Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien

Inauguraldissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der

Fakultät für Chemie

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Dennis Franz-Josef Fiegen

aus Kleve

April 2005

INHALTSVERZEICHNIS ______

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ...... III Abbildungsverzeichnis ...... IX Tabellenverzeichnis ...... XI Abkürzungsverzeichnis ...... XII

1. Einleitung ...... 1 1.1 GTP-bindende Proteine als Elemente der Signaltransduktion ...... 2 1.2 Die Ras-Superfamilie ...... 3 1.3 Die GTPasen der Rho-Familie ...... 7 1.4 Regulatoren und Effektoren der RhoGTPasen ...... 8 1.5 Die Signaltransduktion der Plexin-Transmembranrezeptoren...... 15 2. Zielsetzung ...... 21 3. Material und Methoden ...... 22 3.1 Material ...... 22 3.1.1 Bakterienstämme ...... 22 3.1.2 Insektenzelllinien ...... 22 3.1.3 Nährmedien und Antibiotika ...... 23 3.1.3.1 Nährmedien und Zusätze ...... 23 3.1.3.2 Antibiotika ...... 23 3.1.4 Puffer und Lösungen ...... 23 3.1.5 Vektoren ...... 27 3.1.6 Oligonukleotide ...... 28 3.1.6.1 Oligonukleotide zur Fragmentherstellung ...... 28 3.1.6.2 Oligonukleotide zur Sequenzierung ...... 29 3.1.7 Biochemikalien und Chemikalien ...... 30 3.1.7.1 Proteine und Enzyme ...... 30 3.1.7.2 Nukleotide ...... 30 3.1.7.3 Protein- und Nukleinsäurestandards ...... 31 3.1.7.4 Proteinase-Inhibitoren ...... 31 3.1.7.5 FPLC-Säulenmaterial ...... 31 3.1.7.6 Chemikalien ...... 31 3.1.7.7 Antikörper ...... 32

______III Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien INHALTSVERZEICHNIS ______

3.1.8 Kit-Systeme ...... 32 3.1.9 Geräte ...... 32 3.1.10 Verbrauchsmaterialien ...... 33 3.1.11 Kristallographische Screens ...... 34 3.1.12 Programme ...... 34 3.2 Molekularbiologische Methoden ...... 35 3.2.1 Herstellung kompetenter E. coli Zellen ...... 35 3.2.2 Transformation von E. coli ...... 35 3.2.3 Kultivierung und Lagerung von transformierten Bakterienzellen ...... 35 3.2.4 Isolierung von Plasmid-DNA ...... 36 3.2.5 Präparation von Bakmid-DNA ...... 36 3.2.6 Hydrolyse von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen ...... 37 3.2.7 Agarose-Gelelektrophorese ...... 37 3.2.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen ...... 38 3.2.9 Ligation ...... 38 3.2.10 Polymerasekettenreaktion (PCR) ...... 38 3.2.11 Analytische Schnell-PCR zur Bestimmung positiver Klone ...... 40 3.2.12 DNA-Sequenzierung ...... 41 3.3 Insektenzellen ...... 42 3.3.1 Kulturbedingungen ...... 42 3.3.2 Transfektion von Sf21-Zellen mit rekombinanter Bakmid-DNA ...... 42 3.3.3 Bestimmung des Virus-Titers ...... 43 3.3.4 Virusamplifikation ...... 44 3.3.5 Proteinexpression in Sf21-Zellen ...... 44 3.4 Proteinchemische Methoden ...... 45 3.4.1 Analytische Expression rekombinanter Plasmide ...... 45 3.4.2 Analytischer Aufschluss von Bakterienzellen ...... 45 3.4.3 Präparative Expression rekombinanter Proteine...... 45 3.4.4 Präparativer Aufschluss von Bakterienzellen ...... 46 3.4.5 Präparativer und analytischer Aufschluss von Insektenzellen ...... 46 3.4.6 Affinitätschromatographie ...... 46 3.4.6.1 GST Gene Fusion System ...... 47 3.4.6.2 QIAexpress System ...... 47 3.4.7 Ionenaustauscherchromatographie ...... 47

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien IV INHALTSVERZEICHNIS ______

3.4.8 Gelfiltration ...... 48 3.4.9 Protease-Verdau von GST-/6xHis-Fusionsproteinen ...... 48 3.4.10 Ultrafiltration zur Konzentrierung ...... 49 3.4.11 Konzentrationsbestimmung nach Bradford ...... 49 3.4.12 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)...... 49 3.4.13 Western Blot ...... 51 3.4.14 Umkehrphasen HPLC ...... 53 3.4.15 Nukleotidaustausch ...... 53 3.4.16 GTPase Pulldown Assay ...... 54 3.4.17 Gelelektrophorese nativer Proteine ...... 55 3.5 Biophysikalische Methoden ...... 56 3.5.1 Massenspektrometrie ...... 56 3.5.2 Fluoreszenzspektroskopische Methoden...... 56 3.5.2.1 Bestimmung langsamer Reaktionskinetiken ...... 57 3.5.2.2 Stopped-Flow-Messungen schneller Reaktionen ...... 58 3.5.2.3 Graphische Auswertung der Fluoreszenzdaten ...... 58 3.5.3 Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ...... 59 3.6 Kristallographische Methoden ...... 60 3.6.1 Kristallisation ...... 60 3.6.2 Kristallisation nach der Methode des hängenden Tropfens ...... 61 3.6.3 Kristallisation nach der Methode des sitzenden Tropfens ...... 62 3.6.4 Kristallisationsbedingungen...... 62 3.6.5 Silikonisierung von Deckgläsern...... 62 3.6.6 Kristallmontage ...... 63 3.6.6.1 Verwendung einer Quarzkapillare ...... 63 3.6.6.2 Kristallmontage unter kryogenen Bedingungen...... 63 3.6.7 Grundlagen der Röntgenstrukturanalyse...... 63 3.6.8 Datensammlung ...... 65 3.6.9 Phasenproblem ...... 65 3.6.10 Strukturbestimmung ...... 67 3.6.10.1 Molekularer Ersatz (MR) ...... 67 3.6.10.2 Multipler isomorpher Ersatz (MIR) ...... 68 3.6.11 Modellbau und Strukturverfeinerung ...... 70

______V Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien INHALTSVERZEICHNIS ______

4. Ergebnisse ...... 73 4.1 GTPasen der Ras- und Rho-Familien...... 73 4.1.1 Klonierung und Expression von Rho-GTPasen ...... 73 4.1.2 Reinigung der GTPasen ...... 74 4.2 GTPase bindende Domänen der Plexine (GBD) ...... 75 4.2.1 Klonierung und Expression ...... 76 4.2.2 Reinigung der GBDs ...... 76 4.2.3 Kristallisation der GBDs ...... 77 4.2.4 Charakterisierung der GTPase-GBD Bindung ...... 78 4.2.4.1 Native Gelelektrophorese ...... 78 4.2.4.2 Pulldown Experimente ...... 80 4.2.4.3 GDI Assay ...... 81 4.2.4.4 Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ...... 82 4.2.5 Kristallisation von PlexinB1 GBD mit Rnd1...... 84 4.3 Zytoplasmatische Domänen (CPD) der Plexine ...... 84 4.3.1 Klonierung und Expression in E. coli ...... 85 4.3.2 Reinigung der CPDs aus E. coli ...... 86 4.3.3 α-Chymotrypsin Proteolyse von Plexin A2 CPD ...... 88 4.3.4 Klonierung und Expression der CPDs in Insektenzellen ...... 89 4.3.5 Reinigung der PlexinA2, B1 und B2 CPDs aus Insektenzellen ...... 90 4.3.6 Kristallisation der CPDs ...... 91 4.3.7 Kristallstruktur von Hsp31 ...... 93 4.3.7.1 Kristallisationsbedingung...... 93 4.3.7.2 Analyse der Kristalle ...... 93 4.3.7.3 Derivatisierung der Kristalle ...... 95 4.3.7.4 Datenaufnahme und -prozessierung der Hsp31-Kristalle ...... 96 4.3.7.5 Multipler isomorpher Ersatz (MIR) von Hsp31...... 99 4.3.7.6 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität von Hsp31 ...... 100 4.3.8 Charakterisierung der GTPase-CPD Interaktion ...... 103 4.3.9 Untersuchung der CPDs auf GAP-Aktivität ...... 104 4.4 Kristallstrukturen von Rac1b·GDP und Rac1b·GppNHp ...... 107 4.4.1 Verwendete Proteine ...... 107 4.4.2 Nukleotidaustausch und Nukleotidbefreiung von Rac1b ...... 107 4.4.3 Kristallisation von Rac1b und Rac1b∆C ...... 108

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien VI INHALTSVERZEICHNIS ______

4.4.4 Datenaufnahme von Rac1b∆C·GDP/GppNHp...... 109 4.4.5 Datenprozessierung von Rac1b∆C·GDP/GppNHp ...... 110 4.4.6 Molekularer Ersatz von Rac1b∆C·GDP/GppNHp ...... 111 4.4.7 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität der Modelle ...... 113 4.4.8 GDP/GppNHp-Bindung von Rac1b∆C ...... 116 4.5 Die Kristallstrukturen von TC10...... 119 4.5.1 Verwendete Proteine ...... 119 4.5.2 Nukleotidaustausch ...... 119 4.5.3 Kristallisation ...... 120 4.5.4 Datenaufnahme und –prozessierung ...... 124 4.5.5 Eigenrotationsfunktionen ...... 132 4.5.5 Molekularer Ersatz ...... 135 4.5.6 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität der Modelle ...... 138 4.5.7 Vergleich der TC10 Strukturen...... 148 4.5.7.1 Gemeinsamkeiten ...... 148 4.5.7.2 GDP/GppNHp-Bindung von TC10 ...... 149 4.5.7.3 Die Switch-Regionen von TC10 ...... 153 4.5.7.4 Die β2/β3 Region von TC10 ...... 154 4.5.7.5 Oberflächeneigenschaften von TC10 und Cdc42...... 156 4.5.8 Untersuchung der Normalmodi von TC10·GDP/GTP ...... 157 5. Diskussion ...... 159 5.1 Charakterisierung der Plexin-Proteinfamilie ...... 159 5.1.1 Reinigung und Kristallisation der Plexin-Proteine ...... 160 5.1.2 GTPase-Plexin Interaktion ...... 164 5.1.3 Sind die zytoplasmatischen Domänen der Plexine GAPs? ...... 165 5.1.4 Hsp31-Struktur ...... 166 5.2 Kristallstrukturen von Rac1b∆C ...... 169 5.2.1 Rac1b·GDP/GppNHp zeigen eine konservierte Struktur ...... 170 5.2.2 Der hoch mobile Switch II und die Insertion ...... 171 5.2.3 Die offene Konformation des Switch I ...... 171 5.2.4 Interaktion von Rac1b mit Regulatoren und Effektoren ...... 173 5.2.5 Rac1b im zellulären Kontext ...... 174 5.3 Kristallstrukturen von TC10 ...... 176 5.3.1 Die TC10 Strukturen im Vergleich ...... 177

______VII Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien INHALTSVERZEICHNIS ______

5.3.2 Das zusätzliche Mg2+-Ion im β2/β3-Bereich von TC10∆C·GDP...... 178 5.3.3 Die Nukleotidbindung von TC10 ...... 178 5.3.4 Die Switch-Regionen von TC10 ...... 180 5.3.5 Die Insert-Helix ...... 186 5.3.6 Die Oberflächen im Vergleich ...... 187 5.3.7 Interaktion von TC10 mit Regulatoren und Effektoren ...... 188 6. Zusammenfassung ...... 194 7. Literaturverzeichnis ...... 197 Danksagung ...... 218 Lebenslauf ...... 220 Liste der Publikationen ...... 221

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien VIII INHALTSVERZEICHNIS ______

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1: Die molekulare Schalterfunktion kleiner regulatorischer GTPasen. 3 Abb. 1.2: Strukturelle Übersicht über das Ras-Protein. 6 Abb. 1.3: Regulation der Morphogenese, Adhäsion und Migration durch Rho-GTPasen. 8 Abb. 1.4: Schematische Übersicht der Regulation der RhoGTPasen. 9 Abb. 1.5: Semaphorine und ihre Rezeptoren. 16 Abb. 1.6: Modelle der Semaphorin Signaltransduktion. 17 Abb. 1.7: Sequenzvergleich ausgewählter Plexin und RasGAPs. 20 Abb. 3.1: Struktur von 3‘-O-(N-methyl)-anthranoyl-GTP. 57 Abb. 3.2: Kristallisation und Proteinkonzentration. 60 Abb. 3.3: Kristallisation nach der Methode des hängenden Tropfens. 61 Abb. 3.4: Kristallisation nach der Methode des sitzenden Tropfens. 62 Abb. 3.5: Bragg’s Gesetz. 64 Abb. 3.6: Argand Diagramm für den SIR-Fall. 69 Abb. 3.7: Harker Konstruktion für den SIR-Fall. 69 Abb. 4.1: Übersicht über die verwendeten GTPasen der Ras- und der Rho-Familien. 73 Abb. 4.2: Reinigung von Rnd1∆NC. 74 Abb. 4.3: Übersicht über die Reinheit der verwendeten GTPasen. 75 Abb. 4.4: Übersicht über die verwendeten GTPase-bindenden Domänen der Plexine. 75 Abb. 4.5: Exemplarische Reinigung von PlexinD1 GBD. 76 Abb. 4.6: Übersicht über die Reinheit der Plexin GBDs. 77 Abb. 4.7: Native Gelelektrophorese von verschiedenen Plexinkonstrukten. 79 Abb. 4.8: Native Gelelektrophorese von Ras∆C mit RafRBD als Positivkontrolle. 79 Abb. 4.9: Pulldown Experimente mit GST-Plexin GBDs 80 Abb. 4.10: Pulldown Experiment von Cdc42∆C mit GST-WASp als Positivkontrolle. 81 Abb. 4.11: GDI Experiment für Plexin GBDs mit RhoA, Rac1 und Cdc42. 82 Abb. 4.12: ITC-Dissoziationsmessung von PlexinB1 GBD. 83 Abb. 4.13: ITC-Experiment der Bindung von PlexinB1 GBD an Rho-GTPasen. 83 Abb. 4.14: Übersicht über die verwendeten zytoplasmatischen Proteinfragmente der Plexine. 85 Abb. 4.15: Exemplarische Reinigung von PlexinA2 CPD. 87 Abb. 4.16: α-Chymotrypsin Proteolyse von PlexinA2 CPD. 88 Abb. 4.17: Massenspektroskopische Analyse der α-Chymotrypsin behandelten PlexinA2 CPD. 89 Abb. 4.18: Exemplarische Reinigung von PlexinB1 CPD aus Sf21-Zellen. 91 Abb. 4.19: Kristalle von PlexinB1 CPD. 92 Abb. 4.20: Kristalle von Hsp31. 93 Abb. 4.21: SDS-PAGE/Westernblot der Hsp31-Kristalle und des Kristallisationstropfens. 94 Abb. 4.22: Massenspektroskopische Analyse der Hsp31 Kristalle. 95 Abb. 4.23: Wilsondiagramm des nativen Hsp31-Datensatz. 97 Abb. 4.24: Ramachandran-Diagramm und gemittelte Temperaturfaktoren von Hsp31. 102 Abb. 4.25: Die asymmetrische Einheit der Hsp31-Kristalle. 103 Abb. 4.26: Pulldown Experiment von GST-GTPasen mit PlexinB1 CPD. 103 Abb. 4.27: Stopped-Flow Experimente zur Bestimmung der GAP-Aktivität von PlexinB1 CPD. 105 Abb. 4.28: Stopped-Flow Experimente zur Bestimmung der GAP-Aktivität von COS7 Zelllysaten. 106 Abb. 4.29: Übersicht über die von Rac1b verwendeten Konstrukte im Vergleich zu Rac1. 107 Abb. 4.30: Kristalle von Rac1b∆C GDP/GppNHp. 109 Abb. 4.31: Wilsondiagramme der Rac1b∆C·Datensätze. 110 Abb. 4.32: U-V-Ebene bei W=0 der nativen Pattersondichte des Rac1b∆C·GDP Datensatzes. 112 Abb. 4.33: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheiten von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. 115 Abb. 4.34: Überlagerung der asymmetrischen Einheiten von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. 115 Abb. 4.35: Ramachandran-Diagramme von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. 116 Abb. 4.36: Nukleotidbindung von Rac1b. 117 Abb. 4.37: Stereo-Darstellung des aktiven Zentrums von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. 118 Abb. 4.38: Übersicht über die von TC10 verwendeten Konstrukte. 119 Abb. 4.39: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GDP. 121 Abb. 4.40: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GppNHp. 122 Abb. 4.41: PEG/Ion Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GppNHp. 123 ______IX Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien INHALTSVERZEICHNIS ______

Abb. 4.42: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆NC·GDP. 124 Abb. 4.43: Wilsondiagramm des TC10∆C·GDP Datensatzes. 126 Abb. 4.44: Wilsondiagramm des TC10∆C·GppNHp Datensatzes. 129 Abb. 4.45: Wilsondiagramm des TC10∆NC·GDP Datensatzes. 131 Abb. 4.46: Stereographische Projektion der Eigenrotationsfunktion von TC10∆C·GDP. 133 Abb. 4.47: Stereographische Projektion der Eigenrotationsfunktion von TC10∆C·GppNHp. 134 Abb. 4.48: Stereographische Projektion der Eigenrotationsfunktion von TC10∆NC·GDP. 135 Abb. 4.49: U-V-Ebene bei W=0,5 der nativen Pattersondichte des TC10∆C·GppNHp Datensatzes. 137 Abb. 4.50: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆C·GDP. 139 Abb. 4.51: Die asymmetrische Einheit und Kristallpackung eines TC10∆C·GDP Kristalls. 140 Abb. 4.52: Ramachandran-Diagramm von TC10∆C·GDP. 141 Abb. 4.53: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆C·GppNHp. 142 Abb. 4.54: Die asymmetrische Einheit und Kristallpackung eines TC10∆C·GppNHp Kristalls. 143 Abb. 4.55: Ramachandran-Diagramm von TC10∆C·GppNHp. 144 Abb. 4.56: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆NC·GDP. 146 Abb. 4.57: Die asymmetrische Einheit und Kristallpackung eines TC10∆NC·GDP Kristalls. 147 Abb. 4.58: Ramachandran-Diagramm von TC10∆NC·GDP. 147 Abb. 4.59: Überlagerung der drei TC10 Strukturen. 148 Abb. 4.60: Überlagerung der beiden Strukturen von TC10·GDP und von Cdc42·GDP. 149 Abb. 4.61: Omit-Elektronendichtekarten des aktiven Zentrums von TC10. 150 Abb. 4.62: Nukleotidbindung von TC10. 152 Abb. 4.63: Koordination des zusätzlichen Magnesiumions in der TC10∆C·GDP Struktur. 155 Abb. 4.64: Oberflächeneigenschaften von TC10∆NC·GDP, TC10∆C·GppNHp und Cdc42·GDP. 157 Abb. 4.65: Analyse der Schwingungsmodi von Cdc42·GDP, TC10·GDP und TC10·GTP. 158 Abb. 5.1: Modell zur intrazellulären Signaltransduktion der CPD der Plexin-Proteine. 159 Abb. 5.2: Sequenzvergleich der GBDs der Plexine. 161 Abb. 5.3: Die Koordination des Malonat-Ions. 168 Abb. 5.4: Die 19-Aminosäuren lange Insertion von Rac1b. 169 Abb. 5.5: Vergleich der Rac1 und Rac1b Strukturen. 170 Abb. 5.6:.Der selbstaktivierende Mechanismus von Rac1b. 175 Abb. 5.7: Sequenzvergleich ausgewählter Rho-GTPasen. 176 Abb. 5.8: Überlagerung aller TC10 Strukturen. 177 Abb. 5.9: Stereo-Überlagerung der β2/β3-Regionen. 178 Abb. 5.10: Der molekulare Switch I der Rho-GTPasen im Vergleich. 182 Abb. 5.11: Sequenzvergleich der Rho-GTPasen für die β2/β3-Region. 185 Abb. 5.12: Oberflächeneigenschaften von TC10∆NC·GDP, TC10∆C·GppNHp und Cdc42·GDP. 188

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien X INHALTSVERZEICHNIS ______

Tabellenverzeichnis

Tab. 1.1: Die Ras-Superfamilie der kleinen GTPasen. 4 Tab. 1.2: Die Rho-Familie. 7 Tab. 3.1: Verwendete Bakterienstämme. 22 Tab. 3.2: Verwendete Insektenzelllinien. 22 Tab. 3.3: Primäre Antikörper. 32 Tab. 3.4: Sekundäre Antikörper. 32 Tab. 3.5: Herstellung von Glycin-SDS-Polyacrylamidgelen. 50 Tab. 3.6: Herstellung von Tricin-SDS-Polyacrylamidgelen. 51 Tab. 3.7: Herstellung von Polyacrylamidgelen für die native Gelelektrophorese. 55 Tab. 4.1: Klonierung und Expression der GTPasen. 74 Tab. 4.2: Klonierung und Expression der Plexin GBDs. 76 Tab. 4.3: ITC-Messungen der Bindung von PlexinB1-GBD an Rho-GTPasen. 84 Tab. 4.4: Derivatisierung der Hsp31 Kristalle. 96 Tab. 4.5: Datenaufnahme des nativen und der Derivatdatensätze. 97 Tab. 4.6: Datenprozessierung des nativen und der Derivatdatensätze. 98 Tab. 4.7: Ausgewählte Parameter der Datensätze im Vergleich. 99 Tab. 4.8: Verfeinerte Schweratomparameter der Derivate. 100 Tab. 4.9: Mittlere Figure of Merit (FOM) in Abhängigkeit von der Auflösung. 100 Tab. 4.10: Strukturverfeinerung von Hsp31. 101 Tab. 4.11: Datensammlung an Rac1b∆C. 109 Tab. 4.12: Datenprozessierung von Rac1b∆C. 111 Tab. 4.13: Molekularer Ersatz für Rac1b∆C. 112 Tab. 4.14: Strukturverfeinerung von Rac1b∆C. 114 Tab. 4.15: Datensammlung an TC10∆C·GDP. 125 Tab. 4.16: Datenprozessierung an TC10∆C·GDP. 127 Tab. 4.17: Datensammlung an TC10∆C·GppNHp. 128 Tab. 4.18: Datenprozessierung an TC10∆C·GppNHp. 129 Tab. 4.19: Datensammlung an TC10∆NC·GDP. 130 Tab. 4.20: Datenprozessierung an TC10∆NC·GDP. 132 Tab. 4.21: Molekularer Ersatz für TC10∆C·GDP. 136 Tab. 4.22: Molekularer Ersatz für TC10∆C·GppNHp. 137 Tab. 4.23: Molekularer Ersatz für TC10∆NC·GDP. 138 Tab. 4.24: Strukturverfeinerung von TC10∆C·GDP. 139 Tab. 4.25: Strukturverfeinerung von TC10∆C·GppNHp. 142 Tab. 4.26: Strukturverfeinerung von TC10∆NC·GDP. 144

______XI Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ______

Abkürzungsverzeichnis

A A Ampere (Stromstärke) Abb. Abbildung Ak Antikörper Amp Ampicillin APS Ammoniumperoxodisulfat Arf ADP-ribosylation factor Arl Arf-like AS Aminosäure ATP Adenosintriphosphat

B bp Basenpaare (base pairs) BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin) bzw. beziehungsweise

C C‘ C-terminal verkürztes Protein °C Temperatur in Grad Celsius Ca2+ Kalziumion Cdc42 cell division cycle 42 cDNA komplementäre DNA (complementary DNA) cm Zentimeter C-Terminus Carboxy-Terminus

D Da Dalton DEAE Diethylaminoethyl DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNAse Desoxyribonuklease dNTP Desoxynukleosidtriphosphat

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien XII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ______

DTE 1,4 – Dithioerythreitol DTT 1,4 – Dithiothreitol

E E.coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Em Emissionswellenlänge ERM Ezrin/Radixin/Moesin et al. et alia (und Co-Autoren) etc. et cetera Ex Excitationswellenlänge

F fl full length (volle Länge) FPLC fast performance liquid chromatography

G g Erdbeschleunigung GAP GTPase aktivierendes Protein GBD GTPase-bindende Domäne GDI Guaninnukleotid–Dissoziations-Inhibitor GDP Guanosindiphosphat GEF Guaninnukleotidaustauschfaktor (guanine nucleotide exchange factor) GMP Guanosinmonophosphat

GppCH2p Guanosin-5‘-(β,γ-methylen)triphosphat GppNHp Guanosin-5‘-(β,γ-imido)triphosphat G-Protein Guaninnukleotid-bindendes Protein GSH Glutathion (reduziert) GST Glutathion-S-Transferase GTP Guanosintriphosphat GTPase Guanosintriphosphatase

H h hora (Stunde)

______XIII Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ______

HCl Salzsäure/Chlorwasserstoff HPLC high pressure liquid chromatography H-Ras Harvey-Ras

I IG Immunglobulin IgG Immunglobulin G IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

K kb Kilobasenpaar kDa Kilodalton kcat maximale Geschwindigkeitskonstante

KD Dissoziationskonstante

KM Michaelis-Menten-Konstante kobs beobachtete Geschwindigkeitskonstante koff Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation kon Geschwindigkeitskonstante der Assoziation K-Ras Kirsten-Ras

L l Liter LB Luria Bertani

M µg Mikrogramm µl Mikroliter µM Mikromolar M molar, Mol pro Liter mA Milliampere mant N-Methylanthraniloyl MAPK mitogen activated protein kinase MCS multiple cloning site mg Milligramm

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien XIV ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ______mant-GDP/mGDP 2’,3’-bis-O-(N-methyl)anthranoyl-GDP min Minute ml Milliliter mM Millimolar

N nf nukleotidfrei ng Nanogramm NLS nuclear localization signal nm Nanometer N-Ras Neuroblastoma-Ras N-Terminus Amino-Terminus

O OD optische Dichte

P PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese Pak p21-activated protein kinase PBS phosphate-buffered saline PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) PDE Phosphodiesterase PDGF platelet derived growth factor PEG Polyethylenglykol Pfu Pyrococcus furiosus (Polymerase) PI 3-K phosphatidylinositol-3-kinase PKC Proteinkinase C PVDF Polyvinyldifluorid

R Rab Ras-like proteins from rat brain Rac Ras-related C3-botulinum toxin substrate Rad Ras associated with diabetes Rag Ras-related GTP-binding protein Ran Ras-related nuclear proteins ______XV Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ______

Ras rat sarcoma RBD Ras-bindende Domäne Rheb Ras homolog enriched in brain Rho Ras homology Rit Ras-like protein in many tissues RNA ribo nucleic acid (Ribonukleinsäure) Rock rho-associated coiled-coil kinase rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Raumtemperatur

S s Sekunde S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae sec Sekunde SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese SH2, SH3 src homology 2/3 srp signal recognition particle

T TAE Tris-Acetat-EDTA Taq Thermophilus aquaticus TBA Tetrabutylammoniumbromid TBST Tris-buffered saline with Tween-20 TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Tiam T-Zell-Lymphom Invasion und Metastasierung (T-cell lymphoma invasion and metastasis) Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan TSS transformation and storage solution Tween-20 Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaureat

U U Unit (Einheit der Enzymaktivität) u.a. unter anderem U/min Umdrehungen pro Minute ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien XVI ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ______

UV Ultraviolett

V V Volt Vol. Volumen v/v Verhältnis Volumen/Volumen

W wt Wildtyp w/v Verhältnis Masse/Volumen

Abkürzungsverzeichnis für Aminosäuren Abkürzungen für Aminosäuren werden im Ein- beziehungsweise Drei-Buchstaben-Code angegeben. A Ala Alanin C Cys Cystein D Asp Aspartat/Asparaginsäure E Glu Glutamat/Glutaminsäure F Phe Phenylalanin G Gly Glycin H His Histidin I Ile Isoleucin K Lys Lysin L Leu Leucin M Met Methionin N Asn Asparagin P Pro Prolin Q Gln Glutamin R Arg Arginin S Ser Serin T Thr Threonin V Val Valin W Trp Tryptophan Y Tyr Tyrosin

______XVII Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ______

Abkürzungsverzeichnis für Nukleotide Abkürzungen für Nukleotide werden im Ein-Buchstaben-Code angegeben.

A Adenin C Cytosin G Guanin T Thymin U Uracil

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien XVIII EINLEITUNG ______

1. Einleitung

Die enorme strukturelle Variabilität und funktionelle Kapazität eines multizellulären Organismus ist dadurch bedingt, dass er die biochemischen Reaktionen von vielen verschiedenen Zellen des gesamten Organismus koordinieren kann. Die Basis hierfür ist die interzelluläre Kommunikation, die es erlaubt, dass eine einzelne Zelle das Verhalten vieler anderer Zellen in einer spezifischen Art und Weise beeinflusst. Die Kommunikation von Zellen erfolgt auf vielen unterschiedlichen Wegen. Neben chemischen Botenstoffen, Gap junctions und direkter Zell-Zell-Interaktion werden auch elektrische Signale als Kommunikationsmechanismus verwendet. Die Weiterleitung von elektrischen Impulsen durch Nervenzellen beruht auf Änderungen im Membranpotential. Nervenzellen benutzen diese Änderungen um mit anderen Zellen an den Synapsen zu kommunizieren. Wichtig hierfür ist die Tatsache, dass elektrische Signale in chemische umgewandelt werden können. Die interzelluläre Signaltransduktion beeinflusst annähernd jede physiologische Reaktion. Sie stellt sicher, dass alle Zellen eines Typs ein für sie bestimmtes Signal erhalten, umsetzen und synchron auf dieses Signal reagieren. Eine weitere Funktion von Signalwegen ist die Koordination des metabolischen Flusses zwischen verschiedenen Geweben. In höheren Organismen haben Signalwege die wichtige Aufgabe der Regulation und Koordination der Zellteilung, so dass sich die Zellen eines Gewebes synchron teilen oder, wenn notwendig, die Zellteilung unterbrechen und in einen Ruhezustand übergehen. Die zelluläre Kommunikation hat ebenfalls einen hohen Stellenwert in der Differenzierung und Entwicklung eines Organismus. Die Entwicklung eines Organismus beruht auf einem genetischen Programm, das zu jedem Zeitpunkt inter- und intrazelluläre Signalkaskaden verwendet. Botenstoffe, die von einer Zelle produziert und ausgesendet werden, beeinflussen die Funktion und die Morphologie einer anderen Zelle des Organismus. Ein weiterer wichtiger Aspekt der Signaltransduktion ist die Wahrnehmung und Verarbeitung von sensorischen Informationen. Externe Reize, wie optische oder akustische Signale, Stress oder das Nährstoffangebot werden in sensorischen Zellen registriert und über Signalwege an andere Zellen des Organismus weitergegeben.

______1 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien EINLEITUNG ______

1.1 GTP-bindende Proteine als Elemente der Signaltransduktion

Signaltransduktion ist im Allgemeinen ein aktiver und folglich energieaufwendiger Prozess, im Gegensatz zu metabolischen Prozessen, wo die Energie aus der enzymatischen Hydrolyse der Phosphoanhydridbindungen des ATP stammt, wird im Fall der regulatorischen Prozesse die Energie des GTP verwendet. Regulatorische GTP-bindende Proteine sind neben der Regulation der Signaltransduktion ebenfalls an der Regulation der ribosomalen Proteinbiosynthese, des intrazellulären Transports von Proteinen und RNA und dem Membrantransport beteiligt (Bourne et al., 1990). Die Einteilung der GTP-bindenden Proteine in fünf „Superfamilien“ erfolgt anhand ihrer Funktion (Bourne et al., 1990; Bourne et al., 1991):

1. die α-Untereinheiten der heterotrimeren G-Proteine (Gα mit Gαs, Gαi, Gαt, Gαo und

Gαq) 2. die Translationsfaktoren der Proteinbiosynthese (IF-2, EF-Tu, EF-G und RF-3) 3. die Ras-homologen Proteine 4. das Signalerkennungspartikel und dessen Rezeptor (SRP und SR) 5. die großen GTP-bindenden Proteine (GBP, Mx und Dynamin)

Regulatorische GTPasen binden GTP und hydrolysieren es Magnesium-abhängig zu GDP und Orthophosphat. Die Grundlage für ihre Schalterfunktion ist durch Konformationsänderungen gegeben, die dem Übergang vom GDP zum GTP gebundenen Zustand folgen (Abb 1.1). Die

Kristallstrukturen von Gαi (Coleman et al., 1994), Transducin (Noel et al., 1993), FtsY (Montoya et al., 1997), EF-Tu (LaCour et al., 1985; Berchtold et al., 1993), EF-G (Czworkowski et al., 1994), Ras (Pai et al., 1989; Milburn et al., 1990), Ran (Scheffzek et al., 1995), Rho (Wei et al., 1997; Ihara et al., 1998), hGBP1 (Prakash et al., 2000) und Dynamin (Niemann et al., 2001) konnten zeigen, dass die Bindung des Nukleotids in strukturell ähnlichen G-Domänen erfolgt. Die Bindungsaffinitäten für das Nukleotid sind sehr hoch und liegen meist in einem Bereich von 107 – 1011 M-1 (Bourne et al., 1991).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 2 EINLEITUNG ______

Abb. 1.1: Die molekulare Schalterfunktion kleiner regulatorischer GTPasen. Die intrinsischen Funktionen, die GTP-Hydrolyse und die Nukleotiddissoziation, der kleinen GTPasen sind langsam, so dass sie regulatorische Proteine benötigen, die diese Prozesse beschleunigen. Der Nukleotidaustausch und die damit verbundene Aktivierung der GTPase kann durch Guaninnukleotidaustauschfaktoren (GEFs) erheblich beschleunigt werden. Gleiches gilt für die Beschleunigung der GTP-Hydrolyse durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs), die dadurch den molekularen Schalter wieder inaktivieren.

1.2 Die Ras-Superfamilie

Ras wurde 1979 als virales Onkogenprodukt des rat sarcoma Virus entdeckt (Chien et al., 1979; Shih et al., 1979). Es ist an der Kontrolle von Wachstum und Differenzierung normaler und transformierter Zellen beteiligt (Wiesmüller & Wittinghofer, 1993; Macara et al., 1996) und ist in etwa 30% aller menschlichen Tumore mutiert (Grunicke et al., 1995). Folge der Mutationen ist häufig, dass onkogene Ras-Proteine konstitutiv im aktiven, GTP-gebundenen Zustand, vorliegen, da sowohl die intrinsische als auch die GAP-stimulierte GTP Hydrolysereaktion beeinträchtigt sind (Chung et al., 1993; Bos et al., 1989; Neri et al., 1988; Seeburg et al., 1984). Das Ras-Protein ist der Prototyp der Ras-Superfamilie der kleinen GTPasen, die auf der Basis von Sequenzähnlichkeiten in neun weitere Familien unterteilt werden kann (Tab. 1-1 Die Ras- Superfamilie): 1. Ras-Proteine (rat sarcoma) regulieren Apoptose, Proliferation und Differenzierung eukaryotischer Zellen (Vojtek & Der, 1998) 2. Rho-Proteine (ras homologous) sind für die Reorganisation des Zytoskeletts, die Kontrolle des Zellwachstums und die Regulation der Genexpression verantwortlich (Mackay & Hall, 1998; Sander & Collard, 1999) 3. Rab-Proteine (ras like proteins from brain) regulieren den Vesikeltransport (Schimmoller et al., 1998; Somsel & Wandinger-Ness, 2000) 4. Arf-Proteine (ADP-ribosylation factor) steuern die Bildung von Vesikeln, ihren Transport von und zum Endoplasmatischen Retikulum sowie zum Golgi-Apparat (Jackson & Casanova, 2000; Moss & Vaughan, 1998)

______3 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien EINLEITUNG ______

5. Ran-Proteine (ras related nuclear transport) sind an der Regulation des Kerntransports beteiligt (Moore, 1998) 6. Rad-Proteine (Ras-associated with diabetes) sind wahrscheinlich an der Reorganisation des Zytoskeletts beteiligt (Bilan et al., 1998; Pan et al., 2000) 7. Rheb-Proteine (ras homolog enriched in brain) scheinen Antagonisten des Ras- Signalwegs zu sein (Clark et al., 1997; Yee & Worley, 1997) 8. Rit-Proteine (ras-like expressed in many tissues) sind vermutlich an der Calcium- vermittelten Signaltransduktion beteiligt (Lee et al., 1996) 9. Rag-Proteine (ras related GTP-binding proteins) sind im Ran-RCC1-Signalweg involviert (Nakashima et al., 1996)

Ras Rho Rab Arf Rad Ran Rheb Rit Rag H-Ras RhoA Rab1A Arf1 Rad Ran Rheb Rit RagA K-Ras RhoB Rab1B Arf2 Gem Rin RagB N-Ras RhoC Rab2 Arf3 Rem1 Ric Gtr1 R-Ras Rac1 Rab3A Arf4 Rem2 Gtr2 M-Ras Rac1b Rab3B Arf5 Kir TC21 Rac2 Rab4 Arf6 Rap1A Rac3 Rab5A Arl1 Rap1B RhoG Rab5B Arl2 Rap2A Cdc42 Rab6 Arl3 Rap2B Rif Rab7 Arl4 RalA TCL Rab8 Arl5 RalB Wrch1 Rab9 Arl6 dexRas Chp Rab10 Arl7 Rhes RhoD Rab11 TC10 Rnd1 Rnd2 Rnd3 TTF Miro1 Miro2 RhoBTB1 RhoBTB2 RhoBTB3

Tab. 1.1: Die Ras-Superfamilie der kleinen GTPasen. Die Ras-Superfamilie kann anhand von der Primärsequenz und funktionellen Gesichtspunkten in neun Familien unterteilt werden. Diese lassen sich erneut anhand vergleichbarer Kriterien in Unterfamilien aufteilen.

Das zentrale Strukturmotiv dieser 18 bis 30 kD großen Proteine ist die sogenannte G- Domäne, die die charakteristischen Funktionen, Nukleotidbindung und Hydrolyse, ausführt. Diese Kerndomäne besitzt eine konservierte Gesamtstruktur, die aus einem zentralen sechs- strängigen β-Faltblatt und fünf α-Helices besteht. 10 Schleifenregionen verknüpfen diese Sekundärstrukturelemente miteinander. Fünf dieser Schleifen (G1 – G5, Abb. 1.2) sind für die Spezifität und die hoch affine Bindung des Nukleotids verantwortlich (John et al., 1990; Bourne et al., 1991; Schmidt et al., 1996; Via et al., 2000).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 4 EINLEITUNG ______

Das G1 oder L1-Motiv, das auch als Phosphat bindende Schleife oder P-Loop bezeichnet wird, mit der Konsensussequenz 10GxxxxGK(S/T)17 hat den größten Beitrag zu der hoch affinen Bindung des Nukleotids (Saraste et al., 1990). Es bindet die Phosphatgruppen des Nukleotids und enthält drei wichtige Aminosäuren: Kodon 12, das für die Aminosäure Gly12 kodiert, ist das am häufigsten mutierte Ras-Kodon in menschlichen Tumoren (Barbacid, 1987; Bos, 1989); Lys16 bildet eine Ring-förmige Struktur, die das β-Phosphat umschließt und so eine positiv geladene Umgebung schafft; Ser17 koordiniert sowohl das Mg2+-Ion als auch das β-Phosphat. Die Substitution von Ser17 zu Asparagin (S17N) führt zu einem dominant negativen Verhalten von Ras, bedingt durch einen drastischen Verlust an Nukleotidbindungsaffinität und einer damit verbundenen höheren Affinität für Guaninnukleotid Austauschfaktoren (Farnsworth and Feig., 1991; John et al., 1993; Feig, 1999). Das G2 oder L2 ist ein integraler Bestandteil der Effektor-bindenden Schleife und enthält das invariante Thr35. Diese Aminosäure ist absolut notwendig für die funktionelle Dynamik der Switch I Region und folglich wichtig für die Effektorbindung (Spörner et al., 2001). Die G3 oder L4-Schleife enthalten das 57DxxG60 Motiv. Die Seitenkette von Asp57 ist dabei an der Koordination des Mg2+-Ions beteiligt, während Gly60 durch eine Wasserstoffbrückenbindung das γ-Phosphat bindet. Gly60 ist ein wichtiger Sensor für die Konformationsänderungen der Switch II Region (Wittinghofer et al., 1993). Die G4 und G5 Schleifen sind für die Erkennung der Guaninbase verantwortlich. Wichtig für die hohe Spezifität der Guanin-Bindung ist das 116NKxD119-Motiv (G4-Schleife), welches mit der Base interagiert. Eine Mutation von Asp119 in Ras führt, wie gezeigt werden konnte, zu einer Änderung der Nukleotidspezifität von Guanosin zu Xanthosin (Schmidt et al., 1996; Cool et al., 1999). Das 145SAK147-Motiv (G5-Schleife) enthält Ser145, das wiederum Asp119 stabilisiert. Ala146 bindet an die Guaninbase und stellt eine weitere Determinante für die Eigenschaft von Ras dar, Guaninnukleotide zu binden. Die G1, G2 und G3 Sequenzmotive sind strukturell um das γ-Phosphat lokalisiert und entsprechen dem Reaktionszentrum des universellen Schalters (Bourne et al., 1991; Wittinghofer & Pai, 1991; Sprang, 1997a). Neben den für die Nukleotidbindung wichtigen Sequenzmotiven existiert bei den meisten GTPasen der Ras-Superfamilie eine weitere Konsensussequenz, die am C-Terminus der Proteine lokalisiert ist, die sogenannte CaaX-Box (C = Cystein, a = aliphatische Aminosäure, X = beliebige Aminosäure). Diese Signalsequenz dient der posttranslationalen Modifikation der GTPase durch hydrophobe Gruppen wie z.B. Farnesyl- oder Geranylgeranyl-Reste. Eine solche Lipidmodifikation ist für die Funktion der GTPasen essentiell und führt zu einer Lokalisierung in der Zellmembran (Brown & Goldstein, 1993). Die letze Aminosäure der

______5 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien EINLEITUNG ______

CaaX-Box bestimmt welche Art der Modifikation erfolgt: bei Serin oder Methionin erfolgt die Modifikation durch eine Farnesyltransferase, bei Leucin hingegen durch eine Geranylgeranyltransferase (Goldstein et al., 1991; Marshall, 1993; Moores et al., 1991; Reiss et al., 1991; Seabra et al., 1991). Nachdem die Thioetherbildung durch die Transferase erfolgt ist, werden die letzten drei Aminosäuren durch eine Endopeptidase abgespalten und die entstehende Carboxylgruppe durch eine Methyltransferase methyliert (Gutierrez et al., 1989; Hancock et al., 1991a). Eine weitere Palmitoylierung an C-terminal liegenden Cysteinen spielt bei der Stabilität der Membranassoziation eine große Rolle und ist aufgrund des Thioesters reversibel (Hancock et al., 1989; Hancock et al., 1990; Choy et al., 1999; Magee & Marshall, 1999; Völkert et al., 2001; Rocks et al., 2005).

Abb. 1.2: Strukturelle Übersicht über das Ras-Protein. A Sekundärstrukturelemente sind als Zylinder (α-Helices) und Pfeile (β-Faltblattstränge) dargestellt. Die Guaninnukleotidbindungstasche wird durch fünf Schleifenregionen ausgebildet (G1-G5; gelbe Kästchen), die in allen GTPasen konserviert sind. Die CaaX-Box, die der Isoprenylierung dient, ist am C-Terminus hervorgehoben. B Die Strukturen des C-terminal verkürzten Ras·GDP ist auf der linken Seite (Pai et al., 1990), während auf der rechten Seite Ras·GppNHp (Milburn et al., 1990) dargestellt ist. Der P-Loop ist in blau, der Switch I in rot, der Switch II in grün, das Nukleotid in schwarz und das Mg2+-Ion in zyan hervorgehoben.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 6 EINLEITUNG ______

1.3 Die GTPasen der Rho-Familie

Bisher sind 24 verschiedene Proteine bekannt, die der Rho-Familie kleiner regulatorischer GTPasen zugeordnet werden und aufgrund ihrer Primärsequenzhomologien in sieben Untergruppen unterteilt werden können (Bishop & Hall, 2000; Ellis & Mellor, 2000; Vignal et al., 2000; Wherlock & Mellor, 2002). RhoA (ras homologous A), Rac1 (ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) und Cdc42 (cell division cycle 42) gehören dabei zu den bisher am Besten untersuchten Proteinen der Rho-Familie (Hall, 1998).

Rho Rac Cdc42 RhoD TTF Rnd Miro RhoBTB RhoA Rac1 Cdc42 RhoD TTF Rnd1 Miro1 RhoBTB1 RhoB Rac1b TCL Rif Rnd2 Miro2 RhoBTB2 RhoC Rac2 Wrch1 Rnd3 RhoBTB3 Rac3 Chp RhoG TC10

Tab. 1.2: Die Rho-Familie. Die hier dargestellte Unterteilung der Rho-Familie in sieben Gruppen erfolgte auf der Basis von Primärsequenzhomologien und funktionellen Eigenschaften der einzelnen Proteine.

Im Gegensatz zu den Proto-Onkogenen der Ras-Familie, die durch Punktmutationen konstitutiv aktiviert werden können und so zur Tumorentstehung und Progression beitragen, hat man bisher nur in einem Fall (RhoH) mutierte Rho-Proteine in Tumoren entdeckt (Preudhomme et al., 2000). Dennoch hat diese Proteinfamilie eine zentrale Rolle bei der Tumorprogression und Metastasierung von Zellen (Price & Collard, 2001; Schmitz et al., 2000). Diese Eigenschaft beruht auf einem erhöhten Expressionslevel oder der veränderten Aktivität aktivierender Regulatorproteine (Sahai & Marshall, 2002; Boettner & van Aelst, 2002). Die Signaltransduktion durch RhoGTPasen und die damit verbundenen biologischen Funktionen waren in den letzten Jahren Gegenstand intensiver Forschung. Ihre Rolle bei der Tumorentstehung und –progression ist allerdings noch wenig untersucht. Abbildung 1.3 zeigt eine Übersicht über die biologischen Prozesse in denen RhoGTPasen involviert sind, zu denen Morphogenese, Phagozytose, Pinozytose, Zytokinese, Axonwachstum, Zell-Zell und Zell-Matrix Adhäsion, sowie Kontrolle der Zellpolarität, des Zellzyklus und der Zellbewegung gehören (Kaibuchi et al., 1999; Chimini & Chavier, 2000; Luo, 2000; van Aelst & D’Souza-Schorey, 1997; Daub et al., 2001; Etienne-Manneville & Hall, 2001; Raftopoulou & Hall, 2004). Die Zellbewegung ist im Besonderen für die Embryonalentwicklung, Immunantwort, Wundheilung, Tumorbildung und Metastasierung von Bedeutung (Horwitz & Parsons, 1999). Die Aktivierung der GTPasen durch extrazelluläre Signale (Abb. 1.3), wie Wachstumsfaktoren und Zytokine, führt vorwiegend zu

______7 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien EINLEITUNG ______einer Reorganisation des Aktinzytoskeletts. Die unterschiedliche subzelluläre Lokalisation der Rho-Proteine geht einher mit ihren biologischen Funktionen. RhoGTPasen sind sowohl an der Regulation der Aktinpolymerisation an Membranen, als auch an der Kontrolle der Genexpression über Signalkaskaden von der Plasmamembran in den Kern beteiligt (Mackay & Hall, 1998). So reguliert RhoA z.B. die Ausbildung von Aktomyosinfasern, sogenannten Stressfasern, die eine wichtige Rolle bei der Zellkontraktion spielen, andererseits aber auch die Entstehung von fokalen Adhäsionen, die für die Zell-Matrix Adhäsion essentiell sind. Rac1 ist für die Ausbildung von netzartigen Membranfortsätzen verantwortlich, die auch als Lamellipodien bezeichnet werden. Eine Aktivierung von Cdc42 hingegen führt über die Polymerisation von Aktin zu langen fingerähnlichen Membranausstülpungen, sogenannten Filopodien (Hall, 1998).

Abb. 1.3: Regulation der Morphogenese, Adhäsion und Migration durch Rho-GTPasen. Die Rho-Proteine sind über ihre C-terminale Modifizierung an der Plasmamembran verankert. Die Aktivierung erfolgt aufgrund eines extrazellulären Signals. In ihrer aktiven GTP-gebundenen Form wird das Signal an viele verschiedene Effektorproteine weitergeleitet, die ihrerseits ein Spektrum biologischer Prozesse kontrollieren. Transiente Transfektionexperimente haben gezeigt, dass die GTPasen auch untereinander in Wechselwirkung treten können.

1.4 Regulatoren und Effektoren der RhoGTPasen

Die Funktion der RhoGTPasen als molekulare Schalterproteine hängt, wie bei den anderen Mitgliedern der Ras-Superfamilie, von ihrem Nukleotid-gebundenen Zustand ab. Fast alle GTPasen der Ras-Familie durchlaufen einen Regulationszyklus mit einem inaktiven, GDP- gebundenem Zustand und einem aktiven, GTP-gebundenem Zustand, in dem die Signalweiterleitung durch Bindung von Effektorproteinen möglich ist. Die intrinsischen Prozesse, die Hydrolyse von GTP bzw. der Austausch von GDP zu GTP, sind sehr langsam

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 8 EINLEITUNG ______und bedürfen somit zusätzlicher Regulatorproteine, die den Nukleotid-gebundenen Zustand der GTPase strikt kontrollieren (Abb. 1.4).

1. Guaninnukleotidaustauschfaktoren (guanine nucleotide exchange factors, GEFs; Zheng, 2001; Cerione & Zheng, 1996; Schmidt & Hall, 2002) 2. Guanosintriphosphatase-aktivierende Proteine (GTPase activating proteins, GAPs; Lamarche & Hall, 1994) 3. Guaninnukleotiddissoziationsinhibitoren (guanine nucleotide dissociation inhibitors, GDIs; Olofsson, 1999)

Abb. 1.4: Schematische Übersicht der Regulation der RhoGTPasen. Die Rho-Proteine zirkulieren zwischen dem aktiven, GTP-gebundenem und dem inaktiven, GDP-gebundenem Zustand. Dabei wird der Nukleotid-gebundene Zustand der GTPase an der Membran strikt durch GAPs und GEFs kontrolliert. Durch die Translokation von der Membran ins Zytoplasma verhindern GDI-Proteine die Aktivierung der GTPasen durch GEFs, indem sie die RhoGTPasen vom Ort ihrer Aktivierung und Wirkung entfernen. In der aktiven Form übertragen die Rho-Proteine das empfangene Signal auf diverse Effektormoleküle, die das Signal amplifizieren und propagieren. Die Zellantwort ist abhängig von der Art und der Lokalisierung des jeweils aktivierten Effektors.

Guaninnukleotidaustauschfaktoren (GEFs)

Guaninnukleotidaustauschfaktoren aktivieren die GTPase, indem sie die langsame intrinsische Dissoziation des GDP beschleunigen (Abb. 1.4). Für das Ras-Protein existiert ein Modell (Lenzen et al., 1998), welches einen ternären Komplex aus Ras·GDP und GEF postuliert. In diesem Komplex ändert sich die Konformation der Switch-Regionen der GTPase durch die GEF-Bindung und führt zu einer Verringerung der Nukleotidaffinität. Nach der

______9 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien EINLEITUNG ______

Nukleotiddissoziation stabilisiert das GEF den nukleotidfreien Zustand und ermöglicht so die nachfolgende Bindung von GTP, das in der Zelle in höherer Konzentration als GDP vorliegt. Durch die GTP-Bindung wird der GTPase·GEF Komplex wieder aufgelöst. Die Nukleotide GDP und GTP konkurrieren also kompetitiv um die Bindung, wobei das Gleichgewicht konzentrationsabhängig weit in Richtung GTP-Bindung verschoben ist. Die Guaninnukleotidaustauschfaktoren für Rho-Proteine gehören fast ausnahmslos zur Familie der Dbl-homologen Proteine, mit zurzeit mehr als 69 Mitgliedern (Schmidt & Hall, 2002). RhoGEFs werden in den meisten Fällen entweder durch extrazelluläre Signale aktiviert oder zur Zellmembran rekrutiert, wo sie dann spezifisch den Austausch von GDP zu GTP katalysieren (Vetter & Wittinghofer, 2001; Zheng, 2001; Schmidt & Hall, 2002; Moon & Zheng, 2003; Erickson & Cerione, 2004). Charakteristikum der RhoGEFs ist die Dbl- homologe Domäne (DH), die für die GEF-Aktivität verantwortlich ist (Hart et al., 1994). Der DH-Domäne folgt eine Pleckstrin-homologe Domäne (PH), die an Inositol-Phospholipide binden kann und folglich als eine Membran-bindende Domäne angesehen wird (Cerione & Zheng, 1996; Irvine, 1998). Den PH-Domänen von Trio und SOS wurde eine direkte regulierende Wirkung auf die DH-Aktivität zugeschrieben. Dies zeigte die Kristallstruktur von SOS, die eine direkte Interaktion der DH- und der PH-Domäne bestätigte (Liu et al., 1998; Soisson et al., 1998). Die dreidimensionale Struktur von Tiam1 im Komplex mit Rac1 hingegen zeigte keine Interaktion der PH- mit der DH-Domäne (Worthylake et al., 2000). Zusätzliche Domänen der jeweiligen GEFs kontrollieren möglicherweise die Variabilität der intrazellulären Lokalisation (Cerione & Zheng, 1996). Ein weiterer Aspekt in diesem Zusammenhang könnte die Modulation der GEF-Funktion sein. Es wurde schon vielfach gezeigt, dass die zusätzlichen Domänen auch regulatorisch auf die GEF-Aktivität einwirken können (Schmidt & Hall, 2002). Ein weiterer interessanter Aspekt der RhoGEFs ist die Tatsache, dass viele dieser Proteine protoonkogene Eigenschaften besitzen (Eva & Aaronson, 1985; Katzav et al., 1989; Miki et al., 1993; Chan et al., 1994; Horii et al., 1994; Toksoz & Williams, 1994; Whitehead et al., 1995a,b; Chan et al., 1996; Glaven et al., 1996; Chuang et al., 1995; Habets et al., 1994; Zheng et al., 1995; Westwick et al., 1998). So ist beispielsweise Bcr an der Entstehung von Leukämie und Tiam1 an der Tumorinvasion und Metastasierung beteiligt. Eine erhöhte Genexpression oder eine veränderte subzelluläre Lokalisierung kann zu Fehlregulation und unkontrollierter Aktivierung der Rho-Proteine führen. Eine der möglichen Folgen ist eine erhöhte Zellproliferation (Stam & Collard, 1999). Dies wäre ebenfalls eine Erklärung für die erhöhte, abnormale Aktivität von RhoGTPasen in manchen metastasierenden Tumoren (Clark et al., 2000; del Peso et al., 1997). ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 10 EINLEITUNG ______

Guanosintriphosphatase-aktivierende Proteine (GAPs)

Von den Guanosintriphosphatase-aktivierenden Proteinen sind zurzeit etwa 20 Vertreter bekannt. RhoGAPs können die sehr langsame intrinsische Hydrolyse der RhoGTPasen zur Beendigung der Signaltransduktion des aktiven GTP-gebundenen Zustands bis zu 105-fach beschleunigen (Wittinghofer et al., 1997; Graham et al., 1999). Über den Mechanismus der GAP-katalysierten GTP-Hydrolyse wurde lange spekuliert. Anhand der Kristallstruktur des Ras·p120GAP-Komplexes in Anwesenheit von Aluminiumfluorid (Scheffzek et al., 1997a) und durch die biochemische Charakterisierung des Einflusses verschiedener Aminosäuren auf die GAP-Katalyse (Ahmadian et al., 1997), konnte gezeigt werden, dass GAP-Proteine aktiv an der GTP-Hydrolyse beteiligt sind. Aluminiumfluorid bindet in Gegenwart von GDP an der Position des γ-Phosphats und imitiert so, aufgrund seiner trigonal bipyramidalen Koordination, den Übergangszustand der GTP- Hydrolysereaktion (Mittal et al., 1996). Für die Stabilisierung dieses Übergangszustands ist sowohl ein konserviertes Glutamin (Q61 in Ras, Rac und Cdc42 bzw. Q63 in Rho), als auch auf Seiten des GAP-Proteins ein konserviertes Arginin von entscheidender Bedeutung. Dieser sogenannte Arginin-Finger ist in allen bekannten Ras- und Rho-GAPs konserviert (Ahmadian et al., 1997; Scheffzek et al., 1998) und neutralisiert die während des Übergangszustands entstehende negative Ladung, so dass der in-line Angriff des nukleophilen Wassermoleküls erfolgen kann. Diese Einblicke in den Mechanismus der GAP-katalysierten GTP- Hydrolysereaktion lieferten gleichzeitig die Erklärung für die im ras-Gen häufig vorkommenden onkogenen Mutationen, Gly12 und Q61. Fehlt die Glutaminseitenkette, so erfolgt keine Stabilisierung des für den nukleophilen Angriff auf das γ-Phosphat verantwortlichen Wassermoleküls. Eine Substitution des Glycins durch eine andere Aminosäure verwehrt dem Arginin-Finger sterisch den Zugang zum aktiven Zentrum (Scheffzek et al., 1997). Ras ist dadurch in einem konstitutiv aktiven, GTP-gebundenem Zustand und kann auch durch GAP-Proteine nicht mehr inaktiviert werden. Vergleichbare Mechanismen wurden ebenfalls für die GTP-Hydrolyse der RhoGTPasen nachgewiesen (Hoffman et al., 1998; Rittinger et al., 1997).

Guaninnukleotiddissoziationsinhibitoren (GDIs)

In stimulierten Zellen sind die RhoGTPasen vornehmlich an der Zellmembran lokalisiert, wo sie ihre biologische Funktion ausüben. Neben dem schon beschriebenen GTPase Zyklus (Abb. 1.1) gibt es bei den RhoGTPasen einen weiteren Zyklus, der dem Transfer zwischen

______11 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien EINLEITUNG ______

Plasmamembran und Zytosol entspricht (Abb. 1.4) und durch Guaninnukleotid- dissoziationsinhibitoren gewährleistet wird (Olofsson, 1999). In ruhenden Zellen können GDI-Proteine die isoprenylierten RhoGTPasen aus der Zellmembran extrahieren und erzeugen so eine zytosolische Fraktion. Drei GDIs sind zurzeit für die Rho-Familie beschrieben: GDI-1 (auch GDIα; ubiquitäre Expression; 23.4 kDa), GDI-2 (auch GDIβ, D4- GDI oder Ly-GDI; ausschließlich im hämatopoetischen System exprimiert; 25,3 kDa) und GDI-3 (auch RhoGDIγ; Expression in Gehirn und Pankreas; 25,3 kDa) (Olofsson, 1999). Die Bindung der RhoGDIs an die RhoGTPasen erfolgt nur mit hoher, subnanomolarer Affinität, wenn diese isoprenyliert vorliegen (Gosser et al., 1997; Nomanbhoy et al., 1999, Newcombe et al., 1999). Insgesamt sind bisher sieben GDI Strukturen bekannt, von denen vier im Komplex mit RhoA, Cdc42, Rac1 und Rac2 gelöst wurden (Keep et al., 1997; Lian et al., 2000; Longenecker et al., 1999; Hoffman et al., 2000; Scheffzek et al., 2000; Grizot et al., 2001). Demnach zeigen GDI-Proteine eine kleine N-terminale Domäne mit einem Helix-Loop-Helix-Motiv (~3 kDa), der eine Immunglobulin-ähnliche Domäne folgt (16 kDa). Im vorgeschlagenen regulatorischen Modell binden die GDI-Proteine zunächst an die Switch- Regionen der GTPase und extrahieren dann in einem zweiten Schritt die Isoprenylgruppe der RhoGTPasen aus der Zellmembran, durch eine Insertion dieser Gruppe in eine hydrophobe Tasche des GDI (Hoffman et al., 2000). Hierdurch werden die Rho-Proteine von der Plasmamembran entfernt und eine Aktivierung durch die Membran-assoziierten GEFs unmöglich. Diese Translokation ins Zytoplasma der Zelle ist durch eine Interaktion des GTPase·GDI-Komplexes mit den Proteinen der ERM (Ezrin/Radixin/Moesin)-Familie reversibel (Abb. 1.4).

