Dalbergia Tonkinensis Prain) Ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGŨ TRƯỜNG NHÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội, 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGŨ TRƯỜNG NHÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số chuyên ngành: 9.44.01.17

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường 2. TS. Đỗ Hữu Nghị

Hà Nội, 2019 i

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...... v

LỜI CẢM ƠN ...... vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...... vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ...... ix

DANH MỤC CÁC HÌNH ...... xi

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ...... xiv

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ...... xv

MỞ ĐẦU ...... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...... 3

1.1. KHÁI QUÁT VỀ HỌ ĐẬU (FABACEAE) VÀ CHI TRẮC (DALBERGIA) ...... 3

1.1.1. Khái quát về họ Đậu (Fabaceae) ...... 3

1.1.2. Khái quát về chi Trắc (Dalbergia) ...... 3

1.1.3. Tổng quan về loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ...... 4 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI TRẮC

(DALBERGIA) TRÊN THẾ GIỚI ...... 5

1.2.1. Hợp chất khung flavan ...... 7

1.2.2. Hợp chất khung isoflavan ...... 8

1.2.3. Hợp chất khung neoflavan ...... 10

1.2.4. Hợp chất khung flavanol ...... 10

1.2.5. Hợp chất khung flavanone ...... 11

1.2.6. Hợp chất khung isoflavanone...... 14

1.2.7. Hợp chất khung flavanonol ...... 15

1.2.8. Hợp chất khung isoflavanonol ...... 16

1.2.9. Hợp chất khung flavone ...... 17

1.2.10. Hợp chất khung isoflavone ...... 18

1.2.11. Hợp chất khung neoflavone ...... 21

1.2.12. Hợp chất khung 4-aryl-coumarin...... 21

1.2.13. Hợp chất khung aurone ...... 23

1.2.14. Hợp chất khung chalcone ...... 23

1.2.15. Lớp chất diaryl propanoid ...... 25

1.2.16. Lớp chất cumarin và dẫn xuất ...... 25

1.2.17. Lớp chất lignan ...... 27

1.2.18. Lớp chất benzophenon...... 28

1.2.19. Lớp chất terpenoid ...... 28

1.2.20. Các lớp chất khác ...... 29 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI TRẮC

(DALBERGIA) Ở VIỆT NAM ...... 30

1.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHI TRẮC (DALBERGIA)...... 34

1.4.1. Hoạt tính chống oxi hóa ...... 34

1.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào ...... 37

1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn ...... 40

1.4.4. Hoạt tính kháng viêm ...... 41

1.4.5. Hoạt tính chống đái tháo đường ...... 41

1.4.6. Hoạt tính chống dị ứng ...... 42

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 43

2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ...... 43

2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu ...... 43 2.1.2. Các phương pháp nghiên cứu thực vật loài Sưa (Dalbergia tonkinensis

Prain) ...... 43

2.1.3. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết ...... 46

2.1.4. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ...... 46

2.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học ...... 46

2.2.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ...... 46

2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase ...... 48

2.3. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách ...... 49

2.3.1. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-561)...... 49

2.3.2. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-612)...... 54

2.4. Thông số hóa lý và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập ...... 61

iii

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...... 67 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ VI PHẪU VÀ DNA CỦA CÂY SƯA (DALBERGIA

TONKINENSIS PRAIN) ...... 67

3.1.1. Kết quả nghiên cứu vi phẫu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ...... 67

3.1.2. Kết quả nghiên cứu DNA cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ...... 70 3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) (C-

561) ...... 74

3.2.1. Hợp chất pinocembrin (DT.01) ...... 75

3.2.2. Hợp chất naringenin (DT.02) ...... 78

3.2.3. Hợp chất 3'-hydoxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol (DT.03)...... 80

3.2.4. Hợp chất medicarpin (DT.04) ...... 82

3.2.5. Hợp chất buteaspermanol (DT.05) ...... 84

3.2.6. Hợp chất mới daltonkin A (DT.06) ...... 85

3.2.7. Hợp chất mới daltonkin B (DT.07) ...... 93 3.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) (C-

612) ...... 101

3.3.1. Hợp chất Dalbergin (DT.08) ...... 101

3.3.2. Hợp chất isoliquiritigenin (DT.09) ...... 102

3.3.3. Hợp chất 7,3',5'-trihydroxyflavanone (DT.10) ...... 104

3.3.4. Hợp chất vestitone (DT.11) ...... 106

3.3.5. Hợp chất calycosin (DT.12) ...... 108

3.3.6. Hợp chất 4',7-dihidroxy-3-methoxyflavone (DT.13) ...... 109

3.3.7. Hợp chất liquiritigenin (DT.14) ...... 110

3.3.8. Hợp chất sativanone (DT.15) ...... 112

3.3.9. Hợp chất 3'-O-methylviolanone (DT.16) ...... 112

3.3.10. Hợp chất sulfuretin (DT.17)...... 114

3.3.11. Hợp chất formononetin (DT.18) ...... 115

3.4. KẾT LUẬN VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT ...... 116

3.5. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC ...... 119

3.5.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane ...... 119 3.5.2. Tác dụng ức chế enzyme -glucosidase của các cặn chiết và các hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ...... 120

KẾT LUẬN ...... 129

KIẾN NGHỊ ...... 131

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...... 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...... 133

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả thu được trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Ngũ Trường Nhân

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Với sự kính trọng, lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường và TS. Đỗ Hữu Nghị là những người thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể cán bộ Phòng Hoạt chất sinh học và các đồng nghiệp Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi cũng cám ơn đề tài nghiên cứu số 104.01-2015.49 do quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) do PGS. TS Nguyễn Mạnh Cường làm chủ nhiệm đã tài trợ cho các nghiên cứu trong luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn đến các đồng nghiệp, bạn bè gần xa đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành tốt luận án này. Cuối cùng, tôi xin gửi lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đến đấng sinh thành, những người đã không ngại khó khăn, vất vả, đã luôn giúp đỡ, khích lệ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án

Ngũ Trường Nhân

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Diễn giải Tiếng Anh D. Chi Trắc Dalbergia Advanced glycosylation AGEs Các sản phẩm của quá trình glycat hoá end products Carbon -13 Nuclear 13C- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13C Magnetic Resonance Spectroscopy CC Sắc ký cột Column Chromatography D Chi trắc Dalbergia Nồng độ hoạt chất bắt đầu bảo vệ được ED50 Effective Dose at 50% 50% sự sống sót EN Phân hạng ở mức độ nguy cấp Endangered

EtOAc CH3COOC2H5 Ethyl acetate

EtOH C2H5OH Ethanol Liver hepatocellular Hep-G2 Dòng tế bào ung thư ở gan người carcinoma/Human hepatoma HeLa Ung thư cổ tử cung người Henrietta lacks HTSH Hoạt tính sinh học Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Nuclear Magnetic 1H-NMR Resonance Spectroscopy 1H -1H - Correlation 1H-1H-COSY Phổ tương tác proton Spectroscopy Phổ tương tác dị nhân qua nhiều liên kết Heteronuclear Multiple HMBC (HMBC) Bond Correlation Heteronuclear Single HSQC Phổ tương tác dị nhân qua 1 liên kết Quantum Coherence

viii

High Resolution Electron Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng HR-ESI-MS Spray Ionization Mass phun mù điện tử Spectroscopy IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy Inhibitory concentration IC50 Nồng độ ức chế 50% 50% Human epidermoid KB Dòng tế bào ung thư biểu mô carcinoma

LD50 Liều độc cấp tính Lethal dose 50

LU-1 Ung thư phổi người Human lung carcinoma

Cancer Foundation-7 MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú Michigan

MeOH CH3OH Methanol Minimum Inhibitory MIC Nồng độ ức chế tối thiểu Concentration Human small cell lung NCI-H187 Dòng tế bào ung thư phổi cancer NĐ- CP Nghị định- Chính phủ NĐ/2006/NĐ- Nghị định 32/2006 của Chính phủ CP RD Ung thư màng tim Rhabdosarcoma

SC50 Khả năng bẫy gốc tự do 50% Scavening capacity SH-SY5Y Ung thư thần kinh người Human neurobastoma STT Số thứ tự UV Phổ tử ngoại Ultraviolet

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các loài đã được nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Trắc

(Dalbergia) trên thế giới (bao gồm tên loài, bộ phận và vùng lấy mẫu) ...... 6

Bảng 1.2. Các hợp chất flavan từ chi Trắc (Dalbergia) ...... 8

Bảng 1.3. Các hợp chất isoflavan từ chi Trắc (Dalbergia) ...... 9

Bảng 1.4. Các hợp chất neoflavan từ chi Trắc (Dalbergia) ...... 10

Bảng 1.5. Các hợp chất flavanol từ chi Trắc (Dalbergia) ...... 11

Bảng 1.6. Các hợp chất flavanone từ chi Trắc (Dalbergia) ...... 12

Bảng 1.7. Các hợp chất isoflavanone từ chi Trắc (Dalbergia) ...... 14

Bảng 1.8. Các hợp chất flavanonol từ chi Trắc (Dalbergia)...... 16

Bảng 1.9. Các hợp chất isoflavanonol từ chi Trắc (Dalbergia) ...... 17

Bảng 1.10. Các hợp chất flavone từ chi Trắc (Dalbergia) ...... 18

Bảng 1.11. Các hợp chất isoflavone từ chi Trắc (Dalbergia) ...... 19

Bảng 1.12. Các hợp chất neoflavone từ chi Trắc (Dalbergia) ...... 21

Bảng 1.13. Các hợp chất chalcone từ chi Trắc (Dalbergia) ...... 23 Bảng 1.14. Danh sách các loài Dalbergia đã được nghiên cứu về thành phần hóa học

ở Việt Nam ...... 30

Bảng 1.15. Giá trị ED50 của dịch chiết MeOH từ gỗ loài Trắc (D. cochinchinensis) ...... 35

Bảng 1.16. Giá trị IC50 của naringenin và eriodictoyl so với BTH ...... 36

Bảng 2.1. Thông tin các cặp mồi sử dụng ...... 45 Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền của từng vùng gen so sánh giữa 2 mẫu nghiên cứu với 6 loài trên Genbank ...... 72

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.01 và chất tham khảo ...... 77

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.02 và chất tham khảo ...... 79

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.03 và chất tham khảo ...... 81

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.04 và chất tham khảo ...... 83

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.05 và chất tham khảo ...... 85

Bảng 3.7. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của chất daltonkin A ...... 93

Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của chất daltonkin B ...... 99

Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.08 và chất tham khảo ...... 102

Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.09 và chất tham khảo ...... 103

Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.10 và chất tham khảo ...... 106

Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.11 và chất tham khảo ...... 107

Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.11 và chất tham khảo ...... 109

Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.14 và chất tham khảo ...... 111

Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.16 và chất tham khảo ...... 113

Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.17 và chất tham khảo ...... 115

Bảng 3.17. Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa...... 117

(Dalbergia tonkinensis Prain) ...... 117 Bảng 3.18. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập từ loài

(Dalbergia tonkinensis Prain) ...... 120 Bảng 3.19. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của cao chiết methanol lõi gỗ cây Sưa

(Dalbergia tonkinensis Prain) ...... 121

Bảng 3.20. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các cao phân đoạn từ lõi gỗ ...... 123

Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ...... 123 Bảng 3.21. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của sativanone và formononetin so với acarbose trên 4 nguồn enzyme khác nhau ...... 125 Bảng 3.22. Hoạt tính ức chế α-glucosidase trên chuột của cao chiết các bộ phận và 2 hợp chất từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ...... 127

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở TP. Buôn Ma Thuột ...... 3

Hình 1.2. Sản phẩm từ gỗ chi Trắc (Dalbergia) ...... 4 Hình 1.3. Một phần lõi gỗ, rễ và lá loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thu ở

Tp.BMT ...... 5

Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất khung flavan ...... 8

Hình 1.5. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavan ...... 10

Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ khung neoflavan ...... 10

Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất khung flavanol ...... 11

Hình 1.8. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavanone ...... 15

Hình 1.9. Cấu trúc các hợp chất khung flavanonol ...... 16

Hình 1.10. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavanonol ...... 17

Hình 1.11. Cấu trúc các hợp chất khung flavone ...... 18

Hình 1.12. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavone ...... 21

Hình 1.13. Cấu trúc các hợp chất khung neoflavone...... 21

Hình 1.14. Cấu trúc các hợp chất khung 4-aryl-coumarin...... 23

Hình 1.15. Cấu trúc các hợp chất khung aurone ...... 23

Hình 1.16. Cấu trúc các hợp chất khung chalcone ...... 25

Hình 1.17. Cấu trúc các hợp chất diaryl propanoid ...... 27

Hình 1.18. Cấu trúc các hợp chất cumarin và dẫn xuất ...... 27

Hình 1.19. Cấu trúc các hợp chất ligan ...... 28

Hình1.20. Cấu trúc các hợp chất benzophenon ...... 28

Hình 1.21. Cấu trúc các hợp chất terpenoid ...... 29

Hình 1.22. Cấu trúc các hợp chất khác ...... 30

Hình 1.23. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ chi Trắc (Dalbergia) ở Việt Nam .... 34 Hình 2.1. Hai mẫu Sưa được thu tại Buôn Ma Thuột (C-561-L) và Hà Nội (C-564-

L) ...... 44

Hình 2.2. Mẫu lá Trắc được thu tại Buôn Ma Thuột (C-562-L) ...... 44

Hình 3.1. Vi phẫu lá Sưa ...... 68

xii

Hình 3.2. Phiến lá Sưa ...... 68

Hình 3.3. Vi phẫu thân loài Sưa ...... 69

Hình 3.4. Đặc điểm bột lõi thân ...... 69

Hình 3.5. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 1% ...... 70 Hình 3.6. So sánh khả năng phân biệt giữa các loài Dalbergia của 3 vùng gen nghiên cứu ...... 74

Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.01 ...... 75

Hình 3. 8. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.01 ...... 77

Hình 3. 9. Phổ DEPT của hợp chất DT.01 ...... 77

Hình 3.10. Cấu trúc hợp chất pinocembrin ...... 77

Hình 3.11. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.02 ...... 78

Hình 3. 12. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.02 ...... 79

Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất naringenin ...... 79

Hình 3.17. Phổ IR của hợp chất DT.06 ...... 86

Hình 3.18. Phổ UV của hợp chất DT.06 ...... 86

Hình 3.19. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất DT.06 ...... 87

Hình 3.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.06...... 88

Hình 3.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.06 ...... 88

Hình 3.22. Phổ DEPT của hợp chất DT.06 ...... 89

Hình 3.23. Phổ HSQC của hợp chất DT.06 ...... 89

Hình 3.24. Phổ COSY của hợp chất DT.06 ...... 90

Hình 3.25. Phổ HMBC của hợp chất DT.06 ...... 91

Hình 3.26. Phổ CD của hợp chất DT.06 ...... 91

Hình 3.27. Phổ CD của hợp chất ...... 91

Hình 3.28. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin A ...... 92

Hình 3.29. Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất daltonkin A ...... 92

Hình 3.30. Phổ khối phân giả cao HR-ESI-MS của hợp chất DT.07 ...... 94

Hình 3.31. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.07 ...... 95

Hình 3.32. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.07 ...... 95

Hình 3.33. Phổ DEPT của hợp chất DT.07 ...... 96

xiii

Hình 3.34. Phổ HSQC của hợp chất DT.07 ...... 97

Hình 3.35. Phổ COSY của hợp chất DT.07 ...... 98

Hình 3.36. Phổ HMBC của hợp chất DT.07 ...... 98

Hình 3.37. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin B ...... 100

Hình 3.38. Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất daltonkin B ...... 100

Hình 3.39. Cấu trúc hợp chất Dalbergin ...... 102

Hình 3.40. Cấu trúc hóa học hợp chất isoliquiritigenin ...... 103

Hình 3.41. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.10 ...... 104

Hình 3.43. Phổ DEPT của hợp chất DT.10 ...... 105

Hình 3.44. Cấu trúc hợp chất 7,3',5'-trihydroxyflavanone ...... 105

Hình 3.45. Cấu trúc hợp chất vestitone ...... 107

Hình 3.46. Cấu trúc hợp chất calycosin ...... 108

Hình 3.47. Cấu trúc hóa học hợp chất 4',7-dihidroxy-3-methoxyflavone ...... 110

Hình 3.48. Cấu trúc hợp chất liquiritigenin ...... 111

Hình 3.49. Cấu trúc hợp chất sativanone ...... 112

Hình 3.50. Cấu trúc hợp chất 3'-O-methylviolanone ...... 113

Hình 3.51. Cấu trúc hợp chất 7,3',4'-trihydroxyaurone ...... 114

Hình 3.52. Cấu trúc hợp chất fomononetin ...... 116 Hình 3.53. Khả năng ức chế α-glucosidase của các bộ phận loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ...... 122 Hình 3.54. Độ bền pH (2-13) của cao chiết methanol lõi gỗ Sưa và tương quan hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase...... 123 Hình 3.55. Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của các cao phân đoạn và hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ...... 124

xiv

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-

561) ...... 49

Sơ đồ 2.2. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết dichloromethane 50

Sơ đồ 2.3. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết ethyl acetate ...... 51

Sơ đồ 2. 4. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cao nước đun sôi ...... 53 Sơ đồ 2.5. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-

612) ...... 54

Sơ đồ 2.6. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DHT-2 ...... 56

Sơ đồ 2.7. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DHT-3 ...... 58

Sơ đồ 2.8. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết HDT-4 ...... 60

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Các phổ của hợp chất pinocembrin (DT.01) ...... PL1 Phụ lục 2: Các phổ của hợp chất narigenin (DT.02) ...... PL2 Phụ lục 3: Các phổ của hợp chất 3'-hydroxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol (DT.03) PL3 Phụ lục 4: Các phổ của hợp chất medicarpin (DT.04) ...... PL4 Phụ lục 5: Các phổ của hợp chất buteaspermanol (DT.05) ...... PL5 Phụ lục 6: Các phổ của hợp chất daltonkin A (DT.06) ...... PL6 Phụ lục 7: Các phổ của hợp chất daltonkin B (DT.07) ...... PL7 Phụ lục 8: Các phổ của hợp chất dalbergin (DT.08) ...... PL8 Phụ lục 9: Các phổ của hợp chất isoliquiritigenin (DT.09) ...... PL9 Phụ lục 10: Các phổ của hợp chất 7,3',5'-trihydroxyflavanone (DT.10) ...... PL10 Phụ lục 11: Các phổ của hợp chất vestitone (DT.11) ...... PL11 Phụ lục 12: Các phổ của hợp ch ất calycosin (DT.12) ...... PL12 Phụ lục 13: Các phổ của hợp chất 4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone (DT.13) .. PL13 Phụ lục 14: Các phổ của hợp chất liquiritigenin (DT.14) ...... PL14 Phụ lục 15: Các phổ của hợp chất sativanone (DT.15) ...... PL15 Phụ lục 16: Các phổ của hợp chất 3'-O-methylviolanone (DT.16) ...... PL16 Phụ lục 17: Các phổ của hợp chất sulfuretin (DT.17) ...... PL17 Phụ lục 18: Các phổ của hợp chất formononetin (DT.18) ...... PL18

MỞ ĐẦU

Việt Nam có diện tích khoảng 330000 km2, trải dài 1650 km qua 15o vĩ, có khí hậu nhiệt đới gió mùa, hai mùa nóng ẩm, độ ẩm tương đối lớn (trên 80%), lượng mưa hàng năm dồi dào (trung bình 1200-2800 mm) [1]. Với đặc thù môi trường thiên nhiên như thế đã tạo ra một hệ thực vật đa dạng phong phú về chủng loại, quanh năm xanh tốt, và có nhiều công dụng phục vụ cuộc sống con người như là lương thực, chế biến đồ dùng nội ngoại thất, làm cảnh, làm thuốc,… Theo số liệu thống kê, hệ thực vật bậc cao Việt Nam có trên 10.000 loài [2], trong đó có khoảng 3.200 loài cây được sử dụng trong y học dân tộc làm thuốc chữa bệnh [3]. Trong hệ thực vật đó thì chi Trắc (Dalbergia) thuộc cây họ Đậu (Fabaceae) là một trong ba chi có số loài đa dạng và phong phú nhất. Theo tìm hiểu qua tri thức bản địa thì rất nhiều loài trong chi này như Trắc hoàng đàn Dalbergia assamica Bent, Trắc lá Dalbergia foliacea Wall. ex Benth, Cẩm lai một hạt Dalbergia candenatenis, Dalbergia rimosa, Dalbergia sissoo, Dalbergia odorifera.., được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian ở nhiều quốc gia để chữa nhiều bệnh như: đau đầu, chữa ung nhọt, ho suyễn, gãy xương, phong thấp, chảy máu cam, nhiễm trùng, bệnh giang mai, tiêu chảy, ghẻ, sốt rét, v/v [ 4]. Trong y học cổ truyền, chúng cũng được sử dụng như các thuốc giảm đau, thuốc chống ho, tiêu chảy, chống viêm, chống ung thư, chống vi khuẩn, hạ sốt, chống loét sinh dục, diệt tinh trùng, tim mạch [5, 6]. Lõi gỗ của cây Sưa ở Việt Nam có giá trị kinh tế cao và được cho là có được sử dụng làm thuốc hiệu dụng. Đã có một số nghiên cứu ở Trung Quốc cho thấy lõi gỗ của loài Sưa Hải Nam Dalbergia odorifera được sử dụng để điều trị các bệnh về tim mạch như suy tim, viêm cơ tim, nhồi máu cơ tim và xơ vữa động mạch [7, 8]. Các nghiên cứu hóa học về các loài Dalbergia tập trung là nghiên cứu bộ phận gỗ và lá. Thành phần hóa học của các loài Dalbergia rất đa dạng và phong phú, ngoài lớp chất chính flavonoid như flavone, isoflavone, neoflavone, flavanone isoflavanone, isoflavanone glycosid. Ngoài ra còn có các phenol, phytosterol, sesquiterpen cùng các dẫn xuất của coumestan và coumaronochromone [9-12]. Ngoài ra, các loài Dalbergia còn sở hữu các tác dụng sinh học quý khác như tái tạo xương,

làm giãn động mạch vành, chống bệnh than, chống dị ứng, chống androgen, kháng viêm, gây độc tế bào ung thư, chống tia tử ngoại, kháng ký sinh trùng, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, diệt muỗi, ức chế enzyme Tyrosinase [12]. Loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) có hoa màu trắng, nhưng trong dân gian thường được gọi là “Sưa Đỏ” do lõi gỗ cây nhiều năm tuổi có màu đỏ và lõi gỗ đỏ này thường được buôn bán, săn lùng với giá trị cao bị khai thác quá mức, hiện có trong danh mục sách Đỏ Việt Nam (2007), phân hạng ở mức nguy cấp [13]. Tuy nhiên, cho đến nay loài Sưa ở Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ và toàn diện về thực vật học, thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Về mặt hóa học chỉ mới có một công trình nghiên cứu sơ bộ trong nước [14, 15]. Từ những cơ sở thực tiễn trên. Nhằm mục đích đi sâu nghiên cứu loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) một cách hệ thống và đầy đủ, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam''

Với mục tiêu nghiên cứu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) về các mặt: thực vật (vi phẫu, trình tự gen), thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.

Để đạt được các mục tiêu nêu trên, luận án đã thực hiện các nội dung sau: 1. Thu mẫu của loài nghiên cứu. 2. Nghiên cứu về thực vật (vi phẫu và trình tự gen) của loài này

3. Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain): điều chế cặn chiết và phân đoạn, phân lập các hợp chất từ cặn chiết bằng các phương pháp sắc ký. 4. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp hóa lý hiện đại. 5. Đánh giá tác dụng sinh học: kháng khuẩn và ức chế enzym -glucosidase của cao chiết tổng, cao chiết phân bố và một số hợp chất sạch phân lập từ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. KHÁI QUÁT VỀ HỌ ĐẬU (FABACEAE) VÀ CHI TRẮC (DALBERGIA) 1.1.1. Khái quát về họ Đậu (Fabaceae) Theo định nghĩa của hệ thống APG (Angiosperm Phylogeny Group) thì họ Đậu (danh pháp khoa học: Fabaceae), từ đồng nghĩa: Leguminosae (hay Fabaceae sensu lato) là một họ trong bộ Đậu. Đây là họ thực vật có hoa lớn thứ ba, sau họ Phong lan và họ Cúc, với khoảng 730 chi và 19.400 loài trên toàn thế giới. Các loài đa dạng tập trung nhiều trong các phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) và phân họ Đậu (Faboideae) [16].

Hình 1.1. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở TP. Buôn Ma Thuột

1.1.2. Khái quát về chi Trắc (Dalbergia) Theo cơ sở dữ liệu The Plant List, tính đến thời điểm 12/2018 chi Trắc (Dalbergia) có đến 647 loài, trong đó 304 loài đã được công nhận. Ở Việt Nam hiện đã thống kê được khoảng 27 loài [16]. Một số loài thuộc chi này có giá trị cao về gỗ như: Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain), Trắc (Dalbergia cochinchinensis), Hồng sắc Ấn Độ (Dalbergia latifolia) và Cẩm lai (Dalbergia oliveri). Về mặt hình thái Các loài thực vật thuộc chi Trắc (Dalbergia) là các cây có kích thước từ nhỏ đến trung bình, cây gỗ, cây bụi hoặc dây leo thân gỗ. Lá kép lông chim 1 lần lẻ, mọc cách. Hoa nhỏ, nhiều, có mùi thơm, hoa màu trắng hoặc màu kem, màu tím hoặc đôi khi có màu đỏ, bầu có đế, noãn ít, ngắn, cong, đầu nhụy nhỏ. Quả thuôn dài hình mũi mác, nhẵn, phẳng, lấy hạt. Hạt có hình bầu dục, dẹt và nhẵn, màu nâu sáng, không có phôi nhũ. Rễ phổ biến là mấu nhỏ [17].

Về giá trị Nhiều loài được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh khác nhau như: bệnh phong, sốt rét, loét miệng, chảy máu cam, chảy máu nhiều, tiêu chảy, khó tiêu, xuất huyết, bệnh thấp khớp, ghẻ lở, đau dạ dày, chấn thương, tăng chức năng của thận, làm khai thông kinh mạch huyệt đạo, chống lão hóa, bệnh lậu, bệnh giang mai. Một số loài được trồng vì mục đích thương mại, gỗ của chúng được sử dụng trong các ngành công nghiệp đồ nội thất và ngoài ra chúng còn có mùi thơm.

Hình 1.2. Sản phẩm từ gỗ chi Trắc (Dalbergia)

Sự phân bố Chi Dalbergia gồm nhiều loài phân bố chủ yếu ở Châu Á như vùng Đông Nam Á, Tây Á, Nam Á và một phần ở Đông Bắc Á, ở Châu Mĩ, Châu Phi và một số khu vực khác trên thế giới. Cụ thể, chúng phân bố nhiều ở các quốc gia: Indonesia, Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Myanmar, Brunei, Malaysia, Lào, Thái Lan, Singapore, Sri Lanka, Brazil, Mexico, Madagascar, Costa Rica, Bolivia, Guatemala, Mexico và Panama, Malawi, Mozambique, Tanzania, Zambia và Zimbabwe, Venezuela, Argentina, Ethiopia, Bờ Biển Ngà, Kenya, v/v [18]. 1.1.3. Tổng quan về loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Được đặt tên bởi Prain, 1901. Tên khoa học (Dalbergia tonkinensis Prain). Tên thường gọi là Sưa, Sưa trắng, Trắc bắc bộ, Trắc thối, Huỳnh đàn [17]. Về mặt hình thái Cây gỗ trung bình hay lớn, cao 15-25 m, đường kính đạt 0,5-0,7 m. Vỏ màu xám hay nâu xám, thịt vỏ nâu vàng, có mùi hơi tanh. Cây phân cành thấp, tán xòe rộng. Cành dài và mảnh, khi non màu xanh, sau chuyển xám xanh. Lá kép lông chim

một lần lẻ, mọc cách, mang 7-17 lá chét hình trứng hay bầu dục, gốc tròn, đầu có mũi nhọn ngắn, mặt trên xanh thẫm, dưới xanh nhạt, khi non màu xanh lá mạ, dài 4-5 cm, rộng 2,5-3 cm. Lá kép dài 15-30 cm, cuống chính màu xanh, gốc cuống hơi phình. Cây rụng lá vào mùa đông, già chuyển màu vàng, mép lá hơi cong về phía dưới. Cụm hoa là xim dạng chùy ở nách lá. Đài hoa hình chuông có 5 cánh xẻ thành 2 môi, đài màu xanh. Tràng hoa 5 cánh, có móng dài màu trắng. Nhị 10 hợp thành 2 bó. Ra hoa tháng 3-5, có quả tháng 9-11. Quả dẹt thuôn dài 5-7 cm, rộng 2-2,5 cm, bầu quả gần tròn, mỗi quả mang 1-2 hạt tròn dẹt nổi lên bề mặt vỏ quả. Gỗ thớ mịn, màu sắc đỏ nâu hoặc lâu tím, vân đen bốn mặt (màu sắc rất ảo diệu), cứng, thơm, không bị mối mọt [17, 19].

Hình 1.3. Một phần lõi gỗ, rễ và lá loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thu ở Tp.BMT

Giá trị khoa học và bảo tồn Đây là loài hiếm gặp trong rừng tự nhiên, được xếp vào nhóm sẽ nguy cấp (V) theo Sách Đỏ Việt Nam (năm 1996). Được xếp vào nhóm IA, theo Nghị định 32/2006/NĐ-CP thực vật rừng nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại [19]. Phân bố Ở Việt Nam: cây Sưa phân bố chủ yếu ở Lạng Sơn, Phú Thọ, Hà Nội, Quảng Bình, Nghệ An, Đắk Lắk [20]. 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI TRẮC (DALBERGIA) TRÊN THẾ GIỚI Tính đến thời điểm này, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và xác định thành phần hóa học của nhiều loài thuộc chi Trắc (Dalbergia) như: Dalbergia

oliveri, Dalbergia parvifolia, Dalbergia sisso, Dalbergia volubilis, Dalbergia frutescens, Dalbergia odorifera, v/v. Trong số đó thì loài Dalbergia lanceolaria (Pakistan và Bangladesh) được nghiên cứu đầu tiên vào năm 1967 bởi Malhotra và cộng sự, đã phân lập được hợp chất lanceolarin từ rễ loài này. Có khoảng 17 loài đã được nghiên cứu về hóa học (đã tìm thấy 235 hợp chất, trong đó có 40 chất mới từ các loài thuộc chi này). Trong số đó loài Dalbergia odorifera (Trung Quốc) và loài Dalbergia parviflora (Ấn Độ) được nghiên cứu nhiều nhất, bộ phận được nghiên cứu nhiều nhất là lõi gỗ. Hầu hết đại đa số các hợp chất được tách ra từ chi Dalbergia là các hợp chất phenolic. Đặc biệt đại đa số các hợp chất phenolic đó thì phần lớn ở dạng khung flavonoid (lớp chất chính, khoảng 142 chất thuộc lớp chất này đã được tách ra), bao gồm nhiều loại khung đặc trưng như: isoflavone, isoflavanone, flavanone, isoflavan, flavan, chalcon, uron. Ngoài ra còn có một số các lớp chất phenolic khác như: diary propanoid, dẫn xuất coumarin và lignan. Sau đây là bảng chúng tôi đã thống kê lại các loài trong chi Trắc (Dalbergia) trên thế đã được nghiên cứu về thành phần hóa học tính đến 12/2018 (bảng 1.1). Bảng 1.1. Các loài đã được nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Trắc (Dalbergia) trên thế giới (bao gồm tên loài, bộ phận và vùng lấy mẫu) Stt Tên loài Bộ phận Vùng lấy mẫu TLTK 1 D. oliveri Vỏ East Indies [21, 22] 2 D. volubilis Hoa Bangladesh [23] 3 D. retusa Lõi gỗ Costa Rica [24] 4 D. odorifera Lõi gỗ China [12, 25, 26, 27, 28, 29] 5 D. coromandeliana Lá India [29] 6 D. nigra Lá Brazil [30] 7 D. odorifera T. Chen Rễ, lõi gỗ China [31, 32] 8 D. frutescens Vỏ thân Argentina [33] Bangladesh and 9 D. sissoo Lá [34] Pakistan

10 D. cultrata Vỏ India, Thai Lan [12,35]

11 D. nigrescens Vỏ India, Thai Lan [12, 35]

12 D. louveliti Lõi gỗ Madagascar [36] 13 D. congestiflora Lõi gỗ Mexico [37] 14 D. candenatensis Lõi gỗ Indonesia [38] 15 D.parviflora Lõi gỗ Borneo [12, 39, 40, 41, 50] 16 D. melanoxylon Lõi gỗ Angola [43] 17 D. sissoides Lõi gỗ India [44]

Hợp chất phenolic thiên nhiên bao gồm một dãy lớn những hợp chất hữu cơ có vòng benzene liên kết trực tiếp với một hay nhiều nhóm hidroxyl. Hợp chất phenolic đơn giản nhất là phenol, còn lại là các polyphenol. Trong số các hợp chất phenolic thì các hợp chất khung flavonoid chiếm phần lớn. Đơn vị cơ bản của flavonoid bao gồm 15 carbon (C6-C3-C6 ). Tùy theo mức độ oxid hóa của mạch 3C, sự có mặt hay khiếm diện của nối đôi giữa C-2 và C-3 và nhóm carbonyl ở C-4 mà người ta phân biệt flavonoid thành các dạng khung sau: flavane, isoflavane, neoflavan, flavanone, flavone, isoflavone, neoflavone, chalcon, auron [45].

Ngoài ra còn các hợp chất phenolic còn các dạng khung: lignan (C6-C3)2, biflavonoid (C6-C3-C6)2, tannin (C6-C3-C6)n. Dựa trên cơ sở phân loại đó, khoảng 200 hợp chất gồm các phenolic phân lập từ chi Trắc (Dalbergia) có dạng khung C6-C3-C6 (flavonoid) cùng với các hợp chất phenolic khác được được chúng tôi thống kê dưới đây: 1.2.1. Hợp chất khung flavan Flavan là một trong những khung của lớp chất flavonoid. Các hợp chất này được tách chiết chủ yếu từ lõi gỗ 2 loài như: D. odorifera và D. candenatensis. Tác giả An và cộng sự trong bài công bố năm 2008 đã phân lập và xác định cấu trúc của 2 hợp chất từ lõi gỗ loài D. odorifera trong đó có 1 chất mới: (2S)-6,7,4′- trihydroxyflavan (1) cùng với 1 hợp chất đã biết: (2S)-6,4′-dihydroxy-7- methoxyflavan (1a)]. Năm 2009, Cheenpracha và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 10 hợp chất từ lõi gỗ loài D. candenatensis trong đó có 1 chất mới: candenantein E (1b).

