การตรวจเชื้อ Bacillus cereus, Staphylococcus aureus และ Listeria monocytogenes ในน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านม ในพื้นที่จังหวัดนครราชสีมา

นายกิตติศักดิ์ วงศ์อนุ นายณัฐวุฒิ นามสีฐาน นายวิสุทธิ์ ท้าเจริญตระกูล

รายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์นี้เป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรเทคโนโลยีบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีผลิตภัณฑ์นม (ต่อเนื่อง) คณะวิทยาศาสตร์และศิลปศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลอีสาน ปีการศึกษา 2558 การตรวจเชื้อ Bacillus cereus, Staphylococcus aureus และ Listeria monocytogenes ในน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านมในพื้นที่จังหวัดนครราชสีมา

นายกิตติศักดิ์ วงศ์อนุ นายณัฐวุฒิ นามสีฐาน นายวิสุทธิ์ ท้าเจริญตระกูล

รายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์นี้เป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรเทคโนโลยีบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีผลิตภัณฑ์นม (ต่อเนื่อง) คณะวิทยาศาสตร์และศิลปศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลอีสาน ปีการศึกษา 2558 Detection of Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in raw milk from milk collection center of Nakhon Ratchasima province

Kittisak Wongau Natthawut Namsithan Wisut Tromchaintrakool

A Project Report Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Bachelor of Technology Program in Dairy Technology (Continuing Program) Faculty of Sciences and Liberal Arts Rajamangala University of Technology Isan Academic Year 2015 รายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์ การตรวจเชื้อ Bacillus cereus, Staphylococcus aureus และ Listeria monocytogenes ในน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านมในพื้นที่ จังหวัดนครราชสีมา (Detection of Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in raw milk from milk collection center of Nakhon Ratchasima province) นักศึกษา 1. นายกิตติศักดิ์ วงศ์อนุ 2. นายณัฐวุฒิ นามสีฐาน 3. นายวิสุทธิ์ ท้าเจริญตระกูล คณะกรรมการที่ปรึกษา 1. ดร.ชนิดา กุประดิษฐ์ 2. ดร.ศศิธร อินทร์นอก 3. ดร.จิรายุส วรรัตน์โภคา หลักสูตร เทคโนโลยีบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีผลิตภัณฑ์นม (ต่อเนื่อง) สาขาวิชา ชีววิทยาประยุกต์ ปีการศึกษา 2558

สาขาวิชาชีววิทยาประยุกต์ คณะวิทยาศาสตร์และศิลปศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยี ราชมงคลอีสาน อนุมัติให้รายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์นี้เป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาหลักสูตร เทคโนโลยีบัณฑิต

...... (ดร.ศศิธร อินทร์นอก) หัวหน้าสาขาวิชาชีววิทยาประยุกต์ คณะกรรมการสอบรายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์ ………………………….... ประธานกรรมการ (ดร.ชนิดา กุประดิษฐ์) ………………………...… กรรมการ (ดร.ศศิธร อินทร์นอก) ………………………….… กรรมการ (ดร.จิรายุส วรรัตน์โภคา) 24 พฤษภาคม 2559 ลิขสิทธิ์ของสาขาวิชาชีววิทยาประยุกต์ คณะวิทยาศาสตร์และศิลปศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลอีสาน ก

รายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์ การตรวจเชื้อ Bacillus cereus, Staphylococcus aureus และ Listeria monocytogenes ในน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านมในพื้นที่ จังหวัดนครราชสีมา นักศึกษา 1. นายกิตติศักดิ์ วงศ์อนุ 2. นายณัฐวุฒิ นามสีฐาน 3. นายวิสุทธิ์ ท้าเจริญตระกูล คณะกรรมการที่ปรึกษา 1. ดร.ชนิดา กุประดิษฐ์ 2. ดร.ศศิธร อินทร์นอก 3. ดร.จิรายุส วรรัตน์โภคา หลักสูตร เทคโนโลยีบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีผลิตภัณฑ์นม (ต่อเนื่อง) สาขาวิชา ชีววิทยาประยุกต์ ปีการศึกษา 2558

บทคัดย่อ

ในจังหวัดนครราชสีมามีศูนย์รับน้้านมดิบเป็นจ้านวนมาก แต่ยังขาดข้อมูลของการ แยกและคุณลักษณะของเชื้อก่อโรคในน้้านมดิบ ดังนั้นวัตถุประสงค์ในงานวิจัยนี้คือ ส้ารวจความชุก และคุณลักษณะของเชื้อก่อโรค ได้แก่ Bacillus cereus Listeria monocytogenes และ Staphylococcus aureus จากตัวอย่างน้้านมดิบ 33 ตัวอย่างในศูนย์รับน้้านมดิบ 9 แห่งซึ่งตั้งอยู่ใน จังหวัดนครราชสีมา ระหว่างเดือนกุมภาพันธ์ถึงมีนาคม พ.ศ. 2559 ผลการส้ารวจแสดงให้เห็นว่า ไม่ พบการปนเปื้อนของเชื้อ L. monocytogenes ในตัวอย่างน้้านมที่น้ามาทดสอบ และพบว่าความชุก ข อ ง เ ชื้ อ B. cereus แ ล ะ S. aureus คื อ 6% (20 – 2.0 × 104 CFU/ml) แ ล ะ 54% (85 – 2.7 × 104 CFU/ml) ตามล้าดับ เชื้อ B. cereus และ S. aureus ที่แยกได้ ถูกน้าไประบุเชื้อ ด้วยปฏิกิริยาชีวเคมีและมัลติเพลกซ์พีซีอาร์ (m-PCR) ด้วยการใช้ไพร์เมอร์ (primers) ที่จ้าเพาะต่อยีน (gene specific primers) และ 16S rDNA primers โดยยีนเป้าหมายส้าหรับการตรวจเชื้อ S. aureus และ B. cereus คือ eap gene และ Enterotoxin FM gene ตามล้าดับ ผลการทดสอบ พบว่า รูปแบบการเกิดปฏิกิริยาชีวเคมีในแต่ละ isolate มีความแปรผันที่แตกต่างกันเพียงเล็กน้อย อย่างไรก็ตาม พบผลิตภัณฑ์ PCR ขนาด 230 bp จากยีน eap และ 513 bp จากยีน Enterotoxin FM ในเชื้อ S. aureus ทั้ง 27 isolates (จาก 17 ตัวอย่าง) และเชื้อ B. cereus 6 isolates (จาก 2 ตัวอย่าง) ตามล้าดับ การปนเปื้อนของเชื้อก่อโรคเหล่านี้อาจมาจากปัญหาในด้านสุขลักษณะของ ฟาร์มโคนมและศูนย์รับน้้านมดิบในบริเวณนั้น ๆ จากข้อมูลที่ได้ในงานวิจัยนี้ชี้ให้เห็นว่า การบริโภค น้้านมดิบที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื้ออาจเป็นสาเหตุให้เกิดโรคที่เกี่ยวข้องกับเชื้อก่อโรคที่มาจากอาหารได้ ข

ค าส าคัญ: Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, น้้านมดิบ

ค

Project Report Title Detection of Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in raw milk from milk collection center of Nakhon Ratchasima province By 1. Mr.Kittisak Wongau 2. Mr.Natthawut Namsithan 3. Mr.Wisut Tromchaintrakool Project Report Advisor 1. Dr.Chanida Kupradit 2. Dr.Sasidhorn Innok 3. Dr.Jirayus Woraratphoka Program Dairy Technology (Continuing Program) Department Applied Biology Academic Year 2015

Abstract

There are numerous numbers of raw milk collection centers in Nakhon Ratchasima but lack information of the isolation and characterization of foodborne pathogens in raw milk. Therefore, the purpose of this research was to investigate the prevalence and characterization of foodborne pathogens include Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus from 33 raw milk samples of 9 different raw milk collection centers located in Nakhon Ratchasima between February and March 2016. The contaminations of L. monocytogenes were not detected in any of the raw milk sample tested. The prevalence of B. cereus and S. aureus in raw milk samples were found to be 6% (20 – 2.0 × 104 CFU/ml) and 54% (85 – 2.7 × 104 CFU/ml), respectively. Several isolates of B. cereus and S. aureus were identified by biochemical reactions and multiplex polymerase chain reaction (m-PCR) using gene specific and 16S rDNA primers. The target genes for specific detection of S. aureus and B. cereus were eap gene and Enterotoxin FM gene, respectively. Minor variation of biochemical profiles were found among isolates. However, the PCR products of 230 bp from eap gene and 513 bp from Enterotoxin FM gene were observed from 27 isolates of S. aureus (from 17 samples) and 6 isolates of B. cereus (from 2 samples), respectively. The contamination of these pathogens should be the sanitation problems in dairy farms and raw milk collection centers in those areas. Based on the results obtained from these investigations, consumption of unpasteurized raw milk might be cause of human foodborne disease.

Key Words: Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, raw milk

ง

กิตติกรรมประกาศ

โครงงานวิทยาศาสตร์ที่นักศึกษาท้าการศึกษาค้นคว้าทดลองครั้งนี้ ได้รับการสนับสนุน ให้ค้าปรึกษา ให้การอนุเคราะห์ด้านวัสดุอุปกรณ์ และสถานที่ปฏิบัติงาน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ดร. ชนิดา กุประดิษฐ์ ดร. ศศิธร อินทร์นอก และดร. จิรายุส วรรัตน์โภคา ที่ให้ค้าปรึกษาระหว่างการ ทดลอง การแก้ปัญหาอุปสรรคต่าง ๆ ข้อชี้แนะและความช่วยเหลือ จนกระทั่งโครงงานส้าเร็จลุล่วงไป ได้ด้วยดี คณะผู้จัดท้าขอกราบขอบพระคุณอย่างสูงมา ณ ที่นี้ ขอกราบขอบพระคุณอาจารย์ที่ปรึกษา ที่ให้ความกรุณาในการแก้ไขข้อบกพร่องต่างๆ ของ โครงงานและให้ความรู้ ให้ค้าแนะน้าทั้งก้าลังใจ ท้ายสุดนี้คณะผู้จัดท้าหวังเป็นอย่างยิ่งว่า ข้อมูลในโครงงานนี้จะเป็นประโยชน์ต่อการศึกษา และผู้ที่สนใจต่อไป

กิตติศักดิ์ วงศ์อนุ ณัฐวุฒิ นามสีฐาน วิสุทธิ์ ท้าเจริญตระกูล

จ

สารบัญ

เรื่อง หน้า บทคัดย่อภาษาไทย ก บทคัดย่อภาษาอังกฤษ ค กิตติกรรมประกาศ ง สารบัญ จ สารบัญรูปภาพ ช สารบัญตาราง ซ บทที่ 1 บทน า 1 1.1 ที่มาและความส าคัญ 1 1.2 วัตถุประสงค์ 3 1.3 ขอบเขตของการวิจัย 3 1.4 ประโยชน์ที่คาดว่าจะได้รับจากการวิจัย 3 บทที่ 2 ทฤษฎีและงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง 4 2.1 ส่วนประกอบของนม 4 2.2 จุลินทรีย์ก่อโรคในอาหาร 5 2.3 มาตรฐานฟาร์มโคนม 12 2.4 งานวิจัยที่เกี่ยวข้อง 13 บทที่ 3 วิธีด าเนินการวิจัย 14 3.1 วัสดุและสารเคมีที่ใช้ในการวิจัย 14 3.2 อุปกรณ์และเครื่องมือที่ใช้ในงานวิจัย 15 3.3 วิธีการทดลอง 16 3.3.1 การเก็บตัวอย่าง 16 3.3.2 การตรวจสอบคุณภาพน้ านมดิบเบื้องต้น 17 3.3.3 การตรวจสอบการปนเปื้อนของเชื้อก่อโรค 17 3.3.4 การระบุตัวอย่างด้วยเทคนิค PCR 19 บทที่ 4 ผลการทดลอง 22 4.1 การตรวจสอบคุณภาพน้ านมเบื้องต้น 22 4.2 การตรวจสอบคุณสมบัติของเชื้อก่อโรคที่ทดสอบ 24 4.3 การระบุเชื้อด้วยเทคนิค PCR 37 ฉ

สารบัญ (ต่อ)

เรื่อง หน้า บทที่ 5 สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง 40 5.1 วิจารณ์ 40 5.2 สรุปผลการทดลอง 41 บรรณานุกรม ภาคผนวก ภาคผนวก A สีย้อมสารเคมีทดสอบ และอาหาร 44 ภาคผนวก B วิธีการทดสอบลักษณะทางสัณฐานวิทยาและคุณสมบัติการเกิด ปฏิกิริยาชีวเคมี 49

ช

สารบัญรูปภาพ

รูปภาพที่ หน้า ภาพที่ 2.1 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื้อ S. aureus 5 ภาพที่ 2.2 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื้อ B. cereus 7 ภาพที่ 2.3 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื้อ L. monocytogenes 8 ภาพที่ 2.4 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื้อ Salmonella spp. 9 ภาพที่ 2.5 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื้อ E. coli 11 ภาพที่ 4.1 ลักษณะโคโลนีของเชื้อ S. aureus บนอาหารวุ้น Baird Parker agar 25 ภาพที่ 4.2 การทดสอบ coagulase test ของเชื้อ S.aureus บนอาหาร Baird Parker agar ที่มี fibrinogen plasma trypsin inhibitor suppelment 25 ภาพที่ 4.3 ลักษณะโคโลนีเชื้อ B. cereus และเชื้อ isolate อื่น ๆ ที่แยกได้จาก ตัวอย่างน้ านมดิบบนอาหาร MYP agar 27 ภาพที่ 4.4 การเจริญเป็นแบบ galaxy shape บนอาหารวุ้น NA ที่อุณหภูมิ 30ºC เป็นเวลา 7 วัน 28 ภาพที่ 4.5 ลักษณะโคโลนีเชื้อ isolate อื่น ๆ ที่แยกได้จากตัวอย่างน้ านมดิบ บนอาหาร PALCAM agar 30 ภาพที่ 4.6 การเพิ่มปริมาณยีน eap ด้วยปฏิกิริยา multiplex PCR โดยใช้ SA_eap primers และ 16S rDNA primers 38 ภาพที่ 4.7 การเพิ่มปริมาณยีน Enterotoxin FM ด้วยปฏิกิริยา multiplex PCR โดยใช้ Ent_FM primers และ 16S rDNA primers 39

ซ

สารบัญตาราง

ตางรางที่ หน้า ตารางที่ 3.1 ข้อมูลศูนย์รับน้ านมดิบที่ท าการเก็บตัวอย่างในพื้นที่จังหวัดนครราชสีมา 16 ตารางที่ 3.2 Primers ที่ใช้ในการระบุเชื้อด้วยเทคนิค m-PCR 21 ตารางที่ 4.1 ผลการตรวจสอบคุณภาพน้ านมดิบ 22 ตารางที่ 4.2 คุณสมบัติของเชื้อ S. aureus ที่แยกได้จากตัวอย่างน้ านมดิบจากศูนย์รับน้ านมดิบพื้นที่ จังหวัดนครราชสีมา 31 ตารางที่ 4.3 คุณสมบัติของเชื้อ B. cereus ที่แยกได้จากตัวอย่างน้ านมดิบจากศูนย์รับน้ านมดิบพื้นที่ จังหวัดนครราชสีมา 34

บทที่ 1 บทน ำ 1.1 ที่มำและควำมส ำคัญ ในปัจจุบันมีการบริโภคน ้านม และผลิตภัณฑ์นมอย่างแพร่หลาย ซึ่งนมเป็นอาหารธรรมชาติที่มี ความสมบูรณ์และมีคุณค่าทางโภชนาการสูง อุดมด้วยแร่ธาตุอาหารครบทุกหมู่ ได้แก่ โปรตีน วิตามิน เกลือแร่ คาร์โบไฮเดรต และไขมัน ซึ่งมีความส้าคัญ และเป็นประโยชน์ต่อร่างกายท้าให้นมเป็นอาหาร ที่มีความจ้าเป็น และมีความต้องการจากกลุ่มผู้บริโภคสูง น ้านมที่บริโภคควรจะเป็นน ้านมที่ปลอดเชื อ โดยผ่านกระบวนการฆ่าเชื อด้วยวิธีต่าง ๆ เพื่อความปลอดภัยของผู้บริโภค อย่างไรก็ตาม น ้านมที่บริโภคอาจปนเปื้อนด้วยจุลินทรีย์ แม้ว่าในน ้านมจะมีสารป้องกันจุลินทรีย์ ตามธรรมชาติเพื่อมิให้เกิดการติดเชื อของเต้านม แต่สารเหล่านี มีอยู่เพียงเล็กน้อยไม่สามารถเป็น หลักประกันคุณภาพ และความปลอดภัยให้แก่น ้านมได้ จุลินทรีย์ที่มีการปนเปื้อนในนมได้แก่ แบคทีเรีย ยีสต์ รา และไวรัส โดยเฉพาะอย่างยิ่งแบคทีเรีย ซึ่งก่อให้เกิดโรคอาหารเป็นพิษ ซึ่งสามารถ จ้าแนกได้เป็น 2 กลุ่มตามคุณสมบัติขององค์ประกอบของผนังเซลล์ คือ กลุ่มที่ 1 แบ คที เรียแกรมบ วก ได้แก่ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens และ Listeria monocytogenes เป็นต้น กลุ่มที่ 2 แบคทีเรียแกรมลบ ได้แก่ Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Vibrio gastroenteritis, Yersinia enterocolitica และ Campylobacter jejuni เป็นต้น กำรติดเชื้อในฟำร์มโคนมหรือศูนย์รับน้ ำนมดิบ การตรวจสอบคุณภาพน ้านมดิบ เป็นวิธีที่ใช้ทดสอบว่าคุณภาพน ้านมดิบที่ผลิตได้จากฟาร์ม โคนมมีคุณภาพดีหรือไม่ ก่อนน้าไปแปรรูปเป็นผลิตภัณฑ์ส้าหรับบริโภคต่อไป โดยท้าการตรวจสอบใน ห้องปฏิบัติการของศูนย์รวมน ้านมดิบของสหกรณ์หรือบริษัทเอกชน ซึ่งเป็นการคัดกรองน ้านมดิบ คุณภาพดี และยังผลต่อราคาน ้านมดิบที่เหมาะสม นอกจากนี ผลที่ได้จากการตรวจสอบยังสามารถใช้ ในการเฝ้าระวังปัญหาการผลิตน ้านมดิบคุณภาพต่้ากว่าเกณฑ์มาตรฐานในระดับฟาร์ม ซึ่งน้าไปสู่ กระบวนการหาแนวทางแก้ไข และป้องกันต่อไปในอนาคต เพื่อประโยชน์สูงสุดส้าหรับเกษตรกรผู้ เลี ยงโคนม และผู้เกี่ยวข้องอื่นโดยเฉพาะผู้บริโภค เชื อจุลินทรีย์ก่อโรคในอาหารที่ก่อให้เกิดปัญหาได้บ่อยในระบบสาธารณสุขของไทย ได้แก่ B. cereus, S. aureus และ Salmonella spp. (จิราภรณ์ และนภสร, 2549) อาจพบการ ปนเปื้อนของเชื อเหล่านี ได้ในอาหารทั่วไป เช่น ผัก เนื อสัตว์ต่าง ๆ ผลิตภัณฑ์จ้าพวกนม และอาหาร ปรุงส้าเร็จบางชนิด หากรับประทานอาหารที่ปนเปื้อนเชื อจุลินทรีย์เหล่านี เข้าไปอาจท้าให้เกิดอาการ อาหารเป็นพิษ เกิดท้องร่วงรุนแรง คลื่นไส้อาเจียน และปวดท้องได้ นอกจากนี ยังเป็นดัชนีตัวหนึ่งที่ 2

