Estudo De Associação Genética Em Larga Escala Identifica Potenciais Regiões Candidatas Para O Bruxismo Do Sono

Rosalvo Amaral Junior

Estudo de associação genética em larga escala identifica potenciais regiões candidatas para o bruxismo do sono

Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências

São Paulo 2017

Rosalvo Amaral Junior

Estudo de associação genética em larga escala identifica potenciais regiões candidatas para o bruxismo do sono

Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências

Orientadora: Profa. Dra. Monica Levy Andersen

Coorientadora: Dra. Camila Hirotsu

São Paulo 2017

Amaral Junior, Rosalvo Estudo de associação genética em larga escala identifica potenciais regiões candidatas para o bruxismo do sono/ Rosalvo Amaral Junior. São Paulo, 2017. xxiii, 100f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Psicobiologia.

Título em inglês: Genome-wide association study identifies potential candidate gene regions for sleep bruxism.

1. Bruxismo do sono. 2. Genética. 3. Polimorfismo. 4. Polissonografia.

Rosalvo Amaral Junior

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE PSICOBIOLOGIA

Chefe do Departamento: Prof. Dr. José Carlos Fernandes Galduróz

Coordenadora do Curso de Pós-graduação: Profa. Dra. Débora Cristina Hipólide

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Rosalvo Amaral Junior

Estudo de associação genética em larga escala identifica potenciais regiões candidatas para o bruxismo do sono

Presidente da banca: Profa. Dra. Monica Levy Andersen

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Síntia Iole Nogueira Belangero Prof. Dr. José Tadeu Tesseroli de Siqueira Prof. Dr. Gustavo Antonio Moreira

Aprovada em: 29/01/2017

Este estudo foi desenvolvido na seguinte instituição:

Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM)

Departamento de Psicobiologia Disciplina de Medicina e Biologia do Sono

Auxílio financeiro:

Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa (AFIP)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

DEDICATÓRIA

Dedico esta dissertação à Maria Ines Prado Lopes, que esteve ao meu lado durante a maior parte de minha vida e continua presente, apoiando meus projetos, criando com sabedoria nossos filhos Laura e Enzo, e cuidando com carinho de minha saúde física e mental. Minha melhor amiga.

vii

AGRADECIMENTOS

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Agradeço profundamente ao meu pai Rosalvo (In Memoriam) e à minha mãe Lourdes por me ensinarem com muita ênfase que o estudo pode proporcionar transformações e a oportunidade de construir um mundo melhor. Este ensinamento é um dos eixos de minha vida. Aos meus irmãos Maria Regina, Carlos Daniel, Rosângela e Marisa, seus filhos, netos e agregados. À família Bernini Amaral, exemplo de diversidade e respeito. À minha melhor amiga e ex-esposa Maria Ines Prado Lopes. Consegui chegar até aqui porque ela dividiu comigo sua energia. Amparou-me nos momentos difíceis. Comemorou as conquistas. Incentivou a procurar outros rumos. Despertou-me para novas dimensões. Mostrou horizontes muito além do que eu podia enxergar. Muito, muito obrigado. Aos meus filhos Maria Carolina, Laura e Enzo, que talvez ainda não saibam ou percebam o quanto me ensinam. Cada um ao seu modo me ajuda a escrever meu currículo de vida enquanto escrevem os seus. À Profa. Dra. Monica Levy Andersen, que inspirou e motivou este Mestrado desde o princípio. Que o tornou realidade me aceitando como aluno. Que me acolheu quando a vida me interrogou. Sou admirador de suas aulas, carreira profissional e história; de sua orientação científica e de sua orientação para a vida; de seu trato com as pessoas e especialmente sua capacidade de estimular em cada um as virtudes e de fazer refletir sobre as atitudes. O título de professora e cientista está estampado em sua presença. À minha coorientadora Dra. Camila Hirotsu. Consolidamos nossa amizade ao compartilharmos este trabalho. Como se me ensinasse a escrever minhas primeiras palavras estimulou meu raciocínio e minha atividade científica. Com uma paciência especial respondeu todas as dúvidas. Estimulou a pesquisa. Sacudiu meu acomodamento. Ensinou-me a confiar mais em mim. Parceria estabelecida para sempre. Ao Dr. Diego Robles Mazzotti, por ter facilitado o estudo da genética com seus ensinamentos e orientações. Sua atuação foi especial e decisiva para a concretização do Mestrado. Seu espírito científico e inovador e sua capacidade didática o torna merecedor da carreira de sucesso construída.

Ao Prof. Dr. Sergio Tufik, pela magnífica obra que vislumbrou, construiu e continua edificando e que permitiu tornar real este e tantos outros projetos. Ao grupo Progressão, jovens cientistas entusiasmados e competentes, pelo auxílio cotidiano a um estudante não tão jovem. Especialmente gostaria de agradecer à Lenise Kim que com sua amizade e generosidade tornaram mais fáceis a superação de muitos obstáculos e a ter momentos prazerosos de bate-papo. Especial também foi a amizade de Cristina Frange que carinhosamente dedicou sua atenção especial em momentos muito difíceis. Camila Hirotsu, Gabriel Pires, Andréia Bezerra, Paula Araujo, Tathiana Alvarenga, Daniel Polesel, Karen Nozoe, Rachel Albuquerque, John Helbert, Luísa de Barros, Daniela Oliveira, Priscila Tempaku, Vinícius Silva: sou um privilegiado por ter tido a oportunidade de conviver com todos vocês. A todos os funcionários da Unifesp, profissionais que admiro e que às vezes anonimamente conduzem a vida da instituição. Waldermaks Aires (Dunga), Mara Viana, Valéria Acquilino, Maria de Oliveira: muito obrigado pelo sorriso com que sempre fui recebido. Aos meus amigos Fabian, Nelson e Assis que pelo menos semanalmente me lembra do quanto é importante lutar pela construção de um mundo mais justo, solidário e fraterno. Às agências de fomento Fapesp, CNPq, Afip e Capes, pelo importante apoio financeiro que possibilitou a execução deste trabalho.

"Para quem vive em busca do sol,

é sempre madrugada."

Helena Kolody Poesia mínima

SUMÁRIO xii

DEDICATÓRIA ...... vi AGRADECIMENTOS ...... viii SUMÁRIO ...... xii LISTAS ...... xiv RESUMO ...... xx 1 INTRODUÇÃO ...... 01 1.1 Bruxismo do sono ...... 02 1.2 Epidemiologia do bruxismo do sono ...... 03 1.3 Etiologia e fisiopatologia do bruxismo do sono ...... 04 1.4 Genética e o bruxismo do sono ...... 13

2 RELEVÂNCIA ...... 16 3 OBJETIVOS ...... 18 3.1 Objetivo geral...... 19 3.2 Objetivos específicos ...... 19

4 MATERIAL E MÉTODOS ...... 20 4.1 Métodos ...... 21 4.1.1 Seleção dos voluntários ...... 21 4.1.2 Polissonografia ...... 22 4.1.3 Diagnóstico do bruxismo do sono ...... 23 4.1.4 Questionários ...... 24 4.1.5 Avaliações Genéticas ...... 25 4.1.6 Análise estatística ...... 25 5 RESULTADOS ...... 30 6 DISCUSSÃO ...... 37 7 CONCLUSÕES ...... 52 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 54 9 ANEXOS ...... 71

xiii

LISTAS

xiv

Lista de Figuras

Figura 1: Gráfico Quantile–quantile...... 26

Figura 2: Gráfico Manhatan Plot...... 28

Figura 3: Exemplo de gráfico de desequilíbrio de ligação...... 28

Lista de Tabelas

Tabela 1. Dados sociodemográficos dos grupos controle (CTRL) e bruxismo...... 32

Tabela 2. Polimorfismos (SNPs) em ordem crescente de significância até p=10-5 e sua distribuição entre os grupos de bruxismo e controles...... 33

Tabela 3. Genes identificados na análise ao nível de genes por ordem crescente de significância...... 35

Tabela 4. Vias biológicas identificadas na análise ao nível de vias biológicas em ordem crescente de significância...... 36

xvi

Lista de Unidades

% porcentagem h hora kb kilobases mb megabases

xvii

Lista de Abreviaturas e Siglas

AASM American Academy of Sleep Medicine

Afip Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa

ARMM Atividade repetitiva da musculatura mastigatória

Assist Alcohol smoking and substance involvement

ATP Adenosina trifosfato

BS Bruxismo do sono

BV Bruxismo da vigília

C Citosina

CAP Cyclic alternating pattern

Capes Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior

CEP Comitê de Ética em Pesquisa

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

CR Cromossomo

Ctrl Controle

DNA Ácido desoxirribonucleico

DRS Distúrbio respiratório do sono

EDTA Ácido etilenodiamino tetracético

EEG Eletroencefalograma

EMG Eletromiograma

EOG Eletrooculograma

Episono Estudo epidemiológico do sono

EPM Escola Paulista de Medicina

EUA Estados Unidos da América

xviii

Fapesp Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

GABA gamma-aminobutyric acid

GWAS Genome-wide association studies

HapMap Projeto de mapeamento de haplótipos

IAH Índice de apneia e hipopneia

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IC Intervalo de confiança

IMC Índice de massa corporal

N Número de indivíduos

NREM Não rapid eye movement

OR Odds ratio

P Significância estatística

REM Rapid eye movement

RNA Ácido ribonucleico

SAOS Síndrome da apneia obstrutiva do sono

SNP Single nucleotide polymorphism

T Timina

Unifesp Universidade Federal de São Paulo

VDR Vitamin D receptor

xix

RESUMO

Resumo

Amaral Junior, R. Estudo de associação genética em larga escala identifica potenciais regiões candidatas para o bruxismo do sono 2017. 100 p. Dissertação (Mestrado) - Departamento de Psicobiologia. Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brasil.

Introdução: O bruxismo do sono é geralmente associado com o desgaste dental excessivo e fraturas ou outros problemas de saúde como dores de cabeça matinais, dores musculares e aumento do risco de alguns distúrbios temporomandibulares. Evidências sugerem que um de seus componentes fisiopatológicos seja de origem genética. Objetivos: O presente estudo teve como objetivo avaliar potenciais polimorfismos, genes e vias biológicas associadas ao bruxismo do sono. Métodos: Foi realizado um estudo transversal de associação genética em larga escala do tipo caso-controle com 75 casos e 568 controles extraídos da coorte EPISONO. O bruxismo do sono foi diagnosticado por meio de polissonografia e questionários. O DNA de todos os indivíduos foi extraído do sangue periférico coletado na manhã após a polissonografia e realizou-se a genotipagem de 730.025 polimorfismos de nucleotídeo simples (SNP) por meio da técnica de microarray. Resultados: Os resultados mostram a identificação de 2 SNPs associados ao bruxismo do sono com nível de significância <10-5: rs741448 localizado em 19q12 (p=5,12 x10-6) e rs1721781 localizado em 2p22.3 (p=7,18 x10-6), e 38 SNPs com nível de significância <10-4. Além disso, por meio da análise de vias de gene e de vias biológicas, foram encontradas associações com genes como EPN3 (Epsin 3) com nível de significância <10-4 e vias biológicas como Melanin biosynthesis com nível de significância 10-3, entre outros ainda não explorados por hipóteses fisiopatológicas do bruxismo do sono. Conclusão: Este é o primeiro estudo a identificar associação genética no bruxismo do sono. Quando replicado, poderá apontar novas hipóteses na fisiopatologia do bruxismo do sono.

Palavras-chaves: bruxismo do sono, genética, polimorfismos, polissonografia.

xxi

Abstract

Amaral Junior, R. Genome-wide association study identifies potential candidate gene regions for sleep bruxism. 2016. 100 p. MSc Dissertation - Department of Psychobiology. Universidade Federal de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil.

Introduction: Sleep bruxism is usually associated with excessive dental attrition and fractures or other health problems, such as morning headaches, muscle pain and increased risk of some temporomandibular disorders. Some evidence suggests that its pathophysiology may be influenced by genetic factors. Objectives: The present study aimed to evaluate potential polymorphisms, genes and biological pathways associated with sleep bruxism. Methods: It was performed a cross-sectional genome-wide association study with 75 sleep bruxism cases and 568 controls, all of them extracted from EPISONO cohort. Sleep bruxism was diagnosed by polysomnography and questionnaires. The DNA of all individuals was extracted from peripheral blood and 730,025 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were genotyped through microarrays. Results: The results showed 2 SNPs associated with sleep bruxism with significance level <10-5: rs741448 located in 19q12 (p=5.12 x10-6); rs1721781 located in 2p22.3 (p=7.18 x10-6) and 38 SNPs with significance <10-4. In addition, through gene pathway and biological pathway analysis, associations with genes such as EPN3 (Epsin 3) with significance level <10-4 and biological pathways such as Melanin biosynthesis with significance level 10-3 were found between others not yet explored by pathophysiological hypothesis of sleep bruxism. Conclusions: This is the first study that identified genetic association with sleep bruxism. When replicated, it may point to new hypotheses in the pathophysiology of sleep bruxism.

