ALTERAÇÕES MORFOFUNCIONAIS PROVOCADAS PELA INOCULAÇÃO DO VENENO TOTAL DA SERPENTE Philodryas Nattereri STEINDACHNER, 1870 EM RATOS

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS M O MI O M I N I IN I

FRED RIBEIRO SANTIAGO

ALTERAÇÕES MORFOFUNCIONAIS PROVOCADAS PELA INOCULAÇÃO DO VENENO TOTAL DA SERPENTE Philodryas nattereri STEINDACHNER, 1870 EM RATOS

FORTALEZA – CEARÁ 2017 2

FRED RIBEIRO SANTIAGO

ALTERAÇÕES MORFOFUNCIONAIS PROVOCADAS PELA INOCULAÇÃO DO VENENO TOTAL DA SERPENTE Philodryas nattereri STEINDACHNER, 1870 EM RATOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Ciências Veterinárias. Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista

FORTALEZA – CEARÁ 2017

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida e por sempre me mostrar o caminho da luz e da verdade. Aos meus pais Francisco José Cochrane Santiago e Maria Roscicléa Ribeiro Santiago por todo o amor, dedicação, paciência e apoio durante todos esses anos. Aos meus irmãos Fábio Ribeiro Santiago e Flávio Ribeiro Santiago pelo companheirismo. À minha orientadora Profa. Dra. Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista, pela confiança, dedicação e atenção para a realização desse trabalho. Aos meus amigos Roberta Rocha Braga, Juliana Menezes de Souza e Antônio Jackson Forte Beleza. Vocês foram essenciais para a realização desse trabalho. Ao prof. Dr. William Cardoso Maciel pela ajuda e parceria. À profa. Dra. Selene e a Daniela Ribeiro Alves pelo acolhimento e pela parceria. À profa. Dra. Diva Maria Borjes Nojosa, pela contribuição na minha qualificação e pela parceria com o NUROF. À profa. Dra. Lúcia de Fátima Lopes dos Santos por me ajudar durante a minha vida acadêmica e pela contribuição para a elaboração desse trabalho. À profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro pelas correções e sugestões para a melhoria desse trabalho. Ao corpo docente e a todos os funcionários do curso de Pós-graduação em Ciências Veterinárias A todos os funcionários do NUROF, em especial à Roberta Rocha Braga e Castielle Holanda. A todos os colegas do Laboratório de Morfologia Experimental Comparada (MEC): Nina, Fernanda, Karen, Júnior, Marrie, Juliana, Glícia, Steffi, Maria, Isadora, Isadora Lobão, Gislane, Agnes, Míriam e João Alison. A todos vocês o meu muito obrigado!

RESUMO

Philodryas nattereri Steindachner, 1870 é uma espécie encontrada na região da caatinga do nordeste do Brasil. Essas serpentes apresentam uma glândula de Duvernoy bem desenvolvida, conectada a um dente sulcado posterior (dentição opistóglifa), especializado para a inoculação de toxinas. Na literatura, observa-se pouca investigação quanto aos venenos de serpentes opistóglifas. O objetivo do trabalho foi caracterizar histologicamente a glândula de Duvernoy e estudar as alterações morfofuncionais e histopatológicas em diversos órgãos e tecidos após a inoculação do veneno total da serpente Philodryas nattereri em ratos. Para a caracterização histológica da glândula de Duvernoy foram utilizados quatro pares de glândulas de animais oriundos de projetos de pesquisa em história natural e distribuição da herpetofauna, tombadas e depositadas na Coleção Herpetológica do Núcleo Regional de Ofiologia da UFC (NUROF- UFC). Após a extração, as glândulas de Duvernoy foram coradas em hematoxilina-eosina e para o estudo histoquímico utilizou-se o PAS (Ácido Periódico de Schiff), PAS + Amilase Salivar e Azul de Toluidina. As fotomicrografias revelaram uma glândula revestida por uma cápsula de tecido conjuntivo denso que emitia septos e dividia a glândula em lóbulos. Cada lóbulo continha túbulos secretores formados por células serosas, indicando a produção de proteínas como enzimas. Foram observadas células mucosas no ducto excretor, o que pode estar relacionado à produção de glicoproteínas. Um pool de veneno da serpente P.nattereri foi obtido após uma série de extrações no serpentário do NUROF-UFC. 2 horas após a inoculação do veneno por via intraperitoneal em diferentes grupos de ratos e utilizando diferentes concentrações (0.5, 0.7 e 0.9 mg), os animais foram eutanasiados e fragmentos de fígado, pulmões, coração e rins foram retirados e processados histologicamente. As lâminas confeccionadas foram coradas com hematoxilina e eosina e os cortes de 5µm examinados em microscopia de luz. Foram observadas zonas hemorrágicas na pele e na musculatura abdominal, a presença de eritrócitos em abundância nos espaços alveolares e congestão pulmonar, citoplasma hipereosinofílico em células do músculo cardíaco, hemorragia no fígado com dilatação dos sinusóides e congestão em túbulos contorcidos proximais e distais em rins. Concluimos que o veneno foi capaz de causar alterações morfofuncionais em órgãos e tecidos de ratos, sendo dose dependente. Nos animais do grupo controle não foram evidenciadas alterações histopatológicas significativas. A glândula de Duvernoy da serpente Philodryas nattereri enquadrou-se na segunda categoria descrita por TAUB (1967).

PALAVRAS –CHAVE : Dipsadidade. Opistóglifa. Histopatologia. Glândula de Duvernoy.

ABSTRACT

Philodryas nattereri Steindachner, 1870 is a species found in the caatinga region of northeastern Brazil. These snakes present a well developed Duvernoy gland, connected to a posterior grooved tooth (Opistoglyphous dentition), specialized for the inoculation of toxins. In the literature, little research is done on the venoms of Opistoglyphous snakes. The aim of this study was to characterize the Duvernoy gland histologically and to study morphofunctional and histopathological changes in various organs and tissues after inoculation of the total venom of the Philodryas nattereri snake in rats. For the histological characterization of the Duvernoy gland, four pairs of animal glands from natural history research and herpetofauna distribution designs were used, deposited in the Herpetological Collection of the Regional Nucleus of Ophiology of UFC (NUROF-UFC). After extraction, the Duvernoy glands were stained with hematoxylin-eosin and to histochemical study was used PAS (Schiff's Periodic Acid), PAS + Salivary Amilase and Toluidine Blue. Photomicrographs revealed a gland lined by a dense connective tissue capsule that emitted septa and divided the gland into lobules. Each lobe contained secretory tubules formed by serous cells, indicating the production of proteins as enzymes. Mucous cells were observed in the excretory duct, which may be related to the production of glycoproteins. A pool of venom from the snake was obtained after a series of extractions in the NUROF-UFC. 2 hours after intraperitoneal venom inoculation in different groups of rats and using different concentrations (0.5, 0.7 and 0.9 mg), the animals were euthanized and liver, lung, heart and kidneys fragments were removed and histologically processed. The prepared slides were stained with hematoxylin and eosin and the 5μm sections were examined under light microscopy. Hemorrhagic zones were observed in the skin and abdominal musculature, presence of abundant erythrocytes in the alveolar spaces and pulmonary congestion, hypereosinophilic cytoplasm in cardiac muscle cells, liver hemorrhage with sinusoidal dilatation and congestion in contiguous proximal and distal tubules in the kidneys. It was concluded that the venom was able to cause morphofunctional changes in organs and tissues of rats, being dose dependent. No significant histopathological changes were observed in the control animals. The Duvernoy gland of the snake Philodryas nattereri fell into the second category described by TAUB (1967).

