UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

JOÃO PAULO SILVA PINHEIRO

UTILIZAÇÃO DE DIFERENTES DILUIDORES E EQUIPAMENTOS NA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CURIMATÃ (Prochilodus brevis)

FORTALEZA 2014

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JOÃO PAULO SILVA PINHEIRO

UTILIZAÇÃO DE DIFERENTES DILUIDORES E EQUIPAMENTOS NA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CURIMATÃ (Prochilodus brevis)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.

Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.

Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves.

Orientadora: Profa. Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley.

FORTALEZA 2014 2

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Aos meus pais, Francisco Borges e Suzete Maria; Ao meu irmão, Adson Rodrigo; À minha tia, Francisca Castro,

Com gratidão e amor, dedico.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me concedido o dom da vida, além de que tenho a certeza que com Ele posso vencer os obstáculos, continuar a jornada e concretizar todos os meus sonhos. À Universidade Estadual do Ceará, pelo suporte desde a graduação e durante todo o mestrado, e por ter me proporcionado momentos de enriquecimento científico e social ao lado de pessoas maravilhosas. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, por ter concedido a bolsa de mestrado. À Financiadora de Estudos e Projetos – FINEP, pelo apoio financeiro fornecido ao LBRP, sendo assim possível a realização de todo o experimento. À minha orientadora Profa. Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley, por ter me orientado desde a graduação, pelos seus conselhos, orientações, incentivos e paciência. Ao prof. Dr. José Ferreira Nunes, por ter me aceito inicialmente no mestrado como orientador e por contribuir na banca de defesa dessa dissertação. Aos professores: Dra. Renata Guimarães Moreira e Dr. Rodrigo Magionni por terem aceito prontamente a participar e a contribuir com seus conhecimentos na defesa dessa dissertação. À Professora Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva por ter aceito participar como suplente da banca de defesa dessa dissertação. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias - PPGCV por todo apoio, incentivo, experiências e conhecimentos fornecido durante o mestrado. Aos funcionários, em especial a Adriana Maria S. Albuquerque, pela paciência e ajuda em tornar as coisas mais simples de todo o funcionamento do programa. À Profa. Dra. Ana Gláudia Vasconcelos Catunda, pela realização e explicação da estatística da parte experimental. Aos colegas de pós-graduação do Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes – LBRP: Liliane Veras Leite, Júlia Trugílio Lopes, Mayara Setúbal Oliveira, Larissa Teixeira Nunes, Jordana Sampaio Leite, Francisco Renan Aragão Linhares por terem me ajudado durante o período de realização do experimento e de construção do conhecimento desde a iniciação científica e pelo companheirismo no dia a dia. Em especial, a minha “mãe científica” – Mônica Aline Parente Melo Maciel, que sempre me ajudou nas pesquisas e na experimentação, fornecendo dicas, críticas e elogios.

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Aos ex e atuais ICs do LBRP, Thais Maia Torres, Yasmim Maia Ferreira, Priscila Silva de Almeida, Rômulo Roberto Ribeiro Pinheiro, Maria Eduarda Magalhães de Souza, Renata Vieira do Nascimento pelo companheirismo e por terem tornado os trabalhos menos laboriosos. Aos colegas da turma de mestrado, pela troca de experiências e conhecimentos. Aos membros e funcionários do Núcleo Integrado de Biotecnologia, pelo companheirismo e apoio, em especial, a Dona Maria Iraci Clemente de Melo, pelo carinho fornecido durante todos esses anos. A minha amiga Henna Roberta Quinto, pelo seu grande incentivo desde a graduação (me mandando estudar para o mestrado), pela sua amizade e carinho em todos os momentos, compartilhando alegrias e tristezas, dúvidas e anseios. A minha grande amiga Lívia Maria Galdino Pereira, pela sua dedicação em tornar os meus dias menos complicados, pelo carinho, atenção, companheirismo e ajuda no meu crescimento como pessoa e como pesquisador. Aos meus amigos desde a graduação, Edlâny Pinho Romão, Camila Miranda Barbosa e Diego Sales Lucas, pela amizade e diversas alegrias compartilhadas. Aos meus pais: Francisco Borges Pinheiro e Suzete Maria da Silva Pinheiro, que sempre me deram educação, amor, carinho, companheirismo, me encorajaram para trilhar os caminhos da vida, enfim, são a base de toda a minha trajetória. Ao meu irmão Adson Rodrigo Silva Pinheiro, pelo seu “ombro amigo”, pelo apoio nas horas difíceis e por sempre me escutar e compartilhar comigo diversas experiências de vida. Ao meu irmão Edyhelver Silva Pinheiro por ter compartilhado alguns momentos dessa jornada, a minha tia Francisca Castro da Silva (Zulena), pelo seu apoio, amor e incentivo e aos demais familiares que sempre me ajudaram de alguma forma desde meu nascimento. Enfim, quero agradecer a todos que contribuíram de forma direta ou indireta para a conclusão de mais uma etapa da minha vida.

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RESUMO

Curimatã comum (Prochilodus brevis) é um peixe reofílico encontrado em alguns estados (Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte) da região Nordeste do Brasil. No entanto, a pesca predatória e o impedimento, pelas barragens nos rios, da migração dessa espécie para a reprodução põe em risco a sobrevivência do P. brevis. Com isso, surge nos pesquisadores o interesse sobre a criopreservação do sêmen dessa espécie, tanto para a produção em aquicultura como para preservação de material genético em programas de conservação. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência de diferentes diluidores e equipamentos de congelação na criopreservação do sêmen de curimatã (P. brevis). Os machos (n=12) pertencentes ao plantel do Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes foram induzidos hormonalmente com extrato hipofisário de carpa comum (3 mg kg-1) para a espermiação. Após 18h da indução, os animais foram sedados individualmente e realizada a coleta de sêmen, mensuração do comprimento e a pesagem dos mesmos. Depois da coleta seminal, realizou-se a análise objetiva da motilidade do sêmen com auxílio do Sperm Class Analyzer; foram também mensurados pH, volume, osmolaridade, fixadas alíquotas para morfologia e para concentração espermática, e em seguida, iniciado o processo de criopreservação. As amostras seminais (n=8) de cada animal foram diluídas em quatro diferentes tratamentos (glicose+dimetilsulfóxido-DMSO, glicose+metil glicol-MG, Beltsville Thawing Solution- BTS+DMSO e BTS+MG), envasadas em palhetas de 0,25 mL e submetidas a dois diferentes equipamentos de congelação: máquina de congelação programada e dry shipper. Após 10 dias, as amostras seminais foram descongeladas (25 ºC / 30s) e avaliadas quanto à cinética e à morfologia espermáticas com auxílio do software Sperm Class Analyzer. Os parâmetros físico-químicos (pH: 8,21 ± 0,27; osmolaridade: 250,29 ± 25,84 mOsm; concentração: 15,12 ± 2,77 x109 sptz mL-1) do sêmen in natura foram similares aos observados em outros estudos de Characiformes, portanto permitindo a criopreservação do sêmen. A glicose, quando usada como diluente em associação com o crioprotetor MG (glicose+MG), conferiu elevado percentual de espermatozoides móveis após congelação no equipamento dry shipper (76,88 ± 4,84%; P>0,05; Coeficiente de Variação – C.V.: 17,8) e em máquina de congelação programada (70,95 ± 1,76%; P>0,05; C.V.: 7,01) sendo superior (P<0,05) aos demais tratamentos (glicose+DMSO: 23,64 ± 2,26% e 18,10 ± 2,87%; BTS+DMSO: 41,12 ± 3,14% e 37,58 ± 2,62; BTS+MG: 37,38 ± 5,06% e 50,86 ± 3,36%). Além disso, o tratamento glicose+MG conferiu velocidades espermáticas (VCL:79,52 ± 2,88 µm s-1; VSL:45,46 ± 3,01 µm s-1; VAP:67,92 ± 3,08 µm s-1; P<0,05) superiores aos demais tratamentos estudados, e uma maior quantidade de espermatozoides normais (74,56 ± 0,77%; P<0,05) foi observado quando o sêmen foi criopreservado utilizando a máquina de congelação programada. A anormalidade

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espermática mais encontrada foi a de cauda dobrada. Dessa forma, é recomendável a utilização de glicose+MG, em combinação com o dry shipper ou com a máquina de congelação programada para a criopreservação do sêmen de P. brevis. A utilização de uma máquina de congelação programada é mais recomendada, porque os resultados obtidos são mais uniformes do que utilizando o dry shipper.

Palavras-chave: Dry shipper. Máquina de congelação programada. Peixe. Reprodução.