Bảng 1.2. Các hợp chất flavan từ chi Trắc (Dalbergia) Kí hiệu Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK 1 (2S)-6,7,4′-trihydroxyflavan D. odorifera Lõi gỗ [46] (2S)-6,4′- dihydroxy-7- 1a D. odorifera Lõi gỗ [12] methoxyflavan 1b Candenatenin E D. candenatensis Lõi gỗ [38]

(2S)-6,7,4′-trihydroxyflavan (1)

R1=OH, R2=R3=H (2S)-6,4-dihydroxy-7-methoxyflavan (1a) R1=OCH3, R2=R3=H Candenantein E (1b) R1=H, R2=R3=OCH3 Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất khung flavan 1.2.2. Hợp chất khung isoflavan Các hợp chất isoflavan phân lập từ chi Dalbergia chủ yếu từ các loài như D. odorifera, D. parviflora, D. congestiflora, v/v, khá phong phú. Tác giả Yahara và cộng sự trong bài công bố năm 1989, phân tách trên cột silicagel với các dung môi rửa giải khác nhau đã phân lập và xác định cấu trúc của 12 chất trong đó có 5 chất từ lõi gỗ loài D. odorifera: (3R)- vestitol (2), (3R)-claussequinone (3), (3R)-5′-methoxyvestitol (4), (3R)-3′,8- dihydroxyvestitol (5), (3R,4R)-trans-2′,3′,7-trihydroxy-4′-methoxy-4[(3R)-2′,7- dihydroxy-4′-methoxyisoflavan-5′-y]isoflavan (6). Còn từ rễ của loài D. odorifera, có 9 hợp chất đã được phân lập trong đó có 3 isoflavan: odoriflavene (7), (3R)-5′-methoxyvestitol (4), (3R)-vestitol (2). Từ năm 2004 đến năm 2012, nhóm tác giả Yu, Huerta, Umehara, Songsiang và cộng sự đã phát hiện được 6 hợp chất khung isoflavan trong đó có 1 chất mới là vestitol [69′′, 7-O7′′] obtusaquinone (8) và 5 hợp chất đã biết: (3R)-vestitol (2), (3R)-mucronulatol (9), (3R)-5′-methoxyvestitol (4), và duartin (10). Các isoflavan chiết tách từ các loài thực vật chi Dalbergia được trình bày trong bảng 1.3.

Bảng 1.3. Các hợp chất isoflavan từ chi Trắc (Dalbergia) Ký Bộ hiệ Tên hợp chất Loài thực vật TLTK phận u D. parviflora 2 (3R)-vestitol Lõi gỗ [25, 26, 31, 41] D. odorifera 3 (3R)-claussequinone D. odorifera Lõi gỗ [25] D. parviflora Lõi gỗ, 4 (3R)-5′-methoxyvestitol [41, 47] D. odorifera rễ 5 (3R)-3′,8-dihydroxyvestitol D. odorifera Lõi gỗ [25] (3R, 4R)-trans-2′,3′,7- trihydroxy-4′- methoxy-4[(3R)-2′,7- 6 D. odorifera Lõi gỗ [25] dihydroxy-4′- methoxyisoflavan-5′- yl]isoflavan 7 Odoriflavene D. odorifera Rễ [47] Vestitol[6  9′′,7-O D. 8 Lõi gỗ [12] 7′′]obtusaquinone congestiflora D. oliveri 9 (3R)-mucronulatol Lõi gỗ [20, 23, 40, 41] D. parviflora 10 Duartin D. parviflora Lõi gỗ [40]

(3R)-vestitol (2) (3R)-5′- (3R)-3′,8- Odoriflavene (3R)-

R1=OH methoxyvest dihydroxyves (7) mucronul

R2=R3=R4=H itol (4) titol (5) R1=OH atol (9)

R1=OH R1=R2=R4=O R2=OCH3 R1=OCH3,

R2=R4=H H R3= R4=H R2=OH

R3=OCH3 R3=H R3=R4=H

Duartin (10)

R1=R4=O

CH3 vestitol[6  R2=OH, (3R)- 9′′,7-O R3=H claussequinone (3) (3R,4R)-trans-2′,3′,7- 7′′]obtusaquino trihydroxy-4′- ne (8) methoxy-4[(3R)-2′,7- dihydroxy-4′- methoxyisoflavan-5′- yl]isoflavan (6) Hình 1.5. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavan

1.2.3. Hợp chất khung neoflavan Tác giả Bezuidenhoudt và cộng sự trong bài báo công bố năm 1984 đã phân lập và xác định cấu trúc của 1 hợp chất từ thân gỗ loài D. nitidula: 1-(3S,4S)-3,4- trans-2′,7-dihydroxy-4′-methoxy-4-[(3S)-2′,7-dihydroxy-4′-methoxyisoflavan-5′- yl]isoflavan (14) [12]. Bảng 1.4. Các hợp chất neoflavan từ chi Trắc (Dalbergia) Ký Loài thực Tên hợp chất Bộ phận TLTK hiệu vật 1-(3S,4S)-3,4-trans-2′,7-dihydroxy- 11 4′-methoxy-4-[(3S)-2′,7-dihydroxy- D. nitidula Lõi gỗ [12] 4′-methoxyisoflavan-5′-yl]isoflavan

1-(3S,4S)-3,4-trans-2′,7-dihydroxy-4′-methoxy-4-[(3S)- 2′,7- dihydroxy-4′-methoxyisoflavan-5′-yl]isoflavan (11) Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ khung neoflavan 1.2.4. Hợp chất khung flavanol Qua tổng hợp tài liệu, có 2 chất thuộc nhóm này được báo cáo phân lập từ chi Trắc (Dalbergia). Năm 1989, Nunes và cộng sự đã phân lập 2 flavanol từ vỏ loài D.

monetaria: epifisetinidol-(4→8)-epicatechin (12) và epiguibourtinidol-(4→8)- epicatechin (13) [14]. Bảng 1.5. Các hợp chất flavanol từ chi Trắc (Dalbergia)

Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu

Epifisetinidol-(4→8)- 12 epicatechin D. monetaria Vỏ [12] Epiguibourtinidol-(4→8)- 13 epicatechin

Epifisetinidol-(4→8)-epicatechin (12) R=OH Epiguibourtinidol-(4→8)-

epicatechin (13) R=H

Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất khung flavanol

1.2.5. Hợp chất khung flavanone Flavanone là một trong những khung chính của lớp chất flavanoid, chúng được tìm thấy chủ yếu ở các 2 loài D. odorifera và D. parviflora. Các hợp chất naringenin (14), liquiritigenin (15), butin (16) được phân lập từ lõi gỗ loài D. odorifera. Bên cạnh đó trong thành phần loài D. odorifera có chứa rất nhiều flavanone khác như: 4′,5,7-trihydroxy-3-methoxyflavanone (17), (2S)-6,4′-dihydroxy-7- methoxyflavanone (18), carthamidin (19), eriodictoyl (20), (2S)-3′,5,5′,7- tetrahydroxyflavanone (21), (2S)-pinocembrin (22), (2S)-7-methoxy-4′,6- dihydroxyisoflavanone (23) và (2S)-pinostrobin (24).

Ở một số bộ phân khác như lá, rễ và thân gỗ, 3 hơp chất: naringenin (14), sophoraflavanone A (25), liquiritigenin (15) cũng được phân lập từ các loài D. parviflora, D. candenatensis, D. stevensonii, v/v. Các hợp chất naringenin (14), liquiritigenin (15), alpinetin (26), hesperetin (27), (2S)-pinocembrin (22) cũng được phân tách từ lõi gỗ loài D. parviflora. Các flavanone được tách ra từ các loài thực vật chi Dalbergia được trình bày trên bảng 1.6 như sau: Bảng 1.6. Các hợp chất flavanone từ chi Trắc (Dalbergia) Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu

D. odorifera [40, 14 Naringenin Lõi gỗ D. parviflora 48]

D. oliveri [12, 15 Liquiritigenin D. parviflora Lõi gỗ 40, 48] D. odorifera

16 Butin D. odorifera Lõi gỗ [48]

4′,5,7-trihydroxy-3- 17 D. odorifera Lõi gỗ [12] methoxyflavanone

(2S)-6,4′-dihydroxy-7- 18 D. odorifera Lõi gỗ [12] methoxyflavanone

19 Carthamidin D. odorifera Lõi gỗ [26]

20 Eriodictoyl D. odorifera Lõi gỗ [12]

(2S)-3′,5,5′,7- 21 D. odorifera Lõi gỗ [49] tetrahydroxyflavanone

D. parviflora [40, 22 (2S)-pinocembrin Lõi gỗ D. odorifera 49]

(2S)-7-methoxy-4′,6- 23 D. odorifera Lõi gỗ [49] dihydroxyisoflavanone

24 (2S)-pinostrobin D. odorifera Lõi gỗ [49]

25 sophoraflavanone A D. candenatensis Lõi gỗ [38]

26 Alpinetin D. parviflora Lõi gỗ [12]

27 Hesperetin D. parviflora Lõi gỗ [12]

Tên chất R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 Naringenin (14) OH H OH H OH H H Liquiritigenin (15) H H OH H H OH H Butin (16) H H OH OH OH H H

4′,5,7-trihydroxy-3- OH H OH H H OH OCH3 methoxyflavanone (17)

(2S)-6,4′-dihydroxy-7- H OH OCH3 H OH H H methoxyflavanone (18) Carthamidin (19) OH OH OH H OH H H Eriodictoyl (20) OH H OH OH OH H H (2S)-3′,5,5′,7- OH H OH OH H OH H tetrahydroxyflavanone (21) (2S)-pinocembrin (22) H H H OH H OH H (2S)-7-methoxy-4′,6- H OH H H OH OCH3 H dihydroxyflavanone (23)

(2S)-pinostrobin (24) H H H OH H OCH3 H SophoraflavanoneA (25) H OH H OH H OH Geranyl

Alpinetin (26) OCH3 H OH H H H H

Hesperetin (27) OH H OH H OCH3 OH H

1.2.6. Hợp chất khung isoflavanone Từ năm 1972 đến năm 2011, có 15 isoflavanone được được phân lập và xác định cấu trúc bởi nhóm tác giả Adinarayana, Donnelly, Chan, v/v. Các hợp chất được tách ra chủ yếu từ lõi gỗ của 6 loài: D. parviflora, D. paniculata, D. louvelii, D. odorifera, D. stevensonii và D. oliveri. Có 4 hợp chất mới đã được tìm thấy: (3R)-7,2′-dihyroxy-4′,5′- dimethoxyisoflavanone (28), dalparvin A (29), dalparvin B (30), (3R)-sativanone (31). Bên cạnh đó một số hợp chất đã biết: 3′-O-methylviolanone (32), (3R)-violanone (33), (3R)-vestitone (34), (3S)-secundiflorol H (35), (3R)-2′,3′,7-trihydroxy-4′- methoxyisoflavanone (36), dalparvin (37), lanceolarin (38), kenusanone G (39) và (3R)- 4′-methoxy-2′,3,7-trihydroxyisoflavanone (40) cũng được phân lập. Các isoflavanone này không chỉ được tách ra từ bộ phận lõi gỗ mà chúng còn được tìm thấy ở hạt, vỏ và thân gỗ của các loài. Một số hợp chất đã được phân lập như: dalpanin (41) và onogenin (42). Bảng 1.7. Các hợp chất isoflavanone từ chi Trắc (Dalbergia) Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu (3R)-7,2′- dihyroxy-4′,5′- 28 D. louvelii Lõi gỗ [12] dimethoxyisoflavanone 29 Dalparvin A D. parviflora Lõi gỗ [39] 30 Dalparvin B D. parviflora Lõi gỗ [29] 31 (3R)-sativanone D. odorifera Lõi gỗ [26, 41] 32 3′-O-methylviolanone D. odorifera Lõi gỗ [41, 50] D. odorifera 33 (3R)-violanone Lõi gỗ [47, 48] D. parviflora 34 (3R)-vestitone D. odorifera Thân gỗ [26] 35 (3S)-Secundiflorol H D. parviflora Vỏ [50] (3R)-2′,3′,7-trihydroxy-4′- 36 D.odorifera T. Chen Lõi gỗ [25] methoxyisoflavanone 37 Dalparvin D. parviflora Lõi gỗ [41] 38 Lanceolarin D. odorifera Thân gỗ [12] 39 Kenusanone G D. parviflora Lõi gỗ [39] (3R)-4′-methoxy-2′,3,7- 40 D. odorifera Lõi gỗ [12] trihydroxyisoflavanone 41 Dalpanin D. paniculata Hạt [12] 42 Onogenin D. stevensonii Lõi gỗ [12]

Tên chất R1 R2 R3 R4 R5 R6 TLTK (3R)-7,2′- dihyroxy-4′,5′- H H OH H OCH3 H [12] dimethoxyisoflavanone (28)

Dalparvin A (29) OH H OCH3 H OH H [39]

Dalparvin B (30) H H OH OCH3 H H [39]

(3R)-sativanone (31) H H OCH3 H H H [26, 41]

3-O-methylviolanone (32) H H H H OCH3 OCH3 [41, 50]

(3R)-violanone (33) H H OCH3 OH H H [47, 48] (3R)-vestitone (34) H H OH H H H [12]

(3S)-Secundiflorol H (35) OH H OCH3 OH H H [50] (3R)-2′,3′,7-trihydroxy-4′- H H OH OH H H [25] methoxyisoflavanone (36)

Dalparvin (37) H H OCH3 H OH H [41] Lanceolarin (38) OH H H H H H [12] Kenusanone G (39) H H H OH H H [39] (3R)-4′-methoxy-2′,3,7- H H OH H H H [12] trihydroxyisoflavanone (40)

Onogenin (42)

Dalpanin (41) Hình 1.8. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavanone 1.2.7. Hợp chất khung flavanonol Nhóm tác giả Donnelly, Umehara, Songsiang và cộng sự đã phân lập được 50 hợp chất trong đó đã phát hiện được 4 flavanonol bao gồm 1 hợp chất mới là: dalparvinol C (43) và 3 hợp chất đã biết: 3,5,7-trihydroxyflavonol (44), ericibenin D (45), alpinetin (46). Các flavanonol được tách từ các loài thực vật chi Dalbergia được tóm tắt ở bảng 1.8.

Bảng 1.8. Các hợp chất flavanonol từ chi Trắc (Dalbergia) Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu 43 Dalparvinol C D. parviflora Lõi gỗ [39] 44 3,5,7-trihydroxyflavonol D. parviflora Thân gỗ [50] 45 Ericibenin D D. parviflora Thân gỗ [41] 7-hydroxy-5- 46 D. parviflora Thân gỗ [50] methoxydihydroflavonol Dalparvinol C (43)

R1= R5=OCH3, R2= R4=OH, R3=H 3,5,7-trihydroxyflavonol (44)

R1=R2=H, R3=OH, R4=OCH3 Ericibenin D (45)

R1=OCH3, R2=R5=OH, R3= R4=H

7-hydroxy-5- methoxydihydroflavonol (46)

R1=R2= R4=H, R5=OH, R3=OCH3 Hình 1.9. Cấu trúc các hợp chất khung flavanonol

1.2.8. Hợp chất khung isoflavanonol Các isoflavanonol được tách ra chủ yếu từ lõi gỗ của các loài D. odorifera, D. parviflora và loài D. melanoxylon. Trong những năm gần đây từ 2008 đến 2013 đã có 6 isoflavanonol được phân tách bởi nhóm tác giả Umehara, Zhao, Lee và Mutai cùng các cộng sự bao gồm 1 hợp chất mới là dalparvin C (47) và các hợp chất đã biết: (3R)-2′,3,7-trihydroxyisoflavanone (48), (3S)-2′,4′-dimethoxy-3,7- dihydroxyisoflavanone (49), isodalparvinol B (50), kenusanone F7-methyl ether (50) và sophoronol-7-methyl ether (51).

Bảng 1.9. Các hợp chất isoflavanonol từ chi Trắc (Dalbergia) Ký TLT Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận hiệu K 47 dalparvin C D. parviflora Lõi gỗ [ 39] D. odorifera Lõi gỗ [26, 48 (3R)-2′,3,7-trihydroxyisoflavanone D. parviflora Thân gỗ 49] (3S)-2′,4′-dimethoxy-3,7- 49 D. odorifera Lõi gỗ [49] dihydroxyisoflavanone 50 isodalparvinol B D. parviflora Lõi gỗ [39] 51 kenusanone F7-methyl ether D. melanoxylon Lõi gỗ [43] 52 sophoronol-7-methyl ether D. melanoxylon Lõi gỗ [43]

Dalparvin C (47) (3S)-2′,4′-dimethoxy-3,7- Kenusanone F 7- Sophoronol-7-

R=OCH3 dihydroxyisoflavanone methyl ether (51) methyl ether (52)

(49) R1=OCH3, R2=H (3R)-2′,3,7- Isodalparvinol B (50) trihydroxyisoflavan R1= R2=OH one (48) R=H Hình 1.10. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavanonol

1.2.9. Hợp chất khung flavone Trong khoảng thời gian từ năm 1988 đến năm 2000, nhóm tác giả Bezuidenhoudt, Borai, Wang và cộng sự đã phân lập được 3 flavone từ lõi gỗ, lá và rễ của 3 loài: D. nitidula, D. stipulacea và D. odorifera. Vestitol-(5′→2)-2′-hydroxyformononetin (53) là hợp chất đầu tiên phân lập và xác định cấu trúc bởi Bezuidenhoudt và cộng sự.

Sau đó, luteolin (54) và 4′,5,7- trihydroxy-3-methoxyflavone (55) được phát hiện từ các loài trên và chúng có cấu tạo chung như sau: Bảng 1.10. Các hợp chất flavone từ chi Trắc (Dalbergia) Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu Vestitol-(5′→2)-2′- 53 D. nitidula Lõi gỗ [12] hydroxyformononetin 54 Luteolin D. stipulacea Lá [12, 51] 4′,5,7- trihydroxy-3- 55 Rễ [12, 51] methoxyflavone D. odorifera T chen

(53)

Luteolin (54) R1=OCH3, R2=H

4′,5,7- trihydroxy-3-methoxyflavone

(55) R1=H, R2=OH

Hình 1.11. Cấu trúc các hợp chất khung flavone 1.2.10. Hợp chất khung isoflavone Qua tổng hợp tài liệu, có 36 hợp chất thuộc nhóm này được báo cáo phân lập từ chi Trắc (Dalbergia) trong đó đã phát hiện được 3 chất mới là olibergin A (68), dalparvone (84) và dalparvone B (85). Các chất được tách ra chủ yếu từ 9 loài khác nhau như: D. volubilis, D. retusa, D. frutescens, D. odorifera, D. louvelii, v/v. Ngoài bộ phận được nghiên cứu nhiều nhất là lõi gỗ, chúng còn được phân lập từ hoa, lá, vỏ và thân gỗ các loài. Đây là một dạng khung chính của chi này.

Bảng 1.11. Các hợp chất isoflavone từ chi Trắc (Dalbergia)

R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 TLT K Volubilin (56) H H OCH3 H OH H OCH3 Rha [12, 23] Isovolubilin (57) H H OCH3 H OH Rha OCH3 H [12, 23] Retusin (58) H H OCH3 H H H OH OH [12, 24] 8-O-methylretusin H H OCH3 H H H OH OCH3 [12, (59) 24] ’ 3 -methoxydaidzein H OCH3 OH H H H OH H [31, (60) 41] Daidzein (61) H H OH H H H OH H [33, 49] Biochanin (A) (62) H H OCH3 H OH H OH H [33, 34] Genistein (63) H H OH H OH H OH H [12] Castanin (64) H H OCH3 H H OCH3 OH H [33] Odoratin (65) H OH OCH3 H H OCH3 OH H [33] Glycitein (66) H H OH H H OCH3 OH H [33] Caviunin (67) OCH3 H OCH3 OCH3 H OCH3 OH H [34] OliberginA (68) OCH3 H OH OCH3 OH H OH H [49, 52] Formononetin (69) H H OCH3 H H H OH H [33, 49] Pseudobaptogenin H H OCH2O H H H OH H [33] (70) Cuneatin (71) OCH3 H OCH2O H H H OH H [33] 7,4′-dihydroxy-3′- H H OH OCH3 H H OH H [12] methoxyisoflavone (72) 3′,7-dihydroxy-2′,4′- OCH3 OH OCH3 H H H OH H [21, dimethoxyisoflavone 41] (73) Khrinones A (74) OH H OCH3 OH H H OH H [41]

2′-ethoxyformononetin OCH3 H OCH3 H H H OH H [41, (75) 49] Calycosin (76) H OH OCH3 H H H OH H [41] Khrinone B (77) OH H OCH3 OH OH H OH H [41] Khrinone C (78) OCH3 OH OCH3 H OH H OH H [41]

Khrinone D (79) OCH3 H OCH2O H OH H OH H [41]

7-demethylrobustigenin OCH3 H OCH3 OCH3 OH H OH H [41] (80)

Theralin (81) OCH3 H OH H OH H OH H [41]

’ 2 -methoxybiochanin OCH3 H OCH3 H OH H OH H [41] A (82)

Pratensein (83) H H OCH3 OH OH H OH H [34, 41]

Dalparvone (84) OCH3 H OCH3 OH OH H OH H [40]

Dalparvone B (85) OCH3 H OH OH OH H OH H [50] 5,7,3′,4′- H OH OH H OH H OH H [50] tetrahydroxyisoflavo ne (86)

2′-hydroxybiochanin OH H OCH3 H OH H OH H [50] A (87)

Tectorigenin (88) H H OH OCH3 H OCH3 OH H [41] Cajanin (89) OH H OH H H H OH H [39]

Fujikinetin (90) H H OCH2O H H OCH3 OH H [33]

Olibergin B (91) 5-hydroxybowdichione (92) Bowdichione (93) Hình 1.12. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavone 1.2.11. Hợp chất khung neoflavone Từ 2 loài D. sissoo và D. congestiflora 2 hợp chất neoflavone được phân lập. Năm 1971, Mukerjee và cộng sự đã phân tách được hợp chất dalbergichromene (94) từ vỏ và lõi gỗ loài D. sissoo. Đến năm 2004, Barragán- Huerta và cộng sự cũng phân lập và xác định cấu trúc hóa học 1 hợp chất có cấu tạo phức tạp hơn là: neocandenatone (95). Bảng 1.12. Các hợp chất neoflavone từ chi Trắc (Dalbergia) Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu 94 Dalbergichromene D. sissoo Lõi gỗ [12] 95 Neocandenatone D. congestiflora Lõi gỗ [12]

Dalbergichromene (94) Neocandenatone (95) Hình 1.13. Cấu trúc các hợp chất khung neoflavone 1.2.12. Hợp chất khung 4-aryl-coumarin Từ năm 1968 đến năm 2010, đã có 14 hợp chất thuộc khung 4-aryl-coumarin được phân lập và xác định cấu trúc bởi nhóm tác giả Chan, Liu, Kite,v/v. Các chất tách ra chủ yếu là từ bộ phận lõi gỗ, ngoài ra còn phân lập từ lá và thân gỗ. Trong số các loài thuộc chi này, phải kể đến 7 loài được nghiên cứu nhiều như: D. cultrata, D. nigra, D. volubilis, D. odorifera, D. sissoo, D. Baronii và D. stevensonii . Các hợp chất được phân lập từ các loài này có cấu tạo chung như sau:

R1 R2 R3 R4 R5 TLTK

Melannein (96) H OH OCH3 H OH [12] 4-Phenylcoumarin H H H H H [12] (97)

Isodalbergin (98) H OCH3 OH H H [51] [12, Nordalbergin (99) H OH OH H H 53]

Dalbergin (100) H OH OCH3 H H [12]

Stevenin (101) H OH OCH3 OH H [12]

Volubolin (102) H H OH OH OCH3 [12]

Seshadrin (103) OCH3 H OH OH OCH3 [12]

Voludal (104) OCH3 CHO OH OH OCH3 [12] 7,3′-dihydroxy-5,4′- dimethoxy-6-

formyl-4- OCH3 CHO OH OH OCH3 [12] phenylcoumarin (105) 7,3′-dihydroxy-4′- methoxy-4- H H OH OH OCH3 [12] phenylcoumarin (106)

3'-

Hydroxymelanettin H OH OCH3 OH OH [12] (107)

Melanettin (108) H OH OCH3 H OH [12] [51, Dalnigrin (109) H OH OCH3 H OCH3 53]

Hình 1.14. Cấu trúc các hợp chất khung 4-aryl-coumarin 1.2.13. Hợp chất khung aurone Aurone là một dạng khung đặc biệt, chỉ tìm thấy 1 hợp chất duy nhất. Vào năm 2011, Zhao và cộng sự đã phân lập được hợp chất sulfuretin (110) từ lõi gỗ của loài D. odorifera có công thức cấu tạo như sau [12]:

Sulfuretin (110) Hình 1.15. Cấu trúc các hợp chất khung aurone 1.2.14. Hợp chất khung chalcone Qua tổng hợp tài liệu thấy rằng, các hợp chất thuộc khung chalcone được phân lập tương đối ít, bộ phận nghiên cứu chủ yếu ở đây là lõi gỗ của loài D. odorifera. Chỉ có 7 hợp chất được xác định công thức hóa học, trong số đó có 1 chất mới là 4,2′,5′-trihydroxy-4′-methoxychalcone (115). Bảng 1.13. Các hợp chất chalcone từ chi Trắc (Dalbergia)

Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu

α,2′,3,4,4′- [49] 111 D. odorifera Lõi gỗ pentahydroxydihydrochalcone

α,2′,4,4′- 112 D. odorifera Lõi gỗ [49] tetrahydroxydihydrochalcone

113 Butein D. odorifera Lõi gỗ [29, 49]

114 2′-O-methylisoliquilitigenin D. odorifera Lõi gỗ, rễ [25, 47]

4,2′,5′-trihydroxy-4′- 115 D. odorifera Lõi gỗ [46] methoxychalcone

D. oliveri 116 Isoliquiritigenin D. louvelii Lõi gỗ [12, 41] D. odorifera

117 4′-hydroxy-2′-methoxychalcone D. cochinchinesis Lõi gỗ [17, 54]

Công thức cấu tạo của các hợp chất chalcone được mô tả chi tiết ở hình 1.16.

α,2′,3,4,4′-pentahydroxydihydrochalcone (111)

α,2′,4,4′- tetrahydroxydihydrochalcone (112)

R1 R2 R3 R4 R5 R6 TLTK Butein (113) OH OH OH OH H H [29, 49] 2′-O-methylisoliquilitigenin H OH H OH H OCH3 [25, 47] (114)

4,2′,5′-trihydroxy-4′- H OH OH OCH3 OH H [46] methoxychalcone (115)

OCH3 O Isoliquiritigenin (116) 4′-hydroxy-2′-methoxychalcone (117) Hình 1.16. Cấu trúc các hợp chất khung chalcone

Để thấy được sự đa dạng về thành phần hóa học của chi Trắc (Dalbergia), bên cạnh việc nghiên cứu lớp chất chính flavonoid, chúng tôi còn tìm hiểu một số hợp chất được tách ra từ các khung khác như: diaryl propanoid, cumarin và dẫn xuất, lignan, terpenoid, benzophenon và một số lớp chất khác. 1.2.15. Lớp chất diaryl propanoid Trong những năm 1978 đến 2011, từ lõi gỗ của 7 loài: D. candenatensis, D. odorifera, D. parviflora, D. cultrata, D. nigrescens, D. retusa, D. louvelii đã phát hiện được 66 hợp chất trong đó có 19 diaryl propanoid. Một số hợp chất diaryl propanoid đặc trưng như: dalberatin A (118), dalberatin B (119), dalberatin C (120), dalberatin D (121) và dalberatin E (122). Trong đó dalberatin A (118) và dalberatin B (119) là 2 hợp chất mới được tìm thấy [35]. Năm 2009 công bố của 4 tác giả Cheenpracha, Choi, Umehara, Songsiang và cộng sự đã phân lập được 6 diaryl propanoid từ lõi gỗ các loài D. candenatensis, D. odorifera, D. parviflora trong đó có 4 hợp chất mới là candenatenin A (123) [35], candenatenin B (124), candenatenin C (125) và candenatenin D (126) [38] và 1 hợp chất đã biết là hydroxyobustyrene (127) [41]. Ngoài ra, một số các hợp chất thuộc lớp chất này cũng được phân lập như: isomucronustyrene (128), xenognosin A (129), obtusanstyrene (130), obtustyrene (131) và dalparvinene B (132) cũng được tìm thấy [24, 50].

1.2.16. Lớp chất cumarin và dẫn xuất

Dalberatin A (118) Dalberatin B Dalberatin C Dalberatin D Dalberatin E

R1= R5=OCH3 (119) (120) (121) (122)

R2= R4=OH, R3=H R1= R4=OH R1= R1= R5=OH R1=OCH3

R2=H R4=OCH3 R2=H R1=H

R3= R5=OCH3 R2= R5=OH R3= R2= R4=R5=OH

R3=H R4=OCH3

Candenatenin A( 123) Candenatenin B Candenatenin D (126) (124) R=H Candenatenin C(125)

R=OCH3

Hydroxyobustyrene (127) R1=H, R2=H2,

R3=OCH3, R4=OH

Isomucronustyrene Xenognosin A Obtusanstyrene Obtustyrene Dalparvinene (128) (129) (130) (131) B (132)

R1= R2=H, R4=OH R1= R3=OH R1= R2= R4= R1= R2= R1= R4=H

R3= R5=OCH3 R2= R4=H R5=H R4=H R2=OCH3

R5=OCH3 R3=OH R3= R5=OH

R3=OH

R5=OCH3

Hình 1.17. Cấu trúc các hợp chất diaryl propanoid

Donnelly và cộng sự (1974) đã phân lập 5 hợp chất từ lõi gỗ loài D. oliveri, trong đó có chất: 7,2′-dihydroxy-4′-methoxy-3-phenylcoumarin (133) [22]. Beldjoudi và cộng sự (2003) đã phân lập 1 hợp chất mới từ lõi gỗ loài D. louvelii: 3-(2,4-dihidroxy-5-methoxy) phenyl-7-hydroxycoumarin (134) [12]. 7,2′-dihydroxy-4′-methoxy-3- phenylcoumarin

(133) R1=H, R2=OCH3 3-(2,4-dihidroxy-5-methoxy)phenyl-7-

hydroxycoumarin (134) R1=OCH3, R2=OH 1.2.17. Lớp chất lignan Hình 1.18. Cấu trúc các hợp chất cumarin và dẫn xuất

Lignan là một lớp chất tồn tại phổ biến trong tự nhiên. Về mặt cấu tạo chúng được tạo bởi 2 đơn vị phenyl propanoid. Donnelly và cộng sự (1973) đã phân lập 1 hợp chất từ lõi gỗ loài D. stevensonii: medicarpin (135) [31, 40]. Chawla và cộng sự (1976) đã phân lập 1 hợp chất từ hoa và lõi gỗ loài D. volubilis và D. congestiflora : (+)-(6aS,11aS)–3-acetoxy-9-methoxypterocarpan (136) [35]. Songsiang và cộng sự (2011), đã phân lập từ lõi gỗ loài D. parviflora được 15 hợp chất, trong đó có 2 chất: 4-hydroxy-3-methoxy-8,9-methylenedioxypterocarpan (137) và 3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan (138) [49].

Medicarpin (135)

4-hydroxy-3-methoxy- 3,8-dihydroxy-9- 8,9- methoxypterocarpan methylenedioxypterocarp (138)

(+)-(6aS, 11aS) –3-acetoxy- an (137) R1= R3=OH, R2=OCH3, 9-methoxypterocarpan (136) R1= R3=OCH3, R2= R4=H

R4=OH

Hình 1.19. Cấu trúc các hợp chất ligan 1.2.18. Lớp chất benzophenon Qua tổng hợp tài liệu cho thấy các hợp chất benzophenon được tìm thấy rất ít. Chỉ có 2 hợp chất được phân lập: 2,4-dihydroxy-5-methoxybenzophenone (139), 2- methoxy-3-hydroxyxanthone (140), chúng được tách ra từ rễ và lõi gỗ loài D. odorifera [25, 48].

2,4-dihydroxy-5- 2-methoxy-3-

methoxybenzophenone (139) hydroxyxanthone (140)

Hình1.20. Cấu trúc các hợp chất benzophenon

1.2.19. Lớp chất terpenoid Terpenoid cũng được tìm thấy ở Chi này. Tao và cộng sự (2010) đã phân lập 2 hợp chất terpenoid từ loài D. odorifera T. Chen là (3S,6R,7R)-3,7,11-trimethyl-3,6- epoxy-1,10-dodecadien-7-ol (141) và (3S,6S,7R)-3,7,11-trimethyl-3,6-epoxy-1,10- dodecadien-7-ol (142) [56]. Songsiang và cộng sự (2011), đã phân lập từ lõi gỗ loài D. parviflora được 15 hợp chất, trong đó có chất: dalberpene (143) [50].

OH O

(3S,6R,7R)-3,7,11- (3S,6S,7R)-3,7,11- Dalberpene (143) trimethyl-3,6-epoxy- trimethyl-3,6-epoxy-1,10- 1,10-dodecadien-7-ol dodecadien-7-ol (142) (141) Hình 1.21. Cấu trúc các hợp chất terpenoid

1.2.20. Các lớp chất khác Bên cạnh những lớp chất phenol chính được liệt kê trong các nghiên cứu ở trên, còn có rất nhiều hợp chất phenolic dạng khung khác từ các loài Dalbergia cũng được phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Các hợp chất được phân lập bởi nhóm tác giả Van Heerden, Songsiang, Cheenpracha, Dixit, Kuroyanagi, v/v có công thức cấu tạo như sau:

(6aR,llaR)-3,8-dihydroxy-9- 3-hydroxy-2,4-dimethoxybenzaldehyde methoxyptcrocarpan (144) [12] (145) [28, 50]

(3R)-calussequinone (146) [28] genistein-6-C-glucoside (147) [12]

Maackiain (148) [12] Obtusafuran (149) [12]

(R)-4-methoxydalbergione (150) [36] (S)-4-methoxydalbergione (151) [12]

Cearoin (152) [27] Nutiducol (153) [12] R=Geranyl

Geranyl

Latifolin (154) 2,4,5-trimethoxy- 5-O- 4,5-dimethoxy-2- [[12, 49]] 3’- methoxylatifolin hydroxydalbergiquinol

R1= R4=H hydroxydalbergiqui (156) [12] (157) [49]

R2=CH3, nol (155) [49, 53] R1= R2=CH3 R1=CH3

R3=OH R1= R2=CH3 R3=OH, R4=H R2= R3= R4=H

R3=H, R4=OH

Latinone (158) [54] Candenatenin F (159) [38]

(E)-4-methoxy-2-(3,4-dihydroxybenzylidene)-4-oxobutanoic acid (160) [12] Hình 1.22. Cấu trúc các hợp chất khác 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI TRẮC (DALBERGIA) Ở VIỆT NAM Ở Việt Nam có 27 loài và đã có 4 loài được nghiên cứu về mặt hóa học. Đã tách ra 26 chất, trong đó có 5 hợp chất mới được tách ra [15, 17, 51]. Các nghiên cứu được chúng tôi thống kê cụ thể (bảng 1.14). Bảng 1.14. Danh sách các loài Dalbergia đã được nghiên cứu về thành phần hóa học ở Việt Nam

Vùng lấy Stt Tên loài Bộ phận TLTK mẫu

D. cochinchinensis [17, 1 Thân gỗ (giác và lõi) Đăk Lăk (Trắc) 54]

D. tonkinensis 2 Chưa rõ bộ phận Miền Bắc [15] (Sưa)

3 D. vietnamensis (Trắc Gai) Thân gỗ (giác và lõi) Đăk Lăk [70]

4 D. oliveri (Cẩm Lai) Thân gỗ (giác và lõi) Đăk Lăk [64]

Shirota và công sự (2003), đã phân lập được 6 hợp chất từ lõi gỗ loài D. cochinchinensis. Trong đó có 3 hợp chất mới: 2-[4,5-dimethoxy-5-(3-phenyl-trans- allyl)cyclohexa-3,6-dien-2-on-1-ylmethyl]-5-hydroxy-6-methoxy-3- phenylbenzofuran (161), 2-[4,5-dimethoxy-2-(3-phenyl-trans-allyloxy)benzyl]-5- hydroxy-6-methoxy-3-phenylbenzofuran (162), 2-(2-hydroxyl-1-methyl-2 - phenylethyl)-4,5-dimethoxyphenol (163) và 3 hợp chất đã biết: 4′-hydroxy-2′- methoxychalcone (117), latinone (158) và dalbergiphenol (164) [54]. Trần Tuấn Anh và cộng sự (2009), đã phân lập được 3 hợp chất từ loài D. tonkinensis : genistein (63), lanceolarin (38) và 9,10-threo-3-[7-(3,10-dihydroxy-9- hydroxymethyl-2,5-dimethoxy)-9,10- dihydrophenanthrenyl]propenal (165) [15]. Phạm Thanh Loan và cộng sự (2012) đã phân lập được 4 hợp chất từ thân gỗ của loài D. vietnamensis (Trắc Gai), trong đó có 2 hợp chất đã biết: caviunin (67) , caviunin [7-O--D- apiofuranosyl-(16)--D-glucopyranoside] (166) và 2 hợp chất mới: dalspinosin 7-O-[-D-apiofuranosyl-(16)--D-glucopyranoside] (167) và caviunin[7-O-(5-O-trans-p-coumaroyl)--D-apiofuranosyl-(16)--D- glucopyranoside] (168) [70]. Cùng thời gian này, Phạm Thanh Loan và cộng sự (2012) đã phân lập được 9 hợp chất từ thân gỗ của loài D. oliveri (Cẩm Lai): liquiritigenin (15), (3R)-5′- methoxyvestitol (4), (6aS,11aS)-medicarpin (169), (6aS,11aS)-8-hydroxymedicarpin (170), maackiain (148), formononetin (67), (3R)-violanone (33) và isoliquiritigenin (116) và 4 hợp chất từ thân gỗ của loài D. cochinchinensis (Trắc): 5-O-methyllatifolin (156), 2,4,5-trimethoxydalbergiquinol (171), (S)-4-methoxydalbergione (151) và obtusafuran (149) [17, 51].