Keywords: sleep bruxism, genetics, polymorphism, polysomnography.

xxii

1. INTRODUÇÃO

1.1 Bruxismo do sono

O bruxismo é considerado um distúrbio de sono relacionado a movimentos, definido como uma atividade repetitiva da musculatura mastigatória (ARMM) que é caracterizada pelo apertamento ou ranger dos dentes e/ou movimentos forçados da mandíbula (AASM, 2014). Entre os cirurgiões-dentistas, o bruxismo constitui uma de suas preocupações devido ao dano potencial que este distúrbio pode trazer para os dentes, restaurações, próteses e implantes bem como devido a sua associação com dores musculares, dores na articulação temporomandibular e cefaleias (Koyano et al, 2008; Carra et al, 2012). Além disso, deve-se considerar ainda a queixa de perturbação de sono do parceiro de quarto e/ou familiares diante dos ruídos característicos que o ranger de dentes provoca. O bruxismo apresenta 2 manifestações diferentes de acordo com o ritmo circadiano: bruxismo do sono (BS) e bruxismo da vigília (BV) (AASM, 2014). Embora sejam considerados distúrbios distintos (Lavigne et al, 2008) com etiologias diferentes (Lobbezoo e Naeije, 2001; Manfredini e Lobbezzo, 2009), estudos indicam uma forte associação entre essas 2 formas de bruxismo. Winocur e colaboradores (2011) concluíram haver uma relação bidirecional entre BS e BV, pois a presença do BS aumentava em 5 vezes a razão de chance do indivíduo apresentar BV e o resultado se repetia com a mesma magnitude se a variável dependente fosse o BS. O BS pode ser classificado em subtipos primário e secundário. O BS primário ou idiopático não apresenta uma causa definida, enquanto o secundário é associado a outras condições como a síndrome de Down, doença de Parkinson, apneia obstrutiva do sono, distúrbio comportamental do sono REM (rapid eyes moviment), estados demenciais, além do uso de substâncias como álcool, nicotina, cafeína, drogas ilícitas e antidepressivos inibidores seletivos de recaptação de serotonina (Ohayon et al, 2001; Winocur et al, 2003; Lavigne et al, 2008; Carra et al, 2012; AASM, 2014). Embora o diagnóstico do BS seja clínico, a Academia Americana de Medicina do Sono estabelece que o exame de polissonografia é o melhor método para se diagnosticar o BS. O exame deve conter ao menos 1 canal de eletromiografia para registro da atividade do músculo masseter. Somado a isso, idealmente deve haver registros de áudio e vídeo para associação da atividade muscular com os sons de ranger dos dentes, descartando assim movimentos diferentes da ARMM.

1.2 Epidemiologia do bruxismo do sono

Podemos afirmar que os estudos sobre a prevalência do BS apresentam resultados com um grau elevado de variabilidade. Esta realidade se justifica devido à ausência de padronização dos critérios de diagnóstico e às diferentes metodologias de pesquisa e populações estudadas. Vários instrumentos de pesquisa têm sido utilizados, como questionários, entrevistas por telefone, relatos de cônjuges e parentes, exames de estruturas anatômicas bucais (em busca de desgastes dentários, marcas dos arcos dentários na língua, mordiscamento na mucosa jugal) e a polissonografia (Horowitz, 1963; Hublin et al, 2001; Manfredini et al, 2013; Maluly et al, 2013). Em uma revisão sistemática sobre a prevalência do bruxismo em adultos (2013), Manfredini e colaboradores encontraram apenas 7 estudos com os critérios mínimos de aceitabilidade quanto à validade externa, porém com alguns problemas em relação à validade interna devido ao uso de questionários como instrumentos de pesquisa. Destes, apenas 3 (Ohayon et al, 2001; Santos-Silva et al, 2010; Winocur et al, 2011) relataram dados para o BS. Ciancaglini e colaboradores (2001) e Bernhardt e colaboradores (2004) descreveram resultados usando o termo bruxismo de uma forma genérica e Argeberg e Carlsson (1972) encontraram que o ranger de dentes era predominantemente noturno e o apertar dos dentes diurno, mas não quantificaram estes dados. Também nesta revisão, 2 estudos apresentaram resultados para o BV (Jensen et al 1993; Winocur et al 2011). Assim a prevalência para o termo genérico bruxismo se situou entre 8% e 31,4%; o BV entre 22,1% e 31%; e o BS entre 9,7% e 15,9%. Não houve associação com gênero, mas sim com a idade, uma vez que os estudos mostraram uma redução desse distúrbio com o envelhecimento. No entanto, esses dados devem ser analisados com cuidado, pois são provenientes de estudos que utilizaram apenas questionários para definir o fenótipo do BS (Manfredini et al, 2013). Até o presente momento, apenas 1 estudo epidemiológico utilizou a associação de ferramentas subjetivas e objetivas para descrever a prevalência do BS em uma população adulta (Maluly et al, 2013). Partindo de uma amostra representativa dos habitantes da cidade de São Paulo obtida por meio da técnica de amostragem probabilística por conglomerados em 3 estágios (Santos-Silva et al, 2009), os autores avaliaram 1042 exames de polissonografias e questionários de

queixas de sono e encontraram uma prevalência de 7,4% de BS quando apenas a polissonografia foi considerada; 12,5% quando apenas o questionário foi positivo para o ranger/apertar de dentes e 5,5% quando os 2 instrumentos foram positivos para o BS. Recentemente um grupo de especialistas desenvolveu uma proposta consensual para estabelecer um sistema de classificação diagnóstica para o BS e do BV, visando reduzir as variações nas metodologias de pesquisa e nos diagnósticos e abordagens clínicas do bruxismo. Os autores concluíram que a adoção de regras e critérios comuns nas pesquisas futuras pode gerar um maior desenvolvimento científico na área da Odontologia do Sono (Lobbezoo et al, 2013).

1.3 Etiologia e fisiopatologia do bruxismo do sono

Apesar dos sintomas bem definidos, a etiologia do BS ainda é pouco conhecida e muitos são os mecanismos propostos para explicar sua fisiopatologia. Com exceção do papel da oclusão, cujas evidências científicas não sugerem uma associação relevante (Kardachi et al,1978; Rugh et al,1984), os demais mecanismos parecem se inter-relacionar, não havendo uma explicação simples ou isolada que possa caracterizar este fenômeno. Durante muito tempo, a oclusão dentária foi a principal hipótese de fator etiológico do BS. Em 1961, Ramfjord estudou 34 indivíduos entre 19 e 60 anos diagnosticados com bruxismo grave, muitos dos quais apresentavam dores na articulação temporomandibular e nos músculos mastigatórios. Os voluntários do estudo passaram por exames clínicos para detectar problemas oclusais e uma avaliação eletromiográfica dos músculos masseter e temporal em ambos os lados direito e esquerdo na presença de diversos movimentos mandibulares e de mastigação antes das sessões de ajuste oclusal. Estes ajustes objetivavam eliminar as diferenças da oclusão habitual ou máxima intercuspidação para a posição de relação cêntrica, definida como um relacionamento maxilo-mandibular no qual as cabeças da mandíbula se articulam com a porção mais fina e avascular dos seus respectivos discos na posição anteroposterior, contra as formas das eminências articulares (The Glossary of Prosthodontic Terms, 2005). Neste ajuste também eram eliminados fortes interferências oclusais nos movimentos laterais. O autor relata que

após a conclusão destes ajustes ocorreu uma diminuição e uma estabilidade da atividade eletromiográfica, bem como os pacientes passaram a relatar o desaparecimento dos eventos de ranger de dentes durante a noite. Estas evidências não se sustentaram com a aplicação de outras metodologias de pesquisa. Em um estudo piloto um total de 20 indivíduos foram distribuídos em grupos de BS tratados por ajuste oclusal, biofeedback e controles, foram encontrados resultados contraditórios independente do tratamento instituído. Houve variação (aumento ou diminuição) na atividade eletromiográfica e nos relatos de bem-estar subjetivo, sem uma associação com as modalidades terapêuticas (Kardachi et al, 1978). Bailey e Rugh (1980) não encontraram efeitos na atividade eletromiográfica durante o sono no músculo masseter de 9 indivíduos que buscavam tratamento para bruxismo e foram monitorados no momento do ajuste oclusal, antes dele e após 2 semanas. Em 1984, Rugh e colaboradores criaram artificialmente interferências oclusais colocando coroas metálicas nos molares de 10 indivíduos. Dessa forma, os autores avaliaram as mudanças eletromiográficas no músculo masseter dos voluntários durante noites de sono em períodos anteriores, coincidentes e posteriores à remoção das coroas metálicas, constatando que 9 indivíduos apresentaram uma redução na atividade eletromiográfica. Em um ensaio clínico duplo cego randomizado, pesquisadores avaliaram 11 mulheres em 4 momentos distintos: a) ao colar tiras metálicas em superfícies oclusais, criando interferências ativas, b) ao colar as mesmas tiras metálicas em superfícies dentárias não oclusais sem criar, portanto, interferências oclusais, c) em momento anterior à colocação das tiras metálicas, d) em momento posterior à remoção destas. Foi medida a atividade eletromiográfica do músculo masseter com eletromiógrafos portáteis durante o período noturno e o principal resultado obtido foi uma redução do número de períodos de atividade do músculo masseter por hora de sono além da redução da amplitude da atividade eletromiográfica quando as tiras metálicas foram fixadas em regiões que causavam interferência oclusal ativa. Nenhuma das voluntárias desenvolveu sinais ou sintomas de disfunção temporomandibular e todas se adaptaram razoavelmente bem ao desequilíbrio oclusal (Michelotti et al,2005). Diante dessas evidências, parece que enquanto não houver um número significativo de estudos controlados e coleta de dados adequada e objetiva, o debate sobre o papel da oclusão no BS persistirá (Lavigne et al, 2008; Lobbezoo et al, 2012).

Outro fator considerado importante durante muitos anos para a etiologia do BS é o seu aspecto psicológico, representado principalmente pelo estresse, depressão e ansiedade (Pierce et al, 1995; Ohayon et al, 2001; Ahlberg et al 2004; Winocur et al, 2011; Ahlberg et al 2013; Karakoulak et al 2015). Em um estudo com 100 indivíduos diagnosticados com BS foi investigada a sua relação com autorrelato de estresse. Os registros eletromiográficos do músculo masseter da noite anterior ao evento de estresse relatado e da noite seguinte foram examinados. Foram registradas 15 noites de eletromiografia para cada paciente, a partir das quais se observou uma correlação positiva entre os eventos de estresse e o BS em 8% dos indivíduos (Pierce et al, 1995). Ohayon e colaboradores (2001) em 13.057 entrevistas por telefone encontraram uma razão de prevalência aumentada em 30% para o BS em indivíduos com uma vida altamente estressante. A mesma razão de prevalência aumentada para o BS foi observada em indivíduos com ansiedade. Em outro estudo com 402 indivíduos da população adulta, não foi encontrada associação entre a autopercepção de estresse, necessidade de controle, ansiedade frente ao tratamento dentário e engasgos com o BS e BV (Winocur et al, 2011). Também foram estudados os efeitos independentes da ansiedade e estresse em 874 trabalhadores de uma mesma empresa distribuídos em grupo de trabalhadores por turnos e trabalhadores de turno regular diurno de 8 horas. Não foram encontradas diferenças entre a ocorrência de bruxismo e o tipo de turno de trabalho. Os autores relataram que os indivíduos com bruxismo grave apresentaram 2 vezes mais chances de ter passado por estresse grave ou ansiedade do que aqueles com bruxismo leve ou ausente (Ahlberg et al, 2013). Recentemente pesquisadores utilizando um dispositivo de eletromiografia portátil e descartável encontraram um índice elevado de autopercepção de estresse entre indivíduos com BS quando comparados com grupo controle. Os autores também relataram uma diferença em um biomarcador de estresse na saliva, o cortisol, o qual apresentou níveis maiores nos indivíduos com BS em relação aos controles. Outro biomarcador de estresse analisado, a α-amilase, não apresentou diferenças entre os grupos. As evidências sobre os fatores psicológicos associados ao bruxismo sugerem que estes podem, em algum grau, predispor, manter ou agravar o BS (Karakoulaki et al, 2015). A ARMM, à qual o BS está normalmente associado, é um dos tipos de atividade motora que pode ocorrer na boca e na face durante o sono. Outros tipos de movimentos como, por exemplo, deglutição, tosse, falar durante o sono e sucção

de lábio são atividades consideradas normais ou manifestações clínicas de outras patologias, podendo ocorrer ao mesmo tempo em que outros movimentos do corpo (Dutra et al, 2009). Diferente destes outros movimentos normalmente aleatórios e sem padrão, ARMM pode ser definida como contrações breves e repetitivas dos músculos da mastigação especificamente masseter e temporal durante o sono, que são os movimentos que caracterizam, dentro de determinados graus, o BS (Reding et al, 1966; Lavigne et al, 1996). Em um estudo polissonográfico, pesquisadores encontraram a presença de ARMM em 60% dos indivíduos não diagnosticados com BS. Os indivíduos diagnosticados com BS apresentaram uma frequência de surtos de contração muscular 2 vezes maior que os controles, além de maiores amplitudes de contração. Assim, a presença de ARMM em indivíduos não diagnosticados com BS sugere que estes movimentos estariam relacionados com alguma função fisiológica normal do sono (Lavigne et al, 2001a). Em outro estudo, as atividades orofaciais em indivíduos com BS foram comparadas com grupo controle. Foi encontrada uma frequência de ARMM 7 vezes maior nos indivíduos com BS (Dutra et al, 2009). O exame padrão-ouro para diferenciar a ARMM de outros movimentos durante o sono é a polissonografia com registro de áudio-vídeo. Por meio desta metodologia é possível discriminar o BS de outros movimentos faciais e bucais e sua associação com movimentos corporais (Velly et al, 2003; Kato et al, 1999). Assim, foi possível determinar que na ARMM ocorre uma co-contração dos músculos de fechamento e de abertura bucal (Lavigne et al, 1996; Lavigne et al, 2001a; Kato et al, 2001), e que os episódios de ARMM são acompanhados de 60% a 90% de movimentos do corpo de uma maneira geral, tanto em indivíduos negativos quanto nos positivos para BS (Bader et al, 1997; Macaluso et al, 1998; Kato et al, 2001). Apesar da principal hipótese etiológica capaz de explicar os mecanismos centrais que geram a ARMM ainda não ser totalmente conhecida, evidências sugerem a participação inicial do tronco cerebral no sistema nervoso central (SNC) (Lavigne et al, 2007; Khoury et al, 2008), o qual está relacionado fisiologicamente com os despertares (Macaluso et al, 1998; Lobbezoo et al, 2001; Lavigne et al, 2007). Foi descrita uma sequência de fatos fisiológicos anteriores à ARMM, contribuindo para uma melhor compreensão do BS. Esta cadeia de eventos parece iniciar com uma alteração no equilíbrio entre os sistemas simpático e parassimpático na regulação autonômica cardíaca, seguido por um aumento da atividade no eletroencefalograma (EEG). Esta resposta excitatória é seguida por taquicardia e

