EXPLORACIÓN DE RELACIONES SIMBIÓTICAS EN RAÍCES DE PINO ROMERÓN (Retrophyllum rospigliosii) (Pilg.) C.N. Page (PODOCARPACEAE) EN UN FRAGMENTO DE BOSQUE ANDINO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA, SEDE MEDELLIN PROGRAMA BIODIVERSIDAD PARA EL DESARROLLO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FORESTALES PROYECTO MANEJO Y CONSERVACIÓN DE LA FLORA

EXPLORACIÓN DE RELACIONES SIMBIÓTICAS EN RAÍCES DE PINO ROMERÓN (Retrophyllum rospigliosii) (Pilg.) C.N. Page (PODOCARPACEAE) EN UN FRAGMENTO DE BOSQUE ANDINO

Contrato 4444 de 2002

Investigador principal MARIA CLAUDIA DIEZ G. Departamento de Ciencias Forestales

Interventor JUAN LÁZARO TORO M. Ing. Forestal, Subdirección Territorial

MEDELLÍN

MARZO DE 2004

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA PROGRAMA BIODIVERSIDAD PARA EL SEDE MEDELLIN DESARROLLO

PROYECTO MANEJO Y CONSERVACIÓN DE LA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FORESTALES FLORA

Equipo del proyecto

M. Claudia Díez G. Investigadora Principal Profesora Coordinadora del proyecto Departamento de Ciencias Forestales Area Ecología Forestal Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín Francisco Hernanado Orozco P. Investigador Profesor Area Microbiología de Suelos Escuela de Geociencias Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín Ana esperanza Franco M. Investigador Profesora Area Taxonomía de macromicetes Instituto de Biología Universidad de Antioquia Octavio González Auxiliar de investigación- Laboratorista Laboratorio Microbiología del Suelo Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín Vicente Betancur O. Auxiliar de investigación- Laboratorista Laboratorio Ecología y Conservación Ambiental Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín Adriana Corrales O. Auxiliar de investigación Estudiante de pregrado Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín Jhon Mauricio Silva B. Auxiliar de investigación Estudiante de pregrado Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín Alejandro Andrés Londoño U. Auxiliar de investigación Estudiante de pregrado Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín Sandra Patricia Jaramillo P. Auxiliar de investigación Estudiante de posgrado Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín Juan Lázaro Toro M. Interventor Ingeniero Forestal Subdirección territorial CORANTIOQUIA

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Tabla de contenido

Introducción 4 Area de estudio 6

1. Caracterización de los nódulos de las raíces de pino romerón 7 1.1. Las raíces de las Podocarpaceae 7 1.2. Métodos 8 1.3. Resultados y discusión 8

2. Evaluación de micorrizas arbusculares en pino romerón 10 2.1. Reportes de micorrizas arbusculares en Podocarpaceae 10 2.2. Métodos 11 2.2.1. Evaluación de la presencia de esporas de hongos micorrizo-arbusculares en la 11 rizosfera de pino romerón 2.2.2. Evaluación de la presencia de micorrizas arbusculares en raíces y nódulos 12 2.2.3. Montaje del ensayo de inoculación de plántulas 13 • Producción de plántulas estériles de pino romerón 13 • Preparación de inóculos de hongos micorrizo-arbusculares 14 • Diseño experimental del ensayo 15 • Siembra de plántulas 16 • Seguimiento del ensayo 17 • Evaluación del ensayo 17 2.3. Resultados y discusión 19 2.3.1. Colonización de raíces y nódulos de pino romerón 19 2.3.2. Desarrollo de las plántulas 19

3. Evaluación de Ectomicorrizas en pino romerón 23 3.1. Reportes de ectomicorrizas en Podocarpaceae 23 3.2. Métodos 23 3.2.1. Colección e identificación de macromicetes en bosques de pino romerón 23 3.2.2. Montaje del ensayo de inoculación de plántulas 30 3.3. Resultados y discusión 31 3.3.1. Colección de macromicetes asociados a bosques de pino romerón 31 3.3.2. Desarrollo de las plántulas 32

4. Evaluación de organismos fijadores de N asociados al pino romerón 36 4.1. Reportes de organismos fijadores de N asociados a Podocarpaceae 36 4.2. Métodos 38 4.2.1. Recolección de nódulos en el campo 38 4.2.2. Procesamiento de las muestras en el laboratorio 39 4.2.3. Montaje del ensayo de inoculación con plántulas 40 4.3. Resultados y discusión 40 4.3.1. Crecimiento de colonias 40 4.3.2. Desarrollo de las plántulas 41 4.3.3. Comparación entre los mejores tratamientos de aplicación de esporas y de nódulos 42

Conclusiones generales 45 Referencias bibliográficas 47 Anexos 49

3 Introducción

La reforestación de las zonas altas de la región andina colombiana, además de tener gran importancia para el aprovechamiento industrial, es una prioridad para la conservación de recursos fundamentales como la biodiversidad, el agua y el suelo, y es una herramienta útil para la restauración de los ecosistemas naturales (Cavelier et al. 2001). Pero cuando las entidades interesadas en desarrollar este tipo de proyectos se enfrentan con la selección de especies para la plantación, encuentran grandes vacíos en el conocimiento de la silvicultura de los árboles nativos.

Además, generalmente estas plantaciones se deben realizar en suelos de muy baja fertilidad natural o que se han degradado por efecto de actividades agrícolas y ganaderas (Jin et al. 2000). Muchas de las especies nativas no logran crecer apropiadamente en los sitios de plantación, tal vez porque no encuentran las poblaciones de microorganismos con las que se asocian en sus ecosistemas naturales (Brundrett 1991, Haselwandter & Bowen 1996). Esta limitación contribuye a que la reforestación, incluso aquella que se realiza con fines de protección, continúe utilizando principalmente las especies introducidas Pinus patula, Cupressus lusitanica y Eucalyptus saligna, y solo unas pocas especies nativas como Alnus acuminata (Cavelier & Tobler 1998).

El pino romerón (Retrophyllum rospigliosii) es una conífera nativa con grandes posibilidades de utilización en la reforestación comercial o con fines de conservación en las zonas andinas colombianas, pues tiene usos en ebanistería, construcción y producción de pulpa (Marín 1998, Ludeña & Bueno 1989), extracción de taninos (Parent 1989) y posiblemente de otros compuestos con actividades biológicas que se han detectado en otras especies de Podocarpaceae (Kubo et al. 1992, Xuan et al. 1995, Becerra et al. 2002 y Stahlhut et al.1999).

