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UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE DES ORGANISMES ______

THESE EN CO-TUTELLE POUR L’OBTENTION DU DIPLÔME DE DOCTORAT EN SCIENCES DE LA VIE SPECIALITE : BIOLOGIE VEGETALE (PHYSIOLOGIE VEGETALE)

INHIBITION DE L’EXPRESSION DES GENES DE VIRULENCE CHEZ Rhodococcus fascians ET

Pseudomonas aeruginosa PAR DES FLAVONOIDES ISOLES CHEZ LES GENRES Dalbergia ET Combretum

Présenté par RAJAONSON Sanda Faneva Soutenu le : 16 Décembre 2011

Président : Ramavovololona Professeur Titulaire Directeurs de thèse : El Jaziri Mondher Professeur Ordinaire Ralambofetra Eliane Maître de Conférences Rapporteurs : Raherimandimby Marson Professeur Titulaire Duez Pierre Professeur Ordinaire Examinateurs : Andrianarisoa Blandine Professeur Titulaire Ranomenjanahary Sahondramalala Directeur de Recherche

A ma femme Kerri,

A mon fils Wyatt

A mes parents Alain et Bako

A mes frères Rindra et Tahiny REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé en co-tutelle entre le Laboratoire de Biotechnologie Végétale de l’Université Libre de Bruxelles, le Département de Biologie et Ecologie Végétales de l’Université d’Antananarivo et l’Institut Malgache de Recherches Appliquées. Cette thèse a été supportée par l’Agence Universitaire de la Francophonie (Madagascar), la Commission Universitaire pour le Développement (CUD Belgique) et la Fondation Van Buuren (Belgique). Ce travail entre également dans le cadre du programme PIC 2009 Madagascar (financé par la CUD Belgique). C’est avec mon enthousiasme le plus vif et le plus sincère que je voudrais rendre mérite à tous ceux qui, à leur manière, m’ont aidé à mener à bien cette thèse. Je tiens à remercier tout d’abord Monsieur Mondher El Jaziri de m’avoir accueilli dans son laboratoire et d’avoir mis à ma disposition tous les moyens nécessaires pour la réalisation de ce travail. Ce fut un réel plaisir de venir travailler dans son laboratoire et d’avoir eu la chance de discuter de ce travail avec lui. Je lui sais gré pour la confiance et la liberté qu’il m’a accordé. Je ne le remercierai jamais assez pour toute l’aide qu’il m’a apporté depuis le début jusqu’à la fin de cette thèse malgré ses responsabilités. Un grand merci également à Monsieur Olivier Vandeputte pour son énorme participation à l’encadrement scientifique de ce travail. Je salue son attention, sa patience et sa grande disponibilité. Sa qualité de vision, sa conception de la recherche, son niveau d’exigence et sa rigueur scientifique m’ont fait apprendre beaucoup de choses et restent pour moi un exemple. Qu’il trouve ici l’expression de ma profonde reconnaissance. Je tiens aussi à exprimer ma gratitude envers Madame Eliane Ralambofetra. Je lui suis vivement très reconnaissant pour le temps qu’elle m’a consacré et son énergique contribution à la réalisation de cette thèse malgré ses nombreuses occupations. Son expérience et nos nombreuses discussions m’ont permis de mener à bien ce travail. Je ne saurais oublier Monsieur Billo Diallo, grâce à qui j’ai appris beaucoup sur les techniques chromatographiques. Il a surtout participé à l’identification et l’élucidation des structures des composés chimiques isolés dans ce travail. Sa gentillesse et sa culture générale en font une personne à fréquenter sans modération. Mes remerciements s’adressent également aux membres du jury de soutenance : A Madame Ramavovololona qui n’a pas hésité d’accepter de juger et a fait l’honneur d’être la présidente du jury de ce travail. A Monsieur Pierre Duez, qui a fait l’honneur d’être le président du comité d’accompagnement de cette thèse à l’Université Libre de Bruxelles et d’en être le rapporteur. Je le remercie également d’avoir ouvert la porte de son laboratoire pour la réalisation de certaines parties phytochimiques de ce travail. J’en profite pour remercier son équipe en particulier Madame Caroline Stévigny, Monsieur Gilles Berger et Monsieur Pierre Van Antwerpen pour leur aide sur l’organisation et l’interprétation des données des spectres RMN et de masse ainsi que pour toutes les discussions fructueuses sur la confirmation de la structure de la perbergine. A Monsieur Raherimandimby Marson qui a témoigné de l’intérêt pour cette thèse en acceptant de juger ce travail et d'en être le rapporteur. A Madame Blandine Andrianarisoa qui a eu la gentillesse de bien vouloir accepter le rôle d’examinateur malgré ses nombreuses occupations. A Madame Sahondramalala Ranomenjanahary d’avoir spontanément accepté avec bonne volonté d’examiner ce travail de thèse. A toute l’équipe et collègues du Laboratoire de Biotechnologie Végétale de l’ULB en particulier Madame Marie Baucher pour sa sympathie et ses aides précieuses et Madame Adeline Mol qui m’a initié aux différentes techniques de tests d’activités biologiques. A toutes les personnes qui ont participé à la réalisation et le perfectionnement des articles listés dans les Annexes 11, 12 et 13 de ce travail. A tous les collègues de l’IMRA, en particulier Aro Vonjy Ramarosandratana, qui n’a pas hésité à appuyer mon dossier pour le prolongement de ma bourse de doctorat. Je lui suis très reconnaissant pour son amitié, son soutien, son écoute et ses encouragements. Je remercie également l’équipe du Laboratoire de Phytochimie avec laquelle j’ai effectué mes premières extractions chimiques. Je n’oublie pas la présence et le soutien des personnes qui me sont chères. Kerri, Wyatt, mon père, ma mère, mes frères et ma famille qui m’ont toujours supporté tout au long de cette thèse et grâce à qui j’ai réalisé ce parcours. Mon frère Rindra et son amie Hoby qui m’ont beaucoup aidé pour les procédures administratives et qui m’ont servi de liaison directe avec les contacts à Madagascar pendant tout mon séjour à l’étranger. A tous ceux qui ont participé de près ou de loin à la réalisation de cette thèse.

TABLE DES MATIERES

CHAPITRE I : ...... 1

INTRODUCTION GENERALE ...... 1

CHAPITRE II : ...... 6

GENERALITES ...... 6 I. Généralités sur les plantes étudiées ...... 7 I.1. Le genre Dalbergia ...... 7 I.1.1. Position systématique des Dalbergia ...... 7 I.1.2. Description morphologique des Dalbergia ...... 7 I.1.2.1. L’appareil végétatif ...... 7 I.1.2.2. L’appareil reproducteur ...... 8 I.1.3. Exploitation du bois de Dalbergia ...... 9 I.1.4. Rappels sur quelques études scientifiques effectuées au sein du genre Dalbergia ...... 10 I.1.4.1. Quelques informations ethnobotaniques sur le genre Dalbergia .... 10 I.1.4.2. Etudes pharmacologiques réalisées sur le genre Dalbergia ...... 11 I.1.4.3. Propriétés antimicrobiennes du genre Dalbergia ...... 11 a. Activité antimicrobienne d’extraits de plantes ...... 11 b. Activité antimicrobienne des composés isolés ...... 12 I.1.4.4. Les études phytochimiques réalisées sur le genre Dalbergia ...... 12 I.2. Le genre Combretum ...... 13 I.2.1. Position systématique ...... 13 I.2.2. Description morphologique ...... 14 I.2.2.1. Appareil végétatif ...... 14 I.2.2.2. Appareil reproducteur ...... 15 I.2.3. Rappel sur quelques études scientifiques effectuées au sein du genre Combretum ...... 15 I.2.3.1. Informations ethnobotaniques sur le genre Combretum ...... 15 I.2.3.2. Etudes pharmacologiques réalisées sur le genre Combretum ...... 15 I.2.3.3. Activité antimicrobienne du genre Combretum ...... 16 a. Activité antimicrobienne des extraits bruts ...... 16 b. Activité antimicrobienne des molécules isolées ...... 17 I.2.3.4. Les études phytochimiques réalisées sur le genre Combretum ...... 17 II. Généralités sur les bactéries étudiées ...... 18

II.1. Pseudomonas aeruginosa ...... 18 II.1.1. Position systématique de P. aeruginosa ...... 19 II.1.2. Description, structure et identification...... 19 II.1.3. La pathogénicité de P. aeruginosa ...... 20 II.1.3.1. Les facteurs de virulence cellulaires ...... 21 II.1.3.2. Les facteurs de virulence secrétés ...... 21 a. Les lectines solubles ( lecA et lecB ) ...... 21 b. L’exotoxine A ( exoA ) ...... 22 c. Les protéases ...... 22 d. Les rhamnolipides ( rhlA et rhlB ) ...... 22 e. Les phénazines ...... 22 e.1. La pyocyanine ...... 23 e.2. La pyoverdine ...... 23 II.1.4. Régulation de l’expression des gènes de virulence chez P. aeruginosa ..... 23 II.1.4.1. Définition et principes du quorum sensing ...... 23 a. Définition ...... 23 b. Principe ...... 24 II.1.4.2. Mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa ...... 24 a. Le système las ...... 25 b. Le système rhl ...... 26 c. L’autoinducteur PQS ...... 27 II.2. Rhodococcus fascians ...... 27 II.2.1. Position systématique ...... 28 II.2.2. Description, structure et identification...... 29 II.2.3. Les différents hôtes et la distribution géographique de R. fascians ...... 30 II.2.4. Les différents symptômes causés par R. fascians ...... 30 II.2.5. Pathogénicité de R. fascians ...... 31 II.2.5.1. Rappel sur l’isolement du plasmide circulaire et les premières étapes des études moléculaires de R. fascians ...... 32 II.2.5.2. Le plasmide linéaire et son implication dans la production des facteurs de virulence chez R. fascians ...... 32 a. Le locus fas ...... 32 b. Régulation de l’expression de fas ...... 33 c. Le locus att ...... 34 d. Régulation de l’expression de att ...... 34 e. Rôles du locus att dans le développement du symptôme ...... 34 f. Liaison entre le locus fas et att dans le développement du symptôme ...... 35 g. Le locus hyp ...... 35 II.2.6. Rôle des phytohormones dans la formation des galles feuillées ...... 36 II.2.6.1. Les cytokinines ...... 36 II.2.6.2. Les auxines ...... 37 II.2.7. Intérêt biotechnologique de R. fascians ...... 37 III. Conclusions ...... 38

CHAPITRE III : ...... 40

MATERIEL ET METHODES ...... 40 I. Matériel ...... 41 I.1. Matériel végétal ...... 41 I.1.1. Critères de sélection du matériel végétal ...... 41 I.1.2. Matériel végétal issu de l’environnement in situ ...... 41 I.1.3. Matériel végétal issu de la culture in vitro ...... 42 I.1.4. Conditions de préparation du matériel végétal...... 43 I.1.4.1. Séchage et broyage ...... 43 I.1.4.2. Conditions de culture in vitro ...... 43 I.2. Souches bactériennes, gènes d’intérêt et conditions de culture ...... 43 I.2.1. Les gènes d’intérêt étudiés ...... 43 a. Les gènes d’intérêt fusionnés avec le gène rapporteur uidA ...... 44 b. Les gènes d’intérêt fusionnés avec le gène rapporteur lacZ ...... 44 I.2.2. Les différentes souches bactériennes ...... 44 I.2.3. Conditions de culture des bactéries avant les tests d’activités biologiques ...... 47 II. Méthodes ...... 47 II.1. Etude de l’effet des extraits de Dalbergia sur l’expression des gènes responsables de la production de facteurs de virulence chez R. fascians ...... 47 II.1.1. Etude préliminaire : Infection de N. tabacum , de P. tremula x P. tremuloïdes et des 4 espèces de Dalbergia issues de la culture in vitro ...... 49 II.1.2. Obtention des extraits et des composés actifs pour les tests d’activités biologiques ...... 49 II.1.2.1. Extractions chimiques ...... 49 a. Extraction à partir des galles feuillées ...... 50 b. Extraction à partir des plantes pour les tests d’activités biologiques ...... 50 b.1. Extractions réalisées sur les espèces de Dalbergia ...... 50 b.2. Extractions réalisées avec N. tabacum ...... 51 b.3. Macération, évaporation et conservation ...... 51 II.1.2.2. Fractionnements, isolement et purification du composé actif chez D. pervillei ...... 51 a. Fractionnements chromatographiques ...... 52 b. Isolement et purification de la fraction active ...... 55 b.1. Identification et élucidation structurale du composé actif ...... 55 b.1.1. La RMN ...... 55 b.1.2. La spectrométrie de masse ...... 55 II.1.3. Préparation des échantillons pour les tests d’activités biologiques ...... 56 II.1.4. Les tests d’activités biologiques ...... 58 II.1.4.1. Test d’activité GUS ( β-D-glucuronidase) ...... 58 a. Préparation des bactéries pour le test d’activité GUS ...... 59 b. Détermination de la condition optimale d’induction (COI) ...... 59 c. Mesure de la densité bactérienne ...... 60 d. Mesure de l’activité GUS ...... 60 e. Critères de sélection des extraits lors du criblage ...... 61 e.1. Définition des limites de sélection ...... 61 e.2. Vérification de l’effet de l’extrait sélectionné sur l’activité de l’enzyme β-glucuronidase ...... 61 e.3. Confirmation de l’activité de l’extrait sélectionné ...... 62 f. Présentation des résultats et analyses statistiques ...... 62 II.1.4.2. Test d’activité LacZ ( β-galactosidase) ...... 62 a. Préparation des souches bactériennes pour le test ...... 63 b. Mesure de la densité bactérienne ...... 63 c. Mesure de l’activité LacZ avec les souches d’ A. caulinodans ...... 63 d. Analyse statistique des résultats ...... 64 II.1.4.3. Etude de la viabilité de R. fascians ...... 64 II.1.4.4. Etude de la croissance chez R. fascians ...... 64 II.1.4.5. Analyse in planta de l’expression des gènes de virulence chez R. fascians ...... 65 II.1.4.6. Infection des graines de tabac avec la souche de R. fascians traitée ou non avec la perbergine ...... 66 II.2. Criblage des extraits de Dalbergia pour l’inhibition de l’expression de quelques gènes responsables de la production de facteurs de virulence chez P. aeruginosa ...... 66 II.2.1. Obtention des extraits et des fractions pour les tests d’activités biologiques ...... 67 II.2.1.1. Extractions chimiques à partir des plantes de Dalbergia pour les tests d’activités biologiques ...... 67 II.2.1.2. Fractionnement de l’extrait actif ...... 68 II.2.2. Préparation des échantillons à tester ...... 68 II.2.3. Tests d’activités biologiques ...... 69 II.2.3.1. Test d’activité LacZ ...... 69 a. Préparation des souches bactériennes pour le test ...... 69 b. Mesure de la densité bactérienne ...... 69 c. Mesure de l’activité LacZ avec les souches de P. aeruginosa ...... 70 d. Présentation des résultats et analyses statistiques ...... 70 II.2.3.2. Etude de la production de pyocyanine ...... 71 a. Préparation de la suspension bactérienne pour le test ...... 71 b. Quantification de la production de pyocyanine ...... 71 II.3. Etude de l’effet du composé isolé de C. albiflorum sur le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa ...... 71 II.3.1. Extractions et fractionnements des composés actifs du matériel végétal pour les tests d’activités biologiques ...... 72 II.3.1.1. Extraction chimique réalisée avec C. albiflorum ...... 73 II.3.1.2. Fractionnements, isolement et identification des composés actifs chez C. albiflorum ...... 73 a. Fractionnements et isolement des composés actifs ...... 73 b. Elucidation de la structure chimique du composé actif issu de C. albiflorum ...... 74 II.3.2. Préparation des échantillons pour les tests d’activités biologiques ...... 75 II.3.3. Tests d’activités biologiques ...... 75 II.3.3.1. Quantification de la production de pyocyanine et d’élastase ...... 75 a. Préparation de la suspension bactérienne pour le test ...... 75 b. Quantification de la production de pyocyanine ...... 76 c. Quantification de la production d’élastase ...... 76 II.3.3.2. Test d’activité LacZ ...... 77 II.3.3.3. Mesure de la densité bactérienne ...... 77 II.3.3.4. Etude de la viabilité chez P. aeruginosa ...... 77 II.3.3.5. Analyse statistique des résultats ...... 77 CHAPITRE IV : ...... 78

RESULTATS ...... 78 I. Inhibition de l’expression des gènes impliqués dans la production des

facteurs de virulence chez R. fascians...... 79 I.1. Résultats des études préliminaires : Résistance des espèces de Dalbergia étudiées à l’infection par R. fascians ...... 79 I.2. Les composés chimiques responsables de l’atténuation de l’expression des gènes de virulence chez R. fascians ...... 81 I.2.1. Détermination de la condition optimale d’induction et de la condition sans induction de l’expression du locus att ...... 82 I.2.2. Criblage des différents extraits de Dalbergia sur l’expression du gène attH ...... 83 I.2.2.1. Expression du gène attH en présence des extraits des plantules de Dalbergia cultivées in vitro ...... 83 I.2.2.3. Confirmation de l’activité de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei ...... 86 a. Effet de l’extrait dichlorométhanique de D. pervillei sur l’activité de l’enzyme β-glucuronidase ...... 86 b. Effet général de l’extrait dichlorométhanique de D. pervillei sur l’expression du gène attH ...... 87 I.2.3. Isolement et identification de la perbergine comme inhibiteur de l’expression du gène attH ...... 88 I.2.3.1. Les différentes étapes de fractionnement ...... 88 a. Première étape de fractionnement ...... 88 b. Deuxième étape de fractionnement ...... 89 c. Troisième étape de fractionnement ...... 90 d. Quatrième étape de fractionnement ...... 91 I.2.3.2. Isolement et purification du composé dans la fraction F6-6-4-9 ..... 92 I.2.3.3. Analyse des spectres RMN ...... 93 I.2.3.4. Analyse du spectre de masse ...... 93 I.2.4. Elucidation et confirmation de la structure chimique du composé 1 ...... 94 I.3. Effet de la perbergine sur la viabilité et la croissance de R. fascians ... 96 I.3.1. Effet de la perbergine sur la viabilité de R. fascians et la détermination de sa concentration minimale qui inhibe l’expression du gène attH ...... 96 I.3.2. Effet de la perbergine sur la croissance de R. fascians ...... 98 I.4. Comparaison de l’activité de la perbergine avec des isoflavonoïdes connus ...... 98 I.5. Mécanisme d’action de la perbergine sur l’expression des gènes localisés sur le plasmide linéaire de R. fascians ...... 99 I.5.1. Effet de la perbergine sur l’expression des loci att et fas ...... 99 I.5.2. Effet de la perbergine sur l’expression d’autres gènes chez R. fascians .... 100 I.6. Expression in planta des gènes attH, fasA et nrp5 lors de l’infection de N. tabacum et de D. pervillei par R. fascians ...... 101 I.7. Effet de l’ajout tardif de la perbergine sur l’expression du locus att chez R. fascians...... 102 I.8. Expression des gènes appartenant à la famille LysR en présence de la perbergine...... 102 I.9. Effet de la perbergine sur l’agressivité de R. fascians ...... 103 I.9.1. Effet de la perbergine sur le développement des cotylédons chez les plantules de tabac infectées avec R. fascians ...... 103 I.9.2. Effet de la perbergine sur l’activité du méristème chez les plantules de tabac infectées avec R. fascians ...... 105 I.9.3. Effet de la perbergine sur la formation de galles feuillées chez les plantules de tabac infectées avec R. fascians ...... 107 I.9.4. Comparaison des différents phénotypes de plantules de tabac infectées avec les souches de R. fascians traitées ou non avec la perbergine ...... 108 II. Expression des gènes impliqués dans le mécanisme du quorum sensing

chez P. aeruginosa ...... 110 II.1. Criblage des extraits de Dalbergia sur l’inhibition du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa ...... 110 II.1.1. Première étape de criblage ...... 110 II.1.2. Deuxième étape de criblage ...... 112 II.1.3. Troisième étape de criblage ...... 113 II.1.4. Quatrième étape de criblage ...... 114 II.2. Effet de l’extrait de Combretum sur l’expression des gènes impliqués dans le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa ...... 116 II.2.1. Isolement et identification du composé 2 (catéchine) à partir de l’extrait d’écorces de C. albiflorum ...... 117 II.2.1.1. Fractionnement et isolement du composé actif ...... 117 II.2.1.2. Détermination de la structure chimique du composé 2 ...... 118 a. Analyse des spectres UV ...... 118 b. Analyse des spectres de masse ...... 118 II.2.2. Confirmation de l’activité de la catéchine ...... 119 II.2.3. Détermination de la concentration maximale en catéchine qui inhibe la production de la pyocyanine sans affecter la croissance de P. aeruginosa ...... 120 II.2.4. Effet de la catéchine sur la croissance et la viabilité de P. aeruginosa .... 121 II.2.5. Effet de la catéchine sur la production de pyocyanine et d’élastase chez P. aeruginosa ...... 121 II.2.6. Effet de la catéchine sur l’expression des gènes impliqués dans le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa ...... 122 II.2.7. Effet de la catéchine sur la production de pyocyanine après addition des homosérines lactones ...... 124 CHAPITRE V : ...... 126

DISCUSSION ...... 126 1. Importance de l’étude de l’expression des gènes de virulence dans la lutte

contre la pathogénicité des bactéries ...... 127 2. Rôle des métabolites secondaires dans l’interaction entre les plantes et les

microorganismes ...... 127 3. Intérêt de la diversité chimique au sein des genres Dalbergia et

Combretum ...... 128 4. Inhibition de l’expression des gènes de virulence chez R. fascians par des

composés chimiques chez les espèces de Dalbergia ...... 129 5. Identification de la perbergine parmi les composés chimiques

responsables de la résistance de Dalbergia à l’infection de R. fascians ..... 130 6. Mécanismes d’action de la perbergine dans l’inhibition de l’expression

des gènes de virulence chez R. fascians ...... 131

7. La perbergine et le régulateur de type LysR ...... 133 8. Intérêt de l’identification de la structure de la perbergine dans le

traitement phytosanitaire ...... 134 9. Identification des activités anti-quorum sensing chez les Dalbergia de

Madagascar ...... 135 10. Identification de la catéchine parmi les composés anti-quorum sensing

chez C. albiflorum ...... 136 11. Mécanisme d’action de la catéchine dans l’inhibition du quorum sensing

chez P. aeruginosa ...... 137

CHAPITRE VI : ...... 139

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES...... 139

Références Bibliographiques ...... 144

ANNEXES ...... 170

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Les souches bactériennes utilisées dans cette étude...... 45 Tableau 2. Différentes compositions de milieux de culture pour la détermination de la condition optimale d’induction de l’expression du gène attH chez R. fascians ...... 60 Tableau 3. Les différents phénotypes induits par la souche virulente D188 de R. fascians sur N. tabacum , P. tremula x P. tremuloïdes et les 4 espèces de Dalbergia ...... 79 1 13 Tableau 4. Spectre RMN H et C indiquant les déplacements chimiques δ (ppm) du

composé 1 dans le CDCl 3 en corrélation avec les résultats de la HMBC (les valeurs entre parenthèse représentent J et sont exprimées en Hz)...... 93 Tableau 5. Effet de la catéchine sur l’expression des gènes lasI, lasR, lasB, rhlI, rhlR, rhlA et aceA chez P. aeruginosa...... 123

LISTE DES PHOTOS ET DES FIGURES

Photo 1. Quelques photos illustrant les différents types morphologiques de Dalbergia . (A) Photo de D. lactea qui est une liane de petite taille ; (B) Photo de D. obovata qui est une plante grimpante qui monte dans la canopée et pouvant aller jusqu’à 30 m de haut ; (C) Photo de D. benthamii qui est un arbuste ; (D) Photo de D. lanceolaria qui est un arbre avec une hauteur variant de 10 à 27 m de haut. Sources : A : http://www.zimbabweflora.co.zw/speciesdata/image-display.php?species_id=131050 &image_id=3 ; B : http:// www.plantzafrica.com/plantcd/plimagescd/dalbergoboni chol4.jpg ; C : http://www.flickr.com/photos/mingiweng/5488744208/sizes/o/in/photo stream/ ; D : http://www.flickr.com/photos/dineshvalke/2499771230/sizes/o/in/pho tostream/...... 8 Photo 2. Quelques photos illustrant les caractéristiques des feuilles, des fleurs et des fruits chez Dalbergia . (A) Feuilles composées alternes imparipennées de D. melanoxylon ; (B) Fleurs de D. brownei ; (C) Inflorescence en grappe de cyme chez D. lanceolaria ; (D) Fruits en gousse de D. cochinchinensis . (E) Exemples de bois de Dalbergia (F) D. trichocarpa ; (G) D. chlorocarpa ; (H) D. purpurascens ; (I) D. pervillei . Sources : A : http://www.prota4u.org/plantphotos/Dalbergia%20melanoxylon%208.jpg ; B : http://striweb.si.edu/esp/tesp/plant_pictures/i_sp1053.mx.jpg ; C : http://www.flickr .com/photos/dinesh_valke/2498936993/sizes/o/in/photostream/ ; D : http://woodplanet .info/kra-nhourng/dalbergia-cochinchinensis-pierre.jpg. E-F : The tribe of Dalbergiaea (Bosser et Rabevohitra 2002)...... 9 Photo 3. Quelques exemples de photos illustrant les caractères morphologiques des appareils végétatifs et reproducteurs chez Combretum . (A) Photo de C. erythrophyllum ; (B) Feuilles simples opposées chez C. quadrangulare ; (C) Inflorescence axillaire en épis chez C. fruticosum ; (D) Caractéristique des fruits chez C. laxum . Sources : A : http://lifestyleseeds.co.za/usd/product_info.php?products_id= 91&osCsid=86cbb9bce9c3ecaef5c79e178cf0bfba ; B : http://www.flickr.com/photos/ phuonglovejesus2782010/5007669375/sizes/l/in/photostream/ ; C : http://www.flickr .com/photos/kadai/2597522346/sizes/o/in/photostream ; D : http://www.discoverlife .org/mp/20q?search=Combretum+laxum...... 14 Photo 4. Structure morphologique et caractéristique de la colonie de P. aeruginosa . (A) Caractéristique de la colonie de P. aeruginosa mise en culture dans un milieu solidifié ; (B) Vue microscopique de la forme en bacille chez P. aeruginosa . Sources : A : Présent travail ; B : http://www.visualsunlimited.com/image /I0000a7snGnaUiyk...... 20 Photo 5. Structure morphologique et caractéristique de la colonie de R. fascians . (A) Caractéristique d’une culture de R. fascians mise en culture dans le milieu LB ; (B) Grossissement de la structure de la colonie de R. fascians ; (C) Vue au microscope électronique à balayage de la structure filamenteuse qui se fragmente en bâtonnet chez R. fascians ; Source : Présent travail...... 29 Photo 6. Quelques photos représentant les différents types de symptôme causés par R. fascians . (A) Distorsion foliaire et régénération de bourgeons adventifs chez Acanthus mollis ; (B) Fasciation chez Daphne odora ; (C) Formation de galles feuillées chez Coreopsis ; (D) Prolifération des pousses chez Dicentra ; (E) Formation de galles feuillées à partir du méristème axillaire chez Atropa belladonna ; (F) Formation de galles feuillées à partir du méristème apical chez Nicotiana tabacum . Sources : A-D : (Putnam et Miller 2007) ; E : (Vereecke et al. 2000) ; F : présent travail...... 31 Photo 7. Phénotypes induits par la souche sauvage D188 de R. fascians sur les espèces de plantes étudiées. (A-B) Phénotypes induits chez Nicotiana tabacum ; (C-D) Populus tremula x P. tremuloïdes ; (E-F) Dalbergia chlorocarpa ; (G-H) D. purpurascens ; (I- K) D. pervillei ; (L-M) D. trichocarpa après la cinquième semaine d’infection. Les flèches indiquent les phénotypes obtenus après infection des bourgeons avec la souche non virulente D188-5 de R. fascians . Les pointes de flèches indiquent les phénotypes obtenus lorsque les bourgeons sont infectés avec la souche sauvage D188 de R. fascians ...... 81 Photo 8. Comparaison de l’état phénotypique des plantules de N. tabacum infectées par la souche virulente D188 traitée ou non avec la perbergine et par la souche non virulente D188-5 de R. fascians . Phénotype général des lots infectés avec : (A) la souche virulente D188, (B) la souche D188 pré-incubée avec la perbergine [D188-In], (C) la souche D188 traitée avec la perbergine au moment d’infection [D188-P] et (D) la souche non virulente D188-5 de R. fascians 7 semaines après infection. La barre d’échelle représente 5 mm...... 109 Photo 9. Chromatogramme de l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa sur plaque CCM...... 114

Figure 1. Représentation schématique du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa...... 24 Figure 2. Représentation schématique de l’organisation des deux loci fas (rouge) et att (bleu) localisés sur le plasmide linéaire pFiD188 de R. fascians . Les flèches indiquent l’orientation de chaque gène. La régulation de l’expression du locus att est assurée par le gène attR (jaune), qui est orienté dans le sens opposé à celui du locus att , tandis que celle du locus fas est assurée par le gène fasR (mauve) ( Crespi et al. 1992; Maes et al. 2001 )...... 35 Figure 3. Carte géographique montrant les zones de collecte des espèces de Dalbergia . (A) Carte de Madagascar ; (B) Carte de la Région du Menabe ; (C) Les différentes zones de collecte des pieds de Dalbergia (représentées par les cercles)...... 42 Figure 4. Représentation schématique des différentes étapes de l’étude de l’effet des extraits et du composé isolé de Dalbergia sur l’expression des gènes responsables de la production des facteurs de virulence chez R. fascians...... 48 Figure 5. Représentation schématique des extractions successives par des solvants de polarité croissante...... 51 Figure 6. Structures chimiques de la génistéine et de la daidzéine ...... 58 Figure 7. Représentation schématique des différentes étapes de criblage des extraits de Dalbergia pour l’inhibition de l’expression de gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence chez P. aeruginosa...... 67 Figure 8. Représentation schématique des différentes étapes de l’étude de l’effet des extraits et du composé actif isolé de Combretum sur le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa...... 72 Figure 9. Comparaison de l’expression du gène attH chez la souche D188::pTGGUSDV1 de R. fascians mise en culture dans différentes conditions d’induction à travers l’activité GUS. C1 : Milieu d’induction ; C2 : Milieu d’induction contenant du pyruvate ; C3 : Milieu d’induction contenant de l’histidine ; C4 : Milieu d’induction contenant de l’extrait de galles feuillées ; C5 : Milieu d’induction contenant du pyruvate et de l’histidine ; C6 : Milieu d’induction contenant du pyruvate et de l’extrait de galles feuillées...... 82 Figure 10. Comparaison de l’effet des extraits méthanoliques des plantes de N. tabacum , D. chlorocarpa, D. pervillei, D. purpurascens et de D. trichocarpa cultivées in vitro sur l’expression du gène attH chez R. fascians . La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle (COI) est marqué par le signe (*)...... 84 Figure 11. Criblage des extraits de quelques espèces de Dalbergia sur l’expression du gène attH chez R. fascians . Effets des différents extraits (A) de racines, (B) de feuilles et (C) d’écorces de D. chlorocarpa, D. pervillei, D. purpurascens et D. trichocarpa sur la croissance et l’expression du gène attH chez R. fascians ...... 85 Figure 12. Effet de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei sur l’activité de l’enzyme β-glucuronidase...... 87 Figure 13. Comparaison de l’activité des extraits dichlorométhaniques d’écorces issus de 5 pieds différents de l’espèce D. pervillei sur la croissance et l’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians ...... 87 Figure 14. Criblage des premières fractions de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei sur la croissance et l’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians ...... 89 Figure 15. Criblage des sous-fractions de la fraction F6 de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei sur la croissance et l’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians ...... 90 Figure 16. Criblage des sous-fractions de la fraction F6-6 de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei sur la croissance et l’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians ...... 90 Figure 17. Chromatogramme de la fraction F6-6-4 issue de l’extrait d’écorces de D. pervillei sur HPLC à 254 nm...... 91 Figure 18. Criblage des sous-fractions de la fraction F6-6-4 de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei sur la croissance et l’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians ...... 91 Figure 19. Chromatogramme de la fraction F6-6-4-9 de l’écore de D. pervillei sur HPLC à 254 nm...... 92 Figure 20. Spectre de masse du composé 1 isolé de l’extrait d’écorces de D. pervillei ...... 94 Figure 21. Spectre UV du composé 1 isolé de l’extrait d’écorces de D. pervillei ...... 94 Figure 22. Structure chimique du composé 1 (perbergine) isolé de l’extrait d’écorces de D. pervillei ...... 96 Figure 23. Activité de la perbergine appliquée à différentes concentrations sur la viabilité de R. fascians mise en culture dans la COI...... 97 Figure 24. Activité de la perbergine à différentes concentrations sur l’expression de attH chez R. fascians mise dans la COI...... 97 Figure 25. Activité de la perbergine à différentes concentrations (µM) sur la croissance de R. fascians ...... 98 Figure 26. Comparaison de l’activité de la génistéine, de la daidzéine et de la perbergine à 0.2 µM sur l’expression du gène attH chez R. fascians ...... 99 Figure 27. Activité de la perbergine à 0.2 µM sur l’expression des gènes attA, attH, attR et fasA chez R. fascians ...... 100 Figure 28. Activité de la perbergine à 0.2 µM sur l’expression des gènes pFi_065 , nrp5 et stk1 chez R. fascians ...... 100 Figure 29. Comparaison de l’expression in planta des gènes attH, fasA et nrp5 chez les plantules de N. tabacum et D. pervillei infectées avec R. fascians . La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle ( N. tabacum ) est marqué par le signe (*)...... 101 Figure 30. Activité de la perbergine ajoutée à des temps différents pendant la période d’incubation sur l’expression du gène attH mise en culture dans la COI...... 102 Figure 31. Evaluation de l’expression des gènes hemA et nodA chez A. caulinodans en présence ou en absence de la naringénine et de la perbergine. La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle ( hemA )est marqué par le signe (*)...... 103 Figure 32. Comparaison des phénotypes cotylédonaires de plantes de N. tabacum infectées avec R. fascians traitée ou non avec la perbergine. Développement des cotylédons des plantules de N. tabacum (A) une, (B) deux, (C) trois et (D) cinq semaines après infection par la souche D188 traitée ou non avec la perbergine à 0.2 µM et la souche non virulente D188-5 de R. fascians (a = aire cotylédonaire)...... 104 Figure 33. Comparaison des activités du méristème de plantes de N. tabacum infectées par R. fascians traitée ou non avec la perbergine. Activité du méristème de plantes de N. tabacum infectées avec la souche D188 traitée ou non avec la perbergine et la souche non virulente D188-5 de R. fascians après (A) une, (B) trois et (C) cinq semaines d’infection...... 106 Figure 34. Evolution de la formation de galles feuillées chez les plantules de N. tabacum infectées par la souche virulente D188 traitée ou non avec la perbergine et la souche non virulente D188-5 de R. fascians . La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle (D188) est marqué par le signe (*)...... 108 Figure 35. Criblage des extraits de quelques espèces de Dalbergia sur l’activité anti- quorum sensing chez P. aeruginosa . Evaluation de l’expression (A) du gène lasB et (B) du gène rhlA chez P. aeruginosa en présence ou en absence de l’extrait méthanolique d’écorces, de feuilles ou de racines de D. chlorocarpa, D. pervillei, D. purpurascens et D. trichocarpa . La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle est marqué par le signe (*)...... 111 Figure 36. Criblage des extraits bruts de D. pervillei et de D. trichocarpa sur l’activité anti-quorum sensing chez P. aeruginosa . Evaluation de l’expression (A) du gène lasB et (B) de rhlA de P. aeruginosa en présence ou en absence des extraits méthanoliques [M], dichlorométhaniques [D] ou hexaniques [H] de feuilles de D. pervillei et de D. trichocarpa ...... 112 Figure 37. Comparaison de l’activité des extraits de D. trichocarpa à différentes concentrations sur le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa . Effet des extraits hexanique et dichlorométhanique de feuilles de D. trichocarpa utilisés à différentes concentrations sur l’expression (A) du gène lasB et (B) du gène rhlA chez P. aeruginosa ...... 113 Figure 38. Criblage des fractions de l’extrait de feuilles de D. trichocarpa sur l’activité anti-quorum sensing chez P. aeruginosa . Effet des différentes fractions de l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa sur l’expression (A) du gène lasB et (B) la production de la pyocyanine chez P. aeruginosa ...... 115 Figure 39. Criblage des extraits de feuilles et d’écorces de C. albiflorum sur l’activité anti- quorum sensing chez P. aeruginosa . (A) Effet des extraits de C. albiflorum sur la production de la pyocyanine chez P. aeruginosa ; (B) Effet des extraits de C. albiflorum sur la croissance de P. aeruginosa ...... 116 Figure 40. Chromatogramme à 280 nm de la fraction Fc21 issue de l’extrait d’écorces de C. albiflorum et les différents temps de rétention de ses sous-fractions...... 117 Figure 41. Comparaison des spectres UV du composé 2 isolé de l’extrait d’écorces de C. albiflorum et de la catéchine...... 118 Figure 42. Comparaison des spectres de masse du composé 2 et de la catéchine. (A) Spectre de masse du composé 2 (Fraction Fc21-7) isolé de C. albiflorum ; (B) Spectre de masse de la catéchine...... 119 Figure 43. Structure chimique du composé 2 (catéchine) isolé de l’extrait d’écorces de C. albiflorum ...... 119 Figure 44. Activité de la catéchine à différentes concentrations sur la croissance et la production de la pyocyanine chez la souche PAO1 de P. aeruginosa ...... 120 Figure 45. Effet de la catéchine sur la viabilité de P. aeruginosa après 8 et 18 h d’incubation ...... 121 Figure 46. Activité de la catéchine sur le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa . (A) Effet de la catéchine sur la production de pyocyanine et (B) d’élastase chez P. aeruginosa ...... 122 Figure 47. Interférence de la catéchine sur la perception des homosérines lactones dans le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa . (A) Effet de la catéchine sur la production de pyocyanine avec la souche PAO1 de P. aeruginosa après ou sans l’ajout d’homosérines lactones ; (B) Effet de la catéchine sur la production de pyocyanine avec la souche mutante ∆PA3476 de P. aeruginosa après addition des homosérines lactones C4-HSL et 3-oxo-C12-HSL...... 124

LISTE DES ABREVIATIONS ET GLOSSAIRE

3-oxo-C12-HSL : N-(3-oxododécanoyl)-L-homosérine lactone. ADN : Acide désoxyribonucléique. AHL : N-acyl-homosérine lactone. AIA : acide-3-indole acétique. ARN : Acide ribonucléique. ARNm : Acide ribonucléique messager. ARNt : Acide ribonucléique de transfert. Bactéricide : Le terme bactéricide désigne une substance possédant la capacité de tuer des bactéries. Bactériémie : Présence momentanée de bactéries dans le sang circulant de l’organisme, s’accompagnant ou pas de symptômes cliniques. Bactériostatique : Le terme bactériostatique désigne l'action de certaines substances permettant de suspendre la multiplication des bactéries, ce qui aboutit au vieillissement de celles-ci et à leur mort, à condition que la dose utilisée soit suffisante. β-gal : β-D-galactosidase. C4-HSL : N-butanoyl-L-homosérine lactone. CCM : Chromatographie sur Couche Mince. CFU : Unité Formatrice de Colonie (Colony Forming Unit). CMI : Concentration minimale d’inhibition. COI : Concentration Optimale d’Induction. Cytostatique : Ce terme qualifie les substances ayant la propriété de bloquer la croissance et la multiplication cellulaires. Cytotoxique : Ce terme qualifie les substances nocives pour les cellules. DMSO : diméthylsulfoxyde. DO : Densité Optique. Facteur de virulence : Le facteur de virulence se réfère à des substances produites par un microbe et qui sont nécessaires ou qui potentialisent sa capacité à provoquer une maladie. FOFIFA/CENRADRU : Centre National de la Recherche Appliquée au Développement Rural. Gène d’intérêt : Désigne le gène codant une protéine d’intérêt. Dans cette étude, il s’agit des gènes impliqués ou non dans la production des facteurs de virulence de la bactérie. Gène rapporteur : Un gène rapporteur est un gène-témoin qui code une protéine possédant une activité connue fusionnée à des régions promotrices d’un gène d’intérêt pour étudier son expression. GUS : β-glucuronidase. HPLC : Chromatographie Liquide à Haute Performance. IDSA : Infectious Diseases Society of America. IMRA : Institut Malgache de Recherches Appliquées. Infection nosocomiale : Les infections nosocomiales – aussi appelées infections hospitalières – sont des infections acquises pendant un séjour à l’hôpital et qui n’étaient ni présentes ni en incubation au moment de l’admission du patient. Les infections survenant plus de 48 heures après l’admission sont habituellement considérées comme nosocomiales. INRA : Institut National de la Recherche Agronomique. LTTR : Régulateur transcriptionnel de type LysR. MUG : 4-méthylumbelliféryl-β-D-glucuronide. Multirésistance : La multirésistance bactérienne est la capacité des bactéries à développer des résistances vis-à-vis de différentes familles d’antibiotiques. OMS : Organisation Mondiale de la Santé. oNPG : ortho -nitrophényl-β-D-galactoside. pNPG : para -nitrophényl-β-D-glucuronide. Quorum sensing : Il s’agit d’un processus par lequel les bactéries communiquent entre elles par l’intermédiaire de molécules signal afin de coordonner un comportement (généralement l’expression de gènes) dans un environnement particulier lorsque leur population atteint un nombre suffisant (ou quorum ). RMN : Résonance Magnétique Nucléaire.