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ABSTRACT

Common Curimatã (Prochilodus brevis) is a rheophilic fish found in some states (Ceará, Piauí and Rio Grande do Norte) of northeastern Brazil. However, overfishing and river dams, which prevent the migration of P. brevis of for reproduction, jeopardize the survival of this species. Accordingly, there is interest among researchers regarding P. brevis semen cryopreservation, both for aquacultural production and for the preservation of genetic material in conservation programs. This study aimed to evaluate the efficiency of different extenders and freezing equipment to freeze the semen of P. brevis. Males (n = 12) bred at Laboratory of Biotechnology of Reproduction Fish were hormonally induced with a pituitary extract from common carp (3 mg kg-1) to induce spermiation. After 18 h of induction, the animals were sedated, their lengths and weights the same were recorded, and semen was collected individually. After collection, an objective analysis of the motility of the semen was performed with the aid of Sperm Class Analyzer; the pH, volume, osmolality were measured and fixed rates for morphology and sperm concentration. For cryopreservation, the semen samples (n = 8) from each animal were diluted in four different treatments (glucose + DMSO-dimethyl sulfoxide, glucose + MG-methyl glycol, Beltsville Thawing Solution-BTS+ DMSO and BTS + MG) and packaged into 0.25 mL straws. Two different types of freezing equipment were used: a programmed freezing machine and a dry shipper. After 10 days, the semen samples were thawed (25 °C / 30 s) and evaluated with regard to kinetics and sperm morphology with the aid of the Sperm Class Analyzer software. The physico-chemical parameters (pH: 8.21 ± 0.27; osmolarity: 250.29 ± 25.84 mOsm; concentration: 15.12 ± 2.77 x109 sptz ml-1) of the semen in natura were similar to those observed in other studies of Characiformes, thus allowing semen cryopreservation. Glucose, when used as a diluent in association with the MG cryoprotectant (glucose + MG), resulted in a high percentage of mobile spermatozoa after dry shipper (76.88 ± 4.84%, P> 0.05; Coefficient of Variation – C.V.: 17.8) and programmed freezing machine (70.95 ± 1.76%, P> 0.05; C.V.: 7.01), and both were higher (P <0.05) than with the other treatments (glucose + DMSO: 23.64 ± 2.26% and 18.10 ± 2.87%; BTS + DMSO: 41.12 ± 3.14% and 37.58 ± 2.62; BTS + MG: 37.38 ± 5.06% and 50.86 ± 3.36%). Furthermore, glucose + MG resulted in superior sperm velocities (VCL: 79.52 ± 2.88 µm s-1; VSL: 45.46 ± 3.01 µm s-1; APV: 67.92 ± 3.08 µm s-1, P <0.05) to other treatments, and a larger amount of normal spermatozoa (74.56 ± 0.77%; P<0,05) was observed when the semen was cryopreserved using the programmed freezing machine. However, bent tail was an observed abnormality. Thus, glucose + MG in combination with dry shipper or programmed freezing machine is recommended for P. brevis semen cryopreservation.

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The use of the programmed freezing machine is preferred because the results were more uniform than when using the dry shipper.

Keywords: Dry shipper. Programmed freezing machine. Fish. Reproduction.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Curimatã comum (Prochilodus brevis) ------18

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Lista de alguns peixes Characiformes e os crioprotetores, os diluentes e os equipamentos utilizados no processo de criopreservação seminal ------22

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LISTA DE TABELAS

Capítulo 1

Tabela 1 - Lista de alguns peixes Characiformes e os crioprotetores, os diluentes e os equipamentos utilizados no processo de criopreservação seminal ------38

Capítulo 2

Table 1 - Mean ± standard deviation of P. brevis semen parameters in natura (n= 8 males) ------65

Table 2 - Mean and standard error of the kinetic parameters (curvilinear velocity - VCL, straight-line velocity - VSL, and average path velocity - VAP) of P. brevis semen after thawing for various treatments (n= 6 replicate straws x 8 males from each treatment) ------66

Table 3 - Mean ± standard error of the variables recorded as a percentage of mobile spermatozoa; the results were evaluated post-thawing in P. brevis semen as a function of the interaction of treatment and freezing method (n= 3 replicate straws x 8 males from each treatment and from each freezing method) ------67

Table 4 - Percentage of defects in the tail of post-thaw sperm (broken tail, coiled tail, and corrugated tail) of semen from P. brevis for various treatments (n= 6 replicate straws x 8 males from each treatment) ------68

Table 5 - Correlation matrix among the kinetic, morphological, and physico-chemical characteristics of P. brevis semen ------69

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACP – Água de Coco em Pó ATP – Adenosina tri-fosfato BTS – Beltsville Thawing Solution CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CASA – Análise do Sêmen Assistida por Computador (Computer Assisted Sperm Analyses) CE – Ceará DMA – Dimetilacetamida DMF – Dimetilformamida DMSO – Dimetilsulfóxido EDTA – Ácido etilenodiamina tetra-acético EHC – Extrato Hipofisário de Carpa FINEP – Financiadora de Estudos e Projetos LBRP – Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes M III – Merck III MF – Metilformamida MG – Metil glicol pH – Potencial Hidrogeniônico PI – Piauí PPGCV – Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias RN – Rio Grande do Norte SAS - Statistical Analysis System SCA – Sperm Class Analyzer UECE – Universidade Estadual do Ceará UFC – Universidade Federal do Ceará USP – Universidade de São Paulo VAP – Velocidade média do percurso (Average Path Velocity) VCL – Velocidade Curvilinear (Curvilinear Velocity) VSL – Velocidade Progressiva Linear (Straight Line Velocity)

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ------16 2 REVISÃO DE LITERATURA ------18 2.1 ESPÉCIE ------18 2.2 TAXONOMIA------19 2.3 CRIOPRESERVAÇÃO------19 2.3.1 Diluidores------20 2.3.2 Equipamentos------26 2.3.2.1 Dry shipper ------27 2.3.2.2 Caixa térmica de poliestireno------28 2.3.3.3 Máquina de congelação programada------28 2.4 ANÁLISE SEMINAL------29 2.4.1 Análise da cinética espermática ------29 2.4.2 Análise da morfologia espermática ------30 3 JUSTIFICATIVA ------32 4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS------33 5 OBJETIVOS------34 5.1 OBJETIVO GERAL------34 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS------34 6 CAPÍTULO 1------35 7 CAPÍTULO 2------44 8 CONCLUSÕES------70 9 PERSPECTIVAS------71 10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS------72

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1 INTRODUÇÃO

A espécie Prochilodus brevis, popularmente conhecida como curimatã comum, é um peixe Characiforme que se distribui em bacias hidrográficas interiores e costeiras do Nordeste do Brasil, sendo endêmica nos estados do Ceará, do Rio Grande do Norte e do Piauí (ROSA et al., 2005; CHELLAPPA et al., 2009). Apesar de possuir uma considerável importância econômica e ecológica nesta região, sua biologia reprodutiva é pouco conhecida. Além disso, esta espécie fica bastante ameaçada pela pesca predatória no período que antecede a sua desova e pela construção de barragens em rios, que impedem a realização da migração para se reproduzirem (NASCIMENTO, M. et al., 2012). Em virtude disso, surge nos pesquisadores o interesse sobre o estudo da reprodução dessa espécie, e uma das áreas em ascensão para reprodução assistida é a criopreservação do sêmen, tanto para a produção em aquicultura, como para preservação de material genético em programas de conservação (CAROLSFELD et al., 2003). Vários estudos mostram que a criopreservação é uma boa alternativa para a melhoria da reprodução de peixes, tendo em vista que seus benefícios são variados, dentre eles: sincroniza a disponibilidade dos gametas; facilita o transporte e evita envelhecimento dos mesmos; conserva a variabilidade genética; reduz os custos de manutenção do plantel de reprodutores e possibilita trocas de material genético entre criadouros (CARNEIRO et al., 2006). No entanto, para se obter uma boa qualidade seminal pós-descongelação é necessária a interação de diversos fatores, como de um bom diluidor, que assegure a nutrição e a proteção dos espermatozoides, e de taxas de resfriamento adequadas, que evitem as crioinjúrias. Havendo, portanto, a necessidade da padronização de protocolos de criopreservação, principalmente da técnica empregada para controle da queda da temperatura, que pode ser obtida com a utilização do dry shipper ou da máquina de congelação programada. Quando a interação adequada entre esses fatores supracitados não acontece, podem ocorrer danos celulares, havendo a necessidade de que se analisem os principais parâmetros do sêmen pós-descongelação, como a motilidade e morfologia espermática (SALMITO- VANDERLEY et al., 2014), que influenciam diretamente a taxa de fertilização (RURANGWA et al., 2004; FELIZARDO et al., 2010). 17

Diante disso, este trabalho objetiva avaliar a eficiência de diferentes diluidores e equipamentos de congelação na criopreservação do sêmen de curimatã (P. brevis) quanto aos parâmetros: motilidade total, velocidades e morfologia espermáticas. Para uma melhor compreensão do assunto abordado nessa dissertação, seguirá uma revisão de literatura abordando os tópicos: espécie, taxonomia, criopreservação e análise seminal.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 ESPÉCIE

A espécie (Figura 1) Prochilodus brevis Steindachner, 1875 (=Prochilodus cearensis), conhecida regionalmente por curimatã comum, é um teleósteo pertencente à ordem dos Characiformes e nativo do semiárido nordestino brasileiro (CE, PI, RN) sendo introduzido em alguns estados da região sudeste (DOURADO, 1981).

Figura 1. Curimatã comum (Prochilodus brevis)

Fonte: Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes, 2012

O curimatã possui grande valor biológico e econômico, que de acordo com Fontenele (1982) ocupa lugar de destaque pela precocidade, prolificidade, regime alimentar e grande aceitação pelos habitantes do Nordeste. Caracteriza-se por ter um hábito alimentar planctófago em seus estágios iniciais de vida e na fase adulta é iliófago, alimentando-se de restos de animais e de vegetais depositados no fundo de açudes e viveiros (DOURADO, 1981). Constitui-se como uma espécie de desova total e reofílica, que migra vários quilômetros rio acima a fim de encontrar as áreas de reprodução e realizar a desova (GURGEL; VERANI; CHELLAPPA, 2012). A reprodução em ambiente natural está relacionada às enchentes dos rios, nas épocas de chuvas no Nordeste, que ocorrem entre os meses de dezembro a junho. Nesse período constata-se a evolução das gônadas, migração para realização da desova, ao mesmo tempo, a liberação dos espermatozoides pelos machos, ocorrendo a fecundação externa (PORTO, 1987). Quando não ocorrem as chuvas ou quando o animal está em cativeiro, essa migração para a reprodução é impedida, sendo, portanto necessária à realização da indução hormonal para a maturação final e reprodução assistida. Um dos preparados hormonais mais utilizados em espécies nativas brasileiras é o extrato bruto hipofisário de carpa (EHC) (ZANIBONI 19

FILHO; WEINGARTNER, 2007), que atua induzindo essa maturação final, com consequente liberação dos gametas. Além das secas, a construção de barragens em rios impedindo a realização da migração para a reprodução e a pesca predatória no período que antecede a desova, afetam a sobrevivência dessa espécie (NASCIMENTO, M. et al., 2012). Também, a urbanização, a poluição, o extrativismo, as intensas atividades agrícolas com o uso de agrotóxicos, a sobrepesca, e a introdução de espécies exóticas estão relacionadas com o declínio dos estoques de peixes de piracema (CAROLSFELD et al., 2003).

