CONSTRUCCIÓN DE UNA COLECCIÓN NÚCLEO DE Solanum Tuberosum L

UIVERSIDAD MAYOR DE SA SIMÓ FACULTAD DE CIECIAS AGRÍCOLAS PECUARIAS FORESTALES Y VETERIARIA “DR. MARTÍ CÁRDEAS” DIRECCIÓ DE POSGRADO

CONSTRUCCIÓN DE UNA COLECCIÓN NÚCLEO DE Solanum tuberosum L. subsp. andigena Hawkes CONSERVADA EN EL BANCO NACIONAL DE TUBÉRCULOS Y RAÍCES ANDINAS EN BASE A MARCADORES MORFOLÓGICOS Y MOLECULARES

Tesis de Posgrado para obtener el grado de Maestría en “ Conservación y Manejo de Recursos Fitogenéticos y Biotecnología Vegetal Aplicada ”

Postulante: Fidel Hernan Cortez Alvarez Tutor: Jorge Antonio Rojas Beltrán, Ph. D.

Cochabamba – Bolivia 2011

DEDICATORIA

Para todas las familias más necesitadas,

quienes conservan y se nutren de los

valiosos recursos genéticos

de nuestra Madre Tierra.

A toda mi Familia

AGRADECIMIE!TOS

A todas las familias de productores ancestrales de papa, custodios milenarios de la biodiversidad en su conjunto; a nuestros ancestros por dejarnos este legado megadiverso y una cultura en armonía con la naturaleza. Todo es gracias a nuestro Creador.

A todas las personas e instituciones nacionales e internacionales que juntamente han trabajado para la caracterización, conservación y uso de la diversidad del germoplasma boliviano de papa. Al Estado Plurinacional de Bolivia, Instituto Nacional de Innovación Agropecuaria y Forestal (I.N.I.A.F.), por darme el honor de ver Nuestro Tesoro Vivo.

A los financiadores de las becas para la Maestría “Conservación y Manejo de Recursos Fitogenéticos y Biotecnología Vegetal Aplicada” : Comisión Universitaria para el Desarrollo (C.U.D.), Bélgica. Y a la Universidad Mayor de San Simón, Escuela Universitaria de Posgrado, Facultad de Ciencias Agrícolas Pecuarias Forestales y Veterinarias ” Martín Cárdenas” (FCAPFyV), Dirección de Posgrado.

A la Dirección de Posgrado, FCAPFyV, y todo su personal, por su guía, apoyo e incentivo.

Al financiamiento desde los Países Bajos mediante el IP – Holanda. A la Fundación PROINPA y todo su personal, por todo el apoyo y recursos ofrecidos en los últimos años.

A Jorge A. Rojas Beltrán, Ing. Agr. Ph.D., por su motivación, guía y apoyo constante. A Gabriela Bottani Claros Lic. M.Sc y Juan Herbas Ing. Agr. M.Sc., por sus sugerencias, consejos y apoyo permanente.

Yolita Sánchez… ¡muchas gracias por tu enseñanza!, y a todas mis queridas compañeras y compañeros del Laboratorio de Biología Molecular y Bioinformática, por su apoyo, consejos y buen ánimo.

A todos mis docentes, autoridades, compañeras y compañeros, que crean un ambiente de inspiración, que estimulan y encaminan nuestra formación.

A mi familia eterna, por su compañía continua, amor entrañable, e inspiración inacabable.

Í!DICE DE CO!TE!IDO DEDICATORIA ...... i AGRADECIMIE!TOS...... ii Í!DICE DE CO!TE!IDO...... iii Í!DICE DE TABLAS ...... v Í!DICE DE FIGURAS ...... vi Í!DICE DE A!EXOS...... vi RESUME! ...... vii ABSTRACT...... viii 1. I!TRODUCCIÓ! ...... 1 Objetivo general...... 2 Objetivos específicos ...... 2 2. REVISIÓ! DE LITERATURA ...... 3 2.1. Importancia de la conservación de papa cultivada y la subespecie andigena...... 3 2.1.1. Importancia del cultivo de Solanum tuberosum L. subsp. andigena Hawkes ...... 3 2.2. Taxonomía y genética de las especies de papa cultivada ...... 4 2.2.1. Ubicación taxonómica de la subespecie andigena...... 5 2.2.2. Número cromosómico y filogenia de la papa cultivada ...... 6 2.3. Diversidad genética en la papa cultivada y la subespecie andigena ...... 7 2.4. Distribución geográfica de la subespecie andigena y la papa cultivada en Bolivia ....8 2.5. Colectas de la papa cultivada en Bolivia ...... 10 2.6. Caracterización morfológica en la subespecie andigena ...... 11 2.7. Evaluaciones agronómicas en la subespecie andigena ...... 12 2.8. Caracterización molecular en papa cultivada y la subespecie andigena...... 12 2.9. Necesidad de construcción de colecciones núcleo ...... 13 2.10. Etapas en la construcción de colecciones representativas ...... 14 2.10.1. Identificación de los genotipos conservados ...... 14 2.10.2. Construcción de diferentes grupos significativos ...... 15 2.10.3. Decisión sobre el número de accesiones por grupo...... 15 2.10.4. Selección de las accesiones que se incluirán en la colección núcleo...... 16 2.11. Herramientas informáticas para conformar una colección núcleo...... 17 2.11.1. Software para el análisis de datos de caracterizaciones...... 17 2.11.2. Software para la selección de colecciones representativas de germoplasma....17 3. MATERIALES Y MÉTODOS ...... 19 3.1. Localización...... 19 3.2. Materiales y equipos ...... 19

iii

3.2.1. Material vegetal ...... 19 3.2.2. Materiales y equipo de laboratorio ...... 19 3.2.3. Material de gabinete...... 20 3.3. Métodos ...... 20 3.3.1. Caracterización morfológica y evaluaciones agronómicas...... 20 3.3.2. Caracterización molecular ...... 21 3.3.2.1. Colecta del material vegetal...... 21 3.3.2.2. Molido y almacenamiento de las muestras...... 21 3.3.2.3. Extracción de ADN...... 21 3.3.2.4. Cuantificación del ADN ...... 23 3.3.2.5. Amplificación y separación de fragmentos y matriz de datos...... 23 3.3.3. Análisis de datos...... 23 3.3.3.1. Cálculo del Índice de Polimorfismo (PIC) ...... 24 3.3.3.2. Cálculo del Índice de Heterocigosidad ...... 24 3.3.3.3. Análisis de estructura genética ...... 25 3.3.4. Construcción de la colección núcleo de la subespecie andigena ...... 25 3.3.4.1. Análisis de la información molecular ...... 25 3.3.4.2. Análisis con la información morfológica y evaluaciones agronómicas ...... 26 3.3.4.3. Elección de accesiones y formación de la colección núcleo ...... 26 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓ! ...... 28 4.1. Extracción de ADN...... 28 4.2. Matriz binaria de datos moleculares ...... 28 4.3. Análisis de datos ...... 29 4.3.1. Distribución geográfica de las accesiones de la subespecie andigena...... 29 4.3.2. Índices de diversidad y número de alelos encontrados...... 30 4.3.3. Análisis de coordenadas principales...... 31 4.4. Construcción de la colección núcleo de las accesiones de la subespecie andigena...33 4.4.1. Análisis de información molecular y caracteres morfológicos...... 33 4.4.2. Análisis de correlación con las evaluaciones agronómicas ...... 36 4.4.3. Formación de la colección núcleo de la subespecie andigena ...... 37 5. CO!CLUSIO!ES ...... 47 6. RECOME!DACIO!ES ...... 48 7. BIBLIOGRAFÍA ...... 49 A!EXOS...... 55

Í!DICE DE TABLAS

Tabla 1. Propuestas de clasificación taxonómica de las especies cultivadas de papa ...... 5 Tabla 2. Especies cultivadas de papa, número cromosómico y nivel de ploidía...... 6 Tabla 3. Reseña de colectas de papa en Bolivia ...... 11 Tabla 4. Número de accesiones con caracterización morfológica por especie...... 11 Tabla 5. Resumen de alelos generados con 5 microsatélites en 6 especies de papa...... 13 Tabla 6. Ejemplo de datos binarios de 15 accesiones, microsatélite STG0016...... 29 Tabla 7. Índices calculados y alelos encontrados en los 20 microsatélites...... 31 Tabla 8. Caracteres de mayor significación en el espacio común de las accesiones...... 35 Tabla 9. Colección núcleo de 114 accesiones de la subespecie andigena ...... 39 Tabla 10. Comparación entre la colección núcleo y la colección original ...... 42 Tabla 11. Lista de accesiones con probable duplicidad...... 45

Í!DICE DE FIGURAS

Figura 1. Altitud, temperatura y precipitación media anual de Bolivia ...... 8 Figura 2. Distribución geográfica de S. tuberosum subsp. andigena y otras especies ...... 9 Figura 3. Pobreza, diversidad y productividad en el cultivo de papa por ecoregiones...... 10 Figura 4. Ejemplo de visualización del ADN total de las accesiones ...... 28 Figura 5. Distribución geográfica de 531 accesiones en el territorio boliviano...... 30 Figura 6. Agrupación de accesiones en análisis de coordenadas principales...... 32 Figura 7. Representación de las accesiones en el método de escalamiento...... 34 Figura 8. Tendencia de los caracteres más significativos en el espacio común ...... 35 Figura 9. Tendencia de las evaluaciones agronómicas en el espacio común ...... 37 Figura 10. Ventana que muestra el programa PowerCore al realizar la búsqueda mediante el método M de maximización de la diversidad retenida...... 38 Figura 11. Visualización de la colección núcleo generada de 114 cultivares ...... 40 Figura 12. Colección generada al azar de 115 cultivares de la subespecie andigena ...... 41 Figura 13. Distribución de la colección núcleo de la subespecie andigena ...... 43 Figura 14. Distribución de las 114 accesiones de la colección núcleo...... 44

Í!DICE DE A!EXOS

Anexo 1. Lista de iniciadores de los 20 microsatélites utilizados...... 56 Anexo 2. Dendograma de las 688 accesiones estudiadas...... 57 Anexo 3. Ejemplos de formas de utilizar una colección núcleo...... 64

RESUME!

La papa es el tercer cultivo alimenticio más importante en el mundo. En este cultivo, Solanum tuberosum L. subsp. andigena es la fuente principal de diversidad genética. Bolivia, como país centro de origen de la papa, conserva la colección de la subespecie andigena en el Banco Nacional de Tubérculos y Raíces Andinas, bajo custodia del Instituto Nacional de Innovación Agropecuaria y Forestal - INIAF. Su conservación y manejo es difícil, debido a su complejidad genética y por ser tan numerosa. Por ello se ha propuesto construir una colección núcleo, a fin de que represente la diversidad genética de esta colección, y facilite su uso y conservación. Se complementó la caracterización molecular de 688 accesiones de la subespecie andigena , utilizando 20 marcadores microsatélites. Se utilizó CTAB para la extracción de ADN nuclear. La separación de fragmentos se hizo mediante electroforesis capilar. Se realizó el escalamiento multidimensional con la información molecular. Se hizo la correlación de las dimensiones obtenidas, con la información morfológica, y la información de evaluaciones agronómicas. También se hizo el análisis de coordenadas principales. Se obtuvo una colección núcleo de 114 accesiones (un 16 % de la colección original), mediante la estrategia M o de maximización en la selección, utilizando el programa informático PowerCore. Así se retuvo un 100 % de la diversidad de alelos y la información morfológica. Se complementó el análisis con la información de evaluaciones agronómicas. La colección núcleo obtenida debe ser validada y enriquecida con mayor información de caracterizaciones y evaluaciones.

vii

ABSTRACT

The potato is the third most nutritious important crop in the world. In this crop, Solanum tuberosum L. subsp. andigena is the main source of genetic diversity. Bolivia, as country center of origin of the potato, conserves the collection of the subspecie andigena in the National Bank of Andean Tubers and Roots, custodied by the INIAF (Instituto Nacional de Innovación Agropecuaria y Forestal). Their conservation and handling is difficult, due to its genetic complexity and to be so numerous. Hence, it proposed to build a core collection, so that it represents the genetic diversity of this collection, and facilitate their use and conservation. The molecular characterization of 688 accessions of the subspecies andigena was supplemented, using 20 microsatellites markers. CTAB was used for the extraction of nuclear DNA. The separation of fragments became by means of capillary electrophoresis. The multidimensional scaling was made with the molecular information. The correlation of the obtained dimensions was made, with the morphological information, and the information of agronomic evaluations. There was also made the principal coordinates analysis. A core collection of 114 accessions was obtained (16% of the original collection), by means of the M strategy (maximization in the selection), using the PowerCore software. It was retained this way 100% of the alleles diversity and morphological information. The analysis was supplemented with the information of agronomic evaluations. The obtained core collection should be validated, and enriched with information of characterizations and evaluations.

viii

1. I!TRODUCCIÓ!

La papa cultivada es uno de los principales alimentos de origen andino, y sirve de sustento a las familias del mundo entero y de Bolivia. Actualmente ocupa el tercer lugar en el consumo mundial, como alimento básico en la dieta de la población (Centro Internacional de la Papa, 2008). Se constituye además en la principal fuente de ingresos para los agricultores de Bolivia, gran parte de los cuales produce este cultivo (Choque et al ., 2007).

Solanum tuberosum L. subsp. andigena posee la mayor diversidad genética de la papa cultivada. Por ello, la conservación de esta riqueza genética es una prioridad para el mejoramiento genético de la papa. Existen muchas accesiones poco utilizadas de la subespecie andigena que poseen la información genética para resistencia a heladas, sequía, plagas y enfermedades. Estas accesiones deben utilizarse en programas de mejoramiento.

Por otro lado, con el transcurso del tiempo, las variedades cultivadas van perdiendo su vigor, sanidad y la capacidad de responder a nuevas condiciones ambientales adversas. Esta situación reduce la productividad y el rendimiento del cultivo. Entonces, surge la necesidad de obtener nuevas variedades que hagan frente a los problemas anteriormente expuestos.

Se ha realizado la caracterización morfológica de las accesiones de esta subespecie conservadas ex situ en Bolivia, y paralelamente se ha realizado la caracterización molecular de las mismas. Los marcadores microsatélites son útiles para discriminar genotipos con mayor precisión y asignar una huella genética a cada accesión.

La gran diversidad hallada en las accesiones de la subespecie andigena genera dificultades en el manejo y conocimiento de su potencial genético. El manejo es mucho más difícil a causa del gran número de accesiones existentes. Esto ocasiona que no se utilice toda la riqueza potencial de esta subespecie.

Una colección núcleo, que represente la diversidad genética, facilitará el manejo, las evaluaciones y promoverá el uso eficiente de toda la diversidad conservada. Al tener accesiones representativas del germoplasma se reducirá la complejidad del manejo y el germoplasma será más accesible para realizar evaluaciones dentro la colección. Además, se

1 contribuirá a la utilización de los cultivares, ya sea de manera directa por los productores o para programas de mejoramiento (López y Oliveira, 2007).

Diferentes estrategias son utilizadas para conformar colecciones núcleo empleando marcadores morfológicos y moleculares. Por ello, es necesario desarrollar un método adecuado para construir una colección núcleo. Hasta el presente no se había realizado la formación de una colección núcleo de accesiones bolivianas de la subespecie andigena, utilizando las herramientas de la biología molecular.

En esa perspectiva, se plantea la construcción de una colección núcleo de Solanum tuberosum L. subsp. andigena empleando marcadores morfológicos y moleculares, complementándola con la información de evaluaciones agronómicas realizadas al germoplasma.

Objetivo general

Construir una colección núcleo de accesiones bolivianas de Solanum tuberosum L. subsp. andigena Hawkes en base a marcadores morfológicos y moleculares.

Objetivos específicos

-Complementar y recolectar información de caracterización molecular, caracterización morfológica y evaluaciones agronómicas de accesiones de Solanum tuberosum L. subsp. andigena .

-Conformar una colección núcleo de Solanum tuberosum L. subsp. andigena a partir de 688 accesiones en base a la información molecular, morfológica y mediante evaluaciones agronómicas.

2. REVISIÓ! DE LITERATURA

2.1. Importancia de la conservación de papa cultivada y la subespecie andigena

El centro mundial de origen y diversidad de la papa se encuentra en Bolivia. La papa se cultiva por milenios desde altitudes próximas al nivel del mar como ser en los yungas bolivianos, hasta altitudes superiores a los 4200 metros, como es el altiplano. La multivariabilidad existente en la papa es producto de su domesticación, habiéndose obtenido cultivares de diferentes usos, colores, formas, sabores, características de calidad, precocidad, respuestas a factores bióticos y abióticos, entre otros (Rea, 1991).

La papa es el cultivo más productivo, al compararla con todos los demás cultivos alimenticios más importantes. Una hectárea de papa puede rendir entre dos y cuatro veces más cantidad de alimento que los cultivos de granos. La papa produce más alimento por unidad de agua que cualquier otro cultivo importante, y con relación a los cereales, es hasta siete veces más eficiente (Centro Internacional de la Papa, 2010; FAO, 2008).

