Retrophyllum Rospigliosii Parte 1 Universidad De Los Andes-Facultad De Ciencias-Postgrado En Química Aplicada

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Montealegre Roger Enrique Diterpenoides y biflavonoides de las hojas de Retrophyllum rospigliosii parte 1 Universidad de Los Andes-Facultad de Ciencias-Postgrado en Química Aplicada. 2005. p. 131 Venezuela Disponible en: http://bdigital.ula.ve/RediCiencia/busquedas/DocumentoRedi.jsp?file=33583&type=ArchivoDocumento &view=pdf&docu=26866&col=5

¿Cómo citar? (::(!/ t_¡} >< '¡J:),3J,11'vS

Universidad de Los Andes Facultad de Ciencias Departamento de Química Laboratorio de Productos Naturales

Diterpenoides y Biflavonoides de las Hojas del Retrophyllum rospigliosii

Trabajo de Grado de Maestría Postgrado Interdiciplinario en Química Aplicada Mención Química Orgánica -Productos Naturales

Lic. Roger Enrique Montealegre

Mérida-Venezuela Septiembre, 2008 III

AGRADECIMIENTOS

Culminar una meta propuesta, con muchos sacrificios, es razón suficiente, de poder expresar, cuando alguien en la vida se propone algo lo logra.

• A Dios Todopoderoso, por ser mi protector y darme el don de la vida, la fuerza y el poder, iluminando mis conocimientos para emprender el sendero del éxito. • A mi Madre, por el amor, apoyo incondicional, confianza, a ti madre por ser todo en mi vida, para ti este triunfo. • A mis Hijos y Nietos, son ellos la fuerza para continuar luchando. • A Victoria Montealegre, se que estas en el cielo, junto a Dios, a pesar que estuviste tan poco tiempo con nosotros, pero fue el suficiente para amarte. • A Ivis, mi compañera, por brindarme todo su apoyo. • A mi Hermano Javier, por el apoyo y la fuerza para seguir luchando. • Gracias al profesor Juan Amaro, por brindarme la oportunidad de trabajar con en este proyecto y de forma especial le doy gracias por ser un amigo y un Padre .. • Al Profesor Paulino Delgado, por sus sabios concejos y esperando pronta recuperación. • A los profesores. Ali Bahsas, Andrés Abbad, Sonia Kothec y Carmelo Rosquete. • A mis Amigos del laboratorio de Productos Naturales, por su apoyo, hermandad • Gracias A los Técnicos Pedro Ribas, Ciro Rodríguez, por brindarme su amistad y ayuda. • Y a todas aquellas personas que de una u otra forma contribuyeron para la elaboración de este trabajo. • A la ilustre Universidad de Los Andes. • Al CONICIT, por el apoyo financiero otorgado para la realización de este Trabajo Especial de Grado, a través del Proyecto SI-97001521. 2

CONTENIDO

Página 1. Acta...... i 2. Agradecimientos ..... :...... ii 3. Contenido ...... 2 4. Introducción ...... 4 5. Hipótesis .:...... 6 6. Objetivos ...... 6 7. Resultados y Discusión ...... 7 7.1. Ferruginol [1] ...... 9 7.2. Sempervirol [2) ...... 23 7.3. Totarol [3) ...... 36 7.4. Nagilactona F [4] ...... 49 7.5. Sciadopitysina [5] ...... 63 7.6. 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6] ...... 84 7.7. 7, 7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7] ...... 100 7.8. Podocarpusflavona A [8] ...... 116 7.9. Amentoflavona [9] ...... 131 7.10. 7,4',7",4"'-Tetra-0-Metil-Amentoflavona [10] ...... 148 8. Parte Experimental ...... 151 9. Conclusiones ...... 161 10. Referencias Bibliográficas ...... 162 11. Índices ...... 183 3

RESUMEN

De las hojas del Retrophyllum rospigliosii fueron aislados los diterpenoides Ferruginol [1], Sempervirol [2], Totarol [3] y Nagilactona F (4], y las biflavonas Sciadopitysina (5], 7,4',7"-Tri-0-jietil/Amentoflavona (6], 7 ,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7], Podocarpusflavona A [8], Amentoflavona [9] y 7,4',7",4"'-Tetra-0-Metil-Amentoflavona [10]. Estos compuestos fueron caracterizados sobre la base de estudios espectroscópicos, incluyendo experimentos uni- y bi-dimensionales de RMN. La coexistencia en esta especie de diterpenos aromáticos tricíclicos de las series de:l abietano, sempervirano y totarano, sustenta la teoría sobre el posible origen biogenético de estos tres esqueletos, a partir de un precursor común. La amplia gama de actividades reportada en la bibliografía para los compuestos aislados, indica que el R. rospigliosii es una nueva fuente importante de metabolitos potencialmente activos desde el punto de vista biológico y/o farmacológico.

SUMMARY

The diterpenoids Ferruginol (1], Sempervirol [2], Totarol (3] and Nagilactone F (4], and the biflavones Sciadopitysin (5], 7,4',7" Tri-0-Methyl-Amentoflavone [6], 7,7"-Di-0-Methyl-Amentoflavone [7], Podocarpusflavone A [8], Amentoflavone (9] and 7,4',7",4"'-Tetra-0- Methyl-Amentoflavone [10] have been isolated from leaves of Retrophyllum rospigliosii. These compounds were characterized on the basis of spectroscopic studies, including lD- and 2D-NMR experiments. The coexistence in this species of aromatic tricyclic diterpenes of abietane totarane and sempervirane series, supports the theory on a possible biogenetic origin of these skeletons, from a common precursor. The wide range of activities reported in the bibliography for the isolated compounds, indicates that R. rospigliosü is an important new source of potential biological and pharmacological active metabolites. 4

INTRODUCCIÓN

La familia Podocarpaceae, incluida en la clase Pinophyta (Conifera), del grupo de las Girnnosperrnas, la integran especies arbóreas o arbustivas, que se agrupan en 17 géneros y aproximadamente unos 150 taxa (Page, 1990). Su área de distribución geográfica se concentra principalmente en el Hemiferio Sur, aún cuando algunas especies alcanzan, en Asia, las regiones subtropicales de China y Japón, y en América, el cinturón de países que se extiende a lo largo de Centroarnérica, desde el sur de México hasta Colombia y Venezuela, y algunos países en las islas caribeñas corno Cuba y la República Dominicana (Farjon, 1998). El género más representativo de la familia, Podocarpus, el cual en un principio estuvo conformado por unas cien (100) especies, ha sido reorganizado en varias oportunidades (Buchholz & Gray, 1948; Page, 1989) y en razón a ello, el mismo ha sido segregado en ocho géneros: Afrocarpus, Dacrycarpus, Halocarpus, Lagarostrobos, Nageia (=Decussocarpus), Podocarpus, Prumnopitys y Retrophyllum (De Laubenfels, 1969; 1972; 1978; 1985; 1987; 1989; Page, 1989; Quinn, 1970; 1982). La evolución histórica de esta reorganización se representa en el Cuadro 1:

1 Cuadro 1: Reorganización Histórica del Género Podocarpus "sensu lato"

1 Podocarpus-L;Héritier ex Pers'oon "sen su /atÓ" ·¡==>Género descritopo¡· L'Helitier (1807J · · · Bertrand (1874) De Laubenfels (1969; 1972; 1985) Engler & Prantl (1915) De Laubenfels (1969) l_Dac{rcarpus De Lau~_ ;. ntelsJ tPrumn -~pitys Ph U~ J Page (1989) 1 Decussocarpus De Laubenfels

[ Sundacarpus" C.~ N. Page' 1 ll 111 Nombre declarado ilegal por De Laubenfels (1987) ¡Nageia Gaertn.~ 1 Halocáqíus Quinn Page (1989) J u, . J .Af"rocarpusC. N. Page} Géuero segregado de Daczydiwn - ' ,, por Quinn (1982), en el cual se [ ~· .. '1. incluyen luego dos especies de Retrop~YII!:!m C.~· P~9e J Podocal'pus s. J. (Page, 1989)

JNageia Gaertn. "sen~u~tricto" J 1" Podocarpus "sensu stricto" J 5

Tomando en cuenta esta reorganización, en la actualidad, en Venezuela se reconocen 16 taxa de Podocarpaceae, incluídas en los géneros Podocarpus "s. s.", (10 especies y 2 variedades), Prumnopitys (dos especies) y Retrophyllum (1 especie) (De Laubenfels, 1982; 1985; Page, 1989). La única especie incluída en el género Retrophyllum, el R. rospigliosii (Pilger) C. N. Page, fue denominada anteriormente Podocarpus rospigliosii Pilger y Decussocarpus rospigliosii De Laubenfels (Veillon, 1962). Popularmente se le conoce en Mérida con los nombres comunes de "Pino Laso", "Pino Real" y "Pinabete" (Fig. 1), y se considera la conífera más representativa de la región andina venezolana, encontrándose con relativa frecuencia en los bosques nublados de los estados Mérida, Táchira y Trujillo. Este árbol posee un notable interés en silvicultura (Corredor Treja, 1975; 2001), siendo su madera apreciada para trabajos de ebanistería (Corothie, 1948; Keenan & Tejada, 1987).

Figura 1: Retrophyllum rospigliosii (Pilger) C. N. Page

~ 1 Ejemplar adulto joven 1 6

La reorganización taxonómica del género Podocarpus s. l. ha sido sustentada, principalmente, en caracteres anatómicos y morfológicos (Quinn, 1970; Page, 1989); sin embargo, en la conformación de los nuevos géneros y en la delimitación de sus especies, los caracteres químicos han jugado un papel relevante (Aplin et al., 1963; Cambie & Weston, 1968; Holloway, 1938; Lowry, 1972; Markham et al., 1985). En conexión con lo anterior, en el Laboratorio de Productos Naturales del Departamento de Química de la Universidad de Los Andes, emprendimos, hace unos años, el estudio fitoquímico del Retrophyllum rospigliosii (Pilger) C. N. Page, para entonces denominado Decussocarpus rospigliosii (Pilger) De Laubenfels: Inicialmente abordamos el análisis de la corteza, y comprobamos que la misma es una fuente importante de metabolitos secundarios, potencialmente activos desde el punto de vista biológico y farmacológico (Amaro-Luis & Carroz, 1988; 1989). Posteriormente siguieron estudios d.e las semillas (Ortiz-Pernía, 2003) y de un subextracto en diclorometano de las hojas (Amaro-Luis et al., 2006). Continuando en esta línea de investigación, el presente trabajo lo centramos en el estudio del extracto acetónico de las hojas. Este estudio se fundamentó en la siguiente hipótesis y en concordancia con la misma se plantearon los objetivos expuestos a continuación:

HIPÓTESIS

En vista de que los metabolitos secundarios son compuestos que, se encuentran frecuentemente presentes en las diferentes partes de las especies del género Podocarpus "sensu lato", cabría esperar que las hojas del "Pino Laso", Retrophyllum rospigliosii (Pilger) C. N. Page (sin. Podocarpus rospigliosii Pilger) sean una nueva fuente de este tipo de productos, análogos a los hasta ahora reportados en el género, los cuales pudieran presentar interés como marcadores taxonómicos o corno productos activos desde el punto de vista biológico.

OBJETIVOS

1. Aislar, purificar e identificar los principales metabolitos secundarios presentes en las hojas del Retrophyllum rospigliosii (Pilger) C. N. Page. 2. Aportar datos fitoquímicos con el fin de que los mismos: A. Sirvan de ayuda para esclarecer el estatus taxonómico del género Retrophyllum. B. Permitan orientar los estudios que se pretendan realizar en el futuro, sobre la actividad biológica y/o farmacológica de esta especie, o los compuestos que de ella se logren aislar. 7

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las hojas del Retrophyllum rospigliosii (Pilger) C. N. Page fueron secadas a la sombra y posteriormente molidas. El material vegetal molido, se extrajo hasta agotamiento durante varios días, con acetona, a la temperatura ambiente. El extrado acetónico obtenido, se adsorbió sobre gel de sílice y se percoló a través de una columna de gel de sílice "al vacío" utilizando la técnica de Coll & Bowden (1986). De esta manera se obtuvieron cuatro fracciones, bajadas con los solventes hexanos, diclorometano, acetato de etilo y metanol, aplicados en orden creciente de polaridad. La fracción de acetato de etilo fue concentrada en rotavapor y el extracto obtenido, fue cromatografiado en columna de gel de sílice al vacío. Cada una de las fracciones fue posteriormente procesada, utilizando diferentes técnicas cromatográficas (Coll & Bowden, 1986; Henke, 1996; Mikes, 1979; Sjovall et al., 1968; Snyder & Kirkland, 1974; Stahl, 1969), hasta lograr la purificación de los productos. En el Esquema I se representa el proceso global empleado en el aislamiento, separación y purificación de los productos.

Esquema 1: Procedimiento Empleado en el Aislamiento, Separación y Purificación de los Metabolitos Secundarios del Retrophyllum rospigliosii (Pilger) C. N. Page

1) El.:tracción con Material vegetal, acetona a 25 "C seco v molido Extracto {hojas) 2) Concentración en acetónico rota\·apor al \-a<:ío Percolado en columna de gel de sílice "al vacío"

(no procesada)

Reuniones de las fracciones l sobre la base -----+ A de SU análiSIS porTLC 1) Cromatografía en columna de gel de sílice 2) Cromatografia sobre Sephadex I.Ji·20 3) TLC preparath·a en placas de gel de sílice 4) Cristalización 8

Este procedimiento condujo a la separación de diez (10) productos (Cuadro II), los cuales fueron estructuralmente caracterizados mediante métodos físicos y espectroscópicos (Crew et al., 1998; Lamber et al., 1998).

Cuadro 11: Compuestos Aislados de las Hojas del Retrophyllum rospigliosii (Pilger) C. N. Page

Ferruginol [1) Sempervirol [2]

Totarol [3) Nagilactona F [4)

Sciadopitysina (5] Podocarpusflavona A [8] Rt = R2 = ~ : CH3 ; R3 : H ~ : CH3; R1 = R2 = R3 : H

7,4',7"-Tri-(0)-Metil-Amentoflavona [6) Amentoflavona [9] R1 = R2 = R3 : CH3 ; ~ : H R1 = R2 = R3 = ~ : H

7,7"-Di-(0)-Metil-Amentoflavona (7] 7,4',7", 4"'-Tetra-(0)-Metil-Amentoflavona [10 R1 = R3 : CH3 ; R2 = ~ : H R1 = R2 = RJ = ~ : CH3 9

Ferruginol [ 1]

De las fracciones 5-8 de la cromatografía general se aisló un sólido blanco que recristalizó en metano! como finas agujas de P.F. = 130-132°C; [a] = +40,6°. La presencia en su EM (Fig. lE; Tabla lE) de un ión molecular a m/z: 286 y los datos derivados del análisis de su espectro de RMN-13C (Fig. lD; Tabla lD) sobre el número y tipo de carbonos presentes en la molécula, permitieron proponer para esta sustancia la fórmula molecular C20H300, a la cual corresponden seis insaturaciones. En su espectro IR (Fig. lA; Tabla lA) se aprecian absorciones características de hidroxilos [vwax: 3.390 cm·1 (0-H} vwax: 1.160 cm·1 (C-0)] y de aromáticos 1 (vmax: 1.650 y 757 cm- ) (Bellamy, 1975), con lo cual quedó establecida la naturaleza del único átomo de oxígeno de la fórmula molecular y se justificaron cuatro de los seis grados de insaturación que exige la misma. El espectro UV (Fig. lB), con bandas a A.max.: 207 y 278 nm, confirmó la existencia de un anillo aromático.

Figura 1A: Espectro Infrarrojo (KBr), del Ferruginol [1]

105,5

104

102 OH 3390 100 %T 17 98

CH 3 2931 19 18 94,0 4000,0 3000 2000 1500 1000 450,0 cm-1

Tabla lA: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR (KBr), del Ferruginol [1]

Umax. ( cm-1) 3.390 2.931 -2.843 1.650 1.241 1.160 757

Asignación 0-H C-H (-CH 3 y CH2) C=C C-H (Isoprop.) C-0 =C-H 10

Figura 1B: Espectro lN (MeOH) del Ferruginol [1]

16 207nm OH 2,73 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 ABS 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 000 ' 190,0 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 nm

Su espectro de RMN- 1H (Fig. 1C; Tabla 1C) muestra señales que caracterizan a un grupo isopropilo [dobletes superpuestos a OH: 1,24 U= 7Hz) (H-16 y H-17) y septuplete a OH: 3,12 U= 7Hz) (H-15)], el cual, ante la posición a bajo campo de este septuplete, debe estar situado sobre un anillo aromático; el acoplamiento entre los .· dobletes y el septuplete es evidente por el cruce que presentan estas señales en el espectro 1H/H-COSY (Fig. 1F). Los picos de los carbonos que conforman el referido grupo isopropilo fueron localizados mediante el espectro HMQC (Fig. 1G) a

8c: 23,0, -CH3 (C-16); Oc: 22,9, -CH3 (C-17) y Oc: 27,2, >CH (C-15); estos picos se cruzan, en el espectro HMBC (Fig. 1H-1 y 1H-2; Diagrama 1), con las señales de los hidrógenos que forman parte del grupo isopropilo, conformando la secuencia de correlaciones [C-15 +-+ H-16 +-+ C-17 +-+ H-15 +-+ C-16 +-+ H-17 +-+ C-15]. Por otro lado, las observaciones de cruces entre un pico [oc:127,0 (C-14)] que tipifica a un carbono aromático cuaternario y las señales asignadas a H-15, H-16 y H-17, confirma que el isopropilo se une a un anillo bencénico, a través de este carbono (subunidad [A]). 11

En el espectro de RMN- 1H. también se observa un par de finos singuletes (oH: 6,64 y oH: 6,84], que caracterizan a dos· hidrógenos aromáticos en disposición "para", no acoplados (H-11 y H-14, respectivamente), cuyos carbonos, según el espectro HMQC, resuenan a oc: 111,3 (C-11) y Se: 127,0 (C-14). Sobre la base de las correlaciones observadas en el espectro HMBC (Fig. 1H-1) [(C-15 +-+ H-14 +-+ C-14 +-+ H-15 +-+ C-13 +-+ H-11; C-13 +-+ H-15)], es evidente que estos dos carbonos se sitúan adyacente a un carbono aromático cuaternario que soporta un grupo hidroxilo [=C-OH; Se: 151,0 (C-12)], el cual a su vez, se une al carbono que lleva el grupo isopropilo (C-13). De esta manera quedó establecida la subunidad estructural [B], la cual, ante la presencia en el espectro de RMN-13C (Fig. 1D; Tabla 1D) de dos picos asignables a carbonos aromáticos cuaternarios =C< [oc= 127,6 (C-8); 8c= 149,0 (C-9)], debe insertarse en un núcleo bencénico 1,2,4,5-tetrasustituido para conformar la subunidad estructural [C].

16 CH3 R 1st-H 'e"13 l ' CH3 IR 17

Subunidad [A] Subunidad [B] Subunidad [C]

Figura 11: Subunidades Estructurales en el Ferruginol [1]

Los picos asignados a los carbonos aromáticos cuaternarios alquilados C-8 y C-9, se correlacionan en el espectro HMBC (Fig. 1H-1 y 1H-2), con dos multipletes [oH: 2,77, ddd (] =4, 7 y 16Hz) {H-7a) y 8H: 2,89, ddd (]:::: 2, 7 y 16 Hz) (H-7rJ)], los cuales se cruzan en el espectro HMQC (Fig. 1G), con el pico de un carbono atribuible a un metileno bencílico [oc=30,1 (C-7)]. Este pico, a su vez, muestra correlaciones en el HMBC con la señal de un protón metínico [8H:1,31, dd (] =2 y 13Hz) (H-5)] y las de dos protones metilénicos (8H:1,86, ddt U= 2, 7 y 13Hz) (H-6a) y SH:1,66, m, (H-6rJ)]; los picos de los carbonos unidos a estos hidrógenos [Oc: 50,7 (C-5) y Oc: 19,6 (C-6)] se cruzan ambos con las señales asignadas a H-7a y a H-7rJ. Estos datos indican de manera inequívoca que la subunidad estructural [C] se prolonga a través de C-8 en una cadena alquílica -CH2-CH2-CH2-, para constituir la subunidad estructural [D]. 12

El espectro HMBC (Fig. lH-1), indica también que el pico correspondiente a C-9 se cruza con la señal de H-5 y con un singulete atribuible a un metilo terciario [oH: 1, 17, H-20)). Este metilo está situado sobre un carbono cuaternario sp3 [oc: 37,9 (C-10)], el cual se correlaciona con H-5, H-6 y H-20. Por otro lado el pico del C-5 se cruza con las señales de H-6, H-7 y H-20. Es pues evidente que el anillo aromático (subunidad estructural [C]) se prolonga a través de C-9 hacia un carbono cuaternario que soporta un metilo, y luego hacia el metino C-5 que se une a C-6 para cerrar un ciclo de seis miembros y constituir la subunidad estructural [E].

Subunidad [D] Subunidad [E] Subunidad [F]

Figura 1J: Subunidades Estructurales en el Ferruginol [1]

El espectro de RMN- 1H, exhibe otros dos singuletes típicos de metilos terciarios [oH: 0,92 (H-19) y oH: 0,94 (H-18)], cuyos carbonos, según el espectro HMQC, resuenan respectivamente a oc= 21,9 (C-19) y oc= 33,8 (C-18). Ambos singuletes se correlacionan en el espectro HMBC con el pico del C-5, y con las señales correspondientes a un carbono cuaternario sp3 [oc: 33,7 (C-4)] y a un carbono metilénico [oc: 42,1 (C-3)]; la señal de este carbono metilénico se corresponde con un doblete ancho [oH: 2,17 (H-1¡3)], asignable a uno de los protones de otro metileno [oc: 39,2 (C-1], y dicho doblete se correlaciona además con C-20 y con el pico de un· tercer metileno foc:19,7 (C-2]. Estos datos demuestran que la subunidad estructural.

