M MECHERARA-IDJERI Samira-Faiza Sujet

N°d’ordre : 17 / 2007-E/CH

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE HOUARI BOUMEDIENE (U.S.T.H.B.) ALGER

FACULTE DE CHIMIE

THESE Présentée pour l’obtention du diplôme de Doctorat d’Etat

En CHIMIE

Spécialité : CHIMIE ORGANIQUE APPLIQUEE

Par Mme MECHERARA-IDJERI Samira-Faiza

Sujet :

EXTRACTION DES HUILES ESSENTIELLES DE TROIS ESPECES DE PISTACIA : P. LENTISCUS L., P. TEREBINTHUS L. ET P. ATLANTICA DESF. ET CARACTERISATION PAR CPG, CPG-SM ET RMN 13C

Soutenue publiquement le : 17 / 12 /2007, devant le Jury composé de :

Mr B.Y MEKLATI Professeur (U.S.T.H.B.) Président Mme A. HASSANI Professeur (ENS Kouba.) Directeur de thèse Mr J. CASANOVA Professeur (U. Corse, France) Examinateur Mr A. BAALIOUAMER Professeur (U.S.T.H.B.) Examinateur Mr M.H. GUERMOUCHE Professeur (U.S.T.H.B.) Examinateur Mr B. NEDJEMI Professeur (ENS Kouba) Examinateur Mr N. SABAOU Professeur (ENS Kouba) Examinateur

Remerciements

. Ce travail a été réalisé au laboratoire d’Analyse Organique Fonctionnelle de la faculté de Chimie de l’université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene sous la direction de Madame A. Hassani, Professeur à l’Ecole Normale Supérieure et au laboratoire de L’équipe de « Chimie et Biomasse » de l’Université de Corse, sous la direction du Professeur J. Casanova.

Je tiens tout particulièrement à remercier Madame le Professeur Aicha Hassani de m’avoir proposé ce sujet et de m’avoir guidé tout au long de ce travail. Je lui suis par ailleurs reconnaissante pour la liberté qu’elle m’a accordée dans les orientations de mes recherches et pour la confiance qu’elle m’a toujours témoignée. Qu’elle trouve ici ma profonde gratitude.

Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance au Professeur Joseph Casanova de m’avoir accueillie au sein de son équipe. Sa grande expérience et ses précieux conseils ont permis la réalisation de cette thèse. Je lui suis également reconnaissante pour sa grande disponibilité, son dévouement incomparable, pour ses encouragements constants à mon égard et à la confiance qu’il m’a accordée. Je garde un souvenir émouvant et inoubliable du contact que j’ai eu avec lui mais également avec toute son équipe.

Je suis très sensible à l’honneur que me fait le Professeur B.Y. Meklati directeur du Centre de Recherche Scientifique et Technique en Analyse physico- chimique (CRAPC) d’avoir accepté de présider le jury de cette thèse. Qu’il trouve ici mes sincères remerciements pour ces encouragements incessants.

Que Monsieur le Professeur B.A Baaliouameur, directeur du laboratoire d’Analyse Organique Fonctionnelle (Faculté de Chimie) qui a accepté de participer au jury de cette thèse trouve ici l’expression de mes sincères remerciements pour ses conseils éclairés et l’intérêt qu’il a bien voulu porter à ce travail.

Je suis très sensible à l’honneur que me font Monsieur le Professeur H. Guermouche (faculté de Chimie USTHB), Monsieur le Professeur B. Nedjemi (Ecole Normale Supérieure) pour avoir accepté d’être les rapporteurs de ce travail. Je suis très heureuse de bénéficier de leurs recommandations et je tiens à leur exprimer ma sincère reconnaissance pour cette marque d’intérêt. Je tiens à remercier Monsieur le Professeur N. Sabaou (Ecole Normale Supérieure) de m’avoir permis de réaliser les analyses microbiologiques dans son laboratoire et d’avoir accepté de juger ce travail. Qu’il trouve ici mes sincères remerciements.

Mes remerciements vont aussi à Monsieur le Professeur Y. Badjah Hadj Ahmed pour son aide et pour sa disponibilité de chaque instant.

Je remercie Monsieur A. Zitouni Maître de Conférence à l’Ecole normale Supérieure, de m’avoir initiée aux techniques de l’analyse microbiologique.

Je ne saurai oublier tous mes amis de l’équipe du laboratoire d’Analyse Organique Fonctionnelle ainsi qu’au personnel du CRAPC pour leur disponibilité et leur aide à la réalisation de ce travail.

Je tiens encore à remercier toute l équipe de « Chimie et biomasse »de l’université de Corse (Joséphine Ottavioli Kai Liu, Vincent Castola, Felix Tomi, Ange Bighelli, Pascale Bradesi, Dominique de Rocca serra, Cathy Lugrezi et Marie- Christine) pour l’intérêt qu’ils ont porté à mon travail ainsi que pour leur sympathie, leurs discussions fructueuses et leur bonne humeur au sein du laboratoire.

Je tiens à remercier également mes amies : Hakima, Leila, Nadia, radia, kahina, fahima, leila Bousmaha pour leur soutient permanent et leur amitié.

Merci à tous ceux qui me liront et qui y trouveront un intérêt….

DÉDICACES

A ma grand-mère lalla adorée que Dieu ait son âme.

A mes parents

A mon mari

A maria, feriel et adlane

A mes sœurs wahiba et zola

A mon frère bachir et à ma belle-sœur souad

A mon beau-frère mohamed

A ma tante massika

A toute ma famille et à tous mes amis.

SOMMAIRE

Introduction 1

PARTIE I : Etude bibliographique sur les extraits naturels, leurs modes d’extraction et leurs méthodes d’analyse Chapitre I : Etude botanique du genre Pistacia I- Introduction 3 II- L’espèce Pistacia lentiscus L. a- Etude botanique : 5 b- Propriétés naturelles et emplois. 6 III- L’espèce Pistacia térébinhtus L. a- Etude botanique : 7 b- Propriétés et emploi : 8 IV- L’espèce Pistacia atlantica Desf. : a- Etude botanique 9 b- Propriétés et emploi 9 Chapitre II : Les huiles essentielles I- Définition 11 II- Localisation dans la plante 11 III- Procédés d’obtention des huiles essentielles 12 III-1-Distillation : 12 a- L’hydrodistillation 12 b- Distillation à la vapeur d’eau 13 III-2- Expression à froid : 13 III-3- Enfleurage : 13 III-4- Extraction par solvant organique : 13 III-5- Distillation-extraction simultanée : 14 III-6- Extraction au fluide supercritique : 14 IV- Composition chimique des extraits volatils 15 Chapitre III : Les méthodes d’analyses des mélanges naturels I- Introduction 16 II- Analyse par les couplages « en ligne » (voie A) 17 II-1- La chromatographie en phase gazeuse (CPG) 17 II-2- Couplage chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (CPG-SM) 18 II-3- Couplage CPG multidimensionnelle-SM 19 II-4- Couplage CPG/IRFT et CPG/IRFT/SM 20 II-5- Couplage chromatographie liquide à haute performance 21 (CLHP)/SM et CLHP/CPG/SM II-6- Couplage CLHP/RMN-1H 21 III- Identification des constituants après purification : VOIE B 23 IV- Analyse par RMN du carbone-13 sans séparation préalable : VOIE C 24 IV.1. Intérêt de la RMN du carbone-13 24 IV.2. Identification des constituants en mélange 25 IV-2-1- Observation et individualisation des signaux 25 IV-2-2- Attribution des signaux 26 IV-2-3 Quelques exemples d’analyse en mélange par 27 RMN du 13C

IV-3- La méthode d’analyse développée au laboratoire 28 de l’équipe « Chimie et Biomasse » V- Problématique de la recherche 31

PARTIE II : Caractérisation d’huiles essentielles et d’extraits aux solvants de Pistacia lentiscus. L (Anacardiaceae) Chapitre I : Etude bibliographique de la composition chimique des huiles essentielles du Pistacia. lentiscus L. 33

Chapitre II : Analyse de divers échantillons d’huiles essentielles de lentisque II-1 Lieu de récolte et méthode d’extraction 38 II-2 Rendement d’extraction 39 II-3- Indices physiques 40 II-4- Analyse par CPG ET CPG-SM 40 II-5 Bilan de l’étude sur Pistacia lentiscus 47

Chapitre III : Evaluation de la Cinétique d’extraction sur le rendement et la composition chimiques des huiles essentielles des feuilles de lentisque. III-1- Introduction 48 III-2- Variation du rendement en fonction du temps 49 III-3-Variation de la composition chimique en fonction du temps 52

Chapitre IV : Influence du mode d’extraction sur la composition en produits volatiles des feuilles de lentisque IV-1-Extraction par solvants organiques 56 IV-1-1- Introduction 56 IV-1-2- Méthode d’extraction 56 IV-1-3- Compositions chimiques des extraits 58 des feuilles de lentisque IV-1-4-Composition chimique des extraits de poudre de lentisque 63 IV-2- Extraction au fluide supercritique (EFS-CO2) 69 IV-2-1- Principe et propriétés des fluides supercritiques 69 IV-2-2- Application des technologies supercritiques : 70 VI-2-3-Echantillons et méthode d’extraction 70 IV-2-4- Compositions chimiques des extraits au SFE-CO2 71

Chapitre V : Variabilité Chimique intra spécifique des huiles essentielles de feuilles et de fruits de lentisque 78 V-1- Variabilité intra spécifique des huiles essentielles de feuilles 78 V-1-1- Echantillonnage 78 V-1-2- Composition chimiques des 17 échantillons 79 d’huiles essentielles V-1-2-3- Comparaison des huiles d’Algérie avec celles d’autres origines. 80

V-2- Caractérisation des échantillons d’huile essentielle de fruits 85 V-2-1- Echantillonnage 85 V-2-2- Composition chimique des neuf essences 85 V-2-3- Comparaison avec les données de la littérature 87

VI- Conclusion 90

Partie III : Utilisation de la RMN du carbone-13 pour la caractérisation des huiles essentielles des trois espèces de Pistacia et de l’huile végétale de lentisque. Etude antimicrobienne de ces extraits.

Chapitre I : Utilisation de la RMN du carbone 13 pour la caractérisation d’une huile essentielle de lentisque. 91

Chapitre II : Caractérisation des huiles essentielles du Pistacia Atlantica Desf. par CPG, RMN 13C et CPG-SM 96 II-1-Etude bibliographique de la composition chimique 96 des huiles essentielles du Pistacia atlantica Desf. II-2-Lieu de récolte et méthode d’extraction 97 II-3- Analyse d’un échantillon d’huile essentielle 97 par RMN-13C et par CPG II-4- Fractionnement de l’huile essentielle et analyse des fractions 101 II-5- Analyses par CPG, CPG-SM et RMN C-13 de différents échantillons d’huiles essentielles du P. Atlantica. 104 II-6- Comparaison de nos huiles essentielles avec celles reportées dans la littérature 108

Chapitre III : Caractérisation des huiles essentielles du Pistacia terebinthus L. III-1- Etude bibliographique 109 III-2- Echantillonnage et méthode d’extraction 111 13 III-3- Analyse par CPG et par RMN- C de l’échantillon F1 111 III-4- Analyse de divers échantillons d’huiles essentielles de P. terebinthus par CPG, RMN 13C ET CPG-SM 115 III-5-- Variation de la composition 118 III-6-- Comparaison avec la littérature 121

Chapitre IV : Caractérisation des huiles végétales de baies de lentisque par la RMN du carbone-13 IV-I- Introduction 124 IV-2- Echantillonnage et méthode d’extraction 125 IV-3- Analyse par RMN 13C et par CPG des huiles fixes de lentisque. 126 IV-3-1- Evaluation de la classe lipidique et des acides gras libres. 127 IV-3-2- Identification et quantification des chaines grasses 130 IV-3-3-Distribution des chaines grasses sur les positions du glycérol 134

Chapitre V- Activité antimicrobienne des huiles essentielles des trois espèces de Pistacia 137 Conclusion générale 141 Partie expérimentale 144 Bibliographie 148 Annexe

INTRODUCTION

Introduction

Les plantes médicinales constituent depuis longtemps des ressources précieuses pour la grande majorité des populations rurales des pays en développement. La médecine traditionnelle occupe une place importante dans les cultures arabes et africaines et fait des plantes médicinales un atout majeur.

Les recherches sur les substances naturelles sont le fruit d’une longue expérience. Elles ont commencé par l’inventaire systématique des plantes utilisées par les guérisseurs indigènes, auquel est venu s’adjoindre un criblage chimique systématique permettant de déceler les principales catégories de substances naturelles actives.

L’Algérie est dotée d’une végétation variée. Sa flore est très riche de part la variation de son climat et de ses sols. Ainsi nous retrouvons de nombreuses espèces aromatiques susceptibles de fournir des huiles essentielles utilisées dans différents domaines pour leurs propriétés thérapeutiques et organoleptiques notamment odorantes (parfumerie et cosmétique), pharmaceutiques et gustatives (additifs alimentaires).

Ces plantes aromatiques sont a l’origine de produits à très forte valeur ajoutée qui peuvent contribuer au développement économique de notre pays, néanmoins la valorisation des huiles essentielles et autres extraits végétaux passe par une indispensable étape de caractérisation et d’analyse.

Ainsi, le couplage de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) avec la Spectrométrie de Masse (SM), associée à l’utilisation des indices de rétention est par excellence la stratégie utilisée dans le domaine des huiles essentielles.

Une autre alternative dans l’identification des mélanges complexes est l’utilisation de la RMN-13C. C’est une méthode d’analyse basée sur la RMN-13C pour l’identification et la quantification des composés de mélanges complexes sans séparation préalable. Le principe de cette méthode repose sur la comparaison, assistée par ordinateur, des raies de résonance du spectre de mélange avec celles de composés de référence contenus dans une bibliothèque de

1 spectres. Elle a été appliquée avec succès à l’identification de terpènes et autres constituants des huiles essentielles et des lipides dans les huiles végétales.

Ainsi, dans le cadre de la connaissance et la valorisation des produits naturels algériens principalement d’origine végétale, nous nous sommes intéressé à ; d’une part, la caractérisation chimique des huiles essentielles de trois espèces du genre Pistacia : lentiscus L., terebinthus L. et atlantica Desf. et d’autre part la mise en valeur de la technique d’identification de la composition d’un mélange complexe par RMN du carbone 13.

Dans la première partie de ce travail, nous décrirons les plantes utilisées et nous passerons en revue les principales techniques utilisées pour l’analyse des huiles essentielles et des autres familles de composés à travers divers exemples. Pour chaque technique, nous mettrons en évidence les champs d’application, les avantages, les limites et inconvénients. Ensuite nous présenterons également la méthode d’analyse par RMN 13C .

La seconde partie de ce travail a été consacrée à l’analyse détaillée des huiles essentielles issues des feuilles, baies et rameaux du P. lentiscus prélevés sur trois sites naturels du pays. L’influence du mode d’extraction sur la composition chimique des extraits aux solvants des feuilles de lentisque a également été étudiée.

Ainsi, nous avons extrait la partie volatile des feuilles de lentisque par solvant en utilisant différent modes : le soxhlet, macération assistée par ultrasons et fluide à l’état supercritique (CO2). Nous reportons également, dans cette partie les résultats de l’’étude de la variabilité chimique des huiles essentielles de feuilles et de fruits de lentisque

Dans la troisième partie de ce travail, les potentialités de la RMN du carbone-13 ont été utilisées pour identifier et caractériser, sans séparation préalable, les constituants des huiles essentielles des parties aériennes du P. lentiscus, P. terebinthus et P. atlantica. Cette méthode a également été utilisée pour la caractérisation des acides gras de trois échantillons d’huiles végétales de baies de lentisque (deux échantillons commerciaux et une huile extraite au laboratoire).

Afin de confirmer ou d’infirmer les potentialités thérapeutiques des trois espèces de Pistacia étudiées dans ce travail nous avons évalué l’activité antimicrobienne de leurs huiles essentielles et de l’huile végétale sur une quinzaine de microorganismes, en utilisant la méthode des microdilutions qui permet d’avoir les concentrations minimales d’inhibition.

PARTIE I

Etude bibliographique sur les extraits naturels, leurs modes d’extraction et leurs méthodes d’analyse

Les substances naturelles d’origine végétale sont primordiales pour les scientifiques qui les ont de tout temps considérées comme sources de matières premières et comme modèles. Ces produits naturels se présentent souvent sous forme d’un mélange complexe constitué de plusieurs dizaines de composés en proportions variables. Les produits d’origine végétale tels les huiles essentielles obtenues par entraînement à la vapeur d’eau ou par expression à froid de plantes à essence et les extraits aux solvants organiques ou au CO2 supercritique, renferment de nombreux mono- et sesquiterpènes mais aussi des composés non volatils qui sont constitués de plusieurs familles très diverses tant au niveau structural que fonctionnel. On distingue des composés du métabolisme primaire : glucides, lipides, acides aminés. D’autres sont issus du métabolisme secondaire (flavonoides, alcaloides, tanins), terpènes et stéroides (ditèrpènes, tritèrpènes, phytostérols,…) [1, 2]. Les huiles essentielles et les extraits végétaux constituent des matières premières particulièrement intéressantes pour des secteurs industriels très divers telles que la parfumerie, les cosmétiques, la pharmaceutique et l’agro-alimentaire [1]. D’autres produits naturels tels que les oléorésines de pins ou de pistachiers fournissent par distillation l’essence de térébenthine, utilisée comme solvant ou comme matière première pour la synthèse d’arômes [1] et la colophane (résidu de distillation) qui entre dans la composition d’adhésifs, peintures et vernis. Toutefois, la valorisation de ces produits, quel que soit leur débouché, requiert en général une étape de caractérisation qui inclut l’analyse de leur composition chimique.

Chapitre I : Etude botanique du genre Pistacia

I- Introduction La famille des Anacardiaceae comprend 600 espèces réparties en 70 genres dont le genre Pistacia. Les Anacardiacées sont en général des arbres ou des arbustes aromatiques fournissant une riche variété de baumes, de résines, d’oléorésines. Quelques espèces comme la mangue, les noix de cajou ou les pistaches en sont les plus connues. Le genre Pistacia, monographié pour la première fois par M. Zohary en 1952, comprend onze espèces. Son aire est discontinue et compte quatre régions phytogéographiques : méditerranéenne, irano-touranienne, sino-japonaise et mexicaine [3,4]. Dans le bassin méditerranéen, on trouve à l’état spontané, Pistacia lentiscus, Pistacia terebinthus, Pistacia khinjuk, Pistacia atlantica et Pistacia vera, originaire de l’Iran et de l’Inde et qui est cultivé pour ses fruits (pistache).

Nous en retrouvons trois espèces spontanées sur tout le littoral Algérien ainsi que dans les régions du sublittoral (exemple Mouzaia), et jusqu'à l’Atlas Saharien (Djelfa) : P. lentiscus Linné., P. terebinthus Linné. et P. atlantica Desfontaine [5]. La taxonomie du genre est décrite ci-dessous par Quezel et Santa[6].

Règne Végétal Embranchement spermaphytes Sous embranchement Angiospermes Classe Dicotylédones Ordre Sapindales Famille Anacardiaceae Sous famille Rhoidées Genre Pistacia

II- L’espèce Pistacia lentiscus L. a- Etude botanique : Le pistacia lentiscus L. (lentisque) a été décrit pour la première fois par le botaniste Linné en 1753 [3]. C’est un petit arbre spontané à feuilles persistantes, qui pousse dans les garrigues et les maquis des climats méditerranéens [5]. Il est connu des populations locales sous différentes appellations : Akind en Albanie, drou en arabe, lentisque en français, lentisco en Espagnol, lentischio en Italien, ochinis en Grec. Le lentisque est un arbrisseau pouvant atteindre 3 mètres. Il a un port buissonnant et arrondi. Son feuillage est persistant, vert, pouvant virer légèrement au rouge. Les feuilles, composées, étroites et coriaces, sont paripennées, [6] (figure 1). Le fruit est une petite drupe arrondie d’environ 5 millimètres qui mûrit à partir du mois d’Aout. D’abord rouge, elle devient ensuite noire. La graine est identique aux pistaches, mais beaucoup trop petite pour être consommée. Le lentisque est largement répandu en Algérie. Son aire s’étend d’est à l’ouest en pénétrant jusqu’aux régions sub-sahariennes. Il joue un rôle fondamental dans l’entretien des écosystèmes à risque naissant de désertification en raison de sa forte résistance à la sécheresse, à l’érosion et aux incendies qui ravagent les maquis [7,8]. Il est connu comme indicateur des sols argileux. La plante a une odeur aromatique typique des maquis méditerranéens. Le lentisque est souvent associé à l’olivier dans l’Ouest méditerranéen.

Figure 1: Le Pistacia lentiscus L:

b- Propriétés naturelles et emplois. Le lentisque produit un suc résineux, qui s’écoule des incisions pratiquées à l’écorce de l’arbre et qui se dessèche en formant des grains globuleux et incolores. C’est une résine jaune claire fortement aromatique qui est appelée mastic d’où son nom d’arbre à mastic. Le plus recherché est le mastic de l’ile de Chios (mer Egée, Grece) qui depuis des siècles et jusqu’à nos jours en est le plus gros producteur [9]. En Grèce et en Turquie, Il est utilisé en pâtisserie et en dentisterie [10]. Il entre également dans la confection de pâtes ou de gommes à mâcher parfumées qui furent la douceur favorites des sultans de l’empire ottoman et des femmes du Moyen-Orient. Cette pâte aurait la propriété de purifier l’haleine, blanchir les dents, traiter les problèmes de gingivites, traiter les affections pulmonaires, les problèmes gastriques et les ulcères de l’estomac [11-13]. Aksoy et coll. [14] ont montré les propriétés bactéricides et antimicrobiennes de la résine. On peut également citer les travaux de Dedoussis et coll. [11] sur l’effet antioxydant et antiathérogène de l’extrait polaire de résine ainsi que les travaux de Balan et coll. [15] sur l’effet inhibiteur sur des cellules cancéreuses du colon. De ce mastic après distillation est récupérée une essence qui entre dans la fabrication des parfums, produits cosmétiques, pharmaceutiques et alimentaires [16]. Des feuilles et des rameaux est extraite une huile essentielle à odeur puissante et balsamique qui est utilisée en aromathérapie et en phytothérapie pour ses propriétés décongestionnantes. En cosmétique elle est utilisée comme raffermissant et régénérant. De récentes études ont démontré également des propriétés bactéricides [17-20] et anti tumorales

des huiles essentielles de lentisque [21]. Lamiri et coll. [22] et Traboulsi et coll. [23] ont étudié l’effet insecticide de ces huiles et ont montré leur efficacité sur les œufs de mouches. Afin de confirmer les effets thérapeutiques de la plante utilisée dans la médecine traditionnelle du Moyen-Orient, Shtayeh et coll. [24] ont démontré ses propriétés bactéricides sur plusieurs microorganismes. Janakat et coll. [25] ont également étudié l’effet hépato protecteur des extraits aqueux, tandis que Pedrag et coll. [26-27] ont démontré in vivo les propriètés antioxydantes de ces extraits aqueux. Leurs effets antifongiques ont été étudiés par Kordali et coll. [28]. Il est à signaler que les décoctions de lentisque sont couramment prescrites dans les remèdes traditionnels dans de nombreuses affections telles que l’eczéma, la diarrhée, maux de gorges, calculs rénaux, maux d’estomac et hépatites [24-29] les décoctions sont aussi utilisées comme antiseptique et antiseptique buccal [30]. En Espagne, la décoction des parties aériennes de la plante (feuilles et rameaux) est utilisée contre l’hypertension artérielle. Cette propriété intéressante de la plante a d’ailleurs été démontrée par Sanz et al [31]. Au Maroc les feuilles et l’écorce de l’arbre, en décoction ou en poudre, sont utilisées dans le traitement des maladies du ventre et de l’intestin. L’huile, extraite des fruits, est utilisée contre les douleurs dorsales [32]. Une étude récente sur les extraits méthanoliques de plantes utilisées dans la médecine traditionnelle marocaine a montré que l’extrait de lentisque est très actif contre le virus herpes simplex [33]. En Tunisie le lentisque est utilisé dans le traitement de diverses douleurs et contre le rhumatisme [18]. En Algérie, toute la plante est signalée, avoir des propriétés astringentes, et son usage, se limite à des bains de bouche pour soigner les aphtes, aromatiser l’eau ou en usage externe pour resserrer les tissus blessés ou irrités et faciliter la circulation sanguine [34]. L’huile végétale extraite des baies de lentisque est commercialisée comme remède aux problèmes de brulures et de cicatrisation.

III- L’espèce Pistacia terebinthus L. a- Etude botanique : Le Pistacia terebinthus L., décrit pour la première fois par Linné en 1753, est un petit arbre méditerranéen de 2 à 6m de haut, à odeur résineuse très prononcée. Ses feuilles caduques, sont composées d’un nombre impair (7 à 11) de folioles ovales et glabres. Ses fruits ovoïdes, en grappes caractéristiques sont rouges puis brun à maturité [3] (figure 2). Il est souvent utilisé comme porte greffe pour Pistacia vera (vrai pistachier) car il est

particulièrement adapté, aussi bien aux sols calcaires qu’aux roches volcaniques acides. Il a un très bon système racinaire qui s’enfonce profondément dans le sol [35,36]. On le trouve à l’état spontané sur tout le littoral algérien mais aussi jusqu’à l’atlas tellien saharien, [3,6,37].

Figure 2 : Pistacia terebinthus L.

b- Propriétés et emploi : Des études archéologiques menées en Turquie ont montré que les fruits du P. terebinthus étaient utilisés comme aliments il y a 9000 ans. Des autochtones continuaient, il n’y pas si longtemps, à les consommer en tant que stimulant de l’appétit [38,39]. Dans une récente étude sur les caractéristiques chimiques des fruits, Özcan et coll. [39] ont montré leur haute valeur nutritionnelle. En effet leurs apports en protéines, minéraux et acides oléique et linoléique peuvent en faire une matière première pour l’industrie alimentaire. Plusieurs études sur les activités médicinales du P. terebinthus ont montré que les huiles essentielles [20,21], les extraits aqueux [28], et quelques triterpènes [40-44] avaient des activités anti-inflammatoire, antifongique, anti-hypertensive, antirhumatismale et anticancérigène [21,28,40-44]. Mélangées à d’autres plantes aromatiques les parties aériennes du P. terebinthus servent à la préparation de tisanes médicinales « zaatar » [45]. La résine obtenue par incision du tronc est utilisée dans l’industrie cosmétique, en parfumerie et aussi comme aromatisant dans l’industrie alimentaire. Elle est, par ailleurs, antiseptique, antispasmodique. Elle est également utilisée dans le traitement des bronchites chroniques, infections urinaires, ulcères d’estomac, et contre certaines formes de cancer [12,46].

IV- L’espèce Pistacia atlantica Desf. : a- Etude botanique Le Pistacia atlantica Desf., décrit pour la première fois par le botaniste Desfontaines, est un bel arbre qui peut atteindre les 20 mètres de hauteur et plus d’un mètre de diamètre au sol (figure 3). Ses feuilles sont caduques, et les fruits sont des drupes comestibles de la grosseur d’un pois [3]. Sur les feuilles, poussent des galles, verdâtre-brunes et rugueuses, qui sont produites par des insectes [47]. P. atlantica occupe une aire très vaste englobant le Maroc, l’Algérie, la Tunisie, la Libye, la Turquie, la Syrie, la Jordanie, la Palestine, l’Iran et l’Afghanistan [3]. L’arbre est très tolérant à la sécheresse et s’adapte parfaitement aux zone arides à semi- arides où peu d’espèce peuvent survivre. On le retrouve soit seul soit formant des petites colonies [3,7,35]. P. atlantica est utilisé dans la conservation des sols. C’est l’un des porte- greffes le plus vigoureux pour le Pistacia vera [3,36,37]. Le P. atlantica appelé aussi le Pistachier de l’Atlas (el bettoum ou boutma en arabe et Igguerh en berbère), est l’un des arbres le plus caractéristique de l’atlas Algérien comme son nom l’indique. Il existe à l’état disséminé dans l’Oranie, Djelfa (Senabla, Ain oussera,), sud de Laghouat (messaâd), et Ghardaïa [6,48]. Il est souvent associé au ziziphus lotus qui lui constitue une bonne protection et aiderait à la germination des graines donc à la régénération de l’arbre [5]. Les colonies d’arbres sont généralement reléguées dans des sortes de canyons appelés dayas. Grace à son puissant système racinaire, il contribue fortement à la lutte contre l’érosion et la désertification qui menace la steppe pastorale. Sa présence dans les montagnes de l’Ahaggar est d’ailleurs, une preuve de son extraordinaire résistance au climat rigoureux (froid, chaleurs extrêmes, longues périodes de sécheresse). Malheureusement, les derniers betoum Sahariens d’Algérie sont menacés d’extinction par l’homme. En effet, ces magnifiques arbres sont convoités, car ils fournissent aux hommes un complément indispensable à leur vie quotidienne (nourriture, exploitation abusive comme fourrage et bois de chauffage, pâturage,..) [48,49]. b- Propriétés et emploi Les applications du P. atlantica en industrie et en médecine locale sont nombreuses [32, 50,51]. En effet son bois est très prisé pour la fabrication d’objets artisanaux mais est aussi utilisé comme source d’énergie dans les régions les plus retranchées [48]. L’écorce produit une oléorésine qui exsude naturellement par temps chaud. Exposée à l’air libre, elle devient solide (comme une résine) et peut avoir des propriétés cicatrisantes pour les parties

endommagées de l’arbre, prévenant ainsi des infections microbiennes qui peuvent l’affecter [47]. Elle aurait également, des vertus médicinales [32] et est utilisée dans la fabrication de masticatoires en médecine dentaire. L’huile extraite des fruits, riche en acides gras insaturés, est utilisée pour la saponification et comme ingrédient dans la fabrication des cosmétiques adoucissants [52]. Elle peut être également mélangée aux dattes écrasées et est consommé ainsi tout au long de la journée pour ses vertus énergisantes. Les Touaregs de l’Ahaggar lui attribuent des vertus médicinales et nutritives. Ses feuilles et ses fruits sont utilisés en infusion contre les douleurs d’estomac, les coups de froid et les infections de l’œil [53]. Les fruits appelés elkhodiri par les populations locales, sont des drupes comestibles, consommées comme telles ou séchées, écrasées et réduites en poudre puis ramassées avec de l’eau sucrée et consommées en petites galettes.

Figure 3: Pistacia Atlantica Desf.

Chapitre II : Les huiles essentielles

I- Définition D’après l’association française de normalisation [54] les huiles essentielles sont des substances huileuses volatiles et généralement odorantes, obtenues soit par entrainement à la vapeur d’eau des végétaux, soit par expression du péricarpe frais, soit par distillation à sec. Mais cette définition est très restrictive et n’est pas toujours acceptée, car elle exclut d’une part les produits odorants d’origine animale et d’autre part les essences obtenues par d’autres procédés d’extraction. Il nous semble donc utile de définir les termes les plus couramment utilisés dans ce domaine [55].

I-1- Concrète: Extrait à odeur caractéristique, obtenu à partir d’une matière première d’origine végétale, qui est épuisée au moyen d’un solvant organique volatil non aqueux. I-2- Pommade florale: Corps gras parfumé obtenu à partir de fleur soit par « enfleurage à froid » (c’est-à-dire la diffusion des constituants odorants des fleurs dans le corps gras) soit par « enfleurage à chaud » (c’est-à-dire la digestion ou l’immersion des fleurs dans le corps gras). I-3- Absolue: Produit ayant une odeur caractéristique, obtenu à partir d’une concrète, d’une pommade florale ou d’un résinoïde par extraction à l’éthanol à température ambiante. La solution obtenue est généralement refroidie et filtrée dans le but de supprimer les cires ; l’éthanol est ensuite éliminé par distillation.

De ce fait, quand on examine une huile essentielle il faut avoir à l’esprit deux préoccupations principales : le matériel botanique d’où elle est issue ainsi que son mode d’extraction. Notons enfin que la notion d’arôme est à la fois différente et plus vaste que celle des huiles essentielles puisqu’elle s’applique à tout principe odorant qui émane de substances naturelles ou qui est engendré par un processus physique, chimique ou enzymatique (café torréfié, viande grillée, poisson, fromage… .). II- Localisation dans la plante Les huiles essentielles sont largement répandues dans le règne végétal avec des familles à haute teneur en matière odorante comme les conifères, rotacées, myrtacées, ombellifères, labiacées, graminées, etc… . Elles peuvent se rencontrer dans tous les organes

végétaux, comme les écorces chez le cannelier, les sommités fleuries chez la lavande ou la menthe, les racines chez le vétiver, les rhizomes chez le gingembre, les fruits chez l’anis ou le fenouil et le bois chez le camphrier. Dans une même plante les essences peuvent être présentes à la fois dans différents organes, la composition chimique pouvant varier d’un organe à l’autre. On obtient par exemple deux huiles essentielles différentes pour la feuille et la fleur du citronnier [1]. Dans les organes de la plante, les essences peuvent être localisées dans des cellules sécrétrices isolées (cas des lauracées et magnoliacées), mais on les trouve le plus souvent dans des organes sécréteurs spécialement différenciés et variables suivant les familles botaniques. On peut citer par exemple les poils sécréteurs externes des labiacées, les poches sécrétrices schizolysigènes des Rutacées ou bien les canaux sécréteurs des Ombellifères et conifères. Les canaux sécréteurs peuvent être externes comme dans bon nombre de labiacées ou bien internes comme c’est le cas pour les différents Eucalyptus (myrtacées).

III- Procédés d’obtention des huiles essentielles Plusieurs techniques d’extraction des huiles essentielles et des principes aromatiques végétaux sont à ce jour connues. Toutefois les normes liées à l’utilisation de ces essences limitent en général le choix de la méthode d’extraction. Le mode d’obtention des huiles essentielles a un impact certain sur leurs qualités et leurs applications thérapeutiques. En effet la localisation histologique des composés aromatiques dans le végétal ainsi que la destination finale du produit extrait peuvent orienter le choix technologique. Les méthodes d’extraction sont adaptées aux propriétés les plus importantes des huiles essentielles : leur volatilité dans l’air et dans la vapeur d’eau et leur solubilité dans les solvants organiques. III-1-Distillation Ce procédé est basé sur le fait que la plupart des composés odorants volatils (en particulier les huiles essentielles) contenus dans le végétal sont susceptibles d’être entraînés par des aérosols de vapeur d’eau du fait de leur point d’ébullition relativement bas et de leur caractère hydrophobe. Ils ne sont donc ni retenus, ni solubilisés dans l’eau. Il en existe deux types : a- L’hydrodistillation : Elle consiste à immerger directement le matériel végétal à traiter (intact ou broyé) dans un alambic rempli d’eau qui est ensuite porté à ébullition. Les vapeurs hétérogènes formées sont condensées et l’essence se sépare par différence de densité.

b- Distillation à la vapeur d’eau : Pour ce type de distillation le végétal n’est pas en contact avec l’eau. La vapeur nécessaire à l’extraction arrive à l’intérieur de l’alambic par le fond et repart de manière homogène au moyen d’un tube circulaire muni de nombreuses ouvertures. Notons toutefois que de nouvelles techniques éliminant les inconvénients dû à l’hydrodistillation (artefact, dégradation, temps trop long…) sont apparues il s’agit entre autres de « superheated water extraction » [56], l’hydrodistillation assistée par micro-onde (MWHD) [56-58] ou encore la distillation assistée par induction directe [59].

III-2- Expression à froid

Ce procédé concerne uniquement les huiles essentielles d’agrumes. En effet ces huiles essentielles facilement péroxydables, ne supportent pas une préparation à chaud et sont donc extraites des péricarpes frais des agrumes par différents modes d’expression. Le procédé consiste à exercer une action abrasive (manuellement ou mécaniquement) sur le péricarpe du fruit sous un courant d’eau à forte pression. L’huile essentielle est ensuite séparée de la phase aqueuse par centrifugation [60]. III-3- Enfleurage : Cette technique est réservée aux organes végétaux particulièrement fragiles tels que les fleurs. Elle consiste à mettre les pétales en contact avec un corps gras sur des châssis superposés à température ambiante. Au bout de quelques jours le corps gras est saturé en essence. On renouvelle les fleurs dix à quinze fois jusqu’à l’obtention d’une pommade de plus en plus parfumée qui est épuisée par un alcool dans lequel les corps gras sont peu solubles. Les composés volatils contenus dans la fraction alcoolique sont isolés par simple évaporation.

III-4- Extraction par solvant organique Le matériel végétal est mis en contact avec un solvant à chaud ou à froid (on opère le plus souvent à température ambiante). Le produit obtenu après évaporation du solvant est appelé « concrète ». Ce terme résulte de la tendance du produit à se solidifier en raison de la présence de matière grasse entraînée par le solvant. Le traitement à froid de la concrète par l’alcool absolu permet ensuite de séparer les matières grasses et obtenir après évaporation de l’alcool, la phase dite « absolue » des huiles essentielles. Actuellement, l’extraction assistée par ultrasons est une technique de choix pour les solvants de faibles points d’ébullition

[61,62]. De nombreux travaux d’extraction assistées par ultrasons sont décrits, pour des cas récents, comme l’extraction de la fraction volatile du miel [63], l’extraction des feuilles d’Iles paraguariensis [64] ou encore l’extraction des parties aériennes de Salvia officinalis L. et Salvia glutinosa L. [65]. L’avantage essentiel de ce procédé est de réduire considérablement la durée d’extraction, d’augmenter le rendement en extrait et de permettre l’extraction des molécules thermosensibles. Cependant l’emploi restrictif de l’extraction par solvant organique se justifie par son coût, les problèmes de sécurité et de toxicité, ainsi que la réglementation liée à la protection de l’environnement.

III-5- Distillation-extraction simultanée Cette technique mise au point par Likens et Nickerson en 1964, consiste à immerger la matière végétale dans l’eau. Les vapeurs obtenues par l’hydrodistillation sont recueillies dans un solvant volatil (pentane ou hexane), l’huile essentielle et le solvant sont alors récupérés par décantation, puis l’essence est obtenue par évaporation du solvant. Cette technique a été récemment utilisée dans l’extraction des métabolites secondaires des fruits de Xylopia aromatica [66].

III-6- Extraction au fluide supercritique L’extraction par gaz liquéfié ou par fluide à l’état supercritique met en œuvre généralement le dioxyde de carbone [67-71]. D’autres travaux de recherche montrent l’utilisation de l’eau dans son état supercritique [72]. Dans ce système, le solvant est utilisé en boucle par interposition d’échangeur de chaleur, d’un compresseur et d’un détenteur afin de porter le solvant à l’état désiré à chaque stade du processus. La séparation de l’extrait a lieu en phase gazeuse par simple détente. L’avantage de cette méthode est la possibilité d’éliminer et de recycler le solvant par simple compression détente. De plus les températures d’extraction sont basses dans le cas du dioxyde de carbone et non agressives pour les constituants les plus fragiles. A ces différents avantages s’ajoutent ceux de l’innocuité, d’inertie et d’ininflammabilité du CO2. En outre, en fonction des conditions de pression et de température, on modifie le pouvoir solvant. Il est donc possible dans certaines limites d’orienter la composition de l’extrait d’autant qu’il est envisageable d’utiliser un agent de co-extraction pour réguler la polarité. Le frein au développement de cette technologie est le coût élevé des appareillages lié à l’application de pressions de plusieurs centaines de bars.

Il est bien évident que la composition aromatique diffère selon le procédé d’extraction utilisé, d’après les normes en vigueur l’hydrodistillation et l’expression à froid conduisent à des huiles essentielles, l’extraction par solvant à une concrète, l’extraction par gaz à l’état critique ou supercritique à une composition aromatique à laquelle la normalisation n’a pas encore attribué d’appellation précise. IV- Composition chimique des extraits volatils Une huile essentielle est constituée de molécules les plus diverses, toutes issues de métabolites secondaires, Aussi il est difficile d’établir une classification basée uniquement sur une fonction chimique, d’autant plus que les essences en renferment un très grand nombre, en proportions variables.

Ces molécules sont généralement des hydrocarbures terpéniques : monoterpènes (C10), sesquiterpènes (C15), rarement des diterpènes (C20) ou triterpènes (C30). Elles prennent naissance à partir d’un multiple pair ou impair d’unités isopréniques (C5). elles ont toutes la même origine biogénique : l’isopentényl pyrophosphate de structure hémiterpénique qui est le précurseur commun de ces molécules [1]. Ces mono et sesquiterpènes peuvent être acycliques, monocycliques ou bicycliques. Ils sont formés dans cet ordre chronologique dans les végétaux et fonctionnalisés selon leurs degrés d’oxydation par des groupes hydroxydes, époxydes, aldéhydes ou carbonyles. Les huiles essentielles renferment également des composés odorants de type « phénylpropanoïde », qui empruntent une voie biosynthétique, dite de l’acide shikimique conduisant essentiellement à la synthèse de la lignine [1]. Une huile essentielle est très fluctuante dans sa composition, car peuvent intervenir un grand nombre de paramètres, d’ordre naturel ayant une origine intrinsèque (génétique, localisation, maturité…) ou extrinsèque (sol, climat…..) et d’ordre technologique, c’est-à- dire liés au mode d’exploitation du matériel végétal. La composition d’une huile essentielle varie au sein d’un même genre, mais aussi dans une même espèce (cas du lentisque). On parle alors de races chimiques ou chémotypes.

Chapitre III- Les méthodes d’analyses des mélanges naturels

I- Introduction Les avancées technologiques de ces dernières décennies permettent de disposer aujourd’hui d’un vaste panel de techniques analytiques, chacune d’elles ayant sa spécificité et son domaine d’application. Cependant, l’identification et la quantification des constituants d’un mélange naturel demeurent toujours des opérations délicates qui nécessitent souvent l’utilisation de plusieurs techniques complémentaires [73].

L’analyse de la composition chimique d’un mélange complexe s’effectue de manière conventionnelle selon les voies A et B (figure 1).

- La voie A fait intervenir le couplage « en ligne » d’une ou de plusieurs techniques chromatographiques avec une ou plusieurs techniques spectroscopiques. Selon les techniques utilisées (CPG-SM, CPG-IRTF, etc…), elle est particulièrement bien adaptée aux analyses de routine tels que les contrôles de qualité d’échantillons d’huiles essentielles ou d’extraits végétaux dont les constituants ne présentent pas de difficultés d’identification. Par ailleurs, l’introduction des couplages CLHP-SM et CLHP-RMN 1H a récemment ouvert un nouvel axe de recherche et de développement des méthodes d’analyse.

- La voie B nécessite une purification préalable des constituants avant leur identification. Cette voie est recommandée pour l’analyse d’un échantillon nouvellement étudié, et/ou dont les constituants sont délicats à identifier (structures complexes et/ou très proches).

L’analyse peut également être menée selon la voie C (figure 1), plus originale, qui met en œuvre la Résonance Magnétique Nucléaire du carbone-13 (RMN 13C) pour l’identification des composés en mélange sans séparation préalable ou précédée d’une étape de fractionnement réduite au minimum. Cette méthode peut également être employée pour la quantification des constituants lorsque celle-ci est délicate par les méthodes usuelles.

Figure 4: Les méthodes d’analyse d’un mélange complexe

II- Analyse par les couplages « en ligne » (voie A)

II-1- La chromatographie en phase gazeuse (CPG) La Chromatographie en phase gazeuse (CPG) est l’une des techniques de séparation la plus utile et la plus répandue dans les laboratoires de chimie analytique. Cette méthode séparative permet une bonne adaptabilité par un grand choix de phases stationnaires, de températures et du débit de la phase mobile. Rapide et particulièrement bien adaptée à l’individualisation des composés volatils, elle résout la plupart des problèmes de séparation [74]. Cependant, les informations auxquelles elle permet d’accéder (indices de rétention, teneur) sont insuffisantes dès lors qu’il s’agit de l’identification des constituants des mélanges complexes. En effet, s’il est admis que la CPG reste l’une des techniques d’analyse séparative des plus efficaces pour des composés volatils, surtout depuis la mise sur le marché des colonnes capillaires, elle ne peut en général conduire, à elle seule, à leur identification. Dans le cas de molécules non volatiles, leur séparation n’est rendue possible qu’après une réaction de dérivatisation (acétylation, silylation), qui rend ces composés volatils à des températures ne provoquant pas leur décomposition [75]. L’identification des constituants d’un mélange à partir du seul chromatogramme n’est réalisable que dans le cas où ces derniers seraient parfaitement connus et où en fait, le profil chromatographique est comparé à un profil standard. En effet, les temps de rétention propres à chaque composé dépendent fortement des conditions opératoires (nature de la phase

stationnaire, programmation de la température, vieillissement de la colonne, etc.) et ne constituent pas, malgré l’utilisation de deux colonnes de polarité différente, une base suffisante pour une identification certaine.