La papa es el tubérculo alimenticio más importante del mundo. Aporta la mayor cantidad de carbohidratos en la dieta de cientos de millones de personas en los países en desarrollo, incluyendo poblaciones de Sud América y Asia. Es el tercer cultivo alimenticio de importancia mundial en el consumo humano, después del arroz y el trigo (Centro Internacional de la Papa, 2008).

2.1.1. Importancia del cultivo de Solanum tuberosum L. subsp. andigena Hawkes

Solanum tuberosum L. subsp. andigena Hawkes constituye el grupo más importante y representativo dentro de las especies de papa cultivada en los Andes (Bonierbale et al ., 2004). Lo mismo se refleja en las colecciones ex situ , donde este grupo viene a ser el más numeroso dentro del germoplasma conservado en el Banco Nacional de Germoplasma de Tubérculos y Raíces Andinas de Bolivia, y de igual manera en la colección conservada en el Centro Internacional de la Papa (Durán et al ., 2003; Mayer, 2001).

Actualmente la amplia diversidad de este cultivo se ha visto amenazada, principalmente por el uso de variedades comerciales. Por ejemplo, unas cuantas variedades son usadas para la producción y gradualmente otros tipos se dejan de sembrar y se pierden. Algunas variedades antiguas ya no se pueden encontrar, también debido a trastornos sociales, enfermedades o cambios climáticos (Centro Internacional de la Papa, 2008).

2.2. Taxonomía y genética de las especies de papa cultivada

Es complejo clasificar las papas cultivadas y definir el número de especies, así como sus interrelaciones. Se tienen diferentes propuestas para clasificarlas, pero se han presentado diferencias entre cada una de ellas. Por lo tanto existe necesidad de lograr un consenso para lograr una propuesta definitiva, coherente y práctica (Rodríguez, 2009).

Por ejemplo, según Hawkes (1990) las papas cultivadas de la región andina se han agrupado en 8 especies y subespecies del género Solanum : S. stenotomum, S. goniocalyx, S. phureja, S. ajanhuiri, S. curtilobum, S. juzepczukii , S. tuberosum subsp. andigena y S. tuberosum subsp. tuberosum . Alternativamente, han sido considerados como grupos dentro de una sola especie: S. tuberosum , en base al análisis de la caracterización morfológica de 267 accesiones en el Centro Internacional de la Papa (Huamán y Spooner, 2002).

Spooner et al . (2007) proponen clasificar las papas cultivadas en cuatro especies complementando información morfológica y molecular. Las cuatro especies son: S. ajanhuiri, S. juzepczukii, S. curtilobum y S. tuberosum . Dentro de este último se incluye a dos grupos: el grupo Andigena y el grupo Chilotanum (que corresponde a la subespecie tuberosum ). Debido a su complejidad, los autores mencionados señalan que para clasificarlas debe contarse con un conjunto integral de herramientas de caracterización y evaluación de las accesiones.

Un resumen de las propuestas de clasificación se muestra en la Tabla 1, ubicándose a la subespecie andigena , en la especie S. tuberosum .

Tabla 1. Propuestas de clasificación taxonómica de las especies cultivadas de papa

Bukasov (1971), Huamán y Spooner Spooner et al. Ploidía Dodds (1962) Hawkes (1990) Ochoa (1990, 1999) Lechnovich (1971) (2002) (2007) 2x S. tuberosum S. ajanhuiri Juz. y Bukasov S. ajanhuiri S. ajanhuiri S. tuberosum S. ajanhuiri Grupo Stenotomum S. canarense Juz. y Bukasov S. stenotomum S. stenotomum Grupo Ajanhuiri Subgrupo Goniocalyx S. erlansonii Bukasov ssp. goniocalyx S. goniocalyx Grupo Stenotomum Subgrupo Stenotomum S. goniocalyx Juz. y Bukasov ssp. Stenotomum Grupo Phureja S. macmillanii Bukasov Subgrupo Amarilla S. phureja Juz. y Bukasov Subgrupo Phureja S. rybinii Juz. y Bukasov S. phureja S. phureja Grupo Phureja S. stenotomum Juz. y Bukasov ssp. hygrothermicum ssp. phureja 3x S. tuberosum S. boyacense Juz. y Bukasov S. chaucha S. chaucha Grupo Chaucha S. juzepczukii Grupo Chaucha S. chaucha Juz. y Bukasov S. chocclo Bukasov S. ciezae Bukasov y Lechn. S. cuencanum Juz. y Bukasov S. juzepczukii Bukasov S. juzepczukii S. mamilliferum Juz. y Bukasov S. juzepczukii S. juzepczukii Grupo Juzepczukii S. tenuifilamentum Juz. y Bukasov 4x S. tuberosum S. andigenum Juz. y Bukasov S. tuberosum S. tuberosum Grupo Andigena S. tuberosum Grupo Andigena S. molinae Juz. ssp. andigena ssp. andigena Grupo Andigena Grupo Tuberosum S. leptostigma Juz. ssp. tuberosum ssp. Tuberosum Grupo Chilotanum Grupo Chilotanum S. tuberosum L. S. hygrothermicum 5x S. curtilobum S. curtilobum Juz. y Bukasov S. curtilobum S. curtilobum Grupo Curtilobum S. curtilobum Fuente: Rodríguez (2009).

2.2.1. Ubicación taxonómica de la subespecie andigena

La subespecie andigena de papa cultivada ha sido clasificada de la siguiente manera, según Estrada (2001) y Huamán (1986): Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Solanales Familia: Solanaceae Juss., nom. cons. Género: Solanum Linnaeus Sección: Petota Dumortier Subsección: Potatoe G. Don Superserie: Rotacea Hawkes Serie: Tuberosa Rybd., Hawkes Especie: Solanum tuberosum L. Subespecie: Solanum tuberosum L. subsp. andigena Hawkes Nombre común: papa Sinónimo según USDA-GRIN (2011): 5

Solanum tuberosum L. subsp. andigenum (Juz. & Bukasov) Hawkes

Spooner et al . (2007) proponen que el taxón de subespecie andigena , no se considere como una subespecie, sino que sea incluido como un grupo dentro de la especie S. tuberosum . La denominación propuesta es Grupo Andigenum, por la complejidad genética observada.

2.2.2. !úmero cromosómico y filogenia de la papa cultivada

Según Rodríguez (2009) y Huamán (1986) todas las especies cultivadas pertenecen a la Sección Petota, y según el nivel de ploidía varían entre el nivel diploide y pentaploide (Tabla 2).

Tabla 2 . Especies cultivadas de papa, número cromosómico y nivel de ploidía.

Especies Número de cromosomas Nivel de ploidía

S. x ajanhuiri 2n = 2x = 24 diploide S. goniocalyx S. phureja S. stenotomum

S. x chaucha 2n = 3x = 36 triploide S. x juzepczukii

S. tuberosum 2n = 4x = 48 tetraploide subsp. tuberosum subsp. andigena

S. x curtilobum 2n = 5x = 60 pentaploide

Fuente: Huamán (1986)

Sin embargo, Spooner et al . (2007) ponen en evidencia que la determinación de la ploidía no es suficiente para explicar la estructura genética de la papa cultivada, especialmente en el caso de la subespecie andigena . Señalan que varias accesiones diploides, triploides y tetraploides se agrupan en el conjunto de accesiones que estudiaron, a los que nombraron Grupo Andigenum. También observaron varios casos de ploidía diferente en esta subespecie que fueron agrupadas con las accesiones de las otras especies de papa cultivada.

Respecto a su origen filogenético, Estrada (2001) señala que varias especies silvestres pudieron ser los ancestros de la papa cultivada. Por ejemplo, la subespecie andigena se habría originado del cruce entre S. stenotomum y S. sparsipilum (Hawkes, 1988), o de S. stenotomum y S. phureja (Hawkes, 1979).

2.3. Diversidad genética en la papa cultivada y la subespecie andigena

Existe una amplia y valiosa riqueza genética de papas cultivadas (Solanum spp.), en los agroecosistemas de montaña de los Andes bolivianos, caracterizadas por su diversidad y alta tolerancia a condiciones ambientales adversas (Terrazas et al ., 2005). La papa, en los Andes, posee los mayores recursos genéticos que se conoce entre los cultivos para los diferentes caracteres y factores adversos. Además, su capacidad de cruzamiento, entre diferentes especies del género para el mejoramiento, hace su cultivo aún más valioso (Estrada, 2001).

Existe una amplia variabilidad morfológica y fisiológica en Solanum tuberosum L. subsp. andigena Hawkes (Sukhotu et al ., 2005). Cientos de cultivares fueron descritos morfológicamente en Bolivia, entre ellos están: Imilla Blanca, Imilla Negra, Lunka Imilla, Q'oyllu, Sani Imilla, Sani Runa, Saq'ampaya, Waych'a, Wila Imilla, Wila Waka Lajra, entre otros. Cada uno de ellos posee variadas formas, colores, sabores y diferentes usos (Ugarte e Irirarte, 2003).

Esta diversidad en la subespecie andigena ha sido un material genético importante para realizar los trabajos de caracterización, evaluación y mejoramiento. Inicialmente las accesiones fueron caracterizadas principalmente por la forma, color y otras características del tubérculo, por la alta diversidad observada (Alandia, 1994). También para el mejoramiento genético se utilizaron principalmente accesiones de la subespecie andigena utilizando esa importante diversidad genética (Estrada et al ., 1995).

2.4. Distribución geográfica de la subespecie andigena y la papa cultivada en Bolivia

El territorio boliviano posee una amplia diversidad geográfica, en comparación con el resto de los países. Existen las condiciones en altitud sobre el nivel del mar, temperatura y precipitación que dieron origen a la diversidad de la papa. Esto se puede ver de manera general en los mapas presentados por Hijmans et al . (2002) (Figura 1).

(Fuente: Hijmans et al . 2002).

Figura 1 . Altitud, temperatura y precipitación media anual de Bolivia.

La representación geográfica de la diversidad de la papa cultivada en la colección boliviana de germoplasma es notable, y señala la alta diversidad encontrada en el territorio boliviano. El germoplasma conservado proviene de siete, de los nueve departamentos de Bolivia y representa a 52 provincias, según la información de la subespecie andigena conservada en el Banco Nacional de Tubérculos y Raíces de Bolivia (2009).

En la Figura 2 se muestra una proyección sobre la distribución de papa cultivada, junto a Solanum tuberosum subsp. andigena (Schmiediche, 1977). Se puede notar que todas las especies coinciden en su mayor amplitud de distribución en el territorio boliviano. También se observa que S. tuberosum subsp. andigena se expande hacia el norte y sur del país, en una estrecha franja geográfica.

Fuente: Schmiediche (1977).

Figura 2 . Distribución geográfica de Solanum tuberosum subsp. andigena y otras especies

Por otra parte, a pesar de la amplia diversidad de papa observada en las diferentes ecoregiones bolivianas, se observa una realidad socioeconómica que es imprescindible resaltar. Por ejemplo, las zonas de mayor pobreza y de necesidades insatisfechas de Bolivia coinciden con las mismas zonas de mayor diversidad de la papa cultivada. Estas mismas zonas son las de mayor riesgo climático (Plan Nacional de Desarrollo de Bolivia, 2009).

Existe una relación entre diversidad, pobreza y productividad en el cultivo de papa para las diferentes ecoregiones, que debe encararse en su conservación y mejoramiento (Figura 3). Esta situación incide fuertemente en la vida de los agroecosistemas, con la tendencia a 9 seguir reduciéndose la diversidad genética (Balderrama y Terceros, 2008). Aunque el análisis en la Figura 3 se presenta de manera general, estimula a profundizar el conocimiento de la elevada diversidad de variedades nativas en Bolivia.

Fuente: Balderrama y Terceros (2008)

Figura 3 . Pobreza, diversidad y productividad en el cultivo de papa por ecoregiones.

Por ello, se debe profundizar en las estrategias de conservación y manejo de esta diversidad. Por ejemplo, considerando el éxito de los agricultores andinos al proteger esta diversidad. Cada cultivar es diferente en su respuesta a los diferentes factores adversos, y su uso por el agricultor es también diverso (Rea, 1994).

2.5. Colectas de la papa cultivada en Bolivia

Las colectas de papa se han realizado a fin de encontrar material genético valioso principalmente para incorporarlo a programas de mejoramiento. Las primeras colectas con fines de investigación convencional en Bolivia se reporta desde el año 1910 en adelante (Alandia, 1994). Sin embargo a través del tiempo, se estima que no más del cuatro por ciento de la riqueza genética ha sido utilizada en programas de mejoramiento (Contreras, 2005). En la Tabla 3 se presenta una reseña de colectas realizadas en Bolivia.

Tabla 3 . Reseña de colectas de papa en Bolivia.

Año Investigadores Origen de la investigación

1910 Walter Cevallos Tovar Bolivia 1926 a 1932 Juzepczuck, Lekhnovitch, Vavilov, Bukasov, Kesselbrenner URSS 1930 E. Baur, Schick von Rosenstiel Alemania, (MPI) 1931 Erlanson, Mac Millan Estados Unidos 1933 a 1934 C. Hammarlund Suecia 1939 Martín Cárdenas Bolivia 1938 a 1939 Balls, Hawkes, Gourlay Comunidad de Naciones 1940 Humberto Gandarillas Bolivia 1958 Zhukovsky URSS 1958 Correl Estados Unidos 1958 Ross, Rimpau, Dieris Alemania 1959 Ross Alemania 1960 Dodds, Pasman and Hjerting Inglaterra 1962 Dodds y Simonds Inglaterra 1971 Hawkes, Herting y Cribb Inglaterra Fuente: Alandia (1994) y Contreras (2005).

2.6. Caracterización morfológica en la subespecie andigena

Un 79 % de la colección conservada de papa cultivada boliviana tiene caracterización morfológica, y en la misma proporción en el caso del grupo andigena . La colección completa cuenta con datos de caracterización de follaje en un 96 por ciento, datos de floración un 91 por ciento, datos de fruto un 79 por ciento y datos de tubérculo un 97 por ciento (Zeballos et al , 2009). La Tabla 5 muestra el número de accesiones caracterizadas.

Tabla 4. Número de accesiones con caracterización morfológica por especie

Especie N° de accesiones

S. tuberosum subsp. andigena 815 S. ajanhuiri 49 S. tuberosum subsp . tuberosum 48 S. x curtilobum 79 S. goniocalyx 4 S. x juzepczukii 77 S. phureja 1 S. stenotomum 205 Solanum sp . 4 Total 1282 Fuente: Zeballos et al . (2009).

2.7. Evaluaciones agronómicas en la subespecie andigena

Según Contreras (2005) las evaluaciones realizadas en el mundo, en las colecciones de papa nos indican que son importantes por el potencial aporte de genes. Estas evaluaciones son útiles para conocer la respuesta a diferentes factores como ser: hongos, bacterias, virus, insectos, nematodos, heladas, calor, sequía, salinidad. Otras evaluaciones permiten conocer el alto contenido de sólidos, alto contenido de fenoles, buena calidad culinaria, entre otros.

Se ha realizado diferentes evaluaciones agronómicas a la colección de papa boliviana. Un 67 por ciento de las accesiones del grupo andigena han sido evaluadas por su respuesta a factores bióticos, y un 19 por ciento de las especies de papa conservadas ex situ (FAO, 2005).

Existen evaluaciones que son difíciles de planificar, como por ejemplo, la respuesta a heladas. Este fenómeno natural no siempre se presenta en un determinado sitio y periodo del año, o puede presentarse con una severidad que destruya las plantas. El año 2009 se registró una helada que afectó a toda la colección en campo, por lo que se realizó una evaluación preliminar para este factor abiótico. (Zeballos et al ., 2009).

2.8. Caracterización molecular en papa cultivada y la subespecie andigena

Se ha iniciado la caracterización del germoplasma de papa cultivada boliviana utilizando marcadores moleculares. Se han utilizado microsatélites para evaluar la diversidad de la colección, revelando una alta diversidad principalmente en la subespecie andigena .

Por ejemplo, se ha establecido patrones moleculares de referencia para 5 microsatélites: STWAX-2, STPoAC-58, STM 0037, STM 1104 y STM 0019. Sin embargo se recomienda comparar dicho patrón, con el establecido en el Centro Internacional de la Papa, y continuar con los estudios de diversidad genética a fin de asignar una huella genética a todas las accesiones de la colección (Rojas et al ., 2009).

En la Tabla 6 se muestra una resumen de los alelos generados para los 5 microsatélites, según Rojas et al . (2009).

