T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
( YÜKSEK LİSANS TEZİ )
MKA/MR OLGULARINDA GENETİK ETİYOLOJİNİN ARRAY-CGH TEKNİĞİ İLE ARAŞTIRILMASI
MARYAM BARGHI MASTAN ABAD
PROF. DR. BEYHAN TÜYSÜZ
GENETİK ANABİLİM DALI GENETİK PROGRAMI
İSTANBUL-2018
BEYAN
Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmayla elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığı beyan ederim.
MARYAM BARGHI MASTAN ABAD
ii İTHAF
Sevgili Aileme…
iii TEŞEKKÜR
Yüksek lisans eğitimim boyunca engin bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım, desteğini her zaman yanımda hissettiğim, tez çalışmamın her satırında emeği olan sevgili danışman hocam sayın Prof. Dr. Beyhan TÜYSÜZ’e;
Yol gösterici ve anlayışlı tavrıyla her zaman destek olan, bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen sevgili hocam sayın Doç. Dr. Birsen KARAMAN’a;
Tez çalışmalarım boyunca birlikte çalışma fırsatı yakaladığım, bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım, desteğini her zaman hissettiğim sayın Dr. Dilek ULUDAĞ’a;
Eğitimim boyunca hiçbir konuda yardımlarını esirgemeyen, her zaman destekleyen, her birinin ayrı ayrı emeği olan tüm Çocuk Genetik Anabilim Dalı çalışanlarına ve arkadaşlarıma,
Desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen ve her an yanımda olan sevgili aileme sonsuz teşekkür ederim.
iv İÇİNDEKİLER
TEZ ONAYI……………………………………………………………………………….... İ
BEYAN ………...... İİ
İTHAF...... İİİ
TEŞEKKÜR...... İV
İÇİNDEKİLER...... V
TABLOLAR LİSTESİ...... Vİİİ
ŞEKİLLER LİSTESİ...... İX
SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ...... Xİ
ÖZET...... Xİİİ
ABSTRACT...... XİV
1. GİRİŞ VE AMAÇ...... 1
2. GENEL BİLGİLER...... 3
2.1 Mental RetardasyonTanımı ve Epidemiyolojisi…………………….…………………... 3
2.2 MR’nin Sınıflandırılması……………………………………………………………….. 3
2.3 Multipl Konjenital Anomali (MKA)Tanımı ve Epidemiyolojisi……………..………… 4
2.4 MKA/MR’nin Etiyolojisi………………………………………………………………. 5
2.4.1 MKA/MR'ye Sebep Olan Genetik Nedenler……………………….…………………. 8
2.4.1.1 MKA/MR Etiyolojisinde Kromozom Anomalileri…………………………………. 9
2.4.1.1.2 Sayısal Kromozom Anomalileri…………………………………………………. 10
2.4.1.1.3 Yapısal Kromozom Anomalileri………………………………………………… 10
2.4.1.1.3.1 Dengeli Yapısal Kromozom Anomalileri……………………………………… 10
2.4.1.1.3.2 Dengesiz Yapısal kromozom Anomalileri…………………………………….. 12
2.4.1.2 Tek Gen Hastalıkları………………………………………………………………. 14
Otozomal Dominant Geҫişli Olan MR……………………………………………………… 14
Otozomal Resesif Geҫişli Olan MR……………..………………………………………….. 15
X’e Bağlı MR……………………………………………………………………………..… 15
v 2.5 MKA/MR Tanısında Kullanılan Teknikler…………………………………………...... 16
2.5.1 Klasik Sitogenetik Teknikleri………………………………………………………… 16
Kromozom Elde Edilmesi…………………………………………………………………... 16
Giemsa Bandlama Yöntemi (G-Banding) ………………………………………………...... 17
Yüksek Rezollüsyonlu Bantlama Tekniği (HRBT)…………………………………………. 18
2.5.2 Moleküler Sitogenetik Teknikler……………………………………………………... 19
2.5.2.1 Floresan İn situ Hibridizasyon (FISH)……………………………………………... 19
2.5.2.2 CGH (Comperative Genomic Hybridisation) ……………………………………… 22
2.5.2.3 Mikroarray Analizleri………………………………...…………………………….. 23
2.5.2.4 Array-CGH…………………………………………………………………………. 23
2.4.2.5 SNP-Array………………………………………………………………………...... 28
2.4.2.6 CGH Array'ler ile SNP Array'lerin Karşılaştırılması………………………………. 29
3. GEREÇ-YÖNTEM………………………………………………………………………. 31
3.2 Gereçler………………………………………………………………………………… 31
3.2.1 Kullanılan Taşınabilir Cihazlar………………………………………………………. 31
3.2.2. Kullanılan Kimyasal Malzemeler……………………………………………………. 32
3.3 Kullanılan Teknikler…………………………………………………………………… 33
3.3.2 Array-CGH Çalışması……………………………………………………………...… 34
3.3.2.1 Hasta ve Referans DNA’nın İşaretlenerek Hibridizasyonu…..……………………. 34
3.3.2.2 Yıkama Aşaması…………………………………………………………………… 36
3.3.2.3 Tarama Aşaması……………………………………………………………………. 36
3.3.2.4 Analiz Aşaması……………………………………………………….……………. 37
4. BULGULAR……………………………………………………………………….…….. 39
4.1 a-CGHʼde Patolojik Varyant Saptanan 4 Olgunun Sunumu…………………………… 40
5. TARTIŞMA……………………………………………………………………………… 58
KAYNAKLAR…………………………………………………………………………...…. 67
FORMLAR………………………………………………………………………………….. 72
vi ETİK KURUL KARARI……………………………………………………………….…… 73
ÖZGEÇMİŞ………………………………………………………………………………… 74
vii TABLOLAR LİSTESİ
Tablo2-1: IQ test puanlamasına göre MR sınıflandırılması ...... 4
Tablo 2-2: Fetal hayatın farklı evrelerinde ve postnatal dönemde kromozom anomalilerinin sıklığı…………………………………………………………………………………………. 9
Tablo 2-3: Sık görülen bazı mikrodelesyon sendromları ve lokalizasyonları………………. 13
Tablo 4-1: Çalışmaya Dahil Edilen Bireyler ve Bilgileri…………………………………… 39
Tablo 4-2: a-CGHʼde patolojik varyant saptanan 4 olgunun özeti…………………………. 40
Tablo 5-1: 6qterminal delesyonuyla ilşkili en önemli genler, fonksiyonları ve yol aҫtıkları hastalıklar…………………………………………………………………………………… 60
Tablo 5-2: 22q11.2 delesyonuyla ilşkili en önemli genler, fonksiyonları ve yol aҫtıkları hastalıklar…………………………………………………………………………………… 61
Tablo 5-3: Xq27.3q28 duplikasyonu ile ilşkili en önemli genler, fonksiyonları ve yol aҫtıkları hastalıklar…………………………………………………………………………………… 62
Tablo 5-4: Xp22.33 delesyonuyla ilşkili en önemli genler, fonksiyonları ve yol aҫtıkları hastalıklar…………………………………………………………………………………… 64
Tablo 5-5: 16p11.2 mikrodelesyon ile ilşkili en önemli genler, fonksiyonları ve yol aҫtıkları hastalıklar…………………………………………………………………………………… 65
viii ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 2-1: MKA/MR’ye sebep olan genetik nedenler………………………………………... 9
Şekil 2-2: 3.kromozomda perisentrik inversiyon örneği……………………………………. 12
Şekil 2-3: MR ile ilişkili bazı otozomal genler ve kromozomlar üzerindeki yerleri………... 14
Şekil 2-4: OMIM'de X'e bağlı MR sorumlu olarak rapor edilen genlerin kromozomal lokalizasyonu ve ilişkili oldukları hastalıklar………………………………………………... 16
Şekil 2-5: CTF’de yapılan G-bantlama örneği……………………………………………… 18
Şekil 2-6: FISH çalışma prensibi…………………………………………………………… 20
Şekil 2-7: CGH yönteminin akış şeması……………………………………………………. 22
Şekil 2-8: Database of Genomic Variants’da arşivlenmiş CNV’lerin büyüklük dağılımları…………………………………………………………………………………... 28
Şekil 2-9: CNV’lerin tek ve çift vuruş fenotip etkisi……………………………………….. 25
Şekil 2-10: a-CGH tekniğinin uygulama aşamaları………………………………………… 26
Şekil 2-11: Kromozom analizi normal sonuҫlanan olgulardaki a-CGH incelemelerinde akış şeması……………………………………………………………………………………….. 28
Şekil 2-13: CGH arrayʼler ile SNP arrayʼlerin karşılaştırılması……………………………. 30
Şekil 4-1: olgu 17ʼye ait aile ağacı………………………………………………………….. 40
Şekil 4-2: Olgu 17’e ait 5.5 yaş fotoğrafları………………………………………………… 41
Şekil 4-3: Olgu 17'e ait karyotip görüntüsü………………………………………………… 42
Şekil 4-4: Olgu 17’ye ait a-CGH (Agilent platformu ile) görüntüsü……………………….. 42
Şekil 4-5: Olgu 17’e ait 6. kromozomundaki delesyon bölgesinin a-CGH görüntüsü……… 43
Şekil 4-6: Olgu 18ʼe ait aile ağacı…………………………………………………………... 44
Şekil 4-7: Olgu 18’e ait 16 yaş fotoğrafları…………………………………………………. 44
Şekil 4-8: Olgu 18'e ait karyotip görüntüsü………………………………………………… 45
Şekil 4-9: Olgu 18’e ait a-CGH (Agilent platformu ile) görüntüsü………………………… 46
Şekil 4-10: Olgu 18’e ait 22. kromozomundaki delesyon bölgesinin a-CGH görüntüsü…… 46
Şekil 4-11: Olgu 18'e ait FISH görüntüsü…………………………………………………... 47
ix Şekil 4-12: Olgu 19ʼa ait aile ağacı…………………………………………………………. 48
Şekil 4-13: Olgu 19’a ait 4.5 yaş fotoğrafları……………………………………………….. 49
Şekil 4-14: Olgu 19'a ait karyotip görüntüs………………………………………………… 49
Şekil 4-15: Olgu 19’a ait a-CGH (Agilent platformu ile) görüntüsü……………………….. 50
Şekil 4-16: Olgu 19’a ait X. kromozomundaki delesyon/duplikasyon bölgelerinin a-CGH görüntüsü……………………………………………………………………………………. 51
Şekil 4-17: olgu 19'a ait FISH görüntüsü…………………………………………………… 52
Şekil 4-18: olgu 19'un annesine ait FISH görütüsü…………………………………………. 53
Şekil 4-19: Olgu 20ʼye ait aile ağacı………………………………………………………... 53
Şekil 4-20: Olgu 20’ye ait 5.5 yaş fotoğrafları……………………………………………… 55
Şekil 4-21: Olgu 20'ye ait karyotip görüntüsü……………………………………………… 55
Şekil 4-22: Olgu 20’ye ait a-CGH (Agilent platformu ile) görüntüsü…………………….... 56
Şekil 4-23: Olgu 20’ye ait 16. kromozomundaki delesyon bölgelerinin a-CGH görüntüsü…56
x
SEMBOLLER/KISALTMALAR LİSTESİ
ACC: korpus kallozum agenezi a-CGH: Array Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon
BAC: Bacterial Artificial Chromosome
CMA: Kromozomal Mikro-array
CNV: Kopya Sayısı Değişiklikler
DGV: Database of Genomic Variations
DNA: Deoksiribonükleik Asit
Dup: Duplikasyon
EtBr: Etidyum Bromür
FISH: Floresans In Situ Hibridizasyon
GDD: Global Gelişim Geriliği
GTL: Giemza- Leishman, Tripsin
MKA: Multipl Konjenital Anomali
MR: Mental Retardasyon
QF-PCR: Kantitatif floresan PCR
HRBT: Yüksek Rezolüsyonlu Bantlama Tekniği
İnv: İnversiyon
IQ: Zeka Katsayısı
LB: lizis Buffer
LOH: Heterozigosite Kaybı
MLPA: Multipleks Liganda-bağlı Prob Amplifikasyon
NOR: Nucleer Organising Region
OMIM: Online Mendelian Inheritance In Man
PKS: Pallister-Killian Sendromu
xi PVNH: Periventriküler Nodüler Heterotopi
RNA: Ribonükleik Asit
UPD: Uniparental Dizomi
WCP: Whole Chromosome Painting
XLMR: X’e Bağlı Mental Retardasyon
YAC: Yeast Artificial Chromosome
xii ÖZET
Multipl Konjenital Anomaliler (MKA) ve Mental retardasyon (MR) genel toplumun %2- 3’ünü etkileyen, etiyolojik olarak geniş heterojeniteye sahip nörogelişimsel bir bozukluktur. MKA/MR etiyolojisinde kromozom anomalileri çok önemli bir yer tutmaktadır. Sayısal ve 5- 10 Mb boyutundan büyük yapısal kromozom anomalileri konvansiyonel sitogenetik tekniklerle tanınabilirken, 5Mb’dan daha küçük boyuttaki submikroskobik değişimlerin tanısında klasik bantlama yöntemleri yetersiz kalmaktadır. Son yıllarda, konvansiyonel sitogenetik ile tanısı konulmamış, 3Mb’dan daha küçük boyuttaki submikroskobik değişimlerin tanısı array tabanlı Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (a-CGH) tekniği ile gerҫekleşebilmektedir. Nedeni bilinmeyen MKA/MR tanılı olgularda kromozom analizinin katkısı %3-5 iken (bilinen kromozom sendromları dışlanarak), uygulanan a-CGH tekniğinin sonucunda olguların %15-20’sinde çeşitli kopya sayısı değişiklikler saptanmaktadır.
Bu tez kapsamında, mental retardasyona eşlik eden nöromotor gelişim geriliği, konjenital majör malformasyonlar ve spesifik dismorfik bulgulara sahip 20 postnatal olgu çalışmaya dahil edildi. Tüm genom a-CGH çalışmaları sonucunda 20 olgunun 4’ünde farklı bölgelerde patojenik kopya sayısı değişiklikleri saptandı. Bu değişimler, kırık noktaları, anomali boyutu, kapsadıkları gen sayısı ve işlevleri ve fenotiple olan korelasyonları değerlendirilerek patojenik olarak raporlandı. 2 olguda, değişim bölgelerine göre FISH tekniği ile konfirmasyon çalışması yapıldı. Ayrıca, a-CGH incelenmesinde saptanan ailevi genomik dengesizliklerin kaynaklandığı ebeveyni belirlemek amacıyla aile bireyleri ile birlikte değerlendirildi. a-CGH yönteminin grubumuzda tanı koyma oranı şekilde %20 olarak hesaplanmıştır.
Anahtar kelimeler: Multipl Konjenital Anomaliler, mental retardasyon, submikroskobik değişiklikler, konvansiyonel sitogenetik, array-CGH, FISH.
xiii ABSTRACT
Multiple Konjenital Anomalies (MCA) and Mental Retardation (MR) are neurodevelopmental disorders with etiologically broad heterogeneity that affect %2-3 of general population. Chromosome anomalies have a very important place in MCA/MR etiology. Numerical and structural abnormalities which are greater than 5-10 Mb can be identified by conventional cytogenetic tecniques, whereas these methods are insufficient for submicroscopic changes smaller than 5 Mb. In recent years, array Comparative Genomic Hybridization (a-CGH) technique has been used for high sensitivity detection of submicroscopic changes less than 3 Mb, which are not recognized by conventional cytogenetic. While the contribution and diagnistic rate of the chromosome analysis is 3-5% (excluding recognizable chromosomal syndromes) in cases with unexplained MCA/MR, As a result of the applied a-CGH technique, various copy number variations are detected in 15- 20% of the cases.
In this thesis, 20 postnatal cases with neuromotor developmental retardation, congenital major malformations and specific dysmorphic findings accompanying mental retardation were included in the study. In all patients, chromosome analysis was normal as a result of conventional cytogenetic examination. As a result of all genomic a-CGH studies, changes in the number of pathogenic copy number variations in different regions were detected in 4 of 20 cases. These changes were reported pathologically by evaluating break points, anomaly size, number of involved genes and their functions and phenotypic correlations. Confirmation study was performed with FISH technique according to change regions in 2 cases. In addition, a-CGH was evaluated together with the family members to determine the parents of the familial genomic imbalances detected in the study.
Key words: Multiple Congenital Anomalies, mental retardation, submicroscopic changes, conventional cytogenetic, array-CGH, FISH.
xiv 1.GİRİŞ VE AMAÇ
Multipl Konjenital Anomaliler ve Mental Retardasyon (MKA/MR) toplumun % 2-3’ünü etkileyen, engellilik ve mortalite oranı yüksek bir hastalık grubudur (1,2). Bu grup hastalıkların yarısına yakın bir kısmında etiyoloji tam olarak aydınlatılamamış olsa da genetik ve çevresel faktörlerin etkin olduğu bilinmektedir (1). Klinik olarak MR, entelektüel ve adaptif fonksiyonlarda belirgin yetersizliğin olması ve bu durumun 18 yaşından önce ortaya çıkması olarak tanımlanmaktadır (3). MKA ise birden çok dokuda veya organda embriyonik sürecin oluşmaması, gecikmesi veya yanlış yönlendirilmesi ile oluşan anatomik bozukluklardır.
MKA/MR etiyolojisinde kromozom anomalileri çok önemli bir yer tutmaktadır; ağır (IQ<50 ) ve hafif (IQ 50-70) MR tanısı alan olgularda kromozomal anomali saptama oranı sırası ile %40 ve %10-20 olarak bildirilmişir. Nedeni bilinmeyen MKA/MR olan hastaların ise ~%5’inde çesitli kromozom anomalileri saptanmaktadır (4). MKA/MR olgularının yaklaşık %5-13’ünden çevresel ve teratojenik nedenler ve %10’undan ise tek gen hastalıkları sorumludur (5).
Kromozomal anomalilerin tanısında çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Sayısal ve 5-10 Mb’dan daha büyük yapısal değişimler konvansiyonel sitogenetik yöntemlerle gösterilebilir ancak daha küçük boyuttaki submikroskobik (kb düzeyinde) değişimlerin tanısı moleküler sitogenetik yöntemleri ile gerçekleşebilir. Bu yöntemler arasında hedefe yönelik FISH, Kantitatif floresan PZR (QF-PCR), Multiplex Ligand-dependent Probe Amplification (MLPA), CGH ve array-CGH (a-CGH) teknikleri yer almaktadır. Günümüzde, kromozom anomalilerin tanısında hedefe yönelik FISH tekniği ne kadar katkı sağlasa da, non-spesifik klinik bulguları olan ve klinik olarak herhangi bir sendromla uymayan hastalarda bu teknik yetersiz kalmaktadır. Bu nedenle normal sitogenetik ve FISH teknikleri ile tespit edilemeyen submikroskobik değişimler, geliştirilen array teknikleri ile (a-CGH/mikroarray) artan hassasiyetle tanınmakta ve tüm genom yüksek hassasiyetle incelenebilmektedir. Klasik karyotip analizi ile tanısı konulamayan MKA/MR olgularında subtelomerik FISH incelemesinin tanıya katkısı orta ve ağır MR’si olan olgularda %4-6, hafif MR’si olan olgularda %1-2 olarak bildirilmiştir. Subtelomerik FISH uygulaması için, ailede MR varlığı, prenatal büyüme geriliği, postnatal büyüme geriliği veya aşırı büyüme, iki veya daha fazla dismorfik bulgu veya doğumsal anomali varlığı test için seçilme kriterleri olarak belirlenirse sonuç verme şansının arttığı görülür (6).