[E] se acopla a través de C-5 y C-10 al resto alquílico -CH2-CH 2-CH 2-C(CH 3) 2- para conformar la estructura gruesa [F]. La estructura [F] resultó congruente con el patrón de fragmentación (Esquema 1) detectado en su EM (Fig. lE; Tabla lE) en el cual destacan los iones a m/z: 175, m/z: 189, m/z: 201, m/z: 215 y m/z: 243, todos ellos originados por ruptura del anillo A y subsiguientes reagrupamientos. Este patrón concuerda con los reportados en la literatura para otros diterpenos tricíclicos aromáticos de las series del abietano y totarano (Enzell, 1966b; Enzell & Ryhage, 1967a; 1967b). 13

1 J Figura 1C: Espectro de RMN- H (CD(:l3,, 400 MHz), del Ferruginol [1] j

H-16 16 H-20 H-17

H·18 H-19

19 18

H-11 ,, 1 • '' 1.2 ... H-14

- 11 " 2

Tabla 1C: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro 1 de RMN- H (CDCl3,400 MHz), del Ferruginol [1]

H H-1a H-1J3 H-2a. H-2P H-3a. H-3J3 H-5 o 1,39 2,17 1,58 1,73 1,20 1,47 1,31 mult ddd d (a) m d (a) dsx dd dd J (Hz) =3, 7 y 13 =13 - =3 y 13 ::3 =3 y 13 ::2 y 13 H H-6a H-6J3 H-7a H-7J3 H-11 H-14 H-15 o 1,86 1,66 2,77 2,89 6,64 6,84 3,12 mult ddt m ddd ddd S S spt J (Hz) =2, 7 y 13 - =4, 7 y 16 =2, 7 y 16 -- ::7 H H-16 y H-17 H-18 H-19 H-20 OH TMSi o 1,24 0,94 0,92 1,17 4,62 como Patrón mult d (solapados) S S S S Interno J (Hz) ::7 - - - - 14

13 Figura lD: Espectro de RMN- C (CDCl3 , 100 MHz) del Ferruginol (1]

C-18

C-16 C-2 C·5 C-18 C·? C-3 C-1 C·lO C-4 C-15 C-20 C-17 C-19 C-6

1 1 1 ,. .. .. "'

OH. 16

C-14 C-11 17

19 18

Tabla 10: Desplazamientos Químicos (8) en el Espectro 13 de RMN- C (CDC1 3,, 100 MHz), del Ferruginol [1] e C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 o (ppm) 39,2 19,7 42,1 33,7 50,7 19,6 30,1

Tipo >CH2 >CH 2 >CH2 >C< >CH >CH2 >CH2 e C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14 o (ppm) 127,6 149,0 37,9 111,3 151,0 131,8 127.0 Tipo =C< =C< >C< =CH =COH =C< =CH e C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 TMSi corno 27,2 o (ppm) 23,0 22,9 33,8 21,9 25,1 Patrón Interno Tipo >CH -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 15

Figura lE: Espectro de Masas (lE, 70 eV), del Ferruginol(l]

%T 17 100 271 90

80 19 18 70 175 60

50 201 286 40 189 30 69 20 55 10

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 miZ

Tabla lE: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas (lE, 70 e V), del Ferruginol (1)

m/z 286 271 243 229 215 203 201 189

Abundancia 47,21 100,0 7,14 12,10 5,72 7,72 45,28 35,46 Relativa

m/z 187 175 173 159 133 115 69 55

Abundancia 9,21 63,12 11,25 7,49 3,72 5,89 22,65 10,31 Relativa 16

Esquema 1: Interpretación del.Patrón de Fragmentación en el Espectro de Masas del Ferruginol [1]

-C:¡Ha -H· -C~a -H" [a] [b]

[al

m/z: 243 m/z: 286 [M+] m/z: 229 C2oH3oO

-C;Jlla

(e] [d]

m/z: 215 m/z: 271 m/z: 229

[e]

1 ' ' ""'.... _," , 1

-caH1o + +

m/z: 189 m/z: 175 m/z: 201 17

1 Figura 1F: Espectro H/H-COSY (CI;>Cl3 , 400 MHz), del Ferruginol [1)

1.0 19 18 H-15/H-1 ~ H-15//H-1 1.5

~ 2.0

2.5

H-7jliH-6a ~ ~ H-7a/H-6Jl

J.O

.,.

Pl'• 3 o 2.0 1.5

1 Correlaciones en el Espectro H/H-COSY (CDCI3, 400 MHz), del Ferruginol [1]

I ( H-ta)

( H-16 )M--•---..{ H-15 )M--•----..{ H-17 ) 18

Figura 1G: Espectro HMQC (CDCl3), del Ferruginol [1]

H-14 H-11

20 •••

o 40

H 16

C-11

C-14

C-1~ C-7

C-~ 19

Figura 1H-1: Espectro HMBC {CDCl3), del Ferruginol [1]

H-14Hf11 H-7a H-15 H- 7 ~ 1 1 A i ... 11 Jl ...... e 1' • - tJ 1 o "fll, 16 •• Q) ¡• .. .1!) 1 o H o IP. "' 12 13 15 C·5 ---1 .. ~ 17 ~C:S/H-7a • DO ~-... ,..... " ~:.:· :' :: ,. r+----l f\ii ao 19 18

100 e 11/H-14 C-11- o • C-13/H· 6 120 lA41J.115 C-13/H· 7 C-14.~ 0 C-8/H ~1 o OOib C-8 .:;-- OC-13/E -11 o • C-13 c-t3ii -15 1-40 l..·~tn· u C-9 C-9/H-1 C-!/H-7 C-12 & $ C-12/E -11 ( ·12/H-15 o ..,.. C-!/H-7 .. = . 0011

ppo

H-11 H-14

C-11- <:..__;::> C-11/H-11

C-14 C-SH-11 c-a= ~ ... C-13- {50s:::::::22.) C-1g/H·11 ...

C-9/H-14 C-9/H-11 c-9 - ee==::> J ... L· f.:;tn·.l'l l..· L-4'0·~~ = C-12- 1._~ O./ - .' "

.: 20

Figura tH-2: Espectro HMBC (CDCI3), del Ferruginol [1]

H-16 H-17 H-20

H-7a H-15 H-7p·

125 o ei(:JO~ C-8/H 7a C-13/H-16 C-14/H- ~ C-8/H 7P C-13/H-17·r, 16 '"' o H C-13/H·l~ 12 15 ® ~3 17 "" ~·".1 ..,,. 10 8 7 ... : 6 H. 19 18 C-9/H-7a "" C-9/H-7P C-9 lo D ~ ,,. C-12 ~ C-12/H--~- ~ C-9/H-20 ,, J. O .' 2 D H-16 H-18 H-17 H-20 H-19

C o ID ro C.-R/1 f.I-!> D • C~6 C-6/H-7a C-19 - ~ ¡;¡¡~. S rJ ~ l C-6/H-7p 1 o 0 :-' 1 o C-20 - ~ 25 C-15 - o C-15, fl-16 ~ C-15¡ fl-17 C-7/H-6p o C-7 - ... JO C-4 C-1-a- o~oo ~ ~- G C-10/H-6p 'iiO "' C-1 0- p. • r C-1 - o~ ,o: 40 18 C-3 C-1 20 - ~~~-3/HC-3/H 1!1

45 ~-5/H-HI C-5/H-7a C-5/H-20 5/H-19 C-5/H·7P C-5/H-6p A 1~ C-5 - vv ·w 50 ~ 1\M - JIPI J.O ... 2 D ... 1 o 21

Diagrama 1: Correlaciones 13CfH, en el Espectro HMBC del Ferruginol [1]

H-2}€)H-20 C-1 H-5 }€) H-6 H-11}8H-15

H-1 H-7}8H-15 C-8 H-16}8 H-3 B H-17

H-7 }0 H-15lQ H-11 C-9 H-20 H-17 J'\:'l

H-3 H-1 }e H-5 H-6 C-10 H-15~ H-16~ H-6 H-20 H-18 H-19 H-14 le H-5 }~ H-19 ~ H-6 H-7 H-11~ H-18 H-5 ~ H-19 H-14~ H-18~ H-20 H-11 H-5 ~ H-15 H-7 J'\::_/ H-16 H-5}9 H-17 22

Al consultar la bibliografía pudo constatarse que la estructura gruesa [F], corresponde a la reportada para el Ferruginol [1], un diterpeno aislado por primera vez del Podocarpus ferrugineus (Brandt & Neubauer, 1939). Su estructura fue completamente establecida por Campbell & Todd (1942) y luego confirmada por síntesis total (Matsumoto & Usui, 1979; Matsumoto et al., 1977; Meyer et al., 1966; 1975; Snitman et al., 1978; Takai et al., 1984; Torii et al., 1977). Los datos de RMN, de este diterpeno, los cuales pudieron ser inequívocamente asignados mediante técnicas bidimensionales, coinciden con los reportados en la literatura.

El ferruginol también se encuentra presente en muchas otras especies, pertenecientes a las familias Cupressaceae, Lamiaceae, Podocarpaceae, Taxaceae, Taxodiaceae y Verbenaceae, tales como Austrocedrus chilensis (Flores et al., 2001), Taxodium balticum (Otto et al., 2002), Thuja plicata (Sharp et al., 2001) y Vitex rotundifolia (Ono et al., 1999). Su presencia en el género Salvia es particularmente notable, habiendo sido reportado para las especies S. aurea, S. argentea, S. cavaleriei, S. constanea, S. eriophora, S. manigero, S. milthiorriza, S. syriaca, S. trijuga, S. viridis y S. yunnanensis, entre otras (Aboul-Ela et al., 2000; Miyasaka et al., 1985; Ulubelen et al., 2000; 2002; Yang et al., 1996). Por último es oportuno destacar que el ferruginol ha mostrado ser un diterpeno notablemente activo desde el punto de vista biológico y farmacológico. Particularmente notable es su actividad antibacteriana (Muhammad et al., 1996; Moujir et al., 1996), antifúngica (Chang et al., 1999), citotóxica (He et al., 1997), hipotensiva (Kolak et al., 2001), antioxidante (Ono et al., 1999) e inhibidora de la agregación plaquetaria (Luo et al., 1988). 23

Sempervirol [2)

De las fracciones 5-8 de la cromatografía general se aisló un sólido blanco que recristalizó en metanol como finas agujas de P.F. = 130-132°C, [a] = +60° El análisis detallado de sus espectros de RMN-13C (Fig. 2D; Tabla 2D), permitió determinar el número, tipo de hibridación y grado de sustitución de cada uno de los carbonos que conforman la molécula. Con estos datos, y la detección en el espectro de masas (Fig. 2E; Tabla 2E) de un ión molecular a m/z: 286, fue posible establecer la fórmula molecular C20H30Ü. En su espectro IR (Fig. 2A; Tabla 2A) se aprecian absorciones características de hidroxilos [vmax: 3.415 cm·1 (0-H); vmax: 1.160 cm·1 (C-O)J y de aromáticos 1 1 [vmax: 1.648 cm· (C=C) y 754 cm· ( =C-H)] (Bellamy, 1975). Al tomar en cuenta que la fórmula molecular incluye un solo átomo de oxígeno, es obvio que éste forma parte de un grupo hidroxilo.

Figura 2A: Espectro Infrarrojo (KBr), del Sempervirol [2)

106,0

100 OH 3415 754 95 C-0 1160 %T CH CHCH 90 3 3 1239

CH3 80,0 2924 4000,0 3000 2000 1500 1000 450,0 cm-1

Tabla 2A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR (KBr ), del Sempervirol [2]

Umax.(cm·l) 3.415 2.924 -2.840 1.648 1.160 754 1

Asignación 0-H C-H {-CH 3 y -CH2 ) C=C C-0 =C-H 1 24

Al comparar los espectros de RMN-1H (Fig. 2C; Tabla 2C) y de RMN-13C de este compuesto con los del producto anterior ·(Ferruginol [1]), se observa una gran similitud entre ellos; en consecuencia, hemos de suponer que este compuesto es también un diterpeno tricíclico aromático. En efecto, el espectro de RMN-1H muestra, a bajo campo, dos finos singuletes [8H: 7,19 (H-11) y 8H: 6,43 (H-14)] propios de hidrógenos aromáticos. Cada uno de estos singuletes se corresponde en el espectro HMQC (Fig. 2G), con sendos picos, asignables, de acuerdo a su orientación en el DEPT, a metinos aromáticos [8c= 122,7 (C-11) y Be: 115,2 (C-14)]. Si a esto se suma que en el espectro de RMN-13C se detectan cuatro señales típicas de carbonos aromáticos cuaternarios, localizadas a Be: 132,1 (C-12), De: 134,1 (C-8), Be: 143,2 (C-9) y Be: 150,6 (C-13), pareciera lógico suponer la existencia en la molécula de un anillo aromático tetrasustituído. Ahora bien, es evidente, en razón del desplazamiento qmm1co del pico atribuido al carbono cuaternario C-13, que uno de los sustituyentes de este anillo aromático es un hidroxilo fenólico. Por otro lado, es también evidente, ante la presencia en el espectro de RMN-1H de un septete [oH: 3,15, spt. U= 7,0 Hz) (H-15)], asignable, en razón de su posición y multiplicidad, a un m13tino bencílico que forma parte de un grupo isopropilo* [ 8H: 1,26, d, 6H (C-16 y C-17}], que dicho grupo isopropilo es otro de los sustituyentes del núcleo aromático. De igual manera es notable la presencia en el espectro de RMN-1H de un multiplete a 8H: 2,85-2,78 característico de los hidrógenos de un metileno bencílico (H-7a. y H-7¡3), con lo cual se deduce que los otros dos sustituyentes forman parte de otro anillo, fusionado al núcleo aromático. Al tomar en cuenta estos datos y los anteriores, es obvio que el referido núcleo aromático posee los mismos sustituyentes que el Ferruginol, pero en posiciones distintas; lógicamente, el hecho de que las señales atribuidas a los hidrógenos aromáticos sean singuletes, asegura que los mismos guardan entre si una disposición "para" y por lo tanto el anillo aromático es 1,2,4,5-tetrasustiuido. De esta manera son posibles dos patrones de sustitución, [A] y {B]. El patrón (A] implicaría un esqueleto del abietano, en el cual necesariamente el hidroxilo tendría que situarse en posición "orto" al grupo isopropilo, para que los hidrógenos aromáticos se mantengan entre sí ~ ROH en posición "para"; este patrón sería igual al del Ferruginol [1). El patrón {B] correspondería .CH2 ....-CH2 a otro esqueleto, en el cual se permutarían las (A] [B] posiciones del hidroxilo y del isopropilo.

(*J El grupo isopropilo fue perfectamente identificado a través del espectro 1H, 1H-COSY (Fig. 2F) en el cual se detecta el cruce H-15 ~ H-16/ H-17, indicativo del acoplamiento entre el melino y los metilos 25

1 1 Figura 2C: Espectro de RMN- H (CDCJ3, 400 MHz), del Sempervirol [2] 1

H-16 H-20 H-17 H-18 H-19

H-11 -,------.---~-.-~---,-·-----,.-- H-14 ,., 1.-4 1.2 1 o o.

PP• 3 2

Tabla 2C: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro 1 de RMN- H (CDC13, 400 MHz), del Sempervirol [2]

H H-1a. H-1p H-2a. H-2P H-3a. H-3P H-5 H-7a. H-7P o(ppm) 1,91 2,60 1,60 1,66 1,21 1,49 1,32 2,85 2,78 m dd d t t dd dd dd d 1 m J (Hz) 14 y 3 14 y 3 3 4 1 2 10 - 3 y 13

H H-11 H-14 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 OH 1 o(ppm) 7,19 6,43 3,15 1,26 1,26 0,94 0,92 1,18 4,61

1 m S S sept d d S S S S J (Hz) - - 7 7 7 -- - - 26

13 1 Figura 2D: Espectro de RMN- C (CDCI3, 400 MHz) del Sempervirol [2] j

16 7 15

12 11 u OH 20 1 -....; C-18 C-20 ...... : 14 1 9 C-19 2 10 8 3 5 7 4 6 e-u ~¡"¡ 19 t8

C-3 C-1 C-7 C-2 C-6

C-17 C-S C-U C-4 C-16 C-ll C-14 C-13 C-8 C-12

-~~~-,--~~~r-T~~~-,--~~--,---,-cr --r~~~-r----o~-~--r PP• t•o 120 100 BO 60 •o

Tabla 2D: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro 13 de RMN- C (CDCl 3 , 100 MHz), del Sempervirol [2] e C-1 C-7 1 e-2 C-3 e-4 e-5 C-6 (5 (ppm) 39,5 . 19,7 42,1 33,7 51,1 19,4 30,4 Tipo >eH >CH >CH >C< >CH >CH >CH 2 1 2 2 2 2 e C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14 (5 (ppm) 134,1 143,2 37,8 122,7 132,1 150,6 115,2 Tipo =C< 1 =C< >C< =CH =e< =COH =CH e C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 TMSi como (5 (ppm) 27,6 57,4 14,5 33,8 21,9 25,4 Patrón Tipo -eH -CH -CH -eH -CH Interno >CH 1 3 3 3 3 3 27

La escogencia entre los patrones [A] y [B] fue posible hacerla, recurriendo a la información derivada del análisis del espectro·IDvfBC (Fig. 2H-1 y 2H-2; Diagrama 2). Así pues, las correlaciones del carbono aromático oxigenado (C-13), con H-7, H-11, H-14 y H-15 y la del carbono aromático hidrogenado (C-14) con H-7, sitúa al hidroxilo fenólico entre el metino aromático (C-14) vecinal a C-8 y el carbono que soporta al isopropilo (C-12); éste a su vez se correlaciona con H-14 y con los hidrógenos del grupo isopropilo (H-15, H-16 y H-17), mientras que el otro carbono aromático hidrogenado (C-11) se correlaciona sólo con el hidrógeno metínico del isopropilo (H-15). Estos datos demuestran que el anillo aromático se ajusta al patrón representado por la subestructura [B] y no al de la [A]. Una vez definido el patrón de sustitución del anillo aromático, prácticamente quedó establecida la estructura del compuesto, puesto que el resto de la molécula es igual a la del Ferruginol. Así pués: • Los datos de RMN- 1H y RMN-13C permiten caracterizar a un metilo angular [8H: 1.18 (H-20), HMQC +-+ 8c: 25,4 (C-20)], situado sobre un carbono cuaternario [8c: 37,8 (C-10)], bencílico al anillo aromático (cruces HMBC : C-10 ~ H-11 y C-9 ~ H-20). Las secuencias de cruces HMBC: C-20 ~ H-5 ~ C-8 y C-10 ~ H-20 ~ C-5 ~ H-7 ~ C-8 ~ H-6 ~ C-10 ~ H-5 ~ C-6 ~ H-7 +-+ C-9 demuestran que este metilo angular se inserta en un anillo ciclohexánico, que se fusiona al núcleo aromático a través de los carbonos C-8 y C-9. • El espectro de RMN- 1H exhibe otros dos singuletes típicos de metilos terciarios [8H: 0,92 (H-19) y 8H: 0,94 (H-18)], cuyos carbonos resuenan respectivamente a 8c: 21,9 (C-19) y 8c: 33,8 (C-18), según el espectro HMQC. Ambos singuletes se correlacionan en el espectro HMBC con los 3 picos de un carbono cuaternario sp [8c:33,7 (C-4)] (H-18 +-+ C-4 ~ H-19) y de un carbono metilénico [8c: 42,1 (C-3)] (H-18 +-+ C-3 ~ H-19). De igual ·manera se correlacionan con el pico del carbono metínico C-5, in\'Olucrado en el anillo ciclohexánico anteriormente referido (H-:18 ~ C-5 +-+ H-19); por otro lado, los picos de C-18 y C-19 se cruzan con las señales de H-3 y H-5 (C-18 +-+ H-3 +-+ C-19 ~ H-5 +-+ C-18); estos datos permiten caracterizar a un grupo gem-dimetilo. Éste se sitúa sobre otro anillo ciclohexánico que se fusiona al anterior para formar una decalina, según demuestra la secuencia de correlaciones HMBC: C-4 +-+ H-3 +-+ C-5 ~ H-7 ~ C-6 +-+ H-5 +-+ C-4 ~ H-2 +-+ C-3 ~ H-1 ~ C-2 ~ H-3 +-+ C-1 +-+ H-20 ~ C-5 +-+ H-1 +-+ C-20. Los datos anteriores permiten concluir que el compuesto en estudio posee la estructura (2], la cual corresponde a la del8,11,13-abeo{13 ~12}-abietatrien-13-ol. 28

Esta estructura resultó congruente con el patrón de fragmentación detectado en su EM (Fig. 2E; Tabla 2E; Esquema 2) en el cual destacan los iones a m/z: 175, m/z: 189, m/z: 201, m/z: 215 y m/z: 243, todos ellos originados por ruptura del anillo A y subsiguientes reagrupamientos (Enzell, 1966b; Enzell & Ryhage, 1967a; 1967b). El pico base en este espectro de masas, m/z: 271, corresponde a un fragmento originado del ión molecular por pérdida de un radical metilo [M+-CH3]; éste a su vez pierde un radical isopropilo para generar el ión a m/z: 229.