Dalbergia cochinchinensis

2-[4,5-dimethoxy-5-(3-phenyl- 2-[4,5-dimethoxy-2-(3-phenyl- 2-(2-hydroxyl-1-methyl-2 - trans-allyl) cyclohexa-3,6-dien- trans-allyloxy)benzyl]-5- phenylethyl)-4,5- 2-on-1-ylmethyl]-5-hydroxy-6- hydroxy-6-methoxy-3- dimethoxyphenol methoxy-3-phenylbenzofuran phenylbenzofuran (163) (161) (162)

4’-hydroxy-2’-methoxychalcone latinone (158) dalbergiphenol (164) (117)

5-O-methyllatifolin 2,4,5- (S)-4-methoxydalbergione (156) trimethoxydalbergiquinol (151) (171)

Obtoxafuran (149) Dalbergia tonkinensis (Sưa)

genistein (63) lanceolarin (38) 9,10-threo-3-[7-(3,10-dihydroxy- R1= R2= R4= R6= R8=H R1=OCH3, R2= R4=H 9-hydroxymethyl-2,5-dimethoxy)- R3= R5= R7=OH R3=-β-D-Apiofuranosyl- 9,10- (16)-β-D-glucopyranoside dihydrophenanthrenyl]propenal (165) Dalbergia vietnamensis (Trắc Gai)

Dalspinosin 7-O-[-D-apiofuranosyl-(16)-- Caviunin [7-O-(5-O-trans-p-coumaroyl) -- D-glucopyranoside] (167) D- apiofuranosyl-(16)--D- glucopyranoside] (168)

Caviunin (67) Caviunin [7-O--D- apiofuranosyl-(16)-- R1= R3= R4= R6=OCH3 D- glucopyranoside] (166) R2= R5= R8=H, R7=OH

Dalbergia oliveri (Cẩm Lai)

liquiritigenin (15) (3R)-5′-methoxyvestitol (4) (6aS,11aS)-medicarpin (169)

(6aS,11aS)-8- Maackiain (148) Formononetin (67) hydroxymedicarpin (170) R1= R2= R3= R4= R5= R6=H

(3R)-Violanone (33) Isoliquiritigenin (116)

Hình 1.23. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ chi Trắc (Dalbergia) ở Việt Nam

Qua các nghiên cứu hóa học ở Việt Nam về chi Trắc (Dalbergia), chúng tôi nhận thấy: việc nghiên cứu thành phần hóa học các loài còn đang rất ít. Chỉ có 4 loài trên tổng số 27 loài được nghiên cứu về mặt hóa học. Đặc biệt những nghiên cứu hóa học về loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) vẫn còn khiêm tốn và chỉ mới phân lập được 3 hợp chất. 1.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHI TRẮC (DALBERGIA) Từ năm 1967 đến nay, khoảng hơn 259 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ các bộ phận của 21 loài thuộc chi Trắc (Dalbergia), trong đó có khoảng 42 hợp chất mới. Cùng với quá trình nghiên cứu về mặt hóa học, thì việc nghiên cứu hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của các cặn chiết, các hợp chất tinh khiết từ chi này luôn được phát triển và hoàn thiện. Kết quả nghiên cứu cho thấy chi Trắc Dalbergia có phổ hoạt tính sinh học rộng và mạnh [12]. Một số hoạt tính đáng quan tâm như kháng u, kháng ung thư, kháng viêm, kháng dị ứng, kháng trùng sốt rét, chống oxy hoá, kháng dị ứng, chống huyết khối, kìm hãm estrogen, hoạt tính giảm đau, kháng vi sinh vật kiểm định. Trong đó, nổi bật là các hoạt tính kháng androgen, tác dụng tim mạch, gây độc một số dòng tế bào ung thư khác nhau tập chung vào lớp chất flavone và flavanone của loài D. odorifera [ 27, 58-60]. 1.4.1. Hoạt tính chống oxi hóa Năm 2006, Sofidiya và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống oxi hóa từ cao chiết methanol của loài D. saxatilis, kết quả cho thấy cặn chiết này có tác dụng chống oxi hóa trên hệ 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl [61]. Đến năm 2011, Khalid và cộng sự đã nghiên cứu và đánh giá về khả năng chống oxi hóa của dịch chiết EtOH từ vỏ của loài Hồng Sắc Ấn Độ D. latifolia bằng nhiều phương pháp khác nhau được tiến hành trên hệ DPPH, NO, thiocyanate. Kết quả cho thấy chúng có khả năng chống oxi hóa [62].

Cũng trong thời gian này Bala và cộng sự cũng báo cáo dịch chiết methanol của vỏ loài D. spinosa có khả năng chống lại gốc tự do DPPH rất tốt [63]. Ngoài một số kết quả nghiên cứu nước ngoài thì một số nghiên cứu được báo cáo bởi trong nước bởi Phạm Thanh Loan (2014) và cộng sự, kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa trên hệ DPPH từ dịch chiết MeOH của lá, cành và quả của loài Sưa (D. tonkinensis) cho thấy: Dịch chiết MeOH từ quả loài Sưa (D. tonkinensis) có tác dụng quét gốc tự do trên hệ DPPH ở mức trung bình với giá trị SC50 là 117,5 휇g/ml so với axit ascorbic (SC50 là 20,5 휇g/ml); Dịch chiết từ các bộ phận còn lại không thể hiện hoạt tính chống oxi hóa trên hệ DPPH. Tiếp đó đánh giá khả năng bảo vệ tế bào gan khỏi tác nhân oxi hóa từ dịch chiết MeOH của lá, cành loài Sưa (D. tonkinensis). Kết quả cho thấy chúng không có khả năng bào vệ tế bào gan dưới tác động của tác nhân oxi hóa H2O2 tại nồng độ 100 휇g/ml. Cũng nhóm tác giả này đã tiến hành đánh giá thêm khả năng bảo vệ tế bào gan khỏi tác nhân oxi hóa từ dịch chiết MeOH của gỗ loài Trắc (D. cochinchinensis). Các hợp chất được sàng lọc ở nồng độ ban đầu là 100 휇g/ml. Kết quả cho thấy dịch chiết MeOH từ gỗ loài Trắc (D. cochinchinensis) có khả năng bào vệ được trên

50% tế bào gan dưới tác động của tác nhân oxi hóa H2O2 tại nồng độ 100 휇g/ml. Vì vậy, chúng được tiếp tục nghiên cứu và xác định giá trị ED50 (là giá trị hoạt chất tại đó bảo vệ 50% sự sống sót của tế bào gan). Kết quả cho thấy dịch chiết MeOH của gỗ loài Trắc (D. cochinchinensis) đã thể hiện hoạt tính bảo vệ tế bào gan mạnh với giá trị ED50 là 9,39 휇g/ml tương đương với curcumin (ED50 là 8,99 휇g/ml) [17].

Bảng 1.15. Giá trị ED50 của dịch chiết MeOH từ gỗ loài Trắc (D. cochinchinensis) % sự sống sót Nồng độ (휇g/ml) Dịch chiết MeOH từ gỗ loài Curcumin Trắc (D. cochinchinensis) 100 62,35 88,20 20 53,53 71,66 4 45,19 22,54 0,8 33,27 0,78 ED50 9,39 8,99

Cùng với việc nghiên cứu hoạt tính oxi hóa các cặn chiết thì việc đánh giá hoạt tính trên các chất sạch được thực hiện. Năm (1998) Cheng và cộng sự, đã đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của butein (113) được phân lập từ loài D. odorifera, kết quả hợp chất này ức chế quá trình oxi hóa lipid do sắt gây ra ở chuột đồng với giá trị IC50 3,3 ± 0,4 μM tương đương với vitamin E trong việc dọn các gốc tự do trên hệ diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) tự do ổn định với IC50 là 9,2μM. Nó cũng ức chế hoạt động của xanthine oxidase với IC50, 5,9 ± 0,3 μM [42]. Năm (2000) Wang và cộng sự đã phân lập được 9 hợp chất từ Dalbergia odorifera T. Chen, trong đó có 1 hợp chất mới là 2,4-dihydroxy-5-methoxybenzophenone (139) và 8 hợp chất đã biết là 3R-2′,3′,7-trihydroxy-4′-methoxyisoflavanone (36), 3′- methoxydaidzein (60), 4′,5,7-trihydroxy-3-methoxyflavone (55), (3R)-vestitol (2), medicarpin (135). Sau đó, nghiên cứu tiềm năng chống oxy hóa thì thấy các hợp chất này có hoạt tính oxi hóa mạnh, đồng thời nếu các hợp chất này khi được trộn với α-tocopherol thì các yếu tố bảo vệ của chúng tăng lên. Ngoài ra, các hợp chất này còn được đánh giá trên hệ thống ổn định oxi hóa ở 100˚C. Kết quả cho thấy, 5 hợp chất bao gồm 2,4-dihydroxy-5-methoxybenzophenone (139), (3R)-2′, 3′, 7-trihydroxy-4′- methoxyisoflavanone (36), 3′-methoxydaidzein (60), 4’,5,7-trihydroxy-3-methoxyflavone (55), (3R)-vestitol (2) và medicarpin (135) có hoạt tính chống oxi hóa mạnh [31]. Đến năm 2011, nhóm nghiên cứu của Hou và cộng sự đã phân lập được các hợp chất từ lõi lõi gỗ của loài D. odorifera T.Chen, tuy nhiên trong số đó chỉ có 2 hợp chất là naringenin (14) và eriodictoyl (20) có hoạt tính chống oxi hóa mạnh hơn BHT [32]. Nhận xét: theo như các công trình đã nghiên cứu trước đây thì các hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa hầu như được phân lập từ loài D. odorifera.

Bảng 1.16. Giá trị IC50 của naringenin và eriodictoyl so với BTH Nồng độ Hợp chất 0,012% 0,02% Naringenin 4,20 ± 0,02 5,57 ± 0,07 Eriodictoyl 6,48 ± 0,31 9,32 ± 0,28 BHT 3.61 ± 0.10 4.22 ± 0.48

Năm 2013, Phạm Thanh Loan và các cộng sự đã phân lập và nghiên cứu các hợp chất trong gỗ loài Cẩm lai (D. oliveri), kết quả cho thấy trong 10 hợp chất được đánh giá bằng thử nghiệm kiểm tra chống oxi hóa in invitro trên tế bào gan phân lập, chỉ có hoạt chất (6aR, llaR)-3,8-dihydroxy-9-methoxyptcrocarpan (144) có khả năng bảo vệ hơn

50% tế bào gan chuột dưới tác động của tác nhân oxi hóa mạnh là H2O2, với ED50 là

31,46 휇g/ml so với chất đối chứng là curcumin với ED50 là 8,99 휇g/ml. Như vậy, hợp chất này được đánh giá khả năng chống oxi hóa ở mức trung bình [64]. 1.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào Năm 2013, chiết xuất methanol của gỗ cứng của D. odorifera có khả năng ức chế đáng kể và mạnh mẽ sự gia tăng các dòng tế bào khối u của con người, bao gồm các tế bào kháng đa kháng thể in vitro [49]. Năm 2014, Phạm Thanh Loan và cộng sự đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào từ cặn MeOH của một số loài Dalbergia phân bố ở Việt Nam như: Dalbergia oliveri, Dalbergia cochinchinensis, Dalbergia sp, Dalbergia discolor, Dalbergia aff, Dalbergia burmanica, Dalbergia pierriana. Kết quả cho thấy, chỉ có mẫu loài trắc Dalbergia cochinchinensis thể hiện hoạt tính kháng 2 dòng tế bào ung thư là ung thư phổi (Lu) và ung thư màng tim (RD). Ở nồng độ 17,98 μg/ml có 50% dòng tế bào Lu bị ức chế và ở nồng độ 15,76 μg/ml có 50% dòng tế bào RD bị ức chế. Các mẫu còn lại đều không biểu hiện có hoạt tính gây độc tế bào. Còn loài Cẩm lai Dalbergia oliveri cũng thể hiện hoạt tính gây độc trên dòng tế bào Hep-G2 với giá trị IC50 là 45,71 μg/ml [17]. Cùng với việc đánh giá hoạt tính từ cao chiết. Các hợp chất được phân lập từ các loài Dalbergia trong chi này cũng được đánh giá hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư. Kết quả cho thấy khá nhiều các hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào. Năm 2003 Ito và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng u của các hợp chất bằng cách kích hoạt virus Epstein-Barr trên dòng tế bào Raij. Kết quả cho thấy, các hợp chất olibergin B (91) từ gỗ loài Cẩm lai (D. oliveri), dalberatin A (118) và B (119) từ gỗ loài Trắc dao (D. cultrata) và dalberatin C (120) và E (122) từ gỗ loài Trắc đen (D. nigrescens) cho thấy có tác dụng kháng u. Hơn nữa, các nghiên cứu này cũng chỉ ra

nhóm prenyl và geranyl trong isoflavonoid có ảnh hưởng quan trọng trong việc ức chế sự tiết ra quá trình khởi sinh kháng thể siêu vi Epstein-Barr [12, 52]. Năm 2007, Yu và cộng nghiên cứu hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư thần kinh người SH-SY5Y của các hợp chất, formononetin (69), (3R)-5′- methoxyvestitol (4), odoriflavene (7) và 2'-O-methylisoliquiritigenin (114) phân lập từ rễ loài D. odorifera T.Chen. Kết quả, 4 hợp chất này đều ức chế mạnh sự phát triển của dòng tế bào SH-SY5Y với IC50 lần lượt tương ứng là 13,4, 28,5, 11,2 và 32,5μM [47]. Năm 2007, từ loài D. oliveri Gamble ex Prain, hợp chất (3R)-mucronulatol (9) được phân lập cho thấy hoạt tính độc tế bào đáng kể đối với dòng tế bào bạch cầu

HBL100 với giá trị LC50 lên đến 5,7 μM [21]. Năm 2009, Choi và cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất từ chiết xuất methanol của cây gỗ của D. odorifera. Các hợp chất này ức chế đáng kể sự gia tăng của các dòng tế bào khối u ở người, kể cả các tế bào kháng đa kháng sinh trong ống nghiệm. 7 flavonoid gồm medicarpin (135), 3-hydroxy-2,4-dimethoxybenzaldehyde (145), formononetin (69), tectorigenin (88), (3R)-mucronulatol (9), (3R)-5′-methoxyvestitol (4), hydroxyobustyrene (127) cùng 2 phenolic bao gồm liquiritigenin (15) và (3R) - calussequinone (146) [28]. Kết quả, trong 9 hợp chất thì có 2 hợp chất là medicarpin (135) và hydroxyobtustyrene (127) biểu hiện hoạt tính độc tế bào mạnh nhất với giá trị ED50 là 5,8-7,3 và 5,1-6,8 µg /ml. Năm 2009, Cheenpracha cùng các cộng sự, tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của 10 hợp chất phân lập được từ gỗ loài Trắc một hạt (D. candenatensis) trên các dòng tế bào HT-29 (ung thư ruột kết), KB (ung thư biểu mô), MCF-7 (ung thư vú), HeLa (ung thư cổ tử cung). Kết quả chỉ ra rằng, các hợp chất candenatenin

B (124) và candenatenin C (125) thể hiện hoạt tính mạnh với dòng tế bào HT-29 (IC50 lần lượt 17,8 và 19,7 μM), Ngoài ra, có hoạt tính trung bình với 3 dòng tế bào KB,

MCF-7 và HeLa (IC50 từ 48,8-83,7 so với chất đối chứng camptothecin IC50 từ 1,22- 2,44 μM) [38].

Theo Songsiang (2009), 2 hợp chất (3R)-mucronulatol (9) và dalparvinene B (132) phân lập từ gỗ loài D. parviflora có khả năng phát triển thành thuốc để phòng ngừa ung thư trên các dòng tế bào KB (ung thư biểu mô), NCI-H187 (ung thư phổi) với kết quả đánh giá khả năng gây độc trên các dòng tế bào đó với IC50 trên 2 dòng tế bào của từng hợp chất lần lượt là 0,53; 2,04 μg/ml và 9,89; 1,46 μg/ml [40]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Songsiang đã thử hoạt tính của một hợp chất isoflavanone (3S)-Secundiflorol H (35) được phân lập từ thân D. parviflora, cho thấy hoạt tính độc tế bào mạnh đối với các dòng tế bào KB, MCF-7 và NCI-H187 với giá trị IC50 tương

ứng là 4,18, 5,37 và 3,47 μg/ml, so với chất đối chứng ellipticine (IC50 : 1,18-1,27. Ngoài ra, các hợp chất còn lại dalparvone B (85), 5,7,3', 4'-tetrahydroxyisoflavone (86), 2'-hydroxybiochanin A (87), 5– hydroxybowdichione (92), 3'-O-methylviolanone (32), 3,5,7-trihydroxyflavonol (44), eriodictoyl (20), isomucronustyrene (128), xenognosin A (129), (3S)-Secundiflorol H (35), dalparvinene B (132), 4-hydroxy-3-methoxy-8,9- methylenedioxypterocarpan (137),3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan (138) và 3- hydroxy-2,4-dimethoxybenzaldehyde (145) có hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình (IC50 : 6,27-48,89 μg/ml) [50]. Cùng với các nghiên cứu về các hoạt chất gây độc tế bào của chi Dalbergia ở nước ngoài thì trong nước cũng ghi nhận một vài báo cáo. Theo đó, năm 2014 Phạm Thanh Loan và cộng sự khi nghiên cứu hoạt tính sinh học của 10 hợp chất phân lập từ cao chiết MeOH của gỗ loài Cẩm lai Dalbergia oliveri bao gồm: liquiritigenin (15), genistein-6-C-glucoside (147), maackiain (148), formononetin (69), pratensein (83), (3R)-violanone (33), isoliquiritigenin (116), (3R)-5'-methoxyvestiol (4), 3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan (138) và medicarpin (135). 8 hợp chất được tiến hành thử nghiệm, kết quả cho thấy hoạt chất 3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan (138) và hoạt chất medicarpin (135) có hoạt tính gây độc tế bào rất tốt (IC50 nằm trong khoảng từ 3,76-7,09 μg/ml. Chất đối chứng dương ellipticine). Hoạt tính này thể hiện trên một số các dòng tế bào ung thư như LU-1 (ung thư phổi người), KB (ung thư biểu mô), MCF7 (ung thư vú) và Hep G2 (ung thư gan người) [64].

1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn Năm (2000), Khan và cộng sự, tiến hành nghiên cứu khả năng kháng loài Trùng roi gây bệnh tiêu chảy (Giardia intesstinalis) của 10 hợp chất isoflavone phân lập từ loài D. Frutescens, kết quả chỉ ra rằng hợp chất formononetin kháng Giardia intesstinalis tốt, với giá trị IC50: 30 µg/ml, so với chất đối chứng metronidazone, loại thuốc đặc trị amip và tiêu diệt trùng roi Giardia sp (IC50: 100 µg/ml) [33]. Kết quả nghiên cứu của Beldjoudi và cộng sự (2003) cho thấy, 4 hợp chất được phân lập từ gỗ loài D. louvelii: 7,4′-dihydroxy-3′-methoxyisoflavone (72), (R)-4- methoxydalbergione (150), obtusafuran (149) và isoliquiritigenin (116) có tác dụng ức chế mạnh sự phát triển của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum trong thử nghiệm in vitro (IC50: 5,8-8,7 µg/ml) so với chất đối chứng chloroquine (IC50: 100 µg/ml ) [36]. Songsiang và cộng sự (2009), đã nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất formononetin (69), biochanin A (62), dalparvone (84), (3R)- violanone (33), (3R)-sativanone (31), liquiritigenin (15), (2S)-pinocembrin (22), naringenin (14), (3R)-mucronulatol (9), duartin (13) và dalparvinene B (132) phân lập từ gỗ loài D. Parviflora trên các chủng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, nấm Cannida albicans và khuẩn Mycobacterium. Kết quả cho thấy, hợp chất dalparvinene B

(132) có tác dụng kháng C. albicans ở mức độ trung bình với (IC50: 25,32 µg/ml), so với chất đối chứng amphotericin B(IC50: 0,034µg/ml), hợp chất dalparvone (84) có khả năng kháng Plasmodium falciparum ở (IC50: 8,19µg/ml), chất đối chứng dihydroartemisinin

(IC50: 3,7µg/ml), hợp chất (2S)- pinocembrin (22) có tác dụng kháng M. Tuberculosis với giá trị MIC là 12,5 µg/ml. Ngoài ra, 2 hợp chất dalparvone (84) và dalparvinene B (132) đều có MIC là 50,0 µg/ml, so với chất đối chứng isoniazid (MIC là 0,02 µg/ml ) [40]. Năm 2011, Zhao cùng các cộng sự tiến hành đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh khô héo Ralstonia solanacearum của 9 hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài D. odorifera bao gồm (3R)-sativanone (31), (3R)-vestitone (34), (3R)-2′,3′,7- trihydroxydroxy-4′-methoxyisoflavanone (36), liquiritigenin (15), carthamidin (19), (3R)-vestitol (2), isoliquiritigenin (116) và sulfuretin (110). Kết quả thấy rằng, hợp chất (3R)-vestitol (2) có tác dụng kháng khuẩn mạnh với đường kính vòng tròn vô khuẩn

đạt 16,62 mm, so với chất đối chứng streptomycin sulfate (16,80 mm). Các hợp chất (3R)-vestitone (34), liquiritigenin (15) và isoliquiritigenin (116) có khả năng kháng khuẩn ở mức trung bình với đường kính vòng tròn vô khuẩn tương ứng 11,9, 12,23 và 14,15 mm [26]. 1.4.4. Hoạt tính kháng viêm Năm 2013, Lee và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính ức chế sự sản sinh nitric oxide (NO) trên đại thực bào RAW 264.7 của 24 hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài D. odorifera. Kết quả cho thấy, hợp chất (2S)-pinocembrin (22) có khả năng ức chế mạnh sự sản sinh nitric oxide (NO) trên đại thực bào RAW 264.7 với IC50 18,1 μM, so với chất đối chứng aminoguanidime IC50 là 16,6 μM. Ngoài ra, 2 hợp chất olibergin

A (68) và butein (113) có khả năng ức chế ở mức trung bình với IC50 tương ứng 45,5 và 35,1 μM. Kết quả này mở ra tiềm năng trong việc tìm kiếm các flavonoid làm thuốc kháng viêm [49]. 1.4.5. Hoạt tính chống đái tháo đường Như đã biết, quá trình glycat hóa protein là sự gắn kết của một phân tử glucose với một protein mà không cần enzyme, làm thay đổi cấu trúc và chức năng của các protein. Đường huyết càng tăng và sự tiếp xúc giữa đường và protein càng lâu thì quá trình này càng lan rộng. Quá trình glycat hoá sản sinh ra các gốc tự do và các sản phẩm được gọi chung là AGEs. AGEs có vai trò rất quan trọng trong cơ chế bệnh sinh các biến chứng mạn tính của bệnh đái tháo đường. Khi nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường gây ra đối với chuột ở liều 250 và 500 mg/kg, và so sánh với chất đối chứng là glibenclamide từ dịch chiết ethanol của lá D. sissoo. Kết quả cho thấy. Dịch chiết có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu lên đến 189,2, 115,2 và 104,6 mg/dL sau 7,14 và 21 ngày, với liều 500 mg/kg, trong khi glibenclamide giảm tối đa 250,2, 141,2 và 120,4 mg/dL. So với glibenclamide thì dịch chiết này cao hơn 12% trong việc giảm mức độ lượng đường trong máu. Hoạt tính kháng tiểu đường cũng được nghiên cứu trên các chất tinh khiết trong Chi này nhưng rất hiếm báo cáo. Theo đó, các thử nghiệm cho thấy. Các hợp chất (3R)-sativanone (31) và formononetin (69) phân lập từ loài Dalbergia odorifera T. Chen có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ nấm men [12, 65].

1.4.6. Hoạt tính chống dị ứng Năm 1998, Chan và cộng sự đã báo hợp chất (S) -4-methoxydalbergione (151) và cearoin (152), phân lập từ lõi gỗ của loài D. odorifera, có hoạt tính kháng dị ứng đáng kể với IC50 là 17,6 và 17,9 μM, kìm hãm sự giải phóng tác nhân trung gian gây dị ứng là β-glucuronidase với IC50 là 20,0 và 16,3 μM đối với tác nhân gây dị ứng histamine phóng thích ra từ tế bào. Ngoài ra hợp chất (S)-4-methoxydalbergione (151) cũng cho thấy giá trị IC50 là 20,6 và 7,9 μM tương ứng với sự hình thành của β-glucuronidase và giá trị IC50 > 30,0 và 11,7 μM tương ứng với sự giải phóng lysozyme khỏi bạch cầu trung tính và bạch cầu trung tính được sử dụng làm kiểm soát dương tính [27]. Ngoài các hoạt tính sinh học đặc trưng chính nêu trên thì chi Dalbergia còn có thêm một số hoạt tính sinh học khác: hoạt tính chống loãng xương [12], hoạt tính bảo vệ [46], hoạt tính kháng androgen [57], hoạt tính chống côn trùng [65], hoạt tính hạ sốt [66], hoạt tính liên quan đến huyết áp, chống huyết khối, chống tập kết tiểu cầu và co giãn động mạch chủ [12, 36, 67], hoạt tính lợi tiểu [69] và hoạt tính giảm đau [63, 71].

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) bao gồm các bộ phận vỏ thân, lá và lõi được thu hái vào tháng 1/2015 và tháng 3/2016 tại đường Mai Hắc Đế, thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đăk Lăk (12o45’59’’N-108o19’31’’E). Tên khoa học của cây được xác định bởi TS. Nguyễn Quốc Bình, Bảo Tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản của cây được lưu trữ tại phòng tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, kí hiệu mẫu là C-561 và C-612. Mẫu thực vật sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, chỉ lấy phần thân lõi đỏ phơi khô. Sau đó mẫu được xay nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng MeOH ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần như: n-hexane, chloroform hoặc dichloromethane, etyl acetat và nước. Các dung môi dùng để chiết tách và chạy sắc ký được làm khan, lọc và cất lại trước khi sử dụng. 2.1.2. Các phương pháp nghiên cứu thực vật loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 2.1.2.1. Nghiên cứu vi phẫu Phương pháp nghiên cứu a) Tiêu bản vi học thân và lá - Làm tiêu bản bằng phương pháp cắt trực tiếp, tẩy và nhuộm kép. - Hoá chất sử dụng: dung dịch javen thương phẩm; dung dịch acid acetic 5%; dung dịch xanh methylene, dung dịch đỏ carmin. - Dụng cụ quang học: Kính hiển vi màn hình kết nối camera Nikon Eclips Ci b) Bột dược liệu - Làm tiêu bản bằng phương pháp giọ tép. - Dụng cụ quang học: Kính hiển vi màn hình kết nối camera Nikon NikonEclipsCi 2.1.2.2. Nghiên cứu DNA

 Nguyên liệu 01 mẫu lá Sưa được thu tại khu vực đường Mai Hắc Đế, thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đăk Lăk (12o45’59’’N-108o19’31’’E), được ký hiệu mẫu C-561-L và C- 612. 01 mẫu lá Sưa được thu tại đường Hoàng Quốc Việt, Hà Nội (21o01’42’’N- 105o51’12’’E), ký hiệu mẫu C-564-L. 02 mẫu lá thu được kiểm tra hình thái và làm tiêu bản tại phòng thực vật, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam và phòng thí nghiệm Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn -Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật để phục vụ cho các phân tích

Hình 2.1. Hai mẫu Sưa được thu tại Buôn Ma Thuột (C-561-L) và Hà Nội (C-564-L)

Hình 2.2. Mẫu lá Trắc được thu tại Buôn Ma Thuột (C-562-L)

Phương pháp Tách chiết DNA tổng số Mẫu lá được tách chiết theo phương pháp CTAB của Doyle và cs (1987) có cải tiến để phù hợp với điều kiện Việt Nam. Kiểm tra độ sạch và hàm lượng DNA

bằng đo quang phổ hấp thụ kết hợp với điện di trên gel agarose 1%. DNA tổng số được pha loãng dùng cho phản ứng PCR ở nồng độ 10 ng/µl. Trình tự các cặp mồi rpoB, rpoC và rbcL được tổng hợp dựa theo các nghiên cứu của Kress vả cs 2007 [72], của Hasebe và cs (1994) [73] (bảng 2.1) Bảng 2.1. Thông tin các cặp mồi sử dụng

Tên Nhiệt độ Chiều dài vùng Mồi xuôi Mồi ngược bắt cặp Tham khảo vùng gen gen mồi

CTTCTGCGAAATCAG CTTCTCCTTCCTC rpoC 50 600 [72] AGTGTTTG TAAATGATAAG

TCTAGCACACGAAAG CTTCGGCACAAA [73] rbcL 56 600 TCGAAGT ATACGAAACG ATCTCTCCA GCC ACC ATC GAA ACA CGA TCT rpoB 52 600 [72] TAT CTG GT CGT CGC TAA CC

Tối ưu và nhân bản gen bằng phản ứng PCR Phản ứng nhân gen được thực hiện trong tổng thể tích là 50µl với các thành phần gồm có: 32 l H2O, 5 l đệm, 5 l dNTP, 3 l mồi xuôi F (30 pM), 3 l mồi ngược R (30 pM), 1 l DNA tổng số, 1 l enzyme Taq polymerase. Chu trình nhiệt được thực hiện trên máy PCR system 9700 với các chu kỳ như sau: biến tính ở 95oC 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ lặp lại: 95oC 30 giây; bắt cặp ở 50oC, 52oC, 56oC trong 1 phút, kéo dài mạch ở 72oC trong 1 phút, cuối cùng là 72oC trong 10 phút để kết thúc phản ứng và giữ mẫu ở 4oC. Sản phẩm PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, nhuộm gel bằng ethidium bromide và chụp ảnh trên hệ thống máy ảnh có chiếu ánh sáng UV. Giải trình tự và xử lý số liệu Giải mã trình tự nucleotide được thực hiện bằng kit BigDye terminator v3.1 trên máy đọc trình tự ABI 3100 Avant genetic analyzer (Applied Biosystems). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Sephadex G50 (Sigma) trước khi tiến hành đọc trình

tự. Phần mềm ClustalW (Thompsom và cs, 1994) [74], GenDoc (Nicholas và cs, 1997) [75] và MEGA5.2 (Tamura và cs, 2011) [76] được dùng để phân tích dẫn liệu, xác lập bảng khoảng cách di chuyền. 2.1.3. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Các phương pháp sắc ký được sử dụng để chiết tách và phân lập các hợp chất từ cặn chiết thô bao gồm: sắc ký bản mỏng TLC, sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (Merck loại 40-63 m) hoặc pha đảo (ODS, YMC (30-50 μm)), sắc ký cột Dianion HP-20, Sephadex LH-20. Bên cạnh đó còn dùng phương pháp kết tinh để thu chất sạch. 2.1.4. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ra được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp vật lý và hóa học, và sử dụng các phương pháp phổ 2.1.4.1. Phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) Phổ khối ion hóa bụi điện tử ESI-MS được ghi trên máy ghi Agilent 6310 Ion Trap, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF LC/MS hoặc máy MicroQ-TOF III mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany). 2.1.4.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C- và DEPT NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz đo với TMS là chất chuẩn nội. Sử dụng các dung môi hòa tan được hoàn toàn mẫu thử chủ yếu là DMSO-d6, MeOD-d4, CDCl3. 2.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.2.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương pháp của H. Xiong và cs (2009) [77].  Chủng vi sinh vật kiểm định: Vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtillis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538

Nấm sợi (mốc): Aspergillus niger ATCC 9763, Fusarium oxysporum ATCC 48112 Nấm men: Candida albicans ATCC 10231, Saccharomyces cerevisiae ATCC 16404 Chủng chuẩn (nguồn ATCC, Manassas, Mỹ) được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương và lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên). Pha dịch vi sinh vật: Dùng que cấy vô trùng lấy 1 quai khuẩn lạc của chủng vi sinh vật pha hòa tan vào 10 mL nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn vortex được huyền dịch vi sinh vật. Đánh giá nồng độ vi sinh vật bằng cách so sánh với chuẩn 0,5 McFarland (đo ở =550 nm) được huyền dịch nồng độ 150 x106 CFU/mL. Môi trường: Saboraud 4% Dextrose Agar (SDA; Merck, Damstaadt, CHLB Đức) cho nấm men và nấm mốc. Tryptic Soy Agar (TSB-Merck) cho vi khuẩn. Các chất đối chứng dương là: Streptomycin (4 μM), Penicillin (50 μM ) cho vi khuẩn Gr (+) và Nystatin cho nấm sợi và nấm men. Kháng sinh được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm Tp. HCM. Chất đối chứng âm là các vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử  Thử nghiệm và đánh giá kết quả Chuẩn bị mẫu thử: Hòa tan mẫu trong DMSO 100% bằng máy vortex với nồng độ 4mg/mL với mẫu cao chiết và 1mg/mL với mẫu tinh. Pha mẫu với DMSO 5% trên phiến 96 giếng (template plate) theo nồng độ giảm dần (log2 cho 5 thang nồng độ). Nhỏ mẫu từ phiến template lên phiến 96 giếng (phiến test) và bổ sung dịch vi sinh vật để dải nồng độ mẫu từ 200-100-50-25,5-12,5 µL (lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ). Để trong tủ ấm ở 37oC trong 24h đối với vi khuẩn và 30oC/48h đối với nấm. Mẫu được xác định có hoạt tính khi không có sự phát triển của vi sinh vật ở ít nhất một nồng độ mẫu thử nghiệm so với chứng (-) (khi nuôi cấy lại ở nồng độ này kiểm tra trên đĩa thạch giá trị CFU<5). Mẫu biểu hiện hoạt tính được test ở dãy nồng độ mẫu khác nhau để xác định được nồng ức chế tối thiểu MIC (g/mL) là nồng độ thử nghiệm thấp nhất mà vi sinh vật bị ức chế). Mẫu được xác đinh có hoạt tính khi giá trị MIC 200 g/mL đối với mẫu cao chiết và ≤ 50g/mL đối với mẫu tinh sạch.