Keywords: Dipsadidae. Opistoglyphous. Histopathology. Duvernoy’s gland

LISTA DE FIGURAS

Revisão de Literatura

Figura 1 Dentição das serpentes. Áglifa (A e B). Proteróglifa (C e D). Solenóglifa (E e F) e Proteróglifa( G e H)...... 15

Figura 2 Esquema de classificação das Metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs). Coluna da esquerda : estrutura da proteína nascente (precursor). Coluna da direita: representa a estrutura da proteína madura. Pontos de interrogação indicam que o produto processado não foi encontrado no veneno. P: peptídeo sinal; Pro: pró-domínio; S: região espaçadora; Dis: domínio desintegrina, Dis-like: domínio tipo – desintegrina; Cys- Rich: domínio rico em cisteínas; Lec: domínio tipo lectina...... 19

Figura 3 Lâmina basal e lâmina reticular...... 20

Figura 4 Estrutura da laminina - glicoproteina adesiva formada por três cadeias polipeptidicas trançadas entre si na forma de uma cruz. O desenho mostra os locais da molécula com alta afinidade para receptores de membrana e para componentes da membrana basal - colágeno do tipo IV e sulfato de heparana. Desse modo, a laminina promove a adesão entre as células e suas lâminas basais...... 21

Figura 5 Esquematização da hidrólise dos componentes da matriz extracelular (MEC) pelas metalopreoteinases de venenos de serpentes (SVMPs)...... 23

Figura 6 Serpente Philodryas nattereri...... 24

Capítulo 1

Figure 1 Macroscopic images after 2 h of intraperitoneal inoculation (arrows) of three different doses of Philodryas nattereri snake venom. A-B: Control group. Received 0.3 mL of PBS. No evidence hemorrhage. C-D: 0.5 mg and E-F: 0.7 mg of venom dissolved in 0.3 mL of PBS (1.66 mg/mL and 2.33 mg/mL respectively). Note the small hemorrhagic areas at the site of venom inoculation. It was observed an extensive hemorrhagic zone in the peritoneum of animals that received 0.9 mg (G-H) dissolved in 0.3 mL of PBS (3mg/mL)……………………………. 38

Capítulo 2

Figure 1 A. Philodryas nattereri snake. B. Round pupils and opistoglyphous teeth (arrow). C. Dissection of the Duvernoy´s gland. D. Duvernoy´s gland extracted from the Philodryas nattereri snake. E. Duvernoy gland (arrow) of Philodryas nattereri snake……………………………………………………… 54

Figure 2 Photomicrographs of the Duvernoy and supralabial glands of the Philodryas nattereri snake. HE. A. Duvernoy´s gland divided into lobes (L) and separated by septa (S); 100X. B. Capsule (Cp), nerve (N), blood vessel (Vs) and serous secretory tubules (St) presente in the Duvernoy´s gland; 400X; C. Septa (S), Supralabial gland (SpG) and Duvernoy´s gland (Dg). D. Serous cells (Sc) with triangular shape and e basal nuclei (arrow); 400x. E. Serous cells forming secretory tubules (St); 200X. F. Excretory duct (Ed) presenting mucous cells (Mc) and serous cells (Sc) 100X. Nikon trinocular optical microscope / Software Nis 4.0……………………………………………………………….. 55

Figure 3 Photomicrographs of the Duvernoy´s gland of the Philodryas nattereri snake. Staining method: Periodic acid-Schiff (PAS): A and B. PAS+ Salivary amylase: C and D. Toluidine blue: E and F. A. Excretory duct margins (Ed) with presence of mucous cells (Mc) stained in magenta; 100x. B. Mucous cells (arrows) stained in magenta, 100x. C and D. Reactive mucosal cells (arrows) even after PAS reaction + salivary amylase; 200x. E. Excretory duct margins (Ed). Mucous cells (arrows) reactive to the staining of toluidine blue; 100x. F. Mucous glands (arrows) of the supralabial gland most strongly stained with toluidine blue; 100x. Nikon Trinocular optical microscope / Nis Software 4.0…………………………………………………………………… 56

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS g : Grama h : hora H.E. : Hematoxilina-eosina I.M. : Intramuscular i.p. : Intraperitoneal kDa : Quilodalton Kg : Quilograma MB : Membrana basal MEC : Matriz extracelular mg : Miligramas mL : Mililitros NUROF : Núcleo Regional de Ofiologia PBS : Tampão fosfato-salino (phosphate buffered saline) PLA2 : Fosfolipase A2 SINAN : Sistema de Informação de Agravos de Notificação SVMPs : Metaloproteinases de venenos de serpentes UECE : Universidade Estadual do Ceará UFC : Universidade Federal do Ceará µm : Micrômetro µg : Micrograma % : Porcentagem

SU M Á R I O

1 INTRODUÇÃO...... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA...... 14 2.1 ORIGEM, DIVERSIDADE, BIOLOGIA E CARACTERÍSTICAS DAS SERPENTES...... 14 2.2 VENENO DE SERPENTES...... 16 2.3 METALOPROTEINASES DE VENENO DE SERPENTES (SVMPS)...... 17 2.4 MEMBRANA BASAL (MB)...... 20 2.5 EFEITOS DAS SVMPS NA MEMBRANA BASAL (MB)...... 22 2.6 ESPÉCIE Philodryas nattereri...... 23 2.7 O VENENO DA SERPENTE Philodryas nattereri...... 25 2.8 2.8 GLÂNDULA DE DUVERNOY...... 25 3 JUSTIFICATIVA...... 27 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA...... 28 5 OBJETIVOS...... 29 5.1 GERAL...... 29 5.2 ESPECÍFICOS...... 29 6 CAPÍTULO 1- Systemic effects induced by the snake venom from Philodryas nattereri Steindachner, 1870 in rats……………………………………………….. 30

7 CAPÍTULO 2 - Histological haracterization of the uvernoy’s Gland from a Philodryas nattereri Steindachner, 1870 Snake…………………………………... 40

8 CONCLUSÕES...... 57 9 PERSPECTIVAS...... 58 REFERÊNCIAS...... 59 ANEXOS...... 65

ANEXO A – COMITÊ DE ÉTICA...... 66

1 INTRODUÇÃO

Os estudos com venenos de serpentes têm contribuído para a descoberta de vários mecanismos moleculares envolvidos no processo fisiológico e no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para o tratamento de doenças cardiovasculares e hematológicas, o que tem possibilitado a elucidação dos diversos processos bioquímicos e fisiológicos que se manifestam durante o processo do envenenamento. Essas pesquisas favorecem a modelagem molecular de novos princípios ativos de fármacos para os mais diversos fins (MENEZ, 1998; GUTIERREZ, 2002; KINI, 2006). As serpentes peçonhentas possuem um par de glândulas supralabiais, volumosas e simetricamente localizadas em ambos os lados da cabeça, ao longo dos maxilares. O veneno produzido é um líquido viscoso, transparente, levemente leitoso ou amarelado. É constituído por enzimas proteolíticas, neurotoxinas e fosfatases diversas. A peçonha ajuda no processo digestivo das serpentes, facilitando a assimilação dos alimentos (GIBBS; MACKESSY, 2009). No ato de picar, ocorre a contração dos músculos que espremem as glândulas, provocando a saída do veneno pelos canais existentes nas presas inoculadoras (NUNES, 2004). Philodryas nattereri Steindachner, 1870 é conhecida popularmente como “corre campo” ou “tabuleiro”, sendo encontrada em regiões de caatinga e no semiárido brasileiro (MESQUITA et al., 2011; NERY, 2012). Essas serpentes possuem dentição opistóglifa, apresentando uma glândula de Duvernoy bem desenvolvida, homóloga às verdadeiras glândulas de veneno de serpentes proteróglifas e solenóglifas. Essa glândula está conectada a um dente sulcado, especializado para a inoculação de toxinas (MACKESSY, 2002; NERY, 2012). Serpentes da família Dipsadidae (antes Colubridae) não eram consideradas uma ameaça real aos seres humanos. Porém, partir de 1999, o Ministério da Saúde passou a considerar Philodryas olfersii, P. patagoniensis, P. viridissimus como serpentes de importância médica (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001; LIRA- DA –SILVA et al., 2009). Em 1992, após um óbito confirmado de uma criança, decorrente de uma picada causada por P. olfersii no Rio Grande do Sul, evidenciou-se a necessidade de atenção médica aos acidentes causados por algumas espécies dessa família (RIBEIRO et al., 1994), principalmente considerando-se que, muito provavelmente, os acidentes por estas serpentes são subdimensionados e a casuística, portanto, não reflete a sua magnitude (PUORTO; FRANÇA, 2009; FRY et al., 2012). 13

É sabido que o veneno das espécies do gênero Philodryas contém enzimas com diferentes atividades biológicas: Proteolítica, fibrogenolítica, hemorrágica e edematogênica (ASSAKURA et al., 1994; PEICHOTO et al., 2005). Entretanto, há escassez na literatura sobre os efeitos sistêmicos do veneno em animais, o que desperta o interesse da pesquisa em estudar os possíveis efeitos nos sistemas respiratório, cardíaco, renal e hepático. O quadro fisiopatológico dos acidentes causados por espécies de Philodryas assemelham-se aos botrópicos, onde muitas vezes, o soro antibotrópico é administrado indevidamente. Os venenos de serpentes opistóglifas continuam sendo pouco explorados, apesar de serem considerados fontes promissoras para pesquisas ecológicas, evolutivas, biomédicas e biotecnológicas (PEICHOTO et al., 2012). Devido aos acidentes que ocorrem em animais e seres humanos, torna-se necessário conhecer o quadro clínico e o prognóstico das vítimas após a inoculação do veneno, com o objetivo de direcionar o tratamento e para o melhor entendimento do mecanismo de ação após o envenenamento que envolve essas espécies, já que não se possui o soro específico contra o veneno da serpente P. nattereri.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Origem, diversidade, biologia e características das serpentes.