aumento da atividade muscular supra-hioidea, que constituem os músculos responsáveis pela abertura bucal. Na sequência, há um aumento da amplitude respiratória e do EEG dos músculos de fechamento da boca, o que normalmente é descrito como ARMM (Lavigne et al, 2007). Em 2008, Khoury e colaboradores encontraram que 4 segundos antes da ARMM ocorre um aumento da amplitude respiratória entre 8 e 23% e que este aumento passaria a ser maior no início da atividade supra-hioidea, oscilando entre 60 a 82% no segundo anterior ao da ARMM e atingindo o ápice no momento desta com uma amplitude maior entre 108% e 206%. As ARMM acompanhadas de despertares podem ser acompanhadas de aumento na amplitude respiratória de até 11 vezes do que as sem despertares. Além disso, evidências mostram que também ocorre uma flutuação da pressão sanguínea antes, durante ou após o BS, reforçando o conceito de que a ARMM secundária à ativação motora autonômica transitória acima do normal provoca os despertares (Nashed et al, 2012). A ARMM e o BS podem ocorrer em todos os estágios do sono, sendo mais frequentes, porém, nos estágios 1 e 2 do sono NREM (non-rapid-eye moviment) (N1 e N2) e antes das transições para o estágio de sono REM. Nesses períodos ocorrem 80% dos episódios do BS (Reding et al, 1966; Lavigne et al, 1996). Evidências recentes associam a ARMM e o BS com a microestrutura do sono representada pelo padrão alternante cíclico (cyclic alternating pattern, CAP). O CAP é uma atividade periódica eletroencefalográfica que ocorre principalmente durante o sono NREM (Terzano et al, 1985). Caracteriza-se por uma sequência de eventos eletrocorticais repetitivos, transitórios e diferentes da atividade eletroencefalográfica basal com duração de até 60 segundos e separados entre si por intervalos de atividade basal com duração similar (Terzano e Parrino, 2000). O CAP exibe ciclos de 20 a 40 segundos caracterizados por períodos fásicos relacionados aos despertares denominados de fase A seguidos por períodos de desativação ou retorno ao registro basal chamado fase B. A fase A é subdividida em fases A1, A2 e A3 classificadas de acordo com o aumento da força de despertar. A fase A1 é a fase correlacionada a eventos de início e manutenção do sono. A fase A2 é transitória em relação à pressão para despertar e a fase A3 é a fase com maior pressão de despertar, apresentando padrão eletroencefalográfico dessincronizado (Terzano et al, 1996). Sugere-se que durante o sono NREM, 88% dos episódios de ARMM e do BS ocorrem em surtos seguindo o mesmo ritmo que a oscilação do CAP, sendo

observados principalmente na fase A3 (Macaluso et al, 1998). Observou-se que a ARMM possui sua ocorrência facilitada pelas fases excitatórias para o despertar (A2 e A3 do CAP) (Carra et al, 2010). Posteriormente o mesmo grupo defendeu a hipótese que os despertares não são geradores da ARMM, mas apenas permitem que estes eventos motores ocorram quando outras condições estão presentes. Estas outras condições seriam representadas por uma fase instável do sono, principalmente pelo aumento da pressão pelo despertar que ocorre nas fases A2 e A3 do CAP e pela ativação autonômica simpática que ocorre principalmente nos períodos que antecedem o sono REM (Carra et al, 2011). Os mecanismos fisiopatológicos anteriormente descritos e associados ao BS não identificam as causas que o desencadeiam. As evidências existentes não oferecem explicações claras sobre os fatores etiológicos, mas há estudos que indicam associações com comorbidades e uso de substâncias, os quais podem constituir fatores de risco importantes no desenvolvimento do BS e, consequentemente, no seu manejo e prevenção. A atuação dos componentes neuroquímicos participantes do mecanismo de sono e vigília faz parte das hipóteses etiológicas do bruxismo do sono. Poucas evidências suportam a participação da dopamina, noradrenalina, serotonina e ácido gama-aminobutírico (gamma-aminobutyric acid, GABA) no surgimento da ARMM (Lavigne et al, 2008). O suposto papel do sistema dopaminérgico no BS foi pesquisado em um estudo clínico duplo-cego com 10 pacientes usando doses pequenas de levodopa (precursor de dopamina, adrenalina e noradrenalina) por 2 dias. Os resultados indicaram uma redução do número de episódios de BS por hora de sono em 7 dos 10 pacientes (em média de 7,2/h para 1,4/h) após o tratamento. Em 1 dos pacientes o número de episódios de BS permaneceu o mesmo e em 2 deles o número de episódios de BS aumentou (Lobbezoo et al, 1997a). O mesmo grupo de pesquisa também descreveu em 2 casos clínicos o uso de bromocriptina (agonista do receptor dopaminérgico D2), encontrando uma redução de 20 a 30% nos episódios de BS em relação ao uso de placebo (Lobbezoo et al, 1997b). Em um estudo clínico randomizado duplo cego, não foi encontrada qualquer alteração nos episódios de BS ao usar a bromocriptina (Lavigne et al, 2001). Em 3 casos clínicos de pacientes com BS e BV foi demonstrado hipoperfusão do lóbulo frontal esquerdo com baixa resposta a levodopa e bromocriptina e resposta favorável à metoclopramida (bloqueador dopaminérgico). Desta forma, hipotetizou-se que esses

pacientes possuíam uma hipersensibilidade pré-sináptica do receptor dopaminérgico D2, de forma a responder tanto nos estados hiperdopaminérgicos quanto nos hipodopaminérgicos (Chen et al, 2005). Em estudo por meio de experimento randomizado controlado e cruzado, 2 medicações simpatolíticas foram testadas em sua ação sobre o BS e a atividade simpática que o precede. Foram usados o propranolol (bloqueador beta-adrenérgico não seletivo) e a clonidina (agonista alfa- adrenérgico seletivo). O propranolol não exerceu nenhum efeito sobre o BS enquanto a clonidina diminuiu o tônus simpático no minuto que antecedeu o surto de BS, diminuindo os episódios e número de surtos do BS. Esses achados sugeriram um papel da atividade do sistema simpático na fisiopatologia do bruxismo. Como efeito colateral, os autores encontraram hipotensão matinal em 19% dos pacientes Huyinh et al, 2006). Confirmando estes achados, Carra e colaboradores (2010) encontraram uma diminuição de 61% dos episódios de BS com o uso da clonidina. A clonidina também proporcionou um aumento do estágio N2 e uma diminuição marcante do estágio REM. Pesquisadores estudaram o efeito da hidroxizina (anti- histamínico) em estudo randomizado duplo-cego controlado em crianças cujos pais relataram a presença de BS seguindo o critério definido pela AASM (2014), excetuando-se a avaliação do exame dentário. Os resultados mostraram uma diminuição do BS em 90% das crianças tratadas com hidroxizina comparado a 44% que receberam placebo. Seu principal resultado foi medido por uma escala geral de análise de sintomas (Clinical Global Severity Scale) e por escala visual analógica. Nenhum efeito colateral importante foi relatado nesse estudo (Ghanizadeh et al, 2013). Recentemente um ensaio duplo-cego controlado cruzado avaliou o efeito do clonazepan e da clonidina em 19 pacientes com BS. A clonidina reduziu em mais de 30% o número de episódios de ARMM quando comparado ao uso de placebo e do clonazepan. Ambos os medicamentos reduziram o estágio de sono REM. Esses dados sugerem que a diminuição dos episódios da ARMM seja mediada pela supressão da atividade do sistema nervoso autônomo e da diminuição do número de transições do sono NREM para o sono REM (Sakai et al, 2016). Na literatura, os relatos clínicos associando a utilização de inibidores seletivos da recaptação da serotonina e BS têm se tornado cada vez mais frequentes, gerando hipóteses sobre seu mecanismo de ação no BS (Lewis et al, 1971; Ellison e Stanziani, 1993). As drogas serotonérgicas aumentariam os níveis extrapiramidais de serotonina, inibindo assim vias dopaminérgicas que controlam os movimentos.

Este déficit dopaminérgico geraria movimentos dos músculos mandibulares e consequentemente o BS, como uma forma de acatisia (Jaffe e Bostwick, 2000). De fato, o sistema dopaminérgico parece ter um papel importante no BS e BV induzido ou tratado pelo uso de drogas psicotrópicas, embora o mecanismo desta modulação ainda seja pouco conhecido (Falisi et al, 2014). De um modo geral, os estudos sugerem que dependendo de qual via dopaminérgica for afetada os resultados para níveis hipodopaminérgicos ou hiperdopaminérgicos podem ser diferentes. O sistema serotonérgico também possui um papel importante na regulação das vias motoras, provavelmente devido sua relação íntima com a via dopaminérgica. Sugere-se que exista uma inter-relação entre a dopamina e outros neurotransmissores (além da serotonina), e que o bruxismo provavelmente possua mecanismos múltiplos a serem desvendados. Recentemente uma revisão sistemática demonstrou a associação significativa do BS com consumo de álcool, cafeína, tabaco e drogas ilícitas (Bertazzo-Silveira et al, 2016). Em relação ao consumo de álcool, um estudo com 23 indivíduos avaliou se a quantia de álcool consumida estava associada com atividade noturna do músculo masseter medida por meio de dispositivo portátil em domicílio. Os autores encontraram uma maior duração média da atividade do masseter nos indivíduos que fizeram uso de bebidas alcoólicas comparado aos indivíduos que não beberam (Hojo et al, 2007). Em um estudo de coorte com cerca de 10.229 indivíduos gêmeos finlandeses, observou-se uma razão de prevalência de 1,8 vezes para o BS nos indivíduos que faziam o consumo exagerado de bebidas alcoólicas em relação aos que não bebiam (Rintakoski et al, 2013). Quanto ao consumo de cafeína, o trabalho revelou que o consumo de mais de 8 xícaras de café por dia aumentou em 1,4 vezes a chance de apresentar BS, independente do uso de tabaco (Rintakoski et al, 2013). Em relação ao consumo de tabaco, no mesmo estudo anterior, os autores encontraram que fumar aumentava em 2,9 vezes a razão de prevalência de apresentar BS. Um estudo realizado por meio de questionários identificou que entre o grupo positivo para o BS de grau leve, 24,4% eram fumantes, enquanto entre os que apresentaram BS grave este índice subiu para 43,2%. Fumantes apresentaram 2,4 vezes mais chances de relatar BS do que os não fumantes (Rintakoski et al, 2010b). Por meio de estudo polissonográfico, confirmou-se a relação entre o tabagismo e o BS (Lavigne et al, 1997). Observou-se que a razão de prevalência de BS era quase o dobro (1,9) nos indivíduos fumantes em relação aos não fumantes

(12% e 6,7%, respectivamente). Ainda, entre os fumantes, houve 5 vezes mais episódios de ranger de dentes. Sobre a associação entre fumantes passivos e o BS, estudo randomizado relatou que 76% das crianças com BS eram expostas à fumaça de cigarro no ambiente familiar. Posteriormente, estas foram distribuídas em 2 grupos, sendo que em um deles a família se comprometeu a não fumar no ambiente familiar por 6 meses. Após este período, 90% das crianças que permaneceram expostas ao cigarro ainda apresentavam BS contra 38% das crianças cujas famílias suspenderam o cigarro no ambiente comum (Montaldo et al, 2012). Ultimamente a associação do BS com os distúrbios respiratórios do sono (DRS) tem sido relatada, embora ainda sem evidências consistentes (Saito et al, 2013; Hosoya et al, 2014; Saito et al, 2016). Em um experimento observacional, 10 indivíduos com a síndrome da apneia obstrutiva do sono (SAOS) conjuntamente com BS diagnosticado por meio de polissonografia associada com áudio e vídeo foram estudados. Os indivíduos foram classificados quanto à ordem da ocorrência, isto é, associação com apneia ou hipopneia obstrutiva do sono anterior ou posterior ao BS. Observou-se que 80,5% dos episódios de BS ocorreram dentro dos 5 minutos próximos aos episódios de apneia e hipopneia, sendo 54,9% com os eventos respiratórios antecedendo o BS e 25,5% no sentido inverso. A proximidade com até 10 segundos de diferença entre os eventos correspondeu a 74,3% do total de apneias e hipopneias antes do BS e a 41,4% quando o BS antecedeu o evento respiratório (Saito et al, 2013). Em um estudo com 67 indivíduos com SAOS e 16 controles, observou-se a coincidência temporal de eventos de BS com eventos respiratórios obstrutivos (Hosoya et al, 2014). No grupo com SAOS, os eventos de BS acompanhados de despertares decorrentes de apneias ou hipopneias ocorreram na frequência de 4,6 eventos/hora, enquanto no grupo controle esta frequência foi muito baixa (0,1 eventos/hora). O BS e despertares não oriundos de apneias e hiponeias tiveram frequência semelhante, sendo de 1,6 eventos/h no grupo com SAOS e 2,4 eventos/h no grupo controle. Diante destes dados, os autores concluíram que pacientes com SAOS possuem risco elevado para o BS (Hosoya et al, 2014). No entanto, recentemente, 59 indivíduos com relato de BS e apneia obstrutiva do sono foram avaliados em um estudo que utilizou polissonografia com áudio e vídeo (Saito et al, 2016). Os autores encontraram apenas 50,8% de presença concomitante dos eventos respiratórios com BS, somado a uma associação fraca com despertares. Ainda, os eventos respiratórios obstrutivos foram

mais associados a outros movimentos mandibulares que não a ARMM, sugerindo assim que a origem do BS e dos eventos respiratórios decorrentes da apneia obstrutiva do sono possuam modulação distinta.