Tabla 5. Resumen de alelos generados con 5 microsatélites en 6 especies de papa

MICROSATÉLITES : STWAX-2 STPoAc58 STM0037 STM1104 STM0019 Rango de alelos ( pb ) : 216-239 241-252 74-126 163-186 91–236 S. tuberosum subsp. andigena 5 6 13 8 16 S. ajanhuiri 4 4 7 7 10 S. x curtilobum 3 1 2 3 4 S. x juzepczukii 5 4 7 5 7 S. phureja 3 3 3 5 4

S. stenotomum 5 6 10 10 13 Total de alelos por microsatélite : 6 7 13 14 24 Fuente: Rojas et al . (2009).

2.9. !ecesidad de construcción de colecciones núcleo

Al incrementarse el número de accesiones en las colecciones, el tamaño de estas se convierte en un factor limitante para mejorar el conocimiento y el uso de las mismas. Frente a esta situación surge la necesidad de construir colecciones representativas llamadas también colecciones núcleo. Se define la colección núcleo como una muestra representativa de la colección en la cual se incluye la variabilidad genética de un cultivo y las especies emparentadas con un mínimo de repeticiones (Frankel y Brown, 1984).

Los marcadores morfológicos y moleculares son complementarios para la selección de la colección núcleo con el fin de asegurar su representatividad. Los marcadores moleculares son una herramienta sensible y precisa para complementarse con los marcadores morfológicos. Adicionalmente, se debe complementar la selección de la colección representativa con las evaluaciones realizadas e información ecogeográfica para determinar los usos y el manejo del germoplasma (Hidalgo, 2003; van Hintum et al ., 2003).

En Bolivia se construyó una colección núcleo de papa en el Banco Nacional de Germoplasma de Tubérculos y Raíces Andinas, que actualmente es administrada por el Instituto Nacional de Innovación Agropecuaria y Forestal –I.N.I.A.F., basándose en la caracterización morfológica. La determinación del número de accesiones dentro de cada

13 grupo, y la selección de estas fue realizada mediante el método de componentes principales para variables cualitativas, sin embargo en el caso de la subespecie andigena se consideró que su diversidad no fue totalmente representada debido a las limitaciones del método utilizado y por tratarse únicamente de caracteres morfológicos, considerando la alta variabilidad que encierra la colección boliviana (Durán et al ., 2003).

2.10. Etapas en la construcción de colecciones representativas

Los criterios y estrategias para la formación de una colección núcleo resultan del análisis de la información que contiene cada accesión (van Hintum et al , 2003). López y Oliveira (2007) compararon varios métodos para construir colecciones núcleo basándose en la caracterización morfológica. Estudiaron muestreos estratificados y aleatorios, comprobándose la efectividad de los métodos multivariados frente a los métodos aleatorios en la construcción de colecciones núcleo.

Más adelante, para definir el tamaño de la colección núcleo, se tomará en cuenta diferentes factores. Estos factores incluyen: el grado de diversidad genética de la colección, los recursos disponibles, y las condiciones de manejo existentes, entre otros. Por ejemplo, si hay muchos grupos pequeños en la colección se tomaría un mayor número de accesiones. También la complejidad del manejo sería otro factor que incidiría en el tamaño de la colección núcleo (van Hintum et al , 2003).

A continuación se resume las etapas en el desarrollo de una colección representativa, existiendo diferentes opciones y herramientas estadísticas para elegirla a partir de una misma colección base.

2.10.1. Identificación de los genotipos conservados

En esta etapa, se debe elegir a todo el material que estaría representado en la futura colección núcleo. Con frecuencia se busca representar a todo el material de cierta especie cultivada, en determinados casos se han conformado colecciones que representan sólo una

14 parte de una colección inicial, o en otros casos se incluye además a sus parientes silvestres (van Hintum et al , 2003).

2.10.2. Construcción de diferentes grupos significativos

La representatividad de la colección núcleo será eficaz, si se separan primero grupos con alguna significación. Los grupos deben conformarse de manera que se maximice la variación entre grupos y se reduzca al mínimo la variación dentro de ellos. Sin embargo, todo ello depende de la forma en que varía la diversidad genética y la información disponible sobre las accesiones (van Hintum et al , 2003).

Esta estratificación puede concluir cuando no es posible dividir en más grupos. Por ejemplo, esto sucedería cuando los grupos son genéticamente homogéneos o porque no se cuenta con información adicional confiable que permita separar grupos genéticamente diferentes. El análisis multivariado podría ayudar significativamente a este procedimiento (van Hintum et al , 2003).

2.10.3. Decisión sobre el número de accesiones por grupo

Consiste en la elección del número de accesiones que se incluirá en cada grupo, luego de la división en grupos diferenciados genéticamente. Se pueden asignar accesiones según el número que contenga cada grupo, la diversidad dentro de cada grupo, y las necesidades de los usuarios. Combinar diferentes estrategias sería lo más apropiado. Otra decisión común es incluir al menos una accesión de cada grupo aunque se trate de grupos muy pequeños (van Hintum et al , 2003).

Existen procedimientos que se basan ya sea en el tamaño del grupo o en la diversidad encontrada. Cuando se elige utilizar el tamaño de los grupos, el número de cada grupo reflejará el resultado de las colectas, del trabajo de investigación, de las necesidades históricas y del interés de los usuarios. Cuando se elige utilizar la diversidad de marcadores, se tienen datos que indican cuánta diversidad hay dentro de los grupos. Sin embargo, el conocimiento que se tenga de las accesiones, que puede ser subjetivo como el

15 conocimiento informal, ayudará a realizar ajustes al tamaño de cada grupo (van Hintum et al , 2003).

Existe un método llamado estrategia M que se ha utilizado en el desarrollo de una colección núcleo en base a datos de marcadores moleculares. Éste método utiliza la información de las accesiones, analizando los diferentes tipos de alelos presentes. Mediante un programa lineal se maximiza el número de alelos retenidos en el número de accesiones. Este método ayuda a identificar las accesiones que se deberían incluir en el grupo (van Hintum et al , 2003).

2.10.4. Selección de las accesiones que se incluirán en la colección núcleo

El paso final consiste en elegir las accesiones que realmente conformarán la colección núcleo, puesto que hasta aquí solo se tiene una colección clasificada por estratos o grupos. Entonces, faltará definir cuáles de las accesiones se van a escoger de cada grupo, siendo las que mejor representen al grupo y cumplan mejor la función y los objetivos de la colección núcleo (van Hintum et al , 2003).

Hay diferentes criterios y procedimientos para la selección tanto analíticos como una elección al azar. Cuando se tiene información documentada de las accesiones, tales como cultivares bien conocidos, la selección será diferente del caso de especies silvestres desconocidas. Así, también influirán no solo la diversidad genética, sino también si hay accesiones importantes utilizadas en programas de mejoramiento, asimismo la calidad de la información de las accesiones. (van Hintum et al , 2003).

En la decisión del tamaño de la colección núcleo, no existe un parámetro fijo. Las características genéticas de la población tendrán su efecto en el tamaño de la colección núcleo, así como aspectos de manejo o los recursos disponibles. Todo ello fue señalado por van Hintum et al (2003), que citando a diversos trabajos para formar colecciones núcleo, indican que generalmente se llega a conformar entre un 5 a 20 % del tamaño de la colección original, pero el rango observado en diferentes colecciones en el mundo es desde menos de 1% hasta más del 50%.

2.11. Herramientas informáticas para conformar una colección núcleo

Existen programas informáticos con diferente capacidad y utilidades que sirven de herramientas para evaluar la diversidad genética (van Hintum et al , 2003). En dichos programas se puede realizar el análisis con grandes cantidades de datos, utilizando las diferentes técnicas de análisis multivariado (Valadez y Kahl, 2000). Adicionalmente, se considera que la información geográfica tiene importancia en la determinación de colecciones núcleo (van Hintum et al , 2003), para lo cual también existen programas especializados. Algunos de los programas utilizados son citados a continuación.

2.11.1. Software para el análisis de datos de caracterizaciones

NTSYSpc (Rohlf, 2008) es un programa informático que permite realizar distinto tipo de cálculos: para observación, manejo de matrices, cálculo de coeficientes y obtención de matrices de similitud, obtención de dendogramas. También para realizar métodos de ordenación: como el análisis de coordenadas principales y otros, así como obtener gráficos correspondientes de alta calidad.

DARwin (Perrier y Jacquemoud-Collet, 2006) es un programa de uso libre desarrollado para el análisis de diversidad con diferentes funciones. Se puede transformar matrices, realizar análisis multivariado, construcción de dendogramas, y visualizarlos en gráficos editables. Los análisis que permite realizar para describir la estructura de diversidad en una población se basa en los métodos de distancia genética (Perrier et al ., 2003).

2.11.2. Software para la selección de colecciones representativas de germoplasma

Se ha desarrollado algunas herramientas informáticas para maximizar la diversidad representada en una colección. El programa MSTRAT ayuda al usuario a definir el tamaño de la colección básica para conformar la colección representativa, y también para estudiar y maximizar la riqueza genética en la futura colección representativa (Gouesnard et al ., 2001).

Otro programa desarrollado llamado PowerCore, propone un análisis similar para maximizar la representatividad de la futura colección núcleo. Además se ha realizado una comparación de métodos y herramientas utilizadas de los programas MSTRAT y PowerCore. La comparación fue realizada con información proveniente de una colección de arroz para dos grupos de datos: fenotípicos y microsatélites (Kyu –Won et al ., 2007).

En la comparación mencionada se afirma que PowerCore permitió optimizar en un 100 % la representatividad tanto para datos fenotípicos como moleculares. En tanto que MSTRAT mostró una cobertura de un 94,8 % para datos fenotípicos y un 88,9% para datos provenientes de microsatélites (Kyu –Won et al ., 2007).

Otra herramienta muy útil en el análisis multivariado de datos es el programa PASW Statistics V. 18. Posee importantes herramientas para análisis de datos. Por ejemplo, mediante las funciones de PROXSCAL, se procede a realizar el escalamiento de proximidades, lo que le permite analizar las similitudes entre objetos e incorporar características para los objetos en el mismo análisis. Con esta herramienta se muestra las proximidades como distancias en un orden de asignación para obtener una comprensión espacial de cómo se relacionan los objetos estudiados (PASW, 2009).

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Localización

Este estudio se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular y Bioinformática, en la Fundación PROINPA (Fundación para la Promoción e Investigación de Productos Andinos), localidad de El Paso, Provincia Quillacollo, Bolivia.

3.2. Materiales y equipos

3.2.1. Material vegetal

El trabajo comprende el análisis de 688 muestras de accesiones provenientes del Banco Nacional de Germoplasma de Tubérculos y Raíces Andinas, que está bajo responsabilidad del Estado Plurinacional de Bolivia mediante el Instituto Nacional de Innovación Agropecuaria y Forestal – I.N.I.A.F. Las accesiones fueron colectadas para su conservación ex situ en diferentes años, de zonas de producción tradicional de papa de 7 departamentos de Bolivia: La Paz, Oruro, Potosí, Cochabamba, Santa Cruz, Chuquisaca y Tarija.

Se colectaron para el estudio folíolos de hojas en crecimiento, en buen estado fisiológico y de sanidad de 688 accesiones de papa correspondientes a la subespecie andigena . Esta colecta fue hecha para complementar la caracterización molecular de las accesiones. Las 688 accesiones representan a una parte de la colección de la subespecie andigena , debido a la disponibilidad del material vegetal y el tiempo requerido para el trabajo de laboratorio.

3.2.2. Materiales y equipo de laboratorio

Para realizar la colecta de los folíolos se utilizaron: cajas de plastoformo para conservar las muestras, bolsas, hielo, tijeras y etiquetas.

Los equipos utilizados fueron: refrigerador, congeladora (-20 °C), campana extractora de gases, micropipetas de diferentes capacidades, microcentrífuga de 12000 rpm, baño María, equipo de electroforesis, medidor de pH, balanzas electrónica y analítica, estabilizador de

19 voltaje, horno microondas, transiluminador de rayos ultravioleta, digitalizador de imágenes para la visualización del ADN.

Se utilizaron los siguientes reactivos: CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (Cetyl- trimethyl ammonium bromide ó CTAB en inglés), tampón de extracción CTAB 2X, β- mercaptoetanol, cloroformo, isopropanol, etanol absoluto diluido a 75%, ARNasa. Además: agarosa, TBE 10X, Tris HCl 1M pH 8.0, ácido bórico y EDTA 0.5 M pH 8.0, marcador de peso molecular de 10000 pares de bases, tampón de cargado, SYBR green, dNTPs, magnesio, Taq polimerasa, tampón, iniciadores para microsatélites de papa o SSR (abreviación de “Simple Sequence Repeat”, nombre que indica que los microsatélites son secuencias simpes repetidas de nucleótidos de la molécula de ADN)

3.2.3. Material de gabinete

Información de caracterizaciones morfológicas y evaluaciones agronómicas de 688 accesiones de la subespecie andigena , realizadas en años anteriores. Equipo y programas informáticos. Software para la selección de colecciones representativas de germoplasma. Software para análisis de datos moleculares. Software para análisis geoespacial de datos. Información sobre el origen geográfico de las accesiones.

3.3. Métodos

3.3.1. Caracterización morfológica y evaluaciones agronómicas

Se accedió a la base de datos de la caracterización morfológica y evaluaciones agronómicas de las accesiones de la subespecie andigena , del Banco Nacional de Germoplasma de Tubérculos y Raíces de Bolivia, que está bajo la administración del I.N.I.A.F. Las caracterizaciones y evaluaciones fueron realizadas en diferentes años, anteriores a la realización del presente trabajo.

3.3.2. Caracterización molecular

3.3.2.1. Colecta del material vegetal

Se seleccionaron folíolos de hojas en pleno crecimiento, en condiciones apropiadas de sanidad, almacenándolas en bolsas de polietileno a - 20 °C, hasta el momento de molido. Cada muestra fue debidamente identificada con un código que identifica a cada accesión del germoplasma boliviano.

3.3.2.2. Molido y almacenamiento de las muestras

Se procedió al molido de las muestras en un mortero previamente enfriado, añadiendo nitrógeno líquido, hasta obtener un polvo fino. Cada muestra se conservó a - 20 °C en tubos de 1.5 mL etiquetados, hasta el momento de la extracción de ADN. Se cargaron alrededor de 100 mg de la muestra molida a tubos de 1.5 mL de capacidad, identificados con el código de cada accesión. Todo el proceso de molido se realizó con nitrógeno líquido a fin de evitar la degradación del ADN en las muestras.

3.3.2.3. Extracción de AD!

Se utilizó el protocolo de extracción CTAB a fin de obtener la cantidad suficiente de ADN para realizar todos los análisis necesarios (Doyle and Doyle, 1990). La extracción de ADN consistió en la extracción con solventes orgánicos para retener solamente los ácidos nucleicos, añadiendo al final la enzima ARNasa para obtener solamente el ADN. El protocolo se detalla a continuación, se coloca entre paréntesis las modificaciones y adaptaciones realizadas para trabajar con papa:

1. Calentado del baño María a 65 °C.

2. Añadir a cada tubo de 1.5 mL con los 100 mg de tejido molido, 700 µL de tampón CTAB 2X y 2 µL de 2-mercaptoetanol, mezclar inmediatamente. Conservar los tubos en hielo.

3. Incubar las muestras en baño María a 65 °C durante 45 minutos, agitar suavemente las muestras cada 5 minutos para homogeneizar la suspensión. Mientras se incuba, preparar dos juegos de tubos de 1.5 mL para cada muestra, identificados con el código correspondiente.

4. Luego de la incubación, agregar 700 µL de cloroformo. Mezclar vigorosamente durante 5 minutos a fin de formar una emulsión homogénea.

5. Centrifugar las muestras durante 5 minutos a 10.000 r.p.m., de preferencia a 4 °C. Sacar los tubos de la centrífuga con cuidado para evitar que se mezclen las fases, transferir el sobrenadante a un tubo de 1.5 mL nuevo, teniendo cuidado de no absorber la interfase.

6. Repetir los pasos 4 y 5, es decir: añadir cloroformo, agitación y centrifugado.

7. Recuperar el sobrenadante final en un tubo de 1.5 mL estimando la cantidad recuperada. Agregar un volumen igual de isopropanol a cada tubo. Invertir los tubos vigorosamente 4 a 5 veces para precipitar el ADN.

8. Centrifugar a 10.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante con cuidado para no perder el precipitado de ADN.

9. Lavar el precipitado de ADN con 200 µL de etanol frío al 75% (con las muestras de papa se utilizó 400 µL). Centrifugar las muestras a 10.000 revoluciones por minuto durante 10 minutos a temperatura ambiente. Eliminar con cuidado el etanol. Este lavado se puede realizar dos veces, dependiendo del tejido (el lavado con etanol se hizo dos veces en todas las muestras a fin de eliminar sales y eventuales pigmentos).

10. Secar el precipitado dejando los tubos abiertos.

11. Disolver el precipitado en 100 µL de agua destilada estéril (utilizamos 60 µL de agua y se agregó 0,6 µL de ARNasa). Incubar en baño María a 37º C durante una hora.

