Todos los derechos reservados. La totalidad o una parte de este libro no puede ser reproducida o utilizada en cualquier forma o medio, electrónico o mecánico, incluyendo copias o grabaciones o por cualquier medio de almacenar información y sistema de recuperación, sin el previo permiso por escrito del IRNAS‐CSIC.

© Estefanía Porca Belío Diseño y maquetación: Estefanía Porca Belío. Portada: Fotografía de un espeleotema de la Cueva de Castañar de Ibor (Extremadura). Diseño de Miguel Ángel Rogerio Candelera y Estefanía Porca Belío.

Editado por: Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla, IRNAS‐CSIC, España, Noviembre 2011

I.S.B.N: 978‐84‐695‐0670‐7

Impreso en España‐ Printed in Spain

Aerobiología: mecanismos de dispersión de los

microorganismos en cuevas turísticas.

Memoria que presenta la Licenciada en Biología Dña. ESTEFANÍA PORCA BELÍO para optar al título de Doctor Europeo en Biología por la Universidad de Sevilla.

Sevilla 2011

Memoria que presenta la Licenciada en Biología Dña. ESTEFANÍA PORCA BELÍO para optar al título de Doctor Europeo en Biología por la Universidad de Sevilla.

Aerobiología: mecanismos de dispersión de los

microorganismos en cuevas turísticas.

Visado en Sevilla, a 11 de Noviembre de 2011

LOS DIRECTORES

Prof. Dr. D. CESÁREO SÁIZ JIMÉNEZ Dra. Dña. VALME JURADO Profesor de Investigación en el Instituto de Doctora contratada en el Instituto Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla de Recursos Naturales y Agrobiología (IRNAS‐CSIC) de Sevilla (IRNAS‐CSIC).

LA TUTORA

Dra. Dña. CAROLINA SOUSA MARTÍN Profesora Titular de la Universidad de Sevilla Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia. PROF. DR. D. CESÁREO SÁIZ JIMÉNEZ, PROFESOR DE INVESTIGACIÓN DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (IRNAS‐CSIC) Y DRA. DÑA. VALME JURADO LOBO, DOCTORA CONTRATADA

CERTIFICA: Que la presente Memoria de Investigación titulada ”Aerobiología: mecanismos de dispersión de los microorganismos en cuevas turísticas”, presentada por la Lcda. en Biología ESTEFANÍA PORCA BELÍO para optar al grado de Doctor Europeo en Biología, ha sido realizada en el Departamento de Geoecología, Biogeoquímica y Microbiología Ambiental (IRNAS‐CSIC), bajo nuestra dirección reuniendo todos los requisitos exigidos.

Y para que así conste, se expide y firma el presente certificado.

En Sevilla, a 11 de Noviembre de 2011

Fdo.: Prof. Dr. D. Cesáreo Sáiz Jiménez Fdo.: Dra. Dña. Valme Jurado Lobo

DR. D. JOSÉ MANUEL PARDO PRIETO DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (IRNAS‐CSIC)

CERTIFICA: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Aerobiología: mecanismos de dispersión de los microorganismos en cuevas turísticas”, presentada por la Lcda. en Biología ESTEFANÍA PORCA BELÍO para optar al grado de Doctor Europeo en Biología, ha sido realizada en el Departamento de Geoecología, Biogeoquímica y Microbiología Ambiental (IRNAS‐CSIC), bajo la dirección del Prof. Dr. D. CESÁREO SÁIZ JIMÉNEZ y la Dra. Dña. VALME JURADO LOBO, reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales.

Y para que así conste, se expide y firma el presente certificado.

En Sevilla, a 11 de Noviembre de 2011

Fdo.: Dr. D. José Manuel Pardo Prieto Agradezco...

Al Prof. Dr. Sáiz Jiménez y a la Dra. Jurado por todo lo que me han enseñado durante estos cuatro años, y el esfuerzo y dedicación que ellos también han puesto en esta tesis.

A todos los compañeros del grupo del Dr. D. Cesáreo Sáiz, pero muy, muy especialmente a Valme e Isabel, os llevaré siempre en mi corazón.

A las supervisoras de los grupos donde he ido de estancia, por el tiempo que me han dedicado y todo lo que me han enseñado, la Dra. Rebekka Artz (The Macaulay Land Use Research Institute, Escocia), Dra. Alena Nováková (Institute of Soil Biology, Repúbica Checa), Dra. Fabiola Bastián (INRA/ Université de Bourgone, Francia) y la Dra. Pašić (University of Ljubljana, Eslovenia).

Al Dr. D. José Díaz (Universidade da Coruña) que fue el primero que creyó en mí y me dio la oportunidad de empezar y descubrir este apasionante mundo de la investigación.

A Aitana, Andrea, Marta, Miriam, Julia, etc. por su cariño y apoyo en todo momento.

Muy especialmente agradecer a mi familia su apoyo y comprensión incondicional, sin olvidarme de mi abuelo Antonio.

A la beca predoctoral de la Junta de Ampliación de Estudios (JAE) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) gracias a la cual ha sido posible realizar esta tesis.

La financiación proporcionada por los siguientes proyectos de investigación:

 Investigación en Tecnologías para la conservación y valorización del Patrimonio Cultural (TCP) (CSD2007‐00058). Ministerio de Ciencia e Innovación.

 Écologie Microbienne de la Grotte de Lascaux. Ministerio de Cultura y de la Comunicación de Francia.

 Observatorio microbiológico de cuevas visitables: evaluación y control de comunidades fúngicas en cuevas sometidas al impacto de actividades turísticas (RNM‐5137). Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa (Junta de Andalucía).

A todo el personal de las cuevas estudias, Castañar de Ibor, Altamira, Ardales y Lascaux por la disposición y facilidades prestadas a la hora de realizar los muestreos.

Parte de los resultados obtenidos han sido incluidos en dos informes científicos sobre la cueva de Altamira y la de Lascaux presentados a los Ministerios de Cultura Español y Francés.

Además se han obtenido las siguientes publicaciones científicas relacionadas con este trabajo:

 Saiz‐Jimenez, C., Cuezva, S., Jurado, V., Fernández‐Cortés, A., Porca, E., Benavente, D., Cañaveras, J.C. y Sánchez‐Moral, S. (2011). Paleolithic Art in Peril: Policity and Science Collide at Altamira Cave. Science 334: 42‐43.

 Martín‐Sánchez, P.M., Bastián, F., Nováková, A., Porca, E., Jurado, V., Sánchez‐Cortés, S., López‐ Tobar, E., García‐ Sánchez, A., Ariza, C., Hernández‐Mariné, M., Alabouvette, C. y Saiz‐Jimenez, C. (2011). Écologie Microbienne de la Grotte de Lascaux. IRNAS‐CSIC, Spain. I.S.B.N. 978‐84‐694‐7852‐3.

 Fernández‐Cortés, A., Cuezva, S., Sánchez‐Moral, S., Porca, E., Jurado, V., Martín‐Sánchez, P.M. y Saiz‐Jimenez, C. (2011). Detection of human‐induced environmental disturbance in a subterranean environment: microclimatic and aerobiological monitoring. Environmental Science and Pollution Research 18: 1037‐1045.

 Porca, E., Jurado, V., Martín‐Sánchez, P.M., Hermosin, B., Bastián, F., Alabouvette, C. y Saiz‐Jimenez, C. (2011). Aerobiology: an ecological indicator for early detection and control of fungal outbreaks in caves. Ecological Indicators 11: 1594‐1598

 Jurado, V., Porca, E., Cuezva, S., Fernández‐Cortés, A., Sánchez‐Moral, S. y Saiz‐Jimenez, C. (2010). Fungal outbreak in a show cave. Science of the Total Environment 408: 3632‐ 3638.

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Capítulo 1: Introducción

1.1‐ CUEVAS………………………………………………………………………………………… 1

1.2‐ DIVERSIDAD MICROBIANA EN CUEVAS………………………………………… 12

1.3‐ AEROBIOLOGÍA…………………………………………………………………………….. 22

Capítulo 2: Antecedentes y Objetivos

2.1‐ ANTECEDENTES……………………………………………………………………………. 33

2.2‐ OBJETIVOS……………………………………………………………………………………. 38

Capítulo 3: Descripción de las Cuevas Estudiadas

3.1‐ CUEVA DE CASTAÑAR DE IBOR (EXTREMADURA)………………………….. 41

3.2‐ CUEVA DE ARDALES (ANDALUCÍA)………………………………………………… 49

3.3‐ CUEVA DE ALTAMIRA (CANTABRIA)……………………………………………… 58

3.4‐ CUEVA DE LASCAUX (FRANCIA)…………………………………………………….. 71

Capítulo 4: Material y Métodos

4.1‐ MUESTREO Y ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS……………………………………. 83 4.1.1‐ DUO SAS SUPER 360……………………………………………………………. 84 4.1.2‐ CORIOLIS μ…………………………………………………………………………… 95

4.2‐ LOCALIZACIÓN DE LAS MUESTRAS………………………………………………… 101 4.2.1‐ CUEVA DE CASTAÑAR DE IBOR (EXTREMADURA)…………………. 102 4.2.2‐ CUEVA DE ARDALES (ANDALUCÍA)……………………………………….. 104 4.2.3‐ CUEVA DE ALTAMIRA (CANTABRIA)……………………………………… 105 4.2.4‐ CUEVA DE LASCAUX (FRANCIA)……………………………………………. 107

4.3‐ MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES…………………………………………….. 108 4.3.1‐ MEDIOS DE CULTIVO……………………………………………………………. 108 4.3.2‐ SOLUCIONES………………………………………………………………………… 109

Capítulo 5: Resultados y Discusión

5.1‐ CUEVA DE CASTAÑAR DE IBOR (EXTREMADURA)………………………….. 114

5.1.1 Muestreador DUO SAS SUPER 360………………………………………… 114 5.1.1.1‐ DIVERSIDAD DE HONGOS……………………………………………. 114 5.1.1.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS…………………………………………. 121 5.1.2 Muestreador Coriolis μ…………………………………………………………. 128 5.1.2.1‐ DIVERSIDAD DE HONGOS……………………………………………. 128 5.1.2.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS…………………………………………. 133

5.2‐ CUEVA DE ARDALES (ANDALUCÍA)………………………………………………… 140

5.2.1 Muestreador DUO SAS SUPER 360………………………………………… 140 5.2.1.1‐ DIVERSIDAD DE HONGOS……………………………………………. 140 5.2.1.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS…………………………………………. 145

5.3‐ CUEVA DE ALTAMIRA Y ESTALACTITAS 154 (CANTABRIA)………………………………………………………………………………………..

5.3.1 Muestreador DUO SAS SUPER 360………………………………………… 154 5.3.1.1‐ DIVERSIDAD DE HONGOS……………………………………………. 154 5.3.1.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS…………………………………………. 159 5.3.2 Muestreador Coriolis μ…………………………………………………………. 165 5.3.2.1‐ DIVERSIDAD DE HONGOS……………………………………………. 165 5.3.2.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS…………………………………………. 169

5.4‐ CUEVA DE LASCAUX (FRANCIA)…………………………………………………….. 176

5.4.1 Muestreador DUO SAS SUPER 360………………………………………… 176 5.4.1.1‐ DIVERSIDAD DE HONGOS……………………………………………. 176 5.4.1.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS…………………………………………. 186

5.5‐ VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS DOS MUESTREADORES DE 196 AIRE EMPLEADOS EN ESTA TESIS……………………………………………………

5.6‐ CONSIDERACIONES GENERALES……………………………………………………. 199

Capítulo 6: Conclusiones

6.1‐ CUEVA DE CASTAÑAR DE IBOR (EXTREMADURA)………………………….. 202

6.2‐ CUEVA DE ARDALES (ANDALUCÍA)………………………………………………… 203

6.3‐ CUEVA DE ALTAMIRA (CANTABRIA)………………………………………………. 204

6.4‐ CUEVA DE LASCAUX (FRANCIA)…………………………………………………….. 205

6.5‐ COMPARACIÓN DE LAS CUATRO CUEVAS……………………………………… 206

Chapter 7: Summary and Conclusions………………………………………………… 209

Capítulo 8: Bibliografía……………………………………………………………………………. 219

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1.1.‐ LAS CUEVAS

1.1.1‐ DEFINICIÓN Y TIPOS

Para definir cueva o cavidad existe una amplia variedad de criterios. Ford (1988) y Ford y Williams (1989) definen como cueva, o sistemas de cuevas kársticas, a conductos formados por disolución, de un tamaño mayor a 15 milímetros de diámetro (tamaño mínimo correspondiente a la apertura mínima efectiva para el flujo turbulento), que se extienden, de forma continua, desde unos puntos de entrada de agua subterránea a unos puntos de salida. Cuando son menores de 5 milímetros se habla de protocuevas (Ford y Ewers, 1978) y cuando se trata de conductos menores aislados se utiliza el término de huecos. White (1984) define cavidad como “una oquedad

1 en la roca que actúa como conducto para el flujo de agua, ocasionalmente continuo, entre puntos de entrada como las simas o diversos conductos preferenciales de infiltración y puntos de salida como manantiales o goteos”. Gillieson (1996) aporta una definición más antropocéntrica definiendo la cavidad como un “hueco natural en el terreno al que puede acceder una persona”, lo cual implica unas dimensiones mínimas de 0,3 metros de diámetro.

Son muy numerosos y variados los sistemas de clasificación de las cavidades: considerando una cavidad individualmente en función de sus génesis, geología y tamaño (Bögli, 1980), en función además de su relación con su entorno (Worboys y col., 1982), e incluso desde el punto de vista de su protección y gestión ambiental (Gillieson, 1996).

Heaton (1986) establece tres categorías para las cavidades kársticas según los niveles de intercambio de energía con el exterior: de alta energía, de energía moderada y de baja energía. Además los niveles de energía varían en un espectro infinito, y en una única cueva puede tener diferentes zonas con niveles de energía muy distintos.

‐ Cavidades de alta energía En ellas se producen habitualmente eventos caracterizados por su velocidad y alta energía (cauces activos, crecidas estacionales, etc.) que originan cambios ambientales importantes en su interior (erosión, cambios de humedad, de temperatura, cambios de circulación de aire, etc.). Los habituales y enérgicos cambios ambientales mitigan completamente los efectos generados por la presencia de visitas.

2 ‐ Cavidades de energía moderada La presencia de un cauce continuo de agua o una circulación constante de aire hace que las variaciones ambientales dependan de la intensidad de estos factores. La presencia de visitas tiene efectos más duraderos que en las de alta energía, pero su impacto no es mayor que los propios procesos de moderada energía que normalmente se producen.

‐ Cavidades de baja energía En estos ambientes la tasa de intercambio con el exterior es mínima, siendo los goteos de agua los eventos de mayor energía. Los procesos de intercambio de energía corresponden a las variaciones en la velocidad del aire por circulación barométrica o convectiva (estacional, día‐noche, etc.), o bien a variaciones en la intensidad de goteo de la estalactitas. Al introducirnos en cuevas de baja energía lo que hacemos es convertirlas en cavidades de energía moderada. En este último grupo se englobarían las cuevas que son objeto de estudio de esta tesis, la de Castañar de Ibor (Extremadura), Ardales (Andalucía), Altamira (Cantabria) y Lascaux (Francia).

1.1.2‐ CARACTERÍSTICAS

En general, las cuevas son ecosistemas con bajo contenido en nutrientes, estables en las condiciones ambientales, con temperaturas similares a las medias externas anuales y elevada humedad próxima a la saturación. Están colonizadas por una gran variedad de microorganismos (Cunningham y col., 1995; Engel y col., 2004; Barton y Northup, 2007). Las comunidades bióticas que aparecen en las cuevas son poco diversas, con una estructura simple

3 y sensibles a los cambios, como la introducción de materia orgánica proveniente del exterior (Chelius y col., 2009).

Las cuevas son estructuras geológicamente estables, por lo que es posible identificar, medir y modelizar cómo los nutrientes y otras fuentes de energía penetran en ellas. Existen tres rutas principales de entrada de energía y nutrientes en estos ambientes subterráneos, permitiendo el crecimiento de los microorganismos:

- gases atmosféricos (nitrógeno, CO2 y compuestos orgánicos volátiles);

- compuestos aromáticos y poliaromáticos derivados del suelo que llegan al sistema subterráneo por percolación;

- iones metálicos reducidos (Mn2+ y Fe2+) de la propia roca que movilizan los microorganismos. Algunas especies microbianas que aparecen en cuevas son capaces de movilizar fosfato inorgánico, oxidar metano e hidrógeno (Barton y Jurado, 2007).

El suelo actúa como primera membrana o filtro de las oscilaciones externas. Su espesor, composición y textura (porosidad‐ permeabilidad) son fundamentales ya que actúa como zona de captación y transmisión del agua meteórica, y en él tienen lugar numerosos procesos micro y macrobiológicos con generación y consumo de CO2, condicionando, por tanto, la calidad y cantidad de agua que llega al sistema interno (Cuezva y col., 2004).

4 Los espeleotemas, tales como estalactitas y estalagmitas, que aparecen en las cuevas son el resultado de la precipitación de los carbonatos presentes en el agua que circula sobre el suelo que está encima de la cavidad. Este agua se filtra a través de las pequeñas grietas del terreno y se va cargando en CO2, originándose ácido carbónico que reacciona con la roca y disuelve el carbonato cálcico. Cuando este agua cargada de carbonato cálcico entra en contacto con la atmósfera de la cueva, precipita. Algunas de las formaciones minerales están asociadas al desarrollo de bacterias heterotróficas (Barton y Jurado, 2007).

En el interior de las cavidades hay variaciones ambientales de unas zonas a otras en función principalmente de la distancia a la entrada y del espesor de roca suprayacente en cada punto. Las entradas de las cuevas son regiones en las que las variables ambientales están bajo influencia del ambiente externo. Desde un punto de vista ecológico esta zona de transición entre sistemas epigeos e hipogeos constituye el ecotono (zona de transición entre sistemas ecológicos adyacentes; Prous y col., 2004). Proporciona un incremento en la disponibilidad de recursos, al tiempo que resulta una zona en la que pueden coexistir especies de ambos ambientes vecinos (epigeo e hipogeo) con aquellas otras específicas del ecotono mismo, lo que puede llegar a favorecer una mayor diversidad en el área de transición que en los ambientes contiguos (Figura 1).

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Figura 1‐ Modelo gráfico de representación de las diferentes regiones del sistema epigeo‐hipogeo. Fuente: Modificado de Prous y col. (2004).

1.1.3‐ CUEVAS Y TURISMO

España es un país muy rico en cuevas y cuenta con más de treinta mil cavidades conocidas, exploradas y topografiadas. Con objeto de representar y aunar los esfuerzos de las cuevas turísticas nació en 1997 la Asociación de Cuevas Turísticas Españolas (ACTE), que en la actualidad reúne a treinta y cuatro cuevas turísticas repartidas por toda España, incluyendo Baleares y Canarias (Figura 2). Muchas de ellas han sido declaradas Monumentos Naturales y otras pocas declaradas Patrimonio de la Humanidad por la UNESCO (www.cuevasturisticas.es).

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Figura 2‐ Localización de algunas de las cuevas turísticas de España. Fuente: www.cuevasturisticas.es

Algunas cavidades pueden contener pinturas rupestres. El mayor número de cavidades con arte rupestre paleolítico se da en el sudoeste de Europa, con distinguidos ejemplos como las cuevas pintadas del Valle del Vézère (Francia) y la Cueva de Altamira (Cantabria) incluídas en la lista del Patrimonio de la Humanidad de la UNESCO. En el área Cantábrica (Cantabria, Asturias, País Vasco) existen más de cien cuevas con arte rupestre, siendo menos numerosas en Andalucía, donde no obstante existen ejemplos muy relevantes como la Cueva de la Pileta y de Ardales en Málaga, y la Cueva de los Murciélagos en Córdoba (Sánchez‐Moral y col., 2008).

7 1.1.4‐ IMPACTO DE LOS VISITANTES

Las cuevas son ecosistemas naturales cuyo equilibrio se ve afectado por cualquier actividad desarrollada tanto en su zona de influencia exterior como en el interior (Cañaveras y Sánchez‐Moral, 2002). Las condiciones microambientales y su estabilidad pueden verse alteradas por el hombre directamente, por las acciones en el interior de la cueva, e indirectamente, por aquellas realizadas en el área exterior, área de influencia o impluvial.

Las actividades que se desarrollan en el exterior pueden producir cambios en la composición química del agua de infiltración (cambios en el contenido de CO2 o fenómenos de contaminación), cambios en la morfología del karst, disminución de la cobertura rocosa, modificación de la red de drenaje, e incluso problemas de estabilidad (actividad minera en superficie, construcción de infraestructuras, etc.) que repercuten de forma directa sobre las condiciones ambientales en el interior de la cavidad (William, 1995; LaMoreaux y col., 1997) y generan alteraciones importantes en el sistema físico‐ químico del medio kárstico e incluso riesgo de carácter estructural.

En el interior de la cavidad los principales impactos antrópicos provienen de la entrada de visitas turísticas. Por un lado, la adecuación del espacio de la entrada de visitantes desencadena gran variedad de modificaciones morfológicas‐geomorfológicas del karst (creación de caminos, suelos, instalación de iluminación, etc.).

En relación a las condiciones ambientales de una cavidad y su estabilidad, la entrada de personas al interior puede incidir directamente sobre parámetros físicos (variación de temperatura y

8 humedad), químicos (variaciones en la concentración de CO2 en el aire) e incluso biológicos (contaminación y/o propagación microbiológica) (Huppert y col., 1993).

Debido a su propio metabolismo, los visitantes se comportan como fuentes de calor, vapor de agua y dióxido de carbono (junto con el consumo de oxígeno) que se incorpora a la atmósfera interior de la cueva, afectando de forma directa a la física‐química kárstica (Villar y col., 1984; Andrieux, 1988). La cuantificación de estos aportes depende de las características físicas de cada visitante (peso, altura, edad, etc.), del tiempo de permanencia en el interior de la cueva y de las características morfométricas de la misma, especialmente el volumen de la cavidad considerada (Sánchez‐Moral y col., 2008) (Figura 3).

Figura 3‐ Esquema del funcionamiento físico‐biogeoquímico de una cavidad kárstica. Fuente: Sánchez‐Moral y col. (2008).

9 La entrada de personas al interior de una cavidad puede incidir directamente sobre los parámetros biológicos, produciendo modificaciones en el ecosistema natural de la cueva. Además de las modificaciones ambientales que pueden incidir directamente sobre el ecosistema, se ha comprobado que la apertura al público de una cavidad introduce en el ambiente de la misma esporas, bacterias, y materia orgánica, transportados por los turistas mediante la ropa o la piel (Cabrol, 1997).

Todo ello puede afectar al frágil equilibrio dinámico del sistema kárstico, induciendo procesos de deterioro, con impredecibles consecuencias sobre la conservación del patrimonio cultural contenido en las cavidades, más concretamente del arte rupestre. En este sentido, y desde la perspectiva de la protección ambiental y gestión del turismo en cuevas, Cigna (1993) diferencia tres categorías:

- cuevas donde los flujos de energía natural exceden a los creados por los visitantes, con la consecuencia de que sus parámetros ambientales no se ven afectados por el desarrollo turístico;

- cuevas donde los flujos de energía natural y turística son de similar magnitud, donde los parámetros ambientales responden a las visitas pero vuelven a su equilibrio natural después;

- cuevas donde los flujos de las visitas exceden a los flujos naturales, y así el equilibrio ambiental natural puede ser destruido.

10 A lo largo de todos estos estudios, se ha comprobado que la influencia antrópica en el microambiente kárstico ha sido más o menos importante en función del número de visitantes, tiempo de permanencia en el interior de la cueva y dimensiones y dinámica de ésta (Andrieux, 1988; Ford, 1990; Hoyos y col., 1998). Para cada espacio hipogeo es fundamental, por tanto, definir un umbral de equilibrio que permita establecer un régimen de visitas óptimo para favorecer la conservación del patrimonio cultural y/o kárstico (Fortea, 1993; Juberthie, 1995). Para la gestión ambiental en cavidades, en los años setenta fue introducido el concepto de “Capacidad de Carga Turística” (Visitors Carrying Capacity) (Aley, 1976; Van Cleave, 1976; Forssell, 1977). Posteriormente se ha ido desarrollando y redefiniendo como “Capacidad de Visita” (Cigna, 1987, 1993; Andrieux, 1988; Ford, 1990; Huppert y col., 1993; Hoyos y col., 1998; Mangin y col., 1999; Calaforra y col., 2003; Fernández‐ Cortés y col., 2006; etc.). Se define como el número máximo de visitantes aceptable en una unidad de tiempo, que no implique una desestabilización ambiental permanente de la cavidad, reflejada en un parámetro relevante (factor crítico) (Cigna, 1993). Se basa en que las condiciones naturales son óptimas para garantizar la protección y que las fluctuaciones naturales de los factores ambientales determinan los límites admisibles que pueden introducir las visitas con su presencia. Los factores críticos a tener en cuenta, pueden variar significativamente de una cueva a otra y su evaluación es compleja.

El establecimiento de áreas de protección en el sistema kárstico y de un régimen de visitas controlado puede ayudar a la conservación del

11 arte rupestre al mismo tiempo que se hace compatible con el disfrute de estos valores patrimoniales.

1.2‐ DIVERSIDAD MICROBIANA EN CUEVAS

1.2.1‐ MICROORGANISMOS

Los microorganismos constituyen el grupo de organismos más diverso de nuestro planeta dando lugar a comunidades muy dinámicas y con capacidades metabólicas extraordinarias (Brock y col., 2000). Además, los microorganismos también tienen la capacidad de adaptarse rápidamente a nuevas condiciones (Cases y de Lorenzo, 2002). Sin embargo, hoy en día se considera que sólo se conoce un mínimo porcentaje del total de las especies microbianas existentes (Curtis y col., 2002). Esto se atribuye a que una proporción extremadamente baja de microorganismos se puede cultivar empleando medios de cultivo tradicionales (Fry, 1990). Por otro lado, se considera que es prácticamente imposible conocer la totalidad de la diversidad microbiana de una comunidad natural, debido a los límites de los métodos de detección y a la elevada cantidad de microorganismos existentes (Pommier y col., 2005; Curtis y col.,

2002).

Gracias a su enorme diversidad y capacidad de colonización, los microorganismos desempeñan un papel relevante en la mayoría de los procesos biogeoquímicos que tienen lugar en el planeta (Pace, 1997; Whitman y col., 1998). También son fuente de conocimiento de las estrategias y límites de la vida, fuente de nuevos genes y

12 organismos de valor biotecnológico. Asimismo, los microorganismos juegan un papel importante en la conservación y restauración de los ecosistemas y las comunidades microbianas son un excelente modelo de las interacciones biológicas y de la historia evolutiva.

Para conocer el grado de parentesco de los microorganismos se han llevado a cabo estudios filogenéticos basados en los genes del ARN ribosómico (ARNr), debido a su ubicuidad y alto grado de conservación (Woese y col., 1990) (Figura 4). Las células de todos los organismos contienen genes ribosómicos, por ello si se comparan las secuencias de estos genes, se obtienen similitudes y diferencias, permitiendo conocer su grado de parentesco.

Figura 4‐ Árbol filogenético de los organismos vivos basado en las secuencias de genes del ARNr 16S. Fuente: Woese y col. (1990).

Como se puede apreciar en la Figura 4, el dominio Archaea se divide en cinco filos: Euryarchaeota, Crenarchaeota, Korarchaeota, Nanoarchaeota y Thaumarchaeota (Dawson y col., 2006). Se han

13 llevado a cabo numerosos estudios para investigar la diversidad de Euryarchaeota y Crenarchaeota en diferentes ambientes (Schleper y col., 2005; Zhang y col., 2011). Actualmente este dominio contiene 108 géneros y 426 especies (http://www.bacterio.cict.fr/cv.html).

Los representantes cultivables de Euryarchaeota consisten en diversos mesófilos y termófilos anaerobios y halófilos, mientras que los representantes cultivables de Crenarchaeota consisten en hipertermófilos sulfo‐dependientes y termófilos (Huber y col., 1996); recientemente se han encontrado cepas de arqueas oxidadoras de amonio (Könneke y col., 2005; de la Torre y col., 2008). Desde los años noventa se han llevado a cabo multitud de estudios independientes del cultivo para poner de manifiesto la ubicuidad de los miembros de Crenarchaeota en los océanos (DeLong, 1992; Fuhrman y col., 1992), lagos (Schleper y col., 1997), suelos (Ochsenreiter y col., 2003) y otros ambientes con temperaturas bajas. La mayoría de las especies hipertermófilas conocidas de Crenarchaeota crecen a una temperatura óptima de 80 °C (Stetter, 1996; Boone y Castenholz, 2001). Muchas de ellas son

‐ +3 quimiolitoautótrofas de H2, S o H2S, usando O2, NO3 , S, o Fe como aceptores de electrones (Stetter 1996; Spear y col., 2005; Dawson y col., 2006), compuestos abundantes en las fuentes termales.

Varios son los estudios que se han realizado para conocer la diversidad de arqueas en cuevas. Los llevados a cabo en los sedimentos de Wind Cave (Dakota del Sur, EE.UU.) han encontrado veinte filotipos diferentes de Crenarchaeota y dos de Euryarchaeota (Chelius y Moore, 2004). Otros llevados a cabo en el guano de murciélagos en Domica Cave (Eslovaquia) han encontrado que en su

14 mayoría son arqueas no termófilas pertenecientes a la división Crenarchaeota (Chroňáková y col., 2009).

En la cueva de Frasassi (Italia) con un elevado contenido en azufre, se estudió la diversidad microbiana existente en las formaciones mucosas denominadas snottites de varios puntos en la cueva, observando que estas formaciones estaban compuestas por bacterias relacionadas con Acidithiobacillus sp. y arqueas pertenecientes a la clase Thermoplasmata (Macalady y col., 2007).

Dentro del dominio Bacteria actualmente hay descritos 30 filos, 1.909 géneros y un total de 10.329 especies (http://www.bacterio.cict.fr/cv.html).

El filo Actinobacteria es de los más importantes en cuanto a su abundancia en las cuevas. Las colonias de actinobacterias aparecen como colonias blancas, amarillas o rosas en rocas calizas o en la lava y son los responsables del olor característico de las cuevas. Estas bacterias han sido ampliamente estudiadas en el biodeterioro de cuevas con pinturas rupestres como la de Altamira y otras en España

(Groth y Saiz‐Jimenez, 1999).

Las bacterias están implicadas en todas las fases del ciclo del nitrógeno en cuevas. Los estudios se han centrado en las bacterias nitrificantes, tales como Nitrosomonas y Nitrobacter (Fliermans y col., 1974). También se han encontrado bacterias fijadoras de nitrógeno como Mesorhizobium (Bottomley, 1992) o Ralstonia taiwanensis

(Zhou y col., 2007).

15 En la última década se han llevado a cabo muchos estudios sobre las bacterias del azufre ya que han sido descubiertas muchas cuevas con elevado contenido en este elemento. Son abundantes en cuevas las bacterias oxidadoras de sulfuro y azufre, y bacterias sulfato reductoras (Schabereiter‐Gurtner y col., 2003).

Varios estudios proponen la participación de los microorganismos en la formación de depósitos de manganeso y hierro en cuevas. Las bacterias oxidadoras de manganeso y hierro, incluyen géneros como Leptothrix, Gallionella y Crenothrix (Caldwell y Caldwell, 1980; Peck, 1986; Davis y col., 1990). La mayoría de los estudios han investigado sólo la presencia de estas bacterias, pero algunos han demostrado la producción de óxidos de hierro y manganeso cultivando los microorganismos de las cuevas.

Otro filo del dominio Bacteria, es el de Cyanobacteria, cuyos representantes se encuentran frecuentemente en la entrada y zonas con poca luz de las cuevas, solas o en simbiosis formando los líquenes. Algunas están adaptadas a muy bajas condiciones de luz y tienen la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico. Dos de las cianobacterias descritas en cuevas son Geitleria calcarea (Friedmann, 1955) y Scytonema julianum (Asencio y Aboal, 2000). Los géneros que aparecen con más frecuencia son: Oscillatoria, Phormidium y Gleocapsa (Northup y Lavoie, 2001).

En ambientes subterráneos también se han detectado miembros del filo Proteobacteria. Ésta es una de las más abundantes y diversas del planeta (Rappé y Giovannoni, 2003; Buckley y Schmidt, 2001; Zwart y col., 1998). En ella se engloban cinco clases que son:

16 ‐ Alfaproteobacteria: incluye bacterias capaces de crecer en condiciones oligotróficas (escasas en nutrientes). Destaca el orden Rhizobiales debido a su capacidad para inducir la fijación de nitrógeno en simbiosis con plantas (Madigan y col., 2000);

‐ Betaproteobacteria: son capaces de emplear una gran variedad de nutrientes y se relacionan con procesos de degradación, concretamente en procesos de oxidación de

amonio (Whitby y col., 1999);

‐ Gammaproteobacteria: constituye el grupo mejor conocido de las Proteobacteria y en él se incluyen una gran variedad de

tipos fisiológicos y fenotípicos (Woese, 1987);

‐ Deltaproteobacteria: poseen una gran importancia en el ciclo del azufre, ya que muchas son bacterias reductoras de sulfato. También han sido encontradas en cuevas, como la

Cueva de Altamira (González y col., 2006);

‐Epsilonproteobacteria: sus representantes a menudo están implicados en la oxidación de compuestos inorgánicos de azufre y reducción de compuestos inorgánicos nitrogenados (Sievert y col., 2008). En ambientes subterráneos se han encontrado bacterias pertenecientes a este grupo (Engel y

col., 2004).

Dentro del dominio Eukarya se engloban los animales, las plantas, las algas y los hongos, entre otros. Las algas son un grupo diverso de organismos eucariotas fototróficos que contienen clorofila. Algunas

17 de ellas están adaptadas a bajos niveles de luz, pudiendo desarrollarse en la entrada de las cuevas. En cuevas han sido encontradas las algas verdes (Chlorophyta) y diatomeas (Bacillariophyceae). Junto con las cianobacterias, las algas tienen una presencia destacable en cuevas con iluminación artificial.

Los hongos constituyen un grupo heterogéneo cuya clasificación molecular presenta diversidad de opiniones. Actualmente no existe un consenso general con respecto a su estructura filogenética, aunque existen dos fila claros: Ascomycota y Basidiomycota (James y col., 2006). Una amplia variedad de hongos se ha documentado en cuevas (Dickson y Kirk, 1976; Rutherford y Huang, 1994), pero los estudios sobre sus funciones son limitados. En las cuevas, los hongos crecen gracias a diversas fuentes de materia orgánica como madera, restos de animales muertos y guano. Los hongos desempeñan el papel de descomponedores de la materia orgánica en cuevas y además producen una gran variedad de enzimas extracelulares (lipasas, proteinasas y quitinasas) que degradan los residuos de ésta. Los hongos más comunes encontrados en cuevas son los filamentosos y Zygomycetes (Northup y Lavoie, 2001).

1.2.2‐ EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS CUEVAS

Las cuevas con temperatura relativamente constante y humedad elevada, son un hábitat favorable para el desarrollo de numerosos microorganismos (Agarossi y col., 1985).

Los microorganismos juegan un papel importante en los sistemas hipogeos, puesto que son capaces de colonizar las superficies de las

18 rocas, utilizando como fuentes de energía una amplia gama de compuestos orgánicos e inorgánicos, desarrollándose prácticamente en cualquier hábitat y además participando y regulando los ciclos biogeoquímicos de los elementos (Whitman y col., 1998; Northup y Lavoie, 2001).