1.4 Genética e o bruxismo do sono

Doenças complexas comuns como câncer, diabetes, transtornos neuropsiquiátricos e doença de Alzheimer são doenças que parecem se agrupar nas famílias dos doentes com uma frequência maior que na população em geral. Assim como em outros distúrbios de sono, no BS interações complexas entre variações genéticas combinadas com exposições ambientais parecem atuar em conjunto para desencadear, exacerbar ou diminuir o processo saúde-doença. Distúrbios com estas características são considerados de origem multifatorial e sua distribuição familiar caracteriza um padrão de herança referido como complexo (Nussbaum et al, 2016). Para quantificar as contribuições relativas à variação genética e do ambiente normalmente se utilizam estudos de agregação familiar e estudos com gêmeos. Nos estudos de agregação familiar compara-se a razão entre a frequência do problema ou doença, no caso o BS, nos parentes diretos do indivíduo afetado com a prevalência na população em geral. Tem-se então a razão de prevalência, que com valor igual a 1 indica que a probabilidade de um parente direto desenvolver a doença não é maior do que a de qualquer outro indivíduo da população. Se a razão de prevalência é maior que 1, há indício de que um parente direto tenha maior risco que a população em geral. Outra abordagem utilizada para quantificar a contribuição genética na variabilidade de um determinado fenótipo é o estudo de amostras de gêmeos. Devido à similaridade genética completa de gêmeos monozigóticos (ou univitelinos) em relação à similaridade aproximada de 50% em gêmeos dizigóticos (ou bivitelinos), o estudo de características complexas nestes indivíduos é uma ferramenta importante e muito informativa a respeito de sua contribuição genética. Dessa forma, controlando para a participação de fatores ambientais compartilhados, espera-se maior concordância entre gêmeos monozigóticos e menor concordância entre gêmeos dizigóticos quando uma característica com forte contribuição genética é investigada (Nussbaum et al, 2016). Nesta abordagem encontramos diversos estudos sobre o BS (Horowitz, 1963; Lindqvist, 1974; Hublin et al, 1998; Rintakoski

et al, 2012) com diferenças metodológicas adequadas à época de sua realização. Quando os monozigóticos são separados ao nascer e criados em famílias diferentes, tem-se a oportunidade de avaliar indivíduos com o mesmo genótipo, mas com influências ambientais diferentes (Michalowicz et al, 2000). Com o avanço das metodologias de investigação genética como a genotipagem de polimorfismos (variantes genéticas com frequência de 1%), sequenciamento de DNA e microarrays (plataformas de interrogação de genes e variantes genéticas), a pesquisa na área de genética avançou de maneira surpreendente. Neste sentido, após a identificação da existência de contribuição genética na variabilidade do fenótipo, é possível identificar os genes responsáveis por meio do estudo de genes candidatos ou pela varredura genômica. Estudos em que se tem uma hipótese prévia sobre a existência de um mecanismo biológico plausível sobre o papel da doença se encaixam nos estudos de genes candidatos. Por exemplo, nos distúrbios de sono, genes candidatos seriam aqueles envolvidos na neurotransmissão. Uma abordagem para identificação da contribuição genética para uma doença consiste em encontrar alelos associados à doença em uma determinada amostra populacional. Esta abordagem não depende da existência de um padrão de herança definido e, portanto, é adequada para descobrir contribuições genéticas nos distúrbios com herança complexa. Procura-se assim uma associação com a doença buscando maior frequência de um alelo em particular em indivíduos atingidos pela doença comparados com outros saudáveis ou controles. Há 2 desenhos comumente usados: transversal, coorte longitudinal ou caso-controle. No primeiro uma amostra aleatória da população é analisada se está afetada por uma determinada doença (transversal) ou são acompanhados por um período de tempo para verificar se desenvolvem a doença (longitudinal). São analisados os números de indivíduos com ou sem a doença e com ou sem o alelo estudado. No estudo caso-controle indivíduos diagnosticados com a doença são escolhidos a partir de uma população e um grupo semelhante sem a doença é usado como comparação. Este é o caso dos 2 únicos estudos com marcadores genéticos no BS, BV e ambos (Abe et al, 2012, Oporto et al 2016). Atualmente os polimorfismos são elementos importantes para o estudo da genética humana. Polimorfismo genético é a ocorrência, na mesma população, de 2 ou mais alelos (segmentos homólogos de DNA, isto é, formas alternativas de um mesmo gene) em um locus (posição ocupada pelo gene no cromossomo), cada um

com frequência considerável. Um locus é arbitrariamente considerado como sendo polimórfico se o alelo mais raro tiver uma frequência de pelo menos 1% na população. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs, do inglês single nucleotide polymorphisms), são os mais simples e comuns polimorfismos e se caracterizam por ter apenas 2 alelos que ocupam uma localização específica no genoma (Nussbaum et al, 2016). Com o lançamento do Projeto de Mapeamento de Haplótipos (International Hap Map Consortium, 2005), tornou-se possível testar sistematicamente uma associação entre qualquer doença e milhares de alelos tanto raros quanto comuns no genoma humano sem definir conceitos anteriores de relevância ou conveniência. Os estudos de associação genética em larga escala (GWAS, do inglês genome-wide association studies) possibilitam uma varredura genômica em larga escala para 300.000 a 1 milhão de variantes isoladas e localizadas em todo o genoma a fim de investigar associação com uma doença ou fenótipo específico. Estudos de GWAS foram realizados para vários distúrbios ou características de sono (Winkelmann et al, 2007; Hor et al, 2010; Raizen et al, 2011; Ollila et al, 2014; Cade et al, 2016; Lane et al, 2016) como a síndrome das pernas inquietas, narcolepsia, duração de sono e cronotipo. Porém, nenhum foi realizado até o momento para o BS. Diante destas evidências, estabelecemos como hipótese para este estudo a existência de variabilidade genética importante entre indivíduos com e sem o BS e a possibilidade de identificar genes ou regiões candidatas associadas ao fenótipo de BS.

2. Relevância

O BS é uma doença prevalente na população com consequências importantes para a qualidade de vida, pois é potencialmente causador de desgastes e/ou fraturas dentárias, dores musculares e cefaleias. Destaca-se, porém, que seus mecanismos fisiopatológicos estão ainda pouco esclarecidos, principalmente no que tange a contribuição da genética deste distúrbio de sono. Em doenças complexas como o BS o esclarecimento do papel da genética parece ser de fundamental importância para estabelecer tratamentos e desenvolver ações preventivas eficazes e não somente ações paliativas como as que ocorrem atualmente. A oportunidade de estudar a associação de marcadores genéticos no BS em uma amostra representativa da cidade de São Paulo pode contribuir para a geração de novas hipóteses fisiopatológicas e direcionar futuros estudos que caminhem na direção deste objetivo. A escassez de conhecimento nesta área reforça a necessidade de ampliarmos o espectro de pesquisas sobre o BS, contribuindo com novas informações para a medicina e odontologia do sono.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Encontrar polimorfismos genéticos associados ao BS em uma amostra populacional da cidade de São Paulo.

3.2 Objetivo específico

Por meio de um estudo de associação genética em larga escala:  Investigar a presença de polimorfismos com frequência estatisticamente diferente em indivíduos com BS em comparação a controles;  Elencar potenciais genes ou regiões genômicas associadas com o fenótipo do BS;  Avaliar as vias metabólicas candidatas à associação com o fenótipo do BS.

4. MATERIAL e MÉTODOS

4.1 Métodos

4.1.1 Seleção dos voluntários

Para este estudo foram selecionados pacientes diagnosticados com BS por meio do exame de polissonografia (n=75) e grupo controle (n=568) de acordo com estudo prévio realizado por Maluly e colaboradores (2013). Estes dados foram extraídos do Estudo Epidemiológico do Sono (EPISONO) realizado na cidade de São Paulo (Brasil) entre julho e dezembro de 2007. O estudo EPISONO foi desenvolvido com o objetivo de estabelecer o perfil epidemiológico dos distúrbios de sono e seus fatores associados na população de acordo com idade, sexo e classe social. Seu desenho, métodos e técnicas utilizadas foram descritos detalhadamente por Santos-Silva e colaboradores (2009). A amostragem probabilística da população com idade entre 20 e 80 anos da cidade de São Paulo teve seu tamanho definido para estimar prevalências com 3% de precisão. Para se obter uma amostra representativa dos habitantes foi utilizada técnica de amostragem probabilística por conglomerados de 3 estágios. De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) a cidade foi dividida em 1.500 distritos e em 4 regiões socioeconomicamente homogêneas na época da coleta de dados. Destes foram selecionados 96 distritos de forma randômica e proporcional. O segundo estágio foi a seleção aleatória de 11 domicílios de uso residencial em cada distrito. Em caso de prédios residenciais, os apartamentos foram individualmente considerados domicílios. Locais com endereços de localização duvidosa ou que oferecessem perigo como favelas foram excluídos. No terceiro estágio, com uma planilha pré- determinada em ordem de idade decrescente dos moradores, foi sorteado o morador do domicílio que seria convidado a participar do estudo. Se após 3 tentativas o contato com o morador sorteado não tivesse sido estabelecido, ocorria a substituição deste seguindo regras pré-estabelecidas. Grávidas, lactentes, indivíduos com problemas físicos ou mentais que necessitassem de cuidadores foram excluídos bem como indivíduos fora da faixa etária estabelecida pelo estudo (20 a 80 anos) e os que trabalhassem em turno noturno todas as noites da semana. A amostra necessária estabelecida foi de 1.056 voluntários, sendo que na etapa domiciliar

foram coletadas 1.101 pessoas representativas da população da cidade de São Paulo. Cada voluntário entrevistado pelo instituto de pesquisa Datafolha em seu domicílio assinou termo de consentimento livre e esclarecido e respondeu a questionários. Todos foram convidados a realizar o exame de polissonografia com data agendada no Instituto do Sono, sendo este responsável pelo transporte e jantar dos indivíduos. Dos 1.101 indivíduos selecionados, 1.042 aceitaram participar do estudo com polissonografia (taxa de recusa de 5%) e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Os voluntários foram programados para chegar ao Instituto do Sono com 2 horas de antecedência ao horário de sono habitual e responderam a uma nova série de questionários antes da preparação para a polissonografia, além de ter suas medidas de peso e altura registradas para cálculo do índice de massa corporal (IMC). Após este processo, o voluntário foi montado com eletrodos para o exame de polissonografia, dormindo sempre que possível em seu horário habitual. Após finalizar o exame de polissonografia, todos tiveram 10 mL de sangue periférico coletado em tubos com ácido etilenodiamino tetracético (EDTA) para extração de DNA, conforme o método de salting-out definido em protocolo de Miller e colaboradores (1988) com modificações. O presente estudo foi previamente analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de São Paulo (#0593/2006) e registrado internacionalmente na plataforma do ClinicalTrials.gov (NCT00596713).

4.1.2 Polissonografia

O exame polissonográfico de noite inteira foi realizado em sistema digital (EMBLA N7000, Embla Systems, Inc, Broomfield, CO, EUA), tentando-se respeitar ao máximo o horário habitual de sono dos voluntários. Foram monitorizadas simultaneamente e continuamente as seguintes variáveis fisiológicas: 4 canais para eletroencefalograma (EEG) (C3-A2, C4-A1, O1-A2, O2-A1); 2 canais para eletrooculograma (EOG) (EOG-Esquerdo-A2, EOG-Direito-A1); 4 canais para eletromiograma (EMG) de superfície (músculo da região submentoniana, músculo tibial anterior, região do músculo masseter; 7° espaço intercostal); 1 canal para eletrocardiograma (derivação V1 modificada); 2 canais para detecção do fluxo aéreo

por termopar e cânula de pressão nasal; 2 canais para esforço respiratório torácico e abdominal por pletismografia de indutância; 1 canal para ronco e 1 canal para posição corporal, ambos com sensores EMBLA. A saturação do oxigênio percutânea

(SpO2) foi avaliada via oxímetro EMBLA. Todos os sensores de registro foram fixados ao paciente, de maneira não invasiva, com a utilização de fita adesiva e/ou colódio elástico. O sono foi estagiado de acordo com os critérios padronizados para estudos do sono (Rechtschaffen & Kales, 1968), enquanto a marcação de eventos respiratórios foi realizada seguindo-se os critérios da Academia Americana de Medicina de Sono (Iber et al, 2007).

4.1.3 Diagnóstico de bruxismo do sono

Para a definição do BS, uma calibração prévia ao início do exame de polissonografia foi realizada em ambos os músculos masseter direito e esquerdo e temporal direito e esquerdo para averiguar se os sensores realmente estavam posicionados em seu maior volume (Maluly et al, 2013). Os episódios de BS foram determinados seguindo o Manual de Estagiamento do Sono e Eventos Associados da Associação Americana de Medicina do Sono (Iber et al, 2007). Os critérios utilizados para a marcação dos eventos de BS foram: a) Cada episódio de BS deveria apresentar uma atividade no EMG com amplitude de pelo menos 2 vezes a amplitude basal; b) O episódio fásico corresponderia a uma atividade no EMG com pelo menos 3 surtos de 0,25 a 2 segundos de duração; c) o episódio tônico deveria apresentar uma elevação na atividade do EMG de pelo menos 2 segundos de duração; d) O episódio misto corresponderia a uma associação dos episódios fásicos e tônicos e) um período de pelo menos 3 segundos de atividade no EMG basal deveria ocorrer antes de ser marcado novo episódio de BS. Posteriormente, foram verificados e analisados os episódios de BS por hora de sono de acordo com os critérios polissonográficos para diagnóstico do BS definidos pela Academia Americana de Medicina do Sono (2005). Os indivíduos foram agrupados em controles (menos que 2 episódios por hora de sono) e com BS (maior ou igual a 2 episódios por hora de sono) (Rompré et al., 2007). Além disso, todos os indivíduos incluídos no presente estudo responderam a um questionário com perguntas relativas ao BS, construído por especialistas do

Instituto do Sono (São Paulo, Brasil), e ao questionário de sono UNIFESP (Braz et al., 1987; Santos-Silva et al., 2009). As 2 questões que apresentavam perguntas indicativas da presença ou ausência de queixas de bruxismo do sono foram: “Em algum momento da vida o senhor (a) rangeu, apertou, ou fez ruído com os dentes durante o sono?” (Santos-Silva et al, 2009) e “Qual a frequência que o senhor (a) range seus dentes atualmente?” (Braz et al, 1987). Para este estudo foram considerados positivos para o BS e incluídos todos os indivíduos que apresentaram na polissonografia 2 ou mais episódios de BS por hora de sono, independente da resposta dada às perguntas do questionário. Já para a inclusão no grupo controle, o voluntário deveria ter sido diagnosticado como negativo para o BS na polissonografia (<2 eventos/hora de sono) e ter respondido as 2 perguntas citadas acima negativamente. O grupo controle foi definido com base na ausência completa de sinais e sintomas de BS medidos pelos instrumentos disponíveis embora esta escolha diminuísse o número total de indivíduos examinados. Indivíduos que não preencheram adequadamente os questionários foram excluídos do estudo.