Figura 2E: Espectro de Masas (lE, 70 e V), del Sempervirol [2]

%T 16 100 271 90

30 286 20 175 69 201 189 10

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 miZ

Tabla 2E: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas (lE, 70 eV) del Sempervirol [2] m/z 286 271 243 229 215 203 201 189 187 Abundancia 30,09 100,0 3,72 5,09 4,80 4,55 17,15 12,08 6,37 Relativa m/z 176 175 173 159 147 133 115 69 55 Abundancia 2,63 19,10 4,91 4,96 3,64 2,92 2,43 15,28 4,24 Relativa 1 29

Esquema 2: Interpretación del.Patrón de Fragmentación en el Espectro de Masas del Sempervirol (2]

OH OH

m/z: 229 m/z: 229 m/z: 215

-C¡¡}Io

(a] -H· ,,,¡-~ (d] l-~ OH ~~

-CHj

,, 1 1 OH m/z: 286 {M+) m/z: 271 \~.·' C2oH3oO

[bJ l-CJH6 -H' [ij1 OH -~ .. 1 OH OH

+ 1 m/z: 189

OH OH OH -c,H12 -CsHto + [g] [h]

m/z: 201 m/z: 175 30

1 1 1 Figura 2F: Espectro H, H-COSY (CD~l3 , 400 MHz), del Sempervirol [2] 1

1 Correlaciones en el espectro H/H-COSY (CDCI3 , 400 MHz), del Sempervirol [2]

1 ( H-la J

( H-16 )..--.----...[ H-15 )~+---• -----+~{ H-17 ) 31

Figura 2G: Espectro HMQC (CDC13), del Sempervirol [2]

C·6 C-2 >::=±r-----1------4----,--W~~~ 20 C-19 C-16 --""' C-17 C·20 C-15

C-18

C-1-1 50 C-5 ... C-11

2 5 20 1 5 1 o 32

Figura 2H-1: Espectro HMBC (CDCI 3), del Sempervirol [2]

H-11 H-14

: ..¡ 6 o ..1 ,. tJ ' .¡ 1 ~ ' ! 1 l~~... 7 ,. i -

'1 ;

e-1 JH-7a . C-141 ~-11 e-1 VH-7P ' 1 1 1 <& 19 18 1 e o • 1 z/14 e 1~/UH . ~ ~e- o. • r¡, C-9Jl -14 ~ e- 3/0H ( -9/H-15 . -9 zo ~e-13/l -7a w ,. e-13/l r< C-13 H-11 -711 ... ' H-16 H-18 H-17\t:JL H-20 H-19

C-20 C-15 C-7

50 C-5

000

PP• I.B 1 6 1 .• t.Z 1 o 0.8 33

Figura 2H-2: Espectro HMBC (CDCI 3), del Sempervirol (2]

H-11 H 14 H-7a 1 1 1 ~ .....-6/H-7a C-6/H-71J C-2/H·11J C-20 - C-6 ~- C-15/H-11 C-2 11 n 20 w ""' C-15 - ol ~ o C-16 C.;!_9 C-17 C-20 oO 9~ -16/H 15 .~ __:::: C-15 o C-7 C-17/H-11 C- /H-14 -17/H 15 C-15/H-11J ~ C-7 30 8 ':' - Q C-10/H-11J C·lO/H-11 ¡,.. .. ,_ C-3 C-10 ov e 10/H-14 ~ ~ ( C-3 i-1p C-1.- ~~ o o 1 a C-5 •• ~o '~ C-5/H-7a C-5/H·1P C-5/H-71J ... P ,_o ... • o

H-16 H-17 H-20 H-7<1 H-1<1 H-11 "t n-¡_p ~-S l Cf H¡lP H~ ~C-UH-7<1 C-11/H-7 Oc 4/H·ll ~ o

1 i ' 1 C-11/H-15 '1 o 1· D~-11/H· 4 ! 0 0 : e 11 1 C-8/H-5 e- -16 ' Oe-tZ/OH C-12/H-15 ~ C-8/H14 (9 g e- *2¡u-17 -8/H-11 @ e C-8/H-7<1 e ~IH-6<1 : i ~of<

1 C-8/H-7P 1 ' ' !tJ C·9/H-7<1 e 20 C-9 C-9/H-7P ~ o 'H-14 ~ e-9/H-5 1

f.¡ 1 .r... /1.1.7• 1 1 ~Ji 1 • -.~, C-13/H-151! .. -.. ~-·· >/fi"'" ~ 11C-13/H·7P

1 oq·

PD• 7.2 34

Diagrama 2: Correlaciones 13CfH, Espectro HMBC del Sempervirol [2]

H -2 1.1;::'\. H-5 1fc;\ H-11}~ H-20~ H-6 ~ H-15 ~

H-7 H-1 ~ l_;;:-:-\ H-16LQ H-3~ H-15R/ H-17Jt/

H-1 H-7 H-2 }0 H-1slQ H-11 C-9 H-20 H-17~

H-3 H-1 H-6 }eC-10 H-15l.Q H-5 H-16~ H-6 H-20 H-18 H-19 H-14}@ H-5 }·~ H-19 ~ H-6 H-7 H-18 H-11lQ H-5~ H-19 H-14Jt'l H-18~ H-20 · H-11 H-5 llz.0 H-15 H-7 J'\:::J H-16 H-5}9 H-17 35

La estructura [2] se corresponde con la asignada al Sempervirol, un diterpeno aislado por primera vez del Cupressus sempervirens (Cupressaceae) (Mangoni & Caputo, 1967a; 1967b). Su estructura fue luego confirmada por síntesis total del (±)-racemato (Caputo & Mangoni, 1967) y años más tarde fue establecida su configuración absoluta (Matsumoto et al., 1972). Desde entonces, el Sempervirol ha ·sido encontrado en varias especies de Gimnosperrnas, incluídas en las familias Cupressaceae: Chamaecyparis formosensis (Lin et al., 1999a), Chamaecyparis obtusa (Gough & Welch, 1978), Cupressus torulosa (Prasad & Krishnamurty, 1977) y otras especies de Cupressus (Cool et al., 1998), funiperus chinensis (Fang et al., 1993), Juníperos procera {Adams, 2001) y Thujopsis dolabrata (Hasegawwa & Hirose, 1981), y Podocarpaceae (Cambie et al., 1983). En las Angiospermas sólo se ha reportado en Salvia multicaulis (Ulubelen et al., 1997). Su presencia en el género Retrophyllum no había sido observada hasta ahora. Últimamente han adquirido relevancia algunos estudios orientados a detectar la presencia de terpenoides en restos fósiles de varias especies de Coníferas que en la actualidad se encuentran extinguidas, pero que fueron dominantes en los periodos geológicos Eoceno y Mioceno. En dichos estudios se ha determinado que el patrón de terpenoides observados en estos fósiles es similar al detectado en las especies actuales. El Sempervirol y otros diterpenos se encuentran presentes en varias muestras analizadas (Otto & Simoneit, 2001; Staccioli & Bartolini, 1997; Staccioli et al, 2002); estos resultados indican que estos diterpenos fenólicos, desde el punto de vista filogenético y quimiosistemático, pueden considerarse biomarcadores taxonómicos importantes (Otto & Wilde, 2001). Después de la síntesis inicial de Caputo & Mangoni {1967) se han descrito varias síntesis del (±)-Sempervirol (Banik & Ghatak, 1989; Matsumoto et al., 1976), de su metil éter (Das et al., 1992; 1994) y del ( + )-Sempervirol (Gathak, 1990; Matsumoto & Usui, 1979; Miyake et al., 2007). Otro aspecto de interés en lo que respecta a este diterpeno, es su producción en cultivos celulares a partir de especies de la familia Cupressaceae (Ohgaku et al., 1984). Por último, es procedente resaltar que son escasos los estudios realizados en torno a la posible actividad biológica o farmacológica de Sempervirol; esto probablemente se debe a los bajos rendimientos obtenidos, cuando el mismo se ha aislado de fuentes naturales. A pesar de ello, se han registrado algunas patentes de preparados que contienen éste y otros diterpenos, los cuales son efectivos frente al microorganismo Propionobacterium acnes, el agente causante del acné juvenil (Hata et al., 1994). También se ha patentado un dentífrico que contiene Sempervirol como principio activo contra Streptococcus nutans, la bacteria responsable de la peridontitis bucal (Shimatani et al., 1989). 36

Totarol [3]

De las fracciones 1-4 de la cromatografía general se aisló un sólido blanco, el cual fue purificado por recristalización en metanol [P.F.= 131-133 oc; [a] 0 = +44°]. La presencia en su EM (Fig. 3E; Tabla 3E) de un ión molecular a m/z: 286

(congruente con la fórmula molecular C20H300), la detección en su espectro de RMN- 1H (Fig. 3C; Tabla 3C) de señales asignables a protones aromáticos y la observación en su espectro de RMN- 13C (Fig. 3D; Tabla 3D) de veinte picos, seis de los cuales corresponden a carbonos aromáticos, indican que se trata de otro diterpeno tricíclico aromático, isómero del Ferruginol [1] y del Sempervirol [2]. Su espectro IR (Fig. 3A; Tabla 3A) muestra absorciones típicas de un anillo aromático [vmax: 1.585 cm·1 (C=C) y vmax: 804 cm·1 (=C-H)], cuya presencia fue también confirmada a través del espectro UV (Fig. 3B) [A.max.: 207 y 278 nm ]. Por otro 1 lado, la detección en el IR de bandas características de 0-H (vmax: 3.529 cm- ) y de 1 enlaces C-0 (vmax: 1.269 cm- ), demuestra que el átomo de oxígeno de la fórmula molecular forma parte de un grupo hidroxilo.

Figura 3A: Espectro Infrarrojo (KBr), del Totarol [3]

%T SO

30 1.585 C=C 20 3.529 804 0-H =C-H 10 .1.269 C-0 0,0 3700,0 3000 2000 cm·' 1500 1000 450,0

Tabla 3A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR (KBr), del Totarol [3]

umax. (cm-1) 3.529 2.938 -2.843 1.585 1.269 804

Asignación 0-H C-H (-CH 3 y CH 2) C=C C-0 =C-H 37

Figura 3B: Espectro UV (l\1e0H) del Totarol [3]

%A 207nm 2,10 16 1,80

1,20

0,60

A. ma.-x (nm) 190 210 230 250 270 290 310

Al analizar con más detalle los espectros de RMN, se infiere que el compuesto es un diterpeno tricíclico con un patrón de sustitución diferente al de [1] y [2], en el anillo aromático. En efecto, la presencia en el espectro de RMN- 13C de cuatro picos propios de carbonos aromáticos cuaternarios [oc: 134,0 (C-8); oc: 143,1 (C-9); Oc: 151,9 (C-13) y Oc: 130,9 (C-14)] y de dos picos asignables a metinos aromáticos [oc: 114,2 (C-12) y Oc: 122,9 (C-11)], confirman un anillo bencénico tetrasustituído; ahora bien, el hecho de que cada uno de los picos de los metinos aromáticos se cruce en el HMQC (Fig. 3G) con sendos dobletes [oH: 7,00 (H-11) y oH: 6,52 (H-12)], los cuales, según se observa en el 1H/H-COSY (Fig. 3F), están mutuamente acoplados U= 8,5 Hz), exige que estos metinos sean adyacentes y que sus respectivos protones se dispongan en "orto", con lo cual el anillo bencénico es 1,2,3,4-tetrasustituído. Es evidente también, según los datos de RMN, que uno de los sustituyentes del anillo bencénico es el grupo hidoxilo [en razón del desplazamiento químico de uno de los carbonos aromáticos cuaternarios, Oc: 151,9, =C-0- (C-13)] y que otro es un grupo isopropilá [dobletes a oH: 1,~5 (-CH3 ; H-16) y oH: 1,36 (-CH3 ; H-17) y septuplete a campo bajo oH: 3,29 (>CH; H-15)]; el acoplamiento entre estos dos dobletes y el septuplete U = 7,0 Hz) es perfectamente observable en el espectro 1H/H-COSY (Fig. 3F), al igual que lo son en el espectro HMBC (Fig. 3H-1; Diagrama 3), las correlaciones C ~ H entre las señales de los metilos y del melino que conforman el grupo isopropilo: C-15 ~ H-16 ~ C-17 ~ H-15 ~ C-16 ~ H-17 ~ C-15. 38

1 Figura 3C: Espectro de RMN- H (CDC1 3, 400 MHz), del Totarol (3]

Z50 2.25 200

H-11 CDC13 H-12

pp~ 7 5 4

Tabla 3C: Desplazamientos Químicos (B) en el Espectro 1 de RMN- H (CDC13 , 400 MHz), del Totarol (3]

H H-5 H-7p H-7a H-11 H-12 H-15 H-16 H-17 H-18 H-19 H-20 OH

o 1,26 2,95 2,76 7,00 6,52 3,29 1,35 1,36 0,93 0,92 1,18 4,48 (ppm) mull dd dd m d d spt d d S S S S /{Hz) 6,0y2,0 17,0 y 6,5 - 8,5 8,5 7,0 7,0 7,0 - - -- 39

13 Figura 3D: Espectro de RMN- C (CpCl3 , 100 MHz), del Totarol [3]

C-5 C-18 C-17 C-16 C-11 C-19 C-12 16 C-20

C-7 19 18 C-3 C-1 C-2

CDCl3 C-11 C-5 C-4

C-12 C-10 C-14 C-9 C-13 C-8 J J

ppn 140 120 100 60 60 40 20

Tabla 3D: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro 13 de RMN- C (CDCl3, 100 MHz), del Totarol [3] e C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 e-6 e-7 o (ppm) 39,5 19,4 . 41,5 33,3 49,5 19,3 28,7

Tipo >eH2 >eH2 >CH2 >C< >CH >CH 2 >CH2 e C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14 o (ppm) 134,0. 143,1 37,6 122,9 114,2 151,9 130,9 Tipo =C< =C< >C< =CH =CH =C< =C< e C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 TMSi como (ppm) 27,1 20,3 20,3 33,2 21,5 25,1 o Patrón

Tipo >CH -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 -CH3 Interno 40

Al tomar en cuenta que los otros dos sustituyentes del núcleo bencénico deben ser carbonos contiguos, a través de los cuales este núcleo se acopla a otro de los anillos del diterpeno, es posible postular dos estructuras parciales, [A] y [B], para el anillo aromático, las cuales -se diferencian sólo en la posición relativa del hidroxilo y el isopropilo; la subestructura [A] correspondería a un [A] [B] esqueleto del abietano y la [B] a un esqueleto del totarano.

La escogencia de la subestructura [B] para el compuesto en estudio, fue sustentada en los sigl!ientes hechos:

• El apantallamiento del doblete correspondiente al protón aromático H-12, (óH: 6,52), como consecuencia del efecto resonante que induce el grupo hidroxilo, el cual produce un H aumento de la densidad electrónica sobre *'0-H ~z + C-12. Este hecho explica también la 1 "' .. +----+:l?YI13 ?.-H posición a campo alto del pico asignado _,_ /. 14 a este carbono (óc: 114,2), frente al pico correspondiente al C-11 (óc: 122,9). • Los cruces en el espectro HMBC entre la señal del hidrógeno hidroxílico y los picos de los carbonos C-12, C-13 y C-14, y las secuencias de correlaciones C-H entre los componentes del grupo isopropilo y los del núcleo aromático: C-13 +---+ H-15 +---+ C-14 +---+ H-16 +---+ C-17 +---+ H-15 ~ C-16 +---+ H-17 ~ C-15 ~ H-16 ~ C-14 +---+ H-17 y C-9 +---+ H-12 ~ C-13 ~ H-11 +---+ C-8 ~ H-15 (Fig. 3H-2). • El cruce HMBC entre el pico asignado al carbono aromático que soporta el grupo isopropilo [oc: 130,9 (C-14)] y las señales de los dos hidrógenos de un metileno bencilico, centradas a oH: 2,95, d U:;:: 17,0 y 6,5 Hz) (H-7~) y óH: 2,76, m (H-7a.). Este hecho permite incluso transformar la subunidad [B], en la [C], al incluir como sustituyente en la misma al referido metileno (C-7). Figura 3H-2 41

La prolongación de la subunidad [C] a través del metileno C-7 y del sustituyente aromático subicado en C-9, ocurre de igual manera que en el caso de los diterpenos [1] y [2], para conformar un anillo decalínico que posee un metilo angular (en la unión de los dos ciclos de la decalina) y un gem-dimetilo en C-4. Esta afirmación fue sustentada en los siguientes datos: • La presencia en el espectro de RMN-1H de un singulete atribuible a un metilo angular [SH: 1,18 (H-20)], el cual se cruza en el HMQC con el pico que resuena a Se: 25,1 (C-20). Este singulete se correlaciona en el HMBC con picos asignables a un melino [Se: 49,5 (C-5)], a un metileno [Se= 39,5 (C-10)], a un carbono sp3 cuaternario [Se: 37,6 (C-10)] y a un carbono sp2 cuaternario aromático OH [Se: 143,1 (C-9)]. El pico del carbono del metilo (C-20) ·se cruza en el HMBC con las señales de los dos protones metilénicos del C-1 [SH: 2,24, dt U :: 3,0 y 0,5 Hz) (H-1f}) y SH: 1,35, m, (H-1a)] y con un doble doblete, [SH: 1,26, dd U =6,0 y 2,0 Hz) (H-5)], propio del protón del metino angular (C-5); es obvio Fig. 3H-3 [D] que la multiplicidad de este doblete indica que el melino C-5 se une a un metileno [SH: 1,60 y SH: 1,91, m (H-6)], cuyo carbono [Se: 19,3 (C-6)] , se corresponde en el HMBC con las señales de H-5 y H-7. Si a esto se suman las correlaciones H-5 +-+ C-7 +-+ H-6 +-+ C-5 +-+ H-7 (Fig. 3H-3), se concluye que la subunidad estructural [C] puede expandirse para conformar la subunidad [D]. • El gem-dimetilo, identificado a través de los espectros de RMN- 1H, de RMN- 13C y HMQC [SH: 0,93, s (H-18) +-+Se: 33,2 (C-18) y SH: 0,92, S (H-19)+-+ Se= 21,5 (C-19)] se ubica sobre un carbono [Se= 33,3 (C-4)], adyacente al melino C-5 y a un metileno [Se: 41,5 (C-3); 8¡¡: 1,23 y 1,44, dd U= 13,0; 4,0 y 2,0 Hz) (H-3a/H-3f3)], en un todo de acuerdo con las correlaciones HMBC: C-3 +-+ H-18 +-+ C-5 +-+ H-3 +-+ C-4 +-+ H-18 +-+ C-19 +-+ H-5 +-+ C-18 +-+ H-19 +-+ C-4 +-+ H-5 +-+ C-3 +-+ H-19 (Fig. 3H-4). De esta manera, la subunidad [D] se transforma en la [E]. La estructura del producto (3], se completa, al insertar [E] en la subunidad [E], el metileno que origina el único pico no asignado aún en Fig. 3H-4 el espectro de RMN-13C [Se: 19,4 (C-2)]. 42

La estructura [3] resultó congruente con el patrón de fragmentación detectado en su EM (Fig. 3E; Tabla 3E; Esquema 3) en el cual destacan los iones a a m/z: 175, m/z: 189, m/z: 201, m/z: 215 y m/z: 243, todos ellos originados por ruptura del anillo A y subsiguientes reagrupamientos. Este patrón concuerda con los reportados para otros diterpenos tricíclicos aromáticos de las series del abietano y totarano (Enzell, 1966b; Enzell & Ryhage, 1967a; 1967b).

Figura 3E: Espectro de Masas (lE, 70 eV), del Totarol [3]

%T 100 271

90 16

80 3 70 19 18 175 60

40 201 286

30 189 20 69 10

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 miZ

Tabla 3E: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas (lE, 70 eV) del Totarol (3] m/z 286 271 243 229 215 203 201 189 187 Abundancia Relativa 38,71 100,0 5,12 7,17 5,72 3,72 35,74 25,92 6,94

m/z 176 175 173 159 157 133 115 69 55 Abundancia Relativa 8,05 60,22 5,49 4,74 2,57 6,16 4,29 13,75 6,39 43

Esquema 3: Interpretación del.Patrón de Fragmentación en el Espectro de Masas del Totarol (3)

-CJHo )1 -CaHs -H· (a]

m/z: 286 [M+] m/z:243 m!z: 229 C2oH3oO

OH ,'---[a]

-CH3 -C4Hs (b]

m/z: 271 m/z:215 (Pico Base) l''' ~-' • ~§) m/z:175 l 1-CJHo GJOH-....;: /. +

' 1-C,H,. 1-c,H,. m/z: 133

-....;: OH -....;: -C3H6 + /. c9Y ~H~ m/z: 189 m/z:159 44

1 1 Figura 3F: Espectro H, H-COSY (CDCI3, 400 MHz}, del Totarol [3)

Correlaciones 1WH H-20 H-18 más Destacadas H-16 H-19 H-17

H-20 H-18 H-16 H-19 H-17 T 1 H-12 1 H-16 H-17 45

114,2 1Z OH

H-5 li: 1,26 (dd) J= 6,0 y 2,0 Hz

t8 33,2

Figura 3G: Espectro HMQC (CDCI3), del Totarol [3]

H- H-20 H-18 16 H-17 H-19

C-17 C-6 C-16 C-2 20 C-19 @ CJ

30 C-18

C-1

C-3

C-5 50

p ...