CHAPITRE I : INTRODUCTION GENERALE

Chapitre I : Introduction Générale

Depuis plusieurs millions d’années les plantes interagissent avec les microorganismes (Heckman et al. 2001; Jones et Dangl 2006; Bonfante et Anca 2009). Ces interactions sont généralement d’ordre trophique et impliquent une communication chimique spécifique entre les deux partenaires (Bonfante et Anca 2009; Newton et al. 2010). En effet, au cours des différentes étapes de l’évolution, l’autotrophie chez les plantes constitue une source d’eau et de composés carbonés et azotés (nutriments) pour les êtres vivants hétérotrophes, notamment pour les microorganismes (Bell 2007; Hartmann et al. 2009). Pour accéder à ces nutriments, les bactéries sont capables de coloniser, d’envahir et/ou d’infecter leurs plantes hôtes avec une issue très différente selon que les bactéries ont adopté des stratégies pathogènes, symbiotiques ou mutualistes (Hartmann et al. 2009; Soto et al. 2009). La capacité de gérer les interactions avec les microorganismes symbiotiques, de détecter et de monter un système de défense contre les microorganismes pathogènes est primordiale à l’évolution et au succès des plantes (Chisholm et al. 2006; Dicke et al. 2009). L’absence de cellules mobiles chez les végétaux les a obligé à mettre en place un système de défense performant, sophistiqué qui s’adapte aux différents modes de vies et de stratégies d’infections des microorganismes. Ce système de défense est assuré par chacune des cellules qui composent les différents tissus de la plante (Bais et al. 2004; Jones et Dangl 2006; Bais et al. 2008; Pieterse et al. 2009). Ces cellules communiquent entre elles par l’intermédiaire de signaux chimiques et répondent aux infections par la synthèse de molécules spécifiques. Ces composés chimiques font partie des « métabolites secondaires » (Dixon 2001; Jenke-Kodama et al. 2008; Jucker et al. 2008; Bednarek et Osbourn 2009). Les métabolites secondaires sont des molécules chimiques synthétisées par la plante en réponse à des stress physiologiques. Ils sont différents des métabolites primaires (glucides, lipides, protéines, acides aminés et acides nucléiques) car ces derniers sont impliqués directement dans les processus anabolique et catabolique qui maintiennent les cellules en vie (Bennett et Ciegler 1983). Les métabolites secondaires appartiennent à des groupes chimiques très variés allant des molécules complexes comme des protéines de défense aux molécules de faible poids moléculaire appartenant à différentes classes chimiques comme les composés phénoliques, les alcaloïdes et les terpènes (Baldwin et al. 2006; Bednarek et Osbourn 2009). La structure chimique et les fonctions de ces métabolites secondaires sont très diverses dans une même plante ou d’une plante à une autre (Bednarek et Osbourn 2009; Dicke et al. 2009). Par conséquent, il est difficile d’appliquer des conventions moléculaires pour attribuer des fonctions particulières à une molécule chez les plantes (Bednarek et Osbourn 2009). Malgré cette diversité, ces substances ont toujours été exploitées par l’Homme, initialement par

Chapitre I : Introduction Générale l’utilisation d’extraits de plantes, plus tard par des applications scientifiques pour identifier des métabolites avec des fonctions particulières et par la suite par l’exploitation de ces produits à des fins thérapeutiques (Osbourn et Lanzotti 2009). Dans le cadre de la lutte contre les bactéries pathogènes, les propriétés antimicrobiennes des métabolites secondaires ont été exploitées, depuis quelques décennies, dans la recherche de nouveaux produits naturels antibiotiques efficaces autant chez l’Homme que chez les animaux et les plantes (González-Lamothe et al. 2009; Saleem et al. 2009). Ainsi, depuis l’an 2000, plus de 300 métabolites d’origine naturelle ayant une activité antimicrobienne tels que des acides phénoliques et des polyphénols (Nikitina et al. 2007), des phénanthrènes (Okwu et Nnamdi 2011), des flavonoïdes (Cushnie et Andrew 2005) et des terpénoïdes (Inouye et al. 2001) ont été décrits. Parmi ces métabolites, une centaine possède une activité antimicrobienne in vitro à des concentrations minimales d’inhibition (CMI) comprise entre 0.02 et 10 µg/ml (Saleem et al. 2009). Les agents antimicrobiens sont souvent catégorisés selon leur mécanisme d'action principale. Ces mécanismes comprennent : (1) l'interférence avec la synthèse de la paroi cellulaire, (2) l'inhibition de la synthèse des protéines, (3) l'interférence avec la synthèse des acides nucléiques, (4) l'inhibition des voies métaboliques et (5) la rupture de la structure membranaire (Annexe 1) (Neu 1992). L’un des problèmes majeurs qui a poussé les chercheurs à travailler sur les agents antimicrobiens dérivés des produits naturels est l’émergence sans cesse croissante d’infections nosocomiales causées par des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques (Talbot et al. 2006; Boucher et al. 2009; Spellberg 2010). Ce problème de résistance est dû à l’utilisation massive d’antibiotiques dans les hôpitaux résultant en une pression de sélection importante favorisant l’émergence de souches de bactéries mutantes multi-résistantes (Andersson et Hughes 2010; Spellberg 2010). Mais il est également important de noter que l’arsenal courant des antibiotiques a été conçu sur des plateformes chimiques limitées avec peu d’innovation depuis les années 80, ce qui a laissé aux pathogènes l’opportunité non seulement de muter mais surtout de développer des mécanismes de résistance aux antibiotiques (Dennesen et al. 1998; Talbot et al. 2006; Boucher et al. 2009). La résistance des bactéries aux agents antimicrobiens se manifeste à travers une variété de mécanismes. Au-delà de la résistance naturelle, les bactéries peuvent acquérir des résistances à plusieurs classes d’agents antimicrobiens par des phénomènes de mutation ou via l'acquisition des gènes de résistances d’autres organismes (Woodford et Ellington 2007). Ces résistances acquises permettent aux bactéries de produire des enzymes qui peuvent dégrader les antibiotiques, d'exprimer des systèmes d'efflux qui empêchent les antibiotiques d'atteindre leur cible intracellulaire, de modifier la structure des

Chapitre I : Introduction Générale sites cibles des agents antimicrobiens ou de produire une voie métabolique alternative qui contourne l'activité de l'antibiotique (McManus 1997; Tenover 2006; Lin et al. 2010). Par ailleurs, au vu de la mobilité accrue des denrées alimentaires et de l’Homme, ces souches résistantes se sont propagées de par le monde beaucoup plus rapidement qu’avant (Shah 2005; Talbot et al. 2006; Saleem et al. 2009). Selon le rapport de l’IDSA (Infectious Diseases Society of America), ce problème de résistance s’aggrave chaque année car de plus en plus d’industries pharmaceutiques se retirent des recherches et du développement de nouveaux antibiotiques et s’orientent plutôt vers les domaines plus lucratifs comme le traitement des cancers (Boucher et al. 2009; Spellberg 2010). En effet, le développement d’un antibiotique demande beaucoup de temps et rarement de nouveaux médicaments atteignent le marché (Saleem et al. 2009; Spellberg 2010). Selon l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), la résistance bactérienne se classe parmi l’une des trois premières menaces pour la santé humaine (Spellberg 2010). Face au problème de résistance aux antibiotiques, il est intéressant de développer une nouvelle approche de lutte contre les bactéries multi-résistantes. La plupart des recherches menées dans le cadre des programmes de lutte contre les bactéries pathogènes sont orientées vers la recherche de composés chimiques ayant une activité antimicrobienne (cytotoxique ou cytostatique). Malgré la forte activité de ces composés, le risque de mutation vers la résistance n’est pas à exclure surtout que le cycle de vie chez les bactéries est très court et qu’elles doivent assurer leur survie. Nous supposons que si la majorité des microorganismes ne parvient pas à provoquer d’infection chez une plante donnée alors qu’ils y sont toujours présents, il est donc probable que cette dernière secrète en permanence des métabolites secondaires, autre que les antibiotiques, qui inhibent la production des facteurs de virulence de ces bactéries sans affecter leur viabilité et qui lui permettent de contrôler cette interaction. L’une des alternatives de lutte serait donc d’utiliser des composés chimiques qui diminuent ou inhibent l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence chez les bactéries pathogènes sans affecter ni leur croissance ni leur viabilité. Actuellement, cette stratégie reste encore peu exploitée. Cependant elle pourrait être intéressante comme elle ne touche pas directement la vie des bactéries et donc minimise le risque de mutation mentionné ci-dessus. Par conséquent, nous avons orienté ce travail vers la recherche de ce type de métabolites secondaires à partir de plantes qui sont utilisées dans la pharmacopée traditionnelle pour traiter les infections bactériennes. L’objectif ciblé dans le cadre de ce travail est de contribuer à la valorisation de la biodiversité malgache en identifiant des plantes présentant une capacité à inhiber la

Chapitre I : Introduction Générale production de facteurs de virulence chez une bactérie phytopathogène ( Rhodococcus fascians ) et une bactérie pathogène de l’Homme ( Pseudomonas aeruginosa ). Ces deux bactéries ont été choisies car les mécanismes qui contrôlent la transcription des gènes impliqués dans la production de leurs facteurs de virulence sont connus. Pour atteindre cet objectif, différentes espèces de plantes appartenant aux genres Dalbergia et Combretum de Madagascar ont été sélectionnées. Ces plantes ont été choisies parmi les plantes endémiques retenues par l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA) dans le cadre du programme de conservation et de valorisation de la biodiversité à Madagascar. La sélection de ces plantes parmi tant d’autres a été basée sur leur usage ethnobotanique comme anti-infectieux et par les résultats de recherches préliminaires réalisées au sein de l’Institut pour leur activité antimicrobienne. Les objectifs spécifiques concernés dans le cadre de ce travail sont les suivants : - Criblage des extraits de plantes pour leur effet sur l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence chez R. fascians et P. aeruginosa (utilisation de souches rapportrices). - Identification du ou des extraits bruts qui inhibent l’expression de certains gènes clés sans affecter ni la croissance ni la viabilité des bactéries cibles. - Fractionnements et isolement des composés actifs par différentes méthodes chromatographiques (chromatographie sur colonne, chromatographie sur couche mince, chromatographie liquide à haute performance (HPLC)) guidés par les tests d’activités biologiques reposant sur l’utilisation de souches rapportrices. - Elucidation de la structure chimique en utilisant les techniques de spectrométrie de masse (LC-MS-MS) et de résonance magnétique nucléaire (RMN). - Validation de l’activité des composés identifiés par différents tests in vitro ou in vivo reposant sur l’étude de l’expression du réseau de gènes de virulence chez chacune des bactéries sélectionnées et sur la capacité des bactéries à infecter leur hôte.

CHAPITRE II : GENERALITES

Chapitre II : Généralités

I. Généralités sur les plantes étudiées

I.1. Le genre Dalbergia

Le genre Dalbergia est représenté par plus de 250 espèces réparties dans toutes les régions tropicales (Klitgaard et Lavin 2005). Ces espèces offrent des bois de qualité (palissandre et bois de rose) qui sont très recherchés pour la fabrication d’objets d’art et en ébénisterie (Flynn et Holder 2001). A Madagascar, le genre Dalbergia est représenté par 48 espèces dont 47 sont endémiques (Bosser et Rabevohitra 2002; 2005). Les Dalbergia qui fournissent le bois de palissandre et les bois de rose de Madagascar sont représentés par 25 espèces (Bosser et Rabevohitra 2002).

I.1.1. Position systématique des Dalbergia

La position systématique du genre Dalbergia est la suivante : Règne : PLANTAE Sous-règne : TRACHEOBIONTA Division : MAGNOLIOPHYTA Classe : MAGNOLIOPSIDA Ordre : FABALES Famille : FABACEAE Sous-famille : PAPILIONIDEAE Tribu : DALBERGIEAE Genre : Dalbergia Espèces : sp. Noms vernaculaires : Manary (Ouest), Voamboana et Hazovola (Centre et Est), Palissandre, Rosewood

I.1.2. Description morphologique des Dalbergia

I.1.2.1. L’appareil végétatif

Le genre Dalbergia comprend des lianes (Photos 1A et 1B), des arbustes (Photo 1C) ou des arbres (Photo 1D) qui peuvent atteindre jusqu’à 30 m de haut. Les feuilles sont de type composées, imparipennées et alternes (Photo 2A) avec des stipules caduques. Les racines sont

Chapitre II : Généralités le plus souvent pivotantes (Bosser et Rabevohitra 2002).

A B

C D

I.1.2.2. L’appareil reproducteur

Les fleurs sont hermaphrodites de petite taille à taille moyenne (2,5 à 15 mm de long), de couleur blanche crème ou parfois mauve (Photo 2B). Elles s’organisent en des inflorescences terminales et/ou axillaires en panicule (Photo 2C), et sont rarement solitaires. Les fruits sont des gousses indéhiscentes, de taille variable et de forme ovale, elliptique, oblongue ou linéaire renfermant une ou plusieurs graines (Photo 2D). Les graines sont plus ou moins réniformes, aplaties, lisses ou ridées, de couleur généralement brunâtre à brun rougeâtre ou rougeâtre.

Chapitre II : Généralités

Les caractères morphologiques des 4 espèces de Dalbergia étudiées dans ce travail sont illustrés sur les Photos 2F, 2G, 2H et 2I.

A B C

D E F

G H I

Photo 2. Quelques photos illustrant les caractéristiques des feuilles, des fleurs et des fruits chez Dalbergia . (A) Feuilles composées alternes imparipennées de D. melanoxylon ; (B) Fleurs de D. brownei ; (C) Inflorescence en grappe de cyme chez D. lanceolaria ; (D) Fruits en gousse de D. cochinchinensis . (E) Exemples de bois de Dalbergia (F) D. trichocarpa ; (G) D. chlorocarpa ; (H) D. purpurascens ; (I) D. pervillei . Sources : A : http://www.prota4u.org/plantphotos/Dalbergia%20melanoxylon%208.jpg ; B : http://striweb.si. edu/esp/tesp /plant_pictures/i_sp1053.mx.jpg ; C : http://www.flickr.com/photos/dinesh_valke/2498936993/sizes/o/in/photost ream/ ; D : http://woodplanet.info/kra-nhourng/dalbergia-cochinchinensis-pierre.jpg. E-F : The tribe of Dalbergiaea (Bosser et Rabevohitra 2002).

I.1.3. Exploitation du bois de Dalbergia

Les bois de Dalbergia (Photo 2E) sont réputés pour leur qualité et pour leur propriété technologique et sont très recherchés et demandés sur le marché tant au niveau national qu’international et par conséquent plusieurs espèces de bois de rose et de palissandres sont menacées en raison de leur surexploitation illicite (Du Puy 1997; Bosser et Rabevohitra 2002;

Chapitre II : Généralités

2005). Entre 1998 et 2001, le volume de bois exporté est passé de quelques centaines de tonnes à plus de 30.000 tonnes (Schuurman et Lowry 2009). Suite à la crise politique à Madagascar qui a débuté en 2009, une exploitation illégale s’est mise en place conduisant à l’exportation d’environ 1187 conteneurs de palissandres (équivalent à 37.000 tonnes) d’une valeur estimée à 227.4 millions de dollars pour couvrir la demande du marché rien qu’en Chine (Ballet et al. 2010; Barrett et al. 2010; Randriamalala et Liu 2010). Tous ces facteurs, couplés à la dégradation de l’écosystème malgache dû à la déforestation et la pratique des cultures sur abattis-brûlis (Razanaka et al. 2001) conduisent à un risque d’extinction des palissandres et des bois de rose malgaches (Barrett et al. 2010). La situation actuelle des Dalbergia malgaches nécessite leur protection via une règlementation du commerce international sous le couvert de la convention sur le commerce international des espèces de faune et de flore sauvages menacées d’extinction (CITES) (Barrett et al. 2010).

I.1.4. Rappels sur quelques études scientifiques effectuées au sein du genre Dalbergia

I.1.4.1. Quelques informations ethnobotaniques sur le genre Dalbergia

À notre connaissance, peu d’études scientifiques, voire aucune, n’a été réalisée sur l’utilisation des Dalbergia de Madagascar dans le traitement des maladies. En revanche, après avoir discuté avec nos guides et quelques représentants de la population locale à l’endroit où nous avions effectué les récoltes de Dalbergia utilisés dans le cadre de ce travail, nous avons pu recueillir les informations suivantes. L’écorce verte de D. greveana et D. purpurascens pilée en pâte est utilisée pour désinfecter les blessures et pour accélérer la cicatrisation. L’infusion des feuilles de ces espèces est utilisée pour traiter différentes maladies infectieuses. L’infusion d’écorces de D. trichocarpa est utilisée pour traiter la diarrhée mais également pour apaiser les douleurs intestinales. Les feuilles sont également utilisées pour traiter des infections intestinales et éliminer les vers intestinaux. La décoction d’écorces et de feuilles de D. chlorocarpa est utilisée pour traiter les gonorrhées. La mastication des feuilles de D. pervillei supprime les maux de tête et les maux de dents. La décoction d’écorces de cette espèce est utilisée pour désinfecter des blessures. Après l’accouchement, l’infusion d’écorces verte de D. pervillei aide le corps de la femme à se rétablir très vite.

Chapitre II : Généralités

I.1.4.2. Etudes pharmacologiques réalisées sur le genre Dalbergia

Plusieurs études pharmacologiques ont été réalisées sur le genre Dalbergia . La majorité de ces activités sont dues à des flavonoïdes. A titre d’exemple, les 4 flavonoïdes, ( R)-4"- méthoxydalbergione, obtusafurane, 7,4‘-dihydroxy-3‘-méthoxyisoflavone et isoliquiritigenine, isolés de l’extrait de bois de l’espèce endémique de Madagascar D. louvelii présentent des activités antiplasmodiques avec des valeurs IC 50 variant de 5.8 à 8.7 µM (Beldjoudi et al. 2003). Parmi les 25 composés chimiques identifiés chez D. odorifera , la ( S)- 4-méthoxydalbergione et la cearoine ont montré à la fois des activités anti-allergiques et anti- inflammatoires intéressantes tandis que la butéine, la koparine, la bowdichione, la 3 ′-O- méthylviolanone et la xénognosine B ont montré uniquement une activité anti-inflammatoire significative (Chan et al. 1998). A partir des extraits éthanoliques des deux espèces D. cultrate et D. nigrescens , cinq cinnamylphénols ont été isolés, à savoir : les dalbératines A et B à partir de D. cultrate et les dalbératines C, D et E à partir de D. nigrescens (Ito et al. 2003a). Ces composés inhibent l’activation précoce de l’antigène du virus Epistein-Barr induit par le 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate chez les cellules Raji, les qualifiant comme agents potentiels de chimio-prévention du cancer (Ito et al. 2003a).

I.1.4.3. Propriétés antimicrobiennes du genre Dalbergia

a. Activité antimicrobienne d’extraits de plantes

Plusieurs études ont décrit une activité antimicrobienne de certains extraits bruts de Dalbergia . L’extrait éthanolique d’écorces de D. saxatilis présente une activité antimicrobienne contre Staphylococcus aureus , Bacillus subtilis , Escherichia coli et P. aeruginosa respectivement à des concentrations minimales d’inhibition (CMI) de 250, 125, 1000 et 1000 µg/ml tandis que les feuilles présentent uniquement une activité contre S. aureus à une CMI de 1000 µg/ml (Okwute et al. 2009). Il a été rapporté qu’une préparation contenant de la poudre de D. sissoo possède une activité potentielle contre S. aureus, Streptococcus pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa et Klebsiella pneumoniae (Yadav et al. 2008). L’extrait d’écorces de D. melanoxylon a montré une activité antibactérienne significative contre les bactéries à Gram négatif ( E. coli , P. aeruginosa , Salmonella typhimurium et Yersinia pestis ) et les bactéries à Gram positif ( B. subtilis , Klebsiella pneumoniae et S. aureus ). Une activité antifongique a également été rapportée contre Candida albicans et Aspergillus niger avec le même extrait (Gundidza et Gaza 1993). L’extrait méthanolique de la racine de D. spinosa

Chapitre II : Généralités présente également une activité antibactérienne très intéressante (Senthamarai et al. 2003).

b. Activité antimicrobienne des composés isolés

Les composés chimiques responsables de l’activité des extraits bruts des différents organes et espèces de Dalbergia qui ont été identifiés sont peu nombreux. A titre d’exemple, le flavanone pinocembrine, l’isoflavone dalparvone et le dérivé cinnamyl dalparvinène isolés de l’extrait éthanolique de la tige de D. parviflora présentent des activités contre Mycobacterium tuberculosis à des concentrations minimales d’inhibition (CMI) respectivement de 12.5, 25 et 50 µg/ml (Songsiang et al. 2009). Deux isoflavanones prénylés, le 5,5'-dihydroxy-3',4'-methylenedioxy-5''-prenyl-6'',6''-dimethyl-dihydropyrano-(2'',3'',7,8)- isoflavanone connu sous le nom de dalhorridine (I) et le 5,7 5'-trihydroxy-3',4'- methylenedioxy-8-[5-methyl-2-(2-hydroxyisopropyl)-1,4-hexadienyl]-isoflavanone connu sous le nom de dalhorridine (II) ainsi que deux isoflavones, le 3-(3,4-diméthoxyphényl)-5,7- dihydroxy-6-méthoxychromen-4-one connu sous le nom de dalspinosine et le 3-(1,3- benzodioxol-5-yl)-5,7-dihydroxy-6-méthoxychromen-4-one connu sous le nom de dalspinine, ont été rapportés pour leur activité antimicrobienne. Ces composés ont été isolés à partir de l’extrait méthanolique de la racine de l’espèce D. horrida (Narayanan et al. 2007).

I.1.4.4. Les études phytochimiques réalisées sur le genre Dalbergia

Comme toutes les plantes appartenant à la sous-famille des Papilionideae, l’une des particularités du genre Dalbergia est sa richesse en isoflavonoïdes (Veitch 2007; 2009). Plusieurs structures d’isoflavonoïdes ont été décrites pour la première fois au sein du genre. A titre d’exemples, les isoflavonoïdes khrinones A, B, C, D et E, l’isodarparvinol B, la dalparvine et le (3 S)-sativanone ont été isolés à partir du bois de D. parviflora (Umehara et al. 2009). Les deux isoflavonoïdes prénylés olibergine A et olibergine B ont été isolés de l’extrait éthanolique d’écorces de D. olivari (Ito et al. 2003b) et le dérivé 8-géranyl du 5-hydroxy-7,4’- diméthoxyisoflavone à partir de D. lanceolata (Khalivulla et al. 2007). Chez l’espèce malgache D. louvelii , 4 molécules, à savoir le 1-(3-hydroxyphényl)-3-(4-hydroxy-2,5- diméthoxyphényl)-propane, la spirolouvéline, le (3R)-7,2`-dihydroxy-4`,5`- diméthoxyisoflavanone et le 3-(2,4-dihydroxy-5-méthoxy) phényl-7-hydroxycoumarine, ont été isolés à partir du bois (Beldjoudi et al. 2003). Par ailleurs, plusieurs composés connus appartenant à différentes classes chimiques ont été également isolés et identifiés chez les espèces du genre Dalbergia . A titre d’exemple, les

Chapitre II : Généralités composés phénoliques candenaténines A, B, C, D, E et F ont été isolés à partir de l’extrait dichlorométhane du bois de D. candenatensis (Cheenpracha et al. 2009). Deux sesquiterpènes ayant une activité antiplaquettaire (empêchant la formation de caillots sanguins) à savoir le (3S,6R,7R)-3,7,11-triméthyl-3,6-époxy-1,10-dodécadien-7-ol et le (3S,6S,7R)-3,7,11- triméthyl-3,6-époxy-1,10-dodécadien-7-ol, ont été identifiés dans l’huile essentielle du bois de D. odorifera (Tao et Wang 2009). Le premier alcaloïde identifié au sein de la tribu des Dalbergieae , la quinolizidine, a été isolé de l’espèce D. monetaria (Kinghorn et al. 1982). Deux furanes, à savoir le parvifurane (5-hydroxy-6-méthoxy-3-méthyl-2-phénylbenzofurane) et l’isoparvifurane (5-hydroxy-6-méthoxy-2-méthyl-3-phénylbenzofurane) isolés à partir de D. parviflora , sont les premières molécules de cette classe décrites chez le genre Dalbergia (Muangnoicharoen et Frahm 1981).

I.2. Le genre Combretum

La famille des Combretaceae est représentée par 20 genres dans le monde et est largement distribuée dans la région tropicale et subtropicale (Eloff et al. 2008). Les genres les plus larges sont Combretum , Terminalia et Quisqualis (Eloff et al. 2008). Le genre Combretum est représenté par environ 370 espèces et se trouve majoritairement en Afrique (McGaw et al. 2001) . A Madagascar, le genre est actuellement représenté par 20 espèces dont 19 sont endémiques après la reclassification de quelques espèces des genres Poivrea et Calopyxis (Jonkind 1995).

I.2.1. Position systématique

La position systématique du genre Combretum est la suivante :

Règne : PLANTAE Sous-règne : TRACHEOBIONTA Division : MAGNOLIOPHYTA Classe : MAGNOLIOPSIDA Ordre : MYRTALES Famille : COMBRETACEAE Genre : Combretum Espèces : sp Noms vernaculaires : Tamenaka

Chapitre II : Généralités

I.2.2. Description morphologique

I.2.2.1. Appareil végétatif

Le genre Combretum comprend des arbres (Photo 3A), des arbustes ou des lianes. Les feuilles sont simples, polymorphes, alternes ou opposées (Photo 3B). Les racines sont généralement pivotantes.

A B

C D

Photo 3. Quelques exemples de photos illustrant les caractères morphologiques des appareils végétatifs et reproducteurs chez Combretum . (A) Photo de C. erythrophyllum ; (B) Feuilles simples opposées chez C. quadrangulare ; (C) Inflorescence axillaire en épis chez C. fruticosum ; (D) Caractéristique des fruits chez C. laxum . Sources : A : http://lifestyleseeds.co.za/usd/product_info.php?products_id=91&osCsid=86cbb9b ce9c3e caef5c79e178cf0bfba ; B : http://www.flickr.com/photos/phuonglovejesus2782010/5007669375/ sizes/l/in/photostream/ ; C : http://www.flickr.com/photos/kadai/25975 22346/sizes/o/in/photostream ; D : http://www.discoverlife.org/mp/20q?search=Combretum+laxum.

Chapitre II : Généralités

I.2.2.2. Appareil reproducteur

Les fleurs sont hermaphrodites, tétramériques ou pentamèriques de couleur jaune, blanche ou rouge. Elles sont de petite taille et groupées en inflorescence soit terminales ou axillaires en épis (Photo 3C) soit en racème ou panicules. L’inflorescence mesure entre 3 à 10 cm. Les fruits sont des samares, c’est-à-dire sec et indéhiscent, constitués de 4 à 5 ailes (Photo 3D).

I.2.3. Rappel sur quelques études scientifiques effectuées au sein du genre Combretum

I.2.3.1. Informations ethnobotaniques sur le genre Combretum

Plusieurs espèces appartenant à la famille des Combretaceae sont utilisées dans le domaine médical dans le monde (Eloff et al. 2008). En Afrique, plusieurs espèces du genre Combretum sont utilisées dans la pharmacopée traditionnelle pour traiter plusieurs maladies y compris les maladies du ventre, les maladies du dos, les infections bactériennes, les cancers, la diarrhée, la constipation, la fièvre, les maladies du cœur, l’ulcère gastrique, la toux, l’hypertension, la tuberculose, la jaunisse, etc. (Ake Assi et Guinko 1991; Eloff et al. 2008). En Afrique de l’Est, l’espèce C. micranthum est largement utilisée comme diurétique, fébrifuge et pour sa capacité à améliorer la digestion (Eloff et al. 2008). Les feuilles sont également utilisées pour traiter l’insuffisance hépatique, l’hépatite et la constipation (Eloff et al. 2008). L’espèce C. micranthum fait partie des 50 plus importantes espèces de plantes médicinales sélectionnée par l’African Medicinal Plants Standards Association (AAMPS) (Eloff et al. 2008). A Madagascar, le genre Combretum est utilisé dans la pharmacopée traditionnelle pour traiter différentes maladies. Les graines, connues sous le nom de Voatamenaka , sont utilisées comme vermifuge. La décoction des feuilles est employée comme diurétique, mais aussi pour traiter les calculs rénaux, la jaunisse et la cirrhose.

I.2.3.2. Etudes pharmacologiques réalisées sur le genre Combretum

Plusieurs études ont été menées sur l’exploitation des propriétés médicinales du genre Combretum . A titre d’exemple, l’extrait méthanolique de feuilles de C. micranthum a été étudié pour son activité anti-inflammatoire sur l’œdème induit par la carragénine au niveau des pattes chez les rats et sur la perméabilité vasculaire induite par l’acide acétique chez les

Chapitre II : Généralités souris (Olajide et al. 2003). Les résultats ont montré que l’extrait utilisé à 50 et 100 mg/kg inhibe significativement ( p<0.05) l’induction de l’œdème par la carragénine chez le rat et l’extrait à 100 mg/kg inhibe l’accroissement de la perméabilité vasculaire induite par l’acide acétique chez les souris (Olajide et al. 2003). Plusieurs molécules antinéoplasiques, anticancéreuses, appartenant au groupe des combretastatines ont été également rapportées chez l’espèce C. caffrum (Pettit et al. 1988; Elzayat et al. 1993). Parmi les produits naturels anticancéreux connus, la combretastatine A4 inhibe la polymérisation de la tubuline et montre la plus forte activité inhibitrice de la croissance des cellules tumorales (Dorr et al. 1996). La propriété vermifuge de quelques espèces de Combretum a été également rapportée sur les schistosomules de l’espèce Schistosoma haeomatobium qui sont responsables de la bilharziose (McGaw et al. 2001). Les extraits aqueux de C. imberbe , C. kraussii et C. nelsonii sont actifs à la concentration minimale d’inhibition (CMI) de 12 mg/ml tandis que les espèces C. molle , C. paniculatum et C. petreophilum le sont à 25 mg/ml (McGaw et al. 2001). Des propriétés antioxydantes ont également été attribuées à quelques espèces de Combretum . Le composé antioxydant majeur isolé de C. woodii , la combretastatine B5, possède une activité antioxydante huit fois plus élevée que celle de la vitamine E (Eloff et al. 2008).

I.2.3.3. Activité antimicrobienne du genre Combretum

Plusieurs utilisations des Combretaceae sont orientées vers leurs activités anti- infectieuses y compris les activités antimicrobienne, antifongique et antiparasitique (Eloff et al. 2008).

a. Activité antimicrobienne des extraits bruts

Le screening phytochimique de quelques espèces de Combretum révèle que ces plantes sont très riches en tanins, ce qui pourrait expliquer leur activité antimicrobienne (Elegami et al. 2002). Lors d’une étude menée sur l’activité antimicrobienne des feuilles de 27 espèces de Combretaceae comprenant les genres Combretum , Terminalia , Pteleopsis et Quisqualis par Eloff et ses collaborateurs (1999), différents degrés d’activité ont été observés sur des bactéries telles que S. aureus , Enterococcus faecalis , E. coli et P. aeruginosa ,. En effet, bien que les extraits de toutes les espèces inhibent la croissance de ces bactéries, avec des valeurs de CMI comprises entre 0,1 à 6 mg/ml et une valeur moyenne de 2.01 mg/ml, les plus fortes activités ont été obtenues avec les espèces du genre Combretum (Eloff 1999). Les espèces C. molle , C. petrophilum , C. moggii , C. erytrophyllum , C. padoides , C. paniculatum et

Chapitre II : Généralités

C. mossambicense présentent les plus fortes activités antimicrobiennes (Eloff 1999). Les différents extraits de feuilles de C. woodii obtenus par extraction avec des solvants différents ont tous montré des activités sur S. aureus , E. faecalis , E. coli et P. aeruginosa (Eloff et al. 2005a).

b. Activité antimicrobienne des molécules isolées

Quelques molécules réparties dans différentes classes chimiques et isolées et décrites chez Combretum sont connues pour leur propriété antimicrobienne. La combretastatine B5 isolée de l’extrait acétone de feuilles de C. woodii a montré une activité antibactérienne significative contre S. aureus avec une CMI de 16 µg/ml et contre P. aeruginosa et Enterococcus faecalis avec une CMI de 126 µg/ml et une légère activité sur E. coli (Eloff et al. 2005b). Le dosage de la combretastatine B5 dans les feuilles a montré des valeurs entre 5- 10 mg/g de poudre de feuilles (Eloff et al. 2005b). Chez C. imberbe , une espèce très utilisée dans la pharmacopée traditionnelle en Afrique pour traiter des infections bactériennes, cinq triterpènes, à savoir l’acide 1 α,3 β-dihydroxy-12-oléanèn-29-oïque, l’acide 1-hydroxy-12- oléan-30-oïque , le 3,30-dihydroxyl-12-oléanen-22-one , l’acide 1,3,24-trihydroxyl-12-oléan- 29-oïque et l’acide-3β-O-2,4-di-acétyl-L-rhamnopyranoside 1 α,23-dihydroxy-12-oléanèn-29- oïque, ont été isolés puis rapportés pour leur activité antibactérienne contre S. aureus et E. coli avec des CMI modérées à fortes, le premier et le dernier composés étant les plus actifs (Angeh et al. 2007a). Chez l’espèce C. erythrophyllum , 7 flavonoïdes ayant des propriétés antibactériennes ont été isolés de l’extrait de feuilles, à savoir l’apigénine, la genkwanine, la rhamnasine, la rhamnocitrine, le kaempférol, le 5-hydroxy-7,4’-diméthoxyflavone et la quercétine-5,3’-diméthyléther (Martini et al. 2004). Ces composés ont montré des activités intéressantes contre Vibrio cholerae et E. faecalis avec des CMI comprises entre 25 à 50 µg/ml (Martini et al. 2004). La rhamnocitrine et la quercétine-5,3’-diméthyléther inhibent la croissance de Micrococcus luteus et de Shigella sonei à 25 µg/ml (Martini et al. 2004). Le triterpénoïde glycoside de type oléanène identifié comme l’acide 1 α-23-β-dihydroxy-12- oléanèn-29-oique-23-β-O-α-4-acétylrhamnopyranoside, a été isolé à partir de l’extrait dichlorométhanique des feuilles de C. padoides et possède une activité antibactérienne contre S. aureus (Angeh et al. 2007a; Angeh et al. 2007b).

I.2.3.4. Les études phytochimiques réalisées sur le genre Combretum

La famille des Combretaceae est une source d’un large spectre de composés chimiques

Chapitre II : Généralités tels que les tanins, les flavonoïdes, les terpénoïdes, les alcaloïdes et les stilbénoïdes phénols (Eloff et al. 2008; Sini et al. 2008). Le screening de l’extrait aqueux des racines de C. sericeum a montré la présence d’anthocyanes, de flavonoïdes, de tanins, de stéroïdes et d’alcaloïdes (Sini et al. 2008). Les stilbénoïdes phénols ont généré un immense intérêt dans la famille des Combretaceae à cause de leur potentiel thérapeutique (Pettit et al. 1987; Eloff et al. 2005b). A titre d’exemple, les deux molécules cis-stilbènes, combretastatines A1 et B1, ont été isolées pour la première fois chez le genre C. caffrum (Pettit et al. 1987). Ces molécules sont connues pour leurs propriétés antinéoplasiques ou anticancéreuses (Pettit et al. 1987). Des polyphénols comme les cyclobutanes et les chalcones dimères ont été isolés à partir de l’extrait dichlorométhanique de la partie aérienne de C. apiculatum et C. albopunctatum (Katerere et al. 2004). Plusieurs terpénoïdes ont été également rapporté chez le genre Combretum entre autre le triterpène saponine de type oléanane β-D- glucopyranosyl 2-α,3-β,6-β-trihydroxy-23-galloyloléan-12-en-28-oate qui a été isolé de l’extrait acide acétique et n-butanol d’écorces de C. molle (Ponou et al. 2008). Cette molécule possède une activité anti-inflammatoire (Ponou et al. 2008). Par ailleurs, quelques alcaloïdes ont également été isolés de Combretum tels que la 4-hydroxyproline bétaïne et les combrétacines ont été isolées des feuilles et des écorces de C. micranthum (Ogan 1972; Bassene et al. 1986).

II. Généralités sur les bactéries étudiées

II.1. Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène capable de causer de sérieuses infections tant chez les mammifères (Tan et al. 1999; Jander et al. 2000) que chez les insectes (Jander et al. 2000), les nématodes (Mahajan-Miklos et al. 1999) et les plantes (Rahme et al. 1995; Silo-Suh et al. 2002). Chez l’Homme, la bactérie est reconnue comme un pathogène émergent opportuniste capable de provoquer de nombreuses pathologies notamment chez les patients dont le système immunitaire est affaibli (c'est-à-dire les patients atteints de diabète, de fibrose cystique, du SIDA, de cancer ainsi que les patients sous ventilation mécanique) (Driscoll et al. 2007). La bactérie est responsable de plusieurs maladies nosocomiales telles que la pneumonie, l’infection des voies urinaires, la bactériémie, l’infection du site opératoire (Cross et al. 1983). Dans les unités de soins intensifs, le taux d’infection nosocomiale par P. aeruginosa s’élève de 13.2 à 22.6 % (Driscoll et al. 2007). Parmi les cas de bactériémies

Chapitre II : Généralités nosocomiales dues à des bactéries à Gram négatif, P. aeruginosa est la troisième bactérie la plus souvent isolée (Diekema et al. 1999; Peleg et Hooper 2010; Cabrera et al. 2011). Selon le rapport du « National Nosocomial Infections Surveillance », la bactérie se trouve en seconde position comme responsable de pneumonies nosocomiales après Staphylococcus aureus (NNIS 2003) et le taux de mortalité due aux pneumonies à P. aeruginosa peut varier de 24 à 76 % (Fagon et al. 1996; Antonicelli et al. 2010).

II.1.1. Position systématique de P. aeruginosa

Historiquement, la bactérie a été connue sous différentes appellations telles que Bacterium aeruginosum par Schroeter en 1872, Micrococcus pyocyaneus par Zopf en 1884, Bacillus aeruginosus par Trevisan en 1885, Bacillus pyocyaneus par Flugge en 1886, Pseudomonas pyocyanea par Migula 1895, Bacterium pyocyaneum par Lehmann et Neumann en 1896 avant sa dénomination actuelle Pseudomonas aeruginosa proposée par Migula en 1900 (Krieg et Holt 2001). Actuellement la position systématique de la bactérie est la suivante : Règne : BACTERIA Phylum : PROTEOBACTERIA Classe : GAMMAPROTEOBACTERIA Ordre : PSEUDOMONADALES Famille : PSEUDOMONADACEAE Genre : Pseudomonas Espèce : aeruginosa

II.1.2. Description, structure et identification

P. aeruginosa est une bactérie aérobie à Gram négatif appartenant à la famille des Pseudomonadaceae. La bactérie se présente sous forme de bacilles de 0.5 à 0.8 µM de diamètre et de 1.5 à 3.0 µM de longueur. Elle est très mobile, grâce à sa ciliature monotriche, et apparait isolée ou en diplobacille (Krieg et Holt 2001). Il existe trois types de colonies chez P. aeruginosa. Il s’agit pour le premier de petites colonies, rugueuses et convexes, le deuxième est caractérisé par de colonies larges, lisses et bombées au centre (ayant l’apparence d’un œuf sur le plat) et le troisième par des colonies mucoïdes, bombées, opaques, visqueuses et parfois coulantes (Krieg et Holt 2001). Le premier type de colonies est généralement isolé du sol et de l’eau tandis que les deux derniers sont généralement isolés des échantillons 19

Chapitre II : Généralités cliniques (Kirisits et al. 2005). Lorsque Carle Gessard (1882) a isolé la bactérie responsable de la coloration bleu-vert sur les pansements de patients blessés, celle-ci fut identifiée comme étant P. aeruginosa . Ce composé bleu-vert fut identifié comme étant la pyocyanine (Schoental 1941). La production de la pyocyanine est devenue un des outils permettant de distinguer P. aeruginosa des autres espèces de Pseudomonas ainsi que des autres bactéries car elle est la seule bactérie à Gram négatif capable de produire une quantité considérable de pyocyanine (Haynes 1951; Reyes et al. 1981). D’autres pigments comme la pyoverdine (jaune vert), la pyomélanine (brun noir), la pyorubine (rouge) et la fluorescéine sont également produits par P. aeruginosa (Reyes et al. 1981). La température optimale de croissance de la bactérie se trouve entre 30 et 37°C et elle est capable de se multiplier à 42°C, température à laquelle la croissance de certaines de ses relatives comme P. putida et P. fluorescens est impossible (Reyes et al. 1981). Les images sur la Photo 4 montrent la caractéristique générale de la colonie de P. aeruginosa ainsi que leur structure morphologique. A B

Photo 4. Structure morphologique et caractéristique de la colonie de P. aeruginosa . (A) Caractéristique de la colonie de P. aeruginosa mise en culture dans un milieu solidifié ; (B) Vue microscopique de la forme en bacille chez P. aeruginosa . Sources : A : Présent travail ; B : http://www.visualsunlimited.com/image /I0000a7snGnaUiyk.

II.1.3. La pathogénicité de P. aeruginosa

P. aeruginosa produit un arsenal conséquent de facteurs de virulence pour faciliter sa survie dans son environnement. Ces facteurs de virulence peuvent être classés en deux groupes à savoir les facteurs de virulence cellulaires et les facteurs de virulence extracellulaires appelés également facteurs de virulence secrétés (Van Delden et Iglewski 1998; Bentzmann et al. 2000; Choy et al. 2008).

Chapitre II : Généralités

II.1.3.1. Les facteurs de virulence cellulaires

Il s’agit des facteurs de virulence qui sont associés à la paroi bactérienne et principalement impliqués dans l’adhésion et la motilité cellulaire (Feldman et al. 1998; Van Delden et Iglewski 1998; Choy et al. 2008). En effet, l’adhésion des bactéries aux cellules hôtes est la première étape du processus d’infection (Gilboa-Garber 1996). Les adhésines qui participent à cette phase sont considérées comme des facteurs de virulence car elles sont capables d’interférer avec le système immunitaire, de participer à l’introduction des molécules toxiques dans la cellule hôte et de favoriser l’invasion bactérienne (Wu et al. 2003). Parmi ces facteurs de virulence, on peut également citer le flagelle et les pili, ainsi que les lipopolysaccharides [LPS] et les exopolysaccharides [EPS] (Cryz et al. 1984; Van Delden et Iglewski 1998). Les LPS sont des composés complexes liés à la paroi externe de la bactérie. Ce sont des endotoxines constitués de Lipide A, d’un noyau oligosaccharide et d’une fraction polysaccharidique appelée O-antigène (Raetz et Whitfield 2002). Les EPS sont des polymères composés d’une longue chaine de glucides constitué de plusieurs sucres simples liés à la membrane cellulaire qui participent à la viscosité et à l’adhésion de la membrane bactérienne sur une surface solide (Myszka et Czaczyk 2009).

II.1.3.2. Les facteurs de virulence secrétés

Il s’agit de produits extracellulaires secrétés par P. aeruginosa et provoquant des lésions cellulaires et tissulaires chez l’hôte infecté (Hamood et al. 1996; Bentzmann et al. 2000). Ils interviennent également dans la dissémination des bactéries et dans l’atténuation des défenses de l’hôte (Hamood et al. 1996). Parmi ces facteurs de virulence, on peut citer entre autres les lectines solubles ( lecA et lecB ), l’exotoxine A ( exoA ), les protéases ( aprA ), les élastases ( lasA et lasB ), les rhamnolipides ( rhlA et rhlB ), les phénazines (dont la pyocyanine et la pyoverdine).

a. Les lectines solubles ( lecA et lecB )

Il s’agit de protéines qui jouent le rôle d’adhésine et impliquées dans la formation et la stabilisation des biofilms (Diggle et al. 2006). La lectine LecA facilite la formation des agrégats ou de colonies bactériennes par l’intermédiaire des dérivés galactoses présent sur les LPS. La lectine LecB inhibe le battement des cellules pulmonaires (Chemani et al. 2009).

Chapitre II : Généralités

b. L’exotoxine A ( exoA)

Il s’agit de la protéine la plus toxique produite par P. aeruginosa (Wolf et Elsasser- Beile 2009). Cette toxine est capable d’inhiber la synthèse des protéines par ADP-ribosylation du facteur d’élongation cellulaire perturbant ainsi la synthèse des protéines entraînant in fine la mort des cellules par nécrose (Wolf et Elsasser-Beile 2009; Park et al. 2010).

c. Les protéases

P. aeruginosa secrète un certain nombre de protéases qui contribuent à sa virulence (Malloy et al. 2005). La protéase alcaline ( aprA ), l’élastase A ( lasA ), l’élastase B ( lasB ) et la protéase IV sont les protéases les plus importantes connues dans la pathogénicité de P. aeruginosa (Kida et al. 2008). La protéase AprA et l’élastase LasB présentent un certain nombre d’activités similaires comme la dégradation des éléments du système immunitaire tels que les composants du complément (C1q et C3), l’immunoglobuline A ainsi que l’interféron gamma et le facteur alpha de nécrose tumorale de l’hôte (Thibodeaux et al. 2007). Les élastases LasA et LasB sont responsables de la dégradation de l’élastine, un des composants majeurs de l’épithélium respiratoire, conduisant à la perméabilisation de l’épithélium facilitant l’action des autres facteurs de virulence tels que les LPS (Toder et al. 1994; Azghani et al. 2000; Kida et al. 2008). L’élastase LasA joue également un rôle important dans la maladie du poumon et de la cornée chez l’Homme (Coin et al. 1997; Preston et al. 1997).

d. Les rhamnolipides ( rhlA et rhlB )

Les rhamnolipides sont des glycolipides extracellulaires issus de l’expression des gènes rhlA et rhlB . Ils jouent un rôle de biosurfactant de type amphiphile et peuvent émulsifier les phosphates membranaires. Ils participent également à la structuration du biofilm, notamment dans la croissance des microcolonies et le détachement des bactéries du biofilm (Soberon- Chavez et al. 2005).

e. Les phénazines

Il s’agit de pigments ayant des propriétés antibiotiques secrétés par P. aeruginosa dans son environnement pour contrôler les autres organismes compétiteurs (Dietrich et al. 2006). Les phénazines les plus connues sont la pyocyanine et la pyoverdine.

Chapitre II : Généralités

e.1. La pyocyanine

La pyocyanine est une molécule zwittérionique de couleur bleue secrétée par la bactérie qui pénètre facilement au travers des membranes biologiques. Elle est secrétée par P. aeruginosa pour éliminer les microorganismes concurrents dans son environnement grâce à sa propriété antibiotique (Ran et al. 2003; Dietrich et al. 2006). En effet, la cytotoxicité de la pyocyanine est liée à son cycle rédox-actif et à sa capacité de produire des espèces réactives de l’oxygène connues sous le nom de ROS (Reactive Oxygen Species) qui tuent les cellules eucaryotes et procaryotes (Hassett et al. 1992; Ahmad et al. 2011). Par ailleurs, elle est impliquée dans de nombreux mécanismes de pathogénicité comme l’inhibition de la libération de prostacyclines par les cellules endothéliales et l’induction d’une apotose des neutrophiles polynucléaires via les radicaux libres (Usher et al. 2002; Allen et al. 2005). Elle contribue également à l’habilité de la bactérie à persister dans le poumon des patients atteints par la fibrose cystique (Ran et al. 2003; Lau et al. 2004).

e.2. La pyoverdine

La pyoverdine est un sidérophore du fer et joue plusieurs rôles dans la virulence de P. aeruginosa notamment dans la formation de biofilm à travers des mécanismes qui impliquent des interactions complexes de sous-populations de la bactérie (Yang et al. 2009). Elle participe également à la régulation d’autres facteurs de virulence comme l’exotoxine A et entre en compétition avec la protéine humaine transferrine pour accumuler le fer car ce dernier est important dans la virulence de la bactérie (Meyer et al. 1996).

II.1.4. Régulation de l’expression des gènes de virulence chez P. aeruginosa

La régulation de l’expression des gènes de virulence chez P. aeruginosa est sous le contrôle du mécanisme du quorum sensing .

II.1.4.1. Définition et principes du quorum sensing

a. Définition

Le quorum sensing est un processus par lequel les bactéries communiquent entre elles par l’intermédiaire de molécules signal afin de coordonner un comportement (généralement l’expression de gènes) dans un environnement particulier lorsque leur population atteint un nombre suffisant (ou quorum ) (Miller et Bassler 2001; Waters et Bassler 2005; Decho et al.

Chapitre II : Généralités

2010; Dickschat 2010).

b. Principe

Le mécanisme du quorum sensing repose sur la synthèse de petites molécules signal autoinductrices, comme les N-acyl-homosérines lactones (AHLs), qui diffusent de façon continue vers l’intérieur et l’extérieur des cellules bactériennes (Waters et Bassler 2005; Williams et Camara 2009; Dickschat 2010). Le terme « auto-inductrice » est attribué à ces molécules signal car ces dernières induisent leur propre production (Miller et Bassler 2001; Dickschat 2010). La concentration de ces AHLs augmente avec la concentration bactérienne dans une niche particulière (Williams et Camara 2009). Lorsque le seuil de concentration critique est atteint, ceci indique que la population bactérienne est prête pour la coordination de comportements particuliers (Miller et Bassler 2001; Decho et al. 2010).