4.1.4 Questionários

Para análises das covariáveis que poderiam influenciar os resultados da análise genética foram usados os questionários e critérios definidos no EPISONO (Santos-Silva et al, 2009). Para o diagnóstico da SAOS, os critérios foram estabelecidos de acordo com Classificação Internacional dos Distúrbios do Sono (AAMS, 2005), que considera a presença do índice de apneia e hipopneia (IAH) entre 5 e 15 somado à presença de pelo menos 1 dos sintomas a seguir: queixas de ronco alto pelo menos 3 vezes por semana (Netzer et al., 1999), pausas respiratórias observadas pelo menos 3 vezes por semana (Netzer et al., 1999), sonolência diurna (Johns, 2002) ou fadiga (pontuação mínima maior ou igual a 4) (Chalder et al, 1993). Quando o IAH era acima de 15, a SAOS era considerada positiva independente da presença de queixas associadas. Para a coleta de informações sobre o consumo de álcool e tabaco nos últimos 3 meses foi usada a versão em português do questionário que avalia o risco de dependência química validado para a língua inglesa (ASSIST – Alcohol Smoking and Substance Involvement) (WHO ASSIST

Working Group, 2002). Já o consumo de álcool no dia do exame polissonográfico foi avaliado pelo questionário pré-sono preenchido antes da realização do exame (Bittencourt et al, 2005). A avaliação do uso de medicamentos ou substâncias que afetam o SNC pelos indivíduos foi feita por meio do questionário de sono da UNIFESP (Braz et al., 1987) e questionário pré-sono. A avaliação de classe social foi feita por meio de questionário da Associação Brasileira de Empresas de Pesquisa (ABEP, 2003).

4.1.5 Avaliações genéticas

As amostras de DNA foram genotipadas utilizando o Human Omni Express BeadChip array (Illumina, EUA), no qual foram interrogados até 730.525 SNPs em cada amostra. Para garantir que apenas marcadores e amostras de alta qualidade fossem incluídos no estudo, alguns parâmetros de controle de qualidade foram considerados. Foram excluídas amostras que apresentaram menos de 95% de genótipos válidos e marcadores que apresentaram genótipos válidos em menos de 95% das amostras. Também foram excluídos marcadores que se apresentaram fora do Equilíbrio de Hardy-Weinberg, utilizando um nível de significância de 0,001.

4.1.6 Análise estatística

Dados sociodemográficos e clínicos categóricos foram avaliados por meio de teste de qui-quadrado e resíduos ajustados maiores que 2,0 foram considerados estatisticamente significantes. Dados de idade e IMC foram analisados por meio do teste T de Student. Para essas análises, adotamos nível de significância p<0,05. Uma matriz de correlação genética com todos os marcadores foi desenhada para permitir a estimação do grau de similaridade genética entre os indivíduos. Foram excluídas as amostras que apresentaram estimativa de grau de parentesco (identity by descent IBD, mensurado pelo parâmetro pihat) maior que 12,5% com outra amostra. A análise de componentes principais com todos os marcadores foi realizada para estimar a ancestralidade, a qual foi utilizada como covariável para

controlar a inflação genômica decorrente da estratificação populacional em populações miscigenadas como a brasileira (Hancok et al, 2007). Os primeiros 5 componentes principais foram utilizados como covariáveis dos modelos de regressão logística subsequentes. Modelos de regressão logística usando a presença do BS como variável dependente e os polimorfismos como variáveis independentes foram realizados para verificação da associação genética. Foi realizada a análise com correção para os componentes principais, ancestralidade e para o uso de medicamentos que afetam o SNC (ansiolíticos, neurolépticos, antidepressivos, hipnóticos e estimulantes), única variável que se mostrou significativamente diferente entre os grupos BS e controle. Foram construídos gráficos do tipo quantile-quantile plot (QQ-plot) (Figura 1) para verificar a distribuição dos valores de p das associações observadas e esperadas, de forma a tentar identificar se a inflação genômica decorrente da estratificação populacional poderia ser reduzida após a correção pelos componentes principais. Os valores de p sem correção para múltiplos testes foram representados em gráficos do tipo Manhattan plot (Figura 2) para verificar a sua distribuição ao longo do genoma e auxiliar a identificação de regiões genômicas candidatas associadas ao BS. Para essas análises foi utilizado o software PLINK 1.9 (https://www.cog- genomics.org/plink2) (Chang et al, 2015).

Figura 1. Gráfico quantile-quantile para avaliar a estratificação populacional da amostra. A linha vermelha corresponde à distribuição esperada na população enquanto o traçado preto indica a distribuição da amostra. O gráfico 1 apresenta a distribuição da amostra bruta enquanto o gráfico 2 apresenta os dados corrigidos para ancestralidade e a covariante “Uso de medicação que afeta o sistema nervoso central”. À aproximação de quase todos os dados encontrados (em preto) da distribuição esperada na população (reta vermelha) indica que o efeito da estratificação populacional foi controlado corretamente.

Desta forma, a lista de genes candidatos foi comparada com a listas de genes cuja caracterização funcional e participação biológica já são bem estabelecidas. Após a definição dos SNPs, os resultados das associações foram representados em gráficos mostrando a região genômica envolvida (localização do SNP de interesse flanqueada por 500 kb de pares de bases em cada direção), bem como o desequilíbrio de ligação (ocorrência de combinações específicas de alelos em 2 ou mais loci ligados de maneira mais frequente do que o esperado casualmente na população) entre o SNP e outros SNPs ao redor levando em consideração o mapa de desequilíbrio de ligação da população europeia do projeto 1000 Genomes Novembro de 2014. Esta população foi escolhida como referência, pois não há nenhuma população brasileira caracterizada para fornecer tal informação e devido ao grau elevado de ancestralidade genética europeia na população estudada (Guindalini et al, 2010). Os gráficos foram elaborados usando o software LocusZoom (http://locuszoom.sph.umich.edu/locuszoom) (Pruim et al, 2010) (Figura 3). Além da análise dos SNPs, foi utilizado o software MAGMA (http://ctg.cncr.nl/software/magma) (de Leeuw et al, 2015) para 2 outras análises: análise no nível do gene e análise no nível de vias biológicas. Estas análises permitem que os resultados dos SNPs sejam combinados de forma que seus efeitos, em conjunto, possam ser amplificados levando em consideração a localização genômica dos SNPs e dos genes (análises no nível do gene) e a função dos genes em vias biológicas pré-determinadas (análise no nível de vias biológicas), facilitando a tradução dos resultados individuais dos SNPs em significado biológico. A análise no nível do gene levou em consideração o mapeamento dos SNPs aos genes de acordo com o desequilíbrio de ligação entre estes e as regiões em que os genes se encontram (genoma de referência hg19/GRCh37, total de genes investigados: 19.159). Foram considerados genes significantes aqueles que apresentaram valor de p agregado <10-8 e a correção de múltiplos testes de Bonferroni foi aplicada levando em consideração o número total de genes analisados. A análise no nível de vias biológicas levou em consideração um total de 1.011 listas de genes obtidas do banco de dados Reactome (http://www.reactome.org) (Fabregat et al, 2016). Cada lista contém genes que participam de uma mesma via ou função biológica, e a análise permite verificar o enriquecimento destas vias com base na informação das associações identificadas entre os SNPs e o BS, bem como os valores agregados no nível do gene. O nível de significância adotado para a análise no nível de vias

biológicas foi de 0,05, e a correção para múltiplos testes de Bonferroni também foi aplicada levando em consideração o número de vias testadas.

Figura 2. Gráfico do tipo Manhattan plot mostrando o resumo das associações verificadas neste estudo. O eixo X representa a posição genômica ao longo dos cromossomos no genoma, o eixo Y mostra –log10(p) para cada polimorfismo (SNP) testado. A linha azul representa o limiar de significância sugestiva (10-5) e a linha vermelha representa o limiar de significância ao longo do genoma (10-8).

Figura 3. Região genômica envolvida na associação com o rs741448. O gráfico mostra a posição do rs741448 no cromossomo 19 e suas relações com outros polimorfismos e genes próximos a uma distância aproximada de 500 Kilobases. A graduação no lado esquerdo da figura mostra a significância (p) da associação dos polimorfismos descritos neste estudo com o bruxismo do sono. À direita os números descrevem a taxa de recombinação. Abaixo

dos nomes dos genes há o posicionamento dos polimorfismos e genes dentro do cromossomo 19 em Megabases. A caixa localizada na parte superior esquerda graduada e assinalada com cores mostra o coeficiente de desequilíbrio de ligação entre os polimorfismos com base no polimorfismo principal (cor violeta).

5. RESULTADOS

Do total de 643 indivíduos participantes, 75 foram diagnosticados com BS e 568 foram considerados controles conforme critério descrito anteriormente. A Tabela 1 ilustra os dados sociodemográficos e clínicos dos grupos. Para as análises dos polimorfismos, os grupos BS e controle foram reduzidos para 70 e 518 indivíduos, respectivamente, devido à perda ou deficiência nos dados. A Figura 1, por meio dos gráficos quantile-quantile, ilustra que o efeito da estratificação populacional foi controlado corretamente. A Figura 2 demonstra a posição de cada SNP testado em sua localização genômica e sua significância, enquando a Figura 3 exemplifica a análise realizada para cada SNP e sua associação com regiões genômicas. Não foram encontradas diferenças significativas na associação entre os SNPs estudados e o BS após a correção de Bonferroni para múltiplos testes. Todos os SNPs com p<10-4 (n=40) estão representados na Tabela 2. Para a análise no nível do gene, identificamos que dos 19.159 genes, um total de 17.258 apresentaram SNPs que foram mapeados. No entanto, nenhum destes genes apresentou significância após correção de múltiplos testes de Bonferroni. Os 10 primeiros genes por nível de significância estão listados na Tabela 3 Da mesma forma nenhuma das 1.011 vias biológicas testadas permaneceram significantes após correção de múltiplos testes de Bonferroni. As 10 primeiras vias em nível de significância estão ilustradas na Tabela 4.

Tabela 1. Dados sociodemográficos dos grupos controle e bruxismo do sono.

CTRL Bruxismo p (n=568) (n=75) Sexo, %(n) Masculino 45,8(260) 50,7(38) 0,42 Feminino 54,2(308) 49,3(37)

Estado civil, %(n) Solteiro(a) 28,9(162) 26,7(20) Relação estável/união consensual 10,9(61) 12(9) Casado(a) 52,2(293) 54,7(41) 0,98 Separado(a)/Divorciado(a) 4,8(27) 4(3) Viúvo(a) 3,2(18) 2,7(2)

Condição Socioeconômica, %(n) A 11,1(63) 13,3(10) B 35,2(200) 46,7(35) C 42,6(242) 30,6(23) 0,23 D 10,4(59) 9,7(7) E 0,7(4) 0(0)

SAOS, %(n) Positivos 31,7(180) 37,3(28) 0,32

Medicação afetando SNC, %(n) Usuários 7,9(45) 14,7(11)* 0,05

Uso de tabaco (últimos 3 meses), %(n) Diariamente 20,5(107) 29,5(18) Semanalmente 2,5(13) 3,3(2) 0,16 Mensalmente 2,1(11) 4,9(3)

Uso de álcool (últimos 3 meses), %(n) Diariamente 6,2(29) 3,5(2) Semanalmente 32,3(152) 33,3(19) 0.65 Mensalmente 30,6(144) 36,8(21)

Uso de álcool (dia do exame), %(n) Sim 2,7(15) 2,7(2) 0,99 CTRL: indivíduos controle sem bruxismo do sono; Bruxismo: indivíduos diagnosticados com bruxismo do sono; SAOS: síndrome da apneia obstrutiva do sono, SNC: Sistema Nervoso Central. *frequência observada estatisticamente maior que frequência esperada.