12. Conservar el ADN disuelto a -20º C para su uso posterior.

3.3.2.4. Cuantificación del AD!

La cuantificación del ADN se hizo mediante electroforesis en gel de agarosa para comprobar la cantidad y calidad de ADN extraído. Este procedimiento se realizó para cada una de las accesiones:

1. Se procedió a diluir 1 µl de la solución de ADN obtenido con 8 µl de agua destilada y 1 µl de tampón de carga. El tampón de carga tenía 1 ml de tampón de cargado + 8 µl de SYBR green. Se cargó cada una de las muestras preparadas a los pocillos del gel de agarosa al 1 %.

2. Se realizó la migración horizontal de las muestras de ADN en el gel de agarosa. Luego de la migración fueron visualizados con luz U.V. y fotografiados.

La calidad y la cantidad de ADN obtenido, fue evaluado por comparación con el estándar de peso molecular utilizado (200 a 10000 pares de bases). Para las muestras que no tenían suficiente cantidad y calidad de ADN se realizó una repetición de la extracción de ADN a fin de tener suficiente material para realizar todos los análisis.

3.3.2.5. Amplificación y separación de fragmentos y matriz de datos

La amplificación y separación de fragmentos fue realizada mediante electroforesis capilar. Para la separación de fragmentos se inyectó a cada tubo capilar las muestras más el estándar de tamaño. Se utilizaron 20 pares de iniciadores específicos de papa cultivada (ver Anexo 1).

Se identificó a cada accesión de acuerdo al patrón encontrado para cada uno de los fragmentos. Se transformó la matriz de peso molecular en una matriz binaria.

3.3.3. Análisis de datos.

Se realizó un análisis exploratorio de los datos obtenidos mediante la caracterización molecular. Se identificó a cada accesión por el patrón de alelos generados. Se registró el

23 número de alelos encontrados para cada marcador, la frecuencia de alelos por marcador, y se calcularon los índices que permitan describir las accesiones estudiadas para estimar la diversidad existente. Se calculó el índice de polimorfismo para cada microsatélite, así como la heterocigosidad para cada locus microsatélite

3.3.3.1. Cálculo del Índice de Polimorfismo (PIC)

El cálculo del PIC se realizó según la siguiente fórmula (Botstein et al ., 1980):

n n n PIC = 1 - ∑ pi 2 - ∑ ∑ pi 2 pj

i= 1 i=1 j=1 Donde: i = 1, 2,……………..n alelos j = i – 1 pi = frecuencia del i-ésimo alelo pj = frecuencia del j-ésimo alelo

3.3.3.2. Cálculo del Índice de Heterocigosidad

Para el Índice de Heterocigosidad se utilizaron los siguientes cálculos:

2 Un locus j con i alelos: hj = 1 – Σp i

L Promedio para varios loci: H = Σ j hj / L Este último promedio también se denominó heterocigosidad promedio para los 20 loci microsatélites.

Donde:

hj = la heterocigosidad por locus

p y q = las frecuencias alélicas

H = la heterocigosidad promedio para varios loci

L = el número total de loci

3.3.3.3. Análisis de estructura genética

Se calculó la similitud entre cultivares, construyendo una matriz de similitudes entre accesiones, utilizando el coeficiente de similitud de Jaccard. Se realizó un análisis preliminar para comprender y visualizar la estructura genética de la colección en su conjunto, en base a la información molecular. Se utilizó el análisis de coordenadas principales. Se visualizó la ubicación correspondiente a cada accesión mediante el programa NTSYSpc V. 2.1.

La información morfológica proviene de la base de datos correspondiente a los cultivares del grupo andigena . Se exploró la correlación de los datos moleculares con los datos de caracterización morfológica, para comprender la estructura genética, mediante el análisis de escalamiento multidimensional.

Se recolectó información de evaluaciones realizadas al germoplasma, principalmente sobre respuesta a factores bióticos, realizadas en años anteriores. También se complementó con una evaluación agronómica preliminar: la respuesta de las accesiones de la subespecie andigena a una helada ocurrida en la etapa de floración de las plantas (Zeballos et al ., 2009).

3.3.4. Construcción de la colección núcleo de la subespecie andigena

Se procedió a la construcción de la colección representativa basada en el análisis de la caracterización molecular, para luego complementarla con la caracterización morfológica y evaluaciones realizadas, como se describe a continuación.

3.3.4.1. Análisis de la información molecular

En base al análisis coordenadas principales, se visualizó la diversidad genética de accesiones. Se visualizó la estructura dentro de la colección por su similitud genética, con el fin comprender dicha estructura, y la diversidad de la información genética obtenida.

Se realizó el análisis mediante las herramientas de escalamiento multidimensional (MDS por la sigla en inglés de Multidimensional Scaling) mediante el cual se representó en pocas dimensiones las relaciones genéticas entre los cultivares. Se obtuvo una matriz de dos dimensiones que representa las accesiones en un plano, mediante el programa PASW Statistics Versión 18.

3.3.4.2. Análisis con la información morfológica y evaluaciones agronómicas

La técnica de escalamiento multidimensional se pudo utilizar de manera complementaria con otra técnica de análisis, como es la correlación entre matrices de información molecular, con la información morfológica. La información de la caracterización morfológica y evaluaciones agronómicas proviene de la base de datos del banco de germoplasma.

De la misma manera, se añadió al análisis la información de las evaluaciones agronómicas realizadas a cada accesión. Esta complementación con la información morfológica y con las evaluaciones realizadas a las accesiones, sirvió para ayudar a comprender la relación de la caracterización molecular con la caracterización morfológica y las evaluaciones agronómicas.

3.3.4.3. Elección de accesiones y formación de la colección núcleo

Se realizó la selección de accesiones, basándose en la caracterización molecular, incorporando la información de las caracterizaciones y evaluaciones. La información utilizada fue de 29 caracteres morfológicos y 8 evaluaciones.

Se utilizaron los datos de evaluaciones de respuesta a helada, nemátodos, gorgojo, polilla, rizoctoniasis, verruga, y una evaluación de rendimiento. Falta complementar evaluaciones a factores bióticos entre un 25 a 70 % de las accesiones del germoplasma analizadas. Sin embargo, los datos existentes fueron utilizados para la selección de accesiones.

Se realizó la selección de las accesiones que formarían una colección representativa utilizando la técnica M de maximización en la búsqueda de accesiones representativas. Con la búsqueda se obtuvo el número de accesiones que retengan la diversidad alélica total en un menor número de cultivares. Se utilizó las herramientas de búsqueda del programa PowerCore Versión 1.1.

Para fines de comparación con la colección en formación se realizó además la selección de accesiones al azar entre todos los cultivares. Se comparó la colección elegida al azar con la colección núcleo.

Se comparó la colección núcleo frente a la colección original mediante los índices de diversidad, los rangos y el número de alelos. De esa manera se comprobó la representatividad de la diversidad genética de la nueva colección propuesta mediante la estrategia utilizada, respecto a la colección original de 688 accesiones del grupo andigena .

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓ!

4.1. Extracción de AD!

El método de extracción CTAB fue el adecuado para obtener ADN de buena calidad, de foliolos de papa cultivada. Esto permitió obtener productos electroforéticos de alta calidad. La Figura 4 muestra un ejemplo de un gel de electroforesis horizontal en agarosa al 1 %, utilizado para verificar la calidad y cantidad de ADN obtenido.

Figura 4 . Ejemplo de visualización del ADN total de las accesiones. A la izquierda: M, el marcador de peso molecular de 10.000 pb

4.2. Matriz binaria de datos moleculares

Los fragmentos de los microsatélites fueron separados mediante electroforesis capilar. Con la matriz de datos resultante, se obtuvo una matriz binaria. La Tabla 6 muestra parte de la

28 matriz binaria obtenida. Se toma como ejemplo, el microsatélite STG0016 . El tamaño de los fragmentos para este microsátelite tiene un rango de 137 a 180 pares de bases.

Tabla 6. Ejemplo de datos binarios de 15 accesiones, microsatélite STG0016

Tamaño de fragmentos en pares de bases (pb) Accesión 137 140 143 144 145 150 153 156 158 159 161 162 170 174 180 278 001000010100010 279 001000110000000 280 000001010000000 281 001000010110000 282 000001110000000 283 000001010000000 284 000000110000000 285 001000010101000 370 000010000000000 440 101000110000000 441 010000010001000 690 000100010001000 898 000000001001010 907 001000010100001 922 000000010000100

4.3. Análisis de datos

4.3.1. Distribución geográfica de las accesiones de la subespecie andigena

La mayor parte de las zonas productoras, de donde proviene la colección de la subespecie andigena , están representadas por las accesiones estudiadas. Estas zonas tienen un amplio rango de distribución de esta subespecie. Para visualizar esta distribución se utilizó el programa informático DIVA GIS Ver. 7.1.1. La representatividad geográfica de las accesiones se visualizó, según el número de accesiones por celda.

La Figura 5 muestra la distribución geográfica de accesiones de la subespecie andigena conservadas en el Banco de germoplasma de Bolivia. Sólo 531 de las 688 accesiones estudiadas, contaban con datos de origen geográfico para su ubicación geoespacial.

Fuente: Elaborada en base a datos de georeferenciación existentes

Figura 5 . Distribución geográfica de 531 accesiones en el territorio boliviano.

Como se ve en la Figura 5, las accesiones abarcan 7 de los 9 departamentos de Bolivia con excepción de Pando y Beni. Las zonas con mayor número de accesiones, se muestran en color rojo, indicando mayor abundancia. Por ejemplo, las áreas representadas con un mayor número de accesiones son: la zona entre el Este de Oruro y el Norte del departamento de Potosí, y el sur del departamento de La Paz. Existen zonas aún no representadas.

4.3.2. Índices de diversidad y número de alelos encontrados

La Tabla 7 muestra el Indice de Polimorfismo (PIC) y la Heterocigosidad (H) para cada uno de los 20 microsatélites estudiados o SSR (abreviación de “Simple Sequence Repeat”. También se observa el número de alelos, y el rango encontrado en el tamaño de los alelos, expresado en número de pares de bases (pb), encontrados en las 688 accesiones de la subespecie andigena .

Tabla 7. Índices calculados y alelos encontrados para cada microsatélite SSR PIC H N° alelos Rango STG0016 0.783 0.805 15 137-180 STM1064 0.497 0.553 7 202-213 STM5114 0.608 0.674 7 302-318 STM1053 0.498 0.585 8 182-214 STG0010 0.667 0.716 8 177-190 STI0001 0.548 0.614 12 190-216 STI0012 0.716 0.752 17 173-240 STI0032 0.579 0.644 9 127-143 STPoAc58 0.547 0.589 8 231-257 STM0019 0.629 0.681 15 175-251 STI0004 0.622 0.653 16 92-123 STI0033 0.616 0.644 16 120-163 STM1104 0.831 0.849 13 180-198 STM1052 0.763 0.791 19 201-277 STI0014 0.467 0.519 6 136-149 STG0025 0.515 0.574 7 121-221 STM1106 0.575 0.591 13 145-212 STG0001 0.703 0.740 17 136-159 STM0037 0.823 0.839 18 88-133 STI0030 0.775 0.799 16 101-224 PROMEDIOS 0.638 0.681 12.4

El promedio del PIC es 0.638 y la heterocigosidad promedio 0.681. El número promedio de alelos por locus microsatélite, es 12,4. Los 20 microsatélites contienen un polimorfismo elevado y revelan alta diversidad genética en esta colección.

Esto confirma tanto la riqueza como la complejidad genética que se conserva en este grupo de cultivares estudiados. Huamán y Spooner (2002) también hallan que esa diversidad y complejidad, es característica de esta subespecie.

Sin embargo, los mismos autores añaden que se debe recurrir a conjunto integral de herramientas técnicas para la caracterización del germoplasma, en particular en esta subespecie. Esto se debe a la complejidad genética observada, la existencia de ploidía diferente, y la mezcla con las especies más emparentadas a esta subespecie.

4.3.3. Análisis de coordenadas principales

Para los análisis multivariados, se utilizó la matriz de similitudes calculada en base el coeficiente de similitud de Jaccard. Con el análisis de coordenadas principales se visualiza la diversidad genética conservada en las accesiones de la subespecie andigena (Figura 6).

chap1 0.31 taran2 witar1 carp2palch4corchtara4 sin11 puchs wacla4 phap n27 ph3 pukt00 yanch yusul1 yusul3 pucpa wisut3pukt03 pucwg1pucppr imro15 aja3 malk8 n50 yusul2 Saqampayas chin n44 thawa2 canb1 palch3 tenep n17 qoyta larP02malmyasaq1 saq46 pukllk5 n52 cuch3 yaway curch wila2 saq28malk4 pukru2 wirmalsaq21yurun4pukllk2 wuaru saq10 n09 alchmosc1 isl11 sulim2 saq59 saq17 saq60saq05 run07 alp04 chaipukllk3 alcq ika17 soldtsaq56lunsq saq15saq16yusaq2 lambn yarun4 lloqt2lloq2 sani01 yarun5allp sonsi1yatakchau wacarchowaypucsqn30 koy4 sin02 saq29 larP17n45 yusaq1puchi aja1 Palm wiim02 qoyrchaloyaqoy3gen16 teke1 saq41saq25saq42 pukru3saq27 saq33sutamo larqlloqt3amj8paam larl cullmwakñ2 n53yuim4n29 wayr iso2 alm1yacanamj5pit2 abj4 wila4copa1 cap cica com yarun2 imb09argchejmzn1alm2mil7 cat saq55 saq61 pukru4lekp3 yarin06morsq saq49polo1pit1wisut2laj1 wipin32 im6 n20wiim14 chor3 Pa10 mulaqomschl3 yarun1totor n25 yullu2goy3 palch2 wiim22 wiim15wansu Imillas warsy1 Pa28 n59 pukch mucwlechket2tuffmpoln5 mora2mil5 chii11 kun ika04 0.11 saq06 tara1 abj3 yullu4wilajchui2larsu2 sani11janP5sin04sulim1koy2 n12 añi qorsn55way3 wallj2sulimn wiim21 alp03saq02 n54 gallrmarc2alp10yuim1yurun1malk7sulim0 sin19durz6saq35 n31 way5 wiim10 sichim lunim2 alp08umalPa14qalu qoy1run03 wispa3sin15im3waso3cuch1riñ palch1larP05 alq collrway2 imro19 nucl saq34 n10 chch amj1 mzni1monoimro18 quer wilca saq57 imro16amj7im9 yaggwiwal4gog yugg2saq36 kusill yaluncen mzni5 sachp qallp durz4 gen11 pucor wiP04 goy2wilaqP sesechap2 tunti1saq45yuim5 lunim8pukllk1 chui1 alql2 lojim gen07 wiwal11 pukPa2polo4isl10waso2amj4poli pacl mem1chs1 n40mil8 pukpc1gen05way1im5 n13saq50pukñ8aja2 alpi Pa18sanru1pitw4 Runas imro17 colll run02sailusin12 tara2 pukñ2 wiwal7 sipa3pucwg2larP04pukñ10alp12 paru larP01 rosaalql1 sonsi3ph2 witar2 sann1 chl1wiim08kol qoy2 alp06saq14wiP02 larP15 coni1Pa17 alqsn47 cabp chipw im4sani08 mzni2alqi03 chii18 alqi02wari maj5 ika16 imro21 chii02 jachPaltw sanPa1 conch koy1saq01yasulkosiim1yullu5larP14 runk alqi09 sani12khuchp imro11 mora1 isl06 alqi15 chii03 wiP22muyQ4ket1 jalprun15 jansu amj2 imro22pukñ1chuq wiim23mayr wiim09millu wiim24wallj1 wiim20 wiim03 imb05 dom2 lekp4 akr llus3 lunnaPa31rostm n62 n16 salla past sani07 lunim6sani09sani16ari1 chii25 n21 Palp llamrpurepukllk4run06 malk1 n28 run10 n34 pukg n23 chiai15jatpsi sani05 chiai07 Pa02 alp11 Pa06lek kalumamt1 wacla1 isl12 noe wilaqi1alqi10pukPa3 pac2 n33 pac3 imro20 maj3 wiwal13sin09 yullu1wiP15 n39 tiris salam run11 chojmamt0 isl13sani02lunim5 janP1 chii26 wiP11wiP30 sutan wiP16 wallo pukt02 che1 mil2 sani03 poln1 coni5qosechialq lekp1ari3chiai08chepchiai12chiai06 alqi08lunic1n36 janP3 llus1 Pa33chich canb2candsuta2 PalPisl01 Pa20pucgo2 chiai02 rosd1 waso1 mzni4teke3 lunim7 Pa27wiwal3 wiim17sultunegJ toral2 rosd2 luni n14 imro03chii01sin08 imb11sikin1 Palrs2 luk wiwal2 alp09 pukgg1pha sayrusurim1 karsu isl14 gen10 maj8 pitw3 Pa32 Pa03amj3 yugg1 sonsi4 chuj ata1 tunti2maj2isl09 ika03ika07 chii24 kuchwispa1wiwal10 chii27wiP23 lloqt1 goy1 kunrr1 poim n58 Palas larP08 Pa01n46 sipa4wiP12 wiwal12 mzn3 chiai03 chs2 chii20 Pa05tanth pucPal Palb mzn4 n24 C2 -0.10 surim3 Pa22 pukñ5chii22 wiwal6yuwlaj1n11 abj1 yasaq2 n48 chl2 wacla2 sonsi2 lunim3 gen04 alqi04 wiP20yuwlaj2 suta5 wiP25 alp05 kusle chii31 chii17 ika15 pukñ3 wacla3 mach n38 chiai11 chii13 imb07maj7apon35 chii16 wiP31 alqi19 imro06ika11 ika10n03 jancp lunim1 chii08maj1 imro10lunk3chii30 wiP10 kata chiai05 chii33 immchii09red kellP polo2 isl08 imro13wiyakchii06chii14chii21lunk4lunic2chii12lunk1luntq2 Pa15 chejP yuim3 chii28 ika02 n18 wiP01 laraq chii07 sani04 chii15imro07 crir sanPa2 yaPa1yasut larP11 Imillas negras wisut1 Pa26 -0.31 larn1 larn5 larP19 morch yaPa2 Palas Pa12 larP09larn2

sulamn larn3 lunPlarsu1llus2 larsu3larP18 llusl wilP00thawa1 larP10 larP03pukPa1 wiP19 saq52larn4wiP33Pa09 wikPa wiP18 wiP28 larn6 wiP29 larP16n41sipa2janP6 larP07jann -0.51 -0.35 -0.12 0.11 0.34 0.57 C1

Figura 6 . Agrupación de accesiones por su similitud genética. Se marcaron algunos grupos de accesiones. Análisis de coordenadas principales mediante el programa NTSYSpc Ver. 2.1

En la Figura 6 se observa la alta diversidad genética conservada en las 688 accesiones. Para su visualización, se ha utilizado los nombres comunes abreviados de las accesiones. Las líneas trazadas alrededor de algunos grupos de accesiones, señalan tendencias de agrupación de accesiones por su similitud genética. Sin embargo, debido a la complejidad de la nube de puntos formada por las accesiones, tales grupos no se aprecian claramente.