Los suelos con mayor potencial para reforestación con pino romerón en las zonas altoandinas son los derivados de cenizas volcánicas (Andisoles). Estos se caracterizan por una baja concentración de fósforo en la solución del suelo debido a que este elemento resulta fuertemente adsorbido por la arcilla alófana y o a que se forman fosfatos de hierro y aluminio de baja solubilidad que se precipitan (Fassbender 1987). La alta capacidad de retención de fósforo de estos suelos limita la eficiencia de la fertilización, ya que el fosfato disuelto de los fertilizantes fosfóricos solubles es rápidamente precipitado o adsorbido. Así mismo, aunque los contenidos de materia orgánica y de N en estos suelos son altos (Fassbender 1987), muestran una baja tasa de mineralización, por lo cual

4 el N llega a constituirse en un factor limitante para el crecimiento en los bosques tropicales de tierras altas (Montagnini & Jordan 2002).

Una alternativa para mejorar la eficiencia de las plantas para absorber fósforo y adquirir nitrógeno en este tipo de suelos, es valerse de las asociaciones simbióticas que pueden formar muchas especies forestales, bien sea con bacterias fijadoras de nitrógeno o con hongos micorrícicos (Vogt et al. 1996).

En el país se han establecido plantaciones de pino romerón, pero no se han definido los protocolos adecuados para la inoculación de las plántulas en invernadero, debido al desconocimiento de las interacciones de esta especie con microorganismos simbiontes. Este puede ser uno de los factores claves para el buen desempeño de ésta y otras especies de Podocarpaceae en Colombia (Marín 1998).

Este estudio tiene un carácter exploratorio por cuanto se desconoce la identidad de los organismos asociados a la rizosfera de esta especie en las regiones andinas de Colombia. Se evalúo la presencia de micorrizas arbusculares, ectomicorrizas y bacterias fijadoras de nitrógeno en la rizosfera del pino romerón, bajo condiciones naturales. Así mismo, se evalúo el efecto de algunos de los microorganismos encontrados sobre el crecimiento y nutrición de plántulas en condiciones de invernadero.

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Area de estudio

La recolección de muestras de plantas, hongos y suelo realizó en un fragmento de bosque altoandino localizado en la vereda Río Frío, entre los municipio de Támesis y Jericó (suroeste de Antioquia). Las coordenadas del fragmento son 05°43´41.1" N y 75°44´35.9" W.

El bosque está a una altitud de 2.205 msnm. La precipitación promedia anual es de 2.415 mm, con dos épocas de lluvias en el año, de abril a junio y de agosto a noviembre. Los suelos son ácidos (pH 5.0), con altos contenidos de materia orgánica, niveles medios de nitrógeno y bajo contenido de fósforo intercambiable.

Este bosque está dominado por árboles de Retrophyllum rospigliosii de más de 30 cm de diámetro y el subdosel y sotobosque están compuestos por otras especies de árboles y arbustos latifoliados. El fragmento tiene forma lineal, a lo largo de una quebrada. Está rodeado de extensas áreas de potreros con pequeños fragmento remanentes de bosque degradado.

Los ensayos de invernadero se establecieron en la Estación Forestal Piedras Blancas, en un invernadero administrado por CORANTIOQUIA. La Estación Forestal se encuentra a una altitud de 2.400 msnm. La precipitación promedia anual es de 1.815 mm y la temperatura promedia anual de 14.9 ° C (EPM 1994).

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1. Caracterización de los nódulos de las raíces de pino romerón

1.1. Las raíces de las Podocarpaceae

Desde hace varias décadas se reporta la presencia de protuberancias en las raíces de varias familias de Gimnospermas como Podocarpaceae, Araucariaceae y Phillocladaceae (Duhoux et al. 2001, Khan & Valder 1972). Todas las especies de la familia Podocarpaceae poseen este tipo de nódulos (Baylis et al. 1963, Furman 1970, Grez 1988). Se trata de pequeños nódulos esféricos, en series longitudinales a lo largo de las raíces, en colores y tamaños variables desde blanquecinos hasta amarillos y marrones de 0.2 a 1.0 mm (Grez 1988, Duhoux et al. 2201, Russell et al. 2002, Khan & Valder 1972). Estos nódulos son diferentes de los nódulos radicales fijadores de nitrógeno que poseen las plantas actinorrícicas y las leguminosas, ya que se caracterizan por ser cercanos y regularmente espaciados a lo largo de la raíz, en dos a cuatro filas longitudinales y de tamaño uniforme (Duhoux et al. 2001).

Los nódulos de las Podocarpaceae son una característica constitutiva de la raíz, es decir, se trata de raíces laterales modificadas con un vaso vascular conectado a la raíz parental, los cuales son invadidos en algunos casos, por micorrizas arbusculares (Griffiths 1965, Rusell et al. 2000). Como de los nódulos de las Podocarpaceae y otras familias de gimnospermas contienen hongos filamentosos no septados, se les ha denominado “nódulos microrrícicos” (Dunhoux et al. 2001). Concretamente en pino romerón, los nódulos se comportan como una estructura inherente a la raíz, no inducida por microorganismo alguno, pero juegan un papel importante en la asociación micorrizal, al servir como refugio para albergar al hongo micorrizógeno (Hodson & Guerrero 1987).

El pino romerón posee una raíz de tipo pivotante, con una raíz principal gruesa y ramificaciones laterales menos desarrolladas que crecen a intervalos de siete a ocho cm, casi perpendiculares con respecto al eje de la raíz principal (Furman 1970). Las raíces más finas son relativamente gruesas (entre 0.4 y 1 mm). Estas raíces pequeñas presentan engrosamientos que corresponden a brotes de crecimiento resurgente. El sistema carece de pelos radicales, por lo cual se puede deducir una alta dependencia de la absorción de nutrientes que realiza el micelio de los hongos asociados (Hodson & Guerrero 1987).

7 1.2. Métodos

Durante las salidas de campo que se realizaron mensualmente, se recogieron muestras de raíces finas de árboles adultos y de plántulas de pino romerón. Las raíces se empacaron en bolsas plásticas de cierre hermético. Se transportaron a baja temperatura en una nevera de icopor con bolsas de hielo azul, para evitar su desecación y descomposición.