As serpentes são répteis que evoluíram dos lagartos há mais de 130 milhões de anos. Para alguns povos do oriente, elas são representantes de deuses aqui na terra, para outros, personificam o mal. No símbolo da medicina veterinária, a serpente representa a sabedoria e a preservação da saúde. Esses répteis prestam uma grande contribuição à humanidade devido o controle de pequenos roedores e de outras populações de animais na natureza, promovendo o equilíbrio no ecossistema. Além disso, os venenos produzidos pelas serpentes consistem em poderosas ferramentas para a produção de fármacos e pesquisas científicas (NUNES, 2004). As serpentes são animais ectotérmicos, vertebrados, da classe Reptilia e ordem Squamata. Apresentam o corpo alongado e não possuem patas. A ausência do osso externo e maxilas permite uma grande abertura da boca, possibilitando a ingestão de presas inteiras, algumas com até 3,5 vezes o seu diâmetro. São exclusivamente carnívoras e utilizam estruturas quimiossensíveis para caçar (FRANCO, 2009; BERNARDE, 2014). No mundo são conhecidas atualmente 3.619 espécies de serpentes (UETZ, 2017), das quais 392 espécies foram identificadas somente no Brasil. O país ocupa atualmente a terceira posição com maior riqueza de espécies de répteis do mundo (COSTA; BÉRNILS, 2015). Segundo o Sistema de Informação de Agravos de notificação – SINAN (2017), somente no ano de 2016, foram registrados 26.244 casos de envenenamento por picada de serpentes em humanos no Brasil. No quadro de envenenamentos causados por colubrídeos e dipsadídeos, destacam-se o processo inflamatório e /ou necrose, hemorragia local, podendo ou não apresentar sintomas de ordem sistêmica (PUORTO, 2009). Um aspecto que distingue as serpentes peçonhentas das não peçonhentas é com relação à dentição e a sua capacidade de injetar veneno. São divididas em quatro grupos: áglifa (ausência de presas apropriadas à inoculação do veneno), proteróglifa (par de presas bem desenvolvidas, fixadas em posição anterior no maxilar e apresentam um canal central), solenóglifa (par de dentes bem desenvolvidos, móveis, situados anteriormente de cada lado do maxilar superior. São presas grandes, pontiagudas e têm um canal central) e opistóglifas (dentes inoculadores localizados em posição posterior no maxilar superior - fundo da boca e que apresentam um sulco externo por onde o veneno é injetado) (NUNES, 2004). As serpentes do gênero Crotalus, Lachesis e Bothops são da família Viperidae e classificadas de acordo com a sua dentição como Solenóglifas (Figura 5 E e F). As serpentes

do gênero Micrurus são da família Elapidae e são classificadas como proteróglifas (Figura 5 C e D). A serpente P. nattereri possui dentição opistóglifa (Figura 5. G e H) (NOGUEIRA; ANDRADE, 2011).

Figura 1-Dentição das serpentes. Áglifa (A e B). Proteróglifa (C e D). Solenóglifa (E e F) e Proteróglifa (G e H).

Fonte: Bernarde (2014).

2.2 Venenos de serpentes

Os venenos de serpentes representam uma “caixa de tesouro” devido a sua composição e há anos tem sido bastante investigados, despertando o interesse em pesquisadores. Seus componentes ativos podem ser utilizados como importantes ferramentas para os mais variados processos biológicos, tais como a adesão, migração e proliferação celular, agregação plaquetária, entre outros (SELISTRE-DE-ARAÚJO, 2007). Uma mistura muito rica de compostos orgânicos e inorgânicos compõe o veneno de serpentes. Entre os compostos inorgânicos, estão o cálcio, o ferro, o magnésio, o sódio, o fósforo, o cobalto e o zinco. Outros componentes estão presentes, como os carboidratos, aminoácidos, lipídios e aminas biogênicas. A maior parte dos compostos que integram o veneno das serpentes são as proteínas, que correspondem a cerca de 90 a 95% do peso seco (SELISTRE-DE-ARAÚJO, 2007). Uma classificação simplista dos venenos de serpentes reúne componentes de toxinas como neurotoxinas, hemorraginas, miotoxinas, nefrotoxinas, citotoxinas, substâncias coagulantes e hemolíticas. As neurotoxinas produzem paralisia neuromuscular que pode variar de tonturas a ptose, paralisia muscular facial flácida, disfagia, paralisia de grandes grupos musculares e finalmente paralisia dos músculos respiratórios e consequentemente asfixia, levando o indivíduo a óbito. Substâncias coagulantes consomem os fatores de coagulação causando o sangramento. Alguns componentes do veneno podem danificar o endotélio de vasos sanguíneos levando também ao sangramento (KINI, 2006; KLAASSEN, 2012). Agentes citotóxicos apresentam propriedades proteolíticas ou necróticas, levando a desagregação do tecido. Sinais típicos desses agentes citotóxicos incluem edema, descoloração, dor, hematomas, bolhas e feridas exsudativas. As miotoxinas causam impacto direto na contratilidade muscular levando a paralisia, rabdomiólise ou ruptura da musculatura esquelética (KLAASSEN, 2012). O veneno das serpentes pode causar sérios problemas a humanos e animais domésticos, entretanto, as descobertas científicas das propriedades desses venenos contribuíram para o bem da humanidade. Podemos citar o veneno de Bothrops jararaca, no qual foi produzido a partir das pesquisas o anti-hipertensivo captopril. Já a proteína Enpak, conhecida como exterminadora endógena da dor, foi obtida a partir do veneno da serpente Crotalus durissus, que demonstrou ter um efeito analgésico 600 vezes mais potente do que a morfina. Os venenos de serpentes possuem um enorme potencial para o desenvolvimento e

produção de novos fármacos, denotando assim a importância da pesquisa científica para a descoberta de novos medicamentos (BERNARDE, 2014). Em um estudo realizado com a espécie Philodryas chamissonis, verificou-se que após a injeção intraperitoneal de seu veneno em camundongos, foi observado extensas zonas hemorrágicas no peritônio e presença de edema no local da aplicação (URRA et al., 2015). Recentemente foi realizado uma pesquisa onde se conseguiu purificar o veneno de uma serpente proveniente da Austrália (Pseudechis autralis). Os pesquisadores identificaram o potente anticoagulante PLA2, identificado como Pa11. Esse anticoagulante poderá ser utilizado em pesquisas futuras para dissolver trombos na corrente sanguínea (DU et al., 2016). Essas descobertas mostram os imensos benefícios que os venenos de serpentes podem trazer para a humanidade.

2.3 Metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs)

As proteinases representam uma das enzimas encontradas no veneno da maioria das serpentes e são estruturalmente classificadas como serinoproteinases e metaloproteinases (TAKEDA et al., 2012). Análises proteômicas têm mostrado que as metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs) são os maiores componentes do veneno da família Viperidae, com uma percentagem do total de proteínas variando de 11 % a 65% (CALVETE et al., 2007). As SVMPs são amplamente distribuídas não somente em membros das famílias Viperidae e Colubridae, mas também são encontradas em membros da família Elapidae, embora em menor quantidade comparado aos membros da família Viperidae. (WELDON; MACKESSY, 2010; PETRAS et al., 2011). AS SVMPs são as principais toxinas responsáveis pela hemorragia após o envenenamento. Isso se deve à atividade dessas enzimas sobre os componentes da matriz extracelular e da lâmina basal dos vasos sanguíneos (GUTIÉRREZ et al., 2016ab). As metaloproteinases são hidrolases do tipo endopeptidases que dependem da ligação de um metal, geralmente o zinco, em seu sítio catalítico, para a manifestação de suas atividades enzimáticas (BJARNASON; FOX, 1995). As SVMPs possuem uma organização multimodular e são classificadas em três classes: P-I, P-II, e P-III (figura 1), de acordo com a massa molecular e organização desses domínios. A classe P-I inclui as pequenas SVMPs (cerca de 20 a 30kDa de massa molecular) que tem somente o pró-domínio e o domínio metaloprotease em sua forma madura e