Tabela 2. Polimorfismos (SNPs) em ordem crescente de significância até p=10-5 e sua distribuição entre os grupos de bruxismo e controles

Frequência OR ajustado CR SNP Pares de Base p não ajustado p ajustado Casos Controles (95% IC) 19 rs741448 29737948 0,407 0,231 7,20x10-6 2,52 (1,69-3,74) 5,12 x10-6 2 rs1721781 36179344 0,186 0,376 9,42x10-6 0,34 (0,22-0,55) 7,18 x10-6 10 rs867768 31414304 0,386 0,226 3,66x10-5 2,39 (1,61-3,56) 1,64 x10-5 2 rs12713013 48937154 0,172 0,065 1,34x10-5 3,21 (1,86-5,52) 2,70 x10-5 6 rs16874223 13562277 0,171 0,062 4,03x10-6 3,01 (1,80-5,05) 2,94 x10-5 20 rs2585424 52798579 0,179 0,073 3,04x10-5 3,09 (1,82-5,24) 3,08 x10-5 3 rs7642644 84920368 0,229 0,105 2,39x10-5 2,63 (1,67-4,14) 3,19 x10-5 2 rs10183223 14784871 0,336 0,187 4,42x10-5 2,40 (1,59-3,63) 3,29 x10-5 12 rs12306950 87922782 0,136 0,052 1,19x10-4 3,78 (2,01-7,11) 3,62 x10-5 10 rs1887136 114075199 0,645 0,461 5,05x10-5 2,23 (1,52-3,26) 3,64 x10-5 10 rs10885329 114072091 0,636 0,451 3,89x10-5 2,20 (1,52-3,21) 3,65 x10-5 20 rs2245792 52817404 0,136 0,046 1,85x10-5 3,56 (1,95-6,50) 3,68 x10-5 21 rs2823227 16682922 0,429 0,283 4,13x10-4 2,31 (1,55-3,43) 3,81x10-5 9 rs11139315 84181238 0,186 0,355 6,66x10-5 0,38 (0,24-0,60) 4,19x10-5 2 rs3116534 204833769 0,407 0,229 5,08x10-6 2,29 (1,54-3,41) 4,27x10-5 15 rs12232304 42285495 0,143 0,045 2,99x10-6 3,20 (1,83-5,59) 4,51x10-5 11 rs10904 123596055 0,507 0,327 2,75x10-5 2,17 (1,50-3,15) 4,62x10-5 17 rs4793661 48620517 0,300 0,154 1,82x10-5 2,39 (1,57-3,64) 5,13x10-5 6 rs6926104 129620833 0,279 0,457 6,36x10-5 0,43 (0,29-0,65) 5,45x10-5 10 rs1863021 109691871 0,314 0,18 1,61x10-4 2,35 (1,55-3,56) 5,50x10-5 13 rs4941980 41058857 0,129 0,296 3,09x10-5 0,33 (0,19-0,57) 5,89x10-5

20 rs2585423 52802989 0,200 0,091 7,49x10-5 2,82 (1,70-4,67) 5,91x10-5 2 rs1721779 36178894 0,212 0,382 1,35x10-4 0,39 (0,25-0,62) 6,21x10-5 10 rs2171730 16509960 0,179 0,082 2,32x10-4 2,98 (1,74-5,10) 6,68x10-5 10 rs3847388 28596995 0,221 0,396 6,36x10-5 0,42 (0,27-0,64) 6,80x10-5 3 rs3821763 10948354 0,121 0,04 2,69x10-5 3,68 (1,94-6,98) 6,89x10-5 1 rs12124242 38185814 0,214 0,097 3,04x10-5 2,58 (1,61-4,12) 7,65x10-5 3 rs3856841 2426104 0,471 0,299 4,12x10-5 2,19 (1,48-3,24) 8,10x10-5 13 rs7981143 84796477 0,300 0,484 4,34x10-5 0,45(0,30-0,67) 8,16x10-5 4 rs3956582 126808685 0,209 0,373 1,93x10-4 0,41(0,25-0,64) 8,25x10-5 12 rs10777129 88961713 0,329 0,218 3,45x10-3 2,4 (1,55-3,72) 8,68x10-5 6 rs1490392 129637915 0,614 0,441 1,15x10-4 2,15 (1,47-3,14) 8,69x10-5 8 rs9693207 120772055 0,643 0,472 1,48x10-4 2,14 (1,46-3,13) 9,22x10-5 11 rs4385902 67472905 0,157 0,06 2,72x10-5 3,11 (1,76-3,49) 9,32x10-5 13 rs7336222 66998578 0,564 0,38 3,09x10-5 2,07 (1,44-2,98) 9,38x10-5 1 rs7543296 101348100 0,571 0,405 1,78x10-4 2,09 (1,44-3,02) 9,44x10-5 13 rs12854161 41202384 0,288 0,144 2,31x10-5 2,36 (1,53-3,64) 9,47x10-5 10 rs7909212 3707650 0,421 0,275 3,59x10-4 2,11 (1,45-3,07) 9,62x10-5 16 rs227761 19861305 0,579 0,397 4,16x10-5 2,11 (1,45-3,06) 9,69x10-5 2 rs11124102 106901623 0,186 0,093 7,26x10-4 2,78 (1,66-4,66) 9,92x10-5 CR: cromossomo; SNP: polimorfismo; OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança; p: significância estatística

Tabela 3. Genes identificados na análise à nível de genes por ordem crescente de significância.

Gene CR Posição inicial Posição final n SNPs n Z STAT p p Bonf

EPN3 17 48610043 48621111 4 588 3,93 4,19x10-5 0,712

EIF2S1 14 67827034 67853233 3 588 3,7 1,10x10-4 1,000

LAMA2 6 129204286 129837711 127 588 3,59 1,67x10-4 1,000

CCDC140 2 223162866 223169936 3 588 3,4 3,36x10-4 1,000

C1orf109 1 38147242 38158007 5 588 3,31 4,70x10-4 1,000

KIF1BP 10 70748477 70776739 5 588 3,2 6,77x10-4 1,000

TOMM20L 14 58862644 58875419 1 588 3,2 6,86x10-4 1,000

MTMR9 8 11142000 11185655 14 588 3,18 7,41x10-4 1,000

BRF1 14 105675623 105781914 15 588 3,15 8,14x10-4 1,000

ZNF202 11 123594997 123612383 9 588 3,12 8,90x10-4 1,000 CR: cromossomo; n SNPs: números de polimorfismos de nucleotídeo simples; n: número de indivíduos analisados Z STAT:parâmetro estatístico para cálculo de significância; p: nível de significância; p Bonf: nível de significância após correção de Bonferroni EPN3: Epsin 3; EIF2S1: Eukaryotic Translation Initiation Factor 2 Subunit Alpha; LAMA2: Laminin Subunit Alpha 2; CCDC140: Coiled-Coil Domain Containing 140; C1orf109: Chromosome 1 Open Reading Frame 109; KIF1BP: KIF1 BindingProtein; TOMM20L: Translocase Of Outer Mitochondrial Membrane 20 Like; MTMR9: Myotubularin Related Protein 9; BRF1: BRF1, RNA polymerase III transcription initiation factor 90 kDa subunit; ZNF202: Zinc Finger Protein 202

Tabela 4 Vias biológicas identificadas na análise em nível de vias biológicas em ordem crescente de significância.

N beta Erro Vias biológicas beta p p ajustado Genes padronizado padrão

Melanin biosynthesis 2 2,11 0,023 0,692 0,001 0,002

CRMPs in Sema3A signaling 15 0,73 0,022 0,24 0,001 0,004

Initial triggering of complement 16 0,702 0,022 0,237 0,002 0,005

Activation of RAS in B cells 5 0,628 0,011 0,388 0,053 0,007

Toxicity of botulinum toxin type E (BoNT/E) 3 1,46 0,019 0,555 0,004 0,01

ALKBH3 mediated reversal of alkylation damage 4 0,827 0,013 0,448 0,033 0,015

Signaling by plasma membrane FGFR1 fusions 3 0,776 0,01 0,43 0,035 0,016

Zinc transporters 15 0,262 0,008 0,221 0,118 0,016 Classical antibody-mediated complement 5 1,19 0,02 0,467 0,005 0,019 activation Creation of C4 and C2 activators 10 0,769 0,019 0,312 0,007 0,021 beta: coeficiente de regressão; p: nível de significância CRMPs: Collapsin Response Mediator Protein; Sema3A: Semaphorin 3A; ALKBH3: alkB homolog 3, alpha-ketoglutaratedependent dioxygenase; FGFR1: fibroblast growth factor receptor 1

6. DISCUSSÃO

O presente estudo caracterizou pela primeira vez a distribuição da frequência de polimorfismos genéticos em larga escala em indivíduos com fenótipo de BS em relação a controles por meio de um GWAS. Embora os resultados não tenham atingido o nível de significância esperado para o tipo de estudo (p<10-8) (Hardy e Singleton, 2009), estes poderão ser um marco referencial para pesquisas futuras no estudo etiológico do BS, gerando novas perguntas e hipóteses para este distúrbio de sono. Poucos são os estudos de associação de fatores genéticos com o fenótipo de BS na literatura, sendo que a maioria demonstra resultados positivos para esta associação. Estudos com gêmeos (Horowitz, 1963; Lindqvist, 1974; Hublin et al 1998; Rintakoski et al 2012), estudo de agregação familiar (Reding et al, 1966) e estudo tipo caso-controle de genes candidatos (Abe et al, 2012; Oporto et al 2016) têm reforçado a hipótese do envolvimento genético nesta doença de caráter complexo. O único estudo discordante foi o de Michalowicz e colaboradores (2000) que, pesquisando gêmeos monozigóticos e dizigóticos criados em ambientes separados ou compartilhados, não encontraram diferenças no relato de ranger ou apertar de dentes durante o sono entre os grupos estudados, concluindo que a genética e tão pouco o ambiente familiar seriam responsáveis pela variação do fenótipo investigado. O primeiro estudo descreveu a concordância no padrão de atrição dentária em gêmeos monozigóticos, sugerindo uma possível influência genética (Horowitz, 1963). Posteriormente, em estudo com 2 grupos de estudantes, o BS foi investigado por meio de questionários. Apesar das limitações do estudo em relação ao método subjetivo e da seleção da amostra, os dados do trabalho indicaram que o BS possui uma prevalência relevante para sua inclusão entre os problemas de saúde pública (Reding et al, 1966). Em pesquisa com 117 pares de gêmeos monozigóticos (n=28) e dizigóticos (n=89) com média de idade de 12 anos, foram realizados exames clínicos e modelos de gesso. Foram identificadas facetas de desgaste em 54% do total da amostra, sem diferenças individuais entre os 2 grupos. Entre os pares de gêmeos monozigóticos, 53,5% apresentaram desgastes versus 76,4% dos dizigóticos. O autor concluiu que esses resultados indicavam que a hereditariedade influenciaria fortemente o padrão dos movimentos mastigatórios, sendo importante na determinação da presença ou não de facetas de desgaste relacionadas ao bruxismo. No entanto, estudos com

gêmeos não proporcionam informação sobre os mecanismos genéticos, apenas indicam se o fator estudado apresenta contribuição genética ou não (Lindqvist, 1974). Hublin e colaboradores(1998) realizaram uma análise de 11.220 questionários sobre parassonias em gêmeos finlandeses (3.409 monozigóticos, 7.001 dizigóticos e 810 sem definição). As perguntas tratavam da frequência do BS na idade adulta e na lembrança da existência e frequência desse na infância. Utilizando como método os modelos de equação estruturais para estimar as variações dos componentes e comparar com diferentes modelos genéticos, os autores encontraram 49,1% de influência genética no BS para o sexo masculino na infância e 63,6% para o sexo feminino. Para a idade adulta o componente genético explicaria 38,9% do BS nos homens, enquanto para as mulheres este índice explicaria 53,2%. Houve uma forte concordância entre o relato de BS na idade adulta e a lembrança de BS na infância para ambos os sexos. Os resultados do trabalho sugeriram haver uma forte tendência de manutenção na idade adulta da presença ou ausência de BS que se manifestou na infância, confirmando o papel significante que a genética assume na existência do BS. Michalowicz e colaboradores (2000) estudaram a herdabilidade do BS por meio de um estudo com gêmeos monozigóticos e dizigóticos criados separados ou juntos. Por meio de questionários e exames clínicos, os autores não encontraram nenhuma diferença para o hábito de ranger ou apertar os dentes entre monozigóticos e dizigóticos, criados separados ou juntos. Neste estudo, os resultados indicaram que nem a genética e nem o ambiente compartilhado foram responsáveis pela variação do bruxismo. Ao contrário, os fatores ambientais isolados e individuais foram os principais determinantes. Rintakoski e colaboradores (2012) utilizaram uma amostra de gêmeos finlandeses diferentes da pesquisada pelo grupo de Hublin (1998) para replicar parcialmente a pesquisa realizada. A prevalência em geral de BS foi de 8,7%. A correlação genética foi maior para os monozigóticos do que para os dizigóticos. Não foram encontradas diferenças na expressão genética entre homens e mulheres. Os autores concluíram que, independente do sexo, 52% da variância do BS poderia ser explicada por fatores genéticos. Em 2012, pela primeira vez um estudo sobre BS utilizou marcadores genéticos para investigar a associação genética em indivíduos diagnosticados com

BS (n=66) ou controles (n=48). Todos responderam a questionários e escalas para avaliar diversas outras comorbidades ou características de personalidade potencialmente relacionadas com o BS. Foram mapeados 13 SNPs em 4 genes (solute carrier family 6 member 4, SLC6A4; 5-hydroxytryptamine receptor 1A, HTR1A; 5-hydroxytryptamine receptor 2A, HTR2A; 5-hydroxytryptamine receptor 2C, HTR2C) reconhecidamente relacionados com a neurotransmissão serotonérgica. Após análise univariada, apenas 3 dos 13 SNPs foram selecionados como preditores do BS (rs6313, rs2770304 e rs4941573), ambos pertencentes ao gene HTR2A. Foi realizada, então, análise de regressão logística multivariada com os preditores selecionados anteriormente. Apenas a presença do alelo C no rs6313 do gene HTR2A foi associada ao BS com razão de prevalência 4,25 vezes maior em relação à presença do alelo T. Este estudo apresentou algumas limitações. A principal delas foi a ausência da polissonografia como instrumento de diagnóstico do BS. O estudo foi conduzido por exames clínicos e anamnese com critérios definidos pela literatura e por um sistema portátil com apenas 1 canal de EMG. Outra limitação foi não pesquisarem polimorfismos relacionados a outros neurotransmissores também sugeridos como possivelmente relacionados com o BS (Abe et al, 2012). Recentemente, um estudo avaliou 130 pacientes diagnosticados e distribuídos em grupos de BS (n=26), BV (n=61) e com ambos BS e BV (n=43) além de um grupo controle de 59 indivíduos. Foram pesquisadas diferenças entre 7 SNPs localizados em genes envolvidos com a neurotransmissão serotonérgica. Os indivíduos incluídos eram pacientes tratados para bruxismo oriundos de clínicas de ensino odontológico de uma universidade e diagnosticados como bruxismo provável de acordo com o consenso internacional (Lobbezoo et al, 2014). Foram utilizados questionários, entrevistas e exames clínicos para definir o diagnóstico. Não há relatos de como foram recrutados os indivíduos do grupo controle. Os autores relataram não haver diferenças entre os gêneros. Cada grupo de acordo com seu diagnóstico (BS, BV e ambos) foi comparado ao controle e apenas o rs27703045 localizado no íntron do gene HTR2A apresentou diferença entre o grupo BS e controle com razão de prevalência 2,13 vezes maior de apresentar BS na presença do alelo C do que na presença do alelo T (Oporto et al, 2016). Procuramos encontrar, dentro dos nossos resultados, associações fenotípicas já conhecidas com os SNPs, genes e vias biológicas passíveis de se relacionarem com o BS, ainda que intuitivamente. Como referência, buscamos conhecer mais