Los microorganismos están implicados en diferentes procesos:

‐ destructivos: causando la desintegración parcial o total del sustrato, como roca, espeleotemas o pigmentos;

‐ constructivos: provocando la alteración del sustrato, originando moonmilk, depósitos de sales, etc. El crecimiento microbiano concentrado en puntos determinados da lugar a colonizaciones. Por tanto la colonización biológica se presenta como uno de los grandes problemas que afecta a la conservación de las cuevas con pinturas rupestres. Su crecimiento y desarrollo está favorecido por el aporte de materia orgánica disuelta en las aguas de infiltración (Saiz‐Jimenez y Hermosín, 1999), así como posibles desequilibrios en el sistema por efecto de las visitas (Cañaveras y col., 1999, 2001).

Los microorganismos son uno de los principales causantes del deterioro de materiales (Brock y Sand, 1993; Saiz‐Jimenez, 1994). El biodeterioro puede definirse como cualquier cambio indeseado en las propiedades de un material causado por las actividades vitales de los organismos (Huek, 1965, 1968). Las comunidades asociadas a tales materiales son en parte responsables del deterioro químico y físico sufrido por los mismos, alterando a través de distintos mecanismos su apariencia estética y su integridad física. La excreción de enzimas y la producción de ácidos orgánicos disuelve los

19 componentes estructurales de los distintos sustratos, contribuyendo así al proceso de deterioro (Krumbein, 1988).

A continuación se exponen algunos ejemplos de biodeterioro en ambientes subterráneos:

‐ el crecimiento de microorganismos sobre el arte rupestre. Las pinturas están compuestas por pigmentos como hematita, óxidos de manganeso, arcilla y carbón vegetal mezclados con algún tipo de aglutinante orgánico, resina o grasa. Su desarrollo se debe a concentraciones locales de materia orgánica y éste se ve favorecido por las condiciones ambientales de la cueva. Un ejemplo de ello son las colonizaciones bacterianas sobre las pinturas de la cueva de Altamira (Cantabria) (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002a).

‐ el desarrollo de organismos fototróficos como cianobacterias, algas y diatomeas en catacumbas (Albertano y col., 1991, 2003; Sánchez‐ Moral y col., 2005). Esto es debido a que estos organismos consiguen ajustar la fotosíntesis y sus pigmentos a la composición espectral y a la intensidad de luz disponible. Este proceso es muy frecuente en cuevas turísticas que poseen luz artificial en su interior, como por ejemplo en la cueva de Lascaux (Francia) (Sire, 2006) y en la cueva de Tito Bustillo (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002b).

‐ la masiva colonización de hongos en la cueva de Lascaux en 2001, causada por Fusarium solani (Bastián y col., 2010). Este hongo se extendió por el suelo y paredes de la cueva, afectando a la conservación de sus pinturas rupestres. Otro ejemplo es la colonización por los géneros Fusarium y Penicillium en la Catacumba de Milos, Grecia (Pantazidou y col., 1997).

20

Los procesos anteriores son raramente causados por un solo grupo de microorganismos. Una gran variedad de microorganismos coexisten sobre un determinado material y el biodeterioro resulta de las interacciones de comunidades complejas. Esta complejidad ha de ser tenida en cuenta en la evaluación y control del biodeterioro de cualquier material (Warscheid, 1996).

Los esfuerzos realizados para eliminar los microorganismos que contribuyen al deterioro de monumentos han sido generalmente inefectivos, debido al desconocimiento de la diversidad microbiana existente en dicho objetos. Tradicionalmente, la estrategia a seguir cuando se ha abordado el estudio de comunidades microbianas responsables del deterioro sufrido por monumentos ha sido el uso de técnicas microbiológicas clásicas. Estas técnicas conllevan una serie de ventajas, tales como obtener cultivos puros de los microorganismos presentes en monumentos, con la consiguiente posibilidad de estudiar actividades metabólicas de los mismos, y su posible relación con el deterioro sufrido por el objeto. Estas técnicas poseen desventajas como es la cantidad de muestra necesaria para diseñar una buena estrategia de cultivo (distintos medios de cultivo, temperatura, humedad, pH, etc.). Con los métodos microbiológicos convencionales, sólo una pequeña proporción de los microorganismos presentes en una comunidad microbiana pueden ser cultivados en condiciones de laboratorio (Giovannoni y col., 1990; Ward y col. 1990). Microorganismos de crecimiento lento, pero potencialmente involucrados en el deterioro de monumentos, no pueden detectarse mediante técnicas microbiológicas en presencia de otros de crecimiento rápido, que no estén directamente

21 implicados en el proceso de biodeterioro (Bianchi y col. 1980). En las últimas décadas la aplicación de técnicas microbiológicas convencionales ha proporcionado una aceptable idea del tipo de microorganismos presentes en las superficies de monumentos deteriorados (Saiz‐Jimenez y col., 1995; Ariño y col., 1997; Groth y col., 1999), aunque como puso de manifiesto Saiz‐Jimenez (1994), la presencia de un microorganismo sobre un material deteriorado no implica necesariamente que éste haya causado el daño observado. Una segunda estrategia a seguir en el estudio de comunidades microbianas, es el uso de técnicas moleculares. La Biología Molecular se introdujo a principios de los años noventa para estudiar la diversidad microbiana en diferentes hábitats (Ward y col. 1990; Amman y col., 1995).

1.3‐ AEROBIOLOGÍA

1.3.1‐ DEFINICIÓN Y ORIGEN

El término Aerobiología fue introducido en los años 30 del siglo XX por Fred C. Meier (fitopatólogo), para incluir bajo esta denominación los estudios realizados sobre esporas de hongos, granos de polen y bacterias presentes en la atmósfera. Concretamente Meier estaba interesado en la dispersión de las esporas de los hongos a través de la atmósfera y de cómo se transmitían. Sin embargo, estos no fueron los primeros aerobiólogos ya que científicos como Charles Darwin (1809‐1882), Louis Pasteur (1822‐1895) o Pierre Miquel (1850‐1922),

22 considerado este último como el padre de la aerobiología, analizaron muestras del aire y establecieron diferencias estacionales.

Más recientemente, Pathirane (1975) consideró la aerobiología como una ciencia multidisciplinar que comprende la liberación, retención, dispersión, deposición e incidencia atmosférica de esporas, pólenes y otros microorganismos aerovagantes. Desde entonces, se han ido incluyendo en esta ciencia el estudio de otras partículas biológicas aéreas como: virus, algas microscópicas, fragmentos de micelios, fragmentos de líquenes (soredios), pequeñas semillas, fragmentos de plantas superiores, protozoos, pequeños insectos, etc. También se considera de gran importancia, en el ámbito de la aerobiología la propagación de enfermedades en el hombre, animales y plantas, incluyendo infecciones cruzadas en los hospitales y la interacción entre la materia biótica y los contaminantes atmosféricos.

La aerobiología en España comenzó a principios del siglo XX con un primer trabajo sobre la atmósfera de Madrid en 1921 (Chaparro, 1991) y un segundo sobre la ciudad de Santander en 1924 donde se relacionaban los conidios de los hongos presentes en la atmósfera con los procesos alérgicos (Jiménez Díaz, 1932). En la década de los años treinta comenzó a estudiarse la biocontaminación de la atmósfera de Barcelona (Darder y Duran, 1936) aunque no fue hasta los años 40‐50 cuando se pasó de hacer investigación estrictamente descriptiva a investigación analítico‐explicativa, tratando de esclarecer las causas que originan el contenido de polen atmosférico con respecto a los parámetros meteorológicos y a la incidencia alérgica (Barrios, 1942; Montserrat, 1951; Surinyach y col., 1956; Pla‐ Dalmau, 1958). Sin embargo, el verdadero auge de la aerobiología

23 como ciencia en España tiene lugar a partir de la década de los ochenta donde, tanto biólogos como médicos comenzaron a realizar estudios sobre las partículas aerovagantes. En 1992 se creó la Red Española de Aerobiología (REA), cuyo principal objetivo era coordinar los distintos centros de control y crear una base de datos aerobiológicos común para su difusión.

Hoy en día son muchos los campos en los que la aerobiología encuentra aplicación: la medicina (Comtois y Marcoux, 1999), agricultura (Díaz y col., 1997), conservación del patrimonio cultural (Petushkova y Kandyba, 1999), estudios de cambio climático (Emberlin y col., 1997), contaminación ambiental (Cariñanos y col., 1998), modelos de dispersión de partículas, etc. El área de las alergias es el campo de mayor aplicación.

1.3.2‐ PROCESOS AEROBIOLÓGICOS

El proceso aerobiológico implica el transporte de los granos de polen y las esporas a través del aire en el que participan una serie de fenómenos:

- Producción de partículas aerovagantes Las especies vegetales no sólo determinan los tipos polínicos más abundantes, sino que también condicionan el crecimiento de ciertos hongos debido a su condición de parásitos y saprófitos. Otro factor importante para el desarrollo de muchos hongos es la presencia de agua. Las mayores concentraciones fúngicas suelen coincidir con la época de lluvias y con el mayor acúmulo de materia vegetal muerta sobre la que crecerán los hongos, mientras que en la estación más

24 seca el número de esporas y la variedad de las mismas disminuyen (Jones y Harrison, 2004).

Finalmente la producción de los granos de polen y de un gran número de esporas de hongos responde a una estacionalidad debido a la propia fisiología de las plantas y hongos que hace que los niveles alcanzados en la atmósfera no sean constantes a lo largo del año, aunque la concentración de esporas en el aire es generalmente más elevada que la del polen (Sterling y col., 1999);

- Liberación El transporte de las partículas desde la fuente de producción a la atmósfera está influenciado en gran medida por los parámetros meteorológicos. El viento y la humedad relativa desempeñan un papel importante en la liberación de los granos de polen. En cuanto a los hongos, presentan una mayor diversidad en relación a los mecanismos activos y pasivos de dispersión. La liberación pasiva suele tener lugar en los hongos que crecen en una superficie elevada, como por ejemplo Oidium, siendo las corrientes de aire las que arrastran las esporas que están sobre la superficie de las hojas (Lacey y West, 2006). Sin embargo, muchos de ellos están relacionados con el agua. El impacto de las gotas de lluvia sobre determinadas estructuras reproductivas favorece la liberación de una nube de esporas, mientras que otras son dispersadas al mezclarse con el agua resultante del impacto, que hace que se resuspendan gran cantidad de microgotas (rain‐splash).

25 - Transporte y dispersión Una vez que las partículas están en la atmósfera, su permanencia dependerá en gran medida de los movimientos de las masas de aire, turbulencias, lluvias y convecciones térmicas que crean un transporte vertical u horizontal según los casos. La concentración de partículas aerovagantes alcanzada en el aire mostrará un descenso en el incremento de la distancia a la fuente de liberación, aunque también se puede producir un transporte a larga distancia (Spieksma, 1992);

- Deposición e impacto Finalmente las partículas son depositadas sobre diversas superficies como el suelo, agua o vegetación, principalmente por el efecto de la gravedad, pudiendo ser de modo pasivo (por sedimentación gravimétrica) o de una forma activa (por impacto al colisionar contra una superficie que interfiere en la trayectoria del flujo de aire) (Madelin, 1994). Un método especial de impacto está ocasionado por la lluvia que ejerce un efecto lavado de la atmósfera arrastrando las partículas aerovagantes, denominada deposición húmeda (Nilsson,

1992).

- Resuspensión Tras la deposición de la partícula sobre una superficie, es posible que una partícula vuelva de nuevo a la atmósfera por un fenómeno de reflotación, repitiéndose de nuevo los procesos de transporte y deposición (Mandrioli y col., 1998).

26 1.3.3‐ MÉTODOS DE MUESTREO

Uno de los primeros muestreadores volumétricos fue diseñado por Pasteur a mediados del siglo XIX para analizar los microorganismos presentes en la atmósfera. A finales de este mismo siglo Miquel desarrolló una serie de captadores y métodos de muestreo volumétricos con los que realizó un estudio exhaustivo de partículas, tanto de esporas como bacterias cuantificando y describiendo las variaciones estacionales e incluso horarias que se producían en la composición del aire (Comtois y col., 1999). Hesse fue uno de los primeros microbiólogos que observó la diferente aerodinámica de las esporas de los hongos frente a las bacterias que se dispersan formando agregados, lo que dificulta el transporte (Madelin, 1994).

Aunque el interés por las esporas presentes en el aire decreció a comienzos del siglo XX al conocerse que las grandes epidemias del hombre estaban causadas por bacterias y virus (la mayoría a través del agua contaminada) los estudios continuaron gracias a los alergólogos y patólogos vegetales. May (1945) desarrolló un captador en cascada en cuatro fases, mientras que poco después Hirst (1952) inventó el captador volumétrico automático de muestreo continuado que sigue siendo el más utilizado para estudios polínicos y de esporas en ambientes exteriores en la actualidad.

Se puede decir que los estudios aerobiológicos tanto en exteriores como en interiores comenzaron a estandarizarse en la segunda mitad del siglo XX, a medida que se fueron desarrollando nuevos aparatos de muestreo basados en diversos métodos físicos y que ya han sido ampliamente descritos en numerosos trabajos bibliográficos (Cox y

27 Wathes, 1995; Jato y col., 2001; Lacey y West, 2006; Galán y col.,

2007) (Tabla 1).

Tabla 1: Principales métodos para la captación y toma de muestras de aire.

PRINCIPALES MÉTODOS DE MUESTREO DE AIRE TIPOS SUBTIPOS EJEMPLOS

Portaobjetos Muestreadores Precipitación Placas Petri de gravimétrica Captador Durham (Durham, 1946) precipitación Captador Tauber (Tauber, 1974) Succión Captador Hirst (Hirst, 1952)

Muestreadores Cascada Captador Andersen (Andersen, 1956) de impacto Inerciales y Captador Rotorod (Mandrioli, 1998; Perkins, 1957) y Ciclónicos captador Burkard (Razmovski, 1998) Captador Cour (Cour, 1974) Filtros de fibra Filtros sólidos Muestreadores Filtros por membrana de filtración Filtros por cassette Filtrado en Captador McLeod medio líquido Multi‐Stage Liquid Impinger

- Muestreadores de precipitación gravimétrica Los métodos de precipitación gravimétrica, consisten en la exposición de una superficie horizontal cubierta de una sustancia adhesiva, sobre la cual pueden depositarse las partículas por acción de la gravedad. Son los más simples y han sido muy utilizados, sin embargo con dichos métodos, no se pueden calcular concentraciones. Sólo dan una idea de la presencia y abundancia de las partículas. Entre los muestreadores basados en este sistema de captación destacan el de Durham (Durham, 1946) (Figura 5) y Tauber (Tauber, 1974) (Figura 6).

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Figura 5‐ Captador Durham. Figura 6‐ Esquema del captador Tauber.

- Muestreadores de impacto Los muestreadores de succión son los que, por medio de una bomba de vacío u otro dispositivo similar, absorben el aire donde están contenidas las partículas. Éstos presentan un inconveniente que es el de conseguir que la corriente de aire que entra al muestreador sea igual al flujo de aire aspirado por el motor. Un ejemplo es el muestreador Hirst (Hirst, 1952) (Figura 7).

Figura 7‐ Muestreador Hirst.

Otro muestreador es el Andersen (Andersen, 1956) (Figura 8), que es un impactador en cascada que capta las partículas en una serie de placas con medio de cultivo a un caudal de aire determinado. En general, este impactador tiene seis niveles de captación, cada nivel está separado del siguiente por un elemento perforado por

29 cuatrocientos orificios, debajo de cual se coloca la placa con medio de cultivo, en cada nivel todos los orificios tienen el mismo diámetro, pero de un nivel al siguiente disminuye el tamaño del diámetro de los orificios, lo que provoca un aumento de la velocidad del aire al pasar de un nivel a otro. La captación se basa en la inercia de las partículas, en el primer nivel se separan las partículas de mayor tamaño; las de menor tamaño, cuya inercia no es lo suficientemente grande, son arrastradas por la corriente de aire que pasa al siguiente nivel, al aumentar la velocidad también aumenta la inercia de las partículas arrastradas, algunas serán captadas en el segundo nivel mientras que otras seguirán en el aire pasando al tercer nivel, y así sucesivamente. El resultado final es una separación por tamaño de partícula.

Figura 8‐ Fotografía y esquema del funcionamiento del muestreador Andersen.

Del tipo inercial, el primero de estos aparatos fue el Rotorod (Mandrioli y col., 1998; Perkins, 1957) (Figura 9). Este captador, de reducidas dimensiones, dispone de dos brazos en forma de “u” en los que se insertan las superficies receptoras. Al girar a gran velocidad por acción de un motor, interceptan las partículas.

30 Del tipo ciclónico destaca el Burkard (Razmovski y col., 1998) (Figura 10). Se basa en que las masas de aire son forzadas a moverse en trayectorias de rotación o en espiral y las partículas resultan discriminadas por la fuerza centrífuga generada.

Figura 9‐ Fotografía del muestreador Rotord. Figura 10‐ Fotografía del muestreador Burkard.

- Muestreadores de filtración En los muestreadores de filtración, el aire atraviesa los poros de un filtro que retiene o permite el paso de las partículas dependiendo de su tamaño. Ejemplo de muestreador de filtración es el captador Cour (Cour, 1974) (Figura 11), que consiste en sustituir un porta o una cinta colectora por una superficie de gasa hidrófila impregnada en aceite de silicona. Con este método, se pueden recoger pólenes de tamaño y velocidad de caída muy variados, pero sus principales inconvenientes radican en que su eficacia varía con la velocidad del viento y no es posible conocer las concentraciones polínicas diarias.

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Figura 11‐ Muestreador Cour.

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2.1‐ ANTECEDENTES

Actualmente no hay muchos grupos que se dediquen al estudio de la Geomicrobiología. Esta ciencia estudia el papel de los microorganismos y actividades microbianas en procesos geológicos y geoquímicos y viceversa. La mayoría de los grupos de investigación más conocidos se localizan en Estados Unidos y están liderados por las doctoras Macalady (Pennsylvania State University), Barton (Northern Kentucky University), Engel (University of Tennessee) o Northup (University of New Mexico). En Europa también hay varios grupos que trabajan en este área como son los del: Prof. Dr. Sáiz Jiménez (Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla,

33 IRNAS‐CSIC), la Dra. Pašić (University of Ljubljana, Eslovenia) o la Dra. Lee (University of Munich, Alemania).

Algunos de los trabajos publicados sobre este tema son los estudios sobre diversidad microbiana en la cueva de Lascaux (Bastián y col., 2009a‐c, 2010), en una cueva en Eslovenia (Pašić y col., 2010), en la cueva de Lower Kane en USA (Engel y col., 2010), en la cueva Frasassi en Italia (Macalady y col., 2007), Carlsbad Cavern en New Mexico, USA. (Barton y col., 2007) o en la cueva de Lechuguilla (Northup y col., 2003).

Muy pocos estudios se han realizado para conocer la diversidad microbiana presente en el aire de las cuevas. Hay un estudio realizado por Docampo y col., (2010) de la Universidad de Málaga sobre la aerobiología en la cueva de Nerja, pero en este caso es aire exterior, y se realizó un estudio polínico y de hongos mediante técnicas de microscopía y no de biología molecular (Docampo, 2008; (Docampo y col., 2010, 2011).

En esta tesis se propone un estudio sobre la diversidad microbiana de bacterias y de hongos presentes en el aire de varias cuevas empleando dos muestreadores de aire para la recogida de muestras: un muestreador de impacto por succión (DUO SAS SUPER 360) y otro de succión (Coriolis μ). Para la identificación de los organismos se emplearon técnicas de biología molecular.

En este trabajo se han estudiado cuatro cuevas turísticas (tres españolas y una francesa) con un régimen de visitas diferente: las cuevas de Castañar de Ibor (Extremadura), Ardales (Andalucía), Altamira (Cantabria) y Lascaux (Francia) (Figura 12).

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Cueva de Lascaux

Cueva de Altamira

Cueva de Castañar de Ibor

Cueva de Ardales

Figura 12‐ Mapa que representa la situación geográfica de las cuevas estudiadas.

La cueva de Castañar de Ibor se localiza en la comunidad autónoma de Extremadura. Fue descubierta en 1967. Se trata de la cavidad con mayor abundancia de espeleotemas de aragonito de España, por lo que en 1997 fue declarada Monumento Natural. Desde su apertura en 2003, se ha mantenido un estricto control de visitas. En septiembre de 2008 se cerró la cavidad y ha permanecido cerrada hasta el día de hoy. Se han realizado estudios sobre el microclima, parámetros microambientales y los espeleotemas por los grupos del Dr. Sánchez‐Moral (Museo Nacional de Ciencias Naturales‐Consejo Superior de Investigaciones Científicas, MNCN‐CSIC) (Lario y col., 2006; Fernández‐Cortés y col., 2009, 2010a; Muñoz‐Barco y col., 2006) y de la Dra. Alonso‐Zarza (CSIC‐Universidad Complutense de Madrid) (Alonso‐Zarza y col., 2005; Martín‐García y col., 2009; Martín‐Pérez y col., 2005; Martín‐Pérez y col., 2008).

35 La cueva de Ardales, localizada en la provincia de Málaga, fue descubierta en 1821 tras un terremoto. En 1992 la Consejería de Cultura de la Junta de Andalucía declaró la cavidad Bien de Interés Cultural (BIC). Contiene numerosos vestigios culturales de la época Paleolítica. Existe un control en el número de visitantes, así en el año 2007 accedieron a la cueva 2.640 personas, aunque la media anual es de 1.000 visitantes. Actualmente permanece abierta al público. Se han realizado estudios previos sobre el microclima y parámetros microambientales llevados a cabo por el grupo del Dr. Sánchez‐Moral (MNCN‐CSIC) (Fernández‐Cortés y col., 2011). También sobre las comunidades microbianas presentes en dicha cueva (sedimentos y colonizaciones blancas de espeleotemas) en una tesis doctoral realizada en el IRNAS‐CSIC (Stomeo y col., 2007, 2008 y 2009; Stomeo, 2008).

La cueva de Altamira, según Lasheras (2002), fue descubierta en el año 1868 y lo más destacable de esta cueva son las pinturas paleolíticas en la Sala de Polícromos, datadas en 14.000 ± 500 años de antigüedad. Fue declarada Monumento Nacional en el año 1924. Un año después se creó una Comisión para la gestión y exploración de la cueva, con objeto de incrementar su protección, evitar su deterioro y realizar un estudio adecuado de sus contenidos. En el año 1955, la cueva fue visitada por unas 50.000 personas y ya entonces se observaron las primeras evidencias de deterioro. En el año 1973, la cueva fue visitada por más de 174.000 personas, volviendo a saltar la voz de alarma y dando lugar, en el año 1976, a la creación de una Comisión de Investigación cuyo informe dio como resultado el cierre de la cueva en el año 1977. La cueva de Altamira se volvió a abrir al

36 público durante el año 1982 con un régimen de visitas restringido. En el año 1985 fue declarada Patrimonio de la Humanidad por la UNESCO. En septiembre de 2002 la cueva fue cerrada al público hasta el día de hoy para estudiar su estado de conservación. Se han realizado numerosos estudios sobre el microclima y parámetros microambientales por el MNCN‐CSIC (Lario y col., 2005). También se han estudiado las comunidades microbianas presentes en dicha cueva (sedimentos, aguas de infiltración, moonmilk, diferentes colonizaciones presentes en las paredes, etc.) por el grupo del IRNAS‐ CSIC (Laiz y col., 1999; González y col., 2006; Jurado y col., 2008a y 2009; Portillo, 2007; Portillo y col., 2009; Portillo y González, 2011).

La cueva de Lascaux está situada en el Perigord Negro, cerca de la localidad de Montignac. Fue descubierta en septiembre de 1940. Lo más destacable son las pinturas que alberga datadas en 17.000 años de antigüedad. El análisis formal de las figuras de Lascaux hace pensar que este arte pertenecería a una tradición solutrense. En 1979 fue declarada Patrimonio de la Humanidad por la UNESCO. Debido al gran número de visitantes que recibía, aparecieron numerosos problemas, lo que provocó el cierre de la cueva en 1963. También se aplicaron numerosos tratamientos para intentar solventar los problemas de contaminación biológica que tenían lugar. Hoy en día la cueva está cerrada al público y es objeto de estudio por varios grupos de investigación. Se han realizado numerosos estudios del microclima y parámetros microambientales por el Centre Nacional de la Recherche Scientifique (CNRS) (Denis y col., 2005), y de las comunidades microbianas presentes por los grupos del IRNAS‐

37 CSIC y del Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) (Bastián y col., 2009a‐c, 2010).

2.2‐ OBJETIVOS

Este trabajo se ha centrado en la aerobiología de cuatro cuevas que presentaron en el pasado, o presentan en la actualidad, diferente afluencia de visitantes y problemas de conservación. Los objetivos de este trabajo son:

 Conocer la diversidad fúngica y bacteriana existente en el aire de las cuevas de Castañar de Ibor (Extremadura), Ardales (Andalucía), Altamira (Cantabria) y Lascaux (Francia).

 Comparar los resultados obtenidos con dos muestreadores de aire diferentes, el DUO SAS (Surface Air System) SUPER 360 (PBI International, Milan, Italy) y el Coriolis µ (Bertin Technologies, Francia), y en base a ello determinar la idoneidad de sus aplicaciones en diferentes casos de estudio.

 Evaluar la influencia antrópica en cada una de las cuevas, observando los efectos de las visitas en las cuevas y relacionándolo con el estado actual de las mismas.

 Recomendar una serie de medidas para garantizar la conservación de la cueva y evitar futuros brotes fúngicos.

38  Y finalmente, proponer un índice basado en la concentración de esporas para caracterizar el estado de contaminación del aire de las cuevas y evaluar su potencial riesgo.

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3.1‐ CUEVA DE CASTAÑAR DE IBOR (EXTREMADURA)

DESCUBRIMIENTO E HISTORIA

La cueva de Castañar de Ibor está situada en la localidad cacereña del mismo nombre (Figura 13). Fue descubierta fortuitamente en 1967 por un vecino que realizaba tareas agrícolas. Esto dejó al descubierto una cavidad con unos impresionantes espeleotemas. En 1997 fue declarada Monumento Natural mediante el Decreto 114/1997, de 23 de septiembre (D.O.E. nº 114, de 30 de septiembre de 1997), en un intento de conservar un espacio que presenta importantes valores geológicos y científicos, y evitar así un uso inadecuado del mismo.

41 Cueva de Castañar de Ibor

Figura 13‐ Localización de la cueva de Castañar de Ibor.

Castañar puede ser definida como una “cueva de baja energía” que muestra una gran estabilidad microambiental a través de un ciclo anual, bajo condiciones naturales (Lario y col., 2006). Esta gran estabilidad microclimática es una característica básica de los sistemas kársticos y es muy sensible a cambios en las condiciones ambientales, tales como la temperatura y actividades antrópicas.

DESCRIPCIÓN

La cavidad tiene una única entrada situada a una cota superior respecto del resto de las salas y galerías, por la que se accede mediante una escalera por la que se desciende 9 metros (Figura 14). Esta entrada está cerrada por una puerta metálica que sólo se abre puntualmente para el acceso de los visitantes (Figura 15). Una caseta protege el recinto de entrada a la cavidad, actuando como receptáculo aislante frente a las variaciones climáticas externas y como cámara de intercambio previo al acceso de la cueva (Fernández‐Cortés y col., 2010b).

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Figura 14‐ Escalera de acceso a la cueva por la que se descienden 9 metros.

Figura 15‐ La entrada a la cueva está cerrada por una puerta metálica.

Formaciones como las que aparecen en esta cueva, son muy poco frecuentes en el mundo (Figura 16).

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Figura 16‐ Fotografías que muestran algunas de las formaciones de la cueva de Castañar de Ibor.

Desde el año 2003, cuando la cueva fue abierta al público, se mantuvo un estricto control de visitas. En el 2004 visitaron la cavidad 1.508 personas, con una media de ciento veintiséis personas/mes y con un 66 % de los días del año sin visitas. Durante el 2007 sólo 1.010 personas accedieron a la cueva con un máximo de cinco visitantes por grupo acompañados por un guía en todo momento. El tiempo medio de permanencia en la cueva fue de sesenta y cinco minutos con un recorrido preestablecido. El recorrido de las visitas transcurría

44 por la Galería de la Entrada (punto 10), Pasillo (punto 9), Sala Blanca (punto 6), Sala de la Librería (punto 5) y por la zona del Jardín (punto 7), sin alcanzar la Sala de los Lagos (Figura 17). El intervalo de tiempo entre la salida del primer grupo y la entrada del siguiente era superior a cinco horas, con objeto de no producir efectos acumulativos en los incrementos de los parámetros microclimáticos (Fernández‐Cortés y col., 2010b).

Figura 17‐ Mapa con los puntos del recorrido de la zona visitable llevado a cabo por los visitantes. Fuente: modificado de Jurado y col. (2010).

El 24 de agosto de 2008 uno de los visitantes vomitó en la cueva a unos cincuenta metros de la salida. La mañana del 26 de agosto de 2008 el lugar del vómito apareció cubierto de largos micelios blancos (Figura 18) (Jurado y col., 2010). Este desarrollo explosivo de los hongos en la cueva dio lugar a su estudio durante más de un año, con el fin de controlar el brote de hongos.

45 A B

Figura 18‐ A: Punto de vertido en la cueva. B: Hongo crecido en el itinerario de visitas. Fuente: Jurado y col. (2010).

GEOLOGÍA Y CARACTERÍSTICAS KÁRSTICAS

La cueva está formada por materiales muy antiguos, con una edad superior a 520 millones de años (M.a.) (Precámbrico‐Cámbrico Inferior). Se originó por la disolución de estratos de dolomita intercalados con pizarras y grauvaca y contiene una particular variedad de espeleotemas de aragonito y calcita y también depósitos de moonmilk compuestos por huntita, dolomita e hidromagnesita (Alonso‐Zarza y Martín‐Pérez, 2008).

PARÁMETROS AMBIENTALES

‐ EXTERIOR La zona de Castañar de Ibor presenta un clima templado próximo a la semiaridez. La temperatura media exterior durante el ciclo anual de 2007‐2008 fue de 15,82 °C. La oscilación térmica fue alta, entre 40 y 43 °C según el ciclo anual considerado, con las temperaturas mínimas entre noviembre y marzo (‐2,9 °C en 2004 y 0,58 °C en 2007) y las máximas de junio a agosto (entre 40 y 41 °C para ambos ciclos anuales). Desde el punto de vista térmico se reconocen dos períodos

46 bien diferenciados: uno frío (de noviembre a abril) y otro cálido (desde junio a septiembre). Ambos están separados por dos períodos templados de transición (mayo y octubre).

La humedad relativa fue bastante alta como corresponde a una zona intramontañosa. El valor medio de humedad relativa fue de 60,6 % en 2007, con un elevado rango de variación interanual en torno al 95 % para ambos períodos. A lo largo del ciclo anual se distinguió un período con menor humedad ambiental (de junio a septiembre) en el que no se alcanzó la saturación en ningún momento o bien sólo esporádicamente (como sucedió en agosto debido a períodos de lluvias abundantes). El resto del año se registraron fuertes variaciones intramensuales, notables incrementos al final de verano y una mayor humedad y estabilidad en invierno.

Las precipitaciones registradas en el año 2004 corresponden a una zona climática próxima a la semiaridez (543,3 L/m3), concentrándose principalmente entre octubre y noviembre. Las precipitaciones registradas durante el año hidrológico 2007‐2008 indicaron la continuación de la tendencia a la semiaridez (480,3 L/m3) (Fernández‐ Cortés y col., 2010b).

‐INTERIOR Estudios microclimáticos continuos durante dos años (2004‐2005) mostraron una elevada estabilidad térmica a lo largo de todo el ciclo anual. La temperatura media anual del aire de la Sala Nevada fue de 16,95 °C (± 0,16 °C) y en la Sala de los Lagos fue de 16,97 °C (± 0,15 °C) (Fernández‐Cortés y col., 2009).

47 La humedad relativa del aire en el interior de la cavidad (controlada en la Sala Nevada) permaneció muy próxima a la saturación a lo largo de todo el año, oscilando entre el 99,5 y el 100 %, suficiente para mantener un continuo grado de humedad sobre las paredes y el techo. La humedad absoluta media a lo largo de un ciclo anual fue de 14,65 g/m3. El valor mínimo se registró en agosto (14,62 g/m3) y el máximo en abril (14,72 g/m3).

La concentración de CO2 en el aire de la cavidad en la Sala Nevada fue durante 2007‐2008 de 3.810 ppm con un rango de oscilación moderado‐bajo.

El valor medio anual de la concentración de radón 222Rn en el aire interior fue de 31.891 Bq/m3 en 2004 y de 35.401 Bq/m3 en 2007‐ 2008. Los valores mínimos se registraron entre julio y agosto (aproximadamente 17.600 Bq/m3) y las máximas concentraciones en marzo (entre 44.000 y 48.500 Bq/m3) para ambos ciclos anuales, aunque para el ciclo 2007‐2008 los máximos anuales también se registraron en marzo de 2008. Estos valores son elevados y han condicionado el diseño y readaptación del régimen de visitas (tiempo de permanencia). Son indicativos de una tasa de intercambio de aire muy baja entre la atmósfera subterránea y el exterior y, además, están directamente relacionados con las características composicionales y texturales de la roca encajante de la cavidad (Fernández‐Cortés y col., 2009, 2010b).

48 3.2‐ CUEVA DE ARDALES (ANDALUCÍA)

DESCUBRIMIENTO E HISTORIA

La cueva de Ardales, también conocida como la Cueva de Doña Trinidad o de Calinoria, está situada en Ardales, en la provincia de Málaga (España) (Figura 19).

Cueva de Ardales

Figura 19‐ Localización de la cueva de Ardales.

Esta cueva fue descubierta en 1821 tras un terremoto que dejó la boca de acceso abierta, la cual había permanecido cerrada por la sedimentación durante más de 8.000 años. La utilización turística de la cueva empezó gracias a Doña Trinidad Gründ de Heredia que en 1852 habilitó el interior construyendo escalinatas. Tras la muerte de Doña Trinidad en 1896, la cueva quedó abandonada hasta que en 1918 fue visitada por el Abate Henri Breuil que descubrió algunas pinturas y grabados. Breuil fue el primer gran estudioso de la cueva cuyas investigaciones se publicaron en L´Antropologie XXXI (Breuil, 1921). En 1992 la Consejería de Cultura de la Junta de Andalucía

49 declaró la cavidad Bien de Interés Cultural y el Ayuntamiento de Ardales asumió su gestión continuada abriendo las puertas de la cueva al público de forma controlada (Cantalejo y col., 2006).

De las dataciones absolutas obtenidas de distintas estalagmitas (Durán, 1992; Durán y López, 1995), se deduce que la génesis o inicio de la karstificación de la cueva de Doña Trinidad, debe situarse entre el Plioceno Superior y el Pleistoceno Inferior (anterior a 1,8 millones de años) (López y col., 1995).

Durante este período tuvo lugar: la estabilización de un nivel alto de karstificación, el descenso de la superficie piezométrica y encajamiento de la red kárstica y una nueva etapa de estabilización a un nivel inferior.