Effektorproteine

Die Signalweiterleitung der RhoGTPasen erfolgt im aktiven, GTP-gebundenen Zustand, durch die Wechselwirkung mit Effektorproteinen (Bishop & Hall, 2000; van Aelst & D’Souza-Schorey, 1997; Schmitz et al., 2000). Aufgrund der Vielfalt wichtiger zellulärer Prozesse, an denen die Rho-Proteine beteiligt sind, ist es nicht überraschend, dass intensiv an der Identifikation und Charakterisierung dieser Ziel- und Effektorproteine gearbeitet wurde, um die Signalübertragung zwischen GTPase und Effektor zu verstehen. Mehr als 30 potentielle Effektoren für Rho, Rac und Cdc42 sind bis heute bekannt und wurden primär mittels Two-Hybrid-System und äffinitätschromatographischer Verfahren identifiziert (Bishop & Hall, 2000; van Aelst & D’Souza-Schorey, 1997). Eine wichtige Eigenschaft von ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 12 EINLEITUNG ______

Effektoren ist ihre Fähigkeit zwischen dem GDP- und dem GTP-gebundenen Zustand der GTPase unterscheiden zu können. Die Aktivierung des Effektormoleküls erfolgt durch die Interaktion mit der aktiven, GTP-gebundenen GTPase, so dass anschließend das Signal an nachgeschaltete Moleküle weitergegeben werden kann. Ein Vergleich der Kristallstrukturen von RhoA·GDP und RhoAG14V·GTPγS zeigt Konformationsänderungen hauptsächlich in der Switch I-Region (Aminosäuren Asp28 – Thr37) und der Switch II-Region (Aminosäuren Ala61 – Pro71) (Wei et al., 1997; Ihara et al., 1998). Mutationsstudien haben gezeigt, dass Effektorproteine nicht nur zwischen dem aktiven beziehungsweise inaktiven Zustand der GTPase unterscheiden, sondern auch zusätzlich spezifische Regionen außerhalb der Switch-Regionen erkennen. Hier sind insbesondere die β2/β3-Region und die Insert-Helix (Aminosäuren 125 – 137) zu nennen (Maesaki et al., 1999; Fujisawa et al., 1998; Lamarche et al., 1996; Joneson et al., 1996). Die Rho-Effektoren werden zurzeit anhand ihrer Rho-bindenden Domänen (RBD) in drei Klassen unterteilt. Die bisher als Rho-Effektoren identifizierten Proteine (Citron-Kinase, rho- associated coiled coil kinase (ROCK), mDia, Rhotekin, Rhophilin und PKN) besitzen nur geringe Homologie in ihrer Aminosäureprimärsequenz. Die RBD der drei Effektorproteine Rhotekin, Rhophilin und PKN wird als Klasse I-Motiv, die von ROCK als Klasse II- und die von Citron als Klasse III-Motiv bezeichnet (Reid et al., 1996). Für p140mDia, das zur Familie der Formin-ähnlichen Proteine gehört, ist die Art der Rho- selektiven Bindung Gegenstand intensiver Forschung. Da die Sequenz von mDia aber keine Homologie zu der eines anderen Effektors aufweist (Watanabe et al., 1997), handelt es sich bei dieser RBD vermutlich um eine eigene Klasse. Die Kristallstruktur des RhoA·PKN-Komplexes zeigt für die RBD von PKN eine antiparallele coiled-coil-Faltung, die auch als ACC-Finger bezeichnet wird (Maesaki et al., 1999). Sie besteht aus zwei langen und einer kurzen Helix. Der ACC-Finger von PKN interagiert mit der Switch I-Region, mit den β-Faltblattsträngen β2 und β3, sowie mit der C-terminalen α5- Helix. Mit der extrahelikalen Domäne konnte allerdings keine Interaktion gezeigt werden. Die für die Spezifität wichtigen Aminosäurereste liegen in den Interaktionsregionen und unterscheiden sich von denen, die aus den verschiedenen Cdc42-Effektorkomplexen bekannt sind. Zusätzlich wurde für den RhoA·PKN-Komplex eine zweite Kontaktfläche gezeigt, die die β3 und die Switch II-Region umfasst. Die erste Kontaktfläche zeichnet sich durch elektrostatische Wechselwirkungen aus, während die zweite hydrophober Natur ist. Ob RhoA tatsächlich über zwei Bindungsstellen verfügt ist derzeit unklar, obwohl in Lösung eine GTP-

______13 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien EINLEITUNG ______abhängige 1:2-Stöchiometrie für den RhoA·PKN-Komplex gefunden wurde (Maesaki et al., 1999). Aus Sequenzvergleichen wurde ursprünglich auch für ROCK vermutet, dass es ein ACC- Finger-Motiv enthält. Die Struktur des RhoA·ROCK-RBD-Komplexes zeigte hingegen, das ROCK zwar auch in Form einer coiled-coil-Struktur vorliegt, aber keinen ACC-Finger besitzt (Ihara et al., 2000; Dvorsky et al., 2004). Im Gegensatz zu den RhoA-Effektoren enthalten viele Effektorproteine von Rac und Cdc42 eine konservierte GTPase-bindende Konsensussequenz, das sogenannte CRIB (Cdc42/Rac- interactive binding)-Motiv (Burbelo et al., 1995). Anhand von NMR-Studien an Cdc42 im Komplex mit αPAK, WASP beziehungsweise ACK (Mott et al., 1999; Abdul-Manan et al., 1999; Morreale et al., 2000) konnte gezeigt werden, dass alle G-Protein-bindenden Domänen (GBD) der drei Effektoren an dieselben Regionen von Cdc42 binden. Dies sind die Switch I- und die Switch II-Region, die Helices α1 und α5, sowie die β-Faltblattstränge β2 und β3. Der N-Terminus, an dem das CRIB-Motiv lokalisiert ist, zeigt die größte Homologie in der Sequenz der Effektorproteine. Alle drei Strukturen zeigen, dass die Bindung an Cdc42 durch Ausbildung eines intermolekularen β-Faltblatts erfolgt. Die C-Termini der GBDs der drei Effektorproteine sind nicht homolog und zeigen Unterschiede in der Art der Bindung. Die Art und Weise der Interaktion in Form eines intermolekularen β-Faltblatts ähnelt eher der Interaktion der Ras-RalGDS und Rap1A-Raf Komplexe (Huang et al., 1998; Nassar et al., 1995) als der des Rho·PKN-Komplexes (Maesaki et al., 1999).

Bakterielle Toxine

Neben den oben angesprochenen zellulären Regulatoren der Rho-Proteine sind diese auch Angriffsziel bakterieller Toxine. Diese wirken entweder als GEF- oder GAP-ähnliche Regulatoren oder modifizieren die Rho-GTPasen kovalent durch ADP-Ribosylierung, Glykosylierung oder Desaminierung und aktivieren oder inaktivieren diese dadurch langfristig (Hardt et al., 1998; Goehring et al., 1999; Aktories et al., 2000; Barbieri et al., 2002; Boquet & Lemichez, 2003). Um der Phagozytose durch Makrophagen zu entgehen, injizieren die Bakterien ihre pathogenen Faktoren in die eukaryotische Zelle und beeinflussen so die zelluläre Signaltransduktion, wobei hier vor allem die Dynamik der Aktinpolymerisation von Bedeutung ist. Hierdurch steuern sie ihre eigene Aufnahme in die Zelle und entgehen so der Immunantwort des Wirtsorganismus. Die Kristallstruktur des bakteriellen SopE-GEFs bewies, dass dieses GEF mechanistisch vergleichbar zu den zellulären RhoGEFs ist, aber weder sequentielle noch strukturelle Homologien zu diesen aufweist (Buchwald et al., 2002). ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 14 EINLEITUNG ______

1.5 Die Signaltransduktion der Plexin-Transmembranrezeptoren

Auswachsende Axone exprimieren Rezeptoren für Botenmoleküle, die von benachbarten Zellen präsentiert werden. Die Aktivierung dieser Rezeptoren und die darauffolgende Signalweiterleitung determinieren, ob ein Axon einem Ziel entgegenwächst oder sich von diesem entfernt (Tessier-Lavinge & Goodman, 1996). In diesem System des Axonwachstums spielen die Semaphorine und ihre Rezeptoren die Neuropiline und Plexine, neben anderen, eine bedeutende Rolle. Allerdings ist ihre Funktion nicht nur auf die neuronale Entwicklung beschränkt, sondern in vielen anderen Bereichen von ebenso großer Bedeutung. Die Semaphorin-Familie umfasst etwa 20 Mitglieder, die sowohl löslich als auch Membran- gebunden vorliegen können. Ihnen gemeinsam ist eine 55 kDa große Domäne, die als ‚Sema’- Domäne bezeichnet wird. Viele verschiedene neuronale Zellen, wie z.B. sympathische, Motor-, cerebellare, hippocampale, olfaktorische und corticospinale Neurone, reagieren auf Semaphorin-Signale (Chisholm & Tessier-Lavigne, 1999). Repulsive Signale, ausgelöst durch Semaphorine, werden durch zwei Rezeptorfamilien weitergeleitet: die Neuropiline, NP1 und NP2, und die Plexine, die in vier Familien unterteilt werden können, PlexinA1-4, PlexinB1-3, PlexinC1 und PlexinD1 (Tamagnone & Comoglio, 2000). Viele Semaphorine binden direkt an die extrazelluläre Domäne der Plexine und aktivieren so die zytoplasmatischen Signalkaskaden. Die gut charakterisierte Familie der Klasse 3 Semaphorine (Sema3A-F) benötigt hingegen die Neuropiline als Korezeptoren für die Plexin-Signaltransduktion (Raper, 2000; Tamagnone et al., 1999; Winberg et al., 1998; Cheng et al., 2001; Comeau et al., 1998; Swiercz et al., 2002). Plexine sind Transmembranrezeptoren, die interessanterweise an ihrem N-Terminus selbst eine Sema-Domäne besitzen, ähnlich zu der ihrer Semaphorin-Liganden. Zusätzlich enthalten sie ein Cystein-reiches Motiv in der extrazellulären Region und eine konservierte Plexin- spezifische Sex-Plexin-Domäne in ihrem zytoplasmatischen Teil (Tamagnone & Comoglio, 2000). Die extrazelluläre Sema-Domäne der Plexine übt eine autoinhibitorische Funktion auf den Gesamtrezeptor aus, die dann durch Ligandenbindung aufgehoben wird (Takahashi & Strittmatter, 2001). Vergleichbar zu vielen anderen Rezeptoren werden auch die Plexine nach erfolgter Ligandenbindung phosphoryliert. Das offensichtliche Fehlen einer Kinasedomäne in den Plexinen führte zu der Vermutung, dass andere Kinasen dafür verantwortlich sein müssen. Ein erster Kandidat war Otk (off-track kinase) für den eine Interaktion mit PlexinA nachgewiesen werden konnte (Winberg et al., 2001). Obwohl Otk zunächst als Kinase identifiziert wurde, besitzt es, bedingt durch Substitutionen in konservierten Aminosäuren, keine Kinase- ______15 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien EINLEITUNG ______

Aktivität, so dass es vermutlich als Adapter-Protein für andere Kinasen dienen könnte. Im Fall von PlexinB1 konnte hingegen gezeigt werden, dass es zusammen mit dem Met- Rezeptor, ein Rezeptor für den Hepatozyten-Wachstumsfaktor, einen Rezeptorkomplex bildet, der für die Sema4D-Ligandenbindung verantwortlich ist. Der Met-Rezeptor besitzt eine intrinsische Kinase-Aktivität und ist zusammen mit PlexinB1 für das invasive Wachstum von Epithelzellen verantwortlich (Giordano et al., 2002).

Abb. 1.5: Semaphorine und ihre Rezeptoren. A Semaphorine existieren als sekretierte, Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerte und transmembrane Proteine. Die Subklassen 1 und 2 repräsentieren die Semaphorine der Invertebraten, 3-7 die der Vertebraten und V die viralen. B Plexine, Otk, Neuropiline, L1 und Met fungieren als Semaphorin Rezeptoren oder sind deren Teilkomponenten: (i) SemaVA, SemaVB, Sema7A und Klasse 4 Semaphorine interagieren direkt mit den Plexinen; (ii) in Drosophila führt das Sema1a Signal zur Axon-Repulsion über einen PlexinA·Otk- Komplex; (iii) die Klasse 3 Semaphorin Rezeptoren sind die derzeit am Besten charakterisierten und bestehen aus Neuropilin, Plexin und L1; (iv) Der Effekt von Sema4D auf das invasive Wachstum von Epithelzellen wird durch einen PlexinB1/Met-Rezeptorkomplex vermittelt. Domänen: BD, basisch; C, intrazelluläre C-terminale GAP-ähnliche Domäne; CUB, Komplement Bindung; FIII, Fibronectin Typ III; FV/FVIII, Koagulationsfaktor; GBD, GTPase-bindend; G-P, Glycin-Prolin reich; GPI, Anker; Ig, Immunoglobulin-ähnlich; MAM, ‚Meprin, A5, Mu’; MRS, Met-verwandte Sequenz; N, intrazelluläre N- terminale GAP-ähnliche Domäne; Sema, Semaphorin; SS, Signalsequenz; TK, Tyrosinkinase; Thrombospondin (modifiziert nach Pasterkamp & Kolodkin, 2003).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 16 EINLEITUNG ______

Abb. 1.6: Modelle der Semaphorin Signaltransduktion. A Sema1a Signale führen über einen PlexinA/Otk-Rezeptorkomplex. Da Otk keine intrinsische Kinaseaktivität besitzt, könnte es dazu dienen weitere Rezeptorkomponenten zu rekrutieren. MICAL-Proteine assoziieren direkt mit PlexinA und werden für den Sema1a Signalweg benötigt. Substrate der MICAL und Effektoren sind derzeit unbekannt. B Die PlexinB1 vermittelte Sema4D-induzierte Axonrepulsion erfolgt durch eine koordinierte Regulation der Rac- und Rho-GTPasen: PlexinB1 bindet Rac·GTP und inhibiert seine Bindung an PAK. Gleichzeitig wird über die GEFs PDZ-RhoGEF und LARG Rho aktiviert. Während der Regulation des invasiven Wachstums von Epithelzellen erfolgt die Sema4D-Signaltransduktion über einen PlexinB1-Met Rezeptorkomplex. Die Bindung von Sema4D an PlexinB1 führt zur Aktivierung von Met, wodurch Met, PlexinB1 und das Met-Zielprotein Gab1 phosphoryliert werden. C Der Sema3A induzierte Kollaps von Wachstumskegeln durch Bindung an Neuropilin (NP), die mit einem der vier Klasse A Plexine assoziiert vorliegen. L1 ist ebenso ein Teil des Klasse 3 Semaphorin Rezeptor Komplexes und könnte durch eine Modulation der cGMP-Level an der Semaphorin-Signaltransduktion beteiligt sein. Eine Anzahl von Tyrosinkinasen, wie Cdk5, Fes, Fyn und GSK-3, scheinen nach Ligandenbindung aktiviert zu werden und Plexine, sowie andere intrazelluläre Proteine zu phosphorylieren. Die Klasse A Plexine sind in der antagonistischen Regulation von Rnd1 und RhoD involviert. Eine Aktivierung von PlexinA reduziert die Rac Signaltransduktion via PAK und induziert Rho-abhängige Signalwege, die zu einer Aktivierung von LIM-KInase und zur Inaktivierung von Cofilin führen. Pfeile geben Interaktionen wieder. Gestrichelte Pfeile zeigen mögliche Interaktionen an; NIP, Neuropilin aktivierendes Protein; P, Phosphorylierung; ROCK, Rho-activated kinase (modifiziert nach Pasterkamp & Kolodkin, 2003).

Verschiedene Arbeitsgruppen haben gezeigt, dass die GTPasen der Rho-Familie an der Signaltransduktion der Semaphorine beteiligt sind und diese physikalisch mit der zytoplasmatischen Region der Plexine interagieren (Liu & Strittmatter, 2001). Für PlexinB1 konnte eine Bindung an Rac1·GTP gezeigt werden, während die Bindung an den Rac-Effektor ______17 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien EINLEITUNG ______

PAK gleichzeitig inhibiert wird (Driessens et al., 2001; Hu et al., 2001; Vikis et al., 2002). Eine Bindung von Rac an die PlexinA-Proteine konnte jedoch nicht nachgewiesen werden (Driessens et al., 2001; Hu et al., 2001; Vikis et al., 2000; Jin & Strittmatter, 1997; Jurney et al., 2002; Rohm et al., 2000; Vastrik et al., 1999; Kuhn et al., 1999). RhoD und Rnd1 hingegen zeigen eine Bindung an PlexinA1, wobei RhoD antagonistisch auf die PlexinA1- Rnd1-vermittelte Repulsion von Axonen wirkt (Rohm et al., 2000; Zanata et al., 2002). Um den Ort der GTPase-Interaktion auf der 66 kDa großen zytoplasmatischen Domäne einzugrenzen, wurden Deletionsstudien durchgeführt. Die große zytoplasmatische Region wird aus zwei konservierten Domänen gebildet, die für die Weiterleitung von Semaphorinsignalen notwendig sind. Die N-terminale und die nicht konservierte „Linker“- Region, die sich zwischen den beiden Domänen befindet, sind an der Bindung der GTPase beteiligt, während die C-terminale Domäne hierfür nicht erforderlich ist (Abb. 1.7). Durch einen Sequenzvergleich wurde ein CRIB-Motiv in der nichtkonservierten „Linker“-Region lokalisiert (Vikis et al., 2000; Driessens et al., 2001). Interessanterweise ist das CRIB-Motiv von Regionen umgeben, die Sequenzhomologie zu RasGAP-Proteinen aufweisen (Abb. 1.7; Rohm et al., 2000). Kürzlich konnte diese intrinsische GAP-Aktivität der zytoplasmatischen Domäne auf R-Ras nachgewiesen werden (Oinuma et al., 2004). Hierfür muss der Rezeptor durch Sema4D aktiviert und intrazellulär Rnd1 an die zytoplasmatische Domäne gebunden sein. Dabei könnte die direkte Regulation der R-Ras Aktivität durch PlexinB1, das als GAP fungiert, als Mechanismus für die Transmembranrezeptor-vermittelte Signaltransduktion dienen. Die Inaktivierung von R-Ras ist gleichzeitig in der Sema3A-induzierten Repulsion von Axonen involviert. Die Aktivierung von R-Ras führt über Integrine zu Zell-Adhäsion und kontrolliert Zellmigration und Neuritenwachstum (Zhang et al., 1996; Keely et al., 1999; Ivins et al., 2000; Kinbara et al., 2003). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Sema3A und Sema4D die Integrin-vermittelte Zelladhäsion und –migration inhibieren können (Serini et al., 2003; Takahashi et al., 1999; Barberis et al., 2004). Folglich könnte eine Inaktivierung von R-Ras durch Plexine die Integrin-Aktivierung unterdrücken und dadurch die Zelladhäsion verringern. Dies führt wiederum zu einem Kollaps der Wachstumskegel und zur Neuritenretraktion. Neben dieser intrinsischen GAP-Aktivität der zytoplasmatischen Domäne konnte auch eine Involvierung der GEF-Proteine im Rahmen der PlexinB-Signaltransduktion nachgewiesen werden (Driessens et al., 2002; Aurandt et al., 2002; Hirotani et al., 2002; Perrot et al., 2002; Swiercz et al., 2002). Dabei interagieren die PDZ-(postsynaptic density protein/Discs Large/zona occludens 1) Domänen von PDZ-RhoGEF und LARG (leukemia associated RhoGEF) mit dem extremen C-Terminus der Klasse B Plexine (Abb. 1.7). Die Bindung von ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 18 EINLEITUNG ______

Sema4D an PlexinB1 bzw. die Aktivierung eines chimären PlexinB2 Proteins zeigten eine Regulation der beiden RhoGEFs und führten zur Aktivierung von RhoA (Driessens et al., 2002; Aurandt et al., 2002; Hirotani et al., 2002; Perrot et al., 2002; Swiercz et al., 2002).

______19 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien EINLEITUNG ______

AA-Mutante. Æ

t.

els der GCG Software Software GCG der els er Plexine sind vollständiger Plexine dende Domäne (GBD) ist grau verwendeten RR GBD mit den GTPasen inhibiert: GBD mit den GTPasen inhibiert: r humanen zytoplasmatischen Domänen von Domänen zytoplasmatischen r humanen von PDZ-RhoGEF und LARG ist rot hinterleg rot LARG ist und von PDZ-RhoGEF . Dargestellt ist der Sequenzvergleich de Sequenzvergleich ist der . Dargestellt n-1) und R-RasGAP. Der Sequenzvergleich der Plexine wurde mitt wurde Plexine der Sequenzvergleich Der R-RasGAP. n-1) und rch drei rote Pfeile gekennzeichnet), die die Interaktion der die rch drei rote Pfeile gekennzeichnet), ulierten Arginin-Finger der Plexine und damit die Position der der Plexine und ulierten Arginin-Finger rminale GAP-Domäne (N und C). Die cyan hinterlegten Sequenzen d Sequenzen cyan hinterlegten (N und C). Die GAP-Domäne rminale (2000) um die GAP-Domänen von NF1 und R-RasGAP ergänzt. Deutlich zu erkennen ist die erkennen ist Deutlich zu und R-RasGAP ergänzt. NF1 von die GAP-Domänen (2000) um

et al. GTPase-bin postulierte sind. Die wichtig RasGAPs der GAP-Funktion humanen PlexinB-Familie für die PDZ-Domänen für PlexinB-Familie humanen

Sequenzvergleich ausgewählter Plexin und RasGAPs und Plexin ausgewählter Sequenzvergleich

: GGA. Die PDZ-Erkennungssequenz (VTDL) der (VTDL) Die PDZ-Erkennungssequenz GGA. Æ erstellt und auf der Basis des Sequenzvergleichs von Rohm von des Sequenzvergleichs der Basis und auf erstellt Unterteilung der cytoplasmatischen Domäne in die N- und die C-te in die der cytoplasmatischen Domäne Unterteilung konserviert. In gelb hinterlegt sind Aminosäuren, die für sind Aminosäuren, gelb hinterlegt In konserviert. ist du (Position beschrieben Mutante eine wurde GBD Innerhalb der hervorgehoben. Die beiden schwarzen Pfeile kennzeichnen den post kennzeichnen Pfeile schwarzen Die beiden hervorgehoben. Abb. 1.7 Abb. (Neurofibromi von NF1 GAP-Domänen mit den PlexinA1, A2, B1 und B2 LVP ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 20 ZIELSETZUNG ______

2. Zielsetzung

Im Rahmen dieser Dissertation sollten die Interaktionen der Ras- und Rho-Familie mit der zytoplasmatischen Domäne der Plexin-Transmembranrezeptoren biochemisch und strukturell charakterisiert werden. Hierzu war zunächst die Klonierung der DNA-Konstrukte der GTPase-bindenden Domänen (GBDs) und der vollständigen zytoplasmatischen Domänen (CPDs) von PlexinA2, PlexinB1, PlexinC1 und PlexinD1 erforderlich. Anschließend sollten Expressions- und Reinigungsprotokolle für die rekombinanten Proteine ausgearbeitet und etabliert werden. Im Vordergrund des Interesses stand die Untersuchung der Bindungsspezifität der verschiedenen GBDs und CPDs mit den GTPasen der Rho-Familie. Diese Interaktionen sollten qualitativ und quantitativ durch in vitro Messungen untersucht werden. Da die N- und C-terminalen Domänen der CPDs Sequenzhomologien zu GTPase- aktivierenden Proteinen (GAPs) der Ras-Familie aufweisen, wurden die CPDs auf ihre GAP- Aktivität und Spezifität hin untersucht. Weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die dreidimensionale Struktur einer GBD oder CPD alleine bzw. im Komplex mit einer GTPase darzustellen. Ein zusätzlicher zentraler Punkt dieser Dissertation war die strukturelle Charakterisierung der 19 Aminosäuren-Insertion von Rac1b. Dabei waren die Struktur dieser 19 zusätzlichen Aminosäuren und ihr Einfluss auf den übrigen Teil der GTPase, sowie auf die Nukleotidbindung von besonderem Interesse. Weiterhin sollte untersucht werden, welchen Einfluss die Art des gebundenen Nukleotids (GDP oder GTP) auf die Struktur der 19 Aminosäuren-Insertion von Rac1b hat. Durch die strukturelle Charakterisierung von TC10, sowohl im GDP als auch im GTP gebundenen Zustand, wurde ein Beitrag zum Verständnis der Signaltransduktion dieser GTPase erwartet. Die Lösung der dreidimensionalen Struktur sollte dabei als Grundlage für die Suche nach Interaktionspartnern dienen. Dabei waren die Unterschiede zwischen dem aktiven und dem inaktiven Zustand ein wichtiger Aspekt.

______21 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien MATERIAL ______

3. Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Bakterienstämme

E. coli Stamm Genotyp Referenz TG1 supE, hsd∆5, thi, ∆(lac-proAB), F‘ [traD36, Gibson, 1984 proAB+, lacIq, lacZ∆M15]

- - BL21 (DE3) ompT, hsdSB (rB ,mB ), gal(λcIts857 ind1, Studier&Moffat, 1986 Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm (DE3)

- - BL21(DE3) ompT, hsdSB (rB ,mB ), gal(λcIts857 ind1, Carstens&Waeshe, 1999 CodonPLUS RIL Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm (DE3), Tetr, endA, HTE (argU, ileY, leuW, Camr)

- - Rosetta ompT, hsdSB (rB ,mB ), gal(λcIts857 ind1, Novagen, Produkt-Infor- Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm (DE3), mation pRARE2 (CmR)

DH10Bac™ bMon14272, pMon7124 Invitrogen (Karlsruhe)

Tab. 3.1: Verwendete Bakterienstämme.

3.1.2 Insektenzelllinien

Zelllinie Beschreibung Referenz Sf21 Adhärent und in Suspensionskultur Vaughn et al., 1977 wachsende Zelllinie aus dem Eierstock- Gewebe von Spodoptera frugiperda, unregelmäßige Morphologie

Tab. 3.2: Verwendete Insektenzelllinien.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 22 MATERIAL ______

3.1.3 Nährmedien und Antibiotika

3.1.3.1 Nährmedien und Zusätze

Luria-Bertani(LB)-Voll-Medium 10 g/l Bacto-Tryptone 10 g/l NaCl 5 g/l Hefe-Extrakt (0,25% (v/v) 2M NaOH)

LB-Platten-Agar 10 g/l Bacto-Tryptone 10 g/l NaCl 5 g/l Hefe-Extrakt 16 g/l Bacto-Agar

TB-Voll-Medium 12 g/l Bacto-Tryptone 24 g/l Hefe-Extrakt 0,4% (v/v) Glycerin

2,31 g/l KH2PO4

12, 54 g/l K2HPO4

TC100-Insektenzellmedium Invitrogen (Karlsruhe)

Fötales Kälberserum (FCS) Invitrogen (Karlsruhe)

3.1.3.2 Antibiotika

Ampicillin 100 mg/l Medium Chloramphenicol (in EtOH) 25 mg/l Medium Kanamycin 50 mg/l Medium Tetrazyklin 25 mg/l Medium Gentamycin 7 mg/l Medium

3.1.4 Puffer und Lösungen

Acrylamid-Lösung 30% (w/v) Acrylamid 0,8% (w/v) Bisacrylamid ______23 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien MATERIAL ______

Anodenpuffer für Semi-dry Blot 300 mM Tris 100 mM Tricin pH 8,8

Anodenpuffer (Tricingel) 200 mM Tris.HCl pH 8,9

Anodenpuffer (native Gele) 4 mM Tris HCl pH 8,4 50 mM Glycin

Austauschpuffer (10x) 2 M (NH)2SO4

1 mM ZnCl2

Blockierlösung 4% Magermilchpulver in TBST

6x DNA-Probenpuffer 10 mM Tris.HCl 25 mM EDTA 30% (v/v) Glycerin 0,4% (w/v) Orange G dNTP-Lösung 0,5 mM dATP 0,5 mM dCTP 0,5 mM dGTP 0,5 mM dTTP

Entfärbelösung 40% (v/v) Ethanol 10% (v/v) Essigsäure

Färbelösung 40% (v/v) Methanol 10% (v/v) Essigsäure 4 g/l Coomassie Brilliant Blue R250 4 g/l Coomassie Brilliant Blue G250

GSH-Elutionspuffer 50 mM Tris.HCl pH 7,5 100 mM NaCl

1 mM MgCl2 5 mM DTT ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 24 MATERIAL ______

20 mM Glutathion (reduziert)

GST-Fish-Puffer 50 mM Tris.HCl pH 7,4 100 mM NaCl

2 mM MgCl2 10% (v/v) Glycerin 1% (w/v) Igepal CA-630

Hochsalz/ATP-Puffer 50 mM Tris.HCl pH 7,5 100 mM NaCl 400 mM KCl

1 mM MgCl2 5 mM DTT 1 mM ATP

HPLC-Puffer 10 mM TBA

57,48 g/l K2HPO4

93,25 g/l KH2PO4

Kathodenpuffer für Semi-dry Blot 300 mM Capronsäure 30 mM Tris pH 8,7

Kathodenpuffer (Tricin-Gel) 100 mM Tris.HCl pH 8,25 160 mM Tricin 1% (w/v) SDS

Kathodenpuffer (native Gele) 40 mM Tris HCl pH 8,4 500 mM Glycin

5x Laemmli Probenpuffer 50 mM Tris.HCl 50% (v/v) Glycerin 500 mM DTE 10% (w/v) SDS

______25 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien MATERIAL ______

Meßpuffer 30 mM Tris.HCl pH 7,5

10 mM NaxHxPO4 pH 7,5

1 mM MgCl2 3 mM DTT

PBS (phosphate-buffered saline) 137 mM NaCl 2,7 mM KCl

10,2 mM Na2HPO4

1,8 mM KH2PO4

4x SDS-Probenpuffer 33% (v/v) Glycerin 300 mM DTE 6,7% (w/v) SDS 0,01% (w/v) Bromphenolblau 80 mM Tris.HCl pH 6,8

SDS-Laufpuffer 25 mM Tris 192 mM Glycin 2% (w/v) SDS

. SDS-Sammelgelpuffer 500 mM Tris H3PO4 pH 6,8 4% (w/v) SDS

. SDS-Trenngelpuffer 500 mM Tris H3PO4 pH 8,8 4% (w/v) SDS

Standard-Puffer (GSH-Sepharose) 50 mM Tris.HCl pH 7,5 100 mM NaCl

1 mM MgCl2 5 mM DTT

Standardpuffer (Ni-NTA-Agarose) 50 mM Tris.HCl pH 7,5 100 mM NaCl

1 mM MgCl2 1 mM β-Mercaptoethanol ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 26 MATERIAL ______

Standardpuffer (salzfrei) 50 mM Tris.HCl pH 7,5 5 mM DTT

TAE-Puffer 40 mM Tris.NaOH pH 8,5 1 mM EDTA

TBST-Puffer 150 mM NaCl 0,1% Tween 20 20 mM Tris.HCl pH 7,4

TE-Puffer 100 mM Tris pH 8,0 10 mM EDTA pH 8,0

Tricin-Gelpuffer 3 M Tris pH 8,45 0,3% (w/v) SDS

TSS-Puffer 85% LB-Medium (ohne NaOH) 10 % (w/v) PEG 8000 5% DMSO

50 mM MgCl2 pH 6.5

Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Puffer und Lösungen in Aqua bidest angesetzt.

3.1.5 Vektoren pcDNA3-Flag Invitrogen (Paisley, UK) pGEX4T1, 4T2, 4T3 Amersham Pharmacia (Freiburg) pProEx HTa, HTb, HTc Invitrogen (Paisley, UK) pQE 30 Qiagen (Hilden) pFastBac HTa, HTb, HTc Invitrogen (Paisley, UK)

______27 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien MATERIAL ______

3.1.6 Oligonukleotide

3.1.6.1 Oligonukleotide zur Fragmentherstellung

Plexa2 K1740*sal as 5' - CG GAA TTC TCA CTT GCT GCC CCG GTC ACC CT - 3' Plexa2S1963*sal1 as 5' - ACG CGT CGA CTC AGC TCT CAA TGG ACA TGG C - 3' Plexa2*xho1A1910as60 5' - CCG CTC GAG TCA GGC GTG CAG GCG GGA CTG CT - 3' Plxa2*xho1S1963as58 5' - CCG CTC GAG TCA GCT CTC AAT GGA CAT GGC ATT AAT - 3'

Plexb1bamh1V1599s62 5' - CGC GGA TCC GTG GAG CAA GGG CTG GGG CAG - 3' Plexb1bamh1L1640s60 5' - CGC GGA TCC CTG CTC ACC GTG GCA CTG CAT G - 3' PlxB1BamH1V1769s60 5' - CGC GGA TCC GTG AAG GTC CTA GAC TGT GAC AC - 3' plexb1*ecor1_c1_as 5' - CT GAA CTG TCC TGG AAC TAC TCC TGA GAA TTC CG - 3' plexb1*xho1S2079as60 5' - CCG CTC GAG TCA GGA GTA GTT CCA GGA CAG TTC AG - 3' Plxb1*sal1L2135as60 5' - ACG CGT CGA CTC ATA GAT CTG TGA CCT TGT TTT CCA - 3' Plxb1*xho1L2135as60 5' - CCG CTC GAG TCA TAG ATC TGT GAC CTT GTT TTC CAC - 3' Plxb1*ecor1L2135_as60 5' - CG GAA TTC TCA TAG ATC TGT GAC CTT GTT TTC CAC A - 3' plexb1*ecor1_c3_as 5' - GAT GAC CTG TTC CAG GTG ATT CTC TGA GAA TTC CG - 3' plxb1*sal1L1941s62 5' - ACG CGT CGA CTC AGA GAA TCA CCT GGA ACA GGT CAT - 3' plexb1bamh1_n4_s 5' - CGC GGA TCC GAC AGT GTG ACA GGC AAG GCC A - 3'

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 28 MATERIAL ______plexb1*ecor1_c4_as 5' - GG CCT CGG AGG GGC AGC CTT TGA GAA TTC CG - 3' Plexb1_r1724bam_s58 5' - CGC GGA TCC CGT GCC TAC GTG GCA TCT CTG - 3' Plexb1 e1639bamh1 s58 5' - CGC GGA TCC GAG ATG ACC GAT CTC ACC AGT - 3' Plexb1 L2226*sal as 5' - ACG CGT CGA CCT ATA GAT CTG TGA CCT TGT TTT C - 3' Plexb1 t1885*sal as 5' - ACG CGT CGA CCT AGG TGA GAG GCA CTC CTT TAT AAA - 3' Plexd1_Dbam_s60 5' - CGC GGA TCC GAC GCC ATC ACA GGC AAG GCC - 3' Plxd1*ecor1H_as58 5' - CG GAA TTC TCA GTG AGA CTT CTT GGG CTC CGC - 3'

Rnd1_P9_bamh1_s_60 5' - CGC GGA TCC CCA GTC GTG GCC AGA TGT AAG C - 3' Rnd1_K190*_xho1_as_58 5' - CCG CTC GAG TCA CTT GTT CAG ACA CAG CAT GGA TG - 3'

3.1.6.2 Oligonukleotide zur Sequenzierung

5'pGEX 60C 5' – GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG - 3' 3'pGEX 76C 5' – CGG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG - 3'

Plexina2_1720seqs56 5' - GTG GCA TCT GGT GAA GAA CCA T - 3' Plexa2D1544bams58 5' - CGC GGA TCC GAT GCC ATC ACG GGC GAG GC - 3' Plexa2 D1368bams58 5' - CGC GGA TCC GAT ATC AAT GAG TTG ACC AGT GAC - 3' Plexa2bamh1Q1415s60 5' - CGC GGA TCC CAG CAC GTG GAG AAG GCC CTG - 3' ______29 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien MATERIAL ______

Plexa2bamh1L1458s58 5' - CGC GGA TCC CTC ATC ATG ACC GGC CTG CAG - 3'

Plexinb1_1870seqs56 5' - GGA GAA GAT GCT GGA CCA GCT - 3'

3.1.7 Biochemikalien und Chemikalien

3.1.7.1 Proteine und Enzyme

Alkalische Phosphatase Sigma (Deisenhofen) Faktor Xa Roche Diagnostics (Mannheim) Glutathion S-Transferase MPI-Dortmund Igase MPI-Dortmund TEV MPI-Dortmund Pfu-DNA-Polymerase Stratagene (Amsterdam) Phosphodiesterase Sigma (Deisenhofen) Pwo-DNA-Polymerase Roche Diagnostics (Mannheim) Rac Antikörper Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY) Restriktionsendonukleasen New England Biolabs (Beverly, MA) T4-DNA-Ligase New England Biolabs (Beverly, MA) Taq-DNA-Polymerase Qiagen (Hilden) Thrombin Serva (Heidelberg)

3.1.7.2 Nukleotide

GDP Sigma (Deisenhofen) GppNHp Sigma (Deisenhofen)

GppCH2p Sigma (Deisenhofen) GTP Sigma (Deisenhofen) mant-GDP MPI-Dortmund, Jena Biosciences (Jena) mant-GppNHp MPI-Dortmund, Jena Biosciences (Jena) mant-GTP MPI-Dortmund, Jena Biosciences (Jena) mant-GTPγS Jena Biosciences (Jena) tamra-GTP MPI-Dortmund, Jena Biosciences (Jena)

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 30 MATERIAL ______

3.1.7.3 Protein- und Nukleinsäurestandards

Proteinstandard: SDS 7 (Sigma) mit 66/45/36/29/24/20/14,2 kDa SDS6-H (Sigma) mit 205/116/97/66/45/29 kDa

Nukleinsäurestandard: λ-DNA, BstEII hydrolysiert (AGS) (113-8453 bps) MBBL (Bielefeld)

3.1.7.4 Proteinase-Inhibitoren

Aprotinin (2 mg/ml) ICN Biomedicals (Eschwege) Benzamidin (78 mg/ml) ICN Biomedicals (Eschwege) Leupeptin (1 mg/ml) ICN Biomedicals (Eschwege) Pepstatin (0,7 mg/ml) ICN Biomedicals (Eschwege) Pefabloc (5 mg/ml) ICN Biomedicals (Eschwege)

3.1.7.5 FPLC-Säulenmaterial

GSH-Sepharose fast flow Amersham Pharmacia (Freiburg) Hi-Load™ Superdex 75 und 200 Amersham Pharmacia (Freiburg) Ni-NTA-Agarose Qiagen (Hilden)

3.1.7.6 Chemikalien

Agarose Life Technologies (Karlsruhe) DMSO Serva (Heidelberg) DTE/DTT Gerbu (Gaiberg) Entwickler/Fixierer für Röntgenfilme Agfa (Mortels, BE) Ethidiumbromid Serva (Heidelberg) Formaldehyd Roth (Karlsruhe) Glutathion Merck (Darmstadt) Glutathion Sepharose 4B Amersham Pharmacia (Freiburg) Imidazol Merck (Darmstadt) IPTG Gerbu (Gaiberg) Ni-NTA-Agarose Qiagen (Hilden) SDS Gerbu (Gaiberg)

______31 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien MATERIAL ______

Alle weiteren Chemikalien wurden im höchsten erhältlichen Reinheitsgrad von den Firmen Aldrich, Fluka, Merck, Roth, Serva, Riedel de Haen, ICN und Sigma bezogen.

3.1.7.7 Antikörper

3.1.7.7.1 Primäre Antikörper Bezeichnung, Spezifität Organismus, Typ Firma anti-GST Maus IgG MPI-Dortmund anti-His Kaninchen IgG Santa Cruz (Heidelberg)

Tab. 3.3: Primäre Antikörper.

3.1.7.7.2 Sekundäre Antikörper Spezifität, Organismus Konjugat Firma Schaf anti-Maus IgG Meerrettich-Peroxidase Amersham Pharmacia (SHAMPO) (Freiburg) Esel anti-Kaninchen IgG Meerrettich-Peroxidase Amersham Pharmacia (DARPO) (Freiburg)

Tab. 3.4: Sekundäre Antikörper.

3.1.8 Kit-Systeme

ABI PRISM™ Dye Terminator Cycle Perkin Elmer (Überlingen) Sequencing Ready Reaction Kit ECL Chemolumineszenz Kit (West Pico) Perbio Science (Bonn) QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen (Hilden) QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen (Hilden) QIAprep Spin Gel Extraction Kit Qiagen (Hilden) QIAprep Spin PCR Purification Kit Qiagen (Hilden)

3.1.9 Geräte

Analysenwaage Sartorius (Göttingen) Detektor Drei-Kreis Hi-Star Siemens Detektor MAR345 Image Plate System X-Ray Research GmbH (Norderstedt) DNA-Gelelektrophoresekammer Werkstatt MPI Dortmund

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 32 MATERIAL ______

ESI-MS Finnigan (San Jose, CA, USA) Fast-Blot Apparatur Power Pack P25 Biometra (Göttingen) Fluidizer Microfluidics Corporation Fluoreszensspektrometer (LS 50 B) Perkin Elmer (Überlingen) FPLC (Äkta Prime) Amersham Pharmacia (Freiburg) HPLC (System Gold 166) Beckman (München) Inkubator HAT Infors GmbH (Übach Palenberg) Magnetrührer RCT basic IKA Labortechnik PAGE-Kammern cti (Idstein) PCR-Gerät MiniCycler MJ Reasearch (Watertown, USA) PerpHect LogRmeter model 320 (pH-Meter) Orion Photometer BioPhotometer Eppendorf (Hamburg) Pipetten Gilson (Abimed, Langenfeld) Präzisions-Quarzküvetten Hellma Rotierende Anoden Nonius / Siemens Rotoren (JA 10-17, 30.50) Beckman (München) Spannungsquellen (Power Pac 300) BioRad (München) Stopped Flow (SX16MV) Applied Photophysics Thermomixer (5436) Eppendorf (Hamburg) Thermoschrank WTC binder (Tuttlingen) Tischzentrifuge (Biofuge 13) Kendro (Hanau) Tischzentrifuge, kühlbar (5427R) Eppendorf (Hamburg) Tischzentrifuge, kühlbar (Universal 32R) Hettich (Tuttlingen) Vakuum-Membranpumpe Ilmvac GmbH (Ilmenau) Zentrifugen (J2-HC, J2-HS und Avanti30) Beckman (München)

3.1.10 Verbrauchsmaterialien

Zentrifugen-/Kultur-Röhrchen Becton Dickinson/Falcon (Heidelberg) Pipettenspitzen Gilson (Abimed, Langefeld) Mikropipettenspitzen Eppendorf (Hamburg) Nap-5 Säulen Amersham Pharmacia (Freiburg) Plastik-Küvetten Sarstedt (Nümbrecht) PVDF Membran Roche Diagnostics (Mannheim) Reaktionsgefäße Eppendorf (Hamburg) ______33 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien MATERIAL ______

Sterilfilter Schleicher &Schüll (Dassel) Vivaspin-Röhrchen Vivascience Whatman 3 MM Papier Schleicher & Schüll (Dassel)

3.1.11 Kristallographische Screens

Crystal Fast Screen I Hampton Research Crystal Fast Screen I Lite Hampton Research Crystal Fast Screen II Hampton Research Index Screen HT Hampton Research Qick Screen Hampton Research Clear Strategy Screen (CSS) MPI-Dortmund NaCl-Screen MPI-Dortmund LiCl-Screen MPI-Dortmund

(NH4)2SO4-Screen MPI-Dortmund MPD-Screen MPI-Dortmund PEG/Ion-Screen Hampton Research PEG6000-Screen Hampton Research PEG/NaCl-Screen Hampton Research

3.1.12 Programme

Die Auswertung und graphische Darstellung von Messdaten erfolgte mit GraFit (Erithacus Software, Staines, UK, Version 3.0/4.0/5.0), Microsoft Excel (Microsoft Corporation) und Microcal Origin 7. Zur Datenreduktion, Strukturaufklärung und -verfeinerung wurden XDS (Kabsch, 1993), Programme des CNS-Pakets (Brünger et al., 1998), Programme des CCP4-Pakets (CCP4, 1994) sowie Solve/Resolve (Terwilliger, 1999; Terwilliger & Berendzen, 1999) verwendet. Elektronendichtekarten wurden mit Hilfe des Grafikprogrammes O (Jones, 1991) interpretiert. Zur Strukturüberprüfung wurden die Programme WHATIF/WHATCHECK und PROCHECK verwendet. Strukturbiologische Abbildungen wurden mit Molscript/Bobscript angefertigt. Für Darstellungen von Oberflächen wurde Grasp (Nicholls et al., 1991) bzw. MSMS (Sanner et al., 1996) verwendet.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 34 METHODEN ______

3.2 Molekularbiologische Methoden

3.2.1 Herstellung kompetenter E. coli Zellen

Damit E. coli Zellen Plasmide bei einer Transformation aufnehmen können, müssen die Zellen zunächst kompetent gemacht werden. Dies erfolgt für die hier verwendeten TG1-, BL21(DE3)- und BL21(DE3)CodonPlus-Stämme nach einer nach Chung et al., 1989 modifizierten Methode. Die 5 ml Vorkultur eines Einzelklons wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 200 ml LB-Medium mit 2 ml der Vorkultur angeimpft und unter Schütteln (180 rpm) bei 37 °C kultiviert. Beim Erreichen einer OD600 von 0,3 bis 0,4 lagerte man die Zellsuspension für 20 Minuten auf Eis. Nach einer 10 minütigen Zentrifugation bei 1200 g und 4 °C wurde das Sediment in 1/10 des Ausgangsvolumens (20 ml) eiskaltem TSS resuspendiert. Die kompetenten Zellen wurden aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

3.2.2 Transformation von E. coli

Für die Transformation wurden 100 µl, der auf Eis aufgetauten kompetenten Bakterien, mit 10 µl des Ligationsansatzes oder 20 ng gereinigter Plasmid-DNA (Mini-Präparation) zunächst 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der für die Aufnahme des Plasmids in die Bakterienzellen nötige Hitzeschock erfolgte durch zweiminütige Inkubation bei 42 °C. Dann wurde 1 ml LB- Medium zugegeben und die Bakteriensuspension zur Ausbildung der Antibiotikaresistenz für 60 Minuten bei 37 °C unter Schütteln im Heizblock kultiviert. Nach Sedimentation der Zellen durch Zentrifugation (60 Sekunden bei 13000 rpm) wurde 1 ml des Überstands abgenommen und verworfen. Die Zellen wurden dann im Restvolumen resuspendiert und die Bakteriensuspension auf einer LB-Platte mit dem entsprechenden Antibiotikum zur Selektion ausgestrichen. Die Inkubation der Kultur erfolgte bei 37 °C über Nacht in einem Brutschrank oder bei Raumtemperatur über drei Tage.

3.2.3 Kultivierung und Lagerung von transformierten Bakterienzellen

Von dem Ausstrich auf der LB-Platte wurde eine einzelne Kolonie gepickt und damit eine 5 ml Minikultur (LB-Medium + Antibiotikum) angeimpft. Diese wurde über Nacht bei 37 °C

______35 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______im Schüttelinkubator kultiviert. Für die stabile Lagerung der Kultur als Glycerinstock wurden 500 µl der Kultur mit 500 µl Glycerin (50% v/v) versetzt und bei -80 °C gelagert.

3.2.4 Isolierung von Plasmid-DNA

Plasmid-DNA wurde aus 5 ml Schüttelkulturen mit Hilfe des Qiaprep Spin Plasmid Kit der Firma Qiagen nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Plasmidisolierung erfolgt dabei durch alkalische Lyse der Bakterienzellen mit anschließender Neutralisation und dem Einstellen von Hochsalzbedingungen. Das Abtrennen der DNA vom restlichen Lysat erfolgt durch eine selektive Adsorption der DNA an eine DEAE-gekoppelte Silicagelmatrix. 2-4 ml der E. coli Übernachtkulturen wurden für 60 Sekunden bei 13000 rpm zentrifugiert. Das Zellsediment wurde dann in 250 µl Puffer P1 (enthält RNase A) resuspendiert und durch Zugabe von 250 µl Puffer P2 (enthält NaOH/SDS) lysiert. Die Zugabe von SDS bewirkt eine Solubilisierung der Membranlipide und der Membranproteine, wodurch der Zellinhalt freigesetzt wird. Die alkalischen Bedingungen sind für die Hydrolyse der RNA, die Denaturierung der DNA und der Proteine notwendig. Die Zugabe von 350 µl des Puffers N3 führte zu einer Neutralisierung der klaren, viskosen Suspension. Die mit diesem Puffer gleichzeitig geschaffenen Hochsalzbedingungen führen zur Präzipitation der Proteine, der chromosomalen DNA und des SDS. Die im Vergleich zur chromosomalen DNA kurze Plasmid-DNA kann unter diesen Bedingungen renaturieren und verbleibt in Lösung. Das Präzipitat wurde durch 10 minütige Zentrifugation bei 13000 rpm sedimentiert. Der klare Überstand wurde auf eine QIAprep Spin Säule überführt und für 1 Minute bei 13000 rpm in das sich darunter befindende Eppendorfreaktionsgefäß abzentrifugiert. Die negative Ladung des Phosphatrückgrats der Plasmid-DNA führt zur Adsorption an die positiv geladenen DEAE-Gruppen der Silicalgel-Matrix. Optional konnte die an die Membran adsorbierte DNA zunächst mit 500 µl Puffer PB und dann mit 750 µl Puffer PE gewaschen werden. Die Elution der DNA erfolgte durch 20-100 µl Wasser. Die im Wasser gelöste Plasmid-DNA wurde bei -20 °C gelagert.

3.2.5 Präparation von Bakmid-DNA

Die Isolierung von Bakmid-DNA erfolgte aus 5 ml-Kulturen von DH10Bac-Zellen, die mit pFastBac HT-Derivaten transformiert worden waren und auf Selektionsplatten blau gefärbt waren. 2 ml der Kultur wurden bei 13000 rpm (Tischzentrifuge) für 2 Minuten

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 36 METHODEN ______abzentrifugiert. Das Zellsediment wurde mit 300 µl Lösung 1 (s.u.) resuspendiert. Dann wurden 300 µl Lösung 2 (s.u.) zugegeben und vorsichtig gemischt. Nach 5-minütiger Inkubation wurden 300 µl 3 M Kaliumacetat pH 5,5 zugegeben und wiederum vorsichtig gemischt. Die Lösung wurde 10 Minuten auf Eis inkubiert und schließlich für 10 Minuten bei 13000 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit 800 µl Isopropanol gefällt. Nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde die DNA abzentrifugiert (15 Minuten, 13000 rpm) und mit 70 % Ethanol gewaschen. Nach erneutem Abzentrifugieren wurde das Sediment für 5 bis 10 Minuten getrocknet und in 40 µl TE (3.1.4) aufgenommen. Lösung 1: 15 mM Tris HCl pH 8,0 10 mM EDTA 100 µg/ml RNAse A Lösung 2: 0,2 N NaOH 1 % (w/v) SDS

3.2.6 Hydrolyse von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen

Die Hydrolyse von doppelsträngiger DNA mit Restriktionsendonukleasen erfolgte sowohl für analytische (Überprüfung des Klonierungserfolgs) als auch für präparative Zwecke (Herstellung kompatibler Enden für Ligationen). Restriktionsendonukleasen hydrolysieren doppelsträngige DNA in palindromischen DNA- Sequenzen, die eine für den jeweiligen Typ spezifische Erkennungssequenz aufweisen. Bei der Wahl der Pufferbedingungen, Inkubationstemperaturen und Inkubationszeiten wurden die Angaben des Herstellers berücksichtigt. Die durch die Restriktion entstandenen Fragmente wurden durch DNA-Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt mit Ethidiumbromid angefärbt (interkaliert in doppelsträngige DNA) und unter ultraviolettem Licht anhand ihrer Größe identifiziert.

3.2.7 Agarose-Gelelektrophorese

DNA-Fragmente wurden durch horizontale Agarose-Gelelektrophorese anhand ihrer Größe aufgetrennt (McDonell et al., 1977). Das Trennprinzip beruht hierbei auf dem Molekularsiebeffekt des Gels. Kleinere Fragmente wandern schneller durch das Gel als größere Fragmente. Um eine optimale Auftrennung von 300-6000 Basenpaaren langen Fragmenten zu erhalten wurden 0,8 %ige Agarosegele verwendet. Hierzu wurde die Agarose mit TAE-Puffer bis zur

______37 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______vollständigen Auflösung der Agarose aufgekocht und nach einer Abkühlung auf cirka 50 °C mit Ethidiumbromid (0,75 µg/ml) versetzt. Aus dieser Lösung wurde ein Gel in einer horizontalen Gelkammer gegossen und nach dem Erhärten mit TAE-Puffer überschichtet. Die Proben wurden mit 1/5 Volumen 6-fach DNA-Probenpuffer versetzt und dann zusammen mit einem Größenstandard als Referenz auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei einer konstanten Spannung von 8 bis 12 V/cm Gellänge. Die Detektion der DNA- Fragmente erfolgte auf einem UV-Transilluminator bei 312 nm Wellenlänge.

3.2.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen

Für die präparative Reinigung einer DNA-Bande aus einem Agarose-Gel wurde diese mittels eines Skalpells aus dem Gel ausgeschnitten und mit Hilfe des QIAprep Gel Extraction Kits nach Herstellerangaben isoliert. Das hierbei verwendete Prinzip der Reinigung ähnelt dem des QIAprep Spin Miniprep Kits. Hierbei wird die Agarose jedoch zuvor in einer 6 M Natriumiodid Lösung bei 50 °C aufgelöst und die freigesetzte DNA wiederum an eine DEAE-gekoppelte Silicagel-Matrix gebunden, nachfolgend gewaschen und eluiert.

3.2.9 Ligation

Um über eine PCR-Reaktion amplifizierte DNA-Fragmente in Vektoren zu ligieren wurde das Enzym T4-DNA-Ligase verwendet. Das komplementär zum Vektor restringierte Fragment wurde in 5-8 fachem Überschuss zu dem linearisierten Vektor (20 ng) eingesetzt. Weitere Bestandteile waren 1 µl T4-DNA-Ligase-Puffer (New England Biolabs) und eine Einheit Enzym. Das Endvolumen von 10 µl wurde mit Wasser eingestellt. Nach Inkubation bei 4 °C über Nacht wurde der vollständige Ligationsansatz für die nachfolgende Transformation eingesetzt. Für die Religationskontrolle, zur Überprüfung der Selbstligation des Vektors, wurde anstelle des Fragments Wasser in die Reaktion eingesetzt.

3.2.10 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction, Mullis et al., 1992) ist ein in vitro Verfahren zur selektiven Amplifizierung von Nukleinsäuren. Die Reaktion erfolgt durch eine hitzestabile DNA-Polymerase sowie durch zwei Oligonukleotide, die die zu vervielfältigende DNA-Sequenz flankieren und zu je einem

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 38 METHODEN ______kurzen Abschnitt der beiden DNA-Stränge komplementär sind. Die Amplifizierung erfolgt durch mehrfaches Durchlaufen eines dreistufigen Reaktionszyklus: zunächst erfolgt die Trennung des Matrizenstrangs (template) durch thermische Denaturierung bei 95 °C. Das nachfolgende Abkühlen des Reaktionsgemisches auf eine Temperatur von 50 bis 60 °C, führt zur Anlagerung der Oligonukleotide an die komplementären Sequenzen des Matrizenstrangs (annealing). Im dritten Schritt synthetisiert die DNA-Polymerase bei 72 °C, vom Oligonukleotid ausgehend, unter Verwendung von dNTPs den neuen DNA-Strang (elongation). Die hier dargestellten drei Schritte (Denaturierung, Anlagerung und Elongation) werden 25 - 30-mal wiederholt, wobei die Anzahl der Kopien pro Zyklus theoretisch exponentiell anwachsen sollte. In der praktischen Anwendung ist eine Verdopplung der Kopienzahl pro Zyklus realistischer. Für den Erfolg einer PCR-Reaktion ist die richtige Bestimmung der Annealing-Temperatur der Oligonukleotide von entscheidender Bedeutung. Eine zu hohe Temperatur verhindert die Hybridisierung, während eine zu niedrige Temperatur zu einer unspezifischen Bindung des Primers an die Template-DNA führt. Die Annealing-Temperatur ist im Wesentlichen von der Länge und vom G/C-Gehalt des Oligonukleotids abhängig und kann anhand der Wallace- Formel (Sambrook et al., 1989) angenähert berechnet werden:

(Gl. 3.1) T = 2(N A + NT ) + 4(N G + N C ) −10 [°C]

NX ist die Anzahl der paarenden Basen X in der Primersequenz.

Wichtig für die routinemäßige Anwendung der PCR war die Verfügbarkeit von thermostabilen DNA-Polymerasen mit einem hohen Temperaturoptimum, wodurch ein kontinuierlicher Ablauf der Amplifikationszyklen möglich wurde. Für analytische Zwecke wurde die Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus verwendet. Diente die Vervielfältigung der DNA jedoch zum weiteren Klonieren, so wurde die Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus eingesetzt, die im Gegensatz zur Taq-Polymerase eine Korrekturlesefunktion (3'-5'- Exonukleaseaktivität) verfügt und deshalb eine geringere Fehlerrate aufweist.

______39 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

Die Reaktionsansätze hatten ein Volumen von 100 µl: 10-fach Pfu-Puffer 10 µl dNTP-Mix 2 mM 10 µl

MgCl2 10 µl DMSO 10 µl Template-DNA 100 ng 5'-Primer 100 pmol 3'-Primer 100 pmol Pfu-Polymerase 2,5 U

H2O ad 100 µl auffüllen

Programm

2 min 94 °C 1 min 92 °C 1 min 60 °C 1 min, 30 sec 72 °C 5 min 72 °C ∞ 24 °C Die Schritte 2 bis 5 wurden 30-mal wiederholt.

Die verwendeten Primer sind unter 3.1.6.1 aufgeführt. Um die unspezifische Bildung von Sekundärstrukturen zu verhindern wurde bei der Klonierung rekombinanter Sequenzen 10% DMSO zugesetzt. Nach der PCR-Reaktion wurden die Proben mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, das PCR- Produkt aus der Agarose zurückgewonnen und dann mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen geschnitten. Diese mit kohäsiven Enden versehenen Fragmente wurden dann für die Ligation eingesetzt.

3.2.11 Analytische Schnell-PCR zur Bestimmung positiver Klone

Zur schnellen Überprüfung des Klonierungserfolgs wurde die Fast-PCR verwendet (mit verkürzten Zeiten und weniger Zyklen). Mit einem sterilen Zahnstocher wurde ein einzelner Klon von der LB-Platte gepickt, in einem 0,5 ml Eppendorfreaktionsgefäss abgestreift und

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 40 METHODEN ______dann eine 5 ml Minikultur angeimpft. Folgendes Reaktionsgemisch wurde dann in das Eppendorfreaktionsgefäss hinzugegeben:

10-fach Taq-Puffer 1 µl 5-fach Q-Solution 2 µl dNTPs 2 mM 0,5 µl 5'-Primer (10pmol/µl) 0,5 µl 3'-Primer (10pmol/µl) 0,5 µl Taq-DNA-Polymerase 0,5 µl

H2O ad 10 µl auffüllen

Bei der Fast-PCR wurde das gleiche Programm wie bei 3.2.10 verwendet, allerdings mit nur 20 Zyklen. Die verwendeten Primer sind unter 3.1.6.2 aufgeführt.

3.2.12 DNA-Sequenzierung

Für die DNA-Sequenzierung wurde ein ABIMED-Sequenzierer verwendet. Die Sequenzierreaktion wurde mittels der Didesoxykettenabbruchmethode nach Sanger et al. (1977) mit dem ABIPRISM™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit der Firma Perkin Elmer (Überlingen) durchgeführt. Die Plasmid-DNA wurde mit einer thermostabilen Polymerase in einer PCR-Reaktion unter Anwesenheit von fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden amplifiziert. Der hier verwendete Terminator- Mix enthält dNTPs, fluorophormarkierte ddNTPs und die Polymerase Amplitaq©FS. Diese fluorophormarkierten ddNTPs führen bei einem Einbau in die DNA zum Kettenabbruch. Die Sequenzbestimmung erfolgt durch Auftrennung der amplifizierten DNA auf einem Polyacrylamidgel und nachfolgende Abtastung des Gels mit einem Laser, der die fluorophormarkierten Basen anhand der Emmissionscharakteristika des Fluorophors erkennt. Ansatz für die PCR-Reaktion:

Terminator-Mix 4 µl Plasmid-DNA 1 µg Sequenzierprimer (vektorspezifisch) 10 pmol

H2O ad 20 µl auffüllen

______41 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

PCR-Programm: 5 min 96 °C 30 sec 96 °C 15 sec 50 °C 4 min 60 °C

Nach der PCR-Reaktion wurde der Reaktionsansatz ad 100 µl mit sterilem Wasser aufgefüllt, mit 1/10 des Volumen an 3 M Natriumacetat (pH 4,6-4,8) und 3 Volumina absolutem Ethanol (100%) gefällt. Zur Detektion des DNA-Sediments wurde dem Ansatz 1 µl Dextranblau (10

µg/µl in H2O) zugefügt, da der Farbstoff DNA bindet und markiert. Nach 30 minütiger Zentrifugation bei 13000 rpm wurde der Überstand abgenommen und verworfen. Die gefällte DNA wurde dann mit 450 µl Ethanol (70% v/v) gewaschen und erneut bei 13000 rpm für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet bei 37 °C an der Luft getrocknet. Die anschließende Polyacrylamidgelelektrophorese und die Auswertung des Bandenmusters mit Hilfe des ABIMED-Sequenzierers (Langenfeld) erfolgte durch die zentrale Einrichtung ''Synthese und Sequenzierung'' des MPI Dortmund. Bei der Verwendung von Plasmid-DNA aus einer Mini-Präparation wurden für die Sequenzierung 5 µl der Mini-Präparation nach der oben beschriebenen Methode gefällt und das Pellet direkt in die PCR- Reaktion eingesetzt.