Les indices de rétention, calculés à partir d’une gamme étalon d’alcanes ou d’esters linéaires par interpolation logarithmique à température constante (indices de Kováts, IK) ou par interpolation linéaire en programmation de température (Ir), sont plus fiables que les temps de rétention [74]. Néanmoins, il est fréquent d’observer entre les données obtenues au laboratoire et celles de la littérature, des écarts d’indices de rétention de l’ordre de 10 unités Kováts (en particulier sur colonne polaire). De plus l’identification des constituants par la CPG-IK peut être très délicate dans la mesure où il a été montré que 230 sesquiterpènes de même masse moléculaire se répartissent sur une plage de 300 unités Kováts [73] et engendre donc des cas de co-élution. Ainsi divers couplages de la CPG avec des techniques spectroscopiques ont été développées dans le but de rendre plus fiables l’identification des composés [76].

II-2- Couplage chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (CPG-SM) Actuellement, le couplage de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) avec la Spectrométrie de Masse en mode Impact Electronique (SM-IE) est la technique d’analyse de base de la plupart des laboratoires de recherche et de contrôle. Facile à manipuler, c’est la méthode standard en analyse organique des composés volatils. Cette méthode, très sensible, permet d’identifier la plupart des composés organiques malgré une gamme de concentration étendue. La CPG permet d’individualiser la plupart des composés et la SM les détecte même à l’état de traces [77]. Le principe de la SM-IE consiste à bombarder à l’aide d’électrons une molécule qui sera fragmentée; les différents fragments obtenus, chargés positivement sont caractéristiques d’une molécule et vont constituer son spectre de masse [78]. Les spectres obtenus sont ensuite comparés avec ceux des molécules de référence contenues dans des bibliothèques de spectres. A l’heure actuelle, des banques de spectres de masse qui contiennent plusieurs milliers de composés sont commercialisées [79-82]. Dans le domaine des huiles essentielles, l’utilisation conjointe de la SM, technique ayant une très grande sensibilité, avec les indices de rétention calculés sur deux colonnes de polarité différente, permet l’identification de la majorité des constituants.

Il arrive cependant que deux composés (souvent des stéréoisomères) présentent des spectres de masse identiques ou insuffisamment différenciés et des indices de rétention trop proches pour qu’il soit possible de les identifier sans ambiguïté. A titre d’exemple, nous pouvons citer le cas de l’α-bisabolol et de l’épi-α-bisabolol qui possèdent des spectres de masse superposables en mode impact électronique (IE) et des indices de rétention très proches [82].

Parfois, l’utilisation de techniques « d’ionisation douce » telles que l’ionisation chimique positive (ICP) ou l’ionisation chimique négative (ICN) peut constituer une solution à certains problèmes d’identification rencontrés en mode impact électronique (IE) [78,83]. L’ionisation douce produit des ions quasi moléculaires qui ne sont pas toujours visibles en mode impact électronique. L’observation de ces ions donne accès à la masse moléculaire des composés ce qui permet notamment de différencier des esters de thymyle, de néryle, de bornyl et de lavandulyle dans l’huile essentielle d’Eupatoruim cannabium lorsque l’ammoniac ou le méthane sont employés comme gaz réactif [83] ou encore .les alcools de leurs acétates comme c’est le cas pour le trans-nérolidol et l’acétate de trans-nérolidyle lorsque l’ammoniac est employé comme gaz réactif [84].

Une amélioration de l’analyse spectrale est obtenue avec l’utilisation de la SM multidimensionnelle à double ou triple analyseur (SM-SM ou SM-SM-SM), qui est réputée pour sa sélectivité nettement supérieure à celle d’un seul spectromètre de masse [85,86]. Cette technique a été notamment utilisée dans le cadre d’analyses de traces, de contrôles de fabrication de produits pharmaceutiques ou bien encore de polluants environnementaux [87,88]. Dans le domaine des huiles essentielles, le couplage CPG-SM-SM a permis d’obtenir un modèle de fragmentation précis de la khusimone et de confirmer l’identification de ce composé dans l’huile essentielle de vétiver bourbon [89].

II-3- Couplage CPG multidimensionnelle-SM La résolution des pics en CPG est parfois insuffisante pour parvenir à la caractérisation complète de mélanges très complexes. Ainsi, pour réduire les possibilités de co-élution, la chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle (CPG-2D) constitue une amélioration particulièrement intéressante [90-91]. Cette technique met en ligne deux colonnes capillaires. Après la séparation des constituants à analyser par la première colonne (pré-colonne), ceux-ci

sont transférés par l’intermédiaire d’un piège à la seconde colonne (colonne analytique) qui améliore la séparation [90] L’optimisation des conditions chromatographiques a permis d’obtenir la caractérisation par CPG-2D d’effluents pétrochimiques pour lesquels la résolution en CPG est insuffisante [92]. Elle est également utilisée dans d’autres domaines comme l’analyse d’huiles essentielles [93] ou bien de médicaments [94]. A titre d’exemple, Foudil-Cherif et coll. ont déterminé la distribution énantiomérique de cinq monotèrpènes (β-pinène, sabinène, linalol, terpinèn-4-ol et l’α-terpinéol) dans les huiles essentielles de neuf espèces d’Eucalyptus [95]. Cependant, si la SM donne d’excellents résultats dans la plupart des cas, certains spectres qui ne sont pas présents en bibliothèque peuvent s’avérer difficilement interprétables par les mécanismes classiques de fragmentation. La labilité thermique de certains composés constitue un frein dans la détermination des masses moléculaires relatives. Pour contourner certaines difficultés rencontrées en SM, un autre moyen d’identification des composés organiques présents dans un mélange complexe est utilisé. Il s’agit de la spectrométrie Infra Rouge par Transformée de Fourier (IRTF), couplée à la CPG.

II-4- Couplage CPG/IRFT et CPG/IRFT/SM La spectroscopie infrarouge à transformée de fourrier, tout comme les autres méthodes spectroscopiques, fournit une «empreinte digitale» des composés que l’on peut comparer avec les spectres de référence. Même en l’absence de tels spectres, cette technique renseigne sur les fonctions chimiques présentes dans les molécules, la stéréochimie des doubles liaisons et permet en général de différencier des isomères. Cette technique est particulièrement intéressante lorsqu’elle permet d’identifier des molécules présentant des spectres de masse insuffisamment différenciés. L’IRFT a démontré son efficacité en permettant l’identification de composés susceptibles de subir des transpositions sous l’effet de l’impact électronique comme dans le cas du germacrène-B et du bicyclogermacrène qui se transposent, respectivement en γ-élémène et en bicycloélémène. En effet, le germacrène-B et le bicyclogermacrène ont été identifiés par ce couplage dans les huiles essentielles d’orange et de pamplemousse [96]. Avec la combinaison de la CPG/SM et la CPG/IRTF, Vera et coll. ont identifié les constituants de l’huile essentielle d’Origanum majorana L. [97]. De même, que ce couplage (CPG/IRTF) a permis de déceler l’existence du β-cédrène, composé non identifié par CPG-SM [98].

La combinaison de l’IRFT et des indices de rétention permet donc d’identifier certains constituants des huiles essentielles. Cependant, le nombre moins important de banques de données IRTF comparativement à celles de la SM, tout autant que la différence de résolution entre les IR en phase vapeur et en phase liquide, constituent les limites du couplage CPG/IRTF. En effet, les spectres enregistrés en phase vapeur sont moins résolus que ceux enregistrés en phase liquide [99]. La CPG peut d’ailleurs être couplée à la fois au détecteur infrarouge et au spectromètre de masse (CPG-IRTF-SM) [100]. II-5- Couplage chromatographie liquide à haute performance (CLHP)/SM et CLHP/CPG/SM Les composés thermolabiles, polaires, et ceux ayant une très haute température de vaporisation sont souvent mal ou non élués par la CPG et donc indétectables. La chromatographie liquide à haute performance couplée à la SM permet de palier à cet inconvénient. Néanmoins, sa mise en œuvre nécessite de contourner certains problèmes dus aux conditions opératoires des deux techniques : haute pression, température ambiante et phase liquide pour la CHLP ; vide poussé, haute température et phase gazeuse pour la SM. Le développement de microcolonnes à très faible débit a rendu possible ce couplage. Ainsi, le couplage est employé pour l’analyse de terpènes (diterpènes acides ou glycosylés, triterpènes), d’alcaloïdes ou bien encore de composés phénoliques [101-102]. La spectrométrie de masse en tandem couplée avec la chromatographie liquide (CLHP-SM-SM) est utilisée, par exemple, pour la détermination des traces de pesticides [103]. La chromatographie en phase gazeuse a été couplée à la chromatographie liquide haute performance. Une pré-séparation des constituants est effectuée en fonction de leur classe chimique (hydrocarbures, aldéhydes, esters, alcools,…) par la CLHP, ce qui diminue considérablement les co-élutions au cours de la séparation en CPG. Ainsi, ce couplage procure une meilleure séparation des constituants et augmente la fiabilité des résultats obtenus par SM. Le couplage CLHP/CPG/SM a été utilisé pour analyser les constituants chimiques des huiles essentielles de zeste de différentes espèces du genre Citrus [104].

II-6- Couplage CLHP/RMN-1H la RMN du proton (RMN-1H), technique d’analyse structurale de premier plan est couplée directement à la CLHP [105]. Ce couplage présente l’avantage de combiner le pouvoir séparateur de la CLHP sans dégradation de produit, avec les informations obtenues par la RMN du proton. Toutefois cette association n’a été rendu possible que grâce aux

importantes avancées technologiques réalisées notamment au niveau des sondes de RMN (flow probes) qui ont été adaptées à l’identification des composés dissous dans un flux chromatographique [106]. L’utilisation de ces sondes, associée à la mise en service de cryoaimants de plus en plus puissants, a permis à la RMN 1H d’abaisser considérablement sa limite de détection à des valeurs de l’ordre du nanogramme. Le couplage de la CLHP avec la RMN du proton permet d’effectuer des mesures selon deux modes : le «flux continu» (continuous flow) et le «flux stoppé» (stopped flow). Dans le premier mode, l’acquisition des données est faite tout au long du passage du flux chromatographique dans la cellule RMN alors que dans le second, l’élution est arrêtée lorsqu’un constituant est présent dans la sonde du spectromètre, ce qui permet de mettre en œuvre des séquences bidimensionnelles [105]. À titre d’exemple, Spring et coll. ont caractérisé trois lactones sesquiterpéniques dans un extrait de feuilles de Zaluzania grayana en utilisant le couplage de la CLHP avec la RMN du proton mono- et bidimensionnelle [107]. Plus récemment, la CLHP-RMN 1H a permis l’identification des produits de dégradation issus de l’acide 5-aminosalicylique dans un médicament générique [108]. Actuellement le couplage de la CLHP avec la RMN 1H et la SM (CLHP-RMN 1H-SM) se révèle comme un moyen de détection et d’identification performant des composés connus ou inconnus présents dans des échantillons biologiques complexes ou encore dans des extraits de plantes [109,110]. Dans la grande majorité des cas, l’utilisation des couplages pour l’analyse des huiles essentielles donne d’excellents résultats. Cependant, divers auteurs ont dénoncé l’utilisation superficielle de ces couplages, liée à un excès de confiance de ces techniques informatisées. Van Beek et Lelyveld [111] ont caractérisé par RMN-1H et RMN-13C, les principaux sesquiterpènes préalablement isolés de l’huile essentielle de gingembre. Ils ont montré que l’identification de ces composés par l’utilisation unique de la SM a conduit à des résultats erronés. De même, après avoir résumé les avantages et les inconvénients de ces couplages, Joulain [73] a dénoncé les erreurs fréquemment commises tant au niveau qualitatif que quantitatif.

Il ressort que les couplages sont complémentaires. Pour une bonne analyse des huiles essentielles, l’utilisation d’au moins deux d’entre eux, par exemple CPG/SM et CPG/IRFT, combinée aux indices de rétention sur deux colonnes de polarité différente est vivement recommandée.

Il apparaît également que le couplage faisant intervenir la RMN-1H apporte des informations de premier ordre pour l’identification de plusieurs familles de composés. C’est cet apport d’informations dû à la RMN qui est mis en avant dans la voie B.

III- Identification des constituants après purification : VOIE B Certains composés en mélange, non décrits ou absents des bibliothèques de spectres doivent être isolés par différentes techniques chromatographiques telles que la chromatographie sur colonne (CC), la chromatographie sur couche mince (CCM), la CLHP ou la chromatographie en phase gazeuse préparative (CPGP). La distillation fractionnée peut aussi être mise en œuvre. Ils sont ensuite identifiés par diverses méthodes spectroscopiques telles que l’ultra-violet (UV), l’infrarouge, la spectrométrie de masse, la RMN du proton et du carbone-13. Bien que cette voie soit longue à mettre en œuvre (purification suivie de l’identification de chaque constituant du mélange), celle-ci se révèle être particulièrement fiable et adaptée pour l’étude de mélanges complexes, grâce notamment, à l’utilisation de spectromètres de RMN plus puissants, qui permettent l’enregistrement des spectres avec des quantités de plus en plus faibles de produits. Cette voie analytique qui était surtout utilisée pour l’identification des composés non volatils, trouve de nos jours un regain d’intérêt pour l’identification des constituants chimiques des huiles essentielles complexes. Pour illustration, citons les travaux de Weyerstahl et coll. qui utilisent cette méthode pour analyser de façon plus détaillée les huiles essentielles de Cistus ladaniferus [112] et de certaines plantes aromatiques du Brésil [113- 114]. On peut également citer les travaux de Bicchi et coll. qui ont identifié 108 composés après fractionnement dans l’huile essentielle d’Artemisia roxburghiana. L’identification a été réalisée par CPG-SM et pour 23 composés, dont de nombreux isomères sesquiterpéniques, c’est la RMN du 1H et du 13C qui a été utilisée [115]. Dans le cas des extraits végétaux, Barrero et coll. ont travaillé sur des extraits de feuilles de Juniperus (phoenicea et thurifera). Ils ont identifié par RMN, après chromatographie sur colonne et recristallisation, une trentaine de composés parmi lesquels 8 nouvelles molécules mono- et diterpéniques [116].

La voie A de par sa rapidité est particulièrement bien adaptée aux analyses de routine . A l’opposé, la voie B, plus longue, garantit l’identification des composés des mélanges complexes, grâce notamment à l’utilisation de la RMN-1H et -13C mono- et

bidimensionnelles, qui constitue un formidable outil d’analyse structurale. Ceci nous conduit vers une troisième voie C. Celle-ci est basée sur l’identification et parfois la quantification des constituants à partir du spectre de RMN-13C des mélanges, sans séparation préalable.

IV- Analyse par RMN du carbone-13 sans séparation préalable : VOIE C

La voie C est basée sur l’identification et parfois la quantification des constituants à partir du spectre RMN du carbone 13 des mélanges, sans séparation préalable. Dans le domaine des huiles essentielles, les premiers travaux précurseurs sont ceux de Formàcek et Kubeczka [117-118]. Toutefois, cette technique d’analyse était plutôt utilisée comme méthode de confirmation que comme méthode propre d’identification. Partant de ce constat, l’équipe « Chimie et Biomasse » de l’Université de Corse a mis au point et développé, une méthode d’analyse des mélanges complexes naturels basée sur la RMN du carbone-13, efficace, fiable et complémentaire des techniques conventionnelles [119-120].

IV-1- Intérêt de la RMN du carbone-13 Malgré sa faible abondance isotopique naturelle (1,1%) et son moment magnétique qui le rend environ 5700 fois moins sensible que le proton [121], le carbone-13 est préféré aux autres noyaux, car : 9 Le carbone constitue le squelette de toutes les molécules organiques et les différents atomes présents sont, à quelques exceptions près, magnétiquement non équivalents. Donc, on observe en général dans un spectre de RMN du carbone-13 autant de raies de résonance qu’il y a de carbones dans la molécule. 9 Les spectres de RMN du carbone-13 peuvent être simplifiés par irradiation totale des hydrogènes, ce qui permet de n’observer dans le spectre qu’une seule raie de résonance par carbone. Cette irradiation permet d’augmenter l’intensité des signaux par l’effet NOE (Nuclear Overhauser Enhancement) .

9 Le temps de relaxation transversal T2 (temps de relaxation spin-spin) est plus important pour le carbone que pour le proton. La largeur à mi-hauteur du signal de

résonance étant inversement proportionnelle à T2, il en résulte un gain dans la finesse des pics et donc en résolution. 9 Le domaine de résonance du carbone s’étend sur une plage beaucoup plus vaste que celle du proton (250 ppm par rapport à 12 ppm) ce qui procure une plus grande dispersion spectrale [121].

9 Les spectres sont réalisés à température ambiante, ce qui évite la dégradation ou la transformation éventuelle des molécules thermosensibles. De plus l’analyse des composés à haut poids moléculaire s’effectue sans difficulté. 9 Enfin, la RMN étant une technique non destructive, l’échantillon peut être récupéré pour être éventuellement soumis à d’autres analyses.

IV-2- Identification des constituants en mélange L’identification des constituants d’un mélange par RMN-13C est réalisée par comparaison des déplacements chimiques du mélange avec ceux des composés de référence contenus dans une ou plusieurs bibliothèques de spectres. Il est donc indispensable de pouvoir tout d’abord individualiser le maximum de signaux avant de les attribuer à une molécule. Pour cela, les conditions expérimentales d’enregistrement des spectres doivent être optimisées et standardisées de façon à permettre une bonne reproductibilité des résultats obtenus. Ces conditions permettent la limitation des variations des déplacements chimiques des carbones, d’un composé donné dans le mélange, par rapport à ceux du composé pur. Il est également important de savoir apprécier la concentration minimale du mélange, permettant une possible observation dans le spectre, des signaux d’un produit minoritaire.

IV-2-1- Observation et individualisation des signaux L’observation des raies de résonance des carbones d’une molécule dépend de la sensibilité de l’appareil qui s’exprime par le rapport signal sur bruit (S/B), du nombre d’acquisitions, de la masse de produit disponible ainsi que de sa solubilité dans le solvant choisi. La sensibilité s’exprime par le rapport signal sur bruit S/B. Elle croît 3/2 proportionnellement à l’intensité du champ magnétique (B0) (soit B0 ) [121,122]. L’augmentation du nombre d’accumulations permet de pallier un manque de sensibilité de l’appareil (pour les spectromètres de routine ou à champs moyens), mais cela entraîne un temps d’utilisation plus important. En effet, le rapport S/B étant proportionnel à la racine carrée du nombre d’acquisition, au-delà d’un certain nombre d’accumulations le temps d’analyse devient prohibitif par rapport au gain en signal [121]. De nos jours, des cryoaimants pouvant générer un champ magnétique important (21.1T), améliorent la sensibilité et contribuent à diminuer le temps d’une analyse, même avec une faible quantité de produit. Par ailleurs, certaines séquences impulsionnelles permettent d’augmenter la sensibilité. Ainsi, l’irradiation des protons liés aux noyaux de carbone, produit par l’intermédiaire de l’effet Overhauser nucléaire (NOE), une augmentation d’intensité pouvant s’élever à 200%. De

même, une augmentation du rapport S/B (jusqu’à 300%) peut être réalisée en utilisant la séquence «Distortionless Enhancement by Polarization Transfert» (DEPT) ou «Insensitive Nuclei Enhancement by Polarization Transfert» (INEPT) [121]. Parallèlement à la sensibilité, il faut tenir compte de la résolution de l’appareil qui est définie comme étant la plus petite différence de fréquence entre deux signaux de résonance pouvant être enregistrés séparément [121]. La résolution est meilleure quand on utilise un appareil à haut champ. En effet, 250 ppm correspondent à 12 500 Hz avec une fréquence de résonance de 50 MHz pour le carbone (4,7T) et à 25 000 Hz pour une fréquence de 100 MHz pour le carbone (9,4T). La résolution est améliorée par l’utilisation de consoles numériques qui permettent la digitalisation d’un interférogramme avec 128K de mémoire, soit une résolution digitale de 0,187 Hz par point contre 0,763 Hz par point dans les conditions standard d’utilisation des consoles analogiques dans des appareils opérant à 4,7 Tesla. De plus, diverses techniques d’acquisition des données et/ou de traitement du signal permettant d’améliorer la résolution sont disponibles. 9 L’utilisation de fenêtres réduites permet d’enregistrer le spectre sur une largeur spectrale qui correspond uniquement à la zone d’intérêt, ce qui a pour conséquence d’accroître considérablement la résolution digitale. Par exemple, dès 1989 Alemany [123] enregistre le spectre d’un mélange des deux diastéréoisomères du farnésane avec un appareil opérant à 5,8T. En fait, en enregistrant plusieurs spectres avec des fenêtres réduites, il observe 29 signaux sur les 30 attendus, certains d’entre eux n’étant séparés que de 0,003 ppm. Cependant, le temps d’acquisition des données étant inversement proportionnel à la largeur de la fenêtre spectrale, l’enregistrement de ce type de spectres augmente considérablement le temps d’analyse. 9 La méthode du «Zero Filling» augmente la déconvolution du signal et permet d’augmenter le nombre de points de digitalisation sur la première partie de la Free Induction Decay (FID). Les pics sont alors définis par un nombre de points plus importants, ce qui donne une meilleure définition des signaux [124]. 9 Une multiplication exponentielle (Lorentz-Gauss) effectuée sur le FID préalablement à la transformée de Fourier [121] accroît la résolution des spectres. IV-2-2- Attribution des signaux La RMN procure trois types de données spectrales qui sont le déplacement chimique (δ), la multiplicité et l’intensité des signaux. Son intérêt réside dans sa faculté à reconnaître un noyau par rapport à son environnement dans la molécule. La fréquence de résonance des carbones (déplacement chimique) est très sensible à l’environnement stérique et électronique.

La moindre modification structurale se traduit par des variations plus ou moins importantes des déplacements chimiques de pratiquement tous les carbones de la molécule. Contrairement à la majorité des autres techniques spectroscopiques, il est très peu probable que deux composés de structure différente présentent des spectres de RMN-13C superposables ou insuffisamment différenciés. De plus, les valeurs de déplacements chimiques d’une molécule sont indépendantes de la valeur du champ magnétique Bo, des séquences impulsionnelles, des paramètres d’enregistrement des spectres et du traitement du signal. Il en résulte que le déplacement chimique est la donnée spectroscopique la plus utilisée pour identifier un composé connu dans un mélange. IV-2-3- Quelques exemples d’analyse des mélanges par RMN du carbone-13 Divers travaux concernant l’analyse des mélanges complexes par RMN du carbone 13 ont été publiés. Maple et Allerhand ont réussi, en combinant l’utilisation de fenêtres réduites, la multiplication exponentielle et la méthode du «Zero Filling», à individualiser avec un appareil opérant à moyen champ (4,7T), 1800 pics avec une résolution de 0,08hz dans le spectre d’un échantillon d’essence sans plomb [125]. Matlengiewicz et coll. ont mis au point une méthode de données informatiques basée sur les déplacements chimiques des carbones et leurs intensités relatives. Avec cette méthode, ils ont identifié et quantifié des hydrocarbures aromatiques [126] et des alcadiènes [127] dans des fractions d’essence. Certains auteurs ont déterminé par cette méthode, la présence d’acides gras libres dans les mélanges, de mono-, di- et triglycérides ou de phospholipides [127]. De même, il a été possible à partir de l’observation des signaux relatifs à certains carbones, d’accéder à la classe lipidique [128], à la distribution des acides gras sur le glycérol [129-131], à la position et à la stéréochimie des doubles liaisons [132]. Dans le domaine des huiles essentielles, l’utilisation de la RMN-13C pour l’identification des constituants majoritaires a été faite pour la première fois par Formácek et Kubeczka [117,118]. En constituant leur propre bibliothèque de spectres et en analysant les huiles essentielles dans les mêmes conditions expérimentales, ces auteurs ont montré qu’il était possible de confirmer la présence de terpènes mis en évidence par CPG. Suivant ces travaux initiateurs, la RMN-13C a permis l’identification des composés majoritaires de l’huile essentielle d’ Echinophora sibthorpiana [133]. Tout en permettant l’identification de sesquiterpènes dans une fraction chromatographique de l’huile essentielle de bois de Guarea guidonia, la RMN-13C a permis la différenciation des oxydes de caryophyllène et d’isocaryophyllène, ce qui était difficile avec la CPG/SM [134].

Il ressort de cette synthèse bibliographique, que la méthode d’analyse par RMN-13C est applicable à différents types de mélanges. Cependant, elle n’a pas été souvent utilisée comme outil propre d’analyse spectrale. En effet, l’exploitation du spectre d’un mélange reste un problème délicat qui nécessite la création de banques de données spectrales et la possibilité d’une recherche informatisée dans ces bibliothèques.

IV-3- La méthode d’analyse développée au laboratoire de l’équipe « Chimie et Biomasse » Depuis le début des années 1990, de l’équipe « Chimie et Biomasse » utilise la RMN du carbone-13 comme outil d’analyse des mélanges complexes. En effet, contrairement aux méthodes décrites précédemment qui permettent de confirmer la présence des molécules dans un mélange, la méthode développée au laboratoire a pour but l’identification des constituants de mélanges naturels sans séparation préalable (ou tout au moins en limitant au maximum cette étape). Cette méthode est basée sur la comparaison des déplacements chimiques présents dans le spectre du mélange avec ceux des composés de référence contenus dans des bibliothèques de spectres. L’enregistrement des spectres de référence et des mélanges est réalisé avec les mêmes conditions expérimentales (concentration, nature du solvant, paramètres d’enregistrement des spectres). Un logiciel d’aide à l’identification a été mis au point et développé au laboratoire (figure 5), il tient compte de plusieurs paramètres : 9 le nombre de pics observés par rapport au nombre de pics attendus pour chaque molécule. 9 le nombre de superpositions de pics qui peuvent se produire quand deux carbones de deux molécules différentes ont fortuitement le même déplacement chimique, ou quand les composés présents ont une partie de leur squelette et de leur fonctionnalisation très proche. 9 les variations des déplacements chimiques des carbones dans le spectre du mélange par rapport aux valeurs de référence. De plus, l’intensité des pics permet éventuellement de contrôler l’appartenance du signal d’un carbone à tel ou tel composé. Les composés volatils identifiés à partir du spectre de RMN du carbone-13, sont ensuite repérés sur le chromatogramme du mélange par comparaison de leurs indices de rétention sur colonnes polaire et apolaire avec ceux des produits de référence, ce qui permet à la fois de confirmer leur identification et de les quantifier.

Sucres SPECTRE DU MÉLANGE Acides gras COMPLEXE Phénols

Terpènes

BIBLIOTHÈQUES DE SPECTRES

LOGICIEL D’AIDE

À L’IDENTIFICATION

Nombre de carbones observés

Nombre de superpositions

Variation des déplacements chimique

IDENTIFICATION

Figure 5 : Identification des constituants d’un mélange complexe par RMN du carbone-13

Cette méthode d’analyse, qui allie rapidité et fiabilité, est complémentaire des techniques conventionnelles exposées précédemment. Dans le domaine des huiles essentielles, des résultats très intéressants ont été obtenus : 9 La teneur minimale des composés identifiables avec le spectromètre (9,4T) est de l’ordre de 0,5%. Parfois des composés présents à des teneurs inférieures peuvent être identifiés (0,3%-0,4%). 9 Dans un même mélange, une trentaine de composés peuvent être identifiés simultanément au cours d’une seule analyse avec un appareil à 9,4T. 9 En général, tous les carbones des molécules identifiées sont observés, à l’exception de certains carbones quaternaires appartenant aux composés minoritaires. 9 Le nombre de superpositions est limité et n’empêche pas l’identification d’un composé. 9 Les variations des déplacements chimiques (Δδ) sont généralement inférieures à 0,05 ppm pour la très grande majorité des cas. Il y a quelques exceptions, en particulier avec les composés phénoliques (thymol, carvacrol…) dont certains carbones présentent des variations de déplacement chimique plus importantes, selon la polarité des autres constituants du mélange et les liaisons hydrogènes qui en découlent.

L’utilisation de la RMN du carbone-13 devient particulièrement intéressante lorsqu’elle permet d’identifier des composés délicats à analyser par les techniques conventionnelles. Nous pouvons citer : 9 les composés absents des bibliothèques commerciales de spectres de masse. A titre d’exemple, les 5-[(Z et E)-hexyldiène]-5H-furan-2-ones ont été identifiées dans l’huile essentielle de feuilles d’Isolona cooperi [135]. 9 les stéréoisomères. On peut citer l’identification aisée des quatre stéréoisomères α- et β- funébrènes, α- et β-cédrènes ont été identifiés à côté d’autres sesquiterpènes possédant un squelette tricyclo[5.3.1.01,5]undécanique, notamment le cédrol, dans une huile pyrolytique de Cupressus funebris du Vietnam [136]. Citons également l’identification en mélange de quatre stéréoisomères dérivés du squelette farnésane, les bisépoxyfarnesa- 1,7(14)-10-triènes dans une fraction de l’huile essentielle de Dittrichia viscosa [137]. 9 les molécules thermosensibles. Ainsi, le furanodiène qui se transpose thermiquement en furanoélémène dans l’huile essentielle de Smyrnium olusatrum [138]. De

même, l’isoascaridole a été identifiée à côté de l’ascaridole dans l’huile essentielle de Chenopodium ambrosioides [139].

Cette méthode, associée ou non au couplage GPG-SM, a permis de caractériser un grand nombre d’huiles essentielles de végétaux aromatiques de Corse, de Sardaigne et du pourtour méditerranéen [140-142], ou encore d’Afrique [143], de Madagascar [144], d’Amérique du Sud [145], et du Viêt-Nam [146].

En permettant l’identification, des composés jusqu’à une teneur de 0,3-0,5% la RMN du carbone-13, combinée à la CPG (indices de rétention), est bien adaptée à l’étude de la variabilité chimique. Elle a été appliquée avec succès aux huiles essentielles de Pinus nigra ssp. laricio [147], de Lavandula dendata [148], de Pistacia lentiscus [149], de divers Juniperus [150-151] et de différents thyms [152-153].

De plus, la méthode développée au laboratoire a été utilisée pour l’analyse de composés « lourds » ou peu volatils présents dans des mélanges naturels variés tels que : les triterpènes présents dans les extraits de liège [154] et les diterpènes présents dans l’oléorésine de pin [155], ou les acides gras présents dans les fruits de lentisque [156].

Nous avons vu que la semi-quantification des composés volatils présents dans les huiles essentielles, et préalablement identifiés par RMN du carbone-13, pouvait être réalisée, en général sans difficulté par CPG. Dans le cas des composés non volatils, elle peut être réalisée par HPLC, quand la molécule est identifiée avec certitude. La quantification par RMN peut être une alternative intéressante aux méthodes chromatographiques conventionnelles (CPG précédée d’une étape de dérivatisation ou chromatographie en phase liquide).

V- Problématique de la recherche Ce travail, s’inscrit dans le cadre des travaux de l’équipe du laboratoire «Analyse organique fonctionnelle» sur la valorisation des produits issus de la biomasse végétale et en particulier des plantes médicinales (huiles essentielles, extraits végétaux, etc…). Les huiles essentielles constituent des produits naturels à forte valeur ajoutée qui peuvent être par la suite valorisés dans différents secteurs d’activité : pharmacie, aromathérapie, parfumerie, cosmétique ou agro-alimentaire. Nous avons vu dans cette partie que l’analyse des mélanges complexes est une opération délicate qui nécessite la mise en œuvre de techniques analytiques

complémentaires. Elle est cependant indispensable car elle permet leur caractérisation, la détermination d’une éventuelle spécificité et le contrôle de la qualité de ces mélanges naturels. Dans ce contexte, nous nous sommes proposés, dans la première partie de ce travail, de faire une étude détaillée sur la composition chimique des huiles essentielles et des extraits volatils de lentisque. L’identification des mélanges se fera par CPG et CPG/SM. Dans la seconde partie, nous allons montrer la complémentarité de la RMN du carbone- 13 et de la CPG en caractérisant les diverses huiles essentielles de lentisque, de P. terebinthus et P. atlantica. Nous avons donc analysé les différents échantillons en combinant la CPG, la CPG-SM et la RMN du carbone-13. Pour expliciter la méthode d’analyse par RMN, nous allons décrire en détail l’analyse des huiles essentielles des trois espèces de pistachier. Nous allons également aborder l’analyse par RMN des acides gras contenus dans les huiles végétales de lentisque. Afin d’affirmer ou d’infirmer les propriétés médicinales de ces plantes, souvent utilisées par les populations locales et en particulier rurales, nous avons fait une étude sur l’effet antimicrobien de ces huiles essentielles, sur des bactéries, des champignons et des levures.

PARTIE II

Analyse des huiles essentielles et des extraits du Pistacia lentiscus L. par CPG et CPG-SM.

Chapitre I : Etude bibliographique de la composition chimique des huiles essentielles du Pistacia. lentiscus L.

Plusieurs études concernant la composition chimiques des huiles essentielles du lentisque ont été publiées. Ces divers travaux concernent des plantes du pourtour méditerranéen (Grèce, Turquie, Italie, France, Egypte, Maroc, Tunisie et Algérie). Nous les présentons par ordre chronologique de publication. La première étude détaillant la composition chimique des essences de lentisque date de 1966 et décrit une huile essentielle de lentisque du sud de la France riche en monoterpènes oléfiniques (α-et β-pinène, camphène, p-cymène, myrcène …) [157]. Calabro et coll. [158] ont étudié la fraction oléfinique d’un échantillon d’huile essentielle de lentisque de Sicile. Le myrcène avec 25% en teneur, représentait le composé majoritaire. Viennent ensuite l’α- pinène (11%), l’α-phéllandrène, le p-cymène, le limonène et le terpinolène (6-8% chacun). Buil et coll. [159] ont identifié 19 composés dans un échantillon de lentisque de Provence (France). Cette huile est caractérisée par la prédominance de l’α-pinène (16%), suivi du terpinèn-4-ol (9%), du limonène, du p-cymène, du β-caryophyllène, du δ-cadinène et de l’α- cadinol (4-6% chacun). Picci et coll. [160] ont identifié 31 composés dans l’huile essentielle de lentisque sarde. Le terpinèn-4-ol est le composé majoritaire (22%), suivi de l’α-pinène (9%). Viennent ensuite le β-pinène, le limonène, l’α-terpinéol et le β-caryophyllène (environ 4% chacun). De Pooter et coll. [161] ont analysé par CPG-SM un échantillon de lentisque d’Egypte qui se caractérise par la prédominance du δ-3-carène (65%). On note également la présence du limonène, du β-bourbonène, du β-bisabolène, et de l’oxyde de caryophyllène (environ 3- 5% chacun). La même année, Boelens et coll. publient la composition chimique d’une huile essentielle d’Espagne [162]. Ils obtiennent un rendement de 0.2% pour les feuilles et identifient 94 composés parmi lesquels le myrcène (19.2%), l’α-pinène (11.2%), le terpinèn- 4-ol (8.4%), l’α-terpinéol (6.7%), le β-caryophyllène (8.6%) et le germacrène D (6.3%). Fleisher et coll. [163] ont analysé une huile essentielle d’Israël, dont les feuilles étaient conservées dans de l’alcool et hydrodistillées par la suite. Ces auteurs ont identifié 14 composés linéaires parmi lesquels le linolénate d’éthyle et l’héxanoate d’éthyle avec des teneurs de 10% ainsi que 29 composés terpéniques dont les plus importants sont l’α-terpinéol (13%) et le terpinen-4-ol (5%).

Bonsignore et coll. [164] ont analysé par CPG-MS et par GC-FTIR un échantillon de lentisque sarde comprenant les feuilles et les baies. Ces huiles sont caractérisées par la présence du myrcène (13.3%, 19.8%), de l’α-pinène (11.3%, 17.7%), du limonène (9.6%, 14.5%), de l’undécan-2-one (4.2%, 6.0%) respectivement pour les feuilles et les baies. Notons également la présence de l’α-tocophérol à une teneur appréciable de 5.3% et 9.4%. Etudiant la composition et les propriétés antimicrobiennes des huiles essentielles des parties aériennes récoltées sur l’ile de Chios (Grèce), Magiatis et coll. [17] ont identifiés 63 composés les plus importants sont le myrcène (20.6%), le germacrène D (13.3%), le β- caryophyllène (8.3%), l’α-cadinol (7.3%) et le δ-cadinène (7%) pour les feuilles, tandis que l’huile des rameaux est dominées par le myrcène (47.9%) et le germacrène D (15.5%). Fernandez et coll. [165] ont décrit une essence d’origine espagnole dominée par l’α- pinène (13.0%) et le β-caryophyllène (6.9%). En plus de ces composés majoritaires le β- pinène (4.9%), le p-cymène (4.7%), le δ-cadinène (4.1%), l’oxyde de caryophyllène et l’α- cadinol (3.7% chacun) sont présents à des teneurs appréciables. Dans le but d’étudier la variabilité chimique intraspécifique des huiles essentielles de lentisque, Castola et coll. [149] ont hydrodistillé 105 échantillons récoltés en Corse. L’identification des constituants a été faite par CPG/Ir et par RMN 13C. L’analyse statistique détaillée a révélé que les échantillons peuvent être répartis en trois groupes en fonction des proportions importantes des produits majoritaires. 74% des échantillons appartiennent au groupe de l’α-pinène (moyenne 31.9%)/terpinen-4-ol (moyenne 25.6%) avec des teneurs moindres en sabinène, β-pinène, p-cymène, limonène et γ-terpinène. Le second groupe (7% des échantillons) est dominé par le limonène (moyenne 47%) et des teneurs relativement importantes du terpinèn-4ol (11.2% en moyenne) et en α-pinène (5.2% en moyenne). Le dernier groupe (19% des échantillons) est caractérisé par une forte proportion en myrcène (76.9% en moyenne).’ Verzera et coll. [166] ont analysé par « Distillation extraction simultanée » (SDE) la composition chimique d’un échantillon de Sicile (Italie) 78 composés ont été identifiés dont le myrcène (27%), le β-caryophyllène (10.5%) et le germacrène D (29.2%) sont les plus importants.

Appliquant la technique d’extraction par fluide à l’état super critique (SFE, CO2) à deux échantillons récoltés en Sardaigne, Congiu et coll. [167] ont identifié les compositions chimiques des extraits de feuilles et de baies. Les essences de feuilles se caractérisent par la forte prédominance des sesquiterpènes oléfiniques (75.6%) dont le β-caryophyllène (31.4%),

34 le germaccrene D (12.0%) et le δ-cadinène (6.5%) en comparaison avec l’hydrodistillation où ils ne représentent que 38.1% de la teneur totale. Par contre l’extrait des baies de lentisque a donné une composition relativement similaire à l’huile essentielle. En effet, le myrcène (56.1 (SFE) et 46.7%( hydrodistillation)) et l’α-pinène (8.3 (SFE) et 8.9% (hydrodistillation)) sont les produits les plus importants. Duru et coll. [20] ont étudié la composition chimique des huiles essentielles de trois espèces de Pistacia (vera, terebinthus et lentiscus) et déterminé leur activité antifongique. L’essence de lentisque de Turquie se caractérise par la prédominance du terpinen-4-ol (29.9%), suivi du limonène (10.6%) et de l’α-pinène (4.2%). Kivçak et coll. [168] ont également étudié un échantillon de Turkie qui est aussi dominé par le terpinèn-4-ol (29.2%) qui est en même proportion que le β-caryophyllène (29.2%). Zrira et coll. [169] ont pris trois échantillons de différentes régions du Maroc et ont fait un suivi sur six mois. Les rendements d’extraction ne dépassent guerre les 0.2% et ce, quelle que soit la période ou la région de prélèvement. Des variations importantes sont observées entre les trois essences. La première région est dominée par une huile à limonène (6.7-8.1%) et terpinen-4-ol (14.5-19.3%), la seconde est caractérisée par l’α-pinène (16.5- 38.5%), le myrcène (10.2-11.5%) et le limonène (6.8-9.8%) tandis que le terpinèn-4-ol (32.7- 43.8%), l’α-pinène (7.1-13.5%) et le bornyl acétate (6.8-10.3%) prédominent dans le dernier échantillon. Cependant aucune variation majeure n’est observée dans la composition chimique en fonction de la période de récolte. Vidrich et coll. [170] ont fait un suivi de la composition chimique des huiles essentielles des feuilles, des branches, et des baies durant deux années consécutives. Les composés dominants des feuilles sont l’α-pinéne (16.1-25.3%), le limonène (6.6-12.3%), le β- caryophyllène (5.2-8.7%), le terpinen-4-ol (7.6-12.7%) et le germacrène D (10.2-14.3%). L’essence des rameaux est caractérisée par l’α-pinène (34.4-46.2%), le myrcène (6.3-11.6%), le limonène (8.1-13.0%) et le germacrène D (5.8-8.3%) tandis que celle des baies est dominée par le myrcène (68.2-71.0%) et le limonène (19.7-9.6%). Des variations quantitatives mineures ont été observées sans que la dominance des composés majoritaires ne soit affectée. Ben Douissa et coll. [18] ont publié une étude sur l’activité antibactérienne de l’huile essentielle de lentisque de Tunisie. L’α-pinène (16.8%), le β-phéllandrène (8.9%) et le terpinèn-4-ol (11.9%) sont les produits majoritaires identifiés dans cette essence. Papagérogiu et coll. [171] ont étudié l’effet antioxydant des extraits méthanoliques de lentisque ainsi que la variation de la composition chimique des huiles essentielles de lentisque de Grèce, en fonction de la période de récolte. Ces auteurs ont reporté que l’effet antioxydant

35 des feuilles de lentisque était meilleur en période de floraison. A cette même période, correspond une composition chimique dominée par les monoterpènes, en particulier l’α- pinène (24.9%), le limonène (17.8%), et le β-pinène (6.9%). A la période de maturation la teneur des monoterpènes oxygénés double pratiquement, tandis que celle des sesquiterpènes devient trois fois plus grande grâce à au germacrène D qui passe notamment de 3.3% à 13.5%. En Algérie deux études sur le lentisque ont été publiées. Benyoucef et coll. [172] ont analysé par CPG-SM la composition de deux échantillons provenant d’Alger (forêt de Bainem) et El taref. Ces deux huiles essentielles se caractérisent par la prédominance du terpinén-4-ol (34.7 et 17.3%), de l’α-terpinéol (11.0 et 10.4%) et du germacrène D (8.4 et 15.8%). Dob et coll. [173] ont étudié la composition chimique d’huiles essentielles des feuilles récoltées sur trois sites d’Algérie (Alger, Tizi-Ouzou et Oran). Les composés majoritaires décrits sont l’α-pinène (3.6, 2.8 et 19.0%), sabinène (0.4, 1.3 et 12.6%), trans-β- terpinéol (5.0, 15.8 et 13.1%) et le longifolène (12.8, 16.4 et 5.2%) avec des proportions moindre en terpinèn-4-ol (3.4, 7.0 et 1.3%), γ-muurolène (4.2, 5.7 et 2.0%) et le γ-cadinène (6.2, 2.4 et 1.1%) respectivement pour Alger, Tizi-Ouzou et Oran. Les huiles essentielle de la résine de lentisque (mastic gum) ont aussi fait l’objet d’analyses de leur composition chimique, il en ressort que l’α-pinène est toujours prépondérant avec plus de 70% de la teneur totale de l’huile [162, 174, 175]. Par ailleurs plusieurs triterpènes ont été identifiés au sein de la fraction non volatile du mastic. Ainsi, Marner et coll. [176] ont identifié par CPGHT-SM, le tirucallol, le lupéol, la β- amyrine, la β-amyrone et le germanicol dans la fraction neutre d’un échantillon de mastic. Très récemment Papagérigiou et coll. [177] ont identifié 10 acides triterpéniques appartenant à la famille des oléanes et des lanostanes parmi lesquels les acides moronique, oléononique, masticadiénonique, et isomasticadiénonique sont les plus abondants. Kivçak et coll. [40] ont identifié et quantifié l’α-tocophérol dans l’extrait hexanique des feuilles de lentisque. Ce composé leur confère une activité anti oxydante. Cette propriété a été par ailleurs démontrée par Ljubuncic et coll. [27]. Au regard des données bibliographiques, il apparaît que les huiles essentielles de Pistacia lentiscus poussant à l’état spontané dans divers pays du bassin méditerranéen, présentent des compositions assez variées en particulier en ce qui concerne les composés majoritaires. En effet : - le δ-3-carène qui représente 65% de la composition totale d’une huile d’Egypte [161] n’est présent qu’à de très faibles concentrations dans tous les autres échantillons.

Tableau I: Quelques composés majoritaires des huiles essentielles de feuilles de Pistacia lentiscus L. reportés dans la littérature.