1 Array yöntemlerinin klinik kullanıma girmesi ile subtelomerik FISH incelemesi giderek önemini kaybetmiştir ve klasik karyotip analizi normal saptanan olgularda ilk basamak test olarak array incelemesi önerilmektedir. a-CGH submikroskobik kromozom anomalilerinin tek bir test ile Deoksiribonükleik Asit (DNA) düzeyinde tanınabilmesine olanak sağlayan yeni bir tekniktir. Bu tekniğin temeli, test (hasta) ve referans DNA örneğinin karşılaştırılmasına dayanmaktadır. a-CGH’de, izole edilen hasta ve referans DNA farklı flouresan boyalar ile işaretlendikten sonra beraber bir slayt üzerinde sabitlenmiş problar ile hibridize edilmesine dayanmaktadır. Hibridizasyon ve yıkama aşamasından sonra array-probları bilgisayarda uygun parametreler seçilerek taranır.
Yapılan çalışmalarda nedeni bilinmeyen MKA/MR olgularında array yöntemlerinin tanı koyma oranı %15-20 olarak bildirilmiştir (7).
Bu çalışmanın amacı;
1) Mental retardasyon ve multipl konjenital anomalileri olup kromozom analizi normal bulunan ve klinik olarak herhangi bir bilinen mikrodelesyon/duplikasyon veya tek gen geçişli sendrom tanısı konulamayan 20 olguda a-CGH tekniğinden yararlanarak, tüm genomdaki olası submikroskobik dengesiz yapısal kromozom anomalilerin varlığını araştırmak,
2) Kırık noktaları, anomali boyutu, anomali bölgesinde yer alan genler ve fonksiyonlarını irdelemek,
3) Bulunan değişimin klinik açıdan öneminin incelenmesi ve genotip-fenotip korelasyonu yapılarak, aileye doğru genetik danışma verilmesidir.
2 2.GENEL BİLGİLER
2.1 Mental Retardasyon Tanımı ve Epidemiyolojisi
Amerikan Psikiatri Derneği’nin “Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (Zihinsel Bozukluklar için Tanı ve İstatistik El Kitabı, DSM-V)” isimli kitabında Mental retardasyon, 18 yaşın altında başlamak şartı ile entellektüel ve uyumsal fonksiyonların anlamlı derecede ortalamanın altında olması olarak tanımlanmıştır (8). Bu nörogelişimsel bozukluk 2006 yılına kadar Mental Retardasyon olarak ifade edilmekte iken günümüzde Zihinsel Yetersizlik (Intellectual Disability/ID) tanımı kullanılmaktadır. Uyumsal fonksiyonlarda bozukluk kavramsal (karar, plan, akademik eğitim, tecrübe, sebep sonuç problemleri), sosyal (kişisel iletişim yeteneği) ve pratik (günlük kişisel bakım) alanlar olmak üzere 3 ana başlıkta ele alınır ve adaptif fonksiyonlarının anlamlı derecede bozuk olması, iletişim, özbakım, ev yaşamı, sosyal ve kişisel beceri, halka açık kaynakların kullanımı, kendi kendini yönetme, akademik fonksiyonlar, çalışma, boş zamanlarını değerlendirme, sağlık ve güvenlik yeteneğine göredeğerlendirilir (9,10). 5 yaş altında olan çocuklarda MR terimi yerine kullanılmakta olan Global Gelişim Geriliği (GDD), kaba/ince motor, dil/konuşma, sosyal/kişisel ve günlük yaşam aktiviteler gibi gelişimsel alanlardan en az ikisinde ciddi düzeyde gecikme saptanması olarak tanımlanmaktadır (11).
MR prevalansı farklı toplumlarda yaş, cinsiyet ve tanı kriterlerine göre farklılıklar gösterse de Amerikan Psikiyatri Derneği’nin belirlediği kriterlere göre toplumdaki genel prevalansi %1-3 olarak bildirilmiştir (12). MR erkeklerde 1.4-1.6:1 oranında daha sık görülmektedir. Bunun nedeni X'e bağlı MR'nin erkekleri daha çok etkilemesidir (13). Hafif MR’nin sıklığı ise orta ve ağır MR’ye göre 7-10 kat daha fazladır (14).
2.2 MR’nin Sınıflandırılması
İlk olarak 1912 yılında Alman psikolog Wilhelm Stern tarafından, beynin entelektüel fonksiyonlarının değerlendirilmesi amacıyla zeka katsayısı (Intelligence Quotient=IQ) terimi kullanılmıştır. Bireyin IQ test puanının 70 ve altında olması MR olarak tanımlanmıştır. DSM- V'e göre MR; hafif, orta, ağır ve çok ağır MR olmak üzere dört ana grup altında yer alır:
Hafif MR: IQʼnun 52-69 seviyesinde olması hafif MR olarak tanımlanır. Tüm MRʼli olguların % 85ʼini oluşturur ve okul yaşına kadar farkedilmeyebilir. Uygun eğitimle olguların
3 birçoğu kendi yaşamlarını bakıma muhtaç olmadan sürdürebilecek sosyal ve mesleki yetenek kazanabilirler.
Orta MR: IQʼnun 36-51 seviyesinde olması orta MR olarak tanımlanır. Tüm MRʼli olguların %10ʼunu oluştur. Özel eğitimden fayda görürler. Kendi bakımlarını karşılayabilecek ve basit işlerde çalışabilecek durumdadırlar.
Ağır MR: IQ seviyesi 20-34 arasında olan gruptur. Tüm MRʼli olguların %4ʼünü oluşturular. Bazılarına bazı beceriler öğretilebilir.
Çok ağır MR: IQ seviyesi 20ʼnin altında olması çok ağır MR olarak tanımlanır. Tüm MRʼli olguların %1’ini oluşturular ve hastalar genellikle total bakıma muhtaçtırlar. Yaygın bir gelişme geriliği mevcut olup özel eğitimle bazı motor becerileri kazanırlar.
Bu dağılım yaşa, sosyo-ekonomik faktörler ve kültürel yapıya göre değişkenlik gösterir. Örneğin sosyo-ekonomik düzeyi düşük toplumlarda hafif MR oranı yüksektir. Buna karşılık, orta ve ağır MR sosyo-ekonomik düzeyden bağımsız olarak her toplumda benzer oranlarda gözükmektedir (8). Tablo2-1’de IQ dereceleri ve beceri karşılaştırmaları yapılmıştır.
Tablo2-1: IQ test puanlamasına göre MR sınıflandırılması
MR sınıflaması IQ aralığı Okul, iş veya günlük yaşam aktivitelerinde gereken destekler Aralıklı ve minimum destekle günlük Hafif (85%) 52-69 aktivite ve sosyal becerilerini yerine getirebilirler.
Günlük yaşamda gerekli desteğe ihtiyaç Orta (10%) 36-51 duyarlar. Akademik başarı ve sosyalleşme açısından akranlarına göre daha geç öğrenirler. Günlük aktivitelerinde yoğun bakıma Ağır (4%) 20-35 ihtiyaçları vardır ve öğrenme becerileri kısıtlıdır. Günlük aktivitelerinde 7/24 bakıma Çok ağır (1%) < 20 mühtaçlar.
4
Mental retardasyontek başına bulunabileceği gibi bir sendroma veya hastalığa eşlik edebilir. Hafif grup genellikle tek başına görülürken, ağır MR hastaları çoğunlukla sendromiktir. Sendromik hastalarda dismorfik yüz ve major malformasyonlar vardır ve MKA/MR grubu olarak incelenirler. Non-sendomik MR çoğunlukla işitme, görme bozuklukları, otizm ve diğer davranış problemleri ve epilepsi ile birliktelik gösterir.
2.3 Multipl Konjenital Anomali (MKA) Tanımı ve Epidemiyolojisi
Konjenital anomali; doğumdan itibaren varolan ve vücudun bir veya daha fazla bölgesindeki yapısal bozukluklardır. Sıklığı tüm yenidoğanlarda %2-3 olarak bildirilmiştir. Etiolojisinde genetik ve çevresel faktörler rol oynamaktadır. Konjenital anomaliler yapısal önemine göre majör anomaliler ve minör anomaliler olarak 2 ana grupta incelenirler.
1) Major anomaliler: Hasta için ciddi tıbbi ve kozmetik sorun yaratan, medikal ve cerrahi tedavi gerektiren anatomik değişikliklerdir. En sık rastlanan majör anomalilere örnek olarak yarık damak/dudak, konjenital kalp anomalileri verilebilir. Yenidoğanların %2’sinde ilk günde farkedilen majör anomaliler mevcuttur. Ölü doğumlarda ise majör anomali sıklığı %15-20 arasında değişmektedir.
2) Minor anomaliler: Hastaya ciddi tıbbi ve kozmetik sorun yaratmayan anatomik özelliklerdir, %70’i el ve yüz bölgesinde bulunmaktadır. El 5. parmakta klinodaktili, ayak 2- 3. parmaklar arasında parsiyel kütanöz sindaktili minör anomalilere örnektir. Yenidoğanlarda minör anomali sıklığı farklı çalışmalarda %7 ile %41 arasında tanımlanmıştır. Bir minör malformasyon varlığında majör anomali saptanma olasılığı %3-4’e yükselir. Eğer üç veya daha fazla minör anomali varsa majör anomali saptanma olasılığı %20-90’lara çıkar (5, 15).
2.4 MKA/MR’nin Etiyolojisi
MKA/MR’ye neden olan etkenler çok heterojendir. MR’nin nedeni genetik bozukluklar olabileceği gibi sinir sisteminin gelişimini ve fonksiyonunu etkileyen çevresel faktörlerden de kaynaklanabilir. Ağır MR genellikle genetik nedenlerle oluşurken hafif MR çevresel şartlara bağlı olarak gelişmektedir. Fragile X sendromu, fetal alkol sendromu, bilinen diğer
5 sendromlar, demir eksikliği, beyin malformasyonları ve tuberöz skleoz gibi durumlar MRʼye yol aҫabilir (9). MR derecesine göre etiyolojik nedenler değişmektedir. Buna göre:
Ağır MR 1. Prenatal (%55) Kromozomal ve diğer genetik faktörler (%34) Multipl konjenital anomaliler ve spesifik sendromlar (%12) Gebelikte meydana gelen dış etkenler (%8)
2. Perinatal (%15) Hipoksi/asfiksi (%12) Santral sinir sistemi enfeksiyonları (%3)
3. Postnatal (%12)
4. Nedeni bilinmeyen (%18),
Hafif MR 1. Prenatal (%23) Kromozomal ve diğer genetik faktörler (%5) Multipl konjenital anomaliler ve spesifik sendromlar (%10) Gebelikte alınan alkol (%8)
2. Perinatal (%18) Hipoksi/asfiksi (%17) Santral sinir sistemi enfeksiyonları (%1)
3. Postnatal (%4)
4. Nedeni bilinmeyen (%55) (16).
6 Ağır MR'nin en sık nedeni kromozom anomalilerdir, hafif MRʼde ise bilinen en sık neden perinatal hasarlar ve ailesel MRʼdir. Dikkatli araştırmalar ile ağır MRʼnin %60- 75ʼinin, hafif MRʼnin %38-55ʼinin nedeni aydınlatılabilir (15).
Bilinen en önemli çevresel faktörler arasında prenatal dönemdeki malnutrisyon, prenatal ve postnatal asfiksi, nörotoksik bileşiklere maruziyet ve prematür doğum yer almaktadır. Prenatal, perinatal ve postnatal nedenler beynin gelişimini olumsuz yönde etkileyerek MKA/MR’nin ortaya ҫıkmasına neden olabilmektedir.
Prenatal nedenler: Enfeksiyon ( toksoplazma, rubella, sitomegalovirüs, herpes simpleks virüsü gibi) Genetik anomaliler: trizomi 21, Fragile X, diğer (nokta mutasyonları, kromozomal delesyon, duplikasyon, yeniden düzenlenmeler) Toksinler ve teratojenler ( alkol kullanımı, ilaç kullanımı, radyasyona maruziyet) Konjenital hipotiroidizm Yenidoğan metabolik hastalıklar
Perinatal nedenler: Hipoksi Prematüre doğum komplikasyonları İntrakranial hemoraji Perinatal santral sinir sistemi hastalıkları komplikasyonları
Posnatal nedenler: Edinsel beyin hasarı Santral sinir sistemi (SSS) hemorajisi SSS enfeksiyonu SSS maligniteleri Çevresel faktörlerin yoksunluğu Şiddetli malnutrisyon Toksinler (kurşun, civa) (17).
7 2.4.1 MKA/MR'ye Sebep Olan Genetik Nedenler:
MR sendromik ve non-sendromik (izole) olmak üzere iki grup altında ele alınmaktadır. MR bireyde ek problemler olmaksızın tek başına bulunduğunda “non-sendromik” MR, eşlik eden MKA varlığında “sendromik MR” olarak adlandırılır. Down sendromu, Frajil X sendromu, 4p delesyonu, 22q11.2 delesyonu, Prader Willi/Angelman sendromu gibi kromozomal anomaliler ve özgün klinik bulguları olan ve nörogelişim geriliğinin eşlik ettiği hastalıklar sendromik MR grubu altında tanı alır. Üçten fazla minör anomalinin bulunması sendromik MRʼnin tanısında yararlı olabilir. Etiyolojinin aydınlatılması için sendromik ve non-sendromik MR’lerin birbirinden ayrılması gerekmektedir. Altta yatan nedenin aydınlatılması ile hastalığın prognozu hakkında bilgi verilebilir, tedavinin düzenlenmesi ve tekrarlama risklerinin önlenmesi sağlanabilir. MKA/MR etiyolojisindeki genetik nedenler 4 ana gruba ayrılmaktadır.
1) Kromozom anomalileri Saysıal kromozom anomalileri Yapısal kromozom anomalileri
2) Tek gen hastalıkları Otozomal Dominant Otozomal Resesif X’e bağlı-Dominant X’e bağlı resesif
3) Poligenik-Multifaktöriyel hastalıklar
4) Mitokondriyal nedenler (Şekil 2-1).
8
Şekil 2-1: MKA/MR’ye sebep olan genetik nedenler (13)
2.4.1.1 MKA/MR Etiyolojisinde Kromozom Anomalileri
Kromozom anomalileri, bir organizmanın kromozomlarında oluşan tüm sayısal ve yapısal değişimlerdir. Bu değişimler otozomal kromozomlarda olduğu gibi cinsiyet kromozomlarında da gerçekleşebilir. Tekrarlayan fetal kayıplar, prenatal/neonatal ölüm, MKA/MR, fertilite problemleri gibi birçok morbidite ve mortalite ile ilişkilidir (18). Ağır ve hafif MR tanısı alan olgularda kromozom anomali saptanma oranı sırası ile %40 ve %10-20 olarak bildirilmiştir. Nedeni bilinmeyen MKA/MR olan hastaların ise ~ %5ʼinde ҫeşitli kromozomal anomaliler saptanmaktadır.
2.4.1.1.1 Kromozom anomalilerin Sıklığı
Canlı doğumların ~%1ʼinde, 35 yaş üstü gebeliklerde yapılan kromozom analizlerinin ~%2’sinde ve ilk trimester dönemindeki spontan abortusların yaklaşık yarısında çeşitli kromozomal anomalileri saptanmaktadır. Bu anomalilerin büyük bir kısmı sayısal anomalilerdir ve klinik etkilenme oranları ağır olduğundan yaşamla bağdaşamazlar (18) (Tablo 2-2).
9 Tablo 2-2: Fetal hayatın farklı evrelerinde ve postnatal dönemde kromozom anomalilerinin sıklığı (18)
>35 yaş annelerin Anormal Karyotip Ilk Trimester Abortuslar fetüsleri Canlı doğum Total insidans 1/2 1/50 1/160 Anomali yüzdesi Sayısal anomaliler 96% 85% 60% Yapısal anomaliler Dengeli - 10% 30% Dengesiz 4% 5% 10%
MKA/MR ile ilişkili yaklaşık 1000 kromozomal anomali sendromu bildirilmiştir (19). Ağır ve hafif MRʼsi olan hastalarda kromozomal anomali saptama oranı hasta seçim kriterleri ve çalışmada kullanılan tekniğe bağlı olarak %10-40 arasında değişmektedir (4).
2.4.1.1.2 Sayısal Kromozom Anomalileri
Normal bir insana ait somatik hücrelerinde diploid (2n=46) sayıda kromozom bulunur. Kromozom sayısında oluşan herhangi bir artış veya azalış sayısal anomalilere neden olmaktadır. Sayısal kromozom anomalileri öploidi ve anöploidi olmak üzere iki gruba ayrılır. MKA/MR etiyolojisinde saptanan kromozom anomalilerinin önemli bir bölümü sayısal kromozom anomalileri (~%80), bir kısmı (~%20) ise dengesiz yapısal kromozom anomalileridir (4). İnsanlarda en çok rastlanan anöploidiler trizomilerdir. Tüm kromozom trizomileri nadiren yaşamla bağdaşır. Trizomi 21, trizomi 13, trizomi 18 ve cinsiyet kromozomtrizomileri (47,XXY, 47,XYY ve 47,XXX) yaşamla bağdaşabilen sayısal kromozom anomalileridir. Bu durum kromozomların içerdikleri fonksiyonel gen sayısının az olmasıyla bağlantılıdır. Trizomiler genomun herhangi bir parçasında parsiyel olarak da bulunabilir (18). Otozomal kromozomların monozomisi ise letaldir. Turner Sendromu neden olan X kromozom monozomisi ve Mikst gonadal disgeneziye yol açan Y kromozomun yokluğu yaşamla bağdaşabilen cinsiyet kromozom monozomileridir.
2.4.1.1.3 Yapısal Kromozom Anomalileri
Anöploidilerden sonra sıklığı en çok olan yapısal kromozom anomalileri, yenidoğanların 1/375ʼinde saptanmaktadır. Kromozomda meydana gelen kırıklar ve yeniden düzenlenmeler, segmental delesyon/duplikasyon veya translokasyona yol açarak yapısal kromozom anomalilerine neden olur. Homolog kromozomların yanlış rekombinasyonu veya replikasyon
10 hataları yapısal kromozom yeniden düzenlenmelerine sebep olabilir. Genomik materyaldeki kayıp/kazanç olup olmamasına göre dengeli ve dengesiz kromozomal anomalileri olarak sınıflandırılmaktadır. Kalıtım şekline göre ise de novo ya da ailevi olarak 2 gruba ayrılırlar (18,21).
2.4.1.1.3.1 Dengeli Yapısal Kromozom Anomalileri
Dengeli yapısal anomalilerin yenidoğanlardaki insidansı 1/500ʼdur. MKA/MR olguların %4ʼünde ҫeşitli dengeli kromozom anomaliler saptanmaktadır (20) . Bu durumda kromozom materyalinde artma veya azalma olmadan kopan bölge sadece yer değiştirir ve fenotipik etkilenme beklenmez, ancak mikroskobik olarak dengeli görünmesine rağmen submikroskobik düzeyde genetik materyalin kaybı veya kazancı fenotipin etkilenmesine neden olabilmektedir. Dengeli yapısal kromozom anomalileri, translokasyon ve inversiyon olmak üzere sınıflandırılır.