Durante la segunda mitad del Pleistoceno Medio se produjo el hundimiento y relleno de alguna de las paleobocas de la cavidad. Durante el Pleistoceno Superior se sucedieron una serie de períodos de crecimiento y otros de erosión o no deposición de espeleotemas. Durante el Holoceno se produjeron depósitos de carbonatos parietales (sobre las pinturas rupestres y grabados considerados del Paleolítico Superior). Con posterioridad al momento cronológico correspondiente al momento cultural del Neolítico, debió de producirse el taponamiento de las bocas de la cavidad existentes en ese momento (la de las Galerías Altas y la actual). Según fuentes históricas, en el 1821 se produjo la reapertura de la boca actual debido a un movimiento sísmico.

La cueva de Ardales contiene numerosos vestigios culturales de la época Paleolítica. En el recorrido por la cueva se presentan imágenes

50 simbólicas repartidas por la mayor parte de las salas y galerías y figuras animales, localizadas en una galería del fondo de la cueva. Entre las figuras simbólicas se encuentran puntuaciones, bastones, líneas paralelas, etc., realizadas con pintura. Los símbolos grabados son en su mayoría haces de líneas, reticulados, triangulares, etc. Entre los animales se encuentran cérvidos, équidos, carpidos, peces, serpientes y varias figuras animales de dudosa afiliación (Figura 20).

A B

Figura 20‐ A: Mano negativa en color negro en una columna. B: Barras rojas paralelas en colores. Fuente: Cantalejo y col. (2006).

DESCRIPCIÓN

Este complejo subterráneo está situado a 565 m sobre el nivel del mar, en la falda norte del Cerro de la Calinoria.

Según la descripción proporcionada por Cantalejo (Cantalejo y col., 2006) “la cavidad tiene un recorrido total de 1.577 metros, con una distancia en planta de 1.394 metros. El desnivel máximo es de 34,31 metros, estando el punto más bajo en las Galerías Blancas (‐27,63) y el más alto en el Camarín (+6,68 metros)”. De forma natural, la cavidad tiene distintas salas y galerías a las que se les asignaron nombres durante el siglo XIX o durante las distintas

51 exploraciones del XX. Un acceso en forma de torca y después de una empinada rampa aparecen las primeras galerías, conocidas como Sala del Saco y la Sala de las Estrellas. A partir de esta zona, la cavidad ofrece formaciones de estalactitas y estalagmitas. Desde esta última gran sala parten varias galerías entre las cuales destacan la Sala del Lago y la Galería de los Laberintos presentándose esta última como una red de pequeñas salitas y galerías, incluso estrechas, con un aspecto laberíntico.

Desde el primer tramo de los Laberintos se accede, por medio de una subida de 18 metros, a las Galerías Altas, sector que por su reciente descubrimiento, presenta una óptima conservación. En el lado opuesto de la Sala de las Estrellas se abre una sala empinada, de techo plano conocida como El Calvario que termina en una chimenea vertical, designada como El Camarín por el Abate Breuil en 1918 (Breuil, 1921). Este es el sector que conserva la mayor parte del grafismo paleolítico dedicado a las representaciones de fauna y figuras femeninas, con numerosos signos y algunas manos. Se trata, por lo tanto, del lugar más crítico de los aspectos de conservación de todas las zonas descritas como galerías bajas o visitables (Figura 21).

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Figura 21‐ Mapa de la cueva de Ardales y aproximadamente el itinerario realizado por los visitantes. Fuente: Cantalejo y col. (2006).

El suelo de esta galería está ocupado por bloques desprendidos del techo que se convirtieron durante el Paleolítico Superior en soporte de grandes cantidades de grabados, así como las dos paredes (derecha e izquierda) y todas las grietas y situados al fondo. Por tanto, existen en la cueva dos zonas bien diferenciadas. Por un lado, las galerías visitables, habilitadas por Trinidad Gründ durante la primera mitad del siglo XIX, y por el otro, las galerías altas, descubiertas en 1981, que se mantienen fuera de las visitas culturales que recibe la cueva. Hoy el acceso a las galerías altas permanece sellado por un derrumbe. La única boca actual, por tanto, es la que permite la visita a todo el conjunto.

En la cueva de Ardales existe un control en el número de visitantes, así en el 2007 accedieron a la cueva 2.640 personas. El itinerario seguido por los visitantes va desde los Lagos hasta la Sala de las Estrellas y puntualmente acceden al Calvario o Galería de los

53 Grabados (cuando el tamaño del grupo es inferior a 15 personas) (Figura 21). Durante el año 2007 el número de visitantes medio por mes fue de 224. Durante este año el 59 % de los días la cueva permaneció cerrada a las visitas. El tamaño medio del grupo de visitantes es de 16 personas.

En los muestreos llevados a cabo en esta cueva se observó una gran cantidad de excrementos de roedores, ricos en carbono orgánico y nitrógeno, colonizados por hongos. De hecho, los excrementos fueron evidentes a partir de la escalera de bajada, alcanzando en la Gran Sala su máxima concentración, y llegando hasta la Galería del Calvario y el Camarín (Hermosín y col., 2010) (Figura 22).

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Figura 22‐ Cueva de Ardales. A: En la cueva se encuentran abundantes excrementos de roedores colonizados por hongos. B: Detalle de la colonización de hongos, donde se observa la presencia de Mucor sp. e Isaria felina. C: Micelios de hongos sin identificar. D: Excremento reciente de roedor con colémbolos. E: Excrementos de roedor del que emergen estructuras reproductivas de Isaria felina. F: Basiodiomiceto creciendo a partir de un excremento de roedor. Fuente: Hermosín y col. (2010).

55 GEOLOGÍA Y CARACTERÍSTICAS KÁRSTICAS

Desde el punto de vista geológico, la cueva de Ardales se encuentra encuadrada en una zona de materiales carbonatados que afloran entre las localidades de Ardales y Carratraca. La composición de la roca es fundamentalmente dolomítica o calizo‐dolomítica. En zonas como El Saco y El Camarín, afloran materiales no carbonatados insolubles. En el interior de la cueva se pueden apreciar numerosos espeleotemas que han sido generados a lo largo de un dilatado proceso geológico que guarda relación con eventos climáticos.

La cueva cuenta con varias generaciones de espeleotemas superpuestos, separadas entre sí por fases de no‐crecimiento y/o erosión, lo que demuestran que las condiciones físico‐químicas en que se depositaron los rellenos estalactíticos y estalagmíticos han variado durante el período evolutivo de la cavidad. Las causas de dichas variaciones son básicamente los cambios paleoclimáticos ocurridos durante el Pleistoceno (Cuaternario), condicionantes a su vez de las modificaciones de la vegetación, la temperatura, la pluviometría y otros parámetros que controlan los equilibrios de la cadena de reacciones en el proceso de disolución‐precipitación del carbonato cálcico (López y col., 1995). Se localizaron tres generaciones de espeleotemas entre el límite Pleistoceno Medio‐ Pleistoceno Superior‐actualidad, que corresponden a las tres últimas etapas de crecimiento activo.

56 PARÁMETROS AMBIENTALES

‐ EXTERIOR El clima en el área próximo a la cueva de Ardales se caracteriza por una temperatura media de 17,6 °C (aproximadamente 0,8 °C más que en el interior de la cueva), oscilando entre 2,7 °C y 37 °C. La pluviosidad fue de 377 mm durante 2007‐2008 con una humedad relativa media del 65,8 % (Fernández‐Cortés y col., 2011).

‐ INTERIOR El valor medio de temperatura del aire en el interior de la cueva oscilaba entre 16,74 °C /16,90 °C en las áreas más profundas de la cueva (Estrellas y Lagos) y 17,01 °C en la parte más elevada (Calvario), en 2007‐2008. Se ha observado un efecto acumulativo en la temperatura del aire de la zona del Calvario debido al efecto de las visitas, en esta zona la temperatura nunca fue inferior a 17 °C. Presenta unos valores de humedad relativa constantes y próximos a la saturación, y consecuentemente, un moderado intercambio de energía con el exterior. Los valores de humedad absoluta varían entre 14,1 g/m3 en la Sala de las Estrellas y 15,2 g/m3 en el Calvario.

La concentración media de CO2 era de 1.037 ppm. Los niveles medios de 222Rn varían desde 5.050 Bq/m3 (en la entrada de la cueva) hasta 7.712 Bq/m3 (en el Calvario) durante el ciclo anual de 2007‐2008. Se observaron tasas de ventilación y de intercambio de masa entre la cueva y el exterior durante los meses de verano (Fernández‐Cortés y col., 2011).

57 3.3‐ CUEVA DE ALTAMIRA (CANTABRIA)

DESCUBRIMIENTO E HISTORIA

La cueva de Altamira está situada en las proximidades de Santillana del Mar (Cantabria, España) (Figura 23) y conserva uno de los conjuntos pictóricos más importantes de la Prehistoria. Sus pinturas pertenecen a los períodos Magdaleniense y Solutrense (Paleolítico Superior), y representan un ejemplo típico de la denominada Escuela Franco‐Cantábrica (Clottes y Lewis‐Williams, 1965) que se caracteriza por el realismo de las figuras representadas. En la cueva de Altamira el alto grado de conservación observado en el momento de su descubrimiento ha sido consecuencia fundamentalmente de dos condiciones muy favorables (Villar y col., 1984; Hoyos, 1993): la baja tasa de infiltración de agua a través de los estratos calcáreos que separaban la Sala de Polícromos y la superficie exterior, y el mantenimiento de unas condiciones microclimáticas estables desde el cierre natural de la cueva en tiempos prehistóricos hasta su descubrimiento.

Cueva de Altamira

Figura 23‐ Localización de la cueva de Altamira.

58 La cueva de Altamira según Lasheras (2002) fue descubierta en el año 1868 por un labrador llamado Modesto Cubillas, quien encontró la entrada de la cueva. Marcelino Sanz de Sautuola, erudito en paleontología y descubridor de las pinturas, debió de conocer la existencia de la cueva directamente por Cubillas, pero no la visitó hasta el año 1875. En un principio, sólo observó algunos signos abstractos, como rayas negras repetidas, a las que no dio ninguna importancia, por no considerarlas obra humana. Cuatro años después, durante el verano de 1879, volvió por segunda vez a Altamira acompañado por su hija, interesado en excavar la entrada de la cueva con objeto de encontrar algunos restos arqueológicos. El descubrimiento de las pinturas se produjo de forma casual por la niña mientras su padre permanecía en la boca de la cueva. Ella penetró hasta una sala lateral descubriendo los famosos bisontes. Sanz de Sautuola quedó sorprendido al contemplar el grandioso conjunto de pinturas que cubrían la casi totalidad de la bóveda.

Al año siguiente, 1880, Sanz de Sautuola publicó un manuscrito titulado “Breves apuntes sobre algunos objetos prehistóricos de la provincia de Santander” en el que sostenía el origen prehistórico de las pinturas e incluía una reproducción gráfica hecha por él mismo. Expuso sus hipótesis al catedrático de Geología de la Universidad de Madrid, Juan de Vilanova, que las acogió como propias. Pese a todo, la opinión de Sanz de Sautuola no fue aceptada por los prestigiosos maestros franceses Cartailhac, Mortillet y Harlé, los científicos más expertos de la época en estudios prehistóricos y paleontológicos en Europa. La aceptación de la antigüedad y autenticidad de las pinturas por la comunidad científica no se produjo hasta el año 1902.

59 Mediante técnicas de datación del carbono, Valladas y col. (1992) propusieron una antigüedad para las pinturas de Altamira de 14.000 ± 500 años. El alcalde de Santillana del Mar, en el año 1910, creó la “Junta para la Protección y Conservación de la Cueva de Altamira” y en el año siguiente asignó un primer guía para la cueva. Tras haber sido declarada Monumento Nacional en el año 1924, se creó en 1925 una comisión para la gestión y exploración de la cueva de Altamira, con objeto de incrementar su protección, evitar su deterioro y realizar un estudio adecuado de sus contenidos.

En el año 1955, la cueva de Altamira fue visitada por unas 50.000 personas y ya entonces se produjeron las primeras advertencias por su posible deterioro. Con objeto de reforzar el techo decorado, se creó en 1957 una comisión técnica que determinó la construcción de muros de contención para la bóveda. Las visitas siguieron aumentando progresivamente durante los años 60 y 70 haciendo peligrar el microclima de la cueva y la conservación de las pinturas. En el año 1973, la cueva de Altamira fue visitada por más de 174.000 personas, volviendo a crearse un estado de alarma y dando lugar, en el año 1976, a la creación de una comisión de investigación cuyo informe dio como resultado el cierre de la cueva en el año 1977.

En el año 1979, se inauguró el Museo Nacional y Centro de Investigación de la cueva de Altamira como medio para la coordinación de los estudios y la investigación de la Oficina de Patrimonio Artístico. También se inició en aquellos años un proyecto de investigación sobre la conservación de las pinturas que se llevó a cabo por las Universidades de Santander y del País Vasco. La cueva de Altamira se volvió a abrir al público durante el año 1982 con un

60 régimen de visitas restringido y, dado el amplio número de personas que deseaba visitar la cueva y el largo período de espera necesario para acceder a ella, se planteó la construcción de una réplica. En 1985 fue declarada Patrimonio de la Humanidad por la UNESCO. En 1992 se aprobó el plan para el diseño del actual Museo Nacional y Centro de Investigación de la cueva de Altamira. Desde 1994, el Consejo Superior de Investigaciones Científicas, dependiente entonces del Ministerio de Educación y Ciencia, fue el organismo encargado del estudio del estado de conservación de la Cueva de Altamira. En 1997 comenzaron los trabajos del edificio que iba a albergar el museo, que se inauguró en el año 2001. Destaca en su interior la llamada Neocueva de Altamira, una fiel reproducción de las pinturas de la Sala de los Polícromos. También existe otra reproducción de estas pinturas en una cueva artificial construida en el jardín del Museo Arqueológico Nacional de España, en Madrid. En septiembre de 2002 la cueva fue cerrada al público, y así continúa hasta el día de hoy, para estudiar su estado actual. En el año 2007 se renovó el Convenio de Colaboración entre el Ministerio de Cultura, Dirección General de Bellas Artes y Bienes Culturales, y el CSIC, con una duración de treinta meses.

Uno de los principales problemas que se presenta en esta cueva fue la aparición y crecimiento de consorcios microbianos en las paredes de la cueva, poniendo en peligro las pinturas. Las observaciones macroscópicas permitieron diferenciar, a simple vista, variaciones fundamentalmente en el color de las colonizaciones microbianas, distinguiéndose así tres coloraciones principales: blancas, amarillas y

61 grises. Además, en cada una de ellas existe variabilidad en cuanto a morfología, dimensiones y tonalidades de color, etc. (Figura 24).

Figura 24‐ Aspecto general de un muro donde se distinguen las tres coloraciones principales de consorcios microbianos: amarillo, gris y blanco (señalados mediante un círculo en su respectivo color). Fuente: modificado de Cuezva (2008).

Los estudios microbiológicos en la Cueva de Altamira han sido enfocados a la identificación de los microorganismos constituyentes de estas comunidades microbianas y su grado de actividad metabólica. Una revisión de esos estudios puede encontrarse en el informe elaborado por Sánchez‐Moral y col. (2009) y en los trabajos llevados a cabo en el seno de este proyecto de investigación. Los resultados obtenidos han puesto de manifiesto la existencia de diferencias significativas en las comunidades correspondientes a cada color, confirmando así que las colonizaciones con distinta coloración presentan diferencias en la composición de sus comunidades microbianas (Cuezva, 2008).

62 DESCRIPCIÓN

La cueva de Altamira está formada por una galería con escasas ramificaciones, donde se distinguen varias zonas características (Figura 25). Un área en la entrada constituida por un amplio vestíbulo, llamado la Cocina, que en el Paleolítico se hallaba abierta al exterior e iluminada por luz natural y que fue el lugar preferentemente habitado durante generaciones en el Paleolítico Superior. Del vestíbulo se pasa a la gran sala de pinturas polícromas, llamada Sala de Polícromos, apodada "Capilla Sixtina del Arte Cuaternario" donde se encuentra la mayor parte de las representaciones. Otras salas y corredores en las que también hay manifestaciones artísticas de menor trascendencia son La Hoya, La Gran Sala, la Sala del Pozo y La Cola de Caballo. En la actualidad, el aspecto de la Sala de Polícromos ha variado enormemente desde su descubrimiento. Su bóveda sigue manteniendo los 18 metros de largo por 9 metros de ancho, pero su altura original (entre 190 y 110 centímetros) se ha aumentado artificialmente al rebajarse el suelo para facilitar la contemplación de las pinturas, a excepción de una isla/testigo central que muestra la altura que poseía originalmente este recinto.

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Figura 25.‐ Plano de la cueva de Altamira. Fuente: modificado de Cuezva (2008).

El animal más representado es el bisonte, hay hasta 16 ejemplares en diversos tamaños, posturas y técnica pictórica junto a caballos, ciervos, un jabalí y signos tectiformes. Los artistas de la cueva de Altamira dieron solución a varios de los problemas técnicos que la representación plástica tuvo desde sus orígenes en el Paleolítico, destacando el realismo anatómico, el volumen, el movimiento y la policromía. La sensación de realismo se consiguió mediante el aprovechamiento de los abultamientos naturales de la roca que crean la ilusión tridimensional. La viveza de los colores que rellenan las superficies interiores fundamentalmente rojo y negro y la técnica

64 del dibujo y del grabado, que delimita los contornos de las figuras, son las características esenciales de las representaciones de la cueva de Altamira (Figura 26).

A B

Figura 26‐ A: Pinturas de los bisontes de la Sala de Polícromos. B: Pintura de una cierva en las paredes de la cueva. Fuente: Saiz‐Jimenez.

En esta cueva ha sido detectada la presencia de hongos en el trabajo llevado a cabo por Jurado y col., (2009) (Figura 27).

Figura 27‐ Crecimiento fúngico en la cueva de Altamira. A: Excremento de roedor. B: Pie de un trípode en el sedimentos colonizado por Aspergillus sp. Fuente: Saiz‐ Jimenez y col. (2011).

65 GEOLOGÍA Y CARACTERÍSTICAS KÁRSTICAS

La cueva de Altamira forma parte de las cavidades superiores en zona vadosa superior de un sistema kárstico (Hoyos, 1993; Sánchez‐Moral y col., 1999). Se sitúa a una profundidad media de 8 metros (mínima de 5 y máxima de 22 metros). Debido a su situación en zona vadosa superior, el nivel freático se encuentra a cotas inferiores y la alimentación hídrica del karst se produce por infiltración directa de agua de lluvia. La red de fracturación constituye la vía de circulación natural del agua, ya que la roca encajante presenta muy baja permeabilidad, lo que da lugar a que la circulación de agua a nivel de la cueva es escasa. La mineralogía de los espeleotemas que adornan la cueva es mayoritariamente carbonato cálcico (calcita y/o aragonito), a excepción de algunos depósitos de tipo moonmilk y costras que están compuestas por hidromagnesita y otros carbonatos magnésicos (Cañaveras y col., 1999). La roca encajante de la cueva es en su mayoría calcarenita con algunas intercalaciones arcillolimosas.

La cobertura edáfica en la superficie exterior sobre la cueva no presenta gran desarrollo y en la zona de infiltración directa a la cavidad raramente supera los 70 centímetros. Por encima de la roca carbonatada situada sobre gran parte de la cueva, se dispone un suelo poroso (25‐40 %), de gran espesor (30 a 60 centímetros), con vegetación herbácea y muy rico en compuestos nitrogenados orgánicos como consecuencia de actividades ganaderas recientes. Esta actividad ha dado lugar a la formación de un fango orgánico y altas tasas de producción de CO2 en la cobertura edáfica exterior. Es un suelo silicatado con el nivel superior rico en cuarzo y progresivamente más arcilloso en profundidad.

66 PARÁMETROS AMBIENTALES

La temperatura es un factor físico fundamental en el desarrollo de las reacciones químicas que tienen lugar en el sistema y condiciona otras variables como los movimientos de la masa de aire entre el exterior y el ambiente subterráneo en función de su densidad. Según Wilkening y Watkins (1976), uno de los parámetros más útiles como índice cuantitativo de ventilación en ambientes confinados es la concentración del gas Radón (222Rn) en las cavidades. El agua, líquida y gaseosa (como humedad), es esencial en los procesos de transferencia de gases, de disolución y precipitación mineral. El agua procedente de la atmósfera exterior, atraviesa el suelo y la roca sobre la cueva interaccionando químicamente con sus componentes. La tasa de interacción varía en función del caudal y del tiempo de retención (Tooth y Fairchild, 2003), quedando reflejada en sus características físico‐químicas y en la composición de los espeleotemas generados. De esa tasa de interacción va a depender la cantidad de carbono orgánico disuelto en el agua que va a facilitar el desarrollo de microorganismos heterotróficos.

Los datos microclimáticos han sido registrados mediante un sistema de adquisición automatizado (Sánchez‐Moral y col., 2000). El estudio de los datos microclimáticos de varios ciclos anuales (1997‐1998 y 2004‐2005) realizados por el equipo del MNCN‐CSIC permitió concluir que el sistema presenta un microclima estable y, en conjunto, un bajo intercambio energético con el exterior, controlado fundamentalmente por la diferencia de temperaturas y densidades del aire exterior/interior y en clara conexión con la cobertura edáfica externa. Por otro lado, la elevada humedad de la cueva, cercana a

67 saturación, hace que el agua se condense sobre las superficies favoreciendo la colonización por microorganismos (Sánchez‐Moral y col., 2009).

‐ EXTERIOR Según los datos registrados por el sistema de monitorización en continuo (registros cada treinta minutos), la temperatura media anual exterior del ciclo septiembre 2007‐agosto 2008 fue de 13,19 °C, cerca de medio grado (concretamente 0,42 °C) superior a la del ciclo de septiembre 2008‐agosto 2009 con 12,77 °C de media.

La humedad relativa del aire en el exterior es muy elevada, la media anual de la humedad relativa exterior del ciclo septiembre 2007‐ agosto 2008 fue de 83,92 % levemente inferior a la del ciclo septiembre 2008‐agosto 2009 con 85,92 % de media. Se mantiene en valores por encima del 90 % gran parte del año.

Las precipitaciones totales anuales registradas a lo largo del ciclo septiembre 2007‐agosto 2008 fueron de 990 L/m2, sustancialmente inferiores a las precipitaciones del ciclo septiembre 2008‐agosto 2009 con 1061,8 L/m2. Además durante el ciclo septiembre 2007‐agosto 2008 las precipitaciones mínimas se produjeron principalmente en invierno y las máximas en invierno‐primavera. En cambio, para el ciclo septiembre 2008‐agosto 2009 las precipitaciones mínimas se registraron en primavera y las máximas en otoño (Sánchez‐Moral y col., 2009).

- INTERIOR La temperatura del aire en el interior de la cavidad en la zona más próxima a la Entrada presentó para el ciclo anual septiembre 2008‐

68 agosto 2009 una media anual de 14,15 °C en la zona próxima al techo (a 2,46 metros de altura) y de 13,88 °C en la zona próxima al sedimento (a 15 centímetros del sedimento).

La humedad relativa del aire en las zonas internas de la cavidad (Sala de Polícromos, Cruce y Sala del Pozo), mantuvo valores muy próximos a la saturación (superiores al 99 %) durante todo el período monitorizado (agosto 2007‐septiembre 2009), aunque en la zona de la entrada este parámetro presentó variaciones en cuanto a la altura (diferencias entre la zona más próxima al techo con respecto a la más cercana al suelo) y también estacionales.

La concentración de CO2 en el aire de la cavidad registrada en la zona próxima a la entrada para el período monitorizado septiembre 2008‐ agosto 2009, presentó valores medios anuales en torno a 2.800 ppm.

En la zona de la entrada, el registro en continuo de la concentración de gas radón en el aire presentó discontinuidades, por lo que el valor medio anual de 3.104 Bq/m3 calculado para el período septiembre 2007‐agosto 2008 puede estar infra/sobrevalorado. Los valores mínimos se registraron durante el período estival y son marcadamente inferiores en 2009. El valor medio anual de la concentración de 222Rn en el aire interior de la cavidad (Sala de Polícromos) fue de 3.518 Bq/m3 para el período de septiembre 2008‐ agosto 2009. Los valores mínimos se registraron durante el período estival (agosto 2009 con 719 Bq/m3) y fueron muy similares durante el ciclo septiembre 2007‐agosto 2008 (690 Bq/m3 en agosto de 2008), pero inferiores a los registrados en 2007.

69 El registro en continuo de la presión atmosférica en diferentes puntos de la cavidad ha demostrado que prácticamente no existen diferencias de presión a lo largo de la cavidad, debido probablemente a la mínima diferencia de cota existente. A escala anual los valores son muy semejantes a lo largo de un ciclo anual a otro con 1.000‐ 1.001 mba de media anual en el período de septiembre 2007‐agosto 2008 y de 1000 mba en septiembre 2008‐agosto 2009. En resumen, se observa que las variaciones en la presión obedecen a los patrones estacionales, dominando las bajas presiones fundamentalmente en primavera. Sin embargo, el patrón de evolución temporal es muy variable en respuesta a la variabilidad interanual de los procesos meteorológicos.

La velocidad del aire se ha registrado en continuo en dos puntos clave para los procesos de interconexión cavidad‐exterior: el Cruce y la Sala de Polícromos. El análisis de los datos ha mostrado una mayor intensidad del movimiento del aire en el Cruce que en la Sala de Polícromos así como un patrón de evolución temporal diferente (Sánchez‐Moral y col., 2009).

70 3.4‐ CUEVA DE LASCAUX (FRANCIA)

DESCUBRIMIENTO E HISTORIA

La cueva de Lascaux está situada en el Perigord Negro, cerca de la localidad de Montignac (Figura 28). Las pinturas que alberga esta cueva datan del 17.000 a.C. En 1998, y más adelante en 2002, dos dataciones radiocarbónicas realizadas a partir de fragmentos de varilla de cuerno de reno hallados en las excavaciones de Henri Breuil y Séverin Blanc, con una edad situada entre 18.600 y 18.900 años de antigüedad, en el límite entre el Solutrense Superior y el Badeguliense. El análisis formal de las figuras de Lascaux hace pensar que este arte pertenecería a una tradición solutrense.

Cueva de Lascaux

Figura 28‐ Localización de la cueva de Lascaux.

Fue descubierta por cuatro jóvenes en septiembre de 1940, Marcel Ravidat, Jacques Marsal, Georges Agnel y Simon Coencas. Entre 1947‐ 1948 se llevaron a cabo trabajos de acondicionamiento para facilitar el acceso a las salas que contienen pinturas. En 1948 se abrió la cueva al público.

71 A continuación se detallan los acontecimientos sucedidos en dicha cueva:

Primera crisis biológica (1955‐1983)

En 1955 aparecieron los primeros indicios de la alteración causada por el CO2 emitido por el gran número de visitantes. En ese momento la cueva recibía 30.000 visitas/año.

Entre 1957‐1958 se instaló el primer sistema de regeneración de la atmósfera para eliminar el exceso de CO2. En 1960 se detectaron las primeras “manchas verdes” por el conservador de la cueva. La luz fue la causante del crecimiento de Bracteacoccus minor (alga verde unicelular). En 1962 se extendieron las “manchas verdes” causadas por algas. Lascaux recibía en esos momentos 100.000 visitantes/año, con picos de 1.800 personas/día durante el verano.

Un año después, en 1963 se creó una comisión de investigación para eliminar las “manchas verdes” y las “manchas blancas”. También se produjo el cierre de la cueva por motivos de conservación, y se llevaron a cabo diferentes tratamientos, consistentes en aplicación de un spray de estreptomicina y penicilina para eliminar las bacterias y de formaldehido para eliminar las algas. Estos tratamientos fueron efectivos hasta 1969, cuando fue necesario empezar otra vez un programa de limpieza y mantenimiento de la cueva.

Entre 1965‐1967 se desmontó la máquina de regeneración de aire antigua y se instaló otro sistema de asistencia climática. En 1979 fue declarada Patrimonio de la Humanidad por la UNESCO. Cuatro años después, en 1983 se abrió al público “Lascaux II”, réplica exacta de la

72 Sala de los Toros y del Divertículo Axial. En 1998‐2000 se produjo el reemplazamiento del sistema de regulación climática (Orial y col., 2009).

Segunda crisis biológica (2000‐2008)

En julio de 2001 apareció el primer brote fúngico en la cueva, causado por Fusarium solani, asociado con la bacteria Pseudomonas fluorescens. Este hongo cubrió sedimentos y paredes de la cueva. El origen de la contaminación es desconocido (Figura 29).

Figura 29‐ Brote fúngico de Fusarium solani. Fuente: Ministerio de Cultura y Comunicación de Francia.

En 2001‐2003 se realizaron tratamientos con biocidas para eliminar el brote fúngico y bacterias asociadas. Se empleó el cloruro de benzalconio (Vitalub QC50), estreptomicina y polimixina (Figura 30).

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Figura 30‐ Aplicación del cloruro de benzalconio (Vitalub QC50), estreptomicina y polimixina para eliminar el brote fúngico. Fuente: Ministerio de Cultura y Comunicación de Francia.

En 2004, los tratamientos con cloruro de benzalconio fueron sustituidos por limpieza mecánica y extracción de aire. Entre 2005‐ 2007 se llevaron a cabo diversas campañas para constatar el estado de la cueva (Orial y col., 2009).

Tercera crisis biológica (2006)

En 2007 se llevó a cabo un estudio preliminar para la sustitución del sistema de regulación climático. También en ese año, aparecieron las “manchas negras” sobre el Pasaje y la Nave (Figura 31), aunque algunas de estas manchas ya estaban presentes desde 2003. Se aislaron algunas especies de Verticillium y Scolecobasidium (hifomicetos dematiáceos) de las manchas.

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Figura 31‐ Presencia de las “manchas negras” en la cueva. Fuente: Ministerio de Cultura y Comunicación de Francia.

En 2006‐2008, los restauradores realizaron un nuevo tratamiento con un biocida en el Pasaje y la Nave. El biocida empleado fue el Parmetol mezclado con cloruro de benzalconio (Figura 32). Para evaluar los efectos de los tratamientos, el Comité Científico decidió realizar un estudio en cuatro zonas seleccionadas de la cueva (Orial y col., 2009), que aún continúa.

Figura 32‐ Aplicación de un biocida para eliminar las “manchas negras”. Fuente: Ministerio de Cultura y Comunicación de Francia.

75 DESCRIPCIÓN

El desarrollo total del conjunto de galerías accesibles al hombre no supera los 235 metros. El suelo de la cavidad está en pendiente, con un desnivel de ‐13 metros en la extremidad del Divertículo Axial y de ‐19 metros en la parte baja del Pozo. El volumen de cueva accesible es de 3.300 ± 500 m3, donde 320 m3 corresponden a la Sala de los Toros y 1.300 m3 para el Ábside y la Nave.

Se pueden distinguir morfológicamente, una parte axial compuesta por la Sala de los Toros y el Divertículo Axial y una parte lateral, formada por el Pasaje, la Nave y el Ábside (sala grande con forma de cúpula) que permiten el acceso al Pozo. El Pozo y el Divertículo de los Felinos se encuentran a ‐24 y ‐25 metros sobre la superficie topográfica. La altura máxima en la Sala de los Felinos es de un metro y en la Sala de los Toros de 6 metros (Figura 33 y 34).

Figura 33‐ Mapa en el que se muestra la diferente profundidad a la que están las salas. Fuente: http://www.lascaux.culture.fr

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Figura 34‐ Mapa de la cueva de Lascaux en el que aparecen las diferentes salas.

Fuente: Norbert Aujoulat.

La Sala de los Toros es una prolongación de la entrada. Tiene aproximadamente 20 metros de longitud y entre 5,5‐7,5 metros de ancho. Entre el techo y la parte más baja aparecen muchas pinturas que se extienden ininterrumpidamente por toda la longitud de la sala y a ambos lados de la misma. La roca se encuentra frecuentemente cubierta por concreciones carbonatadas. Existe un total de 130 figuras en esta sala, incluyen 36 representaciones de animales y aproximadamente 50 signos geométricos. Aparecen 17 caballos, un uro, 11 vacas y toros y 6 ciervos. También un oso (Figura 35 y 36).

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Figura 35‐ Panel del unicornio que aparece en la Sala de los Toros. Fuente: http://www.lascaux.culture.fr

Figura 36‐ Representación de un uro con unas dimensiones de 350 centímetros. Fuente: http://www.lascaux.culture.fr

El Divertículo Axial es un conducto de aproximadamente 30 metros de largo y las figuras se distribuyen sobre las dos paredes. La roca se encuentra frecuentemente cubierta por concreciones carbonatadas.

El Pasaje une la Sala de los Toros con la Nave y el Ápside. En él aparecen una gran cantidad de figuras, que a menudo son difíciles de interpretar. Aquí han sido detectadas un total de 385 grabados y figuras pintadas.

78 En la Nave hay cuatro paneles en la pared izquierda: el de los 7 íbices, de la huella, de la Gran Vaca Negra (Figura 37) y de los bisontes adosados. La de la derecha sólo está ocupada por el friso de los ciervos.

Figura 37‐ Panel de la Gran Vaca Negra. Fuente: http://www.lascaux.culture.fr

El Divertículo de los Felinos tiene una extensión de 25 metros, en la que aparecen más de 80 figuras. En un espacio de una superficie limitada aproximadamente a 30 m2, con una elevación media de 3,5 metros. El Ábside contiene más de 1.000 figuras. Entre ellas, cerca de 500 animales y 600 signos geométricos o trazos diversos. El Pozo contiene un número limitado de figuras, 8 en total. 4 son figuras de animales (un caballo, un bisonte, un pájaro y un rinoceronte) y 3 figuras geométricas (puntos y corchetes). En el centro de la representación aparece una figura humana.

GEOLOGÍA Y CARACTERÍSTICAS KÁRSTICAS

Los acantilados del Perigord y sobre todo los del valle del río Vézère corresponden a los pisos geológicos del Coniaciense Superior y de una parte del Santoniense Inferior.

79 Dos fenómenos geológicos, relacionados con la disolución natural de la roca, han marcado profundamente este territorio, y originaron la formación de abrigos y de cuevas.

En lo más alto de este piso, se observó la presencia de un nivel muy karstificado, el cual dio origen a la formación de numerosas cuevas. Este nivel agrupa cerca del 85 % de cavidades de la región, donde más de 400 cuevas han sido inventariadas. En el valle del río Vézère, estas cuevas se hallan colgadas del acantilado y difícilmente accesibles, desmanteladas por la erosión, características que explican las pocas cavidades contabilizadas. En cambio, en la zona del río Beune, afluente principal del río Vézère, el recorte de estos acantilados en escalones facilita el acceso a los distintos registros.

Esta cueva se ha desarrollado por la erosión kárstica de la parte superior de las rocas calizas del Coniaciense (Lastennet y col., 2009).

Se pueden apreciar ocho capas calcáreas superpuestas que se distinguen por la abundancia de aportes detríticos y su estado de compactación. Estratigráficamente, la sucesión de depósitos sedimentarios se vio alterado por la presencia de intercalaciones, de las cuales tres son muy visibles en la primera parte de la cueva.

En la cueva, las rocas calizas de las paredes son más compactas en la Sala de los Toros y se prolongan axialmente, pero pueden presentar estados de cohesión y de rugosidad variables. Este es el caso de las calizas menos cimentadas de la bóveda del Pasaje. El análisis del sustrato rocoso se ha centrado en sus características morfológicas (la porosidad de la roca, la permeabilidad intrínseca, etc.) con el objetivo

80 de conocer sus implicaciones en los procesos de almacenamiento y transporte de agua.