แสดงถึงความปลอดภัยของอาหารอีกด้วย (สาวิตรี, 2549) ส้าหรับเชื อ S. aureus เป็นแบคทีเรียแก รมบวกทรงกลมสามารถพบได้ในอาหารจ้าพวกเนื อสัตว์ต่าง ๆ ไข่ และผลิตภัณฑ์จ้าพวกนม โดยเชื อ S. aureus จะสร้างสาร enterotoxin ปนเปื้อนในอาหารหากรับประทานเข้าไปจะท้าให้เกิดอาการ อาหารเป็นพิษเกิดท้องร่วงรุนแรง คลื่นไส้ อาเจียน และปวดท้อง ส่วน B. cereus เป็นแบคทีเรีย แกรมบวกลักษณะเซลล์เป็นท่อน พบได้ทั่วไปตามธรรมชาติ มักพบปนเปื้อนในอาหารจ้าพวกนม ไข่ และอาจพบได้ในอาหารปรุงส้าเร็จ เช่น ข้าวผัด ไอศกรีม และซอส เป็นต้น ส้าหรับ L. monocytogenes เป็นเชื อแบคทีเรียแกรมบวก รูปท่อน สามารถพบได้ทั่วไปในดิน น ้า มูลสัตว์ปีก และสัตว์กีบคู่ น ้านมดิบ และอาหารที่ประกอบจากน ้านมดิบ หากรับประทานอาหารที่มีการปนเปื้อน เชื อเข้าไปจะมีอาการคล้ายไข้หวัดคือ เป็นไข้หนาวสั่น ปวดศีรษะ ปวดกล้ามเนื อ คอแข็ง สับสนอ่อน แรง อาเจียน อาจมีอุจจาระร่วง ติดเชื อในกระแสเลือด และเยื่อหุ้มสมองอักเสบ ส้าหรับพื นที่จังหวัดนครราชสีมามีศูนย์รับน ้านมดิบอยู่มากกว่า 30 แห่งประกอบไปด้วยศูนย์รับ น ้านมขนาดเล็กไปจนถึงศูนย์รับน ้านมขนาดใหญ่ ซึ่งอาจพบการปนปื้อนของแบคทีเรียได้ตั งแต่ใน ฟาร์มโคนมจนกระทั่งถึงการขนส่งน ้านมดิบไปยังศูนย์รับน ้านมซึ่งศูนย์รับน ้านมดิบ แต่ละแห่งจะมี ระบบเก็บน ้านมดิบ ก่อนที่จะกระจายขนส่งไปยังโรงงานแปรรูปน ้านมต่าง ๆ ดังนั นการดูแลรักษา ความสะอาดในการผลิต การบรรจุ เก็บรักษาน ้านมดิบจนถึงขั นการเคลื่อนย้ายน ้านม ต้องเข้มงวด และเน้นในเรื่องความปลอดภัยเป็นส้าคัญโดยรัฐบาลได้ออกกฎหมายควบคุม และมีมาตรฐานส้าหรับ อาหารประเภทนี โดยเฉพาะ ดังนั นเพื่อไม่ให้น ้านมเป็นแหล่งของการแพร่กระจายของเชื อแบคทีเรีย ก่อโรคจากศูนย์รับน ้านมดิบไปยังโรงงานแปรรูปน ้านม จึงควรมีการส้ารวจการปนเปื้อนของเชื อก่อโรค ในน ้านมดิบจากศูนย์รับน ้านมดิบ เพื่อเป็นข้อมูลซึ่งแสดงถึงคุณภาพการจัดการฟาร์มในท้องที่นั น ๆ และกระบวนการเก็บน ้านมดิบในศูนย์รับน ้านมดิบก่อนกระจายสู่โรงงานแปรรูปนม อย่างไรก็ตามศูนย์รับน ้านมดิบในจังหวัดนครราชสีมา ยังไม่พบการรายงานข้อมูลที่สามารถ สืบค้นได้ซึ่งเกี่ยวข้องกับการส้ารวจการปนเปื้อนของเชื อแบคทีเรียก่อโรคในน ้านมดิบจากศูนย์ต่างๆ ดังนั นการศึกษานี จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบแบคทีเรียก่อโรคกลุ่มแกรมบวก 3 ชนิด ได้แก่ S. aureus, B. cereus และ L. monocytogenes ซึ่งเป็นเชื อที่ควบคุมไม่ให้มีการปนเปื้อนในนมและ ผลิตภัณฑ์นม โดยเชื ออาจมีการปนเปื้อนขณะขนส่งจากฟาร์มโคนมมายังศูนย์รับน ้านมดิบท้าให้อาจ แพร่กระจายไปยังโรงงานแปรรูปผลิตภัณฑ์นมได้

3

1.2 วัตถุประสงค์ 1) เพื่อตรวจการปนเปื้อนของเชื อ B. cereus, S. aureus และ L. monocytogenes ในน ้านม ดิบจากศูนย์รับน ้านมดิบในพื นที่จังหวัดนครราชสีมา 2) เพื่อตรวจสอบความชุกของเชื อ B. cereus, S. aureus และ L. monocytogenes ในศูนย์ รับน ้านมดิบพื นที่จังหวัดนครราชสีมาช่วงระหว่างเดือนกุมภาพันธ์ พ.ศ. 2559 – เดือนมีนาคม พ.ศ. 2559 1.3 ขอบเขตของกำรวิจัย 1) เก็บตัวอย่างน ้านมดิบ โดยจะท้าการสุ่มเก็บตัวอย่างจากศูนย์รับน ้านมหรือสหกรณ์โคนม ใน อ้าเภอต่าง ๆ ของจังหวัดนครราชสีมา ได้แก่ อ้าเภอเมือง อ้าเภอพิมาย อ้าเภอชุมพวง อ้าเภอปากช่อง อ้าเภอเสิงสาง อ้าเภอปักธงชัย อ้าเภอขามสะแกแสง และอ้าเภอสีคิ ว โดยจะมีการเก็บตัวอย่างทั งหมด 8–9 แห่ง แห่งละ 1- 4 ครั ง เพื่อน้าไปตรวจสอบคุณภาพน ้านมดิบเบื องต้นและการปนเปื้อนเชื อก่อ โรค 2) ตรวจสอบคุณภาพน ้านมดิบในเบื องต้น ได้แก่ ค่า pH, สี และปริมาณเชื อทั งหมด 3) ตรวจสอบความชุกของการปนเปื้อนเชื อ B. cereus, S. aureus และ L. monocytogenes ที่ พบในศูนย์รับน ้านมดิบจากแต่ละแห่งในช่วงเดือนกุมภาพันธ์ พ.ศ. 2559 – เดือนมีนาคม พ.ศ. 2559 1.4 ประโยชน์ที่คำดว่ำจะได้รับจำกกำรวิจัย 1) ทราบข้อมูลความชุก และการปนเปื้อนของเชื อแบคทีเรียก่อโรค B. cereus, S. aureus และ L. monocytogenes ในน ้านมดิบ ระหว่างช่วงเดือนกุมภาพันธ์ พ.ศ. 2559 – เดือนมีนาคม พ.ศ. 2559 2) สามารถน้าข้อมูลที่ได้ไปใช้ประกอบการดูแลรักษาฟาร์ม และหาแนวทางลดหรือป้องกันการ แพร่กระจายของเชื อก่อโรคในพื นที่ที่มีความชุกสูง โดยอาศัยแนวโน้มจากข้อมูลในช่วงเวลาดังกล่าว

บทที่ 2 ทฤษฎีและงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง 2.1 ส่วนประกอบของนม นมเป็นอาหารธรรมชาติที่มีความสมบูรณ์ และมีคุณค่าทางโภชนาการสูง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ประกอบด้วยน ้าตาลนมหรือแล็กโทส (Lactose) และโปรตีนที่เรียกว่า เคซีน (casein) ซึ่งพบในน ้านม เท่านั น นมจึงมีความส้าคัญอย่างยิ่งในการพัฒนาร่างกาย และสมองของเด็ก และเยาวชน นมมี ส่วนประกอบดังนี 1) น ้า เป็นสื่อกลางในการช่วยละลายสารอาหารหลายชนิด ท้าให้สะดวกในการบริโภค โดยเฉพาะเด็กอ่อนหรือทารกที่ยังไม่มีฟันเคี ยวอาหาร 2) ไขมัน ตามปกติเรียกไขมันจากน ้านมว่า มันเนย เป็นส่วนประกอบที่ส้าคัญทางโภชนาการ และเศรษฐกิจ ให้พลังงานตลอดจนสารอาหาร และวิตามินเอ ดี อี และเค นอกจากนี ยังเป็นปัจจัยที่ ส้าคัญใช้ในการก้าหนดราคาซื อขายน ้านมดิบเพราะสามารถน้าไปใช้ในอุตสาหกรรมนมได้ นอกจากนี นมยังให้ไขมันเพียงเล็กน้อยเมื่อเทียบกับขนมปัง นมผงถั่วเหลือง หรือเนื อ การดื่มนมจึงไม่ท้าให้อ้วน 3) โปรตีนในน ้านมเกือบทั งหมดประกอบด้วยสารอาหารโปรตีนที่เรียกว่า เคซีนโกลบุ ลิน (globulin) อัลบูมิน (albumin) ในปริมาณค่อนข้างสูง และมีกรดอะมิโน (amino acid) อยู่ 19 ชนิด ซึ่งมีประโยชน์ต่อการสร้างเนื อเยื่อ เลือด และกระดูก นอกจากนี ยังมีเอนไซม์ชนิดต่าง ๆ อีกด้วย 4) สารประกอบที่มีไนโตรเจน ตามปกตินมจะมีแร่ธาตุไนโตรเจนอยู่ประมาณร้อยละ 0.5 เท่านัน 5) แล็กโทส เมื่อถูกย่อยแล้วจะกลายเป็นกลูโคส (glucose) และกาแล็กโทส (galactose) น ้าตาลกาแล็กโทสนี เป็นส่วนประกอบของซีรีโบรไซด์ (cerebroside) ซึ่งพบมากในเยื่อหุ้มสมอง และ เยื อหุ้มประสาท ดังนั นทารก และเด็กจึงมีความต้องการแล็กโทสเพื่อน้าไปใช้ในการเจริญเติบโตของ สมอง 6) วิตามินในนมมีวิตามินเอ บี1 บี2 บีรวม บี6 บี12 ซี และดี ซึ่งช่วยป้องกันโรคลักปิดลักเปิด อัมพาต โรคผิวหนัง โรคล้าไส้ และโรคฟันผุ เป็นต้น 7) แร่ธาตุในน ้านม มีลักษณะเป็นเถ้า ประกอบด้วยโพแทสเซียม แคลเซียม โซเดียม แมกนีเซียม ฟอสฟอรัส คลอไรด์ ซิเทรต เหล็ก ทองแดง และไอโอดีน นอกจากน ้านมจะเป็นแหล่งที่อุดมไปด้วยแร่ธาตุ และสารอาหารต่าง ๆ ที่ส้าคัญต่อการ เจริญเติบโตแล้ว นมยังเป็นแหล่งอาหารของจุลินทรีย์ด้วยเนื่องจากมีน ้าตาลและโปรตีนที่จุลินทรีย์ สามารถใช้ได้ ดังนั นนมจึงอาจเป็นแหล่งของจุลินทรีย์ต่าง ๆ ที่เจริญได้รวมทั งจุลินทรีย์ก่อโรคด้วย

5

2.2 จุลินทรีย์ก่อโรคในอาหาร จุลินทรีย์ก่อโรคในอาหารเป็นสาเหตุส้าคัญของโรคอาหารเป็นพิษมีสาเหตุส้าคัญจากการ ปนเปื้อนของเชื อแบคทีเรียในอาหาร ความรุนแรงของโรคขึ นอยู่กับปริมาณของเชื อ และชนิดของ สารพิษที่เชื อขับออกมา เมื่อมีอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการเจริญของเชื อแบคทีเรียในอาหารจะท้าให้ เชื อสามารถแบ่งตัวเพิ่มจ้านวน และผลิตสารพิษได้อย่างรวดเร็วจนมีปริมาณมากพอที่จะท้าให้เกิด อาการป่วยได้ ตัวอย่างเชื อที่เป็นสาเหตุส้าคัญ ได้แก่ 2.2.1 Staphylococcus aureus (ภาพที่ 2.1) เป็นแบคทีเรียแกรมบวกเมื่อส่องภายใต้กล้อง จุลทรรศน์พบโครงสร้างเซลล์มีรูปร่างกลม มักพบเป็นคู่เกาะกันด้วยสายสั น ๆ เป็นกิ่ง หรือเป็น ลักษณะพวงองุ่น บางสายพันธุ์สามารถสร้างสารพิษที่เป็นโปรตีนซึ่งทนต่อความร้อนได้ดี และเป็น สาเหตุให้เกิดอาการเจ็บป่วยในมนุษย์ซึ่งโรคอาหารเป็นพิษจากเชื อ Staphylococcus นั นมีชื่อเรียก คือ Staphyloenterotoxicosis และ Staphyloenterotoxemia

ภาพที่ 2.1 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื อ S. aureus ที่มา : http://www.foodnetworksolution.com/wiki/word/1197/staphylococcus-aureus 2.2.1.1 แหล่งที่พบและสาเหตุการเกิดโรค เชื อ S. aureus ที่แพร่กระจายทั่วไป อาจ เป็นสาเหตุให้เกิดการปนเปื้อนในตัวอย่างจ้านวนมากได้ เชื อจะมีชีวิตอยู่ในอากาศ ฝุ่นละออง ขยะมูล ฝอย น ้า อาหาร หรืออาหารบรรจุเสร็จ สภาวะแวดล้อมภายนอกมนุษย์และสัตว์ ซึ่งมนุษย์และสัตว์ นั นเป็นแหล่งปฐมภูมิของเชื อชนิดนี โดยจะพบอยู่ตามระบบทางเดินหายใจ ล้าคอ เส้นผม และผิวหนัง อาจพบเชื อชนิดนี ได้ถึง 60-80% ในผู้ที่สัมผัสโดยตรงกับผู้ป่วยหรือผู้ที่สัมผัสกับสภาพแวดล้อมใน โรงพยาบาล ตลอดจนผู้ประกอบอาหาร รวมไปถึงขั นตอนของการบรรจุและสภาพแวดล้อมภาย นอกนั นก็เป็นสาเหตุส่วนใหญ่ที่ท้าให้เกิดการปนเปื้อน สิ่งที่ต้องค้านึงถึงอีกอย่างหนึ่ง คือการเก็บ 6

อาหารไว้ในอุณหภูมิที่ไม่เหมาะสมเป็นผลให้อาหารที่มีการปนเปื้อนอยู่ แล้วมีการเพิ่มจ้านวนของเชื อ และสร้างสารพิษอย่างรวดเร็ว 2.2.1.2 อาการของโรค ลักษณะอาการที่บ่งบอกว่าติดเชื อ S. aureus นั นจะแสดงให้ เห็นอย่างรวดเร็ว และรุนแรงในหลาย ๆ กรณี โดยทั งนี จะขึ นอยู่กับสภาพความต้านทานสารพิษของ ร่างกาย ปริมาณการปนเปื้อนของเชื อในอาหาร และปริมาณสารพิษที่เชื อสร้างขึ นในอาหาร รวมทั ง สภาพร่างกายโดยทั่วไปของผู้ที่ได้รับเชื อด้วย อาการทั่วไปที่พบ คือ หลังจากรับประทานอาหารที่ ปนเปื้อนเข้าไปประมาณ 2-4 ชั่วโมง ผู้ป่วยจะมีอาการคลื่นไส้ อาเจียน วิงเวียนเป็นตะคริวในช่องท้อง และอ่อนเพลีย ในผู้ป่วยบางรายอาจมีอาการอื่นแทรกซ้อน เช่น ภาวะขาดน ้าอย่างรุนแรง ปวดหัว เป็นตะคริวที่กล้ามเนื อ และมีการเปลี่ยนแปลงความดันโลหิตเป็นระยะ ๆ รวมทั งอาจมีการเต้นของ ชีพจรผิดปกติซึ่งโดยทั่วไปอาการจะดีขึ นภายใน 2-3 วัน 2.2.1.3 การป้องกัน สามารถท้าได้โดยอบรมให้ผู้ประกอบอาหารมีความรู้ และเห็นถึง ความส้าคัญของการรักษาความสะอาดในขณะปรุงอาหารเพื่อเป็นการลดโอกาสในการปนเปื้อนของ เชื อ ส่วนในการบริโภคนั นให้รับประทานอาหารที่ปรุงสุกใหม่ ๆ หรือน้าอาหารที่ปรุงส้าเร็จแล้วไปเก็บ ที่อุณหภูมิต่้าเพียงพออย่างรวดเร็วหากยังไม่รับประทานในทันที เพื่อป้องกันการเจริญของเชื อ และอุ่น อาหารให้ร้อนก่อนรับประทานทุกครั ง 2.2.1.4 มาตรฐานอาหารด้านจุลินทรีย์ที่ท าให้เกิดโรค ค่ามาตรฐานที่ก้าหนดส้าหรับ การตรวจการปนเปื้อนของแบคทีเรียในผลิตภัณฑ์นมพร้อมบริโภคชนิดเหลวที่ผ่านกรรมวิธีการฆ่าเชื อ ด้วยความร้อนโดยวิธีพาสเจอร์ไรส์ ได้แก่ นมโค นมปรุงแต่ง ผลิตภัณฑ์นม และผลิตภัณฑ์ที่ผลิตจาก นมของสัตว์อื่นที่มิใช่นมของโค ตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข พ.ศ. 2543-2545 ก้าหนดให้ ต้อง ไม่พบเชื อ S. aureus ในตัวอย่าง 0.1 มิลลิลิตร ซึ่งการตรวจเชื อชนิดนี ก้าหนดให้ใช้วิธีวิเคราะห์ จุลินทรีย์ที่ท้าให้เกิดโรค ตามวิธี Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online U.S. food and Drug Administration ที่เป็นปัจจุบันหรือวิธีที่มีความถูกต้องเทียบเท่า 2.2.1 Bacillus cereus (ภาพที่ 2.2) เป็นแบคทีเรียแกรมบวก สามารถสร้างสปอร์ได้ทั งในที่ที่ มีออกซิเจนและไม่มีออกซิเจน เซลล์มีลักษณะเป็นแท่งขนาดใหญ่ และ sporangium ในสปอร์จะไม่ บวม ลักษณะพิเศษเหล่านี รวมถึงลักษณะส้าคัญทางชีวเคมีและการวิเคราะห์การเคลื่อนไหวสามารถใช้ บอกความแตกต่างและยืนยันลักษณะเฉพาะของ B. cereus ได้ 7

ภาพที่ 2.2 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื อ B. cereus ที่มา : http://footage.framepool.com/en/shot/571359986-bacterial-infection-bacterial- multiplication-bacillus-anthracis-bacillus-cereus 2.2.2.1 แหล่งที่พบและสาเหตุการเกิดโรค เชื อ B.cereus สามารถพบได้ในอาหารทั่วไป ตัวอย่าง เช่น เนื อสัตว์ นม ผัก ท้าให้เกิดอาการท้องร่วงจากอาหารเป็นพิษ การระบาดของอาหารที่ท้า ให้เกิดโรคโดยทั่วไปจะเกิดจากผลิตภัณฑ์จากข้าว และอาหารจ้าพวกแป้งอื่น ๆ เช่น มันฝรั่ง พาสต้า และผลิตภัณฑ์เนยแข็ง รวมทั งอาหารปรุงแต่ง เช่น ซอส พุดดิ ง ซุป ลูกชิ น พาย และสลัด 2.2.2.2 อาการของโรค อาการที่เกิดเหมือนกับอาการท้องร่วงที่เกิดจากการได้รับเชื อ Clostridium perfringens คือ ถ่ายอุจจาระเป็นน ้า มีอาการปวดเกร็งที่ช่องท้อง ซึ่งจะเกิดภายใน 6-15 ชั่วโมง หลังจากบริโภคอาหารที่มีการปนเปื้อน อาจมีอาการคลื่นไส้พร้อม ๆ กับปวดท้องแต่ อาการอาเจียนเกิดขึ นไม่บ่อยนักอาการของโรคจะยังคงอยู่นานที่สุด 24 ชั่วโมง อาหารเป็นพิษชนิดที่ ท้าให้เกิดอาการอาเจียนจะมีลักษณะเฉพาะ คือ มีอาการคลื่นไส้ และอาเจียนภายในเวลา 5-6 ชั่วโมง หลังจากบริโภคอาหารที่มีการปนเปื้อน 2.2.2.3 การป้องกัน ท้าได้โดยการเก็บอาหารที่ปรุงเสร็จแล้วไว้ที่อุณหภูมิต่้ากว่า 7oC หรือเก็บที่อุณหภูมิสูงกว่า 55-60oC และควรจะมีการอุ่นอาหารที่เก็บไว้ก่อนที่จะน้ามารับประทาน เสมอเพื่อป้องกันการงอกของสปอร์เชื อชนิดนี 2.2.2.4 มาตรฐานอาหารด้านจุลินทรีย์ที่ท าให้เกิดโรค ค่ามาตรฐานที่ก้าหนดส้าหรับ การตรวจการปนเปื้อนของแบคทีเรียในผลิตภัณฑ์นมพร้อมบริโภคชนิดเหลวที่ผ่านกรรมวิธีการฆ่าเชื อ ด้วยความร้อนโดยวิธีพาสเจอร์ไรส์ ได้แก่ นมโค นมปรุงแต่ง ผลิตภัณฑ์นม และผลิตภัณฑ์ที่ผลิตจาก นมของสัตว์อื่นที่มิใช่นมของโค ตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข พ.ศ. 2543-2545 ก้าหนดให้ B. cereus ต้องไม่เกิน 100 CFU ในตัวอย่าง 1 มิลลิลิตร ซึ่งการตรวจเชื อชนิดนี ก้าหนดให้ใช้วิธี วิเคราะห์จุลินทรีย์ที่ท้าให้เกิดโรคตามวิธี Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online U.S. food and Drug Administration ที่เป็นปัจจุบันหรือวิธีที่มีความถูกต้องเทียบเท่า 8