Translokasyonlar
Translokasyonlar, homolog olmayan kromozomlar arasında olan parça değişimleri (resiprokal translokasyon), bir kromozomdan kopan ara bir segmentin aynı ya da farklı bir kromozomun yapısına katılması (insersiyonel translokasyon) ya da iki akrosentrik kromozomun sentromerlerinden birleşmesi (Robertsonyan translokasyon) sonucu oluşan yapısal kromozom anomalileridir.
Mikroskobik düzeyde “dengeli” görünen translokasyonların moleküler düzeyde “dengesiz” olması 3 mekanizma ile açıklanmaktadır:
Translokasyon, DNA düzeyinde dengesiz kayıp ve/veya artışa yol açmıştır, Translokasyon dengelidir ancak kırık noktası işlevsel bir genin yapısını bozarak fonksiyon kaybına yol açmıştır, Kırık noktalarında bulunan gen yeni bir fonksiyon kazanmıştır (18).
İnversiyonlar (inv)
Tek bir kromozomda oluşan iki kırık sonucu ortaya çıkan kromozom segmentinin ters dönerek tekrar aynı kromozom üzerinde yerleşmesi ile oluşmaktadır. Inversiyonlar sentromerik bölgeyi içerip içermedikleri açısından iki gruba ayrılır:
1) Parasentrik inversiyonlar: kromozomun aynı kolunda oluşan iki kırık sonucu kopan parçanın, 180 derece dönerek yerine yerleşmesine denir.
11 2) Perisentrik inversiyonlar: kromozomun farklı kollarında oluşan iki kırık sonucu sentromeri de içeren kopan parçanın, 180 derece dönerek yerine yerleşmesine denir (Şekil2-2).
İnversiyon ve dengeli translokasyon taşıyıcılarda genomik materyelde kayıp ya da kazanç olmadığı için fenotipik etkilenme beklenmez fakat taşıyıcı kişilerin dengesiz kromozom anomalili gamet oluşturma riski bulunmaktadır.
Şekil 2-2: 3.kromozomda perisentrik inversiyon örneği (22)
2.4.1.1.3.2 Dengesiz Yapısal kromozom Anomalileri
Genetik materyalde kayıp ve/veya kazanca yol açan yapısal anomalilerdir. Bu anomalilerin, kaybolan veya artan parçanın içerdikleri fonksiyonel gen/ler ve dozaj etkisine bağlı olarak fenotipe yansıması beklenmektedir. Bu anomaliler parental translokasyon, insersiyon veya inversiyonların dengesiz ürünleri olabildikleri gibi de novo olarak da ortaya çıkabilmektedir. Delesyon, duplikasyon, izokromozom, disentrik kromozom, halka (ring) kromozom ve marker kromozomu bilinen dengesiz yapısal kromozom anomalileri arasında yer alır.
Delesyonlar (del)
Kromozomun bir bölgesinin kaybı ile ortaya çıkan dengesiz anomalileridir. Kromozomların uç kısmında oluştuklarında “terminal delesyon”, ara bölgelerinde oluştuklarında ise “interstisyel delesyon” olarak isimlendirilir. Delesyonlar 3 farklı mekanizma ile oluşabilir:
12 Kromozomda kırılma ve kopan asentrik parçanın kaybı, Mayozda homolog kromozomların veya kardeş kromatidlerin yanlış eşleşmesi sonucu eşit olmayan krossing-over, Dengeli translokasyon veya inversiyonların anormal segregasyonu.
Mikrodelesyonlar
Sıklığı 1000 canlı doğumda 1 olan mikrodelesyonlar konvansiyonel sitogenetik tekniklerle görülemeyecek kadar küçük, moleküler yöntemlerle gösterilemeyecek kadar büyük olan anomalileridir. Mikrodelesyonlar, ardışık genlerin delesyonuna sebep olur, bu nedenle mikrodelesyon sendromları “contiguous gene sendromu” olarak da adlandırılır. Mikrodelesyonların tanısı FISH ve array gibi moleküler sitogenetik tekniklerle gerçekleşir. FISH tekniği ile 1-5 Mbʼlık DNA değişimleri tanımlanabilir. Günümüzde 200ʼden fazla mikrodelesyon sendromu tanımlanmıştır ve sık görülen mikrodelesyon sendromlarından bazıları Tablo 2-3ʼte gösterilmiştir (23,24).
Tablo 2-3: Sık görülen bazı mikrodelesyon sendromları ve lokalizasyonları
Sendrom Kromozomal lokalizasyonu Di George/VelokardiyofasyalSendrom 22q11.2 Prader Willi Sendromu 15q11-q13 Angelman Sendromu 15q11-q13 Williams Sendromu 7q11.23 Smith Magenis Sendromu 17p11.2 Miller Dieker Sendomu 17p11.3 Cri du Chat Sendromu 5p15 Retinoblastom 13q14 Rubinstein Taybi Sendromu 16p13.3 Wolf Hirschorn Sendromu 4p16.3 WAGR 11p13
Duplikasyonlar (dup)
Duplikasyon, bir kromozomun bir parçasının o kromozom üzerinde, arka arkaya ters (non-tandem) veya direkt (tandem) tekrarlaması olarak tanımlanır. Duplikasyonlar, delesyonlar gibi mayoz esnasında eşit olmayan krossing-over, translokasyon ya da inversiyon taşıyan bireylerin gametogenezinde anormal segregasyon sonucu oluşur. Duplikasyonlar delesyonlara göre daha yaygın ve zararsızdır, genellikle fenotipik yansımaları daha hafif olur. Spesifik klinik bulguları olan bazı sendromlar duplikasyonlarla ilişkilendirilmektedir. En bilinen duplikasyon sendromu örneklerinden biri 12p tetrazomisidir ve spesifik kraniofasial
13 özellikleri olan, MRʼye yol açan Pallister-Killian sendromuna (PKS) neden olmaktadır. PKS hastalarında 12p tetrazomisi genellikle fibroblastlarda veya epitel hücrelerinde mozaik olarak saptanmaktadır (25).
2.4.1.2 Tek Gen Hastalıkları
Tek gen bozuklukları, MR hastalarının %10’undan sorumludur. Verilere göre MR etiyolojisinde Xʼe bağlı genlerdeki mutasyonlar %10 sorumluyken, otozomal kalıtımlı MR genlerin katısı %25 olarak bildirilmiştir (28). Şekil 2-3’te MR ile bağlantılı bazı otozomal genler ve kromozomal lokalizasyonları gösterilmiştir.
Şekil 2-3: MR ile ilişkili bazı otozomal genler ve kromozomlar üzerindeki yerleri (28)
Son 15 yılda moleküler tekniklerin ilerlemesi ve yeni nesil dizileme tekniklerinin rutin kullanıma girmesi ile tek gen kalıtım gösteren MR’lerde tanı oranı artmıştır. Bugüne dek Online Mendelian Inheritance In Man (OMIM) veri tabanında sendromik ve sendromik olmayan MR ile ilişkili 800’den fazla gen (hastalıkla ilişkisi kanıtlanmış 4500 genin %18’i) bulunmaktadır. X kromozomu üzerinde MR’ye neden olan 100’den fazla gen tanımlanmıştır (26).
14 Otozomal Dominant Geҫişli Olan MR Ağır MRʼden sorumlu olan ve dominant kalıtım özelliği gösteren gen mutasyonları, etkilenmiş bireylerin genellikle çocuk sahibi olamaması ve bu tür mutasyonların de novo olarak ortaya çıkmaları nedeniyle kolaylıkla araştırılamamaktadır. Son zamanlarda tüm ekzom dizileme ve tüm genom dizileme yaklaşımları MKA/MR tanısı alan olgularda de novo DNA varyantlarını belirlemek için kullanılmaktadır. Bu çalışmalar ağır MKA/MR’li hastaların yaklaşık %35-45'ne de novo varyantların sebep olduğunu göstermektedir (27).
Otozomal Resesif Geҫişli Olan MR
Otozomal resesif kalıtılan MKA/MR’ye neden olan genlerin tanımlanmasında aynı bulgulara sahip birden çok ailenin bulunması ve bu ailelerden elde edilen genetik bilgilerin birleştirilmesi ile altta yatan genetik sebep tanımlanabilmiş ve MKA/MRʼye sebep olan 250’denf azla gen tanımlanmıştır (28). Doğumsal metabolik hastalıklar (aminoasit metabolizması bozuklukları, organik asidemiler, lizozomal depo hastalıkları, peroksizomal hastalıklar) otozomal resesif kalıtılan mental retardayonun önemli bir sebebidir. Nedeni bilinmeyen MR olgularında metabolik incelemelerin tanıya katkısı %1-3’tür (29).
X’e Bağlı MR
X’e bağlı MR’nin en sık görülen nedeni 5’UTR bölgesindeki FMR1 geninin trinükleotit tekrarlarıdır. Bu durum Frajil X sendromuna neden olur. OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) veritabanında MR ile ilişkili genlerin 100’den fazlasının X kromozom üzerinde bulunduğu bildirilmiştir (26, 29, 30) (Şekil 2-4).
15
Şekil 2-4: OMIM'de X'e bağlı MR sorumlu olarak rapor edilen genlerin kromozomal lokalizasyonu ve ilişkili oldukları hastalıklar (29)
2.5 MKA/MR Tanısında Kullanılan Teknikler
2.5.1 Klasik Sitogenetik Teknikleri
Kromozom Elde Edilmesi
İnsandaki bölünme özelliğini kaybetmemiş olan birçok doku sitogenetik analiz için kullanılabilmektedir. Doku tipi kültür aşama süresi, hastanın prenatal ya da postnatal endikasyonu ve hastalığın klinik özelliklerine bağlı olarak değişmektedir. Prenatal tanıda amniyotik sıvı, koryon villus örnekleri ve fetal kan hücreleri tercih edilmektedir. Abortus nedeniyle sonlandırılan gebeliklerde ise fetüsa ait plasenta, deri, akciğer ve böbreklerden alınan dokular analiz yapmak için kullanılabilir. Yenidoğan ve erişkinler (postnatal) için
16 öncelikle tercih edilen materyal periferik kandan elde edilen lenfositlerdir. Bunlarla birlikte, klinik belirtiler ve sitogenetik tanısının amacına göre kemik iliği, deri fibroblast hücreleri ve malign tümör dokuları kromozom analizinde kullanılabilmektedir (18).
Heparinli tüplere alınan periferik kan, steril bir şekilde laboratuara gönderilir. Bu tip hücrelerin spontan mitotik aktivitesi olmadığından, uygun besiyerde kültür edilerek, mitoz bölünme geçirmesi sağlanmalıdır. Kan kültürü için hazırlanan besiyerleri içinde fetal calf serumu, mitotik stimülan olarak fitohemaglutinin ve antibiyotik bulunur. Ekilen tüpler 72 saat 37°C’lik etüv ortamında bekletilir ve 70.saatte kolşisin ilave edilerek metafaz evresinde inhibe edilir. Harvest aşamasına geçerken hücreler 10-15 dakika hipotonik tuz çözeltisi ile muamele edilir. Bu solüsyon hücrelerin şişmesi ve kromozomların birbirinden ayrılmasını sağlamaktadır. Hipotonik solüsyon aşamasından hemen sonra hücreler 1:3 oranında hazırlanan asetikasit:metanol solüsyonu fikse edilir ve hazırlanmış hücre süspansiyonları uygun şartlar altında temiz lamlar üzerine damlatılarak yayılır. Yayılan preparatlar yaşlandırıldıktan sonra özgün bantlama teknikleri ile boyanır. Son olarak kromozomların sayısı ve yapısı incelenerek International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN) kurallarına göre raporlandırılır (31). Konvansiyonel sitogenetik rutin analizinde kullanılan en yaygın bantlama tekniği G-bantlamasıdır. Bu teknik dışında uygulanabilecek farklı bantlama yöntemleri (C,R,Q ve NOR) de bulunmaktadır.
Giemsa Bandlama Yöntemi (G-Banding)
Sitogenetik çalışmalarda en sık kullanılan bu teknikte, ışık mikroskobu ile tüm sayısal ve 5-10 Mb’dan büyük yapısal değişiklikler tespit edilebilmektedir (Şekil2-5). G-bantlama yönteminde tripsin veya pankreatin gibi proteazlar uygulanarak histon ve non-histon proteinleri denatüre edildikten sonra çıplak kalan DNA Giemsa (GTG) veya Leischman (GTL) ile boyanır. Sonuç olarak kromozomlar açık ve koyu bölgeler olarak bantlanır. Geç replike olan adenin ve timinden zengin heterokromatin bölgeleri koyu boyanırken, erken replike olan sitozin ve guanin içeren ökromatin bölgeleri açık renk boyanır. Açık renge boyanan bölgeler aktif genlerin bulunduğu kromozom bölgeleridir. Bu teknikle 400-500 arasında bant değerledirilebilir. Kromozomların daha detaylı değerlendirilmesinde uygulanan yüksek rezolüsyonlu bantlamada (HRBT) daha uzun bantlara sahip kromozomlar elde edilebilir (32).
17
Şekil 2-5: CTF’de yapılan G-bantlama örneği
Yüksek Rezollüsyonlu Bantlama Tekniği (HRBT)
İlk olarak 1976 yılında Yunis ve ark. Tarafından geliştirilen bu teknikte, kan kültürüne metotraksat, etidyum bromür (EtBr) ve timidin gibi kimyasal maddeler eklenerek hücre bölünmesi senkronize edilir ve bölünme prometafaz evresinde durdurulur. Prometafazda incelenen kromozomların bant seviyesi 550-800’dır ve sayısal ve 5-10 Mb’lık yapısal değişiklikler saptanabilmektedir. Bu tekniğin en önemli avantajı mikrodelesyon/mikroduplikasyon sendromlarının tanısına olanak sağlamasıdır (33). G- bantlama ve HRBT dışında, seçici bantlama tekniklerden faydalanarak, kromozomların belirli bölgelerindeki olası değişimler aydınlatılır. Örnek olarak:
Q-bantlama(Quinacrine bantlama): 1, 9 ve 16. kromozomların perisentromerik bölgeleri ve Y kromozomun uzun kolunun distal bölgesinde uygulanarak heteromorfizmler tanımlanır.
R-bantlama (Reverse bantlama): Kromozomların telomer bölgelerini kapsayan anomalilerin incelenmesinde kullanılır.
C-bantlama (Constitutive heterochromatin bantlama): Bu yöntem ile 1, 3, 9 ve 16. kromozomların heterokromatin bölgeleri ve Y kromozomunun uzun kolundaki distal bölge koyu renge boyanır.
18 NOR boyama (Nucleolar Organizer Region): Tüm akrosentrik kromozomların satellit bölgeleri boyanır. Bu bölgeler ribozomal RNA ve protein genlerini içerir ve gümüş nitrat ile boyanır.
Mikroskobik düzeyde olası sayısal ve yapısal kromozom anomalileri saptayabileceğinden, prenatal ve postnatal tanıda kullanılan konvansiyonel sitogenetik çalışmaları “altın standart” olarak kabul edilmektedir. Tüm genomun tek seferde görüntülenmesi, düşük oranındaki mozaisizmlerin bile saptanabilmesi ve özgün bölgelerde kullanılan farklı bantlama yollarıyla çeşitli anomalilerin açığa çıkması klasik karyotip incelemesinin avantajlarıdır.
2.5.2 Moleküler Sitogenetik Teknikler
Rutin karyotip çalışmarında 5-10 Mb’lık daha büyük boyuttaki kromozomal anomaliler saptanabilir. Ayrıca, gen içeriği zengin olan subtelomerik bölgelerin tanısında konvansiyonel sitogenetik yöntemleri eksik kalmaktadır. Bu nedenle daha düşük boyuttaki (<3Mb) değişimlerin tanısı ileri moleküler tekniklerin yardımıyla yapılmaktadır. Bu teknikler arasında hedefe yönelik FISH, CGH ve a-CGH yöntemleri yer almaktadır.
2.5.2.1 Floresan İn situ Hibridizasyon (FISH)
Sitogenetik ve moleküler genetik arasında köprü kuran bu teknik denatüre edilmiş DNA /ribonükleik asit (RNA) ve nükleik asit problarının hibridizasyonuna dayanır. FISH, kromozomların belli bölgelerine özgün DNA/RNA dizilerinin enzimatik yolla fluoresan ışık veren maddelerle işaretlenmesi (prob), hedef DNA bölgesiyle hibrid oluşturması ve bu hibrid sinyallerin uygun filtreler aracığıyla fluoresan mikroskopta analiz edilmesi aşamaları içeren bir yöntemdir (Şekil2-6).
19
Şekil 2-6: FISH çalışma prensibi
FISH için kullanılan problar; kozmid, Bacterial Artificial Chromosome (BAC) veya Yeast artificial chromosome (YAC) vektörü kullanılarak veya sentetik olarak klonlanmış genomik dizilerdir. Bu probların, metafaz kromozomları ya da interfaz nükleus DNA’sına hibridizasyonu sayesinde özgün bölgeler görüntülenebilir. Problar, kromozom üzerindeki hedef bölgelerine göre lokusa özgü problar, tekrarlayan dizi probları ve kromozomun tümünü veya belirli bir kolunu işaretleyen problar olmak üzere üç sınıfa ayrılırlar.
Lokusa Özgü Problar
15-500 kb büyüklüğünde olan, interfaz nükleusunda ya da metafaz kromozomlarında bir gene veya genin içindeki bir bölgeye ait özgün DNA dizilerinden oluşan problardır. Daha çok mikrodelesyon/mikroduplikasyon sendromlarının saptanmasında ve kırık noktalarının belirlenmesinde kullanılmaktadır.
Tekrarlayan Dizi Probları
Alfa satellit probları; kromozomların sentromerine özgün tekrarlayan monomer dizilerdir. Bu probların büyüklüğü 1-170 kb arasındadır. Beta satellit probları; perisentrik heterokromatin bölgelere, akrosentrik kromozomlara ve 9. kromozoma lokalize olup kişiden kişiye farklılık gösterir. Klasik satellit probları; AATGG tekrar dizileri ile bağlantılı olarak 1, 9, 15 ve 16. kromozomların perisentrik heterokromatin bölgelerine ve Y kromozomun uzun koluna özgün DNA dizisir.
20 Telomerik problar; 2-15kb büyüklüğündeki 5’-TTAGGG-3’ tekrarlarından oluşan problardır. Bunlara Pan telomerik FISH probları da denir.
Kromozomun tümünü veya bir kolunu isaretleyen problar
Bir kromozomun kısa kolunu (p) terminalinden uzun kolunun (q) terminaline kadar tamamını boyayan Whole Chromosome Painting (WCP) ya da kromozomların her bir kolunu ayrı renklerde boyayabilen arm spesifik problardır.
Konvansiyonel sitogenetik tekniklerle tanımlanamayan 5 Mb’dan daha düşük submikroskobik (mikrodelesyon/duplikasyonlar, translokasyonlar, inversiyonlar ve marker kromozomları) kromozomal anomaliler özelliklede bilinen mikrodelesyon ve mikroduplikasyon sendromlarının tanısı, bu probların kullanımıyla pratik, hızlı ve maliyet açısından uygun bir şekilde gerçekleşir.