normalmente apresentam pouca ou nenhuma atividade hemorrágica. A classe P-II inclui as proteínas de tamanho médio (cerca de 30 a 60 kDa) que contém um domínio desintegrina adicional na porção C-terminal. A classe P-II foi subdividida em 5 diferentes classes (P-IIa, P- IIb, P-IIc, P-IId e P-IIe) de acordo com a possibilidade de processamento proteolítico posterior e a formação de estruturas diméricas (FOX; SERRANO, 2005; JUNQUEIRA, 2005; FOX; SERRANO, 2008; MARKLAND JR.; SWENSON, 2013; GÂZ et al., 2016). A classe P-III (60 a 100 KDa) inclui um domínio tipo desintegrina e um domínio rico em cisteína. Esta classe é considerada a mais potente em relação à atividade hemorrágica e também pode ser dividida em 4 subclasses (P-IIIa, P-IIIb, P-IIIc e P-IIId). Os membros da classe P-IIId contém um domínio lectina tipo-C adicional na porção C-terminal, ligado através de uma ponte de enxofre entre o domínio rico em cisteína e o domínio tipo lectina (BJARNASON; FOX, 1994; JUNQUEIRA, 2005; FOX ; SERRANO, 2008; MARKLAND JR. ; SWENSON, 2013; GÂZ et al., 2016). O primeiro elemento comum a todas as SVMPs é o peptídeo sinal (P), que tem como função guiar a proteína que está nascendo ao retículo endoplasmático (RE). Durante o transporte ao RE, o peptídeo sinal é removido. As metaloproteases são sintetizadas na forma latente como pró- enzimas inativas (zimogênio), contendo um peptídeo sinal e um pró- domínio, e necessitam de ativação para ter a sua atividade proteolítica funcional. A ligação entre a cisteína, presente no pró-domínio, com o zinco presente no domínio catalítico, através de um mecanismo conhecido como “cystein-switch” previne com que a água ou outros substratos acessem a região do sítio ativo inibindo dessa forma a catálise e a função da enzima, até que o pró-domínio seja desligado por um evento catalítico. (BJARNASON; FOX, 1994; FOX; SERRANO, 2008; TAKEDA et al., 2012; GÂZ et al., 2016). Para a maioria das espécies de colubrídeos, especialmente da subfamília Dipsadinae, incluindo o gênero Philodryas, as metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs) são componentes predominantes nos transcriptomas e proteomas. Todas as sequências descritas em Colubridae até o momento pertencem à classe P-III de SVMPs, que incluem o pré e pró- domínios, um domínio catalítico de metaloproteinase, um domínio tipo-desintegrina e um domínio rico em cisteína (CASEWELL et al., 2011; JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO et al., 2016). Uma árvore filogenética representativa de SVMPs indica que, apesar de um alto grau de diversidade entre as SVMPs de Colubrídeos, eles compartilham um ancestral comum da classe P–III de SVMPs de elapídeos e atractaspididae (JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO et al., 2016).

Figura 2 - Esquema de classificação das Metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs). Coluna da esquerda : estrutura da proteína nascente (precursor). Coluna da direita: representa a estrutura da proteína madura. Pontos de interrogação indicam que o produto processado não foi encontrado no veneno. P: peptídeo sinal; Pro: pró- domínio; S: região espaçadora; Dis: domínio desintegrina, Dis-like: domínio tipo – desintegrina; Cys- Rich: domínio rico em cisteínas; Lec: domínio tipo lectina.

Fonte: Fox; Serrano (2008).

2.4 Membrana basal (MB)

A membrana basal (MB) é uma camada extracelular situada abaixo dos epitélios e possui 2 constituintes: a lâmina basal e a lâmina reticular ( figura 2). A lâmina basal está mais próxima das células epiteliais e é produzida por elas. A lâmina basal possui 2 regiões: a lâmina lúcida, que fica imediatamente abaixo do epitélio e consiste principalmente nas glicoproteínas extracelulares laminina e entactina. As moléculas de laminina na lâmina basal aderem às integrinas e hemidesmossomos e fixam as células epiteliais à membrana basal. A lâmina densa tende a formar uma rede semelhante a uma tela de arame. Seus principais constituintes são o colágeno não fibrilar tipo IV, o proteoglicano perlecano ou perlecan e a laminina. (GARTNER e HIATT, 2007; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013; TORTORA; NIELSEN, 2013). A laminina é um heterodímero em forma de cruz, de 820 kDa, que conecta as células aos componentes da matriz extracelular. A laminina possui domínios que se ligam ao colágeno tipo IV e ao heparan sulfato ou sulfato de heparana (Figura 3). Além de mediar a adesão à membrana basal, a laminina pode também modular a proliferação, a diferenciação e a motilidade celulares (KUMAR et al., 2013). A lâmina basal se prende ao tecido conjuntivo por meio de fibrilas de ancoragem constituídas por colágeno tipo VII (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013).

Figura 3- Lâmina basal e lâmina reticular

Fonte: Fawcett (1994).

O colágeno tipo IV é de fundamental importância para a manutenção da integridade e do funcionamento da membrana basal em situações de estresse mecânico. O colágeno tipo IV possui a capacidade de formar andaimes estruturais complexos, covalentemente ligados, encontrados em membranas basais de: glomérulos e túbulos renais, pulmões, testículos, cóclea, olhos, músculos lisos, pele entre outros órgãos (PÖSCHL et al., 2004). A face da lâmina densa voltada para a lâmina reticular também possui fibronectina (um grande heterodímero ligado por pontes dissulfeto sintetizada por várias células, incluindo fibroblastos, monócitos e endotélio). Existe nas formas plasmática e tecidual. As fibronectinas possuem domínios específicos que se ligam a um amplo espectro de componentes da Matriz extracelular como: colágeno, fibrina, heparina e proteoglicanos (GARTNER; HIATT, 2007; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013; KUMAR et al., 2013). A lâmina reticular é responsável pela fixação da lâmina densa ao tecido conjuntivo subjacente (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013).

Figura 4- Estrutura da laminina - glicoproteina adesiva formada por três cadeias polipeptidicas trançadas entre si na forma de uma cruz. O desenho mostra os locais da molécula com alta afinidade para receptores de membrana e para componentes da membrana basal - colágeno do tipo IV e sulfato de heparana. Desse modo, a laminina promove a adesão entre as células e suas lâminas basais.

Fonte: Junqueira; Carneiro (2013).

2.5 Efeitos das SVMPs na membrana basal (MB):

A MB é uma estrutura complexa da matriz extracelular (MEC) e altamente especializada. Desempenha um papel de sustentação das células endoteliais dos capilares e em outros tipos de células. No contexto dessa complexidade, existem SVMPs hemorrágicas que enfraquecem a estabilidade mecânica dos microvasos levando a hemorragia (ESCALANTE, et al., 2011). A interrupção da integridade dos microvasos que levam à hemorragia é um dos efeitos mais importantes induzidos pelas SVMPs de viperídeos e Colubrídeos (ESCALANTE et al., 2011; JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO et al., 2016, GUTIÉRREZ et al., 2016ab). A capacidade das SVMPs para hidrolisar componentes da MB in vitro foi demonstrada em vários estudos (BJARNASON et al., 1988; BJARNASON; FOX, 1994; OLIVEIRA, et al., 2010) . A análise proteômica de exsudados coletados após a inoculação do veneno de Bothrops asper e várias SVMPs hemorrágicas purificadas revelaram a presença de vários componentes da membrana basal, como laminina, nidogen (entactina), colágeno tipo IV e o proteoglicano heparan sulfato. Essas proteínas foram degradadas, conforme avaliado pela massa molecular dos fragmentos detectados nas análises. O fato desses fragmentos dos componentes da MB estarem presentes em exsudados coletados em períodos iniciais após injeção de veneno ou SVMPs sugere fortemente que a hidrólise dessas proteínas é devido à ação direta das SVMPs no tecido, de acordo com observações in vitro. (IOZZO, 2005; ESCALANTE et al., 2011; HERRERA et al., 2015; HERRERA et al., 2016; GUTIÉRREZ et al., 2016ab). A hidrólise do colágeno do tipo IV na patogênese da hemorragia também foi mostrada no caso de uma SVMP classe P- III a partir do veneno de Bothrops jararaca (BALDO et al., 2010; TANJONI et al., 2010). Estudos revelam que os distúrbios genéticos afetando o colágeno tipo IV estão associados a alterações vasculares (PÖSCHL et al., 2004) e AVC hemorrágico (FEDERICO et al., 2012). Algumas SVMPs hidrolizam componentes na BM de vasos capilares, fibras musculares esqueléticas e junção derme-epiderme. No caso das SVMPs hemorrágicas, postulou-se que a hidrólise do colágeno tipo IV é um passo chave na desestabilização da MB, o que leva ao extravasamento de sangue. As SVMPs também hidrolizam proteínas da MEC (figura 4). As SVMPs também podem hidrolisar os componentes da membrana plasmática, como as integrinas, que interagem com os componentes da MB. Todas essas ações hidrolíticas resultam em uma alteração profunda da MEC, com conseqüências para os

processos de danos, reparos e regeneração de tecidos induzidos pelo veneno ( GUTIÉRREZ et al., 2016).

Figura 5- Esquematização da hidrólise dos componentes da matriz extracelular (MEC) pelas metalopreoteinases de venenos de serpentes (SVMPs).

Fonte: Gutiérrez et al (2016b).

A B 2.6 Espécie Philodryas nattereri

Classificação Reino: Animalia Filo: Chordata Classe: Reptilia Ordem: Squamata Subordem: Serpentes Família: Dipsadidae Gênero: Philodryas Espécie: Philodryas nattereri Steindachner 1870

A espécie Philodryas nattereri, Steindachner, 1870, incluída na família Dipsadidae e subfamília Xenodontinae (ZAHER et al., 2009), é conhecida popularmente como “corre - campo” ou “tabuleiro”. É uma serpente de médio porte, muito veloz, podendo atingir até 1,8 metros de comprimento. Possui pico de atividade durante as horas mais quentes do dia. Apresenta pupilas redondas e sua cor predominante é o marrom claro, com pequenas manchas nas escamas (Figura 6). Atrás da cabeça, pode conter tonalidade laranja, que é mais intenso nos jovens. (FREITAS, 2003; MESQUITA et al., 2011).