2.2 TAXONOMIA

Domínio : Eukaryota Reino : Animalia Filo : Chordata Subfilo : Vertebrata Superclasse : Gnathostomata Classe : Actinopterygii Subclasse : Neopterygii Divisão : Teleostei Subdivisão : Euteleostei Superordem : Ostariophysi Ordem : Characiformes Família : Prochilodontidae Gênero : Prochilodus Espécie : Prochilodus brevis (= Prochilodus cearensis)

(CASTRO; VARI, 2003)

2.3 CRIOPRESERVAÇÃO

A criopreservação é uma técnica que permite o armazenamento de células, como os gametas, em nitrogênio líquido a -196 ºC, mantendo-se a viabilidade estrutural e funcional celulares por tempo indeterminado. 20

Os benefícios da criopreservação de sêmen consistem em: a) fornecer subsídios para a formação de bancos de germoplasma, a fim de garantir a diversidade e a preservação do material genético de espécies de interesse econômico e ambiental; b) troca de material genético entre as explorações piscícolas, evitando o transporte de animais; c) disponibilidade de sêmen em períodos menos favoráveis, evitando assim o problema de assincronia da maturação gonadal; d) economia de sêmen, pois permite o uso do volume total disponível, principalmente quando é de difícil obtenção; ou quando grandes quantidades de volume de sêmen são obtidas em cativeiro, permitindo o armazenamento do sêmen e a sua utilização posteriormente; e) viabilidade de programas de hibridização utilizando peixes com a reprodução em diferentes épocas do ano (CAROLSFELD et al., 2003; MARIA; AZEVEDO; CARNEIRO, 2009; CABRITA et al., 2010; CARNEIRO et al., 2012). Além disso, permite o transporte de material genético através de longas distâncias com baixo custo, maior segurança, preservando a integridade física do animal e evitando a propagação de doenças entre eles (CARNEIRO et al., 2012). No entanto, para obter o sucesso de tal técnica é necessária a utilização e interação de diversos fatores, tais como: bom diluente, que forneça nutrientes adequados às células; crioprotetor, que evite as crioinjúrias, como a formação de cristais de gelo; tempo e método de adição dos crioprotetores; método de envase; taxa de resfriamento, temperatura e tempo de descongelação apropriados, com o objetivo de evitar choque térmico e de danificar os espermatozoides quanto à morfologia; método de avaliação da motilidade espermática, dentre outros (SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). Por isso, observa-se na literatura a busca da padronização de protocolos adequados aos parâmetros fisiológicos (por exemplo: a osmolaridade, o pH, entre outros) de cada espécie animal (SILVA; GUERRA, 2011; SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). Com isso, garante-se uma qualidade seminal pós-descongelação e o uso do sêmen em programas de fertilização assistida obtendo melhores taxas de fertilização e eclosão, como encontrado por Viveiros et al. (2010) ao criopreservarem sêmen de Prochilodus lineatus, em que obtiveram 97% de espermatozoides móveis e uma taxa de fertilidade de 64%.

2.3.1 Diluidores

Para que o sêmen possa ser criopreservado é necessário que seja adicionado uma solução diluidora, que é composta por um diluente, com a função de diluir e de fornecer nutrientes, e por crioprotetor intracelular e extracelular, com o intuito de permitir o 21

armazenamento adequado e proteger os espermatozoides contra o choque térmico (MARIA; CARNEIRO, 2012; SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). As condições exigidas para que o diluidor possa atuar de forma eficaz são: isotonicidade (que não ative a motilidade espermática), estabilidade ao longo do armazenamento, que seja estéril e carreador de crioprotetores (MARIA, 2005). Os diluentes (Quadro 1) já utilizados no processo de criopreservação do sêmen de peixes Characiformes foram: glicose, cloreto de sódio (NaCl), Beltsville Thawing Solution (BTS), água de coco, água de coco em pó (ACP®), Saad, Merck III, Ringer e Kurokura. Observa-se na literatura, que o diluente glicose é o mais utilizado na criopreservação de sêmen de peixes Characiformes (SALMITO-VANDERLEY et al, 2012), conferindo elevado percentual de espermatozoides móveis. Isso pode ser observado em diversas espécies, como P. lineatus – motilidade entre 63 a 92% (NASCIMENTO, A. et al., 2012), Prochilodus magdalenae – motilidade entre 20 a 71% (MARTÍNEZ; TARAZONA- MORALES; PARDO-CARRASCO, 2012), Brycon orbignyanus – motilidade entre 77 a 89% (NASCIMENTO, A. et al., 2012) e Brycon opalinus – motilidade entre 18 a 88% (VIVEIROS et al., 2012b). Além de proporcionar bons resultados, a glicose é um diluente bastante simples e estável, que pode ser utilizado em fazendas sem nenhum equipamento de laboratório, uma vez que é adquirida como uma solução estéril e pronta para o uso (NASCIMENTO et al., 2010). Outro diluente que foi desenvolvido para o sêmen de suínos, mas que vem sendo amplamente utilizado em sêmen de peixes Characiformes é o BTS (SALMITO- VANDERLEY et al., 2012), que possui em sua composição glicose, citrato de sódio, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), bicarbonato de sódio, cloreto de potássio e sulfato de gentamicina. Foi testado com sucesso em Brycon insignis – motilidade entre 23 a 77% (VIVEIROS et al., 2011a), B. orbignyanus – motilidade entre 77 a 92% (NASCIMENTO, A. et al., 2012) e P. lineatus – motilidade entre 69 a 92% (NASCIMENTO, A. et al., 2012). Já os crioprotetores irão atuar evitando a formação de cristais de gelo, diminuindo o estresse osmótico por meio da reposição de água necessária para manutenção do volume celular, interagindo com íons e macromoléculas, reduzindo o ponto de congelação da água, assim como servir como tampão ajustando as alterações do pH (MEDEIROS et al., 2002; SOARES; GUERRA, 2009). Eles podem ser classificados em intracelular, que é uma substância química não tóxica capaz de retirar a água da célula e diminuir a temperatura de congelação no seu interior, impedindo a formação de cristais de gelo internamente; ou em 22

extracelular, que revestem a célula externamente e estabilizam sua membrana, diminuindo os danos provocados pela congelação (CARNEIRO, 2007). Os crioprotetores mais utilizados (Quadro 1) em sêmen de peixes Characiformes foram: a) Intracelulares: Dimetilsulfóxido (DMSO), metil glicol (MG), metanol, propilenoglicol, dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) e metilformamida (MF); b) Extracelulares: gema de ovo e lactose. Entre os crioprotetores internos supracitados, os mais utilizados são o DMSO e o metil glicol. O DMSO já vem sendo testado com sucesso em diversas espécies de Characiformes, como B. insignis – motilidade entre 23 a 46% (VIVEIROS et al., 2011a), B. opalinus – motilidade entre 28 a 78% (VIVEIROS et al., 2012b), B. orbignyanus – motilidade entre 77 a 89% (NASCIMENTO, A. et al., 2012), P. lineatus – motilidade entre 63 a 92% (NASCIMENTO, A. et al., 2012) e P. magdalenae – motilidade entre 20 a 71% (MARTÍNEZ; TARAZONA-MORALES; PARDO-CARRASCO, 2012). O metil glicol também apresenta resultados satisfatórios nas espécies B. insignis – motilidade entre 77 a 82% (VIVEIROS et al., 2011a), B. opalinus – motilidade entre 18 a 88% (VIVEIROS et al., 2012b), B. orbignyanus – motilidade entre 78 a 88% (NASCIMENTO, A. et al., 2012) e P. lineatus - motilidade entre 70 a 85% (NASCIMENTO, A. et al., 2012).

Já entre os crioprotetores externos supracitados, o mais utilizado na literatura é a gema de ovo. No entanto, Leite et al. (2011) ao criopreservarem sêmen de tambaqui (Colossoma macropomum) concluíram que a adição de gema de ovo ao diluidor seminal diminuiu a motilidade espermática após descongelação.

Quadro 1. Lista de alguns peixes Characiformes e os crioprotetores, os diluentes e os equipamentos utilizados no processo de criopreservação seminal.