α‐ β‐ myrcène δ‐3‐ limonène β‐ terpinèn‐4‐ α‐ β‐caryophyllène germacrène oxide pinène pinène carène phellandrène ol terpinéol D caryophyllène [159] 6.5‐ 2.7‐1.5 4.0‐6.3 0.2‐0.8 3.8‐7.4 0.1 9.1‐13.8 2.5‐6.8 5.2‐6.5 ‐ 3.7‐5.1 15.8 [162] 11.2 2.9 19.2 tr 1.6 0.2 8.4 6.7 8.6 6.4 0.1

[161] 1.0 1.5 1.3 65.3 4.6 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 4.1

[164] 11.3 3.5 13.3 0.6 9.6 0.2 ‐ 0.5 1.6 ‐ ‐

[17] 0.8 0.2 20.6 ‐ ‐ 1.5 0.2 1.3 8.3 13.3 0.4

[165] 13.0 4.9 0.8 0.1 2.7 2.7 2.8 2.2 6.9 2.3 3.7

[149] 4.9‐ 0.6‐8.8 0.7‐74.0 ‐ 0.3‐54.0 0.4‐5.4 0.6‐35.1 0.7‐4.4 0.4‐2.2 1.1‐3.2 ‐ 41.7 [166] 0.2 0.2 27.0 ‐ 0.3 0.1 tr 0.2 10.5 29.2 0.1

[167] 0.2 18.7 ‐ ‐ ‐ 12.6 1.2 1.6 13.2 3.9 0.6

[20] 4.2 1.9 ‐ ‐ 10.6 ‐ 29.9 11.6 3.2 0.7 0.8

[169] 6.3‐ 0.8‐5.4 1.9‐11.3 0.0‐1.3 1.5‐7.8 0.1‐0.8 0.5‐40.1 ‐ 0.8‐4.7 0.1‐0.2 0.2‐6.5 32.0 [170] 16.1‐ 4.2‐6.8 4.6‐8.3 ‐ 6.6‐12.3 2.4‐5.0 7.6‐12.7 ‐ 5.2‐8.7 9.6‐14.3 ‐ 25.3 [18] 16.8 4.3 1.2 ‐ ‐ 8.9 11.9 ‐ 1.9 3.3 ‐

[172] ‐ 0.6‐3.4 0.2‐2.5 0‐0.5 3.5‐3.8 ‐ 17.3‐34.7 10.4‐11.0 2.7‐5.0 8.4‐15.8 0.3

[173] 2.8‐ 3.3‐6.5 ‐ Tr‐0.6 1.2‐3.0 0.0‐2.6 1.3‐7.0 1.3‐1.9 ‐ 0.1‐0.5 1.1‐1.4 19.0 [159] et [149]: France, [162] et [165] : Espagne, [161] : Egypte, [164] [167] [166] [170]: Italie, [17] Grèce, [20] : Turquie, [169] : Maroc, [18] : Tunisie [172] [173] : Algérie.

- Le terpinèn-4-ol dont la teneur peut atteindre les 43% n’est pas reporté dans les huiles d’Egypte [161] et de Sardaigne [164]. - Certains constituants peuvent devenir ponctuellement importants tels que le β- caryophyllène (29.2% en Turquie [168] et le germacrène D (29.2% en Italie [166]. - L’α-pinène qui est en général présent dans tous les échantillons à des taux variables n’est pas cité dans les essences d’Algérie [172]. - Le longifolène et le t-β-terpinéol ne sont cités que dans des huiles d’Algérie [173]. Les variations observées dans les différentes huiles essentielles de diverses origines sont probablement liées à différents facteurs tels reportés par Verpoorte et coll. (variation de 25 à 150% en teneur d’un composé suivant le moment de cueillette pendant la journée) [178]. En effet, étant donnée la diversité des études, il n’est pas possible de présager s’il s’agit de facteurs pédoclimatiques ou environnementaux ou de facteurs génétiques. En ce qui nous concerne et dans la continuité des travaux menées au laboratoire sur la caractérisation des plantes aromatiques poussant à l’état spontané en Algérie, à travers la composition de leurs huiles essentielles et autres extraits [179,180], notre objectif était d’étudier l’huile essentielle de lentisque dans le but de mieux la connaître et la valoriser. Ainsi nous avons analysé par CPG et CPG-SM la composition chimique d’échantillons issus de population (échantillonnage de divers pieds), en considérant différents organes de la plante ; feuille, fruit et rameaux.

Chapitre II : Analyse de divers échantillons d’huiles essentielles de lentisque

II-1 Lieu de récolte et méthode d’extraction De toutes les études qui ont porté sur l’analyse des huiles essentielles, aucune n’a manqué de souligner l’importance de l’échantillonnage et du mode d’extraction sur la qualité de l’essence. En effet celle-ci reste dépendante de nombreux facteurs tels que l’origine de la plante, la maturité des feuilles et des fruits, la situation géographique, l’ensoleillement, la pluviométrie etc…. Les parties aériennes de lentisque soumises à cette étude ont été récoltées entre septembre et octobre 2004 dans trois régions différentes du pays: maquis de hameur el ain (wilaya de Tipaza, échantillon 1), forêt de Bouchaoui (wilaya d’Alger, échantillon 2) et forêt de Texanna (wilaya de Jijel, échantillon 3). Chaque échantillon a été prélevé, sur 3 à 4 pieds de lentisque. La cueillette a, à chaque fois, été faite dans la matinée. L’authenticité des échantillons a été attestée par un spécialiste de l’institut national d’Agronomie.

Les échantillons fraichement cueillis sont préalablement séchés à l’air libre et à l’abri de la lumière de 3 à 5 jours. Nous séparons ensuite les feuilles des fruits et des rameaux. Avant leur extraction, ces derniers sont préalablement coupés en petits bâtonnets d’environ 1cm de longueur. La charge de chaque extraction est d’environ 250g. Les huiles essentielles des différentes parties du végétal (feuilles, rameaux et fruits) sont alors extraites par hydrodistillation à l’aide d’un appareil de Clevenger modifié (figure 1). La durée de chaque extraction a été fixée à trois heures. A la fin de chaque expérience, l’échantillon d’huile essentielle obtenue par décantation, est récupéré, séché sur du sulfate de sodium anhydre, puis conservé au réfrigérateur afin d’éviter toutes dégradation de l’essence.

Réfrigérant

Huile essentielle Phase aqueuse

Vegétal + eau

Calotte chauffante

Figure 6 : Appareil de Clevenger modifié

II-2 Rendement d’extraction: Les rendements d’extraction des 9 échantillons étudiés sont calculés par rapport à la masse de la matière sèche (relation 1). Ils sont rassemblés dans le tableau 2.

R(%) =m1/m2*100 (1)

m1 : masse d’huile essentielle m2 : masse de matière végétale sèche hydrodistillée.

Tableau 2 : Rendements de l’hydrodistillation: Echantillon F1 Fr1 R1 F2 Fr2 R2 F3 Fr3 R3 Rendement (%) 0.21 0.27 0.10 0.11 0.20 0.09 0.07 0.33 0.24 F : feuille, Fr : fruit, R : rameau, 1 : hameur el ain, 2 : Forêt de Bouchaoui, 3 : Forêt de Texanna

Les rendements obtenus sont relativement homogènes. Nous remarquons, cependant, que les fruits de lentisque sont mieux pourvus en huiles essentielles que les autres organes

39 considérés ici. Les rameaux de Tipaza et Bouchaoui sont les moins riches en essence avec respectivement 0.1% et 0.09% contrairement à ceux de Jijel qui donne la plus grande valeur (0.24%). La comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature (tableau 3) montre une bonne corrélation entre nos valeurs et les rendements des essences de différentes origines. Notons néanmoins le rendement assez élevé obtenu par Bonssignore et coll. [164] pour l’essence des fruits (1.13%). Ceci pourrait être expliqué par le fait que l’hydrodistillation a été très poussée (5 heures) et que des produits lourds ont aussi été récupérés.

Tableau 3 : Rendements reportés dans la littérature : référence [157] [161] [164] [17] [165] [149] [167] [20] [169] [172] [173] [171] Rendement 0.1- 0.4- 0.36(F) 0.5(F) 0.25 0.05- 0.25- 0.3 0.2 0.02 0.1- 0.3 (%) 0.2 0.5 1.13(Fr) 0.2(R) 0.1 0.28 0.2 F : feuille, Fr : fruit, R : rameau, [157] et [149] : France, [161] : Egypte, [164] et [167] : Italie, [17] et [171] : Grèce, [165] :Espagne, [20] : Turquie, [169] : Maroc, [172] et [173] : Algérie.

II-3- Indices physiques:

Les indices physiques (indice de réfraction nD et le pouvoir rotatoire αD) de nos huiles essentielles calculés selon les normes AFNOR [54] sont rassemblés dans le Tableau 4. Le pouvoir rotatoire a été calculé à 25°C. On note que les valeurs maximale et minimale de la densité sont respectivement pour les feuilles et les fruits de Texanna. De même, celles de l’indice de réfraction sont attribuées aux feuilles de Hameur el Ain et aux rameaux de Texanna. Les différences observées dans ces valeurs sont directement liées aux compositions chimiques des essences et à leurs produits majoritaires. La seule valeur disponible dans la littérature fait état d’un pouvoir rotatoire compris entre 0° et 3° mais cette valeur a été obtenue pour l’essence issue de la concrète des rameaux feuillés [55]. On ne peut donc faire de comparaison sur ces valeurs car les normes internationales pour l’espèce étudiée sont inexistantes.

Tableau 4 : Indices de réfraction et Pouvoir rotatoire des neuf essences. F1 Fr1 R1 F2 Fr2 R1 F3 Fr3 R3 20 nD 1.4749 1.4749 1.4849 1.4859 1.4735 1.4790 1.4923 1.4710 1.4793

αD (°) -24.00 -8.10 -16.13 -20.83 +11.22 +20.51 -11.11 +14.28 +35.71 F : feuille, Fr : fruit, R : rameau, 1 : hameur el ain, 2 : Forêt de Bouchaoui, 3 : Forêt de Texanna

II-4- Analyse par CPG ET CPG-SM Les huiles essentielles étant des mélanges très complexes de composés avec des squelettes carbonés et des fonctions diverses, leurs analyses conduisent souvent à un important travail de séparation et d’identification. La chromatographie en phase gazeuse est la méthode la plus appropriée pour une telle analyse. La grandeur la plus reproductible pour interpréter les chromatogrammes est sans aucun doute, l’indice de rétention. Introduit par Kovats en 1966 pour des analyses en isotherme, puis repris par Van Den Dool et Kratz [74] qui l’ont par la suite adapté en programmation de température, il est défini par la relation 2 suivante:

tr (x) − tr (z) (2) I R (z) = 100n +100.z tr (z + n) − tr (z )

t r (x) = Temps de rétention du soluté (x) étudié, t r (z) = Temps de rétention de l’alcane à z atome de carbone qui précède (x), t r (z +1) = Temps de rétention de l’alcane à z+1 atome de carbone qui suit (x), n = différence du nombre d’atome de carbone entre les deux alcanes (généralement n =1).

L’association de la chromatographie en phase gazeuse à la spectrométrie de masse constitue une technique analytique de choix dans l’identification. Les identifications se font en général par comparaison des différents pics expérimentaux avec les spectres de masses déjà référenciés [79-82]. L’outil informatique permet d’écourter le temps de traitement, même si la banque de spectres en contient plusieurs milliers.

Dans ce travail, l’analyse qualitative et semi-quantitative des neuf essences a été effectuée par CPG sur phase stationnaire apolaire de type HP1. L’identification a été réalisée grâce au couplage CPG-SM dans le mode impact électronique (IE), sur colonne apolaire de type HP5MS. L’injection des n-alcanes, sous les mêmes conditions opératoires nous a permis de calculer les indices de rétention de tous les pics. Les composés identifiés dans les neuf essences, leurs indices de rétention ainsi que leurs teneurs relatives sont reportés dans le tableau 5. Pour la détermination quantitative des constituants, nous avons admis que le détecteur à ionisation de flamme réagissait de manière identique à tous les composés et que leurs coefficients de réponse étaient tous égaux à l’unité. Les chromatogrammes de différents échantillons sont illustrés en annexe (figures A1-A5)

Tableau 5 : Indices de rétention et teneurs relatives des composés identifiés par CPG et CPG-SM dans les huiles essentielles des feuilles, fruits et rameaux de lentisque prélevés sur trois sites naturels.

Composé identifié par Ik F1 Ik Fr1 Ik R1 Ik F2 Ik Fr2 Ik R2 Ik F3 Ik Fr3 Ik R3 GC/MS tricyclène 923 0.3 923 0.5 920 0.7 920 1.2 920 0.1 918 0.3 925 0.4 921 0.1 920 0.2 α-thujène - - 923 tr - 924 0.2 - - - 925 0.5 α-pinène 931 7.7 936 9.5 932 12.9 930 11.6 928 12.0 934 28.6 932 4.8 929 9.5 931 15.7 camphène 944 0.9 947 1.7 944 2.4 942 3.1 941 1.7 944 2.4 944 1.0 941 1.1 942 1.6 sabinène 965 2.1 968 1.0 966 3.1 965 0.9 965 0.3 970 3.0 967 0.9 964 0.9 967 1.6 β-pinène 970 3.0 973 7.2 971 9.4 970 6.5 969 4.0 974 10.1 971 4.2 967 4.5 971 20.1 myrcène 984 25.6 995 58.1 983 24.6 983 4.4 988 29.0 985 6.4 985 0.6 990 56.2 983 1.1 α-phéllandrène 993 1.1 1002 3.2 993 1.5 993 1.6 998 1.5 996 6.6 996 3.9 996 3.1 996 10.6 δ-3-carène 999 0.1 - 999 tr - 1003 1.0 - 1002 tr 1001 0.3 - α-terpinène 1005 0.2 1008 0.4 1004 0.2 1005 1.0 1009 1.0 - 1009 1.5 1006 0.8 1006 0.5 p-cymène 1009 2.1 1013 0.8 1008 1.0 1008 8.1 1011 0.7 1010 1.6 1012 2.0 1009 1.2 1009 1.6 cinéol 1012 0.5 ------limonène +β-phéllandrène 1018 5.0 1025 4.5 1018 4.0 1019 9.5 1024 19.0 1025 12.4 1023 5.3 1020 3.8 1022 8.4 cis-ocimène 1027 0.5 1030 tr 1027 0.1 1025 0.4 1030 3.3 - tr 1028 0.2 - trans-ocimène 1034 0.2 1036 0.1 1034 0.1 - 1039 0.1 1040 0.2 1041 0.1 1039 0.9 1041 0.2 γ-terpinène 1046 0.5 1048 0.5 1046 0.3 1048 2.3 1050 2.2 1050 0.7 1053 4.2 1049 1.4 1049 1.6 2-nonanone 1075 1.6 1070 0.1 1074 0.4 1072 0.5 1076 0.9 1073 0.2 1075 0.2 tr 1073 0.1 terpinolène 1082 1.2 1076 0.6 1082 0.2 1077 1.6 1078 1.3 1077 0.4 1080 1.6 1076 0.5 1077 0.6 isopentyl isovalérate 1088 1.9 1083 0.1 1088 0.2 1090 0.2 1090 0.4 1085 0.1 1093 0.2 - 2-nonanol 1090 0.3 1089 0.1 1090 0.1 - - 1087 0.2 1096 tr- - fenchol 1095 0.4 1092 0.1 1103 0.1 1097 0.5 1097 0.5 1091 0.2 - - 1102 0.1 cis para menth-2-en-ol 1125 0.2 1129 tr 1114 tr - 1118 0.2 1118 0.2 - 1117 0.1 1117 0.1 transpinocarvéol 1128 0.5 - 1127 0.1 ------pinocarvone 1138 0.2 1138 tr 1136 0.1 ------bornéol 1145 0.1 - 1145 0.1 1144 0.3 1145 0.1 1145 0.1 tr - - terpinen-4-ol 1166 1.5 1159 0.2 1166 0.2 1158 0.6 1165 1.2 1160 1.6 1162 1.6 1158 0.9 1160 2.4 p-cymène-8-ol 1170 0.1 1165 tr - 1164 0.1 - tr 1164 0.1 α-terpinéol 1173 0.6 1169 0.1 1173 0.2 1169 0.9 1177 1.4 1169 0.4 1172 0.6 1168 0.2 1169 0.3 myrténal 1184 0.2 - 1183 0.1 - - 1175 0.1 - - - 1175 0.1 myrténol 1191 0.1 - 1192 0.1 ------isopentyl héxanoate 1234 0.5 - 1234 0.1 1232 1.2 1235 0.6 1233 0.1 1236 0.3 1232 0.1 1233 0.2 bornyl acétate 1275 2.8 1277 0.5 1269 0.1 1265 2.5 1268 1.1 1266 1.7 1268 0.9 1264 0.7 1265 0.7 2-undécanone 1283 0.3 1284 0.1 1275 0.9 1272 2.7 1274 0.8 1273 0.5 1275 0.4 1272 0.1 1272 0.1

Composé identifié par Ir F1 Ir Fr1 Ir R1 Ir F2 Ir Fr2 Ir R2 Ir F3 Ir Fr3 Ir R3 GC/MS 2-undécanol - 1286 0.1 1285 tr - 1284 0.3 - - - δ-élémène 1332 0.1 1332 tr 1332 0.1 1327 tr 1329 0.8 1332 0.7 1328 0.2 1328 0.5 α-cubébène 1348 0.2 1347 tr 1348 0.2 1341 0.3 1346 tr 1346 0.2 1341 0.1 1342 0.1 α-copaène 1375 0.5 1375 0.1 1375 0.5 1368 0.3 1368 0.1 1368 0.1 1372 0.9 1368 0.2 1368 0.5 b-bourbonène 1382 tr 1382 tr 1382 tr - - 1377 tr 1378 tr - tr β-cubébène 1387 0.2 1387 tr 1380 tr 1380 tr 1382 0.3 - - β-élémène 1390 1.1 1390 0.1 1390 0.9 1385 0.8 1385 0.3 1384 0.7 1386 1.0 1383 0.3 1385 1.1 β-caryophyllene 1420 5.0 1422 1.1 1421 7.4 1417 9.5 1413 1.8 1414 2.7 1417 9.3 1415 1.8 1414 4.0 β-gurjunène 1430 0.6 1430 0.1 1430 0.8 1418 0.3 1423 0.1 1423 0.4 1423 0.7 1423 0.2 1422 0.6 aromadendrène 1437 0.1 1439 tr 1437 0.1 1433 tr 1433 0.1 1434 0.5 1434 0.3 1433 0.1 1433 0.2 methylbutylbenzoate 1444 0.4 1444 0.1 1445 0.4 1437 0.7 1439 0.2 1442 0.2 1438 0.3 1437 0.1 1437 0.2 α-humulène 1451 1.2 1451 0.2 1453 1.4 1448 1.8 1449 0.5 1449 0.5 1449 2.8 1442 0.5 1443 1.5 allo-aromadendrène 1460 0.7 1460 0.1 1461 0.6 1450 0.2 1453 0.2 1456 0.1 1455 0.9 1449 0.2 1450 0.5 γ-gurjunène 1472 0.1 1472 tr 1472 tr ------γ-muurolène 1477 1.3 1479 0.2 1479 1.1 1468 1.0 1470 0.5 - - - 1471 1.4 germacrène D 1480 3.4 1483 1.2 1484 5.9 1472 2.7 1476 1.1 1474 7.4 1480 18.4 1471 3.8 1476 10.9 β-sélinène - 1475 tr 1479 0.2 1484 0.4 1477 0.1 1480 0.1 épi- 1490 0.1 1491 tr 1491 0.1 1481 tr 1482 0.1 1482 0.1 1486 0.2 1480 0.1 1482 0.2 bicyclosesquiphéllandrène bicyclogermcrène 1494 0.2 1494 tr 1494 0.3 1484 tr - 1485 0.3 1490 1.1 1484 0.2 1485 0.6 α-muurolène 1499 0.8 1499 0.1 1499 0.9 1490 0.9 1493 0.5 1488 0.1 1493 1.5 1487 0.3 1488 0.6 germacrène A 1502 0.4 1502 0.1 1502 0.4 - 1494 0.1 1498 0.4 1493 0.1 1494 0.1 β-bisabolène 1506 0.2 1505 tr 1506 0.2 1499 0.2 - 1502 1.0 Tr 0.1 γ-cadinène 1514 0.5 1514 tr 1514 0.3 1510 0.6 1508 0.5 1509 0.4 1508 0.6 1510 0.3 1508 1.1 cubébol 1517 0.2 - 1517 0.1 - - 1513 0.2 1512 0.3 - 1511 0.1 δ-cadinène 1521 2.2 1522 0.2 1522 2.7 1518 1.9 1517 1.3 1518 0.8 1518 5.1 1519 1.1 1519 1.8 cadina-1,4-diène 1529 0.1 1528 tr 1529 0.2 1525 0.5 1523 0.3 1525 0.1 1524 0.5 1524 0.1 1524 0.2 α-cadinène 1532 0.2 1532 tr 1532 0.1 - 1528 0.1 1529 0.3 1529 0.2 - 1529 0.2 α-calacorène 1535 0.1 1537 tr - - 1534 0.2 - - - - élémol 1537 0.2 - 1538 0.2 - 1540 0.1 1537 0.1 1535 0.3 - 1537 0.1 germacrène B 1548 0.1 - 1548 tr 1547 0.3 - 1543 1546 0.7 - 1542 - hexenyl benzoate 1554 0.2 1555 tr 1554 0.3 1552 0.2 1555 0.2 - 1555 0.1 spathunélol 1574 0.7 1573 tr 1574 0.5 1566 1.0 1566 0.2 1568 0.5 1567 0.3 1567 0.1 1568 0.4 caryophyllène oxide 1580 0.2 1583 tr 1581 0.2 1569 1.5 1572 0.3 1575 0.2 1572 0.5 1573 0.2 1573 0.3 globulol 1585 2.1 1587 tr 1585 0.5 1575 0.8 1579 0.1 1580 0.2 1580 0.4 - 1582 0.2 viridiflorol 1594 0.1 1596 tr 1594 0.1 - 1586 0.1 1588 0.2 - 1588 0.1

Composé identifié par Ir F1 Ir Fr1 Ir R1 Ir F2 Ir Fr2 Ir R2 Ir F3 Ir Fr3 Ir R3 GC/MS Salvial-4(14)-en-1-one 1597 0.1 1597 0.1 1595 0.3 - - humulène epoxide II 1601 0.1 1602 0.1 1599 0.4 1598 0.1 1598 0.3 1598 0.1 1602 0.1 1599 0.2 fonénol- 1609 0.2 1608 tr 1609 0.2 1607 0.6 1608 0.2 1609 0.4 1607 0.5 - tr γ-eudesmol 1618 0.2 1618 tr 1619 0.2 - - tr 1615 0.2 tr 1-epi cubénol 1625 0.5 1624 tr 1625 0.4 1622 0.7 1621 0.3 1623 0.3 1622 1.8 1621 0.3 1618 0.5 Tau-muurolol 1633 1.9 1632 0.1 1632 1.4 1627 2.7 1629 0.8 1630 0.7 1628 3.4 1629 0.6 1628 0.8 t-cadinol 1636 0.6 1636 tr 1635 0.6 1630 1.4 1632 0.6 1633 0.3 1632 1.5 1633 0.4 1633 0.5 α-muurolol 1640 0.2 - 1636 1.0 1335 0.3 1636 0.3 tr - 1636 0.2 α-cadinol 1644 2.1 1645 0.1 1644 1.6 1642 4.9 1643 1.8 1639 0.9 1640 4.1 1640 0.8 1640 0.8 α-eudesmol 1650 0.3 1650 0.1 - - - α-Bisabolol 1667 0.4 1666 0.3 1659 1.0 1665 0.2 1662 0.4 1663 0.2 1657 0.1 1658 0.1 epi-α-Bisabolol 1672 0.2 1672 0.2 1662 tr 1668 tr 1667 0.2 1667 1.0 1661 0.3 1661 0.4 benzyl benzoate 1720 0.2 - - - 1720 0.4 C20H32 (acyclique) 1948 0.4 1948 0.5 1945 tr 1943 0.6 1940 0.3 Oxyde de manoyle 1983 0.1 1983 0.2 1975 tr 0.4 1973 0.1 1974 0.1 Total 93.1 93.2 96.0 99.6 98.7 99.8 98.0 99.3 99.8 Monoterpènes oléfiniques 51.0 88.1 60.5 52.2 77.4 72.7 30.5 84.5 64.3 Monoterpènes oxygénés 6.7 0.9 1.1 4.8 4.5 4.4 3.1 1.9 3.9 Sesquiterpènes 19.3 3.5 24.2 21.0 7.9 15.4 46.5 9.7 26.3 oléfiniques Sesquiterpènes oxygénés 10.6 0.2 7.1 16.3 5.0 5.3 16.0 2.9 4.8 autres 5.5 0.5 3.1 5.3 3.9 2.0 1.9 0.3 0.5 F : feuille, Fr : fruit, R : rameau, 1 : hameur el ain, 2 : Forêt de Bouchaoui, 3 : Forêt de Texanna Ik : indices de rétention calculés sur une HP1, Tr : %< 0.05

Cependant, nous devons signaler que l’identification n’est pas toujours aisée vu la similitude des spectres de masse entre les composés, en particulier en ce qui concerne les mono et sesquiterpènes. Si l’ambiguïté pour les monoterpènes est levée grâce aux données de rétention, pour les sesquiterpènes le problème est plus délicat vu le nombre important de ces composés dont les indices de rétention ne sont pas différenciables [73]. Nous avons aussi constaté une inversion dans l’ordre d’élution de certains composés entre la HP1 et la HP5MS. De ce fait la proposition de chaque composé est basée à la fois sur l’équivalence de spectre, l’ordre d’élution et les indices de rétention. Par ailleurs, des interférences de spectres ont été également rencontrées dans certains cas de co-élution. Si l’utilisation de deux colonnes de polarités différentes peut résoudre le problème, il n’en demeure pas moins que de nouvelles co-élution de composés apparaissent [181]. La combinaison de ces deux méthodes analytiques nous a permis d’identifier plus de 80 phytoconstituants, représentant entre 93.1 et 99.8% de la composition totale (tableau 5). Tous les échantillons d’huile essentielle sont qualitativement proches dans la mesure où ils sont tous caractérisés par les mêmes composés dominants. Ils sont tous riches en monoterpènes (51.0-88.1%), suivi par les sesquiterpènes puis par les sesquiterpènes oxygénés et enfin par les monoterpènes oxygénés, à l’exception de l’échantillon des feuilles de Jijel qui est caractérisé par la dominance des sesquiterpènes oléfiniques et oxygénés (62.5%) (figure 7).

100 80 autres 60 Monoterpènes oxygénés 40 Sesquiterpènes oxygénés 20 Sesquiterpènes oléfiniques 0 Monoterpènes oléfiniques F1 F2 F3 Fr1 Fr2 Fr3 R1 R2 R3 F : feuille, Fr : fruit, R : rameau, 1 : Tipaza, 2 : Bouchaoui, 3 : Texanna

Figuu re 7 : variation de la teneur des différentes classes chimiques pour les neuf essences étudiées.

L’histogramme de la figure 7 nous montre que les 3 organes sont qualitativement proches, et ce, quel que soit le site de prélèvement. Ainsi, les fruits sont les plus riches en composés oléfiniques (85.2-94.2%), les rameaux viennent en seconde position (84.7-90.6%) puis les feuilles qui en sont les moins riches (70.3-77.0%). Cependant, les proportions de la plupart des constituants varient considérablement d’une région à une autre ou d’un organe à l’autre pour une région donnée. Quelques observations sont à noter :

- l’echantillon 1 (Hameur El ain) est caractérisé par le myrcène (25.6%), suivi de l’α- pinène (7.7%), du β-caryophyllène (5.0%) et du limonène (5.0%) - L’echantillon 2 (Bouchaoui) est lui dominé par l’α-pinène (11.6%), le limonène (9.5%), le β-caryophyllène (9.5%) et le p-cymène (8.1%). - Le dernier échantillon (Texanna) est le plus particulier puisque dominé par deux sesquiterpènes, le germacrène D (18.4% ) et le β-caryphyllène (9.3%). Le limonène (5.3%), le δ-cadinène (5.1%), l’α-pinène (4.8%), le β-pinène et le γ-terpinène (4.2% chacun) Sont aussi présents à des teneurs moindres

D’autres composés sont toutefois présents à des teneurs appréciables dans les trois échantillons de feuilles. Il s’agit: du camphène (0.9-3.1%), de l’α-phéllandrène (1.1-3.9%), 2- undécanone (0.4-2.7%), l’α-humulène (1.2-2.8%). Le τ-muurolol (1.9-3.4%) et l’α-cadinol (2.1-4.9%) représentent les sesquiterpènes oxygénés les plus importants. En ce qui concerne les trois échantillons d’huiles essentielles de rameaux, nous pouvons remarquer que :

- l’échantillon 1 (hameur el ain) est dominé par le myrcène (24.6%), l’α-pinène (12.9%), le β-pinène (9.4%), suivi des deux sesquiterpènes les plus abondants, le β-caryophyllène (7.4%) et le germacrène D (5.9%). - L’échantillon 2 (Bouchaoui) est caractérisé par la dominance de l’α-pinène (28.6%), suivi du limonène (12.4%), du β-pinène (10.1%), du germacrène D (7.4%), du myrcène et l’α-phéllandrène (environ 6% chacun). - Le dernier échantillon est dominé par le β-pinène (20.1%), l’α-pinène (15.7%), le germacrène D (10.9%), l’α-phéllandrène (10.6%) et le limonène (8.4%).

Ces compositions chimiques sont sensiblement similaires aux données de la littérature. En effet, Magiatis et coll. [17] identifient une essence à myrcène (47.9%), tandis que Vidrich et coll. [170] reportent une huile de rameau à α-pinène (34.2-46.2%).

Par ailleurs des compositions sensiblement différentes sont observées dans les trois échantillons d’huiles essentielles extraites des fruits. Ainsi le myrcène est toujours le composé dominant (25.6-58.1%) suivi de l’α-pinène (9.5 et 9.5%) et du limonène (4.5 et 3.8%) respectivement pour Hameur el ain et Jijel, tandis que pour Bouchaoui, c’est le limonène avec 19.0% qui est le deuxième composé majoritaire suivi de l’α-pinène (12.0%).

Le myrcène, majoritaire dans toutes les essences de l’échantillon 1 est présent avec de faibles teneurs dans F3 et R3 (0.6 et 1.1% respectivement). L’α-phéllandrène qui atteint les 10.6% dans R3 ne dépasse pas les 3.9% dans toutes les autres essences et il est présent à l’état de trace dans R2. La teneur du cis-ocimène atteint les 3.3% dans les fruits de Bouchaoui (Fr2) alors qu’il est inexistant ou ne dépassant pas les 0.5% dans las autres essences. Le fonénol

(C15H26O), sesquiterpène oxygéné identifié dans toutes les feuilles, est cité ici pour la première fois dans les huiles de lentisque. Son spectre de masse est représenté dans la figure 8 ci-dessous :

Figure 8: spectre de masse du fonénol, (a): identifé dans feuille de Texanna (F3), (b): référence(Wiley)

II5 Bilan de l’étude sur Pistacia lentiscus

Après ces premières études réalisées sur les huiles essentielles d’échantillons de trois organes (feuilles, fruits et tiges) du P. lentiscus, récoltés sur trois sites différents, nous

47 pouvons tirer les premières conclusions. Ces trois organes de lentisque produisent des huiles essentielles qui sont caractérisées par un grand nombre de composés oléfiniques qu’ils soient mono ou sesquiterpéniques. Ainsi les fruits donnent à priori une huile à myrcène, tandis que les essences des feuilles et des tiges sont caractérisées par plusieurs composés dont les plus abondants sont l’α-pinène, le β-pinène, le myrcène, le β-caryophyllène et le germacréne D. Avec cette étude préliminaire, nous avons mis en évidence une variabilité chimique de l’huile essentielle de lentisque. La poursuite de cette étude sur un plus grand échantillonnage à différents endroits du pays va permettre de mieux mettre en évidence une variabilité chimique des huiles essentielles de cette espèce, d’en ressortir les différents groupes et donner toutes les compositions chimiques possibles. Cependant avant d’entamer ce travail, il nous a semblé utile d’étudier : i) la cinétique d’extraction des feuilles de lentisque. ii) les compositions chimiques des extraits de feuilles de lentisque obtenus par

solvants et par fluide supercritique (CO2) et les comparer aux huiles essentielles afin de montrer l’influence du mode d’extraction sur la composition chimique des extraits naturels.

Chapitre III : Evaluation de la Cinétique d’extraction sur le rendement et la composition chimiques des huiles essentielles des feuilles de lentisque.

III-1- Introduction Beaucoup de recherches sont faites sur le plan de l’extraction des huiles essentielles mais très peu d’entre elles concernent l’étude des cinétiques d’hydrodistillation. Lucchesi et coll. [183] ont réalisé des extractions à partir d’herbes aromatiques afin de comparer l’hydrodistillation avec la distillation assistée par micro-ondes. Ils ont évalué le temps nécessaire pour atteindre la température d’extraction (100°C). Celui-ci est de 5minutes pour la distillation assistée par micro-ondes tandis qu’elle est de 90minutes pour la distillation dite conventionnelle. Ils ont également étudié l’évolution du rendement d’extraction en fonction du temps. Le rendement maximum pour l’huile essentielle de thym est obtenu après 30mn d’extraction par la distillation assistée par micro-ondes contre 4h30 pour l’hydrodistilation. Afin de comparer la méthode d’extraction par solvant avec l’extraction assistée par micro-ondes, Chemat et coll. [184] ont effectué des extractions à partir des graines de carvi

(Carum carvi L.). Ils ont évalué l’effet des radiations dans les cinétiques d’extraction de la carvone et du limonène. Le rendement a été de 19 grammes de carvone et de 13.5 grammes de limonène par kg de carvi, après 60 minutes de traitement à une irradiation de 120W, contre 13.5g de carvone et de 12.6 grammes de limonène par kg de graines pour l’hydrodistillation. D’une façon générale, la production des huiles essentielles peut être assimilée à une combinaison de trois processus : • L’extraction proprement dite, appelée hydrodiffusion conduisant au relargage des composés volatils dans le milieu aqueux sous l’action physique qu’exerce le gonflement de l’eau et de la matière végétale. Des études récentes ont montré que le processus d’hydrodiffusion implique des facteurs physico-chimiques liés aux échanges « osmotiques » qui s’opèrent entre le substrat végétal et la phase aqueuse d’immersion [62,65]. En effet, les cellules sécrétrices d’huiles essentielles sont soit superficielles (sites exogènes), soit sous-cutanées (sites endogènes). La vitesse d’hydrodiffusion dépend donc principalement des données dimensionnelles du substrat [65]. • La co-distillation eau/composés volatils : après l’hydrodiffusion, l’essence est transférée de la surface de la particule végétale dans le bain aqueux au sein duquel elle se disperse. La durée de la co-distillation dépend alors principalement de la tension de vapeur des composés aromatiques. Celle-ci est relativement élevée pour les hydrocarbures oléfiniques (environ 140 mmHg pour l’α-pinène à 100°C) mais faible pour les composés oxygénés (5mmHg pour le carvacrol à 100°C). En conséquence, les premiers co-distillent rapidement alors que la présence de composés de faibles tensions de vapeur rend les huiles essentielles difficilement hydrodistillables [59]. • La séparation de l’huile essentielle des condensats impliquant la coalescence et la décantation, fait intervenir une vitesse de transfert de matière entre deux phases liquides. L’isolement des composés volatils après leur distillation est déterminé dans une large mesure par leur degré de solubilité dans l’eau. La séparation de l’huile essentielle après condensation est en fait l’étape déterminante pour recueillir les composés préalablement libérés.

III-2- Variation du rendement en fonction du temps Une hydrodistillation est menée à terme quand, théoriquement, toute l’huile essentielle contenue dans la matière végétale est récupérée. Ce temps est déterminé en fait quand nous n’obtenons plus d’huile dans le distillat.

Afin de déterminer la durée optimale de l’hydrodistillation, nous avons suivi les variations en fonction du temps, du rendement et de la composition chimiques des huiles essentielles des parties aériennes d’un échantillon de lentisque prélevé dans le maquis de hameur el ain (Tipaza). Nous avons divisé cet échantillon en deux lots de 350 grammes chacun. Le premier lot nous a servi à faire une hydrodistillation en continu des feuilles, le second a été utilisé pour l’étude cinétique. Après 40 minutes de chauffage, la température d’ébullition du mélange est atteinte et les premières gouttes d’huile essentielle commencent à apparaître. L’essence décantée, est récupérée à différents intervalles de temps. Les quantités d’huile essentielle ainsi que les rendements cumulés sont donnés dans le tableau 6.

Tableau 6 : Variation du rendement en huile essentielle en fonction du temps d’extraction Temps d’extraction 0 45 55 70 100 130 160 220 280 290 (mn) Quantité d’HE 0 16.2 16.6 49.2 18.7 49.3 63.5 57.4 5.1 0 extraite (mg) Rendement cumulé 0 0.0046 0.0094 0.0234 0.0287 0.043 0.061 0.0774 0.0786 0.0786 (%)

Nous pouvons observer sur les figures 9 et 10 les variations de la masse d’huile essentielle et le rendement cumulé tout au long de l’extraction. Cette masse augmente jusqu’à 70 minutes (portion de courbe AB) puis chute brutalement jusqu’à 100 minutes (portion de courbe BC). Cette période (AC) correspondrait à la récupération de l’huile située à la surface externe du végétal (sites exogènes). La masse d’huile correspondante représente prés de 37% du rendement total obtenu. De ce point C, qui marquerait approximativement le début de la diffusion intra- particulaire, la quantité d’huile augmente à nouveau pour atteindre un maximum à 160 mn puis décroit jusqu’à épuisement total des composés distillables.

60 0,08 B D 50 0,06 40

30 0,04

20 B C C 0,02 10 D

0 masse d'huile essentielle extraite (mg) extraite essentielle d'huile masse A 0,00 rendement cumulé en rendement huilecumulé essentielle (%) A -10 0 50 100 150 200 250 300 0 50 100 150 200 250 300 temps d'extraction (mn) temps d'extraction (mn) Figure 9 : Variation de la masse d’HE extraite en Figure 10 : Variation du rendement en fonction fonction du temps du temps

L’huile obtenue pendant cette seconde période (CD) proviendrait des sites sécréteurs internes (sites endogènes). Le distillat récupéré à 290mn de l’hydrodistillation a été traité au diéthylether afin de récupérer les dernières traces d’essence. Cependant l’analyse par GC a montré un chromatogramme vide. Nos courbes ne sont pas très différentes de celles obtenues lors des extractions par hydrodistillation assisté par micro-ondes des graines de nigelles [58] si ce n’est le temps d’extraction extrêmement faible (10 mn environ). Ces travaux ont mis en évidence l’existence de trois paliers lors de l’extraction, le premier correspondrait à la diffusion des composés aromatiques situés au voisinage immédiat du solide. Le second palier serait contrôlé par la diffusion de l’huile à l’intérieur des pores tandis que le troisième indiquerait le stade de l’épuisement où les quelques traces d’essence sont extraites des sites intraporeux. Luchessi et coll. [183] ont comparé les cinétiques d’extraction par hydrodistillation (HD) et l’extraction assistée par micro-ondes. Les courbes (rendement en fonction du temps) obtenues par les deux méthodes ont des allures similaires. Cependant la première étape (diffusion à partir des sites exogènes) n’a pas été mise en évidence. Ceci pourrait être expliqué par le fait que leur essence ne soit pas située sur la surface externe de la charge végétale. L’allure des courbes d’extraction serait fortement influencée par la nature même de la matière végétale (morphologie, granulométrie…)[65] Ferhat et coll. [57] ont aussi comparé les cinétiques d’extraction des deux méthodes sur le citron Eurêka. L’allure des courbes d’extractions obtenues sont similaires. Cependant, pour

51 atteindre un même rendement en huile essentielle il faut attendre 20mn pour l’extraction sans solvant assistée par micro-ondes (ESSAM) et plus de deux heures en HD.

III-3-Variation de la composition chimique en fonction du temps Afin d’évaluer l’influence du temps d’extraction sur la composition chimique de l’huile essentielle, nous avons analysé des échantillons d’huile prélevés à 5, 15, 30, 60, 90, 120 et 180 minutes après l’obtention de la première goutte. Les chromatogrammes de chaque extrait sont reportés en annexe sur les figures (A6-A12). Les résultats de l’analyse qualitative et semi-quantitative sont reportés dans le tableau 7. Cette essence est prédominée principalement par le myrcène. Le chromatogramme des premières gouttes d’huile prélevées après 5 minutes est assez dense et rend compte qualitativement de la composition totale de l’huile essentielle, tandis que l’extrait prélevé à 15 minutes est très pauvre en composés. Cet échantillon est en fait caractérisé par une forte teneuru en myrcène (54.1% contre 35.0% dans l’huile totale). La figure 11 relative à la variation du pourcentage de certains composés majoritaires montre que globalement, les teneurs relatives atteignent leurs maximums après 120 minutes de distillation. Ceci est le cas par exemple pour le limonène (6.9%), le γ- terpinène (6.2%) ou le β-caryophyllène (7.3%). La valeur maximale du germacrène D (13.9%) est obtenue après 90mn d’extraction tandis que pour le terpinèn-4-ol (4.1%) cette valeur est atteinte après 60mn.

60 15 50 30 40 30 180 60 20 90 90 10 30 0 5 120 180 tot

Figure 11 : variation de la teneur relative de quelques composés majoritaires de l’huile essentielle de lentisque en fonction du temps d’extraction.

L’histogramme de la figure 12 rend compte de la variation du pourcentage des différentes familles chimiques qui constituent l’HE de lentisque tout au long de la distillation.

Nous constatons ainsi que les monoterpènes oléfiniques sont récupérés en plus grande proportion à 15mn du début de l’hydrodistillation, tandis que les composés sesquiterpèniques et les composés oxygénés distillent mieux à partir de 60mn. Cependant, la teneur des composés oxygénés est la plus élevée à la fin de la distillation (environ 15%) mais aussi dans l’huile distillée en continue (environ 20%). Ce qui conforte le fait que les composés à faibles tensions de vapeur (sesquiterpènes et composés oxygénés) distillent moins rapidement que les monoterpènes. Leurs temps de contact avec la phase aqueuse étant plus long, ces composés sont plus vulnérables aux réactions d’hydrolyse au cours de l’hydrodistillation.

80 70 60 50 monoterpènes oxygénés 40 sesquiterpènes oxygénés 30 20 sesquiterpènes 10 monoterpènes 0

tot 5 15 30 60 90 120 180 Tot : huile totale

Figure 12: Influence du temps d’extraction sur la teneur des différentes familles chimiques de l’huile e ssentielle de lentisque.

Cette étude a permis de mettre en évidence le mécanisme de distillation de l’huile essentielle de lentisque. Ce mécanisme serait constitué de deux étapes importantes : récupération de l’essence à partir des sites externes puis diffusion à partir des cellules sécrétrices internes. Le processus de l’hydrodistillation dépendrait de la composition même de l’huile essentielle et de la morphologie du végétal étudié (feuille, graine, poudre ..). Dans le cas des feuilles de lentisque, nous avons pu déterminer de façon qualitative la composition chimique de l’huile cinq minutes après les premières gouttes, de plus l’analyse a montré que la majeuure partie des sesquiterpènes seraient récupérées après 90 minutes de distillation.

Tableau 7: Variation de la composition de l’huile essentielle des feuilles de lentisque en fonction du temps d’extraction.