3.3 Insektenzellen

3.3.1 Kulturbedingungen

Die Kultivierung von Sf21-Zellen (3.1.2) erfolgte bei 27°C entweder in 6 Well-Platten, Petrischalen oder in Suspensionskultur. Suspensionskulturen wurden in Fährenbach-Kolben bei 27°C kultiviert. Die Zellen wurden alle zwei Tage gezählt und passagiert, um eine Zelldichte von 1·106 - 2·106 Zellen/ml einzuhalten. Sf21-Zellen wurden in TC10-Medium mit 10 % (v/v) FCS und 1 % (v/v) Pluronic (Invitrogen) kultiviert.

3.3.2 Transfektion von Sf21-Zellen mit rekombinanter Bakmid-DNA

Im Bac-to-Bac-System der Firma Invitrogen wurden rekombinante Bakuloviren zur Expression von Fremdgenen unter der Kontrolle des Polyhedrinpromoters des Autographa californica-nukleären-Polyhedrosis-Virus (AcNPV) benutzt. Das Polyhedringen wurde in der

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 42 METHODEN ______sehr späten Phase des Bakulovirus-Zyklus exprimiert. Die rekombinanten Bakuloviren wurden durch homologe Rekombination in E. coli hergestellt. Dazu wurden E. coli DH10Bac-Zellen (3.1.1) mit dem rekombinanten pFastBac HTB-Plasmid transformiert. Auf der Basis von sequenzspezifischer Transposition erfolgte in diesen Zellen die Eingliederung der Expressionskassette in die Bakmid-DNA des Stammes. Das Bakmid stellt das rekombinante Virus-Genom dar. Rekombinante Bakmide konnten durch Blaufärbung auf LB- Platten mit Kanamycin, Gentamicin, Tetrazyclin, 50 µM IPTG und 100 µg/ml X-Gal identifiziert werden. Sie wurden isoliert und durch PCR und Restriktionsanalyse charakterisiert. Durch Transfektion der Sf21-Zellen mit rekombinanter Bakmid-DNA erfolgte die Bildung von Viruspartikeln. Zur Transfektion wurden je 1·106 Sf21-Zellen in 2 ml Medium in einer 6 well-Platte ausgesät und für eine Stunde bei 27°C inkubiert. 5 µl Bakmid-DNA und 6 µl CellFECTIN wurden getrennt in jeweils 100 µl Medium verdünnt, kurz gemischt und dann 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden nach einer Stunde mit 2 ml Medium gewaschen. Zu jedem Transformationsansatz wurden 800 µl Medium gegeben und die Mischung anschließend auf die Zellen getropft. Die Zellen wurden 5 Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde der Transfektionskomplex von den Zellen abgenommen und 2 ml Medium zugegeben. Die Zellen wurden für 4 Tage im Brutschrank kultiviert. Danach wurden die Zellen mit dem Medium abgeschwemmt, in Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und bei 2500 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Die Zellen wurden zur Überprüfung der Expression lysiert und im Western Blot analysiert (s.u.).

3.3.3 Bestimmung des Virus-Titers

Zur Bestimmung des Virus-Titers wurden 6·106 Zellen abzentrifugiert und in 12 ml Medium mit Serum gelöst. Je 2 ml wurden in die sechs Vertiefungen einer 6 well-Platte gegeben und 1 Stunde inkubiert. Währenddessen wurden Verdünnungen des zu testenden Virus hergestellt. Der Virus wurde 1:105, 1:106 und 1:107 in Medium verdünnt. Nach 1 Stunde wurde das Medium von den Zellen abgenommen und 1 ml Virus-Verdünnung aufgetropft. Ein well wurde nur mit Medium betropft und diente als Kontrolle. Die Platte wurde dann 2 Stunden bei Raumtemperatur geschwenkt. In dieser Zeit wurden 0,5 g Agarose in 20 ml A. bidest aufgekocht und in ein 48°C-Wasserbad gestellt. Außerdem wurden 5 ml Medium mit Serum auf 48°C erwärmt. Nachdem der Virus von den Zellen abgenommen worden war, wurden 5 ml Agarose mit 5 ml 48 °C-Medium und 10 ml Medium (Raumtemperatur) gemischt und je 2,5 ml vorsichtig auf die Zellen gegeben. Bis die Agarose erstarrt war, wurde die Platte nicht ______43 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______bewegt. Anschließend wurde sie für 10 Tage im Brutschrank inkubiert. Um die Plaques sichtbar zu machen wurde mit 0,1 % (w/v) Neutralrot für 1 Stunde gefärbt.

3.3.4 Virusamplifikation

Für die erste Virusamplifikation nach der Transfektion von Sf21 Zellen mit Bakmid-DNA und der anschließenden Ernte der gebildeten Viruspartikel wurden 3·106 Sf21-Zellen pro 60 mm-Schale in 4,7 ml Medium ausgesät. Dann wurden 300 µl Virus zugegeben und die Zellen für 3 bis 4 Tage im Inkubator kultiviert. Anschließend wurden die Zellen bei 2500 rpm (Tischzentrifuge) abzentrifugiert, und der Überstand verwahrt. Für die nächste Amplifikation wurden 5·106 Zellen in einer 10 cm-Schale in 9 ml Medium ausgesät, und mit 2 ml Virus versetzt. Nach 3- bis 4-tägiger Inkubation wurde der Überstand durch Abzentrifugieren der Zellen gesammelt. Für die dritte Amplifikation wurden 2·108 Zellen in 500 ml Medium in einer 1 l Spinner-Flasche mit 5 ml Virus versetzt. Nach 3 bis 4 Tagen wurde der Überstand wie oben beschrieben gesammelt und der Titer bestimmt. Der Virus wurde bei 4°C als Stock gelagert. Für alle weiteren Amplifikationen des Viruses wurde generell eine Sf21-Kultur bei 2500 g 10 Minuten abzentrifugiert und in frischem Medium auf eine Zelldichte von 2·106 Zellen/ml verdünnt. Dann wurde die Kultur mit einer MOI (multiplicity of infection, Viruspartikel pro Zelle) von 0,1 infiziert und für vier Tage unter Kulturbedingungen inkubiert. Danach wurden die Zellen wiederum abzentrifugiert. Der virushaltige Überstand wurde im Plaque-assay untersucht, das Zellpellet wurde zur Überprüfung der Expression und/oder zur Proteinreinigung verwendet.

3.3.5 Proteinexpression in Sf21-Zellen

8 Zur Proteinexpression wurden 2,5·10 Zellen in der gewünschten Menge frischem Medium aufgenommen und mit einer MOI (multiplicity of infection) von 3 infiziert. Nach dreitägiger Kultivierung in Fährenbach-Kolben bei 27°C wurden die Zellen bei 2500 g für 10 Minuten abzentrifugiert und bei -20°C eingefroren.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 44 METHODEN ______

3.4 Proteinchemische Methoden

3.4.1 Analytische Expression rekombinanter Plasmide

Zur Bestimmung optimaler Expressionsbedingungen und des Anteils an löslichem rekombinantem Protein wurden Proteinpräparationen zunächst in analytischem Maßstab durchgeführt. 20 ml Expressionskulturen wurden mit 200 µl einer über Nacht Kultur angeimpft und bis zum Induktionszeitpunkt bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Variiert wurden der Induktionszeitpunkt, die Konzentration des Induktors (0,05 mM, 0,1 mM und 1 mM IPTG) und die Temperatur (20-37 °C). In gewissen Zeitintervallen (3h, 6h und über Nacht) wurden je zwei 1 ml Proben entnommen. Eine Probe diente dazu, nach Sedimentation der Zellen eine SDS-PAGE zur Kontrolle des Genexpressionsmusters durchzuführen. Mit der anderen Probe wurde ein analytischer Zellaufschluss durchgeführt, der der Bestimmung des löslichen Anteils an rekombinantem Protein mittels SDS-PAGE dienen sollte.

3.4.2 Analytischer Aufschluss von Bakterienzellen

Der analytische Aufschluss von Bakterienzellen erfolgte, im Gegensatz zum präparativen, mittels Blockbuster-Kit der Firma Novagen.

3.4.3 Präparative Expression rekombinanter Proteine

10 bis 20 l TB-Medium, mit dem entsprechenden Antibiotikum versehen (Ampicillin 100 mg/l), wurden mit einer über Nacht gewachsenen Vorkultur (100-300 ml) im Verhältnis 1:100 angeimpft und im Schüttler bis zum Induktionspunkt (meist eine OD600 von 0,5-0,8) bei 37 °C und 180 rpm inkubiert. Nach der Induktion mit der in der analytischen Expression bestimmten IPTG-Konzentration (meist 200 µM), wurde die Temperatur auf die optimale Temperatur eingestellt. Nach Abschluss der Inkubation (meist über Nacht) wurden die Zellen 20 Minuten bei 5000 rpm in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor zentrifugiert und dann in Waschpuffer (30 mM Tris pH 7,5) resuspendiert. Die Zellen wurden dann 20 Minuten bei 8000 rpm abzentrifugiert und pro Gramm Zellen in 3 ml Standardpuffer gründlich resuspendiert. Zur Verbesserung des Aufschlusses wurden die Zellen bei -20 °C eingefroren. Der präparative Aufschluss der Zellen erfolgte mittels Microfluidizer wie nachfolgend beschrieben.

______45 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

3.4.4 Präparativer Aufschluss von Bakterienzellen

Die Suspension der rekombinanten E. coli-Zellen wurde über Nacht bei 4 °C aufgetaut und mit Proteinaseinhibitoren 1:1000 (v/v) aus den entsprechenden Stammlösungen versetzt. Der Aufschluss der Bakterienzellen erfolgte mittels Microfluidizer. Dabei werden die Zellen mit etwa 700 kPa durch eine Kapillare gepresst. Durch die entstehenden hohen Scherkräfte brechen die Zellen auf. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt, um einen möglichst vollständigen Aufschluss zu gewährleisten. Zur Abtrennung unlöslicher Proteine und höhermolekularer Zellbestandteile wurde 60 Minuten bei 40000 bis 100000 g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig dekantiert und das Sediment verworfen.

3.4.5 Präparativer und analytischer Aufschluss von Insektenzellen

Zur Isolierung von Proteinen aus Sf21-Zellen wurde das Zellsediment (aus 10 ml – 2 l Kultur) zunächst 1 ml PBS-Puffer pro Gramm Zellen resuspendiert. Die Zellsuspension wurde durch Ultraschallbehandlung im Eisbad aufgeschlossen. Die Behandlung erfolgte dreimal für je 10 Sekunden (Mikrospitze; Stufe 5). Nach dem Aufschluss wurde NaCl aus einer 5 M Stammlösung bis zu einer Konzentration von 500 mM zugegeben. Dann wurde das Lysat für 45 Minuten bei 40000 g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig dekantiert und das Sediment verworfen.

3.4.6 Affinitätschromatographie

Die Reinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie beruht auf der selektiven hochaffinen Interaktion zwischen auf der Matrix der Säule fixierten Molekülen und einem sogenannten tag am Protein. Die anderen Proteine, die im Lysat enthalten sind, haben keine oder eine nur geringe Affinität für den matrixfixierten Liganden, so dass sie durch Waschschritte mit Puffer eluiert werden können. Das aufzureinigende Protein kann anschließend unter geeigneten Pufferbedingungen von der Affinitätsmatrix eluiert werden. Der Vorteil dieser Methode ist die sehr hohe Spezifität, da aufgrund biochemischer Eigenschaften und nicht nach chemisch-physikalischen Unterschieden (Masse, Ladung, etc.) getrennt wird. Die am häufigsten verwandten Systeme sind das GST Gene Fusion System von Amersham Pharmacia und das QIAexpress System von Qiagen.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 46 METHODEN ______

3.4.6.1 GST Gene Fusion System

Bei diesem System wird das aufzureinigende Protein in einen pGEX-Vektor kloniert und so als Fusionsprotein mit einem N-terminalen GST-Anker, der Glutathion-S-Transferase (aus Schistosoma japonicum) exprimiert. Bei der Reinigung wird der Proteinüberstand auf die mit Standard I-Puffer äquilibrierte Glutathion-Sephadex-Säule (GSH Sepharose 4B, GSH FastFlow-Sepharose 4B, Pharmacia) aufgetragen und bis zur Rückkehr auf eine konstante

Basislinie (OD280) mit Standard I-Puffer gewaschen. Um unspezifisch bindende Proteine abzutrennen wurde anschließend mit Hochsalzpuffer (Standard I-Puffer mit 500 mM Natriumchlorid) gewaschen bis die Basislinie wieder erreicht war. Dann wurde nochmals mit Standard I-Puffer gespült. Die Elution des an die Affinitätsmatrix gebundenen Proteins erfolgte mit Glutathion-Puffer (Standard I-Puffer mit 20 mM Glutathion, reduziert, pH 7,5). Die erhaltenen 5 ml Fraktionen wurden anhand des Elutionsdiagramms vereinigt. Zur Kontrolle wurde das vereinigte Eluat auf einem SDS-Gel analysiert.

3.4.6.2 QIAexpress System

Das QIAexpress System mit seinen pQE-Plasmidvektoren verwendet einen sogenannten 6- fachen His-tag, der aus 6 Histidin-Resten besteht und sowohl am carboxyterminalen als auch am aminoterminalen Ende des Proteins exprimiert werden kann. Als Affinitätsmatrix dient hier eine Sephadex-Säule, an die Nickel-Nitriloessigsäure (Nickel-NTA) gekoppelt wurde. Nitriloessigsäure komplexiert das Ni2+-Ion, lässt aber noch Bindungsstellen frei, an die dann der Histidin-Anker des Fusionsproteins binden kann. Die Elution erfolgt über einen Imidazolgradienten nach dem Konkurrenzprinzip, analog zur GSH-Elution beim GST- Fusionssystem.

3.4.7 Ionenaustauscherchromatographie

Die Ionenaustauscherchromatographie ist wie die Gelfiltration eine Methode, die sich physikalische Eigenschaften der Proteine – in diesem Fall Ladung – zunutze macht, um eine Trennung zu erreichen. An das geladene Trägermaterial absorbieren die verschiedenen Proteinmoleküle, abhängig von ihrer Ladung, mehr oder weniger gut und können durch das Anlegen eines Gradienten, der nach und nach die Ionenstärke des Puffers durch Steigern der Salzkonzentration (0-500 mM NaCl) erhöht, fraktioniert eluiert werden. Mit den gesammelten Fraktionen wurde analog zur Affinitätschromatographie (3.4.6) verfahren. ______47 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

3.4.8 Gelfiltration

Das Prinzip der Gelfiltration beruht im Gegensatz zur Affinitätschromatographie auf physiko- chemischen Unterschieden, hier der Molekülgröße. In das hochporöse Säulenmaterial können bevorzugt kleine Moleküle eindringen, denen damit annähernd das gesamte Säulenvolumen zur Verfügung steht. Große Moleküle hingegen verbleiben im Ausschlussvolumen und passieren die Säule schneller. Diesen Effekt bezeichnet man auch als Molekularsiebeffekt. Bedingt durch die Größenunterschiede wird das Volumen, das zur Diffusion zur Verfügung steht, limitiert. Die Moleküle eluieren somit in der Reihenfolge abnehmender molekularer Masse. Über eine Kalibrierung der Säule mit Proteinen bekannter Größe lassen sich so die Größen der eluierten Proteine über das Elutionsvolumen abschätzen. Folglich kann die Gelfiltration auch als analytische Methode zur Untersuchung von Protein-Protein- Interaktionen eingesetzt werden. Ein hinreichend affiner Proteinkomplex kann über das Elutionsvolumen und damit über sein Molekulargewicht von seinen einzelnen Untereinheiten unterschieden werden. Die Porengröße des Säulenmaterials definiert die Größe der auftrennbaren Proteine. Hier wurden Sephadex S75- und Sephadex S200-Säulen (Pharmacia) verwendet. Proteine mit einen Molekulargewicht über 75 beziehungsweise 200 kDa werden nicht mehr aufgetrennt, da sie im Ausschlussvolumen eluieren. Die Gelfiltrationssäulen wurden mit mindestens einem Säulenvolumen Kristallisationspuffer I äquilibriert. Nach dem Probenauftrag wurde dann mit demselben Puffer eluiert und fraktioniert gesammelt. Die für die Gelfiltration verwendeten Puffer wurden filtriert und entgast.

3.4.9 Protease-Verdau von GST-/6xHis-Fusionsproteinen

Zur Abtrennung des GST- bzw. 6xHis-Anteils vom Fusionsprotein wurde das Protein meist über Nacht bei 4 °C mit einer spezifischen Protease behandelt. Es wurden pro Milligramm Fusionsprotein etwa 1 Einheit (unit) Thrombin bzw. 4 µg TEV-Protease verwendet. Die Abtrennung des GST/6xHis erfolgte dann durch einen weiteren Reinigungsschritt, der entweder aus einer Gelfiltration oder einer Nickel-NTA-Säule bestand.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 48 METHODEN ______

3.4.10 Ultrafiltration zur Konzentrierung

Die nach den Reinigungsschritten erhaltene Proteinlösung wurde aufkonzentriert, entweder um sie konzentriert in einen weiteren Reinigungsschritt einzusetzen oder um sie zur dauerhaften Lagerung einzufrieren. Für eine relativ schonende Konzentrierung des Proteins wurde das Vivaspin-System (Vivascience) verwendet. Es basiert darauf, dass die Proteinlösung durch Zentrifugation durch eine Membran mit definierter Porengröße gepresst wird. Die Membran ist für das Lösungsmittel und niedermolekulare Substanzen permeabel, während das Protein zurückgehalten wird. Es wurden Vivaspin-Membranen mit Ausschlussgrößen von 5000, 10000 und 30000 Da (MWCO = molecular weight cut off) verwendet. Zur Konzentrierung wurde die Proteinlösung in das Reservoirgefäss gefüllt und dann in einer Hettich- Tischzentrifuge bei 4000g und 4 °C so lange zentrifugiert, bis die gewünschte Endkonzentration erreicht war.

3.4.11 Konzentrationsbestimmung nach Bradford

Die Konzentration von Proteinlösungen wurde nach der Methode von Bradford (1976) bestimmt. Dabei interagiert der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue© G250 mit den Seitenketten von Arginin, Histidin, Lysin, Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin (Compton & Jones, 1987) und wird in seiner anionischen Form stabilisiert. Dadurch kommt es zu einer bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nach 595 nm. Für die Konzentrationsbestimmung der Proteinlösung wurden verschiedene Volumina (meist 1 bis 10 µl) der Lösung in 500 µl Coomassie Protein Assay Plus Reagenz (Sigma) gegeben, gründlich gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion wurde dann bei 595 nm gegen pures Reagenz bestimmt. Als Proteinstandard zur Kalibrierung diente bovine serum albumin (BSA).

3.4.12 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Zur analytischen Auftrennung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts wurde die denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Laemmli, 1970; Shapiro et al., 1967) mit einem diskontinuierlichen Puffersystem verwendet. Die durch den Probenpuffer geschaffenen denaturierenden Bedingungen führen zur Auflösung von Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturen, so dass die Proteine als ellipsoide

______49 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

Strukturen vorliegen. Im Puffer ist das Detergenz Sodiumdodecylsulfat (SDS) enthalten und durch seine Bindung (etwa ein Molekül SDS pro zwei Aminosäurereste) werden die intra- und intermolekularen Wechselwirkungen zerstört. Das ebenfalls enthaltene β- Mercaptoethanol (alternativ DTE/DTT) bewirkt die reduktive Spaltung von Disulfidbrückenbindungen. Aufgrund der negativen Ladung der Kopfgruppe des SDS- Moleküls wird die Eigenladung des Proteins maskiert und führt so zu einem nahezu konstanten Verhältnis von Ladung zu Molekulargewicht. Die Auftrennung einer Proteinprobe auf einem Polyacrylamidgel mit definierter Porengröße erfolgt durch den Molekularsiebeffekt des Gels. Die relativen Mobilitäten der Proteine sind umgekehrt proportional zum Logarithmus des Molekulargewichts. Um die Proteinprobe konzentriert, als dünne Bande, auf das Trenngel aufzugeben, wurde dem Trenngel ein grobporigeres Sammelgel vorgeschaltet (sogenannte diskontinuierliche SDS- PAGE). Das Prinzip der Bandenschärfung beruht auf der Anwesenheit von Leit- und Folgeionen im Puffer (Pingoud & Urbanke, 1997). Als Folgeion fungiert das negativ geladene Glycinat, das aufgrund des pH-Wertes (pH 6,8) im Gleichgewicht mit Glycin vorliegt. Glycin trägt als Zwitterion keine Nettoladung und hat so eine geringere Mobilität. Als Leition an der Probenfront dient Chlorid, dicht gefolgt von den SDS-Proteinkomplexen. Zwischen den getrennten Leit- und Folgeionen erhöht sich die lokale Feldstärke. Dies führt zu einer Beschleunigung der SDS-Proteinkomplexe und so dicht hinter der Leitionenfront als scharfe, konzentrierte Bande laufen. Erreicht die Proteinprobe das Trenngel, so verschiebt sich das Gleichgewicht zwischen Glycin und Glycinat, aufgrund des höheren pH-Werts im Trenngel in Richtung des negativ geladenen Glycinat. So können die Folgeionen die Proteinbande überholen. Polyacrylamidgele wurden durch die Kopolymerisation von Acrylamid und N,N'-Methylen- Bisacrylamid hergestellt. Die radikalische Kettenreaktion wurde durch Ammoniumperoxi- disulfat (APS) als Radikalstarter und Tetramethylethylendiamin (TEMED) als Katalysator initiiert.

5% Sammelgel 12,5% Trenngel 15% Trenngel

H2O 2,1 ml 1,65 ml 1,14 ml Acrylamidlösung 30 % 0,45 ml 2,1 ml 2,5 ml Trenngelpuffer - 1,25 ml 1,25 ml Sammelgelpuffer 0,84 ml - - 10% (w/v) APS 100 µl 100 µl 100 µl TEMED 10 µl 10 µl 10 µl

Tab. 3.5: Herstellung von Glycin-SDS-Polyacrylamidgelen. ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 50 METHODEN ______

Trenn- und Sammelgel wurden entsprechend der Tabellen 3.5 bzw. 3.6 hergestellt. Das Trenngel wurde zwischen zwei Glasplatten mit Abstandhaltern gegossen und während der Polymerisation mit Ethanol überschichtet, um die Ausbildung eines Meniskus zu verhindern und Luftausschluss zu gewährleisten. Das Ethanol wurde dekantiert und das auspolymerisierte Trenngel mit dem Sammelgel überschichtet. Zur Ausbildung der Probentaschen wurde ein Teflonkamm zwischen den Glasplatten positioniert. Die Proteinproben wurden mit 1/4 des Probenvolumens 5-fach Probenpuffer versetzt und vor dem Auftragen fünf Minuten bei 95 °C gekocht. Die Elektrophorese erfolgte bei konstanter Stromstärke mit 34 mA. Die SDS-Gelelektrophorese nach Schägger & von Jagow (1987), stellt eine Variante, der oben beschriebenen SDS-PAGE dar. Sie kennzeichnet sich vor allem durch ein größeres Auflösungsvermögen im Bereich bis 20 kDa Proteingröße, und verwendet neben Glycerin und Tricin auch ein spezielles Puffersystem aus Anoden- bzw. Kathodenpuffer.

5% Sammelgel 10% Trenngel 16% Trenngel

H2O 7,76 ml 5 ml 1,9 ml Acrylamidlösung 30 % 1,24 ml 5,2 ml 8,3 ml Tricin-Gelpuffer 3 ml 6,7 ml 6,7 ml Glycerin 100 % - 3,1 ml 3,1 ml 10% (w/v) APS 100 µl 100 µl 100 µl TEMED 10 µl 10 µl 10 µl

Tab. 3.6: Herstellung von Tricin-SDS-Polyacrylamidgelen.

Zur Färbung des Gels wurde es in eine Färbelösung bestehend aus Coomassie Brilliant Blue G250 und R250, Ethanol und Essigsäure überführt. Die Kontrastierung erfolgte mit einer Mischung aus Ethanol und Essigsäure oder alternativ mit Wasser.

3.4.13 Western Blot

Unter Blotting versteht man den elektrophoretischen Transfer von Proteinen von einem Gel auf eine Membran. Der Transfer von zuvor elektrophoretisch aufgetrennten Proteinen auf eine Membran wird als Western Blot bezeichnet und erlaubt spezifische Nachweisreaktionen von auf der Membran immobilisierten Proteinen. Der Transfer wird nach dem Elektroblot-Verfahren in einer Halbtrockenzelle (semi-dry) druchgeführt. Auf die Anodenplatte werden zunächst zwei in Anodenpuffer getränkte ______51 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

Whatman-Papiere, dann die durch Methanol aktivierte PVDF-Membran und schließlich das Gel gelegt. Darauf plaziert man dann zwei weitere, diesmal allerdings in Kathodenpuffer getränkte, Whatman-Papiere. Die abschließende Kathodenplatte wird während der Blotting- Prozedur mit Eis gekühlt. Das Blotting erfolgt für ein Gel bei 300 mA für 15 Minuten. Danach wird die Membran kurz in Färbelösung geschwenkt und dann 5 Minuten in Entfärber gewaschen, bis klare Proteinbanden zu erkennen sind. Die Markerbanden und die einzelnen Spuren werden mit Kugelschreiber auf der Membran markiert. Die Membran wird anschließend in TBST-Puffer entfärbt. Nach dem Transfer von Proteinen aus einem Polyacrylamid-Gel auf eine PVDF-Membran können diese selektiv durch Antigen-spezifische Antikörper immunologisch nachgewiesen werden. Der spezifische Nachweis rekombinanter Proteine erfolgt durch Antikörper, die gegen ein Epitop der entsprechenden Proteine gerichtet sind. Für die Detektion nach der ECL™-Methode wird der primäre Antikörper von einem sekundären Antikörper erkannt und gebunden, welcher kovalent an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist. Das Vorhandensein eines bestimmten Proteins wird also indirekt durch die enzymatische Aktivität eines Enzyms sichtbar gemacht. Unspezifische Bindungsstellen auf der Membran werden zunächst durch Inkubation mit Blockierlösung (4% Magermilchpulver in TBST-Puffer) für mindestens eine Stunde abgesättigt. Alle Inkubationen werden auf einem Schüttler bei Raumtemperatur durchgeführt. Es folgt die einstündige Inkubation mit dem Erst-Antikörper, der in TBST-Puffer mit 0,4% Magermilchpulver entsprechend verdünnt wird. Danach wird dreimal mit TBST gewaschen und es erfolgt analog zum Erst-Antikörper die Inkubation mit dem Zweit-Antikörper. Abschließend wird die Membran dreimal für 10 Minuten mit TBST-Puffer gewaschen. Zur Visualisierung der Proteinbanden wird das ECL™-Chemolumineszenz-Substrat benutzt. Dabei wird ein zyklisches Diacylhydrazid (Luminol) mit Wasserstoffperoxid durch die an den Sekundär-Antikörper gekoppelte Peroxidase oxidiert. Das Reaktionsprodukt befindet sich in einem elektronisch angeregten Zustand und gibt seine Energie durch Aussendung von Licht wieder ab. Diese Chemolumineszenz wird dabei durch die Anwesenheit von sogenannten Enhancer-Molekülen verstärkt. Das Maximum der Lichtemission liegt bei 428 nm und kann mit kurzen Expositionszeiten zur Belichtung von hochsensitiven Röntgenfilmen benutzt werden.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 52 METHODEN ______

3.4.14 Umkehrphasen HPLC

HPLC-Analysen wurden zur relativen und absoluten Bestimmung der Nukleotidkonzentration von Lösungen sowie zur Unterscheidung von unterschiedlichen Nukleotidderivaten verwendet. Die Probenauftrennung bei der Umkehrphasen (Reversed phase) HPLC erfolgte isokratisch unter Ionenpaarbindung (Tucker et al., 1986). Die positiv geladenen Tetrabutylammonium (TBA)-Ionen binden an die negativ geladenen Phosphatgruppen. Der hydrophobe Acylanteil der TBA-Ionen interagiert mit der stationären ODS Hypersil C18 Matrix der Trennsäule. Unter diesen Bedingungen nimmt die Retentionszeit mit steigender Anzahl an Phosphatgruppen zu. Eventuell in der Probe enthaltene Proteine wurden über eine Nucleosil 100-C18-Vorsäule (Bischoff, Leonberg) entfernt. Die Nukleotidkonzentration kann über den molaren Extinktionskoeffizienten

−1 −1 −1 −1 (ε 254 ()GXP = 16700 ⋅ l ⋅ mol ⋅ cm , ε 254 (GXP) = 22000 ⋅ l ⋅ mol ⋅ cm ) nach dem Lambert- Beer'schen-Gesetz aus der Absorption bei λ = 254 nm berechnet werden. Durch Kalibrierung des HPLC-Durchflussphotometers mit Proben bekannter Konzentration und Zusammensetzung können sowohl die Zusammensetzung als auch die Nukleotidkonzentration bestimmt werden. Über eine Variation der Acetonitrilkonzentration der mobilen Phase (7,5 bis 25%) kann bei einer Flussgeschwindigkeit von 1,8 ml/min die Retentionszeiten der Nukleotide verändert werden.

3.4.15 Nukleotidaustausch

Um Proteine quantitativ mit verschiedenen Nukleotiden zu beladen, müssen sie zunächst vom gebundenen Nukleotid, in der Regel GDP, befreit werden. Die Nukleotidbefreiung erfolgt in zwei Schritten in einem speziellen Austauschpuffer (3.1.4), in welchem die

Nukleotidaustauschrate erhöht ist. Im ersten Schritt wird ein Nukleotidanalog, GppCH2p oder GppNHp, in etwa 1,2-2fachem Überschuß zugegeben. Durch die Zugabe von Alkalischer Phosphatase (5U/mg Protein) wird freies GDP zu GMP hydrolysiert, während

GppCH2p/GppNHp aufgrund der Methylen- bzw. Imido-β-γ-Verknüpfung nicht hydrolysiert werden können. Der Ansatz wird bei 4°C inkubiert und die Hydrolyse von GDP zu GMP mittels HPLC verfolgt. GppCH2p/GppNHp binden mit wesentlich höherer Affinität an das

GTP-bindende Protein als GMP, so dass letztlich das gesamte Protein GppCH2p/GppNHp gebunden vorliegt. Das Protein kann in diesem Zustand über eine kleine Gelfiltration von dem ______53 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

Austauschpuffer und Nukleotidresten befreit werden, was allerdings nur nötig ist, wenn man mit dem GppCH2p/GppNHp-gebundenem Protein weiterarbeiten möchte. Die Reaktion ist bis hier vor allem für den Austausch zu dem nicht hydrolysierbaren GTP-Analog GppNHp von Bedeutung. Für die eigentliche Nukleotidbefreiung ist ein zweiter Schritt nötig, in welchem dann das

GppCH2p mittels Phosphodiesterase hydrolysiert wird. Der Abbau kann auch hier mittels HPLC verfolgt werden. Das nukleotidfreie Protein kann mit einem beliebigen (auch fluoreszenzmarkierten) Nukleotid beladen werden, indem dieses im 1.2-1.5fachen Überschuß zu der GTPase gegeben wird. Nach einer kurzen Inkubationsphase wird ungebundenes Nukleotid durch eine weitere Gelfiltration über eine NAP® 5-Säule (Pharmacia) abgetrennt. Die Konzentration an aktivem, nukleotidgebundenem Protein wird wie beschrieben mittels HPLC (3.4.14) bestimmt.

3.4.16 GTPase Pulldown Assay

Die GTPase-bindenden Domänen von Rho-Effektoren binden mit sehr hoher Affinität und Spezifität an die zugehörigen aktiven GTPasen. Diese Eigenschaft kann man sich zunutze machen, um festzustellen, ob und wieviel eines isolierten Proteins in aktiver Form vorliegt. Zusätzlich kann damit auch überprüft werden, ob eine GTPase in GDP-, GppNHp, oder nukleotidfreier Form an einen bestimmten Bindungspartner bindet. Mit GST (Glutathion S- Transferase) fusionierte GTPase-bindende Domänen des entsprechenden Bindungspartners werden dazu an GSH-Sepharose-Material (Amersham, Pharmacia) gekoppelt. Dazu wird die in Ethanol gelagerte Sepharose dreimal mit Meßpuffer gewaschen und anschließend mit der entsprechenden Proteinlösung versetzt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 4°C auf einem Rotator wird der Überstand abgenommen und die Sepharose erneut dreimal mit Puffer gewaschen. Anschließend werden 110 µl des Gel-Materials mit der entsprechenden GTPase (in bereits gereinigter und mit dem gewüschten Nukleotid beladender Form) oder präpariertem Zelllysat versetzt und erneut 30 Minuten bei 4°C auf einem Rotator inkubiert. Anschließend wird die Sepharose kurz anzentrifugiert, der Überstand abgenommen und dreimal mit Puffer gewaschen. Im letzten Schritt wird der Überstand abgenommen und verworfen, während das Matrixmaterial mit Elutionspuffer (Messpuffer mit 20 mM Glutathion) oder direkt mit SDS-Probenpuffer versetzt wird. Zu dem Eluat wird danach, falls noch nicht geschehen, SDS-Probenpuffer gegeben, die Probe einige Minuten bei 95°C inkubiert und danach mittels SDS-PAGE (3.4.12) oder Western Blot (3.4.13) analysiert.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 54 METHODEN ______

3.4.17 Gelelektrophorese nativer Proteine

Die Gelelektrophorese nativer Proteine wurde in dieser Arbeit dazu verwendet Protei-Protein Interaktionen nachzuweisen. Da Proteine unter alkalischen Bedingungen vornehmlich negativ geladen sind, wandern sie in einem Polyacrylamidgel mit definierter Porengröße auf der Basis ihrer Eigenladung und des Molekularsiebeffekts. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist dabei abhängig von der Ladung, der Porengröße des Gels, der Proteinstruktur und dem Molekulargewicht des Proteins. Der Nachweis der Proteininteraktion erfolgt dann durch Vergleich der Laufweiten der Einzelproteine und des Komplexes. Trenn- und Sammelgel wurden entsprechend der Tabelle 3.7 hergestellt. Das Trenngel wurde zwischen zwei Glasplatten mit Abstandhaltern gegossen und während der Polymerisation mit Ethanol überschichtet, um die Ausbildung eines Meniskus zu verhindern und Luftausschluss zu gewährleisten. Das Ethanol wurde dekantiert und das auspolymerisierte Trenngel mit dem Sammelgel überschichtet. Zur Ausbildung der Probentaschen wurde ein Teflonkamm zwischen den Glasplatten positioniert.

3 % Sammelgel 10 % Trenngel

H2O 2,0 ml 0,2 ml Acrylamidlösung 30 % 0,5 ml 3,3 ml Tris-pH8,8 - 3,0 ml Sucrose 50 % 2,5 ml 3,4 ml 10% (w/v) APS 100 µl 100 µl TEMED 10 µl 10 µl

Tab. 3.7: Herstellung von Polyacrylamidgelen für die native Gelelektrophorese.

3 µg der Proteinproben wurden in 10 µl des Probenpuffers (30 % Glycerol, 0,25 % Bromphenolblau) aufgenommen in die Taschen aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei konstanter Spannung mit 100 V bei 4°C. Die Färbung der nativen Gele erfolgte entsprechend der von denaturierenden Gelen.

______55 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

3.5 Biophysikalische Methoden

3.5.1 Massenspektrometrie

Massenspektren von Proteinen zur Bestimmung des Molekulargewichts wurden an einem Elektrospray Ionisations LCQ Massenspektrometer (ESI-MS, Finnigan, San Jose, CA, USA) mit Nano-Elektrospray Ionenquelle aufgenommen. Die Proteinlösung wurde in MeOH/H2O 1:1 (v/v) und 5% Ameisensäure aufgenommen. Das Verdampfen der Probe erfolgte aus einer goldbeschichteten Quartzkapillare mit 1 µm Durchmesser an der Spitze (Wilm & Mann, 1996). Zur Dekonvolution des Spektrums wurde folgende Beziehung verwendet: m M = z ⋅ − z (Gl. 3.2) W z

3.5.2 Fluoreszenzspektroskopische Methoden

Moleküle sind, abhängig von ihrer elektronischen Struktur, in der Lage Lichtquanten zu absorbieren. Durch Licht einer bestimmten Wellenlänge und den enthaltenen Energiebetrag werden Elektronen vom Grundzustand auf ein höheres Energieniveau gehoben. Durch das Zurückfallen in den Zustand niedrigerer Energie wird die Energiedifferenz in Form von Wärme und Strahlung wieder frei. Das elektronisch angeregte Molekül verliert einen Teil seiner Energie durch Translation, Rotation und Vibration, bevor es in den Grundzustand zurückkehrt. Aus diesem Grund ist die Strahlung, die dabei abgegeben wird, energieärmer und damit langwelliger, als die Anregungswellenlänge. Die Strahlungsemission wird als Fluoreszenz bezeichnet. Die Fluoreszenz eines Moleküls ist eine Funktion der Umgebung. Die Polarität der Umgebung hat Einfluß auf die Fluoreszenzintensität, weil strahlungslose Übergänge, das sogenannte „Quenching“, unterschiedlich stark begünstigt oder verhindert werden. Dabei wird die Energie strahlungslos in Form von Translations-, Schwingungs- und Rotationsenergie auf die molekulare Umgebung des angeregten Moleküls übertragen. Die Wellenlänge wird durch diesen Prozeß kaum verschoben. Damit ermöglicht die Fluoreszenzspektroskopie die zeitaufgelöste Messung von Polaritätsänderungen in der Umgebung des Fluorophors. Aus diesem Grund kann die Methode für kinetische Messungen verwendet werden, wenn sich die Fluorophorumgebung im Laufe der Reaktion genügend ändert.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 56 METHODEN ______

Um die Nukleotidassoziation bzw. –dissoziation bestimmter GTPasen zeitaufgelöst verfolgen zu können, werden in dieser Arbeit Nukleotidanaloga verwendet, die mit fluoreszierenden Gruppen modifiziert sind. Diese werden durch Nukleotidaustausch an die jeweilige GTPase gebunden (3.3.10). In diesem Fall werden mant- oder tamra-modifizierte Nukleotide verwendet, welche kovalent an die 2‘ bzw. 3‘-Position der Ribose gebunden ist.

O N O O O NH -O P O P O P O N O N NH2 O- O- O- O OH O C NH CH3

Abb. 3.1: Struktur von 3‘-O-(N-methyl)-anthranoyl-GTP.

Die Messungen werden alle in entgastem und steril filtriertem Messpuffer bei 20 bzw. 25°C durchgeführt. Eingesetzte Proteinlösungen werden zentrifugiert, um Schwebepartikel zu entfernen, und vor Gebrauch entsprechend verdünnt.

3.5.2.1 Bestimmung langsamer Reaktionskinetiken

Fluoreszenzemissionsspektren langsamer Reaktionen (>1000 sec) werden im Fluoreszenzspektrometer (Perkin-Elmer LS50B) gemessen. Konstante Meßparameter sind die Exzitations- und Emissionswellenlänge, die auf 366 und 450 nm eingestellt sind, während die Schlitzbreiten je nach Anfangsfluoreszenz variiert werden (Exzitation: 5-15 mm; Emission: 10-20 mm). Durch den Einsatz eines Küvettenwechslers werden 4 Proben mit je 600µl Küvettenvolumen simultan in 20 sec-Intervallen gemessen. Die mit fluoreszenzmarkiertem Nukleotid beladene GTPase wird in einer konzentration von 0,1-0,2 µM vorgelegt und sowohl GEF als auch nicht-fluoreszenzmarkiertes Nukleotid (sowie alle weiteren verwendeten Komponenten) hinzu pipettiert. Die Auswertung der Meßdaten erfolgt mit dem Programm GraFit (Erithacus Software Ltd.).

______57 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

3.5.2.2 Stopped-Flow-Messungen schneller Reaktionen

Reaktionen, die zeitlich mittels Fluoreszenzspektrometer nicht mehr aufgelöst werden können (u.a. Nukleotidassoziation an nukleotidfreie GTPasen), werden mit Hilfe einer Stopped-Flow- Apparatur (Applied Photophysics SX16MV) aufgenommen. Auf diesem Weg kann die Kinetik von sehr schnellen Reaktionen fluoreszenzspektroskopisch gemessen werden. Das Prinzip dieser Methode beruht auf der automatischen Injektion zweier Lösungen, welche die beiden Interaktionspartner enthalten, in eine Meßzelle und dem Aufnehmen des Fluoreszenzsignals. Die gerätebedingte Totzeit ist bei dem verwendeten Gerät kleiner als 2 Millisekunden. Die Exzitation für mant-modifizierte Nukleotide erfolgt bei 360nm, das Emissionsignal wird hinter einem Kantenfilter bei Wellenlängen über 408 nm mit einem Photomultiplier gemessen. Für tamra-modifizierte Nukleotide erfolgt die Exzitation bei 546 nm. Für die Emission werden die Wellenlängen unterhalb von 570 nm mit einem Kantenfilter abgeschnitten und ebenfalls mittels Photomultiplier detektiert. Jede Messung wird bei 20°C mindestens dreimal durchgeführt und anschließend über die mitgelieferte Software (Applied Photophysics-SpectraKinetic Workstation© 1990,1994 v4.099) gemittelt. Die Auswertung erfolgt auch hier mit dem Programm GraFit (Erithacus Software Ltd.).

3.5.2.3 Graphische Auswertung der Fluoreszenzdaten

Die erhaltenen Daten werden mit Hilfe des Programms GraFit ausgewertet, wobei im Zuge dieser Arbeit folgende drei mathematische Funktionen zur Anpassung an die Daten angewandt werden: y = relative Fluoreszenz t = Zeit in s A = Amplitude (1) Einfach exponentielle Funktion: k = Rate in s-1 . –kt y = A (1 – e ) + offset (Gl. 3.3) A1 = Amplitude 1 A2 = Amplitude 2 -1 k1 = 1. Rate in s -1 (2) Doppelt exponentielle Funktion: k2 = 2. Rate in s

. –k1t . –k2t y = A1 (1 – e ) + A2 (1 – e ) + offset (Gl. 3.4) y = Rate in s-1

c = Konzentration des Titranden in µM (3) Hyperbolische Funktion: k = Rate der Reaktion aus (1) oder (2)

KD = Gleichgewichtskonstante in µM . y = k c / c + KD (Gl. 3.5)

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 58 METHODEN ______

3.5.3 Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)

Kalorimetrische Titrationen wurden an einem Microcal MCS Titrationskalorimeter (Microcal,

Northhampton, MA, USA) durchgeführt. In der Zelle (V0 = 1,4195 mL) wurden 50 µM Protein vorgelegt und mit einer 500 µM Lösung des Liganden in der Titrationsspritze in 8 µl Schritten bis zur Sättigung titriert. Die Injektionszeit betrug etwa 2 µl/s, die Integrationszeit 2 s. Nach jeder Injektion wurde 240 s die Rückkehr zur Basislinie abgewartet. Die Integration der Wärmeänderungen und der Kurvenangleich wurden mit Microcal Origin für die ITC Version 7 durchgeführt. Zur Herleitung der für die Auswertung der Daten verwendeten Gleichung wird die Assoziationsgleichgewichtskonstante K (in M-1) für die Bindung des Liganden L an ein Enzym E als Funktion des Bindungsgrades ν ausgedrückt:

ν (Gl. 3.6) K = . ()1 −ν ⋅ []L

Dabei ist [L] die Konzentration an freiem Liganden in M und ν der Anteil der mit Ligand besetzten Bindungsstellen. Die Massenbilanz für den Liganden lautet dann

(Gl. 3.7) [L]0 = [L]+ n ⋅ν ⋅ [E]0 ,

Wobei [L]0 und [E]0 die Gesamtkonzentrationen des Liganden bzw. Enzyms in M und n die Anzahl aktiver Bindungsstellen des Enzyms bedeuten. Kombination der Gleichungen 3.6 und 3.7 führt auf Gleichung 3.8

2 ⎛ [L]0 1 ⎞ [L]0 (Gl. 3.8) ν −ν ⋅ ⎜1 + + ⎟ + = 0 . ⎝ n ⋅ []E 0 n ⋅ K ⋅ []E 0 ⎠ n ⋅ []E 0

Der Wärmeinhalt Q der Lösung in V0 bei Bindungsgrad ν relativ zu ν = 0 ist

(Gl. 3.9) Q = n ⋅ν ⋅ [E]0 ⋅ ∆H ⋅V0 .

______59 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

Q ist die Wärmemenge in J, ∆H die molare Reaktionsenthalpie der Ligandenbindung in J/mol und V0 das Messvolumen der Zelle. Lösen von Gleichung 3.8 nach ν und Einsetzen in Gleichung 3.9 liefert Gleichung 3.10:

⎛ 2 ⎞ n ⋅[]E ⋅ ∆H ⋅V ⎜ []L 1 ⎛ []L 1 ⎞ 4 ⋅ []L ⎟ Q = 0 0 ⋅ 1 + 0 + − ⎜1 + 0 + ⎟ − 0 (Gl. 3.10) 2 ⎜ n ⋅ []E n ⋅ K ⋅ []E ⎜ n ⋅ []E n ⋅ K ⋅ []E ⎟ n ⋅ []E ⎟ ⎝ 0 0 ⎝ 0 0 ⎠ 0 ⎠

Durch Anpassen einer Kurve nach Gleichung 3.10 an die gemessenen Wärmemengen kann die Gleichgewichtsassoziationskonstante K, die molare Bindungswärme ∆H und die Anzahl aktiver Bindungsstellen n berechnet werden. Bei Kenntnis der Stöchiometrie ist aus n der Anteil aktiven Enzyms ermittelbar.

3.6 Kristallographische Methoden

3.6.1 Kristallisation

Kristallkeime wachsen nicht innerhalb gesättigter Lösungen. Das System muss dazu übersättigt sein (sogenanntes Nicht-Gleichgewicht), um die treibende thermodynamische Kraft für eine Kristallisation zu liefern.

Abb. 3.2: Kristallisation und Proteinkonzentration. Kristallwachstum ist nur im Bereich oberhalb der Sättigungskonzentration (durchgezogene Linie) der Proteinlösung möglich. Die Bildung von stabilen Keimen ist nur oberhalb der gestrichelten Linie möglich. Aus McPherson, 1989.

Bei einer langsamen Verdunstung des Lösungsmittels geht die Lösung in einen übersättigten Zustand über und eine feste Phase (Kristall, Keim) kann entstehen. An diese kann sich dann das Protein anlagern. Hat sich in einer übersättigten Lösung ein stabiler Keim gebildet wird er

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 60 METHODEN ______kontinuierlich weiterwachsen bis der Gleichgewichtszustand wieder erreicht ist. Ein stabiler Kristallkeim kann als ein molekulares Aggregat angesehen werden, an dessen Oberfläche sich mehr Moleküle anlagern, als zurück in Lösung gehen. Ideales Kristallwachstum beginnt mit Keimen, die in der labilen Phase gerade oberhalb der Phasengrenze der metastabilen Phase (gestrichelte Linie, Abb. 3.2) gebildet werden. Das Kristallwachstum vollzieht sich dann langsam, und die Lösung geht in die metastabile Phase über, in der keine weiteren Keime mehr gebildet werden, gebildete Kristalle aber weiterwachsen.

3.6.2 Kristallisation nach der Methode des hängenden Tropfens

Um eine kontrollierte Konzentrierung des Präzipitans und des Proteins zu erhalten wurde in dieser Arbeit die Methode des hängenden Tropfens (hanging drop method) verwendet (siehe Abb. 3.3). Dabei wurden 2 µl der Proteinlösung auf die silikonisierte Oberfläche des Deckglases aufgebracht und mit 2 µl der Reservoirlösung vermischt. Das Deckglas wurde dann kopfüber auf eine Vertiefung gelegt, die mit 400 bis 1000 µl der Reservoirlösung gefüllt war. Damit das Deckglas die Vertiefung luftdicht abschließt, wurden die Ränder mit Vakuumfett bestrichen. Für die einzelnen Ansätze wurden Linbro-Platten mit 24 Vertiefungen verwendet. Bei dieser Methode ist die Konzentration an Präzipitans im Reservoir größer als die des Tropfens, so dass durch Diffusionsvorgänge eine Equilibrierung beider Lösungen stattfindet. Wasser diffundiert aus dem Tropfen, wodurch sich die Präzipitanskonzentration und die Proteinkonzentration erhöhen. Dieser Prozess findet solange statt, bis sich ein Gleichgewicht zwischen Reservoir und Tropfen eingestellt hat. Die resultierende übersättigte Lösung im Tropfen kann zur Kristallisation des Proteins führen.

Abb. 3.3: Kristallisation nach der Methode des hängenden Tropfens. (modifiziert nach J. Drenth)

______61 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

3.6.3 Kristallisation nach der Methode des sitzenden Tropfens

Um initiale Kristallisationsbedingungen zu finden wurde in dieser Arbeit der Mosquito Kristallisationsroboter (TTP Labtech, UK) verwendet. Verfahrenstechnisch ist hier eine Kristallisation nach der Methode des sitzenden Tropfens einfacher realisierbar und in Abbildung 3.4 schematisch dargestellt. Für die einzelnen Ansätze wurden 96-well Platten benutzt, in deren Vertiefungen die Reservoirösungen manuell vorgelegt wurden. Die Mischung von 200 nl Proteinlösung mit 200 nl der Reservoirlösung erfolgte dann durch den Roboter. Anschließend wurde die Platte mit selbstklebender Folie luftdicht verschlossen und bei der gewünschten Temperatur inkubiert.

Abb. 3.4: Kristallisation nach der Methode des sitzenden Tropfens. (modifiziert nach J. Drenth)

3.6.4 Kristallisationsbedingungen

Angesichts der vielen unterschiedlichen Parameter, die die Kristallisation von Proteinen beeinflussen, werden kommerziell verschiedene Screens angeboten. Diese verwenden unterschiedliche Konzentrationen an Präzipitantien und Salzen, sowie unterschiedliche Puffer und pH-Werte. In dieser Arbeit wurden dazu die unter (3.1.11) aufgeführten Screens verwendet.

3.6.5 Silikonisierung von Deckgläsern

Um eine gute Tropfenform zu erhalten wurden die verwendeten Deckgläser silikonisiert. Dazu wurden sie zunächst in Wasser und 70% igem Ethanol (v/v) gewaschen. Zum Silikonisieren wurde eine 1%ige (w/v) Lösung aus AquaSil und Aqua dest. hergestellt. In dieser Lösung wurden die Deckgläser 72 Stunden inkubiert, danach mit Aqua dest. gründlich gespült und zum Trocknen ausgelegt.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 62 METHODEN ______

3.6.6 Kristallmontage

3.6.6.1 Verwendung einer Quarzkapillare

Makromolekulare Kristalle bestehen durchschnittlich zu etwa 50% aus Lösungsmittel. Das restliche Volumen besteht aus dem Protein selbst, so dass der gesamte Kristall als ein geordnetes Gel mit ausgedehnten Zwischenräumen, in denen Lösungsmittel und kleine Moleküle frei diffundieren, angesehen werden kann. Um eine Austrocknung und damit verbundene Zerstörung des Kristalls im Röntgenstrahl zu verhindern, muss der Verlust des im Kristall enthaltenen Lösungsmittels vermieden werden. Dazu wurde der Kristall in eine dünnwandige Quarzkapillare überführt und durch absaugen der Mutterlauge in der direkten Umgebung trocken gelegt. Die beiden Enden füllte man dann, in einigem Abstand zum Kristall, mit der Mutterlauge, so dass der Kristall zwar trocken liegt, sich aber in einer Lösungsmittel gesättigten Umgebung befindet. Zum verschließen der Kapillare wurde Hartwachs verwendet. Der Kristall wurde unmittelbar vor der Datensammlung auf einem Goniometerkopf im Schnittpunkt des Röntgenstrahls mit der Rotationsachse montiert.

3.6.6.2 Kristallmontage unter kryogenen Bedingungen

Um eine Strahlenschädigung der Kristalle zu verringern wurden sie in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Dazu mussten sie zunächst in eine cryogene Lösung, bestehend aus Mutterlauge und einem Gefrierschutzzusatz, überführt werden. Als Zusätze dienten in dieser Arbeit Glycerol, Sucrose, Xylitol, MPD, PEG400 und Malonat. Für den eigentlichen Friervorgang wurde dann der Kristall aus der Gefrierschutzlösung in einem passenden Loop (Hampton Research) aufgenommen und in flüssigen Stickstoff getaucht. Die Lagerung der Kristalle bis zur Datensammlung erfolgte unter flüssigem Stickstoff (100 K).

3.6.7 Grundlagen der Röntgenstrukturanalyse

Die molekulare Struktur und die Anordnung der Moleküle in der Einheitszelle bestimmen die Intensitäten der am Kristallgitter gebeugten Strahlen. Der Streuvorgang ist eine Interaktion zwischen Röntgenstrahlen als elektromagnetische Wellen und den Elektronen der Atome in den Proteinen. Wenn elektromagnetische Wellen auf ein Elektronensystem einwirken, üben die elektronischen und magnetischen Komponenten der Wellen eine Kraft auf die Elektronen aus. Dies bewirkt ein Oszillieren der Elektronen mit der gleichen Frequenz wie die der ______63 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______einwirkenden Welle. Die oszillierenden Elektronen wirken wie ''Strahlungsstreuer'' und senden ihrerseits Strahlung aus, was man als Sekundärwellenbildung bezeichnet. Durch die Elektronen wird Energie der einwirkenden Welle absorbiert und dann eine neue Welle emittiert. Die Elektronen eines Atoms können bei der Röntgenstreuung als freie Elektronen angesehen werden. Die durch einen Kristall gestreuten Wellen können als Summation einer großen Anzahl von Einzelwellen angesehen werden. Jede dieser Einzelwellen wird durch Wechselwirkung mit einem einzelnen Elektron gebildet. Eine Einheitszelle in einem typischen Kristall umfasst mehrere hunderttausend Elektronen und ein Kristall besteht aus einer großen Anzahl von Einheitszellen. Die Interferenz zwischen allen vom Röntgenstrahl im Kristallgitter getroffenen Elektronen führt zu deutlich voneinander getrennten Beugungspunkten (Reflexen) in bestimmten Richtungen. Jeder dieser Reflexe wird aus der Summe aller positiven Interferenzen mit gleichem Beugungswinkel gebildet. Dies wird durch die Bragg'sche Reflexionsbedingung (Bragg, 1913) beschrieben:

2⋅d ⋅sinθ = n⋅λ (Gl. 3.11)

Hierbei sind d der Netzebenenabstand im Kristall, λ die Wellenlänge der Röntgenstrahlung, θ der Glanzwinkel und n die Beugungsordnung.

Abb. 3.5: Bragg’s Gesetz. Dargestellt sind zwei Gitterebenen, die durch den Abstand d voneinander getrennt sind. Der einfallende und der reflektierte Strahl erzeugen mit der Gitterebene den Winkel θ. (modifiziert nach J. Drenth)

Nach Bragg kann man sich die Streuung von Röntgenstrahlen als Reflexion der Röntgenstrahlen an Ebenen im Kristall vorstellen. Die geometrischen Verhältnisse sind in Abbildung 3.5 dargestellt. Trifft ein einfallender Strahl unter dem Glanzwinkel θ auf eine Netzebenenschar, so kommt es genau dann zu konstruktiver Interferenz der an den einzelnen Ebenen gestreuten Strahlen, wenn der Gangunterschied ein ganzzahliges Vielfaches der Wellenlänge ist. Dies ist der Fall, wenn θ die Bragg'sche Gleichung erfüllt. Unter der

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 64 METHODEN ______

Voraussetzung, dass die betreffenden Ebenen mit Atomen besetzt sind, erhält man einen Reflex, der genau diese Netzebenenschar repräsentiert.

3.6.8 Datensammlung

Die erhaltenen Einkristalle wurden zum Testen und zur Datensammlung auf einem Goniometerkopf im Schnittpunkt des Röntgenstrahls mit der Rotationsachse montiert. Als Detektor kam ein MAR345 Image Plate System (X-Ray Research GmbH, Norderstedt) zum Einsatz. Als Röntgenquelle diente eine rotierende FR591 CuKα Anode (Enraf Nonius, Delft, Niederlande), die mit 10 kV und 20 mA betrieben wird. Die damit erzeugte monochromatisierte CuKα Röntgenstrahlung besitzt eine Wellenlänge von λ = 1,54179 Å. Zur Fokussierung des Strahls finden osmische Spiegel (X-Ray Research GmbH, Norderstedt) Verwendung. Der verwendete Kollimator besaß eine Breite von 0,3 mm. Hochauflösende Datensätze von nativen und derivatisierten Kristallen wurden an verschiedenen Synchrotronquellen (ESRF Grenoble, Frankreich bzw. DESY Hamburg) gesammelt. Zur Indizierung (Suche nach einem reziproken Gitter) und Integration der Intensitätsdaten sowie zur Datenreduktion wurde das Programmpaket XDS (Kabsch, 1993) verwendet.

3.6.9 Phasenproblem

Die Elektronendichte eines Moleküls wird durch folgende Gleichung definiert:

1 (Gl. 3.12) ρ(xyz) = ∑ F(hkl) exp[]− 2πi(hx + ky + lz) + iα(hkl) V hkl

|F(hkl)| entspricht dabei der Strukturfaktoramplitude des Reflexes (hkl), inklusive des Temperaturfaktors. α(hkl) ist der Phasenwinkel. x, y und z sind die kartesischen Koordinaten in der Einheitszelle. Aus dem aus der Messung erhaltenen Streumuster erhält man die Werte der einzelnen Intensitäten der Reflexe I(hkl). Über die Beziehung

2 (Gl. 3.13) I(hkl) = F(hkl) können die Amplituden |F(hkl)|, der mit den Millerschen Indizes h, k und l bezeichneten

______65 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

Reflexe bestimmt werden. Aus der Messung erhält man allerdings keine Informationen über die Phasenwinkel, was gemeinhin auch als Phasenproblem bezeichnet wird. Aus Gleichung 3.12 geht hervor, dass für die Berechnung von Elektronendichtekarten sowohl die Amplituden, als auch die Phasenwinkel bekannt sein müssen. Anhand dieser Werte lassen sich dann die Strukturfaktoren berechnen. Es werden vier verschiedene Techniken angewendet, um die Phaseninformation zu erhalten. Die erste Methode findet bei kleinen Molekülen Anwendung und basiert auf statistischen Beziehungen von Intensitätsverteilungen (Hauptmann et al., 1991). Die Gültigkeit dieser statistischen Beziehungen fällt mit ansteigender Anzahl von Atomen in der Einheitszelle und ist deshalb für die Phasenbestimmung von Proteinen nicht anwendbar (Karle, 1989). Zur Anwendung des multiplen isomorphen Ersatzes (MIR) benötigt man Protein, an das eine kleine Anzahl von Schweratomen (Atome mit einer großen Anzahl von Elektronen) angelagert sind. Der Intensitätsunterschied für jeden Reflex zwischen dem derivatisierten und dem nativen Kristall wird dann dazu benutzt, die Schweratompositionen zu bestimmen und damit die gesuchte Phaseninformation. Bei der dritten Methode handelt es sich um multiple anomale Wellenlängenstreuung (MAD). Für diese Methode sind anomal streuende Atome nötig. Die anomale Streuung wird von Elektronen hervorgerufen, die innerhalb des Kristalls als nicht vollkommen frei betrachtet werden können und mit den Röntgenstrahlen in Resonanz treten. Dieser Effekt hängt von der verwendeten Wellenlänge ab. Der Streufaktor f ist folgendermaßen definiert:

f ()θ,λ = f o (θ ) + f ′(λ) + i ⋅ f ′′(λ) (Gl. 3.14) wobei f° der normale freie Elektronenstreufaktor ist. f' und f'' sind die anomalen wellenlängenabhängigen Korrekturen. Der reale Teil der anomalen Streuung, f', ist der dispersive Teil und der imaginäre Teil, f'', ist der Absorptionsterm und um 90° phasenverschoben. Die Phaseninformation wird durch die Lokalisation der Atome erhalten, die durch Variationen ihrer anomalen Streueigenschaften bei verschiedenen Wellenlängen identifiziert werden. Diese Methode benötigt eine in der Wellenlänge veränderbare Röntgenquelle (Synchrotronstrahlung). Der molekulare Ersatz ist die vierte verwendete Methode. Hierbei wird die Ähnlichkeit einer unbekannten Struktur mit einer bekannten Struktur ausgenutzt. Diese Methode wurde in dieser Arbeit zur Strukturaufklärung verwendet.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 66 METHODEN ______

3.6.10 Strukturbestimmung

3.6.10.1 Molekularer Ersatz (MR)

Die zur Berechnung der Elektronendichteverteilung nötige Phaseninformation wurde für die Proteine Rac1b und TC10 nach der Methode des molekularen Ersatzes (Navaza, 1993) indirekt bestimmt. Sie kann angewendet werden, wenn die Struktur eines Proteins mit homologer Aminosäuresequenz bekannt ist. Die Struktur dieses homologen Proteins wird dann als Ausgangspunkt für das neue Protein verwendet. Die Phasen des kristallisierten Moleküls werden durch die Phasen des anderen Moleküls angenähert. Dazu wird ein Suchmodell durch Rotation und Translation in der Einheitszelle des gemessenen Datensatzes plaziert. Anschließend können mit den gemessenen Strukturfaktoramplituden und den berechneten Phasen die ersten Elektronendichtekarten berechnet werden. Die Rotationssuche dient der korrekten Orientierung des Suchmodells im Kristallgitter. Dies wird durch Vergleich der aus dem Suchmodell und den gemessenen Daten berechneten Pattersonfunktion erreicht. Pattersonfunktionen sind Karten aller interatomaren Abstandvektoren, die von einem gemeinsamen Ursprung ausgehen und ohne Phaseninformation berechnet werden können. Die korrekte relative Orientierung des

Suchmodells führt zu einem Maximum im Produkt der Pattersonfunktionen P1 und P2 (Gleichung 3.15).