II.1.4.2. Mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa

GacA VfR RsmA QscR RpoS RsaL VqsR rhlR lasR rsaL lasI rhlI Gènes régulants

LasI RhlI LasR RhlR O O O O N H O O O N O H O O 3-oxo-C12-HSL N O H O N O H LasR O RhlR C4-HSL

pqsA pqsB pqsC pqsD pqsE phnA phnB pqsR Gènes régulants

PqsABCD pqsH PqsR O

O OH N O H N PqsH OH H O HHQ PqsR

N N H PqsR H PQS

exoA lasA xcpR lasB aprA rhlAB phz Gènes régulés

Exotoxine LasA Xcp Élastase Protéase Rhamnolipides Pyocyanine Autres machinerie LasB gènes

Figure 1. Représentation schématique du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa. 24

Chapitre II : Généralités

Le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa est constitué d’un réseau très large et complexe influençant, positivement et négativement, la transcription d’environ 5 à 10 % du génome de P. aeruginosa (Wagner et al. 2003; Wagner et al. 2007). Le schéma représentant le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa est résumé dans la Figure 1. La transcription de la plupart des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence chez P. aeruginosa est sous le contrôle de trois systèmes du quorum sensing à savoir le système las , le système rhl , qui emploient tous deux des molécules signal appartenant à la famille des N-acyl-homosérinelactones (AHL), et le système PQS qui utilise des molécules de la classe des 2-alkyl-4-quinolones comme molécules signal (Pesci et al. 1997; Pesci et al. 1999; Dekimpe et Deziel 2009; Williams et Camara 2009; Heeb et al. 2010).

a. Le système las

Ce système est le premier à avoir été décrit et comprend le gène lasR et le gène lasI (Gambello et Iglewski 1991; Pesci et al. 1997). Le gène lasR code la protéine régulatrice LasR, qui appartient à la famille du régulateur transcriptionnel LuxR (Subramoni et Venturi 2009). Le gène lasI code une enzyme synthétase LasI, nécessaire à la synthèse de la N-(3- oxododécanoyl)-L-homosérine lactone (ou 3-oxo-C12-HSL) (Duan et Surette 2007; Steindler et al. 2009). L’expression du gène lasR est régulée par le gène vfr (régulateur de facteur de virulence) et le gène qui code l’activateur global GacA et cette expression augmente avec la densité bactérienne et induit la formation de la protéine LasR (Albus et al. 1997; Reimmann et al. 1997). D’autre part, l’expression de lasI est régulée par un autre gène qui code une protéine régulatrice appartenant à la famille des LuxR, qui est vqsR (Juhas et al. 2004). En effet, son inactivation supprime la production de 3-oxo-C12-HSL indiquant son importance dans la transcription de lasI (Juhas et al. 2004; Li et al. 2007). Par la suite, le complexe LasR/3-oxo-C12-HSL se forme et active également l’expression du gène lasI d’où l’installation d’une boucle de rétroaction positive du complexe LasR/LasI (Steindler et al. 2009; Williams et Camara 2009). Malgré l’autorégulation du gène lasI , la quantité du produit LasI reste relativement constante (Williams et Camara 2009). En effet, l’expression du gène lasI est régulée négativement par le gène rsaL qui est situé juste en aval du gène lasR (Rampioni et al. 2007).

Chapitre II : Généralités

Le répresseur transcriptionnel RsaL se lie sur le promoteur bidirectionnel rsaL -lasI et empêche ainsi la transcription de lasI et de rsaL (Rampioni et al. 2006; Rampioni et al. 2007). Par conséquent, cette réaction génère une boucle de rétroaction négative qui s’oppose à la boucle de rétroaction positive médiée par le complexe LasR/LasI, ce qui contribue à l’homéostasie de la production de 3-oxo-C12-HSL (Rampioni et al. 2007; Williams et Camara 2009). Les complexes LasR/LasI n’entrent pas en compétition pour le même site de liaison, mais occupent des sites adjacents au niveau du promoteur rsaL -lasI de sorte que lorsque les deux protéines sont liées à l’ADN, la répression exercée par RsaL est dominante sur l’activation par LasR (Rampioni et al. 2007). Les gènes activés par le système lasR /lasI comprennent les gènes lasA, lasB et aprA respectivement nécessaire à la production de deux élastase et une protéase alcaline, exoA qui code l’exotoxine A, les gènes rhlI et rhlR ainsi que le gène lasI nécessaire pour orchestrer le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa (Williams et Camara 2009).

b. Le système rhl

Le système rhl comprend le gène rhlR codant la protéine régulatrice RhlR, également membre de la famille du régulateur transcriptionnel LuxR, et le gène rhlI codant la synthétase RhlI nécessaire à la synthèse d’un second type d’AHL : la N-butanoyl-L-homosérine lactone (C4-HSL) (Duan et Surette 2007; Steindler et al. 2009). L’expression des gènes rhlR et rhlI est régulée positivement par le complexe LasR/3- oxo-C12-HSL ce qui met le système las en premier dans la hiérarchie du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa (Wagner et al. 2007; Dekimpe et Deziel 2009; Williams et Camara 2009). En même temps, cette relation hiérarchique entre las et rhl est dépendante de la croissance bactérienne (Latifi et al. 1996; Wagner et al. 2007). Les deux gènes gacA et vqsR régulent également l’expression de rhlR (Reimmann et al. 1997; Juhas et al. 2004). Ensuite, l’expression de rhlR induit à la fois l’expression de rhlI et la production de la protéine régulatrice RhlR. Lorsque la concentration en C4-HSL atteint un seuil critique, une molécule d’AHL se lie à deux protéines RhlR et le complexe RhlR/C4-HSL active la transcription de plusieurs gènes notamment l’opéron rhlAB nécessaire à la production de rhamnolipides, l’opéron phzABCDEFG nécessaire à la production de pyocyanine, les gènes lasA et lasB nécessaire à la production de l’élastase, le gène aprA nécessaire à la production de protéases (Choy et al. 2008; Bjarnsholt et al. 2010). Il est également important de noter que le gène rhlI est régulé négativement par les gènes qscR et rpoS permettant de contrôler

Chapitre II : Généralités l’équilibre de fonctionnement du système rhl (Fuqua 2006; Kayama et al. 2009).

c. L’autoinducteur PQS

Un autre système de quorum sensing qui utilise l’autoinducteur appartenant à la classe des 2-alkyl-4-quinolone (AQ), différent des AHLs, a été décrit chez P. aeruginosa . Il s’agit du 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone appelé également PQS. Il a été montré que cette molécule signal contrôle également l’expression de lasB qui code l’élastase (Pesci et al. 1999). La molécule appartient à la famille des 4-hydroxy-2-alkylquinolines (HAQ) qui sont connues pour leur activité antimicrobienne (Deziel et al. 2004). La synthèse et la bioactivité de PQS dépendent respectivement des systèmes las et rhl (Pesci et al. 1999). Les molécules PQS sont produites à la fin de la phase exponentielle de croissance de la souche sauvage de P. aeruginosa . La transcription des gènes nécessaire à la synthèse de PQS est régulée positivement par LasR et négativement par le système rhl (Diggle et al. 2003). La synthèse des HAQ est sous le contrôle de deux opérons, à savoir pqsABCDE et phnAB . L’expression de ces deux opérons est régulée positivement par le facteur transcriptionnel associé à la virulence PqsR connu sous l’ancien nom de MvfR (Deziel et al. 2005). L’opéron phnAB permet la synthèse de l’anthranilate via l’anthranilate synthase. L’action des protéines PqsA, B, C et D sur l’anthranilate génère la molécule 4-hydroxy-2-heptylquinoline (HHQ). Cette dernière est transformée en PQS par oxydation par PqsH dont l’expression est contrôlée par LasR (Deziel et al. 2004). D’autre part, PqsR forme un complexe avec HHQ et se lie au promoteur de psqA entraînant une augmentation majeure de PQS. Le PQS agit donc comme un co-inducteur de PqsR (Wade et al. 2005). Par ailleurs, le PQS forme également un complexe avec PqsR et se lie aux promoteurs de psqA, rhlR et phnA régulant positivement leur expression. Cependant, le complexe RhlR-C4-HSL régule négativement la transcription de PqsA et PqsR (Xiao et al. 2006)

II.2. Rhodococcus fascians

Rhodococcus fascians est une bactérie phytopathogène responsable de malformations chez de très nombreuses plantes tant monocotylédones que dicotylédones (Crespi et al. 1992; Vereecke et al. 2000; Putnam et Miller 2007). Parmi les espèces du genre Rhodococcus , R. fascians est la seule connue comme phytopathogène (Bell et al. 1998). Certaines espèces ont été rapportées comme pathogène chez l’Homme et les animaux (Bell et al. 1998). Les symptômes induits par cette bactérie furent décrits pour la première fois chez Lathyrus

Chapitre II : Généralités odoratus (sweet pea – pois de senteur) par Tilford (1936) lorsqu’il a isolé la bactérie responsable de la fasciation chez cette plante. Il a été rapporté que l’infection par la bactérie entraine une sévère réduction de la floraison (Tilford 1936). Plus tard la bactérie fut identifiée chez d’autres plantes telles que les choux-fleurs, les fraisiers, les œillets, les chrysanthèmes et les asparagus (Lacey 1939). Depuis, les effets de R. fascians ont été notés en particulier chez les plantes ornementales à cause de la réduction de la production des fleurs suite à l’infection (Goethals et al. 2001; Putnam et Miller 2007). Selon Putnam et Miller (2007), l’impact économique de R. fascians dans l’industrie de production de plantes et l’industrie ornementale augmente chaque année et la bactérie devient une vraie menace pour l’industrie horticole. A titre d’exemple, en 1950, la bactérie a été signalée comme un facteur important limitant la culture commerciale de la marguerite shasta daisy ( Leucanthemum x superbum ) en Californie et sur certaines plantes ornementales (Baker 1950). Vingt cinq ans plus tard, R. fascians était toujours présente dans les mêmes territoires et est présente virtuellement dans toutes les plantes (Oduro 1975). En revanche, la bactérie apparait de façon sporadique sur d’autres plantes ornementales qui ont poussé dans différents systèmes de production. Les œillets, qui font partie des espèces les moins susceptibles, ont été affectés par la maladie dans une pépinière pendant plus de 10 ans mais la bactérie a eu une incidence évaluée à 5%. Cependant, chez les chrysanthèmes et les dahlias, l’incidence a atteint jusqu’à 77.7 et 100% respectivement selon les cultivars (Oduro 1975). Récemment, une perte estimée à plus de 1 million de dollars a été rapportée dans toute une pépinière sur une période d’une année due à une perte de vente et de temps pour la propagation et la maintenance des matériels qui ont été infectés par R. fascians . Une autre pépinière a perdu annuellement environ 394.000$ en raison d’infections par la bactérie. D’autres pépinières ont supprimé toutes leurs plantes ou arrêté de cultiver des espèces particulières en raison d’infections par R. fascians (Putnam et Miller 2007).

II.2.1. Position systématique

La classification systématique de R. fascians a rencontré plusieurs changements avant sa position systématique actuelle. Tilford (1936) fut le premier à isoler la bactérie qui est responsable de la fasciation chez le pois de senteur et l’a baptisée Phytomonas fascians . Trois ans plus tard, Lacey (1939) a renommé la bactérie Bacterium fascians à cause d’un accord sur la nomenclature des bactéries qui provoque des fasciations. En 1942, Dowson a résolu la position systématique de la bactérie en positionnant le pathogène parmi les bactéries

Chapitre II : Généralités corynéformes appartenant à la classe des Actinomycètes et le nom Corynebacterium fascians a été proposé (Dowson 1942). Cette nomenclature a été retenue jusqu’en 1984 malgré une discussion sur la position taxonomique exacte au sein des Actinomycètes qui a fait balloter la bactérie entre Nocardia (Lacey 1955), Corynebacterium (Harrington 1966; Yamada et Komagata 1972), Mycobacterium et Rhodococcus (Gordon 1966; Goodfellow et Alderson 1977). Plus tard, la bactérie a été renommée Rhodococcus fascians par Goodfellow et cette nouvelle classification est basée sur des données chimiques, génétiques et phénotypiques (Goodfellow 1984). La position systématique actuelle de Rhodococcus fascians est donc la suivante :

Règne : BACTERIA Phylum : ACTINOBACTERIA Classe : ACTINOMYCETES Ordre : ACTINOMYCETALES s/ordre : CORYNEBACTERINEAE Famille : NOCARDIACEAE Genre : Rhodococcus Espèce : fascians

II.2.2. Description, structure et identification

R. fascians est une bactérie aérobie à Gram positif appartenant à la famille des Nocardiaceae (Goodfellow 1984; Lechevalier 1989). A B C

Photo 5. Structure morphologique et caractéristique de la colonie de R. fascians . (A) Caractéristique d’une culture de R. fascians mise en culture dans le milieu LB ; (B) Grossissement de la structure de la colonie de R. fascians ; (C) Vue au microscope électronique à balayage de la structure filamenteuse qui se fragmente en bâtonnet chez R. fascians ; Source : Présent travail.

Chapitre II : Généralités

Il s’agit d’une bactérie pléomorphe nocardioforme car elle forme un hyphe ramifié qui se fragmente en bâtonnets et en cocci au cours de sa reproduction (Lechevalier 1989). La bactérie est immobile, dépourvue de spore et la colonie se présente sous forme d’une crème humide de couleur orange qui peut être lisse ou rugueuse sans que ceci n’affecte la pathogénicité de la bactérie (Tilford 1936; Elia et al. 1983; Elia et al. 1984; Goodfellow 1984). Les images sur la Photo 5 montrent la structure et l’aspect général de la colonie de R. fascians .

II.2.3. Les différents hôtes et la distribution géographique de R. fascians

Les hôtes de R. fascians appartiennent à une large gamme de plantes appartenant tant aux dicotylédones qu’aux monocotylédones (Crespi et al. 1992). Plus de 164 espèces réparties dans 43 familles sensibles à R. fascians ont été répertoriées dont la majorité sont des plantes herbacées (Putnam et Miller 2007; Depuydt et al. 2008b; Stes et al. 2011). La distribution géographique de R. fascians est assez large. La bactérie a été identifiée dans 19 Etats des Etats Unis d’Amérique, au Mexique, au Canada, en Europe du Nord, au Moyen Orient, en Asie, en Australie et en Nouvelle Zélande. Dans le continent Africain et en Amérique du Sud, l’espèce a été identifiée respectivement en Egypte et en Colombie (Putnam et Miller 2007). La présence de la bactérie à Madagascar n’a toutefois pas encore été signalée jusqu’à présent.

II.2.4. Les différents symptômes causés par R. fascians

Les différents phénotypes induits par R. fascians comprennent la déformation des feuilles, l’épaississement des feuilles ou des pousses, la prolifération des bourgeons axillaires au niveau des feuilles donnant la forme de balai de sorcière, le développement anormale des bourgeons et la fasciation (Vereecke et al. 2000; Goethals et al. 2001; Putnam et Miller 2007). Néanmoins, le symptôme le plus typique est la formation de la galle feuillée (Vereecke et al. 2000). La galle feuillée est constituée d’un bouquet de plusieurs bourgeons, dont la croissance est inhibée, entourés de feuilles épaisses atrophiées et déformées en raison d’une altération de la dominance apicale (Lacey 1939; Vereecke et al. 2000; Putnam et Miller 2007). La sévérité des symptômes dépend de l’hôte (Putnam et Miller 2007), de l’âge de la plante et des conditions de culture (Faivre-Amiot 1967; Vereecke et al. 2000) ainsi que des souches bactériennes (Eason et al. 1995). Les images sur la Photo 6 montrent quelques exemples illustrant les phénotypes induits par R. fascians chez les plantes.

Chapitre II : Généralités

A B

C D

Photo 6. Quelques photos représentant les différents types de symptôme causés par R. fascians . (A) Distorsion foliaire et régénération de bourgeons adventifs chez Acanthus mollis ; (B) Fasciation chez Daphne odora ; (C) Formation de galles feuillées chez Coreopsis ; (D) Prolifération des pousses chez Dicentra ; (E) Formation de galles feuillées à partir du méristème axillaire chez Atropa belladonna ; (F) Formation de galles feuillées à partir du méristème apical chez Nicotiana tabacum . Sources : A-D : (Putnam et Miller 2007) ; E : (Vereecke et al. 2000) ; F : présent travail.

II.2.5. Pathogénicité de R. fascians

Chez les bactéries, les plasmides sont généralement associés à l’expression des facteurs de virulence (Francis et al. 2007). Il est important de noter que la souche sauvage D188 de

Chapitre II : Généralités

R. fascians possède deux plasmides à savoir un plasmide circulaire d’une longueur de 138 kb nommé pD188 et un plasmide linéaire d’environ 200 kb nommé pFiD188 (Desomer et al. 1988; Crespi et al. 1992).

II.2.5.1. Rappel sur l’isolement du plasmide circulaire et les premières étapes des études moléculaires de R. fascians

La présence d’un plasmide circulaire pD188 a été décrite en premier par Desomer et ses collaborateurs (1988) chez la souche sauvage D188 de R. fascians lorsqu’ils ont travaillé sur la résistance de cette souche au cadmium. Depuis, l’étude des mécanismes moléculaires mis en œuvre par R. fascians pour infecter ses plantes hôtes a connu un essor. En effet, les techniques de transformation de R. fascians par électroporation, le développement des vecteurs de clonages et les procédures de mutagenèse aléatoire furent développées (Desomer et al. 1990; Desomer et al. 1991). Puis la méthodologie d’intégration des gènes rapporteurs qui sont utiles pour les études d’expression chez R. fascians fut développée (Desomer et al. 1992).

II.2.5.2. Le plasmide linéaire et son implication dans la production des facteurs de virulence chez R. fascians

La production des facteurs de virulence chez R. fascians D188 est intimement dépendante du plasmide linéaire pFiD188. Il a été rapporté que la souche D188-5 de R. fascians, une souche dépourvue de plasmide, n’induit pas de symptôme chez le tabac (Crespi et al. 1992). Le plasmide linéaire pFiD188 est également impliqué dans l’efficacité de la pénétration et de la colonisation des tissus infectés par R. fascians (Cornelis et al. 2001). Trois loci impliqués dans la formation des galles feuillées ont été identifiés sur ce plasmide linéaire. Il s’agit du locus fas , du locus att et du locus hyp (Crespi et al. 1992; Crespi et al. 1994).

a. Le locus fas

Le locus fas est essentiel pour la virulence de R. fascians car sa délétion produit une souche non virulente (Crespi et al. 1992). Il est impliqué dans le développement de la fasciation ainsi que dans la production de cytokinines (Crespi et al. 1992; Crespi et al. 1994; Temmerman et al. 2000; Pertry et al. 2009; Pertry et al. 2010). Le locus fas comporte 6 cadres ouverts de lecture connus également sous le terme de « open reading frames » (ORFs) dont la

Chapitre II : Généralités transcription est orientée dans la même direction (Crespi et al. 1994; Temmerman 2000). Selon la littérature, les mutants en ORF1, ORF4 et ORF6 sont non-virulents et n’induisent pas le développement des symptômes chez le tabac (Crespi et al. 1992; Crespi et al. 1994; Temmerman 2000). Le mutant en ORF5 inhibe la croissance des plantules tandis que chez les plantes âgées, aucun symptôme n’a été détecté (Crespi et al. 1994). Plus la plante infectée par ce mutant est jeune plus le symptôme est sévère, ce qui indique que l’ORF5 est nécessaire pour compléter les processus de fasciation chez les plantes âgées (Crespi et al. 1994; Temmerman 2000). Les produits issus de l’ORF1 et de l’ORF2 interviendraient dans la dégradation des phytoalexines synthétisées par les plantes (Crespi et al. 1994). L’ORF3 code un peptide dont la fonction n’est pas connue (Crespi et al. 1994; Pertry et al. 2009; Pertry et al. 2010).

b. Régulation de l’expression de fas

L’expression du locus fas est régulée par le gène constitutif fasR , un gène régulateur appartenant à la famille des régulateurs transcriptionnels de type AraC (Temmerman et al. 2000). Sa transcription est orientée dans la même direction que les autres gènes du locus. Etant le régulateur de l’expression du locus fas , le gène fasR est important pour l’expression des facteurs de virulence chez R. fascians car la souche mutante ∆fasR est incapable d’induire la formation des symptômes chez le tabac (Temmerman et al. 2000; Goethals et al. 2001; Pertry et al. 2009; Pertry et al. 2010). Il est important de noter que la nature du ou des composés qui induisent l’expression du locus fas reste inconnue. En revanche, l’expression de ce locus peut être détectée après infection de la plante par la bactérie avant même que le symptôme ne soit visible ce qui suggère que les conditions d’induction sont rencontrées rapidement par les bactéries lorsqu’elles colonisent la plante hôte. Il semble que ce ou ces composés diffusent rapidement puisque les organes non infectés ainsi que le milieu de culture des plantes infectées contiennent également cette activité inductrice (Vereecke 1997; Goethals et al. 2001; Vandeputte 2003). In vitro , son expression est induite en présence d’histidine ou d’extrait de galles feuillées mais pas lorsque de l’extrait d’une plante non-infectée est ajouté à R. fascians (Crespi et al. 1992; Temmerman 2000). L’expression optimale du locus fas dépend des conditions environnementales y compris le pH du milieu (5.5), l’oxygénation, les sources d’azote, de phosphate et de carbone ainsi que la densité cellulaire (Temmerman et al. 2000).

Chapitre II : Généralités

c. Le locus att

Le locus att est impliqué dans la formation de galles feuillées car son expression affecte la sévérité du symptôme (Maes et al. 2001). Des plantes de tabac infectées par des souches de R. fascians dont le locus att a été muté (délétion complète ou partielle) présentent des phénotypes atténués qui se traduisent par la formation de galles feuillées de taille réduite ou moins compacte (Crespi et al. 1992; Maes et al. 2001). Le locus att présente 9 ORFs homologues à certains gènes de biosynthèse de l’arginine et de biosynthèse des β-lactames. Toutes ces ORFs sont orientées dans la même direction (Maes et al. 2001).

d. Régulation de l’expression de att

L’expression du locus att est régulée par le gène attR qui est orienté dans la direction opposée à celle du locus att (Maes et al. 2001). Il s’agit d’un régulateur transcriptionnel de type LysR (famille des LysR-type transcriptional regulators ou LTTRs) (Schell 1993; Maes et al. 2001; Maddocks et Oyston 2008). Similairement au locus fas , in vitro , l’expression de att est induite par l’histidine ou par l’extrait de galles feuillées mais non par l’extrait d’une plante non-infectée (Vereecke et al. 1996; Temmerman et al. 2000; Maes et al. 2001; Vandeputte et al. 2005; Vandeputte et al. 2007).

e. Rôles du locus att dans le développement du symptôme

Les produits issus de l’expression des gènes att sont inconnus, mais au vu des phénotypes atténués provoqués par les mutants en att (Crespi et al. 1992; Maes et al. 2001), plusieurs hypothèses peuvent être avancées. Il est probable que ces produits jouent le rôle de phytotoxines qui affaibliraient la barrière défensive de la plante facilitant l’infection par R. fascians . Ceci est en accord avec le fait que chez le tabac, les blessures au niveau du tissu infecté améliorent le développement des symptômes (Goethals et al. 2001; Maes et al. 2001). Ces produits peuvent également interagir avec le locus fas en augmentant la sensibilité de la plante aux cytokinines, ou alternativement, les produits de att et de fas peuvent agir de concert pour induire un développement complet du symptôme (Goethals et al. 2001). Par conséquent, ce phénotype atténué pourrait s’expliquer par la diminution de la production des produits de fas qui est due à l’insuffisance de la production d’inducteur codé par att (Goethals et al. 2001; Maes et al. 2001).

Chapitre II : Généralités

f. Liaison entre le locus fas et att dans le développement du symptôme

L’expression des loci att et fas est étroitement liée (Crespi et al. 1992; Maes et al. 2001) . Leur organisation au niveau du plasmide linéaire est représentée dans la Figure 2. Durant la colonisation des plantes, les produits issus de l’expression de att se forment et agissent comme des molécules autorégulatrices qui induisent à la fois l’expression des gènes att et fas (Maes et al. 2001; Cornelis et al. 2002) . En effet, le confinement de la bactérie dans des conditions spécifiques lors de l’infection des plantes crée les paramètres nécessaires pour générer des quantités critiques d’inducteur dérivé de att , conduisant, par une boucle de rétroaction positive, à une quantité d’inducteur suffisante qui répond aux exigences de l’expression des gènes du locus fas (Temmerman et al. 2000; Goethals et al. 2001; Maes et al. 2001).

attR attX attA attB attC attD attE attF attG attH fasR

fasR fasA fasBfasC fasD fasE fasF 1kb

Figure 2. Représentation schématique de l’organisation des deux loci fas (rouge) et att (bleu) localisés sur le plasmide linéaire pFiD188 de R. fascians . Les flèches indiquent l’orientation de chaque gène. La régulation de l’expression du locus att est assurée par le gène attR (jaune), qui est orienté dans le sens opposé à celui du locus att , tandis que celle du locus fas est assurée par le gène fasR (mauve) ( Crespi et al. 1992; Maes et al. 2001 ).

Lors de l’évaluation de l’expression de fas et de att durant l’infection des plantules de tabac, l’expression de att diminue graduellement durant la période d’infection et se manifeste chez les bactéries qui sont présentes à la surface des plantes. En revanche, les gènes fas sont exprimés chez les bactéries qui se trouvent à l’intérieur et à la surface de la plante. En outre, l’expression de fas reste élevée et dure plus longtemps que celle de att (Cornelis et al. 2002). Ceci suggère que lorsque la bactérie pénètre à l’intérieur de la plante, le rôle des inducteurs de att devient secondaire et d’autres composés de régulation se forment pour empêcher l’expression de att et permet de poursuivre l’expression de fas (Cornelis et al. 2002).

g. Le locus hyp

Le locus hyp est impliqué dans le degré de sévérité du développement du symptôme

Chapitre II : Généralités induit par R. fascians . Le locus est composé d’une seule ORF qui est homologue à la famille « D-E-A-D box » des ARN hélicases (Crespi et al. 1992; Vereecke et al. 1996; Goethals et al. 2001). L’infection des plantules de tabac décapitées par les souches mutantes en hyp induit la formation d’une galle feuillée plus large (Crespi et al. 1992).

II.2.6. Rôle des phytohormones dans la formation des galles feuillées

La galle feuillée qui se forme durant l’interaction entre R. fascians et les plantes est considérée comme la niche écologique de R. fascians (Depuydt et al. 2009). Durant cette forme d’interaction, des changements métaboliques se produisent à l’intérieur de la bactérie (Forizs et al. 2009). Le changement morphologique au sein de la plante hôte dû à l’infection par R. fascians est similaire au phénotype résultant d’un déséquilibre hormonal chez les plantes (Vereecke et al. 2000; de O. Manes et al. 2004). La nature des molécules impliquées dans la formation de galles feuillées est encore inconnue, cependant les cytokinines et les auxines synthétisées par la bactérie peuvent jouer un rôle important dans ce mécanisme (Vereecke et al. 2000; Vandeputte et al. 2005; Depuydt et al. 2008a; Pertry et al. 2009; Stes et al. 2011).

II.2.6.1. Les cytokinines

Chez R. fascians , les cytokinines classiques dérivent principalement de l’ARNt (Matsubara et al. 1968; Murai et al. 1980). Par ailleurs, un gène qui code l’isopentényl transférase ( ipt ) a été identifié chez la bactérie (Crespi et al. 1992). Selon Crespi et ses collaborateurs (1992), l’expression de ce gène est nécessaire pour la virulence de la bactérie. L’isopentényl transférase catalyse la première étape de la réaction qui conduit à la biosynthèse de l’isopentényl adénine (iP), à partir du 5’ AMP et de l’isopentényl pyrophosphate (Chen 1997). Jusqu’à présent, 12 cytokinines ont été identifiées chez R. fascians à savoir la méthylaminopurine, l’isopentényl adénine (iP), l’isopentényl adénosine, le 2- méthylthioisopentényladénine (2MeSiP) et son riboside, la cis -zéatine (cZ), la 2-méthylthio- cis -zéatine (2MeScZ), la 2-méthylthio-trans -zéatine (2MeStZ), la trans -zéatine (tZ), la zéatine-riboside, la dihydrozéatine (DZ) et la dihydrozéatine-riboside (Helgeson et Leonard 1966; Scarbrough et al. 1973; Armstrong et al. 1976; Murai et al. 1980; Eason et al. 1996; Pertry et al. 2009). Plusieurs types de symptômes induits par R. fascians tels que le froissement des feuilles, la prolifération des bourgeons adventifs, l’inhibition du développement racinaire, le

Chapitre II : Généralités retardement de la sénescence rappellent les effets des cytokinines sur les plantes (Klambt et al. 1966; Oduro et Munnecke 1975). Bien que les cytokinines puissent être impliquées dans le développement des galles feuillées, aucune corrélation entre les cytokinines identifiées chez R. fascians avec le développement des galles feuillées n’a été rapportée (Pertry et al. 2009).

II.2.6.2. Les auxines

Les phénotypes des plantes infectées par R. fascians ne peuvent pas être attribués uniquement à l’action des cytokinines. Certaines caractéristiques de galles feuillées telles que la différenciation de tissus vasculaires, l’élongation cellulaire et l’inhibition du développement des bourgeons sont connus comme des effets typiques de l’auxine. Cependant, très peu de données montrent une possible implication de l’auxine dans l’interaction de R. fascians avec son hôte. Chez les plantes infectées par R. fascians développant des galles feuillées, la concentration en acide-3-indole acétique (AIA) est plus élevée que dans les tissus non-infectés (Vereecke et al. 2000; de O. Manes et al. 2001). En outre, il a été rapporté que R. fascians produit et secrète de l’AIA et cette dernière est fortement induite in vitro lorsque la bactérie se trouve en présence de l’extrait de galles feuillées (Vandeputte et al. 2005). Cependant, il est important de noter que les gènes qui régulent la production d’AIA ne se trouvent pas au niveau du plasmide linéaire mais sont plutôt chromosomiques (Vandeputte et al. 2005).

II.2.7. Intérêt biotechnologique de R. fascians

La formation de la galle feuillée due à l’infection par R. fascians est le résultat d’une perturbation de l’équilibre hormonal (cytokinines et auxines) de la plante infectée (Vandeputte et al. 2005; Depuydt et al. 2008a; Pertry et al. 2009). Cependant, ce changement peut être contourné en un véritable outil potentiel de propagation des plantes in vitro . En effet, le transfert de galles feuillées dans un milieu sans hormone contenant un antibiotique qui élimine la bactérie entraine le développement normal des bourgeons. Les nouvelles pousses obtenues s’enracinent facilement lorsqu’elles sont transférées vers un autre milieu frais même en absence d’hormone (Vereecke et al. 2000). De plus, les études menées par Vereecke et ses collaborateurs (2000) ont montré que les plantes issues de cette voie de propagation montrent une variabilité réduite comparée à celles issues de la technique de propagation in vitro classique. Dans le même travail, ils ont rapporté que les galles feuillées peuvent également servir de germplasme. En effet, il a été montré que

Chapitre II : Généralités des galles feuillées conservées à 4°C pendant deux ans conservent des bourgeons actifs capables de se développer en nouvelles plantules entières et fertiles.

III. Conclusions

Ainsi que notre revue bibliographique l’a montré, de nombreuses études phytochimiques et pharmacologiques ont mis en évidence une importante variété de composés chimiques tant chez les Dalbergia que chez les Combretum . Bien que ces deux genres soient fortement utilisés dans la pharmacopée traditionnelle africaine et que l’activité antimicrobienne d’extraits ou de composés isolés de plusieurs espèces appartenant à ces deux genres soit clairement établie, rares, voire inexistantes, sont les études qui ont visé à identifier des composés qui inhibent l’expression des gènes de virulence de bactéries pathogènes, que celles-ci s’attaquent à l’Homme ou aux plantes. Cibler l’expression des gènes de virulence est une stratégie de lutte contre les bactéries pathogènes qui semble clairement sous-exploitée et prometteuse compte tenu des problèmes d’émergence de multi-résistances aux antibiotiques existants. Dans ce contexte, il est intéressant de noter que la compréhension des mécanismes moléculaires régulant l’expression des gènes de virulence chez de nombreuses bactéries pathogènes a connu un essor important ces dernières années et que de nouvelles cibles pharmacologiques ont été mises à jour. Ainsi, il a été montré chez P. aeruginosa que la plupart des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence sont sous le contrôle du mécanisme de quorum sensing . Le fonctionnement de ce mécanisme de communication inter-bactérien densité-dépendant repose sur deux systèmes génétiques, à savoir les systèmes las et rhl , qui régulent la production des facteurs de virulence majeurs de cette bactérie, comme l’élastase, les biofilms, la pyocyanine et les rhamnolipides. Connaissant le fonctionnement et l’importance de ce mécanisme dans l’expression des facteurs de virulence chez P. aeruginosa , l’une des stratégies qui devrait être adoptée pour lutter contre la bactérie et de minimiser le risque de résistance serait de diminuer ou d’inhiber l’expression de ces systèmes. Dans ce cas, le métabolisme général de la bactérie n’est pas affecté et par conséquent le risque de mutation est moindre. Il est à noter que l’expression des facteurs de virulence chez les bactéries ne dépend pas toujours du mécanisme de quorum sensing . D’autres bactéries ont adopté d’autres stratégies pour coloniser leur hôte. Ainsi, on peut citer l’exemple du système d’autorégulation chez R. fascians. Bien que très peu d’informations soient disponibles en ce qui concerne

Chapitre II : Généralités l’épidémiologie de R. fascians et que, jusqu’à présent, aucun traitement efficace pour l’éradication de la bactérie n’ait été décrit, les outils de bases sont disponibles afin de comprendre le mécanisme de l’expression des gènes de virulence chez cette bactérie. Il a ainsi été montré que les gènes de virulence de la souche D188 de R. fascians sont localisés sur le plasmide linéaire pFiD188. Les deux loci ( fas et att ) qui sont les plus importants dans la production des facteurs de virulence chez la bactérie sont respectivement indispensables pour la formation de la galle feuillée (qui est la forme la plus sérieuse des symptômes provoqués par cette bactérie) et nécessaires à la production de composés autorégulateurs nécessaires pour l’expression optimale du locus fas . Il ressort clairement qu’aucune des espèces de Dalbergia ou de Combretum n’a été criblée pour des activités anti-quorum sensing ou inhibitrices de l’expression des gènes de virulence chez des bactéries pathogènes. Avec le développement des outils moléculaires permettant d’étudier les réseaux génétiques de régulation de l’expression des gènes de virulence chez les bactéries, il devient maintenant possible de tester tout cet arsenal de plantes utilisées dans la pharmacopée traditionnelle africaine, qui souvent sont endémiques et qui ont très probablement été ignorées à tort.

CHAPITRE III : MATERIEL ET METHODES

Chapitre III : Matériel et Méthodes

Ce chapitre décrit toutes les informations relatives au matériel végétal, aux bactéries et leurs conditions de cultures ainsi qu’aux différentes techniques et tests biologiques utilisés dans le cadre de ce travail.

I. Matériel

I.1. Matériel végétal

Le matériel végétal utilisé dans le cadre de ce travail peut être divisé en deux groupes à savoir le matériel issu de l’environnement in situ et le matériel issu de la culture in vitro .

I.1.1. Critères de sélection du matériel végétal

Les quatre espèces de Dalbergia et l’espèce C. albiflorum utilisées dans le cadre de ce travail ont été sélectionnées à partir d’une liste de genres et d’espèces de plantes qui figurent dans un programme de conservation et de valorisation des espèces menacées de disparition de Madagascar mené par l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA). La sélection est basée sur les critères suivants : ••• Leurs usages ethnobotaniques comme anti-infectieux et antimicrobiens, ••• Leur endémicité, ••• Leur degré de rareté et de menace selon les bases de données de la liste rouge de l’IUCN (International Union for Conservation of Nature) http://www.iucnredlist.org.

I.1.2. Matériel végétal issu de l’environnement in situ

Il s’agit tout d’abord de graines, de feuilles, d’écorces vertes et de racines des 4 espèces de Dalbergia (D. chlorocarpa, D. pervillei, D. trichocarpa et D. purpurascens ) dont la récolte a été effectuée dans la région du Sud Ouest de Madagascar dans la Région du Menabe Morondava aux alentours des villages de Marofandilia et de Kirindy, et dans une partie de la Réserve Spéciale d’Andranomena en janvier 2007 (cf. Figure 3). Une deuxième récolte plus importante d’écorces vertes de D. pervillei prélevées sur cinq pieds différents a été réalisée en janvier 2008. D’autres feuilles de D. trichocarpa ont été également collectées en quantité plus importante en janvier 2009. Pour chaque espèce étudiée, des échantillons d’herbiers (TEF) ont été identifiés auprès du FOFIFA/CNRADRU (Centre National de la Recherche Appliquée au Développement Rural) à Madagascar pour confirmer leur position systématique.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

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Figure 3. Carte géographique montrant les zones de collecte des espèces de Dalbergia . (A) Carte de Madagascar ; (B) Carte de la Région du Menabe ; (C) Les différentes zones de collecte des pieds de Dalbergia (représentées par les cercles).

Il s’agit ensuite de feuilles et d’écorces de tige de Combretum albiflorum qui ont été récoltées dans la région du Sud de Madagascar en 2004 et en janvier 2010. Des échantillons d’herbiers ont été déposés auprès de l’herbarium de l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA) pour la confirmation de la position systématique de l’espèce. Il s’agit enfin des graines de Nicotiana tabacum (L.) Petit Havana qui ont été obtenues auprès du Jardin botanique Jean Massart de l’Université Libre de Bruxelles en Belgique.

I.1.3. Matériel végétal issu de la culture in vitro

Il s’agit en premier lieu de plantules âgées de 4 et 8 semaines des 4 espèces de Dalbergia citées ci-dessus obtenues à partir des graines récoltées in situ . Il s’agit ensuite des plantules de N. tabacum âgées de 1, 4 et 8 semaines ainsi que des galles feuillées, produites par infection de plantes de tabac âgées de 4 semaines avec R. fascians D188, récoltées 8 semaines après infection. Enfin des boutures de peuplier Populus tremula x P. tremuloïdes clone INRA 353-38 qui ont été obtenues auprès de l’Institut National de la Recherche Agronomique en France.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

I.1.4. Conditions de préparation du matériel végétal

I.1.4.1. Séchage et broyage

La même condition de séchage a été appliquée à tous les échantillons avant de procéder à toute forme d’extraction. En effet, tout matériel végétal récolté in situ et in vitro a été séché à l’abri de la lumière et à température ambiante. La durée de séchage varie selon les échantillons. Après séchage, les échantillons sont réduits en poudre pour les extractions chimiques.

I.1.4.2. Conditions de culture in vitro

Les conditions de culture in vitro du matériel végétal utilisé dans ce travail sont les suivantes : Les graines de N. tabacum et des 4 espèces de Dalbergia ont été désinfectées par transfert successif dans une solution d’éthanol à 70 % pendant 1 min, une solution aqueuse contenant 5 % d’hypochlorite de calcium et 0.1 % de Tween 80 pendant 10 min, puis les graines ont été rincées 4 fois 5 min dans de l’eau distillée stérile. Les graines désinfectées sont transférées dans le milieu de culture Murashige et Skoog (MS/2) contenant des vitamines (Duchefa) et 1 % de sucrose, solidifié avec 0.2 % de phytagel, pour leur germination in vitro . Les boutures de peuplier sont mises en propagation in vitro dans le milieu McCown Woody Plant contenant des vitamines (Duchefa) et 3 % de sucrose et solidifié avec 0.7 % d’agar. Pour toutes les plantes, la température de la chambre de culture est maintenue à 24 ± 2°C et la photopériode est fixée à 16 h de lumière et 8 h d’obscurité (70 µmol photons/m 2/s).

I.2. Souches bactériennes, gènes d’intérêt et conditions de culture

I.2.1. Les gènes d’intérêt étudiés

Les gènes d’intérêt étudiés dans le cadre de ce travail peuvent être groupés en deux selon la nature du gène rapporteur avec lequel ils sont fusionnés, c'est-à-dire soit avec le gène rapporteur uidA , soit avec le gène rapporteur lacZ . La définition et le principe de fonctionnement des gènes rapporteurs sont décrits dans l’Annexe 2.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

a. Les gènes d’intérêt fusionnés avec le gène rapporteur uidA

Les gènes d’intérêt fusionnés avec le gène rapporteur uidA (codant la β-glucuronidase ou GUS) sont les suivants : - Les gènes attH , attA, attR et fasA qui se trouvent sur le plasmide linéaire pFiD188 et qui sont impliqués dans la virulence de R. fascians (Temmerman et al. 2000; Maes et al. 2001). - Les gènes pFi_065, nrp5 et stk1 qui sont des gènes constitutifs localisés sur le plasmide linéaire de R. fascians (Danny Vereecke, communication personnelle) . Les souches bactériennes portant le plasmide qui contient le promoteur et une partie du gène d’intérêt fusionné avec le gène rapporteur uidA sont dites « rapportrices ». Les différentes souches rapportrices de R. fascians portant ces différentes fusions sont décrites dans le Tableau 1.

b. Les gènes d’intérêt fusionnés avec le gène rapporteur lacZ

Les gènes d’intérêt fusionnés avec le gène rapporteur lacZ (codant la β-D-galactosidase) sont les suivants : - Les gènes rhlR, rhlI, lasR, lasI, lasB et rhlA qui sont impliqués dans la régulation du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa (Williams et Camara 2009). - Le gène aceA qui est un gène constitutif indépendant du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa (Diaz-Perez et al. 2007; Kretzschmar et al. 2008). - Le gène nodA chez A. caulinodans dont l’expression dépend de la protéine NodD, qui est une protéine de type LysR, et qui est inductible par le flavonoïde naringénine (Goethals et al. 1989; Recourt et al. 1989; Goethals et al. 1990). - Le gène constitutif hemA chez Sinorhizobium meliloti introduit dans A. caulinodans dont l’expression est indépendante de la protéine NodD (Leong et al. 1985; Tsukada et al. 2009). La description des souches rapportrices portant ces différentes fusions est détaillée dans le Tableau 1.

I.2.2. Les différentes souches bactériennes

Trois espèces de bactéries ont été utilisées dans le cadre de ce travail. Il s’agit de Rhodococcus fascians, Pseudomonas aeruginosa et d’ Azorhizobium caulinodans . Les

Chapitre III : Matériel et Méthodes différentes souches de R. fascians et P. aeruginosa proviennent de la collection du Laboratoire de Biotechnologie Végétale de l’Université Libre de Bruxelles, Belgique. Les souches d’ Azorhizobium caulinodans proviennent du Département de Production de Plantes de l’Université de Gand, Belgique. Les caractéristiques de chacune de ces souches sont décrites dans le Tableau 1.

Tableau 1. Les souches bactériennes utilisées dans cette étude.

Souches Caractéristiques Références

Rhodococcus fascians D188 Souche sauvage virulente contenant le (Crespi et al. plasmide linéaire pFiD188 et le plasmide 1992) circulaire pD188. D188-5 Souche non virulente dépourvue de (Crespi et al. plasmide. 1992) D188::pTGGUSDV1 Intégrant une fusion traductionnelle attH - (Maes et al. uidA. 2001) Pousse en présence de chloramphénicol (25 µg.ml -1). D188::pUCGUSTM1 Intégrant une fusion traductionnelle attA- (Maes et al. uidA. 2001) Pousse en présence de chloramphénicol (25 µg.ml -1). D188::pSPGUSTM2 Contenant une fusion transcriptionnelle attR - (Maes et al. uidA. 2001) Pousse en présence de chloramphénicol (25 µg.ml -1). D188::pUCWT1 Contenant une fusion traductionnelle fasA- (Temmerman uidA. et al. 2000) Pousse en présence de chloramphénicol (25 µg.ml -1). D188::pSP stk1 IF1 Contenant une fusion traductionnelle stk1- Vereecke, non uidA. publié Pousse en présence de chloramphénicol (25 µg.ml -1). D188::pUC8bGUS Contenant une fusion transcriptionnelle Vereecke, non nrp5 -uidA. publié Pousse en présence de chloramphénicol (25 µg.ml -1). D188::pSP72AFGUSCm Contenant une fusion transcriptionnelle Vereecke, non pFi_065 -uidA . publié Pousse en présence de chloramphénicol (25 µg.ml -1).

Chapitre III : Matériel et Méthodes

Azorhizobium caulinodans ORS571::pRG290- Contenant une fusion transcriptionnelle (Goethals et 12::T20 nodA-lacZ. al. 1989; Pousse en présence de carbénicilline Goethals et (200 µg.ml -1) et de kanamycine (50 µg.ml -1) al. 1990) ORS571::pXLGD4 Contenant une fusion transcriptionnelle (Leong et al. hemA-lacZ. 1985) Pousse en présence de carbénicilline (200 µg.ml -1) et de tétracycline (10 µg.ml -1) Pseudomonas aeruginosa PAO1 Souche sauvage virulente PAO1::p β01 Contenant une fusion transcriptionnelle lasB- (Ishida et al. lacZ. 2007) Pousse en présence de carbénicilline (300 µg.ml -1). PAO1::p β02 Contenant une fusion transcriptionnelle rhlA- (Ishida et al. lacZ. 2007) Pousse en présence de carbénicilline (300 µg.ml -1). PAO1::pPCS223 Contenant une fusion transcriptionnelle lasI- (Toder et al. lacZ . 1994) Pousse en présence de carbénicilline (300 µg.ml -1). PAO1::pPCS1001 Contenant une fusion transcriptionnelle lasR- (Pesci et lacZ. Iglewski Pousse en présence de carbénicilline 1997) (300 µg.ml -1). PAO1::pLPR1 Contenant une fusion transcriptionnelle rhlI- (Toder et al. lacZ. 1994) Pousse en présence de carbénicilline (300 µg.ml -1). PAO1::pPCS1002 Contenant une fusion transcriptionnelle rhlR- (Pesci et lacZ. Iglewski Pousse en présence de carbénicilline 1997) (300 µg.ml -1). PAO1::pTB4124 Contenant une fusion transcriptionnelle (Kretzschmar aceA-lacZ. et al. 2008) Pousse en présence de carbénicilline (300 µg.ml -1). ∆PA1430 Mutant lasR : incapable de produire de (Jacobs et al. l’élastase même en présence de 3-oxo-C12- 2003) HSL. Pousse en présence de tétracycline (10 µg.ml -1). ∆PA1432 Mutant lasI : produit de l’élastase seulement (Jacobs et al. en présence de 3-oxo-C12-HSL. 2003) Pousse en présence de tétracycline (10 µg.ml -1).

