ii

iii

Aos meus queridos pais, que são a

minha fortaleza e que sempre me incentivaram

ao longo da minha vida, com todo amor, dedico.

iv AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa

concedida.

À minha orientadora Dra. Márcia Regina Braga pelo incentivo e dedicada orientação,

paciência, confiança e amizade conquistada ao longo dos anos de trabalho em conjunto.

À Dra. Rosemeire Aparecida Bom Pessoni pela co-orientação e auxílio dado durante o

exame de qualificação ao doutorado, por todo incentivo e atenção, por me ouvir sempre

em todos os momentos mais difíceis.

Ao Dr. Jorge M. Vivanco do Centro para Biologia da Rizosfera da Universidade Estadual

do Colorado, Estados Unidos, pela co-orientação.

Ao Dr. Frank Stermitz do Departamento de Química da Universidade Estadual do

Colorado, Estados Unidos, pela colaboração e ensinamentos profissionais.

À Dra. Jiang Du pela elucidação estrutural das substâncias isoladas neste trabalho e por

todo auxílio dado no laboratório de química da Universidade Estadual do Colorado,

Estados Unidos.

Ao Dr. Martin Wanner do Instituto van’t Hoff de Ciências Moleculares da Universidade

de Amsterdam, pelo envio de uma amostra de sesbanimida.

Ao Dr. José Alberto Cavalheiro e à Dra. Luciana de Ávila Santos da Universidade

Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho de Araraquara, pela colaboração nas análises da

sesbanimida.

À Dra. Elaine Cardoso Lopes pela colaboração e amizade.

Ao Dr. Massuo Jorge Kato do Instituto de Química da USP.

v
Ao Dr. Cláudio José Barbedo da Seção de Sementes do Instituo de Botânica pelo auxílio

nas análises estatísticas e pela atenção.

À Amanda Souza pela amizade e ajuda nas análises do GC-MS e pelo download de

muitos e muitos PDFs.

À Amanda Pereira pela amizade, pelo download de PDFs e por me acompanhar na busca

das sementes de jatobá no Instituto Florestal de São Paulo.

Ao Dr. Marco Aurélio Tiné pelas dicas no laboratório, pela paciência em responder

minhas dúvidas, e claro pela amizade durante anos de laboratório.

À Dra. Marília Gaspar pela amizade e ajuda durante o exame de qualificação.

À Dra. Luce Brandão e à Dra. Cláudia Young pela ajuda “fitoquímica” e amizade.

À querida amiga Amanda Asega por toda amizade e apoio dados em todos os instantes.

À amizade da querida Patrícia Pinho Tonini, companheira nesta jornada desde 2004,

agradeço por todos os momentos em conjunto, desde os profissionais, como as coletas de

sesbania e as disciplinas, até os momentos de descontração os quais tornaram a minha

vida muito mais leve durante esse período.

Aos queridíssimos amigos Aline Cavalari, Cláudia Alves, Clóvis Oliveira (C2), Clóvis

Silva (C1), Fernanda Kretzschmar, Fernanda Macedo, Juliana Iura, Ludmila Raggi,

Vanessa Oliveira, Tatiana Botelho, Rodrigo Caccere, Simone Leduc, Marlise Strabeli e

Paola Mitie Garcia.

Aos amigos Elie Kassis, Nayra Quintana, Jiang Du e Ommer Falik que foram

praticamente a minha família durante a minha estadia em Fort Collins.

À minha querida irmã Silvania Simões e à minha amada sobrinha Gabriela.

Às funcionárias de apoio da seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas Ana Alice, Cida,

Helena e Mary Monteiro.

vi
À querida Liliam Panagio, secretária do programa de pós-graduação em Biologia Celular

e Estrutural da Unicamp, pelo organizado apoio dado às questões burocráticas do curso e

pela paciência e amizade.

À todos da Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas e ao Instituto de Botânica de

São Paulo.

À Universidade Estadual do Colorado, Fort Collins, EUA.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia

da Universidade Estadual de Campinas.

vii ÍNDICE

ABREVIATURAS e SÍMBOLOS...... xiii

RESUMO...... xvi

ABSTRACT...... xviii

1 Introdução geral e objetivos ...... 1

1.1 INTRODUÇÃO...... 2

1.2 OBJETIVOS...... 16

1.3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 17

2 Dinâmica da liberação, caracterização química e atividade biológica de substâncias exsudadas por sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers ...... 25

RESUMO...... 26

ABSTRACT...... 28

2.1 INTRODUÇÃO...... 30

2.2 MATERIAL E MÉTODOS...... 33

2.2.1 Material Biológico...... 33

2.2.2 Germinação das sementes de S. virgata ...... 33

2.2.3 Obtenção dos exsudatos das sementes...... 34

2.2.4 Quantificação de proteínas e açúcares exsudados...... 34

2.2.5 Análise da composição de açúcares por HPAEC/PAD...... 35

2.2.6 Bioensaios de fitotoxicidade em alface e tomate dos exsudatos liberados durante o processo germinativo...... 36

2.2.7 Isolamento e identificação dos compostos ativos...... 38

viii 2.2.8 Quantificação de compostos ativos nos tecidos e nos exsudatos das sementes durante o processo germinativo ...... 44

2.2.9 Bioensaios de atividade fitotóxica com plântulas de A. thaliana ...... 44

2.2.10 Bioensaios de atividade fitotóxica com plântulas de O. sativa ...... 46

2.2.11 Detecção de substâncias antifúngicas ...... 47

2.2.12 Obtenção e ensaios de atividade biológica de oligossacarídeos de galactomanano...... 48

2.2.13 Análise estatística...... 51

2.3 RESULTADOS ...... 52

2.3.1 Açúcares e proteínas exsudados por sementes de S. virgata ...... 52

2.3.2 Fitotoxicidade dos exsudatos em sementes de alface e tomate...... 55

2.3.3 Identificação das substâncias fitotóxicas dos exsudatos e extratos das sementes...... 60

2.3.4 Atividade antifúngica dos exsudatos das sementes...... 77

2.3.5 Atividade biológica de oligossacarídeos derivados de galactomanano...... 80

2.4 DISCUSSÃO ...... 87

2.4.1 Exsudação de açúcares e substâncias alelopáticas...... 87

2.4.2 Atividade biológica de oligossacarídeos de galactomanano...... 95

2.5 CONCLUSÕES...... 100

2.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 101

3 Dinâmica da liberação, caracterização química e atividade biológica de substâncias exsudadas por sementes de Hymenaea courbaril var . stilbocarpa ...... 110

RESUMO ...... 111

ABSTRACT...... 113

3.1 INTRODUÇÃO...... 115

ix 3.2 MATERIAL E MÉTODOS...... 118

3.2.1 Material biológico...... 118

3.2.2 Germinação de sementes...... 119

3.2.3 Bioensaios de fitotoxicidade em alface e tomate...... 119

3.2.4 Detecção de substâncias antifúngicas...... 120

3.2.5 Isolamento e caracterização de compostos ativos...... 121

3.2.6 Análises das frações por HPLC-MS ...... 123

3.2.7 Análises por cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas – GC-MS...... 123

3.2.8 Bioensaios de atividade fitotóxica com plântulas de A. thaliana ...... 124

3.2.9 Ensaios de atividade seqüestradora de radicais livres...... 127

3.3.10 Ensaios de atividade antifúngica com leveduras e fungos filamentosos ...... 128

3.3.11 Análise estatística ...... 129

3.3 RESULTADOS ...... 130

3.3.1 Detecção da liberação de substâncias fitotóxicas e antifúngicas pelas sementes de H. courbaril...... 130

3.3.2 Isolamento e caracterização das substâncias fitotóxicas das sementes de H. courbaril ...... 134

3.3.3 Testes de atividade antifúngica das bicumarinas isoladas com fungos filamentosos e leveduras ...... 148

3.3.4 Atividade seqüestradora de radicais livres com as bicumarinas isoladas das sementes de jatobá...... 151

3.4 DISCUSSÃO ...... 153

3.5 CONCLUSÕES ...... 158

3.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 159

x 4 Considerações finais ...... 165

4.1 CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 166

4.2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………………...169

ANEXOS

Anexo 1: Espectro de 1H RMN da fração AcOEt derivada da partição orgânica de exsudatos das sementes de S. virgata ...... 171

Anexo 2: Espectro de 1H RMN da fração H derivada do fracionamento do extrato AcOEt obtido de exsudatos das sementes de S.virgata ...... 172

Anexo 3 : Espectro de 1H RMN da fração 2 obtida por fracionamento em cromatografia “flash” da fração H derivada de exsudatos das sementes de S. virgata ...... 173

Anexo 4 : Espectro de 1H RMN da fração FS3 (quercetina) obtida por fracionamento do extrato

AcOEt derivado das sementes de Sesbania virgata ...... 174

Anexo 5 : Espectro de 1H RMN da fração FS7 (catequina) obtida por fracionamento do extrato

AcOEt derivado das sementes de Sesbania virgata ...... 175

Anexo 6: Espectro de 1H RMN da fração FH5 (himenaína) obtida no fracionamento por cromatografia “flash” do extrato do embrião das sementes de H. courbaril ...... 176

Anexo 7: Espectro de 13 C RMN da fração FH5 (himenaína) obtida no fracionamento por cromatografia “flash” do extrato do embrião das sementes de H. courbaril ...... 177

Anexo 8: Espectro de 1H RMN da fração FH9 (ipomopsina) obtida no fracionamento por cromatografia “flash” do extrato do embrião das sementes de H. courbaril...... 179

Anexo 9: Espectro de 13 C RMN da fração FH9 (ipomopsina) obtida no fracionamento por cromatografia “flash” do extrato do embrião das sementes de H. courbaril ...... 180

xi Anexo 10 : “Phytotoxic catechin leached by seeds of the tropical weed Sesbania virgata” ……183

Anexo 11: “Ipomopsin and hymenain, two biscoumarins from seeds of Hymenaea courbaril” 206

xii ABREVIATURAS e SÍMBOLOS

1- D – Unidimensional

2-D – Bidimensional

AcOEt – Acetato de etila

ANS – Antocianina Sintase

ANR – Antocianina Redutase

ATP – Adenosina Trifosfato

BDA – Batata-Dextrose-Ágar

13 C RMN – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

CCD – Cromatografia em Camada Delgada

CD – Dicroísmo Circular

COSY – Correlation Spectroscopy d – Dubleto

DCM – Diclorometano

DFR – Dihidroflavonol Redutase

DMSO – Dimetilssulfóxido

DPPH – 2,2-Difenil-1-picril-hidrazila

EUCAST – Comitê Europeu para Testes de Susceptibilidade Antimicrobianos.

EROS – Espécies Reativas de Oxigênio

EtOH – Etanol

F3H – Flavanona-3-hidroxilase

GC-MS – Cromatógrafo a Gás acoplado a Espectrômetro de Massas

xiii GM – Galactomanano

GGM – Galactoglucomanano

Hex – Hexano

HPAEC/PAD – Cromatografia de Troca Iônica de Alto Desempenho com Detecção de Pulso

Amperométrico

1H RMN – Ressonância Magnética Nuclear Protônica

HRFABMS – High-Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectra

HMBC – Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HMQC –Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HPLC – Cromatografia Líquida de Alto Desempenho

J – Constante de acoplamento

LAR – Leucoantocianidina Redutase

MeOH – Metanol

NCCLS – Comitê Nacional para Padrões de Laboratórios Clínicos.

NOESY – Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

OAPM – Oligossacarídeos de alto peso molecular

OBPM – Oligossacarídeos de baixo peso molecular

OGM - Oligossacarídeo de galactomanano

Rf – Fator de relação s - Singleto

SDA – Sabouraud-Dextrose-Ágar

TFA – Ácido Trifluoroacético

UFC – Unidade Formadora de Colônia

UV – Ultravioleta

xiv XG – Xiloglucano

λλλ – Comprimento de onda

δδδ – Deslocamento químico

xv RESUMO

Sesbania virgata (Cav.) Pers. e Hymenaea courbaril L. var. stilbocarpa (Fabaceae) são duas espécies tropicais que acumulam, respectivamente, galactomanano e xiloglucano como polissacarídeos de reserva nas sementes, os quais são mobilizados logo após protrusão da radícula, gerando grande quantidade de monossacarídeos e oligossacarídeos. Parte desses açúcares é liberada para o meio, sem que haja, contudo, contaminações por microrganismos.

Estudos prévios indicaram que exsudatos dessas sementes apresentam substâncias com atividade antifúngica e fitotóxica e sugeriram também que oligossacarídeos oriundos da degradação do galactomanano agem como moléculas sinalizadoras de mecanismos de defesa em plantas.

Entretanto, a liberação, natureza química e atividade biológica desses compostos ainda não haviam sido estudadas. Dessa forma, este trabalho teve por objetivos elucidar as estruturas químicas e estudar a exsudação de substâncias fitotóxicas e antifúngicas por sementes de S. virgata e H. courbaril, assim como, verificar a possível influência de oligossacarídeos derivados de galactomanano na produção desses metabólitos ativos em S. virgata. As sementes de S. virgata e H. courbaril foram germinadas em câmaras climatizadas à 25º C e fotoperíodo de 12 h e seus exsudatos foram coletados em diferentes períodos do processo de embebição, sendo posteriormente submetidos à bioensaios de fitotoxicidade com sementes de alface ( Lactuca sativa

L.) e de tomate ( Solanum lycopersicum L.). Para o isolamento de compostos ativos, extratos dos exsudatos e extratos das sementes foram obtidos em larga escala através de extrações com solventes orgânicos, sendo, posteriormente, fracionados em colunas de gel de sílica utilizando gradientes de diclorometano e MeOH. As frações coletadas foram ensaiadas quanto a sua atividade fitotóxica em plântulas de Arabidopsis thaliana L. e de arroz ( Oryza sativa L.) cultivadas in vitro. A atividade antifúngica dos extratos e frações foi determinada por métodos de bioautografia e microdiluição in vitro com fungos filamentosos e leveduras. As substâncias

xvi isoladas foram identificadas e caracterizadas por técnicas de 13 C RMN e 1H RMN (1-D e 2-D).

Quantificação e detecção de compostos também foram realizadas por análises em HPLC, HPLC-

MS e GC-MS. Os resultados obtidos demonstraram que ambas as sementes exsudam metabólitos secundários antifúngicos e fitotóxicos logo no início do processo de embebição. O flavonóide

(+)-catequina é a principal fitotoxina dos exsudatos das sementes de S. virgata , sendo encontrada no tegumento das sementes e liberada em altas concentrações no primeiro dia de embebição.

Quercetina também foi encontrada no tegumento das sementes de S. virgata , mas não é exsudada durante a germinação. Análises cromatográficas sugeriram a presença do alcalóide sesbanimida A nos extratos do embrião e nos exsudatos de S. virgata, como a principal substância antifúngica presente. Sementes de S. virgata embebidas em soluções contendo oligossacarídeos de galactomanano exsudaram maior quantidade de (+)-catequina do que aquelas embebidas apenas em água destilada, sugerindo que esses oligossacarídeos possam atuar como oligossacarinas sinalizadoras. Duas bicumarinas, a ipomopsina, anteriormente extraída de outra espécie vegetal e a himenaína, uma bicumarina inédita, foram isoladas de extratos do embrião das sementes de H. courbaril. Esses metabólitos também são exsudados durante a germinação e apresentam toxicidade às raízes de plântulas de A. thaliana quando co-aplicados e não apresentam atividade antifúngica, com exceção da escopoletina, também detectada nestes extratos. Entretanto, essas substâncias apresentaram atividade antioxidante, sendo himenaína a que apresentou maior capacidade seqüestradora do radical livre DPPH, sugerindo o envolvimento desses compostos na proteção a danos causados por radicais livres. Os dados obtidos neste trabalho sobre a atividade fitotóxica, antifúngica e antioxidante dos metabólitos isolados das sementes de S. virgata e H. courbaril sugerem que eles podem funcionar como estratégias adaptativas que contribuem para o sucesso do estabelecimento inicial dessas espécies.

xvii ABSTRACT

Sesbania virgata (Cav.) Pers. and Hymenaea courbaril L. var. stilbocarpa (Fabaceae) are two tropical legume species with seeds that contain galactomannan and xyloglucan, respectively, as seed storage polysaccharides, which are broken down after germination, generating large amounts of monosaccharides and oligosaccharides. Part of these sugars is released to the environment, but no contamination is observed. Previous studies demonstrated that these seed leachates have antifungal and phytotoxic activity and also suggested that oligosaccharides derived from galactomannan can act as signaling molecules in plant defense mechanisms.

However, exudation, chemical structure and biological activities of the compounds have not been studied. Therefore, the aims of this work were to study the release of the bioactive compounds from seeds of S . virgata and H. courbaril , to elucidate their chemical structure and to analyze the influence of galactomannan oligosaccharides on the production of these substances in S. virgata .

Seeds of S. virgata and H. courbaril were germinated at 25º C and photoperiod of 12 h, and the leachates were collected at different periods of the imbibition process, and submitted to phytotoxic bioassays with seeds of lettuce ( Lactuca sativa L.) and tomato ( Solanum lycopersicum

L.). For compound isolation, extracts of seeds and leachates were obtained in large amounts and fractionated in silica gel columns with different gradient of dichloromethane and methanol. The fractions collected were assayed in vitro with seedlings of Arabidopsis thaliana L. and rice

(Oryza sativa L.). The antifungal activity of the extracts and fractions were determined by bioautography and microdilution tests. The compounds were identified and characterized by 13 C

NMR and 1H NMR (1-D and 2-D) techniques. Compounds were also detected and quantified by

HPLC, HPLC-MS and GC-MS. Our results showed that both seeds exude antifungal and phytotoxic metabolites at the beginning of imbibition process. The flavonoid (+)-catechin is the major phytotoxin in the S. virgata seed exudates, being found in the seed coat and leached in high

xviii amounts at the first day of imbibition. Quercetin was also found in the seed coat of S. virgata seeds, but it is not released during germination. The alkaloid sesbanimide A was detected in the embryo and exudates extracts of S . virgata , being the most important antifungal compound found in the extracts. Seeds of S. virgata imbibed with a galactomannan oligosaccharide solution leached more (+)-catechin than those imbibed in distilled water, suggesting that these molecules can act as oligosaccharins. Two biscoumarin, ipomopsin, previously reported in other plant species, and hymenain, a novel one, were identified in embryo extracts of H. courbaril. These compounds are also released by the seeds during germination, and showed a phytotoxic effect on roots of A. thaliana seedlings when co-applied, but they have not antifungal activity. Escopoletin were also detected in the embryo extracts, and showed antifungal activity to Cladosporium sphaerospermum Pemzig. Additionally, the biscoumarin and scopoletin, showed antioxidant activity, hymenain being the substance with higher scavenger activity to DPPH free radical, suggesting its involvement in the protection of the cells against free radical damages. Our findings related to the phytotoxic, antifungal, and antioxidant activities of metabolites isolated from seeds of S. virgata and H. courbaril suggest that they could act as adaptive strategies that contribute to the success of the initial establishment of these species.

xix

1. Introdução Geral e Objetivos

1 1.1 INTRODUÇÃO

Interações planta-planta e planta-microrganismo

As interações estabelecidas entre planta-planta, planta-microrganismo, planta-nematóide, planta-inseto ocorrem, na maioria das vezes, pela produção, liberação e reconhecimento mútuo de vários tipos de sinais químicos por estes organismos (Hirsch et al . 2003). Estes sinais podem, por sua vez, induzir mudanças no comportamento, morfologia, fisiologia e bioquímica dos organismos expostos a eles, com conseqüências positivas, negativas ou neutras (Perry et al.,

2007).

Muitas das complexas interações químicas e também interações físicas e biológicas existentes entre as plantas e outros seres vivos ocorrem na rizosfera (região do solo que circunda as raízes vegetais) (Bais et al ., 2006). As raízes das plantas produzem e secretam muitos compostos de natureza química diversa, tais como íons, enzimas, mucilagens e vários metabólitos primários e secundários (Uren, 2000), os quais podem regular a formação de comunidades vizinhas, podendo servir como atrativos ou repelentes para outras espécies (Weir et al. , 2004).

A liberação de compostos atrativos pelas plantas também pode influenciar indiretamente o desenvolvimento de outras populações. A exsudação de ácidos orgânicos por sementes, plântulas e raízes de pepino (Cucumis sativus L.) e tomate ( Solanum lycopersicum L.) estimula o crescimento da bactéria Pseudomonas fluorescens Migula WCS365, a qual é responsável pelo controle biológico do fungo Fusarium oxysporum Schltdl. f. sp. radicis lycopersici , um patógeno que ataca plantas de tomate (Kamilova et al. 2005, 2006). Exsudatos de raízes de Arabidopsis thaliana L. Heynh. parecem favorecer o crescimento de Bacillus subtilis Cohn , cujas colônias formam um biofilme na superfície das raízes, limitando assim o espaço para o crescimento da

2 bactéria Gram-negativa Pseudomonas syringae V. Hall pv. tomato DC3000, que infecta as raízes e causa necrose e morte das plantas . Além da formação do biofilme, as colônias de B. subtilis , assim como outras bactérias Gram-positivas, produzem surfactina, um composto antimicrobiano que inibe o crescimento de P. syringae (Bais et al ., 2006).

A inibição química de uma espécie pela outra é denominada alelopatia, termo proveniente do Grego “allelon ” e “ pathos ”, palavras que significam, respectivamente, mútuo e prejuízo (Weir et al . 2004; Inderjit & Duke, 2003). Rice (1984) definiu alelopatia como o efeito de substâncias liberadas por uma planta (ou também de um microrganismo) sobre o crescimento de outra planta

(ou microrganismo). Contudo, essa definição é muito ampla, sendo assim, muitos autores reconhecem apenas os efeitos negativos como efeitos alelopáticos (Hierro & Callaway, 2003;

Inderjit & Duke, 2003; Perry et al ., 2007, Inderjit et al ., 2008).

Os compostos com atividade alelopática são geralmente provenientes do metabolismo secundário das plantas e são chamados de aleloquímicos, podendo ser encontrados em todos os tecidos vegetais e liberados para o ambiente pelas raízes e por queda e/ou lixiviação das partes aéreas das plantas, assim como por emissão, no caso de compostos voláteis (Harborne, 1999,

Inderjit & DuKe, 2003, Weir et al. 2004).

O mecanismo de secreção/liberação de aleloquímicos ainda é pouco conhecido, sendo o processo de exsudação das raízes o mais estudado. Ele ocorre por difusão passiva, transporte de vesículas e/ou por canais de ânions mediados por ATPases (Walker et al. , 2003). Recentemente,

Loyola-Vargas et al. (2007) avaliaram a exsudação de aleloquímicos pelas raízes de A. thaliana na presença e ausência de inibidores específicos de ATPases de membrana e da síntese de ATP, assim como de bloqueadores de canais de cálcio e potássio. Esses autores verificaram que apenas cianeto de potássio e ortovanadato de sódio, inibidores da síntese de ATP e de ATPases de membrana, respectivamente, reduziram a exsudação de metabólitos secundários pelas raízes de A.

3 thaliana , de maneira dose-dependente, sugerindo que esse processo é dependente de ATP nesta espécie.

Nas interações planta-planta, os aleloquímicos exercem sua fitotoxicidade por diferentes mecanismos, que podem ser diretos, quando comprometem o crescimento e o metabolismo vegetal, ou indiretos, quando alteram propriedades do solo, tais como a disponibilidade de nutrientes e as populações de microrganismos benéficos nele encontradas (Rizvi et al. , 1992). A geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) tem sido observada como um efeito direto de aleloquímicos em plantas (Inderjit & DuKe, 2003, Bais et al. , 2003, Weir et al. 2004). A toxicidade de muitas quinonas e compostos fenólicos tem sido atribuída à formação de radicais que doam elétrons para o oxigênio molecular resultando na formação dos ânions superóxido (O -

2), os quais ainda podem formar radicais mais reativos como o radical hidroxila (OH
) e a

hidroperoxila (HO 2 ) (Inderjit & DuKe, 2003). Os efeitos fitotóxicos de muitos aleloquímicos podem ainda estar relacionados à inibição da fotossíntese, da respiração mitocondrial e da síntese de ATP (Inderjit & DuKe, 2003).

Sorgoleona, uma benzoquinona derivada de raízes de Sorghum spp, é um potente aleloquímico inibidor do fotossistema II, inibindo a transferência de elétrons entre as plastiquinonas A e B (Kagan et al. , 2003). Além disso, essa substância também reduz consideravelmente a atividade de H +-ATPase de membranas microssomais de raízes de milho, que é necessária para a manutenção do gradiente eletroquímico na rizosfera, responsável pelo controle da entrada de nutrientes na planta (Hejl & Koster, 2004).

A naftohidroquinona juglona, uma fitotoxina presente em Juglans nigra L., também interfere na respiração e fotossíntese. Sua forma reduzida não é tóxica (hidrojuglona), mas quando em contato com o ar ela é oxidada, o que a torna muito tóxica (Bertin et al ., 2003). Foi demonstrado que o flavonóide quercetina também causa decréscimo na respiração em

4 mitocôndrias isoladas de hipocótilo de soja ( Glycine max L.), provavelmente por interferir diretamente no transporte de elétrons e no desacoplamento da fosforilação oxidativa (Abrahim et al. , 2000, Weir et al. , 2004). O flavonóide catequina também é conhecido por sua fitotoxicidade

(Buta & Lusby, 1986; Bais et al. , 2002; Iqbal et al. , 2003). Em raízes de A. thaliana , essa substância levou à produção de espécies reativas de oxigênio, seguida de um aumento nos níveis de Ca 2+ e acidificação do citoplasma, com a conseqüente morte celular (Bais et al. 2003).

A quantidade de aleloquímicos produzida pode variar durante as diferentes fases do ciclo de vida das plantas. A produção e acúmulo de momilactona B, uma fitoalexina sintetizada por arroz ( Oryza sativa L.) capaz de inibir o crescimento de microrganismos e também o crescimento e a sucessão de plantas vizinhas, aumenta nos caules e raízes de arroz durante o desenvolvimento das plantas até o início da floração, quando seus níveis começam a decrescer (Kato-Noguchi &

Ino, 2005). Em trigo ( Triticum aestivum L.) foi observado que a quantidade total de aleloquímicos derivados de ácidos hidroxâmicos varia de acordo com a idade da planta, assim como sua distribuição nas folhas e raízes, sendo encontrados também em altos níveis nas sementes dessa espécie (Villagrasa et al . 2006).

Compostos exsudados por sementes

A região do solo que envolve as sementes que germinam é denominada de espermosfera

(Nelson, 2004). Essa área é análoga à rizosfera e representa uma região dinâmica com rápidas mudanças e que possui muitos compostos que são liberados para o solo no início do processo de embebição das sementes. As sementes são ricas em compostos de reserva, principalmente carboidratos, proteínas e lipídeos, que são mobilizados e utilizados durante a germinação como fonte de carbono inicial para o desenvolvimento do embrião, tornando-as muito atrativas para o

5 crescimento de microrganismos. Dessa maneira, a existência de estratégias de defesa que incluem a presença e a liberação de substâncias antimicrobianas e também de substâncias que inibem a germinação de sementes e o desenvolvimento de espécies competidoras é crucial para garantir o estabelecimento e desenvolvimento inicial de plântulas (Nelson, 2004).

Exsudatos de sementes podem conter diversos compostos, tais como, açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, proteínas, peptídeos, flavonóides, alcalóides, terpenóides e esteróides

(Ndakidemi & Dakora, 2003). Muitas substâncias exsudadas pertencentes a estes grupos químicos são aleloquímicos e, deste modo, exsudatos oriundos de sementes possuem potencial de exercer efeitos inibitórios em sementes e plântulas de outras espécies. Entretanto, ainda há poucos estudos relacionados à ocorrência de alelopatia entre sementes e sementes e plântulas.

Em exsudatos de sementes de Datura stramonium L. foram identificados alcalóides do tipo tropano, como a escopolamina e a hiosciamina, os quais foram responsáveis pela inibição do crescimento radicular de ervas daninhas (Levitt & Lovett, 1984). Em Citrullus vulgaris Schrad.

(melancia), o ácido vanílico isolado de sementes foi o responsável pela atividade alelopática em plantas do gênero Amaranthus e de alface (Lactuca sativa L.) e tomate (Kushima et al. , 1998). Os isoflavonóides medicarpina, 4-metoximedicarpina e as saponinas liberadas por sementes de alfafa

(Medicago sativa L.) afetam a germinação e o desenvolvimento inicial de várias espécies vegetais

(Xuan & Tsuzuki, 2002, Dorbon et al. , 1990, Guenzi et al., 1964). Sementes de Lepidium sativum

L. produzem e exsudam uma substância denominada lepidimoide, a qual em baixas concentrações (3 µM) promoveu o crescimento do hipocótilo de Amaranthus caudatus L., mas que em concentrações superiores a 100 µM inibiu o crescimento da raiz de A. caudatus

(Hasegawa et al ., 1992).

6 As sementes de Sesbania punicea (Cav.) Benth., uma fabácea capaz de invadir campos abandonados e formar densas populações na África do Sul, produzem um alcalóide denominado sesbanimida, o qual parece estar envolvido com o comportamento invasor dessa espécie, uma vez que essa substância foi capaz de inibir drasticamente a germinação e o crescimento de diferentes espécies vegetais (Gorst-Allman et al. , 1984, Van Staden & Grobbelaar, 1995).

Outros trabalhos relatam a ocorrência de efeitos alelopáticos em exsudatos das sementes, no entanto, a natureza química das substâncias ativas ainda permanece desconhecida. Esse é o caso das sementes de Lotus tenuis Waldst et Kit que inibe a germinação de sementes e a emergência de plântulas de Carduus acanthoides L. (Laterra & Bazzalo, 1999) e das sementes de

Vigna mungo L. Hepper, cujos exsudatos inibem a germinação e crescimento da raiz de T. aestivum, Zea mays L. (milho), Cicer arietinum L. (grão-de-bico) e Lens esculentum Medik

(lentilha) (Suman et al. , 2002).

Nas interações planta-microrganismo, os metabólitos secundários produzidos por sementes também exercem papel nos casos da associação simbiótica de algumas fabáceas com bactérias fixadoras de nitrogênio (Ndakidemi & Dakora, 2003). A luteolina exsudada por sementes de alfafa, por exemplo, pode agir como quimioatrativo para bactérias do gênero

Rhizobium , além de promover o crescimento e induzir a transcrição dos genes de nodulação ( nod genes) da bactéria simbionte (Caetano-Anolles et al. 1988). Nas interações que ocorrem inibição do crescimento de microrganismos, as sementes, do mesmo modo como ocorre em outros órgãos vegetais, podem acumular substâncias antimicrobianas constitutivas, denominadas de fitoanticipinas, ou, induzidas, como as fitoalexinas que são metabólitos secundários de baixo peso molecular sintetizados de novo em resposta ao ataque de microrganismos (Shaw et al ., 2006).

Em soja ( Glycine max L.), foi verificada a presença das isoflavonas daidzeína e genisteína nas células dos cotilédones das sementes, as quais são precursoras da síntese de gliceolinas, que

7 são as principais fitoalexinas sintetizadas por essa espécie, e que possuem papel fundamental na resistência dos tecidos de soja contra a infecção do fungo patogênico Phytophthora megasperma

Drechs f. sp. glycinea. Essas isoflavonas também são exsudadas pelas sementes e raízes primárias de plântulas, sendo que a genisteína possui efeito tóxico direto em P. megasperma (Graham,

1991).

O alcalóide agmatina, que possui atividade antifúngica, também foi encontrado em sementes de soja, contribuindo para os mecanismos de defesa da espécie (Stoessl & Unwin,

1970). Outros alcalóides, como angustifolina, lupanina e 1,3-hidroxilupanina também são bacteriostáticos e podem estar envolvidos nos processos de defesa contra microrganismos em sementes (Tyski et al., 1988).

Ceballos et al. (1998) verificaram a exsudação de catequinas, proantocianidinas e luteolina por duas espécies de Sesbania . Em Sesbania drummondii (Rydb) Cory (espécie perene), o flavonóide (+)-catequina foi encontrado em quantidade superior à de (-)-catequina e em Sesbania vesicaria (Jacq.) Ell. (espécie anual) houve o predomínio de (-)-catequina. Os autores relataram que a segunda espécie é mais suscetível ao ataque do fungo Alternaria sp . e que os exsudatos de suas sementes não causam inibição do crescimento deste microrganismo. Estudos realizados com extratos de sementes de Cassia tora L. , também pertencente à família Fabaceae, mostraram a presença de antraquinonas que são capazes de inibir o crescimento de vários fungos fitopatogênicos (Kim et al. , 2004).

Outros compostos como proteínas, peptídeos e aminoácidos também estão relacionados à mecanismos de defesa também tem sido relatada em sementes (Thomma et al ., 2002; Ng, 2004).

Canavanina, um aminoácido não protéico, exsudado por sementes de alfafa foi capaz de inibir fortemente populações de Bacillus cereus encontrados na espermosfera (Emmert et al ., 1998).

8 A exsudação de substâncias por sementes é iniciada com a embebição, considerada a fase

I do processo germinativo (Nelson, 2004). Após hidratação completa, quando a entrada de água nas sementes cessa, inicia-se a segunda fase da germinação, na qual ocorrem várias reações metabólicas que desencadeiam a protrusão da radícula, como por exemplo, a síntese de mRNAs e proteínas. Com a protrusão da radícula o processo de germinação é finalizado e inicia-se o desenvolvimento de plântulas (fase III). Esse período também é acompanhado por um aumento da exsudação de metabólitos de baixo peso molecular seguido pelo aumento dos produtos de degradação dos compostos de reserva, como por exemplo, os carboidratos de parede celular, utilizados como fonte de carbono inicial para o desenvolvimento de plântulas (Nelson, 2004).

Parede celular e oligossacarídeos sinalizadores

A parede celular vegetal é uma matriz altamente complexa e dinâmica, cuja composição e estrutura variam durante o crescimento e a diferenciação celular e em resposta a fatores ambientais. Essa matriz exerce funções como a de definir a forma e tamanho da célula, controlar a expansão celular, atuar no transporte intercelular, armazenar compostos de reserva, participar no reconhecimento entre células e da liberação de moléculas sinalizadoras, as quais regulam diversos processos fisiológicos em plantas (Vorwek et al ., 2004; Knox, 2008).

A parede celular é formada de dois, ou algumas vezes, de três domínios estruturalmente independentes, mas que interagem entre si (Carpita & McCann 2000). O primeiro domínio é formado por microfibrilas de celulose envolvidas por hemiceluloses (xiloglucanos, arabinoxilanos ou mananos), o que confere resistência mecânica à célula vegetal. Este domínio celulose-hemicelulose encontra-se imerso em um segundo domínio, formado pela matriz péctica, que atua como controladora da porosidade da parede celular, sendo composta por uma mistura de

9 polissacarídeos ácidos (homogalacturonanos e ramnogalacturonanos I e II) e neutros

(arabinogalactanos, arabinanos), os quais comumente se apresentam como ramificações dos polissacarídeos ácidos (Buckeridge et al. , 2000, Carpita & McCann, 2000; Ridley et al ., 2001).

O terceiro domínio da parede celular é formado por redes de proteínas estruturais, responsáveis pela regulação do crescimento, como por exemplo, as glicoproteínas ricas em hidroxiprolina, as proteínas ricas em prolina e em glicina; e também por compostos aromáticos, como ácidos hidroxicinâmicos e as ligninas, os quais conferem resistência a patógenos, rigidez adicional e impermeabilidade à parede celular (Carpita & McCann, 2000).

Nas sementes, os carboidratos de parede celular podem ser depositados em grande quantidade, servindo como compostos de reserva, sendo degradados durante a germinação e utilizados como fonte de carbono para o crescimento do embrião. Além disso, estes carboidratos também podem influenciar a embebição de água, devido às suas propriedades hidrodinâmicas, protegendo a semente contra o dessecamento, além de controlar a expansão celular durante o desenvolvimento da plântula e de atuar como reservatório de moléculas sinalizadoras de processos vegetais (Buckeridge & Reid, 1996; Buckeridge et al. 2000; Aziz et al ., 2004).

Os carboidratos de reserva de parede celular de sementes estão divididos em três grupos: o grupo dos (arabino)galactanos, o grupo dos mananos (composto por galactomananos, mananos puros e glucomananos), e dos xiloglucanos (Buckeridge et al. 2000).

Os galactanos são polissacarídeos formados por uma cadeia principal de unidades de galactose, sendo comumente encontrados em sementes de Lupinus , onde estudos de determinação estrutural de polissacarídeos demonstraram a existência de dois tipos de polímeros: um formado por ligações β- 1,3, β- 1,6 e poucas ligações β- 1,4 entre as unidades de galactose; e outro

10 formado por ligações β- 1,4 na cadeia principal de galactose, contendo ramificações de arabinose

(Buckeridge et al . 2000).

Os galactomananos (GM) são hemiceluloses de parede secundária, formados por cadeia principal linear de unidades de manose ligadas entre si por ligações β-1,4, contendo ramificações de unidades de galactose α-1,6-ligadas (Buckeridge & Reid, 1996). Os GMs são geralmente encontrados em parede celular de células do endosperma de sementes das fabáceas Trigonella foenum-graecum L., Cyamopsis tetragonolobus (L.) Taub. e Sesbania virgata (Cav.) Pers., sendo degradados durante a germinação da semente (Buckeridge et al ., 2004). A degradação do GM ocorre por ação de três hidrolases: uma α-galactosidase, que tem ação nas ligações α-1,6 das ramificações de galactose; uma endo β-1,4 mananase, que cliva ligações β-1,4, liberando oligossacarídeos de manose e, por fim, uma β-manosidase ou exo-β-manosidase, que age sobre mano-oligossacarídeos produzidos pela endo β-1,4 mananase, liberando monossacarídeos e dissacarídeos (Buckeridge & Reid, 1996).

Os xiloglucanos (XG) de reserva de sementes possuem uma cadeia principal celulósica, formada por unidades de glucose β-1,4-ligadas, ramificada em alguns pontos por unidades de xilose α-1,6 ligadas, as quais ainda podem conter unidades de galactose β-1,2-ligadas

(Buckeridge et al ., 2000). Ao contrário dos GM que aparecem no endosperma de sementes, os

XG são depositados nas paredes celulares espessadas dos cotilédones de várias espécies, entre elas as fabáceas Copaifera langsdorffii Desf. e Hymenaea courbaril L. (Buckeridge et al ., 2000).

A mobilização desse polissacarídeo ocorre após a germinação pela ação das enzimas β- galactosidase, β-glucanase, α-xilosidase e β-glucosidase, com a concomitante produção de diversos oligossacarídeos, sacarose e glucose (Tiné et al. , 2000).

11 Oligossacarídeos oriundos da degradação da parede celular podem funcionar como sinais químicos que controlam diversos processos fisiológicos nas plantas (Vorwek et al ., 2004). Esses fragmentos com atividade biológica são chamados de oligossacarinas e sua ação relaciona-se à regulação de processos fisiológicos, como morfogênese, crescimento e floração, e ainda como sinais envolvidos na indução de respostas de defesa na planta contra predadores e patógenos

(Albersheim et al. 1992; Darvill et al. 1992).

Oligossacarídeos gerados pela degradação de polissacarídeos pécticos de plantas, especificamente do homogalacturonano, denominados de oligogalacturonídeos, também são responsáveis pela indução de várias respostas de defesa, alterando o crescimento e o desenvolvimento de plantas (Ridley et al. 2001; Aziz et al ., 2004).