Los grupos de accesiones que llevan el mismo nombre nativo, en varios casos, forman diferentes grupos de similitud genética dentro de la subespecie andigena . Por ejemplo, existen grupos de accesiones que por su nombre común tienden a agruparse como “Palis o Palas”, “Saqampayas”, “Imillas”, o “Runas”.

Esto permite constatar que las accesiones conservadas a lo largo de muchos años, han mantenido su identidad, como es el caso de esta colección. También se observa que los grupos se entremezclan, lo que se debería principalmente a la hibridación ocurrida en sus sitios de origen y desarrollo, por lo que comparten caracteres similares.

Debido a que existe complejidad en la formación de grupos, la selección de la colección núcleo se realizó de manera conjunta, como un solo grupo, en las 688 accesiones. Además, en el futuro, es necesario complementar las caracterizaciones y evaluaciones agronómicas.

4.4. Construcción de la colección núcleo de las accesiones de la subespecie andigena

4.4.1. Análisis de información molecular y caracteres morfológicos

El método de escalamiento multidimensional (MDS) permitió representar las relaciones entre las accesiones en un plano de dos dimensiones, a través de la utilización de la matriz de similitudes, construida en base al Coeficiente de Jaccard. Se utilizó para ello la herramienta PROXSCAL del programa Pasw Statistics 18.

El resultado del análisis permitió representar a las 688 accesiones, por sus relaciones de similitud genética, en un plano de dos dimensiones, denominadas DIM 1 y DIM 2. La Figura 7 muestra la disposición de las accesiones, con sus nombres respectivos abreviados.

Saqampa yas

Imillas

Palas

Figura 7 . Representación de las accesiones en un espacio común con el método de escalamiento.

En la Figura 7 se marcaron algunos grupos de cultivares para mostrar su ubicación. Se puede ver la orientación de las accesiones dispuesta en el plano. Esta semejanza de distribución en un plano de dos dimensiones, con dos técnicas distintas, escalamiento multidimensional (Figura 7) y coordenadas principales (Figura 6), confirma la consistencia del análisis de ordenación de las accesiones por su similitud genética.

Las coordenadas obtenidas, mediante la herramienta PROXSCAL, sirvieron para relacionar las variables del análisis molecular con otras variables provenientes de las caracterizaciones y evaluaciones. Se realizó un análisis de correlación entre las dos dimensiones (DIM 1 y DIM 2) de cada punto y las caracterizaciones. Se eligieron para su visualización, aquellos caracteres morfológicos que muestran mayor correlación con la diversidad genética revelada en los microsatélites. La correlación se muestra en la Tabla 8 y Figura 8.

Tabla 8. Caracteres de mayor significación en el espacio común de las accesiones

T U B É R C U L O T A L L O F L O R Distribución Forma Color Color Color Profundidad del color Color del general del principal secundario principal de ojos secundario tallo tubérculo de la piel de la pulpa de la flor de la piel Dimensiones FGR POJ CPPL DSCPL CSPL CTL CPF DIM 1 -0.26** 0.44** 0.22** -0.26** 0.19** 0.33** -0.07 DIM 2 -0.04 0.09* 0.13** -0.03 -0.02 -0.01 -0.11**

Los caracteres morfológicos con la mayor correlación en el análisis son 6, en el siguiente orden: profundidad de ojos, forma general del tubérculo, color principal de la piel, distribución del color secundario de la piel, color secundario de la pulpa, color del tallo, y color principal de la flor. La Figura 8, muestra la disposición y tendencia de los 6 caracteres morfológicos en el plano.

Correlación entre caracterización morfológica y el espacio factorial

0.150

0.22, 0.13 ColPPiel 0.100 0.44, 0.09 Saqampayas Imillas ProfOj

0.050

0.000 0.33, -0.01 -0.300 -0.200 -0.100 0.000 0.100 0.2000.19, -0.02 0.300 0.400 0.500 DisCSPiel -0.26, -0.03 ColTall -0.26, -0.04 ColSPul ForTub -0.050

-0.100 Palas -0.07, -0.11 ColPFlor

-0.150

Figura 8. Tendencia de los caracteres más significativos en el espacio común

Se puede ver en la Tabla 8, como en la Figura 8, que la dimensión horizontal o dimensión 1 (DIM 1) lleva la mayoría de los caracteres expresados en el espacio común del análisis. A la derecha del gráfico se encuentran las accesiones con mayor profundidad de ojos, coloración del tallo, coloración principal de la piel, y coloración secundaria de la pulpa del tubérculo.

Hacia la izquierda se hallan las accesiones con una forma del tubérculo más alargada, y una distribución del color secundario de la piel más dispersa. Por otro lado, en la dimensión vertical o DIM 2, se observa que las accesiones con un color más oscuro de la flor se encuentran más hacia abajo del gráfico.

Esta disposición espacial, sugiere que las caracterizaciones molecular y morfológica tienen relación mutua y se complementan entre sí. Por esta razón, ambas caracterizaciones se deben analizar conjuntamente al seleccionar la colección núcleo.

Todos los demás caracteres, de los 29 analizados, mostraron menor y diferente grado de correlación con la información genética expresada en el plano. Sin embargo, ello no sugiere descartarlos para la selección de la colección núcleo, ya que son también informativos, en la medida que expresan la información genética de cada accesión.

4.4.2. Análisis de correlación con las evaluaciones agronómicas

El análisis de correlación con las evaluaciones agronómicas, también ayuda a comprender la colección total. Existe correlación entre la caracterización molecular con la respuesta a algunos factores bióticos y abióticos analizados, aunque existe influencia ambiental en el caso de las evaluaciones agronómicas. La representación de las relaciones genéticas entre accesiones, muestran tendencias que agrupan a las accesiones por sus características morfológicas y su respuesta en las evaluaciones realizadas.

En la Figura 9 se visualiza las correlaciones de 3 evaluaciones agronómicas y de los caracteres morfológicos, en relación al espacio de dos dimensiones. Las accesiones con mayor susceptibilidad a la helada están a la izquierda, en la dimensión 1, y la

36 susceptibilidad a nemátodos es mayor hacia la derecha. Aunque estas correlaciones sugieren una tendencia, se requiere un análisis más detallado de la expresión genética, pues existe una diversidad de respuesta de cada accesión a los diferentes factores evaluados.

Correlación entre caracterización morfológica y evaluacio ne s

0.15

0.22, 0.13 ColPPiel 0.10 0.44, 0.09 -0.23, 0.08 ProfOj HELADA 0.05

0.00 0.01, -0.01 0.33, -0.01 -0.40 -0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.200.19, -0.02 0.30 0.40 0.50 0.60 DisCSPiel GLOB ColTall -0.26, -0.03 ColSPul -0.26, -0.04 0.50, -0.04 ForTub -0.05 NACOB

-0.10 -0.07, -0.11 ColPFlor

-0.15

Figura 9. Tendencia de las evaluaciones agronómicas en el espacio común

Este análisis sugiere que la información preliminar de respuesta a heladas, puede ser de ayuda para encontrar accesiones con mayor tolerancia a este factor. Las accesiones de la subespecie andigena poseen importante información genética como una respuesta a las bajas temperaturas provocadas por el cambio climático. La respuesta a nemátodos sugiere una tendencia, y debe ser complementada mediante evaluaciones, al resto de las accesiones. 4.4.3. Formación de la colección núcleo de la subespecie andigena

La estrategia de muestreo más eficaz para la selección de accesiones, con el mayor número de alelos y el menor número de redundancias, es la llamada estrategia M o de maximización. Al obtener la colección núcleo, se realizó una selección del 100 % de alelos observados, en el menor número de accesiones. Según Kim et al. (2007), este resultado ha

37 sido también obtenido en otros estudios, al conformar una colección núcleo reteniendo el 100 % de alelos con el método de maximización M, con ayuda del programa PowerCore.

La diversidad retenida fue del 100 % de los alelos de las 688 accesiones. Se obtuvo mediante la estrategia M, una colección núcleo de 114 accesiones que retiene todos los alelos de esta colección, así como la diversidad expresada por los caracteres morfológicos y las evaluaciones agronómicas.

En la Figura 10 se muestra la ventana del programa PowerCore, durante la búsqueda de accesiones representativas. Esta búsqueda ha permitido retener la diversidad de los alelos de todo el conjunto de accesiones analizado.

Figura 10. Ventana que muestra el programa PowerCore al realizar la búsqueda mediante el método M de maximización de la diversidad retenida.

La Tabla 10 muestra la lista de las 114 accesiones elegidas con ayuda del programa PowerCore, que permitió asegurar la retención del 100 % de los alelos de la colección original. Son 114 accesiones elegidas con la estrategia de maximización (M), que representa un 16 % del conjunto total de 688 cultivares. En la Tabla 10, además, se señala el origen geográfico, nombre de la accesión, nombre abreviado y código respectivo. 38

Tabla 9. Colección núcleo de 114 accesiones de la subespecie andigena

Depto. Provincia Nombre local Nom.corto COD Depto. Provincia Nombre local Nom.corto COD Cochabamba sin dato PUKA LLOKALLA pukllk1 98 La Paz Pedro Domingo Murillo LARAM LUKI larlu 3798 Cochabamba Tiraque WAYCHA way4 1040 Oruro sin dato ALQA LLUSTA alqll2 179 Cochabamba Cercado ICARI ika5 1042 Oruro Cercado SAQAMPAYA saq12 182 Cochabamba Arque PALA Pa07 2609 Oruro Eduardo Avaroa LEKE leke 1210 Cochabamba Bolívar CHURCA IMILLA chri2 2631 Oruro Tomás Barrón POLONIA poln2 1427 Cochabamba Esteban Arce PIÑU piñu 2653 Oruro Cercado LUNKA IMILLA lunki5 1435 Cochabamba Bolívar PALI Pali3 2676 Oruro Saucarí SAQAMPAYA saq14 1461 Cochabamba Arque CHURCA IMILLA chri1 2716 Potosí Tomás Frías IMILLA NEGRA imin09 1056 Cochabamba Quillacollo sin dato n24 2741 Potosí Chayanta LLUSTA llus2 1207 Cochabamba Chapare YANA CANCHIRI yacan 2747 Potosí Chayanta WILA WAKA LAJRA wiwal7 1257 Cochabamba Arque ARICHUA arich 2759 Potosí Rafael Bustillo YURAJ IMILLA yuim4 1662 Cochabamba Carrasco QOSEÑA qose 2867 Potosí Cornelio Saavedra ALQA PALA alP04 2804 Cochabamba Tiraque RUNA run06 2870 Potosí José María Linares QOYU QOYU goyqy 2812 Cochabamba Narciso Campero SAYRURA PAPA sayru 3129 Potosí Tomás Frías PALTA WAYKU paltw 2996 Cochabamba Tapacarí JANQO COPACABANA jancp 3156 Potosí Chayanta LARAM NAIRA larn2 3221 Cochabamba Carrasco PUKA RUNA pukru1 3772 Potosí Rafael Bustillo KUNU kunu 3247 Cochabamba Tiraque MONO MAQUI mono 3803 Potosí Rafael Bustillo PAPA CHILENA pacl 4847 Cochabamba Bolívar ISLA isl5 3822 Potosí Rafael Bustillo YANA WAYCU yaway 4862 Cochabamba Bolívar CHIYAR IMILLA chii09 3823 Potosí Rafael Bustillo WALLPA JINCHO wallj1 4877 Cochabamba Bolívar MILAGRO mil3 3831 Potosí Rafael Bustillo PHAPHU PAPA phap 4912 Cochabamba Bolívar PALA Pa09 3834 Potosí Rafael Bustillo YURAJ RUNA yurun2 4941 Cochabamba Bolívar MANZANA IMILLA mzni4 3836 Potosí Rafael Bustillo CHILENO chlo 4946 Cochabamba Bolívar CHIYAR IMILLA chii10 3841 Potosí Rafael Bustillo PUCA GOYU pukg 4953 Cochabamba Bolívar WILA IMILLA wiim08 3846 Potosí Rafael Bustillo YANA SAKAMPAYA yasaq2 4954 Chuquisaca Oropeza SULIMANA NEGRA sulimn 2815 Potosí Rafael Bustillo SOLDADITO soldt 4955 Chuquisaca Oropeza PALI PALI PalPi 2818 Potosí Rafael Bustillo MUCU WAYCO mucw 4981 Chuquisaca Yamparáez CAPIRO capi 2830 Potosí Rafael Bustillo CABADA PAPA cabp 4983 Chuquisaca Oropeza sin dato n26 2846 Potosí Rafael Bustillo TENEKEA PAPA tenep 4990 La Paz Omasuyos AMAJAYA amjy1 13 Potosí Rafael Bustillo YURAJ SAKAMPAYA yusaq2 4998 La Paz sin dato KUSI LEULE kusle 17 Potosí Rafael Bustillo WACA LLOCO wallo 4999 La Paz Omasuyos LUNKA IMILLA lunki1 18 Potosí Rafael Bustillo YURAJ IMILLA yuim3 5001 La Paz Omasuyos CHINCHA CHIYAR chich 23 Potosí Rafael Bustillo YANA CHUJLLU yanch 5021 La Paz Aroma GENDARME gen02 35 Potosí Rafael Bustillo LUNKU NATIVIRA lunna 5029 La Paz Omasuyos RUNA run01 157 Potosí Rafael Bustillo YURAJ GOYUGOYU yugg2 5031 La Paz Omasuyos TARAKO tara1 186 Potosí Rafael Bustillo MARCOS PINTARO marco 5038 La Paz Pedro Domingo Murillo RUNA run02 1163 Potosí Alonzo de Ibáñez QOYLLU TAKA qoyta 5168 La Paz Los Andes KUNURARA kunrr 1195 Potosí Alonzo de Ibáñez CHAUCHA chau 5179 La Paz sin dato AJAHUIRI aja1 1283 Potosí Alonzo de Ibáñez YURAC SULIMANA yusul0 5180 La Paz Aroma DURAZNILLO durz1 1298 sin dato sin dato LARAM PALI larPi09 206 La Paz Pedro Domingo Murillo CHIYAR IMILLA chii03 1300 sin dato sin dato YANA LUNKA yalun 1097 La Paz Pedro Domingo Murillo TUNTA IMILLA tunta 1306 sin dato sin dato sin dato n32 1543 La Paz Pedro Domingo Murillo LARAM PALI larPi01 1315 sin dato sin dato WILA WAKA LAJRA wiwal8 2137 La Paz Aroma WILA IMILLA wiim03 1350 sin dato sin dato PALA Pa12 2318 La Paz Aroma ALQA PALA alP01 1525 sin dato sin dato WILA IMILLA wiim11 2380 La Paz Aroma LUNKA ICARI lunic2 1571 sin dato sin dato MALKACHO malk3 2444 La Paz Aroma MAJARILLO maj2 2905 sin dato sin dato PALA Pa13 2524 La Paz Aroma ALQA PALU alPu 2924 sin dato sin dato YURAJ LLUSTA yullust 2561 La Paz Pedro Domingo Murillo sin dato n03 3006 sin dato sin dato KETU ket2 2722 La Paz Pedro Domingo Murillo PALA Pa02 3059 sin dato sin dato CENTEÑA cent 2956 La Paz Pedro Domingo Murillo PUKA ÑAWI pukñ2 3072 sin dato sin dato SAQAMPAYA saq30 2971 La Paz Pedro Domingo Murillo WISLLA PAQUI wispa1 3085 sin dato sin dato LARAM PALA larPa6 2976 La Paz Pedro Domingo Murillo LARAM PALI larPi04 3102 sin dato sin dato sin dato n43 3115 La Paz Aroma WILA WAKA LAJRA wiwal4 3615 sin dato sin dato IMILLA ROSADA imros7 3190 La Paz Aroma sin dato n07 3621 sin dato sin dato PUKA RUNA pukru3 3263 La Paz Aroma CHIYAR ALQA IMILLA chiai05 3644 sin dato sin dato WIRA MALCACHO wirmal 5190 La Paz Aroma MAYRURU mayr 3666 sin dato sin dato MALCACHO MIRKA MAYU malmm 5194 La Paz Aroma sin dato n13 3681 sin dato sin dato AMAJAYA amjy5 5206

La Figura 11 presenta un dendograma visualizando la estructura de la colección núcleo obtenida. Se identifica a las 114 accesiones por su nombre local.

