การตรวจเชื้อ Bacillus cereus, Staphylococcus aureus และ Listeria monocytogenes ในน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านม ในพื้นที่จังหวัดนครราชสีมา นายกิตติศักดิ์ วงศ์อนุ นายณัฐวุฒิ นามสีฐาน นายวิสุทธิ์ ท้าเจริญตระกูล รายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์นี้เป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรเทคโนโลยีบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีผลิตภัณฑ์นม (ต่อเนื่อง) คณะวิทยาศาสตร์และศิลปศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลอีสาน ปีการศึกษา 2558 การตรวจเชื้อ Bacillus cereus, Staphylococcus aureus และ Listeria monocytogenes ในน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านมในพื้นที่จังหวัดนครราชสีมา นายกิตติศักดิ์ วงศ์อนุ นายณัฐวุฒิ นามสีฐาน นายวิสุทธิ์ ท้าเจริญตระกูล รายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์นี้เป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรเทคโนโลยีบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีผลิตภัณฑ์นม (ต่อเนื่อง) คณะวิทยาศาสตร์และศิลปศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลอีสาน ปีการศึกษา 2558 Detection of Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in raw milk from milk collection center of Nakhon Ratchasima province Kittisak Wongau Natthawut Namsithan Wisut Tromchaintrakool A Project Report Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Bachelor of Technology Program in Dairy Technology (Continuing Program) Faculty of Sciences and Liberal Arts Rajamangala University of Technology Isan Academic Year 2015 รายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์ การตรวจเชื้อ Bacillus cereus, Staphylococcus aureus และ Listeria monocytogenes ในน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านมในพื้นที่ จังหวัดนครราชสีมา (Detection of Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in raw milk from milk collection center of Nakhon Ratchasima province) นักศึกษา 1. นายกิตติศักดิ์ วงศ์อนุ 2. นายณัฐวุฒิ นามสีฐาน 3. นายวิสุทธิ์ ท้าเจริญตระกูล คณะกรรมการที่ปรึกษา 1. ดร.ชนิดา กุประดิษฐ์ 2. ดร.ศศิธร อินทร์นอก 3. ดร.จิรายุส วรรัตน์โภคา หลักสูตร เทคโนโลยีบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีผลิตภัณฑ์นม (ต่อเนื่อง) สาขาวิชา ชีววิทยาประยุกต์ ปีการศึกษา 2558 สาขาวิชาชีววิทยาประยุกต์ คณะวิทยาศาสตร์และศิลปศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยี ราชมงคลอีสาน อนุมัติให้รายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์นี้เป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาหลักสูตร เทคโนโลยีบัณฑิต .............................................................. (ดร.ศศิธร อินทร์นอก) หัวหน้าสาขาวิชาชีววิทยาประยุกต์ คณะกรรมการสอบรายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์ ………………………….... ประธานกรรมการ (ดร.ชนิดา กุประดิษฐ์) ………………………...… กรรมการ (ดร.ศศิธร อินทร์นอก) ………………………….… กรรมการ (ดร.จิรายุส วรรัตน์โภคา) 24 พฤษภาคม 2559 ลิขสิทธิ์ของสาขาวิชาชีววิทยาประยุกต์ คณะวิทยาศาสตร์และศิลปศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลอีสาน ก รายงานโครงงานฉบับสมบูรณ์ การตรวจเชื้อ Bacillus cereus, Staphylococcus aureus และ Listeria monocytogenes ในน้้านมดิบจากศูนย์รับน้้านมในพื้นที่ จังหวัดนครราชสีมา นักศึกษา 1. นายกิตติศักดิ์ วงศ์อนุ 2. นายณัฐวุฒิ นามสีฐาน 3. นายวิสุทธิ์ ท้าเจริญตระกูล คณะกรรมการที่ปรึกษา 1. ดร.ชนิดา กุประดิษฐ์ 2. ดร.ศศิธร อินทร์นอก 3. ดร.