MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

MÁRCIA ALVES DIAS DE MATOS

ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO E MOLECULAR DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE B EM AFRO-DESCENDENTES DE COMUNIDADE ISOLADA NO ESTADO DE GOIÁS (KALUNGAS)

Orientadora:

Profª Drª Regina Maria Bringel Martins

Tese de Doutorado

Goiânia-GO 2007 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

MÁRCIA ALVES DIAS DE MATOS

ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO E MOLECULAR DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE B EM AFRO-DESCENDENTES DE COMUNIDADE ISOLADA NO ESTADO DE GOIÁS (KALUNGAS)

Orientadora:

Profª Drª Regina Maria Bringel Martins

Tese submetida ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical/ Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor em Medicina Tropical na área de concentração de Microbiologia.

Este trabalho foi realizado com auxilio financeiro do CNPq, processo nº 4773319/2003-3

Goiânia-GO 2007

Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

11. Identificação do material bibliográfico: [] Dissertação [X] Tese

12. Identificação da Tese ou Dissertação Autor(a): Márcia Alves Dias de Matos CPF: 87952793187 E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [x] Sim [ ] Não Vínculo Empregatício do autor Agência de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Sigla: CNPq Tecnológico País: Brasil UF: GO CNPJ: Título: ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO E MOLECULAR DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE B EM AFRO-DESCENDENTES DE COMUNIDADE ISOLADA NO ESTADO DE GOIÁS (KALUNGAS) Palavras-chave: Hepatite B; Prevalência; Aspectos Moleculares;Afro-descendentes Título em outra língua: EPIDEMIOLOGICAL AND MOLECULAR STUDY OF HEPATITIS B VIRUS INFECTION IN AFRO-DESCENDANTS FROM ISOLATED COMMUNITY IN GOIÁS STATE (KALUNGAS)

Palavras-chave em outra língua: Hepatitis B; Prevalence; Afro-Descendants; Molecular aspects Área de concentração: Microbiologia Data defesa: (dd/mm/aaaa) 18/12/2007 Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical Orientador(a): Regina Maria Bringel Martins CPF: 215655031-04 E-mail: [email protected]

3. Informações de acesso ao documento: Liberação para disponibilização?1 [ ] total [ x ] parcial

Em caso de disponibilização parcial, assinale as permissões: [x] Capítulos. Especifique:Introdução e Materiais e Métodos [x] Outras restrições: Aguardando publicação dos resultados e discussão Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O Sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.

______Data: ____ / ____ / _____ Assinatura do (a) autor (a)

1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados.

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (GPT/BC/UFG)

Matos, Márcia Alves Dias de. M433e Estudo epidemiológico e molecular da infecção pelo vírus da hepatite B em Afro-descendentes de comunidade isolada no Estado de Goiás (Kalungas) / Márcia Alves Dias de Matos. - Goiânia, 2007. xv, 132 f. : il.

Orientadora: Profª Drª Regina Maria Bringel Martins.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2007.

Bibliografia :f. 74-106 Inclui índices de tabelas, de quadro e de figuras. Anexos.

1. Hepatite B – Afro-descendentes (Kalungas) – Goiás 2. Hepatite B – Aspectos moleculares 3. Epidemiologia molecular I. Martins, Regina Maria Bringel II. Universidade Federal de Goiás, Institu- to de Patologia Tropical e Saúde Pública III. Título.

CDU:616.36-002(817.3) Dedico este trabalho a toda população Kalunga, pessoas as quais devo o meu respeito e aprendizado; Aos meus avós por me ensinarem as melhores lições da vida; Aos meus queridos pais, Bernardina e Delfino, pela grandeza na dedicação e renúncias na luta pela educação dos filhos; Aos meus irmãos, Maysa, Delciron e Lázaro pela presença constante em minha vida; Ao meu esposo Marcos pelo incentivo, carinho, dedicação e companhia nas longas horas de estudo; A professora Regina, pelo carinho, orientação e oportunidade de crescimento. Agradecimentos

Por muitas vezes cometi a falha de não agradecer pelas bênçãos que me foram concedidas. Também várias foram as vezes que me espantei quando percebi as dádivas recebidas, sem que eu ao menos houvesse solicitado. Então compreendi que havia “Alguém” cuidando e traçando o meu destino. Assim, agradeço primeiramente a Deus por projetar mais essa vitória em minha vida e por mostrar o seu amor, muitas vezes de forma misteriosa, mas não menos extraordinária. Obrigada Senhor por colocar pessoas especiais em meu caminho, que foram importantes na concretização deste sonho:

• À Professora Drª Regina Maria Bringel Martins. Acredito que as palavras jamais conseguirão expressar a minha gratidão! Mesmo assim, agradeço pelos sete anos de orientação, carinho, dedicação e oportunidade de crescimento. Sua competência e disciplina foram fundamentais na realização deste trabalho. • À Professora Drª Sheila Araújo Teles, pela ajuda na coleta das amostras e análise dos dados, pelas palavras que tanto me incentivaram na vida pessoal e profissional. És um exemplo de competência e profissionalismo. • À Professora Drª Megmar Aparecida dos Santos Carneiro, minha “irmã mais velha” por sempre me ajudar a solucionar problemas, pelo exemplo de professora, mãe e esposa dedicada. A sua amizade e companheirismo jamais serão esquecidos. • À Professora Drª Ana Rita Coimbra Motta de Castro, pela ajuda desde o início deste estudo, bem como na coleta das amostras, além de sempre dispensar atenção e apoio. Sua ajuda foi essencial para a realização deste trabalho • À Professora, amiga e doutoranda Carmem Luci Rodrigues Lopes, a grande responsável por me direcionar à iniciação científica, fato que norteou a minha caminhada rumo ao objetivo de concluir a pós-graduação. Sua serenidade e solidariedade são grandes virtudes que não esquecerei. • Às amigas do Laboratório de Virologia: Renata C. Ferreira, Nádia Rúbia S. Reis, Aline G. Koslowsky, Nara Rúbia Freitas, Laura B. Nascimento, Viviane R. Tavares. Obrigada por vivermos como uma família, pela atenção em momentos de doença, por compartilhar as risadas em momentos de descontração, por tantos “almoços felizes” e até pelas “broncas” quando foram necessárias. Obrigada também pela ajuda na coleta das amostras. Jamais conseguirei retribuir a tudo que fizeram por mim. • À amiga Adriane da Silveira Gomes, por todo o tempo que esteve ao meu lado no Laboratório de Virologia. Além de me presentear com o bom humor de sempre, foi seguindo o seu exemplo que aprendi mais sobre perseverança e lutar pelos meus sonhos. • Ao biomédico e amigo, Ágabo Macedo Costa e Silva, pela sua importante ajuda nos testes moleculares, pelos conselhos e palavras de incentivo. • Às amigas e bolsistas de Iniciação Científica: Thaís A. Marinho e Thamíris A. Marinho, pelo apoio e incentivo durante a realização deste trabalho. • À Drª. Selma Gomes Andrade e ao doutorando Francisco F.C. A. Mello da Fundação Oswaldo Cruz, pela receptividade e apoio na realização do seqüenciamento. • Aos integrantes do NUCLAIDS (FEN/UFG): Michelle Dias da Silva Oliveira e Marcos André de Matos, pela valiosa ajuda na coleta das amostras. • Aos amigos da Casa do Estudante Universitário da UFG, local que me acolheu em toda a minha formação acadêmica e grande parte da pós- graduação, possibilitando a realização dos meus objetivos. • A todos os funcionários da Secretaria Municipal de Cavalcante, pela receptividade e apoio imprescindível durante a coleta das amostras. • A todos os professores e funcionários do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, que me ensinaram e acolheram com tanto carinho, em especial àqueles que participaram da banca de qualificação: André Kipnis, Divina Cardoso, Fabíola Fiaccadori, Joaquim Caetano e Maria do Rosário. • Aos funcionários e professores da Faculdade de Enfermagem, em especial aos professores Marcelo Medeiros, que primeiramente me ensinou o valor da pesquisa científica e Maria Alves Barbosa que me acolheu no PET (FEN/UFG) estimulando o ingresso à Iniciação Científica. • Às enfermeiras do Hospital de Doenças Tropicais: Ana Maria e Agda pela compreensão e por organizar uma escala de trabalho em dias que não atrapalhasse a conclusão do doutorado. • Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro.

NÃO SEI (Cora Coralina)

Não sei... Se a vida é curta ou longa demais pra nós, mas sei que nada do que vivemos tem sentido, se não tocamos o coração das pessoas. Muitas vezes basta ser: Colo que acolhe, Braço que envolve, Palavra que conforta, Silêncio que respeita, Alegria que contagia, Lágrima que corre, Olhar que acaricia, Desejo que sacia, Amor que promove. E isso não é coisa de outro mundo, é o que dá sentido à vida. É o que faz com que ela não seja nem curta, nem longa demais, mas que seja intensa, verdadeira e pura... Enquanto durar.

SUMÁRIO

ÍNDICE DE FIGURAS...... x ÍNDICE DE TABELAS...... xii

ÍNDICE DE QUADROS...... xiii

RESUMO...... xiv

SUMMARY...... xv

1. INTRODUÇÃO………………………………………………….………..…….....……..01

1.1 Histórico……………………...... ………………….…...... 01

1.2 Classificação e estrutura do vírus da hepatite B...... ……..………...03

1.2.1 Classificação...... 03

1.2.2 Características biológicas...... 03

1.2.3 Organização genômica do HBV...... 05

Fase de leitura aberta Pré-S/S...... 06

Fase de leitura aberta Pré-C/C...... 06

Fase de leitura aberta P...... 07

Fase de leitura aberta X...... 08

1.3 Variabilidade Antigênica e Genética do HBV...... 08

1.3.1 Subtipos...... 08

1.3.2 Genótipos...... 10

Subgenótipos...... 13

1.3.3 Mutações no genoma do HBV...... 14

Mutações na região S...... 14

Mutações na região Pré-Core e Core...... 15

Mutações na região X...... 17

Mutações na região P...... 17 1.4 Replicação do vírus da hepatite B...... 17

1.5 Aspectos clínicos e tratamento da hepatite B...... 19

1.6 Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HBV...... 23

1.7 Epidemiologia da infecção pelo HBV...... 26

1.7.1 Transmissão do HBV...... 26

1.7.2 Prevalência da infecção pelo HBV...... 28

1.7.3 Distribuição dos subtipos e genótipos...... 33

1.8 Prevenção e controle da hepatite B...... 35

1.9 Os afro-descendentes no Brasil e a comunidade Kalunga...... 38

1.10 Justificativa...... 43

2. OBJETIVOS...... 44

3. MATERIAL E MÉTODOS...... 45

3.1 População estudada...... 45

3.2 Entrevista e coleta de sangue...... 45

3.3 Testes Sorológicos...... 46

3.3.1 Detecção do HBsAg...... 46

3.3.2 Detecção do anti-HBc Total...... 47

3.3.3 Detecção de anti-HBs...... 47

3.3.4 Detecção do HBeAg e anti-HBe...... 48

3.4 Detecção e genotipagem do HBV...... 49

3.4.1 Extração do HBV DNA...... 49

3.4.2 Reação em cadeia da polimerase...... 49

3.4.3 Eletroforese em gel de agarose...... 50 3.4.4 Genotipagem por RFLP...... 51

3.5 Sequenciamento da região Pré-S/S...... 51

3.5.1 Amplificação das amostras para a região Pré-S/S...... 51

3.5.2 Purificação do DNA...... 52

3.5.3 Sequenciamento e análise da região Pré-S/S...... 53

3.6 Processamento e análise dos dados...... 54

4. RESULTADOS...... 55

4.1 Características da população estudada...... 55

4.2 Marcadores sorológicos e moleculares...... 57

4.3 Fatores de risco associados à infecção pelo HBV...... 59

4.4 Prevalência de infecção oculta pelo HBV...... 62

4.5 Análise filogenética da região Pré- S/S...... 62

5. DISCUSSÃO...... 64

6. CONCLUSÕES...... 73

7. REFÊRENCIAS...... 74

ANEXOS...... 107 ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. Representação esquemática da estrutura do vírus da hepatite B...... 04

FIGURA 2. Micrografia eletrônica do virion e partículas subvirais não infecciosas...... 04

FIGURA 3. Genoma do HBV com as quatro regiões de leitura aberta (ORF): pré-S/S, pré-C/C, P e X...... 05

FIGURA 4. Organização da HBV polimerase ...... 08

FIGURA 5. Determinante “a” e subdeterminantes d ou y e w ou r, com os subtipos sorológicos do HBV...... 10

FIGURA 6. Árvore filogenética com os oito genótipos do HBV (A-H)...... 11

FIGURA 7. Representação esquemática do ciclo replicativo HBV...... 19

FIGURA 8. Perfil sorológico da hepatite B aguda ...... 25

FIGURA 9. Perfil sorológico da hepatite B crônica...... 25

FIGURA 10. Distribuição geográfica mundial da hepatite B crônica...... 32

FIGURA 11. Rota dos escravos ao Brasil – Origem comunidade Kalunga...... 39

FIGURA 12. Povo Kalunga...... 41

FIGURA 13. Casa Kalunga feita de adobe e palha...... 41

FIGURA 14. Cozinha Kalunga, com fogão a lenha...... 41

FIGURA 15. Escola Kalunga feita com adobe e palha ...... 42

FIGURA 16. Mulheres Kalunga trabalhando em artesanato...... 42

FIGURA 17. Kalungas no preparo da farinha de mandioca...... 42

FIGURA 18. Figura 18 - Sanfoneiro em festa Kalunga...... 42

FIGURA 19. Crianças da comunidade Kalunga ...... 42

FIGURA 20. Prevalência para os marcadores anti-HBs e anti-HBc de acordo com faixa etária da comunidade Kalunga, Goiás...... 58 FIGURA 21. Árvore filogenética da região pré-S/S do HBV ...... 63 ÍNDICE DE TABELAS

TABELA 1. Características dos 878 afro-descendentes estudados da comunidade

Kalunga do Estado de Goiás...... 56

TABELA 2. Prevalência dos marcadores sorológicos para o vírus da hepatite B nos

878 indivíduos da comunidade kalunga...... 57

TABELA 3. Características sorológicas e moleculares das 16 amostras HBsAg positivas...... 59

TABELA 4. Análise univariada dos fatores de risco associados à infecção pelo HBV em indivíduos da comunidade

Kalunga...... 60

TABELA 5. Análise multivariada dos fatores de risco associados à infecção pelo

HBV em indivíduos da comunidade Kalunga...... 61

TABELA 6. Características de risco relatadas pelos cinco indivíduos que apresentaram infecção oculta pelo HBV na comunidade Kalunga...... 62 ÍNDICE DE QUADROS

Quadro 1. Resíduos de aminoácidos que especificam os determinantes do

HBsAg...... 09

Quadro 2. Correlação dos genótipos e subtipos do HBV...... 12

Quadro 3. Estudos sobre a prevalência da infecção pelo vírus da hepatite B realizados em Goiás...... 31

Quadro 4. Primers utilizados na amplificação da região Pré-S/S e sequenciamento...... 53 RESUMO

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) apresenta distribuição mundial. Na África, é altamente endêmica, sendo a maioria dos indivíduos infectada durante a infância. Embora o Brasil seja considerado um país de endemicidade intermediária, taxas variadas de prevalência têm sido encontradas nas cinco regiões geográficas e mesmo dentro de uma mesma região. Este estudo teve como objetivo investigar o perfil epidemiológico e molecular da infecção pelo HBV na população Kalunga em Goiás, Brasil Central, que é considerada a maior comunidade afro-descendente isolada no Brasil. Um total de 878 indivíduos foi entrevistado sobre características sócio-demográficas, fatores de risco e vacinação contra hepatite B. Amostras sanguíneas foram coletadas de todos os participantes e os soros triados para detecção dos marcadores HBsAg, anti-HBc total e anti-HBs por ensaio imunoenzimático. As amostras HBsAg positivas foram submetidos à detecção dos marcadores HBeAg e anti-HBe. O DNA viral foi detectado nas amostras HBsAg e anti-HBc reagentes pela reação da polimerase em cadeia, sendo as amostras HBV DNA positivas genotipadas pela análise do polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição (RFLP) e sequenciamento da região Pré-S/S. A prevalência global da infecção pelo HBV foi de 35,4% (IC 95% 32,3-38,7), sendo de 1,8% (IC 95% 1,1-3,0) para o HBsAg. A análise multivariada mostrou que aumento da idade, gênero masculino, analfabetismo e história de múltiplos parceiros sexuais foram fatores associados a esta infecção. Em 301 (34,3%) indivíduos, verificou-se positividade isolada ao marcador anti-HBs, sugerindo imunidade ao HBV. O HBV DNA foi detectado em 75% (12/16) das amostras HBsAg reagentes, em 100% (2/2) das HBeAg e 83,3% (10/12) das anti-HBe positivas. Um índice de 1,7% (5/295) para infecção oculta pelo HBV foi encontrado nos indivíduos anti-HBc reagentes. Todas as amostras genotipadas por RFLP foram do genótipo A. O sequenciamento da região Pré-S/S confirmou a circulação do genótipo A (subgenótipo Aa) nesta comunidade. Os achados epidemiológicos indicam que medidas preventivas, como programas de educação em saúde e de vacinação contra hepatite B, são necessárias para o controle da infecção pelo HBV nesta população. Além disso, os resultados moleculares sugerem que o genótipo A, subgenótipo Aa foi introduzido no Brasil durante o tráfico de escravos da África. SUMMARY

Hepatitis B virus (HBV) infection occurs throughout the world. In Africa, this infection is highly endemic, with the majority of individuals becoming infected during childhood. Although Brazil has been globally considered a country of HBV intermediate endemicity, variable rates have been found in all five Brazilian regions and even inside the same region. This study aimed to investigate the epidemiological and molecular profile of the HBV infection among the Kalunga population in Goiás, Central Brazil, which is considered the largest Afro-Brazilian isolated community. A total of 878 individuals were interviewed about sociodemographic characteristics, risk factors and HBV vaccination. Blood samples were collected from all participants and serum samples were screened by enzyme-linked immunosorbent assay for the presence of HBsAg, anti-HBc and anti-HBs serological markers. HBsAg-positive samples were submitted to HBeAg and anti-HBe detection. HBsAg and anti-HBc positive samples were tested for HBV DNA detection by polymerase chain reaction and genotyping by subsequent restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis and nucleotide sequencing of preS/S region. The overall prevalence of HBV infection was 35.4% (95% CI: 32.3-38.7). HBsAg carrier rate was 1.8% (95% CI: 1.1- 3.0). Multivariate analysis of risk factors showed that increased age, male gender, illiteracy and history of multiple sexual partners were associated with this infection. Isolated anti-HBs was found in 301 (34.3%) individuals who were immune for hepatitis B. HBV DNA was detected in 75% (12/16) of the HBsAg positive samples, in 100% (2/2) of the HBeAg and in 83.3% (10/12) of the anti-HBe positive samples. An occult HBV infection rate of 1.7% (5/295) was found among anti-HBc positive individuals. All genotyped isolates belonged to genotype A by RFLP analysis. Nucleotide sequencing of preS/S region confirmed the circulation of genotype A (subgenotype Aa) in this community. The epidemiological findings indicate that preventive measures, such as additional health education and HBV vaccination programs, are needed to control HBV infection in this population. In addition, the molecular results suggest the introduction of genotype A, subgenotype Aa in Brazil from Africa during the slave trade. 1. INTRODUÇÃO

1.1 Histórico

O termo hepatites virais é convencionalmente utilizado para designar as doenças ocasionadas por um grupo de vírus hepatotrópicos. A história das hepatites virais remonta desde períodos anteriores a Era Cristã. Existem relatos de surtos de icterícia na Babilônia, há mais de 2500 anos. Hipócrates descreveu a icterícia epidêmica em 400 A.C. (Freitas 2003).

Inicialmente, muitos surtos de icterícia coincidiam com épocas de guerras. Assim, o surgimento do termo “doença de soldado” foi amplamente associado com epidemias em Flandres, em 1743 (durante a guerra de Sucessão Austríaca), no Egito, em 1798 (durante a batalha de Napoleão), e em Paris, em 1870, durante a guerra Franco-Prussiana (Kuntz & Kuntz 2002, Freitas 2003).

Entretanto, foi a partir de 1883 que se observou casos de icterícia de longo período de incubação (geralmente de 2 a 6 meses). Esses episódios ocorreram em Bremen, na Alemanha, envolvendo trabalhadores de um estaleiro naval que receberam doses de uma vacina contra varíola. Tal vacina havia sido preparada com linfa humana. De 1289 trabalhadores que receberam essa vacina, 191 desenvolveram a doença. A partir desses eventos, houve a primeira especulação sobre um possível agente de transmissão parenteral ocasionando icterícia. Provavelmente, esse seria, então, o primeiro relato de epidemia por hepatite B (Lürman 1885).

Em 1909, ocorreram outros casos de icterícia, após administração de uma medicação utilizada para tratamento de sífilis por via endovenosa (Bigger 1943). Casos semelhantes ocorreram em 1922, com a administração da insulina no tratamento de diabetes (Flaum et al. 1926). Porém, somente fatos ocorridos na década de 40 elucidaram a hipótese da transmissão parenteral do agente envolvido com a infecção, pois em 1942, 28.585 soldados americanos apresentaram icterícia após receber vacina contra febre amarela, sendo que 62 faleceram em decorrência dessa doença (Krugman 1989). Além disso, investigações mostraram o risco de hepatite associado ao uso de plasma humano fresco, seco ou sangue total (Beeson 1943, Morgan & Williamson 1943).

MacCallum denominou, em 1947, os agentes causadores da icterícia epidêmica, nomeando-os de “vírus da hepatite A” (HAV) e “ vírus da hepatite B” (HBV). O primeiro era referente à icterícia infecciosa, com período de incubação curto (18 a 37 dias), e o segundo à icterícia sérica, de período de incubação longo (50 a 180 dias). Tais termos foram aprovados pelo Comitê de Hepatites Virais da Organização Mundial de Saúde (OMS) em 1977, e continuam sendo utilizados até os dias de hoje (ICTV 2006).