J. O l o 1 o l ' 1.' o ' 46

Figura 3H-1: Espectro HMB~ (CDCI 3), del Totarol (3]

H-20 H -18 H-11 H-12 or H-1 9 l 1 l H-1li IJ-,? 11 • j, 1,,

o eE

100

C-12 C-l2:0H C-14/H-15 7 C-11--~ - C-8/H-11 \ C-l4/H- __:_C-1 4/H-16 C-14 • C-8 a ~ c-~4/H-12 ~¡¡¡c-8~-6 ~C-1~ -17 14 1 C-9 o C-~/H-12 C- /0HC-9/H-76~:> C-9/H-5 «>tc-9/H -20 C-13 t ' C-13/H-12 1 o ... C-13/H-11 f C-13/0H C-13/H-15 f....

ppn 15

H-20 -18 H-19 16 H-113 H-6a 2 H-15 H-7

3 17

19 18 e-6 e2 20 e-19 ~-19/H-18 e-2 o e-20/H-113 ~~ e-15- e-15/H-16 e -7 e-15/H-17 JO

e-18 e-18/H-19 e-4 e-4/H-18 e-4/H-19 e-10 ~ e -1 1 .., e-3 e-3/H-18 e-3/H-19

e-5/H-7 1 e-5/H-18 C-5 e-5/H-19 50

,,.

PP• l.O 2 5 2.0 >.5 ' o 47

Diagrama 3: Correlaciones 13CfH en el Espectro HMBC del Totarol [3]

16 2

19 18

H-5 H-7 H-2 }® H-6 H-12 H-20 H-11 }® H-15 H-16 H-7 H-17 H-1H-3 }®C-2 H-6}® OH H-11 C-8 H-15 H-12}e H-1}®H-2 H-16 C-1a H-18 C-3 H-5}eH-7 H-17 H-19 H-12 C-9 H-20 H-15~C-16 H-3 H-17 j'\:J H-5 H-1 H-6 H-5 H-18 H-6 H-19 H-11 H-20 H-3 H-3 }e H-6 NP H-5 C-18 H-7 }@ H-19 H-18 OH H-19 }§ H-3 }e H-20 H-5 C-19 H-18 H-12 H-5 H-ll}e ~~5 C-13 H-1 H-7 }@ H-5 48

La estructura [3], corresponde a un esqueleto de la serie del totarano y para la misma se asume que la unión de la estructura decalínica es "trans" (5a.H; 10¡3Me), como ocurre en todos los totaranos naturales (Buckingham, 2000). Esta estructura se corresponde con la del8,11,13-totaratrien-13-ol, al cual se le conoce como Totarol. Este diter_peno ha sido aislado de varias especies de la familia Podocarpaceae, pertenecientes a los géneros Afrocarpus, Dacrycarpus, Dacrydium, Nageia, Podocarpus y Prumnopitys (Bendall & Cambie, 1995; Bennett & Cambie, 1967; Brandt & Thomas, 1952; Cambie et al., 1963; 1983; 1984; Hembree et al., 1979; Ying & Kubo, 1991). También es común en otros muchos géneros de Gimnospermas tales como Cedrus (Casalicchio & Conte, 1985), Cupressus (Mangoni & Caputo, 1967a), Cryptomeria (Su et al., 1994), juniperus (Adams, 1990; Doi & Shibuya, 1972; Fang et al., 1993; Kuo et al., 1994; San Feliciano et al., 1992), Tetraclinis (Chow & Erdtman, 1960), Thuja (Gough & Welch, 1978) y Thujopsis (Hasegawa & Hirose, 1981). Hasta el presente sólo ha sido descrito en dos especies del género Retrophyllum: R. comptonii C. N. Page (Cambie et al., 1984) y R. vitiensis (Seem.) C. N. Page (Cambie et al., 1983). El totarol o su derivado metilado han sido sintetizados en varias oportunidades mediante procesos estereoselectivos (Barltrop & Rogers, 1957; 1958; Das et al., 1992; Matsumoto & Suetsugu, 1979; Pyne, 1963; Taylor, 1961); también ha sido utilizado como material de partida para la realización de muchas reacciones químicas y para la síntesis de otros terpenoides naturales (Adegoke et al., 1965; Bendall et al., 1991; 1992; 1993; 1994; Bennett & Cambie, 1966; Cambie & Hayward, 1974; Cambie et al., 1976; 1982; 1988; 1990a; 1990b; Cutfield et al., 1974; Enzell, 1966a; Falshaw et al., 1963a; 1963b; Short & Wang, 1951). En lo que respecta a su potencial como producto farmacológicamente activo cabe destacar su actividad antioxidante (Haraguchi et al., 1996a; 1997), antitumoral (Hembree et al., 1979; lwamoto et al., 2001), hipocolesterolémica (Enomoto et al., 1977), inhibidora de la enzima aromatasa responsable del decrecimiento de los niveles de estrógenos en plasma (Minami et al., 2002), antagonista de los receptores del factor activante de las plaquetas, PAF (Yang et al., 1995), antifúngica (Becerra et al., 2002) y sobre todo antibacteriana y antimicobacteriana (Becerra et al., 2002; Bernabeu et al., 2002; Constantine et al., 2001; Evans & Fourneaux, 2000; Evans et al., 1999; 2000; Hamilton, 2001; Haraguchi et al. 1996b; Kubo et al., 1992; 1994; 1995; Mateo et al., 2000; Micol et al., 2001; Muhammad et al., 1995; Muroi & Kubo, 1994; 1996; Nicolson et al., 1999; Shapiro & Guggenheim, 1998). Desde el punto de vista biológico destaca su actividad larvicida frente al insecto Culex pipiens (Lee et al., 2000) y su papel como biomarcador de los suelos en los bosques de coníferas (Almendros et al., 1996; Casalicchio & Conte, 1985). 49

N agilactona F [4]

De las fracciones eluidas en hexano-acetona 3:1 en el percolado del extracto acetónico de las hojas, precipitó un sólido cristalino en forma de agujas, que se revelaba ·en capa fina como una sustancia impura. Este sólido fue purificado por cromatografía preparativa utilizando como eluyente una mezcla de hexano-acetato de etilo 3:1, obteniéndose un sólido homogéneo en capa fina, que cristalizó como agujas blancas: P.F. = 275-277 °C; (a]0 = -112°. La estructura y la estereoquímica de este producto fue establecida al analizar, interpretar y coordinar la información obtenida de sus espectros de IR (Fig. 4A, Tabla 4A), UV (Fig. 4B), RMN-1H (Fig. 4C; Tabla 4C), RMN-13C (Fig 4D; Tabla 4D), 1H,lH-COSY (Fig. 4F), HMQC (Fig. 4G), HMBC (Fig. 4H-1 y 4H-2) y NOESY (Fig. 4I).

La fórmula molecular del compuesto, C19H24Ü 4 , fue deducida al determinar su número de carbonos por RMN-13C (BB y DEPT) y al establecer la naturaleza de los mismos (hibridación y grado de sustitución), en base a los desplazamientos químicos y a la orientación en el espectro DEPT, de cada uno de los picos (Tabla 4).

Tabla 4: Determinación de la Fórmula Molecular de la Nagilactona F [4) 1

Grupos Estructurales Composición Elemental 1 Número de Tipo de Grupo Número de Número de Número de Grupos (Carbono) Carbonos Hidrógenos Oxígenos

4 -CH3 4 12 o

3 >CH2 3 6 o 3 >CH 3 4 o 2 >C< 2 o o 2 H-C-0 2 2 2* 1 =C-H 1 1 o 2 =C< 2 o o 2 0-C=O 2 o 4* Fórmula Molecular C¡g Hz4 04

(*) El oxígeno unido al carbono mediante un enlace simple (C-0) es el mismo en ambos grupos estructurales y por consiguiente sólo debe contabilizaese una vez. 50

El espectro IR muestra bandas típicas de dobles enlaces [vmax: 1.644 cm· 1 1 1 (C=C) y vmax: 890 cm· (=C-H)], de enlaces C-0 (vmax: 1.266 cm- ) y dos absorciones 1 característica de grupos carbonilos (vmax: 1.772 y vmax: 1.704 cm- ). La observación en el espectro UV de un máximo a A.max.: 268 nm, sugiere la posibilidad de sistemas insaturados, en los cua).es se involucran carbonilos y dobles enlaces (Scott., 1969).

Figura 4A: Espectro Infrarrojo (KBr), de la Nagilactona F [4]

~óT lOO

>CH, >C=C< =C-H -GH, 2975 "1644 890 2980 >C= >C=O >C-0 1772 1266 o 1704 4000 3000 2000 1000 cm·l

Tabla 4A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro Infrarrojo (KBr), de la Nagilactona F [4]

vmax (cm-1) 1.772 1.704 1.644 1.266 890 Asignación C=O C=O C=C C-0 =C-H

Figura 4B: Espectro UV (MeOH), de la Nagilactona F [4]

UD.l 51

La fórmula molecular asignaaa C19H24Ü 4 , corresponde a un compuesto con ocho instauraciones, el cual necesariamente tiene que ser tetracíclico, puesto que cuatro de estas instauraciones, involucran a dos grupos carbonilos y a los dos dobles enlaces (identificados por RMN-13C, al analizar el número y tipo de carbonos presentes en la molécula, Tabla 4). Su espectro de RMN- 1H (Fig. 4C; Tabla 4C) muestra señales que caracterizan a un grupo isopropilo [dos dobletes a 8H: 1,25 (H-16) y oH: 1,03 (H-17) (J =7,0 Hz) y un multiplete a 8H: 2,31 (H-15)]. El acoplamiento entre los dobletes y el multiplete es evidente por el cruce que presentan estas señales en el 1H/H-COSY (Fig. 4F). Los picos de los carbonos que conforman este grupo fueron localizados mediante el espectro HMQC (Fig. 4G) a oc= 19,7, -CH3 (C-16) y oc: 15,3, -CH3 (C-17) y oc= 29,8, >CH (H-15); estos picos se cruzan en el espectro HMBC (Fig. 4H-1; Diagrama 4), según la siguiente secuencia de correlaciones: [C-15 +-+ H-16 +-+ C-17 +-+ H-15 +-+ C-16 +-+ H-17 +-+ C-15], confirmatoria del grupo isopropilo. Por otro lado, también en el HMBC, se observan cruces entre los dobletes asignados a los metilos de este grupo isopropilo y una señal [8c: 83,1 (C-14)], propia de un carbono metínico unido a un oxígeno, -0-CH. La señal de este carbono se corresponde en el HMQC con un fino doblete [oH: 4,87 O= 1,0 Hz) (H-14)]. Los datos anteriores indican que el grupo isopropilo conforma la subunidad estructural [A]. En la región central del espectro RMN- 1H, se observa un doblete de dobletes, [8H: 5,08, dd U =5,0 y 2,0 Hz) (H-6)], el cual se cruza en el HMQC con un pico que resuena a 8c: 71,9 (C-6), caracterizando a otro grupo oximetínico (-0-CH-). Es evidente, en base a la multiplicidad de la señal en el espectro protónico, que este oximetino se sitúa entre otros dos metinos, uno de los cuales forma parte de un doble enlace, dado que en el HMBC se detectan correlaciones entre el doblete de dobletes (oH: 5,08) y dos resonancias de carbonos sp2 olefínicos [8c: 121,8, =CH, (C-7) y Oc: 134,3, =C<, (C-8)]; el carbono olefínico metínico (C-7), se correlaciona en el HMQC con un doblete de dobetes, [oH: 6,17, dd U= 2,0 y 1,0 Hz) (H-7)]. El metino adyacente (C-5), fue identificado a través del espectro 1H, 1H-COSY (H-6 +-+ H-5) y su protón origina un doblete [oH: 1,97, d O = 5,0 Hz) (H-5)], que se cruza en el HMQC con un pico que resuena a 8c: 47,7 (C-5). Todos [B] estos datos permiten engranar la subunidad estructural [B]. 52

1 Figura 4C: Espectro de RMN- H (CDCI3 , 400 MHz), de la Nagilactona F [4]

H-18 H-20

H-17 H-16

H-5

H-16 H-17

H-14

H-7

H-11 H-5 H-14 H-7 H-6

ppn 7

Tabla 4C: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro de 1 RMN- H (CDCI3, 400 MHz), de la Nagilactona F [4)

H H-5 H-6 H-7 Í H-11 H-14 H-15 H-16 H-17 H-18 H-20 1,20 o (ppm) 1,97 5,08 6,17 1 5,78 4,87 2,31 1,25 1,03 1,38 d dd dd d d m d d S S multipl. 1 2,0 1,0 J (Hz) 5,0 1,0 1,0 - 7,0 7,0 -- 5,0 2,0 1 53

Figura 4D: Espectro de RMN-13C (CDCl~, 100 MHz), de la Nagilactona F [4)

C-7

C·l C-3 C-2 C-18

Tabla 4D: .Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro de 13 RMN- C (CDCI3, 100 MHz), de la Nagilactona F [4)

e C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10 1 1

o 1 30,2 17,6 27,9 42,9 47,7 71,9 121,8 134,3 159,3 35,2

Tipo 1 >CH2 >CHz >CH2 >C< >e-H H-C-0 =C-H =C< =C< >C<

e 1 C-11 C-12 C-14 C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 Patrón o lu2,1 164,3 83,1 29,8 19,7 15,3 24,4 180,9 24,9 Re f. 1 TMS Tipo 1 =C-H O=C< H-C-0 >C-H -CH 3 -CH3 -CHa O=C< -CH3 54

1 Figura 4F: Espectro H/H-COSY (CDCI3 , 400 MHz) de la Nagilaciona F [4]

H-7 H-11 H-6 H-14 H-17 ~ H-17/H 15 ,. H-17~ .. H-16~ H-16 IH-15• 1' t : H-5/H-6, 0.: IJI. 1• , •••• 1

o H-1 4/H-7 . • , , H-14/l ~-6 •'· • • • :·:· 1 .. • ·'lo H-11/ ~-7 H-11--=< 1 1 H-7-~=< .. • .1 • • H-6/H 7 ... Acoplamiento Homoalílico Acoplamiento Alílico C!!J.-.a.--.a

Acoplamiento del grupo isopropilo Acoplamiento Vecinal a.___. a+-+' H-161

R R R H 1rH 55

Otra señal que aparece a campo bajo en el espectro RMN- 1H, resultó ser un fino doblete [oH: 5,78, d, U= 1,0 Hz) (H-11)] que se correlaciona en el HMQC con un pico asignable a un carbono olefínico [oc: 112,1(C-11)]. Este doblete se cruza en el HMBC con uno de los picos característico de un carbonilo [oc: 164,3 (C-12)] y con otro atribuible a un carbono cuaternario sp3 [oc= 35,2, >C< (C-10)]: R Este carbono cuaternario se une a un grupo metilo H,tt..,.....e...... __ 12 .... [8H: 1,20, s, (H-20)], cuyo carbono fue localizado a e través del HMQC a <>e= 24,9 (C-20). La interpretación 11 de estos datos, permiten proponer la subunidad T,.....e,_ 20 ...... 9 .... estructural (C], integrada por un doble enlace e trisustituido conjugado a un carbonilo y adyacente, a CH3""to\ través del segundo ca_rbono oleffnico, [<>e= 159,3 (C-9)], al carbono cuaternario (C-10), que soporta al metilo [C] (cruce HMBC: C-9 +--+ H-20). La presencia en el espectro de RMN- 13C de otro pico asignable a un carbonilo [<>e: 180,9; -0-C=O, (C-19)], caracteriza a un anillo butirolactónico, cuyo protón base fue identificado como H-6 [8H: 5,08 U= 5,0 y 2,0 Hz)], dado que en el HMBC se cruza el pico de este carbonilo y el doblete de H-5 [8H: 1,97, d U= 5,0 Hz)]. Según se 1 demostró anteriormente a través del cruce H-6 +--+ H-5 en el H/H-COSY (pág. 51), el metino C-5 es vecinal al oximetino C-6 (subunidad estructural [B]) y en consecuencia, es evidente la secuencia O=C-O-CH16l-CH 15l. Por otro lado, las correlaciones en el HMBC: C-5 +-+ H-18 +-+ C-19 +-+ H-5 +-+ C-18 y H-5 +-+ C-4 +-+ H-18 indican que el carbonilo C-19 se une al carbono cuaternario C-4 (<>e: 42,9), el cual soporta a un metilo terciario [8H: 1,38, s, (H-18) ..... HMQC, <>e= 24,4 (C-18)] y además se enlaza a C-5, cerrando de esta manera el anillo lactónico. Estos datos permiten proponer la subunidad estructural [D]. Otra subunidad estructural ([E]), fácilmente identificable en la molécula, es la integrada por tres metilenos contiguos [Be: 30,2 (C-1); Oc: 17,6 (C-2) y <>e: 27,9 (C-3)], que se insertan entre las subunidades [C] y [D], en un todo de acuerdo con las siguientes correlaciones HMBC: C-1 +-+ H-20; C-2 +-+ H-1 +-+ C-20 y C-3 +-+ H-18 +-+ C-4 +--+ H-3. Así mismo, en el 1H, 1H-COSY se detectan cruces solapados entre las señales de H-1, H-2 y H-3. [D] [E] 56

Figura 4G: Espectro HMQC (CDC1 3), de la Nagilactona F [4]

H-16 H-18 H-20 H-17

z.o 1 o 1 ' H-16 H-18 \ H-20 \ ,/H-17

.. 89 •• • •• C-5 ·0 ••

C-6

IDO

C-11

C-7 120

... z 57

Fig 4H-1: Espectro HMBC (CDG1 3), de la Nagilactona F (4]

H-16 H-20 H-18¡_,( H-17

~ i • ! e-10-= ---: .. ,. e-10/f ·6 • e-4- i c-1{) f'H-11. 1 .. e-s- t· • 1 o i 1 H 11 1 1l e-6- 13 H '-;;1~ ¡t· e-14---' 1 .2\ 1 1 1 9 .. ~.. ! 10 e- 4/11-11 18 H ~ S t DO 4 6 7 17 e-11- ... H 1 e-7{ f-1-6 J e-7~ 18 O ""H 19 t 1 C-8/ fl-11 e-8- !• • C-6/11 o

! t C-9fl:l· e-9 -: -9/H-5 • e-12 - ¡.e- 2/H-11 • 115 C-19 ..., e 19/H-5 a •· e- /J - ... 4.5 ......

H-18 H-16 H-20 H-17 ~~LJJ~U C-17 - €~ C-17/H-16 C-2 fC-2/H-1 -___. C-16/H-17t: ~ C-16 20 "'F' C-18/H-5 C-18/H-2 C-18 (-20{H-1 ~ C-20 = tJ ~ C-3/H-18

C-3 ~ ·G C-15 -~ ~~ fr~ -==: 3D C-1 C-15/H-16~ " C-10/H-5 e C-1 ~ 7 C-10/H-1 -·1~·20 C-10 - @) t ~ C-10/H-20 .. C-4 ----' §) ·C 4/H-3 C-4/H· 8~ ~ C-4/H-5 C-5/H-1 C-5 - • C-5/H-1 ~~ ~ C-5/H-2( -- - ... ..• ... ..• t. O 58

Fig 4H-2: Espectro HMBC (CDCl 3), de la Nagilactona F (4]

C-9w 5 C-9 ..:: r.. IIH-?.0 lffW 166 o w H n 12 165 ' nO H 1 16 1 2' 9 2 10 1 :•~H 170 3 S 4 6 7 H 11 = .....,, ···' IÍ 18., o H 17!1 o 19

1 Q 180 C-19 -= ~ C-19/1 -5 e 19/H- 8~ ~

18:5 ! - PI>• 1.9 1.8 1.7 1 a 1.5 ... !.2 1.1

H-11 H~6 -----~------~J 20

C-10 J5 C-10/H-6 ..

"'' '' '. .' ' . •• 59

Diagrama 4: Correlaciones 13CfH en el Espectro HMBC, de la Nagilacfona F [4]

H-6 }88 H-16}-e H-zo}@ H-11 C- H-17

H-1 }@ H-5 }8 H-20 C-g H-17 }§ H-18 }@ H-1 H-5 H-6 H-16 }@ H-3 }e H-11 H-5 C-4 H-18 H-20 H-2 }e H-5 H-18}@ NP }§ ·H-20

H-11}9 H-5H-18 }eC-19 NP }@

H-16}8 H-1 H-6 }@ H-17 le 60

Al coordinar los datos anteriormente descritos, es obvio que la subunidad estructural [E] se inserta entre las subunidades estructurales [C] y [D], a través de los carbonos C-1 y C-3, respectivamente. De igual manera, la subunidad [D] se acopla a la [B] a través de los carbono C-5 y C-6 que comparten. Ahora bien, al tomar en cuenta las correlaciones H-1- C-10- H-5 ~ C-9 y H-6 ~ C-10- H-11, es evidente que estas cinco subunidades conforman la subunidad expandida [F] (Esquema 4). Por otro lado, el espectro 1H/H-COSY muestra cruces correspondientes a los acoplamientos alílicos: H-7 +-+ H-11 y H-6 ~ H-14 ~ H 7, los cuales permiten incorporar la subunidad [A] a la [F], a través del carbono C-14, el cual necesariamente debe unirse al C-8. Por último, es lógico asumir la existencia de un enlace C-8/C-9 para completar el anillo decalínico y así satisfacer las ocho insaturaciones que exige la fórmula molecular C19H24Ü 4 asignada al compuesto. De esta manera quedó establecida para este compuesto la estructura [4).