(Gl. 3.15) R(C) = P1 (x)⋅ P2 (x′)⋅ dV ∫U

R(C) ist die Rotationsfunktion, C eine Matrix, die eine Rotation von Molekül x relativ zu x' definiert und U ist das Volumen, über das integriert wird. Das Integrationsvolumen U wird durch den Pattersonintegrationsradius definiert. Dieser liegt im Idealfall im Bereich des Molekülradius, so dass die Pattersonfunktion keine intermolekularen Abstände enthält, welche das Signal/Rausch-Verhältnis der Rotationsfunktion verschlechtern würden. Die exakte Lösung des Rotationsproblems ist Voraussetzung für eine eindeutige Lösung des Translationsproblems. Das Konzept für die Translationsfunktion ist dem der Rotationsfunktion ähnlich. Hier wird das orientierte Suchmodell in Schritten von etwa 1 Å durch die Einheitszelle bewegt. An jedem Punkt wird die Korrelation der beobachteten Intensitäten und der Abstandsvektoren der symmetrieverwandten Moleküle untersucht. An der richtigen Position sollte die Translationsfunktion Maxima an den Stellen haben, die den Translationsvektoren zwischen den symmetrieverwandten Molekülen entsprechen. Die Suche ______67 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______nach einer richtigen Lösung erfolgte in dieser Arbeit mit den Programmen AMoRe (Navaza, 1993), Molrep (CCP4, 1994) und Phaser (CCP4, 1994).

3.6.10.2 Multipler isomorpher Ersatz (MIR)

Um die Methode des multiplen isomorphen Ersatzes anwenden zu können, benötigt man die Amplitudeninformation des nativen Proteinkristalls und wenigstens eines Schweratomderivats. Um die Intensitätsdaten zwischen nativen und derivatisierten Kristallen miteinander vergleichen zu können, müssen diese zunächst relativ zum nativen skaliert werden. Um ein gutes Signal für die gebundenen Schweratome zu bekommen, ist eine gute Isomorphie der Kristalle untereinander besonders wichtig. Nicht-Isomorphie zeigt sich häufig in einer Veränderung der Parameter der Einheitszelle; kann aber auch durch eine leichte Rotation des Proteins durch die Scweratombindung zustande kommen, ohne eine Änderung der Zellparameter zu verursachen. Dies kann im Weiteren zu einer schlechten Verfeinerung der Schweratomparameter führen. Folgende Schritte sind im allgemeinen Teil des Isomorphen Ersatzes: 1. Herstellung mehrer Schweratom enthaltende Kristalle 2. Sammlung von Intensitätsdaten für den nativen und die derivatisierten Kristalle 3. Anwendung der Patterson Funktion, zur Bestimmung der Schweratompositionen 4. Verfeinerung der Schweratomparameter und anschließende Berechnung der Proteinphasenwinkel 5. Berechnung der Elektronendichte für das Protein

Nach dem Erhalt von Intensitätsdaten können aus den Amplituden des nativen Kristall FP und des Derivats F die isomorphen Unterschiede ∆ F berechnet werden. Verwendet PH iso man diese dann als Koeffizienten zur Berechnung der Pattersonfunktion, so erhält man eine Differenz-Pattersonkarte:

1 P(uvw) = (∆ F ) 2 exp(−2πi(hx + ky + lz)) (Gl. 3.16) ∑ iso V hkl

mit ∆ F = F − F . (Gl. 3.17) iso PH P

Hierbei sind u, v und w die Koordinaten des Pattersonraums, während x, y und z denen des realen Raums entsprechen. Das Volumen V der Einheitszelle dient der Normierung.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 68 METHODEN ______

Anhand der Harker-Sektionen (Anhäufung von Maxima in bestimmten Ebenen der Pattersonkarte bedingt durch Symmetrieelemente) der Pattersonkarte können dann die Positionen der Schweratome berechnet werden. Sind die Positionen der Schweratome einmal bekannt, so kann die darin enthaltene Information dazu verwendet werden, die Phasenwinkel des nativen Proteins anzunähern. Dies ist schematisch in den beiden folgenden Abbildungen dargestellt (Abb. 3.6 und 3.7).

Abb. 3.6: Argand Diagramm für den SIR-Fall. |FP| entspricht der Amplitude des nativen Kristalls und |FPH| der des Derivats. |FH|, der Schweratombeitrag zu den Amplituden von |FPH| kann aus der oben aufgeführten Formel berechnet werden. α sind die zugehörigen Winkel.

Abb. 3.7: Harker Konstruktion für den SIR-Fall.

Die Skalierung der Intensitätsdaten der Derivate relativ zum nativen Datensatz erfolgte in dieser Arbeit durch die Programme FHSCAL und SCALEIT (CCP4, 1994). Die Analyse der Derivate erfolgte durch eine Vielzahl von Programmen: MLPHARE (CCP4, 1994), FFT (CCP4, 1994), SHELX (Schneider & Sheldrick, 2002), CNS 1.1 (Brünger et al., 1998) und SHARP (La Fortelle & Bricogne, 1997). Die Phasenbestimmung erfolgte letztendlich unter

______69 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

Verwendung von SOLVE (Terwilliger & Berendzen, 1999). Die anschließende Elektronendichtemodifikation erfolgte mit RESOLVE (Terwilliger, 1999).

3.6.11 Modellbau und Strukturverfeinerung

Der abschließende Schritt zum Lösen einer Struktur ist der Modellbau und die Strukturverfeinerung. Im Allgemeinen sind hier vier verschiedene Parameter pro Atom zu verfeinern: die Raumkoordinaten x, y und z sowie der Temperaturfaktor B. Zur Strukturverfeinerung wird eine Energiefunktion E minimiert, die im Wesentlichen aus einem Kraftfeldterm und einem Term für die Röntgendaten besteht.

E = EKraftfeld + E X −ray (Gl. 3.18)

Das Kraftfeld berücksichtigt Van-der-Waals-Abstände, polare und ionische Wechselwirkungen. Bei dem Prozess der Verfeinerung einer Struktur wird versucht, die beobachteten und die berechneten Strukturfaktoren unter Erhalt der Stereochemie anzugleichen. Durch einen Vergleich der beobachteten und der aus dem Modell berechneten Strukturfaktoramplituden kann die Qualität des Angleichs abgeschätzt werden (R-Faktor).

Der aus diesem Vergleich berechnete Fehler wird als kristallographischer R-Faktor, Rcryst, bezeichnet und ist definiert als

∑ Fo (hkl) − Fc (hkl) hkl Rcryst = (Gl. 3.19) ∑ Fo ()hkl hkl

wobei Fo und Fc die beobachteten beziehungsweise die berechneten Strukturfaktoramplituden des Reflexes hkl bezeichnen. Die Zahl der anzugleichenden Parameter übersteigt häufig die Anzahl der Reflexe, so dass das System unterbestimmt ist und der Angleich des Modells an die Daten zu lokalen, aber falschen Minima führen kann. Der sogenannte freie R-Faktor, Rfree, wurde deshalb zur

Kontrolle entsprechend zu Rcryst berechnet. Hierfür wurden 5-10% der gemessenen Reflexe verwendet, die nicht für die Strukturverfeinerung eingesetzt wurden ( h ⊂ T ).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 70 METHODEN ______

∑ Fo (hkl) − Fc (hkl) hkl⊂T R free = (Gl. 3.20) ∑ Fo ()hkl hkl⊂T

Die Konvergenz der Strukturverfeinerung kann über diese Kreuzvalidierung kontrolliert werden (Brünger, 1992b).

Für die Strukturverfeinerung und Energieminimierung wurde in dieser Arbeit das Programmpaket CNS Version 1.1 (Brünger et al., 1998) verwendet. Die Interpretation der Elektronendichtekarten und der Modellbau erfolgte mit dem Programm O (Jones et al., 1991) an einem Octane Computer (Silicon Graphics, Mountain View, CA, USA). Sowohl für den Molekularen Ersatz als auch für die initiale Phase der Verfeinerung wurde das Nukleotid, das Magnesiumion und die Effektorschleifen (Switch I und II) aus dem Modell entfernt. Nach einer rigid body-Verfeinerung des Moleküls erfolgte eine simulated annealing Minimierung. Dies diente dazu den Einfluss des ursprünglichen Modells auf die zu bestimmende Struktur zu verringern. Der Einbau der Aminosäuren, des GTP-Nukleotids und des Magnesiumions erfolgte durch wiederholten Modellbau im Graphikprogramm O und anschließendes simulated annealing mittels CNS (Brünger et al., 1998). Nach einer Verfeinerung der individuellen B-Faktoren (bindividual). Der B-Faktor ist ein Maß für die Beweglichkeit eines Moleküls oder Atoms in einer bestimmten Umgebung. Temperaturänderungen beeinflussen die thermischen Bewegungen von Atomen, was wiederum die Streuintensitäten beeinflusst. Die thermische

⎡ ⎛ 2 Θ ⎞⎤ Bewegung von Atomen bewirkt einen Intensitätsabfall um den Faktor exp − B sin , ⎢ ⎜ 2 ⎟⎥ ⎣ ⎝ λ ⎠⎦

−2 −2 wobei B = 8πui der Temperaturfaktor ist und ui die Beweglichkeit des Teilchens i in den drei Raumrichtungen x, y und z angibt. Nachdem alle Aminosäuren eingebaut waren wurde eine composite omit map erstellt bei deren Berechnung eine Anzahl von Aminosäuren des Modells nicht berücksichtigt wird, so dass die entstehende Elektronendichtekarte ohne Einfluss des Modells ist. Mit dieser Methode können bei der Interpretation der Elektronendichte unterlaufene Fehler nachträglich entdeckt und korrigiert werden. Der Einbau von Wassermolekülen erfolgte automatisiert mit CNS 1.1 (waterpick, Brünger et al., 1998) oder ArpWarp (Perrakis et al., 1997). Wassermoleküle die den verwendeten

______71 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien METHODEN ______

Parametern nicht entsprachen, oder deren B-Faktor oberhalb von 80 lag wurden nicht eingebaut. Jedes einzelne Wassermolekül wurde dann in seiner Position und auf eine Absättigung der Wasserstoffbrückenbindungen überprüft. Für die letzten Schritte der Verfeinerung wurde das Programm REFMAC5 (CCP4, 1994) unter Verwendung der TLS- Option benutzt.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 72 ERGEBNISSE ______

4. Ergebnisse

4.1 GTPasen der Ras- und Rho-Familien

Um die Interaktion des zytoplasmatischen Teils der Plexine mit den GTPasen der Ras- und der Rho-Familien in vitro zu untersuchen, mussten zunächst verschiedene GTPasen rekombinant exprimiert und isoliert werden. Abbildung 4.1 gibt einen Überblick über die verwendeten GTPasen.

Abb. 4.1: Übersicht über die verwendeten GTPasen der Ras- und der Rho-Familien. Die Zahlen geben die N- und C-terminale Aminosäure des verwendeten Fragmentes an.

4.1.1 Klonierung und Expression von Rho-GTPasen

Für die rekombinante Expression der GTPasen wurden zunächst verschiedene DNA- Konstrukte aus cDNA oder von vorhandenen Konstrukten mittels PCR (3.2.10), Restriktion (3.2.6) und Ligation (3.2.9) hergestellt.

______73 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Tab. 4.1: Klonierung und Expression der GTPasen Protein Vektor Restriktion Menge in mg/10l Rnd1 pGEX 4T1 BamHI/XhoI 100 Rnd1∆NC pGEX 4T1 BamHI/XhoI 150 Rac1∆C (Q61L) pGEX 4T1 BamHI/EcoRI 220

Die Expression aller verwendeten GTPasen erfolgte unter ähnlichen Bedingungen. Die

Kulturen wurden bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6 inkubiert und dann durch Zugabe von 0,1-0,3 mM IPTG induziert. Nach einer 10-14 stündigen Inkubation bei 30°C in einem Schüttelinkubator (150-170 rpm) wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert.

4.1.2 Reinigung der GTPasen

Alle in dieser Arbeit verwendeten GTPasen wurden aufgrund ihrer vergleichbaren Eigenschaften ähnlich gereinigt. Abbildung 4.2 zeigt den Verlauf der Proteinreinigung beispielhaft für Rnd1∆NC. Die Expression als GST-Fusionsprotein erfolgte über Nacht in 5 - 20 l Medium bei 30°C. Der Zellaufschluss erfolgte wie unter 3.4.4 beschrieben.

A) B)

Abb. 4.2: Reinigung von Rnd1∆NC. A) Aufschluss und Reinigung mittels GSH-Sepharose Säule. 1 Gesamtprotein nach Zellaufschluss; 2 Sediment nach Zentrifugation; 3 Überstand nach Zentrifugation; 4 Durchfluss Affinitätschromatographie; 5 Durchfluss Hochsalzwaschschritt; 6 Eluat B) Gelfiltration; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an.

Der erste Reinigungsschritt erfolgte durch eine Affinitätschromatographie (3.4.6). Da der affinitätschromatographische Schritt häufig keine ausreichende Reinheit des Proteins gewährleistete, wurde anschließend eine Größenausschlusschromatographie (3.4.8) durchgeführt. Alle verwendeten GTPasen konnten mit hohem Reinheitsgrad erhalten werden (Abb. 4.3). Reinheit und Nukleotidbeladung wurden nach jeder Reinigung mittels SDS-PAGE bzw.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 74 ERGEBNISSE ______

HPLC analysiert. Rnd1 ist nach der Proteinreinigung, genauso wie die homologen Proteine Rnd2 und Rnd3, mit GTP beladen und zeigt keine nennenswerte GTP Hydrolyse.

Abb. 4.3: Übersicht über die Reinheit der verwendeten GTPasen. 1 RhoA∆C, 2 Rac1, 3 Rac1b∆C, 4 Cdc42, 5 TC10∆C, 6 TC10∆NC, 7 Rnd1∆NC, 8 Rnd3∆NC, 9 H-Ras∆C.

4.2 GTPase bindende Domänen der Plexine (GBD)

Die Bindung von GTPasen der Rho-Familie an die zytoplasmatische Domäne (CPD) der Plexine wurde im Jahr 2000 erstmals beschrieben (Rohm et al., 2000; Vikis et al., 2000; Driessens et al., 2000). Die GTPase-bindende Domäne (GBD) konnte auf eine 20 kDa große zentrale Region der CPD eingegrenzt werden. Im Verlauf dieser Arbeit sollte die Interaktion der GTPasen mit den GBDs der Plexine bezüglich Spezifität und kinetischer Parameter in vitro charakterisiert werden. Außerdem wurden die erhaltenen Proteinfragmente für die Kristallisation eingesetzt. Abbildung 4.4 zeigt die verwendeten Konstrukte.

Abb. 4.4: Übersicht über die verwendeten GTPase-bindenden Domänen der Plexine. Die Zahlen geben die N- und C-terminale Aminosäure des verwendeten Fragmentes an.

______75 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

4.2.1 Klonierung und Expression

Um die Interaktion mit den GBDs charakterisieren zu können, mussten diese rekombinant in E. coli exprimiert werden. Dazu wurden die in Tabelle 4.2 aufgelisteten Konstrukte mittels PCR (3.2.10), Restriktion (3.2.6) und Ligation (3.2.9) ausgehend von vorhandenen Konstrukten kloniert.

Tab. 4.2: Klonierung und Expression der Plexin GBDs Protein Vektor Restriktion Menge in mg/10l Plexin A2 GBD pGEX2TTEV BamH1/EcoR1 125 Plexin B1 GBD pGEX2TTEV BamH1/EcoR1 440 Plexin C1 GBD pGEX2TTEV Nco1/Xho1 240 Plexin D1 GBD pGEX2TTEV BamH1/EcoR1 310

Die Expression der GBDs erfolgte als GST-Fusionsprotein unter ähnlichen Bedingungen. Die Expressionsbedingungen wurden zunächst durch Variation der Temperatur und der IPTG- Konzentration optimiert. Die Standardbedingungen erwiesen sich dabei als optimal. Die

Kulturen wurden bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6 inkubiert und dann durch Zugabe von 0,3 mM IPTG induziert. Nach einer 10-14 stündigen Inkubation bei 30°C in einem Schüttelinkubator (150-170 rpm) wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert.

4.2.2 Reinigung der GBDs

Die Reinigung der GBDs von PlexinA2, B1, C1 und D1 erfolgte unter vergleichbaren Bedingungen und ist für PlexinD1-GBD exemplarisch in Abbildung 4.5 dargestellt.

A) B)

Abb. 4.5: Exemplarische Reinigung von PlexinD1 GBD. A) Aufschluss und Reinigung mittels GSH-Sepharose Säule. 1 Gesamtprotein nach Zellaufschluss; 2 Sediment nach Zentrifugation; 3 Überstand nach Zentrifugation; 4 Durchfluss Affinitätschromatographie; 5 Durchfluss Hochsalzwaschschritt; 6 Eluat; 7 proteolytische Spaltung B) Gelfiltration; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an. ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 76 ERGEBNISSE ______

Die GBDs wurden über den N-terminalen GST-Anteil affinitätschromatographisch gereinigt (3.4.6). Das Fusionsprotein wurde anschließend proteolytisch durch TEV Protease gespalten. Da nicht alle bakteriellen Verunreinigungen durch den ersten Reinigungsschritt abtrennbar waren, wurde als zweiter Reinigungsschritt eine Gelfiltration verwendet. Dadurch konnten sowohl bakterielle Verunreinigungen als auch ein Teil des GST von den GBDs abgetrennt werden. Das noch vorhandene GST wurde durch eine weitere GSH-Sepharose-Säule quantitativ vom zu reinigenden Protein getrennt. Die Reinheit der Proteine war in allen Fällen größer 95%. Die Stabilität der GBDs von PlexinB1, C1 und D1 war sehr gut, so dass sie mit guten Ausbeuten erhalten wurden. Die GBD von Plexin A2 hingegen war schon als GST- Fusionsprotein sehr instabil. Dies konnte während der Proteinkonzentrierung und der proteolytischen Spaltung beobachtet werden, da hier eine Präzipitation des Proteins erfolgte. Demzufolge konnten nur geringe Proteinmengen von PlexinA2-GBD erhalten werden, die für eine vollständige biochemische Charakterisierung nicht ausreichten.

Abb. 4.6: Übersicht über die Reinheit der Plexin GBDs. 1 PlexinA2-GBD, 2 PlexinB1-GBD, 3 PlexinC1-GBD, 4 PlexinD1-GBD.

4.2.3 Kristallisation der GBDs

Die GBDs von PlexinB1, C1 und D1 wurden nach der Proteinreinigung auf etwa 20 mg/ml konzentriert und in Kristallisationpuffer (20 Tris/HCl, pH 7,5 und 2mM DTT) überführt. Die Kristallisation erfolgte sowohl unter Verwendung der Methode des hängenden als auch des sitzenden Tropfens. Die unter 3.1.11 aufgeführten Bedingungen wurden unter Variation der Proteinkonzentration (5 mg/ml, 10 mg/ml und 20 mg/ml) und der Temperatur (4°C, 12°C und 20°C) ausgetestet. So wurden für jedes Protein etwa 3600 mögliche Kristallisationsbedingungen getestet, von denen keine zu streufähigen Kristallen führte.

______77 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

4.2.4 Charakterisierung der GTPase-GBD Bindung

Da bisher die Charakterisierung der GTPase-GBD Interaktion nur durch Pulldown-, Two- Hybrid- und Overlay-Assays (Rohm et al., 2000; Vikis et al., 2000; Driessens et al., 2000) erfolgte, war ein Ziel dieser Arbeit die Suche nach einer Methode, die sowohl eine Aussage bezüglich der Spezifität der Interaktionen als auch eine Quantifizierung der kinetischen Parameter ermöglichte.

4.2.4.1 Native Gelelektrophorese

Um die Spezifität der Interaktion von mehreren GTPasen mit vielen Bindungspartnern untersuchen zu können, wurde nach einer einfachen, schnellen und aussagekräftigen Methode gesucht. Die native Gelelektrophorese (3.4.17) schien in diesem Zusammenhang bestens geeignet, so dass für die Etablierung der Methode zunächst die Interaktion zwischen Ras und RafRBD verwendet wurde. Dabei ist eine Interaktion zwischen beiden Molekülen durch eine Änderung des Laufverhaltens im Vergleich zu den einzelnen Proteinen als Referenz zu beobachten. Für die Untersuchung der GTPase-GBD Interaktion wurden die GTPasen RhoA, Rac1, Cdc42 und TC10, jeweils im GppNHp-gebundenen Zustand, mit den GBDs der Plexine A2, B1, C1 und D1 gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Die sich anschließende elektrophoretische Trennung erfolgte wie unter 3.4.17 beschrieben (siehe Abb. 4.7, Geltaschen 3, 5, 7 und 9). Als Referenz dienten hierbei ebenfalls die einzelnen Proteine (siehe Abb. 4.7, Geltaschen 1, 2, 4, 6 und 8). Alle untersuchten Proteine konnten bei dieser Methode verwendet werden, da sie ein entsprechendes Laufverhalten zeigten. Auffallend war die hohe Laufgeschwindigkeit der PlexinC1-GBD, die sich deutlich von PlexinA2, B1 und D1-GBD unterschied. Dies kann durch die hohe negative Nettoladung von -14 erklärt werden. PlexinB1 GBD besitzt zum Vergleich eine negative Nettoladung von -5. Für keine der getesteten GTPase-GBD Kombinationen konnte mit dieser Methode eine Interaktion nachgewiesen werden, obwohl die Positivkontrolle zeigt, dass dies prinzipiell möglich sein sollte. Ein Grund hierfür könnte eine nur niedrigaffine Bindung zwischen GTPasen und GBDs sein (5.1.2).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 78 ERGEBNISSE ______

Abb. 4.7: Native Gelelektrophorese von verschiedenen Plexinkonstrukten mit A) RhoA∆C·GppNHp, B) Rac1∆C·GppNHp, C) Cdc42∆C·GppNHp und D) TC10∆C·GppNHp. Die einzelnen Proben sind wie folgt aufgetragen: 1) GTPase, 2) PlexinA2-GBD, 3) PlexinA2-GBD + GTPase, 4) PlexinB1-GBD, 5) PlexinB1-GBD + GTPase, 6) PlexinC1-GBD, 7) PlexinC1-GBD + GTPase, 8) PlexinD1-GBD, 9) PlexinD1-GBD + GTPase, 10) PlexinB1-CPD, 11) PlexinB1-CPD + GTPase, 12) PlexinA2-CPD und 13) PlexinA2-CPD + GTPase.

Um die Methode zu etablieren und um eine Positivkontrolle zu haben, wurde die sehr gut untersuchte Interaktion zwischen Ras und seinem Effektor RafRBD untersucht. Abbildung 4.8 zeigt die GTP-abhängige Interaktion durch eine Komplexbildung von Ras∆C·GppNHp und RafRBD und die damit verbundene Änderung des Laufverhaltens. RafRBD ist mit einem Molekulargewicht von 8 kDa sehr klein und wanderte deshalb in den nativen Gelen zu schnell, so dass es nur im Komplex mit Ras nachgewiesen werden konnte.

Abb. 4.8: Native Gelelektrophorese von Ras ∆C mit RafRBD als Positivkontrolle. 1) Ras∆C·GppNHp 2) Ras∆C·GDP 3) RafRBD 4) Ras∆C·GppNHp + RafRBD 5) Ras∆C·GDP + RafRBD.

______79 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

4.2.4.2 Pulldown Experimente

Pulldown Experimente werden häufig für einen Interaktionsnachweis zwischen Effektoren und GTPasen eingesetzt. Auch für die GTPase-Plexin Interaktion wurde diese Methode schon angewendet (Rohm et al., 2000; Vikis et al., 2000; Driessens et al., 2000). Mittels Pulldown Assay (3.4.16) sollte in dieser Arbeit die Spezifität der Plexin-GTPase Interaktion untersucht werden. Dazu wurden die PlexinA2, B1, C1 und D1 GBDs als GST- Fusionsproteine an GSH-Sepharose gebunden und mit den GDP- und GppNHp-gebundenen GTPasen RhoA, Rac1, Cdc42 und Rnd1 (GTP-gebunden) inkubiert. Nach mehreren Waschschritten wurden die GST-Fusionsproteine eluiert und mittels SDS-PAGE elektrophoretisch getrennt (Abb. 4.9). Eine Interaktion zwischen GTPase und Plexin-GBD sollte durch eine zusätzliche Bande für die GTPase deutlich erkennbar sein, wie die Positivkontrolle (Cdc42-WaspGBD) in Abbildung 4.10 zeigt.

Abb. 4.9: Pulldown Experimente mit GST-Plexin GBDs (A2, B1, C1 und D1) und RhoA∆C, Rac1∆C, Cdc42∆C und Rnd1∆NC. 1 GST-Plexin GBD; 2 GBD + RhoA·GDP; 3 GBD + RhoA·GppNHp; 4 GBD + Rac1·GDP; 5 GBD + Rac1·GppNHp; 6 GBD + Cdc42·GDP; 7 GBD + Cdc42·GppNHp; 8 GBD + Rnd1·GTP.

Die Untersuchung der GTPase-GBD Interaktion ist in Abbildung 4.9 dargestellt. Es konnte hierbei in keiner der dargestellten Experimente eine Interaktion nachgewiesen werden, so dass auch diese Methode für eine Spezifitätsbestimmung nicht geeignet erschien (5.1.2).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 80 ERGEBNISSE ______

Abb. 4.10: Pulldown Experiment von Cdc42∆C mit GST-WASp als Positivkontrolle. 1 GST-WASp; 2 GST-WASp + Cdc42∆C·GDP; 3 GST-WASp + Cdc42∆C·GppNHp

4.2.4.3 GDI Assay

Die Bindung eines Effektors an eine GTPase verringert die Nukleotiddissoziation und kann so als indirekter Interaktionsnachweis verwendet werden kann. Dieser Guaninnukleotid- Dissoziations-Inhibitions (GDI) Effekt wurde bisher erfolgreich für die Quantifizierung der Effektorinteraktion mit Ras (Herrmann et al., 1995, 1996), Cdc42 (Rudolph et al., 1998) und Rac Proteinen (Haeusler et al., 2003; Fiegen et al., 2004) eingesetzt. Für einen qualitativen Interaktionsnachweis zwischen Rho-GTPasen und Plexin-GBDs wurden RhoA, Rac1 und Cdc42 mit mant-GppNHp beladen und mit einer Konzentration von 0,2 µM eingesetzt. Der Effekt der Inhibition der Nukleotiddissoziation sollte bei einem 10- fachen Überschuss der jeweiligen Plexin-GBD (B1, C1 und D1) sichtbar sein. Die Reaktion wurde durch die Zugabe eines 50-fachen Überschusses an GppNHp gestartet. Dies führt zu der Freisetzung des fluoreszenzmarkierten Nukleotids und damit zu einem Intensitätsabfall. Die für die qualitative Interaktionsbestimmung zwischen RhoA·GppNHp, Rac1·GppNHp und Cdc42·GppNHp sowie PlexinB1, C1 und D1 GBD als Bindungspartner durchgeführten Messungen sind in Abbildung 4.11 dargestellt. Es konnte in keiner der Messungen ein Hinweis auf eine Interaktion gefunden werden (5.1.2).

______81 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

A) RhoA B) Rac1 1 RhoA mGppNHp + 1 Rac1 mGppNHp + mGppNHp Plexin C1 mGppNHp Plexin C1 GBD GBD RhoA RhoA Rac1 Rac1 mGppNHp + mGppNHp + mGppNHp + mGppNHp + Plexin B1 Plexin D1 Plexin B1 Plexin D1 GBD GBD GBD GBD

0,8 0,8 rel. Fluoreszenz rel. rel. Fluoreszenz rel.

0,6 0,6

0,4 0,4 0 20000 40000 60000 80000 100000 0 10000 20000 30000 40000 50000 Zeit (sec) Zeit (sec)

Cdc42 C) 1 Cdc42 mGppNHp + mGppNHp Plexin C1 GBD Cdc42 Cdc42 mGppNHp + GppNHp + Plexin B1 Plexin D1 GBD GBD 0,8 rel. Fluoreszenz rel.

0,6

0,4 0 10000 20000 30000 40000 50000 Zeit (sec)

Abb. 4.11: GDI Experiment für Plexin GBDs mit RhoA, Rac1 und Cdc42. Die Messungen erfolgten mit 0,2 µM GTPase und einem 10-fachen Überschuss Plexin GBD (2 µM). Die Reaktion wurde durch die Zugabe eines 50-fachen Überschusses GppNHp (10 µM) gestartet. A) RhoA·mantGppNHp B) Rac1·mantGppNHp C) Cdc42·mantGppNHp.

4.2.4.4 Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)

Da nach den zuvor durchgeführten Experimenten vermutet wurde, dass es sich bei der GTPase-GBD Interaktion um eine niedrigaffine Bindung handelt, wurden ITC-Messungen durchgeführt. Dazu wurde zunächst eine 500 µM PlexinB1-GBD-Lösung gegen Puffer titriert (siehe Abb. 4.12). Dabei zeigte sich, was zuvor schon anhand von analytischen Gelfiltrationen vermutet wurde, dass die PlexinB1-GBD als Dimer vorliegt. Hierdurch war der Versuchsaufbau für eine Interaktionsbestimmung mit den verschiedenen Rho-GTPasen vorgegeben. PlexinB1-GBD wurde mit einer Konzentration von 50 µM in der Messzelle vorgelegt und mit einer 500 µM Lösung der GTPasen titriert. Die so erhaltenen

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 82 ERGEBNISSE ______

ITC-Thermogramme und thermodynamischen Parameter sind in Abbildung 4.13 dargestellt bzw. in Tabelle 4-3 zusammengefasst.

t (min) Abb. 4.12: ITC-Dissoziationsmessung von Plexin B1 0 30 60 90 120 150 GBD. Titration von 500 µM Plexin B1 GBD aus der Spritze 0,2 gegen Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,5 und 2 mM MgCl2) in

0,1 der Messzelle. Die Anpassung der Daten an eine Dissoziationsgleichung liefert: K = 325 µM und ∆H°= 8,6 0,0 kcal/mol. Die Messung erfolgte bei 20°C. µcal/sec

-0,1

1,5

1,0

kcal/mol 0,5

0,0 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 Äquivalente Monomer Konzentration

t (min) t (min) t (min) 0306090120150 0306090120150 0306090120150

0,0 0,0 0,0

-0,2 -0,2 -0,2

-0,4 -0,4 -0,4

-0,6 -0,6 -0,6 µcal/sec µcal/sec µcal/sec

-0,8 -0,8 -0,8

-1,0 -1,00 -1,0

0 0

-2 -2 -2

-4 -4 kcal/mol kcal/mol kcal/mol -4 -6 -6

-8 -6 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Molares Verhältnis (B1 GBD/Rac1Q61L) Molares Verhätnis (B1 GBD/Rnd1∆NC) Molares Verhältnis (B1 GBD/Rnd3∆NC)

Abb. 4.13: ITC-Experiment der Bindung von Plexin B1 GBD an GTPasen der Rho- Familie. Alle Messungen erfolgten bei 20°C und in Puffer bestehend aus 20 mM Tris/HCl, pH 7,5 und 2 mM MgCl2. A) Titration von 50 µM PlexinB1 GBD in der Messzelle mit 500 µM Rac1(Q61L)·GTP aus der Spritze. Eine Anpassung der Daten an Gleichung 3-10 liefert: Ka = 7,47·104 M-1, ∆H° = -9,0 kcal/mol und n = 0,69. B) Titration von 50 µM Plexin B1 GBD in der Messzelle mit 500 µM Rnd1·GTP aus der Spritze. Eine Anpassung der Daten an Gleichung 3-10 4 -1 liefert: Ka = 8,21·10 M , ∆H° = -7,7 kcal/mol und n = 1,0. C) Titration von 50 µM Plexin B1 GBD in der Messzelle mit 500 µM Rnd3·GTP aus der Spritze. Eine Anpassung der Daten an Gleichung 3- 4 -1 10 liefert: Ka = 9,73·10 M , ∆H° = -6,6 kcal/mol und n = 0,62.

______83 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Es konnte für Rac1(Q61L), Rnd1 und Rnd3 eine Bindung an die PlexinB1-GBD gezeigt werden. Die Anzahl der Bindungsstellen (n) liegt in der Nähe von 1. Dies zeigt, dass sowohl das Protein in der Probenzelle (PlexinB1-GBD) als auch die GTPasen in der Spritze während der gesamten Messung aktiv bleiben und nicht oder nur gering präzipitieren. Die Assoziation der PlexinB1-GBD an die Rho-GTPasen ist durch energetisch günstige Enthalpieänderungen getrieben (negative ∆H°-Werte) und im Fall von Rac1(Q61L) bzw.

Rnd1 entropisch ungünstig (negative T∆S°-Werte). Die Bindung kann mit KD-Werten im mikrokolaren Bereich als niedrigaffin angesehen werden. Weiterhin unterscheiden sich die Bindungskonstanten für die drei GTPasen nur unwesentlich. Für Rac1·GDP bzw. GppNHp, RhoA·GppNHp, Cdc42·GppNHp und TC10·GppNHp konnte mit dieser Methode keine Bindung nachgewiesen werden (5.1.2)

Tab. 4.3: ITC-Messungen der Bindung von Plexin B1 GBD an Rho-GTPasen

Protein n Kd (µM) ∆G° (kcal/mol) ∆H° (kcal/mol) T∆S° (kcal/mol) Rac1(Q61L) GTP 0,69 13,4 -6,537 -9,000 -2,463 Rac1 GDP keine Bindung Rac1 GppNHp keine Bindung Rnd1 1,01 12,0 -6,592 -7,650 -1,058 Rnd3 0,62 10,3 -6,693 -6,565 0,128 RhoA GppNHp keine Bindung Cdc42 GppNHp keine Bindung TC10 GppNHp keine Bindung

4.2.5 Kristallisation von PlexinB1-GBD mit Rnd1

Die GBD von PlexinB1 wurde äquimolar mit Rnd1·GTP gemischt und mit Kristallisationspuffer auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml eingestellt. Die Kristallisation erfolgte unter Verwendung der Methode des hängenden Tropfens. Die unter 3.1.11 aufgeführten Bedingungen wurden bei 20°C ausgetestet. Keine der getesteten Bedingungen führte zu Kristallen.

4.3 Zytoplasmatische Domänen (CPD) der Plexine

Neben den GBDs der Plexine wurde versucht, die vollständigen CPDs sowohl biochemisch als auch kristallographisch zu charakterisieren. Hierfür ist es häufig nötig nach stabilen kleineren Proteinfragmenten zu suchen und so einzelne Subdomänen zu charakterisieren. Die

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 84 ERGEBNISSE ______in dieser Arbeit verwendeten bzw. hergestellten Proteinfragmente der CPDs der Plexine A2, B1 und B2 sind in Abbildung 4.14 graphisch dargestellt.

Abb. 4.14: Übersicht über die verwendeten cytoplasmatischen Proteinfragmente der Plexine. Die Zahlen geben die N- und C-terminale Aminosäure des verwendeten Fragmentes an.

Die verkürzten Konstrukte von Plexin B1 wurden auf der Basis von Sequenzvergleichen zu R-RasGAP und durch Sekundärstrukturvorhersagen (JPred, Expasy) hergestellt. Da die GBD- Fragmente eine hohe Stabilität zeigten, wurde diese Information ebenfalls dazu verwendet neue Fragmente herzustellen (N0C4 und N4C2). Diese Fragmente enthalten dann entweder die N- bzw. C-terminal GAP-homologe Region sowie die GBD.

4.3.1 Klonierung und Expression in E. coli

Um die verschiedenen zytoplasmatischen Proteinfragmente biochemisch und/oder kristallographisch charakterisieren zu können, mussten diese rekombinant in E. coli exprimiert werden. Die verwendeten Konstrukte wurden mittels PCR (3.2.10), Restriktion (3.2.6) und Ligation (3.2.9) ausgehend von vorhandenen Konstrukten kloniert. Die Expression der Proteinfragmente erfolgte im Fall der pGEX-Vektoren als GST- Fusionsprotein bzw. als 6xHis-Fusionsprotein bei den pQE-Vektoren. Die

______85 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Expressionsbedingungen wurden zunächst durch Variation der Temperatur und der IPTG- Konzentration optimiert und waren je nach Konstrukt sehr verschieden. Für die CPD-Fragmente von Plexin A2, B1 und B2 erwiesen sich die Standardbedingungen als optimal, so dass die Kulturen bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6 inkubiert und dann durch Zugabe von 0,3 mM IPTG induziert wurden. Nach einer Inkubation über Nacht bei 30°C in einem Schüttelinkubator (150-170 rpm) wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert. Allerdings war die Überexpression dieser Proteine trotz akzeptabler Löslichkeit nur gering. Die übrigen Konstrukte (N0C4, N1C1, N2C2, N4C2, N3C3 und ∆GBD) zeigten unter keiner der getesteten Bedingungen eine gute Überexpression. Auch ihre Löslichkeit war in vielen Fällen nur gering.

4.3.2 Reinigung der CPDs aus E. coli

Die Reinigung der zytoplasmatischen Fragmente erfolgte entweder über einen N-terminalen GST-Tag (pGEX-Vektoren), oder über einen N-terminalen 6xHis-Tag. Für die CPD- Fragmente war eine Reinigung über den His-Tag nötig, da die entsprechenden GST- Fusionsproteine nicht in ausreichender Qualität isoliert werden konnten. Die Reinigung von 6xHis-PlexinA2-CPD aus E. coli ist in Abbildung 4.15 exemplarisch dargestellt. Nach dem präparativen Aufschluss der Bakterienzellen (3.4.4) wurden die Zellfragmente sedimentiert. Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA-Agarose-Säule aufgetragen (3.4.6.2), wodurch ein Großteil der Verunreinigungen abgetrennt werden konnte. Die sich anschließende Elution (Abb. 4.15B) zeigte, dass PlexinA2-CPD schon bei sehr geringen Imidazolkonzentrationen und über einen breiten Bereich eluiert (50-210 mM). Die relativ starke Verunreinigung oberhalb von 66 kDa konnte durch die folgende Gelfiltration (3.4.8) abgetrennt werden (Abb. 4.15B/C). Dies war für die Verunreinigung bei etwa 24 kDa nicht möglich. Hierbei könnte es sich auch um ein Abbauprodukt der CPD handeln, da der N- Terminus und der C-Terminus miteinander interagieren (4.3.3). Der Western-Blot in Abbildung 4.15D zeigt, dass tatsächlich eine Degradation des Proteins stattfindet, wie an der Bande bei etwa 36 kDa zu erkennen ist. Es wurden weitere Reinigungsverfahren wie z.B. Ionenaustauschchromatographie (3.4.7) getestet, allerdings führten sie zu keiner Verbesserung der Proteinqualität. So waren die Verunreinigungen bzw. die Abbauprodukte bei 36 und 24 kDa mit keiner der verwendeten Methoden vom Protein (66 kDa) abtrennbar. Schon bei den ersten Reinigungsversuchen der CPDs zeigte sich eine Salzabhängigkeit bezüglich der Löslichkeit der Proteine. Geringe Salzkonzentrationen führten zu einer Präzipitation des Proteins, so dass während der gesamten Reinigung mit mindestens 300 mM ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 86 ERGEBNISSE ______

NaCl im Puffer gearbeitet wurde. Die Reinheit (>90%) und Ausbeute (~6mg/l Kultur) von PlexinA2 CPD war nicht optimal (Abb. 4.16A). Es wurde dennoch für erste biochemische und kristallographische Experimente eingesetzt.

A) B)

C) D)

Abb. 4.15: Exemplarische Reinigung von Plexin A2 CPD. A) Aufschluss und Reinigung mittels Ni-NTA-Sepharose Säule. 1 Gesamtprotein nach Zellaufschluss; 2 Sediment nach Zentrifugation; 3 Überstand nach Zentrifugation; 4 Durchfluss Affinitätschromatographie; 5 Durchfluss Hochsalzwaschschritt; 6 Durchfluss nach Hochsalz B) Elution der Ni-NTA Sepharose Säule mit Imidazolgradient von 0 – 250 mM. Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an. C) Gelfiltration; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an. D) Western-Blot der Reinigung 1 Gesamtprotein; 2 Sediment nach Zentrifugation; 3 Überstand nach Zentrifugation; 4 Durchfluss; 5 Protein (2,5 µg) nach Elution; 6 Protein (5 µg) nach Elution.

PlexinB1-CPD konnte ebenfalls aus E. coli rekombinant gewonnen und gereinigt werden. Dieses Protein war aber instabil und präzipitierte innerhalb kürzester Zeit nahezu vollständig. Da sich die Expression und Reinigung der größeren zytoplasmatischen Fragmente aus E. coli schwierig gestaltete, eine Aussage über eine korrekte Faltung der Proteine nicht möglich war und ein geeigneter Aktivitätstest nicht zur Verfügung stand, wurden später die CPDs in einem Insektenzellsystem hergestellt (4.3.4 und 4.3.5).

______87 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

4.3.3 α-Chymotrypsin Proteolyse von PlexinA2-CPD

Da flexible Regionen in Proteinen für die Kristallisation häufig hinderlich sind, wurde das rekombinant hergestellte PlexinA2-CPD Protein mit α-Chymotrypsin und ProteinaseK behandelt. Hierzu wurden zunächst verschiedene Proteolysebedingungen ausgetestet. So wurden die Temperatur (8°C und 25°C) und die Inkubationszeit der Proteolyse (2h, 4h, 6h, 12h und 4d) variiert. Der Verlauf der Proteolyse von PlexinA2-CPD mit α-Chymotrypsin und die anschließende Reinigung sind in Abbildung 4.16 exemplarisch dargestellt.

A) B) C)

Abb. 4.16: α-Chymotrypsin Proteolyse von Plexin A2 CPD. A) Zeitlicher Verlauf der Proteolyse mit α-Chymotrypsin bei 8°C. 1 Plexin A2 CPD nach der Reinigung; 2 Proteolyse mit α-Chymotrypsin (Verhältnis 1:3600) nach 3h bei 8°C; 3 Proteolyse mit α-Chymotrypsin (Verhältnis 1:3600) nach 12h bei 8°C; B) Ionenaustauscherchromatographie, Q-Sepharose, Gradient 50-500 mM NaCl; Ch Chymotrypsin behandeltes Plexin A2 CPD Protein vor der Q-Sepharose; D Durchfluss beim Probenauftrag; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an. C) Gelfiltration; Sephadex S200; vor Proteinqualität nach der Q-Sepharose und vor der Gelfiltration; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an.

Optimale Bedingungen für die α-Chymotrypsin-Behandlung von PlexinA2-CPD waren ein Protein-Protease Verhältnis von 1:3600, bei einer Inkubation von drei Stunden und 8°C. Die Bedingungen für ProteinaseK waren vergleichbar. Das Ausgangsprotein war hier nach etwa sechs Stunden vollständig verdaut. Um die Reaktion zu beenden, wurden die α-Chymotrypsin spezifischen Proteaseinhibitoren Aprotinin und Pefabloc im Verhältnis 1:100 zugegeben. Um die entstandenen Fragmente (35 kDa, 30 kDa und 24 kDa laut Gel) voneinander zu trennen, wurden verschiedene chromatographische Reinigungsschritte getestet. Allerdings war eine Trennung weder durch Ionenaustauscherchromatographie noch durch Gelfiltration möglich, so dass hier ein hochaffiner Komplex vorliegen muss. Die Analyse der Fragmente der α-Chymotrypsin Behandlung mittels Western-Blot (Abb. 4.21B) zeigte, dass der 6xHis- Tag im 36 kDa Fragment enthalten ist. Folglich muss eine der kleineren Banden (30 kDa oder 24 kDa) dem C-terminalen Fragment der CPD entsprechen. Weiterhin lässt sich aus diesen

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 88 ERGEBNISSE ______

Daten schlussfolgern, dass der N- und der C-Terminus der CPD von PlexinA2 miteinander interagieren (5.1.3).

Abb. 4.17: Massenspektroskopische Analyse der α-Chymotrypsin behandelten PlexinA2-CPD.

Die erhaltenen Fragmente wurden massenspektroskopisch untersucht (Abb. 4.17), wobei vier Maxima erhalten wurden. Das Maximum entspricht dem größten erhaltenen Fragment und enthält den N-Terminus mit einem Molekulargewicht von 36955 Da. Die kleineren Maxima haben Molekulargewichte von 30840, 30525 und 20927 Da. Das N-terminale Fragment enthält folglich den 6xHis-Tag und geht voraussichtlich bis zu Aminosäure I1607. Über die anderen Fragmente ist auf der Basis der hier zur Verfügung stehenden Daten keine vergleichbare Aussage möglich.

4.3.4 Klonierung und Expression der CPDs in Insektenzellen

Da die Qualität der rekombinant in E. Coli hergestellten CPD Proteine nicht zufriedenstellend war und vermutet wurde, dass die Proteine nicht richtig gefaltet sein könnten, wurden die CPD-Fragmente für ein Insektenzellsystem (Sf21) vorbereitet. Dazu wurden die vorhandenen

______89 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Konstrukte der zytoplasmatischen Domänen von PlexinA2, B1 und B2 mittels Restriktion (3.2.6) und Ligation (3.2.9) kloniert. Nach der erfolgreichen Klonierung in pFastBac-Vektoren erfolgte die Rekombination in das Bacmid (3.2.5). Bacmid-DNA wurde anschließend isoliert (3.2.5) und in Sf21-Zellen transfiziert (3.3.2). Nach einer ersten Virusamplifikation (3.3.4) wurde die Expression der Proteine mittels Western-Blot (3.4.13) überprüft. Nach weiteren Virusamplifikationen in ansteigenden Volumina erfolgte die Bestimmung des Virustiters (3.3.3). Die Expressionen erfolgten dann in 500 ml – 2 l Medium, je nach Bedarf und Expression des Proteins. Nach einer Inkubation über drei bis vier Tage in einem Schüttelinkubator wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert. Der Zellaufschluss erfolgte wie unter 3.4.5 beschrieben. Die CPD-Fragmente von PlexinA2 und B1 zeigten eine gute Überexpression in diesem eukaryotischen System, während die Expression von Plexin B2 nur gering war.

4.3.5 Reinigung der PlexinA2, B1 und B2 CPDs aus Insektenzellen

Die Reinigung der CPD-Proteine erfolgte über den N-terminalen 6xHis-Tag und ist für 6xHis- PlexinB1-CPD in Abbildung 4.18 exemplarisch dargestellt. Nach dem präparativen Aufschluss der Insektenzellen (3.4.5) wurden die Zellfragmente sedimentiert. Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA-Agarose-Säule aufgetragen (3.4.6.2), wodurch ein Großteil der Verunreinigungen abgetrennt werden konnte. Die sich anschließende Elution (Abb. 4.15A) zeigte, dass PlexinB1 CPD bei Imidazolkonzentrationen zwischen 30 mM und 60 mM eluiert. Die Proteinreinheit war nach diesem ersten Reinigungsschritt schon besser als die des in E. coli hergestellten Proteins am Ende der Reinigung. Kleinere Verunreinigungen konnten durch die folgende Gelfiltration (3.4.8) abgetrennt werden (Abb. 4.18B). Das Abbauprodukt bei 36 kDa konnte aber auch hier nicht vom full length-Protein abgetrennt werden, wie ein Western- Blot zeigte. Es wurden weitere Reinigungsverfahren wie z.B. Ionenaustauschchromatographie (3.4.7) getestet, allerdings führten sie zu keiner Verbesserung der Proteinqualität. So waren die Abbauprodukte bei 36 und 24 kDa mit keiner der verwendeten Methoden vom Protein (~66 kDa) abtrennbar.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 90 ERGEBNISSE ______

A) B)

C) Abb. 4.18: Exemplarische Reinigung von PlexinB1 CPD aus Sf21-Zellen. A Aufschluss und Reinigung mittels Ni-NTA-Sepharose Säule. G Gesamtprotein nach Zellaufschluss; Ü Überstand nach Zentrifugation; P Sediment nach Zentrifugation; D Durchfluss Affinitätschromatographie; Zahlen Elution der Ni-NTA Sepharose Säule mit Imidazolgradient von 0 – 250 mM. Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an. B Gelfiltration; Sephadex S200; Die Zahlen geben die aufgetragenen Fraktionen an. C Reinheit der verwendeten cytoplasmatischen Domänen von 1 PlexinA2 und 2 PlexinB1.

Im Fall von PlexinB1 CPD konnten ungefähr 15mg reines (>95%) Protein pro Liter Kultur erhalten werden. Diese Ausbeute ist für ein eukaryotisches Expressionssystem erstaunlich hoch. PlexinA2-CPD konnte unter sehr ähnlichen Bedingungen und in vergleichbarer Ausbeute aus Insektenzellen isoliert werden. PlexinB2 CPD hingegen wurde in nur geringen Mengen exprimiert, so dass hier nur etwa 0,5 – 1 mg reines Protein pro Liter Kultur erhalten wurden. Die in Insektenzellen exprimierten CPD-Proteine zeigten insgesamt bessere Eigenschaften (Reinheit, Löslichkeit und Stabilität) als die aus E. coli erhaltenen Proteine.

4.3.6 Kristallisation der CPDs

Für die Kristallisation der CPDs wurden die aus E. coli erhaltenen Proteine 6xHisPlexinA2 CPD, GST-PlexinA2 CPD, 6xHisPlexinB1 CPD und GST-PlexinB1 CPD, sowie die mit α- Chymotrypsin verdauten Fragmente von PlexinA2 CPD eingesetzt. Nach der Etablierung der Reinigung von PlexinA2 und B1 CPD aus Insektenzellen wurden auch diese Proteine zur Kristallisation verwendet. Alle Proteine wurden nach der Proteinreinigung auf 10-20 mg/ml konzentriert und in Kristallisationpuffer (20 Tris/HCl, pH 7,5, 150 - 300 mM NaCl und 2mM DTT) überführt. Die Kristallisation erfolgte sowohl unter Verwendung der Methode des hängenden als auch des sitzenden Tropfens. Die unter 3.1.11 aufgeführten Bedingungen wurden unter Variation der Proteinkonzentration (5 mg/ml, 10 mg/ml und 20 mg/ml) und der Temperatur (4°C, 12°C und 20°C) ausgetestet. ______91 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Für das aus Insektenzellen gereinigte PlexinB1 CPD Protein konnten mittels des Indexscreens (Hampton Research, Bedingungen F9, G5 und H10) initiale Kristallisationbedingungen erhalten werden (Abb. 4.19A). Diesen Bedingungen war eine hohe PEG 3350 Konzentration (20 - 25%) gemeinsam, während die Salzart verschieden war (Ammoniumsulfat, Lithiumsulfat und Natriumcitrat). Diese initialen Bedingungen mussten weiter optimiert werden, da es sich zunächst um sehr dünne Nadeln handelte. Durch Zinkchlorid als Additiv konnte die Nukleationsrate erhöht werden. Durch das wiederholte Aussähen von Kristallisationkeimen (Seeding) bei niedrigeren PEG3350 Konzentrationen konnten die Bedingungen weiter optimiert werden (Abb. 4.19B). Erste Diffraktionstests unter verschiedenen kryogenen Bedingungen zeigten jedoch keine Diffraktion.

Abb. 4.19: Kristalle von Plexin B1 CPD. A Initiale Bedingung des Hampton Research Indexscreens. B Optimierte Bedingung nach Seeding bei 25-facher Vergrößerung

Im Fall des in E. coli hergestellten PlexinA2-CPD Proteins wurde nach etwa acht Wochen ein einzelner Kristall erhalten, der auch reproduziert werden konnte (4.3.7.1). Aufgrund der langen Inkubationszeit wurde vermutet, dass es sich hierbei um ein Abbaufragment von PlexinA2 handeln könnte. Trotz eingehender Analyse der Kristalle (4.3.7.2) konnte dies nicht verifiziert werden. Die Strukturaufklärung dieser Kristalle (4.3.7.6) zeigte später, dass hier nicht ein Fragment von PlexinA2 kristallisierte, sondern eine Verunreinigung durch das Hsp31 Chaperonprotein.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 92 ERGEBNISSE ______

4.3.7 Kristallstruktur von Hsp31

4.3.7.1 Kristallisationsbedingung

Unter Verwendung des aus E. coli gereinigten PlexinA2-CPD Proteins kristallisierte, wie später die Strukturaufklärung zeigte, das Hsp31 Protein statt des Plexins. Die Bedingung hierfür wurde aus dem Crystal Screen II (Hampton Research) unter Verwendung der Methode des hängenden Tropfens erhalten. Die ersten Kristalle wuchsen in Bedingung Nr. 14 (2 M Ammoniumsulfat, 200 mM Na/K-Tartrat und 100 mM Natriumcitrat, pH 5,6) nach etwa 8 Wochen. Unter Variation der Ammoniumsulfat-Konzentrationen konnten die Kristalle in einem Zeitraum von 8 Wochen reproduziert werden. Durch eine Erhöhung der Proteinkonzentration von 10 mg/ml auf 40 mg/ml konnte die Inkubationszeit von acht Wochen auf zwei bis vier Wochen verkürzt werden. Es wurden üblicherweise ein bis zwei Kristalle pro Tropfen erhalten (Abb. 4.20).

A B

Abb. 4.20: Kristalle von Hsp31. A Kristall bei 25-facher Vergrößerung B Im Loop aufgenommener mit K2PtCl4 derivatisierter Kristall (aufgenommen an der ESRF Synchrotronröntgenquelle ID14-EH3)

4.3.7.2 Analyse der Kristalle

Da, wie zuvor schon angedeutet, nicht eindeutig klar war, welches Protein in den Kristallen enthalten war, wurden diese biochemisch näher charakterisiert. Aufgrund der langen Inkubationszeiten lag die Vermutung nahe, dass es sich bei dem kristallisierenden Protein um ein Abbauprodukt von PlexinA2 CPD handeln könnte (Abb. 4.21). Allerdings konnte die Kristallisation einer Verunreinigung ebenfalls nicht ausgeschlossen werden. Als erstes wurden die Kristalle mittels SDS-PAGE analysiert, wodurch gezeigt werden konnte, dass tatsächlich ein kleineres Protein (~32 kDa) in den Kristallen enthalten ist (Abb. ______93 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

4.21). Eine Western-Blot Analyse der Kristalle konnte den N-terminalen 6xHis-Tag nicht nachweisen, so dass nach diesen beiden Experimente nach wie vor keine Aussage über die Art des kristallisierten Proteins gemacht werden konnte.

A) B) Abb. 4.21: SDS-PAGE/Westernblot der Hsp31-Kristalle und des Kristallisationstropfens. A SDS-PAGE des 1 Kristallisationstropfens und der 2 Kristalle B Western-Blot des 2/3 Kristallisationstropfens und der 4 Kristalle. 1 Westernblot des α-Chymotrypsin verdauten Plexin A2 CPD Proteins (sh 4.3.3) als Vergleich und Positivkontrolle.

Als nächstes wurden die Kristalle vollständig trypsinisiert und die entstandenen Fragmente massenspektroskopisch untersucht. Bei der Trypsinisierung eines Proteins entstehen proteinspezifische Fragmente, über deren Massen ein Protein eindeutig identifiziert werden kann. Durch diese Methode konnte allerdings ebenfalls keine klare Aussage über die Art des Proteins getroffen werden. Weiterhin wurde das Protein in den Kristallen einer N-terminalen Proteinsequenzierung unterzogen (Seqlab, Göttingen). Die erste Sequenzierung von sieben Aminosäuren ergab folgendes Ergebnis: X - V/I - Q/F - N/T - D/S - D/K - N/I - P. Hieraus ergeben sich 64 mögliche Sequenzen, so dass ein eindeutiger Nachweis unwahrscheinlich ist. Die erhaltene Sequenz wurde trotzdem mit der Sequenz von PlexinA2-CPD und einer E. coli Datenbank verglichen. Allerdings wie vermutet ohne eindeutiges Ergebnis. Ein zweiter Sequenzierungsversuch (fünf Aminosäuren) der gleichen Kristalle ergab dann eine N- terminale Modifizierung/Blockierung des Proteins, so dass kein Ergebnis erhalten werden konnte. Durch eine massenspektroskopische Analyse der Kristalle konnte das Molekulargewicht des kristallisierenden Proteins auf einen Bereich von 31307 - 31320 Da eingeschränkt werden (Abb. 4.22).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 94 ERGEBNISSE ______

Abb. 4.22: Massenspektroskopische Analyse der Hsp31 Kristalle. Das in den Kristallen enthaltene Protein besitzt ein Molekulargewicht von 31307-31320 Da. Gezeigt sind drei Einzelbestimmungen (rot, blau und gelb).

Trotz der diversen biochemischen Kristallanalysen konnte also keine klare Aussage über das in den Kristallen enthaltene Protein gemacht werden, so dass die Strukturaufklärung fortgesetzt wurde.

4.3.7.3 Derivatisierung der Kristalle

Für das Derivatisieren der Kristalle musste zunächst eine adäquate Aufbewahrungslösung gefunden werden, die im besten Fall auch gleichzeitig als Gefrierschutz dienen könnte. Es wurde zunächst 10% Sucrose und 5% Xylitol zur Mutterlauge hinzugegeben, was allerdings bei längeren Inkubationszeiten zu einem Streuverlust der Kristalle führte. Am Besten geeignet als Aufbewahrungs- und Gefrierschutzlösung erschien eine 2,5 M Ammoniumsulfatlösung pH 6,5. Nach einigen Derivatisierungsexperimenten und der Sammlung von Röntgendaten stellte sich allerdings heraus, dass keines der bisher erhaltenen Derivate isomorph zum nativen Datensatz war. Zu erkennen war dies vornehmlich an den sehr unterschiedlichen Zellparametern, die für die c-Achse zwischen 312 Å und 325 Å je nach Derivat variierten. Folglich wurde dann versucht, die Struktur mittels eines SAD- (Single Anomalous Dispersion) oder MAD-(Multiple Anomalous Dispersion) Ansatzes zu lösen. Dies führte aber zu keiner Lösung des Phasenproblems, da die Datenqualität nicht ausreichte. Da Malonat schon häufiger dazu verwendet wurde, Ammoniumsulfat in der Mutterlauge zu ersetzen (Holyoak et al., 2003), wurde eine 2,5 M Malonatlösung (pH 6,5) als Aufbewahrungs- und Gefrierschutzlösung getestet. Diese zeigte sich für beide Zwecke als ______95 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______bestens geeignet. Vor dem eigentlichen Derivatisierungsexperiment wurden die Kristalle für 2 Stunden in dieser Lösung aufbewahrt, um für eine vollständige Äquilibrierung zu sorgen. Hiermit wurde gewährleistet, dass alle verwendeten Kristalle möglichst gleiche Ausgangsbedingungen hatten und die Vorbehandlung nicht der Grund für spätere Isomorphieprobleme ist. Die spätere Strukturaufklärung unter diesen Bedingungen zeigte, dass der Wechsel zur Malonatlösung tatsächlich zu einer besseren Isomorphie der Kristalle führte (siehe 5.1.4). Tabelle 4.4 zeigt die zur Strukturaufklärung verwendeten Kristallderivate und unter welchen Bedingungen die Derivatisierung erfolgte. Neben den in Tabelle 4.4 aufgeführten

Verbindungen wurden noch eine Reihe weiterer Verbindungen getestet (GdCl, EuCl3,

KAuCN, LaCl3, AuCl3, SmCl3 und PbAcetat), die allerdings entweder nicht zur Strukturaufklärung beitrugen oder als Derivat nicht brauchbar waren.