MKA/MR’de Subtelomerik Anomalilerin Araştırılması
Kromozomların subtelomerik bölgeleri aktif genler açısından zengin olmakla birlikte özgün bant kalıplarına sahip değildir. Bu nedenle de bu bölgelerdeki yeniden düzenlenmelerin tanısı klasik bantlama analizleri ile hemen hemen imkansızdır. Bu bölgelerin önemi anlaşıldıktan sonra geliştirilen subtelomerik bölgelere özgün FISH probları, klasik yöntemlerle kromozom anomalisi gösterilemeyen MKA/MR’li olgularda etiolojinin araştırılmasında önemli katkılar sağlamıştır. Ҫalışılan 11.688 olguda subtelomerik FISH çalışmasında %3 oranında subtelomerik yeniden düzenlenme saptamıştır (34). Literatürde MKA/MR’li olgularda subtelomerik FISH ile anomali saptanma oranı %0-23 arasında verilmektedir (35). Bildirilen anomali oranlarındaki farklılıklar, olgu gruplarının oluşturulmasındaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır.
FISH Tekniğinin Avantajları
Klasik bantlama teknikleri ile tanımlanamayan 3-5 Mb’dan daha küçük yapısal anomalileri tanıyabilmesi; Anöploidi taramalarında metafaz kromozomları ve interfaz hücrelerinde uygulanabilmesi Pratik, hızlı ve maliyet açısından uygun olması; Subtelomerik bölge anomalilerinin analizine olanak sağlaması;
21 Marker kromozomların detaylı araştırılabilmesine olanak tanımasıdır.
FISH Tekniğinin Dezavantajları
Ancak bilinen hedef bölgelere özgün çalışabilmesi; Probların spesifik bağlanma bölgesi dışındaki diğer kromozomal değişimleri tanıyamaması; Probların ancak sendroma özgün klinik bulguların varlığında kullanılabilmesi; Probların henüz tüm kromozomal bölgeler için ticari olarak mevcut olmaması; Klinik veya sitogenetik yönlendirme gerekliliğidir.
2.5.2.2 CGH (Comperative Genomic Hybridisation)
Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), ilk defa Kallioniemi ve ark. tarafından 1992’da yayınlanan, dengesiz yapısal/sayısal kromozom anomalilerini araştırmak amacıyla kullanılan, ilk etkilimoleküler sitogenetik yöntemidir. Temeli FISH’e dayanan bu teknikte, farklı fluoresan boyalar (yeşil ve kırmızı) ile işaretlenen test (hasta) ve referans DNA örneklerinin normal metafaz kromozomları üzerinde hibridizasyonu sonucunda oluşan sinyallerinin fluoresan mikroskop ile değerelendirilerek genetik materyalindeki olası kayıp ve kazançların bulunduğu bölgeler tespit edilir (Şekil 2-7).
22
Şekil 2-7: CGH yönteminin akış şeması
CGH Tekniğinin Avantajları
Elde edilmiş hücrelerden az miktarda kullanımı yeterli olması; Tek deneyde genetik materyaldeki olası artış ve/veya azalışlar için tüm genom incelenmesine olanak sağlaması.
CGH Tekniğinin Dezavantajları
Metafaz plağına ihtiyaç duyulması; Kromozomların perisentrik ve terminal bölgesine hassasiyeti düşük olması; Rezolüsyonunun kısıtlı olması; Uygulama ve analiz zorluluğu (36,37).
2.5.2.3 Mikroarray Analizleri
Mikroarray, tüm genomdaki Kopya Sayısı Değişiklikler (Copy Number Variation: CNV) veya Tek Nükleotid Polimorfizm (Single Nucleotide Polymorphism: SNP) farklılıklarını
23 belirleyerek genomdaki dengesizlikleri saptayabilmektedir. Bu tekniğin temeli ilk olarak 1996’da Solinas-Toldo ve ark. tarafındancam matriks üzerine hedef bir diziyi immobilize ederek atılmıştır ve 1999 yılında Pollack ve ark. tarafından array seti üzerine cDNA dizileri immobilize edilerek genom düzeyinde DNA’daki CNV bölgeleri incelenmiştir. 2004 yılından bu yana, tüm genom boyunca kb düzeyindeki olası delesyon ve duplikasyonların saptanmasında kromozomal mikroarraylerin (Chromosomal Microarray: CMA) kullanımı büyük kolaylık sağlamıştır (38).
2.5.2.4 Array-CGH
a-CGH, kopya sayısı değişiklikleri (kayıp ve kazanç) ve submikroskobik kromozom anomalilerinin tek bir test ile DNA düzeyinde tanınabilmesine olanak sağlayan yeni bir tekniktir. Bu teknik, hücre kültürü ve metafaz plağına gerek duyulmadan, az miktarda DNA örneği ile çalışılabilmesi, rezolüsyonu yüksek olup DNA üzerindeki kilobaz düzeyindeki değişiklikleri bile saptayabilmesi ve birden fazla genomun birbirleri ile karşılaştırabilmesine olanak sağlaması açısından diğer tekniklere göre daha avantajlıdır. a-CGH tekniğinin bu avantajlarının yanı sıra, olası değişimin teknik ve hibridizasyon hatası olup olmadığının yorumlanması, değişim bölgesinin bilinen bir fenotiple kesin ilişkili olup olmadığının belirlenmesi, dengeli kromozom anomalilerinin ve poliploidilerin, düşük oranlı mosaizmlerin saptanamaması gibi dezavantajları da bulunmaktadır (39).
Kopya Sayısı Varyasyonları (CNVs)
Referans genomla karşılaştırıldığında, CNV’ler insan genomunda, tüm genoma dağılmış halde bulunan 1 kilobaz (kb)’dan onlarca megabaza kadar uzayabilen yapısal değişikliklerdir. Son yıllarda kullanılan teknolojilerin gelişmeleri sonucunda 1 kb’dan daha kısa CNV bölgelerinin bulunduğu da gösterilmiştir (Şekil2-8). Mikroskobik düzeyindeki CNV'lerin ilk tanımlanmasından bugüne yaklaşık 50 yıl, submikroskobik CNV’lerin yaygın prevalansı hakkındaki ilk raporların yayımlanmasından ise 7 yıl geçmiştir (40,41). İnsan genom projesinin tamamlanması ve ardından genomik araştırmalarda yaşanan ilerlemeler, bireyler arasında var olan değişikliklerin temellerinin anlaşılmasına olanak sağlamıştır. CNV’lerin toplandığı veritabanı olan Database of Genomic Variations (DGV)’ye göre güncel olarak 500 bini aşkın kopya sayısı değişikliklerden söz edilmektedir (41).
24
Şekil 2-8: Database of Genomic Variants’da arşivlenmiş CNV’lerin büyüklük dağılımları
CNV’lerin Fenotipik Etkileri
CNV’ler nesilden nesile ailevi olarak kalıtılabildiği gibi, de novo mutasyonlarla da ortaya çıkabilir. Kişiden kişiye ya da dokudan dokuya farklılıklar gösterebilmektedir. Bu değişiklikler bir genin tamamını, bir parçasını, çok sayıda geni veya regülatör elementleri içerebilir ya da gen dışı bölgelerde bulunabilir. Bu dizilerinklinik etkisi, penetransyokluğu veya ekspresivite değişkenliği gibi mekanizmalarla aynı aile içinde fenotipik farklılıklar gösterebilmektedir. Çevresel faktörler veya diğer yapısal varyasyonların varlığı bu fenotipik farklılıkların ortaya çıkmasında etkili olabilmektedir. Fenotipi etkilemeyecek bir CNV'nin genomun başka bölgesindeki bir CNV'nin ya da çevresel faktörlerin etkileriyle patolojik bir özellik kazanması, "çift vuruş hipotezi" ile açıklanmaktadır (Şekil2-9) (42).
Şekil 2-9: CNV’lerin tek ve çift vuruş fenotip etkisi
25 Array-CGH Tekniğinin Uygulama Aşamaları
Bu tekniğin temeli, test (hasta) ve referans DNA örneğinin karşılaştırılmasına dayanmaktadır. a-CGH’de, izole edilen hasta DNA Cy5 (Siyanin 5 mavi renk), referans DNA Cy3 (Siyanin 3 kırmızı renk) olmak üzere farklı flouresan boyalar ile işaretlendikten sonra beraber bir slayt üzerinde sabitlenmiş problar ile hibridize edilmesine dayanmaktadır. Hibridizasyon aşamasından sonra yıkama işlemi ile non-spesifik bağlanmalar uzaklaştırılır ve array-probları bilgisayarda uygun parametreler seçilerek taranır. Tarama işleminden elde edilen görüntünün analizi ise çeşitli software programlar kullanarak yapılır (Şekil2-10).
Şekil 2-10: a-CGH tekniğinin uygulama aşamaları
a-CGH tekniğindeki en önemli noktalar kitlerin seçimi, filtreleme, sonuçların doğru bir şekilde değerlendirilmesi ve başka tekniklerle konfirme edilmesidir.
array-CGH kitlerdeki çözünürlüğüne göre adlandırılmaktadır. Kit seçimindeki çözünürlük 15Kb ile 2.7Mb arasındadır ve 1 Mb’dan küçük değerlerdeki değişimleri saptayabilen arrayler, yüksek çözünürlüklü array olarak tanımlanırlar. Örnek olarak 300Kbʼlık bir array, genoma 300K sayıda prob yerleştirilerek oluşturulur. Çözünürlüğün artması, beraberinde kullanılan prob sayısını arttırmakta ve prob boyutunu azaltmaktadır.
26 Özellikle prenatal çalışmalarda a-CGH verilerinin değerlendirilmesinde karşılaşılan en büyük sorun tespit edilen değişimin tam olarak klinik etkisinin bilinmemesidir. Bir CNV'nin patojenik olarak değerlendirilmesinde önemli olan faktörler ise:
Etkilenmiş ebeveynde de aynı CNV’nin bulunması; Değişim de novo ise klinik bulguların varlığı; Veritabanlarında daha önce benzer fenotip ilişkili olarak tanımlanmış olması; Değişimin büyük olması ve içerdiği genlerin sayısının çok olması; Polimorfik bir varyant ile uyumlu olmaması; Duplikasyondan çok delesyon olmasıdır.
Dolayısıyla bir CNV tespit edildiğinde:
Aynı CNV etkilenmiş ebeveynde de görülmüş ise; Ebeveynde var olan fakat olguda değişime uğramış bir CNV ise; Etkilenmiş diğer aile bireylerinde saptanmış ise; CNV veritabanlarında (ISCA, DECIPHER, DGV vb) MKA/MR, gelişim geriliği olanolgularda bildirilmiş bir değişimle örtüşüyorsa; Bilinen bir mikrodelesyon/duplikasyon sendromu ile ilişkiliyse; CNV çok sayıda gen içeriyorsa ve OMIM ilişkili genlerin sayısı fazla ise; saptanan değişim patolojik olarak raporlanır. CNV delesyon (özellikle homozigot) veya amplifikasyon ise patolojik olma olasılığı yüksektir. Ayrıca, bir CNV:
Sağlıklı ebeveynden aynı şekilde kalıtılmış ise; Birçok sağlıklı aile bireyinde de gösterilmiş ise; Veritabanlarında sağlıklı bireylerde de gösterilmiş ise; İçeriğindeki genler klinik bir fenotiple ilişkilendirilmemiş ise; Duplikasyonise ve dozaja hassas bir gen ya da regülatör elementler içermiyorsa, değişim zararsız olarak kabul edilebilir (43).
Sonuçların değerlendirilmesinde klinik etkisinin kesin olarak bilinmeyen de novo değişimlerde ek tekniklerle doğrulanması gerekmektedir. Çıkan a-CGH sonuçlarına göre:
Değişim telomerik veya mikrodelesyon/duplikasyon bölgesinde yer alıyorsa konfirmasyon ticari/BAC problarının kullanımı ile FISH;
27 Değişim bölgesine özgün MLPA prob miksi varsa MLPA; Başka seçenek yoksa özgün primerler tasarlanarak Real Time qPCR; Veya olası hibridizasyon hatasını önlemek için 2. bir platformla array çalışması yapılmalıdır.
Kromozom analizinde herhangi bir anomali saptanmayan fakat array sonuçlarında tespit edilen değişimlerin izlenmesi (Şekil 2-11).
Şekil 2-11: Kromozom analizi normal sonuҫlanan olgulardaki a-CGH incelemelerinde akış şeması 2.4.2.5SNP-Array
Tüm genetik varyasyonların %90’ını oluşturmakta olan SNPʼler belirli bir baz pozisyonunda meydana gelen tek nükleotid değişikliklerdir. İnsan genomunda ortalama her 300 nükleotid arasına yerleşen SNP’lerin sayısı bugüne kadar 191 milyonu aşmaktadır ve birçoğunun 2 alleli mevcuttur (44) (Şekil 2-12).
28
Şekil 2-12: NCBI veritabanına göre insan genomundaki SNP sayısı
Popülasyonda genetik varyasyonların tespitinde kullanılan mikroarray yöntemlerden biri olan SNP-Array tekniği, hastalıkla ilişkili bölgeler ve kopya sayısı değişikliklerin tespitinde kullanılmaktadır. SNP-Array’in temeli işaretlenen hasta (test) DNA’sının uyumlu prob dizisine hibridizasyonu ve tek baz uzama prensibine dayanarak allel dağılımının tespit edilebilmesidir. Her SNP için 2 baz genotipi A ve/veya B allel frekansı olarak adlandırılır. Böylece heterozigot olan (AB) ve olmayan ( Loss Of Heterozigosity: LOH, AA veya BB) bölgelerin genotipi aydınlatılır. Ardından hasta bireyin sinyal yoğunluğu referans sinyal yoğunluğu ile bilgisayar ortamında kıyaslanarak her bir SNP için bir de CNV değeri elde edilir. Elde edilen CNV değeri sayesinde LOH bölgesinin gerçek homozigot veya delesyon kaynaklı allel kaybı olduğu anlaşılabilir (45).
2.4.2.6 CGH Array'ler ile SNP Array'lerin Karşılaştırılması
1. CNV’lerin normalizasyonu a-CGH’te hasta ve kontrol DNA’ların farklı boyalar ile işaretlenerek tek bir slayt üzerine birlikte hibridizasyonu ile yapılır. SNP-Array’de ise sadece test DNA işaretlenerek uyumlu problar üzerine hibridize edilir ve kontrol DNA ile bilgisayar ortamda karşılaştırılır (Şekil 2-13).
2. Array-CGH, genom boyunca serbest bir şekilde yerleştirilmiş 50-70 Kb büyüklüğünde oligonükleotid probları, tek bir slaytta kontrol DNA segmentleri ile karşılaştırma yaparak CNV saptanmasında optimal bir tekniktir. SNP-Array ise tek nükleotid polimorfizmlerin genomik dağılımı ile sınırlı ve problardaki oligonükleotidler kısa olduğundan yanlış hibridizasyonlara yol açabilir.
3. Özellikle kansere neden olan somatik LOH, akraba evliliği ve Uniparental Disomy (UPD) gibi durumların sebebiyet verdiği yapısal heterozigozite yokluğu (Absence Of Heterozygosity: AOH) gibi olayların saptanmasında Array-CGH yöntemi yetersiz kalmakta iken SNP-Array, LOH ve AOH durumların tespitinde uygun bir tekniktir.
29 Son yıllarda her iki mikroarray tekniğinden daha verimli olmaları amacıyla, a-CGH’lere tek nükleotid polimorfizm probları, SNP-Array’lere ise polimorfik olmayan problar ekleyerek, bahsi geçen yöntemlerin dezavantajları ortadan kaldırılmıştır.
Şekil 2-13: CGH arrayʼler ile SNP arrayʼlerin karşılaştırılması
30 3. GEREÇ-YÖNTEM
3.1 Çalışmaya Dahil Edilen Bireyler Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Çocuk Genetik Bilim Dalı ve İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Bilim Dalı’nın ortak çalışması olarak retrospektif olarak yürütülmüştür. Postnatal döneminde MKA/MR nedeni ile İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı, Çocuk Genetik Bilim Dalı’na başvuran 20 hastanın klinik değerlendirilmesi, Prof. Dr. Beyhan Tüysüz tarafından yapılmıştır. Bu bireylerin yaş, cinsiyet, hastalık öyküsü, öntanıları, kullandığı ilaçlar, yapılan tetkiklerden elde edilen bulgular klinik değerlendirme formlarına kaydedilmiştir. Bu hastalar öncelikle klinik olarak bilinen kromozomal ve mikrodelesyon sendromları ve tek gen kalıtılan sendromlar açısından incelenmiş ve kromozom analizleri yapılmıştır. Mental retardasyon ve multipl konjenital anomalileri olup kromozom analizi normal bulunan ve klinik olarak herhangi bir bilinen mikrodelesyon/duplikasyon veya tek gen geçişli sendrom tanısı konulamayan 20 olgu nedeni bilinmeyen MKA/MR grubu hasta olarak sınıflandırılmış ve array CGH incelemesi planlanmıştır.
Her bir bireyden 5-10 ml periferik kan EDTA’lı tüpe alınıp +4ºC buzdolabında saklanmış ve DNA eldesi manuel yöntem ile yapılmıştır. DNA materyali anonim olarak numaralandırılarak -20ºC dondurucularda saklanmıştır. Hastanın kromozom analizi tamamlandıktan sonra İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Genetik Anabilim Dalı'nda Doç. Dr. Birsen Karaman tarafından Array-CGH çalışmasına dahil edilmiştir. Array- CGH incelemesi sonucunda saptanan değişimlerin validasyonu uygun FISH tekniği ile yapılmıştır. Değişimlerin de novo/ailevi olarak belirlenmesi ise ek parental çalışmalar ile gerçekleşmiştir.
Çalışmanın etik açıdan uygunluğu, İ.Ü Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Çalışmaya katılan tüm aile üyeleri ve sağlıklı bireylerden bilgilendirilmiş onam alınmıştır.
31 3.2 Gereçler 3.2.1 Kullanılan Taşınabilir Cihazlar
NimbleGen MS 200 Mikroarray Tarayıcı (Roche) Agilent Hibridizasyon Fırını BioRad / T100 Thermal Cycler Santrifüj- Allegra X22R (Beckman) Mikrosantrifüj- 5415R (Eppendorf) Spektrofotometre- Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) Mikropipet Seti- (Gilson, Finpette) PCR tüpleri- (Axygen) Buzdolabı- SR-L629EV (Samsung) İnkübatör- Shake n stack (Hybide) Masaüstü ısıtıcı blok- Accublock (SBH130D Stuart) Vorteks (V-1 plus BioSan) Bilgisayar (Samsung) DNA Bankalama programı- Özel yapım veritabanı (File Maker Pro V 8) Array-CGH Analizi (Agilent Feature Extraction for CytoGenomics + CytoGenomics v.2.9.1.3, v. 3.0.0.019 (Versiyon belirli aralıklarla güncellenmektedir.)) Fluoresan Ataşmanlı Mikroskop Hibridizasyon Cihazı (Dako/Hybridizer)
3.2.2. Kullanılan Kimyasal Malzemeler
Agilent Mikroarray Kitleri (SurePrint G3 Hmn CGH+SNP 4X180 K) Agilent SureTag DNA Labelling Kit Purification Columns Vacuum Concentrator (Savant DNA 120 Speed Vac Concentrator) (Thermo Scientific) 2xSSC çözeltisi 0.4xSSC çözeltisi Tween-20 solüsyonu TE tampon 10 X Lysis Buffer (LB) 1X Lysis Buffer White Blood-Cell Lysis (WBL) Buffer
32 Amonyum Asetat Tris HCl %10 SDS 0.5 M EDTA H2O2 Proteinaz K
3.3 Kullanılan Teknikler
3.3.1 DNA İzolasyonu
Periferik kandan elde edilen DNA günümüzde birçok farklı manuel ve ticari kitler ile uygulanmaktadır ve hepsinin temeli 3 aşamaya dayanır: Liziz buffer ile hücre membranın parçalanması; Proteaz enzimiyle DNA-protein kompleksinin ayrıştırılması ve Amonyum Asetat ile proteinlerin çöktürülmesi; DNA'nın izopropanal veya Etanol ile yıkanarak pürifikasyonu.