AMAJAYA PALTAW AYKU W ILAW AKALAJRA W ISLLAPAQ UI W ILAW AKALAJRA CHINCHACHIYAR MANZANAIMILLA LARAMPALI LARAMNAIRA KUNURARA LEKE YURAJIMILLA YANASAKAMPAYA ALQ ALLUSTA LARAMPALI LUNKUNATIVIRA W ILAW AKALAJRA PALA KUSILEULE IC ARI C HIYARIMILLA LUNKAIC ARI C HIYARIMILLA ARIC HUA MAJARILLO IMILLANEGRA LUNKAIMILLA LUNKAIMILLA GENDARME YANALUNKA W ILAIMILLA C HIYARALQ AIMILL MAYRURU C ENTEÑA R68 C HIYARIMILLA DURAZNILLO IMILLARO SADA YURAJIMILLA RUNA SAYRURAPAPA SULIMANANEGRA TENEKEAPAPA MARC O SPINTARO MILAGRO YANAW AYC U PUC AGO YU C ABADAPAPA W AYC HA YURAJLLUSTA C HURC AIMILLA AJAHUIRI Q O SEÑA TUNTAIMILLA PALA KETU R79 JANQ O C O PAC ABANA Q O YUQ O YU PO LO NIA R46 YANAC ANC HIRI AMAJAYA LARAMPALA PAPAC HILENA PUKALLO KALLA C HAUC HA PALA ALQ APALA CHILENO PALI ALQ APALU PALA JANQ O C O PAC ABANA ISLA SAQ AMPAYA TARAKO YURAJSAKAMPAYA SAQ AMPAYA SO LDADITO PALA SAQ AMPAYA LARAMLUKI PUKARUNA RUNA LARAMPALI MALC AC HO MIRKAMA MALKAC HO W IRAMALC AC HO R76 PUKARUNA YURAJRUNA LLUSTA R31 W AC ALLO C O C HURC AIMILLA PUKAÑAW I R63 ALQ APALA C APIRO PALIPALI W ILAIMILLA W ALLPAJINC HO PHAPHUPAPA YURAC SULIMANA R54 YANAC HUJLLU KUNU YURAJGO YUGO YU Q O YLLUTAKA MUC UW AYC O PIÑU MO NO MAQ UI W ILAIMILLA RUNA 0.25 0.40 0.55 0.70 0.85 1.00 Similitud (J)

Figura 11. Visualización de la colección núcleo generada de 114 accesiones

Se observa que la colección núcleo, conserva la estructura de la colección original (dendograma de las 688 accesiones, en el Anexo 2). La similitud entre cultivares está entre 0.28 y 0.95, y no se presentan redundancias. Las accesiones con similitud mayor a 0.9,

40 tienen diferencias, según la información de la caracterización morfológica, así como de las evaluaciones agronómicas.

Para la comparación con la colección núcleo en formación, también se generó una colección núcleo al azar, de las 688 accesiones,. Se obtuvo 115 accesiones elegidas al azar, que representan un 16,7 % del total de la población original. La Figura 12 muestra el dendograma de las 115 accesiones elegidas al azar.

CHIARIMILLA IMILLAROSADA IMILLAMORADA IKARI CHIARIMILLA JANQOIMILLA APOSINA CHIARIMILLA QOYLLU JANQOIMILLA CHIARIMILLA IKARI NN MAJARILLO LUNKAIMILLA PAST USA WACASONQO NN ROSADA WILAIMILLA NN WAYCHA PACEÑA SANIIMILLANEGRA SANIIMILLA WILAIMILLA IMILLA WAYCOROJO CAT AHUINEGRO QOYLLOROJO IMILLAROSADA ALQAIMILLA LUNKAICARI SAQAMPAY A ALQA MILAGRO MILAGRO KALULOPAPA GOGOYU PUCAGOGOYU GOYUGOYU PUREKA CHUCHIQOLLU ISLA AMAJAY A CHIARALQA NN KOY U ALQASANI WILAWAKALAJRA PALA SUT AMARIMORADA ABAJEÑA ALQALLUST A LARAMPALI PUKALLOKALLA Y ANAWAYCU SANIIMILLANEGRA Y ANARUNA PALA Y ANACANCHIRI Y ANARUNA WILAIMILLA RUNA SAY RURAPAPA QOYLLU SAQAMPAY A NN SONSAIMILLA WILAT ARAKO CARLOSPAPA PUCAPALT A IMILLAROSADA WACALAJRA CULLIMORADO NN Y URAJLLUST A UMALACHI SAQAMPAY A LUNKUSAQAMPAY A SAQAMPAY A CHOY OHUAY KU WACARANTINA CHAÑOPALI KOSIIMILLA NN PALA JANQOCOPACABANA SUT AMARINEGRO PUKAÑAWI MOROCHA WILAPALI T HANTAWAWA LUNCUPALI SIPANCACHI WILAPALA JANQOPALA NN PALI WILAPALA LLOQALLIT O PALA ALQAPALA ALQAPALI CHOQORUNA Y URAJRUNA RUNA PUKAÑAWI POLONIA QOYUQOYU WILAWAKALAJRA ALQAMARI PALIPALI CAPIRO PHAPHUPAPA Y URAJSULIMANA 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Similitud (J) Figura 12. Colección generada al azar de 115 cultivares de la subespecie andigena .

En esta colección núcleo generada al azar, se puede ver que no se conserva una estructura similar a la de la colección núcleo, debido principalmente a que el muestreo al azar no busca la optimización que se necesita. Su representatividad es reducida, con una pérdida de 74 alelos, de los 247 alelos de toda la colección, lo que resulta en la retención solamente de un 70 % de los alelos. Además presenta mayor redundancia de accesiones, por lo que la información de evaluaciones y caracterizaciones no está representada de manera óptima.

En la Tabla 10 se compara la colección núcleo con la colección original. Se ha calculado el índice de polimorfismo (PIC), la heterocigosidad (H), el rango y número de alelos por microsatélite. El número y el rango de alelos de la colección núcleo y la colección original se han conservado igual. Se ha resaltado en negrilla los valores de la colección núcleo.

Tabla 10. Comparación entre la colección núcleo y la colección original

COMPARACIÓN DE DIVERSIDAD ENTRE LA COLECCIÓN NÚCLEO Y LA COLECCIÓN ORIGINAL INDICES DE LA COLECCIÓN AL AZAR PIC PIC H H N° alelos Rango Cambios Cambios en SSR (Colección (Colección (Colección (Colección (igual en (igual en PIC H en N° de el rango original) Núcleo) original) Núcleo) ambas) ambas) alelos STG0016 0.783 0.779 0.805 0.802 15 137-180 0.774 0.797 11 137-174 STM1064 0.497 0.534 0.553 0.587 7 202-213 0.494 0.552 6 STM5114 0.608 0.631 0.674 0.692 7 302-318 0.609 0.673 6 STM1053 0.498 0.529 0.585 0.605 8 182-214 0.504 0.590 6 182-193 STG0010 0.667 0.717 0.716 0.755 8 177-190 0.655 0.706 6 177-185 STI0001 0.548 0.639 0.614 0.686 12 190-216 0.549 0.614 9 STI0012 0.716 0.750 0.752 0.779 17 173-240 0.706 0.743 10 184-218 STI0032 0.579 0.649 0.644 0.699 9 127-143 0.588 0.650 7 STPoAc58 0.547 0.573 0.589 0.614 8 231-257 0.563 0.604 6 247-257 STM0019 0.629 0.724 0.681 0.755 15 175-251 0.590 0.650 8 175-249 STI0004 0.622 0.675 0.653 0.699 16 92-123 0.606 0.639 9 95-123 STI0033 0.616 0.680 0.644 0.702 16 120-163 0.644 0.675 10 120-163 STM1104 0.831 0.845 0.849 0.861 13 180-198 0.814 0.835 11 183-198 STM1052 0.763 0.802 0.791 0.822 19 201-277 0.772 0.798 8 215-273 STI0014 0.467 0.505 0.519 0.557 6 136-149 0.448 0.499 5 STG0025 0.515 0.524 0.574 0.573 7 121-221 0.526 0.586 5 216-221 STM1106 0.575 0.707 0.591 0.725 13 145-212 0.604 0.624 11 STG0001 0.703 0.743 0.740 0.769 17 136-159 0.706 0.743 12 STM0037 0.823 0.854 0.839 0.865 18 88-133 0.830 0.846 15 88-132 STI0030 0.775 0.800 0.799 0.819 16 101-224 0.777 0.802 12 103-224 PROMEDIOS 0.638 0.683 0.681 0.718 12.4 0.638 0.681 8.7

Los índices de diversidad de la colección núcleo son superiores a los de la colección original, porque se han reducido las redundancias, por lo tanto, las frecuencias alélicas son mayores.

Se puede ver que la representatividad de la colección núcleo, es consistente, considerando que tiene una estructura tan diversa y compleja, como es el caso de la subespecie andigena . La diversidad genética en la colección núcleo se mantiene, y las accesiones representativas retienen el 100 % de los alelos de toda la colección estudiada. Además, se ha reducido la redundancia al mínimo.

La Figura 13, muestra la distribución en un espacio de 3 dimensiones de la colección núcleo resultante. La nube de puntos representa a las 688 accesiones estudiadas, y los nombres abreviados de los cultivares, representan a las 114 accesiones de la colección núcleo, para su mejor visualización en el gráfico. Esta distribución de la colección núcleo en un espacio de 3 dimensiones, se ha visualizado mediante análisis de coordenadas principales, utilizando el programa NTSYSpc.

. . . alqll2 ...... larPi04 ...... marco...... 0.14 . wiwal4...... 0.14 ...... wiwal8...... lunna. . . . . chiai05...... yalun .kusle . wiwal7 . alPu. . . . chii09 wispa1 . . . . mzni4 . . yuim4...... alP04. .. 0.04 ...... kunrr ...... Pa02 . leke...... n24 ...... chii03. . . chich. . . . pacl . tenep...... lunic2. . . .jancp. Pa07 . . . . sayru. . . arich...... mayr. . . . . durz1 ...... yaway . . . . Pali3 . . ... paltw saq14. chloyacan amjy1 .. .imin09 ...... amjy5. pukg . . maj2 -0.05-0.05. C3 ...... Pa12 . . . run01...... chau...... ika5 . .. llus2...... wiim03...... Pa09 .. . chri1 . sulimn...... soldt. . . tunta.. larPa6 . mil3 ..gen02 . yasaq2Pa13. . . . qose yuim3...... pukllk1. . . .chii10...... wiim08...... larn2 ...... lunki5way4 -0.15-0.15 . . . wallo. . yusaq2 .cent. mono. . . . . larPi09...... mucw ... . n13...... pukru3. . poln2...... n43... . qoyta ...... run02...... saq12 . isl5. . yullust. . . lunki1 ...... n32 . . . . alP01 .. .piñu ...... cabpn03 . . . -0.37-0.37. . kunu . . pukñ2 ...... -0.25-0.25-0.31-0.31. imros7 . C1 . yugg2aja1.-0.24-0.24. . wallj1 . tara1. .. ket2 . . phap. -0.21-0.21 . . -0.11-0.11.. run06. . . . n26 . 0.02 . . larlu . . . . yanch -0.10 C2 0.02 wirmal. . ... -0.10 0.15 . . . wiim11 . . PalPi. . .. 0.00 ...... saq30 0.11 . ... chri2. . capigoyqy . . . . malk3 . . malmm yurun2. . . . pukru1 n07 yusul0 . larPi01......

. Figura 13. Distribución de la colección núcleo de la subespecie andigena .

La Figura 13 muestra la disposición de las accesiones en el espacio, con el eje 3 dispuesto en forma vertical. Para mostrar otra perspectiva de esta distribución, en la Figura 14 se ve el mismo gráfico con la disposición del eje 3 inclinado hacia el frente.

. 0.14 ...... larPi09. . 0.04 . . . . . -0.05-0.05 C3 . larn2 ...... -0.15-0.15 . . . . . -0.37-0.37 . ..lunic2 . . . . C1 . . . chii09.chii03.. . . -0.24-0.24 . -0.25-0.25-0.31-0.31 ...... -0.11-0.11 . kusle...... 0.02 . alPu . . . . . 0.15 . . . . . ika5 . Pali3wiwal4. ..jancp ...... wiwal8...... kunrr .. . . -0.21-0.21 . . .wispa1...... alP04 . lunki1...... sayru . chiai05...... yasaq2...... maj2 ...... lunna . . alqll2. . arich. . . . . chich .. Pa12 .leke ...... Pa02...... imin09. . n32 ...... C2 ...... wiim08...larPi04mayr.pukg. qose . . . . -0.10-0.10. C2 ...... wiwal7. . . .marco. yalun mzni4...... wallollus2.yuim4...... paltw . . .. . pacl.. . . lunki5run01.. wiim03durz1 ...... chii10...... run06...... gen02 ...... Pa09PalPi . n03 . . wallj1 ...... yullust. chri1. amjy1...... Pa07... tunta. pukllk1. .. cabp .. .. n43 . 0.00 . . . .. n24...... centmonosulimn ...... isl5... .chlo...... way4 . pukñ2 .. .. .yacan...... run02Pa13. . . ..amjy5yugg2 . .. . mil3...... mucw. . . chau kunu. . .saq14...... poln2 . . .tenep..yuim3.. yaway . larPa6 .. . . n13...... tara1. pukru3. . . .ket2 ...... 0.11 soldt ...... wiim11 .. . . saq12 yusaq2 ...... chri2 alP01goyqy.larlu . qoyta...... aja1 ...... capi...... wirmal...... saq30 . n07 . . imros7 ...... pukru1 yurun2 piñu phap yanch . . malmm . n26 . larPi01 . . . .. malk3 yusul0......

Figura 14. Distribución de las 114 accesiones de la colección núcleo.

En las Figuras 13 y 14, se observa que la colección núcleo obtenida, se distribuye entre toda la colección de manera amplia, explicando su representatividad.

La presente colección núcleo de 114 accesiones, representa un 16 % de las accesiones de la colección original. Huamán et al . (2000), también reportan la selección de una colección núcleo de la subespecie andigena , de accesiones provenientes de Bolivia. Indican que se

44 obtuvo una colección núcleo, que representó en un 17 % a un grupo de accesiones bolivianas de la subespecie andigena . En dicho trabajo, la caracterización se basó en un análisis con isoenzimas, en el banco de germoplasma conservado en el Centro Internacional de la Papa.

Este porcentaje de accesiones elegidas, señala la alta diversidad de la subespecie andigena en las accesiones bolivianas. También se confirma la importancia de conocer la diversidad de la subespecie andigena , conservada en el germoplasma de Bolivia. Esta diversidad debe promoverse y utilizarse en los programas y estrategias de mejoramiento genético

Esta alta diversidad también se verifica, al haberse encontrado un grupo reducido de probables duplicados. Se han encontrado 4 grupos con una similitud mayor a 0,98 dentro de cada grupo en la colección original de 688 accesiones. Cada grupo tiene entre 2 a 4 accesiones, siendo en total 12 accesiones. Sin embargo se debe constatar la duplicación, con la caracterización morfológica en campo, y de pasaporte. En Tabla 11 se ve la lista de las accesiones identificadas como probables duplicados.