Tab. 4.4: Derivatisierung der Hsp31 Kristalle

Kristall HgCl2 I2/KI PCMBS K2PtCl4 TAMM Konzentration (mM) 2,5 200/100 2,5 10 1 Zeit (min) 150 2 30 360 600 "Backsoaked " ja nein ja nein nein

4.3.7.4 Datenaufnahme und -prozessierung der Hsp31-Kristalle

Zur Datensammlung bei 100 K an den DESY Röntgenquellen BW-7A und BW-7B wurden die nativen und derivatisierten Kristalle in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Einige der verwendeten Messparameter sind in Tabelle 4.5 zusammengefasst. Die maximale Auflösung des nativen Datensatzes betrug 2,10 Å. Besonders berücksichtigt wurde bei der Datensammlung die ungewöhnlich lange c-Achse der Einheitszelle, da hierdurch die maximal mögliche Auflösung der Kristalle unter den gegebenen Messbedingungen eingeschränkt wurde. Ein weiteres wichtiges Kriterium für die Datensammlung war eine hohe Redundanz der Daten. Die Wellenlänge der Röntgenquelle wurde basierend auf den Eigenschaften des jeweiligen Derivats und eines Fluoreszenzscans so gewählt, dass das anomale Signal möglichst groß war und somit für die Strukturaufklärung verwendet werden konnte. Sämtliche erhaltenen Datensätze wurden mit XDS (Kabsch, 1993) prozessiert. Die Indizierung der Daten zeigte ein primitiv hexagonales Gitter (P622). Da jeder zweite Reflex auf der l-Achse systematisch abwesend war, wurde das Vorliegen einer Schraubenachse vermutet. Da hier sowohl P6(1)22 als auch P6(5)22 in Betracht kamen, wurden beide

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 96 ERGEBNISSE ______möglichen Raumgruppen im multiplen isomorphen Ersatz berücksichtigt. Die Raumgruppe P6(5)22 konnte durch die Lösung des multiplen isomorphen Ersatzes bestätigt werden.

Tab. 4.5: Datenaufnahme des nativen und der Derivatdatensätze

Kristall nativ HgCl2 I2/KI PCMBS K2PtCl4 TAMM Anzahl der Bilder 151 518 200 400 166/115 63/340 MAR345 MARCCD MAR345 MARCCD MARCCD MARCCD Detektor (165mm) (165mm) (165mm) (165mm) DESY DESY DESY DESY DESY DESY Röntgenquelle BW7A BW7B BW7A BW7B BW7B BW7B Wellenlänge (λ, D) 0,8414 1,0064 0,8414 1,0056 1,072 1,0056 Anzahl der Oszillationen 1 1 1111 Startwinkel (ϕ, °) 0 0 0 0 90/45 0/24 Endwinkel (ϕ, °) 45,3 207,2 80 160 156,4/91 25,2/160 Winkel pro Bild (°) 0,3 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Detektor-Abstand (mm) 400 250 430 250 250 250 Maximale Auflösung (D) 2,1 3,23 2,6 3,24 3,45 3,3

14

12 log()

10 0 0,02 0,04 sin2(θ)/λ 2

Abb. 4.23: Wilsondiagramm des nativen Hsp31-Datensatz. Die Abbildung zeigt die Intensitätsverteilung (log()) in Abhängigkeit von der Auflösung (19,4 - 2,1 Å) in Einheiten von sin2 ()θ / λ2 .

Das Wilsondiagramm des nativen·Datensatzes ist in Abb. 4.23 mit einem Auflösungsbereich von 19,41 – 2.10 Å dargestellt. Die Auflösung ist in Einheiten von sin2 ()θ / λ2 aufgetragen, mit λ (Wellenlänge des Röntgenlichts) und θ als Beugungswinkel. Nach linearer Regression ergibt sich aus dem y-Achsenabschnitt der Skalierungsfaktor des Datensatzes (13,6). Aus der Steigung der Geraden erhält man den mittleren Temperaturfaktor (B = 27 Å2). Tabelle 4.6 fasst die wesentlichen Kristallparameter und die Statistik der Datenprozessierung zusammen.

______97 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Alle Datensätze zeigen ein sehr hohes Signal/Rausch-Verhältnis in der äußeren Schale, da aufgrund der langen Zellachse, nicht die gesamte Auflösung der Kristalle verwendet werden konnte.

Tab. 4.6: Datenprozessierung des nativen und der Derivatdatensätze

Kristall nativ HgCl2 I2/KI Raumgruppe P6(5)22 / Nr. 179 P6(5)22 / Nr. 179 P6(5)22 / Nr. 179 Einheitszelle (D) a=b=52,98 c=313,64 a=b=52,88 c=315,2 a=b=52,90 c=313,01 α=β=90° γ=120° α=β=90° γ=120° α=β=90° γ=120° Auflösungbereich (D) 19,41-2,10 27,82 - 3,23 14,99 - 2,60 Zahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 83473 / 16354 103615 / 7919 80312 / 15012 Redundanz (-fach) 5,1 13,1 5,3 Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 4,2 / 11,1 5,7 / 15,8 4,5 / 13,0 Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 98,9 / 98,9 98,9 / 89,3 98,7 / 97,3 Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 26,2 / 13,5 43,5 / 14,8 29,1 / 11,3

Kristall PCMBS K2PtCl4 TAMM Raumgruppe P6(5)22 / Nr. 179 P6(5)22 / Nr. 179 P6(5)22 / Nr. 179 Einheitszelle (D) a=b=53,14 c=314,82 a=b=52,98 c=314,75 a=b=52,88 c=314,95 α=β=90° γ=120° α=β=90° γ=120° α=β=90° γ=120° Auflösungbereich (D) 27,85 - 3,24 27,81 - 3,45 27,81 - 3,23 Zahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 80258 / 7944 46530 / 6539 77109 / 7442 Redundanz (-fach) 10,1 7,1 10,4 Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 4,3 / 10,0 4,4 / 12,8 5,7 / 12,4 Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 99,2 / 91,9 99,0 / 92,5 99,4 / 99,8 Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 44,41 / 18,03 37,29 / 12,77 36,63 / 18,29

Das Zellvolumen liegt in diesem Fall bei 762702 Å3. Das Molekulargewicht des in den Kristallen enthaltenen Proteins war aufgrund der massenspektroskopischen Analyse bekannt und beträgt 31,3 kDa. Aufgrund der vorliegenden hexagonalen Symmetrie ist die Einheitszelle aus 12 asymmetrischen Einheiten aufgebaut. Mit einem Molekül pro asymmetrischer Einheit ergibt sich ein Matthews Koeffizient von 2,0 Å3/Da und ein Solvensanteil von 39%.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 98 ERGEBNISSE ______

4.3.7.5 Multipler isomorpher Ersatz (MIR) von Hsp31

Als erster Schritt für den multiplen isomorphen Ersatz mussten die aufgenommenen Datensätze gegen den nativen Datensatz skaliert werden. Dies erfolgte durch Programme des CCP4 Pakets (CCP4, 1994). Aufgrund der zusätzlichen Schweratome im Kristall verändern sich die Amplituden der Schweratomdatensätze relativ zum nativen Datensatz. Quantitativ gibt der Rscale diese Unterschiede wieder, so dass er als Indikator für Isomorphie und Qualität des jeweiligen Derivats dienen kann (Tab. 4.7).

Tab. 4.7: Ausgewählte Parameter der Datensätze im Vergleich

Kristall HgCl2 I2/KI PCMBS K2PtCl4 TAMM

RScale (%, alle Reflexe) 28,3 13,9 20,0 16,3 25,0 Auflösungbereich (D) 27,82 - 3,23 14,99 - 2,60 27,85 - 3,24 27,81 - 3,45 27,81 - 3,23 Anzahl der Schweratome26212 R (%, zentrische Reflexe) 68 69 59 69 66 anomales Signal (%) 123121412

Die Phasenbestimmung erfolgte mit dem Programmpaket Solve/Resolve (Terwilliger, 1999; Terwilliger & Berendzen, 1999). Solve wurde für die Bestimmung der Schweratomparameter und deren Verfeinerung verwendet. Hierbei wurden alle Derivate gleichzeitig benutzt und die Auflösung iterativ (3.0 Å, 2,5 Å und 2,1 Å) erhöht. Die Anzahl der gefundenen Schweratome und deren verfeinerte Parameter sind in den Tabellen 4.7 bzw. 4.8 wiedergegeben. In allen fünf Derivaten wurden die anomalen Differenzen für die Lokalisierung der Schweratome, aber nicht für die Verfeinerung der Schweratomparameter verwendet. Drei der Schweratome in Tabelle 4.8 zeigen einen Temperaturfaktor von 1 und eine niedrige Besetzung (Occ). Diese wurden nur der Vollständigkeit halber aufgeführt und haben wahrscheinlich keinen nennenswerten Beitrag zur Strukturaufklärung. Die mittlere Figure of Merit (FOM), wie sie in Tabelle 4.9 aufgeführt ist, kann als Maßstab für die Qualität der erhaltenen Elektronendichte angesehen werden. Nach Solve betrug sie für den gesamten Auflösungsbereich 0,3. Für den Auflösungsbereich, in dem Schweratominformation vorhanden war (bis 2,6Å), betrug die mittlere FOM hingegen 0,55. Der letzte Schritt der Phasenbestimmung in Solve erfolgte mit der gesamten zur Verfügung stehenden Auflösung, da diese im nächsten Schritt für die Dichtemodifikation und Phasenerweiterung mittels Resolve eingesetzt wurde. Durch Resolve konnte, wie an den FOM-Werten in Tabelle 4.9 zu erkennen ist, die Qualität der Phaseninformation verbessert werden. Hinzu kam die Phasenerweiterung bis 2,1 Å, so dass für die nachfolgende

______99 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Elektronendichteinterpretation auch der höhere Auflösungsbereich zur Verfügung stand. Die mittlere FOM betrug nach Resolve 0,64 für den gesamten Auflösungsbereich. Die berechneten Elektronendichtekarten zeigten klare Sekundärstrukturelemente, sowie Seitenketteninformation in vielen Bereichen.

Tab. 4.8: Verfeinerte Schweratomparameter der Derivate Parameter X Y Z B Occ

HgCl2 #1 0,2207 0,3263 0,0053 24,3 0,67 #2 0,3332 0,4028 0,0057 1 0,05

I2/KI #1 0,1334 0,8668 0,0831 18,1 0,17 #2 0,2708 0,8691 0,0488 39,3 0,29 #3 0,3627 0,0962 0,0584 13,5 0,18 #4 0,2495 0,1052 0,0398 53,2 0,23 #5 0,3080 0,8531 0,0748 31,8 0,19 #6 0,6137 0,9423 0,0505 14,7 0,17 PCMBS #1 0,2308 0,3266 0,0043 34,3 0,55 #2 0,8789 0,8821 0,0157 1 0,02

K2PtCl4 #1 0,0221 0,5754 0,0756 60 0,63 TAMM #1 0,2229 0,3248 0,0054 25,0 0,71 #2 0,5554 0,5740 0,0284 1 0,004

Tab. 4.9: Mittlere Figure of Merit (FOM) in Abhängigkeit von der Auflösung Solve Auflösung (D) Gesamt 7,51 4,76 3,72 3,16 2,79 2,53 2,33 2,17 Anzahl Reflexe 16245 829 1391 1764 2018 2266 2483 2695 2799 FOM 0,30 0.83 0.81 0.70 0.45 0.34 0.06 0.00 0.00

Resolve Auflösung (D) Gesamt 6,0 3,8 3,0 2,6 2,3 2,1 Anzahl Reflexe 16245 770 2257 2775 2734 4813 2896 FOM 0,64 0,94 0,94 0,86 0,72 0,47 0,30

4.3.7.6 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität des Hsp31-Modells

Die Interpretation der erhaltenen Elektronendichtekarte erfolgte zunächst automatisch mit Resolve und führte zu einem schon recht vollständigen Modell. In diesem Modell war bereits die Hauptketteninformation für 213 Aminosäuren enthalten. Dies entspricht bezüglich der Hauptkette etwa 70% des vollständigen Modells.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 100 ERGEBNISSE ______

Auf der Basis dieses Modells und der Elektronendichte wurde versucht, die Sequenz von PlexinA2 anhand großer Seitenketten (Tyr, Phe, Arg und Trp) in der Struktur zu lokalisieren. Da keine der PlexinA2-Sequenzmotive in die Elektronendichte passte, wurde das erhaltene Modell für das Proteinrückgrat mit der Datenbank des DALI-Server (Holm & Sander, 1993) verglichen, um so nach verwandten Strukturen zu suchen. Die DALI-Suche ergab als ersten Treffer das Hsp31 Chaperon Protein aus E. coli, mit einer Koordinatenabweichung von 0,7 Å. Dies entspricht einer sehr hohen Übereinstimmung, so dass davon auszugehen war, dass tatsächlich nicht ein PlexinA2 Fragment in den Kristallen enthalten war, sondern das Hsp31 Chaperon Protein. Um das Modell zu vervollständigen und endgültige Sicherheit zu haben, wurde die Hsp31 Proteinsequenz zusammen mit ArpWarp (Perrakis et al., 1997) verwendet, um das Modell zu komplettieren. ArpWarp konnte so 271 der 292 Aminosäuren (~93%) vollständig, das heißt mit Seitenketten, interpretieren. Die letzten Schritte der Verfeinerung erfolgten durch REFMAC5 (CCP4, 1994) unter Verwendung der TLS Option. Die Verfeinerung der anisotropen Bewegung mittels TLS führte zu einer Verringerung des freien R-Faktors. Nach etwa 5 Zyklen wurde ein Modell erhalten, dessen freier R-Faktor nicht mehr verringerbar war. Tabelle 4.10 gibt einen Überblick über die Verfeinerung und die geometrischen Eigenschaften des finalen Modells. Der kristallographische R-Faktor Rcryst des finalen Modells liegt bei 15,7 %, mit einem freien R-Wert von 22,2 %.

Tab. 4.10: Strukturverfeinerung von Hsp31 Statistik Auflösungbereich (D) 19,43 - 2,10 Anzahl der Reflexe 15427 Atome in asymmetrischer Einheit 2373 Malonat Moleküle 1 Wassermoleküle 199 ungeordnetes Lösungsmittel (k, B) (e/D3, D2) 0,614 / 250 Rcryst / Rfree (%) 15,7 / 22,2 Größe des Testsets (%) 5

Stereochemische Parameter Standardabweichung der Bindungslängen / -winkel (D, °) 0,020 / 1,802 Proteinatome (D2) 17,4 mittlerer Koordinatenfehler nach Luzzati (1952) (D2)0,21

Das finale Modell der Hsp31-Struktur umfasst die Aminosäuren 5 bis 282 (Abb. 4.25). Weiterhin sind in dem Modell ein Malonatmolekül und 199 Wassermoleküle enthalten. Um die relative Mobilität einzelner Bereiche in der Struktur abzuschätzen, wurden die gemittelten

______101 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Temperaturfaktoren der Aminosäuren gegen die Sequenzposition aufgetragen (Abb. 4.24A). Abbildung 4.25 zeigt das finale Modell von Hsp31 mit seinen Sekundärstrukturelementen.

A) B)

40

20 Mittlerer Temperaturfaktor Mittlerer

0 10 30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 Aminosäure

Abb. 4.24: A) Ramachandran-Diagramm und B) gemittelte Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von Hsp31. Aufgetragen sind die gemittelten Temperaturfaktoren gegen die Sequenzposition.

Die sterisch sinnvolle Verteilung der φ/ψ-Winkel des Modells geht aus dem dargestellten Ramachandran Diagramm (Abb. 4.24B; Ramachandran & Sasisekharan, 1968; Laskowski et al., 1993) hervor. 88,6 % aller nicht Gly-Reste besitzen φ/ψ-Winkel in bevorzugten Bereichen und 10,1 % der Aminosäuren liegen in zusätzlich erlaubten Bereichen. Zwei Aminosäuren (0,8%) liegen in erweitert erlaubten Bereichen und eine Aminosäure (Cys185, 0,4%) liegt in einem nicht erlaubten Bereich. Cys185 ist in einer sehr engen Schleifenregion zwischen einer α-Helix und einem β-Strang lokalisiert. Weiterhin ist die konformationelle Freiheit dieser Aminosäure bedingt durch die Seitenketten der umgebenden Aminosäuren stark eingeschränkt. Interessanterweise ist dieses Cystein am Schwefel der Seitenkette durch ein Sauerstoffatom modifiziert (Hydroxy-Cystein), was zu einer weiteren Einschränkung führen könnte. Da Cys185 zur katalytischen Triade von Hsp31 gehört, könnte die beobachtete Konformation auch von katalytischer Bedeutung sein (siehe 5.1.4).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 102 ERGEBNISSE ______

Abb. 4.25: Die asymmetrische Einheit der Hsp31-Kristalle. Die Sekundärstrukturelemente sind folgendermaßen hervorgehoben: α-Helices in rot, β-Faltblattstränge in blau und flexible Regionen in grau.

4.3.8 Charakterisierung der GTPase-CPD Interaktion

Mittels Pulldown Assay (3.4.16) sollte in dieser Arbeit die Interaktion der rekombinant gewonnenen PlexinB1-CPD mit den GTPasen der Rho-Familie untersucht werden. Dazu wurden GST-Rnd1∆NC, GST-Rnd1 und GST-Rac1(Q61L) an GSH-Sepharose gebunden und mit PlexinB1-CPD inkubiert. Nach mehreren Waschschritten, wurden die GST- Fusionsproteine eluiert und mittels SDS-PAGE elektrophoretisch getrennt (Abb. 4.26). Eine Interaktion zwischen GTPase und PlexinB1-CPD sollte durch eine zusätzliche Bande für das Plexin-Protein deutlich erkennbar sein.

A) GST-Rnd1 B) GST-Rac1(Q61L)

Abb. 4.26: Pulldown Experiment von GST-GTPasen mit Plexin B1 CPD. A) 1-4 zeigen das Gesamtprotein und 5-8 das Pulldown-Experiment. 1 GST-Rnd1∆NC; 2 GST-Rnd1; 3 GST-Rnd1∆NC + PlexinB1-CPD; 4 GST-Rnd1 + PlexinB1-CPD; 5 GST-Rnd1∆NC; 6 GST-Rnd1; 7 GST-Rnd1∆NC + PlexinB1-CPD; 8 GST-Rnd1 + PlexinB1-CPD. B) 1 Gesamtprotein GST-Rac1(Q61L) + PlexinB1-CPD; 2 Pulldown-Experiment GST-Rac1(Q61L) + PlexinB1-CPD. Die Pfeile zeigen die Position der PlexinB1- CPD Bande. ______103 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Die Experimente in den Abbildungen 4.26A und B zeigen eine schwache aber im Rahmen des Experimentes signifikante Interaktion zwischen den Rnd1-Proteinen und der CPD von PlexinB1 (Abb. 4.26A, Spuren 7 und 8), sowie zwischen Rac1(Q61L) und PlexinB1 (Abb. 4.26B, Spur 2). Für die hier dargestellten Experimente wurde mit der aus Insektenzellen gewonnenen PlexinB1-CPD gearbeitet. In zuvor durchgeführten Pulldown-Experimenten konnte allerdings keine Interaktion von Rac1(Q61L) mit GST-PlexinB1-CPD aus E. Coli nachgewiesen werden. Dies könnte darauf hindeuten, dass tatsächlich ein Unterschied bezüglich der Faltung der Proteine abhängig vom Expressionssystem besteht. Weiterhin scheinen die N- und C-terminalen Regionen von Rnd1 keinen Einfluss auf die Bindung von PexinB1 zu haben, da für beide Proteine GST-Rnd1∆NC und GST-Rnd1 eine schwache Bindung gezeigt werden konnte (siehe 5.1.2).

4.3.9 Untersuchung der CPDs auf GAP-Aktivität

Auf der Basis von Sequenzhomologien (Rohm et al., 2000) wurde vermutet, dass die CPDs der Plexine eine GTPase aktivierende (GAP)-Aktivität besitzen könnten. Da in verschiedenen Experimenten (in Zusammenarbeit mit Dr. M. Driessens) keine GAP-Aktivität der Plexine auf eine Reihe von Rho-GTPasen mittels einer HPLC-basierten Methode gezeigt werden konnte, wurde dass in der Einleitung (Abb. 1.7) bereits vorgestellte Modell postuliert. Dieses Modell sieht zunächst eine Aktivierung der Plexine durch eine Upstream-GTPase vor, die an die GBD des Plexins bindet und so zu einer Aktivierung der GAP-Funktion führt. Eine Downstream-GTPase wird daraufhin inaktiviert. Aber auch die in diesem Zusammenhang durchgeführten HPLC-Experimente (ebenfalls in Zusammenarbeit mit Dr. M. Driessens) konnten keine GAP-Funktion der Plexine nachweisen. Basierend auf einer kürzlich erschienenen Studie (Oinuma et al., 2004), die eine GAP- Aktivität für den aktivierten Transmembranrezeptor PlexinB1 anhand von Membranfraktionen zeigen konnte, wurden die in Abbildung 4.27 dargestellten Stopped-Flow Experimente durchgeführt. Hierbei wurden 0,1 µM R-Ras (mit Tamra-GTP beladen) in einer Spritze vorgelegt, während in der anderen Spritze die CPD von PlexinB1 (10-facher Überschuss, 1µM) zusammen mit Rnd1 (Abb. 4.27A) bzw. Rac1(Q61L) (Abb. 4.27B) (100- facher Überschuss, 10µM) enthalten war.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 104 ERGEBNISSE ______

A) B) 1,02

1,06

1 1,04 rel. Fluoreszenz rel. rel. Fluoreszenz rel. 1,02 0,98

1

0,96 0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000 Zeit (sec) Zeit (sec)

R-Ras + R-Ras + R-Ras PlexinB1 PlexinB1 R-Ras CPD + Rnd1 CPD + Rac1(Q61L) R-Ras + R-Ras + PlexinB1 R-Ras + Rnd1 R-Ras + CPD PlexinB1 Rac1(Q61L) CPD

Abb. 4.27: Stopped-Flow Experiment zur Bestimmung der GAP-Aktivität von rekombinantem Plexin B1 CPD Protein. Für die Experimente wurden 0,1 µM R-Ras, 1 µM Plexin B1 CPD und 10 µM GTPase eingesetzt. A Rnd1∆NC als Upstream-GTPase von Plexin B1. B Rac1(Q61L) als Upstream-GTPase von PlexinB1.

Da Tamra-modifiziertes GTP bei der GTP-Hydrolyse von GTPasen eine Fluoreszenzänderung zeigt (persönliche Mitteilung von A. Eberth), sollte bei Vorhandensein von GAP-Aktivität eine Beschleunigung der Hydrolyse anhand der Fluoreszenzänderung messbar sein. Allerdings konnte, wie aus Abbildung 4.27 erkennbar ist, für die rekombinant hergestellte CPD von PlexinB1 unter den verwendeten Bedingungen keine GAP-Aktivität gemessen werden (5.1.3). Interessanterweise zeigte schon die Inkubation von Rnd1 bzw. Rac1(Q61L) mit dem Tamra-beladenen R-Ras eine Fluoreszenzänderung, die aus den dargestellten Experimenten allerdings nicht direkt erklärt werden konnte. Da die Vermutung nahe lag, dass vielleicht eine zusätzliche Aktivierung der Plexine bzw. posttranslationale Modifikationen eine Rolle in der Signaltransduktion der Plexine spielen könnten, wurde in Zusammenarbeit mit Prof. A. Püschel und C. Hömme (Universität Münster) eine Expression des PlexinA1 Rezeptors in COS7-Zellen angestrebt. Hierzu wurde PlexinA1 alleine oder zusammen mit Rnd1, Rac1 und Neuropilin1 für 24h in COS7-Zellen exprimiert.

______105 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

A) B) 1 1

0,98 0,98

0,96 0,96 1 1 0,98 0,98 0,94 0,96 0,94 0,96 0,94 0,94 Fluoreszenz rel. rel. Fluoreszenz rel. 0,92 0,92 0,92 0,92 0,9 0,9 0,88 0,88 0,9 0,9 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20

0,88 0,88 0 100 200 300 400 500 0 100 200 300 400 500 Zeit (sec) Zeit (sec)

Plexin A1 + Plexin A1 + R-Ras NF1-333 H-Ras NF1-333 Rac1 Rac1 Plexin A1 + Plexin A1 + Plexin A1 + Plexin A1 + Neuropilin + Neuropilin + Rnd1 Rnd1 Sema3A Sema3A

Abb. 4.28: Stopped-Flow Experimente zur Bestimmung der GAP-Aktivität von COS7 Zelllysaten. Für die Experimente wurden 0,1 µM H-Ras bzw. R-Ras und 100 µl der Membranfraktionen eingesetzt. A H-Ras als Downstream-GTPase von PlexinA1. B R-Ras als Downstream-GTPase von PlexinA1. Als Positivkontrolle wurde die katalytische Domäne von Neurofibromin1 (NF1-333) eingesetzt.

Nach dem Zellaufschluss erfolgte die Isolation der Membranfraktionen durch C. Hömme. Anschließend wurden diese in Messpuffer aufgenommen und in Stopped-Flow Experimenten vergleichbar zu den oben dargestellten Experimenten eingesetzt. Die Ergebnisse dieser GAP- Aktivitätsmessungen sind in Abbildung 4.28 dargestellt. Es konnte hierbei keine GAP- Aktivität von aktiviertem PlexinA1 auf H-Ras (Abb. 4.28A) oder auf R-Ras (Abb. 4.28B) nachgewiesen werden. Als Positivkontrolle wurde in beiden Fällen die GAP-Domäne von NF1 (NF1-333) verwendet, wo die Beschleunigung der GTP-Hydrolyse gut zu erkennen ist.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 106 ERGEBNISSE ______

4.4 Kristallstrukturen von Rac1b·GDP und Rac1b·GppNHp

Der Sequenzvergleich von Rac1 und Rac1b zeigt eine Insertion von 19 Aminosäuren zwischen den Aminosäuren Thr75 und Asp76. Strukturell befindet sich diese Insertion folglich am C-Terminus der Switch II Region von Rac1. Da der Switch II essentiell für die Funktion von Rac1 als Schaltermolekül ist, war es in dieser Arbeit von Interesse, die Struktur dieser 19 zusätzlichen Aminosäuren und ihren Einfluss auf den übrigen Teil der Struktur, sowie auf die Nukleotidbindung zu charakterisieren. Weiterhin sollte untersucht werden, welchen Einfluss die Art des gebundenen Nukleotids (GDP oder GTP) auf die Struktur der 19 Aminosäuren-Insertion von Rac1b hat. Hierzu wurde die dreidimensionale Struktur von Rac1b im GDP- und GppNHp-gebundenen Zustand gelöst.

4.4.1 Verwendete Proteine

Die Klonierung, Expression und Reinigung von Rac1b und Rac1b∆C erfolgte durch Dr. Lars- Christian Häusler. Abbildung 4.29 zeigt die verwendeten Proteine im Vergleich zu Rac1. Hervorgehoben ist die 19 Aminosäuren lange Insertion von Rac1b zwischen den Aminosäuren 75/76. Alle verwendeten Proteine besaßen einen hohen Reinheitsgrad (Abb. 4.3) und waren unter den verwendeten Bedingungen stabil. Bedingt durch die intrinsische GTP-Hydrolyse von Rac1b wurden die Proteine in ihrer GDP gebundenen Form isoliert und konnten als solche direkt für die Kristallisation verwendet werden.

Abb. 4.29: Übersicht über die von Rac1b verwendeten Konstrukte im Vergleich zu Rac1. Die Zahlen geben die N- und C-terminale Aminosäure des verwendeten Fragmentes an. Hervorgehoben ist die 19 Aminosäure lange Insertion zwischen den Aminosäuren 75/76 von Rac1.

4.4.2 Nukleotidaustausch und Nukleotidbefreiung von Rac1b

Um Rac1b und Rac1b∆C mit einem GTP-analogen Nukleotid, in diesem Fall GppNHp, zu beladen bzw. vollständig vom gebundenen Nukleotid zu befreien, wurden die GTPasen wie ______107 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______unter 3.4.15 beschrieben ausgetauscht. Hierzu wurden jeweils 20 mg reines Protein eingesetzt. Hydrolysiertes Nukleotid wurde durch eine anschließende Größenausschlusschromatographie

(in 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 2 mM DTE und 100 µM GDP bzw. GppNHp) vom Protein getrennt. Die nukleotidfreien Formen von Rac1b und Rac1b∆C stellten sich dabei, im Vergleich zu anderen GTPasen der Rho-Familie, als ungewöhnlich stabil heraus. Dies führte zu der Vermutung, dass die 19 Aminosäuren Insertion die Funktion haben könnte, den nukleotidfreien Zustand der GTPase zu stabilisieren. Um die Vollständigkeit des Austausches zu überprüfen und um die erfolgreiche Nukleotidbindung nachzuweisen, wurde die Nukleotidbeladung mittels HPLC überprüft. Beide Proteine waren vollständig und ausschließlich mit GppNHp beladen. Im Fall der Nukleotidbefreiung von Rac1b∆C war kein Nukleotid mehr nachweisbar. Die native Faltung dieses nukleotidfreien Proteins wurde überprüft, indem es mit GTP beladen und mittels HPLC auf GTP-Hydrolyseaktivität hin untersucht wurde.

4.4.3 Kristallisation von Rac1b und Rac1b∆C

Für die Kristallisation wurden sowohl full length-Rac1b, als auch die C-terminal verkürzte Variante Rac1b∆C, in jeweils GDP- bzw. GppNHp-gebundenem Zustand, eingesetzt. Ebenso wurde versucht, nukleotidfreies Rac1b∆C zu kristallisieren. Hierzu fanden die unter 3.1.11 aufgeführten Bedingungen Verwendung. 2 µl der jeweiligen Reservoirlösungen wurden mit 2 µl der verschiedenen Proteinlösungen (10 mg/ml) gemischt und nach der Methode des hängenden Tropfens bei 20 °C inkubiert. Kristalle von Rac1b∆C in der GDP- und GppNHp-gebundenen Form konnten unter Bedingung 41 des Crystal Screen I (Hampton Research) erhalten werden. Diese Bedingung besteht aus 10 % Isopropanol, 100 mM Hepes/NaOH, pH 7,5 und 20 % PEG 4000. Die Reproduktion dieser initialen Bedingung gestaltete sich schwierig. Keine der getesteten Variationen (Isopropanol-Konzentration, pH-Wert, Puffersubstanz oder PEG 4000- Konzentration) führte zum Kristallisationserfolg. Erst der Wechsel zu einer niedermolekulareren PEG-Lösung (PEG3350) führte zu einer Reproduzierbarkeit der initialen Bedingung. Die in Abb. 4.30 dargestellten Kristalle konnten durch Mischen von 2 µl einer 0,5 mM Lösung des entsprechenden Rac1b ∆C Proteins (GDP oder GppNHp, in 20 mM

Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 2 mM DTE und 100 µM GDP bzw. GppNHp) mit 2 µl einer Reservoirlösung bestehend aus 100 mM Hepes, pH 7,5, 18 - 30 % PEG 3350 und 2 - 6 % Isopropanol, erhalten werden. Wie in der Abbildung zu erkennen, wuchsen die Kristalle

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 108 ERGEBNISSE ______häufig in Form von Rosetten an einem zentralen Kristallisationskeim, konnten aber ohne weiteres zwecks Datensammlung vereinzelt werden. Für die full length-Rac1b Proteine (GDP und GppNHp) und für das nukleotidfreie Rac1b∆C- Protein konnten unter den ausgetesteten Bedingungen keine initialen Kristallisationsbedingungen erhalten werden.

A B

Abb. 4.30: Kristalle von Rac1b∆C GDP/GppNHp. A Kristall bei vierfacher Vergrößerung B Kristall bei zehnfacher Vergrößerung

4.4.4 Datenaufnahme von Rac1b∆C·GDP/GppNHp

Um für die erhaltenen Rac1b∆C GDP/GppNHp Kristalle die Datensammlung an einer Syncrotron-Röntgenquelle zu ermöglichen wurde nach einem Kryoprotektionsmittel gesucht. Hierzu wurden verschiedene Lösungen an Kryoprotektionsmitteln mit der Reservoirlösung vermischt. Als geeignet erwies sich eine Mischung aus Reservoirlösung mit 10 – 20% Glycerol.

Tab. 4.11: Datensammlung an Rac1b∆C GDP GppNHp Anzahl der Bilder 220 224 Detektor ADSC Q4 CCD ADSC Q4 CCD Röntgenquelle ID14-EH1 ID14-EH1 Wellenlänge (λ, D) 0,933 0,933

Anzahl der Oszillationen 1 1 Startwinkel (ϕ, °) 00 Endwinkel (ϕ, °) 110 112 Winkel pro Bild (°) 0,5 0,5 Detektor-Abstand (mm) 159,71 159,61 Maximale Auflösung (D) 1,75 1,75

______109 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Zur Datensammlung bei 100 K an der ESRF (European Syncrotron Radiation Facility) Röntgenquelle ID14-EH1 wurden die Kristalle von Rac1b∆C GDP bzw. GppNHp in der Kryoprotektionslösung aufgenommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Einige der verwendeten Messparameter sind in Tabelle 4.11 zusammengefasst. Die maximale Auflösung der Kristalle betrug 1,75 Å.

4.4.5 Datenprozessierung von Rac1b∆C·GDP/GppNHp

Die erhaltenen Datensätze wurden mit XDS (Kabsch, 1993) prozessiert. Die Indizierung der Daten wies in beiden Fällen auf ein primitiv orthogonales Gitter hin. Da jeder zweite Reflex auf allen drei hkl-Achsen systematisch abwesend war, wurde das Vorliegen einer Schraubenachse vermutet. Die Prozessierung in P2(1)2(1)2(1) zeigte für den Rac1b∆C·GDP Datensatz eine mittlere gemessene Intensität von 0,8 % (1,2 % für GppNHp) der mittleren Gesamtintensität für 62 (bzw. 85) der gemessenen systematisch abwesenden Reflexionen. Die Raumgruppe P2(1)2(1)2(1) konnte durch die Lösung des molekularen Ersatzes für die GDP- und GppNHp-Struktur bestätigt werden.

Rac1b ∆C·GDP Rac1b ∆C·GppNHp

14 14

12 12 log() 10 log() 10

8 8

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0 0,02 0,04 0,06 0,08 sin2(θ)/λ 2 sin2(θ)/λ 2

Abb. 4.31: Wilsondiagramme der Rac1b∆C·Datensätze. Die Abbildung zeigt die Intensitätsverteilung (log()) in Abhängigkeit von der Auflösung (20 - 1,75 Å) in Einheiten von sin2 ()θ / λ2 .

Die Wilsondiagramme der Rac1b∆C·Datensätze sind in Abb. 4.31 mit einem Auflösungsbereich von 20 - 1,75 Å dargestellt. Die Auflösung ist in Einheiten von ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 110 ERGEBNISSE ______sin2 ()θ / λ2 aufgetragen, mit λ als Wellenlänge des Röntgenlichts und θ als Beugungswinkel. Nach linearer Regression ergeben sich aus den y-Achsenabschnitten die Skalierungsfaktoren der Datensätze (12,98 für GDP und 12,97 für GppNHp). Aus der Steigung der Geraden erhält man den mittleren Temperaturfaktor (B = 30 Å2 für GDP und GppNHp). Die nachfolgende Tabelle (Tab. 4.12) fasst die wesentlichen Kristallparameter und die Statistik der Datenprozessierung zusammen.

Tab. 4.12: Datenprozessierung von Rac1b∆C GDP GppNHp Kristall Abmessungen (mm) 0,2 x 0,2 x 0,5 0,2 x 0,2 x 0,7 Alter (d) 7-14 7-14 Raumgruppe P2(1)2(1)2(1) / Nr. 19 P2(1)2(1)2(1) / Nr. 19 Einheitszelle (D) a = 51,64 b = 78,69 c = 96,79 a = 51,55 b = 78,67 c = 96,88 α = β = γ = 90° α = β = γ = 90° 3 VM (D /Da) 2,5 2,5 Zahl der Moleküle pro asym. Einheit 2 2 Lösungsmittelgehalt (%) 49,7 49,7 Auflösungbereich (D) 24,92 - 1,75 26,26 - 1,75 Mosaizität (°) 0,216 0,182

Statistik Zahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 170229 / 38560 172626 / 38875 Redundanz (-fach) 4,4 4,4 Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 5,4 / 40,9 5,1 / 40,6 Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 95,1 / 88,3 96,0 / 90,1 Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 15,21 / 3,37 16,62 / 3,75

Das Zellvolumen liegt in diesem Fall bei 410523 Å3. Das Molekulargewicht von Rac1b∆C beträgt etwa 20 kDa. Aufgrund der orthogonalen Symmetrie ist die Einheitszelle aus 4 asymmetrischen Einheiten aufgebaut. Mit einem Molekül Rac1b∆C pro asymmetrischer Einheit ergibt sich ein Matthews Koeffizient von 4,9 Å3/Da. Mit zwei Molekülen erhält man einen Wert von 2,5 Å3/Da, was sehr gut einem durchschnittlichen Proteinkristall entspricht. Der molekulare Ersatz zeigte, dass zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit enthalten waren.

4.4.6 Molekularer Ersatz von Rac1b∆C·GDP/GppNHp

Für den Molekularen Ersatz von Rac1b∆C·GDP/GppNHp wurde das Programm AMoRe (Navaza, 1993) verwendet. Als Suchmodell diente die Rac1·GppNHp Struktur (PDB Code: 1MH1, Hirshberg et al., 1997), aus der die beiden Schalterregionen (Switch I und II), das Magnesiumion und das Nukleotid entfernt wurden. Die Auflösungsbereiche für die Rotations- und die Translationssuche wurden variiert, ebenso der Integrationsradius. In der P2(1)2(1)2(1) Raumgruppe wurde für beide Rac1b∆C-Datensätze eine eindeutige Lösung mit zwei

______111 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Molekülen pro asymmetrischer Einheit gefunden. Die Parameter der Lösung sind in Tabelle 4.13 zusammengefasst.

Tab. 4.13: Molekularer Ersatz für Rac1b∆C GDP GppNHp Suchmodell Rac1 GppNHp Rac1 GppNHp Auflösungsbereich Rotation / Translation (D) 10,0-4,0/8,0-4,0 10,0-4,0/8,0-4,0 Pattersonradius (D)2222 Rotation für Molekül 1 (Eulerwinkel) 152,02/70,81/163,02 152,21/70,87/163,31 Translation für Molekül 1 (orthogonales System, D) -4,99/-7,34/-8,63 -4,54/-7,50/-8,47 Rotation für Molekül 2 (Eulerwinkel) 151,49/70,92/162,12 151,46/70,96/161,47 Translation für Molekül 2 (orthogonales System, D) -1,80/32,33/-9,06 -1,89/32,30/-9,40 Korrelationskoeffizient / R-Faktor (%) 61,5/47,9 62,6/45,3 Korrelationskoeffizient / R-Faktor (der besten falschen Lsg., %) 22,6/64,1 25,3/60,7

Die hier erhaltene Lösung ist in beiden Fällen sehr gut, wie der Unterschied zwischen den Korrelationskoeffizienten der richtigen und der besten falschen Lösung zeigt. Er beträgt 38,9% für Rac1b∆C·GDP und 37,3% für die GppNHp Struktur. Der Unterschied in den R- Faktoren liegt bei 16,2% für die GDP und 15,4% für die GppNHp Struktur. Das verwendete Rac1-Modell wurde mit den angegebenen Parametern rotiert und translatiert. Die sterische Korrektheit der Lösung wurde anhand der Packung der symmetrieverwandten Moleküle überprüft. Die anschliessend berechnete Elektronendichtekarte zeigte eindeutig positive Dichte an den erwarteten Nukleotidpositionen, so dass man von der Korrektheit der Lösungen ausgehen konnte (das Nukleotid war nicht im Modell enthalten).

Abb. 4.32: U-V-Ebene bei W = 0 der nativen Pattersondichte des Rac1b∆C·GDP Datensatzes. Die Berechnung erfolgte mit dem Programm FFT (CCP4, 1994). Es wurden Daten im Auflösungsbereich 25-4 Å verwendet. Die Konturierung erfolgte bei 15% der Gesamtsignalhöhe in Schritten von 1%. Das Maximum entspricht 50% der Gesamtsignalhöhe.

Wie der Tabelle 4.13 zu entnehmen ist, sind die beiden Moleküle der jeweiligen asymmetrischen Einheiten durch eine reine Translation um etwa 40 Å fast genau entlang der y-Achse des realen Raums (entspricht der Hälfte der y-Achse) miteinander verwandt. Der ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 112 ERGEBNISSE ______

Vektor für die Transformation von Molekül A nach Molekül B ist gegeben durch x = 0,065, y = 0,5 und z = 0,000. Eine derartige reine Translation sollte in einer nativen Pattersondichte als Maximum zu erkennen sein und dient damit als zusätzliche Bestätigung der Richtigkeit der Lösung. Abbildung 4.32 zeigt die U-V-Ebene bei W = 0 (die Koordinaten des realen Raums x, y und z, werden im Pattersonraum durch U, V und W wiedergegeben) der nativen Pattersondichte von Rac1b∆C GDP. Deutlich zu erkennen sind die beiden Maxima bei U = 0,065 bzw. U = 0,935 und V = 0,5. Die zusätzlichen Maxima bei U = 0 und V = 0 sind die Ursprungmaxima.

4.4.7 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität der Modelle

Aus dem Suchmodell (Rac1·GppNHp) wurden anhand der Lösungen des molekularen Ersatzes die asymmetrischen Einheiten der Rac1b∆C·GDP/GppNHp Kristalle konstruiert. In den anfänglichen Modellen waren die beiden Schalterregionen (Switch I und II), das Magnesiumion und das Nukleotid nicht enthalten. Eine erste berechnete composite omit- Elektronendichte wurde dazu verwendet, die Lage der Aminosäuren zu überprüfen und zu korrigieren. Seitenkettenatome wurden wo möglich eingebaut, ebenso wie Teile der fehlenden Regionen. Die letzten Schritte der Verfeinerung erfolgten durch REFMAC5 (CCP4, 1994). Die Verwendung der TLS Option führte zu einer deutlichen Verringerung des freien R- Faktors. Nach etwa 20 Zyklen wurde in beiden Fällen (Rac1b∆C·GDP und GppNHp) ein Modell erhalten, dessen freier R-Faktor nicht mehr verringerbar war. Tabelle 4.14 gibt einen Überblick über die Verfeinerung und die geometrischen Eigenschaften des finalen Modells.

Der kristallographische R-Faktor Rcryst des finalen Modells der Rac1b ∆C·GDP Struktur liegt bei 18,8 %, mit einem freien R-Wert von 22,3 %. Die Werte für die GppNHp Struktur sind sehr ähnlich mit einem Rcryst von 18,1 % und einem Rfree von 21,9 %. Für alle vier Moleküle konnten die beiden artifiziellen N-terminalen, durch die Thrombinolyse erhaltenen, Gly-Ser-Reste beobachtet werden und sind dementsprechend im Modell enthalten. Das finale Modell der Rac1b∆C·GDP Struktur umfasst die Aminosäuren 1- 59 und 93-201 für das Molekül A. Das Molekül B dieser Struktur beinhaltet die Aminosäuren 1-58 und 93-199. Die Struktur von Rac1b∆C·GppNHp enthält die Aminosäuren 1-60 und 93- 201 für das Molekül A, sowie die Aminosäuren 1-58 und 93-199 für das Molekül B. Weiterhin sind in den Modellen jeweils das entsprechende Nukleotid (GDP bzw. GppNHp) und ein Magnesiumion (Mg2+) enthalten.

______113 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Tab. 4.14: Strukturverfeinerung von Rac1b∆C GDP GppNHp Statistik Auflösungbereich (D) 24,92 - 1,75 26,26 - 1,75 Anzahl der Reflexe 37724 38205 Atome in asymmetrischer Einheit 2917 2942 GDP+Mg2+ / GppNHp+Mg2+ 29 33 Wassermoleküle 273 296 ungeordnetes Lösungsmittel (k, B) (e/D3, D2) 0,873 / 250 0,840 / 250 Rcryst / Rfree (%) 18,8 / 22,3 18,1 / 21,9 Größe des Testsets (%) 4,9 5

Stereochemische Parameter Standardabweichung der Bindungslängen / -winkel (D, °) 0,021 / 1,873 0,021 / 1,883 Proteinatome 1. Mol / 2. Mol (D2) 22,71/22,10 24,17/22,10 GppNHp+Mg2+ 1. Mol / 2. Mol (D2) 15,25/15,88 19,02/17,17 mittlerer Koordinatenfehler nach Luzzati (1952) (D2) 0,257 0,254

Um die relative Mobilität einzelner Bereiche in der Struktur abzuschätzen, wurden die gemittelten Temperaturfaktoren der Aminosäuren gegen die Sequenzposition aufgetragen (Abb. 4.33). Die Switch I Region (Aminosäuren Tyr32 – Tyr40), die Insert Helix (Aminosäuren Lys135 – Pro155) und die C-Termini der Strukturen zeigen jeweils leicht erhöhte Temperaturfaktoren. Die Switch II Region (Aminosäuren Gly60 – Tyr72) konnte für keines der Moleküle gebaut werden, da in diesem Bereich keine Elektronendichte zu erkennen war und somit auf eine extrem hohe Mobilität dieser Sequenzregion schließen lässt (siehe 5.2.2). Die asymmetrische Einheit beider Strukturen zeigt ein kristallographisches Dimer (Abb. 4.34). Die beiden Moleküle liegen „Kopf“ zu „Kopf“ zueinander, wobei die Kontaktfläche über die β-Faltblattstränge β1 bis β3, die α1-Helix und beide Switch I-Regionen entsteht und eine Gesamtfläche von 1347 Å2 besitzt. Durch Größenausschlusschromatographie konnte gezeigt werden, dass Rac1b in Lösung monomer vorliegt und dieses Dimer damit rein kristallographisch bedingt ist. Die in Abb. 4.34 dargestellte Überlagerung von Rac1b∆C·GDP und GppNHp zeigt, dass sich die beiden Strukturen in ihren Sekundärstrukturelementen nicht unterscheiden. Berechnet man die mittlere Abweichung der Atomkoordinaten für die Cα-Atome der asymmetrischen Einheiten der beiden Strukturen, so erhält man einen sehr niedrigen Wert von 0,22 Å (für 336 Cα-Atome). Marginale Unterschiede zwischen der GDP und der GppNHp Struktur sind nur im Bereich des C-Terminus von Molekül A und am C-Terminus der β3-Stränge zu erkennen.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 114 ERGEBNISSE ______

Rac1b∆C·GDP Molekül A Rac1b∆C·GDP Molekül B

60 60

40 40

20 20 Mittlerer Temperaturfaktor Mittlerer Temperaturfaktor

0 0 10 30 50 70 90 10 30 50 70 90 110 130 150 170 190 110 130 150 170 190 Aminosäure Aminosäure

Rac1b∆C·GppNHp Molekül A Rac1b∆C·GppNHp Molekül B

60 60

40 40

20 20 Mittlerer Temperaturfaktor Mittlerer Temperaturfaktor Mittlerer

0 0 10 30 50 70 90 10 30 50 70 90 110 130 150 170 190 110 130 150 170 190 Aminosäure Aminosäure

Abb. 4.33: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheiten von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. Aufgetragen sind die gemittelten Temperaturfaktoren gegen die Sequenzposition.

Abb. 4.34: Überlagerung der asymmetrischen Einheiten von Rac1b∆C·GDP und GppNHp. Die Struktur von Rac1b∆C·GDP ist in blau dargestellt; die von Rac1b∆C·GppNHp in rot. Die Nukleotide der beiden Moleküle sind als ball-and-stick-Modelle und das Mg2+-Ion als Kugel dargestellt.

______115 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Die sterisch sinnvolle Verteilung der φ/ψ-Winkel der vier Moleküle geht aus dem dargestellten Ramachandran Diagramm (Abb. 4.35; Ramachandran & Sasisekharan, 1968; Laskowski et al., 1993) hervor. Für die GDP-Struktur besitzen 93,0 % aller nicht Gly-Reste φ/ψ-Winkel in bevorzugten Bereichen und 7,0 % der Aminosäuren liegen in zusätzlich erlaubten Bereichen. Vergleichbar ist die Situation für die GppNHp-Struktur mit 91,7 % der Aminosäuren in den bevorzugten Bereichen und 8,3 % in den zusätzlich erlaubten Bereichen.

Rac1b ∆C·GDP Rac1b ∆C·GppNHp

Abb. 4.35: Ramachandran-Diagramme von Rac1b∆C·GDP und GppNHp.

4.4.8 GDP/GppNHp-Bindung von Rac1b∆C

Abbildung 4.36 zeigt eine schematische Darstellung der Nukleotidbindung mit den möglichen Wasserstoffbrückenbindungen und ionischen Wechselwirkungen, während Abb. 4.37 den Ausschnitt einer Elektronendichte der Nukleotidbindungsstellen von Rac1b∆C·GDP und Rac1b∆C·GppNHp zeigt. Für die Nukleotidbindung von kleinen GTPasen sind fünf sehr konservierte Sequenzmotive von entscheidender Bedeutung (Bourne et al., 1991). Der P-Loop (13AVGKT Motiv) spielt eine wichtige Rolle bei der Bindung des Phosphatanteils der Nukleotide und ist ebenso an der Koordination des Mg2+-Ions durch Thr17 beteiligt (Abb 4.36). Das 134TKLD- und das 176CSAL-Motiv (115TKLD bzw. 157CSAL-Motiv, Rac1 Nummerierung) interagieren direkt mit der Guaninbase und sichern so die Guanin-Spezifität der GTPase. Die zentrale Region des Switch I (32YIPT) und der N-Terminus des Switch II (57DTAGQ), die für die ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 116 ERGEBNISSE ______

Magnesiumkoordination und die Bindung des γ-Phosphat verantwortlich sind, zeigen die größten strukturellen Unterschiede im Vergleich zwischen Rac1b und Rac1. Der Switch I ist nicht über Thr35 an der Koordination des Magnesiumions beteiligt und zeigt im Vergleich zu Rac1 eine offene Konformation (siehe 5.2.3). Durch die Interaktion mit dem NCS-verwandten Molekül ist er sehr gut definiert. Die Interaktionsfläche der beiden Moleküle ist hydrophober Natur und wird durch die jeweiligen Aminosäuren Phe37, Tyr40 und Ile21 ausgebildet. Der Switch II und die darauf folgende 19 Aminosäuren lange Insertion hingegen, konnten in der Elektronendichte nicht beobachtet werden. Diese Beobachtung ist ein Indiz dafür, dass diese Insertion sehr mobil ist und weiterhin zu einer höheren Mobilität des Switch II führt (siehe 5.2.2).

A: Rac1b∆C·GDP

∆ B: Rac1b C·GppNHp

Abb. 4.36: Nukleotidbindung von Rac1b. A Rac1b∆C·GDP; B Rac1b∆C·GppNHp; Die beiden 2+ dargestellten Skizzen zeigen die Nukleotidbindung an Rac1b. Der Cofaktor Mg ist entsprechend hervorgehoben. Wassermoleküle wurden mit einem W gekennzeichnet. Die gestrichelten Linien entsprechen Wasserstoffbrückenbindungen mit den in Å angegebenen Distanzen.

______117 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Die Koordination des zentralen Magnesiumions erfolgt, wie in den Abb. 4.36 und 4.37 dargestellt, in Rac1b∆C·GDP durch das β-Phosphat, Thr17 und vier Wassermoleküle (W1, W2, W116 und W117). In der GppNHp-Struktur ist hingegen das β- und das γ-Phosphat, sowie Thr17 an der Koordination beteiligt. Die restlichen Bindungsstellen werden durch die Wassermoleküle W1, W142 und W167 eingenommen. Wie oben schon angedeutet, ist die Carbonylfunktion von Thr35 nicht an der Koordination des Magnesiumions beteiligt (siehe 5.2.3). Diese Bindungsstelle wird in den Rab1b·GDP- und GppNHp-Strukturen jeweils durch die Wassermoleküle W1 besetzt (Abb. 4.36).

Abb. 4.37: Stereo-Darstellung des aktiven Zentrums von Rac1b∆C·GDP (A) und GppNHp (B). Dargestellt ist die endgültige 2Fo-Fc-Elektronendichtekarte bei einer Kontourierung von 1σ. Für das Nukleotid wurde ein ball-and-stick-Modell gewählt. Wassermoleküle innerhalb des aktiven Zentrums wurden in Orange, während das Mg2+-Ion in Türkis wiedergegeben wurde. C Struktureller Vergleich des P-loop und der Switch I-Region von Rac1b·GppNHp (rot), Rac1·GppNHp (braun; Hirshberg et al., 1997) und des nukleotidfreien Komplexes von Rac1·Tiam1 (grün; Worthylake et al., 2000). Die Seitenketten von Tyr32, Ile33 und Pro34 sind als stick-Modell dargestellt, während Thr35 als ball-and-stick-Modell gezeigt wird. ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 118 ERGEBNISSE ______

4.5 Die Kristallstrukturen von TC10

Die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur von Molekülen ist Voraussetzung für das Verständnis ihrer Wechselwirkung auf atomarer Ebene. Von der Struktur von TC10, sowohl im GDP als auch im GTP gebundenen Zustand, wurde ein Beitrag zum Verständnis der Signaltransduktion dieser GTPase erwartet. TC10 ist in der Familie der Rho-GTPasen ein bisher noch wenig charakterisiertes Mitglied, so dass eine dreidimensionale Struktur als Grundlage für die Suche nach Interaktionspartnern dienen sollte. Von besonderem Interesse sollten weiterhin die Unterschiede zwischen dem aktiven und dem inaktiven Zustand sein. Ein zusätzlicher interessanter Aspekt sollte der verlängerte N-Terminus von TC10 sein, über den weder strukturell noch funktionell etwas bekannt ist. Aus diesem Grund wurden sowohl TC10∆C als auch TC10∆NC (Abb. 4.38) für die Kristallisation verwendet.

4.5.1 Verwendete Proteine

Die Klonierung, Expression und Reinigung von TC10∆C und TC10∆NC erfolgte durch A. Eberth. Abbildung 4.38 zeigt die verwendeten Fragmente im Vergleich zum Wildtyp-Protein. Alle verwendeten Proteine besaßen einen hohen Reinheitsgrad und waren unter den verwendeten Bedingungen stabil (Abb. 4.3). Bedingt durch die intrinsische GTP-Hydrolyse von TC10 wurden die Proteine in ihrer GDP gebundenen Form isoliert und konnten als solche direkt für die Kristallisation verwendet werden.

Abb. 4.38: Übersicht über die von TC10 verwendeten Konstrukte. Zahlen geben die N- und C-terminale Aminosäure des verwendeten Fragmentes an.

4.5.2 Nukleotidaustausch

Da GTPasen ihre biologische Aktivität abhängig vom Nukleotidzustand wahrnehmen, müssen sich die Komplexe in ihrer Struktur unterscheiden. Der Nukleotidzustand bestimmt, ob eine Wechselwirkung mit Effektormolekülen möglich ist. Um TC10 im GTP-gebundenen Zustand zu kristallisieren, musste das nach der Reinigung gebundene GDP entfernt und durch ein nicht

______119 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______hydrolysierbares GTP-Analog ersetzt werden. Dementsprechend wurden jeweils 20 mg TC10∆C und TC10∆NC mit GppNHp beladen. Die sich anschließende Gelfiltration diente dazu, hydrolysiertes Nukleotid (vom GDP stammend) und überschüssiges GppNHp vom GppNHp beladenen TC10 abzutrennen. Gleichzeitig wurde hierdurch das Protein in

Kristallisationpuffer (20 mM Tris pH 7.5, 2 mM MgCl2 und 2 mM DTT) überführt. Die Konzentrierung auf 10 mg/ml erfolgte durch Ultrafiltration. Um die Vollständigkeit des Austausches zu überprüfen und um die erfolgreiche Nukleotidbindung nachzuweisen, wurde die Nukleotidbeladung mittels HPLC überprüft. Beide Proteine waren vollständig und ausschließlich mit GppNHp beladen.

4.5.3 Kristallisation

TC10∆C GDP

Für die Kristallisation des gereinigten GDP-gebundenen TC10∆C Proteins wurde zum Austesten von Kristallisationsbedingungen der Hampton Crystal Screen I und der PEG/Ion Screen verwendet. Es wurden 2 µl der jeweiligen Reservoirlösungen mit 2 µl einer 0,5 mM TC10∆C-Lösung nach dem Verfahren des hängenden Tropfens bei 20 °C inkubiert. Initiale Kristallisationsbedingungen für TC10∆C, in Form von Spheruliten, ergaben sich nach etwa 2 Tagen aus der Bedingung sechs des Hampton Crystal Screen. Diese Bedingung enthält

200 mM MgCl2, 100 mM Tris/HCl pH 8,5 und 30 % PEG4000 (Abb. 4.39A). Durch eine gezielte Variation der Salzkonzentration, der Pufferzusammensetzung und des PEG-Gehaltes konnte die initiale Bedingung verbessert werden. Durch Verwendung von HEPES-Puffer pH 7,5 und einer geringeren PEG3350-Konzentration wurden kleine, aber unregelmäßig aufgebaute Kristalle erhalten (Abb. 4.39B). Verhältnissmässig große Einkristalle von TC10 wurden nach dreiwöchiger Inkubation unter Verwendung von 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 190-

200 mM MgCl2 und 7-9 % PEG4000 als Reservoirlösung erhalten (Abb. 4.39C und D). Für die finalen Ansätze wurde eine 1 mM Proteinlösung verwendet, da durch eine Erhöhung der Proteinkonzentration die Kristalle vergrößert werden konnten.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 120 ERGEBNISSE ______

A B

C D

Abb. 4.39: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GDP. Dargestellt ist jeweils ein Ausschnitt aus den Tropfen. A 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 200 mM MgCl2, 30% PEG 4000 (4 fache Vergrößerung), B 100 mM HEPES pH 7,5, 250 mM MgCl2, 25% PEG 3350 (10 fache Vergrößerung), C und D 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 190-200 mM MgCl2, 7-9% PEG 4000 (10 fache Vergrößerung).

TC10∆C GppNHp

Für die Kristallisation des GppNHp-gebundenen TC10∆C Proteins wurde zunächst die

Kristallisationsbedingung von TC10∆C GDP (100 mM Tris/HCl pH 8,5, 190-200 mM MgCl2 und 7-9 % PEG4000) getestet. Es wurden 2 µl Reservoirlösung mit 2 µl einer 0,5 mM Lösung von TC10∆C·GppNHp gemischt. Unter dieser Bedingung wurden innerhalb einer Stunde die in Abb. 4.40 abgebildeten Kristalle erhalten. Die dargestellten Kristalle zeigen deutliche Verwachsungen und erschienen schon optisch nur bedingt für eine Datensammlung geeignet.

Durch Variation der MgCl2-Konzentration, der PEG-Konzentration, des PEG- Molekulargewichts und der Pufferzusammensetzung wurde die Bedingung optimiert. Es konnten allerdings keine Einkristalle erhalten werden.

______121 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

A B

Abb. 4.40: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GppNHp. Dargestellt ist jeweils ein Ausschnitt aus den Tropfen unter folgender Bedingung 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 190-200 mM MgCl2, 7-9% PEG 4000. A 4 fache Vergrößerung, B 10 fache Vergrößerung.

Zum Austesten von weiteren Kristallisationsbedingungen wurde der Hampton Crystal Screen I und der PEG/Ion Screen verwendet. Es wurden auch hier 2 µl der jeweiligen Reservoirlösungen mit 2 µl einer 0,5 mM TC10∆C·GppNHp-Lösung nach dem Verfahren des hängenden Tropfens bei 20 °C inkubiert. Der PEG/Ion Screen war hier mit 16 initialen Bedingungen besonders erfolgreich. Abbildung 4.41 ist eine Übersicht der erhaltenen Kristalle unter verschiedenen Bedingungen. Kritisch für das Kristallwachstum waren das Molekulargewicht der PEG-Lösung (PEG3350) und die PEG-Konzentration. Die Art des Salzes war hingegen weniger kritisch, wie die große Anzahl an Treffern im PEG/Ion Screen zeigt. Unter Bedingung 6, mit 200 mM NaCl, wuchsen Kristallrosetten, die nachträglich vereinzelt werden konnten (Abb. 4.41E). Diese Bedingung konnte durch eine Variation des Puffers (MES pH 6.0) optimiert werden (Abb. 4.41F).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 122 ERGEBNISSE ______

A B

CD

EF

Abb. 4.41: PEG/Ion Kristallisationsbedingungen von TC10∆C·GppNHp. Dargestellt ist jeweils ein Ausschnitt aus den Tropfen in 10 facher Vergrößerung. A PEG/Ion 3; B PEG/Ion 7; C PEG/Ion 23; D PEG/Ion 42; E PEG/Ion 6; F 100 mM MES pH 6.0, 200 mM NaCl, 20 % PEG 3350.