Las muestras se llevaron al Laboratorio de Microbiología del Suelo (Escuela de Geociencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín). Una vez en el laboratorio, se lavaron las raíces y se desprendieron los nódulos. Se seleccionaron algunos nódulos para cortarlos manualmente en secciones muy finas (1 mm aproximadamente), y se tiñeron con azul de metileno y azul de lactofenol para facilitar su observación en microscopio de luz. También se hizo el seguimiento de la aparición de nódulos en plántulas provenientes de semillas que germinaron en cuarzo estéril, las cuales se regaron con agua destilada para evitar contaminación.

1.3. Resultados y discusión

La especie produce numerosos nódulos esféricos, en filas a lo largo de las raíces. Los nódulos nuevos aparecen continuamente a lo largo del año, tanto en las raíces maduras como en las raíces laterales jóvenes, por lo cual la mayoría de las raíces tienen nódulos más viejos mezclados con nódulos jóvenes (Figura 1.1).

Figura 1.1. Aspecto de los nódulos de las raíces de pino romerón.

8 Los nódulos tienen un tamaño de 0.8 a 1.0 mm. Su superficie es lisa y libre de tricomas. Los nódulos jóvenes son blanquecinos con una epidermis suave y toman una coloración anaranjada a marrón claro cuando están maduros, posiblemente por la acumulación de varias capas de células muertas sobre la epidermis. Los nódulos se originan en el periciclo de la raíz, adyacente al polo de xilema, con un patrón similar al de la formación de raíces laterales.

Las plántulas de Retrophyllum rospigliosii sembradas en medio estéril formaron nódulos unos cuatro a cinco meses después de su germinación, y en ellos no se detectó la presencia de organismos endófitos, como se explicará en los capítulos posteriores. Estas observaciones coinciden con las de Baylis et al. 1963, Hodson & Guerrero 1987 y Rusell et al. 2000, quienes afirman que los nódulos son una característica constitutiva de la raíz de las Podocarpaceae y no son originados por organismos simbiontes fijadores de nitrógeno.

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2. Evaluación de Micorrizas Arbusculares en pino romerón

2.1. Reportes de micorrizas arbusculares en Podocarpaceae

Los árboles de gimnospermas que dominaron los bosques del planeta durante el Jurásico y el Cretáceo incluyendo géneros como Podocarpus, Agathis, Araucaria, Pyllocladus y Ginkgo, poseían micorrizas arbusculares. En la actualidad, todas las gimnospermas poseen endomicorrizas, excepto las del género Gnetum y las de la familia Pinaceae que se caracterizan por su asociación con ectomicorrizas. No se conocen gimnospermas no micorrícicas (Richards 1972, Brundett 2002).

Desde hace varias décadas se reporta la presencia de micorrizas arbusculares en varias especies de la familia Podocarpaceae (Baylis et al. 1963). En Malasia se encontró que las especies Podocarpus imbricatus y Dacrydium elatum presentan micorrizas arbusculares (Griffiths 1965). Más recientemente se han realizado otros estudios en Podocarpaceae que igualmente concluyen que están colonizadas por hongos endomicorrícicos. En Chile se encontraron este tipo de asociaciones en Dacrydium fonckii, Podocarpus nubigena, Podocarpus saligna, Prummnopitys andina y Saxegothea conspicua (Godoy & Mayr 1989). En Nueva Zelanda se realizó una evaluación de las raíces de las plántulas de bosques de Podocarpaceae y angiospermas. Entre las especies de la familia Podocarpaceae (Podocarpus totara, Dacrycarpus dacrydioides, Dacrydium cupressium y Prumnopytis ferruginea), se encontró que los nódulos estaban fuertemente colonizados por micorrizas arbusculares, en individuos que crecían tanto en el sotobosque como en los claros (Hurst et al. 2002). En Pakistán se evaluó el estado micorrizal de 11 especies de gimnospermas tomando muestras de individuos adultos, entre ellas Podocarpus chinenesis, en la cual se encontraron endomicorrizas (Iqbal et al. 1990). Igualmente, al evaluar el estado micorrizal de árboles nativos de los bosques montanos secos de Etiopía, incluyendo la especie Podocarpus falcatus, se revela la colonización por micorrizas arbusculares (Wubet et al. 2002).

A pesar de que en los estudios anteriormente mencionados se encontró colonización por hongos micorrizo-arbusculares en las raíces de las Podocarpaceae, solo una investigación efectuada en Nueva Zelanda, ha logrado identificar los linajes de los hongos asociados. Mediante técnicas de PCR, Russell et al. (2002) lograron realizar la secuenciación del ADN de los hongos contenidos en los nódulos de Prumnopitys ferruginea, P. taxifolia, Dacrycarpus dacrydiodes y Dacrydium

10 cupressinum. Los hongos fueron identificados como Glomus intraradices, Glomus mosseae, Glomus etunicatum, Glomus versiforme, Acaulospora rugosa, Acaulospora spinosa, Entrophospora colombiana, Gigaspora albida, Gigaspora gigantea, Scutellospora pellucida, Scutellospora dipapillosa, Archaeospora trappei, Archaeospora gerdemanni, Paraglomus occultum y Paraglomus brasilianum (Russell et al. 2002). Este amplio espectro de hongos asociados muestra que al parecer la relación no es muy específica.

El primer reporte de endomicorrizas en pino romerón (Retrophyllum rospigliosii) fue el de Furman (1970). En este trabajo se describe que las células corticales y los nódulos jóvenes son ocupados por hongos filamentosos. Las hifas tienen unos 3 a 3.5 µm de diámetro en promedio, pero se adelgazan y se ensanchan; también son comunes las vesículas. Posteriormente, Hodson & Guerrero (1987) realizaron un estudio de la asociación micorrizal en pino romerón. Concluyeron que la especie en condiciones naturales posee asociación con hongos micorrizo-arbusculares. En este estudio también se extrajeron esporas de la rizosfera y se identificaron como Acaulospora mellea, Acaulospora appendicula, Glomus sp, Acaulospora spinosa, y otras dos especies de Acaulospora que no se identificaron. La presencia de estas esporas en la rizosfera no necesariamente implica que estos sean los linajes de hongos que están colonizando las raíces del pino romerón.