2.2.3 Listeria monocytogenes (ภาพที่ 2.3) เป็นแบคทีเรียในสกุล Listeria มีรูปร่าง ลักษณะเป็นท่อน มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 0.5 ไมโครเมตร ยาว 0.5-2 ไมโครเมตร เป็นแบคทีเรียแกรม บวก ไม่สร้างสปอร์ สร้างแคปซูล เป็นแบคทีเรียที่สามารถเจริญได้ทั งสภาวะที่มีออกซิเจน และไม่มี ออกซิเจน (facultative anaerobe)

ภาพที่ 2.3 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื อ L. monocytogenes ที่มา : http://www.foodsafety.asn.au/resources/listeria-monocytogenes/ 2.2.3.1 แหล่งที่พบและสาเหตุการเกิดโรค พบได้ทั่วไปในดิน น ้า มูลสัตว์ปีก และสัตว์ กีบคู่ในน ้านมดิบ และอาหารที่ประกอบจากน ้านมดิบ 2.2.3.2 อาการของโรค คล้ายอาการของไข้หวัดคือ ไข้หนาวสั่น ปวดศีรษะ ปวด กล้ามเนื อ คอแข็ง สับสน อ่อนแรง อาเจียน อาจมีอุจจาระร่วง ติดเชื อในกระแสเลือด และเยื่อหุ้ม สมองอักเสบ 2.2.3.3 การป้องกัน ไม่ดื่มน ้านมดิบหรืออาหารที่ประกอบจากน ้านมดิบ รวมทั ง ผลิตภัณฑ์นมที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื อ ล้าง และขัดถูผิวด้านนอกของผัก ผลไม้ ด้วยน ้าไหลสะอาดจ้านวน มากก่อนรับประทาน และควรล้างผลไม้แม้จะปอกเปลือกก่อนรับประทานก็ตาม ปรุงอาหารให้สุกก่อน การรับประทาน ไม่ควรรับประทานอาหารที่เก็บค้างมื อ กลุ่มเสี่ยงควรรับประทานอาหารที่ปรุงสุกใหม่ ล้างมือก่อนรับประทานอาหาร และหลังจากการประกอบอาหารล้างมีด และอุปกรณ์ประกอบอาหาร ให้สะอาดก่อน และหลังการใช้งาน 2.2.3.4 มาตรฐานอาหารด้านจุลินทรีย์ที่ท าให้เกิดโรค ค่ามาตรฐานที่ก้าหนดส้าหรับ การตรวจการปนเปื้อนของแบคทีเรียในผลิตภัณฑ์นมพร้อมบริโภคชนิดเหลวที่ผ่านกรรมวิธีการฆ่าเชื อ ด้วยความร้อนโดยวิธีพาสเจอร์ไรส์ ได้แก่ นมโค นมปรุงแต่ง ผลิตภัณฑ์นม และผลิตภัณฑ์ที่ผลิตจาก นมของสัตว์อื่นที่มิใช่นมของโค ตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข พ.ศ. 2543-2545 ก้าหนดให้ ต้อง ไม่พบเชื อ L. monocytogenes ในตัวอย่าง 25 มิลลิลิตร ซึ่งการตรวจเชื อชนิดนี ก้าหนดให้ใช้วิธี 9

วิเคราะห์จุลินทรีย์ที่ท้าให้เกิดโรค ตามวิธี Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online U.S. food and Drug Administration ที่เป็นปัจจุบันหรือวิธีที่มีความถูกต้องเทียบเท่า 2.2.4 Salmonella spp. (ภาพที่2.4) เชื อ Salmonella เป็นแบคทีเรียที่มีรูปร่างเป็นท่อน ไม่สร้างสปอร์ ย้อมติดสีแกรมลบ สามารถเคลื่อนที่ได้ดัวยแฟลกเจลลาที่อยู่รอบตัว เจริญได้ดีใน สภาวะที่มีออกซิเจน และในสภาวะที่มีหรือไม่มีออกซิเจน Salmonella มีหลายชนิด (species) แต่ ละชนิดมีลักษณะความเป็นอยู่หรือการด้ารงชีวิตที่ต่างกันไป เช่น เชื อ S. typhi ซึ่งเป็นสาเหตุของโรค ติดเชื อในระบบทางเดินอาหาร ที่เรียกว่า ไข้ไทฟอยด์ โดยพบในมนุษย์มากกว่าสัตว์อื่น ๆ อย่างไรก็ ตามจะพบเชื อจากสัตว์ติดต่อสู่มนุษย์ และสัตว์อื่น ๆ เช่น หนู สัตว์ปีก แมลง วัว ควาย สุนัข แมว และ ม้า เป็นต้น ส้าหรับการติดเชื อในมนุษย์นั นส่วนมากจะได้รับเชื อปนเปื้อนมาในน ้า และอาหาร บางครั ง อาจเกิดจากสัตว์เลี ยงที่อาศัยตามอาคารบ้านเรือน ซึ่งเป็นพาหะของเชื อ ด้วยเหตุนี จึงท้าให้เชื อ Salmonella เป็นสาเหตุส้าคัญที่ท้าให้เกิดอาการท้องร่วงประกอบกับเชื อมีอัตราการแพร่ระบาดสูง จึงสามารถพบผู้ป่วยที่เป็นโรคจากเชื อนี ในอัตราสูงด้วยและเรียกโรคที่เกิดจากเชื อ Salmonella ว่า salmonellosis 2.2.4.1 แหล่งที่พบและสาเหตุการเกิดโรค อาหารที่เป็นสาเหตุ ได้แก่ เนื อหมู เนื อวัว เนื อไก่ ไข่ นม ผลิตภัณฑ์จากนม เนื อปลา และอาหารทะเลที่ไม่ได้ผ่านความร้อนอย่างเพียงพอซึ่งการ รับประทานอาหารสุก ๆ ดิบ ๆ ไม่ว่าจะเป็นแหนม ลาบ ย้า ปูเค็ม ปูดอง ผักสด หากมีเชื อโรคก็มี โอกาสติดโรคได้เท่ากัน ส้าหรับไข่นั น หากเปลือกไข่มีเชื อ Salmonella อยู่ เชื อจะสามารถผ่านเข้าไป ในไข่ขาวและไข่แดงได้ ดังนั น ในการปรุงอาหารที่มีไข่เป็นส่วนประกอบจึงควรจะปรุงให้สุกด้วยความ ร้อนที่พอเหมาะ นอกจากนี หากมีบุคคลที่ท้างานเกี่ยวข้องกับการแปรรูปอาหารแล้วมีสุขลักษณะไม่ดี พอ เช่น ไว้เล็บยาว หลังกลับจากห้องน ้ามิได้มีการล้างมือให้สะอาดและเป็นโรค salmonellosis ด้วย เชื อ Salmonella ก็มีโอกาสที่จะปนเปื้อนลงไปยังอาหารได้

ภาพที่ 2.4 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื อ Salmonella spp. ที่มา : http://odpc3.ddc.moph.go.th/DataCenter/outbreak/agentinformation.php?idagg=15 10

2.2.4.2 อาการของโรค อาการจะเกิดขึ นหลังจากบริโภคอาหารที่มีการปนเปื้อนแล้ว ประมาณ 6-48 ชั่วโมงและจะมีอาการอยู่ในระหว่าง 1-5 วัน ส้าหรับอาการของโรค salmonellosis ที่พบได้ทั่วไป คือ คลื่นไส้ อาเจียน ท้องเดิน ปวดศีรษะ ปวดท้อง มีไข้ หนาวสั่น และอ่อนเพลีย ความ รุนแรงของอาการที่เกิดขึ นนั นจะแตกต่างไปตามปริมาณเชื อที่บริโภค ชนิดของเชื อที่บริโภค และความ ต้านทานของผู้บริโภค ถ้าหากเป็นผู้สูงอายุหรือเด็กทารก จะพบว่ามีอาการรุนแรงกว่าคนในวัยอื่นที่ บริโภคอาหารปนเปื้อนเชื อชนิดเดียวกันในปริมาณที่เท่ากัน และยังพบอีกว่าผู้ป่วยโรค AIDS มีโอกาส เกิดโรคแทรกซ้อนจากเชื อ Salmonella ได้มากกว่าคนธรรมดาถึง 20 เท่า 2.2.4.3 การป้องกัน เชื อ Salmonella ถูกท้าลายได้ง่ายที่อุณหภูมิ 60oC นาน 4-5 นาที หรือที่อุณหภูมิ 100oC นาน 1 นาที ดังนั น การรับประทานอาหารที่ปรุงสุกใหม่ และรับประทานใน ขณะที่ยังร้อน จะช่วยลดการติดเชื อ Salmonella ได้มาก ส่วนการแช่เย็นที่อุณหภูมิต่้ากว่า 4oC ก็ เป็นอีกวิธีหนึ่งที่จะยับยั งการเจริญของเชื อ Salmonella ได้ นอกจากนี ควรใช้ภาชนะบรรจุอาหารที่ สะอาดถูกสุขลักษณะและท้าความสะอาดหลังใช้แล้วทุกครั ง 2.2.4.4 มาตรฐานอาหารด้านจุลินทรีย์ที่ท าให้เกิดโรค ค่ามาตรฐานที่ก้าหนดส้าหรับ การตรวจการปนเปื้อนของแบคทีเรียในผลิตภัณฑ์นมพร้อมบริโภคชนิดเหลวที่ผ่านกรรมวิธีการฆ่าเชื อ ด้วยความร้อนโดยวิธีพาสเจอร์ไรส์ ได้แก่ นมโค นมปรุงแต่ง ผลิตภัณฑ์นม และผลิตภัณฑ์ที่ผลิตจาก นมของสัตว์อื่นที่มิใช่นมของโค ตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข พ.ศ. 2543-2545 ก้าหนดให้ ต้อง ไม่พบเชื อ Salmonella ในตัวอย่าง 25 กรัม ซึ่งการตรวจเชื อชนิดนี ก้าหนดให้ใช้วิธีวิเคราะห์จุลินทรีย์ ที่ท้าให้เกิดโรค ตามวิธี Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online U.S. food and Drug Administration ที่เป็นปัจจุบันหรือวิธีที่มีความถูกต้องเทียบเท่า 2.2.5 Escherichia coli เป็นเชื อแบคทีเรียประจ้าถิ่น (normal flora) ที่พบได้ในล้าไส้ของ คน และสัตว์เลือดอุ่น (ภาพที่ 2.5) โดยปกติจะไม่ก่อให้เกิดอันตรายหรือก่อโรคร้ายแรง เมื่ออยู่ใน ล้าไส้จะช่วยย่อยอาหารที่เรารับประทานเข้าไป แต่หากเชื อ E. coli ลุกล ้าเข้าสู่ระบบต่าง ๆ ของ ร่างกายก็จะท้าให้เกิดโรคติดเชื อรุนแรง เช่น โรคติดเชื อระบบทางเดินปัสสาวะ โรคเยื่อหุ้มสมอง อักเสบและการติดเชื อในกระแสเลือด เป็นต้น

11

ภาพที่ 2.5 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื อ E.coli ที่มา : http://www.cdc.gov/ecoli/ 2.2.5.1 แหล่งที่พบและสาเหตุการเกิดโรค เชื อ E. coli บางสายพันธุ์ท้าให้เกิดโรค อุจจาระร่วงได้ โดยพบการปนเปื้อนของเชื อในอาหารหรือน ้าดื่ม ทั งนี เชื อ E. coli ที่สามารถก่อโรค อุจจาระร่วง (Diarrheagenic E. coli) จะมีกลไกการก่อโรค และสามารถสร้างสารพิษได้แตกต่างกัน ในแต่ละสายพันธุ์ เช่น เชื อ Enterotoxigenic E. coli ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่สร้างสารพิษ enterotoxin ท้าให้เกิดอาการท้องร่วงแบบเฉียบพลัน ถ่ายเหลวเป็นน ้า หรือเชื อ Enterohaemorrhagic E. coli ที่ สร้างสารพิษ Shiga ท้าให้เกิดอาการท้องร่วงอย่างรุนแรง ถ่ายเป็นมูกเลือด ก่อให้เกิดกลุ่มอาการเม็ด เลือดแดงแตก และไตวายเฉียบพลัน 2.2.5.2 อาการของโรค มีได้ตั งแต่ไม่แสดงอาการจนถึงอาการรุนแรง บางรายถ่ายเหลว เป็นน ้า บางรายอาจมีอาการคลื่นไส้อาเจียน มีไข้ต่้าร่วมด้วย และอาจรุนแรงถึงขั นมีอาการปวดบิด ถ่ายเป็นมูกเลือด และมีอาการแทรกซ้อน คือ เกิดกลุ่มอาการเม็ดเลือดแดงแตก และไตวาย ทั งนี อาการรุนแรงต่าง ๆ ขึ นอยู่กับสภาพร่างกายของแต่ละคนที่ได้รับเชื อ ปัจจัยในการก่อโรค และปริมาณ ของเชื อที่ได้รับเข้าสู่ร่างกาย 2.2.5.3 การป้องกัน ล้างมือให้สะอาดทุกครั งหลังเข้าห้องน ้า หลังสัมผัสสัตว์ก่อน รับประทานอาหาร และก่อนปรุงอาหาร ถ่ายอุจจาระลงในห้องส้วมที่ถูกสุขลักษณะ ไม่ทิ งอุจจาระ หรือสิ่งปฏิกูลลงในแหล่งน ้า และที่ส้าคัญ ดื่มน ้า และรับประทานอาหารที่สะอาดปรุงสุกใหม่ ๆ 2.2.5.4 มาตรฐานอาหารด้านจุลินทรีย์ที่ท าให้เกิดโรค ค่ามาตรฐานที่ก้าหนดส้าหรับ การตรวจการปนเปื้อนของแบคทีเรียในผลิตภัณฑ์นมพร้อมบริโภคชนิดเหลวที่ผ่านกรรมวิธีการฆ่าเชื อ ด้วยความร้อนโดยวิธีพาสเจอร์ไรส์ ได้แก่ นมโค นมปรุงแต่ง ผลิตภัณฑ์นม และผลิตภัณฑ์ที่ผลิตจาก นมของสัตว์อื่นที่มิใช่นมของโค ตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข พ.ศ. 2543-2545 ก้าหนดให้ ต้อง ไม่พบเชื อ E. coli ในตัวอย่าง 0.1 มิลลิลิตร ซึ่งการตรวจเชื อชนิดนี ก้าหนดให้ใช้วิธีวิเคราะห์จุลินทรีย์ ที่ท้าให้เกิดโรค ตามวิธี Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online U.S. food and Drug Administration ที่เป็นปัจจุบันหรือวิธีที่มีความถูกต้องเทียบเท่า