2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase  PHƯƠNG PHÁP Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase được thực hiện theo phương pháp của N.V. Bon và cộng sự (2018) [78]. Phép thử dựa trên hoạt tính xúc tác của enzyme α-glucosidase chuyển hoá cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid thành α-D-glucose và p-nitrophenol có màu vàng hấp thụ ở =405 nm. Khi chất thử có hoạt tính ức chế enzyme, cường độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng sẽ giảm và phần trăm (%) ức chế enzyme được xác định tương ứng với mỗi nồng độ mẫu thử khi so sánh với đối chứng (-). Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng, thể tích phản ứng là 250 µL/giếng. Các thành phần phản ứng bao gồm: 50µL cơ chất p-nitrophenyl -D-glucopyranoside (pNPG), 100µL đệm phosphate (0,1 mol/L, pH 7), 50µL enzyme -glucosidase từ vi khuẩn, nấm men, và gạo ở các nồng độ lượt là 1,0; 0,25 và 0,1 U/mL và mẫu thử (50 µL) ở các nồng độ khác nhau. Ở mẫu đối chứng âm, mẫu thử được thay bằng đệm phosphate và acarbose được sử dụng làm đối chứng (+). Hỗn hợp phản ứng enzyme được ủ ở nhiệt độ 37o C. Sau 30 phút (60 phút đối enzym từ chuột), phản ứng được dừng bằng 100 µl Na2CO3 0,1 M. Độ hấp thụ của phản ứng được xác định ở bước sóng 405 nm trên máy đo quang Infinite F50 (Tecan, Thụy Sỹ). Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase từ chuột được thực hiện theo phương pháp của N.V.Bon và cộng sự (2017) [79]. Enzyme -glucosidase từ gạo, từ nấm men (Saccharomyces cerevisiae), từ vi khuẩn (B. stearothermophilus), từ chuột cùng với cơ chất p-nitrophenyl -D- glucopyranoside (pNPG) và acarbose mua tại hãng Sigma Aldrich, St. Louis City, MO, USA. Khả năng ức chế enzyme -glucosidase của mẫu thử được xác định qua công thức:

Tỷ lệ ức chế (%) = [(A – B) /A] x 100% A giá trị quang của mẫu đối chứng B giá trị quang của mẫu thật

IC50 (half maximal inhibitory concentration), nồng độ của chất thử ức chế 50% hoạt động của enzyme -glucosidase, được xác định sử dụng phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel Scientific, USA). 2.3. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách 2.3.1. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-561) Lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (3,7 kg) đem phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng (5 lần x 7 lít ), lọc và cô cất trong chân không. Phần cặn methanol (120g, M) được hòa vào hỗn hợp methanol/nước (tỉ lệ 1/1) rồi chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần như: n- hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước cho các cặn chiết tương ứng lần lượt là cặn n-hexane (29,0 g, MH), dichloromethane (45,1 g, MD), ethyl acetate (11,1 g, ME) và cặn nước (12,0 g, MW). Bã sau khi chiết bằng methanol được đun nóng với nước (4 lần x 3,0 L), sau 12 giờ thu được cặn chiết nước (4,2 g, W) ( Sơ đồ 2.1).

Lõi gỗ Chú thích: (3,7 kg) M: methanol W: nước

Ngâm MeOH (5 x 7,0 L) H: n-hexane D: dichloromethane

E: ethyl acetate

Bã sau khi chiết Cao methanol (120 g, M) Đun nước Chiết phân bố (4 x 3,0L) n-hexane dichloromethane ethyl acetate nước W MH MD ME MW (12,0 g) (4,2 g) (29,0 g) (45,1 g) (11,1 g)

Sơ đồ 2.1. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-561) 2.3.1.1. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết dichloromethane Cặn dịch chiết dichloromethane (45,1 g, MD) được hoà tan bằng một lượng methanol vừa đủ. Dung dịch thu được đem trộn với một lượng silicagel vừa đủ, cô quay khô, nghiền thành dạng bột mịn. Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được đưa lên cột sắc ký, cột được nhồi bằng silicagel pha thường (Merck, loại 400 – 630 mesh). Cột sau khi đã tương đối ổn định, bột silicagel tẩm dịch chiết được đưa lên đầu cột, với hệ gradient

dung môi rửa giải là n-hexane/acetone (3/2-0/1) tăng dần độ phân cực thu được 6 phân

đoạn từ (MD1-MD6).

Phân đoạn MD2 (7,2 g) được tiếp tục phân tách trên cột CC, silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải chloroform/acetone (99/1, v/v) thu được 7 phân đoạn được ký hiệu từ (MD2.1-MD2.7). Phân đoạn MD2.3 (1,5 g) được phân tách trên cột sắc ký silicagel pha thường với hệ dung môi n-hexane/acetone (9/1, 8/1, v/v) được 4 phân đoạn ký hiệu từ

(MD2.3A-MD2.3D). Chạy tách chất phân đoạn MD2.3A (0,4 g) trên cột sắc ký silicagel pha thường, làm sạch với hệ dung môi n-hexane/acetone (9/1, v/v) thu được 2 hợp chất sạch

DT.01 (30 mg) và DT.03 (20,5 mg). Phân đoạn MD2.6 (0,6 g) được chiết tách trên cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel pha thường và rửa giải bởi hệ dung môi n- hexane/acetone (5/1, v/v) được chất sạch DT.02 (25 mg) (Sơ đồ 2.2).

Chú thích: MD O.PC.C: Sắc khí cột, pha thường. (45,1 g) SiO2: silicagel Hệ HA: n-hexane/acetone Hệ CA: chloroform/acetone SiO2, O.P C.C HA (3/2-0/1)

MD1 MD2 MD3 MD4 MD5 MD6 5,5 g 7,2 g 2,1 g 3,0 g 0,8 g 1,5 g

SiO2, O.P C.C CA (99/1, v/v)

MD2.1 MD2.2 MD2.3 MD2.4 MD2.5 MD2.6 MD2.7 0,2 g 0,5 g 1,5 g 1,1 g 0,95 g 0,6 g 0,8 g SiO , O.P C.C 2 SiO2, O.P C.C HA (9/1, v/v) HE (5/1, v/v)

DT.02 MD2.3A MD2.3B MD2.3C MD2.3D 25 mg 0,4 g 0,25 g 0,15 g 0,2 g

SiO2, O.P C.C HA (9/1, v/v)

DT.01 DT.03

30 mg 20,5 mg

Sơ đồ 2.2. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết dichloromethane

2.3.1.2. Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate Cặn ethyl acetate (11,1 g, ME) được tiến hành phân tách trên sắc kí cột CC, silicagel pha thường, rửa giải với hệ dung môi dichloromethane/acetone theo tỷ lệ

(40/1, 30/1, v/v) thu được 11 phân đoạn ký hiệu từ (ME1-ME11). Phân đoạn ME1 (850 mg) tiếp tục được phân tách trên sắc kí cột CC, silicagel pha thường và giải hấp bởi hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate (5/1, v/v) tăng dần độ phần cực, thu được hợp chất DT.04 (5,0 mg).

Phân tách phân đoạn ME9 (650 mg) trên cột silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexane-aceton (3/1, v/v) thu được 2 phân đoạn ME9.1 (420 mg) và ME9.2

(120 mg). Tách tiếp phân đoạn ME9.1 trên cột silicagel bằng hệ chloroform/methanol theo tỷ lệ (9/1, v/v) thu được hợp chất DT.05 (8 mg). (Sơ đồ 2.3).

Chú thích: O.P C.C: sắc khí cột, pha thường. SiO2: silicagel ME Hệ HA: n-hexane/acetone (11,1 g) Hệ DA: dichloromethane/acetone Hệ HE: n-hexane/ethyl acetate SiO2, OP.CC Hệ MW: methanol/nước DA (40/1, 30/1, v/v

ME1 ME2 ME3 ME4-6 ME7-8 ME9 ME10-11

850 mg 370 mg 900 mg 4992 mg 1000 650 mg 350.5 mg

mg SiO , O.P C.C SiO , O.P C. 2 2 HA (3/1, v/v) HE (5/1, v/v)

DT.04 ME9.1 ME9.2 5,0 mg 420 mg 120 mg

SiO2,O.P C.C CM (9/1, v/v)

DT.05 8 mg

Sơ đồ 2.3. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết ethyl acetate

2.3.1.3. Phân lập các chất từ cặn chiết nước cao nước đun sôi Cao nước đun sôi (4,2 g, W) được tách phân đoạn trên sắc ký cột HP-20 bằng chất hấp phụ silicagel pha đảo với hệ dung môi rửa giải nước/methanol (1/0-0/1), thu

được 5 phân đoạn (W1-W5).

Phân đoạn W2 (210,0 mg) chạy tách chất trên cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel pha thường, triển khai theo chế độ gradient dung môi dichloromethane/methanol/nước

(30/1/0,1, v/v/v), sau đó tiến hành sắc ký bản mỏng TLC thu được 2 phân đoạn (W2.1-

W2.2). Tinh chế phân đoạn W2.2 (150 mg) trên sắc ký cột CC với silicagel pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate/ acid formic (130/80/2, v/v/v) thu được chất sạch DT.06 (5,5 mg).

Phân đoạn W4 (800 mg) được phân tách trên cột sắc ký silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol/nước (30/1/0,1, v/v/v), thu được

4 phân đoạn từ W4.1-W4.4. Tiến hành tách chất phân đoạn W4.1 (65 mg) trên cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate/ acid formic (80/80/2, v/v/v) thu được hợp chất sạch DT.07 (5,0 mg).

Chú thích: W O.P C.C: sắc khí cột, pha thường. (4,2 g) HP-20: diaion HP-20 SiO2: silicagel Hệ WM: nước/methanol HP-20,WM (1/0-0/1) Hệ DMW: dichloromethane/methanol/nước Hệ HEF: n-hexane/ethyl acetate/ acid formic W1 W2 W3 W4 W5 937,9 mg 210 mg 250 mg 800 mg 300 mg

SiO2, O.P C.C SiO2, O.P C.C SiO2, O.P C.C DMW (3/1/0,1, v/v/v) DMW (30/1/0,1, v/v/v) DMW (30/1/0,1, v/v/v)

W2.1 W2.2 W4.1 W4.2 W4.3 W4.4 W1.1 W1.2 W1.3 W1.4 W1.5-1.7 W1.8-1.9 60 mg 150mg 65 mg 106 102 mg 150 70 mg 80 mg 66,6 mg 120 mg 159 mg 292 mg mg mg SiO2, O.P C.C SiO2, O.P C.C HEF (130/80/2, v/v/v) HEF (80/80/2, v/v/v)

DT.07 (5,5 mg) DT.06 (5,0 mg)

Sơ đồ 2. 4. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cao nước đun sôi

2.3.2. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-612) Lõi gỗ cây Sưa (1,2 kg) đem phơi khô, nghiền nhỏ sau đó ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng (5 lần x 3 lít), lọc và cô cất trong chân không thu được phần cặn methanol (60,3 g, M). Phần cặn methanol này được hoà tan trong lượng nước vừa đủ và chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước. Cho các cặn chiết tương ứng là các cặn n-hexane (1,6 g, HDT-1), dichloromethane (27,2 g, HDT-2), ethyl acetate (2,6 g, HDT-3) và nước (3,7 g, HDT- 4) ( Sơ đồ 2.5). Chú thích: H: Heartwood

Lõi gỗ D: Dalbergia T: tonkinensis (1,2 kg)

Ngâm MeOH (5 x 3,0L)

Cao methanol

(M, 60,3 g)

Chiết phân bố

n-hexane dichloromethane ethyl acetate Nước

HDT-1 HDT-2 HDT-3 HDT-4 (1,6 g) (27,2 g) (2,6 g) (3,7 g)

Sơ đồ 2.5. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-612) 2.3.2.1. Phân lập các chất từ cặn chiết dichloromethane Cặn dịch chiết dichloromethane (27,2 g, HDT-2) được tiến hành phân tách trên sắc ký cột CC, silicagel pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone

theo tỷ lệ (3/2-0/1) thu được 14 phân đoạn ký hiệu từ (C1-C14). Phân đoạn C1 (1560 mg) được tách trên cột sắc ký silicagel pha thường, triển khai theo chế độ gradient dung môi chloroform/methanol (12/1, v/v) , sau đó sử dụng phương pháp sắc kí bản

mỏng TLC thu được 4 phân đoạn từ (C1.1-C1.4). Tinh chế phân đoạn C1.1 (95 mg) bằng sắc ký cột silicagel pha thường, giải hấp bởi hệ dung môi n-hexane/acetone (3/2,

v/v…) thu được chất sạch DT.08 (9 mg). Phân đoạn C1.2 (280 mg) được chiết tách

trên cột silicagel bằng hệ dung môi chloroform/methanol theo tỷ lệ (10/1; 9/1, v/v…)

được hợp chất DT.10 (7 mg) và DT.11 (10 mg).

Chạy tách chất phân đoạn C1.3 (314 mg) trên cột sắc ký và được rửa giải bởi hệ dung môi chloroform/methanol (10/1,5, v/v) tăng dần độ phân cực, thu được 3 phân đoạn được ký hiệu từ C1.3.1-C1.3.3. Từ phân đoạn C1.3.1 (95 mg) ta thu được chất sạch DT.09 (10 mg) bằng phương pháp chạy pha đảo với chất hấp phụ silicagel, được lọc rửa bằng hệ dung môi methanol/nước theo tỷ lệ (1,5/1, v/v). Phân đoạn C2 (4108 mg) tiếp tục tinh chế bằng sắc ký cột silicagel pha thường (230-400 mesh), rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone (30/5-0/10) thu được 5 phân đoạn (C2.1-C2.5). Tinh chế phân đoạn C2.1 (173 mg) bằng phương pháp sắc khí cột silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải là chloroform/acetone (3/1, v/v) được chất sạch DT.12 (8 mg).

Phân đoạn C2.7 (341 mg) sau khi cất loại bỏ dung môi, thu được tinh thể kết tinh màu trắng, sấy khô, trích mẫu thử hòa tan trong trong hệ chloroform/acetone theo tỷ lệ (3/1, v/v) thấy mẫu tan, tiếp tục sắc kí cột hệ chloroform/acetone (3/1, v/v) thu được hợp chất DT.13 (7 mg) (Sơ đồ 2.6).

Chú thích: O.PC.C: sắc khí cột, pha thường RP18: pha đảo HDT-2 SiO2: silicagel Hệ HA: n-hexane/acetone 27,2 g Hệ CM: chloroform/methanol Hệ CA: chloroform/acetone SiO2, O.P C.C Hệ CE: chloroform/ethylacetate HA (3/2-0/1)

C1 C2 C3 C4 C5 C6-C8 C9-C11 C12-C14 1560 mg 4108 mg 566 mg 670 mg 850 mg 1247 mg 1151 mg 1235 mg

SiO2, O.P C.C CM (12/1, v/v) SiO2, O.P C.C HA (30/5-0/10)

C1.1 C1.2 C1.3 C1.4-1.5 95 mg 280 mg 314mg 133 mg

SiO2, O.P C.C CM (10/1,5, v/v) C2.1 C2.2-2.3 C2.4-2.5 C2.6 C2.7 C2.8 SiO , O.P C.C SiO2, O.P C.C 2 455 mg 564 mg HA (3/2, v/v) CM (10/1, v/v) 173 506 196 mg 341 mg mg mg Rửa tinh thể SiO2, O.P C.C CA (3/1, v/v) CA (3/1, v/v)

DT.08 DT.10 DT.11 DT.12 DT.13 9 mg 7 mg 10 mg 8 mg 7 mg

DT.09 SiO2, RP18 C.C C1.3.1 C1.3.2 C1.3.3 10 mg MW (1,5/1, v/v) 95 mg 64 mg 33,6 mg

Sơ đồ 2.6. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DHT-2

2.3.2.2. Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate Cao ethyl acetate (2,6 g, HDT-3) được tiến hành phân tách trên cột sắc ký silicagel pha thường (40-63 mesh) được rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone theo tỷ lệ (99/1-0/1) tăng dần độ phân cực, thu được 12 phân đoạn ký hiệu từ (E1-

E12). Phân đoạn E1 (0,5 g) tiếp tục được tách phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel pha thường và làm sạch bởi hệ dung môi chloroform/acetone (30/2-20/3) thu được 8 phân đoạn từ (E1.1-E1.8).

Phân đoạn E1.1 (178.6 mg) được chạy tách chất trên cột sắc ký silicagel pha thường và giải hấp phụ bởi hệ dung môi n-hexane/acetone (3/2, 3/3, v/v) thu được chất sạch DT.14 (7 mg). Phân đoạn E1.2 (200 mg) được rửa giải với hệ dung môi chloroform/ethyl acetate theo tỷ lệ (11/3, 10/3, v/v), sau đó thực hiện sắc kí bản mỏng thu được hợp chất DT.15 (10,0 mg). Phân đoạn E2 (0,12 g) được phân tách trên cột silicagel pha thường, sau đó giải hấp bởi hệ dung môi n-hexane/acetone (3/1, v/v) thu được hợp chất DT.16 (6,0 mg).

Phân đoạn E4 được tách phân đoạn trên cột sắc ký silicagel pha thường với hệ dung môi giải hấp chloroform/ethyl acetate (3/1, v/v) thu được 15 phân đoạn ký hiệu từ (E4.1-4.15). Tiếp tục tinh chế phân đoạn E4.14 (100 mg) bằng cột silicagel và làm sạch bởi hệ dung môi chloroform/ethyl acetate theo tỷ lệ (4/1, v/v) được chất sạch DT.17 (10 mg) (Sơ đồ 2.7).

58 Chú thích: O.P C.C: sắc khí cột, pha thường. RP18: pha đảo SiO2: silicagel HDT-3 TLC: sắc kí bản mỏng (2,6 g) Hệ HA: n-hexane/acetone Hệ MW: methanol/nước SiO2, O.P C.C Hệ CA: chloroform/acetone Hệ CE: chloroform/ethyl acetate HA (99/1-0/1) Hệ MW: methanol/nước E1 E2 E3 E4 E5-7 E8-10 E11-12

0,5 g 0,12 g 0,15 g 0,42 g 0,45 g 0,6 g 0,3 g

SiO2, O.P C.C SiO2, O.P C.C CA (30/2-20/3) SiO2, O.P, CC HA (5/1, v/v) CE (3/1, v/v)

E4.1-4.2 E4.3 E4.4-4.7 E4.8-4.11 E4.12-4.13 E4.14 E4.15 E1.1 E1.2 E1.3-E1.8 70 mg 50 mg 63 mg 20,5 mg 100 mg 15 mg 178,6 mg 200 mg 110 mg 30 mg

SiO , O.P C.C 0 0 TLC 0 2 CE (11/3, 10/3, v/v) CE (4/1, v/v)

SiO2, O.P C.C HA (3/2-3/3) DT.16 DT.17 6 mg 10 mg

DT.14 DT.15 7 mg 10 mg

Sơ đồ 2.7. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DHT-3

2.3.2.3. Phân lập các chất từ cao nước Tiến hành tách phân đoạn cao nước (3,7 g, HDT-4) theo phương pháp sắc ký cột trên chất hấp phụ silicagel pha thường với hệ gradient dung môi rửa giải là chloroform/ethyl acetate tăng dần độ phân cực theo tỷ lệ (3/1-0/1), thu được 8 phân

đoạn ký hiệu từ (W1-W8).

Phân đoạn W2 (0,42 g) được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel pha thường với hệ dung môi chloroform/ethyl acetate (2/1-0/1) thu được 15 phân đoạn từ

(W2.1-2.15). Chạy tách phân đoạn W3 (0,8 mg) trên cột silicagel pha thường và được giải hấp bởi hệ dung môi chloroform/acetone theo tỷ lệ (12/1, 11/1, v/v) thu được 6 phân

đoạn từ (W3.1-W3.6). Tinh chế phân đoạn W3.3 (110 mg) trên cột CC silicagel pha thường và được làm sạch bằng hệ rửa giải chloroform/acetone (8/2, v/v…) thu được chất sạch DT.18 (8,0 mg) ( Sơ đồ 2.8).

HDT-4 (3,7 g) Chú thích: SiO2, O.P C.C O.PC.C: sắc khí cột, pha thường CE (3/1-0/1) SiO2: silicagel Hệ CA: chloroform/acetone Hệ CE: chloroform/ethylacetate W1-2 W2 W3 W4-8 0,35 g 0,42 g 0,8 g 0,5 g

SiO2, O.P C.C 230-400 mesh SiO2, O.PC.C CA (12/1-0/1) CE (2/1-0/1)

W2.1-2.3 W2.4- W2.8-2.11 W2.12- W2.14 W2.15 W3.1-3.2 W3.3 W3.4-3.6 31,2 2.7 101 mg 2.13 80 mg 15 mg 300 mg 110 mg 250 mg mg 42 mg 93,5 mg CE (5/2, v/v),kết tinh SiO2, O.PC.C chậm, rửa acetone 3 lần CA (8/2, v/v)

MCNM-2 DT.18 13 mg 8 mg mg Sơ đồ 2.8. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết HDT-4

2.4. Thông số hóa lý và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập 1 Pinocembrin (DT.01): chất bột màu vàng, (C15H12O4, M = 256), H-NMR (500 MHz, DMSO): 7,44 (2H, t, 8,3 Hz, H-2', H-6'), 7,52 (2H, t, 8,4 Hz, H-3', H-5'), 7,39 (1H, t, 7,0 Hz, H-4'), 5,92 (1H, d, 2,0 Hz, H-6) 5,89 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 5,57 (1H, dd, 12,6,

3,1, H-2), 3,24 (1H, dd, 17,1, 12,6 Hz, Hb-3), 2,77 (1H, dd, 17,1, 2,7 Hz, Ha-3), (PL-1). 13C-NMR (125 MHz, DMSO): 195,8 (s, C-4), 167,0 (s, C-7), 163,5 (s, C-5), 138,7 (s, C-1'), 128,5 (d, C-3', C- 5'), 128,5 (d, C-4'), 162,7 (s, C-8a), 127,0 (d, C-2', C-6'), 101,7 (s, C-4a), 95,1 (d, C-6), 96,0 (d, C-8), 78,4 (d, C-2), 42,1 (t, C-3), (PL-1).

1 Naringenin (DT.02): bột màu vàng, (C15H12O5, M = 272), H-NMR (500

MHz, CD3OD): 7,34 (2H, d, 8,5 Hz, H-2', H-6'), 6,83 (2H, d, 8,5 Hz, H-3', H-5'), 5,91 (2H, d, 2,0 Hz, H-6, H-8), 5,36 (1H, dd, 13,0, 3,0 Hz, H-2), 3,13 (1H, dd, 17,0, 13,0

Hz, Hb-3), 2,72 (1H, dd, 17,0, 3,0 Hz, Ha-3), (PL-2).

13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): 197,8 (s, C-4), 168,4 (s, C-7), 165,5 (s, C-5), 164,9 (s, C-8a), 159,1 (s, C-4'), 131,8 (s, C-1'), 129,1 (d, C-2', C-6'), 116,4 (d, C-3', C- 5'), 103,4 (s, C-4a), 97,1 (d, C-6), 96,2 (d, C-8), 80,5 (d, C-2), 42,3 (t, C-3), (PL-2). 3'-hydroxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol (DT.03): bột màu trắng

1 (C18H20O4, M = 300), H-NMR (500 MHz, CDCl3): 7,14 (1H, t, 7,5 Hz, H-5'), 6,67 (1H, s, H-6), 6,54 (1H, s, H-3), 6,76 (1H, d, 7,5 Hz, H-6'), 6,64 (1H, s, H-2'), 6,65

(1H, s, H-4'), 6,24 (1H, ddd, 17,0, 10,5, 7,0 Hz, H-2''), 5,19 (1H, d,10,0 Hz, Ha-3),

5,04 (1H, d, 6,5 Hz, H-1''), 4,94 (1H, d, 17,0, Hz, Hb-3), 3,88 (3H, s, 4-OCH3), 3,73

(3H, s, 2-OCH3), 3,77 (3H, s, 5-OCH3), (PL-3).

13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): 155,5 (s, C-3'), 151,5 (s, C-2), 148,3 (s, C-4), 145,4 (s, C-1'), 143,0 (s,C-5), 140,2 (d, C-2''), 129,3 (d, C-5'), 123,0 (s, C-1), 121,1 (d, C-6'), 112,9 (d, C-4'), 116,3 (t, C-3''), 113,7 (s, C-6), 116,2 (d, C-2'), 98,5 (d, C-3),

56,8 (q, 2-OCH3), 56,7 (q, 5-OCH3), 56, 2 (q, 4-OCH3), 47,0 (d, C-1''), (PL-3). 1 Medicarpin (DT.04): dạng bột trắng, (C17H17O4, M = 285), H-NMR (500

MHz, CD3OD), δ (ppm): 7,27 (1H, d, 8,5 Hz, H-1), 7,12 (1H, d, 8,0 Hz, H-7), 6,51 (1H, dd, 2,5, 8,0 Hz, H-2), 6,42 (1H, dd, 2,0, 8,0 Hz, H-8), 6,37 (1H, d, 2,5 Hz, H- 10), 6,33 (1H, d, 2,5 Hz, H-4), 5,41 (1H, t, 7,0 Hz, H-11a), 3,47 (1H, dd, 2,5, 10,5

Hz, H-6a), 3,71 (3H, s, 9-OCH3), 4,17 (1H, dd, 2,5, 10,5 Hz, H-6) 3,51 (1H, t, 10,5 H-6) (PL-4).

13 C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 162,5 (s, C-3), 161,9 (s, C-4a), 160,0 (s, C-9), 158,0 (s, C-10a), 133,2 (d, C-1), 125,9 (d, C-7), 120,8 (s, C-6b), 112,9 (s, C- 11b), 110,7 (d, C-2), 107,2 (d, C-8), 104,1 (d, C-4), 97,6 (d, C-10), 80,0 (d, C-11a),

67,5 (t, C-6), 55,9 (q, 9- OCH3), 40,8 (d, C-6a), (PL-4). 1 Buteaspermanol (DT.05): bột màu trắng, (C16H12O5, M = 284), H-NMR

(500 MHz, CD3OD), δ (ppm): 7,56 (2H, t, J=7,0 Hz, H-2, H-6), 7,40-7,45 (3H, m, H-3, H-4, H-5), 7,31 (1H, s, H-5), 6,43 (1H, s, H-8), 5,09 (1H, d, J=12,0 Hz, H-2),

4,53 (1H, d, J=12,0 Hz, H-3), 3,88 (3H, s, 7-OCH3), (PL-5).

13 C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 194,3 (s, C-4), 159,7 (s, C-8a), 156,8 (s, C-7), 145,5 (s, C-1),138,8 (s, C-6), 129,8 (s, C-4), 129,3 (d, C-3, C-5), 128,9 (d, C- 2, C-6), 112,1 (s, C-4a), 108,2 (d, C-5), 104,5 (d, C-8), 85,9 (d, C-3), 74,6 (d, C-2),

56,6 (q, 7-OCH3), (PL-5). Daltonkin A (DT.06): Chất rắn vô định hình màu trắng, tan tốt trong dung môi metanol. Xác định định tính bằng sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng silica gel tráng sẵn

60 F254 (Merck), dung môi triển khai là n-hexan/etyl axetat/axit formic = 80/120/2; Rf -1 = 0,40; (C18H16O6, M = 328), IR (film, cm ): 3354, 2947, 2835, 1701, 1637, 1610,

1452, 1022, 975, 689; UV λmax (MeOH): 293 nm; CD (c 0,4, MeOH): ∆ε288 (nm) 

 10,43, ∆ε330 (nm) + 2,10; HR-ESI-MS: m/z 327,0868 [M  H] (tính toán C18H15O6 =

1 327,0868); H-NMR (500 MHz, methanol-d4) δH (ppm): 5,47 (1H, dd, J = 13,0, 3,0

Hz, H-2), 3,11 (1H, dd, J = 17,0, 13,0 Hz, H-3ax), 2,80 (1H, dd, J = 17,0 và 3,0 Hz,

H-3eq), 6,02 (1H, s, H-6), 7,52 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-2′ và H-6′), 7,44 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-3′ và H-5′), 7,39 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-4′), 2,86 (2H, t, J = 8,0 Hz, H-9), 2,49 (2H, t, J = 8,0 Hz, H-10), (PL-6).

13 C-NMR (125 MHz, methanol-d4) δC (ppm): 80,5 (C-2), 44,3 (C-3), 197,5 (C- 4), 103,3 (C-4a), 162,8 (C-5), 95,6 (C-6), 166,1 (C-7), 108,5 (C-8), 162,8 (C-8a), 18,7 (C-9), 34,1 (C-10), 177,7 (C-11), 140,5 (C-1′), 127,3 (C-2′ và C-6′), 129,6 (C-4′), 129,7 (C-3′ và C-5′), (PL-6).

Daltonkin B (DT.07): chất rắn vô định hình màu trắng, tan tốt trong dung môi metanol. Xác định định tính bằng sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng silica gel tráng sẵn

60 F254 (Merck), dung môi triển khai là n-hexan/etyl axetat/axit formic = 80/80/2; Rf = -1 0,25; (C21H20O9, M = 415), IR (film, cm ): 3369, 2987, 2864, 1751, 1676, 1575, 1411,

1022, 894, 754, 696; UV λmax (MeOH): 297 nm; CD (c 0,4, MeOH): ∆ε291 (nm)  8,29,

 ∆ε330 (nm) + 2,05; HR-ESI-MS m/z 415,1014 [M  H] (tính toán C21H19O9 415,1024);

1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: H-NMR (500 MHz, methanol-d4) δH (ppm): 5,39 (1H, dd, J = 13,0, 3,0 Hz, H-2), 3,13 (1H, dd, J = 17,0, 13,0 Hz, H-3ax), 2,79 (1H, dd, J =

17,0, 3,0 Hz, H-3eq), 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′ và H-6′), 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′ và H-5′), 2,85 (2H, m, H-9), 2,55 (2H, m, H-10), 2,81 (2H, m, H-9′), 2,51 (2H, m, H-10′), (PL-7).

13 C-NMR (125 MHz, methanol-d4) δC (ppm): 80,3 (C-2), 44,0 (C-3), 198,6 (C- 4), 103,4 (C-4a), 159,8 (C-5), 109,0 (C-6), 163,9 (C-7), 108,3 (C-8), 161,1 (C-8a), 18,8 (C-9), 34,4 (C-10), 179,1 (C-11), 19,4 (C-9′), 34,8 (C-10′), 179,2 (C-11′), 131,4 (C-1′), 128,8 (C-2′ và C-6′), 158,9 (C-4′), 116,4 (C-3′ và C-5′), (trang PL-7).

1 Dalbergin (DT.08): tinh thể màu vàng, (C16H12O4, M = 268), H-NMR (500

MHz, CD3OD): 7,57 (3H, m, H-3', H-4', H-5'), 7,51 (2H, m, H-2', H-6'), 7,06 (1H, s,

H-8), 6,88 (1H, s, H-5), 6,21 (1H, s, H-3), 3,99 (3H, s, 7-OCH3), (PL-8).

13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): 163,8 (s, C-2), 158,2 (s, C-4), 153,6 (s, C-7), 150,4 (s, C-4a), 145,2 (s, C-6), 137,1 (s, C-1'), 130,8 (d, C-4'), 129,9 (d, C-3', C-5'), 129,5 (d, C-2', C-6'), 112,3 (d, C-3), 111,9 (d, C-5), 113,1 (s, C-8a), 101,1 (d, C-8),

56,8 (q, 7-OCH3), (PL-8).

Isoliquiritigenin (DT.09): chất bột màu trắng, vô định hình, (C15H12O4, M =

1 316). H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) H ppm: 7,74 (4H, s, H-α, H-β, H-2, H-6), 6,84 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-3, H-5), 6,27 (1H, d, J= 2,5 Hz, H-3'), 6,41 (1H, dd, J= 9,0, 2,5 Hz, H-5'), 8,14 (1H, d, J= 9,0 Hz, H-6'), (PL-9).

13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) C ppm: 191,5 (s, C-4), 144,3 (C- β), 117,5 (C-α), 131,2 (d, C-2, C-6), 115,9 (d, C-3, C-5), 125,8 (s, C-1), 165,0 (s, C-2'), 102,6 (C-3'), 165,8 (s, C-4'), 108,2 (C-5'), 132,8 (C-6'), 113,0 (s, C-1'), (PL-9).

7,3',5'-trihydroxyflavanone (DT.10): chất rắn không màu (C15H12O5, M =

1 272); H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) H: 7,64 (1H, d, 9,0Hz, H-5), 6,88 (1H, s, H-4'), 6,74 (2H, s, H-2', H-6'), 6,49 (1H, dd, 2,5, 9,0 Hz, H-6), 6,32 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 5,37

(1H, dd, 30; 12,5 Hz, H-2), 3,03 (1H, dd, 12,5; 17,0 Hz, H-3ax), 2,62 (1H, dd, 3,0, 17,0

Hz, H-3eq), (PL-10).

13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) C: 190,0 (C-4), 164,6 (C-8a), 163,1 (C-7), 145,1 (C-3'), 145,6 (C-5'), 129,9 (C-1'); 128,3 (C-5); 117,8 (C-4'), 114,2 (C-2', C-6'), 113,5 (C-10), 110,4 (C-6), 102,5 (C-8), 78,9 (C-2), 43,2 (C-3), (PL-10). 1 Vestitone (DT.11): chất bột màu trắng (C16H14O5, M = 286); H-NMR (500

MHz, DMSO-d6): 7,67 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 6,84 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,41 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 6.51 (1H, dd, 8,5, 2,0 Hz, H-6), 6.31 (1H, dd, 8,5, 2,0 Hz, H-5'), 6,29

(1H, d, 2,0 Hz, H-3'), 4,48 (1H, t, 11,0 Hz, Ha-2), 4,40 (1H, dd, 11,0, 5,5, Hb-2), 4,10

(1H, dd, 11,5, 5,5 Hz, H-3), 3,67 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-11). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): 190,5 (s, C-4), 164,2 (s, C-7), 163,2 (s, C- 8a), 158,1 (s, C-4'), 158,0 (s, C-2'), 130,5 (d, C-5), 128,9 (d, C-6'), 114,2 (s, C-1'), 99,4 (d, C-3'), 106,9 (d, C-5'), 103,6 (d, C-6), 114,1 (s, C-4a), 102,3 (d, C-8), 70,4 (t,

C-2), 56,0 (q, 4'-OCH3), 46,6 (d, C-3), (PL-11).

1 Calycosin (DT.12): chất bột màu vàng, vô định hình (C16H12O5, M = 287); H-

NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6): 8,28 (1H, s, H-2), 7,97 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 6,93 (dd, 9,0; 2,0 Hz, H-6), 6,92 (1H, d, 2,5 Hz, H-8), 7,05 (1H, s, H-2'), 6,94 ( 1H,

d, 9,0 Hz, H-6'), 6,94 ( 1H, d, 9,0 Hz, H-5'), 3,79 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-12).

13 C-NMR (125 MHz, 500 MHz, DMSO-d6): 174,5 (s, C-4), 162,5 (s, C-7), 147,5 (s, C- C-4'), 157,3 (s, C-8a), 153,0 (d, C-2), 119,7 (d, C-6'), 127,3 (d, C-5), 123,3 (s, C-3), 124,7 (s, C-1'), 116,6 (s, C-4a), 116.4 (s, C-2'), 115,1 (d, C-6), 146,0

(d, C-3'), 112,0 (d, C-5'), 102,5 (d, C-8), 55,6 (q, 4'-OCH3), (PL-12).