Alguns estudos demonstraram que oligossacarídeos específicos, produzidos a partir da hidrólise do XG de parede celular por celulase microbiana podem estimular ou inibir a extensão celular promovida pela auxina (York et al ., 1984; Fry et al ., 1993). York et al . (1984) demonstraram que nonassacarídeos de xiloglucano, em concentrações de 10 -8-10 -9M foram capazes de inibir o crescimento de hipocótilos de ervilha ( Pisum sativum L.) induzido pela aplicação da auxina sintética 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético). McDougall & Fry (1990), ao analisarem o efeito de oligossacarídeos de xiloglucano não fucolisados em segmentos de caule de ervilha, observaram o aumento do alongamento destes segmentos nas concentrações próximas a

10 -6 M. Vargas-Rechia et al. (1998) verificaram que oligossacarídeos de XG derivados de sementes de H. courbaril , em concentrações nanomolares, induziram o crescimento de coleóptilos de trigo, na ausência de 2,4-D.

Auxtová et al. (1995) também observaram que oligossacarídeos derivados de galactoglucomanano (OGGM) de Populus monilifera Ait apresentam atividade biológica, sendo capazes de inibir o crescimento de segmentos de caule de ervilha induzido por 2,4-D. Um estudo

12 recente mostrou que esse efeito inibidor de crescimento também ocorre em segmentos de caule de ervilha induzidos por ácido indol-3-acético (IAA) e por ácido giberélico (GA 3), e que a remoção de unidades de galactose das moléculas desses oligossacarídeos causa redução dessa atividade anti-auxínica (Kollárová et al ., 2006).

Em células de pepino, a aplicação de OGGMS influenciou a produção de enzimas envolvidas na reação de hipersensibilidade (Slováková et al. 1994). Foi verificado também, que

OGGMs induziram respostas de defesa contra a infecção pelo vírus da necrose do tabaco

(Nicotiana tabacum L.) (Slováková et al. 2000), sugerindo que além de possuir atividade anti- auxínica, os OGGMs também parecem estar envolvidos em mecanismos de resistência ao ataque de patógenos.

Estudos com sementes de S. virgata e H. courbaril

S. virgata e H. courbaril são duas espécies de Fabaceae que acumulam em suas sementes

GM e XG, respectivamente, como polissacarídeos de reserva de parede celular (Buckeridge et al .,

2000).

Em sementes de S. virgata o GM é degradado no terceiro dia do processo de germinação.

Os oligossacarídeos e monossacarídeos produzidos são translocados para o embrião em crescimento (Buckeridge & Dietrich, 1996). Parte destes açúcares resultantes da degradação do

GM é exsudada, podendo ser encontrada na água germinação, sem que, entretanto, tenha sido observada a contaminação por microrganismos. Duas substâncias altamente fungitóxicas foram detectadas nos exsudatos dessas sementes, estando uma delas presente em sementes quiescentes e outra apenas durante a germinação, podendo talvez ser produzida durante o processo de degradação do GM (Rahal, 2002). Os exsudatos dessas sementes também mostraram atividade

13 inibidora do crescimento do sistema radicular de plântulas de alface (Braga & Buckeridge, 1997).

Adicionalmente, alguns relatos indicam que S. virgata exibe comportamento invasor em culturas de arroz irrigado (Kissmann & Groth, 1999), o que está de acordo com os efeitos fitotóxicos dos exsudatos das sementes S. virgata observados em alface por Braga & Buckeridge (1997), sugerindo a existência de estratégias alelopáticas nas sementes.

Ensaios com extratos obtidos do endosperma de sementes de S. virgata também evidenciaram a presença de atividade indutora de fitoalexinas (Rahal et al., 1998). Foi observado que essa atividade estava presente em várias fases do processo germinativo sendo mais intensa no período coincidente com a degradação do GM. Através de curvas dose-resposta, foi possível observar que o efeito biológico detectado está relacionado à presença de moléculas indutoras nesses extratos e não a possíveis efeitos tóxicos e /ou osmóticos provocados pelos mesmos. Foi sugerido que a atividade indutora poderia ser determinada por um trissacarídeo composto de dois resíduos de manose ligados β1,6 e um de galactose α1,6 ligado a uma das manoses (Rahal, 2002).

Para as sementes de H. courbaril a germinação ocorre cerca de 35 dias após o início da embebição de água e a degradação do XG tem início neste período, estendendo-se por cerca de 20 dias. Como ocorre com S. virgata , sementes de H. courbaril também exsudam compostos com atividade antimicrobiana a partir de suas sementes (Oliveira & Braga, dados não publicados).

Nesse caso, entretanto, os processos de embebição de água, germinação da semente e degradação das reservas são muito mais lentos quando comparados a S. virgata , sugerindo a velocidade de exsudação de substâncias com atividade biológica seja bastante distinta entre as duas espécies.

Para o jatobá, a possível atividade fitotóxica dos exsudatos de suas sementes não era conhecida.

Apesar desses estudos, a natureza química das substâncias ativas, bem como a dinâmica de liberação dessas substâncias pelas duas sementes de Fabaceae com diferentes períodos de embebição, germinação e mobilização de seus polissacarídeos de reserva, ainda não era

14 conhecida. Além disso, embora a atividade biológica dos exsudatos das sementes de S. virgata seja maior durante a degradação do GM, não havia estudos sobre a possível influência endógena de oligossacarídeos oriundos da hidrólise deste polissacarídeo na indução de substâncias bioativas na própria semente de S. virgata .

15 1.2 OBJETIVOS

Este trabalho teve por objetivos estudar e comparar a exsudação de substâncias com atividade antimicrobiana e fitotóxica em sementes de S. virgata e H. courbaril, que acumulam diferentes carboidratos de reserva de parede celular, assim como, estudar a atividade biológica de oligossacarídeos de galactomanano. Dentro desse contexto foram analisados:

• o efeito fitotóxico dos exsudatos das sementes das duas espécies de fabáceas sobre a

germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de outras espécies vegetais;

• o potencial inibidor dos exsudados das sementes sobre o crescimento de fungos;

• a influência de oligossacarídeos de galactomanano na indução de substâncias bioativas em

S. virgata.

Além disso, as principais substâncias ativas foram caracterizadas quimicamente.

16 1.3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABRAHIM, D., BRAGUINI, W.L., KELMER-BRACHT A.M. & ISHII-IWAMOTO, E.L. 2000.

Effects of four monoterpenes on germination, primary root growth, and mitochondrial

respiration of maize. Journal of Chemical Ecology 26: 611-624.

ALBERSHEIM, P., DARVILL, A.G., AUGUR, C., CHEONG, J., EBERHARD, S., HAHN, M.,

MARFÁ, V., MOHNEN, D., O’NEILL, M.A., SPIRO, M.D. & YORK, W.S. 1992.

Oligosaccharins: oligosaccharide regulatory molecules. Accounts of Chemical Research 25:

77-83.

AUXTOVÁ, O., LISKOVÁ, D., KAKONIOVÁ, D., KUBACKOVÁ, M., KARACSONYI, S. &

BILISICS, L. 1995. Effect of galactoglucomannan derived oligosaccharides on elongation

growth of pea and spruce stem segments stimulated by auxins. Planta 196: 420-424.

AZIZ, A., HEYRAUD, A. & LAMBERT, B. 2004. Oligogalacturonide signal transduction,

induction of defense-related responses and protection of gravepine against Botrytis cinerea .

Planta 218: 767-774.

BAIS, H.P., WALKER, T.S., STERMITZ, F.R., HUFBAUER, R.A. & VIVANCO, J.M. 2002.

Enantiomeric-dependent phytotoxic and antimicrobial activity of (+) catechin. A

rhizosecreted racemic mixture from spotted knapweed. Plant Physiology 128: 1173-1179

BAIS, H.P., VEPACHEDU, R., GILROY, S., CALLAWAY, R.M. & VIVANCO, J.M. 2003.

Allelopathy and exotic plant invasion: from molecules and genes to species interactions.

Science 301: 1377-1380 .

BAIS, H.P., WEIR, T.L., PERRY, L.G., GILROY, S. & VIVANCO, J.M. 2006. The role of root

exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant

Biology 57: 233-266.

17 BEKKARA, F., JAY, M., VIRICEL, M.R. & ROME, S. 1998. Distribution of phenolic

compounds within seed and seedlings of two Vicia faba cvs differing in their seed tannin

content, and study of their seed and root phenolic exudations. Plant and Soil 203: 27-36.

BERTIN, C., YANG, X. & WESTON, L. A. 2003. The role of root exudates and allelochemicals

in the rhizosphere. Plant and Soil 256: 67-83.

BRAGA, M.R. & BUCKERIDGE M.S. 1997. Fungitoxic compounds exudates by seeds of

Sesbania marginata Benth. (Leguminosae) following germination. Programa e Resumos da

XXVI a Reunião Anual da SBBq. E-76, p 41.

BUCKERIDGE, M.S. & REID, J.S.G. 1996. Major cell wall storage polysaccharides in legume

seeds: Structure, catabolism and biological functions. Ciência e Cultura 48: 153-162.

BUCKERIDGE, M.S, SANTOS, H.P. & TINÉ, M.A.S. 2000. Mobilisation of storage cell wall

polysaccharides in seeds. Plant Physiology and Biochemistry 38: 141-156.

BUCKERIDGE, M.S., SANTOS, H.P., TINÉ, M.A.S. & AIDAR, M.P.M. 2004. Mobilização de

reservas. In : Germinação: do básico ao aplicado. Ferreira, A.G. & Borghetti, F. Porto Alegre:

Art Med, p. 163-185.

BUTA, J.G. & LUSBY, W.R. 1986. Catechins as germination and growth inhibitors in Lespedeza

seeds. Phytochemistry 25: 93-95.

CAETANO-ANOLLES G., CRIST-ESTES D.K. & BAUER W.D. 1988. Chemotaxis of

Rhizobium meliloti to the plant flavone luteolin requires functional nodulation genes. Journal

of Bacteriology 170: 3164-3169.

CARPITA, N.C. & McCANN, M.C. 2000. The cell wall. In: BUCHANAN, B.B., GRUISSEM,

W. & RUSSEL, R.J. Biochemistry and molecular biology of plants. 3ed. American Society of

Plant Physiologists, Rockville. p. 52-108.

18 CEBALLOS, L., HOSSAERT-MCKEY, M., MCKEY, D. & ANDARY, C. 1998. Rapid

deployment of allelochemicals in exudates of germinating seeds of Sesbania (Fabaceae): roles

of seed anatomy and histolocalization of polyphenolic compounds in anti-pathogen defense of

seedlings. Chemoecology 8: 141-151.

DARVILL, A.G., AUGUR, C., BERGMAN, C., CARLSON, W., CHEONG, J.J., EBERHARD,

S. & HAHN, M.G. 1992. Oligosaccharins-oligosaccharides that regulate growth,

development, and defense responses in plants. Glicobiology 2: 181-198.

DORBON, D.L., SPENCER, J.G.F. & MILLER, R.W. 1990. Medicarpin delays alfalfa seed

germination and seedling growth. Crop Science 30: 162-166.

EMMERT, E.A.B., MILNER, J.L., LEE, J.C., PULVERMACHER, K., OLIVARES, H.A.,

CLARDY, J. & HANDELSMAN, J. 1998. Effect of canavanine from alfafa seeds on the

population biology of Bacillus cereus . Applied and Environmental Microbiology 64: 4683-

4688.

FRY, S.C., ALDINGTON, S., HETHERINGTON, P.R. & AITKEN, J. 1993. Oligosaccharide as

signals and substrates in the plant cell wall. Plant Physiology 103: 1-5.

GORST-ALLMAN, C. P., STEYN P. S., VLEGGAAR, R. & GROBBELAAR, N. 1984.

Structure elucidation of sesbanimide using high-field RMN spectroscopy. Journal of

Chemical Society 1: 1311-1314.

GRAHAM, T.L. 1991. Flavonoid and isoflavonoid distribution in developing soybean seedling

tissues and in seed and root exudates. Plant Physiology 95: 594-603.

GUENZI, W.D., KEHR, W.R. & MCCALLA, T.M. 1964. Water-soluble phytotoxic substances

in alfalfa forage: variation with variety, cutting, year and stage of growth. Agronomy Journal

56: 499-500.

19 HASEGAWA, K., MIZUTANI, J., KOSEMURA, S. & YAMAMURA, S. 1992. Isolation and

identification of lepidimoide, a new allelopathic substance from mucilage of germinated cress

seeds. Plant Physiology 100: 1059-1061.

HEJL, A.M. & KOSTER, K.L. 2004. The allelochemicals sorgoleone inhibits root H +-ATPase

and water uptake. Journal of Chemical Ecology 30: 2181-2191.

HIERRO, J.L. & CALLAWAY, R.M. 2003. Allelopathy and exotic plant invasion. Plant and

Soil 256: 29-39.

HIRSCH, A.M., BAUER, W.D., BIRD, D.M., CULLIMORE, J., TYLER, B. & YODER, J.I.

2003. Molecular signals and receptors: controlling rhizosphere interactions between plants

and other organisms. Ecology 84:858–68

INDERJIT & DUKE, S.O. 2003. Ecophysiological aspects of allelopathy. Planta 217: 529-539 .

INDERJIT, POLLOCK, J.L., CALLAWAY, R.M. & HOLBEN, W. 2008. Phytotoxic effects of

(±)-catechin in vitro , in soil, and in the field. Plos One 3: 1-11.

IQBAL, Z. 2003. Allelopathic activity of buckwheat: isolation and characterization of phenolics .

Weed Science 51: 657–662.

KAGAN, I.A., RIMANDO, A.M. & DAYAN, F.E. 2003. Chromatographic separation and in

vitro activity of sorgoleone congeners from the roots of Sorgum bicolor . Journal of

Agricultural and Food Chemistry 51: 7589-7595.

KAMILOVA, F., VALIDOV, S., AZAROVA, T., MULDERS, I. & LUGTENBERG, B. 2005.

Enrichment for enhanced competitive root tip colonizers selects for a new class of biocontrol

bacteria. Environmental Microbiology 7: 1809-1817.

20 KAMILOVA, F., KRAVCHENKO, L.V., SHAPOSSHNIKOV, A.I., AZAROVA, T.,

MAKAROVA, N. & LUGTENBERG, B. 2006. Organic acids, sugars, and L-tryptophane in

exudates of vegetables growing on stonewall and their effects on activities of rhizosphere

bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions 19: 250-256.

KATO-NOGUCHI, H. & INO, T. 2005. Possible involvement of momilactone B in rice

allelopathy. Journal of Plant Physiology 162: 718-721.

KIM, Y.-M., LEE, C.-H., KIM, H.-G. & LEE, H.-S. 2004. Anthraquinones isolated from Cassia

tora (Leguminosae) seed show no antifungal property against phytopathogenic fungi. Journal

of Agricultural and Food Chemistry 52: 6096-6100.

KNOX, J. P. 2008. Revealing the structural and functional diversity of plant cell walls. Current

Opinion in Plant Biology 11: 308-313.

KOLLÁROVÁ, K., LIŠKOVÁ, D. & CAPEK, P. 2006. Further biological characteristics of

galactoglucomannan oligosaccharides. Biologia Plantarum 2: 232-238.

KUSHIMA, M., KAKUTA, H., KOSEMURA S., YAMAMURA, S., YAMADA, K.,

YOKOTANI-TOMITA, K. & HASEGAWA, K. 1998. An allelopathic substance exuded

from germinating watermelon seeds. Plant Growth Regulation 25: 1-4.

LATERRA, P. & BAZZALO, M.E. 1999. Seed-to-seed allelopathic effects between two invaders

of burned Pampa grasslands. Weed Research 39: 297-308.

LEVITT, J. & LOVETT, J.V. 1984. Datura stramonium L.: alkaloids and allelopathy. Australian

Weeds 3: 108-112.

LOYOLA-VARGAS, V.M., BROECKLING, C.D., BADRI, D. & VIVANCO, J.M. 2007. Effect

of transporters on the secretion of phytochemicals by the roots of Arabidopsis thaliana .

Planta 225: 301-310.

21 MC DOUGALL, G.J. & FRY, S.C. 1990. Xyloglucan oligosaccharides promote growth and

activate cellulase - evidence for a role of cellulase in cell expansion. Plant Physiology 93:

1042-1048.

NDAKIDEMI, P.A. & DAKORA, F.D. 2003. Legume seed flavonoids and nitrogenous

metabolites as signals and protectants in early seedling development. Functional Plant

Biology 30: 729-745.

NG, T.B. 2004. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins.

Peptides 25: 1215-1222.

NELSON, E.B. 2004. Microbial dynamics and interactions in the spermosphere. Annual Review

of Phytopathology 42 : 271-309.

PERRY, L.G., ALFORD, É.R., HORIUCHI, J., PASCHKE, M.W. & VIVANCO, J.M. 2007.

Chemical signals in the rhizosphere: root-root and root-microbe communication. In : The

Rhizosphere. 2ed. Pinton, R., Varanini, Z. & Nannipieri, P. CRC Press. Boca Raton, FL. p.

297-330.

RAHAL, R.L. 2002. Atividade indutora de fitoalexinas e produção de substâncias fungitóxicas

durante a germinação de sementes de Sesbania marginata Benth. Dissertação de Mestrado,

IB-UNICAMP, 98p.

RAJARAM, N. & JANARDHANAN, K. 1991. The biochemical composition and nutritional

potential of the tribal pulse, Mucuna gigantea (Willd) DC. Plants Foods for Human

Nutrition 44: 45-51.

RICE, E. L. 1984. Allelopathy. Academic Press, Orlando, FL.

RIDLEY, B.L., O’NEILL, M.A & MOHNEN. 2001. Pectins: structure, biosynthesis, and

oligogalacturonide-related signaling. Phytochemistry 57: 929-967.

22 RIZVI, S.J.H., HAQUE, H., SINGH, V.K. & RIZVI, V. 1992. A discipline called allelopathy. In :

Allelopathy. Chapman & Hall, London.

SHAW, L. J., MORRIS, P. & HOOKER, J.E. 2006. Perception and modification of plant

flavonoid signals by rhizosphere microorganisms. Environmental Microbiology 8: 1867-1880

SLOVÁKOVÁ, L., LISKOVÁ, D., CAPEK, P., KUBACKOVÁ, M. & KARÁCSONYI, S. 2000.

Defence responses against TNV infection induced by galactoglucomannan-derived

oligosaccharides in cucumber cells. European Journal of Plant Physiology 106: 543-553.

SLOVÁKOVÁ, L., SUBKOVÁ, V. & FARKÁS, V. 1994. Influence of xyloglucan

oligosaccharides on some enzymes involved in the hypersensitive reaction to TNV (tobacco

necrosis virus) of cucumber cotyledons. Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten und

Pflanzenschutz 101: 278-285.

SUMAN, A., SHAHI, H.N., SINGH, P. & GAUR, A. 2002. Allelopathic influence of Vigna

mungo (black gram) seeds on germination and radical growth of some crop plants. Plant

Growth Regulation 38: 69-74.

THOMA, B.P.H.J., CAMMUE, B.P.A. & THEVISSEN, K. 2002. Plant defensins. Planta 216:

193-202.

TINÉ, M.A.S., CORTELAZZO, A.L. & BUCKERIDGE, M.S. 2000. Xyloglucan mobilization in

cotyledons of developing plantlets of Hymenaea courbaril L. (Leguminosae-

Caesalpinioideae). Plant Science 154: 117-126.

TYSKI, S., MARKIEWICZ, M., GULEWILZ, K. & TWARDOWSKI, T. 1988. The effect of

lupin alkaloids and ethanol extracts from seeds of Lupinus angustifolius on selected bacterial

strains. Journal of Plant Physiology 133: 240-242.

23 UREN, N.C. 2000. Types, amounts and possible functions of compounds released into the

rhizosphere by soil grown plants. In The Rhizosphere: Biochemistry and Organic Substances

at the Soil Interface . Pinton, R., Varanini, Z., Nannipieri, P. New York: Marcel Dekker. p.19-

40.

VAN STADEN, J. & GROBBELAAR, N. 1995. The effect of sesbanimide and Sesbania seed

extracts on germination and seedling growth of a number of plant species. Environmental and

Experimental Botany 35: 321-329.

VARGAS-RECHIA, C., REICHER, F., SIERAKOWSKI, M.R., HEYRAUD. A., GRIGUEZ, H.

& LIÉNART, Y. 1998. Xyloglucan octasaccharide XXLG derived from the seeds of

Hymenaea courbaril acts as a signaling molecule. Plant Physiology 116: 1013-1021.

VILLAGRASA, M., GUILLAMÓN, M., LABANDEIRA, A., TABERNER, A., ELJARRAT, E.

& BARCELÓ, D. 2006. Benzoxazinoid allelochemicals in wheat: distribution among foliage,

roots and seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54: 1009-1015.

VORWERK, S., SOMERVILLE, S. & SOMERVILLE, C. 2004. The role of plant cell wall

polysaccharide composition in disease resistance. Trends in Plant Science 9: 203-209.

WALKER, T.S., BAIS, H.P., GROTEWOLD, E. & VIVANCO, J.M. 2003. Root exudation and

rhizosphere biology. Plant Physiology 132:44–51.

WEIR, T.L., PARK, S.-W. & VIVANCO, J.M. 2004. Biochemical and physiological

mechanisms mediated by allelochemicals. Current Opinion in Plant Biology 7:472-479.

XUAN, T.D. & TSUZUKI, E. 2002. Varietal differences in allelopathic potential of alfalfa.

Journal of Agronomy and Crop Science 188: 2-7.

YORK, W.S., DARVILL, A.G. & ALBERSHEIM, P. 1984. Inhibition of 2,4-

dichlorophenoxyacetic acid-stimulated elongation of pea stem segments by a xyloglucan

oligosaccharide. Plant Physiology 75: 295-297.

24

2. Dinâmica da liberação, caracterização química e atividade

biológica de aleloquímicos exsudados por sementes de

Sesbania virgata (Cav.) Pers.

25 RESUMO

Sesbania virgata (Cav.) Pers é uma fabácea tropical de porte arbustivo (1-4 m de altura), nativa da América do Sul, que apresenta crescimento rápido e grande produção de sementes. As paredes celulares das células do endosperma dessas sementes são ricas em um polissacarídeo de reserva, o galactomanano, o qual é degradado após a germinação gerando grande quantidade de oligossacarídeos e monossacarídeos. Estudos prévios mostraram que os exsudatos das sementes de S. virgata exercem efeito inibidor sobre plântulas e fungos e que esse efeito é mais intenso durante a mobilização do galactomanano. O objetivo desse trabalho foi de avaliar a liberação e caracterizar quimicamente as principais substâncias inibidoras exsudadas pelas sementes de S. virgata , assim como de investigar a possível influência de oligossacarídeos derivados do galactomanano na produção desses metabólitos. As sementes S. virgata foram germinadas em câmaras climatizadas à 25º C e fotoperíodo de 12 h e seus exsudatos foram coletados em diferentes pontos do processo de embebição, sendo posteriormente submetidos à quantificação e análise quanto à composição de carboidratos por HPAEC/PAD. Além disso, a atividade fitotóxica dos exsudatos foi avaliada por bioensaios de fitotoxicidade com sementes de alface ( Lactuca sativa L.) e de tomate ( Solanum lycopersicum L.). Para o isolamento de compostos ativos, extratos dos exsudatos e extratos das sementes foram obtidos através de extrações com solventes orgânicos e foram fracionados em colunas de gel de sílica utilizando gradientes de diclorometano e MeOH. As frações coletadas foram analisadas por CCD e HPLC-MS e ensaiadas quanto a sua atividade fitotóxica em plântulas de Arabidopsis thaliana L. e de arroz ( Oryza sativa L.) cultivadas in vitro. A atividade antifúngica dos extratos e frações foi determinada pelo método de bioautografia utilizando o fungo Cladosporium sphaerospermum Pemzig. As substâncias isoladas foram identificadas e caracterizadas por H 1 RMN. Grandes quantidades de açúcares, como manose, galactose e sacarose são liberadas pelas sementes, principalmente, após o terceiro dia de

26 germinação. Substâncias fitotóxicas e antifúngicas são exsudadas logo no início do processo de embebição. A fitotoxina (+)-catequina foi isolada dos exsudatos das sementes de S. virgata . Este flavonóide está presente no tegumento das sementes e é liberado em altas concentrações após 24 horas de embebição. Quercetina também foi isolada de extratos das sementes e, assim como (+)- catequina está presente no tegumento. Entretanto, quercetina não é exsudada durante a germinação. (+)-Catequina exerceu fitotoxicidade aos tecidos radiculares de plântulas de A. thaliana e O. sativa . Outros compostos com atividade fitotóxica também são exsudados pelas sementes de S. virgata . Esses metabólitos são oriundos do tegumento das sementes e também do embrião, como, por exemplo, o alcalóide sesbanimida A detectado nos extratos dos exsudados das sementes, sendo um dos metabólitos secundários responsáveis também pela atividade inibidora do crescimento do fungo C. sphaerospermum. Sementes de S. virgata embebidas em soluções contendo fragmentos de galactomanano exsudaram maior quantidade de (+)-catequina do que as sementes embebidas apenas em água destilada. Esse efeito foi observado até 72 horas de incubação com oligossacarídeos, sendo mais intenso nas primeiras 24 horas de embebição. Os resultados obtidos nesse estudo mostraram que exsudação de substâncias antifúngicas e fitotóxicas pode representar uma vantagem adaptativa nestas sementes, contribuindo para o sucesso do estabelecimento inicial de plântulas de S. virgata . Além disso, este trabalho também demonstra que oligossacarídeos derivados de galactomanano podem agir como sinais capazes de desencadear respostas de defesa nas sementes de S. virgata .

27 ABSTRACT

Sesbania virgata (Cav.) Pers. is a tropical fast-growing shrub (1-4 m in height), native from

South America, that produce lots of seeds. The walls of the endospermic cells of the seeds of S. virgata contain galactomannan, a storage polysaccharide that is broken-down after germination, producing large amounts of oligosaccharides and monosaccharides. Previous studies evidenced that seed leachates of S. virgata showed inhibitory effects against plants and fungi, and that this effect was more intense during galactomannan mobilization. The aim of this work was to evaluate the exudation of inhibitory compounds from seeds of S. virgata , as well as to proceed their chemical characterization and to investigate the probable influence of galactomannan oligosaccharides in the production of these metabolites. Seeds of S. virgata were germinated at

25º C and photoperiod of 12 h, and the exudates were collected at different periods of the imbibition process and after that, the leachates were submitted to phytotoxic bioassays with seeds of lettuce ( Lactuca sativa L.) and tomato ( Solanum lycopersicum L.) and also analyzed by

HPAEC/PAD for the determination of their carbohydrate composition. For compound isolation, extracts of seeds and leachates were obtained in large amounts and fractionated in silica gel columns with different gradients of dichloromethane and methanol. The fractions collected were analyzed by CCD and HPLC-MS and assayed in vitro with seedlings of Arabidopsis thaliana L. and rice ( Oryza sativa L.). The antifungal activity of the extracts and fractions was determined by bioautography using spore suspension of Cladosporium sphaerospermum Pemzig. The isolated compounds were identified by 1H NMR. Large amounts of sugars, such as mannose, galactose, and sucrose were found in seed leachates after the third day of germination. Phytotoxic and antifungal substances are exuded at the beginning of the imbibition process. The phytotoxin (+)- catechin was isolated from the leachates of the S. virgata seeds. This flavonoid is present in

28 tegument of the seeds and it is released in high concentrations after 24 hours of imbibition.

Quercetin was also isolated from the seed extracts, and as (+)-catechin, it is present in the seed coat, although this molecule is not exuded during germination. (+)-Catechin showed phytotoxicity to radicle tissues of Arabidopsis thaliana L. Heynh and Oryza sativa L. (rice).

Others non-identified phytotoxic compounds are also exuded from S. virgata seeds. These metabolites are derived from the seed coat and also from the embryo, for example the alkaloid sesbanimide A, detected in the seed extracts and leachates. This secondary metabolite is also responsible for the growth inhibitory activity against the fungal Cladosporium sphaerospermum

Pemzig. Seeds of S. virgata imbibed in a galactomannan oligosaccharide solution exuded more

(+)-catechin than those maintained in distilled water. This effect was observed up to 72 hours of incubation with the oligosaccharides and it was more intense at the first 24 hours of imbibition.

Our results showed that the exudation of antifungal and phytotoxic compounds may represent an adaptative advantage to these seeds that contribute to S. virgata to successfully establish in the environment. Moreover, this work also demonstrates that oligosaccharides from galactomannan can act as signals able to promote defense responses in S. virgata seeds.

29 2.1 INTRODUÇÃO

A sobrevivência de sementes e plântulas depende, dentre outros fatores, das interações que ocorrem entre as mesmas e outros organismos presentes no ambiente. A liberação de metabólitos secundários capazes de inibir o crescimento de patógenos e de outras espécies vegetais competidoras no início da germinação (aleloquímicos) é um mecanismo adaptativo importante que pode influenciar a dominância, a sucessão de plantas e a formação de comunidades (Nelson, 2004).

A eficácia ecológica dos aleloquímicos exsudados por sementes durante a germinação depende da natureza química, localização histológica, quantidade e velocidade de liberação desses compostos (Ceballos et al ., 1998). Sementes e plântulas acumulam constitutivamente substâncias bioativas, muitas vezes na forma de precursores imediatos, capazes de repelir inimigos naturais (Graham, 1991, Ceballos et al ., 1998).

Os flavonóides constituem a classe química de metabólitos comumente encontrados em altas concentrações nos exsudatos de sementes germinantes, especialmente de Fabaceae, sendo geralmente acumulados no tegumento durante o desenvolvimento das sementes e liberados prontamente no início da embebição (Bekkara et al ., 1998, Ndakidemi & Dakora, 2003, Silva et al. , 2004). Além de atuar como fitotoxinas (Bais et al. , 2002), fitoalexinas e fitoanticipinas

(Dakora & Phillips, 1996), os flavonóides participam significativamente de interações mutualísticas na rizosfera, atuando como quimioatrativos para bactérias do gênero Rhizobium

(Caetano-Anolles et al. 1988). Metabólitos nitrogenados, tais como, alcalóides, aminoácidos e peptídeos, também são comumente encontrados nos exsudatos e tecidos de sementes de fabáceas, sendo associados a atividades de inibição do desenvolvimento de plantas e também à potente

30 inibição de crescimento de fungos e bactérias (Rosenthal et al. 1982, Tyski et al ., 1988,

Ndakidemi & Dakora, 2003).

S. virgata (sinonímia = Sesbania marginata Benth.) (Fabaceae) é uma espécie tropical da sub-família Faboideae (tribo Robinieae), nativa da América do Sul, que ocorre principalmente em beiras de estradas, campos alagáveis e em solos arenosos ou argilosos. S. virgata é perene, arbustiva, podendo atingir até 4 m (Figura 1). O florescimento e a frutificação podem ser iniciados quando a planta atinge 40 cm. Essa espécie produz grande quantidade de sementes que são dispersas ainda nos frutos indeiscentes que flutuam na água (Pott & Pott, 1994). S. virgata têm sido descrita como uma espécie invasora em solos úmidos e alagados, especialmente em plantações de arroz irrigado (Kissmann & Groth, 1999).

Braga & Buckeridge (1997) detectaram a presença de um potencial inibidor do crescimento radicular de alface e também substâncias fungitóxicas em exsudatos de sementes de

S. virgata . Rahal et al. (1998) e Rahal (2002) verificaram que durante o processo de germinação ocorre um aumento da produção de metabólitos secundários ativos, possivelmente em decorrência da ação indutora de oligossacarídeos gerados durante a mobilização do galactomanano (GM) presente no endosperma dessas sementes. A natureza química dos compostos bioativos produzidos por sementes de S. virgata , bem como a influência de oligossacarídeos derivados do GM na produção desses compostos não foram elucidados. Sabe-se apenas que para o gênero Sesbania foi relatada a ocorrência do alcalóide sesbanimida (Van

Staden & Grobbelaar 1995, Kim et al. , 1992, Powell et al. 1990, Powell et al. 1984); de proantocianidinas, catequinas e luteolina (Ceballos et al. 1998,) e ácido linoléico como inibidor do crescimento de plantas (Buta, 1983). Entretanto, não existem estudos que indiquem que estas substâncias sejam as responsáveis pela atividade biológica presente nos exsudatos de sementes de

S. virgata . Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi o de avaliar a liberação e caracterizar as

31 principais substâncias inibidoras exsudadas pelas sementes de S. virgata , assim como analisar a influência de oligossacarídeos derivados de galactomanano na produção desses metabólitos de defesa.

A

20 cm

B C

1 cm

D

1 cm 1 cm

Figura 1 . Sesbania virgata , hábito (A), folhas (B), flores (C) e sementes (D).

32 2.2 MATERIAL E MÉTODOS

2.2.1 Material biológico

• Sementes de S. virgata foram obtidas a partir de frutos coletados de indivíduos

encontrados na região urbana de São Bernardo do Campo, SP.

• Sementes de alface (L. sativa ) cv. Grand Rapids TBR e de tomate ( S. lycopersicum ) cv.

Santa Cruz Kada foram adquiridas no comércio local (Isla ).

• Sementes de A. thaliana variedade Columbia (Col-0) foram adquiridas de Lehle Seed Co.

(TX).

• Sementes de arroz irrigado ( O. sativa ) cultivar IAC 106 foram fornecidas pelo Instituto

Agronômico de Campinas, SP.

• Os fungos Aspergillus niger v. Tiegh. (SPC 1493), Cladosporium cladosporioides

(Fresen.) G.A. de Vries (SPC 140), C. sphaerospermum (SPC 491) e Fusarium solani (Mart.)

Sacc. (SPC 980) foram obtidos a partir de culturas fornecidas pela Micoteca do Instituto de

Botânica de São Paulo e foram mantidas em meio BDA (batata-dextrose-ágar), no escuro a

25ºC por 15 dias.

2.2.2 Germinação das sementes de S. virgata

Em todos os experimentos realizados, as sementes de S. virgata foram selecionadas por tamanho (em torno de 5 mm de comprimento) e cor do tegumento, apresentando peso médio de

90mg (±10). As sementes foram escarificadas, com o auxílio de uma lixa, na região acima do hilo

(lente), ou foram colocadas em um frasco hermeticamente fechado e agitadas vigorosamente em

33 moinho de bolas (na ausência da bola) por 10 minutos. Após escarificação, cinco, dez ou cinqüenta sementes foram distribuídas, respectivamente, em placas de Petri de 5, 9 ou 15 cm de diâmetro, contendo dois papéis de filtro umedecidos com água destilada na razão 0,7 mL/ semente e mantidas em câmara climatizada (Estufa BOD) a 25°C em 12 horas de luz. Nos experimentos de análise dos carboidratos exsudados e atividade indutora de oligossacarídeos derivados do galactomanano, as sementes foram germinadas em placas de Petri nas mesmas condições, porém sobre filtros de microfibra de vidro.

2.2.3 Obtenção dos exsudatos das sementes

Após início do processo de embebição, as sementes foram removidas das placas nos dias

1, 2, 3, 4, 5 e 6, período no qual compreende o processo de total embebição, germinação e mobilização dos compostos de reserva das sementes de S. virgata . Em todos os experimentos, os exsudatos foram coletados por lavagem dos papéis de filtro com água destilada, filtrados em membrana de nylon e os tiveram os volumes ajustados de acordo com o tamanho das placas de

Petri utilizadas em cada ensaio (10,5, 35 ou 105 mL para as sementes germinadas nas placas de

Petri de 5, 9 e 15 cm de diâmetro, respectivamente). Em todos os experimentos realizados, os exsudatos foram obtidos em triplicata.

2.2.4 Quantificação de proteínas e açúcares exsudados

Sementes de S. virgata foram germinadas em triplicata em placas de Petri de 5 cm de diâmetro (5 sementes/ placa) contendo filtros de microfibra de vidro. Alíquotas de 1 mL dos exsudatos de sementes obtidos a cada dia do processo germinativo foram submetidas a dosagens

34 de açúcares totais pelo método fenol-sulfúrico (Dubois et al. , 1956) e de açúcares redutores pelo método Somogyi-Nelson (Somogyi, 1945), sendo utilizada glucose como padrão; e também a dosagens de ácidos urônicos pelo método de Filisetti-Cozzi & Carpita (1991), utilizando ácido galacturônico como padrão. As proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford (1976), tendo albumina de soro bovino como padrão.

O restante dos exsudatos foi liofilizado, retomado em 2 mL de água destilada, centrifugado em micro-centrífuga a 5000 rpm, e o sobrenadante submetido à precipitação etanólica (4 vezes o volume), durante 48 horas a 5°C. Após precipitação, o material foi centrifugado a 2000 rpm, por 60 min a 5 °C. O sobrenadante foi recolhido com auxílio de uma pipeta Pasteur, concentrado até secura em roto-evaporador sob pressão reduzida (40º C), retomado em água destilada (2 mL) e submetido a análise de oligossacarídeos por HPAEC/PAD

(item 2.2.5). O precipitado foi seco em liofilizador, solubilizado em água quente, hidrolisado e analisado quanto à composição de monossacarídeos neutros em sistema HPAEC/PAD (item

2.2.5).

2.2.5 Análise da composição de açúcares por HPAEC/PAD

Alíquotas de 2 mg em equivalentes de açúcar do precipitado etanólico dos exsudatos, obtidas conforme item 2.2.4, foram hidrolisadas com 2 mL de ácido sulfúrico 72%, para a análise da composição dos monossacarídeos presentes nesta fração. A hidrólise foi realizada em ampolas seladas em autoclave a 121 ° C e 1,5 atm por 1 hora. Após neutralização do ácido com a adição de gotas de uma solução de NaOH 1M, as amostras foram filtradas em resinas Dowex Sigma catiônica (50 W x 8-100) e aniônica (1 x 8 – 100-Cl) e analisadas por cromatografia líquida de

35 troca aniônica de alta resolução com detector de pulso amperométrico (HPAEC/PAD) em coluna

Carbo-Pac PA1 em sistema Dionex ICS-3000. Os monossacarídeos foram eluídos isocraticamente com NaOH 20 mM e identificados por comparação dos tempos de retenção com padrões comerciais de fucose, arabinose, ramnose, galactose, glucose, manose e xilose (Sigma).

As análises de oligossacarídeos foram realizadas na fração sobrenadante dos exsudatos (item

2.2.4) sem hidrólise ácida prévia, sendo as amostras apenas filtradas em resinas Dowex, conforme descrito acima. A eluição dos oligossacarídeos foi realizada com NaOH 100 mM e os padrões comerciais utilizados para comparação foram mio-inositol, glucose, frutose, sacarose, rafinose e estaquiose (Sigma).

2.2.6 Bioensaios de fitotoxicidade em alface e tomate dos exsudatos liberados durante o processo germinativo

Bioensaios foram realizados preliminarmente utilizando como plantas-teste alface e tomate com finalidade de detectar a atividade fitotóxica dos exsudatos das sementes de S. virgata liberados durante o processo germinativo. Essas duas espécies foram escolhidas preliminarmente por serem comumente utilizadas para bioensaios de alelopatia.

a) Bioensaio de co-germinação com número crescente de sementes de S. virgata

Sementes de S. virgata , alface e tomate foram co-germinadas variando-se o número de semente de S. virgata para averiguar se os exsudatos obtidos destas sementes apresentavam efeito alelopático dose-dependente. Vinte sementes de tomate ou de alface foram distribuídas em placas de Petri (5 cm de diâmetro) contendo de 0 a 5 sementes de S. virgata . As sementes de S. virgata foram dispostas no centro das placas de Petri e as sementes das plantas-teste foram distribuídas de

36 maneira circular ao redor das sementes de S. virgata . As sementes foram embebidas em 3,5 mL de água destilada e as placas foram mantidas em câmara climatizada a 25 °C, sob 12 horas de luz.