12

2.3 มาตรฐานฟาร์มโคนม มาตรฐานฟาร์มโคนม และการผลิตน ้านมดิบนี ก้าหนดเป็นมาตรฐานเพื่อให้ฟาร์มโคนมที่ต้องการ ขึ นทะเบียนรับรองว่าเป็นฟาร์มโคนมที่ได้มาตรฐานเป็นที่ยอมรับ ได้ยึดถือเป็นแนวทางปฏิบัติด้านการ จัดการฟาร์ม ซึ่งมาตรฐานนี เป็นเกณฑ์ขั นพื นฐานส้าหรับฟาร์มโคนมที่จะได้รับการรับรองมาตรฐาน ฟาร์มโคนม และการผลิตน ้านมดิบนี ก้าหนดวิธีปฏิบัติด้านฟาร์ม การจัดการฟาร์ม สุขภาพโคนม การ เก็บรักษาน ้านมดิบ และการจัดการสิ่งแวดล้อม เพื่อให้ได้น ้านมที่ถูกสุขลักษณะ และเหมาะสมส้าหรับ ผู้บริโภค ลักษณะของฟาร์มโคนม เนื อที่ของฟาร์มโคนม ต้องมีเนื อที่เหมาะสมกับขนาดของโรงเรือน และ การอยู่อาศัยของโคนม การจัดแบ่งพื นที่ ต้องมีเนื อที่กว้างขวางเพียงพอ ส้าหรับการจัดการแบ่งการ ก่อสร้างอาคารโรงเรือนอย่างเป็นระเบียบ สอดคล้องกับการปฏิบัติงาน และไม่หนาแน่นตามหลัก วิชาการ ฟาร์มโคนมจะต้องมีการแบ่งบริเวณพื นที่เป็นสัดส่วน โดยมีผังแสดงการจัดวางที่แน่นอน บ้านพักอาศัย และอาคารส้านักงานอยู่ในบริเวณอาศัยโดยเฉพาะ ไม่มีการเข้าอยู่อาศัยในบริเวณ โรงเรือนเลี ยงสัตว์ บ้านพักต้องอยู่ในสภาพแข็งแรง สะอาด เป็นระเบียบ ไม่สกปรกรกรุงรัง มีปริมาณ เพียงพอกับจ้านวนเจ้าหน้าที่ ต้องแยกห่างจากบริเวณเลี ยงสัตว์พอสมควร สะอาด ร่มรื่น มีรั วกั น ไม่ ควรให้สัตว์เลี ยงที่อาจเป็นพาหะน้าโรคเข้าไปในบริเวณเลี ยงโคนม ลักษณะโรงเรือนที่จะใช้เลี ยงโคนม ควรมีขนาดที่เหมาะสมกับจ้านวนโคนมที่เลี ยง ถูกสุขลักษณะ และอยู่สุขสบาย อย่างไรก็ตามน ้านมดิบที่มาจากฟาร์มโคนมในแต่ละพื นที่ อาจมีปัญหาในการปนเปื้อนของเชื อก่อ โรคต่างกัน เนื่องจากกระบวนการจัดการฟาร์มสภาวะแวดล้อม และการเก็บรักษาในศูนย์รับน ้านมดิบ ที่มีความต่างกัน ซึ่งเชื อจุลินทรีย์ก่อโรคในอาหารที่ก่อให้เกิดปัญหาได้บ่อยในระบบสาธารณสุขของ ไทย (จิราภรณ์ และนภสร , 2549) ได้แก่ B. cereus, S.aureus และ Salmonella spp. อาจพบ การปนเปื้อนในอาหารทั่วไป เช่น ผัก เนื อสัตว์ต่าง ๆ ผลิตภัณฑ์จ้าพวกนม และอาหารปรุงส้าเร็จบาง ชนิด หากรับประทานอาหารที่ปนเปื้อนเชื อจุลินทรีย์เหล่านี เข้าไปอาจท้าให้เกิดอาการอาหารเป็นพิษ เกิดท้องร่วงรุนแรง คลื่นไส้อาเจียน และปวดท้องได้ ส่วน L. monocytogenes เป็นแบคทีเรียอีก ชนิดหนึ่งที่มักพบการปนเปื้อนในนม และอาหารต่าง ๆ (สาวิตรี , 2549) 2.4 งานวิจัยที่เกี่ยวข้อง จุลินทรีย์ที่ปนเปื้อนในนมมีการศึกษากันอย่างแพร่หลาย เช่น ในประเทศอิหร่าน (Jamali และ คณะ, 2015) ได้ท้าการศึกษาความชุก และความต้านทานต่อยาต้านจุลชีพของเชื อ Staphylococcus ที่แยกได้จากน ้านมดิบ (วัวและแกะ) และผลิตภัณฑ์นม จากตัวอย่างนมดิบจากวัวและแกะทั งหมด 2,650 ตัวอย่างถูกน้าไปทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพ ซึ่งมีตัวอย่างที่มีเชื อทนต่อยาปฏิชีวนะ ทั งหมด 328 ตัวอย่าง แยกออกเป็นดังนี ยาปฏิชีวนะ (47.3%) oxacillin (16.2%) lincomycin (11.9%) clindamycin (11.3%) erythromycin (7.9%) streptomycin (5.8%) cefoxitin (5.5%) 13 kanamycin (4%) chloramphenicol (3.7%) และ gentamicin (2.1%) ผลการศึกษานี แสดงให้ เห็นการบริโภคน ้านมดิบ และผลิตภัณฑ์นมมีความเสี่ยงที่อาจเกิดการติดเชื อจากอาหารในภูมิภาคนี ในประเทศบราซิล มีการศึกษาเกี่ยวกับการปนเปื้อนเชื อ B. cereus ในนมพาสเจอไรส์ และพื นผิว อุปกรณ์ในกระบวนการผลิตโดย (ในปี2009 Salustiano และคณะ) รายงานว่าพื นผิว post- pasteurization เป็นบ่อเกิดของ B. cereus จากการจ้าแนกเชื อโดยอาศัยเทคนิค ribotyping สามารถจ้าแนกได้เป็น 7 ribogroups แสดงให้เห็นถึงความแปรปรวนของจุลินทรีย์ พื นผิวอุปกรณ์ที่มี บทบาทส้าคัญในการปนเปื้อนของนมพาสเจอไรส์ ส้าหรับในประเทศไทยก็มีการศึกษาเกี่ยวกับการปนเปื้อนจุลินทรีย์ในนมเช่นกัน (ในปี พ.ศ. 2556, สุทธิทัศน์ และคณะ) ได้ศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างระยะเวลาการเก็บรักษา และชุดการผลิต กับปริมาณเชื อ B. cereus ที่ปนเปื้อนในนมยูเอชทีจ้านวน 74 ตัวอย่างที่สุ่มตัวอย่างจากโรงเรียนใน จังหวัดชลบุรีในช่วง เดือนมกราคม – สิงหาคม 2556 พบการปนเปื้อนของเชื อชนิดนี ในนมยูเอชที จ้านวน 17 ตัวอย่าง ซึ่งคิดเป็นร้อยละ 22.97 เมื่อท้าการเปรียบเทียบปริมาณเชื อชนิดนี ในนมยูเอชที ของชุดการผลิตทั ง 3 ชุด ซึ่งเก็บรักษาที่อุณหภูมิห้องในช่วงระยะเวลา 3–73 วันพบปริมาณเชื อชนิดนี อยู่ในช่วง 3.73-5.13 logCFU/ml และเมื่อท้าการเปรียบเทียบปริมาณเชื อชนิดนี จ้าแนกตามชุดการ ผลิตของนมยูเอชทีพบว่าไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยส้าคัญที่ระดับนัยส้าคัญ 0.05 จากการศึกษาข้างต้นจะเห็นได้ว่าเชื อก่อโรคอาจเกิดการปนเปื้อนได้ในน ้านมดิบรวมถึงผลิตภัณฑ์ นมพร้อมบริโภค จากข้อมูลที่สามารถสืบค้นได้ในปัจจุบันพบว่า การส้ารวจการปนเปื้อน และความชุก ของเชื อก่อโรคในน ้านมดิบ ในพื นที่จังหวัดนครราชสีมานั นยังมีข้อมูลน้อยมากโดยเฉพาะการส้ารวจ การปนเปื้อนของเชื อก่อโรคจากศูนย์รับน ้านมดิบในจังหวัดนครราชสีมา ซึ่งจังหวัดนครราชสีมามีศูนย์ รับน ้านมดิบมากกว่า 30 แห่ง แต่ยังไม่มีการศึกษาเกี่ยวกับการตรวจหาเชื อแบคทีเรียที่ปนเปื้อน ดังกล่าว 3 ชนิด ได้แก่ S. aureus, L. monocytogenes และ B. cereus ดังนั นการศึกษานี มี วัตถุประสงค์เพื่อตรวจเชื อจุลินทรีย์แกรมบวก 3 ชนิด ได้แก่ S. aureus, B. cereus และ L. monocytogenes ซึ่งมีการปนเปื้อนในน ้านมดิบได้ง่าย

บทที่ 3 วัสดุและวิธีด ำเนินกำรทดลอง

3.1 วัสดุและสำรเคมีที่ใช้ในกำรวิจัย วัสดุและสำรเคมี ยี่ห้อ จานเลี้ยงเชื้อ (petri dish) Anumbra ตะเกียงแอลกอฮอล์ (alcohol burner) - แท่งแก้วเกลี่ยเชื้อ (speader) - ห่วงเขี่ยเชื้อ (loop) - หลอดทดลอง (test tube) Pyrex แผ่นสไลด์แก้ว (glass slides) Sail brand สารละลาย 70% แอลกอฮอล์ - สารละลาย 0.85% NaCl - น้้ากลั่น (distilled water) - อาหารวุ้น PALCAM agar Himedia อาหารวุ้น mannitol yolk polymyxin agar Himedia อาหารวุ้น Baird Parker agar Himedia อาหาร half Fraser broth Himedia อาหาร Fraser broth Himedia อาหารวุ้น Plate Count agar - สารละลาย peptone water ปลอดเชื้อ - แท่งกวนสาร (stirring rod) - หลอดปั่นเหวี่ยง (Centrifuge tube) - Tips ขนาดต่าง ๆ 1 ml, 10 µl และ 100 µl - Autopipette ขนาด 20 µl 200 µl และ 1000 µl Biohit บีกเกอร์ (beaker) Bomex อลูมิเนียมฟอยล์ Aro ปากกาเขียนแก้ว Fabfr - castell ขวดเก็บตัวอย่าง (duran bottle) - ขวดรูปชมพู่ (erlenmeyer flask) Schott 15

กระบอกตวง (cylinder) MC ตะแกรงใส่หลอดทดลอง (rack) - อาหารและสารเคมีที่ใช้ส้าหรับทดสอบลักษณะทางสัณฐานวิทยา - ได้แก่ การย้อมแกรม (A1) และการย้อมสปอร์ (A2) อาหารและสารเคมีส้าหรับทดสอบปฏิกิริยาทางชีวเคมี ได้แก่ - MR test (B2.1), VP test (B2.2), oxidase test (B2.3), catalase test (B2.4), coagulase test (B2.5), carbohydrate fermentation test (B2.6), rhizoid (rhizoid growth) (B2.7), lysozyme resistant test (B2.8), การทดสอบ nitrate reduction test (B2.9), β-hemolysis test (B2.10) และ CAMP test (B2.11)

3.2 อุปกรณ์และเครื่องมือที่ใช้ในกำรวิจัย อุปกรณ์และเครื่องมือ ยี่ห้อ ตู้เย็น (refrigerator) Electrolux ตู้บ่มเชื้อ (incubator) JP selecta เครื่องเขย่าผสม (vortex mixture) Specification กล้องจุลทรรศน์ (light microscope) Nikon ตู้อบลมร้อน (hot air oven) Memmert เครื่องชั่งทศนิยม 2 ต้าแหน่ง (balance) Denver instrument เครื่องต้มสารสาร (hot plate stirrer) Denville scientific inc หม้อนึ่งความดันไอน้้า Selecta ตู้ปลอดเชื้อ (laminar Flow) Bioairaeuroclone divison เครื่อง PCR (thermal cycle) Techne ตู้แช่แข็ง -20◦C Everned ชุดแยก DNA ด้วยกระแสไฟฟ้า Ccosmo bio เครื่องวัดความเป็นกรด-ด่าง (pH meter) Dynamica เครื่องปั่นเหวี่ยง (centrifuge) Dynamica ตู้อบไมโครเวฟ (microwave) Whirl Pool

16

3.3 วิธีกำรทดลอง 3.3.1 กำรเก็บตัวอย่ำง การเก็บตัวอย่างน้้านมสิ่งที่ส้าคัญต้องปฏิบัติให้ถูกต้องเพื่อตัวอย่างนั้นจะได้เป็นตัวแทนของ น้้านมจากถังเก็บน้้านมรวมอย่างแท้จริง โดยเฉพาะอย่างยิ่งการตรวจวิเคราะห์ด้านแบคทีเรียต้องระวัง เรื่องความสะอาดและการปนเปื้อนเชื้อจุลชีพอื่น ๆ ระหว่างท้าการเก็บตัวอย่าง ท้าการเก็บตัวอย่างน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านมหรือสหกรณ์โคนม ในจังหวัดนครราชสีมา ได้แก่ อ้าเภอเมือง อ้าเภอพิมาย อ้าเภอปากช่อง อ้าเภอเสิงสาง อ้าเภอปักธงชัย อ้าเภอชุมพวง อ้าเภอ ขามสะแกแสง อ้าเภอสีคิ้ว และอ้าเภอเสิงสาง โดยแต่ละแห่งมีการเก็บตัวอย่างทั้งหมด 4 ครั้ง ยกเว้น ในอ้าเภอสีคิ้ว และอ้าเภอเสิงสาง ซึ่งเก็บตัวอย่างเป็นจ้านวน 3 และ 1 ครั้งตามล้าดับ ช่วงเวลาในการ เก็บตัวอย่าง คือ ระหว่างเดือนกุมภาพันธ์–มีนาคม พ.ศ. 2559 โดยข้อมูลของศูนย์รับน้้านมดิบดัง แสดงในตารางที่ 3.1 ขั้นตอนในการเก็บตัวอย่างน้้านมดิบ เริ่มจากเก็บน้้านมในแต่ละศูนย์รับน้้านมโดยเก็บจากถัง รับน้้านมรวม (รวมน้้านมดิบที่รับมาจากแต่ละฟาร์ม) ท้าการเก็บตัวอย่างน้้านมดิบในสภาวะปลอดเชื้อ ใส่ลงขวดปลอดเชื้อประมาณ 3/4 ของขวดโดยเจ้าหน้าที่ของศูนย์รับน้้านมดิบ จากนั้นบันทึกค่า อุณหภูมิหน้าถังเก็บน้้านมรวม และระบุรายละเอียดตัวอย่างให้ชัดเจน น้าตัวอย่างน้้านมดิบแช่ใน กระติกน้้าแข็งเพื่อน้าตัวอย่างไปตรวจสอบคุณภาพในด้านต่าง ๆ ในห้องปฏิบัติการ ตำรำงที่ 3.1 ข้อมูลศูนย์รับน้้านมดิบที่ท้าการเก็บตัวอย่างในพื้นที่จังหวัดนครราชสีมา จ ำนวน ศูนย์ ปริมำณน ำนมดิบ ฟำร์มที่ ช่วงเวลำที่ศูนย์ส่ง รับ ต ำแหน่งที่ตั ง ช่วงเวลำในกำรรับ ในถังรับน ำนมดิบ ส่งน ำนม น ำนมดิบไปยัง น ำนม (ต ำบล/อ ำเภอ) น ำนมดิบที่ศูนย์ ต่อวัน (ตัน) ดิบไปยัง โรงงำน ดิบ ศูนย์ PK พลกรัง/เมือง 6.5 37 07.00-09.00 น. 18.00-19.00 น. PM พิมาย 28-30 143 07.00-09.00 น. 19.00-20.00 น. CP ชุมพวง 6.5 33 07.00-09.00 น. 19.00-20.00 น. PC ปากช่อง - - - - PCNS หนองสาหร่าย/ปาก 40-42 230 07.00-09.00 น. 10.00-12.00 น. ช่อง 13.00-18.00 น. 18.00-18.30 น. SS เสิงสาง 9.5 49 07.00-08.40 น. 08.40-09.40 น.

17

จ ำนวน ศูนย์ ปริมำณน ำนมดิบ ฟำร์มที่ ช่วงเวลำที่ศูนย์ส่ง รับ ต ำแหน่งที่ตั ง ช่วงเวลำในกำรรับ ในถังรับน ำนมดิบ ส่งน ำนม น ำนมดิบไปยัง น ำนม (ต ำบล/อ ำเภอ) น ำนมดิบที่ศูนย์ ต่อวัน (ตัน) ดิบไปยัง โรงงำน ดิบ ศูนย์ PTC ปักธงชัย 9 44 07.00-09.00 น. 18.00-20.00 น. KS ขามสะแกแสง 4.6 42 06.00-09.00 น. 17.00-18.00 น. SK สีคิ้ว 7 29 07.00-09.00 น. 18.00-20.00 น.

3.3.2 กำรตรวจสอบคุณภำพน ำนมดิบเบื องต้น ตัวอย่างน้้านมดิบของแต่ละศูนย์รับน้้านมจะถูกน้าไปตรวจสอบคุณภาพน้้านมดิบทาง กายภาพโดยใช้ประสาทสัมผัส ได้แก่ สี โดยผู้ที่ท้าการตรวจสอบจะต้องเป็นบุคคลเดียวกันและมีการ ฝึกฝนการใช้ประสาทสัมผัสในการตรวจสอบคุณภาพน้้านมมาก่อน การตรวจสอบคุณภาพน้้านมดิบ ทางเคมีท้าได้โดยการวัดความเป็นกรด-ด่าง ในน้้านมด้วยเครื่อง pH meter ตรวจสอบคุณภาพน้้านม ดิบโดยการตรวจปริมาณจุลินทรีย์ทั้งหมด โดยวิธี spread plate technique บนอาหารวุ้น Plate Count agar (PCA) (Himedia) ที่ระดับความเจือจาง 100 ถึง 10-6 3.3.3 กำรตรวจกำรปนเปื้อนของเชื อก่อโรค การตรวจสอบการปนเปื้อนของเชื้อก่อโรค ได้แก่ S. aureus, B. cereus และ L. monocytogenes เพื่อทราบความชุกของเชื้อดังกล่าวในพื้นที่มีขั้นตอนการด้าเนินงานดังต่อไปนี้ 3.3.3.1 การตรวจการปนเปื้อนของเชื้อ S. aureus น้าตัวอย่างน้้านมดิบ 10 ml ใส่ลงในฟลาสก์ขนาด 150 ml ที่บรรจุ 0.1% peptone water (Himedia) ปริมาตร 90 ml ผสมให้เข้ากัน จากนั้นน้าตัวอย่างมาเจือจางที่ความ เข้มข้นต่าง ๆ (100-10-9) ในสารละลาย 0.85% NaCl ที่ปลอดเชื้อ และน้าสารละลายตัวอย่างแต่ละ ความเข้มข้นมาปริมาตร 0.1 ml เกลี่ยบนอาหารวุ้น Baird Parker agar (Himedia) ที่มี Egg yolk และ 3.5% Potassium tellurite solution เป็นองค์ประกอบ จากนั้นน้าตัวอย่างแต่ละตัวอย่างไป บ่มที่อุณหภูมิ 35oC เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เพื่อนับจ้านวนโคโลนีที่พบและตรวจสอบลักษณะโคโลนีที่ได้ โดยโคโลนีของ S. aureus จะมีลักษณะสีด้า เงา ขอบเรียบ มีการสร้างโซนทึบ (opaque zone) หรือ โซนใส (clear zone) รอบโคโลนี จากนั้นน้าโคโลนีที่คาดว่าจะเป็น S. aureus มาเพาะเลี้ยงในอาหาร trypticase soy agar (TSA) (A4.5) บ่มที่ 35oC เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และเก็บเชื้อลงในหลอดขนาด 1.5 ml ที่มีสารละลาย 0.85% NaCl และ 20% glycerol เป็นองค์ประกอบในปริมาณ 0.5 ml และ 18

เก็บที่อุณหภูมิ -20oC การทดสอบคุณสมบัติต่าง ๆ ของเชื้อ S. aureus ในการระบุเชื้อ S. aureus ได้แก่ คุณสมบัติทางสัณฐานวิทยา (ภาคผนวก B1) คุณสมบัติทางชีวเคมี (ภาคผนวก B2) และการ ระบุเชื้อด้วยเทคนิคทางชีววิทยาระดับโมเลกุล คุณสมบัติทางสัณฐานวิทยาได้แก่ การย้อมเซลล์ด้วย เทคนิค Gram stain (B1.1) คุณสมบัติทางชีวเคมีประกอบด้วย การทดสอบ methyl red test (B2.1), Voges-Proskauer production test (B2.2), oxidase test (B2.3), catalase test (B2.4), การทดสอบ coagulase test (B2.5), การใช้ glucose และ mannitol ในสภาพไร้ออกซิเจน (B2.6) ส่วนการทดสอบคุณสมบัติทางชีววิทยาระดับโมเลกุลใช้เทคนิค multiplex polymerase chain reaction หรือ (m-PCR) ดังแสดงรายละเอียดในหัวข้อที่ 3.4 3.3.3.2 การตรวจการปนเปื้อนของเชื้อ B. cereus น้าตัวอย่างน้้านมดิบ 10 ml ใส่ลงในฟลาสก์ขนาด 150 ml ที่มี 0.1% peptone water ปริมาตร 90 ml ผสมให้เข้ากัน จากนั้นน้าตัวอย่างมาเจือจางที่ความเข้มข้นระดับ ต่าง ๆ (100-10-9) ในสารละลาย 0.85 % NaCl ที่ปลอดเชื้อ และน้าสารละลายตัวอย่างแต่ละความ เข้มข้นมาปริมาตร 0.1 ml เกลี่ยบนอาหารวุ้น mannitol yolk polymyxin (MYP) agar (Himedia) ด้วยเทคนิค spread plate จากนั้นน้าไปบ่มที่อุณหภูมิ 30oC นาน 24 ชั่วโมง เพื่อตรวจสอบลักษณะ โคโลนี โดยโคโลนีที่คาดว่าเป็นเชื้อ B. cereus มีลักษณะการสร้างโซนสีเหลืองซึ่งเกิดจากปฏิกิริยาของ เอนไซม์ lecithinase (lecithinaes activity) และโคโลนีมีสีส้ม-ชมพูซึ่งเกิดจาก activity-non fermenting mannitol ท้าการนับจ้านวนโคโลนีที่มีลักษณะดังกล่าวจากนั้นน้าโคโลนีที่มีลักษณะ คล้าย B. cereus มาเพาะเลี้ยงในอาหาร trypticase soy agar (TSA) น้าไปบ่ม 35oC เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นจึงท้าการเก็บเชื้อลงในหลอดขนาด 1.5 ml ซึ่งมีสารละลายของ 0.85% NaCl และที่มี 20% glycerol เป็นองค์ประกอบปริมาณ 0.5 ml และน้าไปเก็บที่อุณหภูมิ -20oC การ ทดสอบคุณสมบัติเพื่อระบุว่าเป็น B. cereus ประกอบด้วยการทดสอบทางสัณฐานวิทยา ได้แก่ ตรวจสอบเซลล์ด้วยเทคนิค Gram stain (A1), การย้อมสปอร์ (A2), การทดสอบการเจริญบนอาหาร nutrient agar (NA) เพื่อสังเกตลักษณะโคโลนีแบบ rhizoid growth (B2.7) ส้าหรับการทดสอบทาง ชีวเคมี ได้แก่ การทดสอบ methyl red test (B2.1) Voges-Proskauer test (B2.2), oxidase test (B2.3), catalase test (B2.4), lysozyme resistant test (B2.8), nitrate reduction test (B2.9) ส่วนการระบุเชื้อ B. cereus ด้วยเทคนิค m-PCR แสดงรายละเอียดดังหัวข้อที่ 3.4 3.3.3.3 การตรวจการปนเปื้อนของเชื้อ L. monocytogenes น้าตัวอย่างน้้านมดิบปริมาณ 10 ml ใส่ลงฟลาสก์ขนาด 150 ml ที่มี อาหารเหลว half Fraser broth (Himedia) ปริมาณ 90 ml ซึ่งมี Fraser selective supplement และ Fraser supplement เป็นองค์ประกอบในปริมาณครึ่งหนึ่งของ Fraser broth เขย่าผสมให้เข้า 19