Composé identifié HE 45mn 55mn 70mn 100mn 130mn 160mn 220mn Ik % Ik % Ik % Ik % Ik % Ik % Ik % Ik % tricyclène 920 0.1 919 0.2 919 0.4 925 0.4 920 0.3 916 0.2 α-pinène 929 3.4 926 5.8 926 7.9 926 6.8 926 7.9 930 5.9 927 6.8 926 7.6 camphène 940 0.8 937 0.8 - 937 1.1 937 1.3 943 1.2 938 1.3 937 1.6 sabinène 969 1.3 961 1.0 960 1.5 961 2.0 961 1.8 964 0.8 961 1.0 960 0.5 β-pinène 972 3.4 965 4.6 965 4.2 964 5.5 965 5.1 970 4.7 myrcène 990 35.0 990 41.3 990 54.2 984 30.1 984 26.6 987 15.2 986 23.2 980 8.6 α-phéllandrène 996 2.1 997 2.8 997 4.1 994 3.8 994 4.4 999 4.0 996 4.3 992 5.1 δ-3-carène 1001 tr 1002 0.2 1002 0.1 γ-terpinène 1006 1.1 1007 1.0 1006 1.4 1010 1.4 1007 2.1 1005 2.5 p-cymène 1009 3.2 1009 1.1 1007 3.4 1008 1.5 1010 3.8 1013 2.2 1009 1.6 1007 2.2 limonène 1020 3.8 1019 3.9 1016 5.4 1018 5.1 1119 5.9 1022 5.5 1019 5.8 1017 6.9 cis-β- ocimène 1025 tr 1026 0.2 1025 0.2 1026 0.1 trans-β- ocimène 1035 0.1 1036 0.9 1036 0.5 1036 0.9 1038 0.6 1037 0.4 1035 0.3 γ-terpinène 1048 3.3 1046 1.9 1044 2.7 1046 3.1 1045 4.1 1050 4.5 1047 4.3 1045 6.2 2-nonanone 1074 tr 1070 0.1 1071 0.2 terpinolène 1078 1.1 1074 0.7 1073 1.1 1074 1.1 1074 1.6 1077 1.6 1075 1.5 1074 2.4 isoamylisobutanoate 1086 tr 1082 0.2 fenchol - 1090 0.1 1090 0.1 cis-para-menth-2-en-ol - 1116 0.2 terpinèn-4-ol 1160 2.2 1157 1.9 1154 2.2 1156 3.00 1156 4.1 1160 2.4 1157 2.1 1155 1.3 α-terpinéol 1168 0.5 1167 0.3 1167 0.5 1167 0.8 1170 0.7 1168 0.7 1166 0.9 3-methyl butyl hexanoate 1230 0.2 1231 0.1 1231 0.2 1233 0.2 1232 0.2 1231 0.2 acétate de bornyl 1264 0.9 1263 0.8 1261 0.8 1263 0.9 1263 1.0 1266 1.2 1264 1.0 1262 0.9 2-undécanone 1272 0.4 1270 0.2 1271 0.2 1370 0.2 1275 0.4 1272 0.3 1272 0.4 bicycloélémène 1330 0.4 1327 0.4 1327 0.5 1327 0.6 1331 0.6 1328 0.5 1326 0.4 α-cubébène 1442 0.1 1340 0.1 1343 0.1 1342 0.1 α-yanglène - 1362 0.1 1363 0.1 α-copaène 1367 0.3 1367 0.4 1367 0.6 1367 0.2 1370 0.7 1368 0.6 1366 0.6 b-élémène 1386 0.5 1381 0.7 1381 0.9 1380 0.8 1383 1.0 1382 0.8 1380 0.7 β-caryophyllène 1415 7.1 1411 1.5 1406 3.6 1411 5.9 1408 6.1 1413 6.9 1411 5.8 1409 7.3 β-gurjunène 1423 0.3 1418 0.5 1416 0.5 1418 0.6 1417 0.9 1420 0.6 1419 0.5 1417 0.5 aromadendrène 1429 0.1 1428 0.1 1431 0.2 1429 0.2 1427 0.2 methyl butyl benzoate 1433 0.2 1432 0.2 1432 0.2 1432 0.4 1435 0.3 1433 0.2 1432 0.2 α-humulène 1447 1.3 1442 1.2 1442 1.6 1441 1.8 1445 1.9 1443 1.6 1441 2.1 allo-aromadendrène 1450 0.4 1449 0.4 1449 0.5 1448 0.6 1453 0.6 1450 0.5 1448 0.6 γ-muurolène 1471 1.4 1462 0.8 1464 1.2 1466 1.8 54

Composé identifié HE 45mn 55mn 70mn 100mn 130mn 160mn 220mn Ik % Ik % Ik % Ik % Ik % Ik % Ik % Ik % germacrène D 1475 6.1 1474 8.7 1466 4.7 1472 11.7 1469 7.9 1478 13.9 1468 11.4 1470 7.0 bicyclosesquiphéllandrène 1481 0.2 1478 0.2 1480 0.3 1479 0.3 1477 0.3 β-selinène 1485 0.2 1481 0.2 1481 0.2 1483 0.6 1483 0.2 1482 0.2 1480 0.2 bicyclogermacrène 1488 0.3 1488 0.5 1484 0.6 1487 0.7 1487 0.8 1486 0.6 1483 0.6 α-muurolène 1492 1.0 1488 0.6 1488 0.7 1490 0.3 1491 1.1 1489 0.9 1487 1.4 germacrεne A 1496 0.1 1494 0.1 1497 0.2 1495 0.1 1494 0.4 β-bisabolène 1500 0.4 1497 0.3 1496 0.4 - 1500 0.5 1498 0.4 1497 0.5 γ-cadinène 1503 0.5 1500 0.6 1500 0.6 - 1504 0.7 1501 0.6 1500 0.6 δ-cadinène 1515 2.9 1512 1.8 1507 1.3 1510 2.2 1511 2.4 1514 3.5 1513 2.9 1511 5.1 cadina-1,4 -diène 1520 0.3 1518 0.2 1518 0.6 1521 0.4 1519 0.3 1518 0.5 α-cadinène 1523 0.2 1521 0.1 1520 0.1 - - élémol 1530 0.1 1533 0.1 1532 0.2 1535 0.3 1530 0.2 1532 0.3 germacrène B 1540 0.1 1540 0.1 1540 0.2 1542 0.4 1541 0.3 1539 0.6 Hexenl benzoaate 1545 tr 1546 0.2 spathulénol 1560 0.2 1555 0.2 1555 0.2 1558 0.3 1556 0.3 1554 0.5 caryophyllène oxide 1565 0.3 1560 0.3 1560 0.2 1563 0.4 1561 0.3 1560 0.4 globulol 1570 0.1 1566 0.1 1569 0.3 1566 0.2 1566 0.4 viridiflorol 1580 0.1 1574 0.1 1578 0.2 1575 0.1 1574 0.3 Salvial-4(14)-en-1-one 1587 Tr 1585 0.2 1587 0.2 - époxide d’humulène II 1598 0.2 1594 0.1 1603 0.2 1600 0.2 1598 0.1 1596 0.2 épi cubénol 1612 1.2 1607 0.6 1607 0.5 1606 0.5 1610 1.4 1608 0.8 1607 1.9 τ-muurolol 16223 3.1 1620 0.9 1619 0.8 16717 0.7 1624 1.7 1621 1.2 1620 2.8 τ-cadinol 1624 1.5 1623 0.5 1622 0.6 1626 1.1 1624 0.8 1622 1.7 α-cadinol 1635 4.2 1632 1.3 1627 0.7 1630 1.2 1629 1.0 1635 2.3 1633 1.7 1632 2.7 α-bisabolol 1663 0.3 1658 0.1 1661 0.2 1658 0.1 1657 0.2 épi-α-bisabolol 1666 0.3 1661 0.4 1661 0.4 1664 0.7 1662 0.5 1660 0.9 benzyl benzoate 1716 0.1 1715 0.1 1721 0.2 1716 0.1 1714 0.3 acide héxadécanoique 1941 0.2 1946 0.3 phytol 1974 0.1 1969 0.1 total 99.3 94.5 99.1 99.9 96.3 97.3 97.2 96.6 Monoterpènes 58.7 66.4 84.5 62.6 63.4 48.0 57.3 48.5 Monoterpènes oxygénés 3.6 3.3 3.0 4.4 5.9 4.3 3.9 3.1 Sesquiterpènes 24.1 18.6 10.9 28.0 24.2 34.6 28.7 31.4 Sesquiterpènes oxygénés 11.7 4.9 0.7 4.3 2.2 9.3 6.3 12.3 autres 1.2 1.3 0.6 0.6 1.1 1.0 1.3 Ik : indices de rétention calculé sur une colonne apolaire HP1, tr : %< 0.05.

Chapitre IV : Influence du mode d’extraction sur la composition en produits volatiles du lentisque

IV-1- Extraction par solvants organiques IV-1- Introduction L’origine de l’extraction végétale se perd dans la nuit des temps. L’homme a en effet découvert très tôt les bienfaits des végétaux et les premières techniques pour en retirer les extraits actifs. Ces premiers extraits étaient obtenus par extraction aqueuse essentiellement ou fermentation alcoolique et selon des procédés tels que l’infusion, la macération, la décoction ou l’hydrodistillation. L’emploi de l’alcool fut une invention d’une extrême importance pour la parfumerie et il eu pour résultat de permettre d’utiliser, au même titre que les huiles essentielles, les parfums des fleurs extraits par la macération ou l’enfleurage. Son introduction dans la production des parfums marque un tournant décisif dans l’histoire des techniques [55]. Cependant l’utilisation des solvants est à proscrire si le produit final est utilisé à des fins thérapeutiques. Les extraits naturels tels qu’ils se présentent (couleur, odeur, composition chimique) lors de leur production, sont donc le résultat de plusieurs facteurs endogènes (organes, cycle végétatif, âge) et exogènes (lieu de récolte, climat, mode d’extraction et de conservation,…) agissant sur la matière première végétale. La connaissance de l’influence des différents facteurs sur les constituants aromatiques est indispensable. Dans notre étude, nous nous sommes intéressés à différents modes d’obtention des extraits volatils ainsi qu’à l’influence de l’état de la matière végétale sur leurs compositions chimiques.

IV-1-2- Méthodes d’extraction :

Nous avons choisi de faire nos extractions par deux modes différents : le soxhlet (figure 13) et la macération (à température ambiante) assistée par ultrasons. Ce dernier mode d’extraction est actuellement en plein essor [62-66]. En effet, l’amélioration principale apportée par les ultrasons est le temps d’extraction relativement court. Le mécanisme le plus probable proposé pour cette extraction, est l’intensification du transfert de masse par l’éclatement presque total des glandes sécrétrices et la pénétration du solvant à l’intérieur des tissus végétaux ce qui favorise le phénomène d’osmose [62,183]. Cette méthode relativement efficace, est une bonne alternative aux méthodes traditionnelles. Elle a été employée pour l’extraction des produits actifs tels que les flavonoides [184], des antioxydants issus de

Rosmarinus officinalis [185], des esters d’acides gras [186] et des stéroïdes et triterpènes [187] à partir de matrices naturelles.

Figure 13 : Schéma du soxhlet

En ce qui nous concerne, après la récolte en juin 2004 dans la forêt de Bouchaoui (wilaya d’Alger), les feuilles préalablement séchées à l’air libre et à l’abri de la lumière, sont divisées en deux lots. Le premier lot reste constitué de feuilles entières, tandis que dans le second lot, les feuilles sont finement broyées et passées sur un tamis.les échantillons sont traités par deux solvants : l’hexane et le dichlorométhane. Pour chaque extraction nous avons pesé 20g de matière sèche, que nous avons épuisé avec trois fois 100 ml de solvant, pour l’extraction par macération assistée par ultrasons et 200ml de solvant (hexane) pour l’extraction au soxhlet. La durée de chaque extraction a été fixée à une heure. Les extraits sont alors purifiés sur du charbon actif afin de les débarrasser des chlorophylles et autres produits lourds. Cependant le solvant dissout non seulement la partie volatile mais aussi divers substances et notamment des cires et des lipides. Après élimination du solvant par évaporation sous vide, on obtient une masse cireuse appelée concrète. Celle-ci est alors reprise par l’éthanol absolu qui dissout la fraction volatile (qui est alors appelée absolue). Le mélange est ensuite centrifugé et mis au congélateur (10 à 15°C au-dessous de zéro) [55]. Au bout de 24heures, toutes les cires et autres produits lourds ont précipité. La phase liquide alcoolique, contenant les composés volatils est ensuite filtrée et analysée directement par CPG et CPG-SM.

Les mêmes échantillons de feuilles (entières et broyées) sont aussi soumis à une hydrodistillation afin de pouvoir comparer les compositions chimiques.

IV-1-3- Compositions chimiques des extraits des feuilles de lentisque

La composition chimique des extraits volatils d’une plante aromatique dépend en grande partie du mode d’extraction appliqué et du solvant utilisé. En effet des modifications importantes, tant au niveau de la teneur en extrait qu’au niveau de la composition chimique, sont observées [64,65].

Kimbaris et coll. [188] ont étudié l’influence du mode et du solvant d’extraction sur la composition chimique des produits aromatiques de l’ail (allium sativum). Ils ont conclu que les profils chromatographiques des extraits obtenus par hydrodistillation assistée par micro- ondes MWHD et la distillation-extraction simultanée SDE sont qualitativement et quantitativement très différents de ceux obtenus par ultrasons USE. Ils suggèrent par ailleurs que cette dernière méthode qui s’effectue généralement à température ambiante, est la plus appropriée car elle empêche la formation d’artéfacts induits par l’hydroditillation et évite la dégradation thermique des produits thermosensibles. Jerbović et coll. [63] ont observé une modification importante de la composition de la fraction volatile de Robinia pseudoacacia L. qui se traduit par la dominance du phenylacétaldéhyde (66.5%) dans l’huile essentielle et de l’héxadécanol (8.0%), l’acide palmitique (11.4%) et le tetracosane (12.3%) dans l’extrait obtenu par ultrasons.

Stashenko et col [66] ont appliqué différentes méthodes d’extraction afin de comparer qualitativement les compositions chimiques de métabolites secondaires à partir de Lippia alba et Xylopia aromatica. L’extraction par solvant (ES) s’est révélée la plus efficace pour l’obtention des monoterpènes hydrocarbonés, suivie par l’extraction par micro-ondes (EMO), puis de l’hydrodistillation conventionnelle (EH) et enfin de l’extraction par fluide à l’état supercritique (EFS). Par contre l’extrait le plus riche en monoterpènes oxygénés a été obtenu par EFS, puis ES, EH et EMO. Alors que la concentration la plus haute en sesquiterpènes hydrocarbonés a été obtenue par EFS, ES, puis EMO et EH. Les valeurs des rendements obtenus pour les concrètes montrent que l’extraction au soxhlet et macération assistée par ultrasons à l’hexane sont sensiblement similaires, par contre l’extraction au dichlorométhane donne le meilleur rendement (1.8%) (tableau 8).

Les chromatogrammes des différents extraits utilisés pour cette étude comparative (annexe figures A13-A16) montrent des différences qualitatives et quantitatives entre l’huile essentielle obtenue par hydrodistillation et les extraits par solvants. Le tableau 8 donne les teneurs des composés identifiés par CPG et CPG-SM des différents échantillons d’extraits. Nous avons pu identifier entre 86.3 et 98.9% des compositions totales.

On peut observer sur l’histogramme de la figure 14 que la proportion des monoterpènes oléfiniques est très importante dans l’huile essentielle (81.1%) tandis qu’elle ne représente qu’environ 22% pour les autres échantillons. Ceux-ci sont par ailleurs caractérisés par la dominance des sesquiterpènes oléfiniques (37.8-62.0%). L’extrait au dichlorométhane se distingue des autres par sa teneur élevée de composés oxygénés mono- et sesquiterpéniques (32.6% contre 3.2% (HD), 8.8% (SHe), 10.4% (USHe)).

HD SHe USdiCh USHe

HD : Hydrodistillation, SHe : soxhlet à l’hexane, USHe : ultrasons à l’hexane, USdiCh : ultrasons au dichlorométhane

Figure 14 : variation de la teneur des différentes classes de composés en fonction du mode d’extraction et du solvant.

L’huile essentielle présente une composition qui se différencie donc quantitativement de celle des extraits aux solvants. Des variations importantes sont observées tant au niveau des composés majoritaires que minoritaires.

Tableau 8 : Composition chimique d’une huile essentielle et d’extraits aux solvants de feuilles de lentisque analysés sur une HP5MS. Composés identifiés Ir HD Ik SHe Ik USHe Ik USdiCh tricyclène 926 0.4 925 0.1 930 0.4 - α-thujène 931 0.3 930 0.2 - - α-pinène 938 38.9 937 8.9 942 9.7 940 9.4 camphène 953 1.9 952 0.5 957 0.5 955 0.5 sabinène 977 5.5 975 4.4 982 4.2 979 0.7 β -pinène 980 8.0 978 5.3 986 4.9 981 5.3 myrcène 992 1.1 991 0.3 1000 0.4 994 0.4 α- phéllandrène 1005 1.7 1004 0.2 1013 0.4 1005 Tr α--terpinène 1018 2.1 1019 0.2 1024 0.1 1020 0.1 para-cymène 1027 6.6 1025 0.3 1032 0.1 1028 0.5 Limonène* 1031 8.0 1029 2.2 1036 1.9 1033 2.9 γ-terpinène 1060 4.7 1059 0.3 1064 0.4 1062 1.8 cis-sabinène hydrate - 1067 0.1 1073 0.2 1070 0.5 α-terpinolène 1087 1.9 - 1093 0.2 1092 0.1 2-nonanone 1090 0.1 - - - trans sabinène hydrate 1097 - 1095 0.1 - 1097 0.5 isopentyl isovalérate 1099 0.1 1099 0.1 1103 0.4 1102 0.1 menth-2-en-1-ol cis para 1121 - 1124 0.1 1125 0.1 1129 1.4 menth-2-en-1-ol trans- para 1140 - - - 1145 3.3 terpinèn-4-ol 1173 0.2 1171 0.9 1178 1.9 1174 2.3 α-terpinéol 1185 0.2 1184 0.1 1190 0.3 1186 0.1 isopentyl hexanoate 1239 0.1 1238 0.1 1245 0.1 1239 0.1 acétate de bornyl 1274 0.3 1272 0.2 1280 0.3 1274 0.3 2-undécanone 1280 0.1 1278 0.2 1286 0.2 1279 0.3 2-undécanol - - - 1291 0.2 bicycloélémène 1330 0.1 1332 0.8 1330 0.4 1334 0.1 α-cubébène 1344 Tr 1340 0.6 1341 0.1 1342 0.4 α-yanglène - 1370 0.3 - - α-copaène 1378 0.4 1376 0.9 1367 0.5 1360 0.7 β-bourbonène 1389 0.1 1387 0.3 1377 0.4 1369 0.2 β-élémène 1396 0.4 1394 1.6 1382 1.1 1375 0.7 β-caryophyllène 1424 4.3 1423 24.4 1412 12.7 1401 14.3 β-gurjunène 1432 0.1 1431 5.2 1422 1.1 1411 0.5 2-méthylbuthylbenzoate 1437 0.1 1440 0.1 1427 0.1 1429 0.2 aromadendrène 1441 0.1 1443 2.3 1439 0.4 1433 0.2 α-humulène 1454 0.9 1450 6.5 1450 2.5 1440 2.2 allo-aromadendrène 1461 0.3 1457 0.8 1458 0.6 1448 0.8 γ-muurolène 1473 0.5 1469 1.8 1474 0.9 1464 1.5 germacrène D 1477 4.1 1475 7.1 1481 26.0 1471 10.2 β-sélinène 1482 0.1 1480 0.1 1476 0.1 épi-bicyclosesquiphéllandrène 1487 0.1 1485 0.5 1494 0.5 1483 0.1 épi-cubébol - - - 1490 0.5

Composés identifiés Ik HD Ik SHe Ik USHe Ik USdiCh viridiflorène - 1490 4.2 - - bicyclogermacrène 1490 0.6 1497 1.0 - α-muurolène 1492 0.4 1494 0.4 1499 0.9 1494 1.3 β-bisabolène 1499 0.1 - - 1499 0.3 γ-cadinène 1504 0.2 1503 0.9 1502 0.3 cubébol - 1505 0.5 1516 2.0 1504 0.7 δ-cadinène 1513 1.2 1512 2.5 1523 1.7 1513 3.0 cadina-1,4-diène 1523 Tr 1521 0.4 1530 0.2 1522 0.3 α-cadinène 1528 Tr 1527 0.4 1539 0.2 1528 0.2 germacrene B 1545 Tr - - 1542 0.4 cis-muurol-5-en-4-α ol - - 1568 0.1 1556 1.7 germacrène D-4-ol - 1566 0.3 1576 0.9 - spathulénol 1565 0.2 1568 0.2 - 1567 0.7 oxide de caryophyllène 1575 0.5 1574 0.7 1584 1.0 1575 0.9 globulol 1584 0.2 1581 0.1 - 1581 0.5 salvial-4(14)-en-1-one - 1595 0.3 1590 0.3 1591 0.4 époxide de humulène 1602 0.1 1603 0.3 1603 0.4 Fonénol - 1611 0.1 1610 0.4 épi-cubénol 1617 0.2 1616 0.3 1629 0.2 1618 0.5 γ-eudesmol 1621 Tr - - 1622 0.2 caryophylla-4(14),8(15)-dien-5-α-ol - 1627 0.3 - 1627 1.8 τ-cadinol - 0.2 - - τ-muurolol 1630 0.6 1630 0.9 1643 0.8 1632 1.3 α-muurolol 1634 Tr 1635 0.2 1647 0.2 1636 0.4 α-cadinol 1642 0.6 1644 0.9 1656 0.7 1645 2.0 7-épi-α-eudesmol - - - 1650 1.1 α-bisabolo** 1667 0.1 1668 0.2 1683 0.4 1660 0.3 épi- α-bisabolol** - 1671 0.5 1690 0.6 1666 0.4 trans-α-bisabolène epoxide** 1679 1.3 - 1679 4.2 benzyl benzoate 1757 0.1 - 1750 0.3 acide hexadécanoique - 1980 0.1 1968 1980 0.9 phytol 2010 0.1 Rendement en concrète (%) 1.1 0.9 1.8 Total 98,9 94,2 82.5 88.5 Monoterpènes 81,1 22.9 23,2 21.7 Monoterpènes oxygénés 0.7 1,5 2.8 8.4 Sesquiterpènes 14,0 62,0 51.2 38.0 Sesquiterpènes oxygénés 2,5 7.2 7.3 18.2 autres 0.6 0.6 0.8 2.2

Ik : indice de rétention obtenu sur une HP5MS, HD : huile essentielle, SHe : absolue obtenue par soxhlet à l’hexane, USHe : absolue obtenue par ultrasons dans l’hexane, USdiCh : absolue obtenue par ultrasons dans le dichlorométhane, Tr < 0.05%. * : coélution avec le β-phéllandrène ; ** tentative d’identification.

- Les proportions de l’α-pinène, composé majoritaire dans l’HE (38.9%) sont beaucoup plus faibles dans les autres extraits (environ 9%). Par contre les proportions du β-caryophyllène (24.4% (SHe), 12.7 (USHe) et 14.3% (USdiCh) ) et du germacrène D (7.1% (SHe), 26.0%(USHe) et 10.2% (USdiCh) sont plus importantes dans les extraits par comparaison à celles observées dans l’huile essentielle (environ 4% chacun). - Au niveau des composés minoritaires, les proportions du limonène (8.0% contre 1.9-2.9%), du p-cymène (6.6% contre 0.1-0.5%), de l’α-terpinène (2.1% contre 0.1-0.2%), du γ-terpinène (4.7% contre 0.3-1.8%) et du terpinolène (1.9% contre 0.0-0.2%) sont beaucoup plus importants dans l’HE que dans les autres échantillons.

Notons également la présence de composés dans les extraits aux solvants non identifiés dans nos huiles essentielles de lentisque. Il s’agit du cis et trans sabinène hydrate, de l’épi-cubébol présent uniquement dans l’absolue au dichlorométhane, du viridiflorène présent dans l’absolue obtenue par soxhlet à l’hexane. Ces deux composés sont identifiés au détriment du bicyclogermacrène qui est plus caractéristique de nos huiles essentielles. Notons également la présence des deux isomères du muurol-5-ène-4-ol dans les absolues obtenues par ultrasons. Ces deux composés n’ont jamais été cités dans les huiles essentielles de lentisque reportés dans la littérature. Après ces analyses, il ressort qu’il y a des modifications significatives de la composition chimique des extraits aromatiques liées au mode d’extraction mais également au solvant utilisé. Ces observations ont été par ailleurs, confirmées par les différents travaux reportés dans la littérature [63-66]. L’huile essentielle des feuilles est plus riche en molécules monoterpèniques oléfiniques, principalement l’α-pinène, que les absolues qui elles, sont caractérisés par le β- caryophyllène et le germacrène D. Notons que la 2-nonanone non identifiée dans les absolues, pourrait être un produit d’artéfact. Enfin la polarité du solvant peut être un facteur sélectif qui favoriserait l’hydrodiffusion des composés polaires. Ces quelques résultats pourrait corroborer l’idée selon laquelle la composition aromatique d’extraits naturels dépendrait particulièrement de la méthode d’extraction et que la finalité de l’extrait orienterait cette extraction (parfumerie ou à usage thérapeutique).

IV-1-3-Composition chimique des extraits de poudre de lentisque

Un autre facteur pouvant modifier la composition chimique (qualitative et quantitative) et les caractères organoleptiques, est l’état de la matière végétale (broyée ou entière). En effet, nous avons voulu savoir quel serait l’effet du broyage sur la composition chimique des différents extraits. La poudre obtenue est immédiatement extraite afin d’éviter toutes transformations de la composition chimique dû au broyage (oxydation, évaporation des composés volatils). Les rendements des différentes concrètes obtenues, reportés dans le tableau 9, montrent que visiblement les feuilles broyées donnent de meilleurs rendements que les feuilles entières (augmentation d’environ 100%)). On note par ailleurs que l’extraction au dichlorométhane donne le meilleur rendement (3.1% contre 2.3 et 1.9%). Les chromatogrammes des absolues étudiés dans ce travail sont donnés en annexe (figures A17-A19). Les composés identifiés, les indices de rétention ainsi que leur teneur relative sont reportés dans le tableau 9. Nous avons pu identifier entre 90 et 94% de la composition totale. Les oléfines sesquiterpèniques (entre 60 et 80%) constituent la fraction dominante pour les quatre extraits étudiés. Le β-caryophyllène (17.1-21.7%) et le germacrène D (16.7-40.2%) en sont les composés majoritaires. A côté de ceux-ci, nous retrouvons l’α- humulène (3.2-4.0%), l’α-muurolène (1.2-2.7%) et le δ-cadinène (1.8-6.3%).

Comme dans le cas des feuilles entières, les cis- et trans-sabinène hydrate et les muurol-5-ène-4- β et α-ol semblent être des composés caractéristiques des extraits aux solvants, même s’ils existent à moindres teneurs, car ils ne sont pas identifiés dans l’huile essentielle. Il est également intéressant de noter la présence de l’eugénol à 2.1% dans l’extrait au soxhlet et l’époxyde alloaromadendrène dans l’absolue au dichlorométhane (USdiCH). Ces deux composés n’ont jamais été détectés auparavant. Il est intéressant de signaler la présence du cubébol (1.9-2.8%) et de l’épi cubébol (1.3% environ) dans les absolues au détriment de l’épi-cubénol, du τ-muurolol et de l’α- cadinol. Ces composés présents en plus grand pourcentage dans les huiles essentielles pourraient être issus de la solvolyse du cubébol ou de l’épi-cubébol selon le mécanisme de la figure 15.

Tableau 9: Indices de rétention et teneurs relatives des composés identifiés dans les absolues de la poudre des feuilles de lentisque. Analyse par CPG et CPG-SM.

Composé identifié Ik HD Ik SHe Ik USHe Ik USdiCH tricyclène 927 0.1 933 0.1 926 0.2 - α-pinène 938 3.0 940 0.7 932 2.4 937 0.9 camphène 953 0.8 955 0.1 947 0.2 952 0.1 sabinène 977 0.2 978 0.3 972 2.8 976 0.5 β -pinène 980 1.4 981 0.6 975 2.2 979 1.1 myrcène 992 0.2 993 0.1 989 0.2 - α-phéllandrène 1005 1.4 1007 0.1 1003 0.2 - α-terpinène 1018 0.3 1020 0.1 1015 0.1 - para-cymène 1027 1.1 1028 0.1 1022 0.1 1025 0.2 Limonène* 1031 1.7 1032 0.4 1026 1.5 1030 0.7 γ-terpinène 1060 0.7 1051 Tr 1055 0.2 1059 0.3 cis-sabinène hydrate - 1061 0.2 1064 0.1 1068 0.2 terpinolène 1087 0.5 1088 Tr 1084 0.1 1080 Tr trans sabinène hydrate - 1096 0.1 1094 0.1 1095 0.2 isopentyl isovalérate 1100 0.1 1099 0.1 Tr menth-2-en-1-ol cis para 1120 0.1 1116 Tr 1127 0.1 menth-2-en-1-ol t- para 1138 0.1 Tr terinène-4-ol 1176 0.6 1173 1.7 1169 0.2 1172 1.3 α-terpinéol 1185 0.2 1185 0.1 1182 Tr - isopentyl héxanoate 1240 0.1 1239 0.1 1238 0.1 bornyl acétate 1274 0.6 1274 0.2 1271 0.1 1273 0.2 2-undécanone 1280 0.5 1276 0.1 - bicycloélémène 1328 0.1 1328 0.4 1327 0.6 1328 0.3 α-cubébène 1344 0.2 1344 0.2 1343 0.1 1333 0.3 eugénol - 1354 2.1 - - α-copaène 1378 0.6 1378 0.6 1376 0.7 1365 0.7 β-bourbonène 1389 0.2 1389 0.2 1387 0.2 1376 0.2 β-élémène 1396 1.1 1396 1.5 1395 1.5 1383 1.6 β-caryophyllène 1424 17.1 1427 19.9 1427 21.7 1415 21.2 β-gurjunène 1432 0.5 1433 1.2 1432 1.8 1423 1.3 2-methylbuthylbenzoate 1437 0.2 1437 0.2 1436 0.1 1428 0.1 aromadendrène 1446 0.2 1446 0.5 1445 0.7 1437 0.5 α-humulène 1454 3.2 1455 3.6 1454 4.0 1445 3.5 allo-aromadendrène 1461 1.0 1461 0.9 1460 0.8 1452 1.0 g-gurjunène 1470 0.5 - - 1462 0.1 γ- muurolène 1473 2.3 1477 Tr 1465 1.3 germacrène D 1477 16.7 1481 35.3 1482 40.2 1470 27.2 α-sélinène 1482 0.2 - - épi-bicyclosesquiphé 1487 0.9 1484 0.2 1484 0.1 1480 0.1 Epi-cubébol - 1488 1.3 - 1483 1.5 bicyclogermacrène 1490 3.1 1491 1.3 1488 0.4 1486 0.8 α-muurolène 1492 1.8 1492 1.2 1491 2.7 1488 1.2 germacrène A Tr 1495 0.2 1495 0.2 1493 0.1 β-bisabolène 1497 0.6 1497 0.3 1499 Tr 1595 0.3 γ-cadinène 1504 1.3 - - 1506 0.3 cubébol - 1507 2.6 1506 1.9 1509 2.8 δ-cadinène 1513 6.3 1513 3.0 1512 1.8 1512 2.0

Composé identifié Ik HD Ik SHe Ik USHe Ik USdiCH Cis-calaménène 1516 0.8 cubénène 1523 0.4 1521 0.3 1519 0.2 1523 0.5 α-cadinène 1528 0.5 1523 0.2 1526 0.1 1527 0.2 cis α-bisabolène 1539 0.1 1530 0.1 1529 0.1 - elémol 1545 0.3 1539 0.1 1537 0.1 - muurol-5en-4-b-ol cis - 1542 0.2 Tr 1541 0.3 germacrène B 1550 0.2 1546 0.1 1546 Tr Tr muurol-5en-4-aol cis 1560 0.4 1562 0.2 1555 0.2 germacrène D-4-ol - 1567 0.4 1565 0.8 1566 0.7 spathulénol 1569 1.2 1569 0.4 - 1568 0.6 oxide de caryophyllène 1575 2.3 1575 0.8 1573 0.3 1574 1.0 globulol - Tr 1583 Tr 1581 Tr 1584 Tr salvia-4(14)-en-1-one 1584 0.8 1594 0.1 1594 0.1 1594 0.5 époxide de humulène 1602 0.5 1602 0.3 1603 0.1 1602 0.4 fonénol 1610 0.4 1611 0.1 - 1610 0.2 épi-cubénol 1618 1.4 1618 0.3 1617 0.1 1617 0.4 γ-eudesmol 1623 0.3 Alloaromadendrène époxide 1627 1.0 τ-cadinol 1630 2.3 1633 1.9 1630 0.7 épi- α-muurolol 1633 2.3 1637 0.5 1631 0.5 1632 1.0 α-muurolol 1637 1.3 1641 0.3 1637 0.2 1636 0.5 α-cadinol 1646 4.8 1646 2.2 1644 0.5 1643 2.4 α-bisabolol 1673 0.9 1973 0.9 1671 0.4 1672 1.2 épi- α-bisabolol 1679 0.8 1679 1.8 1678 0.3 1679 3.6 benzyl benzoate 1761 0.2 1760 0.2 1765 - 1767 0.4 acide hexadécanoique 1958 0.1 1956 0.2 1955 Tr 1962 0.6 phytol - 1983 0.2 2018 Tr 0.1 Rendement en concrète (%) 2.3 1.9 3.1 Monoterpènes 11,4 2,6 10,2 3.8 Monoterpènes oxygénés 1,4 2,5 0,7 2.0 Sesquiterpènes 59.9 71.2 77.9 64.8 Sesquiterpènes oxygénés 19,6 14.6 5.5 19.0 Autres 1.1 3.1 0.4 1.2 Total identifié 93.4 94.0 94.7 90.8 MS Ik: indice de rétention obtenu sur une HP5 , HD : huile essentielle obtenue par hydrodistillation, SHe : absolue obtenue par soxhlet à l’hexane, USHe : absolue obtenue par ultrasons dans l’hexane, USdiCh : absolue obtenue par ultrasons dans le dichlorométhane, Tr < 0.05%, * : tr de β-phéllandrène.

+ +

H OH H H H H H cubébo l, épicubébol H (+)-delta-cadinène +

O H OH H

H H OH OH H H

cubénol épicubénol

H H

tau-m uu rolol alpha-muuro lol

Figure 15 : Solvolyse du cubébol ou de l’épicubébol

Dans l’hydrodistillation des feuilles broyées, la fraction des oléfines monoterpèniques ne représente que 10.9% alors qu’elle atteignait les 80% pour les feuilles entières. Au contraire, la fraction des composés sesquiterpèniques oxygénés est assez importante (19.3%) dans le cas de la poudre, alors qu’elle ne représentait qu’environ 2.5% dans le cas des feuilles entières. Cette modification pourrait être expliquée par le fait que les composés odorants sont mis plus rapidement en contact avec l’eau et deviennent ainsi plus vulnérables aux réactions d’oxydation, évaporation...

100

HD 0 SHe USdiCh USHe

HD : huile essentielle, SHe : absolue obtenue par soxhlet à l’hexane, USHe : absolue obtenue par ultrasons dans l’hexane, USdiCh : absolue obtenue par ultrasons dans le dichlorométhane Figure 16 : variation de la teneur des différentes classes chimiques en fonction du mode d’extraction

Nous devons également signaler la présence de composés triterpéniques (C30) dans les extraits obtenus par solvants. Citons par exemple l’α-tocophérol (vitamine E, figure 17), le γ- sitostérol (figure 18), le hop-22 (29)-en-3-one (figure 19) , le hop-22 (29)-en-3-β−ol et l’urs- 12-en-28-al ces composés ont tous été identifiés par CPG-SM mais non résolus en CPG. Leurs teneurs relatives (obtenues par CPG-SM) sont appréciables en particulier dans les extraits à l’héxane. Leurs spectres de masse sont représentés ci-dessous :

(a)

(b)

Figure 17: spectres de masse de l’α-tocophérol identifié dans l’extrait au soxhlet (a) et (b) : référence Wiley

Cette étude a permis d’observer des modifications importantes de la composition chimique des extraits volatils des feuilles de lentisque dues non seulement aux modes d’extraction mais aussi au traitement préalable de la matière végétale.

(a)

(b)

Figure18 : spectres de masse du γ-sitostérol identifié dans l’extrait au soxhlet (a) et (b) : référence Wiley

(a)

(b)

Figure19 : spectres de masse du hop-22 (29)-en-3-one identifié dans l’extrait au soxhlet(a) et (b) : référence Wiley

Ainsi les feuilles entières produisent par hydrodistillation une essence riche en composés monoterpéniques oléfiniques, tandis que les extraits par solvants donnent des compositions chimiques riches en sesquiterpènes en particulier le β-caryophyllène et le germacrène D. Ces mêmes composés sont également caractéristiques de l’huile essentielle et des extraits aux solvants obtenus à partir des feuilles broyées. Le traitement préalable de la matière végétale (broyage) a conduit à des extraits assez pauvres en oléfines monoterpèniques. Cependant dans les extraits à l’hexane (soxhlet ou ultrasons), nous avons identifié des molécules triterpéniques tel que l’α-tocophérol qui confirmerai l’effet antioxydant des feuilles de lentisque reportés dans la littérature [26,40].

IV-2- Extraction au fluide supercritique (EFS-CO2) : IV-2-1- Principe et propriétés des fluides supercritiques : Au cours de ces dernières années, une importance grandissante est donnée à la qualité et à la sécurité des produits alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques extraits par différentes méthodes. La présence souvent non négligeable, sinon importante de solvants dans les extraits a provoqué chez les consommateurs une prise de conscience du danger de tels produits. D’où des réglementations internationales restrictives d’emploi de certains solvants. Ainsi, l’extraction par les fluides supercritiques (EFS) se présente de plus en plus comme une alternative aux techniques classiques d’extraction liquide-solide pour la préparation d’échantillons d’origines diverses. Le diagramme d’un corps pur présente les différents états de la matière (solide, liquide et gazeux). Par définition, l’état supercritique est caractérisé par la disparition de l’interface séparant l’état liquide et l’état gazeux au-dessus d’une certaine température et d’une certaine pression. Les propriétés des fluides supercritiques sont intermédiaires entre celles des liquides et celles des gaz. Le fluide supercritique présente une viscosité faible et une diffusivité élevée comme les gaz et une masse volumique se rapprochant de celle d’un liquide [33]. Un ordre de grandeur de la masse volumique, de la viscosité et de la diffusivité pour les gaz, les liquides et le CO2 supercritiques est repris dans le tableau 10 ci-dessous :

Tableau 10: Propriétés physiques pour les gaz, le CO2 supercritique et les liquides [189]

Propriétés Gaz CO2 supercritique Liquide

(30°C et 1atm) (Tc et Pc) (30°C et 1 atm) Masse volumique 10-3 0.47 0.6-1.6 (g/cm3) Diffusivité (cm2/s) 10-1 10-3 5 10-6 Viscosité (g/cm.s) 10-4 10-4 10-2

Le dioxyde de carbone (CO2) présente de multiples avantages qui en font de loin le fluide le plus utilisé. Il est peu couteux, non toxique, ininflammable et chimiquement inerte. Sa température critique et pression critique facilement accessibles sont compatibles avec les composés thermiquement instables. En outre, son état gazeux à pression atmosphérique permet de le séparer spontanément du produit final et d’éviter ainsi la présence de solvants résiduels. IV-2-2- Application des technologies supercritiques : Les fluides supercritiques proposent désormais au monde industriel et pharmaceutique une vaste gamme de technologies innovantes dans des secteurs d’application très diversifiés. Un de leurs atouts majeurs est d’être une alternative à l’usage de solvants organiques et donc de rencontrer des normes de plus en plus strictes en matière d’environnement. Dans certains cas, ils offrent des solutions que ne peuvent apporter les techniques traditionnelles [67,190]. L’extraction par fluide supercritique constitue le secteur d’application le plus ancien. L’EFS prend de plus en plus d’essor par rapport aux techniques conventionnelles pour l’extraction à partir de matrices solides. On cite à titre d’exemples, l’extraction de substances naturelles d’intérêt biologique comme l’extraction de la vitamine E [191] et de la cocaine [192] ou encore dans l’agroalimentaire pour l’extraction de colorants naturels [193]. Le domaine des huiles essentielles, aromes et parfums est un secteur offrant également un large éventail d’applications [67-71]. La composition du produit obtenu par cette technique est généralement assez proche de l’huile essentielle [67]. En ce qui nous concerne, nous nous sommes intéressées à l’extraction de l’huile essentielle de lentisque par le fluide supercritique (CO2). Nous avons voulu tester cette méthode d’extraction innovante sur les feuilles et fruits de lentisque. VI-2-3-Echantillons et méthode d’extraction : Ce travail a été rendu possible grâce à l’aimable collaboration du Pr Bruno Marongiu de l’université de Cagliari en Italie. Nous avons pris comme échantillons une partie du lot prélevé dans la forêt de Bouchaoui et étudié dans la première partie de ce travail. Les feuilles et les fruits sont préalablement séchés à l’abri de l’air et de la lumière. Avant leur utilisation pour l’extraction au fluide supercritique, ils sont finement broyés. L’extraction a été menée dans un appareil de laboratoire (figure 20) équipé d’une enceinte d’extraction de 400cm3 qui permet de charger jusqu’à 250g de matériel végétal.

Celui-ci est ensuite traversé par du CO2 en phase supercritique.

L’opération est alors réalisée en deux étapes. La première étape consiste à extraire le matériel végétal à température modérée et forte pression (40°C et 90 bars), on obtient une sorte de pâte jaunâtre presque solide contenant des cires et des composés lourds (triterpènes) en plus des composés volatils. Les composés lourds sont précipitées à -10°C dans un premier séparateur. Sous ces conditions l’huile essentielle est très soluble dans le CO2 et est transportée dans le second séparateur qui se trouve sous une pression de 15 bars et une température de 15°C. Ces conditions sont choisies afin de minimiser les pertes en huile essentielle. Après une phase de détente qui provoque le passage du gaz carbonique de l’état supercritique à l’état gazeux, on obtient une huile légèrement colorée d’une consistance et d’une viscosité proches de celles d’une huile essentielle obtenue par hydrodistillation.

Figure 20: Appareillage d’extraction par le CO2 supercritique

IV-2-4- Compositions chimiques des extraits : Les rendements en extraits par EFS sont de 0.37% pour les feuilles et 0.29% pour les fruits contre 0.11% et 0.20% respectivement pour les feuilles et les fruits lors de l’hydrodistillation. Les deux extraits obtenus par fluide supercritique et les huiles essentielles sont analysés par CPG et CPG-SM. Les chromatogrammes des essences obtenues par EFS-

CO2 et par hydrodistillation sont représentés sur les figures (20-21).

(a)

(b)

Figure21: Chromatogrammes des essences de fruits de lentisque a : SFE-CO2., b : hydrodistillation

(a)

(b)

Figure22: Chromatogrammes des essences de feuilles de lentisque a : SFE-CO2., b : hydrodistillation

L’examen des quatre fingerprints montre que les extraits par EFS-CO2 sont plus riches en composés et en particulier les composés à haut poids moléculaires. Les composés identifiés ainsi que leurs proportions sont reportés dans le tableau 11. Au total 80 constituants ont été identifiés et ils représentent 99.6% et 68.2% pour les feuilles et 98.7% et 83.6% pour les fruits respectivement de l’huile essentielle (HE) et de l’extrait

EFS-CO2. En ce qui concerne les extraits de feuilles, Leurs compositions chimiques sont qualitativement proches dans la mesure où presque tous les composés volatils sont identifiés dans l’huile essentielle et l’extrait au CO2. L’α-pinène (11.6 vs 10.9% respectivement dans

HE et l’extrait-CO2) et le limonène (9.5 vs 11.9) sont les composés majoritaires communs aux deux extraits.

Cependant des variations majeures sont à signaler pour certains composés : - Le β-caryophyllène et le p-cymène sont respectivement identifiés à 9.5% et 8.1% dans l’huile essentielle (hydrodistillation). Leurs teneurs chutent d’environ 60% et 90% (β-

caryophyllène 3.9%, p-cymène 0.9%) dans l’extrait-CO2

- Le sabinène a une teneur de 6.0% dans l’extrait-CO2 alors qu’il est faiblement présent dans l’huile essentielle (0.9%).

- L’acide hexadécanoique est identifié à 2.4% dans l’extrait-CO2 et elle est totalement absente dans HE. Les composés sesquiterpéniques et en particulier les oxygénés sont mieux extraits par hydrodistillation (16% vs 5.0%). Cette observation à déjà été reportés dans les travaux de Marongiu et coll. [194] dans l’extraction de la fraction volatile de Juniperus phoenicea.

Il faut également signaler que le faible pourcentage de composés identifiés dans l’extrait-CO2 est dû à l’existence de pics chromatographiques de composés lourds (type triterpénique) que nous n’avons pas pu identifier car les bibliothèques de spectres pour ce type de composés sont très restreintes.

Les extraits de fruits obtenus par hydrodistillation et par EFS-CO2 sont quantitativement très différents. En effet le myrcène qui est le composé majoritaire des fruits

(29.1%) ne fait plus que 10% dans l’extrait-CO2. D’ailleurs les monoterpènes dominaient avec 77.4% de la composition totale dans l’huile essentielle ne sont plus qu’à 25.1% dans l’extrait-CO2. Mais la plus grande différence réside dans la présence non négligeable d’acides gras essentiels dans l’extrait-CO2. Nous avons identifié dans cet extrait l’acide linoleique

(C18:2) avec une teneur de 11.6% à côté de l’acide oléique (5.1%) et l’acide palmitique (7.7%). Les spectres de masses sont reportés sur les figures (23-25).

Abundance

Scan 2539 (43.849 min): PIST16.D 43 9000 8000 73 (a) 7000 57 6000 5000 4000 3000 129 256 85 2000 97 213 115 157 171 185 1000 143 199 227 239 275 0 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z--> Abundance

#195440: Hexadecanoic acid (CAS) $$ Palmitic acid $$ Palmiti 43 73 9000 60 8000 7000 (b) 6000 5000 4000 129 3000 85 2000 97 256 115 213 157 171 185 1000 143 199 227 239 0 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z-->

Figure 23 : spectres de masse de l’acide palmitique identifié dans l’extrait-CO2 (a) des fruits de lentisque (b) : référence Wiley.