[B]

[C]

[D] [A] [E]

[F] o 1

16 16

[2)

Esquema 4: Ensamblaje de la Estructura de la Nagilactona F [4) 61

Una vez establecida la estructura gruesa del compuesto se procedió a determinar su estereoquírnica, utilizando el.espectro NOESY (Fig. 41). Así pues, en dicho espectro se observan interacciones H-14 +-+ H-20, las cuales indican que el metilo angular (C-20) se orienta en la molécula, hacia el mismo lado que lo hace el protón (H-14) situado sobre el carbono base del grup9 isopropilo. Asumiendo que el compuesto pernenezca a la serie diterpénica normal (H-5a., C(10lMef3), como ocurre en todos los terpenoides hasta ahora aislado de la familia Podocarpaceae, es evidente que ambos, el metilo (C-20) y el hidrógeno H-14, son axiales y orientados en J3. Por otro lado, la detección de efectos NOE: H-18 +-+ H-6 +-+ H-5 indican que el grupo metilo (C-18) situado en C-4 se orienta en a., al igual que H-5 y H-6; en consecuencia la y-lactona saturada (19 -4 6) es "cis" y su anillo se orienta f3. La estereoestructura [4] se corresponde con la reportada en la literatura para la Nagilactona F, uria lactona norditerpénica de la serie del totarano aislada por primera vez de las raíces del Podocaipus nagi (Hayashi et al., 1968), y reportada posteriormente para otras especies del género Podocarpus s. J.: P. milanjianus, P. sellowii (Hembree et al., 1979), P. macrophyllus (Hayashi et al., 1972) y P. nubigena (Silva & Bittner, 1972). También esta lactona fue encontrada en la corteza de la especie en estudio, pero para la época dicha especie se denominaba Decussocarpus rospigliosii (Amaro & Carroz, 1988). La estructura de esta lactona ha sido confirmada por síntesis total (Barrero et al., 1999; Yuji et al., 1979).

H-14 o 4,87 ppm (d) H-11 J: 1,0 Hz o:5,78 ppm (d) J: 1,0 Hz H-20 H-20 o: 1,25 ppm (s) o: 1,20 ppm (s) 19,74 16 H3 17,59 H H-15 o:2,31 ppm (m) 27,91 H3 24,35 __. H-17 18 .= ó 1,03 ppm (s) H3C H H-18 Q H-6 O 5,08 ppm (t,d) H-7 o 1,38 ppm (s) J: 2,0 y 5,0 Hz o: 6,17 ppm (t,d) J: 1,0 y 5,0 Hz 62

j Figura 41: Espectro NOESY (CDCl3, 400 MHz), de la Nagilactona F (4] 1

H-16 ~~CL 1 1 H-14 +-+ H- 6 p t ·o• H-14 +-+ H 15 Ql 1 H-14 +-+ H-2( 1 1 5.0 0 H-6 +-+ H-5 ft H-6 +-+ H-1

5.5

1 1 1 fl-11 +-+ H-1 1 H-11-~=::::' 1 10;)0 l H-11 f-+ H-2 1 H-11 +-+ H-20

6.0 : H-7 +-+ H-15 H-7 f+ H-17 H-7 :o H-7 +-+ fl-18 ' 1 ~ H-7 +-> H-20 .... 2 o '-" 1.0 - H-18

...

1.5

2.0 63

Sciadopitysina [5]

Al concentrar la fracción de AcOEt obtenida en el percolado del extracto acetónico, precipitó un sólido de color amarillo, que se revelaba en capa fina como una sustancia aún impura. Este sólido fue purificado por cromatografía sobre Sephadex LH-20 seguida de cromatografía preparativa sobre placas de gel de sílice, obteniéndose unas agujas (P.F > 260 °C), cuya mancha en TLC se intensificaba al exponer la placa a vapores de amoniaco, y adquiría coloración púÍ'pura a la luz ultravioleta. Esto indica que posiblemente se trata de un compuesto de naturaleza flavonoide (Markhan, 1982). La presencia en su espectro UV (Fig. 5B-1; Tabla 5B) de dos bandas de absorción a A.max: 267 nm y a "-ruax: 323 nm confirmó esta suposición (Mabry et al., 1975). En su espectro de masas (Fig. 5E; Tabla 5E) aparece el ión molecular a m/z: 580 y en su espectro de RMN- 13C (Fig. 5D-1 y 5D-2; Tabla 5D) se localizan dos picos propios de carbonilos a,J3-insaturados [8c: 181,9 y 8c: 182,0] y veintiocho 2 señales de carbonos sp , con lo cual cabe suponer que el compuesto es un biflavonoide. Esto fue confirmado en su espectro de RMN-1H (Fig. 5C; Tabla 5C), en el cual se distinguen señales para doce protones aromáticos y/u olefínicos.

La fórmula molecular del compuesto, C33H 24Üw fue deducida al determinar su número de carbonos por RMN- 13C y al establecer la naturaleza de los mismos (hibridación y grado de sustitución), en base a los desplazamientos químicos y a la orientación en el espectro DEPT (Fig. 5D-2), de cada uno de los picos (Tabla 5).

1 Tabla 5: Determinación de la Fórmula Molecular de la Sciadopitysina (5] 1 Grupos Estructurales Composición Elemental 1 1 Número de Tipo de Grupo Número de Número de Número de Grupos (Carbono) Carbonos Hidrógenos Oxígenos

3 -OCH3 3 9 3 (*) 12 =CH 12 12 o 6 =C- 6 o o 10 -0-C= 10 o 10 (*) 2 C=O 2 o 2 3 OH o 3 3 (*)

Fórmula Molecular c33 Hz4 010

(*)El oxígeno unido al carbono mediante un enlace simple (C-0) es el mismo en ambos grupos estructurales y por consiguiente sólo debe contabilizaese una vez. 64

El espectro IR (Fig. 5A; Tabla 5A) muestra señales típicas de hidroxilos 1 1 [vmax: 3.342 cm· (0-H) y vmax: 1.180 cm· · (C-0)], de carbonilos a,f3-insaturados [vmax: 1.660 y 1.606 cm·1 (C=O)] y de sistemas aromáticos [vmax: 1.590 cm-1 (C=C) y 1 [vmax: 837 cm· ( =C-H)].

Figura 5A: Espectro Infrarrojo (KBr), de la Sciadopitysina [5)

%T 80

40 =C-H 30 837 cm-1 C=C 1590 cm-1 C..O 20 C=O 1180 cm-1 Libre 1660 cm·' C=O 1 10 3342cm·1 1606cm·

3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 soo 600 cm -1

Tabla 5A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR (KBr), de la Sciadopitysina [5]

Vmax (crn-t) 3.342 2.925 1.660 1.606 1.590 1.180 837 Asignación OH (libre) H---OH C=O C=O C=C C-0 =C-H 65

El espectro de RMN- 1H (Fig. 5C; Tabla 5C) revela la existencia de veinte y cuatro hidrógenos, los cuales, de acuerdo a su naturaleza, se distribuyen de la siguiente manera: Doce situado sobre carbo~os sp2 (señales entre 6,33 y 8,42 ppm), nueve que forman parte de treS grupOS metOXÍlOS (singuleteS a OH: 3,74; OH: 3,79 Y oH: 3,80) y por último, cinco correspondientes a protones hidroxílicos, dos de los cuales resuenan como singulete a oH: ¡2,90 y oH: 13,06 (protones hidroxílicos que se enlazan por puentes de hidrógeno a oxígenos carborn1ios) y tres que generan una señal ancha y difusa a OH: 10,94. El espectro DEPT (Fig. 5D-2; Tabla 5D) muestra, además de los picos típicos de los tres grupos metoxilos [oc: 55,0; Oc: 55,4 y oc: 55,9], las señales de doce 2 melinos sp , que se corresponden en el espectro HMQC, con los doce hidrógenos que resuenan en la región de los protones aromáticos y olefínios. La comparación entre el espectro de RMN- 13C de banda ancha y el DEPT permitió detectar dieciocho carbonos cuaternariós, de los cuales, dos son carbonilos, diez son carbonos sp2 unidos a oxígenos y los seis restantes son carbonos aromáticos cuaternarios (Tabla 5D). En consecuencia con los datos anteriores fue deducida, la fórmula molecular del compuesto: C33H24010' Dicha fórmula, y los 22 grados de instauración derivados de la misma, resultaron congruentes con los de una biflavona, cuyos esqueletos, 2 3 exigen cuatro anillos aromáticos y dos anillos de 6 ' -piren-4-ona (Geiger & Quinn, 1975); es evidente, que dos de los oxígenos de esta fórmula corresponden a otros tantos carbonilos a,~-insaturados, cuya presencia ya fue detectada en el IR y confirmada en el espectro de RMN- 13C [oc: 181,9 (C-4) y Oc: 182,0 (C-4")]. Tomando en cuenta lo anterior, se procedió a determinar el tipo de esq:ueleto de la biflavona y su patrón de sustitución. Ello se logró, al analizar con más detalle en el espectro de RMN- 1H, la región en la que resuenan los protones unidos a 2 carbonos sp , en la cual se distinguen las siguientes señales:

A. Dos singuletes oH: 6,99 (H-3) y oH: 6,98 (H-3"), propios de dos hidrógenos olefínicos, situados sobre los carbonos a-cetónicos (C-4 y C-4") de 2 3 los dos sistemas 6 ' -pire-4-ona, que integran los anillos e de las subunidades monoméricas del biflavonoide. La presencia de estos dos singuletes, confirma una vez más que el compuesto en estudio es una biflavona y no un biflavonol, y por otro lado descarta de antemano que la unión interflavonil se realice a través de los carbonos C-3 ó C-3". 66

B. Un par de dobletes [oH: 6,33 (H-6) y oH: 6,75 (H-8)], H cuya constante de acoplamiento U= 2,0 Hz), los oT ubica como integrantes de un sistema AX, conformados por dos protones "meta" -acoplados. Este sistema caracteriza al anillo A de una de las subunidades de la biflavona, con sustituyentes· o--e oxigenados en los carbonos C-5 y C-7. Más aún, el referido sistema fue corroborado en el espectro 1H, 1H-COSY (Fig. 5F). C. Tres señales acopladas entre sí, integrando un típico sistema AMX [oH: 7,34 (H-5'), oH: 8,06 (H-2') H H y oH: 8,18 (H-6') (d, d y dd; J =9,0 y 2,0 Hz)], propio de un anillo bencénico 1,3,4-trisustituido. o--e Este sistem~. detectado también en 1H, 1H-COSY (Fig. 5F), caracteriza al anillo B de la otra unidad monomérica (Anillo B-1). Probablemente este anillo se encuentra involucrado en la unión interflavonil, dado que el desplazamiento químico de H-2', corresponde al de un protón aromático situado sobre un carbono adyacente a carbonos aromáticos cuaternarios. D. Un singulete a oH: 6,42 (H-6"), típico de un protón T aromático, situado sobre un carbono contiguo a dos carbonos sp2 que soportan sustituyentes O oxigenados ( =C-OR) (Mabry et al., 1970). Esta condición, permite ubicar al referido protón en el anillo A-II, bien en C-6 o C-8; y además permite establecer que dicha subunidad también a-- se involucra en la unión interflavonil, la cual, tiene que efectuarse a través de uno de los carbonos en "meta", respecto al carbono que lleva el protón.

E. Un sistema A2B2 típico de dos pares de hidrógeno H H "para"-acoplados [oH: 6,91 (H-3"'/H-5"') y oH: 7,57 (H-2'"/H-6'") (d, J = 9,0 Hz)]. Este sistema es sólo compatible con el anillo B terminal de una de las unidades monoméricas, y el mismo fue también corroborado en el espectro 1H/H-COSY, en el cual H H se observa claramente un mismo cruce, indicativo de los acoplamientos H-2'"/H-3'" y H-5'"/l-I-6"'.

Los patrones de sustitución de todos estos anillos aromáticos resultaron congruentes con los datos de RMN- 13C y siempre fue posible correlacionar las señales de los hidrógenos con las de sus respectivos carbonos, a través del HMQC. 67

1 Figura 5C: Espectro de RMN- H (DMSO-d6 , 400 MHz), de la Sciadopitysina [5]

OC:It1 OCH, OCI~

H-3" H-6" H-3

H-2"'/H-6"'

...... r-"'""...-...... ,-...... -...... -,--. .. ~ PO• S2 lt lt H-2'"/H-6"'

H-6 H-2' H-8

H-5'

H-6'

PPII 6.0 7 5 7. o

Tabla 5C: Desplazamientos Químicos (a) en el Espectro de RMN-1H

(DMSO-d6, 400 MHz), de la Sciadopitysina [5] H H-3 H-6 H-8 H-2' H-5' H-6' H-3" H-6" 8 (ppm) 6,99 6,33 6,75 8,06 7,34 8,18 6,98 6,42 multipl. S d d d d dd S S J - 2,0 2,0 2,0 9,0 9,0 y 2,0 - -

H H-2"'/ll-6"' H-3'"/ll-5"' OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH 8 {ppm) 7,57 6,91 3,80 3,79 3,74 13,06 12,90 10,94 multipl. d d S S S S S S J 9,0 9,0 - ' - ' - - 68

13 Figura 50-1: Espectro RMN- C (BB) (DMSO-d6 , 100 MHz), de la Sciado it sina [5)

OCH, OCH,

orn,

C-8" C-3" C-10" -·"""'--~~..,-V--"-1.-''-,"V.-"'"~-.---.~...-> C-2"'

C·l'

C-9 C·7 C-4'" C-4' C-2" C-5 C-5" C-9" C-2 C-7"

C-3"'/C-5'" C·B" C-2"'/C-6"'

C-4 C-7 C-9 69

13 Figura 5D-2: Espectro de RMN- C (DEPT) (DMSO-d6, 100 MHz), de la Sciadopitysina [5]

C-2"'/C-6"' C- C-3" C-6" C-8

C-8" C-10"

Tabla 5D: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro 13 de RMN- C (DMSO-d6 , 100 MHz), de la Sciadopitysina [5] e C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 o 163,6 103,8 181,9 161,1 98,1 165,1 92,7 157,3 Tipo =C-0 =C-H O=C< =C-0 =C-H =C-0 =C-H =C-0 e C-10 C-1' C-2' C-3' C-4' C-5' C-6' C-2" o 104,7 122,8 128',3 122,4 160,4 111,7 130,9 163,0 Tipo =C< =C< =C-H =C< =C-0 =C-H =C-H =C-0 e C-3" C-4" C-5" C-6" C-7" C-8" C-9" C-10" o 103,2 182,0 160,5 98,6 161,8 103,6 154,3 103,6 Tipo =C-H O=C< =C-0 =C-H =C-0 =C< =C-0 =C<

e C-1"' C-2"'/ C-6"' C-3"'/ C-5'" C-4'" OMe OMe OMe Patrón o 122,8 127,7 114,5 162,2 55,0 55,9 55,4 Re f. TMS Tipo =C< =C-H =C-H =C-0 -OC~ 3 -OCH3 -OCH3 70

El hecho de que en el espectro de RMN-13C se observen, a aproximadamente 122 ppm, tres señales de carbonos sp2 cuaternarios, indica que la unión interflavonil es del tipo C-C y no C-0-C; de no ser así sólo aparecerían en esta zona dos picos de carbonos cuaternarios (C-1' y C-1"'). Más aún, esta unión se realiza entre el anillo B de la subunidad I y el anillo A de la subunidad II, por las siguientes razones: • La existenda en el espectro de masas (Fig. 5E) de iones a m/z: 448 y m/z: 132 (ver Esquema 5), los cuales se originan mediante ruptura retro Diels-Alders de la unidad monomérica II (Mabry & Ulubelen., 1980). La presencia de estos iones confirma que uno de los carbonos involucrados en la unión interflavonil pertenece al anillo A-II, pero no permite asegurar si dicho carbono es el C-6 o el C-8. • El hecho de que en el HMBC (Fig. 5H-2; Diagrama 5), se observen correlaciones de los hidrógenos del anillo A-I (H-2' y H-5') con los picos asignados a dos carbonos cuaternarios sp2 [oc= 103,6 (C-8") y oc= 122,4 (C-3')], confirma una unión C-C. Ahora bien, la secuencia de correlaciones C-5" +-+ H-6" +-+ C-7", indica que el hidrógeno presente en el anillo A-II se encuentra ubicado en C-6" y no en C-8". Por otro lado, el pico atribuido al C-9" (oc: 154,3) no se correlaciona ni a dos ni a tres enlaces con hidrógeno alguno; esto asegura que los carbonos situados en "orto" (C-8" y C-10") y "meta" (C-2", C-4", C-5", C-7" y C-3') al C-9" no poseen hidrógenos.

Al tomar en cuenta esto último y compaginarlo con los datos de RMN- 1H anteriormente discutidos, es evidente que la biflavona en estudio está constituida por dos unidades monoméricas, enlazadas entre sí a través de los carbonos C-3' y C-8", y con sustituyentes oxígenados en los carbonos C-5, C-7, C-4', C-5", C-7" y C-4'". En consecuencia, es evidente que la biflavona pertenece a la serie de la amentoflavona (Geiger & Quinn, 1975). Los datos de RMN- 13C respaldan esta aseveración, ya que los mismos confirman el patrón de sustitución del anillo B-II, al observarse sólo dos· picos para los pares de carbonos equivalentes C-3"'/C-5"' (oc: 114,5) y C-2"'/C-6"' (oc: 127,7), y también el patrón de sustitución del anillo B-I cuyos carbonos metínicos generan, en el DEPT, tres señales que aparecen en fase normal [oc: 128,3 (C-2'); Oc: 111,7 (C-5') y Oc: 130,9 (C-6')]. De igual manera, confirma los patrones de los anillos A-I [metinos sp2 a 8c: 98,1 (C-6) y Oc: 92,7 (C-8] y A-II (metino sp2 a Oc: 98,6 (C-6")]. Como mencionamos anteriormente, los picos asignados a cada uno de estos carbonos se correlacionan adecuadamente, en el HMQC, con las señales que originan sus respectivos hidrógenos. Por último el patrón de fragmentación observado en el espectro de masas concuerda perfectamente con el de una flavona de la serie de la amentoflavona (Esquema 5). 71

Figura 5E: Espectro de Masas (lE, ?O eV), de la Sciadopitysina [5]

580-

55 193 91 69

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 miz

Tabla· 5E: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas (70 e V), de la Sciadopitysina [5]

m/z 580 448 420 ! 414 290 282 208 193 166 152 Abundancia 100,0 3,27 f 1 0,83 0,64 5,86 22,09 0,81 9,42 Relativa 1,09 0,76 1

m/z 132 121 115 1 107 105 91 81 69 67 55 Abundancia ! 1,92 28,351 5,32 1 4,13 4,20 18,34 14,24 15,50 10,13 25,37 Relativa l 72

Esquema 5: Patrón de Fragmentación (EM), de la Sciadopitysina [5]

CH30

OCH3

m/z: 580 i+ [M+] OH O CH30~'f.0 ~~o Q'+ OH c::rn m/z: 166 m/z: 132

¡+ !+ He=: e CH30

OCH3 o

OH o m/z: 448 ~o miz: 414 OH l-eo 1 ¡+ He=: e CH30

~o OH OH m/z: 282 m/z: 420 73

1 1 Figura 5F: Espectro H, H-COSY (DMSO-d6 , 400 MHz), de la Sciadopitysina [5]

H-3"' H-2"' H-6'"

6.5

H-a--< o H-3''!::: §~;: H-2'"/H-3"' H-3 = f----+-----+..:.:H;...:;:·6-""'':.:.:1Jf:..:::·5_"'---4-Q----+-----l 7.0

H-5'/H-6'o

®o @) ¡¡¡ H·2'/H·6'

ppo 0.0 '·"

Sistema At\fX en Anillo B-1

Sistema A2B2 en Anillo B-11 Sistema AXen Anillo A-1

H-6"' H-5'" w H-8

*CH, 1 H-2"' H-3"' WH-6r- w J B JI OH ~ * 74

Figura 5G: Espectro HMQC (DMS~-d6 ), de la Sciadopitysina (5]

H-3"' H-5"' H-2"' H-3 H-3" H-6" H-6"'

1 90

" 1 C-8 1 1 G)o 1 C-6---= ¡..' 0 C-6" 1 6") 3" o o 100 r.-., .. ~ o o e -3------i 1

1 1 G) 110 C-5' 1 C-3" ' 1 oo ~ C-5" ' 1 @ oo® 1 1 120 ~ -! ~ ~ C-2 ... 0 C-6 "' C-6' """""] o o ff'loo 130 C-2'--1 o - n-

~) ppm

ppm B.O 7.5 7 .o 6.5

CH30 75

Una vez establecido el esqueleto de la flavona y su patrón de sustitución, sólo faltaría fijar la posición en el mismo _de los grupos hidroxilos y metoxilos. La ubicación de los grupos hidroxilos resultó inmediata a la luz de las siguientes evidencias: A. La presencia de dos singuletes a oH: 13,06 y oH: 12,90, típicos de protones hidroxílicos quelados que se enlazan por puentes de hidrógenos a carbonilos (Badawi & Fayez, 1967), demuestra la existencia de hidroxilos libres en C-5 y en C-5". Por oto lado, las correlaciones en el espectro HMBC: C-4 +-+OH; C-4"+-+ OH; C-5 +-+OH y C-5"+-+ OH y los desplazamiento de la banda 1 (~"-max = 38 nm), al correr el espectro UV

en presencia de A1Cl 3 (Fig. 5B-4) y AlCl3 + HCl (Fig. 5B-5) confirman esta conclusión (Mabry et al.,1970). B. La magnitud molecular de los iones m/z: 132 y m/z: 448 en el espectro de masas (Esquema 5), demuestra que el sustituyente del anillo B-1 es un grupo metoxilo, y que los dos sustituyentes del anillo A-11 son grupos hidroxilos. Esto fue además puesto en evidencia al observar en el

espectro HMBC (Fig. 5H-3), la correlación C-4' +-+ OCH3 • Por otro lado, los desplazam.tentos químicos en UV en presencia' de NaOMe (Fig. 5B-2) [banda 1, ~"-max = 51 nm] y NaOAc (Fig. 5B-3) [banda 1, ~"-max= 41 nm; banda 11, ~"-max = 3 nm], asegura la existencia de un hidroxilo libre en C-7" (Mabry et al., 1970). C. Al quedar fijada la posición de los tres grupos hidroxilos, quedó igualmete fijada, por exclusión, la de los tres grupos metoxilos. No obstante, el análisis del espectro HMBC corroboró que C-7 lleva

como sustituyente un metoxilo (C-7 +-+ OCH3 y H-6 +-+ C-7 +-+ H-8), que

otro metoxilo se ubica en C-4' (C-4' +-+ OCH3 y H-2'/H-5' +-+ C-4' +-+ H-6') y que el tercero, como ya habíamos demostrado en el apartado B, se

sitúa. en C-4"',(C-4'"+-+ OCH3 y H-2"'/H-6"'+-+ C-4"' +-+ H-3"'/H-5'"). D. Por último, el análisis detallado del patrón de fragmentación del EM confirmó de manera inequívoca la posición ya fijada de los tres grupos hidroxilos y también proporcionó evidencias directas para ubicar los grupos metoxilos en C-7, C-4' y C-4"'. En efecto, los iones a m/z: 448, m/z: 414 sustentan la existencia de hidroxilos libres en C-5, C-5" y C-7", mientras que los fragmentos a m/z: 420, m/z: 282, m/z: 166 y m/z: 132 aseguran la ubicación de los grupos metoxilos (Maby & Markham, 1975).