4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone (DT.13): dạng bột màu trắng, (C16H12O4, M 1 = 268), H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 7,97 (1H, d, J=8,8 Hz, H-5), 6,94 (1H dd, J=8,8, 2,1 Hz, H-6), 6,86 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 7,50, (2H, d, J=8,7 Hz, H-2', H-6'), 6,86 (2H, d, J=8,7 Hz, H-3', H-5'), 3,78(3H, s, 3-OCH3), (PL-13).

13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): 175,1 (s, C-4), 163,0 (s, C-7), 157,9 (s, C-4'), 159,4 (s, C-8a), 153,6 (s, C-2), 130,5 (d, C-2', C-6'), 124,7 (d, C-5), 127,8 (s, C-3), 123,6 (s, C-1'), 117,7 (s, C-4a), 115,7 (d, C-6), 114,1 (d, C-3', C-5'), 102,6 (d, C-8), 55,6 (q, 3-

OCH3), (PL-13). 1 Liquiritigenin (DT.14): chất bột màu vàng, (C15H12O4, M = 256), H-NMR

(500 MHz, methanol-d4): 7,65 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 7,32 (2H, d, 8,5 Hz, H-2', H-6'), 6,80 (2H, d, 8,5 Hz, H-3', H-5'), 6,51 (1H, dd, 2,5, 8,5 Hz, H-6), 6,33 (1H, d, 2,5 Hz,

H-8), 5,42 (1H, dd, 3,0, 13,0 Hz, H-2), 3,06 (1H, dd, 13,0, 17,0 Hz, Ha-3), 2,64 (1H, dd, 3,0, 17,0, Hb-3), (PL-14)

13 C-NMR (125 MHz, methanol-d4): 190,1 (s, C-4), 164,7 (s, C-8a), 163,6 (s, C-7), 157,6 (s, C-4'), 131,4 (s, C-1'), 129,3 (s, C-5), 128,4 (d, C-2', C-6'), 115,2 (d, C-3', C- 5'), 110,5 (s, C-4a), 114,8 (d, C-6), 102,8 (d, C-8), 79,0 (d, C-2), 43,2 (t, C-3), (PL-14) 1 Sativanone (DT.15): chất bột màu trắng: (C17H16O5, M = 300); H-NMR (500

MHz, Acetone-d6) H: 9,40 (1H, br s, 7-OH), 7,77 (1H, d, 9,0 Hz, H-5), 7,01 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,59 (1H, d, 2,5 Hz, H-8), 6,58 (1H, dd, 9,0, 2,5 Hz, H-6), 6,48 (1H, dd, 8,5, 2,5 Hz, H-5'), 6,40 (1H, d, 2,5 Hz, H-3'), 4,56 (1H, t, 11,0 Hz, H-2ax), 4,45

(1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-2eq), 4,18 (1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-3), 3,79 (3H, s, 2'-OCH3),

3,78 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-15).

13 C-NMR (125 MHz, Acetone-d6) C: 190,7 (C-4), 164,5 (C-7), 164,3 (C-8a), 161,1 (C-4'), 159,1 (C-2'), 131,2 (C-5), 129,7 (C-6'), 117,0 (C-1'), 115,6 (C-4a), 110,8

(C-6), 105,3 (C-5'), 103,1 (C-3'), 99,2 (C-8), 71,4 (C-2), 55,6 (4'-OCH3), 55,2 (2'-

OCH3), 47,6 (C-3), (PL-15). 1 3'-O-methylviolanone (DT.16): chất bột màu trắng, (C18H18O6, M = 330), H-

NMR (500 MHz, CD3OD): 6,54 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 6,86 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,36 (1H, d, 2,5 Hz, H-8), 6,54 (1H, dd, 8,5, 2,5 Hz, H-6), 6,75 (1H, d, 8,5 Hz, H-5'), 4,55

(1H, t, 11,5 Hz, Ha-2), 4,15 (1H, dd, 11,5, 5,5 Hz, Hb-2), 4,44 (1H, dd, 11,5, 5,5 Hz,

H-3), 3,82 (3H, s, 4'-OCH3), 3,83 (3H, s, 2'-OCH3), 3,85 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-16).

13 C-NMR (125MHz, CD3OD): 194,2 (s, C-4), 166,5 (s, C-7), 165,8 (s, C-8a), 155,1 (s, C-4'), 153,2 (s, C-2'), 130,4 (d, C-5), 126,0 (d, C-6'), 123,1 (s, C-1'), 143,6 (s, C-3'), 108,8 (d, C-5'), 111,8 (d, C-6), 115,6 (s, C-4a), 103,7 (d, C-8), 72,3 (t, C-2),

61,2 (q, 3'-OCH3), 61,0 (q, 2'-OCH3), 56,0 (q, 4'-OCH3), 49,5 (d, C-3), (PL-16). 1 Sulfuretin (DT.17): Chất bột màu vàng; (C15H10O5, M = 270); H-NMR (500

MHz, DMSO-d6) H: 7,60 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 7,44 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 7,23 (1H, d, 2,0, 8,5 Hz, H-6), 6,83 (1H, d, 8,5 Hz, H-5'), 6,74 (1H, d, 2,0 Hz, H-2'), 6,69 (1H, dd, 2,0, 8,5 Hz, H-6'), 6,62 (1H, s, H-2), (PL-17).

13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) C: 181,2 (C-4), 167,5 (C-7), 166,3 (C- 8a), 148,2 (C-4'), 145,7 (C-3), 145,6 (C-3'), 125,7 (C-5), 124,5 (C-1'), 123,4 (C- 6'), 117,9 (C-2'), 116,0 (C- 5'), 113,1 (C-4a), 112,9 (C-6), 111,9 (C-2), 98,4 (C-8), (PL-17).

Formononetin (DT.18): chất bột màu vàng, vô định hình, (C16H14O4, M = 1 270), H-NMR (500 MHz, CD3OD): 8,18 (1H, s, H-2), 8,06 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5), 6,99 (1H dd, J=8,5, 2,5 Hz, H-6), 6,90 (1H, d, J=2,5 Hz, H-8), 7,56, (2H, d, J=8,5 Hz,

H-2', H-6'), 6,98 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3', H-5'), 3,83(3H, s, 4'-OCH3), (PL-18). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): 178,1 (s, C-4), 164,9 (s, C-7), 161,1 (s, C-4'), 159,8 (s, C-8a), 154,8 (d, C-2), 131,4 (d, C-2', C-6'), 128,5 (d, C-5), 125,7 (s, C-3), 125,6 (s, C-1'), 118,1 (s, C-4a), 116,6 (d, C-6), 114,9 (d, C-3', C-5'), 103,3 (d, C-8), 55,7 (q, 4'-

OCH3), (PL-18).

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ VI PHẪU VÀ DNA CỦA CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) Cho đến thời điểm này, chỉ có một công trình nghiên cứu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) về mặt thực vật sinh học phân tích ADN trong nước [14] và ba công trình ngoài nước [80-82]. Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào đầy đủ và kỹ lưỡng về mặt thực vật (đặc biệt là đặc điểm vi học chưa có một công bố nào). Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu các đặc điểm vi học của thân, lá và vi học bột thân của cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) và sử dụng DNA Markers để hỗ trợ cho phân loại hình thái cũng như bổ sung cơ sở dữ liệu di truyền cho loài này. 3.1.1. Kết quả nghiên cứu vi phẫu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 3.1.1.1. Vi phẫu lá Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Mặt cắt ngang qua lá cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) gồm 2 phần: phiến lá và gân lá. Phần gân lá lồi lên rõ ràng ở mặt dưới của phiến lá. Biểu bì trên (2) là một lớp tế bào có kích thước tương đối đồng đều nhau mang lông che chở (1); Mô dày trên (3) gặp ở phần gân chính của phiến lá, gồm các tế bào đỏ đậm, có vách dày, xếp thành hình trụ; Mô cứng gồm 3-5 lớp tế bào có vách dày, màu xanh, xếp thành hình cung bao lấy phía trên (4) và phía dưới (7) của bó libe gỗ; Gỗ (5) gồm các bó mạch gỗ có kích thước lớn ở phía dưới và nỏ ở phía trên, xếp xen kẽ với các cụm mô mềm gỗ; Libe (6) gồm các nhóm tế bào có kích thước nhỏ, xếp thành cung phía trong vòng mô cứng; Mô dày dưới (8) có khoảng 3-5 lớp tế bào vách dày, màu đỏ đậm; Mô mềm (9) gồm các tế bào màu đỏ, vách mỏng, kích thước và hình thái thay đổi; Biểu bì dưới (10) cấu tạo bởi một lớp tế bào có kích thước tương đối đều nhau, mỗi tế báo có kích thước nhỏ hơn mỗi tế bào của biểu bì trên và không mang lông che chở. Cấu tạo phiến lá; Biểu bì trên và dưới tiếp nối từng phần gân lá (11), (12); Mô giậu (13) gồm 1-2 hàng tế bào dài và hẹp xếp sít nhau. Hạ bì trên (12) gồm vài tế bào có kích thước lớn, mỏng bắt màu hồng nhạt, sắp xếp không theo qui luật.

Hình 3.1. Vi phẫu lá Sưa 1- Lông che chở; 2- Biểu bì trên; 3-Mô dày trên; 4; 7- Mô cứng; 5- Gỗ; 6- Libe;

8- Mô dày dưới; 9- Mô mềm; 10- Biểu bì dưới Hình 3.2. Phiến lá Sưa 11- Biểu bì trên; 12- Hạ bì trên; 13- Mô giậu; 14- Mô khuyết; 15 – Biểu bì dưới.

3.1.1.2. Vi phẫu thân cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Mặt cắt ngang vi phẫu có hình tròn. Từ ngoài vào trong cấu tạo gồm có: Bần (1) có khoảng 3-4 hàng tế bào hình chữ nhật xếp vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm; Tinh thể calcioxalat (2) hình khối xếp thành vòng tròn trong mô mềm vỏ và bắt màu xanh; Mô mềm vỏ (3) gồm các tế bào có vách mỏng, màu đỏ, hình thái thay đổi sắp xếp không theo qui luật; Sợi libe là các đám tế bào có vách dày, màu xanh có thể tập chung thành nhóm phía trên bó libe mô mềm; Vỏ (4) hoặc gồm các tế bào mô cứng xếp thành từng cụm rời trong bó libe cấp hai (5); Libe cấp hai (6) gồm các tế bào có vách mỏng, xếp thành dãy xuyên tâm; Tầng phát sinh libe-gỗ (7), là một lớp tế bào hình chữ nhật, màu đỏ nằm ở giữa libe cấp 2 và gỗ cấp 2; Gỗ cấp 2 gồm các mạch gỗ lớn (8) và tế bào mô mềm mỡ (10) có vách dày hóa gỗ, màu xanh; Sợi gỗ (9) là các cụm tế bào có vách dày, màu xanh, xếp thành từng cụm rải rác ở gỗ cấp 2; Tia ruột hẹp.

Hình 3.3. Vi phẫu thân loài Sưa 1- Bần; 2- Tinh thể calcioxalat hình khối; 3- Mô mềm; 4- Sợi vỏ; 5- Sợi libe; 6- Libe; 7- Tầng phát sinh libe-gỗ; 8- Mạch gỗ lớn ;

9- Sợi gỗ; 10- Mô mềm gỗ; 3.1.1.3. Đặc điểm bột lõi thân cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Hình 3.4. Đặc điểm bột lõi thân 1,2- Hạt tinh bột; 3a,3b- Mạch điểm; 4-Sợi 5- Tinh thế calcioxalat hình khối; 6- Tế bào cứng; 7- Mảnh mang màu.

Bột màu nâu, không mùi, không vị. Soi trên kính hiển vi có các đặc điểm sau: hạt tinh bột đơn, hình tròn hoặc hình bẩu dục. Mảnh mạch điểm. Tinh thể calcioxalat hình khối. Sợi dài rõ vách tế bào. Tế bào cứng và mảnh mang màu. Bột màu nâu, không mùi, khôngvị. Soi trên kính hiển vi có các đặc điểm sau: Hạt tinh bột đơn, hình tròn hoặc hình bầu dục. Mảnh mạch điểm. Tinh thể calcioxalat hình khối. Sợi dài rõ vách tế bào. Tế bào cứng và mảnh mang màu. Đặc điểm vi phẫu lá, thân và bột lõi thân từ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) được thu hái tại Đak Lak đã được nghiên cứu lần đầu tiên. Các đặc điểm giải phẫu học này đã được miêu tả cụ thể, góp phần tiêu chuẩn hóa loài cây gỗ quý này.

3.1.2. Kết quả nghiên cứu DNA cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 3.1.2.1. Kết quả nhân bản vùng gen rpoC Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel Agarose 1% cho thấy rõ một băng DNA kích thước khoảng 600 bp tương ứng với kích thước vùng gen rpoC dự kiến (hình 3.6)

Hình 3.5. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 1% 1. Mẫu Trắc, 2.Mẫu Sưa đỏ 3.1.2.2. Đặc điểm phân tử vùng gen rpoC Kết quả cho thấy: Chỉ số tương đồng của vùng gen rpoC từ hai mẫu nghiên cứu với trình tự tương đồng từ hai loài Trắc (Dalbergia cochinchinensis) và Sưa (Dalbergia tonkinensis) tham khảo là 99%. Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy vùng gen rpoC có khả năng dùng trong phân loại các loài của chi Sưa (Dalbergia). Đoạn gen rpoC dài 600 bp của hai loài Dalbergia cochinchinensis và Dalbergia tonkinensis của Việt Nam đã được đăng kí tại Genbank với mã số lần lượt là KY287755 và KY287750. 3.1.2.3. So sánh khả năng phân loại loài sưa đỏ (Dalbergia tonkinensis) Việt Nam của một số vùng gen lục lạp 3 đoạn gen rpoB, rbcL và rpoC có chiều dài 600bp đã được nhân bản và đọc trình tự 2 chiều. Kết quả giải trình tự hai chiều nhận được của mỗi đoạn gen sau đó được ghép nối với nhau để thu về một trình tự duy nhất bằng phần mềm Chromas Pro. Trình tự thu được sau hiệu chỉnh ở định dạng file fasta (.fas) được đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) bằng công cụ BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Công cụ BLAST cho phép chúng tôi định danh đến mức độ loài của các trình tự thu được bằng cách xác định các trình tự tương đồng với trình tự này trong cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen (GenBank). Sử dụng phương pháp tìm kiếm những trình tự có điểm số bắt cặp cao giữa chuỗi truy vấn và các chuỗi trong cơ sở dữ liệu, công cụ BLAST tìm những trình tự tương đồng thông qua việc phát hiện các đoạn bắt cặp ngắn theo từng bộ 3 nulceotide gối lên nhau giữa trình tự cần truy vấn và trình tự có sẵn trong cơ sở dữ liệu. Tiếp đó, nếu mỗi bộ 3 này đạt tới một ngưỡng T tối thiểu được tính toán bằng ma trận điểm (scoring matrix), chúng sẽ được đưa vào sắp xếp thẳng hàng (alignment) bởi thuật toán được sử dụng trong công cụ BLAST. BLAST sẽ cho ra kết quả các trình tự tương đồng được thể hiện ở dạng bảng đi kèm với thông tin của trình tự trên ngân hàng gen cùng với các chỉ số tương đồng (ident), độ dài của chuỗi trình tự được bắt cặp ở dạng phần trăm (query cover), điểm số bắt cặp giữa 2 trình tự. Trình tự nào có điểm số tương đồng cao hơn sẽ có mức độ giống nhau cao hơn. Dựa vào việc phân tích các chỉ số tương đồng của các trình tự sẽ giúp đưa ra được kết quả giám định loài cho các mẫu vật nghiên cứu. Kết quả so sánh với các trình tự có trong ngân hàng gen (NCBI) bằng công cụ Blast cho thấy 3 vùng gen rbcL, rpoB và rpoC bắt cặp cao nhất với loài Dalbergia tonkinensis với điểm số bắt cặp tương đồng (query cover) tương ứng lần lượt là 99%, 98% và 97%. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã thành công trong việc khuếch đại và giải mã đúng trình tự vùng gen đích. Kết quả phân tích trình tự trên phần mềm Chromas Pro cho thấy đã giải mã tốt được đoạn gen có chiều dài 511bp cho vùng gen rpoC, đoạn gen dài 563pb cho gen rbcL và đoạn gen dài 565bp cho gen rpoB. Kết quả phân tích lần lượt 3 vùng gen này trên phần mềm ClustalW, so sánh với 4 loài Dalbergia khác (bảng 2) cho thấy đoạn gen rpoC dài 511bp của Sưa mã hoá được cho 170 acid amin. Tỷ lệ Guanine chiếm 22,9%; Thymine chiếm 30,9%; Adenine chiếm 29,7%; Cytosine chiếm 16,4%. Thành phần A và thành phần T không có sự dao động lớn. Thành phần C và G có khoảng dao động lần lượt 16,4% đến 22,9% và 16,4% đến 23,5%. Phát hiện 8 vị trí biến đổi (variable) tương ứng ở các vị trí 54 (G->A); 62 (A->G); 64(A->T); 70(A->G); 74(A->C); 238(A- >G); 290(A->G); 369(C->T), trong đó giá trị mang thông tin (Parsimory informative) chiếm 1 vị trí là 54 (G->A). Số cặp nucleotide tương đồng trung bình là 503. Hệ số trung

bình của cặp Si (Transition) và Sv (transversion) là 1.0. Hệ số này đối với vị trí codon thứ nhất, thứ hai và thứ ba tương ứng là 1. Đoạn gen rpoB dài 565bp của Sưa đỏ mã hoá được cho 197 acid amin. Tỷ lệ Guanine chiếm 23,6%; Thymine chiếm 26,7%; Adenine chiếm 31,2%; Cytosine chiếm 18,5%. Phát hiện 05 vị trí biến đổi (variable) tương ứng ở các vị trí 226 (G- >A); 264 (T->A); 414(G->T); 563(C->T); 608(G->A) ở cả hai loài Sưa đỏ và Trắc), trong đó có 1 vị trí là 563(C->T) có ý nghĩa Parsimony Vùng gen rbcL của 2 mẫu nghiên cứu sau khi loại bỏ các vùng nhiễu rối thì thu được đoạn gen dài 562bp. . Kết quả phân tích trên phần mềm Mega cho thấy đoạn gen này mã hoá được cho 183 acid amin. Tỷ lệ Guanine chiếm 22,4%; Thymine chiếm 29,3%; Adenine chiếm 27%; Cytosine chiếm 21,3%. Khi so sánh vùng gen này với vùng gen rbcL tương ứng của 5 loài Dalbergia khác trên Genbank phát hiện thấy có 14 vị trí biến đổi, trong đó có 11 vị trí Nu có ý nghĩa Parsimony. Kết quả so sánh khả năng phân biệt ở cấp độ loài của 3 vùng gen này với 6 loài Dalbergia khác (sử dụng loài giáng hương Pterocarpus santalinus (KJ749960.1) là loài ngoài nhóm) được thể hiện ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền của từng vùng gen so sánh giữa 2 mẫu nghiên cứu với 6 loài trên Genbank rpoB rpoC rbcL C-561-L 0 0 0 C-564-L 0 0 0 D. tonkinensis (FR854140) 0 0 0 D. cochinchinensis (FR854124) 0.0032 0.008 0.01 D. assamica (FR854122) 0.0024 0.003 0.0067 D. sissoo (JX856444) 0.003 0 0.006 D. odorifera (GQ435947.1) 0 0 0.0032 Pterocarpus santalinus (KJ749960.1) 0.0064 0.007 0.015

Gen rpoB và rpoC là gen mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu các cây họ dầu (Dipterocarpaceae), đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài. Hiện nay rpoB là gen được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần gũi. Cùng với gen 16S rRNA, rpoB được sử dụng trong

nhiều nghiên cứu để xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này được đề xuất là chỉ thị barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác. Trong các nghiên cứu gần đây, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%) [83]. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, kết quả kiểm tra khả năng phân loại một số loài sưa (bảng 3.1) của 3 vùng gen rpoB, rpoc và rbcL cho thấy đoạn gen rpoB dài 565bp nhưng chỉ chứa 5 vị trí Nu có khả năng biến đổi, trong đó có 1 Nu mang ý nghĩa parsimony, trong khi đoạn gen rpoC dài 511bp chứa 8 vị trí Nu có khả năng biến đổi, 1 vị trí Nu có ý nghĩa Parsimony, điều đó cho thấy gen rpoC có tiềm năng phân loại các loài sưa tốt hơn so với gen rpoB, tuy nhiên khi so sánh các hệ số khoảng cách di truyền giữa 2 vùng gen này thì cho thấy khả năng phân loại của 2 gen này khá giống nhau. Cụ thể vùng gen rpoC không chỉ ra được sự khác biệt giữa 3 loài D. tonkinensis, D. sissoo và D. odorifera nhưng phân biệt khá rõ các loài còn lại. Trong khi vùng gen rpoB không chỉ ra được sự khác biệt giữa là D. tonkinensis và D. odorifera nhưng với các loài còn lại thì cho chỉ số về khoảng cách di truyền cũng không cao. Như vậy có thể kết luận đối với 2 vùng gen rpoB và rpoC thì có khả năng phân biệt được các loài sưa, tuy nhiên không phải là chỉ thị thích hợp nhất để sử dụng. So sánh với 2 vùng gen rpoB và rpoC thì vùng gen rbcL đã thấy rõ khả năng phân biệt các loài sưa tốt hơn hẳn so với 2 vùng gen rpoB và rpoC. Kết quả so sánh vùng gen rbcL với 5 loài sưa khác (GB) thì phát hiện14 vị trí biến đổi, trong đó có đến 11 vị trí Nu mang ý nghĩa Parsimony. Chỉ số khoảng cách di truyền khi so sánh với 5 loài sưa khác của vùng gen này đều cho chỉ số tương đối cao hơn nhiều so với 2 vùng gen rpoB và rpoC. Khả năng phân biệt các loài Sưa của 3 vùng gen rpoB, rpoC và rbcL được thể hiện ở hình 3.6.

0.016 0.014 0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0

rpoB rpoC rbcL

Hình 3.6. So sánh khả năng phân biệt giữa các loài Dalbergia của 3

vùng gen nghiên cứu

Kết luận: 3 vùng gen rpoB, rpoC và rbcL là thích hợp để phân loại các loài thuộc chi Sưa (Dalbergia) với tỉ lệ phân biệt tương ứng lần lượt là 99%, 98% và 97%. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã thành công trong việc khuếch đại và giải mã đúng trình tự vùng gen đích. Trình tự 3 vùng gen rbcL, rpoB và rpoC của loài sưa Việt Nam đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen với số hiệu lần lượt là KY283103, KY287755 và KY287750. 3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) (C-561) Lõi gỗ Sưa (C-561) được chiết bằng methanol, sau đó cô quay đuổi dung môi thu được cặn chiết. Cặn chiết được chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước. Phần chiết dichloromethane được phân tách nhiều lần bằng các phương pháp sắc ký cột pha thường thu được 3 hợp chất bao gồm 2 hợp chất flavanone là naringenin và pinocembrin cùng 1 hợp chất neoflavonoid 3'-hydoxy-2,4,5- trimethoxydalbergiquinol. Từ phần cặn chiết ethyl acetate phân tách được 2 hợp chất gồm 1 hợp chất flavanonol là buteaspermanol và 1 hợp chất neoflavonoid là medicarpin.

Từ cặn chiết nước đun sôi của bã sau khi chiết bằng methanol phân tách được 2 hợp chất flavanone mới là (2S)-8-carboxyethylpinocemprin (daltonkin A) và (2S)-2,6-dicarboxyethylnaringenin (daltonkin B). 3.2.1. Hợp chất pinocembrin (DT.01) Hợp chất DT.01 được phân lập dưới dạng chất bột màu vàng, tan tốt trong MeOH. Phổ 1H-NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho

2 proton gép meta thuộc về vòng A tại vị trí H [5,92 (1H, d, 2,0 Hz, H-6) và 5,89 (1H, d, 2,0 Hz, H-8)]. Các tín hiệu của các proton thuộc về vòng B bao gồm 4 proton

được đặc trưng bởi hệ spin AA'BB' tại H 7,44 (2H, t, 8,3 Hz, H-2', H-6'), 7,52 (2H, t, 8,4 Hz, H-3', H-5')] và 1 tín hiệu proton tại H 7,39 (1H, t, 7,0 Hz, H-4')]. Hệ vòng

C được nhận biết nhờ tín hiệu doublet của nhóm oxymethin ở H 5,57 (1H, dd, 12,6,

3,1 Hz, H-2) và 1 nhóm methylen tại H [2,77 (1H, dd, 17,1, 2,7 Hz, Ha-3) và tại H

3,24 (1H, dd, 17,1, 12,6 Hz, Hb-3)].

Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.01

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT chứng minh phân tử có 15 nguyên tử carbon bao gồm tín hiệu của 1 nhóm carbonyl tại [C 195,8 (s, C-4), tín hiệu của 1 carbon oxymethin cầu nối tại C 78,4 (d, C-2) và tín hiệu 1 carbon methylen tại C 42,1 (t, C-3)]. Các tín hiệu này được xem là ‘‘vân tay’’ gợi ý rằng hợp chất này có dạng khung flavanone [84]. Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT còn cho thấy có 4 nhóm methin thơm đối xứng tại [C (ppm) 128,5 (d, C-3', C-5') và C 127,0 (d, C-2', C-6')] và 2 nhóm methin thơm khác tại [C 95,1 (d, C-6), 96,0 (d, C-8)] cùng với tín hiệu của 3 nguyên tử carbon thơm liên kết với oxy tại [C 163,5 (s, C-5), 167,0 (s, C-7) và 162,7 (s, C-8a )]. Cuối cùng là 2 tín hiệu carbon thơm không liên kết hydro tại [C 101,7 (d, C-4a) và 138,7 (d, C-1')] với độ dịch chuyển hóa học nằm về phía trường cao.

Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.01

Hình 3. 8. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.01

Hình 3. 9. Phổ DEPT của hợp chất DT.01

Phân tích các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất DT.01 được xác định là pinocembrin [85]. Đã được phân lập từ lõi gỗ loài D. odorifera [12], loài D. Parviflora [40], rễ loài Boesenbergia rotunda (L.) và từ lá loài Glycyrrhiza glabra [ 86].

Hình 3.10. Cấu trúc hợp chất pinocembrin

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.01 và chất tham khảo Vị trí DT.01 (*) Pinocembrin δH (ppm) δC (ppm) δC [85] δH [85] 1 - - 2 5,57 (dd, J =12,6, 3,1 Hz) 78,4 80,4 5,33 (dd, J =12,8, 3,6 Hz) 3,24(dd, J =17,1, 12,6 Hz) 2,98 (dd, J =17,4, 12,9 Hz) 3 42,1 44,1 2,77 (dd, J =17,1, 2,7 Hz) 2,67 (dd, J =17,0, 3,6 Hz) 4 - 195,8 197,3 -

4a - 101,7 103,3 - 5 - 163,5 165,4 - 6 5,92 (d, J =2,0 Hz) 95,1 96.2 5,87 (d, J =1,84 Hz) 7 - 167,0 168,3 - 8 5,89 (d, J =2,0 Hz) 96,0 97,2 5,87 (d, J =1,84 Hz) 8a - 162,7 164,6 - 1' - 138,7 140,3 - 2' 7,44 (t, J =8,3 Hz) 127,0 127,3 7,34, m 3' 7,52 (t, J =8,4 Hz) 128,5 129,6 7,34, m 4' 7,39 (t, J =7,0 Hz) 128,5 129,7 7,34, m 5' 7,52 (t, J =8,4 Hz) 128,5 129,6 7,34, m 6' 7,44 (t, J =8,3 Hz) 127,0 127,3 7,34, m (*)1H-NMR (500 MHz, DMSO), 13C-NMR (125 MHz, DMSO)

3.2.2. Hợp chất naringenin (DT.02) Hợp chất DT.02 được phân lập dưới dạng chất bột màu vàng, tan tốt trong MeOH. So sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của hợp chất này thì thấy hoàn toàn tương tự hợp chất pinocembrin. Chỉ có sự khác biệt duy nhất khi proton methin thơm H-4' của hợp chất pinocembrin được thay thế bởi một nhóm hydroxy. Do vậy, sẽ xuất hiện thêm tín hiệu 1 carbon thơm liên kết với oxy tại C 165,5 (s, C-5) trên vòng C trong hợp chất DT.02.

Hình 3.11. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.02

Hình 3. 12. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.02

Phân tích, kết hợp các dữ kiện phổ và đối chứng với tài liệu tham khảo đã công bố. Hợp DT.02 được xác định là naringenin đã được phân lập từ lõi gỗ loài D. parviflora [40] và loài Swatzia polyphylla [87, 88].

Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất naringenin

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.02 và chất tham khảo Vị DT.02 (*) Naringenin [87] trí δH (ppm) δC (ppm) δC (ppm) δH (ppm) 1 - - - - 5,47 (1H, dd, J = 12,6; 2,7 2 5,36 (1H, dd, J = 13,0; 3,0 Hz) 80,5 78,9 Hz)

2,71 (1H, dd, J = 17,0; 3,0 2,72 (1H, dd, J =17,0, 3,0 Hz) Hz) 3 3,13 (1H, dd, J =17,0, 13,0 Hz 44,1 42,3 3,30 (1H, dd, J =17,0; 12,9 ) Hz) 4 - 197,8 196,9 - 4a - 103,4 102,6 - 5 - 165,5 164,2 - 6 5,91 (1H, d, J =2,0 Hz) 97,1 96,6 5,91 (1H, s) 7 - 168,4 167,3 - 8 5,91 (1H, d, J =2,0 Hz ) 96,2 95,5 5,91 (1H, s) 8a - 164,9 163,2 - 1' - 131,8 130,9 - 2' 7,34 (1H, d, J =8,5 Hz) 129,1 129,2 7,35 (1H, d, J =8,4 Hz) 3' 6,84 (1H, d, J =8,5 Hz) 116,4 115,9 6,82 (1H, d, J =8,4 Hz) 4' - 159,1 158,6 - 5' 6,83 (1H, d, J =8,5 Hz) 116,4 115,9 6,82 (1H, d, J =8,4 Hz) 6' 7,34 (1H, d, J =8,5 Hz) 129,1 129,2 7,35 (1H, d, J =8,4 Hz) 1 13 (*) H-NMR (500 MHz, methanol-d4); C-NMR (125 MHz, methanol-d4) 3.2.3. Hợp chất 3'-hydoxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol (DT.03) Hợp chất DT.03 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR cho thấy 2 tín hiệu tại [H 6,67 (1H, s, H-6), 6,54 (1H, s, H-3) ] đặc trưng cho hai proton ở vị trí para của vòng benzen ABCX của vòng A. 4 tín hiệu proton tại [H 7,14 (1H, t, 7,5 Hz, H- 5'), 6,76 (1H, d, 7,5 Hz, H-6'), 6,64 (1H, s, H-2'), 6,65 (1H, s, H-4')] của vòng thơm 2 nhóm thế, 1 tín hiệu của nhóm vinyl [H 6,24 (1H, ddd, 17,0, 10,5, 7,0 Hz, H-2''), 5,19 (1H, d, 10,0

Hz, Ha-3) và 4,94 (1H, d, 17,0 Hz, Hb-3)]. Ngoài ra còn có 1 tín hiệu của 1 proton nối với 3 1 carbon sp tại H 5,04 (1H, d, 6,5 Hz, H-1''). Quan sát trên phổ H-NMR còn có sự xuất hiện thêm các tín hiệu đặc trưng của 3 nhóm thế methoxy tại [H 3,88 (3H, s, 4-OCH3),

3,73 (3H, s, 2-OCH3) và 3,77 (3H, s, 5-OCH3)]. Các tín hiệu trên phổ 13C-NMR và DEPT khẳng định hợp chất DT.03 cho tín hiệu 18 carbon bao gồm 4 carbon thơm liên kết với oxy tại C [148,3 (s, C-4), 151,5 (s,

C-2), 143,0 (s, C-5) và 155,5 (s, C-3')], 2 carbon thơm không liên kết hydro tại [C 123,0 (s, C-1) và 145,4 (s, C-1')] cùng với 6 tín hiệu carbon methine vòng thơm trong

khoảng [C (98,5-129,3)], 2 tín hiệu của carbon nhóm vinyl tại [C 140,2 (d, C-2'') và 3 116,3 (t, C-3'')]. 1 tín hiệu của carbon sp tại C (47,0, d). Cuối cùng là tín hiệu 3 nhóm methoxy tại [C 56,8 (q, 2-OCH3), 56,7 (q, 5-OCH3) và 56,2 (q, 4-OCH3)]. Tổng hợp các dữ liệu phổ đã phân tích trên đồng thời kết hợp đối chiếu với tài liệu tham khảo. Chúng tôi kết luận hợp chất DT.03 là 3'-hydoxy-2,4,5- trimethoxydalbergiquinol được tìm thấy ở loài D. odorifera. Hợp chất này có tác dụng

ức chế NO sản sinh trong dòng tế bào RAW 264,7 với IC50 là 70,3 μM [49, 53].

Hình 3.14. Cấu trúc hợp chất 3'-hydoxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.03 và chất tham khảo Vị trí DT.03 (*) 3'-hydoxy-2,4,5- trimethoxydalbergiquinol [53]

δC δC δH (ppm) δH (ppm) (ppm) (ppm) 1 - 123,0 - 123,2 2 - 151,5 - 151,2 2- 3,71, s 56,8 3,73, s 56,8 OCH3 3 6,54, s 98,5 6,52, s 98,3 4 148,3 - 148,2 4- 3,75, s 56,1 3,88, s 56,2 OCH3 5 - 143,0 - 143,0 5- 3,75, s 56,7 3,77, s 56,7 OCH3 6 6,67, s 113,7 6,66, s 113,6 1' - 145,4 - 145,2 2' 6,64, s 116,2 6,62 (d, J =2,0 Hz) 115,4

3' - 155,5 - 155,4 4' 6,65, s 112,9 6,64 (dd, J =8,0, 2,0 Hz) 112,9 5' 7,14 (t, J =7,5 Hz) 129,3 7,11 (dd, J =8,0, 7,6 Hz) 129,2 6' 6,76 (d, J =7,5 Hz) 121,1 6,64 (d, J =7,6 Hz) 120,9 1'' 5,04 (d, J =6,5 Hz) 47,0 5,03 (d, J =6,7 Hz) 46,9 6,24 ( ddd, J =17,0, 10,5, 7,0 6,22 (ddd, J =17,1, 10,2, 1,6 140,1 2'' 140,2 Hz) Hz) 4,94 (d, J =17,0 Hz) 4,92 (dd, J =17,1, 1,6 Hz) 3'' 116,3 5,19 (d, J =10,0 Hz) 5,17 (dd, J =10,2, 1,6, Hz) 116,1 (*)1H-NMR (500 MHz, chloroform-d); 13C-NMR (125 MHz, chloroform-d) 3.2.4. Hợp chất medicarpin (DT.04) Hợp chất DT.04 thu được dưới dạng bột trắng. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H kết hợp với 13C-NMR và DEPT xác định giả thiết về một hợp chất thuộc lớp chất pterocarpanoid phytoalexin, là dẫn xuất của isoflavonoid với bộ khung Benzo- pyrano-furano-benzene. Kết hợp phổ 13C-NMR và DEPT thấy xuất hiện 16 tín hiệu tương ứng với số nguyên tử carbon trong phân tử, trong đó bao gồm tín hiệu của 1 nhóm methoxy tại δC 55,9 (9-OCH3), 1 nhóm oxymethylen δC 67,5 (C-6), 1 nhóm oxymethin δC tại 80,0 (C-11a), 6 tín hiệu carbon của nhóm metin hệ vòng thơm và một 1 tín hiệu carbon methin CH bão hòa nằm trong vùng trường cao tại δC 40,8 (C- 6a) cùng với 4 tín hiệu nguyên tử carbon thơm liên kết với oxy và 2 tín hiệu nguyên tử carbon thơm không liên kết hydro.