Os ensaios foram realizados em triplicata e a distribuição das placas foi inteiramente casualizada dentro da câmara climatizada. Após 4 dias, as sementes das plantas-teste foram retiradas das placas de Petri e a porcentagem de germinação e o comprimento da radícula e do hipocótilo foram avaliados. Para a realização da análise estatística (item 2.2.13), os dados de porcentagem de germinação foram transformados em arcoseno (Labouriau, 1983).

b) Bioensaio com exsudatos obtidos de diferentes dias de embebição das sementes de S. virgata

Para avaliar se os efeitos alelopáticos dos exsudatos se intensificavam durante a germinação e mobilização de reservas das sementes de S. virgata , sementes de alface e tomate foram germinadas em placas de Petri contendo exsudatos de sementes de S. virgata obtidos de diferentes períodos do processo germinativo. Vinte sementes de tomate ou de alface foram distribuídas em placas de Petri (9 cm de diâmetro) contendo 7 mL de exsudatos de 10 sementes de S. virgata obtidos do 1º ao 6º dia de embebição. Para controle do ensaio, 20 sementes de cada planta-teste foram distribuídas em placas contendo apenas 7 mL de água destilada. O ensaio foi realizado em triplicata e as placas mantidas em câmara climatizada a 25 °C, sob 12 horas de luz, sendo a distribuição das placas inteiramente casualizada dentro da câmara climatizada. Após 3 dias da semeadura para alface e 4 dias para tomate, foi calculada a porcentagem de germinação e medido o comprimento da radícula e hipocótilo das plantas-teste. Os dados de porcentagem obtidos foram transformados em arcoseno (Labouriau, 1983) e submetidos à análise estatística

(item 2.2.13).

37 2.2.7 Isolamento e identificação dos compostos ativos

a) Obtenção dos extratos dos exsudatos das sementes de S. virgata

Exsudatos coletados de 6000 sementes de S. virgata embebidas em água destilada por 3 dias em placas de Petri (15 cm de diâmetro) foram reunidos, liofilizados e pesados (6 g). As seis mil sementes foram removidas das placas e separadas, com o auxílio de um bisturi, em tegumento, endosperma e embrião. O material separado foi liofilizado, triturado e submetido a extrações com EtOH comercial 80% por 3 vezes (1 g para 200 mL). Os extratos etanólicos foram secos sob pressão reduzida em roto-evaporador (40 °C) e armazenados em temperatura ambiente.

Extratos etanólicos também foram obtidos a partir de outras 6000 sementes de S. virgata intactas embebidas por 3 dias nas mesmas condições descritas acima. As sementes foram liofilizadas e trituradas previamente e submetidas à extração com EtOH 80%. Após secura dos extratos etanólicos das sementes intactas, das partes isoladas e dos exsudatos em roto-evaporador, os extratos secos foram retomados em 200 mL de água destilada e submetidos a partições por 3 vezes com o mesmo volume de (200 mL) Hex e posteriormente com AcOEt. As frações orgânicas foram evaporadas sob pressão reduzida em roto-evaporador (40º C). As frações aquosas foram liofilizadas, e os materiais secos obtidos foram extraídos com 200 mL de MeOH por 3 vezes. Os resíduos da extração metanólica foram armazenados a -20º C e a fração metanólica foi evaporada em roto-evaporador a 40º C (Figuras 2, 3 e 4).

b) Isolamento dos compostos ativos

A fração AcOEt (1,18 g) obtida dos exsudatos das sementes foi fracionada em coluna de gel de sílica 60 (0,063-0,200 mm) Merck (80 x 3 cm) utilizando um gradiente de MeOH e diclorometano (DCM) (0% → 100% de MeOH). A eluição foi realizada com 100 ml da mistura

38 dos solventes nas seguintes proporções de MeOH: 0, 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 50 e 100 %).

Foram coletadas 50 frações (20 mL cada), as quais tiveram os seus perfis analisados por cromatografia em camada delgada (CCD) em placas de sílica gel 60 F254 Merck desenvolvidas em DCM: MeOH 9:1, 8:1 e 7:1 (v/v). As placas foram visualizadas sob luz ultravioleta e após análise das mesmas as 50 frações foram reunidas em 10 frações (A-J) (Figura 2). A fração H foi analisada por 1H RMN (item c) e fracionada em um sistema de cromatografia “flash” (Still et al .,

1978) em coluna de gel de sílica (25 x 1cm) utilizando como solvente DCM:MeOH (9:1 v/v), sendo coletadas 28 novas frações, as quais foram analisadas novamente por CCD. A fração pura obtida ( 2) foi analisada por 1H RMN e por espectro de dicroísmo circular (CD) (item c).

A fração AcOEt (670 mg) obtida a partir de extratos etanólicos de sementes intactas de S. virgata (Figura 3) também foi submetida a separação em coluna de gel de sílica (20 x 2 cm), utilizando um gradiente de DCM e MeOH (0 →100% de MeOH). A eluição foi realizada com 80 mL da mistura dos solventes nas seguintes proporções de MeOH: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25,

30 e 100 %). Sessenta frações (15 mL) foram coletadas e agrupadas em 15 novas frações ( FS1-

15 ), de acordo com os perfis observados por CCD desenvolvidos sob as mesmas condições descritas acima. As frações FS3, FS4 e FS7 obtidas neste processo foram analisadas por 1H RMN

(item c).

c) Análises por ressonância magnética nuclear protônica ( 1H RMN) e espectro de dicroísmo circular (CD)

Compostos ativos presentes nas frações dos exsudatos e extratos das sementes de S. virgata foram identificados por 1H RMN (Varian INOVA 400-MHz) utilizando MeOH deuterado

(CD 3OD) como solvente. A atividade óptica da substância isolada (fração 2) foi obtida por espectro de dicroísmo circular (CD) em um espectrofotômetro Aviv modelo 202 e por

39 comparações com o espectro de um padrão de (+)-catequina comercial (Sigma). Essas análises foram efetuadas na Universidade Estadual do Colorado (EUA).

d) Análises das frações por HPLC-MS

As frações obtidas dos exsudatos de S. virgata (Figura 2) foram analisadas em coluna C18

Dionex Acclaim (150 x 4,6 mm) em um HPLC-MS constituído por um sistema Dionex de cromatografia líquida de alta resolução (com detector UV- UVD170U) acoplado a um espectrômetro de massas Thermo Finnigan Surveyor MSQ. As amostras foram eluídas usando

ácido acético (0,1%) em água (Eluente A) e 0,1% de ácido acético em MeOH (Eluente B) em um gradiente linear de 10% de B (3 min) até 90% de B (45 min) com vazão de 0,7 mL min -1. A detecção no ultravioleta foi de 280 nm. A ionização para as análises de espectrometria de massas foi realizada no modo positivo e negativo utilizando ionização por “electron-spray” com nitrogênio (80 psi), voltagem capilar de 3 kV e voltagem do cone de 70V.

40 Exsudato bruto

(6g)

Partição com Hex e AcOET Liofilização Extração com MeOH

Bioensaio com Hexano (6 mg) Acetato de etila (1,18 g) Metanol (1,5 g) Arabidopsis thaliana

Análise por HPLC-MS 1H RMN

Coluna de sílica gel (DCM:MeOH)

CCD

Análise por A B C D E F G H I J HPLC-MS (3mg) (24mg) (13 mg) (9,8mg) (8,4mg) (11mg) (134mg) (110mg) (177mg) (167mg) Bioensaio com

Arabidopsis thaliana

Coluna sílica gel 1 H RMN (cromatografia “flash”)

CCD

Frações 1...28 CCD

CD espectro Bioensaio com Frações 2 e 3 (23 e 17 mg) Arabidopsis thaliana 1 H RMN e Oryza sativa

Figura 2. Fluxograma do fracionamento e identificação de compostos ativos encontrados nos exsudatos de Sesbania virgata.

41

Extrato EtOH 80% das sementes intactas (17,27 g)

Evaporação sob pressão reduzida (40º C)

Fração aquosa

Partição com Hex e AcOEt Liofilização Extração com MeOH

Hexano (359 mg) Acetato de etila (670 mg) Metanol (1,45 g)

600 mg

Coluna de sílica gel (DCM:MeOH)

CCD

FS1 FS2 FS3 FS4 FS5 FS6 FS7 FS8 FS9 FS10 FS11 (29’mg) (17 mg) (3 mg) (22 mg) (4 mg) (4,5mg) (33 mg) (17,8mg) (5,2 mg) (6,6 mg) (22,7mg )

FS12 FS13 FS14 FS15 (20 mg) (20 mg) (74 mg) (147mg)

1 1H RMN H RMN Bioensaio com Arabidopsis thaliana

Figura 3. Fluxograma do fracionamento e identificação de substâncias presentes nos extratos das

sementes de Sesbania virgata .

42 6000 sementes de Sesbania virgata

Dissecção

Extrato EtOH Tegumento Extrato EtOH Endosperma Extrato EtOH Embrião (4 g) (3,11 g) (9 g)

Evaporação do EtOH Evaporação do EtOH

Fração aquosa Fração aquosa Fração aquosa

Partição com Hex e AcOEt Partição com Hex e AcOEt Liofilização Liofilização Extração com MeOH Extração com MeOH

Hexano (63,6 mg) Hexano (43,4 mg) Hexano (723,6 mg)

Acetato de etila (141,2 mg) Acetato de etila (8,2 mg) Acetato de etila (137,6 mg)

Metanol (4,5 g) Metanol (1,65 g) Metanol (3,35g)

Bioensaios com Arabidopsis thaliana

Figura 4. Fluxograma do fracionamento dos extratos dos diferentes tecidos das sementes de

Sesbania virgata (tegumento, endosperma e embrião) .

43 2.2.8 Quantificação de compostos bioativos nos tecidos e nos exsudatos das sementes durante o processo germinativo

Sementes de S. virgata (40 por placa de Petri) foram germinadas e a cada dia entre o início da embebição e término da germinação (1 a 6 dias) as sementes foram removidas das placas de Petri e seus tecidos foram separados em tegumento, endosperma e embrião e estes posteriormente, liofilizados e extraídos com EtOH 80% por três vezes (1g para 200 mL). Após evaporação do EtOH e água em roto-evaporador (40º C), os extratos foram solubilizados em 1 mL de água destilada e extraídos com 1 mL de AcOEt por 4 vezes. Após secos, os extratos foram solubilizados em MeOH e analisados por HPLC-MS (item 2.2.7 c). Os exsudatos obtidos das sementes a cada dia do processo germinativo também foram coletados, liofilizados e submetidos a extrações com AcOEt (4 vezes) e analisados por HPLC-MS (item 2.2.7 d). Os compostos foram quantificados utilizando padrões comerciais de (+)-catequina e quercetina Sigma e cromatografados em mesmas condições descritas acima.

2.2.9 Bioensaios de atividade fitotóxica com plântulas de A. thaliana

Embora os bioensaios preliminares de fitotoxicidade tenham sido realizados com alface e tomate, plântulas de A. thaliana foram utilizadas para o isolamento dos compostos fitotóxicos presentes nos exsudatos das sementes de S. virgata . Esses ensaios foram realizados no laboratório do Dr. Jorge M. Vivanco do Centro para Biologia da Rizosfera da Universidade Estadual do

Colorado (EUA), onde foi realizada parte deste trabalho. Essa espécie foi selecionada devido a sua sensibilidade a diferentes fitotoxinas (Pennachio et al ., 2005) e, adicionalmente, pelo fato de

44 ser um microensaio, o que permite o biomonitoramento da atividade fitotóxica com pequena quantidade dos extratos.

Plântulas de A. thaliana foram utilizadas para monitorar a atividade das substâncias ativas durante o processo de isolamento das mesmas devido a seu alto grau de sensibilidade a diferentes aleloquímicos (Pennachio et al ., 2005). Sementes de A. thaliana foram desinfetadas por 20 minutos em solução de hipoclorito de sódio comercial diluído a 20% (v/v) e lavadas por 4 vezes com água destilada autoclavada. As sementes foram germinadas em placas de Petri contendo meio basal Murashige & Skoog (1962) sólido (0,9% de agar, p/v), sob temperatura de 25 ºC e fotoperíodo de 16 horas. Após 5 dias, as plântulas foram transferidas para microplacas de cultura de tecidos com 12 poços de 2,5 cm de diâmetro x 2 cm de profundidade (1 plântula/poço), contendo 1 mL de meio MS líquido e mantidas em um agitador orbital sob 25 ± 2º C e 16 horas de luz. Após 1 dia, as frações obtidas da partição do exsudatos brutos e de extratos das sementes de S. virgata (Figuras 2, 3, 4), assim como padrões comerciais de (+)-catequina e quercetina

(Sigma, grau de pureza 98%) foram ensaiadas quanto à sua atividade fitotóxica em plântulas de

A. thaliana . As frações obtidas dos exsudatos e extratos das sementes, assim como padrões eventualmente utilizados em alguns ensaios foram dissolvidos em MeOH ou EtOH (conforme sua solubilidade) e aplicados (20 µL) em diferentes concentrações no meio MS. Como controle do ensaio foi aplicado nas plântulas o mesmo volume dos solventes utilizados (MeOH ou EtOH). Os ensaios foram realizados com o mínimo de 6 repetições e as plântulas foram mantidas sob agitação constante e tratamento por 7 dias, quando foram removidas dos poços das placas, fotografadas e tiveram as medidas de comprimento da raiz, biomassa da raiz e parte aérea e razão parte/raiz avaliadas.

45 2.2.10 Bioensaios de atividade fitotóxica com plântulas de O. sativa

Plântulas de O. sativa (arroz) foram utilizadas para testar a atividade da substância isolada dos exsudatos das sementes de S. virgata devido aos relatos existentes da invasão de S. virgata em cultivos de arroz. Sementes de arroz foram mergulhadas em EtOH 80% durante 30 segundos, rapidamente enxaguadas com água destilada autoclavada e submetidas à submersão em uma solução de hipoclorito de sódio comercial diluído a 30% (0,6% cloro ativo) durante 30 minutos. Na seqüência, as sementes foram enxaguadas novamente com água destilada autoclavada e por último imersas em solução de 0,2% do fungicida Derosal (Bayer) por 30 minutos, sendo em seguida lavadas por 4 vezes com água destilada autoclavada. As sementes foram germinadas em frascos de vidro de 250 mL contendo 20 mL meio basal MS sólido e mantidas a 25 ºC em fotoperíodo de 16 horas. Após 6 dias, as plântulas foram transferidas para tubos de ensaio contendo 1 mL de meio MS líquido e mantidas em um agitador orbital sob 25 ±

2º C e 16 horas de luz. Após 24 horas, a fração com alto grau de pureza ( 2) obtida dos exsudatos das sementes de S. virgata (Figura 2) ou (+)-catequina (Sigma, grau de pureza 98%) foram solubilizadas em MeOH e aplicadas (20 µL) em diferentes concentrações no meio MS das plântulas de arroz. Como controle do ensaio foi aplicado o mesmo volume de MeOH. Os ensaios foram realizados com 6 repetições e as plântulas foram mantidas sob agitação constante e tratamento por 7 dias, quando foram removidas dos tubos, fotografadas e tiveram medidas de biomassa da raiz e parte aérea e razão parte aérea/raiz avaliadas, como descrito para os ensaios com A. thaliana .

46 2.2.11 Detecção de substâncias antifúngicas

a) Bioautografia

Alíquotas de 100 µg de extratos obtidos por partição com AcOEt dos exsudatos de sementes de S. virgata do 1º ao 6º dia de embebição e das frações obtidas por cromatografia dos exsudatos de sementes do 3º dia de embebição (Frações A-J) foram submetidas à cromatografia em camada delgada em placas de sílica-gel 60 F254 Merck (CCD). As placas foram desenvolvidas em clorofórmio: MeOH (8:2 v/v), observadas sob luz ultravioleta (366 e 254 nm) e submetidas ao ensaio de bioautografia (Homans & Fuchs, 1970), utilizando uma suspensão de esporos do fungo C. sphaerospermum em meio líquido de sais e glucose. A suspensão de esporos do fungo foi aspergida sobre as cromatoplacas e estas foram incubadas a 26 °C, no escuro, por 72 horas. Padrões de (+)-catequina (Sigma) e sesbanimida A, gentilmente cedido pelo Dr. Martin

Wanner (van’t Hoff Institute of Molecular Sciences-University of Amsterdam, Netherlands), foram utilizados para comparação.

b) Bioensaios de microdiluição

Esses ensaios de atividade antifúngica foram realizados utilizando os fungos filamentosos

F. solani , A. niger e C. cladosporioides de acordo com as normas do NCCLS (National

Commitee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS, 2002). Culturas com 7 dias de idade, cultivadas a 28 ºC no escuro em meio de cultura Batata-Dextrose-Agar (BDA), tiveram seus esporos extraídos e suspensos em solução salina (NaCl 0,85%). A concentração de esporos em suspensão foi determinada e ajustada para 5x10 4 UFC mL -1 por contagem dos esporos em câmara de Neubauer. Em placas de ensaio com cavidades foram aplicados 200 µL de meio BDA (50ºC) e

47 100 µL das suspensões dos fungos e 100 µL de (+)-catequina isolada das sementes de S. virgata nas concentrações finais de 200, 100, 50, 25 e 12 µg ml -1. Como controle do ensaio foi utilizada a droga anfotericina B em diferentes concentrações (0,03 – 32 mg mL -1), DMSO e MeOH nas mesmas concentrações utilizadas para diluição da anfotericina B e da (+)-catequina, respectivamente. As placas foram mantidas em estufa no escuro a 28 ºC por 5 dias, para observação do crescimento dos fungos.

2.2.12 Obtenção e ensaios de atividade biológica de oligossacarídeos de galactomanano

a) Extração do galactomanano (GM)

Sementes de S. virgata foram desinfetadas com solução de hipoclorito de sódio comercial

10 % (0,2% de cloro ativo) por 10 min. Após lavagem abundante com água destilada, as sementes foram embebidas em um béquer com água destilada (0,7 mL/ por semente) durante 24 horas, a temperatura ambiente. Após embebição, os endospermas foram separados do tegumento e do embrião. Os endospermas isolados foram secos em liofilizador, moídos em moinho de bolas por aproximadamente 10 minutos, pesados e homogeneizados em água destilada (10 g por L) por 8 horas a 80 ºC. O extrato contendo o GM foi filtrado em náilon pele de ovo e submetido à precipitação com 3 volumes de EtOH comercial, durante 24 horas, a 4ºC. Após precipitação, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi coletado por filtração em náilon pele de ovo e lavado com EtOH puro e acetona. Após secagem à temperatura ambiente, o GM foi solubilizado em água destilada a 60ºC e centrifugado a 6000 g, sendo o sobrenadante coletado, liofilizado e pesado (Buckeridge & Dietrich, 1990).

48 b) Obtenção dos oligossacarídeos de GM por hidrólise ácida

O GM foi submetido à hidrólise ácida para obtenção de oligossacarídeos com diferentes graus de polimerização. A hidrólise foi realizada com ácido trifluoroacético (TFA) 0,4 M (1 g de

GM para 30 mL de TFA) durante 70 min, a 98º C em banho-maria em frascos de vidro (250 mL), de acordo com método descrito por Slovákova et al . (2000). Após a hidrólise, o ácido foi evaporado em roto-evaporador (50 ºC) até secura, e o material seco foi retomado em EtOH comercial, sendo novamente evaporado até secura e retomado em água destilada. O hidrolisado aquoso obtido foi submetido à precipitação com 3 volumes de EtOH comercial puro durante 48 horas a 4ºC. O sobrenadante foi coletado por filtração em náilon, seco em roto-evaporador, retomado em água destilada, liofilizado e denominado fração de oligossacarídeos de baixo peso molecular (OBPM). O material precipitado também foi liofilizado e denominado fração de oligossacarídeos de alto peso molecular (OAPM). Ambos (OBPM e OAPM) foram submetidos a dosagens de açúcares totais utilizando glucose como padrão (Dubois et al . 1956) e ácidos urônicos, tendo ácido galacturônico como padrão (Filisetti-Cozzi & Carpita, 1991).

c) Separação dos oligossacarídeos por cromatografia em coluna de exclusão molecular

Alíquotas de 100 mg mL -1 da fração OBPM foram separadas por cromatografia de exclusão molecular em coluna Bio Gel P-2 Fine (45-90 µm Bio Rad) com dimensões de 0,15 x

1,70 m e volume de 300 mL. A eluição dos oligossacarídeos foi realizada com água deionizada.

A calibração da coluna foi efetuada com padrões comerciais de diferentes massas moleculares

(manose, sacarose, rafinose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose e blue dextran) na concentração de 2 mg mL -1. O volume coletado de cada fração foi de 2 mL e a presença de oligossacarídeos foi detectada colorimetricamente por reação de fenol-sulfúrico

(Dubois et al ., 1956). As frações que continham açúcares foram reunidas de acordo com o perfil

49 cromatográfico em 8 frações denominadas de OGM (oligossacarídeos de galactomanano) 1 → 8, as quais foram posteriormente submetidas à quantificação do teor de açúcares totais (Dubois et al .

1956) e analisadas por HPAEC/PAD (item 2.2.5).

d) Ensaio de atividade biológica dos oligossacarídeos nas sementes de S. virgata

Sementes de S. virgata foram embebidas em 3,5 mL de soluções da fração OBPM nas concentrações de 0,5, 1, 2, 5 e 10 mg mL -1 em placas de Petri 5 cm de diâmetro, contendo filtros de microfibra de vidro. Após 3 dias de embebição, as sementes foram removidas e utilizadas para avaliação de sua massa fresca e seca. Os exsudatos foram coletados das placas e os volumes dos mesmos ajustados para 15 mL. Em um segundo experimento, sementes foram embebidas em 5 mg mL -1 da fração OBPM e a cada dia as sementes foram removidas das placas e embebidas em nova solução da fração OBPM; os exsudatos das mesmas foram coletados a cada intervalo de tempo. Os ensaios foram realizados em triplicata e o controle negativo foi efetuado com sementes embebidas apenas em água destilada. Os exsudatos obtidos foram analisados conforme descrito no item e a seguir.

e) Análises dos exsudatos por HPLC

Os exsudatos coletados foram extraídos por 4 vezes em mesmo volume (15 mL) com

AcOEt. Após evaporação do AcOEt, os extratos foram retomados em 1 mL de MeOH e filtrados em filtros Millipore de 45 µm. As amostras foram aplicadas (20 µL) em coluna C18 em sistema de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography-HPLC)

Varian, sendo a separação realizada em gradiente linear com água e MeOH acidificados com

0,1% de ácido acético (20% → 100 % MeOH, vazão de 0,8 mL min -1). A detecção dos

50 compostos no ultravioleta foi de 280 nm. (+)-Catequina (Sigma) foi utilizada como padrão em diferentes concentrações para detecção e quantificação dessas substâncias nas amostras.

2.2.13 Análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando os programas Winstat (R. Fitch Software), Bioestat

3.0 (Sociedade Civil Mamirauá, MCT/CNPq) e Sodek. As médias foram submetidas à ANOVA e teste a posteriori de Tukey (P < 0,05).

51 2.3 RESULTADOS

2.3.1 Açúcares e proteínas exsudados por sementes de S. virgata

Açúcares redutores, ácidos urônicos e material protéico foram detectados nos exsudatos das sementes de S. virgata no início do processo de embebição e durante a germinação (Figura 5).

As concentrações dos açúcares e proteínas exsudados não aumentaram até o 3 º dia, havendo porém um incremento considerável no teor de açúcares totais a partir do 4º dia pós-embebição.

As análises dos monossacarídeos neutros por HPAEC/PAD mostraram que no 1º e 2º dias de embebição das sementes os principais açúcares encontrados no precipitado etanólico após hidrólise ácida foram glucose, arabinose e galactose (Tabela 1). Ramnose foi detectada apenas a partir do 2º dia. Após o 3º dia, ocorreu um aumento das proporções de galactose e manose nos exsudatos acompanhado por redução na abundância relativa de glucose.

As análises da fração sobrenadante resultante da precipitação etanólica dos exsudatos mostraram que glucose, frutose e mio-inositol foram os monossacarídeos livres exsudados em maior quantidade pelas sementes no 1º dia de germinação (Tabela 2). Manose e galactose também foram exsudadas, entretanto, em maior quantidade no 3º dia de embebição das sementes.

Oligossacarídeos como maltose, rafinose e estaquiose não foram detectados nos exsudatos, porém sacarose, que foi encontrada em pequenas quantidades nos primeiros dias, apresentou grande aumento após o 3º dia de embebição das sementes (Tabela 2).

52

500 açúcares redutores ácidos urônicos 400 açúcares totais proteínas 300

200 g por g semente µ 100

0

1d 2d 3d 4d 5d 6d

Dias após embebição

Figura 5 . Quantificação dos açúcares e proteínas exsudados por sementes de Sesbania virgata durante o processo germinativo. As barras representam o desvio padrão das médias de triplicatas.

53 Tabela 1. Abundância relativa (%) de monossacarídeos neutros após hidrólise ácida do precipitado etanólico dos exsudatos de sementes de Sesbania virgata durante o processo germinativo (1º ao 6º dia) obtida por análise de HPAEC/PAD.

Abundância relativa (%) de monossacarídeos neutros

Exsudados Fuc Ara Ram Gal Glc Xil Man

1º dia 1,0 25,0 ND 19,0 55,0 ND ND

2º dia 1,0 18,0 18,0 15,0 39,0 6,0 3,0

3º dia 0,3 9,0 0,7 22,0 25,0 2,0 41,0

4º dia 1,0 5,0 2,0 27,0 10,0 3,0 52,0

5º dia 0,2 2,0 14,0 14,0 21,0 0,8 48,0

6º dia 1,0 7,0 3,0 24,0 23,0 3,0 39,0

Controle* ND ND ND ND ND ND ND

* hidrolisado do precipitado da água coletada da lavagem de placas contendo apenas filtro de microfibra de vidro.

Fuc = fucose, Ara = arabinose, Ram = ramnose, Gal =galactose, Glc = glucose, Xil = xilose, Man = manose e ND = não detectado.

54 Tabela 2. Quantificação de monossacarídeos neutros e oligossacarídeos do sobrenadante resultante da precipitação etanólica dos exsudatos de sementes de Sesbania virgata obtidos durante o processo germinativo (1º ao 6º dia) por HPAEC/PAD. Dados entre parênteses referem- se à abundância relativa em %.

Oligossacarídeos e monossacarídeos em µg/ semente (abundância relativa em %)

Exsudatos Ino Glc Gal Man Fru Sac Total

1º dia 12,2 (11,5) 70,7 (66,3) 3,2 (3) 9,6 (9) 9,7 (9) 0,97 (1) 106,3

2º dia 0,4 (18) 0,6 (27) ND 0,6 (27) 0,4 (16) 0,23 (12) 2,2

3º dia 4,1 (5) 27,6 (33) 10,2 (12) 10,3 (12) 3,4 (4) 28,5 (34) 84,1

4º dia 2,2 (2) 0,6 (0,5) 5,2 (4) 6,6 (5,5) 5,7 (5) 102,2 (83) 122,5

5º dia 3,1 (5) 4,3 (7) 5,4 (8) 6,2 (9) 5,0 (8) 40,9 (63) 64,8

6º dia 3,8 (3) 0,7 (0,5) 1,2 (1) 12,5 (11) 0,58 (0,5) 97,0 (84) 115,5

Controle* ND ND ND ND ND ND ND

* hidrolisado do precipitado da água coletada da lavagem de placas contendo apenas filtro de microfibra de vidro.

Ino = mio-inositol, Gal =galactose, Glu = glucose, Man = manose, Fru = frutose, Sac= sacarose e ND = não detectado.

2.3.2 Fitotoxicidade dos exsudatos em sementes de alface e tomate

Nos experimentos nos quais foi utilizado o número variável de sementes de S . virgata por placa de Petri (0-5 sementes) (Figura 6) foi verificado que apenas a germinação de tomate foi afetada pelo aumento da quantidade de sementes (Figura 6 A e B). Entretanto, redução do comprimento da radícula e do hipocótilo foi observado para alface e tomate ao se aumentar a quantidade de sementes de S. virgata co-germinadas (Figura 6 C-F).

55 Nenhuma influência dos exsudatos obtidos das sementes de S. virgata (1° ao 6° dia pós- embebição) foi observada na germinação das sementes de alface (Figura 7A), o que confirma os dados da Figura 6 A. Entretanto, o crescimento do sistema radicular foi afetado a partir do 1° dia de embebição (Figura 7B), sendo o efeito inibitório mais intenso observado a partir da degradação do galactomanano que ocorre por volta do 3° dia após a embebição. Todos os tratamentos afetaram significativamente o crescimento dos hipocótilos de alface, contudo, não houve efeito fitotóxico tempo-dependente dos exsudatos de S. virgata como observado para a radícula de alface (Figura 7B).

Para sementes de tomate, os dados de porcentagem de germinação mostram efeito inibitório com os exsudatos de sementes do 2º e 4º dias após a embebição (Figura 8A). Conforme observado em alface (Figura 7B), também foi verificada redução do crescimento radicular de tomate em todos os tratamentos (Figura 8B), já com exsudatos do 1º dia pós-embebição (Figura

8B). O comprimento do hipocótilo de tomate foi afetado significativamente com exsudatos obtidos do 2º e 4º dias pós-embebição (Figura 8B).

56 Alface Tomate A B 100 a a a a a a a 100 80 a 80 b ab 60 60 b b 40 40

Germinação(%) 20 20

0 0 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5

1,2 a C 2,0 D

a 0,9 b 1,5 (cm) b b 0,6 b 1,0 b

c c Hipocótilo 0,3 0,5 c c d 0,0 0,0 -1 0 1 2 3 4 5 -1 0 1 2 3 4 5

3,5 6,0 a E a F 3,0 5,0 2,5 4,0 2,0 b 3,0 1,5 b bc 1,0 b 2,0 Radícula(cm) cd bc 0,5 d 1,0 c c c 0,0 0,0 -1 0 1 2 3 4 5 -1 0 1 2 3 4 5 Nº de sementes de S. virgata /placa Nº de sementes de S. virgata /placa

Figura 6. Efeito do número de sementes de Sesbania virgata na germinação (A e B), no comprimento dos hipocótilos (C e D) e comprimento das radículas (E e F) de sementes de alface

(Lactuca sativa ) e tomate ( Solanum lycopersicum ), respectivamente. As barras representam o desvio padrão das médias. Letras diferentes representam diferenças significativas (ANOVA,

P<0,05, teste a posteriori Tukey).

57 A

100

80

60

40 Germinação (%) 20

0 B

o 0,9 a 0,6 b b b b

Hipocótil 0,3 b b 0,0

(cm) -0,3 d -0,6 cd d -0,9

Radícula -1,2 b bc bcd

-1,5 -1,8 a -2,1 C 1d 2d 3d 4d 5d 6d C 1º 2º 3º 4º 5º 6º

Dia

Figura 7. Ensaio de fitotoxicidade de exsudatos de sementes Sesbania virgata obtidos em diferentes períodos do processo germinativo (1º ao 6º d) sobre sementes e plântulas de alface

(Lactuca sativa ). ( A) Efeito na germinação das sementes e ( B) no comprimento do hipocótilo e radícula das plântulas. O tratamento C equivale ao controle do ensaio. Os valores representam médias das triplicatas do ensaio. As barras representam o desvio padrão das médias. Letras diferentes representam diferenças significativas (ANOVA, P<0,05, teste a posteriori Tukey).

58 A 100 a

80 ab ab ab ab 60 b

40 Germinação (%)

20 c

0 B

0,6 a ab ab 0,3 ab b ab c Hipocótilo 0,0 -0,3

(cm) c bc bc -0,6 bc bc -0,9 b

-1,2

Radícula -1,5 -1,8 a -2,1 C 1° 2º 3° 4º 5° 6° Dia

Figura 8. Ensaio de fitotoxicidade de exsudatos de sementes Sesbania virgata obtidos em diferentes períodos do processo germinativo (1º ao 6º d) sobre sementes e plântulas de tomate

(Solanum lycopersicum ). ( A) Efeito na germinação das sementes e ( B) no comprimento do hipocótilo e radícula das plântulas. O tratamento C equivale ao controle do ensaio. Os valores representam médias das triplicatas do ensaio. As barras representam o desvio padrão das médias.

Letras diferentes representam diferenças significativas (ANOVA, P<0,05, teste a posteriori

Tukey).

59 2.3.3 Identificação das substâncias fitotóxicas dos exsudatos e extratos das sementes

Esta parte do trabalho foi realizada no laboratório do Dr. Jorge M. Vivanco do Centro para

Biologia da Rizosfera da Universidade Estadual do Colorado (EUA), utilizando A. thaliana , espécie selecionada pelo pesquisador como planta-teste para todos os ensaios de fitotoxicidade realizados no seu laboratório.

O exsudato bruto e as frações dele resultantes mostraram-se tóxicos às plântulas de A. thaliana na concentração de 200 µg mL -1 (concentração inicialmente sugerida para os ensaios,

Dr.Vivanco, comunicação pessoal) (Figura 9). Os extratos exerceram efeitos similares na parte aérea e no sistema radicular das plântulas, reduzindo a biomassa e o comprimento da raiz. Além disso, as raízes das plântulas tratadas com o extrato apresentaram aspecto escuro e danificado

(dados não mostrados). As plântulas tratadas com o extrato Hex e AcOEt apresentaram maior razão parte aérea/raiz, o que indica efeito mais acentuado desses extratos sobre as raízes de A. thaliana (Figura 9D).

Espectros de H 1 RMN indicaram a presença da fitotoxina catequina no extrato AcOEt.

Considerando que esse extrato apresentou bom rendimento e atividade promissora, ele foi selecionado para o processo de purificação dos metabólitos ativos. O fracionamento em coluna de gel de sílica resultou em 10 frações ( A-J) (Figura 2). Todas as frações inibiram o crescimento das plântulas de A. thaliana na concentração de 200 µg mL -1 (Figura 10). As frações A-D tiveram efeitos mais drásticos nas plântulas, com despigmentação da parte aérea e morte (dados não mostrados). As demais frações, especialmente as frações H e I, também foram muito tóxicas e inibiram principalmente o desenvolvimento das raízes, conforme indicado pela maior razão parte aérea/raiz, mostrada na Figura 10D.

60 A Tabela 3 mostra a razão massa/carga obtida por análises de HPLC-MS de alguns íons detectados nos cromatogramas das frações A-J. Nas frações A a D, que causaram mortalidade das plântulas de A. thaliana , os picos majoritários foram o 1 (Fração A), o 7 (Fração C) e o 11

(Fração D). Nas frações E e F os principais picos foram 15 e 16. As frações G e H apresentaram alto grau de pureza e o principal metabólito constituinte dessas frações apresentava m/z 291

(Picos 19 e 21, Tabela 3).

61

0,08 A 5,0 B a a

4,0 0,06

3,0 b b 0,04 b b 2,0

b 0,02 b b

Biomassa parteda aérea (g) b 1,0

Comprimento da raiz (cm)

0,0 0,00 Controle Bruto Hex AcOEt MeOH Controle Bruto Hex AcOEt MeOH

a C D 0,020 C 200

0,015 150

0,010 100

0,005 Parte aérea: raiz Biomassa da raiz (g) 50 b b b b 0,000 0 Controle Bruto Hex AcOEt MeOH Controle Bruto Hex AcOEt MeOH

Figura 9. Biomassa da parte aérea ( A), comprimento da raiz ( B), biomassa da raiz ( C) e razão parte aérea: raiz ( D) de plântulas de Arabidopsis thaliana cultivadas durante 7 dias em meio MS líquido contendo 200µg mL -1 de exsudato bruto (Bruto) das sementes de Sesbania virgata (3º dia) ou de suas frações obtidas por partição em hexano (Hex), acetato de etila (AcOEt) e metanol

(MeOH) . O controle refere-se ao tratamento apenas com MeOH, que foi utilizado para solubilizar os extratos. As barras indicam o desvio padrão das médias (n= 9). As letras diferentes representam diferenças significativas por ANOVA, p<0,05, teste a posteriori Tukey.

62 B

0,06 A 5,0 A a (g) 0,05 A 4,0 a B 0,04 B 3,0 b parte aérea 0,03 2,0 0,02 b 1,0 0,01 Comprimentoda raiz(cm) Biomassada 0,0 0,00 I J F I A B C D E H G J E F B C D H A G EtOH EtOH MeOH MeOH D 0,015 C 80

A 0,012 60 a 0,009 40 B 0,006 teaérea: raiz Par 20 Biomassada raiz(g) 0,003 b

0 0 I J F I H A B C D E G J F A B C D E H G EtOH MeOH EtOH MeOH Controle Controle

Figura 10. Biomassa da parte aérea ( A), comprimento da raiz ( B), biomassa da raiz ( C) e razão parte aérea: raiz (D) de plântulas de Arabidopsis thaliana crescidas por 7 dias em meio MS líquido contendo as frações A-J coletadas por cromatografia dos exsudatos das sementes de

Sesbania virgata . Cada fração foi aplicada na concentração de 200 µg mL -1 de MS. O tratamento com EtOH refere-se ao controle das frações A-D, e o tratamento com MeOH refere-se aos controle das frações F-J. As barras representam o desvio padrão das médias (n=6). As letras diferentes representam as diferenças significativas entre os tratamentos e seus respectivos controles (ANOVA, teste a posteriori Dunnet’s, P<0,05).

63 Tabela 3. Massa molecular de alguns picos selecionados e detectados em frações obtidas dos exsudados das sementes de Sesbania virgata em sistema HPLC-MS.

Fração Picos majoritários Tempo de retenção (min) Razão massa/carga (m/z)* nos cromatogramas

A 1 21.82 165 2 25.50 329,359, 389 3 31.06 271, 301 B 4 14.62 166, 223, 253 5 23.86 138, 177, 273, 301 C 6 21.65 327, 387, 357, 435, 513 7 23.45 123, 167, 243, 271, 301 8 24.85 259, 287, 347, 317, 403 9 26.11 273, 317, 361, 167 D 10 14.45 231, 271, 11 22.77 134, 193, 285, 303 12 25.43 271, 287, 360, 365 13 27.85 287, 365 E 14 18.03 303, 405 15 21.72 285, 303 16 28.43 151, 365 F 17 21.95 285, 303 18 23.25 303, 291 G 19 15.68 139, 291 20 19.52 139, 291 H 21** 14.66 139,291 22 18.80 139, 291 23 24.35 387, 577 I 24 20.36 567 25 21.24 573 J 26 25.46 577

* Obtida em modo de ionização positivo.

** Catequina.

64 O espectro de 1H RMN (ver anexo 2) da fração H revelou que ela era composta principalmente pelo flavonóide catequina. A fração H foi re-cromatografada em coluna de sílica gel (Figura 2) e 20 novas frações foram coletadas, sendo que em duas delas (Frações 2 e 3), que apresentavam alto grau de pureza, foi identificada catequina. A determinação da atividade óptica pelo espectro de dicroísmo circular revelou tratar-se do enantiômero (+)-catequina, apresentando mesmo sinal negativo no comprimento de 280 nm do padrão comercial (Figura 11).