Espécie Crioprotetores Diluentes Equipamento Autores

Brycon 10% DMSO, gema “V2e”; Glicose Caixa térmica Ninhaus - cephalus de ovo de poliestireno Silveira et al., 2006

Brycon 10% DMSO e 10% 0,9% NaCl, 5% glicose, Dry shipper Viveiros et insignis Metil glicol 5% BTS e 6% Merck al., 2011a III (M III) 23

10% Metil glicol Beltisville Thawing Dry shipper Viveiros et Solution (BTS) al., 2012a

Brycon 10% DMSO e 10% NaCl 154mM, NaCl Dry shipper Oliveira et nattereri Metil glicol 200mM, Saad, BTS e al., 2007 glicose 277mM

10% Metil glicol BTS, 0,9% NaCl Dry shipper Viveiros et al., 2011b

Brycon 10% DMSO e 10% NaCl e glicose Dry shipper Viveiros et opalinus Metil glicol al., 2012b

Brycon 10% DMSO, 10% NaCl 154 mM, 5% BTS Dry shipper Maria et al., orbignyanus Metanol, 10% e 6% M III 2006 Metil glicol, 5%

Gema de ovo

DMSO e gema de Glicose Dry shipper Galo et al., ovo 2011

Colossoma Dimetilacetamida, - Dry shipper Menezes et macropomum DMSO, metanol, al., 2008 propilenoglicol e etilenoglicol

10% DMSO, 10% ACP e Ringer Caixa térmica Vieira, 2010 Metil glicol de poliestireno

10% ACP Dry shipper Leite et al., Dimetilsulfóxido e 2011 5% e 10% gema de ovo

5% glicerol; 10% BTS Dry shipper Varela Jr. et al., 2012a DMSO; e 2%, 5%, 8%, e 11% de 24

Dimetilacetamida, de Metilformamida, e de dimetilformamida

5, 10, 15 e 20% de BTS Dry shipper Varela Jr. et al., 2012b DMSO

10% DMSO, 10% 5%, 5,4%, 5,8%, 6,2% Dry shipper e Carneiro et Metil glicol e 10% e 6,6% de solução de Máquina de al., 2012 gema de ovo glicose Congelação Programada (TK 4000®)

Piaractus 10% DMSO e 10% ACP, 5% Glicose e Caixa térmica Velásquez- brachypomus Metil glicol Ringer de poliestireno Medina, e Dry shipper 2008

10% DMSO e 10% ACP e Ringer Dry shipper Melo, 2010 Metil glicol

10% DMSO e 10% Glicose e BTS Dry shipper Nascimento Metil glicol et al., 2010

Gema de ovo, 10% Glicose Dry shipper Ramírez- de DMSO, 5% de Merlano et etilenoglicol, ou al., 2011 10% de metanol

Piaractus 20 % de gema de 5 % glicose, Zorlesco Dry shipper Streit Jr. et mesopotamicus ovo, 10 % DMSO, modificado al., 2006 0,16g de KCl mais (ZOR), BTZOR 10% de glicerol. (desenvolvido na UEM), Andro-Hepes, 25

BTS

Gema de Glicose Dry shipper Streit Jr. et al., 2009 Ovo e DMSO

Metanol 10% e 5% BTS Dry shipper Paulino et dimetilsulfóxido al., 2012. (DMSO) 10%

Prochilodus 10% DMSO e 10% 0,9% NaCl, 5% glicose, Dry shipper Viveiros et lineatus Metil glicol 5% BTS e 6% M III al., 2009

10% Metil glicol ACP e 5% de glicose Dry shipper Viveiros et al., 2010

8% DMSO, 5% BTS Dry shipper Felizardo et metanol, 5% gema al., 2010 de ovo, lactose

Metanol 8% , BTS Dry shipper Felizardo et DMSO 8% e al., 2011 lactose 5%

Metanol ou DMSO 5% BTS Dry shipper Miliorini et nas concentrações al., 2011 de 5%,7,5%,10% e 12,5%.

DMSO BTS Dry shipper Navarro et al., 2014

Prochilodus 12% Gema de ovo; 5,5%, 6% e 6,5% Dry shipper Martínez; magdalenae DMSO nas Glicose Tarazona- concentrações de Morales; 5%, 10% e 15% Pardo- Carrasco,

2012 26

12% gema de ovo, 6% glicose Máquina de Martínez; 10% DMSO congelação Pardo- programada Carrasco, (FreezeControl 2013 ®, CryoLogic Pty. Ltd., Victoria,

AU)

8%, 10% e 12% de 6% Glicose Dry shipper Atencio et Dimetilacetamida e al., 2013 12% gema de ovo

De acordo com Watson (2000), o protocolo de criopreservação tem uma série de tensões potencialmente prejudiciais às células. Por um lado, a mudança de temperatura, que pode afetar as estruturas presentes nas membranas, como as proteínas; em segundo, as tensões osmóticas e tóxicas apresentadas pela exposição aos crioprotetores, e em terceiro, a formação de cristais de gelo e a dissolução de gelo no meio extracelular. Logo, a fim de verificar a eficiência do protocolo utilizado, Cabrita et al. (2010) ressaltaram a importância da avaliação da qualidade do sêmen usando as ferramentas disponíveis, tais como testes de viabilidade, o teor de ATP, a análise da motilidade, a integridade do DNA, entre outros. De fato, esta análise bem feita será decisiva para a seleção de amostras com um bom sêmen e para a padronização de protocolos de criopreservação adequados para cada espécie.

2.3.2 Equipamentos utilizados no processo de criopreservação

Após a etapa de diluição do sêmen e envasamento do sêmen diluído em palhetas ou criotubos, o material é submetido à diminuição de temperatura, até serem finalmente mergulhados e armazenado em nitrogênio líquido (SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). Pode-se observar na tabela 1 que os equipamentos utilizados para a redução da temperatura e, consequente, congelação do sêmen de peixes Characiformes são o dry 27

shipper, caixas térmicas de poliestireno, máquinas de congelação programada e botijões criogênicos. Nos três primeiros equipamentos de congelação citados, o sêmen diluído permanece por um período limitado até que seja transferido aos botijões criogênicos. Nestes, como a velocidade do metabolismo celular é quase nula a -196 ºC, o tempo de estocagem pode ser ilimitado em condições ideais, que compreende basicamente a manutenção do nível de nitrogênio líquido no botijão (CARNEIRO, 2007). Agora será detalhado cada um dos equipamentos utilizados no processo de resfriamento do sêmen para posterior congelação e transferência ao botijão.

2.3.2.1 Dry shipper

O dry shipper é um equipamento de alumínio prático e seguro utilizado no processo de criopreservação, já que é fácil de ser transportado e possui em seu interior um material poroso que absorve o nitrogênio líquido e evitando assim o perigo de vazamento (CAROLSFELD et al., 2003). Esse equipamento atua liberando o nitrogênio na forma de vapor, fazendo assim que a congelação das células espermáticas ocorra de forma gradativa, em uma taxa de congelação de 25-40 ºC/min com uma estabilização gradual a -181 ºC em 3 min. (TAITSON; CHAMI; GODINHO, 2008). As palhetas ou criotubos que foram introduzidos nesse equipamento permanecem por um curto período de tempo, que pode ser de alguns minutos a poucos dias, sendo assim transferidos posteriormente, de acordo com o protocolo, para os botijões criogênicos. O dry shipper já foi testado com sucesso em protocolos de criopreservação de diversas espécies de peixes Characiformes, como B. insignis (VIVEIROS et al., 2011a; VIVEIROS et al., 2012a), Brycon nattereri (OLIVEIRA et al., 2007; VIVEIROS et al., 2011b), B. opalinus (VIVEIROS et al., 2012b), B. orbignyanus (MARIA et al., 2006; GALO et al., 2011), C. macropomum (MENEZES et al., 2008; LEITE et al., 2011; CARNEIRO et al., 2012; VARELA JR. et al., 2012a; VARELA JR. et al., 2012b), Piaractus brachypomus (VELÁSQUEZ-MEDINA, 2008; MELO, 2010; NASCIMENTO et al., 2010; RAMÍREZ- MERLANO et al., 2011), Piaractus mesopotamicus (STREIT JR. et al., 2006; STREIT JR. et al., 2009; PAULINO et al., 2012), P. lineatus (VIVEIROS et al., 2009; FELIZARDO et al., 2010; VIVEIROS et al., 2010; FELIZARDO et al., 2011; MILIORINI et al., 2011; NAVARRO et al., 2014) e P. magdalenae (MARTÍNEZ; TARAZONA-MORALES; 28

PARDO-CARRASCO, 2012; ATENCIO et al., 2013), observando-se também que é o mais utilizado nos últimos anos na congelação de células espermáticas de peixes (Quadro 1).

2.3.2.2 Caixa térmica de poliestireno

A caixa térmica de poliestireno, conhecida popularmente como caixa de isopor, ainda não é amplamente utilizada no processo de criopreservação de peixes Characiformes, porém foi observado o seu uso nas espécies Brycon cephalus (NINHAUS - SILVEIRA et al., 2006), C. macropomum (VIEIRA, 2010) e P. brachypomus (VELÁSQUEZ-MEDINA, 2008), como observado na tabela 1. As principais vantagens da caixa de isopor são: fácil manuseio, fácil transporte e baixo custo de aquisição, sendo assim possível a utilização em locais que não há disponibilidade de tecnologias e em fazendas de criação de peixes. Entretanto, possui como desvantagens: difícil padronização das curvas de congelação e controle da temperatura. Tal “equipamento” é adaptado utilizando-se uma bandeja metálica, conhecida como rampa, que dista do fundo do recipiente alguns centímetros, geralmente 10 cm. Para a congelação das amostras é adicionada uma determinada quantidade de nitrogênio líquido, que altera de acordo com a temperatura desejada, a espécie de peixe e o tipo de diluidor utilizado. Então, as amostras diluídas são suspensas na bandeja e congeladas por um período específico (LINHARES, 2012). No trabalho realizado por Irawan, Vuthiphandchai e Nimrat (2010) com carpa comum (Cyprinus carpio) testando diferentes métodos de congelação para o sêmen de tal espécie, obtiveram que a utilização da caixa térmica de poliestireno (91% de motilidade total) é tão eficiente quanto à utilização de uma máquina de congelação programada (89% de motilidade total).

2.3.2.3 Máquina de congelação programada

No processo de criopreservação, a velocidade da queda da temperatura utilizada também pode influenciar os resultados. Logo, a utilização de uma técnica padronizada, como a máquina de congelação computadorizada, irá permitir a queda homogênea e gradual da temperatura. Há diversos modelos, em que o pesquisador programa a velocidade e a curva de refrigeração desejada. 29

Na literatura observa-se a utilização da máquina de congelação programada em diversas espécies de animais, como a humana (DOHLE et al., 2008) e a canina (NEVES et al., 2009), existindo poucos trabalhos que a utilizam no sêmen de peixes Characiformes, nas espécies C. macropomum (CARNEIRO et al., 2012) e P. magdalenae (MARTÍNEZ; PARDO-CARRASCO, 2013), como observado na tabela 1. Além das vantagens mencionadas, os congeladores programáveis são apropriados para a congelação de grandes quantidades de palhetas de sêmen (SOARES; GUERRA, 2009) permitindo assim a utilização em larga escala na Aquicultura.