1 Phổ H-NMR, nhóm methoxy (9-OCH3) liên kết trực tiếp với nhân thơm đặc trưng với tín hiệu singlet tại 3,71ppm. Hai proton methylen multilet H-6 (δH 4,17 và 3,51) trong phổ 1H-NMR tạo vòng pyran liên kết trực tiếp với dị tố oxy. Hai tín hiệu nằm trong vùng trường thấp dạng doublet H-1 (δH 7,27, d, 8,5 Hz) và H-4 (δH 6,33, d, J = 2,5 Hz) và một peak doublet-doublet H-2 (δH 6,51, dd, J = 8,5, 2,5 Hz) cấu thành nên vòng benzo (hệ vòng chromene). Tương tự, proton dạng doublet - doublet

H-8 (δH 6,42, dd, J = 8,0, 2,0 Hz), cặp proton doublet H-7 (δH 7,12, d, J = 8,0 Hz) và

H-10 (δH 6,37, d, J = 2,5 Hz) chứng minh sự tồn tại của một vòng benzo khác (Hệ vòng benzofuran). Hai proton dạng peak doublet-doublet H-6a (δH 3,47, dd, J = 10,5,

6,0, 2,5 Hz) và triplet H-11a (δH 5,41, t, J = 7,0 Hz) thuộc về một liên kết chung giữa hai dị vòng pyran và furan. Cặp nguyên tử cacbon bất đối C-6a, 11a với hằng số tách

J = 6,5 Hz và [α]D = + 225,2 (c = 0,60, MeOH) xác định tính chất lập thể với cấu hình tuyệt đối dạng R và đồng phân hình học dạng cis. Do vậy chúng tôi xác định đây là hợp chất (+)-(6aR, 11aR)-cis-3-hydroxy-9-methoxypterocarpan (medicarpin). Hợp chất này được phân lập từ lõi gỗ loài Dalbergiacongestiflora Pittier, Dalbergia odorifera và Dalbergia oliveri và có các hoạt tính chống oxi hóa, gây độc tế bào [89, 90].

Hình 3.15. Cấu trúc hợp chất medicarpin Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.04 và chất tham khảo DT.04 (*) Medicarpin [ 89] Vị trí δ δ δ (ppm) C C δ (ppm) H (ppm) (ppm) H 1 7,27 (d, 8,5 Hz) 133,2, d 132,2 7,37 (d,8,5 Hz) 2 6,51 (dd, 2,5, 8,5 Hz) 110,7, d 109,8 6,54 (dd, 8,5, 2,5 Hz) 3 - 162,5, s 161,0 - 3-OH - - - 5,52 (s) 4 6,33 (d, 2,5 Hz) 104,1, d 103,6 6,40 (d, J = 2,5 Hz) 4a - 161,9, s 160,6 - 5 - - - -

3,51 (t, 10,5 Hz) 3,62 (t, 11 Hz) 6 67,5, t 66,5 4,17 (dd, 10,5, 2,5, Hz) 4,22 (ddd, 11,0, 5,0, 0,5 Hz)

6a 3,47 (ddd, 2,5, 6,0, 10,5 Hz) 40,8, d 39,4 3,52 (ddd,11,0, 6,5, 5,0 Hz)

6b - 120,8, s 119,1 - 7 7,12 (d, 8,0 Hz) 125,9, d 124,8 7,12 (d, 9,0 Hz) 8 6,42 (dd, 8,0, 2,0 Hz) 107,2, d 106,4 6,46 (dd, 9,0, 2,0 Hz) 9 - 160,0, s 157,0 -

9- 3,71 (s) 55,9, q 55,5 3,70 (s) OCH3 10 6,37 (d, 2,5 Hz) 97,6, d 96,9 6,45 (s) 10a - 158,0, s 156,6 - 11 - - - - 11a 5,41 (d, 7,0 Hz) 80,0, d 78,5 5,48 (d, 6,5 Hz) 11b - 112,9, s 112,6 - 1 13 (*) H-NMR (500 MHz, methanol-d4); C-NMR (125 MHz, methanol-d4) 3.2.5. Hợp chất buteaspermanol (DT.05) Hợp chất DT.05 thu được dưới dạng bột trắng. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR xác định bộ khung dạng dihydroflavanol. Các tín hiệu doublet thuộc về proton H-2 (δH 5,09) và H-3 (δH 4,53) với giá trị hằng số tương tác J = 12,0 Hz chứng minh tính chất lập thể trans-diaxial giữa hai nhóm oxymethin. Tín hiệu dạng singlet xác định proton H-5 (δH 7,31) và H-8 (δH 6,43), 7-OCH3 (δH 3,88) chứng minh hệ vòng benzo (vòng A) thế hai lần. Hệ vòng cơ sở B được chứng minh bởi các tín hiệu dạng multilet và triplet nằm trong vùng trường thấp H-2, H-6 [(δH 7,56, 2H, t, J=7,0

Hz)] và H-3, H-4, H-5 [(δH 7,40-7,45, 3H, m)]. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT xác định một hợp chất có 17 nguyên tử carbon trong đó gồm 1 nhóm carbonyl C=O liên hợp tại δC 194,3 (C-4), 7 nhóm methin vòng thơm, 3 tín hiệu carbon thơm liên kết với oxy, 2 tín hiệu carbon thơm không liên kết hydro. Ngoài ra còn có 2 tín hiệu của carbon nhóm oxymethin -OCH [δC 74,6 (C-2), δC 85,9 (C-3)] và 1 tín hiệu carbon nhóm methoxy

7-OCH3 (δC 56,6, q). So sánh với các công trình đã được công bố chúng tôi kết luận đây là một hợp chất dạng khung flavanol có tên buteaspermanol được phân lập từ cây Butea monosperma có hoạt tính chống estrogen, ức chế sự sinh sản và tác dụng tạo mô xương [91, 92].

Hình 3.16. Cấu trúc hợp chất buteaspermanol

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.05 và chất tham khảo Vị trí DT.05 (*) Buteaspermanol [92]

δH (ppm) δC (ppm) δC (ppm) δH (ppm) 1 - - 5,09 (1H, d, J = 12,0 5,14 (1H, dd, J = 11,6 2 74,6 72,9 Hz) Hz) 4,53 (1H, d, J =12,0) 4,53 (1H, dd, J = 11,6, 3 85,9 84,0 3,7 Hz) 4 - 194,3 192,5 - 4a - 112,1 111,0 - 5 7,31,s 108,2 107,6 7,19 (1H, s) 6 138,8 137,9 7- 3,88, s 56,6 56,2 3,80 (1H, s) OCH3 8 6,43,s 104,5 103,6 6,43 (1H, s) 8a - 159,7 157,5 - 1' - 145,5 144,3 - 2' 7,56 (1H, t, J =7,0 Hz) 128,9 128,8 7,55, m 3' 7,40-7,45, m 129,3 128,5 7,41-7,48, m 4' 7,40-7,45, m 129,8 128,3 7,41-7,48, m 5' 7,40-7,45, m 129,3 128,5 7,41-7,48, m 6' 7,56 (1H, t, J =7,0 Hz) 128,9 128,5 7,55, m

1 13 (*) H-NMR (500 MHz, methanol-d4); C-NMR (125 MHz, methanol-d4) 3.2.6. Hợp chất mới daltonkin A (DT.06) Hợp chất DT.06 được phân lập dưới dạng chất rắn vô định hình, tan tốt trong dung môi methanol. Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất DT.06 xuất hiện các cực đại

-1 hấp thụ tại vị trí νmax tại 3354 và tại νmax 1701 cm đặc trưng cho các dao động của nhóm hydroxyl OH và nhóm carbonyl C=O cùng các dao động của liên kết C=C

(benzene) tại (νmax: 1701, 1637, 1610, 1452).

Hình 3.17. Phổ IR của hợp chất DT.06

Trên phổ tử ngoại UV của hợp chất này xuất hiện các đỉnh đặc trưng cho nối

đôi liên hợp ở UV (MeOH) λmax nm (logε): 293 nm.

Hình 3.18. Phổ UV của hợp chất DT.06

Phổ khối phun bụi điện tử (HR-ESI-MS) cho pic ion giả phân tử ở m/z = 327,0868 [M – H]– (theo lý thuyết là 327,0863). Từ đó suy ra công thức phân tử của hợp chất DT.06 là C18H16O6.

Hình 3.19. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất DT.06

Kết hợp phân tích các tín hiệu trên phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HSQC (tương tác trực tiếp carbon với proton) cho thấy, ngoài các tín hiệu đặc trưng cho 2 vòng benzen A và B còn xuất hiện thêm các tín hiệu của 1 carbon methylen tại δC 44,3 (C-

3), 1 tín hiệu carbon nhóm oxymethin ở vị trí δC 80,5 (C-2) và tín hiệu 1 carbon của 13 nhóm carbonyl tại δC 197,5 (C-4) của vòng C trong phổ C-NMR. Điều này cho phép kết luận hợp chất này là một flavanone [93]. Khi so sánh phổ 1H và 13C-NMR của DT.06 cho thấy các tín hiệu hoàn toàn tương tương tự phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất pinocembrin, ngoại trừ sự thay thế 1 proton thơm H-8 trong hợp chất pinocembrin bởi 1 nhóm carboxyethyl

(CH2CH2COOH) (H-9 [δH 2,86, t, 8,0 Hz]/C-9 [δC 18,7], H-10 [δH 2,49, t, 8,0

Hz]/C-10 [δC 34,1] và C-11 [δC 177,7]) [85].

Hình 3.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.06

Hình 3.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.06

Hình 3.22. Phổ DEPT của hợp chất DT.06

Hình 3.23. Phổ HSQC của hợp chất DT.06

Mạch nhánh carboxyethyl được chứng minh thông qua các tương quan giữa proton methylen H-9 và H-10 trong phổ COSY, cũng như các tương quan giữa proton H-9 và H-10 với carbon C-11 của nhóm carbonyl trong phổ (HMBC).

Hình 3.24. Phổ COSY của hợp chất DT.06

Phân tích kỹ trên phổ HMBC sẽ thấy các tương quan của proton H-9 với các carbon C-7, C-8 và C-8a. Điều này cho phép xác định nhóm carboxyethyl gắn vào vị trí C-8 của vòng A. Như vậy vị trí mạch nhánh đã được xác định.

Hình 3.25. Phổ HMBC của hợp chất DT.06 Các nghiên cứu trước đây cho thấy các flavanone cấu hình 2S trên phổ CD (lưỡng sắc vòng - circular dichroism) thường có hiệu ứng Cotton dương trong vùng

* gần 330 nm (n– ) và hiệu ứng Cotton âm ở vùng 270–290 nm.

Phổ CD (c 0,4, MeOH) của hợp chất DT.06 (hình 3.26) cho thấy có hiệu ứng

* * Cotton dương tại 330 + 2,10 (n– ) và hiệu ứng Cotton âm tại 288 – 10,43 (– ). Kết hợp các thông tin trên phổ CD và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định cấu hình của C-2 trong hợp chất DT.06 là 2S [84].

Hình 3.27. Phổ CD của hợp chất Hình 3.26. Phổ CD của hợp chất (2S)-pinocembrin tham khảo DT.06

Qua phân tích tổng hợp các dữ liệu phổ trên cho phép xác định hợp chất DT.06 là (2S)-8-carboxyethylpinocembrin, đây là một hợp chất mới lần đầu tiên phân lập từ thiên nhiên và được chúng tôi đặt tên là daltonkin A. Các phổ đầy đủ của hợp chất daltonkin A (DT.06) được trình bày ở phần phụ lục (PL-6).

Hình 3.28. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin A

Hình 3.29. Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất daltonkin A

Bảng 3.7. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của chất daltonkin A daltonkin A

δH (ppm) δC (ppm) HMBC COSY Vị trí (500 MHz) (125 MHz) (HC) (HH)

( methanol-d4) (methanol-d4) (J, Hz) 2 5,47( dd, 13,0, 3,0) 80,5, d C-4 H-3 2,80 (dd, 17,0, 3,0, H-3 ) C-1'; C-4; C-4a H-2 3 eq 44,3, t 3,11 (dd, 17,0, 13,0, H-3ax) 4 197,5, s 4a 103,3, s 5 162,8, s 6,02, s C-5; C-7; C-8; 6 95,6, d C-4a 7 166,1, s 8 108,5, s 8a 162,8, s 2,86 ( t, 8,0) C-11; C-7; C-8; H-10 9 18,7, t C-8a 10 2,49 (t, 8,0) 34,1, t C-8a; C-11 H-9 11 177,7, s

9' 10' 11' 1' 140,5, s 2',6' 7,52 (d, 7,5) 127,3, d C-2 H-3'; H-4'; H-5' 7,39 (t, 7,5) H-3'; H-5'; H-2'; 4' 129,6, d H-6' 3',5' 7,44 (d, 7,5) 129,7, d H-4'; H-2'; H-6'

3.2.7. Hợp chất mới daltonkin B (DT.07) Hợp chất DT.07 được phân lập dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng. Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất DT.07 xuất hiện các cực đại hấp thụ đặc trưng cho

-1 -1 nhóm hydroxyl OH (νmax 3369 cm ) và nhóm carbonyl C=O (νmax 1751 cm ) và dao -1 động các liên kết C=C (benzen) (νmax, 1751, 1676, 1575 cm ). Phổ tử ngoại UV tương tự hợp chất DT.07 cũng xuất hiện các đỉnh đặc trưng cho nối đôi liên hợp ở UV

(MeOH) λmax nm (logε): 297 nm.

Phổ khối phun bụi điện tử (HR-ESI-MS) cho pic ion giả phân tử ở m/z = 415,1014 [M – H]– (tính toán là 415,1024).Từ đó suy ra công thức phân tử của hợp chất DT.07 là C21H19O9.

Hình 3.30. Phổ khối phân giả cao HR-ESI-MS của hợp chất DT.07

Tương tự như hợp chất DT.06, các tín hiệu carbon của hợp chất DT.07 đặc trưng cho một khung flavanone bao gồm: 1 tín hiệu của carbon methylen tại δC 44,0

(C-3), 1 tín hiệu carbon nhóm oxymethin ở vị trí δC 80,3 (C-2) và 1 tín hiệu carbon 13 của nhóm carbonyl tại δC 197,5 (C-4) trong phổ C-NMR [93]. Phổ 1H và 13C-NMR của DT.07 có các tín hiệu tương tự như của flavanone narigenin đã được phân lập từ loài Dalbergia odorifera, ngoại trừ sự thay thế tín hiệu 2 proton của vòng benzen (H-6 và H-8) trong hợp chất narigenin bởi tín hiệu của 2 nhóm carboxyethyl (H-9 [δH 2,85, m]/C-9 [δC 18,8], H-10 [δH 2,55, m]/C-10 [δC 34,4] và C-11 [δC 179,1]) và (H-9' [δH 2,81, m]/C-9' [δC 19,4], H-10' [δH 2,51, m]/C-10' [δC

34,8] và C-11' [δC 179,2]) [87, 88].

Hình 3.31. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.07

Hình 3.32. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.07

Hình 3.33. Phổ DEPT của hợp chất DT.07

Hình 3.34. Phổ HSQC của hợp chất DT.07

Các dữ kiện phổ 2 chiều HSQC, HMBC, COSY được sử dụng để xác định cấu trúc khung flavanone, 2 nhóm carboxyethyl và vị trí của gắn của chúng với vòng A của DT.07. Trên phổ COSY ta thấy rõ tương quan giữa các proton methylen H-9/H-10 và H-9'/H-10' trong phổ COSY cũng như các tương tác giữa các proton H-9 và H-10 với C-11 cùng các tương tác của proton H-9' và H-10' với carbon C-11'. Phổ HMBC khẳng định có hai nhóm carboxyethyl qua các tương tác giữa các proton methylen H- 9 và H-10 với carbonyl carbon C-11 cũng như tương tác của proton H-9' và H-10' với carbon C-11'. Vị trí gắn kết của hai nhóm carboxyethyl được xác định qua tương tác giữa proton H-9' với các carbon C-5, C-6 và C-7, và các tương tác của proton H-9 với C- 7, C-8 và C-8a trên phổ HMBC. Các tương tác đó cho phép kết luận hai nhóm carboxyethyl gắn vào vị trí C-6 và C-8 của vòng A.

Hình 3.35. Phổ COSY của hợp chất DT.07

Hình 3.36. Phổ HMBC của hợp chất DT.07

Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của chất daltonkin B daltonkin B

δH (ppm) δC (ppm) HMBC COSY (500 MHz) (125 Vị trí ( methanol-d4) MHz) (J, Hz) (methanol

-d4) C-4; C-3; C-1'; H-3 2 5,39 (dd, 13,0, 3,0) 80,3, d C-2'; C-6'

2,79 (dd, 17,0, 3,0 Hz, H-3eq) H-2 3 44,0, t 3,13 (dd, 17,0, 13,0 Hz, H-3ax) 4 198,6, s 4a 103,4, s 5 159,8, s 6 109,0, s 7 163,9, s 8 108,3, s 8a 161,1, s 9 2,85, m 18,8, t C-7; C-8; C-11 H-10 10 2,55, m 34,4, t C-8; C-11 H-9 11 179,1, s C-6; C-5; C-7; H-10' 9' 2,81, m 19,4, t C-11' 10' 2,51, m 34,8, t C-6; C-11' H-9' 11' 179,2, s 1' 131,4, s 2',6' 7,36 (d, 8,5) 128,8, d H-3'; H-5' 4' 158,9, s 3',5' 6,85 (d, 8,5) 116,4, d H-2'; H-6'

100

Tương tự DT.06, hợp chất DT.07 được xác định có cấu hình 2S. Như vậy, cấu trúc của hợp chất mới daltonkin B được xác định.

Hợp chất dicarboxyethylflavanone mới này có tên thường gọi là (2S)-6,8- dicarboxyethylnaringenin, lần đầu được phân lập trong tự nhiên (chúng tôi đặt tên là daltonkin B). Các phổ đầy đủ của hợp chất daltonkin B (DT.07) được trình bày trong phụ lục (PL-7).

Hình 3.37. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin B

Hình 3.38. Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất daltonkin B

Kết luận về cấu trúc 2 hợp chất mới: cho đến nay rất hiếm các báo cáo về các hợp chất thiên nhiên có mạch nhánh acid propanoic và carboxyethyl trong tự nhiên. Một vài báo cáo cho thấy dẫn xuất của acid pheylpropanoic được tìm thấy từ lõi gỗ loài Cordia trichotoma và loài Streptomycetes strain [95]. Carboxyethylchromanone từ loài Calophyllum papuanum [96]. Đặc biệt, chỉ có hợp chất L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) được phân lập từ hạt loài D. retusa and D. glabra thuộc Chi Dalbergia [97]. Đây là lần đầu tiên các hợp chất mono và dicarboxyflavanone được tìm thấy trong tự nhiên từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain).

101

3.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) (C-612) Lõi gỗ sưa đỏ được chiết bằng methanol, sau đó cô quay đuổi dung môi thu được cặn chiết. Cặn chiết được chiết phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước. Các phần chiết tiến hành phân lập đã được trình bày chi tiết ở phần thực nghiệm, mục 2.3.2. Kết quả đã phân lập được 11 hợp chất. Cấu trúc các hợp chất sạch được xác định bằng việc phân tích các dữ liệu phổ 1D và 2D được trình bày dưới đây. 3.3.1. Hợp chất Dalbergin (DT.08) Hợp chất DT.08 được phân lập dưới dạng tinh thể màu vàng, tan tốt trong MeOH.

1 Các tín hiệu trên phổ H-NMR cho thấy đặc trưng của khung coumarin thế 3 lần tại [H 7,06 (1H, s, H-8), 6,88 (1H, s, H-5) và 6,21 (1H, s, H-3)], thêm vào đó là 2 tín hiệu của vòng benzen thế một lần [H 7,57 (3H, m, H-3', H-4', H-5') và 7,51 (2H, m, H-2', H-6')], 1 tín hiệu của 3 proton nhóm methoxy tại H 3,99 (3H, s, 7-OCH3). Phổ 13C-NMR kết hợp DEPT khẳng định sự hiện hiện của 16 carbon bao gồm

1 carbon nhóm carbonyl tại C 163,8 (s, C-2), 8 tín hiệu của carbon thơm (3 carbon thơm không liên kết với hydro, 3 carbon thơm liên kết với oxy) trong khoảng C

(113,1-158,2 ppm), 2 carbon methin thơm [C 112,3 (d, C-5) và 101,1 (d, C-8)] cùng với 3 tín hiệu của carbon nhóm phenyl [C (129,5-129,9 ppm)]. Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho thầy xuất hiện thêm tín hiệu của 1 carbon olefin ở vị trí C 112,3 (d, C-3). Cuối cùng là một tín hiệu 1 carbon nhóm methoxy tại C (56,8 q, 7-OCH3). Từ những lập luận trên cho phép xác định DT.08 là một neoflavanon. So sánh với dữ kiện phổ của hợp chất này với tài liệu tham khảo, xác định hợp chất DT.08 là Dalbergin, đã được tìm thấy ở loài Dalbergia rubiginosa [98].

102

Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.08 và chất tham khảo Vị trí DT.08 (*) Dalbergin [98] δH δC δC δH 1 - - - - 2 - 163,8 161,0 - 3 6,21, s 111,9 111,7 6,26, s 4 - 158,2 155,3 - 4a - 113,1 110,8 - 5 6,88, s 112,3 112,1 6,99, s 6 - 153,6 149,6 - 7 - 145,2 141,9 - 7-OCH3 3,99, s 56,8 56,0 3,96,s 8 7,06, s 101,1 110,0 6,90, s 8a - 150,4 148,9 - 1' - 137,1 135,1 - 2' 7,51, m 129,5 127,8 7,48, m 3' 7,57, m 129,9 128,4 7,48, m 4' 7,57, m 130,8 129,1 7,48, m 5' 7,57, m 129,9 128,4 7,48, m 6' 7,51, m 129,5 127,8 7,48, m 1 13 (*) H-NMR (500 MHz, methanol-d4); C-NMR (125 MHz, methanol-d4)

Hình 3.39. Cấu trúc hợp chất Dalbergin

3.3.2. Hợp chất isoliquiritigenin (DT.09) Chất DT.09 phân lập được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Tín hiệu của 15 nguyên tử carbon ở vùng trường thấp trên phổ 13C-NMR và các tín hiệu xuất hiện ở vùng proton của nhân thơm quan sát trên phổ 1H-NMR cho thấy DT.09 cũng thuộc lớp chất flavonoid. Các cặp tín hiệu C-β (H 7,74; C 144,3), C-α (H 7,74; C

117,5), C=O (C 191,5) gợi ý chất DT.09 là 1 chalcon. Hệ tương tác spin ABX quan 1 sát được trên phổ H-NMR (H 8,14, d, J =9,0 Hz; 6,41, dd, J = 2,5, 8,0 Hz; và 6,27 d, J = 2,0 Hz) cho thấy vòng A của chalcon DT.09 bị thế tại hai vị trí C-5 và C-7. Thêm vào đó là tín hiệu các proton thuộc vòng benzen thế para tại 6, 84 (2H, J = 8,5

Hz) cùng với tín hiệu của 4 proton chập nhau tại H 7,74.

103

Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy xuất hiện tín hiệu 15 carbon, bao gồm 1 tín hiệu nhóm carbonyl tại C 191,5, tín hiệu 3 carbon thơm liên kết với oxi tại C 160,3,

165,0, 165,8, tín hiệu của 2 carbon thơm không liên kết với hydro tại C 125,8, 113,0 cùng với 9 carbon methine trong khoảng C (102,6-144,3). Ngoài ra các tín hiệu cộng hưởng thuộc hệ AA’BB’ quan sát được trên phổ 1H và 13C-NMR đã khẳng định vòng B trong cấu trúc của DT.09 bị thế para. Cuối cùng, kết hợp sự phân tích giữa các phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC và HMBC của hợp chất DT.09 và đối chiếu với tài liệu tham khảo cho phép xác định cấu trúc hóa học của hợp chất này là isoliquiritigenin đã được phân lập từ gỗ cây Cẩm lai (Dalbergia oliveri) [51].

Hình 3.40. Cấu trúc hóa học hợp chất isoliquiritigenin Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.09 và chất tham khảo

Vị trí DT.09 (DMSO-d6) Isoliquiritigenin [51]

δH (500 MHz) δH δC δC (125MHz) (J, Hz) * α * 7,75 117,4 117,5 7,74

* * β 144,3 7,74 7,75 144,2 C=O 191,5 - 192,4 1 125,8 125,7 2, 6 131,2 7,74* 7,75* 131,1 3, 5 115,9 6,84 (d, 8,5) 6,84 (d, 8,5) 115,8 4 160,3 160,3 1’ 113,0 - 112,9 ’ 2 165,0 165,2 3’ 102,6 6,27 ( d, 2,0) 6,27 (d, 2,5) 102,6 4’ 165,8 - 165,8 6,40 (dd, 2,5, 108,2 5’ 108,2 6,41 (dd, 2,5, 9,0) 8,0) ’ 6 132,8 8,14 (d, 9,0) 8,15 (d, 8,0) 132,8 (*) Tín hiệu bị chồng chập

104

3.3.3. Hợp chất 7,3',5'-trihydroxyflavanone (DT.10) Hợp chất DT.10 phân lập dưới dạng tinh thể hình kim không màu. Phổ 1H và 13C -NMR của DT.10 tương tự như của liquiritigenin. Sự khác biệt là ở vòng B thế 3 lần ở các vị trí 1',3',5'. Do đó trên vòng B của hợp chất DT.10 xuất hiện các tín hiệu của 3 proton tại [δH 6,88 (1H, s, H-4') và 6,74 (2H, s, H-2', H-6').

Hình 3.41. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.10

Hình 3.42. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.10

105

Hình 3.43. Phổ DEPT của hợp chất DT.10

Kết hợp phân tích các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT đồng thời so sánh với tài liệu tham khảo, chúng tôi xác định hợp chất này là 7,3',5'- trihydroxyflavanone [102]. Hợp chất này đã được phân lập từ vỏ thân của loài Caesalpinia decapetala. Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên được phát hiện từ chi Dalbergia và có hoạt tính bảo vệ tế bào gan [103].

Hình 3.44. Cấu trúc hợp chất 7,3',5'-trihydroxyflavanone

106

Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.10 và chất tham khảo Vị trí DT.10 7, 3', 5'-trihydroxyflavanone

(DMSO-d6) (DMSO-d6) [86 ] δ δ δ (500 MHz), (J, Hz) δ (125MHz) H C H C (250 MHz) (125MHz) 1 - - - - 2 5,37 (dd, 3,0, 12,5) 78,9 5,36 (dd, 3,0, 12,5) 81,2 3,03 (dd, 12,5, 17,0) 3,02 (dd, 12,5, 16,5) 44,8 3 43,2 2,62 (dd, 3,0, 17,0) 2,61 (dd, 3,0, 16,5) 4 - 190,0 - 193,8 4a - 113,5 - 114,8 5 7,64 (d, 9,0) 128,3 7,74 (d, 8,5) 129,8 6 6,49 (dd, 2,5, 9,0) 110,4 6,48 (dd, 2,5, 8,5) 111,8 7 - 163,1 - 164,9 8 6,32 (d, 2,0) 102,5 6,31 (d, 2,5) 103,8 8a - 164,6 - 165,7 1' - 129,9 - 131,8 2' 6,74, s 114,2 6,74, s 115,2 3' - 145,1 - 146,2 4' 6,88, s 117,8 6,88, s 119,4 5' - 145,6 146,2 6' 6,74, s 114,2 6,74, s 115,2

3.3.4. Hợp chất vestitone (DT.11) Hợp chất DT.11 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của hợp chất này được đặc trưng bởi các tín hiệu các proton thuộc vòng benzen bao gồm: tín hiệu 3 proton thơm dạng ABX của hệ vòng A tại H [7,67 (1H, d, 8,5 Hz, H- 5), 6,51 (1H, dd, 8,5, 2,0 Hz, H-6) và 6,41 (1H, d, 2,0, H-8)] cùng với tín hiệu 3 proton thơm hệ ABX của hệ vòng B tại H [6,84 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,31 (1H, dd, 8,5, 2,0 Hz, H-5') và 6,29 (1H, d, 2,0 Hz, H-3')].

1 Ngoài ra, phổ H-NMR còn xác định sự có mặt của 1 nhóm oxymethylen [H 4,48

(1H, t, 11,0 Hz, H-2ax), 4,40 (1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-2eq)] và 1 nhóm methin H 4,1 (1H, dd, 11,5, 5,5 Hz, H-3). Còn lại là 1 nhóm methoxy tại H 3,67 (3H, s, 4'-OCH3). Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DT.11 xuất hiện 16 tín hiệu carbon bao gồm tín hiệu 1 carbon carbonyl tại C 190,5 (s, C-4), 1 carbon oxymethylen tại δC

70,4 (C-2), 1 carbon methin tại δC 46,6 (C-3) gợi ý hợp chất có dạng khung isoflavanone [104].

107

Trên phổ phổ 13C-NMR và DEPT cũng cho thấy tín hiệu 6 carbon methin thơm tại δC [130,5 (C-5), 128,9 (C-6'), 103,6 (C-6), 106,9 (C-5'), 99,4 (C-3'), 102,3

(C-8)], 4 tín hiệu carbon thơm liên kết với oxy tại δC 164,2 (C-7), 163,2 ( C-8a), 158,1

(C-4'), 158,0 (C-2')], 2 tín hiệu carbon thơm không liên kết hydro tại δC [114,2 (C-

1'), 114,1 (C-4a)]. Cuối cùng là tín hiệu của 1 nhóm methoxy 56,0 ( 4'-OCH3). Kết hợp dữ kiện phổ trên và so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc hóa học của hợp chất DT.11 được xác định là một isoflavanone có tên là vestitone, được phân lập từ lõi gỗ loài D. odorefira và có hoạt tính kháng khuẩn [26].

Hình 3.45. Cấu trúc hợp chất vestitone

Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.11 và chất tham khảo

DT.11 (DMSO-d6) vestitone [26]

Vị trí δH (500 MHz) δC (125MHz) δC δH (J, Hz) 1 - - - - 4,40 ( dd, 11,0, 5,5) 4,40 ( dd, 11,0, 5,5) 2 70,4 72,0 4,48 ( t, 11,0) 4,56 ( d, 11,0) 3 4,10 ( dd, 11,5, 5,5) 46,6 48,7 4,12 ( dd, 11,0, 5,5) 4 - 190,5 194,7 - 4a - 114,1 115,7 - 5 7,67 ( d, 8,5) 130,5 130,4 7,74 ( d, 8,8) 6 6,51 (dd, 8,5, 2,0) 103,6 111,7 6,48 ( d, 2,2, 8,8) 7 - 164,2 166,4 - 8 6,41 ( d, 2,0) 102,3 103,6 6,31 (d, 2,2 ) 8a - 163,2 165,8 - 1' - 114,2 115,8 - 2' - 158,0 157,6 - 3' 6,29 (d, 2,0) 99,4 102,7 6,38 (d, 2,4) 4' - 158,1 161,8 - 4'- 3,67 56,0 55,7 3,70, s OCH3 5' 6,31 (dd, 8,5, 2,0) 106,9 106,0 6,34 (dd, 8,4) 6' 6,84 (d, 8,5) 128,9 131,8 6,88 (d, 8,4)

108

3.3.5. Hợp chất calycosin (DT.12) Hợp chất DT.12 thu được dạng chất bột màu vàng. Phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu của 6 proton vòng benzen. Trong đó 3 tín hiệu proton đặc trưng bởi hệ

ABX thuộc vòng A cộng hưởng tại H [7,97 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), H ), 6,93 (dd, 9,0;

2,0 Hz, H-6) và H 6,92 (1H, d, 2,5 Hz, H-8)] và các tín hiệu của 3 proton cộng hưởng tại H [7,05 (1H, s, H-2'), 6,94 ( 1H, d, 9,0 Hz, H-6') và 6,94 (1H, d, 9,0 Hz, H-5')] thuộc vòng B. Ngoài ra, còn có 1 tín hiệu của proton oxymethin cầu nối tại 8,28 (1H, s, H-2) và tín hiệu của proton thuộc nhóm methoxy ở H 3,79 (3H, s, 4'-OCH3). Kết hợp phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy hợp chất có 16 carbon bao gồm bao gồm 1 nhóm carbonyl tại C 174,5 (s, C-4), 6 nhóm methin thơm tại C [127,3 (d, C-5), 115,1 (d, C-6), 102,5 (d, C-8), 116,4 (s, C-2'), 112,0 (d, C-5') và 119,7 (d, C-

6')] cùng với tín hiệu 2 carbon thơm không liên kết hydro tại C [124,7 (s, C-1' và

116,6 (s, C-4a)], 4 carbon thơm liên kết với oxi tại C [162,5 (s, C-7), 157,3 (s, C-8a),

146,0 (d, C-3') và 147,5 (s, C- C-4')] cùng với 1 nhóm oxymethin tại C 153,0 (s, C-

2). Cuối cùng là tín hiệu 1 nhóm methoxy tại C 55,6 (q, 4'-OCH3). Từ các dữ kiện phổ 1D, 2D và kết hợp với tài liệu tham khảo, hợp chất DT.11 được xác định là calycosin đã được phân lập từ loài D. parviflora và loài Astraglus Membranaceus [41, 109].

Hình 3.46. Cấu trúc hợp chất calycosin

109

Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.11 và chất tham khảo Vị trí DT.11 Calycosin [109]

(DMSO-d6) (DMSO-d6)

δ δC (125MHz) δ (500 MHz), (J, Hz) δ (125MHz) H H C (250 MHz) 1 - - - - 2 8,28 (1H, s0 153,0 153,3 8,30 (1H, s0 3 - 123,3 123,6 - 4 - 174,5 174,8 - 4a - 116,6 116,9 - 5 7,97 (1H, d, 8,5) 127,3 127,5 7,97 (1H, d, 8,8) 6,90 (1H, dd, 8,8, 6 6,93 (1H, dd, 9,0, 2,0) 115,1 115,4 2,0) 7 - 162,5 162,8 - 8 6,92 (1H, d, 2,5) 102,5 102,4 6,95 (1H, br.s) 8a - 157,3 157,6 - 1' - 124,7 125,0 - 2' 7,05 (1H, s) 116,4 116,7 7,06 (1H, br.s) 3' 146,0 146,3 4' - 147,5 147,8 - 4'-OCH3 3,79 (3H, s) 55,6 54,6 3,80 (3H, s) 5' 6,94 (1H, d, 9,0) 112,0 112,3 6,95 (1H, br.s) 6' 6,94 (2H, d, 9,0) 119,7 119,9 6,95 9 (1H, br.s)

3.3.6. Hợp chất 4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone (DT.13) Hợp chất DT.13 được phân lập dưới dạng bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho một isoflavone thế hai lần, hệ spin

ABX 7,97 (1H, d, J=8,8 Hz, H-5), 6,94 (1H dd, J=8,8, 2,1 Hz, H-6), và H 6,86 (1H, d,

J=2,0 Hz, H-8)] thuộc về vòng A. Vòng B được đặc trưng bởi hệ spin AA'BB' [H 7,50,

(2H, d, J=8,7 Hz, H-2', H-6') và H 6,86 (2H, d, J=8,7 Hz, H-3', H-5')]. Ngoài ra còn có thêm tín hiệu proton của 1 nhóm methoxy H 3,78 (3H, s, 3-OCH3). Phổ 13C-NMR chứng minh phân tử có 16 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm carbonyl tại [C 175,1 (s, C-4), 4 nhóm methin thơm đối xứng dạng vạch chập tại [C

130,5 (d, C-2', C-6') và C 114,1 (d, C-3', C-5')] cùng với 3 nhóm methin thơm khác tại [C 124,7 (s, C-5), C 115,7 (d, C-6) và C 102,6 (d, C-8)]. Thêm vào đó là tín hiệu của 5 nguyên tử carbon thơm tại C [123,6 (s, C-1'), 157,9 (s, C-4'), 163,0 (s, C-7),

159,4 (s, C-8a) và 117,7 (s, C-4a)] cùng với tín hiệu của 2 carbon oxyolefin tại C

110

[153,6 (s, C-2) và 127,8 (s, C-3)] và tín hiệu của 1 carbon methoxy tại C 55,6 (q, 3-

OCH3). Phân tích các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp đối chiếu và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất DT.13 được xác định là flavone đã được phân lập từ loài Trifolium repens có tên là 4',7-dihidroxy-3-methoxyflavone [107].