Manuel DNA izolasyonu akış şeması:
1. 50 mlʼlik falkon tüpüne 10 ml periferik kan eklenir, üzerine 1:3 oranında Lysis Buffer (1XLB) (30 ml) eklenir. 15 dk bekletilir. 2. Soğutmalı santrifüjde, 4400 rpmʼde 10 ºC, 20 dk santrifüj edilir. 3. Süpernatant atılır. Üzerine 1-2 ml 1XLB eklenir, dökülür. Üzerine 10 ml 1XLB eklenir. 4. Vortekslenir,4400 rpm de 10 ºC de, 10 dk santrifüj edilir. 5. Süpernatant atılır. Üzerine 1-2 ml 1XLB eklenir, dökülür. Çalışmaya devam ediliyorsa, süspanse olmuş örneğe 5 ml WBL eklenir iyice vorteks yapılır. %10’luk SDS ten 80 µl ve 50 µl Proteinaz K eklenir. Tüp yavaşça karıştırılır. 6. 37 ºC’de 1 gece veya 56 ºC’de 3 saat inkübe edilir. 7. 4 ml amonyum asetat ilave edilir. Tüp iyice çalkakanır. -20 ºCʼde, 30 dk bekletilir. 8. Sogutmalı santrifüjde 4400 rpm de 10 ºC de,50 dk santrifüj edilir. 9. Süpernatant temiz bir falcona aktarılır. Üzerine 1: 2 oranında etil alkol ilave edilir. DNA tüpün yukarısına çıkana kadar beklenir.
33 10. Mikropipet ucuyla DNA alınır, eppendorfa tüpün cidarına aktarılır. DNA nın kuruması beklenir. 11. DNA miktarına göre 100-300 µl arası TE ilave edilir. 12. Bir gece oda sıcaklığında bekletilir. Ölçümleri yapılır ve -20 ºCʼye kaldırılır.
3.3.2 Array-CGH Çalışması
a-CGH tekniği hasta (test) ve referans DNA’nın işaretlenmesi, hibridizasyonu, yıkama, tarama ve analiz aşamalardan oluşan 2 günde tamamlanan bir çalışmadır.
3.3.2.1 Hasta ve Referans DNA’nın İşaretlenerek Hibridizasyonu
1. Hasta materyallerinden elde edilmiş izole DNA örneklerinin konsantrasyonları 500’e
bölünür ve çıkan değer dH2O ile 20.2 µl ye tamamlanır. Hesaplanan bu değerler 0.2 ml’lik PCR tüplerine her hasta için ayrı ayrı konulur ve tüpler numaralandırılır. 2. Kız ve erkek kontrol DNA’larından da elimizdeki hasta cinsiyetine göre 2.5 ng/µl DNA
örneği ve 17.7 µl dH2O kullanılarak 20.2 µl değeri sağlanmış olur. Bu değerler de 0.2 ml’lik PCR tüplerine ayrı ayrı konulur ve tüpler numaralandırılır.
3. Başka bir ependorf tüpte ise 20 µl dH2O (nuclease-free water), 26 µl 10xRestriction Enzyme Buffer, 2 µl BSA, 2 µl Alu I ve 2 µl Rsa I’den oluşan digestion mix hazırlanır. 4. PCR cihazında ilk olarak 37oC’de 2 saat ve sonrasında 65oC’de 20 dk’dan oluşan toplam 2 saat 20 dk’lık bir programdan oluşan AGI 1 programına konulur. 5. Tüp elle hafifçe karıştırılır ve santrifüjde spin edilir. 6. Bu digestion mix’den her hasta ve kontrol tüpüne 5.8 µl eklenir. Tüpler elle hafifçe karıştırılır ve santrifüjde spin edilir. 7. PCR’dan çıkan tüpler hemen buza saplanır. (Tüpler bu aşamada -20 oC’de saklanabilir) 8. PCR’dan çıkan tüplerin her birine 5 µl Random Primer konulur. Tüpler elle hafifçe karıştırılır ve santrifüjde spin edilir. 9. Tüpler PCR cihazında 95oC 4 dk’dan oluşan AGI 2 programına konulur. 10. Tüpler PCR cihazından çıkar çıkmaz buza saplanır ve 5 dk buzda bekletilir. 11. ( 5. basamaktaki labelling mix bu 5 dk’lık zaman diliminde hazırlanır.) 12. Hasta ve kontrol grupları için Cy5 (mavi=hasta) ve Cy3 (pembe=kontrol) olmak üzere 2 ayrı labelling mix hazırlanır ependorf tüplerde.
34 13. Cy3 = 50 µl 5x Reaction Buffer + 25 µl 10x dNTPs + 15 µl Cyanine 3-dUTP + 5 µl Exo (-) Klenow 14. Hazırlanan bu karışımlar hasta ve kontrol gruplarına göre her tüpe 19 µl konulur. ( Bu işlem de buz kabı üzerinde yapılmaktadır) 15. Sonrasında tüpler PCR cihazında ilk olarak 37oC’de 2 saat ve ardından 65 oC’de 10 dk’dan oluşan 2 saat 10 dk’lık AGI 3 programına konulur. 16. PCR’dan sonra tüpler buz üzerine alınır. (Tüpler bu aşamada da -20oC’de saklanabilir) 17. Bu 2 saat 10 dk’lık zaman diliminde her örnek için 2’şer pürifikasyon tüpü ve 1’er filtre hazırlanır. 18. Pürifikasyon tüplerine yerleştirilmiş her filtrelere ayrı ayrı örnek ve 430 µl TE buffer (pH 8.0) konulur. 19. Tüpler 14.000 rcf’de 10 dk santrifüj edilir. 20. Santrifüjden çıkan tüplerin altı dökülür ve her pürifikasyon filtresine 480 µl TE buffer eklenir. 21. Tüpler tekrar 14.000 rcf’de 10 dk santrifüj edilir. 22. Santrifüjden çıkan tüplerin altı değiştirilir ve filtreleri ters kapatılıp 1.000 rcf’de 1 dk santrifüj edilir. 23. Tüpte yaklaşık 21 µl olmasına dikkat edilmelidir. (Bu aşamadan sonra hep buz üzerinde çalışılmalıdır.) 24. Santrifüjden sonra, örneklerimizin konsantrasyonu nanodropta ölçülür. 25. Nanodropta mikro-array opsiyonu seçilir. DNA konsantrasyonları ve Cy3-Cy5 absorbsiyonları not edilir. 26. Bu çıkan değerlere göre Excel dosyasında bir hesaplama işlemi uygulanır ve örneklerimizin spesifik aktivitesi oluşur. Oluşan bu değer aralığı bizim örneğimizin çalışma için yeterince uygun olup olmadığını göstermektedir. Kontrol (Cy3) için 20-35, hastalar (Cy5) için ise 20-30 aralığındaki spesifik aktivite uygun görülmektedir. Yine bu işlemler sürerken örneklerimiz için bir yield belirlememiz gerekmektedir, böylece de örneğimizden ekleyeceğimiz hacim ortaya çıkmaktadır. Bu yield değeri de 5-6 arasında olmalı, bu değerleri aşmamalıdır. 27. Hasta ve kontrol örneklerimiz bu hesaplamalarda çıkan oranlara göre birleştirilir. Distile su ile 39 µl’ye tamamlanır. 28. Bu oran 39 µl’den fazla ise vakum konsantrasyonda orta ısıda fazlası uçurulur. (Bu aşamada da örnekler -20oC’de saklanabilir)
35 29. Hasta ve kontrol örneklerini birleştirdikten sonra her tüpe 5 µl Cot-1 DNA, 11 µl 10x aCGH Blocking Agent ve 55 µl 2x HI-RPM Hybridizaiton Buffer eklenir. 30. Tüpler elle hafifçe karıştırılır ve santrifüjde spin edilir. 31. Tüpler PCR cihazında 95oC’de 3 dk ve 37oC’de 30 dk’dan oluşan 33 dk’lık AGI 4 programına konulur. 32. Bu 33 dk’lık zaman diliminde hibridizasyon için hazırlık yapılır. Gasket slide, Agilent SureHyb chamber base ve microarray slide çıkarılır ve ortam yükleme yapmak için hazır hale getirilir. 33. PCR’dan alınan örnekler yükleme aşamasında beklerken 37oC’de tutulur. 34. Temiz gasket slide, chamber base’in içine uygun bir şekilde yerleştirilir. 35. Her örnekten 100’er µl gasket bölmelerine yükleme yapılır. 36. Mikroarray slaytının aktif kısmı ters olarak çok dikkatli bir şekilde gasket slaydının üzerine konulur. Bu şekilde, gasket slaytının agilent-etiketli barkotlu yüzüyle, microarray slaytının agilent-etiketli barkotlu yüzünün birbirine bakması sağlanmış olur. Sandwich- pair olarak adlandırılan bu iki slaydın aynı hizada yerleştirilmesine çok dikkat edilir. 37. SureHyb chamber cover bu slaytların üzerine dikkatlice konulur, kıskaç chamber’ın ortasına getirilerek sıkıca kapatılır. 38. Yüklemesi ya pılan chamber dikey olarak döndürülür ve slaytın ıslanması, baloncukların hareket etmesi sağlanır. 39. Slide chamber, hibridizasyon cihazında rotator rafa yerleştirilerek, 67oC, 20 rpm’de en az 20 saat hibridizasyon yapması sağlanır.
3.3.2.2 Yıkama Aşaması
1. Hibridizasyon cihazından alınan chamber’dan çıkarılan ikili sayt (gasket ve microarray slaytı) ayrılmak için Wash I solüsyonunun içine konulur. Böylelikle, gasket microarray slayttan dikkatli bir şekilde ayrılır. 2. Gasketten ayrılan microarray slaytı, preparat tutucuya yerleştirilir ve oda ısısında, 2.7 hızına ayarlanan cihaza konulan Wash I solüsyonunun içine konulur ve 5 dk bekletilir. 3. Daha sonra 50 oC’de 2.7 hızında ayarlanan cihaza etüvden çıkan Wash II solüsyonu konulur ve microarray slayt hemen bu solüsyonun içine konulur. 1 dk bekletilir ve yavaşça çıkarılır. Wash II solüsyonu yıkama aşamasından önce 37 oC’lik etüvde bekletilir. 4. Hemen sonrasında microarray slayt oda ısısında, 2.7 hızında ayarlanan cihaza konulan Asetonitril’e konulur ve 10 sn bekletilir.
36 5. Asetonitrilden çıkarılan slayt yine oda ısısında, 2.7 hızında ayarlanan cihaza konulan Drying solüsyonunun içine konulur ve 30 sn bekletilir. Sonrasında yavaşça çıkarılır.
3.3.2.3 Tarama Aşaması 1. Yıkama aşaması bittikten sonra mikroarray slayt hemen slayt tutucuya yerleştirilir ve tarayıcıya konulur. 2. Bilgisayarda uygun parametreler seçilerek tarama işlemi başlatılır. 3. Tarama işleminden elde edilen görüntü analizin yapılacağı bilgisayara aktarılır.
3.3.2.4 Analiz Aşaması 1. İlk olarak analizin yapılacağı bilgisayarda örneklerin yüklendiği tarih ile adlandırılan bir dosya açılır. 2. Tarama cihazından elde edilen görüntü bu dosyaya aktarılır. 3. Bu işlemden sonra analiz için ilk aşama olan Agilent Feature Extraction for CytoGenomics programı açılır ve taramadan elde edilen görüntü bu programa da yüklenir. 4. Gerekli parametre ve protokol seçilerek extraction işlemi başlatılır. 5. İkinci aşama için ise CytoGenomics programı açılır ve hastaların adı, soyadı ve array numaraları kaydedilir. 6. Analiz ile tüm kromozomlar tek tek incelenebilir, probların bağlanma düzey ve kalitesi gözlenebilir. 7. Değişim saptanan kromozom bölgesinde bulunan gen bölgelerinin üzerine gelerek UCSC Genome Browser, ENSEMBL, OMIM, DECIPHER ve ISCA gibi veritabanlarına bağlanılabilir.
3.3.3 FISH Çalısması
1. Hücre peleti lamların üzerine yayılır. Preparatların kuruma işleri tamamlandıktan sonra bir gece 65℃ʼlik etüvde yaşlandırma yapılır. 2. 2×SSCʼde, 37℃ʼde, 45 dk bekletilir. 3. Etüvden ҫıkarılan preparatlar 2×SSCʼi gitmesi iҫin distile sudan geҫirilir.
37 4. Oda ısısında sırayla %75, %85, %100ʼlük etanol serisinde 3ʼer dk dehidrate edilir ve kurutulur. 5. Prob uygulanması karanlık ortamda olur. Üzeri lamelle kapatılır ve yapıştırıcı ile kenarları kapatılır. 6. Kuruyan preparatlara 5μl prob uygulanır. 7. Prob ve hedef DNA hybriteʼta ilk olarak 73℃ʼde, 5 dk tutularak denatüre edilir. 8. Preparatlar 37℃ʼde nemli ve karanlık bir kutu iҫinde veya hybriteʼde bir gece (16-18 saat) bekletilerek hybridize olur. 9. Yıkama iҫin preparatların üzerinden parafinler kaldırılır, lameller ҫekilir. (Lam-lamel arası nemli olmalı, lamel lamın üzerinden kaymalıdır. 10. 0.4 ×SSC+0.3% NP4O solüsyonda 5 dk yıkanır. (Solüsyon 73℃ʼde saklanmalıdır) 11. Ardından oda sıcaklığında 2×SSC+0.1% NP4Oʼlı ortamda 30s-1dkʼda bekletilir. 12. Çıkarılan preparatlar distile sui le yıkanır ve karanlık odada beklenir. 13. Kuruyan preparatlara 10휇푙 dapi uygulanır. Büyük lamelle kapatıldıktan sonra aliminiyom folyaya sarıp 10-15 dk, +4℃ʼde bekletilir. Ardından okuma yapılır.
38 4.BULGULAR
MKA/MR nedeni ile İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Çocuk Genetik Bilim Dalı tarafından izlenen 20 hasta çalışmaya alındı. Hastaların 14’ü erkek ve 6’si kız idi, E/K oranı 2.3:1 olarak hesaplandı. Ortalama başvuru yaşı 4,5 yaş (1 gün-16 yaş) idi. Ailelerin %30’unda (n=6) akraba evliliği mevcuttu. Çalışmaya alınan 20 hastanın 16ʼsında a-CGH yapıldıktan sonra herhangi bir kopya sayısı değişikliği saptanmadı. Bu 16 hastanın klinik özellikleri Tablo 4-1'de gösterilmiştir.
Tablo 4-1: Çalışmaya Dahil Edilen Bireyler ve Bilgileri
Olgu Yaş(başvuru) Cins Klinik bulgular Ön tanı Hafif MR,IQ:73, dismorfik bulgular (pitoz, yay şeklinde kaşlar, geniş ve hafif 1 6,5yaş K yüksek damak, küçük kulak, lateral yerleşimli meme başları, sandal açıklığı, MKA/MR ciltte hipopigmente lezyon),epilepsi, strabismus. Orta MR,IQ: 51, boy kısalığı, dismorfik bulgular (mavi sklera, 2 12yaş E mikroretrognati, lumbal lordoz, sandal açıklığı, cafe au lait),opere sağ inmemiş MKA/MR testis, renal kist ve kalkül, miyopi Orta MR, DQ:43, dismorfik bulgular (kaba yüz görünümü, metopiksütür 3 2,5yaş E belirgin, seyrek kaşlar, bilateral5.parmakkamptodaktili),makrozomi, ileri MKA/MR kemik yaşı, koroidpleksus kisti, Tip2 DM Hipotonisite, ciddi motor gerilik(13 aylık iken oturamıyor) dismorfik 4 1 gün E bulgular(Hipotelorizm, glabelladakapillerhemanjiyom, uzun filtrum, düşük Amyoplazi kulak, mikroretrognati, kamptodaktili) epilepsi, renal anomali, inmemiş testis Ağır NMR (6 yaşında desteksiz oturamıyor), dismorfik bulgular (frontal 5 2.5 yaş E bossing, seyrek kaş ve kirpikler, anoftalmi, eklemlerde MKA/MR hipermobilite)epilepsi(hipsaritmi), mikrosefali Hafif MR,DQ:76, dismorfik bulgular (epikantus, burun kökü basıklığı, kaba 6 2 yaş E yüz görünümü), boy kısalığı, brakidaktili, nefrolitiazis, strabismus, cilttecafeau MKA/MR lait lekeleri Dikkat dağınıklığı, unutkanlık, renalanomali, opereptozis, dar palpebralfissur, MKA/Dikkat 7 7 yaş E inguinalherni dağınıklığı Hafif MR, IQ:61, GKD*, aort darlığı, astigmatizm, hipermobilite,dismorfik 8 7 yaş E yüz bulguları ( temporal darlık, üçgen yüz, mavi sklera,düşük kulak, geniş kaş MKA/MR yapısı, ayakta 2-3 sindaktili) Orta MR,DQ:50, dismorfik yüz bulgular (küçük ağız, yüksek damak, büyük 9 3 yaş E MKA/MR kulak), mikrosefali, motor gerilik, Mikrolizensef 10 1 yaş E Mikrosefali, motor gerilik, epilepsi, lizensefali, hipermetropi, astigmatizm ali Ağır MR, DQ:34, mikrosefali, dismorfik yüz bulguları (temporal darlık, 11 2 yaş K MKA/MR yüksek damak, mikroretrognati) Ağır MR, DQ 14, hipotoni, dismorfik bulgular (makrosefali, hidrosefali, basık 12 7 yaş E burun kökü, sivri burun, mikrognati, brakidaktili, bilateral simian line, MKA/MR serebellar atrofi Ağır MR, IQ:36,dismorfik yüz(Uzun üçgen yüz, epikantus, dar yüksek damak, 13 6,5 yaş E MKA/MR retrognati)IUGG, boy kısalığı, hidrosefali, hipermetropi Motor gerilik, dikkat dağınıklığı, dismorfik bulgular (hipertelorizm, palpebral fissur dar, basık ve geniş burun kökü, düşük kulak, preaurikular skin tag, MKA/Dikkat 14 1 ay K umblikal herni, sakral dimple, brakidaktili, ayak 2-3-4 parmaklar aynı kökten dağınıklığı çıkıyor) Ağır MR, DQ:17, dismorfik bulgular (Dar palpebralfissur, epikantus, 9 ay E MKA/MR 15 antimongoloid aks), GÖR, BGG, yarık damak, şaşılık 16 4 yaş K Ağır nöromotor gerilik, hipotonisite, gülme nöbetleri, ekstra meme başı MKA/MR
39 *VSD= Ventriküler Septal Defekt *DM= Diyabetes Mellitus (Diyabet) *GKD= Gelişimsel Kalҫa Displazi *IUGG= Intrauterin Gelişme Geriliği *BGG= Boykısalığı ve Gelişme Geriliği *GÖR= Gastroözofageal Reflü *MRG= Manyetik Rezonans Görüntüleme
Kalan 4 olguda ise a-CGH sonucu genomun farklı bölgelerinde klinik ile uyumlu delesyonlar/duplikasyonlar saptanmıştır. Bu 4 olguda saptanan CNVʼler Tablo 4-2ʼde gösterilmiştir.