Diferentes concentrações de (+)-catequina isolada das sementes de S. virgata foram ensaiadas em A. thaliana e sua atividade foi comparada ao padrão de (+)-catequina comercial. Os resultados obtidos pelas análises estatísticas dos dados encontram-se na Tabela 4. Diferenças entre (+)-catequina comercial e (+)-catequina derivada de S. virgata foram notadas apenas para alguns parâmetros de crescimento. Redução da biomassa da parte aérea foi observada a partir da concentração de 50 µg mL -1 para as duas fontes de (+)-catequina (Figura 12 A). O comprimento da raiz foi afetado, por sua vez, significativamente apenas a partir da aplicação de 100 µg mL -1 de

(+)-catequina derivada de S. virgata e a partir de 200 µg mL -1 de (+)-catequina comercial (Figura

12 B). Diferenças significativas na biomassa da raiz ocorreram com o tratamento de (+)-catequina a partir da concentração 50 µg mL -1 (Figura 12B). As concentrações de 200 e 500 µg mL -1 foram extremamente tóxicas às raízes de A. thaliana , conforme indicam os dados da razão parte aérea/raiz (Figura 12 D), além disso, estas concentrações causaram escurecimento das raízes, total inibição do desenvolvimento de raízes laterais e redução da biomassa (Figuras 12C e 13).

65 A

OH

HO O OH

OH

OH (+)-catequina

B

20 (+)Catequina catequina Comercial Sigma 15 catequinaCatequina Sesbania de Sesbania virgata

10

5

]

Θ 0 [

-5

-10

-15

-20 240 280 320 360 400

(nm)

Figura 11. Estrutura ( A) e espectro de dicroísmo circular (CD) ( B) do flavonóide (+)-catequina de fonte comercial (Sigma) e isolada dos exsudatos das sementes de Sesbania virgata.

66 Tabela 4 . Análise de variância fatorial (2x5) dos dados obtidos pelo bioensaio de atividade fitotóxica com plântulas de Arabidopsis thaliana com diferentes concentrações de (+)-catequina comercial e derivada de sementes de Sesbania virgata .

G.L Q.M p Biomassa da parte aérea Fonte de (+)-catequina ( S. virgata e comercial) 1 0,00087 0,66815 Concentração 4 0,00439 0,00001 Fonte de catequina x concentração 4 0,00022 0,06045 Resíduo 50 0,00009

Comprimento da raiz Fonte de (+)-catequina 1 3,85067 0,00025 Concentração 4 7,95233 0,00001 Fonte de (+)- catequina x concentração 4 0,55566 0,04654 Resíduo 50 0,21387

Biomassa da raiz Fonte de (+)-catequina 1 42,47404 0,00473 Concentração 4 410,48465 0,00001 Fonte de catequina x concentração 4 9,98040 0,09674 Resíduo 50 4,80242 G.L = grau de liberdade, Q.M= quadrado médio, p= significância.

67 A B 0,080 a 5,0 aA

0,060 b 4,0 bB bA b 3,0 b bA 0,040 bcB cB 2,0 d 0,020

Biomassada parte aérea (g) 1,0 Comprimentoda raiz(cm)

0,000 0,0 Controle 50 100 200 500 Controle 50 100 200 500 C D 0,020 100 a

0,016 80

0,012 b 60

b 0,008 40

Parteaérea/ raiz c Biomassada raiz(g) 0,004 20 c

0,000 0 Controle 50 100 200 500 Controle 50 100 200 500 -1 µg mL µg mL -1

Figura 12. Biomassa da parte aérea ( A), comprimento da raiz ( B), biomassa da raiz ( C) e razão parte aérea: raiz (D) de plântulas de Arabidopsis thaliana cultivadas durante 7 dias em meio MS líquido contendo diferentes concentrações de (+)-catequina isolada dos exsudatos de Sesbania virgata (□) ou (+)-catequina comercial ( ■). As barras indicam o desvio padrão das médias (n=6).

Letras minúsculas comparam as médias entre as concentrações (Controle = 0 µg mL -1) e as letras maiúsculas comparam os tratamentos entre as duas fontes de (+)-catequina (comercial e derivada de Sesbania virgata ) (teste a posteriori Tukey, P<0,05).

68

1 cm

-1 -1 Con trol e 50 µg mL -1 100 µg mL -1 200 µg mL 500 µg mL

Figure 13. Fitotoxicidade de diferentes concentrações da (+)-catequina exsudada de sementes de

Sesbania virgata. As setas indicam as raízes menores e escurecidas mostrando o efeito fitotóxico típico da (+)-catequina nos tecidos das raízes de Arabidopsis thaliana descrito por Bais et al .

(2002, 2003). Após o 7º dia de crescimento, as raízes das plântulas controle estavam claras e havia presença de raízes laterais diferentemente das raízes tratadas com (+)-catequina, que estavam mortas.

69 (+)-Catequina comercial e derivada de S. virgata também foram ensaiadas quanto sua toxicidade em plântulas de arroz, considerando que existem relatos da invasão de S. virgata em plantações de arroz irrigado. Os resultados obtidos pela análise estatística dos dados com plântulas de arroz encontram-se na Tabela 5. Diferenças entre as fontes de (+)-catequina foram notadas apenas na biomassa da parte aérea, especificamente na concentração de 50 µg mL -1 com catequina comercial, que estimulou o crescimento (Tabela 5, Figura 14A). Não foi observada redução da biomassa da parte aérea pela adição de (+)-catequina ao meio de cultivo (Figura 14A).

Diferenças significativas do comprimento da raiz das plântulas em relação ao controle foram encontradas apenas para o tratamento com 500 µg mL -1 (Figura 14 B). Reduções significativas da biomassa do sistema radicular ocorreram a partir de 100 µg mL -1 de (+)-catequina (Figura 14C).

As raízes das plântulas de arroz tratadas com (+)-catequina também ficaram mais escuras que as do controle (Figura 15), assim como observado para A. thaliana (Figura 13). A razão parte aérea/raiz das plântulas tratadas com 200 e 500 µg mL -1 de (+)-catequina comercial e derivada de

S. virgata indicaram que o efeito foi mais intenso nas raízes de arroz.

70 Tabela 5. Análise de variância fatorial (2x5) dos dados obtidos pelo bioensaio de atividade fitotóxica com plântulas de Oryza sativa com diferentes concentrações de (+)-catequina comercial e derivada de sementes de Sesbania virgata .

G.L Q.M p Biomassa da parte aérea Fonte de (+)-catequina ( S. virgata e comercial) 1 0,005358 0,00008 Concentração 4 0,007328 0,00001 Fonte de catequina x concentração 4 0,005664 0,00001 Resíduo 50 0,000232

Comprimento da raiz Fonte de (+)-catequina 1 0,0005992 0,95833 Concentração 4 0,9077931 0,00739 Fonte de (+)- catequina x concentração 4 0,798106 0,54264 Resíduo 50 11.4590840

Biomassa da raiz Fonte de (+)-catequina 1 0,0564843 0,85599 Concentração 4 27,6160616 0,00001 Fonte de catequina x concentração 4 0,7751290 0,79508 Resíduo 50 1,8437319 G.L = grau de liberdade, Q.M= quadrado médio, p= significância.

71

A B 0,08 2,0 a ab ab bA ab

0,06 1,5 b aA aA aB aA 1,0

0,04 toda raiz(cm) aB

0,02 0,5 Biomassada parte aérea (g) Comprimen

0,00 0,0

Control 50 100 200 500 Control 50 100 200 500 D C 0,009 15 a 0,008 ab 12

0,006 b bc 9 0,005 c 6 0,003 Parteaérea/ raiz Biomassada raiz(g)

0,002 3

0,000 0 Control e 50 100 200 500 Control 50 100 200 500 -1 µg mL µg mL -1

Figura 14. Biomassa da parte aérea ( A), comprimento da raiz ( B), biomassa da raiz ( C) e razão parte aérea: raiz ( D) de plântulas de arroz irrigado (Oryza sativa ) (IAC-106) cultivadas durante 7 dias em meio MS líquido contendo diferentes concentrações de (+)-catequina isolada dos exsudatos de Sesbania virgata (□) e (+)-catequina comercial ( ■). As barras indicam o desvio padrão das médias (n=6). Letras minúsculas comparam as médias entre as concentrações

(Controle = 0 µg mL -1) e as letras maiúsculas comparam os tratamentos entre as duas fontes de

(+)-catequina (comercial e derivada de Sesbania virgata ) (teste a posteriori Tukey, P<0,05).

72

1 cm

Controle 50 µg mL -1 -1 -1 -1 100 µg mL 200 µg mL 500 µg mL

Figura 15. Fitotoxicidade de diferentes concentrações da (+)-catequina exsudada de sementes de

Sesbania virgata em plântulas de arroz ( Oryza sativa ) após 7 dias de tratamento . As setas indicam as raízes e menores e escurecidas em comparação a planta controle.

73 (+)-Catequina também foi isolada do extrato de sementes intactas de S. virgata (extrato

AcOEt, Figura 3). Este extrato foi fracionado em coluna de gel de sílica (segundo item 2.8.1 b) e dois compostos foram isolados e identificados por 1H RMN, a (+)-catequina ( FS7 , 33 mg) e quercetina ( FS3 e FS4 , 3 e 22 mg). Quercetina também foi altamente fitotóxica para as plântulas

A. thaliana reduzindo a biomassa da raiz e parte aérea em concentrações de 50 µg mL -1 (dados não mostrados).

Após análises por HPLC-MS, ambos flavonóides foram detectados apenas no tegumento das sementes (dados não mostrados). Entretanto, somente a (+)-catequina é rapidamente exsudada em grandes quantidades pelas sementes de S. virgata (Figura 16). Cerca de 235 µg de

(+)-catequina por semente são exsudados logo no 1º dia de embebição, havendo decréscimo a partir do 2º dia. Redução nos teores de catequina e de quercetina foi observada no tegumento ao longo da germinação.

Dados referentes ao bioensaio com plântulas de A. thaliana com os extratos Hex, AcOEt,

MeOH (Figura 4), indicaram que substâncias fitotóxicas estão presentes também no endosperma e embrião das sementes (Figura 17). A maioria dos extratos ensaiados na concentração de 200 µg mL -1 afetou drasticamente o acúmulo de biomassa da parte aérea das plântulas, com exceção do extrato Hex do tegumento das sementes, o qual não mostrou diferença em relação ao controle realizado com EtOH. As plântulas controle tratadas apenas com EtOH foram afetadas por esse solvente neste ensaio, mas esse fato não interferiu na detecção dos efeitos fitotóxicos dos extratos

Hex de S. virgata sendo possível notar as diferenças entre esses tratamentos. Os extratos das sementes de S. virgata também reduziram a biomassa e comprimento das raízes das plântulas de

A. thaliana (Figura 17).

74

260 (+)-Catequina exsudato (+)-Catequina casca 208 Quercetina exsudato

Quercetina casca 156

104

gpor semente µ µ µ µ

52

0 1d 2d 3d 4d 5d 6d

Figure 16. Quantificação de quercetina e catequina presentes no tegumento e nos exsudatos das sementes de Sesbania virgata durante o período do início da embebição (1 d) até o término da germinação (6 d). Peso médio das sementes 90 mg (± 10). As análises foram realizadas por LC-

MS e os compostos foram detectados e quantificados utilizando um padrão comercial. As barras representam o desvio padrão das médias (n=3).

75 Cas c a A 0.090 Embrião

Endosperma

0.060

(g)

0.030 * Biomassa parteda aérea 0.000 * EtOH MeOH Hex Acoet MeOH 0.0 20 B 0.0 15

(g) 0.0 10

Biomassa da raiz 0.0 05 * * * 0.0 00 4 .0 EtOH MeOH Hex Acoet MeOH C

3 .0 * * 2 .0 *

(cm)

1 .0 Comprimento da raiz

0 .0 EtOH MeOH Hex AcoetAcOEt MeOH Controle Extratos

Figura 17. Biomassa da parte aérea (A) e da raiz (B) e comprimento da raiz (C) de plântulas de

Arabidospsis thaliana cultivadas durante 7 dias em meio MS líquido contendo 200 µg mL -1 de extratos das sementes de Sesbania virgata fracionados com hexano (Hex), acetato de etila

(AcOEt) e metanol (MeOH). Os controles referem-se ao tratamento das plântulas apenas com etanol (EtOH), utilizado para solubilizar os extratos hexânicos (Hex) e metanol (MeOH), utilizado para solubilizar os demais extratos. As barras indicam o desvio padrão das médias

(n=6). Os asteriscos indicam diferenças significativas em relação ao controle respectivo de cada tratamento (ANOVA, teste a posteriori Dunnet’s, P<0,05).

76 2.3.4 Atividade antifúngica dos exsudatos das sementes

Substâncias antifúngicas foram detectadas em extratos dos exsudatos das sementes de S. virgata do 1º ao 6º dia de germinação, sendo que a partir do 3º dia de germinação foi observada a presença de uma segunda zona antifúngica nas cromatoplacas (Rf = 0,54) (Figura 18). (+)-

Catequina isolada dos exsudatos das sementes de S. virgata e oriunda do tegumento das sementes não inibiu o crescimento dos fungos C. sphaerospermum , C. cladosporioides , F. solani e A. niger

(dados não mostrados).

As frações A-J obtidas no processo de fracionamento dos extratos AcOEt dos exsudatos de sementes de S. virgata (Figura 2) foram também submetidas a CCD (100 µg de cada fração) e bioautografia com C. sphaerospermum juntamente com 10 µg do padrão de sesbanimida A

(Figuras 19 e 20). Atividade antifúngica foi detectada apenas nas frações A a D. Duas zonas antifúngicas (Rf = 0,62 e 0,75) são responsáveis pela atividade nas frações A, B e C e uma terceira mancha de inibição com atividade mais fraca foi detectada na fração D (Rf= 0,50).

Sesbanimida A inibiu fortemente o crescimento do fungo, apresentando o mesmo Rf das substâncias detectadas nas frações A, B e C (Rf = 0,62), sugerindo a presença desse composto nos exsudatos de S. virgata como metabólito antifúngico.

77

Frente

Rf = 0,67

Rf = 0,54

Origem

1d 2d 3d 4d 5d 6d

Figura 18. Bioautografia em camada delgada em placa de sílica-gel dos extratos de exsudatos de sementes de Sesbania virgata obtidos a cada dia do processo germinativo (1-6 d). As placas foram desenvolvidas em clorofórmio: MeOH (8:2 v/v) e reveladas com esporos do fungo

Cladosporium sphaerospermum ; as zonas claras correspondem à inibição do crescimento do fungo.

78

Frente

0, 75

0, 62

0, 50

Origem Ses. A A B C D E F G I J H

Figura 19. Bioautografia em camada delgada em placa de sílica-gel das frações (100 µg) obtidas dos exsudatos de sementes de Sesbania virgata ( A-J) e 10 µg de um padrão de sesbanimida A

(Ses. A). As placas foram desenvolvidas com clorofórmio: metanol (8:2 v/v) e reveladas com esporos do fungo Cladosporium sphaerospermum ; as zonas claras correspondem à inibição do crescimento do fungo.

79

O O CH 3 O O CH3 OH O O CH2 OH

HN OH O CH2 HN OH O

O O

Figura 20 . Estrutura dos tautômeros de sesbanimida A.

2.3.5 Atividade biológica de oligossacarídeos derivados de galactomanano

A análise da atividade biológica dos oligossacarídeos de galactomanano foi efetuada com a fração de oligossacarídeos de baixo peso molecular (OBPM), uma vez que estudos prévios de indução de respostas de defesa com oligossacarídeos de manose apontam as moléculas de baixo grau de polimerização como as mais ativas (Rahal, 2002; Slováková et.al. 2000).

A embebição das sementes de S. virgata em soluções da fração OBPM resultou em mudança na coloração dos exsudatos que ficaram bem mais claros (menos amarelos), principalmente nas concentrações de 5 e 10 mg mL -1 (Figura 21). Além disso, foi observado menor tamanho da radícula para as sementes tratadas com as mesmas concentrações (Figura 21).

Incremento acentuado dos níveis de (+)-catequina foi detectado nos exsudatos das sementes eliciadas com os oligossacarídeos de galactomanano (Figura 22). O aumento da quantidade de (+)-catequina exsudada foi linear ao aumento da quantidade de oligossacarídeos

80 aplicados (Figura 22). Outros compostos não identificados também foram exsudados em maior proporção pelas sementes de S. virgata e a liberação desses também foi maior com o aumento da concentração dos oligossacarídeos aplicados (Figura 23). A resposta biológica das sementes à aplicação de oligossacarídeos de GM ocorreu principalmente nas primeiras 24 horas de embebição, sendo que após 72 horas de tratamento as sementes continuaram a exsudar maior quantidade de catequina em comparação ao controle (Figura 24).

5 0,5

0

10 1

1 cm

Figura 21 . Sementes de Sesbania virgata embebidas por 3 dias em diferentes concentrações de oligossacarídeos de baixo peso molecular extraídos de galactomanano (OBPM) (0= controle, 0,5-

10 mg ml -1). Nota-se diferenças na coloração das placas nos tratamentos de 5 e 10 mg mL -1.

81

250 e

200 d

150

c 100

gde catequina/semente µ µ µ µ b 50 a a

0 Controle 0.5 1 2 5 10

Oligossacarídeos mg mL -1

Figura 22 . Quantificação de catequina por HPLC em exsudatos de sementes de Sesbania virgata embebidas em diferentes concentrações de oligossacarídeos de GM e água (controle). Peso médio das sementes 90 mg (± 0,01). As barras representam o desvio padrão das médias (n=3). As letras diferentes representam as diferenças significativas entre as concentrações (ANOVA, P<0,05, teste a posteriori Tukey).

82

400 A 400 B

300 300

mVolts 200 200 Catequina

100 100 NI Catequina NI NI

0 0 5 10 15 20 25 30 5 10 15 20 25 30

400 C 400 D Catequina 300 300

Catequina mVolts 200 200

NI 100 100 NI NI NI

0 0 5 10 15 20 25 30 5 10 15 20 25 30 Minutos Minutos

Figura 23 . Perfis cromatográficos obtidos por HPLC ( λ= 280 nm) dos extratos dos exsudatos de sementes de Sesbania virgata embebidas com solução da fração OBPM contendo oligossacarídeos de galactomanano nas concentrações de 2 (B), 5 (C) e 10 mg mL -1 (D) ou com

água destilada (A, controle). NI= não identificado.

83

300 2 170 YOGM = -0,0267X +4,2625X+66,993 2 200 R =0,9414 136 100 Ycontrole = 38,7 102 0 24 48 72 96

68

gde catequina /semente µ µ µ µ 34

0 24 48 72 96

Intervalo (h)

Figura 24. Quantificação de (+)-catequina por HPLC em exsudatos de sementes de Sesbania virgata embebidas com solução de oligossacarídeos de galactomanano ( e OGM 5 mg mL -

1) e água ( e - - -, controle) por diferentes períodos. Peso médio das sementes 0,09 g (± 0,01).

As barras representam o desvio padrão das médias (n=3). O inserto mostra as regressões efetuadas com as somas dos valores de (+)-catequina exsudada em diferentes períodos.

84 A análise da fração OBPM em coluna de exclusão molecular Bio Gel P-2 revelou, de acordo com a curva de calibração da coluna com padrões comerciais, a presença de oligossacarídeos com GP de 1 a 8 (dados não mostrados).

Os dados de rendimento, proporção relativa dos monossacarídeos presentes nas frações

OGM1 →8, assim como a razão entre estes monossacarídeos encontram-se na Tabela 6. Nota-se que a fração OGM1, constituída por proporções relativas praticamente iguais de galactose: manose foi a apresentou o maior rendimento. As outras frações apresentaram razão manose: galactose 2:1, indicando a possível presença de oligossacarídeos de galactomanano com composição e massa molecular semelhantes a outros descritos em literatura como ativos na indução de respostas fisiológicas em plantas.

85 Tabela 6. Composição em monossacarídeos por HPAEC/ PAD e rendimento dos oligossacarídeos de GM extraído de sementes de Sesbania virgata .

Frações da Abundância relativa (%) de Razão man:gal Rendimento coluna de Bio monossacarídeos mg / g Gel Galactose Manose OGM1 52 48 1:1 228,55 OGM2 24 76 3:1 116,55 OGM3 26 74 2:1 111,2 OGM4 27 73 2:1 62,5 OGM5 29 71 2:1 35,95 OGM6 29 71 2:1 38,15 OGM7 29,5 70,5 2:1 29,25 OGM8 NA* NA* NA* 1,2 * NA= não analisado devido ao pequeno rendimento.

86 2.4 DISCUSSÃO

2.4.1 Exsudação de açúcares e substâncias alelopáticas

As sementes de S. virgata completam o processo de embebição após dois dias em contato com a água, quando ocorre a protrusão da radícula. A exsudação de açúcares, proteínas e substâncias bioativas por sementes dessa espécie ocorre já nas primeiras 24 horas de embebição.

Os açúcares encontrados nos exsudatos derivados do período pré-germinativo das sementes de S. virgata são provavelmente produtos da degradação de oligossacarídeos da série rafinósica

(Tabelas 1 e 2). Estes oligossacarídeos são formados por sacarose e galactose e estão presentes na camada de aleurona das sementes de S. virgata (região entre o tegumento e o endosperma), sendo degradados antes da protrusão da radícula, servindo como fonte de carbono inicial para o processo germinativo (Buckeridge & Dietrich, 1996).

No decorrer da germinação, o teor desses oligossacarídeos da série rafinósica diminui nas sementes, principalmente após o 3º dia de embebição, quando ocorre o início da mobilização do galactomanano. A degradação desse polissacarídeo ocorre pela ação de três hidrolases: uma α- galactosidase, que quebra as ligações α-1,6 das ramificações de galactose, uma β-mananase, que cliva as ligações β-1,4 da cadeia principal de manose, liberando oligossacarídeos de manose, e uma β-manosidase ou exo-β-manosidase, que atua nestes oligossacarídeos de manose, liberando monossacarídeos e dissacarídeos (Buckeridge & Reid, 1996). Estes oligossacarídeos são então translocados para o embrião e utilizados para o seu crescimento e desenvolvimento. Estes eventos explicam o aumento dos níveis de açúcares totais e o incremento de manose e galactose nos exsudatos após o 4° dia do processo germinativo (Tabelas 1 e 2).

87 A presença de açúcares e compostos protéicos nos exsudatos de S. virgata torna a área que circunda as sementes uma região atrativa e rica em carbono para o crescimento de microrganismos do solo. Muitos fungos, como por exemplo, F. solani, sobrevivem no solo na forma de clamidósporos e têm sua germinação desencadeada pela presença de açúcares e aminoácidos, como, glucose, sacarose, frutose, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato e fenilalanina encontrados em exsudatos de sementes (Nelson, 2004). Em contraste, a exsudação de compostos protéicos pelas sementes pode inibir o crescimento de fungos, já que muitas proteínas e peptídeos com atividade antifúngica têm sido descritos em sementes (van’t Hof et al ., 2001;

Thomma et al ., 2002; Wang et al . 2002).

A maior concentração de açúcares nos exsudatos das sementes de S. virgata (Figura 5) coincidiu com o período no qual foi observado maior efeito fitotóxico desses exsudatos em plântulas de alface e tomate (Figura 6 e 7). A presença de altas concentrações de manose nos exsudatos pode ter contribuído para acentuar esse efeito. Stein & Hansen (1999) verificaram que concentrações micromolares de manose reduziram a biomassa de raízes de A. thaliana e células de milho cultivadas em suspensão, além disso, as células das raízes e das culturas dessas espécies apresentaram sintomas característicos de apoptose. Manose e também glucose foram capazes de inibir a germinação de sementes de A. thaliana (Pego et al ., 1999).

O aumento da atividade fitotóxica dos exsudatos ao longo da germinação das sementes de

S. virgata deve-se possivelmente ao aumento da exsudação e acúmulo de substâncias inibidoras e/ou liberação de outros compostos, os quais podem potencializar esse efeito, agindo aditivamente ou sinergisticamente. Substâncias osmoticamente ativas também podem acentuar a atividade inibidora de extratos. Astarita et al. (1996) relataram que o potencial osmótico dos extratos pode exercer um efeito negativo, que se soma aos efeitos tóxicos e inibidores, atrasando, reduzindo ou até mesmo impedindo o desenvolvimento de plântulas.

88 O ácido abcísico (ABA), em determinadas concentrações, pode causar atraso da germinação, redução do crescimento da radícula e inibição da mobilização de reservas de sementes (Grot & Karsen, 1992; Potomati & Buckeridge, 2002; Kermode, 2005; Tonini et al .,

2006). O ABA é encontrado principalmente no tegumento das sementes de S. virgata , sendo sua concentração neste tecido maior no primeiro dia pós-embebição com redução durante o terceiro dia de embebição, quando ocorre a mobilização do galactomanano presente no endosperma das sementes (Tonini et al ., 2006). Provavelmente, este hormônio difunde-se do tegumento das sementes e sua presença nos exsudatos pode estar relacionada aos efeitos observados. O ABA foi detectado em exsudatos das sementes de S. virgata do 4º dia pós-embebição (dados não mostrados), indicando que talvez ele possa ter contribuído a redução da porcentagem de germinação de tomate e para a redução do comprimento da radícula e hipocótilo de tomate e alface (Figura 7 e 8).

Como o efeito fitotóxico significativo dos exsudatos das sementes já foi observado a partir de 24 horas pós-embebição, isso indica que ele é determinado por substâncias exsudadas no início do processo de entrada de água da semente, como provavelmente a fitotoxina (+)-catequina que é rapidamente liberada do tegumento das sementes em altas concentrações principalmente no primeiro dia de embebição (Figura 16). O flavonóide quercetina também foi detectado no tegumento, entretanto, ele não é exsudado pelas sementes. Muitos flavonóides têm sido encontrados no tegumento de sementes de espécies de Sesbania e de outras fabáceas (Ceballos et al ., 1998; Silva et al ., 2004; Pang et al. , 2007).

A catequina exerce toxicidade em várias plantas, entretanto, a intensidade desse efeito varia de espécie para espécie e também com as condições experimentais (Buta & Lusby, 1986;

Bais et al ., 2002, 2003; Iqbal et al ., 2003; Perry et al ., 2005a; Thelen et al ., 2005; D’Abrosca et al ., 2006; Thorpe 2006; Weir et al ., 2006; Furubayashi et al . 2007). Neste trabalho, o efeito

89 inibitório da (+)-catequina comercial e daquela isolada das sementes de S. virgata foi, de modo geral, muito similar. As diferenças ocorreram ou devido às diferenças no grau de pureza entre as fontes de (+)-catequina ou mais provavelmente devido à própria variação da biomassa das plântulas de A. thaliana .

A concentração de 50 µg mL -1 de (+)-catequina causou efeitos visíveis de toxicidade nas raízes de A. thaliana (Figura 12). A fitotoxicidade dos enantiômeros (+) e (-)-catequina nas células das raízes de A. thaliana já foi previamente descrita em estudos realizados por Bais et al.

(2002, 2003). (+) e (-)-Catequina inibem o desenvolvimento das raízes laterais das plântulas de A. thaliana, o que explica a considerável redução da biomassa da raiz nas plântulas tratadas com essa fitotoxina (Figura 11 B). O mecanismo de ação da (+) e (-)-catequina, assim como o seu alvo celular, ainda não são completamente conhecidos. O efeito fitotóxico nas células das raízes de A. thaliana parece ocorrer como causa da condensação do citoplasma gerada pela rápida indução de espécies reativas de oxigênio (EROS), seguida pelo aumento de Ca 2+ e acidificação do citoplasma e subseqüente morte celular (Bais et al ., 2003).

Os efeitos da (+)-catequina nas raízes fasciculadas das plântulas de arroz foram parecidos com aqueles observados para as raízes pivotantes de A. thaliana . A adição de (+)-catequina no meio de cultura das plântulas de arroz causou escurecimento e redução da biomassa das raízes, entretanto, esse efeito foi menos drástico do que para A. thaliana . O estímulo no crescimento da parte aérea das plântulas de arroz quando foram utilizados 50 µg mL -1 de (+)-catequina de fonte comercial pode ter ocorrido pelo fato de que quando esta substância é aplicada em quantidades abaixo ou próximo da sua concentração inibitória mínima, ela pode estimular o crescimento de plantas (Prithiviraj et al ., 2007).

90 Os enantiômeros (+) e (-)-catequina podem funcionar como um auto-regulador da germinação e crescimento de sementes e plântulas de Centaurea maculosa Lam., e sementes de

Lespedeza sp., causando interferência intra-específica nas populações (Buta & Lusby, 1986, Perry et al ., 2005b). Efeitos de autotoxicidade à (+)-catequina, como inibição da germinação e redução do comprimento e biomassa da radícula de sementes de S. virgata , não foram observados quando as sementes foram embebidas em solução contendo (+)-catequina na concentração de 1 mg mL -1

(dados não mostrados). Raízes de plântulas de Lupinus sericeus Pursh e Gaillardia grandiflora

Van Houtle são muito resistentes a ação da (+) e (-)-catequina, e isso se deve ao fato de suas raízes exsudarem grandes quantidades de oxalato, o qual minimiza os efeitos da (+) e (-)- catequina, por interromper a geração de EROS induzida por ação dessa fitotoxina (Weir et al.

2006). Dessa forma, é provável que as sementes e plântulas de S. virgata também possuam mecanismos que protegem as mesmas de autotoxicidade da (+)-catequina.

S. virgata foi descrita como uma espécie invasora em solos alagados, especialmente em plantações de arroz irrigado (Kissmamm & Groth 1999). A exsudação de grandes quantidades de

(+)-catequina pode representar uma estratégia dessa espécie que pode contribuir para o seu comportamento invasor. Conforme descrito por Ceballos et al. (1998), a organização anatômica de sementes de Sesbania facilita a rápida liberação de aleloquímicos para a espermosfera (zona que circunda as sementes). Embora essas substâncias possam ser alteradas por reações com outros compostos, pela degradação por microrganismos ou por sua própria instabilidade, a liberação de grande quantidade de substâncias ativas pelo tegumento das sementes durante o período inicial de embebição sugere papel ecológico desses compostos.

As raízes de Centaurea maculosa , uma espécie exótica que mostrou efeito devastador sobre espécies nativas dos Estados Unidos, exsudam uma mistura racêmica de catequina (Bais et al ., 2002). Os níveis de (+) e (-)-catequina encontrados na rizosfera dessa planta, assim como a

91 atividade fitotóxica dessa substância no solo, têm sido extensivamente discutidos (Blair et al .

2005, 2006; Perry et al. 2007). Essa fitotoxina parece ser exsudada em pulsos de alta concentração, capazes de conferir vantagens para C. maculosa em períodos críticos do desenvolvimento e sua atividade é dependente da sua estabilidade em diferentes tipos de solo

(Blair et al . 2005, 2006; Perry et al. 2007, Inderjit et al. 2008).

A detecção de outras frações com atividade fitotóxica nos exsudados das sementes de S. virgata que não possuem (+)-catequina, assim como a alta fitotoxicidade em A. thaliana dos extratos obtidos das sementes (Figuras 10 e 17), indicam que outros compostos presentes nos exsudatos devem também contribuir para atividade inibidora observada, potencializando esse efeito. Esse fato é reforçado pela sugestão da presença de sesbanimida A nas frações A a C

(Figura 19), que ocasionaram a morte das plântulas de A. thaliana quando aplicadas na concentração de 200 µg mL -1. Van Staden & Grobbelaar (1995) também observaram alta toxicidade dos extratos do embrião de sementes de Sesbania punicea (Cav) Benth e Sesbania bispinosa (Jacq.) em espécies de alface, pepino, trigo e em duas ervas daninhas ( Bidens pilosa L. e Tagetes minuta L.). Essas espécies de Sesbania possuem no embrião o alcalóide sesbanimida

(A, B e C) que é altamente citotóxico (Kim et al. , 1992, Powell et al. 1990, Powell et al. 1984), capaz de inibir o crescimento das espécies descritas acima em concentrações de 32,6 a 326 µmol

L –1 (Van Staden & Grobbelaar, 1995). S. punicea tem sido descrita como uma espécie nociva na

África do Sul, por invadir campos abandonados, competir com outras espécies, formar populações densas e apresentar toxicidade a alguns animais. Este comportamento tem sido associado à presença de sesbanimida nas sementes dessa espécie (Gorst-Allman et al . 1984, Van

Staden & Grobbelaar, 1995).

92 Sesbanimida ocorre em muitas espécies de Sesbania (Powell et al. , 1990) possuindo também atividade antitumoral e antimicrobiana, além de apresentar estrutura semelhante aos antibióticos do grupo glutarimida, como a cicloheximida, a streptovitacina A e a streptoimidona

(Powell et al. , 1990, Acebal et al ., 1999). No presente estudo, a sesbanimida A apresentou forte atividade inibidora do crescimento do fungo C. sphaerospermum . Análises por CCD e bioautografia sugeriram a presença desse metabólito no embrião das sementes de S. virgata

(dados não mostrados), que assim como a catequina, parece ser exsudada já no primeiro dia de embebição das sementes (Figura 18). No terceiro dia de germinação das sementes de S. virgata , outra substância é liberada (Rf = 0,54, Figura 18). No total, foram detectadas três manchas antifúngicas nos exsudados de sementes de S. virgata . As demais substâncias detectadas podem ainda se tratar de outras moléculas de sesbanimida, como a sesbanimida B ou C, as quais também possuem atividade biológica (Powell et al ., 1990).

A (+)-catequina não apresentou atividade antifúngica sobre fungos filamentosos testados neste estudo. Báidez et al. (2006) verificaram que catequina apresentou atividade antifúngica contra os fungos fitopatogênicos Phytophthora megasperma Drechs e Cylindrocarpon destructans (Zins) Scholt. Essa atividade não foi observada para F. solani , C. sphaerospermum e

A. niger , talvez pela diferença de sensibilidade dos organismos e também pela diferença nas concentrações ensaiadas. A dose de catequina capaz de reduzir 50% do crescimento radial das culturas de P. megasperma e C. destructans foi de 4,2 e 5,6 mg mL -1, respectivamente, caracterizando uma atividade fraca dessa substância (Báidez et al. , 2006). No presente estudo, a concentração máxima utilizada nos experimentos com (+)-catequina isolada das sementes de S. virgata foi de 200 µg mL -1, cerca de 20 vezes inferior aquelas ensaiadas por Báidez et al. (2006), o que poderia explicar a ausência de atividade antifúngica. Concentrações maiores, como as utilizadas por esses autores não foram ensaiadas neste trabalho, pelo fato delas serem superiores

93 às quantidades de (+)-catequina produzidas e exsudadas pelas sementes de S. virgata. Baidez et al. 2006 também verificaram que quercetina apresentou forte atividade antifúngica reduzindo em

50% o crescimento radial das culturas de P. megasperma e C. destructans com 3 e 14 µg mL -1, além disso, os fungos apresentaram mal formações estruturais, com hifas anormais e alterações nas membranas e paredes celulares das hifas (Báidez et al. , 2006). Dessa maneira, estas informações indicam o possível papel deste flavonóide, também encontrado nas sementes de S. virgata , em processos de defesa vegetal. Apesar da fraca atividade antifúngica atribuída à (+)- catequina, sabe-se que esta substância é eficaz na inibição do crescimento de bactérias fitopatogênicas encontradas no solo, como Erwinia carotovora Jones, Xanthomonas campestris

(Pan) Downson e Pseudomonas fluorescens Migula (Veluri et al. 2004).

Desse modo, a presença de (+)-catequina e possivelmente de sesbanimida A e outras substâncias ativas ainda não identificadas nos exsudatos e nas sementes de S. virgata sugere a possível existência de uma estratégia competitiva e de defesa durante a germinação, o que pode contribuir para proteção das sementes contra o ataque de patógenos e também para a supressão de espécies competidoras. Embora estas substâncias possam ser alteradas no solo por reações com outras substâncias, degradação microbiana ou pela própria instabilidade das mesmas, a exsudação delas pelas sementes de S. virgata pode desempenhar um papel ecológico importante, representando um mecanismo adaptativo que pode conferir vantagens às sementes de S. virgata durante o estabelecimento inicial de suas plântulas.

94 2.4.2 Atividade biológica de oligossacarídeos de galactomanano

A indução das sementes de S. virgata com altas concentrações de OBPMs (5 e 10 mg mL -

1) aumentou a exsudação de (+)-catequina do tegumento das sementes de S. virgata (Figura 22).

As sementes tratadas com 10 mg mL -1 de oligossacarídeos de GM exsudaram, em média, 222 µg de catequina por semente, cerca de 8 vezes mais do que as sementes embebidas com água destilada (26 µg de catequina por semente). Em plântulas de C. maculosa cultivadas in vitro , a produção racêmica de catequina pode também ser aumentada por eliciação das raízes com fragmentos de parede celular, porém nesse caso oriundos do fungo Phytophthora cinnamomi

Rands (Bais et al. , 2002). A raiz de cada plântula de C. maculosa exsudou cerca 80 µg da mistura racêmica de catequina por mL de meio MS e após tratamento com eliciador de P. cinnamomi a quantidade de exsudada passou a ser de 185 µg mL -1 (Bais et al ., 2002).

(+) e (-)-Catequina são unidades monoméricas das proantocianidinas (ou taninos condensados) (Figura 25). Estes compostos estão presentes principalmente nos tegumentos das sementes e nas cascas dos frutos dos vegetais, protegendo as plantas contra patógenos e herbívoros por sua ação tóxica e interações com enzimas digestivas de herbívoros (Dixon et al .,

2005).

O acúmulo e biossíntese de proantocianidinas no tegumento das sementes ocorre durante o desenvolvimento das mesmas. Em sementes de Medicago truncatula Gaertn o acúmulo de proantocianidinas no tegumento das sementes atinge níveis máximos em torno de 20 dias após a polinização e a abundância relativa dos níveis de transcritos dos genes das enzimas responsáveis pela síntese desses compostos (ANS, ANR, LAR, F3H e DFR) é maior nos períodos de 12 e 16 dias após a polinização (Pang, et al ., 2007).

95 Não foram encontrados relatos na literatura que descrevam a síntese de catequina ou outros flavonóides no tegumento de sementes durante o processo germinativo. Foram encontrados apenas estudos que mostram a existência dessas substâncias constitutivamente no tegumento, como por exemplo, os estudos de Ceballos et al. (1998) que relataram que luteolina e proantocianidinas estão localizadas principalmente no parênquima subhilar do tegumento de sementes dormentes de Sesbania vesicaria (Jacq.) Ell. e Sesbania drummondii (Rydb.) Cory , as quais são difundidas para o exterior após início da embebição.

Maior liberação de (+)-catequina foi observada com o tratamento com oligossacarídeos de

GM no período de 24 horas pós-embebição das sementes de S. virgata (Figura 25). A rápida exsudação desse metabólito é um indicativo da sua presença constitutiva nas células do tegumento das sementes. Entretanto, a presença de precursores imediatos e a ocorrência da síntese de novo dessas substâncias não pode ser descartada. Assim, os resultados obtidos neste trabalho ainda não permitem dizer se os oligossacarídeos de GM induziram a síntese de catequina no tegumento das sementes de S. virgata ou se apenas aumentaram a exsudação dos compostos. É relevante salientar que o endo-tegumento das sementes de S. virgata é um tecido vivo, onde são encontradas as enzimas responsáveis pela degradação do galactomanano do endosperma das sementes (Tonini et al . 2006). Além disso, quando os extratos das sementes tratadas com oligossacarídeos de GM foram analisados por HPLC, foi verificado nos cromatogramas que as sementes induzidas continham picos que indicaram maior quantidade de outras substâncias que não puderam ser identificadas, as quais talvez possam ser moléculas precursoras da síntese de catequinas (Figura 24). Entretanto, outras análises mais específicas ainda devem realizadas para identificação desses picos.