Hình 3.47. Cấu trúc hóa học hợp chất 4',7-dihidroxy-3-methoxyflavone

3.3.7. Hợp chất liquiritigenin (DT.14) Hợp chất DT.14 được phân lập dưới dạng chất bột màu vàng, tan tốt trong MeOH. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.14 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho một flavanone thế hai lần, hệ spin ABX tại [H 7,65 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), H 6,51

(1H, dd, 2,5, 8,5 Hz, H-6), và H 6,33 (1H, d, 2,5 Hz, H-8)] thuộc về vòng A. Vòng

B được đặc trưng bởi hệ spin AA'BB' tại [H 7,32 (2H, d, 8,5 Hz, H-2', H-6') và H 6,80 (2H, d, 8,5 Hz, H-3', H-5')], hệ vòng C được nhận biết nhờ tín hiệu doublet của nhóm oxymethin H 5,42 (1H, dd, 3,0, 13,0 Hz, H-2) và nhóm methylen tại [H 3,06

(1H, dd, 13,0, 17,0 Hz, Ha-3) và H 2,64 (1H, dd, 3,0, 17,0 Hz, Hb-3)]. Phổ 13C-NMR và DEPT chứng minh phân tử có 15 nguyên tử carbon, bao gồm

1 nhóm carbonyl tại [C 190,1 (s, C-4)], 1 carbon oxymethin cầu nối tại C 81,0 (d, C-

2) và 1 carbon methylen tại C 43,2 (t, C-3) gợi ý hợp chất này có dạng khung flavanone

[93]. Thêm vào đó là tín hiệu 4 nhóm methin thơm đối xứng dạng vạch chập tại [C

115,2 (d, C-3', C-5') và C 128,4 (d, C-2', C-6')], 3 nhóm methin thơm khác tại [C 129,3

(s, C-5), C 114,8 (d, C-6), và C 102,6 (d, C-8)], 5 nguyên tử carbon thơm trong khoảng 1 13 C 110,5-164,7 ppm. Phân tích các dữ kiện phổ H-NMR, C-NMR và đồng thời so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất DT.14 được xác định là flavanone có tên là liquiritigenin [99]. Hợp chất này đã được phân lập từ lõi gỗ loài D. odorifera [26]. Liquiritigenin có hoạt tính bảo vệ gan và tế bào thần kinh [100, 101].

111

Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.14 và chất tham khảo

Vị trí DT.14 (*) Liquiritigenin

δH (ppm) (J, Hz) δC (ppm) δC [99] δH [99] 1 - - - -

2 5,42 (dd, 3,0, 13,0) 79,0 80,8 5,35 (dd, 3,0, 13,0)

3,06 (dd, 3,0, 17,0) 3,01 (dd, 13,0, 16,9) 3 43,2 44,9 2,64 (dd, 3,0, 17,0) 2,66 (dd, 3,0, 16,9)

4 - 190,1 193,3 -

4a - 110,5 113,7 -

5 7,65 (d, 8,5) 129,3 129,8 7,68 ( d, 8,8)

6 6,51 (dd, 2,5, 8,5) 114,8 113,1 6,43 (dd, 2,3, 8,8)

7 - 163,6 165,7 -

8 6,33, d, 2,5 102,6 104,2 6,27, d, 2,3

8a - 164,7 169,9 -

1' - 131,4 131,1 -

2' 7,32 (d, 8,5) 128,4 128,8 7,31 (d, 8,6)

3' 6,80 (d, 8,5) 115,2 116,2 6,81 (d, 8,6)

4' - 157,6 159,0 -

5' 6,80 (d, 8,5) 115,2 116,2 6,81 (d, 8,6)

6' 7,32 (d, 8,5) 128,4 128,8 7,31 (d, 8,6)

1 13 (*) H-NMR (500 MHz, methanol-d4); C-NMR (125 MHz, methanol-d4)

Hình 3.48. Cấu trúc hợp chất liquiritigenin

112

3.3.8. Hợp chất sativanone (DT.15) Hợp chất DT.15 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Quan sát trên phổ 1H-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy sự hiện diện của 1 nhóm oxymethylen

[δH 4,56 (1H, t, 11,0 Hz, H-2ax) và 4,45 (1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-2eq)/δC 71,4 (C-2)],

1 nhóm methin tại [δH 4,18 (1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-3)/δC 47,6 (C-3)] và 1 nhóm carbonyl tại δC 190,7 (C-4). Các tín hiệu này gợi ý đây là một isoflavanone [104]. Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR của hợp chất này đặc trưng cho vòng benzen thế ở vị trí 1,2,4 (vòng A và B) bởi các tương tác của 2 hệ spin ABX tại [δH 7,77 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5), 6,58 (1H, dd, J = 9,0, 2,5 Hz, H-6) và 6,59 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-

8); δH 7,01 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,48 (1H, dd, 8,5, 2,5 Hz, H-5') và 6,40 (1H, d, 2,5

Hz, H-3')]. Thêm vào đó là tín hiệu của 2 nhóm methoxy tại δH 3,79 (3H, s, 2'-OCH3) 13 và 3,78 (3H, s, 4'-OCH3). Phổ C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với oxy tại δC l164,5 (C-7), 164,3 (C-8a), 161,1 (C-4'), 159,1 (C-2')] và

2 carbon thơm không liên kết với hydro tại δC l17,0 (C-1'), 115,5 (C-4a)], 6 carbon methin thơm tại δC [131,2 (C-5), 129,7 (C-6'), 110,8 (C-6), 105,3 (C-5'), 103,1 (C-

3'), 99,2 (C-8)], 2 nhóm methoxy tại δC 55,6 (4'-OCH3) và δC 55,2 (2'-OCH3). Dựa trên những bằng chứng phổ phân tích trên cùng với tài liệu tham khảo đã công bố [26]. Hợp chất này được xác định là sativanone, đã phân lập từ lõi gỗ loài D. parviflora và D. odorifera [26, 41]. Sativanone có hoạt tính kháng khuẩn và chống oxi hóa [12, 105].

Hình 3.49. Cấu trúc hợp chất sativanone

3.3.9. Hợp chất 3'-O-methylviolanone (DT.16) Hợp chất DT.16 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng, tan tốt trong MeOH. Phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất DT.16 thì thấy các tín tương đồng với hợp chất sativanone (DT.15), sự khác biệt được xác định khi tín hiệu của nhóm methin proton thơm H-3' của hợp chất DT.16 bị thay thế bởi 1 nhóm methoxy tại C 61,2 (q, 3'-OCH3). Do vậy, dẫn đến xuất hiện thêm một tín hiệu carbon thơm liên kết với oxy tại C 143,6 (s, C-3') ở hợp chất DT.16. Điều này được chứng

113

minh trên phổ 1H-NMR của vòng C hợp chất DT.16 chỉ còn hai tín hiệu của proton thơm gép ortho tại H [6,75 (1H, dd, 8,5 Hz, H-5') và 6,86 (1H, d, 8,5 Hz, H-6')]. So sánh với tài liệu tham khảo, chúng tôi xác định được hợp chất này là 3'-O- methylviolanone, một isoflavanone đã được phân lập từ lõi gỗ loài Dalbergia odorifera và rễ loài Belamcanda chinensis, có hoạt tính kháng viêm [27, 106].

Hình 3.50. Cấu trúc hợp chất 3'-O-methylviolanone Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.16 và chất tham khảo Vị trí DT.16 (*) 3'-O-methylviolanone [106]

δH (ppm) (J, Hz) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 - - - - 4,14 (dd, 12,0, 5,5) 4,52 (dd, 11,2, 11,2) 2 72,3 71,1 4,57 ( t, 11,5) 4,15 (dd, 11,2, 5,2) 3 4,43 (dd, 11,0, 5,5) 49,5 4,45 (dd, 11,2, 5,2) 47,8 4 - 194,2 - 190,9 4a - 115.5 - 114.3 5 7,79 (d, 8,5) 130,4 7,69 (d, 8,8) 129,4 6 6,54 (dd, 8,5, 2,0) 111,8 6,54 (dd, 8,8, 2,4) 111,1 7 - 166,5 - 164,8 8 6,37 (d, 2,0) 103,7 6,36 (d, 2,4) 102,8 8a - 165,8 - 163,7 1' - 123,1 - 122,1 2' - 153,2 - 151,9 2'- 3,83, s 61,0 3,74, s 60,6 OCH3 3' - 143,6 - 142,2 3'- 3,82, s 61,2 3,71, s 60,9 OCH3 4' - 155,1 - 153,5 4'- 3,86, s 56,6 3,78, s 56,3 OCH3 5' 6,75 (d, 8,5) 108,8 6,76 (d, 8,8) 108,2 6' 6,86 (d, 9,0) 126,0 6,85 (d, 8,8) 124,9 1 13 (*) H-NMR (500 MHz, methanol-d4); C-NMR (125 MHz, methanol-d4)

114

3.3.10. Hợp chất sulfuretin (DT.17) Hợp chất DT.17 được phân lập dưới dạng tinh thể màu vàng. Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR cho thấy đặc trưng của các proton thế 1,2,4 của hai vòng benzen A và

B.Trong đó vòng A đặc trưng bởi 3 proton tương tác hệ ABX tại H [7,60 (1H, d, 8,4 Hz, H-5), 7,44 (1H, d, 2,0 Hz, H-8) và 7,23 (1H, d, 2,0, 8,3 Hz, H-6]. Các tín hiệu của 3 proton trên vòng B cũng được đặc trưng cho hệ ABX cộng hưởng ở các vị trí

H [6,83 (1H, d, 8,2 Hz, H-5'), 6,74 (1H, d, 1,7 Hz, H-2') và 6,70 (1H, dd, 1,8, 8,4 Hz,

H-6')] cùng với tín hiệu của 1 proton olefin ở vị trí H [6,62 (1H, s, H-2)].

13 Phổ C-NMR cho thấy tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với oxy tại C 167,5

(C-7), 166,3 (C-8a), 148,2 (C-4'), 3 carbon thơm không liên kết với hydro tại C 145,6

(s, C-3'), 124,5 (s, C-1'), 113,1 (C-4a) và 6 carbon methin vòng thơm tại δC 125,7 (C- 5), 123,4 (C-6'), 117,9 (C-2'), 116,0 (C-5'), 112,9 (C-6) và 98,4 (C-8). 13 Hơn nữa, trên phổ C-NMR còn xuất hiện tín hiệu 1 carbon carbonyl tại δC

181,2 (C-4) cùng với 1 nhóm carbon olefin tại [δC 145,7 (C-3) và 111,9 (C-2)] gợi ý hợp chất có dạng khung aurone [99, 100]. Từ những lập luận trên và kết hợp với tài liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất DT.17 có tên 7,3',4'-trihydroxyaurone (sunfuretin) đã được phân lập từ loài Dalbergia odorifera [110, 113]. Sulfuretin có tác dụng kháng viêm [111] và gây độc tế bào ung thư [112].

Hình 3.51. Cấu trúc hợp chất 7,3',4'-trihydroxyaurone

115

Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.17 và chất tham khảo Position DT.17 Sulfuretin [113]

(DMSO-d6) δH (500 MHz) (J, Hz) δC (125MHz) δC [1] δH [1] 1 - - - - 2 6,62, s 111,9 113,4 6,73, d 3 145,7 146,3 4 181,2 183,1 5 7,60 (d, 8,4) 125,7 125,5 7,63 (d, 8,0) 6 7,23 (dd, 2,0, 8,3) 112,9 113,3 7,26 (d, 8,6) 7 167,5 168,4 8 7,44 (d, 2,0) 98,4 98,0 7,55, s 4a 113,1 115,3 8a 166,3 167,0 1' - 124,5 125,0 - 2' 6,74 (d, 1,7) 117,9 112,7 6,73, d 148,0 3' 145,6

4' 148,2 145,3 5' 6,83 (d, 8,2) 116,0 117,5 6,87 (d, 8,0) 6' 6,70 (dd, 1,8, 8,4) 123,4 124,1 6,73 (d, 8,0)

3.3.11. Hợp chất formononetin (DT.18) Hợp chất DT.18 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, tan tốt trong MeOH. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.18 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho một isoflavone với hệ spin ABX [H 8,08 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), H 6,97 (1H, dd, 8,5,

2Hz, H-6) và H 6,88 (1H, d, 2,0 Hz, H-8)] thuộc về vòng A. Vòng B được đặc trưng bởi hệ spin AA'BB' [H 7,49 (2H, d, 8,5 Hz, H-2', H-6') và H 7,01 (2H, d, 8,5 Hz, H-3', H-

5')]. Hệ vòng C được nhận biết nhờ tín hiệu singlet của nhóm oxymethin cầu nối tại H

8,17 (1H, s, H-2), còn lại là tín hiệu của proton nhóm methoxy H 3,85 (3H, s, 4'-OCH3). Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT chứng minh phân tử có 16 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm carbonyl tại [C 178,1 (s, C-4), 4 nhóm methin thơm đối xứng dạng vạch chập [C 131,4 (d, C-2', C-6') và C 114,9 (d, C-3', C-5')] cùng với 3 nhóm methin thơm khác [C 128,5 (s, C-5), C 116,6 (d, C-6) và C 103,3 (d, C-8)], 5 nguyên tử carbon vòng thơm trong khoảng C 118,1-164,9 ppm. Cuối cùng là 1 carbon oxyolefin cầu nối tại C 154,8 (d, C-2) và 1 carbon methoxy tại C 55,7 (q, 4'-OCH3) với độ dịch

116

chuyển hóa học nằm về phía trường cao. Phân tích các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT đồng thời kết hợp đối chứng với tài liệu tham khảo. Hợp chất DT.18 được xác định là isoflavone có tên gọi formononetin đã được phân lập từ loài D. odorifera, D. parviflora và loài Euchresta formosana [12, 108].

Hình 3.52. Cấu trúc hợp chất fomononetin

3.4. KẾT LUẬN VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT Như vậy, từ phân đoạn dichloromethane, ethyl acetate, nước và cao chiết nước đun sôi sau khi chiết methanol từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã phân lập được 18 hợp chất flavonoid bao gồm 10 flavanone, 02 neoflavonoid, 03 flavone, 01 aurone, 01 chalcone và 01 aryl-coumarin. Trong số các hợp chất đó, có 02 hợp chất mới là daltonkin A và daltonkin B lần đầu tiên phân lập từ thiên nhiên. Cấu trúc của các hợp chất này đã được xác định bằng các phương pháp phổ NMR (1D, 2D), ESI-MS, HR-ESI-MS. Cấu trúc của các hợp chất được liệt kê ở bảng 3.17 dưới đây:

117

Bảng 3.17. Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Pinocemprin Naringenin

3'-hydoxy-2,4,5- Medicarpin trimethoxydalbergiquinol

Buteaspermanol Daltonkin A (2S)-8-carboxyethylpinocemprin (Chất mới)

Daltonkin B (2S)-2,6-dicarboxyethylnaringenin Dalbergin (Chất mới)

118

7,3',5'-trihydroxyflavanone Liquiritigenin (Chất lần đầu phân lập từ Chi)

Vestitone Sativanone

3'-O-methylviolanone 4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone

Formononetin Calycosin

Isoliquiritigenin

7,3',4'-trihydroxyaurone (Sulfuretin)

119

Nhận xét: kết quả các hợp chất được phân lập từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về hợp chất thiên nhiên được phân lập từ các cây ở Việt Nam. Đặc biệt các kết quả về thành phần hóa học này cũng cho thấy sự tương đồng nhất định về lớp chất chính flavonoid của chi Dalbergia ở Việt Nam với chi này trên thế giới. 3.5. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC 3.5.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane Các hợp chất pinocembrin, naringenin và 3'-hydroxy-2,4,5- trimethoxydalbergiquinol phân lập từ cặn chiết dichloromethane của lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) được thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên một số chủng: Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Aspergillus niger, Fusarium oxyporum, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans. Kết quả thử nghiệm in vitro hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được trình bày ở bảng 3.18. Từ bảng 3.18 cho thấy, trong số các hợp chất thử nghiệm, hợp chất pinocembrin biểu hiện hoạt tính ức chế mạnh đối với hai chủng nấm mốc và Fusarium oxyporum và Aspergillus niger với nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 50 µg/mL. Loài nấm Fusarium oxyporum là loại gây bệnh thối cổ rễ. Một trong các bệnh gây hại nhiều đến mùa màng nước ta. Còn đối với các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans và vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus thì hợp chất pinocembrin cho thấy khả năng ức chế trung bình với giá trị MIC=100µg/mL. Hợp chất naringenin có tác dụng ức chế vửa phải đối với chủng vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus và chủng nấm mốc Aspergillus niger. Trong khi đó hợp chất 3'-hydroxy-2,4,5- trimethoxydalbergiquinol không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật trên các chủng thử nghiệm.

120

Bảng 3.18. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập từ loài (Dalbergia tonkinensis Prain)

Hoạt tính kháng khuẩn (MIC: µg/mL) Hợp chất Vi khuẩn Nấm mốc (sợi) Nấm men Bacillus Staphylococcus Aspergillus Fusarium Saccharomyces Candida subtillis aureus niger oxyporum cerevisiae albicans pinocembrin (-) 100 50 50 100 100 naringenin (-) 100 100 (-) (-) (-) 3'-hydroxy- (-) (-) (-) (-) (-) (-) 2,4,5- trimethoxydalbe rgiquinol (-): IC50 ≥ 200 µg/mL 3.5.2. Tác dụng ức chế enzyme - glucosidase của các cặn chiết và các hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Bệnh đái tháo đường (diabetes mellitus), một trong những bệnh được quan tâm toàn cầu, đã và đang gia tăng nhanh chóng và làm giảm chất lượng sống của con người trên toàn thế giới. Năm 2013, số người mắc đái tháo đường được báo cáo là 382 triệu người. trong số này thì 90% bị bệnh đái tháo đường loại 2, số người mắc bệnh đái tháo đường ước tính sẽ là 592 triệu vào năm 2035. Biến chứng của bệnh này vô cùng nghiêm trọng. Người bị đái tháo đường rất dễ có nguy cơ mắc các bệnh khác như suy thận, bệnh tim mạch, huyết áp và các bệnh khác. Các báo cáo cho thấy, số người tử vong do bệnh đái tháo đường chiếm 8,4% tổng số người chết trong năm 2013 [114, 115]. Do đó, bệnh đái tháo đường luôn là mối quan tâm đặc biệt trên toàn thế giới. Một số phương pháp điều trị cho bệnh đái tháo đường loại 2 đã được nghiên cứu. Trong số này, việc sử dụng tác nhân ức chế enzyme α-glucosidase aGIs cũng được coi là một liệu pháp hiệu quả cho căn bệnh toàn cầu này [116]. Tác nhân ức chế enzyme α-glucosidase được thu được từ nhiều nguồn, bao gồm quá trình tổng hợp hóa học, các loại thảo dược, từ vi sinh vật và từ nấm men. Trong số này, aGIs có nguồn từ thảo dược đã được quan tâm nhiều để bởi tính an toàn của chúng trong việc điều trị và kiểm soát đái tháo đường loại 2 [117-124]. Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới và là quốc gia đa dạng sinh học thứ 16 trên thế giới với 4.000 loài đã được sử dụng làm nguồn dược liệu. Do đó, việc nghiên

121

cứu sàng lọc và phân lập các hợp chất hoạt tính sinh học từ thảo dược luôn được quan tâm trong những năm gần đây [125-127]. Trong nghiên cứu này, các cao chiết và các hợp gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thu tại tỉnh Đăk Lăk, đã được khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase ở nồng độ thử nghiệm mạnh hơn acarbose (một loại thuốc điều trị đái tháo đường). Do đó, việc nghiên cứu theo định hướng hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase của loài này mở ra tiềm năng phát triển thành thực phẩm chức năng trong việc kiểm soát bệnh tiểu đường loại 2. 3.5.2.1. Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết methanol lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Lõi gỗ cây Sưa được chiết bằng methanol sau đó được thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase. Hoạt tính ức chế được tính bằng giá trị IC50. Kết quả cho thấy cao chiết methanol lõi gỗ cây Sưa có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase từ nấm men với giá trị (IC50 = 0,17 mg/mL) mạnh hơn acarbose (IC50 = 1,21 mg/mL) và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase cao chiết methanol lõi gỗ cây Sưa cũng mạnh hơn cao chiết methanol các bộ phận khác của một số cây thuốc thu ở tỉnh Đăk Lăk (IC50 = 0,25- 4,0 mg/mL) [123-124]. Bảng 3.19. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của cao chiết methanol lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

STT Tên loài Bộ phận IC50 (mg/mL) 1 Dalbergia tonkinensis Lõi gỗ 0,17 ± 0,013 2 Acabose (đối chứng dương) 1,21 ± 0,103

Định hướng kế tiếp là xác định xem bộ phận nào của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase mạnh nhất: vỏ, lõi gỗ hay lá. Các bộ phận này được chiết với methanol và được thử hoạt tính. Kết quả thử hoạt tính chế enzyme α-glucosidase được trình bày ở hình 3.53.

122

A A IC50 B B (mg/mL1.6 ) 1.6 100 1.25 1.25 100 1.4 1.4 Hoạt 1.2 80 80 1.2 tính 1.0 1.0 0.78 ức 60 60 0.78 0.8 chế 0.8 0.57 0.57

aGI (%) aGI 40 (%) (%) aGI 40 Lõi gỗ 0.6 HeartwoodHeartwood 0.6

TrunkVỏ bark (mg/mL) EC50 Trunk bark 0.4 (mg/mL) EC50 20 Lá 0.4 20 LeavesLeaves 0.17 0.17 AcarboseAcarbose 0.2 Acarbose 0.2 0 0 0.0 0.0 0 0 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 HeartwoodHeartwoodBark BarkLeavesLeavesAcarboseAcarbose ConcentrationNồng Concentrationđộ (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) Lõi gỗ Part Vỏ used Part Lá used Acarbose

Hình 3.53. Khả năng ức chế α-glucosidase của các bộ phận

loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Từ hình 3.53, cho thấy tất cả các bộ phận của cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đều có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase mạnh (ức chế 98-100%) hơn cả chất đối chứng dương acarbose (ức chế 62%). Trong các cao chiết methanol của các

bộ phận (lõi gỗ, vỏ và lá) thì giá trị (IC50 = 0,17 mg/mL) của cao chiết lõi gỗ là nhỏ

nhất, kế tiếp là cao chiết vỏ (IC50 = 0,57 mg/mL) rồi đến cao chiết lá (IC50 = 0,78

mg/mL. Cuối cùng là chất đối chứng dương acarbose (IC50 = 1,25 mg/mL). Kết quả này chỉ ra rằng cao chiết methanol bộ phận lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase mạnh nhất. Kết quả này giúp định hướng phân lập các hoạt chất có tiềm năng ức chế enzyme α-glucosidase từ cao chiết methanol của bộ phận lõi gỗ cây Sưa. 3.5.2.2. Kết quả nghiên cứu độ bền pH (2-13) của cao chiết methanol và tương quan hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết methanol lõi gỗ cây Sưa trong môi trường pH từ 2 đến 13. Kết quả được trình bày trong hình 3.54

123

Hoạt 100 tính ức chế 80 (%) 60

Relativeactivity (%) 20

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 pH treatment pH Hình 3.54. Độ bền pH (2-13) của cao chiết methanol lõi gỗ Sưa và tương quan hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase Kết quả cho thấy hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase từ nấm men của cao chiết methanol thay đổi không đáng kể trong khoảng pH từ 2 đến 13. Tỉ lệ ức chế ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết từ 80-98% 3.5.2.3. Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của các phân đoạn cao chiết methanol lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Tiến hành tạo cao chiết methanol tổng (HDT) của lõi gỗ cây Sưa và các cao chiết phân bố hexane (HDT-1), dichloromethane (HDT-2), ethyl acetate (HDT-3) và cao nước

(HDT-4). Kết quả thử hoạt tính ức chế chế enzyme α-glucosidase từ nấm men của các phân đoạn cao chiết được trình bày bảng 3.20. Bảng 3.20. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các cao phân đoạn từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Khả năng ức chế enzyme α- Kí hiệu Mẫu cao chiết glucosidase

IC50 (mg/mL) Ức chế (%)* HDT (cao chiết methanol) 0,172±0,011 98±3,2 HDT-1 (cao phân đoạn hexane) 1,712±0,210 73±4,1 HDT-2 (cao phân đoạn dichloromethane ) 0,124±0,003 90±2,5 HDT-3 (cao phân đoạn ethyl acetate) 0,069±0,001 95±3,7 HDT-4 (cao phân đoạn nước) 0,513±0,051 82±2,3 Acarbose (đối chứng dương) 1,357±0,03 62±1,8

124

(*): Khả năng ức chế của acarbose và các phân đoạn được xác định trong khoảng nồng độ 0,1-5 mg/mL Từ bảng 3.20 cho thấy cao chiết ethyl acetate (HDT-3) có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase mạnh nhất (95% và giá trị IC50 = 0,069 mg/mL). Dựa trên đánh giá sắc ký lớp mỏng. Chúng tôi chọn cao chiết phân đoạn này và cao chiết nước để phân lập các hợp chất theo định hướng tác dụng sinh học. 3.5.2.4. Kết thử nghiệm hoạt tính ức enzyme α-glucosidase các phân đoạn của cao chiết ethyl acetate (HDT-3), cao chiết nước (HDT-4) và các hợp chất phân lập Các kết quả thử nghiệm hoạt tính chế ức chế enzyme α-glucosidase từ nấm men của các phân đoạn con từ cao ethyl acetate (HDT-3), các phân đoạn con từ cao nước (HDT-4) và 2 hợp chất được tinh sạch của các cao chiết này được trình bày trong hình 3.55.

A B C Hoạt tính 100 100 100 ức chế 80 80 80 (%) 60 60 60

aGI (%) aGI (%) aGI 40 40 (%) aGI 40

20 20 20

0 0 0

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 3.10 3.11 3.12 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 Sub-fractions of HDT-3 Components separated from HDT-3.1 Các phân đoạn HDT-3 Các phân đoạn HDT-3.1 Các Sub-fractionsphân đoạn HDT of HDT-4-4 D E 100 100 Hoạt tính 80 80 ức chế 60 60

(%) 40

aGI (%) aGI

40 (%) aGI Sativanone 20 Compound 1 (purified HDT-3.1.2) 20 CompoundFormononetin 2 (purified HDT-4.3.3) AcarboseAcarbose (positive control) 0 0 0 1 2 3 4 5

4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 ComponentsCác phân đoạnseparated HDT from-4.3 HDT-4.3 ConcentrationNồng độ (mg/mL) (mg/mL)

Hình 3.55. Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của các cao phân đoạn và hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Phân tích các kết quả trên hình 3.55 cho thấy khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của các cao phân đoạn ethyl acetate (HDT-3.1 và HDT-3.1.2) rất mạnh (ức chế 98-99%) cao hơn các phân đoạn còn lại chỉ ức chế (2-36%) ở cùng nồng độ

125

thử là 0,1 mg/mL. Trong số 8 phân đoạn của cao nước được thử nghiệm thì phân đoạn (HDT-4.3) cho kết quả ức chế enzyme α-glucosidase tốt và được tiến hành sắc kí bản mỏng để chia thành 6 phân đoạn con và các phân đoạn con này được tiếp tục thử nghiệm. Kết quả cho thấy phân đoạn con (HDT-4.3.3) có hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase cao nhất trong 6 phân đoạn đem đánh giá (98,5%). Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của 2 hợp chất sativanone và formononetin phân lập theo các phép thử hoạt tính dẫn đường đã cho thấy khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của 2 hợp chất này mạnh hơn acarbose (chất đối chứng dương) với tỉ lệ ức chế và giá trị

IC50 tương ứng lần lượt sativanone (90%, IC50 =0,23 mg/mL) và formononetin (98%,

IC50 = 0,059 mg/mL) so với acarbose (62%, IC50 =1,321 mg/mL). Sativanone và formononetin đã được báo cáo tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase phân lập từ nấm men [65]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi khẳng định hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của 2 hợp chất này là mạnh hơn và lần đầu tiên phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain). 3.5.2.5. Kết quả thử hoạt tính chức chế enzyme α-glucosidase của 2 hợp chất phân lập từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) trên các enzyme α-glucosidase từ các nguồn khác nhau Để các nghiên cứu thực hiện một cách đầy đủ và toàn diện hơn so với nghiên cứu trước đó, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính chức chế enzyme α-glucosidase của 2 hợp chất trên 4 nguồn enzyme α-glucosidase khác nhau bao gồm (nấm men, chuột, vi khuẩn và gạo) nhằm đánh giá tiềm năng của chúng trong việc kháng tiểu

đường. Hoạt tính ức chế được đánh giá bằng giá trị IC50. Kết quả được trình bày trong bảng 3.21. Bảng 3.21. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của sativanone và formononetin so với acarbose trên 4 nguồn enzyme khác nhau

STT Nguồn enzyme Khả năng ức chế tính theo IC50 (mg/mL) α-glucosidase Sativanone Formononetin Acarbose 1 Nấm men 0,23±0,012 0,06±0,002 1,321±0,048 2 Chuột 0,37±0,022 0,23±0,037 0,121±0,001 3 Vi khuẩn 0,07±0,001 0,03±0,002 0,001±0,000 4 Gạo 0,81±0,023 0,98±0,029 0,031±0,005 Tất cả thử nghiệm được tiến hành 3 lần

126

Nhận xét: trong thí nghiệm này enzyme α-glucosidase từ nấm men, từ chuột, từ vi khuẩn và từ gạo đã được sử dụng để đánh giá tác dụng chống đái tháo đường in vitro của các hoạt chất phân lập từ lõi gỗ cây Sưa. Kết quả cho thấy 2 hợp chất này đều có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ 4 nguồn enzyme α-glucosidase của nấm men, chuột, vi khẩn và gạo. Cụ thể, hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của sativanone đối với enzym từ nấm men và chuột cao nhưng lại ức chế yếu trên nguồn enzyme từ vi khuẩn và gạo. Trong khi đó formononetin biểu hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase yếu từ gạo và biểu hiện hoạt tính ức chế tốt từ chuột, nấm men và vi khuẩn. Khả năng biểu hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của 2 hợp chất này trên enzyme từ vi khuẩn và chuột tương đương với acarbose. Đối với nấm men thì 2 hợp chất này biểu hiện khả năng ức chế mạnh hơn so với acarbose còn đối với enzym từ gạo thì biểu hiện khả năng ức chế yếu so với acarbose. Mặc dù enzyme từ nấm men đã được sử dụng trong thử nghiệm in vitro chống đái tháo đường đã được báo cáo [65]. Tuy nhiên, enzyme α-glucosidase từ chuột được cho là nguồn enzyme tốt hơn để đánh giá tác dụng kháng tiểu đường của các hợp chất thiên nhiên vì enzyme này gần với enzyme của người. Trong nghiên cứu này, cả sativanone và formononetin đã được chứng minh khả năng ức chế enzyme α- glucosidase từ nấm men mạnh hơn so với acarbose và có tác dụng ức chế enzyme α- glucosidase tương đương so với acarbose khi thử nghiệm với enzyme α-glucosidase của chuột. 3.5.2.6. Kết quả thử hoạt tính chức chế enzyme α-glucosidase từ chuột của cao chiết các bộ phận và 2 hợp chất phân lập từ lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Tất cả cao chiết của lõi gỗ, vỏ và lá của và 2 hợp chất được tiến hành thử nghiệm khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ chuột. Kết quả thử nghiệm thể hiện được trình bày ở bảng 3.22.

127

Bảng 3.22. Hoạt tính ức chế α-glucosidase trên chuột của cao chiết các bộ phận và 2 hợp chất từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase trên chuột Thành phần IC50 (mg/mL) Ức chế cực đại (%) 1,72±0,116 61±3,46 Cao chiết (HDT)

2,91±0,289 Cao chiết vỏ 51±4,62

2,78±0,173 Cao chiết lá 54±4,60

1,31±0,057 HDT-3 68±5,77

1,13±0,057 HDT-3.1 75±5,20

0,92±0,023 HDT-3.1.2 77±5,18

0,357±0,006 91±4,61 Sativanone

1,43±0,115 67±2,89 HDT-4

0,87±0,035 78±4,61 HDT-4.3

0,55±0,012 84±6,42 HDT-4.3.3

0,251±0,006 94±5,11 Formononetin

0,119±0,005 93±2,50 Acarbose

Kết quả cho thấy rằng các cao chiết, cao phân bố, các phân đoạn và 2 hợp chất từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) là các tác nhân ức chế enzyme α- glucosidase mạnh và có tiềm năng phát triển thành chế phẩm hỗ trợ điều trị đái tháo đường trong tương lai. Trong số cao chiết các bộ phận (lõi gỗ, vỏ và lá) thì cao chiết lõi gỗ (HDT) biểu hiện hoạt tính mạnh nhất với khả năng ức chế và giá trị IC50 tương ứng (61%, 1,27 mg/mL). Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

128

tăng dần từ cao chiết tổng (HDT) qua đến các cao chiết phân đoạn (HDT-3, HDT- 4) kế tiếp là các cao phân đoạn con (HDT-3.1, HDT-3.1.2, HDT-4.3, HDT4.3.3) và cuối cùng đến các chất tinh sạch sativanone và fomononetin với tỉ lệ ức chế và

IC50 tương ứng (91%, 94%, 0,357 mg/mL, 0,251 mg/mL) so với chất đối chứng dương acarbose (93%, 0,119 mg/mL). Kết luận về đánh giá tác dụng sinh học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain): các hợp chất phân lập từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã được đánh giá tác dụng sinh học. Kết quả thử nghiệm cho thấy các hợp chất có tác dụng kháng khuẩn, hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh. Các kết quả này bước đầu cho thấy mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất thuộc nhóm flavonoid của chi Dalbergia.

129

KẾT LUẬN

Luận án thực hiện nghiên cứu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) họ Đậu Fabaceae về các mặt: thực vật, hóa học và tác dụng sinh học. 1. Về kết quả nghiên cứu thực vật  Các đặc điểm vi phẫu của lá, thân và bột lõi thân của cây Sưa đã được miêu tả cụ thể, góp phần tiêu chuẩn hóa loài cây gỗ quý này. Đã xác định trình tự 3 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB và rpoC của 2 mẫu Sưa và so sánh khoảng cách di truyền của từng vùng gen đó với 5 loài Dalbergia khác đã công bố trình tự trên GenBank.  3 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB và rpoC có khả năng phân biệt các loài thuộc chi Sưa (Dalbergia) với tỉ lệ phân biệt cao tương ứng lần lượt là 99%, 98% và 97%.  Trình tự 3 vùng gen rbcL, rpoB và rpoC của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam đã được đăng ký trên ngân hàng gen với số hiệu lần lượt là KY283103, KY287755 và KY287750. 2. Về mặt hóa học  Lần đầu tiên từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 18 hợp chất flavonoid: pinocembrin, naringenin, 3'-hydroxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol, medicarpin, buteaspermanol, daltonkin A [(2S)-8-carboxyethylpinocembrin], daltonkin B [(2S)-2,6- dicarboxyethylnaringenin], dalbergin, isoliquiritigenin, 7,3',5'- trihydroxyflavanone, vestitone, calycosin, 4',7-dihydroxy-3- methoxyflavone, liquiritigenin, sativanone, 3'-O-methylviolanone, 7,3',4'- trihydroxyaurone và formononetin.  02 hợp chất daltonkin A và daltonkin B là các hợp chất mono- và dicarboxyethylflavanone mới.