2.2. Métodos

2.2.1. Evaluación de la presencia de esporas de hongos micorrizo- arbusculares en la rizosfera de pino romerón

Durante las salidas de campo que se realizaron durante los meses de febrero, marzo y abril de 2003, se recogieron muestras de suelo de la rizosfera de árboles adultos y plántulas de pino romerón. Para esto se excavaron pequeños tramos de raíces y se retiró cuidadosamente el suelo más cercano a su superficie (aproximadamente 1 cm de distancia). El suelo se empacó en bolsas plásticas de cierre hermético marcadas con el código del árbol y se transportó a baja temperatura en una nevera de icopor con bolsas de hielo azul para evitar su desecación y descomposición. Las muestras se llevaron al Laboratorio de Microbiología del Suelo (Escuela de Geociencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín). Una vez en el laboratorio, se siguió el siguiente procedimiento (Habte & Osorio 2001): Cada muestra de suelo se puso en solución de agua y se le agregó pirofosfato de sodio para dispersar las partículas. Se agitó durante unos 10 min a 1500 rev/min.

11 Luego, la solución se tamizó a través de una serie de mallas de diferente tamaño (500, 250. 106 y 53 μm) con agua corriente, evitando que se saliera por los tamices. Se recogió el contenido de los tamices de 250, 106 y 53 y se puso en tubos marcados con los códigos de la muestra de suelo y de la malla. Se le agregó una solución azucarada para aumentar la densidad de la solución y lograr que se suspendieran las esporas. Se llevaron nuevamente a la centrífuga durante unos 10 min. Luego se lavaron las paredes del tubo sobre el tamiz más fino y éste lavado se pasó por un papel de filtro (Whatman No. 1). Se observaron las esporas al estereoscopio (Leica DME) y se separaron los tipos más comunes de esporas.

2.2.2. Evaluación de la presencia de micorrizas arbusculares en raíces y nódulos

Durante las salidas de campo que se realizaron mensualmente durante el año 2003, se recogieron muestras de raíces finas de árboles adultos e individuos jóvenes de pino romerón. Las raíces se empacaron en bolsas plásticas de cierre hermético. Se transportaron a baja temperatura en una nevera de icopor con bolsas de hielo azul para evitar su desecación y descomposición. Las muestras se llevaron al Laboratorio de Microbiología del Suelo. En el laboratorio, se siguió el siguiente procedimiento:

Se lavaron intensamente las raíces con agua corriente hasta que estuvieron completamente libres de suelo. De cada muestra se sacaron de 4 a 5 porciones representativas de las raíces más delgadas, se partieron en segmentos de unos 3 cm de longitud y se pusieron en recipientes plásticos pequeños. A continuación se realizó un procedimiento denominado aclareamiento que elimina materiales nucleares y citoplasmáticos y facilita la penetración del colorante (Phillips & Hayman 1970): A cada recipiente se agregó una cantidad de KOH al 10% que cubriera totalmente las raíces y se dejó durante entre 24 y 48 horas a temperatura ambiente. Después de un día se verifica el color de las raíces y si todavía estaban muy oscuras, se cambiaba el KOH y se dejaban otro día más en esta solución. También se ensayó el procedimiento de poner al baño maría las raíces sumergidas en KOH, pero se prefirió establecer el protocolo ya explicado debido a los vapores tóxicos que emana el KOH a altas temperaturas. Después de este tiempo se descargaba el KOH y se enjugaban las raíces con agua destilada, al menos con cuatro cambios de agua. Puesto que las raíces de pino romerón tienen una pigmentación muy fuerte fue necesario realizar un procedimiento adicional llamado blanqueamiento: Se agregó a cada recipiente plástico, una cantidad de H2O2 alcalina que cubriera totalmente las raíces. Se ensayaron varios tiempos de inmersión (entre 10 a 40 min) y se

12 decidió establecer el protocolo con 20 a 25 min, pues con poco tiempo no se producía ningún efecto y por encima de 30 min las raíces empezaban a deshacerse. Al final de este procedimiento las raíces se lavaban con abundante agua destilada.

Posteriormente se efectuó la acidificación de las raíces para facilitar la retención del colorante. Para esto las raíces se cubrían con HCL al 10% durante 5 a 10 min. Luego se evacuaba el ácido pero no se lavaban las raíces, e inmediatamente se procedía a realizar la tinción. Para este procedimiento se ensayaron los colorantes Azul de Trypan (Brundrett et al. 1996) y Fucsina ácida (Kormanik et al. 1980). La tinción resultó exitosa con ambos colorantes, pero debido a que el Azul de Trypan está reportado como cancerígeno, se decidió establecer el protocolo utilizando Fucsina ácida que es un colorante menos tóxico. Para esto se cubrieron las raíces con una solución de fucsina ácida y ácido láctico y se incubaron a temperatura ambiente durante 24 a 48 h. Para remover el exceso de colorante se sacaron las raíces y se sumergieron en una mezcla de solventes específicos del colorante durante unas 24 h a temperatura ambiente. Después de este tiempo se decantó sobre papel de filtro (Whatman No. 1). Las raíces se observaron al microscopio (Olympus BMX-40) para detectar la presencia de estructuras de hongos micorrícicos en su interior.

2.2.3. Montaje del ensayo de inoculación de plántulas

• Producción de plántulas estériles de pino romerón El montaje de la germinación de semillas se llevó a cabo en el Laboratorio de Ecología y Conservación Ambiental (Departamento de Ciencias Forestales, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín) (temperatura diaria entre 23 y 25 ºC y HR entre 65 y 75%). Las semillas fueron suministradas por CORANTIOQUIA y provenían de diferentes fuentes semilleras del suroeste de Antioquia.

Las semillas se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% (Zangaro et al., 2000); además se limpió el exterior de cada semilla con un cepillo suave. Luego se lavaron en abundante agua destilada. Se pusieron a remojar durante 5 días en agua destilada, sin cubrirlas totalmente. Las cubetas de germinación se lavaron inicialmente con jabón y agua corriente y luego con hipoclorito de sodio al 1% y agua destilada. Las semillas se sembraron en cuarzo grueso esterilizado en autoclave a 240 °F durante 20 min. Se regaron inmediatamente con agua destilada hasta saturar el sustrato. Se taparon y se continuó agregando agua cuando se detectó desecación. Las cubetas se

13 instalaron en un área de baja iluminación en el Laboratorio (unos 400 a 500 µm/m2/seg de radiación fotosintéticamente activa), pues bajo este ambiente se podían obtener mejores porcentajes de germinación. Una vez empezaron a germinar, se transplantaron las plántulas a macetas plásticas desinfectadas con sustrato de cuarzo grueso estéril y se transportaron hasta la Estación Forestal Piedras Blancas, donde se hizo el montaje del ensayo.