Chapitre III : Matériel et Méthodes

∆PA3476 Mutant rhlI : produit de la pyocyanine (Jacobs et al. seulement en présence de C4-HSL. 2003) Pousse en présence de tétracycline (10 µg.ml -1). ∆PA3477 Mutant rhlR : incapable de produire de la (Jacobs et al. pyocyanine même en présence de C4-HSL. 2003) Pousse en présence de tétracycline (10 µg.ml -1).

I.2.3. Conditions de culture des bactéries avant les tests d’activités biologiques

Les souches de Rhodococcus ont été mises en culture dans le milieu liquide LB (Duchefa) à pH 7.2 avec les antibiotiques appropriés pendant 48 h sous agitation à 150 rpm à 28°C. Les souches d’ Azorhizobium caulinodans ont été mises en culture dans le milieu liquide YEB (composition Annexe 3) à pH 7 avec les antibiotiques appropriés pendant 18 h sous agitation à 150 rpm à 37°C. Les souches de Pseudomonas aeruginosa ont été mises en culture dans le milieu liquide LB contenant 10 g.l -1 de MOPS (Sigma) à pH 7.0 avec les antibiotiques appropriés pendant 18 h sous agitation à 175 rpm à 37°C.

II. Méthodes

Les recherches effectuées dans ce travail peuvent être divisées en trois parties. Pour chaque partie, différents protocoles ont été utilisés. La première partie de ce travail concerne l’étude de l’effet des extraits de Dalbergia sur l’expression des gènes responsables de la production de facteurs de virulence chez R. fascians . La deuxième partie concerne le criblage des extraits de Dalbergia pour l’inhibition de l’expression de quelques gènes responsables de la production de facteurs de virulence chez P. aeruginosa . La troisième partie concerne l’étude de l’effet de l’extrait de C. albiflorum , sur le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa

II.1. Etude de l’effet des extraits de Dalbergia sur l’expression des gènes responsables de la production de facteurs de virulence chez R. fascians

Les différentes étapes réalisées dans cette partie sont résumées dans la Figure 4.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

Etude Préliminaire 1 Comparaison des phénotypes obtenus chez Dalbergia, N. tabacum et Populus après infection avec R. fascians

Extraits méthanoliques des plantules Détermination de la condition optimale in vitro de Dalbergia et de N. tabacum 2 d’expression des gènes d’intérêt chez R. fascians (test d’activité GUS) Extraits hexaniques, dichlorométhaniques et méthanoliques 3 Criblage des extraits de Dalbergia et de N. tabacum de feuilles, d’écorces et de racines des 4 sur l’expression du gène attH (test d’activité GUS) espèces de Dalbergia (D. chlorocarpa, D. pervillei, D. trichocarpa et D. purpurascens ) récoltées in situ

4 Confirmation de l’activité de l’extrait sélectionné (extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei) en tenant compte des artéfacts microenvironementaux

5 Fractionnement des extraits et isolement du composé actif par des techniques chromatographiques couplées avec le test d’activité GUS sur l’expression du gène attH

Identification et élucidation de la structure du composé actif (perbergine) par les 6 techniques de spectrométrie de masse et de résonance magnétique nucléaire

Détermination de la concentration minimale de perbergine qui inhibe l’expression 7 du gène attH et qui n’affecte ni la croissance ni la viabilité de R. fascians

Comparaison de l’activité sur l’expression du gène attH avec celle de la daidzéine et de la génistéine

Effet sur l’expression des gènes attR, attA, fasA, pFi_065, stk1, nrp5 chez R. fascians (test d’activité GUS) Elucidation du mécanisme d’action de la perbergine 8 Effet sur l’expression de la protéine NodD, de type LysR, à travers l’expression du gène nodA chez A. caulinodans (test d’activité LacZ)

Evaluation des phénotypes chez N. tabacum lorsque celle-ci est infectée avec R. fascians traitée ou non avec la perbergine

Figure 4. Représentation schématique des différentes étapes de l’étude de l’effet des extraits et du composé isolé de Dalbergia sur l’expression des gènes responsables de la production des facteurs de virulence chez R. fascians.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

II.1.1. Etude préliminaire : Infection de N. tabacum , de P. tremula x P. tremuloïdes et des 4 espèces de Dalbergia issues de la culture in vitro

Cette procédure d’infection a été utilisée lors de l’étude préliminaire comparative des phénotypes obtenus chez les 4 espèces de Dalbergia et ceux des plantes sensibles à l’infection de R. fascians telles que N. tabacum et P. tremula x P. tremuloïdes lorsque celles-ci ont été infectées avec les souches virulente D188 et non virulente D188-5 de la bactérie. L’infection des plantules in vitro de N. tabacum, de P. tremula x P. tremuloïdes et des 4 espèces de Dalbergia a été réalisée avec des plantules âgées de 4 semaines. Chaque espèce est groupée en 4 lots de 6 plantules. Les deux premiers lots ont été directement infectés respectivement par la souche virulente D188 et la souche non virulente D188-5 de R. fascians en pleine phase de croissance . Le troisième et le quatrième lot sont également infectés respectivement avec la souche D188 et la souche D188-5 de R. fascians mais les zones à infecter ont été préalablement blessées à l’aide d’une pince. Dans tous les cas, la procédure d’infection pour les 4 lots est la suivante : après 48 h de culture, les bactéries sont récupérées par centrifugation à 3220 g puis récupérées dans du glycérol à 75 %. Par la suite, 5 µl de cette préparation sont déposés sur le méristème apical bléssé ou non des plantes de N. tabacum et les bourgeons axillaires blessés ou non des plantes de P. tremula x P. tremuloïdes et des plantes de Dalbergia . Les phénotypes obtenus sont évalués toutes les semaines.

II.1.2. Obtention des extraits et des composés actifs pour les tests d’activités biologiques

Afin d’identifier le ou les composés chimiques chez Dalbergia qui sont responsables de la résistance ou de l’atténuation de l’expression des facteurs de virulence chez R. fascians , différents types d’extractions chimiques et de fractionnements chromatographiques couplés avec des tests d’activités biologiques ont été réalisés.

II.1.2.1. Extractions chimiques

Les extractions réalisées dans cette partie peuvent être groupées en deux. Le premier concerne l’extraction des galles feuillées obtenues à partir des plantules de tabac infectées avec R. fascians pour la détermination de la condition optimale d’induction (COI) de l’expression des gènes d’intérêt étudiés chez la bactérie. Le deuxième groupe concerne les extractions réalisées avec N. tabacum et Dalbergia pour le criblage de l’activité de leurs

Chapitre III : Matériel et Méthodes extraits sur l’expression des gènes d’intérêt étudiés chez R. fascians .

a. Extraction à partir des galles feuillées

Les galles feuillées âgées de 8 semaines, issues de l’infection de N. tabacum par la souche virulente D188 de R. fascians , sont collectées puis 200 g ont été broyés à l’aide d’un mixeur dans 1 L d’eau milliQ. Après incubation à 4°C pendant une nuit sous agitation à 600 rpm, l’extrait aqueux est filtré à l’aide d’un coton pour éliminer les gros débris. Les filtrats sont récupérés dans des tubes Falcon de 50 ml puis centrifugés pendant 30 min à 3220 g à 4°C pour éliminer les petits débris. Les surnageants sont ensuite récoltés dans des boîtes Steri Vent High Model (Duchefa), congelés à -20°C puis lyophilisés. Les résidus obtenus ont été récupérés dans 50 ml d’eau milliQ. Après centrifugation pendant 15 min à 4°C à 3220 g, le surnageant est mélangé avec trois volumes de dichlorométhane. Ensuite, l’extrait aqueux est de nouveau récupéré puis transféré dans des seringues de 20 ml (Terumo) connectées à des filtres de 0.22 µm (Sartorius) pour éliminer les bactéries et les débris restants. Le filtrat récupéré peut être conservé à -20°C ou peut être directement utilisé pour la recherche des conditions optimales d’induction de l’expression des gènes de virulence chez R. fascians .

b. Extraction à partir des plantes pour les tests d’activités biologiques

b.1. Extractions réalisées sur les espèces de Dalbergia

Dans cette partie, deux types d’extractions ont été réalisés avec le matériel végétal du genre Dalbergia . Il s’agit pour le premier d’une extraction méthanolique directe des poudres de la partie aérienne des 4 espèces de Dalbergia âgées de 8 semaines et issues de la culture in vitro . Les poudres de plantes sont macérées dans le méthanol à raison de 1 g de poudre pour 10 ml de solvant. Les extraits méthanoliques obtenus ont été utilisés pour l’étude préliminaire de l’expression des gènes de virulence chez R. fascians à travers celle de attH par le test d’activité GUS. Le deuxième type est une extraction successive par des solvants de polarité croissante qui utilise différents types de solvants organiques. Ce type d’extraction a été appliqué aux poudres de feuilles, d’écorces et de racines des 4 espèces de Dalbergia récoltées in situ . Les poudres de plantes ont été macérées successivement avec de l’hexane puis du dichlorométhane et enfin du méthanol à raison de 1 g de poudre pour 10 ml de solvants. La

Chapitre III : Matériel et Méthodes procédure d’extraction est présentée dans la Figure 5. Les extraits ainsi obtenus ont été utilisés pour le criblage de leur activité sur l’expression du gène attH chez R. fascians.

Poudre de plantes

Macération avec l’hexane

Filtrat Dépôt Évaporation Macération avec le dichlorométhane Extrait hexanique

Filtrat Dépôt Évaporation Macération avec le méthanol Extrait dichlorométhanique

Filtrat Dépôt Évaporation

Extrait méthanolique

Figure 5. Représentation schématique des extractions successives par des solvants de polarité croissante.

b.2. Extractions réalisées avec N. tabacum

La partie aérienne (feuilles + tiges) des plantules saines de tabac âgées de 8 semaines issues de la culture in vitro est macérée dans le méthanol à raison de 1 g de poudre de plantes pour 10 ml de solvant. Après extraction, le solvant est évaporé et les extraits obtenus sont utilisés pour l’étude de l’expression du gène attH chez R. fascians .

b.3. Macération, évaporation et conservation

Pour les extractions citées ci-dessus, la durée de macération dans chaque solvant a été fixée à 24 h et sous agitation à 175 rpm à température ambiante. Après filtration à l’aide d’un papier filtre, chaque solution obtenue a été évaporée au rotoévaporateur (pour les solvants organiques) ou lyophilisée (pour le solvant aqueux). Les extraits récupérés ont été conservés à -20°C jusqu’à utilisation ultérieure pour les tests biologiques.

II.1.2.2. Fractionnements, isolement et purification du composé actif chez D. pervillei

Différentes techniques de chromatographie ont été utilisées pour le fractionnement,

Chapitre III : Matériel et Méthodes l’isolement et la purification des composés actifs à partir de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei . Il s’agit de la chromatographie d’adsorption, la chromatographie sur couche mince (CCM) et la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Les détails concernant la définition et le principe de chaque technique chromatographique utilisée dans ce travail sont décrits dans l’Annexe 4. Afin de sélectionner les fractions et d’identifier le ou les composés actifs, chaque étape de fractionnement chromatographique a été réalisée en parallèle avec le test d’activité GUS pour l’évaluation de l’expression du gène attH chez R. fascians . Dans ce travail sont retenus : les extraits, les fractions ou les composés isolés des plantes qui à la fois inhibent l’expression du gène attH chez R. fascians et qui n’ont pas d’effet ni sur la viabilité ni sur la croissance des bactéries. Pour s’assurer de la fiabilité des résultats, les bactéries ont été mises en culture dans une condition optimale d’induction (COI) de l’expression des gènes de virulence.

a. Fractionnements chromatographiques

Quatre étapes chromatographiques ont été réalisées.

Etape 1 : Chromatographie d’adsorption

Il s’agit du fractionnement sur colonne de l’extrait résultant de l’extraction dichlorométhanique de 3 kg de poudre d’écorces de D. pervillei . La phase stationnaire utilisée est un gel de silice normal Si60 de Merck (0.040 à 0.063 mm) préparé dans du dichlorométhane et monté sur une colonne de verre de 70 cm de hauteur et de 6 cm de diamètre. La phase mobile consiste en un gradient successif de deux systèmes de solvants réalisé comme suit : • Le premier système de solvants consiste en un gradient progressif d’un mélange dichlorométhane - acétate d’éthyle allant de (100:0) vers (0:100) avec une progression par étape de 10%. • Le deuxième système de solvants consiste en un gradient progressif d’un mélange acétate d’éthyle – méthanol allant de (100:0) vers (0:100) avec une progression par étape de 10%. Dans les deux cas, 100 ml de solvants ont été utilisés dans chaque étape de progression et la collecte de fraction s’est faite tous les 10 ml. Les fractions collectées ont été ensuite

Chapitre III : Matériel et Méthodes groupées selon leur profil chromatographique après révélation de leur distance de migration sur une plaque de chromatographie sur couche mince Si60F254 qui utilise comme système de solvant un mélange de dichlorométhane - acétate d’éthyle (9:1) avec une distance de migration de 8 cm. A l’issue de cette chromatographie, 9 fractions nommées F1 à F9 ont été obtenues et ont été ensuite évaporées puis conservées à -20°C jusqu’à utilisation ultérieure pour les tests d’activité sur l’expression du gène attH chez R. fascians .

Etape 2 : Chromatographie d’adsorption

Il s’agit du fractionnement sur colonne de la fraction F6 (9 g) qui est l’une des fractions actives issues de la première étape de fractionnement. La phase stationnaire utilisée est un gel de silice normal Si60 de Merck (0.040 à 0.063 mm) préparé dans de l’hexane puis monté sur une colonne de verre de 30 cm de hauteur et 4 cm de diamètre. La phase mobile consiste en un gradient successif de 3 systèmes de solvants décrits comme suit : • Le premier système de solvants consiste en un gradient d’un mélange hexane – dichlorométhane allant de (100:0) vers (0:100) avec une progression par étape de 10%. • Le deuxième système de solvants consiste en un gradient d’un mélange dichlorométhane – acétate d’éthyle allant de (100:0) vers (0:100) avec une progression par étape de 20%. • Le troisième système de solvants consiste en un gradient d’un mélange acétate d’éthyle – méthanol allant de (100:0) vers (0:100) avec une progression par étape de 20%. Dans les trois cas, 50 ml de solvants ont été utilisés dans chaque étape de progression et la collecte de fraction s’est faite tous les 10 ml. Les fractions collectées ont été ensuite groupées selon leur profil chromatographique après révélation de leur distance de migration sur une plaque de chromatographie sur couche mince Si60F 254 qui utilise comme système de solvants un mélange de dichlorométhane – acétate d’éthyle – acide acétique (9:0.5:0.5) avec une distance de migration de 8 cm. Par la suite, 17 fractions nommées F6-1 à F6-17 ont été obtenues. Ces fractions ont été évaporées puis conservées à -20°C jusqu’à utilisation ultérieure pour les tests sur l’expression du gène attH chez R. fascians .

Chapitre III : Matériel et Méthodes

Etape 3 : Chromatographie préparative sur couche mince (CCM)

Il s’agit du fractionnement de la fraction F6-6 (72 mg) qui est l’une des fractions actives issues de la deuxième étape de fractionnement de l’extrait d’écorces de D. pervillei sur une plaque chromatographique préparative (20 x 20 cm). La phase stationnaire utilisée est un gel de silice Si60F 254 et la phase mobile est un mélange d’hexane – dichlorométhane – acétate d’éthyle – acide acétique (5:3:1:0.5). La quantité d’extrait chargée par plaque était de 15 mg et la distance de migration a été fixée à 18 cm. Après migration, chaque tache observée à l’œil nu et sous UV à 254 et 365 nm a été grattée séparément, dissoute dans du méthanol, centrifugée. Les surnageants sont ensuite récupérés puis évaporés et les résidus obtenus sont conservés à -20°C jusqu’à utilisation ultérieure pour les tests sur l’expression du gène attH chez R. fascians . A l’issue de cette étape de fractionnement, 6 fractions nommées F6-6-1 à F6-6-6 ont été obtenues.

Etape 4 : Fractionnement par chromatographie liquide à haute performance (HPLC)

Il s’agit du fractionnement de la fraction active F6-6-4 (10 mg) issue de l’étape précédente. La chaine HPLC utilisée est composée d’un contrôleur Waters 600S couplé à une pompe Waters 626 pump , une colonne de phase inverse C-18 ( Atlantis, 250 x 4.6 mm; 5 µm) pour la phase stationnaire et à un détecteur Waters 996 photodiode array detector . La phase mobile est constituée d’un mélange des deux types de solvants suivants : - Le premier type, nommé solvant A, est un mélange d’eau et de 0.1% d’acide fluoroacétique, - Le second type, nommé solvant B, est un mélange d’acétonitrile et de 0.1% d’acide fluoroacétique, Les gradients de ces deux solvants ont été programmés comme suit : • Mélange de solvant A (50%) et de solvant B (50%) pendant 10 min, • Suivi d’un gradient linéaire du solvant B allant de 50% à 100% en 15 min, • Puis le solvant B maintenu à 100% pendant 5 min, • Enfin, un gradient linéaire du solvant B allant de 100% à 50% en 5 min. Pour chaque analyse, le volume de solution injecté a été de 40 µl, le débit a été maintenu à 1 ml.min -1 et chaque pic détecté à 254 nm a été collecté, évaporé et le résidu correspondant a été conservé à -20°C jusqu’à utilisation ultérieure pour les tests sur l’expression du gène attH chez R. fascians et l’élucidation de la structure chimique.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

b. Isolement et purification de la fraction active

La fraction active F6-6-4-9 représentée par le pic majoritaire de la fraction F6-6-4 qui sort à 19.8 min avec la condition HPLC décrite précédemment a été collectée séparément puis réinjectée sur HPLC avec la même condition pour vérifier sa pureté. Suite à cette étape de purification, 5 mg de la fraction F6-6-4-9 (composé actif) ont été obtenus. La fraction a été conservée à -20°C avant l’étape d’identification et d’élucidation de la structure du composé majoritaire.

b.1. Identification et élucidation structurale du composé actif

Afin d’élucider la structure chimique du composé actif, la fraction active F6-6-4-9 (5 mg) a été analysée en utilisant la technique de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et la spectrométrie de masse. Les principes de fonctionnement de ces deux techniques sont détaillés dans l’Annexe 5.

b.1.1. La RMN

La définition et le principe de la RMN sont détaillés dans l’Annexe 5. La fraction F6-6-

4-9 (5 mg) a été dissoute dans 0.5 ml de chloroforme deutéré (CDCl 3) et les spectres RMN ont été enregistrés à l’aide des appareils Bruker Avance 300 MHz et Varian 600MHz. Les différents spectres RMN enregistrés sont les suivants : - La RMN monodimensionnelle (RMN – 1D) o La RMN proton ( 1H), o La RMN carbone ( 13 C) : Broadband et DEPT 135 - La RMN bidimensionnelle (RMN – 2D) o COSY ( 1H – 1H) o HQSC ( 1JH – C) o HMBC ( 2JH – C, 3JH – C)

b.1.2. La spectrométrie de masse

La définition et le principe de la spectrométrie de masse sont décrits en détail dans l’Annexe 6. Après la RMN, la fraction F6-6-4-9 est dissoute dans du méthanol contenant 0.1 % d’acide acétique puis injectée dans un spectromètre de masse pour la détermination de

Chapitre III : Matériel et Méthodes sa masse et l’acquisition de son spectre de masse. La spectrométrie de masse a été réalisée en utilisant le système de chromatographie liquide (LC) qui utilise l’appareil Agilent 1200 Series Rapid Resolution équipé d’une pompe ( Binary pump SL ), d’un dégazeur, d’un injecteur automatique ( ALS SL ), d’un compartiment de colonne thermostatisé ( TCC ) et d’un détecteur (Diode Array Detector SL ) couplé avec l’appareil de spectrométrie de masse Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS équipé d’une source électropulvérisateur (ESI). Une colonne de phase inverse C-18 ( Agilent Zorbax, 150 x 4.6 mm; 5 µm) a été utilisée comme phase stationnaire. Pour la phase mobile, un gradient linéaire d’un mélange de méthanol avec 0,1% d’acide acétique (solvant A) et de l’eau avec 0,1% d’acide acétique (solvant B) allant de 25% de A à 100% de A pendant 3 min, suivi de 100% de A maintenu pendant 9 min suivi d’un gradient linéaire de 100% de A à 25% de A en 1 min et enfin 25% de A maintenu pour 1 min avec un débit de 0.4 ml.min -1 a été utilisé. En sortant du système de chromatographie liquide, la fraction analysée est dirigée directement vers le spectromètre de masse par mode de vaporisation positive. Les paramètres suivants sont utilisés pour acquérir les données : - le voltage capillaire du vaporisateur est fixé à 3500 V et la fragmentation à 125 V, - la pression du liquide nébuliseur est fixée à 50 psi, - le débit de l’azote pour le séchage est fixé à 11 L.min -1, - la température de séchage à 325°C.

Les ions compris entre m/z 100 et 1000 ont été scannés à un rythme de 1 s par scan. Les spectres issus de la spectrométrie de masse et de la RMN sont combinés pour élucider la structure des molécules actives.

II.1.3. Préparation des échantillons pour les tests d’activités biologiques

Les conditions de préparation des échantillons utilisés pour le test d’activité GUS sont les suivantes. Les extraits méthanoliques issus de la partie aérienne des 4 espèces de Dalbergia et de N. tabacum âgées de 8 semaines et cultivées in vitro sont préparés de telle sorte que le poids des extraits qui correspond chacun à 0.2 g de poudre de plantes soit dissout dans 1 ml de DMSO. Les solutions obtenues ont été utilisées pour le criblage de leur activité sur l’expression du gène attH chez R. fascians . Les extraits hexaniques, dichlorométhaniques et méthanoliques d’écorces, de feuilles et de racines des 4 espèces de Dalbergia ont été préparés de la même manière que précédemment et les solutions obtenues ont été utilisées pour le criblage de leur activité sur

Chapitre III : Matériel et Méthodes l’expression du gène attH chez R. fascians . Les fractions ainsi que le composé isolé de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei sont dissouts dans du DMSO de telle sorte que le rapport entre la concentration de départ (c'est-à-dire l’équivalent de 0.2 g de poudre de plante par ml de DMSO) soit respecté. Les solutions obtenues ont été utilisées pour le fractionnement bioguidé des extraits actifs sur l’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians . La perbergine (composé actif isolé de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei ) a été dissoute dans du DMSO et testée à différentes concentrations finales de 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 5 et 10 µM dans la suspension bactérienne mise dans la COI afin de déterminer sa concentration minimale d’inhibition de l’expression du gène attH qui n’affecte ni la croissance ni la viabilité de R. fascians . La perbergine à la concentration finale de 0.2 µM a été ajoutée dans des suspensions bactériennes mises sous COI pour évaluer son effet sur l’expression des autres gènes impliqués ou non dans la production des facteurs de virulence de R. fascians à savoir les gènes attR, attA, fasA, pFi_065, stk1 et nrp5 . La perbergine à la concentration finale de 0.2 µM a également été ajoutée dans la suspension bactérienne mise sous COI à différents moments de l’incubation, c'est-à-dire au début ou après 4, 8 et 16 h d’incubation pour évaluer l’effet tardif de l’ajout de la perbergine sur l’expression du gène attH . Deux isoflavonoïdes standard disponibles sur le marché, à savoir la génistéine (Sigma) et la daidzéine (Sigma) dont les structures chimiques sont présentées dans la Figure 6, ont été préparés dans du DMSO et testés à une concentration finale de 0.2 µM dans la suspension bactérienne mise dans la COI. Le but de l’utilisation de ces deux isoflavonoïdes était de deux ordres. Le premier était d’étudier la relation entre la structure et l’activité de la perbergine. En effet, ces deux isoflavonoïdes possèdent les mêmes structures de base que la perbergine car elles font toutes partie du groupe des isoflavanones (Figure 6). La différence qui existe entre ces composés chimiques se trouve au niveau du nombre et de la répartition des groupements hydroxyle et méthyle mais également la présence ou non du groupement prényle. Dans ce cas, si ces isoflavonoïdes sont tous actifs, alors il est probable que l’activité pourrait être due à la structure de base des isoflavanones. Sinon, l’activité pourrait être due soit à la présence ou non du groupement prényle, soit à la position des groupements hydroxyle et/ou méthyle, soit les deux. Le deuxième objectif était d’obtenir une quantité suffisante de composé actif, c'est- à-dire que si ces isoflavonoïdes sont tous actifs, il serait plus facile de continuer les expériences avec des molécules qui sont disponibles sur le marché.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

HO O HO O 8 9 O 7 2 A C 2' 3 1' 6 10 3' 5 4 B OH O O OH OH O 6' 4' 5' Genistéine Daidzéine Structure de base des isoflavanones

Figure 6. Structures chimiques de la génistéine et de la daidzéine

Dans tous les cas, le DMSO a été utilisé comme contrôle pour tenir compte de son effet sur l’expression des gènes étudiés mais également sur les mesures spectrophotométriques. Pour le test d’activité GUS en général, 10 µl de préparation ont été ajoutés dans les puits contenant les suspensions bactériennes mises dans la COI pour maintenir une concentration en DMSO de 1 %. Pour chaque condition, trois répétitions ont été effectuées. Les blancs ont également été respectés. Les cultures sont ensuite incubées à 28°C sous agitation à 150 rpm pendant 24 h.

II.1.4. Les tests d’activités biologiques

Cette partie décrit en détails les différents tests d’activités biologiques utilisés lors de l’étude de l’expression des gènes de virulence chez R. fascians .

II.1.4.1. Test d’activité GUS ( β-D-glucuronidase)

Le test d’activité GUS a été utilisé pour étudier l’expression des gènes attH, attA, attR, fasA, pFi_065, stk1 et nrp5 chez R. fascians respectivement avec les souches rapportrices D188::pTGGUSDV1, D188::pUCGUSTM1, D188::pSPGUSTM2, D188::pUCWT1, D188::pSP72AFGUSCm, D188::pSP stk1 IF1 et D188::pUC8bGUS (Tableau 1). Ce test a également servi pour guider en parallèle le fractionnement et l’isolement du composé actif dans l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei qui inhibe ou atténue l’expression des gènes impliqués dans les mécanismes de virulence chez R. fascians . Le principe du test d’activité GUS ainsi que la composition des tampons et des substrats utilisés dans ce travail sont détaillés dans l’Annexe 7.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

a. Préparation des bactéries pour le test d’activité GUS

Après 48 h de croissance dans 20 ml de milieu liquide LB, les bactéries ont été collectées par centrifugation à 3220 g pendant 5 min. Chaque culot est ensuite récupéré dans 10 ml de milieu de culture minimum appelé « JM medium » (composition voir Annexe 7). Cette dernière étape est répétée deux fois pour éliminer le reste de milieu LB de départ. A la fin du lavage, le culot est récupéré dans du JM medium pour atteindre une densité bactérienne à 600 nm comprise entre 0.4 et 0.5. Cette suspension bactérienne est ensuite distribuée dans les plaques de 24 puits (Greiner Bioone) à raison de 850 µl par puits pour les tests ultérieurs. Pour le test proprement dit, 10 µl d’échantillons préparés dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) sont ajoutés dans les puits contenant les suspensions bactériennes.

b. Détermination de la condition optimale d’induction (COI)

Toutes les expériences sur l’étude de l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence de R. fascians ont été réalisées dans la condition COI avec ou sans les échantillons étudiés (c’est-à-dire des extraits, des fractions ou des composés actifs issus des plantes). Il en est de même pour l’étude de l’expression des gènes non impliqués dans la virulence de R. fascians . La détermination de la COI chez R. fascians a été réalisée avec la souche D188::pTGGUSDV1. La COI est définie comme la condition où l’expression du gène attH est maximale et où la croissance des bactéries n’est pas affectée. Afin de déterminer ces conditions , les différentes conditions décrites dans le Tableau 2 basées sur des travaux précédents (Maes et al. 2001) ont été utilisées. Pour chaque condition, 4 répétitions ont été effectuées et les cultures sont incubées à 28°C sous agitation à 150 rpm pendant 24 h. Une fois la COI définie, cette condition a été gardée pour l’étude de l’expression des autres gènes chez R. fascians . Les suspensions bactériennes mises sous la COI ont été utilisées pour les contrôles. Pour tenir compte de l’effet de la coloration des extraits ou des produits qui peuvent influencer les mesures spectrophotométriques, des volumes équivalents de JM medium contenant les différents produits utilisés sans les bactéries ont été utilisés pour servir de « Blanc ».

Chapitre III : Matériel et Méthodes

Tableau 2. Différentes compositions de milieux de culture pour la détermination de la condition optimale d’induction de l’expression du gène attH chez R. fascians .

Pyruvate Histidine Extrait de galles Eau distillée Condition (mM) (mM) feuillées (µl) (µl) C1 - - - 40 C2 10 - - 30 C3 - 10 - 30 C4 - - 10 30 C5 10 10 - 20 C6 10 - 10 20

c. Mesure de la densité bactérienne

Après 24 h d’incubation, la densité optique (DO) bactérienne est mesurée à 600 nm dans une plaque à 96 puits avec 200 µl de suspension bactérienne par puits. La différence entre les valeurs de la DO à 600 nm des suspensions bactériennes et les blancs constitue la valeur réelle de la densité bactérienne. Dans cette étude, les valeurs de la densité bactérienne obtenues sont converties en pourcentage et la densité optimale (100 %) est attribuée aux bactéries mises dans la COI (contrôle).

d. Mesure de l’activité GUS

Après la mesure de la densité bactérienne, 500 µl de suspensions bactériennes sont centrifugés à 16000 g pendant 1 min. Le surnageant est éliminé et le culot est récupéré dans 500 µl de tampon phosphate (voir Annexe 7 pour la composition), 30 µl de chloroforme et 1 µl de substrat pNPG ( para -nitrophényl-β-D-glucuronide) ou MUG (4-méthylumbelliféryl-β- D-glucuronide) à 1 M. Après passage au vortex, le tout est incubé pendant 20 min à 37°C, puis la réaction GUS est stoppée en ajoutant 200 µl de solution aqueuse de 2-amino-2méthyl- 1,3-propanediol à 105 mg.ml -1. Après centrifugation à 16000 g, le surnageant est récupéré puis dilué 4 fois avec de l’eau distillée. Pour le substrat pNPG, l’intensité de la coloration qui représente l’activité GUS est mesurée à 405 nm dans les plaques 96 puits à partir de 200 µl de réaction. Pour le substrat MUG, l’intensité de la fluorescence qui représente l’activité GUS est mesurée avec une excitation à 365 nm et une émission à 450 nm dans les plaques 96 puits à fond noir OptiPlate TM -96 F (PerkinElmer). Des blancs ont été mesurés pour exclure la

Chapitre III : Matériel et Méthodes fluorescence liée à l’autodégradation du MUG ou la fluorescence des échantillons. Il s’agit de la mesure de la fluorescence des échantillons sans le MUG et la fluorescence du MUG sans les échantillons. L’activité GUS est calculée selon la formule suivante :

DO × 4 Activité GUS = 20 × DO DO 405 : Absorbance du p-nitrophénol L’activité MUG est calculée selon la formule suivante :

Em × 4 Activité MUG = 20 × DO Em 450 : Intensité de fluorescence du 4-méthylumbelliférol

Dans cette étude, l’activité GUS et l’activité MUG sont converties en pourcentages et l’activité optimale (100 %) est attribuée aux bactéries mises dans la COI (contrôle).

e. Critères de sélection des extraits lors du criblage

e.1. Définition des limites de sélection

Durant le criblage, deux limites ont été considérées afin de sélectionner le ou les extraits actifs. En effet, les extraits qui à la fois diminuent à plus de 80 % l’expression du gène attH (c'est-à-dire activité GUS en-dessous de la barre de 20 %) et n’affectent pas la croissance à plus de 20 % (c'est-à-dire la densité bactérienne au-dessus de la barre de 80 %) ont été retenus.

e.2. Vérification de l’effet de l’extrait sélectionné sur l’activité de l’enzyme β-glucuronidase

Afin de vérifier si la diminution de l’activité GUS n’est pas due à la dégradation ou à l’inhibition de l’enzyme β-glucuronidase par l’extrait sélectionné, la souche D188::pTGGUSDV1 de R. fascians a été mise en culture dans la COI. Après 24 h d’incubation, les cellules sont cassées à l’aide du MagNA Lyser pour libérer l’enzyme β- glucuronidase. Le surnageant est ensuite récupéré par centrifugation et l’extrait sélectionné y est ajouté à la même concentration que pendant le test d’activité GUS normal. L’activité GUS a été mesurée après 6 et 24 h d’incubation.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

e.3. Confirmation de l’activité de l’extrait sélectionné

Pour confirmer l’effet général de l’extrait sélectionné, les artéfacts microenvironementaux ont été pris en compte. Ainsi, des extractions séparées à partir de différents pieds de l’espèce sélectionnée ont été réalisées. Dans le cadre de ce travail il s’agit de l’extrait dichlorométhanique d’écorces issu de 5 pieds différents de D. pervillei . La procédure d’obtention de chaque extrait a suivi le protocole décrit dans la Figure 5. Les extraits obtenus ont été utilisés pour le test d’activité GUS.

f. Présentation des résultats et analyses statistiques

Les résultats obtenus pour les tests d’activité GUS et les tests d’activité MUG ont été présentés sous forme d’histogrammes à deux axes. L’axe des ordonnées à gauche représente l’activité GUS exprimée en pourcentages dont le maximum d’activité à 100 % représentent les résultats obtenus avec les bactéries mises en culture dans la COI. L’axe des ordonnées à droite représente la densité bactérienne exprimée en pourcentages après mesure de la DO à 600 nm. Les valeurs de la densité bactérienne estimées à 100 % sont obtenues avec les bactéries mises dans la COI. L’axe des abscisses représente les échantillons testés. Chaque test a été réalisé en 3 répétitions et les résultats obtenus sont représentés par des histogrammes représentant les moyennes de chaque répétition avec les déviations standard correspondantes. L’analyse statistique des résultats a été réalisée avec le test t de Student . La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle, si elle existe, est marquée par un astérisque.

II.1.4.2. Test d’activité LacZ ( β-galactosidase)

Dans cette partie, le test d’activité LacZ a été utilisé pour l’étude de l’expression de la protéine NodD de type LysR A. caulinodans en présence ou en absence de la perbergine. Dans le cadre de cette étude, l’expression de NodD a été évaluée à travers l’expression du gène nodA avec la souche ORS571::pRG290-12::T20 d’ A. caulindans (Tableau 1). En effet, l’expression du gène nodD est induite par la naringénine et son activation induit l’expression de nodA . Dans ce cas, si la perbergine inhibe l’expression de nodD même en présence de la naringénine, alors le gène nodA ne sera pas exprimé. L’expression du gène hemA avec la souche ORS571::pXLGD4 a été utilisée comme contrôle car son expression est constitutive et ne dépend pas de la protéine NodD. Le principe du test d’activité LacZ ainsi que les compositions des tampons et du substrat

Chapitre III : Matériel et Méthodes utilisés dans ce travail sont détaillés dans l’Annexe 8.

a. Préparation des souches bactériennes pour le test

Après 18 h de culture des souches ORS571::pRG290-12::T20 et ORS571::pXLGD4 d’ Azorhizobium (Tableau 1) dans le milieu YEB avec les antibiotiques appropriés, la suspension bactérienne est diluée 50 fois puis après 1 h, 20 µM de naringénine sont ajoutés dans le milieu. Cette condition est considérée comme la condition optimale de l’expression des gènes d’intérêt. Pour le test, 10 µl de perbergine dissoute dans du DMSO, équivalent à une concentration finale de 0.2 µM, sont ajoutés dans la suspension bactérienne. Une autre condition sans la naringénine ni la perbergine a également été considérée afin de vérifier l’effet inducteur de la naringénine.

b. Mesure de la densité bactérienne

Après 18 h d’incubation des souches d’ A. caulinodans avec ou sans la naringénine et/ou la perbergine, 50 µl de suspension sont dilués 4 fois avec de l’eau milliQ et la turbidité est mesurée à 600 nm.

c. Mesure de l’activité LacZ avec les souches d’ A. caulinodans

Après 18 h d’incubation des souches d’ A. caulinodans avec ou sans la naringénine et/ou la perbergine, 200 µl de suspension sont prélevés puis centrifugés et le culot est récupéré dans le tampon de perméabilisation avec 0.1 % de Triton X-100. Ensuite, 1 mg.ml -1 de substrat oNPG a été ajouté et lorsque la coloration jaune s’est bien développée, mais n’est pas encore saturée, la réaction est stoppée avec 1 M de Na 2CO 3. Après centrifugation, l’ ortho -nitrophénol est quantifié à 414 nm et l’activité LacZ est calculée avec la formule suivante :

DO 414 × 1000 Activité LacZ (Unité Miller) = DO 600 × DO 420 : absorbance de l’ o-nitrophénol,

DO 600 : densité bactérienne, t : temps d’incubation de la réaction en minutes.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

d. Analyse statistique des résultats

Chaque test a été réalisé en 3 répétitions et l’analyse statistique des résultats a été réalisée avec le test t de Student . La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle (COI) a été tenue en compte.

II.1.4.3. Etude de la viabilité de R. fascians

Le test de viabilité a été réalisé avec le kit de viabilité Bac light TM L-7012 (Molecular Probes Inc.) qui utilise deux marqueurs à savoir le SYTO 9 (3.34 mM) et l’iodure de propidium (20 mM) qui déterminent respectivement les bactéries vivantes et mortes. La technique utilisée suit le protocole décrit dans le manuel d’utilisation du kit. Le principe de ce test ainsi que la technique utilisée pour la construction de la droite étalon qui permet de quantifier le rapport entre les bactéries mortes et vivantes sont détaillés dans l’Annexe 9. Dans cette partie, le test de viabilité a été réalisé avec la souche D188::pTGGUSDV1 de R. fascians . Après 48 h de croissance dans le milieu LB, la suspension bactérienne est préparée de la même manière que celle décrite dans le Chapitre III – II.1.4.1.a et la perbergine est ajoutée à différentes concentrations finales, à savoir 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 5 et 10 µM. Ces concentrations ont été calculées à partir de la valeur de la masse molaire de la perbergine. Après incubation pendant 24 h, la suspension bactérienne est centrifugée puis récupérée dans le même volume d’eau milliQ et 100 µl de ces suspensions sont ajoutés dans la plaque 96 puits à fond noir OptiPlate TM -96 F (PerkinElmer). Après l’ajout de 100 µl de marqueurs (voir Annexe 9 pour la préparation des marqueurs) dans chaque puits, l’intensité de fluorescence qui représente les bactéries vivantes et mortes est mesurée après une excitation à 480 nm et une émission respectivement à 530 nm (SYTO 9) et 630 nm (Iodure de propidium). La formule utilisée pour la détermination du rapport entre les bactéries vivantes et mortes est décrite dans l’Annexe 9.

II.1.4.4. Etude de la croissance chez R. fascians

Cette partie permet de déterminer si l’inhibition de l’expression des gènes étudiés est liée à une perturbation de la croissance de la bactérie. Après 48 h de croissance dans le milieu LB, la suspension bactérienne de la souche D188 de R. fascians est préparée de la même manière que celle décrite dans le Chapitre III – II.1.4.1.a et la perbergine est ajoutée à différentes concentrations finales, à savoir 0, 0.2, 1, 5 et 10 µM. Ensuite les cultures ont été incubées à 28°C sous agitation à 175 rpm et la densité

Chapitre III : Matériel et Méthodes optique a été mesurée à 600 nm toutes les 2 h sur une période de 30 h. Chaque test a été réalisé en 3 répétitions.

II.1.4.5. Analyse in planta de l’expression des gènes de virulence chez R. fascians

L’objectif ciblé dans cette partie est de montrer si l’expression des gènes attH, fasA et nrp5 est affectée in planta pendant la période d’infection des plantules de D. pervillei par R. fascians . Ainsi, les plantules de tabac et de D. pervillei âgées de 4 semaines ont été groupées en 3 lots de 5 plantules. Le premier lot est infecté avec 5 µl de mélange de la souche sauvage D188 avec la souche D188::pTGGUSDV1 dans une proportion de [1:5] préparés dans du glycérol à 75 %. Le deuxième lot est infecté par 5 µl de mélange de D188 et de D188::pUCWT1 préparé de la même manière. Le troisième lot est infecté par 5 µl de mélange de la souche D188 avec D188::pUC8bGUS toujours avec la proportion de [1:5] dans 75 % de glycérol. Dans tous les cas, la partie infectée est le bourgeon axillaire. Après 10 jours d’infection, les galles feuillées formées chez le tabac et la section de la zone infectée chez D. pervillei ont été collectées. Le poids approximatif de matériel collecté pour chaque lot est de 200 mg. Chaque matériel collecté est broyé dans 500 µl d’eau stérile dans des tubes Eppendorf. Ensuite, 50 µl ont été prélevés pour l’évaluation de la CFU (nombre de colonies formées) à travers une série de dilutions 10 fois dans le milieu liquide LB. 50 µl de chaque série de dilutions sont étalés sur un milieu solide LB avec (pour déterminer la CFU totale) ou sans le chloramphénicol (pour déterminer la CFU des souches rapportrices). D’autre part, 100 µl du broyat ont été utilisés pour évaluer l’activité GUS en utilisant le MUG comme substrat. L’intensité de la fluorescence qui représente l’activité GUS est mesurée après excitation à 365 nm et mesure de l’émission à 450 nm toutes les 20 min pendant une période de 6 h. Des blancs ont été mesurés pour exclure la fluorescence liée à l’autodégradation du MUG ou la fluorescence des échantillons. L’expression de chaque gène est calculée comme étant le rapport entre la fluorescence et le nombre de CFU compté sur le milieu solide LB contenant du chloramphénicol. Chaque test a été réalisé en 3 répétitions et l’analyse statistique des résultats a été réalisée avec le test t de Student . La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle (COI) a été prise en compte.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

II.1.4.6. Infection des graines de tabac avec la souche de R. fascians traitée ou non avec la perbergine

Cette partie vise à évaluer le degré d’agressivité in vivo de R. fascians en fonction des différents traitements avec la perbergine sur une plante sensible à la bactérie ( N. tabacum ). L’expérience a été réalisée avec des graines de N. tabacum en phase de germination après une semaine de mise en culture in vitro . Les graines ont été groupées en 4 lots de 16 graines et l’expérience a été répétée 3 fois. Le premier lot est infecté avec 5 µl de la souche D188 de R. fascians mise en suspension dans du glycérol à 75% comme décrit ci-dessus. Le deuxième lot est infecté avec 5 µl de la souche D188 de R. fascians préalablement incubée dans une solution finale de perbergine à 0.2 µM avant la mise en suspension dans le glycérol à 75 % (D188-In). Le troisième lot est infecté avec 5 µl de la souche D188 de R. fascians mise en suspension dans du glycérol à 75 % contenant de la perbergine à 0.2 µM (D188-P) au moment de l’infection. Le quatrième lot est infecté avec 5 µl de la souche avirulente D188-5 de R. fascians mise en suspension dans du glycérol à 75 %. Les phénotypes observés sont évalués toutes les semaines pendant 7 semaines. Trois types de phénotypes ont été étudiés à savoir le développement des cotylédons, l’activité du méristème via la production de feuilles et la formation de galles feuillées. Le développement des cotylédons a été évalué sur base de la mesure de la surface cotylédonaire. Cette mesure a été réalisée avec le logiciel Photoshop après avoir pris les photos des plantules avec les échelles appropriées. Les valeurs obtenues sont ensuite groupées en catégories afin de déterminer la distribution des surfaces pour chaque lot infecté. Ensuite, afin de mesurer l’activité du méristème, le nombre de feuilles formées par chaque plantule dans chaque lot a été compté toutes les semaines. Enfin, pour la mesure de la formation de galles feuillées, les phénotypes des plantules ont été observés à la loupe binoculaire et le nombre de galles feuillées formées a été compté toutes les semaines. Dans cette étude, chaque expérience a été réalisée en 3 répétitions.

II.2. Criblage des extraits de Dalbergia pour l’inhibition de l’expression de quelques gènes responsables de la production de facteurs de virulence chez P. aeruginosa

Les différentes étapes réalisées dans cette partie sont résumées dans la Figure 7.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

Extraits méthanolique de feuilles, d’écorces et de racines de plantes de Dalbergia récoltées in situ 1

Extraits à polarité croissante de feuilles de D. trichocarpa et de D. pervillei 2

Criblage des extraits de Dalbergia pour l’inhibition de l’expression des gènes lasB et rhlA chez P. aeruginosa Détermination de la concentration maximale des (test d’activité LacZ) extraits dichlorométhanique et hexanique de feuilles de D. trichocarpa qui inhibe l’expression des 3 gènes lasB et rhlA et qui n’affecte pas la croissance de P. aeruginosa

Fractionnement de l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa couplé avec le test d’activité LacZ 4 sur l’expression du gène lasB et la mesure de la production de pyocyanine chez P. aeruginosa

Figure 7. Représentation schématique des différentes étapes de criblage des extraits de Dalbergia pour l’inhibition de l’expression de gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence chez P. aeruginosa.

II.2.1. Obtention des extraits et des fractions pour les tests d’activités biologiques

II.2.1.1. Extractions chimiques à partir des plantes de Dalbergia pour les tests d’activités biologiques

Dans cette partie, deux types d’extraction ont été réalisés. Il s’agit pour le premier d’une extraction méthanolique directe des poudres d’écorces, de feuilles et de racines issues des 4 espèces de Dalbergia collectées in situ . Le deuxième type d’extraction a été appliqué avec le matériel végétal sélectionné à partir des résultats des tests d’activités biologiques issus du premier type d’extraction. Il s’agit d’une extraction successive de feuilles de D. pervillei et de D. trichocarpa par des solvants de polarité croissante (Figure 5). Dans les deux cas, les poudres de plantes sont macérées dans chaque solvant à raison de 1 g de poudre pour 10 ml de solvant. Les extraits obtenus ont été utilisés pour le criblage de leur activité sur l’expression des gènes lasB et rhlA chez P. aeruginosa à l’aide du test

Chapitre III : Matériel et Méthodes d’activité LacZ respectivement avec les souches PAO1::p β01 et PAO1::p β02 (Tableau 1).