Em 1965, o geneticista Baruch Blumberg e seus colaboradores, realizando pesquisa sobre características polimórficas herdadas em diferentes partes do mundo, observaram que em uma amostra de soro de um aborígene australiano havia um antígeno que reagia com o soro de dois hemofílicos politransfundidos, e o denominaram antígeno Austrália (Au) (Blumberg et al. 1965). Esse antígeno também foi encontrado em pacientes com leucemia e síndrome de Down (Blumberg et al. 1967, Sutnick et al. 1968).

Mais tarde, estudos de Prince (1968) e Levene & Blumberg (1969) evidenciaram a associação do antígeno Austrália e a infecção pelo vírus da hepatite B. Em 1970, um pesquisador australiano, identificou o vírus da hepatite B (HBV), com cerca de 42 nm de diâmetro, que foi denominado de partícula de Dane (termo que faz referência ao nome do próprio pesquisador). Ainda, verificou que essa partícula era constituída por um invólucro externo, que correspondia ao antígeno Austrália. Atualmente, esse antígeno é designado como antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) (Dane et al. 1970).

1.2 Classificação e Estrutura do Vírus da Hepatite B

1.2.1 Classificação

O HBV pertence à família Hepadnaviridae, a qual inclui uma variedade de vírus aviários e de mamíferos que compartilham características similares, como organização genética, órgão de tropismo e a estratégia de replicação. Os vírus dessa família que infectam mamíferos estão agrupados no gênero Orthohepadnavirus, e os que infectam aves no gênero Avihepadnavirus (ICTV 2006).

Como exemplos de vírus do gênero Avihepadnavirus, tem-se: DHBV (Duck hepatitis B virus), HHBV (Heron hepatitis B virus), STHBV (Storks hepatitis B virus). Esses vírus foram identificados como agentes de infecção em patos, garças e cegonhas, respectivamente (Mason 1980, Zhou 1980, Sprengel et al. 1988, Pult et al. 2001). No gênero Orthohepadnavirus, são encontrados o HBV (Hepatitis B virus), WHV (Woodchuck hepatitis virus), GSHV (Ground squirrel hepatitis virus), WMHBV (Woolly monkey hepatitis B virus) e ASHV (Artic ground squirrel hepatitis virus), que infectam humanos, marmotas, esquilo de faias, macacos e esquilo do Ártico, respectivamente (Summers et al. 1978, Marion et al. 1980, Seeger et al. 1984, Lanford et al. 1998, Kidd-Ljunggren et al. 2002, Robertson & Margolis 2002).

1.2.2 Características Biológicas

A partícula completa do vírus da hepatite B (vírion ou partícula de Dane), com 40-42 nm de diâmetro, apresenta externamente o envelope viral, constituído principalmente pelo antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg), e internamente, o nucleocapsídeo ou core, que mede cerca de 27 nm de diâmetro (Figura 1). Essa estrutura possui simetria icosaédrica, sendo formada pelo antígeno do core (HBcAg) e pelo genoma viral (DNA), que encontra-se associado à enzima DNA polimerase/transcriptase reversa (Tiollais et al. 1985, Befeler & Bisceglie 2000). Figura 1 – Representação esquemática da estrutura do vírus da hepatite B Fonte: http://www.rit.edu/~japfaa/infectious.html (modificada)

No soro de indivíduos infectados pelo HBV, podem, ainda, ser observadas partículas subvirais, não-infecciosas, que são formadas, principalmente, pelo HBsAg (Figura 2). Tais partículas podem apresentar-se nas formas tubular ou esférica, com diâmetro de 22 nm (Hollinger 1996b, Jilbert & Mason 2002, Khouri & Santos 2004).

Figura 2 – Micrografia eletrônica do virion e partículas subvirais não infecciosas Fonte: http://www.ictvdb.rothamsted.ac.uk/Images/Safrica/hbv3b.jpg

1.2.3 Organização Genômica do HBV O genoma do HBV é extremamente compacto, sendo um dos menores dentre os genomas de vírus que infectam o homem (Rapicetta et al. 2002). É constituído por uma molécula de DNA circular de fita parcialmente dupla. A fita incompleta é de polaridade positiva. Já a fita completa tem polaridade negativa, sendo complementar ao RNA mensageiro viral e contém 3200 pares de base (bp) que estão organizados em quatro regiões de leitura aberta (Open Reading Frame - ORF): Pré-S/S, Pré-C/C, P e X (detalhadas a seguir) (Figura 3). O genoma possui quatro promotores (Pré-S1, Pré-S2/S, core e X), que atuam regulando a atividade gênica. Além disso, próximo à extremidade de ambas as fitas, estão presentes seqüências pequenas de 11 nucleotídeos que são diretamente repetidas (Direct Repeats - DR) designados de DR1 e DR2. Tais seqüências são importantes na iniciação da replicação do HBV (Tiollais et al. 1985, Seeger et al. 1986, Ganem & Varmus 1987, Kao & Chen 2002, Locarnini 2004, Locarnini & Omata 2006).

Figura 3 – Genoma do HBV com as quatro regiões de leitura aberta (ORF): pré-S/S, pré-C/C, P e X. Fonte: http://www.drthuthuy.com/images/genotype02.jpg (modificado) Fase de leitura aberta Pré-S/S

Na ORF pré-S/S, há três códons de iniciação. Dessa forma, a leitura a partir do códon de iniciação Pré-S1 seguida de Pré-S2 e S resulta na formação da proteína grande (L - “large”) que contém 368 aminoácidos (aa). A proteína de tamanho intermediário (M - “middle” 281 aa) é codificada pela região Pré-S2 e S. A menor proteína (S - “small” 226 aa) é sintetizada a partir do códon localizado no início da região S. Assim, todas possuem o mesmo códon de terminação localizado ao final da região S (Figura 3). As três proteínas se distribuem de forma irregular, sendo que as partículas subvirais do HBV são quase que na sua totalidade constituídas pela proteína S, com quantidades variáveis da proteína M. A proteína L está presente em menor porção, ou mesmo ausente nessas partículas (Heermann et al. 1984, Seeger & Mason 2000, François et al. 2001, Kao & Chen 2002).

Nos vírions, há predominância da proteína L, que contém os sítios de ligação do HBV aos receptores celulares específicos (Neurath et al. 1986, Klingmuller & Schaller 1993). A proteína M também tem importância na adsorção do HBV (Thung & Gerber 1984). A proteína S é o constituinte do HBsAg, sendo capaz de induzir anticorpos específicos (anti-HBs), com atividade neutralizante e protetora. Por essa característica, o HBsAg é utilizado no desenvolvimento de vacinas. Além disso, a caracterização antigênica do mesmo tem propiciado a classificação do HBV em diferentes subtipos que serão comentados adiante (Grob 1998, Kidd-Ljunggren et al. 2002).

Fase de leitura aberta Pré-C/C

A região Pré-C/C codifica as proteínas HBeAg e HBcAg, que possuem propriedades antigênicas distintas. A tradução a partir do códon de iniciação localizado na região Pré-C dá origem a um produto que é translocado para o retículo endoplasmático, onde é clivado, resultando na formação de uma proteína solúvel (HBeAg ou antígeno e) (Garcia et al. 1988). O HBeAg não é incorporado aos vírions, sendo então secretado pelos hepatócitos e liberado na circulação sanguínea. Esse antígeno está associado com alta infecciosidade (Hatzakis et al. 2006). O HBcAg é codificado a partir do códon de iniciação da região C. Esse antígeno é importante na composição do nucleocapsídeo viral, no qual 180 monômeros dessa proteína se organizam, formando a partícula icosaédrica (Nassal & Schaller 1996). O HBcAg está presente no tecido hepático de pacientes infectados pelo HBV, não sendo detectado no soro. Entretanto esse antígeno é capaz de induzir a produção de anticorpos (anti-HBc), independentemente de células T, podendo ser detectáveis no soro, nas frações IgM ou IgG (Milich & Mclachalam 1986, Oubinã 1996).

Fase de leitura aberta P

A ORF P codifica uma enzima com atividade de DNA polimerase, transcriptase reversa e ribonuclease (RNAse). Essa ORF sobrepõe as demais regiões e engloba cerca de 3/4 do genoma do HBV. A polimerase viral pode ser dividida em quatro regiões, representadas na Figura 4: (i) domínio amino-terminal, que atua como proteína terminal ou primase, sendo importante para o início da síntese da fita de DNA de polaridade negativa, (ii) região “espaçadora”, que parece não ter função específica, (iii) domínio de transcriptase reversa, que contém sete motivos denominados de A a G e (iv) domínio carboxi-terminal (ou C), que exibe atividade de RNAse H (Ngui et al. 1999, Seeger & Mason 2000, Sablon & Shapiro 2005).

A polimerase viral possui o motivo YMDD (Tirosina-Metionina-Aspartato- Aspartato), que é parte do sítio ativo do domínio C, presente também na transcriptase reversa. O uso prolongado de antivirais análogos de nucleosídeos, principalmente a lamivudina, está freqüentemente associado ao desenvolvimento de mutações na polimerase do HBV, causando resistência à esse antiviral (Lai et al. 2003a, Craxi et al. 2006).

Transcriptase reversa

Região NH Proteína terminal Ribonuclease H COOH 2 espaçadora YMDD 1 183 349 692 843aa (rt1) (rt344) Domínio catalítico

I (G) II (F) A B C D E rt1 rt344 Figura 4 - Organização da HBV polimerase Fonte: Kay & Zoulim (2007) (modificado)

Fase de leitura aberta X

O gene X é encontrado apenas em vírus que infectam mamíferos e codifica um polipeptídeo (HBx) de aproximadamente 154 aminoácidos. Embora sua função ainda não esteja claramente definida, sabe-se que HBx é uma proteína reguladora que pode ativar a transcrição de alguns genes virais e celulares (Feitelson & Duan 1997, Seeger & Mason 2000). Além disso, alguns estudos realizados com animais transgênicos relataram a associação entre a expressão do gene X e o aparecimento de câncer hepático (Rapicetta et al. 2002, Robertson & Margolis 2002, Cougot et al. 2005).

1.3 Variabilidade Antigênica e Genética do HBV 1.3.1 Subtipos

A heterogeneidade do antígeno de superfície do HBV foi verificada logo após a sua identificação, no início da década de 70, quando Le Bouvier descreveu a presença de dois determinantes antigênicos mutuamente exclusivos d e y. Posteriormente, em 1972, Bancroft et al. descreveram dois determinantes adicionais, denominados w e r.

Naquele mesmo ano, o estudo realizado por Le Bouvier, utilizando a técnica de imunodifusão, mostrou que o envelope glicoproteico do HBV contém um epítopo grupo-específico, presente em todos os subtipos, denominado de determinante comum “a”. Até aquele momento, então, sabia-se que cada amostra do HBV poderia ser classificada em quatro grupos de subtipos principais: adw, adr, ayw ou ayr (Le Bouvier 1972).

Em 1983, Courocé-Pauty et al. realizaram um grande estudo envolvendo 5337 soros de portadores crônicos do HBV provenientes de vários países. Esse estudo contribuiu para a identificação dos nove subtipos sorológicos do HBV, conhecidos como adw2, adw4, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, adrq+, adrq- e ayr (Figura 5).

Com a realização de estudos moleculares, ficou estabelecido que os subdeterminantes são especificados por mutações pontuais no gene S, nos nucleotídeos 365 e 479, resultando em substituições, respectivamente, nos aminoácidos na posição 122 (lisina para arginina), que determinam os subtipos d ou y, e na posição 160 (w ou r). As alterações no aminoácido 127 estão associadas a subespecificidades do subdeterminante w (w1-w4) (Quadro 1) (Magnius & Norder 1995, Kidd-Ljunggren et al. 2002, Kramvis et al. 2005). Ainda, outras mudanças em aminoácidos nas posições 144, 145, 158, 159, 177 e 178 estão relacionadas aos demais determinantes (Okamoto et al. 1987b, Okamoto et al. 1989, Norder et al. 1992a).

Quadro 1 - Resíduos de aminoácidos que especificam os determinantes do HBsAg

Posição Aminoácido Especificidade Posição 160 Lisina Arginina Lisina d dw dr 122 Arginina y yw yr

127 Prolina w1-w2 Treonina w3 Leucina w4 Figura 5 - Determinante “a” e subdeterminantes d ou y e w ou r, com os subtipos sorológicos do HBV

A identificação dos subtipos pode ser uma ferramenta útil na compreensão epidemiológica da infecção pelo vírus da hepatite B numa determinada população, podendo inclusive, em alguns casos, ajudar a estabelecer rotas e mecanismos de transmissão (Kidd-Ljunggren et al. 2002).

1.3.2 Genótipos

Okamoto et al. (1998) sugeriram que a heterogeneidade do HBV poderia ter uma organização em grupos genômicos, uma vez que a análise da seqüência completa de nucleotídeos de 18 amostras do vírus permitiu verificar a existência de quatro grupos que apresentavam uma divergência de mais de 8% entre eles, sendo esses designados de genótipos A, B C e D. Um grau de divergência na seqüência genômica completa ≥ 8% ou no gene S >4% é utilizado para a definição dos genótipos do HBV (Okamoto et al. 1988, Norder et al. 1992a,b, 1994).

Posteriormente, Norder et al., comparando a região S, encontraram mais dois genótipos (E e F) (Norder et al. 1992b, 1994). No ano de 1993, no Brasil, foi identificada uma amostra pertencente ao genótipo F, subtipo adw4, que apresentava uma divergência na seqüência genômica de 15%, sendo considerada a maior divergência relatada entre isolados do HBV em humanos (Naumann et al. 1993).

Nesses últimos sete anos, mais dois genótipos foram descritos. Stuyver et al. (2000) identificaram o genótipo G, em amostras de doadores de sangue da França e Estados Unidos, e Arauz-Ruiz et al. (2002) o genótipo H, em amostras de indivíduos provenientes do Nicarágua e Estados Unidos. Dessa forma, até o presente momento, o HBV pode ser classificado em oito genótipos principais, que são denominados em ordem alfabética de A-H (Figura 6).

Figura 6 – Árvore filogenética com os oito genótipos do HBV (A-H) Fonte: Kramvis et al. 2005 (modificada)

Os genótipos e subtipos do HBV apresentam uma certa correlação (Quadro 2). De forma geral, isolados adw são encontrados nos genótipos A, B, F, G e H, enquanto que os do genótipo C correspondem aos subtipos adr e ayr. Já nos genótipos D e E, geralmente são encontrados isolados ayw (Kao 2002, Miyakawa & Mizokami 2003).

Quadro 2 - Correlação dos genótipos e subtipos do HBV

Genótipo Subtipo A adw2, ayw1 B adw2, ayw1 C adrq+, adrq-,ayr D ayw2, ayw3 E ayw4 F adw4, adw2,ayw4 G adw2 H adw4

Re-infecção e infecção simultânea com diferentes genótipos do HBV têm sido descritas (Kramvis 2005, Schaefer 2005). A infecção com genótipo G parece ser comumente associada à infecção com genótipo A (Kato et al. 2002a). Também já foram observadas recombinações entre os genótipos A/D, B/C e A/C (Bollyky et al. 1996, Hannoun et al. 2000, Morozov et al. 2000, Owiredu et al. 2001, Jeantet et al. 2002, Sugauchi et al. 2002).

Assim como os subtipos, o estudo dos genótipos do HBV pode ser útil para traçar rotas de transmissão desse vírus. Além disso, os genótipos podem influenciar a progressão da doença hepática, bem como a resposta à terapia antiviral em pacientes com hepatite B (Miyakawa & Mizokami 2003, Echavarria 2005, Günther 2006).

Subgenótipos O termo “subgenótipo” é usado quando há divergência nucleotídica de 4 a 8% dentro de um mesmo grupamento genotípico. Para designar esses subgrupos, muitas vezes, são usados sufixos (letras alfabéticas), geralmente indicando o local de origem da amostra. Entretanto, alguns autores defendem que a utilização de números cardinais proporciona uma melhor identificação (Kramvis et al. 2005).

Em 1997, Bowyer et al., ao realizarem a análise filogenética da região Pré-S2 e S em amostras da África do Sul, identificaram o subgenótipo A1 (também conhecido como A’ ou Aa), sendo que o sufixo “a” indica amostras oriundas da África e Ásia. O subgenótipo A2, A-A’ ou Ae é referente as amostras de origem européia. Mais recentemente, Kurbanov et al. (2005) identificaram o subgenótipo A3 ou Ac (amostras provenientes de Camarões) (Bowyer et al. 1997, Sugauchi et al. 2004a, Kurbanov et al. 2005).

Similarmente, o genótipo B pode ser classificado em cinco subgrupos: Bj ou B1, Ba ou B2, B3, B4 e B5 (Sugauchi et al. 2002, 2003a, 2004b, Norder et al. 2004, Nagasaki et al. 2006, Sakamoto et al.,2006). Em 2004, um estudo envolvendo análise filogenética, realizado por Huy et al., classificou o genótipo C em C1 e C2. Além desses, já foram descritos os subgenótipos C3, C4 e C5 (Huy et al. 2004, Norder et al. 2004, Günther 2006, Sakamoto et al. 2006).

Para o genótipo D, já foram observados cinco subgenótipos (D1-D5) (Norder et al. 2004, Banerjee et al. 2006, De Maddalena et al. 2007). Em relação ao genótipo F, inicialmente, Mbayed et al. (2001) propuseram quatro subgenótipos, que foram previamente nomeados de clusters (I-IV). Entretanto, posteriormente, o cluster I foi designado de subgenótipo F1, e os cluters II e IV compreendem o subgenótipo F2. O cluster III, atualmente, corresponde ao genótipo H (Norder et al. 2004, Kato et al. 2005). Além desses, já foram identificados os subgenótipos F3 e F4 (Devesa et al. 2004, Huy et al. 2006).

1.3.3 Mutações no genoma do HBV Os termos mutantes e variantes são usados para descrever todos os vírus geneticamente heterogêneos, independentemente do mecanismo causal (François et al. 2001). É estabelecido que os diferentes genótipos do HBV são considerados como formas estáveis do vírus, os quais resultam de alterações selecionadas por muitos anos, pela pressão seletiva da população. Já os mutantes surgem em indivíduos sob uso de medicações, ou naturalmente na hepatite B crônica, induzidos pela pressão imune (Weber 2005).

O genoma do HBV tem alta taxa de mutações, presentes em todos os genes virais e elementos regulatórios, sendo 10 vezes maior que outros vírus DNA e aproximadamente 104 vezes mais freqüente que no genoma humano. Entretanto, as taxas de substituições dos nucleotídeos podem variar de acordo com o estágio da doença. Considerando a evolução natural, na infecção crônica, essas taxas são de aproximadamente 1,4 x 10-5 a 3,2 x 10-5 substituições/sítio/ano. Já em transplantados, são mais elevadas, podendo ocorrer até 100 vezes mais (Okamoto et al. 1987a, Sterneck et al. 1997, Mizokami & Orito 1999, Lim et al. 2006).

Mutações na região S

Mutações no gene S foram primeiramente descritas há cerca de 17 anos atrás (Carman et al. 1990). Atualmente, são encontradas mutações nas regiões Pré-S1/2 e S, sendo caracterizadas pela positividade simultânea dos marcadores HBsAg e anti-HBs ou HBsAg negativo e anti-HBs positivo. Essas situações ocorrem principalmente em portadores crônicos do HBV (Blum et al. 1997, Khouri & Santos 2004).

Muitos isolados apresentam mutação no gene S, reconhecida pela troca de uma glicina por arginina no códon 145 (G145R), sendo essa a mais frequentemente documentada (Weber 2005, Hatzakis et al. 2006). Esse mutante torna-se estável no decorrer do tempo, sendo capaz de replicar-se em altos títulos por muitos anos (Carman et al. 1990). Além disso, pode ser transmitido horizontalmente, uma vez que persiste em leucócitos no sangue periférico de portadores assintomáticos do HBV (Chakravarty & Varadarajan 2000). Ainda, a mutação G145R em combinação com inserção no determinante “a” entre os aminoácidos 122 e 123 do HBsAg parece estar relacionada com hepatite fulminante (Carman et al. 1995).

Há outras mutações descritas para o gene S, sendo que algumas delas alteram os aminoácidos nas posições 120, 123, 124, 126, 129, 131, 133 e 141. Na região Pré-S, há também uma substituição de aspartato pela alanina no resíduo 144 (SD144A) (Seddigh-Tonekaboni et al. 2000).

Tais alterações podem resultar em reativação da doença em portadores crônicos, falha na detecção do HBsAg e evasão à resposta imune protetora (anti- HBs), podendo, assim, prejudicar a terapia baseada na utilização de anticorpos específicos na supressão da infecção em indivíduos transplantados (Carman et al. 1990, Blum 1993). Além disso, mutações na região S podem ter implicação epidemiológica, pois, a dificuldade de detecção sorológica do HBsAg facilita a disseminação do HBV por transfusão sanguínea, principalmente em locais de alta prevalência e que não adotam técnicas moleculares para triagem de doadores (Chang 2006, Fang 2006, Lelie & Heaton 2006, Liu et al. 2006a).

Mutações na região Pré-core e Core

Assim como nas mutações do gene S, o surgimento de variantes da região Pré-core e core também está geralmente associado à infecção crônica. Casos de mutações pré-core foram descritos pela primeira vez na Itália, em que mostravam ausência de marcador HBeAg, embora permanecessem detectáveis o HBsAg, anti- HBe, anti-HBc e o DNA viral (Brunetto et al. 1990).

Essas mutações estão relacionadas com aumento da gravidade da doença hepática crônica e hepatite B fulminante, sendo prevalentes em regiões como a Ásia e Mediterrâneo, onde os genótipos B, C e D são predominantes. Por outro lado, são raras na América do Norte e Europa, onde o genótipo A é comumente encontrado (Rodriguez-Frias et al. 1995, Lindh 1997, Dai et al. 2001, Hadziyannis & Vassilopoulos 2001, Shiraki et al. 2002, Hatzakis et al. 2006). As mutações que produzem um códon de parada na região Pré-core são geralmente pontuais, havendo a substituição de um único nucleotídeo (nt). Algumas delas tem sido descritas no nt 1762 (A→T), 1764 (G→A), 1835 (A→C), 1896 (G→A) e 1899 (G→A), sendo responsáveis pela redução da expressão do HBeAg. Dessas, a mutação no códon 28 (G1896→A) é a mais comum, resultando na interrupção da síntese do HBeAg. Contudo, o impacto dessa mutação na história natural da hepatite B e o seu papel na patogênese da doença hepática permanece desconhecido. Mutações nas posições 1817, 1874 e 1897 também causam alterações na síntese do HBeAg, bem como aquelas nos nucleotídeos 1814, 1815 e 1816 (Brunetto et al. 1989, Carman et al. 1989, Protzer et al. 1996, Dai et al. 2001, Dumps et al. 2001, Hadziyannis & Vassilopoulos 2001, Locarnini et al. 2003).