Aproximadamente 25% da fração OBPM é constituída por monossacarídeos (manose e galactose). Testes utilizando manose, galactose e manose+galactose na concentração de 2 mg mL -

96 1, indicaram que esses açúcares não são responsáveis pelo aumento da exsudação de catequina pelas sementes de S. virgata . Testes utilizando polietilenoglicol (PEG) nas mesmas concentrações osmóticas das soluções de oligossacarídeos (-0,04 MPa) descartaram a possibilidade de efeito osmótico. A ausência de pectinas na fração OBPM indicou que não existe a possibilidade de que oligogalacturonídeos, que são oligossacarinas muito ativas na resposta de defesa em plantas, estejam presentes junto com os OGMs nessa resposta (dados não mostrados). Um parâmetro importante que ainda deve ser avaliado é o pH das amostras dos oligossacarídeos ensaiadas, uma vez que, ele pode alterar a exsudação de substâncias pelas sementes (Nelson, 2004).

Vários oligossacarídeos têm sido descritos como sinais reconhecidos por diferentes espécies vegetais (Klarzynski et al. 2000, Kollárová et al ., 2006, Laporte et al., 2007). Slovákóva et al . (2000) relataram que oligossacarídeos de galactoglucomanano, derivados da parede celular secundária de Picea abies (L.) Karst., são capazes de induzir resistência inespecífica em cotilédones de pepino inoculados com o vírus da necrose de tabaco (TNV). Os fragmentos mais ativos foram os que possuíram GP 3, 6 e 7, sendo capazes de reduzir o número de lesões causadas pelo TNV quando aplicados em concentrações de 5 mg L -1, principalmente durante as 24 horas que antecederam a indução. Além disso, esses oligossacarídeos também induziram aumento na atividade de proteínas relacionadas à patogênese, como peroxidases, β-glucanases e quitinases

(Slovákóva et al ., 2000). Oligossacarídeos derivados de xiloglucano também podem influenciar reações de defesas, como por exemplo, a resposta de hipersensibilidade ao TNV em cotilédones de pepino (Slováková et al ., 1994). Rahal (2002) observou que extratos contendo oligossacarídeos gerados pela degradação do galactomanano durante a germinação de sementes de S. virgata foram capazes de induzir a síntese de fitoalexinas em cotilédones de soja. Ensaios preliminares realizados com os oligossacarídeos isolados de galactomanano (GP 2-7) naquele

97 trabalho apontaram que trissacarídeos foram capazes de induzir a síntese de fitoalexinas

(gliceolinas e coumestrol) em cotilédones de soja (dados não mostrados).

Com base nos resultados obtidos neste trabalho, estudos detalhados da atividade biológica de oligossacarídeos derivados de GM em sementes de S. virgata ainda são necessários para que se investigue o oligossacarídeo mais ativo, qual a influência das ramificações de galactose presentes nas suas estruturas e como sinais secundários gerados pela sua aplicação exercem alguma influência nas respostas avaliadas. Embora os efeitos observados neste estudo tenham sido maiores nas primeiras 24 horas de embebição das sementes, momento no qual ainda não ocorre a degradação do GM, eventos que causem a antecipação da quebra do GM, como por exemplo, a infecção de patógenos que secretam enzimas hidrolíticas capazes de degradar carboidratos de reserva de parede celular e liberar oligossacarídeos ativos, talvez possam influenciar a produção e exsudação de (+)-catequina pelas sementes de S. virgata .

Os dados obtidos neste trabalho sugerem que o galactomanano presente no endosperma das sementes de S. virgata contém oligossacarídeos que podem funcionar como sinais que modulam respostas de defesa em sementes de S. virgata .

98 4-Coumaril-CoA

Naringenina

F3H OH

HO O

OH

OH O Dihidroflavonol

OH DFR OH

HO O HO O OH LAR

OH OH

OH OH OH Proantocianidinas (+)-Catequina

OH ANS OH

HO O HO O ANR OH

OH OH OH OH

Antocianidinas (-)-Catequina

Figura 25. Via biossintética dos enantiômeros (+) e (-)-catequina (Pang et al ., 2007). F3H= flavanona-3-hidroxilase, DFR = dihidroflavonol redutase , ANS = antocianidina sintase, LAR = leucoantocianidina redutase, ANR = antocianidina redutase.

99 2.5 CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos neste trabalho pode-se concluir que as sementes de

S. virgata exsudam potentes metabólitos antifúngicos e fitotóxicos, os quais podem contribuir para a defesa contra o ataque de microrganismos e também para inibição da germinação e do crescimento de outras espécies de plantas, contribuindo para o rápido estabelecimento dessa espécie no seu ambiente. Dessa forma é possível que esses metabólitos e outros ativos ainda não identificados contribuam para o comportamento invasivo da espécie. Pode-se concluir também que oligossacarídeos de galactomanano parecem agir como oligossacarinas, por influenciar a produção de substâncias bioativas nas sementes de S. virgata .

100 2.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ACEBAL, C., ALCAZAR, R., CANEDO, L.M., DE LA CALLE, F., RODRIGUEZ, P.,

ROMERO, F. & PUENTES, J.L.F. 1998. Two marine Agrobacterium producers of

sesbanimide antibiotics. Journal of Antibiotics 51 : 64-67.

ASTARITA, L.V., FERREIRA, A.G., BERGONCI, J.I. 1996. Mimosa bimucronata : Allelopathy

and osmotic stress. Allelopathy Journal 3: 43-50.

BÁIDEZ, A.G., GÓMEZ, P., DEL RÍO, J.A. & ORTUÑO, A. 2006. Antifungal capacity of

major phenolic compounds of Olea europaea L. against Phytophthora megasperma Drechsler

and Cylindrocarpon destructans (Zinssm.) Scholten. Physiological and Molecular Plant

Pathology 69: 224-229.

BAIS, H.P., WALKER, T.S., STERMITZ, F.R., HUFBAUER, R.A. & VIVANCO, J.M. 2002.

Enantiomeric-dependent phytotoxic and antimicrobial activity of (+)-catechin. A

rhizosecreted racemic mixture from spotted knapweed. Plant Physiology 128: 1173-1179.

BAIS, H.P., VEPACHEDU, R., GILROY, S., CALLAWAY, R.M. & VIVANCO, J.M. 2003.

Allelopathy and exotic plant invasion: from molecules and genes to species interactions.

Science 301: 1377-1380.

BEKKARA, F., JAY, M., VIRICEL, M.R. & ROME, S. 1998. Distribution of phenolic

compounds within seed and seedlings of two Vicia faba cvs differing in their seed tannin

content, and study of their seed and root phenolic exudations. Plant Soil 203: 27-36.

BLAIR, A.C., HANSON, B.D., BRUNK. G.R., MARRS, R.A., WESTRA, P., NISSEN, S.J. &

HUFBAUER, R.A. 2005. New techniques and finds in the study of a candidate

allelochemical implicated in invasion success. Ecology Letters. 8: 1039-1047.

101 BLAIR, A.C., NISSEN, S.J., BRUNK G.R. & HUFBAUER, R.A. 2006. A lack of evidence for

an ecological role of the putative allelochemical (±)-catechin in spotted knapweed invasion

success. Journal of Chemical Ecology 32: 2327-2331.

BRADFORD, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilizing the principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry

72: 248- 254.

BRAGA, M.R. & BUCKERIDGE M.S. 1997. Fungitoxic compounds exudates by seeds of

Sesbania marginata Benth. (Leguminosae) following germination. Programa e Resumos da

XXVI a Reunião Anual da SBBq. E-76, p 41.

BUCKERIDGE, M.S. & DIETRICH, S.M.C. 1990. Galactomannan from Brazilian legume seeds.

Revista Brasileira de Botânica 13: 109-112.

BUCKERIDGE, M.S. & DIETRICH, S.M.C. 1996. Mobilisation of the raffinose family

oligosaccharides and galactomannan in germinating seeds of Sesbania marginata Benth.

(Leguminosae- Faboideae). Plant Science 117: 33-43.

BUCKERIDGE, M.S. & REID, J.S.G. 1996. Major cell wall storage polysaccharides in legume

seeds: Structure, catabolism and biological functions. Ciência e Cultura 48: 153-162.

BUTA, G.J. 1983. Linoleic acid as a plant growth inhibitor from seeds of Sesbania punicea .

Journal of Natural Products 46: 775.

BUTA, J.G. & LUSBY, W.R. 1986. Catechins as germination and growth inhibitors in Lespedeza

seeds. Phytochemistry 25: 93-95.

CAETANO-ANOLLES, G., CRIST-ESTES, D.K. & BAUER, W.D. 1988. Chemotaxis of

Rhizobium meliloti to the plant flavone luteolin requires functional nodulation genes. Journal

of Bacteriology 170: 3164-3169.

102 CEBALLOS, L., HOSSAERT-MCKEY, M., MCKEY, D. & ANDARY, C. 1998. Rapid

deployment of allelochemicals in exudates of germinating seeds of Sesbania (Fabaceae): roles

of seed anatomy and histolocalization of polyphenolic compounds in anti-pathogen defense of

seedlings. Chemoecology 8: 141-151.

D'ABROSCA, B., DELLAGRECA, M., FIORENTION, A., ISIDORI, M., MONACO, P. &

PACIFICO, S. 2006. Chemical constituents of the aquatic plant Schoenoplectus lacustris :

evaluation of phytotoxic effects on the green alga Selenatrum capricornutum . Journal of

Chemical Ecology 32: 81-96.

DAKORA, F.D. & PHILLIPS, D.A. 1996. Diverse functions of isoflavonoids in legumes

transcend anti-microbial definitions of phytoalexins. Physiological and Molecular Plant

Pathology 49: 1-20.

DIXON, R.A., SHARMA, S.B. & XIE, D. 2005. Proanthocyanidins - a final frontier in flavonoid

research? New Phytologist 165: 9-28.

DUBOIS, M., GILLES, A., HAMILTON, J.K., REBERS, P.A. & SMITH, F. 1956. Colorimetric

method of determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 28: 350-355.

FILISETTI-COZZI, T.M.C.C. & CARPITA, N.C. 1991. Measurement of uronic acids without

interference from neutral sugars. Analytical Biochemistry 197: 157-162.

FURUBAYASHI, A., HIRADATE, S. & FUJII, Y. 2007. Role of catechol structure in the

adsorption and transformation reactions of L-Dopa in soils. Journal of Chemical Ecology 33:

239-250.

GORST-ALLMAN, C. P., STEYN P. S., VLEGGAAR, R. & GROBBELAAR, N. 1984.

Structure elucidation of sesbanimide using high-field RMN spectroscopy. Journal of

Chemical Society 1: 1311-1314.

103 GRAHAM, T.L. 1991. Flavonoid and isoflavonoid distribution in developing soybean seedling

tissues and in seed and root exudates. Plant Physiology 95:594-603.

GROT, S.P.C. & KARSEN, C.M. 1992. Dormancy and germination of abscisic acid-deficient

tomato seeds. Studies with the sitiens mutant. Plant Physiology 99: 952-958.

HOMMANS, A.L. & FUCHS, A. 1970. Direct autography on thin-layer chromatograms as a

method for detecting fungitoxic substances. Journal of Chromatography 51: 325-327.

INDERJIT, POLLOCK, J.L., CALLAWAY, R.M. & HOLBEN, W. 2008. Phytotoxic effects of

(±)-catechin in vitro , in soil, and in the field. Plos One 3: 1-11.

IQBAL Z, HIRADATE, S., NODA, A., ISOJIMA, S. & FUJII, Y. 2003. Allelopathic activity of

buckwheat: isolation and characterization of phenolics . Weed Science 51: 657–662.

KERMODE, A.R. 2005. Role of abscisic acid in seed dormancy. Journal of Plant Growth

Regulation 24: 319–344.

KIM, H.L., KRAKOFF, I.H. & NEWMAN, R.A. 1992. Isolation of sesbanimide from the seed of

Sesbania vesicaria . Genetic Pharmacology 23: 701-703.

KISSMANN, K.G. & GROTH, D. 1999. Plantas infestantes e nocivas . BASF, São Bernardo do

Campo.

KLARZYNSKI, O., PLESSE B., JOUBERT, J.M., YVIN, J.C., KOPP, M., KLOAREG, B. &

FRITIG, B. 2000. Linear β-1,3 glucans are elicitors of defense response in tobacco. Plant

Physiology 124: 1027-1037.

KOLLÁROVÁ, K., LIŠKOVÁ & CAPEK, P. 2006. Further biological characteristics of

galactoglucomannan oligosaccharides. Biologia Plantarum 50: 232-238.

LABOURIAU, L.G. 1983. A germinação de sementes. OEA, Washington, DC.

104 LAPORTE, D., VERA, J., CHANDÍA, N.P., ZÚÑIGA, E.A., MATSUHIRO, B., MOENNE, A.

2007. Structurally unrelated algal oligosaccharides differentially stimulate growth and

defense against tobacco mosaic virus in tobacco plants. Journal of Applied Phycology 19: 79-

88.

MURASHIGE, T. & SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with

tissue culture. Physiologia Plantarum 15: 473 - 497.

NCCLS. 2002. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of

Filamentous Fungi. Approved Standard M-38-A. Wayne, PA, National Committee for

Clinical Laboratory Standards 22: 1-50.

NDAKIDEMI, P.A. & DAKORA, F.D. 2003. Legume seed flavonoids and nitrogenous

metabolites as signals and protectants in early seedling development. Functional Plant

Biology 30: 729-745.

NELSON, E.B. 2004. Microbial dynamics and interactions in the spermosphere. Annual Review

of Phytopathology 42: 271-309.

PANG, Y., PEEL, G.J., WRIGHT, E., WANG, Z. & DIXON, R. A. 2007. Early steps in

proanthocyanidins biosynthesis in the model legume Medicago truncatula . Plant Physiology

145: 601-615.

PEGO, J.V., WEISBEEK, P.J. & SMEEKENS, S.C.M. 1999. Mannose inhibits Arabidopsis

germination via a hexokinase-mediated step. Plant Physiology 119: 1017-1023.

PENNACCHIO, M., JEFFERSON, L.V. & HAVENS, K. 2005. Arabidopsis thaliana : a new test

species for phytotoxic bioassays. Journal of Chemical Ecology 31: 1877-1885.

PERRY, L.G., JOHNSON, C., ALFORD, E.R., VIVANCO, J.M. & PASCHKE, M.W. 2005a.

Screening of grassland plants for restoration after spotted knapweed invasion. Restoration

Ecology 13: 725-735.

105 PERRY, L.G., THELEN, G.C., RIDENOUR, W.M., WEIR, T.L., CALLAWAY, R.M.,

PASCHKE, M.W. & VIVANCO, J.M. 2005b. Dual role for an allelochemical: (±)-catechin

from Centaurea maculosa root exudates regulates conspecific seedling establishment. Journal

of Ecology 93: 1126-1135.

PERRY, L.G, THELEN, G.C., RIDENOUR, W.M., CALLAWAY, R.M., PASCHKE, M.W. &

VIVANCO, J.M. 2007. Concentrations of the allelochemical (±)-catechin in Centaurea

maculosa soils. Journal of Chemical Ecology 33: 2337-2344.

POTOMATI, A. & BUCKERIDGE, M.S. 2002. Effect of abscisic acid on the mobilization of

galactomannan and embryo development of Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Leguminosae-

Faboideae). Revista Brasileira de Botânica 25: 303-310.

POTT, A. & POTT, V.J. 1994. Plantas do Pantanal. EMPRAPA/CPAP/SPI, Corumbá.

POWELL, R.G., SMITH, C.R. & WEISLEDER, D. 1984. Sesbanimide A and related tumor

inhibitors from Sesbania drummondii : structure and chemistry. Phytochemistry 23: 2789-

2796.

POWELL, R.G., PLATTNER, R.D. & SUFFNESS, M. 1990. Ocurrence of sesbanimide in seeds

of toxic Sesbania species. Weed Science 38, 148-152.

PRITHIVIRAJ, B., PERRY, L.G., DAYAKAR, B.V. & VIVANCO, J.M. 2007. Chemical

facilitation and induced pathogen resistance mediated by a root-secreted phytotoxin. New

Phytologist 173: 852-860.

RAHAL, R.L., BRAGA, M.R, & BUCKERIDGE, M.S. 1998. Phytoalexin-inducing activity

generated during galactomannan degradation in seeds of Sesbania virgata . Programa e

resumos da XXVII a Reunião Anual da SBBq . E-14.

106 RAHAL, R.L. 2002. Atividade indutora de fitoalexinas e produção de substâncias fungitóxicas

durante a germinação de sementes de Sesbania marginata Benth. Dissertação de Mestrado,

IB-UNICAMP.

ROSENTHAL, G.A., HUGHES C.G. & JANZEN, D.H. 1982. L-Canavanine, a dietary nitrogen

source for the seed predator Caryedes brasiliensis (Bruchidae). Science 217: 353-355.

SILVA, L.B., SALES, M.P., OLIVEIRA, A.E.A., MACHADO, O.L.T., FERNANDES, K.V.S.

& XAVIER-FILHO, J. 2004. The seed coat of Phaseolus vulgaris interferes with the

development of the cowpea weevil [Callosobruchus maculates (F.) (Coleoptera: Bruchidae)].

Anais da Acadêmica Brasileira de Ciências 76: 57-65.

SLOVÁKOVÁ, L., SUBIKOVÁ, V. & FARKAS, V. 1994. Influence of xyloglucan

oligosaccharides on some enzymes involved in the hypersensitive reaction to TNV (tobacco

necrosis vírus) of cucumber cotyledons. Zeitschrift für Plflanzenkrankheiten und

Pflanzenschutz 101: 278-285.

SLOVÁKOVÁ, L., LISKOVÁ, D., CAPEK, P., KUBACKOVÁ, M. & KARÁCSONYI, S. 2000.

Defence responses against TNV infection induced by galactoglucomannan-derived

oligosaccharides in cucumber cells. European Journal of Plant Physiology 106: 543-553.

SOMOGYI, M. 1945. A new reagent for the determination of sugars. Journal of Biological

Chemistry 160: 61-68.

STEIN, J.C. & HANSEN, G. 1999. Mannose induces an endonuclease responsible for DNA

laddering in plant cells. Plant Physiology 121: 71-79.

STILL, W.C., KAHAN, M. & MITRA, A. 1978. Rapid chromatographic technique for

preparative separations with moderate resolution. Journal of Organic Chemistry 43: 2223-

2225.

107 THELEN, G.C., VIVANCO, J. M., NEWINGHAM, B., GOOD, W., BAIS, H. P., LANDRES,

P., CAESAR, A. & CALLAWAY, R. M. 2005. Insect herbivory stimulates allelopathic

exudation by an invasive plant and the suppression of natives. Ecology Letters 8: 209 –217.

THOMA, B.P.H.J., CAMMUE, B.P.A. & THEVISSEN, K. 2002. Plant defensins. Planta 216:

193-202.

THORPE, A. 2006. Biochemical effects of Centaurea maculosa on soil nutrient cycles and plant

communities. PhD Dissertation. University of Montana, Missoula.

TONINI, P.P., LISBOA, C.G.S., FRESHI, L., MERCIER, H., MAZZONI-VIVEIROS, S.C. &

BUCKERIDGE, M.S. 2006. Effect of absicic acid on galactomannan degradation and endo-β-

mannanase activity in seeds of Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Leguminosae). Trees 20: 669-

678.

TYSKI, S., MARKIEWICZ, M., GULEWICZ, K. & TWARDOWSKI, T. 1988. The effect of

lupin alkaloids and ethanol extracts from seeds of Lupinus angustifolius on selected bacterial

strains. Journal of Plant Physiology 133: 240-242.

VAN STADEN, J. & GROBBELAAR, N. 1995. The effect of sesbanimide and Sesbania seed

extracts on germination and seedling growth of a number of plant species. Environmental and

Experimental Botany 35: 321-329.

VAN´T HOF, W., VEERMAN, E.C.I., HELMERHOST, E.J. & AMERONGEN, A.V.N. 2001.

Antimicrobial peptides: properties and applicability. Biological Chemistry 382: 597-619.

VELURI, R., WEIR, T.L., BAIS, H.P., STERMITZ, F.R. & VIVANCO, J.M. 2004. Phytotoxic

and antimicrobial activities of catechin derivatives. Journal of Agriculture and Food

Chemistry 52: 1077-1082.

108 WANG, X., THOMA, R.S., CARROLL, J.A. & DUFFIN, K.L. 2002. Temporal generation of

multiple antifungal proteins in primed seeds. Biochemical and Biophysical Research

Communications 292: 236-242.

WEIR, T.L., BAIS, H.P., STULL, V.J., CALLAWAY, R.M., THELEN, G.C., RIDENOUR,

W.M., BHAMIDI, S., STERMITZ, F.R. & VIVANCO, J.M. 2006. Oxalate contributes to

the resistance of Gaillardia grand flora and Lupinus sericeus to a phytotoxin produced by

Centaurea maculosa . Planta 223: 785-795

109

3. Dinâmica da liberação, caracterização química e atividade

biológica de substâncias exsudadas por sementes de

Hymenaea courbaril var . stilbocarpa

110 RESUMO

Hymenaea courbaril L. var. stilbocarpa é uma espécie arbórea, pertencente à família Fabaceae

(sub-família Caesalpinoideae, tribo Detariae), que ocorre principalmente em florestas tropicais, sendo considerada uma espécie clímax tardia. As sementes de H. courbaril são grandes e cerca de

40% da sua massa seca é composta por xiloglucano, um polissacarídeo de reserva presente nos cotilédones dessas sementes, tornando-as alvos fáceis do ataque de microrganismos durante a germinação. Não há relatos de estudos do metabolismo secundário de defesa em sementes dessa espécie, assim como não existem trabalhos que demonstrem a exsudação de metabólitos e sua atividade inibidora do crescimento de plantas e microrganismos. Deste modo, este trabalho teve por objetivos estudar da exsudação de substâncias pelas sementes de H. courbaril , assim como isolar e caracterizar quimicamente as substâncias ativas. As sementes de H. courbaril foram germinadas em câmaras climatizadas à 25º C e fotoperíodo de 12 h e seus exsudatos foram coletados em diferentes pontos do processo de embebição, sendo posteriormente submetidos à bioensaios de fitotoxicidade com sementes de alface ( Lactuca sativa L.) e de tomate ( Solanum lycopersicum L.) e plântulas de Arabidopsis thaliana L. cultivadas in vitro . Extratos dos exsudatos e extratos das sementes foram obtidos em larga escala através de extrações com solventes orgânicos, sendo, posteriormente, separados em colunas de gel de sílica utilizando gradientes de diclorometano e metanol. As frações coletadas foram analisadas por HPLC-MS e

GC-MS e a caracterização química das substâncias isoladas foi realizada por técnicas de 1H RMN and 13 C RMN (1-D and 2-D). A atividade antifúngica dos extratos e das substâncias isoladas foi determinada pelos métodos de bioautografia e microdiluição in vitro com fungos filamentosos e leveduras. As sementes de H. courbaril exsudam compostos com atividade fitotóxica logo no início do processo de embebição. Os exsudatos das sementes inibiram a germinação e o

111 crescimento de alface e tomate, e também do fungo Cladosporium sphaerospermum Pemzig.

Duas bicumarinas, a ipomopsina, já isolada anteriormente de outra espécie vegetal, e a himenaína, reportada pela primeira vez neste trabalho, foram isoladas do extrato do embrião das sementes. Escopoletina também foi detectada nestes extratos. Esses metabólitos são exsudados pelas sementes, mas apenas a escopoletina apresenta atividade antifúngica. As duas bicumarinas mostraram toxicidade às plântulas de A. thaliana apenas quando co-aplicadas. Essas substâncias também apresentaram atividade seqüestradora de radicais livres, sendo himenaína a mais eficaz com capacidade para seqüestrar 50% do radical livre DPPH com a dose de 100 µM. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a presença e liberação dessas substâncias bioativas podem proteger as sementes contra danos causados por estresse oxidativo e patógenos, além de inibir o crescimento de outras espécies vegetais, o que pode conferir vantagens adaptativas a H. courbaril .

112 ABSTRACT

Hymenaea courbaril L. var. stilbocarpa is a tree species of Fabaceae (sub-family

Caesalpinoideae, tribe Detariae), occurring mainly in tropical forests and considered a climax species. H. courbaril produces large seeds with approximately 40% of its dry mass composed by xyloglucans, a polysaccharide stored in the cotyledons, and that make these seeds an attractive substrate to the attack of microorganisms. No references were found about secondary metabolites produced and/or exuded by these seeds as defensive substances against plants and microorganisms. Thus, the aim of this work was to study the exudation of substances from these seeds, as well as to elucidate the chemical composition of their bioactive compounds. Seeds of H. courbaril were germinated at 25º C and photoperiod of 12 h, and the exudates were collected at different points of the imbibition process. The collected leachates were submitted to phytotoxic bioassays with seed of lettuce ( Lactuca sativa L.) and tomato ( Solanum lycopersicum L.).

Extracts of seeds and leachates were obtained in large amounts and fractionated in silica gel columns with different gradient of dichloromethane and methanol. The fractions collected were assayed in vitro with seedling of Arabidopsis thaliana L and also analyzed by HPLC-MS and

GC-MS. The chemical characterization f the compounds were performed by 1H NMR and 13 C

NMR (1-D and 2-D) techniques. The antifungal activity of the extracts and fractions were determined by bioautography and micro-dilution tests with filamentous fungi and yeast. The seed leachates inhibited seed germination and plantlet growth of lettuce and tomato, and also inhibited the growth of the fungus Cladosporium sphaerospermum Pemzig. Two biscoumarin, ipomopsin, previously reported in another plant, and hymenain, reported here for the first time, were isolated from the embryo extracts of seeds of H. courbaril . Scopoletin were also detected at this extracts.

These compounds are exuded for the seeds, but only scopoletin has antifungal activity. It was

113 shown that seeds of H. courbaril exude phytotoxic compounds at the beginning of the imbibition process. The biscoumarins showed toxicity to Arabidopsis thaliana L., only when co-aplied.

These substances also showed free radical scavenger activity and hymenain was the most efficient, being able to scavenger 50% of free DPPH radical at concentrations of 100 µM. Our results suggest that the presence and exudation of these bioactive substances can protect seeds of

H. courbaril against damage derived from the oxidative stress and pathogens, and furthermore they can also inhibit the growth of competing plant species, conferring adaptive advantages to H. courbaril seeds.

114 3. 1 INTRODUÇÃO

H. courbaril var. stilbocarpa (popularmente conhecida como jatobá, Figura 1) é uma espécie arbórea de 15-30 m, pertencente à família Fabaceae (sub-família Caesalpinioideae, tribo

Detariae) que está distribuída na África, México, América Central e América do Sul. Ela ocorre na Floresta Estacional Semi Decidual e na Floresta Ombrófila Densa e em zonas subtropicais secas e úmidas, sendo considerada como uma espécie clímax, ou seja, uma espécie secundária tardia na sucessão florestal (Lee & Langenheim, 1975). A floração ocorre durante a estação seca ou na transição para a estação chuvosa (Ratter et al ., 1973) e seus frutos são indeiscentes, apresentando endocarpo carnoso, farináceo e comestível, contendo 3-6 sementes sem endosperma

(Lee & Langenheim, 1975). Essa espécie é uma das principais fontes econômicas de resina, sendo utilizada na fabricação de vernizes, em artesanato e com fins medicinais (Lee & Langenheim,

1975).

As sementes de H. courbaril são grandes e apresentam cotilédones globóides não fotossintetizantes, ricos em xiloglucano (XG), um polissacarídeo de reserva de parede celular que compõe aproximadamente 40% do peso seco da semente (Buckeridge & Dietrich, 1990). O XG possui uma cadeia principal celulósica (unidades de glucose β-1,4-ligadas), ramificada em alguns pontos por unidades de xilose α-1,6 ligadas e galactose β-1,2 ligadas. Este polissacarídeo é mobilizado durante o desenvolvimento das plântulas por ação das enzimas xiloglucano-endo- transglicosilase (XET), α-xilosidase, β-glucosidase e β-galactosidase (Tiné et al ., 2000).

O XG também está relacionado ao controle da embebição, que é essencial para sincronizar o processo de mobilização com o crescimento do eixo embrionário (Tiné et al ., 2000).

Entretanto, a grande quantidade de carboidratos de reserva que é mobilizada após a germinação torna as sementes de H. courbaril muito atrativas ao ataque de patógenos. Dessa forma, a

115 presença de mecanismos de defesa pode ser crucial para o processo de germinação e estabelecimento inicial das plântulas dessa espécie.

Estudos fitoquímicos realizados com folhas, tronco, frutos de espécies de Hymenaea indicam principalmente a presença de sesquiterpernos e diterpenos do tipo clerodano, enantio - labdanóico e ent -halimano (Khoo et al ., 1973, Marsaioli et al ., 1975; Abdel-Kader et al ., 2002,

Nogueira et al. , 2002, Imamura, et al. , 2004). Entretanto, não há relatos de estudos da química de metabólitos secundários presentes nas sementes de H. courbaril e nem estudos que demonstram a exsudação desses compostos e o potencial dos exsudatos dessas sementes em inibir o crescimento de plantas e microrganismos. Deste modo, este trabalho teve por objetivos estudar a exsudação de substâncias fitotóxicas e antifúngicas pelas sementes de H. courbaril , assim como o isolar e caracterizar quimicamente as substâncias bioativas.

116

A B

1 m 5 cm

5 cm

1 cm C D

Figura 1. Hábito (A), plântulas (B), sementes (C) e frutos (D) de Hymenaea courbaril var. stilbocarpa.

117 3.2 MATERIAL E MÉTODOS

3.2.1 Material biológico

• Sementes de H. courbaril var. stilbocarpa (jatobá) (Fabaceae), procedentes da Estação

Experimental de Santa Rita do Passa Quatro, SP foram adquiridas do Instituto Florestal de São

Paulo, São Paulo, SP.

• Sementes de L. sativa cv. Grand Rapids TBR (alface) e de S. lycopersicum (tomate) cv.

Santa Cruz Kada foram adquiridas no comércio local (Isla ).

• Sementes de A. thaliana variedade Columbia (Col-0) foram adquiridas da Lehle Seed Co.

(TX), USA.

• Os fungos Aspergillus niger v. Tiegh. (SPC 1493), Cladosporium cladosporioides

(Fresen.) G.A. de Vries (SPC 140), C. sphaerospermum (SPC 491) e Fusarium solani (Mart.)

Sacc. (SPC 980), foram obtidos a partir de culturas fornecidas pela Coleção de Culturas do

Instituto de Botânica de São Paulo. Os fungos foram mantidos em meio de cultura BDA

(batata-dextrose-ágar), no escuro a 25ºC por 15 dias.

• As leveduras patogênicas Candida albicans (Robin) Berk. (ATCC 90029), C. parapsilosis

(Ashford) Langeron & Talice (ATCC 22019) e C. tropicalis (Castellani) Berk. (ATCC 7625)

foram obtidas da coleção do Laboratório de Micologia da Universidade Federal de São Paulo

(UNIFESP) e mantidas em meio Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) a 37 ºC no escuro por 48

horas.

118 3.2.2 Germinação de sementes

As sementes de H. courbaril foram lavadas com esponja comum, para remoção do arilo aderido ao tegumento, desinfetadas em solução aquosa de hipoclorito de sódio comercial a 15 %

(0,3% de cloro ativo) por 15 minutos e escarificadas mecanicamente na posição oposta ao eixo embrionário, com o auxílio de um alicate. Após escarificação, as sementes foram desinfetadas novamente com hipoclorito de sódio sob condições assépticas e lavada abundantemente com

água destilada autoclavada. As sementes foram germinadas em bandejas contendo vermiculita umedecida com água destilada (razão 20 mL/semente), ou em frascos de 250 mL (1 semente/frasco), contendo 20 mL de água destilada autoclavada (1 semente por frasco), ou 100 mL de meio Murashige & Skoog (1962) com metade das suas concentrações de sais e ausência de vitaminas e açúcares, solidificado pela adição de 0,8 % de agar. As sementes foram mantidas em câmara climatizada a 25ºC, sob 12 horas de luz.

3.2.3 Bioensaios de fitotoxicidade em alface e tomate

Exsudatos obtidos de sementes de H. courbaril de 10-30 dias, em intervalos de 5 dias, após embebição em água destilada (item 3.3.2), foram coletados e tiveram seu volume ajustado para 20 mL com água destilada, sendo utilizados para a avaliação do seu potencial fitotóxico.

Cinco mL dos exsudatos foram aplicados em placas de Petri de 5 cm de diâmetro contendo papéis de filtro pré-umedecidos, sobre os quais foram colocadas 20 sementes de alface ou 20 de tomate.

Como controle do ensaio, as sementes das plantas-teste foram mantidas em placas contendo o mesmo volume de água destilada. O ensaio foi realizado em triplicata e as placas mantidas em câmara climatizada a 25 °C, sob 12 horas de luz. A distribuição das placas foi inteiramente

119 casualizada dentro da câmara climatizada. Após 3 dias da semeadura para alface e 4 dias para tomate, foi calculada a porcentagem de germinação e medido o comprimento da radícula e hipocótilo das plantas-teste. Os dados de porcentagem obtidos foram transformados em arcoseno

(Labouriau, 1983) e submetidos à análise estatística (item 3.2.11).

3.2.4 Detecção de substâncias antifúngicas

Para a análise das substâncias antifúngicas liberadas pelas sementes de H. courbaril, exsudados obtidos de 10 – 40 dias, em intervalos de 10 dias após embebição das sementes em meio MS sólido (3.2.2) foram recolhidos e extraídos com 200 mL de EtOH 40%. O extrato etanólico foi concentrado sob pressão reduzida em roto-evaporador até secura (40º C), sendo em seguida retomado em água destilada (100 mL) e, posteriormente, submetido à partição com o mesmo volume de AcOEt por 2 vezes. Após total evaporação das frações orgânicas em roto- evaporador (40º C), os extratos foram retomados em 500 µL de AcOEt e 50 µL dos mesmos foram submetidos à cromatografia em camada delgada (CCD) em placas de gel de sílica, sendo as mesmas desenvolvidas em clorofórmio: MeOH (8:2 v/v), observadas sob luz ultravioleta (366 e

254 nm) e reveladas por uma solução de sais e glucose contendo esporos do fungo C. sphaerospermum . A suspensão de esporos do fungo foi vaporizada sobre as cromatoplacas e estas incubadas a 26 °C, no escuro, por 72 horas (Homans & Fuchs, 1970).

120 3.2.5 Isolamento e caracterização de compostos ativos

a) Obtenção de exsudatos e extratos das sementes

Duzentos e cinqüenta sementes de H. courbaril foram germinadas em bandejas plásticas contendo vermiculita (item 3.2.2) e em torno do 15º dia de embebição, após emissão da radícula, os exsudatos foram coletados através da lavagem abundante da vermiculita com água destilada.

Os exsudatos coletados foram filtrados primeiramente em náilon e em seguida em papel de filtro em sistema a vácuo, liofilizados e armazenados. As sementes frescas foram coletadas e dissecadas com o auxílio de um bisturi em tegumento e embrião, o material separado foi triturado e extraído por 3 vezes com EtOH 80 % (1 g/mL). Os extratos obtidos foram secos em roto- evaporador e armazenados.

b) Extração de constituintes dos exsudatos de H. courbaril

Seis gramas dos exsudatos brutos obtidos das sementes de H. courbaril foram extraídos por três vezes com 250 mL de Hex, AcOEt e MeOH em temperatura ambiente sob agitação por 1 hora (Figura 2). Os extratos etanólicos obtidos do tegumento e embrião das sementes (item a) foram retomados em água destilada (250 mL) e foram submetidos a partições orgânicas por três vezes com Hex e subseqüentemente com AcOEt (Figura 2). As frações orgânicas foram evaporadas em roto-evaporador (40º C) e as frações aquosas foram liofilizadas e extraídas com

250 mL de MeOH por três vezes, sendo em seguida evaporada em roto-evaporador e resíduo da extração armazenado. Todos os extratos foram avaliados quanto à sua atividade fitotóxica em plântulas de A. thaliana (item 3.2.8). As frações obtidas dos exsudatos das sementes foram também analisadas por HPLC-MS (item 3.2.6). A fração AcOEt proveniente dos extratos do

121 embrião das sementes foi submetida à separação em coluna de gel de sílica conforme descrito abaixo (item c).

c) Fracionamento em coluna de sílica

A fração AcOEt (741 mg) obtida do extrato etanólico do embrião das sementes de H. courbaril foi analisada em coluna de gel de sílica em fase normal (120 g, volume 48 mL, Redi

Sep Disposable Flash Column) em sistema Combiflash Retrieve de cromatografia “ flash ” com um fluxo de 30 mL /min (Figura 3). Foram coletadas 225 frações de aproximadamente 20 mL utilizando um gradiente de DCM e MeOH (0 →100% de MeOH). A eluição foi realizada com 200 ml da mistura de solventes nas seguintes proporções de MeOH: 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25,

30, 50 e 100 %). As frações coletadas foram agrupadas em 23 frações ( FH1 -23 ), de acordo com o perfil observado por CCD em placas de sílica gel 60 F254 Merck desenvolvidas em DCM:

MeOH 9:1, 8:1 e 7:1 (v/v) e observadas sob luz UV. As frações com alto grau de pureza ( FH5 e

FH9) foram submetidas aos procedimentos de identificação (item d, a seguir). Estas frações também foram analisadas por HLC-MS e submetidas a ensaios com plântulas de A. thaliana (item

3.2.8), ensaios de atividade antifúngica (item 3.2.10) e de atividade seqüestradora de radicais livres (3.2.9).

d) Identificação dos compostos

Os compostos isolados das sementes de H. courbaril foram identificados por 1H RMN,

13 C RMN, HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), HMBC (Heteronuclear Multiple

Bond Coherence), COSY (Correlation Spectroscopy) e NOESY (Nuclear Overhauser

Enhancement Spectroscopy) obtidos em instrumento Varian INOVA 500 utilizando dimetilsulfóxido-d6 (DMSO-d6) como solvente. Os espectros de massas dos compostos foram

122 obtidos por HRFABMS (High-Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectra). O espectro infravermelho da fração FH5 foi determinado em KBr em instrumento AVATAR 320 FT-IR e o espectro de ultra-violeta foi obtido em sistema de HPLC-MS com detector Dionex PDA-100

Photodiode Array. O ponto de fusão da substância isolada ( FH5 ) foi obtido em equipamento

Büchi Melting Point B-545. A elucidação estrutural foi realizada pela Dra. Jiang Du da

Universidade Estadual do Colorado, EUA.

3.2.6 Análises das frações por HPLC-MS

Extratos dos exsudatos das sementes de H. courbaril foram solubilizados em MeOH e injetados em coluna C18 (150mm x 4.6 mm) em um HPLC-MS composto de um sistema Dionex de cromatografia líquida de alta resolução (com detector UV- UVD170U) acoplado a um espectrômetro de massas (Thermo Finnigan Surveyor MSQ). As amostras foram eluídas usando

0,1 % de ácido acético em água (Eluente A) e em MeOH (Eluente B), seguindo um gradiente linear de 10% (3 min) até 90% de B (45 min) com vazão de 0,7 mL min -1. A detecção no ultravioleta foi de 280 nm. A ionização para as análises de espectrometria de massas foi realizada no modo positivo e negativo utilizando ionização por “electron-spray” com nitrogênio (80 psi), voltagem capilar de 3 kV e voltagem do cone de 70V.