TC10∆NC GDP

Erste Kristalle von TC10∆NC·GDP wurden durch Mischen einer 0,5 mM Proteinlösung mit

200 mM CaCl2 und 20 % PEG 3350 nach der Methode des hängenden Tropfen bei 20 °C erhalten (Abb 4.42A). Durch Absenken der PEG-Konzentration und Variation der Salzkonzentration konnten die Kristalle vergrößert werden. Im weiteren Verlauf zeigte sich, dass zweiwertige Kationen (Mg2+, Ca2+ oder Mn2+) für die Kristallisation wichtig sind. Allerdings konnte dadurch keine weitere Verbesserung der Diffraktionseigenschaften im

Vergleich zu CaCl2 erreicht werden. Auch die Verwendung von Puffern hatte lediglich einen negativen Einfluss. Als finale Kristallisationsbedingung wurde eine Lösung aus 180-210 mM

CaCl2 und 14-16 % PEG 3350 verwendet.

______123 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______A B

Abb. 4.42: Optimierung der Kristallisationsbedingungen von TC10∆NC·GDP. Dargestellt ist jeweils ein Ausschnitt aus den Tropfen mit 10 facher Vergrößerung. A initiale Bedingung (Nr. 7) des PEG/Ion Screens, B optimierte Kristallisationsbedingung (180-210 mM CaCl2, 14-16 % PEG 3350).

4.5.4 Datenaufnahme und –prozessierung

Die Stabilität von Kristallen im Allgemeinen ist bei Bestrahlung mit Röntgenlicht begrenzt. Der Grund hierfür ist die Absorption von Röntgenlicht durch das Protein oder durch das im Kristall enthaltene Wasser. In Folgereaktionen kommt es dabei zur homo- oder heterolytischen Spaltung von chemischen Bindungen. Nach der Bildung von freien Radikalen aus Wasser können in Kettenreaktionen viele Bindungen in Proteinmolekülen gespalten werden. Besonders problematisch sind in diesem Zusammenhang Raumtemperaturmessungen, da die entstandenen freien Radikale frei in den Kanälen des Kristalls diffundieren können. Dementsprechend wurde wie im Folgenden beschrieben nach Kryobedingungen gesucht. Der Vorteil von Messungen bei niedrigen Temperaturen ist eine Inhibition der Diffusion, wodurch wiederum Strahlenschäden am Kristall verringert werden können.

TC10∆C·GDP

Um die Kristalle von TC10∆C·GDP längerfristig haltbar zu machen und Strahlenschäden bei einer Datenaufnahme an einer Syncrotron-Röntgenquelle zu minimieren, wurde nach einem Kryoprotektionsmittel gesucht. Hierzu wurden Lösungen von Glycerol, PEG 4000, PEG400,

Xylitol und Sucrose mit der Reservoirlösung 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 190-200 mM MgCl2 und 7-9 % PEG 4000 vermischt. Die Konzentrationen und die Einwirkdauer der Kryoprotektionsmittel wurden variiert und die Streueigenschaften der gefrorenen Kristalle

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 124 ERGEBNISSE ______untereinander verglichen. Als geeignet erwies sich eine Lösung von 100 mM Tris/HCl pH

8,5, 200 mM MgCl2, 8 % PEG 4000 und 25 % Glycerol.

Von einem TC10∆C·GDP Kristall aus 100 mM Tris/HCl pH 8,5, 200 mM MgCl2, 8 % PEG 4000 und einer 1 mM Proteinlösung wurde an der ESRF (European Syncrotron Radiation Facility) Röntgenquelle ID14-EH4 ein nativer Datensatz aufgenommen. Einige der verwendeten Messparameter sind in Tabelle 4.15 zusammengefasst. Durch die hohe Intensität an einer Syncrotronstrahlenquelle konnte die maximale Auflösung von etwa 3 Å an einer Drehanode auf 2,2 Å verbessert werden.

Tab. 4.15: Datensammlung an TC10∆C GDP 1. Teil 2. Teil Anzahl der Bilder 120 70 Detektor ADSC Q4 CCD ADSC Q4 CCD Röntgenquelle ESRF ID14-EH4 ESRF ID14-EH4 Wellenlänge (λ, D) 0,9796 0,9796

Anzahl der Oszillationen 1 1 Startwinkel (ϕ, °) 070 Endwinkel (ϕ, °) 84 105 Winkel pro Bild (°) 0,7 0,5 Detektor-Abstand (mm) 180 180 Maximale Auflösung (D)2,22,2

Die Indizierung und Integration der gemessenen Intensitäten wurde mit XDS (Kabsch, 1993) durchgeführt. Durch die Indizierung des Datensatzes konnte die Raumgruppe auf ein tetragonales Gitter eingeschränkt werden. Charakteristisch hierfür sind eine vierzählige und zwei dazu senkrecht stehende zweizählige Achsen (P422). Das Vorliegen einer Schraubenachse war wahrscheinlich, da jeder zweite Reflex auf der l-Achse systematisch abwesend war. Für 12 der gemessen systematisch abwesenden Reflexionen war die mittlere gemessene Intensität dieser Reflexe -0,5 % der mittleren Gesamtintensität. Die danach möglichen Raumgruppen waren P4(2)22 und P4(2)2(1)2. Anhand der h- und der k-Achse konnte keine weitere Einschränkung getroffen werden, da die Daten hier nicht eindeutig genug waren. Die Prozessierung der Intensitätsdaten erfolgte deshalb zunächst in P422. Durch die Lösung des molekularen Ersatzes zeigte sich, dass P4(2)22 die richtige Raumgruppe war. Trägt man den Quotienten aus den gemessenen Intensitäten und den theoretischen Streuintensitäten ungeordneter Atome gegen die Auflösung auf, so erhält man eine Abschätzung für den mittleren Temperaturfaktor (B) der Atome in der Einheitszelle (French & Wilson, 1978).

______125 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

14

12 log()

10

0 0,02 0,04 0,06 sin2(θ)/λ 2

Abb. 4.43: Wilsondiagramm des TC10∆C·GDP Datensatzes. Die Abbildung zeigt die Intensitätsverteilung (log()) in Abhängigkeit von der Auflösung (20-2,2 Å) in Einheiten von sin2 ()θ / λ2 .

Das Wilsondiagramm des TC10∆C·GDP Datensatzes ist in Abb. 4.43 dargestellt. Es wurden die Intensitätsdaten im Auflösungsbereich von 20 bis 2,2 Å verwendet. Die Auflösung ist in Einheiten von sin2 ()θ / λ2 aufgetragen, mit λ der Wellenlänge des Röntgenlichts und θ als Beugungswinkel. Nach linearer Regression ergibt sich aus dem y-Achsenabschnitt der Skalierungsfaktor des Datensatzes (13,98), mit dem die Strukturfaktoramplituden der Atome relativ zu der eines Elektrons normiert werden können. Aus der Steigung der Geraden erhält man den mittleren Temperaturfaktor (B = 38 Å2). Die nachfolgende Tabelle (Tab. 4.16) fasst die wesentlichen Kristallparameter und die Statistik der Datenprozessierung zusammen.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 126 ERGEBNISSE ______

Tab. 4.16: Datenprozessierung von TC10∆C GDP Kristall Abmessungen (mm) 0,2 x 0,2 x 0,5 Alter (d) 21 Raumgruppe P4(2)22 / Nr. 93 Einheitszelle (D) a = b = 113,3 c = 84,0 α = β = γ = 90° 3 VM (D /Da) 3,4 Zahl der Moleküle pro asym. Einheit 2 Lösungsmittelgehalt (%) 63,2 Auflösungbereich (D) 20 - 2,2 Mosaizität (°) 0,8

Statistik 1. Teil 2. Teil Zahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 190125 / 28315 79056 / 28085 Redundanz (-fach) 6,7 2,8 Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 10,1 / 43,8 6,7 / 27,4 Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 99,8 / 100 99,8 / 99,0 Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 12,39 / 4,38 9,78 / 3,47

Der zweite Teil der Datensammlung zeigt einen deutlich niedrigeren R-Faktor für den

Vergleich der symmetrieverwandten Reflexe (Rsym = 6,7 % vgl. zu 10,1 %) und war ausreichend vollständig, so dass für die weitere Strukturaufklärung nur dieser zweite Teil verwendet wurde. Die Ursache für diesen Unterschied könnte die Verwendung des kleineren ∆ϕ-Winkels während der Datensammlung sein (Tab. 4.15), da dadurch die einzelnen Reflexe besser voneinander getrennt sind. Dies macht sich, bedingt durch die starken Reflexe, besonders im niedrigen Auflösungsbereich bemerkbar. Für einen molekularen Ersatz ist es wichtig, die Anzahl der Moleküle in der Einheitszelle bzw. in der asymmetrischen Einheit abschätzen zu können. Hierzu ermittelt man zunächst aus den Zellkonstanten das Volumen der Einheitszelle. Die Divison durch die Masse der darin 3 enthaltenen Proteinatome definiert dann den Matthewsparameter VM (Å /Da). Da ein durchschnittlicher Proteinkristall etwa zu 50 % Wasser enthält, liegt dieser Wert für Proteinkristalle zwischen 1,7 und 3,0 Å3/Da mit einem Durchschnittswert von 2,6 Å3/Da (Matthews, 1968). Das Zellvolumen liegt in diesem Fall bei 1078300 Å3. Das Molekulargewicht von TC10∆C beträgt etwa 20 kDa. Aufgrund der tetragonalen Symmetrie ist die Einheitszelle aus acht asymmetrischen Einheiten aufgebaut. Mit einem Molekül TC10∆C pro asymmetrischer Einheit ergibt sich daher ein Matthews Koeffizient von 6,7. Mit zwei Molekülen erhält man einen Wert von 3,4 bzw. mit drei Molekülen einen von 2,2. Dementsprechend sind zwei bis drei Moleküle TC10∆C pro asymmetrischer Einheit am wahrscheinlichsten. Der molekulare Ersatz zeigte, dass zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit enthalten waren.

______127 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

TC10∆C GppNHp

Um die Kristalle von TC10∆C·GppNHp mit einem Kryoprotektionsmittel zu schützen, wurden Lösungen von Glycerol, PEG 3350, PEG400, Xylitol und Sucrose mit der Reservoirlösung 100 mM MES pH 6,0, 200 mM NaCl und 20 % PEG 3350 vermischt. Als geeignet erwies sich eine Lösung von 100 mM MES pH 6,0, 200 mM NaCl und 20 % PEG 3350 und 15 % Glycerol. Von einem der erhaltenen TC10∆C·GppNHp Kristalle wurde an der ESRF (European Syncrotron Radiation Facility) Röntgenquelle ID14-EH1 ein nativer Datensatz aufgenommen. Einige der verwendeten Messparameter sind in Tabelle 4.17 zusammengefasst. Die maximale Auflösung dieser Kristalle betrug 2,6 Å.

Tab. 4.17: Datensammlung an TC10∆C GppNHp Anzahl der Bilder 145 Detektor ADSC Q4 CCD Röntgenquelle ESRF ID14-EH1 Wellenlänge (λ, D) 0,934

Anzahl der Oszillationen 1 Startwinkel (ϕ, °) 0 Endwinkel (ϕ, °) 145 Winkel pro Bild (°) 1 Detektor-Abstand (mm) 225 Maximale Auflösung (D)2,6

Die Indizierung und Integration der gemessenen Intensitäten wurde mit XDS (Kabsch, 1993) durchgeführt. Durch die Indizierung des Datensatzes konnte die Raumgruppe auf ein primitiv orthogonales Gitter eingeschränkt werden. Charakteristisch hierfür sind drei senkrecht zueinander stehende Achsen (P222). Das Vorliegen einer Schraubenachse war wahrscheinlich, da jeder zweite Reflex auf allen drei hkl-Achsen systematisch abwesend war. Für 73 der gemessenen systematisch abwesenden Reflexionen betrug die mittlere gemessene Intensität dieser Reflexe 1,7 % der mittleren Gesamtintensität. Die danach wahrscheinlichste Raumgruppe war P2(1)2(1)2(1). Da die Aussagen auf der Basis der systematischen Abwesenheiten nicht immer absolut eindeutig sind, erfolgte die Prozessierung der Intensitätsdaten zunächst in P222. Der molekulare Ersatze zeigte, dass P2(1)2(1)2(1) die richtige Raumgruppe war.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 128 ERGEBNISSE ______

14

12 log()

10

8 0 0,02 0,04 sin2(θ)/λ 2

Abb. 4.44: Wilsondiagramm des TC10∆C·GppNHp Datensatzes. Die Abbildung zeigt die Intensitätsverteilung (log()) in Abhängigkeit von der Auflösung (20-2,6 Å) in Einheiten von sin2 ()θ / λ2 .

Das Wilsondiagramm des TC10∆C·GppNHp Datensatzes zeigt in Abb. 4.44 die Intensitätsdaten im Auflösungsbereich von 20 bis 2,6 Å. Der Skalierungsfaktor des Datensatzes beträgt 13,014, während der mittlere Temperaturfaktor des Datensatzes B = 58 Å2 beträgt. Die wesentlichen Kristallparameter und die Statistik der Datenprozessierung sind in Tabelle 4.18 zusammengefasst.

Tab. 4.18: Datenprozessierung von TC10∆C GppNHp Kristall Abmessungen (mm) 0,1 x 0,1 x 0,4 Alter (d) 7 Raumgruppe P2(1)2(1)2(1) / Nr. 19 Einheitszelle (D) a = 43,69 b = 82,20 c = 114,31 α = β = γ = 90° 3 VM (D /Da) 2,6 Zahl der Moleküle pro asym. Einheit 2 Lösungsmittelgehalt (%) 51,7 Auflösungbereich (D) 20 - 2,6 Mosaizität (°) 1,4

Statistik Zahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 75580 / 13159 Redundanz (-fach) 5,7 Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 4,8 / 34,8 Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 99,4 / 100 Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 22,37 / 5,41

______129 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Das Zellvolumen liegt in diesem Fall bei 410523 Å3. Das Molekulargewicht von TC10∆C beträgt etwa 20 kDa. Aufgrund der orthogonalen Symmetrie ist die Einheitszelle aus 4 asymmetrischen Einheiten aufgebaut. Mit einem Molekül TC10∆C pro asymmetrischer ergibt sich ein Matthews Koeffizient von 5,1 Å3/Da. Mit zwei Molekülen erhält man einen Wert von 2,6 Å3/Da. Durch den molekularen Ersatz konnten zwei Moleküle pro asymmetrischer Einheit bestätigt werden.

TC10∆NC GDP

Zur Kryoprotektion wurden die Kristalle von TC10∆NC·GDP in Lösungen von Glycerol, PEG 3350, PEG400, Xylitol und Sucrose vermischt mit der Reservoirlösung aufgenommen.

Als geeignet erwies sich eine Lösung von 200 mM CaCl2 und 15 % PEG 3350 und 20 % Glycerol. Da die Kristalle beim direkten Transfer in das Kryoprotektionsmittel an Ordnung verloren, erfolgte ein serieller Transfer mit ansteigenden Glycerolkonzentrationen (5 %, 10 %, 15 % und 20 %). Die Verweildauer der Kristalle betrug in den jeweiligen Lösungen etwa 1 min. Mit dem seriellen Transfer konnten die Kristalle dann unter kryogenen Bedingungen stabilisiert werden. Ebenfalls sehr gute Kryoprotektionseigenschaften wurden mit Mineral-Öl (Sigma) erzielt. Hierbei wurde der Kristall direkt in das Öl transferiert, von der ihn umgebenden Mutterlösung befreit und dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Von einem TC10∆NC·GDP Kristall aus 180-210 mM CaCl2 und 14-16 % PEG 3350 wurde an der ESRF (European Syncrotron Radiation Facility) Röntgenquelle ID14-EH4 ein nativer Datensatz aufgenommen. Einige der verwendeten Messparameter sind in Tabelle 4.19 zusammengefasst.

Tab. 4.19: Datensammlung an TC10∆NC GDP 1. Teil 2. Teil 3. Teil Anzahl der Bilder 100 240 120 Detektor ADSC Q4 CCD ADSC Q4 CCD ADSC Q4 CCD Röntgenquelle ESRF ID14-EH4 ESRF ID14-EH4 ESRF ID14-EH4 Wellenlänge (λ, D) 0,9198 0,9198 0,9198

Anzahl der Oszillationen 1 1 1 Startwinkel (ϕ, °) 05555 Endwinkel (ϕ, °) 30 127 127 Winkel pro Bild (°) 0,3 0,3 0,6 Detektor-Abstand (mm) 215 215 335 Maximale Auflösung (D) 2,06 2,06 2,45

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 130 ERGEBNISSE ______

Die Indizierung und Integration der gemessenen Intensitäten wurde mit XDS (Kabsch, 1993) durchgeführt. Durch die Indizierung des Datensatzes konnte die Raumgruppe auf ein tetragonales Gitter eingeschränkt werden. Charakteristisch hierfür sind eine vierzählige und zwei dazu senkrecht stehende zweizählige Achsen (P422). Das Vorliegen einer Schraubenachse (P4(3)22) war wahrscheinlich, da nur jeder vierte Reflex auf der l-Achse systematisch vorhanden war. Für 72 der gemessenen systematisch abwesenden Reflexionen betrug die mittlere gemessene Intensität dieser Reflexe 3,6 % der mittleren Gesamtintensität. Da die Aussagen auf der Basis der systematischen Abwesenheiten nicht immer absolut eindeutig sind erfolgte die Prozessierung der Intensitätsdaten zunächst in P422. Durch die Lösung des molekularen Ersatzes zeigte sich, dass P4(3)22 die richtige Raumgruppe war.

14

12 log()

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0 0,02 0,04 0,06 sin2(θ)/λ 2

Abb. 4.45: Wilsondiagramm des TC10∆NC·GDP Datensatzes. Die Abbildung zeigt die Intensitätsverteilung (log()) in Abhängigkeit von der Auflösung (20-2,2 Å) in Einheiten von sin2 ()θ / λ2 .

Das Wilsondiagramm (Abb. 4.45) zeigt den Auflösungsbereich von 20 bis 2,2 Å. Als Faktor für die Skalierung der Daten ergibt sich ein Wert von 14,3. Der mittlere Temperaturfaktor ist B = 36,3 Å2.

______131 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Tabelle 4.20 zeigt die Statistik der Datenprozessierung.

Tab. 4.20: Datenprozessierung von TC10∆NC GDP Kristall Abmessungen (mm) 0,05 x 0,05 x 0,8 Alter (d) 7 Raumgruppe P4(3)22 / Nr. 95 Einheitszelle (D) a = b = 73,87 c = 289,95 α = β = γ = 90° 3 VM (D /Da) 2,5 Zahl der Moleküle pro asym. Einheit 4 Lösungsmittelgehalt (%) 49,9 Auflösungbereich (D) 20 - 2,2 Mosaizität (°) 1,25

Statistik Zahl der Reflexe/Zahl der unabhängigen Reflexe 395458 / 39621 Redundanz (-fach) 9,98 Rsym (%, alle Reflexe, äußere Schale) 7,4 / 15,5 Vollständigkeit (%, alle Reflexe, äußere Schale) 94,2 / 84,5 Signal/Rausch-Verhältnis (alle Reflexe, äußere Schale) 20,74 / 11,32

Das Zellvolumen liegt in diesem Fall bei 1582193 Å3. Aufgrund der tetragonalen Symmetrie ist die Einheitszelle aus 8 asymmetrischen Einheiten aufgebaut. Mit einem Molekül TC10∆NC pro asymmetrischer Einheit ergibt sich ein Matthews Koeffizient von 9,9 Å3/Da. Mit zwei Molekülen erhält man einen Wert von 4,9 Å3/Da, mit drei 3,3 Å3/Da und mit vier 2,5 Å3/Da. Demnach sind drei bis fünf Moleküle wahrscheinlich. Der molekulare Ersatz zeigte, dass vier Moleküle in der asymmetrischen Einheit enthalten sind.

4.5.5 Eigenrotationsfunktionen

Die Eigenrotationsfunktion vergleicht die Eigen-Patterson-Funktion mittels einer Rotation um ein Winkelinkrement mit sich selbst. Dadurch entstehen Maxima bei allen Rotationswinkeln, die einer kristallographischen bzw. nichtkristallographischen Symmetrieoperation entsprechen. Bei der Berechnung der Patterson-Funktion geht die Information für die Translation verloren. Daraus folgt, dass die Rotationsfunktionen für alle durch Translation (Schraubenachsen) abgeleiteten Raumgruppen gleich sind. Ist in einer asymmetrischen Einheit mehr als ein Molekül vorhanden, so sind die beiden Moleküle durch eine nichtkristallographische Symmetrieoperation (NCS) miteinander verwandt. Diese zusätzliche Symmetrie kann unter Umständen in der Eigenrotationsfunktion beobachtet werden, so dass die Eigenrotationsfunktion Aufschluss über den Aufbau des

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 132 ERGEBNISSE ______

Kristalls gibt. Da in allen drei beschriebenen Datensätzen mehr als ein Molekül pro asymmetrischer Einheit erwartet wurde, war eine Interpretation der Eigenrotationsfunktion von besonderem Interesse.

TC10∆C·GDP

Für die Berechnung der Eigenrotationsfunktion des TC10∆C·GDP Datensatzes wurde das Programm POLARRFN (CCP4, 1994) verwendet. Es berechnet die Maxima der Rotationsfunktion in Polarkoordinaten (ω, θ, mit Drehwinkel κ). Die wahrscheinlichste nicht- kristallographische Symmetrie für Proteinkristalle entspricht einer zweizähligen Achse, die durch die κ = 180° Sektion repräsentiert wird. Die Eigenrotationsfunktion für diesen Datensatz ist in Abb. 4.46 dargestellt.

Abb. 4.46: Stereographische Projektion der κ = 180° Sektion der Eigenrotationsfunktion des TC10∆C·GDP Datensatzes. Die Berechnung erfolgte mit dem Programm POLARRFN (CCP4, 1994). Es wurden Daten im Auflösungsbereich 10-5 Å mit einem Integrationsradius von 28 Å verwendet. Die Konturierung erfolgte bei 50 % der Gesamtsignalhöhe.

TC10∆C·GDP kristallisierte in einer tetragonalen Raumgruppe (P422), so dass eine vierzählige und zwei dazu senkrechte zweizählige Achsen zu erwarten sind. Da die κ = 180° Sektion entlang der vierzähligen Hauptachse in die Ebene projiziert ist, erscheint diese in der Mitte der Projektion. Alle Maxima, die auf dem Rand des Kreises liegen, beschreiben Achsen, die im rechten Winkel auf der vierzähligen Achse stehen mit ω = 90°. Die Position dieser Maxima auf dem Kreisrand wird wiederum durch den Winkel θ beschrieben. Er ist am Rande des Kreises angegeben. Bedingt durch die tetragonale Symmetrie ist die Information in der Rotationsfunktion redundant, so dass die asymmetrische Einheit durch den Winkelbereich θ = 0°-45° vollständig beschrieben ist. Dabei entsprechen die Maxima bei θ = 0° und 45° jeweils

______133 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______den beiden zweizähligen Achsen und sind somit kristallographischen Ursprungs (Abb. 4.46). Der Vergleich zu Abb. 4.48, in der die Rotationsfunktion des TC10∆NC·GDP Datensatzes dargestellt ist, der ebenfalls eine tetragonale Symmetrie besitzt, zeigt, dass im TC10∆C·GDP ein zusätzliches Maximum zwischen 0° und 45° vorhanden ist (θ = 22,5° mit 91 % der Gesamtsignalhöhe). Damit kann man sagen, dass mindestens zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit vorliegen müssen, die durch die eben beschriebene NCS miteinander verwandt sind. Es besteht aber nach wie vor die Möglichkeit eines dritten Moleküls, das nicht in der Eigenrotationsfunktion gefunden wurde. Eine endgültige Entscheidung hierzu kann erst nach dem molekularen Ersatz getroffen werden.

TC10∆C·GppNHp

Die Eigenrotationsfunktion des TC10∆C·GppNHp Datensatzes ist in der folgenden Abbildung 4.47 dargestellt. Da dieses Protein in einer orthogonalen Raumgruppe (P222) kristallisierte, sind drei zueinander senkrechte zweizählige Achsen zu erwarten. Die κ = 180° Sektion zeigt die erste zweizählige Achse im Mittelpunkt der Projektion. Maxima auf dem Kreisrand (ω = 90°) entsprechen wieder Achsen, die zu der ersten senkrecht stehen. Bei θ = 0° und θ = 90° sind jeweils Maxima zu erkennen, die der zweiten und dritten Achse entsprechen, so dass die asymmetrische Einheit vollständig durch den Bereich θ = 0°-90° beschrieben wird. Da hier keine zusätzlichen Maxima zu erkennen sind, ist zunächst keine Aussage über das Vorliegen bzw. die Beschaffenheit einer NCS möglich.

Abb. 4.47: Stereographische Projektion der κ = 180° Sektion der Eigenrotationsfunktion des TC10∆C·GppNHp Datensatzes. Die Berechnung erfolgte mit dem Programm POLARRFN (CCP4, 1994). Es wurden Daten im Auflösungsbereich 10-5 Å mit einem Integrationsradius von 28 Å verwendet. Die Konturierung erfolgte bei 50 % der Gesamtsignalhöhe.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 134 ERGEBNISSE ______

TC10∆NC GDP

Die Eigenrotationsfunktion des TC10∆NC·GDP Datensatzes ist in Abbildung 4.48 dargestellt. Da dieses Protein ebenfalls wie TC10∆C·GDP in einer tetragonalen Raumgruppe kristallisierte, lassen sich die Eigenrotationsfunktionen gut miteinander vergleichen. Da hier z.B. im Vergleich zu Abb. 4.46 (TC10∆C·GDP) keine zusätzlichen Maxima zu erkennen sind, kann keine Aussage über die Beschaffenheit einer NCS gemacht werden.

Abb. 4.48: Stereographische Projektion der κ = 180° Sektion der Eigenrotationsfunktion des TC10∆NC·GDP Datensatzes. Die Berechnung erfolgte mit dem Programm POLARRFN (CCP4, 1994). Es wurden Daten im Auflösungsbereich 10-5 Å mit einem Integrationsradius von 28 Å verwendet. Die Konturierung erfolgte bei 50 % der Gesamtsignalhöhe.

4.5.5 Molekularer Ersatz

TC10∆C GDP

Um eine Lösung für das Phasenproblem bei TC10∆C·GDP durch molekularen Ersatz zu finden, wurde die strukturelle Information eines sehr ähnlichen Proteins benötigt. Dieses dient dann als Suchmodell und wird durch Rotation und anschließende Translation im reziproken Gitter des gemessenen Datensatzes platziert. Für den Molekularen Ersatz von TC10∆C·GDP wurde das Programm AMoRe (Navaza, 1993) verwendet. Als Suchmodell diente das Molekül A der Cdc42 Struktur (PDB Code: 1A4R, Rudolph et al., 1999), aus dem die beiden Schalterregionen (Switch I und II), das Magnesiumion, das Nukleotid und die β2/β3-Region entfernt wurden. Da auf der Basis der Indizierung noch keine absolut eindeutige Aussage bezüglich der Raumgruppe möglich ist,

______135 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______wurden zunächst die Raumgruppen P4(2)22 und P4(2)2(1)2 verwendet. Weiterhin wurden die Auflösungsbereiche für die Rotations- und die Translationssuche variiert, sowie der Integrationsradius. In der P4(2)22 Raumgruppe wurde eine eindeutige Lösung mit zwei Molekülen pro asymmetrischer Einheit gefunden. Die Parameter der Lösung sind in Tabelle 4.21 zusammengefasst.

Tab. 4.21: Molekularer Ersatz für TC10∆C GDP Suchmodell Cdc42 (Rudolph et al , 1999) Auflösungsbereich Rotation / Translation (D) 10,0-5,0 / 8,0-4,0 Pattersonradius (D)22 Rotation für Molekül 1 (Eulerwinkel) 13,7 / 45,35 / 255,29 Translation für Molekül 1 (orthogonales System, D) -28,99 / 121,21 / 28,23 Rotation für Molekül 2 (Eulerwinkel) 57,40 / 44,45 / 252,83 Translation für Molekül 2 (orthogonales System, D) 7,60 / 70,19 / 45,92 Korrelationskoeffizient / R-Faktor 47,7 / 46,0 Korrelationskoeffizient / R-Faktor (der besten falschen Lsg.) 32,6 / 51,7

Der Korrelationskoeffizient und der R-Faktor dienen als Güteparameter für eine Lösung. Für eine gute Lösung sollten sie sich um etwa 10 % von der nächstbesten falschen Lösung abheben. Dies ist hier gegeben: der Unterschied zwischen den Korrelationskoeffizienten beträgt 15 %, der zwischen den R-Faktoren 5,7 %. Das verwendete Cdc42-Modell wurde mit den angegebenen Parametern rotiert und translatiert. Die sterische Korrektheit der Lösung wurde anhand der Packung der symmetrieverwandten Moleküle überprüft. Die anschliessend berechnete Elektronendichtekarte zeigte eindeutig positive Dichte an den erwarteten Nukleotidpositionen, so dass man von der Korrektheit der Lösung ausgehen kann (das Nukleotid war nicht im Modell enthalten).

TC10∆C GppNHp

Für den Molekularen Ersatz von TC10∆C·GppNHp wurde das Programm Molrep (CCP4, 1994) verwendet. Als Suchmodell diente die TC10∆C·GDP-Struktur, aus der das Magnesiumion und das Nukleotid entfernt wurden. Da auf der Basis der Indizierung noch keine absolut eindeutige Aussage bezüglich der Raumgruppe möglich ist, wurden hier alle in Frage kommenden Raumgruppen (P222, P222(1), P2(1)2(1)2 und P2(1)2(1)2(1)) verwendet. Für die Rotations- und die Translationssuche wurde der Auflösungsbereich von 20,0 – 4,0 Å verwendet. Der Integrationsradius betrug 23 Å. In der P2(1)2(1)2(1) Raumgruppe wurde eine eindeutige Lösung mit zwei Molekülen pro asymmetrischer Einheit gefunden. Die Parameter der Lösung sind in Tabelle 4.22 zusammengefasst. ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 136 ERGEBNISSE ______

Tab. 4.22: Molekularer Ersatz für TC10∆C GppNHp Suchmodell TC10∆C GDP Auflösungsbereich Rotation/Translation (D) 20,0-4,0 Pattersonradius (D)23 Rotation für Molekül 1 (Eulerwinkel) 55,95 / 90,0 / 142,38 Translation für Molekül 1 (fraktional) 0,305 / 0,120 / 0,371 Rotation für Molekül 2 (Eulerwinkel) 55,95 / 90,0 / 142,38 Translation für Molekül 2 (fraktional) 0,811 / 0,257 / 0,874 Korrelationskoeffizient / R-Faktor 58,9 / 45,3 Korrelationskoeffizient / R-Faktor (der besten falschen Lsg.) 25,6 / 57,9

Der Korrelationskoeffizient der Lösung beträgt 58,9%, während der R-Faktor einen Wert von 45,3% hat. Wie der Tabelle 4.22 zu entnehmen ist, sind die beiden Moleküle der asymmetrischen Einheit durch eine Translation miteinander verwandt. Der Vektor für die Transformation von Molekül B nach Molekül A ist gegeben durch x = -0,496, y = -0,188 und z = -0,498. Eine derartige reine Translation sollte in einer nativen Pattersondichte als Maximum zu erkennen sein und dient damit als zusätzliche Bestätigung der Richtigkeit der Lösung.

Abb. 4.49: U-V-Ebene bei W = 0,5 der nativen Pattersondichte des TC10∆C·GppNHp Datensatzes. Die Berechnung erfolgte mit dem Programm FFT (CCP4, 1994). Es wurden Daten im Auflösungsbereich 20-4 Å verwendet. Die Konturierung erfolgte bei 15 % der Gesamtsignalhöhe in Schritten von 3 %. Das Maximum entspricht 35 % der Gesamtsignalhöhe.

Abbildung 4.49 zeigt die U-V-Ebene bei W = 0,5 (die Koordinaten des realen Raums x, y und z, werden im Pattersonraum durch U, V und W wiedergegeben) der nativen Pattersondichte von TC10∆C·GppNHp. Deutlich zu erkennen sind die beiden Maxima bei U = 0,5 und V = 0,188 bzw. V = 0,812.

______137 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

TC10∆NC GDP

Der Molekulare Ersatz für TC10∆NC·GDP erfolgte ebenfalls mit Molrep (CCP4, 1994). Als Suchmodell diente auch hier die TC10∆C-GDP Struktur, aus der das Magnesiumion und das Nukleotid entfernt wurden. Da auf der Basis der Indizierung P4(3)22 die wahrscheinlichste Raumgruppe war, wurde zunächst diese verwendet. Für die Rotations- und die Translationssuche wurde der Auflösungsbereich von 20,0 – 3,0 Å verwendet. Der Integrationsradius betrug 30 Å. In der tetragonalen P4(3)22 Raumgruppe wurde eine eindeutige Lösung mit vier Molekülen pro asymmetrischer Einheit gefunden. Tabelle 4.23 zeigt die Parameter der Lösung.

Tab. 4.23: Molekularer Ersatz für TC10∆NC GDP Suchmodell TC10∆C GDP Auflösungsbereich Rotation/Translation (D) 20,0-3,0 Pattersonradius (D)30 Rotation für Molekül 1 (Eulerwinkel) 37,27 / 90,00 / 269,86 Translation für Molekül 1 (fraktional) 0,187 / 0,981 / 0,437 Rotation für Molekül 2 (Eulerwinkel) 38,22 / 90,00 / 317,85 Translation für Molekül 2 (fraktional) 0,234 / 0,294 / 0,932 Rotation für Molekül 3 (Eulerwinkel) 56,17 / 87,38 / 141,61 Translation für Molekül 3 (fraktional) 0,489 / 0,201 / 0,825 Rotation für Molekül 4 (Eulerwinkel) 35,70 / 90,00 / 257,76 Translation für Molekül 4 (fraktional) 0,233 / 0,756 / 0,939 Korrelationskoeffizient / R-Faktor 51,4 / 43,6

4.5.6 Modellbau, Strukturverfeinerung und Qualität der Modelle

TC10∆C GDP

Mit der erhaltenen Lösung des molekularen Ersatzes (AMoRe) wurde aus dem Suchmodell die asymmetrische Einheit des TC10∆C·GDP-Kristalls konstruiert. Als Startmodell diente das Molekül A der Cdc42 Struktur (PDB Code: 1A4R, Rudolph et al., 1999), aus dem die beiden Schalterregionen (Switch I und II), das Magnesiumion, das Nukleotid und die β2/β3-Region entfernt wurden. Alle nicht-identischen Aminosäuren zwischen Cdc42 und TC10 wurden zu Alanin mutiert. Eine erste berechnete composite omit-Elektronendichte wurde dazu verwendet, die Lage der Aminosäuren zu überprüfen und zu korrigieren. Seitenkettenatome wurden, wo möglich, eingebaut, ebenso wie Teile der fehlenden Regionen (Switch I und II, Magnesiumion, Nukleotid und die β2/β3-Region). Das so erhaltene Modell wurde durch iterative Runden von Verfeinerungen (simulated annealing, CNS; Brünger et al., 1998) und

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 138 ERGEBNISSE ______

Elektronendichteinterpretation in O (Jones et al., 1991) vervollständigt. Die letzten Schritte der Verfeinerung erfolgten durch REFMAC5 (CCP4, 1994). Die Verwendung der TLS Option, wobei die Moleküle A und B der asymmetrischen Einheit separat behandelt wurden, resultierte in einer Verringerung des freien R-Faktors. Nach etwa 20 Zyklen wurde ein Modell erhalten, dessen freier R-Faktor nicht mehr verringerbar war. Tabelle 4.24 gibt einen Überblick über die Verfeinerung und die geometrischen Eigenschaften des finalen Modells.

Tab. 4.24: Strukturverfeinerung von TC10∆C GDP Statistik Auflösungbereich (D) 20,0-2,20 Anzahl der Reflexe 26573 Atome in asymmetrischer Einheit 3087 GDP+Mg2+ 58 Mg2+ 2 Wassermoleküle 237 ungeordnetes Lösungsmittel (k, B) (e/D3, D2) 0,802 / 250 Rcryst / Rfree (%) 17,3 / 20,9 Größe des Testsets (%) 5

Stereochemische Parameter Standardabweichung der Bindungslängen / -winkel (D, °) 0,024 / 2,026 Proteinatome 1. Mol / 2. Mol (D2) 27,0 / 28,7 GDP+Mg2+ 1. Mol / 2. Mol (D2) 20,6 / 21,3 mittlerer Koordinatenfehler nach Luzzati (1952) (D2) 0,303

Molekül A Molekül B

60 60

40 40 Mittlerer Temperaturfaktor Mittlerer Temperaturfaktor 20 20 25 35 45 55 65 75 85 95 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 125 135 145 155 165 175 185 195 105 115 125 135 145 155 165 175 185 195 Aminosäure Aminosäure Abb. 4.50: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆C·GDP. Aufgetragen sind die gemittelten Temperaturfaktoren der beiden Moleküle A und B der asymmetrischen Einheit gegen die Sequenzposition.

Beide Moleküle der asymmetrischen Einheit zeigen die Aminosäuren 16 bis 193. Die Aminosäuren 2 bis 15, sowie die zwei artifiziellen durch die Thrombinolyse am N-Terminus

______139 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______verbleibenden Reste (Gly-Ser) waren in den Elektronendichtekarten nicht interpretierbar. Für den Switch II Bereich war der Verlauf der Polypeptidkette nur schwierig zu interpretieren, wie auch an den hohen Temperaturfaktoren zu erkennen ist (Abb. 4.50). Um die relative Mobilität einzelner Bereiche in der Struktur abzuschätzen wurden die gemittelten Temperaturfaktoren der Aminosäuren gegen die Sequenzposition aufgetragen (Abb. 4.50). Die oft sehr mobilen Switch Regionen (Switch I: 43 bis 52, Switch II: 73 bis 86) zeigen auch in dieser Struktur im Vergleich zum übrigen Protein hohe Werte für den Temperaturfaktor, ebenso wie die N- und C-terminalen Regionen der jeweiligen Moleküle. Das endgültige Modell besteht aus zwei Molekülen TC10∆C, die als Liganden jeweils GDP und ein Magnesiumion (Mg2+) gebunden haben (Abb. 4.51). Der kristallographische R-Faktor des Modells beträgt 17,3 %, während der freie R-Faktor bei 20,9 % liegt.

A B

Abb. 4.51: Ansicht der asymmetrischen Einheit A) und der Kristallpackung B) eines TC10∆C·GDP Kristalls. A Die beiden Moleküle der asymmetrischen Einheit. Deutlich zu erkennen sind die beiden zusätzlichen Magnesiumionen im Schleifenbereich β2/β3. B Projektion der Einheitszelle entlang der z-Achse. Die TC10∆C·GDP Kristallpackung mit der asymmetrischen Einheit in gelb.

Die sterisch sinnvolle Verteilung der φ/ψ-Winkel der beiden Moleküle geht aus dem nachfolgend dargestellten Ramachandran Diagramm (Abb. 4.52; Ramachandran & Sasisekharan, 1968; Laskowski et al., 1993) hervor. 93,2 % aller nicht Gly-Reste haben φ/ψ- Winkel in den bevorzugten Bereichen. 6,5 % der Aminosäuren liegen in zusätzlich erlaubten Bereichen, während lediglich eine Aminosäure (0,3 %, Met17A) in einem großzügig erlaubten Bereich anzutreffen ist.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 140 ERGEBNISSE ______

Abb. 4.52: Ramachandran-Diagramm von TC10∆C·GDP.

TC10∆C GppNHp

Mit der erhaltenen Lösung des molekularen Ersatzes (MOLREP) wurde aus dem Suchmodell (TC10∆C) die asymmetrische Einheit des TC10∆C·GppNHp Kristalls konstruiert. Als Startmodell diente die TC10∆C·GDP-Struktur, aus der die beiden Schalterregionen (Switch I und II), das Magnesiumion und das Nukleotid entfernt wurden. Die Verfeinerung erfolgte analog zur TC10∆C·GDP-Struktur. Unterschiedlich war hier nur, dass während der gesamten Verfeinerung die beiden Moleküle der asymmetrischen Einheit durch die NCS eingeschränkt wurden (siehe Tab. 4.25). Dies ist bedingt durch die niedrigere Auflösung dieser Struktur und dem daraus resultierenden Observationen/Parameter Verhältnis von 1,2. Dabei sind die Observationen die Anzahl der gemessenen Reflexe. Die Parameter sind gegeben durch die Anzahl der Atome in der asymmetrischen Einheit und die vier Parameter für jedes Atom die anhand der gemessenen Daten verfeinert werden müssen (x, y, z und B). Die letzten Schritte der Verfeinerung erfolgten durch REFMAC5 (CCP4, 1994) unter Verwendung der TLS Option und der NCS Einschränkung. Nach etwa 20 Zyklen wurde ein Modell erhalten, dessen freier R-Faktor nicht mehr verringerbar war. Tabelle 4.25 gibt einen Überblick über die Verfeinerung und die geometrischen Eigenschaften des finalen Modells. Das erste Molekül umfasst die Aminosäuren 8 bis 193, genauso wie das zweite Molekül. Die Aminosäuren 2 bis 7, sowie die zwei artifiziellen durch die Thrombinolyse am N-Terminus verbleibenden Reste (Gly-Ser) waren in den Elektronendichtekarten nicht interpretierbar.

______141 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Tab. 4.25: Strukturverfeinerung von TC10∆C GppNHp Statistik Auflösungbereich (D) 19,84 - 2,65 Anzahl der Reflexe 11826 Atome in asymmetrischer Einheit 2935 GppNHp+Mg2+ 66 Mg2+ 2 Wassermoleküle 13 ungeordnetes Lösungsmittel (k, B) (e/D3, D2) 0,614 / 250 Rcryst / Rfree (%) 21,0 / 26,0 Größe des Testsets (%) 5 NCS Gruppierung (Aminosäuren) 10-135 / 136-150 / 151-201

Stereochemische Parameter Standardabweichung der Bindungslängen / -winkel (D, °) 0,018 / 1,755 Proteinatome 1. Mol / 2. Mol (D2) 34,28 / 33,73 GppNHp+Mg2+ 1. Mol / 2. Mol (D2) 25,31 / 25,84 mittlerer Koordinatenfehler nach Luzzati (1952) (D2) 0,507

Um die relative Mobilität einzelner Bereiche in der Struktur abzuschätzen, wurden die gemittelten Temperaturfaktoren der Aminosäuren gegen die Sequenzposition aufgetragen (Abb. 4.53). Die oft sehr mobilen Switch Regionen (Switch I: 43 bis 52, Switch II: 73 bis 86) zeigen auch in dieser Struktur im Vergleich zum übrigen Protein hohe Werte für den Temperaturfaktor. Die jeweiligen N-Termini der Strukturen werden durch Ausbildung eines intermolekularen β-Faltblatts (z.B. Gly12B bis Leu16B, β1, mit Tyr54A bis Ser57A, β2) zwischen den beiden Molekülen der asymmetrischen Einheit stabilisiert. Die ist auch an den Temperaturfaktoren der N-Termini erkennbar.

Molekül A Molekül B

60 60

40 40 Mittlerer Temperaturfaktor Mittlerer Temperaturfaktor Mittlerer

20 20 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 Aminosäure Aminosäure Abb. 4.53: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆C·GppNHp. Aufgetragen sind die gemittelten Temperaturfaktoren der beiden Moleküle A und B der asymmetrischen Einheit gegen die Sequenzposition.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 142 ERGEBNISSE ______

Diese intermolekulare Interaktion der beiden Moleküle der asymmetrischen Einheit ließ vermuten, dass TC10∆C·GppNHp auch in Lösung als Dimer vorliegen könnte und damit diese Interaktion auch eine physiologische Bedeutung haben könnte. Durch analytische Gelfiltrationen konnten jedoch eindeutig gezeigt werden, dass TC10∆C·GppNHp in Lösung als Monomer vorliegt. Als Referenzen wurden hier TC10∆C·GDP, TC10∆NC·GDP und Standardmoleküle zur Säulenkalibrierung verwendet. Das endgültige Modell besteht aus zwei Molekülen TC10∆C, die als Liganden jeweils GppNHp und ein Magnesiumion (Mg2+) gebunden haben (Abb. 4.54). Der kristallographische R-Faktor des Modells beträgt 21,0 %, während der freie R-Faktor bei 26,0 % liegt.

A B

Abb. 4.54: Ansicht der asymmetrischen Einheit A) und der Kristallpackung B) eines TC10∆C·GppNHp Kristalls. A Die beiden Moleküle der asymmetrischen Einheit. In der Mitte der Abbildung ist das intermolekulare β-Faltblatt zu erkennen. B Projektion der Einheitszelle entlang der x-Achse. Die TC10∆C·GppNHp Kristallpackung mit der asymmetrischen Einheit in gelb.

Das Ramachandran-Diagramm (Abb. 4.55; Ramachandran & Sasisekharan, 1968; Laskowski et al., 1993) zeigt, dass 90,9 % aller nicht Gly-Reste φ/ψ-Winkel in den bevorzugten Bereichen haben. 7,9 % der Aminosäuren liegen in zusätzlich erlaubten Bereichen, während 1,3 % in großzügig erlaubten Bereichen anzutreffen sind.

______143 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Abb. 4.55: Ramachandran-Diagramm von TC10∆C·GppNHp.

TC10∆NC GDP

Anhand des molekularen Ersatzes wurde die asymmetrische Einheit des TC10∆NC·GDP Kristalls aufgebaut. Die weitere Verfeinerung erfolgte wie für TC10∆C·GDP beschrieben. Eine Statistik über den Verlauf der Verfeinerung und die geometrischen Eigenschaften des Modells zeigt Tabelle 4.26.

Tab. 4.26: Strukturverfeinerung von TC10∆NC GDP Statistik Auflösungbereich (D) 20,0 - 2,2 Anzahl der Reflexe 37568 Atome in asymmetrischer Einheit 5746 GDP+Ca2+ 116 Ca2+ 16 Wassermoleküle 217 ungeordnetes Lösungsmittel (k, B) (e/D3, D2) 0,756 / 250 Rcryst / Rfree (%) 19,4 / 24,3 Größe des Testsets (%) 5,1

Stereochemische Parameter Standardabweichung der Bindungslängen / -winkel (D, °) 0,02 / 1,78 Proteinatome 1. Mol. / 2. Mol. / 3. Mol. / 4. Mol. (D2) 25,9 / 21,5 / 29,2 / 32,7 GDP+Ca2+ 1. Mol. / 2. Mol. / 3. Mol. / 4. Mol. (D2) 17,2 / 15,7 / 17,9 / 21,2 mittlerer Koordinatenfehler nach Luzzati (1952) (D2) 0,303

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 144 ERGEBNISSE ______

Das erste Molekül umfasst die Aminosäuren 15-192, das zweite Molekül die Aminosäuren 16 bis 193, das dritte die Aminosäuren 15 - 192 und das vierte die Aminosäuren 18 - 192. Bedingt durch die Klonierung und die anschließende Proteasespaltung sind im Protein N- terminal sechs zusätzliche Aminosäuren enthalten (Gly-Ala-Met-Gly-Gly-Ser). Im Molekül A und C konnte jeweils das Serin (Aminosäure 14) noch aus der Dichte interpretiert werden. In den beiden anderen Molekülen sind diese Aminosäuren nicht enthalten, da sie in der Elektronendichte nicht erkennbar waren. Für die Aminosäuren Glu76 und Asp77 von Molekül B war die Dichte ebenfalls nicht einwandfrei zuzuordnen, so dass diese Aminosäuren ebenfalls nicht in das endgültige Modell aufgenommen wurden. Der Switch II-Bereich (Aminosäuren 76 bis 86) von Molekül D erscheint vollkommen unstrukturiert und wurde ebenfalls nicht ins das Modell aufgenommen. Ursache hierfür ist vermutlich ein benachbartes Molekül, das in diesen Bereich hineinragt und dadurch die Ausbildung der Sekundärstruktur des Moleküls D stört. Der insgesamt höhere Temperaturfaktor des Moleküls D ist ebenfalls auffällig und könnte seine Ursache wiederum in der zuvor genannten Deformation des Switch II haben (Abb. 4.56). Um die relative Mobilität einzelner Bereiche in der Struktur abzuschätzen wurden die gemittelten Temperaturfaktoren der Aminosäuren gegen die Sequenzposition aufgetragen (Abb. 4.56). Die oft sehr mobilen Switch Regionen (Switch I: 43 bis 52, Switch II: 73 bis 86) zeigen auch in dieser Struktur hohe Werte für den Temperaturfaktor. Besonders auffällig ist hier das Molekül C. Das endgültige Modell besteht aus vier Molekülen TC10∆NC, die als Liganden jeweils GDP und ein Calciumion (Ca2+) gebunden haben (Abb. 4.57). Der kristallographische R-Faktor des Modells beträgt 19,4 %, während der freie R-Faktor bei 24,3 % liegt.

______145 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Molekül A Molekül B

60 60

40 40

20 Mittlerer Temperaturfaktor Mittlerer Temperaturfaktor Mittlerer 20

0 20 30 40 50 60 70 80 90 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 190 Aminosäure Aminosäure Molekül C Molekül D

60 60

40 40

20 20 Mittlerer Temperaturfaktor Mittlerer Temperaturfaktor

0 0 20 30 40 50 60 70 80 90 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 Aminosäure Aminosäure

Abb. 4.56: Temperaturfaktoren der asymmetrischen Einheit von TC10∆NC·GDP. Aufgetragen sind die gemittelten Temperaturfaktoren der vier Moleküle A, B, C und D der asymmetrischen Einheit gegen die Sequenzposition. Deutlich zu erkennen sind die in Molekül D im Vergleich zu den anderen drei Molekülen erhöhten B-Faktoren (Aminosäuren 60-170).

Abbildung 4.58 (Ramachandran & Sasisekharan, 1968; Laskowski et al., 1993) zeigt das Ramachandran-Diagramm der 4 TC10∆NC·GDP Moleküle. 90,1 % aller nicht Gly-Reste haben Winkel in den bevorzugten Bereichen. 9,1 % der Aminosäuren liegen in zusätzlich erlaubten Bereichen, während 0,5 % in großzügig erlaubten Bereichen anzutreffen sind. Zwei Aminosäuren (Glu76A und Gln75C) besitzen nicht erlaubte φ/ψ-Winkel. Diese beiden Aminosäuren befinden sich jeweils am Anfang der Switch II Region und waren aus der Elektronendichte nicht anders zu interpretieren.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 146 ERGEBNISSE ______

A B

Abb. 4.57: Ansicht der asymmetrischen Einheit A) und der Kristallpackung B) eines TC10∆NC·GDP Kristalls. A Die vier Moleküle der asymmetrischen Einheit. B Projektion der Einheitszelle entlang der z-Achse. Die TC10∆NC·GDP Kristallpackung mit der asymmetrischen Einheit in gelb.

Abb. 4.58: Ramachandran-Diagramm von TC10∆NC·GDP.

______147 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

4.5.7 Vergleich der TC10 Strukturen

Im folgenden Abschnitt werden die drei TC10 Kristallstrukturen untereinander und mit anderen Mitgliedern der Rho-GTPase Familie (Cdc42 und Rac1) verglichen. Auf der Basis der Sequenzidentität ist dabei Cdc42 die am nächsten zu TC10 verwandte GTPase. Gemeinsamkeiten und Unterschiede sollen so herausgearbeitet werden.

4.5.7.1 Gemeinsamkeiten

Das zentrale Bauelement der TC10 Strukturen ist ein β-Faltblatt, das von sieben α-Helizes flankiert wird (Abb. 4.59). Das β-Faltblatt besteht aus sechs Strängen, von denen fünf antiparallel und einer parallel verlaufen. Von den sieben Helizes sind α1, α5, α6 und α7 regulär, während zwei kurze 310-helikale Bereiche die Switch II Region (α2) ausbilden. Der

N-terminale Bereich der Insert-Region besteht ebenfalls aus einer kurzen 310 Helix (α4) auf die die reguläre Helix α5 folgt. Die Helix α3 erscheint als zwei aufeinanderfolgende Helizes, da sie durch einen Knick, gebildet von den Aminosäuren Glu109, Glu110 und Trp111, unterbrochen wird.

A B

Abb. 4.59: Überlagerung der drei TC10 Strukturen. TC10∆C·GDP in rot, TC10∆C·GppNHp in blau und TC10∆NC·GDP in beige eingefärbt. A Ansicht der Überlagerung mit der Switch I- Region im Zentrum. B Überlagerung wie in A aber 90° in der Ebene gegen den Uhrzeigersinn gedreht.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 148 ERGEBNISSE ______

Im Folgenden werden nur noch die jeweiligen Moleküle A der einzelnen Strukturen miteinander verglichen, da sie am besten definiert sind. Die Unterschiede der einzelnen Moleküle der asymmetrischen Einheiten untereinander sind gering, wie die mittlere Abweichung der Cα-Atome zeigt. Für die TC10∆C-GDP Struktur beträgt die mittlere Abweichung zwischen Molekül A und Molekül B 0,38 Å (177 Cα Atome). Die Moleküle A und B der TC10∆C·GppNHp Struktur zeigen eine etwas größere mittlere Abweichung der Cα-Atome von 0,65 Å (185 Cα-Atome), was auf Unterschiede im Bereich der Insert-Region (Asp135 – Pro150) zurückzuführen ist. Die Unterschiede zwischen den Molekülen der TC10∆NC-GDP Struktur ist wie folgt: A zu B 0,99 Å (161 Cα Atome), A zu C 0,86 Å, A zu D 0,78 Å, B zu C 0,52 Å, B zu D 1,21 Å und C zu D 1,18 Å. Die mittlere Abweichung aller Cα-Atome der drei Strukturen untereinander ist wie folgt und bezieht sich nur auf die Moleküle A der jeweiligen asymmetrischen Einheiten (jeweils 177 Cα-Atome): TC10∆C·GDP zu TC10∆NC·GDP 1,02 Å, TC10∆C·GDP zu TC10∆C·GppNHp 0,95 Å und TC10∆NC·GDP zu TC10∆C·GppNHp 0,95 Å.

Abb. 4.60: Überlagerung der beiden Strukturen von TC10·GDP und von Cdc42·GDP. Die beiden TC10 Strukturen sind in blau, während die Cdc42 Struktur in rot dargestellt ist.

4.5.7.2 GDP/GppNHp-Bindung von TC10

Die Berechnung der ersten Elektronendichten der drei Strukturen erfolgte ohne die Nukleotidinformation. Die Dichte für das entsprechende GDP bzw. GppNHp Nukleotid war deutlich erkennbar. Die Abbildung 4.61 zeigt den Ausschnitt einer omit-Elektronendichte der Nukleotidbindungsstellen von TC10∆C·GDP und TC10∆C·GppNHp, wobei die Berechnung der Phasenwinkel ohne Nukleotidinformation erfolgte. Eine entsprechende schematische

______149 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Darstellung der Nukleotidbindung mit den möglichen Wasserstoffbrückenbindungen ist in Abb. 4.62 gezeigt.

A: TC10∆C·GDP

∆ B: TC10 C·GppNHp

Abb. 4.61: Omit-Elektronendichtekarten des aktiven Zentrums von TC10. A TC10∆C·GDP; B TC10∆C·GppNHp. Dargestellt ist eine 2Fo-Fc Elektronendichtekarte, bei deren Berechnung das Nukleotid entfernt wurde. Die Hauptketten der fünf für die Nukleotidbindung wichtigen Schleifen sind als Coil-Modell wiedergegeben. Das Nukleotid und wichtige an der Nukleotidbindung beteiligte Aminosäuren sind als ball-and-stick-Modelle dargestellt.

Die Guaninbase wird in allen Molekülen von Phe42 kontaktiert (Abb. 4.61). Die Seitenkette von Phe42 steht senkrecht auf dem aromatischen System der Base und wird durch Leu174 in ihrer Position durch hydrophobe Wechselwirkungen stabilisiert. Phe42 ist innerhalb der Ras- homologen Proteine stark konserviert. Auf der gegenüberliegenden Seite von Phe42 wird die

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 150 ERGEBNISSE ______

Nukleobase durch die Methylengruppen von Gln130 kontaktiert. Dies entspricht einer Degeneration des NKxD-Motivs GTP-bindender Proteine innerhalb der Rho-Familie zu [N, C, T][K, Q]xD. Die meisten Vertreter der Rho-Familie haben einen Threoninrest anstelle des Asparagins. Die Cdc42-homologen Proteine (TC10, TCL, Chp und Wrch) haben anstelle des Lysins einen Glutaminrest (Gln130) parallel zur Base orientiert. Die Seitenketten Aminofunktion von Gln130 zeigt einen Abstand zwischen 3,1 Å (GDP) und 3,6 Å (GppNHp) zum O4’ Atom der Ribose in den hier beschriebenen Strukturen, so dass eine schwache Wasserstoffbrückenbindung möglich ist. Allerdings dürfte die Substitution von Lysin zu Glutamin zu einer etwas geringeren Nukleotidaffinität beitragen. Die Spezifität der Nukleotidbindungstasche für Guaninnukleotide wird analog zu allen anderen kleinen GTP-bindenden Proteinen durch die bidentale Wasserstoffbrücke von Asp132 sowie durch die Wasserstoffbrücke zwischen dem O6-Sauerstoffatom (Ketofunktion der Base) und der NH-Gruppe von Ala173 erreicht (Abb. 4.62). Die Hauptunterschiede zwischen der GDP- und der GppNHp-gebundenen Strukturen von TC10 zeigen sich in der Art und Weise der Bindung der Phosphatgruppen. Der Vergleich der beiden GDP-Strukturen zeigt, dass die Bindung der Nukleotide annähernd identisch ist und wird im Folgenden für das Molekül A der TC10∆C·GDP-Struktur beschrieben. Die in Klammern angegebenen Reste beziehen sich auf das Molekül A von TC10∆NC·GDP. Die Koordination des α-Phosphats erfolgt durch die Thiol- und die NH-Gruppe von Cys32. Das gegenüberliegende Sauerstoffatom wird durch zwei Wassermoleküle W113 und W44 (W5043 und W5002) gebunden. Der Brückensauerstoff zwischen α- und β-Phosphat wird durch die NH-Gruppe des in der Phosphatschleife liegenden Gly29 koordiniert. Dieselbe Aminosäure bindet ebenfalls ein Sauerstoffatom des β-Phosphats. Weitere Kontakte zum β-Phosphat erfolgen durch Lys30, Ala27 und dem Magnesiumion bzw. dem Calciumion in der TC10∆NC·GDP-Struktur (Abb. 4.62).

Die Kristallisation von TC10∆NC GDP erfolgte in der Anwesenheit von 200 mM CaCl2. Bei der Strukturverfeinerung wurden FoFc-Elektronendichtekarten verwendet, die zusätzliche Dichte im Bereich des zunächst eingebauten Magnesiumions zeigte. Da während der Kristallisation große Mengen an Calcium vorhanden waren und Ca2+ ebenfalls zu einer oktaedrischen Koordination fähig ist, wurden die Magnesiumionen durch Calciumionen ersetzt und eine Neuberechnung der Elektronendichten zeigte eine ausgeglichenere Elektronendichte. Die Liganden des Ca2+ in dieser Struktur zeigen Abstände zwischen 2,1 Å und 2,4 Å.