• Preparación de inóculos de hongos micorrizo-arbusculares El conteo de la diversidad de esporas de la rizosfera de pino romerón mostró consistentemente la abundancia de tres tipos de esporas de hongos nativos. Como no se cuenta con su identificación definitiva se denominaron hongo de espora amarilla de tamaño medio, hongo de espora negra de tamaño grande y hongo de espora ámbar, posiblemente del género Glomus (Figura 2.1). Con estas tres esporas y con las esporas de otros tres hongos de la colección del Laboratorio de Microbiología del Suelo, se prepararon los inóculos para el ensayo. Las esporas se recuperaban de la muestras de suelo traídas del campo, mediante el procedimiento de extracción de esporas detallado en el numeral 2.2.1. También se realizó este mismo procedimiento de extracción de esporas y preparación de inóculos, utilizando las colecciones que se mantienen en el laboratorio. En este caso los hongos se encontraban asociados a plantas de sorgo que se mantenían en cuartos de crecimiento. Los hongos seleccionados fueron Glomus intraradices, Glomus fasciculatum y Entrophospora colombiana.

Con ayuda del estereoscopio (Leica DME) se separaron los grupos de esporas y se empacaron en tubos Eppendorf marcados, que contenían una mezcla de caolinita y turba en una proporción 1:1. Cada tubo contenía 50 esporas de un tipo específico de hongo micorrizo-arbuscular. Estos inóculos se guardaron a 5 º C hasta el momento de su aplicación.

14 A B

C

Figura 2.1. Esporas de hongos micorrizo-arbusculares nativos que se incluyeron en los ensayos de inoculación: A: Espora negra, B: Espora ámbar y C: Espora amarilla.

• Diseño experimental del ensayo El ensayo se condujo de acuerdo con un diseño completamente al azar. Se establecieron 8 tratamientos y cada tratamiento tuvo cinco repeticiones. Cada repetición correspondió a una plántula. Los tratamientos establecidos fueron: Tratamiento 1: Testigo: Las plántulas se sembraron sin inóculo. Tratamiento 2: Las plántulas se sembraron con inóculo del hongo de espora negra grande. Tratamiento 3: Las plántulas se sembraron con inóculo del hongo de espora ambar, posible Glomus sp. Tratamiento 4: Las plántulas se sembraron con inóculo del hongo de espora amarilla mediana . Tratamiento 5: Las plántulas se sembraron con inóculo de Glomus intraradices. Tratamiento 6: Las plántulas se sembraron con inóculo de Glomus fasciculatum. Tratamiento 7: Las plántulas se sembraron con inóculo de Entrophospora colombiana. Tratamiento 8: Las plántulas se sembraron con la mezcla de las esporas del los tratamientos anteriores.

15 Durante el tiempo de monitoreo del experimento, las unidades experimentales se cambiaban continuamente de localización en el invernadero con el fin de disminuir la influencia de factores ambientales localizados.

• Siembra de plántulas Se seleccionaron las plántulas de pino romerón que tuvieran tamaños y desarrollo similar para el montaje del experimento. Las plántulas tenían inicialmente en promedio unos 7 cm de altura y un peso seco de 0.6 g.

Las plántulas se sembraron en Jarras de Leonard. Cada jarra consistía de un recipiente inferior que contenía la solución nutritiva Norris (Anexo 1) y un recipiente superior que contenía el sustrato donde se sembraron las plántulas. El sustrato era una mezcla de cuarzo fino y grueso estéril en una proporción 1:2. Sobre el cuarzo se puso un pequeño horizonte de hojarasca traída del bosque de pino romerón, previamente esterilizada y triturada. El recipiente superior tenía una mecha de algodón que llegaba hasta el fondo del recipiente inferior para permitir el ascenso de la solución nutritiva.

Al momento de la siembra, todos los elementos utilizados habían sido esterilizados previamente y se trabajó en condiciones de asepsia para evitar la contaminación de otros organismos diferentes a los de los inóculos. En el recipiente superior de la jarra de Leonard se abrió un hoyo utilizando una barra de vidrio. En su interior se dejó caer el contenido de un tubo Eppendorf (el inóculo de un hongo específico), y luego se sembró la plántula, teniendo cuidado de que las raíces no quedaran dobladas. Las jarras se cubrieron en la parte inferior con una bolsa plástica negra, para disminuir la proliferación de algas y en la parte superior con una bolsa de papel kraft, que tenía un pequeño orificio por donde salía el tallo, con el fin de evitar contaminación de esporas externas. Tanto las jarras como las bolsas se marcaron con los códigos de los tratamientos y las repeticiones (Figura 2.2.).

El ensayo se localizó en un invernadero que administra CORANTIOQUIA, dentro de la Estación Forestal Piedras Blancas. El área del invernadero donde estaba el ensayo, se cubrió con tela de sombra del 50% para favorecer las condiciones de crecimiento de las plántulas de pino romerón que al parecer requieren de sombra en sus primeras etapas (Lamprecht 1990).

16 . Figura 2.2. Aspecto general del montaje del ensayo de inoculación con plántulas de pino romerón

• Seguimiento del ensayo Las jarras se regaron tres veces por semana con agua destilada para evitar la desecación del sustrato. Se realizaron visitas semanales y en algunos casos quincenales, desde el montaje de experimento en mayo de 2003 hasta su cosecha en febrero de 2004. En estas visitas se evaluaba el estado de las plántulas, en cuanto a posibles ataques de plagas o enfermedades que pudieran poner en riesgo el montaje. Igualmente se verificaba el nivel de la solución nutritiva y la intensidad de la contaminación con algas. Cuando el nivel de la solución bajaba considerablemente se llenaba nuevamente el recipiente inferior con solución preparada recientemente. Cuando se presentaba una alta contaminación por algas en el frasco, se descartaba la solución, se lavaba el frasco con agua destilada y se llenaba nuevamente.