กัน น้าตัวอย่างไปบ่มที่อุณหภูมิ 37oC เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นย้ายเชื้อจากอาหาร half Fraser broth ปริมาณ 0.1 ml ใส่ลงในอาหารเหลว Fraser broth (Himedia) ที่มี Fraser selective supplement และ Fraser supplement ปริมาณ 10 ml และ น้าไปบ่มที่อุณหภูมิ 37oC เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แล้วน้าไป streak บนอาหารวุ้น PALCAM ที่มี Listerria selective supplement และ น้าไปบ่มที่อุณหภูมิ 35oC เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เพื่อตรวจสอบลักษณะโคโลนีของเชื้อที่คาดว่าเป็นเชื้อ Listeria spp. โดยโคโลนีของ Listeria spp. บนอาหารวุ้น PALCAM มีสีน้้าตาล-ด้า เกิดการสร้าง โซนสีด้ารอบโคโลนี จากนั้นน้าโคโลนีที่มีลักษณะดังกล่าวมา streak ลงบนอาหาร TSA น้าไปบ่มที่ 35oC เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นท้าการเก็บเชื้อลงในหลอดขนาด 1.5 ml ที่มีสารละลาย 0.5 ml ของ 0.85% NaCl และ 20% glycerol น้าเชื้อไปเก็บที่อุณหภูมิ -20oC การทดสอบ คุณสมบัติต่าง ๆ เพื่อระบุว่าเป็น L. monocytogenes ได้แก่ การทดสอบทางสัณฐานวิทยา ประกอบด้วย Gram stain (B1.1), และ motility test ส้าหรับการทดสอบทางชีวเคมี ประกอบด้วย ก า ร ท ด ส อ บ catalase test (B2.4), carbohydrate fermentation test (B2.6), ก า ร เกิ ด β-hemolysis (B2.11) และ CAMP test (B2.12) 3.3.4 กำรระบุตัวอย่ำงด้วยเทคนิค PCR ตัวอย่างเชื้อที่แยกได้ซึ่งมีลักษณะโคโลนีบนอาหารจ้าเพาะที่คล้ายคลึงกับ S. aureus และ B. cereus ถูกน้าไปสกัด DNA และ น้าไปท้า PCR ด้วย primers ที่มีความจ้าเพาะกับเชื้อ ซึ่ง การท้า PCR เป็นเทคนิคที่ให้ความแม่นย้าสูงในการระบุว่าโคโลนีเป้าหมายเป็น B. cereus หรือ S. aureus หรือไม่ โดยมีขั้นตอนดังต่อไปนี้ 3.3.4.1 การสกัด DNA เพื่อใช้เป็น DNA แม่แบบ (DNA template) เลี้ยงเชื้อที่ต้องการทดสอบบนอาหารวุ้น TSA ที่อุณหภูมิ 35oC เป็นเวลา 18- 24 ชั่วโมง จากนั้นย้ายเชื้อจากอาหารวุ้นในปริมาณเท่าหัวไม้ขีดไฟแล้วเขี่ยลงในหลอดขนาด 1.5 ml ที่มีสารละลาย DNA extraction buffer ปริมาตร 250 µl (10mM Tris-CI, pH 8.0 และ 2.5 mg/ml lysozyme) ผสมให้เข้ากันด้วยเครื่องปั่นผสมเป็นเวลา 30 วินาที แล้วน้าตัวอย่างไปบ่มที่ อุณหภูมิ 37oC เป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นเติมสารละลาย Iysis buffer ปริมาณ 500 µl (50 mM Tris-CI, pH8.0, 100 mM EDTA, 1% SDS) และ Proteinase K (ความเข้มข้นสุดท้ายเป็ น 1 mg/ml) ผสมให้เข้ากันโดยการกลับหลอด จากนั้นเติมสารละลาย phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) ปริมาณ 500 µl ผสมให้เข้ากันด้วยการกลับหลอดไปมา จากนั้นน้าไป ปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 13,000 rpm เป็นเวลา 5 นาที แล้วย้ายสารละลายส่วนบน (aqueous phase) เพื่อตกตะกอนDNA ด้วยการใช้ 125 mM NaCl และ Absolute isopropanol ในปริมาณ 1 เท่า (1 volume) จากนั้นผสมสารละลายโดยการพลิกหลอดไปมาช้า ๆ (ในขั้นตอนนี้อาจเห็น DNA ตกตะกอนเป็นสาย) น้าสารละลายไปแช่ที่อุณหภูมิ -20oC เป็นเวลา 3 ชั่วโมง เพื่อเพิ่มปริมาณตะกอน 20

ของ DNA จากนั้นท้าการแยกตะกอน DNA ด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 13,000 rpm เป็นเวลา 10 นาที เทส่วนใสด้านบนทิ้งแล้วล้างตะกอน DNA ด้วยสารละลาย 70% ethanol ปริมาตร 500 µl แยกตะกอน DNA ออกด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 13,000 rpm เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นเท สารละลาย 70% ethanol ทิ้ง แล้วคว่้าหลอดบนกระดาษที่สะอาด โดยการเปิดฝาหลอดไว้ที่ อุณหภูมิห้อง เพื่อระเหยสารละลายเอทานอลที่เหลือออก และท้าให้ตะกอน DNA แห้งซึ่งสังเกตจาก ตะกอนที่เห็นเป็นสีขาวขุ่นเริ่มมีขอบใสละลายตะกอน DNA ด้วยสารละลาย TE buffer 10 mM Tris- Cl, PH 8.0 และ 1 mM EDTA ปริมาณ 30-50 µl ซึ่งขึ้นอยู่กับปริมาณของตะกอน จากนั้นเติม RNaseA เพื่อย่อยสลาย RNA แล้วบ่มสารละลาย DNA ที่อุณหภูมิ 65oC เพื่อละลายตะกอนของ DNA เก็บสารละลาย DNA ที่ 4oC เพื่อใช้เป็นแม่แบบในการท้าปฏิกิริยา m-PCR เพื่อระบุเชื้อที่ต้องการ ตรวจสอบ ในหัวข้อที่ 3.3.4.2 3.3.4.2 การเพิ่มปริมาณยีนเป้าหมายด้วยเทคนิคPCR ในงานวิจัยนี้คณะผู้วิจัยใช้เทคนิค (m-PCR) ในการระบุเชื้อเป้าหมาย ซึ่งเป็นเทคนิคที่มีความจ้าเพาะและรวดเร็วโดยสามารถใช้ตรวจสอบ DNA เป้าหมายได้หลายยีนจาก การเพิ่มปริมาณ DNA ในปฏิกิริยาเดียวกัน ในปฏิกิริยา m-PCR ประกอบด้วย 1X PCR buffer

(Promega, USA), 1 mM MgCl2 (Promega), 0.2 mM dNTPs (Promega), 0.4 µm ของแต่ละ primers ได้แก่ forward และ reverse primers (ตารางที่ 3.2), 0.5 U GoTaq® Flexi DNA polymerase (Promega), โดยแต่ละปฏิกิริยาประกอบด้วย 16S rRNA primers และ gene specific primers ซึ่งมีความจ้าเพาะกับยีนเป้าหมายของเชื้อเป้าหมายแต่ละเชื้อที่ต้องการทดสอบ ขั้นตอนการท้า m-PCR เริ่มจากเตรียม master mix โดยการปิเปตต์สารต่าง ๆ ตามองค์ประกอบ ดังกล่าวลงในหลอด PCR จากนั้นผสมให้เข้ากันโดยการดูดปิเปตต์ขึ้นลงหรือใช้นิ้วดีดเบา ๆ ที่ข้าง หลอด จากนั้นปั่นตกด้วยเครื่อง spin down (1-2 วินาที) เพื่อให้สารละลายที่ติดข้างหลอดไหลมา รวมกันทั้งหมด แล้วแบ่งสารละลาย master mix ที่ผสมเข้ากันแล้วใส่ในหลอด PCR ในปริมาณ 24 µl และใส่ DNA แม่แบบของเชื้อที่ต้องการทดสอบลงในหลอด master mix แต่ละหลอดในปริมาตร 1 µl ได้ปริมาณรวมหลอดละ 25 µl จากนั้นน้าตัวอย่างที่เตรียมในหลอด PCR ทั้งหมดไปใส่ในเครื่อง เพิ่มปริมาณ (DNA thermal cycle) เพื่อให้เพิ่มปริมาณ DNA เป้าหมายที่ต้องการ โดยตั้งโปรแกรม เครื่องดังนี้ ขั้นที่ 1 ท้าให้ DNA เสียสภาพที่อุณหภูมิ 95oC เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วยขั้นที่ 2 ตั้ง อุณหภูมิ 95oC 30 วินาที ตามด้วย 52oC เป็นเวลา 45 วินาที และ 72oC เป็นเวลา 60 วินาที โดย ท้าซ้้าที่สภาวะเดิมในขั้นตอนที่ 2 เป็นจ้านวน 35 รอบ และตามด้วยการเพิ่มปริมาณ DNA อย่าง สมบูรณ์ในขั้นสุดท้ายที่อุณหภูมิ 72oC เป็นเวลา 5 นาที ทดสอบผลผลิต PCR ที่ได้โดยเทคนิค เจลอิเล็กโทรโฟริซิส (gel electrophoresis) 21

3.3.4.3 การตรวจสอบผลิตภัณฑ์ PCR ด้วยเทคนิคเจลอิเล็กโทรโฟริซิส การตรวจสอบผลิตภัณฑ์ PCR เทคนิค เริ่มโดยเตรียมสารละลายบัฟเฟอร์ 1X Tris-acetate EDTA (TAE) จากนั้นเตรียม agarose gel ความเข้มข้น 1.5% โดยละลายผง agarose (Gene Mate) ปริมาณ 1.5 กรัม ในสารละลาย 1X TAE buffer ปริมาตร 100 ml ในขวด รูปชมพู่ เขย่าให้เข้ากัน ปิดปากขวดรูปชมพู่ด้วยพลาสติกห่อหุ้มอาหาร ต้มในเตาไมโครเวฟจนผง agarose ละลายหมด (เปลี่ยนจากสีขาวขุ่นเป็นสีใส) ปล่อยให้ agarose gel อุ่น เติม SYBR® Safe DNA Gel Stain 1 µl ใน 1.5% agarose gel ที่ละลายแล้ว แกว่งขวดรูปชมพู่เบา ๆ เพื่อให้ สารละลายเข้ากันได้ดี แล้วเท agarose gel ลงในถาดที่วางหวี (comb) ไว้เพื่อให้เกิดช่องส้าหรับใส่ ตัวอย่าง หากมีฟองอากาศเกิดขึ้นให้ใช้ปลายทิปไล่หรือแตะให้ฟองอากาศแตก ปล่อย agarose ไว้ แข็งตัวแล้วดึงหวีออก น้า agarose ที่แข็งตัวไปวางในเครื่อง อิเล็กโทรโฟรีซิส แล้วเท 1X TAE ให้ท่วม แผ่น agarose gel ประมาณ 1–3 mm จากนั้นเตรียมตัวอย่างเพื่อหยอดลงหลุมโดยหยดตัวอย่าง DNA บนแผ่นพลาสติกผสม loading dye กับตัวอย่าง DNA ให้เข้ากัน และหยอดตัวอย่าง DNA ที่ ผสมกับ loading dye แล้ว ลงในหลุมบน agarose gel โดยช่องตัวอย่างที่ 1 ส้าหรับ 100 bp DNA marker (100 mg/µl) ปริมาตร 3 µl หลังจากหยดตัวอย่างทั้งหมดลงใน agarose gel แล้ว ต่อ ขั้วไฟฟ้าของชุดแยก DNA เข้ากับเครื่องก้าเนิดกระแสไฟฟ้า โดยให้ DNA วิ่งจากขั้วลบไปขั้วบวก เปิด กระแสไฟฟ้าโดยตั้งโวลต์ (volt) คงที่ที่ 100 โวลต์ ให้ DNA เคลื่อนที่ใน gel จนสีที่ผสมในตัวอย่าง DNA เคลื่อนที่ 2 ใน 3 ของความยาวเจล จากนั้นน้าแผ่น agarose gel ไปตรวจสอบการเรืองแสงของ DNA ที่ติดสี SYBR® Safe ด้วยเครื่อง Gel Documentation แล้วบันทึกไฟล์และพิมพ์ภาพผลการ ทดลอง ตำรำงที่ 3.2 Primers ที่ใช้ในการระบุเชื้อด้วยเทคนิค m-PCR

ขนำด เชื อ/ยีน ล ำดับนิวคลีโอไทด์ (5’ to 3’) ผลิตภัณฑ์ แหล่งที่มำ เป้ำหมำย PCR (bp)

Eubacteria / 16S_F: AGACTCCTACGGGAGGC Kupradit 16S rRNA 625-655 16S_R: GGTAAGGTTCTTCGCGT et al. (2013) gene B. cereus / BC_EntFM_F: TGCTGCTGATGTATTAATGTTCGTTC Enteroxin 513 งานวิจัยนี้ BC_EntFM_R: GCGTTGTATGTAGCTGGGCCT FM gene S.aureus / SA_eap_F: TTAAATCGATATCACTAAATACCTC Hussain et eap gene 230 SA_eap_R: TACTAACGAAGCATCTGCC al. (2008)

บทที่ 4 ผลการทดลอง ในงานวิจัยนี้ ได้ท าการสุ่มตรวจสอบคุณภาพน้ านมดิบจากศูนย์รับน้ านมดิบในพื้นที่ทั่วจังหวัด นครราชสีมาจ านวน 9 อ าเภอ รวม 33 ตัวอย่าง โดยวิเคราะห์คุณภาพน้ านมดิบเบื้องต้น ได้แก่ การ วิเคราะห์คุณลักษณะภายนอก ค่าความเป็นกรด-ด่าง (pH) ปริมาณจุลินทรีย์ทั้งหมดในตัวอย่าง และ วิเคราะห์การปนเปื้อนของเชื้อก่อโรค คือ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus และ Listeria monocytogenes เพื่อส ารวจความชุกของเชื้อก่อโรคในพื้นที่จังหวัดนครราชสีมา นอกจากนี้ คณะผู้วิจัยได้ท าการทดสอบคุณลักษณะทางด้านสัณฐานวิทยา ชีวเคมี และชีววิทยาระดับโมเลกุล เพื่อความถูกต้องในการระบุเชื้อและทราบถึงคุณลักษณะที่หลากหลายของเชื้อในท้องถิ่นส าหรับ น าไปใช้ในงานวิจัยอื่นต่อไป โดยผลการด าเนินงานแสดงดังหัวข้อต่อไปนี้ 4.1 การตรวจสอบคุณภาพน้้านมดิบเบื้องต้น ในการตรวจสอบคุณภาพของน้ านมดิบเบื้องต้นจากแต่ละแห่ง โดยการวัดค่าความเป็น กรด– ด่าง การวัดอุณหภูมิขณะเก็บตัวอย่าง การนับปริมาณเชื้อทั้งหมด และการตรวจสอบการ ปนเปื้อนของเชื้อ S. aureus, B. cereus และ L. monocytogenes โดยการใช้อาหาร Baird Parker agar, MYP agar และ PALCAM agar ตามล าดับ ผลที่ได้ดังแสดงในตารางที่ 4.1 ตารางที่ 4.1 ผลการตรวจสอบคุณภาพน้ านมดิบ

ค่าความ ปริมาณเชื้อ อุณหภูมิ S. aureus B. cereus L. monocytogenes ตัวอย่าง เป็น กรด- ทั้งหมด (oC) (CFU/ml) (CFU/ml) (CFU/ml) ด่าง (CFU/ml) PM 6.58 2 1.1 x 106 - - - 2PM 6.72 4 6.1 x 107 - - - 3PM 6.68 4 1.7 x 106 7.0 x 103 - - 4PM 6.72 4 1.5 x 108 - - - PCF 6.76 3 2.0 x 107 - - - PCT2 6.68 3 1.6 x 106 9.0 x 103 - - PCT2M 6.72 4 1.5 x 106 - - -

23

ค่าความ ปริมาณ อุณหภูมิ S. aureus B. cereus L. monocytogenes ตัวอย่าง เป็น เชื้อทั้งหมด (oC) (CFU/ml) (CFU/ml) (CFU/ml) กรด-ด่าง (CFU/ml) 2PC 6.74 4 <2.5 x 104 2.0 x 102 - - 3PC 6.76 4 4.0 x 107 2.0 x 103 - - 4PC 6.71 4 1.5 x 107 7.0 x 102 - - CP 6.48 4 1.1 x 105 2.5 x 102 - - 2CP 6.76 4 <2.5 x 104 3.4 x 103 - - 3CP 6.72 4 1.9 x 105 85 - - 4CP 6.75 4 1.6 x 107 2.7 x 104 - - PCNS 6.67 4 2.0 x 106 - 20 - 2PCNS 6.69 4 8.7 x 105 - - - 3PCNS 6.78 4 2.3 x 107 - - - 4PCNS 6.74 4 7.7 x 106 - - - PK 6.68 3 1.8 x 106 1.8 x 103 - - 2PK 6.68 4 1.9 x 107 - - - 3PK 6.76 4 3.1 x 107 - - - 4PK 6.70 4 1.3 x 108 2.0 x 102 - - 2SK 6.78 4 <2.5 x 105 1.3 x 103 - - 3SK 6.68 4 8.5 x 105 5.0 x 103 - - 4SK 6.70 4 7.1 x 104 2.6 x 103 - - 2KS 6.76 4 2.0 x 105 1.2 x 103 - - 3KS 6.76 4 1.8 x 105 5.1 x 103 - - 4KS 6.8 4 2.1 x 107 4.5 x 103 - - PTC 6.72 3 <2.5 x 104 - 2.0 x 104 - 2PTC 6.73 4 4.0 x 105 7.0 x 102 - - 3PTC 6.79 4 4.2 x 104 - - - 4PTC 6.74 4 5.3 x 104 - - - 4SS 6.68 4 1.9 x 105 - - -