2.4. ANÁLISE SEMINAL

Para verificar a eficácia das variáveis do protocolo de congelação, como a utilização do diluente, do crioprotetor e do método de congelação empregado, é necessário utilizar mecanismos de avaliação da qualidade seminal pós-descongelação, em que os principais são: avaliação da morfologia e da cinética espermática, pois esses parâmetros estão relacionados diretamente com a taxa de fertilização.

2.4.1. Análise da cinética espermática

O estudo da motilidade espermática serve de base para a avaliação do material fecundante (SALISBURY; VANDEMARK, 1964), uma vez que a motilidade e a sua duração são correlacionadas positivamente com as taxas de fertilização em peixes (RANA, 1996; VIVEIROS et al., 2010). Dessa forma, há necessidade de que se avalie o sêmen antes e após o processo de criopreservação, a fim de que se tenha um material com um possível potencial fecundante. Essa avaliação pode ser realizada de forma subjetiva ou objetiva. Na forma subjetiva, com o auxílio da microscopia óptica, o avaliador estima, por meio de uma escala arbitrária de 0 a 100%, a taxa de espermatozoides móveis (TAITSON; CHAMI; GODINHO, 2008). Apesar da subjetividade de tal técnica, Viveiros et al. (2010) comprovaram que essa análise é tão confiável quanto a realizada objetivamente. Nos últimos anos, os métodos objetivos são considerados mais relevantes para a pesquisa em reprodução (SALMITO-VANDERLEY et al., 2014), o Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) é um sistema automático (hardware e software Sperm Class Analyzer -SCA) utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, em que 30

se obtêm dados significativos do movimento individual de cada célula, bem como de subpopulações de células espermáticas (AMANN; KATZ, 2004). Com o auxílio do software Sperm Class Analyzer é possível avaliar objetivamente a porcentagem de espermatozoides móveis (ou taxa de motilidade), além da porcentagem de espermatozoides com velocidade rápida, média ou lenta (SALMITO-VANDERLEY et al., 2014), morfologia, morfometria, fragmentação do DNA, concentração e vitalidade. Além disso, avalia as velocidades espermáticas (Velocidade curvilínea - VCL - μm s-1, velocidade linear progressiva - VSL – μm s-1 e velocidade média da trajetória - VAP – μm s-1) que são correlacionadas com a taxa de fertilização em peixes (VIVEIROS et al., 2010 – VCL: r = 0,8; VSL: r = 0,56; VAP: r = 0,72; CARVALHO, 2013 – VCL: 79%; VSL: 69%; VAP: 78%). O CASA já foi utilizado para vários grupos animais, como em humano (CRAUSAZ et al., 2008), cão (RIGAU et al., 2001), coelho (LAVARA et al., 2005) e garanhão (QUINTERO-MORENO et al., 2003). Em peixes já foi utilizado em diversas espécies, como B. insignis (VIVEIROS et al., 2012a), C. macropomum (LEITE et al., 2011), P. brachypomus (MELO, 2010), P. lineatus (VIVEIROS et al., 2010) e P. magdalenae (MARTÍNEZ; PARDO-CARRASCO, 2013).

2.4.2. Análise da morfologia espermática

Além da motilidade espermática, outro fator que influencia a taxa de fertilização do sêmen pós-descongelação é a morfologia espermática, uma vez que o aumento das patologias espermáticas acarreta a diminuição na capacidade de fertilização (LAHNSTEINER et al., 1998). Do mesmo modo, estudos têm comprovado que a criopreservação pode afetar a qualidade espermática, influenciando negativamente as taxas de fertilização (RURANGWA et al., 2004). Na análise da morfologia espermática, observam-se as patologias primárias (flagelo dobrado, cabeça isolada, gotas citoplasmáticas proximal e distal), que são decorrentes do processo de espermatogênese e as patologias secundárias (flagelo quebrado, enrolado, degenerado, macrocefalia, microcefalia), que são oriundas de fatores ambientais ou do processo de manejo, como a coleta do sêmen ou confecção das lâminas para avaliação dessas patologias (HERMAN; MITCHELL; DOAK, 1994). Essa análise irá auxiliar o uso de sêmen com menor quantidade de patologias, a fim de favorecer uma taxa de fertilização (CBRA, 2013) e eclosão mais alta, contribuindo com o 31

aumento da produção em aquicultura. O padrão normal de morfoanomalias dos espermatozoides é preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal para mamíferos: bovinos, equinos, ovinos e suínos, no entanto, em peixes, as referências ainda não foram estabelecidas (MILIORINI, 2006).

32

3. JUSTIFICATIVA

Experimentos de criopreservação de sêmen de diversas espécies do gênero Prochilodus já foram descritos na literatura, no entanto, não foi encontrado nenhum trabalho com a espécie P. brevis, que é nativa da região Nordeste do Brasil. Possui grande relevância econômica e ecológica, além disso, o curimatã encontra-se como uma das espécies com grande probabilidade de entrar em extinção, em virtude da pesca predatória que antecede a desova, sendo assim de fundamental importância a determinação de protocolos de criopreservação com o sêmen de curimatã comum. Resultados satisfatórios já foram observados com a utilização dos diluentes BTS e Glicose associados aos crioprotetores Dimetilsulfóxido (DMSO) ou Metil glicol em P. lineatus, que obtiveram ótimas taxas de motilidade espermática do sêmen pós-descongelado e menores danos às células espermáticas, contribuindo dessa forma para a utilização em outras espécies próximas, como no caso P.brevis. Além disso, para a implantação da criopreservação em larga escala na aquicultura, é necessário que haja a padronização do protocolo de congelação, que pode ser alcançado por meio da utilização da máquina de congelação programada. Esse equipamento ainda não foi testado para o sêmen de curimatã e na literatura existem poucos trabalhos com a utilização na criopreservação de peixes Characiformes.

33

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS

O diluente BTS associado ao Metil glicol confere taxas de motilidade e de espermatozoides normais de curimatã pós-descongelação superior aos demais tratamentos. A máquina de congelação programada é mais eficaz que o dry shipper para a criopreservação do sêmen de curimatã comum (P. brevis).

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5. OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a eficiência de diferentes diluidores e equipamentos de congelação na criopreservação do sêmen de curimatã (P. brevis).

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Avaliar a motilidade espermática do sêmen fresco e pós descongelação por meio do CASA;  Comparar a motilidade e morfologia espermática entre os diluidores, entre os tratamentos e entre o sêmen fresco e pós descongelação;  Verificar a eficiência da máquina de congelação programada, comparado ao equipamento padrão (dry shipper) no processo de criopreservação do sêmen de curimatã;  Avaliar se há interação entre diluente, crioprotetor e o equipamento de congelação quanto à motilidade, velocidades e morfologia espermáticas.

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6 CAPÍTULO 1

Metodologias para criopreservação e mecanismos de avaliação do sêmen de peixes Characiformes

Methodologies for cryopreservation and mechanisms of sperm evaluation in characiformes fish

Periódico: Acta Veterinaria Brasilica, v.8, Supl. 2, p. 343-350, 2014 36

37

38

39

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7 CAPÍTULO 2

Use of different extenders and equipment for the cryopreservation of sperm from common curimatã (Prochilodus brevis)

Uso de diferentes diluidores e equipamentos na criopreservação de sêmen de curimatã comum (Prochilodus brevis)

Periódico: Journal of Applied Ichthyology (Submetido em 18 de agosto de 2014). 45

Use of different extenders and equipment for the cryopreservation of sperm from common

curimatã (Prochilodus brevis)

João Paulo Silva Pinheiro1, Mônica Aline Parente Melo-Maciel1, Francisco Renan Aragão

Linhares1, Júlia Trugilio Lopes1, Priscila Silva de Almeida1, Rômulo Roberto Ribeiro Pinheiro1,

Thaís Maia Torres1, Ana Gláudia Vasconcelos Catunda1 & Carminda Sandra Brito Salmito-

Vanderley1.

1State University of Ceará, Integrated Center for Biotechnology, Biotechnology of Fish

Reproduction Laboratory, Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Fortaleza, Ceará, Brazil. [email protected]

Resumo

O estudo avaliou a eficiência de várias soluções e equipamentos de congelação sobre a cinética e morfologia do sêmen criopreservado de Prochilodus brevis. As amostras seminais foram diluídas em cada um dos quatro diferentes tratamentos (glicose + dimetilsulfóxido-DMSO, glicose + metil glicol-MG, Beltsville Thawing Solution-BTS + DMSO e BTS + MG), envasadas em palhetas de

0,25 ml e submetidas a dois diferentes equipamentos de congelação (máquina de congelação programada e dry shipper). Após 10 dias, as amostras seminais foram descongeladas e avaliadas quanto à morfologia e cinética espermáticas. Os parâmetros físico-químicos do sêmen in natura foram similares aos observados em outros estudos de Characiformes, portanto permitindo a criopreservação do sêmen. A glicose, quando usada como diluente em associação com o crioprotetor MG (glicose + MG), conferiu maior percentual de espermatozoides móveis após congelação no equipamento dry shipper (76,88 ± 4,84%) e em máquina de congelação programada 46

(70,95 ± 1,76%) do que quando a glicose foi utilizada com DMSO. Além disso, esse tratamento

(glicose + MG) conferiu velocidades espermáticas (VCL:79,52 ± 2,88 µm s-1; VSL:45,46 ± 3,01

µm s-1; VAP:67,92 ± 3,08 µm s-1) mais elevadas que os demais tratamentos estudados, e uma maior quantidade de espermatozoides normais (74,56 ± 0,77%) foi observada quando o sêmen foi criopreservado utilizando a máquina de congelação programada. A anormalidade espermática mais encontrada foi a de cauda dobrada. Dessa forma, é recomendável a utilização de glicose + MG, em combinação com o dry shipper ou com a máquina de congelação programada para a criopreservação do sêmen de P. brevis. A utilização de uma máquina de congelação programada é mais recomendada, porque os resultados obtidos são mais uniformes do que utilizando o dry shipper.

