Isolamento E Caracterização De Elementos Transponíveis Em Espécies Do Gênero Brycon (Characidae, Bryconinae)
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
JESICA RUIZ SILVA Isolamento e Caracterização de Elementos Transponíveis em Espécies do Gênero Brycon (Characidae, Bryconinae) Botucatu - SP 2012 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS Isolamento e Caracterização de Elementos Transponíveis em Espécies do Gênero Brycon (Characidae, Bryconinae) Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas - Genética Jesica Ruiz Silva Orientadora: Profa. Dra. Adriane Pinto Wasko Botucatu - SP 2012 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Ruiz-Silva, Jesica. Isolamento e caracterização de elementos transponíveis em espécies do gênero Brycon (Characidae, Bryconinae) / Jesica Ruiz-Silva. – Botucatu : [s.n.], 2012 Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Adriane Pinto Wasko Capes: 20200005 1. Peixe - Genética. 2. Characidae. 3. Brycon. 4. Reação em cadeia de polimerase. Palavras-chave: Brycon amazonicus; Brycon orbignyanus; Família Rex; Hibridação in situ; PCR; Retrotransposons. Dedico este trabalho à minha família que, do jeitinho deles, sempre me apoiaram, me incentivaram e compartilharam desses momentos tão importantes na minha vida. AGRADECIMENTOS A todos que colaboraram direta ou indiretamente para a concretização deste trabalho. Meus sinceros agradecimentos... ... à Deus, pois sem Ele não chegaria até onde cheguei; ... à meus pais Lázaro e Edna, meu irmão Jorge, minha irmã Juliane, meus sobrinhos Ana Laura, Jorge Lucas, Gabriele, Sofia e Rafael, pelo apoio, paciência e carinho que sempre me proporcionaram, sem vocês nada disso seria possível; ... à minha orientadora Profª. Drª. Adriane Pinto Wasko, pelos conhecimentos transmitidos, sempre com muita dedicação e paciência, para a elaboração deste trabalho; ... ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudos; ... à meu querido amigo Daniel, por todos os momentos que passamos juntos desde a graduação, sem os quais não teria força pra chegar até aqui, você estará pra sempre no meu coração; ... aos amigos e colegas de laboratório, principalmente à Bianca, Éder e Valquíria, que tive a oportunidade de conhecer e compartilhar muitos momentos felizes, à todos obrigado pelo carinho e amizade; ... à Profª. Drª. Lígia pela amizade; ... ao técnico Renato, pela grande ajuda com os peixes; ... à Profª. Drª. Margarida, que me proporcionou a oportunidade de estar neste centro de grande conhecimento que é a UNESP; ... ao Prof. Dr. César Martins, Kbelo, Diogo, Andréia, Irani, Danilo, Bruno e Taka, pelos conhecimentos a mim transmitido e pela amizade; ... ao Prof. Dr. Alexandre Borges, Zé Filho, Peres e Paulo, sempre durões mas, também, transmitindo conhecimentos sempre com muito carinho e atenção; ... aos funcionários do Departamento de Genética e da Pós Graduação , que sempre me atenderam com muito carinho e dedicação; ... e por último (mas os últimos sempre são os primeiros), ao Edval, essa pessoa incrível que estou tendo a oportunidade de conviver, muito obrigada pela ajuda, incentivo, compreensão e carinho que tem por mim, você deixa a minha vida mais feliz; Para mim, o que importa não é O QUE eu tenho na vida, mas QUEM eu tenho na vida. Por isso guardo todas as pessoas importantes da minha vida em uma caixinha dentro do meu coração!!! RESUMO Grande parte do genoma dos eucariotos é composta de múltiplas cópias de DNA, conhecidas como DNAs repetitivos, cuja função em relação à manutenção, estrutura e funcionamento do genoma ainda precisa ser melhor investigada. Os DNAs repetitivos classificados como elementos transponíveis vêm sendo considerados como um dos principais representantes do genoma de vertebrados e, de maneira particular, os peixes têm chamado atenção em relação à grande diversidade de classes destes elementos encontradas em seus genomas. Visando ampliar os dados acerca de elementos transponíveis em peixes, o presente trabalho teve como objetivos o isolamento e a caracterização de retrotransposons da família Rex em duas espécies de Characidae - Brycon amazonicus e B. orbignyanus - e realizar inferências acerca de sua organização e dinâmica evolutiva. Desta forma, amostras de DNA foram utilizadas em PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificar segmentos dos retroelementos Rex1, Rex3 e Rex6 e os fragmentos obtidos foram clonados e sequenciados. Adicionalmente, estes segmentos de DNA foram utilizados como sondas em experimentos de hibridação in situ visando identificar a localização cromossômica destes retrotransposons. A identificação de elementos Rex em B. cephalus e B. orbignyanus demonstrou a presença destes