Abundance

Scan 2894 (49.549 min): PIST16.D 41 55 67 9000 8000 81 7000 (a) 6000 95 5000 4000 3000 109 2000 123 280 1000 135 149 264 164 180191 207 222235246 0 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z--> Abundance

#226103: 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)- (CAS) $$ Linoleic 55 67 9000 8000 81 7000 41 (b) 6000 95 5000 4000 3000 109 2000 123 1000 137 280 149 165 182195 209222235 256 0 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z-->

Figure24 : spectre de masse de l’acide linoléique identifié dans l’extrait-CO2 (a) des fruits de lentisque (b) : référence Wiley.

Abundance

Scan 2911 (49.823 min): PIST16.D 55 9000 41 8000 7000 69 (a) 6000 83 5000 97 4000 3000 2000 111 264 125 1000 137151 165 180194207 222235246 282 0 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z--> Abundance

#228694: 9-Octadecenoic acid (Z)- (CAS) $$ Oleic acid $$ Red 55 9000 8000 69 7000 41 83 (b) 6000 5000 97 4000 3000 111 2000 125 264 1000 137 151 222 165 180193207 235246 282 0 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z-->

Figure 25: spectre de masse de l’acide oléique identifié dans l’extrait-CO2 (a) des fruits de lentisque (b) : référence Wiley.

Une autre famille de composés de structure Phénol-3-n alkyl est identifiée avec une teneur assez élevée (environ 20%). Son spectre de masse type est représenté sur la figure 26 ci- dessous :

Abundance

Scan 3481 (58.975 min): PIST16.D 108 8000 (a) 6000

4000

2000 43 304 121 57 77 149 91 135 164178192206220234247262 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z--> Abundance

#254858: Phenol, 3-pentadecyl- $$ Phenol, m-pentadecyl- $$ m 108 8000 (b) 6000

4000

2000 43 304 29 121 57 77 149 4 91 134 164178192 206 220234248262 275 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z--> Figure 26: spectre de masse d’un composé phénolique identifié dans l’extrait-CO2 (a) des fruits de lentisque (b) : référence Wiley. .

Tableau 11 : Composition chimique des huiles essentielles et des extraits au SFE-CO2 des feuilles et des fruits de lentisque identifié par CPG et CPG-SM. Composé identifié Ik HD SFE HD SFE F F Fr Fr tricyclène 920 1.2 0.3 0.15 tr α-thujène 928 - 0.1 0.2 0.4 α-pinène 930 11.6 10.9 12.0 3.1 camphène 942 3.1 1.2 1.7 0.23 sabinène 965 0.9 6.0 4.3 0.9 β-pinène 970 6.5 3.8 1.2 Myrcène 983 4.4 2.1 29.1 10.8 α-Phéllandrène 993 1.6 0.1 1.5 0.4 δ-3-carène 1003 - 1.0 0.3 α-Terpinène 1005 1.0 0.1 1.0 0.4 para-cymène 1008 8.1 0.9 tr tr limonène* 1024 9.5 11.9 19.7 5.2 (E)- β-ocimène 1030 0.4 (Z)- β-ocimène 1045 0.4 0.1 3.3 1.1 γ-terpinène 1050 2.3 0.3 2.2 0.5 cis-sabinène hydrate - - 0.1 tr α-terpinolène 1072 1.6 0.2 1.3 0.2 2-nonanone 1077 0.5 0.2 0.9 0.2 trans sabinène hydrate 1082 0.1 Isopentyl- 2-méthyl butanoate 1090 0.2 0.4 0.4 fenchol 1097 0.5 0.1 0.5 cis p-menth-2-en-ol 1118 0.2 transpinocarvéol 1127 tr 0.1 - Bornéol 1144 0.3 0.1 0.1 tr terpinèn--4-ol 1158 0.6 1.5 1.2 0.2 α-terpinéol 1169 0.9 1.6 1.4 0.2 isopentyl hexanoate 1232 1.2 2.8 0.6 tr bornyl acetate 1265 2.5 0.5 1.1 0.3 2-undécanone 1272 2.7 0.4 0.8 tr δ-élémène 1327 tr tr - tr α-cubébène 1341 0.3 0.1 tr tr α-copaène 1368 0.3 0.2 0.1 tr β-bourbonène 1382 - 0.1 tr b-cubébène 1387 tr β-élémène 1390 0.8 0.3 0.3 tr β-caryophyllène 1422 9.5 3.9 1.8 1.5 β-gurjunène 1428 géri0.2 0.2 0.1 tr aromadendrène 1436 tr 0.1 2-méthyl butyl benzoate 1443 0.7 - 0.2 tr α-humulène 1450 1.8 0.6 0.5 tr allo-aromadendrène 1458 0.2 0.2 0.2 tr γ-muurolène 1469 1.0 0.4 0.5 0.5 germacrène D 1475 2.7 2.8 1.1 1.8 β-sélinène 1480 tr tr 0.2 tr

Composé identifié Ik HD SFE HD SFE F F Fr Fr épi-bicyclosesquiphéllandrène 1485 tr 0.3 0.1 tr bicyclogermacrène 1490 tr 0.3 - tr α-muurolène 1499 0.9 0.5 0.5 0.3 b-bisabolène 1502 0.2 0.3 - γ-cadinène 1511 0.6 0.3 0.5 0.5 cubebol 1518 - 0.6 0.2 δ-cadinène 1522 1.9 0.7 1.3 1.1 cadina-1,4-diène 1529 0.5 tr 0.3 tr α-cadinène 1532 - tr 0.1 tr α-calacorène 1537 0.2 - élémol 1540 - tr 0.1 tr germacrèneB 1548 0.3 - germacrène D-4-ol 1566 - 0.5 - 0.2 spathulénol 1568 1.0 0.2 0.2 - oxide de caryophyllène 1573 1.5 0.7 0.3 tr globulol 1576 0.8 tr 0.1 - époxyde de humulène II 1597 0.4 tr 0.1 - fonénol 1547 0.6 0.1 0.2 - 1-épi-cubénol 1607 0.7 1.2 0.3 - τ-cadinol 1614 1.4 0.5 0.6 tr τ-muurolol 1627 2.7 0.4 0.8 tr α-muurolol 1630 1.0 tr 0.3 tr α-cadinol 1636 4.9 1.2 1.8 tr α-bisabolol** 1659 1.0 0.2 0.2 épi-α-bisabolol** 1662 tr Tr 1.3 cembrène 1910 - 0.9 - C20H30 1932 - 0.3 0.6 1.3 acide héxadécanoique 1960 tr 2.4 7.7 oxyde de manoyl 1965 tr 1.2 0.4 - épi-13-oxyde de manoyl 1980 tr tr acide linoléique 2115 - - 11.6 acide oléique 2122 - - 5.1 C19H28O. 2209 - - 3.1 3-pentadécyl phénol (304) 2350 - - 12.0 phénol -3-n-alkyl (330) 2479 - - 8.3 squalène 2556 - 1.1 0.7 Total 99,6 68,2 98,7 83,6 Monoterpènes oléfiniques 52,2 38,1 77,4 25,1 Monoterpènes oxygénés 4,8 4 4,5 0,6 Sesquiterpènes oléfiniques 21,3 11,2 8 5,7 Sesquiterpènes oxygénés 16 5,6 4,9 1,5 Acides gras - 2.4 - 24.4 Autres 5.3 6.9 3.8 26.3 Ik : indice de rétention obtenu sur une colonne apolaire HP1, Tr < 0.05%. * : co-élution avec le β-phéllandrène. ** tentative d’identification

L’extraction par fluide supercritique fait partie des nouvelles techniques de préparation d’échantillons qui ont émergé au cours de ces dernières années. Elle constitue une alternative intéressante aux techniques classiques d’extraction liquide solide car le pouvoir solvant du fluide supercritique est ajustable, non seulement par la température, mais aussi par la pression [71]. Cependant les extraits obtenus pour les feuilles et les fruits de lentisque par cette technique sont relativement différents de leurs huiles essentielles. La technique serait plus ou moins adaptée à des matrices naturelles dont la composition chimique contiendrait des molécules thermosensibles.

Chapitre V : Variabilité Chimique intra spécifique des huiles essentielles de feuilles et de fruits de lentisque

Il ressort des précédentes analyses ainsi que des données de la littérature, que les huiles essentielles de lentisque présentent une grande variation dans leurs compositions chimiques. Ainsi nous essayerons de mettre en évidence une éventuelle variabilité chimique intra spécifique à travers les compositions de 17 échantillons d’huiles essentielles de feuilles et 9 échantillons de fruits. Ces huiles essentielles ont été obtenues à partir d’un échantillonnage effectué sur des sites naturels du territoire national entre septembre et novembre 2005. Les huiles essentielles des différents échantillons de fruits et de feuilles sont obtenues par hydrodistillation pendant 3 heures avec un appareil de type Clevenger. Les analyses qualitatives et semi-quantitatives de ces huiles ont été réalisées par CPG sur deux colonnes de polarité différente (apolaire de type BP-1 et polaire de type BP-20), CPG-SM et pour quelques échantillons nous avons commencé à appréhender l’analyse par RMN13C.

V-1- Variabilité intra spécifique des huiles essentielles de feuilles

V-1-1- Echantillonnage Les 17 échantillons de feuilles de lentisque ont été prélevés sur 12 sites naturels du pays entre septembre et novembre 2005 dans les localités suivantes: forêt de Bainem (11, Alger), forêt de Bouchaoui (3, 4, Alger), forêt de Tipaza, (1, 10, 100km à l’ouest d’Alger), maquis de Gouraya (2, 6, 12, 160 km à l’ouest d’Alger), parc National de Chrea (14, 50 km au sud d’Alger), Bouira (9, 140 km à l’est d’Alger),

Tigzirt (7, 15, 140 km à l’est d’alger), Bejaia (15, 240 km à l’est d’Alger), forêt de Texanna (16, Jijel), Annaba (5), Berrouaghia (8) et Djelfa (17) (région semi-aride). Le prélèvement des feuilles s’est à chaque fois fait sur des pieds individuels et dans des conditions climatiques similaires pour l’ensemble des échantillons.

V-1-2- Composition chimiques des 17 échantillons d’huiles essentielles Les rendements en huile essentielle des 17 échantillons, varient entre 0.1 et 0.3%. Les composés identifiés, leurs indices de rétention sur colonnes apolaire et polaire, leurs teneurs relatives sont donnés dans le tableau 12. Nous pouvons constater que la composition de la majorité des huiles est dominée par des monoterpènes (49.6-76.1%) avec des quantités moindres en sesquiterpènes (6.5-19.8%). Cependant, la composition varie de manière quantitative d’un échantillon à un autre. Les composés majoritaires étant soit l’α-pinène, le sabinène, le β-pinène, myrcène, α-phéllandrène ou le limonène. Deux échantillons (16 et 17) sont caractérisés par la prédominance des sesquiterpènes hydrocarbonés (45.4% et 43.9%) et oxygénés (16.6 % et 25.9%) [195]. Afin de décrire au mieux cette variabilité, nous avons soumis nos résultats à une analyse statistique des données que nous avons visualisée sur un dendrogramme (figure 27). Ainsi, les 17 échantillons d’huile essentielle se répartissent en 4 groupes suivant le composé majoritaire. Le plus important est le groupe de l’α-pinène (9 échantillons). Le pourcentage de ce composé varie entre 23% et 34%. Le produit dominant dans les deux échantillons du second groupe est le myrcène (33% (14) et 23% (15)) suivi de l’α-pinène (environ 20%), tandis que les huiles du troisième groupe sont dominées par le limonène (44% (10) et 29% (11)). Dans ce groupe l’α-pinène a une teneur de 11% et 18.5% respectivement. Le dernier groupe constitué de quatre échantillons (12, 13, 16 et 17), est caractérisé par son faible pourcentage en α-pinène (moins de 4%) l’échantillon 12 est caractérisé par le limonène (25.5%) accompagné du myrcène (12.0%) tandis que dans les essences 16 et 17 le β- caryophyllène est le produit majoritaire (13.1% et 19.3% respectivement). L’examen de la composition des 17 échantillons d’HE de feuilles de lentisque en plus de la caractérisation des trois premiers échantillons (chapitre II), montre l’existence d’une variabilité chimique qui repose sur les teneurs relatives en α-pinène, en myrcène et en limonène ce qui nous a permis de distinguer 4 groupes d’inégale importance dont le plus important est le groupe à α-pinène (9 des 17 échantillons).

17 16 13 12 10 limonene / α-pinene 11 15 myrcene / α-pinene 14 2 4 1 α-pinene 9 8 3 5 7 6

Figure 27 : Schéma de répartition des 17 huiles essentielles des feuilles de lentisque

Nous avons également constaté, à travers toutes ces analyses que la composition chimique de ces huiles semble être indépendante du lieu de récolte. En effet, des échantillons provenant d’un même site de récolte n’appartiennent pas forcément au même groupe, par exemple les essences 2 et 12 ou encore 1 et 10. Paradoxalement, deux autres essences prélevées pour l’une, sur une zone côtière et l’autre en zone semi-aride possèdent le même composé majoritaire (échantillons 7 et 8). L’échantillon de Djelfa (17), classé en dernier sur le dendrogramme, est le plus pauvre en composés monoterpèniques (2.1%) et ne ressemble pas aux autres huiles.

V-1-2-3- Comparaison des huiles d’Algérie avec celles d’autres origines Les huiles essentielles de lentisque Algérien ont donné plusieurs compositions chimiques qui nous permettent de les comparer aux huiles du pourtour méditerranéen. Nous avons rassemblés toutes les compositions chimiques (nos résultats et ceux de la littérature (tableau 1) en considérant les dix produits majoritaires et nous les avons soumis à

80 une analyse statistique. Le dendrogramme de la figure 28 montre que les huiles algériennes se retrouvent pratiquement dans tous les chimiotypes à l’exception du groupe à δ-3-carène qui est particulier à l’Egypte. En effet, les essences du groupe à myrcène ou à α-pinène sont similaires à ceux de Corse [149] et du Maroc [169]. Les huiles à dominance limonène correspondent aussi à ceux de corse [149] et de Sardaigne [164] tandis que l’essence contenant du β-caryophyllène et du germacrène D ressemble à l’essence sicilienne [166]. Le dernier échantillon (17 Djelfa), est vraiment atypique dans la mesure où nous ne lui avons pas trouvé de correspondance dans la littérature.

Sa2 A14 A13 limonene C3 A12 A4 A3 C2 A7 A5 α-pinene A6 A8 A9 M2 I A10 A18 A19 G Sa1 Sp1 M3 A15 P1 P3 A1 P2 Sp2 Tn A11 A2 Tk terpinen-4-ol C1 M1 δ-3-carene E A16 A17 M4 myrcene C4

Figure 28 : Schéma de répartition des huiles essentielles de lentisque. A : Algérie, C : Corse (France), M : Maroc, Sp : Espagne, Sa : Sardaigne (Italie), P :provence (France), Tk : Turquie, G : Grèce, Tn : Tunisie, E : Egypte.

Tableau 12 : Compositions chimiques des 17 échantillons d’huiles essentielles de feuilles de Pistacia lentiscus L. provenant de différents sites d’Algérie

Composé identifié Ia Ip 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 tricyclène 920 1022 0.9 1.8 0.5 0.6 tr 2 1.6 1.1 1.4 0.1 0.4 0.2 0.3 0.3 0.9 0.1 - α-thujène 922 1023 0.1 0.1 0.2 0.2 4.8 0.2 0.3 0.3 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 0.2 tr - α-pinène 932 1026 34.2 25.8 27.2 32.1 28.0 27.3 29.0 22.7 20.0 10.8 18.5 2.9 3.9 17.9 22.0 3.5 0.5 camphène 944 1070 3.8 6.8 1.9 2.4 1.4 7.1 6.1 4.3 5.7 0.6 2.2 0.7 1.9 1.3 3.7 0.6 tr sabinène 965 1124 4.4 5.5 5.6 3.1 7.7 11.5 11.7 8.7 2.9 0.8 0.2 3.6 7.1 1.9 8.3 1.3 0.1 β-pinène 972 1113 17.4 21.8 6.7 10.1 6.5 5.0 5.6 6.6 4.2 8.5 7.6 0.8 2.3 8.9 4.3 1.4 0.2 myrcène 980 1162 1.5 4.9 2.7 3.1 4.4 0.9 1.4 3.5 3.6 2.4 2.8 11.6 0.8 33.1 23.0 8.4 0.1 α-phellandrène 997 1167 0.3 0.4 1.8 5.5 1.3 0.5 0.6 0.4 14.1 0.1 5.0 tr 0.1 2.3 0.6 0.7 0.1 δ-3-carène 1004 1150 tr Tr 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 0.1 tr 0.1 tr tr tr 0.1 0.1 - α-terpinène 1009 1183 1.0 1.1 2.3 2.0 2.1 2.5 2.7 2.4 1.0 0.3 0.2 - tr 0.7 1.1 0.2 0.1 p-cymène 1011 1272 0.3 0.3 2.8 1.0 0.7 0.2 0.5 0.8 1.0 0.2 3.1 4.2 7.7 0.6 1.3 1.3 0.1 limonène* 1021 1203 6.0 2.1 9.4 4.7 4.9 2.2 1.9 13.8 5.3 43.8 29.0 25.5 9.8 2.3 1.7 2.8 0.1 β-phellandrène* 1021 1213 2.5 2.3 2.5 4.0 3.4 1.7 1.9 2.0 4.4 1.0 3.0 tr 0.3 2.4 1.6 - 0.3 (Z)-β-ocimène 1024 1234 tr 0.1 0.1 tr 0.1 tr 0.1 0.3 0.2 - 0.1 - - 0.2 0.7 tr - (E)-β-ocimène 1036 1246 0.3 0.4 0.5 0.4 0.9 0.7 0.4 3.8 0.8 0.3 1.2 - - 0.8 2.1 0.1 tr γ-terpinène 1048 1250 1.8 1.7 4.2 3.1 3.4 3.8 4.1 3.9 1.5 0.6 0.4 tr 0.1 1.1 2.1 0.4 0.3 2-nonanone 1068 1390 0.4 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.5 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 terpinolène 1078 1284 0.9 0.8 1.5 1.2 1.1 1.6 1.9 1.4 0.7 0.5 0.5 tr 0.1 0.5 1.1 0.2 0.2 Isoamyl 2-methylbutyrate 1082 1295 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 0.2 0.2 0.1 isopentyl isovalerate 1088 1295 0.1 0.3 0.1 0.2 0.2 0.1 0.4 0.1 0.1 tr 1.3 0.3 0.2 0.1 0.4 - tr α-fenchol 1098 1581 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 tr 0.2 0.1 0.1 - tr cis -p-menth-2-en-1-ol 1106 1623 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 tr 0.1 tr 0.2 0.1 0.2 - tr trans-p-menth-2-en-1-ol 1122 1655 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 tr 0.5 0.1 0.2 - 0.1 camphène hydrate 1132 1596 0.1 0.1 tr 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 Tr - 0.2 tr 0.1 - tr bornèol 1148 1701 0.1 0.1 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 tr 0.2 tr 0.1 - 0.1 terpinèn-4-ol 1162 1600 3.4 2.8 5.3 4.8 4.3 7.0 5.2 7.1 1.7 1.1 0.4 0.5 6.3 1.8 5.1 0.2 0.7 α-terpinèol 1172 1697 2.5 1.7 1.3 1.6 0.8 0.9 0.9 1.2 1.1 1.5 1.0 0.1 1.5 0.9 0.8 0.4 1.1 myrtènol 1178 1792 0.1 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 tr 0.1 tr 0.2 tr 0.1 - 0.1 isoamyl hexanoate 1231 1457 0.2 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 0.3 0.1 0.8 0.1 0.2 - 0.3 bornyl acètate 1267 1579 0.8 3.9 0.5 1.2 0.8 4.1 1.9 3.0 3.9 0.2 0.8 0.1 1.3 0.6 1.6 0.3 3.2

Composé identifié Ia Ip 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2-undécanone 1272 1595 1.0 0.5 0.5 0.6 0.7 0.6 0.4 0.3 0.5 0.9 0.2 0.8 1.2 0.4 0.5 0.9 1.7 α-terpinyl acétate 1331 1687 - - - 0.1 0.5 - - 0.6 - tr - - - tr tr - - δ-élémène 1334 1469 tr tr tr tr tr tr tr tr tr tr - tr tr tr tr - tr α-cubébène 1349 1457 tr Tr 0.1 0.1 tr tr tr tr 0.1 0.1 tr 0.1 0.3 0.1 tr 0.2 0.1 α-copaène 1377 1491 0.2 0.1 0.2 0.3 0.2 0.4 0.1 0.1 0.4 0.4 0.2 0.3 0.7 0.4 0.1 1.0 0.4 β-élémène 1388 1588 0.6 0.2 0.3 0.5 0.5 0.6 0.4 0.4 0.9 0.6 0.4 3.5 0.6 0.6 0.4 0.8 1.0 benzyl isovalérate 1411 1917 - 0.2 0.2 0.2 - tr 0.1 0.2 - 0.1 0.5 - 0.4 0.1 0.2 - 0.9 isocaryophyllène 1411 1571 0.2 - - - 0.2 - - - 0.1 - - 0.1 - - - - - β-caryophyllène 1420 1596 2.8 5.3 2.4 2.5 2.4 5.4 4.3 2.0 2.1 2.7 2.6 5.1 0.7 1.9 2.5 13.1 19.3 β-gurjunène 1428 1591 0.1 0.1 0.2 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.2 0.3 0.2 0.7 0.1 0.1 0.7 0.9 isoamyl benzoate 1445 2106 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 tr tr 0.2 α-humulène 1452 1669 0.5 0.5 0.5 0.5 0.7 0.8 0.5 0.2 0.8 0.9 0.6 0.9 0.4 0.8 0.4 3.4 2.9 allo-aromadendrène 1459 1644 0.2 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 0.3 0.4 0.2 0.6 0.3 0.3 0.1 0.8 0.6 γ-muurolène 1471 1688 0.4 0.1 0.6 0.5 0.5 0.6 0.2 0.2 0.2 0.7 0.5 0.4 1.5 0.7 0.3 3.4 2.2 γ-gurjunène 1475 1659 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 tr 0.8 0.2 tr 0.1 0.1 0.2 - 1.6 0.4 germacrène D 1477 1710 2.8 1.4 2.2 2.8 6.3 3.6 5.2 1.7 5.3 10.3 2.5 1.2 - 6.2 2.9 10.2 2.3 epi-bicyclo 1483 1727 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 tr tr 0.1 0.1 0.1 0.1 0.3 0.1 0.1 tr 0.5 0.7 sesquiphellandrène bicyclogermacrène 1487 1733 0.1 tr 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 0.4 0.3 0.2 0.1 0.5 0.4 0.3 0.1 0.9 0.8 α-muurolène 1594 1719 0.6 0.2 0.5 0.6 0.6 0.6 0.5 0.1 1.0 0.8 0.7 0.5 0.8 0.7 0.4 1.9 3.4 β-bisabolène 1499 1720 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 tr 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1 0.2 - 0.2 0.1 0.2 0.8 γ-cadinène 1507 1757 0.2 0.1 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.5 0.3 0.2 0.3 0.9 0.4 0.2 0.6 1.8 δ-cadinène 1515 1757 1.3 0.6 1.0 1.6 1.3 1.4 1.0 0.6 2.0 1.6 0.8 0.3 0.3 1.6 1.0 5.4 5.7 cubébol 1517 1939 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 tr 0.2 0.1 tr - - 0.1 tr 0.4 0.4 cubénène 1523 1761 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 tr - - 0.1 tr 0.5 0.2 α-cadinène 1532 1744 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.4 élémol 1542 2086 0.1 tr 0.3 tr tr - 0.1 0.1 tr 0.1 0.3 0.4 1.2 - - 0.2 0.3 germacrène D 4-ol 1560 2060 - tr 0.3 0.1 0.1 0.1 0.1 - 0.1 tr 0.2 - 0.6 tr 0.2 - 0.8 spathulénol 1565 2115 0.1 0.1 0.2 tr tr tr 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 5.8 1.3 0.1 tr 0.7 3.5 caryophyllène oxide 1571 1986 0.1 0.3 1.2 0.2 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 0.7 3.2 7.0 0.1 0.3 1.5 4.8 Viridiflorol 1583 2083 tr tr 0.2 0.1 0.1 tr tr tr 0.1 tr Tr 1.4 0.2 rr 0.1 - 0.4 humulène epoxide II 1595 2089 tr tr 0.2 tr tr tr tr tr 0.1 0.1 0.2 0.6 1.4 0.1 0.1 0.4 1.3 1-épi-cubénol 1616 2059 0.2 0.1 0.5 0.4 0.2 0.2 0.2 tr 0.7 0.3 0.2 0.8 0.9 0.4 0.3 1.8 1.0 γ-eudesmol 1619 2167 0.2 tr 0.3 0.1 tr 0.3 0.1 - 0.2 0.1 0.1 0.1 0.4 0.1 0.1 0.3 0.6 τ-muurolol 1627 2188 0.8 0.5 1.1 1.2 0.9 0.5 1.1 0.4 1.7 1.0 1.1 1.0 2.5 1.0 1.3 2.1 3.4

Composé identifié Ia Ip 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

α-muurolol 1629 2173 0.2 0.1 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.1 0.5 0.2 0.2 0.2 0.8 0.3 0.3 1.5 0.7 τ-cadinol 1632 2173 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 0.4 0.2 0.1 0.2 0.4 0.3 0.2 2.7 0.8 α-cadinol 1639 2235 1.0 0.7 1.6 1.5 1.2 0.7 1.5 0.5 2.3 1.3 1.2 1.9 3.1 1.4 1.5 3.6 4.6 α-bisabolol 1667 2214 0.1 0.2 0.2 0.1 0.3 tr 0.2 0.3 0.5 0.1 0.2 0.1 0.2 0.3 0.2 1.0 1.3 epi-α-bisabolol 1669 2217 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 0.2 2.0 benzyl benzoate 1725 2630 0.1 0.1 0.1 tr tr tr 0.1 tr tr 0.1 0.2 0.5 0.7 tr tr 0.2 1.9 Monoterpènes hydrocarbonés 75.4 75.9 70.0 73.6 70.7 67.3 69.9 76.1 67.0 70.1 74.3 49.6 34.5 74.4 74.0 21.1 2.1 Monoterpènes oxygénés 7.3 9.1 7.7 8.3 6.8 12.5 8.6 12.5 7.3 3.2 2.8 0.7 10.6 3.6 8.3 0.9 5.3 Sesquiterpène hydrocarbonés 10.5 9.2 9.2 10.7 14.1 14.6 13.4 6.5 15.6 19.8 9.4 14.7 7.9 14.8 8.7 45.4 43.9 sesquiterpènes oxygénés 3.1 2.2 6.8 4.4 3.5 2.4 4.1 1.8 7.2 3.9 4.7 15.7 20.1 4.3 4.7 16.6 25.9 Autres 2.0 1.6 1.5 1.6 1.7 1.5 1.7 1.2 1.3 2.0 2.9 2.0 3.8 1.1 1.7 1.4 5.2 Total 98.3 98.0 95.2 98.6 96.8 98.3 97.7 98.1 98.4 99.0 94.1 82.7 76.9 98.2 98.2 85.4 82.4 L’ordre d’élution et les pourcentages sont donnés sur colonne BP-1. *: pourcentage donné sur une colonne BP-20. Ia, Ip = indices de rétention sur deux colonnes, apolaire (BP-1) et polaire (BP-20), respectivement. tr< 0.05%. Tous les composés ont été identifiés par CPG (Ik) et CPG-SM. Les échantillons 1, 2, 4, 6, 8, 12, 13, 14 et 17 ont été analysés par RMN 13C.

V2 Caractérisation des échantillons d’huile essentielle de fruits:

V-2-1- Echantillonnage

Les échantillons de fruits proviennent des sites suivants : Gouraya (1, 4, 160 km à l’ouest d’Alger), forêt de Tipaza, (2, 100 km à l’ouest d’Alger), forêts de Bainem et Bouchaoui (8 et 5, Alger), le parc national de Chrea (6, 50 km au sud d’Alger), le maquis de Tigzirt (7, 150 km à l’est d’Alger), Annaba (3, 600 km à l’est d’Alger), et Berrouaghia (9, 200 km au sud d’Alger). Les rendements obtenus et exprimés par rapport à la masse du végétal frais, varient entre 0,19 et 0.76% pour les fruits. V-2-2- Composition chimique des neuf essences Les résultats des analyses qualitatives et quantitatives effectuées sur les échantillons d’huile essentielle de baies sont reportés dans le tableau 13. Au total sur l’ensemble des 9 échantillons, ce sont 76 constituants représentant de 89.5 à 99.7% de la composition chimique globale de chaque échantillon d’huile essentielle qui sont identifiés [196]. Parmi ces constituants, les monoterpènes oléfiniques constituent la fraction dominante (70.4-94.0%) tandis que la teneur en sesquiterpènes ne varie qu’entre 1.7 et 9.4%. L’α-pinène et le myrcène sont les composés prédominants. Leurs teneurs varient substantiellement d’un échantillon à un autre (tableau 13). Le β-caryophyllène (0.5-2.1%) et le germacrène D (0.2-3.6%) sont les sesquiterpènes les plus abondants dans l’essence des baies.

A partir de la figure 29, nous pouvons distinguer deux groupes bien distincts caractérisé chacun par un composé majoritaire. - les huiles essentielles du premier groupe (échantillons 1-3) sont dominées par l’α- pinène (37.9-51.5%). Le second composé majoritaire est soit le β-pinène (17.3%), le myrcène (16.8%) ou le sabinène (11.6%) dans les échantillons 2, 3 et 1 respectivement. Des composés tels que le camphène (1.6-5.8%), le limonène (2.0-5.8%) et le terpinèn-4-ol (0.7-2.5%) sont présents à des teneurs non négligeables. - les six échantillons du second groupe (4-9) sont caractérisés par une forte teneur en myrcène (27.0-69.7%).celui-ci est suivi par l’α-pinène (9.4-19.5%) ou le limonène (24.1%) dans l’échantillon (8). On observe dans ce groupe uns variation importante de la concentration en limonène (0.8-24.1%). Le sabinène (0.1-5.2%), le β-pinène (2.8-6.8%), le p-cymène (0.3- 3.7%) sont aussi identifiés à des teneurs moindres. Notons par ailleurs que la fraction

85 oxygénée, dominée par le terpinèn-4-ol (6.3%) est la plus importante dans l’échantillon 9 (16.0%).

80 1

60 2 3 40 4 20 5 0 6 7 8 9

Figur e 29 : variation du pourcentage de quelques composés majoritaires dans les neuf échantillons d’huiles essentielles de baies

70 60 50 40 30 20 min 10 max 0

Figure 30: teneur maximum (max) et minimum (min) des principaux composés dans les essences de fruits

Le β-phéllandrène (0.4-2.5%), le cis-ocimène (tr-2.0%), le trans-ocimène (0.3-6.0%), le γ-terpinène (0.2-3.3%) et le bornyl acétate (0.7-3.3%) sont les composés minoritaires présents dans tous les échantillons. Il est intéressant de signaler que le myrcène, cité en littérature [162,164,167,170,197] comme étant le composé majoritaire des baies de lentisque, est identifié à sa teneur minimale dans l’échantillon 1(figure 30). D’autre part, deux échantillons provenant de la même localité (gouraya) n’appartiennent pas au même groupe. L’un (échantillon 1) est à α-pinène (51.5%) tandis que l’autre (échantillon 4) est à myrcène (69.7%). Ces résultats, bien qu’obtenus avec un faible nombre d’échantillons, montrent une variabilité de la composition chimique des huiles essentielles des fruits de lentisque.

V-2-3- Comparaison avec les données de la littérature Les compositions des huiles essentielles de baies de lentisque présentent des similitudes et des différences avec les huiles essentielles des autres provenances. Ainsi la composition chimique des échantillons 4 et 5 (myrcène ultra majoritaire) se rapproche de celles reportées dans la littérature pour les échantillons d’huiles essentielles d’Espagne [162] et d’Italie [170]. Tandis que les échantillons 6 et 7 s’apparenteraient à des huiles essentielles de Sardaigne (myrcène-α-pinène) [167]. Les essences 8 et 9 (myrcène-limonène-α-pinène) sont qualitativement similaires aux HE de Sardaigne [164] et d’Australie [197]. D’après Wyllie et coll. [197] les monoterpènes tels que le myrcène, l’ocimène, le limonène, le phéllandrène contribuent fortement à la qualité olfactive de l’huile essentielles de lentisque. Il est intéressant de signaler que le groupe à dominance α-pinène est reporté pour la première fois. La composition des huiles essentielles de baies de lentisque est fortement dominée par des monoterpènes oléfiniques. Deux chimiotypes peuvent être déterminés : l’un à α-pinène, l’autre à myrcène.

Tableau 13 : Compositions chimiques de neuf échantillons d’HE des fruits de lentisque provenant de diverses régions : Composé identifié Ia Ip 1 2 3 4 5 6 7 8 9 tricyclène 920 1022 1.7 0.7 0.3 0.4 0.1 0.2 0.2 0.1 0.7 α-thujène 922 1023 0.2 0.1 1.5 0.1 0.1 0.1 0.2 tr 0.2 α-pinène 932 1026 51.5 43.5 37.9 9.4 19.5 16.5 14.1 9.4 17.1 camphène 944 1070 5.8 3.8 1.6 1.5 0.5 0.9 0.9 0.6 3.0 sabinène 965 1124 11.6 0.4 3.7 1.4 0.3 2.0 5.2 0.1 3.5 β-pinène 972 1113 4.4 17.3 4.6 6.8 2.8 6.6 3.0 3.5 4.7 myrcène 980 1162 0.9 7.6 16.8 69.7 62.8 45.4 44.4 28.0 27.0 α-phéllandrène 997 1167 0.4 0.6 0.3 0.1 1.3 2.2 0.7 tr 0.4 δ-3-carène 1004 1150 tr 0.1 tr 0.1 0.1 0.2 0.1 tr 0.2 α-terpinène 1009 1183 0.8 0.5 0.3 0.2 0.2 0.3 0.5 tr 1.7 p-cymène 1011 1272 0.2 0.5 0.9 0.3 0.8 0.3 0.9 3.7 1.4 limonène* 1021 1203 2.0 5.8 3.0 0.8 2.6 1.9 1.5 24.1 6.3 β-phéllandrène* 1021 1213 1.1 2.5 1.2 1.0 1.2 1.9 1.4 0.4 1.7 (Z)-β-ocimène 1024 1234 tr tr 1.8 0.5 0.3 2.0 1.2 tr 0.6 (E)-β-ocimène 1036 1246 0.5 0.3 5.2 1.0 0.8 6.0 3.5 0.4 3.6 γ-terpinène 1048 1246 1.3 0.9 0.8 0.3 0.3 0.5 1.1 - 3.3 2-nonanone 1068 1390 0.2 0.4 0.2 0.2 0.1 0.2 0.2 0.5 0.1 terpinolène 1078 1284 0.7 1.1 0.4 0.2 0.3 0.3 0.7 0.1 1.3 isoamyl-2-methylbutyrate 1082 1295 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.1 perillène 1085 1404 0.1 tr tr tr tr tr 0.1 0.9 tr isoamyl-3-methylbutyrate 1088 1295 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.3 0.8 0.1 fenchol 1098 1581 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 tr 0.1 0.2 0.1 cis-p-menth-2-en-1-ol 1102 1619 0.1 0.1 tr tr tr tr 0.1 0.2 0.1 trans-p-menth-2-en-1-ol 1122 1657 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.3 0.2 camphène hydrate 1132 1596 0.1 0.2 0.1 tr tr tr tr 0.1 0.1 bornèol 1148 1701 0.1 0.3 0.1 tr tr tr 0.1 0.1 0.2 cryptone 1154 1663 - tr tr tr tr tr tr 0.5 tr terpinèn-4-ol 1162 1600 2.5 0.7 1.2 0.8 0.3 0.5 2.4 0.3 6.3 α-terpinéol 1172 1697 0.7 2.6 0.7 0.6 0.4 0.3 0.5 0.7 1.8 myrténol 1178 1792 tr 0.1 tr tr tr tr tr 0.2 0.2 trans-carvéol 1196 1834 tr tr tr - - - tr 0.5 tr cis-carvéol 1207 1865 tr tr tr - - - tr 0.2 tr thymylméthyl oxide 1212 1594 0.1 tr - - tr tr 0.7 tr cuminaldéhyde 1225 1790 0.2 0.2 tr tr tr 0.1 tr 0.2 tr isoamyl hexanoate 1231 1457 - 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1 0.2 0.3 0.1 bornyl acétate 1267 1579 3.3 0.7 1.4 0.9 0.2 0.5 0.9 0.6 3.2 2-undécanone 1272 1595 0.3 0.6 0.4 0.1 0.1 0.2 0.4 0.4 0.3 α-cubébène 1352 1457 0.1 tr 0.1 - tr 0.1 tr 0.4 tr α-longipinène 1358 1475 - tr tr - tr tr tr 0.5 tr α-yanglène 1372 1472 - tr tr - tr tr tr 0.3 tr α-copaène 1377 1491 0.3 tr 0.2 tr 0.1 0.2 0.2 0.2 tr β-bourbonène 1381 1517 tr tr tr tr tr tr tr 0.3 tr β-élemène 1390 1588 0.4 0.1 0.4 0.1 0.1 0.3 0.4 0.6 0.2 benzyl isovalérate 1411 1917 tr 0.1 0.1 tr tr tr 0.1 0.5 0.2 β-caryophyllène 1420 1596 1.5 1.3 1.2 0.9 0.5 0.7 2.1 0.4 1.9

Composé identifié Ia Ip 1 2 3 4 5 6 7 8 9 β-gurjunène 1428 1590 0.1 0.1 0.1 tr tr 0.1 0.1 0.1 0.1 isoamyl benzoate 1447 2106 0.1 tr 0.1 tr tr 0.1 tr 0.1 0.5 α-humulène 1452 1669 0.3 0.2 0.5 0.1 0.1 0.4 0.4 0.7 0.2 allo-aromadendrène 1459 1644 0.1 tr 0.2 tr 0.1 0.2 0.2 0.4 tr γ-muurolène 1471 1688 0.4 0.1 0.5 tr 0.2 0.5 0.5 0.4 0.1 γ-gurjunène 1475 1659 0.1 0.1 - tr 0.1 - - tr germacrène D 1477 1710 1.5 0.6 3.6 0.3 0.2 2.9 2.1 tr 0.8 epi-bicyclosesquiphéllandrène 1483 1719 tr 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 - tr bicyclogermacrène 1487 1727 0.2 tr 0.2 tr 0.1 0.2 0.2 0.1 tr α-muurolène 1593 1723 0.4 0.3 0.4 0.1 0.2 0.4 0.5 0.5 0.1 β-bisabolène 1499 1720 tr 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 γ-cadinène 1507 1757 0.3 0.1 0.6 tr 0.2 0.4 0.3 0.3 0.1 δ-cadinène 1515 1757 1.0 0.5 1.0 0.2 0.5 1.1 1.3 0.1 0.5 cubébol 1517 1940 0.1 tr tr - tr tr 0.1 - tr Cadina-1,4-diene 1523 1763 0.1 tr 0.1 tr tr 0.1 0.1 - 0.1 α-cadinène 1532 1744 0.1 0.1 0.1 tr tr 0.1 0.1 0.2 0.1 élémol 1541 2084 0.1 tr 0.1 tr - tr tr 0.2 tr germacrène D 4-ol 1564 2051 0.1 0.1 0.3 0.1 tr 0.1 0.2 0.1 0.2 spathulénol 1567 2115 tr tr tr - tr tr tr 0.3 tr caryophyllène oxide 1571 1986 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.3 1.1 0.2 humulène epoxide II 1595 2089 tr tr 0.1 tr tr tr 0.1 0.4 0.1 1-epi-cubènol 1616 2059 0.1 0.2 0.2 tr tr 0.1 0.4 0.2 0.1 γ-eudesmol 1618 2167 0.1 tr 0.1 tr - tr 0.1 0.1 0.1 -muurolol 1627 2188 0.3 0.3 0.5 0.1 0.1 0.3 1.2 0.8 0.5 α-muurolol 1629 2217 0.1 0.1 0.1 - tr 0.1 0.3 0.2 0.1 -cadinol 1632 2173 0.1 0.2 0.2 tr tr 0.1 0.2 0.2 0.1 β-eudesmol 1636 2223 0.1 0.2 0.2 - tr tr - 0.1 0.1 α-cadinol 1639 2235 0.4 0.4 0.6 0.2 0.2 0.3 1.5 0.9 0.6 α-bisabolol 1669 2214 tr 0.2 0.2 tr tr 0.1 0.2 0.1 0.2 benzyl benzoate 1725 2630 tr 0.1 tr - - tr tr 0.1 0.1 Acide héxadécanoique 1940 - tr 0.1 0.2 0.1 0.2 0.1 0.2 tr Monoterpènes hydrocarbonés 83.1 85.7 80.3 93.8 94.0 87.3 79.6 70.4 76.7 Monoterpènes oxygénés 7.3 5.3 3.7 2.5 1.1 1.5 4.3 5.7 12.2 Sesquiterpènes hydrocarbonés 6.9 3.7 9.4 1.7 2.5 8.0 8.7 5.6 4.3 Sesquiterpènes oxygénés 1.6 1.8 2.8 0.5 0.4 1.2 4.6 4.7 2.3 Autres 0.8 1.6 1.4 0.8 0.6 1.0 1.5 3.1 1.5 Total 99.7 98.1 97.6 99.3 98.6 99.0 98.7 89.5 97.0 L’ordre d’élution et les pourcentages sont donnés sur la colonne BP-1 *: pourcentage donné par la colonne BP-20. Ira. Irp= indice de rétention sur colonne apolaire (BP-1) et polaire (BP- 20) respectivement. tr< 0.05%. Les échantillons 1, 2 et 8 ont été traités par RMN 13C

VI- Conclusion La caractérisation des huiles essentielles des différents organes de la partie aérienne du lentisque a montré que bien que ces huiles soient très proches qualitativement, des variations importantes de la teneur des composés sont observées. Les différents modes d’extraction appliqués sur les feuilles de lentisque afin d’en extraire la partie volatile, ont montré des différences importantes de la composition chimique. De ce fait, l’extraction végétale mise en œuvre par une multitude de paramètres aussi varié que le mode d’extraction, le solvant utilisé, la température, le broyage permet d’obtenir une infinité d’extraits différents. Mais le paramètre le plus important est la matière première qui est la plus difficile à maitriser. En effet pour une même variété, la qualité de l’extrait peut être variable suivant les conditions climatiques, les pratiques culturales ou l’origine géographique. La multiplicité et la diversité de paramètres à intégrer en extraction végétale fait qu’elle est encore aujourd’hui impossible à modéliser. Elle nécessite de plus en plus de connaissances scientifiques dans des domaines aussi éloignés que la botanique, l’analytique ou le génie des procédés, mais elle reste avant tout un art dans la juste mise en œuvre de toutes ces compétences.

PARTIE III

Utilisation de la RMN du carbone 13 pour la caractérisation des huiles essentielles de trois espèces de Pistacia et de l’huile végétale de lentisque.

Etude antimicrobienne

I- Utilisation de la RMN du carbone 13 pour la caractérisation d’une huile essentielles de lentisque

Dans la précédente partie de ce travail nous avons emprunté « la voie A » qui fait intervenir le couplage d’une technique chromatographique avec une technique spectroscopique dans le but de caractériser les huiles essentielles de lentisque.

L’analyse peut également être menée selon la voie C, plus originale, qui met en œuvre la Résonance Magnétique Nucléaire du carbone-13 (RMN 13C) pour l’identification des composés en mélange sans séparation préalable ou précédée d’une étape de fractionnement réduite au minimum.

Le but de ce travail est autant d’appréhender les potentialités et les limites de la RMN du carbone-13 pour la caractérisation d’un mélange complexe, telle qu’une huile essentielle, que de réaliser l’étude détaillée de sa composition chimique. En effet, l’utilisation de la RMN du carbone-13 permet, à partir d’un spectre unique, l’identification des composés terpéniques à une teneur proche de 0,5%.

Afin d’illustrer la méthode d’analyse des huiles essentielles par RMN du carbone-13, sans séparation préalable et cerner ses potentialités, nous décrirons en détail l’analyse par RMN du carbone-13 d’un échantillon d’huile essentielle de lentisque. En effet, le spectre de RMN de cet échantillon, enregistré avec un appareil de 9,4 Tesla (fréquence de 100 MHz pour le carbone) et avec 3000 accumulations, contient plus de 270 raies de résonnance.