En conclusión, la estructura de la biflavona en estudio quedó establecida como la 7,4",4'"-tri-0-Metil-Amentoflavona [5]. 76

La estructura [5] corresponde a la descrita en la literatura para la bifl.avona Sciadopitysina. Sus constantes físicas c0ncuerdan con las reportadas en la literatura (Baker et al., 1959), al igual que sus datos espectrales de RMN y EM (Reddy & Krupadanam, 1996). En este trabajo se realiza por primera vez un análisis detallado de RMN mediantes técnicas bidimensionales, a través del cual pudieron ser inequívocamente asignadas todas sus señales en los espectros de RMN- 1H y -13C.

H-8 H-6' H·5' H-3"' y H·5"' -OCH3 l): 6,75 S: 8,18 S: 7,34 S: 3,80 (s) S: 6,91 dfl= 2,0Hz) dd U = 2,0 y 9,0 Hz) dU= 9,0Hz) d U= 9,0 Hz)

-QCH3 55,9 S: 3,79 (s) ) -DCH3 CH 3 0 S: 3,74 (s)

H-6~ 9B,t S: 6,33 dU = 2,0Hz) 55fl0 e 3

-OH S: 12,90 (s)

H-3" S: 6,98 (s) CaaH24Ü1o (M = 580 glmol) Sciadopitysina

La Sciadopitysina [5], fue aislada por primera vez de Sciadopitys verticillata (Kawano., 1959), y reportada posteriormente para otras especies, tales como Cephalotaxus koreana (Chang-Soo et al., 2000), C. oliveri (Ma et al., 1986), Cryptomeria japonica (Tatsuo & Tokunosuke, 1958), Encephalartos transvenosus, E. villosus y E. woodii, (Mohammad et al., 1983), Ephedra gerardiana (Tokunosufe, 1958), Ginkgo biloba (Baker et al., 1959), ]uniperus communis (Ilyas & Ilyas 1990), Podocarpus brevifolius (Gu et al., 1997), P. nagi (Xu & Fang, 1991), P. neriifolius (Xu et al., 1993), Taxus baccata (Modica et al., 1959), T. canadensis (Olsen et al., 1998}, T. cuspidata (Tachibana et al., 1994) y T. wallichiana (Parveen et al., 1985; Qiu et al., 1989). Su presencia en el género Retrophyllum es descrita por primera vez en este trabajo. 77

Figura 5H-1: Espectro HMBC (DMSO-d6), de la Sciadopitysina (5]

H-2"' H-3 H-3" H-6"'

!60

170

!70

ISO C-4"/H-3" o ~ C-4/H-8 C-4/H- """ IIP• a. o 7.0

-! C-9/H-8 C-9 f-t57 !5 ~ " f- ~ C¡-,-4'ilf,-6 . C-5"/H·" (,', C-4'/H-5' ¡-160.0 ,C·5" j! C·4 C-7''/H-~" 1 C-4'/H-2' f. 1; C·5 -; ' :-5~ ~ ~ ( C-7 " C-4" C-4"'/H-2"' 'l C-4"'/H-3"' ~~-- ¡-162 5 .. C-4"'/H-6"' C-4"'/H-5"' : C·2 ,j ·2- e 5: C-2/H-2' C·2/H·3 C-2"/H-3" ~ \, C-7 - ... o C-2/H-6 o C· 'H-6 ~ o --:; C-7/H-8 ... e o 7 • 7.0 .. - 78

Figura 5H-2: Espectro HMBC (DMSO-d6), de la Sciadopitysina [5]

H-3"'

~ C-8 o ~-8/li-6 -:! e-6/H-8 C-6 o C-6.- 100 e e-Bj: -1-2' e 10"/H-3" e-~~"~C-3" " fi)-10"/H 6 e-3/C-10 a e-10/H-3 ~o~ ::-10/H-6 e-10/H-8 110 e-s·~ C3"' e-5"' -= ~ C-3'/H-5' C-3' 120 e-1' C-1 "' _.:; ~ ' V~~~~ ' e-1"'/H-.:" e-1/H-5 e "'IH ,, e-6JI -2' -1 -3 C-2"' -2"'/II-6"' e- "'/H· '" C-6"' C-6'~ @) el( -6"'/II-2"' 1 5 130 C-2'~ ~ l?Jc-2' 1;: ~-6' ppo

ppo B.O 7.5 1.0 6.5

OH OH

C-IIOH C-4"/0H 79

Figura 5H-3: Espectro HMBC (DM~O-d6), de la Sciadopitysina [5]

X L

C-4

C-4"

OH OH 80

13 Diagrama 5: Correlaciones CfH en el Espectro HMBC (DMSO-d6), de la Sciadopitysina [5]

H-3}@H-2' C-2 H-5'}@H-3 H-6" }€) H-6'

NP }@ H-6'}@ H-2'}9H-6" H-3 H-6 NP}@ NP H-8 }@ OH HH:5.2' }e H-6' NP }§ H-6}@ OH NP}@ H-3"'H-3" }eC-1"' H-5"'

H-8}@OH NP}@ NP }€) H-6 H-8 H-3"}9 OH NP }€) OCH 3 NP}€) H-6}@ H-2"'/H-6"'OCH3 }eC-4"'. H-3"}€) H-3"'/H-5"' H-s}@ OH NP }€) H-3 H-6" le H-6 H-8 NP OH OH le }§ 81

Figura 5B-1: Espectro UV (MeQH) de la Sciadopitysina (5)

0,6 %A

0,5

Bandall 0,4 Bandal HO

0,3

0,2

0,1

200 250 300 350 400 450 500 550

Figura 5B-2: Espectro UV (MeOH + NaMeO) de la Sciadopitysina (5) 82

Figura 5B-3: Espectro UV (MeOH + ~aAcO) de la Sciadopitysina [5]

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2 Banda 11 Bandal 0,1 365nm

).max{nm)

200 250 300 350 400 450 500 550

Figura 5B-4: Espectro UV (MeOH + AIC13) de la Sciadopitysina [5]

0,6

0,5 Bandalla 297nm 0,4 Bandaiib/ Bandalb HO 276nm 326nm 0,3 . Bandala

0,2

0,1

200 250 300. 350 400 450 500 550 83

Figura 5B-5: Espectro UV (MeOH + AIC13 + HCl) de la Sciadopitysina [5]

0,6

0,5 Banda Ha 297nm 0,4 Banda Ilb/ Banda lb 0,3 277 nm 327 nm Banda la 0,2 381 nm

0,1

200 250 300 350 400 450 500 550

Tabla 5B: Bandas de Absorción (Ároaxl en el Espectro UV, en Metanol y en Presencia de los Reactivos de Desplazamiento, de la Sciadopitysina [5]

Reactivo Banda 1 Banda 11 Desplazamiento /:1/.. (A.,.,ac- /..MeOH) /:i'A. P•reac" A.MeOH)

Me OH 323 - 267 -

MeOH + NaMeO 374 +51 282 +15

MeOH + NaAcO 364 +41 270 +3

MeOH + AICI3 326;381 +3; +38 276;297 +9;+30

MeOH + A1Cl3 + HCI 327;381 +4; +38 277;297 +10;+30

MeOH + H3BÜ4 324 +1 268 +1 84

7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona (6]

De las fracciones 17-24 de la cromatografía general, precipitó un sólido amarillo, el cual fue purificado por repetidos procesos cromatográficos en columna ~1 y final.mente por cromatografía preparativa. El sólido puro cristalizó de metano! en 1 agujas amarillas, P. F. > 260 oc. Su comportamiento cromatográfico en TLC,

sus espectros de RMN y su fórmula molecular, C33H24Üw determinada por espectrometría de masas (EM-FAB, m/z: 582 [M+2H+]) y a través de la caracterización, por RMN, del número y de los tipos de carbonos e hidrógenos presentes en la molécula, indican que se trata de otro biflavonoide isómero de la Sciadopitysina (5]. Este hecho fue confirmado, al observar en el espectro UV (Fig. 6B-1) las dos bandas características de estos compuestos a "-max.: 271 nm y "-max.: 320 nm (Markharn & Mabry, ·1975). La presencia en su espectro IR (Fig. 6A; Tabla 6A), de absorciones asignables a los dos carbonilos cetónicos a,r3-insaturados de las unidades ~2 ' 3 -pire-4-ona, propias de estos flavonoides [vmax.: 1. 656 y 1.606 cm·1 (C=O)] y la de bandas típicas de aromáticos [vmax.: 1. 504 cm·1 (C=C) y vmax.: 836 (=C-H)] y de hidroxilos [vmax.: 3.442 cm·1 (0-H], refuerzan aún más que el compuesto sea un biflavonoide.

Figura 6B-1: Espectro UV (MeOH), de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

0,6 %A 1 6' 5' CH30 1 1 0,5

1 0,4

1 0,3 .~ 0,2 0,1

200 250 300 350 400 450 500 550 85

Figura 6A: Espectro Infrarrojo (KBr), de la 7,4',7"-Tri-0-MetiJ-Amentoflavona [6]

Ir 5' CHaO

80 OH O 70

50 836 =C-H 40

20 1606 10 C=O

3500 3000 2500 2000 1soo 1600 1400 1200 1000 soo 600 cm -1

Tabla 6A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR (KBr), de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

1 vmax (cm·l) 3.442 2.934 1.656 1.606 1.504 1.260-1.160 836 Asignación 0-H C-H C=O C=O C=C C-0 =C-H

Asumiendo como base de trabajo que este compuesto es un isómero de la Sciadopitysina, para llegar a su caracterización estructural, procede dilucidar, sin ambigüedad alguna, los tres siguientes aspectos: • Confirmar si su esqueleto biflavonoide pertenece o no a la serie de la amentoflavona (unión interflavonil C-3' ~ C-8"). • Determinar, en el esqueleto biflavonoide, la ubicación de los sustituyentes oxigenados (patrón de sustitución en cada unidad monomérica). • Establecer la naturaleza y posición relativa de cada sustituyente. 86

En conexión con lo anteriormente expuesto, realizaremos la descripción de este producto centrándonos en estos tres aspectos; ahora bien, la discusión se hará abordando los argumentos que se utilizarán para dilucidar estos aspectos, en forma integrada. Así pues: • La presencia en el espectro de RMN- 1H (Fig. 6C; Tabla 6C) de señales típiCas de un sistema AMX, cuyo patrón de acoplamiento se evidencia también en el espectro 1H/H-COSY (Fig. 6F) [8H: 8,17, d U= 1,5 Hz) (H-2'); 8H: 7,39, d U =8,0 Hz) (H-5') y 8H: 8,20, dd U =1,5 y 8,0 Hz) (H-6')], confirma que una de las unidades flavonoides monoméricas, contiene un núcleo bencénico 1,3,4-trisustituido (anillo B-1).

• La detección de un sistema A2X2 identifica a un segundo núcleo bencénico "para"-sustituido [8H: 7,66 y~: 6,94, d U:: 8,0 Hz) (H-2"'/H-6"' y H-3"'/H-5"')], caracterizando al anillo B-11 de otra unidad flavonoide monomérica. • La presencia de dos finos dobletes, cuyo acoplamiento se detecta a través del espectro 1H/H-COSY [8H: 6,31 y 8H: 6,68, d (J:: 1,8 Hz) (H-6 y H-8)], identifica a los hidrógenos "meta"-acoplados de un núcleo bencénico 1,2,3,5-tetrasustituido (anillo A-I). • La localización en la región de los protones olefínicos y aromáticos de tres singuletes a 8H: 6,80 (H-3), 8H: 6,71 (H-3") y 8H: 6,48 (H-6") confirmó la 2 3 presencia en la molécula de las dos unidades ó ' -piren-4-ona, que caracterizan a los anillos C-I y C-11, y también la de un núcleo aromático pentasustituído (anillo A-11). • Los datos anteriores confirman que las dos unidades flavonoides monoméricas poseen patrones de sustitución idénticos a los de la Sciadopitysina; hecho éste que pudo además ser corroborado al analizar e interpretar el espectro de RMN-13C (Fig. 6D-1 y 6D-2; Tabla 6D), en el cual destacan los picos correspondientes a los carbonos metínicos, cuya asignación fue realizada sin ambigüedad alguna, a· través de sus correlaciones en el espectro HMQC (Fig. 6G). • La unión C-3'/C-8" entre las dos unidades monoméricas quedó firmemente establecida, al detectar en el espectro HMBC (Fig. 6H-1 y 6H-2; Diagrama 6) las correlaciones C-5" ~ H-6" +-+ C-10" que confirman que C-6" es un metino y el cruce C-8" ~ H-2', que sitúa a C-8" a tres enlaces de H-2'. • La posición de los grupos metoxilos en C-7, C-4' y C-7" fue establecida al observar en el espectro HMBC (Fig. 6H-2), las correlaciones entre los picos de cada uno de estos carbonos y los respectivos singuletes de cada metoxilo. 87

1 Figura 6C: Espectro de RMN- H [(CD3) 2CO, 400 MHz], de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

H·3" OH o H-3 H-6 30CH3 H·2"'/H·6"'

H-2' H-3'"/H-5'"

H-8 1 H-6" 1 1 H-5' H-6' l 7. 7S '·"" 7.25 7.00 6.15 ....

OHOH Jj JJJ o.. 12 11 10 9

Tabla 6C: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro de RMN-1 H

[(CD 3) 2CO, 400 MHz], de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6] H H-3 H-6 H-8 H-2' H-5' H-6' H-3" H-6" 8(ppm) 6,80 6,31 6,68 8,17 7,39 8,20 6,71 6,48 i mult. S S S d d d : d dd J - 1,8 1,8 1,5 8,0 8,0 y 1,5 - -

H H-2"'/H-6"' H-3"'/H-5'" OCH3 OCH3 1 OCH3 OH OH OH 8(ppm) 7,66 6,94 3,92 3,90 3,80 13,13 12,95 9,85

mult. d d S S S S S S ' ' J 8,0 8,0 - 1 - - - 88

13 Figura 6D-1: Espectro RMN- C (BB) [(CD3} 2CO, 100 MHz)], de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona 6)

OH O

183.4 183.3 183.< 183.1 18

C-7 C-4"' C-4' C-9 C-2 C-2" C-s"

C-5

llJ)a 166 165 164 163 162 161 160 159 158 157 156 C-3"'/C-5"' C-2"'/C-6"'

C-2' C-5' C-8" C-6' C-1"' 3 C-1' C-3" C-8 C-3' ~- C-6

...... C·ltl~ /'C·lO"L ·••C-6" '1''11'"" 1' ... ,.,. 11 ...... ,~ 'l' 1 1 1 1 ' 1 1 1 1 130 125 120 115 110 105 100 95 89

13 Figura 6D-2: Espectro de RMN- C, DEPT [(CD3) 2CO, 100 MHz)], de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6] .. ..

OH o C-2'"/C-6'" C-3"'/C-5'"

30CH3

C-6" C-7 C-9" ~~~ 1l. ... d' 11;'' J.J • ~~ )1 l. .i. l ""·- 160 l.tll 120 100 eo 60 Tabla 6D: Desplazamientos Químicos (B) en el Espectro de RMN- 13C

[(CD 3) 2CO, 100 MHz)], de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona (6] e C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 o 164,9 104,9 183,2 163,0 98,7 166,5 93,3 158,7 Tipo =C-0 =C-H O=C< =C-0 =C-H =C-0 =C-H =C-0 e C-10 C-1' C-2' C-3' C-4' C-5' C-6' C-2" o 106,0 124,0 132,1 122,8 162,0 112,5 129,1 164,5 Tipo =C< =C< =C·H =C< =C-0 =C-H =C-H =C-0 e C-3" C-4" C-5" C-6" C-7" C-8" C-9" C-10" o 104,2 183,4 162,7 99,6 163,6 105,3 155,8 104,8 Tipo =C-H O=C< =C-0 =C-H =C-0 =C< =C-0 =C< e C-1'" C-2"'/ C-6"' C-3"'/ C-5"' C-4"' O Me O Me 0:1\.le Patrón Re f. 124,2 128,9 115,3 163,6 56,4 56,4 55,9 o TMS

Tipo =C< =C-H =C-H =C-0 -OCH3 -OCH3 -OCH3 90

Figura 6E: Espectro de Masas (EM-FAB; 70 eV), de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

154 6' 5' 100 CH30

90 69

80 137 70 95 60

40 487 30 176 09 582 20 465 10 mjz

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

Tabla 6E: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas (EM-FAB, 70 eV), de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

m/z 582 487 465 460 435 405 1 367 315 307 289 Abundancia 23,98 33,25 13,64 9,97 4,92 4,05 5,12 7,08 4,64 Relativa 7,951

m/z 267 176 154 137 122 109 95 83 69 55 Abundancia 9,91 28,00 100,0 71,77 9,52 26,11 58,73 62,30 87,27 98,52 Relativa 91

1 Figura 6F: Espectro H/H-COSY [(CD 3) 2CO, 400 MHz], de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

H-6 H-6/H-B((j}

6.~

H-2"'/H-3'" H-3'"/H-5' .. H-5"'/H-6"' 7 .o

7 .!1 H-2"'/H-6'"

(g) dQj) H-5'/H-6' H-2'/H-6' - B.O 7.~ ~ Sistema AMX en Anillo 1-B CE] fr-6'-5' CE] e ~-B/. OCH, Q]H-2'

Sistema A2B2 en Anillo 11-B Sistema AXen Anillo 1-A ~ [1] [O 1 H-2'" 1 1 H-5"' 1 [El r-:0 1 ! 1 1 H-Jm 1 1 H-6"' 1 1 [E) QJH-6 Q] CIJ H "----./ * 92

Figura 6G: Espectro H;MQC [(CD3) 2CO], de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

CH30

OH O

C-8 0~ 0 C-6 6" .@t C-6"----i m 100

C-3 " ~' 3" C-3 ~ 3

~ 110 1~~ C-5' O) C-3"'/C-5" ' ~ B ~~

120 ~ ~0 C0 C-2'"/C-6"' @) €21(6~ C-6' ~~ 130 C-2' -5: mczJ

DD1t 8.0 '.5 7.0 6.5 93

Asignaciones en el Espectro de RMN- 1H de la 7 ,4', 7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

.-----::------H-8 H-6' H-5' -üCH3 H-3'" y H-5"' S: 6,68 S:8,20 a: 7,39 S: 3,92 (s) S: 6,94 d_(J = 1,8 Hz) dd (J = 1,5 y 8,0 Hz) d(J = 8,0 Hz) d(J = 8,0 Hz)

-üCH3 S: 3,90 (s)

-QH H S: 9,85 (s)

-QH S: 12,95 (s)

-üCH3 S: 3,80 (s) H-6" a: 6,48 (s) -QH 8: 13,13 (s)

Asignaciones en el Espectro de RMN- 13C de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

G) 93,3 55,9 CH3

Q) 164,5 0 t:::\ 104,2

Al quedar situados en la molécula los grupos metoxilo, quedaron también fijados, por exclusión, los grupos hidroxilo. Más aún, la ubicación de éstos últimos en C-5, C-5" y C-4"' fue corroborada al localizar en el espectro de RMN- 1H los dos SinguleteS a OH: 12,95 Y OH: 13,13, CaracterÍStiCOS de prOtOneS hidrO:XÍliCOS queladOS (hidroxilos en C-5 y C-5"), y al detectar en los espectros UV corridos con reactivos de desplazamiento (Fig. 6B-2; 6B-3, 6B-4 y 6B-5; Tabla 6B), corrimientos batocrómicos en la banda I, que demuestran la existencia de hidroxilos libres en C-5 y C-5" (~A. MeOH!AICla: 26 y 60 nm) y en C-4"' (~A. MeOH/NaMeO: 50 nm). Los datos anteriores indican que el compuesto en estudio es un isómero de la Sciadopitysina, la 5, 5",4"'-Trihidroxi-7,4',7"-Trimetoxi-3'~8"-Biflavona (6], a la cual se le denomina también 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona. Esta biflavona fue detectada por primera vez en la Araucaria excelsa, de la cual fue aislada como triacetato (Ilyas et al., 1978). Posteriormente ha sido descrita para otras especies tales como Araucaria angustifolia (Fonseca et al., 2000; Ilyas & Ilyas, 1994), Thuja javanica y T. gigantea (Roy et al., 1987), Taxus baccata (Parmar et al., 1993) y Taxus wallichiana (Mai et al., 2002). Hasta el presente no ha sido reportada su presencia en la familia Podocarpaceae. En lo que respecta a la actividad biológica de esta biflavona sólo se ha descrito un trabajo orientado a ensayar su posible actividad antiinvasiva, es decir su capacidad para inhibir la migración de células cancerosas hacia otros tejidos en los procesos metastásicos (Parmar et al., 1997)