La roca conserva evidencias de múltiples episodios diagenéticos (disolución y precipitación). En la Sala de los Toros en particular, el sustrato está cubierto por una concreción de carbonato de varios milímetros (Lastennet y col., 2009).

PARÁMETROS AMBIENTALES

‐ EXTERIOR El clima de la zona es principalmente de tipo oceánico. El grado de pluviosidad es medio, del orden de 880 mm/año, repartidos en dos períodos principales, otoño y primavera. La temperatura atmosférica media es de 12,6° C, con temperaturas mensuales que fluctúan entre 3° C en invierno y 20 ° C en verano.

‐ INTERIOR La temperatura en la cueva es de 12° C y la humedad relativa es del 99 % (Orial y col., 2009).

81

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4.1‐ MUESTREO Y ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS

En cada una de las diferentes cuevas y campañas de muestreo se tomaron muestras de aire empleando dos muestreadores diferentes:

4.1.1‐ DUO SAS (Surface Air System) SUPER 360 (PBI International, Milan, Italy)

4.1.2‐ Coriolis µ (Bertin Technologies, Montigny‐le‐ Bretonneux, Francia)

Con el primero de los muestreadores se pretendían identificar los microorganismos cultivables y con el segundo los microorganismos no cultivables. El objetivo final era determinar la diversidad microbiana presente en el aire ya que ambos métodos se complementarían.

83 4.1.1‐ Muestreador DUO SAS (Surface Air System) SUPER 360 (PBI International, Milan, Italy)

Para realizar el análisis de las muestras tomadas con el muestreador de aire DUO SAS (Surface Air System) SUPER 360 se siguió el siguiente esquema:

Muestreo

Incubación, recuento y aislamiento a.‐ Extracción del ADN genómico b.‐ Medida de la concentración de ADN c.‐ Amplificación del gen ARN ribosómico 16S / región ITS por PCR d.‐ Electroforesis en gel de agarosa Identificación e.‐ Purificación de los productos de PCR f.‐ Secuenciación g.‐ Identificación de las secuencias

Análisis de datos

MUESTREO

Este aparato se basa en la captación del aire a la velocidad deseada durante un cierto tiempo a través de un cabezal provisto de numerosos agujeros (Figura 38). El flujo de aire penetra por los agujeros e impacta directamente sobre el medio de cultivo contenido en placas Petri de 90 milímetros de diámetro (el medio presente en las placas varía según los organismos que se deseen cultivar). Antes de comenzar a tomar las muestras, se esterilizan los cabezales de dicho aparato durante veinte minutos a 121 °C y además una vez en la cueva se rocían con alcohol isopropílico comercial (BACTY‐SP IPA

84 SPRAY, PBI International) para una mayor esterilidad (siguiendo las instrucciones del fabricante). Al finalizar las medidas (toma de muestras), se extraen las placas, se tapan y se incuban a la temperatura óptima de los organismos, el crecimiento en las placas es visible a simple vista.

A B

C

Figura 38‐ Muestreador de aire DUO SAS SUPER 360. A: Visión general del equipo. B: Placa Petri colocada en el cabezal del equipo. C: Detalle del cabezal con los agujeros por los que entra el flujo de aire.

Para recoger las muestras de hongos, las placas Petri contenían el medio comercial Diclorán Rosa de Bengala Cloranfenicol Agar (DRBCA; Merck) (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y Soluciones). Este medio ha sido seleccionado ya que el diclorán reduce el diámetro de las colonias de hongos, el rosa de bengala reduce el tamaño y la altura de las colonias de hongos y por último el cloranfenicol inhibe el crecimiento de las bacterias. Todo ello favorece que sea mucho más fácil el recuento (King y col., 1979).

85 Para recoger las muestras de bacterias, las placas Petri contenían el medio Triptona‐Soja‐Agar (TSA) con cicloheximida 50 µg/mL de concentración final (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y Soluciones). La función de la cicloheximida es la de inhibir el crecimiento de eucariotas (Salkin y Hurd, 1972), facilitando los recuentos y posteriores aislamientos.

Se tomó un volumen de 100 L de aire (considerado como óptimo por experimentos previos realizados) que impactaban sobre las placas que contenían el medio. Todas las muestras se tomaron por duplicado.

INCUBACIÓN, RECUENTO Y AISLAMIENTO

Las placas de hongos se incubaron en oscuridad a 25 °C durante cinco días (temperatura y tiempo considerado como óptimo por experimentos previos realizados). Sin embargo, las placas de bacterias fueron incubadas en ausencia de luz a 28 °C durante 4 días, este período de tiempo es aproximado ya que depende de la cantidad de bacterias adheridas a las partículas contenidas en el aire y presentes en la atmósfera de la cueva. Cuanto mayor sea esta cantidad en el ambiente, el recuento deberá realizarse en un período de tiempo más corto para facilitar los recuentos y aislamientos. Tras ese período de tiempo se efectuó el recuento de todas las colonias existentes en cada una de las placas y se tomaron fotos de cada placa haciendo uso de una cámara digital (Canon PowerShort A630).

Posteriormente se aislaron los hongos y bacterias que presentaban características morfológicas diferentes (morfología de la colonia,

86 color, forma, patrón de crecimiento, producción y pigmentación de los exudados, etc.) dentro de cada placa y también se contó el número de colonias de cada tipo para luego poder efectuar los cálculos de unidades formadoras de colonias (UFC). Los aislamientos de hongos fueron realizados en placas que contenían el medio Extracto de Malta‐Agar (MEA) y las bacterias en placas que contenían TSA. Los aislamientos de hongos fueron conservados en tubos de vidrio con MEA a 4 °C. Mientras que los de bacterias fueron conservados en crioviales (tubos con glicerol al 20 % v/v) a ‐80 °C.

IDENTIFICACIÓN

a.‐ Extracción del ADN genómico

En un tubo Bio101 Lysing Matrix E (Qbiogene Inc., Carlsbad, California, EE.UU.) se añadió una cantidad representativa de biomasa. Se añadieron 500 µL de TNE (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y Soluciones). Se adicionaron 500 µL de fenol:cloroformo:isoamilalcohol (25:24:1, pH8, Fisher BioReagents). Se lisaron las células por métodos físicos y mecánicos usando Fast Prep‐24 (Solon, Ohio, EE.UU.), 15 segundos a una velocidad de 5.000 rpm (repetido 2 veces). Se centrifugó 5 minutos a 12.500 rpm. Se transfirió la capa acuosa a un tubo limpio. Se añadió el mismo volumen de cloroformo:isoamilalcohol (24:1, Sigma‐Aldrich) (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y Soluciones). Se mezcló y se centrifugó 5 minutos a 12.500 rpm. Se transfirió la capa superior a un tubo limpio. Se precipitaron los ácidos nucleicos con 1/10 volumen de acetato de sodio (3M) (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y

87 Soluciones) y 1 volumen de isopropanol. Se mezcló varias veces. Se centrifugó 30 minutos a 12.500 rpm y se eliminó el sobrenadante. Se lavó con 1 mL de etanol al 70 % (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y Soluciones). Se centrifugó 5 minutos a 12.500 rpm y se eliminó el sobrenadante. Se dejó secar hasta que todo el etanol se hubiese evaporado. Se añadieron 50 µL de agua estéril (Sigma‐Aldrich) y se mezcló (Griffiths y col., 2000).

b.‐ Medida de la concentración de ADN

Se midió la concentración y la calidad del ADN en cada una de las muestras, con el fin de tener una idea aproximada de la cantidad que se debía añadir a la mezcla de la reacción para que se amplificase mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR). Para ello se empleó el espectrofotómetro U‐0080D Bio spectrophotometer (Hitachi High‐Technologies, Tokio, Japón).

Para determinar la pureza del ADN se midió la absorbancia a unas longitudes de onda de 260, 280 y 230 nm y se calcularon

los ratios A260/A280 y A260 /A230 con el objetivo de detectar la presencia de posibles contaminantes en las muestras. Los contaminantes orgánicos absorben principalmente a 230 nm y las proteínas a 280 nm, mientras que el ADN absorbe principalmente a 260 nm. En general, se acepta que un ADN

es puro cuando los ratios de A260/A280 y A260/A230 son de aproximadamente 1,8 y 2,0 respectivamente (Warburg y

Christian, 1942; Kalb y Bernlohr, 1977).

88 c.‐ Amplificación del gen ARN ribosómico 16S y la región contenida en los Espaciadores Inter‐Transcripcionales mediante PCR

Para la identificación de los hongos se amplificó mediante PCR la región contenida en los Espaciadores Inter‐ Transcripcionales (Internal Transcribed Spacer, región ITS) comprendida entre la subunidad pequeña y grande del ARN ribosómico (ARNr), 18S y 28S respectivamente (ITS1 e ITS2) (Figura 39).

Figura 39‐ Región ITS comprendida entre la subunidad pequeña y grande del ARNr (ITS1 e ITS2).

Para la identificación de las bacterias se amplificó mediante PCR el gen ARNr 16S.

Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador iCyclerTM de BioRad (Hercules, California, EE.UU.).

Las reacciones se prepararon en tubos de 0,2 mL (Greiner BioOne, Monroe, North California, EE.UU.). Cada reacción contenía: 5 µL de tampón de PCR 10x BioTaq (Bioline,

Randolph, Massachussets, EE.UU.), 1,5 µL de MgCl2 (solución stock 50 mM), 1 µL de de una mezcla de los cuatro nucleótidos (dNTP) (2 mM) (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.), 0,5 µL de cada uno de los cebadores ITS1 e ITS4 para

89 hongos (50 µM) o 616F y 1522 R para bacterias (50 µM) (Tabla 2), 0,25 µL de la ADN polimerasa BioTaq (Bioline, Randolph, Massachussets, EE.UU.) equivalente a 2,5 unidades y ADN genómico (50‐100 ng). El volumen final de la reacción se completó hasta 50 µL con agua libre de ácidos nucleicos y nucleasas (Sigma‐Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.).

Tabla 2: Cebadores empleados para la amplificación y secuenciación del ADN.

Posición relativa CEBADOR Secuencia (5´→ 3´) (gen ARNr 16S de Organismo diana Referencia Escherichia coli)

AGA GTT TGA TYM Juretschko y 616F 27‐46 Bacteria TGG CTC AG col., 1998 CCC CGT CAA TTC ATT Weisburg y col., 907R 907‐886 Bacteria TGA GTT T 1991 AAG GAG GTG ATC Edwards y col., 1522R 1522‐1503 Bacteria CAG CCG CA 1989 TCC GTA GGT GAA White y col., ITS1 ‐ Hongos CCT GCG G 1990 TCC TCC GCT TAT TGA White y col., ITS4 ‐ Hongos TAT GC 1990 TAA TAC GAC TCA CTA Vector pCR4‐TOPO Ausubel y col., T7p ‐ TAG GG (Invitrogen) 1993 CAG GAA ACA GCT Vector pCR4‐TOPO Ausubel y col., M13R ‐ ATG AC (Invitrogen) 1993

El programa empleado para amplificar la región ITS fue el siguiente: ‐ un ciclo de desnaturalización (94 °C durante 2 minutos). ‐ 35 ciclos de: desnaturalización (94 °C durante 1 minuto), alineamiento (50 °C durante 1 minuto), elongación (72 °C durante 1 minuto). ‐ un ciclo de elongación final (72 °C durante 5 minutos).

90 El programa empleado para amplificar el gen ARNr 16S fue el siguiente: ‐ un ciclo de desnaturalización (95 °C durante 2 minutos). ‐ 30 ciclos de: desnaturalización (95 °C durante 2 minutos), alineamiento (55 °C durante 15 segundos), elongación (72 °C durante 2 minutos). ‐ un ciclo de elongación final (72 °C durante 10 minutos).

d.‐ Electroforesis en gel de agarosa

Para confirmar el resultado positivo de las amplificaciones por PCR, se realizó una electroforesis en gel de agarosa (SeaKem, CAMBREX Bio Science Rockland, Rockland, Nueva York, EE.UU.) al 1% (p/v) (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y Soluciones). Para ello, 5 μl de los productos amplificados por PCR se mezclaron con 1 μl de tampón de carga que lleva incorporado el colorante SYBR Green I (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.) a una concentración final de 1/100.000 (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y Soluciones). La electroforesis se realizó en una unidad de electroforesis horizontal modelo HU10 (SCIE‐PLAS, Southhampthon, Inglaterra) utilizando TAE 0,5x (pH 8,2) como tampón de electroforesis (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y Soluciones).

Se empleó una fuente de alimentación eléctrica EPS 600 (Amersham Biosciences, New York, EE.UU.). La electroforesis se llevó a cabo durante 20 minutos a 90 voltios. El gel fue

91 observado en el transiluminador (Vilber Loumat, Marne‐la‐ Vallé, Francia) que emite luz UV a una longitud de onda de 312 nm. Los geles se fotografiaron con una cámara digital Kodak Edas DC290 utilizando el programa “Kodak 1D Image Análisis Software” (Kodak, New Haven, Connecticut, EE.UU.).

e.‐ Purificación de los productos de PCR

Con el objetivo de eliminar los restos de cebadores, nucleótidos y enzima que no fueron utilizados en la PCR, se purificarion los productos de PCR empleando el kit comercial JETquick PCR Product Purification Spin Kit (Genomed, Löhne, Germany) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

f.‐ Secuenciación

Los productos de PCR purificados se secuenciaron en el secuenciador capilar ABI3700 utilizando el ABI PRISM dye terminador sequencing core kit (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.) en la empresa SECUGEN (Madrid) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para la secuenciación se emplearon los cebadores: ITS1, ITS4, 616F, 907R y 1522R (Tabla 2).

g.‐ Identificación de las secuencias Los resultados de secuenciación fueron visualizados mediante el software BioEdit Sequence Alignment Editor v.7.0.9 (Hall, 1999) para comprobar la calidad de las secuencias y eventualmente editarlas. Se utilizó la base de datos de ADN del GenBank disponible en el National Centre for Biotechnology Information (NCBI)

92 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para comparar las secuencias obtenidas con las secuencias depositadas en dicha base de datos. Las secuencias fueron analizadas mediante el algoritmo BLAST (Altschul y col., 1990), pero adicionalmente también se emplearon dos bases de datos más: Greengenes (DeSantis y col., 2003) y EzTaxon (Chun y col., 2007). Para el alineamiento y comparación de las secuencias también se empleó el BioEdit Sequence Alignment Editor v.7.0.9.

ANÁLISIS DE DATOS

Una vez identificados todos los aislamientos, se procedió a realizar los siguientes cálculos. Según las instrucciones del fabricante del DUO SAS SUPER 360, el número de organismos contados en la superficie de las placas debe ser corregido debido a la probabilidad estadística de que múltiples partículas atraviesan el mismo agujero del cabezal del aparato. El número de colonias de cada aislamiento (Tabla 3, columna de la izquierda) fue sustituido por el número más probable (MPN Pr) (Tabla 3, columna de la derecha).

93 Tabla 3: Tabla para corregir los valores obtenidos del recuento del número de colonias en las placas. Fuente: instrucciones.

Posteriormente se sustituyeron los valores obtenidos en la siguiente fórmula:

V = volumen de aire muestreado (100 L)

r = unidades formadoras de colonias contadas en una placa de 90 mm de diámetro

Pr = número más probable obtenido tras la corrección aportada por las tablas.

x = Unidades Formadoras de Colonias por 1.000 L 3 (1 m ) de aire

94 4.1.2‐ Muestreador Coriolis µ (Bertin Technologies, Montigny‐le‐ Bretonneux, Francia)

Para realizar el análisis de las muestras tomadas con el muestreador de aire Coriolis μ se siguió el siguiente esquema:

Muestreo

a.‐ Filtración y extracción de ADN b.‐ Medida de la concentración de ADN c.‐ Amplificación del ADN por PCR Identificación de los d.‐ Electroforesis en gel de agarosa componentes de la e.‐ Purificación de los productos de PCR comunidad microbiana f.‐ Clonación y construcción de genotecas g.‐ Secuenciación h.‐ Análisis de los datos

MUESTREO

El muestreador de aire Coriolis µ (Figura 40) es un tipo de instrumento ciclónico basado en el principio descrito por Decker y col., 1969.

Figura 40‐ Fotografía del Coriolis µ con el recipiente cónico donde quedan retenidas las partículas aerovagantes, y la abertura frontal por donde se produce la captación de aire.

95 El aire es aspirado por una abertura frontal y pasa a un cono estéril que contiene 15 mL de Triton X100 (0.005%) (siguiendo las recomendaciones del fabricante). El flujo de aire ajustado en el equipo fue de 100 L/min y el tiempo de recogida de las muestras de 10 minutos. El volumen final de aire muestreado fue de 1.000 L. Las partículas presentes en el aire (bacterias, granos de polen y esporas de hongos) fueron retenidas en el líquido contenido en el recipiente cónico (Figura 41). Después de tomar las muestras, el recipiente cónico se cerró y conservó a ‐80 °C hasta que las muestras fueron procesadas.

Figura 41‐ Esquema del funcionamiento y toma de muestras del Coriolis µ.

IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPONENTES DE LAS COMUNIDAD MICROBIANA

a.‐ Filtración y extracción de ADN

Inicialmente se filtró la muestra tomada con el Coriolis. Para ello se empleó una jeringa estéril de 20 mL, portafiltros estériles Millipore (Swinnex), filtros Millipore de 0,22 µm de diámetro y tubos Falcon estériles de 15 mL. Esto se realizó en condiciones de esterilidad.

96 Posteriormente se depositó el filtro en un tubo de 2 mL de Lysing Matrix E (contenido en el kit comercial FastDNA SPIN Kit for Soil, Q‐BIOgene). Se añadieron 978 μl de “tampón fosfato de sodio” y 122 μl de “tampón MT” (contenidos en el kit anterior). Se homogeneizó en el vortex durante 30 segundos y se realizó la lisis mecánica usando el Fast Prep‐24 (Solon, Ohio, EE.UU.) durante 30 segundos a una velocidad de 5.000 rpm (2 ciclos). Se centrifugó la muestra a 13.000 rpm durante 7 minutos. Finalmente se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio de 2 mL y se continuó con las instrucciones del fabricante del kit comercial FastDNA SPIN Kit for Soil (Q‐BIOgene).

b.‐ Medida de la concentración de ADN (ver apartado 4.1.1).

c.‐ Amplificación del gen ARN ribosómico 16S y la región ITS mediante PCR (ver apartado 4.1.1).

d.‐ Electroforesis en gel de agarosa (ver apartado 4.1.1).

e.‐ Purificación de los productos de PCR (ver apartado 4.1.1).

f.‐ Clonación y construcción de genotecas

Con el objetivo de determinar los principales microorganismos presentes en las muestras de aire, se construyeron genotecas del gen ARNr 16S de bacterias y de la región ITS de hongos.

Para ello los productos purificados de PCR tanto de bacterias como de hongos se clonaron empleando el kit comercial

97 TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen, California, USA) y siguiendo las instrucciones del fabricante. El vector empleado fue el plásmido pCR4‐TOPO (Invitrogen) (Figura 42) que contiene dos genes que le confieren resistencia a la ampicilina y kanamicina; también el gen ccdB unido al carbono terminal del fragmento LacZα que permite una selección directa de los recombinantes mediante la interrupción del gen letal de Escherichia coli, ccdB (Bernard y Couturier, 1992; Bernard y col., 1993; Bernard y col., 1994). La ligación del producto de PCR interrumpe la expresión de lacZα‐ ccdB permitiendo sólo el crecimiento de aquellos recombinantes que tienen el inserto. Las células que no contienen el vector con el inserto no crecerán en las placas con el medio Luria‐Bertani suplementado con ampicilina (100 mg/mL) (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y Soluciones).

Figura 42‐ Esquema del plásmido pCR4‐TOPO empleado para la clonación.

98 Este kit incluye dos pasos. En el primer paso se produce la ligación del producto de PCR al plásmido pCR4‐TOPO mediante la topoisomerasa (ya que permite una ligación mucho más eficiente que la ligasa). En el segundo paso se produce la transformación de la construcción anterior en células competentes de Escherichia coli DH5α™‐T1R (cepa resistente al bacteriófago T1) (Invitrogen). Tras la transformación, las células se siembran en placas de LB‐ ampicilina (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y Soluciones) y se incuban a 37 °C durante toda la noche (aproximadamente 18 h).

Las colonias obtenidas se recogieron al azar empleando palillos estériles y se crecieron en medio líquido de LB‐ ampicilina (ver composición en apartado 4.3 Medios de cultivo y Soluciones). Con el fin de comprobar que los clones tenían el inserto (producto purificado de PCR) se realizó una PCR (tal y como se explica en el apartado 4.1.1c) empleando los cebadores T7p y M13R (Tabla 2).

Las condiciones de la PCR fueron: ‐ un ciclo de desnaturalización (95 °C durante 2 minutos). ‐ 35 ciclos de: desnaturalización (95 °C durante 15 segundos), alineamiento (55 °C durante 15 segundos), elongación (72 °C durante 30 segundos). ‐ un ciclo de elongación final (72 °C durante 10 min).

Los productos de PCR se comprobaron en un gel de agarosa al 1% (p/v) como se ha descrito previamente.

99 g.‐ Secuenciación

Los clones fueron procesados en el secuenciador 3730XL DNA de la empresa Macrogen (Seúl, Corea). Para la secuenciación se emplearon los cebadores 1522R en bacterias y el ITS4 (Tabla 2) en hongos.

h.‐ Análisis de datos

Los resultados de secuenciación fueron visualizados mediante el software BioEdit Sequence Alignment Editor v.7.0.9 (Hall, 1999) para comprobar la calidad de las secuencias y editar manualmente los nucleótidos determinados errónea o ambiguamente por el sistema automático del secuenciador y en su caso tratar de mejorar las secuencias en base a los cromatogramas. Mediante un pre‐tratamiento de las secuencias se eliminó el vector empleando el programa Geneious 4.8.5 (Drummond y col., 2009). Las posibles estructuras quiméricas generadas durante la amplificación por PCR fueron detectadas y eliminadas con el programa MOTHUR (Schloss, 2009).

Haciendo uso del programa MOTHUR (Schloss, 2009), se calcularon los OTUs (Operational Taxonomical Units, Unidades Taxonómicas Operacionales), con una distancia evolutiva del 3% y las secuencias representativas de cada uno de ellos con sus frecuencias. También se calculó el porcentaje de cobertura de la muestra empleando la fórmula de Good (Good, 1953).

Se emplearon las bases de datos de ADN del GenBank disponible en el National Centre for Biotechnology

100 Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Greengenes (DeSantis y col., 2003) y EzTaxon (Chun y col., 2007) para comparar las secuencias representativas de cada OTU con las secuencias depositadas en dichas bases de datos.

4.2‐ LOCALIZACIÓN DE LAS MUESTRAS

Como se ha mencionado anteriormente, se han muestreado cuatro cuevas (tres españolas y una francesa): la cueva de Castañar de Ibor (Extremadura), Ardales (Andalucía), Altamira (Cantabria) y Lascaux

(Francia) (Figura 12).

A excepción de la cueva de Altamira, en todas las cuevas se han efectuado dos campañas de muestreo. En la Tabla 4 se indican las fechas de los muestreos realizados en cada una de las cuevas y las muestras tomadas.

Tabla 4: Fechas de los muestreos realizados en las diferentes cuevas. MUESTREOS REALIZADOS DUO SAS SUPER 360 CUEVA FECHA Coriolis μ Hongos Bacterias

Castañar de Enero 2009  ‐‐

Ibor Septiembre 2009    Marzo 2010   ‐ Ardales Abril 2010   ‐ Altamira Junio 2009    Febrero 2010   ‐ Lascaux Septiembre 2010   ‐

: Muestras analizadas; ‐: Ausencia de muestras

101 4.2.1‐ CUEVA DE CASTAÑAR DE IBOR (EXTREMADURA)

En la cueva de Castañar de Ibor se realizaron dos muestreos. El primero de ellos tuvo lugar el 29 de Enero de 2009, cinco meses después de un vertido accidental de materia orgánica. El segundo muestreo fue el 15 de Septiembre de 2009, un año después del incidente. Se tomaron muestras con el DUO SAS SUPER 360 y Coriolis μ.

En ambos muestreos se seleccionaron un total de 11 puntos, 10 en el interior de la cueva y uno en el exterior de la misma. Los puntos muestreados fueron: en la zona no visitable (Laberinto Sur/punto 1, Planchas/punto 2, Laberinto Norte/punto 3, Lagos/punto 4, Librería/punto 5, Sala Blanca/punto 6) y en la zona visitable (Jardín/punto 7, Sala Nevada/punto 8, Pasillo/punto 9, entrada de la cueva/punto 10 y exterior de la misma/punto 11) (Figura 43).

Se intentó muestrear el mayor número de salas para comprobar si existían diferencias en la composición microbiana del aire de la cueva. Con la muestra del exterior se pretendía comparar las posibles diferencias entre la diversidad específica existente en el interior y exterior de la cueva.

102

4

5 6

7 3 2 9

8

1 10

11 Exterior

Figura 43‐ Plano de la cueva en donde se representan los puntos muestreados. Fuente: personal de la cueva.

103 4.2.2‐ CUEVA DE ARDALES (ANDALUCÍA)

En la cueva de Ardales se realizaron dos muestreos. El primero de ellos fue el 23 de Marzo de 2010, después de una visita de 32 personas durante 90 minutos. El segundo, el 29 de Abril de 2010 después de dos días sin visitas, con el fin de conocer el efecto de las visitas en la aerobiología.

En ambos muestreos se seleccionaron 4 puntos, tres en el interior de la cueva y uno en el exterior: Sala del Calvario (punto 1), Sala de las Estrellas (punto 2), entrada de la cueva (punto 3) y exterior de la cueva (punto 4). Sólo se tomaron muestras con el DUO SAS SUPER 360 por la falta de electricidad en el interior de la cueva (Figura 44).

1 4 Exterior Figura 46‐ Mapa de la cueva de Ardales en donde aparecen con números los 3 diferentes puntos muestreados. Fuente:2 Cantalejo y col., 2006.

Figura 44‐ Plano de la cueva donde se representan los puntos muestreados. Fuente: Modificado de Cantalejo y col. (2006).

104 4.2.3‐ CUEVA DE ALTAMIRA (CANTABRIA)

En la cueva de Altamira fueron seleccionados un total de 11 puntos, 10 en el interior de la cavidad y uno en el exterior. Las muestras se recogieron en: Cola de Caballo (punto 1), Sala del Pozo (punto 2), Gran Sala (punto 3), Sala de la Hoya (punto 4), Pasillo entre la Sala de la Hoya y la Sala de los Muros (punto 5), Sala de los Muros (punto 6), Cruce (punto7), fondo de la Sala de Polícromos (punto 8), entrada de la Sala de Polícromos (punto 9), entre las dos puertas (punto 10) y exterior de la cueva (punto 11) (Figura 45). Adicionalmente se tomaron dos muestras en la cueva anexa a la cueva de Altamira, la cueva de las Estalactitas (que no recibe visitas, a excepción del personal de Altamira para labores de mantenimiento), en el fondo y en la entrada. Se tomaron muestras con el DUO SAS SUPER 360 y Coriolis μ.

105 11 Exterior

10

8 9 7

4 6

5

3

2

1

Figura 45‐ Plano de la cueva donde aparecen los diferentes puntos muestreados. Fuente: modificado de Cuezva (2008).

106 4.2.4‐ CUEVA DE LASCAUX (FRANCIA)

En la cueva de Lascaux se realizaron dos muestreos. El primero fue el 16 de febrero de 2010 y el segundo el 21 de septiembre de 2010. Las muestras se recogieron sólo con el DUO SAS SUPER 360.

Se seleccionaron 9 puntos (Figura 46), 8 en el interior de la cavidad y uno en el exterior (punto 1). Las zonas que se muestrearon en la cueva fueron: la sala previa a la Sala de los Toros o SAS2 (punto 2), la Sala de los Toros (punto 3), la zona entre la Sala de los Toros y el Divertículo Axial (punto 4), el Divertículo Axial (punto 5), el Pasaje (punto 6), la zona entre el Pasaje, el Ábside y la Nave (punto 7), el Divertículo de los Felinos (punto 8) y el Pozo (punto 9).

5

4 8 6 7 3 2

9

1 Exterior

Figura 46‐ Plano de la cueva donde aparecen los puntos muestreados. Fuente: Norbert Aujoulat.

107 4.3‐ MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES

4.3.1‐ MEDIOS DE CULTIVO

Diclorán Rosa de Bengala Cloranfenicol Agar (DRBCA) Disolver 31,6 g de DRBC (Merck) en 1.000 mL de agua destilada. Autoclavar durante 20 minutos a 121° C.

Triptona‐Soja‐Agar (TSA) Disolver 20 g de BactoTM Agar (BD), 30 g de BactoTM Triptona (BD) en 1.000 mL de agua destilada. Autoclavar durante 20 minutos a 121° C.

TSA con cicloheximida (50 µg/mL) Preparar el TSA como se ha indicado anteriormente. Esterilizar y enfriar a 50 °C. Añadir la cicloheximida a una concentración final de 50 µg/mL.

Extracto de Malta‐Agar (MEA) Disolver 20 g de BactoTM extracto de malta (BD), 20 g de BactoTM Agar (BD) en 1.000 mL de agua destilada. Autoclavar durante 20 minutos a 121° C.

Luria‐Bertani (LB) Disolver 10 g de BactoTM Agar (BD), 5 g de extracto de levadura (Oxoid), 10 g de NaCl y 20 g de agar en 1.000 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8 y autoclavar a 121 °C

durante 20 minutos.

108 LB con ampicilina (100mg/mL) Preparar el medio LB, esterilizar y enfriar a 50 °C. Añadir 1 mL de una solución stock de ampicilina (100 mg/mL).

4.3.2‐ SOLUCIONES

Solución glicerol al 20 % (v/v) Mezclar 20 mL de glicerol (Merck) en 80 mL de agua destilada. Autoclavar durante 20 minutos a 121 °C.

Solución Tris‐HCl 1M (pH 8) Disolver 121,1 g de Base Tris [Tris (hidroximetil)‐ aminometano] en 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8,0 empleando HCl concentrado. Añadir agua destilada hasta un volumen final de 1.000 mL. Autoclavar durante 20 minutos a 121 °C.

Solución NaCl 5M Disolver 365,25 g de NaCl en 1.000 mL de agua destilada. Autoclavar durante 20 minutos a 121 °C.

Solución EDTA 0.5 M (pH 8)

Disolver 186,1 g de EDTA‐2H2O (Ácido etilendiaminotetraacético) en 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8,0 con NaOH y añadir agua destilada hasta un volumen final de 1.000 mL. Autoclavar durante 20 minutos a 121 °C.

109 Tampón TNE (10 mM Tris, pH8; NaCl; 1mM EDTA) Mezclar: 1 mL de Tris‐HCl 1M (pH 8), 2 mL de NaCl 5M, 0,2 mL de EDTA 0.5 M (pH 8) y 96,8 mL de agua destilada. Autoclavar durante 20 minutos a 121° C.

Solución cloroformo: isoamilalcohol (24:1) Mezclar 96 mL de cloroformo y 4 mL de isoamilalcohol.

Solución acetato de sodio 3M (pH 7) Disolver 49,2 g de acetato de sodio en 150 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7,0 con ácido acético glacial. Añadir agua destilada hasta un volumen final de 200 mL. Autoclavar durante 20 minutos a 121 °C.

Solución etanol al 70 % (v/v) Añadir 70 mL de etanol al 100 % a 30 mL de agua destilada.

Tampón TAE 50x (Tris‐ Acetato‐EDTA) Mezclar: 242 g de Base Tris, 57,1 mL de ácido acético glacial, 37,2 g de EDTA. Ajustar el volumen a 1.000 mL con agua destilada y autoclavar durante 20 minutos a 121 °C.

Tampón TAE 0,5x (pH 8.2) Añadir 10 mL de TAE 50x a 990 mL de agua destilada.

Tampón de carga para electroforesis Mezclar: 25 mL de glicerol al 100 %, 20 mL de EDTA 0,5M (pH 8,0), 25 mg de Azul de Bromofenol y 45 µL de SYBR Green I comercial.

110 Gel de agarosa al 1% (p/v) Añadir 1 g de agarosa en 100 mL de tampón TAE 0,5x.

111

CCaappííttuulloo 55 Capítulo 5

RRReeesssuuullltttaaadddooosss yyy DDDiiissscccuuusssiiióóónnn

En esta tesis se han empleado dos muestreadores de aire, el DUO SAS SUPER 360 y el Coriolis μ. Mientras que el primero se podía considerar idóneo a juzgar por la bibliografía revisada (Buttner y Stetzenbach, 1993; Coccia y col., 2010), el segundo, recientemente introducido en el mercado, presentó muchos problemas con su aplicación en el campo. Con el DUO SAS SUPER 360 se muestreó un volumen de aire de 100 L y con el Coriolis μ de 1.000 L (volúmenes seleccionados como óptimos, tal y como se describe en el capítulo de

Material y Métodos).

Para facilitar la comprensión de los resultados y su discusión se ha individualizado la presentación de los resultados obtenidos en cada cueva. En el caso de los resultados obtenidos con el Coriolis μ, debido a las limitaciones del equipo, sólo se pudo aplicar en las cuevas de Castañar de Ibor y Altamira.

113 555...111‐‐‐ AAAeeerrrooobbbiiiooolllooogggíííaaa dddeee lllaaa CCCuuueeevvvaaa dddeee CCaaassstttaaañññaaarrr dddeee IIIbbbooorrr (((EEExxxtttrrreeemmmaaaddduuurrraaa)))

5.1.1‐ MUESTREADOR DUO SAS SUPER 360

5.1.1.1‐ DIVERSIDAD DE HONGOS

La Tabla 5 muestra los resultados obtenidos durante el muestreo realizado el 29 de enero de 2009, cinco meses después del vertido accidental de materia orgánica. En esta tabla aparecen los recuentos totales de esporas fúngicas por metro cúbico de aire (UFC/m3) en cada una de las salas muestreadas, tanto en el interior de la cueva como en el exterior. Además se presentan las identificaciones de los hongos en cada una de las salas con el porcentaje de similitud y la estimación de su abundancia.

En las zonas visitables de la cueva se observó mayor cantidad de esporas en el aire que en las zonas no visitables, a excepción del Laberinto Sur que registró la mayor cantidad de esporas en el aire de toda la cueva. La sala limítrofe entre ambas zonas (Sala Blanca) presentó un elevado número de esporas (1.990 UFC/m3 aire). La mayor cantidad de esporas en la zona visitable se recogió en la zona del Pasillo, donde tuvo lugar el vertido accidental de materia orgánica

(vómito de un visitante) en agosto de 2008.

114 Tabla 5: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de los hongos del muestreo realizado en enero de 2009 en Castañar de Ibor (Extremadura).