24

ในการตรวจสอบคุณภาพน้ านมดิบเบื้องต้นพบว่า น้ านมดิบในแต่ละแห่งมีคุณลักษณะเบื้องต้นที่ ใกล้เคียงกันคือ มีค่าความเป็นกรด-ด่างอยู่ในช่วงที่มาตรฐานก าหนด คือ 6.6-6.8 ปริมาณเชื้อทั้งหมด อยู่ในช่วง 103-108 CFU/ml และอุณหภูมิของถังรวมที่เก็บน้ านมดิบอยู่ในช่วง 2-4oC ส าหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างน้ านมที่ปนเปื้อนเชื้อก่อโรคโดยนับจ านวนโคโลนีที่มีลักษณะคล้าย S. aureus, B. cereus และตรวจสอบลักษณะเชื้อ L. monocytogenes ในอาหารจ าเพาะ พบการ ปนเปื้อนของเชื้อ S. aureus ในตัวอย่างน้ านมดิบจ านวน 18 ตัวอย่าง ซึ่งมีความเข้มข้นอยู่ในช่วง 85 ถึง 2.7 x 104 CFU/ml ส่วนเชื้อ B. cereus พบการปนเปื้อนในตัวอย่างจ านวน 2 ตัวอย่าง จาก จ านวนทั้งหมด 33 ตัวอย่าง ซึ่งมีความเข้มข้นอยู่ในช่วง 20 ถึง 2.0 x 104 CFU/ml (ตารางที่ 4.1) อย่างไรก็ตามไม่พบการปนเปื้อนของเชื้อ L. monocytogenes จากตัวอย่างทั้งหมดทั้ง 33 ตัวอย่าง 4.2 การตรวจสอบคุณสมบัติของเชื้อก่อโรค จากการตรวจสอบเชื้อก่อโรคที่ปนเปื้อนในน้ านมดิบ โดยการน าเชื้อที่มีลักษณะโคโลนีบน อาหารเลี้ยงเชื้อที่จ าเพาะซึ่งมีลักษณะตรงตามเชื้อเป้าหมายมา restreak ลงบนอาหารจ าเพาะอีกครั้ง และน าไประบุความถูกต้องด้วยลักษณะทางสัณฐานวิทยา คุณสมบัติด้านชีวเคมี และเทคนิคทาง ชีววิทยาระดับโมเลกุล ได้ผลการตรวจสอบดังนี้ เชื้อ S. aureus ที่พบในตัวอย่างน้ านมดิบมีลักษณะโคโลนีที่เจริญบนอาหาร Baird Parker agar คือ มีสีด า ขอบเรียบ และเกิดการสร้างโซนทึบสีเหลืองรอบโคโลนี (ภาพที่ 4.1) จากการเก็บ โคโลนีที่มีลักษณะดังกล่าวจ านวนทั้งหมด 29 isolates จากตัวอย่างน้ านมดิบทั้งหมดจ านวน 18 ตัวอย่างมาท าการระบุความถูกต้องด้วยลักษณะทางสัณฐานวิทยา คุณสมบัติด้านชีวเคมี และ เทคนิคทางชีววิทยาระดับโมเลกุล แสดงผลดังตารางที่ 4.2 พบว่าทั้ง 29 isolates มีลักษณะ และ คุณสมบัติที่เหมือนกับเชื้อมาตรฐาน ได้แก่ เกิดการสร้างโซนบนอาหาร Baird Parker agar เมื่อย้อม เซลล์และสังเกตรูปร่างเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ พบว่ารูปร่างเซลล์มีลักษณะกลม (coccus) ให้ผล เป็นลบต่อการทดสอบ oxidase test แต่ให้ผลเป็นบวกต่อการทดสอบ catalase test สามารถใช้ น้ าตาลกลูโคส และแมนนิทอลเป็นแหล่งคาร์บอนให้ผลผลิตเป็นกรดแต่ไม่ผลิตแก๊ส อย่างไรก็ตามใน การทดสอบ methyl red (MR) test พบว่าเชื้อมาตรฐานที่น ามาทดสอบให้ผลที่แตกต่างกัน และมี เชื้อจ านวน 7 isolates ให้ผลบวกในการทดสอบ MR test ซึ่งคล้ายกับเชื้อมาตรฐาน S. aureus TISTR 746 และจ านวน 22 isolates ที่ให้ผลเป็นลบคล้ายกับเชื้อมาตรฐาน S. aureus TISTR 587 นอกจากนี้มีเชื้อจ านวน 14 isolates ที่ให้ผลเป็นบวกในการทดสอบ VP test โดยต่างจากผลการ ทดสอบที่ได้จากเชื้อมาตรฐานทั้ง 2 สายพันธุ์ ซึ่งให้ผลเป็นลบ ส าหรับการทดสอบ coagulase test สามารถทดสอบได้บนอาหาร Baird Parker agar ซึ่งมี fibrinogen plasma trypsin inhibitor supplement เป็นองค์ประกอบ โดยผลที่เป็นบวกจะพบการเกิดลักษณะของโซนทึบรอบโคโลนีที่ ทดสอบ (ภาพที่ 4.2) พบว่า isolate เกือบทั้งหมดที่ทดสอบให้ผลเป็นบวกซึ่งคล้ายกับเชื้อมาตรฐาน 25

ยกเว้น 5 isolates ที่ให้ผลเป็นลบซึ่งไม่พบการสร้างโซนทึบหรือมีการสร้างโซนน้อยมากบนอาหาร ดังกล่าว หลังจากท าการทดสอบคุณสมบัติต่าง ๆ ของแต่ละ isolate แล้ว จากนั้นน า isolate ทั้ง 29 isolates ไประบุความถูกต้องด้วยเทคนิค m-PCR ต่อไป

ภาพที่ 4.1 ลักษณะโคโลนีของเชื้อ S. aureus บนอาหารวุ้น Baird Parker agar

A

S. aureus TISTR 030 F G B L H

S. aureus TISTR 746 K I E J C

D S. aureus TISTR 587

ภาพที่ 4.2 การทดสอบ coagulase test บนอาหาร Baird Parker agar ที่มี fibrinogen plasma trypsin inhibitor supplement หลังจากน าเชื้อที่ต้องการตรวจสอบ ขีดลงบนอาหาร Baird Parker agar บ่มที่ 35 C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง พบว่า (A): 2KS_SA7; (B): 4PTC_SA2; (C): 2PTC_SA5; (D): 2SK_SA3; (F): 2KS_SA5; (G): 2PTC_SA4; (H): 4PTC_SA4; (I): 4PTC_SA1; (J): 2PTC_SA4; (K): 2PCNS_B3; (L): 2CP_SA2 ให้ผลเป็นบวก (+) ซึ่งมีการสร้างโซนเกิดขึ้นเมื่อ เทียบกับ Reference stain ซึ่งเกิดการสร้างโซนเหมือนกันแต่ (E): 2PC_SA1 ให้ผลเป็นลบ (-) เนื่องจากไม่มีการสร้างโซนเกิดขึ้น 26

ส าหรับเชื้อ B. cereus มีลักษณะโคโลนีที่เจริญบนอาหาร MYP คือ มีลักษณะการสร้างโซน สีเหลืองซึ่งเกิดจากการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซม์ lecithinase (lecithinase activity) และโคโลนีที่มีสี ส้ม-ชมพูซึ่งเกิดจากคุณลักษณะที่ไม่สามารถใช้แมนนิทอลเป็นแหล่งคาร์บอนได้ (activity-non fermenting mannitol) ดังแสดงในภาพที่ 4.3 จากการเก็บโคโลนีที่มีลักษณะดังกล่าวจ านวน ทั้งหมด 14 isolates จากทั้งหมด 7 ตัวอย่าง มาท าการระบุความถูกต้องด้วยลักษณะทางสัณฐาน วิทยา คุณสมบัติด้านชีวเคมี และเทคนิคทางชีววิทยาระดับโมเลกุล แสดงผลดังตารางที่ 4.3 พบว่าเมื่อ ย้อมเซลล์และสังเกตรูปร่างเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ มีจ านวน 5 isolates ที่มีรูปร่างเซลล์กลม (coccus) ซึ่งต่างจากเชื้อ Bacillus มาตรฐาน และ 9 isolates ที่มีรูปร่างเซลล์เป็นท่อนสั้น (rod) และท่อนยาว (bacillus) (ตารางที่ 4.3) ซึ่งเหมือนกับเชื้อ Bacillusมาตรฐาน เมื่อพิจารณาคุณสมบัติ การเจริญของโคโลนีทั้ง 9 isolates บนอาหาร NA พบว่ามีเพียง 7 isolates ที่มาจากตัวอย่าง PCNS และ PTC เท่านั้น ที่มีลักษณะการเจริญเป็นแบบ galaxy shape คล้ายเชื้อมาตรฐาน B. cereus TISTR 1474 ซึ่งเมื่อท าการย้อมสปอร์พบลักษณะของสปอร์อยู่ในต าแหน่งกึ่งกลาง (S/C) จ านวน 4 isolates และต าแหน่งท้าย (S/T) จ านวน 1 isolate จากการทดสอบทั้ง 14 isolates พบว่า isolates ที่พบการสร้างสปอร์ทั้ง 5 isolates อยู่ในกลุ่มของ 7 isolates ที่มาจากตัวอย่าง PCNS และ PTC ซึ่ง มีลักษณะการเจริญเป็นแบบ galaxy shape ทั้งหมด (ภาพที่ 4.4) และรูปร่างเซลล์เป็นท่อนคล้ายเชื้อ มาตรฐาน B. cereus TISTR 1474 โดยเมื่อเปรียบเทียบปฏิกิริยาชีวเคมีอื่น ๆ ของทั้ง 7 isolates พบว่าให้ผลที่คล้ายกับเชื้อ B. cereus มาตรฐาน ได้แก่ ให้ผลบวกเมื่อทดสอบปฏิกิริยา MR test, lysozyme resistant test และ nitrate reduction test อย่างไรก็ตาม เมื่อน าทั้ง 7 isolates ไป ทดสอบปฏิกิริยาชีวเคมีอื่น ๆ พบว่า มี 2 isolates ให้ผลบวกกับปฏิกิริยา VP test, 1 isolate ให้ผล ลบกับปฏิกิริยา oxidase test และ 3 isolates ไม่พบกิจกรรมของเอนไซม์ lecithinase บนอาหาร MYP agar (ภาพที่ 4.4) ซึ่ง isolate เหล่านี้ให้ผลที่มีความแตกต่างจากผลที่พบเมื่อเปรียบเทียบกับ เชื้อ B. cereus มาตรฐาน อย่างไรก็ตาม เพื่อให้การระบุเชื้อมีความความถูกต้องแม่นย า ดังนั้นจึงน า isolate ทั้ง 14 isolates และ isolate อื่นที่มีลักษณะโคโลนีที่แตกต่างจากเชื้อ B. cereus ซึ่งไม่ใช่ เชื้อเป้าหมายแต่สามารถเจริญได้บนอาหาร MYP agar ไประบุความถูกต้องด้วยเทคนิค m-PCR ต่อไป

27

(A)

(B)

(C)

ภาพที่ 4.3 ลักษณะโคโลนีเชื้อ B. cereus และเชื้อ isolate อื่น ๆ ที่แยกได้จากตัวอย่างน้ านมดิบ บนอาหาร MYP agar (A) เชื้อที่เจริญมีลักษณะ galaxy shape บนอาหารวุ้น NA (B) เชื้อที่เจริญมีลักษณะ Rhizoid shape บนอาหารวุ้น NA (C) เชื้อที่เจริญมีลักษณะไม่ใช่ ทั้ง galaxy และ rhizoid shape บนอาหาร NA

28

(A) (A) PTC_BC3 PTC_BC4 PTC_BC6

PTC_BC8 PTC_BC9 PTC_BC10

PCNS_BC1 PM_BC1 B. cereus TISTR 1474

(B) 4PCNS_BC1 2SK_BC1 4KS_P2

(C) 3CP_Y1 4CP_W1 2SKC3

2BC13 2PC_BC2 3PC_BC4

B. subtilis TISTR 1248 B. amyloliquefaciens TISTR 1045

ภาพที่ 4.4 การเจริญเป็นแบบ galaxy shape บนอาหารวุ้น NA ที่อุณหภูมิ 30ºC เป็นเวลา 7 วัน (A): ลักษณะ galaxy shape, (B): rhizoid shape และ (C): ไม่ใช่ทั้ง galaxy และ Rhizoid shape

29

ในการตรวจเชื้อ L. monocytogenes ในตัวอย่างน้ านมดิบ โดยใช้อาหาร half Fraser broth และ Fraser broth ในขั้นตอนการท า pre-enrichment และ enrichment แล้วน าเชื้อที่ เจริญใน Fraser broth มา streak ลงบนอาหาร PALCAM agar และสังเกตโคโลนีที่มีลักษณะเหมือน Listeria spp. ได้แก่ โคโลนีสีเทา-ด า อาหารที่อยู่รอบโคโลนีมีการเปลี่ยนสีเป็นสีน้ าตาลด า ผลจากการ ส ารวจลักษณะโคโลนีที่พบจากการแยกเชื้อ Listeria spp. จากตัวอย่างน้ านมดิบทั้ง 33 ตัวอย่าง (ภาพที่ 4.5) แสดงให้เห็นว่า ไม่พบตัวอย่างที่มีโคโลนีลักษณะคล้าย L. monocytogenes ดังนั้น จึง สรุปว่า ไม่พบเชื้อ L. monocytogenes จากตัวอย่างน้ านมดิบที่น ามาทดสอบทั้ง 33 ตัวอย่าง

2CP_Y1 2CP_Y2 3CP_W1

2PCNS_SW1 2PCNS_SW2 PK_W1

PK_W2 2PK_R1 2SK_W1

30

2KS_W1 2KS_W 3KS_W1 2

L. monocytogenes 3KS_W2 2PTC_R1 DSM 12464

ภาพที่ 4.5 ลักษณะโคโลนีเชื้อ isolate ต่าง ๆ ที่แยกได้จากตัวอย่างน้ านมดิบบนอาหาร PALCAM agar

22

22

ตารางที่ 4.2 คุณสมบัติของเชื้อ S. aureus ที่แยกได้จากตัวอย่างน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านมดิบพื้นที่จังหวัดนครราชสีมา คุณสมบัติทางชีวเคมีและปฏิกิริยาต่าง ๆ PCR Gram stain การสร้างโซน Methyl Voges- Carbohydrate รหัสเชื้อที่ทดสอบ บนอาหาร Oxidase Catalase Coagulase (SA_eap red (MR) Proskauer fermentation Baird Parker test test test gene) แกรม รูปร่าง test (VP) test agar Glucose Mannitol (230 bp) S.aureus TISTR 587 + coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + S.aureus TISTR 746 + coccus สร้าง + - - + + A/- A/- + 3PM_SA01 + coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + 3PM_SA05 - coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + 2PC_SA1 + coccus สร้าง + - - + - A/- A/- + 3PC_SA2 + coccus สร้าง - + - + + A/- A/- + 4PC_SA1 + coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + 4PC_SA2 + coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + 4PC_SA3 + coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + CP_SA05 + coccus สร้าง + - - + + A/- A/- + 2CP_SA2 + coccus สร้าง - + - + + A/- A/- + 2CP_SA8 + coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + 3CP_SA1 + coccus สร้าง + + - + - A/- A/- + 3CP_SA5 - coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + 4CP_SA1 - coccus สร้าง - + - + + A/- A/- + 4CP_SA2 + coccus สร้าง - + - + + A/- A/- + 31

ตารางที่ 4.2 (ต่อ) คุณสมบัติของเชื้อ S. aureus ที่แยกได้จากตัวอย่างน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านมดิบพื้นที่จังหวัดนครราชสีมา คุณสมบัติทางชีวเคมีและปฏิกิริยาต่าง ๆ การสร้างโซน PCR Gram stain Methyl Voges- Carbohydrate รหัสเชื้อที่ทดสอบ บนอาหาร Oxidase Catalase Coagulase (SA_eap red (MR) Proskauer fermentation Baird Parker test test test gene) (230 แกรม รูปร่าง test (VP) test Glucose Mannitol agar bp) S. aureus TISTR 587 + coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + S. aureus TISTR 746 + coccus สร้าง + - - + + A/- A/- + 4CP_SA4 - coccus สร้าง - + - + + A/- A/- + 4CP_SA5 + coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + PK_SA01 - coccus สร้าง + + - + + A/- A/- + 4PK_SA1 + coccus สร้าง - - - + - A/- A/- + 4PK_SA2 + coccus สร้าง - + - + + A/- A/- + 4PK_SA3 - coccus สร้าง - - - + - A/- A/- + 2SK_SA3 - coccus สร้าง - + - + + A/- A/- + 3SK_SA1 + coccus สร้าง + + - + + A/- A/- + 4SK_SA1 - coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + 2KS_SA4 - coccus สร้าง - + - + + A/- A/- + 3KS_SA7 + coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + 3KS_SA8 + coccus สร้าง + + - + + A/- A/- + 4KS_SA2 + coccus สร้าง + + - + + A/- A/- + 4KS_SA6 + coccus สร้าง - - - + + A/- A/- + 2PTC_SA4 + coccus สร้าง - + - + + A/- A/- + 32

Gram stain = +: แบคทีเรียกลุ่มแกรมบวก, - : แบคทีเรียกลุ่มแกรมลบ Methyl red = +: สีของ Methyl red ที่เติมในอาหารทดสอบจะเปลี่ยนเป็นสีแดง, - : ไม่เกิดการเปลี่ยนแปลงของสีในอาหารทดสอบ Voges-Proskauer test = +: เกิดสีแดงในอาหารทดสอบ หลังจากเติมสารทดสอบลงในอาหารประมาณ 15 นาที, - : ไม่เกิดการเปลี่ยนแปลงของสีในอาหาร ทดสอบ Oxidase test = +: สารทดสอบถูกออกซิไดส์และโคโลนีเปลี่ยนเป็นสีน้้าเงิน – ด้า, - : สารทดสอบไม่เปลี่ยนแปลงสีที่ผิวหน้าโคโลนี Catalase test= +: เกิดการสร้างฟองออกซิเจนเกิดขึ้น, - : ไม่พบการเกิดฟองแก๊ส Coagulase test = +: เกิดการสร้างโซนบนอาหาร, - : ไม่พบการสร้างโซน Carbohydrate fermentation = A/- : เกิดการเปลี่ยนแปลงสีของอาหารทดสอบจากสีม่วงเป็นสีเหลือง เนื่องจากเกิดการผลิตกรดขึ้นในอาหารทดสอบแต่ไม่มี การสร้างแก๊ส

33

ตารางที่ 4.3 คุณสมบัติของเชื้อ B. cereus ที่แยกได้จากตัวอย่างน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านมดิบพื้นที่จังหวัดนครราชสีมา คุณสมบัติทางชีวเคมีและปฏิกิริยาต่าง ๆ Gram stain Shape PCR Methyl Voges- Lecithinase รหัสเชื้อที่ทดสอบ Endospore Oxidase Catalase of Lysozyme Nitrate (enterotoxin red Proskauer resistant activity staining test test colony reduction _fm gene) แกรม รูปร่าง test test test test test on NA (513 bp) B. cereus + rod S/C + - + + G + + + + TISTR 1474 B. amyloliquefaciens TISTR 1045 + rod S/C + - + + - + - - - B. subtilis TISTR + rod S/C + + + + - + - - - 1248 PCNS BC 01 + rod S/C + - + - G + + + + PTC BC 03 - bacillus S/C + + + + G + + + - PTC BC 04 + rod - + - + + G + + + + PTC BC 06 + bacillus S/C + - + + G + + - + PTC BC 08 + rod S/C + - + + G + + + + PTC BC 09 + bacillus S/T + + + + G + + - + PTC BC 10 + rod - + - - + G + + - + PM BC 01 + coccus - + + + + G + + + - 2 SK BC 1 + coccus - - - - + R + + - - 2 SK BC 3 + coccus - + - - + - + + + - 34

คุณสมบัติทางชีวเคมีและปฏิกิริยาต่าง ๆ Gram stain Shape PCR Methyl Voges- Lecithinase รหัสเชื้อที่ทดสอบ Endospore Oxidase Catalase of Lysozyme Nitrate (enterotoxin red Proskauer resistant activity staining test test colony reduction _fm gene) แกรม รูปร่าง test test test test test on NA (513 bp) 2 SK BC 13 + coccus - + - + + - + + + - 2 PC BC 2 + rod - + - - + - + + + - 3 PC BC 4 + rod - + - - + - + + - - 4 PCNS BC 1 + coccus - + - - + R + - - ND