Durante el ensayo se tomaron muestras de la solución Norris para evaluar la conductividad eléctrica y el pH, y de acuerdo con los resultados se renovaba la solución de todas las jarras. Fue necesario realizar este procedimiento en dos ocasiones, en agosto y en noviembre de 2003.

• Evaluación del ensayo El experimento se desmontó en febrero de 2004. Las jarras de Leonard se transportaron en cajas plásticas hasta el Laboratorio de Ecología y Conservación Ambiental, donde se realizó el procesamiento inicial de las plántulas, con el fin de tener mejor control de las mediciones. Cada plántula se retiró cuidadosamente del sustrato de cuarzo teniendo cuidado de que el sistema radical no se partiera y se pudiera evaluar intacto. Para esto fue necesario romper la parte superior de la jarra con una sierra fina. Cada plántula se partió a la altura del cuello con una tijera podadora, para 17 separar la parte aérea y la porción de raíces. A cada plántulas se le realizaron las siguientes mediciones: Altura de la plántula en cm utilizando una escala; número de ramas; diámetro en el cuello de la plántula utilizando un calibrador digital; peso seco de la porción aérea y peso seco de raíces en g utilizando una estufa y una balanza digital; y el número de nódulos por cm de raíz con ayuda de un estereoscopio (Leica DME).

Para hallar el peso seco de las raíces se tomó una muestra que contenía solo las raíces gruesas y se hizo una extrapolación a la biomasa total, pues las raíces finas se necesitaban frescas para evaluar la colonización micorrizal. Para evaluar el número de nódulos por cm de raíz, se tomó el promedio de tres tramos de 1 cm escogidos al azar del sistema radical de cada plántula.

También se evaluó el contenido foliar de fósforo en cada plántula siguiendo el método no destructivo desarrollado por Aziz & Habte (1987). El fósforo se midió siguiendo el método de azul de molibdato (Murphy & Riley 1962). Puesto que el pino romerón posee hojas pequeñas dispuestas a lo largo de las ramas, se tomó la cuarta o quinta hoja desde la base de la rama, en la rama más recientemente formada, la cual corresponde a una hoja madura pero no senil y totalmente expandida. Las hojitas se depositaron en tubos Pirex (18 x 150 mm) marcados con el código de la plántula y se incineraron en una mufla (500 °C durante 3 h). Las cenizas se disolvieron y colorearon de acuerdo con la técnica de azul de molibdeno, agregando una mezcla de reactivos a cada tubo y mezclando su contenido con ayuda de un vortex. Después de 20 min. de reposo, la intensidad del color que se desarrolló en cada tubo se leyó utilizando un espectrofotómetro ultravioleta-visible (Spectronic 601) a una longitud de onda de 882 nm. La concentración de P en la muestra se determinó mediante la referencia a una curva patrón que se construyó al graficar la absorbancia de soluciones conocidas de P contra la concentración de P (Anexo 2). Para hallar el P total contenido en la biomasa aérea, se multiplicó el contenido foliar de P de cada plántula por su peso seco. Para esto se considera que el contenido encontrado en una hoja específica puede extrapolarse a toda la plántula. Este supuesto es cierto para algunas especies arbóreas tropicales (Habte & Osorio 2001).

El análisis estadístico del ensayo se realizó utilizando el programa Statistica versión 6.0. Se evaluó la normalidad de la distribución de los datos de cada variable analizada, se hizo análisis de varianza y los promedios se compararon mediante la prueba de Tukey (Dean & Voss 1999).

18 2.3. Resultados y discusión

2.3.1. Colonización de raíces y nódulos de pino romerón

Las observaciones realizadas, tanto en raíces de plántulas como de individuos adultos de pino romerón, muestran las presencia de hongos micorrizo-arbusculares. En general la colonización es menor en los nódulos blanquecinos jóvenes de las plántulas recién germinadas, pero aumenta en las raíces y nódulos más viejos de los brinzales y de los árboles adultos.

Las hifas de estos hongos presentan cambios irregulares de grosor y ensortijamientos, especialmente en los nódulos. Las vesículas son frecuentes y abundantes, y su forma es entre globosa y ovalada, con algunas de ellas colapsadas. No se observaron arbúsculos. Se observaron esporas en la corteza radical (Figura 2.3.). Lo anterior coincide con lo reportado como el tipo de micorriza característico de las especies de Podocarpaceae, el cual es denominado tipo-Paris con hifas intracelulares que forman rollos o ensortijamientos (Griffiths 1965, Hurst et al. 2002).

Figura 2.3. Aspecto de la colonización de hongos micorrizo-arbusculares en el interior de las raíces de pino romerón.

2.3.2. Desarrollo de las plántulas

Se evaluaron variables que se consideran indicadoras de la calidad de las plántulas de especies arbóreas y que pueden determinar el éxito de su posterior establecimiento en el campo (Rodríguez- Trejo-Duryea 2003). Algunas de estas variables mostraron diferencias significativas entre los

19 tratamientos, en magnitudes evidentes a simple vista como fue la longitud de la porción aérea de las plántulas y la biomasa aérea.(Figura 2.4). El diámetro del cuello que es un buen indicador de la calidad de la plántula en vivero, también mostró diferencias significativas entre los tratamientos. Igualmente se encontraron diferencias significativas entre el P total contenido en la biomasa aérea (Tabla 2.1 y Figura 2.5).

Figura 2.4. Desarrollo de las plántulas bajo diferentes tratamientos de inoculación con hongos micorrizo-arbusculares.

Tabla 2.1. Análisis de varianza para los diferentes tratamientos de inoculación de plántulas de pino romerón con hongos micorrizo-arbusculares. Variable Grados de Cuadrado Grados de Cuadrado F Nivel de libertad medio libertad medio significancia tratamientos tratamientos error error (P) Peso seco biomasa aérea 7 .861027 24 .319896 2.691585 .032989 Peso seco raíces totales 7 .423167 24 .207019 2.044102 .090711 Longitud porción aérea 7 31.415670 24 13.007810 2.415138 .050587 Diámetro cuello de la raíz 7 1.977455 24 .594271 3.327532 .012753 Número de ramas 7 3.995536 24 2.114583 1.889514 .115932 Promedio nódulos por planta 7 19.356650 24 10.811340 1.790402 .135694 Fósforo total biomasa aérea 7 .013850 24 .004880 2.838069 .026389 Las variables con diferencias significativas entre los tratamientos aparecen resaltadas en gris.