Tablo 4-2: a-CGHʼde patolojik varyant saptanan 4 olgunun özeti
Olgu CNV saptanan bölge Anomali büyüklüğü 17 6q27 2.287 Mb(del) 18 22q11.21 2.711 Mb (del) Xq27.3q28, 10.73 Mb (dup), 19 Xp22.33 1.66 Mb (del) 20 16p11.2 533.9 Kb (del)
4.1 a-CGHʼde Patolojik Varyant Saptanan 4 Olgunun Sunumu
A-CGH incelemesi sonucunda patolojik varyant saptanan 4 olgunun klinik ve moleküler özellikleri aşağıda belirtilmiştir.
Olgu 17
Cinsiyet: Dişi
Doğum Tarihi: 2011
Başvuru yaşı: 1,5 yaş
Akrabalık: Yok (Şekil 4-1)
Şekil 4-1: olgu 17ʼye ait aile ağacı
40
Endikasyon: MKA/MR (Mikrosefali+nöromotor gelişim geriliği)
Pozitif bulgular:
Dismorfik yüz bulguları yüz (Hipertelorizm, hafif antimongoloid aks, gaga burun, mikroretrognati) Postnatal başlangıçlı mikrosefali Orta nöromotor retardasyon (DQ:49) Belirgin konuşma geriliği Bilateral simian çizgisi Hipoplazik labia minör Epilepsi (hipsaritmi) Kranial MR: Her iki serebral hemisferlerde frontopariental sulkuslar hafif sığ ve sayıca az, bilateral temporal araknoid kist (Şekil 4-2)
Şekil 4-2: Olgu 17’e ait 5.5 yaş fotoğrafları
Sitogenetik ve Moleküler Sitogenetik İncelemeler
Karyotip: 46, XX (Şekil 4-3)
41
Şekil 4-3: Olgu 17'e ait karyotip görüntüsü
Moleküler inceleme; a-CGH: a-CGH (Agilent 4x180K platformu) sonucu: 46, XX.arr 6q27(168,619,459- 170,906,796)x1
Bulgunun yorumu: 2.287 Mb büyüklüğünde delesyon (Şekil 4-4,4-5)
Şekil 4-4: Olgu 17’ye ait a-CGH (Agilent platformu ile) görüntüsü
42
Şekil 4-5: Olgu 17’e ait 6. kromozomundaki delesyon bölgesinin a-CGH görüntüsü
Delesyon bölgesinde yer alan gen/genler: DACT2, SMOC2, THBS2, TCTE3, FAM120B, PSMB1, WDR27, C6orf120, PHF10, C6orf70, NCRNA00242, C6orf208, LOC154449, DLL.
Parental karyotip sonucu: Anne ve Baba karyotip incelemesi: Normal
Tanı: 6q27 mikrodelesyon Sendromu
Olgu 18
Cinsiyet: Erkek
Doğum Tarihi: 2000
Başvuru yaşı: 16 yaş
Akrabalık: Yok (Şekil 4-6)
43
Şekil 4-6: Olgu 18ʼe ait aile ağacı
Endikasyon: Hafif MR, epilepsi, dismorfik yüz bulguları
Pozitif bulgular:
Dismorfik yüz bulguları (uzun yüz, kısa filltrum, yüksek damak) Hafif MR (IQ:64) Uzun boy Dar toraks, araknodaktili, skolyoz, femur başı düzensizliği (Şekil 4-7)
Şekil 4-7: Olgu 18’e ait 16 yaş fotoğrafları
44
Sitogenetik ve Moleküler Sitogenetik İncelemeler
Karyotip: 46, XY (Şekil 4-8)
Şekil 4-8: Olgu 18'e ait karyotip görüntüsü
Moleküler inceleme; a-CGH: a-CGH (Agilent 4x180K platformu) sonucu: 46,XY.arr 22q11.21(18729944_21440514)x1
Bulgunun yorumu: 2.711 Mb büyüklüğünde delesyon (Şekil 4-9,4-10)
45
Şekil 4-9: Olgu 18’e ait a-CGH (Agilent platformu ile) görüntüsü
Şekil 4-10: Olgu 18’e ait 22. kromozomundaki delesyon bölgesinin a-CGH görüntüsü
Delesyon bölgesinde yer alan gen/genler:
DGCR6, PRODH, DGCR2, TSSK2, GSC2, SLC25A1, CLTCL1, HIRA, MRPL40, UFD1L, CL DN5, SEPT5, GP1BB, TBX1, GNB1L, TXNRD2, COMT, ARVCF, MIR185, DGCR8, TRMT2 A, RANBP1, ZDHHC8, RTN4R, DGCR6L, RIMBP3, ZNF74, SCARF2, MED15, PI4KA, SER PIND1, SNAP29, CRKL, LZTR1, SLC7A4, GGT3P, DGCR5, DGCR9, DGCR10, DGCR11, D GCR14, C22orf39, CDC45, LOC150185, SEPT5,GP1BB, C22orf29, C22orf25, MIR3618, MI R1306, LOC150197, MIR1286, PI4KAP1, KLH22, POM121L4P, TMEM191A, AIFM3, THA P7, FLJ39582, MGC16703, P2RX6, P2RX6P, LOC400891.
Konfirmasyon FISH Ҫalışması: DiGeorge/VCFS TUPLEX1 probu ve subtelomerik kotrol probu (22qter, clone N8a3)(Cytocell) ile yapılan FISH analizinde De George/VCFS bölgesinde delesyon saptanmıştır (Şekil 4-11)
46
Şekil 4-11: Olgu 18'e ait FISH görüntüsü
Parental Ҫalışma: Yapılmadı.
Yorum: Olguda yapılan a-CGH ҫalışmasında 22.kromozomun q11.21 bölgesinde 18729944_21440514 baz ҫiftleri arasında 2,711 Mb büyüklüğünde bir delesyon saptandı. Bu sonuҫ CATCH22 ile uyumludur. Sonucun doğrulanması iҫin FISH ҫalışması yapılarak olası hibridizasyon hataların varlığı dışlanmıştır.
Olgu 19
Cinsiyet: Erkek
Doğum Tarihi: 2009
Başvuru yaşı: 7 ay
Akrabalık: Yok (Şekil 4-12)
47
Şekil 4-12: Olgu 19ʼa ait aile ağacı
Endikasyon: Nöromotor Gelişim Geriliği
Pozitif bulgular:
Dismorfik yüz bulguları (Frontal bossing, burun kökü basık, burun delikleri küҫük, yüksek damak, sinorfis, retrognati) Mikrosefali Hipotoni Orta nöromotor retardasyon (DQ:47) Boy kısalığı Bilateral inmemiş testis Erken fontanel kapanması (7 aylıkken) Brakidaktili Bilateral Kriptorşizm Kranial MRG'de derin ak maddede azalma, incelmiş korpus kallosum Sık sık solunum yolu enfeksiyon geҫirme (şekil 4-13)
48
Şekil 4-13: Olgu 19’a ait 4.5 yaş fotoğrafları
Sitogenetik ve Moleküler Sitogenetik İncelemeler
Karyotip: 46, XY (Şekil 4-14)
Şekil 4-14: Olgu 19'a ait karyotip görüntüs
Moleküler inceleme; a-CGH:
49 a-CGH (Agilent 4x180K platformu) sonucu: 46,XY.arr Xq27.3q28(144,495,493- 155,226,944)×2,Xp22.33(60,701-1,719,057)×0
Bulgunun yorumu: Xq27.3q28 bölgesinde 10.73 Mb büyüklüğünde bir duplikasyon ve Xp22.33 bölgesinde 1.66 Mb büyüklüğünde bir delesyon (Şekil 4-15, 4-16)
Şekil 4-15: Olgu 19’a ait a-CGH (Agilent platformu ile) görüntüsü
50
Şekil 4-16: Olgu 19’a ait X. kromozomundaki delesyon/duplikasyon bölgelerinin a-CGH görüntüsü
Duplikasyon (Xq) bölgesinde yer alan genler:
SLITRK2, MIR506, MIR508, MIR5091, MIR5093,MIR510, FMR1, AFF2, IDS, CXorf40A, MAGEA9, MAGEA9B, MAGEA11, MAGEA8, MAMLD1, MTM1, MTMR1, CD99L2, HMGB, GPR50, VMA21, PRRG3, FATE1, CNGA2, MAGEA4, GABRE, MAGEA5, MAGEA10, GABR A3, MIR1051, MIR1052, GABRQ, MAGEA6, MAGEA2, MAGEA2B,MAGEA12, CSAG1, MA GEA3, CETN2, NSDHL, ZNF185, PNMA5, PNMA3, PNMA6A, TREX2, HAUS7, BGN, ATP2 B3, FAM58A, DUSP,PNCK, SLC6A8, BCAP31, ABCD1, PLXNB3, IDH3G, SSR4, PDZD4, L 1CAM, AVPR2, NAA0,RENBP, HCFC1, TMEM187, IRAK1,MIR718, MECP2, OPN1LW, OP N1MW, TEX28, TKTL1, FLNA, EMD, RPL10, DNASE1L1, TAZ, GDI1, FAM50A, UBL4A, S LC10A3, FAM3A, G6PD, IKBKG, CTAG1B, CTAG1A, CTAG2, GAB3, DKC1, MPP1, F8, M TCP1,RCC3, VBP1, RAB39B, CLIC2,TMLHE, SPRY3, VAMP7, CXorf1, MIR890,MIR888, M IR892A,MIR892B, MIR891B, MIR891A,CXorf51, MIR507, MIR514B, MIR5092, MIR5141,M IR5142, MIR5143, FMRAS1, FMR1NB, LOC100131434, HSFX2, HSFX1, TMEM185A, CXo rf40B, LOC100272228, MIR2114, MIR4330, PASD1, MIR452, MAGEA10MAGEA5, MIR767 , CSAG3, CSAG2, LOC100287428, MAGEA1, ZNF275, ZFP92, SRPK3, ARHGAP4, MIR320
51 21, MIR32022, OPN1MW2, SNORA70, ATP6AP1, PLXNA3, LAGE3, NCRNA00204, NCRNA 00204B, SNORA36A, SNORA56, LOC100132963, H2AFB1, H2AFB3, F8A1, F8A2,F8A3, MI R11841, MIR11842, MIR1184-3, FUNDC2, MTCP1NB, H2AFB2.
Delesyon (Xp) bölgesinde yer alan genler:
GTPBP6, PPP2R3B, SHOX, CRLF2, CSF2RA, IL3RA, SLC25A6, P2RY8, AKAP17A, ASMT, PLCXD1, NCRNA00107, MIR3690, L-AS1, ASMTL, ASMT.
Konfirmasyon FISH Ҫalışması: 46,Y,Xp+.ish der(X)(Xqter->Xq27.3::Xp22.32- >Xqter)(SHOX×1,DXYS129×0,wcpXq+) (Şekil 4-17).
Şekil 4-17: olgu 19'a ait FISH görüntüsü
Parental Ҫalışma:
Baba karyotip sonucu: Normal
Anne karyotip sonucu: 46,X,inv(X)(qter->q27.3::p22.32->q27.3::p22.32->pter)
Anne FISH Ҫalışması:
52
Şekil 4-18: olgu 19'un annesine ait FISH görütüsü
Yorum: Olguda yapılan a-CGH çalışmasında, X kromozomunun q27.3q28 bölgesinde 144,495,493-155,226,944 baz çiftleri arasında 10.73 Mb büyüklüğünde bir duplikasyon ve Xp22.33 bölgesinde 60,701-1,719,057 baz çiftleri arasında yaklaşık 1.66 Mb büyüklüğünde bir delesyon saptandı. Bu anomalinin kromozomal lokalizasyonunu belirlemek amacı ile yapılan kromozom analizinde X kromozomunun p kolunda bir artış saptandı. X kromozomuna özgü arm spesifik, SHOX genine ve Xp subtemlomer bölgesine özgü problar ile yapılan FISH incelemesinde, X kromozomunun p kolundaki artışın Xq bölgesinden kaynaklandığı, Xp subtelomer ve SHOX bölgesinde ise delesyon olduğu gösterildi. Anomalinin kökenini ve olası taşıyıcılığın araştırılması amacıyla yapılan parental kromozom analizinde babada normal kromozom yapısı saptanırken, annede X kromozomunda perisentrik bir inversiyon sapandı. Bu sonuç, X kromozomuna özgü arm spesifik probla yapılan FISH incelemesi ile konfirme edildi. Sonuç olarak, çocuktaki Xp22.32 duplikasyonunun annedeki perisentrik inversiyonun dengesiz bir ürün olarak oluştuğu kesinleşmiştir.
53 Olgu 20
Cinsiyet: Dişi
Doğum Tarihi: 2012
Başvuru yaşı: 4 yaş
Akrabalık: 1,5 derece kuzenevliliği (Şekil 4-19)
Şekil 4-19: Olgu 20ʼye ait aile ağacı
Endikasyon: MKA/MR (Nöromotor Gelişim Geriliği+ PEV+ Nistagmus)
Pozitif bulgular:
Dismorfik yüz bulguları ( Hafif Hipertelorizm, antevert burun delikleri, kulaklar hafif düşük, kulak kepҫesi hipoplazik, uca doğru sivrilen konik şeklinde ҫürük dişler, dolgun yanak, retromikrognati), sandal açıklığı Hafif MR (DQ:64) Konuşma geriliği Hafif aort yetmezliği Pes ekinovarus deformitesi Nistagmus, bilateral hipermetropi ve astigmatizm (sol: +4, sağ: +3), bilateral papilla hafif soluk Sol kulakta ҫok hafif derecede işitme kaybı (Şekil 4-20)
54
Şekil 4-20: Olgu 20’ye ait 5.5 yaş fotoğrafları
Sitogenetik ve Moleküler Sitogenetik İncelemeler
Karyotip: 46, XX (Şekil 4-121)
Şekil 4-21: Olgu 20'ye ait karyotip görüntüsü
Moleküler inceleme; a-CGH:
55 a-CGH (Agilent 4x180K platformu) sonucu: 46,XX.arr 16p11.2(29656684_30190568)x1
Bulgunun yorumu: 533.9 Kb büyüklüğünde bir delesyon (Şekil 4-22, 4-23)
Şekil 4-22: Olgu 20’ye ait a-CGH (Agilent platformu ile) görüntüsü
Şekil 4-23: Olgu 20’ye ait 16. kromozomundaki delesyon bölgelerinin a-CGH görüntüsü
Delesyon bölgesinde yer alan genler:
56 SPN, QPRT, KIF22, MAZ, PRRT2, PAGR1, MVP, SEZ6L2, KCTD13, TAOK2, HIRIP3, DOC 2A, FAM57B, ALDOA, PPP4C, TBX6, YPEL3, GDPD3, MAPK3, C16orf54, ZG16, CDIPT,C DIPT-AS1, ASPHD1, TMEM219, INO80E, C16orf92, LOC101928595.
Parental Ҫalışma:
Baba a-CGH (Agilent 4x180K platformu) sonucu: .arr(1-22)x2,(X,Y)x1
Anne a-CGH (Agilent 4x180K platformu) sonucu: .arr(1-22,X)x2
Yorum: Olguda yapılan a-CGH ҫalışmasında 16.kromozomun p11.2 bölgesinde 29656684_30190568 baz ҫiftleri arasında 533.9 Kb büyüklüğünde bir delesyon saptandı. Bu bölge delesyonlarının dismorfik bulgular, nöromotor gelişim geriliği ve öğrenme güҫlüğü ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Paternal ҫalışmada a-CGH sonucun normal ҫıkması ise ҫocukta saptanan anomalinin de novo oluştuğunu göstermektedir.
Tanı: 16p11.2 mikrodelesyon Sendromu
57 5.TARTIŞMA
MKA/MR’li olgularda, kromozom anomali oranları farklı çalışmalarda %4 ile %28 arasında bildirilmiştir ve anomali saptanma oranı hasta seçim kriterlerine, uygulanan test ve çözünürlüklerine bağlı olarak büyük farklılıklar göstermektedir (46). 5000 yenidoğanın incelendiği bir çalışmada 103 bebekte konjenital anomali tespit edilmiş ve anomali saptanan bebeklerin 28 (%27)’inde kromozom anomalileri saptanmıştır. Anomali saptanan olguların 26’sında klinik olarak kolaylıla tanı konulan sayısal kromozom anomalileri tanımlanırken, 1 olguda dengeli yapısal kromozom anomalisi ve bir olguda delesyon saptanmıştır (47). Moleküler sitogenetik yöntemlerdeki ilerlemeler ve mikroarray yöntemlerin geliştirilmesi ile kromozomdaki submikroskobik değişimlerin saptanması olanaklı hale gelmiştir. Az sayıda hasta grubu ile yapılan ilk yayınlarda nedeni bilinmeyen MKA/MR olgularında array yöntemlerinin tanıya katkısı %10 ve %24 olarak bildirilmiştir (48,49). 2006 yılında yapılan çalışmada kromozom analizi normal saptanan 140 MKA/MR tanılı olguda yapılan array çalışmasında olguların %20’sinde çeşitli kromozom anomalileri gösterilmiştir (50). Yapılan diğer bir çalışmada ise klasik kromozomal ve FISH yöntemleri ile dengeli kromozom anomalisi tanısı konan 12 MKA/MR tanılı olgunun 3’ünde (%25) a-CGH incelemesi sonucu kriptik genomik dengesizlikler saptamışlardır (51). 2010 yılında yayınlanan konsensüs raporunda MKA/MR etiolojisi ile mikroarray yönteminin uygulandığı 21,698 hastayı içeren 33 yayın incelenmiş, mikroarray yöntemlerin tanıya katkısı %15-20 olarak bildirilmiş ve mikroarray yöntemlerin nedeni bilinmeyen MKA/MR olgularında ilk basamak tanı testi olması gerektiği savunulmuştur (43). Ülkemizden yayınlanan bir çalışmada ise MKA/MR endikasyonu ile a-CGH yapılan 971 olgu ve 301 ebeveyninin test sonuçları incelenmiş ve a- CGH bu olgu grubunda tanı koyma oranı %13.6 olarak bildirilmiştir (52). 329 MKA/MR olgunun incelendiği diğer bir çalışmada a-CGH tanıya katkısı %16 olarak saptanmış, hafif mental retardasyonu olan grupta tanıya katkısı %11,4 iken, orta ve ağır MR’si olanlarda bu oran sırası ile %15,3 ve %24,3 olarak bildirilmiştir (53).