detalhadamente os SNPS, genes e vias mais significantes de cada lista obtida confrontando com informações já conhecidas em bases de consulta abertas (PubMed/Gene, Genecard, Omin, Uniprot). Embora nenhum SNP, gene ou via biológica tenha apresentado significância estatística após a correção de Bonferroni para múltiplos testes, escolhemos descrever os primeiros das listas por se tratar de um estudo inédito e com robustez na definição do fenótipo estudado. A replicação deste estudo em uma amostra maior e com poder de associação elevado possivelmente resultará em um maior número de SNPs, genes ou vias que possam ser significantes, contribuindo com o entendimento da etiologia do BS. A maior diferença encontrada entre grupo BS e controle foi rs741448 (p=5,12x10-6) localizado na região 19q12. Este SNP está em desequilíbrio de ligação na região do gene UQCRFS1 (Ubiquinol-Cytochrome C Reductase, Rieske Iron- Sulfur Polypeptide 1). A proteína codificada participa da cadeia respiratória geradora de um potencial eletroquímico ligado à síntese de adenosina trifosfato (ATP). Parece estar envolvido com uma maior agressividade do câncer de mama (Ohashi et al, 2004) e do carcinoma de ovário (Kaneko et al, 2003). Também na área de desequilíbrio de ligação foram encontrados os genes: LINC00906 LOC100505835, LOC284395 e LOC102724958 que são genes de ácido ribonucleico (RNA), não codificadores de proteínas; o gene C19orf12 (Chromosome 19 Open Reading Frame 12), cuja mutação causa a neurodegeneração com acúmulo de ferro cerebral, embora a proteína codificada ainda não tenha sua função especificada (Gagliardi et al, 2015); o gene PLEKHF1 (Pleckstrin Homology And FYVE Domain Containing 1), cuja proteína pode induzir a apoptose através da via lisossoma-mitocondrial (Lin et al, 2012); o gene POP4 (POP4 Homolog, Ribonuclease P/MRP Subunit), cuja proteína codificada está envolvida com o precursor do RNA em um dos complexos nucleolares ribonucleicos, não havendo nenhuma doença conhecida ligada à sua função; e o gene VSTM2B (V-Set And Transmembrane Domain Containing 2B) que é um gene codificador de proteína, embora esta não tenha função identificada ou doença associada ainda. Na sequência, o rs1721781 (p=7,18x10-6) encontrado na região 2p22.3 em região de desequilíbrio de ligação do gene CRIM1 (Cysteine Rich Transmembrane BMP Regulator 1 (Chordin-Like) foi identificado. A proteína CRIM1 pode ter um papel na formação e manutenção capilar durante a angiogênese (Glienke et al, 2002),

além de participar no desenvolvimento embrionário do neurônio motor no SNC dos animais vertebrados (Kolle et al, 2000). O próximo SNP em ordem decrescente de significância foi o rs867768 (p=1,64x10-5) que está posicionado na região 10p11.22. Este SNP está próximo dos genes ZNF438 (zinc finger protein 438) e ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1). Ambos atuam como repressor transcricional (Williams et al,1991; Zhong et al, 2007), tendo esse último, função inibidora do gene IL-2 (interleukin-2), sugerindo que as enzimas por ele codificadas participam na modulação da expressão de outros genes relacionados a processos imunológicos, além de participação na regulação da agressividade em alguns tumores (Galván et al, 2015). Outro gene próximo identificado foi o LYZL2 (lysozyme like 2), um dos codificadores da lisozima, conhecido fator bacteriolítico, o qual teve como fenótipo associado em um estudo GWAS a cárie dentária na região anterior da mandíbula (Shaffer et al, 2013). Próximos de vários genes, o rs12713013 (p=2,7x10-5) localizado na região 2p16.3 foi o segundo SNP do cromossomo 2 entre os mais significantes, embora não esteja em desequilíbrio de ligação com nenhum outro SNP do mesmo cromossomo listado como candidato à associação com BS. Seus genes próximos são: GTF2A1L (general transcription factor IIA subunit 1 like), com função de fator de transcrição encontrado especificamente nos testículos (Upadhyaya et al 1999); STON1 (stonin 1), envolvido na função endocítica e não relacionado a um fenótipo específico (Maritzen et al, 2010); LHCGR (luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor), codificante do receptor do hormônio luteinizante e da gonadotrofina coriônica humana. Mutações genéticas no gene LHCGR alteram o desenvolvimento dos caracteres secundários masculinos e estão relacionadas a patologias como o pseudo-hermafroditismo (Wu, Chan, 1999) e associadas à síndrome do ovário policístico (Thathapudi et al, 2015). Outros genes próximos ao SNP rs12713013 foram: PPP1R21 (protein phosphatase 1 regulatory subunit 21), o qual não presenta ainda definição de função específica ou fenótipo; FOXN2 (forkhead box N2), que codifica proteína com função regulatória do vírus linfotrópico de células T humanas associado à leucemia-linfoma de células T do adulto (Fujisawa et al, 1985; Li et al, 1992); e FSHR (follicle stimulating hormone receptor), codificante do hormônio folículo estimulante, cuja função se relaciona com o desenvolvimento das gônadas. Uma das mutações nesse gene está associada à síndrome da hiperestimulação

ovariana (Uchida et al, 2013) e alterações na espermogênese no homem (Tapanainen et al 1997). Na sequência, encontramos o SNP rs16874223 (p=2,94x10-5) localizado na região 6p23 e também próximo de vários genes como: SIRT5 (sirtuin 5), cuja proteína codificada (sirtuína) não possui ainda uma função bem determinada nos seres humanos, mas em outros organismos se apresentam como um conjunto de enzimas relacionadas ao silenciamento de genes que interferem na longevidade das células, e por consequência envolvidas na preservação e envelhecimento dos tecidos do corpo (Mahlknecht et al, 2006); NOL7 (nucleolar protein 7), codificante de uma proteína cuja função é de supressão tumoral e regulação da angiogênese (Hasina et al, 2006); RANBP9 (RAN binding protein 9) que codifica uma proteína de ligação essencial para translocação do RNA e de proteínas através do núcleo celular, tendo função na regulação celular do sistema imunológico e do SNC (Murrin et al, 2007) e recentemente associado ao risco de esquizofrenia (Bae et al, 2015); GFOD1 (glucose-fructose oxidoreductase domain containing 1), cuja atividade está ligada à oxirredução e foi associado por meio de um GWAS ao transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (Lasky-Su et al, 2008); MCUR1 (mitochondrial calcium uniporter regulator 1), codificante de proteína essencial que atua para permitir a entrada do íon cálcio na mitocôndria (Mallilankaraman et al, 2012), mas sem nenhum fenótipo específico conhecido; TBC1D7 (TBC1 [(Tre-2/Bub2/Cdc16] domain family member 7), gerador de uma proteína com possível função ativadora de GTPases, cuja mutação pode gerar a megaencefalia (Alfaiz et al, 2014); PHACTR1 (phosphatase and actin regulator 1), codificador de uma fosfatase da família de reguladores da actina, controlando assim seu citoesqueleto. Participa na formação dos túbulos pelas células endoteliais (Jarray et al, 2011). Sua variação genética está associada ao infarto do miocárdio, doenças coronárias e acidente vascular encefálico (Bevan et al, 2012); e RNF182 (ring finger protein 182) que gera proteína participante do processo de degradação de proteínas via sistema ubiquitina- proteassoma. Um aumento da concentração da RNF 182 no cérebro de pacientes com doença de Alzheimer sugeriu uma participação desta no controle da renovação celular que é prejudicado nesta doença (Liu et al, 2008). O SNP rs2585424 (p=3,08x10-5), localizado na região 20q13, apresenta um desequilíbrio de ligação importante com mais 2 SNPs encontrados neste estudo. Estes são o rs2245792 (p=3,68x10-5) e rs2585423 (p=5,91x10-5). Ambos estão

próximos dos seguintes genes: PFDN4 (Prefoldin Subunit 4), codificador de proteínas do complexo molecular de chaperonas (Vainberg et al, 1998). Tais proteínas se ligam e auxiliam polipeptídios recém-formados a se estabilizarem na sua forma funcional e caso isso isto não seja possível, elas participam do processo de degradação da proteína malformada. Em alta concentração, o PFDN4 foi associado a melhores prognósticos do câncer de cólon (Miyoshi et al, 2010) e diferentemente, sua expressão aumentada nas células mamárias foi relacionada à maior progressão do câncer de mama (Collins et al, 2001), além de associado à dermatite atópica (Hirota et al, 2012). Outro gene associado ao SNP mencionado foi o CYP24A1 (Cytochrome P450 Family 24 Subfamily A Member 1), o qual codifica um membro da superfamília de enzimas citocromo P450. Este grupo de enzimas são mono-oxigenases responsáveis por oxidar um grande número de substâncias em reações envolvendo o metabolismo de drogas e substâncias tóxicas, a síntese de hormônios esteroides, de colesterol e da vitamina D3 (Danielson, 2002). Especificamente, a proteína mitocondrial CYP24A1 realiza a degradação da 1,25- diidroxi-vitamina D3, a forma fisiologicamente ativa da vitamina D3 que desempenha função importante na homeostase do cálcio e do sistema endócrino, e especialmente do sistema dopaminérgico (Danielson, 2002). Muitos fenótipos estão associados a este gene, como por exemplo, hipercalcemia (Molin et al, 2015; Figueres et al, 2015), calcificação das artérias coronárias (Shen et al, 2010), diabetes tipo 1 (Cooper et al, 2011), melanoma (Brożyna et al, 2014), adenocarcinoma tubular de pâncreas (Hummel et al, 2014), câncer de próstata (Oh et al, 2014), câncer bucal (Zeljic et al, 2012) e outros tipos de câncer (Kósa et al, 2013; Clendenen et al, 2015). Demais genes encontrados próximos foram: BCAS1 (breast carcinoma amplified sequence 1), cuja proteína está aumentada em vários tipos de tumores de mama e a fenótipos mais agressivos (Collins et al 1998); SUMO1P1 (SUMO1 Pseudogene 1), um pseudogene (gene inativo derivado por mutação de um gene ancestral ativo e localizado geralmente na mesma região que seu homólogo funcional); e DOK5 (Docking Protein 5) que codifica proteína adaptadora de sinal, auxiliando uma determinada proteína principal em uma via transdutora, porém ainda sem nenhum fenótipo conhecido associado (Favre et al, 2003). O próximo SNP é o rs7642644 (p=3,19x10-5) situado na região 3p12.1 e próximo aos genes LINC00971 (Long Intergenic Non-Protein Coding RNA 971), não

codificador, e CADM2 (Cell Adhesion Molecule 2), cuja proteína codificada pertence a uma família de moléculas de adesão celular importante para a organização sináptica. Evidência revelou que sua expressão reduzida está associada ao risco de recorrência de carcinoma hepatocelular (Yang et al, 2014). Em relação ao SNP rs10183223 (p=3,29x10-5) localizado na região 2p24.3, verificou-se sua proximidade com os genes FAM84A (Family With Sequence Similarity 84 Member A) e LOC653602 (Uncharacterized LOC653602), cujas proteínas não apresentam ainda nenhum fenótipo claramente associado e LINC00276 (Long Intergenic Non-Protein Coding RNA 276), um gene de RNA não codificador. De forma semelhante, o SNP rs12306950 (p=3,62x10-5) localizado na região 12q21.32 apresentou-se próximo do gene MKRN9P (makorin ring finger protein 9, pseudogene), um pseudogene, e de C12orf50 (Chromosome 12 Open Reading Frame 50), codificador de proteína sem função claramente definida. Por fim, o SNP rs1887136 (p=3,64x10-5) localizado na região 10q25.2 que se encontrou em forte desequilíbrio de ligação com rs10885329 (p=3,65x10-5) e em proximidade a vários genes: GUCY2GP (Guanylate Cyclase 2G, Pseudogene) classificado como pseudogene; TECTB (Tectorin Beta) codificador de proteína de membrana que cobre o neuroepitélio da cóclea contatando com células ciliadas sensoriais especializadas (sem evidências de fenótipo associado); ACSL5 (Acyl-CoA Synthetase Long-Chain Family Member 5) codificante de proteína participante do metabolismo lipídico com evidências de participação em gliomas (Mashima et al, 2009) e na doença celíaca (Obbermuller et al, 2006); MIR6715A (MicroRNA 6715a) e MIR6715B (MicroRNA 6715b), genes de RNA sem categoria definida; ZDHHC6 (Zinc Finger DHHC-Type Containing 6) codificante de proteína ligada à transferase palmitol, sem fenótipos determinados (Ohno et al, 2006); GPAM (Glycerol-3- Phosphate Acyltransferase, Mitochondrial), codificante de enzima mitocondrial que prefere ácidos graxos saturados como substrato para síntese de glicerolipídeos (sem fenótipo associado) (Harada et al, 2012); MIR4295 (MicroRNA 4295), gene de RNA do tipo micro-RNA; e VTI1A (Vesicle Transport Through Interaction With T-SNAREs [soluble NSF attachment receptor] 1A), codificante de proteína relacionada ao transporte vesicular (Zylbersztejn,Galli, 2011), associado ao câncer colorretal por um GWAS recente (Wang et al, 2014).