II.2.1.2. Fractionnement de l’extrait actif

Il s’agit d’une première étape de fractionnement de l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa. La technique de chromatographie utilisée est la CCM préparative (20 x 20 cm) utilisant comme phase stationnaire le gel de silice Si60F 254 et comme phase mobile un mélange hexane – acétate d’éthyle (7:3). La quantité d’extrait chargée par plaque était de 15 mg et la distance de migration a été fixée à 18 cm. A l’issue de ce fractionnement, 25 fractions nommées Ft1 à Ft25 ont été obtenues et après évaporation, ces fractions ont été conservées à -20°C jusqu’à utilisation ultérieure pour les tests sur l’expression des gènes lasB et rhlA chez P. aeruginosa .

II.2.2. Préparation des échantillons à tester

Les extraits méthanoliques des espèces de Dalbergia sont préparés de la même manière que décrit dans le Chapitre III – II.1.3 (c'est-à-dire l’équivalent de 0.2 g de poudre par ml de DMSO). Pour évaluer l’effet de ces extraits sur l’expression des gènes lasB et rhlA chez P. aeruginosa , 10 µl de chaque échantillon sont ajoutés dans les puits contenant les suspensions bactériennes. Les extraits hexanique, dichlorométhanique et méthanolique de feuilles de D. trichocarpa sont dissouts dans du DMSO de telle sorte que pour 10 µl d’échantillon ajoutés dans la suspension bactérienne, la concentration finale en extrait est de 100, 200, 300 et 400 µg.ml -1. Ces différentes concentrations ont été testées pour déterminer la concentration maximale en extrait brut qui inhibe l’expression des gènes lasB et rhlA sans affecter la croissance de la bactérie. Une fois déterminée, cette concentration va servir de référence de base pour la préparation de ses fractions pendant les prochaines étapes bioguidées de fractionnement. Les fractions de l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa issues de la CCM préparative sont dissoutes dans du DMSO de telle sorte que pour 10 µl d’échantillons ajoutés dans la suspension bactérienne, la concentration finale en extrait représente l’équivalent de 200 µg.ml -1 de l’extrait total. Les solutions préparées ont été testées pour leur activité sur l’inhibition de l’expression du gène lasB chez P. aeruginosa . Dans toutes les expériences, l’incubation s’est faite à 37°C sous agitation à 175 rpm pendant 18 h. A chaque fois, des blancs ont été ajoutés pour évaluer l’effet de la couleur de

Chapitre III : Matériel et Méthodes l’extrait lors de la mesure des densités optiques.

II.2.3. Tests d’activités biologiques

Deux types de tests ont été utilisés dans cette partie à savoir le test d’activité LacZ et la quantification de la production de pyocyanine.

II.2.3.1. Test d’activité LacZ

Dans cette partie, le test d’activité LacZ a été utilisé pour l’étude de l’expression des gènes lasB et rhlA chez P. aeruginosa respectivement avec les souches rapportrices PAO1::p β01 et PAO1::p β02 (Tableau 1). Le test a servi pour le criblage et pour détecter les fractions actives dans l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa . Le principe du test d’activité LacZ ainsi que les compositions des tampons et du substrat utilisés dans ce travail sont détaillés dans l’Annexe 8.

a. Préparation des souches bactériennes pour le test

Après croissance pendant 18 h dans le milieu LB contenant du MOPS avec les antibiotiques appropriés, les souches de Pseudomonas contenant le gène qui code la β-D- galactosidase décrites dans le Tableau 1 sont récupérées dans un nouveau milieu frais de la même nature. La densité bactérienne à 600 nm est ajustée entre 0.02 et 0.03 et les suspensions bactériennes sont distribuées dans les plaques à 24 puits à raison de 1 ml par puits. Cette condition est considérée comme la condition optimale d’expression des gènes impliqués dans le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa. Pour le test proprement dit, 10 µl d’échantillons préparés dans du DMSO sont ajoutés dans les puits contenant les suspensions bactériennes

b. Mesure de la densité bactérienne

Pour les différentes souches de Pseudomonas, après 8 et 18 h d’incubation, la suspension bactérienne est diluée deux fois avec de l’eau milliQ et la densité optique (DO) bactérienne est mesurée à 600 nm dans une plaque à 96 puits avec 200 µl de suspension par puits. La différence entre les valeurs de la DO à 600 nm des suspensions bactériennes et les blancs constitue la valeur réelle de la densité bactérienne.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

c. Mesure de l’activité LacZ avec les souches de P. aeruginosa

Après la mesure de la densité bactérienne, 100 µl de suspension bactérienne sont dilués 4, 8 et 16 fois dans un tampon de perméabilisation (voir Annexe 8 pour la composition) dans les plaques de 96 puits. Après 15 min d’incubation, 20 µl de chacune des dilutions sont transférés dans une autre plaque de 96 puits contenant 120 µl de substrat oNPG ( ortho - nitrophényl-β-D-galactoside) [voir Annexe 8 pour la composition du substrat]. La réaction est incubée entre 5 et 60 min à 37°C selon la vitesse de la réaction. Cette dernière est ensuite stoppée avec 150 µl de solution de Na 2CO 3 à 1 M. L’intensité de la coloration, qui représente l’activité LacZ, est mesurée avec 200 µl de réaction à 420 et 550 nm dans les plaques 96 puits. L’activité LacZ est calculée selon la formule suivante :

DO - 1.75× 420 DO Activité LacZ Unité Miller =1000× t ×v×d×DO DO 420 : absorbance de l’ o-nitrophénol,

DO 550 : mesure des débris cellulaires qui, multipliée par 1.75, donne une valeur approximative de l’impact de ces débris cellulaires sur l’absorbance à 420 nm (Miller, 1972), t = temps d’incubation de la réaction en minutes, v = volume de la suspension bactérienne en ml, d = facteur de dilution,

DO 600 : Densité bactérienne.

d. Présentation des résultats et analyses statistiques

Dans cette partie, les résultats obtenus pour les tests d’activité LacZ ont été présentés sous forme d’histogrammes à deux axes. L’axe des ordonnées à gauche représente l’activité LacZ exprimée en pourcentages dont le maximum d’activité à 100 % représentent les résultats obtenus avec les bactéries mises en culture dans la COI. L’axe des ordonnées à droite représente la densité bactérienne exprimée en pourcentages après mesure de la DO à 600 nm. Les valeurs de la densité bactérienne estimées à 100 % sont obtenues avec les bactéries mises dans la COI. L’axe des abscisses représente les échantillons testés. Chaque test a été réalisé en 4 répétitions et les résultats obtenus sont représentés par des histogrammes représentant les moyennes des répétitions avec les déviations standard correspondantes. L’analyse statistique des résultats a été réalisée avec le test t de Student et la différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle a été considérée.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

II.2.3.2. Etude de la production de pyocyanine

La quantification de la production de pyocyanine a été réalisée avec la souche sauvage PAO1 de P. aeruginosa (Tableau 1) en présence ou en absence des fractions de l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa .

a. Préparation de la suspension bactérienne pour le test

Après croissance pendant 18 h dans le milieu LB contenant du MOPS (1%), la souche sauvage PAO1 de P. aeruginosa est récupérée par centrifugation à 3220 g et est resuspendue dans du LB MOPS. La densité bactérienne à 600 nm est ajustée entre 0.02 et 0.03 et les suspensions bactériennes sont distribuées dans les plaques à 24 puits avec ou sans les échantillons à tester.

b. Quantification de la production de pyocyanine

Après 18 h d’incubation dans une plaque à 24 puits à 37°C, 800 µl de suspension bactérienne sont transférés dans un tube Eppendorf de 1,8 ml puis centrifugés à 16000 g pendant 1 min. Puis 700 µl de surnageant de chaque échantillon ont été prélevés et transférés dans des tubes Eppendorf de 2 ml pour le dosage de pyocyanine. Ensuite, 700 µl de chloroforme sont ajoutés dans chaque tube contenant les surnageants et le mélange est passé au vortex pendant quelques secondes pour extraire la pyocyanine. Après centrifugation, deux phases se forment et 600 µl de la phase inférieure qui contient la pyocyanine sont transférés dans un nouveau tube Eppendorf de 1,8 ml. Ensuite, 250 µl d’une solution d’acide chlorhydrique à 0.2 N sont ajoutés dans chaque tube pour extraire de nouveau la pyocyanine. L’utilisation d’une phase acide a pour effet de faire virer la coloration de la pyocyanine du turquoise au rose. En effet, dans la nature la pyocyanine est de couleur bleue, mais il a été montré que dans un milieu acide, les pyocyanines changent de configuration structurale et la couleur bleue vire au rose (Warren et al. 1990). Après centrifugation, de nouveau deux phases apparaissent et cette fois-ci la pyocyanine se trouve dans la phase supérieure. Enfin, 200 µl de cette phase supérieure sont récupérés et l’absorbance de cette solution à 380 nm est mesurée pour quantifier la pyocyanine produite par la bactérie.

II.3. Etude de l’effet du composé isolé de C. albiflorum sur le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa

Les différentes étapes réalisées dans cette partie sont résumées dans la Figure 8. 71

Chapitre III : Matériel et Méthodes

Criblage des extraits aqueux de feuilles et d’écorces de C. albiflorum pour une activité anti- 1 quorum sensing chez P. aeruginosa (quantification de la production de pyocyanine)

2 Fractionnement chromatographique de l’extrait d’écorce

3 Identification du composé actif (catéchine) par la technique de spectrométrie de masse

Détermination de la concentration de catéchine qui inhibe 4 la production de pyocyanine et qui n’affecte ni la croissance ni la viabilité de P. aeruginosa

Evaluation de l’expression des gènes lasR, lasI, rhlR, rhlI, lasB, rhlA et aceA en présence ou en abscence de la catéchine (test d’activité LacZ) Elucidation du mécanisme d’action de la 5 catéchine sur le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa Evaluation de la production de pyocyanine et d’élastase chez des souches mutantes de P. aeruginosa en présence ou en abscence de la catéchine

Figure 8. Représentation schématique des différentes étapes de l’étude de l’effet des extraits et du composé actif isolé de Combretum sur le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa.

II.3.1. Extractions et fractionnements des composés actifs du matériel végétal pour les tests d’activités biologiques

Afin d’identifier le ou les composés chimiques responsables de l’inhibition du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa, une extraction chimique suivi de deux types de fractionnement chromatographique couplés avec des tests d’activités biologiques ont

Chapitre III : Matériel et Méthodes

été réalisés avec C. albiflorum .

II.3.1.1. Extraction chimique réalisée avec C. albiflorum

Il s’agit d’une extraction aqueuse qui utilise comme solvant l’eau milliQ. L’extraction a été réalisée à partir de 5 g de poudres de feuilles et d’écorces de C. albiflorum macérées dans 25 ml d’eau milliQ pendant 24 h. Après filtration, le solvant est évaporé et l’extrait est de nouveau récupéré dans 1 ml d’eau milliQ. Les extraits obtenus ont été utilisés pour le criblage de leur activité sur la production de pyocyanine chez P. aeruginosa .

II.3.1.2. Fractionnements, isolement et identification des composés actifs chez C. albiflorum

a. Fractionnements et isolement des composés actifs

Deux étapes de fractionnement ont été nécessaires pour parvenir à isoler les composés actifs présents dans l’extrait aqueux d’écorces de C. albiflorum .

Etape 1 : Chromatographie d’exclusion

Il s’agit du fractionnement de l’extrait aqueux de C. albiflorum obtenu à partir de 5 g de poudre d’écorces. La phase stationnaire utilisée est un gel Sephadex LH-20 (GE Healthcare Life Sciences) préparé dans de l’eau milliQ puis monté sur une colonne de verre de 7 cm de long et de 2.5 cm de diamètre. Les différentes phases mobiles utilisées sont les suivantes : • Eau milliQ, • Eau – éthanol [Merck] (9:1), • Eau – éthanol (8:2), • Eau – éthanol (1:1), • Eau – éthanol – acétone [Merck] (1:0.5:0.5), • Eau – acétone (1:1). Pour chaque système de solvants, 100 ml ont été utilisés et les fractions ont été collectées tous les 10 ml puis groupées en fonction de leur profil chromatographique. A l’issue de cette étape, 27 fractions nommées Fc1 à Fc27 ont été obtenues, évaporées à sec puis conservées à -20°C jusqu’à utilisation ultérieure pour les tests d’activités sur la production de pyocyanine chez P. aeruginosa .

Chapitre III : Matériel et Méthodes

Etape 2 : Fractionnement sur HPLC

La fraction active Fc21 a été séparée sur une chaîne HPLC utilisant une colonne de phase inverse C-18 ( Symmetry 300 TM , 150 x 2.4 mm, 5 µm) comme phase stationnaire. La phase mobile consiste en un gradient linéaire progressif d’un mélange eau – méthanol allant de (100:0) à (0:100) pendant 30 min. A la suite de cette chromatographie, 19 fractions nommées Fc21-1 à Fc21-19 ont été obtenues et l’une des fractions actives Fc21-7 représentée par un seul pic qui sort à 11 min a été sélectionnée pour la prochaine étape d’identification.

b. Elucidation de la structure chimique du composé actif issu de C. albiflorum

La propriété physico-chimique de la fraction Fc21-7 semble se rapprocher de la catéchine. Afin de confirmer la similarité au niveau de leur structure, les techniques suivantes ont été utilisées : Le temps de rétention et le spectre UV de la fraction Fc21-7 ont été comparés avec ceux de la catéchine (Sigma) dans les mêmes conditions chromatographiques sur HPLC. Ensuite, la même fraction a été simultanément injectée avec la catéchine standard pour vérifier la similarité de leur temps de rétention. Enfin, le spectre de masse de la fraction a été comparé avec celui de la catéchine. La spectrométrie de masse a été réalisée avec le système de chromatographie liquide (LC) Waters 600 system qui utilise une colonne de phase inverse C- 18 ( Bio Wide Pore, 250 x 4.6 mm, 5 µm) couplé à un détecteur UV ( Waters 2487 detector ) et un spectromètre de masse ( Micromass Waters VG Quattro II ). Le solvant utilisé consiste en un gradient linéaire d’un mélange eau – acétonitrile allant de 5 vers 100 % d’acétonitrile pendant 30 min avec un débit maintenu à 1 ml.min -1. À la sortie de la chaîne HPLC, l’éluant contenant le composé à analyser est séparé à l’aide du séparateur LC Packings Splitter puis dirigé vers le spectromètre de masse par mode de vaporisation positive avec un débit de 0.1 ml.min -1. Les paramètres suivants ont été utilisés pour acquérir les données : - le voltage capillaire du vaporisateur a été fixé à 35 kV et la fragmentation à 35 V, - la pression du liquide nébuliseur est fixée à 20 L.h -1, - le débit de l’azote pour le séchage est fixé à 250 L.h -1, - la température de la source est de 80°C, - les ions totaux sont scannés entre m/z 115 à 1000 à un rythme de 1 s par scan.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

II.3.2. Préparation des échantillons pour les tests d’activités biologiques

Les extraits aqueux de C. albiflorum obtenus précédemment ont été utilisés directement pour le criblage de leur activité sur la production de pyocyanine. La solution est testée à raison de 10 µl pour 1 ml de suspension bactérienne. La catéchine a été dissoute dans du DMSO de telle sorte que lorsqu’on ajoute 10 µl de cette solution dans 1 ml de suspension bactérienne, les concentrations finales en catéchine sont de 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 et 16 mM et que la concentration finale en DMSO est de 1 %. Ces différentes concentrations ont été testées pour déterminer le maximum de concentration en catéchine qui inhibe la production de la pyocyanine et qui n’affecte ni la croissance ni la viabilité de P. aeruginosa . La catéchine à une concentration finale de 4 mM a été testée pour son activité sur l’expression des gènes responsables du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa . A cette même concentration, la catéchine a également été testée pour son effet sur la production de pyocyanine et d’élastase chez la souche sauvage et les souches mutantes de P. aeruginosa .

II.3.3. Tests d’activités biologiques

Cette partie décrit en détails les différents tests d’activités biologiques utilisés lors de l’étude de l’inhibition du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa par les extraits et les composés actifs isolés de l’écorce de C. albiflorum.

II.3.3.1. Quantification de la production de pyocyanine et d’élastase

Dans cette partie, la quantification de la production de pyocyanine a été réalisée avec la souche sauvage PAO1 et les souches mutantes ∆PA3476 et ∆PA3477 tandis que celle de l’élastase a été évaluée avec la souche sauvage PAO1 et les souches mutantes ∆PA1430 et ∆PA1432 de P. aeruginosa (Tableau 1).

a. Préparation de la suspension bactérienne pour le test

La préparation de la souche PAO1 est la même que celle décrite dans le Chapitre III - II.2.3.2.a. La suspension bactérienne obtenue a été utilisée pour le criblage de l’effet des extraits aqueux et du composé isolé (catéchine) de C. albiflorum sur la production de pyocyanine. En ce qui concerne les souches mutantes ∆PA3476, ∆PA3477, ∆PA3476 et ∆PA3477, après croissance pendant 18 h dans le milieu LB contenant du MOPS (1%) avec les

Chapitre III : Matériel et Méthodes antibiotiques appropriés, elles ont été récupérées par centrifugation à 3220 g et resuspendues dans du LB MOPS contenant les mêmes antibiotiques. La densité bactérienne à 600 nm est ajustée entre 0.02 et 0.03 et les suspensions bactériennes sont distribuées dans les plaques à 24 puits avec ou sans la catéchine à 4 mM. Une expérience supplémentaire a été réalisée avec la souche sauvage PAO1et la souche mutante ∆PA3476 de P. aeruginosa afin de déterminer l’effet de la catéchine sur la production de pyocyanine chez ces souches après l’ajout d’une quantité définie d’homosérine lactone dans le milieu de culture. Ainsi, après la distribution de la suspension bactérienne dans les plaques à 24 puits, une concentration finale en 3-oxo-C12-HSL ou en C4-HSL de 10 µM est ajoutée dans chaque puits en présence ou non de la catéchine à une concentration finale de 4 mM.

b. Quantification de la production de pyocyanine

Les procédures de quantification de la production de pyocyanine sont les mêmes que celles qui ont été décrites précédemment. La quantification a été réalisée avec les souches PAO1, ∆PA3476 et ∆PA3477 de P. aeruginosa en présence ou en absence de l’extrait aqueux, des fractions de C. albiflorum ou de la catéchine.

c. Quantification de la production d’élastase

Dans cette partie, la quantification de la production d’élastase a été réalisée avec la souche sauvage PAO1 et les souches mutantes ∆PA1430 et ∆PA1432 de P. aeruginosa (Tableau 1). Après 18 h d’incubation dans une plaque de 24 puits à 37°C, 800 µl de suspension bactérienne sont transférés dans un tube Eppendorf de 1.8 ml puis centrifugés à 16000 g pendant 1 min. Puis le surnageant est filtré à travers un filtre de 0.22 µm. Après filtration, 100 µl de filtrat sont prélevés et ajoutés dans un autre tube Eppendorf de 1.8 ml contenant préalablement 900 µl de solution d’Elastine Congo Red (Sigma) à une concentration de

5 mg/ml préparée dans une solution de 1 mM de CaCl 2 et 100 mM de tampon Tris à pH, 7.0. Après le passage au vortex, le mélange est incubé à 37°C sous agitation à 250 rpm pendant 18 h. La réaction est stoppée par addition de 2 ml de 700 mM de tampon phosphate à pH 6.0. Le précipité est supprimé par centrifugation et l’absorption à 495 nm a été mesurée à partir de 200 µl de surnageant.

Chapitre III : Matériel et Méthodes

II.3.3.2. Test d’activité LacZ

Dans cette partie, le test d’activité LacZ a été utilisé pour l’étude de l’expression des gènes lasR, lasI, rhlR, rhlI, lasB, rhlA et aceA chez P. aeruginosa respectivement avec les souches rapportrices PAO1::pPCS1001, PAO1::pPCS223, PAO1::pPCS1002, PAO1::pLPR1, PAO1::p β01, PAO1::p β02 et PAO1::pTB4124 (Tableau 1). Le test a servi pour l’étude de l’effet de la catéchine sur l’expression des gènes impliqués ou non dans le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa. Les mesures de l’activité LacZ ont été effectuées après 8 et 18 h d’incubation. La préparation des souches bactériennes, la mesure de la densité bactérienne après le test ainsi que la mesure de l’activité LacZ suivent les mêmes procédures que celles décrites précédemment pour P aeruginosa .

II.3.3.3. Mesure de la densité bactérienne

Dans cette partie, le protocole de mesure de la densité bactérienne après les tests d’activités biologiques est le même. A la fin de la période d’incubation définie pour chaque type de test, la suspension bactérienne est diluée deux fois avec de l’eau milliQ et la densité optique (DO) bactérienne est mesurée à 600 nm dans une plaque à 96 puits avec 200 µl de suspension par puits.

II.3.3.4. Etude de la viabilité chez P. aeruginosa

L’étude de la viabilité de P. aeruginosa a été réalisée avec la souche sauvage PAO1 mise en culture dans le COI avec ou sans la catéchine à 4 mM. Après 8 et 18 h de culture, les suspensions bactériennes sont centrifugées, récupérées dans le même volume d’eau et 100 µl de cette suspension sont distribués dans une plaque de 96 puits à fond noir OptiPlate TM -96 F. La même technique que celle décrite pour l’étude de la viabilité chez R. fascians est utilisée pour déterminer le rapport entre les bactéries vivantes et mortes.

II.3.3.5. Analyse statistique des résultats

Chaque test d’activité biologique utilisé dans cette partie du travail a été réalisé en 4 répétitions et l’analyse statistique des résultats a été réalisée avec le test t de Student et la différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle a été tenue en compte.

CHAPITRE IV : RESULTATS

Chapitre IV : Résultats

I. Inhibition de l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence chez R. fascians

I.1. Résultats des études préliminaires : Résistance des espèces de Dalbergia étudiées à l’infection par R. fascians

Il a été rapporté que lors des transferts de galles feuillées formées suite à l’infection de R. fascians dans un milieu pourvu d’antibiotique, les bourgeons s’allongent pour donner de nouvelles pousses et cette technique peut être utilisée comme une alternative de multiplication végétative des plantes in vitro (Vereecke et al. 2000). Dans le cadre du programme de conservation et de multiplication in vitro des espèces endémiques de Madagascar, nous avons testé cet effet de R. fascians sur la multiplication des bourgeons chez 4 espèces de Dalbergia à savoir D. chlorocarpa , D. pervillei , D. purpurascens et D. trichocarpa . Ainsi, les plantules mises en culture in vitro âgées de 4 semaines de ces 4 espèces de Dalbergia ont été infectées avec la souche virulente D188 et la souche non virulente D188-5 de R. fascians selon la procédure d’infection décrite dans la partie méthodes pour déterminer leur sensibilité à ces bactéries. Parallèlement, deux plantes sensibles à l’infection de R. fascians ont été infectées avec les mêmes souches pour servir de contrôle. Il s’agit de la plante herbacée Nicotiana tabacum et de la plante ligneuse Populus tremula x P. tremuloïdes . Les phénotypes observés pour chaque lot et pour chaque espèce ont été comparés toutes les semaines pendant 5 semaines et les résultats obtenus sont résumés dans le Tableau 3

Tableau 3. Les différents phénotypes induits par la souche virulente D188 de R. fascians sur N. tabacum , P. tremula x P. tremuloïdes et les 4 espèces de Dalbergia . Espèces N. P. tremula x P. D. D. D. D. tabacum tremuloïdes chlorocarpa pervillei purpurascens trichocarpa Symptômes b1 nb 2 b1 nb 2 b1 nb 2 b1 nb 2 b1 nb 2 b1 nb 2 C3 - - 6/6 6/6 ------4 1 DB ------5

Semaine GF 6/6 6/6 ------C3 - - - - 1/6 - 2/6 - 1/6 - - - 4 3 DB ------2/6 - - - - - 5

Semaine GF 6/6 6/6 6/6 6/6 ------C3 - - - - 1/6 - 2/6 - 1/6 - - - 4 5 DB ------2/6 - - - - - 5

Semaine GF 6/6 6/6 6/6 6/6 ------1 b : bourgeon blessé ; 2 nb : bourgeon non blessé ; 3 C : formation de cals 4 BD : croissance/développement des bourgeons ; 5 GF : formation de galles feuillées

Chapitre IV : Résultats

Réponses des plantules à la première semaine post-infection

Comme décrit dans le Tableau 3, dès la première semaine d’infection avec la souche D188 de R. fascians , toutes les plantules de tabac, blessées ou non au niveau des zones d’infection, ont répondu en formant des galles feuillées. Chez le peuplier, des cals se sont développés sur toutes les plantules infectées, blessées ou non. En revanche, chez les Dalbergia , aucun symptôme n’a été observé dans les deux cas. Par ailleurs, toutes les plantes infectées avec la souche D188-5 ne développent aucun symptôme.

Réponses des plantules à la troisième semaine post-infection

Après 3 semaines d’infection, les galles feuillées se développent sur toutes les plantules de tabac infectées avec la souche virulente D188. De même chez le peuplier, toutes les plantules, blessées ou non, forment des galles feuillées. En revanche, chez les Dalbergia , aucun symptôme n’a été observé lorsque les zones d’infection n’ont pas été blessées. Néanmoins, quelques plantules dont les zones d’infection ont été blessées ont répondu à l’infection de R. fascians. D’après le Tableau 3, une plantule sur 6 blessées de D. chlorocarpa et de D. purpurascens et 2 plantules de D. pervillei sur 6 blessées ont répondu par la formation de cals au niveau des zones infectées. D’autre part, 2 plantules de D. pervillei sur 6 ont répondu par le développement des bourgeons. Cependant, aucun symptôme n’a été enregistré chez D. trichocarpa . Mais en aucun cas, une galle feuillée n’a été observée. Par ailleurs, lorsque les plantes ont été infectées par la souche non virulente D188-5, aucun symptôme n’est observé.

Réponses des plantules à la cinquième semaine post-infection

Les plantes infectées avec la souche non virulente D188-5, ne présentent toujours pas de symptôme même après 5 semaines d’infection (Photos 7A, 7C, 7E, 7G, 7I et 7L). Chez le tabac et le peuplier, les galles feuillées continuent à se développer (Photos 7B et 7D) tandis que chez les Dalbergia , dont les bourgeons sont non blessés, aucun changement phénotypique n’a été observé. Chez les lots de Dalbergia blessés, les proportions de plantules blessées qui présentent des symptômes n’ont pas changé (Tableau 3). Les cals qui se sont formés chez D. chlorocarpa (Photo 7F), D. purpurascens (Photo 7H) et D. pervillei (Photo 7J) augmentent de taille mais restent toujours à l’état cal. D’autre part, les bourgeons chez D. pervillei continuent à se développer (Photo 7K).

Chapitre IV : Résultats

A B C D

1cm 5mm 2mm 2mm

E F G H

2mm 2mm 1mm 1mm

I J K L M

2mm 1mm 1mm 1mm 1mm

Photo 7. Phénotypes induits par la souche sauvage D188 de R. fascians sur les espèces de plantes étudiées. (A- B) Phénotypes induits chez Nicotiana tabacum ; (C-D) Populus tremula x P. tremuloïdes ; (E-F) Dalbergia chlorocarpa ; (G-H) D. purpurascens ; (I-K) D. pervillei ; (L-M) D. trichocarpa après la cinquième semaine d’infection. Les flèches indiquent les phénotypes obtenus après infection des bourgeons avec la souche non virulente D188-5 de R. fascians . Les pointes de flèches indiquent les phénotypes obtenus lorsque les bourgeons sont infectés avec la souche sauvage D188 de R. fascians .

I.2. Les composés chimiques responsables de l’atténuation de l’expression des gènes de virulence chez R. fascians

L’identification d’un des composés responsables de l’inhibition ou de l’atténuation de l’expression des gènes de virulence chez R. fascians a été réalisée après des criblages suivis de fractionnements chromatographiques des extraits actifs de Dalbergia couplés avec le test d’activité GUS. Ce dernier a permi d’évaluer l’expression du gène attH avec la souche D188::pTGGUSDV1 mise en culture dans une condition optimale d’expression de ce gène en présence ou en absence des extraits, des fractions ou des composés isolés des extraits de Dalbergia .

Chapitre IV : Résultats

I.2.1. Détermination de la condition optimale d’induction et de la condition sans induction de l’expression du locus att

Les conditions de culture qui figurent dans le Tableau 2 ont été utilisées pour déterminer la condition optimale de l’expression du locus att à l’aide de la souche D188::pTGGUSDV1 de R. fascians . Après mesure de l’activité GUS et de la densité bactérienne dans chacune de ces conditions, les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 9. Dans ce graphique, l’histogramme bleu représente l’activité GUS qui reflète le niveau d’expression du gène attH et l’histogramme orange la densité bactérienne correspondante.

300 ** * 0.6 ** * 200 * 0.4 DO 600 nm 600

100 0.2 Activité GUS

0 0.0 C1 C2 C3 C4 C5 C6

Expression de attH DO 600 nm

Figure 9. Comparaison de l’expression du gène attH chez la souche D188::pTGGUSDV1 de R. fascians mise en culture dans différentes conditions d’induction à travers l’activité GUS. C1 : Milieu d’induction ; C2 : Milieu d’induction contenant du pyruvate ; C3 : Milieu d’induction contenant de l’histidine ; C4 : Milieu d’induction contenant de l’extrait de galles feuillées ; C5 : Milieu d’induction contenant du pyruvate et de l’histidine ; C6 : Milieu d’induction contenant du pyruvate et de l’extrait de galles feuillées.

D’après la Figure 9, la densité bactérienne est élevée dans les conditions de milieu contenant du pyruvate (C2, C5 et C6) alors que celle-ci est faible en son absence (C1, C3 et C4) suggérant que l’ajout du pyruvate est nécessaire pour avoir une condition optimale de croissance dans le milieu d’induction. En ce qui concerne l’activité GUS, l’ajout de l’histidine ou de l’extrait de galles feuillées dans le milieu d’induction est nécessaire pour déclencher l’expression de attH (C3 à C6). L’activité GUS est optimale pour les conditions C5 et C6 et comme la densité bactérienne dans ces deux conditions est assez importante, elles sont toutes les deux considérées comme des conditions optimales pour l’expression du locus att .

Chapitre IV : Résultats

Dans le cadre de ce travail, nous avons choisi, pour la suite, la condition C6 comme condition optimale pour l’expression du locus att car nous pensons que cette condition se rapproche le plus de la condition in vivo étant donné qu’il s’agit de l’extrait de galles feuillées et qu’il est probable que l’expression de ce locus ne dépend pas d’une seule molécule. Ainsi, cette condition C6 est désormais qualifiée sous le nom de COI (condition optimale d’induction). Cette qualification représente la condition où la croissance de la bactérie et l’activité GUS sont optimales. Malgré le niveau assez élevé d’expression de attH dans les conditions C3 et C4, ces dernières n’ont pas été sélectionnées car la densité bactérienne pour chacune de ces conditions ne permettait pas de conclure que toutes les bactéries sont vivantes durant le temps d’incubation. En revanche, l’ajout du pyruvate a stimulé la croissance bactérienne, ce qui implique que les bactéries étaient actives pendant la période d’incubation. La condition C1 n’a pas été retenue car la densité bactérienne n’est pas comparable à celle obtenue avec la condition COI.

I.2.2. Criblage des différents extraits de Dalbergia sur l’expression du gène attH

I.2.2.1. Expression du gène attH en présence des extraits des plantules de Dalbergia cultivées in vitro

La résistance des plantules de Dalbergia mises en culture in vitro à l’infection par la souche virulente D188 de R. fascians suggère la présence de composés chimiques, dans la plante, capables d’inhiber ou de diminuer l’expression du gène attH chez la bactérie. Ainsi, l’expression du gène attH chez la souche D188::pTGGUSDV1 de R. fascians a été évaluée dans la COI en présence des extraits méthanoliques de la partie aérienne (tige + feuille) des plantules de N. tabacum , D. chlorocarpa, D. pervillei, D. purpurascens et de D. trichocarpa en utilisant le test d’activité GUS. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 10. D’après la Figure 10, les extraits méthanoliques de N. tabacum et de D. chlorocarpa n’ont pas d’effet significatif, à p ≤ 0.05, sur l’expression de attH car l’activité GUS est enregistrée à 98.4 ± 3 % et à 81.4 ± 11 % respectivement. En revanche, les extraits méthanoliques de D. pervillei, de D. purpurascens et de D. trichocarpa diminuent significativement l’activité GUS : celle-ci étant diminuée respectivement à 50.6 ± 5 %, 61.9 ± 5 % et 36.9 ± 3 % par rapport à la COI, suggérant que ces extraits peuvent contenir des composés chimiques qui diminuent l’expression du gène attH chez R. fascians .

Chapitre IV : Résultats

120 100 80 * * 60 * 40 20 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) Dtri COI Dchl Ntab Dper Dpur Expression de attH

Figure 10. Comparaison de l’effet des extraits méthanoliques des plantes de N. tabacum , D. chlorocarpa, D. pervillei, D. purpurascens et de D. trichocarpa cultivées in vitro sur l’expression du gène attH chez R. fascians . La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle (COI) est marqué par le signe (*).

I.2.2.2. Criblage des extraits chimiques de Dalbergia sur l’expression du gène attH chez R. fascians

Etant donné l’insuffisance de la quantité de matériel végétal issu de la culture in vitro , les extraits obtenus à partir de l’extraction avec de solvants de polarité croissante (Figure 5) de feuilles, d’écorces et de racines de D. chlorocarpa, D. pervillei, D. purpurascens et de D. trichocarpa récoltés in situ ont été testés pour leur capacité à inhiber l’expression du gène attH chez R. fascians . Les résultats obtenus lors du criblage sont présentés dans la Figure 11. L’axe des ordonnées à gauche représente l’activité GUS (histogramme bleu) et l’axe des ordonnées à droite représente la densité bactérienne (histogramme orange). Les résultats obtenus pour chaque échantillon testé ont été évalués par rapport aux valeurs obtenues pour la COI. En tenant compte des critères de sélection définis dans les méthodes, tous les extraits de racines des espèces de Dalbergia ont été éliminés car ils affectent tous la croissance de la bactérie (densité bactérienne en dessous de la barre de 80 %) ce qui pourrait expliquer la diminution de l’activité GUS (Figure 11A). En ce qui concerne les extraits de feuilles, tous les extraits hexaniques des 4 espèces ont été éliminés car ils n’ont pas d’effet sur l’expression du gène attH (Figure 11B). Il en est de même pour les extraits dichlorométhaniques de D. chlorocarpa , D. purpurascens et D. trichocarpa (Figure 11B). L’extrait dichlorométhanique de feuilles de D. pervillei et l’extrait méthanolique de feuilles de D. chlorocarpa ont été également éliminés car ils affectent la croissance de la bactérie (Figure 11B). Les extraits méthanoliques des feuilles de

Chapitre IV : Résultats

D. pervillei , de D. purpurascens et de D. trichocarpa n’ont pas d’effet significatif sur la croissance, en revanche la diminution du niveau d’expression de attH (63, 54 et 47 % respectivement) ne satisfait pas le critère de sélection défini dans cette étude (Figure 11B). Ainsi, tous les extraits de feuilles des 4 espèces de Dalbergia ont été éliminés. A

120 120 DO

100 100 600nm 80 * 80 * (%) relative 60 * * * 60 * * * * 40 * * * * * * 40 * 20 * * * * 20 * * * 0 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) COI H D M H D M H D M H D M

D.chlorocarpa D.pervillei D.purpurascens D.trichocarpa B

120 120 DO

100 100 600nm * * * * 80 * 80 * (%) relative 60 * 60 * * 40 * 40 20 * 20 0 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) COI H D M H D M H D M H D M

D.chlorocarpa D.pervillei D.purpurascens D.trichocarpa C

120 120 DO

100 100 600nm 80 * 80

* (%) relative 60 60 * 40 * 40 * 20 * 20 0 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) COI H D M H D M H D M H D M

D.chlorocarpa D.pervillei D.purpurascens D.trichocarpa

Expression de attH Densité bactérienne

H : Extrait hexanique ; D : Extrait dichlorométhanique ; M : Extrait méthanolique

Figure 11. Criblage des extraits de quelques espèces de Dalbergia sur l’expression du gène attH chez R. fascians . Effets des différents extraits (A) de racines, (B) de feuilles et (C) d’écorces de D. chlorocarpa, D. pervillei, D. purpurascens et D. trichocarpa sur la croissance et l’expression du gène attH chez R. fascians .

Chapitre IV : Résultats

En ce qui concerne les extraits d’écorces, tous les extraits hexaniques des 4 espèces de Dalbergia sont éliminés car ils n’affectent pas l’expression du gène attH (Figure 11C). De même que pour les extraits dichlorométhaniques de D. chlorocarpa , D. purpurascens et D. trichocarpa . En revanche, l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei est le seul qui satisfait aux critères de sélection définis ci-dessus car il inhibe l’expression de attH à plus de 92 % (en dessous de la barre de 20 %) et n’affecte pas, de manière significative, la croissance de la bactérie (histogramme au-dessus de la barre de 80 %). Les extraits méthanoliques d’écorces de D. pervillei , D. purpurascens et D. trichocarpa sont également intéressants car l’expression du gène attH est inhibé de 79, 71 et 68 % respectivement et ces extraits n’ont pas d’effet sur la croissance de la bactérie (Figure 11C). Cependant, ces extraits n’ont pas été retenus pour la suite de ce travail car la limite d’inhibition de l’expression du gène attH à plus de 80 % dans ces conditions n’a pas été obtenue. Par conséquent, l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei (Figure 11C) a été retenu pour poursuivre les étapes de fractionnements bioguidés et l’isolement du ou des composés actifs. Mais il est intéressant de noter qu’il y a un effet global sur la croissance de la bactérie et sur l’expression de attH .

I.2.2.3. Confirmation de l’activité de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei

Afin de confirmer l’activité de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei , deux expériences ont été réalisées. Il s’agit pour la première de vérifier si la diminution de l’activité GUS est vraiment due à l’inhibition de l’expression du gène attH et non à l’inhibition de l’activité de l’enzyme β-glucuronidase elle-même. La deuxième consiste en la vérification de l’activité générale de l’espèce D. pervillei en reprenant le test avec des extraits issus d’autres pieds de D. pervillei .

a. Effet de l’extrait dichlorométhanique de D. pervillei sur l’activité de l’enzyme β-glucuronidase

L’effet de l’extrait dichlorométhanique de D. pervillei sur l’activité de l’enzyme β- glucuronidase a été vérifié selon le protocole décrit dans le Chapitre III - II.1.4.1-e.2. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 12. L’axe des ordonnées représente le pourcentage de l’activité GUS et l’axe des abscisses le temps d’incubation de la réaction. Le «contrôle» représente l’activité à 100 % et l’«extrait» représente les tests où l’on a ajouté

Chapitre IV : Résultats l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei .

100 80 60 40 20 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) 6h 24h Contrôle Extrait

Figure 12. Effet de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei sur l’activité de l’enzyme β- glucuronidase.

D’après la Figure 12, quel que soit le temps d’incubation dans un milieu contenant de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei , l’activité de l’enzyme β-glucuronidase ne change pas. Ceci suggère que la diminution de l’activité GUS obtenue en présence de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei n’est pas due à l’inhibition/dégradation de l’activité de l’enzyme β-glucuronidase par l’extrait mais plutôt à l’inhibition de l’expression du gène attH .

b. Effet général de l’extrait dichlorométhanique de D. pervillei sur l’expression du gène attH

La deuxième expérience réalisée vise à confirmer l’activité de l’extrait de D. pervillei en tenant compte des artéfacts microenvironementaux suivant les protocoles déjà décrits dans les méthodes. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 13.

120 120 DO

100 * * 100 600nm 80 80 relative (%) relative 60 60 40 40 * 20 * * * * 20 0 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) COI E1 E2 E3 E4 E5 Expression de attH Densité bactérienne

Figure 13. Comparaison de l’activité des extraits dichlorométhaniques d’écorces issus de 5 pieds différents de l’espèce D. pervillei sur la croissance et l’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians .

Chapitre IV : Résultats

D’après la Figure 13, tous les échantillons testés inhibent à plus de 80 % l’expression du gène attH chez R. fascians . De plus, aucun effet spectaculaire sur la croissance des bactéries n’a été observé malgré quelques différences statistiquement significatives à p ≤ 0.05 observées avec les échantillons E1 et E2 par rapport au contrôle. Ces résultats confirment l’activité de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei et suggèrent la présence de composés chimiques qui pourraient diminuer ou inhiber l’expression du gène attH chez R. fascians sans avoir un effet sur la croissance de la bactérie.

I.2.3. Isolement et identification de la perbergine comme inhibiteur de l’expression du gène attH

I.2.3.1. Les différentes étapes de fractionnement

L’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei a donc été sélectionné pour les prochaines étapes de fractionnements bioguidés afin d’identifier le ou les composés actifs responsables de la diminution de l’expression du gène attH chez R. fascians . Quatre étapes de fractionnement chromatographique couplé avec le test d’activité GUS utilisant la souche D188::pTGGUSDV1 pour évaluer l’expression de attH ont été nécessaires pour isoler le composé actif.

a. Première étape de fractionnement

À partir de 3 kg de poudre d’écorces de D. pervillei , 70 g d’extrait dichlorométhanique ont été obtenus. Le fractionnement par chromatographie de cet extrait sur un gel de silice Si60 a donné 9 groupes de fractions nommés F1 à F9. Ces 9 fractions ont été évaluées pour leur capacité à inhiber l’expression du gène attH et les résultats de ce test sont présentés dans la Figure 14. A partir de cette étape, les limites de la croissance indiquée par la barre à 80 % et l’expression du gène attH indiquée par la barre à 20 % n’ont plus été considérées. En revanche, les fractions qui présentent une activité biologique intéressante et un profil chromatographique moins complexe ont été retenues.

Chapitre IV : Résultats

120 120 DO

100 * * 100 600nm * 80 * 80 * * * (%) relative 60 * 60 40 * * 40 20 * 20 * * 0 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) COI F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 Expression de attH Densité bactérienne

Figure 14. Criblage des premières fractions de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei sur la croissance et l’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians .

La Figure 14 montre que toutes les fractions, sauf la fraction F4, diminuent de manière significative, à p ≤ 0.05 par rapport à la COI, l’expression du gène attH . Les fractions F1 et F9 diminue l’expression à plus de 70 % tandis que les fractions F6, F7 et F8 semblent inhiber complètement l’expression du gène attH car l’activité GUS est presque absente. Par conséquent, le choix a été effectué par rapport à ces 3 fractions. La fraction F6 a été retenue pour la prochaine étape de fractionnement car non seulement la croissance bactérienne est moins affectée mais son profil chromatographique est également moins complexe par rapport aux deux autres.

b. Deuxième étape de fractionnement

Le passage de la fraction F6 (9 g de résidu) dans une deuxième colonne chromatographique a donné 17 groupes de sous-fractions nommés F6-1 à F6-17. Ces 17 sous- fractions ont été testées pour leur activité sur l’expression du gène attH chez R. fascians et les résultats obtenus sont résumés dans la Figure 15. D’après la Figure 15, toutes les fractions F6-1 à F6-17 diminuent de manière significative à p ≤ 0.05 l’expression du gène attH chez R. fascians par rapport à la COI. Les fractions F6-4 à F6-11 inhibent ou réduisent l’expression de ce gène à plus de 80 % suggérant que le ou les composés actifs devraient se trouver dans cette zone. Parmi les fractions bioactives, la fraction F6-6 a été sélectionnée car elle inhibe l’expression du gène attH et son profil chromatographique était plus intéressant (moins complexe) pour continuer vers la prochaine étape de fractionnement.

Chapitre IV : Résultats

* 120 * 120 DO

100 100 600nm * * * 80 * * * * 80 * * * (%) relative 60 * * * * 60 * * 40 * 40 * * * * 20 * * * * 20 0 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) COI F6-1 F6-2 F6-3 F6-4 F6-5 F6-6 F6-7 F6-8 F6-9 F6-10 F6-11 F6-12 F6-13 F6-14 F6-15 F6-16 F6-17 Expression de attH Densité bactérienne

Figure 15. Criblage des sous-fractions de la fraction F6 de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei sur la croissance et l’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians .

c. Troisième étape de fractionnement

Le fractionnement de F6-6 (72 mg de résidu) sur des plaques CCM préparatives

Si60F 254 a donné 6 sous-fractions nommées F6-6-1 à F6-6-6. L’activité de ces fractions sur l’inhibition de l’expression du gène attH a été testée et les résultats sont présentés dans la Figure 16.

120 120 DO

100 100 600nm * * 80 80

* * (%) relative 60 * 60 40 40 20 * * 20 0 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) COI F6-6-1 F6-6-2 F6-6-3 F6-6-4 F6-6-5 F6-6-6 Expression de attH Densité bactérienne

Figure 16. Criblage des sous-fractions de la fraction F6-6 de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei sur la croissance et l’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians .

D’après la Figure 16, les fractions F6-6-1, F6-6-2 et F6-6-6 n’ont pas d’effet sur l’expression du gène attH car aucune différence significative n’est observée avec ces échantillons par rapport à la COI. Cependant, la fraction F6-6-3 diminue à 40 % l’expression du gène attH tandis que les fractions F6-6-4 et F6-6-5 semblent l’inhiber. La fraction F6-6-4 a été sélectionnée pour la prochaine étape de fractionnement car elle semble plus inhiber l’expression de attH que la fraction F6-6-5.

Chapitre IV : Résultats

d. Quatrième étape de fractionnement

La fraction F6-6-4 (10 mg) a été ensuite fractionnée sur HPLC avec les conditions mentionnées dans la méthode correspondante. À l’issue de ce fractionnement, 10 sous- fractions nommées F6-6-4-1 à F6-6-4-10 ont été obtenues. Le profil chromatographique de la fraction F6-6-4 ainsi que le temps de rétention de chacune des 10 sous-fractions sont résumés dans la Figure 17.