Figura 6- Serpente Philodryas nattereri

Fonte: Arquivo pessoal

Apresenta glândula de Duvernoy bem desenvolvida, conectada a um dente sulcado (dentição opistóglifa), especializado para a inoculação de toxinas. São animais normalmente agressivos, podendo desferir botes com mordidas (MARQUES, 2001; NERY, 2012). Encontra-se distribuída em regiões áridas e semiáridas da América do Sul, sendo mais comum na região nordeste do Brasil, principalmente na caatinga. Presente em todo o estado da Bahia (com exceção da região sul), cerrados do Maranhão, centro-oeste até o Mato Grosso e parte do sudeste, sempre em fitofisionomias abertas pelos biomas cerrado e caatinga. Apresenta hábitos diurnos; terrestre; alimenta-se de pequenos roedores, aves e lagartos. É ovípara, pondo de 10 a 21 ovos com postura no meado do mês de junho e nascimento em outubro. Os filhotes medem em torno de 35 cm de comprimento (FREITAS, 2003; FREITAS, 2015).

2.7 O veneno da espécie Philodryas nattereri

Os envenenamentos causados por serpentes do gênero Philodryas caracterizam-se por ação local intensa, como edema, dor, sangramento passageiro, aumento da temperatura no local da mordida, eritema, linfoadenopatia regional e equimose com coagulação normal (RIBEIRO; PUORTO; JORGE, 1999; HESS; BAPTISTÃO, 2012). Pode ocorrer também a degranulação de mastócitos, lesões musculares decorrentes da ação direta ou indireta de toxinas presentes na peçonha, além de alterações na microcirculação, que irá promover o início de uma resposta inflamatória e consequentemente levar a um infiltrado leucocitário para o local da inflamação (GUTIÉRREZ; LOMONTE, 2003). O veneno da serpente P. nattereri é uma mistura de proteínas e peptídeos que provocam alterações locais similares aos acidentes ocorridos por serpentes do gênero Bothrops. Os mecanismos envolvidos que levam a essas alterações são desconhecidos (NERY et al., 2014). Nery (2012) verificou alterações patológicas em ratos e camundongos após a inoculação de diferentes doses do veneno bruto da serpente P. nattereri. Dentre os efeitos encontrados, estão a citotoxicidade, alterações renais, ação hipotensora e bradicárdica, propriedades edematogênicas e miotoxicidade. Em um estudo preliminar sobre a caracterização bioquímica do veneno de cinco espécies de colubrídeos, incluindo Philodryas olfersii e P. patagoniensis (Dipsadídeos), Zelanis et al. (2010) verificaram que a quantidade de proteínas (µg/ mg) presentes no veneno de Philodryas nattereri foi maior do que a quantidade encontrada nas espécies P. patagoniensis e Tomodon dorsatus. A atividade da fosfolipase A2 mensurada revelou que P. natterei apresentou atividade maior do que P. olferssi.

2.8 Glândula de Duvernoy

Durante a captura, a serpente deve subjugar a presa para evitar sua fuga e uma possível retaliação e, eventualmente transformá-la em uma refeição. Para lidar com essas dificuldades, as serpentes desenvolveram uma variedade de mecanismos. Além dos meios químicos, existem meios mecânicos de captura das presas (MACKESSY, 2009). A constrição é uma das táticas usadas por várias espécies de serpentes para lidar com presas perigosas, como os roedores e outras serpentes. A constrição é um mecanismo no qual o corpo da serpente

circunda e comprime a presa, que além de evitar a sua fuga leva a morte por asfixia / trauma torácico e facilita a ingestão. (MACKESSY, 2009; MARQUES; SAZIMA, 2009). O envenenamento é outro modo muito eficiente para subjugar presas perigosas, sendo muito usado por viperídeos, elapídeos, colubrídeos e dipsadideos opistóglifos. O uso do veneno para a captura das presas e para a própria defesa da serpente tem sido foco de discussão, que representa uma estratégia complexa e envolve múltiplas funções dos componentes do veneno e comportamentos predatórios especializados (MACKESSY, 2009). Alguns colubrídeos possuem um sistema glandular oral capaz de produzir secreções com alta toxicidade e ocasionalmente causar mortes em humanos, como ocorreu com os herpetólogos Karl Patterson e Roberts Mertens, que foram a óbito após o envenenamento com os colubrídeos africanos Dispholidus Typus e Thelotonis kirtlandii (MINTON, 1990; GREENE, 1997; BERNARDE, 2014). O veneno de colubrídeos e dipsadídeos com dentição opistóglifa provem da glândula de Duvernoy. Essa glândula localiza-se na região temporal, supralabial e é considerada homóloga às glândulas de veneno dos viperídeos (BERNARDE, 2014). Essa glândula apresenta forma ovalada, com superfície granular e coloração esbranquiçada, com consistência firme a compressão (NERY, 2012). A neurossecreção evidenciada nos túbulos secretores da glândula de Duvernoy de Philodryas olferssi, Phimophis guerini e Thamnodynastes strigatus pode estar relacionada com o processo de estimulação da secreção e inoculação de substâncias tóxicas. A presença acentuada de proteínas nos túbulos secretores em Philodryas olfersii e Philodryas patagoniensis pode estar relacionada ao hábito alimentar de cada espécie, como também relaciona-se ao modo como subjugam as suas presas (SERAPICOS; MERUSSE, 2006). As secreções produzidas pelas glândulas de Duvernoy são um coquetel altamente variável de componentes químicos, principalmente proteínas, onde muitos desses componentes apresentam toxicidade (KARDONG, 2002). Seu esvaziamento se dá por um fluxo de baixa pressão e a secreção é liberada em aberturas próximas à base das presas, diferentemente do que ocorre com os viperídeos, em que o fluxo de secreção se dá por alta pressão via canal das presas (KARDONG, 2002; LOPES, 2008). As pesquisas futuras de secreções e venenos das glândulas de Duvernoy de colubrídeos e dipsadídeos prometem descobertas relevantes para a medicina clínica e laboratorial, bioquímica, imunológica, fisiopatológica e farmacológica (WEINSTEIN et al., 2011).

3 JUSTIFICATIVA

Em contraste com a vasta literatura existente sobre os venenos de serpentes proteróglifas e solenóglifas, observa-se pouca investigação quanto aos venenos de serpentes opistóglifas. Assim, a composição dos venenos de Dipsadídeos é pouco conhecida, bem como os mecanismos de ação. Considerando os poucos relatos na literatura sobre os efeitos sistêmicos do veneno de P. nattereri, o presente trabalho pretende demonstrar a importância da pesquisa morfofisiológica como ferramenta para a elucidação do mecanismo de ação do envenenamento em animais, bem como direcionar a terapêutica.

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA

O veneno da serpente Philodryas nattereri promove alterações morfofuncionais após a inoculação em ratos, sendo dose dependente.

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL Avaliar as alterações morfofuncionais após a inoculação do veneno da serpente Philodryas nattereri em ratos e realizar a caracterização histológica da glândula de Duvernoy da serpente Philodryas nattereri.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Verificar as alterações histopatológicas em pulmões, fígado, rins e coração de ratos Wistar após a inoculação do veneno da serpente Philodryas nattereri em diferentes doses. - Realizar a descrição macro e microscópica da glândula de Duvernoy da serpente P.nattereri. - Analisar a composição química do veneno secretado da serpente P. nattereri através do estudo histoquímico da glândula de Duvernoy. - Verificar em qual categoria a glândula de Duvernoy da serpente P. nattereri se enquadra segundo a histologia descrita por TAUB, 1967.

CAPÍTULO 1

Systemic effects induced by the snake venom from Philodryas nattereri Steindachner,

1870, in rats

Efeitos sistêmicos induzidos pelo veneno da serpente Philodryas nattereri Steindachner,

1870, em ratos.

Artigo submetido ao periódico : Toxicon Em: 03/06/2017 Qualis : A2

Systemic effects induced by the snake venom from Philodryas nattereri Steindachner, 1870 in rats

Fred Ribeiro Santiago1, Roberta da Rocha Braga2, Juliana Menezes de Souza1, Daniela

Ribeiro Alves1, João Alison de Moraes Silveira3, Selene Maia de Morais1, Diva Maria Borges

Nojosa2, Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista1

1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Universidade Estadual do Ceará,

Campus do Itaperi, Fortaleza, Ceará, Brasil.

2Centro de Ciências – Departamento de Biologia – Núcleo Regional de Ofiologia.

Universidade Federal do Ceará, Campus do Pici, Fortaleza, Ceará, Brasil.

3Programa de Pós-graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia.

Universidade Federal do Ceará, Campus do Porangabussu, Fortaleza, Ceará, Brasil.