Summary

This study evaluated the efficiency of various freezing solutions and freezing equipment on the kinetics and morphology of cryopreserved Prochilodus brevis sperm. The semen samples were diluted with one of four different treatments (glucose+ dimethyl sulfoxide-DMSO, glucose+methylglycol-MG, Beltsville Thawing Solution-BTS+DMSO, and BTS+MG), loaded into

0.25 ml straws and subjected to two different freezing processes (programmed freezing machine and dry shipper). After 10 days, the semen samples were thawed and evaluated for sperm morphology and kinetics. The physicochemical parameters of the semen in natura were similar to those observed in studies of Characiformes, thus permitting semen cryopreservation. Glucose, when used as a diluent in association with the cryoprotectant MG (glucose+MG), yielded higher percentages of mobile spermatozoa after freezing in an equipment dry shipper (76.88 ± 4.84%) and in a programmed freezing machine (70.95 ± 1.76%) than when glucose was used with DMSO.

Moreover, this treatment (glucose+MG) yielded a higher sperm velocity (VCL:79.52 ± 2.88 µm s-1;

VSL:45.46 ± 3.01 µm s-1; VAP:67.92 ± 3.08 µm s-1) than the other studied treatments, and a greater amount of normal sperm (74.56 ± 0.77%) was observed when semen was cryopreserved using a 47

programmed freezing machine. The sperm abnormalities observed included bent tail morphology.

Therefore, the use of glucose+MG in combination with either a dry shipper or a programmed freezing machine is recommended for the cryopreservation of P. brevis sperm. The use of a programmed freezing machine is preferred because the results obtained are more consistent than those obtained using a dry shipper.

Introduction

Prochilodus brevis (Steindachner 1875), popularly known as the common curimatã, is a

Characiforme fish distributed in the inland and coastal watersheds of Northeastern Brazil

(Chellappa et al., 2009).

Despite the considerable economic and ecological importance of P. brevis in this region, the reproductive biology of this species is poorly understood. Moreover, this species is threatened by the overfishing of mature individuals and the construction of dams, which impair migration toward breeding habitats (Nascimento, M. M. et al., 2012).

Therefore, researchers have shown increasing interest in the study of assisted reproduction in this species. One area of particular interest is the cryopreservation of semen for use in aquaculture production and the preservation of genetic material in conservation programs

(Carolsfeld et al., 2003). Several studies have shown that cryopreservation exhibits strong potential for the improvement of fish breeding. Cryopreservation presents several benefits, including the synchronization of gamete availability; easier transportation and prevention of gamete aging; conservation of genetic variability; reduction of the maintenance costs of breeding stock; and the potential for exchange of genetic material among laboratories (Carneiro et al., 2006). 48

However, to achieve good sperm quality after thawing, various factors must be considered; these include the use of a good freezing solution, maintaining nutrition for and protection of the sperm, and the use of appropriate cooling rates to prevent cryodamage. Therefore, there is a need for standardization of cryopreservation protocols, especially during freezing. Freezing can be achieved using either a dry shipper or a programmed freezing machine, which allows for the gradual, programmed cooling of semen samples.

When the above interacting factors are not appropriately set, cellular injury can result.

Hence, certain parameters of the thawed sperm that affect fertility, such as motility and morphology, need to be examined (Rurangwa et al., 2004; Felizardo et al., 2010).

A literature search yielded no studies on the characterization and cryopreservation of P. brevis sperm. Thus, this study is the first to describe a protocol for use with this species. Moreover, few studies have examined the use of a programmed freezing machine for the cryopreservation of sperm from Characiforme fish.

This study evaluated the efficiency of various freezing solutions and freezing equipment on the kinetics and morphology of cryopreserved P. brevis sperm.

Material and methods

Animals

Twelve males P. brevis (average age, three years) from the breeding stock of the Biotechnology of

Fish Reproduction Laboratory (3°43'47'' South and 38°30'37'' West) at the Integrated Center for

Biotechnology of the State University of Ceará were studied. The animals were fed daily using 3% of their body weight of feed containing 28% crude protein in two daily meals. Animals that exhibited (n= 8 males) a hyperemic urogenital papilla and that released semen under light 49

abdominal massage were selected, weighed, and measured. The project was approved by the Ethics

Committee for Animal Use - State University of Ceará (case number: 12776936-6).

Semen collection, processing, and freezing

Breeding males were captured from tanks and hormonally induced with a single dose of carp pituitary extract (CPE: 3 mg Kg-1) at the base of the pectoral fin using the intracelomic route. After

18 hours of induction, semen was collected as follows: animals were individually captured and sedated by applying a solution of clove oil (Eugenol; Union Plant Nutritional Supplements Ltd.) (1 mL of clove oil:10 mL of absolute alcohol:10 L of tank water) until the animals visibly lost balance, with their belly facing up. The urogenital papilla was then dried using a paper towel, and abdominal massage was performed in the cranio-caudal direction, avoiding contamination of the semen with water, blood, feces, or urine. Semen was collected in graduated polyethylene tubes, which were labeled and stored in a thermally insulated polystyrene box (~10 ºC). Contaminated samples and samples that showed sperm with less than 80% subjective motility when activated with tank water were not used. The following properties were assessed for valid samples obtained from each animal:

I. Osmolality: An aliquot of semen (100 µL) was obtained from each animal, and

seminal osmolality was measured using a Peltier cooling digital osmometer

(Roebling, Germany).

II. pH: Semen (10 µL) from each animal was tested using pH test strips (Merck,

Germany).

III. Volume: Volume was measured using graduated polyethylene tubes.

IV. Sperm morphology: A 5 μL sample of sperm was fixed in 50 µL of formalin citrate

solution. Then, 10 μL of the fixed sperm was mixed with 3 μL of Rose Bengal dye 50

(C20H2Cl4I4Na2O5; Vetec Fine Chemicals Ltd., Rio de Janeiro, Brazil). From this

mixture, 4 μL was removed and smeared on glass slides. This procedure was

performed twice (using clean blades each time), and 100 spermatozoa were

examined on each slide. In total, 200 sperm were analyzed per male and

cryopreserved. The data obtained from the fresh and post-thawed sperm were then

compared. Any pathologies observed were classified according to Galo et al.

(2011).

V. Sperm Concentration: To determine sperm counts, semen samples from each animal

were fixed in 4% formalin citrate solution (1 μL of semen: 4 mL of fixative

(1:4,000)). From this diluted sample, 20 μL were deposited in a Neubauer

chamber and observed under an optical microscope (400x).

VI. Cryopreservation: The extenders used for cryopreservation were Beltsville Thawing

Solution - BTS™ (Minitub, 318 mOsm) and commercial glucose (Fresenius Kabi

Brazil Ltd., 252 mOsm). The cryoprotectants dimethyl sulfoxide (DMSO, Vetec

Fine Chemicals Ltd., Rio de Janeiro, Brazil) and methylglycol (MG, Vetec Fine

Chemicals Ltd., Rio de Janeiro, Brazil) were used at 10% dilution (v/v).

BTS™ (composed of 79.90 g glucose, 12.71 g sodium citrate, 2.65 g EDTA, 2.65 g of sodium bicarbonate, 1.59 g of potassium chloride and 0.50 g gentamicin sulfate in 1.00 L distilled water) was prepared by diluting 50 g of BTS™ in 100 mL of distilled water, as recommended by the manufacturer.

The following treatments were applied:

1) Glucose+10% DMSO

2) Glucose+10% MG 51

3) BTS+10% DMSO

4) BTS+10% MG

The total semen of each male (n= 8 males) was diluted (1:6 – semen:extender) in all treatments and loaded in 0.25 mL straws (n= 6 replicate straws per male), identified, sealed at the ends with polyvinyl alcohol, and maintained at ~10 ºC for 10 minutes. Simultaneously, three straws from each treatment were put into a programmed freezing machine (Dominium K, BIOCOM™,

Brazil), and three others were put into a Model CP300 dry shipper (Taylor-Wharton). In total, 192 straws (3 replicate straws x 4 media x 2 freezing method x 8 males) were cryopreserved.

For cryopreservation using the programmed freezing machine, a two-step freezing protocol was used. First, the milt was cooled from 10 °C to -12 °C at -3 °C per minute, crystallized for 1 minute, and then cooled again from -12 °C to -60 °C at -3 °C per min; the milt was finally stabilized for 30 minutes.

The straws remained in the dry shipper for 15 minutes or remained in the programmed freezing machine for approximately 55 minutes. After that time, they were transferred to liquid nitrogen, where they were stored for 10 days at -196 °C.

Defrosting and the evaluation of sperm kinetics

The samples were thawed by immersion in a thermal bath at 25 °C for 30 s. After thawing, the semen was activated in a NaCl solution (100 mOsm), and sperm kinetics were observed in a

Makler™ counting chamber placed in a phase contrast microscope (Nikon H550S™, ECLIPSE 50i,

Japan) equipped with a green filter and using pH1 position at 400x magnification. The microscope was connected to a video camera (Basler Vision Technologies™ A312FC, Ahrensburg, Germany), and video was recorded at a frame rate of 25 images/s. Each image (n=25) was analyzed using the standard settings for fish included with Sperm Class Analyzer™ software (SCA version 5.0, 52

Microptics SL, Barcelona, Spain). At least 1,000 sperm were analyzed per straw, and total motility, curvilinear velocity (VCL), straight-line velocity (VSL), and average path velocity (VAP) were measured.