No se obtuvieron diferencias significativas entre los tratamientos con respecto al número de nódulos/ cm de raíz, peso seco total de las raíces y número de ramas. Esto puede deberse a que el número de nódulos/ cm de raíz no depende de la infección de organismos simbiontes, pues los nódulos son una característica morfológica estructural como se explicó en el capítulo 1. Además, la 20 evaluación de esta variable presentó dificultades por cuanto estas estructuras se desprenden fácilmente con la manipulación cuando las raíces empiezan a perder humedad. La biomasa de las raíces no presentó diferencias significativas entre los tratamientos tal vez por la morfología de la raíz de esta especie, que no presenta raíces secundarias muy finas ni pelos radicales. De otro lado, el número de ramas parece ser una característica de la arquitectura de la especie que no cambia significativamente con la longitud de la plántula.

La prueba múltiple de medias de las variables que fueron significativas (Tabla 2.2.) muestra que los mejores tratamientos fueron en general, la inoculación con hongo MA de espora ámbar, la inoculación con hongo MA de espora amarilla y la inoculación con Entrophospora colombiana (Figura 2.5).

Para el peso seco de la biomasa aérea el incremento del mejor tratamiento (espora ámbar) con respecto al peor (testigo) fue del 87 %; para la longitud de la porción aérea fue del 36 % (espora amarilla) y para el diámetro del cuello fue de 56 %(espora ámbar). Estos incrementos representa una ventaja al disminuir el tiempo de permanencia en vivero y mejorar el vigor de la plántula al momento de su establecimiento en el campo

Tabla2.2. Resultados de la prueba de Tukey para las variables que tuvieron diferencias significativas Peso seco biomasa aérea (g/planta) Longitud porción aérea (cm/planta) Tratamiento Promedio Tratamiento Promedio Testigo {1} 1.550 a Testigo {1} 24.525 a Mezcla endo {8} 1.975 ab Mezcla endo {8} 29.475 ab Glomus fasciculatum {6} 2.550 ab Espora negra {2} 30.325 ab Glomus intraradices {5} 2.625 ab Glomus fasciculatum {6} 31.500 ab Espora negra {2} 2.675 ab Glomus intraradices {5} 32.000 ab Espora amarilla {4} 2.725 ab Entrophospora colombiana {7} 32.175 ab Entrophospora colombiana {7} 2.775 ab Espora ámbar {3} 32.475 ab Espora ámbar {3} 2.900 b Espora amarilla {4} 33.450 b Fósforo total en la biomasa aérea (g/planta) Diámetro del cuello (cm) Tratamiento Promedio Tratamiento Promedio Testigo {1} 0.124501 a Testigo {1} 3.650 a Glomus fasciculatum {6} 0.216252 ab Espora negra {2} 4.375 ab Mezcla endo {8} 0.218392 ab Mezcla endo {8} 5.100 ab Espora negra {2} 0.222993 ab Glomus intraradices {5} 5.325 ab Glomus intraradices {5} 0.236112 ab Glomus fasciculatum {6} 5.350 ab Entrophospora colombiana {7} 0.286090 ab Entrophospora colombiana {7} 5.575 b Espora ámbar {3} 0.292169 b Espora amarilla {4} 5.600 b Espora amarilla {4} 0.308869 b Espora ámbar {3} 5.600 b En una columna las medias con distinta letra son diferentes a un nivel de significancia de 0.05 según la prueba de rangos múltiples de Tukey

21 En cuanto al contenido total de fósforo en la biomasa aérea, la inoculación con hongo MA de espora ámbar y la inoculación con hongo MA de espora amarilla resultó en un incremento del 148 %, probablemente por efecto de la mayor absorción de fósforo que pueden realizar los hongos MA asociados a la raíz de las plántulas, comparados con la absorción de la raíz sin asociación. Esto mejora la probabilidad de éxito del establecimiento de las plántulas en condiciones de campo, especialmente en los suelos derivados de cenizas volcánicas (Andisoles), que predominan en las zonas altoandinas donde se planta el pino romerón. Estos suelos se caracterizan porque la concentración de fósforo en la solución del suelo es muy baja debido a que este elemento resulta fuertemente adsorbido por la arcilla alófana y por los óxidos de hierro y aluminio, o se precipita para formar fosfatos de hierro y aluminio de baja solubilidad (Fassbender 1987).

El inóculo con una mezcla de hongos MA no resultó ser tan efectivo como los inóculos de hongos individuales, debido probablemente a un efecto de competencia entre los simbiontes, lo que podría causar que algunos de ellos se comporten como parásitos, lo cual redundaría en menor desarrollo de las plántulas. Esto descartaría aparentemente la posibilidad de utilizar inóculos comerciales que traen una mezcla de varias especies de esporas de hongos MA.

3,8 40

3,4 36

3,0

32 2,6

2,2 28

1,8

±Std. Dev. 24 1,4 ±Std. Err. Mean

1,0 20 Testigo Esp. ámbar G. intrarradices E. colombiana Testigo Esp. ámbar G. intrarradices E. colombiana Esp. negra Esp. amarilla G fasciculatum mezclaen Esp. negra Esp. amarilla G. fasciculatum mezclaen TRATAMIENTOS TRATAMIENTOS a.. Peso seco de biomasa aérea (g/planta) b. Longitud de la porción aérea (cm/planta)

7 0,5

6 0,4

5 0,3

4 0,2

3 0,1

2 0,0 Testigo esp. ámbar G. intrarradices E. colombiana Testigo Esp. ámbar G. intrarradices E. colombiana esp. negra Esp. amarilla G. fasciculatum mezclaen Esp. negra Esp. amarilla G. fasciculatum mezclaen TRATAMIENTOS TRATAMIENTOS c. Diámetro del cuello (cm) d. Fósforo total en la biomasa aérea (g/planta) Figura2.5. Resultados del análisis estadístico del ensayo de inoculación de plántulas de pino romerón