35

Gram stain = +: แบคทีเรียกลุ่มแกรมบวก, - : แบคทีเรียกลุ่มแกรมลบ Endospore staining = S/C: มีการสร้างสปอร์ตรงต้าแหน่งกลางเซลล์, S/T: มีการสร้างสปอร์ต้าแหน่งปลายเซลล์ Methyl red = +: สีของ Methyl red ที่เติมในอาหารทดสอบจะเปลี่ยนเป็นสีแดง, - : ไม่เกิดการเปลี่ยนแปลงของสีในอาหารทดสอบ Voges-Proskauer = +: เกิดสีแดงในอาหารทดสอบ หลังจากเติมสารทดสอบลงในอาหารประมาณ 15 นาที, - : ไม่เกิดการเปลี่ยนแปลงของสีในอาหารทดสอบ Oxidase test = +: สารทดสอบถูกออกซิไดส์และโคโลนีเปลี่ยนเป็นสีน้้าเงิน–ด้า, - : สารทดสอบไม่เปลี่ยนแปลงสีที่ผิวหน้าโคโลนี Catalase test= +: เกิดการสร้างฟองออกซิเจนเกิดขึ้น, - : ไม่พบการเกิดฟองแก๊ส Lysozyme resistant test= +: พบการเจริญของเชื้อในอาหารเหลว nutrient broth ที่มี 0.001% lysozyme, - : ไม่เกิดการเจริญในอาหารทดสอบ Nitrate reduction test= +: เกิดสีแดงเชอรี่ขึ้นหลังจากเติมสารละลาย A และ B ลงในอาหารทดสอบ, - : ไม่เกิดการเปลี่ยนแปลงของสีในอาหารทดสอบ Shape of colony on NA = G: galaxy shape, R: rhizoid shape, - : ไม่ใช่ทั้ง galaxy และ rhizoid shape Lecithinase activity test = +: อาหารทดสอบเกิดการเปลี่ยนแปลงรอบ ๆ โคโลนีเป็นสีเหลือง, - : อาหารทดสอบไม่เกิดการเปลี่ยนแปลงสี

36

37

37

4.3 การระบุเชื้อด้วยเทคนิค m-PCR เชื้อที่แยกได้จากแต่ละตัวอย่างมีผลการทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมีที่แตกต่างกัน ซึ่งจะ เห็นได้ว่ายังไม่สามารถระบุความถูกต้องของเชื้อได้อย่างชัดเจน ดังนั้นจึงได้น าเชื้อที่แยกได้จากแต่ละ แห่ง ซึ่งมีลักษณะโคโลนีและข้อมูลทางชีวเคมีบางส่วนที่เหมือนกับเชื้อมาตรฐานได้แก่ isolate ของ S. aureus (27 isolates) และ B. cereus (14 isolates) รวมทั้งเชื้ออื่น ๆ ที่สามารถเจริญได้บน อาหารจ าเพาะแต่มีลักษณะโคโลนีที่แตกต่างจากเชื้อเป้าหมาย (9 isolates) มาสกัด DNA และน าไป ท า m-PCR โดยใช้ primers ที่มีความจ าเพาะต่อยีนที่จ าเพาะกับเชื้อเป้าหมาย (ตารางที่ 3.2) และ 16S rRNA primers ซึ่งใช้เป็น primer ที่เติมลงในแต่ละปฏิกิริยาเพื่อให้ทราบว่ามี DNA แม่แบบใน ปฏิกิริยา เนื่องจาก 16S rRNA primers สามารถเพิ่มปริมาณ DNA ของ 16S rRNA gene ใน แบคทีเรียทุกชนิดได้ ผลการเพิ่มปริมาณ DNA จากยีนเป้าหมายจากเชื้อ S. aureus และ B. cereus ที่แยกได้แสดงดังภาพที่ 4.6 และภาพที่ 4.7 ตามล าดับ จากภาพที่ 4.6 แสดงให้เห็นว่า พบผลิตภัณฑ์ PCR ขนาด 230 bp ซึ่งเป็นขนาดที่คาดหมายของการเพิ่มปริมาณยีน eap โดยพบในเชื้อ S. aureus ที่แยกได้จากทั้ง 27 isolates จาก 17 ตัวอย่างซึ่งได้ผลเหมือนกับเชื้อมาตรฐาน S. aureus TSSTR 587 จึงสามารถระบุได้ว่าเชื้อที่แยกจากตัวอย่างทั้ง 17 ตัวอย่างคือ S. aureus ทั้งหมด ส าหรับการระบุเชื้อ B. cereus ด้วยเทคนิค m-PCR พบว่า เชื้อที่แยกได้จากทั้ง 2 ตัวอย่าง ได้แก่ ตัวอย่าง PCNS จ านวน 1 isolate และจากตัวอย่าง PTC จ านวน 5 isolates จากทั้งหมด 6 isolates พบขนาดของ PCR ประมาณ 513 bp ซึ่งเป็นขนาดของ Enterotoxin FM gene ซึ่งมีขนาด ตรงกับเชื้อมาตรฐาน B. cereus TISTR 1474 (ภาพที่ 4.7) ในขณะที่เชื้อที่แยกได้ซึ่งมีลักษณะโคโลนี ที่แตกต่างจาก B. cereus หรือมีรูปร่างเซลล์ และคุณสมบัติทางชีวเคมีที่แตกต่างจาก B. cereus จะ พบเพียงขนาดของผลิตภัณฑ์ PCR ประมาณ 625 bp ซึ่งเป็นการเพิ่มปริมาณยีน 16S RNA gene เท่านั้น แสดงให้เห็นว่า เชื้อดังกล่าวไม่มี Enterotoxin FM gene ดังนั้นจึงสรุปว่า เชื้อที่พบในตัวอย่าง PCNS และ PTC เป็นเชื้อ B. cereus จากข้อมูลการระบุเชื้อทั้งหมด จึงสามารถสรุปได้ว่า พบการปนเปื้อนของเชื้อ S. aureus ในตัวอย่างน้ านมดิบจ านวน 18 ตัวอย่างจากทั้งหมด 33 ตัวอย่างและ B. cereus ปนเปื้อนในตัวอย่าง จ านวน 2 ตัวอย่างจากทั้งหมด 33 ตัวอย่าง ส่วน L. monocytogenes ไม่พบการปนเปื้อนของเชื้อ ทั้ง 33 ตัวอย่าง

38

(A) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

16S rRNA gene 625bp eap gene 230 bp

(B) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

16S rRNA gene 625 bp

eap gene 230 bp

ภาพที่ 4.6 การเพิ่มปริมาณยีน eap ด้วยปฏิกิริยา multiplex PCR โดยใช้ SA_eap primers และ 16S rDNA primers (A) เชื้อ S. aureus ที่แยกได้จากตัวอย่าง 3PM, 2PC, 3PC, 4PC, CP, 2CP, 3CP, 4CP:Lane 1 : Molecular weight marker ( 100 bp ladder,lnvitrogen); 2 : S. aureus TISTR 587; Lane 3 : S. aureus TISTR 746; Lane 4-19 : 3PM_SA01; 3PM_SA05; 2PC_SA1; 3PC_SA2; 4PC_SA1; 4PC_SA2; 4PC_SA3; CP_SA05; 2CP_SA2; 2CP_SA8; 3CP_SA1; 4CP_SA1; 4CP_SA2; 4CP_SA4; 4CP_SA5 และH2O ตามล าดับ (B) เชื้อ S. aureus ที่แยกได้จากตัวอย่าง PK, 4PK, 2SK, 3SK, 4SK, 2KS, 3KS, 4KS และ 2PTC: Lane 1 : Molecular weight marker (100 bp ladder); Lane 2 : S. aureus TISTR 587; Lane 3 : S. aureus TISTR 746; Lane 4-16 : PK_SA01; 4PK_SA1; 4PK_SA2; 4PK_SA3; 2SK_SA3; 3SK_SA1; 4SK_SA1;2KS_SA5; 3KS_SA7; 3KS_SA8;4KS_SA2; 2PTC_SA2 และ H2O ตามล าดับ

39

(A) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

16S rRNA gene 625 bp

Enterotoxin FM gene 513 bp

(B) 1 2 3 4 5

16S rRNA gene 625 bp

ภาพที่ 4.7 การเพิ่มปริมาณยีน Enterotoxin FM ด้วยปฏิกิริยา m-PCR โดยใช้ Ent_FM primers และ 16S rDNA primers (A) เชื้อ B. cereus และเชื้ออื่น ๆ ที่สามารถเจริญได้บนอาหาร MYP agar ที่แยกได้จากตัวอย่าง PTC, PTC2M, PCNS, PK, PTC, PM, CP, 2SK, 2PC, 3PC และ 3CP Lane 1 : Molecular weight marker (100 bp ladder, Invitrogen); Lane 2 : B. subtilis TISTR 1248; Lane 3 : B. amyloliquefaciens TISTR 1045; Lane 4 : B. cereus TISTR 1474; Lane 5-24; PTC_MYP_Y2; PTC2M_MYP_W1; PCNS_BC_01; PK_MYP_Y1; PTC_BC03; PTC_BC04; PTC_BC06; PTC_BC08; PTC_BC09; PTC_BC10; PM_BC01; CP_MYPR1; CP_MYPY1; 2SK_BC1; 2SK_BC3; 2SK_BC13; 2PC_BC2; 3PC_BC4; 3CP_Y1 และ 4PCNS_BC1 ตามล าดับ (B) เชื้อ B. cereus และเชื้ออื่น ๆ ที่สามารถเจริญได้บนอาหาร MYP agar ที่แยกได้จากตัวอย่าง 4PCNS, 4PM, 4KS และ 4CP Lane 1 : Molecular weight marker (100 bp ladder); Lane 2-5: 4PM_Y3; 4KS_P2 และ 4CP_W1 และ H2O ตามล าดับ

บทที่ 5 สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง 5.1 วิจารณ์ จากการตรวจสอบคุณภาพของน ้านมโคดิบโดยการใช้ประสาทสัมผัส ได้แก่ สี พบว่าสีของน ้านม อยู่ในเกณฑ์ปกติ สีของน ้านมเป็นสีขาวนวลปกติไม่จับตัวกันเป็นก้อนมีค่าความเป็นกรด-ด่างอยู่ ระหว่าง 6.6-6.8 ซึ่งค่าความเป็นกรด-ด่าง ในระดับนี น ้านมจะมีลักษณะสะอาดปกติ และมีความสด ถือว่าอยู่ในเกณฑ์ที่ปกติ การทดสอบวัดความเป็นกรดในน ้านมเป็นอีกดัชนีที่บ่งบอกถึงคุณภาพน ้านม ว่ามีความเหมาะสมในการแปรรูปด้วยระดับความร้อนต่าง ๆ หรือไม่ น ้านมที่มีคุณภาพดีจะมีค่าความ เป็นกรดอยู่ระหว่าง pH 6.6-6.9 โดยวัดด้วย pH meter หากพบว่ามีความเป็นกรดสูงกว่าปกติจะมี ผลต่อความสามารถในการทนความร้อน (heat stability) เมื่อน้าน ้านมที่เป็นกรดสูงไปผ่าน กระบวนการให้ความร้อนโปรตีนนมถูกท้าลายได้ง่าย และจะจับตัวกันเป็นก้อนซึ่งมีความเป็นกรดที่สูง กว่าปกติมักเกิดจากการที่น ้านมมีการปนเปื้อนของแบคทีเรียที่มีการใช้น ้าตาลในนม (lactose) เกิด การสร้างแลคติก (lactic acid) จากการตรวจสอบหาเชื อ S. aureus จากน ้านมโคดิบในพื นที่นครราชสีมา พบว่ามีการปนเปื้อน 18 ตัวอย่าง จาก 33 ตัวอย่าง คิดเป็น 54% จ้านวนจุลินทรีย์ที่พบมีความเข้มข้นอยู่ในช่วง 85 ถึง 2.7 x 104 CFU/ml จะเห็นได้ว่าเมื่อเทียบกับการตรวจสอบคุณภาพน ้านมแพะดิบในเขตหนองจอก กรุงเทพมหานคร การเพาะแยกเชื อ S. aureus บนอาหารเลี ยงเชื อ Braid-Parker Agar พบว่า ตัวอย่างน ้านมแพะดิบทั งหมดไม่พบเชื อ S. aureus คิดเป็น 0% (ดวงจิต และคณะ, 2557) และเมื่อ เทียบกับการตรวจสอบความชุกและการดื อยาของเชื อ S. aureus ที่แยกได้จากน ้านมโคดิบและ ผลิตภัณฑ์นม จากตัวอย่างทั งหมด 2650 ตัวอย่าง พบการปนเปื้อนในน ้านมโคดิบ 162 ตัวอย่าง คิด เป็น 15.7% และในนมแกะดิบ 49 ตัวอย่าง คิดเป็น 9.6% (Jamali และคณะ , 2014) จะเห็นได้ว่า เชื อ S. aureus ถูกพบการปนเปื้อนในนมมากที่สุด เนื่องจากสภาพสุขอนามัยที่ไม่เหมาะสมใน ระหว่างการรีดนม สภาพโรงเรือนหรือเครื่องมือที่ใช้ไม่สะอาด อย่างไรก็ตามเพื่อลดความเสี่ยง และ อันตรายจากเชื อแบคทีเรียที่อาจจะมีการปนเปื้อนมากับน ้านมโคดิบ ควรท้าความสะอาดเครื่องมือใน การรีดนมหรืออุปกรณ์ที่เกี่ยวข้อง ควรล้างด้วยน ้าสะอาดทุกครั ง และดูแลความสะอาดภายใน โรงเรือนหรือกระบวนการผลิตให้ถูกสุขอนามัย โดยเฉพาะในพื นที่อ้าเภอชุมพวงที่มีการเก็บตัวอย่าง 4 ครั ง โดยพบการปนเปื้อนทั ง 4 ครั ง ส่วนในพื นที่อ้าเภอปากช่อง สีคิ ว และขามสะแกแสงที่มีการเก็บ ตัวอย่างทั งหมด 4 ครั ง ซึ่งพบการปนเปื้อนทั งหมด 3 ครั ง ซึ่งพื นที่ทั ง 4 ควรจะมีการตรวจสอบ สุขลักษณะของฟาร์มหรือโรงเรือนให้เป็นไปตามมาตรฐานฟาร์มโคนม ส้าหรับการตรวจหาเชื อ B. cereus ซึ่งพบการปนเปื้อน 2 ตัวอย่าง คิดเป็น 6% จาก 33 ตัวอย่าง จ้านวนจุลินทรีย์ที่พบมี ความเข้มข้นอยู่ในช่วง 20 ถึง 2.0 x 104 CFU/ml จะเห็นได้ว่าเมื่อเทียบกับการศึกษา สภาวะการ ปนเปื้อนเชื อ B. cereus ในนมพาสเจอร์ไรส์ส้าหรับโรงเรียน ในเขตจังหวัดชลบุรี จากตัวอย่างทั งหมด 89 ตัวอย่าง ซึ่งพบการปนเปื้อนเชื อ B. cereus ในตัวอย่างนมพาสเจอไรส์ 3 ตัวอย่าง คิดเป็น 12.5% และพบการปนเปื้อนในตัวอย่างนม UHT 21 ตัวอย่าง คิดเป็น 28% (สุทธิทัศน์ ทองคาใส และคณะ, 2556) จะเห็นได้ว่าเชื อ B. cereus ถูกพบว่าปนเปื้อนในน ้านมเป็นส่วนน้อย เมื่อเทียบกับเชื อ 41

S. aureus โดยเชื อ B. cereus มีการปนเปื้อนเนื่องจากพบได้ทั่วไปในฝุ่น ควัน และธรรมชาติในดิน ซึ่งไม่พบมากในน ้านม เพื่อลดความเสี่ยงและอันตรายจากเชื อแบคทีเรียควรท้าความสะอาดรอบ บริเวณโรงเรือนหรือฟาร์มโคนม ส้าหรับการตรวจหาเชื อ L. monocytogenes ซึ่งไม่พบการปนเปื้อน จากตัวอย่างทั ง 33 ตัวอย่างคิดเป็น 0% จะเห็นได้ว่าเมื่อเทียบกับ Listeria spp. ในนมดิบ และ ผลิตภัณฑ์นมในประเทศตุรกีซึ่งพบการปนเปื้อนของเชื อ Listeria spp. จากตัวอย่างทั งหมด 157 ตัวอย่าง ซึ่งพบความชุกของเชื อในน ้านมดิบ 2.12% และในผลิตภัณฑ์เนยแข็งถูกพบการปนเปื้อน 8.23% (Aygun and Pehlivanlar, 2006) จะเห็นได้ว่าการศึกษาเกี่ยวกับการปนเปื้อนเชื อ L. monocytogenes ในน ้านมมีการปนเปื้อนอยู่ในระดับต่้า หรือพบน้อยมากเนื่องจาก เชื อ L. monocytogenes มักจะพบได้ในผลิตภัณฑ์อื่น ๆ ที่ไม่ใช่ผลิตภัณฑ์จากนม เช่น ผลิตภัณฑ์เนื อดิบ อาหารส้าเร็จรูปที่ประกอบจากเนื อสัตว์ ฮ็อตดอก อาหารทะเล อาหารแช่เย็น ผักสด ผลไม้สด ที่ ปนเปื้อนเชื อจากดิน และปุ๋ยมูลสัตว์ เมื่อพิจารณาผลการตรวจสอบคุณภาพน ้านมดิบทั งหมดพบเพียงเชื อ S. aureus และ B. cereus จากศูนย์รับน ้านมดิบบางแห่งในพื นที่จังหวัดนครราชสีมา ซึ่งเกินค่ามาตรฐานที่ก้าหนด ส้าหรับคุณภาพน ้านมที่สามารถบริโภคได้อย่างปลอดภัยตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข (ฉบับที่ 364) พ.ศ. 2556 แสดงให้เห็นว่าน ้านมโคดิบที่น้ามาทดสอบนั นมีการปนเปื้อนของเชื อก่อโรค ดังนั น เพื่อความปลอดภัยในการบริโภคน ้านมจึงควรน้าน ้านมดิบมาผ่านการให้ความร้อน เพื่อท้าลายเชื อก่อ โรคก่อนน้าไปบริโภค 5.2 สรุปผลการทดลอง จากการศึกษาการตรวจเชื อ S. aureus, B. cereus และ L. monocytogenes ในน ้านมดิบ จากศูนย์รับน ้านมดิบในพื นที่จังหวัดนครราชสีมา จ้านวน 33 ตัวอย่าง ในช่วงเดือนกุมภาพันธ์ พ.ศ. 2559 ถึงเดือนมีนาคม พ.ศ. 2559 พบการปนเปื้อนของเชื อ S. aureus มากที่สุดถึง 18 ตัวอย่าง คิดเป็น 54% โดยพบในพื นที่อ้าเภอชุมพวงมีความชุกของเชื อ S. aureus สูงสุด รองลงมาคือ B. cereus พบการปนเปื้อนของเชื อ 2 ตัวอย่าง คิดเป็น 6% ซึ่งพบการปนเปื้อนในพื นที่อ้าเภอปาก ช่อง และปักธงชัย ส่วน L. monocytogenes พบว่าไม่พบการปนเปื้อนในตัวอย่างทั ง 33 ตัวอย่าง ซึ่ง คิดเป็น 0% ซึ่งข้อมูลที่ได้ในงานวิจัยนี ท้าให้ทราบว่าเชื อ S. aureus มีความชุกสูงสุดในพื นที่อ้าเภอชุม พวงในช่วงเดือนกุมภาพันธ์ พ.ศ. 2559 ถึงเดือนมีนาคม พ.ศ.2559 ดังนั นเพื่อเป็นการลดการปนเปื้อน ของ S. aureus และ B. cereus จึงควรท้าการตรวจสอบสุขลักษณะของฟาร์ม และศูนย์รับน ้านมใน พื นที่ดังกล่าว เพื่อให้มีการจัดการความสะอาด และสุขลักษณะที่ดี ซึ่งหากสามารถลดการปนเปื้อน ของเชื อก่อโรคได้ตั งแต่ต้นทางคือ ศูนย์รับน ้านมดิบ และฟาร์มโคนมจะท้าให้ลดการกระจายเชื อไปสู่ โรงงานแปรรูปน ้านม ซึ่งรับซื อน ้านมจากศูนย์รับน ้านมดังกล่าวเหล่านี จึงเป็นการลดการปนเปื้อนของ เชื อก่อโรคในผลิตภัณฑ์นมจากโรงงานแปรรูปน ้านม

บรรณานุกรม

จิราภรณ์ เหรียญ ทอง และนภสร จรุงธนาภิบาล. (2549). Detection of food-borne pathogens by multiplex PCR. มหาวิทยาลัยมหิดล. ดวงจิต คนึงเพียร และคณะ. (2557). การตรวจสอบคุณภาพน ้านมแพะดิบ ในเขตหนองจอก กรุงเทพมหานคร. กรุงเทพมหานคร. ปิยะวรรณ กาสลัก. (2540). เอกสารประกอบการสอน Food Microbiology laboratory 305 312. สาขาเทคโนโลยีอาหาร.ส านักเทคโนโลยีการเกษตร. มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสุรนารี. ฝ่ายแบคทีเรียล าไส้สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สาธารณสุขกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์. (2557). Escherichia coli. มาตรฐานฟาร์มโคนม. (ม.ป.ป). [ออนไลน์]. สืบค้นจาก : http://www.goodonefeed.com/ 14508379/มาตรฐานการทาฟาร์มโคนม เรื่องน่ารู้ของนมนมนม. (2555). [ออนไลน์]. สืบค้นจาก : http://www.dek-d.com/board/view/ 927973/ สาวิตรี วทัญญูไพศาล. (2549). การตรวจหาเชื อ Listeria monocytogenes ในผลิตภัณฑ์ไส้ กรอก และการท้าลายเชื อด้วยเตาอบไมโครเวฟ. มหาวิทยาลัยราชภัฏยะลา. สุทธิทัศน์ ทองคาใส กนกวรรณ สิงห์อาษา ธาริณี ทับทิม กุลชัย นาคบุปผา เตือนตา ชาญศิล และสิริ กัญญ์ กาหยี. (2556). เชียงใหม่สัตวแพทยสาร. 13 (1), 43-49. Available : http://www.foodnetworksolution.com/wiki/word/1197/staphylococcus- aureus Aygun, O., and Pehlivanlar, S. (2006). Listeria spp. in the raw milk and dairy products in Antakya, Turkey. Food Control. 17 (8), 676–679. Cappuccino, J. G., and Sherman, N. (1998). Microbiology: a laboratory manual, 5th ed. Benjamin/Cummings Science. California. 470 p. Hussain, M., Eiff, C. v., Sinha, B. Joost, I., Herrmann, M., Peters, G., and Becket, K. (2008). eap Gene as novel target for specific identification of Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Micrology. 46 (2), 470-476. Jamali, H., Paydar, M., Radmehr, B., Ismail, S., and Dadrasnia, A. (2015). Prevalence and antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus isolated from raw milk and dairy products. Food Control. 54, 383-388. Kupradit, C., Ruamkuson, D., Rodtong, S. and Ketudat-Cairns, M. 2013. Novel multiplex polymerase chain reaction and an oligonucleotide array for specific detection of the dominant foodborne bacterial pathogens in chicken meat. Afr. J. Microbiol. Res. 7(24): 3085-3095.