Abstract: Philodryas nattereri snake is commonly distributed in arid and semiarid regions of northeast of Brazil. There is a shortage in the literature on the systemic effects of this venom in animals and humans. After 2 h of intraperitoneally injection with different doses in rats, hemorrhagic zones in skin and the abdominal muscles were observed as well as presence of abundant erytrocytes in alveolar spaces and pulmonary congestion, hypereosinophilic cytoplasm in cells of cardiac muscle. Kidney and liver showed Histopathological changes.

Keywords: bleeding, opisthoglyphous, Dipsadidae

In Brazil, aproximately 26,244 snakebites were reported only in the year of 2016, including venomous and non-venomous snakes (SINAN, 2017). About 20 to 40% of ophidian accidents in Brazil are caused by colubrid snakes (Salomão et al., 2003). The Colubridae family includes opisthoglyphous and aglyphous snakes (Weinstein et al., 2013).

Opisthoglyphous snakes are capable of causing accidents in animals and humans. These snakes possess a Duvernoy gland, responsible for the production of toxic secretion or poison

(Hess, 2012).

Philodryas nattereri Steindachner, 1870 is commonly called “brown racer,” reaching up to 180 mm in total length and it exhibits opistoglyph dentition (Vitt, 1980). P. nattereri is distributed in arid and semiarid regions of Brazil and also in other countries of

South America (Mesquita et al., 2011; Nery, et al., 2014).

There is a shortage in the literature on the systemic effects of Philodryas nattereri venom in animals and humans. Factors such as the low amount of venom produced by the great majority of opisthoglyphous snakes and the inefficiency of extraction methods represent some of the difficulties of researches in this area (Hess, 2012).

The objectives of this work were to evaluate the systemic effects after the inoculation of venom of P. nattereri snake in rats and to verify the histopathological changes in several organs after administration of venom in differents doses.

To the experiments, we had used adult male Wistar rats that were supplied by central animal house, State University of Ceará – Brazil. The rats weighed between 200-250 g. Five rats per group were used. Before each experiment, the animals were maintained fasting for 8 h, but with free water. All experiments followed the ethical standards for animal experiments in toxicological research recommended by the international society of toxinology and approved by Ethical Committee (number: 1571522/2016) from Ceara State University

(UECE). Adult snakes of both sexes of P. nattereri species were used to extract the venom.

Each animal remained in individual enclosure at the serpentarium of the Regional Centre of

Ofiology (NUROF) – Federal University of Ceará- Brazil. To perform the extraction, the snakes were contained manually and the venom were collected directly from opistoglyphous fangs with capillary tubes, according to the method of Ferlan et al. (1983). Pooled venom was obtained after several extractions. Venom was lyophilized and when required, was dissolved in phosphate buffered saline solution (PBS), pH 7,4.

Experiments in vivo, the rats were divided in 4 groups of 5 animals each. Venom was applied intraperitoneally in the lower quadrant of the left abdomen. Five animals of each group received concentrations of 0.50, 0.70 and 0.9 mg dissolved in 0.3 mL of PBS. The control group received 0.3 mL of PBS. Rats were previously anesthetized by ketamine

(75mg/Kg, I.M.) and xylazine (10mg/Kg, I.M.). The injection was applied in the right caudal gracilis muscle. After 2 h of venom injection, rats were euthanized by thiopental overdose and decapitated. Samples of heart, lung, kidney and liver were taken and fixed with 10% buffered formaldehyde solution for 24-48h. The tissue samples were dehydrated in several alcohol solutions, diaphanyzed in xylol and embedded in histological paraffin. Sections of 5µm were cut in a microtome and stained by hematoxylin and eosin (H.E.). A polarized trinocular microscope with fluorescence (NIKON Eclipse Ni, Japan; Software Nis 4.0) was used for histological analysis and characterization.

Protein concentration was assayed in triplicate according to Bradford (1976). For the sample, 2 mg of the P.nattereri snake venom was used. The value of total protein from the venom was 719,0 ± 121 µg/mg. Nery et al. (2014) verified a total protein from the venom of

P. nattereri of 863,9 µg/mg. Zelanis et al. (2010) showed that the protein content was similar among the venoms: Philodryas olfersii (923 ± 113 µg/mg), Philodryas patagoniensis (814 ±

12 µg/mg) and Philodryas nattereri (847± 91 µg/mg).

Hemorrhagic zones in skin and in abdominal muscles were observed after 2 h of intraperitoneally injection with different doses of P. nattereri venom in rats. It was observed extensive hemorrhagic zones in the peritoneum of animals that received 0,9mg (Fig 1.G-H).

The control group demonstrated no evidence of hemorrhage (Fig 1. A-B). After the inoculation of 3 differents doses of venom it was possible to verify the hypereosinophilic cytoplasm in cardiac muscle cells and erythrocytes presence between the fibers in longitudinal cut. (Fig. 2)

Microscopic examination of lungs sections showed the prominent hemorrhage in the pulmonary tissue with presence of abundant erytrocytes in alveolar spaces and congestion on pulmonary parenchyma. These characteristics were evident at each dose of venom injection (Fig. 2). After administration of three differents doses, liver sections showed congestion of blood vessels, edematous and necrotic hepatocytes, sinusoidal dilatation, and clear spaces in centrilobular region (Fig. 2). Kidney sections showed morphological alterations after inoculation of three different doses of venom. Congestion blood in vessels of cortex zone were observed in Fig. 2.

Upon microscopic examination, hemorrhage was evidenced in several organs of rats after inoculation of P. nattereri snake venom. These results are similar to the study realized by Peichoto et al. (2006) using venom of Philodryas patagoniensis, which verified bleeding in differents organs. Bleeding may have been caused due to the action of snake venom metalloproteinases (SVMPs) present in the venom of P. nattereri. In the subfamily Dipsadinae, SVMPs are predominant components in transcriptomes and the proteomes. All sequences described in Colubridae up to date belong to the P-III class of

SVMPs (Casewell et al. 2011; Junqueria-de–Azevedo et al., 2016). SDS- polyacrylamide gel electrophoresis showed multiple protein bands ranging 45 Kda to 100 Kda of P. nattereri venom ( Nery et al., 2014).

There is a two-step model to explain the mechanism of action of hemorrhagic

SVMPs in capillary vessel. In the first step, SVMPs bind to and hydrolyze critical structural components of the basement membrane of capillary vessels, particular type IV collagen and perlecan, and possibly other molecules that link the basement membrane to the fibrilar extracelular matrix (Gutiérrez et. al 2016). Each collagen is composed of three chains that form a trimer in the form of a triple helix. Glycoproteins (laminin and entactin) and proteoglycans (heparan sulfate and perlecan) adhere to the collagenous supra- structure

(Kumar et. al, 2010). The cleavage of peptide bonds of basement membrane components results in the mechanical weakening of this structure. In the second step, the hydrostatic pressure, induce a distention of the vessel wall, until the capillary is eventually disrupted, with the consequent extravasation of blood (Gutiérrez, 2016).

As a conclusion, the snake venom of Philodryas nattereri was capable of causing systemic effects after poisoning. The continuity in studying this snake venom of our Northeast biodiversity region is necessary to investigate the biological effects of total venom and its fractions in different biological systems.

Conflict of interest

All the authors declared that there are no conflicts of interest.

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ontrol Group 0.5 mg 0.7 mg 0.9 mg

A C E G

B D F H

Fig 1. Macroscopic images after 2 h of intraperitoneal inoculation (arrows) of three different concentrations of Philodryas nattereri snake venom. A-B: Control group. Received 0.3 mL of

PBS. No evidence hemorrhage. C-D: 0.5 mg and E-F: 0.7 mg of venom dissolved in 0.3 mL of PBS (1.66 mg/mL and 2.33 mg/mL respectively). Note the small hemorrhagic areas at the site of venom inoculation. It was observed an extensive hemorrhagic zone in the peritoneum of animals that received 0.9 mg (G-H) dissolved in 0.3 mL of PBS (3mg/mL).

ontrol Group 0.5 mg 0.7 mg 0.9 mg

Heart

Lung

Kidney

Liver

Fig 2. Light Photomicrographs. They showed the histopathological alterations after 2 h of

Philodryas natterei venom i.p. inoculation in rats (concentrations: 0.5, 0.7 and 0.9 mg).

Heart: It showed the hypereosinophilic cytoplasm in cardiac muscle cells and erythrocytes present between the fibers in longitudinal cut. Kidney: These sections showed vascular congestion in cortex zone. Lung: It showed hemorrhage in pulmonar parenchyma with presence of abundant erytrocytes in alveolar spaces and vascular congestion. Liver: These sections showed vascular congestion, sinusoidal dilatation, and clear spaces in centrilobular region. All these findings were evident at each dose of inoculation venom. Scale bar, 100 µm.

H.E. Trinocular Light Microscope (NIKON Eclipse Ni, Japan; Software Nis 4.0).