A mutação resultante da alteração da guanina (G) na posição 1896 por adenina (A) confere um aumento na estabilidade da estrutura secundária do sinal de encapsidação, sendo a mesma observada nos genótipos que possuem o nucleotídeo T na posição 1858 (B, D, E e em alguns isolados dos genótipos C e F) (Bonino & Brunetto 2003, Yoo et al. 2003). Apesar dessa mutação estar associada ao aumento da gravidade da doença hepática, tendo em vista sua detecção em pacientes com doença hepática ativa ou hepatite fulminante, foi detectada também em portadores assintomáticos HBeAg negativos (Yoo et al. 2003).

A ocorrência de positividade concomitante para HBsAg, anti-HBe e HBV DNA podem ser especialmente associadas a mutação dupla (1762 A→T e 1764 G→A) que afeta o promotor basal do core (BCP). Essa mutação foi primeiramente descrita em pacientes japoneses (Okamoto et al. 1994, Sato et al. 1995), sendo encontrada mais frequentemente nos genótipos A e H (que apresentam citosina no nt 1858) e também nos subgenótipos Ba e Bj (Chan et al. 1999, Sugauchi et al. 2003a). Além disso, estão relacionadas à cirrose hepática, hepatocarcinoma e reativação da replicação do HBV (Takahashi et al. 1995, Baumert et al. 1996, Gerner et al. 1999, Tong et al. 2005).

Mutações na região X Alguns mutantes do HBV apresentam deleções na região X, sendo geralmente associados à diminuição da expressão do HBsAg, o que dificulta a detecção desse marcador por testes sorológicos e até mesmo por técnicas moleculares, se direcionadas à região deletada. Esses mutantes foram inicialmente encontrados em casos de hepatite pós-transfusional em crianças talassêmicas politransfundidas (Feitelson et al. 1994), pacientes em hemodiálise nos Estados Unidos (Feitelson et al. 1995) e no Japão (Uchida et al. 1994). Ainda no Japão, Fukuda et al. (1996) e Moriyama et al. (1997) encontraram deleções em nucleotídeos na região X, nas posições (1763-1770) e (1753-1772), respectivamente.

Mutações na região P

Os estudos de mutações envolvendo a região da polimerase, basicamente estão relacionados ao tratamento da hepatite B. O uso prolongado de antivirais, principalmente a lamivudina (3TC ou 2’-3’-dideoxi-3’-tiacitidina), está freqüentemente associado ao desenvolvimento de mutações, causando resistência a esse antiviral. Como referido, essas mutações estão relacionadas à alterações na transcriptase reversa, na seqüência YMDD (tirosina-metionina-aspartato-aspartato) (Craxi et al. 2006).

1.4 Replicação do Vírus da Hepatite B

Apesar de ser bem estabelecido que os hepatócitos são o sítio primário da replicação do HBV, ainda não estão bem esclarecidos os mecanismos dos eventos iniciais desse ciclo replicativo, como a adsorção, penetração, desnudamento e liberação do genoma viral dentro do núcleo da célula (Seeger & Mason 2000, Ganem & Schneider 2001, Locarnini & Omata 2006). Entretanto, há algumas evidências que indicam a participação das proteínas L, M e S na ligação da partícula viral aos receptores celulares (Neurath et al. 1986, Pontisso et al. 1989).

Após a adsorção, o vírus perde seu envelope e o core é transportado ao núcleo celular, onde o HBV DNA é liberado e se converte, por ação da DNA polimerase viral, a uma forma circular covalentemente fechada (cccDNA – covalently closed circular). A RNA polimerase II celular transcreve o genoma do HBV a partir do cccDNA em RNAs pré-genômico e subgenômico, sendo que todos eles são capeados na extremidade 5’ e compartilham o mesmo sinal de poliadenilação (AATAAA) na extremidade 3’ (Seeger & Mason 2000, Gonçales 2002, Ganem & Prince 2004, Locarnini 2004, Locarnini & Omata 2006).

Em seguida, as moléculas de RNAm viral são transportadas para o citoplasma e traduzidas em proteínas do core, polimerase e X. Logo após essa tradução, o RNA pré-genômico é encapsidado dentro das partículas do core (HBcAg), juntamente com a polimerase viral. Essa encapsidação parece ser resultado da interação da polimerase, proteínas do capsídeo e de um sinal de encapsidação (ε), localizado na extremidade 5’ do RNA pré-genômico (Bartenschlager & Schaller 1992, Ganem 1996, Seeger & Mason 2000, Ganem & Schneider 2001, Ganem & Prince 2004, Locarnini 2004, , Locarnini & Omata 2006).

No interior do nucleocapsídeo, há a transcrição reversa do RNA pré-genômico em DNA, com a síntese da fita de DNA de polaridade negativa, e posteriormente, há formação da fita de polaridade positiva, que permanece incompleta. A partir daí, o nucleocapsídeo adquire o envelope lipoprotéico no retículo endoplasmático ou complexo de golgi e, finalmente, a partícula viral completa é liberada da célula hepática. Curiosamente, algumas moléculas de DNA, voltam ao núcleo, possibilitando uma espécie de reservatório intranuclear, podendo ser convertidas em cccDNA (Gerelsaikhan et al. 1996, Seeger & Mason 2000, Ganem & Prince 2004). O ciclo replicativo do HBV está esquematizado, resumidamente, na Figura 7. Figura 7 – Representação esquemática do ciclo replicativo HBV Fonte: (http://www.infekt.ch/updown/images/hbv_cycl.gif)

1.5 Aspectos Clínicos e Tratamento da Hepatite B

A hepatite B pode se manifestar como uma doença aguda autolimitada ou em formas graves, como a hepatite fulminante. A evolução da hepatite B aguda inclui quatro fases: período de incubação, prodrômica (pré-ictérica), ictérica e de convalescência (Focaccia 2002). O período de incubação é de 45 a 180 dias, dependendo de fatores como idade do paciente, modo de transmissão, porta de entrada e resposta imune do hospedeiro (Befeler & Di Bisceglie 2000, Juszczyk 2000).

Logo após o período de incubação, ocorre a fase prodrômica, na qual o indivíduo apresenta sinais e sintomas inespecíficos, incluindo mal-estar, febre baixa, anorexia, mialgia, náusea, vômito e dor abdominal. Em seguida, além desses, pode surgir a icterícia (fase sintomática), que é uma importante manifestação clínica das hepatites virais, sendo resultado do aumento dos níveis de bilirrubina no sangue, causando uma coloração escurecida da urina (colúria), descoloração das fezes (acolia fecal) e uma coloração amarelada das mucosas da conjuntiva, esclerótida e pele. A fase ictérica dura cerca de três a quatro semanas. Entretanto, a infecção aguda pelo HBV, geralmente, é assintomática em crianças, estando a icterícia presente em apenas 5-15% delas com 1-5 anos de idade. Já em adultos, está presente em 30 a 50% dos casos. Por último, o período de convalescença é marcado pela eliminação viral e melhora da sintomatologia clínica, com duração de 20 a 30 dias (Befeler & Di Bisceglie 2000, Gonçales 2002). Na progressão para o estado de portador crônico do HBV, o organismo do indivíduo não consegue eliminar o vírus e o HBsAg permanece detectável por mais de 6 meses. O risco de evolução para a cronicidade varia conforme a idade. Dessa forma, quando a infecção é adquirida no período neonatal, cerca de 90% dos casos evoluem para a cronicidade. Em crianças com idade de 1 a 5 anos, esse índice é de 25% a 50%, e em adultos de 6% a 10% (Mahoney 1999, Befeler & Di Bisceglie 2000). A hepatite B crônica pode ainda resultar em cirrose hepática, sendo essa considerada a causa mais comum de carcinoma hepatocelular no mundo (Liaw et al. 2004).

O impacto dos genótipos do HBV no curso natural da infecção e na resposta ao tratamento tem sido estudado nos últimos anos. A infecção pelo genótipo A está associada a índices maiores de remissão espontânea e desenvolvimento de formas mais leves da doença (Sánchez-Tapias et al. 2002, Thakur et al. 2002). Os infectados com o genótipo C podem desenvolver doença hepática mais grave e com maior freqüência do que aqueles com genótipo B ou D. Alguns estudos demonstraram a associação entre o genótipo C e carcinoma hepatocelular (Kao et al. 2000, Orito et al. 2001, Chan et al. 2003, Nakayoshi et al. 2003, Duong et al. 2004, Yu et al. 2005). Além disso, um estudo realizado com pacientes infectados com genótipo F na Espanha, sugere que esse genótipo pode ser associado à maior freqüência de falência hepática e morte (Sanchéz-Tapias et al. 2002).

Em relação aos subgenótipos, diferenças clínicas e virológicas entre Aa e Ae foram relatadas. A infecção pelo Aa está associada à ausência do antígeno e (HBeAg) e níveis baixos do HBV DNA no soro. Esse perfil tem sido associado a alta incidência de hepatocarcinoma induzido pela infecção pelo vírus da hepatite B na África, onde o genótipo A, subgenótipo Aa é predominante (Kramvis et al. 1997, 1998, Kew et al. 2005).

Diferenças na resposta à terapia antiviral e na prevalência do HBeAg em portadores crônicos do HBV infectados com Bj e Ba já foram relatadas (Akuta et al. 2003, Sugauchi et al. 2003a). Entretanto, não foram verificadas diferenças virológicas importantes entre esses dois subgenótipos, e o fato de ser portador de Ba ou Bj parece não afetar a gravidade da doença (Kobayashi et al. 2005). O ideal na terapêutica da hepatite B seria a eliminação do vírus do organismo. Contudo, com a complexidade dessa infecção (como a persistência do cccDNA) e limitações da terapia existente, o alvo do tratamento é a supressão da replicação viral, visando a remissão da doença hepática, normalização dos níveis de ALT e conseqüentemente a redução do risco de desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular (Alberti et al. 2002, Conjeevaran & Lok 2003, Lai et al. 2003b, Pawlotsky 2006, Zoulim 2006).

Não há necessidade do uso de antivirais na hepatite B aguda. E em casos de hepatite fulminante, a conduta recomendável é o transplante hepático (De Franchis et al. 2003). Sendo assim, o tratamento é indicado em casos em que os níveis de ALT permanecem altos, na persistência do HBsAg ou HBV DNA por mais de seis meses, ou, ainda, quando a biópsia hepática sugere hepatite B crônica (Hoofnagle & Di Bisceglie 1997, Pawlotsky 2003, Sanchez-Quijano 2006).

Os principais agentes antivirais aprovados, ou em desenvolvimento, pertencem a duas categorias, dependendo do mecanismo de ação, os moduladores do sistema imune, como interferon alfa (INFα), e os inibidores da polimerase, que são análogos de nucleosídeos, como por exemplo a lamivudina e o adefovir dipivoxil (Zoulim 2006). Atualmente, existem cinco fármacos aprovados pelo FDA (Food and Drug Administrtion) para o tratamento da infecção crônica para o HBV: interferon alfa-2b (aprovado em 1992), lamivudina (1998), adefovir dipivoxil (2002), peginterferon alfa-2a (2005) e entecavir (2005) (Krastev 2006, Sanchez-Quijano 2006, Zoulim 2006). Ainda, novos fármacos em fase de licenciamento ou em teste, vêm sendo estudados, como clevudina e telbivudina. Além disso, a emtricitabina (FTC) e o tenofovir têm mostrado atividade antiviral em infecção pelo HIV e HBV (Craxi 2006, Krastev 2006).

No Brasil, o Ministério da Saúde oferece gratuitamente o interferon alfa e lamivudina, para o tratamento da infecção crônica pelo HBV. A taxa de resposta ao INFα é baixa e está associada ao aparecimento de eventos adversos importantes (resfriados, perda de peso, alopecia, trombocitopenia, leucopenia, alterações tireoidianas e neuropsiquiátricas, dentre outros). Além disso, a injeção subcutânea é a única via de administração dessa medicação. Essas características podem ser agravantes e interferir nos índices de adesão dos pacientes ao tratamento (Brasil 2005).

A lamivudina tem a vantagem da administração por via oral e possui um mecanismo de ação que visa inibir a replicação viral, através do bloqueio da atividade da polimerase/transcriptase reversa, resultando em diminuição significativa nos níveis séricos do DNA viral (Clarke & Bloor 2002, Conjeevaran & Lok 2003, Zoulim 2006). O uso adequado da lamivudina reflete em decréscimo dos níveis da carga viral, manutenção de baixos níveis de HBeAg, com ou sem a detecção do anti- HBe, normalização dos níveis de ALT e uma melhora hepática com comprovação histológica (Clarke & Bloor 2002, Conjeevaran & Lok 2003, Zoulim 2006). Entretanto, o inconveniente do uso prolongado da lamivudina é o desenvolvimento de resistência, que ocorre em cerca de 70% dos pacientes quando utilizada por um tempo superior a quatro anos (Conjeevaram & Lok 2003, Lai et al. 2003a, Lok et al. 2003).

O adefovir dipivoxil tem mostrado ser efetivo no tratamento de indivíduos que apresentam essa resistência. O seu uso em associação à lamivudina demonstrou uma adequada supressão de mutantes do HBV resistentes à lamivudina (Conjeevaram & Lok 2003, Craxi et al. 2006, Krastev 2006).

Diferenças entre os genótipos podem influenciar no tratamento antiviral. Pacientes infectados com genótipo C ou D apresentam uma menor resposta ao interferon do que aqueles infectados com genótipos A ou B (Kao et al. 2002, Janssen et al. 2005). Isso é devido a ocorrência de mais mutações na região do promotor basal do core dos genótipos C e D, em relação aos genótipos A e B. Estudos sobre interferência dos genótipos na resposta à lamivudina ainda são raros. Contudo, Zollner et al. (2001 e 2004) mostraram que há um maior risco de desenvolvimento de resistência à lamivudina no genótipo A, se comparado ao genótipo D.

1. 6 Diagnóstico Laboratorial da Infecção pelo HBV O diagnóstico dessa infecção deve englobar achados bioquímicos (níveis de alanina aminotransferase-ALT e de aspartato aminotransferase – AST), assim como a detecção dos marcadores sorológicos específicos, que incluem a pesquisa de antígenos (HBsAg e HBeAg), dos seus respectivos anticorpos (anti-HBs e anti-HBe) e do anti-HBc (IgM e Total) (Hollinger 1996b). Os antígenos e anticorpos podem ser detectados empregando-se ensaio imunoenzimático (ELISA) ou radioimunoensaio (RIE) (Hollinger 1996b, Mahoney 1999, Badur & Akgun 2001).

O HBsAg é o primeiro marcador sorológico encontrado no soro de pacientes infectados pelo HBV (Figura 8), podendo ser detectado antes mesmo do aparecimento de sintomas, como a icterícia. Surge, geralmente, até a sexta semana após a exposição ao vírus. Na recuperação da infecção, há um declínio nos títulos desse antígeno dentro de um período de quatro a seis semanas, e a partir daí ocorre o surgimento de anticorpos específicos (anti-HBs), sendo esse último, indicador de recuperação clínica e imunidade ao HBV (Ferreira 2000, Badur & Akgun 2001).

O HBcAg induz a formação de anticorpos anti-HBc IgM, que surgem por volta da sexta semana, desaparecendo até o sexto mês de infecção. Esses anticorpos são considerados como marcador de infecção aguda. Posteriormente, o marcador anti-HBc total pode permanecer detectável por toda a vida, sendo considerado marcador de exposição ao HBV (Badur & Akgun 2001). O HBeAg é outro antígeno importante que surge na fase aguda, persistindo por um tempo de três a seis semanas, desaparecendo após a resolução da infecção. Por outro lado, pode permanecer por vários meses ou anos, durante a infecção crônica e está associado à elevada replicação viral nos hepatócitos e infecciosidade. Em resposta ao HBeAg, surgem anticorpos anti-HBe, que estão associados a diminuição ou ausência de replicação viral. O aparecimento desses anticorpos ainda na infecção aguda pode indicar uma possível resolução espontânea da infecção (Hollinger 1996b, Ferreira 2000, Badur & Akgun 2001).

A infecção crônica pelo vírus da hepatite B é definida pela persistência do HBsAg por um período maior ou igual a seis meses, podendo ainda ser detectados os marcadores anti-HBc total, HBeAg ou anti-HBe no soro (Hollinger 1996b, Befeler & Di Bisceglie 2000) (Figura 9).

Mais recentemente, a hepatite B tem sido diagnosticada pela detecção do DNA viral empregando-se técnicas moleculares, como a reação da polimerase em cadeia (PCR) (Hollinger 1996b, Ferreira 2000, Badur & Akgun 2001). O HBV DNA pode ser encontrado no soro de indivíduos com infecção aguda ou crônica, sendo associado à replicação do vírus. O seu desaparecimento na fase aguda indica resolução espontânea da infecção. Já na infecção crônica, os níveis de DNA no soro estão relacionados à dinâmica de seu curso com as seguintes fases: imunotolerância (altos níveis de replicação viral), imunoliberação (baixos níveis de HBV DNA) e “latência clínica” (níveis muito baixos ou indetectáveis de DNA) (De Franchis et al. 2003, Pawlotsky 2003). A análise quantitativa do HBV DNA (carga viral) tem sido utilizada no monitoramento da resposta à terapia antiviral (Hollinger 1996b, Mahoney 1999, Lok 2000).

Sintomas

HBeAg anti-HBe

anti-HBc Total

TTííttuulloo

HBsAg anti-HBc IgM anti-HBs

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100 SemSemananaass aappóóss aa exexposiposiççããoo Figura 8 – Perfil sorológico da hepatite B aguda Fonte: CDC - www.cdc.gov/hcidod/diseases/hepatitis/slideset (modificado)

Aguda Crônica (6 semanas) (Anos) HBeAg anti-HBe HBsAg anti-HBc Total TTííttuulloo

anti-HBc IgM

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 Anos SemanaSemanass aappóóss aa exexppoosisiççããoo

Figura 9 – Perfil sorológico da hepatite B crônica Fonte: CDC - www.cdc.gov/hcidod/diseases/hepatitis/slideset (modificado)

A hepatite B oculta, também conhecida como infecção “silenciosa” ou “latente”, é definida pela presença do HBV DNA no soro e/ou no fígado, com concomitante ausência do marcador HBsAg. Geralmente, o HBV é encontrado no soro numa concentração menor que 104-105cópias/ml, sendo significantemente inferior que naqueles indivíduos que são HBsAg positivos (Hu 2002, Kao 2002, Chemin & Trepo 2005, Hou et al. 2005, Prati et al. 2006). Sendo assim, o HBV DNA pode ser detectado em pacientes HBsAg negativos com anti-HBs detectável, naqueles que são anti-HBc isolados, assim como na ausência de todos os marcadores sorológicos (Nalpas et al. 1985, Tanaka et al. 1990, Fukuda et al. 1999, Chemin et al. 2001).

Na determinação dos genótipos do HBV, diferentes metodologias são utilizadas como o sequenciamento do genoma completo ou da região pré-S/S, que é considerado o método padrão, porém o seu emprego, principalmente em larga escala, tem sido dificultado pela sua complexidade e também por ser considerado mais dispendioso (Naito et al.2001, Zeng et al. 2004). Assim, outros métodos têm sido mais utilizados, como a PCR com primers genótipo-específicos (Repp et al. 1993, Kato et al. 2001, Naito et al. 2001), ou PCR com posterior análise do polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição (RFLP) (Lindh et al. 1998, Mizokami et al. 1999, De Castro et al. 2000, Araújo et al. 2004, Zeng et al. 2004). Esses são métodos de execução mais simples, entretanto, estão sujeitos a dificuldade de interpretação, em especial, quando há infecção com mais de um genótipo (Kato et al. 2002b). A genotipagem pode ainda ser realizada por hibridização reversa dos produtos da PCR (LiPA-Line Probe Assay), que parece ter melhor sensibilidade na dectecção de infecções mistas (Osiowy & Giles 2003), PCR em tempo real (pela análise da curva de anelamento) (Yeh et al.2004, Liu et al. 2006b, Wang et al.2007), pela utilização de “chips” com oligonucleotídeos (Vernet & Tran 2005, Song et al. 2006, Wang et al.2007,Tang et al. 2007) e por ELISA com anticorpos monoclonais (Usuda 1999, Usuda 2000).

1.7 Epidemiologia da Infecção pelo HBV

1.7.1 Transmissão do HBV

As principais formas de transmissão do vírus da hepatite B são as vias parenteral/percutânea, sexual, vertical (mãe-filho) e horizontal (intrafamiliar). O HBV é encontrado em diversos fluidos corpóreos de indivíduos infectados, mas apenas o sangue, sêmem e saliva têm demonstrado ser infeciosos (Alter 2003). A presença do HBsAg já foi verificada na saliva, sêmem, leite materno, urina, secreções pancreáticas, biliares e vaginal, lágrima, líquidos menstrual, pleural e nasofaringeano (Boxall et al. 1974, Heathcote et al. 1974, Villarejos et al. 1974, Irwin et al. 1975, Hoefs et al. 1980, Davison et al. 1987, Hollinger 1996b, Befeler & Di Bisceglie 2000, Knutsson & Kidd-Ljunggren 2000, Maddrey 2000). Um estudo recente, realizado por Kidd-Ljunggren et al. (2006), mostrou a presença de altos títulos do HBV DNA na saliva e no fluido nasofaringeano e, de títulos mais baixos, nas lágrimas de indivíduos cronicamente infectados. Ainda não há evidências de detecção do HBV nas fezes, e segundo Grabow et al.(1975), isso provavelmente se deve à inativação da partícula viral na mucosa, ou por ação da microbiota intestinal. Ainda, de acordo com Bond et al. (1981), o HBV permanece estável por mais de sete dias em superfície de ambientes, podendo levar à disseminação do vírus por contato com objetos inanimados.