0.40

0.35 F6-6-4-1 F6-6-4-2 F6-6-4-3 F6-6-4-4 F6-6-4-5 F6-6-4-6 F6-6-4-7 F6-6-4-8 F6-6-4-9 F6-6-4-10 0.30

0.25

AU 0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

0.002.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 Minutes

Figure 17. Chromatogramme de la fraction F6-6-4 issue de l’extrait d’écorces de D. pervillei sur HPLC à 254 nm.

L’activité de ces 10 sous-fractions sur l’inhibition de l’expression du gène attH a été ensuite testée et les résultats sont présentés dans la Figure 18.

120 120 DO

100 100 600nm * * * 80 80

* (%) relative 60 * * 60 40 * 40 * 20 20 0 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) COI F6-6-4-1 F6-6-4-2 F6-6-4-3 F6-6-4-4 F6-6-4-5 F6-6-4-6 F6-6-4-7 F6-6-4-8 F6-6-4-9 F6-6-4-10

Expression de attH Densité bactérienne

Figure 18. Criblage des sous-fractions de la fraction F6-6-4 de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei sur la croissance et l’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians .

Chapitre IV : Résultats

D’après la Figure 18, les fractions F6-6-4-1 à F6-6-4-5 n’ont pas d’effet notable sur l’expression du gène attH car l’activité GUS pour chaque échantillon n’est pas significativement différente de celle obtenue pour la COI. Les fractions F6-6-4-6 à F6-6-4-8 et la fraction F6-6-4-10 diminuent significativement mais n’inhibe pas l’expression du gène attH . En revanche, la fraction F6-6-4-9 semble être celle qui diminue le plus l’expression du gène attH . Selon le profil chromatographique de la fraction F6-6-4, la fraction F6-6-4-9 est représentée par le pic majoritaire qui sort à 19.8 min (Figure 17). Comme l’extrait n’a pas d’effet spectaculaire sur la croissance de la bactérie malgré une différence statistiquement significative à p ≤ 0.05 par rapport à la COI, cette fraction a été sélectionnée, isolée puis purifiée.

I.2.3.2. Isolement et purification du composé dans la fraction F6-6-4-9

La vérification de la pureté de F6-6-4-9 a été effectuée par sa réinjection sur HPLC dans les mêmes conditions de séparation. Le chromatogramme obtenu est présenté dans la Figure 19.

Figure 19. Chromatogramme de la fraction F6-6-4-9 de l’écore de D. pervillei sur HPLC à 254 nm.

D’après le chromatogramme de la Figure 19, la fraction F6-6-4-9 est représentée par un seul pic qui sort à 19.8 min indiquant l’homogénéité du composé 1. Au total, 5 mg de la fraction F6-6-4-9 (désormais appelé composé 1) ont été obtenus. Afin de déterminer sa structure chimique, les spectres de masse et RMN du composé 1 isolé ont été analysés.

Chapitre IV : Résultats

I.2.3.3. Analyse des spectres RMN

Les résultats détaillés des spectres RMN obtenus avec le composé 1 sont résumés dans le Tableau 4 suivant (voir Annexe 10 pour les détails des spectres RMN correspondants).

1 13 Tableau 4. Spectre RMN H et C indiquant les déplacements chimiques δ (ppm) du composé 1 dans le CDCl 3 en corrélation avec les résultats de la HMBC (les valeurs entre parenthèse représentent J et sont exprimées en Hz).

Position δH δC HMBC 2a 4.54 dd (11.3, 5.2) 70.12 C-3, C -4, C -9, C - 2b 4.69 dd (11.3, 8.6) C-4, C-9 3 4.20 dd (8.6, 5.2) 46.36 C-2, C-4, C-1’, 4 197.26 5 12.41 s (OH) 161.93 C-5, C-10 6 5.97 s 95.67 C-5, C-7, C-8, C - 7 6.20 s (OH) 164.50 C-6, C-7, C-8 8 106.99 9 161.53 10 102.84 1’ 115.31 2’ 5.46 s (OH) 142.67 C-2’ 3’ 6.32 s (OH) 133.63 C-2’, C-3’ 4’ 147.11 5’ 6.47 d (8.6) 103.77 C-1’, C-3’ 6’ 6.74 d (8.6) 119.52 C-3, C-2’, C-4’ 1” 3.36 d (7.2) 21.32 C-7, C-8, C-9, C - 2” 5.25 t (7.1) 121.45 C-1’’, C-4”, C-8” 3’’ 139.95 4’’ 2.08 m 39.92 C-2”, C-3”, C-5” 5” 2.10 m 26.52 C-4”, C-6” 6” 5.05 t (6.7) 123.86 7’’ 132.38 8’’ 1.80 s 16.43 C-2”, C-3”, C-4” 9” 1.67 s 25.90 C-6”, C-7”, C - 10” 1.59 s 17.93 C-6”, C-7”, C-9” OMe 3.87 s 56.37 C-4’

I.2.3.4. Analyse du spectre de masse

Le résultat de la spectrométrie de masse du composé 1 est représenté par la Figure 20.

Chapitre IV : Résultats

x10 3 Cpd 1: C26 H30 O7: +ESI Product Ion (10.903 min) Frag=125.0V [email protected] (455.2000[z=1] -> **) Dpervillei_MSMSc.d Subtract 455.2049 7.5 7 6.5 6 5.5 5 4.5

4 3.5 331.0802 3 2.5 2 1.5 1 153.0533 313.0674 413.2604 0.5 0 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)

Figure 20. Spectre de masse du composé 1 isolé de l’extrait d’écorces de D. pervillei .

D’après la Figure 20, le poids moléculaire plus un proton [M+H] + du composé 1 est de 455.2049 c'est-à-dire que son poids moléculaire réel est de 454.2049.

I.2.4. Elucidation et confirmation de la structure chimique du composé 1

Après isolement, le composé 1 se présente sous forme d’une pâte de couleur jaune clair avec un spectre UV qui présente des maxima d’absorption à 235, 293 et 344 (Figure 21). Ce profil de spectre UV ressemble à celui de l’isoflavanone isolé de l’espèce Sophora secundiflora (Tanaka et al. 1998).

211

235 293273

344

250.00 300.00 350.00 400.00 nm

Figure 21. Spectre UV du composé 1 isolé de l’extrait d’écorces de D. pervillei .

D’après le Tableau 4, le spectre RMN 1H du composé 1 présente 3 signaux intégrant chacun pour un proton double doublet résonnant à δ 4.20 ( J = 8.6, 5.2), 4.54 ( J = 11.3, 5.2) et

Chapitre IV : Résultats

4.69 ( J = 11.3, 8.6). Ces signaux sont assignables aux protons attachés aux carbones C-2 et C- 3 chez les isoflavanones (Nkengfack et al. 1994; Tanaka et al. 1998; Shirataki et al. 1999). La présence du groupe géranyl est indiquée par les signaux à δ 1.59 (3H), 1.67 (3H) et 1.80 (3H) attribuable à 3 groupes méthylés et aux signaux suivants : δ 2.08 (2H), 2.10 (2H), 3.36 (2H), 5.05 (1H) et 5.25 (1H) (Iinuma et al. 1995). Deux doublets [ δ 6.47 (1H) et 6.74 (1H)] et un singulet ( δ 5.97) sont présents dans la région aromatique et est due respectivement à deux protons en position ortho dans le noyau B et un proton dans le noyau A. La présence d’un groupe hydroxyle chélaté attaché au carbone C-5 est classiquement indiquée par la présence d’un singulet à δ 12.41. Ce dispositif, ainsi que la présence d’un singulet unique pour le noyau A dans la région aromatique suggère que le groupe géranyl doit se trouver au niveau du noyau A en position 6 ou 8. Il a été rapporté que chaque fois que le groupe prényle est attaché au C-8 de l’unité isoflavanone, le déplacement chimique de l’hydroxyle chélaté attaché au carbone C- 5 est moins de δ 12.40 tandis que pour une valeur plus de δ 12.40, ceci indique que ce groupe est attaché au carbone C-6 (O'Neill et al. 1986; Fukai et al. 1994; Shirataki et al. 1999; Bojase et al. 2001). Dans notre cas, comme le déplacement chimique du groupement hydroxyle est à δ 12.41, nous suggérons que le groupe géranyl du composé 1 est localisé à la position 8. Cette affirmation est justifiée par des déplacements chimiques similaires de H-6 chez le composé 1 et le tétraptérol C (Tanaka et al. 1994; Iinuma et al. 1995). Cet assignement correspond biogénétiquement au groupe géranyl à C-8 qui est également présent dans l’olibergine B, un isoflavonoïde isolé de D. olivari (Ito et al. 2003b). En outre, cette position est confirmée par analyse des spectres HMBC et de HSQC car le signal méthylène à δ 3.36 (H-1’’) est en corrélation avec le carbone C-8 à δ 164.50 indiquant que le groupe géranyl est attaché au carbone C-8. Un signal d’un groupe méthoxyle est aussi observé à δ 3.87 et ce groupe devrait être localisé au noyau B avec deux fonctions hydroxyle. L’analyse du spectre HMBC montre une corrélation entre le signal méthoxyle à δ 3.87 et le signal C-4’ ( δ 147.11) indiquant ainsi que le groupe méthoxyle est attaché au carbone C-4’. En effet, ce modèle de substitution para méthoxyle a été rapporté pour un dérivé isoflavanone 2’, 3’, 7-trihydroxy-4-méthoxy- isoflavanone, isolé à partir de D. odorifera (Wang et al. 2000) et la fonction méthoxyle est également présente chez l’olibergine B. En outre, les déplacements chimiques pour les protons 5’ et 6’ dans le composé 1 est similaire à ceux rapportés pour l’olibergine B (Ito et al. 2003b). Par ailleurs, l’analyse LC-ESI-MS du composé 1 a conduit à un spectre qui montre une masse moléculaire plus un proton de 455.2061. En conséquence, nous avons proposé la

Chapitre IV : Résultats structure chimique du composé 1 comme suit : ( Z)-3-(2,3-dihydroxy-4-methoxyphenyl)-8- (3,7-dimethylocta-2,6-dienyl)-5,7-dihydroxy-2,3-dihydrochromen-4-one et sa formule chimque est C26 H30 07 (Figure 22). Cette proposition est en accord avec les analyses des spectres RMN 13 C et les RMN deux dimensionnel 1H-1H COSY, HSQC et HMBC (Tableau 4 et Annexe 10). La structure de cette molécule a ensuite été vérifiée dans les bases de données de SciFinder et de PubChem Compound de NCBI (National Center for Biotechnology Information) en décembre 2010. Curieusement, la structure chimique du composé 1 n’a pas encore été décrite. Dès lors, le composé 1 a été nommé «perbergine» étant donné son extraction à partir de Dalbergia pervillei en suivant la nomenclature proposée pour l’olibergine (Ito et al. 2003b). La structure chimique de la perbergine est développée dans la Figure 22.

9" 10" 7"

6" 5"

4" 8" 3"

2" 1"

8 HO 9 O 7 2 OH A C 3 2' 6 OH 10 1' 5 4 B 3' OH O 6' 4' OCH 5' 3

Figure 22. Structure chimique du composé 1 (perbergine) isolé de l’extrait d’écorces de D. pervillei .

I.3. Effet de la perbergine sur la viabilité et la croissance de R. fascians

I.3.1. Effet de la perbergine sur la viabilité de R. fascians et la détermination de sa concentration minimale qui inhibe l’expression du gène attH

L’effet de la perbergine, utilisée à différentes concentrations (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 5 et 10 µM), sur la viabilité et la croissance de R. fascians a été étudié afin de confirmer si les bactéries sont viables durant l’incubation en présence ou en absence du composé et afin de déterminer la concentration minimale de ce composé qui inhibe l’expression du gène attH et qui n’affecte pas la viabilité de la bactérie. Le protocole détaillé pour la réalisation de ce test est résumé dans le Chapitre Méthode et dans l’Annexe 9. Les résultats obtenus pour cette étude sont résumés dans la Figure 23.

Chapitre IV : Résultats

120 120 DO

100 * 100 600nm 80 * * 80

* * * (%) relative 60 60 40 * 40 20 20 Viabilité relative (%) 0 0 0 0.05 0.1 0.2 0.5 1 5 10 Concentration (µM) Viabilté Densité bactérienne

Figure 23. Activité de la perbergine appliquée à différentes concentrations sur la viabilité de R. fascians mise en culture dans la COI.

D’après la Figure 23, aucune différence significative à p ≤ 0.05 n’a été observée sur la viabilité des bactéries non traitées et traitées avec la perbergine au-dessous de 0.5 µM malgré une légère diminution de la turbidité (DO 600 nm ) à cette dernière concentration. Au-delà de cette concentration, la viabilité de la bactérie diminue progressivement et à 10 µM la majorité des bactéries sont mortes malgré les valeurs élevées de la turbidité (DO 600 nm ). Parallèlement à ce test, l’effet de la perbergine à ces différentes concentrations sur l’expression du gène attH a été étudié. Les résultats de l’activité GUS sont reportés dans la Figure 24.

120 100 80 60 * 40 20 * * * * * 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) 0 0.05 0.1 0.2 0.5 1 5 10 Concentration (µM)

Figure 24. Activité de la perbergine à différentes concentrations sur l’expression de attH chez R. fascians mise dans la COI.

La Figure 24 montre que la perbergine diminue significativement l’expression du gène attH à partir de 0.1 µM. A cette concentration, la diminution est de l’ordre de 50 % tandis qu’à partir de 0.2 µM, elle est de 80 %. La concentration minimale en perbergine qui inhibe l’expression de attH qui n’affecte pas la viabilité de la bactérie est de l’ordre de 0.2 µM.

Chapitre IV : Résultats

I.3.2. Effet de la perbergine sur la croissance de R. fascians

L’effet de la perbergine, à différentes concentrations (0, 0.2, 1, 5 et 10 µM), sur la croissance de la bactérie a été testé afin de vérifier si ce composé perturbe le métabolisme général de R. fascians . Après mesure de la densité bactérienne toutes les 2 h pendant une période de 30 h, les résultats obtenus sont reportés dans le graphique de la Figure 25. 1.5 0 0.2 µM 1 µM 1.0 5 µM

600 nm 10 µM

DO 0.5

0.0 0 5 10 15 20 25 30 Temps (h)

Figure 25. Activité de la perbergine à différentes concentrations (µM) sur la croissance de R. fascians .

D’après le graphique de la Figure 25, aucune différence significative n’est observée entre le profil de croissance de la souche D188 de R. fascians en absence ou en présence de 0.2 et 1 µM de perbergine. Ce résultat indique qu’à ces concentrations, la perbergine n’affecte pas le processus de la division cellulaire de R. fascians . En augmentant la concentration à 5 µM, une différence, qui se traduit par un retard de la croissance, commence à être observée après 12 h d’incubation. À une concentration de 10 µM, aucune croissance n’est observée indiquant qu’à cette concentration, la perbergine devient toxique pour la bactérie. Ceci est en accord avec les résultats obtenus pour l’étude de la viabilité de R. fascians en présence de la perbergine confirmant par ailleurs que la concentration minimale d’inhibition de l’expression du gène attH chez R. fascians qui n’affecte ni la croissance ni la viabilité de la bactérie est de l’ordre de 0.2 µM.

I.4. Comparaison de l’activité de la perbergine avec des isoflavonoïdes connus

Les résultats de la comparaison de l’activité de la perbergine avec celle de la génistéine et de la daidzéine, utilisées à la même concentration (0.2 µM), sont présentés dans la Figure 26.

Chapitre IV : Résultats

140 120 DO

120 100 600nm 100 80 80 (%) relative 60 60 40 * 40 20 20 0 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) COI Genistéine Daidzéine Perbergine Concentration à 0.2 µM . Expression de attH Densité bactérienne

Figure 26. Comparaison de l’activité de la génistéine, de la daidzéine et de la perbergine à 0.2 µM sur l’expression du gène attH chez R. fascians .

D’après la Figure 26, la génistéine et la daidzéine à 0.2 µM n’ont pas d’effet sur l’expression du gène attH chez R. fascians . Ceci suggère que l’activité de la perbergine pourrait être probablement due à la présence soit du groupement prényle, soit la fonction méthyle, soit des deux.

I.5. Mécanisme d’action de la perbergine sur l’expression des gènes localisés sur le plasmide linéaire de R. fascians

I.5.1. Effet de la perbergine sur l’expression des loci att et fas

L’expression du gène attA et du gène régulateur attR du locus att (Figure 2) ainsi que celle de fasA qui est localisé dans le locus fas a été étudiée en présence de la perbergine afin d’étudier l’effet de ce composé sur le mécanisme d’autorégulation et son influence sur l’expression des gènes responsables de la production des facteurs de virulence chez R. fascians . Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 27. D’après la Figure 27, la perbergine inhibe à plus de 90 % l’expression des gènes attA , attH et attR ce qui suggère que son activité affecte le mécanisme d’autorégulation chez la bactérie. L’inhibition de l’expression de attA et attH indique que l’expression de tout le locus att tant au niveau transcriptionnel que traductionnel a été inhibé. D’autre part, à cette concentration de 0.2 µM, la perbergine diminue de plus de 60 % l’expression du gène fasA, indiquant que son activité ne se limite pas au locus att mais s’étend également au locus fas . Cette inhibition pourrait s’expliquer par la perturbation du mécanisme d’autorégulation car l’expression de fas dépend en partie de AttR (Temmerman et al. 2000). Ces résultats

Chapitre IV : Résultats permettent de conclure que la perbergine affecte non seulement le mécanisme d’autorégulation chez R. fascians mais également la production des facteurs de virulence.

120 100 80 60 40 * 20 * * * 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) attA attH attR fasA COI Perbergine (0.22µM)

Figure 27. Activité de la perbergine à 0.2 µM sur l’expression des gènes attA, attH, attR et fasA chez R. fascians .

I.5.2. Effet de la perbergine sur l’expression d’autres gènes chez R. fascians

Dans cette partie, l’expression des gènes constitutifs pFi_065, nrp5 et stk1 localisés sur le plasmide pFiD188 de R. fascians a été étudiée en présence ou en absence de la perbergine . Après évaluation de l’activité GUS, les résultats obtenus sont reportés dans la Figure 28.

120 100 80 60 40 20 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) pFi_065 nrp5 stk1 COI Perbergine (0.2 µM) .

Figure 28. Activité de la perbergine à 0.2 µM sur l’expression des gènes pFi_065 , nrp5 et stk1 chez R. fascians .

D’après la Figure 28, l’expression des gènes pFi_065, nrp5 et stk1 n’est pas affectée par la perbergine. Ceci suggère que la perbergine n’affecte pas le mécanisme général de la transcription et de la traduction dans la bactérie mais se limite à un effet sur les loci att et fas . Ceci est en accord avec les résultats obtenus dans la Figure 25 où la croissance, qui dépend de

100

Chapitre IV : Résultats ces mécanismes, n’a pas été affectée.

I.6. Expression in planta des gènes attH, fasA et nrp5 lors de l’infection de N. tabacum et de D. pervillei par R. fascians

L’expression des gènes attH, fasA et nrp5 a été évaluée pendant l’infection des plantules par R. fascians . Les souches D188::pTGGUSDV1, D188::pUCWT1 et D188::pUC8bGUS ont été utilisées pour infecter les plantules in vitro de D. pervillei et de N. tabacum . Chaque lot a été co-infecté avec la souche sauvage D188 de R. fascians . Le but de cette expérience est de montrer si l’expression de ces gènes est affectée in planta . La description de la technique utilisée pour cette expérience est détaillée dans le chapitre matériel et méthodes. Les résultats obtenus sont résumés dans la Figure 29.

1000 C.F.U.) 6

100 *

10 *

Expression de gène (A.U./10 attH fasA nrp5 attH fasA nrp5

N. tabacum D. pervillei

Figure 29. Comparaison de l’expression in planta des gènes attH, fasA et nrp5 chez les plantules de N. tabacum et D. pervillei infectées avec R. fascians . La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle (N. tabacum ) est marqué par le signe (*).

D’après la Figure 29, l’expression des gènes attH et fasA est significativement plus faible lorsque la bactérie infecte D. pervillei que lorsqu’elle infecte N. tabacum . En revanche, aucune différence n’a été observée au niveau de l’expression du gène constitutif nrp5 . Ces résultats sont en accord avec l’activité de la perbergine et renforcent notre hypothèse que D. pervillei contient des composés qui diminuent spécifiquement l’expression des loci att et fas chez R. fascians .

101

Chapitre IV : Résultats

I.7. Effet de l’ajout tardif de la perbergine sur l’expression du locus att chez R. fascians.

Les résultats de l’effet de l’ajout de la perbergine à différents moments (c'est-à-dire après 0, 4, 8 ou 16 h de la période d’incubation) sur l’expression du locus att chez R. fascians sont résumés dans la Figure 30.

120 100 * 80 * 60 * 40 20 0 Activité GUS relativeActivité GUS (%) COI 0h 4h 8h 16h Heure d'ajout de la perbergine (0.2 µM)

Figure 30. Activité de la perbergine ajoutée à des temps différents pendant la période d’incubation sur l’expression du gène attH mise en culture dans la COI.

D’après la Figure 30, lorsque la perbergine est ajoutée à T = 0, c'est-à-dire au tout début de la période d’incubation, l’expression du gène attH est inhibée. Plus l’ajout de la perbergine se fait tard, plus l’activité GUS augmente. Ceci indique que lorsqu’on laisse le système d’autorégulation fonctionner pendant quelques heures avant d’ajouter la perbergine, l’effet inhibiteur de l’expression du gène attH est perdu. Il est donc possible que la perbergine entre en concurrence avec le composé autorégulateur.

I.8. Expression des gènes appartenant à la famille LysR en présence de la perbergine.

Afin de vérifier si la perbergine affecte le fonctionnement général des régulateurs de type LysR, l’expression de la protéine NodD de type LysR chez Azorhizobium caulinodans à travers l’expression du gène nodA a été évaluée en utilisant le test d’activité LacZ. L’expression du gène hemA a été utilisée comme contrôle car son expression est constitutive et ne dépend pas de la protéine NodD. Les résultats obtenus pour ce test sont présentés dans la Figure 31. D’après la Figure 31, l’ajout de la perbergine (+ per) n’affecte pas l’expression de hemA

102

Chapitre IV : Résultats ou nodD en absence ou en présence de la naringénine (+ nar). Par conséquent, la perbergine n’affecte probablement pas le fonctionnement général des régulateurs de type LysR. Il est donc probable que la perbergine est un inhibiteur compétitif de l’inducteur de AttR et que sa structure est proche de celle de l’inducteur naturel.

100 80 60 * 40

Activité LacZ 20 0 hemA hemA hemA nodA nodA nodA + nar+ nar + nar + nar + per + per

Figure 31. Evaluation de l’expression des gènes hemA et nodA chez A. caulinodans en présence ou en absence de la naringénine et de la perbergine. La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle ( hemA )est marqué par le signe (*).

I.9. Effet de la perbergine sur l’agressivité de R. fascians

Le niveau d’agressivité de R. fascians sur N. tabacum , qui est une plante sensible à la bactérie, a été évalué en présence ou en absence de la perbergine comme décrit dans le Chapitre III - II.1.4.6. Trois types de phénotypes ont été étudiés à savoir le développement des cotylédons qui permet d’évaluer la croissance des plantules ; le nombre de feuilles qui reflète l’activité du méristème ; et la formation de galles feuillées qui traduit la sévérité des symptômes.

I.9.1. Effet de la perbergine sur le développement des cotylédons chez les plantules de tabac infectées avec R. fascians

Les résultats des mesures de surfaces cotylédonaires ( a) des plantules après 1, 2, 3 et 5 semaines d’infection sont présentés dans la Figure 32. Sur le graphique, les plantules sont catégorisées selon leur surface cotylédonaire. La première catégorie regroupe les plantules qui n’ont pas développé de cotylédon (Blanc). La deuxième catégorie regroupe les plantules ayant des cotylédons dont la surface est inférieure ou égale à 3 mm 2 (Bleu). La troisième regroupe

103

Chapitre IV : Résultats les plantules ayant des surfaces cotylédonaires comprises entre 3 à 6 mm 2 (Rouge). Enfin, la quatrième regroupe les plantules ayant des cotylédons avec une surface supérieure à 6 mm 2 (Vert). L’axe des ordonnées représente la répartition en pourcentages des différentes catégories de surfaces cotylédonaires. L’axe des abscisses représente les différentes souches et leurs traitements utilisés pour infecter N. tabacum . A B 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40 20 cotylédonaires (%)

cotylédonaires (%) 20 Répartition des aires Répartition des aires 0 0 D188 D188-In D188-P D188-5 D188 D188-In D188-P D188-5 C D 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40

cotylédonaires (%) 20 cotylédonaires (%) 20 Répartition des aires Répartition des aires 0 0 D188 D188-In D188-P D188-5 D188 D188-In D188-P D188-5

a = 0 mm 2 0 < a ≤ 3 mm 2 3 < a ≤ 6 mm 2 a > 6 mm 2

D188 : souche sauvage de R. fascians non traitée avec la perbergine D188-In : souche D188 incubée pendant 18 h avec la perbergine à 0.2 µM D188-P : perbergine à 0.2 µM ajoutée avec la souche D188 au moment de l'infection D188-5 : souche avirulente de R. fascians

Figure 32. Comparaison des phénotypes cotylédonaires de plantes de N. tabacum infectées avec R. fascians traitée ou non avec la perbergine. Développement des cotylédons des plantules de N. tabacum (A) une, (B) deux, (C) trois et (D) cinq semaines après infection par la souche D188 traitée ou non avec la perbergine à 0.2 µM et la souche non virulente D188-5 de R. fascians (a = aire cotylédonaire).

Dès la première semaine après infection (Figure 32A), une différence significative de la répartition des aires cotylédonaires a été constatée au niveau des lots infectés avec la souche traitée ou non à la perbergine. En effet, d’après cette figure, 89, 78 et 80 % des plantules infectées avec R. fascians respectivement traitée avec la perbergine (D188-In et D188-P) ainsi que la souche non virulente D188-5 développent des cotylédons dont les surfaces se trouvent entre 3 à 6 mm 2. En revanche, les cotylédons sont moins développés lorsque les graines en germination ont été infectées avec la souche virulente D188 de R. fascians car 35 % des plantules développent des cotylédons dont les surfaces se trouvent entre 0 à 3 mm² et

104

Chapitre IV : Résultats seulement 53 % entre 3 à 6 mm². Deux semaines après infection (Figure 32B), malgré le développement des cotylédons, la différence phénotypique entre les lots infectés avec la souche D188 traitée ou non à la perbergine persiste. En effet, 62, 45 et 54 % des plantules infectées respectivement avec D188-In, D188-P et D188-5 développent des cotylédons dont l’aire est supérieure ou égale à 6 mm² et 29, 47 et 42 % entre 3 à 6 mm² (Figure 32B). Le lot infecté par la souche virulente D188 présente 52 % des plantules ayant des surfaces cotylédonaires entre 3 à 6 mm² et seulement 20 % développent des cotylédons avec plus de 6 mm² (Figure 32B). Trois semaines après infection (Figure 32C), les surfaces cotylédonaires n’ont plus évolué chez les lots infectés par la souche D188 traitée ou non avec la perbergine. La répartition des surfaces cotylédonaires pour chaque lot reste la même que celle observée après deux semaines (Figure 32C). En revanche, 90 % des plantules développent des cotylédons de plus de 6 mm² chez le lot infecté par la souche non virulente D188-5 de R. fascians (Figure 32C). A partir de la troisième semaine, aucun changement n’a été observé au niveau des cotylédons car ils atteignent leur phase de développement maximal, ce qui explique les résultats obtenus après la cinquième semaine (Figure 32D).

I.9.2. Effet de la perbergine sur l’activité du méristème chez les plantules de tabac infectées avec R. fascians

L’activité du méristème a été mesurée par le nombre de feuilles formées après l’infection des lots de plantules de N. tabacum avec la souche D188 traitée ou non avec la perbergine et la souche non virulente D188-5 de R. fascians . Les mesures ont été effectuées 1, 3 et 5 semaines après infection des graines en germination et les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 33. Les plantules sont catégorisées selon le nombre de feuilles formées. La première catégorie regroupe les plantules qui n’ont pas de feuille (Blanc). La deuxième catégorie regroupe les plantules ayant développées une feuille (Mauve). La troisième regroupe les plantules avec deux feuilles bien distinctes (Jaune). La quatrième regroupe les plantules ayant 3 feuilles bien distinctes (Orange). Enfin, la cinquième regroupe les plantules portant 4 feuilles bien distinctes ou plus (Vert). L’axe des ordonnées représente la répartition en pourcentages des différentes catégories de plantes selon leur nombre de feuilles. L’axe des abscisses représente les différentes souches et leurs traitements utilisés pour infecter N. tabacum .

105

Chapitre IV : Résultats

A B 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40 20 Répartition selon le 20 Répartition selon le nombre de feuilles (%) nombre de feuilles (%) 0 0 D188 D188-In D188-P D188-5 D188 D188-In D188-P D188-5 C 120 n = 0 n = 1 n = 2 100 n = 3 n = 4 80 D188 : souche sauvage de R. fascians non traitée avec la perbergine 60 D188-In : souche D188 incubée pendant 18 h 40 avec la perbergine à 0.2 µM D188-P : perbergine à 0.2 µM ajoutée avec la 20 souche D188 au moment de l'infection Répartition selon le

nombre de feuilles (%) D188-5 : souche avirulente de R. fascians 0 D188 D188-In D188-P D188-5 Figure 33. Comparaison des activités du méristème de plantes de N. tabacum infectées par R. fascians traitée ou non avec la perbergine. Activité du méristème de plantes de N. tabacum infectées avec la souche D188 traitée ou non avec la perbergine et la souche non virulente D188-5 de R. fascians après (A) une, (B) trois et (C) cinq semaines d’infection.

Une semaine après infection (Figure 33A), 15 à 20 % des plantules infectées par la souche D188 traitée ou non avec la perbergine développent leur première feuille tandis que ce pourcentage est de 37 % pour les plantules infectées par la souche non virulente D188-5. Après 3 semaines d’infection (Figure 33B), une différence significative de la répartition des plantes en fonction de leur nombre de feuilles commence à être observée. En effet, plus de 95 % des plantules infectées par la souche non virulente D188-5 de R. fascians développent deux feuilles alors que 35, 37 et 28 % développent respectivement deux, une et zéro feuille lorsque les lots sont infectés avec la souche virulente D188. L’ajout de la perbergine au moment de l’infection (D188-P) semble ne pas affecter le niveau de la virulence de la souche D188 car 34, 32 et 34 % des plantules infectées développent respectivement deux, une et zéro feuille. En revanche, lorsque la souche D188 est incubée avec 0.2 µM de perbergine (D188- In), le méristème semble être plus actif car 68 % des plantes infectées développent deux feuilles et seulement 17 et 15 % développent respectivement une et zéro feuille. Après 5 semaines (Figure 33C), aucune évolution significative n’est observée chez les plantes infectées par la souche virulente D188 de R. fascians car la répartition des plantes en

106

Chapitre IV : Résultats fonction de leur nombre de feuilles est plus ou moins la même par rapport aux résultats obtenus pour la troisième semaine. Lorsque la perbergine est ajoutée au moment de l’infection (D188-P), 4 % des plantules infectées ne développent pas de feuilles tandis que 26, 51, 8 et 11 % développent respectivement 1, 2, 3 et 4 feuilles. Lorsque la souche D188 est incubée avec la perbergine avant l’infection, les pourcentages des plantules développant 3 et 4 feuilles sont assez élevés avec 21 et 28 % respectivement, 43 % développent deux feuilles et 9 % une feuille. L’infection des plantules par la souche non virulente D188-5 montre que 42 et 54 % des plantules infectées développent respectivement 3 et 4 feuilles et 4 % deux feuilles. Ensemble, ces résultats indiquent que la souche non virulente D188-5 n’affecte pas l’activité du méristème tandis que la souche virulente D188, perturbe son activité. Cependant le traitement de la souche virulente D188 avec la perbergine montre une atténuation ou une diminution de l’agressivité de la bactérie qui se traduit par une légère activité du méristème chez D188-P et D188-In.

I.9.3. Effet de la perbergine sur la formation de galles feuillées chez les plantules de tabac infectées avec R. fascians

La formation de galles feuillées a été évaluée sur les plantules de N. tabacum infectées par la souche non virulente D188-5 et la souche D188 traitée ou non avec la perbergine comme décrit dans le cas précédent. Les galles feuillées formées ont été dénombrées 1, 3, 5 et 7 semaines après infection des graines en germination. Les résultats obtenus sont résumés sur le graphique de la Figure 34. L’axe des ordonnées représente le taux de formation de galles feuillées chez les plantules infectées. L’axe des abscisses représente la période où le dénombrement de galles feuillées a été effectué. D’après la Figure 34, aucune galle feuillée n’a été observée après une semaine d’infection quelle que soit la souche ou le traitement effectué sur la souche bactérienne utilisée. Les lots de N. tabacum infectés par la souche non virulente D188-5 n’ont pas développé de galle feuillée même 7 semaines après la période d’infection. En revanche, après 3 semaines, une différence significative au niveau des phénotypes entre les plantes infectées par la souche D188 traitée ou pas avec la perbergine commence à s’installer. En effet, 27 % des plantules infectées par la souche virulente D188 développent déjà des galles feuillées (Figure 34). Lorsque la perbergine est ajoutée à une concentration finale de 0.2 µM au moment de l’infection (D188-P), seulement 10 % des plantules infectées développent des galles feuillées. De même, lorsque la souche D188 est incubée dans un milieu contenant 0.2 µM de perbergine (D188-In), seulement 8 % des plantules de N. tabacum développent des 107

Chapitre IV : Résultats galles feuillées. Après 5 semaines d’infection, le taux de plantules développant des galles feuillées augmente car 54, 29 et 23 % de plantules développant des galles feuillées ont été recensées chez les lots infectés respectivement par D188, D188-P et D188-In. Cette augmentation continue jusqu’à la 7ème semaine d’infection car 65, 44 et 44 % respectivement des plantules infectées ont développé des galles feuillées (Figure 34).

100 D188 80 D188-In D188-P 60 D188-5 * 40 * 20 Taux de formation * de galles feuillées (%) 0 * ** 0 1 3 5 7 Semaines

Figure 34. Evolution de la formation de galles feuillées chez les plantules de N. tabacum infectées par la souche virulente D188 traitée ou non avec la perbergine et la souche non virulente D188-5 de R. fascians . La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle (D188) est marqué par le signe (*).

I.9.4. Comparaison des différents phénotypes de plantules de tabac infectées avec les souches de R. fascians traitées ou non avec la perbergine

Pour avoir une idée globale des phénotypes de N. tabacum infectées par la souche virulente D188 traitée ou non avec la perbergine et la souche non virulente D188-5, des photos de chaque lot ont été prises et sont illustrés sur la Photo 8. D’après les images sur la Photo 8, les galles feuillées semblent être plus développées chez les plantules infectées par la souche virulente D188 de R. fascians et les plantules sont totalement déformées (Photo 8A). Lorsque la souche D188 est incubée pendant 18 h avec la perbergine, la virulence de la bactérie semble être atténuée car le phénotype est moins affecté. En effet, malgré la formation de galles feuillées, ces dernières ne sont pas aussi développées que dans le cas des plantules infectées par la souche virulente D188 (Photo 8B). De plus les feuilles sont moins affectées et bien distinctes indiquant que le méristème est actif (Photo 8B). L’ajout de la perbergine au moment de l’infection diminue également le développement du

108

Chapitre IV : Résultats symptôme car d’après l’image sur la Photo 8C, la taille des galles feuillées est réduite par rapport aux phénotypes observés pour les plantules infectées par la souche D188. La surface foliaire est également réduite et les plantules sont en général légèrement déformées (Photo 8D). A B

C D

Photo 8. Comparaison de l’état phénotypique des plantules de N. tabacum infectées par la souche virulente D188 traitée ou non avec la perbergine et par la souche non virulente D188-5 de R. fascians . Phénotype général des lots infectés avec : (A) la souche virulente D188, (B) la souche D188 pré-incubée avec la perbergine [D188- In], (C) la souche D188 traitée avec la perbergine au moment d’infection [D188-P] et (D) la souche non virulente D188-5 de R. fascians 7 semaines après infection. La barre d’échelle représente 5 mm.

Ces résultats montrent que les plantules infectées par la souche D188 traitée avec la perbergine sont moins déformées par rapport à celles traitées avec la souche D188. Ce qui suggère que la perbergine atténue ou retarde le développement du symptôme induit par R. fascians . Lorsque les plantules sont infectées par la souche non virulente D188-5, aucun symptôme n’est observé et les plantules semblent se développer normalement (Photo 8D).

109

Chapitre IV : Résultats

II. Expression des gènes impliqués dans le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa

II.1. Criblage des extraits de Dalbergia sur l’inhibition du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa

Les extraits chimiques des 4 espèces de Dalbergia à savoir D. chlorocarpa, D. pervillei, D. purpurascens et D. trichocarpa ont été utilisés pour le criblage sur l’inhibition ou la diminution de la production des facteurs de virulence chez P. aeruginosa . En effet, le choix de ces espèces de Dalbergia a été basé sur les résultats obtenus lors du criblage de l’effet de leurs extraits sur l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence chez R. fascians (Figure 11). Nous supposons que si certains extraits de Dalbergia inhibent l’expression des gènes impliqués dans la virulence de R. fascians , qui est une bactérie à Gram positif, il est probable que l’activité pourrait s’étendre vers les bactéries à Gram négatif. Dans le cadre de ce travail, nous avons choisi de travailler sur la bactérie P. aeruginosa pour les raisons suivantes : tout d’abord, étudier le mécanisme de virulence chez les bactéries à Gram négatif est intéressant étant donné que la majorité des bactéries pathogènes appartiennent à ce groupe. Ensuite, les mécanismes contrôlant l’expression des gènes de virulence chez cette bactérie sont bien connus. Comme la bactérie développe facilement des résistances aux antibiotiques, il est intéressant de développer une alternative de lutte qui minimise le développement de résistance. Dans cette étude, l’expression des gènes lasB et rhlA ainsi que la production de la pyocyanine ont été étudiées pour le criblage des extraits des 4 espèces de Dalbergia sur l’inhibition du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa . Ainsi, 4 étapes de criblage ont été réalisées.

II.1.1. Première étape de criblage

Les expressions des gènes lasB et rhlA respectivement chez les souches PAO1::p β01 et PAO1::p β02 de P. aeruginosa ont été utilisées pour le criblage des extraits de Dalbergia sur l’inhibition du mécanisme du quorum sensing. Les résultats obtenus sont résumés dans la Figure 35.

110

Chapitre IV : Résultats

300 * 1.5 * * * * * * DO 200 * * * 1.0

* 600nm 100 * 0.5 Activité LacZ

0 0.0 DMSO E F R E F R E F R E F R

D.chlorocarpa D.pervillei D.purpurascens D.trichocarpa

Expression de lasB Densité bactérienne B

800 * * 600 * * * 1.0 DO

* * 600nm 400 * * 0.5

Activité LacZ 200

0 0.0 DMSO E F R E F R E F R E F R

D.chlorocarpa D.pervillei D.purpurascens D.trichocarpa

Expression de rhlA Densité bactérienne

DMSO : contrôle E : extrait méthanolique de l'écorce F : extrait méthanolique des feuilles R : extrait méthanolique de la racine

Figure 35. Criblage des extraits de quelques espèces de Dalbergia sur l’activité anti-quorum sensing chez P. aeruginosa . Evaluation de l’expression (A) du gène lasB et (B) du gène rhlA chez P. aeruginosa en présence ou en absence de l’extrait méthanolique d’écorces, de feuilles ou de racines de D. chlorocarpa, D. pervillei, D. purpurascens et D. trichocarpa . La différence significative à p ≤ 0.05 par rapport au contrôle est marqué par le signe (*).

D’après la Figure 35A, les extraits de Dalbergia testés n’inhibent pas ou ne diminuent pas l’expression du gène lasB à part l’extrait méthanolique de feuilles de D. pervillei . Cependant, les extraits méthanoliques de feuilles de D. chlorocarpa, de D. pervillei et de D. trichocarpa diminuent l’expression de rhlA (Figure 35B). Les autres extraits ne présentent pas d’activité.

111

Chapitre IV : Résultats

II.1.2. Deuxième étape de criblage

Par la suite, les feuilles de D. pervillei et de D. trichocarpa ont été retenues pour les prochaines étapes du criblage car elles inhibent le plus l’expression des gènes ciblés. Ainsi, les résultats de l’évaluation de l’expression des gènes lasB et rhlA chez P. aeruginosa en présence des extraits hexaniques, dichlorométhaniques et méthanoliques de ces feuilles sont présentés dans la Figure 36. A

300 1.0 0.8 200 DO

0.6 nm 600 0.4 100

Activité LacZ 0.2 0 0.0 DMSO M D H M D H D. pervillei D. trichocarpa Expression de lasB Densité bactérienne B

300 1.5 DO 200 1.0 600 nm 600

100 0.5 Activité LacZ

0 0.0 DMSO M D H M D H D. pervillei D. trichocarpa Expression de rhlA Densité bactérienne

Figure 36. Criblage des extraits bruts de D. pervillei et de D. trichocarpa sur l’activité anti-quorum sensing chez P. aeruginosa . Evaluation de l’expression (A) du gène lasB et (B) de rhlA de P. aeruginosa en présence ou en absence des extraits méthanoliques [M], dichlorométhaniques [D] ou hexaniques [H] de feuilles de D. pervillei et de D. trichocarpa .

D’après la Figure 36, aucun des extraits de Dalbergia n’affecte la croissance de P. aeruginosa . Bien que ces extraits n’aient pas d’effet statistiquement significatif sur l’expression des gènes lasB et rhlA (Figures 36A et 36B), une légère diminution de l’activité LacZ peut être observée en présence de l’extrait dichlorométhanique et hexanique des feuilles de D. trichocarpa . Pour la suite, ces deux extraits ont été retenus pour la prochaine étape de

112

Chapitre IV : Résultats criblage.

II.1.3. Troisième étape de criblage

Afin de vérifier l’activité des extraits dichlorométhanique et hexanique de feuilles de D. trichocarpa, l’expression des gènes lasB et rhlA a été mesurée en présence de ces extraits aux concentrations finales suivantes : 100, 200, 300 et 400 µg.ml -1. L’activité LacZ a été mesurée et les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 42. A

1200 1.2 1000

* DO 800 * 0.8

* * nm 600 600 400 0.4 Activité LacZ 200 0 0.0 DMSO 100 200 300 400 100 200 300 400 Ext. hexan. Ext. dichloro. Concentration (µg/ml) Expression de lasB Densité bactérienne B

1000 1.4 1.2 800 * * 1.0 DO

600 0.8 nm 600 * 400 0.6 ** 0.4 Activité LacZ 200 0.2 0 0.0 DMSO 100 200 300 400 100 200 300 400 Ext. hexan. Ext. dichloro. Concentration (µg/ml) Expression de rhlA Densité bactérienne

Figure 37. Comparaison de l’activité des extraits de D. trichocarpa à différentes concentrations sur le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa . Effet des extraits hexanique et dichlorométhanique de feuilles de D. trichocarpa utilisés à différentes concentrations sur l’expression (A) du gène lasB et (B) du gène rhlA chez P. aeruginosa .

D’après la Figure 37, quelles que soient les concentrations d’extraits de plantes utilisées, la croissance des bactéries n’est pas affectée. En ce qui concerne l’expression du gène lasB,

113

Chapitre IV : Résultats l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa inhibe de manière significative son expression à partir de 200 µg.ml -1 (Figure 37A). Cette inhibition augmente avec les concentrations de l’extrait car à 300 et 400 µg.ml -1, l’expression de lasB est inhibée à presque 50 %. En revanche, l’extrait dichlorométhanique ne commence seulement à être actif qu’à partir de la concentration de 400 µg.ml -1 avec une légère diminution de l’expression comparée à celle obtenue pour l’extrait hexanique (Figure 37A). En ce qui concerne l’expression du gène rhlA , l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa diminue significativement son expression à partir de 100 µg.ml -1, tandis que l’extrait dichlorométhanique n’est actif qu’à partir de 400 µg.ml -1 (Figure 37B). Avec la concentration de 200 µg.ml -1 de l’extrait hexanique, l’expression de rhlA est réduite à 50 %. Cette expression diminue progressivement avec la concentration utilisée car à 300 et 400 µg.ml -1, cette diminution peut être estimée à environ 25 % (Figure 37B). En se basant sur les résultats obtenus, l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa a été choisi pour la première étape de fractionnement car il inhibe significativement l’expression de lasB et de rhlA chez P. aeruginosa sans que la croissance de la bactérie ne soit affectée.

II.1.4. Quatrième étape de criblage

Il s’agit du fractionnement l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa sur CCM couplé avec le test d’activité LacZ sur l’expression du gène lasB . Ce fractionnement a donné 26 fractions nommées Ft1 à Ft26. La distribution de ces fractions sur la plaque chromatographique est illustrée sur la Photo 9.

Le sens de migration est indiqué par la pointe de la flèche (distance de migration = 18 cm)

Photo 9. Chromatogramme de l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa sur plaque CCM.

Ces 26 fractions ainsi que la fraction totale ont ensuite été testées pour leur activité sur l’inhibition de l’expression du gène lasB et de la production de la pyocyanine. Le protocole détaillé de la quantification de la pyocyanine est décrit dans le chapitre matériel et méthodes. Les résultats de ce test sont représentés par la Figure 36.