130

3. Tác dụng sinh học của các cao chiết và chất phân lập được 3.1. Tác dụng kháng khuẩn Hợp chất pinocembrin biểu hiện hoạt tính ức chế trên nấm sợi (với nồng độ ức chế tối thiểu [MIC] là 50 µg/mL), trong khi đó đối với nấm men và vi khuẩn Gram dương staphylococcus aureus thì hợp chất pinocembrin và naringenin cho thấy khả năng ức chế trung bình với giá trị MIC là 100 µg/mL. 3.2. Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase - Cao chiết methanol của lõi gỗ, vỏ và lá của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã được đánh giá hoạt tính ức chế enzyme - glucosidase, trong đó cao chiết methanol của lõi gỗ có tác dụng mạnh nhất

với giá trị IC50 là 0,17 mg/mL, so với chất đối chứng dương là acabose

(IC50 là 1,21 mg/mL). - Phân lập theo định hướng ức chế enzyme α-glucosidase đã xác định 2 hợp chất sativanone và formononetin có khả năng mạnh hơn acarbose (chất

đối chứng dương) với tỉ lệ ức chế và giá trị IC50 lần lượt của sativanone (90%, 0,23 mg/mL) và của formononetin (98%, 0,06 mg/mL) so với acarbose (62%, 1,32 mg/mL). - Cao chiết methanol từ lõi gỗ Sưa (HDT) có tác dụng ức chế enzyme α-

glucosidase trên chuột mạnh hơn của vỏ và lá với IC50 là 1,72 mg/ mL. - Sativanone và formononetin có tác dụng ức chế enzyme α-

glucosidase của chuột với tỉ lệ ức chế và giá trị IC50 lần lượt (91%, 0,357 mg/mL) và (94%, 0,251 mg/mL).

131

KIẾN NGHỊ

Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain), đã dẫn đến việc phân lập và xác định nhiều hợp chất có cấu trúc lý thú và có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn và ức chế mạnh đối với enzyme α-glucosidase cùng với các dẫn liệu phong phú về mặt thực vật (vi phẫu và DNA). - Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các bộ phận gỗ, rễ và lá của cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) nhằm tạo dữ liệu đầy đủ và hệ thống của loài Sưa ở Việt Nam. - Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và khả năng trị bệnh đái tháo đường của cao chiết methanol, cùng 2 hoạt chất sativanone và formononetin từ lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain).

132

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Daltonkins A and B, Two New Carboxyethylﬂavanones from the Heartwood of Dalbergia tonkinensis, Korean Chemical Society, 2017, 38 (12), 1511–1514 (SCI, IF: 0.76). 2. New Records of Potent In-Vitro Antidiabetic Properties of Dalbergia tonkinensis Heartwood and the Bioactivity-Guided Isolation of Active Compounds, Molecules, 2018, 23 (7), 1589-1600 (SCI-E, IF: 3.098). 3. Further study on chemical constituents from the heartwood of Dalbergia tonkinensis, Vietnam Journal of Science and Technology, 2018, 56 (4A), 252- 258 (ACI). 4. So sánh khả năng phân loại loài sưa đỏ (Dalbergia tonkinensis) Việt Nam của một số vùng gen lục lạp, Hội nghị Khoa học Công nghệ Sinh học toàn Quốc, Hà Nội, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 2018, 100-106, ISBN: 978-604- 913-759-4. 5. Tổng quan về lớp chất flavonoid phân lập từ chi Dalbergia, họ Đậu (Fabaceae), Tạp chí Dược học, 2018, 505 (58), 16-21.

133

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Trần Đình Đại, Khái quát về hệ thực vật Việt Nam. Hội thảo Việt- Đức về Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hà Nội, 1998, 16-18 April, 17-27. 2. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển I. NXB Trẻ, Tp. HCM, 1999, 878-889. 3. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, Tp. Hồ Chí Minh, 1999, 1252-1255. 4. N. Vasudeva, M. Vats, S.K. Sharma, S. Sardana, Chemistry and biological activities of the genus Dalbergia - A review, Pharmacognosy Reviews, 2009, 3, 307-319. 5. S.-M. Yu, Z.-J. Cheng, S.-C. Kuo, Endothelium-dependent relaxation of rat aorta by butein, a novel cyclic AMP-specific phosphodiesterase inhibitor, European Journal of Pharmacology, 1995, 280, 69-77. 6. S.-M. Yu, S.-C. Kuo, Vasorelaxant effect of isoliquiritigenin, a novel soluble guanylatecyclase activator, in rat aorta, British Journal of Pharmacology, 1995, 114, 1587-1594. 7. A. Sugiyama, B.-M. Zhu, A. Takahara, Y. Satoh, K. Hashimoto, Cardiac effects of Salvia miltiorrhiza/Dalbergiaodorifera mixture, an intravenously applicable Chinese medicine widely used for patients with ischemic heart disease in China, Circulation Journal, 2002, 66, 182-184. 8. L. Wu, Y. Wang, Z. Li, B. Zhang, Y. Cheng, X. Fan, Identifying roles of “Jun-Chen- Zuo-Shi” component herbs of QiShenYiQi formula in treating acute myocardial ischemia by network pharmacology, Chinese Medicine, 2014, 9, 24. 9. J.P. Abdou, J. Momeni, A. Adhikarid, N. Tsabang, A.T. Tchinda, M.I. Choudhary, A.E. Nkengfack, New coumestan and coumaronochromone derivatives from Dalbergia boehmiiTaub. (Fabaceae), Phytochemistry Letters, 2017, 21, 109-113. 10. S. Kaennakam, P. Siripong, S. Tip-Pyang, Dalvelutinoside, a new isoflavone glycoside from the methanol extract of Dalbergiavelutina roots, Natural Products Research, 2016, 30, 1493-1498.

134

11. J.P. Abdou, J. Momeni, A. Adhikarid, N. Tsabang, A.T. Tchinda, M.I. Choudhary, A.E. Nkengfack, New coumestan and coumaronochromone derivatives from Dalbergia boehmiiTaub. (Fabaceae), Phytochemistry Letters, 2017, 21, 109-113. 12. S. Saha, J.A. Shilpi, H. Mondal, F. Hossain, M. Anisuzzman, M.M. Hasan, G.A. Cordell, Ethnomedicinal, phytochemical, and pharmacological profile of the genus Dalbergia L. (Fabaceae), Phytopharmacology, 2013, 4 (2), 297-324. 13. Chính phủ, Nghị định số 32/2006/NĐ-CP: Nghị định về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp. Quý, hiếm, 2006. 14. Vũ Thị Thu Hiền, Lưu Đàm Cư, Đinh Thị Phòng, Xác định trình tự đoạn gen tRNA- LEU cho hai loài cây gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) và cây gỗ Trắc đỏ (Dalbergia conchinchinensis) phục vụ việc phân loại mẫu vật tại bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2009, 7 (4), 471-477. 15. Trần Anh Tuấn, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Hoài Nam, Nguyễn Quang Hưng, Trần Minh Hợi, Trần Huy Thái, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Các hợp chất isoflavon và dihydrophenanthren từ cây Sưa Bắc Bộ (Dalbergia tonkinensis), Tạp chí Hóa học, 2009, 47 (6), 716-719. 16. Nguyễn Đăng Khôi (Nguyễn Tiến Bân- chủ biên), Chi Dalbergia L. f. (họ Fabaceae). Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Tập II, NXB Nông nghiệp, 2003, 779-786. 17. Phạm Thanh Loan, Một số đặc điểm sinh học, sinh thái và hoạt tính sinh học của một số loài chi Trắc (Dalbergia L.f.) ở Việt Nam. Hội nghị Khoa học toàn Quốc về Sinh thái Tài nguyên và Sinh vật lần thứ 4, Hà Nội, 2014, 1201-1206. 18. The Plant List. Available: http://www.theplantlist.org/tpl1.1/search?q=dalbergia, (Accessed, July 29, 2018). 19. Trần Ngọc Hải, Bảo tồn và phát triển loài quý hiếm Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain). Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ hai, Hà Nội, 2010, 34–36. 20. Đỗ Xuân Cẩm, Cây Sưa ở Huế và các loài Sưa ở Việt Nam, Tạp chí nghiên cứu và phát triển, 2013, 1 (99), 95-100.

135

21. S. Deesamer, U. Kokpol, W. Chavasiri, S. Douillard, V. Peyrot, N. Vidal, S. Combes, J.-P. Finet, Synthesis and biological evaluation of isoflavone analogues from Dalbergiaoliveri, Tetrahedron, 2007, 63, 12986-12993. 22. D.M.X. Donnelly, P.J. Kavanagh, Isoflavanoid of Dalbergia oliveri, Phytochemistry, 1974, 13, 2587-2591. 23. H.M. Chawla, S.S. Chibber, T.R. Seshadri, Volubilinin, a new isoflavone-C- glycoside from Dalbergia volubilis flowers, Phytochemistry,1976, 15, 235-237. 24. M. Gregson, W.D. Ollis, B.T. Redman, I.O. Sutherland, H.H. Dietrichs, O.R. Gottlieb, Obtusastyrene and obtustyrene, cinnamylphenol from Dalbergia retusa, Phytochemistry, 1978, 17, 1395-1400. 25. M. Yahara, T. Ogata, R. Saijo, K. Yoshi, J. Yamahara, K. Miyahara, T. Nohara, Isoflavan and related compounds from Dalbergia odorifera, Chem. Pharm. Bull, 1989, 37 (4), 979-987. 26. X. Zhao, W. Mei, M. Gong, W. Zuo, H. Bai, H. Dai, Antibacterial Activity of Flavonoids from Dalbergia odorifera on Ralstoniasolanacearum, Molecules, 2011, 16, 9775-9782. 27. S.-C. Chan, Y.-S. Chang, J.-P. Wang, S.-C. Chen, S.-C. Kuo, Three new flavonoids and antiallergic, anti-inflammatory constituents from the heartwood of Dalbergia odorifera, Planta Medica, 1998, 64, 153-158. 28. C.W. Choi, Y.H. Choi, M.-R. Cha, Y.S. Kim, G.H. Yon, Y.-K. Kim, S.U. Choi, Y.H. Kim, S.Y. Ryu, Antitumor components isolated from the heartwood extract of Dalbergia odorifera, Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 2009, 52, 375-379. 29. P. Ramesh, C.R. Yuvarajan, Coromandelin, a new isoflavanoneapioglucoside from the leaves of Dalbergia coromandeliana, Journal of Natural Products, 1995, 58, 1240-1241. 30. L.Mathias, I.J.C. Vieira, R. Braz-Filho, E. Rodrigues-Filho, A new isoflavone glycoside from Dalbergia nigra, Journal of Natural Products, 1998, 61, 1158-1161. 31. W. Wang, X. Weng, D. Cheng, Antioxidant activities of natural phenolic components from Dalbergia odorifera T. Chen, Food Chemistry, 2000, 71, 45-49.

136

32. J.-P. Hou, H. Wu, C.-T. Ho, X.-C. Weng, Antioxidant activity of polyphenolic compounds from Dalbergia odorifera T. Chen, Pakistan Journal of Nutrition, 2011, 10, 694-701. 33. I.A. Khan, M.A. Avery, C.L. Burandt, J.R. Mikell, T.E. Nash, A. Azadegan, L.A. Walker, Antigiardial activity of isoflavones from Dalbergia frutescens Bark, Journal of Natural Products, 2000, 63, 1414-1416. 34. P. Dixit, R. Chillara, V. Khedgikar, J. Gautam, P. Kushwaha, A. Kumar, D. Singh, R. Trivedi, R. Maurya, Constituents of Dalbergia sissoo Roxb. Leaves with osteogenic activity, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22, 890-897. 35. C. Ito, M. Itoigawa, T. Kanematsu, N. Ruangrungsi, H. Higashihara, H. Tokuda, H. Nishino, H. Furukawa, New Cinnamylphenols from Dalbergia Species with Cancer Chemopreventive activity, Journal of Natural Products, 2003, 66, 1574-1577. 36. N. Beldjoudi, L. Mambu, M. Labaied, P. Grellier, D. Ramanitrahasimbola, P. Rasoanaivo, M.T. Martin, F. Frappier, Flavanoids from Dalbergia louveliti and antiplasmodial activity, Journal of Natural Products, 2003, 66, 1447-1450. 37. B. Huertaa, J.P. Peralta-Cruz, R. Laredob, J. Karchesyc, Neocandenatone, an isoflavan-cinnamylphenolquinonemethide pigment from Dalbergiacongestiflora, Phytochemistry, 2004, 65, 925-928. 38. S. Cheenpracha, C. Karalai, C. Ponglimanont, A. Kanjana-Opas, Candenatenins A- F, phenolic compounds from the heartwood of Dalbergiacandenatensis, Journal of Natural Products, 2009, 72, 1395-1398. 39. K. Umehara, K. Nemoto, K. Kimijima, A. Matsushita, E. Terada, O. Monthakantirat, W. De-Eknamkul, T. Miyase, T. Warashina, M. Degawa, H. Noguchi, Estrogenic constituents of the heartwood of Dalbergiaparviflora, Phytochemistry, 2008, 69, 546-552. 40. U. Songsiang, S. Wanich, S. Pitchuanchom, S. Netsopa, K. Uanporn, C. Yenjai, Bioactive constituents from the stems of Dalbergia parviflora, Fitoterapia, 2009, 80, 427-431. 41. K. Umehara, K. Nemoto, A. Matsushita, E. Terada, O. Monthakantirat, W. De- Eknamkul, T. Miyase, T. Warashina, M. Degawa, H. Noguchi, Flavonoids from the

137

heartwood of the Thai medicinal plant Dalbergia parviflora and their effects on estrogenic-responsive human breast cancer cells, Journal of Natural Products, 2009, 72, 2163-2168. 42. Z.-J. Cheng, S.-C. Kuo, S.-C. Chan, F.-N. Ko, C.-M. Teng, Antioxidant properties of butein isolated from Dalbergia odorifera, Biochimicaet Biophysica Acta, 1998, 1392, 291-299. 43. P. Mutai, M. Heydenreich, G. Thoithi, G. Mugumbate, K. Chibale, A. Yenesew, 3- Hydroxyisoflavanones from the stem bark of Dalbergia melanoxylon: Isolation, antimycobacterial evaluation and molecular docking studies, Phytochemistry Letters, 2013, 6, 671-675. 44. S. Kavimani, R. Ilango, G. Krishnamoorthy, J.B. Tamizhmozhi, N.S. Nagarajan, C. Manoj, Antiinflammatory activity of biochanin-A isolated from Dalbergiasissoide, Indian Journal of Heterocyclic Chemistry, 1997, 6, 235-236. 45. Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2007. 46. R.-B. An, G.-S. Jeong, Y.-C Kim, Flavonoids from the heartwood of Dalbergiaodorifera and their protective effect on glutamate-induced oxidative injury in HT22 cells, Chem. and Pharm. Bull, 2008, 56 (12), 1722-1724. 47. X. Yu, W. Wang, M. Yang, Antioxidant activities of compounds isolated from Dalbergiaodorifera T. Chen and their inhibition effects on the decrease of glutathione level of rat lens induced by UV irradiation, Food Chemistry, 2007, 104, 715-720. 48. R.-X. Liu, Q. Wang, H.-Z. Guo, L. Li, K.-S. Bi, D.-A. Guo, Simultaneous determination of 10 major flavonoids in Dalbergiaodorifera by high performance liquid chromatography, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 39, 469-476. 49. C. Lee, J.W. Lee, Q. Jin, D.S. Jang, S.J. Lee, D. Lee, J.T. Hong, Y. Kim, M.K. Lee, B.Y. Hwang, Inhibitory constituents of the heartwood of Dalbergia odorifera on nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2013, 23, 4263-4266.

138

50. U. Songsiang, C. Hahnvajanawong, C. Yenjai, Cytotoxicity of chemical constituents from the stems of Dalbergia parviflora, Fitoterapia, 2011, 82(8), 1169-1174. 51. Phạm Thanh Loan, Hoàng Lê Tuấn Anh, Bùi Hữu Tài, Phạm Hải Yến, Đan Thị Thúy Hằng, Nguyễn Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Dương Thị Dung, Nguyễn Xuân Nhiệm, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Trần Huy Thái, Nguyễn Thị Hiền, Các hợp chất flavonoid phân lập từ gỗ cây Cẩm lai (Dalbergia oliveri), Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, 2013, 1140-1146. 52. C. Ito, M. Itoigawa, T. Kanematsu, N. Ruangrungsi, T. Mukainaka, H. Tokuda, H. Nishino, H. Furukawa, Isoflavonoids from Dalbergia oliveri, Phytochemistry, 2003, 64(67), 1265-1268. 53. S.-C. Chan, Y.-S. Chang, S.-C. Kuo, Neoflavonoids from dalbergia odorifera, Phytochemistry, 1997, 46(5), 947-949. 54. O. Shirota, V. Pathak, S. Sekita, M. Satake, Y. Nagashima, Y. Hirayama, Y. Hakamata, T. Hayashi, Phenolic constituents from Dalbergia cochinchinensis, J. Nat. Prod, 2003, 66 (8), 1128-1131. 55. S.F. Farag, A.S. Ahmed, K. Terashima, Y. Takaya, M. Niwa, Isoflavonoid glycosides from Dalbergia sissoo, Phytochemistry, 2001, 57(8), 1263-1268. 56. Y. Tao, Y. Wang, Bioactive sesquiterpenes isolated from the essential oil of Dalbergia odorifera T. Chen, Fitoterapia, 2010, 81(5), 393-396. 57. K. Masanori, U. Akira, H. Yutaka, H. Yusuke, G. Tomoo, I. Takako, K. Syoji, Y. Takuma, S. Motoyoshi, S. Setsuko, Anti-androgen active constituents from Dalbergia cochinchinensis Pierre, Natural Medicines, 1996, 50, 408-412. 58. S. Saha, Md. Aniuzzman, M.K. Islam, H. Mondal, C. Talukder, Anitibacterial and cytotoxic potential of Dalbergia spinosa Roxb Leaves, International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 2013, 4, 512-515. 59. S.W. Hajare, S. Chandra, J. Sharma, S.K. Tandan, J. Lal, A.G. Telang, Anti- inflammatory activity of Dalbergia sisso leaves, Fitoterapia, 2001, 72, 131-139. 60. R.B. Ganga, K.P. Madhu, R.A.D. Vijaya, Investigation og antioxidant and antiinflammatory activity of leaves of Dalbergia paniculata (Roxb), Asian Pacigic Journal of Tropical Medicine, 2012, 455-458.

139

61. M.O. Sofidiya, O.A. Odukoya, O.B. Familoni, S.I. Inya-Agha, Free radical scavenging activity of some Nigerian medicinal plant extracts, Pakistan Journal of Biological Sciences, 2006, 9, 1438-1441. 62. M. Khalid, H.H. Siddiqui, S. Freed, In-vitro assessment of antioxidant activity of Dalbergia latifolia barks extract against free radicals, American-Eurasian Journal of Scientific Research, 2011, 6, 172-177. 63. V. Bala, M.R. Karim, A.K. Shill, I.Z. Shahid, Antinociceptive, antioxidant and cytotoxic activity of Dalbergia spinosa spike, Pharmacologyonline, 2011, 1, 560-566. 64. P.T. Loan, T.H. Thái, P.V. Kiệm, C.V. Minh, Đ.T. Thảo, T.T. Sửu, Hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập từ gỗ cây cẩm lai Dalbergia oliveri Gamble exPrain, Tạp chí sinh học, 2013, 34 (4), 439-444. 65. C. Zhao, Y. Liu, D. Cong, H. Zhang, J. Yu, X. Cui, J. Sun, Screening and determination for potential α-glucosidase inhibitory constituents from

Dalbergia odorifera T. Chen using ultrafiltration-LC/ESI-MSn, Biomedical Chromatography, 2013, 27(12), 1621-1629. 66. S.W. Hajare, S. Chandra, S.K. Tandan, J. Sarma, J. Lal, A.G. Telang, Analgesic and antipyretic activities of Dalbergia sissoo leaves, Indian Journal of Pharmacology, 2000, 32, 357-360. 67. S. Wang, Z. Zheng, Y. Weng, Y. Yu, D. Zhang, W. Fan, R. Dai, Z. Hu, Angiogenesis and antiangiogenesis activity of Chinese medicinal herbal extracts, Life Sciences, 2004, 74, 2467-2478. 68. S.K. Okwute, R. Onyia, C. Anene, O.P. Amodu, Protectant insecticidal and antimicrobial potentials of Dalbergia saxatilis Hookf. (Fabaceae), African Journal of Biotechnology, 2009, 8, 6556-6560. 69. K.P. Jaiganesh, S. Akilandeshwari, R. Senthamarai, Diuretic activity of root extracts of Dalbergia spinosa Roxb, Ancient Science of life, 2009, 28, 11-13. 70. P.T. Loan, H.T.L. Anh, N.T. Cuc, D.T. Yen, D.T. Hang, T.M. Ha, N.X. Nhiem, N.V. Du, T.H. Thai, C.V. Minh, P.V. Kiem, New Isolavone Glycosides from the Stems of Dalbergia vietnamesis, Natural Product Comumnication, 2014, 9 (6), 809-810.

140

71. M. Asif, A. Kumar, Anti-inflammatory activity of ethanolic extract of Dalbergia sissoo (roxb.) bark, Malaysian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009, 7, 39-50. 72. J.W. Kress, K.J. Wurdack, E.A. Zimmer, L.A. Weigt, D.H. Janzen, Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102, 8369– 8374. 73. M. Hasebe, T. Omori, M. Nakazawa, T. Sano, M. Kato, K. Iwatsuki, rbcL Gene Sequences Provide Evidence for the Evolutionary Lineages of Leptosporangiate Ferns, PNAS, 1994, 91(12), 5730-5734. 74. J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J. Gibson, CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions- specific gap penalties and weight matrice choice. Nucleic Acids Research, 1994, 22, 4673-4680. 75. K.B Nicholas, H.B. Nicholas, D.W. Deerfield, GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation. Embnew News, 1997, 4, 14. 76. K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei, S. Kumar, MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Method. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28, 2731-2739. 77. H. Xiong, S. Qi, Y. Xu, L. Miao, P. Y. Qian, Antibiotic and antifouling compound production by the marine-derived fungus Cladosporium sp. F14 Journal of Hydro- Environ Research, 2009, 2(4), 264-270. 78. N.V. Bon, S.L. Wang, New novel α-glucosidase inhibitors produced microbial conversion, Process.Biochem, 2018, 65, 228-232. 79. N.V. Bon, N.A. Dzung, Y.H. Kuo, S.L. Wang, Biosynthesis of α-glucosidase inhibitors by a newly isolated bacterium, Paenibacillus sp. TKU042 and its effect on reducing plasma glucose in mouse model, Int.J.Mol.Sci, 2017, 18, 700. 80. D.T. Phong, V.T.T. Hien, T.T.V. Thanh, N.T. Van, N.Q. Binh, Genetic diversity on tropical rare species of Dalbergia in Viet Nam revealed by inter-simple sequence

141

repeat (ISSR) markers, African journal of Biotechology, 2011, 10 (55), 11397- 11408. 81. T. Li-Bo, L. Li, L. Wei-Jian, H. Yao, Q. Ming-Yan, F. Min, L. Cui-Zhen, DNA Barcoding the plants of Dalbergia odorefira, Journal of Plant Genetic Resources, 2013, 14 (6), 1147-1152. 82. M. Yu, K. Liu, L. Zhou, L. Zhao, S. Liu, Testing three proposed DNA barcodes for the wood indentification of Dalbergia odorefira T. Chen and Dalbergia tonkinensis Prain. Holzforschung, 2016, 70 (2), 127-136. 83. Tsumura Y, Kawahara T, Wickneswari R, and Yoshimura K, Molecular phylogeny of Dipterocarpaceae in Southeast Asia using RFLP of PCR-amplified chloroplast genes. Theoreticaland Applied Genetics, 1996, 93, 22-29. 84. L. Guo, X. Chen, N. Li, W. Tang, Y.T. Pan, J.Q. Kong, Transcriptome-enabled discovery and functional characterization of enzymes related to (2S)-pinocembrin biosynthesis from Ornithogalum caudatum and their application for metabolic engineering, Microb Cell Fact, 2016, 15 (27),1-19. 85. A.Y.L. Ching, T.S. Wah, M.A. Sukari, G.E.C. Lian, M. Rahmani, K. Khalid, Characterization of flavonoid derivatives from Boesenbergia rotunda (L.), The Malaysian Journal of Analytical Sciences, 2007, 11, 154-159. 86. H. Fukui, K. Goto, M. Tabata, Two Antimicrobial Flavanones from the Leaves of Glycyrrhiza glabra, Chem. Pharm. Bull, 1988, 36 (10),4174-4176. 87. F. Maltese, C. Erkelens, F. Kooy, Y.H. Choi, R. Verpoorte, Identification of natural epimeric flavanone glycosides by NMR spectroscopy, Food Chemistry, 2009, 116, 575-579. 88. K. Osawa, H. Yasuda, T. Maruyama, H. Morita, K. Takeya, H. Itokawa, Isoflavanones from Heartwood of Swatzia Polyphylla and Their Antibacterial Activity against Cariogenic Bacteria, Chem. Pharm. Bull, 1992, 40 (11), 2970-2974. 89. C. Martisnez-Sotres, P. Lospez-Albarrán, J. Cruz-de-León, T. García-Moreno, J.G. Rutiaga-Quinones, G. Vázquez-Marrufo, J. Tamariz-Mascarúa, R. Herrera-Bucio, Medicarpin, an antifungal compound identified in hexane extract of Dalbergia

142

congestiflora Pittier heartwood, International Biodeterioration and Biodegradation, 2012, 69, 38-40. 90. H. Wang, W.-L. Mei, Y.-B. Zeng, W.-J. Zuo, Z.-K. Guo, L.-L. Chen, H.-M. Zhong, H.-F. Dai, Phenolic compound from Dalbergia odorifera, Phytochemistry Letters, 2014, 9, 168-173. 91. V.R. Sindhia, R. Bairawa, Plant review: Butea monosperma, International Jounal of Pharmaceutical and clinical Search, 2010, 2 (2), 90-94. 92. R. Maurya, D.K. Yadav, G. Singh, B. Bhargavan, P.S.N. Murthy, M. Saha, M.M. Singh, Osteogenic activity of constituent from Butea monosperma, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2008, 19(3), 610-613. 93. M. Furukawa, H. Suzuki, M. Makino, S. Ogawa, T. Ida, Y. Fujimoto, Studies on the constituents of Lagochilus leiacanthus (Labiate), Chem. Pharm. Bull, 2011, 59, 1535-1540. 94. W. Gaffield, Circular dichroism, oftiacl rotatory dispersion andabsolute configuration of flavanones, 3-hydroxyflavanones and their glycosides Tetrahedron, 1970, 26, 4093-4018. 95. J. E. S. A. Menezes, F. E. A. Machado, T. L. G. Lemos, E. R. Silveira, R. B. Filho, O. D. L. Pessoa, Sesquiterpenes and a Phenylpropanoid from Cordia trichotoma, Z. Naturforsch, 2004, 59, 19-22. 96. G. H. Stout, G. K. Hickernell, K. D. Sears, Calophyllum products. IV. Papuanic and isopapuanic acids, J. Org. Chem, 1968, 33 (11), 4191-4200. 97. J. Durbin, L. E. Fellows, C. R. Dykes, L-DOPA in Seed of Dalbergia retusa Leguminosae-Papilionoideae, Kew Bull. 1984, 39 (4), 799-801 98. M. Jansirani, R. Gandhidasan, Phytochemistry Investigation of Dalbergia rubiginosa, Joural of Natural Product and Resources, 2015, 1 (1), 10-12. 99. S. Khamsan, S. Liawruangrath, A. Teerawutkulrag, S. Pyne, M. Garson, B. Liawruangrath, The isolation of bioactive flavonoids from Jacaranda obtusifolia H. B. K. ssp. rhombifolia (G. F. W. Meijer) Gentry, Acta Pharm, 2012, 62 181190.

143

100. R. Gaur, S. Kumar, P. Trivedi, R.S. Bhakuni, D.U. Bawankule, A. Pal, K. Shanker, Liquiritigenin derivatives and their hepatoprotective activity, Nat. Prod. Commun, 2010, 5(8), 1243–1246. 101. E.-J. Yang, G.H. Park, K.-S. Song, Neuroprotective effects of liquiritigenin isolated from licorice roots on glutamate-induced apoptosis in hippocampal neuronal cells, Neurotoxicology, 2013, 39, 114–123. 102. Q. Zhang, L. Xue-Ting, J.-Y. Liang, M. Zhi-Da, Chemical constituents from the stems of Caesalpinia decapetala, Chinese J. Nat. Med, 2008, 6(3), 168–172. 103. Y. Lin, Y. Kuang, K. Li, S. Wang, S. Ji, K. Chen, W. Song, X. Qiao, M. Ye, Nrf2 activators from Glycyrrhiza inflata and their hepatoprotective activities against

CCl4-induced liver injury in mice, Bioor. Med. Chem, 2017, 25(20), 5522–5530.

104. P.K. Agrawal, Carbon-13 NMR of Flavonoids, Studies in Organic Chemistry, Amsterdam-Oxford-NewTork-Tokyo, 1989, 39,189–191. 105. G. Castellano, F. Torrens, Quantitative structure-antioxidant activity models of isoflavonoids: a theoretical study, Int. J. Mol. Sci, 2015, 16(6), 12891–12906. 106. J.W. Lee, C. Lee, Q. Jin, M.-S. Lee, Y. Kim, J.T. Hong, M.K. Lee, B.Y. Hwang, Chemical constituents from Belamcanda chinensis and their inhibitory effects on nitric oxide production in RAW 264.7 macrophage cells, Arch. Pharm. Res, 2014, 38(6), 991997. 107. M.A. Ponce, J.M. Servino, R.E. Balsells, J.A. Ocampo, A.M Godeas, Flavonoids from shoots and roots of Trifolium repens (white clover) grown in precence of absence of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices, Elsevier, 2004, 65, 1925-1930. 108. W.-L. Lo, F.-R. Chang, T.-J. Hsieh, Y.-C. Wu, The constituents of Euchresta formosana, Journal of the Chinese Chemical Society, 2002, 49(3), 421-426. 109. C.-Q. Song, Z.-R. Zheng, L. Di, Z.-B. Hu, Isoflavones from Astraglus Membranaceus, Acta Botanica Sinica, 1997, 39 (8), 764-768.

144

110. H. Chen, C. Wang, Y. Ye, H. Zhou, R. Tao, Isolation of sulfuretin and butin from Rhus verniciflua Stokes using medium-pressure liquid chromatography and their tyrosinase inhibitory effects, BioResources, 2016, 11(1), 759771. 111. D.-S. Lee, G.-S. Jeong, B. Li, H. Park, Y.-C. Kim, Anti-inflammatory effects of sulfuretin from Rhus verniciflua Stokes via the induction of heme oxygenase-1 expression in murine macrophage, Int. Immunopharmacol, 2010, 10(8), 850858. 112. K.-W. Lee, K.-S. Chung, J.-H. Seo, S.-V. Yim, H.-J. Park, J.-H. Choi, K.-T. Lee, Sulfuretin from heartwood of Rhus verniciflua triggers apoptosis through activation of Fas, Caspase, and the mitochondrial death pathway in HL‐60 human leukemia cells, J.Cell. Biochem, 2012, 113(9), 28352844. 113. C.P.D. Cunha, C.P, R.L.O. Godoy, R.B. Filho, Isolation of flavonoids from rmance Liquid Chromatography, Rev.Virtual Quim, 2016, 8(1), 43-56. 114. H.C. Gerstein, M.E. Miller, R.P. Byington, D.C. Jr. Goff, J.T. Bigger, J.B. Buse, W.C. Cushman, S. Genuth, F. Ismail-Beigi, R.H.J. Grimm, Effects of intensive glucose lowering in type 2 diabetes, N. Engl. J. Med, 2008, 358, 2545–2559. 115. S.H. Ley, O. Hamdy, V. Mohan, F.B. Hu, Prevention and management of type 2 diabetes: Dietary components and nutritional strategies, The Lancet, 2014, 383(9933), 1999–2007. 116. E.B. Melo, A.S. Gomes, I. Carvalho, α-and β-Glucosidase inhibitors: Chemical structure and biological activity, Tetrahedron, 2006, 62(44), 10277–10302. 117. G. Wang, Z. Peng, J. Wang, X. Li, J. Li, Synthesis, in vitro evaluation and molecular docking studiensicannees of novel triazine-triazole derivatives as potential α-glucosidase inhibitors, Eur. J. Med. Chem, 2017, 125, 423–429. 118. U. Ghani, Re-exploring promising a-glucosidase inhibitors for potential development into oral anti-diabetic drugs: Finding needle in the haystack, Eur. J. Med. Chem, 2015, 103, 133–162. 119. N.V. Bon, N.A. Dung, S.-L. Wang, Utilization of fishery processing by- product squid pens for α-glucosidase inhibitors production by Paenibacillus sp, Mar. Drugs, 2017, 15(9), 274.

145

120. C.-H. Hsu, N.A. Dung, S.-L. Wang, Conversion of shrimp heads to α- glucosidase inhibitors via co-culture of Bacillus mycoides TKU040 and Rhizobium sp. TKU041, Res. Chem. Intermed, 2018, 1-11. 121. H. Nam, H. Jung, S. Karuppasamy, Y.S. Park, Y.S. Cho, J.Y. Lee, S. Seong, J.G. Suh, Anti-diabetic effect of the soybean extract fermented by Bacillus subtilis MORI in db/db mice, Food Sci. Biotechnol, 2012, 21(6),1669–1676. 122. P. McCue, Y.-I. Kwon, K. Shetty, Anti-diabetic and antihypertensive potential of sprouted and solid-state bioprocessed soybean, Asian Pac. J. Clin. Nutr, 2005, 14(2), 145–152. 123. N.Q. Vinh, N.A. Dung, S.-L. Wang, Screening and evaluation of α-glucosidase inhibitors from indigenous medicinal plants in Dak Lak Province, Vietnam, Res. Chem. Intermed, 2017, 43(6), 3599-3612. 124. N.Q. Vinh, J.-B. Eun, S.-L. Wang, N.D. Hoang, T.H. Nhung, N.A. Dung, Anti- oxidant and antidiabetic effect of some medicinal plants belong to Terminalia species collected in Dak Lak Province, Vietnam, Res. Chem. Intermed, 2016, 42(6), 5859–5871. 125. N.A. Dung, N.Q. Vinh, S.-L. Wang, Porcine pancreatic α-amylase inhibitors from Euonymus laxiflorus Champ, Res. Chem. Intermed, 2017, 43(1), 259–269. 126. N.Q. Vinh, S.-L. Wang, N.A. Dung, In vitro α-glucosidase and α-amylase inhibition, and in vivo anti-hyperglycemic effects of Psidium littorale Raddi leaf extract, Res. Chem. Intermed, 2018, 44(3), 1745–1753. 127. S.-L. Wang, New novel α-glucosdase inhibitors produced by microbial conversion, Process Biochemistry, 2018, 65, 228–232.