A transmissão desse agente pode ocorrer pela exposição perinatal, por relações sexuais, transplante de órgãos e tecidos, bem como através da exposição ao sangue ou derivados e fluidos corpóreos, seja em transfusões sanguíneas, procedimentos médico invasivos, acidentes ocupacionais, pelo compartilhamento de seringas e agulhas pelos usuários de drogas injetáveis e ainda na realização de acupuntura e tatuagem de forma inadequada (Alter 2003).

Em regiões de alta prevalência, a transmissão do HBV acontece principalmente na infância, podendo ocorrer no período perinatal, pela exposição do recém-nascido ao sangue ou líquido aminiótico, durante a passagem pelo canal vaginal (Lavanchy 2004). Ainda, pode ocorrer pela via horizontal, pelo contato contínuo com familiares portadores do vírus, nos primeiros anos de vida, principalmente em ambientes densamente habitados, com condições socioeconômicas e de higiene precárias (Krugmam & Giles 1970, Margolis et al. 1991, Zampino et al. 2002, Doganci et al. 2005, Chang et al. 2007). Apesar do modo preciso e da dinâmica da transmissão horizontal do vírus da hepatite B não estarem totalmente esclarecidos, sugere-se que este agente pode ser transmitido por contato direto ou indireto entre os membros de um ambiente domiciliar, envolvendo lesões em mucosas ou no tecido percutâneo (Bernier et al. 1982, Chakravarty et al. 2005). Além disso, fatores como o compartilhamento de objetos de higiene pessoal, copos, talheres, balas e doces, tamanho da família, presença de mais de um portador do HBsAg no ambiente domiciliar, status de replicação do portador e origem étnica têm sido considerados importantes nesta forma de disseminação da hepatite B (Szmuness et al. 1975, Kim et al. 1993, Martinson et al. 1998, Zhevachevsky et al. 2000, Doganci et al. 2005).

Os índices de transmissão do HBV de mães infectadas aos neonatos são dependentes do status dos marcadores HBsAg e HBeAg nas gestantes. Dessa forma, em mulheres HBsAg +/HBeAg +, a transmissão ocorre em 70-90%. Já em mulheres HBsAg+/HBeAg -, esse índice varia de 5 a 20%. A transmissão vertical pode ocorrer principalmente no último trimestre de gestação em caso de uma infecção aguda pelo HBV nesse período. Porém, esse percentual é menor, caso a mãe seja portadora crônica, ou se infecte nos primeiros meses da gestação (Hollinger 1996b, Chakravarty et al. 2005, Hou et al. 2005).

Em regiões de baixa prevalência, a infecção pelo HBV ocorre principalmente em indivíduos na fase adulta, muitas vezes influenciada por fatores ambientais e comportamentais, como o uso de drogas injetáveis, relações sexuais com múltiplos parceiros (homossexuais e heterossexuais) e realização de procedimentos invasivos sejam eles para fins terapêuticos ou não (cirurgias, transfusões sanguíneas, uso de piercing, tatuagem, acupuntura, dentre outros) (Hollinger 1996b, Regan et al. 2000, Alter 2003).

1.7.2 Prevalência da infecção pelo HBV

A hepatite B é uma das doenças infecciosas mais freqüentes no mundo. Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS), dois bilhões de pessoas foram infectadas pelo HBV e cerca de 400 milhões encontram-se cronicamente infectadas. A cada ano, cerca de 430.000 casos de câncer hepático são causados por hepatites virais, sendo que quase 60% desses estão associados à infecção pelo HBV. Além disso, estima-se que mais de um milhão de pessoas morrem ao ano, por complicações hepáticas devido à infecção por esse vírus (Maddrey 2000, Kao & Chen 2002, Alter 2003, Lai et al. 2003b, Lavanchy 2004).

A prevalência global da infecção crônica pelo HBV varia bastante nas diferentes regiões geográficas, assim como em diferentes subgrupos populacionais. Considerando-se a prevalência para o HBsAg, observa-se três categorias de endemicidade (alta, intermediária e baixa) (Figura 10). Em áreas de alta endemicidade, a prevalência é superior ou igual a 8%. Índices de 2 a 7% definem as áreas de endemicidade intermediária e, em áreas de baixa endemicidade, a prevalência para o HBsAg é menor que 2% (Lavanchy 2004, WHO 2004).

Dessa forma, regiões como África sub-Sahariana, sudeste asiático, Alasca, Bacia Amazônica, parte da China, do Oriente Médio e Ilhas do Pacífico são consideradas de alta endemicidade. Nesses locais, o risco do indivíduo adquirir a infecção durante a vida é superior a 60% e ocorrem principalmente no período perinatal ou na infância, apresentando, portanto, maiores chances de evolução para a cronicidade. Estima-se que aproximadamente 3/4 dos pacientes com infecção crônica em todo o mundo vivem nesses locais (André 2000, Lai et al. 2003b).

A endemicidade intermediária é observada no leste e sul europeu, Oriente Médio, parte central da Ásia, Japão, Israel, norte da África, Rússia, Tailândia, Coréia e em parte das Américas do Sul e Central. Nesses locais, a possibilidade de um indivíduo adquirir infecção pelo HBV durante a vida varia de 20 a 60%, podendo ocorrer nas diversas faixas etárias. As vias de transmissão são semelhantes àquelas das regiões de alta endemicidade, sendo a via perinatal menos freqüente (Mahoney 1999, André 2000).

Baixa endemicidade é verificada, principalmente, em áreas desenvolvidas, em que a chance de um indivíduo adquirir infecção pelo HBV durante a vida é menor que 20%. Nestes locais, a transmissão envolve principalmente populações de alto risco (usuários de drogas injetáveis, homossexuais, pacientes em hemodiálise, heterossexuais com múltiplos parceiros sexuais, contactantes de pacientes cronicamente infectados, dentre outros). Encontram-se nesse perfil de endemicidade, regiões como a América do Norte, parte da América do Sul, Europa Ocidental e Austrália (Mast et al. 1999, Margolis et al. 1991, André 2000, Tanaka 2000, Alter 2003).

Em relação a América do Sul, a prevalência para o HBsAg é mais alta na Bacia Amazônica e regiões adjacentes (Colômbia, Peru e Venezuela). A prevalência diminui à medida em que se aumenta a distância desses locais, sendo baixa no Chile, Uruguai, Paraguai e Argentina (Custer et al. 2004). Embora, o Brasil seja considerado como de endemicidade intermediária, é possível observar variação na prevalência para o HBsAg entre as regiões e dentro das mesmas (Souto 1999, Tanaka 2000, Chávez et al. 2003).

Na Região Centro-Oeste, Martelli et al.(1999) verificaram em doadores de sangue um índice de positividade para o marcador anti-HBc de 10,7%. Os estudos realizados em Goiânia-Goiás, em diferentes grupos populacionais, mostraram uma variação na prevalência global de 5,9% a 63,4% e uma prevalência para o HBsAg variando de 0 a 14,5%. Esses estudos estão listados no Quadro 3. Ferreira et al. (2006b), ao estudarem todos os pacientes em hemodiálise no Estado de Goiás (n=1095), encontraram uma prevalência global de 29,8% para o HBV e de 2,4% para o HBsAg.

Quadro 3 - Estudos sobre a prevalência da infecção pelo vírus da hepatite B realizados em Goiânia -Goiás.

Prevalência Referência População N HBsAg (%) Global (%)

Cardoso et al. 1990 Feminina 475 - 6,1

Martelli et al. 1990 Prisioneiros 201 - 26,4

Martelli et al. 1990 Primodoadores 1033 - 12,8

Rosa et al. 1992 Pacientes com hanseníase em 83 4,8 16,9 tratamento ambulatorial

Rosa et al. 1992 Pacientes com hanseníase 171 8,8 50,5 institucionalizados

Azevedo et al. 1994 Profissionais da área da saúde 625 2,3 23,4 Porto et al. 1994 Meninos de/na rua 496 2 13,5

Cardoso et al. 1996 Gestantes 1459 0,5 7,5

Borges et al. 1997 Pacientes em diálise 175 13,7 63,4

Teles et al. 1998 Pacientes em hemodiálise 282 12 56,7

Bastos 2000 Pacientes com doenças 63 0 12,7 falciformes Lopes et al. 2001 Profissionais de hemodiálise 152 0,7 24,3

Silva et al. 2002 Indivíduos com suspeita clínica 1396 14,5 50,7 de hepatite Teles et al. 2002 Pacientes em hemodiálise 5,8 -

Carneiro & Daher 2003 Anestesiologistas 90 0 8,9

Costa 2004 Idosos residentes em asilos 195 0,5 32,3

Souza et al. 2004b Portadores de doença mental 433 1,6 22,4

Tavares et al. 2004 Hemofílicos 102 1,1 43,7

Silva et al. 2005b Profissionais de laboratório 648 0,7 24,1

Ferreira et al. 2006b Pacientes em hemodiálise 2,4 -

Oliveira et al. 2006 Adolescentes 664 0,6 5,9 Figura 10 – Distribuição geográfica mundial da hepatite B crônica Fonte: http://www.oeaz.at/zeitung/3aktuell/2005/08/bilder/8-oeaz-hepatitis-b-karte.jpg (modificado)

Apesar do início dos estudos sobre infecção oculta pelo HBV ser relativamente recente, houve um aumento considerável no número de publicações sobre esse assunto, nos últimos anos. A infecção oculta não está restrita às áreas de alta endemicidade e tem sido verificada em diferentes grupos populacionais. A taxa de prevalência desse tipo de infecção em indivíduos com doença hepática criptogênica varia de 20 a 30% na Europa. Já em portadores da hepatite C, varia de 20% na França a cerca de 80% no Japão (Chemin & Trepo 2005).

Em populações com alto risco para adquirir infecção pelo HBV por via parenteral, índices elevados de 45% em usuários de drogas de Baltimore (Torbenson et al. 2004) e 51 % em hemofílicos do Japão foram encontrados (Toyoda et al. 2004). Estudos realizados com hemodialisados na Itália, Canadá, Grécia e Turquia encontraram prevalências com variação de 0% a 36,4% (Besisik et al. 2003, Minuk et al. 2004, Fabrizi et al. 2005, Goral et al. 2006, Kanbay et al. 2006, Siagris et al. 2006). Em pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV), a prevalência da infecção oculta varia de 0 a 89%, conforme estudos realizados no Brasil (5% e 16%)(Gonçales et al. 2003, Santos et al. 2003), França (0,6%, 35% e 37%) (Neau et al. 2005, Piroth et al. 2000, Wagner et al. 2004), Espanha (0%) (Nunez et al. 2002), Itália e México (20%) (Filippini et al. 2006, Torres-Baranda et al. 2006), África do Sul (22%) (Mphahlele et al. 2006), Países Baixos (4%) (Pogany et al. 2005) e Suíça (89%) (Hofer et al. 1998).

Já em doadores de sangue, a prevalência para infecção oculta varia de 0 a 7,7% de acordo com estudos realizados na Alemanha (Henning et al. 2002, Jilg et al. 2001), Estados Unidos (Kleinman et al. 2003) e Venezuela (Gutiérrez et al. 1999). No Brasil, investigações realizadas com esse grupo mostraram prevalência de 2,7% em Recife (Arraes et al. 2003), 3,3% no Rio Grande do Sul (Silva et al. 2005a) e índices variando de 0 a 4% em São Paulo (Almeida Neto et al. 2001 e Gonçales Jr. et al. 2003). Entretanto, há autores que advertem que a determinação de prevalência da infecção oculta pelo HBV ainda necessita ser realizada com cautela, pois, a mesma pode sofrer influência do método utilizado na investigação. É importante ressaltar que os testes laboratoriais diferem quanto à sensibilidade e especificidade. Além disso, ainda são poucos os estudos que retratam a infecção oculta em indivíduos aparentemente saudáveis, como por exemplo doadores de sangue e população em geral, principalmente em países subdesenvolvidos onde esse tipo de infecção parece ser mais freqüente (Allain 2004, Chemin & Trepo 2005).

1.7.3 Distribuição dos Subtipos e Genótipos

Em relação à distribuição mundial, o subtipo ayw1 é mais encontrado no Vietnã, ayw2 (Mediterrâneo, África central e Grécia), ayw3 (Índia, Antilhas, Américas do Norte e Sul), ayw4 (África Ocidental), ayr (Vietnã), adrq (Polinésia Francesa), adrq+ (Sul e Leste Asiático), adw2 (centro e norte Europeu, leste da África do Sul) e adw4 (Polinésia Francesa, Arquipélago de Marquesa e Argentina) (Couroucé-Pauty et al.1983, Norder et al. 2004). No ano de 1987, Gaspar & Yoshida publicaram um estudo, em que mostrava que os subtipos ayw2, ayw3, ayw4, adw2 e adw4 circulavam no Brasil, com a predominância do adw4 e adw2 na Região Norte, adw2 no Nordeste, ayw3 e ayw2 no Sul, adw2 e ayw3 no Sudeste e adw2 na Região Centro-Oeste. Em 2001, todos esses subtipos foram encontrados em garimpeiros no Estado de Mato Grosso (com exceção do ayw4) (Souto et al. 2001a). Em afro-descendentes de comunidades isoladas de Mato Grosso do Sul, o subtipo adw2 foi predominante, seguido por ayw2 (Motta-Castro et al. 2003).

Em Goiânia-GO, Silva et al. (2002), ao subtiparem amostras de indivíduos com evidência sorológica de hepatite B, encontraram os subtipos adw2 (62,7%), ayw3 (23,5%), ayw2 (9,8%) e adw4 (3,9%). Semelhantemente, Souza et al. (2004b) verificaram uma maior freqüência do subtipo adw2 (60%), seguido por adw4 (20%) e ayw3 (20%) em portadores de problemas mentais. No entanto, esse último subtipo foi dominante em hemodialisados (58,3%), seguido por adw2 (38,9%) e adw4 (2,8%) (Teles et al. 2002). O genótipo A é freqüentemente encontrado nos Estados Unidos, na parte central da África, África do Sul, Índia, noroeste da Europa, Hong Kong e Filipinas. O genótipo B é prevalente no Japão, Taiwan, Indonésia, Vietnã e China. O genótipo C tem distribuição geográfica semelhante a do genótipo B, sendo também encontrado nas Ilhas do Pacífico. Apesar de apresentar uma distribuição mundial, o genótipo D tem maior prevalência na região do Mediterrâneo, Índia e Estados Unidos. Já o genótipo E, parece ser restrito à África Ocidental. O genótipo F é prevalente nas Américas Central e do Sul e Polinésia. O genótipo G circula nos Estados Unidos e Europa. Finalmente, o genótipo H é mais encontrado nas Américas do Sul e Central (Magnius & Norder 1995, Bowyer et al. 1997, Stuyver et al. 2000, Arauz-Ruiz et al. 2002, Kao 2002, Echavarria et al. 2005, Günther 2006).

Estudos realizados no Brasil, em diferentes grupos populacionais, mostraram a circulação dos genótipos A, B, C, D e F. Entretanto, há predominância dos genótipos A, D e F, enquanto os genótipos B e C foram observados em uma baixa freqüência na cidade de São Paulo e no Estado do Paraná (Moraes et al. 1996, De Casto et al. 2001, Bertolini 2002, Teles et al. 2002, Araújo et al. 2004, Conde et al. 2004, Carrilho et al. 2004, Sitnik et al. 2004, Oliveira 2005, Motta-Castro et al. 2005, Ferreira et al. 2006b).

1.8 Prevenção e Controle da Hepatite B

Algumas medidas foram estabelecidas para prevenção e controle da transmissão do HBV. Elas incluem, vacinação, profilaxia pós-exposição ou durante o parto, triagem do HBsAg em gestantes, dentre outras (Brasil 1989, Brasil 1993, Kupek 2001). Além disso, os bancos de sangue realizam a triagem sorológica dos doadores para o marcador HBsAg em todo o mundo. Adicionalmente em alguns países, é realizada a triagem para o marcador anti-HBc, o que tem contribuído para a redução da hepatite B pós-transfusional, entretanto o risco de transmissão permanece em portadores assintomáticos HBsAg negativos (Regan 2000, Hou et al. 2005, Brasil 1989, 1993). Mais recentemente, está ocorrendo a inserção gradativa de técnicas moleculares na triagem desses doadores em países desenvolvidos (Gessoni et al. 2005, Weber 2005, Fang 2006, Liu et al. 2006a). A primeira vacina contra o HBV foi licenciada em 1981 e era derivada de plasma humano de portadores crônicos do HBV (Heptavax-B). No entanto, a possibilidade de ocorrer transmissão de outros patógenos veiculados pelo plasma, bem como o avanço da engenharia genética, levaram ao desenvolvimento de vacinas recombinantes de segunda geração, mais seguras, compostas de HBsAg (Engerix-B, Recombivax e outras). Ambas apresentam uma boa imunogenicidade, sendo que 90% dos indivíduos imunocompetentes vacinados desenvolvem imunidade adequada (títulos ≥10 mUI/mL). Todas as vacinas recombinantes licenciadas contém hidróxido de alumínio como adjuvante (Assad & Francis 2000, Kao & Chen 2002, Shouval 2003).

A inclusão de vacina contra hepatite B em diversos países ocorreu a partir de 1991, seguindo a recomendação da OMS. Essa intervenção protege os indivíduos em mais de 95% do desenvolvimento da infecção crônica e, conseqüentemente, de cirrose e hepatocarcinoma associados a esse vírus (Lavanchy 2004, WHO 2004). A imunização efetiva de crianças contra o HBV tem demonstrado ser uma ferramenta eficiente para a redução das taxas de prevalência e incidência dessa infecção em diversos locais, como Estados Unidos, Itália, Holanda e África do Sul (Lin et al. 2003, Tsebe et al. 2001, CDC 2004, Da Villa et al. 2007, Van Houdt et al. 2007). Além disso, em Taiwan e Alaska, países considerados previamente como hiperedêmicos, sucesso na adoção dessa medida foi verificado (Harpaz et al. 2000, Ni et al. 2001). Em Taiwan, por exemplo, oito anos após o início da imunização universal, houve redução de cinco vezes no percentual de crianças HBsAg positivas (Wong & Tsang 1994), ocorrendo, ainda, diminuição significativa nos índices de mortalidade por hepatocarcinoma em crianças naquele país, entre 1984 (época do início da vacinação) e 1993 (Lee & Ko 1997). Todos esses estudos, não só ilustram o impacto dessa importante medida de prevenção, como também encorajam todos os países a adotar e manter a imunização na lista das prioridades no que se refere a Saúde Pública.

O Brasil seguiu essa recomendação, implantando, inicialmente, a imunização em áreas de endemicidade elevada (Amazônia Legal, Paraná, Santa Catarina e Espírito Santo). Posteriormente, a vacina foi oferecida a grupos que apresentavam alto risco de exposição ao HBV, como hemodialisados, profissionais de saúde, profissionais do sexo, homossexuais, dentre outros. Na década de 90, foi adicionada ao calendário nacional de imunização, a vacina para crianças menores de um ano e, no ano de 2001, a vacina passou a ser oferecida para indivíduos até os 20 anos de idade (Brasil 2003, 2005).

O esquema vacinal recomendado é de três doses, sendo 0, 1 e 6 meses, ou seja, com intervalos de um mês entre as duas primeiras doses e de cinco meses entre a 2ª e 3ª dose. A portaria do Ministério da Saúde (MS no.597 08/04/2004) estabelece que essa vacina seja administrada no músculo vasto lateral da coxa direita em crianças menores de dois anos e, a partir dessa idade, no músculo deltóide (Brasil 2004). Cerca de 10% dos indivíduos vacinados não desenvolvem títulos de anti-HBs suficientes para conferir proteção ao HBV. Fatores como estocagem inadequada da vacina, predisposição genética, sexo masculino, tabagismo, idade acima de 40 anos, obesidade, imunodeficiência, desnutrição, bem como o local de administração da vacina, podem ser associados à ausência de resposta vacinal (Assad & Francis 2000, Kao & chen 2002, Shouval 2003).

No Brasil, uma vacina recombinante é produzida no Instituto Butantan (São Paulo), denominada Butang®. Sua imunogenicidade têm sido maior quando administrada em indivíduos com idade inferior a 30 anos (Martins et al. 2004). Um estudo realizado com crianças recém-nascidas em Campo Mourão-Paraná mostrou que essa vacina é altamente imunogênica, desenvolvendo resposta protetora em todas as crianças, inclusive as prematuras, vacinadas com três doses de 10 µg (0, 1 e 6 meses) (Isolani et al. 2006). A boa imunogenicidade da vacina também foi comprovada em adolescentes de Goiânia-Goiás, vacinados com três doses de 20 µg (0, 1 e 6 meses) (Oliveira et al. 2006).

A imunoglobulina hiperimune específica (HBIG) confere proteção passiva, sendo empregada em casos de exposição ao HBV, seja em situações de acidente com material contaminado, abuso sexual, contato sexual com parceiro portador ou ainda em neonatos quando a mãe é HBsAg reagente (Perrillo et al. 1984, Brasil 2005). Esforços para efetivar a prevenção e controle da transmissão do HBV em ambientes hospitalares têm sido observados em programas de educação continuada, que estimulam a adesão às medidas de biossegurança. Esses programas reforçam o uso de equipamentos de proteção individual (EPI), prevenção de injúrias com materiais pérfuro-cortantes contaminados, uso de técnicas adequadas para esterilização/desinfecção de materiais, preparo de medicações em área exclusiva e em doses individuais. Além desses cuidados, no ambiente hemodialítico, tem sido realizado o isolamento de pacientes HBsAg reagentes em máquinas e salas exclusivas. O conjunto dessas medidas contribuiu substancialmente para a redução da incidência da hepatite B nos locais em que foram implementadas (Brasil 1996, 2005, Mast et al. 1999).