Le chromatogramme nous indique que le composé majoritaire représente un peu plus de 27% de l’huile essentielle et que les constituants les plus importants, présents à une teneur comprise entre 1 et 11%, sont environ une douzaine. Enfin, d’autres composés, environ une dizaine, ont une teneur comprise entre 0,5 et 0,9%. Les analyses par CPG-SM et par RMN du carbone-13 ont été menées simultanément et de manière indépendante (Tableau 14). De plus, l’identification des constituants est confirmée par la comparaison des indices de rétention sur colonne polaire et apolaire avec des valeurs de référence.

0.03 0.0 0.03 0.05 0.03* 0.02 0.02 0.05 0.04 0.01 0.01 0.01 0.01 0.06 0.0 0.01 0.0 0.0 0.04 0.03 0.07 0.02 0.02 0.01 0.00 0.04 0.02 0.02 0.04 0.01 0.02 sabinène 0.01 0.02 0.04 0.03 tricyclène α-pinène camphène 0.01 0.02

0.03 0.02 0.01 0.0 0.03 0.01

0.03 0.01 0.01 0.02* 0.01 0.04 0.04 0.01* 0.01 0.03 0.05 0.02 0.05 0.03 0.01 0.0 0.03* 0.04 0.03 0.03 0.05 0.02 0.01 0.04 β-pinène myrcène 0.0 α-phéllandrène 0.03* 0.0 α-terpinène 0.02 0.0 0.02 0.03 0.05 0.0 0.01 0.01 0.0* 0.03 0.02 0.02 0.01 0.02 0.01 0.04 0.01 0.02 0.04 0.03 0.0* 0.03 0.01 0.09 0.02 0.03 0.01 0.03 0.04 0.03 0.01 0.02 0.03 0.02 β-phéllandrène 0.0 γ-terpinène 0.02 0.0* 0.01 0.02 limonène OH 0.01* 0.04 0.02 0.01 0.01 terpinèn-4-ol 0.03 0.01 0.0

0.01 H 0.06 0.02 0.04 0.05* 0.03* 0.03 0.0 0.0 0.0 0.01 0.01 0.06 0.04 0.0 0.01 0.02 0.06 0.05 0.0 0.04 0.01 H 0.04 germacrène D 0.05 0.01 0.05 0.02 0.01 0.01 0.01

0.0 0.01 0.0

0.01 0.03 0.0* 0.01 0.0 0.05 H δ-cadinène 0.06

0.01 0.01 Figure 31. Identification des principaux constituants de l’huile essentielle de lentisque par RMN-13C. Les variations de déplacements chimiques par rapport aux valeurs de référence sont reportées à côté des carbones auxquelles elles correspondent. Les superpositions sont signalées par des asterisk.

En ce qui concerne l’analyse par RMN, après divers essais, le logiciel d’aide à l’identification des molécules a été paramétré comme suit : nombre de signaux des carbones observés dans le spectre du mélange par rapport au nombre de signaux attendus = 60%, variations des déplacements chimiques maxima entre le spectre du mélange et le spectre de la molécule de référence = Δδ = 0,06ppm.

Dans ces conditions, 25 composés ont été identifiés, leurs teneurs étant comprises entre 27.3 et 0,5%. - tous les signaux des carbones ont été repérés, à l’exception de certains carbones quaternaires de neuf composés dont la teneur est inférieure à 1% ; - le nombre de superpositions de signaux est compris entre 1 et 5, ce qui signifie que chaque composé est identifié par l’observation d’au moins 50% des carbones qui lui appartiennent en propre ; - les variations des déplacements chimiques (Δδ ppm) observées entre les valeurs du mélange et celles des spectres de référence sont comprises entre 0,00 et 0,07 ppm pour tous les signaux.

Dans cet échantillon d’huile essentielle obtenue à partir des parties aériennes de P. lentiscus, nous avons donc identifié, grâce à la combinaison de la CPG, CPG-SM et de la RMN du carbone-13, 75 constituants représentant près de 98% de la composition globale de l’huile essentielle (Tableau 14).

L’analyse par RMN du carbone-13 sans séparation préalable, a permis l’identification de 25 composés, majoritairement monoterpéniques, représentant près de 88% de la composition globale.

Tableau 14: composés identifiés dans un échantillon d’huile essentielle de lentisque Composé identifié Ir (a) Ir(p) % identification RMN sup tricyclène 920 1022 2.0 Ir SM RMN 13C 10/10 1 α-thujène 922 1023 0.2 Ir SM α-pinène 932 1026 27.3 Ir SM RMN 13C 10/10 0 camphène 944 1070 7.1 Ir SM RMN 13C 10/10 0 sabinène 965 1124 11.5 Ir SM RMN 13C 10/10 0 β-pinène 972 1113 5.0 Ir SM RMN 13C 10/10 0 myrcène 980 1162 0.9 Ir SM RMN 13C 8/10 1 α-phéllandrène 997 1167 0.5 Ir SM RMN 13C 9/10 3 δ-3-carène 1004 1150 0.1 Ir SM α-terpinène 1009 1183 2.5 Ir SM RMN 13C 10/10 p-cymène 1011 1272 0.2 Ir SM RMN 13C 5/7 1 limonène* 1021 1203 2.2 Ir SM RMN 13C 10/10 3 β-phéllandrène* 1021 1213 1.7 Ir SM RMN 13C 10/10 1 Cis-ocimène 1024 1234 Tr Ir SM trans-ocimène 1036 1246 0.7 Ir SM γ-terpinène 1048 1250 3.8 Ir SM RMN 13C 10/10 1 2-nonanone 1068 1390 0.3 Ir SM terpinolène 1078 1284 1.6 Ir SM RMN 13C 10/10 2 isopentyl 2- 1082 1295 0.2 Ir SM isopentyl isovalerate 1088 1295 0.1 Ir SM fenchol 1098 1581 Tr Ir SM menth-2-en ol Z para 1106 1623 0.1 Ir SM menth-2-en ol E para 1122 1655 0.1 Ir SM camphène hydrate 1132 1596 0.1 Ir SM bornéol 1148 1701 0.1 Ir SM terpin-4-ol 1162 1600 7.0 Ir SM RMN 13C 10/10 0 α-terpinéol 1172 1697 0.9 Ir SM RMN 13C 10/10 2 myrtenol 1178 1792 0.1 Ir SM trans piperitol 1196 1759 Tr Ir SM ascaridole 1214 Tr Ir SM 3-methylbuthyl hexanoate 1231 1733 0.2 Ir SM bornyl acétate 1267 1579 4.1 Ir SM RMN 13C 12/12 0 2-undécanone 1272 1595 0.6 Ir SM RMN 13C 10/11 2 2-undécanol 1284 1850 Tr Ir SM δ-elemene 1334 1469 Tr Ir SM α-cubebene 1349 1457 Tr Ir SM α-copaene 1377 1491 0.4 Ir SM β-boubonène 1381 Tr Ir SM β-élémène 1388 1588 0.6 Ir SM α-gurjunène 1411 Tr Ir SM β-caryophyllène 1420 1596 5.4 Ir SM RMN 13C 15/15 0 β-gurjunène 1428 1591 0.2 Ir SM aromadendrène 1436 1620 Tr Ir SM 3-méthylbuthyl benzoate 1445 2106 0.1 Ir SM α-humulène 1452 1669 0.8 Ir SM RMN 13C 14/15 5 allo-aromadendrène 1459 1644 0.2 Ir SM

Composé identifié Ir (a) Ir(p) % identification RMN sup γ-muurolène 1471 1688 0.6 Ir SM RMN 13C 14/15 4 γ-gurjunène 1475 1659 0.1 Ir SM germacrène D 1477 1710 3.6 Ir SM RMN 13C 15/15 2 β-selinène 1487 1714 0.2 Ir SM Bicyclogermacrène* 1493 1735 0.1 Ir SM α-muurolène* 1594 1722 0.4 Ir SM RMN 13C 14/15 6 β-bisabolène 1500 1720 tr Ir SM γ-cadinène 1507 1757 0.2 Ir SM δ-cadinène 1515 1757 1.4 Ir SM RMN 13C 15/15 2 Cubébol 1517 1939 0.1 Ir SM Cadina 1,4-diene 1523 1761 0.1 Ir SM α-cadinène 1532 1744 0.2 Ir SM Germacrène D4-ol 1560 2060 Tr Ir SM spathulénol 1565 2115 0.1 Ir SM gléenol 1568 2043 Tr Ir SM oxide de caryophyllène 1571 1986 0.1 Ir SM globulol 1574 2074 Tr Ir SM viridiflorol 1583 2083 TR Ir SM époxyde de humulène II 1599 2089 TR Ir SM fonénol 1610 0.1 Ir SM 1-epi cubénol 1616 2059 0.2 Ir SM γ-eudesmol 1619 2167 0.3 Ir SM τ-muurolol 1627 2188 0.5 Ir SM RMN 13C 14/15 5 α-muurolol 1629 2217 0.2 Ir SM τ-cadinol 1632 2173 0.2 Ir SM α-cadinol 1639 2235 0.7 Ir SM RMN 13C 13/15 0 α-bisabolol 1668 2218 Tr Ir SM épi-α-bisabolol 1670 2214 TR Ir SM benzyl benzoate 1725 2630 Tr Ir SM

L’ordre d’élution et les pourcentages sont donnés sur colonne apolaire(BP-1). Ira et Irp : indices de rétention calculés respectivement sur colonne apolaire et polaire (BP-20).

Chapitre II : Caractérisation des huiles essentielles du Pistacia Atlantica Desf. par CPG, RMN 13C et CPG-SM

II-1-Etude bibliographique

La composition chimique des huiles essentielles du P. atlantica, a fait l’objet à notre connaissance qu’à quelques études. La première se rapporte à un échantillon du Maroc (haut Atlas) et la seconde à un échantillon de grèce. Barrero et coll. [198] ont ainsi extrait par hydrodistillation les huiles essentielles de la resine, des fruits et des feuilles de P. atlantica avec des rendements de 32.6%, 0.8% et 0.2% respectivement. Dans l’essence de resine 22 composés on été identifiés représentant 82.5% de la compoition totale, cette huile est caractérisée par la prédominance de l’α-pinène (42.9%), du β-pinène (13.2%) et du p-cymène-8-ol (8.7%) avec des proportions moindre en trans- pinocarvéol (3.2%), limonène (2.0%) et myrténol (2.0%). La composition chimique de l’huile essentielle des feuilles a été identifiée à 83.1%. le terpinènen-4-ol (21.7%) et l’élémol (20.0%) représentent les composés majoritaires. Sont aussi présents à des teneurs moins importantes, le γ-eudesmol (7.0%), le β-eudesmol (8.4%), et le p-cymene (5.0%). L’huile essentielle des fruits, identifiés à 74.0% est dominée par le bornyl acétate (21.5%), suivi par l’acide octanoique (8.2%), l’α-pinene (3.8%), le cuminaldéhyde (3.4%), le terpinen-4-ol (3.2%) et l’α-terpinyl acétate (3.0%). La seconde étude reporté par Tzakou et coll. [199], traite de la composition chimique des feuilles (prélevée sur des pieds mâle et femelle) et fruits de deux régions différentes de la Grèce. Ils ont obtenu des rendements de 0.13-0.24% pour les feuilles et 0.2-0.22% pour les fruits. Les huiles essentielles des feuilles sont caractérisées par le myrcène (17.8% et 24.8%) et le terpinen-4-ol (11.6% et 6.0%) respectivement pour les deux régions et pour le pied femelle tandis que pour les feuilles du pied mâle, c’est le terpinen-4-ol (17.3%) ou le p- mentha-1(7),8-diène (41.1%) qui sont majoritaires. En ce qui concerne les essences issues des fruits, c’est le terpinèn-4-ol (25.7% et 8.9%), le myrcène (20.2% et 34.5%) et le sabinène (14.9% et 19.5%) qui sont les plus dominants. Au vu de l’inéxistance d’autres études détaillées sur les essences du P. atlantica, il nous a semblé intéressant d’aborder et d’approfondir la connaissance de la composition chimique des huiles essentielles du Pistacia atlantica ou pistachier de l’Atlas d’Algérie.

II-2-Lieu de récolte et méthode d’extraction Les parties aériennes du P. atlantica ont été récoltés sur deux sites : daya de la plaine de boussedraya (Ain-oussera) i) en octobre 2005 (échantillon feuille F1, F2, F3) ii) en juin 2006 (feuille F4, fruits Fr4 et galle G4 et au jardin botanique de l’Ecole nationale d’Agriculture (INA, El-Harrach, Alger) i) en octobre 2005 (feuille, F5) ii) juin 2006 (feuilles F6 et fruits Fr6). Les huiles essentielles ont été isolées par hydrodistillation sur un appareil de Clevenger modifié. La durée de chaque extraction a été fixée à trois heures. A la fin de chaque expérience, l’échantillon d’huile essentielle est récupéré, séché sur du sulfate de sodium anhydre, puis conservé au réfrigérateur. Les huiles essentielles brutes ont été analysées par CPG, par CPG-SM et par RMN du carbone-13. Afin d’expliciter la méthode d’identification par RMN, nous décrirons en détail l’analyse d’un échantillon en l’occurrence l’huile essentielle des feuilles du P. atlantica prélevé sur la plaine de Boussedraya. Dans une seconde étape nous décrirons les compositions chimiques détaillées de tous nos échantillons dont les composés ont été identifiés par les trois techniques citées précédemment. Une comparaison sera ainsi faite d’une part entre des échantillons de différentes localités (à deux saisons différentes) et d’autres part entre les différents organes d’un même pied (feuille, fruit, galles). Les galles sont des petites boursouflures se formant sur les feuilles.

II-3- Analyse d’un échantillon d’huile essentielle par RMN-13C et par CPG

L’analyse de l’huile essentielle brute a été réalisée sans séparation préalable des constituants. Le spectre de RMN de cet échantillon, enregistré avec un appareil de 9,4 Tesla (fréquence de 100 MHz pour le carbone) et avec 3000 accumulations, contient 215 raies de résonnance (figure 32). L’interrogation de la bibliothèque a permis d’identifier 14 composés. Tous les constituants de l’huile essentielle identifiés par RMN, sont ensuite repérés sur le chromatogramme en utilisant leurs indices de rétention sur colonnes apolaire et polaire, par comparaison avec ceux des produits de référence (tableau 15).

210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ppm Figure 32 : Spectre RMN 13C de l’huile essentielle des feuilles de P. atlantica

Tableau 15 : Composés identifiés à partir du spectre RMN-13C de l’huile essentielle brute des feuilles du P. atlantica. Composés RMN SUP Ia Ip % tricyclène 6/7 2 920 1028 1.5 α-pinène 10/10 0 933 1031 53.0 camphène 10/10 0 945 1073 5.4 β-pinène 10/10 1 973 1124 9.6 myrcène 9/10 2 981 1163 2.1 limonène* 10/10 1 1021 1203 2.1 β-phéllandrène* 9/10 4 1021 1212 0.5 terpinèn-4-ol 8/10 3 1161 1599 0.8 α-terpinéol 10/10 1 1171 1696 2.0 acétate de bornyl 12/12 0 1269 1579 1.4 germacrène D 15/15 3 1479 1713 5.5 spathulénol 12/15 4 1571 1985 0.8 α-cadinol 13/15 5 1638 2233 1.0 Total 85.7 L’ordre d’élution est donné sur colonne apolaire. RMN : nombre de signaux observés sur le spectre de RMN-13C du mélange par rapport au nombre de signaux attendus. SUP : nombre de superpositions de signaux. I : indices de rétention sur colonnes apolaire (Ia) et polaire (Ip). CPG: pourcentage de chaque composé obtenu sur les colonnes apolaire (%). * : pourcentage sur colonne polaire.

Le logiciel d’aide à l’identification des molécules a été paramétré comme suit : nombre de signaux des carbones observés dans le spectre du mélange par rapport au nombre de

98 signaux attendus = 60%, variations des déplacements chimiques maximum entre le spectre du mélange et le spectre de la molécule de référence = Δδ = 0,06 ppm. Dans ces conditions, 14 composés ont été identifiés, leurs teneurs étant comprises entre 53.0% et 0,5%. Pour tous les composés identifiés (figure 33) : - tous les signaux des carbones ont été repérés, à l’exception de certains carbones et en particulier certains carbones quaternaires de composés dont la teneur est inférieure à 1%.

- le nombre de superpositions de signaux est compris entre 0 et 5, ce qui signifie que chaque composé est identifié par l’observation d’au moins 50% des carbones qui lui appartiennent en propre ;

- les variations des déplacements chimiques (Δδ ppm) observées entre les valeurs du mélange et celles des spectres de référence sont comprises entre 0,00 et 0,07 ppm pour tous les signaux.

Cet échantillon se caractérise par une forte proportion en composés oléfiniques. En effet l’α-pinène, le β-pinene, le camphène et le germacrène D représentent respectivement 53.0%, 9.6%, 5.4% et 5.5% de la composition totale de l’huile. Nous retrouvons aussi à des proportions moindre le myrcene (2.1%), le tricyclène (1.5%) et le limonène (2.1%). En outre on observe la présence de l’α-terpinéol (2.0%) et du bornyl acétate (1.4%) qui semblent être les composés oxygénés les plus importants. La forte concentration de l’α-pinène ne nous a pas permis d’identifier plus de composés par RMN. Nous avons alors décidé d’effectuer une chromatographie flash sur l’huile brute.

0.0 0.02 0.05 0.02 0.04s 0.01 0.04 0.04* 0.04 0.04 0.02 0.01 0.03 0.05* 0.05* 0.01 0.02 0.04 0.00 0.01 0.02 0.04 0.01* 0.01* 0.01 0.00 0.00 0.05s 0.02 0.01 tricyclène camphène α−pinène 0.01 0.01 0.02 0.00

0.00 0.00 0.01 0.02s 0.01 0.02s 0.07 0.01 0.03 0.03 0.01 0.03 0.00 0.01 0.01s 0.01 0.00 0.06 0.01 0.02 0.00 0.02s 0.01 0.04s 0.05s 0.01 β-pinène 0.01 0.03

0.02 0.01 0.01s 003 0.00s 0.07 myrcène limonène β-phéllandrène 0.08s 0.02 0.02

0.02s 0.04s 0.02 0.04 0.00 0.01 0.04s 0.03s 0.05 0.02 0.01 0.01 0.00s 0.01s 0.03 0.05 0.00 0.06 0.06 OH 0.01 0.02 0.02 0.03 0.02 0.01 0.01 0.01 0.03 0.02s 0.01 terpinèn-4-ol OH germacrène D α-terpinéol

0.06 0.02s OH H 0.06s H 0.06 0.04 0.05 0.06s 0.05 0.06 0.05 0.09 0.05 0.04 0.00 0.03s 0.01s 0.02s 0.02 0.00 H 0.02 OH Spathulénol 0.03s 0.01 α-cadinol 0.04s

0.05s 0.03 0.00

Figure 33 : Principaux composés identifiés par RMN 13C dans l’huile essentielle des feuilles de P. atlantica Les molécules sont données dans l’ordre du tableau 15. Les variations de déplacements chimiques par rapport aux valeurs de référence sont reportées à côté des carbones auxquelles elles correspondent. s : superposition

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II-4- Fractionnement de l’huile essentielle et analyse des fractions Afin d’identifier un plus grand nombre de composés par RMN 13C, 1 gramme d’huile essentielle brute a été soumis à un fractionnement par chromatographie flash sur colonne ouverte de silice. Deux fractions f1et f2 ont été obtenues. La première fraction f1 contenant les composés hydrocarbonés est éluée au pentane tandis que la deuxième fraction f2 contenant les composés oxygénés est obtenue en utilisant du diéthyl ether comme éluant. Chaque fraction est analysée par CPG et par RMN 13C. Le tableau 16 ci-dessous, donne la composition des deux fractions.

Tableau 16 : Composés identifiés dans les deux fractions et dans l’huile totale de P. atlantica Composés Ia Ip Huile f1 f2 brute tricyclène 920 1028 1.5 1.2 - 7/7 α-pinène 933 1031 53.0 54.0 2.4 10/10 camphène 945 1073 5.4 5.0 10/10 Sabinène 965 1117 0.5 0.6 9/10 β-pinène 973 1124 9.6 9.6 0.6 10/10 myrcène 981 1163 2.1 2.5 10/10 p-cymène 1011 1272 0.5 0.5 5/7 limonène* 1021 1203 2.1 2.9 10/10 β-phéllandrène* 1021 1212 0.5 0.8 9/10 terpinolène 1078 1284 0.6 0.8 8/10 tans-pinocarvéol 1124 1652 0.3 1.8 8/10 bornéol 1148 1600 0.2 0.7 8/10 terpinen-4-ol 1162 1595 0.8 4.2 10/10 cis-pinocarvéol 1169 1790 0.2 1.0 7/10 α-terpinéol 1171 1696 2.0 11.2 10/10 acétate de bornyl 1269 1579 1.4 7.6 12/12 β-caryophyllène 1420 1597 0.7 1.5 10/15 γ-muurolène 1472 1689 0.3 0.6 14/15 germacrène D 1479 1713 5.5 11.5 3.6 15/15 bicyclogermacrène 1492 1733 0.7 3.0 1.2 15/15 δ-cadinène 1514 1756 0.6 1.1 15/15 élemol 1539 2085 0.2 2.0 10/14 spathulénol 1571 1985 0.8 8.4 15/15 gleenol 1570 2130 0.2 1.6 11/15 globulol 1576 2176 0.3 2.5 15/15 viridiflorol 1583 2080 0.1 1.2 14/15 γ-eudesmol 7-epi 1611 2115 0.2 1.4 10/15 épi-cubénol 1618 2060 0.2 1.5 11/15 ermophyllen-11-ol d 9,10 1625 2200 0.2 1.8 10/15 τ-muurolol 1626 2186 0.4 1.9 15/15 α-cadinol 1638 2233 1.0 6.8 15/15 α-bisabolol 1669 2215 0.2 1.2 10/14 Total 92.3 94.4 64.0 Ia et Ip : indices de rétention mesurés respectivement sur colonnes apolaire et polaire.f1 : fraction oléfinique f2 : fraction des oxygénée

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Dans la fraction oléfinique (f1) 15 composés ont été identifiés par RMN .dont sept non détectés dans l’huile brute ou sujets à trop de superpositions. Il s’agit du sabinène, du p- cymène, du terpinolène et de quatre sesquiterpenes, le β−caryophyllène le γ-muurolène, le bicyclogermacrène et le δ-cadinène. Le spectre RMN de la fraction oxygénée nous a fourni 250 raies qui nous ont permis d’identifier 12 composés supplémentaires par rapport à ceux déjà identifiés dans l’huile brute. Les plus importants mais identifiés précédemment, sont les trois alcools terpéniques, l’α-terpinéol avec 11.2% suivi du spathulénol (8.4%), et de l’α- cadinol (6.8%) et un acétate monoterpénique, l’acétate de bornyl avec une teneur de 7.6%.

Parmi les composés nouveaux identifiés, nous retrouvons une majorité d’alcools mono et sesquiterpèniques dont le trans- et le cis-pinocarvéol (1.8%, 1.0%), l’elémol (2.0%), le gleenol (1.9%), le globulol (2.5%), le viridiflorol (1.2%), l’épi-cubénol (1.5%), l’érémophyllèn-9-ol (1.8%) et le τ-muurolol (1.9%). Les structures de quelque uns de ces composés sont représentées dans la figure (35). La RMN-13C nous a permis d’identifier sans ambiguïté dans cette fraction, l’α-bisabolol qui coélue sur colonne polaire et apolaire avec son épimère l’epi-α-bisabolol et dont les spectres de masse ne sont pas différenciables (figure 34).

Figure 34: spectres de masse de l’α-bisabolol (a) et de l’épi-α-bisabolol (b).

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OH HO H OH Gleenol Elémol Spathulénol

OH OH O H H

H Globulol Oxyde d'humulène II Viridiflorol

OH OH H Erémophilen-9-en-11-ol Eudesmol 10-epi-γ 1-epi-cubénol

HO HO H

H α-bisabolol τ-Muurolol

Figure 35 : Structures de quelques composés identifiés dans la fraction oxygénée

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II-5- Analyses par CPG, CPG-SM et RMN C-13 de différents échantillons d’huiles essentielles du P. Atlantica.

afin de mieux caractériser les huiles essentielles du Pistachier de l’Atlas nous présentons dans cette partie l’analyse d’échantillons d’huiles essentielles de différents pieds provenant i) d’une région sub-saharienne (daya de ain oussera, échantillons de F1-F3 et F4, Fr4 et G4) ii) jardin botanique de l’INA,Alger,(échantillons F5, F6 et Fr6) Plusieurs hydrodistillations ont été effectuées sur chaque échantillon. Les rendements en huiles essentielles ,calculés par rapport à la matière seche, varient entre 0.1% pour les feuilles et 0,5% pour les galles (figure 36). Les meilleurs rendement sont obtenus sur les fruits et les galles de l’échantillon provenant du sud. Tandis que pour les feuilles c’est les échantillons du nord qui sont les plus riches en huiles essentielles. Si nous devons comparer nos valeurs à celles de la bibliographie, nous constatons qu’elles sont inférieures aux rendements des huiles du Maroc [198] mais relativement proches de ceux de Grèce [199].

rendement % 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 F1 F2 F3 F4 Fr4 G4 F5 F6 Fr6 F : feuilles, Fr : fruits, G : galles, 1-4 : Ain-oussera, 5et6 : INA, Alger.

Figure 36 : rendements en huiles essentielles des différents échantillons de P. atlantica Desf.

L’identification des composés a été réalisée en combinant les trois méthodes analytiques : CPG, CPG-SM et RMN du carbone-13. Chaque échantillon (environ 50mg d’huile) est analysé par RMN. L’interrogation de la bibliothèque de spectres, en spécifiant les conditions, comme décrites dans le paragraphe précédent, du nombre de raies de résonance des carbones appartenant à chaque molécule, du nombre de superposition entre deux ou plusieurs signaux et des variations des déplacements chimiques entre le spectre du mélange et celui de chacun des produits de référence contenus dans les banques de spectres- permet d’identifier sans aucun doute tous les composés majoritaires.

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Tableau 17.: Compositions chimiques des huiles essentielles de P. atlantica identifiées par CPG, CPG-SM et RMN 13C.

Composé identifié Ia Ip F1 F2 F3 F4 Fr4 G4 F5 F6 Fr6 tricyclène 920 1022 1.5 1.8 1.8 1.7 1.8 1.0 2.9 0.4 0.9 α-pinène 932 1026 53.0 54.2 54.7 36.2 50.6 48.3 32.6 18.5 20.9 camphène 944 1070 5.4 6.2 6.2 7.7 6.8 4.0 10.0 1.7 5.2 sabinène 965 11240.5 0.7 0.6 0.5 0.9 0.4 1.2 0.1 0.5 β-pinène 972 1113 9.6 10.0 10.1 10.6 13.5 8.0 20.2 2.1 12.3 myrcène 980 1162 2.1 3.1 3.1 1.3 3.3 1.4 3.4 0.3 3.4 α-phéllandrène 997 1167 0.2 0.1 0.1 0.5 0.4 2.2 0.1 - 0.1 δ-3-carène 1004 1150 0.1 tr tr 0.1 tr 0.5 tr tr - α-terpinène 1009 1183 0.2 0.1 0.1 0.3 0.1 0.4 0.1 - 0.2 p-cymène 1011 1272 0.5 0.2 0.2 0.3 0.1 0.8 0.1 0.2 0.3 limonène* 1021 1203 2.1 1.6 1.6 3.0 2.4 6.9 1.9 0.5 3.2 β-phéllandrène* 1021 1213 0.5 0.4 0.4 0.9 0.8 2.8 0.6 0.1 0.6 (Z)-β-ocimène 1024 1234 0.1 tr tr tr 5.6 tr tr 0.1 1.1 (E)-β-ocimène 1036 1246 0.3 0.1 0.1 0.1 1.3 tr 0.1 - 0.3 γ-terpinène 1048 1250 0.3 0.2 0.2 0.5 0.2 0.3 0.2 0.1 0.4 terpinolène 1078 1284 0.6 0.2 0.2 1.3 0.4 3.5 0.2 0.1 0.8 linalool 1082 1544 tr 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 tr 0.2 0.3 α-fenchol 1098 1581 0.1 tr tr 0.2 0.1 0.3 0.1 0.1 0.2 α-campholénal 1104 1480 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 trans-pinocarvéol 1124 1650 0.3 0.1 0.1 0.1 tr 0.1 0.2 0.2 0.1 camphène hydrate 1132 1596 0.1 0.1 0.1 0.3 0.1 0.2 tr 0.2 0.3 pinocarvone 1137 1558 0.1 0.1 0.1 tr tr tr 0.1 0.1 0.1 bornéol 1148 1701 0.2 tr tr 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 0.7 terpinèn-4-ol 1162 1600 0.8 0.3 0.3 1.2 0.6 1.0 0.4 0.4 1.1 cis-pinocarvéol 1168 1791 0.2 0.1 0.1 Tr 0.1 Tr 0.1 0.1 0.1 α-terpinéol 1172 1697 2.0 0.5 0.5 4.5 1.4 9.2 0.5 1.6 3.4 myrténol 1178 17920.2 tr 0.1 0.1 tr 0.1 0.1 0.1 tr formate de bornyl 1215 1575 0.1 0.1 0.1 0.2 tr 0.1 0.1 0.2 0.1 acétate de bornyl 1267 1579 1.4 1.7 1.7 3.7 4.5 0.9 2.1 1.4 3.7 α-terpényl acétate 1331 1687 tr 0.1 0.1 0.2 0.4 0.1 - - - δ-élémène 1334 1469 0.1 0.1 0.1 0.4 tr 0.1 Tr - 0.1 α-copaène 1377 1491 0.1 0.1 0.1 tr tr Tr 0.1 0.3 0.2 β-bourbonène 1384 1515 0.1 0.1 0.1 tr - - 0.4 0.9 0.3 β-élémène 1388 1588 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 tr 0.2 0.4 0.3 α-gurjunène 1410 1524 ------Tr 0.2 0.1 β-caryophyllène 1420 1596 0.7 0.2 0.3 0.1 0.4 0.1 4.3 11.7 9.2 β-gurjunène 1428 1591 0.3 0.4 0.4 0.2 0.1 tr 0.3 0.7 0.5 aromadendrène 1439 1604 0.1 0.1 tr 0.2 tr tr 0.1 1.6 0.2 α-humulène 1452 1669 0.1 0.1 0.1 0.3 0.1 0.1 0.3 1.3 0.8 allo-aromadendrène 1459 1644 0.1 0.1 0.1 0.3 tr 0.1 0.1 0.3 0.1 γ-muurolène 1471 1688 0.3 0.3 0.3 0.2 tr 0.1 0.3 0.9 0.5 germacrène D 1477 1710 5.5 8.6 8.8 4.4 1.9 1.2 11.1 5.6 15.3

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Composé identifié RIa RIp F1 F2 F3 F4 Fr4 G4 F5 F6 Fr6 β-Sélinène 1487 1712 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 tr 0.1 0.5 0.2 lédène* 1492 1697 ------1.0 - bicyclogermacrène* 1492 1733 0.7 0.8 0.8 5.7 0.5 1.2 0.4 - 0.6 α-muurolène* 1592 1719 0.2 0.2 0.2 0.5 0.1 0.1 0.1 1.0 0.6 γ-cadinène 1507 1757 0.2 0.2 0.2 0.1 tr tr 0.1 0.7 0.3 γ-bisabolène 1509 0.4 δ-cadinène 1515 1757 0.7 0.6 0.6 0.5 0.1 0.2 0.5 1.2 1.2 α-calacorène 1530 1891 0.1 0.1 0.1 0.1 - tr tr 0.4 0.2 α-cadinène 1532 1744 0.2 0.2 0.1 0.1 tr tr 0.1 0.2 0.1 élémol 1539 2080 0.2 0.1 0.1 - - tr 0.1 1.1 0.2 germacrène B 1542 1973 0.2 0.2 0.2 0.5 tr tr 0.1 1.0 0.1 E- nérolidol 1545 2036 0.4 Hexenyl benzoate 1552 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 0.2 0.4 0.3 Spathulénol 1567 2115 0.8 0.5 0.5 1.1 0.1 0.4 0.2 3.2 0.5 caryophyllène oxide 1571 1986 0.3 0.1 0.1 0.1 tr tr 0.4 7.6 0.9 globulol 1575 2074 0.3 0.1 0.1 1.8 tr 0.4 0.1 2.4 0.4 viridiflorol 1582 2083 0.1 0.1 0.1 0.6 tr 0.2 0.1 1.2 0.1 Salvial-4(14)-en-1-one 1585 0.6 sesquithuriférol 1591 21150.1 0.1 tr 0.4 tr 0.2 tr 0.3 0.1 lédol 1595 2036 0.4 humulène époxide II 1595 2040 0.2 0.1 0.1 0.2 tr tr 0.1 0.5 0.2 7-epi-γ-eudesmol 1611 2112 0.2 0.1 0.1 0.6 tr 0.2 0.1 1.1 0.4 γ-eudesmol 1616 2167 tr tr 0.1 0.1 tr tr tr 0.4 0.1 1-epi-cubénol 1618 2059 0.2 0.1 0.1 0.1 tr tr 0.1 1.9 0.5 Δ-9,10-eremophilèn-11-ol 1624 2193 0.1 tr 0.1 0.2 tr tr tr 1.9 0.1 τ-muurolol 1627 2188 0.6 0.3 0.3 0.7 Tr 0.1 0.2 2.0 1.0 α-muurolol 1629 2173 0.1 0.1 tr 0.2 - - tr 0.8 0.2 τ-cadinol 1632 2167 0.1 tr tr 0.1 - tr tr 0.4 0.1 α-cadinol 1639 2235 1.0 0.5 0.5 1.3 0.1 0.4 0.4 6.8 2.1 α-eudesmol 1645 2218 0.1 0.1 0.1 0.1 tr tr 0.1 0.6 0.3 α-bisabool 1667 2214 0.2 0.1 0.1 0.2 tr - 0.2 0.6 0.2 juniper camphor 1680 2300 tr tr tr 0.1 - tr tr 0.3 0.1 benzyl benzoate 1725 2630 tr 0.1 0.1 0.1 - - tr 0.3 0.1 Rendement (%) 0.08 0.1 0.10 0.13 0.39 0.47 0.17 0.12 0.2 Monoterpènes hydrocarbonés 77 78,9 79,4 65 88,2 80,5 73,6 24,2 50,2 Monoterpènes oxygénés 5,7 3,3 3,3 10,9 7,6 12,4 4 4,9 10,2 Sesquiterpène hydrocarbonés 9.9 12,7 12.8 13,9 3,4 3,2 18,6 30.3 30.9 Sesquiterpènes oxygenés 4.8 2,6 2,6 8,1 0,3 2 2,3 34.9 7,8 Autres tr 0.1 0.1 0.1 - - tr 0.3 0.1 Total 97,4 97,6 98,2 98 99,5 98,1 98,5 94,6 99,2 F : feuilles, Fr : fruits, G : galles, (1-3) juin,( 4 ) octobre : Ain-oussera, (5) octobre et (6) juin: INA, Alger. L’ordre d’élution et les pourcentages sont donnés sur colonne apolaire (BP-1), excepté pour les composés dont les noms sont suivis d’un astérisque*(colonne polaire BP-20). Ia et Ip : indices de rétention mesurés respectivement sur colonnes apolaire et polaire. Les pourcentages en gras sont ceux des composés identifiés par RMN-13C. tr≤0.05%.

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Nous les repérons ensuite sur les chromatogrammes (colonne polaire et apolaire) grace à leurs indices de rétention, et nous les quantifions. Nous confirmons la présence de ces composés grace à leurs spectres de masse et nous identifions par ailleurs les produits minoritaires grace à la comparaison de leur spectres de masse à ceux proposés par les banques de la littérature. Les compositions chimiques de toutes nos huiles sont données dans le tableau 17 [200]. Les trois techniques d’analyses nous ont permis d’identifier 73 composés représentant entre 94.6 et 99.5% des compositions totales. Toutes ces huiles essentielles se caractérisent par une forte proportion en monoterpènes oléfiniques dont la teneur varie entre 49.2 et 88.2%, excépté pour l’echantillon F6 (feuille INA) dont la composition est prédominée par les sesquiterpenes oléfiniques (30.3%) et oxygénés (34.9%). L’α-pinène est toutefois toujours majoritaire avec des concentrations variant entre 18.5 et 54.7%. nous retrouvons aussi d’autres composés à des teneurs appréciables; β-pinène (2.1-20.2%), camphène (1.7-10.0%), limonène (0.5-6.9%), α- terpinéol (0.5-9.2%) et le bornyl acétate (1.4-4.5%). La fraction sesquiterpénique est représentée par le β-caryophyllène (0.1-11.7%), le germacréne D (1.2-15.3%), spathulénol (0.1-3.2%), l’oxyde de caryophyllène (0.1-7.6%), le τ-muurolol (0.1-3.8%) et l’α-cadinol (0.1-6.1%). Afin de rechercher une éventuelle variabilité dans la composition des huiles essentielles du P. atlantica nous avons considéré les huiles essentielles des feuilles de trois pieds distincts provenants de Ain-oussera (F1-F3 octobre, F4 juin) et un pied provenant de l’INA, echantillon, F5 octobre et F6 juin) à deux saisons différentes, comme nous pouvons le constater sur le tableau (17) les huiles sont qualitativement équivalentes. L’α-pinène, le β- pinène, le camphène et le germacrène D représentent les oléfines les plus importantes. Cette constatation nous laisse présager qu’il n’existe pas de variabilité importante dans les essences de P. atlantica. Toutefois nous pouvons eméttre quelques remarques : - la proportion des monoterpènes et des sesquiterpenes oxygénés est plus importante en été qu’en automne (19.1% contre 6-10.5% pour les feuilles sud) et (39.2% contre 6.3% pour le pied nord). - la teneur en β-caryophyllène est en moyenne 10 fois plus importante dans les echantillons de l’INA par rapport à ceux du sud. - le β-bourbonène n’est présent que dans les echantillons du nord. - le lédène n’apparaît que dans les feuilles nord (juin).

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- l’α-terpenyl acétate est caractéristique des essences du sud. En ce qui concerne les huiles essentielles obtenues à partir des feuilles, fruits et galles d’un même pied, il est intéresant de noter la présence du trans-ocimène dans l’essence des fruits (5.6% sud). La presence de ce composé dans l’huile essentielle justifierait l’odeur plaisante et caractéristique qui lui est conférée [45]. Il est intéressant de noter également la présence du limonéne à 6.9% et l’α-terpinéol à 9.2% dans l’huile essentielle des galles du sud alors que dans les autres huiles essentielles leurs teneurs n’excède pas 3.2 et 4.5% respectivement.

II-6- Comparaison de nos huiles essentielles avec celles reportées dans la littérature

La composition chimique des huiles essentielles du P.atlantica d’Algerie, dominée par l’α-pinene, est totalement différente des huiles du Maroc qui sont caractérisées par la présence du terpinen-4-ol et l’élémol ( huile feuille) et le bornyl acétate (huile fruit) [198]. Cependant la composition de l’huile essentielle de la résine semble etre similaire à nos échantillons. Les échantillons de Grèce [199] sont également différents des nôtres dans la mesure où ils sont prédominés par le myrcène, le terpinen-4-ol, le p-mentha-1(7),8-diène ou le sabinène. Ces quelques études montrent une variabilité certaine dans la composition des huiles essentielles du P. atlantica de trois origines différentes. Cependant on ne peut encore prédire si ces variations sont d’origine géographique, climatique ou génétique.

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References 198-A.F. Barrero, M.M. Herrador, J.F. Arteaga, M. Akssira, F. Mellouki, A. Belgarrabe and M.A. Blàzquez, Chemical composition of the essential oils of Pistacia atlantica Desf. J. Essent. Oil Res., 17, 52-54 (2005).

199-O. Tzakou, I. Bazos, A. Yannitsaros, Volatiles metabolites of Pistacia atlantica Desf. from Greece, Flav. Frag. J., 22 (5), 358-362 (2007).

200- S. Mecherara, A. Hassani, V. Castola, J. Casnova, Composition of leaf, fruit and gall essential oils of Algerian Pistacia atlantica Desf.”, sous presse au Journal of Essential Oil Research. Manuscript RN-2452

45- G. Flamini, A. Bader, P.L. Cioni, A. Katbeh-Bader and I. Morelli, Composition of the Essential Oil of Leaves, Galls and Ripe and Unripe Fruits of Jordanian Pistacia palaestina Boiss. J. Agric. Food Chem., 52, 572-576 (2004).

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Chapitre III : Caractérisation des huiles essentielles du Pistacia terebinthus Linné

III-1- Etude bibliographique

Plusieurs études concernant la composition chimique des huiles essentielles du P. terebinthus de différentes origines (Turquie, Espagne, Grèce, Sardaigne et Jordanie) ont été reportées dans la littérature. Nous les citons dans l’ordre chronologique de publication.

Fernandez et coll. [201] ont extrait par hydrodistillation l’huile essentielle des parties aériennes récoltées dans la province de Jaén, en Espagne. Ils ont obtenu un rendement de 0.38%. Cette huile essentielle est caractérisée par la prédominance du (E)-β-ocimène (15.0%), L’α-pinène (7.9%) et un sesquiterpène non identifié (17.7%).

Couladis et coll. [202] ont extrait les huiles essentielles des jeunes pousses, fleurs, fruits immatures et matures, récoltés dans la province d’Içel en Turquie. Ils ont obtenu des rendements entre 0.54% et 0.74%. Ces huiles essentielles sont toutes différentes les unes des autres. En effet, tandis que les jeunes pousses sont caractérisés par la présence du p-cymène (27.3%), du trans-verbénol(8.8%), du bornyl acétate (6.6%) et du terpinèn-4-ol (6.0%), les fleurs quant à elles sont prédominées par le germacrène D (19.9%), l’α-pinène (12.4%), le limonène (9.4%), le β-caryophyllène (8.9%) et le β-pinène (8.0%). Le limonène est le produit majoritaire des huiles essentielles des fruits avec 34.2 et 32.8% pour les fruits immatures et matures respectivement. L’α-pinène, le β-pinène et L’α-phéllandrène sont aussi présents à des teneurs appréciables (> 5.3%). Duru et coll. [20] ont étudié la composition et les propriétés antifongiques des huiles essentielles des feuilles de trois espèces de Pistacia récoltées dans la région de Fethiye (Turquie). Ils ont identifié dans l’huile essentielle du P. terebinthus 50 composés. Les plus importants sont le terpinène-4-ol (33.7%), le γ-terpinène (9.3%) et l’α-terpinéol (8.1%). En plus de ces composés majoritaires, le limonène (4.8%), le spathulénol (4.6%), l’α- terpinène(3.8%), le 1,8-cinéole (3.3%) et le β-caryophyllène (3.2%) sont présents à des teneurs appréciables.

Kivçak et coll [168] ont analysé la composition chimique des huiles essentielles des feuilles et des rameaux récoltés en Turquie, 77 composés ont été identifiés dans les feuilles dont l’α-cadinol (6.9%), le phytol (5.4%), δ-cadinène (5.1%), α-terpinéol (5.0%) et le bornyl acétate (4.4%) sont les produits majoritaires. Le geramacrène D (10.0%), le β-pinène (7.5%),

109 le bornyl acétate (6.0%), l’α-cubebène (5.9%) et le cubébol (5.4%), sont les composés les plus dominants parmi les 61 identifiés dans l’huile essentielle des rameaux.

Flamini et coll. [45] ont étudié la composition chimique d’huile essentielle des feuilles, fruits et galles du P. palaestina qui est une sous-espèce du P. terebinthus [3,35], récoltés en Jordanie. Ils ont obtenue un rendement de 0.02% pour les feuilles et 0.06% pour les fruits. Ils ont identifié en moyenne 35 composés. Les trois huiles essentielles sont qualitativement différentes. Les feuilles sont caractérisées par la présence de l’α-pinène (63.1%) et le myrcène (13.3%), avec des teneurs moindre en limonène (4.3%), (Z)-ocimène (2.7%), β-caryophyllène (2.9%) et l’α-humulène (2.0%), tandis que les galles sont dominés par l’α-pinène (49.4%) et le sabinène (22.8%). On note également la présence du limonène (8.1%), du terpinène-4-ol (4.4%) et du myrcène (4.2%) à des taux appréciables. La composition de l’huile essentielle des fruits est caractérisée par une forte proportion des deux isomères de l’ocimène, ((E)-ocimène (33.8%) et (Z)-ocimène (13.0%) et du sabinène (24.1%).

Enfin, Usai et coll [203] ont étudié les huiles essentielles des feuilles, des rameaux et des fruits récoltés en Sardaigne (Italie). Les rendements varient de 0.01% pour les feuilles à 1.5% pour les fruits. Les composés majoritaires décrits dans l’huile essentielle des feuilles sont l’α-pinène (16.4%), le β-pinène (13.5%), le β-phéllandrène (8.3%), l’α-terpinéol (8.0%).On peut citer également l’isocaryophyllène (6.9%), le trans-verbénol (5.0%) et l’α- humulène (4.4%). L’essence des rameaux est dominée par l’α-pinène (66.0%) avec des proportions moindres en β-phéllandrène (8.4%) et α-terpinéol (9.0%).L’huile essentielle des fruits se caractérise par la prédominance de l’α- et β-pinène avec respectivement (54.8% et 22.2%). Viennent ensuite le β-phéllandrène (4.9%), le bornyl acétate (4.6%) et le germacrène D (2.6%).