3.2.7 Análises por cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas - GC-MS

As frações resultantes do fracionamento por cromatografia “flash” foram submetidas a análises em um cromatógrafo a gás Agilent 6890 acoplado a um espectrômetro de massas Agilent

5973. As amostras foram analisadas em coluna capilar DB-5 (0,25mm D.I. x 30 m comprimento,

123 0,25 µm de espessura), com rampa de temperatura de 70ºC a 250ºC a 10°C por min. As temperaturas do injetor e detector foram de 250 °C e 230°C, respectivamente. O fluxo de gás

(hélio) foi de 1mL min -1. Foram utilizados como padrões comerciais: escopoletina, umbeliferona, cumarina e ácido ferúlico (Sigma), e também 4-metil-umbeliferona e 6-metil- cumarina (Koch Light Lab.).

3.2.8 Bioensaios de atividade fitotóxica com plântulas de A. thaliana

Sementes de A. thaliana foram esterilizadas por 20 minutos em solução de hipoclorito de sódio comercial diluído a 20% (v/v) e, em seguida, lavadas por 4 vezes com água destilada autoclavada. As sementes foram germinadas em placas de Petri contendo meio basal Murashige

& Skoog (1962) sólido, sob temperatura de 25 ºC e fotoperíodo de 16 horas luz. Após 6 dias, as plântulas foram transferidas para placas de Elisa com poços contendo 1 mL de meio MS líquido e mantidas em um agitador orbital sob 25 ± 2º C e 16 horas de luz. Após 24 h, as frações obtidas da partição do exsudatos brutos e de extratos das sementes de H. courbaril , assim como as substâncias isoladas das mesmas, foram ensaiadas quanto à sua atividade fitotóxica em plântulas de A. thaliana . As frações obtidas dos exsudatos e extratos das sementes de H. courbaril , assim como padrões utilizados eventualmente em alguns ensaios foram dissolvidos em MeOH, EtOH ou DMSO (conforme sua solubilidade) e aplicados (20 µL) em diferentes concentrações no meio

MS. Como controles do ensaio foram aplicados nas plântulas os mesmos volumes de MeOH,

EtOH ou DMSO. Os ensaios foram realizados com o mínimo de 6 repetições e as plântulas foram mantidas sob agitação constante e tratamento por 7 dias, quando foram removidas dos poços das placas, fotografadas e tiveram medidas de biomassa da raiz e parte aérea avaliadas.

124

250 sementes de H.

Exsudatos de 250 se mentes courbaril de H. courbaril (7,29 g) Dissecção Partição com Hex e AcOEt Liofilização Extração com MeOH Casca Embrião Hexano (4,3 mg) Extração EtOH 80%

Acetato de etila

(35,6 mg) Extrato EtOH Extrato EtOH

tegumento (17g) Embrião (22 g) Metanol (51,7 mg) Evaporação do EtOH (40ºC)

Fração aquosa Fração aquosa

Partição com Hex e AcOEt Liofilização Extração com MeOH Bioensaios com Arabidopsis thaliana Análise por HPLC-MS Hexano (19,1 mg) Hexano (721 mg)

Aceta to de etila Acetato de etila (55,7 mg) (741 mg)

Metanol (3,49 g) Metanol (7,2 g)

Bioensaios com Arabidopsis thaliana

Figura 2. Fluxograma do fracionamento dos extratos dos exsudatos e das sementes de Hymenaea courbaril.

125

Acetato de etila (741 mg) Derivada do extrato etanólico do embrião das sementes de Hymenaea courbaril

Fracionamento em Sistema “Flash

Chromatography”

CCD

FH1 FH2 FH3 FH4 FH5 FH6 FH7 FH8 FH9 FH10 57,3 mg 24,6 mg 6 mg 52 mg 67 mg 17 mg 19,3 mg 12 mg 23 mg 31 mg

FH11 FH12 FH13 FH14 FH15 FH16 FH17 FH18 FH19 FH20 13 mg 16 mg 13,6 mg 10 mg 6,6 mg 18,1 mg 41,3 mg 16,3 mg 46,3 mg 55,4 mg

FH21 FH22 FH23 Análises por GC-MS 11,9 mg 39,1 mg 30 mg

1H RMN 1-D e 2-D 13 C RMN HRFABMS FH5 IR Bioensaios com Arabidopsis thaliana 67 mg UV Análise por HPLC-MS Ponto de fusão

Atividade antifúngica Atividade seqüestradora 1H RMN de radicais livres FH9 13 23 mg C RMN HRFABMS

Figura 3. Fluxograma do fracionamento e etapas de caracterização química dos compostos

isolados do extrato AcOEt procedente do embrião das sementes de Hymenaea courbaril .

126 3.2.9 Ensaios de atividade seqüestradora de radicais livres

A atividade seqüestradora de radicais livres foi determinada pelo ensaio fotométrico guiado pela descoloração causada pela redução do radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picril- hidrazil-hidrato), conforme realizado por Xiong et al. (1996), com algumas adaptações para microplacas. As amostras foram dissolvidas em MeOH e DCM (7:3 v/v) em diferentes concentrações e 178 µL foram aplicados nos poços das microplacas, seguidos da aplicação de 72

µL de 0,3 mM de uma solução etanólica de DPPH. Após a mistura, as placas foram mantidas a temperatura ambiente por 30 min e os valores de absorbância medidos a 518 nm e convertidos em atividade antioxidante (AA) utilizando a fórmula: AA%=100-{[(Abs amostra – Abs branco ) x 100]/Abs controle}. Como branco foram utilizados poços contendo apenas EtOH ou extratos das sementes e, como controle (negativo) foram utilizados poços com DPPH e EtOH. Controles positivos foram realizados com diferentes concentrações de padrões de antioxidantes comerciais (catequina e quercetina Sigma). Ensaios de atividade seqüestradora de radicais livres autográficos com radical DPPH utilizando cromatografia em camada delgada (CCD) em placas também foram efetuados. As substâncias foram aplicadas nas placas de sílica em diferentes concentrações e eluídas com clorofórmio: MeOH (9:1v/v) ou Hex: AcOEt (7:3 v/v). Após eluição, as placas foram observadas sob luz ultravioleta e vaporizadas com uma solução etanólica de DPPH 0,3 mM e incubadas no escuro por 30 min. Os halos claros causados pela redução do radical livre foram considerados como atividade antioxidante.

127 3.3.10 Ensaios de atividade antifúngica com leveduras e fungos filamentosos

Os ensaios de atividade antifúngica foram realizados utilizando os fungos filamentosos F. solani , A. niger e C. cladosporioides e com as leveduras C. albicans , C. parapsilosis e C. tropicalis de acordo com as normas do NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory

Standards, NCCLS, 2002a, b) e EUCAST (European Committee for Antimicrobial Susceptibility

Test, EUCAST, 2002).

Para os ensaios com os fungos filamentosos, culturas com 7 dias de idade, cultivadas a 28

ºC no escuro em meio de cultura Batata-Dextrose-Agar (BDA), tiveram seus esporos extraídos e suspensos em solução salina (NaCl 0,85%). A concentração de esporos em suspensão foi determinada e ajustada para 5x10 4 UFC mL -1 por contagem dos esporos em câmara de Neubauer.

Em placas de ensaio com cavidades foram aplicados 200 µL de meio BDA (50ºC) e 100 µL das suspensões e esporos dos fungos e 100 µL das substâncias isoladas das sementes de H. courbaril , resultando nas concentrações finais de 12, 25, 50, 100 e 200 µg ml -1. Como controle do ensaio foi utilizada anfotericina B em diferentes concentrações (0,03 – 32 mg mL -1) e DMSO nas mesmas concentrações utilizadas para diluição dos extratos e da anfotericina B. As placas foram mantidas em estufa no escuro a 28 ºC por 5dias, para observação do crescimento dos fungos.

Nos ensaios antifúngicos com leveduras, as espécies de Candida foram cultivadas em meio de cultura Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) a 37 ºC no escuro e, após 2 dias de cultivo, suspensões de leveduras foram preparadas em solução salina na concentração de 1 a 5x10 5 UFC mL -1. O ensaio de microdiluição in vitro foi realizado apenas com C. albicans , sendo utilizado para o crescimento das leveduras o meio RPMI-1640, contendo L-glutamina sem bicarbonato em tampão MOPS 0,165M pH 7,0 e 2% de glucose (NCCLS, 2002b; EUCAST, 2002). Cem µL de

128 cada suspensão de leveduras foram adicionados aos poços de microplacas que continham 100 µL da solução de anfotericina B ou 100 µL dos extratos testados diluídos em meio RPMI-1640.

Como controle negativo do ensaio foram utilizados poços das microplacas com ausência de antifúngicos. As placas foram incubadas a 37oC por 48 h. O ensaio foi realizado com quatro repetições e, após incubação, o crescimento de microrganismos foi avaliado por medidas espectrofotométricas a 630 nm. Quanto maior a absorbância maior o crescimento das leveduras.

Nos ensaios de suscetibilidade em discos, as suspensões de C. albicans , C. tropicalis e C. parapsilosis foram distribuídas em placas de Petri contendo meio Müller Hinton com o auxílio de um “swab” por esfregaço e discos de papel contendo água destilada, anfotericina B (8 µg) ou as substâncias isoladas das sementes de H. courbaril (12-200 µg) foram dispostos nas placas. O ensaio foi realizado com quatro repetições. As culturas foram incubadas a 37 ºC no escuro e após

48 horas o halo de inibição do crescimento das leveduras foi avaliado.

3.3.11 Análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando os programas Winstat (R. Fitch Software), Bioestat

3.0 (Sociedade Civil Mamirauá, MCT/CNPq) e Sodek. As médias foram submetidas à ANOVA de um ou dois critérios e teste a posteriori de Tukey (P < 0,05).

129 3.3 RESULTADOS

3.3.1 Detecção da liberação de substâncias fitotóxicas e antifúngicas pelas sementes de H. courbaril

Exsudatos das sementes de H. courbaril inibiram a germinação de sementes de alface e de tomate (Figuras 4 e 5). Em alface, a germinação foi afetada apenas com o tratamento com os exsudatos obtidos no período de 30 dias após embebição. Para tomate, exsudatos obtidos a partir de 10 dias de embebição afetaram a germinação, que foi completamente inibida pelos exsudatos de 30 dias (Figura 5A).

O comprimento do hipocótilo e da radícula de alface foi reduzido por todos os exsudados

(Figura 4B), com efeito mais intenso dos exsudatos de 30 dias pós-embebição. Para tomate, o efeito no hipocótilo só foi observado com exsudatos obtidos após 30 dias de embebição, enquanto que a redução do crescimento da radícula já ocorreu com exsudatos de 10 dias (Figura 5B).

130

A 100 aa aa aa 80 a a

60

40

Germinação(%) b 20

0

B

0,6 a b b b 0,3 b B c 0,0 Hipocótilo b b -0,3 b b b (cm) -0,6 -0,9 -1,2

Radícula -1,5 a -1,8 C 10º 15º 20º 25º 30º

Dia

Figura 4 . Efeito de exsudatos de sementes Hymenaea courbaril obtidos do 10º ao 30º dia do processo germinativo sobre a germinação (A) e comprimento do hipocótilo e radícula de alface

(Lactuca sativa ) ( B). O tratamento C equivale ao controle do ensaio. Os valores representam médias das triplicatas do ensaio. As barras representam os desvios padrão das médias. Letras diferentes representam diferenças significativas (ANOVA, P<0,05, teste a posteriori Tukey).

131 A

100 a

80 ab b 60 b b 40 Germinação(%)

20

c 0

B

0,6 a a a a a 0,3 b 0,0 c -0,3 (cm) b b -0,6 b b

-0,9

Radícula -1,2 Hipocótilo

-1,5 a -1,8

C 10º 15º 20º 25º 30º

Dia

Figura 5. Efeito de exsudatos de sementes Hymenaea courbaril obtidos do 10º ao 30º dia do processo germinativo sobre a germinação (A) e comprimento do hipocótilo e radícula de tomate

(Solanum lycopersicum ) ( B). O tratamento C equivale ao controle do ensaio. Os valores representam médias das triplicatas do ensaio. As barras representam os desvios padrão das médias. Letras diferentes representam diferenças significativas (ANOVA, P<0,05, teste a posteriori Tukey).

132 As análises dos extratos de exsudatos de sementes por cromatografia em camada delgada revelou diversas zonas fluorescentes azuis por observação da placa sob UV longo (Figura 6A).

Por bioautografia, quatro zonas antifúngicas diferentes foram detectadas nos exsudatos, sendo duas delas presentes nos extratos dos exsudatos com 10 e 30 dias (Rf = 0,65 e 0,74), três nos de

20 dias (Rf = 0,23, 0,65 e 0,74) e quatro nos exsudatos de sementes com 40 dias pós-embebição

(Rf = 0,07, 0,23, 0,60 e 0,67) (Figura 6C). Todas as zonas de atividade antifúngica apresentaram fluorescência sob luz UV, especialmente aquela com Rf = 0,65 que apresentou forte fluorescência azul (Figura 6A e B).

133

A B C

0,74 0,74 0,69 0,67 0,74 0,65 0,62 0,60 0,67 0,59 0,65 0,54 0,60 0,48

0,23

0,07

C 10 20 30 40 C 10 20 30 40 C 10 20 30 40

Figura 6 . Cromatografia em camada delgada em placas de sílica-gel dos extratos de exsudatos de sementes de Hymenaea courbaril obtidos com 10, 20, 30 e 40 dias após embebição. As placas foram desenvolvidas em clorofórmio: MeOH (8:2 v/v). C = controle contendo apenas extrato de meio de cultura. (A) e ( B) Correspondem à observação da cromatoplaca sob UV longo (366 nm) e curto (254 nm), respectivamente, e ( C) bioautografia com esporos do fungo Cladosporium sphaerospermum , na qual as zonas mais claras correspondem à presença de substâncias inibidoras do crescimento do fungo.

3.3.2 Isolamento e caracterização das substâncias fitotóxicas das sementes de H. courbaril

O isolamento dos compostos ativos derivados das sementes de H. courbaril (Figura 2 e 3) foi biomonitorado pelos ensaios de fitotoxicidade com A. thaliana . O extrato acetato de etila

(AcOEt) dos exsudatos das sementes apresentou maior fitotoxicidade às plântulas de A. thaliana , reduzindo consideravelmente a biomassa e o comprimento da raiz e também a biomassa da parte aérea das plântulas (Figura 7), entretanto, os dados obtidos pela razão parte aérea:raiz indicaram

134 que esse efeito foi mais intenso sobre o sistema radicular (Figura 7D). As plântulas de A. thaliana tratadas com esse extrato ficaram com aspecto danificado e não desenvolveram raízes laterais

(Figura 8). O extrato AcOEt obtido dos exsudatos das sementes apresentou baixo rendimento

(Figura 2), devido ao fato de que se tornaram pouco solúveis em solventes orgânicos após a liofilização. Sendo assim, não foi possível sua utilização para prosseguimento do isolamento dos compostos ativos. Extratos do tegumento das sementes, assim como os extratos do embrião apresentaram alta fitotoxicidade para as plântulas de A. thaliana , afetando o desenvolvimento da parte aérea e das raízes das mesmas (Figura 9). Dessa forma, a fração AcOEt derivada do embrião das sementes de H. courbaril que apresentou fitotoxicidade e bom rendimento foi utilizada para o isolamento das substâncias ativas.

Das 23 frações resultantes da cromatografia em coluna de gel de sílica (sistema flash) desse extrato, algumas apresentavam alto grau de pureza: a fração FH5 (67 mg) contendo uma substância inédita (denominada himenaína) e a fração FH9 (31 mg). A substância da fração FH5 teve sua fórmula molecular determinada como C 20 H14 O8, de acordo com os dados obtidos por espectrometria de massas (HRFABMS). A estrutura dessa substância (FH5) foi elucidada comparando os dados de 1H RMN obtidos para a fração FH9 (Tabela 1, Figura 10) que foi identificada como a bicumarina ipomopsina, relatada em Ipomopsis aggregata (Pursh) V. Grant

(Polemoniaceae) (Arisawa et al. , 1984) (Figura 10 A).

135

A 0.120 a B a a 6.0 a a 0.090 b 4.0 b b

0.060

2.0 0.030

Biomassada parte aérea (g) 0.000 Comprimentoda raiz(cm) 0.0 Controle Hex AcoetAcOEt MeOH Control Hex Acoet MeOH 0.040 C a D a 50 0.030 a 40

0.020 30 20 0.010 Biomassada raiz(g) b Parteaérea: raiz 10

0.000 0 Controle Hex Acoet MeOH Controle Hex AcOEtAcOEt MeOH ControleControle Hex AcOEt MeOHMeOH

Figura 7. Biomassa da parte aérea ( A), comprimento da raiz ( B), biomassa da raiz ( C) e razão parte aérea: raiz ( D) de plântulas de Arabidopsis thaliana cultivadas durante 7 dias em meio MS líquido contendo 200 µg mL -1 de extratos de exsudatos das sementes de Hymenaea courbaril. As barras indicam o desvio padrão das médias (n=12). As letras representam as diferenças significativas (ANOVA, P<0,05, teste a posteriori Tukey).

136

1 cm

Hex AcOEt MeOH Controle

Figura 8. Aspecto das plântulas de Arabidopsis thaliana cultivadas durante 7 dias em meio MS líquido contendo 200 µg mL -1 de extratos de exsudatos das sementes de Hymenaea courbaril . A seta indica as raízes menores mostrando o efeito fitotóxico do extrato acetato de etila (AcOEt).

137 A B 0.060 5.00

) 4.00 0.040 3.00 * * * *

2.00 0.020 * 1.00 Biomassa parteda aérea (g)

Comprimento da raiz (cm * * * 0.000 0.00 EtOH Hex MeOH Acoet

Hex Hex

EtOH D Acoet Acoet C MeOH MeOH MeOH 0.016 35

30 0.012 25

20 0.008 15

Parte aérea: raiz

Biomassa da raiz (g) 10 0.004

* 5 0.000 * * * 0

t t

x x

H H H

H

e E e E

O O O

O

t H H

O O Hex Hex

e e e

c c

E EtOH

Acoet Acoet

M M M MeOH MeOH MeOH

A A CONTROLE TEGUMENTO EMBRIÃO CONTROLE TEGUMENTO EMBRIÃO

Figura 9 . Biomassa da parte aérea (A) e da raiz (B) e comprimento da raiz (C) de plântulas de

Arabidopsis thaliana cultivadas durante 7 dias em meio MS líquido contendo 200 µg mL -1 de

extratos do tegumento e do embrião das sementes de Hymenaea courbaril. Os controles referem-

se ao tratamento das plântulas apenas com etanol (EtOH), utilizado para solubilizar os extratos

hexânicos (Hex) e metanol (MeOH), utilizado para solubilizar os demais extratos. As barras

indicam o desvio padrão das médias (n=6). Os asteriscos indicam diferenças significativas em

relação ao controle respectivo de cada tratamento (ANOVA, teste a posteriori Dunnet, P<0,05).

138 O espectro de 1H RMN da fração FH5 mostrou a presença de grupamentos metoxil em δ

3,81 e 3.74, enquanto que o aparecimento de dubletos em δ 7.99 (1H, d, J=9.6Hz), e δ 6.45 (1H, d, J=9.6Hz) foi característico nos H-4’ e H-3’. Baseando-se nas correlações obtidas por 1H-1H-

COSY e HMBC, cinco singletos em δ 7,57, 7,44, 7,20 e 7,13 e 6,80 foram atribuídos para os H-4,

H-5’, H-8’, H-5 e H-8, respectivamente. De acordo com os dados obtidos a partir do espectro de

13 C RMN, essa molécula possui 17 carbonos aromáticos em sua estrutura, sendo que um deles é um carbono ressonante sobreposto. As comparações possibilitaram determinar que a molécula era composta por duas escopoletinas, assim como observado para ipomopsina. O espectro de 1H

RMN da fração FH5 foi muito similar ao da fração FH9 (ipomopsina), exceto que para FH5 foram observados 7 prótons aromáticos ressonantes enquanto que para a FH9 (ipomopsina) foram observados apenas 6 no espectro. As correlações feitas entre HSQC e HMBC (Tabela 2,

Figura 12) permitiram a confirmação das duas unidades de cumarinas e, de acordo com as diferenças observadas no deslocamento químico do C-3 ( δ 137,6) para a fração FH5 e para ipomopsina ( δ 111,6), foi possível sugerir que essas duas unidades estariam ligadas por um átomo de oxigênio entre o C-3 e C-7, diferentemente da ipomopsina. Os prótons H-5( δ 7,13) e 6-OMe

(δ3,83); H-5’ ( δ7,44) e 6’-OMe ( δ 3,74) mostraram correlações no espectro obtido por NOESY

(Figura 12) e indicaram a presença de um metoxil ligado ao C-6 e de outro metoxil ligado no C-

6’. Essa nova substância foi denominada de himenaína (7-hidroxi-6, 6’-dimetoxi-3, 7’- dicumarinil éter) e caracterizada como um pó amorfo amarelo, com ponto de fusão: 225-226 °C.

-1 UV λ max (MeOH): 351, 303(sh), 257(sh), 215; IR (KBr) vmax cm : 3354, 2924, 2852, 1722,

1611, 1567, 1511, 1462, 1424, 1390, 1284, 1244, 1171, 1137, 1020, 840; 1H RMN (400 MHz,

13 DMSO-d6): C RMN (100 MHz, DMSO-d6), veja Tabela 1. HRFABMS: m/z 382.0784

+ [calculada para C 20 H14 O8 (M+H) 383.0767].

139 Tabela 1. Dados obtidos por 1H e 13 C RMN para as bicumarinas encontradas na fração FH5

(himenaína) e FH9 (ipomopsina) (em DMSO-d6) isoladas do embrião das sementes de

Hymenaea courbaril.

No FH5 FH9

δ, mult , J (Hz) δ δ, mult , J (Hz) δ

2 157.3 160.07 3 137.6 115.78 4 7.57, s 128.0 7.91, s 145.54 5 7.13, s 109.8 7.27, s 110.19 6 146.2 146.08 7 150.5 152.02 8 6.80, s 103.3 6.88, s 103.27 9 147.4 150.00 10 110.9 111.35

6-OCH 3 3.74, s 56.6 3.83,s 56.66 2’ 160.8 161.07 3’ 6.37, d, 9.6 115.2 6.26, d, 12.4 112.46 4’ 7.98, d, 9.6 144.6 7.98, d, 12.4 145.54 5’ 7.44, s 111.4 7.34, s 109.59 6’ 147.0 145.45 7’ 148.6 149.67 8’ 7.20, s 106.7 111.63 9’ 149.1 148.20 10’ 110.9 110.93 6’-OCH3 3.82, s 56.9 3.90, s 56.88

140

OCH3

HO 6’ 7’ 5’

5 4 A H CO 8’ 10’ 3 10 3 4’ 6 9’

O 3’ 7 9 2 HO 8 O O 2’

O

B

H CO 5’ 4’ 3 10’ 3’ 6’

5 4 H3CO O 10 3 7’ 9’ 2’ 6 8’ O O

7 9 2 HO 8 O O

Figura 10. Estrutura química das duas bicumarinas isoladas de extratos do embrião das sementes de Hymenaea courbaril . ( A) Ipomopsina e ( B) himenaína.

141 Tabela 2. Dados obtidos dos espectros NOESY ( 1H – 1H) e HMBC ( 13 C – 1H) em (em DMSO-d6) da bicumarina himenaína ( FH5 ) isolada de extratos do embrião das sementes de Hymenaea courbaril .

HMBC ( 13 C – 1H) NOESY ( 1H -1H) C No. ( δ) J2 ( δδδ) J3 ( δδδ) 1H (δδδ) 1H (δδδ) 2 (157,3) H-C4 (7,57) 3 (137,6) H-C4 (7,57) 4 (128,0) H-C5 (7,13) H-C4 (7,57) - 5 (109,8) H-C4 (7,57) H-C5 (7,13) - 6 (146,2) H-C5 H-C8 (6,8) (7,13) 7 (150,3) H-C8 (6,8) H-C5 (7,13) 8 (103,3) - - H- C8(6,80) - 9 (147,4) H-C8 (6,8) H-C4 (7,57) H-C5 (7,13) 10 (110,9) H-C8 (6,8)

6-OCH3 (56,6) 6-OCH3 (3,74) H-C5 (7,13) 2’ (160,8) H-C4’ (7,98) 3’ (115,2) H- C3’(6,37) - 4’ (144,6) H-C5’ (7,44) H- C4’ (7,98) - 5’ (111,4) H-C4’ (7,98) H- C5’ (7,44) - 6’ (147,0) H-C5’ H-C8’ (7,20) (7,44) 7’ (148,6) H-C8’ H-C5’ (7,44) - (7,20) 8’ (106,7) H- C8’ (7,20) - 9’ (149,1) H-C5’ (7,44) 10’ (110,9) - -

6’-OCH3 (56,9) 6’-OCH3 (3,82) H-C5’ (7,44)

142

H3CO

H CO O 3 O O H3CO

HO O O H3CO O O O

HO O O

Figura 12 . Principais correlações obtidas por HMBC ( →) e NOESY ( ↔) para a bicumarina

himenaína ( FH5 ), isolada de extratos do embrião das sementes de Hymenaea courbaril.

Análises por HPLC-MS de extratos dos exsudatos das sementes revelaram a presença de

picos com o mesmo tempo de retenção e massa molecular da ipomopsina e himenaína no extrato

AcOEt destes exsudatos, indicando que as sementes de H. courbaril exsudam as bicumarinas

presentes no embrião (Figura 13). Quando as duas bicumarinas foram testadas isoladamente

quanto à sua atividade inibidora do crescimento de plântulas de A. thaliana não foram observadas

diferenças na biomassa da parte aérea e das raízes das plântulas em relação ao controle, exceto

para a concentração de 200 µg mL -1 de ipomopsina, a qual reduziu a biomassa da raiz (Figura 14

A e C ). A concentração de 200 µg. mL -1 de himenaína causou redução significativa do

comprimento das raízes de A. thaliana (Figura 14 B). Quando co-aplicadas, as bicumarinas

reduziram o crescimento da parte aérea das plântulas e também das raízes de A. thaliana (Figura

14 A e C), entretanto esse efeito não foi diferente entre as concentrações ensaiadas. A

concentração de 200 µg mL -1 de ipomopsina e himenaína co-aplicadas ocasionou também

reduções no comprimento das raízes (Figura 14 B) .

143 A 1,800 107 381.24 Ipomopsina – 80 TR 25.23 min 60 % 1,000 40 mAU 20 338.1

500 0 100 300 500 700 900 1,100 amu

-200 0.0 2,200 106 381.24 B Himenaína TR – 28.50 80

1,500 % 60 40 1,000 20 191.14 0 100 300 500 700 900 1,100 500 amu

- 200 0. 107 381.23 400 80 C % 60 40 300 20 107 mAU mAU 381.21

28.16 80 200 % 60 40 100 20 Ipomopsina25.43 Himenaína 100 300 500 700 900 1,100 amu -50 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 52.0

Minutos

Figura 13. Perfil de eluição e espectro de massas das bicumarinas isoladas das sementes de

Hymenaea courbaril (A e B) encontradas nos extratos (AcOEt) dos exsudatos das sementes ( C)

por HPLC-MS, detecção a 280 nm. TR= tempo de retenção.

144 Controle 50 ug mL -1 100 ug mL-1 A B 200 ug mL -1

8,00 0,080 A ααα A a a ααα ab αααβββ 6,00 0,060 βββ b βββ 0,040 4,00

0,020 2,00

Comprimentoda raiz(cm) Biomassada parte aérea 0,000 0,00 Ipomopsina Himenaína Ipo+him Controle Ipomopsina Himenaína

C D

8,00 0,020 A a

A ααα (g) 0,016

iz 6,00

raiz AB 0,012 βββ B 4,00 0,008

Parteaérea/ ra 2,00 Biomassada 0,004

0,000 0,00 IpomopsinaIpomopsina Himenaína Himenaína Ipo+him Ipo+him IpomopsinaIpomopsina Himenaína Himenaína Ipo+him Ipo+him

Figura 14. Biomassa da parte aérea (A), comprimento da raiz ( B), biomassa da raiz ( C) e razão parte aérea: raiz ( D) de plântulas de Arabidopsis thaliana cultivadas durante 7 dias em meio MS líquido contendo diferentes concentrações das bicumarinas (ipomopsina e himenaína) isoladas das sementes de Hymenaea courbaril. Os controles referem-se ao tratamento das plântulas apenas com DMSO, utilizado para solubilizar as substâncias. O tratamento ipo+him refere-se à co- aplicação das suas bicumarinas na proporção 1:1. As barras indicam o desvio padrão das médias

(n=6). As letras maiúsculas comparam as médias entre as concentrações de ipomopsina, letras minúsculas comparam os tratamentos com himenaína e letras gregas comparam os tratatamentos

Ipo+him (ANOVA, P<0,05, teste a posteriori Tukey).

145 Pelas análises das frações ( FH1-23 ) por GC-MS foi possível a identificação da cumarina escopoletina em algumas frações ( FH3 e FH4 ), por comparação dos espectros obtidos com o banco de espectro da biblioteca Wiley 275 e por comparações com padrões comerciais (Figura

15). O tempo de retenção da escopoletina, sob as condições de análise, foi de 15,2 minutos e a intensidade relativa dos íons formados pela fragmentação da molécula foi de 192 m/z [M] +

192m/z (100%), 177m/z (62%), 164m/z (32%), 149m/z (56%), 121m/z (29%). Escopoletina também foi detectada na fração AcOEt dos exsudatos das sementes de H. courbaril por análises por GC-MS (dados não mostrados). Análises dos extratos por CCD utilizando dois sistemas de solventes diferentes (clorofórmio: MeOH e Hex: AcOEt, em diferentes proporções) mostraram a presença de uma zona com fluorescência azul com o mesmo Rf do padrão de escopoletina, coincidindo com o Rf 0,65 quando desenvolvidas em clorofórmio:MeOH 8:2 (v/v) (Figura 6).

Outras cumarinas utilizadas como padrões, tais como umbeliferona, cumarina, 6-metil- umbeliferona, 6-metil-cumarina não foram detectadas nas frações pelas análises de CCD e GC-

MS. Apenas ácido ferúlico foi encontrado na fração FH19 por comparações com padrões comerciais, apresentando tempo de retenção 7.75 minutos e fragmentação de 150 m/z (100%),

135 m/z (80%), 107 m/z (40%), 77 m/z (35%).

146

A

Abundância

Minutos

10000 B

H3CO

5000 HO O O

Abundância

0

m/z

Figura 15. Análise por GC-MS da fração FH3 obtida por cromatografia do extrato (AcOEt) do embrião das sementes de Hymenaea courbaril . ( A) Cromatograma da fração e ( B) espectro de massas obtido do pico com tempo de retenção 15.2 min que apresenta 94% de similaridade com o espectro de massas da cumarina escopoletina (biblioteca Wiley 275).

147 3.3.3 Testes de atividade antifúngica das bicumarinas isoladas com fungos filamentosos e leveduras

As bicumarinas isoladas do embrião das sementes de H. courbaril não apresentaram atividade inibidora sobre os fungos C. sphaerospermum, C. cladosporioides , F. solani e A. niger

(dados não mostrados). Nos testes de microdiluição realizados com C. albicans e C. parapsilosis não houve inibição do crescimento das leveduras nas diferentes concentrações utilizadas de himenaína, mas foi notada inibição moderada entre as concentrações de 25 e 200 µg. mL -1

(Tabela 3) de ipomopsina, porém o efeito inibitório do crescimento de C. albicans não foi muito diferente entre as concentrações utilizadas, o que indicou ausência de efeito dose-dependente.

Testes de sensibilidade em discos realizados com as mesmas leveduras e com C. tropicalis utilizando outro solvente para aplicação das substâncias nos discos confirmaram a ausência de atividade antifúngica das bicumarinas (Figura 16).

148 Tabela 3. Teste de suscetibilidade in vitro do microrganismo Candida albicans às bicumarinas isoladas das sementes de H. courbaril .

[ ] µg mL -1 Abs 630 nm Atividade Ipomopsina 200 0,432(±0,174)* ++ 100 0,709(±0,142) ++ 50 0,604(±0,051) ++ 25 0,599(± 0,053) ++ 12 1,315( ±0,028) N

Himenaína 200 1,069(±0,021) N 100 1,709(±0,148) N 50 1,492(±0,093) N 25 1,475(± 0,102) N 12 1,484( ±0,061) N

Anfotericina B 0,003 1,311 N 16 0,100 +++ Controle negativo 1,511(±0,032) N * Os valores entre ( ) representam o desvio padrão da média de 4 repetições. N= nenhuma atividade, + = fraca, ++ = moderada, +++ = forte.

149

Ipomopsina Anf. B

Con. Con.

Himenaína Anf. B

Con. Con.

Ipomopsina Himenaína

Con. Con.

Figura 16 . Ensaio de sensibilidade por discos com Candida albicans (A, B e C) e Candida tropicalis (D, E e F). Anf. B = controle positivo com 8 µg anfotericina B, Con. = controle negativo com água destilada autoclavada. Foram aplicados 200 µg de ipomopsina e himenaína por disco.

150 3.3.4 Atividade seqüestradora de radicais livres com as bicumarinas isoladas das sementes de H. courbaril

Ensaios autográficos de atividade seqüestradora de radicais livres utilizando solução reveladora de DPPH mostraram que muitas frações obtidas por procedimento cromatografia

“flash” do extrato do embrião das sementes de H. courbaril possuíam essa atividade. Em ensaios realizados em microplacas, o extrato bruto das sementes (etanólico) e a fração AcOEt derivada desse extrato apresentaram atividade seqüestradora de radical livre com valores de EC50 = 500 e

100 µg mL -1, respectivamente. A bicumarina himenaína apresentou maior atividade, com 50% de atividade seqüestradora do radical livre DPPH nas concentrações de 100 µM, enquanto a ipomopsina e escopoletina apresentaram o mesmo efeito em concentrações de 300 e 500 µM, respectivamente (Figura 17). Os valores da EC50 dos padrões quercetina e catequina, utilizados como controle do ensaio, foram de 6 e 7 µM, respectivamente.

151

100 Escopoletina A EC50 = 500µM 80

60

40

20

Atividade SequestradoraDPPH de(%) 0 10 20 30 60 100 200 300 400 500 600 700 100 HymenaínaHimenaína

EC50 = 100µM 80 B

60

40

20

Atividade SequestradoraDPPH de(%) 0 10 20 30 60 100 200 300 400 500 600 700 100 Ipomopsina EC50 = 300µM C 80

60

40

20 Atividade SequestradoraDPPH de(%) 0 10 20 30 60 100 200 300 400 500 600 700

µM

Figura 17. Atividade seqüestradora do radical DPPH dos compostos identificados nos extratos das sementes de Hymenaea courbaril . ( A) Escopoletina, ( B) himenaína e ( C) ipomopsina.

152 3.4 DISCUSSÃO

As sementes quiescentes de H. courbaril são grandes, pesando cerca de 5 ± 2 g, e levam cerca de 10 dias para completar o processo de embebição, havendo grande variação temporal na protrusão da radícula. Nos experimentos de atividade fitotóxica, a protrusão da radícula nas sementes de H. courbaril ocorreu de 15-20 dias após início da embebição e em torno de 20-25 dias nos experimentos de bioautografia. Os dados obtidos nos experimentos mostram que as sementes de H. courbaril exsudam substâncias fitotóxicas e antifúngicas durante o período pré e pós-germinativo. Exsudatos coletados aos 10 dias pós-embebição das sementes reduziram significativamente e diferencialmente a germinação e o desenvolvimento da parte aérea e radícula das espécies-teste alface e tomate (Figuras 4 e 5).

As sementes de tomate foram afetadas principalmente quanto à sua germinação e crescimento da radícula, enquanto que em alface houve redução do crescimento do hipocótilo e da radícula. Parvez et al. (2004) estudaram os efeitos fitotóxicos de exsudatos do casca de árvores e de sementes de Tamarindus indica L. (Fabaceae), espécie que também acumula xiloglucano como polissacarídeo de reserva em suas sementes, e observaram que as substâncias fitotóxicas liberadas têm ação espécie-específica.

Os exsudatos coletados aos 30 dias após início da embebição das sementes de H. courbaril foram os que apresentaram maior acúmulo de fitotoxinas, causando efeitos mais drásticos nas espécies-teste. Durante esse período, as sementes de H. courbaril já haviam germinado e iniciado a mobilização do xiloglucano de reserva presente nos cotilédones (Bukeridge et al ., 2000). Estes resultados indicam que a exsudação de compostos bioativos pelas sementes de H. courbaril é maior durante o início da mobilização da reservas.

153 Embora o período em dias entre os experimentos de atividades fitotóxica e antifúngica não coincida (30 dias para os experimentos para atividade fitotóxica e 40 dias nos experimentos com atividade antifúngica), o estádio de desenvolvimento das sementes era praticamente o mesmo, isso porque a embebição das sementes de H. courbaril em meio de cultura MS foi mais lenta, o que ocasionou atraso na protrusão da radícula. Aos 40 dias pós-embebição também foi observada maior exsudação de substâncias antifúngicas (Figura 6). Das quatro substâncias antifúngicas exsudadas, duas foram encontradas apenas após a germinação (Figura 6, Rfs = 0,07 e 0,23) e duas foram liberadas logo no início da embebição das sementes (Figura 6, Rfs = 0,65 e 0,74).

As atividades detectadas nos exsudatos das sementes de H. courbaril podem estar relacionadas à presença das bicumarinas e de escopoletina. Os extratos dos exsudatos e sementes de H. courbaril mostraram-se muito tóxicos a A. thaliana e as bicumarinas isoladas também exerceram fitotoxicidade, especialmente quando co-aplicadas. Cumarinas têm sido descritas como potentes aleloquímicos. Abenavoli et al. (2001) mostraram que cumarinas simples foram capazes de afetar a forma e a função de raízes de trigo ( Triticum turgidum ssp. durum Desf.). Foi observado também que essas cumarinas podem causar inibição irreversível da germinação de trigo, por reduzir a entrada de água, a capacidade de retenção de eletrólitos e o consumo de oxigênio das sementes (Abenavoli et al ., 2004). Monocumarinas e bicumarinas sintéticas também foram relatadas como moléculas reguladoras do crescimento de plantas, sendo capazes de inibir o crescimento de plântulas de ervilha ( Pisum sativum L.), pepino ( Cucumis sativa L.) e trigo, entretanto, o efeito das bicumarinas ensaiadas foi inferior ao das cumarinas simples (Alexieva et al . 2002). Neste trabalho, o efeito da aplicação conjunta de ipomopsina e himenaína não variou com o aumento da concentração aplicada em plântulas de A. thaliana , sugerindo que as concentrações utilizadas possivelmente estão fora da linearidade do efeito dose-resposta dessas substâncias.

154 As bicumarinas isoladas não inibiram o crescimento de leveduras e fungos filamentosos.

Na literatura não foram encontrados relatos que atribuem atividade antifúngica às bicumarinas.