1.9 Os afro-descendentes no Brasil e a comunidade Kalunga

Os africanos chegaram ao Brasil em meados do século XVI, trazidos como forma de mão-de-obra escrava para trabalhar em plantações de cana de açúcar e, mais adiante, nas minas de ouro, diamantes e plantações de café. Estima-se que cerca de 3,5 milhões de africanos vieram para o Brasil entre o período de 1551 e 1850 (Alves-Silva 2000).

Por muito tempo, os escravos foram forçados a viver de forma desumana. Assim, revoltados contra essas condições, se articularam, tentando buscar o direito de serem livres e montaram esconderijos nos locais mais afastados, de difícil acesso, longe dos possíveis ataques. Tais locais foram considerados unidades de resistência e foram chamados de “quilombos” (Silva 2003). O movimento de formação dos quilombos, registra-se como um longo fato histórico que se iniciou em 1630, só terminando em 1888, após a abolição da escravatura (Baiocchi 1999). Atualmente, mais de 1000 comunidades são reconhecidas como remanescentes de quilombos no Brasil, segundo registros da Fundação Palmares, e são considerados locais onde vivem afro-descendentes que preservam a história e tradição do seu povo. Em 2003, Silva detectou aproximadamente 100 comunidades negras no Brasil Central e considerou que 50 delas eram remanescentes de quilombos. Entretanto, a que mais se destaca, por ser considerada a maior comunidade isolada de afro-descendentes do Brasil, é a comunidade Kalunga, situada no Estado de Goiás. Acredita-se que esses indivíduos têm procedência, em sua maioria, do Congo, Angola e Moçambique (Figura 11) (Baiocchi 1999).

ÁFRICA

SUDANESES

Guiné Portuguesa BRASIL Costa do Costa do Costa dos Marfim Ouro Escravos

Golgo da Guiné CONGO

BANTU Tocantins

Bahia Mato ANGOLA Moçambique Grosso

Minas Mato Gerais Grosso do Sul

Figura 11 - Rota dos escravos ao Brasil – Origem comunidade Kalunga (Baiocchi, 1999) A comunidade Kalunga foi formada através dos processos migratórios, vindos das minas de Goyaz e das minas de Tocantins no século XVIII, em que os afro- descendentes agruparam-se nas terras localizadas nos municípios de Cavalcante, Monte Alegre e Teresina de Goiás, às margens do Rio Paranã, entre as serras do Vão de Almas, Vão do Moleque, Contenda e Ribeirão dos Bois. Os Kalungas só foram descobertos em 1982, por ocasião de estudos antropológicos, apoiados pela Universidade Federal de Goiás (Baiocchi 1984). Em 1991, a região habitada por esse povo foi reconhecida como sítio histórico e patrimônio cultural, totalizando uma área de 237.000 hectares. Assim, os Kalungas permanecem praticamente isolados cultural e geograficamente, até os dias de hoje.

Estima-se que a população total seja constituída por aproximadamente 3.000 indivíduos. Os solos da região são variáveis, aptos para a agricultura principalmente, às margens do Rio Paranã, seus afluentes e vãos de serras. A área agricultável corresponde a 30% dos 237.000 hectares, sendo a vegetação predominantemente do cerrado (Baiocchi 1999).

A preservação dos Kalungas, como comunidade isolada, até os dias de hoje, deve-se a vários fatores, dentre eles o difícil acesso à região e sua capacidade de resistência, como a prática da agricultura de subsistência, praticada sem auxílio de máquinas e com a participação de toda a família (mulheres, homens e crianças). Os alimentos mais comuns no plantio são o arroz, mandioca, feijão e milho. A mandioca parece ter um importante valor naquele local, pois serve tanto para o consumo como também para o comércio, sendo a farinha usada para adquirir sal, tecidos, café, querosene, panelas e outros produtos em comércios locais e regionais (Baiocchi 1999, Ministério da Educação 2001).

Além disso, a estrutura alimentar é incrementada com a caça, pesca, criação de gado e porcos, bem como o plantio de alimentos nas proximidades das casas, como hortas (manjericão, coentro, e pimentas) e frutas (banana, mamão, melancia, abacaxi, dentre outras) (Baiocchi 1986, 1999, Silva, 2003). No geral, o modo de vida dos Kalungas é bastante simples. As casas têm poucos cômodos (sala, cozinha e quartos), sendo feitas de adobe e, na preparação do telhado, são utilizadas palhas e madeira da própria região. O chão é feito de terra batida, os móveis se resumem a bancos, camas, armários de cozinha e o cozimento de alimentos é realizado no fogão a lenha. Os banhos, assim como a lavagem dos utensílios domésticos, como panelas e pratos, se dão nos rios. Não há banheiros nas casas, energia elétrica, água encanada e nem rede de esgotos. A taxa de natalidade é considerada alta, caracterizando a população com uma grande concentração de crianças. O índice de analfabetismo é elevado e, apesar de já existirem escolas construídas com o apoio do Governo Federal, ainda são encontradas escolas de palha, com recursos didáticos escassos e situadas em locais onde as crianças muitas vezes têm que caminhar por muito tempo sob o sol para estudar (Baiocchi 1999, Ministério da Educação 2001, Silva 2003).

No entanto, apesar de todas as aparentes dificuldades, os Kalungas são considerados um povo festivo e religioso. Ao longo do ano, várias festas são realizadas e todas elas fazem alusões comemorativas a santos ou elementos católico-romanos ou africanos. Essas festas são eventos sociais, em que comparecem grupos de todas as idades. Para algumas festas, inclusive, há o deslocamento da família inteira, que viajam por muitas horas ou até dias, a pé ou montados a cavalos, até chegarem aos locais das festividades, onde existem espécies de ranchos construídos com a finalidade de abrigar as famílias, bem como cozinhas, locais para danças e capelas para os rituais.

Figura 12 - Povo Kalunga http://photos1.blogger.com/x/blogger/4879/4291/1600/829055/32.jpg Figura 14 - Cozinha Kalunga, com fogão a lenha Figura 13 - Casa Kalunga feita de adobe e palha http://www.ecoviagem.com.br/ecoviagem- brasil/aventura/giro-pela-america/os-kalungas.asp

Figura 15 - Escola Kalunga feita com adobe e palha http://www.unb.br/acs/bcopauta/arquitetura5.htm

Figura 16 - Mulheres Kalunga trabalhando em artesanato http://www.brasiloeste.com.br/fotosma t/kalunga_01.jpg

Figura 17 - Kalungas no preparo da farinha de mandioca http://www.labcom.ubi.pt/agoranet/04/cantia-aline-boloni- leonardo-quilombo-kalunga.pdf Figura 18 - Sanfoneiro em festa Kalunga Figura 19 - Crianças da comunidade Kalunga http://photos1.blogger.com/x/blogger/4879/4291/1600/466839/Sanfoneir www.photografos.com.br/users/marciocabral/normal_1349 o.jpg 27_photo.jpg

1.10 Justificativa

Apesar de terem se passado mais de três décadas da identificação do agente etiológico da hepatite B e de todos os estudos subseqüentes contribuírem para o conhecimento desta infecção, inclusive viabilizando vacinação específica, a hepatite viral do tipo B persiste como um problema de saúde pública mundial, sendo ainda associada a muitos casos de cirrose, hepatocarcinoma e a alta mortalidade (Maddrey 2000, Kao & Chen 2002, Alter 2003, Lai et al. 2003b, Lavanchy 2004).

Estudos epidemiológicos sobre a infecção pelo HBV têm mostrado uma ampla variação nos níveis de endemicidade em todo o mundo, sendo a África considerada uma região de alta endemicidade, que possui um grande número de portadores crônicos da hepatite B e um elevado risco para óbitos como conseqüências desta infecção (Miller et al. 1998, André 2000, Mulders et al. 2004).

A população brasileira é altamente miscigenada, caracterizada principalmente pela mistura entre três grupos étnicos: ameríndios, europeus (portugueses) e africanos. Estima-se que, do total de imigrantes que chegaram ao Brasil (1500- 1972), 40% eram da África (Alves-Silva et al. 2000, Oliveira et al. 2002). Atualmente em nosso País, 1000 comunidades estão oficialmente identificadas como remanescentes de quilombos e poucos são os estudos sobre a infecção pelo HBV nesta população (Motta-Castro et al. 2003, Motta-Castro et al. 2005). A investigação epidemiológica e molecular da infecção pela hepatite B tem se estendido a diversos grupos populacionais na Região Centro-Oeste. No entanto, ainda são inexistentes, no Estado de Goiás, estudos de prevalência abrangendo populações rurais, principalmente aquelas que apresentam diferenças em sua composição, bem como características culturais e raciais específicas. Levando em consideração esses aspectos, este foi o primeiro estudo realizado com a proposta de traçar o perfil epidemiológico e molecular da infecção pelo vírus da hepatite B em afro-descendentes que vivem em comunidade isolada em nosso Estado. Acredita-se que estas informações sejam valiosas para elaboração ou re-estruturação de estratégias específicas de prevenção e controle da hepatite B na população estudada. 2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

♦ Estudar o perfil epidemiológico e molecular da infecção pelo vírus da

hepatite B na população isolada de afro-descendentes no Estado de Goiás

(Kalungas), visando proporcionar informações para subsidiar medidas de

controle e prevenção da hepatite B na comunidade estudada.

2.2 Objetivos específicos

♦ Estimar a prevalência da infecção pelo HBV na comunidade Kalunga em Goiás;

♦ Analisar os principais fatores de risco associados a esta infecção; ♦ Detectar o DNA viral e os marcadores HBeAg e anti-HBe nas amostras HBsAg reagentes;

♦ Verificar o índice de infecção oculta pelo HBV na população estudada;

♦ Caracterizar os isolados do HBV, identificando os genótipos e subgenótipos virais.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 População estudada

Este é um estudo observacional, analítico, de corte transversal, que foi realizado em afro-descendentes de comunidade isolada no Estado de Goiás (Kalungas). Esta população reside em uma área de aproximadamente 237 mil hectares, nos municípios de Cavalcante, Teresina de Goiás e Monte Alegre. Os Kalungas vivem isolados nos vãos entre serras às margens de rios, formando os núcleos de Vão de Almas, Vão do Muleque e Engenho. Atualmente a população total é constituída de aproximadamente 3.000 habitantes.

Para obter a prevalência estimada da infecção pelo HBV em torno de 30%, com uma precisão de 5%, seria necessário estudar o mínimo de 691 indivíduos, considerando um poder estatístico de 80% (β=20%) e um nível de significância de 95% (α=0,05). Desta forma, esta investigação contou com a participação de 878 afro-descendentes.

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Federal de Goiás. 3.2 Entrevista e coleta de sangue

Em maio de 2004, foi realizada uma visita à comunidade Kalunga, afim de conhecer a realidade do local e a população a ser estudada. Na oportunidade, realizou-se a divulgação do estudo e agendamento das entrevistas, bem como das coletas de sangue, para o mês de julho de 2004, em escolas e centros comunitários.

Após informação prévia sobre os objetivos e metodologia da pesquisa, os indivíduos consentiram em participar da investigação por meio da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, ou da coleta de impressão digital dos indivíduos analfabetos. Para indivíduos menores de idade, o referido termo foi autorizado pelos pais ou responsáveis. Em seguida, os mesmos foram submetidos à entrevista utilizando-se um questionário padrão (em anexo), que abordava questões sobre características sócio-demográficas, fatores de risco relacionados à infecção pelo HBV, antecedentes sobre hepatite/icterícia e vacinação contra hepatite B.

A amostra de sangue de cada participante (10 mL) foi obtida por punção da veia cubital e foram centrifugadas a 3000 rpm, em temperatura ambiente, durante 10 minutos. O sobrenadante (soro) foi separado em duas alíquotas, identificadas com o número do registro de cada participante. Os soros foram estocados em freezer a - 20°C (no Hospital Municipal de Cavalcante) e transportados para o Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP/UFG), onde foram armazenados nas mesmas condições, até a realização dos testes sorológicos e moleculares.

3.3 Testes sorológicos

Os testes sorológicos foram realizados através do ensaio imunoenzimático (ELISA), empregando-se kits comerciais. Inicialmente, todas as amostras foram testadas para a detecção dos marcadores HBsAg, anti-HBc e anti-HBs. Em seguida, as amostras que foram reagentes ao HBsAg foram testadas para detecção do HBeAg e anti-HBe.

3.3.1 Detecção do HBsAg

Para a detecção do marcador HBsAg foram empregados reagentes comerciais (Hepanostika HBsAg Uni-Form II, Biomérieux-Holanda). Este teste consiste em um ensaio imunoenzimático (ELISA) baseado no princípio de sandwich em uma única etapa. Em uma microplaca sensibilizada com anticorpos anti-HBs monoclonais e contendo uma esfera de conjugado (anti-HBs marcado com peroxidase), foram adicionados as amostras e controles em suas respectivas câmaras. Após este procedimento, a placa foi incubada e, posteriormente, lavada com tampão fostato. Em seguida, o substrato/cromógeno (tetrametilbenzidina/peróxido de uréia) foi adicionado. Após nova incubação, a reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico a 1N.

Após o término da reação, a leitura espectrofotométrica foi realizada em filtro simples (450 nm), onde foram consideradas positivas as amostras que apresentaram absorbâncias maiores ou iguais ao valor do cut-off, obtido através da soma (CNx+0,050), onde CNx é a média das absorbâncias dos controles negativos.

3.3.2 Detecção do anti-HBc total

A detecção do marcador anti-HBc Total foi realizada com reagentes comerciais (Hepanostika anti-HBc Uni-Form, Biomérieux-Holanda). O princípio da reação era baseado em inibição competitiva. Cada câmara da placa era revestida com antígeno core do vírus da hepatite B (HBcAg). O conjugado era constituído de anticorpos anti-HBc humano interligado à enzima peroxidase.

As amostras em teste e os controles foram incubados juntamente com o conjugado durante 90 minutos a 37ºC e, em seguida, a placa foi lavada com o tampão fosfato. Posteriormente, foi adicionada a solução substrato/cromógeno (tetrametilbenzidina/peróxido de uréia) e incubou-se por 30 minutos. Finalmente, a reação foi interrompida com ácido sulfúrico a 1N e a leitura espectrofotométrica realizada em leitora de microplaca com uso de filtro simples (450 nm).

O valor do cut-off foi obtido pela fórmula: 0,25 (CNx + 3CPx) onde “CNx” é igual ao valor médio das absorbâncias dos controles negativos e “CPx” ao dos controles positivos. Assim, foram consideradas amostras positivas, aquelas que apresentaram absorbância menor ou igual ao valor do cut-off.

3.3.3 Detecção de anti-HBs

A detecção de anticorpos anti-HBs foi realizada através do método imunoenzimático direto (tipo sandwich) em microplacas sensibilizadas com HBsAg (ad e ay). As amostras e controles foram adicionados às suas respectivas câmaras. A placa foi incubada e, em seguida, lavada. Após a adição do conjugado (HBsAg marcado com peroxidase), a placa foi incubada novamente. Realizada a lavagem, a mistura substrato/cromógeno foi adicionada, sendo a placa novamente incubada. Então, a reação foi bloqueada pela ação de ácido sulfúrico, e a leitura realizada em filtro duplo (450 nm e 620nm).

O cut-off foi definido por (CNx + 0,040), onde “CNx” é igual a média das absorbâncias dos controles negativos. Os resultados foram obtidos através da razão entre a absorbância da amostra e o valor do cut-off. As amostras com relação absorbância/cut-off ≥ 1,0 foram consideradas positivas; com relação absorbância/ cut-off ≤ 0,9 foram negativas e, quando esta razão foi igual a 0,9 as mesmas foram indeterminadas.

3.3.4 Detecção do HBeAg e anti-HBe

O teste ELISA Hepanostika HBeAg é baseado no princípio sandwich e, para a detecção do anti-HBe, numa modificação da inibição do sandwich.

No ensaio para HBeAg, adicionou-se as amostras e controles na microplaca sensibilizada com anticorpos anti-HBe humano. Em seguida, realizou-se a incubação e a lavagem. O conjugado (anti-HBe humano ligado à peroxidase) foi acrescentado. Após a segunda incubação e a lavagem, a reação foi revelada pela adição do substrato/cromógeno (peróxido de uréia e TMB). A reação foi interrompida, sendo considerada positiva a leitura espectrofotométrica (filtro 450 nm) que mostrou absorbância maior ou igual ao cut-off, definido de acordo com as instruções do fabricante como a soma das médias das absorbâncias dos controles negativo e positivo x 0,5.

Para detecção do anti-HBe, em microplaca sensibilizada com anti-HBe, foram adicionadas as amostras e controles, juntamente com uma solução contendo HBeAg. Após a incubação, os procedimentos foram os mesmos utilizados para detecção do HBeAg, porém foram consideradas positivas as amostras que apresentaram absorbância menor que a do cut-off, obtido conforme a descrição acima. 3.4 Detecção e genotipagem do HBV DNA

3.4.1 Extração do HBV DNA

As amostras HBsAg reagentes (n=16), bem como amostras positivas para o anti-HBc (n=295) foram submetidas à extração do ácido nucléico viral, realizada em duas etapas, conforme Niel et al. (1994). Resumidamente, a primeira consistiu na adição de 250 µL do soro em 80 µL de solução de lise, sendo esta composta por solução A (Tris 200 mM, SDS 1%, NaCl 700 mM, EDTA 20 mM, tRNA 0,1 mg/mL) e solução B (proteinase K 2mg/mL dissolvida em solução de CaCl2 0,36 mM; o pH final foi ajustado para 9,0 utilizando o HCL). Os soros, juntamente com a solução de lise, foram incubados a 37º C por 4 horas. O DNA viral foi extraído pelo uso de fenol/clorofórmio, centrifugado, e a fase superior transferida para tubos contendo etanol. Estes foram mantidos a -20ºC durante a noite. A segunda etapa da reação, caracterizou-se pela centrifugação do material e a formação de um precipitado, que em seguida foi lavado com etanol a 70%, seco e ressuspenso em 30 µL de água (milliQ autoclavada).

3.4.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Após a extração do DNA, realizou-se uma semi-nested PCR, para amplificação e detecção do DNA viral relativo a região pré-S/S, que foi realizada em duas etapas, de acordo com Motta-Castro et al. (2005).

Para a PCR-1 (1ª etapa), utilizou-se uma mistura contendo 1 pmol de cada primer: PS1 e S2/S22 (Invitrogen) (Quadro 4), responsáveis pela amplificação do fragmento de DNA do nucleotídeo 2826 ao 841 do genoma; 0,2 mM de cada dNTP

(dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 3 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) e 1U de Taq DNA polimerase, num volume final de 50 µL. Dois microlitros do HBV DNA extraído de cada amostra obtido na fase anterior, além dos controles negativos (água) e controle positivo (amostra HBV DNA positiva) foram misturados aos componentes descritos acima, e em seguida esta mistura levada ao termociclador com o seguinte programa: 94ºC por 3 minutos (desnaturação inicial), 30 ciclos de 95ºC por 30 segundos, 52ºC por 40 segundos e 72ºC por 2 minutos (desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente) e 72ºC por 7 minutos (alongamento final).

A segunda etapa (PCR-2) foi realizada empregando-se os primers PS1 e SR (Invitrogen) (Quadro 4), além dos mesmos componentes mencionados acima. O produto final da PCR-1 (2 µL) foi adicionado à nova mistura da reação e levado ao termociclador, com o seguinte programa: 94ºC por 3 minutos (desnaturação inicial), 30 ciclos de 94º C por 20 segundos, 55ºC por 20 segundos e 72ºC por 1 minuto (desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente) e 72ºC por 7 minutos (alongamento final). O produto final da PCR-2 era composto de 1099 pares de base (pb).

3.4.3 Eletroforese em gel de agarose

Ao gel de agarose preparado a 1% em tampão TBE (Tris-Borato EDTA), foi acrescentado brometo de etídeo em uma concentração final de 0,5 µg/mL.Os produtos da PCR-2 foram misturados a 5 µL do corante Azul de bromofenol, aplicados ao gel e submetidos à eletroforese. As bandas formadas foram visualizadas através de luz ultravioleta com auxílio de um transluminador, e comparadas ao controle positivo. Para evitar contaminação, vários cuidados foram tomados, como a preparação dos reagentes pré-PCR, amplificação do DNA e a eletroforese em gel dos produtos de PCR em ambientes separados.

3.4.4 Genotipagem por RFLP (Retriction Fragment Lenght Polymorphism -Análise do polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição)

O fragmento de DNA amplificado foi analisado pelo método de RFLP, utilizando-se três enzimas de restrição ou endonucleases. As enzimas, EcoRI, BamHI e StuI (New England BioLabs), foram diluídos segundo as recomendações do fabricante, tendo como componentes água milliQ (8 µL), tampão específico para cada enzima (2 µL) e enzima (10U).

Dez microlitros do produto obtido após a PCR-2 com igual volume de cada enzima foram incubados a 37ºC durante quatro horas. Após este período, as amostras contendo DNA digerido foram misturadas a 5µL de Azul de bromofenol, aplicadas em gel de agarose a 3% e submetidas à eletroforese. Utilizou-se, também, o marcador de peso molecular (100 bp DNA Ladder- Invitrogen ) (1 µL/mL do marcador, 10 µL de TBE e 5 µL de Azul de bromofenol). As bandas formadas foram visualizadas através de luz ultravioleta com o auxílio de um transluminador e comparadas às bandas do marcador de peso molecular.

O método de RFLP permite, através da interpretação dos padrões eletroforéticos, a distinção entre os genótipos A, D e F, conforme descrito por Araújo et al. (2004). 3.5 Sequenciamento da região Pré-S/S

3.5.1 Amplificação das amostras para a região Pré-S/S

As amostras HBsAg e HBV DNA positivas, genotipadas pela técnica de RFLP, foram também submetidas à semi-nested PCR para amplificação da região Pré-S/S. Na primeira PCR, foram utilizados os primers externos P01 e S2/S22 (Quadro 4). A segunda PCR foi realizada com os primers PS1 e S2/S22. O processo para amplificação, nas duas etapas, incluíram os seguintes passos: desnaturação inicial das amostras a 94ºC por 3 minutos, seguida por 30 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, a 52ºC por 40 segundos e a 72ºC durante 2 minutos. Finalizando, com alongamento a 72ºC por 7 minutos. 3.5.2 Purificação do DNA

O volume total (100 µL) do produto amplificado para região Pré-S/S foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1%, contendo brometo de etídeo. Em seguida, as bandas foram extraídas do gel e colocadas em tubos “eppendorfs” (1,5 mL) para serem eluídas e purificadas utilizando o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI, USA).