CAPÍTULO 2

Histological haracterization of the uvernoy’s Gland from a Philodryas nattereri Steindachner, 1870 Snake

Caracterização histológica da glândula de Duvernoy da serpente Philodryas nattereri Steindachner, 1870

Artigo submetido ao periódico : South American Journal of Herpetology Em : 14/06/ 2017 Qualis : B1

Histological haracterization of the uvernoy’s Gland from a Philodryas nattereri

Steindachner 1870 Snake

Fred Ribeiro Santiago1, Roberta da Rocha Braga2, Juliana Menezes de Souza1, João Alison de

Moraes Silveira3, Diva Maria Borges Nojosa2, Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista1

1Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias. Faculdade de Veterinária.

Universidade Estadual do Ceará. Fortaleza, Ceará, Brazil.

2Núcleo Regional de Ofiologia – NUROF. Centro de Ciências – Departamento de Biologia.

Universidade Federal do Ceará. Fortaleza, Ceará, Brazil.

3Programa de Pós-graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia.

Universidade Federal do Ceará. Fortaleza, Ceará, Brazil.

*Corresponding author. E-mail: [email protected]

ABSTRACT

Philodryas nattereri is a snake commonly found in the semi-arid areas of Brazil. These snakes possess a well-developed Duvernoy’s gland, connected to a rear-fanged for toxin inoculation. This study aimed to perform a histological characterization of the Duvernoy's gland. Four pairs of glands were obtained from specimens used in natural history and herpetofauna distribution research projects, being originally part of the Herpetological

Collection of Núcleo Regional de Ofiologia (NUROF) at the Federal University of Ceará in

Brazil. After the dissection, the glands were maintained in 10% buffered formalin solution and then subjected to histological processing. 5 μm sections were stained by hematoxylin- eosin and toluidine blue. Periodic acid-Schiff (PAS) and PAS + salivary amilase were used in the histochemical study. Macroscopically, the Duvernoy's glands were found to have a whitish color and a lobulated and elongated form. The average length was found to be 6 mm on the left gland and 7 mm on the right whereas the height measurements averaged 3 mm on both sides. Photomicrographs revealed that the glands were coated with a dense connective tissue capsule that emitted septa and divided the gland into lobules. Each lobe contained secretory tubules formed by serous cells that can be viewed as an indication of enzyme production. Additionally, mucous cells were observed in the excretory duct, which may be related to the production of glycoproteins. It was concluded that the Duvernoy's gland of the

Philodryas nattereri snake is predominantly serous, with intercalated mucous cells.

Keywords: Colubrid; Duvernoy’s gland; histological analysis.

RESUMO

Philodryas nattereri é uma serpente comumente encontrada em regiões de caatinga e no semiárido brasileiro. Essas serpentes possuem uma glândula de Duvernoy bem desenvolvida, conectada a um dente sulcado, especializado para a inoculação de toxinas. O trabalho teve como objetivo realizar a caracterização histológica da glândula de Duvernoy desta serpente.

Para o estudo foram utilizados quatro pares de glândulas de animais oriundos de projetos de pesquisa em história natural e distribuição da herpetofauna, tombadas e depositadas na

Coleção Herpetológica do Núcleo Regional de Ofiologia (NUROF) da Universidade Federal do Ceará. Após a dissecção, as glândulas foram mantidas em formol tamponado a 10% e submetidas ao processamento histológico. Cortes de 5 µm foram corados hematoxilina-eosina e azul de toluidina e, para o estudo histoquímico, utilizou-se ácido periódico de Schiff (PAS) e PAS + amilase salivar. Macroscopicamente, a glândula de Duvernoy possuía forma ovulada, lobulada e alongada, apresentando coloração esbranquiçada. A média do comprimento foi de

6 mm para a glândula esquerda e 7 mm para a direita, sendo que ambas tiveram uma média de

3mm cada para a medição da altura. As fotomicrografias revelaram que a glândula de

Duvernoy é revestida por uma cápsula de tecido conjuntivo denso, dividida em lóbulos por septos de tecido conjuntivo. Cada lóbulo contém túbulos secretores formados por células serosas, o que indica produção de proteínas como enzimas. Foi observado glândulas com células mucosas no ducto excretor, o que pode estar relacionado à produção de glicoproteínas.

Concluímos que a glândula de Duvernoy da serpente Philodryas nattereri consiste em uma glândula predominantemente serosa, com células mucosas intercaladas.

Palavras-chave: Análise histológica; colubrídeo; glândula de Duvernoy.

INTRODUCTION

Philodryas nattereri is a snake known in the local language as “corre-campo” or

“tabuleiro”, and is found in the semi-arid regions of Brazil, Paraguay and Colombia (Mesquita et al., 2011). These opisthoglyphous snakes possess a well-developed Duvernoy’s gland, analogous to the true venom glands of the proteroglyphous and solenoglyphous snakes. The

Duvernoy’s gland is located in the temporal, post-orbital region, juxtaposed to the supralabial gland. This gland is connected to a rear fanged, specialized in toxin inoculation (Mackessy,

2002).

The venom of the Philodryas nattereri snake is a mix of proteins and peptides that induce local and systemic actions, similar to those occurring in Bothrops snake bites. The mechanisms involved in the local and systemic actions of this venom are unknown (Nery et al., 2014).

The overall objective of this research work was to perform the histological characterization of the Duvernoy’s gland from specimens of the Philodryas nattereri snake.

The specific goals achieved in this study were the analysis and micro/macro morphological characterization of the glands in addition to the histological processing of the gland’s tissues with two different stains.

MATERIAL AND METHODS

Four Philodryas nattereri composed the sample. All of them were deposited in the

Herpetological Collection from the Ophiology Center of Federal University of Ceará

(NUROF – UFC). Two of them were collected to herpetology studies, under the ICMBio authorization #18596-1, and the other two were part of the alive snakes collection but they had to be humanely euthanized due to captivity nonadaptive syndrome. The animals were euthanized in accordance with the guidelines and protocols of the brazilian regulations. The

morphological study encompassed four pairs of glands from adult Philodryas nattereri snakes.

During the extraction of the Duvernoy's glands, an incision was made to enlarge the opening of the labial commissure, hence improving the dissection of the lateral region of the upper maxilla as described in Serapicos and Merusse (2006). This procedure is shown in

Figures 1C and E. The glands were then fixated in situ with 10% buffered formaldehyde.

After dissection the glands lengths and widths were measured with the help of a digital caliper. The data was appropriately recorded and tabulated. Later the tissues were subjected to histological processing, which started with the dehydration in several alcohol solutions with successively higher concentrations, starting at 70% up until 100% alcohol. After that, the tissues were diaphanyzed in xylol and embedded in paraffin. The microtomy was carried out generating 5 µm slides.

Hematoxylin-eosin and toluidine blue were employed as histological stains allowing characterization of the gland’s tissue and highlighting the acidic structures. Periodic acid–

Schiff (PAS) and PAS + salivary amylase was employed during the histochemical investigation. This allowed the characterization of mucopolysaccharides (neutral) and glycogen, as described by Serapicos and Merusse (2006).

A polarized trinocular microscope with fluorescence (NIKON Eclipse Ni, Japan;

Software Nis 4.0) was utilized for histological characterization. Our results described in this research effort were analyzed in a qualitative descriptive way.

RESULTS

Figures 1A and C shows one of the Philodryas nattereri specimens used in this research. It consisted of a medium-sized snake, with a grayish color, showing some spots on

the scales. In Figure 1B the round pupils and opistoglyphous teeth (rear-fanged present in the upper maxilla) are observed.

The caliper measurements showed an average length of 6mm for the left-side glands and 7 mm for the right-side ones. The average height was found to be 3 mm for both sides. Macroscopically the Duvernoy's glands presented a whitish color and a lobulated and elongated form as can be seen in Figures 1D-E.

The Duvernoy’s gland is composed of secretory tubules, excretory ducts, nerves, and blood vessels (Fig(s). 2B-C and F). It is coated by a dense connective tissue capsule modeled with presence of collagen fibers and fibroblasts. The capsule emits septa rich in collagen fibers that divide the gland into lobules (Fig(s). 2A and C). Each lobe consists of secretory tubules (Fig(s). 2B and D). The tubules are formed by serous cells, with shapes varying from triangular to prismatic with basal nuclei.

The glands were characterized predominantly as serous, with intercalated mucosal cells. The secretory tubules converge to a region where the excretory duct is located. The presence of both mucous and serous cells was verified in the duct walls (Fig. 2F).

Mucous cells and the supra-labial gland reacted positively to PAS, around the borders of the excretory duct, showing magenta tones (Fig(s). 3A-B). The tissues also showed positivity to PAS + salivary amylase in the walls of excretory ducts and mucous cells, although weaker when compared to PAS alone (Fig(s). 3C-D). This indicates that there are other elements, such as neutral mucopolysaccharides. A weak positivity to PAS + salivary amylase was observed in the secretory tubules. The supralabial glands reacted positively to

PAS. These glands consist predominantly of mucous cells, which presented a spherical nucleus in basal position (Fig. 2C).