UFC/m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Laberinto Sur 9.050 Pochonia chlamydosporia 100 % 99,9 (Punto 1) ± 106,1 Doratomyces stemonitis 100 % 0,01 Doratomyces stemonitis 100 % 50 Las Planchas 1.500 Cladosporium sp. 99 % 16,7 (Punto 2) ± 120,2 Geomyces pannorum 99 % 16,7 Mortierella humilis 82 % 16,6

VISITABLE Doratomyces stemonitis 100 % 95,09 Laberinto Norte 510

NO Paecilomyces lilacinus 100 % 3,73 (Punto 3) ± 14,1 Cladosporium sp. 100 % 1,18 ÁREA Doratomyces stemonitis 100 % 38,56 Lagos 490 Cladosporium sp. 100 % 30,82 (Punto 4) ± 113,1 Cladosporium cladosporioides 100 % 15,31 Pochonia chlamydosporia 100 % 15,31 Librería 450 Pochonia chlamydosporia 100 % 60 (Punto 5) ± 141,4 Doratomyces stemonitis 100 % 40 Penicillium sp. 100 % 78,24 Sala Blanca 1.990 ± Penicillium glabrum 100 % 20,90 (Punto 6) 311,1 Mucor racemosus 100 % 0,56 Doratomyces stemonitis 100 % 0,30 Penicillium commune 100 % 42,96

Penicillium crysogenum 100 % 34,04 Jardín 1.390 Penicillium glabrum 100 % 13,59 (Punto 7) ± 21,2 Penicillium sp.100 % 7,69 VISITABLE Doratomyces stemonitis 100 % 1,29

ÁREA Mucor racemosus 100 % 0,43 Penicillium sp. 100 % 72,26 Sala Nevada 1.370 Penicillium glabrum 100 % 25,4 (Punto 8) ± 275,8 Penicillium swiecickii 98 % 2,34 Penicillium sp. 100 % 88,88 Pasillo 2.220 Penicillium glabrum 100 % 7,25 (Punto 9) ± 63,6 Pochonia chlamydosporia 100 % 3,60 Mucor racemosus 100 % 0,27

115 Tabla 5 (continuación).

UFC /m3 IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS (media ± (% similitud) (%) desviación típica) Penicillium sp. 98 % 41,97

Pochonia chlamydosporia 100 % 30,74 Entrada cueva 1.220 Penicillium sp. 100 % 21,31 (Punto 10) ± 445.5 Penicillium glabrum 99 % 3,44 VISITABLE

Doratomyces stemonitis 100 % 1,72

ÁREA Penicillium swiecickii 98 % 0,82 Cladosporium sp. 100 % 86,67 Ceratobasidium sp. 99 % 6,14 Exterior cueva 1.710 Penicillium sp.100 % 5,08 (Punto 11) ± 99 Phaenochaete sordida 88 % 1,05 Botryotinia fuckeliana 100 % 0,53 Penicillium glabrum 100 % 0,53

Resulta excepcional la presencia casi exclusiva e inusualmente abundante de Pochonia chlamydosporia en el Laberinto Sur. Ello sólo puede explicarse por una anómala y masiva colonización y producción de esporas del hongo sobre un animal muerto o restos de materia orgánica. En las otras salas no visitables, el hongo más abundante fue Doratomyces stemonitis seguido del género Cladosporium como se puede comprobar en las Planchas, el Laberinto Norte y los Lagos.

Respecto a las salas de la zona visitable, en la Librería la especie más abundante fue Pochonia chlamydosporia, en la Sala Blanca y Jardín, Penicillium, aunque en estas salas sigue apareciendo Doratomyces stemonitis. En las demás salas, el género más abundante fue Penicillium. Otros géneros presentes fueron Mucor racemosus y

Pochonia chlamydosporia.

En el exterior de la cueva, el género más abundante fue Cladosporium. Otras especies minoritarias fueron Penicillum, 116 Ceratobasidium, Phanerochaete sordida y Botryotinia fuckeliana. Las especies de estos géneros suelen ser saprófitos y patógenos de plantas, como Ceratobasidium (Kataria, 1988) o Botryotinia fuckeliana (Leroux y col., 1999). Phanerochaete sordida es uno de los hongos cortícolas más común y aparece frecuentemente en los troncos de árboles caídos (Eriksson y col., 1978; Lim y col., 2000). La existencia de estos hongos en el exterior de la cavidad se comprende fácilmente ya que la cueva se encuentra en una zona rodeada de abundante vegetación.

En la Tabla 6 se recogen los resultados obtenidos en el muestreo del 15 de septiembre de 2009 (aproximadamente un año después del vertido de materia orgánica).

En este segundo muestreo, ocho meses después del anterior, la cantidad de esporas disminuyó considerablemente en las zonas visitables y no visitables. Un ejemplo de ello son las diferentes salas de la zona no visitable: en la zona de las Planchas la cantidad de esporas se redujo cinco veces, en la del Laberinto Norte diez veces, en la de los Lagos tres veces, en la Librería veintres veces y en la Sala Blanca trece veces. Esta reducción en la cantidad de esporas fúngicas en el aire también se aprecia en las zonas visitables, como por ejemplo en el Jardín, donde se redujo nueve veces, en la Sala Nevada diez veces, en el Pasillo tres veces, mientras que en la Entrada de la cueva se mantuvo más o menos igual.

117 Tabla 6: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de los hongos del muestreo realizado en septiembre de 2009 en Castañar de Ibor.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación ( % similitud) (%) típica) Laberinto Sur 310 Pochonia chlamydosporia 99 % 100 (Punto 1) ± 395.9 Pochonia chlamydosporia 99 % 95,31

Las Planchas 320 Cladosporium cladosporioides 3,13 (Punto 2) ± 113,1 100 % Trichosporon moniliiforme 99 % 1,56 VISITABLE Doratomyces stemonitis 100 % 80 Laberinto Norte 50 NO 10 (Punto 3) ± 28,3 Phoma glomerata 99 % Gymnoascus reesii 98 % 10 ÁREA Chaetomium nigricolor 100 % 83,33 Lagos 150 Chaetomium sp. 97 % 13,33 (Punto 4) ± 212,1 Doratomyces stemonitis 100 % 3,33 Librería 20 Pochonia chlamydosporia 99 % 100 (Punto 5) ± 21,2 Pochonia chlamydosporia 99 % 71,33 Doratomyces stemonitis 100 % 16,67 Sala Blanca 150 4 (Punto 6) ± 141,4 Alternaria alternata 96 % Gymnoascus reesii 98 % 4 Chaetomium nigricolor 100 % 4 Pochonia chlamydosporia 99 % 69,28 Doratomyces stemonitis 100 % 7,85

Trichosporon moniliiforme 99 % 5,71 Jardín 140 Aureobasidium pullulans 87 % 4,29 (Punto 7) ± 134,4 VISITABLE Chaetomium nigricolor 100 % 4,29 Geomyces pannorum 98.8 % 4,29 ÁREA Paecilomyces marquandii 97 % 4,29 Aspergillus ustus 99 % 53,85 Pochonia chlamydosporia 99 % 34,62 Sala Nevada 130 (Punto 8) ± 42,4 Doratomyces stemonitis 100 % 7,69 Cladosporium cladosporioides 3,84 100 % Pasillo 660 Pochonia chlamydosporia 99 % 100 (Punto 9) ± 799 Entrada cueva 1.330 Pochonia chlamydosporia 99 % 100 (Punto 10) ± 70,7

118 Tabla 6 (continuación).

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación ( % similitud) (%) típica) Alternaria alternata 100 % 40,81 Cladosporium cladosporioides 100 % 26,49 Alternaria sp. 99 % 11,89 Exterior cueva 370 Aureobasidium pullulans 99 % 8,92 (Punto 11) ± 452.5 Phoma macrostoma 100 % 5,95 Doratomyces stemonitis 100 % 2,97 Geomyces pannorum 98.8 % 2,97

Cinco meses después del vertido accidental de materia orgánica (enero de 2009), los hongos más abundantes fueron: Penicillium representando un 49 % y Pochonia con un 46 %, entre los dos representan un 95 % del total de UFC/m3 de aire considerando todas las salas muestreadas y seguidos por Doratomyces con un 4 %. El 1 % restante estaba compuesto por Cladosporium, Mucor, Paecilomyces, Geomyces y Mortierella. Sin embargo, doce meses después del incidente (septiembre de 2009), Pochonia aumentó hasta representar el 88 %, seguida de Chaetomium (5 %), Doratomyces (3 %) y Aspergillus (2 %). Cladosporium, Trichosporon, Gymnoascus, Paecilomyces, Geomyces, Aureobasidium y Phoma contribuyen todos juntos al 2 % restante.

Se debe señalar que los niveles de UFC de Pochonia chlamydosporia en este segundo muestreo pueden ser considerados “normales” y muy lejos de las excepcionales concentraciones encontradas en el Laberinto Sur, lo que confirma el resultado anómalo anterior

Comparando la aerobiología del interior de la cueva con la del exterior, en enero de 2009 Cladosporium representaba el 87 % de las

119 UFC/m3 de aire en el exterior, seguido de Penicillium (6 %) y Ceratobasidium (6 %). Sin embargo, en septiembre Alternaria representaba un 53 %, Cladosporium un 26 %, Aureobasidium un 9 %,

Phoma un 6 % y un 3 % para Doratomyces y Geomyces.

Considerando todas las salas, el total de UFC/m3 aire se redujo de enero a septiembre en un 73 %, confirmando que la ausencia de visitantes y el cierre de la cueva a largo plazo favorece una atmósfera con menor carga de microorganismos.

La diversidad encontrada en el aire es diferente de los resultados de los hongos crecidos sobre el sedimento de Jurado y col. (2010). En este trabajo se estudiaron diferentes muestras de la zona del vómito y otras de sedimento de otras zonas. Cinco meses antes, el brote fúngico estaba compuesto por Mucor circinelloides (67 %) y Fusarium solani (33 %). En el muestreo de enero de 2009, Jurado y col. (2010) encontraron que el crecimiento fúngico del sedimento de la cueva en la zona del Pasillo estaba compuesto por Fusarium (57,1 %), Doratomyces (2,4 %), Pochonia (14,3 %) y Cladosporium (7,1 %). Doratomyces microsporus se ha encontrado en excrementos de pequeños animales que habitan las cuevas (Nováková, 2009), y Pochonia chlamydosporia se ha encontrado colonizando insectos muertos en esta misma cueva (Jurado y col., 2010). Esto indica que su abundancia estaría relacionada con la estación de mayor abundancia de insectos (verano‐otoño) y la muerte de éstos en otoño‐invierno.

El género Pochonia ha sido muy abundante en todos los muestreos realizados, mientras que Penicillium no se detectó en el muestreo de septiembre. Según explicó Docampo y col. (2010) el género

120 Penicillium es común en el interior de las cuevas, mientras que el género Cladosporium proviene del exterior. En nuestro caso, la presencia de Penicillium podría ser una consecuencia del aporte accidental de materia orgánica ya que su abundancia disminuyó los meses posteriores al vertido.

La presencia de Pochonia en esta cueva está posiblemente relacionada con los insectos que la habitan. Pochonia chlamydosporia es un hongo común en esta cueva. También, este género ha sido aislado de hongos crecidos sobre rocas, moonmilk y del suelo exterior en la cueva de Altamira de (Jurado y col., 2009). Según Zare y col. (2001) P. chlamydosporia es un hongo nematófago, su origen en la cueva podría deberse a la presencia de nematodos en los sedimentos de esta cueva por ello no concuerda con el elevado numero de UFC en el Laberinto Sur, en el muestreo de enero de 2009. Por otra parte, Humber y col. (2009) lo describen como especie entomopatógena de coleópteros y lepidópteros, lo que confirmaría nuestra anterior aseveración.

5.1.1.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS

Mientras que para los hongos se realizaron dos muestreos, para las bacterias sólo se efectuó un único muestreo con el DUO SAS SUPER 360 durante el mes de septiembre de 2009, aproximadamente un año después del vertido accidental de materia orgánica.

Los resultados del muestreo de septiembre de 2009 se presentan en la Tabla 7, donde se recogen las UFC totales de bacterias/m3 de aire, las identificaciones y sus porcentajes de abundancia.

121 Tabla 7: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de las bacterias del muestreo realizado en septiembre de 2009 en la cueva de Castañar de Ibor.

UFC /m3 aire IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS (media ± (% similitud) (%) desviación típica) Bacillus litoralis 99 % 55,9 Acinetobacter lwoffii 100 % 20,8 Nocardia asteroides 100 % 15,9 Laberinto Sur 2.140 Streptomyces sp. 99 % 3 (Punto 1) ± 374,8 Bacillus weihenstephanensis 100 % 2,9 Micrococcus luteus 99 % 0,5

Pseudomonas oryzihabitans 99 % 0,5 Bacillus simplex 99 % 0,5 Nocardia asteroides 100 % 66,6 VISITABLE

Micrococcus luteus 99 % 20,5 NO Las Planchas 918 Streptomyces sp. 100 % 7,7 (Punto 2) ± 91,9 ÁREA Bacillus megaterium 100 % 2,6 Massilia timonae 99 % 2,6 Nocardia asteroides 100 % 46 Micrococcus luteus 99 % 39,9 Laberinto Norte 904 Streptomyces sp. 100 % 9,7 (Punto 3) ± 77,8 Arthrobacter oxydans 99 % 3,5 Bacillus simplex 99 % 0,9 Nocardia asteroides 100 % 42 Lagos Streptomyces sp. 100 % 30,9 501 Micrococcus luteus 99 % 20,9 (Punto 4) ± 339,4 Streptomyces sp. 100 % 4,6 Staphylococcus pasteuri 99 % 1,6 Micrococcus luteus 99 % 32,5

Nocardia asteroides 100 % 32,5 Librería 644 Streptomyces sp. 100 % 28,3 VISITABLE (Punto 5) ± 21,2 Microbacterium oxydans 98 % 3,3 Rhodococcus erythropolis 99 % 1,7 ÁREA Sporosarcina globispora 97 % 1,7 Nocardia asteroides 100 % 50,9 Micrococcus luteus 99 % 32 Sala Blanca 2.069 Streptomyces sp. 100 % 14,2 (Punto 6) ± 169,7 Rhodococcus erythropolis 99 % 1,6 Pseudomonas sp. 99 % 1,3

122 Tabla 7 (continuación).

UFC /m3 aire (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Streptomyces cyaneogriseus 98 % 34,2 Ensifer adhaerens 99 % 31,1 Jardín 1.176 Nocardia asteroides 100 % 19,4 (Punto 7) ± 459,6 Pseudomonas sp. 99 % 9,2 Bacillus megaterium 100 % 5,1 Tsukamurella pseudospumae 99 % 1 Microbacterium oxydans 98 % 39,7 Nocardia asteroides 100 % 28,1 Sala Nevada 938 Micrococcus luteus 99 % 16,2 (Punto 8) ± 367,7 Streptomyces sp. 100 % 12,2

Microbacterium flavescens 98 % 3,8 Rhodococcus erythropolis 99 % 28,3 Micrococcus luteus 99 % 26,4 VISITABLE

Arthrobacter oxydans 99 % 24,7

ÁREA Streptomyces sp. 100 % 8,4 Pasillo 2.083 Streptomyces cyaneogriseus 98 % 8,1 (Punto 9) ± 176,8 Bacillus sp. 99 % 1,4 Bacillus simplex 99 % 1,4 Tsukamurella pseudospumae 99 % 0,7 Pseudomonas stutzeri 99 % 0,3 Pseudomonas sp. 99 % 0,3 Nocardia asteroides 100 % 63,2 Entrada cueva 1.089 Viridibacillus arvi 100 % 29,8 (Punto 10) ± 374,8 Micrococcus luteus 99 % 3,5 Pseudomonas stutzeri 99 % 3,5 Ensifer adhaerens 99 % 70,8 Arthrobacter sp. 98 % 24,8 Bacillus litoralis 99 % 1,2 Curtobacterium flaccumfaciens 99 % 0,9 Exterior cueva 3.774 Bacillus megaterium 100 % 0,9 (Punto 11) ± 106,1 Bacillus weihenstephanensis 100 % 0,6 Pantoea agglomerans 99 % 0,6 Arthrobacter agilis 99 % 0,1 Streptomyces sp. 100 % 0,1

123 En general en la zona visitable la cantidad de bacterias en el aire es mayor que en la zona no visitable. La excepción es el Laberinto Sur que presenta un valor muy elevado y próximo al que aparece en el Pasillo. La zona donde tuvo lugar el vertido accidental, el Pasillo, es donde se registró la mayor concentración bacteriana de la cueva, sin tener en cuenta el exterior.

La especie Nocardia asteroides, es la mayoritaria en las Planchas, Laberinto Norte, Lagos, Librería, Sala Blanca y Entrada, presentando unas abundancias comprendidas entre el 32,5 y el 63,2 %. Esta especie también aparece en el Laberinto Sur, Sala Nevada y Jardín en menor proporción (15,9‐27,1 %). Está curiosamente ausente en el Pasillo y exterior de la cueva. Nocardia asteroides se encuentra en los suelos (Orchard y Goodfellow, 1980). Otras especies pertenecientes a este género han sido descritas en cuevas, Nocardia altamirensis (Jurado y col., 2008a) en la cueva de Altamira (Cantabria) o Nocardia speluncae (Seo y col., 2007) en una cueva coreana.

En otras zonas de la cueva, la bacteria anterior no fue la más abundante. Por ejemplo, en el Laberinto Sur la especie más abundante fue Bacillus litoralis. Este género también apareció en Las Planchas, el Jardín, el Pasillo y el exterior con unas abundancias comprendidas entre el 2,6 y el 5,1 %. Este género es ubicuo en la naturaleza, incluye especies tanto de vida libre como patógenas. Ha sido encontrado en cuevas como la de Altamira (Laiz y col., 1999), en rocas de abrigos de la Sierra de Cazorla (Laiz y col., 2000a), en la Grotta dei Cervi (Italia) (Laiz y col., 2000b) y en una cueva india

(Baskar y col., 2006).

124 En la Librería las especies más abundantes fueron Nocardia asteroides y Micrococcus luteus. El género Nocardia es relativamente frecuente en cuevas (Groth y col., 1999; Lee, 2006; Seo y col., 2007; Jurado y col., 2008a). Varias especies de este género han sido descritas como patógenas de humanos pudiendo causar nocardiosis (Betrán y col., 2009). Micrococcus luteus ha sido descrita en suelos (Orchard y Goodfellow, 1980), en la cueva de Altamira (Groth y col., 1999) y colonizando los espeleotemas de la Grotta dei Cervi (Italia) (Laiz y col., 2000b). Esta especie está relacionada con enfermedades cutáneas y afecta principalmente a pacientes inmunodeprimidos

(Salar y col., 1997).

En la Sala Nevada la especie más abundante fue Microbacterium oxydans. Este género apareció en las cuevas de Tito Bustillo, Altamira y Grotta dei Cervi (Groth y col., 1999, 2001). Esta especie se suele aislar del material hospitalario contaminado (Schumann y col., 1999). También apareció en ese mismo punto otra bacteria perteneciente al mismo género, Microbacterium flavescens, con una abundancia del 3,8 %, y que ha sido descrita en sedimentos contaminados (Dean‐

Ross y Cerniglia, 1996).

En el Jardín, la más abundante fue Streptomyces cyaneogriseus. Este género también aparece en casi todas las zonas de la cueva, a excepción de la entrada, aunque no es el más abundante. Esta especie ha sido detectada en la cueva de Altamira (Jurado y col.,

2009).

En el Pasillo la especie más abundante fue Rhodococcus erythropolis, aunque también apareció en la Sala Blanca y en la Librería con una

125 abundancia menor al 2 % en ambos casos. Esta especie ha sido aislada en cuevas del norte de España (Groth y col., 1999). Esta especie es capaz de crecer empleando el limoneno como fuente de carbono y energía. El limoneno es un monoterpeno, producto del metabolismo secundario de las plantas, volátil y muy abundante (van der Werf y col., 1999). También crece en condiciones oligotróficas (Ohhata y col., 2007) y degrada la lignocelulosa produciendo varios productos fenólicos monocíclicos (Ahmad y col., 2010)

En el exterior de la cueva la bacteria más abundante fue Ensifer adhaerens. Esta bacteria aparece en el suelo y es capaz de adherirse y lisar otras bacterias del suelo, a pesar de que no es un predador obligado (Casida, 1982). Curtobacterium flaccumfaciens sólo apareció en el exterior de la cueva. Esta especie es un patógeno de plantas (Maringoni y col., 2006). También se ha encontrado en la Cueva de los Murciélagos (Córdoba, España) (Urzi y col., 2010).

Viridibacillus arvi se detectó en la entrada de la cueva. Esta especie ha sido descrita en suelos con elevado contenido en materia orgánica

(Albert y col., 2007).

Las especies del género Arthrobacter aparecieron en el Laberinto Norte, Pasillo y exterior de la cueva. El género Arthrobacter es frecuente encontrarlo en cuevas (Khizhnyak y col., 2003). Especies psicrófilas pertenecientes a este género parecen ser las más abundantes y activas en el limo de cuevas (Gounot, 1967) y en la cueva de Altamira (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002a).

La especie Sporosarcina globispora apareció en la Librería. Este género es frecuente en ambientes subterráneos (Groth y Saiz‐ 126 Jimenez, 1999; Groth y col., 1999; Groth y col., 2001), marinos (Yoon y col., 2001) y en suelos (Kwon y col., 2007).

Tsukamurella pseudospumae sólo apreció en el Jardín y en el Pasillo y en ambos con una abundancia menor o igual al 1 %. Esta especie ha sido aislada de fangos activados (Nam y col., 2004).

Acinetobacter lwoffi apareció en el Laberinto Sur. Esta especie ha sido aislada en la superficie de rocas en dos abrigos en la Sierra de Cazorla (Jaén) (Laiz y col., 2000a), en la Grotta dei Cervi (Italia) (Laiz y col., 2000b), en las aguas de goteo en la cueva de Altamira (Laiz y col., 1999) y en túneles excavados en granito (comunicación personal de A.Z. Miller).

El género Pseudomonas fue encontrado en el Laberinto Sur, Jardín, Sala Blanca, Pasillo y Entrada. Este género abunda en el suelo (Cho y Tiedje, 2000). Ha sido encontrado en el suelo de la cueva de Lascaux (Bastián y col., 2009a; 2009c) y en una muestra de pigmento rojo de un bisonte de la Sala de Polícromos en la Cueva de Altamira

(Schabereiter‐Gurtner y col., 2002a).

La especie Pantoea agglomerans sólo apareció en el exterior de la cueva. Esta especie ha sido encontrada en tapetes microbianos de tres fuentes termales con alto contenido en azufre en la cueva de Lower Kane (EEUU) (Engel y col., 2004). Es una especie patógena que frecuentemente provoca enfermedades en humanos (Cruz y col.,

2007).

Staphylococcus pasteuri sólo apareció en Los Lagos. Esta especie forma parte de la comunidad microbiana de la cueva de Tito Bustillo

127 (Cantabria) (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002b) y es una bacteria habitual en piel y mucosas humanas (Madigan, 2005).

Massilia timonae fue encontrada en las Planchas. Ésta ha sido aislada en sangre de pacientes inmunodeprimidos (La Scola y col., 1998).

No se ha podido observar ningún patrón en la distribución de las bacterias en esta cueva, salvo la amplia distribución de Nocardia asteroides y Micrococcus luteus en nueve de los diez puntos muestreados.

5.1.2‐ MUESTREADOR Coriolis μ

5.1.2.1‐ DIVERSIDAD DE HONGOS

La muestra analizada corresponde a la zona exterior de la cueva y ésta fue tomada en septiembre de 2009. El motivo de presentar una única muestra es que en una etapa inicial y de comprobación del funcionamiento del aparato se seleccionó un punto con elevada concentración de esporas (demostrado previamente con un análisis del DUO SAS SUPER 360) para comprobar las prestaciones del aparato. Una vez observada la idoneidad del método se aplicarían a diferentes muestras del interior de la cueva.

Los resultados obtenidos del análisis de los clones a nivel de especie (97%) de 96 secuencias analizadas se agruparon en 39 OTUs diferentes, y éstos representaron una cobertura del 68,15 %.

128 En la Tabla 8 se recogen las identificaciones de las secuencias más representativas de cada OTU según las bases de datos del NCBI, el organismo cultivable más cercano, su número de acceso y su abundancia.

Tabla 8: Afiliaciones de las Unidades Taxonómicas Operativas (OTUs) de hongos de la muestra de Castañar de Ibor.

Organismo cultivable más Similitud Abundancia OTU representativo cercano (Nº acceso) (%) (%)

I Alternaria azukiae (FJ467366) 77 1,04

II Alternaria alternata (GQ169728) 91 1,04

III Alternaria alternata (FJ872066) 100 22,92

IV Alternaria sp. (FJ210490) 99 2,08

V Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

VI Alternaria sp. (FJ210490) 99 6,25

VII Alternaria sp. (FJ210490) 100 1,04

VIII Alternaria sp. (FJ210490) 99 5,21

IX Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

X Alternaria sp. (FJ210490) 100 2,08

XI Alternaria sp. (FJ210490) 99 6,25

XII Alternaria sp. (FJ210490) 99 3,13

XIII Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XIV Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XV Alternaria sp. (FJ210490) 98 1,04

XVI Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XVII Alternaria sp. (FJ210490) 99 4,17

XVIII Alternaria sp. (FJ210490) 99 3,13

129 Tabla 8 (continuación).

Organismo cultivable más cercano Similitud Abundancia OTU representativo (Nº acceso) (%) (%)

XIX Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XX Alternaria sp. (FJ210490) 99 3,13

XXI Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XXII Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XXIII Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XXIV Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XXV Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XXVI Alternaria sp. (FJ210490) 99 3,14

XXVII Alternaria sp. (FJ210490) 98 1,04

XXVIII Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XXIX Alternaria sp. (FJ210490) 100 2,08

XXX Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XXXI Alternaria sp. (FJ210490) 76 1,04

XXXII Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XXXIII Alternaria sp. (FJ210490) 99 1,04

XXXIV Alternaria sp. (FJ210490) 99 3,14

XXXV Alternaria sp. (HQ166334) 83 1,04

XXXVI cf. Ascomycota sp. F020 (HQ026495) 99 6,25

XXXVII cf. Ascomycota sp. F020 (HQ026495) 99 2,08

XXXVIII cf. Ascomycota sp. F020 (HQ026495) 99 1,04

Coscinocladium gaditanum XXXXIX 89 1,04 (AY449721)

130 Se detectaron los géneros Alternaria (89,59 %), Coscinocladium (1,04 %) y cf. Ascomycota sp. (9,37 %) (Figura 47). Se recuerda que el DUO SAS SUPER 360 detectó Alternaria (52,70 %), Cladosporium cladosporioides (26,49 %), Aureobasidium pullullans (8,92 %), Phoma macrostoma (5,95 %), Doratomyces stemonitis (2,97 %) y Geomyces pannorum (2,97 %) (Tabla 6 y Figura 48).

Coscinocladium Alternaria gaditanum azukiae (1%) (1%) cf. Ascomycota (9%)

Alternaria alternata (24%) Alternaria sp. (65%)

Figura 47‐ Gráfico de sectores en el que se representan las identificaciones de los clones y su abundancia en la muestra tomada con el Coriolis μ en el exterior de la cueva de Castañar de Ibor.

131 Doratomyces Geomyces stemonitis pannorum (3%) (3%) Phoma macrostoma (6%)

Aureobasiduim pullulans (9%) Alternaria alternata (41%) Alternaria sp. (12%)

Cladosporium cladosporioides (26%)

Figura 48‐ Gráfico de sectores en el que se representan las identificaciones y sus porcentajes en la muestra tomada con el DUO SAS SUPER 360 en el exterior de la cueva de Castañar de Ibor.

Con el muestreador DUO SAS SUPER 360 se detectaron seis géneros distintos mientras que con el Coriolis sólo se observaron tres. La especie Alternaria alternata que prácticamente representaba el 41 % en el DUO SAS SUPER 360, alcanzó un 24 % en el Coriolis μ. Alternaria sp., que representó el 12 % en el DUO SAS, en este caso aumentó a un 65 % en el Coriolis µ. El número de clones seleccionados y secuencias fue similar al empleado para estudiar la diversidad microbiana en otras muestras naturales de ambientes subterráneos y suele proporcionar unos resultados representativos de la comunidad microbiana.

132 5.1.2.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS

El muestreo de bacterias se realizó en las mismas condiciones y lugar que el de hongos.

Al analizar las 96 secuencias de los clones a nivel de especie (97%) éstas se agruparon en 88 OTUs diferentes, que representaban el

14,58 % de la cobertura de la muestra.

En la Tabla 9 se recogen los resultados del BLAST de las secuencias representativas de cada OTU, el organismo cultivable más cercano, su número de acceso y su abundancia.

133 Tabla 9: Afiliaciones de las Unidades Taxonómicas Operativas (OTUs) de bacterias de la muestra de Castañar de Ibor.

Organismo cultivable más Simillitud Abundancia OTU representativo cercano (Nº acceso) (%) (%)

I Erwinia amylovora (U80195) 66.157 1,04

II Escherichia coli (EU014689) 94.203 1,04

III Escherichia coli (EU014689) 90.194 1,04

IV Escherichia coli (EU014689) 93.880 1,04

V Escherichia coli (EU014689) 97.884 1,04

VI Escherichia coli (EU014689) 97.219 1,04

VII Escherichia coli (EU014689) 95.549 1,04

VIII Escherichia coli (EU014689) 77.476 1,04

XIX Escherichia coli (EU014689) 97.156 1,04

X Escherichia coli (EU014689) 98.095 1,04

XI Escherichia coli (EU014689) 98.559 1,04

XII Escherichia coli (EU014689) 97.368 1,04

XIII Escherichia coli (EU014689) 97.477 1,04

XIV Escherichia coli (EU014689) 97.914 1,04

XV Escherichia coli (EU014689) 97.436 1,04

XVI Escherichia coli (EU014689) 94.843 1,04

XVII Escherichia coli (EU014689) 98.607 1,04

XVIII Escherichia coli (EU014689) 97.475 1,04

XIX Escherichia coli (EU014689) 98.698 1,04

XX Escherichia coli (EU014689) 95.934 1,04

XXI Escherichia coli (EU014689) 79.104 1,04

XXII Escherichia coli (EU014689) 90.856 1,04

XXIII Escherichia coli (EU014689) 95.880 1,04

134 Tabla 9 (continuación).

Organismo cultivable más Simillitud Abundancia OTU representativo cercano (Nº acceso) (%) (%)

XXIV Escherichia coli (EU014689) 79.272 1,04

XXV Escherichia coli (EU014689) 95.960 1,04

XXVI Escherichia coli (EU014689) 98.675 1,04

XXVII Escherichia coli (EU014689) 98.174 1,04

XXVIII Escherichia coli (EU014689) 78.261 1,04

XXIX Escherichia coli (EU014689) 95.921 1,04

XXX Escherichia coli (EU014689) 97.935 1,04

XXXI Escherichia coli (EU014689) 97.619 1,04

XXXII Escherichia coli (EU014689) 97.441 1,04

XXXIII Escherichia coli (CP001164) 69.742 1,04

XXXIV Escherichia coli (EU014689) 98.975 2,08

XXXV Escherichia coli (EU014689) 98.322 1,04

XXXVI Escherichia coli (EU014689) 93.735 1,04

XXXVII Escherichia coli (EU014689) 93.735 1,04

XXXVIII Escherichia coli (EU014689) 96.782 1,04

XXXIX Escherichia coli (EU014689) 96.782 1,04

XL Escherichia coli (EU014689) 98.748 1,04

XLI Escherichia coli (EU014689) 96.698 1,04

XLII Escherichia coli (EU014689) 98.619 2,08

XLIII Escherichia coli (EU014689) 98.527 1,04

XLIV Escherichia coli (EU014689) 97.420 1,04

XLV Escherichia coli (EU014689) 99.334 4,17

XLVI Escherichia coli (EU014689) 98.969 1,04

XLVII Escherichia coli (EU014689) 95.303 1,04

XLVIII Escherichia coli (CP001164) 97.114 1,04

135 Tabla 9 (continuación).

Organismo cultivable más Simillitud Abundancia OTU representativo cercano (Nº acceso) (%) (%)

XLIX Escherichia coli (CP001164) 98.929 1,04

L Escherichia coli (CP001164) 96.116 1,04

LI Escherichia coli (CP001164) 96.034 1,04

LII Escherichia fergusonii (CU928158) 60.725 1,04

LIII Escherichia fergusonii (CU928158) 88.100 1,04

LIV Escherichia fergusonii (CU928158) 96.851 1,04

LV Eudoraea adriatica (AM745437) 55.618 1,04

Salmonella enterica subsp. salamae LVI 65.912 1,04 (EU014685)

Salmonella enterica subsp. LVII 85.714 1,04 diarizonae (EU014688)

LVIII Shigella boydii (AB273731) 95.804 1,04

LIX Shigella boydii (AB273731) 96.698 1,04

LX Shigella boydii (AB273731) 96.875 1,04

LXI Shigella boydii (AB273731) 98.269 1,04

LXII Shigella boydii (AB273731) 99.290 2,08

LXIII Shigella boydii (AB273731) 98.187 1,04

LXIV Shigella boydii (AB273731) 87.971 1,04

LXV Shigella boydii (AB273731) 98.734 1,04

LXVI Shigella boydii (AB273731) 95.212 1,04

LXVII Shigella boydii (AB273731) 96.698 1,04

LXVIII Shigella boydii (AB273731) 81.461 1,04

LXIX Shigella boydii (AB273731) 98.189 1,04

LXX Shigella boydii (AB273731) 97.047 1,04

136 Tabla 9 (continuación).

Organismo cultivable más Simillitud Abundancia OTU representativo cercano (Nº acceso) (%) (%)

LXXI Shigella dysenteriae (X96966) 74.828 1,04

LXXII Shigella flexneri (X96963) 90.774 1,04

LXXIII Shigella flexneri (X96963) 89.812 1,04

LXXIV Shigella sonnei (AB273732) 96.401 1,04

LXXV Shigella sonnei (AB273732) 98.184 1,04

LXXVI Shigella sonnei (AB273732) 94.761 1,04

LXXVII Shigella sonnei (AB273732) 95.894 1,04

LXXVIII Shigella sonnei (AB273732) 96.433 1,04

LXXIX Shigella sonnei (AB273732) 99.177 1,04

LXXX Shigella sonnei (AB273732) 96.961 1,04

LXXXI Shigella sonnei (AB273732) 94.761 1,04

LXXXII Shigella sonnei (AB273732) 99.015 2,08

LXXXIII Shigella sonnei (AB273732) 96.992 1,04

LXXXIV Shigella sonnei (AB273732) 97.509 1,04

LXXXV Shigella sonnei (AB273732) 97.004 1,04

LXXXVI Shigella sonnei (AB273732) 95.918 1,04

LXXXVII Shigella sonnei (AB273732) 98.338 2,08

Trabulsiella odontotermitis LXXXVIII 74.696 1,04 (DQ453129)

En orden de abundancia las bacterias detectadas fueron Escherichia spp. (62 %), Shigella spp. (34 %), Salmonella enterica (2,08 %), Trabulsiella odontotermitis (1,04 %), Erwinia amylovora (1,04 %) y Eudoraea adriatica (1,04 %) (Figura 49). La cantidad de Escherichia encontrada en el aire fue de casi el doble de la encontrada de Shigella. Comparando los resultados obtenidos con este muestreador 137 de aire y los obtenidos en el mismo punto con el muestreador DUO SAS SUPER 360, con este último fueron detectados: Ensifer adhaerens (70,8 %), Arthrobacter sp. (24,9 %), Bacillus sp. (2,7 %), Curtobacterium flaccumfaciens (0,9 %) y Pantoea agglomerans (0,6 %) (Tabla 7 y Figura 50).

