Estudio De La Diversidad Procariota En Ambientes Salinos Empleando Técnicas Moleculares
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UNIVERSIDAD DE GRANADA Facultad de Farmacia Departamento de Microbiología Estudio de la diversidad procariota en ambientes salinos empleando técnicas moleculares Nahid Oueriaghli Granada, 2013 Editor: Editorial de la Universidad de Granada Autor: Nahid Oueriaghli D.L.: GR 1820-2014 ISBN: 978-84-9083-003-1 UNIVERSIDAD DE GRANADA Facultad de Farmacia Departamento de Microbiología Memoria presentada por la Licenciada en Biotecnologia Dra. Nahid Oueriaghli para aspirar al grado de Doctor Granada, 2013 Vº Bº de los directores Fdo.Dra. Victoria Béjar Luque Fdo. Dr. Fernando Martinez- Checa Barrero Catedrática de Microbiología Profesor Titular de Microbiología Facultad de Farmacia Facultad de Farmacia Universidad de Granada Universidad de Granada La Doctoranda Fdo. Nahid Oueriaghli A mis padres Resumen Los microorganismos son los más abundantes en la Tierra y se encargan de mediar diversos procesos críticos para el medio ambiente. Dado su rol central en procesos ecológicos básicos del ecosistema resulta de gran importancia determinar sus patrones de distribución, su composición poblacional y los factores más relevantes que influyen en la estructura y el funcionamiento de dichas organismos. Actualmente y gracias a la introducción de técnicas de la biología molecular, el estudio de la diversidad microbiana en ambientes naturales ha avanzado enormemente. Estas técnicas han permitido estudiar no sólo la identidad, sino también la actividad y la genómica microbiana. Por otro lado, la utilización de las nuevas técnicas de agrupamiento (FPquest) y ordenación (Canoco) incluyendo los datos de los parámetros ambientales ha permitido analizar y evaluar el impacto de diferentes factores sobre la composición y la estructura de la comunidad microbiana. La utilización en conjunto de ambas metodologías constituye una excelente estrategia para abordar una descripción de la diversidad microbiana en dos niveles de análisis complementario que permiten evidenciar tanto las características más conspicuas como los detalles de la estructura de la comunidad obteniendo, así, una descripción más acabada y fiable de dicha diversidad. En el Capítulo 1 de la presente Tesis Doctoral, se pretende el hallazgo de la diversidad procariota (bacterias, arqueas y Halomonas) en distintos hábitats salinos e hipersalinos de España y Marruecos, empleando técnicas independientes de cultivo, basados en la técnica PCR/DGGE. Durante el desarrollo de este capítulo, incluimos en nuestro trabajo el estudio de un hábitat no salino, un suelo agrícola de la provincia de Granada, que fue estudiado con fines comparativos. Los resultados obtenidos a partir de los perfiles de DGGE indicaron variaciones en la diversidad procariota según el hábitat estudiado y su salinidad, mostrando la existencia de una alta diversidad de bacterias y una diversidad media de arqueas en todos los hábitats analizados. Por otra parte, hemos hallado que los microorganismos más abundantes en el conjunto de los hábitats estudiados pertenecen a los phyla Proteobacteria y Bacteroidetes. Por otro lado, hemos descubierto que los miembros del phylum Euryarchaeota fueron abundantes en todos los ambientes salinos estudiados, siendo el orden Halobacteriales el más dominante. Sin embargo, la comunidad de arqueas hallada en estos suelos agrícolas pertenecían mayoritariamente al phylum Thaumarchaeota y al orden Thermoplasmatales. Respecto a Halomonas, un taxón que se aísla frecuentemente en hábitats salinos y no salinos, se reveló la presencia del mismo en todos los hábitats estudiados excepto en la salina de La Malahá, mostrando asimismo la ubicuidad de dicho género y que la especie más predominante ha sido H. ventosae. I De forma paralela, en el Capítulo 2, se ha llevado a cabo el mismo estudio con más profundidad para describir la diversidad procariota y el efecto de los diferentes parámetros ambientales y temporales que tienen en la misma en Rambla Salada, un ambiente que ha sido estudiado extensamente por nuestro grupo de investigación con métodos clásicos de cultivo. Los resultados de este trabajo indicaron que Rambla Salada resultó altamente sincrónica en cuanto a la variación temporal y a la de los parámetros físico-químicos. Sin embargo, los cambios temporales de la estructura de la comunidad procariota no resultaron concordantes entre las comunidades procariotas halladas en dicho ambiente. Para la comunidad de bacterias, se observó una estrecha relación entre dicha comunidad y la salinidad y el oxígeno, siendo las épocas con concentraciones bajas de salinidad y altas de oxígeno las que presentaron la mayor diversidad. Mientras que para la comunidad de arqueas hallada en este ambiente, ocurrió lo contrario, la mayor diversidad se detectó en la época con mayor concentración de sal. En lo que relaciona la comunidad de Halomonas, los resultados obtenidos demostraron la ubiquidad y la versatilidad de este género, ya que ha sido detectado en todas las zonas y épocas de muestreo, y especialmente con mayor abundancia en la época caracterizada por elevados