Para cada 10 mg de fragmento do gel, adicionou-se 10 µL de solução de ligação à membrana. A mistura foi homogeneizada em vórtex e incubou-se a 50ºC por aproximadamente 10 minutos até a completa dissolução do gel. A seguir, o material foi transferido para uma coluna que foi adaptada a um tubo de coleta, sendo incubado a temperatura ambiente por um minuto e centrifugou-se a 14000 rpm durante um minuto. O resíduo do tubo de coleta foi desprezado. Posteriormente, adicionou-se 700 µL de solução de lavagem previamente diluída com etanol a 95% e centrifugou-se a 14000 rpm por um minuto, sendo o produto do tubo de coleta novamente desprezado. Em seguida, adicionou-se 500 µL da solução de lavagem e centrifugou-se a 14000 rpm por cinco minutos. Para finalizar, a coluna foi adaptada a um novo tubo “eppendorf” (1,5mL) e adicionou-se 50 µL de água livre de nucleases à coluna, deixando incubar a temperatura ambiente por 1 minuto e centrifugando a 14000 rpm por mais um minuto. A coluna foi desprezada e o DNA coletado no tubo “eppendorf” foi armazenado a -20ºC.

Na etapa seguinte, foi realizada a quantificação do DNA purificado. O produto foi aplicado em gel de agarose a 2%, num volume de 4 µL de cada amostra. Também aplicou-se 4 µL do marcador de massa e peso molecular ”low DNA mass ladder” para comparar a intensidade das bandas e calcular a concentração, determinando, assim, o volume de DNA utilizado na técnica de sequenciamento.

3.5.3 Seqüenciamento e análise da região Pré-S/S

As seqüências nucleotídicas das amostras amplificadas para região Pré-S/S foram determinadas utilizando o Kit BigDye Terminator versão 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) com primers específicos (PS1, S4, PS2 e S2). Quando necessário, os primers: PS4 e S7 foram utilizados (Quadro 4).

Para cada reação de sequenciamento, empregou-se 5 µL do DNA na concentração de 40 a 60 ng/µL, adicionados a 1,5 µL de água e 1 µL dos primers específicos para a região Pré-S/S. As reações para sequenciamento foram realizadas em um seqüenciador automático ABI 373 (Applied Biosystems, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A análise das seqüências foi realizada utilizando um programa desenvolvido pelo Grupo de Genética da Universidade de Wisconsin. Para análise filogenética, foi construída uma árvore pelo método “Neighbor-joining” usando o programa Mega versão 3.0 (Kumar et al. 2004).

Os genótipos das amostras do HBV deste estudo foram determinadas acrescentando-se, na análise filogenética, seqüências de referência dos oito genótipos conhecidos (A-H), bem como dos subgenótipos do vírus, disponíveis no GenBank (designadas na árvore filogenética pelo número de acesso e o local de origem - Figura 23 ).

Quadro 4-Primers utilizados na amplificação da região Pré-S/S e sequenciamento Primers Sentido Seqüência (5 ’ 3’) P01 sense GGACTCATAAGGTGGGGAA PS1 sense CCATATTCTTGGGAACAAGA PS2 anti-sense GGTCCCCAGTCCTCGAGAAG PS4 sense ACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTG S2 anti-sense GGGTTTAAATGTATACCCAAAGA S4 sense TGCTGCTATGCCTCATCTTCT S7 anti-sense TGAGCCAGGAGAAACGGGCT S22 anti-sense GTATTTAAATGGATACCCAAAGA SR anti-sense CGAACCACTGAACAAATGGC 3.6 Processamento e análise dos dados

Os dados obtidos nas entrevistas, bem como os resultados dos testes sorológicos e moleculares, foram analisados no programa Epi-Info versão 6.04 (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta. GA). Prevalência e estimativa de risco foram calculadas com intervalo de confiança de 95%. Os testes Qui- quadrado, Qui-quadrado para tendência e exato de Fisher foram utilizados quando apropriados. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Após o cálculo da estimativa de risco dos fatores associados à exposição ao HBV (positividade ao marcador anti-HBc) pela análise univariada, realizou-se a análise multivariada, por regressão logística múltipla, através do pacote estatístico SPSS, versão 11.0 for Windows para identificar as possíveis variáveis confundidoras. 4. RESULTADOS

4.1 Características da população estudada

As características sócio-demográficas dos 878 afro-descendentes estudados da comunidade Kalunga são apresentadas na Tabela 1. A idade destes indivíduos variou de 1 a 88 anos, com média de 28,3 e desvio padrão (dp) de 19,9 anos. Houve predomínio do sexo feminino, representando 60,1% da população estudada.

Em relação ao estado civil, 52,7% dos entrevistados eram solteiros, 44,1% casados ou relataram união consensual e 3,2% referiram ser separados ou viúvos. O nível de escolaridade dos Kalungas foi predominantemente baixo. Do total, 33,9% não possuíam escolaridade alguma, 60,9% tiveram acesso ao ensino fundamental, 5,1% referiram ter cursado o ensino médio e apenas um indivíduo (0,1%) cursou o nível superior.

Grande parte da população (75,2%) relatou renda familiar menor que um salário mínimo, 19,1% de um salário mínimo, 5,7% de dois ou mais salários. A maioria dos participantes informou que exercia atividade como lavrador (66%). Em relação ao restante, 14,5% ocupavam-se de atividades do lar, 10,2% eram estudantes e 9,3% citaram outro tipo de ocupação, como professores, cozinheiras, aposentados e agentes comunitários de saúde. Característica n %

Média de Idade (dp) 28,3 anos (19,9)

Sexo Feminino 528 60,1 Masculino 350 39,9

Estado Civil Solteiro 463 52,7 União consensual/casado 387 44,1 Separado/viúvo 28 3,2

Grau de Instrução* Nenhum 262 33,9 Ensino Fundamental 471 60,9 Ensino Médio 39 5,1 Ensino Superior 1 0,1

Renda Familiar < 1 salário 660 75,2 1 salário 168 19,1 ≥ 2 salários 50 5,7

Tabela 1 – Características dos 878 afro-descendentes estudados da comunidade Kalunga do Estado de Goiás

Ocupação** Lavrador 399 66,0 Do lar 88 14,5 Estudante 62 10,2 Outra 56 9,3 dp = desvio padrão * Foram consideradas apenas crianças acima de 6 anos (n=773) **Foram considerados apenas indivíduos acima de 14 anos (n=605) 4.2 Marcadores sorológicos e moleculares da infecção pelo vírus da hepatite B na comunidade Kalunga

A Tabela 2 mostra a prevalência dos marcadores sorológicos para o vírus da hepatite B na população estudada. Dos 878 indivíduos, 311 apresentaram positividade para o anti-HBc, considerando marcador de exposição prévia, o que resultou em uma prevalência global de 35,4% (IC 95% 32,3 - 38,7). Em 31,4% dos indivíduos, o marcador anti-HBc estava associado ao anti- HBs, em 1,8% ao HBsAg e em 2,2% este marcador foi detectado isoladamente.

Em 301 (34,3%) indivíduos, verificou-se positividade isolada ao marcador anti- HBs, sugerindo imunidade ao HBV.

Por outro lado, em 266 pessoas (30,3%), nenhum marcador para hepatite B foi detectado, sendo estas, portanto, consideradas susceptíveis à infecção pelo HBV.

Tabela 2- Prevalência dos marcadores sorológicos para o vírus da hepatite B nos 878 indivíduos da comunidade kalunga

Positivo Categoria Marcadores sorológicos IC 95%a n % Infectados Anti-HBc 19 2,2 1,3 - 3,4 Anti-HBc/HBsAg 16 1,8 1,1 - 3,0 Anti-HBc/Anti-HBs 276 31,4 28,4 - 34,6 Total (Anti-HBc) 311 35,4 32,3 - 38,7

Vacinados Anti-HBs 301 34,3 31,2 - 37,5

Suscetíveis Ausência de marcador 266 30,3 27,3 - 33,5 a IC: Intervalo de confiança Ao analisar a distribuição da positividade isolada ao anti-HBs, de acordo com a faixa etária, observou-se que a maioria dos soropositivos era crianças menores 10 anos (76,4%). Em indivíduos com 11-20 anos, um índice de 65,1% foi verificado, seguido de um declínio para 10,3% na faixa etária de 21-30 anos, chegando ao índice de 1% naqueles com idade superior a 40 anos (Figura 20).

A prevalência do marcador anti-HBc, segundo a faixa etária, também está representada na Figura 20. Verificou-se uma curva ascendente com o aumento de idade. Em crianças com até 10 anos, a positividade foi de 7,4% havendo um aumento gradativo nos demais grupos de idade, atingindo o índice de 64,6% em indivíduos com idade superior a 40 anos.

80% 70% 60% 50% Anti-HBc (+) 40% Anti-HBs (+) 30% 20% 10% 0% ≤ 10 11-20 21-30 31-40 41-50 >50

Figura 20 - Prevalência para os marcadores anti-HBs e anti-HBc de acordo com faixa etária da comunidade Kalunga, Goiás.

A Tabela 3 mostra os dados sorológicos e moleculares das 16 amostras HBsAg positivas. Somente duas amostras (12,5%) foram HBeAg reagentes, 12 (75%) foram anti-HBe positivas e as outras duas foram negativas para ambos os marcadores. O HBV DNA esteve presente em 75% (12/16) das amostras HBsAg reagentes. Após a realização da genotipagem (RFLP), o genótipo A foi encontrado em 11 amostras (91,6%), sendo todas pertencentes ao padrão AI. Em uma amostra HBV DNA positiva, não foi possível determinar o genótipo pela técnica empregada, tendo em vista que a mesma foi fracamente positiva.

Tabela 3 - Características sorológicas e moleculares das 16 amostras HBsAg positivas

Amostra HBeAg Anti-HBe HBV DNA Genótipoa (Padrão) K-752 + - + A (AI) K -753 + - + A (AI) K -187 - + + A (AI) K -272 - + + A (AI) K -275 - + + A (AI) K -305 - + + A (AI) K -397 - + + A (AI) K -407 - + + A (AI) K -552 - + + ND K -610 - + + A (AI) K -629 - + + A (AI) K -812 - + + A (AI) K -53 - + - - K -755 - + - - K -181 - - - - K -306 - - - - a Padrão de RFLP, ND: não determinado

4.3 Fatores de risco associados à infecção pelo vírus da hepatite B

A Tabela 4 apresenta a análise univariada dos fatores de risco associados à exposição ao HBV na população estudada, com seus respectivos intervalos de confiança a 95%. Dentre os fatores analisados, o aumento da idade, analfabetismo, história de parto realizado por parteiras da própria comunidade e relato de múltiplos parceiros sexuais mostraram-se associados à infecção pelo HBV.

Tabela 4 - Análise univariada dos fatores de risco associados à infecção pelo HBV em indivíduos da comunidade Kalunga Fator de risco HBV % Estimativa de risco Pos/Total (IC 95%)a Idade (anos) 17/203 8,4 1,0 ≤ 10 29/175 16,6 2,2 (1,1-4,3) 11-20 49/126 38,9 6,9 (3,6-13,5) 21-30 65/131 49,6 10,8 (5,7-20,7) 31-40 62/96 64,6 19,9 (10,0-40,4) 41-50 89/143 62,2 18,0 (9,5-34,5) >50 Sem informação 04 Sexo Feminino 178/528 33,7 1,0 Masculino 133/350 38,0 1,2 (0,9-1,6) Analfabetismo* Não 144/511 28,2 1,0 Sim 163/262 62,2 4,2 (3,1-5,8) História de hepatite na família Não 253/724 34,9 1,0 Sim 43/113 38,1 1,1 (0,7-1,7) Sem informação 41 Compartilhamento de objetos de uso pessoal Não 174/485 35,9 1,0 Sim 132/375 35,2 0,9 (0,7-1,3) Sem informação 18 Parto realizado por parteira da comunidade** Não 23/71 32,4 1,0 Sim 115/216 53,2 2,4 (1,3-4,2) Múltiplos parceiros sexuais*** 1,0 Não 10/58 17,2 4,8 (2,4-9,7) Sim 278/556 50,0 Doença Sexualmente Transmissível (DST)*** Não 239/486 49,2% 1,0 Sim 39/70 55,7% 1,3 (0,8-2,1) Sem informação 58 a IC: Intervalo de Confiança *Foram excluídosApós an indiválisíduose mu mltivariada,enores de 6 aajustadnos (n a= 77para3) variáveis confundidoras, verificou-se **Foram incluídas apenas mulheres que já tiveram filhos (n=287) ***Foraque mo inclaumentouídos indiv daíduos idade que manteve-relataram astividadee como sexual fator (n=61 ass4)ociado à infecção pelo HBV. Além disso, observou-se que os afro-descendentes do sexo masculino mostraram uma chance de exposição ao vírus da hepatite B de 1,4 (IC 95% 1,0-2,0) vezes superior em relação àquelas do sexo feminino. Os analfabetos apresentaram um risco de 2,1 (IC 95% 1,4-3,1) vezes maior de infecção pelo HBV do que aqueles que tinham algum grau de instrução. Para os indivíduos com história de múltiplos parceiros sexuais, a chance de aquisição do HBV foi 2,4 (IC 95% 1,1-5,7) vezes maior do que aqueles que não relataram essa característica (Tabela 5).

Tabela 5 - Análise multivariada dos fatores de risco associados à infecção pelo HBV em indivíduos da comunidade Kalunga

Estimativa de risco (IC 95%a ) Fatores de risco P Não Ajustada Ajustada

Sexo b Feminino 1,0 1,0 Masculino 1,2 (0,9-1,6) 1,4 (1,0-2,0) 0,03

Idade (anos)b ≤10 1,0 1,0 11-20 2,2 (1,1-4,3) 1,4 (0,7-2,9) 0,35 21-30 6,9 (3,6-13,5) 4,3 (2,1-8,6) 0,00 31-40 10,8 (5,7-20,7) 5,3 (2,6-10,5) 0,00 41-50 19,9 (10,0-40,4) 8,6 (4,1-18,2) 0,00 > 50 18,0 (9,5-34,5) 6,4 (3,0-13,3) 0,00

Analfabetismob Não 1,0 1,0 Sim 4,2 (3,1-5,8) 2,1 (1,4-3,1) 0,00

Múltiplos parceiros sexuaisb Não 1,0 1,0 Sim 4,8 (2,4-9,7) 2,4 (1,1-5,7) 0,04

Parto com parteirac Não 1,0 1,0 Sim 2,4 (1,4-4,2) 1,6 (0,8-3,3) 0,18 a IC 95%: Intervalo de confiança; b ajustado por sexo, idade, analfabetismo e múltiplos parceiros sexuais; C ajustado por idade, analfabetismo e múltiplos parceiros sexuais.

4.4 Prevalência de infecção oculta pelo HBV

A pesquisa de infecção oculta para o vírus da hepatite B foi realizada em 295 amostras reagentes ao anti-HBc. O HBV DNA foi detectado em cinco destas

Tabela 6 - Características de risco relatadas pelos cinco indivíduos que apresentaram infecção oculta pelo HBV na comunidade Kalunga amostras, sendo todas anti-HBc/anti-HBs positivas e pertencentes ao genótipo A (padrão AI), o que resultou numa prevalência de 1,7% para infecção oculta em indivíduos anti-HBc reagentes na comunidade estudada. Ao verificar as características dos cinco indivíduos que apresentaram infecção oculta para o HBV (Tabela 6), observou-se que todos eram adultos, sendo dois do sexo feminino e três do masculino. Eles relataram características de risco como história de hepatite na família e/ou múltiplos parceiros sexuais, e não receberam a vacina contra hepatite B.

Amostra Idade Sexo Características de risco Vacinação contra HBV K-60 20 Feminino Hepatite na família Não K-69 40 Masculino Hepatite na família Não Múltiplos parceiros sexuais

K-530 30 Feminino Múltiplos parceiros sexuais Não

K-586 41 Masculino Múltiplos parceiros sexuais Não

K-654 63 Masculino Múltiplos parceiros sexuais Não

4.5 Análise filogenética da região Pré-S/S

Foi possível seqüenciar a região pré-S/S em nove das doze amostras HBV DNA positivas, sendo todas elas pertencentes ao genótipo A, subgenótipo Aa. Com a representação destas amostras na árvore filogenética, observou-se que cinco foram agrupadas em dois subclusters (Figura 21). O primeiro foi formado pelos isolados K-407 e K- 397 e, no segundo, agruparam-se os isolados K-752, K-753, K- 812 do HBV. k-407 k-397 k-272 k-305 k-629 k-753 k-752 k-812 k-187 U55222-B Brraazsiill

Aa AY934771-- SSomálomaliaia AY344101-- BBrraasizill AY344105-- BBrraasizill AY233283-- SÁofricutah do Af rSulica

83 AF297625-- SÁofricutah do Af rSulica AF090842-- BBelélgicgiuam 55 M57663-P Filipinahilippsines AF090838-- BBelélgicgiuam

AJ309369-- FFrançarance Ae 93 Z35717-- PPolôniaoland A 90 AY233286-- SÁofricutah do Af Sulrica 66 AY344098-- BBrarasizill X02763- UEstadosSA Unidos AJ012207-Germany 80 - Alemanha AF297624-- SÁofricutah do Af Sulrica AF090839-- BBéellgicgiuam 76 AJ605036-- CCaammarõeeroosn

G AF160501-- FFrançarance B AF282918-- CChhiinaa C V00867-- JapãJapaon D X65257-- ItáliaItaly

E X75664- WOesestte AAffrriicacano F X69798-- BBrarazsiill H 99 AY090457-- Niicarcaráguaagua

0.03 0.02 0.01 0.00

Figura 21 - Árvore filogenética da região pré-S/S do HBV, incluindo nove isolados de afro-descendentes da comunidade Kalunga (K) e 25 seqüências do GenBank dos genótipos A a H (o número de acesso e o país de origem estão indicados). 5. DISCUSSÃO

Mundialmente, a infecção pelo vírus da hepatite B permanece como um grave problema de saúde pública, não só pelos altos índices de prevalência, mas essencialmente por ser uma das principais causas de doença hepática aguda/crônica, cirrose e carcinoma hepatocelular. Essa infecção é uma das três principais causas de morte na África e Ásia (Lavanchy 2005). No território brasileiro, os índices de positividade aumentam no sentido sul/norte, sendo preocupantes os dados do Ministério da Saúde, que estimam que cerca de 15% da população brasileira já teve contato com esse vírus (Brasil 2005).

Estudos epidemiológicos abordando a distribuição da hepatite B em populações são pouco freqüentes em nossa região e têm sido praticamente limitados a grupos específicos. Embora os indivíduos que participaram deste estudo apresentassem características específicas, como o fato de serem todos descendentes de africanos, considera-se que esta é uma investigação que buscou a representatividade de uma população, sendo composta por ambos sexos e com participação de indivíduos de todas as faixas etárias. Além disso, merece destaque o fato de que este trabalho se constitui no primeiro estudo sobre a infecção pelo vírus da hepatite B em afro-descendentes que vivem em comunidade isolada no Estado de Goiás, somando-se ao pequeno contingente de estudos sobre essa infecção na população quilombola do Brasil (Motta-Castro et al. 2003, Motta-Castro et al. 2005).

Neste estudo, foi observada diferença na distribuição da população em relação ao sexo, com predomínio do feminino (60,1%). A média de idade dos Kalungas foi de 28,3 anos, sendo que aproximadamente 50% da população apresentaram idade inferior a 20 anos. Estas características foram semelhantes às encontradas na população de afro-descendentes que vivem em comunidades isoladas em Mato Grosso do Sul (Motta-Castro et al. 2005). O predomínio de mulheres e jovens, dentre os Kalungas estudados, pode representar a realidade da maioria das comunidades rurais brasileiras, onde muitos adultos, principalmente os homens, se deslocam para região urbana à procura de melhorias, como emprego e/ou educação. A escolaridade da comunidade Kalunga mostrou-se baixa, pois a maioria cursou apenas o ensino fundamental (60,9%), bem como um índice expressivo de analfabetismo (33,9%) foi verificado. Ainda, foi detectado um baixo nível socioeconômico, em que grande parte da população possuía renda inferior a um salário mínimo. A atividade ocupacional exercida pela maioria dos indivíduos era o trabalho na lavoura. A comunidade Kalunga vive basicamente da agricultura de subsistência, tal como a população estudada em Mato Grosso do Sul (Motta-Castro et al. 2005). Além disso, a comunidade possui condições de higiene precárias, e suas casas não apresentam banheiro, esgoto, água encanada e energia elétrica.

Estudos realizados na África mostraram uma variação na taxa de positividade para o HBsAg de 9 a 20% (Richard-Lenoble et al. 1995, Kiire 1996, Mulders et al. 2004). No presente estudo, a prevalência de 1,8% observada para este marcador, indicando infecção presente, embora seja menor que o índice encontrado na África, foi maior que o verificado previamente em doadores de sangue no Estado de Goiás (0,8%; IC 95%: 0,7-0,9) (Martelli et al. 1999).

Entretanto, a prevalência para o HBsAg verificada nos Kalungas foi próxima às encontradas em indivíduos procedentes da área rural na Região Amazônica (4,3%; IC 95%:1,9 - 4,7) (Braga et al. 2005), no Vilarejo Ranchão, em Mato Grosso (3%; IC 95%: 2,0-4,0) (Souto et al. 2001b) e em Cavunge, na Bahia (2,6%; IC 95%: 1,9-3,5) (Almeida et al. 2006), bem como à relatada por Motta-Castro et al. (2005) (2,2%; IC 95%: 1,4-3,2) em afro-descendentes de comunidades isoladas em Mato Grosso do Sul.

A prevalência global da infecção pelo HBV, calculada pela positividade para o marcador anti-HBc, foi de 35,4%, sendo maior que a reportada em doadores de sangue no Estado de Goiás (10,7%; IC 95%: 10,4-10,9) (Martelli et al. 1999). Por outro lado, na África, onde muitos países são considerados endêmicos para a hepatite B, essa prevalência assume valores maiores, variando de 31,4% a 90% (Martinson et al. 1998, Miller et al. 1998, André 2000, Karim et al. 2001, Mulders et al. 2004).