Eudoraea adriatica Erwinia amylovora (1%) (1%) Salmonella enterica (2%)

Shigella spp. (34%) Escherichia spp. (62%)

Figura 49‐ Gráfico de sectores en el que se representan las identificaciones y abundancias de los clones de la muestra tomada con el Coriolis μ.

138 Curtobacterium Patoea agglomerans flaccumfaciens (0,6 %) Streptomyces sp. (1%) (0,1%) Bacillus sp. (3%)

Arthrobacter sp. (25%)

Ensifer adhaerens (71%)

Figura 50‐ Gráfico de sectores en el que se representan las identificaciones sus porcentajes de la muestra tomada con el DUO SAS SUPER 360.

Comparando los resultados obtenidos con los dos muestreadores se observa que las especies obtenidas en cada caso son diferentes. El valor de cobertura de esta muestra es del 14,58 %, lo que implica que se ha detectado una parte poco representativa de la comunidad.

139 555...222--- AAAeeerrrooobbbiiiooolllooogggíííaaa dddeee lllaaa CCCuuueeevvvaaa dddeee AArrrdddaaallleeesss (((AAAnnndddaaallluuucccíííaaa)))

5.2.1‐ MUESTREADOR DUO SAS SUPER 360

5.2.1.1‐ DIVERSIDAD DE HONGOS

En la cueva de Ardales se realizaron dos muestreos, uno en el mes de marzo de 2010 (después de una visita de 32 personas) y otro en el mes de abril del mismo año (sin visitas previas en los dos días anteriores). Se muestrearon cuatro puntos de la cueva siguiendo el procediemiento descrito en el Capítulo 4 (Material y Métodos).

En la Tabla 10, se recogen las UFC totales/m3 aire en los cuatro puntos muestreados en marzo de 2010 tras una visita de 32 personas durante 90 minutos. El punto donde se detectó mayor cantidad de esporas fue en la zona del Calvario seguido de la entrada de la cueva.

El género más abundante en el Calvario fue Penicillium, así como en la entrada de la cueva. Sin embargo, Cladosporium apareció en todos los puntos muestreados y es el más abundante en el exterior.

140 Tabla 10: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de los hongos del muestreo de marzo de 2010 (después de una visita) en Ardales.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica)

Penicillium chrysogenum 100 % 97,8 NO Sala del Calvario 1.010 Alternaria sp. 98 % 1,6 (Punto 1) ± 100 ÁREA VISITABLE Cladosporium sp. 100 % 0,6 Sala de las Estrellas 40 Aspergillus sp. 100 % 75

(Punto 2) ± 0 Cladosporium cladosporioides 100 % 25

VISITABLE Penicillium corylophilum 100 % 71,8 Entrada cueva 330 Penicillium chrysogenum 100 % 18,8 ÁREA (Punto 3) ± 28,2 Cladosporium cladosporioides 100 % 9,4 Cladosporium cladosporioides 100 % 51,6 Exterior cueva 620 Cladosporium cucumerinum 99 % 42,6 (Punto 4) ± 40 Penicillium digitatum 100 % 5,8

Los principales géneros que aparecieron en el aire de la cueva fueron: Aspergillus, Penicillium, Cladosporium y Alternaria. Éstos son los hongos más abundantes tanto en ambientes interiores como exteriores (Docampo y col., 2010, 2011). La presencia de Cladosporium en la cueva apunta a una fuerte influencia de las puertas abiertas y al establecimiento de un flujo de aire desde el exterior al interior, durante las visitas, transportando una gran cantidad de esporas. Las esporas de Cladosporium disminuyeron desde la entrada al interior de la cueva. Por el contrario, la cantidad de esporas de Penicillium fue mayor al final de la escalera de la entrada y se concentró en la zona del Calvario, al final de la cueva. Docampo y col., 2010 mostraron que Aspergillus y Penicillium son los géneros de hongos más abundantes en la cueva de Nerja y la tendencia encontrada en esta cueva de Ardales apoya sus datos, particularmente cuando el número de visitantes era elevado y la corriente de aire era máxima. La presencia del género Alternaria, un

141 hongo que normalmente aparece en el exterior, en la zona del Calvario se explicaría igualmente por el transporte mediante las corrientes de aire y las visitas.

Las dos especies más abundantes en el interior de la cueva, en términos de concentración de esporas, fueron Penicillium chrysogenum y Penicillium corylophilum. Ambas especies han sido encontradas en cuevas de todo el mundo (Grishkan y col., 2004; Semikolennykh y col., 2005; Nováková, 2009; Vaughan y col., 2011). Por otro lado, Penicillium corylophilum, que apareció en la entrada de la cueva, ha sido descrito como hongo entomopatógeno de insectos (Da Costa y col., 2003), y su origen podría deberse a que al abrir la puerta para permitir el acceso de las visitas podrían entrar insectos al interior de la cavidad. Sin embargo Penicillium digitatum, que aparece en el exterior de la cueva, es patógeno de plantas (Holmes y Eckert, 1999). Su presencia debe estar relacionada con el hecho de que la cueva de Ardales se localiza en una zona elevada y rodeada de vegetación. Cladosporium cladosporioides fue comparativamente menos frecuente en el interior de la cueva. Sin embargo es el género más abundante en el exterior de la misma. Dentro de este género se engloban algunas especies fitopatógenas y la mayoría saprófitas de vegetación o del suelo. Es un género de distribución cosmopolita, siendo uno de los taxones más aislado y abundante en los recuentos aerobiológicos de todo el mundo (Fernández‐González y col., 1993; Aira y col., 2003; Halwagy, 1994).

La Tabla 11 recoge las UFC totales/m3 aire en los cuatro puntos estudiados durante el muestreo llevado a cabo en abril de 2010 tras

142 dos días sin visitas en la cueva. Se aprecia que la cantidad de UFC/m3 aire se ha reducido considerablemente.

Tabla 11: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de los hongos del muestreo de abril de 2010 (después de dos días sin visitas) en Ardales.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica)

NO Sala del Calvario 10 Arthrinium sp. 99 % 100 (Punto 1) ± 7 ÁREA VISITABLE

Penicillium sp. 99 % 35 Sala de las Estrellas 40 Cladosporium cladosporioides 100 32,5 (Punto 2) ± 21,2 % VISITABLE

Aspergillus sp. 100 % 32,5

ÁREA Entrada cueva 80 Aspergillus sp. 100 % 62,5 (Punto 3) ± 84,9 Penicillium chrysogenum 100 % 37,5 Penicillium sp. 99 % 30 Cladosporium sp. 100 % 30 Alternaria sp. 98 % 10 Exterior cueva 50 (Punto 4) ± 7 Alternaria alternata 98 % 10 Cladosporium cladosporioides 10 100 % Chalara microchona 99 % 10

En el muestreo efectuado en marzo (tras la visita) sólo fueron detectados cuatro géneros (Penicillium, Alternaria, Cladosporium y Aspergillus); en el muestreo de abril fueron detectados en el exterior otros cuatro géneros diferentes (Arthrinium, Penicillium,

Cladosporium y Aspergillus).

En la Sala de las Estrellas el género más abundante fue Penicillium y en la Entrada el género Aspergillus. En el exterior Penicillium representa un porcentaje inferior, siendo el género mayoritario Cladosporium, también presente en la Sala de las Estrellas.

143 Las medidas de la concentración de esporas en los dos muestreos efectuados en la cueva de Ardales muestran el efecto de las visitas.

El mayor impacto de las visitas se registró en la Sala del Calvario, mientras que en la Sala de las Estrellas se registró el más bajo. La entrada de visitantes aumenta cien veces la cantidad de esporas en en la Sala del Calvario, indicando que es la zona más afectada. Sin embargo en la entrada, las visitas aumentan cuatro veces la cantidad de esporas en el aire. En la Sala de las Estrellas, la cantidad permanece inalterable, debido al gran volumen de esta sala y al efecto de dilución.

Los hongos identificados después de varios días sin visitas en la cueva, muestran un patrón diferente. Las bajas concentraciones de Aspergillus, Penicillium y Cladosporium son similares en el final de la escalera de entrada y en la Sala de las Estrellas. Como se ha mencionado anteriormente, son los hongos más abundantes tanto en ambientes interiores como exteriores (Docampo y col., 2010, 2011). Sin embargo, la aparición de Arthrinium en la zona del Calvario después de varios días sin visitas resulta de especial interés. Este es un hongo cosmopolita que ha sido encontrado en suelos y en material vegetal en descomposición, cuyas esporas son dispersadas por el viento. Arthrinium ha sido previamente encontrado en el aire, sedimentos, guano de murciélagos y excrementos de lombrices de tierra en cuevas de Eslovaquia (Nováková, 2009) y fue bastante abundante en Kartchner Caverns, Arizona (Vaughan y col., 2011). En la cueva de Ardales la presencia de murciélagos, roedores y pequeños mamíferos (que han sido vistos durante las campañas de muestreo) apuntan a un origen similar para este hongo. Durante este 144 muestreo en el exterior de la cueva se ha encontrado Chalara microchona, hongo que crece sobre madera (Gams y Holubová‐ Jechová, 1976), elemento que abunda en el exterior de la cueva, ya que ésta está rodeada de vegetación.

En general, los datos de la aerobiología reflejan la importancia de la apertura de las puertas para permitir la entrada de las visitas y el tiempo que éstas permanecen abiertas, todo ello afectando a la aerobiología de la cueva.

5.2.1.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS

Durante el muestreo efectuado en marzo de 2010, tras la visita de 32 personas durante 90 minutos, se registró el mayor número de bacterias en la entrada de la cueva, seguido de la Sala de las Estrellas; la menor cantidad se registró en la Sala del Calvario (Tabla 12).

En los puntos muestreados en el interior de la cueva, el género más abundante fue Bacillus.

El género Streptomyces presente en la Sala del Calvario y Entrada presentó una distribución irregular. La especie más abundante fue Streptomyces zaomyceticus (48,9 %) seguida de Streptomyces avidinii

(4,9 %) y Streptomyces sp. (11,7 %).

145 Tabla 12: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de las bacterias del muestreo de marzo de 2010 (después de una visita) en Ardales.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica)

Bacillus sp. 99 % 65

NO Escherichia coli 98 % 11,7 Sala del Calvario 60

ITABLE (Punto 1) ± 70,7 S Streptomyces zaomyceticus 99 % 11,7 ÁREA VI Streptomyces sp. 99 % 11,7 Bacillus sp. 98 % 35,1 Sala de las Estrellas 330 Micrococcus luteus 99 % 29,7 (Punto 2) ± 205,1 Hydrogenophaga intermedia 99 % 17,6 Bacillus sp. 98 % 17,6

Streptomyces zaomyceticus 99 % 37,2 Bacillus simplex 99 % 28,5 Streptomyces avidinii 99 % 4,9 VISITABLE

Bacillus idriensis 99 % 4,9

ÁREA Entrada cueva 430 Bacillus sp. 98 % 4,9 (Punto 3) ± 367,7 Bacillus weihenstephanensis 99 % 4,9 Arthrobacter methylotrophus 98 % 4,9 Escherichia coli 98 % 4,9 Paenibacillus lautus 98 % 4,9 Acinetobacter sp. 99 % 35,5 Lysinibacillus sphaericus 99 % 21,5 Exterior cueva 120 (Punto 4) ± 42,4 Shigella sonnei 99% 14,1 Streptomyces sp. 99 % 14,1 Bacillus simplex 100 % 7,4

En la Sala de las Estrellas aparecieron las especies Micrococcus luteus e Hydrogenophaga intermedia. La primera de estas especies aparece en suelos (Orchard y Goodfellow, 1980), pero también fue encontrada anteriormente en la Grotta dei Cervi, Italia (Laiz y col., 2000b), en Altamira (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002a), en abrigos con arte rupestre en la Sierra de Cazorla (Jaén) (Laiz y col., 2000a). La segunda de las especies, Hydrogenophaga intermedia, pertenece a un género cuyos miembros son quimio‐organotrofos o

146 quimiolitoautotrofos, usan la oxidación de H2 como fuente de energía y CO2 como fuente de carbono (Wen y col., 1999; Spring y col., 2004).

En la zona del interior de la cueva, concretamente en el Calvario y en la entrada, fue identificada Escherichia coli. Se trata de una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por lo tanto en las aguas fecales. Su origen podría deberse a los excrementos del ganado que pasta en los prados cercanos a la cueva, que llegarían a ésta en las aguas de infiltración del suelo que está inmediatamente encima de la cueva, como se comprobó anteriormente en la cueva de Altamira (Laiz y col., 1999) y las gotas, al colisionar contra el suelo, dispersarían las bacterias incluídas en los aerosoles.

En la zona de la entrada aparecieron Arthrobacter methylotrophus y Paenibacillus lautus. El género Arthrobacter ha sido detectado anteriormente en la cueva de Altamira (Schabereiter‐Gurtner y col., 2002a), Tito Bustillo (Groth y col., 1999) y Grotta dei Cervi (Laiz y col., 2000b). Es frecuente encontrarlo en el suelo, agua y en la piel humana (Koch y col., 1995). La especie Paenibacillus lautus forma esporas y ha sido descrita en suelos y en el tracto intestinal humano

(Heyndrickx y col., 1996).

En el exterior de la cueva la especie más abundante fue Acinetobacter sp. Este género ha sido descrito anteriormente en la cueva de Altamira (González y col., 2003). También aparece en suelos donde contribuye a su mineralización y en el agua (Baumann, 1968); algunas especies son las causantes de infecciones en pacientes inmunodeprimidos (Gerischer, 2008). Por otro lado, se identificó

147 Shigella sonnei con una abundancia del 14,1 %. Su hábitat natural son ambientes con un pH bajo como el tracto gastrointestinal de humanos. Esta especie es altamente patógena y puede causar shigelosis (Boumghar‐Bourtchai y col., 2008). En este mismo punto también aparece Lysinibacillus sphaericus (la segunda bacteria detectada más abundante en esta zona). Ha sido descrita en suelos (Ahmed y col., 2007).

Al contrario que en el interior de la cueva, Bacillus no fue el género más abundante en el exterior.

En el otro muestreo llevado a cabo en abril de 2010, tras dos días sin visitas en la cueva (Tabla 13), se observa que los valores de esporas en el aire han disminuído considerablemente con respecto a los valores del muestreo del mes anterior en la zona del Calvario y en la entrada. En la Sala del Calvario, los valores se redujeron seis veces y en la entrada casi tres veces. Por el contrario en la Sala de las Estrellas aumentaron y en el exterior de la cueva los valores se han mantenido casi iguales. Hay que destacar que este hecho es contradictorio al obtenido con los hongos, en los que se observó una clara influencia de las visitas en la cantidad de esporas del aire.

En este muestreo, la mayor concentración de bacterias se registró en la Sala de las Estrellas donde se observó la mayor actividad de roedores. En ausencia de visitas, la actividad de roedores es máxima.

148 Tabla 13: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de las bacterias del muestreo de abril de 2010 (después de dos días sin visitas) en Ardales.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica)

NO Sala del Calvario 10 Arthrobacter methylotrophus 98 % 100 (Punto 1) ± 7,1 ÁREA VISITABLE

Streptomyces avidinii 99 % 80,5 Paracoccus sp. 99 % 9,3 Bacillus sp. 99 % 1,7 Sala de las Estrellas 580 Bacillus sp. 98 % 1,7 (Punto 2) ± 572,8 Bacillus simplex 99 % 1,7

Escherichia coli 98 % 1,7 Pseudomonas vancouverensis 98 % 1,7 VISITABLE

Streptomyces zaomyceticus 99 % 1,7 Streptomyces avidinii 99 % 41,3 ÁREA Microbacterium phyllosphaerae 99 % 24 Entrada cueva 150 Streptomyces sp. 99 % 17,3 (Punto 3) ± 127,3 Arthrobacter methylotrophus 98 % 8,7 Bacillus simplex 99 % 8,7 Oerskovia paurometabola 99 % 25,3 Escherichia coli 98 % 20 Bacillus sp. 98 % 14,1 Exterior cueva 170 (Punto 4) ± 120,2 Bacillus simplex 99 % 13,5 Rothia amarae 99 % 12,9 Arthrobacter methylotrophus 98 % 7,1 Planococcus sp. 99 % 7,1

Mientras que el género Bacillus estuvo presente en la entrada de la cueva y la Sala de las Estrellas, su abundancia ha disminuido con respecto al muestreo efectuado con visitas. Así en la Sala de las Estrellas Bacillus alcanzó una abundancia del 5,8 % mientras que en la Entrada alcanzó una abundancia del 8,7 %, siendo reemplazado por el género Streptomyces con un 82,2 % en la Sala de las Estrellas y un 58,6 % en la Entrada de la cueva. Mientras que en el muestreo con 149 visitas Streptomyces zaomyceticus alcanzó una abundancia de 11,7 % en la Sala del Calvario y de 37,2 % en la Entrada de la cueva, Streptomyces avidinii sólo mostró un 4,9 % de abundancia en la Entrada. Sin embargo, en el muestreo sin visitas Streptomyces avidinii alcanzó un 80,5 % en la Sala de las Estrellas frente a un 1,7 % del Streptomyces zaomyceticus y un 41,3 % en la Entrada de la cueva. Es interesante esta inversión en las dos especies del género

Streptomyces en función de la presencia o ausencia de visitantes.

Arthrobacter methylotrophus fue la única especie presente en la Sala del Calvario en el muestreo sin visitas y también en la Entrada de la cueva. Curiosamente Arthrobacter methylotrophus se encontró en el exterior de la cueva con una abundacia del 7,1 %. Esta especie de Arthrobacter se caracteriza por utilizar dimetilsulfona (Borodina y col., 2002).

Después de las visitas, en el Calvario se registró una concentración menor que en la Sala de las Estrellas sin visitas. El número de esporas de Bacillus fue bajo cuando en la cueva no había visitas. Este comportamiento fue similar al registrado por los hongos, pudiéndose interpretar que las esporas de Bacillus presentan un patrón de dispersión similar al de las esporas de los hongos, mientras que otras bacterias se dispersan asociadas a partículas.

Las especies de los géneros Arthrobacter, Streptomyces, Paracoccus, Oerskovia, Planococcus y Pseudomonas no presentaron patrones relevantes y se pueden encontrar ocasionalmente en cualquier sala. Estos géneros suelen encontrarse en el suelo (Koch y col., 1995; Witt

150 y col., 1990; Siller y col., 1996; Mann y col., 1978; Shivaji y col., 1988;

Cho y col., 2000).

La especie Microbacterium phyllosphaerae que únicamente fue detectada en la entrada está asociada a la filosfera del pasto (Behrendt y col., 2001) y su origen se encontraría en el exterior de la cueva.

Escherichia coli también es relativamente abundante en el exterior. Esto se debe a que los alrededores de la cueva son una zona de pasto de ganado. Esta bacteria ha sido encontrada aleatoriamente en todos los puntos de muestreo (considerando los dos muestreos), independientemente de los visitantes. También las actividades de los roedores y los murciélagos en el interior de la cueva pueden contribuir a su dispersión.

Por otro lado, Rothia amarae apareció, igual que Escherichia coli, en el exterior de la cavidad. Esta especie ha sido encontrada en aguas residuales (Fan y col., 2002) y su origen podría ser el mismo que el de la especie anterior, relacionado con el ganado que frecuenta los alrededores de la cueva.

En esta cueva se ha encontrado crecimiento bacteriano en las estalactitas, estalagmitas, rocas y sedimentos (Stomeo, 2008; Stomeo y col., 2007, 2008 y 2009). Estos autores establecieron que el filo Actinobacteria era el más frecuente en los análisis de las genotecas del gen ARNr 16S de los espeleotemas de esta cueva, representando un 44 % de las secuencias (de un total de 25 clones). Dentro de este filo, la mayoría de los clones correspondían a microorganismos pertenecientes a Streptomyces, Rubrobacteridae, y una alta 151 proporción de ellos al género Pseudonocardia. Debido a que el número de clones empleado por Stomeo (2008) es demasido bajo no podemos derivar consecuencias ecológicas o compararlo con los datos de aerobiología obtenidos en este trabajo. No obstante, la presencia de especies de Streptomyces, y particularmente S. avidinii y S. zaomyceticus en diferentes zonas de la cueva, es muy interesante y sugiere que miembros de este género estarían implicados en la colonización de los espeleotemas. El género Pseudonocardia no ha sido encontrado en este estudio aerobiológico. Una gran mayoría de las bacterias no son cultivables y esto es más aplicable a las bacterias aerovagantes ya que la capacidad de cultivarlas disminuye con la aerosolización (Heidelberg y col., 1997).

La mayoría de las bacterias registradas son Gram‐positivas, desde un 82,4 % al 100 % en distintas salas. En el exterior el rango va del 50,4 al 81,2 %. Se ha descrito que los organismos que esporulan, tales como especies del género Bacillus y otras bacterias Gram‐positivas, tienden a dominar la diversidad microbiana del aire (Mancinelli y

Shulls, 1978).

La mayoría de las bacterias no presentan ningún otro mecanismo de dispersión que no fuera el derivado de la velocidad del viento, turbulencias, impactos o salpicaduras de gotas que caen de las estalactitas, etc. La actividad de pequeños mamíferos (roedores y murciélagos) y humanos en el interior de la cueva puede ser una fuente de partículas. Lighthart y Shaffer (1997) propusieron que la mayoría de las bacterias del aire están asociadas con partículas y ellas funcionan como un conjunto de células. También se ha indicado la

152 existencia de una alta concentración de bacterias en el aire después de simular la lluvia (Robertson y Alexandre, 1994).

Los datos muestran que después de abrir las puertas a las visitas, la concentración bacteriana en la mayoría de los puntos muestreados aumenta. Esto puede deberse a que cuando los visitantes descienden las escaleras (en cuyos peldaños existen numerosas colonizaciones bacterianas, y también en las estalactitas y estalagmitas) originan turbulencias y erosiones que implican la eliminación mecánica de partículas de sedimento y/o bacterias y su dispersión en el aire.

153 555...333--- AAAeeerrrooobbbiiiooolllooogggíííaaa dddeee lllaaa CCCuuueeevvvaaa dddeee AAllltttaaammmiiirrraaa yyy dddeee lllaaasss EEEssstttaaalllaaaccctttiiitttaaasss (((CCCaaannntttaaabbbrrriiiaaa)))

5.3.1‐ MUESTREADOR DUO SAS SUPER 360

5.3.1.1‐ DIVERSIDAD DE HONGOS

En la cueva de Altamira se efectuó un único muestreo durante el mes de junio de 2009, en el que se tomaron muestras de bacterias y hongos con el muestreador DUO SAS SUPER 360. Hemos dividido la cueva en dos partes, calificándolas de zonas visitables y no visitables, la primera correspondería a la zona donde se encuentran la mayoría de las pinturas, y la segunda al resto de la cueva, con representación rupestre escasa.

En la Tabla 14 se muestra como en las zonas visitables la concentración de esporas en el aire es muy superior (aproximadamente 10 veces) a la de las zonas no vistables. En estas últimas la cantidad de esporas en el aire varía desde 10 a 50 UFC/m3. Por el contrario en las zonas visitables la cantidad de esporas fúngicas

3 en el aire oscila entre 90 y 390 UFC/m .

En el Cruce (zona de paso entre la sala de los Muros y la entrada de Polícromos), la concentración de esporas fue similar a la del fondo de Polícromos.

154 Tabla 14: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de los hongos del muestreo de junio de 2009 en Altamira.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Cola de Caballo 10 Cladosporium sp. 100 % 100 (Punto 1) ± 10 Cladosporium cladosporioides 99 % 50 Sala Pozo 50 Cladosporium sp. 99 % 34 (Punto 2) ± 10 Trichoderma gamsii 100 % 16 VISITABLE Gran Sala 2 Cladosporium sp. 100 % 100

NO (Punto 3) ± 30

Sala Hoya 10 Cladosporium sp. 100 % 100

ÁREA (Punto 4) ± 10 Pasillo entre Sala 10 Hoya‐ Sala Muros Cladosporium sp. 100 % 100 ± 0 (Punto 5) Cladosporium sp. 100 % 80 Sala Muros 170 (Punto 6) ± 70 Cladosporium cucumerinum 99 % 11,76 Epicoccum nigrum 100 % 8,24 Cladosporium sp. 100 % 82,42

Cruce 330 Cladosporium macrocarpum 100 % 11,52 (Punto 7) ± 310 Epicoccum nigrum 100 % 3,64 Pochonia chlamydosporia 99 % 2,42 Cladosporium sp. 100 % 47,44

Epicoccum nigrum 100 % 38,46 Fondo Sala 390 Polícromos Cladosporium sp. 99 % 10,26

VISITABLE ± 40 (Punto 8) Penicillium chrysogenum 100 % 2,56

ÁREA Aspergillus sp. 99 % 1,28 Entrada Sala 90 Polícromos Cladosporium sp. 100 % 100 ± 130 (Punto 9) Cladosporium sp. 100 % 70,4 Acremonium sp. 97 % 10,8 Entre las 2 puertas 250 Cladosporium cladosporioides 99 % 8 (Punto 10) ± 150 Epicoccum nigrum 100 % 8 Penicillium sp. 99 % 2,8 Fusarium sp. 99 % 41,43

Exterior Cueva 1.750 Epicoccum nigrum 100 % 32,57 (Punto 11) ± 340 Epicoccum nigrum 100 % 13,03 Cladosporium sp. 100 % 12,4 Botryotinia fuckeliana 100 % 0,57

155 En la Sala de Polícromos la cantidad de esporas fue aproximadamente cuatro veces mayor en el fondo con respecto a la entrada, posiblemente porque la corriente de aire arrastra las partículas hasta el fondo de la sala.

En todas las salas muestreadas el género más abundante fue Cladosporium. Éste es uno de los hongos más comunes en ambientes exteriores y con una menor proporción en cuevas (Docampo y col.,

2010, 2011).

Penicillium sólo apareció en dos de los once puntos muestreados. Penicillium chrysogenum se detectó en el fondo de Polícromos y

Penicillium sp. entre las dos puertas.

Epicoccum nigrum estaba bastante extendido y apareció en cinco de los diez puntos: los Muros, el Cruce, fondo de Polícromos, entre las dos puertas y exterior. Es destacable que en la entrada de Polícromos no se detectó Epicoccum nigrum, pero éste sí apareció en el fondo de la misma sala. Pochonia chlamydosporia sólo apareció en el Cruce con una abundancia del 2,42 %.

Teniendo en cuenta todas las salas interiores de la cueva de Altamira, el género Cladosporium representó el 80,4 % de las esporas presentes en el aire, seguido de Epicoccum nigrum con un 14,7 %. El género Penicillium sólo representó el 1,3 %. Este hecho es totalmente opuesto al encontrado por Docampo y col., 2010 en la cueva de Nerja (Málaga). Allí los géneros Aspergillus y Penicillium fueron los más abundantes, presentando una concentración media anual del 50 %, seguidos de Cladosporium.

156 En el exterior de la cavidad, la especie más abundante fue Epicoccum nigrum con un 45,60 %. También aparecieron Fusarium sp., Cladosporium sp. y Botryotinia fuckeliana. Estos cuatro géneros son descritos como fitopatógenos (Larena y col., 2005; Killebrew y col., 1988; McHale y col., 1992; Polach y Abawi, 1975) y su presencia se podría deber a que la cueva está situada en una zona con abundante vegetación y actividades agrícolas, y las esporas son transportadas por el viento hasta las proximidades de la cueva.

La cueva de Altamira posee dos partes bien diferenciadas. La primera termina en la Sala de Polícromos (donde se encuentran las pinturas) y en la de los Muros; ambas con paredes artificiales. La segunda parte está formada por galerías y salas que no están confinadas por paredes artificiales como Polícromos. Estas dos partes muestran un comportamiento diferente en cuanto a la aerobiología. La cantidad de esporas en el aire de Polícromos fue de 390 UFC/m3 aire, mientras que en salas interiores de la cueva (como la Hoya o la Gran Sala) poseían una cantidad de esporas mucho menor, 10 y 21 UFC/m3 respectivamente. Se observó una mayor cantidad de esporas de Cladosporium tanto en las zonas visitables como no visitables. Considerando todas la salas en conjunto (el Pasillo entre la Sala de la Hoya y la de los Muros, la Gran Sala, la Sala de la Hoya), en la parte no visitable existe una gran cantidad de Cladosporium (representa el 92,1 % de los hongos) y Trichoderma (el 7,9 % restante). Trichoderma es un hongo cosmopolita y crece sobre restos vegetales (Huh y col.,

2010).

En la zona visitable Cladosporium representó el 79,3 % de las esporas del aire, seguido de Epicoccum con el 15,9 %, Acremonium sp. con el 157 2,2 %, Penicillium chrysogenum con el 1,4 %, Pochonia chlamydosporia con el 0,8 % y Aspergillus sp. con el 0,5 %.

La presencia de Epicoccum nigrum es de especial interés ya que presentó una concentración importante, tanto dentro como fuera de la cueva. La presencia de Cladosporium y Epicoccum resulta interesante debido a que poseen la capacidad de sintetizar polímeros fenólicos negros y melaninas (Latgé y col., 1988; Saiz‐Jimenez y col., 1995) y la colonización de sustratos podría dar lugar a manchas negras, semejantes a las de la cueva de Lascaux.

Los datos indican que en la cueva de Altamira el problema principal es la apertura de puertas, ya que refuerza el papel de la atmósfera como vehículo de transporte y dispersión de microorganismos y nutrientes en el interior de la cueva, incluso en las galerías más alejadas de la entrada.

En la cueva de las Estalactitas (situada a 75 metros de la de Altamira) se efectuó un muestreo en junio de 2009, en el que se tomaron muestras de hongos con el muestreador DUO SAS SUPER 360 (Tabla

15).

Tabla 15: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de los hongos del muestreo de junio de 2009 en la Cueva de las Estalactitas.

UFC /m3 IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS (media ± desviación (% similitud) (%) típica)

Fondo Cueva 300 Cladosporium sp. 100 % 96 Estalactitas ± 240 Epicoccum nigrum 100 % 4

Entrada Cueva 90 Cladosporium sp. 100 % 93,33 Estalactitas ± 110 Penicillium chrysogenum 100 % 6,67

158 En esta cueva, la cantidad de esporas fue aproximadamente cuatro veces mayor en el fondo con respecto a la entrada y muy similar a la registrada en la Sala de Polícromos.

Cladosporium fue el género más abundante con un 96 %, el 4 % restante correspondiendo a Epicoccum nigrum. Epicoccum nigrum apareció al fondo de la cueva de las Estalactitas, mientras que

Penicillium chrysogenum se detectó en la entrada de esta cueva.

Los datos muestran una gran correspondencia entre la cueva de Altamira y la de las Estalactitas, sugiriendo que se trata de ecosistemas comparables con poblaciones de hongos similares, independientemente de las visitas recibidas.

5.3.1.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS

En la Tabla 16 se muestran los resultados obtenidos en el muestreo de bacterias llevado a cabo en junio de 2009 en la cueva de Altamira.

Al igual que ocurría con los hongos, la cantidad de bacterias en el aire fue superior en las zonas visitables con respecto a las zonas que no suelen recibir visitas, aunque las diferencias no son tan importantes como en el caso de los hongos. Así, en las zonas no visitables de la cueva de Altamira, como Cola de Caballo, Pozo, Gran Sala, Hoya y Pasillo (entre la Sala de la Hoya y Polícromos), la cantidad de bacterias varió entre 150 y 740 UFC/m3 aire. En las zonas visitables, tales como la Sala de los Muros, Cruce, fondo y entrada de Polícromos la cantidad de bacterias osciló entre 210 y 1.800 UFC/m3

159 aire. En general, en toda la cueva los valores registrados para las bacterias fueron muy superiores a los de los hongos.

En seis de los diez puntos muestreados, Micrococcus luteus fue la especie más abundante. Esos puntos son: la Sala de los Muros, Cruce, fondo y entrada de Polícromos, entre las dos puertas y exterior. También apareció en una menor proporción en la Gran Sala. Esta especie ha sido descrita en suelos (Orchard y Goodfellow, 1980), en estudios previos de la cueva de Altamira (Groth y col., 1999) y como colonizadora de los espeleotemas de la Grotta dei Cervi (Italia) (Laiz y col., 2000b). Esta especie está relacionada con enfermedades cutáneas y afecta principalmente a pacientes inmunodeprimidos

(Salar y col., 1997).

La especie Massilia timonae sólo pareció en zonas no visitables como la Cola de Caballo, Pozo y Sala de la Hoya.

El género Staphyloccus apareció en baja proporción en la Cola de

Caballo, Gran Sala, Hoya, Sala de los Muros.

El género Acinetobacter ha sido encontrado en la Gran Sala, Sala de la Hoya, Pasillo entre la Sala de la Hoya y la Sala de los Muros, fondo y entrada de Polícromos.

160 Tabla 16: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de las bacterias del muestreo de junio de 2009 en Altamira.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Arthrobacter tumbae 99 % 42,27 Cola de Caballo 260 Microbacterium oleivorans 99 % 28,85 (Punto 1) ± 140 Staphylococcus sp. 99 % 21,92 Massilia timonae 99 % 6,92 Bacillus weihenstephanensis 99 % 89,18 Massilia timonae 99 % 8,11 Sala Pozo 740 Streptomyces sp. 99 % 1,35 (Punto 2) ± 570 Bacillus pumilus 99 % 0,68 Streptomyces microflavus 99 % 0,68 Stenotrophomonas maltophilia 99 % 55,59

Acinetobacter lwoffii 99 % 15 Staphylococcus sp. 99 % 10

VISITABLE Gran Sala 340 Bacillus pumilus 99 % 5 (Punto 3) ± 140 NO Micrococcus luteus 99 % 5

ÁREA Pseudomonas stutzeri 99 % 5 Pseudomonas chlororaphis subsp. 4,41 aurantiaca 99 % Massilia timonae 99 % 40,01 Acinetobacter haemolyticus 98 % 33,33 Sala de la Hoya 150 Staphylococcus epidermidis 99 % 20 (Punto 4) ± 20 Bacillus cereus 99 % 3,33 Bacillus sp. 99 % 3,33 Pseudomonas putida 100 % 68,66 Pasillo entre Sala Hoya‐Sala 450 Kocuria carniphila 99 % 20 Muros ± 120 Acinetobacter johnsonni 99 % 8,67 (Punto 5) Bacillus pumilus 99 % 2,67 Micrococcus luteus 99 % 78,10

Sala de los Microbacterium sp. 97 % 7,14 210 Muros Staphylococcus pasteuri 99 % 7,14

ÁREA ± 60 (Punto 6)

VISITALBE Bacillus sp. 99 % 3,81 Streptomyces sp. 98 % 3,81

161 Tabla 16 (continuación).

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Micrococcus luteus 99 % 88,87 Exiguobacterium sibiricum 99 % 4,81 Cruce 1.330 Arthrobacter oxydans 99 % 1,58 (Punto 7) ± 130 Bacillus pumilus 99 % 1,58 Gordonia malaquae 99 % 1,58 Oerskovia enterophila 99 % 1,58 Micrococcus luteus 99 % 76,89 Pseudomonas coreensis 100 % 8,45 Fondo de Sala 580 Naxibacte rvarians 99 % 6,38 Polícromos ± 510 (Punto 8) Pseudomonas mosselii 99 % 4,14

Acinetobacter radioresistens 99 % 2,07 Bacillus sp. 99 % 2,07

VISITABLE Micrococcus luteus 99 % 81,51

Pseudomonas putida 99 % 11,83 ÁREA Entrada de Sala 1.800 Bacillus pumilus 99 % 2,67 Polícromos ± 220 (Punto 9) Acinetobacter radioresistens 99 % 1,33

Naxibacter varians 99 % 1,33 Pseudomonas stutzeri 99 % 1,33 Micrococcus luteus 99 % 93,49 Entre las 2 Ralstonia eutropha 99 % 3,27 830 puertas Arcobacter sp. 100 % 1,08 ± 20 (Punto 10) Leclercia sp. 99 % 1,08 Naxibacter varians 99 % 1,08 Micrococcus luteus 99 % 37,18

Exterior cueva 960 Bacillus weihenstephanensis 99 % 26,81 (Punto 11) ± 80 Rhodococcus corynebacterioides 99 % 26,81 Bacillus sp. 99 % 9,20

En la zona entre las dos puertas aparecieron Ralstonia eutropha, Arcobacter y Leclercia. Ralstonia eutropha no forma esporas y aparece en el suelo (Laemmli y col., 2000), también ha sido encontrada en las cueva de Lascaux (Bastián y col., 2010), Ardales (Stomeo y col., 2007) y en una cueva china (Zhou y col., 2007). Arcobacter fue aislado en la cueva de Frasassi en Italia (Macalady y 162 col., 2007). El género Leclercia ha sido encontrado en un suelo subterráneo contaminado con petróleo, en la India (Sarma y col.,

2004).