114

Chapitre IV : Résultats

160 140 1.6 120 * * * DO 100 * 1.2 80 600nm 0.8 60 *

Activité LacZ 40 0.4 20 0 0.0 Ft1 Ft2 Ft3 Ft4 Ft5 Ft6 Ft7 Ft8 Ft9 Tot Ft10 Ft11 Ft12 Ft13 Ft14 Ft15 Ft16 Ft17 Ft18 Ft19 Ft20 Ft21 Ft22 Ft23 Ft24 Ft25 Ft26

DMSO Expression de lasB Densité bactérienne B

0.4

0.3 ) * * * * * * 380nm 0.2 * * * * * * * * *

(DO * 0.1 * * * * * * * 0.0 Production de pyocyanine Ft1 Ft2 Ft3 Ft4 Ft5 Ft6 Ft7 Ft8 Ft9 Tot Ft10 Ft11 Ft12 Ft13 Ft14 Ft15 Ft16 Ft17 Ft18 Ft19 Ft20 Ft21 Ft22 Ft23 Ft24 Ft25 Ft26 DMSO Ctrl : Contrôle Fn : Fractions Tot : Fraction hexanique totale

Figure 38. Criblage des fractions de l’extrait de feuilles de D. trichocarpa sur l’activité anti-quorum sensing chez P. aeruginosa . Effet des différentes fractions de l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa sur l’expression (A) du gène lasB et (B) la production de la pyocyanine chez P. aeruginosa .

D’après la Figure 38A, seules les fractions Ft10 à Ft12 et Ft14 ainsi que l’extrait hexanique total de feuilles de D. trichocarpa diminue significativement l’expression du gène lasB . L’effet de l’extrait total est plus marqué par rapport à ceux des fractions, ceci probablement en raison de pertes de rendement durant la phase de fractionnement. En revanche, toutes les fractions, sauf Ft6, Ft22, Ft23 et Ft24, diminuent significativement voire inhibent, pour certaines, la production de la pyocyanine (Figure 38B). L’activité des fractions Ft10 à Ft15 est similaire à celle de l’extrait total indiquant que ces fractions semblent être très actives même à faible dose. En tout, nous supposons que les fractions Ft11 et Ft12 sont intéressantes car elles inhibent complètement la production de la pyocyanine et diminue également l’expression de lasB sans que la croissance de la bactérie ne soit affectée. Cette étude s’est arrêtée à ce niveau mais d’après les résultats obtenus, il semble être intéressant de continuer les prochaines étapes avec les extraits Ft11 et Ft12 (Photo 9).

115

Chapitre IV : Résultats

II.2. Effet de l’extrait de Combretum sur l’expression des gènes impliqués dans le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa

Une étude préliminaire réalisée au sein du Laboratoire de Biotechnologie Végétale de l’ULB a montré que l’extrait aqueux d’écorces de Combretum albiflorum inhibe la production de la violacéine chez la bactérie Chromobacterium violaceum . Il s’agit d’une bactérie à Gram négatif chez laquelle il a été rapporté que la production de la violacéine dépend du mécanisme du quorum sensing (McClean et al. 1997). En effet, l’expérience a été effectuée sur une bactérie mutante CV026 incapable, par elle-même, de produire de la violacéine car la bactérie est incapable de synthétiser de l’homosérine lactone. Lorsqu’une quantité suffisante d’homosérine lactone est ajoutée dans le milieu de culture contenant cette souche bactérienne, cette dernière retrouve sa capacité à produire de la violacéine. Durant cette étude préliminaire, il a été démontré que l’extrait aqueux d’écorces et de feuilles de C. albiflorum inhibent la production de la violacéine chez la souche CV026 de C. violaceum même après addition d’une quantité suffisante d’homosérine lactone (Vandeputte et al. 2010) Sachant l’importance de ce résultat préliminaire, nous étions amenés de voir l’effet de ces extraits sur un autre modèle de mécanisme du quorum sensing d’une bactérie pathogène. Ainsi a été testé l’effet de ces extraits sur la production de la pyocyanine chez P. aeruginosa . En effet, la pyocyanine est l’un des exoproduits dont la production dépend du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa . Les résultats obtenus sont résumés dans la Figure 39. A B 0.8 1.5

0.6

) 1.0

) * 0.4 380 600nm * * (A 0.5 (DO Pyocyanine 0.2 * * 0.0 0.0 Croissance Croissance bactérienne DMSO Extrait Extrait DMSO Extrait Extrait de feuilles d'écorces de feuilles d'écorces

Figure 39. Criblage des extraits de feuilles et d’écorces de C. albiflorum sur l’activité anti-quorum sensing chez P. aeruginosa . (A) Effet des extraits de C. albiflorum sur la production de la pyocyanine chez P. aeruginosa ; (B) Effet des extraits de C. albiflorum sur la croissance de P. aeruginosa .

D’après la Figure 39A, les extraits de feuilles et d’écorces de C. albiflorum inhibent totalement la production de la pyocyanine. Néanmoins, selon la Figure 39B, l’extrait de

116

Chapitre IV : Résultats feuilles affecte significativement la croissance de la bactérie tandis que l’extrait d’écorces ne présente aucun effet. Par conséquent, l’extrait aqueux d’écorces de C. albiflorum a été sélectionné pour la suite de ce travail afin d’isoler et d’identifier le composé actif.

II.2.1. Isolement et identification du composé 2 (catéchine) à partir de l’extrait d’écorces de C. albiflorum

II.2.1.1. Fractionnement et isolement du composé actif

Le fractionnement de l’extrait d’écorces de C. albiflorum a donné 27 fractions nommées Fc1 à Fc27. Les résultats préliminaires ont montré que les fractions Fc21 à Fc27 inhibent la production de la violacéine chez C. violaceum (Vandeputte et al. 2010). Dans le cadre de ce travail, la fraction Fc21 a été sélectionnée pour la suite car d’après son profil chromatographique révélé sur une plaque CCM, elle semble contenir le moins de composés. Le fractionnement de Fc21 sur HPLC préparative a donné 19 sous-fractions nommées Fc21-1 à Fc21-19. Le profil chromatographique sur HPLC ainsi que les temps de rétention des 19 sous-fractions sont montrés dans la Figure 40. L’axe des ordonnées représente l’absorption de chaque sous-fraction à 280 nm. L’axe des abscisses représente le temps de rétention de chaque sous-fraction.

Figure 40. Chromatogramme à 280 nm de la fraction Fc21 issue de l’extrait d’écorces de C. albiflorum et les différents temps de rétention de ses sous-fractions.

Chaque sous-fraction a été testée pour son activité sur l’inhibition de la production de la violacéine. Les sous-fractions Fc21-4 à Fc21-16 ont toutes montré une activité intéressante sur l’inhibition de la production de la violacéine. Après réinjection de chacune de ces sous- fractions en HPLC, la sous-fraction Fc21-7 avec un temps de rétention à 11 min a été

117

Chapitre IV : Résultats sélectionnée car son profil chromatographique ne montrait qu’un seul pic suggérant que le composé 2 (Fc21-7) présente une pureté suffisante pour pouvoir réaliser la détermination de sa structure.

II.2.1.2. Détermination de la structure chimique du composé 2

a. Analyse des spectres UV

D’après la Figure 41, l’analyse du spectre UV du composé 2 montre une ressemblance avec celui de la catéchine avec deux maxima d’absorption à 231 et à 278 nm.

Figure 41. Comparaison des spectres UV du composé 2 isolé de l’extrait d’écorces de C. albiflorum et de la catéchine.

L’injection de la catéchine (Sigma) sur HPLC dans la même condition chromatographique que celle utilisée précédemment montre que celle-ci présente le même temps de rétention que celui du composé 2. L’injection sur HPLC du composé 2 mélangé avec de la catéchine donne un chromatogramme représenté par un seul et unique pic suggérant que les structures chimiques du composé 2 et celle de la catéchine se ressemblent ou sont très proches.

b. Analyse des spectres de masse

Par la suite, les masses moléculaires du composé 2 et de la catéchine ont été analysées. D’après les Figures 42A et 42B, le spectre de masse du composé 2 est similaire à celui de la catéchine. En effet, le composé 2 et la catéchine ont la même masse moléculaire plus un proton qui est de 291. De plus, ils présentent les mêmes fragmentations à m/z avec un ion à 139 et 123 (Figures 42A et 42B) ce qui est en accord avec des données rapportées dans des travaux précédents (Du et al. 2005; Chen et al. 2009).

118

Chapitre IV : Résultats

Figure 42. Comparaison des spectres de masse du composé 2 et de la catéchine. (A) Spectre de masse du composé 2 (Fraction Fc21-7) isolé de C. albiflorum ; (B) Spectre de masse de la catéchine.

Ensemble, toutes ces données confirment que la structure chimique du composé 2 ressemble à celle de la catéchine. La structure chimique du composé 2 est présentée dans la Figure 43. OH OH

HO O

OH OH

Figure 43. Structure chimique du composé 2 (catéchine) isolé de l’extrait d’écorces de C. albiflorum .

II.2.2. Confirmation de l’activité de la catéchine

La dernière étape de la confirmation du composé 2 comme étant la catéchine était de démontrer l’activité de la catéchine (Sigma) sur la production de la violacéine chez C. violaceum . Pour ce faire, la production de violacéine par la souche CV026 de C. violaceum

119

Chapitre IV : Résultats a été évaluée en présence d’une quantité suffisante d’homosérine lactone après ajout de la catéchine à différentes concentrations à savoir 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 et 16 mM. Selon les résultats de cette expérience, la production de la violacéine commence à diminuer lorsqu’on applique la catéchine à 0.25 mM. Au fur et à mesure qu’on augmente la concentration, la production de la violacéine diminue. Le maximum de concentration à laquelle la production de la violacéine est inhibée et où la croissance bactérienne n’est pas touchée a été enregistrée à 4 mM (Vandeputte et al. 2010). Dans le cadre de ce travail, nous avons réalisé la même expérience sur la production de la pyocyanine chez la souche PAO1 de P. aeruginosa .

II.2.3. Détermination de la concentration maximale en catéchine qui inhibe la production de la pyocyanine sans affecter la croissance de P. aeruginosa

La catéchine a été évaluée pour son effet sur la croissance et la production de pyocyanine à différentes concentrations, à savoir 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 et 16 mM finale, chez la souche PAO1 de P. aeruginosa . Après la quantification de la pyocyanine produite par la bactérie en présence de la catéchine, les résultats obtenus sont résumés dans le graphique de la Figure 44. L’axe des ordonnées à gauche représente les valeurs de la DO à 380 nm qui reflètent la quantité de pyocyanine produite par la bactérie. L’axe des ordonnées à droite représente les valeurs de la DO à 600 nm qui correspondent à la densité bactérienne après 18 h d’incubation.

* 0.6 * * 1.0 * * DO * 0.4 nm 600 * * 380nm *** * 0.5 DO 0.2 *

0.0 0.0 1 2 4 8 16 0.5 0.25 0.125 DMSO Concentrations (mM) Pyocyanine Densité bactérienne

Figure 44. Activité de la catéchine à différentes concentrations sur la croissance et la production de la pyocyanine chez la souche PAO1 de P. aeruginosa .

120

Chapitre IV : Résultats

Selon la Figure 44, la production de pyocyanine chez la souche PAO1 de P. aeruginosa est diminuée significativement en présence de la catéchine même à la concentration de 0.125 mM. Cette diminution se trouve aux alentours de 50 % quand les concentrations sont appliquées entre 0.25 à 8 mM. Avec la concentration à 16 mM, l’expression est diminuée jusqu’au tiers. Cependant, si on tient compte de l’effet de la molécule sur la croissance de la bactérie, le maximum de concentration qui n’a pas d’effet sur cette dernière est à 4 mM. Par la suite, la viabilité de la bactérie a été vérifiée avec cette concentration.

II.2.4. Effet de la catéchine sur la croissance et la viabilité de P. aeruginosa

Les tests de viabilité ont été réalisés sur la souche PAO1 après 8 et 18 h d’incubation en présence ou en absence de la catéchine à 4 mM. Cette expérience a été réalisée pour enlever les doutes sur la possibilité de confusion entre la mesure de la turbidité de la suspension bactérienne et la vraie quantité de bactéries vivantes. Les résultats obtenus et présentés dans la Figure 45 montrent que la catéchine, à la concentration de 4 mM, n’a pas d’effet sur la viabilité de la bactérie. Etant donné qu’à cette concentration la production de la violacéine a été également inhibée chez C. violaceum , cette concentration a donc été retenue pour les prochaines étapes afin d’étudier le mécanisme d’action de la catéchine sur l’inhibition du mécanisme de quorum sensing chez P. aeruginosa .

140 120 100 80

(%) 60 40

Taux de viabilité 20 0 DMSO Cat DMSO Cat 8 h 18 h

Figure 45. Effet de la catéchine sur la viabilité de P. aeruginosa après 8 et 18 h d’incubation

II.2.5. Effet de la catéchine sur la production de pyocyanine et d’élastase chez P. aeruginosa

La pyocyanine et l’élastase figurent parmi les plus importants exoproduits secrétés par P. aeruginosa pour faciliter la colonisation de son hôte (Park et al. 2010). Dans le cadre de ce

121

Chapitre IV : Résultats travail, leur production chez la bactérie a été évaluée en présence ou non de la catéchine à 4 mM à partir des souches mutantes de P. aeruginosa à savoir les souches ∆PA3476 et ∆PA3477 qui sont respectivement des mutantes en rhlI et en rhlR et sont incapables de produire de la pyocyanine et les souches ∆PA1432 et ∆PA1430 qui sont respectivement des mutantes en lasI et lasR et sont incapables de produire l’élastase. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 46 La production optimale (100 %) de pyocyanine et d’élastase est représentée par les résultats obtenus avec la souche PAO1 traité uniquement avec le DMSO.

A B

120 120 100 100 80 80 * 60 * 60 * (%) 40 * * 40 * 20 20 0 0 Production de pyocyanine Production d'élastase (%) DMSO DMSO PA3476 PA3477 PA1430 PA1432 ∆ ∆ ∆ ∆ Catéchine Catéchine

PAO1 PAO1

Figure 46. Activité de la catéchine sur le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa . (A) Effet de la catéchine sur la production de pyocyanine et (B) d’élastase chez P. aeruginosa .

D’après les résultats présentés dans la Figure 46, la catéchine diminue la production de la pyocyanine (Figure 46A) et de l’élastase (Figure 46B) respectivement de 50 et 30 %. Chez les deux mutants ∆PA3476 et ∆PA3477, la production de pyocyanine est diminuée respectivement de 69 ± 6 % et de 73 ± 4 %. Chez les deux mutants ∆PA1430 et ∆PA1432, la production de l’élastase est respectivement diminuée de 76 ± 6 % et de 53 ± 5 %. Ces résultats montrent que l’effet de la catéchine sur la production de pyocyanine et d’élastase est intéressant car le niveau d’inhibition se rapproche des résultats obtenus pour les mutants.

II.2.6. Effet de la catéchine sur l’expression des gènes impliqués dans le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa

L’effet de la catéchine à 4 mM a été testé sur l’expression des gènes impliqués dans le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa à savoir les gènes lasB, rhlA, lasR, lasI,

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Chapitre IV : Résultats rhlR et rhlI respectivement à partir des souches PAO1::p β01, PAO1::p β02, PAO1::pPCS1001, PAO1::pPCS223, PAO1::pPCS1002 et PAO1::pLPR1 de P. aeruginosa en utilisant le test d’activité LacZ. L’expression du gène constitutif aceA qui n’intervient pas dans ce mécanisme a également été étudiée à partir de la souche PAO1::pTB4124 de P. aeruginosa . Les résultats obtenus pendant ce test sont résumés dans le Tableau 5.

Tableau 5. Effet de la catéchine sur l’expression des gènes lasI, lasR, lasB, rhlI, rhlR, rhlA et aceA chez P. aeruginosa.

Temps Condition Expression de gène (moyenne Unité Miller ± déviation standard) lasI lasR lasB rhlI rhlR rhlA aceA DMSO 521±31 6055±220 3286±526 9403±634 7520±415 2782±145 610±107 8 Catéchine 314±42* 4892±321 2116±181 5298±654 4629±729 2150±118 525±116

DMSO 1505±222 4199±945 453±34 2718±575 5096±132 2754±73 2029±143 18 Catéchine 1107±371 2002±371 332±23* 1132±214 2276±663 2525±163 2221±46

D’après le Tableau 5, après 8 h d’incubation, la catéchine réduit significativement l’expression des gènes régulateurs du système las de 40 et 20 % respectivement pour les gènes lasI et lasR . De même, pour le système rhl la diminution est de 44 et 38 % respectivement pour les gènes rhlI et rhlR . Après 18 h, l’effet de la catéchine persiste malgré une petite diminution au niveau de son activité sur le gène lasI car l’expression de ce dernier n’est plus réduite que de 26 % alors que pour le gène lasR cette diminution est de 52 %. En ce qui concerne le système rhl , l’expression des gènes rhlI et rhlR est respectivement réduite de 58 et 55 %. Ces résultats indiquent que la catéchine perturbe les deux systèmes responsables du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa . D’autre part, l’expression du gène lasB est également diminuée de 36 et 27 % respectivement après 8 et 18 h d’incubation en présence de la catéchine (Tableau 5). Ces résultats pourraient expliquer la réduction de la production de l’élastase par P. aeruginosa en présence de la catéchine. En ce qui concerne le gène rhlA , son expression est significativement diminuée de 23 % après 8 h en présence de la catéchine. Avec le temps, l’activité de la molécule semble disparaitre car après 18 h d’incubation, aucune différence significative au niveau de l’expression du gène rhlA chez la bactérie traitée ou non avec la catéchine n’est constatée (Tableau 5). Par ailleurs, l’expression du gène aceA qui code l’isocitrate lyase chez P aeruginosa

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Chapitre IV : Résultats

(Diaz-Perez et al. 2007; Kretzschmar et al. 2008) n’est pas affectée par l’addition de la catéchine dans le milieu de culture. En tout, ces résultats indiquent que la catéchine affecte le fonctionnement du système las et rhl, ce qui pourrait être à l’origine de l’inhibition de l’expression de lasB et rhlA et donc de la diminution de la production de l’élastase, des rhamnolipides et de la pyocyanine chez P. aeruginosa . Il est également important de noter que la machinerie de la traduction et transcription n’est pas affectée par la présence de la catéchine car la molécule n’affecte pas l’expression du gène aceA chez P. aeruginosa .

II.2.7. Effet de la catéchine sur la production de pyocyanine après addition des homosérines lactones

Afin de vérifier si la catéchine interfère avec la perception des homosérines lactones, la souche sauvage PAO1 et la souche mutante ∆PA3476 de P. aeruginosa ont été mises en culture dans un milieu contenant ou pas de la C4-HSL ou de la 3-oxo-C12-HSL à 10 µM. Après incubation dans un milieu contenant ou pas de la catéchine, la pyocyanine est quantifiée. Les moyennes des résultats avec les déviations standard correspondantes sont présentées dans la Figure 47.

A B

1.5 2.0 ) ) 1.5

600nm 1.0 600nm 1.0 /DO * /DO 0.5 * *

380nm 380nm 0.5 (A (A 0.0 0.0 Production de pyocyanine Production de pyocyanine DMSO DMSO DMSO DMSO C4-HSL C4-HSL C4-HSL C4-HSL 3oxo-C12-HSL 3oxo-C12-HSL 3oxo-C12-HSL 3oxo-C12-HSL

Contrôles + Catéchine Contrôles + Catéchine

Figure 47. Interférence de la catéchine sur la perception des homosérines lactones dans le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa . (A) Effet de la catéchine sur la production de pyocyanine avec la souche PAO1 de P. aeruginosa après ou sans l’ajout d’homosérines lactones ; (B) Effet de la catéchine sur la production de pyocyanine avec la souche mutante ∆PA3476 de P. aeruginosa après addition des homosérines lactones C4-HSL et 3-oxo-C12-HSL.

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Chapitre IV : Résultats

D’après la Figure 47, l’ajout de la C4-HSL diminue la production de la pyocyanine chez la souche sauvage PAO1 de P. aeruginosa tandis que la 3-oxo-C12-HSL ne l’affecte pas (Figure 47A). Lorsque la catéchine est ajoutée, la production de pyocyanine est significativement réduite malgré l’ajout des homosérines lactones (Figure 47A). La Figure 47B montre que la souche mutante ∆PA3476 de P. aeruginosa est incapable de produire par elle-même de la pyocyanine . Cependant, l’ajout de l’homosérine lactone C4-HSL augmente significativement la production de la pyocyanine tandis que la 3-oxo-C12-HSL ne l’affecte pas. En présence de la catéchine à 4 mM, la production de la pyocyanine est diminuée fortement malgré l’ajout de la C4-HSL.

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CHAPITRE V : DISCUSSION

Chapitre V : Discussion

1. Importance de l’étude de l’expression des gènes de virulence dans la lutte contre la pathogénicité des bactéries

Avec l’avènement du traitement antibactérien dans les années 1940, vint en conséquence le problème de la résistance bactérienne (Abraham et Chain 1940; Abraham et al. 1941; Knapp et al. 2010). Les premiers antibiotiques de type β-lactame tels que la pénicilline ont rapidement perdu leur efficacité dès les années 1960 et par conséquent de nouveaux médicaments tels que la méthycilline ont été développés pour remplacer les anciens (Fairbrother et Taylor 1961). Cependant, malgré les avancées dans la découverte de nouveaux agents antimicrobiens, les problèmes de résistance ne cessent de progresser et en ce moment, le monde fait face à des problèmes de multi-résistances (Boucher et al. 2009; Knapp et al. 2010; Spellberg 2010). En effet, l’utilisation massive actuelle des antibiotiques et leur conception sur des structures chimiques limitées avec peu d’innovation, couplées avec des usages abusifs ou inappropriés créent une pression de sélection qui favorise l’émergence de souches bactériennes mutantes multi-résistantes (Champault et al. 1977; Andersson et Hughes 2010; Ter Beek et Brul 2010). Dans le cadre d’une conception de traitement qui minimise le risque de multirésistance, un composé qui ne tue pas la bactérie mais plutôt atténue ou inhibe sa virulence pourrait permettre au système immunitaire de l’hôte de fonctionner plus efficacement face à une infection bactérienne (Shah 2005; Byrd et Bentley 2010). En effet, ce type d’action est moins susceptible de fournir une pression sélective pour conduire à la résistance (Hentzer et Givskov 2003; Byrd et Bentley 2010). Les agents anti-quorum sensing et ceux qui ciblent l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence semblent correspondre à cette conception. Cependant, ces composés sont, pour l’instant, limités dans le nombre et dans la diversité structurale (Cowan 1999; Faure et Dessaux 2007; Byrd et Bentley 2010). Dans cette optique, ce travail a permis d’identifier des composés chimiques, des extraits et des fractions chimiques qui ciblent l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence et qui n’affecte ni la croissance ni la viabilité des bactéries pathogènes telles que R. fascians et P. aeruginosa .

2. Rôle des métabolites secondaires dans l’interaction entre les plantes et les microorganismes

Dans le cadre de l’interaction avec les microorganismes, la résistance chez les plantes est généralement de type passif. Seule une petite proportion de pathogènes arrive avec succès à envahir les plantes et entrainent des maladies (Baker et al. 1997). Il est intéressant de noter

127

Chapitre V : Discussion que chez les plantes, le système de défense repose essentiellement sur des barrières structurelles telles que l’épiderme, le périderme, les cuticules, les poils et tant d’autres qui les protègent des invasions physiques (Allen et Friend 1983; Samuels et al. 2008; Reina-Pinto et Yephremov 2009). Il y a aussi et surtout les larges gammes de métabolites secondaires qu’elles synthétisent constitutivement ou en réponse à des attaques microbiennes (Bednarek et Osbourn 2009; Iriti et Faoro 2009). Ces métabolites secondaires peuvent soit interférer avec les mécanismes de virulence des agents pathogènes, soit avoir des activités antimicrobiennes (Hartmann et al. 2009; Anderson et al. 2010). Dans cette étude, la résistance des plantules de Dalbergia cultivées in vitro à l’infection de R. fascians et non celle des plantules de N. tabacum ni de P. tremula x P. tremuloïdes (Photo 7) confirme que chaque plante synthétise différents types de métabolites secondaires pour se défendre contre les attaques des microorganismes pathogènes. Selon nos résultats, il est fort probable que les métabolites secondaires qui permettent aux Dalbergia d’acquérir cette résistance sont synthétisés constitutivement car les extraits de plantules stériles cultivées in vitro affectent l’expression des gènes de virulence chez R. fascians . Chez les bactéries, la production des facteurs de virulence est importante pour le succès de la pathogénicité. Elle est parfois liée à des communications entre les cellules bactériennes qui sont généralement contrôlées par des mécanismes d’autorégulation (Boyer et Wisniewski-Dyé 2009). Dans le cas du mécanisme du quorum sensing , ce dernier est contrôlé par des régulations en cascade médiées par des composés autorégulateurs, ce qui permet aux bactéries pathogènes d’agir en communauté plutôt qu’en cellule individuelle (Boyer et Wisniewski-Dyé 2009; Ng et Bassler 2009). Par conséquent, il n’est pas étonnant de rencontrer chez les plantes des molécules de défense qui ciblent la communication de cellule à cellule et n’affectent pas la viabilité de la bactérie (à titre d'exemple : Gonzalez et Keshavan 2006; Teplitski et al. 2010; Vandeputte et al. 2010). Bien que telle activité soit bien répandue chez les plantes supérieures (Gonzalez et Keshavan 2006), très peu de molécules actives ont été isolées et décrites (Faure et Dessaux 2007; Geske et al. 2008; Teplitski et al. 2010).

3. Intérêt de la diversité chimique au sein des genres Dalbergia et Combretum

Ce travail a permis, non seulement d’exploiter la valeur scientifique des plantes endémiques malgaches mais également de confirmer l’hypothèse que les plantes renferment des composés chimiques qui inhibent ou atténuent l’expression des gènes de virulence chez les bactéries pathogènes. Deux types de composés chimiques ont été isolés durant ce travail. Il s’agit pour le premier de la perbergine, qui est un isoflavonoïde prénylé isolé de l’extrait 128

Chapitre V : Discussion d’écorces de D. pervillei. Ce composé inhibe l’expression de certains gènes localisés sur le plasmide linéaire de R. fascians et qui sont responsables de la production des facteurs de virulence chez la bactérie (Annexe 11 et Chapitre IV – I). Le deuxième est un flavonoïde connu sous le nom de catéchine et qui a été identifié parmi d’autres composés isolés de l’extrait d’écorces de C. albiflorum. La catéchine inhibe l’expression des gènes qui sont impliqués dans le mécanisme du quorum sensing ainsi que certains gènes responsables de la production des facteurs de virulence chez P aeruginosa (Annexe 12). D’autres extraits, fractions et sous-fractions ont également montré des activités intéressantes. A titre d’exemples, certaines fractions et sous-fractions de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei montrent des activités intéressantes sur l’expression du gène attH chez R. fascians malgré quelques effets bactéricides pour certaines (Figures 14, 15, 16 et 18). De même, les extraits méthanoliques d’écorces des 4 espèces de Dalbergia diminuent fortement l’expression du gène attH sans avoir d’effet significatif sur la croissance de la bactérie (Figure 11C). Par ailleurs, l’extrait de feuilles de D. trichocarpa inhibe l’expression des gènes responsables de la production de l’élastase ( lasB ) et des rhamnolipides ( rhlA ) chez P. aeruginosa (Chapitre IV – II). Bien que plusieurs extraits chimiques des autres espèces de Dalbergia étudiées dans ce travail aient des activités bactéricides sur R. fascians , ces composés restent intéressants surtout dans le contexte de la recherche de nouveaux composés antibiotiques.

4. Inhibition de l’expression des gènes de virulence chez R. fascians par des composés chimiques chez les espèces de Dalbergia

Il est intéressant de noter que la formation de galles feuillées est l’une des formes d’infection les plus sévères induite par R. fascians (Putnam et Miller 2007; Stes et al. 2011). Les images illustrés dans la Photo 7 montrent que R. fascians est incapable d’induire la formation de galles feuillées chez les 4 espèces de Dalbergia sélectionnées dans cette étude. En effet, le symptôme, s’il existe, est réduit à une formation d’excroissance qui ressemble à des cals et/ou à des développements de bourgeons comme dans le cas des phénotypes observés avec l’espèce D. pervillei infectées avec la souche D188. Par conséquent, nous supposons que ces types de symptômes observés chez les Dalbergia peuvent se traduire par une atténuation de l’expression des gènes de virulence chez la bactérie. Autrement dit, nous pensons que ces espèces de Dalbergia pourraient contenir un ou plusieurs composés chimiques qui peuvent atténuer ou inhiber l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence chez R. fascians . 129

Chapitre V : Discussion

En effet, les gènes responsables de la production des facteurs de virulence chez R. fascians se trouvent sur le plasmide linéaire (Crespi et al. 1992). Nos résultats confirment cette affirmation, car aucun symptôme n’a été observé lorsque les plantes (sensibles ou pas à la bactérie) ont été infectées avec la souche avirulente D188-5 qui est dépourvue de plasmide (Tableau 3 et Photo 7). Il a été rapporté que la souche mutante en att présente une virulence atténuée (Crespi et al. 1992; Maes et al. 2001), ainsi, nous suggérons, sur la base des phénotypes atténués observés, que ces espèces de Dalbergia pourraient contenir des composés chimiques qui inhibent ou diminuent l’expression des gènes du locus att . De plus, comme le locus att est le premier à être exprimé lors d’infection par R. fascians (Maes et al. 2001), nous avons étudié l’expression du gène attH, localisé à la fin du locus att (Figure 2) à l’aide de la souche D188::pTGGUSDV1 (Tableau 1) afin de cribler les extraits chimiques et d’isoler le ou les composés chimiques, chez Dalbergia , responsable(s) de l’inhibition ou de la diminution de l’expression du locus att . Comme nous nous sommes intéressés à des composés qui ciblent uniquement l’expression des gènes impliqués dans la production de facteurs de virulence, nous avons tenu compte de leur effet sur la croissance et la viabilité de la bactérie. Ainsi, le ou les extraits/composés chimiques ayant un effet sur la croissance et la viabilité de la bactérie ont été éliminés. Mais ceux-ci peuvent contribuer à la résistance naturelle des Dalbergia .

5. Identification de la perbergine parmi les composés chimiques responsables de la résistance de Dalbergia à l’infection de R. fascians

Chez R. fascians , l’autorégulation est essentielle pour le déclenchement de l’expression des gènes de virulence (Maes et al. 2001; Cornelis et al. 2002). Au cours de son interaction avec les deux modèles d’hôtes, à savoir N. tabacum et Arabidopsis thaliana , les mécanismes de défense chez les plantes sont déclenchés, cependant, les composés phénoliques accumulés n’affectent pas la bactérie et l’expression des gènes de défense de la plante est diminuée à partir d’un certain moment de l’interaction (Vereecke et al. 1997; Depuydt et al. 2009). Il est évident, dans ce cas, que la bactérie parvient à surmonter ou neutraliser le système de défense de ces plantes. En revanche, nous avons montré, dans le cadre de ce travail, que plusieurs espèces de Dalbergia ne sont pas sensibles à l’infection de R. fascians . A notre connaissance, la résistance des plantes appartenant à la famille des Fabaceae à la souche sauvage D188 de R. fascians n’a pas encore été rapportée. De plus, quelques espèces de légumineuses appartenant au genre Acacia, Cicer, Glycine, Lathyrus, Medicago, Melilotus, Phaseolus, Pisum, Sesbania, Vicia, et Vigna sont sensibles à la bactérie (Vereecke et al. 2000; Putnam et 130

Chapitre V : Discussion

Miller 2007). Ceci suggère que l’atténuation du développement du symptôme serait plutôt spécifique pour les espèces de Dalbergia . Par ailleurs, il est intéressant de noter que les plantes appartenant à ce genre sont connues pour produire une variété de métabolites secondaires utilisés comme insecticides, antifongiques ou agents antimicrobiens (Gundidza et Gaza 1993; Rutiaga Quiñones et al. 1995; Brijesh et al. 2006; Okwute et al. 2009) ainsi qu’à des fins médicales (Umehara et al. 2009). Afin de comprendre la base de cette résistance, différents extraits organiques issus de différents tissus d’espèces de Dalbergia ont été analysés pour leur effet sur la viabilité de R. fascians et sur l’expression du gène attH, qui fait partie de l’opéron impliqué dans la production du composé autorégulateur (Maes et al. 2001). Certains extraits montrent une activité bactéricide prononcée tandis que les extraits dichlorométhaniques des écorces diminuent fortement l’expression de attH sans que la viabilité bactérienne ne soit affectée (Figure 11). Le composé bioactif issu de l’extrait dichlorométhane d’écorces de D. pervillei a été isolé et purifié par une combinaison de plusieurs techniques chromatographiques. L’élucidation de la structure chimique de ce composé actif a été confirmée après analyse de ses spectres RMN et de masse (Tableau 4 et Figure 20). À notre connaissance et selon les bases de données des structures chimiques décrites disponibles sur SciFinder et PubChem Compound de NCBI (National Center for Biotechnology Information) consultées en août 2010, la structure n’a pas encore été décrite ailleurs. Ce composé a été identifié comme un nouvel isoflavonoïde prénylé nommé

« perbergine » et ayant la formule chimique C 26 H30 O7 et dont la structure est (Z) -3 - (2,3- dihydroxy-4-méthoxyphényl) -8 - (3, 7-diméthyl-2 ,6-diényle) -5,7-dihydroxy-2 ,3- dihydrochromen-4-one (Figure 22). L’adoption du nom perbergine a suivi le système de nomenclature de l’olibergine B qui est un isoflavonoïde prénylé isolé de D. oliveri (Ito et al. 2003b). En effet, la structure de la perbergine présente une similarité avec celle de l’olibergine B et les deux composés diffèrent entre-eux par le degré d’hydroxylation du cycle B (la perbergine est hydroxylée en positions 2’ et 3’ tandis que l’olibergine B ne l’est pas) et par la structure du groupe prénylé en position 8 de l’anneau A (Figure 26 ; Ito et al. 2003b).

6. Mécanismes d’action de la perbergine dans l’inhibition de l’expression des gènes de virulence chez R. fascians

La perbergine purifiée n’a affecté ni la croissance ni la viabilité de R. fascians , ce qui implique que le métabolisme général et l’expression des gènes qui maintiennent la vie cellulaire ne sont pas modifiés. L’évaluation de l’effet de la perbergine, utilisée à une concentration de l’ordre du nanomolaire, sur l’expression de plusieurs gènes situés sur le 131

Chapitre V : Discussion plasmide linéaire montre que cet isoflavonoïde n’inhibe pas le mécanisme global de la transcription ni de la traduction de la bactérie (Figure 28). En revanche, elle cible l’expression du gène attR qui régule l’expression de att et de fas (Maes et al. 2001; Pertry et al. 2009). Comme l’expression des gènes stk1, nrp5 et pFi_065 n’est pas contrôlée par AttR (Francis 2009) [ce qui n’est pas le cas pour les gènes fas car lorsqu’un certain seuil est atteint la protéine AttR est activée et induit l’expression du locus att et par la suite celle du locus fas (Maes et al. 2001)] les résultats obtenus dans les Figures 27, 28 et 30 suggèrent que AttR pourrait être la première cible de la perbergine. Il est donc possible que la perbergine déstabilise la protéine AttR en la rendant plus prompte à la dégradation. Si cela était le cas, comme l’expression du gène attR est constitutive et que AttR réprime sa propre transcription (Maes et al. 2001), on pourrait s’attendre à ce que le niveau d’expression de attR en présence de la perbergine soit plus élevé que celui du contrôle (sans la perbergine). Cependant, une inhibition presque complète de l’expression de attR a été observée sous cette condition indiquant que ce mécanisme d’action est peu probable (Figure 27). Alternativement, la perbergine pourrait agir comme un inhibiteur compétitif avec le composé autorégulateur et ainsi interférer avec la liaison de la protéine AttR avec les promoteurs qu’elle régule. Cette compétition est plausible étant donné la diminution de l’inhibition de l’expression de att lorsque l’addition de la perbergine est décalée (Figure 30). C'est-à-dire qu’une quantité suffisante de composés autorégulateurs a été accumulée dans les cellules et ces composés ont eu le temps de se fixer sur les protéines AttR disponibles. Les gènes codant les régulateurs de type LysR sont typiquement transcrits de façon divergente à partir des gènes qu’ils activent. L’activation ainsi que l’autorépression sont contrôlés au niveau d’un seul site de liaison asymétrique appelé «site de liaison du répresseur» (ou repressor binding site [RBS]) contenant le motif T-N11 -A, localisé dans la région divergente du promoteur (Revue par Maddocks et Oyston 2008). Au niveau du promoteur des gènes activés, le site de liaison de l’activateur (ou activator binding site [ABS]) libre est essentiel pour l’activation de la transcription. Dans le cadre d’un modèle de deux dimères coulissant connu sous le nom de « sliding dimer », en absence du co-inducteur, un dimère se lie avec le RBS et un autre avec l’ABS, résultant en une conformation étendue du complexe LysR-ADN tétramérique qui empêche la transcription. En présence d’un co- inducteur, un changement de conformation vers une forme plus compacte entraîne le repositionnement de la protéine LysR lors de sa liaison avec l’ABS permettant une interaction efficace entre le régulateur et l’ARN polymérase, activant ainsi la transcription (Maddocks et Oyston 2008). Les détails sur le mode de fonctionnement de AttR ne sont pas encore connus ;

132

Chapitre V : Discussion cependant, un RBS a été identifié dans la région divergente du promoteur entre attR et attX qui est le premier gène de l’opéron att (Maes et al. 2001), et dans la région en amont de fasA (Pertry 2009). Puisque la perbergine bloque complètement la transcription de attR , nous supposons que ce composé maintien la protéine AttR en mode répresseur étendu. Deux observations suggèrent que AttR a une affinité comparable pour la perbergine et pour le composé autorégulateur endogène, laquelle empêche leur échange une fois que AttR interagit avec l’un des deux. Premièrement, quand on laisse l’autoinducteur endogène s’accumuler, la perbergine ne peut plus prévenir l’induction du gène att (Figure 30). Deuxièmement, lorsque la perbergine est ajoutée au moment de l’induction, le composé autorégulateur ne peut pas interférer avec l’inhibition de l’expression par la perbergine (Figures 27 et 30). L’inhibition irréversible du régulon AttR par la perbergine imite par conséquent l’effet d’une mutation nulle de attR . Cependant, il a été rapporté que les plantes de N. tabacum infectées avec une souche mutante dont le gène attR a été délété présentent un phénotype de virulence atténuée, c'est-à-dire des galles feuillées de petite taille et compactes avec une croissance peu inhibée (Maes et al. 2001). Ce phénotype est comparable à celui obtenu lorsque les plantules de tabac ont été infectées avec la souche D188 de R. fascians traitée avec la perbergine (Photos 8B, 8C). Par conséquent, l’absence du symptôme de virulence chez les espèces de Dalbergia (Photo 7) suggère que la résistance est multifactorielle et est probablement due à des activités biologiques cumulatives et/ou synergiques de plusieurs classes de composés des Dalbergia . En effet, bien que la perbergine ne soit pas toxique in vitro pour R. fascians et que le nombre de bactéries extraites à partir des tissus de D. pervillei et N. tabacum soit comparable (Figure 29), les extraits de Dalbergia et certaines fractions semi-purifiées montrent aussi des activités antimicrobiennes significatives (Figures 11, 13, 14, 15, 16 et 18). Des composés antimicrobiens, en particulier les isoflavonoïdes, ont été trouvés dans différents extraits de plusieurs espèces de Dalbergia telles que D. candenatensis , D. horrida , D. melanoxylon et D. subcymosa (Hamburger et al. 1987; Gundidza et Gaza 1993; Narayanan et al. 2007; Correia et al. 2008). Par ailleurs, d’autres composés produits par Dalbergia pourraient interférer avec l'expression des gènes de virulence puisque l'expression de fasA est plus fortement inhibée in planta que par la perbergine purifiée in vitro .

7. La perbergine et le régulateur de type LysR

Compte tenu de l’importance des régulateurs de type LysR dans les mécanismes de régulation de la virulence chez certaines bactéries pathogènes et la rareté des inhibiteurs 133

Chapitre V : Discussion spécifiques de ces gènes (Brumbley et al. 1993; Sheehan et Dorman 1998; Cao et al. 2001; Heroven et Dersch 2006; Maddocks et Oyston 2008; Porrua et al. 2010), l’identification de la perbergine pourrait constituer une première piste vers une nouvelle conception de composés anti-virulents. Il est cependant intéressant de noter que la perbergine n’a pas d’effet général sur les régulateurs de type LysR car elle n’a pas ciblé l’expression de NodD qui est un régulateur central de type LysR de la bactérie symbiotique A. caulinodans . Ceci suggère que l’activité de la perbergine est spécifique à certains régulateurs de type LysR tel que AttR. Ce résultat n’est pas étonnant car il est probable que le genre Dalbergia ne produit pas des métabolites secondaires qui ciblent les régulateurs de type LysR chez des bactéries symbiotiques. En effet, plusieurs rapports décrivent l’isolement des souches symbiotiques appartenant aux genres Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium et Rhizobium dans les nodules fixateurs d'azote fonctionnels au niveau des racines de quelques espèces de Dalbergia de Madagascar, d’Amérique centrale ou d’Asie (Ghosh et Basu 2002; Parker 2004; Rasolomampianina et al. 2005; Lin et al. 2009). La présence de ces bactéries dans les nodules indique que l’expression de ce type de régulateur au sein de ces bactéries n’est pas affectée par les métabolites secondaires secrétés par les Dalbergia . Dans ce cas, il est possible que la perbergine cible spécifiquement les régulateurs de type LysR chez les bactéries pathogènes.

8. Intérêt de l’identification de la structure de la perbergine dans le traitement phytosanitaire

Étant donné qu'aucune méthode d'éradication efficace n’est actuellement disponible pour assainir les plantations qui sont infectées par R. fascians (Putnam et Miller 2007; Stes et al. 2011), l'identification de la perbergine et son mode d'action pourrait contribuer à l’ouverture d’une voie vers le développement d'un produit inhibiteur d’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence. Dans ce contexte, nous avons obtenu des résultats encourageants. En plus de son activité sur certains régulateurs de type LysR tel que AttR, la perbergine n’affecte pas le mécanisme général de la transcription et de la traduction et elle cible uniquement l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence en particulier chez R. fascians (Figures 27 et 28). Ensuite, elle inhibe l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence sans affecter ni la croissance ni la viabilité de la bactérie, ce qui pourrait minimiser le risque de mutation (Figures 23, 24 et 25). Ces deux observations sont renforcées par les résultats obtenus lorsque les plantules de tabac ont été infectées par R. fascians traitée avec la perbergine (D188-In) ou lorsque la perbergine a été ajoutée au moment de l’infection des plantules par R. fascians 134

Chapitre V : Discussion

(D188-P) (Figures 32, 33, 34 et Photo 8). En effet, l’atténuation du développement des symptômes indique que les bactéries sont vivantes et que la perbergine cible uniquement l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence. Ces données montrent également que cet isoflavanone prénylé présente une activité inhibitrice dans un hôte sensible à l’infection. En outre, la comparaison de l’activité de la perbergine avec les deux isoflavonoïdes disponibles sur le marché, dépourvus du groupement prényle et/ou méthyle, tels que la daidzéine et la génistéine qui ne diminuent pas l’expression de attH, suggèrent une possible importance de la présence de ces groupements pour l’activité de la perbergine. Ceci indique une importance de la relation entre la structure et l’activité du composé. A titre d’exemple, la structure de la perbergine présente une similarité avec celle de l’olibergine B, qui est un isoflavonoïde prénylé isolé de D. oliveri , alors que l’olibergine B présente une activité antivirale. Ceci n’est pas surprenant car chez d’autres isoflavonoïdes prénylés isolés des familles de plantes telles que les Fabaceae, Compositae, Euphorbiaceae, Scrophulariaceae et Moraceae (Veitch 2007; 2009), la diversité au niveau de leur structure ainsi que la substitution et la modification de leur(s) chaîne(s) prénylée(s) se traduisent par une large variation de leurs activités biologiques parmi lesquelles on peut citer les propriétés antimicrobiennes (Veitch 2007; Botta et al. 2009). Ainsi, l’identification de la structure de la perbergine permet d’avoir une idée de base sur la structure d’un composé qui cible la régulation de l’expression des gènes de virulence, en particulier chez R. fascians .

9. Identification des activités anti-quorum sensing chez les Dalbergia de Madagascar

La capacité des organismes supérieurs à produire des inhibiteurs du quorum sensing a été décrite pour la première fois chez l’algue marine Delisea pulchra (Manefield et al. 1999). Depuis, l’activité a été retrouvée chez un certain nombre de plantes supérieures telles que Chlamydomonas reinhardtii, Pisum sativum , Medicago truncatula , Allium sativum, Callistemon viminalis , Daucus carota , Capsicum chinense , Bucida buceras, Conocarpus erectus ainsi que chez quelques espèces de la famille des Combretaceae (Teplitski et al. 2000; Gao et al. 2003; Bjarnsholt et al. 2005; Adonizio et al. 2006; Adonizio et al. 2008; Khan et al. 2009; Szabo et al. 2010; Vandeputte et al. 2010). Malgré cela, le nombre d’extraits ou de composés isolés ayant cette activité reste encore limité. En plus de ce qui a été décrit dans la littérature, nous avons montré dans le cadre de ce travail que les extraits hexaniques de feuilles de D. trichocarpa et de D. pervillei réduisent l’expression des gènes et la production des facteurs de virulence chez P. aeruginosa . Après fractionnement de l’extrait hexanique de feuilles de D. trichocarpa, plusieurs fractions (Ft10-Ft12 et Ft14) inhibent en même temps 135

Chapitre V : Discussion l’expression du gène lasB ainsi que la production de la pyocyanine. Cependant, il est important de noter que l’extrait total (avant fractionnement) inhibe fortement l’expression de lasB alors que les fractions semblent uniquement la diminuer (Figure 38). Cela suggère que l’activité dans l’extrait brut pourrait être probablement due à un effet synergique de plusieurs composés et que lorsqu’ils sont séparés, l’activité diminue. Bien qu’aucun composé ayant une activité anti-quorum sensing chez D. trichocarpa n’ait été isolé ni identifié, ces résultats ouvrent une voie vers la recherche de nouveaux composés anti-quorum sensing chez le genre Dalbergia .