Par ailleurs nous n’omettrons pas de citer les travaux de Papageorgiou et coll [204] sur l’hydrodistillation de la resine du P. terebinthus var. chia (Chios turpentine). Ces auteurs ont obtenu une huile riche en composés monoterpèniques. L’α-pinène (39.6%) et le β-pinène (19.5%) en constituent les composés majoritaires.

Au regard des données bibliographiques, il apparaît que les huiles essentielles du P. terebinthus L. poussant à l’état spontané dans divers pays, présentent une grande variation dans leur composition chimique. Ainsi les huiles d’une même origine géographique –en l’occurrence la Turquie- ne présentent pas de composition homogène [20,168].

110

Les variations observées dans les différentes huiles essentielles sont probablement liées à différents facteurs. En effet, étant donnée la diversité des études, il n’est pas possible de présager s’il s’agit de facteurs pédoclimatiques ou environnementaux ou de facteurs génétiques. En ce qui nous concerne, nous n’avons pas trouvé d’études concernant la composition chimique du P. terebinthus d’Algérie. Il nous a semblé intéressant d’approfondir la connaissance de la composition de son huile essentielle et ainsi de caractériser chimiquement l’espèce algérienne.

III-2- Echantillonnage et méthode d’extraction Les feuilles (F) et fruits (Fr) du P. terebinthus ont été récoltés à Alger dans l’enceinte de l’Université USTHB en juin 2004, 2005, 2006 (F1-F3), septembre 2005 (F4 ,Fr4), ainsi que dans le jardin botanique de l’institut national d’agronomie (INA) en septembre 2005 (F5, Fr5). Les échantillons ont été authentifiés par un spécialiste de l’INA. Les prélèvements ont été effectués sur des pieds individuels et nous avons pris soin de couper des petits rameaux tout autour de l’arbre. Les feuilles et les fruits sont hydrodistillés dans un appareil de type Clevenger pendant 3 heures. Les rendements obtenus sont de 0.09 % en moyenne pour les feuilles, 0,25 et 0,40 % pour les fruits (tableau 18). On remarque que les fruits donnent environ deux fois plus d’huile que les feuilles. Ce résultat confirme les données de la littérature, ou par exemple, Usai et coll. ont obtenu 0.01% pour les feuilles et 1.5% pour les fruits [204].

Tableau 18 : rendements en huile essentielle des différents échantillons: Echantillon F1 F2 F3 F4 Fr4 F5 Fr5

Rendement % 0.09 0.085 0.1 0.056 0.24 0.09 0.41

F :feuille, Fr : fruit, 1-4 : site de l’USTHB, 5 : INA

Tous nos échantillons ont été soumis à la même procédure d’identification; CPG, RMN13C et CPG-SM. Nous présenterons d’abord une analyse par CPG et RMN.

III-3- Analyse par CPG et par RMN-13C de l’échantillon F4

L’échantillon d’huile essentielle des feuilles (F4) a été, directement analysé par RMN- 13C. la figure 37 représente le spectre RMN de l’huile essentielle obtenu avec un appareil de 9.4T et avec 3000 accumulations.

111

Figure 37 : spectre RMN 13C de l’huile essentielle du P. terebinthus ; 1-10 : les dix pics du composé

majoritaire l’α-phéllandrène.

L’interrogation de la bibliothèque de spectres a permis d’identifier 20 composés qui représentent 93.7% de la composition globale de l’huile essentielle (tableau 19). Il s’agit de 13 monoterpènes (12 oléfines et 1 oxygéné) et 7 sesquiterpènes (4 oléfines et 3 oxygénés) . Les monoterpènes sont dominants, non seulement en nombre mais aussi en teneur. Les composés majoritaires de l’huile essentielle sont l’α-phéllandrène (33.5%), l’α-pinène (14.2%) le para-cymène (8.0%) et le bicyclogermacrène (7.8%). A côté de ces composés on observe la présence du limonène (5.5%), le β-élémène (3,3%), le spathulénol (3,5%), le β- phéllandrène (2,8%) et l’α-terpinène (2,3%). Les autres composés identifiés ont des teneurs comprises entre 0.4 et 1.7%. Comme nous pouvons le voir en détail sur la figure 38, pour chacun des constituants identifiés : - tous les carbones des composés majoritaires ont été observés sauf quelques carbones quaternaires de constituant minoritaires. - le nombre de superpositions des signaux est limité à quatre pour les monoterpènes, et à 5 pour les sesquiterpènes, ce qui signifie que chaque composé est identifié par l’observation d’au moins 60% des signaux lui appartenant en propre;

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- les variations de déplacements chimiques (Δδ ppm) observées entre les valeurs répertoriées dans le mélange et celles des spectres de référence sont comprises entre 0.00 et 0,06 ppm pour la majorité des signaux. Il faut signaler que des variations, même importantes (0.1-0.2 ppm) des déplacements chimiques de certains carbones ne gênent en rien l’identification des molécules, en particulier si ces carbones sont liés à des atomes d’oxygènes.

Tableau 19 : Composés identifiés à partir du spectre RMN-13C de l’huile essentielle brute de P. terebinthus. Composés RMN SUP Ia Ip % α-thujène 10/10 2 923 1027 1.3 α-pinène 10/10 0 931 1027 14.2 sabinène 8/10 3 965 1123 0.4 β-pinène 9/10 2 970 1112 0.6 myrcène 10/10 1 980 1163 1.6 α-phéllandrène 10/10 0 999 1169 33.5 α-terpinène 10/10 0 1009 1182 2.3 p-cymène 7/7 0 1012 1273 8.0 Limonène 10/10 2 1021 1203 5.5 β-phéllandrène 10/10 4 1021 1212 2.8 γ-terpinène 10/10 1 1048 1246 1.7 terpinolène 10/10 4 1078 1284 1.5 terpinèn-4-ol 9/10 1 1161 1600 0.6 β-élémène 14/15 3 1388 1589 3.3 β-caryophyllène 10/15 1 1419 1594 0.9 germacrène D 15/15 1 1478 1707 1.5 bicyclogermacrène 15/15 1 1494 1733 8.0 spathulénol 14/15 3 1566 2123 3.5 globulol 13/15 6 1577 2074 1.6 viridiflorol 13/15 3 1584 2083 0.9 Total 93.7 L’ordre d’élution et les pourcentages sont donnés sur colonne apolaire BP-1. RMN : nombre de signaux observés sur le spectre de RMN-13C du mélange par rapport au nombre de signaux attendus. SUP : nombre de superpositions de signaux. I : indices de rétention sur colonnes apolaire (Ia) et polaire (Ip).

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0.02 0.03 0.02 0.02 0.02 0.02 0.01s 0.04 0.01 0.06 0.05 0.06 0.01 0.00 0.02 0.05s 0.00 0.01 0.00 0.07 0.00 0.0 0.06 0.02 0.01 0.03 0.04 0.03 sabinène 0.04s 0.00 0.04 0.02 β-pinène 0.03s 0.04s α-pinène 0.06s 0.00s α-thujène 0.00 0.03 0.04 0.04 0.00 0.02 0.06 0.03 0.02 0.03 0.00 0.06 0.07 0.03 0.03 0.00 0.02 0.02 0.03 0.06 0.05 0.07 0.02s 0.01 0.07 0.03 0.01 0.03 0.04 0.05 0.02 0.02 0.01 0.00 0.03 0.03 0.05 0.05 0.01 0.03 α-phéllandrène α-terpinène p-cymène myrcène 0.03 0.02s 0.02 0.03 0.02s 0.03 0.02s 0.01 0.01s 0.03 0.01 0.02 0.01s 0.03 0.06 0.06 0.04 0.02 0.01 0.01s 0.04 0.02 0.06 0.06 0.05 0.01 0.05 0.06 0.01 0.02s 0.04 0.01 0.00s 0.01 0.02 0.02s 0.05s 0.02s 0.05s 0.02 limonène γ-terpinène terpinolène β-phéllandrène 0.04 0.03s 0.00 0.06 0.02 0.01 0.01 0.04s 0.02 0.04 0.04 0.03 0.01 0.01 H 0.00 0.01 0.07 0.01 0.03s 0.00 0.02 0.01 0.03 0.05s 0.02 H 0.00 OH 0.06 0.03 0.03s 0.00 0.01 0.01 β-caryophyllène β-élémène terpinèn-4-ol 0.03 0.00 0.06 0.01s 0.00 H 0.01 0.05 0.01 0.02 0.04 0.02 0.02 0.05 0.02 0.00 0.04 0.02 0.03 0.02 0.02 0.04 0.02s 0.05 0.02s 0.01 0.01 0.03 0.07 0.03 0.01 0.01 0.06 0.05 0.01 HO 0.05 0.02 0.02 0.0 0.04 0.01s H 0.01S 0.01 0.01s germacrène D bicyclogermacrène spathulénol 0.04

Figure 38: Structures des composés identifiés dans les feuilles de P. terebinthus L. par RMN 13C . Les molécules sont données dans l’ordre du tableau 19. Les variations de déplacements chimiques par rapport aux valeurs de référence sont reportées à côté des carbones auxquelles elles correspondent. Les superpositions sont signalées par des s.

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III-4- Analyse de divers échantillons d’huile essentielles de P. terebinthus par CPG, RMN 13C ET CPG-SM Nous avons considéré ici, les échantillons 4 et 5 prélevés à l’USTHB et l’INA respectivement. Ces échantillons sont constitués des feuilles et des fruits du P. terebinthus. Les essences obtenues ont toutes été identifiées à plus de 94% de leur composition totale les composés identifiés, leurs indices de rétention donnés sur colonne apolaire (BP-1) et polaire (BP-20) et leurs pourcentages relatifs sont donnés dans le tableau 20. Ces huiles présentent toutes des profils oléfiniques (70.0-91.8%) mais différent qualitativement les unes des autres (figure 39). En effet l’échantillon 4, dont plus de 65 composés sont identifiés et 51communs entre feuilles et fruits, est dominé par l’α-phéllandrène (33.5% (F4), 45.6% (Fr4)) et l’α-pinène (14.2% (F4), 24.5% (Fr4)). Nous notons par ailleurs la présence du p-cymène (8.0% (F4), 4.2% (Fr4)) et du limonène (5.5% (F4), 6.6% (Fr4)). Les feuilles se caractérisent des fruits par la présence du bicyclogermacrène à 7.8% alors que sa teneur dans les fruits ne dépasse pas 0.3%. Le β-élémene qui est à 3.3% dans les feuilles est totalement absent dans les fruits. Les sesquiterpènes ne représentent d’ailleurs que 2.6% dans l’échantillon Fr4 contre 23.9% dans F4.

F : feuille, Fr fruit, 4 : USTHB, 5 : INA

Figure 39 : Variation du pourcentage des familles chimiques dans les huiles essentielles de P. terebinthus.

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Tableau 20 : Composition des huiles essentielles des feuilles et des fruits du P. terebinthus. Composé identifié Ia Ip F4 Fr4 F5 Fr5 tricyclène 920 1022 tr tr tr 1.5 α-thujène 923 1023 1.3 0.4 1.0 0.1 α-pinène 932 1026 14.2 24.5 15.3 30.6 camphène 944 1070 0.2 0.1 4.7 5.7 sabinène 965 1124 0.4 0.2 tr 1.1 β-pinène 972 1113 0.6 0.7 2.5 7.9 myrcène 980 1162 1.6 2.0 12.2 3.4 α-phéllandrène 997 1167 33.5 45.6 0.1 0.3 δ-3-carène 1004 1150 0.2 0.1 0.7 0.9 α-terpinène 1009 1183 2.3 0.4 - 0.2 p-cymène 1011 1272 8.0 4.2 0.9 0.3 limonène* 1021 1203 5.5 6.6 1.5 2.2 β-phéllandrène* 1021 1213 2.8 3.7 0.2 9.8 (Z)-β-ocimène 1024 1234 0.1 tr 13.1 16.2 (E)-β-ocimène 1036 1246 0.1 tr 2.3 3.5 γ-terpinène 1048 1250 1.7 0.3 - 0.2 3-nonanone 1060 1356 - - 0.3 para-cyménène 1073 1435 0.1 0.1 0.3 0.1 fenchone 1075 1401 - - 0.5 - terpinolène 1078 1284 1.5 1.8 1.0 4.8 linalool 1082 1543 tr tr 0.8 0.1 Isopentyl isovalerate 1088 1295 - - 0.2 - fenchol 1098 1581 - tr 0.2 0.1 α-campholénal 1104 1480 - - 0.1 - cis -p-menth-2-en-1-ol 1106 1623 0.2 0.5 - tr allo-ocimène 1118 1372 - - 0.5 0.5 camphre 1121 1517 - 0.2 - - trans-p-menth-2-en-1-ol 1122 1625 0.1 0.4 0.4 0.1 trans-pinocarvéol 1124 1650 - 0.1 0.2 0.1 Trans verbénol 1127 1575 - - 0.1 - camphène hydrate 1132 1596 - 0.1 0.1 tr isobornéol 1143 1668 0.1 0.5 - Tr bornéol 1148 1701 0.1 0.3 0.1 0.2 cryptone 1159 1661 tr 0.2 0.3 0.2 terpinèn-4-ol 1162 1600 0.6 0.4 0.2 0.4 α-terpinéol 1172 1697 0.3 0.4 0.7 0.6 verbénone 1179 1707 - 0.2 - - p-mentha1(7)2-dien-6-ol 1182 1805 0.1 0.7 0.1 cis-pipéritol 1184 1686 - - 0.2 - trans-pipéritol 1191 1761 - 0.2 - 0.1 Nérol* 1208 1790 - 0.5 - - Citronéllol* 1208 1764 0.3 hexyl-2-methylbutyrate 1227 1420 - 0.2 0.2 - citral 1237 1731 0.1 tr 0.1 périllaldéhyde 1244 1777 - - 0.3 - décanol 1254 1758 - - - 0.4 thymol 1261 2180 - 0.1 0.3 bornyl acétate 1267 1579 tr 0.1 2.8 3.8 2-undécanone 1275 1659 0.2 0.4 - Terpinyl acétate 1331 1687 0.5 0.3 - 0.1 α−cubébène 1353 1452 - - 0.1 0.2 α-longipinène 1359 1475 - 0.1 - 0.4 isolédène 1374 1462 - 0.1 - - α-copaène 1377 1491 0.1 - 0.4 - β−cubébène 1381 1560 0.2 tr - - β-bourbonène 1384 1515 - tr - - β-élémène 1388 1588 3.3 - tr α-gurjunène 1411 1524 tr -0.4 -

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Composé identifié Ia Ip F4 Fr4 F5 Fr5 β-caryophyllène 1420 1596 0.9 0.1 0.1 - β-gurjunène 1428 1591 - - 0.3 - α-guaiène 1436 1593 - - 0.3 - aromadendrène 1439 1603 0.2 tr 5.1 tr α-humulène 1452 1669 0.2 0.1 0.5 allo-aromadendrène 1459 1644 0.2 tr 0.9 - γ-muurolène 1471 1688 0.1 - 0.2 - germacrène D 1477 1710 1.5 0.1 - 0.1 epi-bicyclo sesquiphéllandrène 1483 1727 0.2 - 0.1 - β-selinène 1487 1712 tr -0.5 - Lédène 1492 1694 - - 3.4 - Bicyclogermacrène* 1492 1733 7.8 0.3 - 0.2 α-muurolène* 1592 1722 0.2 0.3 0.3 0.1 γ-cadinène 1507 1757 tr tr 0.1 δ-cadinène 1515 1757 0.1 tr 0.1 0.2 α-calacorène 1530 1891 - - 0.1 - α-cadinène 1532 1744 - - 0.1 tr germacrène B 1542 - - 1.0 - epi trans sesquisabinène hydrate 7 1543 1996 - - 0.5 - E nérolidol 1545 2038 - - 0.4 - cis-3-hexenyl benzoate 1556 - - 0.2 - palustrol 1558 1916 0.2 - 0.6 - spathulénol 1567 2115 3.5 0.8 2.7 0.3 gléenol 1568 2028 - - 0.3 - caryophyllène oxide 1571 1986 0.1 tr 0.4 - globulol 1575 2075 1.6 0.2 4.7 - viridiflorol 1583 2083 0.9 0.1 1.2 - Salvia-4(14)-en-1-one 1585 0.4 - - - lédol 1591 2030 0.2 - 0.6 - humulène epoxide II 1595 2089 0.1 - 0.4 - eudesmol 7-epi 1611 2105 0.4 tr 0.7 - 1-épi-cubenol 1616 2059 tr 0.1 - - γ-eudesmol 1619 2167 tr tr - - ermophilèn-11-ol Δ 9,10 1621 2193 0.2 0.1 0.3 - τ-muurolol 1627 2188 0.1 tr 0.1 - α-muurolol 1629 2173 tr -- - τ-cadinol 1632 2173 0.1 tr - - α-cadinol 1639 2235 0.5 0.1 0.1 - β-eudesmol 1641 2230 - 0.1 tr - α-bisabolol 1667 2214 - - 0.1 - juniper camphor 1680 2300 - - 0.1 - 2E,6E farnesol 1700 2353 - - 2.3 - benzyl benzoate 1725 2630 - - 0.1 - Acide hexadécanoique 1950 2930 - - - 0.3 Monoterpènes oléfiniques (%) 74,0 90,7 56,1 88,8 Monoterpènes oxygénés(%) 2.3 5,3 8.2 6,9 Sesquiterpènes oléfiniques(%) 15,0 1,1 14 1,2 Sesquiterpènes oxygénés(%) 8,3 1,5 15,6 0,3 autres(%) - - 0.3 0.3 Total identifié par RMN(%) 93.5 90.8 79.0 91.0 Total identifié (%) 99.6 98,6 94,1 97,5 L’ordre d’élution et les pourcentages sont donnés sur colonne apolaire BP-1.. I : indices de rétention sur colonnes apolaire (Ia) et polaire BP-20(Ip). F4 et Fr4 : feuilles et fruits USTHB, F5 et Fr5 : feuilles et fruits INA. Les valeurs en gras : composés identifiés par RMN.* teneurs sur BP-20.

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75 composés ont été identifiés dans les feuilles de l’échantillon 5 (F5) et seulement 47 dans l’essence des fruits (Fr5). Ces deux essences sont prédominé par l’α-pinène (15.3% F5 et 30.6% Fr5), le deuxième composé est le (Z)-β-ocimène avec des teneurs de 13.1% et 16.2% pour F5 et Fr5 respectivement. Le bornyl acétate est le monoterpène oxygéné le plus important avec 2.8% dans F5 et 3.8% dans Fr5. Ce composé trouvé à 21.5% dans les fruits du P. atlantica du Maroc [198] et à plus de 28 % dans un échantillon de P. lentiscus du Portugal s’est révélé très efficace contre des cellules cancéreuses [21] Nous retrouvons également dans F5 le myrcène (12.2%), le camphène (4.7%) et à des pourcentages plus faible le (E)-β-ocimène (2.3%) et le β-pinène (2.5%) et le limonène (1.5%). Les sesquiterpènes les plus dominants sont l’aromadendrène (5.0%) et le lédène (3.4%). Ce composé, qui au départ a été identifié tout naturellement comme étant le bicyclogermacrène car coélué avec lui et déjà identifié dans d’autres échantillons, a été finalement confirmé par RMN-13C. Le globulol (4.7%), le spathulénol (3.0%), le 2E,6E farnésol (2.0%) et le viridiflorol (1.2%) constituent en grande partie la fraction oxygénée de F2. c’est d’ailleurs cette partie qui différencie F5 de Fr5. en effet les sesquiterpènes oxygénés comptent pour 16.3% dans F5 contre seulement 0.3% dans Fr5. Si nous devons caractériser chaque échantillon en fonction du site de prélèvement l’α- phéllandrène et le (Z)-β-ocimène seraient les éléments discriminants. Le premier dont la teneur dépasse les 33% dans les huiles essentielles de l’échantillon 4 est détecté à moins de 0.3% dans celles de 5, tandis que le second dont le pourcentage est à plus de 13% dans les essences de l’échantillon 5 est presque à l’état de trace dans celles de 4. Cette différence dans la composition chimique pourrait être, en partie, dûe à l’âge des arbres sur lesquels ont été prélevés les échantillons. En effet, l’arbre se trouvant dans le jardin botanique de l’INA, aurait une cinquantaine d’années tandis que celui de l’USTHB ne dépasse pas les dix ans d’âge. Nous avons voulu prélever d’autres échantillons sur des arbres spontanés, nous nous sommes adresser pour cela à l’office des forets. Cependant, aucune donnée réelle sur l’aire de répartition de cette espèce ne nous a été fournie.

III-5- Variation de la composition en fonction du temps Pour mettre en évidence une éventuelle variation de la composition chimique de l’huile essentielle de cette espèce en fonction du temps, nous avons fait un suivi, pendant trois ans, sur la partie aérienne prélevée en période de floraison (juin 2004,2005, 2006) –

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échantillons F1-F3-. Afin de limiter le plus possible les causes de variation nous avons toujours considéré le même pied. Les trois échantillons ont été traités selon la même procédure décrite précédemment. Leurs compositions chimiques sont reportées dans le tableau 21. Au total 85 composés ont été identifiés dans l’ensemble des trois échantillons, parmi lesquels 30 (ayant une teneur supérieure à 0,5%) ont été identifiés par RMN-13C et représentent en moyenne 80% de la composition totale de chaque essence. Qualitativement les compositions chimiques des trois huiles essentielles sont très proches.

Tableau 21: variation de la composition chimique de l’huile essentielle du P. terebinthus. Composé identifié Ia Ip F1 F2 F3 tricyclène 920 1022 0.1 tr - α-thujène 923 1023 0.6 0.4 0.9 α-pinène 932 1026 6.6 4.5 12.1 camphène 944 1070 0.3 0.1 0.4 sabinène 965 1124 0.3 0.3 0.5 β-pinène 972 1113 0.4 0.2 0.7 myrcène 980 1162 0.8 0.8 1.4 α-phéllandrène 997 1167 6.9 10.3 10.1 δ-3-carène 1004 1150 0.1 0.1 0.2 α-terpinène 1009 1183 0.3 0.3 0.4 p-cymène 1011 1272 10.3 7.9 11.9 limonène* 1021 1203 3.6 3.8 5.8 β-phéllandrène* 1021 1213 1.3 1.4 2.4 (E)-β-ocimène 1036 1246 tr -- γ-terpinène 1048 1250 0.2 0.3 0.4 para-cyménène 1073 1435 0.1 0.1 0.1 terpinolène 1078 1284 0.4 0.5 0.7 linalool 1082 1543 0.1 0.1 0.1 fenchol 1098 1581 0.1 - - α-campholénal 1104 1480 tr tr - cis -p-menth-2-en-1-ol 1106 1623 tr tr 0.1 trans-p-menth-2-en-1-ol 1122 1562 Tr tr 0.1 trans-pinocarvéol 1124 1650 - tr 0.1 camphène hydrate 1132 1596 - - 0.2 pinocarvone 1137 1558 - - 0.2 isobornéol 1143 1668 0.1 tr 0.9 borneol 1148 1701 0.1 tr 0.3 cryptone 1159 1661 0.1 0.1 0.1 terpinèn-4-ol 1162 1600 0.1 0.1 0.2 α-terpinéol 1172 1697 0.1 tr 0.1 verbénone 1179 1707 0.1 0.1 para mentha1(7)2-dien-6-ol 1182 1805 -0.9 trans-piperitol 1191 1761 0.1 0.1 0.2 methylchavicol 1198 0.2 0.2 0.3 1,3cyclohexadiene 2- 1214 1560 0.6 0.7 1.6 citral 1237 1731 0.1 0.1 0.4 thymol 1261 2180 0.2 0.2 0.6 bornyl acetate 1267 1579 0.6 0.2 0.4 2-undécanone 1271 1595 0.5 veloutone 1286 1.1 1.1 1.0

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Composé identifié Ia Ip F1 F2 F3 2-undécanol 1288 1717 0.7 0.7 Terpinyl acétate 1331 1687 0.6 1.1 0.6 α-cubébène 1353 1452 0.2 0.2 α-longipinène 1359 1475 0.6 0.6 0.6 α-yanglène 1373 1472 0.3 0.3 0.5 α-copaène 1377 1491 0.3 0.3 0.3 α-funébrène 1381 1500 - 1.0 0.6 b-bourbonène 1384 1515 0.7 0.1 0.4 β-élémène 1388 1588 6.9 10.7 6.2 α-gurjunène 1411 1524 0.2 0.1 β-caryophyllène 1420 1596 4.8 2.8 1.8 β-gurjunène 1428 1591 0.2 0.1 aromadendrène 1439 1603 0.5 0.3 0.1 α-humulène 1452 1669 1.0 0.6 0.4 allo-aromadendrène 1459 1644 0.8 0.9 0.5 γ-muurolène 1471 1688 0.6 0.2 0.1 γ-gurjunène 1475 1659 0.1 germacrène D 1477 1710 2.7 4.9 3.1 epi-bicyclo sesquiphellandrène 1483 1727 0.4 0.4 0.2 β-selinène 1487 1712 0.2 0.2 0.1 Bicyclogermacrène* 1492 1733 8.7 18.1 9.5 α-muurolène* 1592 1722 0.8 0.2 0.2 β-bisabolène 1499 1720 0.1 - γ-cadinène 1507 1757 0.4 0.1 0.1 γ-bisabolène 1509 0.2 δ-cadinène 1515 1757 1.1 0.4 0.2 α-calacorène 1530 1891 0.1 - α-cadinène 1532 1744 Tr - élémol 1539 2080 0.2 - - épi-globulol 1558 2011 0.2 0.2 0.5 spathulénol 1567 2115 13.0 9.6 6.1 caryophylléne oxide 1571 1986 1.3 0.4 0.4 globulol 1575 2075 1.6 1.4 1.1 viridiflorol 1583 2083 0.9 0.9 0.7 lédol 1591 2115 0.5 0.4 0.6 humulène époxide II 1595 2089 0.5 0.2 0.3 7-épi eudesmol 1611 2105 0.4 0.3 0.4 1-épi-cubénol 1616 2059 0.1 0.1 γ-eudesmol 1619 2167 0.2 0.1 0.1 ermophilen-11-ol Δ 9,10 1621 2193 1.4 1.1 2.0 τ-muurolol 1627 2188 0.9 0.3 0.4 α-muurolol 1629 2173 0.2 0.1 τ-cadinol 1632 2173 0.4 0.3 0.1 α-cadinol 1639 2235 1.7 1.2 0.5 β-eudesmol 1641 2280 0.4 0.1 Monoterpènes oléfiniques (%) 32,3 31 48 Monoterpènes oxygénés (%) 5,5 4,8 8,4 Sesquiterpènes oléfiniques (%) 31,9 42,5 24,9 Sesquiterpènes oxygénés (%) 23,9 16,6 13,3 Total identifié par RMN (%) 80.6 81.5 78.4 Total identifié (%) 93,6 94,9 94,6 L’ordre d’élution et les pourcentages sont donnés sur colonne apolaire BP-1.. I : indices de rétention sur colonnes apolaire (Ia) et polaire BP-20(Ip). Les valeurs en gras: composés identifiés par RMN.* teneurs sur BP-20.

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Elles sont caractérisées par la prédominance des mêmes composés. Les oléfines majoritaires sont le p-cymène (7.9-11.9-%), l’α-phéllandrène (6.9-10.3%) l’α-pinène (4.5- 12.1%), le β-élémène (6.2-10.7%) et le bicyclogermacrène (8.7-18.1%). Le composé oxygéné le plus important est le spathulénol. Sa teneur varie de 6.1 à 13.0%. A côté de ces composés majoritaires, nous retrouvons à des concentrations appréciables, le limonène (3.6-5.8%), le β- phéllandrène (1.3-2.4%), le β-caryophyllène (1.8-4.8%), le germacrène D (2.7-4.9%), le globulol (1.4-1.6%) et l’érémophylen-11-ol (1.1-2.0%). Nous constatons qu’il n’y a pas de variation majeure dans la composition chimique de l’huile essentielle du P. terebinthus, quand l’échantillon est prélevé à la même période de l’année. Cependant, les concentrations de certains composés majoritaires varient en fonction de la période de floraison ou de fructification de l’arbre. En effet on peut voir, par exemple, que l’α-phéllandrène passe d’environ 10% (F1-F3 (juin)) à 33.8% dans l’échantillon F4 (septembre). On observe également une diminution de la teneur du spathulénol jusqu’à 3.5% et celle de l’ermophilen-11-ol Δ 9,10 à 0.2%.

III-6- Comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature Il nous a semblé opportun de comparer les composés majoritaires et certains composés ayant des teneurs appréciables rapportés dans les différentes huiles essentielles de P. térébintus avec ceux que nous avons identifiés dans cette étude. Ces composés sont reportés dans le tableau 22. L’examen de ce tableau fait apparaître des variations importantes au niveau des teneurs des composés majoritaires des différents échantillons d’huiles essentielles de diverses origines. En effet, on observe pour l’essence des feuilles, par exemple, différents composés majoritaires : α-pinène [45,203], p-cymène [202], (E)-β-ocimène [201] et terpinèn-4-ol [20]. Excepté les échantillons à α-pinène, ces huiles sont très différentes des nôtres. On note également des différences importantes au niveau de la teneur des composés majoritaires des fruits : limonène et β-pinène [202], les deux isomères de l’ocimène et sabinène [45], α- et β-pinène [203] sont majoritaires dans les essences étrangères, tandis que l’α-pinène et l’α-phéllandrène (Fr4) ou l’α-pinène et le (Z)-β-ocimène (Fr5) sont les composés les plus importants dans nos essences de fruits. Nous remarquons par ailleurs que :

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Tableau 22: Composés majoritaires identifiés dans les huiles de diverses origines

Composé [201] [202] (F)- (Fr) [20] [45] [203] (F)- (Fr) [204] α-pinène 7.9 5.3-5.3 1.7 63.1-6.5 16.4-54.8 39.6 sabinène tr - - 1.5-24.1 - 6.5 β-pinène 1.5 1.4-22.5 2.5 1.5-3.6 13.5-22.2 19.5 myrcène 0.2 0.0-1.9 tr 13.3-1.2 0.3-2.1 0.3 α-phéllandrène tr 0.0-11.4 1.1 1.1-0.0 1.0-0.2 - p-cymène 0.1 27.3-0.0 tr tr-0.5 0.5-0.0 2 limonène 0.7 3.0-32.8 4.8 4.3-4.1 - 2.3 β-phéllandrène - - 0.4-0.0 8.3-4.9 - (Z)-ocimène 1.1 - - 2.7-13.0 - tr (E)-ocimène 15.0 0.0-1.8 - 0.5-33.8 - tr γ-terpinène tr tr-0.5 9.3 0.4-0.7 - 1.9 terpinoléne 0.2 tr-7.0 tr tr 1.3-1.7 0.7 trans verbénol - 8.8-0.0 tr - 5.0-0.2 0.9 terpinèn-4-ol - 6.0-0.7 33.7 1.1-1.5 1.2-0.5 3.8 α-terpinéol 0.5 0.0-1.6 8.1 0.9-0.0 8.0-1.9 1.6 verbénone - 5.7-0.0 0.9 - 1.8- 0.3 bornyl acétate - 6.6-tr 0.5 0.4-0.5 0.5-4.6 0.9 β-caryophyllène 0.1 tr-1.6 3.2 2.9-1.3 - tr germacrène D - tr-4.6 2.0 0.5-3.0 0.2-2.6 - δ-cadinène 0.8 0.0-1.2 - 0.5-0.6 0.3-0.3 tr spathulénol - - 4.6 -- - - Oxidede caryophyllène - 7.1-tr 0.8 0.2- -

- le myrcene est présent en très faible proportion dans les huiles de Sardaigne [203] et d’Espagne [201] et non reporté dans celle Turquie [20,168,202]. Par contre c’est le deuxième composé majoritaire dans les huiles essentielles de Jordanie [45] et le troisième dans F5 (12.2%). - Le (E)-β-ocimène qui représente 15.0% de la composition d’un échantillon d’Espagne [201], n’est présent qu’en très faible proportion dans l’huile de Jordanie [45] et absent dans celles des huiles essentielles des autres régions. Dans nos essences sa teneur varie de traces à 3.5% (tableau 4). - le spathulénol qui représente 4.6% d’un échantillon de Turquie [168], est absent dans toutes les autres huiles. Ce composé est présent dans toutes nos huiles et son pourcentage peut aller jusqu’à 13.0% (tableau 5). -le terpinèn-4-ol, composé majoritaire d’un échantillon de Turkie (33.7%) est très faiblement présents dans nos huiles [20].

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- le bicyclogermacrène dont la teneur peut atteindre les 18% (F2, tableau 5) n’est pas cité dans les essences étrangères. Toutes les huiles essentielles de P. terebinthus sont caractérisées par une forte teneur en monoterpènes avec la dominance des oléfines, et quelquefois par une teneur importante en terpinén-4-ol. Cependant, Une étude comparative ne se limite pas seulement aux composés majoritaires, et que les composés minoritaires contribuent aussi aux propriétés physico- chimiques et biologiques des huiles essentielles, la composition globale des huiles de P. terebinthus que nous avons analysées se distingue des autres. En effet, en plus de la différence observée sur les proportions des composés majoritaires, il y a une différence importante sur le plan qualitatif lié à l’identification dans nos huiles de quelques composés, jamais identifiés auparavant dans les huiles de cette espèce. Nous signalons pour la première fois la présence du bicyclogermacrène, du viridiflorol, ou encore du para mentha1(7)2-dien-6-ol et de l‘ermophilen-11-ol Δ 9,10 dans l’huile essentielle de cette espèce. Notre analyse a permis de mieux caractériser l’huile essentielle des feuilles et des fruits du P. terebinthus d’Algérie, de montrer les similarités surtout pour les composés majoritaires et les différences par l’identification de composés minoritaires qui font d’elle, une espèce quelque peu différente des autres.

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Chapitre III : Caractérisation des huiles essentielles du Pistacia terebinthus Linné

III-1- Etude bibliographique

109 le bornyl acétate (6.0%), l’α-cubebène (5.9%) et le cubébol (5.4%), sont les composés les plus dominants parmi les 61 identifiés dans l’huile essentielle des rameaux.

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Tableau 18 : rendements en huile essentielle des différents échantillons: Echantillon F1 F2 F3 F4 Fr4 F5 Fr5

Rendement % 0.09 0.085 0.1 0.056 0.24 0.09 0.41

F :feuille, Fr : fruit, 1-4 : site de l’USTHB, 5 : INA

Tous nos échantillons ont été soumis à la même procédure d’identification; CPG, RMN13C et CPG-SM. Nous présenterons d’abord une analyse par CPG et RMN.

III-3- Analyse par CPG et par RMN-13C de l’échantillon F4

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Figure 37 : spectre RMN 13C de l’huile essentielle du P. terebinthus ; 1-10 : les dix pics du composé

majoritaire l’α-phéllandrène.

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F : feuille, Fr fruit, 4 : USTHB, 5 : INA

Figure 39 : Variation du pourcentage des familles chimiques dans les huiles essentielles de P. terebinthus.

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Tableau 22: Composés majoritaires identifiés dans les huiles de diverses origines

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Chapitre IV : Caractérisation des huiles végétales de baies de lentisque par la RMN du carbone-13

IV-I- Introduction Depuis de nombreuses années, les huiles végétales, appelées aussi huiles fixes par opposition aux huiles essentielles, représentent un enjeu économique important car elles entrent dans la composition de divers produits de large consommation. Issues de familles botaniques diverses, ces huiles ont des applications très variées, que ce soit dans les domaines alimentaire, médicinal ou énergétique. En effet, l’utilisation d’huiles végétales, comestibles ou pas, à des fins énergétiques est actuellement très répandue [205]. L’intérêt d’utiliser la biomasse comme vecteur énergétique réside avant tout dans son impact positif sur l’environnement (réduction des émissions atmosphériques de soufre, de composés aromatiques, d’hydrocarbures imbrûlés…) [206].

Les constituants fortement majoritaires (90 à 99 %) des huiles végétales sont les triacylglycérols, triesters d'acides gras et du glycérol, qui sont des substances de réserve et des sources d’énergie cellulaire. [1]. L’autre partie insaponifiable (2-5%), est composée d’un large panel de composés souvent de natures différentes. On trouve entre autres des stérols (β- sitostérol, campestérol…), des alcools triterpéniques, des tocophérols, des composés hydrocarbonés tel le squalène [207,208] des composés phénoliques. Ces composés, malgré leur faible quantité, peuvent jouer plusieurs rôles. Certains, comme les tocophérols et les composés phénoliques jouent un rôle d’antioxydant pour l’huile végétale [209]. D’autres, comme le squalène, peuvent avoir une fonction de précurseur biologique, dans la biosynthèse de certains stérols [210]. On peut également trouver des glycérides partiels mono- et diglycérides (MG, DG), des acides gras libres (AGL), des aldéhydes et des alcools à chaînes grasses et des phospholipides [1]

C’est dans cette optique que nous nous sommes intéressés à l’analyse de la partie saponifiable de l’huile végétale de lentisque, vendue dans le commerce comme étant une huile médicinale qui guérirait les tissus blessés et les brulures de la peau. Cependant aucune indication sur l’origine de la matière première n’est mentionnée. Nous établissons après quelques expériences au laboratoire que l’huile provient des fruits. En effet, les feuilles emmagasinent rarement des lipides [1].

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Les triacylglycérols issus des végétaux sont des triesters du glycérol et d’acides carboxyliques aliphatiques (acides gras), ayant normalement un nombre pair d’atomes de carbone. La grande majorité des acides gras végétaux se répartit en deux groupes : des acides gras saturés ex : C16 :0, C18 :0, et celui de leurs homologues insaturés ex : C16 :n, C18 :n, où n représente le nombre d’insaturations.

Traditionnellement la détermination de la composition en chaînes grasses des huiles végétales, comestibles ou à usage énergétique, est réalisée en deux étapes : une réaction de transestérification des glycérides suivie de l’analyse par CPG des esters méthyliques [210,211]. La CPG est la méthode de choix pour l’analyse des esters méthyliques d’acides gras, mais ne convient pas à la séparation de glycérides partiels. Aussi, depuis plusieurs années se sont développées des méthodes d’analyse des huiles végétales faisant intervenir la CLHP [212,213] mais également la RMN du carbone 13 [212-214].

Au vu de nos connaissances acquises dans l’analyse des mélanges complexes naturels par RMN du 13C, nous avons utilisé cette technique pour caractériser des échantillons d’huiles végétales de lentisque sans transformation chimique préalable. Cette technique donne accès aux différents types de chaînes grasses portées par le glycérol, leur degré d’insaturation, la stéréochimie de ces insaturations, leur position sur le glycérol [214-218] et à la classe lipidique [219]. Dans une étude sur les huiles de graines de diverses espèces spontanées du sud-est méditerranéen, la composition en chaînes grasses de deux extraits de lentisque, obtenus à partir des baies broyées et extraites à l’hexane, a été décrite [220,221]. Cette composition est dominée par les chaînes oléique (C18:1 Δ9 Z, 52,6 et 54,8%), palmitique (C16:0, 20,3 et 24,5%) et linoléique (C18:2 Δ9,12 ZZ, 13,9 et 21,5%). On trouve en proportions moins importantes les chaînes grasses linolénique (C18:3 Δ9,12,15 ZZZ, 0,3 et 2,0%), stéarique (C18:0, traces et 1,8%), palmitoléique (C16:1 Δ9 Z, traces et 1,2%), vaccénique (C18:1 Δ11 Z, traces et 0,8%), arachidique (C20:0, traces et 0,3%) et gondoïque (C20:1 Δ11 Z, traces et 0,7%).

IV-2- Echantillonnage et méthode d’extraction Nous disposons pour cette analyse de trois échantillons d’huile végétale de lentisque. Deux huiles proviennent du commerce et sont (d’après les indications sur les flacons) de deux origine différentes : la première est de la région d’El-Mila et a l’odeur caractéristique des

125 fruits de lentisque tandis que la seconde est fabriquée dans une région du sud du pays (Ghardaia) et n’a pas cette odeur caractéristique boisée du lentisque. Le troisième échantillon a été extrait au laboratoire.

L’huile expérimentale a été obtenue par extraction de 150 g de fruits de lentisque, secs et broyés, par soxhlet dans l’hexane. L’extraction a duré deux heures, temps nécessaire à l’épuisement de toute la matière végétale. Le rendement de l’extrait brut a été de 24%, il est de couleur verdâtre et a une forte odeur boisée. Afin de purifier l’huile, nous la faisons passer sur du charbon actif. L’extrait cette fois-ci est de couleur jaune limpide et n’a pas perdu son odeur. 50 mg de chaque échantillon sont directement analysés par RMN en utilisant les conditions standards (partie expérimental). Afin de confirmer l’identification et la quantification de nos acides gras, nous les avons analysés par CPG. Les esters méthyliques sont préparés suivant la méthode de Bligh et Dyer [222]. La composition en acides gras des lipides totaux a été déterminée sur une phase stationnaire de type DB225.

IV-3- Analyse par RMN 13C et par CPG des huiles fixes de lentisque. Les spectres RMN des huiles brutes sans séparation préalable sont représentés sur les figures 40-42. Afin d’attribuer les déplacements chimiques à chaque type de carbone nous nous sommes référées aux données de la littérature sur la base d’étalons de mono-, di- et triacylglycérols [216,223-224].

13 Figure 40 : spectre RMN C de l’huile de lentisque d’El-Mila 126

2 10 200 19 0 18 0 170 1 60 150 14 0 1 30 1 20 1 10 1 00 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 p pm Figure 41 : spectre RMN 13C de l’huile de lentisque de Ghardaia

210 2 00 190 180 170 160 1 50 1 40 130 120 110 100 9 0 8 0 7 0 6 0 50 40 3 0 2 0 1 0 0 -10 p pm Figure 42 : spectre RMN 13C de l’huile de lentisque extraite au soxhlet.

IV-3-1- Evaluation de la classe lipidique et des acides gras libres. La détermination de la classe lipidique (mono-, di- et triglycérides, MG, DG et TG respectivement) peut être faite par l’observation des raies de résonnance des carbones glycériques (figure 43), dont les données spectrales sont reportées sur le tableau 23. La quantification des différentes familles de composés (MG, DG et TG) a été réalisée en utilisant l’intensité des signaux des carbones glycériques (50-75 ppm) comme cela a été validé et reporté dans la littérature [226,227]. En effet, dans ses divers travaux sur l’huile de palme, Ng a montré que les carbones glycériques Cα/Cβ possèdent des valeurs de temps de relaxation (T1) comparables (inférieures à 1s) et un effet NOE identique et maximum [219].

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Ces deux conditions doivent permettre de donner une quantification correcte des MG, DG et TG sans mettre en œuvre une séquence de RMN trop longue [214].

Tableau 23 : déplacements chimiques et intensité des signaux des carbones glycériques et aliphatique C-3 dans les spectres des trois huiles végétales. δ (ppm) δ (ppm) Ι δ (ppm) Ι δ (ppm) Ι famille ref H1 H2 Hexp Carbones glycériques 72.13 DG 1,2 β 72.13 0.79 - 70.29 MG β 70.30 0.42 - 68.89 TG β 68.91 21.63 68.91 29.96 68.90 20.94 68.37 DG1,3 β 68.37 2.2 68.40 0.54 65.18 MG γ 65.16 0.43 - 65.05 DG 1,3 α 65.05 3.47 65.06 0.70 65.05 1.45 63.36 MG α 63.34 0.43 - 62.12 TG α/ DG 1,2α 62.12 31.88 62.11 45.01 62.12 30.48 61.54 DG 1,2 γ 61.51 0.84 - Carbone aliphatique C-3 24.90 TG C-3 β 24.89 40.08 24.89 41.33 24.89 31.81 24.87 TG C-3 α 24.86 32.48 24.86 56.07 24.86 33.94 24.75 AGL 24.71 8.3 24.68 0.47 24.72 3.59 H1 : huile El-Mila, H2 : huile Ghardaia, Hexp: huile extraite au laboratoire

Par ailleurs, l’examen des spectres de RMN du 13C des trois échantillons d’huile, nous informent de la présence d’acides gras libres observables par le déplacement chimique caractéristique de la fonction acide à 179,15 ppm (H1). La présence d’AGL est confirmée par la présence du signal à 24,74 ppm correspondant au méthylène en β du carbonyle alors que celui-ci résonne entre 24,86 et 24,94 ppm (positions α/β du glycérol) pour les esters glycériques.