Figura 6B-2: Espectro UV (MeOH + NaMeO) de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

0,6 %A 6' 5' CH30 0,5

0,4

0,3 Bandaii OH o 0,2

0,1 fwmax (nm)

200 250 300 350 400 450 500 550 95

Figura 6B-3: Espectro UV (MeOH + NaAcO) de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

0,6 %A

CHaO 0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

200 250 300 350 400 450 500 550

Figura 6B-4: Espectro UV (MeOH + AICI 3), de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

0,7 %A 6' 5'

0,6 Bandalla 0,5 293nm Bandallb Banda lb 273 nm 1346 nrn 0,4 OH O 0,3

0,2

0,1

200 250 300 350 400 450 500 550 96

Figura 6B-5: Espectro UV (MeOH + AICI 3 + HCI), de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

0,6 6' %A

0,5 Band.alla. 293nm 0,4 Bandallb Bandalb 273nm 1 347mn OH O 0,3

0,2

0,1

200 250 300 350 400 450 500 550

Tabla 6B: Bandas de Absorción P"maxl en el Espectro UV, en Metanol y en Presencia de Reactivos de Desplazamiento, de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

Reactivo Desplaz. Banda 1 ÓAreac- ÓAMeOH Banda 11 ÓAreac- ÓAMeOH ------·- ·---- MeOH 320 - 271 - MeOH + NaMeO 370 +50 278 +7

MeOH + NaAcO 360 +40 275 +4

MeOH + AICI3 346;380 +26; +60 273;293 +2; +22

MeOH + AIC13 + HCI 347;379 +27; +59 273;293 +2; +22 97

Figura 6H-1: Espectro HMBC[(CD 3) 2CO], de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

e-8 @ e-8/H-6 e-M-I-8 e-& -h- C-6' 100

e-8" e-8"/H-2' e-3" Pi: e-10"/H-3" e-10/H_6 e-3 ~ e -10':~--= 9o ~ o e-10/H-3 ~ e-10"/H-6" 110 e-5' e-3'"/e-5". e-3"'/H-5'" ! O e-5'"/H-3'"

120 e-3'/H-5' e-1'~·3' e-1'/H-3 e-1"' @e-1'/H-5' 0 0 e-1'"/H-3" C-2'"/H-6'" a e-&'/H-2' C-6'"/H-2'" e-1"'/H-5'" e-2"'/e-6" t ·¡;· ·a e-1'"/H-3"' e -6' ... - 8.0 7.5 7.0 6.5

,..------~ --- -~-·--~ ·------~- } ---l ~

C-5/li C-4' C-4'¡}{-2' ,.., ~ C-4'!H-6' C-5"!H-6" C-5"---::: e-s<:~ e-4'" ~ C-4"'/H-2"' """"':.:- - _1:,;· C-4"'/H-6"' ¡l -- ~ ·¡ 1 1 ... C-2"!H-2"' e -2"---}- ·¡ C-2"¡}{-3" C-2!H-2' C-2"/H-6"' e C-Z!H-3 C-Z!H-6' i .l ·•i 1 1 l \, ... V C-7 C-7¡}{-6

i 1 * e.o 7.0 98

Fig. 6H-2: Espectro H·MBC [(CD3) 2CO], de la 7,4' ,7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

H·2' H·f!j -----' - §é --, \ l e-5/H ., e-4'/H-2' e-4. 16l ~ e-4'/H-6' e-5"/H·6" e-5"----> e-5¿.. ;, t e-4'" 1 e-4'"/H·2'" .,. ~ e-4"'/H-6'" ,1 l lilA 1 1 ! e-2"/H·2'" 1 e ·2"~~ e-2"/H-3" ~;:- e-2/H·2' e-2"/H-6'" e ·2 e-2/H-3 ·! ~ e-2/H-6' t 166 C-7/H-6

oo• a.o 7.5 7 .1) 65 99

Diagrama 6: Correlaciones 13CfH en el Espectro HMBC de la 7,4',7"-Tri-0-Metil-Amentoflavona [6]

H-3}@ . H-2' C-2 NP }@ CHao}@ H-6' NP}@ H-5'}@ H-z·}@

H-2'}@ H-3}@ H-6' C-4' NP }9 CH30 H-6}@ NP e H-3"~ H-6" ~

H-a}@ H-2' H-3" }9 H-5"' }eC-1"' H-3'" H-3" ~:.o}@ H -2"' }9C-2" H-6"' H-6"' }@ H-6}@ NP }9 H-5"' }8

NP}@ H-2"'~ H-3'' ~ H-6"'~ H-3~ H-6~ H-6"~ H-3"'}9 H-3~ H-5'~ NP}9 H-2'"le 100

7 ,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona (7]

Por cromatografía en columna de gel de sílice de la reunión F, procedente de la cromatografía general de la fracción de acetato de etilo, se logró aislar un sólido amarillo; éste fue purificado por cromatografía preparativa sobre placas de gel de sílice y posterior cristalización en mezclas CHCl 3-hexano, obteniéndose unas escamas amarillas que fundieron con descomposición por encima de 260 °C. La presencia en su espectro de masas (Fig. 7E; Tabla 7E) de un pico a m/z: 566, asignable a un ión molecular [M+], y la determinación del número y tipos de hidrógenos y carbonos presentes en la molécula, a través de sus espectro de RMN- 1H (Fig. 7C; Tabla 7C) y de RMN- 13C (Fig. 7D-1 y lD-2; Tabla 7D), permtió establecer la fórmula molecular C32H22Üw Al observar en. su espectro UV (Fig. 7B-1) dos típicas bandas de flavonoides a A.max.: 263 nm y Awax.: 331 nm y al comparar someramente los espectros de RMN de este producto con los de la Sciadopitysina [5], se dedujo que el mismo era otro biflavonoide de la serie de la amentoflavona con el mismo patrón de sustitución de la Sciadopitysina; más aún, al detectar que su fórmula molecular poseía un carbono y dos hidrógenos menos que la de la Sciadopitysina y que en su espectro de RMN-1H sólo aparecen dos singuletes asignables a metoxilos (óH: 3,76 y óH: 3,80), se infirió que se trataba de un análogo dimetoxilado de la Sciadopitysina.

Figura 7B-1: Espectro UV (MeOH), de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7]

0,6 %A 6' 5'

0,5

0,4. Bandal 0,3 331 nm OH O 0,2

0,1

200 250 300 350 400 450 500 550 101

El análisis de su espectro IR (Fig. 7A; Tabla 7 A), confirma que el producto es una biflavona, dado que en el mismo se observan dos absorciones asignables a 2 3 1 carbonilos de anillos ~ • -piren-4-ona [vmax:1.658 y 1.602 cm· ], además de las bandas típicas de hidroxilos [vmax: 3.366 cm·1(0-H) y vmax: 1.108-1.206 cm·1 (C-0)] y de aromáticos [vmax: 1.570 cm·1 (C=C) y vmax: 830 cm·1 (=C-H)].

Figura 7A: Espectro Infrarrojo (KBr), de la 7,7'.'-Di-0-Metil-Amentoflavona (7]

OH O

%T 80

50 3372 40 OH Ubre 30

20 1570 1206 1658 C=C e-o 10 C=O 1602 C=O

3500 3000 2500 2000 1soo 1600 1400 ·1200 1000 soo 600 cm -1

Tabla 7A: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR (KBr), de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona (7]

1 Vm'ax (cm- ) 3.366 2.944 1.658 1.602 1.570 1.108-1.206 830

Asignación 0-H C-H C=O C=O C=C C-0 =C-H 102

En razón de lo anteriormente expuesto, resulta también en este caso procedente, describir los datos espectrales de este flavonoide, en forma comparativa respecto a los de la Sciadopitysina [5). Así pués, en la región de los protones aromáticos del espectro de RMN-1H se observa el mismo número de señales y con idénticos patrones de acoplamiento que en el caso de la Sciadopitysina; los únicos cambios que se detectan son pequeñas diferencias en los desplazamientos químico de las mismas. El análisis de esta zona del espectro demuestra que: • La unidad monomérica 1 es una flavona 5,7,3'4'-tetrasustituida, dado que en el espectro de RMN- 1H se observa el par de dobletes que identifica a los dos protones "meta" acoplados del anillo A-I [BH: 6,33 y BH: 6,71, d U =2,3 Hz) (H-6/H-8]*, el sistema AMX generado por los tres protones del anillo B-I [BH: 8,01, d U= 2,5 Hz) (H-2'); BH: 7,13, d U= 9,0 Hz) (H-5') y BH: 8,05, d_d U = 2,5 Hz) (H-6')]* y el singulete que origina el protón a-carbonílico [BH: 6,86 (H-3)]. • La unidad monomérica II es una flavona 5,7,8,4' tetrasustituída puesto que el espectro de RMN- 1H muestra los dos dobletes que conforman el

sistema A2X2 que originan los hidrógenos del anillo B-II ''para "-sustituido [BH: 7,54 y 8H: 6,70 d U =: 8,5 Hz) (H-2'"/H-6"' y H-3"'/H-5"')]* y los dos singuletes, típicos del protón aromático del anillo A-II [BH: 6,62 (H-6")] y del protón a-carbonílico del anillo C-II [8H: 6,80 (H-3"], respectivamente.

• La molécula posee dos metoxilos [oH: 3,76 (C7-0CfL) y oH: 3,80 (C7.. -0CJ::L)] y dos hidroxilos que forman puentes de hidrógeno con carbonilos

cetónicos [8H: 12,92 (C 5-0H) y 8H: 13,22 (C 5.-0H)]. La asignación exacta del pico de cada hidroxilo se hizo en función de las correlaciones observadas en el espectro HMBC (Fig. 7H-1 y 7H-2; Diagrama 7); así pués, el singulete que resuena a BH: 12,92 se correlaciona con los picos asignados a C-5 (8c: 161,2) y a C-6 (8c= 98,0), mientras que el que resuena a 8H: 13,22 lo hace con los picos correspondiente a C-5" (8c: 161,4) y C-6" (Be= 95,4) (Diagrama 7). Como veremos más adelante, las señales de los metoxilos, se asignaron también recurriendo a los datos suministrados por el espectro HMBC.

El espectro de RMN-13C muestra treinta (30) picos correspondientes a 2 carbonos sp , cuya posición y orientación en el DEPT (Tabla 7D ), es en cada caso, similar, a la de sus pares en el espectro de la Sciadopitysina (Tabla 5D); además de los dos picos generados por los metoxilos [oc: 56,0 (C 7-0CH3) y Be= 56,4 (C 7-0CH3)], los cuales fueron asignados sin ambigüedad a través del espectro HMQC (Fig. 7G).

( *) Estos sistemas de espín fueron detalladamente analizados en el espectro 1H, 1H-COSY (Fig. 7F). 103

1 Figura 7C: Espectro de RMN- H (DMSO-d6 , 400 MHz), de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7]

H-8

H-3 H-3" H-6" H·3"' H-2' H-5"' H-2"' H-6"'

H-6

H-5' H-6'

PP~ a.o 7D 111 1c 1.2 1.0 ea a.o D4

OH OH

Tabla 7C: Desplazamientos Químicos (8) en el Espectro de RMN- 1H

(DMSO-d6, 400 MHz), de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7]

H H-3 H-6 H-8 H-2' H-5' H-6' o (ppm) 6,86 6,33 6,71 8,01 7,13 8,05 multipl. S d d d d dd J - 2,3 2,3 2,5 9,0 9,0 y 2,5

H H-3" H-6" H-2"'/H-6"' H-3"'/H-5"' OH OCH3 o (ppm) 6,80 6,62 7,54 6,70 12,92/13,22 3,80/3,76 multipl. S S d d S S J -- 8,5 8,5 - - 104

13 Figura 7D-1: Espectro de RMN- C (DMSO-d6 , 100 MHz), de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7]

CH3 0 C-3'" C-5"' C-2"' C-6"'

C-2' C-3 e-6 e-s C-2'

OeH 3

OCI 3

11.

ppo 100 80 50 40

Tabla 7D: Desplazamientos Químicos (8) en el Espectro de RMN-13C

(DMSO-d6, 100 MHz), de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7] !. e C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 1 C-8 C-9 C-10 C-1' o 164,1 103,2 182,3 161,2 98,0 165,1 1 92,7 157,3 104,9 121,0 Tipo =C-0 =C-H O=C< =C-0 =C-H =C-0 =C-H =C-0 =C< =C< 1

e C-2' C-3' C-4' C-5' C-6' C-2" 1 .C-3" C-4" C-5" C-6" o 131,3 119,7 159,6 116,2 128,1 164,0 102,6 181,9 161,4 95,4 Tipo =C-H =C< =C-0 =C-H =C-H =C-0 =C-H O=C< =C-0 =C-H

e C-7" C-8" C-9" C-10" C-1'" C-2"'/ C-6"' 1 C-3"'/ C-5"' C-4"' O Me O Me 162,7 104,7 153,6 104,1 121,3 128,3 115,8 161,2 56,4 56,0 o 1

Tipo =C-0 =C-0 =C-H =C-H =C-0 -OCH3 -OCH3 =C< =C< =C< 1 105

3 Figura 7D-2: Espectro RMN-~ C (DMSO-d6, 100 MHz), de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7] (Ampliado)

. C-8" C-8 C-10 C-10" C-3 C-3" C-6 C-6"

ppo 10~ 102 100 98 9~ C-2'" C-3'" C-6"' C-5'"

C-2' C-6' C·l'C-1"' C-3' C-5'

ppn 130 128 128 12~ 122 120 118 ue 6' 5'

C-5 C-4'"

C-5' C-7 C-2" C-7" C-4' C-9 C-2

ppn 1e5 1!1~ IBJ 1!52 181 180 159 158 157

C-5 e. 4"' C7. C·2"' C-3'" C-6"' C-5'" C-7'

C-4 C-4 " C-9 C-1"' C·B C-9" C-2' C-6

L. l. .. 106

Asignaciones en el Espectro de RMN-1H de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7]

H-6' H-8 li:8,05 4d) li:6,86 4) - J: 9,0 y2,5 Hz J: 2,3 Hz H-5' li:7 ,13 4) J: 9,0 Hz H-3'"/H-5"' 1):6, 70 4) J: 8,5 Hz H H

H-2m/H-6m li:7 ,54 4) J: 8,5 Hz

Asignaciones en el Espectro de RMN-13C de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7] 107

Figura 7E: Espectro de Masas (El, 70 eV), de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7]

95 90 85 OH o 80 75 70 65 60 55 50

45 566 40 35 30 25 20 15 10 5 o o 400

Tabla 7E: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas (lE, 70 eV.), de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7]

miz 566 537 535 283 268 167 121 97 83 1 69 63 1 Abundancia 43,27 2,44 4,89 1,43 2,27 4,86 4,72 7,62 9,20! 13,64 100 Relativa 108

1 Figura 7F: Espectro H,lH-COSY (DMSO-d6 ,400 MHz), de la 7,7"-Di-0-Metil-1\rnentoflavona [7]

H-8 H-3"'

• O· ~ H-6/H-8 0'>--Y

H-2'"/H-3"' o o H-6"'/H-5."' o~ 7.0

H-2"' H-6"'

e.o 7.0 7 ·" ... /\ Sistema AMX en Anillo 1-B CE] fr-6'-5' (]] :-..I-8/. H e[I}H-2

Sistema A2B2 en Anillo 11-B Sistema AXen Anillo 1-A ~ w m m H~">;!;'l'~H (- H·8 1 HA: [1] H-6 0 CE) H ~ * 109

Al quedar establecidos los patrones de sustitución en las dos unidades monoméricas, faltaría sólo fijar la posición de los grupos metoxilos y el tipo de unión interflavonil. Ello se hizo recurriendo a la información contenida en el espectro HMBC y en los espectros UV, corridos con reactivos de desplazamiento (Fig. 7B-1; 7B-2; 7B-3; 7B-4).

• La presencia de hidroxilos libres en C-5 y C-5", ya establecida a través de los espectros de RMN- 1H [singuletes a 8H: 12,92 y 13,22 (OH)] y de HMBC (cruces C-5 +-+OH+-+ C-6 y C-5" +-+OH+-+ C-6"), fue también confirmada

mediante el UV (óA. MeOHJAici3 : 63 y 34 nm ). • La ausencia de desplazamiento en la banda II del espectro UV, cuando el mismo se corre en MeOH/NaAcO [~A. MeOHJNaAco : O nm (banda II)], demuestra que los hidroxilos en C-7 y C-7" están protegidos. Por otro lado, en el ·espectro HMBC (Fig. 7H-2) se observa que los picos de los carbonos C-7 (<>e: 165,1) y C-7" (<>e: 162,7) se cruzan, respectivamente, con

los singuletes que resuenan a 8H: 3,76 (C 7-0CH3) y 8H: 3,80 (C,.-OC!::L), indicando que los metoxilos están situados en C-7 y C-7". • Al quedar fijados los metoxilos en C-7 y C-7", por exclusión, quedó asegurada la presencia de hidroxilos libres en C-4' y C-4"'; esto fue además corroborado por el desplazamiento batocrómico de la banda I, en el espectro UV corrido en MeOH/NaMeO [~A. MeOH!NaMeo: 63 nm]. • La unión interflavonil C-3'/C-8" fue confirmada, al asegurar, a través de los cruces HMBC: C-5" +-+ H-6" +-+ C-10", que C-6" (<>e: 95,4) es un metino,

y por los cruces H-2' +-+ C-8" +-t H-6", que C-8" (8c: 104,7) es un carbono cuaternario, unido a C-3' (8c: 119, 7).

En conclusión, la estructura del compuesto en estudio quedó firmemente establecida como la 5,4',5",4"'-Tetrahidroxi-7,7"-Dimetoxi-3'~ 8"-Biflavona (7), a la cual se le nombra comúnmente como 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona. Esta biflavona fue reportada por primera vez de la Araucaria excelsa (Ilyas et al., 1978). Luego se ha aislado de las especies: Cunninghamia lanceolata (Ansari et al., 1985), Podocarpus imbrincatus (Gu et al., 1990) y Selaginella doederleinii (Lin et al., 1994). Es esta la primera vez que se aisla del género Retrophyllum y la segunda vez que se reporta para una especie de la familia Podocarpaceae. No hemos encontrado referencias relativas a estudios sobre actividad biológica y farmacológica. ·Su estudio espectral, usando técnicas bidimensionales de RMN, no había sido realizado hasta el presente. Este estudio, permitió asignar de manera definitiva, por primera vez, todas las señales en sus espectro de RMN- 1H y de RMN- 13C. 110

Figura 7B-2: Espectro UV (MeOH + NaMeO), de la 7,7"-Di-0-Metil.:Amentoflavona [7]

6' 5' 0,6 %A

0,5

0,4.

0,3 OH O

0,2

0,1

200 250 300 350 400 450 500 550

Figura 7B-3: Espectro UV (MeOH + NaAcO), de la 7, 7"-Di-O-l\1etil-Amentoflavona [7]

0,6 %A

0,5

0,4.

0,3 OH O

0,2

0,1

200 250 300 350 400 450 500 550 111

Tabla 7B: Bandas de Absorción ("-roaxl en el Espectro UV, en Metanol y en Presencia de Reactivos de Desplazamiento, de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7]

Reactivo Desplaz. Banda 1 Ll"-reac - ¿lJ..MeOH Banda 11 Ll"-reac - ~A.MeOH MeOH 331 - 263 - MeOH + NaMeO 394 +63 263 o MeOH + NaAcO 394 +63 263 o

MeOH + AlCl3 344;394 +13; +63 267;297 +4;+34

MeOH + AlCl3 + HCI 344;394 +13; +63 267;297 +4;+34 112

Figura 7G: Espectro HMQC (DMSO-d6), de la 7,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona [7]

OH O

H-3"' H5'" H-2"' H-3 H-3"H-~8 - H-2' H-6" H-6

C-8 C-6" C-6 100 C-3" C-3 GJCV 0 110

C-3"'/C-5"' 0 8 C-5' CJ o

120

C-2'"/C-6"' C-6' 130 C-2' ppm

ppm 8. O 7.5 7.0 6.5 113

Figura 7H-1: Espectro HMBC (DMSO-d6), de la 7,7"-Di-0-Metil-~entoflavona [7]

H ... 2"' H-2' H-6"' H-~A ·u· H-5' H-6 -' il .ll h l ! . 'A" - r

1""'\ n C-8- c ...,_ C..a"/OH C....OH ~ L C·8!1i·6 C<>- .. C-6"- o ,. ~ 1

1 C-6- C-3"- C->- o C·tO"- C-10"/0H ~ c.a·a C·íO"IOH n .• 100

1 n ~o u - - "' '" "' .. C-3"- rvJ, C-3-----: o C-to·~ ~~ C-8"/H-2' C-8"- A r ... e~ C-8"/H-6' V \ 1 .. .. o CH30 • 9 o z '/ \ 4' V C-10/H-~ 1 ..... 1 H 1 1" - """ :-.. 3 Z' 3' ...... 10 • 1" . ,, e.o • CH30 ... 9" o 1·· '/ '\ 4'" ... H 0 1"J ~ 1 Z" - H """ 6" .,-: 4" 3" Z"' 3"' 5" 10" H-2'" H·2' H o H-;i !t'' Hus· Ttl:~:: --.J ~.J

C-3'"/C-5"' e-s·- 1 t·· OH OH __L____j.._ C-t"'/H-3'" C-t"'/H-5"' -3'/H-5' (r· C-3'- li!O (\ f2_ - ,. C-1"'-- 0 C-1•- . C-1'/H-s' 'vu C-1 H-3U1 C·5c::r= o cjoott ,.V C·5'"iOH C-1"'/H - \¡ '"' - e-•-¡ n ,. C.7!0Hv C-2"'/C-6"'--~ C-6'/H- '

! - o 130 "' "' ... .. - C-2'- C-2'/H-' '\.. ,, ,, ,, - ,. 7. '·' ... 114

Figura 7H-2: Espectro HMBC (DMSO-d6), de la 7 ,7"-Di-0-Metil-Amentoflavona (7]

~·m~ C·4'/H·5' C-4'/H-6' ~ -~ ~'/H·2' 1\ C-5"/H-ti 'C-5/H· l&o ~ V C-4"'/H·2'" 1 c. "'/H-3" C- /H-8 C-4"'/H-6'" C- "l C- "fH .. 6" C-2/H-2' C-2/1 -3 / C·2/H·6' ' C-2"/H 3'~ ,., w C-7/1 -8 e 7 H-6 V~ ..,.