Considerando populações rurais brasileiras, a prevalência global encontrada no presente estudo se assemelha à mostrada por Souto et al. (2001b) em Mato Grosso (31%; IC 95%: 27,0-34,0), mas foi superior à taxa verificada por Almeida et al. (2006) (9,8%; IC 95%: 8,3-11,4), que realizaram um estudo em uma população rural que contou com 84,6% de indivíduos afro-brasileiros. A prevalência global para hepatite B na comunidade Kalunga também foi maior que a observada em afro- descendentes isolados de Mato Grosso do Sul (19,8%; IC 95%: 17,5-22,3) (Motta- Castro et al. 2005).

De forma geral, a Região Centro-Oeste é considerada como área de endemicidade baixa a intermediária, tendo em vista os índices de prevalência encontrados para o marcador HBsAg (Souto 1999). Adicionalmente, os achados da presente investigação indicam um padrão semelhante de endemicidade para a comunidade estudada, considerando as categorias determinadas pela Organização Mundial da Saúde (WHO 2004).

A positividade ao anti-HBc de acordo com a idade revelou que 7,4% das crianças com até 10 anos de idade foram expostas ao HBV. Esse índice foi semelhante ao verificado em uma comunidade rural de Mato Grosso (7,5%) (Souto et al. 2001b) e nas comunidades quilombolas de Mato Grosso do Sul (8,1%) (Motta- Castro et al. 2005). Estes dados refletem a aquisição da infecção pelo HBV no início da vida, situação que é característica de regiões endêmicas (Alter 2003, Lavanchy 2004). Embora este resultado sugira a ocorrência da transmissão intrafamiliar ou horizontal do HBV, não foram encontradas crianças com idade inferior a 5 anos com positividade ao HBsAg, bem como mulheres gestantes com reatividade a esse marcador. Sendo assim, mais estudos são necessários para avaliar a ocorrência da transmissão vertical do HBV na comunidade Kalunga. Além disso, alguns trabalhos têm relatado que o contato próximo entre as crianças, o compartilhamento de balas/doces e a presença de lesões da pele, como as provocadas por escabiose, parecem favorecer a disseminação do HBV em comunidades fechadas (Leichtner et al. 1981, Zuckerman 1990, Martinson et al. 1998, Brasil et al. 2003). Na época da coleta de dados e amostras sanguíneas deste estudo, todas essas características foram observadas na comunidade Kalunga. Merece ainda destaque que em outra parcela da população, alvo da campanha de vacinação para hepatite B (os adolescentes), a prevalência para o HBV foi de 16,6 %, sendo superior ao índice encontrado por Oliveira et al. (2006) em Goiânia (5,9%). Ainda, a prevalência global da infecção pelo HBV, segundo a faixa etária, demonstrou que há tendência de crescimento da taxa de infecção proporcionalmente ao aumento idade. Resultados semelhantes foram encontrados em outros estudos realizados no Brasil (Braga et al. 2005, Motta-Castro et al. 2005, Bertolini et al. 2006). Esta característica sustenta a impressão de que a maioria dos Kalungas pode entrar em contato com o HBV, em algum momento de suas vidas e, ainda, justifica a necessidade da expansão da estratégia de vacinação aos indivíduos de todas as faixas etárias.

Aproximadamente 35% dos indivíduos estudados apresentaram positividade isolada ao marcador anti-HBs, refletindo o índice de cobertura vacinal para hepatite B na comunidade Kalunga. Este índice foi semelhante ao encontrado numa população com grande número de afro-brasileiros no Acre (31%) (Viana et al. 2005), superior ao encontrado na Bahia (6,8%) (Almeida et al. 2006) e nos afro descendentes do Mato Grosso do Sul (9,1%) (Motta-Castro et al. 2005).

Ao estratificar este índice por faixa etária, observou-se que a maioria dos vacinados era crianças com idade menor ou igual a 10 anos (76,4%) ou jovens entre 11 e 20 anos de idade (65,1%). Estes percentuais são baixos, uma vez que, considera-se como boa cobertura vacinal, quando 95% da população alvo encontram-se imunizados (Brasil 2001). Por outro lado, nas demais faixas etárias praticamente não foram observados indivíduos protegidos contra esta infecção. Assim, notoriamente, a distribuição da infecção pelo HBV de acordo com a idade assume valores inversamente proporcionais aos de vacinação prévia contra esta doença.

No Brasil, a vacinação para hepatite B foi introduzida no Programa Nacional de Imunização a partir do ano de 1998, sendo direcionada às crianças já no primeiro ano de vida e, em 2001, foi estendida aos indivíduos com até 20 anos de idade. Provavelmente, a longo prazo, essa intervenção diminuirá substancialmente o número de indivíduos infectados e de portadores crônicos do HBV na comunidade Kalunga, pois, apesar da dificuldade de acesso, observou-se que nos últimos anos houve um grande esforço do serviço de saúde pública em imunizar esta população. Entretanto, grande parte dos indivíduos (30,3%; IC 95%: 27,3 - 33,5) não apresentou positividade para nenhum marcador sorológico da hepatite B, revelando um índice alto de pessoas ainda susceptíveis a esta infecção. Tais achados indicam que ainda é necessário desenvolver estratégia de prevenção que considere as peculiaridades de certos grupos populacionais, observando as dificuldades geográficas, bem como as características sócio-culturais.

Quanto a distribuição da prevalência do anti-HBc em relação ao sexo, verificou-se uma maior freqüência deste marcador em indivíduos do sexo masculino (38%) do que no feminino (33,7%). O risco de infecção maior para o sexo masculino foi reportado por outros autores (Lewis-Ximenez et al. 2002, Ferreira et al. 2006). Se considerarmos que a hepatite B é uma importante doença sexualmente transmissível (Russi et al. 2003) e o fato de que homens geralmente têm mais chance de se tornarem portadores crônicos do HBV do que as mulheres (Szmuness et al. 1978), estes achados podem refletir o importante papel do sexo masculino na aquisição e disseminação da hepatite B na comunidade estudada. Como era de se esperar, maiores freqüências de múltiplos parceiros sexuais (59,3%) e de doenças sexualmente transmissíveis (18%) foram encontradas em indivíduos do sexo masculino em relação ao feminino (9,7% e 9,2%, respectivamente - dados não mostrados).

A via sexual parece ser um importante modo de disseminação do HBV na comunidade Kalunga, já que essa população apresenta um gradiente crescente da prevalência em relação à idade dos indivíduos. Confirmando esse achado, o histórico de múltiplos parceiros sexuais permaneceu como um fator associado a infecção pelo vírus da hepatite B, após a análise multivariada. De fato, vários autores relatam que a atividade sexual tem sido apontada como uma das principais causas de transmissão do HBV (Martelli et al.1990, Passos et al. 1992, Clemens et al. 2000, Souto et al. 2001b, Hou et al. 2005).

Embora, na análise multivariada, a história de parto realizado por parteiras não tenha permanecido como um fator associado à infecção pelo HBV, o resultado da análise univariada sugere que a prática das parteiras nesta comunidade pode ser uma importante rota de transmissão horizontal durante o período perinatal. Aliás, tal procedimento é comum em comunidades rurais brasileiras. No ano da coleta de dados deste estudo (2004), o Ministério da Saúde registrou 31 mil partos realizados por parteiras tradicionais em todo o Brasil e, neste mesmo ano, as parteiras Kalungas foram responsáveis pela maioria dos partos dessa comunidade (JB 2005). Além disso, é bastante provável que o procedimento aconteça em condições de higiene precária, sem paramentação adequada e com compartilhamento de objetos entre indivíduos infectados e não infectados. Adicionalmente, a única parteira que participou do estudo apresentou positividade ao marcador anti-HBc, evidenciando, assim, exposição prévia ao HBV.

A transmissão intrafamiliar do HBV também pode ser sugerida nesta investigação. Mais da metade da população Kalunga relatou que teve ou tem algum parente próximo com hepatite. Além disso, a análise filogenética demonstrou a formação de dois subclusters. O primeiro foi formado pelos isolados K-407 e K-397, enquanto o segundo, pelos isolados K-752, K-753 e K-812. É interessante observar que os indivíduos do primeiro subcluster eram dois irmãos, com 35 e 37 anos de idade e ambos relataram o compartilhamento de objetos de higiene pessoal, como cortador de unhas, barbeador e escova de dentes. Além disso, o pai destes dois indivíduos apresentou positividade ao marcador anti-HBc e também referiu que já compartilhou objetos de higiene pessoal em casa. Em relação ao segundo subcluster, observou-se que os três indivíduos tinham idade de 8, 10 e 13 anos, eram irmãs e duas delas apresentaram reatividade ao marcador HBeAg. Ainda, notou-se características de risco comuns às três, como compartilhamento de objetos de uso pessoal (cortadores de unhas e escovas de dente). De fato, alguns estudos indicam uma forte influência do contato interpessoal entre familiares, principalmente entre irmãos, na disseminação do HBV (Hsu et al. 1993, Brasil et al. 2003, Lobato et al. 2006). Além disso, o compartilhamento de objetos de higiene (escovas de dente, barbeador e toalhas de banho), hábito comum em populações pobres, foi observado em freqüência elevada num estudo sobre transmissão intrafamiliar realizado no Acre (Lobato et al. 2006). Apesar de estudos moleculares realizados no Brasil reportarem a circulação dos genótipos A, B, C, D e F, sendo A, D e F os mais prevalentes no País (Moraes et al. 1996, De Castro et al. 2000, Teles et al. 2002, Araújo et al. 2004, Carrilho et al. 2004, Sitnik et al. 2004, Motta-Castro et al. 2005, Viana et al. 2005), apenas o genótipo A foi detectado na comunidade Kalunga. Este genótipo, apesar de apresentar distribuição mundial, é prevalente em certas partes da África (Bowyer et al. 1997, Sugauchi et al. 2003b, Kimbi et al. 2004, Mulders et al. 2004). Semelhantemente, o genótipo A foi dominante em comunidades isoladas de afro- descendentes de Mato Grosso do Sul (Motta-Castro et al. 2005). O mesmo foi encontrado com maior freqüência em afro-descendentes na Venezuela, onde há predomínio do genótipo F (Quintero et al. 2002).

A análise por RFLP mostrou que todos os isolados apresentaram o padrão AI. Este padrão já foi identificado como do subgrupo A’ por Araújo et al. (2004), correspondendo ao subgenótipo Aa (onde “a” indica procedência Africana ou Asiática) (Sugauchi et al. 2004). Para confirmar estes dados, realizou-se a análise filogenética da região Pré-S/S, que mostrou a presença do genótipo A, subgenótipo Aa na comunidade Kalunga. Tais achados, sugerem a procedência africana para o genótipo A, subgenótipo Aa, circulante no Brasil.

Embora o sequenciamento seja considerado como a técnica “padrão-ouro” para caracterização molecular do HBV, neste estudo observou-se total concordância entre amostras genotipadas por RFLP e sequenciamento. Estes resultados demonstram ser a metodogia de RFLP indicada para caracterizar amostras do genótipo A, principalmente no nosso País, onde este genótipo é prevalente (Teles et al. 1998, Araújo et al. 2004, Motta-Castro et al. 2005, Viana et al. 2005). Além disso, deve-se considerar que a técnica de RFLP é um procedimento mais simples, acessível e com um custo menor em relação ao sequenciamento de DNA.

Dentre as 16 amostras HBsAg reagentes, os marcadores HBeAg e anti-HBe foram encontradas em 12,5 % e 75% , respectivamente. O HBV DNA foi detectado em todas as amostras reagentes ao HBeAg e também em 83% das anti-HBe positivas. Alguns estudos sugerem que esse perfil ocorre devido a presença de mutações específicas na região pré-core e promotor do core que podem afetar a expressão do HBeAg nos isolados Aa (Ahn et al. 2003, Kimbi et al. 2004, Sugauchi et al. 2004, Tanaka et al. 2004). Assim, mais estudos são necessários para caracterizar possíveis mutações nessas regiões nos isolados Aa do HBV da comunidade Kalunga que apresentam o fenótipo anti-HBe.

O genótipo E circula predominantemente no Oeste da África e parece ser restrito a esse continente. Um estudo conduzido por Mulders et al. (2004) sugere que o genótipo E tem um curto período de evolução histórica em humanos, o que pode explicar a sua ausência no Brasil, apesar do tráfico de escravos só ter sido extinto em nosso País em 1857. Esse genótipo não foi encontrado na comunidade Kalunga, bem como nas comunidades afro-descendentes de Mato Grosso do Sul (Motta-Castro et al. 2005). Por outro lado, o genótipo E foi reportado pela primeira vez na Argentina em um estudo recente realizado com pacientes afro-descendentes (Mathet et al. 2006). Esse dado sustenta a necessidade de realização de outros estudos moleculares na América do Sul, principalmente nas demais comunidades afro-descendentes no Brasil.

O emprego da biologia molecular e o aperfeiçoamento de algumas técnicas quanto a sensibilidade tornaram possível esclarecer muitos aspectos virológicos da infecção pelo HBV, inclusive contribuíram para demonstrar a ocorrência de infecção oculta pelo vírus da hepatite B, situação onde o DNA deste vírus pode ser encontrado no tecido hepático e/ou no sangue de indivíduos HBsAg negativos (Silva et al. 2005a, Raimondo et al. 2007). Nesta investigação, uma taxa de infecção oculta de 1,7% foi encontrada, sendo o HBV DNA detectado em cinco amostras anti-HBc e anti-HBs reagentes. Esta prevalência está de acordo com os índices encontrados em doadores de sangue no Brasil (0 a 4%) (Almeida Neto et al. 2001, Arraes et al. 2003, Gonçales Jr. et al. 2003, Silva et al. 2005a), bem como de outros países, onde as taxas de infecção oculta são consideradas baixas (0 - 7,7%), como Alemanha (Henning et al. 2002, Jilg et al. 2001), Estados Unidos (Kleinman et al. 2003) e Venezuela (Gutiérrez et al. 1999). Além disso, a prevalência observada na comunidade Kalunga está dentro da faixa reportada para amostras reagentes aos marcadores anti-HBc e anti-HBs (0,5% a 15%) (Liu et al. 2006a). As características de risco relatadas pelos indivíduos que apresentaram infecção oculta pelo HBV como história de hepatite na família e/ou múltiplos parceiros sexuais reforçam os dados da análise filogenética, que sugeriram a ocorrência da transmissão intrafamiliar na comunidade Kalunga, bem como os encontrados na análise dos fatores de risco, ao mostrar relato de múltiplos parceiros sexuais como uma variável independentemente associada a infecção pelo HBV na população estudada.

Diante dos resultados encontrados neste estudo, pode-se inferir que os fatores de risco, bem como outros dados epidemiológicos associados a análise filogenética, apontam a importante participação da transmissão horizontal (sexual e intrafamiliar) do vírus da hepatite B na comunidade Kalunga. Além disso, considerando o grande contingente de indivíduos susceptíveis a esta infecção, faz- se necessária a implementação de medidas que reforcem a educação em saúde, bem como a ampliação das estratégias de vacinação na população estudada. 6. CONCLUSÕES

♦ A prevalência global da infecção pelo HBV de 35,4% foi superior ao encontrado em comunidades quilombolas em Mato Grosso do Sul, indicando uma endemicidade moderada para hepatite B nessas comunidades; ♦ Após análise multivariada, fatores como aumento da idade, analfabetismo e relato de múltiplos parceiros sexuais permaneceram associados à infecção pelo HBV na comunidade Kalunga, o que corrobora os dados encontrados em outras comunidades quilombolas no Brasil Central; ♦ O DNA viral foi detectado, como esperado, na maioria das amostras HBsAg (75%; 12/16) e HBeAg (100%; 2/2) reagentes. Outrossim, em 83% (10/12) das amostras anti-HBe positivas, sugerindo a presença de mutações na região pré-core e promotor do core, que afetam a expressão do HBeAg, o que justifica o perfil anti-HBe associado ao DNA HBV; ♦ O índice de 1,7% para infecção oculta nos indivíduos anti-HBc reagentes está dentro da variação encontrada em outros estudos no Brasil, o que retrata o estado de portador do HBV mesmo na ausência do marcador HBsAg e, consequentemente a possibilidade de transmissão viral; ♦ O genótipo A (padrão AI) foi o único encontrado em todas as amostras genotipadas por RFLP, sendo a presença deste, confirmada pelo sequenciamento (subgenótipo Aa), sugerindo que o mesmo foi introduzido no Brasil durante o tráfico de escravos da África; ♦ Este estudo contém informações importantes sobre a prevalência para todos os marcadores do HBV, que refletem o índice de indivíduos infectados, imunes e susceptíveis à hepatite B, bem como os fatores de risco para essa infecção na comunidade Kalunga. Além disso, fornece dados moleculares que permitem inferir a procedência africana para os isolados do HBV na população estudada. Estes resulltados poderão subsidiar a reestruturação das medidas de controle e prevenção da hepatite B na comunidade Kalunga. 7. REFERÊNCIAS

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Viral features of lamivudine resistant hepatitis B genotypes A and D. Hepatology 39:42-50. Zoulim F 2006. Antiviral therapy of chronic hepatitis B. Antiviral Res 71:206-215. ANEXO:

ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO E MOLECULAR DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE B EM AFRO-DESCENDENTES DE COMUNIDADE ISOLADA DO ESTADO DE GOIÁS (KALUNGAS).

Data:___/___/____ Nº______Nome:______Agente de Saúde:______Local______Sexo: Feminino (1) Masculino (2) Idade: Estado Civil: Solteiro (1) Casado (2) Outro (3) Nome do Pai:______Nome da Mãe:______Nome Esposa (o): ______Nº de filhos: ______Filho (s): ______Nºpessoas/Lar:______Profissão:______Grau de Instrução:______Nenhum (1) 1º Grau (2) 2º Grau (3) 3º Grau (4) Renda Familiar: < 1 salário (1) 1 salário (2) 2 a 4 salários (3) 5 salários (4) Teve Icterícia ou hepatite anterior? Não (1) Sim(2) S/inf.(9) Hepatite na família? Não (1) Sim(2) S/inf.(9) Caso afirmativo: Irmão (1) Pai(2) Mãe(3) Esposo(a)(4) Filho (a) (5) Outro (6) Antecendentes de: a) Doença(s):______b) Hospitalização: Não(1) Sim(2) S/inf.(9) Caso afirmativo: Por que?______ano?______c) Cirurgia: Não(1) Sim(2) S/inf.(9) d) Hemotransfusão: Não(1) Sim(2) S/inf.(9) nº Transfusão______Ano da primeira transfusão______e) Parto normal Não(1) Sim(2) S/inf.(9) Parteira? Não(1) Sim(2) S/inf.(9) f) Contato com sangue de outra pessoa? Não (1) Sim (2) S/inf.(9) g) Compartilhamento de objetos pessoais? Não (1) Sim(2) S/inf.(9) Qual? Lâmina/navalha (1) Escova (2) Outros (3) qual?______h) Tratamento dentário: Não (1) Sim (2) S/inf. (9)

Nº de parceiros: ______DST: ______

Vacina contra Hepatite B: Sim (1) Não (2) S/inf. (9) Caso afirmativo: Nº doses______

Resultados: HBsAg: SNR (1) Reagente (2) Anti-HBc Total: SNR (1) Reagente (2) Anti-HBs: SNR (1) Reagente (2) HBeAg: SNR (1) Reagente (2) Anti-HBe: SNR (1) Reagente (2) DNA-HBV: Negativo (1) Positivo (2) Genótipo:_____ RFLP( ) Sequenciamento ( ) Observações:______

Artigo (no prelo)

Matos MAD, Reis NRS, Kozlowski AG, Teles SA, Motta-Castro ARC, Mello FCA, Gomes SA, Martins RMB. Epidemiological Study of Hepatitis A, B and C in the Largest Afro-Brazilian Isolated Community.Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene (2008) 102. Epidemiological Study of Hepatitis A, B and C in the Largest Afro-Brazilian Isolated Community

Running title: Hepatitis A, B and C in Afro-Brazilian

Márcia A. D. Matos a, Nádia Rúbia S. Reis a, Aline G. Kozlowski a, Sheila A. Teles b, Ana Rita C. Motta-Castro c, Francisco C.A. Mello d, Selma A. Gomes d, Regina M.B. Martins a,* a Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás (UFG), Caixa Postal 131, CEP 74605-050, Goiânia, Goiás, Brazil b Faculdade de Enfermagem, UFG, Goiânia, Goiás, Brazil c Departamento de Farmácia Bioquímica, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil d Departamento de Virologia, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil

______*Corresponding author. Phone: +5562-32096129 Fax: +5562-35211839 E-mail address: rbringel@ terra.com.br (R.M.B. Martins)

Summary

This study was conducted to estimate the prevalence and molecular epidemiological features

of viral hepatitis A, B and C in the Kalunga population, which represents the largest Afro-

Brazilian isolated community. Among 878 individuals studied, the overall prevalence of

anti-HAV was 80.9%, with a significant rise from 44.8% to near 100% between the first and

fourth decade of life. Rates for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibody to hepatitis

B core antigen (anti-HBc) of 1.8% and 35.4%, respectively, were found. Increasing age, male

gender, illiteracy and history of multiple sexual partners were associated with hepatitis B

virus (HBV) infection. An occult HBV infection rate of 1.7% (5/295) was found among anti-

HBc-positive individuals. HBV genotype A (subtype Aa) was dominant in this community.

Only 5/878 individuals (0.6%) were positive for anti-hepatitis C virus (HCV). HCV RNA was

detected in three of them, who were infected with genotype 1 (subtype 1a). These findings

point out high, intermediate and low endemicity for hepatitis A, B and C, respectively, in the

Kalunga community in Brazil. Circulation of HBV genotype A (subtype Aa) in this Afro-

Brazilian isolated community indicates the introduction of this virus during the slave trade

from Africa to Brazil.

