTTTGAATA CTACAGCATG GAATAACAAA ATTGAACAAG CTAAAATTTT TGTTCTTTTT TCTTATTTTG GCTTAGTTAC GATTAATAGG AGTAGTTTGG GGACATTCGT ATTCAGATGT CAGAGGTGAA ATTCTTAGAT TTTCTGGAGA CGAACAACTG CGAAAGCATT TGTCTAAAAT ACTTCCATTA ATCAAGAACG AAAGTTAAGG GAGTGAAGAC GATCAGATAC CGTCGTAATC TTAACCATAA ACTATGCCAA CTAGGTGTTG GATGAAAGTG TAAAAAATAA AAGATGATCT AATGTAACAT TTAGATTGTC TTTTTAGCTT ACTTCCTTCA GTACCTTATG AGAAATCAAA GTCTTTGGGT TCTGGGGCGA GTATTCGCGC AAGCGAGAAA GTTAAAAGAA TTGACGGAAG GGCACCACCA GGCGTGGAGC TTGCGGCTTA ATTTGACTCA ACACGGGAAA ACTCACTAGT TTAAGACAAG AGTAGGATTG ACAGATTAAT AGCTCTTTCT TGATTTCTTG GATGGTGATG CATGGCCGTT TTTAGTTCGT GAATATGATT TGTCTGGTTA ATTCCGATAA CGAACGAGAT CTTAACCTGC TAATTAGCGG TAAATACAAC ATATTCTTAA GTAAATAAGA ATATAGATAA AAATAACAAA TAAGAGAAAA TATTAGGATG TTATTATATA TAATATCCTT TTCCCTTTTC TTCTTATTAT GTTTTTTTTA TTCTATTTCT TTTTTTACTT AAGAATGTAT TTACTTGATT GTAAAGCTTC TTAGAGGAAC ATTGTGTGTC TAACACAAGG AAGTTTAAGG CAACAACAGG

>5+6 Type D TTAAAATTGT TGCAGTTAAA ACGCTCGTAG TTGATTTTCA AAGGAATTTA TTTGAGAAGA TTGCACCACT TTATTGTGTT GTATGCAAAC TTCTCCTCGA AATTCTTTTT TTATTCTACA TATGTTTTCG AATGTATGTA GAATAGTTAC TTTGAGTAAA TTAGAGTGTT CAAAGCAAGT GAATTGCAAA GGGGAAACCC GCTTGAATAC TACAGCATGG AATAACATCA TTGAAAAAGT CGAATGGTGT TTCTTTTTAG AAATTTCGAT TTTTAAAATC TTTTTCTTGA TTTGGCTTAG TTACGATTAA TAGGAGTAGT TTGGGGACAT TCGTATTCAG ATGTCAGAGG TGAAATTCTT AGATTTTCTG GAGACGAACA ACTGCGAAAG CATTTGTCTA AAATACTTCC ATTAATCAAG AACGAAAGTT AAGGGAGTGA AGACGATCAG ATACCGTCGT AATCTTAACC ATAAACTATG CCAACTAGGT GTTGGATGAA AGTGTAAAAA ATAAAAGATG ATCTAATGTA ACATTTAGAT TGTCTTTTAG CTTACTTCCT TCAGTACCTT ATGAGAAATC AAAGTCTTTG GGTTCTGGGG CGAGTATTCG CGCAAGCGAG AAAGTTAAAA GAATTGACGG AAGGGCACCA CCAGGCGTGG AGCTTGCGGC TTAATTTGAC TCAACACGGG AAAACTCACT AGTTTAAGAC AAGAGTAGGA TTGACAGATT AATAGCTCTT TCTTGATCTC TTGGATGGTG ATGCATGGCC GTTTTTAGTT CGTGAATATG ATTTGTCTGG TTAATTCCGA TAACGAACGA GATCTTAACC TGCTAATTAG CGGTAAATAC AACATATTCT TAAGTAAATA AGAATATAGA TAAAAATAAC AAATAAGAGA AAATATTAGG ATGTTATTAT ATATAATATC CTTTTCCCTT TTCTTCTTAT 276 TTTGTTTTTT TATTCTATTT CTTTTTTTAC TTAAGAATGT ATTTACTTGA TTGTAAAGCT TCTTAGAGGG ACATTGTGTG TCTAACACAA GGAAGTTTAA GGCAACAACA GG