จิรายุส วรรัตน์โภคา หลักสูตร เทคโนโลยีบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีผลิตภัณฑ์นม (ต่อเนื่อง) สาขาวิชา ชีววิทยาประยุกต์ ปีการศึกษา 2558 บทคัดย่อ ในจังหวัดนครราชสีมามีศูนย์รับน้้านมดิบเป็นจ้านวนมาก แต่ยังขาดข้อมูลของการ แยกและคุณลักษณะของเชื้อก่อโรคในน้้านมดิบ ดังนั้นวัตถุประสงค์ในงานวิจัยนี้คือ ส้ารวจความชุก และคุณลักษณะของเชื้อก่อโรค ได้แก่ Bacillus cereus Listeria monocytogenes และ Staphylococcus aureus จากตัวอย่างน้้านมดิบ 33 ตัวอย่างในศูนย์รับน้้านมดิบ 9 แห่งซึ่งตั้งอยู่ใน จังหวัดนครราชสีมา ระหว่างเดือนกุมภาพันธ์ถึงมีนาคม พ.ศ. 2559 ผลการส้ารวจแสดงให้เห็นว่า ไม่ พบการปนเปื้อนของเชื้อ L. monocytogenes ในตัวอย่างน้้านมที่น้ามาทดสอบ และพบว่าความชุก ข อ ง เ ชื้ อ B. cereus แ ล ะ S. aureus คื อ 6% (20 – 2.0 × 104 CFU/ml) แ ล ะ 54% (85 – 2.7 × 104 CFU/ml) ตามล้าดับ เชื้อ B. cereus และ S. aureus ที่แยกได้ ถูกน้าไประบุเชื้อ ด้วยปฏิกิริยาชีวเคมีและมัลติเพลกซ์พีซีอาร์ (m-PCR) ด้วยการใช้ไพร์เมอร์ (primers) ที่จ้าเพาะต่อยีน (gene specific primers) และ 16S rDNA primers โดยยีนเป้าหมายส้าหรับการตรวจเชื้อ S. aureus และ B. cereus คือ eap gene และ Enterotoxin FM gene ตามล้าดับ ผลการทดสอบ พบว่า รูปแบบการเกิดปฏิกิริยาชีวเคมีในแต่ละ isolate มีความแปรผันที่แตกต่างกันเพียงเล็กน้อย อย่างไรก็ตาม พบผลิตภัณฑ์ PCR ขนาด 230 bp จากยีน eap และ 513 bp จากยีน Enterotoxin FM ในเชื้อ S. aureus ทั้ง 27 isolates (จาก 17 ตัวอย่าง) และเชื้อ B. cereus 6 isolates (จาก 2 ตัวอย่าง) ตามล้าดับ การปนเปื้อนของเชื้อก่อโรคเหล่านี้อาจมาจากปัญหาในด้านสุขลักษณะของ ฟาร์มโคนมและศูนย์รับน้้านมดิบในบริเวณนั้น ๆ จากข้อมูลที่ได้ในงานวิจัยนี้ชี้ให้เห็นว่า การบริโภค น้้านมดิบที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื้ออาจเป็นสาเหตุให้เกิดโรคที่เกี่ยวข้องกับเชื้อก่อโรคที่มาจากอาหารได้ ข ค าส าคัญ: Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, น้้านมดิบ ค Project Report Title Detection of Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in raw milk from milk collection center of Nakhon Ratchasima province By 1. Mr.Kittisak Wongau 2. Mr.Natthawut Namsithan 3. Mr.Wisut Tromchaintrakool Project Report Advisor 1. Dr.Chanida Kupradit 2. Dr.Sasidhorn Innok 3. Dr.Jirayus Woraratphoka Program Dairy Technology (Continuing Program) Department Applied Biology Academic Year 2015 Abstract There are numerous numbers of raw milk collection centers in Nakhon Ratchasima but lack information of the isolation and characterization of foodborne pathogens in raw milk. Therefore, the purpose of this research was to investigate the prevalence and characterization of foodborne pathogens include Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus from 33 raw milk samples of 9 different raw milk collection centers located in Nakhon Ratchasima between February and March 2016. The contaminations of L. monocytogenes were not detected in any of the raw milk sample tested. The prevalence of B. cereus and S. aureus in raw milk samples were found to be 6% (20 – 2.0 × 104 CFU/ml) and 54% (85 – 2.7 × 104 CFU/ml), respectively. Several isolates of B. cereus and S. aureus were identified by biochemical reactions and multiplex polymerase chain reaction (m-PCR) using gene specific and 16S rDNA primers. The target genes for specific detection of S. aureus and B. cereus were eap gene and Enterotoxin FM gene, respectively. Minor variation of biochemical profiles were found among isolates. However, the PCR products of 230 bp from eap gene and 513 bp from Enterotoxin FM gene were observed from 27 isolates of S. aureus (from 17 samples) and 6 isolates of B. cereus (from 2 samples), respectively. The contamination of these pathogens should be the sanitation problems in dairy farms and raw milk collection