Em relação à análise ao nível de genes, também procuramos detalhar abaixo as associações fenotípicas com os 10 primeiros genes estabelecidos de acordo com o valor de p resultante. O gene EPN3 (Epsin 3) (p=4,19x10-5) localizado na região 17q21 codifica uma proteína da família dos adaptadores endocíticos (Reider et al, 2011), cuja superexpressão parece estar ligada à invasão de células cancerosas particularmente em tumores agressivos (Coon et al, 2011). Também pode estar associado à apoptose de células pancreáticas responsáveis pelo diabetes tipo 1 (Beck et al, 2011). O gene EIF2S1 (Eukaryotic Translation Initiation Factor 2 Subunit Alpha) (p=1,10x10-4) está situado na região 14q23.3 e catalisa a primeira etapa da iniciação da síntese proteica (Ernst et al, 1987). Embora inúmeros estudos e associações tenham sido realizados com esta proteína, nenhum deles se aproximou de relações plausíveis com a etiologia do BS. Na sequência, encontramos o gene LAMA2 (Laminin Subunit Alpha 2) (p=1,67x10-4) posicionado na região 6q22-q23 que codifica uma subunidade componente da membrana basal, a laminina 2 ou merosina que é de fundamental importância no desenvolvimento embrionário. Mutações neste gene causam distrofia muscular congênita deficiente de merosina (Løkken et al, 2015). O gene CCDC140 (Coiled-Coil Domain Containing 140) (p=3,36x10-4) está localizado na região 2q36.1 e codifica uma proteína que parece ser restrita a primatas superiores, mas que ainda não tem possui fenótipo associado descrito. Já o C1orf109 (Chromosome 1 Open Reading Frame 109) (p=4,70x10-4), que também codifica proteína, está situado no cromossomo 1p34.3 sem uma função claramente definida e foi recentemente sugerido como envolvido na proliferação de células cancerosas (Liu et al, 2012). O próximo gene estudado, KIF1BP (KIF1 Binding Protein) (p=6,77x10-4), está posicionado na região 10q22.1. A proteína que ele codifica é necessária para o crescimento e manutenção dos microtúbulos durante o desenvolvimento do sistema nervoso periférico e SNC (Drévillon et al, 2013). A sua mutação genética ocasiona a síndrome de Goldberg-Shprintzen, que ocasiona craniostoses, microcefalia e deficiência intelectual.

O gene TOMM20L (Translocase Of Outer Mitochondrial Membrane 20 Like) (p=6,86x10-4) está localizado na região 14q23.1. Esse parece ser ativo no transporte de proteínas através da membrana, mas sem funções bem estabelecidas. Na sequência, analisamos o gene MTMR9 (Myotubularin Related Protein 9) (p=7,41x10-4) que está situado na região 8p23-p22 e cuja proteína codificada faz parte da família das proteínas associadas a miotubularinas (Appel et al, 2001). Estudos sugerem a possibilidade de variações genéticas neste gene estarem associada a alterações metabólicas como a obesidade (Yanagiya et al, 2007; Tang et al, 2014). Em relação ao gene BRF1 (BRF1, RNA Polymerase III Transcription Initiation Factor 90 KDa Subunit) (p=8,14x10-4), posicionado na região 14q32.33 codifica um dos fatores de transcrição da RNA polimerase III que resultam principalmente em RNAs transportadores. Mutações que diminuem a atividade desta proteína causam anomalias no desenvolvimento neurológico sugerindo sua importância no desenvolvimento normal do cerebelo e da cognição (Borck et al, 2015). Por fim, o gene ZNF202 (Zinc Finger Protein 202) (p=8,90x10-4), localizado na região 11q24, tem sua proteína codificada relatada como uma repressora transcricional que se liga a elementos predominantemente ligados ao metabolismo de lipídios e também envolvidos com doenças vasculares (Stene et al, 2008). Em um GWAS, efeitos adversos extrapiramidais durante tratamento antipsicótico foram associados à SNPs nesse gene (Aberg et al, 2010). A análise no nível de vias biológicas não revelou nenhuma ligação plausível mesmo que intuitiva das vias mais significantes com o BS, suas hipóteses etiológicas ou mecanismos de ação conhecidos até o presente momento. Embora sem aparente relação com o BS, caso os resultados sejam replicados, estudos específicos nestas vias poderão identificar fatores etiológicos ainda desconhecidos para o BS. Evidências científicas sugerem cada vez mais o envolvimento do SNC como componente principal na fisiopatologia do BS (Lobbezoo, Naeije, 2001; Lavigne et al, 2003; Khoury et al, 2008). Dentre os SNPs e genes selecionados neste GWAS, alguns deles se associam de uma forma direta ou indireta com a formação, manutenção e fisiologia do SNC e do complexo neuromuscular potencialmente relacionado com o fenótipo do BS.

Uma possível associação com o SNC se encontra no rs1721781 localizado na região 2p22.3 em região de desequilíbrio de ligação do gene CRIM1, no qual os autores descreveram a participação da proteína codificada interagindo com alguns fatores de crescimento envolvidos na diferenciação e sobrevivência de neurônios motores. Demonstram também que uma interação entre a proteína Crim 1 e TGF-β (Transforming growth factor beta) pode ser importante funcionalmente para o desenvolvimento do SNC. Os autores também destacam que a presença de Crim1 próximo ao neurônio motor em desenvolvimento durante sua apoptose aumenta a possibilidade de que Crim1 esteja envolvido na sobrevivência de neurônios motores durante fases posteriores do desenvolvimento (Kolle et al, 2000). Estudos associam ativações dos motoneurônios trigeminais e os movimentos mandibulares tanto em modelo animal (Mascaro et al, 2009) quanto em humanos (D’Amico et al, 2013). Hipóteses sobre a fisiopatologia do BS envolvem a participação dos neurônios motores trigeminais estimulados por neurotransmissores em regiões específicas do SNC (Jaffee, Bostwick, 2000; Falisi et al, 2014). Desta forma, caso os dados deste estudo sejam replicados futuramente, podemos ter uma nova direção de estudos sobre a fisiopatologia do BS. Destaca-se também nos estudos de SNPs a concentração de 3 deles (p<10-4) no cromossomo 20 em desequilíbrio de ligação em uma região próxima ao gene CYP24A1 (relacionado ao metabolismo da vitamina D). O papel da vitamina D no desenvolvimento cerebral e em suas funções vem sendo estudado nos últimos anos e inúmeras associações têm sido feitas com transtornos neuropsiquiátricos como a esquizofrenia (Chiang et al, 2016) ou doenças degenerativas do SNC como a doença de Parkinson (Lv et al, 2014) e doença de Alzheimer (Banerjee et al, 2015). De uma maneira geral, as deficiências de vitamina D têm sido relacionadas com o mau funcionamento do sistema dopaminérgico (Kesby et al, 2011;Cui et al, 2015). Embora os estudos indiquem que há uma relação entre a vitamina D ou seu receptor (VDR, vitamin D receptor) com a formação e funcionamento dos neurônios dopaminérgicos, esta não está ainda bem estabelecida (Orme et al, 2013; Cui et al, 2013; Cui et al, 2015). Recentemente, estudos avaliando alterações no padrão de sono em humanos têm revelado uma associação entre o déficit de vitamina D e os distúrbios de sono como a hipersonolência e a SAOS (Andersen et al, 2012; Bozkurt et al, 2012; Mete et al, 2013; McCarty et al, 2014; Evatt, 2015; Kerley et al, 2015; de Oliveira et al,

2015). Nenhum trabalho, no entanto, verificou a relação entre a vitamina D e o BS até o presente momento. Estudos com antagonistas e agonistas dopaminérgicos indicam que este sistema tem um papel importante na gênese do bruxismo (Falisi et al, 2014). Distúrbios do sistema dopaminérgico são frequentemente relacionados ao BS (Lobbezoo et al, 1997a; Lobbezoo et al, 1997b; Chen et al, 2005) bem como podem ser induzidos farmacologicamente por agonistas e antagonistas dopaminérgicos (Falisi et al, 2014). Mais uma evidência desta associação foi demonstrada por meio de um aumento no nível de catecolaminas, incluindo a dopamina, a adrenalina e noradrenalina na urina de indivíduos com BS quando comparado a indivíduos controles (Seradairan et al, 2009). Sabe-se que a nicotina pode aumentar a liberação de dopamina (Ohmoto et al, 2014) por meio de um aumento na transmissão sináptica de acetilcolina e glutamato (Li et al, 2008). Estudos com gêmeos monozigóticos e dizigóticos demonstraram uma associação de dose- resposta entre o uso de nicotina e o BS (Rintakoski et al 2010a), além de relacionar a dependência da nicotina a uma maior predisposição ao BS (Rintakoski et al, 2010b). Mesmo o fumante passivo parece estar mais predisposto ao BS (Montaldo et al, 2012). Advindo da análise em nível de genes, o gene KIF1BP situado na região 10q22.1 parece ter uma ação no desenvolvimento do SNC como proteína participante na formação dos microtúbulos formadores do citoesqueleto, interagindo com a actina. Quando mutações acontecem, distúrbios na formação principalmente de estruturas nervosas como axônios e dendritos resultam, por exemplo, na síndrome de Goldberg–Shprintzen, síndrome rara caracterizada por craniostoses e outras deformidades esqueléticas além de déficit cognitivo (Drévillon et al, 2013). O gene ZNF202 localizado na região 11q24, resultante da análise de genes, foi associado por meio de um GWAS a distúrbios de movimento de origem extrapiramidal ocasionado por efeitos adversos em tratamentos com antipsicóticos. O ZNF202 é conhecido pela sua participação no metabolismo dos lipídios e sua mutação poderia alterar a formação da bainha de mielina sugerindo um mecanismo de ação para esta associação (Aberg et al, 2010). Diferente dos primeiros estudos de caso-controle em genes candidatos que relacionaram alterações genéticas no receptor de serotonina ao BS (Abe et al 2012; Oporto et al, 2016), o presente estudo não encontrou nenhum polimorfismo ou gene

ligado ao sistema serotonérgico embora se reconheça sua possível participação na etiologia do BS (Minakuchi et al, 2016). Além disso, os estudos anteriores tiveram sua amostra direcionada para grupos de conveniência e a investigação direcionada para poucos SNPs diferentemente desta amostra derivada de um estudo em larga escala que avaliou em torno de 700.000 SNPs indistintamente. Outra diferença importante é a utilização em nosso estudo do padrão-ouro para diagnóstico de BS, no caso o exame de polissonografia além de questionários, enquanto nos outros estudos os métodos se restringiram a questionários, exames clínicos e EMG portátil de validade limitada para diagnóstico. Nosso estudo apresenta algumas limitações. O principal achado genética atingiu significância de p=10-6, acima do recomendado, porém com valores de razão de chance (odds ratio) elevado. Isso não nos permite afirmar com 100% de certeza que há um SNP marcador genético do BS, mas sim um forte candidato a marcador. A principal razão desse resultado obtido é o tamanho de nossa amostra. Um total de 643 indivíduos foram examinados sendo 75 com BS e 568 para o grupo controle, algo bastante abaixo para estudos GWAS, os quais usualmente utilizam milhares de casos e controle. A nosso favor está o fato de definirmos com precisão o diagnóstico do BS e o estabelecimento do grupo controle isento de BS. Ambos os grupos foram submetidos ao exame de polissonografia basal, considerado o método padrão-ouro para o diagnóstico do BS, além de 2 questionários relacionados. Agrega-se ainda a metodologia usada para se obtenção de uma amostra aleatória e representativa de uma cidade de grande porte. Por fim, ressaltamos o fato de utilizarmos uma amostra genética colhida e preparada dentro de padrão de qualidade rigoroso e cuja análise foi controlada para elementos confundidores incluindo a ancestralidade, fator importante principalmente por se tratar de uma população altamente miscigenada. Conforme publicado anteriormente (Maluly, et al, 2013), os indivíduos classificados como pertencentes ao grupo de bruxismo do sono não foram examinados clinicamente, limitando informações sobre desgastes dentários e cefaleia matinal transitória, sintomas associados ao bruxismo do sono per se (AASM,2014). Outro fator limitante foi o equipamento usado para a polissonografia não conter áudio e vídeo, conforme recomendação da Academia Americana de Medicina do Sono. Estudo recente apresentou resultados superestimados em 23,8% para BS na ausência de registros de áudio e vídeo (Carra et al, 2015). Além disso, os voluntários foram submetidos a apenas 1 noite de polissonografia, sem

adaptação prévia ao equipamento. Este fato pode aumentar a variabilidade do BS, pois o mesmo apresenta normalmente uma oscilação das frequências dos eventos na ordem de 20 a 25% por hora (Lavigne et al, 2001; Dal-Fabro et al, 2009) Estudos de associação genética identificam genes ou regiões genômicas que contribuem para uma determinada doença por meio de testes que verificam a associação com variações genéticas específicas. Um alelo mais frequente em um SNP em indivíduos afetados por uma doença pode ser interpretado como se esta variante adicionasse um risco maior para esta enfermidade específica (Lewis, Knight, 2012). GWAS é um desenho de estudo genético que se concentra nas associações entre os SNPs, identificando possíveis marcadores para determinadas doenças e enfermidades. Normalmente requerem amostras com um número alto de casos e controles e dependendo do desenho do estudo os valores estatisticamente significantes de p se aproximam de 1,0x10-8. Um dos requisitos para que uma região genômica, um gene ou SNP possa ser considerado associado a uma doença nos estudos GWAS é a replicação de resultados em amostras independentes. Como este é o primeiro estudo que conhecemos de associação com o BS, este segundo passo é um desafio para que esforços multicêntricos possam concretizar estudos semelhantes com outras populações e com um número maior de marcadores confirmando ou não nossos resultados e possivelmente indicar estudos adicionais para que nos aproximemos mais do conhecimento sobre a participação genética no BS. Como cada gene ou SNP identificado pode estar ligado e associado com vários outros genes ou SNPs, entendemos que muitos estudos ainda devem ser realizados antes que possamos nos aproximar de uma completa caracterização dos fatores genéticos do BS. Entendemos a dificuldade de se obter amostras amplas de indivíduos com BS dentro do padrão-ouro de diagnóstico e esperamos a evolução das evidências para que métodos mais simples e de custo menor possam nos oferecer a oportunidade de atingir um número maior de pessoas em nossas pesquisas.

7. CONCLUSÕES

O presente estudo investigou, pela primeira vez, a associação do BS com polimorfismos do tipo SNP, genes relacionados e vias biológicas por meio de associação genética em larga escala. Embora não atingindo o nível de significância esperado, identificamos marcadores genéticos, genes e vias biológicas relevantes para o BS, sendo indicada a realização de replicações técnicas e/ou biológicas posteriores. Nosso estudo, possivelmente, auxiliará a gerar hipóteses para aumentar o conhecimento fisiopatológico deste distúrbio altamente prevalente na população.

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ANEXOS

ANEXO 1: Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo.

ANEXO 2: Artigo em primeira autoria

ANEXO 3: Artigo em colaboração