Çalışmamızda incelenen hastaların multipl konjenital anomalilere ek olarak, 11’inde orta-ağır mental retardasyon, 7 olguda hafif MR mevcut idi, 2 olguda ise dikkat problemleri ve dismorfik bulgular nedeni ile a-CGH inceleme yapıldı. Çalışma sonucunda ikisinde hafif, ikisinde orta-ağır MR olan 4 olguda patojen kopya sayısı değişikliği saptanmış olup, a-CGH yönteminin grubumuzda tanı koyma oranı literatüre benzer şekilde %20 olarak hesaplanmıştır. Orta–ağır mental retardasyonu olan olgularda a-CGH tanı koyma oranı da literatür ile uyumlu olarak %18 saptanmıştır. Hafif mental retardasyonu olan olgularda ise bu
58 oran %28 saptanmıştır. Bu oranın literatür verilerine göre yüksek olmasında hasta seçim kriterlerinin ve hasta sayısının az olmasının etkisinin olabileceği düşünülmüştür.
Dikkat eksikliği ve hiperaktivite sendromu ailesel kalıtımın sık görüldüğü, ancak genom boyu bağlantı analizleri ile altta yatan genetik etiyolojinin net olarak açıklanamadığı bir hastalık grubudur. Çalışmalarda hastalık ile ilişkisi olabilecek çok sayıda nadir CNV varyantı tanımlanmıştır. Çalışma grubumuzda ise dikkat bozukluğu olan olgularda patojen kopya sayısı değişikliğine rastlanmamıştır (54).
Orta seviyede MR (DQ:49), mikrosefali, epilepsi, dismorfik bulguları (hipertelorizm, hafif antimongoloid aks, gaga burun, mikroretrognati, bilateral simian çizgisi, hipoplazik labia minör) olan ve kranial görüntülemede araknoid kist saptanan 1.5 yaşındaki 17. olgumuzun a-CGH analizinde 6q27 bölgesinde 168,619,459-170,906,796 baz çiftleri arasında 2.287 Mbʼlık bir delesyon saptanmıştır.
6q terminal delesyonu, nörogelişim geriliği, mental retardasyon, hipotoni, epilepsi, kardiyak anomaliler, retinal anomaliler, dismorfik bulgular (hipertelorizm, geniş burun kökü, işitme anomalileri, uzun filtrum, ince üst dudak) ve beyin/spinal kord malformasyonları ile karakterize (korpus kallozum agenezi (ACC), periventriküler nodüler heterotopi (PVNH), serebellar malformasyonlar, polimikrogiri) klinik heterojenitesi geniş bir yapısal kromozomal anomalisidir. Literatürde 6q terminal delesyonu saptanan hastalarda en sık görülen yapısal beyin malformasyonları korpus kallozum agenezi (KKA) (%62) ve hidrosefali (%27) olarak bildirilmiştir (55). Olgumuzun kranial görüntülemesinde mikrosefali ve araknoid kist saptanmıştır, hidrosefali veya KKA tespit edilmemiştir. Nöromotor retardasyon olguların %90’ında öğrenme güçlüğü %86’sında tanımlanmıştır. Epilepsi sıklığı ise %76 olarak bildirilmiştir. Olgumuzda literatürle uyumlu olarak mikrosefali, mental retardasyon, öğrenme problemleri, dismorfik bulgular ve epilepsi bulunmakta iken 6q terminal delesyonu olan hastalarda bildirilen retinal bulgular, işitme problemleri ve kalp anomalileri saptanmamıştır. 6q subtelomerik bölgesinde yer alan genlerin normal beyin gelişimde önemli rol oynadığı ve yapısal beyin anomalileri olan hastalarda yapılan çalışmalarda, hastaların bir kısmında ilişkili genlerin 6q bölgesine haritalandığı bildirilmiştir (55, 56). Revers genotipleme yaklaşımı ile 7 hastadan oluşan bir çalışmada, 6q27 bölgesinde THBS2, PHF10, DLL1genlerini içeren 1.7Mb boyutundaki bölge hastalıkla ilişkili kritik bölge olarak belirlenmiştir. Bu genler embriyogenez sırasında sinir sisteminin gelişiminde önemli rol oynamaktadır. DLL1 ve
59 THBS2 genleri evrimsel olarak oldukça korunmuş olan ve birçok organ sisteminin gelişiminde görev olan Notch-3 sinyal yolağının aktivasyonundan sorumludur.
Olgumuzun moleküler sitogenetik incelemesinde delesyon saptanan 6q27 bölgesindeprotein kodlayıci birҫok gen ve üҫ non-coding RNA geni (NCRNA00242, C6orf208, LOC154449) bulunmaktadır. Bu bölgelerdeki bazı önemli genlerin fonksiyonu Tablo 5-1ʼde anlatılmıştır.
Tablo 5-1: 6qterminal delesyonuyla ilşkili en önemli genler, fonksiyonları ve yol aҫtıkları hastalıklar(55, 57)
Sembol Cyto Fonksiyonu Klinik Özellikler Paraaksiyel mezodermde eksprese olur ve nöronal kök hücre proliferasyonunun düzenlenmesi ve Yapısal ve fonksiyonel DLL1 6q27 farklılaşmasından sorumludur. beyin anomalilerine yol aҫar. Organ sisteminin gelişiminde görev olan Notch-3 sinyal yolağının aktivasyonundan sorumludur. Trombospondin gen ailesine üye, kemik gelişimi, hücre adezyonu, ekstrasellüler matriks şekillenmesi, inflamasyon yanıtı ve gelişimsel ve Lomber Disk Hernisi
patojenik anjiogenezden sorumlu bir gendir.
Serebral korteks ve serebellumda yüksek oranda THBS2 6q27 eksprese edilmektedir. Organ sisteminin gelişiminde görev olan Notch-3 sinyal yolağının aktivasyonundan sorumludur. Embriyogenez ve yara iyileşmesi sırasında yüksek SMOC2 6q27 oranda eksprese olan SPARC ailesinin bir üyesini Dentin displazi tip 1ʼden kodlar. sorumludur. Kodladığı protein,multipotent nöral kök hücrelerin - PHF10 6q27 yenilenmesi ve nöronal farklılaşma iҫin gereklidir. İzole periventriküler C6orf70 nodüler heterotopi 6q27 Embriyonik gelişim sırasında nöronal göçte rol oynayabilir. (PVNH) Tip 6ʼden sorumludur.
Hafif mental retardasyon ve dismorfik bulguları olan 18. olgumuzun a-CGH analizinde 22q11.21 bölgesinde 2,711 Mb boyutunda bir delesyon saptanmıştır. Sonucun validasyonu DiGeorge FISH prob uygulaması ile yapılmıştır. 22q11.2 delesyonu, embriyogenez sırasında 22q11.2’de yaklaşık 3Mb’lık bir bölgenin kaybı sonucu ortaya çıkan bir mikrodelesyon sendromudur. Sıklığı 2000-4000 canlı doğumda birdir ve en yaygın delesyon sendromu olarak bilinmektedir. Digeorge Sendromu ve Velokardiyofasiyal Sendromu gibi geniş spektrumu olan bu hastalıkta, erken embriyo döneminde 3. ve 4. faringeal ceplerin ve nöral
60 krest hücrelerinin gelişim defekti sonucu, aortik ark ve dalları, kardiyak çıkış traktusu, timus, paratiroid ve damağın, farinksin ve yüzün bazı bölümlerini içeren farengeal ark sistemi doku ve organlarının oluşumunda problemler oluşur (58). Bu nedenle hastalarda dismorfik yüz bulguları (hipertelorizm, upslanting palpepral fissür, geniş burun kökü, bülböz burun, kısa filtrum, mikrognati), konjenital kalp hastalıkları (Fallot tetralojisi, ventriküler septal defekt, interrupted aort arkı, trunkus arteriosus, vasküler ring) (74%), endokrinolojik hastalıklar, immün yetmezliği (77%), nöropsikiyatrik problemler (şizofreni, otizm), damak anomalileri (69%), öğrenme güҫlüğü (70%-90%), göz anomalileri, iskeletal bulguları (skolyoz, hemivertebra, polidaktili, kraniosinostoz), renal anomaliler (31%),işitme ve beslenme problemleri ile gözlenir (58,59). 22q11.2 delesyonu olan çocukların %20'sinde otizm, erişkinlerin ise %25’inde psikiyatrik problemlerin eşlik ettiği bildirilmiştir (59). 22q11.2 delesyon sendromlu hastaların tanı yaşları geniş klinik spektrum ile uyumlu olarak literatürde oldukça değişken olarak bildirilmiştir. İntrauterin dönemde tanı alan hastalar olduğu gibi, erişkin dönemde tanı alan olgular da bildirilmiştir. Özellikle kardiyoloji merkezlerinde yapılan çalışmalarda hastaların ağır klinik tablolarından dolayı erken tanı yaşları, nöroloji/psikiyatri kliniklerinde ise geç tanı yaşları bildirilmektedir. Her yaş grubunda kalp hastalıklarının 22q11.2 delesyon sendromu tanısını koyduran en önemli ipucu olduğunu belirtmiştir. Nöropsikiyatrik bulgular 22q11.2 delesyon sendromunun önemli komponentlerindendir. Erken motor gelişim basamaklarında gecikme ve kaba motor becerilerde zayıflık vardır. Ortalama IQ, normal ile orta derecede gerilik arasında değişmekle beraber yaklaşık olarak 70 seviyesindedir (58).
Olgumuzda hafif MR (IQ:64), dismorfik yüz bulguları (uzun yüz, kısa filltrum, yüksek damak) ve iskelet bulguları (skolyoz, femur başı düzensizliği, dar toraks, araknodaktili) mevcut iken immun sistem bozukluğu ve kardiak anomali bulunmamaktadır.
22q11.2 delesyon sendromu olgularının %90’ında 30 gen içeren 3 Mb büyüklüğünde deleyon saptanmaktadır (59). Bu bölgede yer alan 22q11.2 delesyonundan sorumlu olduğu bildirilen TBX1,COMT, PRODH, Gnb1L, GGCR2, DGCR6, EES2, DGCR8, ZNF74 genleridir (58). Bu bölgelerdeki bazı önemli genlerin fonksiyonu Tablo 5-2ʼde anlatılmıştır.
61 Tablo 5-2: 22q11.2 delesyonuyla ilşkili en önemli genler, fonksiyonları ve yol aҫtıkları hastalıklar(57, 61, 62)
Sembol Cyto Fonksiyonu Klinik Özellikler Traskripsiyon faktörü olarak gelişim sürecin Kraniofasiyel, kalp, timüs paratiroid TBX1 22q11.21 regulasyonunda rol alır. ve damak anomalilerine yol aҫar. Katekol-O-metiltransferaz enzimi, dopamin, epinefrin ve norepinefrin nörotransmitlerini de Nöropsikiatrik davranış COMT 22q11.21 içeren katekolaminlere S-adenozilmetiyoninden bozuklukları, şizofreni, obsesif metil grubu transferini gerçekleştiren enzim kompulsif bozukluklardan sorumludur. Prolini 1-pirolin-5-karboksilata dönüştüren ve Nöropsikiatrik bozuklular, şizofreni, PRODH 22q11.21 mitokondriyal enzimi olanprolin dehidrogenazı hiperprolinemia tipe Iʼe yol aҫar. kodlar Glikoprotein (GP) Ib-beta polipeptid subünitesini kodlar Trombosit bozukluklarından GP1BB 22q11.21 sorumludur.
MKA/MR tanısı ile başvuran 7 aylık 19. olgumuzun a-CGH analizinde Xq27.3q28 bölgesinde 10.73 Mb büyüklüğünde bir duplikasyon ve Xp22.33 bölgesinde 1.66 Mb büyüklüğünde bir delesyon saptanmıştır. Kromozom anomalisinin kökenini araştırmak amacı ile yapılan prental kromozom analizinde annede X kromozomunda perisentrik bir inversiyon tespit edilmiştir. Bu sonuç, X kromozomuna özgu arm spesifik probla yapılan FISH incelemesi ile de doğrulanmıştır. Bu sonuçlar çocuktaki Xp22.33 delesyonu ve Xq27.3-q28 duplikasyonunun annedeki perisentrik inversiyonun dengesiz bir ürünü olarak oluştuğunu göstermektedir.
X’de bağlı MR (XLMR) erkekler görülme sıklığı 1/1000 olarak bildirilmiştir. Xq27.3- qter bölgesinde 246 gen bulunmaktadır. Bu genler arasında (FMR1, IDS, ABCD1, L1CAM, MECP2, FLNA, IKBKG, DKC, FMR2, GDI1, SLC6A8, MECP2) genleri içermektedir ve XLMR sendromik ve non-sendromik formlarından sorumlu olduğu gösterilmiştir (63) (Tablo 5-3).
62 Tablo 5-3: Xq27.3q28 duplikasyonu ile ilşkili en önemli genler, fonksiyonları ve yol aҫtıkları hastalıklar
Sembol Cyto Fonksiyonu Klinik Özellikler *Fonksiyon kaybı: progresif nörolojik Metil CpG bağlayıcı proteinini bozulmanın görüldüğü Rett sendromu kodlayan dozaja duyarlı, DNAdaki fenotipinden sorumludur. metillenmiş CpG dizilerine bağlanarak, *Fonksiyon kazanımı: ağır MR, ağır konuşma kromatinin yoğunlaşmasına ve bozukluğu,korpus kallozum agenezisi, otistik MECP2 Xq28 ekspresyonu sessizleştiren bulgular, anksiyete, hafif dismorfik bulgular komplekslerin bölgeye girmesine yol (brakisefali, midfasyal hipoplazi, belirgin açar. kulaklar ve düzburun kemeri),epilepsi, hipotoni,özellikle alt ekstremitelerde motor gelişim geriliği, yürüme problemleri, tekrarlayan akciğer enfeksiyonlarına yol aҫar. Nöronal hücre migrasyonu, akson demetleri, sinaptogenez, miyelinasyon, Korpus kallozum, hidrosefali, CRASH L1CAM Xq28 nöronal hücre korunması gibi Sendromu, MASA Sendrom, ve MRʼye yol aҫar.
nörodejeneratif aktivitelerinde yer alır. *FMR1’in haypoyetersizliği: Frajil X MR sendromu, Fragil X tremor ataksi sendromuna, prematür overyan yetmezliğine (POF) yol aҫar. FMR1 Xq27.3 Fragile X MR proteinini kodlar. *FMR1 duplikasyonu: X’bağlı MR sendromu duplikasyonunun karakteristik özellikleri boy kısalığı, hipogonadizm ve dismorfik yüz bulgularıdır. 6-25 GCC tekrar sayısı (>200), AFF2 Xq28 transkripsiyonal aktivatörü veya Non-sendromik XL-mental retardasyon splicing faktörü Hmgb3'ün zorla ekspresyonu B-hücresi ve miyeloid farklılaşmasını inhibe Sendromik mikroftalmi HMGB3 Xq28 eder.
klorür kanal 2 proteini kodlar. Bu Fonksiyon kazanımı: X’e bağlı MR, konjenital CLIC2 Xq28 protein riyanodin reseptörünün kalp yetmezliği (atriyal fibrilasyon, düzenlenmesinde rol oynar. kardiyomegali), nöbetler Ras-related protein Rab-39B proteinini kodlar. Bu protein membrane arasında Erkek hastalarda, fonksiyon kazanımı: RAB39B Xq28 vasküler trafiğin düzenlenmesinde nörogelişimsel bozukluklar( hafif MR, davranış küçük bir GTPaz olarak bulunur. problemler) Filamin-A protein, aktin filamentlerini Fonksiyon kazanımı: periventriküler nodüler membran glikoproteinlerine bağlayan heterotopi (PNH), konvülsiyon, Kardiyovasküler aktin bağlayıcı proteindir.Kan bulgular,konjenital stabismus, kısa parmaklar, FLNA Xq28 damarları, kalp ve beyin organlarının öğrenme güҫlüğü (FLNA-Related Periventricular gelişimi sırasında hücreler arasında Nodular Heterotopia - GeneReviews ) temas sağar.
63 Son zamanda a-CGH kullanılması ile yapılan çalışmalarda Xq28 bölgesinde interstisyel duplikasyonlar tespit edilmiştir. Bu duplikasyonların büyüklüğü değiştir, ancak, bizim hastamızda da olduğu gibi sürekli olarak MECP2, L1CAM ve aralarındaki genleri iҫermektedir.
Olgumuzun a-CGH analizinde Xp22.3 bölgesinde ise 1.66 Mb büyüklüğünde mikrodelesyon saptanmıştır. Terminal Xp delesyonların klinik özellikleri olarak boy kısalığı, MR, İktiyozis, Kallmann sendromu, iskelet displazisi, kondrodisplazi punktata ve hipogonadizm olarak bilinmektedir. Bu kromozomal bölge (SHOX, CSF2RA ve ARSE) genleri içermektedir (64). Bu bölgelerdeki bazı önemli genlerin fonksiyonu Tablo 5-4ʼde anlatılmıştır.
Tablo 5-4: Xp22.33 delesyonuyla ilşkili en önemli genler, fonksiyonları ve yol aҫtıkları hastalıklar
Sembol Cyto Fonksiyonu Klinik Özellikler Homeobox gen ailesinin bir parçası olarak Fonksiyon kaybı: embriyogenezde özellikle alt ve üst ekstremite Langer mezomelik displazi, Xp22.33 SHOX kemiklerinin büyümesinde rol alır. Leri-Weill diskondrosteozisi
ve idiopatik ailesel boy kısalığı
CSF2RA Xp22.33 koloni stimüle edici faktör 2 reseptör-a’yı kodlar. Pulmoner alveolar proteinozi
Ayrıca Xp22.33 delesyona uğrayan literatürdekihastalarda pre/postnatal boy kısalığı, mikrosefali, erken frontal kapanması, ağır MR, belirgin konuşma geriliği, ilerleyici nörolojik sorunlar (spastisite ve nöbetler) yürüme bozukluğu veya hiç yürüyememe, hipotoni, hafif ve spesifik olmayan dismorfik bulgular (ince düz kaşklar, kısa/uzun filtrum, küçük ağız, belirgin veya küçük burun), parmak anomalileri, genitalia hipoplazisi veya kriptorşizm ve şiddetli tekrarlayan solunum yolu enfeksiyonu tanımlanmıştır. Bizim hastada da literatürde uyumlu olarak, dismorfik yüz bulgular, mikrosefali, hipotoni, ağır nöromotor retardasyon, boy kısalığı, bilateral kriptorşizm, parmak anomalilerden brakidaktili, erken frontal kapanması ve sık sık solunum yolu enfeksiyonu geçirme bulguları mevcuttur (63, 64).