Tabla 11 . Lista de accesiones con probable duplicidad

Grupo de Accesiones Departamento Provincia Nombre local similitud 1 Oruro ^ IMILLA NEGRA 1 2 Cochabamba Tapacarí IMILLA NEGRA 1 3 Potosí Rafael Bustillo YANA IMILLA 1 4 La Paz Aroma LUNKA ICARI 2 5 La Paz Aroma CHIYAR IMILLA 2 6 La Paz Aroma LUNKA 2 7 Cochabamba Bolívar LUNKU TAQUIÑA 2 8 La Paz Pedro Domingo Murillo CHIYAR IMILLA 3 9 Potosí Tomás Frías IMILLA ROSADA 3 10 La Paz Ingavi WILA YAKU 3 11 Potosí Tomás Frías YANA QOYLLU 4 12 Cochabamba Chapare CATAHUI NEGRO 4

La información genética proveniente de las caracterizaciones morfológica y molecular, señala la alta diversidad de la subespecie andigena en esta colección. Las evaluaciones agronómicas contienen la información de la riqueza genética de la colección, sin embargo

45 tienen diferente grado de influencia de los factores ambientales, como es el caso de la respuesta a heladas.

Por lo tanto, en la formación de la colección núcleo, la caracterización molecular es la base inicial para formar la colección núcleo. Luego, la caracterización morfológica será complementaria para esta selección, porque contiene información genética complementaria a la información genética proporcionada por los 20 microsatélites.

La colección núcleo, debe complementarse con accesiones adicionales que sean de interés para fines como el mejoramiento y su utilización por el agricultor. Además, existen diferentes necesidades en condiciones del agricultor que enriquecerán la colección núcleo.

Posteriormente, la colección núcleo necesitará ser validada, mediante evaluaciones agronómicas y moleculares. Por ejemplo, pueden utilizarse marcadores moleculares asociados a caracteres de interés. La validación permitirá realizar ajustes, o modificaciones parciales, ya sea al tamaño o la composición de la colección núcleo. Esto hará que la colección en conjunto sea más dinámica y mejor conservada.

Por otra parte, en base a las caracterizaciones molecular y morfológica, y con la información de diferentes evaluaciones agronómicas, es posible plantear la construcción de colecciones temáticas. Esta selección se realizaría seleccionando aquellas accesiones representativas para un carácter o conjunto de caracteres de interés, teniendo la información correspondiente de las accesiones. Algunos usos posibles de una colección núcleo son descritas para facilitar el manejo y utilización del germoplasma conservado, en el Anexo 3 (van Hintum et al ., 2005).

La selección realizada para conformar la presente colección núcleo, incluyendo a las técnicas y criterios utilizados, podrá servir de base para fortalecer la gestión y utilización de los recursos genéticos de este cultivo. Es importante considerar que a medida que se vaya complementando las evaluaciones agronómicas y caracterizaciones al germoplasma, la dinámica de la presente colección será fortalecida.

5. CO!CLUSIO!ES

- Se ha complementado la caracterización molecular de 688 accesiones de la subespecie andigena de papa, mediante 20 marcadores microsatélite.

- Existe una alta diversidad genética de la subespecie andigena en las accesiones bolivianas. El análisis mediante 20 microsatélites confirmó esta diversidad. Las accesiones mantienen su identidad genética y se muestra una tendencia a formarse grupos de similitud. Sólo se ha encontrado 4 casos eventuales de probable duplicidad.

- Se ha construido una colección núcleo a partir de 688 cultivares bolivianos de papa de la subespecie andigena , basándose en la caracterización molecular, complementada con la caracterización morfológica y evaluaciones agronómicas. Se obtuvo una colección núcleo de 114 accesiones (un 16 % del total) mediante la estrategia M, maximizando la diversidad retenida, utilizando las herramientas del programa PowerCore. Un 100% de los alelos y la diversidad de los caracteres morfológicos fueron retenidos en la colección núcleo obtenida.

- Existe correlación entre la estructura genética de las accesiones con varios caracteres morfológicos, principalmente del tubérculo. Ello posibilitará seleccionar grupos de accesiones para organizar la colección. Las evaluaciones agronómicas deben complementarse para el resto de las accesiones, para optimizar su conocimiento.

6. RECOME!DACIO!ES

- Es necesario caracterizar y evaluar de manera complementaria las accesiones no incluidas en este estudio, a fin de enriquecer la colección núcleo de la subespecie andigena .

- Por su importancia, como alimento prioritario en Bolivia y el mundo, se recomienda que la colección núcleo obtenida sea utilizada y validada por el I.N.I.A.F., para optimizar el manejo y conservación de germoplasma de papa.

- Se sugiere profundizar en el uso de las diferentes herramientas técnicas y de análisis de la diversidad genética de papa, para utilizarlas en la búsqueda y conocimiento de caracteres de interés.

- Se debe realizar colectas de papa cultivada, incluyendo a la subespecie andigena , para enriquecer la diversidad genética conservada. Esta y otras acciones deben ser parte de las estrategias nacionales de conservación in situ y ex situ de este cultivo.

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A!EXOS

Anexo 1 . Lista de iniciadores de los 20 microsatélites utilizados

Motivo de !ombre Secuencias de los iniciadores T° a repetición STM5127 (TCT)n TTCAAgAATAggCAAAACCA CTTTTTCTgACTgAgTTgCCTC 55 (60)

STG0016 (AGA)n AgCTgCTCAgCATCAAgAgA ACCACCTCAggCACTTCATC 55 (53)

STM1064 (TA)n (TG)n GT gTTCTTTTggTggTTTTCCT TTATTTCTCTgTTgTTgCTg 55 (55) (TG)n STM5114 (ACC)n AATggCTCTCTCTgTATgCT gCTgTCCCAACTATCTTTgA 60 (57)

STM1053 (TA)n (ATC)n TCTCCCCATCTTAATgTTTC CAACACAgCATACAgATCATC 53 (53)

STG0010 (TG)n CgATCTCTgCTTTgCAggTA gTTCATCACTACCgCCgACT 60 (55)

STI0001 (AAT)n CAgCAAAATCAgAACCCgAT ggATCATCAAATTCACCgCT 60 (55)

STI0012 (ATT)n gAAgCgACTTCCAAAATCAgA AAAgggAggAATAgAAACCAAAA 56 (55)

STI0032 (GGA)n TgggAAgAATCCTgAAATgg TgCTCTACCAATTAACggCA 61 (60)

STPoAc58 (TA)n TTgATgAAAggAATgCAgCTTgTg ACgTTAAAgAAgTgAgAgTACgAC – (57)

STM0019 (AT)n (GT)n AATAggTgTACTgACTCTCAATg TTgAAgTAAAAgTCCTAgTATgTg – (47) (AT)n (GT)n (GC)n (GT)n STI0004 (AAG)n GCTgCTAAACACTCAAgCAgAA CAACTACAAgATTCCATCCACAg 60 (55)

STI0033 (AGG)n TgAgggTTTTCAgAAAgggA CATCCTTgCAACAACCTCCT 61 (60)

STM1104 (TCT)n TgATTCTCTTgCCTACTgTAATC CAAAgTggTgTgAAgCTgTgA 53 (57) g STM1052 (AT)n GT (AT)n CAATTTCgTTTTTTCATgTgACA ATggCgTAATTTgATTTAATACgTA 50 (52) (GT)n C A STI0014 (TGG)n (AGG)n AgAAACTgAgTTgTgTTTgggA TCAACAgTCTCAgAAAACCCTCT 54 (55)

STG0025 (AAAC)n TggAATCCgAATTACgCTCT AggTTTTACCACTCgggCTT 56 (55)

STM1106 (ATT)n TCCAgCTgATTggTTAggTTg ATgCgAATCTACTCgTCATgg 51 (55)

STG0001 (CT)n CAgCCAACATTTgTACCCCT ACCCCCACTTgCCATATTTT 58 (52)

STM0037 (TC)n (AC)n AA AATTTAACTTAgAAgATTAgTC ATTTggTTgggTATgATA 52 (53) (AC)n (AT)n TC STI0030 (ATT)n TTgACCCTCCAACTATAgATTC TgACAACTTTAAAgCATATgTCAg 58 (60) TTC C Fuente: Spooner et al . (2007)

Anexo 2 . Dendograma de las 688 accesiones estudiadas. (por partes, en próximas páginas)

imb09mzn1 wiim14chej wiim15 imro18n31 swiim21 ani09 s ani05ani16 s ani07ani02 s ani12ani08 mora1 sann1cen n23sonsi2 chii22pukñ5 mzni1pas t chii14mzni2 chii21 immchii30 En esta página, se chii12lunic2 luntq2lunk1 ika10imro07 chii09lunk3 red wiyakimro13 chii15chii06 visualiza el imro10lunk4 n03ika02 apochii08 n35 ika15maj7 alqi04imb07 maj1chii33 chii28s ani04 dendograma del total chii16 gen04 chii17 chii20 ika11 chl2chii13 chii31imro06 imb11chii26 maj8 de las 688 accesiones alqi08s ikin1 lunim7imro03 chii24maj3 qoy2s in08 imb05chii02 ika16 imro21chii03 chii01n21 ika03ika07 lunic1n36 chii07lunim1 yuim3 machmaj2 alqi15ika04 chii18alqi02 kustunti2 le lekp1ari3 ari1 chl1n48 gen10gen05 gen11lunim2 gen07is l09 chepis l11 pac2 alqi03mzni4 durz4mzni5 sph2 urim1 khuchppoim im1 yasimro17 ul chiai12chuj karschiai02 u wilaqi1luni lunim5is l13 alqi10 is l06 chiai08 chiai06chiai15 chialqis l14 lunim3chiai11 ischiai05 l08 alqi19 chiai03chiai07 lunim8chs 1 alqi09is l12 millusanPa2 lunnasonsi3 coni5 im6amj1 imro20wiim20 wiim03wiim24 wiim08im5 way2pukpc1 way1 wariquer teke1pac3 larlwiim10 yaqoy3wiim22 qoyrcat wayr yatakchalo colllqallp collrn40 chsmalk7 2 pukPa3 lunim6ros d2 teke3saq36 chii25waso1 im3tunti1 coni1n12 luk Pa17lloqt1 mamt1mamt0 alcqwiim02 alchcurch salm2 in12 janP1 mil8poln1 mil5mil2 kalupukñ1 n47paru koy2poli gog alqcabp conchchoj goy1pucgo2 yugg1pukgg1 phapukg wacla1 rosmem1 d1 ata1jatps i way5n33 wiim23n14 wila2 n24s ulim0 n55n58 toral2sachp Palbket2 larsros a u2 run10 mayramj2 Pa20negJ maj5pukñ10 canb1chai yanchn27 imro19 kunkol compucor pukt03pukt00 sis ichim o2 qoytawilca mosc1 wiscullm ut3 corchpucwg1 tara4carp2 taran2palch4 chap1witar1 pucpa tara2imro15 sn53 in11 sonsi1wacla4 ika17arg n44 yuim4yullu2 saq02pukllk1 n09s in19 allpn52 yawayyarun5 cuch3 añin29 amj4wakñ2 srun02 ailu s ulimnayru schich in09 laraq chejPpitw3 dom2Palp wiwal2polo2 wiwal3Pa03 PalrswiP16 2 wacla3 wiwal10yuwlaj1 wiwal6kuch wispa1wacla2 yuwlaj2pukñ3 wiwal12wiwal7 alp03 wiP01ros tm Pa09yaPa1 larn6jann n41 pukllk1 wiP18 swiP29 ipa2 wiP19 larP07pukPa1 saq52larn4 wiP28larP10 larsllus u3l wikPa larP16janP6 larP18larP03 thawa1lunP wilP00wiP33 lluslars u12 larP19 larn5wis ut1 larn3yaPa2 larP09larn2 Pa12morch sPa26 ulamn n18 katakellP yaslarn1 ut leksalam skunrr1 ultu qoy1s urim3 larP15 alpipure stiris uta5 sesen38 llusmuyQ4 1 ket1yullu1 canb2 ispukt02 l01 candmzn3 imro22amj3 imro16chuq chii27 samj7 ipa3 larP01wiim09 llamrs uta2 n28wiP30 larP14Pa05 alp12 sjalp ipa4 ssanPa1 alla spit2 utamo n06pit1 qomsabj4 alql2 yuim1alp10 alql1kus ill larP05palch1 wispa3s ulim1 marc2totor waso3 lechpalch2 waso2palch3 lloq2lloqt2 pukllk5pukllk3 saq10 larP04 lekp3 yalunPa18 n62lojim smula ani11 che1pacl wiP02pukllk4 wiP25 alp05Pa22 wiP15Pa31 wiP31wiP04 wiP10Pa15 n46 Pa33wiP20 Pa32wiP12 larP08pucPal wiP23s utan lluscrir 3 wiP11 lekp4janP3 alp08wilaqP alp11qalu abj1alp09 yarichl3 Paltw saq57umal saq01yullu4 saq34saq45 saq33wilaj yusaq2jans u saq46 tara1saq27 saq28saq14 saq42saq59 chowaysaq41 saq61wacar n30 saq55pucsq lunssaq25 q saq60saq56 saq21 saq50 saq29 yusaq1saq15 saq06n10 ssaq17 oldt koy4yasaq1 chchaja3 s in02 n13goy2 koschap2 i warspukru4 y1 yuim5Pa01 yasaq2jach gen16 saq05n20 lambnsaq16 wuarulloqt3 larP11n16 wiP22Pa14 cica ph3pukllk2 saq49gallr cuch1polo1 amj5yarun1 copa1paam yacan yarun4mors q Pa10amj8 n25abj3 riñpolo4 larq n59larP17 yaggn32 tenepkoy1 alp06chau wiwal4s ani03 pucwg2 mzn4jancp Pa27is l10 akrn39 janP5 yurun1 run07runk n45 laj1pukru3 run15s anru1 wallon11 run03pukñ8 chor3run06 yurun4 way3pukru2 tanthwila4 chui2wiwal13 chii11pukñ2 yarun2 qors s in15 im4aja2 larP02imro11 malmmalk4 n50malk8 wirmalmalk1 tuffm n54alm1 yullu5alqs chui1sonsi4 pukchpukPa2 im9 noenucl qoswitar2 e wiim17mono saq35Pa06 durz6s ani01 puchi yugg2mucw aja1Pa02 mil7poln5 chinn17 chipwpitw4 alp04 caps in04 wisPalP ut2 wansu thawa2 yuspuchs ul2 yuspucppr ul3 s ulim2 yusphap ul1 wallj2wallj1 Palmrun11 wipigoy3 wiwal11n34 Pa28 mora2 0.25 0.40 0.55 0.70 0.85 1.00 Similitud (J)

Anexo 2 . Dendograma de las 688 accesiones estudiadas (Por partes, parte 1 de 6)

AMAJAY A IMILLA WILA-IMILLA WILA-IMILLA PUKA-IMILLA WILA-IMILLA WILA-IMILLA IMILLA PUKA-PACEÑA LARAM-LUKI WAYCHA WAYCHA QUERET A WARICIA PACEÑA T AKENDAMA WILA-IMILLA WILA-IMILLA Y ANA-QOY LLU C AT AHUI-NEGRO QOY LLO-ROJO WAY CO-ROJO C HAUPI-LOMEÑO Y ANA-T AKA KUSI-LEULE ARICHUA LUNKA-IMILLA IMILLA-NEGRA Y URAJ-IMILLA MAJARILLO MACHU-QOY U ICARI LUNKA LUNKA-ICARI C HIY AR-IMILLA LUNKA LUNKU-T AQUIÑA IMILLA-MORADA IMILLA-ROSADA C HIY AR-IMILLA REDONDEÑA IMILLA-NEGRA IMILLA-NEGRA Y ANA-IMILLA C HIY AR-IMILLA IMILLA-ROSADA WILA-Y AKU C HIY AR-IMILLA LUNKA IMILLA-ROSADA ICARI SIN-NOMBRE IMILLA-NEGRA APOSINA SIN-NOMBRE MAJARILLO ICARI WILA-WAKA-LAJRA IMILLA-BLANCA ALQA-IMILLA C HIY AR-IMILLA MAJARILLO SANI-IMILLA Y ANA-IMILLA C HIY AR-IMILLA C HIY AR-IMILLA GENDARME IMILLA-NEGRA ICARI IMILLA-NEGRA C HILENA IMILLA-ROSADA Y ANA-IMILLA IMILLA-NEGRA IMILLA-BLANCA MAJARILLO SIKINCHILLA ALQA-IMILLA IMILLA-ROSADA LUNKA-IMILLA MAJARILLO IMILLA-NEGRA SIN-NOMBRE QOY LLU IMILLA-NEGRA IMILLA-BLANCA ICARI C HIY AR-IMILLA PUKA-IMILLA SIN-NOMBRE C HIY AR-IMILLA ICARI ICARI SIN-NOMBRE LUNKA-ICARI ICARI C HIY AR-IMILLA ALQA-IMILLA ALQA-IMILLA T UNTI-IMILLA LEKE-PEKE ARECHOA SIN-NOMBRE C HILENA GENDARME GENDARME LUNKA-IMILLA GENDARME ISLA GENDARME ISLA DURAZNILLO MANZANA-IMILLA C HEJCHI-PACEÑA PACEÑA MANZANA-IMILLA 0.25 0.40 0.55 0.70 0.85 1.00 Similitud (J)