10. Identification de la catéchine parmi les composés anti-quorum sensing chez C. albiflorum

Il a été démontré que les extraits de feuilles et d’écorces de C. albiflorum réduisent la production de plusieurs facteurs qui sont sous le contrôle du mécanisme du quorum sensing , à savoir la violacéine et la pyocyanine respectivement chez les bactéries C. violaceum CV026 et P. aeruginosa PAO1 (Vandeputte et al. 2010). Cette activité n’est pas surprenante chez les Combretaceae car une activité anti-quorum sensing chez P. aeruginosa PAO1 a été rapportée chez deux espèces de plantes appartenant à cette famille à savoir Conocarpus erectus et Bucida buceras (Adonizio et al. 2006; Adonizio et al. 2008). Il est cependant intéressant de noter que l’extrait de feuilles de C. albiflorum affecte significativement la croissance de P. aeruginosa . Cette activité est normale car les Combretum sont connus pour leur richesse en métabolites secondaires tels que les tanins, les flavonoïdes, les terpénoïdes et les stilbénoïdes qui sont associés à leurs potentiels antimicrobiens (Martini et al. 2004; Eloff et al. 2005b; Angeh et al. 2007b; Eloff et al. 2008). A cause de cette activité antibiotique de l’extrait de feuille, la recherche des composés anti-quorum sensing chez C. albiflorum a été réalisée avec l’extrait d’écorces. Après des séries de criblage sur l’activité de différentes fractions issues de l’extrait d’écorces de C. albiflorum , la catéchine a été isolée. L’application de la catéchine à 4 mM inhibe la production de la violacéine et de la pyocyanine sans que la croissance et la viabilité des bactéries ne soient affectées (Figures 44 et 45). Ce résultat est en accord avec des recherches antérieures qui ont montré que la catéchine n’a pas d’effet bactéricide ni bactériostatique sur des bactéries à Gram positif et négatif y compris P. aeruginosa (Kayser et Kolodziej 1997). Outre la pyocyanine, la catéchine a également été testée pour son activité sur la production d’autres facteurs de virulence tels que l’élastase, la formation des biofilms ainsi que la production des rhamnolipides chez P. aeruginosa . Les résultats obtenus montrent soit 136

Chapitre V : Discussion une inhibition soit une diminution de la production de ces facteurs de virulence (Annexe 12). L’isolement de composés anti-quorum sensing telle que la catéchine n’est pas surprenant car plusieurs composés ayant cette activité ont déjà été isolés à partir des plantes. A titre d’exemple, on peut citer le cas de L-canavanine qui est un acide aminé non protéique isolé à partir de Medicago sativa . Cette molécule, utilisée à une concentration comprise entre 56 µM et 5.6 mM, interfère avec le mécanisme du quorum sensing chez Sinorhizobium meliloti probablement en gênant le pliage de la protéine régulatrice du quorum sensing (Keshavan et al. 2005). On peut également citer la patuline qui est une polykétide lactone isolée de Penicillium coprobium ainsi que l’acide pénicillique isolé de Penicillium radicicola . Ces deux molécules, utilisées respectivement à des concentrations 8 et 147 µM, diminuent l’expression des gènes qui contrôlent le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa (Rasmussen et al. 2005). La curcumine qui est un polyphénol isolé de la plante Curcuma longa , utilisée à une concentration de 1.5 et 3 µg.ml -1, atténue la pathogénicité de P. aeruginosa PAO1 en réduisant la production des facteurs de virulence régulés par le mécanisme du quorum sensing ainsi que la formation des biofilms (Rudrappa et Bais 2008) ainsi que d’autres molécules telles que les furanones synthétisés par l’algue rouge Delisea pulchra (Manefield et al. 1999) et les monoalides isolés de Luffariella variabilis (Skindersoe et al. 2008). Outre les composés isolés des plantes, le criblage de plusieurs groupes de flavonoïdes sur la diminution de la production des facteurs de virulence sous le contrôle du quorum sensing chez P. aeruginosa ont montré que la naringénine, l’ériodictyol et la taxifoline réduisent significativement la production de la pyocyanine et de l’élastase. La naringénine et la taxifoline réduisent également l’expression de plusieurs gènes impliqués dans le mécanisme du quorum sensing tels que lasI , lasR , rhlI , rhlR , lasA , lasB , phzA1 et rhlA . Enfin, la naringénine réduit la production des acyl-homosérines lactones tels que 3-oxo- C12-HSL et C4-HSL et interfère avec le fonctionnement du complexe RhlR/C4-HSL (Annexe 13, Vandeputte et al. 2011).

11. Mécanisme d’action de la catéchine dans l’inhibition du quorum sensing chez P. aeruginosa

Chez P. aeruginosa , l’expression des gènes responsables de la production de ces facteurs de virulence est sous le contrôle du mécanisme du quorum sensing (Dekimpe et Deziel 2009; Williams et Camara 2009). Le mécanisme hiérarchique du quorum sensing chez la bactérie est très complexe mais dépend généralement des systèmes las et rhl (Figure 1 + Chapitre I – II.1.4.2). Il a été démontré dans ce travail que la catéchine affecte à différents 137

Chapitre V : Discussion degrés l’expression des gènes des systèmes las (LasR et LasI) et rhl (RhlR et RhlI) ainsi que l’expression des gènes responsables de la production des facteurs de virulence tels que LasB (responsable de la production de l’élastase) et RhlA (responsable de la production des rhamnolipides) (Tableau 5). Il est intéressant de noter que la catéchine n’affecte pas le mécanisme global de la traduction et de la transcription chez P. aeruginosa . En effet, selon nos résultats, la catéchine n’affecte pas la transcription du gène aceA qui code l’isocitrate lyase et en même temps n’affecte ni la croissance ni la viabilité de la bactérie. Ces résultats suggèrent que la catéchine pourrait agir spécifiquement sur l’expression des gènes impliqués dans le mécanisme du quorum sensing . Malgré ces résultats, le mécanisme d’action exact de la catéchine reste inconnu. En général, le mécanisme du quorum sensing peut être inhibé de plusieurs manières à savoir : (1) par imitation du signal (par exemple avec les furanones et les signaux synthétiques analogues) ayant pour résultat la diminution de l’expression des gènes du quorum sensing , (2) à travers la dégradation enzymatique de l’homosérine lactone, (3) par des protéines anti-activatrices, (4) par des homologues de régulateurs transcriptionnels négatifs, (5) ou par des petits ARNs régulateurs (Whitehead et al. 2001; Gonzalez et Keshavan 2006). Il est probable que la catéchine entre en concurrence avec l’homosérine lactone ou empêche la formation du complexe protéique homosérine lactone. En effet, il a été démontré lors de l’utilisation de biosenseurs ( Escherichia coli dans laquelle les systèmes rhl et las sont introduits) que la catéchine agit en interférant avec la perception de C4-HSL par RhlR (Vandeputte et al. 2010). Ceci est en accord avec les résultats obtenus dans la Figure 47B où la production de la pyocyanine chez la souche mutante ∆PA3476 de P. aeruginosa est diminuée malgré l’ajout d’une quantité suffisante de l’homosérine lactone C4-HSL. L’interférence de la catéchine sur la perception d’autres homosérines lactones telle que 3-oxo-C12-HSL n’a pas été étudiée dans ce travail mais reste probable et mérite d’être approfondie.

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CHAPITRE VI : CONCLUSION GENERALE ET

PERSPECTIVES

Chapitre VI : Conclusion Générale et Perspectives

L’objet de ce travail a été orienté vers la valorisation de l’importance de la diversité chimique de quelques plantes endémiques malgaches en mettant en valeur une alternative de lutte contre la multirésistance chez les bactéries pathogènes. Cette alternative de lutte repose, dans un premier temps, sur l’isolement et l’identification des métabolites secondaires des plantes qui participent à l’inhibition de la production des facteurs de virulence chez des bactéries pathogènes sans avoir d’effet ni sur leur croissance ni sur leur viabilité. Dans un deuxième temps, il s’agit d’élucider le mode d’action de ces composés sur le mécanisme qui contrôle l’expression de ces facteurs de virulence chez les bactéries. Deux bactéries pathogènes, dont les mécanismes qui contrôlent la production des facteurs de virulence sont connus, ont été choisies comme modèles pour la réalisation des tests d’activité biologique. Il s’agit de la bactérie à Gram positif Rhodococcus fascians qui est un phytopathogène et la bactérie à Gram négatif Pseudomonas aeruginosa qui est une bactérie pathogène opportuniste responsable de maladies nosocomiales. L’étude a été réalisée avec 4 espèces de Dalbergia , à savoir D. chlorocarpa , D. pervillei, D. purpurascens et D. trichocarpa, et l’espèce Combretum albiflorum . Les recherches bibliographiques réalisées sur ces plantes ont montré que très peu d’informations voire aucune n’est disponible sur la nature de leur activité biologique. Il en est de même pour les études phytochimiques et pharmacologiques. Dans cette étude, ces plantes ont été choisies parmi d’autres qui sont retenues dans le cadre d’un programme de conservation de la biodiversité à Madagascar. L’un des critères de sélection appliqué a été basé sur leur usage traditionnel pour traiter les maladies infectieuses. Le criblage a été effectué à partir des extraits chimiques de feuilles, d’écorces et de racines de ces plantes sur l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence chez R. fascians et P. aeruginosa à travers l’expression de gènes rapporteurs qui sont fusionnés aux gènes d’intérêt. La méthode d’isolement et de purification de ces composés chimiques a été basée sur l’utilisation d’une combinaison de plusieurs techniques chromatographiques. Ces techniques chromatographiques ont été utilisées en parallèle avec les tests d’activités des gènes rapporteurs afin de sélectionner les extraits et les fractions actives. Les critères de sélection des extraits et des fractions actives sont basés sur leur capacité à inhiber l’expression des gènes d’intérêt sans affecter la croissance des bactéries. Les différentes techniques chromatographiques utilisées sont la chromatographie sur colonne qui utilise le gel de silice Si60, la chromatographie par filtration qui utilise le gel de Sephadex

LH-20, la chromatographie sur couche mince qui utilise le gel de silice Si60F 254 et la chromatographie liquide à haute pression qui utilise une colonne de phase inverse C-18. La

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Chapitre VI : Conclusion Générale et Perspectives détermination structurale de ces composés isolés a été réalisée par analyse de leurs spectres UV, de masse et RMN. Suite au criblage de ces extraits, 2 composés chimiques ont été isolés. Il s’agit pour le premier d’un nouvel isoflavanone que nous avons nommé «perbergine». Ce composé a été isolé à partir de l’extrait dichlorométhanique d’écorces de D. pervillei . Il a été démontré dans ce travail que la perbergine inhibe l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence chez R. fascians et son application sur des plantes sensibles à l’infection par la bactérie atténue le développement des symptômes. Le deuxième composé est un flavonoïde connu sous le nom de catéchine. Ce composé a été isolé à partir de l’extrait aqueux d’écorces de C. albiflorum . Nous avons montré que ce composé inhibe l’expression de plusieurs gènes qui sont impliqués dans le mécanisme du quorum sensing qui contrôle la production des facteurs de virulence chez P. aeruginosa . Ces résultats confirment que les plantes utilisent différentes stratégies pour contrôler l’envahissement microbien parmi lesquelles on peut citer l’inhibition de l’expression des gènes impliqués dans la production des facteurs de virulence. Après l’identification de leur structure, les mécanismes d’action de ces composés ont été étudiés. La perbergine inhibe l’expression des gènes du locus att de R. fascians tels que attH et attA. Cette inhibition peut s’expliquer par le fait qu’elle inhibe complètement l’expression du régulateur AttR. Nous avons également montré que l’activité de la perbergine s’étend vers l’inhibition de l’expression de fasA . Ce résultat n’est pas surprenant, étant donné que la régulation du locus fas dépend également en partie de AttR. Le mécanisme d’inhibition de l’expression de AttR par la perbergine n’est pas encore très clair mais selon nos résultats, plusieurs hypothèses peuvent être avancées. La première possibilité est que la perbergine entre en compétition avec les composés autorégulateurs de AttR et empêche ainsi sa transcription, ce qui empêche par la suite l’expression du locus att . Dans ce cas, il serait intéressant d’identifier puis de déterminer la structure du composé autorégulateur afin de voir sa relation structurale avec la perbergine. La deuxième possibilité est que la perbergine agit en dégradant ou en déstabilisant la protéine AttR. Afin de comprendre ce mécanisme, il serait intéressant de produire une protéine recombinante de AttR et d’étudier sa stabilité en présence de la perbergine. Ce genre d’étude pourrait également être réalisé avec d’autres types de molécules appartenant à la même classe chimique que la perbergine ou à des classes chimiques différentes pour permettre de catégoriser les groupes de molécules qui dégradent ou déstabilisent ce type de protéine. Cette stratégie peut être également appliquée avec la catéchine étant donné qu’elle inhibe l’expression des gènes impliqués dans le mécanisme du

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Chapitre VI : Conclusion Générale et Perspectives quorum sensing chez P. aeruginosa . En effet, l’absence d’expression des systèmes las et rhl en présence de la catéchine indique une possible déstabilisation des protéines LasR, LasI, RhlR et/ou RhlI empêchant le déroulement normal du mécanisme du quorum sensing chez la bactérie. Ceci est en accord avec les résultats qui montrent que la catéchine interfère avec la perception de C4-HSL par RhlR. Cette étude permettrait ainsi de comprendre le mode d’action de la catéchine sur le mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa. Dans le cadre de l’amélioration des traitements phytosanitaires contre l’infection par R. fascians par la perbergine, plusieurs stratégies peuvent être envisagées selon nos résultats. Tout d’abord, vu que le rendement en perbergine est très faible, il semble être intéressant soit de procéder à une synthèse chimique de la perbergine, soit de retrouver le composé chez d’autres espèces de plantes. Les autres perspectives seraient également d’étudier son effet inhibiteur chez d’autres bactéries à Gram positif et à Gram négatif qui utilisent d’autres systèmes de régulation de type LysR vu que ces systèmes sont utilisés par beaucoup de bactéries pathogènes. Par ailleurs, la comparaison de l’activité de la perbergine avec d’autres isoflavonoïdes prénylés et/ou méthylés reste intéressante afin de comprendre l’importance de ces groupements. Ensemble, tous ces résultats confirment que la biodiversité est un réservoir potentiel de métabolites secondaires qui peuvent être exploités dans le traitement contre la résistance des bactéries aux antibiotiques. L’exploitation de cette richesse peut fournir de nouvelles ressources thérapeutiques indispensables. Nos observations renforcent l'importance des programmes de conservation et de protection consacrés aux espèces endémiques de Madagascar et leur environnement local en tant que sources de molécules bioactives dans le cadre de la Convention sur le commerce international des espèces de faune et de flore (CITES). Dans le cadre d’une alternative de lutte contre la multirésistance bactérienne, il est intéressant de se focaliser dans l’avenir sur la caractérisation de la structure-activité des composés chimiques qui inhibent l’expression des gènes clés responsables de la production des facteurs de virulence en particulier chez R. fascians et P. aeruginosa . Dans cette optique, plusieurs extraits et fractions semblent être intéressants. Lors du criblage des extraits de Dalbergia sur l’expression des gènes responsables de la production des facteurs de virulence chez R. fascians , tous les extraits méthanoliques d’écorces des 4 espèces de Dalbergia ont diminué fortement l’expression de ce gène. Ceci suggère que d’autres composés chimiques peuvent avoir les mêmes activités que la perbergine et méritent une attention particulière. De même pour les différentes fractions de l’extrait d’écorces de D. pervillei . En effet, l’identification de la structure chimique de ces composés permet d’explorer des relations

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Chapitre VI : Conclusion Générale et Perspectives structure-activité facilitant par la suite de développer une stratégie de lutte efficace contre la bactérie. En outre, les activités bactéricides de tous les extraits de racines des 4 espèces de Dalbergia restent toujours intéressantes malgré le risque de mutation qu’ils peuvent causer. En effet, l’identification de nouveaux composés antibiotiques restent tout de même une réelle nécessité afin d’élargir la conception des produits antibiotiques.

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ANNEXES

Annexes

ANNEXE 1 Quelques exemples d’agents antimicrobiens

Quelques exemples d’agents antimicrobiens suivant leurs mécanismes d’actions : - Interférence avec la synthèse de la paroi cellulaire, o β-lactames : pénicillines, céphalosporines, carbanèmes, monobactames, o Glycopeptides : vancomycines, teicoplanines, - Inhibition de la synthèse des protéines, o Liaison avec la sous-unité ribosomale 50S : macrolides, chloramphénicol, clindamycine, quinupristine-dalfopristine, linézolides, o Liaison avec la sous-unité ribosomale 30S : aminoglycosides, tétracyclines, o Liaison avec l’isoleucyl-ARNt synthétase bactérienne : mupirocine, - Interférence avec la synthèse des acides nucléiques, o Inhibition de la synthèse d’ADN : les fluoroquinolones, o Inhibition de la synthèse d’ARN : rifampine, - Inhibition des voies métaboliques : sulfonamide, les analogues de l’acide folique, - Rupture de la structure membranaire : polymyxines, daptomycine.

Annexes

ANNEXE 2 Les gènes rapporteurs

1. Définition et principe des gènes rapporteurs

Par définition, un gène rapporteur est un gène qui code une protéine possédant une activité connue et quantifiable. Ces gènes sont utilisés pour étudier l’expression de gènes d’intérêt. Ainsi, les deux gènes sont fusionnés de telle sorte qu’ils soient sous le contrôle d’un même promoteur dans la séquence d’ADN, transcrit en un seul ARN messager (ARNm) et enfin traduit en une seule protéine. En effet, le gène rapporteur peut coder une enzyme capable de dégrader un substrat (dont le clivage libère un chromophore, un fluorochrome ou de la lumière). Le niveau d’expression du gène d’intérêt sera reflété par l’activité de la protéine produite par le gène rapporteur.

2. Les différents types de gène rapporteurs

Il existe plusieurs types de gènes rapporteurs mais les plus connus et les plus généralement utilisés sont les gènes gfp qui code la protéine fluorescente verte (GFP), les gènes lux qui codent les protéines qui sont à l’origine de la bioluminescence, le gène uidA qui code l’enzyme β-glucuronidase et le gène lacZ qui code l’enzyme β-galactosidase.

Annexes

ANNEXE 3 Composition du milieu YEB

Préparation pour 1 L de milieu Extrait de viande ...... 5 g Extrait de levure ...... 1 g Peptone ...... 5 g Sucrose ...... 5 g 1 MgSO 4 (solution stock ) ...... 5 ml Agar ...... 15 g pH 7.2 (1N KOH)

1 Solution stock pour 50 ml MgSO 4 4.92296 g

iii

Annexes

ANNEXE 4 Les différentes techniques chromatographiques

1. Définition de la chromatographie

La chromatographie est une méthode d’analyse physico-chimique qui permet de séparer les constituants d’un mélange, appelés solutés, par entraînement grâce à une force de mobilité due à la phase mobile (liquide ou gazeuse) et une force de rétention exercée par la phase stationnaire (solide ou liquide fixé). Il existe différents types de chromatographie selon les mécanismes de séparation, c’est- à-dire les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules à séparer entre les phases fixe et mobile. Ces facteurs peuvent être la solubilité dans un solvant liquide, la taille (la forme), la polarité, la charge électrique ou la présence de groupements d'atomes formant des sites particuliers. Les différents types de chromatographie résultent du fait que l'on a privilégié l'effet d’au moins l'un de ces facteurs. On peut citer :

2. La chromatographie d’adsorption

C’est une technique chromatographique classique basée sur l’adsorption sélective des composants d’un mélange sur une phase stationnaire. Elle permet de séparer les solutés selon leur polarité car la phase mobile permet une élution différentielle en fonction des composés, en éluant en premier les composés moins polaires.

3. La chromatographie d’exclusion

Cette technique est basée sur la séparation des solutés selon leur poids moléculaire. En effet, la phase stationnaire utilisée dans cette technique est composée de pores à travers lesquels les composés diffusent. Le degré de rétention des composés sur la colonne dépend ainsi de la taille du soluté et de la taille du pore. Dans ce cas, si la molécule a une taille supérieure à la taille du pore, elle ne peut pas y rentrer et elle sera donc éluée plus vite. Les autres molécules élueront plus lentement puisqu’elles auront un « chemin » plus long à parcourir travers les « pores » de la phase stationnaire.

4. La chromatographie sur couche mince (CCM)

La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique chromatographique simple et rapide qui permet de séparer les extraits ou les fractions suivant leur polarité et

Annexes d’avoir une idée globale des métabolites présents dans les échantillons analysés. Elle permet également un contrôle aisé et rapide de la pureté d’un composé lorsque les conditions opératoires sont bien déterminées. En effet, le mélange de composés déposé sur la phase stationnaire est entraîné par la phase mobile et chaque composé migre à une vitesse différente dépendant de la différence d’attraction qu’exercent la phase stationnaire et la phase mobile. A la fin de la migration, chaque composé est identifié par sa référence frontale (Rf). La Rf est le rapport entre la distance parcourue par le composé sur la distance parcourue par le front de l’éluant. La Rf d’un composé donné sur un support donné avec un éluant donné est caractéristique de ce composé. Distance parcourue par le composé Rf = Distance parcourue par le front de l' éluant

5. La chromatographie liquide haute performance (HPLC)

La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est une technique d’analyse qualitative, quantitative et séparative des molécules composant un extrait d’intérêt. Il s’agit d’une amélioration de la chromatographie préparative sur colonne car les performances (efficacité et facteur de résolution) sont meilleures. En effet, cette technique utilise des phases stationnaires très élaborées constituées de particules sphériques très fines dont le diamètre est généralement compris entre 2 et 5 µM. Comme les particules sont très petites, la surface réactionnelle est beaucoup plus élevée et par conséquent la phase mobile doit être poussée sous haute pression pour empêcher la perte de charge provoquée par le remplissage de la colonne. Ainsi, l’utilisation de la haute pression améliore l’efficacité des séparations et réduit fortement le temps d’analyses. Une chaîne HPLC est constituée principalement des appareils suivants : - Des réservoirs de solvants qui contiennent les différentes phases mobiles ; - Un contrôleur qui permet de programmer l’analyse y compris la nature des solvants, le débit, le temps d’analyse, etc. ; - Une pompe qui permet de programmer la nature du solvant. Elle permet de travailler : o En mode isocratique, c’est-à-dire avec le même éluant tout au long de l’analyse ; o En mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants du mélange d’éluant ; - Un injecteur qui permet d’avoir un volume d’injection constant des échantillons à

Annexes

analyser ; - Une colonne contenant l’un des deux types de phases stationnaires suivants : o La phase normale qui est une phase très polaire et constituée de gel de silice. Cette phase s’utilise généralement avec un éluant peu polaire (apolaire). Avec cette colonne, les produits apolaires sortent en tête ; o La phase inverse qui est une phase apolaire et majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 ou C18). Cette phase nécessite un éluant polaire et ce sont les composés polaires qui seront élués en premier ; - Un détecteur qui permet de mesurer le spectre d’absorption des composés à la sortie de la colonne.

Annexes

ANNEXE 5 La résonance magnétique nucléaire (RMN)

1. Définition et principe

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une méthode d’analyse très puissante et performante qui sert principalement pour la détermination structurale des composés moléculaires chimiques. Cette méthode repose essentiellement sur le phénomène de magnétisme qui correspond à une absorption sélective d'énergie par des noyaux possédant un moment magnétique placés dans un champ magnétique et irradiés par une onde électromagnétique. En effet, les noyaux de certains atomes possèdent un moment magnétique nucléaire, c'est-à-dire qu'ils se comportent comme des dipôles magnétiques, comparables à des aimants microscopiques ou des barreaux aimantés, caractérisés par une grandeur quantique appelée « le spin ». Le champ magnétique appliqué aux composés entraîne un dédoublement des niveaux d'énergie du spin nucléaire, de sorte qu'on peut induire des transitions entre eux, suite à l'absorption d'une radiation électromagnétique adéquate. En pratique, les échantillons sont dissous dans un solvant deutéré qui peut être du méthanol, du chloroforme, de la pyridine, etc. Ces solvants possèdent des déplacements chimiques spécifiques. Le tube contenant l’échantillon est soumis à un champ magnétique permettant l’obtention des spectres utiles à l’élucidation structurale. Dans cette technique, les principaux noyaux étudiés sont le proton 1H, le carbone 13 C, le phosphore 31 P et l’azote 15 N.

2. Les différentes techniques de RMN utilisées dans le cadre de ce travail

Deux techniques de RMN sont utilisées dans le cadre de ce travail, à savoir la RMN monodimensionnelle et la RMN bidimensionnelle. - La RMN monodimensionnelle (RMN – 1D) o RMN proton ( 1H) : Cette technique permet de déterminer la structure d’un composé organique inconnu. Le spectre RMN obtenu fournit des informations telles que, les différents types d’hydrogènes présents dans la molécule analysée, les différents types d’hydrogènes présents dans l’environnement électronique, le nombre d’hydrogènes « voisins » d’un hydrogène donné et le déplacement chimique caractéristique de chaque proton. o RMN carbone ( 13 C) : Broadband et DEPT 135 : Cette technique permet de mettre en évidence tous les carbones qui constituent une molécule. Chaque

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Annexes

atome de carbone qui est dans un environnement unique provoque une crête distincte sur un spectre. L'analyse se base sur les déplacements chimiques observés en fonction de l'environnement de chacun des atomes de carbone . Cette technique permet la mise en évidence des carbones primaires (CH3), secondaires (CH2), tertiaire (CH) et dans une moindre mesure les carbones quaternaires. Le Broadband détecte tous les carbones présents dans la molécule

tandis que le DEPT 135° permet d’identifier les CH 3 et les CH 2. - La RMN bidimensionnelle (RMN – 2D) o COSY ( 1H – 1H) : Cette technique fournit des informations sur les couplages homonucléaires 2J et 3J (protons séparés par deux ou trois liaisons) entre les protons voisins et ceux qui sont adjacents. o HQSC ( 1JH – C) : Cette technique permet d'observer les couplages chimiques entre les carbones et les protons directement liés entre eux. Toutefois, elle ne permet pas d'observer les déplacements chimiques des atomes de carbone quaternaires. o HMBC ( 2JH – C, 3JH – C) : Cette technique permet de répondre aux problèmes précédemment posés, puisqu'elle permet la détection des couplages longue distance 2JHC, 3JH-C, et permet de déduire les carbones quaternaires couplés aux protons.

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Annexes

ANNEXE 6 La Spectrométrie de masse

Définition et principe

La spectrométrie de masse est une technique de détection extrêmement sensible qui permet de déterminer le poids moléculaire d’un produit pur ou de recueillir des informations structurales à partir de la nature des fragments obtenus suite à une fragmentation moléculaire. Le principe de la spectrométrie de masse est basé sur l’ionisation de la molécule analysée. En effet, lorsqu’un composé est introduit dans l’appareil de spectrométrie de masse, celui-ci est vaporisé puis ionisé (c'est-à-dire que les électrons sont séparés du noyau) par une source de bombardement électronique. L'ion moléculaire obtenu permet ainsi la détermination de la masse molaire du composé. Des ruptures des liaisons chimiques peuvent se produire et forme ainsi des ions fragments caractéristiques car cette dissociation éventuelle ne se fait pas au hasard mais selon des mécanismes bien déterminés. Ceux-ci sont ensuite séparés en fonction de leur rapport masse/charge dans un analyseur par l'application d'un champ magnétique et/ou électrique, puis collectés par un détecteur qui amplifie le signal associé aux ions qui arrivent en des temps différents. Un système de traitement des données transforme les informations du détecteur en un « spectre de masse » dont la lecture, par comparaison avec des spectres références, permet d’établir l’identité de la molécule. En utilisant un spectromètre de masse haute résolution, il est possible de déterminer la masse exacte du composé et les pourcentages isotopiques de chaque atome.

Annexes

ANNEXE 7 Le test d’activité GUS ( β-glucuronidase)

Ce test fut développé pour la première fois par Richard Anthony Jefferson pendant sa thèse de doctorat à l’Université de Colorado à Boulder aux Etats-Unis entre 1985 et 1987 durant la quelle il travaillait à l’Institut de Plant Breeding à Cambridge. Il a montré que l’enzyme β-glucuronidase, qu’il a identifié chez E. coli , est capable de dégrader des substrats spécifiques peu coloré ou non-fluorescent en produit coloré et fluorescent. Le gène uidA , qui est à l’origine de cette enzyme, fut alors identifié et utilisé comme gène rapporteur dans plusieurs études d’expression de gènes (Jefferson et al. 1986; Jefferson et al. 1987; Jefferson 1989; Gilissen et al. 1998).

1. Principe du test d’activité GUS

Dans ce travail, deux types de substrats ont été utilisés pour évaluer l’activité de l’enzyme β-glucuronidase. Il s’agit du para -nitrophényl-β-D-glucuronide (pNPG) et du 4- méthylumbelliféryl-β-D-glucuronide (MUG). Sous l’activité de l’enzyme β-glucuronidase, le para -nitrophényl-β-D-glucuronide est hydrolysé en deux molécules à savoir le para - nitrophénol (jaune) et l’acide β-D-glucuronique (voir Réaction 1 ci-dessous). De même, le 4- méthylumbelliféryl-β-D-glucuronide est hydrolysé en un fluorochrome (le 4- méthylumbelliférone ou 7-hydroxy-4-méthyl coumarine qui émet de la fluorescence à un maximum de 450 nm après une excitation à 365 nm) et en acide β-D-glucuronique (Voir Réaction 2 ci-dessous). Ainsi, selon le principe du gène rapporteur cité dans l’Annexe 6, le niveau d’expression du gène d’intérêt est reflété par l’activité de l’enzyme β-glucuronidase.

Réaction 1 : Réaction chimique de l’activité GUS sur le substrat pNPG

COOH COOH O NO2 O O OH +H20 OH + HO NO GUS OH 2 OH OH OH OH para-nitrophényl-β-D-glucuronide acide β-D-glucuronique para-nitrophénol

Annexes

Réaction 2 : Réaction chimique de l’activité GUS sur le substrat MUG

CH3

COOH COOH CH O O 3 O O O OH +H20 OH OH + GUS OH OH O O OH OH 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide acide β-D-glucuronique 4-methylumbelliferone

2. Compositions du milieu d’induction, tampons et substrats pour le test d’activité GUS

2.1. Composition du milieu d’induction (milieu minimum JM Medium)

Pour 1 L de milieu dans H 2O - Milieu Gamborg B5 ...... 1 L - MES ...... 0.50 g

- NH 4NO 3 ...... 0.25 g - pH ajusté à 5,5 avec du KOH - Vitamine B1 (Thiamine) ajoutée après stérilisation...... 1 %

Préparation du milieu Gamborg B5

Pour 1 L de milieu dans H 2O

- KNO 3 ...... 2500 mg

- (NH 4)2SO4 ...... 134 mg

- NaH 2PO 4, H 2O ...... 150 mg

- CaCl 2, H 2O ...... 150 mg

- MgSO 4, 7H 2O ...... 250 mg

- MnSO 4, H 2O ...... 10 mg

- H3BO 3 ...... 3 mg

- ZnSO 4, 7H 2O ...... 2 mg - KI ...... 0.75 mg

- Na 2MoO 4, 2H 2O ...... 0.25 mg

- CuSO 4, 5H 2O ...... 0.025 mg

- CoCl 2, 6H 2O ...... 0.025 mg

- Na 2EDTA ...... 18.65 mg

- FeSO 4, 7H 2O ...... 13.9 mg

Annexes

2.2. Composition du tampon GUS 50 mM

Pour 100 ml de tampon - Tampon phosphate pH 7.5 ...... 50 ml - EDTA 0.5M pH 8 ...... 200 µl - SDS (Sodium dodécylphosphate) à 10% ...... 100 µl - β-mercapto-éthanol (99%) ...... 80 µl - Eau...... 50 ml

Préparation du tampon phosphate (pour 100 ml de tampon)

- A : Tampon monobasic potassium phosphate (KH 2PO 4) ...... 0.2 M

- B : Tampon dibasic potassium phosphate (K 2HPO 4) ...... 0.2 M

Préparation du tampon phosphate : 8 ml A + 42 ml B + 50 ml H2O ; pH 7.5

a. Préparation des substrats

Les deux substrats pNPG et MUG ont été dissouts dans l’eau milliQ pour atteindre chacun la concentration de 1 M.

b. Composition du tampon stop

Le tampon stop 2-amino-2méthyl-1,3-propanediol est dissout dans l’eau milliQ à raison de 105 mg/ml

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Annexes

ANNEXE 8 Test d’activité LacZ ( β-D-galactosidase)

L’enzyme β-D-galactosidase fut découverte pour la première fois chez E. coli (Erickson 1970; Matthews 2005). L’enzyme est connue comme catalyseur de l’hydrolyse du β- galactosides en monosaccharides. La production de cette enzyme est sous le contrôle du gène lacZ qui est présent dans l’opéron lactose qui se trouve chez E. coli . En pratique, le gène lacZ est utilisé dans le système de gène rapporteur. En effet, comme celui qui a été décrit pour l’activité du GUS, cet enzyme est capable de dégrader des substrats spécifiques peu coloré en produit coloré.

1. Principe du test d’activité LacZ

Le substrat utilisé est l’ortho -nitrophényl-β-D-galactoside ( oNPG). En effet, sous l’activité de la β-D-galactosidase, l’ ortho -nitrophényl-β-D-galactoside est hydrolysé en deux molécules à savoir l’ ortho -nitrophénol (jaune) et le galactose (Voir Réaction 3 ci-dessous). Le niveau d’expression des gènes d’intérêt est alors reflété par l’intensité de la coloration due à la réaction enzymatique sur le substrat. Réaction 3 : Réaction chimique de l’activité LacZ

CH2OH CH2OH OH O O OH O OH +H 0 OH 2 OH + HO O2N β-D-galactosidase OH OH O2N ortho-nitrophényl-β-D-galactoside galactose ortho-nitrophénol

2. Compositions du milieu d’induction, tampon et substrats

2.1. Composition du milieu d’induction (milieu LB MOPS)

Pour 1 L de milieu de culture LB MOPS - Milieu préfabriqué LB (Duchefa) ...... 25 g - MOPS ...... 50 mM - pH à 7,2 ajustée avec du KOH

2.2. Composition du tampon de perméabilisation

Pour 500 ml de tampon

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Annexes

- Na 2HPO 4 ...... 7,098 g - KCl ...... 0,745 g

- MgSO 4 heptahydrate ...... 0,025 g - CTAB (hexadécyltriméthylammonium bromide) ...... 0,400 g - Sodium déoxycholate ...... 0,200 g - β-mercaptoéthanol ...... 2,7 ml - Volume finale à 500 ml complété avec de l’eau milliQ

2.3. Composition du tampon substrat

Pour 500 ml de tampon

- Na 2HPO 4 ...... 4,260 g

- NaH 2PO 4 ...... 2,768 g - β-mercaptoéthanol ...... 1,35 ml - Volume finale à 500 ml complété avec de l’eau milliQ

2.4. Préparation du substrat

Le substrat ONPG est préparé au moment du test à raison de 1 mg/ml de tampon substrat.

3. Composition du tampon Stop Ce tampon sert pour arrêter la réaction (activité de la β-D-galactosidase). Il

s’agit d’une solution de Na 2CO 3 à 1 M.

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Annexes

ANNEXE 9 Test de viabilité chez les bactéries

1. Principe

La technique utilisée dans ce travail pour déterminer la viabilité des bactéries repose sur l’utilisation de deux fluorochromes ayant des capacités différentes de pénétrer dans les cellules mortes. Dans le cadre de ce travail, le kit LIVE/DEAD® BacLight L7012 de Molecular Probes (Invitrogen) a été utilisé. Ce kit utilise un mélange de deux marqueurs d’acides nucléiques à savoir le SYTO® 9 vert fluorescent (3.34 mM) et l’iodure de propidium rouge fluorescent (20 mM). Ces deux marqueurs diffèrent par leur caractéristique spectrale ainsi que par leur capacité à pénétrer dans les cellules bactérienne. Le marqueur SYTO 9 colore en général toutes les bactéries quelle que soit la nature de la membrane (c'est-à-dire intacte ou endommagée). En revanche, l’iodure de propidium pénètre uniquement dans les bactéries avec une membrane endommagée (mortes). Ainsi, avec un mélange de SYTO 9 et d’iodure de propidium (PI) approprié et une excitation à une longueur d’onde appropriée, les bactéries vivantes émettent de la fluorescence verte tandis que les bactéries mortes émettent de la fluorescence rouge. La quantification de cette intensité de fluorescence permet ainsi de déterminer le rapport entre les bactéries vivantes et morte. Cette technique a été utilisée pour déterminer le taux de viabilité des bactéries R. fascians et P. aeruginosa .

2. Détermination de la droite standard

La droite étalon est construite à partir des suspensions bactériennes dont le rapport bactéries vivantes / bactéries mortes est connu afin de quantifier la proportion de bactéries vivantes dans une condition donnée. Dans cette étude, les bactéries sont mises en culture dans les conditions optimales d’induction de l’expression de leurs gènes de virulence qui sont décrites ci-dessus respectivement pour R. fascians et P. aeruginosa . Après 24 h d’incubation pour R. fascians et 8 et 18 h pour P. aeruginosa , les cultures obtenues sont centrifugées et récupéré dans le même volume d’eau distillée. Ces suspensions sont supposées contenir le maximum de bactérie vivante, c'est-à-dire qu’à ce stade, le rapport bactérie « vivantes »/« mortes » est considéré comme étant de [100:0]. Afin d’obtenir des bactéries « mortes », les bactéries ont été incubé dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 min. Après centrifugation, le culot est récupéré dans l’eau distillée avec le même volume de milieu

Annexes initial. A partir de ces deux suspensions, différentes proportions de bactérie « vivantes »/« mortes » ont été préparés à savoir : [100:0], [75:25], [50:50], [25:75] et [0:100]. Pour chaque proportion, 100 µl ont été ajouté dans une plaque 96 puits à fond noir OptiPlate- 96 F. L’expérience est réalisée en 4 répétitions.

3. Préparation des marqueurs pour la réaction, mesure de la fluorescence et détermination du rapport bactéries vivantes et mortes

Pour préparer la solution contenant les marqueurs, le protocole décrit par Molecular Probes a été suivi, c'est-à-dire que pour 2 ml d’eau distillée, il faut ajouter 6 µl de SYTO 9 et 6 µl d’iodure de propidium. Pour la réaction, 100 µl de cette solution sont ajoutés dans chaque puits de la plaque 96 puits contenant les suspensions bactériennes à mesurer et le tout est incubé à l’obscurité pendant 15 min. Après incubation, l’intensité de fluorescence est mesurée apprès une excitation fixée à 485 nm et aux longueurs d’ondes 530 et 630 nm (maximum d’émission) respectivement pour le SYTO 9 et l’iodure de propidium. Le rapport entre les bactéries mortes et vivantes sont calculés par la formule suivante :

Fluorescence Emission Rapport = Fluorescence Emission Les valeurs obtenues pour les échantillons analysés sont reportées sur la droite étalon afin de déterminer le rapport bactéries « vivantes »/« mortes ».

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Annexes

ANNEXE 10 Les différents spectres RMN de la perbergine

Figure A. Spectre RMN proton 1H de la perbergine

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Annexes

Figure B. Spectre RMN carbone C13 de la perbergine

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Annexes

Figure C. Spectre RMN DEPT 135 de la perbergine

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Annexes

Figure D. Spectre RMN à deux dimensions COSY (proton-proton) de la perbergine

Annexes

Figure E. Spectre RMN à deux dimensions gHMBCAD (carbone-proton) de la perbergine

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Annexes

Figure F. Spectre RMN à deux dimensions gHSQCAD de la perbergine

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ANNEXE 11

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ANNEXE 12

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ANNEXE 13

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Résumé

Inhibition de l’expression des gènes de virulence chez Rhodococcus fascians et Pseudomonas aeruginosa par des flavonoïdes isolés chez les genres Dalbergia et Combretum

Résumé

Les plantes sont continuellement confrontées à une multitude d’attaques qu’elles soient de nature abiotique ou surtout biotique. Il est intéressant de noter que malgré la multitude de bactéries auxquelles les plantes doivent faire face, seules quelques unes sont capables d’induire la mort ou une maladie chez la plante hôte. Il est dès lors fort probable que, outre les métabolites secondaires ayant des propriétés antimicrobiennes, les plantes synthétisent également des métabolites secondaires capables d’inhiber l’expression des gènes de virulence chez les bactéries sans toutefois affecter ni leur croissance ni leur viabilité, ce qui permet aux plantes de contenir les populations bactériennes qu’elles hébergent de gré ou de force. Ce travail porte sur l’identification de ce type de métabolites dans des plantes malgaches (genres Dalbergia et Combretum ) et la démonstration de leurs effets inhibiteurs sur l’expression de gènes de virulence chez deux pathosystèmes différents: Rhodococcus fascians (un phytopathogène) et Pseudomonas aeruginosa (un pathogène opportuniste). Ainsi, deux métabolites ont été isolés en utilisant une combinaison de techniques chromatographiques couplées avec des tests qui évaluent l’expression de certains gènes impliqués dans les mécanismes de virulence de ces bactéries. Le premier est un nouvel isoflavanone prénylé, nommé perbergine, isolé à partir de l’extrait d’écorces de D. pervillei . Il a été montré que la perbergine cible l’expression du gène attR , codant un régulateur transcriptionnel de type LysR qui joue un rôle clé dans la régulation de l’expression des gènes de virulence de R. fascians et qui assure la transition entre un mode de vie épiphyte et le mode pathogène. En conséquence, nous avons également montré que l’expression de l’ensemble des gènes de virulence connu à ce jour chez R. fascians est également affectée alors que l’expression de gènes impliqués dans l’aptitude épiphyte de la bactérie n’est pas altérée. Par ailleurs, l’application de perbergine au moment de l’infection de plantes sensibles à R. fascians montre que cette molécule atténue la virulence de R. fascians in vivo , mettant en exergue le potentiel de la perbergine comme agent anti-infectieux. Le deuxième est un flavonoïde, connu sous le nom de catéchine, isolé de l’extrait d’écorces de C. albiflorum . La catéchine inhibe significativement l’expression des gènes régulateurs du mécanisme du quorum sensing chez P. aeruginosa tels que lasI, lasR, rhlI et rhlR et également lasB et rhlA dont l’expression dépend du quorum sensing. En conséquence, la production des facteurs de virulence tels que la pyocyanine et l’élastase est significativement affectée. Compte tenu de l’appauvrissement de notre arsenal d’antibiotiques et de leur inefficacité croissante, l’identification de ces composés ouvre une voie alternative de lutte contre les bactéries pathogènes et la multirésistance des bactéries pathogènes aux antibiotiques. Nos résultats démontrent également la richesse des plantes malgaches comme (res)sources de nouvelles molécules thérapeutiques et l’importance d’élargir le champ des cibles bactériennes à investiguer pour développer de nouvelles stratégies de lutte dans la guerre sans fin que nous menons contre les bactéries pathogènes.

Mots clés : métabolites secondaires, flavonoïdes, perbergine, catéchine, gène de virulence, régulateurs LysR, quorum sensing , homosérine lactone, Rhodococcus fascians, Pseudomonas aeruginosa, Dalbergia, Combretum , Interaction plante-bactérie, multirésistance aux antibiotiques.

Résumé

Inhibition of virulence gene expression in Rhodococcus fascians and Pseudomonas aeruginosa by flavonoïds isolated from the genera Dalbergia and Combretum

Abstract

Plants are continuously confronted with a multitude attack either abiotic but also biotic in nature. Interestingly, despite the abundance of bacteria that plant has to face, only few are able to induce death or disease in the host plant. It is therefore likely that, in addition to secondary metabolites with antimicrobial properties, plants also synthesize secondary metabolites which are able to inhibit the expression of virulence genes in bacteria without affecting either growth or viability, which allows plants to host willingly or not bacterial populations. This work focuses on the identification of such metabolites in Malagasy plants (genera Dalbergia and Combretum ) and the demonstration of their inhibitory effect on the expression of virulence genes in two different pathosystems: Rhodococcus fascians (a phytopathogen) and Pseudomonas aeruginosa (an opportunistic pathogen). Thus, two metabolites were isolated using a combination of chromatographic techniques coupled with tests that evaluate the expression of certain genes involved in the virulence mechanisms of these bacteria. The first is a new prenylated isoflavanone, named perbergin, isolated from the bark extract of D. pervillei . It was shown that the perbergin target attR gene expression, encoding a LysR-type transcriptional regulator that plays a key role in regulating the expression of virulence genes of R. fascians and the transition from an epiphytic to a pathogenic lifestyle. Therefore, we have also shown that the expression of all virulence genes known to date in R. fascians is also affected while the expression of genes involved in epiphytic fitness of the bacteria is not altered. In addition, the application of perbergin at the time of infection of plants susceptible to R. fascians shows that this molecule reduces in vivo the virulence of R. fascians , highlighting the potential of perbergin as an anti-infective agent. The second is a flavonoid known as catechin, isolated from the bark extract of C. albiflorum . Catechin significantly inhibits the expression of genes that regulate the mechanism of quorum sensing in P. aeruginosa such as lasI , LasR , rhlI and rhlR but also lasB and rhlA which expression depends on quorum sensing . Therefore, the production of virulence factors such as pyocyanin and elastase is significantly affected. Because of the limited number of our arsenal of antibiotics and their increasing ineffectiveness, the identification of these compounds create a path to an alternative in the fight against pathogenic bacteria and multidrug resistance of pathogenic bacteria to antibiotics. Our results also demonstrate the richness of Malagasy plants as (re)sources of new therapeutic molecules and the importance of widening the range of bacterial targets to be investigated to develop new strategies to fight within the endless war that we are waging against bacteria pathogens.

Keywords: secondary metabolites, flavonoïds, perbergin, catechin, virulence gene, LysR regulators, quorum sensing , homoserine lactone, Rhodococcus fascians, Pseudomonas aeruginosa, Dalbergia, Combretum , plant-bacteria interaction, multidrug resistance to antibiotics.