Figure 43 : Spectre RMN de la région glycérique de l’huile 1 d’El-Mila. DG-1,2 DG-1,3 : diglycérides en position 1,2 et 1,3 ;MG-1 : monoglycéride en position 1 ; TG : 128 triglycérides ; Cα Cγ: et Cβ: répartition des chaînes respectivement sur les positions 1,3 et 2 du glycérol

Pour réaliser l’étude quantitative, des acides gras libres (AGL) par rapport aux MG, DG et TG, nous avons pris en compte l’intensité des signaux des carbones aliphatiques C-3 qui présentent un déplacement chimique dans les spectres de nos mélanges à 24.89 ppm (C- 3β) pour les MG, DG et TG et à environ 24,70 ppm pour les AGL. Nous reportons sur le tableau 24, la quantification des mono-, di-, et triglycérides contenus dans nos huiles ainsi que des acides gras libres. Pour l’huile 1 le calcul s’est fait en fonction de l’intensité des carbones glycériques en position β. nous retrouvons dans cette huile en plus des TG ultra-majoritaires, des MG (1.7%), des DG 1,2 (3.1%), des DG 1,3 (8.8%) et des acides gras libres avec une teneur assez importante (17.15%).

Tableau 24 : Evaluation de la classe lipidique par RMN du carbone-13 dans l’huile de lentisque à partir des intensités (I) des signaux des carbones glycériques et des carbones aliphatiques C-3a H1 H2 Hexp I % I % I % MG 0.79 1.7 - - DG (1,2) 0.42 3.1 DG (1.3) 2.2 8.8 0.70 1.5 0.54 3.7 TG 21.63 86.4 45.01 98.5 20.94 96.3 AGL 8.3 17.15 0.47 1.12 3.59 10.14 TG/DG/MG 40.08 82.84 41.33 98.87 31.81 89.86 % : pourcentage molaire, MG : monoglycérides, DG : diglycérides, TG : triglycérides.

En ce qui concerne l’huile 2, nous avons tenté de quantifier les deux classes lipidiques présentes, sur la base de l’intensité des carbones en α. Les monoglycérides et les diglycérides 1,2 ne sont pas identifiés tandis que les DG 1,3 sont très faiblement présents puisque le carbone en β n’apparaît pas sur le spectre. Les AGL représentent une infime partie de l’huile 2 qui semble différentes des deux autres. On note également l’absence des MG dans l’huile expérimentale, tandis que les DG (1,3) ont une teneur assez faible (3.7%). Les AGL représentent 10.14% de l’huile expérimentale, ce qui est inférieur à l’huile commerciale 1. Nous remarquons que pour les trois échantillons la proportion en DG 1,3 est proportionnelle au taux d’acidité libre. Nos résultats sont en accord avec le fait que la

129 présence des DG 1,2 est dû à une biosynthèse incomplète des TG, tandis que les DG1,3 proviennent de la lypolise des TG [210].

IV-3-2- Identification et quantification des chaines grasses Les chaînes polyinsaturées peuvent être différenciées à partir des déplacements chimiques des carbones éthyléniques. Plus intéressante est la possibilité d’accéder à la longueur de la chaîne des molécules saturées, monoinsaturées et polyinsaturées C16, C18, en combinant la comparaison des déplacements chimiques des carbones oléfiniques et des carbones aliphatiques terminaux (ω-1, ω-2 et ω-3) (figure 44).

Figure 44 : résonances caractéristiques de quelques triglycérides comportant des chaînes grasses monoinsaturéesa

31,81 14,12 ω−3 ω−1

H 2 C O C (CH 2 ) 5 (CH 2 ) 2 129,71 130,00 ω−2 O 22,70 HC O C R O

H 2 C O C R Tripalmitoléine (C16:1 Δ9 Z)3 avec R = C15H29 O

31,94 14,12

H C O C (C H ) (C H ) 2 2 5 129,71 130,00 2 4 22,70 O HC O C R O Trioléine (C18:1 Δ9 Ζ)3 avec R = C17H33 H 2 C O C R O

31,55 14,08

H 2C O C (CH2)5 130.01 128.09 127.92 130.22 22,60 O HC O C R O Trilinoléine (C18:1 Δ9,12 Ζ)3 avec R=C17H31 H 2C O C R O

Prenons le cas des chaînes palmitoléiques (C16:1 Δ9 Z) et oléique (C18:1 Δ9 Z), les signaux de leurs carbones oléfiniques sont superposés. Ceci peut s’expliquer par le fait que l’insaturation est séparée de la fonction ester par le même nombre de carbones méthyléniques (figure 44). Par contre, quand nous observons la zone de résonance des carbones aliphatiques ω-3 (31-32 ppm) des chaînes palmitoléique et oléique nous notons qu’il y a une différence de

130

déplacement chimique Δδ = 0,12 ppm. Celle-ci s’explique par la différence du nombre de méthylènes entre le carbone ω-3 et la double liaison dans chacune des chaînes.

Tableau 25: Déplacements chimiques (δ ppm) des carbones éthyléniques et aliphatiques observés dans les spectres de reférence et des huiles végétales de lentisque. δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm) δ (ppm) chaîne (s) position carbone Ref [223] H1 H2 HExp 131,95 C18:3 α/β C-16 130,22 C18:2/C18:3 α/β C-13/C-9 130.21 130.22 130.22 130.02 C16:1/ C18:1 α/β C-10 130.01 130.01 130.02 129.99. C18:2 α/β C-9 129.97 129.98 129.98 129.95 C18:1 ∆11 α/β C-12 129.93 129.88 129.93 129.86 C18:1 ∆11 α/β C-11 129.83 129.81 129.84 129,72 C16:1/C18:1 α C-9 129.71 129.72 129.72 129.70 C16:1/C18:1 β C-9 129.69 129.69 129.69 128,31 C18:3 α/β C-12 128.30 128.30 128,24 C18:3 α/β C-13 128.25 128,10 C18:2 β C-10 128.11 128.10 128.10 128.09 C18:2 α C-10 128.10 128.08 128.08 127,92 C18:2 α C-12 127.91 127.92 127.91 127.91 C18:2 β C-12 127.90 127.90 127,79 C18:3 α/β C-10 127.78 127.77 127.76 127,13 C18:3 α/β C-15 127.15 C16:0/C18:0 β C-2 34.28 34.28 34.21 C16:1/C18:1/C18:2 β C-2 34.21 34.20 34.15 C16:0/C18:0 α C-2 34.07 34.06 34.07 C16:1/C18:1/C18:2 α C-2 34.04 34.04 34.05 31,94 C16:0/C18:0 α/ β ω-3 31.9534 21 31.95 31.96 31.93 C18:1 α/β ω-3 31.93 31.93 31.94 31,81 C16:1 α/β ω-3 31.81 31.81 31.82 31,54 C18:2 α/β ω-3 31.55 31.55 31.55

25,65 C18:2/C18:3 α/β bis allylique 25.65 25.65 25.65 25,55 C18:3 α/β bis allylique 25.54 25.55 25.55 22,70 C16:0/C18:0C16:1/C18 α/β ω-2 22.71 22.71 22.71 :0/C18:1/C20:1/C22:1 22,59 C18:2 α/β ω-2 22.60 22.60 22.61 20,57 C18:3 α/β ω-2 14,28 C18:3 α/β ω-1 14.29 14.29 14.30 14,12 C16:1/C18:0/C18:1/C2 α/β ω-1 14.13 14.13 14.14 0:1/C22:1 14,08 C18:2 α/β ω-1 14.09 14.09 14.09

131

Sur la région des carbones éthyléniques (120-140 ppm) (figure 45), nous remarquons la présence de signaux à 129,94 et 129,84 ppm (d’égales intensités). Ceux-ci confirment la présence des chaînes grasses vaccénique (C18:1 Δ11 Z) et gondoïque (C20:1 Δ11 Z). Ces chaînes grasses peuvent être différenciées par les déplacements chimiques de leur carbone ω- 3 respectivement à 31,81 et 31,94 ppm [228,229].

Figure 45: spectre RMN de la région des carbones ethyléniques de l’huile d’El-Mila. L : C18 :2, O : C18 :1∆9, Po : C16 :1, V : C18 :1 ∆11 (vaccénique)

Sur le plan quantitatif, il a été démontré qu’on pouvait estimer correctement par RMN les proportions de l’ensemble des chaines saturées, monoinsaturés et polyinsaturées, selon la méthode décrite par Bonnet et renou [217,218] qui est basée sur la mesure des intégrales des signaux des carbones oléfiniques et des carbones aliphatiques ω-3. Pour notre part, nous avons appliqué la méthode validée par divers travaux sur des mélanges artificiels d’acides gras [223]. Les estimations sont faites à partir des intensités des signaux éthyléniques et aliphatiques ω-3. Nous n’avons pas calculé la proportion de la chaine palmitoleique (C16 :1) car aucun signal sur le spectre ne lui appartient en propre. A titre d’exemple nous détaillons le calcul des pourcentages molaires en acides gras de l’huile expérimentale :

Région éthylénique : 128.10 ppm (C18 :2 ∆9,12)= 83.92% = a 129.84ppm (C18 :1 ∆11)= 12.06% = 0.14a 127.76ppm (C18 :3 ∆9,12,15)= 4.02%= 0.048a

Région aliphatique : 31.55ppm (C18 :2 ∆9,12)= 19.57%= a 31.94ppm (C18 :1 ∆9) = 49.5% = 2.53a

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31.96ppm (C18:0 , C16 :0) =27.77% = 1.42a a(1+0.14+0.048+2.53+1.42) = 100 on obtient: (C18:2 ∆9,12)= a = 19.46%, (C18:1 ∆9) = 2.53a= 49.23%, (C18:0 , C16 :0) = 1.42a =27.63%, (C18:3 ∆9,12,15)=0.048a = 0.9%, (C18:1 ∆11)= 0.14a = 2.7%.

Parallèlement à ces résultats, nous avons effectué des analyses par CPG pour les trois échantillons afin d’évaluer notre méthode d’identification et de quantification par RMN 13C. Les résultats obtenus pour les trois échantillons sont décrit dans le tableau 25.

Tableau 25: Evaluation par RMN 13C et par CPG des proportions des chaines grasses identifiées dans les huiles de lentisque. Huile 1 Huile 2 Huile expérimentale RMN (%) CPG RMN CPG RMN CPG C16 :0 26.1 6.8 22 C18 :0 26.4 1.3 14.6 3.3 27.6 1.9 C20 :0 0.2 0.2 0.3 C18 :1 ∆9 48.90 46.20 31.9 32.2 49.2 53.1 C18 :1∆11 3.4 1.3 1.8 0.5 2.7 1.3 C16 :1∆9 2.6 0.1 2.1. C18 :2∆9,12 20.8 21.9 51.1 56.5 19.5 18.7 C18 :3∆9,12,15 0.4 0.5 0.6 0.3 0.9 0.6 Tot S 26.4 27.6 14.6 10.3 27.6 24.2 Tot M S 52.3 50.1 33.7 32.9 51.9 56.6 Tot P S 21.2 22.4 51.7 56.8 20.4 19.3 Tot S : total des chaines saturées, Tot M S : total des chaines monoinsaturées, Tot P S : total des chaines polyinsaturées.

L’examen du tableau (25) nous montre une bonne corrélation entre les valeurs trouvées par RMN et les valeurs obtenus par CPG. Cependant nous notons un écart important de la chaine vaccénique (C18:1 ∆11) en RMN par rapport aux valeurs estimés par CPG (1.8- 3.4-% vs 0.5-1.3). Cet écart observé est probablement du au fait qu’en RMN, cette valeur est surestimé et qu’au contraire elle est sous évaluée en CPG. Des variations importantes sont observées entre les différents échantillons. En effet l’échantillon commerciale 1 et l’huile extraite au laboratoire sont dominées par l’acide oléique C18:1 ∆9 (48.9 et 49.1%) puis viennent les acides gras saturées (26.4 et 24.2%) et les polyinsaturée (21.2 et 19.3% respectivement H1 et Hexp). Ces deux huiles semblent avoir les mêmes caractéristiques. L’huile commerciale provenant de Ghardaia est totalement différente dans la mesure où l’acide linoléique (C18:2) est majoritaire dans l’huile (51.1%). Nous avions noté au début de nos analyses que cette huile n’avait pas l’odeur caractéristique du lentisque.

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Etant donne que nous n’avons aucunes informations sur l’origine de cette huile nous ne pouvons donner d’explications quant à cette différence. La comparaison de nos résultats avec ceux publiés par Ucciani [220,221] confirme nos observations (tableau 26). L’huile commerciale 1 et l’huile expérimentale ont des compositions similaires à ceux de la littérature tandis que l’huile commerciale 2 est totalement différente.

Tableau 26: Proportions des chaînes grasses dans les huiles de baies de lentisque estimées à partir de la CPG des esters méthyliques Chaînes grasses H1 H2 Hexp [220,221] C16:0 26.1 6.8 22.0 20,3/24,5 C16:1 Δ 9 2.6 0.1 2.1 tr./1,2 C18:0 1.3 3.3 1.9 tr./1,8 C18:1 Δ 9 46.2 32.2 53.1 52,6/54,8 C18:1 Δ 11 1.3 0.5 1.3 tr./0,8 C18:2 Δ 9,12 21.9 56.5 18.7 21,5/13,9 C18:3 Δ 9,12,15 0.5 0.3 0.6 0,3/2,0 C20:0 0.2 0.2 0.3 tr./0,3 C20:1 Δ 11 - - - tr./0,7

IV-3-3-Distribution des chaines grasses sur les positions du glycérol

La composition en acides gras des TG et leur position sur le glycérol sont les principaux facteurs qui déterminent les propriétés physiques d’une huile [230]. Jusqu’à ces dernières années la distribution des acides gras sur la chaine du glycérol se faisait soit par utilisation d’enzyme soit par voie magnésienne. Chacune de ces techniques présente un certain nombre d’inconvénients dûs à la nature des acides gras impliqués dans la structure des triacylglycérols, aux diverses manipulations obligatoires pour séparer les produits de dégradation. L’emploi de la RMN comme technique d’analyse évite toutes ces manipulations et permet de travailler directement sur l’huile [231]. Pour chacun des échantillons, nous avons estimé à partir de leurs spectres RMN, la distribution des chaines grasses insaturées sur les positions 1,3 et 2 du glycérol. Le rapport des chaines monoinsaturées est calculé par rapport à l’intensité des pics C- 9α/C-9β. il varient de 59/41 à 65/35, ce qui montre que ces chaines ont une légère préférence pour la position 2 du glycérol. En ce qui concerne les chaines linoléiques le calcul s’est fait en

134 fonction des intensités des signaux des C-10α et C-10β. le rapport α/β est de 49/50, ce qui indique une préférence marquée pour la position β. le rapport des chaines saturées est calculé par rapport au signal du carbone C-2 qui vibre au alentour de 34.28 ppm pour la position β et 34.06 ppm pour la position α. Ce rapport de 95/5 montre une nette préférence des chaines grasses saturées pour la position externe α. En fait les chaines insaturées se protègent des réactions d’oxydations en se positionnant dans le site interne du glycérol. Ces résultats sont en accord avec ceux de la littérature [210,214,232,233]. Cette étude montre l’efficacité de la RMN du 13C, quant au degré d’informations donné sur la composition lipidique d’une huile végétale. En effet, la CPG demande, avant sa mise en œuvre une étape de transformation de l’huile en ses esters d’acides gras. De plus on ne peut déterminer la présence d’acides gras de mono-, di- et triglycérides. La présence de ces composés de classes lipidiques différentes peut ainsi être révélatrice du mode de préparation de l’huile mais aussi de ces caractéristiques physico-chimiques Cette étude nous a également permis de caractériser l’huile végétale de baies de lentisque qui à notre connaissance n’a jamais fait l’objet d’aucune étude en Algérie.

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Chapitre V : Activité antimicrobienne des huiles essentielles des trois espèces de Pistacia et de l’huile fixe de lentisque

En botanique et en pharmacie, les plantes médicinales sont reconnues pour offrir par leur administration un effet bienfaisant et thérapeutique sur l’organisme. Employées depuis la plus haute antiquité, souvent en relation avec des pratiques magiques, leurs propriétés réelles ont, à toutes époque, été exagérées, ou niés selon les croyances en vigueur. A l’époque moderne les progrès de la biochimie et de l’analyse organiques, ainsi que ceux de la physiologie végétale, ont permis de commencer un tri scientifique dans la masse des actions attribuées aux végétaux. Ainsi certaines légendes sont détruites alors que d’autres sont solidement établis. Une espèce végétales peut biosynthétiser plusieurs milliers de constituants chimiques différents. Ceux-ci appartiennent à deux types de métabolismes distincts : - un métabolisme primaire élabore des substances indispensables à la vie de la plante comme certaines protéines, des lipides, des glucides… - un métabolisme secondaire, comme les huiles essentielles qui sont modelées par le temps et l’évolution. Elles caractérisent le profil original de chaque espèce végétale, construisant ainsi une biodiversité moléculaire. C’est cette biodiversité qui est à la base de l’action thérapeutique des plantes [234]. La désignation des trois plantes utilisées dans ce travail comme des plantes médicinales, le parcours de la littérature, ainsi que notre modeste expérience dans la caractérisation des huiles essentielles nous ont poussé a vouloir connaître les bienfaits thérapeutiques, avérés ou pas des essences des trois espèces de Pistacia. Des études récentes sur l’activité antimicrobiennes des huiles essentielles de lentisque [17-20] et du P. terebinthus [20] ont été publiées. Magiatis et coll. ont [17] ont évalué l’activité des huiles essentielles des feuilles des rameaux et de la résine de lentisque sur neuf microorganismes. Ils ont démontré que l’essence issue de la résine (à dominance α-pinène) était active sur les neuf microorganismes avec une concentration minimale d’inhibition comprise entre 1.25 et 9 mg/ml. Cependant les huiles essentielles des feuilles et des rameaux n’étaient actives que sur trois microorganismes (Klebsiella Pneumoniae, Staphylococcus aureus et Streptococcus epidermidis) avec des CMI dépassant les 20 mg/ml. Ben douissa et coll. [18] ont montré une remarquable activité (CMI de 30µg/ml) de l’huile essentielle de lentisque sur Salmonella enteritidis et Staphylococcus aureus.

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Duru et coll. [20] ont reporté l’activité anti fongique des HE de lentisque et P. terebinthus sur trois champignons et ont montré que seul Rhizoctonia solani était inhibé par les deux essences. A notre connaissance aucune étude portant sur l’effet antimicrobien des huiles essentielles de P. atlantica n’a été publiée.

Dans ce paragraphe, nous reportons les résultats de l’évaluation de l’activité antimicrobienne de quelques huiles essentielles du genre Pistacia dont la composition a été étudiée précédemment. Cette évaluation a été réalisée au sein du laboratoire de microbiologie de l’Ecole Normale supérieure de Kouba.

Lors de cette étude, les huiles essentielles (P. lentiscus, P. terebinthus et P. atlantica) ainsi que l’huile végétale des fruits de lentisque ont été testées sur des souches bactériennes qui aujourd’hui sont impliquées dans divers infections comme les infections nosocomiales et dont certaines ont acquis une résistance face aux antibiotiques. Quinze souches bactériennes ont donc été utilisées : cinq bactéries à Gram +, quatre à Gram -, quatre champignons et deux levures. Leurs pouvoirs pathogènes sont reportés dans le tableau 29. Les huiles essentielles de feuilles et fruits du P. lentiscus (échantillon de gouraya) et du P. terebinthus (échantillon USTHB), les galles et les feuilles du P. atlantica (échantillon Ain-oussera) ainsi que l’huile végétale obtenues par extraction au soxhlet des fruits de lentisque, ont été utilisées dans la détermination de la concentration minimale d’inhibition (CMI). Les composés majoritaires identifiés dans ces huiles essentielles sont tous de la famille des monotèrpènes. Ils sont reportés dans le tableau 27 ci-dessous:

Tableau 27: Composés majoritaires identifiés dans les échantillons soumis à l’analyse microbiologique. F PL Fr PL G PA F PA F PT (%) Fr PT (%) (%) (%) (%) (%) α-pinène 27.3 51.5 48.3 36.2 14.3 24.5 camphène 7.1 5.8 4.0 7.7 0.2 0.1 sabinène 11.5 11.6 0.4 0.5 0.3 0.2 β-pinène 5.0 4.4 8.0 10.6 0.6 0.7 α-phéllandrène 0.5 0.4 2.2 0.5 33.8 45.6 terpinèn-4-ol 7.0 2.5 1.0 1.2 0.6 0.4 α-terpinéol 0.9 0.7 9.2 4.5 0.3 0.4 bornyl acétate 4.1 3.3 0.9 3.7 tr 0.1 F : feuille, Fr : fruit, G : galle, PL : P. lentiscus, PA : P. atlantica, PT : P. terebinthus

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La CMI a été déterminée en utilisant la méthode des microdilutions. Suivant la quantité d’huile essentielle disponible, les concentrations de chaque échantillon varient de 1 à 100 µl/ml. Les concentrations des microorganismes sont préalablement calibrées à 3 106 cellules/ml. Le comptage des germes été effectué sur l’hématimètre de Malassez. Les résultats de la CMI sont reportés dans le tableau 28. Tableau 28: Evaluation de la concentration minimale d’inhibition (CMI µl/ml) des huiles essentielles du genre Pistacia et de l’huile végétale de lentisque

F PL Fr PL G PA F PA F PT Fr PT HV PL (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) Bactéries à Gram + Bacillus subtilis 5 10 10 5 20 10 50 (ATCC6663) Micrococcus luteus 10 10 50 20 50 20 10 (ATTC9314) Staphylococcus aureus 10 50 20 20 20 20 ≥75 (CIP7625) Listeria monocytogene 10 75 20 100 20 20 ≥75 (CIP82110) Enterococcus faecalis 20 75 20 50 50 75 ≥75 (C.L.M) Bactéries à Gram - Agrobacterium 10 10 20 20 20 20 10 tumefaciens (N°2410) Klebsiella pneumoniae 75 75 50 100 50 75 75 (CIP82.91) Escherichia Coli ≥100 ≥75 10 ≥100 50 20 ≥75 (CIP54.8). Pseudomonas aeruginosa 75 75 50 100 50 20 75 (CIPA22). Champignons Fusarium oxysporum 5 10 10 10 50 10 10 albedinis (CURZA) Fusarium oxysporum lini 10 10 10 10 50 5 10 (CINRA) Mucor ramannianus 10 10 10 20 20 10 20 NRRL 6606 Phoma: (CLM 10 20 10 20 50 10 20 Levures Candida albicans (CLM) 75 ≥75 50 100 ≥50 75 ≥75 Saccharomyces 20 10 10 20 50 5 20 cerevisiae(ATCC 4226) F : feuille, Fr : fruit, G : galle, PL : P. lentiscus, PA : P. atlantica, PT : P. terebinthus, HV : huile végétale

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En ce qui concerne le P. lentiscus, l‘essence de feuille a montré un fort pouvoir inhibiteur contre toutes les bactéries à Gram + et tous les champignons (CMI ne dépassant pas les 10µl/ml). La CMI des bactéries à Gram− est assez élevé (75µl/ml) et augmente au-delà de 100µl/ml pour Escherichia Coli. Cette essence présente un faible pouvoir inhibiteur contre Candida albicans (75µl/m) mais appréciable contre Saccharomyces cerevisiae (20µl/ml). L’essence de fruit donne également des CMI assez faible pour la levure Saccharomyces cerevisiae, les champignons et les bactéries à Gram+ (10µl/ml), excepté pour Staphylococcus aureus (CMI 50µl/ml) et listeria monocytogène (CMI 75µl/ml). Le pouvoir inhibiteur est très faible contre toutes les bactéries à Gram – (CMI ≥75µl/ml). L’essence de feuille du P. atlantica a un fort pouvoir inhibiteur contre Bacillus subtilis (CMI 5µl/ml) mais donne une CMI assez élevée pour listeria monocytogène, Candida albicans et toutes les bactéries à Gram- (≥100µl/ml). Le pouvoir inhibiteur est moyen pour tous les autres microorganismes (10-20µl/ml). L’huile essentielle des galles présente une activité antimicrobienne importante contre une bactérie à Gram - ; Escherichia Coli (10µl/ml) et une CMI comprise entre 10 et 50µl/ml pour tous les autres germes. En ce qui concerne le P. terebinthus, l’essence des feuilles présente une activité antimicrobienne moyenne, la CMI variant de 20 à 50µl/ml pour tous les microorganismes testés. L’huile essentielle des fruits est très active contre le champignon Fusarium oxyporum lini et la levure Saccharomyces cerevisiae (CMI 5µl/ml) et présente une CMI appréciable pour tous les autres microorganismes (10-20µl/ml) excepté pour Klebsiella pneumoniae et Candida albicans où la CMI atteint les 75µl/ml. Par ailleurs les tests effectués sur l’huile végétale montrent en général, un effet inhibiteur assez faible contre tous les germes sauf pour deux levures (Fusarium oxysporum albedinis et Fusarium oxysporum lini et une bactérie à Gram - (Agrobactérium tumefaciens) qui donnent une CMI de 10µl/ml. De manière générale, les activités antimicrobiennes de toutes les huiles essentielles ainsi que l’huile végétale sont plus efficaces contre les bactéries à Gram + et sur les champignons par rapport aux bactéries à Gram – et à la levure Candida albicans. Cette observation a déjà été notée en littérature pour plusieurs plantes [235]. Cette résistance des bactéries à Gram – peut être attribuée au fait que la paroi externe de la bactérie est enveloppé dans un antigène imperméable aux composés lipophiles dont certains constituent les huiles essentielles [235,236]. Chez les bactéries à Gram +, cette enveloppe n’existe pas ce qui augmente la perméabilité ionique de la paroi externe.

139

Parmi tous les échantillons testés, l’huile essentielle des galles du P. atlantica semble la plus active contre la bactérie à Gram -, Escherichia Coli (10µl/ml). L’essence des fruits du P. terebinthus a la CMI la plus faible contre Pseudomonas aeruginosa (20µl/ml). Plusieurs auteurs ont attribué les effets antimicrobiens des huiles essentielles à leurs composés majoritaires en synergie avec les composés minoritaires [17,236,237]. Vagionas et coll. ont montré que des composés monoterpéniques comme le limonène, l’α-pinène, le β- pinène ou le bornyl acétate avaient des pouvoirs inhibiteurs contre plusieurs microorganismes tels que Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ou encore Candida albicans. Ainsi, la présence des monotèrpènes en majorité dans nos huiles pourrait justifier l’activité inhibitrice bien que modérée, des extraits des trois espèces de Pistacia d’Algérie. Les effets antifongiques de ces espèces, démontrés dans cette étude, permettraientt de les utiliser comme substituts aux produits de synthèse qui deviennent de plus en plus inefficaces contre des germes mutant continuellement. Leur abondance et leur disponibilité, et particulièrement le lentisque, peuvent en faire des produits à forte valeur ajoutée pour les industries pharmaceutiques.

Tableau 29: Pouvoirs pathogènes des microorganismes testés dans ce travail Genre et espèce du microorganisme Pouvoir pathogène

Bacillus subtilis (ATCC6663) Non pathogène mais peut provoquer des Infections oculaires Micrococcus luteus (ATTC9314) Infections de la sphère O.R.L Staphylococcus aureus (CIP7625) Infections de la peau, intoxication alimentaire Listeria monocytogene (CIP82110) Listériose: intoxication souvent mortelle pour l’homme Enterococcus faecalis (C.L.M) Infections urinaires et endocardites Agrobacterium tumefaciens (N°2410) Phytopathogène: responsable de tumeurs chez de nombreuse plantes cultivées Klebsiella pneumoniae (CIP82 ,91) Infections pulmonaires Escherichia coli (CIP54.8). Crampes abdominales, diahrées, vomissements Pseudomonas aeruginosa (CIPA22). Peu virulent pour les sujets sains mais très pathogène pour les malades ; infections cutanées, urinaires.. Fusarium oxysporum albedinis Phytopathogène: fusariose du palmier dattier CURZA Fusarium oxysporum lini (CINRA) Phytopathogène: fusariose du lin Mucor ramannianus NRRL 6606 Phytopathogène Phoma: (C.L.M) Phytopathogène Candida albicans (CLM) Mycoses de la peau. Saccharomyces cerevisiae(ATCC Fermentation des matières végétales ou animales 4226)

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CONCLUSION

Conclusion générale

L’Algérie présente par la nature de ses sols (littoral, steppes, désert) et de son climat (méditerranéen, semi-aride et aride) de grandes diversités dans ses richesses végétales, la flore algérienne est particulièrement riche en plantes médicinales et aromatiques dont la plus part à l’état spontané. Malgré l’apparition et l’utilisation croissante des composés de synthèse, ceux- ci n’ont pu se substituer totalement aux produits naturels car ces derniers restent souvent irremplaçables pour différentes raisons : coût, quantité, disponibilité.

La connaissance approfondie des huiles essentielles utilisées traditionnellement et non encore valorisées, constitue un enjeu important auquel notre laboratoire a la volonté de contribuer. Ainsi, dans le cadre de l’axe de recherche du laboratoire «valorisation, extraction et analyse des produits naturels » nous présentons une contribution à l’analyse des huiles essentielles de trois espèces de Pistacia : P. lentiscus, P. terebinthus et P. atlantica.

Dans la première partie, nous avons donné une description botanique du genre Pistacia, où l’on a mis en évidence les différentes espèces existantes et leurs utilisations. Nous avons également fait une synthèse bibliographique des principales techniques utilisées pour l’analyse de divers mélanges complexes. Nous avons mis en évidence leurs domaines d’application, leurs avantages, leurs limites et montré qu’il y a une certaine complémentarité entre ces techniques. La méthode d’analyse par RMN 13C a été présentée et à travers les différents exemples, elle constitue une véritable méthode d’analyse.

La seconde partie de ce travail a été consacré à l’analyse détaillée des huiles essentielles issues des feuilles, baies et rameaux du P. lentiscus prélevés sur trois sites naturels du pays. L’identification par CPG et CPG-SM de la composition chimique des neuf essences a montré une nette prédominance des oléfines telles que l’α-pinène, le myrcène, le limonène, le germacrène D et le β-caryophyllène.

L’influence du mode d’extraction sur la composition chimique des extraits aux solvants des feuilles de lentisque a également été étudiée. Nous avons pu observer des modifications importantes de la composition chimique des extraits volatils dues non

141 seulement aux modes d’extraction mais aussi au traitement préalable de la matière végétale. Ainsi, les feuilles entières produisent par hydrodistillation une essence riche en composés monotèrpéniques oléfiniques, tandis que les extraits par solvants donnent des compositions chimiques riches en sesquiterpènes en particulier le β-caryophyllène et le germacrène D. Ces mêmes composés sont également caractéristiques de l’huile essentielle et des extraits aux solvants obtenus à partir des feuilles broyées. Le traitement préalable de la matière végétale (broyage) a conduit à des extraits assez pauvres en oléfines monoterpèniques. L’extraction au fluide supercritique EFS-CO2 a donnée des compositions chimiques comparables aux huiles essentielles correspondantes. Cependant beaucoup de composés lourds (triterpèniques) ont été extraits en particulier pour les baies de lentisque où nous avons identifié 24% d’acides gras. Ces substances n’ont pas été identifiées dans l’huile essentielle.

Les variations observées dans la composition de ces huiles nous ont poussées à faire une étude sur la variabilité chimique intraspécifique des feuilles et des baies de lentisque. Ainsi d’après l’étude statistique, les essences de lentisque se répartissent en 4 groupes suivant le composé majoritaire. Le plus important est celui de l’α-pinène puis vient le myrcène et enfin le limonène. Le dernier groupe est caractérisé par son faible pourcentage en α-pinène (moins de 4%). Les huiles issues des fruits ont été classées en deux grands groupes : l’un à dominance myrcène et le second à α-pinène.

Dans la troisième partie de ce travail nous avons utilisé la RMN du carbone-13 afin de caractériser les huiles essentielles de trois espèces de Pistacia (lentiscus, terebinthus et atlantica) et l’huile végétale des fruits de lentisque. Cette méthode d’analyse a permis d’identifier sans séparation préalable, les constituants de nos huiles essentielles dont les teneurs étaient supérieures ou égales à 0.5%. L’analyse a montré que les essences des trois espèces de Pistacia étaient toutes prédominées essentiellement par des monoterpènes oléfiniques ; α-pinène, β-pinène, α- phéllandrène. elle a également permis de caractériser les acides gras contenus dans trois échantillons d’huiles végétales de fruits de lentisque. Ainsi, les deux huiles commerciales étudiées ont des compositions différentes dans la mesure où l’une est oléique tandis que l’autre est linoléique. La troisième, extraite au laboratoire, est similaire à la première (oléique).

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L’étude antimicrobienne des huiles essentielles des trois espèces de Pistacia et de l’huile végétale, par la méthode des microdilutions nous a permis de confirmer les potentialités de ces espèces. Généralement toutes les essences testées sont efficaces sur les champignons. Les huiles de lentisque (feuille et fruits) semblent efficaces sur les bactéries à Gram + comme par exemple Bacillus subtilis ou encore Micrococus luteus. Les essences des galles du P. atlantica et ceux du P. terebinthus ont montré une meilleure activité antimicrobienne contre des bactéries à Gram – comme par exemple Escherichia coli. L’huile végétale a également donné une faible concentration minimale d’inhibition (CMI) pour une bactérie à Gram - ; Agrobacterium tumefaciens.

Ainsi, ce travail a permis la caractérisation de trois espèces de Pistacia à travers les huiles essentielles qu’elles produisent et leur mise en valeur par l’étude de leurs potentialités thérapeutiques.

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PARTIE EXPERIMENTALE

Indice de réfraction : (Norme NF T75-112) 20 L’indice de réfraction nD a été déterminé par lecture directe à l’aide d’un réfractomètre d’ABBE en utilisant la lumière diffuse du jour, la température étant maintenue à 20°C à l’aide d’un thermostat.

Pouvoir rotatoire : (Norme NF T75-113) 20 Le pouvoir rotatoire αD a été déterminé à l’aide d’un appareil de marque JASCO 1010, équipé d’une cellule de 1 dm et d’une lampe à raie de sodium de longueur d’onde de 589 nm . La concentration en essence varie de 0.2 à 0.4 (g/100ml) Chromatographie en phase gazeuse (huiles essentielles)

Les analyses chromatographiques en phase gazeuse ont été réalisées à l’aide d’un chromatographe Hewlett packard 6890, équipé d’une colonne apolaire HP5MS (30x 0,25 mm d.i. ; épaisseur du film : 0,25 μm) et d’un détecteurs à ionisation de flamme. Les conditions opératoires sont les suivantes : gaz vecteur : azote, débit 0.8ml/mn, température de l’injecteur : 250°C, température des détecteurs : 300°C, programmation de température : de 60 à 250°C à 2°C/mn, avec deux paliers : 8 minutes à 60°C et 15mn à 280°C, injection de 0.4µl d’huile essentielle pure et de 1µl d’absolue en mode : mode split 1 :20.

Couplage CPG-SM Les huiles essentielles ont été analysées sur un appareil de chromatographie en phase gazeuse couplé à la spectrométrie de masse de marque Hewlet packard 5973A, équipé d’une colonne capillaire apolaire (HP5MS, 30m x 0.25mm, épaisseur de phase :0.25µm).le mode de détection : Impact éléctronique, courant d’ionisation : 70eV, gaz vecteur : helium, debit : 0.7ml/mn, pression de la source : 10-7mbar, température de l’interface : 280°C, température de l’injection : 250°C, la programmation du four : 2°C/min de 60°C à 280°C, avec des isothermes : 8min à 60°C et 15min à 280°C. 0.1 à 0.2µl d’huile essentielle pure et 1µl d’absolue ont été injectés en mode split 1 :20. Extraction assistée par Ultrasons L’extraction s’est effectuée à température ambiante dans un appareil de marque: Prolabo T 710DH

144

Extraction au fluide super critique : L’extraction au fluide supercritique a été effectuée sur un appareil de laboratoire équipé d’un extracteur de 400cm3 et de deux séparateurs de 200 et 300cm3, d’une pompe de type Lewa, modèle EL-1/M210SH6. Le refroidissent du 1er séparateur (précipitation des cires) est réalisé grâce à un thermostat de marque Neslab, modele CC-10011.

Conditions chromatographiques utilisées pour la variabilité chimique : Les analyses chromatographiques pour l’étude de la variabilité chimique des huiles essentielles de lentisque ont été réalisées à l’aide d’un chromatographe Perkin Elmer autosystem, équipé d’un injecteur diviseur, de deux colonnes (50 x 0,22 mm d.i.; épaisseur du film : 0,25 μm), polaire (BP20, polyéthylène glycol) et apolaire (BP1, diméthylsiloxane) et de deux détecteurs à ionisation de flamme. Les conditions opératoires sont les suivantes : gaz vecteur : Hélium, pression en tête de colonne : 20psi, température de l’injecteur : 250°C, température des détecteurs : 250°C, programmation de température : de 60 à 220°C (35 mn) à 2°C/mn, avec un palier de 20 minutes à 220°C, injection : mode split.

L’étude statistique a été réalisée avec le logiciel de statistique XLSTAT 4.2.

Résonance magnétique nucléaire RMN du carbone-13

Les spectres RMN ont tous été réalisés sur un appareil Bruker 400 AVANCE, 9,4 Tesla, opérant à 100,623 MHz pour le carbone-13.

Les spectres du carbone-13 ont été enregistrés avec les paramètres suivants : Sonde de 5 mm : angle d’impulsion 45°; temps d’acquisition = 2,73 s correspondant à une acquisition de 128 K avec une largeur spectrale (SW) de 25000 Hz (250 ppm) ; résolution digitale de 0,183 Hz/pt. Le nombre d’accumulations est compris entre 2000 et 5000 pour chaque enregistrement. Les données du signal de précession libre (FID) sont multipliées avant la transformée de Fourrier par une fonction exponentielle (LB = 1,0 Hz). Pour l’enregistrement des spectres des huiles essentielles, une masse de 50 mg d’huile essentielle est dissoute dans 0,5ml de CDCl3..

145

Chromatographies sur colonne ouverte de silice Les chromatographies sur colonne de silice (CC) de type «flash», qui permettent de séparer les composés hydrocarbonés des composés oxygénés, ont été réalisées avec de la silice ICN 200-500 μm, 60 Å.

Extraction des lipides L’extraction des lipides des fruits de lentisque a été effectuée dans un montage de type soxhlet en utilisant 70 g de fruits broyés et 200ml d’hexane. L’extraction a duré 2h30.

Préparation des esters méthyliques par trans-estérification

Les esters méthyliques sont préparés suivant la méthode de Bligh et Dyer (175). On prélève de 10 à 20mg d’huile végétale à étudier que l’on mélange à 1ml de toluène et 1 ml de

BF3/CH3OH. Le mélange est placé sous agitation (vortex) puis dans un bain marie à 100°C pendant 45 minutes. Après retour à la température ambiante, on rajoute 1ml d’eau et 1ml d’hexane. Après une nouvelle agitation, le mélange est mis en chambre froide. Après décantation la phase supérieure du mélange contenant l’hexane et les esters méthyliques est récupérée et injecté directement en CPG.

Chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques

Les analyses chromatographiques en phase gazeuse ont été réalisées à l’aide d’un chromatographe Perkin Elmer autosystem, équipé d’un injecteur, d’une colonne (30 x 0,32 mm d.i. ; épaisseur du film : 0,25 μm), polaire (DB225J&W, 50% cyanopropylphényl, 50% méthylpolysiloxane) et d’un détecteur à ionisation de flamme. Les conditions opératoires sont les suivantes : gaz vecteur : Hélium, pression en tête de colonne : 1,2 bar, température de l’injecteur : 150°C, température du détecteur : 250°C, programmation de température : de 150°C (3 mn), puis de 150 à 190°C à 10°C/mn, avec un palier de 3 minutes à 190°C, puis de 190 à 210°C à 10°C/mn avec un palier de 3 minutes à 210°C, injection : mode split. Les acides gras sont identifiés par comparaison des temps de rétention des esters méthyliques avec ceux de mélanges standards de composition connue (sigma). La composition en acides gras est exprimée en % de la masse d’esters méthyliques injectés.

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Partie microbiologique

Nous avons testé 15 microorganismes sous références : AT.C.C : American Type Culture Collection. C.U.R.Z.A : Collection de l’Unité de Recherche sur les Zones Arides (Alger). C.I.P : Collection de l’Institut Pasteur de France. C.I.N.R.R : Collection de l’Institut National de Recherche Agronomique Dijon, France. N.R.Rl : Northern Regional Center( U.S.A). C.L.M: Collection du Laboratoire de Microbiologie de l’ENS de Kouba.

Mileu de culture : Agar Nutritive modifié : 10g : Glucose,5g : peptone ,1g :extrait de Malt,

2g : extrait de levure, 5g NaCl, 18g Agar, 100ml H2O , PH=7,2, nous avons ajouté du tween 80 à 1% afin de mieux disperser l’huile dans la gélose nutritive et obtenir un milieu homogène. Mode opératoire : Nous avons utilisé des boites de pétri en verre de 6 cm de diamètre stérilisées. Le milieu de culture, les micropipettes, les microseringues et les tubes à essais destinés à contenir les suspensions microbiennes sont stérilisés à l’autoclave à 120°C pendant 20 minutes. Le comptage des germes s’est effectué sur une cellule de malassez et sous un microscope optique. Chaque boite de pétri contient 3 ml de milieu gélosé et une concentration connue d’huile essentielle. 2 µl de chaque microorganisme sont alors déposés en un point sur la gélose nutritive. Chaque expérience est répétée deux fois afin de confirmer l’effet inhibiteur. L’incubation est ensuite effectuée à 30°C 0 l’intérieur d’une étuve. Les résultats sont lu 24 h après pour les bactéries et les levures et 48 h après pour les champignons. Ces résultats consistent à noter s’il y a présence ou absence de croissance des microorganismes. La concentration la plus faible en huile essentielles qui inhibe totalement la croissance des germes est considérée comme étant la concentration minimale inhibitrice.

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162

ANNEXE

Chromatogrammes des huiles essentielles de lentisque

Figure A1 : Chromatogramme (CPG/FID, HP-1) de l’huile essentielle des feuilles de Bouchaoui

Figure A2 : Chromatogramme (CPG/FID, HP-1) de l’huile essentielle des rameaux de Bouchaoui

Figure A3 : Chromatogramme (CPG/FID, HP-1) de l’huile essentielle des feuilles Texanna

Figure A4 : Chromatogramme (CPG/FID, HP-1) de l’huile essentielle fruit de Texanna

Figure A5 : Chromatogramme (CPG/FID, HP-1) de l’huile essentielle rameaux de Texanna

Chromatogrammes Chapitre cinétique

Figure A6 : Chromatogramme (CPG/FID) de HE des feuilles de lentisque obtenue 5 mn après la 1ère goutte. 1 : α-pinène, 2 : myrcène, 3 : α-phéllandrène, 4 : p-cymène, 5 : limonène, 6 : γ-terpinène, 7 : terpinèn-4-ol,

8 : bornyl acétate, 9 : β-caryophyllène, 1 :α-humulène, 11 : germacrène D, 12 : δ-cadinène, 13 : α-cadinol.

Figure A7: Chromatogramme (CPG/FID, HP-1)de l’huile essentielle obtenu à 15 mn après la 1ère goutte

Figure A8: Chromatogramme (CPG/FID, HP-1) de l’huile essentielle obtenu à 30 mn après la 1ère goutte

Figure A9: Chromatogramme (CPG/FID, HP-1) de l’huile essentielle obtenu à 60 mn après la 1ère goutte

Figure A10: Chromatogramme (CPG/FID, HP-1) de l’huile essentielle obtenu à 90 mn

après la 1ère goutte

Figure A11 : Chromatogramme (CPG/FID, HP-1) de l’huile essentielle obtenu à 120 mn après la 1ère goutte

Figure A12: Chromatogramme (CPG/FID, HP-1) de l’huile essentielle obtenu à 180 mn après la 1ère goutte

Chromatogrammes Chapitre extraction aux solvants

Figure A13: Chromatogramme (CPG/FID,HP5MS) de l’huile essentielle des feuilles de lentisque

Figure A14: Chromatogramme (CPG/FID,HP5MS) de l’extrait au soxhlet des feuilles de lentisque

Figure A15: Chromatogramme (CPG/FID,HP5MS)de l’extrait obtenu par ultrasons dans l’hexane des feuilles de lentisque

Figure A16: Chromatogramme (CPG/FID,HP5MS) de l’extrait obtenu par ultrasons dans le dichlorométhane des feuilles de lentisque

Figure A17: Chromatogramme (CPG/FID,HP5MS) de l’huile essentielle de la poudre de lentisque

MS Figure A18: Chromatogramme (CPG/FID,HP5 )de l’extrait au soxhlet de la poudre de lentisque

Figure A19: Chromatogramme (CPG/FID,HP5MS)de l’extrait obtenu par ultrasons dans l’hexane de la poudre de lentisque