Algumas das atividades biológicas reportadas para essas substânciass incluem a anti-HIV, anticoagulante, antiinflamatória e propriedades inibidoras de enzimas (Khan et al . 2004; Borges et al ., 2005; Choudhary et al ., 2006; Su et al . 2006). Embora as bicumarinas isoladas não tenham atividade antifúngica, a cumarina escopoletina é uma das substânciass responsáveis pela atividade antifúngica dos exsudatos das sementes de H. courbaril , uma vez que essa substância foi detectada nos exsudatos pelas análises de GC-MS e que 5 e 10 µg de padrões comerciais de escopoletina inibiram o crescimento do fungo C. sphaerospermum no ensaio de bioautografia

(dados não mostrados). Em algumas espécies, escopoletina tem sido descrita como uma fitoalexina capaz de inibir o crescimento de vários fungos e bactérias patogênicas (Ahl-Goy et al.

1983, Valle et al ., 1997). Em plantas de tabaco, a indução de escopoletina e escopolina

(conjugado glicosilado de escopoletina) foi observada durante a resposta de hipersensibilidade

(HR) e a resistência localizada adquirida (LAR) durante a infecção pelo vírus TNV (Costet et al .,

2002). Em raízes de Argyreia speciosa Sweet , essa hidroxicumarina também foi encontrada e apresentou forte atividade inibidora do crescimento do fungo Alternaria alternata (Fr.) Kiessler e também mostrou toxicidade em raízes de plântulas de trigo (Shukla et al ., 1999). Em Helianthus annuus L., escopoletina causou inibição do crescimento do fungo Sclerotinia sclerotiorum (Lib.), um patógeno capaz de infestar vários órgãos da planta (Urdangarín et al .,1999).

Escopoletina também é conhecida pelas suas propriedades antioxidantes e têm sido muito utilizada para a quantificação de peróxido de hidrogênio em plantas (Levine et al ., 1994). As características antioxidantes da escopoletina conferem a ela papel importante nos mecanismos de defesa vegetal. Em células de folhas tabaco, a produção desta cumarina contribui para o controle

155 do estresse oxidativo gerado pela resposta de hipersensibilidade induzida por um eliciador glicoprotéico derivado do fungo Phytophthora megasperma Drechs (Costet et al. , 2002).

Apesar da sua comprovada atividade antioxidante, neste estudo a escopoletina não apresentou eficácia no seqüestro dos radicais DPPH apresentando alto valor de EC50 (500 µM,

Figura 17). O mesmo valor de concentração efetiva para essa cumarina no seqüestro do DPPH foi mencionado por Abreu et al. (2008). Os dímeros de escopoletina foram mais eficazes, principalmente a himenaína com valor de EC50 de 100 µM.

Apesar da atividade seqüestradora das bicumarinas não ser tão potente quanto à dos padrões de flavonóides utilizados (catequina e quercetina), a grande quantidade dessas substâncias encontradas nos extratos das sementes de H. courbaril sugere papel na proteção das células do embrião das sementes a danos causados por radicais livres. As frações FH4 e FH10, provenientes do fracionamento em coluna “flash”, encontravam-se muito enriquecidas com himenaína e ipomopsina, respectivamente. O rendimento dessas frações somados ao rendimento das substâncias isoladas totalizaram 119 mg de himenaína e 54 mg de ipomopsina, representando cerca de 25% do extrato de onde foram isoladas.

As espécies reativas de oxigênio (EROs) estão envolvidas em muitos processos fisiológicos das sementes. Muitos processos metabólicos são ativados durante a germinação ou

• infecção por patógenos gerando EROs, tais como o radical hidroxila ( OH), o ânion superóxido

- • (O 2 ), o radical peroxila (ROO ) e peróxido de hidrogênio (H 2O2), os quais podem ocasionar danos ao DNA ou podem causar a oxidação de lipídeos e proteínas (Bailly, 2004). Dessa forma, as substâncias antioxidantes presentes nas sementes de H. courbaril podem conferir um caráter protetor às células, estabilizando ou desativando radicais livres antes que eles ataquem seus alvos biológicos (Bailly et al ., 2004).

156 Muitos trabalhos relatam a presença de terpenos em H. courbaril (Nogueira et al., 2002;

Imamura et al ., 2004), mas não havia estudos dos metabólitos secundários produzidos por suas sementes. A molécula de ipomopsina foi previamente descrita, uma única vez em I. aggregata

(Arisawa et al ., 1984). As cumarinas simples são substâncias comumente encontradas nas plantas superiores, mas as bicumarinas são compostos raros, especialmente as que possuem uma ligação carbono-carbono como a ipomopsina (Liu et al., 2007). Bicumarinas foram encontradas em espécies de: Thymelaeaceae, Lasiosiphon eriocephalus Grant (Sengupta & Das, 1978),

Edgeworthia gardneri Meissen (Majumber et al ., 1974), Edgeworthia chrysantha Lindl. (Baba et al., 1990), Daphne oleoides Schreber (Riaz et al ., 2001), D. giraldii Nitsche (Li et al ., 2005) e D. genkwa Siebold & Zucc. (Park et al ., 2006); de Rutaceae, Boenninghausenia albiflora Reichb &

Meissner (Joshi et al ., 1989), Toddalia asiatica (L.) Lam. (Tsai et al ., 1997) e Ruta Montana L.

(Kabouche et al ., 2003); e de Balsaminaceae, Impatiens balsamina L. (Panichayupakaranant et al ., 1998). Em Fabaceae, bicumarinas também foram encontradas em Coronilla cretica L.,

Coronilla elegan s Panc. e Coronilla orientalis Mill. (Malikov & Saidkhodzaer, 1998).

A presença de escopoletina, dímeros de escopoletina e também ácido ferúlico no embrião das sementes de H. courbaril indica a ativação da via de biossíntese destes compostos nas sementes. Muitos passos da via de biossíntese das cumarinas permanecem desconhecidos

(Bourgaud et al ., 2006, Harbone, 1999).

Os dados obtidos nesse estudo evidenciaram a ocorrência de metabólitos secundários importantes nos processos de defesa contra patógenos, nas interações planta-planta e no processo de proteção aos danos causados por espécies reativas de oxigênio. A ocorrência de escopoletina e bicumarinas nas sementes de H. courbaril abre perspectivas de estudos das rotas biossintéticas dessas substâncias nessa espécie e são exemplos da diversidade química dos produtos naturais encontrados no gênero Hymenaea .

157 3.5 CONCLUSÕES

Com os dados obtidos neste trabalho pode-se concluir que as sementes de H. courbaril são ricas em cumarinas e bicumarinas que são liberadas durante o processo germinativo, cujas atividades biológicas sugerem que elas desempenhem um papel protetor das sementes mediante as circunstâncias de estresse oxidativo, além de possuir potencial inibidor do crescimento de fungos e plantas podendo conferir vantagens adaptativas para o desenvolvimento dessa espécie.

158 3.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABEL-KADER, M., BERGER, J.M, SLEBODNICK, C., HOCH, J., MALONE, S., WISSE, J.H.,

WERKHOVEN, M.C.M., MAMBER, S. & KINGSTON, D.G.I. 2002. Isolation and absolute

configuration of ent-halimane diterpenoids from Hymenaea courbaril from the Suriname rain

forest. Journal of Natural Products 65: 11-15.

ABENAVOLI, M.R., DE SANTIS, C., SIDARI, M., SORGONA, A., BADIANI, M. & CACCO,

G. 2001. Influence of coumarin on the net nitrate uptake in durum wheat ( Triticum durum

Desf. cv. Simeto). New Phytologist 150:619–627.

ABENAVOLI, M.R., SORGONA, A., ALBANO, S. & CACCO, G. 2004. Coumarin

differentially affects the morphology of different root types of maize seedlings. Journal of

Chemical Ecology 30: 1871-1883

ABREU, P.M., MATTHEW, S., GONZÁLEZ, T., VANICKOVA, L., COSTA, D., GOMES, A.,

SEGUNDO, M.A. & FERNANDES, E. 2008. Isolation and identification of antioxidants

from Pedilanthus tithymaloides . Journal of Natural Medicine 62: 67-70.

ALEXIEVA, V., SERGIEV, I., MANOLOV, I. & KARANOV, E. 2002. Plant growth regulating

activity of some coumarins and biscoumarins. Bulgarian Academy of Sciences 55: 91-98.

AHL-GOY, P., SIGNER, H., REIST, R., AICHHOLZ, R., BLUM, W., SCHMIDT, E. &

KESSMANN, H. 1993. Accumulation of scopoletin is associated with high disease resistance

of the hybrid Nicotiana glutinosa x Nicotiana debneyi . Planta 191: 200-206.

ARISAWA, M., KINGHORN, A.D., CORDELL, G.A. & FARNSWORTH, N.R. 1984.

Ipomopsin, a new biscoumarin from Ipomopsis aggregata. Journal of Natural Products 47:

106-112.

159 BABA, K., TANIGUTI, M., YONEDA, Y. & KOZAWA, M. 1990. Coumarin glycosides from

Edgeworthia chrysantha . Phytochemistry 29: 247-249.

BAILLY, C. 2004. Active oxygen species and antioxidants in seed biology. Seed Science

Research 14: 93-107.

BORGES, F., ROLEIRA, F., MIHAZES, N., SANTANA, L. & URIARTE, E. 2005. Simple

coumarins and analogues in medicinal chemistry: occurence, synthesis and biological activity.

Current Medical Chemistry 12: 887-916.

BOURGAUD, F., HEHN, A., LARBAT, R., DOERPER, S., GONTIER, E., KELLNER, S.,

MATERN, U. 2006. Biosynthesis of coumarins in plants: a major pathway still to be

unraveled for cytochrome P450 enzymes. Phytochemistry Reviews 5: 293-308.

BUCKERIDGE, M.S. & DIETRICH, S.M.C. 1990. Galactomannan from Brazilian legume seeds.

Revista Brasileira de Botânica 13: 109-112.

BUCKERIDGE, M.S., SANTOS, H.P. & TINÉ, M.A.S. 2000. Mobilisation of storage cell wall

polysaccharides in seeds. Plant Physiology and Biochemistry 38: 141-156 .

CHOUDHARY, M.I., FATIMA, N., KHAN. K.M., JALIL, S., IQBAL, S., & ATA-UR-

RAHMAN. 2006. New biscoumarin derivatives-cytotoxicity and enzyme inhibitory activities.

Bioorganic and Medicinal Chemistry 23: 8066-8072.

COSTET, L., FRITING, B. & KAUFFMANN, S. 2002. Scopoletin expression in elicitor-treated

and tobacco mosaic virus-infected tobacco plants. Physiologia Plantarum 115: 228-235.

EUCAST. 2002. Method for the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) by

broth dilution of fermentative yeasts. EUCAST Discussion Document 7.1. European Society

of Clinical Microbiology Infectious Diseases , CMI, 9, 1-9.

HARBORNE, J.B. 1999. Recent advances in chemical ecology. Natural Products Reports 16:

509-523.

160 HOMMANS, A.L. & FUCHS, A. 1970. Direct autography on thin-layer chromatograms as a

method for detecting fungitoxic substances. Journal of Chromatography 51: 325-327.

IMAMURA, P.M., MIRANDA, P.C.M.L. & GIACOMINI, R.A. 2004. A complete 1 H and 13 C

NMR data assignment for the diterpene methyl (-) zanzibarate by 2D spectroscopy and NOE

experiments. Magnectic resonance in Chemistry 42: 561-563.

JOSHI, P.C., MANDAL, S. & DAS, P.C. 1989. Jayaninin, adimeric coumarin from

Boenninghausenia albiflora . Phytochemistry 28: 1281-1283.

KABOUCHE, Z., BENKINI, N., SEGUIN, E. & BRUNEAU, C. 2003. A new dicoumarinyl

ether and two rare furonocoumarins from Ruta Montana . Fitoterapia 74: 194-196.

KHAN, K.M., IQBAL, S., LODHI, M.A., MAHARVI, G.M., ULLAH, Z., CHOUDHARY, M.I.,

ATTA-UR-RAHMAN & PERVEEN, S. 2004. Biscoumarin: new class of urease inhibitors;

economical synthesis and activity. Bioorganic and Medicinal Chem istry 12: 1963-1968.

KHOO, S.F., OEHLSCHLAGER, A.C. & OURISSON, G. 1973. Structure and stereochemistry

of the diterpenes of Hymenaea courbaril (Caesalpinioideae) seed pod resin. Tetrahedron 29:

3379-3388.

LABOURIAU, L.G. 1983. A germinação de sementes. OEA, Washington, DC.

LEE, Y.T. & LANGENHEIM, J.H. 1975. Systematics of the genus Hymenaea L. Chemistry of

California Press Ltd.: Los Angeles, 1975, Vol. 69.

LEVINE, A., TENHAKEN, R., DIXON, R. & LAMB, C. 1994. H 2O2 from the oxidative burst

orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell 79: 583-493.

LI, S.H., WU, L.J., GAO, H.Y., CHEN, Y.H. & LI, Y. 2005. A new dicoumarinoid glycoside

from Daphne giraldii . Journal of Asian Natural Products Research 7: 839-842.

LIU, J., FENG, Z., XU, J., WANG, Y. & ZHANG, P. 2007. Rare biscoumarins and chlorogenic

acid derivative from Erycibe obtusifolia . Phytochemistry 68: 1775-1780.

161 MAJUMDER, P.L., SEGUNPTA, G.C., DINDA, B.N. & CHATTERJEE, A. 1974. edgeworthin,

a new bis-coumarin from Edgeworthia gardneri . Phytochemistry 13: 1929-1931.

MALIKOV, V. M. & SAIDKHODZHAEV, A.I. 1998. Coumarins: plants, structure, properties.

Chemistry of Natural Compounds 34:202-264.

MARSAIOLI, A.J., LEITÃO FILHO, H.F. & PAIVA, J.P. 1975. Diterpenes in the bark of

Hymenaea courbaril . Phytochemistry 14: 1882-1883.

MURASHIGE, T. & SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with

tissue culture. Physiologia Plantarum 15: 473 - 497.

NOGUEIRA, R.T., GIACOMINI, R.A., SHEPHERD, G.J., IMAMURA, P.M. 2002. A new ent-

clerodane diterpene from Hymenaea courbaril var. altissima . Journal of Brazilian Chemical

Society 13: 389-391.

NCCLS. 2002a. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of

Filamentous Fungi. Approved Standard M-38-A. Wayne, PA, National Committee for

Clinical Laboratory Standards 22: 1-50.

NCCLS. 2002b. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of

Yeasts. Approved Standard M27-A2. Wayne, PA, National Committee for Clinical

Laboratory Standards 17: 1-44.

PANICHAYUPAKARANANT, P., NOGUCHI, H. & DE-EKNAMKUL, W. 1998. A new

biscoumarin from Impatiens balsamina root cultures. Planta Medica 64: 774-775.

PARK, B.Y, MIN, B.S., OH, S.R., KIM, J.H., BAE, K.H & LEE, H.K. 2006. Isolation of

flavonoids, a biscoumarin and an amide from the flower buds of Daphne genkwa and the

evaluation of their anti-complement activity. Phytotherapy Research 20: 610-613.

PARVEZ, S.S., PARVEZ, M.M., FUJII, Y. & GEMMA, H. 2004. Differential allelopathic

expression of bark and seed of Tamarindus indica L. Plant Growth Regulation 42 : 245-252.

162 RATTER, J.A., RICHARDS, P.W., ARGENT, G. & GIFFORD, D.R. 1973. Observations on the

vegetation of Northeastern Mato Grosso. 1. The woody vegetation types of the Xavantina-

Cachimbo expedition area. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological

Sciences 266: 449-492.

RIAZ, M., MALIK, A., SADHOZAI, S.K., HUSSAIN, M. & ULLAH, N. 2001. Daphwazirin,

biscoumarin glycopyranoside from Daphne oleoides . Natural Products Letters 15: 433-438.

SENGUPTA, S. & DAS, S.C., 1978. Structure of lasioerin: a novel coumarin from Lasiosiphom

eriocephalus Decne (Thymelaeaceae). Chemistry and Industry 16: 954-955.

SHUKLA, Y.N., SRIVASTAVA, A., KUMAR S. & KUMAR S. 1999. Phytotoxic and

antimicrobial constituents of Argyreia speciosa and Oenothera biennis. Journal of Ethno-

pharmacology 67 : 241-245.

SU, C.-X., MOUSCADET, J.-F., CHIANG, C.-C., TSAI, H.-J. & HSU, L.-Y. 2006. HIV-1

Integrase inhibition of biscoumarin analogues. Chemical and Pharmaceutical Bulletin 54:

682-686.

TINÉ, M.A.S., CORTELAZZO, A.L. & BUCKERIDGE, M.S. 2000. Xyloglucan mobilization in

cotyledons of developing plantlets of Hymenaea courbaril L. (Leguminosae-

Caesalpinioideae). Plant Science 154: 117-126.

TSAI, I.L., FANG, S.C., ISHIKAWA, T., CHANG, C.T. & CHEN, I.S. 1997. N-cyclohexyl

amides and a dimeric coumarin from Formosan Toddalia asiatica . Phytochemistry 44:

1383-1386.

URDANGARÍN, C., REGENTE, M.C., JORRÍN, J. & DE LA CANAL, L. 1999. Sunflower

coumarin phytoalexins inhibit the growth of the virulent pathogen Sclerotinia sclerotiorum .

Journal of Phytopathology 147:441-443.

163 VALLE, T., LOPEZ, J.L., HERNANDEZ, J.M. & CORCHETE, P. 1997. Antifungal activity of

scopoletin and its differential accumulation in Ulmus pumila and Ulmus campestris cell

suspension cultures infected with Ophiostoma ulmi spores. Plant Science 125: 97-101.

XIONG, Q., KADOTA, S., TANI, T. & NAMBA, T. 1996. Antioxidative effects of

phenylethanoids from Cistanche deserticola . Biological and Pharmaceutical Bulletin 19:

1580-1585.

164

4. Considerações finais

165

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O ciclo de vida das plantas compreende a embebição de água pelas sementes, a emergência da radícula, o desenvolvimento da raiz, o crescimento, a floração e a formação de sementes. A germinação e o desenvolvimento inicial de plântulas são períodos críticos, onde a sobrevivência pode ser afetada por vários fatores como disponibilidade de luz, água, nutrientes, assim como a presença de patógenos, herbívoros e simbiontes. A presença de mecanismos adaptativos efetivos nas espécies vegetais durante essa fase de desenvolvimento garante o sucesso do seu estabelecimento inicial.

Sesbania virgata e Hymenaea courbaril são duas espécies de Fabaceae com comportamentos ecológicos distintos. S. virgata é uma espécie pioneira de desenvolvimento rápido, perene, que produz grande quantidade de sementes, enquanto H. courbaril é uma espécie perene e clímax tardia que apresenta crescimento lento. As sementes das duas espécies diferem entre si também em vários aspectos morfológicos, anatômicos e bioquímicos. S. virgata apresenta como reserva o galactomanano presente na parede celular das células endospérmicas, o qual é rapidamente degradado por ação de hidrolases após a germinação das sementes (Buckeridge &

Dietrich, 1996). O xiloglucano presente nas paredes celulares das células cotiledonares das sementes de H. courbaril também funciona como uma reserva pós-germinativa, entretanto, o xiloglucano é degradado lentamente em um período de aproximadamente dois meses após a germinação das sementes (Tiné et al ., 2000). Estudos realizados por Santos & Buckeridge (2004) indicaram que o xiloglucano de reserva exerce um papel importante no estabelecimento das plântulas de H. courbaril , especialmente em ambientes com escassez de luz, como por exemplo, no sub-bosque das florestas onde essa espécie ocorre.

166 Os resultados obtidos neste trabalho relativos à química micromolecular das sementes e sobre a atividade biológica das substâncias identificadas adicionam informações importantes a outros estudos já realizados com essas espécies de Fabaceae. Os dados obtidos mostram que independentemente das diferenças ecológicas, estruturais e bioquímicas, as sementes de S. virgata e H. courbaril apresentam substâncias fitotóxicas e antifúngicas, as quais estão presentes e/ou são liberadas no início da embebição das sementes, e que podem contribuir para a proteção ao ataque de patógenos e a danos ocasionados pela geração de radicais livres e para inibir o crescimento de outras espécies vegetais potencialmente competidoras durante os estádios iniciais de crescimento.

Embora não tenham sido elucidados todos os metabólitos ativos, as substâncias majoritárias presentes nos exsudatos e tecidos das sementes foram caracterizadas. As sementes das espécies estudadas apresentam substâncias ativas tanto no tegumento e embrião. As sementes de S. virgata acumulam no tegumento principalmente flavonóides e proantocianidinas e provavelmente acumulam, o alcalóide sesbanimida A no embrião. As sementes de H. courbaril apresentam no tegumento grande quantidade compostos com alta polaridade. Alguns testes realizados com extratos cromatografados e revelados com vanilina sulfúrica demonstraram que existem proantocianidinas (taninos) neste tecido (dados ao mostrados), entretanto esses compostos parecem muito polimerizados, diferentemente do observado para S. virgata que contém grande quantidade de (+)-catequina livre. O embrião das sementes de H. courbaril possui grande quantidade de cumarinas, especialmente as bicumarinas, que são substâncias raras, as que atualmente têm sido estudadas devido às suas propriedades e atividade biológicas relevantes

(Choudhary et al ., 2006; Su et al . 2006; Borges et al ., 2005; Khan et al ., 2004).

Exceto a sesbanimida A, as demais substâncias isoladas das sementes desse trabalho são compostos fenólicos que são derivados da via dos fenilpropanóides. Muitos sinais trocados entre

167 os organismos presentes na rizosfera das raízes de plantas e sementes germinantes são derivativos dessa rota biossintética (Hirsch et al ., 2003). O papel impactante sobre comunidades vegetais do flavonóide catequina foi anteriormente discutido neste trabalho. Estudos recentes mostram a dinâmica desse flavonóide em solos naturais, sendo que em alguns desses solos ele é capaz de exercer fitotoxicidade quando liberada na forma de pulsos de concentrações muito abaixo das quantidades exsudadas pelas plantas, cerca de 40 µg L -1(Inderjit et al . 2008). As cumarinas também podem ter atividade fitotóxica (Abenavoli et al ., 2001, 2004).

Dessa forma, os dados sobre a fitotoxicidade dessas substâncias e a atividade antifúngica e antibacteriana de alguns dos metabólitos isolados de sementes de S. virgata e H. courbaril sugerem a que elas podem participar ativamente de eventuais interações planta-planta e planta- microrganismos que germinam em condições naturais, contribuindo para a permanência e sobrevivência de suas plântulas no meio ambiente. Adicionalmente, esse estudo abre perspectivas para novas investigações no que se refere ao entendimento de como essas substâncias podem ser reconhecidas por outras plantas e por patógenos, contribuindo para a compreensão da dinâmica, regulação e estabelecimento da rede de sinais entre diferentes plantas. Além disso, os estudos com a atividade dos oligossacarídeos de galactomanano são um exemplo de que as plantas são capazes de reconhecer moléculas que lhes são próprias e não-próprias e acrescenta a esses oligossacarídeos o possível papel de moléculas sinalizadoras.

168 4.2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABENAVOLI, M.R., DE SANTIS, C., SIDARI, M., SORGONA, A., BADIANI, M. & CACCO,

G. 2001. Influence of coumarin on the net nitrate uptake in durum wheat ( Triticum durum

Desf. cv. Simeto). New Phytologist 150: 619–627.

ABENAVOLI, M.R., SORGONA, A., ALBANO, S. & CACCO, G. 2004. Coumarin

differentially affects the morphology of different root types of maize seedlings. Journal of

Chemical Ecology 30: 1871-1883.

BORGES, F., ROLEIRA, F., MIHAZES, N., SANTANA, L. & URIARTE, E. 2005. Simple

coumarins and analogues in medicinal chemistry: occurence, synthesis and biological activity.

Current Medical Chemistry 12: 887-916.

BUCKERIDGE, M.S. & DIETRICH, S.M.C. 1996. Mobilisation of the raffinose family

oligosaccharides and galactomannan in germinating seeds of Sesbania marginata Benth.

(Leguminosae- Faboideae). Plant Science 117: 33-43.

CHOUDHARY, M.I., FATIMA, N., KHAN. K.M., JALIL, S., IQBAL, S., & ATA-UR-

RAHMAN. 2006. New biscoumarin derivatives-cytotoxicity and enzyme inhibitory activities.

Bioorganic and Medicinal Chemistry 23: 8066-8072.

HIRSCH, A.M., BAUER, W.D., BIRD, D.M., CULLIMORE, J., TYLER, B. & YODER, JOHN

I. 2003. Molecular signals and receptors: controlling rhizosphere interactions between plants

and other organisms. Ecology 84: 858-868.

INDERJIT, POLLOCK, J.L., CALLAWAY, R.M. & HOLBEN, W. 2008. Phytotoxic effects of

(±)-catechin in vitro , in soil, and in the field. Plos One 3: 1-11.

169 KHAN, K.M., IQBAL, S., LODHI, M.A., MAHARVI, G.M., ULLAH, Z., CHOUDHARY, M.I.,

ATTA-UR-RAHMAN & PERVEEN, S. 2004. Biscoumarin: new class of urease inhibitors;

economical synthesis and activity. Bioorganic and Medicinal Chem istry 12: 1963-1968.

SANTOS, H.P. & BUCKERIDGE, M.S. 2004. The role of the storage carbon of cotyledons in

the establishment of seedlings of Hymenaea courbaril under different light conditions. Annals

of Botany 94: 819-830.

SU, C.-X., MOUSCADET, J.-F., CHIANG, C.-C., TSAI, H.-J. & HSU, L.-Y. 2006. HIV-1

Integrase inhibition of biscoumarin analogues. Chemical and Pharmaceutical Bulletin 54:

682-686.

TINÉ, M.A.S., CORTELAZZO, A.L. & BUCKERIDGE, M.S. 2000. Xyloglucan mobilization in

cotyledons of developing plantlets of Hymenaea courbaril L. (Leguminosae-

Caesalpinioideae). Plant Science 154: 117-126.

170 . Sesbania virgata e e exsudatos das sementes de OD) da fração da OD) derivada AcOEt partição da orgânica d 3 H NMRH (CD 1 Espectro de Espectro Anexo 1.

171

e exsudatos das sementes

derivada do fracionamento do extrato AcOEt obtido d H

OD) OD) da fração

3

H RMN (CD

1

.

Espectro de

Sesbania virgata Anexo 2. de

172

derivada de

H

a a fração

obtida por fracionamento em cromatografia “flash” d

2

.

OD) OD) da fração 3

Sesbania virgata

H H RMN (CD 1

Espectro de

exsudatos das sementes de Anexo 3.

173

cOEt derivado das

(quercetina) obtida por fracionamento do extrato A

FS3

OD) OD) da fração

3

.

H RMN (CD 1

Sesbania virgata

Espectro de

sementes de sementes de Anexo 4.

174

OEt derivado das

(catequina) obtida por fracionamento do extrato Ac

FS7

OD) OD) da fração 3

.

H H RMN (CD

1

Sesbania virgata

Espectro de

Anexo 5. sementes de sementes de

175

ia “flash” do extrato do

(himenaína) obtida no fracionamento por cromatograf

FH5

.

6) da fração d

Hymenaea courbaril H H RMN (DMSO-

1

Espectro de

embrião das sementesembrião de Anexo 6. 176

ia “flash” do extrato

(himenaína) obtida no fracionamento por cromatograf

FH5

.

6) da fração d

Hymenaea courbaril

C RMN (DMSO-

13

Espectro de

do das sementesembrião de Anexo 7.

177

ia “flash” do extrato

(himenaína) obtida no fracionamento por cromatograf

FH5

.

6) da fração d

Hymenaea courbaril

C RMN (DMSO- 13

Espectro de

do das sementesembrião de Anexo 7.

178

fia “flash” do

(ipomopsina) obtida no fracionamento por cromatogra

FH9 .

6) da fração d

Hymenaea courbaril

H H RMN (DMSO-

1

Espectro de

Anexo8. extrato doextrato dasembrião sementes de Anexo 8.

179

fia “flash” do

(ipomopsina) obtida no fracionamento por cromatogra

FH9

.

6) 6) da fração

d

Hymenaea courbaril

C RMN (DMSO-

13

Espectro de Anexo9.

extrato doextrato dasembrião sementes de Anexo 9.

180

fia “flash” do

(ipomopsina) obtida no fracionamento por cromatogra

. FH9

6) da fração d

Hymenaea courbaril

C RMN (DMSO- 13

Anexo9.

Espectro de

extrato doextrato dasembrião sementes de Anexo 9.

181

fia “flash” do

(ipomopsina) obtida no fracionamento por cromatogra

. FH9

6) 6) da fração d

Hymenaea courbaril

C RMN (DMSO- 13

Anexo9.

Espectro de

extrato doextrato dasembrião sementes de Anexo 9.

182 Anexo 10

PHYTOTOXIC CATECHIN LEACHED BY SEEDS OF THE TROPICAL WEED Sesbania

virgata

KELLY SIMÕES 1, JIANG DU 2,3 , FERNANDA S. KRETZSCHMAR 1, COREY D.

BROECKLING 3, FRANK S. STERMITZ 2, JORGE M. VIVANCO 3, and MARCIA R.

BRAGA 4*

1. Departamento de Biologia Celular e Estrutural, Universidade Estadual de Campinas, C.P.

6109, Campinas 13083-863, SP, Brasil.

2. Department of Chemistry, Colorado State University, Fort Collins CO 80523, USA.

3. Center for Rhizosphere Biology, Colorado State University, Fort Collins CO 80523, USA.

4. Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Instituto de Botânica, C.P. 3005, São Paulo

01061-97, SP, Brasil.

*Corresponding author: E-mail: [email protected]

183 Abstract - Sesbania virgata (Cav.) Pers (wand riverhemp) is a fast-growing tropical legume species that has been used for revegetation of riparian forests and rehabilitation of degraded areas and that exhibits an invasive behavior in certain regions of Brazil. Preliminary studies have shown that seed leachates inhibit the germination and development of seedlings of some crop species. Here, we report that the seed leachates of S. virgata inhibit the growth of Arabidopsis thaliana and rice. The flavonoid (+)-catechin is found in high amounts in these leachates. It was active at concentrations of 50 µg ml -1, and its effect was not distinguishable from the (+)-catechin obtained from a commercial source. We found that (+)-catechin is located in the seed coat and is rapidly released in high concentrations (235 µg per seed) at the beginning of imbibition.

Quercetin was also detected in the seed coat of S. virgata , but it is not secreted by the seeds.

Other phytotoxic compounds in the seed leachates were also detected. The fact that S. virgata releases high amounts of (+)-catechin, which also has antimicrobial activity, and other phytotoxins from its seeds at the earliest stages of its development might represent some adaptative advantage to the seedling that contributes to its invasive behavior and successful establishment in different soils.

Key words - Sesbania virgata, Seed leachate, (+)-Catechin, Allelopathy, Allelochemicals,

Quercetin.

Running title - Allelochemicals from Sesbania virgata

184 INTRODUCTION

The seed stage is a crucial phase of plant development, which allows plant to effectively establish in the natural environment. One strategy that enables the success of the early establishment of plants is the release of secondary metabolites and other low-molecular-weight compounds at germination, which can inhibit the proliferation of soil pathogens and the germination and growth of competing plants (Nelson, 2004).

Some studies have examined how phytotoxic secondary metabolites exuded by the roots can influence the ability of a plant to become invasive in a new environment, such as the enantiomers (±)-catechin exuded by Centaurea maculosa Lam. (Bais et al., 2002) and lactones released by Echinochloa crusgalli (L.) Beauv. (Xuan et al., 2006). Although these studies have examined only those compounds that are exuded through the plant root tissues, seeds are also able to rapidly release allelochemicals after the beginning of the imbibition process that contribute to the invasive behavior of some species (Ndakidemi and Dakora, 2003, and refs. therein).

The tropical legume Sesbania virgata (Cav.) Pers (Syn. S. marginata Benthan) is a perennial, fast-growing shrub native to South America. It is 2-4 m in height and occurs in Central,

Southeast, and South Brazil, Argentina, Uruguay, and Paraguay. It produces a lot of seeds with long-term viability that are dispersed within indehiscent legume fruits that float in the water (Pott and Pott, 1994). It has been described as invasive in flood and damp soil, especially in inundated rice plantations (Kissmann and Groth, 1999). This species has been used for revegetation of riparian forests, soil erosion control, and rehabilitation of degraded areas (Pott and Pott, 1994).

Previous studies have demonstrated that S. virgata seed leachates can affect the germination and growth of the radicle of some crop species (lettuce, tomato, and radish) (Simões

185 and Braga, unpublished data). It also has been reported that the seeds of various other Sesbania species contain toxic compounds that are able to restrict the growth of other plant species (Buta,

1983; Powell et al., 1990; Van Staden and Grobbelaar, 1995). Sesbania species generally present abundant seed production and rapid growth, occurring naturally near rivers, in flood places, and in modified soils. Sesbania punicea (Cav) Benth. is described as a noxious weed in South Africa, invading abandoned fields and out-competing natural vegetation, and forming a dense population.

This behavior seems to be associated with the presence of the potent alkaloid sesbanimide in the seeds that can inhibit the seedling growth of several species (Gorst-Allman et al., 1984, Van

Staden and Grobbelaar, 1995). As reported by Singh et al. (2007), under field conditions, intercropping of Sesbania species with cultivated plants reduced the density of grass weeds. Due to its invasive behavior and demonstrated ability to release phytotoxins from its seeds, S. virgata may fit the seed-related allelopathic invasiveness pattern of this genus; however, the chemicals responsible for the phytotoxicity of the S. virgata seed leachates have not been identified yet.

Despite the fact that seed leachates of S. virgata contain large amounts of sugars released during the mobilization of the storage cell wall carbohydrates by the developing embryo

(Buckeridge and Dietrich, 1996), no microbial contamination has been observed during the germination process. This lack of a microbial presence suggests the release of antimicrobial compounds during the early stages of germination. Since the phytotoxic compounds produced are unknown, the aim of the present work was to isolate and identify phytotoxins present in the S. virgata seed leachates. We tested compounds on Arabidopsis thaliana and rice under laboratory conditions. We report that (+)-catechin is the major compound released by S. virgata seeds.

186 MATERIALS AND METHODS

Seed Germination Seeds of Sesbania virgata were collected from natural populations in the region of São Paulo, Brazil. Six thousand seeds were selected, scarified, and placed on two

Whatman 1 filter papers in 15 cm diam Petri dishes along with 0.7 ml of distilled water per seed

(50 seeds per dish). The plates were incubated for 3 d at 25 ºC with a photoperiod of 12 hr.

Extraction and Isolation During the 3rd day of germination, seeds were removed from the Petri dishes, the leachates were collected, and the filter papers were washed x 3 with 105 ml of distilled water (representing three times the initial water volume added to each dish). The leachates of each dish were combined, filtered through a nylon membrane, freeze-dried and weighed (6 g). The resultant powder was dissolved in 300 ml distilled water and extracted sequentially with the same volume of hexane and ethyl acetate (x 3 each). The aqueous extract was freeze-dried and re-dissolved in methanol and evaporated under a vacuum. The ethyl acetate extracts were chromatographed in a regular Merck silica gel 60 (0.063-0.200 mm) column (80 x 3 cm) and eluted with a gradient of dichloromethane (DCM) and MeOH (0 →100% MeOH). Fifty fractions were collected and assembled according to their thin-layer chromatography (TLC) profiles to yield 10 fractions (A-J). One of the largest phytotoxic fractions collected (H, 110 mg) was re-fractioned in a flash chromatography system with a silica gel column (1 x 20 cm) and

DCM: MeOH (9:1) as an isocratic solvent system.

Seeds removed from the Petri dishes were also freeze-dried, triturated with a Walita mixer, extracted x 3 with pure ethanol (0.7 ml per seed), evaporated, and partitioned with hexane, ethyl acetate, and methanol as described above. The ethyl acetate fraction (600 mg) was also submitted to a regular Merck silica gel 60 (0.063-0.200 mm) column (2 x 20 cm) with a gradient with DCM

187 and MeOH (0 →100% MeOH). The 60 fractions collected were compiled into 15 fractions according to their TLC profiles, and one fraction (6) that contained pure quercetin was detected.

Circular Dichroism (CD) Spectroscopy and 1H NMR Analyses Quercetin and catechin isolated

1 from S. virgata seeds and leachates were identified by H NMR spectra analyses in CD 3OD and compared to standards purchased from Sigma by using a Varian INOVA 400-MHz Fourier spectrometer. Catechin was also analyzed by its Circular Dichroism (CD) spectrum, in methanol on an Aviv model 202 spectrometer and compared with the standard. (+)-Catechin showed a

Cotton effect at 280 nm ( ∆Є=-1.511) (Korver and Wilkins, 1971).

Quantification of Isolated Compounds Seeds of S. virgata were germinated as described above and every day between the beginning of the imbibition and the final day of germination (1-6 d), a set of 40 seeds was removed from the Petri dishes, and tissues were separated (seed coat, endosperm, and embryo), freeze-dried, and extracted x 3 with ethanol (0.7 ml per seed). Ethanol was evaporated, and the extracts were suspended in 1 ml distilled water and partitioned with 1 ml ethyl acetate (x 4). After drying, extracts were solubilized in MeOH (HPLC grade) and injected into a C18 Dionex Acclaim column (150 x 4.6 mm) in an HPLC-MS consisting of a system P680 pump, an ASI-100 autosampler, and a UVD170U UV detector coupled to a Thermo Finnigan

Surveyor MSQ mass spectral detector. The samples were eluted with acetic acid (0.1%) in water

(eluent A) and 0.1% acetic acid in methanol (eluent B) in a linear gradient from 10% of B (3 min) to 90% of B (90 min). Compounds were quantified by using Sigma standards for catechin and quercetin chromatographed at the same conditions. Leachates obtained from each germination day were also collected and extracted with ethyl acetate and analyzed by HPLC-MS as described above.

188

Phytotoxicity Bioassays Seeds of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotype Columbia (Col-0) purchased from Lehle Seed Co. (TX) were surface-sterilized with 20% commercial sodium hypochlorite (0.4% active chloride) for 2 min, washed x 4 in sterile distilled water, and further germinated on solid Murashige and Skoog (Murashige and Skoog, 1962) basal medium in Petri dishes at 25± 2ºC and a 16:8 hr L:D photoperiod. After 5 d, the A. thaliana seedlings were relocated to sterile 12-well plates (one plant per well) that contained 1 ml of liquid MS basal media. They were placed on an orbital shaker under the growth conditions described above to oxygenate the roots properly. Six replicates were used per treatment. After 1 d catechin and other fractions obtained from S. virgata seed leachates, and a commercial standard of (+)-catechin

(Sigma), were applied to the liquid MS containing the A. thaliana seedlings. The substances were dissolved in methanol or ethanol, and 10 µl of the extracts containing different concentrations were applied to the wells. Controls were performed using only the solvents. After 7 d, the length and biomass of the plant root tissues were evaluated.

Seeds of inundated rice ( Oryza sativa L.) cultivar IAC 106 (Instituto Agronômico de Campinas,

SP, Brazil) were washed rapidly with 80% ethanol and then surface sterilized with 20% commercial sodium hypochlorite (0.4% active chloride) for 20 min. After that, seeds were washed x 3 with sterile distilled water, then immersed in a 0.2 % fungicide solution (Derosal

Bayer) for 30 min and subsequently washed three times with sterile distilled water. Rice seeds were germinated in 250 ml-flasks that contained solid MS basal medium at 25± 2ºC with 16:8 hr

L:D photoperiod. After 6 d seedlings were transferred to tubes (2.3 x 15 cm) that contained 2 ml of liquid MS basal medium (one seedling per tube). The bioassay was performed as described for

A. thaliana.

189

Statistical Analyses All statistical analyses were performed by using Winstat software (Microsoft,

USA). Growth parameters were subjected to ANOVA, and significant differences between means were determined by using LSD test at 1% probability.