Kocuria carniphila apareció en el Pasillo entre la sala de la Hoya y la de los Muros. Esta especie ha sido aislada de la carne (Tvrzova y col., 2005). Bacterias pertenecientes a este género han sido encontradas en salinas (Li y col., 2006; Tang y col., 2009), aire (Zhou y col., 2008) y aguas marinas (Seo y col., 2009),

En la zona del Cruce aparecieron Exiguobacterium sibiricum, Gordonia malaquae y Oerskovia enterophila. Exiguobacterium sibiricum fue descrito en el permafrost siberiano (Rodrigues y col., 2006). Gordonia malaquae fue encontrada en el fango de una planta de tratamiento de aguas residuales (Yassin y col., 2007). Oerskovia enterophila fue aislada de los excrementos de un miriápodo

(Stackebrandt y col., 2002).

Naxibacter varians apareció en tres de los puntos muestreados, al fondo y en la entrada de Polícromos y en la zona entre las dos puertas. Se ha aislado en el ojo de un paciente (Kämpfer y col., 2008). Otras especies pertenecientes a este género han sido encontradas en el aire (Weon y col., 2008, 2010).

En general, son más abundantes las bacterias Gram‐positivas, que representan el 57,8 % de todas las colonias, que las Gram‐negativas que representan en 42,2 %, a pesar de que Laiz y col. (1999) encontraron que las aguas de goteo estaban dominadas por bacterias Gram‐negativas, lo que indicaría la escasa viabilidad de este grupo de bacterias una vez introducidas en el ambiente de la cueva. 163 En la cueva de las Estalactitas se efectuó un muestreo en junio de 2009 de bacterias, con el muestreador DUO SAS SUPER 360 (Tabla 17).

Tabla 17: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de las bacterias del muestreo de junio de 2009 en la Cueva de las Estactitas.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Micrococcus luteus 99 % 30 Pseudomonas putida 99 % 20 Fondo Cueva 310 Brevundimonas vesicularis 99 % 20 Estalactitas ± 70 Brevundimonas mediterranea 99 % 20 Pseudomonas fluorescens 99 % 10 Entrada Cueva 980 Staphylococcus epidermidis 100 % 81,63 Estalactitas ± 90 Curtobacterium herbarum 99 % 18,37

En general, en la cueva de las Estalactitas, los valores registrados para las bacterias fueron muy superiores a los de los hongos.

Micrococcus luteus fue la especie más abundante en el fondo de la cueva y Staphyloccus epidermidis en la entrada de la cueva.

Brevundimonas spp. fue encontrada en el fondo de la cueva. Este género ha aparecido formando parte de la diversidad microbiana en las cuevas de Carlsbad (Barton y col., 2007), en una cueva de China

(Zhou y col., 2007) y en otras de Nuevo México (Spilde y col., 2005).

Curtobacterium herbarum fue encontrada en la entrada de la cueva.

Esta especie forma parte de la filosfera (Behrendt y col., 2002).

164 5.3.2‐ MUESTREADOR Coriolis μ

5.3.2.1 DIVERSIDAD DE HONGOS

La muestra analizada corresponde a la zona del Pozo, en el interior de la cueva. Se analizaron 96 secuencias a nivel de especie (97 %) y éstas se agruparon en 43 OTUs diferentes que representaban el 61,46 % de la cobertura de la muestra.

En la Tabla 18 se recogen las identificaciones de las secuencias más representativas de cada OTU según las bases del NCBI, el organismo cultivable más cercano, su número de acceso y su abundancia.

165 Tabla 18: Afiliaciones de las Unidades Taxonómicas Operativas (OTUs) de hongos realizadas en este estudio.

Organismo cultivable más cercano Similitud Abundancia OTU representativo (Nº de acceso) (%) (%)

I Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 14,58

II Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 10,42

III Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 10,42

IV Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 9,38

V Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 4,17

VI Isaria cf. farinosa (FN548150) 98 3,13

VII Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 3,13

VIII Isaria cf. farinosa (FN548150) 98 2,08

IX Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 2,08

X Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XI Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XII Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XIII Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XIV Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XIV Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XVI Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XVII Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XVIII Isaria cf. farinosa (FN548150) 98 1,04

XIX Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XX Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XXI Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

166 Tabla 18 (continuación).

OTU Organismo cultivable más Similitud Abundancia representativo cercano (Nº de acceso) (%) (%)

XXII Isaria cf. farinosa (FN548150) 98 1,04

XXIII Isaria cf. farinosa (FN548150) 97 1,04

XXIV Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XXV Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XXVI Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XXVII Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XXVIII Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XXIX Isaria cf. farinosa (FN548150) 97 1,04

XXX Isaria cf. farinosa (FN548150) 93 1,04

XXXI Isaria cf. farinosa (FN548150) 97 1,04

XXXII Isaria cf. farinosa (FN548150) 98 1,04

XXXIII Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XXXIV Isaria cf. farinosa (FN548150) 96 1,04

XXXV Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 2,08

XXXVI Isaria cf. farinosa (FN548150) 98 1,04

XXXVII Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XXXVIII Isaria cf. farinosa (FN548150) 98 1,04

XXXIX Isaria cf. farinosa (FN548150) 99 1,04

XL Isaria cf. farinosa (FN548150) 98 1,04

XLI Verticillium sp. (FJ948142) 96 1,04

XLII Verticillium sp. (FJ948142) 96 1,04

XLIII Verticillium sp. (FJ948142) 96 1,04

167 Se detectaron las especies Isaria cf. farinosa (97 %) y Verticillium sp. (3 %) (Figura 51). Con el muestreador DUO SAS SUPER 360 se identificaron dos especies de Cladosporium (84 %) y Trichoderma gamsii (16 %) (Tabla 14 y Figura 52).

Verticillium sp. (3%)

Isaria cf. farinosa (97%)

Figura 51‐ Gráfico de sectores en el que se representan las identificaciones y abundancia de los clones de la zona del Pozo (Altamira).

Trichoderma gamsii (16%)

Cladosporium cladosporioides Cladosporium sp. (50%) (34%)

Figura 52‐ Gráfico de sectores en el que se representan las identificaciones y abundancia de los hongos obtenidos en la zona del Pozo.

168 Comparado los resultados obtenidos con los dos métodos resulta evidente la disparidad de especies obtenidas y la imposibilidad de extraer conclusiones aceptables con el muestreador Coriolis µ. Sin embargo utilizando el DUO SAS SUPER 360 la identificación de Cladosporium sp. en la zona del Pozo fue coincidente con la presencia de este género en otras salas, y en general en toda la cueva, por lo que es sorprendente su ausencia en los análisis del Coriolis μ.

5.3.2.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS

La muestra analizada corresponde a la zona del Pozo. El análisis de los 96 clones a nivel de especie (97%) proporcionó 76 OTUs diferentes, representando el 28,13 % de la cobertura de la muestra.

En la Tabla 19 se recogen los resultados del BLAST de las secuencias representativas de cada OTU, el organismo cultivable más cercano, su número de acceso y su abundancia.

169 Tabla 19: Afiliaciones de las Unidades Taxonómicas Operativas (OTUs) de bacterias realizadas en este estudio.

OTU Organismo cultivable más Similitud Abundancia representativo cercano (Nº acceso) (%) (%)

I Enterobacter pyrinus (AJ010486) 67.749 1,04

II Escherichia coli (EU014689) 99.190 1,04

III Escherichia coli (EU014689) 93.950 1,04

IV Escherichia coli (EU014689) 78.469 1,04

V Escherichia coli (EU014689) 97.813 1,04

VI Escherichia coli (EU014689) 96.325 1,04

VII Escherichia coli (EU014689) 98.221 1,04

VIII Escherichia coli (EU014689) 93.453 1,04

IX Escherichia coli (EU014689) 98.985 1,04

X Escherichia coli (EU014689) 97.831 1,04

XI Escherichia coli (EU014689) 97.226 1,04

XII Escherichia coli (EU014689) 97.502 1,04

XIII Escherichia coli (EU014689) 98.852 5,21

XIV Escherichia coli (EU014689) 98.962 1,04

XV Escherichia coli (EU014689) 96.421 1,04

XVI Escherichia coli (CP001164) 90.516 1,04

XVII Escherichia coli (EU014689) 97.621 1,04

XVIII Escherichia coli (EU014689) 98.742 1,04

XIX Escherichia coli (EU014689) 97.859 1,04

XX Escherichia coli (EU014689) 98.357 1,04

XIX Escherichia coli (EU014689) 98.773 1,04

170 Tabla 19 (continuación).

Organismo cultivable más Similitud Abundancia OTU representativo cercano (Nº acceso) (%) (%)

XXII Escherichia coli (EU014689) 89.085 1,04

XXIII Escherichia coli (EU014689) 95.495 1,04

XXIV Escherichia coli (EU014689) 96.855 1,04

XXV Escherichia coli (EU014689) 96.689 1,04

XXVI Escherichia coli (EU014689) 99.459 2,08

XXVII Escherichia coli (EU014689) 98.475 1,04

XXVIII Escherichia coli (EU014689) 98.401 1,04

XXIX Escherichia coli (EU014689) 96.932 1,04

XXX Escherichia coli (EU014689) 98.160 1,04

XXXI Escherichia coli (EU014689) 98.428 2,08

XXXII Escherichia coli (EU014689) 98.160 1,04

XXXIII Escherichia coli (EU014689) 87.382 1,04

XXXIV Escherichia coli (EU014689) 96.114 1,04

XXXV Escherichia coli (EU014689) 96.714 1,04

XXXVI Escherichia coli (EU014689) 97.356 1,04

XXXVII Escherichia coli (EU014689) 99.449 4,17

XXXVIII Escherichia coli (EU014689) 98.610 1,04

XXXIX Escherichia coli (CP001164) 98.127 1,04

XL Escherichia coli (CP001164) 97.327 1,04

XLI Escherichia coli (CP001164) 98.441 1,04

XLII Escherichia coli (CP001164) 97.621 1,04

XLIII Escherichia coli (CP001164) 98.330 1,04

171 Tabla 19 (continuación).

Organismo cultivable más Similitud Abundancia OTU representativo cercano (Nº acceso) (%) (%)

XLIV Escherichia coli (CP001164) 99.230 2,08

XLV Escherichia coli (CP001164) 81.449 1,04

XLVI Escherichia fergusonii (CU928158) 98.089 1,04

XLVII Escherichia fergusonii (CU928158) 93.617 1,04

XLVIII Shigella boydii (AB273731) 96.837 1,04

IL Shigella boydii (AB273731) 94.444 1,04

L Shigella boydii (AB273731) 98.744 1,04

LI Shigella boydii (AB273731) 97.985 1,04

LII Shigella boydii (AB273731) 95.770 1,04

LIII Shigella boydii (AB273731) 96.648 1,04

LIV Shigella boydii (AB273731) 97.936 1,04

LV Shigella boydii (AB273731) 98.438 1,04

LVI Shigella boydii (AB273731) 95.763 1,04

LVII Shigella boydii (AB273731) 98.571 3,13

LVIII Shigella sonnei (AB273732) 98.503 3,13

LIX Shigella sonnei (AB273732) 98.125 1,04

LX Shigella sonnei (AB273732) 98.829 4,17

LXI Shigella sonnei (AB273732) 96.137 1,04

LXII Shigella sonnei (AB273732) 98.439 1,04

LXIII Shigella sonnei (AB273732) 98.091 1,04

LXIV Shigella sonnei (AB273732) 98.482 1,04

LXV Shigella sonnei (AB273732) 98.155 1,04

172 Tabla 19 (continuación).

OTU Organismo cultivable más Similitud Abundancia representativo cercano (Nº acceso) (%) (%)

LXVI Shigella sonnei (AB273732) 96.867 1,04

LXVII Shigella sonnei (AB273732) 75.405 1,04

LXVIII Shigella sonnei (AB273732) 97.695 1,04

LXIX Shigella sonnei (AB273732) 92.132 1,04

LXX Shigella sonnei (AB273732) 98.146 1,04

LXXI Shigella sonnei (AB273732) 97.186 1,04

LXXII Shigella sonnei (AB273732) 96.352 1,04

LXXIII Shigella sonnei (AB273732) 97.371 1,04

LXXIV Shigella dysenteriae (X96966) 88.499 1,04

LXXV Shigella dysenteriae (X96966) 95.426 1,04

LXXVI Shigella flexneri (X96963) 96.938 1,04

Se identificaron Shigella spp. (32,24 %), Escherichia spp. (66,72 %) y Enterobacter pyrinus (1,04 %) (Figura 53). En este caso la cantidad de Escherichia encontrada en el aire es el doble de la encontrada para Shigella. El género Enterobacter fue hallado por Laiz y col. (1999) en un estudio de las aguas de goteo de esta misma cueva.

173 Enterobacter pyrinus (1%)

Shigella spp. (32%)

Escherichia spp. (67%)

Figura 53‐ Gráfico de sectores en el que se representan las identificaciones y los porcentajes de los clones de la muestra tomada con el Coriolis μ en la zona del Pozo de la cueva de Altamira.

Con el muestreador DUO SAS SUPER 360 se detectaron: Bacillus spp. (89,86 %), Massilia timonae (8,11 %) y Streptomyces spp. (2,03 %) (Tabla 16 y Figura 54). El género Bacillus ha sido encontrado previamente en las aguas de goteo en esta misma cueva por Laiz y col., (1999). Por el contrario, el género Streptomyces ha sido encontrado principalmente sobre las rocas (Groth y col., 1999).

174 Bacillus pumilus Streptomyces sp. (1%) (1%) Streptomyces microflavus (1%) Massilia timonae (8%)

Bacillus weihenstephanensis (89%)

Figura 54‐ Gráfico de sectores en el que se representan las identificaciones y los porcentajes de la muestra tomada con el DUO SAS SUPER 360 en la zona del Pozo de la cueva de Altamira.

De la comparación de los resultados de ambos muestreadores, se deduce una gran dispersión de resultados, no coincidiendo ninguna de las especies aisladas en uno y otro caso. Teniendo en cuenta que las bacterias identificadas utilizando el Coriolis µ no pueden calificarse de “no cultivables”, resulta difícil explicar la divergencia de resultados en esta aplicación preliminar del equipo Coriolis μ. Tal vez sería necesario un muestreo más exhaustivo y en diversas cuevas y salas, a fin de poder interpretar correctamente los resultados y/o

encontrar explicaciones a tantas diferencias.

En los estudios moleculares de muestras de cuevas y su comparación con los aislamientos obtenidos, se ha encontrado igualmente una gran disparidad de resultados (Laiz y col., 2003). Dado que la metodología empleada en el uso del equipo Coriolis μ se basó en la 175 extracción de ADN y su identificación, creemos que ambos métodos (cultivos y extracción de ADN) presentan sesgos que hacen difícil una comparación. Ello ha sido citado ampliamente en la literatura (Laiz y col., 2003).

555...444--- AAAeeerrrooobbbiiiooolllooogggíííaaa dddeee lllaaa CCCuuueeevvvaaa dddeee LLLaaassscccaaauuuxxx (((FFFrrraaannnccciiiaaa)))

5.4.1‐ MUESTREADOR DUO SAS SUPER 360

5.4.1.1‐ DIVERSIDAD DE HONGOS

En la cueva de Lascaux se llevaron a cabo dos muestreos con el DUO SAS SUPER 360, uno de ellos en febrero y otro en septiembre de

2010.

En la Tabla 20 se recogen los resultados obtenidos en el muestreo realizado en Febrero de 2010. En la sala del Pozo, que es una zona no visitable y de difícil acceso, es donde se registró la menor cantidad de esporas fúngicas en el aire. Dentro de las zonas visitables, los valores más bajos se registraron en el Pasaje y en la Sala de los Toros. Por el contrario el valor más alto se registró en el Divertículo Axial.

La abundancia de los géneros y especies fúngicas que aparecen en este muestreo son, por orden decreciente, Aspergillus (Aspergillus versicolor es mayoritaria), Acremonium (Acremonium murorum y Acremonium nepalense), Pochonia suchlasporia (sólo parece en el Divertículo Axial), Verticillium leptobactrum, Doratomyces sp.,

Cladosporium cladosporioides, Penicillium spp. y Ochroconis sp.

176 Tabla 20: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de los hongos del muestreo de febrero de 2010 en Lascaux.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Pozo 50 Verticillium leptobactrum 98 % 76 (Punto 9) ± 60 Ochroconis sp. 86 % 24 Aspergillus versicolor 99 % 87,57 Divertículo Acremonium murorum 99 % 8,86 de los Felinos 700 Verticillium leptobactrum 98 % 1,43 (Punto 8) ± 780 Cladosporium cladosporioides 99 % 1,43 Aspergillus versicolor 95 % 0,71 Trichoderma velutinum 98 % 28,99 Aspergillus versicolor 95 % 21,15 Aspergillus asperescens 98 % 18,99 Pasaje ‐ Ábside‐Nave 690 Verticillium leptobactrum 98 % 9,57 (Punto 7) ± 100 Ochroconis sp. 86 % 9,57

Doratomyces sp. 98 % 5,79 Alternaria alternata 99 % 3,91 VISITABLE Plectosphaerella cucumerina 95 % 2,03 NO Tritirachium sp. 100 % 36,68

ÁREA Mortierella alpina 95 % 27,33 Verticillium leptobactrum 98 % 10 Pasaje 150 (Punto 6) Geomyces pannorum 99 % 10 ± 10 Doratomyces sp. 98 % 5,33 Ochroconis sp. 82 % 5,33 Plectosphaerella cucumerina 95 % 5,33 Acremonium murorum 99 % 34,20 Pochonia suchlasporia 98 % 26,74 Divertículo Axial 950 Doratomyces sp. 98 % 13,37 (Punto 5) ± 10 Aspergillus versicolor 95 % 12,32 Penicillium commune 99 % 12,11 Ochroconis sp. 86 % 1,26

177 Tabla 20 (continuación).

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Cladosporium cladosporioides 99 % 50 Sala de los Toros‐ Verticillium leptobactrum 98 % 33,45 290 Divertículo Geomyces pannorum 99 % 8,28 ± 250 Axial Emericella rugulosa 94 % 4,14 (Punto 4) Doratomyces sp. 98 % 4,14 Engyodontium album 100 % 36

Mortierella alpina 95 % 28,5

Sala de los Aspergillus versicolor 95 % 21,5 200 Toros Paraphaeosphaeria michotii 98 % 3,5 VISITABLE ± 50 (Punto 3) Geomyces pannorum 99 % 3,5

ÁREA Debaryomyces hansenii 99 % 3,5 Ochroconis sp. 86 % 3,5 Acremonium murorum 99 % 87,83 Geomyces destructans 95 % 6,74 SAS2 460 Aspergillus versicolor 95 % 2,17 (Punto 2) ± 660 Rhizosphaera kalkhoffii 99 % 2,17 Penicillium sp. 96 % 1,09 Penicillium expansum 98 % 71,18 Exterior 170 Cladosporium cladosporioides 99 % 16,47 (Punto 1) ± 20 Penicillium sp. 100 % 8,24 Sporobolomyces coprosmae 99 % 4,11

El género Aspergillus fue el más abundante en las zonas del Divertículo de los Felinos y del Pasaje‐Ábside‐Nave, con unas abundancias del 88,28 y 40,14 %. Sin embargo sólo aparecen dos especies, A. versicolor y A. asperescens. A. versicolor está también presente en otras zonas, aunque en un menor porcentaje como el Divertículo Axial, la Sala de los Toros y SAS2. Esta misma especie ya fue encontrada por Bastián y col. (2009b) en esta cueva, y en cuevas de Eslovaquia (Nováková, 2009) o en las del sur de la India (Koilraj y col., 1999). Aspergillus asperescens ha sido encontrado creciendo

178 sobre excrementos de roedores en la cueva de Ardales (Hermosín y col., 2010).

Pochonia suchlasporia apareció únicamente en el Divertículo Axial. Esta especie es parásita de huevos de nematodos y raramente de larvas de insectos (Atkins y col., 2003a).

Emericella rugulosa, encontrada en la Sala de los Toros‐Divertículo Axial, presentaba un porcentaje de similitud bajo (94 %), por lo tanto esta identificación no sería concluyente. Es un teleomorfo de

Aspergillus rugulosus.

Engyodontium album fue la especie más abundante en la Sala de los Toros. Además es en esta sala en el único punto que aparece. También se ha encontrado en la cueva de Ardales y ha sido descrito como entomopatógeno (Jurado y col., 2008b). Engyodontium album es un hongo común en pinturas murales en el interior de iglesias, catacumbas y también en cuevas. Su origen posiblemente se encuentre en los ácaros y arañas de los que son patógenos (Jurado y col., 2008b).

El género Tritirachium sp. fue la especie más abundante en la zona del Pasaje. Este género está relacionado con los géneros Beauveria y Engyodontium. Su hábitat natural es el suelo y material vegetal. Es patógeno de insectos y en humanos puede causar micosis superficiales (Moraes y col., 2010).

Cladosporium cladosporioides es un hongo muy común, cosmopolita y saprófito. A menudo aparece como invasor secundario en partes necrosadas de diferentes plantas hospedadoras y ha sido aislado del

179 aire, suelo, textiles y otros sustratos (Ellis, 1971). También es endófito (Riesen y Sieber, 1985; El‐Morsy, 2000; Kumaresan y Suryanarayanan, 2002) y ha sido aislado en infecciones cutáneas, pulmonares y en otros tipos de enfermedades (de Hoog y col., 2000).

El género Trichoderma apareció en el Pasaje‐Ábside‐Nave, siendo la segunda especie más abundante en ese punto (detrás de Aspergillus). Está presente en todo tipo de suelos, y destaca por su actividad celulolítica (Cumagun y col., 2009).

En el Divertículo de los Felinos, el Divertículo Axial y en el SAS2, el género Acremonium es bastante común, siendo en estos dos últimos puntos el más abundante. Apareció también en cuevas de Eslovaquia (Nováková, 2009). La mayoría de las especies pertenecientes a este género son saprófitas, aisladas de material vegetal en descomposión y del suelo (Domsch y col., 1980).

Verticillium leptobactrum apareció en seis de los diez puntos muestreados. Se pudo encontrar en todas las salas a excepción del Divertículo Axial, Sala de los Toros, SAS2 y exterior de la cueva. Su abundancia varía desde el 9,57 % hasta el 76 %. Ha sido descrito como nematófago (Gams, 1988).

El género Penicillium fue encontrado en el Divertículo Axial, SAS2 y exterior de la cueva. Penicillium ha aparecido en las cuevas de Nerja (Docampo y col., 2010) y Domica en Eslovaquia (Nováková, 2009). Es un género saprófito, que se puede encontrar en el suelo, en material vegetal caído y en semillas. Sólo algunas especies están reconocidas como patógenas de humanos o de animales domésticos (Pitt, 1994).

180 En la zona del SAS2, apareció Rhizosphaera kalkhoffi. Esta especie ha sido descrita como patógeno de árboles, concretamente de las acículas de coníferas (Livsey y Barklund, 1992). Sobre la cueva de Lascaux hay un bosque de robles y pinos que pudiera ser su origen dada la cercanía de la entrada.

Plectosphaerella cucumerina se ha encontrado en el Pasaje‐Ábside‐ Nave y en el Pasaje. Esta especie ha sido descrita como agente biológico de control de nemátodos (Atkins y col., 2003b).

Alternaria alternata sólo apareció en el Pasaje‐Ábside‐Nave. Este es un hongo ubicuo, muy común en ambientes abiertos, también ha sido descrito como patógeno de plantas (Hatta y col., 2002).

Geomyces apareció en el Pasaje, la Sala de los Toros‐Divertículo Axial, la Sala de los Toros y SAS2. Presentó una abundancia variable entre el 3,5 % y 10 %. Es un hongo saprófito, aislado frecuentemente de suelos y aire (Gianni y col., 2003). Está ampliamente distribuído en algunas cuevas europeas (Bastián y col., 2009b, 2010; Nováková, 2009), pudiendo causar infecciones humanas en la piel y uñas

(Christen‐Zaech y col., 2008).

La especie Ochroconis sp. apareció en cinco de los siete puntos muestreados en el interior de la cueva. Estos puntos son: el Pozo, el Pasaje‐Ábside‐Nave, el Pasaje, el Divertículo Axial y la Sala de los Toros. Presentó unas abundancias comprendidas entre 1 % y 24 % según la sala muestreada. Curiosamente esta especie fue más abundante en la zona del Pozo (de muy difícil acceso) y se ha aislado de manchas negras que invaden la cueva (Martín‐Sánchez y col., 2011). Es importante destacar que las similitudes de las 181 identificaciones de las secuencias son relativamente bajas (85 %), por lo que se podría tratar de una especie nueva.

En el exterior de la cueva apareció Sporobolomyces coprosmae. Este género ha sido aislado de hojas de plantas, suelo y tejidos vegetales necrosados, y raramente están asociados con infecciones en humanos (Vazquez, 2011).

En la Tabla 21 se recogen los recuentos totales de los hongos del muestreo de septiembre de 2010. En general, los valores registrados en este muestreo son ligeramente inferiores a los registrados en el muestreo de febrero de 2010, con la excepción del exterior de la cueva y el Pasaje, cuyos valores son superiores a los registrados en febrero.

En la zona del Pozo fue donde se registró la menor cantidad de esporas. Las zonas de la cueva donde se encontraron una mayor cantidad de esporas fueron el Divertículo de los Felinos y el Divertículos Axial. En el exterior de la cueva, la cantidad de esporas en el aire fue cinco veces mayor que las registradas en el interior de la misma.

182 Tabla 21: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de los hongos del muestreo de septiembre de 2010 en Lascaux.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN ABUNDANCIA SALAS desviación (% similitud) (%) típica) 10 Pozo (Punto 9) Cladosporium sp. 99 % 100 ± 10 Cladosporium sp. 99 % 25,26 Divertículos de los 190 Mortierella sp. 98 % 25,26 Felinos ± 80 Cryptococcus dimennae 97 % 24,74 (Punto 8) Doratomyces sp. 98 % 24,74 Penicillium sp. 98 % 55 VISITABLE

Pasaje ‐Ábside‐Nave Verticillium leptobactrum 99 % 26,66 NO 120

(Punto 7) ± 50 Sporobolomyces sp. 98 % 9,17 ÁREA Cladosporium sp. 99 % 9,17 80 Pasaje (Punto 6) Bulleromyces albus 99 % 100 ± 40 Divertículo Axial 190 Arthroderma quadrifidum 97 % 100 (Punto 5) ± 60 Sala de los Toros‐ Bulleromyces albus 99 % 50 170 Divertículo Axial ± 60 (Punto 4) Cladosporium sp. 99 % 50

Sala de los Toros 140 Doratomyces sp. 98 % 85,71 (Punto 3) ± 60 Penicillium sp. 99 % 14,29 VISITABLE

Hirsutella sp. 98 % 40 Cladosporium sp. 99 % 26,47 ÁREA SAS2 170 Penicillium brevicompactum 99 % 13,53 (Punto 2) ± 30 Penicillium sp. 97 % 13,53 Sporobolomyces roseus 100 % 6,47 Cladosporium sp. 99 % 45,10 Epicoccum nigrum 99 % 45,10 Penicillium sp. 99 % 4,80 Exterior 960 Alternaria sp. 99 % 1,25 (Punto 1) ± 60 Rhizosphaera kalkhoffii 100 % 1,25 Epicoccum nigrum 99 % 1,25 Epicoccum nigrum 100 % 1,25

183 Los géneros y especies de hongos más abundantes en el muestreo efectuado en septiembre fueron diferentes a los que aparecieron en febrero ya que los géneros Aspergillus y Acremonium no se encontraron. Considerando la totalidad de los hongos aislados en este muestro (sin tener en cuenta el exterior), Cladosporium representó el 18,6 %, Arthroderma quadrifidum, aislada sólo en el Divertículo Axial el 17,8 %, Doratomyces sp. el 15,6 %, Penicillium sp. el 12,3 % e Hirsutella sp. sólo apareció en el SAS2 con una abundancia del 6,4 %.

En el Divertículo de los Felinos apareció el género Mortierella, siendo la segunda especie mayoritaria. Dentro de este género se encuentran especies saprófitas, otras aparecen en suelos, semillas y estiércol, entre otros. El mecanismo de dispersión es mediante gotas de agua (water splash). Ha sido encontrado colonizando cadáveres de grillos en una cueva de Eslovenia (Gunde‐Cimerman y col., 1998), en el sistema de cuevas de Domica, Eslovaquia (Nováková, 2009), en los sedimentos de las cuevas de West Virginia (Rutherford y Huang, 1994), en la cueva de Castañar de Ibor (Jurado y col., 2010), en cuevas de Kentucky y Tennessee (Shapiro y Pringle, 2010). También en este mismo punto ha sido encontrado Cryptococcus con una abundancia similar a la del género anterior. Esta levadura aparece en suelos y plantas (Fell y Statzell‐Tallman (1998), algunas especies son patógenas de humanos (Mitchell y Perfect, 1995).

Hirsutella fue el género más abundante en el SAS2, la única zona de la cueva en la que aparece. Ha sido descrita como patógeno de insectos (Hywel‐Jones, 1997) y nematodos (Jaffee y col., 1988).

184 Epicoccum nigrum sólo fue encontrado en el exterior de la cueva, siendo la especie mayoritaria. Ha sido descrita como patógeno de plantas (Hashem y Ali, 2004) y también se emplea como antifúngico contra otros hongos patógenos. Es uno de los más abundantes en la cueva de Altamira tanto en el exterior como en el interior, como se ha mencionado anteriormente.

Bulleromyces albus fue encontrado en el Pasaje y en la Sala de los Toros‐Divertículo Axial. Esta especie de levadura ha sido encontrada en las manchas negras de esta cueva (comunicación personal de C. Saiz‐Jimenez) y en las hojas de diferentes plantas (Sampaio y col.,

2004).

Doratomyces sólo apareció en el Divertículo de los Felinos. Este género ha sido encontrado en cuevas de Eslovaquia (Nováková y col., 2009), Japón (Nagai y col., 1998), en una mina (Chelebiki, 2008) y en los espeleotemas de Kartchner Cavern, Arizona (Vaughan y col.,

2011).

En el Divertículo Axial el único hongo encontrado fue Arthroderma quadrifidum. Esta especie es teleomorfo de Trichophyton terrestre, dermatófito que crece en la piel y uñas humanas (Brillowska‐

Dabrowska y col., 2007).

Verticillium leptobactrum sólo apareció en el Pasaje‐Ábside‐Nave, a diferencia del muestreo de febrero que estaba mucho más extendida, apareciendo en seis de los diez puntos muestreados.

La especie Sporobolomyces sp. ha aparecido en el Pasaje‐Ábside‐ Nave y en la sala SAS2. Por el contrario en el muestreo de febrero

185 sólo aparecía en el exterior de la cueva. Esta levadura ha sido aislada en hojas de plantas (Wang y Bai, 2004).

Como se puede apreciar no se detectó Ochroconis sp. en el aire, al contrario que en el muestreo efectuado en febrero.

5.4.1.2‐ DIVERSIDAD DE BACTERIAS

En la Tabla 22 se recogen los recuentos totales de las bacterias encontradas en el muestreo de febrero de 2010. En la zona del Pozo fue donde se registró la menor cantidad de esporas en el aire, seguido del exterior de la cueva. Estos dos hechos se repitieron con los recuentos de los hongos efectuados en la misma fecha. En las zonas del Pasaje, Pasaje‐Ábside‐Nave y Sala de los Toros presentaron una mayor cantidad de bacterias en el aire.

Por el contrario el valor máximo se registró en el Divertículo de los Felinos con 15.520 UFC/m3, casi 10 veces más que en el resto de las salas.

Se ha contabilizado que del total de bacterias encontradas en la cueva y el exterior, el 27,8 % son Gram‐negativas y las restantes, el

72,7 % son Gram‐positivas.

La especie más abundante en la mayoría de las salas fue Brachybacterium fresconi. Sin embargo no aparece en el Pozo, y en el exterior de la cueva no es la más abundante. Ésta ha sido aislada anteriormente en las pinturas murales de la capilla de Saint‐

Catherine del castillo Herberstein, Austria (Heyrman y col., 2002).

186 El género Bacillus apareció en casi todas las salas muestreadas y en el exterior, a excepción de la Sala de los Toros. Ha sido encontrado en cuevas como la de Altamira (Laiz y col., 1999), abrigos de la Sierra de Cazorla (Laiz y col., 2000a), en la Grotta dei Cervi (Italia) (Laiz y col.,

2000b) y en una cueva india (Baskar y col., 2006). Bacillus muralis sólo apareció en el Divertículo de los Felinos y la Sala de los Toros‐ Divertículo Axial. Ésta se ha encontrado previamente en pinturas murales de la Necrópolis de Carmona y en la iglesia de Greene‐

Kreiensen, Alemania (Heyrman y col., 2005).

Micrococcus lylae fue la segunda bacterias más abundante, después de Brachybacterium fresconis, en el Divertículo Axial, Sala de los Toros‐Divertículo Axial, Sala de los Toros y SAS2. Ésta fue encontrada en la Cueva de los Murciélagos (Urzi y col., 2010).

Olivibacter soli se localizó en el Pozo, Pasaje, Divertículo Axial, Sala de los Toros‐Divertículo Axial y Sala de los Toros. Esta especie ha sido descrita en suelos (Wang y col., 2008).

Rhodococcus globerulus se halló en el Pozo, Divertículo de los Felinos y Sala de los Toros‐Divertículo Axial. También se encontró en el exterior de la cueva, donde es la bacteria más abundante. Esta especie ha sido descrita en suelos (Barnes y col., 1997).

Acinetobacter estuvo presente sólo en dos de los puntos muestreados, en el Divertículo Axial y en el SAS2. Este género ha sido descrito en suelos (Baumann, 1968).