Hafif MR, dismorfik bulgular, hafif aort yetmezliği olan 20. olgumuzda 16p11.2 bölgesinde 533.9 Kb’lık bir delesyon saptanmıştır. Bu bölgede toplam 35 gen tanımlanmıştır. 16p11.2 mikrodelesyon sendromu ilk kez 2008 yılında otizm spektrumunda bozukluğu olan olgularda tanımlanmıştır. Bunun öncesinde 2007 yılında Asperger sendromu tanısı alan bir olguda ve hafif MR, epilepsi ve aort kapak anomalileri olan 2 monozigotik ikizde 16p11.2
64 mikrodelesyonu de novo kopya sayısı varyantı olarak bildirilmiştir. Hastalığın sıklığının 3/10000 olduğu düşünülmektedir. Hastalık gelişim basamaklarında gerilik ve MR ile karakterizdir. Ortalama IQ:82.7 olarak bildirilmiştir. Olguların %70’inde konuşma ve dil gelişimi ile ilgili problemler gözlenmektedir. İfade edici dil özellikleri alıcı dile oranla daha çok etkilenmiştir ve sıklıkla artikülasyon problemleri görülür. Makrosefali sıklıkla gözlenir ve 2 yaşta belirginleşir. %20 hastada epilepsi görülebilmektedir. Kranial incelemede araknoid kist, ekstra aksiyel BOS mesafesinde ve ventriküllerde genişleme, mega sisterna magna ve kavernöz malformasyonları ve Chairi 1 malformasyonu, serebellar tonsillar ektopi, platibazi tanımlanmıştır. Hastalarda minör kardiyak anomaliler, vertebra anomalileri ve obezite gelişme riski normal populasyona göre artmıştır. İşitme kaybı olguların %11’inde gözlenebilmektedir. Düşük kulak, parsiyel sindaktili gibi minor anomaliler bazı bireylerde görülebilir. Aynı ailenin etkilenmiş bireylerinde farklı klinik tablolar görülebileceği gibi, delesyona ragmen klinik olarak etkilenmemiş bireyler bildirilmiştir. Hafif aort yetmezliği, konuşma bozukluğu, hipermetropi, hafif PEV, hafif işitme kaybı bulguları olan olan olgumzun bulguları literatür ile uyumlu bulunmuştur (65,66). Bu bölgelerdeki bazı önemli genlerin fonksiyonu Tablo 5-5ʼde anlatılmıştır.
Tablo 5-5: 16p11.2 mikrodelesyon ile ilşkili en önemli genler, fonksiyonları ve yol aҫtıkları hastalıklar
Sembol Cyto Fonksiyonu Klinik Özellikler Heterozigot fonksiyon kaybı: Sineptosomal protein 25kDa(SNAP25) üzerinden paroksismal kinesigenik
fonksiyon gösterdiği düşünülmektedir. SNAP25 diskinezi, benign ailesel PRRT2 16p11.2 presinaptik membrana bağlı bir proteindir ve infantil epilepsi, koreatetozis sinaptik veziküllerden nörotransmitter salınımında sendromu, infantile konvülyon görevlidir. sendromu
T-box geni traskripsiyon faktörü olarak gelişim Fonksiyon kaybı: TBX6 16p11.2 sürecin regulasyonunda rol alır. vertebra problemleri ve konjenital skolyozdan Bu gen tarafından kodlanan protein kinesin benzeri protein ailesinin üyesidir. Kinestin ailesi, Eklem hipermobilitesi ile KIF22 16p11.2 hücrelerde organel transferi yapan, hücre spondilometafizyel displazi
bölünmesi sırasında kromozomları tip 2 hareketlendiren mikrotübüle bağımlı motorlardır.
65 Bu çalısmada MKA/MR tanısı alan hastalarda a-CGH tekniği ile olguların %20’sinde allta yatan kromozom anomalisi saptanabilmiştir. Kullanılan FISH ve MLPA yöntemlerinin aksine a-CHG, tek bir çalışmada tüm genom analizine olanak sağlaması ve yüksek rezolüsyona sahip olarak DNA üzerindeki kilobaz düzeyindeki değişiklikleri bile saptayabilmesi aҫısından MKA/MR genetik etiyolojisinin tanısında uygun bir yöntem olduğu bu çalışma ile gösterilmiştir.
MKA/MR etiyolojik olarak geniş heterojeniteye sahip nörogelişimsel bir bozukluktur. Bu grup hastalıkların yarısından fazlasının nedeni tam bilinmemektedir. MKA/MR ile doğrudan ilişkilendirilmemiş birçok genin fonksiyonlarının aydınlatılması amacı ile etki mekanizmalarına dair çalışmaların arttırılması gerekmektedir. Bu nedenle, ҫalışmaya katılan hastalarda altta yatan genetik nedenin gösterilemediği grupta yeni nesil dizileme teknolojileri ile MKA/MR ile ilişkilendirilmiş genler arası ilişkili bölgelerin incelenmesi önerilmektedir. Ayrıca, klinikle ilişkilendirilebilen CNV'lerde de novo/ailevi ayırımı yapmak iҫin anne-baba örneklerinde de a-CGH analizi yapılması gerekmektedir.
MKA/MR’nin neden olduğu ciddi ve ömür boyu süren özel gereksinimler, etkilenmiş kişilerin aileleri ve toplum üzerinde ağır yük oluşturmaktadır. Etiyolojinin aydınlatılması, hastalıarın tekrar tekrar tetkik edilmesi ile emek, zaman ve maddi kaynak harcanmasını önler, tedavi seçeneklerinin belirlenmesini ve olası seyrin öngörülmesini sağlar, hastalığın tekrarlamasının önlenmesini ve prenatal tanı verilmesini olanaklı kılar.
66 KAYNAKLAR
1. Bartnik, M., Nowakowska, B., Derwińska, K. ve ark. (2014). Application of array comparative genomic hybridization in 256 patients with developmental delay or intellectual disability. Journal of Applied Genetics, 55: 125–144.
2. Pallab K. Maulik, P.K., Mascarenhas, M.N., Colin D. Mathers, C.D. ve ark (2011). Prevalence of intellectual disability: A meta-analysis of population-based studies, Research in Developmental Disabilities. 32: 419–436.
3. Agatino Battaglia, A., Doccini V., Bernardini, L. ve ark. (2013). Confirmation of chromosomal microarray as a firsttier clinical diagnostic test for individuals with developmental delay, intellectual disability, autism spectrum disorders and dysmorphic features. European journal of peadiatric neurology, 17: 589-599.
4. Celep, F., Sönmez, F.M., Karagüzel, A. (2006). Chromosomal abnormalities in 457 Turkish patients with MCA/MR. The Turkish Journal of Pediatrics, 48(2):130-4.
5. Erҫal, D. (2011). Mental Retardasyona Genetik Yaklaşım. Türkiye Klinikleri J Pediatr, 7(2):26-32.
6. Vries, B.B.A., White, S.M., Knight, S.J.L., ve ark. (2001). Clinical studies on submicroscopic subtelomeric rearrangement: a checklist. Journal of Medical Genetics , 38:145–150.
7. D’Arrigo, S., Gavazzi, F., Alfei, E. ve ark. (2016). The Diagnostic Yield of Array Comparative Genomic Hybridization Is High Regardless of Severity of Intellectual Disability/ Developmental Delay in Children. Journal of Child Neurology, 31(6): 691-699.
8. Christopher L. Heffner. (2014). Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition (DSM-IV). s: 40-42.
9. Patel, D.R., Greydanus, D.E., Callers Jr, J.L., Pratt, H.D. (2010). Developmental Disabilities Across the Lifespan. Disease-a-month - Journal, 56: 305-397.
10. Shafali Spurling Jeste. (2015). Neurodevelopmental Behavioral and Cognitive Disorders. American Academy of Neurology, 21(3): 690–714.
11. Shevell, M., Ashwal, S., Donley, D. ve ark. (2003). Practice parameter: Evaluation of the child with global developmental delay. American Academy of Neurology. 60: 367–380.
12. Vries, B.B.A., Pfundt, R., Leisink, M. ve ark. (2005). Diagnostic Genome Profiling in Mental Retardation. American Journal of Human Genetics, 77: 606–616.
13. Lina Basel-Vanagaite. (2008). Clinical Approaches to Genetic Mental Retardation. The Israel Medical Association Journal (IMAJ),10: 821–826.
67 14. Lisa G. Shaffer. (2005). American College of Medical Genetics guideline on the cytogenetic evaluation of the individual with developmental delay or mental retardation. Genetics IN Medicine, 7: 9.
15. HASANOĞLU, E., DÜŞÜNSEL, R., BİDECİ, A. (2010). Temel pediatri kitabı. s: 245-247.
16. Çoğulu, Ö., Karaca, E., Özkınay, F. (2006). Mental Retardasyon ve Kromozomlarda Subtelomerik Bölge. Bakırköy Tıp Dergisi,2: 73-81.
17. Shea SE. (2012). Intellectual disability (mental retardation). Journal of Pediatrics Review, 33: 110-121;quiz 120-111.
18. Nussbaum, R., McInnes, R., Willard, H. (2007). Thompson genetics in medicine. 7th. Elsevier Health Sciences, Philadelphia: Saunders.
19. Muller RF, Young ID. (2001). Chromosome disorders. In: MullerRF, Young ID, editors. Emery’s elements of medicalgenetics. Edinburgh: Churchill Livingstone. p. 249-266.
20. Derakhshan, S., Shakeri, M. (2016). Cytogenetic findings in patients with intellectual disability and/or multiple congenital anomalies. Journal of Analytical Research in Clinical Medicine, 4(2), 97-103.
21. Gardner RJM, S. R. , Shaffer LG (2012). Chromosome Abnormalities and Genetic Counseling, 4th. Oxford University Press. UK. p. 162.
22. Anja Weise, A., Mrasek, K., Klein, E. (2013). Microdeletion and Microduplication Syndromes. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60(5): 346-358.
23. Carvill, G.L., Mefford, H.C. (2013). Microdeletion syndromes. Current Opinion in Genetics & Development, 23: 232–239.
24. NCBI- dbSNP Short Genomic Variation.
25. Samuels, M.E., Friedman, J.M. (2015). Review Genetic Mosaics and the Germ Line Lineage. Genes journal, 6: 216-237.
26. Stevenson RE, Charles E, Schwartz R, Rogers RC. (2012). Atlas of X-Linked Intellectual Disability Syndromes, Oxford University Press, New York ,p. Xi.
27. Rauch, A. , Wieczorek, d. , Grafark, E. ve ark. (2012). Range of genetic mutations associated with severenon-syndromic sporadic intellectual disability: an exomesequencing study. Lancet journal, 380, 1674–82.
28. Afroze, B. , Chaudhry, B. (2013). Genetics of Non-Syndromic Autosomal Recessive Mental Retardation. Journal of Pakistan Medical Association, 63, 106-10.
68 29. Hans Hilger Ropers. (2010). Genetics of Early Onset Cognitive Impairment. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 11, 161-187.
30. Piton, A., Redin, C., Mandel, L.L. (2013). XLID-Causing Mutationa and Associated Genes Challenged in Light of Data From Large-Scale Human Exome Sequencing. The American Journal of Human Genetics, 93: 368–383.
31. McGowan-Jordan, J., Simons, A., Schmid, M. (2016). An International System for Human Cytogenomic Nomenclature. An International System for Human Cytogenomic Nomenclature. 149, 1-2.
32. Hastings, R., Howell, R., Dagna Bricarelli, F.D. ve ark. (2012). A common European framework for quality assessment for constitutional, acquired and molecular cytogenetic investigations. E.C.A. Permanent Working Group for Cytogenetics and Society. ECA - European Cytogeneticists Association. No. 30.
33. Jorge J. Yunis, J.J. (1976). High Resolution of Human Chromosomes. Science new series journal, 191: 4233, pp. 1268-1270.
34. Ravnan, J.B., Tepperberg, J.H., Papenhausen, P. (2006). Subtelomere FISH analysis of 11 688 cases: an evaluation of the frequency and pattern of subtelomer rearrangements in individuals with developmental disabilitie. Journal of Medical Genetics, 43: 478–489.
35. Joyce, C.A., Dennis, N.R., Cooper, S. ve ark. (2001). Subtelomeric rearrangements: results from a study of selected and unselected probands wit idiopathic mental retardation and control individuals by using high-resolution G-banding and FISH. Journal of Human Genetics, 109: 440–451.
36. Nacheva, E.P., Grace, C.D., Bittner, M. (1998). Comparative Genomic Hybridization: A Comparison with Molecular and Cytogenetic Analysis. Cancer Genetics and Cytogenetics journal, 100: 93-105.
37. Jacobsen, A., Arnold, N., Weimer, J. ve ark. (2000). Comparison of comparative genomic hybridization and interphase fluorescence in situ hybridization in ovarian carcinomas: possibilities and limitations of both techniques. Cancer Genetics and Cytogenetics journal, 122:7–12.
38. Lu X, Shaw CA, Patel A, Li J, Cooper ML, et al (2007) Clinical Implementation of Chromosomal Microarray Analysis: Summary of 2513 Postnatal Cases. PLOS ONE journal, 2(3): e327.
39. Pinkel, D., Albertson, D.G. (2005). Array comparative genomic hybridization and its application in cancer. Nature Genetic, doi:10,1038/ng1569.
40. Lee, Ch., Scherer, S.W. (2010). The clinical context of copy number variation in the human genome. Expert reviews in molecular medicine,12: e8.
69 41. Şahin, M.S., Ipekçi, A.M. (2013). CNV (Kopya Sayısı Farklılıkları)’lerin Kanser Etyolojisindeki Rolleri.
42. Lisenka, E.L.M., Bert, B.A., Joris, A. (2010). Genomic microarrays in mental retardation: from copy number variation to gene, from research to diagnosis. Journal of Medical Genetics, 47: 289-297.
43. Miller, D.T., Adam, M.P., Aradhya S. ve ark. (2010). Consensus Statement: Chromosomal Microarray Is a First-Tier Clinical Diagnostic Test for Individuals with Developmental Disabilities or Congenital Anomalies. The American Journal of Human Genetics, 86: 749– 764.
44. LaFramboise, Th. (2009). Single nucleotide polymorphism arrays: a decade of biological, computational and technological advances. Nucleic Acids Research, 37(13): 4181–4193.
45. Ganal, M.W., Durstewitz, G., Polley, a. ve ark. (2011). A Large Maize (Zea mays L.) SNP Genotyping Array: Development and Germplasm Genotyping, and Genetic Mapping to Compare with the B73 Reference Genome. PLOS ONE journal, 6(12): e28334.
46. Winter, R., Schinzel, A., Ravenswaaij-Arts. (2003). Telomeres: a diagnosis at the end of the chromosomes. Journal of Medical Genetics, 40:385–398.
47. Mohammed, Y.A., Shawky, R.M., Soliman, A.S., Ahmed, M. (2011). Chromosomal study in newborn infants with congenital anomalies in Assiut University hospital: Cross-sectional study. The Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 12: 79–90.
48. Lisenka, E. L. M., Bert, B. A., Osoegawa, K. (2003). Array-Based Comparative Genomic Hybridization for the Genomewide Detection of Submicroscopic Chromosomal Abnormalities. American Journal of Human Genetics,73:1261–1270.
49. Shaw-Smith, C., Redon, R., Rickman, L. ve ark. (2004). Microarray based comparative genomic hybridization (array-CGH) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features. Journal of Medical Genetics, 41:241–248.
50. Menten, B., Maas, N., Thienpont, B. ve ark. (2006). Emerging patterns of cryptic chromosomal imbalance in patients with idiopathic mental retardation and multiple congenital anomalies: a new series of 140 patients and review of published reports. Journal of Medical Genetics, 43: 625–633.
51. Sismani, C., Kitsiou-Tzeli, S., Ioannides, M. ve ark. (2008). Cryptic genomic imbalances in patients with de novo or familial apparently balanced translocations and abnormal phenotype. Molecular Cytogenetics, 1:15.
52. Ozyilmaz, B., Kirbiyik, O., Koc, A. ve ark. (2017). Experiences in microarray-based evaluation of developmental disabilities and congenital anomalies. Clinical Genetics, 92: 372–379.
70 53. D’Arrigo, S., Gavazzi, F., Alfei, E. ve ark. (2016). The Diagnostic Yield of Array Comparative Genomic Hybridization Is High Regardless of Severity of Intellectual Disability/ Developmental Delay in Children. Journal of Child Neurology, 31(6): 691-699.
54. Williams, N.M., Zaharieva, I., Martin, A. ve ark. (2010). Rare chromosomal deletions and duplications in attention-defi cit hyperactivity disorder: a genome-wide analysis. Lancet journal, 376: 1401–08.
55. Peddibhotla, S., Nagamani, S.CS., Erez, A. ve ark. (2015). Delineation of candidate genes responsible for structural brain abnormalities in patients with terminal deletions of chromosome 6q27. European Journal of Human Genetics,23: 54–60.
56. Stevenson, David A.; Brothman, Arthur R.; Carey, John C. ve ark. (2004). subtelomeric deletion: is there a recognizable syndrome?. Clinical Dysmorphology, 13(2): 103-106.
57. https://www.omim.org/entry/607223?search=SMOC2&highlight=smoc2.
58. Göktürk, B., Gökdemir, M., Reisli, I., Yıldırım, M.S. (2016). Otozomal dominat geçişin görüldüğü ailesel 22q11.2 delesyon sendromu. Cukurova Medical Journal, 41(2):379-385.
59. 22q11.2 Deletion Syndrome - GeneReviews® - NCBI Bookshelf.
60. Haskoloğlu, Z.S., İkincioğulları, A. (2014). Kromozom 22q11.2 Delesyon Sendromu (Digeorge Sendromu/Velokardiyofasiyal Sendrom). Turkish Journal of Immunology, 2(3): 57-66.
61. https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=COMT.
62. Prasad, S.E., Howley, S.,Murphy, K.C. (2008). CANDIDATE GENES AND THE BEHAVIORALPHENOTYPE IN 22Q11.2 DELETION SYNDROME. DEVELOPMENTAL DISABILITIES. Developmental Disabilities Research Reviews,14: 26 – 34.
63. Sanlaville, D., Schluth-Bolard, C., Turleau, C. (2009). Distal Xq duplication and functional Xq disomy. Orphanet Journal of Rare Diseases, 4:4.
64. Chih-Ping Chen, Chen-Yu Chen, Schu-Rern Chern. ve ark. (2016). Molecular cytogenetic characterization of Xp22.32/pter deletion and Xq26.3/qter duplication in a male fetus associated with 46,Y,rec(X) dup(Xq) inv(X)(p22.3q26.3), a hypoplastic left heart, short stature, and maternal X chromosome pericentric inversion. Taiwanese Journal of Obstetrics & Gynecology, 55: 705-711.
65. Miller, D.T., Chung, W, Nasir,R. ve ark. (2015). 16p11.2 Recurrent Microdeletion. GeneReviews Advanced Search.
66. Bijlsma, E.K., Gijsbers, A.C.J., Schuurs-Hoeijmakers, J.H.M. ve ark. (2009). Extending the phenotype of recurrent rearrangements of 16p11.2: Deletions in mentally retarded patients without autism and in normal individuals. European Journal of Medical Genetics, 52: 77–87.
71 FORMLAR
1. Yapılması planlanan genetik analizler için sizden 10 ml kan örneği alınacaktır. 2. Alınan kan örneğinden DNA’nız elde edilerek +4C ve -20C’de saklanacaktır. Örneğiniz kişi ismi kullanılmadan numara verilerek saklanacak ve bilgisayarda şifreli bir şekilde korunacaktır. 3. Zeka geriliği ve birden fazla doğumsal bozukluğa neden olduğu düşünülen genlerde araştırma yapılacaktır. 4. Araştırma kapsamında yapılan çalışmaların süresi kesin değildir ve sonucunda tedaviye yönelik bir cevap elde edilmeyebilir. 5. Araştırma sonucunda genetik test sonuçlarının sizi ve ailenizi ruhsal veya diğer bir yönden etkileyeceğini düşünmeniz durumunda isteğiniz üzere ayrılabilirsiniz. 6. Gönüllü olarak katılacağınız bu araştırma kapsamında sizden herhangi bir maddi katkı talebi olmayacaktır.
72