______151 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

A: TC10∆C·GDP

B: TC10∆C·GppNHp

C: TC10∆NC·GDP

Abb. 4.62: Nukleotidbindung von TC10. A TC10∆C·GDP; B TC10∆C·GppNHp; C TC10∆NC·GDP; Die dargestellten Skizzen zeigen die Nukleotidbindung an TC10. Der Cofaktor Mg2+/Ca2+ ist entsprechend hervorgehoben. Wassermoleküle wurden mit einem W gekennzeichnet. Die gestrichelten Linien entsprechen Wasserstoffbrückenbindungen mit den in Å angegebenen Distanzen.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 152 ERGEBNISSE ______

Die Koordination des Mg2+ bzw. Ca2+-Ions ist in beiden GDP-Strukturen vollkommen identisch. Das zentrale zweiwertige Ion wird in oktaedrischer Geometrie durch das β- Phosphat, die Seitenkette von Thr31, die Hauptkettenketofunktion von Thr49 sowie drei Wasserliganden W10 (W5028), W44 (W5002) und W53 (W5125) koordiniert (Abb. 4.62). Die beiden apikalen Pole des Oktaeders werden dabei durch die Carbonylgruppe von Thr49 (Switch I) bzw. das β-Phosphat gebildet. Die axialen Positionen werden durch die drei Wassermoleküle und Thr31 besetzt. Die Koordination der α- und β-Phosphatgruppen von TC10∆C·GppNHp ist vergleichbar zu den beiden GDP Strukturen. Die Koordination des Mg2+-Ions unterscheidet sich hingegen, bedingt durch die zusätzliche γ-Phosphatgruppe. Die Geometrie der Magnesiumkoordination ist hier verzerrt oktaedrisch. Betrachtet man das β-Phosphat und Thr49 als die apikalen Pole, so werden die axialen Positionen durch das γ-Phosphat, Thr31, W1 und W2 besetzt. Der Winkel zwischen Thr49 und β-Phosphat beträgt 131°. Der Winkel zwischen Thr31 und dem γ-Phosphat beträgt 133°. Das γ-Phosphat wird weiterhin durch die Seitenkette von Lys30 gebunden und befindet sich so genau zwischen β- und γ-Phosphat. Der Kontakt zur Switch II Region erfolgt durch die NH-Gruppe von Gly74 (Abb. 4.62).

4.5.7.3 Die Switch-Regionen von TC10

Die größten Konformationsänderungen bei der GTP-Hydrolyse sind bei den meisten kleinen GTPasen auf die Switch-Regionen beschränkt. In Lösung sind sie häufig mobil und in Kristallstrukturen oft nur wenig geordnet. Die im Folgenden verwendeten Definitionen der Switch-Regionen beruhen auf einem strukturellen Vergleich der Strukturen von RhoA·GDP (Wei et al., 1997) und RhoA·GTPγS (Ihara et al., 1998). In der TC10 ∆C·GDP-Struktur sind die Switch Regionen beider Moleküle der asymmetrischen Einheit relativ gut geordnet. Der Switch I (Reste Asp40 – Thr49) besitzt in beiden Molekülen einen niedrigen Temperaturfaktor von 31 Å2. Gleiches gilt für die Switch I Regionen der TC10∆NC·GDP (mittlere Temperaturfaktor von 20-23 Å2) und der TC10∆C·GppNHp (mittlere Temperaturfaktor von 35-36 Å2) Moleküle. Im Bereich des Switch I ist keine direkte Konformationsänderung zwischen der GDP- und der GppNHp-gebundenen Form des Proteins erkennbar. Die Position der Aminosäuren Val47, Pro48 und Thr49 ist vollkommen identisch in allen Molekülen. Eine leichte Variabilität in der Position zeigt sich beim Vergleich der Aminosäuren Glu44, Glu45 und Tyr46, wobei besonders Glu44 und Glu 45 durch höhere Temperaturfaktoren gekennzeichnet sind.

______153 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

Die Switch II Regionen (Reste Ala73 – Pro83) verhalten sich hier im Vergleich zu den Switch I Regionen anders. Sie sind in allen Molekülen schlechter definiert als die Switch I Regionen, was an den Temperaturfaktoren besonders deutlich wird. Molekül A von TC10∆C GDP besitzt für diese Region einen mittleren Temperaturfaktor von 41 Å2 (Molekül B: 49 Å2). Für die GppNHp-Struktur sind es jeweils 48 Å2. Das Molekül A von TC10∆NC·GDP ist in diesem Bereich am Besten definiert mit einem Temperaturfaktor von 32 Å2. Im Molekül B (mittlerer B-Faktor von 36 Å2) fehlen die Aminosäuren Glu76 und Asp77 in der Elektronendichte. Molekül C besitzt in diesem Bereich einen mittleren B-Faktor von 52 Å2. Das Molekül D dieser GDP-Struktur ist am Schlechtesten definiert (es fehlen die Aminosäuren 76 - 86). Die Position von Ala73 ist in allen Molekülen relativ ähnlich. C-terminal dieser Aminosäure beginnt eine strukturell hypervariable Region (Reste Gly74 – Leu81) mit Abweichungen von bis zu 7,3 Å in den Cα-Positionen (Glu76) (siehe 5.3.4).

4.5.7.4 Die β2/β3 Region von TC10

Der Vergleich der β2/β3 Region von TC10 mit der Cdc42 Struktur (Rudolph et al., 1999) zeigt große strukturelle Unterschiede (Abb. 4.60). Dabei zeigt die Schleifenregion zwischen β2 und β3 (Gly61 - Lys63) die größten Unterschiede mit einem Abstand von 6,2 Å zwischen den Cα-Positionen von Gly61 (TC10) bzw. Gly47 (Cdc42). Die TC10∆C·GDP Struktur war die erste TC10-Struktur, die gelöst wurde und zeigte genau in dieser Schleifenregion jeweils ein zusätzliches Magnesiumion für beide Moleküle der asymmetrischen Einheit (Abb. 4.63). Somit wurde zunächst vermutet, dass diese für die Verlagerung der β2/β3-Region verantwortlich sein könnte. Dies konnte aber später durch einen Vergleich mit der TC10∆NC·GDP-Struktur ausgeschlossen werden. Die beiden zusätzlichen Mg2+-Ionen sind in keiner der anderen gelösten Strukturen vorhanden. Beide zusätzlichen Magnesiumionen der TC10∆C GDP Struktur zeigen eine perfekte oktaedrische Koordination durch jeweils sechs Aquoliganden (Abb. 4.63). Mg1 wird zum Beispiel durch die Wassermoleküle W8, W49, W72, W140, W196’ und W202 koordiniert. Die zweite Koordinationsschale besteht dann aus weiteren Wassermolekülen, der Switch I- Region von zwei symmetrieverwandten Molekülen (Switch I’ und Switch I’’ in Abb. 4.63) und der Schleifenregion zwischen β2/β3. So bildet die Ketofunktion von Gly62 eine Wasserstoffbrückenbindung zu W202 aus. Die NH-Gruppe von Gln64 interagiert ebenfalls über eine Wasserstoffbrückenbindung mit W8.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 154 ERGEBNISSE ______

Abb. 4.63: Koordination eines der beiden zusätzlichen Magnesiumionen in der TC10∆C·GDP Struktur. Die Hauptketten der drei an der Bindung beteiligten Moleküle sind als Coil- Modell wiedergegeben. Die beteiligten Aminosäuren sind als ball-and-stick-Modelle dargestellt. Das Mg2+-Ion ist entsprechend hervorgehoben. Wassermoleküle wurden mit einem W gekennzeichnet. Die Linien entsprechen Wasserstoffbrückenbindungen mit den in Å angegebenen Distanzen.

Um nun einen Einfluss dieser zusätzlichen Magnesiumionen auf die TC10·GDP Struktur entweder zu verifizieren oder auszuschließen, wurde das TC10∆NC Konstrukt kristallisiert. Der Vergleich der beiden GDP Strukturen von TC10 (TC10∆C und ∆NC) zeigte, dass nicht das zusätzliche Magnesiumion in TC10∆C für die veränderte Lage der β2/β3 Region im Vergleich zu Cdc42 verantwortlich ist. Es müssen folglich andere Unterschiede zwischen der TC10·GDP und der Cdc42·GDP Struktur die Ursache für diese Konformationsänderung sein (siehe 5.3.2 und 5.3.4). Der Vergleich der GDP- und der GppNHp-gebundenen Strukturen von TC10 zeigt deutliche Unterschiede im Übergangsbereich zwischen den β2/β3-Strängen. Die Distanz zwischen den jeweiligen Cα-Atomen von Gly61 beträgt hier 4,1 Å. Die strukturellen Unterschiede beginnen im Bereich des β2 bei Val56 und enden im Bereich des β3-Strangs bei Leu66. Diese Unterschiede könnten zwei mögliche Ursachen haben: zum einen könnte das GppNHp Nukleotid über die Switch-Regionen dafür verantwortlich sein, zum anderen die Ausbildung des intermolekularen β-Faltblatts mit dem zweiten Molekül der asymmetrischen Einheit (siehe 5.3.4).

______155 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______

4.5.7.5 Oberflächeneigenschaften von TC10 und Cdc42

In Bezug auf die Wechselwirkung mit Interaktionspartnern ist die Verteilung der Oberflächenladung von Proteinen sehr interessant, da die Interaktion von zwei Proteinen über ihre Oberflächen stattfindet. Hierbei haben sowohl die hydrophoben, als auch die geladenen Aminosäuren eine große Bedeutung für die Affinität und Spezifität der Bindung. Der Vergleich der Oberflächeneigenschaften sollte die Fragestellung, ob Interaktionspartner von Cdc42 auch mit TC10 interagieren können, beantworten. Weiterhin sollten Unterschiede zwischen den Oberflächen der GDP und der GTP gebundenen Konformation von TC10 herausgearbeitet werden. Hierzu wurden die Potentialoberflächen von Cdc42·GDP, TC10∆C·GDP und TC10∆C·GppNHp berechnet. Abbildung 4.64 zeigt eine entsprechende Oberflächendarstellung, in der positive Ladungen blau und negative Ladungen rot dargestellt sind. Die linke Seite der Abbildung zeigt die „Vorderseite“ der jeweiligen GTPase mit Blick auf die Switch-Regionen und das Nukleotid, während die rechte Seite die „Rückseite“ mit Blick auf β2/β3 bzw. α5 zeigt. Der Vergleich der beiden TC10 Strukturen zu Cdc42 zeigt hier, dass TC10 auf dieser Seite eine höhere negative Ladungsdichte aufweist. Dies ist sowohl im Bereich der Switch-Regionen als auch im Bereich der Insert-Helix der Fall und könnte auf eine von Cdc42 verschiedene Spezifität bezüglich der Interaktionspartner hinweisen (siehe 5.3.6 und 5.3.7). Ein Unterschied in der Ladungsverteilung zwischen der GDP und der GppNHp-Struktur von TC10 ist allerdings nicht zu erkennen. Die Rückseite mit Blick auf die β2/β3-Region der GTPasen zeigt bei Cdc42 im Vergleich zu den TC10 Strukturen einen stärker positiv geladenen Bereich (Kreise in Abbildung 4.64) hervorgehoben. Ein weiterer interessanter Unterschied zwischen TC10·GDP und TC10·GppNHp bzw. Cdc42·GDP ist eine Aushöhlung in der Oberfläche (Pfeile in Abbildung 4.64), die durch die veränderte Lage der β2/β3-Region in TC10·GDP zu Stande kommt. Hier ist nochmals gut zu erkennen, dass die TC10·GppNHp Struktur in diesem Bereich sehr stark der Cdc42 Struktur ähnelt.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 156 ERGEBNISSE ______

Abb. 4.64: Vergleich der Oberflächeneigenschaften von TC10∆NC·GDP (oben), TC10∆C·GppNHp (mitte) und Cdc42·GDP (unten). Dargestellt ist die Verteilung der Oberflächenladungen der jeweiligen Moleküle. Die Berechnung der Oberflächen und der Ladungsverteilung erfolgte mit dem Programm GRASP (Nicholls et al., 1991). Negative Ladungen sind in rot, während positive Ladungen in blau dargestellt sind. Links ist jeweils die Ansicht von vorne, auf das Nukleotid. Die rechte Ansicht (hinten) erhält man nach einer 180°-Drehung um die Horizontalachse der linken Abbildung. Der Kreis hebt einen positiven Ladungsbereich von Cdc42 im Vergleich zu TC10 hervor. Die Pfeile in der rechten Abbildung weisen auf eine Aushöhlung hin, die durch die zu TC10·GDP veränderte Lage der β2/β3-Region zu Stande kommt.

4.5.8 Untersuchung der Normalmodi von TC10·GDP/GTP

Da die TC10-Strukturen Unterschiede zueinander und zu der Cdc42-Struktur zeigten, wurden diese Unterschiede anhand von Molekulardynamik-Simulationen näher charakterisiert. Hierzu wurde das Programmpaket CHARMm (Brooks et al., 1983) verwendet. Von allen hier verwendeten Strukturen wurden nur die Kerndomänen einer Analyse unterzogen, so dass die häufig flexiblen und oft sehr unterschiedlichen N- und C-Termini keinen Einfluss auf die Analyse haben. Von Cdc42 wurden die Aminosäuren 3 bis 175 und von TC10 die Aminosäuren 17 bis 192 verwendet. Als erstes wurden alle drei Strukturen bezüglich ihres Energieinhalts minimiert. Die eigentliche Analyse der Schwingungsmodi der einzelnen Modelle erfolgte durch die „Vibran“-Funktion von CHARMm (Brooks et al., 1983). Die für

______157 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ERGEBNISSE ______die einzelnen Aminosäuren und Normalmodi (7 – 999) erhaltene Werte wurden aufsummiert und geben Aufschluss über die Flexibilität der jeweiligen Aminosäure. Abbildung 4.65 gibt die dabei erhaltenen Daten wieder.

A) B) 24000

3 20000

16000 2

12000 Quotient

8000 Vibration (rel. Einheiten) 1

4000

0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 20 40 60 80 100 120 140 160 180 6 26 46 66 86 106 126 146 166 Aminosäure Aminosäure (Cdc42/TC10) TC10 GDP / TC10 TC10 Cdc42 GDP TC10 GDP TC10 GppNHp / GppNHp GppNHp TC10 GDP Abb. 4.65: Analyse der Schwingungsmodi von Cdc42·GDP, TC10·GDP und TC10·GTP. A Vergleich der bei der Schwingungsanalyse von Cdc42·GDP, TC10·GDP und TC10·GTP erhaltenen Daten. B Vergleich der für TC10·GDP und TC10·GTP erhaltenen Daten durch Quotientenbildung.

Abbildung 4.65A zeigt, dass sich die drei Moleküle im Wesentlichen sehr ähnlich verhalten. Allen drei gemeinsam sind höhere Flexibilitäten in den folgenden drei Regionen: Switch I (Aminosäuren 26-36 für Cdc42 bzw. Aminosäuren 40-50 für TC10), Switch II (Aminosäuren 59-75 für Cdc42 bzw. Aminosäuren 73-89 für TC10) und die Insert-Helix (Aminosäuren 121- 136 für Cdc42 bzw. Aminosäuren 135-150 für TC10). Die größten Unterschiede allerdings befinden sich interessanterweise in der β2/β3-Region der Strukturen. Für TC10 sind dies die Aminosäuren 55 bis 68 (Aminosäuren 41 bis 54 in Cdc42). Auch der Vergleich der GDP und der GTP-Strukturen von TC10 (Abb. 4.65B) zeigt für diese Region sehr große Unterschiede. TC10·GTP scheint hier aber noch sehr viel flexibler als TC10·GDP zu sein (siehe 5.3.4).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 158 DISKUSSION ______

5. Diskussion

5.1 Charakterisierung der Plexin-Proteinfamilie

Semaphorine und ihre Rezeptoren, die Plexin-Proteinfamilie, sind in einer Vielzahl von unterschiedlichen zellulären Funktionen involviert, wie auch die Komplexität ihrer Signaltransduktion zeigt. Besondere Rollen spielen sie in der Entwicklung des Nervensystems und des Immunsystems (Polleux et al., 2000; Bagnard et al., 1998; Delaire et al., 1998; Hall et al., 1996). In diesem letzteren Zusammenhang ist auch ihr Vorkommen in einigen Viren zu erklären, da Semaphorine und Plexine dazu beitragen könnten, dass der entsprechende Virus vom Immunsystem nicht erkannt wird. Weitere interessante Aspekte sind ihre Beteiligung an der Kontrolle des invasiven Wachstums und der Entwicklung des cardiovaskulären Systems (Trusolino et al., 2002; Giordano et al., 2002).

Abb. 5.1: Modell zur intrazellulären Signaltransduktion der cytoplasmatischen Domäne der Plexin-Proteine. Eine Upstream-GTPase bindet an die GTPase-bindende Domäne GBD der Plexine und aktiviert durch eine Konformationsänderung die intrazelluläre Domäne. Die jetzt GAP- aktive cytoplasmatische Domäne kann eine Downstream-GTPase inaktivieren.

Für viele dieser Funktionen ist eine Reorganisation des Aktinzytoskeletts notwendig, so dass die Tatsache, dass GTPasen der Ras- und Rho-Familien in der Signaltransduktion auf vielfältige Weise eine Rolle spielen nicht überrascht. Erste Studien konnten eine direkte Interaktion der zytoplasmatischen Domäne (CPD) mit Rho-GTPasen nachweisen. Desweiteren legte ein Sequenzvergleich mit RasGAPs eine strukturelle Homologie zu diesen

______159 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______

Proteinen nahe. Bisher sind noch keine detaillierten quantitativen biochemischen Daten zu der Interaktion zwischen den CPDs und den GTPasen bekannt. Ebensowenig ist die molekulare Funktion dieser Interaktionen bekannt. Eine eingehende Charakterisierung der Struktur- Funktionsbeziehungen zwischen GTPasen und Plexinen ist demnach von besonderem Interesse. Als Arbeitshypothese wurde hierzu das in Abbildung 5.1 gezeigte Modell aufgestellt. Eine Rho-GTPase (Upstream-GTPase) bindet über die GTPase-bindende Domäne (GBD) und führt, bedingt durch eine Konformationsänderung der CPD, zu einer Aktivierung der intrazellulären Domäne. Hierdurch wird eine funktionsfähige GAP-Domäne hergestellt, die abermals mit einer weiteren GTPase (Downstream-GTPase) wechselwirkt und zu deren Inaktivierung beiträgt.

5.1.1 Reinigung und Kristallisation der Plexin-Proteine

Für eine spätere qualitative und quantitative Charakterisierung der GTPase-Plexin-Interaktion war es nötig, die GBDs der zytoplasmatischen Domäne rekombinant zu isolieren. In früheren Studien konnte diese GBD innerhalb der CPD lokalisiert werden. Sie befindet sich zwischen den beiden stark konservierten N- und C-terminalen Bereichen der CPD (Driessens et al., 2001; Hu et al., 2001; Vikis et al., 2000; Jin & Strittmatter, 1997; Jurney et al., 2002; Rohm et al., 2000; Vastrik et al., 1999; Kuhn et al., 1999). Basierend auf diesen Daten wurden die in dieser Arbeit verwendeten Konstrukte kloniert und rekombinant in E. coli hergestellt (Abb. 5.2). Für die GBDs von PlexinB1, C1 und D1 war dies mit guter Qualität und in guten Ausbeuten möglich. Für PlexinA2-GBD zeigte sich allerdings schon als GST-Fusionsprotein eine gewisse Instabilität und Proteindegradation. Im weiteren Verlauf präzipitierte dieses Protein sowohl bei der Proteinkonzentrierung als auch bei der Abspaltung des GST-Anteils. Der Sequenzvergleich der GBD-Konstrukte zeigte, dass für dieses instabilere Verhalten von PlexinA2-GBD im Vergleich zu den anderen gereinigten GBDs, eine Serin-reiche Insertion am C-Terminus verantwortlich sein könnte (Abb. 5.2), da hier ein offensichtlicher Unterschied zu den anderen GBDs vorliegt. Ein weitergehender Sequenzvergleich aller humanen Plexin-Proteine zeigte, dass diese Serin-reiche Insertion für die Plexine der A- Klasse spezifisch ist. Ein weiterer Aspekt ist, dass Serin-reiche Regionen bei Proteinreinigungen häufig problematisch sind. Allerdings befindet sich diese Insertions- Region nur wenige Aminosäuren von der publizierten Bindungsstelle der GTPasen entfernt, so dass ein kürzeres Konstrukt nicht in Frage kam (Abb. 5.2; LVPÆGGA Mutante), da ein möglicher Bindungsverlust zu befürchten wäre. ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 160 DISKUSSION ______

Abb. 5.2: Sequenzvergleich der GTPase-bindenden Domänen (GBDs) der Plexine. Der Sequenzvergleich wurde mittels der GCG Software erstellt und mit Genedoc modifiziert. Schwarz hinterlegte Bereiche kennzeichnen 100%ige Konservierung, während grau hinterlegte Bereiche 80%ige Konservierung bedeuten. Der schwarze Balken zeigt die für die PlexinA-Familie charakteristische Serin-reiche Insertion. Innerhalb der GBD wurde eine Mutante beschrieben (Position ist durch drei Pfeile hervorgehoben), die die Interaktion der GBD mit den GTPasen inhibiert: LVPÆGGA.

Alle vier GBDs wurden in verschiedenen Konzentrationen, Temperaturen und mit allen zur Verfügung stehenden Screens auf eine Kristallisation hin untersucht, jedoch konnte hierbei keine Bedingungen gefunden werden, die zu einer strukturellen Information hätten führen können. Die Gründe hierfür können vielfältig sein. Bei dieser Region der Plexine handelt es sich im Vergleich zu den beiden stark konservierten N- und C-terminalen Regionen um eine flexiblere „Linker“-Region, was ebenfalls strukturell zu einer höheren Flexibilität und damit zu einer schlechteren Kristallisation führen könnte. Basierend auf Sekundärstruktur- vorhersagen besteht diese Region vornehmlich aus β-Strängen und Schleifenregionen, was ebenfalls zu dem in PlexinB1 gefundenen CRIB-(Cdc42/Rac interactive binding) Motiv

______161 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______passen würde. Die meisten bisher gelösten GTPase/CRIB-Effektor-Komplexe sind mittels NMR-Technik bestimmt worden (Morreale et al., 2000; Mott et al., 1999; Abdul-Manan et al., 1999). Eine Ausnahme ist hier der Komplex aus Cdc42 und dem Effektor Par6 (Garrard et al., 2003). Einer der Gründe für die Verwendung von NMR in diesem Zusammenhang ist sicherlich die höhere Flexibilität der CRIB-Motiv enthaltenden GBDs. Um die mögliche höhere Flexibilität der GBDs der Plexine zu umgehen und um Informationen über die Art der GTPase-Plexin Interaktion zu gewinnen, wurde ein Komplex aus Rnd1 und PlexinB1-GBD zur Kokristallisation eingesetzt. Aber auch hier konnten keine Kristalle erhalten werden. Um hier im Weiteren strukturelle Informationen bezüglich der GBDs zu bekommen, könnte nach weiteren stabilen GBD-Fragmenten gesucht werden. Auch die Kokristallisation weiterer verschiedener GTPase-Plexin Kombinationen könnte schließlich zu einem Erfolg führen. Ebenso wäre es angebracht über eine NMR-spektroskopische Untersuchung und Strukturaufklärung nachzudenken. Für die Reinigung der vollständigen CPDs der Plexine A2 und B1 war zunächst eine Expression und Reinigung aus E. coli vorgesehen. Diese gestaltete sich jedoch sowohl für PlexinB1-CPD wie auch für PlexinA2-CPD als schwierig und war nicht zufrieden stellend. PlexinB1-CPD aus E. coli war nur schlecht löslich und konnte dementsprechend nur mit geringer Ausbeute gewonnen werden. Für das 6xHis-modifizierte PlexinA2-CPD-Protein war eine gute Ausbeute erzielt worden. Bei diesem Protein war allerdings die Monodispersität begrenzt und weitere Optimierungen führten zu keiner Verbesserung. Die schwierige Reinigung und die hohe Instabilität dieser Proteine wurde auf Faltungsprobleme im E. coli Expressionssystem zurückgeführt. Eine weitere Möglichkeit, die Proteine zu stabilisieren, ist der partielle proteolytische Verdau, bei dem instabile Regionen von Proteinen abgespalten werden können. Eine α-Chymotrypsin- Behandlung der PlexinA2-CPD führte zu einer Spaltung im mittleren Bereich des Proteins, da zwei neue Proteinfragmente ähnlicher Größe (37 bzw. 30 oder 21 kDa) entstanden. Eine Trennung dieser Fragmente war sogar unter extremen Hochsalzbedingungen (1M NaCl) nicht möglich, woraus sich schließen lässt, dass die N- und C-terminalen CPD-Fragmente eine stabile und hochaffine „intramolekulare“ Bindung eingehen. Interessanterweise wurde kürzlich gezeigt, dass die N- und C-terminalen Domänen miteinander interagieren und diese Interaktion wahrscheinlich einer Autoinhibition entspricht (Turner et al., 2004). Demnach ist die Interaktion der N- und C-terminalen Fragmente ein sehr wichtiger autoregulatorischer Aspekt, der eine wesentliche Rolle bei der Rho-GTPase-vermittelten Signaltransduktion der Plexine spielen dürfte.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 162 DISKUSSION ______

Da eine inkorrekte Proteinfaltung der CPDs in E. coli nicht vollständig ausgeschlossen werden konnte, wurde ein eukaryotisches Expressionssystem (Sf21-Insektenzellen) zunächst für PlexinB1-CPD ausgetestet. Hierdurch konnten fast alle Probleme, die bei der Expression in E. coli zu beobachten waren, umgangen werden, so dass die CPDs der Plexine B1, B2 und A2 in guten Ausbeuten (mit Ausnahme der B2-CPD) und mit einem hohen Reinheitsgrad erhalten werden konnte. Die Reinheit von PlexinB2 war zufrieden stellend, jedoch ließ die Proteinausbeute zu wünschen übrig. Eine weitere Optimierung der Expressionsbedingungen könnte hier noch möglich sein. Der einzige kritische Aspekt bei der Expression der CPDs in Sf21-Zellen war eine leichte Proteindegradation, die zu zwei miteinander interagierenden Fragmenten (36 und 24 kDa) führte, die nicht voneinander bzw. von der nicht-gespaltenen CPD (66 kDa) getrennt werden konnten. Dies war, wie oben beschrieben, auch bei den aus E. coli erhaltenen Proteinen zu beobachten und wird auf die physiologisch relevante Interaktion der N- und C-terminalen Domänen zurückgeführt. Insgesamt gesehen war das Insektenzellsystem für die Expression und Reinigung der CPDs der Plexine A2 und B1 sehr gut geeignet. Für die Kristallisation wurden die aus E. coli erhaltenen Proteine von PlexinA2 und das α- Chymotrypsin-behandelte PlexinA2, sowie die aus dem Sf21-Insektenzellsystem erhaltenen Proteine PlexinA2 und PlexinB1 eingesetzt. Bei der Kristallisation von PlexinA2-CPD aus E. coli wurden Kristalle erhalten, die ein 32 kDa großes Protein enthielten. Anhand der durchgeführten biochemischen Analysen konnte allerdings nicht zweifelsfrei festgestellt werden, um welches Protein es sich handelt, so dass erst die Strukturaufklärung es eindeutig als das Hsp31-Chaperonprotein identifizierte (5.1.4). Die Kristallisation von PlexinB1-CPD führte ebenfalls zu Kristallen, die reproduziert und optimiert werden konnten. Jedoch wurde auch nach eingehender Optimierung durch eine Variation der Temperatur, der Salz-, Puffer- und Präzipitansbedingungen, sowie der Verwendung von Additivien keine Diffraktion für die Kristalle erhalten. Die erhaltenen Kristalle sind nach wie vor verhältnismäßig klein, was eine der Ursachen für die mangelnde Diffraktion sein könnte. Weiterhin könnten mobile Regionen des Proteins für eine schlechte Kristallpackung verantwortlich sein. Obwohl im Rahmen dieser Arbeit viele Bedingungen für diverse Fragmente der Plexine A2, B1, C1 und D1 zur Kristallisation eingesetzt wurden, könnte man auch die anderen Mitglieder der Plexin-Familie miteinbeziehen. Hier ist z.B. an die weiteren Homologen der humanen Plexine zu denken: Plexin A1, A3, A4 und B3. Auch Orthologe sollten bei der Suche nach kristallisationsfähigen Proteinen nicht außer Acht gelassen werden. Da zeitbedingt im Rahmen dieser Arbeit keine Kokristallisation von GTPase (Rnd1, Rnd3 oder Rac1(Q61L))

______163 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______mit der aus Insektenzellen gewonnenen B1-CPD möglich war, wäre auch dies ein sehr interessanter Ansatz.

5.1.2 GTPase-Plexin Interaktion

Die Interaktion von GTPasen der Rho-Familie und der CPD der Plexin- Transmembranrezeptoren ist mittlerweile vielfach gezeigt worden. Als Nachweismethoden wurden hier bisher ausschließlich qualitative Methoden wie das Two-Hybrid-System, Overlay-Assays und Pulldown-Experimente verwendet. Für die CPD von PlexinA1 konnte eine Interaktion mit Rnd1 und RhoD gezeigt werden, während Rac1 und Rnd1 an PlexinB1 binden (Driessens et al., 2001; Hu et al., 2001; Vikis et al., 2000; Jin & Strittmatter, 1997; Jurney et al., 2002; Rohm et al., 2000; Vastrik et al., 1999; Kuhn et al., 1999). Für die zytoplasmatischen Domänen von PlexinC1 und PlexinD1 konnte bisher keine Interaktion mit GTPasen nachgewiesen werden. Da vor einer quantitativen Untersuchung der GTPase-Plexin Interaktion zunächst eine qualitative Spezifitätsuntersuchung geplant war, wurden zunächst rein qualitative Methoden verwendet, die es ermöglichen, ein breites Spektrum an GTPasen und Plexinen zu untersuchen. In einem nächsten Schritt sollten dann diese spezifischen Interaktionen bezüglich ihrer kinetischen bzw. thermodynamischen Parameter untersucht werden. Dementsprechend wurden für die qualitative Untersuchung native Gelelektrophoresen, Pulldown-Experimente und der GDI-Assay verwendet. Der GDI-Assay erlaubt in diesem Zusammenhang sowohl qualitative als auch quantitative Aussagen (Herrmann et al., 1996; Blumenstein & Ahmadian, 2004; Häusler et al., 2005). Zunächst wurde versucht, die bereits publizierten Daten bezüglich der GTPase-Plexin-Interaktion zu reproduzieren. Hierfür wurden die Plexin-GBDs von A2, B1, C1 und D1 und die entsprechenden GTPasen RhoA, Rac1, Cdc42, Rnd1, Rnd3 und TC10 verwendet. Jedoch war für die Plexin-GBDs mit keiner der verwendeten GTPasen und keiner der verwendeten Methoden eine Interaktion nachweisbar. Für die vollständige PlexinB1-CPD aus Insektenzellen war allerdings eine schwache Interaktion mit GST-Rnd1 und GST-Rac1(Q61L) nachweisbar. Diese Resultate zeigten, dass die CPDs sehr wahrscheinlich eine höhere Affinität für die GTPasen besitzen als die GBDs. Ein Grund hierfür könnte in einer höheren strukturellen Integrität der vollständigen CPD gegenüber der GBD sein. Ein weiterer Aspekt ist, dass die GBD zwar eine Minimaldomäne für die Bindung von GTPasen darstellen könnte, aber weitere Regionen der CPD (außerhalb der GBD) mit der GTPase interagieren und so für eine höhere Affinität sorgen.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 164 DISKUSSION ______

Die Bindungsaffinitäten für die Interaktion von PlexinB1-GBD mit Rac1(Q61L), Rnd1 und Rnd3 wurden mittels Isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) bestimmt. Die ermittelten

Dissoziationskonstanten KD waren 13,4, 12,0 und 10,3 µM für die jeweilige GTPase, was im Vergleich zu anderen Effektorinteraktionen einer schwachen Bindung entspricht. Es ist wichtig zu betonen, dass im Gegensatz zu der konstitutiv-aktiven Rac1(Q61L)-Mutante keine Interaktion zwischen der PlexinB1-GBD und Rac1-Wildtyp festgestellt werden konnte. Diese Mutante wurde bei den meisten publizierten Arbeiten eingesetzt. Eine biochemische Charakterisierung hat gezeigt, dass die QL-Mutation zu einer drastischen Erhöhung der GTPase-Affinität (25-120-fach) für die Interaktionspartner führt (Owen et al., 2000; Dvorsky & Ahmadian, 2004). Es ist also davon auszugehen, dass die tatsächliche Affinität der PlexinB1-GBD für Rac1 viel niedriger sein könnte, als es im Rahmen dieser Arbeit bestimmt wurde. Diese insgesamt nur schwache Bindung zwischen PlexinB1-GBD und den verwendeten Rho- GTPasen erklärt aber gleichzeitig, die Ergebnisse der nativen Gelelektrophoresen und Pulldown-Experimente.

5.1.3 Sind die zytoplasmatischen Domänen der Plexine GAPs?

Die CPDs der Plexine zeigen Sequenzhomologien zu der Proteinfamilie der Ras-spezifischen GTPase-aktivierenden Proteine (GAPs) (Abb. 1.7). Auf der Basis der Sequenzhomologie handelt es sich dabei um eine geteilte Domäne. In der dazwischen liegenden GBD von PlexinB1 konnte weiterhin ein Cdc42/Rac interactive binding- (CRIB-) Motiv lokalisiert werden (Abb 5.2). Naheliegend ist demnach, dass Rho-GTPasen als „Upstream“ und Ras- verwandte GTPasen als „Downstream“ GTPasen in Frage kommen könnte (Abb. 5.1). Dieses Modell wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Da, wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, die N- und C- terminalen Domänen miteinander interagieren (siehe 4.3.3) und für die CPD keine GAP-Aktivität auf eine Reihe von GTPasen (RhoA, Rac1, Cdc42, R-Ras und H-Ras) gezeigt werden konnte (siehe 4.3.9), kann man schlussfolgern, dass die CPD möglicherweise autoinhibiert vorliegt. Es war daher wichtig zu testen, ob die Zugabe von GppNHp-gebundenen RhoGTPasen, als upstream- GTPase, zur Herstellung der GAP-Struktur und folglich zur Aktivierung der GAP-Domäne führen kann. Hierzu wurde zunächst der Einfluss von rekombinanter PlexinB1-CPD auf R- Ras in der Anwesenheit von Rho-GTPasen (Rac1(Q61L)·GTP bzw. Rnd1·GTP), als aktivierende GTPasen, untersucht. Es konnte keine Beschleunigung der GTP-Hydrolyse von R-Ras gemessen werden (siehe 4.3.9). In einer vor kurzem erschienen Veröffentlichung ______165 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______konnte die GAP-Aktivität der PlexinB1-CPD auf R-Ras nach Stimulation durch den extrazellulären Liganden Sema4D gezeigt werden. Hierzu war zusätzlich die Bindung von Rnd1 an die GBD von PlexinB1 erforderlich (Oinuma et al., 2004). Hauptunterschied zu den in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimenten ist zum einen die Verwendung von Membranfraktionen aus COS7 Zellen und zum anderen die Stimulierung durch den extrazellulären Liganden (für PlexinB1-CPD, siehe 4.3.9). Dies erklärt jedoch nicht nicht, warum PlexinA1 unter Verwendung von Membranfraktionen aus COS7-Zellen keine Aktivität auf R-Ras zeigte (siehe 4.3.9), da Oinuma et al. (2004) ebenfalls eine Involvierung von R-Ras im PlexinA1/Sema3A-Signalweg zeigen konnten. Da es sich bei Oinuma et al. (2004) jedoch nur um einen indirekten Nachweis handelte, kann man annehmen, dass R-Ras möglicherweise nicht direkt durch PlexinA1 inaktiviert worden ist. Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, dass PlexinB1 in der Küvette unter Verwendung gereinigter rekombinanter Proteine keine GAP-Aktivität besitzt. Ursache kann hier eine durch den extrazellulären Liganden induzierte Konformationsänderung sein, aber auch eine posttranslationale Modifikation sollte in Betracht gezogen werden. Da eine Interaktion der Plexine mit Tyrosinkinasen (Met) gezeigt werden konnte, wären z.B. Phosphorylierungen nahe liegend. Da die hier verwendete rekombinante PlexinB1-CPD zunächst für die Kristallisation eingesetzt werden sollte wurde das Protein während der Reinigung dephosphoryliert. Ein interessanter Aspekt wäre hier die gleichen Experimente nochmals durchzuführen, jedoch ohne das Protein zu dephosphorylieren.

5.1.4 Hsp31-Struktur

Hsp31 (heat shock protein 31) ist ein homodimeres Hitze-Schock-Protein, dass ursprünglich bei Transcriptom-Analysen von thermisch gestressten Zellen entdeckt wurde und von dem später gezeigt wurde, dass es Chaperon- und Protease-Aktivität besitzt (Richmond et al., 1999; Malki et al., 2003; Sastry et al., 2002). Weitere hochkonservierte orthologe Proteine sind in verschiedenen Pathogenen vorhanden (Sastry et al., 2002). Weiterhin besitzt Hsp31 strukturelle Homologie zu den PfpI-Peptidasen aus Archaen (Quigley et al., 2003) und zu dem humanen DJ-1 Protein, das mit der Parkinson-Erkrankung in Verbindung gebracht wird (Honbou et al., 2003; Huai et al., 2003; Lee et al., 2003; Tao & Tong, 2003; Wilson et al., 2003). Hsp31 besitzt eine katalytische Triade (Quigley et al., 2003; Lee et al., 2003; Quigley et al., 2004; Zhao et al., 2003), die nur wenig Lösungsmittel-exponiert ist. Das Hsp31-Protein zeigt nur sehr geringe Aktivität gegenüber großen Proteinsubstraten, kann jedoch Fluorophor- gekoppelte Monopeptide spalten, weshalb die physiologische Funktion dieser katalytischen ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 166 DISKUSSION ______

Triade bisher noch unklar ist (Lee et al., 2003). Genetische Evidenzen weisen auf der anderen Seite darauf hin, dass es als eine Art Halterchaperon für das DnaK-DnaJ-GrpE-System dienen könnte (Mujacic et al., 2004). Das Hsp31-Protein wurde in dieser Arbeit als eine in der SDS-PAGE nicht sichtbare Verunreinigung kristallisiert und mittels multiplen isomorphen Ersatzes gelöst. Der rückblickende Vergleich zeigt, dass die durch die erste N-terminale Sequenzierung erhaltene Sequenzinformation mit der durch die Struktur erhaltenen Information übereinstimmt. Eine der möglichen Interpretationen der Sequenzierung stimmt mit dem N-Terminus von Hsp31 überein: X-V-Q-T-S-K-N-P (aus X - V/I - Q/F - N/T - D/S - D/K - N/I – P). Allerdings war diese Sequenz vor der Strukturaufklärung, auch nach einer Suche in Datenbanken, nicht eindeutig zuzuordnen. Die in dieser Arbeit gelöste Struktur von Hsp31 zeigt 15 α-Helices und 16 β-Stränge, die zwei α-β-Domänen ausbilden. Der Vergleich mit anderen kürzlich publizierten Hsp31- Strukturen (Quigley et al., 2003; Lee et al., 2003; Zhao et al., 2003) zeigt eine hohe strukturelle Ähnlichkeit: so beträgt die Abweichung der Cα-Atome (root mean square deviation, r.m.s.d.) zu der am Besten aufgelösten Struktur von Hsp31 aus E. coli (1.6 Å; Quigley et al., 2003) nur 0,56 Å (276 Cα-Atome). Hsp31 besitzt zwei Domänen, wobei die als „A“-Domäne bezeichnete Region (Aminosäuren 46-56; 74-209; 229-283) in beiden Strukturen vollkommen identisch ist (Abb. 4.25). Unterschiede sind allerdings in der als „P“- Domäne bezeichneten Region zu erkennen. Die strukturell unterschiedlichen Aminosäuren bilden den aus zwei β-Faltblattsträngen und einer α-Helix bestehenden N-Terminus (Aminosäuren Thr5 – Tyr29) sowie die α-helikale Region von Ala213 bis Pro224. Die Ursache für die Veränderungen sind zwei Aspekte: zum einen ist es die Kristallpackung zu drei symmetrieverwandten Molekülen und zum anderen ein Malonatmolekül (Bestandteil der Aufbewahrungslösung), das in einem direkt benachbarten hydrophoben Bereich in die Struktur eingelagert ist. Die N-terminalen Aminosäuren (Thr5 – Tyr29) sind an Kristallkontakten zu allen drei symmetrieverwandten Molekülen beteiligt. Das Malonat-Ion ist ebenfalls in diesem Bereich lokalisiert und wird von Tyr29, Phe209, Tyr222, Ile247, Pro263 und Phe264 kontaktiert. Weiterhin sind zwei Wassermoleküle (W62 und W64) an der Bindung beteiligt.

______167 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______

Abb. 5.3: Die Koordination des Malonat-Ions (MLI). Die Abbildung zeigt die Koordination des zusätzlichen Malonat-Ions in der Bindungsspalte der P-Domäne. Als ball-and-stick-Modell hervorgehoben sind die dem Malonat-Ion (MLI) direkt benachbarten Aminosäuren und Wassermoleküle.

Interessanterweise entspricht genau diese veränderte Region einer als flexiblen Linker beschriebenen Region, der eine funktionelle Bedeutung zugeschrieben wird (Sastry et al., 2002). Diese Linker-Region könnte für die hochaffine Substratbindung bei erhöhten Temperaturen verantwortlich sein. Ein weiterer interessanter Aspekt ist, dass das Malonat-Ion weniger als 7 Å von Cys185 entfernt ist und sich somit in direkter Nähe zum aktiven Zentrum der katalytischen Triade von Hsp31 befindet. Da vermutet wird, dass Hsp31 kleine Peptide bindet (Quigley et al., 2003; Sastry et al., 2002), könnte dies darauf hindeuten, dass das Malonat-Ion in einer Substrat-ähnlichen Art und Weise gebunden wird. Das in dieser Struktur vorhandene zusätzliche Malonat-Ion könnte auch für die größere Isomorphie der Malonat- Datensätze im Vergleich zu den unter Ammoniumsulfat-Bedingungen erhaltenen Datemsätzen verantwortlich sein. Das Malonat-Ion bindet in einem flexibleren Bereich und stabilisiert diesen, wie auch die Packung an die benachbarten Moleküle im Kristall.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 168 DISKUSSION ______

5.2 Kristallstrukturen von Rac1b∆C

Rac1 ist die derzeit am Besten charakterisierte Isoform der Rac-ähnlichen Proteine und reguliert die Genexpression, Zellzykluskontrolle und die Reorganisation des Aktinzytoskeletts (Michiels&Collard, 1999). Rac1b wurde als alternative Splicevariante von Rac1 in humanen Tumoren entdeckt und besitzt eine 19 Aminosäuren lange Insertion (zwischen den Aminosäuren 75 und 76) am Ende der Switch II-Region (Jordan et al., 1999; Schnelzer et al., 2000). Abbildung 5.4 zeigt die Lage und Sequenz der Insertion im Vergleich zu Rac1. Als Funktion dieser 19 Aminosäuren-Insertion wurde die Generierung einer neuen Effektorbindungsstelle vorgeschlagen und somit zu Signalwegen beitragen könnte, die mit den neoplastischen Veränderungen der intestinalen Mucosa in Verbindung stehen (Jordan et al., 1999, Singh et al., 2004). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Rac1b nicht mit Rho- GDI und PAK1 interagiert (Matos et al., 2003). Ebenso ist Rac1b nicht an der Ausbildung von Lamellipodien beteiligt; kann aber den Transkriptionsfaktor NF-κB aktivieren (Matos et al., 2003).

Abb. 5.4: Die 19-Aminosäuren lange Insertion von Rac1b. Die Insertion befindet sich am Ende der Switch II-Region zwischen den Aminosäuren 75 und 76 von Rac1. Hervorgehoben sind der Switch I, Switch II und die Insert-Helix.

Der Einfluss der 19 zusätzlichen Aminosäuren auf die Struktur und Funktion von Rac1b war im Rahmen dieser Arbeit von zentralem Interesse. Hierzu wurden die Kristallstrukturen von Rac1b im GDP- und GppNHp-gebundenen Zustand mit einer Auflösung von jeweils 1,75 Å gelöst. Weiterhin wurden in unserer Arbeitsgruppe die Nukleotidbindung, die GTP- Hydrolyse, die Regulation durch das RacGEF Tiam1 und p50RhoGAP, sowie die Interaktion mit dem Effektor PAK untersucht. Rac1b besitzt eine sehr viel geringere Nukleotidaffinität und GTP-Hydrolyse als Rac1 (Fiegen et al., 2004). Diese drastischen Änderungen in den

______169 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______biochemischen Eigenschaften von Rac1b gegenüber Rac1 können durch die beiden Rac1b Strukturen erklärt werden. Die strukturellen und biochemischen Daten zeigen, warum Rac1b als vornehmlich GTP-gebundene Form von Rac1 verstanden werden kann.

5.2.1 Rac1b·GDP/GppNHp zeigen eine konservierte Struktur

Beide Rac1b Strukturen kristallisierten als kristallographisches Dimer, also mit zwei Molekülen pro asymmetrischer Einheit. Die Kontaktfläche zwischen den jeweiligen Molekülen ist vergleichsweise groß und beträgt 1347 Å2. Die an der Interaktion beteiligten Strukturelemente sind die Faltblattstränge β1 bis β3, die α1-Helix sowie die Switch I- Regionen der beiden Moleküle. Allerdings konnte durch Gelfiltrationsexperimente gezeigt werden, dass dieses Dimer nicht physiologisch ist, da Rac1b in Lösung ein monomeres Verhalten zeigte.

Abb. 5.5: Vergleich der Rac1 und Rac1b Strukturen. Darstellung der Sekundärstruktur- elemente von Rac1b GDP (purpur) und Rac1b GppNHp (rot), überlagert mit Rac1 GppNHp (braun) (Hirshberg et al., 1997). Die Switch II-Region ist in Orange hervorgehoben. Das Nukleotid von Rac1b GppNHp und das Magnesiumion sind als ball-and-stick wiedergeben.

Beide Moleküle der asymmetrischen Einheit sind sehr ähnlich, wie die geringe Abweichung der Cα-Atome von 0,45 Å (165 gemeinsame Cα-Atome) zeigt. Abbildung 5.5 zeigt die Sekundärstrukturelemente von Rac1b·GDP und Rac1b·GppNHp überlagert mit der GppNHp- gebundenen Rac1 Struktur (Hirshberg et al., 1997). Die Gesamtstruktur beider Nukleotid- gebundenen Formen von Rac1b ist zueinander sehr ähnlich, aber auch im Vergleich zu Rac1·GppNHp (Hirshberg et al., 1997), RhoA·GTPγS (Ihara et al., 1998) und Cdc42·GDP (Rudolph et al., 1999). Diese nur geringen Unterschiede in der Gesamtstruktur lassen sich besonders gut an den niedrigen Abweichungen für die Positionen der Cα-Atome erkennen:

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 170 DISKUSSION ______für Rac1·GppNHp sind es 0,67 Å (156 gemeinsame Cα-Atome), für RhoA·GTPγS 0,80 Å (155 gemeinsame Cα-Atome) und für Cdc42·GDP 0,81 Å (151 gemeinsame Cα-Atome).

5.2.2 Der hoch mobile Switch II und die Insertion

Trotz der sehr guten Übereinstimmung der Gesamtstrukturen sind zwei Regionen in Rac1b im Vergleich zu Rac1 drastisch verändert. Dies sind, wie Abbildung 5.5 zeigt, die Switch I und die Switch II-Region. Da der Switch II für die Rac1b Strukturen nicht sichtbar war, ist in Abbildung 5.5 der Switch II von Rac1 zur besseren Orientierung in orange hervorgehoben. In den meisten Strukturen von GppNHp-gebundenen GTPasen ist die Switch II-Region verhältnismäßig gut geordnet (Menetrey & Cherfils, 1999), was darauf hinweist, dass die Insertion von Rac1b zu einer höheren Flexibilität des Switch II beiträgt. Dies könnte somit die Ursache für die beeinträchtigte GTP-Hydrolyse-Reaktion von Rac1b sein (Fiegen et al., 2004): die katalytisch essentielle Aminosäure Gln61 (57DTAGQ-Motiv) ist dann sehr flexibel und kann somit das nukleophile Wassermolekül für den Angriff auf das γ-Phosphat nicht ausreichend stabilisieren. Wie schon vorher mehrfach gezeigt wurde, führt eine Mutation von Gln61 sowohl zu einer verringerten intrinsischen als auch GAP-stimulierten GTP Hydrolyse Reaktion (Scheffzek et al., 1998; Xu et al., 1997; Hwang et al., 1996; Ahmadian et al., 1999). p50RhoGAP kann die GTP Hydrolyse von Rac1b beschleunigen (Fiegen et al., 2004), wodurch gleichzeitig indiziert wird, dass die Switch-Regionen von Rac1b in einer GTP Hydrolyse-kompetenten Art und Weise stabilisiert werden können. In einer früheren Veröffentlichung wurde vorgeschlagen (Jordan et al., 1999), dass die Insertion zusammen mit dem Switch II eine neue funktionelle Domäne aus zwei β- Faltblattsträngen ausbilden könnte. Aufgrund der beobachteten hohen Flexibilität dieser Region hat sie dementsprechend keine Sekundärstruktur, so dass die Ausbildung einer zusätzlichen Domäne unwahrscheinlich ist.

5.2.3 Die offene Konformation des Switch I

In den Rac1b Dimeren weicht der Verlauf der Cα-Atome im Kontaktbereich des Dimers (Aminosäuren Ala28 - Asn39) von dem Verlauf in den Strukturen von RhoA·GDP und Rac1·GppNHp ab. Dies ist einer der auffälligsten Unterschiede zwischen den beiden Rac1b- Strukturen und der Rac1·GppNHp Struktur. Weiterhin ist in beiden Rac1b-Strukturen der Abstand des Switch I zum Nukleotid sehr viel größer als in Rac1. So beträgt die Distanz

______171 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______zwischen Mg2+-Ion und dem Cα-Atom von Thr35 etwa 8,3 Å, in Rac1·GppNHp allerdings nur 4,2 Å, so dass in Rac1 das Nukleotid durch den Switch I vollkommen verdeckt ist. Ein Grund für diese offene Konformation des Switch I könnte die fehlende Interaktion zwischen Switch I und Switch II sein. In der Rac1·GppNHp Struktur liegt Phe37 (Switch I) in einer hydrophoben Tasche, die durch Thr58, Tyr64, Leu67 und Arg68 (Switch II) gebildet wird. Bedingt durch die hohe Mobilität des Switch II in den Rac1b Strukturen kann diese Interaktion nicht stattfinden und führt somit zu einer Destabilisierung des Switch I. In Bezug auf die Kristallpackung wird die offene Konformation des Switch I durch hydrophobe Interaktion der Phe37 Seitenketten von zwei benachbarten Molekülen stabilisiert. Dennoch besitzt der Switch I erhöhte Temperaturfaktoren (B = 45 Å2) im Vergleich zum Gesamtprotein (B = 22-24 Å2, Tab. 4.14). Dies lässt vermuten, dass der Switch I in Lösung ebenfalls sehr flexibel ist. Eine der Konsequenzen der offenen Switch I-Konformation ist der Verlust der Interaktion zwischen dem invarianten Thr35 (Hauptketten NH-Gruppe), dem γ-Phosphat und dem Mg2+- Ion (OH-Gruppe der Seitenkette). Dies könnte wiederum eine Erklärung für die schnelle Nukleotiddissoziation von Rac1b sein (Fiegen et al., 2004). Ein ähnliches Verhalten wurde für die T35A Mutation in Ras gezeigt, die ebenfalls zu einer drastischen Verringerung der Nukleotidaffinität führt. Grund ist hier der Verlust der Mg2+-Koordination (John et al., 1993; Spoerner et al., 2001). Auch der Tiam-katalysierte Nukleotidaustausch, wie die Kristallstruktur des nukleotidfreien Rac1·Tiam1 Komplexes gezeigt hat, basiert auf einer Verschiebung der Switch I und der β2-Region (Aminosäuren 27-45) um bis zu 2,7 Å (Worthylake et al., 2000). Als Folge der Interaktion mit der DH-Domäne von Tiam1 wird durch die Verschiebung die Thr35-Mg2+ Interaktion zerstört und erlaubt so die Dissoziation des GDP (Vetter & Wittinghofer, 2001; Worthylake et al., 2000). Da in Rac1b die Kontakte des P-Loop sowohl mit GDP als auch mit GppNHp konserviert und die erhöhten Dissoziationsraten für GDP und GTP vergleichbar sind (Fiegen et al., 2004), ist es vorstellbar, dass die 19 Aminosäuren lange Insertion von Rac1b einen zu Tiam1 ähnlichen Effekt auf den Switch I ausübt. Besonders auffallend war die hohe Dissoziationsrate von GppNHp (~10-fach höher als für GDP/GTP, Fiegen et al., 2004). Ursache hierfür ist vermutlich die fehlende Interaktion zwischen der Amino-Funktion von Ala13 (P-Loop) und der β,γ-Iminogruppe des GppNHp. Eine vergleichbare Beobachtung wurde auch schon für Ras·mantGppNHp gemacht (Schmidt et al., 1996).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 172 DISKUSSION ______

Cdc42·GDP (Rudolph et al., 1999) zeigt im Switch I Bereich eine ähnlich offene Konformation wie die Rac1b-Strukturen. Hier ist höchstwahrscheinlich ebenfalls der fehlende Kontakt zwischen Thr35 und dem Magnesiumion die Ursache.

5.2.4 Interaktion von Rac1b mit Regulatoren und Effektoren

Um die Interaktion von Rac1b mit Regulatoren und Effektoren strukturell zu untersuchen, wurden folgende Komplexstrukturen verwendet: der nukleotidfreie Rac1·Tiam1-Komplex (Worthylake et al., 2000), RhoGDI im Komplex mit Rac1, Rac2 und Cdc42 (Grizot et al., 2001; Scheffzek et al., 1997; Hoffman et al., 2000), der Übergangszustandskomplex aus RhoA und p50RhoGAP (Rittinger et al., 1997), der Rac1·GppNHp·PAK-Komplex (Morreale et al., 2000) und der Komplex aus Rac1(Q61L)·GTP·p67PHOX (Lapouge et al., 2000). Zusätzlich zu der β2/β3/β4-Region im Falle von Tiam1, der β4/α3-Region für RhoGDI bzw. der α1/α5-Region für PAK-GBD interagieren alle diese Proteine, außer p67PHOX, mit den Switch-Regionen der GTPasen. p67PHOX bindet ausschließlich an die α1, β2 und α5 Regionen von Rac. Eine Überlagerung des GDI-Komplexes mit Rac1b zeigte, daß bei einer Bindung von GDI an die Switch II und α3-Region von Rac1b ausreichend Raum für die Insertion bleiben würde. Kürzlich wurde allerdings gezeigt, dass GDI nicht an Rac1b bindet (Matos et al., 2003). Es wurde zuvor bereits gezeigt, dass die α3-Helix für eine Interaktion mit dem GDI-Protein essentiell ist, da eine H103A Mutation zu deren Verlust führt (Haeusler et al., 2003). Die Struktur der α3-Helix von Rac1b ist im Vergleich zu Rac1 nicht verändert, so dass man davon ausgehen kann, dass die Insertion die GDI Bindung sterisch verhindert. Die Assoziation von Tiam1 an Rac1b wurde kürzlich durch Immunpräzipitationsexperimente gezeigt (Matos et al., 2003). Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass die strukturellen Anforderungen für eine Interaktion zwischen Tiam1 und Rac1b durch die 19 Aminosäuren lange Insertion nicht gestört werden. Allerdings konnte im Gegensatz zur Rac1b·p50GAP- Interaktion, die zu einer Stimulation der GTP-Hydrolyse führte, sogar durch einen 50-fachen Überschuß von Tiam1 DHPH keine Beschleunigung der Dissoziation erreicht werden (Fiegen et al., 2004). Im Allgemeinen ist es akzeptiert, dass sowohl GEFs als auch GAPs eine Aktivierung und Membranrekrutierung benötigen, um ihre regulatorische Funktion in der Zelle wahrzunehmen. Dies zusammen mit der Tatsache, dass Rac1b in COS7 Zellen ohne extrazelluläre Stimuli GTP-gebunden vorliegt (Fiegen et al., 2004), deutet darauf hin, dass

______173 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______

Rac1b unabhängig von seinen Regulatoren ist und intrinsisch einen aktivierten Zustand aufrechterhalten kann. Die biochemischen Daten bezüglich der Effektorbindung führen zu der Annahme, dass PAK- GBD die sehr mobilen Switch-Regionen stabilisieren muss und deshalb eine 7-fach geringere Affinität im Vergleich zu Rac1 besitzt. Da full length-PAK eine noch geringere Affinität besitzt, konnte keine Bindung dieses Proteins nachgewiesen werden (Fiegen et al., 2004). Folglich kann Rac1b im zellulären Kontext nicht mit PAK interagieren. Die Bindung eines weiteren Rac-Effektorproteins, p67PHOX, wurde bisher noch nicht untersucht und kann, da die Bindungsstelle auf Rac1b strukturell konserviert ist, nicht ausgeschlossen werden. Die Tatsache, dass Rac1b mit GAP und PAK-GBD interagieren kann, zeigt, dass (i) die sehr mobilen Switch-Regionen von Rac1b durch verschiedene Domänen erkannt und dass (ii) die Insertion nicht notwendigerweise zum vollständigen Verlust der Bindung führen muss. Allerdings ist bei einer Bindung eine stäkere Stabilisierung der Switch-Regionen als in Rac1 nötig und führt offensichtlich zu einer Verringerung der Bindungsaffinität relativ zu Rac1, wie für PAK-GBD gezeigt werden konnte.

5.2.5 Rac1b im zellulären Kontext

Die präsentierten Daten zusammen mit der Veröffentlichung von Matos et al. (Matos et al., 2003) ermöglichen es, ein Konzept für die Regulation und die Interaktion von Rac1b mit Effektoren aufzustellen (Abb. 5.6). Die fehlende Regulation durch GDI-Proteine führt zu einem konstitutiv membrangebundenen Rac1b. Bezieht man die im Vergleich zu Rac1 ungewöhnlichen intrinsischen Eigenschaften von Rac1b mit ein, so könnte man vermuten, dass eine Regulation durch GEFs und GAPs nicht nötig ist. Rac1b kann zwar durch GAPs effektiv inaktiviert werden, tritt aber sofort durch das „eingebaute GEF“, d.h. die 19 Aminosäure-Insertion, in einen neuen GTPase-Zyklus ein. GEFs können hier sogar zu einem noch schnelleren Nukleotidaustausch führen. Die Selbstaktivierung von Rac1b, zusammen mit der langsameren GTPase Reaktion und der Insensitivität gegenüber GDIs führen zu einer Akkumulation von GTP-gebundenem Rac1b in der Zelle (Fiegen et al., 2004).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 174 DISKUSSION ______

Abb. 5.6:.Der selbstaktivierende Mechanismus von Rac1b. Rac1b GTP akkumuliert an der Membran, bedingt durch die fehlende GDI-Regulation, dem schnellen intrinsischen Nukleotidaustausch und die beeinträchtigte GTP-Hydrolyse. Ein GEF (z.B. Tiam1) könnte die Aktivierung von Rac1b weiter beschleunigen, während ein GAP (z.B. p50GAP) die Inaktivierung katalysiert. Die weitere Signaltransduktion ist von PAK unabhängig, könnte aber neben anderen bisher noch nicht identifizierten Effektoren (?) auch p67PHOX involvieren. Die Pfeile zeigen effektive (fett), ineffektive (dünn), mögliche (gestrichelt) oder keine Interaktionen (durchgestrichen).

______175 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______

5.3 Kristallstrukturen von TC10

TC10 ist ein Mitglied der Rho-GTPase Familie und ist dem Zweig der Cdc42-ähnlichen Proteine zuzuordnen. Die höchste Sequenzidentität besteht zwischen TC10 und TCL mit 72%, gefolgt von Cdc42 mit 59%, Rac1 mit 56% und RhoA mit 46% (Abb. 5.7).

Abb. 5.7: Sequenzvergleich ausgewählter Rho-GTPasen. Der Sequenzvergleich wurde mittels der GCG Software erstellt und mit Genedoc modifiziert. Schwarz hinterlegte Bereiche kennzeichnen 100%ige Konservierung, während rot hinterlegte Bereiche 80%ige Konservierung bedeuten. Die schwarzen Balken zeigen die Konsensusmotive der GTPasen: P-Loop, Switch I, Switch II, TQID- und SAL-Motiv.

Im Gegensatz zu den am Besten untersuchten Mitgliedern der Rho-Familie, RhoA, Rac1 und Cdc42, ist die Funktion von TC10 noch nicht genau bekannt. Ein Teil dieser Arbeit sollte der strukturellen Charakterisierung von TC10 dienen, um die biochemischen Eigenschaften dieses Schaltermoleküls erklären zu können und die Funktionsweise besser zu verstehen. Die Strukturaufklärung des GDP- und des GppNHp-gebundenen Zustands, mit einer Auflösung

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 176 DISKUSSION ______von 2,1 Å bzw. 2,65 Å, sollte sowohl Aufschluss über den Schaltermechanismus dieser GTPase als auch über die Regulation und Signaltransduktion geben.