>5+6 Type F5 TTAAAATTGT TGCAGTTAAA ACGCTCGTAG TTGAATTTCA AAGGATCTAT TTTTAAAGCA ACGCTTTATT GGAACCCCAT TACTACGATA CTCAGTATCA TGTTTTGGGG ATTCAATATT ATGTGTTCTT TAAAATAAAA GAGATTCTTT TTAAAAATTC TTTATTGCAT TTTTATGTGA TAAGAATTTT TGTTACTTTG AGTAAATTAG AGTGTTCAAA GCAAACAGTT TAAAACAGGA AACTGTGCTT GAATACTACA GCATGGAATA ACAAAATTGA ACAAGCTAAA ATTTTGTTCT TTTTTCTTAT TTTGGCTTAG TTACGATTAA TAGGAGTAGT TTGGGGACAT TCGTATTCAG ATGTCAGAGG TGAAATTCTT AGATTTTCTG GAGACGAACA ACTGCGAAAG CATTTGTCTA AAATACTTCC ATTAATCAAG AACGAAAGTT AAGGGAGTGA AGACGATCAG ATACCGTCGT AATCTTAACC ATAAACTATG CCGACTAGGT GTTGGATGAA AGTATTAAAA ATAAAAGCGT CTTGATGTAA CAGTCAAGAT GCTTTTAGAT TGCTTCCTTC AGTACCTTAT GAGAAATCAA AGTCTTTGGG TTCTGGGGCG AGTATTCGCG CAAGCGAGAA AGTTAAAAGA ATTGACGGAA GGGCACCACC AGGCGTGGAG CTTGCGGCTT AATTTGACTC AACACGGGAA AACTCACTAG TTTAAGACAA GAGTAGGATT GACAGATTAA TAGCTCTTTC TTGATTTCTT GGATGGTGAT GCATGGCCGT TTTTAGTTCG TGAATATGAT TTGTCTGGTT AATTCCGATA ACGAACGAGA TCTTAACCTG CTAATTAGCG GTAAATACAA CATATTCTTA AGTAAATAAG AATATAGATA AAAATAACAA ATAAGAGAAA ATATTAGGAT GTTATTATAT ATAATATCTT TTTCCCTTTT CCTCTTATTA TGTTTTTTTA TTCTATTTCT TTTTTTACTT AAGAATGTAT TTACTTGATT GTAAAGCTTC TTAGAGGGAC ATTGTGTGTC TAACACAAGG AAGTTTAAGG CAACAACAGG

277 278 Annexe 28 : résultats de la troisième expérience : hémoparasites mis en évidence chez diverses espèces aviaires commensales (autres que Pica pica et Corvus corone corone) au zoo de La Palmyre Tableau (xvi)

Plasmodium Haemoproteus Leucocytozoon Trypanosoma Espèce Numéro Autres spp. spp. spp. spp. Alcedo atthis Aucun. - - - - - Piroplasmes, Anas ou corps C1 - - - - platyrhynchos d’inclusion viraux ? Anas platyrhynchos C2 - - - - ? Anas platyrhynchos C3 - - - - ? Anas platyrhynchos C4 - - - - - Anas platyrhynchos C5 - - - - - Anas platyrhynchos C6 - - - - - Anas platyrhynchos C7 - - - - - Anas platyrhynchos C8 - - - - - Anas platyrhynchos C13 - - - - - Ardea cinerea H1 - - - - - Carduelis chloris V1 - - - - - Carduelis chloris V2 - - - - - Certhia sp. Aucun. - - - - - Columba palumbus Pal1 - - - - - Columba palumbus Pal2 - ++++ - - - Columba palumbus Pal3 - - - - - Columba palumbus Pal4 - - - - - Columba palumbus Pal5 - - - - - Cyanistes Aucun. caeruleus + - - - - Erithacus Aucun. rubecula - - - - - Fringilla Aucun. coelebs - - - - - Gallinula chloropus Pou1 - - - - - 279 Plasmodium Haemoproteus Leucocytozoon Trypanosoma Espèce Numéro Autres spp. spp. spp. spp. Gallinula chloropus Pou2 - - - - - Gallinula chloropus Pou4 - - - - - Larus sp. Aucun. - - - - - Melopsittacus Aucun. undulatus - - - - - Parus major Aucun. - - - - - Passer domesticus Moi2 - - - - - Passer domesticus Moi3 - - - - - Passer domesticus Moi4 - - - - - Passer domesticus Moi5 - - - - - Streptopelia decaocto T1 - - - - - Streptopelia decaocto T2 - - - - - Streptopelia decaocto T3 - - - - - Streptopelia decaocto T4 - - - - - Streptopelia decaocto T6 - - - - - Streptopelia decaocto T7 - - - - - Streptopelia decaocto T9 - - - - - Streptopelia decaocto T10 - - - - - Turdus merula Mer1 - - - - - Turdus merula Mer2 - - - - - Turdus merula Mer3 - - - - - Turdus merula Mer4 - - - - -

+ ou - : présence ou absence de parasites (analyse morphologique). Les parasitémies ont été appréciées semi-quantitatvement : le nombre de symboles « + » est proportionnel à l’intensité de la parasitémie. Les points d’interrogation indiquent des résultats incertains ou douteux.