7.5 7.0 f 5

OCH 3 OCH 3

C-7"

C-7 115

Diagrama 7: Correlaciones 13CfH en el Espectro HMBC, de la 7,7"-Di-0-Metil.:Amentoflavona [7]

H-3}@H-2' C-2 H-6' }§ H-6" }@ H-6' NP}@ H-5' }§ H-6" K0 H-2' H-3}@ H-5' NP H-6' }e le

H-8OH }<0 NP H-3" K0 H-6" }e H-8}@ H-2' OH }§ H-3"'H-5'" }eC-1"' H-3" H-6}<0H-8 H-3' K0 NP }€) H-6}@ NP }9 NP }€) H-8}@ H-3" le H-2'"}@H-6"' H-3}9 H-6 C-10 OH NP H-8 K0 }€)

H-5'}€) NP NP H-3 J€> e 116

Podocarpusflavona A [8]

De las fracciones bajadas en hexanos-AcOEt (1:1), precipitó un sólido de color amarillo, el cual fue purificado por cromatografía sobre Sephadex LH-20, y posterior cromatografía preparativa sobre placas de gel de sílice. De esta manera se obtuvo un producto homogéneo en TLC, el cual fue cristalizado de metanol para dar un sólido amorfo de color amarillo pálido (P.F. >300°C). La presencia en su espectro de masas (Fig. BE; Tabla SE) de un ion molecular a m/z: 552 y los datos derivados del análisis de sus espectros de RMN- 1H (Fig. BC; Tabla 8C) y de RMN- 13C (Fig. 8D; Tabla 8D), en relación al número y a los tipos de hidrógenos y carbonos que conforman la molécula, permitieron establecer la fórmula molecular C31 H20010' Las características físicas y cromatográficas de este compuesto y el hecho de que en su espectro ultravioleta (Fig. SB-1) se detecten dos bandas de absorción a Amax.: 266 nm y Awax.: 329 nm (Mark.ham & Mabry, 1975), indican que se trata de otro compuesto flavonoide estructuralmente relacionado con los anteriores. Más aún, al ojear su espectro de RMN- 1H se concluyó que el mismo era una biflavona monometoxilada de la serie de la amentoflavona, análoga de la Sciadopitysina [5).

Figura 8B-1: Espectro UV (MeOH), de la Podocarpusflavona A [8]

0,6

0,5

Banda 1 0,4

0,3

0,2

0,1

200 250 300 350 400 450 500 117

A tenor de lo anteriormente expuesto, hemos considerado oportuno, al igual que en el caso anterior, abordar la descripción de este producto contrastando sus datos espectrales con los de la Sciadopitysina [5]. Así pués:

• Su espectro IR (Fig. 8A; Tabla 8A), muestra una absorción intensa y 1 1 ensanchada en el rango vmax.: 2.500-3.400 cm· (mínimo a vmax.: 3.378 cm- ), atribuible a vibraciones de tensión de enlaces 0-H; la forma e intensidad de la misma, indica que la molécula posee varios grupos hidroxilos. También se detectan dos bandas intensas, características de carbonilos cetónicos a,f3-insaturados [vmax.: 1. 654 y 1.604 cm·1 (C=O)] y absorciones típicas de aromáticos [vmax.: 1. 508 cm·1 (C=C) y vmax.: 834 (=C-H)].

Figura 8A: Espectro Infrarrojo (KBr), de la Podocarpusflavona A [8]

%T OH o 80

60 so 40 834 30 =C-H 20

35oo 3ooo 2soo 2000 tsoo 1600 1400 1200 1000 800 600 cm -1

Tabla BA: Bandas de Absorción Significativas en el Espectro IR (KBr), de la Podocarpusflavona A [8)

2.922 1.176 834 vmax (cm'l) 3.378 1 1.654 1.604 1.508 Asignación 0-H 1 C-H C=O C=O C=C C-0 =C-H 118

La existencia en la molécula de dos unidades monoméricas de flavona, con patrones de sustitución 5,7,3',4' (unidad I) y 5",7",8",4"' (unidad II), fue confirmada al analizar minuciosamente el espectro de RMN- 1H (Fig. 8C; Tabla 8C) y el 1H, 1H-COSY (Fig. 8F). En los mismos se detectan: • Un típico sistema de espines AMX, que caracteriza a un núcleo

aromático 1,3,4-trisustituido (anillo B-I) [ó8 : 8,22, d O = _2,0 Hz) (H-2'); ()H: 7,22, d 0 := 9,0 Hz) (H-5') y ~: 8,01, dd (J := 2,0 y 9,0 Hz) (H-6')].

• Un sistema A2X2 que identifica a un anillo bencénico "para "-sustituido (anillo B-II) [óH: 6,92 y ()H: 7,79; dO= 8,0 Hz) (H-2"'/H-6"' y H-3"'/H-5"')]. • Un par de dobletes mutuamente acoplados que conforman un sistema AB [óH: 6,25 y ()H: 6,48; d O= 2,0 Hz) (H-6 y H-8)], asignable a los hidrógenos "meta"-acoplados de un núcleo bencénico 1,2,3,5-tetrasustituido (anillo A-1). • Tres singuletes agudos, atribuibles a protones aromáticos u olefínicos no acoplados, uno de los cuales se asignó a un hidrógeno aromático aislado [óH: 6,42 (H-6") (anillo A-II)] y los otros dos, a hidrógenos de dobles enlaces trisustituídos, conjugados a una cetona [óH: 6, 73 (H-3) (anillo C-1) y ()H: 6,70 (H-3") (anillo C-II)].

Las señales de los carbonos de cada una de estas subunidades (Tabla 8D) fueron inequívocamente asignadas, a través de las correlaciones C ~ H, localizadas en los espectros HMQC (Fig. 8G) y HMBC (Fig. 8H; Diagrama 8). En el espectro de RMN- 1H se identifica también un singulete propio de un grupo metoxilo [óH: 3,79 (-OCH3)], el cual se cruza en el HMQC con un pico que resuena a Óc: 56,6 (-O.C.H3). Dicho singulete se correlaciona en el HMBC con el pico del carbono C-4"' (óc: 164,2), el cual fue identificado sin ambigüedad por sus corelaciones HMBC con los dobetes generados por H-2"'/H-6"' y H-3"'/H-5"'. La unión entre las subunidades 1 y II ocurre entre C-3' y C-8" (serie de la amentoflavona), por ~as siguientes razones:

• La detección en el EM (Fig. BE; Esquema 8) de fragmentos a m/z: 420, m/z: 400, m/z: 392 y m/z: 268, generados por rupturas retro Diels-Alder (Mabry & Ulubelen, 1980), demuestra que la unión interflavonil se realiza a través de un carbono del anillo B-I y un carbono del anillo A-II.

• Las correlaciones HMBC: C-5" +-+ H-6" ~ C-7", aseguran que el hidrógeno aromático del anillo A-II se encuentra situado en C-6" y no en C-8".

• Los cruces HMBC: H-6" +-+ C-8" ~ H-2' ~ C-4' +-+ H-5' ~ C-3' identifican los picos de C-3' y C-8", y confirman la unión entre estos carbonos. 119

1 Figura 8C: Espectro de RMN- H [(CD 3) 2CO, 400 MHz], de la Podocarpusflavona A [8]

ou OH 1l '"'" 12 H-3"'/H-5"' OH O H-2'"/H-6"' H-6" H-3 H-3"

H-5' H-2' H-8 H-6

H-6'

ppm 8.00 7. 75 7.50 7.25 7.00 6. 75 6.50 6.25

Tabla 8C: Desplazamientos Químicos (o) en el Espectro de RMN-1H

[(CD 3) 2CO, 400 MHz], de la Podocarpusflavona A [8] H H-3 H-6 H-8 H-2' H-5' H-6' 8 (ppm) 6,73 6,25 6,48 8,22 7,22 8,01

multipl. S d d d d dd J - 2,0 2,0 ::2,0 =9,0 =9,0 y 2,0 = 1 =

1 H H-3" H-6" H-2"'/H-6'" H-3"'/H-5'" OCH3 OH 1 1 1 8(ppm) 6,70 6,42 7,79 6,92 3,79 13,07/13,18 1

multipl. S S d d S S 1 J -- =8,0 =8,0 - - 120

13 Figura 8D: Espectro de RMN- C [(CD 3) 2CO, 100 MHz)], de la Podocarpusflavona A [8]

C-2.C-2".C-7.C-7"

C-5 ... C-.l',C·5 C-1'" C-10. C-lO".C-8.. C-A"j C-3'

f / ~-9_..--" C-9" l1 e-· \

1 •• • ..l

Tabla 8D: Desplazamientos Químicos(&) en el Espectro de RMN-13C

[(CD 3) 2CO, 100 MHz], de la Podocarpusflavona A [8] C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10 C-1' e 1 o 166,2 104,8 183,0 162,5 100,5 165,8 95,6 159,6 105,6 122,9 Tipo =C-0 =C-H O=C< =C-0 =C-H =C-0 =C-H =C-0 =C< =C< e C-2' C-3' C-4' C-5' C-6' C-2" C-3" C-4" C-5" C-6" o 133,4 123,1 163,6 116,5 129,1 166,3 104,9 182,8 164,1 101,6 Tipo =C-H =C< =C-0 =C-H =C-H =C-0 =C-H O=C< =C-0 =C-H

e C-7" C-8" C-9" C-10" C-1'" C-2"'/C-6"' C-3"'/C-5"' C-4"' OQH3 Patrón o 165,2 105,2 157,0 105,4 125,3 129,7 115,9 164,2 56,6 Re f. TMS Tipo =C-0 =C-0 =C< =C< =C-H =C-H =C-0 -OCH3 121

Figura 8E: Espectro de Masas (lE, 70 eV), de la Podocarpusflavona A [8]

100 135

80 107

132 70 95 420 152 GO 83 117 388 375 50 71

40 271

30 243 400

420 20 240 2G8 388 10

100 150 200 250 JOO 350 400 .eso 500 550 600

Tabla BE: Fragmentos (m/z) más Notables en el Espectro de Masas (70 eV.), de la Podocarpusflavona A [8]

m/z 552 535 523 420 403 400 392 388 375 271 Abundancia 12,23 4,36 3,12 22,81 19,72 29,12 6,33 12,01 7,18 38,23 Relativa

miz 268 243 240 152 135 132 124 117 107 95 Abundancia 18,47 28,35 17,53 63,81 100,0 70,12 35,23 53,81 77,68 68,22 Relativa 122

Esquema 8: Patrón de Fragmentación en el Espectro de Masas (lE, 70 eV.), de léi Podocarpusflavona A [8]

m/z: 552 j+ [M+] OH O HO'CfO Q~i+ Y~o OH e=: eH m/z: 152 m/z: 132

¡+ !+ Hc=:c HO

OH o

OH o m/z: 420 C.::::. o m/z: 400 OH l-eo 1 j+ He=: e HO

o o

~o OH OH m/z: 268 m/z: 392 123

1 1 Figura 8F: Espectro H, H-COSY [(CD3) 2CO, 400 MHz], de la Podocarpusflavona A [8]

H-2"' H-3"' H-3" H-6"' H- , H-5"' H-3/ H-6" 5 H·8 H-6

H-6 H-6"-~ H-a 1----+-=H-=--z:::-:'•""""IH:=-:!·f.,.,.,,-----+---+J.::_.c.....L._l--1 H·6'"/H- '" o H-5'/H-6

H-2"' H-6"'=~ OH O '·' H-2' H-6'/H-2'

,, .. ~ Sistema AMX en Anillo I-B (E]3fH6'-5'[0

~1-B/. H CCI)H-2

Sistema A2B2 en Anillo Il-B {"\ Sistema AXen Anillo I-A m co H}f6"·5"' rrn ~II-~ OCH3 \ HO*._H-8

H-4"' H-3'" [!] H-6 0 [!] H ~ 124

Asignaciones en el Espectro de RMN-1H de la Podocarptisflavona A [8]

H-5' H-8 H-6' o: 8,05 (dd) o: 7,72 (d) o: 6,48 (d) J: 9,0 Hz . J: 2,0 Hz J : 9,0 y 2,0 Hz

H H-2"'/H-6"' o: 7,79 (d) J: 8,0 Hz

H-6 o: 6,25 (d) J: 2,0 Hz H-3"'/H-5"' H-3 H-6" o: 6,92 (d) o: 6,73 (s) J: 8,0 Hz l o: 6,42 (s) o H-2' 1 H-3" o: 8,22 (d) 1 o: 6,67 (s) J: 2,0 Hz

Asignaciones en el Espectro de RMN-13C de la Podocarpusflavona A [8]

129,1 ®

OH O

OH O 125

Al quedar identificado el patrón de sustitución entre las dos flavonas monómeras, la unión interflavonil C-3'/H-8" y la ubicación del grupo metoxilo en C-4'", quedó establecida la estructura del biflavonoide, dado que los otros cuatro sustituyetes oxigenados tienen que ser necesariamente hidroxilos. Esta afirmación se sustenta en la magnitud de la fórmula molecular C31H200 10, y en la ausencia de señales atribuibles a otros sustituyentes en los espectros de RMN. La ubicación de los hidroxilos en C-5, C-7, C-4', C-5" y C-7" fue además corroborada al detectar en el espectro de RMN-1H dos singuletes a oH: 13,07 y oH: 13,18, asignables a protones hidroxílicos enlazados por puentes de hidrógeno a los carbonilos cetónicos (hidroxilos en C-5 y C-5"). Por otro lado, el estudio de los espectros UV con reactivos de desplazamiento (Fig. SB-2; SB-3, 8B-4 y SB-5; Tabla 8B) confirma la presencia de hidroxilos libres en C-7 y C-7" (L\A.MeOHJNaAco: 35 y 3 nm), en C-4' (L\A.MeOH!NaMeO: 56 y 8 nm) y en C-5 y C-5" (L\A.MeOH!AlCla: 50 y 34 nm ). En conclusión, la biflavona en estudio quedó definitivamente identificada como la 5,7,4',5",7"-Pentahidroxi-4'"-Metoxi-3'~8"-Biflavona [8] a la cual se le conoce también como 3'"-0-Metil-Amentoflavona y como Podocarpusflavona A. Esta biflavona fue aislada por primera vez de Podocarpus macrophylla y P. nagi (Miura et al., 1969) y desde entonce ha sido encontrada en otras muchas especies (Ferreira et al., 2006; Geiger, 1993; Geiger & Quinn, 1975; 1982; 1988); sin embargo es esta la primera vez que se aisla del género Retrophyllum.

Figura BB-2: Espectro UV (MeOH + NaMeO), de la Podocar usflavona A [8]

%A 0,6 ,. !'

0,5

0,4.

0,3

0,2

0,1

200 250 300 350 400 450 500 550 126

Figura 8B-3: Espectro UV (MeOH + NaAcO), de la Podocarpüsflavona A [8]

0,4 Bandall 279nm

0,3

0,2

0,1 Am¡:¡x (nm) 250 300 350 400 450 500

Figura 8B-4: Espectro UV (MeOH + AICI 3), de la Podocarpusflavona A [8]

0,6 %A

0,5 Banda lb 345nm 0,4

0,3

0,2

0,1

200 250 300 350 400 450 500 127

Figura BB-5: Espectro UV (MeOH + AlCl 3 + HCl), de la Podocarpusflavona A [8]

0,6 %A

0,5 Banda llb 277nm 0,4

0,3

0,2

0,1

200 250 300 350 400 450 500

Tabla 8B: Bandas de Absorción (Amaxl en el Espectro UV, en Metano! y en Presencia de Reactivos de Desplazamiento, de la Podocarpusflavona A [8]

Reactivo Desplaz. Banda 1 A"-reac - AA.MeOH Banda 11 A"-reac - L\A.MeOH

Me OH 329 - 266 -

MeOH + NaMeO 385 +56 274 +8

MeOH + NaAcO 364 +35 279 +3

MeOH + AICI3 345;379 +13; +50 276;296 +10; +30

MeOH + AICI3 + HCI 347;379 +13; +50 277;296 +11; +34 128

La Podocarpusflavona, al igual que muchas otras biflavonas de la serie de la amentoflavona, ha demostrado ser u.na sustancia biológicamente activa en diversos bioensayos. Así pues, se ha reportado su actividad citotóxica frente a líneas celulares cancerosas H-29 (Zhang et al., 2005), su acción tripanomicida y leishmanicida sobre promastigotes de Trypanosoma cruzi (Abe et al., 2004), Leishmania mexicana (Suárez et al., 2003) y Leishmania donovani, y su actividad antimalárica en bioensayos con Plasmodil.im falciparum (Camacho et al., 2000). Su capacidad para inhibir, en ensayos "in vitro", la enzima cAMP-phosphodiesterasa Tipo IV (PDE4), demuestra sus potenciales propiedades antinflamatorias (Lobstein et al., 2002). Otra propiedad importante de la Podocarpusflavona A es su capacidad para inhibir el crecimiento y desarrollo de insectos, y de hecho la resistencia que muestra al ataque de insectos el Podocarpus gracilior se ha asociado, en parte, a la presencia de esta biflavona en sus hojas (Kubo et al., 1983; 1984).

Figura 8G: Espectro HMQC[(CD 3) 2CO], de la Podocarpusflavona A (8]

H-3"'/I-1·5'" H-3 H-8 H-2"'/I-1·6"' " H-J"H-6" OCH3 H-2' H-5'

OCH --"------=3 o

!OC

C-3' "/C-5"' C-5' 120

C-2'--...., ppo

pp~ 6 6 129

Figura 8H: Espectro HMBC [(CD3) 2CO], de la Podocarpusflavona A [8] _ljl__li[ij_

0 C-8/H~

100 o C-8"/H-5'

110 C-3"'/C-5'"

C-fM-5' C-2"'/H-6"' C-6"'/H-2"' C-3'/H-5' C-2"'/C-6'" o C-2'

C-l'"M-3"' C-4""¡1{-5'"

C-4'/H-5' 1 0 ' fJL/ - .-L. --····· C-2/H-3

C-2 C-2" C-7 C-7" pp~

H-2"' H-3"' H-5'" H-6" H-6'" H 5' H-3 1-z· ~6· ~ u u [ H-u Hi6 ' C-8--; 1 C- /H-60 C-10"/H-6" C-6 C-6/H- C-10" ' C-10 C- "1 ¡O 0/H-30 C-9 ...... ~ ' C-10/H- ~c-P~ ' .. ' "' C-3' 1, í) C-5' .. ___; C-3'/H-5' • C-3'....: ' 1 1 CJ C-1"'--= 2' o 'lJ C-1 "/H-3" C-6' ~C-6'/H e -2'-,! C2"' ,O o C- '"/H-5"' j C-6'"c-z·- C- '"/H-3"' ' ', --:=::; ~ ¡ C-2' H-6' C-4"' C-4"'/0CI 3 ' j~ ' -"~

1 ! C2' 1 ' C- 7"~ ' .... 1 C-9/H-8 -: C-4"'/H-2" C- '"/H-3"' .. C-9-: 1 r.-4"'/H-fl" ...... , ..... n ' C-4'" -:5 :o ~ o 10 1• o o ~ o o :o~ ~ ~ 130

Diagrama 8: Correlaciones 13CfH en el Espectro HMBC de la Podocarpustlavona A [8] H-3}@ H-2' C-2 H-6' }@ H-6" H-6' te H-2' NP}@ H-5' }@ H-5' H-6" }e H-2' H-3 }@ H-5' NP H-6' }e }@

NP}@ NP H-3" }€) H-6" }9

H-a}@ H-2' H-3"' K0 H-5"' H-3" }6 H-6}@ H-3" H-8 H-2'" NP H-5'" }9 }§ H-6}@ NP }€) NP }€) H-a}@ H-2'"/H-6'"}0 C-4"' H-3" }0 H-3'"/H-5"'.

H-6H-3}G C-10 NP H-8 H-6" te }€)

H-5'}e NP H-3 NP }E) }€)