Statistical analysis

The study followed a completely randomized design in a 2x4 (freezing methods x treatments) factorial arrangement. After a normality test, the semen parameter data were subjected to analysis of variance to test the effects of freezing method, treatment protocol (dilution), and the interaction between these parameters. Significance was tested by comparing the means using the Tukey test (P

< 0.05). The numbers of sperm exhibiting broken, twisted, or corrugated tails were compared using the Kruskal-Wallis test (P < 0.05). A study of simple Pearson correlations was performed to assess the degree of association between the variables measured in this work. Data were analyzed using

SAS statistical software, version 8.0 (2000).

Results

Characterization

The fish had an average length of 30.71 ± 0.76 cm (mean ± S.D.) and a mean weight of 524.29 ±

47.91 g (mean ± S.D.). The mean values of the semen parameters observed in natura are presented in Table 1.

Kinetic and morphologic analysis of the semen

The choice of freezing method had no effect on the kinetic parameters evaluated, only between treatments (Table 2). T2 (glucose+MG) resulted in a significantly higher (P < 0.05) VCL compared to the other treatments. T1 (glucose+DMSO) and T3 (BTS+DMSO) resulted in the lowest values of

VCL (P < 0.05). The same pattern was observed for VSL and VAP, except that T1 resulted in significantly lower values of VSL and VAP than T3. 53

The total motility and percentage of normal and bent-tailed sperm in the post-thawed semen were affected not only by the treatment used but also by the freezing method employed (Table 3).

Differences in total motility (%) (P < 0.05) between the freezing methods employed were only observed for T4; in T4, the semen cryopreserved using the programmed freezing machine exhibited higher total motility (50.86 ± 3.36%) than the semen frozen using the dry shipper (37.38 ± 5.06%).

T2 resulted in the highest percentage of mobile spermatozoa among the treatments when using the dry shipper (76.88 ± 4.84%) and when using the programmed freezing machine (70.95 ± 1.76%) (P

> 0.05). However, the use of programmed freezing machine was inferred that the lowest coefficient of variation (C.V.) as compared to dry shipper (PFM – C.V.: 7.01 x DS – C.V.: 17.8).

Among the sperm pathologies, under cryopreservation using the dry shipper, T4 presented the highest percentage of normal sperm among the treatments (79.50 ± 2.27%); when using the programmed freezing machine, T2 (74.56 ± 0.77%) presented the highest percentage of normal sperm.

Cryopreservation using the programmed freezing machine presented a greater proportion of bent-tail pathology for all treatments. Using this method, T3 (44.81 ± 1.96%) presented the highest percentage of cells with bent tails, and T2 (23.25 ± 0.65%) presented the lowest amount.

Cryopreservation using the dry shipper presented the highest percentage of cells with bent-tail pathology when using T1 (37.38 ± 2.00%). T2 (23.88 ± 2.96%), T3 (25.19 ± 3.94%), and T4 (19.87

± 2.38%) presented lower percentages of cells with this pathology, and no significant difference (P

> 0.05) was observed between these treatments.

The choice of freezing method did not affect tail defects (broken tail, coiled tail and corrugated tail) appearing in the sperm after thawing; however, the choice of treatment did affect tail defects (Table 4). Among the treatments, T1 conferred a greater number of pathological defects.

T3 and T4 presented the lowest number of abnormalities. Among the abnormalities recorded in 54

Table 4, broken-tail pathology was the most frequent. None of the following sperm abnormalities were observed: free head; macrocephaly; microcephaly; distal and proximal cytoplasmic droplets; or degenerated flagella.

Table 5 presents the correlations found between the kinetic, morphological, and physicochemical characteristics of P. brevis semen. Total motility was positively correlated with sperm velocities including VCL (0.82523, P < 0.001), VSL (0.76214, P < 0.001), and VAP

(0.82256, P < 0.001). In addition, a positive correlation was observed between total motility and normal sperm morphology (0.45908, P < 0.05), and a negative correlation was observed between total motility and the bent-tail (-0.40088, P < 0.05), broken-tail (-0.28728, P < 0.05), and corrugated-tail (-0.42494, P < 0.05) morphologies.

Correlations were observed among the physicochemical characteristics; a positive correlation was observed between seminal pH and seminal osmolality (0.41043, P < 0.05), and negative correlations were observed between pH and volume (-0.37097, P < 0.05) and between pH and sperm concentration (-0.79237, P < 0.001). In addition, seminal volume correlated positively with coiled-tail morphology (0.25476, P < 0.05) and sperm concentration (0.67561, P < 0.001); however, sperm concentration correlated negatively with seminal osmolality (-0.27071, P < 0.05).

Discussion

The present study analyzed the physicochemical parameters of P. brevis semen in natura by evaluating the effects of different media and freezing equipment on the kinetics and morphology of

P. brevis semen; the analysis was conducted using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) system for the evaluation of post-thaw sperm kinetics. This study is the first to describe a protocol for the cryopreservation of semen from this species. 55

Knowledge of semen characteristics is important for evaluating the quality of semen for use in artificial breeding and laboratory experiments (Orfão et al., 2011). This knowledge becomes even more important when evaluating the effects of cryopreservation. Successful cryopreservation is related to semen quality because some loss of semen quality is expected after cryopreservation.

Among the measured characteristics, pH is particularly important because it is related to the regulation of sperm motility in fish (Cosson, 2004). In salmonids, this factor may be responsible for the acquisition of motility during the passage of sperm from the testicle to the spermatic duct

(Morisawa and Morisawa, 1986, 1988; Billard et al., 1995). Thus, knowledge of the pH is fundamentally important to the development of an appropriate freezing solution for sperm cryopreservation (Maria et al., 2010). According to Tabares et al. (2005), sperm pH varies from 6.5 to 8.5. The pH of P. brevis semen found here was within this expected range (8.21 ± 0.27).

Osmolality is also directly related to sperm motility. The sperm of most fish remains quiescent in seminal plasma (~300 mOsm Kg-1), and the sperm of freshwater fish is activated upon contact with hypotonic solution (<300 mOsm Kg-1) (Morisawa and Suzuki, 1980). The present study confirms this finding in P. brevis (250.29 ± 25.84 mOsm Kg-1). It is therefore very important that the osmolality of the diluent used in the cryopreservation is adjusted so that the sperm is not activated before freezing.

It is clear that the evaluation of seminal characteristics is essential to the routine artificial breeding of any species (Solis-Murgas et al., 2011) because the quality of semen after cryopreservation is affected by these characteristics.

After thawing, factors such as total motility, sperm morphology and speed are evaluated because the success of fertilization depends on them. 56

In this study, the extender glucose in combination with the internal cryoprotectant methylglycol yielded the highest percentage of motile spermatozoa among the treatments, and no significant difference was found between the freezing methods used (P > 0.05).

DMSO has been used successfully to cryopreserve the semen of several species of

Characiforme fish (Godinho and Viveiros, 2011). However, in this study, cryopreservation with

DMSO yielded a lower percentage of motile sperm than methylglycol, regardless of the extender used. This finding was also observed by Viveiros et al. (2011) during the cryopreservation of B. insignis semen. One possible cause for this finding is the high toxicity of DMSO when used at high concentrations. Another possibility is that the stabilization time used was too long to protect the sperm against cryodamage.

An influx of water into the sperm may also occur, as shown in a prior experiment in which

Cyprinus carpio sperm swelled upon increasing the concentration of DMSO from 1 to 20%

(Perchec-Poupard et al., 1997). The DMSO concentration used in the present study was 10%.

In addition to total motility, a relationship was observed between sperm speed and fertilization in some studies. When Viveiros et al. (2010) cryopreserved P. lineatus semen, they observed a positive correlation between sperm velocities (VCL, VSL and VAP) and the rate of fertilization; of these velocities, VCL had the highest correlation with fertilization. This result was also found by Carvalho (2013) with cryopreserved Colossoma macropomum semen. In the present study, the highest VCL was observed for semen cryopreserved in glucose plus methylglycol (79.52

± 2.88); this might be the best treatment for use in artificial fertilization because it is closest to that found in semen in natura.

Previous studies have shown that the glucose is the extender most often used for the cryopreservation of sperm from Characiforme fish (Salmito-Vanderley et al., 2012) because it results in a high percentage of motile spermatozoa. This has been observed in several species, 57

including P. lineatus (Nascimento, A. F. et al., 2012), P. magdalenae (Martínez et al., 2012),

Brycon orbignyanus (Nascimento, A. F. et al., 2012), and B. opalinus (Viveiros et al., 2012) and was also observed in the present study, in which a combination of glucose and methylglycol was found to be the best treatment.

In addition to providing good results, glucose is a very simple and stable extender that can be used in farms without any laboratory equipment because it can be purchased as a sterile, ready- to-use solution (Nascimento et al., 2010).

BTS™, which was developed for the cryopreservation of swine sperm, has already been extensively tested in Characiforme semen (Salmito-Vanderley et al., 2012). In the present study,

BTS™ resulted in lower total motility than glucose in combination with methylglycol and higher total motility in combination with DMSO. Some component of BTS™ (sodium citrate, EDTA,

NaHCO3, KCl, or gentamicin) might have negatively affected the sperm during freezing and thawing (Nascimento et al., 2010).

Another important parameter that must considered is spermatozoan morphology because this is also directly associated with fertilization potential. In this study, we observed that the methylglycol and glucose combined treatment yielded a greater number of morphologically normal cells, regardless of the freezing method used. This might have occurred due to the relative nontoxicity of methylglycol (Viveiros et al., 2011) compared to other cryoprotectants.