concentraciones salinas. El análisis de las comunidades procariotas en Rambla Salada, evidenció la predominancia del phylum Bacteroidetes y Proteobacteria. En cuanto a la comunidad de arqueas, las especies del phylum Euryarchaeota, del orden Halobacteriales, han sido las más abundantes. Por otro lado, H. almeriensis y H. ventosae constituyeron los taxa que predominan en la comunidad de Halomonas hallada en Rambla Salada. Finalmente, los resultados de los experimentos realizados con la técnica CARD-FISH cuyo objetivo ha sido cuantificar la comunidad procariota estudiada, revelaron que la comunidad de bacterias representa hasta el 66% de la población total de microorganismos, mientras que las comunidades de arqueas y Halomonas mostraron un 16% y menos del 1% del total de la microbiota hallada en Rambla Salada respectivamente. La biodiversidad procariota encontrada por métodos moleculares fue distinta a la determinada por Luque y col. (2013) empleando métodos tradicionales de cultivo, indicando que, en Rambla Salada existen una serie de filotipos que aún quedan para cultivar. Palabras claves: Hábitats hipersalinos, Rambla Salada, Biodiversidad, PCR/DGGE, CARD- FISH, FPquest, Canoco, Halomonas. II Agradecimientos Primero y antes que nada, dar gracias a Aláh, por ser la fortaleza de mi corazón y la luz de mi mente, por acompañarme y guiarme en cada paso que doy, y por haber puesto en mi camino a las personas que me han acompañado y ayudado durante estos años de trabajo duro. Son muchas las personas que han participado en este trabajo, sobre todo los miembros del grupo de investigación "Exopolisacáridos Microbianos (BIO 188)" de la Facultad de Farmacia de la universidad de Granada, y a quienes quiero expresar mi gratitud por el apoyo y la confianza que me han prestado de forma directa o indirectamente, a la realización de esta tesis doctoral. Quiero expresar mis sinceros agradecimientos a la Dra. Emilia Quesada por haberme dado la oportunidad de trabajar en su grupo de investigación, por confiar en mí como persona para la realización de esta Tesis Doctoral, y por introducirme en el mundo de la biología molecular y del halofilísmo. Me complace agradecer a mis directores de tesis, la Dra. Victoria Béjar y el Dr. Fernando Martínez-Checa, por la paciencia infinita, por los enormes esfuerzos y la dedicación en la dirección y la corrección de esta tesis y por su trato familiar, y por supuesto, quisiera resaltar que, sin ellos, esta tesis nunca hubiese sido posible, por lo tanto quiero decirles en dos palabras, Muchísimas gracias. Agradezco también a la Dra. Inmaculada Llamas por su disponibilidad para escucharme, apoyarme, resolver todas mis dudas, por su amistad y ayuda que no tiene precio. A la Dra. Ana del Moral por sus sugerencias e ideas de las que tanto provecho he sacado, su apoyo e inestimable ayuda en todo momento. III Un especial agradecimiento quiero expresar al Dr. David Porcel por todos sus consejos que me ha ofrecido en lo relacionado con el uso de la Microscopia de Laser Confocal y por haber aceptado formar parte del tribunal de la presente Tesis Doctoral. Me gustaría dar muchísimas gracias a Sami, por ser una parte muy importante de mi vida, por haberme apoyado en las buenas y en las malas, por aguantar mis genios en los momentos de estrés, y sobre todo por su paciencia y amor incompacional. K. B. No puedo olvidar a mis compañeros del laboratorio, los que han pasado y los que continúan (Hakima, Loles, Carmen, Roció, Margarita, Melanie, Sebastián y José), y en especial a mi amigo y compañero del trabajo, A Ali, con el he pasado muchas horas de trabajo, y a quien le quiero decir gracias por los buenos y los difíciles momentos, por aguantarme, y por poder contar contigo cuando lo he necesitado. Quiero agradecer de forma especial a Marta por su apoyo, por el animo y por los enormes mensajes del whatsup, y a ella le quiero decir, Marta, son muy pocas las palabras que he escrito para agradecerte. Quiero expresar mis agradecimientos a Asma y Lamia, las primeras amigas que hice cuando llegue a Granada para realizar mi tesis y con ellas, he pasado los mejores momentos de trabajo y compañía, gracias por vuetra simpatía y cariño, por ayudarme en los momentos de estrés y hacerme amenas las horas de trabajo. A vosotras, mis amigas, las que han compartido conmigo paralelamente este camino (Ikram, Naima, Mirella, Nieve y Sara) y las que se ecuentran lejos (Bahija). Gracias de corazón por vuestra amistad , cariño, apoyo y ánimos. IV La lista de las personas para agradecer es muy larga, porque esta experiencia no habría sido tan agradable sin todas ellas (Belén, Cinta, Kadiya, Patricia, Paula y Vicky) y sus palabras adecuadas cuando se necesita apoyo. A todos los miembros del Departamento de Microbiología de la Facultad de Farmacia por haber compartir conmigo todos estos años, y sobre todo por su amabilidad y simpatía... Por último, y no menos importante, quiero dar las gracias a mi familia, y a mis padres en primer lugar, a pesar de no estar presentes físicamente, se que procuran mi bienestar desde mi país (Marruecos), les quiero agradecer por su cariño, apoyo incondicional y la confianza depositada en mí.