RESULTS

Fractions A-J obtained from the ethyl acetate extract of the seed leachates caused significant reduction in root length and root biomass in A. thaliana plants grown in MS media when compared to controls (Fig. 1). The 1H NMR spectrum from one of the largest fractions collected (H) and also from the G fraction was identical to that of the standard bioflavonoid catechin. When fraction H was re-chromatographed, two of the 20 fractions were pure catechin

(F2 and F3, containing 23 and 17 mg, respectively). 1H NMR of these fractions confirmed that the isolate compound from S. virgata seed leachates was catechin, and the CD spectrum analyses revealed that the molecule was the enantiomer (+)-catechin (data not shown).

Different concentrations of (+)-catechin isolated from S. virgata seed leachates were tested against A. thaliana seedlings and activity was compared with commercial (+)-catechin.

Statistical analyses ( LSD , ANOVA, P=0.01) showed that there were no differences between the treatments with catechin from Sigma and from S. virgata (Fig. 2). The effect of the concentrations of 50 and 100 µg. ml -1 on root length was not different from the effect of methanol alone on control plants (Fig. 2 A); however, differences were detected in root biomass of plants among these treatments (Fig. 2 B). (+)-Catechin appeared to be phytotoxic to root tissues of A. thaliana at the concentration of 50 µg ml -1. The concentrations of 200 and 500 µg ml -1 were

190 toxic, causing a darkening of the plant roots, a total inhibition of lateral root formation (not shown), and drastic reduction in root biomass (Fig. 2).

Toxicity of (+)-catechin purified from S. virgata seed leachates was also observed on rice, and this level of toxicity was similar to that found with catechin purchased from Sigma. With both, toxicity was detected only in the response of root biomass (Fig. 3). This effect was statistically different from control plants when a concentration of 100 µg ml -1 of catechin or higher was used (Fig. 3 B), but root damage was observed even with the lowest concentration (50

µg ml -1).

The flavonoid quercetin was isolated from the seed extracts (25 mg), but it is not exuded by S. virgata seeds (Fig. 4). It was found to be phytotoxic to A. thaliana (data not shown). Both

(+)-catechin and quercetin are located in the seed coat tissues of S. virgata ; these compounds were not detected by HPLC-MS analyses in the extracts of the embryo or endosperm tissues (data not shown).

During the germination of S. virgata , we found that (+)-catechin was rapidly released from the seed coat tissues on the first day of imbibition at levels up to 235 µg per seed (Fig. 4).

After this first release, levels in the seed leachates decreased from the second day of imbibition.

Based on the data of Fig. 4, the amount of (+)-catechin released from one seed was estimated as higher than 400 µg until the sixth day after the beginning of imbibition. The quantity of catechin and quercetin in the seed coat also decreased during germination, but the amount of (+)-catechin found in the seed coat was considerably lower than that measured in the seed leachates (Fig. 4).

191 DISCUSSION

High concentrations of constitutive phenolic compounds in the seed coat have been reported in Sesbania species. Some chemicals are rapidly released during imbibition and are found in the soil surrounding germinating seeds (Ceballos et al., 1998). We found that (+)- catechin was rapidly released from seed coat tissues of S. virgata on the first day of imbibition at much higher (ca. 10 times) levels than those reported for other species of Sesbania (Ceballos et al., 1998) and Lespedeza (Buta and Lusby, 1986).

Catechin has shown phytotoxic effects on a variety of plants, but the level of phytotoxicity varies depending on the species tested and the experimental conditions (Buta and Lusby, 1986;

Bais et al., 2002, 2003; Iqbal et al., 2003; Perry et al., 2005a, Thelen et al., 2005; D’Abrosca et al., 2006; Thorpe, 2006; Weir et al., 2006; Furubayashi et al., 2007). In addition, (+)-catechin has antimicrobial activity and inhibits the growth of the pathogenic soil bacteria Erwinia carotovora ,

E. amylo vora , Xanthomonas campestris , and Pseudomonas fluorescens (Veluri et al., 2004). (±)-

Catechin also acts as an autoregulator of seed germination and seedling development in

Centaurea maculosa and Lespedeza sp. (Buta and Lusby, 1986; Perry et al., 2005b). Seed germination in S. virgata seems not to be affected by its coat leachates, but additional experiments are needed to definitively determine this.

The inhibitory effect of (+)-catechin isolated from seed leachates of S. virgata on A. thaliana growth was similar to that observed by using commercial catechin. Treated plants showed a reduction in root biomass (Fig. 2 B) when compared to control plants. This was most likely due to the characteristic effect of the bioflavonoid catechin in inhibiting the development of lateral roots of seedlings of A. thaliana . The phytotoxicity of catechin on root cell tissues of A. thaliana has been previously described as caused by condensation of the cytoplasm generated by the rapid induction of reactive oxygen species (ROS), followed by a subsequent increase of Ca 2+

192 and acidification of the cytoplasm, which induces cell death (Bais et al., 2003). We also found phytotoxic effects of seed leachate catechin on rice seedlings (Fig. 3).

S. virgata is considered an invasive species to flood and damp soils, especially to inundated rice plantations (Kissmann and Groth, 1999). Therefore, the presence of this toxin in seed leachates may indicate an allelopathic strategy during germination, and may contribute to the protection of S. virgata seeds against the attack of potential pathogens.

S. virgata is a pioneer species that produces many long-term viable seeds within indehiscent legume fruits. These fall on the ground and are further dispersed by water and/or wind, as reported for other Sesbania species (Pott and Pott, 1994; Ceballos et al., 1998). The species thus forms a transitory seedbank, and its allelochemicals are released during seed imbibition. As described by Ceballos et al. (1998), the anatomical organization of Sesbania seeds is finely adapted to facilitate the rapid deployment of chemicals present in the seed coat, contributing to the rapid mobilization of these compounds towards the zone around the imbibed seed. Although, these chemicals can be altered by reactions with other substances in the soil, microbial breakdown, and compound stability, the presence of active substances in the seed coat and their early release in high amounts at the beginning of imbibition suggest that they may play an ecological role. An early pulse of high catechin concentrations could contribute to enabling the species to rapidly and temporarily control the growth of nearby plants under specific environmental conditions. Early allelopathic effects may be advantageous to the competitive outcome; and resource depletion depends on the size of competing plants (Laterra and Bazzalo,

1999). Moreover, antimicrobial activity of (+)-catechin could provide a hostile environment to potential microbial invaders.

Root-secreted (±)-catechin may contribute to the invasive behavior of the noxious weed

Centaurea maculosa, which shows a devastating effect on native species to the Northeast of

193 United States of America (Bais et al., 2002). Despite recent findings that indicate that the amounts of catechin found in soils around C. maculosa are lower than those previously reported to be phytotoxic (Blair et al., 2005; 2006), probably due to the low stability of the catechin in the soil, a short-term pulse of high amounts could be sufficient to confer some advantage at critical periods of development. This has been recently observed in the field for root exudates of C. maculosa (Perry et al., 2007). It is also important to consider that the dynamics of root exudation is different from the release of substances from seed coats. As reported by Phillips et al. (2006), plants are able to recover part of their root-exuded compounds, sometimes with an influx rate that exceeds their efflux. Sesbania virgata produces seeds with the ability to control water imbibition in early stages of germination, and as reported for other species of Sesbania , the anatomical structure of the seed coat plays a role in the establishment of an allelochemical-rich zone during imbibition (Ceballos et al., 1998). Additionally, seed coats remain in the environment, possibly increasing the amounts of soil catechin. The compound continues to be released up to 6 d after the beginning of imbibition as shown in Fig. 4.

The detection of other phytotoxic fractions derived from the S. virgata seed leachates that do not contain (+)-catechin in their molecular composition (Fig. 1) suggests that this seed can likely release other prospective phytotoxins that may relate to the invasive character and to the adaptive mechanisms of this species. Our data indicate that the seed coat of S. virgata contains the bioflavonoids (+)-catechin and quercetin, but only (+)-catechin seems to operate as an allelochemical. Additional experiments are needed to determine the possible presence of other active compounds, and also the possibility of co-interactions that could potentiate phytotoxic effects.

194 Acknowledgments - We thank the Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP-

Brazil) for the PhD fellowship to Kelly Simões (proc. 2004/04477-7) and for the grant to the project (FAPESP, proc. 2005/04139-7). We also thank CNPq for the research fellow grant to

Marcia R. Braga. We thank Emily Wortman-Wunder for editorial assistance. This work was also supported by a grant from the National Science Foundation (grant no. NSF-IBN 0335203 to

J.M.V. and F.R.S.) and by DOD-SERDP (grant no. SI1388 to J.M.V.).

195 REFERENCES

BAIS, H. P., WALKER, T. S., STERMITZ, F. R., HUFBAUER, R. A., and VIVANCO, J. M.

2002. Enantiomeric-dependent phytotoxic and antimicrobial activity of (+)-catechin. A

rhizosecreted racemic mixture from spotted knapweed. Plant Physiol. 128: 1173-1179.

BAIS, H. P., VEPACHEDU, R., GILROY, S., CALLAWAY, R. M., and VIVANCO, J.M. 2003.

Allelopathy and exotic plant invasion: from molecules and genes to species interactions.

Science 301: 1377-1380.

BLAIR, A. C., HANSON, B. D., BRUNK. G. R., MARRS, R.A., WESTRA, P., NISSEN, S. J.,

and HUFBAUER, R. A. 2005. New techniques and finds in the study of a candidate

allelochemical implicated in invasion success. Ecol. Lett. 8: 1039-1047.

BLAIR, A. C., NISSEN, S. J., BRUNK G. R., and HUFBAUER, R. A. 2006. A lack of evidence

for an ecological role of the putative allelochemical (±)-catechin in spotted knapweed

invasion success. J. Chem. Ecol. 32: 2327-2331.

BUCKERIDGE, M. S. and DIETRICH, S. M. C. 1996. Mobilisation of the raffinose family oligosaccharides and galactomannan in germinating seeds of Sesbania marginata Benth. (Leguminosae- Faboideae). Plant Sci. 117: 33-43. BUTA, G. J. 1983. Linoleic acid as a plant growth inhibitor from seeds of Sesbania punicea . J.

Nat. Prod. 46: 775.

BUTA, J. G. and LUSBY, W. R. 1986. Catechins as germination and growth inhibitors in Lespedeza seeds. Phytochemistry 25: 93-95. CEBALLOS, L., HOSSAERT-MCKEY, M., MCKEY, D., and ANDARY, C. 1998. Rapid

deployment of allelochemicals in exudates of germinating seeds of Sesbania (Fabaceae): roles

of seed anatomy and histolocalization of polyphenolic compounds in anti-pathogen defense of

seedlings. Chemoecology 8: 141-151.

196 D'ABROSCA, B., DELLAGRECA, M., FIORENTION, A., ISIDORI, M., MONACO, P., and

PACIFICO, S. 2006. Chemical constituents of the aquatic plant Schoenoplectus lacustris :

evaluation of phytotoxic effects on the green alga Selenatrum capricornutum . J. Chem. Ecol.

32: 81-96.

FURUBAYASHI, A., HIRADATE, S., and FUJII, Y. 2007. Role of catechol structure in the

adsorption and transformation reactions of L-Dopa in soils. J. Chem. Ecol. 33: 239-250.

GORST-ALLMAN, C. P., STEYN P. S., VLEGGAAR, R., and GROBBELAAR, N. 1984. Structure elucidation of sesbanimide using high-field NMR spectroscopy. J Chem. Soc. 1: 1311-1314. IQBAL Z, HIRADATE, S., NODA, A., ISOJIMA, S., and FUJII, Y. 2003. Allelopathic activity

of buckwheat: isolation and characterization of phenolics . Weed Sci. 51: 657–662.

KISSMANN, K. G. and GROTH, D. 1999. Plantas infestantes e nocivas . BASF, São Bernardo do

Campo.

KORVER, O. and WILKINS, C. K. 1971. Circular dichroism spectra of flavonols. Tetrahedron

27 : 5459-5465.

LATERRA, P. and BAZZALO, M. E. 1999. Seed-to-seed allelopathic effects between two

invaders of burned Pampa grasslands. Weed Res. 39: 297-308.

MURASHIGE, T. and SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473 - 497. NDAKIDEMI, P. A. and DAKORA, F. D. 2003. Legume seed flavonoids and nitrogenous

metabolites as signals and protectants in early seedling development. Func. Plant Biol. 30:

729-745.

NELSON, E. B. 2004. Microbial dynamics and interactions in the spermosphere. Annu. Rev.

Phytopathol. 42: 271-309.

197 PERRY, L. G., JOHNSON, C., ALFORD, E. R., VIVANCO, J. M., and PASCHKE, M. W.

2005a. Screening of grassland plants for restoration after spotted knapweed invasion. Restor.

Ecol. 13: 725-735.

PERRY, L. G., THELEN, G. C., RIDENOUR, W. M., WEIR, T. L., CALLAWAY, R. M.,

PASCHKE, M. W., and VIVANCO, J. M. 2005b. Dual role for an allelochemical: (±)-

catechin from Centaurea maculosa root exudates regulates conspecific seedling

establishment. J. Ecol. 93: 1126-1135.

PERRY, L. G, THELEN, G. C., RIDENOUR, W. M., CALLAWAY, R. M., PASCHKE, M. W.

and VIVANCO, J. M. 2007. Concentrations of the allelochemical (±)-catechin in Centaurea

maculosa soils. J. Chem. Ecol . 33: 2337-2344.

PHILLIPS, D. A., FOX, T. C., and SIX, J. 2006. Root exudation (net efflux of amino acids) may

increase rhizodeposition under elevated CO 2. Global Change Biol. 12: 561-567.

POTT, A. and POTT, V. J. 1994. Plantas do Pantanal. EMPRAPA/CPAP/SPI, Corumbá.

POWELL, R. G., PLATTNER, R. D., and SUFFNESS, M. 1990. Ocurrence of sesbanimide in

seeds of toxic Sesbania species. Weed Sci. 38, 148-152.

SINGH, S., LADHA, J. K., GUPTA, R. K., BHUSHAN, L., RAO, A. N., SIVAPRASAD, S., and

SINGH, P. P. 2007. Evaluation of mulching, intercropping with Sesbania and herbicide use

for weed management in dry-seeded rice ( Oryza sativa L.). Crop Protect. 26: 518-524.

THELEN, G. C., VIVANCO, J. M., NEWINGHAM, B., GOOD, W., BAIS, H. P.,

LANDRES, P., CAESAR, A., and CALLAWAY, R. M. 2005. Insect herbivory stimulates

allelopathic exudation by an invasive plant and the suppression of natives. Ecol. Lett. 8: 209 –

217.

THORPE, A. 2006. Biochemical effects of Centaurea maculosa on soil nutrient cycles and plant

communities. PhD Dissertation. University of Montana, Missoula.

198 VAN STADEN, J. and GROBBELAAR, N. 1995. The effect of sesbanimide and Sesbania seed extracts on germination and seedling growth of a number of plant species. Environ. Exp. Bot. 35: 321-329. VELURI, R., WEIR, T.L., BAIS, H. P., STERMITZ, F. R., and VIVANCO, J. M. 2004.

Phytotoxic and antimicrobial activities of catechin derivatives. J. Agric. Food Chem. 52:

1077-1082.

WEIR, T. L., BAIS, H. P., STULL, V. J., CALLAWAY, R. M., THELEN, G. C., RIDENOUR,

W. M., BHAMIDI, S., STERMITZ, F. R., and VIVANCO, J. M. 2006. Oxalate contributes to

the resistance of Gaillardia grand flora and Lupinus sericeus to a phytotoxin produced by

Centaurea maculosa . Planta 223: 785-795.

XUAN, T. D., CHUNG III, M., KHANH, T. D., and TAWATA, S. 2006. Identification of

phytotoxic substances from early growth of Barnyard Grass ( Echinochloa crusgalli ) root

exudates. J. Chem. Ecol. 32: 895-906.

199 LEGENDS TO THE FIGURES

Fig. 1 Root length (A) and root biomass (B) of Arabidopsis thaliana seedlings grown for 7 d in liquid MS media containing one of the fractions A-J collected from the Sesbania virgata seed leachates’ chromatography. Each fraction was administered at the concentration of 200 µg ml -1 of

MS media. Control plants were treated with the same volume of ethanol (Et) used to solubilize the fractions A to D, or of methanol (Me), used to solubilize the fractions E to J. The * indicates a significant difference between the means of the treatments and the controls determined by the test

LSD (ANOVA, P=0.01). The bars represent the STDEV of the means (N=6).

Fig. 2 Effect of different concentrations of (+)-catechin derived from Sesbania virgata seed leachates and commercial (+)-catechin on the root length (A) and root biomass (B) of

Arabidopsis thaliana seedlings after 7 d of treatment. Control plants were treated only with methanol. The * indicates a significant difference between the means of the treatments and the control determined by the test LSD (ANOVA, P=0.01). The bars show the STDEV of the means

(N=6).

Fig. 3 Effect of different concentrations of (+)-catechin derived from Sesbania virgata seed leachates and commercial (+)-catechin on the root length (A) and root biomass (B) of rice seedlings after 7 d of treatment. Control plants were treated only with methanol. The * indicates a significant difference between the means of the treatments and the control determined by the test

LSD (ANOVA, P=0.01). The bars show the STDEV of the means (N=6).

200 Fig. 4 Quantification of quercetin and catechin present in the seed coat and in the seed leachates of Sesbania virgata during the beginning of imbibition (1 d- first day) to the ending of the germination process (6 d- sixth day). Analyses were realized by HPLC-MS, and compounds were quantified and detected using a commercial standard. The bars represents the STDEV of the means (N=3).

201 FIGURES

(A) 5.0 * * 4.0

3.0

2.0 RootLength (cm)

1.0

0.0

(B) 0.015

* 0.012

* 0.009

0.006 RootBiomass (g)

0.003

0 EtMeABCDEFGH I J Control Fractions

Fig. 1

202

Commercial (+)-catechin

(A) 5.0 Sesbania (+)-catechin

4.0 *

3.0 *

2.0 RootLength (cm)

1.0

0.0 (B) 0.020

0.016

0.012 * *

0.008 RootBiomass (g) * 0.004 *

0.000 Control 50 100 200 500

µg ml -1

Fig. 2

203

Commercial (+)-catechin (A) Sesbania (+)-catechin 2.0

1.5

* 1.0

RootLength (cm) 0.5

(B) 0.0

0.009

0.008

0.006 *

* 0.005

* RootBiomass (g) 0.003

0.002

0.000 Control 50 100 200 500

µg ml -1

Fig. 3

204

260 (+)-Catechin-leachate (+)-Catechin-seed coat 208 Quercetin-leachate Quercetin-seed coat 156

per seed µg 104

52

0 1d 2d 3d 4d 5d 6d

Fig. 4

205 Anexo 11

Title: Ipomopsin and hymenain, two biscoumarins from seeds of Hymenaea courbaril

Kelly Simões a, b, *, Jiang Du c, Rosemeire A.B. Pessoni d, Elaine M. Cardoso-Lopes b, Jorge M.

Vivanco e, Frank R. Stermitz c, Marcia R. Braga b

a Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, CP 6109, CEP 13083-863,

Campinas, SP, Brazil b Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Instituto de Botânica, São Paulo, SP Brazil cDepartment of Chemistry, Colorado State University, Fort Collins, CO, United States of

America d Universidade Metodista de São Paulo, São Bernardo do Campo, SP, Brazil e Center for Rhizosphere Biology, Colorado State University, Fort Collins, CO, United States of

America

* Corresponding author. Tel.: +55 11 50736300 ext. 289, fax: +55 11 50733678

E-mail address: [email protected]

206 Abstract

A new biscoumarin (7-hydroxy-6,6’-dimethoxy-3,7’-dicoumarinyl ether), named hymenain ( 1) and the known biscoumarin ipomopsin ( 2) were isolated from the germinated seeds of Hymenaea courbaril var. stilbocarpa . Their structures were elucidated by spectroscopic methods. Scopoletin was also detected in the extracts by TLC and GC-MS analyses. Hymenain and ipomopsin showed direct scavenging effect on a stable free radical, 2, 2-diphenyl-1-picryl- hydrazyl (DPPH) with the EC50 values of 100 µM and 300 µM, respectively.

Key-words: Hymenaea courbaril, Leguminosae, scopoletin, biscoumarins, free radical scavenging activity, 7-hydroxy-6,6’-dimethoxy-3,7’-dicoumarinyl ether.

1. Introduction

Hymenaea (family Leguminosae, Caesalpinoideae, Detariae) is a well-distributed genus in

Central South America, occurring mainly in the Amazon basin (Lee and Langenheim, 1975).

Plants of the Detariae tribe are chemically known by the production of large amounts of resins, natural solutions made up of diterpene acids and sesquiterpenes, which have economic importance and that are used in Brazilian folk medicine (Gottlieb and Mors, 1980). Hymenaea species specifically contain diterpenes of the enantio-labdanoic, ent-halimane and clerodane type

(Khoo et al., 1973; Cunningham et al., 1974; Nogueira et al., 2001).

Hymenaea courbaril L. var stilbocarpa (popularly known as “jatobá” in Brazil) is a large and widely distributed tropical tree that is useful for its timber. Chemicals produced by its leaves, trunk, fruits, and seed pods have been extensively studied (Martin and Langenheim, 1972; Khoo

207 et al., 1973; Nogueira et al., 2001; Abdel-Kader et al., 2002). No reports were found about the chemistry of secondary metabolites from seeds of H. courbaril .

In this paper, we report the occurrence of scopoletin and two biscoumarins, ipomopsin, previously reported in Ipomopsis aggregata (Pursh) V. Grant (Polemoniaceae) (Arisawa et al.,

1984), and the undescribed biscoumarin hymenain from seeds of H. courbaril. We show that ipomopsin and hymenain have free radical scavenging activity, suggesting that these compounds may play a role in protecting seeds of H. courbaril against free radicals during germination.

2. Results and discussion

Compound 1 was obtained as a yellow powder. The IR spectrum revealed the existence of hydroxyl (3354 cm -1), and carbonyl (1722 cm -1) groups, and aromatic rings (1611, 1567 and 1511

-1 cm ). Its molecular formula was determined to be C 20 H14 O8 by HRFABMS. The structure of 1 was assigned by comparing NMR spectral data (Table 1) with those for 2 (ipomopsin) (Arisawa et al ., 1984). The 1H NMR spectrum of 1 showed methoxy groups at δ3.81 and 3.74, while the appearance of doublets at δ 7.98 (1H, d, J=9.6Hz), and δ 6.45 (1H, d, J=9.6Hz) was characteristic of H-4’ and H-3’, respectively. Based on 1H-1H-COSY and HMBC correlations, five singlets at δ 7.57, 7.44, 7.20 and 7.13 and 6.80 were assigned to H-4, H-5’, H-8’, H-5 and H-

8, respectively. There were 17 aromatic carbons (one overlapping carbon resonance) in the 13 C

NMR spectrum. The comparison suggested that 1 was a biscoumarin which contained two scopoletin moieties as in 2. The 1H NMR spectrum of 1 was similar to that of 2 except that 7 aromatic proton resonances were observed in the spectrum of 1 as opposed to the 6 aromatic protons seen in the spectrum of 2. HSQC and HMBC correlations permitted the determination of

208 the two coumarin units (Fig. 1). Since the chemical shift of C-3 ( δ 137.6) of 1 was quite different from that of 2 (δ 111.6), this suggested that the two units were linked through an oxygen bridge at

C-3 and C-7’. Protons H-5 ( δ 7.13) and 6-OMe ( δ3.83); H-5’ ( δ7.44) and 6’-OMe ( δ 3.74) showed correlations in the NOESY spectrum which indicated that one methoxyl was attached to

C-6 and another was at C-6’ (Fig. 1). Thus the structure of compound 1 was identified as 7- hydroxy-6,6’-dimethoxy-3,7’-dicoumarinyl ether, a previously undescribed biscoumarin here named hymenain.

A compound was detected in some fractions by TLC as a blue fluorescent spot under UV light, and it was identified by GC-MS analyses as scopoletin by comparing mass spectra {RRt=

15.2 min, ( m/z, rel. int.): 192 [M] + 192 (100), 177 (62), 164 (32), 149 (56), 121 (29)} with standard compound, library Wiley 275 and literature data (Runkel et al ., 1997). Other coumarins used as standards in GC-MS analyses were not identified in the fractions.

Under our experimental conditions neither 1 nor 2 showed antifungal activity against the filamentous fungi Fusarium solani , Cladosporium cladosporioides , Aspergillus niger and to yeast

Candida albicans. Bioautographic assay against Cladosporium sphaerospermum with 1 and 2 also showed a lack of antifungal activity. In contrast, scopoletin, a well-known fungitoxic compound (Valle et al., 1997; Costet et al., 2002), assayed at concentration five times lower than

1 and 2, inhibited C. sphaerospermum growth.

A TLC autographic test using a DPPH revealing solution was performed with all fractions obtained from the column chromatography and several free radical scavenging compounds were preliminary detected. Seed crude extract and the ethyl acetate fraction had EC 50 values of 500 and

100 µg. ml -1, respectively (Table 2). Hymenain ( 1) showed more powerful DPPH radical scavenging activity than ipomopsin ( 2) or scopoletin. Hymenain reduced 50% of DPPH free

209 radicals at the concentration of 100 µM, while ipomopsin and scopoletin had the same effect at concentrations of 300 and 500 µM, respectively (Table 2). Radical scavenging activity of phenolic compounds depends on not only the number but also the position of hydroxyl groups and methoxyl substituents in the molecules (Cai et al., 2006). This could explain the higher activity for 1 when compared to 2.

To our knowledge the biscoumarin ipomopsin was previously reported only in Ipomopsis aggregata (Pursh) V. Grant (Polemoniaceae) (Arisawa et al., 1984). Biscoumarins and other coumarins from plants and synthesis have been reported as antimicrobial, anticoagulant, antitumoral, anti-inflammatory, enzyme inhibitors, and plant growth regulators (Khan et al. 2004;

Borges et al., 2005; Choudhary et al., 2006). The presence of two biscoumarins with DPPH radical scavenging activity in large amounts in seeds of H. courbaril var. stilbocarpa , together with scopoletin, suggest that these compounds may play a role protecting the embryo from oxidative stresses during seed germination. Moreover, our findings of these two rare biscoumarins could be seen as an example of the diversity of natural products that can be found in the genus Hymenaea .

3. Experimental

3.1. General Experimental Procedures

The 1H NMR, 13 C NMR, HSQC, HMBC (79 ms mixing time), COSY, and NOESY (200 ms mixing time) spectra were measured in DMSO-d6 on a Varian 400 spectrometer. The IR spectrum was acquired with KBr in an AVATAR 320 FT-IR instrument and the UV spectrum was

210 obtained in an HPLC system with a Dionex PDA-100 Photodiode Array detector. The melting point was determined on a Büchi Melting Point B-545.

3.2. Plant material

Seeds of Hymenaea courbaril L. var. stilbocarpa were purchased from Instituto Florestal

– São Paulo, SP, Brazil. Two hundred and fifty (250) seeds were disinfected with sodium hypochlorite (0.5% active chloride) for 30 min and washed with sterile distilled water. Seeds were scarified using pliers, sowed in vermiculite inside of plastic trays and germinated in a climate chamber under 26 ºC and 12 h light photoperiod. After the radicle prominence (15 days), seed coats and embryos were separated.

3.3. Extraction and isolation

Fresh embryos of H. courbaril were triturated in a mixer and extracted three times with

80% EtOH. The ethanolic extract was dried under vacuum, the dried material (22g) partitioned three times with hexane, EtOAc, and MeOH, each extract being subsequently dried under vacuum. The EtOAc fraction (700 mg) was then applied into a silica gel column (120 g, volume

48 mL, Redi Sep Disposable Flash Column) in a Combiflash Retrieve of Flash Chromatography system with the flow rate of 30 ml min -1 with a gradient of MeOH and DCM (0 →100% MeOH).

Two hundred fractions were collected and pooled according to their TLC profile, resulting in twenty three fractions (F 1-F23 ). F 5 (67 mg) and F 9 (23 mg) were pure and identified as compounds

1 and 2, respectively.

211 3.4 Gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) analysis

Fractions 3 and 4 from the flash chromatography procedure were analyzed using a GC

System Agilent 6890 coupled to Agilent 5973 Mass Selective Detector and a capillary column

DB-5 (0.25 mm I.D. x 30 m, and 25 µm thickness). The oven temperature was ramped from 70ºC to 250ºC with a linear rate of 10°C per min. The injector and detector temperatures were 250° and

230°C, respectively. The gas flow (helium) was 1ml min -1. Scopoletin, umbelliferone, and coumarin (Sigma) and 4-methylumbelliferone and 6-methylcoumarin (Koch Light Lab.) were used as standards.

3.5 Characterization

3.5.1 Hymenain. 7-hydroxy-6,6’-dimethoxy-3,7’-dicoumarinyl ether ( 1)

Yellow amorphous powder, m.p. 225-226 °C. UV λ max (MeOH): 351, 303(sh), 257(sh),

-1 215; IR (KBr) vmax cm : 3354, 2924, 2852, 1722, 1611, 1567, 1511, 1462, 1424, 1390, 1284,

1 13 1244, 1171, 1137, 1020, 840; H NMR (400 MHz, DMSO-d6): C NMR (100 MHz, DMSO-d6),

+ see Table 1. HRFABMS: m/z 382.0784 [calcd. for C 20 H14 O8 (M+H) 383.0767].

3.4 Antifungal assay

The antifungal assays were performed using the filamentous fungi Fusarium solani

(Mart.) Sacc. (SPC 980), Cladosporium cladosporioides (Fresen) G. A. de Vries (SPC 140), C. sphaerospermum Pemzig (SPC 491), Aspergillus niger V. Tiegh (SPC 1493), from Culture

Collection of Instituto de Botânica- São Paulo, SP, Brazil, and the yeast Candida albicans

(Robin) Berk. (ATCC 90029) according to National Committee for Clinical Laboratory Standards

212 (NCCLS, 2002 a; b) and with some modifications made by the European Committee for

Antimicrobial Susceptibility Test (EUCAST, 2002). For the filamentous fungi F. solani, C. cladosporioides and A. niger , spores of seven day-old cultures, maintained at 28 ºC in darkness in

Potato-Dextrose-Agar (BDA) medium, were suspended in a sterile saline solution and the final concentration adjusted to 5x10 4 CFU ml -1. The antifungal test was carried out in twelve-well plates, and 200 µL of PDA medium (at 50 ºC) plus 100 µL of each spore suspension and 100 µL of hymenain ( 1) or ipomopsin ( 2) were applied in each well at the final concentrations of 200,

100, 50, 25 and 12 µg ml -1. The drug amphotericin B was used as positive control. The plates were incubated under the same conditions described above and after 3-5 days the colony growth was evaluated.

The antifungal assay with C. sphaerospermum was carried out according to Homans &

Fuchs (1970). In this assay, 100µg of hymenain ( 1) or ipomopsin ( 2) or 20 µg of scopoletin were applied to pre-coated silica-gel TLC plates. The layers we developed in CHCl 3: MeOH (9:1), dried to remove the solvent, and sprayed with a spore suspension of C. sphaerospermum in glucose and salt solution. Plates were incubated for 72 h in a moistened chamber at 25 oC in the dark. Inhibition of fungal growth was detected as a clear zone against a dark background.

C. albicans was cultivated in Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) medium at 37 ºC in darkness, and after two days a yeast suspension (1x10 5 CFU ml -1) was prepared with sterile saline water. The medium RPMI-1640 (prepared according to NCCLS, 2002b and EUCAST, 2002) was used to perform the test and 100 µl of the samples or amphotericin B (dissolved in RPMI-1640) at the same concentrations described above plus 100 µl of the suspension of C. albicans were added to each well.

213 3.5 DPPH radical scavenging assay

The free radical scavenging activity was determined using a DPPH ( 2, 2-diphenyl-1-picryl- hydrazyl Sigma) radical photometric assay (Xiong et al., 1996), adapted to microplates. The samples (178 µL) were dissolved in MeOH and DCM (7:3 v/v) at different concentrations and applied in each well followed by 72 µL of 0.3 mM DPPH in EtOH solution. After 30 min at room temperature the absorbance was measured at 518 nm and the scavenging activity was expressed as EC 50 (the concentration required to cause 50% of DPPH reduction). EtOH plus the plant extracts were used as blanks, and the DPPH solution plus EtOH was used as negative control.

TLC autographic tests were also performed with the fraction using a 0.3 mM DPPH solution. The positive controls were performed using standard solutions of commercial antioxidant compounds

(catechin, quercetin, and scopoletin from Sigma).

Acknowledgements

We thank the Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP-Brazil) for the

PhD fellowship to Kelly Simões (proc.2004/04477-7) and for the grant to the project (proc.

2005/04139-7). This work was also supported by a grant from the National Science Foundation

(grant no. NSF-IBN 0335203 to Jorge M. Vivanco and Frank R. Stermitz) and by DOD-SERDP

(grant no. SI1388 to Jorge M. Vivanco).

214 References

Abel-Kader, M., Berger, J.M, Slebodnick, C., Hoch, J., Malone, S., Wisse, J.H., Werkhoven,

M.C.M., Mamber, S., Kingston, D.G.I. 2002. Isolation and absolute configuration of ent-

halimane diterpenoids from Hymenaea courbaril from the Suriname rain forest. J. Nat. Prod.,

65, 11-15.

Arisawa, M., Kinghorn, A. D., Cordell, G. A., Farnsworth, N.R. 1984. Ipomopsin, a new

biscoumarin from Ipomopsis aggregata. J. Nat. Prod. 47, 106-112.

Borges, F., Roleira, F., Mihazes, N., Santana, L., Uriarte, E. 2005. Simple coumarins and

analogues in medicinal chemistry: occurence, synthesis and biological activity. Curr. Med.

Chem. 12, 887-916.

Cai, Y-Z., Sun, M., Xing, J., Luo, Q., Corke, H. 2006. Structure–radical scavenging activity

relationships of phenolic compounds from traditional Chinese medicinal plants. Life Sci., 78,

2872-2888.

Choudhary, M.I., Fatima, N., Khan. K.M., Jalil, S., Iqbal, S., Atta-ur-Rahman. 2006. New

biscoumarin derivatives-cytotoxicity and enzyme inhibitory activities. Bioorgan. Med. Chem.,

23, 8066-8072.

Costet, L., Friting, B., Kauffmann, S. 2002. Scopoletin expression in elicitor-treated and tobacco

mosaic virus-infected tobacco plants. Physiol. Plant., 115, 228-235.

Cunningham, A., Martin, S.S., Langenheim, J.H. 1974. Labd-13-en-8-ol-15-oic acid in the trunk

resin of amazonian Hymenaea courbaril . Phytochemistry, 13, 294-295.

EUCAST. 2002. Method for the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) by

broth dilution of fermentative yeasts. EUCAST Discussion Document 7.1. European Society

of Clinical Microbiology Infectious Diseases, CMI, 9, 1-9.

215 Gottlieb, O.R., Mors, W.B. 1980. Potential utilization of Brazilian wood extractives. J. Agric.

Food Chem., 28, 196-215.

Homans, A.L., Fuchs, A. 1970. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method

for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr., 51, 327-329.

Khan, K.M., Iqbal, S., Lodhi, M.A., Maharvi, G.M., Ullah, Z., Choudhary, M.I., Atta-ur-Rahman,

Perveen, S. 2004. Biscoumarin: new class of urease inhibitors; economical synthesis and

activity. Bioorgan. Med. Chem., 12, 1963-1968.

Khoo, S. F., Oehlschlager, A.C., Ourisson, G. 1973. Structure and stereochemistry of the

diterpenes of Hymenaea courbaril (Caesalpinioideae) seed pod resin. Tetrahedron, 29, 3379-

3388.

Lee, Y.T., Langenheim, J.H. 1975. Systematics of the genus Hymenaea L. Chemistry of

California Press Ltd.: Los Angeles, 1975, Vol. 69.

Martin, S.S., Langenheim, J.H. 1972. Sesquiterpenes in leaf pocket resin of Hymenaea courbaril .

Phytochemistry, 11, 3049-3051.

NCCLS. 2002a. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of

Filamentous Fungi. Approved Standard M-38-A. Wayne, PA, National Committee for

Clinical Laboratory Standards, 22, 1-50.

NCCLS. 2002b. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of

Yeasts. Approved Standard M27-A2. Wayne, PA, National Committee for Clinical

Laboratory Standards 17, 1-44.

Nogueira, R.T., Shepherd, G.J., Laverde Jr., A., Marsaioli, A.J., Imamura, P.M. 2001. Clerodane-

type diterpenes from the seed pods of Hymenaea courbaril var. stilbocarpa . Phytochemistry,

58, 1153.

216 Runkel, M., Moeller, A., Tegtmeier, M., Willigmann, I., Legrum, W. 1997. Detection of scopolin

in the grapefruit ( Citrus paradisi Macf.). Fresen. J. Anal. Chem., 359, 516-520.

Valle, T., Lopez, J.L., Hernandez, J.M., Corchete, P. 1997. Antifungal activity of scopoletin and

its differential accumulation in Ulmus pumila and Ulmus campestris cell suspension

cultures infected with Ophiostoma ulmi spores. Plant Sci., 125, 97-101.

Xiong, Q., Kadota, S., Tani, T., Namba, T. 1996. Antioxidative effects of phenylethanoids from

Cistanche deserticola . Biol. Pharm. Bull., 19, 1580-1585.

217 Table 1 1H and 13 C NMR data of hymenain ( 1) and ipomopsin ( 2) (in DMSO-d6)

No 1 2

δ, mult , J (Hz) δ δ, mult , J (Hz) δ

2 157.3 160.1 3 137.6 115.8 4 7.57, s 128.0 7.93, s 145.4 5 7.13, s 109.8 7.28, s 110.2 6 146.2 146.1 7 150.5 152.0 8 6.80, s 103.3 6.89, s 103.2 9 147.4 150.0 10 110.9 111.4

6-OCH 3 3.74, s 56.6 3.85, s 56.7 2’ 160.8 161.1 3’ 6.45, d, 9.6 115.2 6.27, d, 12.4 112.5 4’ 7.98, d, 9.6 144.6 8.00, d, 12.4 145.5 5’ 7.44, s 111.4 7.35, s 109.6 6’ 147.0 145.5 7’ 148.6 149.7 8’ 7.20, s 106.7 111.6 9’ 149.1 148.2 10’ 110.9 110.9 6’-OCH3 3.82, s 56.9 3.92, s 56.9

218 Table 2

DPPH radical scavenging activity of the fractions and biscoumarins isolated from seeds of H. courbaril and standard compounds

Compound/Extract DPPH (EC 50 )

Crude extract 500 µg ml -1

EtOAc fraction 100 µg ml -1

Hymenain ( 1) 100 µM

Ipomopsin ( 2) 300 µM

Scopoletin a 500 µM

Catechin a 7 µM

Quercetin a 6 µM

a Standard compounds used as positive controls.

219

H CO H3CO 3 H3CO O H3CO O O O O O

HO O O HO O O (1) (1) OCH3

HO

H3CO

O HO O O O

(2)

Fig 1. Hymenain ( 1) with key HMBC ( →) and NOESY ( ↔) correlations and ipomopsin ( 2).

220