280

Infections à Plasmodium chez les oiseaux Sphénisciformes (manchots) Synthèse bibliographique, analyse rétrospective de cas et étude épidémiologique au zoo de La Palmyre

NOM : LECLERC PRÉNOM : Antoine

RÉSUMÉ : Les infections à Plasmodium des oiseaux sont relativement peu étudiées à l’heure actuelle. Néanmoins, les dommages qu’elles peuvent occasionner chez certaines populations aviaires, tout particulièrement au sein des colonies captives de manchots (ordre des Sphénisciformes), ont suscité un intérêt marqué de la part de quelques scientifiques, tels que les vétérinaires exerçant en parc zoologique. Cette thèse s’ouvre par une synthèse bibliographique en français sur les infections à Plasmodium des oiseaux, mettant l’accent sur leur importance et leurs particularités chez les Sphénisciformes. Le but était de constituer un document complet et facile à consulter, utilisable par les vétérinaires de zoo francophones. Une deuxième partie est consacrée à l’analyse des cas de mortalité de Spheniscus spp. constatés au zoo de La Palmyre au cours des dernières décénies. Enfin, une troisième partie présente les résultats d’une étude épidémiologique menée en 2007 à La Palmyre. L’utilisation de techniques de biologie moléculaire (P.C.R.) a notamment permis d’identifier chez deux espèces aviaires – la pie bavarde (Pica pica) et la corneille noire (Corvus corone sous-espèce corone) – des Plasmodium dont les séquences ADN sont identiques à celles des Plasmodium retrouvés chez les manchots du parc. Ces oiseaux pourraient jouer un rôle de réservoir de l’infection.

MOTS CLÉS : PLASMODIUM, PALUDISME, ÉPIDÉMIOLOGIE, PARC ZOOLOGIQUE, OISEAUX, SPHÉNISCIFORMES, MANCHOTS, LA PALMYRE.

JURY : Président : Pr Directeur : Dr Pascal ARNÉ Assesseur : Pr René CHERMETTE

Invité : Dr Thierry PETIT Invité : Pr emeritus Irène LANDAU

ADRESSE DE L’AUTEUR : M. Antoine LECLERC 20 bis avenue Mac Mahon 75017 PARIS, FRANCE

Plasmodium infections in Sphenisciforme birds (penguins) Bibliographical synthesis, retrospective cases analysis and epidemiological study at La Palmyre zoo

SURNAME : LECLERC GIVEN NAME : Antoine

SUMMARY : Avian Plasmodium infections are hardly studied nowadays. Nonetheless, in consequence of the damages they cause to some avian populations, mainly captive penguin colonies (order Sphenisciformes), they are of the utmost interest for a few scientists, such as zoo veterinarians. This thesis begins with a bibliography on avian Plasmodium infections, insisting on their importance and peculiarities in Sphenisciformes. The aim was to propose a complete and easy-to- consult document for french-speaking zoo veterinarians. A second part is dedicated to the analysis of Spheniscus spp. deaths reported at La Palmyre zoo during the last decades. Finally, a third part summarizes the results of an epidemiological study conducted at La Palmyre in 2007. The use of molecular tools (P.C.R.) has enabled the identification in two avian species – the common magpie (Pica pica) and the carrion crow (Corvus corone subspecies corone) – of several Plasmodium with DNA sequences identical to those of the Plasmodium found in La Palmyre penguins. These avian species could be a reservoir of the infection.

KEYWORDS : PLASMODIUM, MALARIA, EPIDEMIOLOGY, ZOOLOGICAL PARK, BIRDS, SPHENISCIFORMES, PENGUINS, LA PALMYRE.

JURY : President : Pr Director : Dr Pascal ARNÉ Assessor : Pr René CHERMETTE

Guest : Dr Thierry PETIT Guest : Pr emeritus Irène LANDAU

AUTHOR’S ADDRESS: M. Antoine LECLERC 20 bis avenue Mac Mahon 75017 PARIS, France