Anexo 2 . Dendograma de las 688 accesiones estudiadas (parte 2 de 6)

ALQA-IMILLA SURIMANA PHIÑU KHUCHIC HUPA POCO-IMILLA CHIY AR-ALQA-IMI CHIY AR-ALQA-IMI LUNKA-IMILLA CHIY AR-ALQA-IMI ISLA ALQA-IMILLA CHIY AR-ALQA-IMI CHIY AR-ALQA-IMI CHIY AR-ALQA-IMI KARA-SULLU LUNCU-IMILLA WILA-ALQA-IMILL ISLA LUNKA-IMILLA ALQA-IMILLA ISLA CHIY AR-ALQA-IMI CHIY AR-ALQA-IMI CHIY AR-ALQA-IMI ISLA CHIY AR-ALQA CHEST IRI LUNKA-IMILLA ISLA ALQA-IMILLA SANI-PALI MILLU IMILLA PUCA-IMILLA Y ANA-SULIMANI CHUJU LUNKU-NAT IVIRA SONSA-IMILLA CONDOR-IMILLA CENTEÑA SANI-IMILLA SANI-IMILLA SANI-IMILLA SANI-IMILLA SANI-IMILLA SANI-IMILLA SANI-IMILLA MORA-PAPA SANI-IMILLA-NEG MANZANA IMILLA-BLANCA CHEJTIRI WILA-IMILLA WILA-IMILLA SIN-NOMBRE PUKA-IMILLA WILA-IMILLA WILA-WAKA-LAJRA SONSA-IMILLA SIN-NOMBRE PUKA-ÑAWI Y ANA-IMILLA PAST USA MANZANA-IMILLA MANZANA-IMILLA SIN-NOMBRE QALLPA COLLAREJA-LARGA COLLAREJA-REDON MALKACHO CHEST IRI PUKA-PALI ROSADA LUNKA-IMILLA SAQAMPAY A T EKENDAME VAKA-SONQO IMILLA-NEGRA T UNTA-IMILLA IMILLA SIN-NOMBRE CONDOR-IMILLA LUKI LLOKALLIT U PALA T HALLA-MAMA MAMA-T 'ALLA WILA-IMILLA ALCA-CHAQUI CURTI-C HUMPI ALCA-CHAQUETA JALCKAMARI SIN-NOMBRE PUCA-GOY U PUCA-GOYU-GOYU Y URAJ-GOY U-GOY U PUCA-GOGOYU GOY U-GOY U PHANA CONDOR-CHUCHULI WAKA-LAJRA CABADA-PAPA PUKA-ÑAWI KALULO-PAPA SIN-NOMBRE PAPA-RUNA KOY U POLINA GOGOYU JANQO-PALA POLONIA MILAGRO MILAGRO MILAGRO ALQA CHOJLLU-NEGRO 0.25 0.40 0.55 0.70 0.85 1.00 Similitud (J)

Anexo 2 . Dendograma de las 688 accesiones estudiadas (parte 3 de 6)

WAY CHA SIN-NOMBRE WILA-IMILLA WILA MEMBRILLA ROSADA JAT UN-PUKA-SIKI ATACAMA SIN-NOMBRE KETU PALU-BLANCO ROSA LARAM-SUT AMARI SIN-NOMBRE SIN-NOMBRE SIN-NOMBRE SAC HA-PAPA T ORALAPA SOLIMAN MAY RURU AMAJAY A NEGRA-JALQA PALA PUKA-ÑAWI RUNA MAJARILLO CHAÑI-IMILLA SIN-NOMBRE Y ANA-C HUJLLU CANAST ILLA-BLAN KUNU PUKA-IMILLA KOLI PUCA-C ORTE COMELO POCO-TACA PUCA-T ACA QOY LLU-T AKA ISOKAÑA SICHA-IMILLA WILA-C ANAST ILLA MOSCARI CULLI-MORADO IMILLA-ROSADA T ARAKO WILA-SUT AMARI PUCA-WACA-GALLU KORI-CHUMPI CARLOS-PAPA T ARAKO PAPA-LECHE T ARAKO-NEGRO WILA-T ARAKO CHAÑU-PALI PUCA-PALT A SIN-NOMBRE SIN-NOMBRE WILA-WAKA-LAJRA WAC A-LAJRA SONSA-IMILLA ARGENTINA IKARI SIN-NOMBRE Y URAC -LLUST HA Y URAJ-IMILLA PUKA-LLOKALLA SAQAMPAY A SIN-NOMBRE Y ANA-WAY CU SIN-NOMBRE ALLPAC HU Y ANA-RUNA CUCHI-C HUCHULI SIN-NOMBRE SIN-NOMBRE AÑIL WAKA-ÑUÑU AMAJANA RUNA SAILULA SAY RURA-PAPA SULIMANA-NEGRA CHINCHA-CHIY AR SIN-NOMBRE LARAM-ALQA-KOLL CHEJCHI-PALA PIT U-WAY AKA PALA-PANCHA DOMINGUILLO WILA-WAKA-LAJRA WISLLA-PAQUI WILA-WAKA-LAJRA KUCHI-AKIT A WILA-WAKA-LAJRA WAKA-LAJRA WAKA-LAJRA Y URAJ-WACA-LAJR WILA-PALA PALI-ROSADO PUKA-ÑAWI Y URAJ-WACA-LAJR WILA-WAKA-LAJRA POLO PALA WILA-WAKA-LAJRA WILA-WAKA-LAJRA ALQA-PALI ROSAS-T IKA-MORA LARAM-PALI PALI LARAM-NAIRA JANQO-NAIRA SIN-NOMBRE WILA-PALI WILA-PALA SIPANCACHI 0.25 0.40 0.55 0.70 0.85 1.00 Similitud (J)

Anexo 2 . Dendograma de las 688 accesiones estudiadas (parte 4 de 6)

WILA-PALA LARAM-PALA PUKA-PALA LARAM-NAIRA SAQAMPAY A LARAM-PALI WILA-PALA LLUST HA-LARAT I LARAM-SUT AMARI WIKI-PALI LARAM-PALA PALI-BLANCO LARAM-PALI LUNCU-PALI T ANTA-WAWA WILA-PALI MORADO-PALI LARAM-SUT AMARI LLUST HA LARAM-PALI WILA-SUT AMARI LARAM-NAIRA Y ANA-PALI LARAM-NAIRA LARAM-NAIRA LARAM-PALI MOROC HA PALA PALA SULAMAN-NEGRA SIN-NOMBRE KELLU-PALI KAT AWIÑA LARAM-NAIRA Y ANA-SUT AMARI WILA-PALA Y ANA-PALI KUNURARA LEKE SALAMANI SULT UMA SURIMANA QOY LLU ALQA-LLUST A ALQA-PALI Y URAJ-IMILLA LARAM-PALI KUSILLI ALQA-LLUST A SALLAMA PIT IKALLA SUT AMARI-MORADA SIN-NOMBRE PIT IKALLA ABAJEÑA QOMER-SOLDADO MARCOS-PINTARO WILA-WAKA-LAJRA T OT OREÑA WACA-SONQO WISLLA-PAQUI PAPA-LECHE SULIMANA LECHE-PAPA PAPA-LECHE WACA-SONGO PAPA-LECHE LLOKALLIT O LLOQALLA PUKA-LLOKALLA PUKA-LLOKALLA SAQAMPAY A LARAM-PALI PALA LEKE-PEKE LARAM-PALI ALQA-PICHUYA PUREKA T IRI-SIKI SUT UMARI SIN-NOMBRE SESERANI MUY ON-QOY LLU LLUST A Y URAJ-LLUJIT A KET U C ANAST ILLA-BLAN ISLA PUCA-TACA MANZANA C ANA-DURAZNO AMAJAY A PUKA-IMILLA C HUCHI-COLLU PUCA-IMILLA Y ANA-IMILLA AMAJAY A SIPANCAC HI WILA-IMILLA LARAM-PALA SUT UMARI LLAMA-RUNTU WILA-PALI SIN-NOMBRE PALI LARAM-PALA ALQA-PALA JALQA-PAPA SIPANKACHI SAN-PALI Y ANA-LUNKA LOJRU-IMILLA SIN-NOMBRE MULA-RANTINA SANI-IMILLA PAPA-C HILENA 0.25 0.40 0.55 0.70 0.85 1.00 Similitud (J)

Anexo 2 . Dendograma de las 688 accesiones estudiadas (parte 5 de 6)

C HEJCHI PUKA-LLOKALLA LLUST A WILA-PALA JANQO-PALA LEKE-PEKE WILA-ALQA-PALA PALI WILA-PALI WILA-PALI SIN-NOMBRE WILA-PALI WILA-PALI WILA-PALA PALI WILA-PALA PALI PUCA-PALI LARAM-PALA SUT AMARI-NEGRO ALQA-PALU WILA-PALI PALI PALI WILA-PALI WILA-PALI C RIOLLA-RUNA ALQA-PALA ALQA-PALA QALULI ALQA-PALI ABAJEÑA C HILENO PALT A-WAY KU Y ARI SAQAMPAY A T ARAKO SAQAMPAY A SAQAMPAY A SAQAMPAY A SAQAMPAY A SAQAMPAY A SAQAMPAY A C HOY O-HUAY KU WACARANTINA SAQAMPAY A SIN-NOMBRE PUCA-SAKAMPAY A SAQAMPAY A SAQAMPAY A LUNKU-SAQAMPAY A SAQAMPAY A SAQAMPAY A Y URAJ-SAKAMPAY A JANQO-SULT UMA SAQAMPAY A Y URAJ-LLUJTA WILA-WAKA-LAJRA SAQANPAY A SAQAMPAY A SAQAMPAY A WILA-AJAHUIRI SAQAMPAY A SAQAMPAY A SAQAMPAY A SAQAMPAY A Y URAJ-SAKAMPAY A SOLDADIT O SAQAMPAY A Y ANA-SAKAMPAY A KOY U AJAHUIRI SAQAMPAY A SIN-NOMBRE C HINCHILLA SIN-NOMBRE QOYO-QOYO SIN-NOMBRE PUKA-RUNA WARISAY A C HAÑU-PALI KOSI-IMILLA UMA-LACHI SAQAMPAY A PALA Y URAJ-IMILLA Y ANA-SAKAMPAY A JACHA-CHOJU PALA WILA-PALA GENDARME SIN-NOMBRE SAQAMPAY A SAQAMPAY A LAMBRAME-NEGRO LLOKALLIT O WUARUNTO SIN-NOMBRE LARAM-PALI C ICA PIÑU PUKA-LLOKALLA GALLU-RUNTU SIN-NOMBRE POLO RIÑON-DE-VACA Y ANA-CANCHIRI MORADO-SAKAMPAY AMAJAY A Y ANA-RUNA SAQAMPAY A C UCHI-CHUCHULI POLO Y ANA-RUNA AMAJANA C OPAC ABANA 0.25 0.40 0.55 0.70 0.85 1.00 Similitud (J)

Anexo 2 . Dendograma de las 688 accesiones estudiadas (parte 6 de 6)

PAPA-AMAJANI PALA ABAJEÑA LARAM-PALA SIN-NOMBRE LARAM-QAT I SIN-NOMBRE Y ANA-GOYU-GOYU T ENEKEA-PAPA KOY U CHAUCHA PALA SIN-NOMBRE JANQO-COPACABAN MANZANA ALQA-PALA SANI-IMILLA WILA-WAKA-LAJRA PUCA-WAC A-GALLU ISLA RUNA RUNA SIN-NOMBRE WACA-LLOCO PUKA-ÑAWI SIN-NOMBRE RUNA LAJMU Y URAJ-RUNA RUNA-KALA PUKA-RUNA SANI-RUNA RUNA LARAM-PALI MALKACHO MALCACHO-MIRKA- MALKACHO SIN-NOMBRE MALKACHU WIRA-MALCACHO T UFFO-MALCAC HO C HURCA-IMILLA PUKA-ÑAWI PUKA-RUNA Y URAJ-RUNA C HOQO-RUNA WAYCHA WILA T ANTHA WILA-WAKA-LAJRA C HIY AR-IMILLA Y ANA-RUNA C ORI-SONGO SIN-NOMBRE AJAHUIRI IMILLA IMILLA-ROSADA WILA-WAKA-LAJRA AKARAPI JANQO-PALA Y URAJ-LLUST A C HURCA-IMILLA SONSA-IMILLA ALQA-MARI SIN-NOMBRE ALQA-SANI PUKA-PALA PUKA-C HASC AÑAWI IMILLA NUCLO QOSEÑA NOELIA WILA-T ARAKO MONO-MAQUI WILA-IMILLA MUCU-WAY CO Y URAJ-GOY UGOY U PUCA-CHIT O PALA SAQAMPAY A SANI-IMILLA DURAZNILLO PALA AJAHUIRI MILAGRO POLONIA SIN-NOMBRE C HINOLI(REVOLUC ALQA-PALA C APIRO SIN-NOMBRE C HIY AR-PIT U-WAY PIT U-WAY AKA PALI-PALI WILA-SUT AMARI WALLPA-JINCHO WALLPA-JINCHO PHAPHU-PAPA Y URAC-SULIMANA Y URAJ-SULIMANI PUCA-CHAÑA-SULI Y URAJ-SULIMANI PUCA-PUCU-PUCU- SULIMANI WANKO-SULLU T HANTA-WAWA RUNA QOYU-QOYU PALAMA SIN-NOMBRE WILA-PICHUY A WILA-WAKA-LAJRA PALA MORA-PAPA 0.25 0.40 0.55 0.70 0.85 1.00 Similitud (J)

Anexo 3. Ejemplos de formas de utilizar una colección núcleo (van Hintum et al ., 2005) Formas de uso de la Actividades a realizar Función de la colección núcleo colección núcleo Características de la colección 1. Definir dónde asignar nuevo -Proveer un conjunto de referencia, para determinar material el grupo de accesiones con las que se debe comparar el material nuevo 2. Detectar vacíos o fallas en la -Permitir la identificación de lagunas o vacíos en la colecta variación. que indican ausencias de material o conjuntos donde una gran cantidad de variación está asociada con unas pocas accesiones

Manejo de la colección COMO U! 3. Desarrollar cronogramas GRUPO -Las accesiones de la colección núcleo tienen PRIORITARIO para la regeneración prioridad, especialmente cuando se está perfeccionando una colección 4. Asignar prioridades para el -Proveer un conjunto para atender prioridades manejo cuando sea necesario COMO U! 5. Monitorear la viabilidad -Proveer un conjunto apropiado de accesiones para GRUPO DE monitorear la colección completa REFERE!CIA 6. Duplicar por seguridad -Actuar como un grupo prioritario para duplicación de seguridad, para distribuir a bancos de germoplasma regionales o internacionales,o para mantener en diferentes condiciones (p. ej., como genotecas de ADN, en campo, o invitro ) 7. Desarrollar y aplicar nuevos -Suministrar el material de prueba escogido para la métodos de conservación posible llegada de procedimientos mejorados de mantenimiento (como semillas ultrasecas, técnicas in vitro y de crioconservación) Manejo de la información 8. Organizar bases de datos -Suministrar puntos de referencia modelo para la documentación y permitir que se grabe la estratificación de la colección completa COMO U! GRUPO Estudio y uso de la colección EXPERIME!TAL 9. Desarrollar listas de -Elegir accesiones apropiadas para probar la descriptores capacidad de los descriptores para discriminar accesiones 10. Probar caracteres costosos -Permitir el desarrollo de un procedimiento y complejos (como la eficiente de muestreo en dos pasos –primero entre respuesta al fotoperíodo) un grupo y otro, y luego dentro de cada grupo 11. Desarrollar métodos -Proporcionar un conjunto de materiales que tenga probabilidad de abarcar una gama completa de expresión de características COMO U! 12. Establecer relaciones entre -Proporcionar un conjunto restringido con GRUPO diferentes caracteres probabilidad de abarcar una gama completa de REDUCIDO expresión de diferentes caracteres, para maximizar la eficiencia de los estudios de correlación 13. Realizar estudios de -Permitir la selección de material óptimo para los genética estudios de herencia de caracteres y para el cálculo de la capacidad general de combinación 14. Premejoramiento -Suministrar grupos opuestos con probabilidad de contribuir a la identificación de la heterosis o de reunir entre todos nuevas combinaciones de genes

Distribución desde la coleccion 15. Tener a mano un -Pueden producirse mayores cantidades de semilla suministro adecuado de a partir del conjunto limitado de entradas de la semilla colección núcleo 16. Distribuir diversas -Proporcionar la máxima diversidad en conjuntos muestras representativas limitados de accesiones para realizar evaluaciones a las accesiones