Salustiano, V.C., Andrade, N. J., Soares, N. F. F., Lima, J. C., P. C., Luiz, L. M. P., and Fernandes, P. E. (2009). Contamination of milk with Bacillus cereus by post- pasteurization surface exposure as evaluated by automated ribotyping. Food Control. 20, 439-442. United States Food and Drug Administration, (1998). Bacteriological analytical manual / Food and Drug Administration, 8th ed. MD: AOAC International, Gaithersburg.

ภาคผนวก A สีย้อมน ้ำยำทดสอบ และอำหำร

45

ภาคผนวก A สีย้อมน ้ำยำทดสอบ และอำหำร 1. Gram’s Stain 1.1 Crystal violet Solution A Crystal violet (85% dye) 2 g 95% Ethyl alcohol 20 m ละลำยสีในแอลกอฮอล์จนสีละลำยหมด Solution B Ammonium oxalate 0.8 g น ้ำกลั่น 80 ml ละลำย Solution A จนสีละลำยทั งหมด ถ้ำมีตะกอนให้กรองก่อนใช้ และถ้ำสีเข้มข้นเกินอำจ เจือจำง Solution A เป็น 1:10 ก่อนใช้ด้วย Ethyl alcohol แล้วค่อยผสมกับ Solution B 1.2 Safranin O Safranin O 2.5 g 95% Ethyl alcohol 100 ml เจือจำงด้วยน ้ำกลั่นในอัตรำส่วน 1:10 ก่อนใช้ ถ้ำตกตะกอนให้กรองก่อนใช้ 1.3 Gram’s iodine solution (mordant) Iodine (crystal) 1 g Potassium iodide (KI) 2 g น ้ำกลั่น 300 g ละลำย iodine และ KI ในน ้ำกลั่นปริมำณน้อย ๆ ก่อน แล้วค่อยปรับปริมำตร เก็บไว้ในขวด สีชำ 1.4 Alcohol-acetone (decolorizer) 95% Ethyl alcohol 250 ml Acetone 250 ml 2. Endospore staning 2.1 Malachite green 2.2 Safranin O

46

3. น ้ำยำทดสอบและสำรละลำยบัฟเฟอร์ 3.1 lndole test (United States Food and Drug Administration, 1998) Kovacs’ reagent p-dimethylaminobenzaldehyde 5 g Amyl alcohol 75 ml HCl (concentrated) 25 ml ละลำย 5 กรัม p-dimethylaminobenzaldehyde ใน 75 ml amyl alcohol แล้วค่อย ๆ เติม HCl ช้ำ ๆ เก็บสำรละลำยที่ 4°C 3.2 Methyl red-indicator compound Methyl red 0.1 g 95% Ethyl alcohol 300 ml ละลำย 0.1 กรัม Methyl red ใน 95% Ethy alcohol 300 ml ปรับปริมำตรด้วยน ้ำกลั่น ให้ได้ 500 ml 3.3 Nitrate reduction test (United States Food and Drug Administration, 1998) Solution A (Sulfanilic acid reagent) Sulfanilic acid 1 g 5 N Acetic acid 125 ml Solution B (N-(l-naphthyl) Ethylenediamine reagent) N-(1-naphthyl) Ethylenediamine dihydrochloride 0.25 g 5 N Acetic acid 200 ml Solution C (α-Naphthol reagent) α-Naphthol 1 g 5 N Acetic acid 200 ml เตรียมสำรละลำย 5 N กรดอะซิติก โดยเติม 28.75 ml กรดอะซิติกเข้มข้น (glacial acetic) ลงในน ้ำกลั่น 71.25 ml เก็บสำรละลำยในขวดสีชำ 3.4 Voges-Proskauer (VP) (United States Food and Drug Administration, 1998) Barritt’s reagent A α-Naphthol 5 g Absolute alcohol 100 ml

47

Barritt’s reagent B Potassium hydroxide (KOH) 40 g ปรับปริมำตรด้วยน ้ำกลั่น 100 ml 3.5 50X Tris-acctrte EDTA (TAE) Tris base 242 g Glacial acetic acid 57.1 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) 100 ml ปรับปริมำตรด้วยน ้ำกลั่นให้ได้ 100 ml 4. อำหำรเลี ยงเชื อ 4.1 MR-VP broth (United States Food and Drug Administration, 1998) Peptone 5 g Glucose 5 g Dipotassium phosphate (K2HPO4) 5 g ละลำยสำรแต่ละชนิดเข้ำด้วยกัน และปรับ pH, 7.5±0.2 และปรับปริมำตรด้วยน ้ำกลั่นให้ได้ 100 ml แล้วน้ำไปนึ่งฆ่ำเชื อที่อุณหภูมิ 121°C เป็นเวลำ 15 นำที 4.2 Nutrient agar (NA) (ปิยะวรรณ, 2540) Beef extract 3 g Peptone 5 g Agar 15 g ละลำยสำรแต่ละชนิดเข้ำด้วยกัน และปรับ pH 7.0±0.2 และปรับปริมำตรด้วยน ้ำกลั่นให้ได้ 100 ml แล้วน้ำไปนึ่งฆ่ำเชื อที่อุณหภูมิ 121°C เป็นเวลำ 15 นำที 4.3 Purple Carbohydrate broth based, 0.5% carbohydrate (United States Food and Drug Administration, 1998) Proteose peptone 10 g Beef extract 1 g Sodium chloride 5 g Bromocresol purple 0.02 g ละลำยสำรแต่ละชนิดเข้ำด้วยกัน และปรับ pH 6.8±0.2 และปรับปริมำตรด้วยน ้ำกลั่นให้ได้ 800 ml แบ่งอำหำรที่ละลำยปริมำตร 2 ml ลงในหลอดที่มีหลอดดักแก๊สแล้วน้ำไปฆ่ำเชื อที่อุณหภูมิ 118°C เป็นเวลำ 15 นำที เตรียมสำรละลำยน ้ำตำล 2.5% glucose และ mannitol กรองน ้ำตำล 48

ผ่ำนตัวกรองปลอดเชื อขนำดเส้นผ่ำนศูนย์กลำง 0.2 µm ลงในขวดปลอดเชื อ จำกนั นเติมสำรละลำย น ้ำตำลลงในอำหำรทดสอบในปริมำตร 0.5 ml 4.4. Trypticase nitrate broth (Cappuccino and Sherman, 1999) Trypticase 20 g Disodium phosphate (Na2HPO4) 2 g Dextrose 1 g Agar 1 g Potassium nitrate (KNO3) 1 g ละลำยสำรแต่ละชนิดเข้ำด้วยกันและปรับปริมำตรด้วยน ้ำกลั่นให้ได้ 1000 ml น้ำไปนึ่งฆ่ำ เชื อที่อุณหภูมิ 121°C เป็นเวลำ 15 นำที 4.5. Trypticase Soy agar (TSA) Trypticase 15 g Proteose peptone 5 g Sodium chloride 15 g Agar 15 g ปรับปริมำตรด้วยน ้ำกลั่นให้ได้ 1000 ml น้ำไปนึ่งฆ่ำเชื อที่อุณหภูมิ 121°C เป็นเวลำ 15 นำที

49

ภาคผนวก B วิธีกำรทดสอบคุณสมบัติทำงสัณฐำนวิทยำและปฏิกิริยำชีวเคมี

ภาคผนวก B วิธีการทดสอบคุณสมบัติทางสัณฐานวิทยาและปฏิกิริยาชีวเคมี 45

50

ภาคผนวก B วิธีการทดสอบคุณสมบัติทางสัณฐานวิทยาและทางเคมี 1.คุณสมบัติทางสัณฐานวิทยา 1.1 การย้อมสีแกรม เลี้ยงเชื้อที่ต้องการทดสอบบนอาหาร TSA บ่ม 35◦C 24 ชั่วโมง เตรียมสไลด์ ส าหรับการย้อม จากนั้น Fix slide ด้วยเปลวไฟโดยหงายด้านที่มีเชื้อขึ้น ผ่านด้านล่างของ slide ไป มาเหนือเปลวไฟ 2-3 ครั้ง (Heat fix) ซึ่งต้องระวังไม่ให้โดนความร้อนมากเกินไปเพราะจะท าให้แตก หรือเสียรูปร่างได้ แล้วหยดสารละลาย crystral violet จนท่วมสไลด์ ทิ้งไว้ 1 นาทีแล้วล้างออกด้วย น้ า แล้วหยดสารละลายไอโอดีน จนท่วมสไลด์ ทิ้งไว้ 1 นาทีแล้วล้างออกจากนั้นล้างออกโดยค่อยๆ หยด 95 % Ethanol เอียงสไลด์ไปมาจนกระทั่งสีน้ าเงินเริ่มจางแล้วจึงรีบล้างออกด้วยน้ า แล้วหยด safranin ให้ท่วมทิ้งไว้ 30 วินาที แล้วล้างออกด้วยน้ า ซับน้ าด้วยกระดาษหรือผ้า และทิ้งไว้ให้แห้ง จากนั้นก็ตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ด้วยก าลังขยาย 100 เท่า 1.2 การย้อมสปอร์ เลี้ยงเชื้อที่ต้องการทดสอบบนอาหาร TSA บ่ม 35◦C 48 ชั่วโมง ใช้ loop แตะ เชื้อ 1-3 ลูปแตะลงบนสไลด์ smear ออกให้เป็นฟิล์มบางๆ ให้แตะน้ าลงบนสไลด์แล้วเขี่ยเชื้อมาผสม กับน้ าให้กระจายเข้ากันดี ทิ้งไว้ในอากาศให้แห้ง น าแผ่นสไลด์ไปผ่านเปลวไฟจากตะเกียงแอลกอฮอล์ อย่างรวดเร็ว (heat fix) โดยให้ผ่านเปลวไฟอย่างรวดเร็ว 3 – 4 ครั้ง จากนั้นหยดสารละลาย Crystal violet ลงบนรอย smear ทิ้งไว้ 1 นาที แล้วค่อย ๆ ใช้น้ าล้างออก หยดสารละลาย iodine ลงบน รอย smear ทิ้งไว้ 1 นาที แล้วค่อย ๆ ใช้น้ าล้างออก หยดสารละลายแอลกอฮอล์ 95% ทิ้งไว้ 20 วินาที แล้วรีบล้างออกด้วยน้ าทันที จากนั้นหยดสารละลาย malachite green ทิ้งไว้ 5 นาทีที่วางบน ไอน้ าต้มเดือด ทิ้งสไลด์ให้เย็น แล้วล้างด้วยน้ า จากนั้นหยดสารละลาย safranin ทิ้งไว้ 1 นาที จากนั้นค่อย ๆ ใช้น้ าล้างออก และทิ้งให้แห้งแล้วน าไปดูแกรมและการเรียงตัวของเซลล์ ภายใต้กล้อง จุลทรรศน์ด้วยก าลังขยาย 100 เท่า 2. คุณสมบัติทางชีวเคมี 2.1 Methyl red (MR) test เขี่ยเชื้อที่ต้องการทดสอบบนอาหาร TSA ที่ผ่านการบ่ม 35◦C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ย้ายเชื้อจาก TSA ลงในอาหารทดสอบ MR-VP broth บ่มเชื้ออาหารอุณหภูมิ 37◦C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แบ่งอาหาร MR-VP ใส่ในหลอดเปล่า ในปริมาตร 1 ใน 2 ของหลอด ที่เหลือแบ่งไว้ทดสอบ ปฏิกิริยา VP test หยด methyl red indicator ลงใน MR-VP broth 5 หยด และเขย่าเบา ๆ บันทึก ผลการทดลองที่เกิดขึ้น

51

2.2 Voges-Proskauer (VP) test น าอาหารที่แบ่งไว้จากการทดสอบ Methyl red (ข้อ 2.1) มาทดสอบปฏิกิริยา VP test หยด barritt’s reagent A ลงใน MR-VP broth 10 หยด และเขย่าเบา ๆ จากนั้นหยด barritt’s reagent B 10 หยด ในทันที เขย่าอีกครั้ง และเขย่าทุก ๆ 3-4 นาที จนครบ 15 นาที บันทึกผลการทดลองที่เกิดขึ้น 2.3 Oxidase test เลี้ยงเชื้อที่ต้องการทดสอบจากอาหาร TSA บ่ม 35◦C 18-24 ชั่วโมง หยด สารละลายทดสอบ คือ 1% N,N,N,N-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride

(C10H18Cl2N2) ลงบนผิวหน้าของโคโลนีที่เจริญบนอาหารวุ้น TSA สังเกตการเปลี่ยนสีของสารละลาย ทดสอบเป็นสีน้ าเงินเข้มถึงด าภายในเวลา 10–30 วินาที บันทึกผลการทดลองที่เกิดขึ้น 2.4 Catalase test เขี่ยเชื้อที่ต้องการทดสอบจากอาหาร TSA ที่ผ่านการบ่มที่ 35◦C 18-24 ชั่วโมง ไปวางบนสไลด์แล้วหยด 3% hydrogen peroxide (H2O2) สังเกตการเกิดฟองก๊าซ บันทึกผลการ ทดลองที่เกิดขึ้น 2.5 Coagulase test เขี่ยเชื้อที่ต้องการทดสอบจากอาหาร TSA ที่ผ่านการบ่มที่ 35◦C 24 ชั่วโมง แทงลงในอาหารวุ้น Baird parker ager ที่มีส่วนประกอบของ fibrinogen plasma trypsin inhibitor supplement บ่ม 35◦C 18-24 ชั่วโมง ดูการเปลี่ยนแปลงของอาหารที่เกิดโซนรอบ ๆ โคโลนี บันทึกผลการทดลองที่เกิดขึ้น 2.6 Carbohydrate fermentation test เขี่ยเชื้อที่ต้องการทดสอบจากอาหาร TSA ที่ผ่านการบ่มที่ 35◦C 24 ชั่วโมง ลง ในอาหารทดสอบ purple carbohydrate fermentation broth ที่มี glucose และ mannitol เป็น แหล่งคาร์บอนบ่ม 37oC ในสภาวะไร้ออกซิเจนเป็นเวลา 24-48 ชั่วโมงบันทึกผลการสร้างกรดใน อาหารทดสอบจากสีม่วงเป็นสีเหลือง 2.7 Rhizoid growth เขี่ยเชื้อที่ต้องการทดสอบบนอาหาร TSA บ่ม 35◦C 24 ชั่วโมง แตะบนอาหาร nutrient agar (NA) บ่ม 30◦C เป็นเวลา 7 วันบันทึกการเจริญของโคโลนี

52

2.8 Lysozyme resistant test เขี่ยเชื้อที่ต้องการทดสอบจากอาหาร TSA ที่ผ่านการบ่มที่ บ่ม 35◦C 24 ชั่วโมง ลงในอาหารเหลว nutrient broth (NA) ที่มี 0.001% lysozyme บ่มเชื้อที่ 35◦C 24 ชั่วโมงบันทึก ผลการเจริญในอาหารทดสอบ 2.9 Nitrate reduction test เขี่ยเชื้อที่ต้องการทดสอบจากอาหาร TSA ที่ผ่านการบ่มที่ 35◦C 24 ชั่วโมง ลง ในอาหารทดสอบ trypticase nitrate broth บ่ม 37◦C 24 ชั่วโมง หยดสารละลาย A 10 หยด และ หยดสารละลาย B 10 หยด สังเกตการเปลี่ยนสีของอาหารทดสอบและบันทึกผล หากไม่เกิดการ เปลี่ยนสีให้เติมผงสังกะสีลงไป และสังเกตการเปลี่ยนแปลงของสีของอาหารทดสอบ 2.10 ทดสอบการเกิด β-hemolysis ในอาหารวุ้นที่มีเลือดแกะ 5% (sheep blood) เป็นองค์ประกอบและน า โคโลนีเดี่ยวของเชื้อที่คาดว่าเป็น L. monocytogenes ที่เจริญบน TSAye ย้ายลงมาในอาหารเหลว TSBye และบ่มที่อุณหภูมิ 35◦C เวลา 24 ชั่วโมงใช้ needle ย้ายเชื้อจาก TSBye ที่ผ่านการบ่มที่ อุณหภูมิ 35◦C เวลา 24 ชั่วโมง แทงตรง ๆ ลงในอาหารทดสอบที่มีเลือดแกะ 5% เป็นองค์ประกอบ ซึ่งเทค่อนข้างหนาโดยใช้ L. innocua เป็น negative control บ่มที่อุณหภูมิ 35◦C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง สังเกตลักษณะโคโลนีที่เกิดการสลายเม็ดเลือดแดง โดยสังเกตการเปลี่ยนสีของอาหารที่มี เลือดเป็นองค์ประกอบ (ซึ่งเกิดการสร้างโซนสีเหลืองใสรอบๆบริเวณที่มีการเจริญ) 2.11 การทดสอบ CAMP test เป็นปฏิกิริยาที่ใช้ในการยืนยันผลที่ได้จากการท า β-hemolysis เนื่องจากการ เกิดปฏิกิริยาการย่อยสลายเลือดแกะจาก L. monocytogenes อาจไม่ชัดเจน ดังนั้นจึงต้องใช้ ปฏิกิริยา CAMP test ในการยืนยันผลโดยท าการขีดเชื้อ S. aureus และ Rhodococcus equi ทั้ง สองด้านของ blood ager ที่ใช้ในการทดสอบปฏิกิริยา β-hemolysis โดยขีดเชื้อละ 1 เส้น ลงบน sheep blood agar plate ซึ่งเส้นที่ลากต้องขนานและอยู่ตรงข้ามกันจากนั้นใช้ loop ขีดเชื้อ Listeria spp. ที่ต้องการทดสอบให้ตั้งฉากระหว่าง S. aureus และ R.equi โดยการขีดจากด้านขวา ไปด้านซ้าย จากนั้นบ่มที่อุณหภูมิ 35 ◦C เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง และตรวจสอบการเกิด hemolysis ที่เกิดขึ้น

53