5.3.1 Die TC10 Strukturen im Vergleich

Die relativ hohe Sequenzhomologie unter allen Mitgliedern der Rho-Familie lässt eine ähnliche Topologie der Proteine erwarten. Eine Überlagerung bestätigt die nur geringen Unterschiede in den Positionen der Cα-Atome. Die mittlere Abweichung der Cα-Atome zwischen TC10∆C·GDP und Cdc42·GDP (162 Cα Atome) beträgt 0,80 Å. Die Abweichung zwischen TC10∆C·GppNHp und Cdc42·GDP (167 Cα Atome) beträgt ebenfalls nur 0,86 Å. Für Rac1·GppNHp sieht der Vergleich zu TC10 ähnlich aus. Hier sind die mittleren Abweichungen zu TC10∆C·GDP 0,99 Å (166 Cα Atome) und zu TC10∆C·GppNHp 1,11 Å (163 Cα Atome). RhoA ist bezüglich der Sequenzidentität (46%) weiter von TC10 entfernt. Dies findet sich auch in den mittleren Abweichungen der Cα-Atome wieder, wie der r.m.s.d.- Wert von 1,37 Å für 173 Cα-Atome zeigt (TC10∆C·GppNHp im Vergleich zu RhoA·GTPγS; Ihara et al., 1998). Obwohl die mittlere Abweichung der Cα-Atome zwischen den TC10 GDP Strukturen und Cdc42 GDP (Rudolph et al., 1999) nur gering sind, zeigen die Abbildungen (Abb. 4.60; Abb. 5.9) deutliche Unterschiede im Bereich der Switch I und der β2/β3 Region (4.5.7.3 und 4.5.7.4).

Abb. 5.8: Überlagerung aller TC10 Strukturen. Als Überlagerung sind hier alle Moleküle der asymmetrischen Einheiten von TC10∆C·GDP (2 Moleküle, grün), TC10∆NC·GDP (4 Moleküle, blau) und TC10∆C·GppNHp (2 Moleküle, rot). Deutlich zu erkennen ist die ähnliche Konformation des Switch I und die hohe Mobilität in der β2/β3-Schleife und der Switch II-Region.

______177 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______

5.3.2 Das zusätzliche Mg2+-Ion im β2/β3-Bereich von TC10∆C·GDP

Die TC10∆C·GDP-Struktur war die erste gelöste Struktur in dieser Arbeit. Zum Ende der Strukturverfeinerung wurde deutlich, dass sich im Übergangsbereich zwischen den β- Faltblattsträngen β2/β3 ein zusätzliches, durch Wasserliganden koordiniertes Mg2+-Ion befindet (Abb. 4.63). Der Vergleich zu Cdc42 (Rudolph et al., 1999) verdeutlichte, dass hier strukturelle Unterschiede vorliegen (Abb. 5.9). Es stellte sich demnach die Frage, ob die strukturelle Abweichung auf das zusätzliche Magnesiumion zurückzuführen ist, oder für TC10 charakteristisch ist. Dazu wurde eine zweite GDP-Struktur (TC10∆NC·GDP) mit einer anderen Raumgruppe aufgeklärt. Diese Struktur zeigt interessanterweise trotz fehlenden zusätzlichen Magnesiumions die gleiche strukturelle Abweichung in der β2/β3 Region wie die erste Struktur (Abb. 5.9 und Abb. 5.8). Das zusätzliche Magnesiumion bei TC10∆C·GDP hat folglich keinen direkten Einfluss auf die Struktur von β2/β3, sondern stabilisiert nur die schon vorhandene Konformation. Die offensichtlichen Unterschiede in der TC10∆C·GDP Struktur sind nicht nur in Bezug auf die Cdc42 Struktur interessant, sondern ebenfalls in Bezug auf die TC10·GppNHp Struktur (siehe unten).

Abb. 5.9: Stereo-Überlagerung der β2/β3-Regionen. Überlagerung der β2/β3-Regionen von TC10∆C·GDP (grün), TC10∆NC·GDP (beige), TC10∆C·GppNHp (rot) und Cdc42·GDP (blau). Deutlich zu erkennen sind die Unterschiede zwischen TC10 und Cdc42 am N-Terminus von β2, die durch die offene Switch I-Konformation von Cdc42 zustande kommen. Ebenso wird die hohe konformationelle Flexibilität der β2/β3-Schleife veranschaulicht.

5.3.3 Die Nukleotidbindung von TC10

An der Nukleotidbindung von TC10 sind, wie in anderen GTPasen auch, Abschnitte beteiligt, die durch insgesamt fünf konservierte Sequenzmotive charakterisiert werden können (Abb. 5.7). Die Sequenz 24GDGAVGKT31 umfasst die Phosphat-bindende Schleife, die auch als P- ______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 178 DISKUSSION ______

Loop bezeichnet wird (Saraste et al., 1990). Der Switch I enthält die für die Bindung des Mg2+-Ions wichtige Aminosäure Thr49. Die Switch II-Region besteht aus den Aminosäuren 71DTAGQEDYDRL81 und enthält das für die GTP-Hydrolyse essentielle Gln75. Ebenfalls wichtig für die Nukleotidbindung sind die Sequenzmotive 129TQID132 und 172SAL174. Die Phosphat-bindende Schleife ist in allen drei TC10-Strukturen sehr gut definiert. Die Amid-Protonen der Hauptkette sind für die Koordination des α- und β-Phosphats verantwortlich. Die terminale Aminogruppe von Lys30 wechselwirkt in der TC10·GDP- Struktur nur mit dem β-Phosphat, während es in der GppNHp-Struktur zwischen β- und γ- Phosphat lokalisiert ist. Die Elektronendichte für das γ-Phosphat ist in der GppNHp-Struktur gut erkennbar und klar definiert. Für die Bindung des Magnesiumions (bzw. Ca2+ in TC10∆NC·GDP) sind drei der oben angesprochenen konservierten Schleifenregionen, sowie das β-Phosphat in der GDP-Struktur und die β- und γ-Phosphatgruppen in der GppNHp-Struktur verantwortlich. Aus diesen drei Regionen ist jeweils eine Aminosäure für die Mg2+-Koordination von besonderer Bedeutung. In der P-Schleife ist dies Thr31, im Switch I Thr49 und am N-Terminus des Switch II Asp71. Bedingt durch die niedrigere Auflösung von 2.65Å der TC10·GppNHp-Struktur ist die Magnesiumbindungsstelle schlechter aufgelöst als in beiden GDP-Strukturen war jedoch als solche eindeutig in der Elektronendichte identifizierbar. Interessanterweise erfolgt die Koordination des Mg2+-Ions durch Thr49 in den GDP-Strukturen wie auch in der GppNHp- Struktur jeweils durch die Keto-Funktion der Hauptkette, was im Vergleich zu anderen GTP- gebundenen Strukturen einen Unterschied darstellt (Hirshberg et al., 1997; Ihara et al., 1998). In der zu TC10 homologen GDP Struktur von Cdc42 (Rudolph et al., 1999) ist die Position des Carbonylsauerstoffs von Thr49 durch ein Wassermolekül besetzt und führt bei dieser Cdc42-Struktur zu einer offeneren Konformation der Switch I-Region. Die homologe Struktur von RhoA·GDP (Wei et al., 1997) hingegen zeigt eine sehr ähnliche Koordination des Mg2+- Ions wie in den TC10 Strukturen. In der GTP-gebundenen Form von RhoA (Ihara et al., 1998) hingegen ist es die Seitenkette von Thr37, die das Mg2+-Ion stabilisiert. Die Ribose des Nukleotids wird von TC10 nicht kontaktiert. Allenfalls Gln130 (Q116 in Cdc42) des TQID-Motivs koordiniert mit der Aminofunktion der Seitenkette das O4’ Atom der Ribose schwach (Abstand 3,5Å). Allerdings ist in der GppNHp-Struktur die Elektronendichte für die Seitenkette dieser Aminosäure nur partiell vorhanden. Diese Aussage gilt jedoch nicht für die TC10∆C·GDP Struktur, da hier Gln130 sehr gut durch die Elektronendichte definiert ist. Gln130 ist spezifisch für die Cdc42-ähnlichen Proteine (Cdc42, TC10, TCL, Chp und Wrch-1; Abb. 5.7). Die meisten anderen Rho-GTPasen, aber auch die

______179 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______der Ras-Familie haben in dieser Position ein Lysin, dessen ε-Aminogruppe das O4’-Atom der Ribose kontaktiert. Welchen Einfluss die fehlende positive Ladung sowie die fehlende Methylengruppe auf die Nukleotidbindung haben, ist noch unklar. Die intrinsische Nukleodissoziation von TC10 ist sehr langsam und liegt im Vergleich zu den anderen Rho- GTPasen in der gleichen Größenordnung (L.-C. Häusler, 2004). Interessanterweise wurde für die Nukleotidassoziation von TC10 eine 100-fach langsamere Reaktion im Vergleich zu RhoA, Rac1 und Cdc42 gemessen (A. Eberth, persönliche Mitteilung; L.-C. Häusler, 2004). Die Ursache für diesen Umstand ist jedoch anhand der Kristallstrukturen nicht eindeutig erklärbar. Es ist demnach davon ausgehen, dass mehrere kleine, sich aufsummierende Effekte hierfür verantwortlich sein müssen.

5.3.4 Die Switch-Regionen von TC10

Ein Vergleich der GDP- und GTP-gebundenen Strukturen verschiedener RhoGTPasen zeigt, dass zwei Regionen, Asp28 – Thr37 und Ala61 – Pro71 in RhoA sowie Phe28 – Asn39 und Ala59 – Leu67 in Rac1 und Cdc42, Nukleotid-abhängige Konformationsänderungen eingehen. Daher werden diese Regionen als Switch I bzw. Switch II bezeichnet. Diese Regionen spielen eine zentrale Rolle bei der Mg2+-Koordination, Nukleotidbindung, GTP- Hydrolyse sowie für die Interaktion mit Regulatoren und Effektoren (Vetter & Wittinghofer 2001; Dvorsky & Ahmadian, 2004). Die entsprechenden Regionen in TC10 sind Asp40 – Thr49 und Ala73 – Pro83 (Abb. 5.7). Interessanterweise zeigen die TC10·GDP und TC10·GppNHp Strukturen die gleiche Konformation in der entsprechenden Switch I-Region, die mit dem GDP-gebundenen Zustand von Rac, Cdc42 und RhoA übereinstimmt (Abb. 5.10). Die Positionen der Cα-Atome von Val47 bis Thr49 sind in TC10·GDP und GppNHp nahezu identisch. Kleinere Unterschiede sind für die Aminosäuren Ala38 bis Tyr46 erkennbar, wobei diese auf einer leicht veränderten Kristallpackung beruhen könnten. In beiden Strukturen (TC10∆C·GDP und TC10∆C·GppNHp) sind es zwei Switch I-Regionen benachbarter symmetrieverwandter Moleküle, die eine Interaktionsfläche ausbilden. In der TC10·GDP-Struktur sind es die Seitenketten von Tyr46, Phe51, Met35, Thr49 und Asp52, die über van-der-Waals bzw. Wasserstoffbrückenbindungen miteinander wechselwirken. In der TC10·GppNHp Struktur ist das Interface der symmetrieverwandten Moleküle in diesem Bereich kleiner. Hier sind nur die Seitenketten der Aminosäuren Tyr46 und Pro48 (Tyr32 und Pro34 in Cdc42) an hydrophoben Interaktionen beteiligt. Thr49 (Thr35 in Cdc42 bzw. Thr37 in RhoA) ist in allen GTPasen die

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 180 DISKUSSION ______essentielle Aminosäure des Switch I, da sie als Sensor für den Nukleotid-gebundenen Zustand der GTPase dient. Interessanterweise besteht in beiden Nukleotidzuständen von TC10 kein Unterschied in der Koordination des Mg2+-Ions durch Thr49 (Abb. 5.10). In beiden Strukturen erfolgt die Koordination des Mg2+-Ions durch die Ketofunktion der Hauptkette, so dass auch die TC10·GppNHp Struktur im Switch I-Bereich eher dem GDP-gebundenen Zustand der GTPase ähnelt (Abb. 5.10). Daraus leitet sich die Frage ab, ob die Switch I-Definition, wie sie für RhoA getroffen wurden, auch für TC10 gilt. Auf der Basis der zur Verfügung stehenden Daten, scheint der Switch I in TC10 unabhängig vom Nukleotid-gebundenen Zustand der GTPase zu sein. Allerdings liefern die Strukturen keinen eindeutigen Hinweis darauf, warum sowohl im GDP, als auch im GppNHp gebunden Zustand die Koordination des Mg2+-Ions in der gleichen Art und Weise erfolgt. Es gibt hier nur zwei mögliche Ursachen für diese GDP- ähnliche Konformation in der TC10·GppNHp-Struktur: zum einen könnte die Kristallpackung die GDP-Konformation der TC10·GppNHp-Struktur bevorzugen, zum anderen könnten einzelne Aminosäuresubstitutionen diesen Zustand verursachen. Da man für die GTP- gebundene Konformation einen vergleichsweise stabilen Zustand erwarten würden, so wie er in anderen GTP-gebundenen GTPase-Strukturen beobachtet wurde, sollte man diesen Zustand, wenn er denn stabiler ist, auch für TC10·GppNHp erwarten. Dies ist jedoch nicht der Fall. Das Interface der beiden Switch I-Regionen der symmetrieverwandten Moleküle ist sehr klein und scheint eher eine Konformation zu stabilisieren, die schon vorher vorhanden war. Auch in anderen GTP-gebundenen GTPase-Strukturen werden Interaktionen der Switch I- Region mit symmetrieverwandten Molekülen beobachtet: So interagiert z.B. in der RhoA·GTPγS-Struktur Phe39 mit dem Switch II eines benachbarten Moleküls (Ihara et al., 1998). Extensive Kontakte zum Switch I (Tyr32 und Pro34) durch benachbarte Moleküle sind ebenfalls in der Ras·GppNHp Struktur (Scheidig et al., 1999) zu beobachten. In beiden Strukturen ist trotz der Switch I-Kontakte die GTP-Konformation für den Switch zu beobachten, so dass zu vermuten ist, dass wenn diese Konformation auch in TC10 stabiler wäre, sie entsprechend in einer Kristallstruktur beobachtet werden könnte. Somit sind wahrscheinlich Aminosäuresubstitutionen im Bereich des Switch I für diese Konformation verantwortlich. Hierfür in Frage kommen Met35, Glu44 und His53. Met35 z.B. ist ein besonderes Merkmal von TC10. Die entsprechende Aminosäure in Cdc42 und Rac1 ist Ile21. In der GDP-Konformation ist die Seitenkette von Ile21 an einer hydrophoben Interaktion mit Phe37 (Phe51 in TC10) beteiligt und stabilisiert so zusätzlich die GDP-Konformation. Der Einfluss des im Vergleich großen Schwefelatoms von Met35 auf die hydrophobe Packung ist

______181 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______nur schwer abzuschätzen, könnte aber eine der Ursachen für den beobachteten Unterschied sein.

Abb. 5.10: Der molekulare Switch I der Rho-GTPasen im Vergleich. Dargestellt ist die jeweilige Switch I-Region der GTPasen TC10, Cdc42, Rac und RhoA im GDP- (schwarz) und GppNHp- (grau) gebundenem Zustand. Die zentralen Aminosäuren des Switch I sind als ball-and- stick-Modell hervorgehoben: Tyr46 (grün), Val47 (rot), Pro48 (orange) und Thr49 (blau).

Es ist bekannt, dass im GTP-gebundenen Zustand der Switch I in einem Gleichgewicht aus zwei Konformationen vorliegt (Spoerner et al., 2001). In TC10 scheint dieses Gleichgewicht zur GDP-Konformation für den Switch I verschoben zu sein. Ebenfalls in diese Richtung deutet die schwächere Effektorbindung von TC10 (siehe unten). Um die GDP-ähnliche Konformation der TC10·GppNHp-Struktur zu bestätigen bzw. auszuschließen, könnten Mutationsstudien (Thr49ÆAla) unter Beobachtung der Veränderung der Nukleotidaffinität bzw. der Hydrolysereaktion weitere mechanistische Einblicke ermöglichen.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 182 DISKUSSION ______

Vergleicht man die TC10 und Cdc42·GDP Strukturen (Rudolph et al., 1999), so sind hier deutliche Unterschiede im Bereich des Switch I zu erkennen. Ursache für die offene Switch I- Konformation und die unterschiedliche Koordination des Magnesiumions in der Cdc42·GDP- Struktur sind starke Interaktionen von symmetrieverwandten Molekülen mit der Switch I- Region. Der Carbonylsauerstoff von Thr49 koordiniert in TC10 das Magnesium, während Thr35 in Cdc42 nicht an der Bindung beteiligt ist. Verwendet man hingegen den Cdc42·GDP·GDI-Komplex (Hoffman et al., 2000) als Vergleichsstruktur zu TC10, so zeigen sich hier nur marginale Unterschiede. Die Cα-Positionen der Aminosäuren Val47 bis Thr49 sind vollkommen identisch. Die Region Pro43 bis Tyr46 scheint sowohl in Cdc42 als auch in TC10 strukturell variabler zu sein. Auf dieser Basis ist der Cdc42·GDP·GDI-Komplex (Hoffman et al., 2000) die bessere Referenz für den GDP-gebundenen Zustand von TC10. Die Sequenz der Switch II-Region ist für die meisten Mitglieder der Rho-Familie annähernd identisch (Abb. 5.7; Ausnahme ist die Rnd-Familie) und enthält das für die GTP-Hydrolyse essentielle Gln61. Die Sekundärstruktur von Switch II ist in den hier diskutierten TC10 Strukturen im Vergleich zu den anderen bekannten RhoGTPase-Strukturen unverändert und zeigt ebenfalls zwei aufeinanderfolgende 310-helikale Sekundärstrukturelemente. Der Vergleich der TC10·GDP mit der TC10·GppNHp Struktur zeigt aufgrund des Vorhandenseins des γ-Phosphats im Bereich des Switch II Veränderungen. Durch die zusätzliche Interaktion von Gly74 (Gly60 in Cdc42) mit dem γ-Phosphat nähert sich der Bereich von Ala73 bis Leu81 an das γ-Phosphat an. Diese zusätzliche Interaktion könnte zu einer Stabilisierung des Switch II führen. Die biochemischen Daten für TC10 zeigen eine 5-fach niedrigere intrinsische GTP-Hydrolyserate (Neudauer et al., 1998; A. Eberth, persönliche Mitteilung) verglichen mit anderen Rho-GTPase Mitgliedern (z.B. RhoA, Cdc42 und Rac1). Aufgrund der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie des Switch II innerhalb der Rho-Familie müsste die Ursache für diesen Unterschied anderweitig zu suchen sein. Auffällig ist in diesem Zusammenhang die höhere Sequenz- und Strukturvariabilität der Switch I-Region, die je nach GTPase eine leicht veränderte Mikroumgebung im Bereich des γ-Phosphats schaffen könnte. Weiterhin wurde, wie oben beschrieben, in TC10 eine GDP-ähnliche Konformation für den Switch I beobachtet, wobei das Mg2+-Ion durch die Ketofunktion der Hauptkette von Thr35 koordiniert wird. Die fehlende Konformationsänderung nach GTP-Bindung könnte folglich der Grund für die langsamere GTP-Hydrolysereaktion sein. Eine vergleichbare Situation, die ebenfalls zu einer 5-fach langsameren GTP-Hydrolyse führt, wurde bei einer Thr35Ala- Mutation in Ras gefunden (John et al., 1993). Bei dieser Mutation in Ras kann dementsprechend nur noch die Ketofunktion von Thr35 an der Mg2+-Bindung beteiligt sein.

______183 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______

Ein weiterer Aspekt bezüglich der langsameren GTP-Hydrolyse von TC10 ist die fehlende Koordination des γ-Phosphats durch Tyr46. In der RhoA·GTPγS-Struktur (Ihara et al., 1998) ist z.B. die Seitenketten-Hydroxylfunktion von Tyr34 an der Koordination des γ-Phosphats beteiligt, ebenso wie Tyr32 in der Rac1·GppNHp-Struktur (Hirshberg et al., 1997). In der hier beschriebenen TC10·GppNHp Struktur ist eine zu RhoA und Rac1 vollkommen veränderte Position für das entsprechende Tyr46 und keine Beteiligung an der Nukleotidbindung zu erkennen. Für Ras oder Rap scheint allerdings die γ-Phosphat Koordination durch die Hydroxylgruppe von Tyr32 keinen Einfluss auf die GTP-Hydrolyse zu haben, da durch eine Mutation zu Phenylalanin keine Verringerung der Hydrolyserate zu beobachten war (Yamasaki et al., 1994). Im Fall von Rap konnte zusätzlich anhand der GTP- und der GTPγS- Strukturen gezeigt werden, dass das Vorhandensein bzw. Nicht-Vorhandensein einer Bindung zwischen Tyr32 und dem γ-Phsophat keinen Einfluss auf die Struktur des Switch I hat (Menetrey & Cherfils, 1999). Neben der hier beschriebenen Veränderung im Switch II-Bereich gibt es eine weitere Region, die sich in der GDP-gebundenen und der GppNHp-gebundenen Struktur von TC10 unterscheidet. Dies ist die Schleifenregion zwischen den β2/β3-Faltblättern und befindet sich somit genau zwischen beiden Switch-Regionen. Die für TC10·GppNHp zusätzlich sichtbaren N-terminalen Aminosäuren bilden mit dem zweiten Molekül der asymmetrischen Einheit ein intermolekulares β-Faltblatt aus. Diese Interaktion endet genau vor bzw. hinter dem Bereich der veränderten β2/β3-Region (Aminosäuren Ser57 bis Tyr65). Es stellt sich demnach die Frage, ob diese Interaktion die Struktur im β2/β3-Bereich beeinflusst. Es wäre hier zum Beispiel eine konformationelle Einschränkung vorstellbar. Die Bindung des N-Terminus des benachbarten Moleküls scheint die Struktur der Schleifenregion zwischen β2/β3 stark zu beeinflussen. Da analytische Gelfiltrationen gezeigt haben, dass TC10·GppNHp kein physiologisches Dimer ist, kann eine biologische Relevanz ausgeschlossen werden. Die beobachtete Struktur in diesem Bereich ist demnach auf die Kristallpackung zurückzuführen.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 184 DISKUSSION ______

Abb. 5.11: Sequenzvergleich der Rho-GTPasen für die β2/β3-Region. Der Sequenzvergleich wurde mittels der GCG Software erstellt und mit Genedoc modifiziert. Schwarz hinterlegte Bereiche kennzeichnen 100%ige Konservierung, während dunkelgrau hinterlegte Bereiche 80%ige Konservierung und hellgrau hinterlegte Bereiche 60 %ige bedeuten. Die in der Schleifenregion zwischen β2/β3 vorkommenden Glycine sind gelb hervorgehoben.

Weiterhin ist die Schleifenregion zwischen β2/β3 stark Lösungsmittel-exponiert. In vielen Strukturen der Rho-GTPasen besitzt diese Region im Vergleich zum Proteinkern erhöhte Temperaturfaktoren, wie z.B. in Cdc42·GDP (Rudolph et al., 1999), RhoA·GDP (Wei et al., 1997) und RhoA·GTPγS (Ihara et al., 1998). In der Rac1·GppNHp Struktur hingegen wird diese Region sowohl durch intermolekulare Kristallkontakte als auch durch intramolekulare Interaktionen stabilisiert (Hirshberg et al., 1997). Die Carboxylgruppe von Asp47 in Rac1 bildet mit der Guanidiniumgruppe von Arg174 Wasserstoffbrückenbindungen aus. Vergleichbar interagiert Lys49 mit der Ketofunktion von Cys178 (Hirshberg et al., 1997). Auch die Analyse der Normalmodi (4.5.8) zeigt für diese Region eine erhöhte Flexibilität, besonders auffallend für Cdc42. Die Werte für die Vibration von TC10·GDP und GppNHp sind hier deutlich niedriger, weisen aber zueinander ebenfalls Unterschiede auf. TC10·GppNHp ähnelt sowohl in der Konformation der Schleifenregion wie auch in der Vibration eher Cdc42. TC10·GDP zeigt die niedrigsten Werte für die Vibration in diesem Bereich, was auf die schon beschriebene hydrophobe Packung des β2-Strangs mit dem

______185 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______

Proteinkern zurückzuführen sein könnte. Betrachtet man den dargestellten Sequenzvergleich eines Teils der Rho-GTPasen für die β2/β3-Region (Abb. 5.11) so fällt auf, dass nur die Cdc42 ähnlichen Proteine (Cdc42, TC10 und TCL) in der Mitte der β2/β3-Schleife zwei aufeinanderfolgende Glycine (Gly47 und Gly48 in Cdc42) besitzen. Da Glycine im Vergleich zu allen anderen Aminosäuren mehr Bewegungsfreiheit haben, könnte diese Abweichung eine der möglichen Ursachen für die beobachteten Unterschiede sein und zu einer erhöhten Flexibilität dieser Region führen. Bei der β2/β3-Region scheint es sich folglich um eine hochflexible Region zu handeln, die allerdings keine Strukturänderung abhängig vom Nukleotidgebundenen Zustand der GTPase aufweist.

5.3.5 Die Insert-Helix

Einer der Hauptunterschiede zwischen den Proteinen der Ras- und der Rho-Familie ist das Vorhandensein der Insert-Helix. Dies ist ein Bereich von 13 Aminosäuren Länge, der zwischen dem β5-Strang und der Helix α4 eingefügt ist. Eine Bindung von Effektoren und Regulatoren der Rho-GTPasen an diesen Bereich wird derzeit vielfach diskutiert. Eine Interaktion mit den GDI-Proteinen (Wu et al., 1997) konnte gezeigt werden. Weiterhin ist sie an der Bindung der p67PHOX-Untereinheit der NADPH-Oxidase beteiligt (Freeman et al., 1996). Durch den Vergleich der Strukturen von RhoA·GDP (Wei et al., 1997) und RhoA·GTPγS (Ihara et al., 1998) konnte gezeigt werden, dass sie ihre Struktur nicht nukleotidabhängig verändert. Die Insert-Helix (Aminosäuren Asp124 bis Gln136, RhoA, Ihara et al., 1998) zeigt auch in den TC10 Strukturen die gleiche Sekundärstruktur (Abb. 5.8), eine 310-Helix gefolgt von einer senkrecht dazu stehenden α-Helix. Vergleicht man die TC10-Strukturen untereinander durch eine Überlagerung aller Moleküle der asymmetrischen Einheiten, so erkennt man eine hohe Variabilität in dieser Region, die durch die stärkere Lösungsmittelexposition zustande kommt (Abb. 5.8). Erhöhte Temperaturfaktoren für den Bereich der Insert-Helix wurden auch in der Kristallstruktur von Rac1·GppNHp (Hirshberg et al., 1997) beobachtet. In der RhoA·GDP-Struktur (Wei et al., 1997) hingegen wird diese Helix durch Kristallkontakte mit symmetrieverwandten Molekülen stabilisiert und damit ihre Beweglichkeit eingeschränkt. Eine ähnliche Situation wurde in der Kristallstruktur von Rnd3 (Fiegen et al., 2002) beobachtet, wo ebenfalls Kristallkontakte zu einer Stabilisierung der Sekundärstruktur führen. Die Mobilität der Insert-Helix ist aber auch in Lösung erhöht, wie NMR-Studien an Cdc42·GDP (Feltham et al., 1997) zeigen. Die resultierenden Modelle zeigen für diesen

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 186 DISKUSSION ______

Bereich keine Sekundärstruktur, was im Falle von Cdc42 darauf hindeuten könnte, dass dieser Bereich erst durch Bindung anderer Proteine strukturiert wird.

5.3.6 Die Oberflächen im Vergleich

Sowohl TC10·GDP als auch TC10·GppNHp zeigen eine sehr ähnliche Oberfläche und Ladungsverteilung, was aufgrund der nur geringen strukturellen Unterschiede auch zu erwarten ist. Lediglich für einige Seitenketten sind auf der Oberfläche unterschiedliche Konformationen erkennbar. Der in der Elektronendichte von TC10·GppNHp interpretierbare N-Terminus ist im Vergleich zu der Oberfläche von TC10·GDP leicht auszumachen (Abb. 5.12). TC10·GppNHp zeigt ähnlich wie Cdc42 eine Aushöhlung (‚Groove’) zwischen der Switch I-Region und dem N-Terminus, die durch eine Verlagerung der β2/β3-Region zustande kommt. Da die TC10·GDP-Struktur im β2/β3-Bereich eine näher zum Proteinkern ausgerichtete Konformation zeigt, ist hier diese Aushöhlung nicht vorhanden. In der GTP- Konformation von Cdc42 ist diese Aushöhlung für die Erkennung und Bindung des CRIB- Motivs von PAK, ACK und WASp verantwortlich. Der Vergleich der Oberflächen von TC10 und Cdc42 zeigt in einigen Bereichen Unterschiede bezüglich der Ladungsverteilung (Abb. 5.12 und Abb. 4.64). Besonders auffallend sind hier die Insert-Helices, die an einer Position jeweils entgegengesetzte Ladungen aufweisen. So entspricht Asp145 von TC10 Lys131 in Cdc42. Glu127 von Cdc42 entspricht in TC10 hingegen einer hydrophoben Aminosäure (Ala141). Die positive Ladung von Lys138 in TC10 entspricht in Cdc42 hingegen einer polaren Aminosäure (Ser124). Den beiden negativ geladenen Aminosäuren Glu49 und Glu178 von Cdc42 konnte bereits eine Funktion bezüglich der Assoziation an WASp zugeordnet werden (Hemsath et al., 2005). Da die entsprechenden Aminosäuren in TC10 entweder eine positive Ladung besitzen (Lys63) oder ungeladen (Thr192) sind, funktioniert der für die Cdc42/WASp Assoziation beschriebene Mechanismus der elektrostatischen Steuerung für TC10 und WASp nicht. Weitere auffällige Unterschiede in TC10 sind die Aminosäuren Asp40 (Asn26 in Cdc42) und Lys116 (Thr102). In Cdc42 sind dies hingegen die Aminosäuren Lys27 (Ala41 in TC10), Glu143 (Gln157) und Lys153 (Cys167).

______187 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______

Abb. 5.12: Vergleich der Oberflächeneigenschaften von TC10∆NC·GDP (oben), TC10∆C·GppNHp (mitte) und Cdc42·GDP (unten). Dargestellt ist die Verteilung der Oberflächenladungen der jeweiligen Moleküle. Die Berechnung der Oberflächen und der Ladungsverteilung erfolgte mit dem Programm MSMS. Negative Ladungen (Asp und Glu) sind in rot, positive Ladungen (Lys und Arg) in blau, während vornehmlich hydrophobe Aminosäuren (Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp und Tyr) in olive dargestellt sind. Links ist jeweils die Ansicht von vorne, auf das Nukleotid. Die rechte Ansicht erhält man nach einer 180°-Drehung um die Horizontalachse der linken Abbildung. Einzelne, zwischen den Molekülen unterschiedliche Aminosäuren sind markiert und benannt.

5.3.7 Interaktion von TC10 mit Regulatoren und Effektoren

Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs)

GEFs spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation von kleinen GTPasen. Sie stabilisieren den Nukleotidfreien Zustand und ermöglichen so die Nukleotiddissoziation. Durch die höhere GTP-Konzentration in der Zelle bindet anschließend GTP im aktiven Zentrum. Für den katalytischen Mechanismus der Aktivierung von GTPasen durch GEFs sind auf beiden Seiten meist hochkonservierte Strukturmotive verantwortlich. Neben diesen mechanistisch

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 188 DISKUSSION ______interessanten Bereichen, vornehmlich Switch I und Switch II auf Seiten der GTPase, sind weitere zusätzliche Regionen für eine spezifische Erkennung der GTPase durch das GEF verantwortlich. Für die Interaktion mit den Dbl-homologen GEFs spielt hier die β1/β2/β3- Region der GTPasen eine besondere Rolle (Karnoub et al., 2001; Snyder et al., 2002). Diese Aminosäuren sind Thr3 (Met17 in TC10), Ala41 (Ala55), Thr43 (Ser57), Thr52 (Leu66), Gly54 (Gly68) und Phe56 (Tyr70) bei Cdc42 und dem GEF ITSN (Snyder et al., 2002). Die biochemischen Daten zeigten, dass die DHPH-Domänen von einigen typischen RhoGEFs keine Aktivität bezüglich TC10 zeigen. So waren Tiam1, p190, p115, Asef, hPEM, Cdc24, α- Pix, β-Pix und Abr inaktiv auf TC10 (L.-C. Häusler, 2004; A. Eberth, persönliche Mitteilung). Auch gegenüber Dbl scheint TC10 insensitiv zu sein (Hart et al., 1994 JBC). Der Grund hierfür sind die zuvor angesprochenen sechs Spezifitätsdeterminanten. Tyr70 in TC10 (Phe56 in Cdc42) wird z.B. eine der Ursachen dafür sein, dass Tiam1-DHPH keine Aktivität auf TC10 zeigt, da Tiam1 in der Lage ist, kleine Unterschiede auf Seiten der GTPase zu erkennen. Spezifitätsuntersuchungen mit Rac1 und Cdc42 haben gezeigt, dass eine einzige Aminosäure (W56) ausreicht, um die Erkennung von Trio, GEF-H1 und Tiam zu gewährleisten (Gao et al., 2001; Karnoub et al., 2001; Karnoub et al., 2004). Eine Mutation von F56W in Cdc42 reicht zwar nicht aus, um die Spezifität des Tiam1-GEFs von Rac1 auf Cdc42 zu verändern, allerdings ist dies für die umgekehrte Mutation in Rac, W56F, bezüglich des Cdc42-GEFs Intersectin möglich (Karnoub et al., 2001; Gao et al., 2001). Das bakterielle Toxin SopE, das als GEF von RhoGTPasen (Cdc42 und Rac1) fungiert, zeigt interessanterweise Austauschaktivität bezüglich TC10 (A. Eberth, persönliche Mitteilung). Daher wurden die TC10·GDP Strukturen mit dem Cdc42·SopE-Komplex (Buchwald et al., 2002) überlagert und verglichen. Neben den Switch I und Switch II Regionen von Cdc42, die mechanistisch eine wichtige Rolle spielen, sind auch der N-Terminus des β2-Strangs und der C-Terminus des β3-Strangs für die Interaktion zwischen GEF und GTPase wichtig. Im Bereich der β2/β3-Stränge der GTPase sind es vornehmlich folgende Aminosäuren die mit SopE interagieren: Asp38 (Asp52 in TC10), Tyr40 (Tyr54), Ala41 (Ala55) und Phe56 (Tyr70). Fast alle beteiligten Aminosäuren in den an der Interaktion beteiligten Regionen (Switch I, Switch II und β2/β3) sind auf der Basis von Sequenz und struktureller Topologie konserviert. Es ist anzunehmen, dass die Hydroxygruppe des Tyr70 von TC10 (Phe56 von Cdc42) zusätzlich noch Wasserstoffbrückenbindungen mit den Keto-Gruppen der Aminosäuren Ile177 und Ser178 von SopE eingehen könnte. Eine GEF-vermittelte TC10-Aktivierung in der Zelle wird auf der Basis der Resultate dieser Arbeit vorausgesetzt, da die Nukleotiddissoziation von TC10 sehr langsam ist und da diese

______189 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______

Reaktion durch das bakterielle Toxin (SopE) beschleunigt werden kann. Es ist daher anzunehmen, dass unter den 69 verschiedenen GEFs der Dbl-Familie (Rossman et al., 2005) TC10-spezifische Proteine existieren. Struktur- und Sequenzvergleiche kombiniert mit anschließenden biochemischen Analysen sollten zur Identifizierung eines TC10-GEFs führen. Weiterhin zeigt die Austauschaktivität von SopE auf TC10, dass diese Aktivität im zellulären Kontext eine wichtige Rolle bei der bakteriellen Pathogenese spielen könnte.

GTPase-Aktivierende Proteine (GAPs)

Die Interaktion der GAP-Proteine, wie z.B. p50GAP, erfolgt vornehmlich über die Switch I, Switch II und die α3-Regionen der GTPasen, was anhand von GAP·GTPase Komplexstrukturen gezeigt werden konnte (Rittinger et al., 1997; Nassar et al., 1998). Vergleicht man die Struktur von TC10∆C·GppNHp mit der Übergangszustandsstruktur des

Cdc42·GDP·AlF3·p50GAP-Komplexes (Nassar et al., 1998), so zeigen sich die größten Unterschiede im Bereich des Switch I. Dies ist bedingt durch die GDP-ähnliche Struktur dieser Region in TC10·GppNHp. p50GAP müsste demnach eine Hydrolyse-kompetente Konformation im Switch I zunächst induzieren. Der Switch II hingegen ist in beiden Strukturen sehr ähnlich und zeigt vergleichbare Konformationen. Bezieht man die Sequenzinformation mit ein, so sind alle Aminosäuren, die im Switch I bzw. II an der Ausbildung des Interface beteiligt sind, konserviert. Im Bereich der α3 gibt es bezüglich der Sequenz nur eine interessante Abweichung: Glu110 (Lys96 in Cdc42). Das Glutamat in TC10 könnte hier sogar für eine höher affine Bindung sorgen, da es Wasserstoffbrückenbindungen mit Thr310 und Arg314 auf Seiten des p50GAP eingehen könnte, die mit Lys96 von Cdc42 nicht möglich sind. Auf der Basis der strukturellen Daten und der Sequenzinformation ist eine Interaktion mit p50GAP sehr wahrscheinlich und wird auch durch biochemische Daten bestätigt. p50GAP zeigt, was TC10 betrifft, eine zu anderen Rho-GTPasen vergleichbare Beschleunigung der intrinsischen GTP Hydrolyse (Neudauer et al., 1998; A. Eberth, persönliche Mitteilung).

Guanin-Nukleotid-Dissoziationsinhibitoren (GDI)

Die Kristallstruktur des RhoGDI·Cdc42·GDP Komplexes zeigt als Bindungsepitope die Switch I, Switch II und die dem Switch II benachbarte α3-Helix (Hoffman et al., 2000). Ein vergleichbares Interface ist auch in den RhoGDI·Rac2·GDP und RhoGDI·RhoA·GDP Komplexen identifiziert worden (Scheffzek et al., 2000; Longenecker et al., 1999). Auf Seiten

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 190 DISKUSSION ______der GTPase sind im Switch I die Aminosäuren Thr35 (Thr49 in TC10) und Val36 (Val50 in TC10) an der Interaktion mit dem GDI-Protein beteiligt. Der N-terminale Bereich des Switch II erscheint für die Interaktion besonders wichtig und ist mit folgenden Aminosäuren beteiligt: Ala59 (Ala73), Tyr64 (Tyr78) und Leu67 (Leu81 in TC10) des Switch II bilden zusammen mit Leu41, Tyr51, Leu55 und Leu56 von RhoGDI einen hydrophoben Cluster. Die Seitenkette von Tyr64 (Tyr78) wird weiterhin durch Wasserstoffbrückenbindungen zu Asp42 und Lys52 von RhoGDI stabilisiert. An der Ausbildung der Interaktionsfläche beteiligt sind weiterhin die Aminosäuren Asp63 (Asp77), Arg66 (Arg80), Leu70 (Leu84), Ser71 (Ser85) und Pro73 (Pro87 in TC10). Im Bereich der α3-Helix sind es vornehmlich die Aminosäuren Glu100 (Glu114), His103 (Glu117) und His104 (Tyr118) die hydrophobe Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen eingehen. Besonders auffallend ist hier die Wasserstoffbrücke zwischen His103 (Cdc42) und Asp184 (RhoGDI). Betrachtet man die TC10·GDP-Struktur bezüglich einer Interaktion mit dem GDI-Protein, so zeigt sich eine deutliche strukturelle Konservierung. Keines der beteiligten Sekundärstrukturelemente zeigt besondere Auffälligkeiten. Auch auf der Sequenzebene sind im Switch I- und Switch II-Bereich alle beteiligten Aminosäuren konserviert. Die einzigen Abweichungen sind in der α3-Helix zu beobachten. Zwei der für die Interaktion wichtigen Aminosäuren sind substituiert: His103 (Glu117 in TC10) und His104 (Tyr118). Die Substitution von Histidin nach Tyrosin in Position 104 scheint, unter Berücksichtigung der RhoGDI·RhoA·Struktur, nur einen geringfügigen Einfluss zu haben, da RhoA an dieser Position ein Phenylalanin besitzt. Ob die Substitution von His103 nach Glutamat zu einer elektrostatischen Abstoßung mit Asp184 (RhoGDI) führt, ist nicht auszuschließen. Berücksichtigt man allerdings, dass für die hochaffine GDI-Bindung die C-terminale Modifizierung verantwortlich ist und wahrscheinlich einen deutlich größeren Beitrag zur Bindung liefert (Nomanbhoy & Cerione, 1996; Hori et al., 1991; Platko et al., 1995; Longenecker et al., 1999), wird dies für eine Bindung zwischen TC10 und GDI sehr viel wichtiger sein.

ACK

ACK (activated Cdc42-associated kinase) ist eine Nicht-Rezeptor Tyrosinkinase und ein Cdc42 spezifischer Effektor (Yang & Cerione, 1997; Eisenmann et al., 1999). Anhand von strukturellen Studien des Cdc42·GBD Komplexes konnte vorgeschlagen werden, dass Val42 und Leu174 von Cdc42 mit der GBD-Domäne von ACK interagieren (Mott et al., 1999). Diese Aminosäuren sind in TC10 allerdings konserviert (Val56 von TC10) bzw. konservativ ______191 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DISKUSSION ______substituiert (Ile188 von TC10) und können nicht dafür verantwortlich gemacht werden, dass TC10 nicht an ACK bindet (Neudauer et al., 1998). Eine kürzlich veröffentlichte Studie an Cdc42-TC10 Chimären konnte die β2/β3-Region als Spezifitäts-determinierende Region für die Bindung an ACK ausmachen (Gu et al., 2004). Interessanterweise ist dies genau die Region in TC10, die strukturelle Unterschiede zu Cdc42 aufweist. Acht Aminosäuren (39NYAVTVMIGGEPYTLGLF56 in Cdc42 und 53HYAVSVTVGGKQYLLGLY70 in TC10; Fett hervorgehoben) sollen demnach in Cdc42 für die Bindungsspezifität an ACK verantwortlich sein. Diese Region ist in allen Rho-GTPasen vergleichsweise gering konserviert und könnte demnach idealerweise für die unterschiedlichen Effektor- Bindungsspezifitäten verantwortlich sein. Die vorliegenden strukturellen Daten von TC10 zusammen mit den angeführten Mutationsstudien (Gu et al., 2004) weisen auf eine wichtige Rolle der β2/β3-Region bezüglich der Effektorbindung und Spezifität hin. Interessanterweise sind nur die Aminosäuren der β2-Region direkt an der Interaktion mit ACK beteiligt (Mott et al., 1999). Man würde demnach nicht unbedingt einen Einfluss der β3-Aminosäuren auf die Interaktion erwarten. Da aber auf der anderen Seite die NMR-Struktur von Cdc42 und ACK nur die GBD-Domäne enthält, könnten im full length-ACK weitere Spezifitäts- determinierende Bereiche vorhanden sein, die auch den β3-Bereich der GTPase miteinbeziehen.

WASp

Kürzlich konnte gezeigt werden, dass TC10 mit WASp und N-WASp interagieren kann, wobei diese Interaktion bis zu 800-fach schwächer ist, als für Cdc42 (Hemsath et al., 2005). Ile21, Thr24 und Thr25 von Cdc42 (Met35, Ala38 und Asn39) sind die einzigen Aminosäuren, die sich dabei im GTPase-WASp Interface unterscheiden. Mutationsstudien haben gezeigt, dass diese Unterschiede in Bezug auf die kinetischen Daten keinen Einfluß haben (Hemsath et al., 2005). Es ist jedoch beschrieben, dass neben den Aminosäuren, die direkt an der Bindung beteiligt sind auch komplementär geladene Regionen auf beiden Proteinen in der Nähe der Bindungsstelle wichtig für die Spezifität und effiziente Komplexbildung verantwortlich sein können (Schreiber, 2002). Dieser elektrostatische Steuerungsmechanismus ist bekanntermaßen für eine Erhöhung der Assoziationsgeschwindigkeit der Protein-Protein-Interaktion verantwortlich (Kiel et al., 2004; Sheinerman et al., 2000; Sinha & Smith-Gill, 2002).

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 192 DISKUSSION ______

Durch die TC10 Kristallstrukturen, sowie durch bioinformatische Analysen und Mutationsstudien konnte bewiesen werden, dass die basische Region von WASp und zwei für Cdc42 spezifische Glutamate (Glu49 und Glu178) für einen elektrostatischen Steuermechanismus (electrostatic steering) verantwortlich sind (Hemsath et al., 2005). Diese Glutamate sind in TC10 nicht vorhanden (Lys63 und Thr192), so dass dieser Steuermechanismus für eine TC10-WASp Interaktion nicht funktioniert (Abb. 5.12). Zusammen mit der Tatsache, dass die TC10·GppNHp Struktur eine GDP-ähnliche Konformation für den Switch I aufweist, müsste WASp als Effektor zunächst die typische GTP-Konformation im Switch I induzieren, was mit einem Affinitätsverlust einhergehen könnte. Beide angesprochenen Effekte zusammen könnten folglich die bis zu 800-fach geringere Affinität von WASp an TC10 erklären. Ob TC10 im zellulären Kontext mit WASp als Effektorprotein interagiert und WASP-vermittelte Aktinpolymerisation induzieren kann, muss genauer untersucht werden.

PAK1

PAK1 bindet genauso wie WASp und ACK unter Ausbildung eines intermolekularen β- Faltblatts an die β2-Region der GTPasen Cdc42 und Rac. Das Interface zwischen GTPase und PAK in diesem Bereich ist vornehmlich durch hydrophobe Interaktionen geprägt und zwischen Cdc42, Rac und TC10 relativ gut konserviert. Dies ist möglicherweise der Grund, warum PAK einen unspezifischen Effektor darstellt. Die 10-fach geringere Affinität von PAK für TC10 (Hemsath et al., 2005) könnte ähnlich wie bei WASp darauf hindeuten, dass PAK zunächst eine GTP-Konformation im Switch I induzieren muss, um in typischer Art und Weise an TC10 zu binden.

______193 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ZUSAMMENFASSUNG ______

6. Zusammenfassung

Die kleinen GTPasen der Ras- und Rho-Familien und die Transmembranproteine der Plexin- Familie sind in der Tumorprogression und Metastasierung involviert. Die zytoplasmatischen Domänen (CPDs) der Plexinrezeptoren (66 kDa) besitzen bemerkenswerte strukturelle Eigenschaften: (i) ein mittlerer variabler Sequenzabschnitt (200 Aminosäuren), wird als GTPase-bindende Region (GBD) bezeichnet und wird für die Bindung von kleinen GTPasen verantwortlich gemacht; (ii) die N- (170 Aminosäuren) und C-terminalen (180 Aminosäuren) konservierten Domänen, die durch die GBD unterbrochen werden, zeigen Sequenzhomologien zu den Ras-spezifischen GTPase-aktivierenden Proteinen (RasGAPs). Während die Funktion der GTPasen als molekulare Schalter gut erforscht ist, ist ihre Regulation durch die Plexine bzw. der Einfluss dieser Membranrezeptoren auf die GTPasen noch weitgehend unklar. Gegenstand dieser Dissertation war es, die Struktur- Funktionsbeziehung dieser zwei Proteinfamilien zu untersuchen. Für die rekombinante Expression der Plexine konnten verschiedene Proteinfragmente kloniert, in E. coli exprimiert und gereinigt werden. Die GBD-Domänen von PlexinB1, C1 und D1 konnten in hoher Reinheit und guter Ausbeute erhalten werden. PlexinA2-GBD stellte sich als instabil heraus. Die Reinigung der CPDs von PlexinA2 und B1 aus E. coli war nur unter Vorbehalt möglich, da hier eine Fehlfaltung des Proteins nicht auszuschließen ist. Die Expression und Reinigung der CPDs aus dem eukaryotischen Sf21-System hingegen erfolgte mit großer Reinheit und in guten Ausbeuten. Die Interaktion der Rho-GTPasen mit den GBDs konnte qualitativ mittels nativer Gelelektrophorese, Pulldown-Experimenten und GDI-Assay nicht gezeigt werden. Allerdings konnte eine Interaktion von PlexinB1-GBD mit Rac1(Q61L), Rnd1 und Rnd3 durch ITC- Experimente nachgewiesen werden. Aus den thermodynamischen Parametern kann ein niedrigaffiner 1:1 Komplex aus GTPase und PlexinB1-GBD postuliert werden. Die niedrigen Affinitäten im mittleren mikromolaren Bereich (10 - 15 µM) erklären, warum die Interaktion in den qualitativen Experimenten nicht nachzuweisen war. Weiterhin konnte für Rnd1 und Rac1(Q61L) qualitativ eine Interaktion mit der rekombinant hergestellten CPD von PlexinB1 ermittelt werden. Für die rekombinante CPD von PlexinB1 im Komplex mit Rnd1 oder Rac1(Q61L) war keine GAP-Aktivität auf R-Ras messbar. Ebenso konnte keine Beschleunigung der GTP-Hydrolyse von R-Ras oder H-Ras durch PlexinA1 gemessen werden. Als mögliche Ursachen kommen hier in Frage, dass die Plexin-Transmembranrezeptoren zunächst durch einen extrazellulären

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 194 ZUSAMMENFASSUNG ______

Liganden aktiviert werden müssen, bzw. dass eine intrazelluläre posttranslationale Modifikation (z.B. Phosphorylierung) nötig ist, um GAP-Aktivität zu zeigen. Bei der Kristallisation von PlexinA2-CPD (66 kDa, E. coli) wurden Kristalle für ein 32 kDa großes Proteinfragment erhalten. Trotz eingehender biochemischer Untersuchungen konnte nicht eindeutig geklärt werden, ob es sich um ein Fragment von PlexinA2 handelt, so dass die Struktur mittels multiplen isomorphen Ersatzes (MIR) gelöst wurde. Die Struktur mit einer Auflösung von 2.1 Å zeigte, dass es sich bei dem kristallisierten Protein um eine Verunreinigung, das Chaperonprotein Hsp31, gehandelt hat. Für die CPD von PlexinB1 (Sf21) konnten nadelartige Kristalle erhalten werden, die jedoch trotz intensiver Optimierung keine Diffraktion zeigten.

Rac1b ist eine Spleissvariante von Rac1 und besitzt eine 19 Aminosäuren lange Insertion am Ende der Switch II-Region. Der Einfluss dieser Insertion auf die Struktur der GTPase sollte in dieser Arbeit untersucht werden. Dazu wurde das C-terminal verkürzte Rac1b (Rac1b∆C) in zwei verschiedenen Nukleotidzuständen (GDP und GppNHp) kristallisiert. Die dreidimensionalen Strukturen konnten durch molekularen Ersatz unter Verwendung des Programms AMoRe gelöst werden. Die finale Auflösung der beiden Strukturen beträgt 1.75 Å. Der Vergleich dieser Strukturen zeigte interessanterweise, abgesehen vom gebundenen Nukleotid, keinen Unterschied. Die Switch I-Regionen beider Strukturen sind gut definiert, zeigen jedoch keine Beteiligung an der Nukleotidbindung, da sie eine offene Konformation besitzen. Für die Switch II-Regionen und die C-terminal liegenden 19 Aminosäuren- Insertionen konnte keine Elektronendichte beobachtet werden. Dies ist auf eine hohe Mobilität der Insertion und eine dadurch erhöhte Mobilität der Switch II-Regionen zurückzuführen. Diese strukturellen Veränderungen erklären, warum Rac1b eine höhere Nukleotiddissoziation und GTP-Hydrolyserate hat. Die Insertion scheint, durch eine Veränderung der Dynamik der Switch-Regionen, einem intrinsischen GEF zu ähneln. Rac1b·GTP akkumuliert an der Membran, bedingt durch die fehlende GDI-Regulation, dem schnellen intrinsischen Nukleotidaustausch und die beeinträchtigte GTP-Hydrolyse. Ein GEF (z.B. Tiam1) könnte die Aktivierung von Rac1b weiter beschleunigen, während ein GAP (z.B. p50GAP) nach wie vor die Inaktivierung katalysieren könnte. Die weitere Signaltransduktion ist von PAK unabhängig, könnte aber neben anderen bisher noch nicht identifizierten Effektoren auch p67PHOX involvieren.

______195 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien ZUSAMMENFASSUNG ______

TC10 zeigte im Vergleich zu Cdc42 und anderen Rho-GTPasen unterschiedliche Eigenschaften. Unsere Untersuchungen konnten zum einen bisher keinen zellulären Austauschfaktor für diese GTPase identifizieren. Zum Anderen besitzt TC10 im Vergleich zu Cdc42 eine 1000-fach niedrigere Bindungsaffinität für das Wiskott-Aldrich syndrom protein (WASp). Daher war es von größter Wichtigkeit, das Cdc42-homologe TC10-Protein strukturell zu charakterisieren. Hierzu konnte TC10∆C im GDP und GppNHp gebundenen Zustand kristallisiert werden. Weiterhin wurde ein zusätzlich N-terminal verkürztes Protein (TC10∆NC) im GDP-gebundenen Zustand kristallisiert. Die Phaseninformation konnte durch molekularen Ersatz für alle drei Strukturen angenähert werden. Die Auflösung der TC10∆C·GDP Struktur beträgt 2,2 Å, die der TC10∆C·GppNHp Struktur 2,6 Å und die der TC10∆NC·GDP Struktur 2,2 Å. Der Vergleich der beiden Nukleotid-gebundenen Zustände (GDP und GppNHp) zeigte interessanterweise keine Unterschiede für den Switch I-Bereich, während der Switch II, die für Rho-GTPasen typische Konformationsänderung zeigt. In allen drei Strukturen wird das Mg2+- Ion (bzw. Ca2+-Ion für TC10∆NC·GDP) durch die Ketogruppe der Hauptkette koordiniert und entspricht somit im Fall des GppNHp-gebundenen TC10 einer GDP-ähnlichen Konformation. Diese Daten erklären die veränderten biochemischen Eigenschaften von TC10 im Vergleich zu anderen Rho-GTPasen (Rac, Rho und Cdc42) bezüglich Nukleotidbindung, GTP- Hydrolyse und Effektor-Interaktion. Anhand der TC10-Strukturen konnten zwei wichtige Aspekte bezüglich der Aktivierung und der Interaktion mit den Effektoren erklärt werden. Eine Beschleunigung der sehr langsamen Nukleotiddissoziation durch GEFs ist essentiell, konnte jedoch mit den bisher untersuchten GEFs der Dbl-Familie in vitro nicht gezeigt werden. Dass dies im Prinzip möglich ist, zeigten die Experimente mit dem bakteriellen SopE-GEF. Andererseits haben die TC10·GppNHp Struktur und Modellanalysen gezeigt, dass die WASP-bindende Region zwischen TC10 und Cdc42 keine signifikanten Unterschiede besitzen und dass die 1000-fach unterschiedlichen Affinitäten zwischen TC10 und Cdc42 von Aminosäuren abseits der WASP-Bindefläche herrühren, die an einem Mechanismus beteiligt sind, der als „electrostatic steering“ bekannt ist.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 196 LITERATURVERZEICHNIS ______

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______217 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien DANKSAGUNG ______

Danksagung

Zum Gelingen dieser Arbeit haben sehr viele Personen beigetragen. Ihnen möchte ich an dieser Stelle für Ihre Hilfe und Ihr Verständnis danken.

An erster Stelle Prof. Dr. Wittinghofer für die Möglichkeit diese Arbeit in seiner Abteilung anfertigen zu können, für die Übernahme des Erstgutachtens, sowie seine Bereitschaft als Erstprüfer in der Promotionskommission zu fungieren. Danken möchte ich weiterhin Prof. Dr. Heumann für die Übernahme des Korreferats und Prof. Dr. Weingärtner für die Übernahme der Drittprüfer-Funktion in der Promotions- kommission.

Besondere Anerkennung gilt PD Dr. Reza Ahmadian für die interessante Thematik dieser Arbeit, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes in seiner Arbeitsgruppe, die gute Betreuung, die vielen Vorschläge und Ideen sowie die stete Diskussionsbereitschaft.

Ebenso möchte ich mich bei Dr. Ingrid Vetter für Ihre Bereitschaft mich im kristallographischen Bereich dieser Arbeit zu betreuen. Ihr Ideenreichtum und Ihre tiefe Einsicht in Strukturbiologische Zusammenhänge werden für mich auch in Zukunft ein Leitfaden sein.

Mein ganz besonderer Dank gebührt Patricia Stege für die hervorragende Einarbeitung und ihre Hilfsbereitschaft, die ganz wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat. Weiterhin möchte ich mich in aller Form auch bei meinen Laborkollegen Lars Blumenstein, Ulrike Herbrand, Lars-Christian Häusler, Lars Hemsath, Alexander Eberth, Katja Gotthardt, Benjamin Reinartz und Radovan Dvorsky bedanken, die mit ihrer Kollegialität und Unterstützung ganz wesentlich zu einem ausgezeichneten Arbeitsklima beigetragen haben. Eine weitere Danksagung für ihre Hilfsbereitschaft geht an die Mitarbeiter in Prof. Wittinghofers Arbeitsgruppe, vor allem Doro Kühlmann.

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 218 DANKSAGUNG ______

Bei allen Mitarbeiter/Innen des MPI Dortmund möchte ich mich bedanken; im Besonderen bei der Abteilung Strukturelle Biologie und der X-Ray Gemeinschaft für die außergewöhnlich angenehme Arbeitsatmosphäre. All denen, I. Schlichting, W. Blankenfeldt, M. Weyand, Ö. Yildiz und A. Scheidig, die durch Sammeln von Datensätzen zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, möchte ich meinen Dank bekunden.

Ein besonderer Dank gebührt meinen Eltern und meiner Schwester, die mich stets in jeder Hinsicht unterstützt und mir in allen Lebenslagen viel Verständnis entgegengebracht haben.

Ein weiterer persönlicher Dank gilt allen Freunden, die in diesen drei Jahren außerhalb der Arbeit für mich da waren.

______219 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien LEBENSLAUF ______

Lebenslauf

Persönliche Daten Name: Dennis Fiegen Geburtsdatum: 11.01.1977 Geburtsort: Kleve Familienstand: ledig

Promotion 03/2002 – 06/2005 Dissertation am Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie, Thema: „Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien“

06/2002 – 06/2004 Stipendium des Fonds der chemischen Industrie (FCI)

Diplom-Biochemie 10/1997 – 01/2002 Studium der Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum Abschluss: Diplom-Biochemiker Note: sehr gut mit Auszeichnung

07/2001 – 01/2002 Diplomarbeit am Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie Thema: „Strukturelle Aspekte der Rho-Familie und ihrer Interaktionspartner“

Zivildienst 10/1996 – 11/1997 Institut für Humangenetik in Bonn

Schullaufbahn und Abitur 06/1996 allgemeine Hochschulreife, Note: 1,5

08/1987 – 06/1996 Freiherr-vom-Stein-Gymnasium Kleve

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 220 LISTE DER PUBLIKATIONEN ______

Liste der Publikationen

Haeusler, L.C., Hemsath, L., Fiegen, D., Blumenstein, L., Herbrand, U., Dvorsky, R., Vetter, I.R. and Ahmadian, M.R. (2005) Purification and biochemical properties of Rac 1, 2, 3 and the splice variant Rac1b (A. Hall, editor), submitted to Methods in Enzymology

Hemsath, L., Dvorsky, R., Fiegen, D., Carlier, M.F. and Ahmadian, M.R. (2005) A novel mechanism of Cdc42 recognition by Wiskott-Aldrich Syndrome Proteins (submitted to Mol. Cell.)

Fiegen, D., Dvorsky, R. and Ahmadian, M.R. (2005) Structural Principles of Ras interaction with Regulators and Effectors. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands (C.J. Der, editor), in press

Fiegen, D., Haeusler, L.C., Blumenstein, L., Herbrand, U., Dvorsky, R., Vetter, I.R. and Ahmadian, M.R. (2004) Alternative splicing of Rac1 generates Rac1b, a self-activating GTPase. J. Biol. Chem. 279(6), 4743-4749.

Fiegen, D., Blumenstein, L., Stege, P., Vetter, I.R. and Ahmadian, M.R. (2002) Crystal structure of Rnd3/RhoE: functional implications. FEBS Lett. 525 (1-3), 100-104.

Brondijk, T.H.C., Fiegen, D. and Cole, J.A. (2002) Roles of NapF, NapG and NapH, subunits of the Escherichia coli periplasmic nitrate reductase, in ubiquinol oxidation. Mol Microbiol. 44(1), 245-255.

______221 Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien LISTE DER PUBLIKATIONEN ______

______Struktur-Funktionsbeziehungen der Rho- und der Plexin-Proteinfamilien 222