KEYWORDS Hepatitis A virus; Hepatitis B virus; Hepatitis C virus; Afro-Brazilian; Prevalence; Genotypes

1. Introduction

Viral hepatitis A, B and C occur throughout the world. However, there are marked

geographical differences with regard to the epidemiological patterns and health impact of the

respective infections (Lavanchy, 2002). The endemicity of hepatitis A virus (HAV) infection

varies between developed and developing countries (Jacobsen and Koopman, 2004). In

Brazil, although hepatitis A is considered an endemic infection, some studies have shown a

shift from high to intermediate endemicity in HAV infection epidemiological pattern,

especially in south and southeast regions. Furthermore, within this country seroprevalence

rates may vary by age, socioeconomic status, urbanisation level and access to clean water as

sanitation facilities (Vitral et al., 2006).

Despite of a highly effective vaccine, hepatitis B virus (HBV) infection is still a

significant health concern in the world. In Western countries, HBV infection is acquired

primarily in adulthood, whereas it occurs perinatally or in childhood in Africa and Asia where

chronic hepatitis B is common (Lavanchy, 2004). Current HBV infection is commonly

diagnosed by the presence of hepatitis B surface antigen (HBsAg). However, HBV DNA has

been detected in blood or liver of HBsAg-negative individuals. This condition is called occult

HBV (Chemin and Trépo, 2005). HBV has been classified into eight genotypes (A to H),

which have a characteristic geographical distribution (Allain, 2006). In Brazil, the prevalence

of HBV infection is heterogeneous, with the highest rates in Western Amazon region

(Martelli et al., 1999; Viana et al., 2005). Genotypes A, D and F predominate in this country, whilst genotypes B and C have been detected at a very low prevalence (Araujo et al., 2004;

Sitnik et al., 2004; Viana et al., 2005). Similarly, hepatitis C virus (HCV) infection prevalence and genotypes (1-6) have distinct geographical distributions (Prati, 2006; Simmonds et al.,

2005). In Brazil, anti-HCV prevalence in blood donors varied from 0.3% in Santa Catarina state, South region, to 5.9% in Amazon region (da Fonseca and Brasil, 2004; Rosini et al.,

2003). In the five Brazilian geographical regions, genotype 1 has been the most frequently detected (Campiotto et al., 2005).

The Brazilian population is descendant mainly from European colonisers, Africans, and Amerindians. African individuals were introduced to Brazil by slave trade. Some of them escaped from gold mines or farms, settling in remote valleys. These runaway-slave descendants stayed in culturally and isolated communities, called quilombos, without significant additional admixture since their establishment. Nowadays, there are 1137 communities whose history and tradition allows them to be identified as remnants of quilombos. The Kalunga community, which is located in Central Brazil, is considered the largest Afro-Brazilian isolated community. The epidemiological status of HAV, HBV and

HCV infections of this community remains unknown. The objective of this study was to evaluate the prevalence and epidemiological features of the viral hepatitis A, B and C among the Kalunga population in Brazil.

2. Materials and methods

2.1. Study population

The Kalunga community occupies an area of approximately 237000 hectares in the northeast of the State of Goiás, Central Brazil, and is located near the cities of Cavalcante,

Monte Alegre and Teresina de Goiás, with an estimated population of 3000 individuals. The

Kalungas live in very poor conditions in remote settlements in the mountains on both sides of the Paraná River, on slopes and in valleys, called Vãos. All of the area occupied by the

Kalungas was officially recognised by the state government in 1991 as an Historical Site and the Kalungas are preserved as Patrimônio Cultural Kalunga. Figure 1 shows the geographical location of this community.

In a pilot study, rates of 80%, 30%, and 0.5% were found for HAV, HBV, and HCV infections, respectively. In this study, to evaluate the prevalence for these infections, the studied sample was estimated according to the size of population (3000 inhabitants) and on the basis of an expected HCV prevalence of 0.5%. In accordance with these data, the minimum sample size necessary would be 855 individuals. Thus, the present study included

878 randomly selected individuals living in the Kalunga community. Informed consent was obtained from all participants (or their parents for children). Between May and July 2004, participants were interviewed regarding demographic characteristics, HBV vaccination and risk factors known to be associated with hepatitis transmission. Blood samples were collected from all individuals and sera were stored at -20ºC.

The population ranged in age from <1 to 88 years (average 28.3 years). There were

528 females and 350 males. The majority of these individuals had low socioeconomic (95% reported income ≤ one Brazilian minimum wage/month, approximately US$ 165) and education levels (34% were illiterate, 61% had < 8 years and 5% had >8 years of schooling), poor hygiene and crowded conditions. Also, the majority of them lived basically on subsistence agriculture or cattle-raising, and their houses had no sewage system and tap water service.

2.2. Serological tests

All serum samples were tested by ELISA for the presence of anti-HAV antibodies

(total anti-HAV), HBsAg, antibody to hepatitis B core antigen (anti-HBc), antibody to hepatitis B surface antigen (anti-HBs) and hepatitis C antibody (anti-HCV). Total anti-HAV- positive samples were submitted to IgM anti-HAV detection (Hepanostika Uni-form Organon

Teknika B.V., Boxtel, The Netherlands). Anti-HCV-positive samples were re-tested for confirmation using a line immunoassay (INNO-LIATM HCV Ab III; Innogenetics, Ghent,

Belgium).

2.3. Detection of viral nucleic acid and genotyping

2.3.1 HAV RNA - As none of the study participants showed serological evidence of acute or recent of hepatitis A infection, testing for HAV RNA was not performed.

2.3.2 HBV DNA – HbsAg-and anti-HBc-positive samples were submitted to DNA extraction using phenol/chloroform following treatment of 250 µl of serum with 0.5 mg/ml of Proteinase

K in the presence of 0.2 M NaCl and 0.25% sodium dodecyl sulphate, for 4 h at 37ºC (Niel et al., 1994). After precipitation with ethanol, the pellet was dried and re-suspended in 30 µl of distilled water. A previously developed genotyping method (Araujo et al., 2004), based on

PCR amplification of the preS/S region and subsequent RFLP analysis, was used with some modifications (Motta-Castro et al., 2005). Briefly, the first round of PCR was performed with

1 µl of DNA in a final volume of 50 µL using a mixture of one sense primer (PS1:

5’-CCATATTCTTGGGAACAAGA-3’, nucleotide positions 2826-2845) and two antisense primers (S2 5’-GGGTTTAAATGTATACCCAAAGA-3’, 819-841; and S22:

5’-GTATTTAAATGGATACCCACAGA-3’, 819-841). The second round of amplification was performed with 1µL of the first round PCR product, with sense primer PS1 and antisense primer SR (5’-CGAACCACTGAACAAATGGC-3’, 685-704), generating a fragment of about 1099 bp in length. Ten microliters of PCR products were digested separately with

BamHI, EcoRI and StuI restriction endonucleases. Digestion products were analysed in 2% agarose gel electrophoresis.

HBV DNA-positive samples by PCR-RFLP genotyping were further submitted to amplification of the entire preS/S region using a semi-nested PCR assay. This region was first amplified with external primers P01 (5’ – GGA CTC ATA AGG TGG GGA A-3’, sense,

2470-2488) and S2/S22. The second round was performed using sense primer PS1 and antisense primers S2/S22. The HBV DNA amplification for the sequencing procedure included the following steps for the first and second round: initial denaturation of samples at

94°C for 3 min, followed by 30 cycles each of denaturation at 95°C for 30s, annealing at 52°C for 40s and extension at 72°C for 2 min. The final extension was at 72°C for 7 min. PCR products (50 ul) were loaded onto 2% agarose gel. DNA bands were extracted from the agarose gel and purified using the Kit WizardR SV Gel and PCR Clean-up System (Promega,

Madison, WI, USA). Nucleotide sequences of preS/S region were determined by direct nucleotide sequencing reaction in both directions using BigDyeR Terminator Kit (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA) with specific internal HBV primers PS1, S4 (5’-TGC

TGC TAT GCC TCA TCT TCT-3’, sense, 416 – 436), PS2 (5’-GGT CCC CAG TCC TCG

AGA AG-3’, antisense, 143-124) and S2, as well as (when necessary) the primers PS4

(5’-ACA CTC ATC CTC AGG CCA TGC AGT G-3’, sense, 3194-3218), S2, S4, and S7 (5

´-TGA GCC AGG AGA AAC GGG CT-3´, antisense, 676 – 656). Sequencing reactions were performed on an ABI 373 automated sequencer (Applied Biosystems). Bioinformatic analysis of the sequences was performed using the University of Wisconsin Genetic Computer Group package. A Neighbour-joining phylogenetic tree was drawn and rearranged using the Mega program version 3 (Kumar et al., 2004).

2.3.3 HCV RNA – All ELISA anti-HCV positive samples were submitted to RNA extraction, reverse transcription and a nested PCR with primers complementary to the conserved area of the 5’ NC region of HCV, essentially as described by Ginabreda et al. (1997). HCV genotyping was determined in all HCV RNA-positive samples. A line probe assay (Inno-

LiPA HCV II; Innogenetics) was used to determine the genotype in the amplicons of the 5’

NC region according to the procedure described by the manufacturer. In HBV DNA and HCV RNA detection, to avoid cross-contamination between samples standard precautions were used in all manipulations. Separate areas were used for reagents, samples and manipulation of amplified products.

2.4. Statistical analysis

The χ2 test and χ2 for trend were undertaken to evaluate risk factors associated with

HBV infection (defined as anti-HBc positivity). Statistical significance was assessed at

P=0.05 in all analyses. Risk factors, first estimated by odds ratio in univariate analysis, were subsequently analysed by multiple logistic regression to identify possible confounders.

Statistical evaluations were performed using EpiInfo (CDC, Atlanta, GA, USA).

3. Results

An overall anti-HAV prevalence of 80.9% (95% CI 78.1 - 83.4%) was found among the Kalunga population. Figure 2 shows the prevalence of anti-HAV in different age groups.

There was a significant association for increasing anti-HAV positivity with increasing age, rising from 44.8% in the 0-10 years age group to 83.4% among the 11-20 year-old Kalungas, reaching near 100% in those >30 years (χ2 = 224.9; P < 0.001).

Of the 878 individuals, 16 (1.8%) were positive for HBsAg and anti-HBc, 19 (2.2%) were anti-HBc-positive only and 276 (31.4%) had anti-HBs and anti-HBc markers, resulting in an overall anti-HBc prevalence of 35.4% (95% CI 32.3-38.7%). Isolated anti-HBs was detected in 301 persons (34.3%) who reported vaccination. The prevalence of anti-HBc in different age groups is shown in Figure 3. There was a significant association for increasing anti-HBc positivity with increasing age, which revealed that 7.4% of the 0-10-year-old

Kalungas were infected by HBV. This rate increased to 16.6% among those 11-20 years old, with further rises to 38.9% and 49.6% among 21-30 year-old and 31-40-year-old groups, respectively. The seroprevalence reached 62.2% in the 41-50-year-old group and was 64.6% among those >50 years (χ2 = 5.9; P = 0.01). On the other hand, a decrease was observed for anti-HBs positivity with increase age (Figure 3). Among the 0-10 year-old and 11-20-year-old groups, 76.4% and 65.1% had anti-HBs and reported hepatitis B vaccination, decreasing to

10.3%, 4.6% and 1% in the other age groups, respectively.

Analysis of all risk factors studied showed that age, illiteracy, history of multiple sexual partners and delivery with traditional birth attendants were significantly associated with HBV positivity by univariate analysis. However, multivariate analysis revealed that male gender, increasing age, illiteracy and history of multiple sexual partners were independently associated with HBV infection in this population (Table 1).

HBV DNA was detected in 12/16 (75%) HBsAg-positive serum samples. Of these, 11

(91.6 %) HBV DNA-positive samples were successful genotyped by RFLP. All belonged to genotype A (AI RFLP pattern). Nucleotide sequencing of the preS/S region was successful performed in 9 of the 11 isolates previously genotyped by PCR-RFLP. Phylogenetic analysis was performed, including the 9 HBV sequences determined in this study and 25 additional sequences available from GenBank. Figure 4 shows a phylogenetic tree which confirmed that nine Kalungas isolates belonged to genotype A, subtype Aa. Among them, two subclusters were observed: the first was constituted by two HBV isolates (K-407 and K-397) from members of the same family and the other by three isolates (K-753, K-752 and K-812) from members of another family.

All only anti-HBc positive samples were HBV DNA-negative. Five anti-HBs-and anti-

HBc-positive samples were HBV DNA-positive (genotype A, AI RFLP pattern), resulting in an occult HBV infection rate of 1.7% (5/295) among anti-HBc-positive individuals.

With respect to HCV infection, only 5/878 (0.6%, 95% CI 0.2-1.4%) were anti-HCV- positive. These individuals ranged in age from 12 years to 74 years. Three were males and two females. HCV RNA was detected in three of them, who were infected with genotype 1, subtype 1a. 4. Discussion The present study is the first report on the epidemiology of HAV, HBV and HCV infections in the largest Afro-Brazilian isolated community, which constitutes a useful approach to evaluate future improvements in health and sanitation standards. The anti-HAV prevalence found in the Kalunga community was similar to that obtained in urban and rural isolated Afro-descendant communities in the State of Mato Grosso do Sul, Central Brazil

(75.6%) (Kozlowski et al., 2007). In these populations, low income, low educational level, crowding and lack of access to safe drinking water and sanitation facilities are associated with increased HAV seroprevalence. Also, the age-specific anti-HAV prevalence profile found in the Kalunga community (Figure 2) was similar to the pattern observed in areas with high endemicity (Jacobsen and Koopman, 2004). Thus, improvements in education and sanitary conditions in this community are a priority to change this pattern as well as to prevent other enterically transmitted infections.

The proportions of anti-HBc and HBsAg markers in this Afro-Brazilian isolated community were lower than those observed in Africa (56-98% and 5% to ≥ 20%, respectively) (Custer et al., 2004; Kew, 1996; Kiire, 1996; Mulders et al., 2004), but higher compared with rates found in local blood donors (10.7% and 0.8%, respectively) (Martelli et al., 1999). With reference to other Afro-Brazilian isolated communities, although a similar

HBsAg prevalence (2.2%) was reported by Motta-Castro et al. (2005) in the State of Mato

Grosso do Sul, Central Brazil, a lower anti-HBc prevalence (19.8%) was shown in those communities of African origin.

The age-specific anti-HBc prevalence profile showed that 7.4% of the children under

10 years were exposed to HBV. Many studies have demonstrated that maternal transmission during the perinatal or early childhood period as well as horizontal transmission that occurs as a consequence of close contact between family members are important routes of HBV spread, especially in communities with poor hygiene conditions and low socio-economic and education levels (Dumpis et al., 2001; Kew, 1996; Silveira et al., 1999; Stuver et al., 1997).

Intrafamilial transmission of HBV was also indicated in the Kalunga community by phylogenetic tree analysis, in which two subclusters were observed. The first was constituted by HBV isolates (K-407 and K-397) from two brothers (aged 35 and 37 years) whose father was anti-HBc positive, whilst the other (K-752, K-753 and K-812) was from three sisters

(aged 8, 10 and 13 years, respectively) whose mother was anti-HBc positive. Additionally, in this community delivery with traditional birth attendants is also an important route of horizontal transmission during the perinatal period, as suggested by univariate analysis of risk factors. It is most likely that this procedure occurred in poor hygienic conditions, with sharing of ancillary supply equipment such as scissors between infected and non-infected individuals.

The anti-HBc prevalence increased with age, suggesting that sexual activity may contribute to horizontal spread of this infection among adults in the Kalunga community. In fact, history of multiple sexual partners was significantly associated with HBV infection.

Male gender also seemed to play an important role in the acquisition of HBV infection. These findings are in accordance with other Brazilian studies (Lewis-Ximenez et al., 2002; Silveira et al., 1999).

Although only HBV isolates of genotype A were detected in the studied population, other genotypes (B, C, D and F) circulate in Brazil (Araújo et al., 2004; Sitnik et al., 2004;

Viana et al., 2005). Genotype A has been shown to be prevalent in certain parts of Africa

(Bowyer et al., 1997; Kimbi et al., 2004; Mulders et al., 2004). Of note, only this genotype was found in other Afro-Brazilian isolates communities (Motta-Castro et al., 2005) and was also detected in Afro-Venezuelan groups at a frequency higher than in the general population of Venezuela, where genotype F is dominant (Quintero et al., 2002). In this study, all HBV isolates showed the same RFLP pattern (AI), which was identified previously as subgroup A’ (Araújo et al., 2004) or subtype Aa (‘a’ standing for Africa/Asia) (Sugauchi et al., 2004).

Additionally, phylogenetic analysis of the preS/S region confirmed the presence of genotype

A, subtype Aa in the largest Afro-Brazilian isolated community, which may be result of the displacement of African population during the slave trade that occurred from the 16th to 19th centuries.

The present study provides the first data on the prevalence of occult HBV infection in a community-based population in Brazil. Although no similar reports are available for comparative purposes, the proportion found among the anti-HBc-positive individuals in the

Kalunga community was within the range of occult HBV infection rates reported among anti-

HBc-positive blood donors in Brazil (0-4%) (Almeida Neto et al., 2001, Gonçales Jr et al.

2003).

Although Brazil included the hepatitis B vaccine in the childhood immunisation schedule in 1998 and this vaccine has also been recommended and offered free of charge to all individuals under 20 years old since 2001, one-third of this target population in the

Kalunga community did not reported HBV vaccination. This finding emphasises the need for additional health education programmes to improve the HBV vaccination coverage in this target group.

The anti-HCV prevalence found in this study was lower than that observed previously in local blood donors (1.4%) (Martins et al., 1994), but comparable with those reported in other Brazilian rural populations (0-1.7%) (Ferrari et al., 1999; Silva et al., 1995). These data show that HCV infection has a low endemicity in rural populations in Brazil.

In conclusion, our findings point out high, intermediate and low endemicity for hepatitis A, B and C, respectively in the Kalunga community in Brazil. This investigation also demonstrates the circulation of HBV genotype A, subtype Aa, indicating a common introduction of this virus during the slave trade from Africa to Brazil. However, owing to the large extension of Brazilian territory, further studies in remnants of quilombos from other geographical regions are needed to design appropriate and effective prevention and control strategies for this target population.

Authors’ contributions: SAT, ARCMC and RMBM designed the study protocol; MADM,

NRSR, AGK, SAT, ARCMC and RMBM carried out the interview and blood collection;

MADM, NRSR and AGK carried out the serological tests, detection of viral nucleic acid and genotyping; FCAM and SAG carried out the nucleotide sequencing and phylogenetic analysis; SAT carried out the statistical analysis. MADM and RMBM drafted the manuscript. All authors read and approved the final manuscript. MADM and

RMBM are guarantors of the paper.

Acknowledgments

The authors are grateful to the members of the Kalunga community who agreed to participate in this study, and to the public authorities and health workers of the city of

Cavalcante, State of Goiás, Brazil, for their local support help. We acknowledge Ágabo M.C.

Silva, Laura B. Nascimento, Marcos A. Matos, Michelle D.S. Oliveira, Nara R. Freitas,

Renata C. Ferreira and Viviane R. Tavares for their technical assistance. We are grateful to the sequencing group of the PDTIS program of Fundação Oswaldo Cruz for performing the

DNA sequencing.

Funding: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq, Brazil

(Ref. No. 504628/2003-8). Conflicts of interest: None declared.

Ethical approval: Ethical Committee of the Federal University of Goiás, Goiânia city, Goiás state, Brazil (Ref. No. 64/2003)

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%) ence (

Seroprevel

Age groups (years)

Figure 2 Age-specific seroprevalence rates of hepatitis A virus antibodies among Kalungas in Brazil. HBs) among Figur

e 3 Seroprevalence (%)

Preva

Kalungas lence of a i n Braz ntibod il ies acco to hepat rding it A to a is Bc ge gr ge. ore o ups ant (y igen ( ears) ant i-HBc) and hepa tit is B

sur face ant igen

(an ti- Table 1 Logistic regression model with variables associated with hepatitis B virus infection in the univariate analysis in the Kalunga community, Brazil

Variable Crude Adjusted P-value OR (95%CI) OR (95% CI)

Gendera female 1.0 1.0 male 1.2 (0.9-1.6) 1.4 (1.0-2.0) 0.03

Age (years)a ≤10 1.0 1.0 11-20 2.2 (1.1-4.3) 1.4 (0.7-2.9) 0.35 21-30 6.9 (3.6-13.5) 4.3 (2.1-8.6) 0.00 31-40 10.8 (5.7-20.7) 5.3 (2.6-10.5) 0.00 41-50 19.9 (10.0-40.4) 8.6 (4.1-18.2) 0.00 ≥ 50 18.0 (9.5-34.5) 6.4 (3.0-13.3) 0.00

Illiteracya no 1.0 1.0 yes 4.2 (3.1-5.8) 2.1 (1.4-3.1) 0.00

Multiple sexual partnersa no 1.0 1.0 yes 4.8 (2.4-9.7) 2.4 (1.1-5.7) 0.04

Delivery with traditional birth attendants b no 1.0 1.0 yes 2.4 (1.4-4.2) 1.6 (0.8-3.3) 0.18 OR: odds ratio. a adjusted by gender, age, illiteracy and multiple sexual partners. b adjusted by age, illiteracy and multiple sexual partners.

k-407 k-397 k-272 k-305 k-629 k-753 k-752 k-812 k-187 U55222-Brazil Aa AY934771-Somalia AY344101-Brazil AY344105-Brazil AY233283-South Africa 83 AF297625-South Africa AF090842-Belgium 55 M57663-Philippines AF090838-Belgium AJ309369-France Ae 93 Z35717-Poland A 90 AY233286-South Africa 66 AY344098-Brazil X02763-USA AJ012207-Germany 80 AF297624-South Africa AF090839-Belgium 76 AJ605036-Cameroon G AF160501-France B AF282918-China C V00867-Japan D X65257-Italy E X75664-West Africa F X69798-Brazil 99 H AY090457-Nicaragua

0.03 0.02 0.01 0.00 Figure 4 Phylogenetic tree analysis of the pre-S/S region of 9 hepatitis B virus (HBV) isolates from this study (K=Kalunga), as well as 5 Brazilian HBV isolates and 20 GenBank sequences of genotypes A to H (accession number countries of origin are indicated).