Mucous cells had shapes ranging from cuboid to columnar with oval nuclei. These cells were clustered together and formed tubules that encircled the lumen. The tissues stained

with toluidine blue showed a strong reactivity of the mucous cells present in both supralabial gland (Fig. 3F) and in the mucous cells intercalated between the serous cells or those bordering the excretory duct of the Duvernoy gland (Fig. 3E).

DISCUSSION

Philodryas nattereri is part of the Dipsadidae family (Zaher et al., 2009) and

Xenodontinae subfamily. It is characterized morphologically by having opisthoglyphous teeth and rounded pupils. In terms of ecology, the Philodryadini tribe is characterized by semi- arboreal or arboreal species and usually constrictors.

In a study involving 12 opistoglyphodonts of the subfamily Xenodontinae and the families Colubridae and Dipsadidae, (including the genus Philodryas), Serapicos and Merusse

(2006) showed that the Duvernoy's gland is divided into lobules constituted by secretory tubules that may or may not be branched. Each lobule is delimited by a connective tissue septum rich in collagen fibers. The columnar serous cells constitute the secretory tubules and the cytoplasm is acidophilic. Each secretory tubule presents a light with acidophilic content.

The secretory tubules converge to the central region of the gland, where there is an excretory duct. This duct runs longitudinally and is composed by mucous cells. The description by

Serapicos and Merusse corroborates the results found in the present study.

Serapicos and Merusse (2006) also verified that the Duvernoy gland of the

Philodryas olfersii and Philodryas patagoniensis snakes were characterized by a strong positivity to proteins and showed reactivity to PAS + Alcian blue, which turned out to be a seromucosa gland.

The PAS reaction is used to detect cells rich in granules whose contents have vic- glycol radicals. These radicals are found in some carbohydrates, such as glycogen for

example. The reaction of the glucose residues with the periodic acid-Schiff results in magenta coloration (Renner and Sabóia-Morais, 2000).

In similar studies involving Duvernoy's glands of Helicops modestus, Clelia plumbea, Natrix tessellata, Oxyrbopus guibei, Phimophis guerini, Tomon dorsatus,

Thamnodynastes strigatus, Philodryas patagoniensis and Philodryas olfersii showed positivity to PAS in the excretory duct epithelium, which presented magenta coloration after the reaction (Akat et al., 2011; Oliveira et al., 2016; Serapicos and Merusse, 2006). The same magenta coloration was observed in the epithelium of the excretory duct of the specie

Philodryas nattereri.

The mucosal cells present in both the supralabial gland and the Duvernoy’s gland reacted more strongly with Toluidine blue. This is likely due to the fact that the mucous cells produce glycoproteins. Toluidine blue is a basic dye that binds to basophilic structures of cells and tissues. It is also a positively charged cationic stain that will react with a negatively charged substrate. The main components of the tissues that react with the basic stains contain acids in their composition, such as nucleic acids, glycosaminoglycans and acid glycoproteins

(Junqueira and Carneiro, 2013).

Taub (1967) points out that the Duvernoy’s gland can be grouped into four main categories according to its histology. The Duvernoy’s gland of the Philodryas nattereri snake is predominantly serous, with intercalated mucous cells, therefore falling in the second category as described by Taub (1967). In a previous study on the biochemical characterization of venom from five species of colubrid (including Philodryas olfersii and P. patagoniensis

(Dipsadidae), Zelanis et al. (2010) found that the amount of protein (μg/mg) present in the poison of Philodryas nattereri was greater than the amount found in the species Philodryas patagoniensis and Tomodon dorsatus. A higher concentration of proteins found in the

Philodryas nattereri venom is a consequence of the large number of serous cells, leading to the secretion of enzymes.

Serous cells are able to secrete toxic substances that help in the immobilization and capture of prey, in the lubrication of the food and also perform digestive functions, preventing the putrefaction of the food inside the digestive tract (Serapicos and Merusse,

2006; Cardozo et al., 2009).

Hartmann and Marques (2005) point out that snakes of the Philodryadini tribe used constriction and / or poisoning to ingest their prey. According to observations made at

NUROF - UFC, the Philodryas nattereri snake uses both constriction and poisoning to subjugate its prey. Simultaneously to constriction, the snakes of the genus Philodryas inoculate the venom by biting and clinging to a single place, alternately moving the right and left maxilla. The Duvernoy gland is connected to the sulphate opistoglyphous teeth where the venom escapes (Cardozo et al., 2009).

The innoculation occurs under low pressure flow and the secretion is released in openings near the base of the prey, unlike what occurs with the viperids, where the venom is stored in a large lumen and the secretion flow occurs under high pressure via the preys channel (Kardong, 2002).

Further research into the composition of venoms produced by the Duvernoy’s glands of Colubridae and Dipsadidae familys is expected to yield breakthhroughs in the areas of human and veterinary medicine, clinical and laboratory, biochemical, immunological, pathophysiological and pharmacological (Weinstein et al., 2011). It’s then paramount to study the pathophysiological mechanisms of ophidian accidents caused by Philodryas nattereri.

This study lead to the conclusion that the Duvernoy’s gland of the Philodryas nattereri snake falls into the second histological category according to Taub (1967), which consists of a predominantly serous gland with intercalated mucous cells. The histological

characterization of this gland serves as a tool for characterization of the venom’s chemical composition, as well as to show the correlation between the morphology of the gland and the habit, the eating behavior. It also contributes to the study of the morphological mechanisms involved in the snakebite accidents caused by this species.

DISCLOSURE OF INTERESTS

All researchers involved in this study agreed upon the publication of this work and declare to have no conflict of interest neither personal or institutional.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank the researchers team of NUROF – UFC for technical assistance. This work was supported by grants provided by the Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado do Ceará (FUNCAP).

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Fig. 1. A. Philodryas nattereri snake. B. Round pupils and opistoglyphous teeth (arrow). C. Dissection of the Duvernoy´s gland. D. Duvernoy´s gland extracted from the Philodryas nattereri snake. E. Duvernoy gland (arrow) of Philodryas nattereri snake.

Fig. 2. Photomicrographs of the Duvernoy and supralabial glands of the Philodryas nattereri snake. HE. A. Duvernoy´s gland divided into lobes (L) and separated by septa (S); 100X. B. Capsule (Cp), nerve (N), blood vessel (Vs) and serous secretory tubules (St) presente in the Duvernoy´s gland; 400X; C. Septa (S), Supralabial gland (SpG) and Duvernoy´s gland (Dg). D. Serous cells (Sc) with triangular shape and e basal nuclei (arrow); 400x. E. Serous cells forming secretory tubules (St); 200X. F. Excretory duct (Ed) presenting mucous cells (Mc) and serous cells (Sc) 100X. Nikon trinocular optical microscope / Software Nis 4.0.

Fig. 3. Photomicrographs of the Duvernoy´s gland of the Philodryas nattereri snake. Staining method: Periodic acid-Schiff (PAS): A and B. PAS+ Salivary amylase: C and D. Toluidine blue: E and F. A. Excretory duct margins (Ed) with presence of mucous cells (Mc) stained in magenta; 100x. B. Mucous cells (arrows) stained in magenta, 100x. C and D. Reactive mucosal cells (arrows) even after PAS reaction + salivary amylase; 200x. E. Excretory duct margins (Ed). Mucous cells (arrows) reactive to the staining of toluidine blue; 100x. F. Mucous glands (arrows) of the supralabial gland most strongly stained with toluidine blue; 100x. Nikon Trinocular optical microscope / Nis Software 4.0.

8 CONCLUSÕES

A glândula de Duvernoy da serpente Philodryas nattereri enquadrou-se na segunda categoria descrita por TAUB (1967), sendo caracterizada como sendo predominantemente serosa com células mucosas intercaladas, o que está correlacionado ao seu hábito alimentar e o modo de subjugar suas presas. O veneno produzido pela glândula de Duvernoy dessa espécie foi capaz de causar alterações morfofuncionais em órgãos e tecidos de ratos após o envenenamento, sendo dose dependente.

9 PERSPECTIVAS

Os resultados obtidos nesse trabalho mostraram as alterações morfofuncionais que o veneno total da serpente Philodryas natterei foi capaz de causar em ratos em diferentes concentrações. É necessário dar continuidade aos estudos desse veneno com o intuito de realizar o fracionamento e determinar as suas propriedades químicas. Verificamos que o veneno foi capaz de causar hemorragia em diferentes órgãos e tecidos, levando a alterações de hepatócitos, eosinofilia de células cardíacas, hemorragia pulmonar e congestão de túbulos contorcidos distais e proximais em rins. Os estudos desse veneno contra as células tumorais podem levar a resultados animadores.

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ANEXO

ANEXO A – COMITÊ DE ÉTICA