retrotransposons não-LTR (Long Terminal Repetition) em um maior número de espécies de Characiformes e, especificamente, no grupo Characidae. Os segmentos analisados de Rex1 e Rex3 correspondem aos domínios codificantes 3-7 e 1, 2, 2A, A e B do gene da transcriptase reversa (RT), respectivamente. O fragmento de DNA relativo ao retroelemento Rex6 isolado codifica a porção C-terminal de uma endonuclease. Comparações entre sequências nucleotídicas de diferentes espécies de peixes levaram à observação de que tais regiões apresentam um alto grau de conservação entre grupos diversos. Embora os dados obtidos para B. amazonicus tenham apontado para uma maior similaridade entre Rex1 e Rex3 de Characidae e Loricariidae, o que pode ser reflexo do maior grau de relação entre estas duas famílias, ambas incluídas em Ostariophysi, as demais comparações entre B. amazonicus, B. orbignyanus e outras espécies de peixes não refletiram correlações filogenéticas. De forma similar ao padrão descrito para outra espécie de Characiformes (Erythrinus erythrinus), B. amazonicus e B. orbignyanus mostraram repetições Rex1 e Rex3 organizadas em diversos clusters em diferentes cromossomos, tendo preferencialmente um padrão de distribuição dispersa destes elementos. Comparações entre diferentes peixes indicaram que espécies de um mesmo táxon apresentam padrões similares de distribuição destes elementos repetitivos nos cromossomos. Os dados apontam para a proposição de que a aquisição de elementos repetitivos da família Rex em peixes provavelmente está associada à transferência horizontal e sua distribuição nos cromossomos segue um padrão similar entre espécies de grupos mais correlacionados filogeneticamente, o que sugere um mecanismo não aleatório de integração, manutenção e evolução destes elementos no genoma destes vertebrados. ABSTRACT A huge part of the eukaryote genome is constituted by multiple DNA copies, known as repetitive DNAs, which role regarding to the maintenance, structure, and function of the genome needs to be better understandable. The repetitive DNAs that are classified as transposable elements have been considered one of the main parts of the vertebrate genome and, particularly, fishes have gain attention due to the presence of many different classes of these elements in their genomes. In order to improve data on fish transposable elements, the present work intent to isolate and characterize retrotransposons of the Rex family in two Characidae species - Brycon amazonicus and B. orbignyanus - and infer on the organization and evolutionary dynamics of these elements. Therefore, DNA samples were used on PCR (Polymerase Chain Reaction) in order to amplify segments of the Rex1, Rex3, and Rex6 elements, and the obtained fragments were cloned and sequenced. Additionally, these DNA segments were used as probes throughout in situ hybridization procedures to identify the chromosome localization of these retrotransposons. The identification of Rex elements in B. cephalus e B. orbignyanus evidenced the presence of these non-LTR (Long Terminal Repetition) retrotransposons in a large number of Characiformes species and, specifically, in Characidae. The analyzed fragments of Rex1 and Rex3 correspond to the coding domains 3-7 and 1, 2, 2A, A and B of the reverse transcriptase (RT) gene, respectively. The DNA segment correlated to the Rex6 element codifies a C-terminal portion of an endonuclease. Nucleotide sequence comparisons among different fish species showed that these regions are highly conserved in diverse groups. Although the obtained data for B. amazonicus seemed to point to a higher similarity between Rex1 and Rex3 of Characidae and Loricariidae, a fact that could reflect the higher relationship between these two families, both included in Ostariophysi, the additional comparative data on B. amazonicus, B. orbignyanus and other fish species did not reflect any phylogeny correlations. Similar to the pattern described for other species of Characiformes (Erythrinus erythrinus), B. amazonicus e B. orbignyanus presented Rex1 and Rex3 repetitions that are organized in several clusters on different chromosomes, with a general disperse distribution pattern of these elements. Comparisons among different fish indicated that species that belong to the same taxon present similar distribution patterns for these repetitive elements in their chromosomes. The present data point to the hypothesis that the insertion of Rex elements in fish is probably associated to horizontal transfer and that their chromosome distribution follows a pattern that is similar among phylogenetic related groups, which suggest a non randomly mechanism of incorporation, maintenance, and evolution of