centers in those areas. Based on the results obtained from these investigations, consumption of unpasteurized raw milk might be cause of human foodborne disease. Key Words: Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, raw milk ง กิตติกรรมประกาศ โครงงานวิทยาศาสตร์ที่นักศึกษาท้าการศึกษาค้นคว้าทดลองครั้งนี้ ได้รับการสนับสนุน ให้ค้าปรึกษา ให้การอนุเคราะห์ด้านวัสดุอุปกรณ์ และสถานที่ปฏิบัติงาน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ดร. ชนิดา กุประดิษฐ์ ดร. ศศิธร อินทร์นอก และดร. จิรายุส วรรัตน์โภคา ที่ให้ค้าปรึกษาระหว่างการ ทดลอง การแก้ปัญหาอุปสรรคต่าง ๆ ข้อชี้แนะและความช่วยเหลือ จนกระทั่งโครงงานส้าเร็จลุล่วงไป ได้ด้วยดี คณะผู้จัดท้าขอกราบขอบพระคุณอย่างสูงมา ณ ที่นี้ ขอกราบขอบพระคุณอาจารย์ที่ปรึกษา ที่ให้ความกรุณาในการแก้ไขข้อบกพร่องต่างๆ ของ โครงงานและให้ความรู้ ให้ค้าแนะน้าทั้งก้าลังใจ ท้ายสุดนี้คณะผู้จัดท้าหวังเป็นอย่างยิ่งว่า ข้อมูลในโครงงานนี้จะเป็นประโยชน์ต่อการศึกษา และผู้ที่สนใจต่อไป กิตติศักดิ์ วงศ์อนุ ณัฐวุฒิ นามสีฐาน วิสุทธิ์ ท้าเจริญตระกูล จ สารบัญ เรื่อง หน้า บทคัดย่อภาษาไทย ก บทคัดย่อภาษาอังกฤษ ค กิตติกรรมประกาศ ง สารบัญ จ สารบัญรูปภาพ ช สารบัญตาราง ซ บทที่ 1 บทน า 1 1.1 ที่มาและความส าคัญ 1 1.2 วัตถุประสงค์ 3 1.3 ขอบเขตของการวิจัย 3 1.4 ประโยชน์ที่คาดว่าจะได้รับจากการวิจัย 3 บทที่ 2 ทฤษฎีและงานวิจัยที่เกี่ยวข้อง 4 2.1 ส่วนประกอบของนม 4 2.2 จุลินทรีย์ก่อโรคในอาหาร 5 2.3 มาตรฐานฟาร์มโคนม 12 2.4 งานวิจัยที่เกี่ยวข้อง 13 บทที่ 3 วิธีด าเนินการวิจัย 14 3.1 วัสดุและสารเคมีที่ใช้ในการวิจัย 14 3.2 อุปกรณ์และเครื่องมือที่ใช้ในงานวิจัย 15 3.3 วิธีการทดลอง 16 3.3.1 การเก็บตัวอย่าง 16 3.3.2 การตรวจสอบคุณภาพน้ านมดิบเบื้องต้น 17 3.3.3 การตรวจสอบการปนเปื้อนของเชื้อก่อโรค 17 3.3.4 การระบุตัวอย่างด้วยเทคนิค PCR 19 บทที่ 4 ผลการทดลอง 22 4.1 การตรวจสอบคุณภาพน้ านมเบื้องต้น 22 4.2 การตรวจสอบคุณสมบัติของเชื้อก่อโรคที่ทดสอบ 24 4.3 การระบุเชื้อด้วยเทคนิค PCR 37 ฉ สารบัญ (ต่อ) เรื่อง หน้า บทที่ 5 สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง 40 5.1 วิจารณ์ 40 5.2 สรุปผลการทดลอง 41 บรรณานุกรม ภาคผนวก ภาคผนวก A สีย้อมสารเคมีทดสอบ และอาหาร 44 ภาคผนวก B วิธีการทดสอบลักษณะทางสัณฐานวิทยาและคุณสมบัติการเกิด ปฏิกิริยาชีวเคมี 49 ช สารบัญรูปภาพ รูปภาพที่ หน้า ภาพที่ 2.1 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื้อ S. aureus 5 ภาพที่ 2.2 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื้อ B. cereus 7 ภาพที่ 2.3 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื้อ L. monocytogenes 8 ภาพที่ 2.4 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื้อ Salmonella spp. 9 ภาพที่ 2.5 ลักษณะรูปร่างเซลล์ของเชื้อ E. coli 11 ภาพที่ 4.1 ลักษณะโคโลนีของเชื้อ S. aureus บนอาหารวุ้น Baird Parker agar 25 ภาพที่ 4.2 การทดสอบ coagulase test ของเชื้อ S.aureus บนอาหาร Baird Parker agar ที่มี fibrinogen plasma trypsin inhibitor suppelment 25 ภาพที่ 4.3 ลักษณะโคโลนีเชื้อ B. cereus และเชื้อ isolate อื่น ๆ ที่แยกได้จาก ตัวอย่างน้ านมดิบบนอาหาร MYP agar 27 ภาพที่ 4.4 การเจริญเป็นแบบ galaxy shape บนอาหารวุ้น NA ที่อุณหภูมิ 30ºC เป็นเวลา 7 วัน 28 ภาพที่ 4.5 ลักษณะโคโลนีเชื้อ isolate อื่น ๆ ที่แยกได้จากตัวอย่างน้ านมดิบ บนอาหาร PALCAM agar 30 ภาพที่ 4.6 การเพิ่มปริมาณยีน eap ด้วยปฏิกิริยา multiplex PCR โดยใช้ SA_eap primers และ 16S rDNA primers 38 ภาพที่ 4.7 การเพิ่มปริมาณยีน Enterotoxin FM ด้วยปฏิกิริยา multiplex PCR โดยใช้ Ent_FM primers และ 16S rDNA primers 39 ซ สารบัญตาราง ตางรางที่ หน้า ตารางที่ 3.1 ข้อมูลศูนย์รับน้ านมดิบที่ท าการเก็บตัวอย่างในพื้นที่จังหวัดนครราชสีมา 16 ตารางที่ 3.2 Primers ที่ใช้ในการระบุเชื้อด้วยเทคนิค m-PCR 21 ตารางที่ 4.1 ผลการตรวจสอบคุณภาพน้