187 Tabla 22: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de las bacterias del muestreo de febrero de 2010 en Lascaux.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN Abundancia ZONA desviación (% similitud) (%) típica) Streptomyces sp. 99 % 41,62 Agrococcus sp. 96 % 25,16 Pseudomonas stutzeri 99 % 16,77 Pozo 310 Terrabacter sp. 99 % 4,19 (Punto 9) ± 180 Bacillus sp. 99 % 4,19 Olivibacter soli 98 % 4,19 Rhodococcus globerulus 99 % 1,94 Bacillus muralis 99 % 1,94 Brachybacterium fresconis 99 % 88,36 Agrococcus sp. 99 % 3,18 Streptomyces sp. 99 % 2,65 Bacillus sp. 99 % 2,12 Divertículo Streptomyces sp. 99 % 1,06 de los 15.520 Acinetobacter sp. 99 % 0,79

Felinos ± 70 (Punto 8) Bacillus muralis 99 % 0,53 Streptomyces sp. 99 % 0,53 VISITABLE Micrococcus sp. 99 % 0,26 NO Massilia timonae 99 % 0,26 Rhodococcus globerulus 99 % 0,26 ÁREA Brachybacterium fresconis 99 % 80,27

Pasaje ‐ Bacillus pumilus 99 % 13,67 1.500 Ábside‐Nave Agrococcus sp. 99 % 3,8 ± 1.420 (Punto 7) Streptomyces sp. 99 % 1,53 Bacillus sp. 99 % 0,73 Brachybacterium fresconis 99 % 43,30 Microbacterium oxydans 99 % 26,87 Agrococcus sp. 99 % 13,39 Sphingomonas sp. 98 % 5,98 Pasaje 1.120 Streptomyces sp. 99 % 2,95 (Punto 6) ± 310 Streptomyces sp. 99 % 2,95 Pseudomonas stutzeri 99 % 1,52 Olivibacter soli 98 % 1,52 Bacillus sp. 99 % 1,52

188 Tabla 22 (continuación).

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN Abundancia SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Brachybacterium fresconis 99 % 81,11 Micrococcus lylae 99 % 8,25

Bacillus sp. 99 % 3,53

Divertículo Streptomyces sp. 99 % 2,07 4.050 VISITABLE Axial Olivibacter soli 99 % 1,78 ± 1.120

NO (Punto 5) Bacillus sp. 99 % 1,48 Massilia timonae 99 % 1,19 ÁREA Pseudomonas stutzeri 99 % 0,3 Acinetobacter sp. 99 % 0,3 Brachybacterium fresconis 99 % 83,15 Micrococcus sp. 99 % 8,55 Micrococcus lylae 99 % 6,73 Sala de los Streptomyces sp. 99 % 0,45 Toros‐ 4.470 Divertículo Olivibacter soli 98 % 0,22 ± 80 Axial Microbacterium oxydans 99 % 0,22 (Punto 4) Olivibacter soli 99 % 0,22 Bacillus muralis 99 % 0,22 VISITABLE

Rhodococcus globerulus 99 % 0,22

ÁREA Brachybacterium fresconis 99 % 50,64 Micrococcus lylae 99 % 24,06 Sala de los 2.490 Microbacterium oxydans 99 % 15,42 Toros ± 110 (Punto 3) Pseudomonas stutzeri 99 % 5,54 Olivibacter soli 98 % 3,09 Olivibacter soli 99 % 1,25

189 Tabla 22 (continuación).

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN Abundancia SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Brachybacterium fresconis 99 % 78,11 Micrococcus lylae 99 % 6,74 Curtobacterium herbarum 99 % 6,28

Advenella incenata 99 % 2,02 Pseudosphingobacterium domesticum 3,14 98 % SAS2 4.550

VISITABLE Streptomyces sp. 99 % 0,90

(Punto 2) ± 440 Pseudomonas stutzeri 98 % 0,90 ÁREA Bacillus sp. 99 % 0,81 Pseudomonas stutzeri 99 % 0,44 Acinetobacter sp. 99 % 0,44 Flavobacterium sp. 98 % 0,22 Rhodococcus globerulus 99 % 21,66 Microbacterium oxydans 99 % 21,66 Brachybacterium fresconis 99 % 15,27 Agrococcus sp.99 % 12,22 Exterior 360 Curtobacterium herbarum 99 % 9,17 (Punto 1) ± 110 Bacillus licheniformis 99 % 9,17 Arthrobacter sp. 99 % 3,06 Staphylococcus sp. 99 % 3,06 Bacillus sp. 99 % 3,06 Arthrobacter arilaitensis 99 % 1,67

Sphingomonas se encontró en el Pasaje. Este género ha sido descrito en ambientes terrestres y acuáticos, y también formando parte del sistema radicular de las plantas (Mano y Morisaki, 2008).

El género Agrococcus apareció en el Pozo, Divertículo de los Felinos, Pasaje‐Ábside‐Nave, Pasaje y exterior. Las especies pertenecientes a este género han sido encontradas en la filosfera de patatas (Behnrendt y col., 2008), suelo de bosques (Zhang y col., 2010), pinturas murales de la capilla del castillo de Herberstein, Austria

190 (Wieser y col., 1999) y en el aire de la capilla Virgil, Austria (Zlamala y col., 2002).

El género Terrabacter sólo apareció en la zona del Pozo. Algunas especies han sido descritas en suelos (Montero‐Barrientos y col.,

2005) y otras en muestras de aire (Weon y col., 2007).

El género Pseudomonas apareció en el Pozo, Pasaje, Divertículo Axial, Sala de los Toros y SAS2. Las especies de este género son ubicuas y han sido encontradas en suelos (Gill y col., 1994), rizosfera (van Peer y col., 1991) y filosfera de plantas (Behrendt y col., 2003); también aparecen en ambientes acuáticos marinos (Kurath y Morita, 1983) y dulceacuícolas (Hussein y col., 2004). Diferentes especies de este género han sido encontradas anteriormente por Bastián y col.

(2009a, 2009c y 2010) en esta misma cueva.

Streptomyces fue la bacteria más abundante en la zona del Pozo. Aunque también aparece en el Divertículo de los Felinos, Ábside, Pasaje, Divertículos Axial y SAS2 en un menor porcentaje (0,45 %‐ 4,90 %). Es un género muy abundante en ambientes subterráneos como cuevas (Groth y col., 1999), minas (Hamdali y col., 2011), tumbas romanas (Albertano y Urzì, 1999), etc. Muchas de las especies son productoras de sustancias bioactivas, un ejemplo es la cervimicina, componente principal del antibiótico producido por Streptomyces tendae aislado de la Grotta dei Cervi en Italia (Herold y col., 2005).

La Tabla 23, correspondiente al muestreo efectuado en septiembre de 2010, indica que la cantidad de bacterias se ha reducido considerablemente en el interior de la cueva (entre cuatro y diez

191 veces dependiendo de la sala). Por el contrario, en el exterior de la cavidad se ha incrementado aproximadamente tres veces. Este mismo hecho también ha ocurrido con los hongos.

En la zona del Pozo se registró la menor cantidad de bacterias. Mientras que la mayor cantidad se detectó en la Sala de los Toros. Sin embargo, teniendo en cuenta todos los puntos muestreados, incluyendo el exterior, es en este último punto donde apareció el valor más elevado de todos.

La especie Brachybacterium fresconis, la bacteria más abundante en la mayoría de las salas en el muestreo de febrero, no fue detectada en este nuevo muestreo. Así, dependiendo de la sala varían las especies o géneros más abundantes: Bacillus (Pozo, Pasaje y Divertículo Axial), Pseudomonas (Divertículo de los Felinos y exterior), Rhodococcus erythropolis (SAS2), Debaryomyces hansenii (Sala de los Toros) y Microbacterium (Sala de los Toros‐Divertículo Axial y Pasaje‐

Ábside‐Nave).

Pseudomonas es el género más abundante en el Divertículo de los Felinos. Anteriormente se encontró en esta misma cueva como consecuencia de la intensiva utilización de cloruro de benzalconio (Bastián y col., 2009a), y también en la de Altamira aunque en este caso no se ha utilizado nunca biocidas (Schabereiter‐Gurtner y col.,

2002a).

Streptomyces xanthophaeus ha sido encontrado en el Pasaje‐Ábside‐ Nave. También ha aparecido en el agua de goteo de la cueva de Altamira (Laiz y col., 1999), cueva de Tito Bustillo (Groth y col., 1999) y en la cueva de Ardales (Fernández‐Cortés y col., 2011). 192 Tabla 23: Recuentos totales, identificaciones y abundancias de las bacterias del muestreo de septiembre de 2010 en Lascaux.

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN Abundancia SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Bacillus cereus 97 % 28,56 Bacillus sp. 99 % 14,29 Pozo 70 Rhodococcus erythropolis 95 % 28,57 (Punto 9) ± 80 Olivibacter soli 99 % 14,29 Bacillus simplex 99 % 14,29 Pseudomonas sp. 99 % 37,57 Bacillus muralis 99 % 29,19 Divertículo de 740 Micrococcus lylae 99 % 14,59 los Felinos ± 320 (Punto 8) Microbacterium sp 99 % 12,57 Rhodococcus erythropolis 99 % 4,05 Streptomyces sp. 99 % 2,03

Microbacterium sp. 99 % 64,60 Micrococcus lylae 99 % 10,79 Pseudomonas stutzeri 99 % 7,63 VISITABLE

Pasaje ‐Ábside‐ 760 NO

Nave Streptomyces xanthophaeus 99 % 6,18 ± 230 (Punto 7) Streptomyces sp. 95 % 4,61 ÁREA Bacillus sp. 99 % 4,61 Arthrobacter sp. 99 % 1,58 Bacillus sp. 99 % 54,63

Pasaje 540 Agromyces fucosus 99 % 34,07 (Punto 6) ± 30 Pseudomonas stutzeri 82 % 6,67 Acinetobacter johnsonii 98 % 4,63 Bacillus sp. 99 % 78,88

Divertículo Axial 360 Pseudomonas stutzeri 86 % 10,56 (Punto 5) ± 400 Phyllobacterium ifriqiyense 99 % 5,28 Doratomyces sp. 98 % 5,28

193 Tabla 23 (continuación).

UFC /m3 (media ± IDENTIFICACIÓN Abundancia SALAS desviación (% similitud) (%) típica) Microbacterium sp. 99 % 70,48 11,67 Sala de los Toros‐ Bacillus sp. 99 % 420 Divertículo Axial 5,95 ± 320 Pseudomonas stutzeri 84 % (Punto 4) Terrabacter sp. 83 % 5,95 Rhodococcus erythropolis 99 % 5,95 Debaryomyces hansenii 99 % 45,20

Microbacterium sp. 99 % 35,60 Olivibacter soli 82 % 6,84 Sala de los Toros 980

VISITABLE 5,51 (Punto 3) ± 90 Rhodococcus erythropolis 99 % Phyllobacterium sp. 77 % 2,76 ÁREA Pseudomonas stutzeri 95 % 2,76 Agrococcus sp. 100 % 1,33 Rhodococcus erythropolis 99 % 55 Rahnella genomosp. 84 % 25,42 SAS2 700 7,86 (Punto 2) ± 330 Microbacterium sp. 99 % Pseudomonas stutzeri 98 % 7,86 Streptomyces sp. 99 % 3,86 Pseudomonas stutzeri 89 % 50,37 Bacillus sp. 99 % 18,17 Exterior 1.090 Sediminibacterium sp. 85 % 9,08 (Punto 1) ± 100 Curtobacterium flaccumfaciens 99 % 9,08 Stenotrophomonas maltophilia 87 % 9,08 Staphylococcus sp. 99 % 4,22

Agromyces fucosus fue encontrado en el Pasaje. Estas especies son comunes en suelos de cuevas (Jurado y col., 2005).

Phyllobacterium ifriqiyense únicamente apareció en el Divertículo Axial. Esta bacteria ha sido descrita en el rizoplano y nódulos de la raíz de varias plantas (Mantelin y col., 2006).

Rhodococcus erythropolis fue la bacteria más abundante en la zona del SAS2, y cuyas características ya se comentaron anteriormente.

194 Debaryomyces hansenii apareció en la Sala de los Toros. Ha sido descrita como una levadura halotolerante (Neves y col., 1997).

Microbacterium sp. fue la más abundante en la Sala de los Toros‐ Divertículo Axial y Ábside. Algunas especies pertenecientes a este género fueron aisladas en suelos contaminados por petróleo (Schippers y col., 2005) y licores comerciales de maíz (Yokota y col.,

1993).

Olivibacter soli apareció en el Pozo y en la Sala de los Toros. En la primera de las salas presentó una abundancia casi del doble que en la Sala de los Toros, pero la identificación de esta especie en la Sala de los Toros no es concluyente debido al bajo porcentaje de similitud

(82 %).

Rahnella genomospecie apareció en el SAS2 aunque con un porcentaje de similitud bajo (84 %). Éstas son difíciles de diferenciar fenotípicamente de otras especies pertenecientes a este mismo género (Brenner y col., 1998).

En el exterior de la cueva y con igual abundancia, aparecieron Stenotrophomonas maltophilia, Curtobacterium flaccumfaciens y Sediminibacterium sp. La especie Curtobacterium flaccumfaciens ha sido descrita como patógeno de plantas (Maringoni y col., 2006). En los casos de Stenotrophomonas y Sediminibacterium el porcentaje de similitud es relativamente bajo, indicando que pudieran tratarse de géneros diferentes. Sin embargo Stenotrophomonas maltophilia anteriormente había sido encontrada en muestras de paredes y sedimentos de esta misma cueva (Bastián y col., 2009) y descrita como productora de cristales en las catacumbas romanas de San 195 Calixto (Sánchez‐Moral y col., 2004). Sediminibacterium sp. ha sido encontrada en sedimentos de un reservorio eutrófico (Qu y Yuan,

2008).

555...555--- VVVeeennntttaaajjjaaasss eee iiinnncccooonnnvvveeennniiieeennnttteeesss dddeee lllooosss dddooosss mmmuuueeessstttrrreeeaaadddooorrreeesss dddeee aaaiiirrreee eeemmmpppllleeeaaadddooosss eeennn eeessstttaaa ttteeesssiiisss

El muestreador de aire Coriolis μ presentó más limitaciones que el DUO SAS SUPER 360. Con el primero de ellos se muestrearon 1.000 L de aire por punto y se analizaron dos muestras de aire tomadas con el muestreador Coriolis μ como se indica en el apartado 4.1.2, una muestra de la cueva de Castañar de Ibor y otra de la cueva de Altamira. El objetivo fue obtener unos resultados preliminares del funcionamiento del equipo, ya que las limitaciones de éste son muchas para el trabajo en cuevas, principalmente derivados de la rápida degradación de las baterías, que obligan a trabajar con corriente eléctrica, no disponible en la mayoría de cuevas.

En las siguientes tablas (Tabla 24 y 25) se comparan las ventajas e inconvenientes de ambos métodos de muestreo empleados en esta tesis, DUO SAS SUPER 360 y Coriolis μ:

196 Tabla 24: Ventajas e inconvenientes del muestreador DUO SAS SUPER 360.

DUO SAS SUPER 360

VENTAJAS INCONVENIENTES

 Sólo detecta los  Deteccion de mayor microorganismos diversidad microbiana cultivables

 Necesita emplear  Permite capturar diferentes medios de diferentes tipos de cultivo para el estudio de microorganismos hongos y bacterias

 Hay que esperar una  Rapidez en la toma de semana para efectuar los muestras recuentos

 Selección de una  Exige el procesamiento amplia variedad de volumen inmediato de las muestras de aire

 Fácil de transportar (1,75 Kg)

 Programable

 Puede funcionar con batería y electricidad

 El análisis de las muestras supone un menor coste económico (con respecto al Coriolis µ)

197 Tabla 25: Ventajas e inconvenientes del muestreador Coriolis μ.

CORIOLIS μ

VENTAJAS INCONVENIENTES

 Limitaciones en la toma  Fácil de transportar (3 Kg) de muestras

 Detección de  Aparentemente detecta microorganismos cultivables y una menor diversidad no cultivables

 Protocolo de análisis más  No exige el complejo y mayor tiempo para procesamiento inmediato de el procesamiento de las las muestras muestras

 Para capturar grandes volúmenes de aire, el líquido  Permite capturar al contenido en el cono se mismo tiempo hongos y evapora y hay que rellenarlo, bacterias pudiendo existir pérdidas de esporas/bacterias.

 El análisis de las muestras supone un mayor coste  Selecciona una amplia económico, 6 veces mayor con variedad de volumen de aire respecto al DUO SAS SUPER 360.

 Programable

 La batería resultó tener una vida útil muy corta y/o  Puede funcionar con defectuosa, sin posibilidad de batería y electricidad recarga tras el segundo muestreo (la casa comercial no se hizo responsable)

198 555...666--- CCCooonnnsssiiidddeeerrraaaccciiiooonnneeesss gggeeennneeerrraaallleeesss

De acuerdo con los resultados obtenidos en el estudio aerobiológico se observaron los siguientes hechos:

 Las cuevas con doble puerta soportan mejor las visitas y las protegen de las corrientes de aire y del transporte de esporas.

 La apertura de puertas durante períodos prolongados de tiempo origina el transporte hacia el interior de hongos comunes en el aire exterior de la cueva, tales como Cladosporium, Alternaria, Aspergillus, etc. Por el contrario, la apertura de puertas durante cortos períodos de tiempo y/o la existencia de una doble puerta aisla la cueva del exterior.

 Las zonas no visitables están mucho menos contaminadas que las zonas visitables. Esto se observa particularmente en algunas cuevas con largas galerías.

 La introducción de materia orgánica, bien sea accidental o natural, origina desequilibrios en las comunidades, provocando que se desarrollen aquellos miembros de la comunidad más especializados en la descomposición del tipo de materia orgánica introducida.

 Si los vertidos de materia orgánica originan un brote fúngico, éste resulta muy difícil de eliminar.

199  La presencia de pequeños mamíferos (roedores y/o murciélagos) produce un elevado impacto en la cueva por la deposición de excrementos, que son rápidamente colonizados por hongos y dispersa sus esporas en el aire.

Por todo ello se recomienda:

 En cuevas con elevada concentración de esporas fúngicas o bacterias:

‐ disminuir el régimen de visitas hasta que la concentración de esporas/bacterias disminuya hasta niveles permisibles.

‐ si existe persistencia de concentración moderadamente alta de esporas/bacterias en la cueva, hay que estudiar el origen o fuente de producción a fin de arbitrar medidas de control.

200

CCaappííttuulloo 66 Capítulo 6

CCCooonnncccllluuusssiiiooonnneeesss

A continuación se enumeran las conclusiones obtenidas tras el estudio de las diferentes cuevas objeto de la presente tesis. Éstas se presentan, al igual que los resultados, de manera individualizada por cuevas para facilitar su comprensión y de manera global, al comparar los resultados de las cuatro cuevas en conjunto.

Existe una gran divergencia en los resultados obtenidos con dos tipos de muestreadores diferentes, DUO SAS SUPER 360 y Coriolis μ. Mientras que el equipo DUO SAS SUPER 360 parece proporcionar unos resultados más coherentes y tiene una larga tradición en los estudios de aerobiología, el Coriolis μ es de reciente introducción en el mercado y su uso es muy limitado.

201 6.1.‐ CUEVA DE CASTAÑAR DE IBOR (EXTREMADURA)

 La cueva de Castañar de Ibor (Extremadura) sufrió un brote fúngico a causa del vómito de un visitante. Los estudios aerobiológicos fueron llevados a cabo 5 y 12 meses después del accidente. En la zona del accidente 5 meses después del mismo, la cantidad de esporas fúngicas en el aire era de 2.220 UFC/m3, pero doce meses después, esta cantidad se había reducido casi cuatro veces, 660 UFC/m3.

 Existen varias salas en esta cueva que no son visitables. Éstas muestran unas cantidades de esporas fúngicas en el aire de 20‐50 UFC/m3 en ambos muestreos, mostrando claras diferencias entre las zonas visitables y no visitables.

 La zona donde tuvo lugar el vertido accidental mostró en ambos muestreos mayor cantidad de esporas fúngicas que en el exterior de la cueva.

 En esta cueva predomina la especie Pochonia chlamydosporia en la mayoría de las salas estudiadas. Su abundancia en el muestreo de septiembre se podría relacionar con la presencia de insectos, ya que es un hongo entomopatógeno y también coloniza especímenes muertos.

 Las especies de Penicillium, particularmente presentes en el área del vertido, se encontraron sólo en el área visitable de la cueva, y ausentes en el área no visitable.

202  Cladosporium alcanza un porcentaje elevado en el exterior de la cueva, pero mínimo en las zonas no visitables. Esto sugiere que los hongos procedentes del exterior tienen una influencia muy baja o nula en la aerobiología de esta cueva. Esta circunstancia debe explicarse por el aislamiento de la cueva con el exterior debido al sistema de doble puerta que evita las corrientes de aire en su interior.

6.2‐ CUEVA DE ARDALES (ANDALUCÍA)

 La cueva de Ardales (Andalucía) ha sido muestreada después de una visita de 32 personas y después de dos días sin visitas. La zona del Calvario (donde se concentra la mayor cantidad de arte Paleolítico) resultó ser la más sensible, ya que la cantidad de esporas en el aire se multiplicó por 100 después de la visita.

 Cladosporium es un hongo que procede del exterior de la cueva, siendo su abundancia entre el 60‐94% de las UFC/m3. Por el contrario, Penicillium es un hongo que se encuentra en interior de la cueva, ya que la cantidad en el exterior es de 6‐ 30 %.

 La elevada cantidad de Penicillium en el interior de la cueva después de la visita es destacable. Esto se debería a que es dispersado gracias a las turbulencias del aire procedentes de las visitas.

203 6.3‐ CUEVA DE ALTAMIRA (CANTABRIA)

 En la cueva de Altamira (Cantabria) se pueden apreciar dos zonas bien diferenciadas. La primera de ellas termina en la Sala de Polícromos y la Sala de los Muros. La segunda está formada por salas que no presentan muros artificiales que las compartimenten y sus galerías y salas presentan un estado natural. Estas dos zonas muestran un comportamiento diferente en cuanto a la aerobiología. La concentración de esporas fúngicas en la Sala de Polícromos fue de 390 UFC/m3 aire, mientras que en las galerías interiores como la Gran Sala y el Pozo muestran concentraciones de 10‐21 UFC/m3 aire.

 Se ha observado una mayor incidencia de Cladosporium en esta cueva, tanto en las zonas visitables como no visitables. Las zonas no visitables registraron igualmente la presencia de Cladosporium, hecho opuesto a lo encontrado en otras cuevas. Se ha sugerido que pudiera ser debido a una posible conexión entre el Pozo (en la zona no visitable) y otra cueva muy cercana, Castañera (muy contaminada y utilizada como vertedero).

 En la Sala de Polícromos destaca la presencia de Cladosporium y Epicoccum, procedentes del exterior lo que demuestra su sensibilidad a las corrientes de aire derivadas de la apertura de puertas.

 Los datos obtenidos en la cueva de la Estalactita (a 75 m de la de Altamira) son muy parecidos a aquella, indicando que el comportamiento de los microorganismos es comparable. 204

 Los datos muestran que en la cueva de Altamira el problema primordial es la apertura de la puerta principal, que refuerza el papel de la atmósfera como vehículo de transporte y dispersión de microorganismos y nutrientes hacia el interior de la cueva, incluso a la Sala de Polícromos.

6.4‐ CUEVA DE LASCAUX (FRANCIA)

 En el aire de la cueva de Lascaux (Francia), la cantidad de esporas fúngicas fue mayor en el muestreo de febrero que en el de septiembre, mientras que la cantidad de esporas fúngicas en el exterior de la cueva fue menor en el muestreo de febrero que en el de septiembre.

 Aproximadamente el 15 % de los hongos presentes en el aire del Divertículo Axial son hongos melanizados (Doratomyces y Ochroconis). Ochroconis mostró unos porcentajes de abundancia de hasta el 24% en algunas de las salas no visitables.

 El estudio de aerobiología ha demostrado la presencia de Ochroconis. Este hongo ha sido descrito como uno de los formadores de las manchas negras que amenazan desde el año 2001 las pinturas rupestres.

 Destaca la gran variabilidad entre las especies de los hongos y bacterias y su distinta abundancia en los muestreos de febrero y de septiembre de 2010. La diferencia existente entre ambos muestreos es el funcionamiento de un sistema

205 de regulación climática en el interior de la cueva durante el mes de septiembre, por lo que ello puede ser atribuible al uso de este sistema.

6.5‐ COMPARACIÓN DE LAS CUATRO CUEVAS

A la vista de los resultados de este estudio, se extraen las siguientes conclusiones generales:

 La concentración de esporas fúngicas está relacionada con el número de visitas. Esta relación no es tan evidente para la concentración de bacterias en el aire.

 Con los datos obtenidos se podría establecer una clasificación para intentar describir el grado de contaminación de la atmósfera de una cueva turística. Se proponen 5 categorías que van desde una cueva que no presenta problemas a una que está en peligro:

- categoría 1: una cueva sin problemas de hongos se caracteriza por unas concentraciones menores a 50 UFC/m3 aire; - categoría 2: una cueva con unas concentraciones entre 50‐150 UFC/m3 aire se encuentra en el límite de alarma y se recomiendan controles periódicos y estudios para conocer el origen de ésta y proponer soluciones; - categoría 3: una cueva amenazada por los hongos mostrará unas concentraciones en el aire comprendidas entre 150‐500 UFC/m3 aire. En este 206 caso son necesarias la adopción de una serie de medidas tales como: el control de las visitas, el estudio de las corrientes de aire, el cierre de las puertas, etc.; - categoría 4: una cueva muy afectada por los hongos como consecuencia de las visitas, de vertidos de materia orgánica, etc. muestra unas concentraciones entre 500‐1.000 UFC/m3 aire; - categoría 5: una cueva en claro peligro tanto para los visitantes como para las pinturas, muestra unas concentraciones mayores o iguales a 1.000 UFC/m3. Se recomienda el cierre de la cueva mientras se llevan a cabo estudios para determinar la fuente de contaminación microbiana del aire y diseñar estrategias de conservación.

Esta clasificación debe ser considerada como una hipótesis de trabajo y tendrá que ser validada mediante la realización de otros muestreos en otras cuevas con diferente régimen de visitas. Para que los resultados sean comparables se debe seguir la metodología y condiciones aplicadas en este trabajo.

Con esta investigación se ha pretendido conocer los problemas derivados del uso turístico de las cuevas y su impacto sobre el arte rupestre, y se proponen una serie de medidas para preservar las cuevas, el arte rupestre y conseguir un turismo sostenible.

207

CCChhhaaapppttteeerrr 777

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CCCooonnncccllluuusssiiiooonnnsss

It is well known that caves are ecosystems with low nutrient content, stable environmental conditions, low temperatures, high humidity, and are colonized by a variety of microorganisms (Cunningham et al., 1995; Engel et al., 2004; Barton and Northup, 2007). The biotic communities dwelling in caves are not very diverse, contain simple structures and are sensitive to changes, such as the introduction of organic matter from the outside (Chelius et al., 2009).

Spain has more than thirty thousand known caves. Many of them were declared as natural monuments and a few of them were declared World Heritage by UNESCO (www.cuevasturisticas.es).

209 Caves are extremely susceptible to energetic disturbances induced by anthropogenic activity. Some of them include geological, biological and/or cultural features that should be preserved. These changes, and the contributions of organic matter from the outside, can cause a progressive alteration on the microenvironment that result in irreversible damages to a medium‐term (Sanchez‐Moral et al., 1999; Sanchez‐Moral et al., 2000). Each visitor produces several changes in the microclimate of the cave due to the human metabolism.

Aerobiology is defined as the study of the sources, dispersion, and effects of airborne biological materials, such as pollen, spores and microorganisms. Aerobiology in caves is still in its infancy. Few works have been published using different methods. At present, no information has been accomplished on the concentration of fungi in different caves, as well as on its limits of acceptance. These measurements permit to characterize the atmosphere of subterranean environments, particularly those containing rock‐art paintings, in order to preserve these assets.

AIMS

This PhD thesis arises from the growing national and international interest on the aerobiology of caves as one of the most complex areas of microbiology. This study aimed to characterize microbial diversity (bacteria and fungi) in the air of several caves using the air samplers DUO SAS SUPER 360 and Coriolis µ. The caves studied were Castañar de Ibor (Extremadura, Spain), Ardales (Andalucía, Spain), Altamira (Cantabria, Spain) and Lascaux (France).

210 MATERIAL AND METHODS The cave of Castañar de Ibor (Extremadura, Spain) was opened to public visits in 2003. Since then a strict control of visits was designed. Visits were cancelled (on September, 2008) due to an accidental organic matter input (vomit of a visitor) and a subsequent fungal outbreak. Since 2009 the cave is only visited by scientists and staff people.

The cave of Ardales (Andalucía, Spain) was opened to visitors in 1852, but the visits were discontinued in 1896. Actually, this cave is characterized by a very moderate to low visitors impact (1.000 visitors/ year).

The cave of Altamira (Cantabria, Spain) was opened to public in 1917. Massive visits during the 60s and 70s (175,000 visitors) strongly altered the microclimatic conditions resulting in an increasing deterioration of the impressive Paleolithic paintings. The cave was closed to the public in 1977, but reopened in 1982. In 2002 the cave was closed again and nowadays the cave is still close to visitors.

The cave of Lascaux (France) is a paradigm of the effects of massive visits on a rock‐art cave. Briefly, after its discovery in 1940, the cave was seriously disturbed by several destructive interventions. In 1963, the cave was closed due to algal growth on the walls. In 2001, the ceiling, walls and sediments were colonized by the fungus Fusarium solani (Bastian et al., 2009, 2010). Later, black fungal strains appeared on the walls. Biocide treatments, including quaternary ammonium derivates, were applied during several years until January

211 2008. The cave is now closed to visits and periodical controls are being carried out (Bastian et al., 2009, 2010).

In all the caves several sampling campaigns were conducted. Different samplings points were selected (visited and non visited areas), in order to cover as much as possible all cave areas.

For the identification of microorganisms (bacteria and fungi), classical and molecular biology techniques were performed. The samples were taken using the DUO SAS SUPER 360 and Coriolis µ. Subsequently, isolation and identification of the microorganisms were accomplished.

CONCLUSIONS

This thesis dealt with the aerobiology of different touristic caves, in particular the dispersion mechanisms of microorganisms within three Spanish caves and one French cave. The experimental approaches of this thesis were developed in accordance with the objectives.

Castañar de Ibor Cave (Extremadura)

 Castañar de Ibor Cave (Extremadura) suffered a fungal outbreak due to the vomit of a visitor. Aerobiological studies were conducted five and twelve months after the accident. In the area of the accident five months after that event, the amount of fungal spores in the air was 2,220 CFU/m3. Nevertheless, twelve months later the concentration decreased almost four times, 660 CFU/m3.

212  There are several non‐ visited halls in this cave. They showed low fungal spores concentrations (20‐50 CFU/m3) in both samplings, revealing clear differences between visited and non‐visited areas.

 The spillage area always yielded higher concentrations than the outdoor atmosphere.

 In this cave the fungus Pochonia chlamydosporia predominates in most halls sampled. Its abundance in the sampling performed in September 2009 could be related to the presence of insects. This species is a common entomopathogenic fungus and colonizes dead specimens.

 The genus Penicillium was particularly present in the spillage area, but it was only found in the visited areas and was absent in the non‐visited areas.

 The genus Cladosporium represented a high percentage outside the cave, and low percentage in the non‐visited areas. This suggest that outdoor fungi have very low or no influence on the aerobiology of this cave. This could be due to the double door system that avoids sudden air current inside the cave.

213 Ardales Cave (Andalucía)

 The Ardales Cave (Andalucía) has been monitored after a visit of 32 people and without visits. The area so‐called Calvary (which concentrates the greatest number of Paleolithic art) is the most sensitive area since the concentration of fungal spores was 100 times higher after the visit.

 Cladosporium is a fungus which comes from the exterior of the cave since it is more abundant outdoors (60‐94% CFU/m3). In contrast, Penicillium reproduces inside the cave, reaching around 6‐30% outdoors.

 The high concentration of Penicillium inside the cave after the visit is remarkable. This could be caused by the dispersion inside the cave by the air turbulences produced by the visitors.

Altamira Cave (Cantabria)

 The Altamira Cave (Cantabria) has two different areas. The first one ends in the Polychromes Hall and Walls Hall. The second area consists in several halls without man‐made walls. These two areas showed differences concerning aerobiology. The concentration of fungal spores in Polychromes Hall was 390 CFU/m3 air, while in the inner galleries, such as the Great Hall and the Hole Hall, the concentrations were 10‐21 CFU/m3 air.

214  It has been observed a major incidence of Cladosporium in the cave, in both visited and non‐visited areas. The non‐ visited areas showed an unexpected high concentration of this fungus, contrasting with the data obtained in other caves. This could be caused by the possible connection between the Well Hall (in the non‐visited part) and the neighbouring cave, Castañera, which is very polluted and is it used as a landfill.

 In the Polychromes Hall, the presence of Cladosporium and Epicoccum was remarkable, denoting a direct contribution from the outside air.

 The data obtained from the Stalactite Cave (75 m far away from Altamira) and Altamira Cave were very similar, indicating a similar microbial behaviour.

 The data showed that in the cave of Altamira the main problem is the opening of the entrance door, which reinforces the role of the atmosphere as a transport vehicle for the dispersion of microorganism and nutrients inside the cave, even to the deepest galleries.

Lascaux Cave (France)

 In the air of Lascaux Cave (France), the concentration of fungal spores inside was higher in the sampling survey carried out in February 2010 than in September 2010. In contrast, the concentration of fungal spores outside the cave

215 was lower in the sampling survey conducted in February than in September.

 About 15 % of the fungal genera present in the air of the Painted Gallery were melanised fungi (Doratomyces and Ochroconis). Ochroconis reached higher concentrations (up to 24 %) in some non‐visited areas.

 The aerobiological study showed the presence of Ochroconis within this cave. This fungus has been related to the black stains observed on the cave walls and thus can contribute to the biodeterioration of the Paleolithic paintings.

 It is important to note the high variability among fungal and bacteria species and their different abundance in the sampling from February and September 2010. The difference between both sampling was the operation of a climate‐ control system inside the cave during September, therefore the differences observed could be attributed to the use of this system.

To the light of the results of this study, the following general conclusions can be reached:

 Fungal spores concentrations in the air are related to the number of visits. This relationship is not so clear concerning the air concentrations of bacteria.

 A classification has been proposed to describe the atmosphere cleanness of a touristic cave. We propose five

216 categories ranging from no danger to potential danger, related to fungal air concentration:

- category 1: a cave with no fungal problem (< 50 CFU/m3);

- category 2: cave with alarm signal and recommends a series of periodic inspections and studies to disclose the problem (50‐150 CFU/m3);

- category 3: a cave threatened by fungi and this case involves a series of different measures such as control visits, drafts, closing doors, etc. (150‐500 CFU/m3);

- category 4: cave greatly affected by fungi as a result of visits, spillage, etc. (500‐1.000 CFU/m3);

- category 5: a cave in danger (>1.000 CFU/m3). The closing of the cave is recommended while studies to determine the source of microbial air contamination and conservation strategies are performed.

This classification should be considered as a working hypothesis and must be validated carrying out further samplings in other caves with different visitation regime. For comparison purposes the methodology and conditions applied in this work should be followed for the study of other caves. We attempted to know the problems caused by the touristic use of caves and their damage in Paleolithic art. Finally, this work proposes a series of measures to preserve the caves, rock‐art paintings and manage a sustainable tourism.

217

CCCaaapppííítttuuulllooo 888

BBBiiibbbllliiiooogggrrraaafffíííaaa

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Lascaux: www.lascaux.culture.fr

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