Among the pathologies found, bent-tail morphology was most common, as expected based on the studies of Streit Jr. et al., (2009) on the cryopreservation of Piaractus mesopotamicus sperm.

Semen with spermatozoan abnormalities exhibit decreased rates of fertilization because the sperm exhibit circular and oscillatory movements (Kavamoto et al., 1999).

The normal rate of sperm morphological abnormalities recognized by the Brazilian College of Animal Reproduction for mammalian organisms is 30% for bovines and horses and 20% for 58

sheep and pigs. However, the rates in fish have not yet been established (Miliorini, 2006). However, the results found in this study are considered acceptable when following established protocols, regardless of the diluting solution and freezing method employed.

The technique used to decrease seminal temperature during cryopreservation can also influence the results. Dry shippers are used in most studies of sperm cryopreservation in

Characiforme fish (Godinho et al., 2011), and the programmed freezing machine remains underutilized (Carneiro et al., 2012; Martínez and Pardo-Carrasco, 2013). However, the programmed freezing machine can be a more precise alternative than the use of a dry shipper because it does not require much control by the operator and allows a homogeneous and gradual temperature decrease.

In addition to the advantages mentioned, programmable freezers are suitable for freezing large amounts of semen straws (Soares and Guerra, 2009), thus facilitating their use in large-scale aquaculture.

For P. brevis, the programmed freezing machine yielded similar results to the dry shipper; however, the use of the programmed freezing machine proved less laborious and presented more homogeneous results than the dry shipper.

Regarding the correlations observed between the seminal characteristics, we note the positive correlation between pH and seminal osmolality (0.41043, P<0.05). This was possibly due to H+ ion availability, which can cause an increase in semen osmolality. This increase in osmolality modifies the ion distribution and causes hypoosmotic shock, resulting in a greater number of tail defects. The same phenomenon occurs during sperm activation (Chapon, 2011).

59

Conclusions

Thus, P. brevis sperm can be successfully cryopreserved in glucose combined with the cryoprotectant methylglycol using either a dry shipper or a programmed freezing machine because these methods resulted in high numbers of motile and morphologically normal spermatozoids.

However, the use of a programmed freezing machine is recommended because it provides more consistent results than a dry shipper.

Acknowledgments

This study was supported by the State University of Ceará, Brazil and by Funding Authority for

Studies and Projects (FINEP). The authors thank the National Department of Works Against the

Droughts (DNOCS), Pentecoste, Ceará, Brazil for the replacement breeding by the team from the

Biotechnology of Fish Reproduction Laboratory, MINITUB™ for providing one of the extenders

(BTS) used in this study and Coordination of Improvement of Higher Education (CAPES).

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65

Table 1 Mean ± standard deviation of P. brevis semen parameters in natura (n= 8 males).

Parameter Mean ± S.D.

pH 8.21 ± 0.27

Volume (mL) 1.24 ± 0.33 Osmolarity (mOsm) 250.29 ± 25.84

Concentration (x109 sptz mL-1) 15.12 ± 2.77

Total motility (%) 98.23 ± 1.64

VCL (µm s-1) 126.60 ± 10.34

-1 VSL (µm s ) 65.37 ± 10.66

VAP (µm s-1) 110.76 ± 15.18

VCL: curvilinear velocity, VSL: straight-line velocity and

VAP: average path velocity .

66

Table 2 Mean and standard error of the kinetic parameters (curvilinear velocity - VCL, straight-line velocity - VSL, and average path velocity -

VAP) of P. brevis semen after thawing for various treatments (n= 6 replicate straws x 8 males from each treatment).

KINETIC PARAMETERS TREATMENT VCL (µm s-1) VSL (µm s-1) VAP (µm s-1)

T1 39.03 ± 0.92 c 17.39 ± 1.08 d 28.33 ± 1.08 d

a a a T2 79.52 ± 2.88 45.46 ± 3.01 67.92 ± 3.08 T3 44.07 ± 1.05 c 28.74 ± 1.07 c 38.60 ± 1.15 c

T4 63.68 ± 2.71 b 36.85 ± 2.04 b 54.06 ± 2.08 b

Different letters in the same column represent results that differ significantly according to the Tukey test (P < 0.05). T1: glucose+DMSO; T2: glucose+MG; T3: BTS+DMSO; T4: BTS+MG.

67

Table 3 Mean ± standard error of the variables recorded as a percentage of mobile spermatozoa; the results were evaluated post-thawing in P. brevis semen as a function of the interaction of treatment and freezing method (n= 3 replicate straws x 8 males from each treatment and from each freezing method).

TREATMENT

VARIABLE METHOD T1 T2 T3 T4

MOT (%) DS 23.64 ± 2.26 Ca 76.88 ± 4.84 Aa 41.12 ± 3.14 Ba 37.38 ± 5.06 Bb

PFM 18.10 ± 2.87 Da 70.95 ± 1.76 Aa 37.58 ± 2.62 Ca 50.86 ± 3.36 Ba

NORMAL (%) DS 53.19 ± 1.55 Cb 72.88 ± 4.18 Ba 72.19 ± 3.89 Ba 79.50 ± 2.27 Aa

PFM 62.38 ± 2.10 Ba 74.56 ± 0.77 Aa 53.31 ± 2.07 Cb 63.75 ± 1.75 Bb

BENT TAIL (%) DS 37.38 ± 2.00 Aa 23.88 ± 2.96 Ba 25.19 ± 3.94 Bb 19.87 ± 2.38 Bb

PFM 33.13 ± 1.89 Ba 23.25 ± 0.65 Ca 44.81 ± 1.96 Aa 34.81 ± 1.61 Ba

Uppercase letters in the same line represent differences between treatments; lower case letters in the same column represent differences between freezing methods as determined using PDIFF (P < 0.05). T1: glucose+DMSO; T2: glucose+MG, T3: BTS+DMSO; T4: BTS+MG, DS: dry shipper; PFM: programmed freezing machine.

68

Table 4 Percentage of defects in the tail of post-thaw sperm (broken tail, coiled tail, and corrugated tail) of semen from P. brevis for various treatments (n= 6 replicate straws x 8 males from each treatment).

DEFECTS (%)

TREATMENT BROKEN COILED CORRUGATED

T1 4.12 a 0.37 a 2.46 a

T2 1.75 b 0.53 a 0.43 b

T3 1.81 b 0.37 a 0.06 c

T4 0.84 b 0.12 a 0.06 c

Different letters in the same column represent results that differ significantly according to the Kruskal-Wallis test (P < 0.05). T1: glucose+DMSO; T2: glucose+MG, T3: BTS+DMSO; T4: BTS+MG.

67

Table 5 Correlation matrix among the kinetic, morphological, and physico-chemical characteristics of P. brevis semen.

Total VCL VSL VAP Normal Bent tail Broken tail Corrugated Coiled tail pH Volume Osmolarity

Motility tail

VCL 0.82523** ------

VSL 0.76214** 0.90721** ------

VAP 0.82256** 0.98020** 0.96734** ------

Normal 0.45908* 0.54447** 0.47695** 0.52504** ------

Bent tail -0.40088* -0.49589** -0.40962** -0.46819** -0.96063** ------

Broken tail -0.28728* -0.33259* -0.32468* -0.32951* -0.40869* 0.16607 ------

Corrugated tail -0.42494* -0.35063* -0.44418* -0.40396* -0.43729* 0.24648* 0.46994** - - - - -

Coiled tail 0.01648 -0.00385 0.00286 0.00491 -0.35806* 0.25014* 0.29223* 0.23702 - - - -

pH -0.11316 -0.08651 -0.08417 -0.10136 -0.00070 -0.02362 0.04140 0.10452 0.03006 - - -

Volume -0.02557 -0.07909 -0.14484 -0.11191 -0.05925 0.08050 -0.12800 -0.00942 0.25476* -0.37097* - -

Osmolarity -0.09445 -0.10339 -0.17703 -0.13505 0.08524 -0.08285 -0.12598 0.07968 0.05871 0.41043* -0.02261 -

Concentration 0.10418 0.03441 0.02249 0.03703 0.02401 -0.00879 -0.03629 -0.07729 -0.00538 -0.79237** 0.67561** -0.27071*

(*) significant at P < 0.05; (**) significant at P < 0.001.

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8 CONCLUSÕES

O sêmen de curimatã comum (P. brevis) pode ser criopreservado com sucesso em glicose associado ao metil glicol utilizando o dry shipper ou a máquina de congelação programada, uma vez que ambos equipamentos conferiram altas taxas de espermatozoides móveis e morfologicamente normais pós-descongelação. No entanto, o uso da máquina de congelação é mais recomendado, já que proporcionou resultados mais homogêneos em relação ao dry shipper. Além disso, nas condições deste trabalho, há interação do equipamento com os diluidores quanto aos parâmetros motilidade total, espermatozoides morfologicamente normais e espermatozoides com cauda dobrada, mostrando que dependendo do diluidor utilizado deve-se escolher o melhor equipamento.

71

9 PERSPECTIVAS

 Difundir os resultados dessa pesquisa, a fim de que possam contribuir para a formação de bancos de germoplasma e favorecer melhor produção na aquicultura.  Realizar outros testes para verificar a qualidade seminal pós-descongelação, como a vitalidade espermática, integridade do DNA, tempo de duração da motilidade espermática entre outros.  Testar a utilização de antioxidantes na solução diluidora, com o intuito de melhorar a qualidade seminal pós-descongelação.  Determinar a dose inseminante e realizar testes de fertilização com o sêmen criopreservado e in natura, comparando os tempos e estádios do desenvolvimento embrionário.  Realizar estudos avaliando a interferência de alguns aspectos ambientais na qualidade seminal, como a administração de diferentes protocolos de alimentação para machos e fêmeas reprodutores.

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