22

3. Evaluación de Ectomicorrizas en pino romerón

3.1. Reportes de Ectomicorrizas en Podocarpaceae

Hasta el momento no se han encontrado reportes de ectomicorrizas en especies de la familia Podocarpaceae, a pesar de que se han establecido estudios concretos para evaluar este tipo de asociación. Como se mencionó en el numeral 2.1. en la actualidad se conoce que todas las gimnospermas forman asociaciones con micorrizas, pero solo en la familia Pinaceae esta asociación es ectomicorrícica (Brundett 2002). Estas asociaciones se establecieron muy tempranamente cuando comenzó la evolución y diversificación de éstos taxones y son, por lo tanto, de tipo filogenético entre ciertos grupos de plantas y ciertos grupos de hongos

En Nueva Gales del Sur (Australia), se evaluaron las micorrizas de 57 especies de Ginkgoales, Taxales y Coniferales, incluyendo varias especies de la familia Podocarpaceae. Solo se encontraron micorrizas ectotróficas en las de la familia Pinaceae; todas las demás poseían endomicorrizas (Khan & Valder 1972). De otro lado, en bosques secos montanos de Etiopía se evaluó el estado micorrizal de árboles nativos, entre ellos Podocarpus falcatus y se encontró ausencia completa de colonización por ectomicorrizas (Wubet et al. 2002).

3.2. Métodos

3.2.1. Colección e identificación de macromicetes en bosques de pino romerón

Se realizaron salidas de campo para la recolección de macromicetes durante un año, entre marzo de 2003 y febrero de 2004, con visitas mensuales al área de estudio. Las recolección de los ejemplares se realizó mediante un muestreo oportunístico, el cual consistió en realizar en cada visita, un recorrido completo por el bosque y colectar los cuerpos fructíferos que se encontraban.

Se buscaron cuerpos fructíferos principalmente en la zona de influencia de las raíces de los individuos de pino romerón. Los hongos podían estar visibles o escondidos en la hojarasca, bajo un arbusto o un tronco en descomposición. Era necesario buscar cuidadosamente para encontrar los hongos de tamaño pequeño o con colores crípticos. Puesto que la base del estípite es importante para la identificación del

23 hongo, se tenía cuidado de recolectarla completamente y no dañarla. Para la colección se extrajo todo el hongo, incluyendo la base del estípite, con un cuchillo de campo pequeño. Cuando era posible se recogieron varios especímenes jóvenes y maduros.

Se hicieron descripciones de campo sobre el hábitat donde crecían y se anotaron otras características morfológicas de los ejemplares frescos como color, producción de látex, olores fuertes característicos y que se pierden cuando el espécimen se seca. Los ejemplares se empacaron individualmente, en forma de “confite”, en papel parafinado para evitar desecación. El papel se marcó con el número de colección correspondiente. Los ejemplares se ponían cuidadosamente en una canasta que se cubría con una tela suave (Figura 3.2.a.). Las colecciones se llevaron el mismo día de la recolección al Laboratorio de Taxonomía de Macromicetos del Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia, evitando exponerlos al calor o la luz solar directa. Después de colectados los hongos, se tomaron fotografías en campo (cámara digital Canon Power Shot S50), si las condiciones climáticas lo permitían; de lo contrario se tomaban las fotografías en el laboratorio.

24

Hydnopolyporus palmatus Auricularia delicada Entoloma sp1.

Antrodia sp1. Pseudohydnum gelatinosum Hygrocibe mineatus

Protubera jamaicensis Hypholoma sublateritium Phallus rubicundus

Pseudohiatula sp1. Sarcosoma sp.1 Thelephora cervicornis Figura 3.1. Macromicetes asociados a bosques de pino romerón 25

Xerula steffenii Isaria sp 1 Isaria sp2

Mycena sp1 Phillipsia sp1. Xeromphalina tenuipes

Lentinus swartzii Geastrum fimbriatum Polyporus arcularius

Agaricus sp1 Camarophyllus sp1 Collybia sp1 Figura 3.1. Continuación. Macromicetes asociados a bosques de pino romerón

26

Leucoagaricus rubrotinctus Marasmius sp1 Polyporus sp1

Polyporus tricholoma Trametes sp1 Calvatia sp1

Gymnopus sp1 Gymnopus macropus Hygrocybe sp1

Hygrocybe sp2 Lepiota sp1 Hypholoma subviridae Figura 3.1. Continuación. Macromicetes asociados a bosques de pino romerón

27

Marasmius sp2 Morganella fuliginea Mycena sp2

Ramaria sp1 Gerronema sp1 Hygrocybe conica

Marasmius sp1 Polyporus sp2 Xylaria sp1

Tremella sp1 Polyporus sp3 Lepiota sp2 Figura 3.1. Continuación. Macromicetes asociados a bosques de pino romerón

28

Figura 3.2. a. Recoleccion de hongos en el campo, b. Secado de hongos en el laboratorio

Una vez en el laboratorio se desempacó cuidadosamente cada ejemplar y se hizo la descripción macroscópica, mediante el registro principalmente de las características que se pierden en el proceso de secado (Tabla 3.1). Antes de realizar el proceso de secado se extrajo la esporada de los ejemplares colectados. Para esto se tomó un píleo completo y se cortó el estípite justo en su inserción, con el fin de que quedara completamente plano, y se puso un trozo de papel blanco, después envolverlo en papel parafinado para evitar su rápida deshidratación. Se dejó en un lugar fresco durante 24 horas (Singer 1986). Mediante el procedimiento descrito anteriormente, se colectaron las esporas que se descargaban y se observaron en masa, ya que la coloración del conjunto es un carácter taxonómico muy importante para la identificación de algunos grupos.

Para las descripciones microscópicas se realizaron cortes tangenciales del receptáculo o de las masas glebales con el fin de observar las estructura microscópicas del himenio, las esporas y las hifas que lo conforman. Estos cortes se hidrataron en agua, después se montaron en KOH y se tiñeron con rojo congo. Además se montaron en reactivo de Melzer para observar si eran amiloides, inamiloides o dextrinoides. Todas las medidas y descripciones están basadas en observaciones realizadas con un aumento de 100x.

Posteriormente se secaron los cuerpos fructíferos colectados, haciéndoles previamente un corte longitudinal y se dejaron en el deshidratador por 24 horas aproximadamente con una etiqueta preliminar para su identificación (Figura 3.2.b). Después de este tiempo se hicieron las etiquetas definitivas con la predeterminación y la información básica correspondiente. Cada ejemplar se guardó 29 en una bolsa plástica pequeña y se introdujo en cajas de cartón. Su localización final es la colección del Herbario de la Universidad de Antioquia (H.U.A.).

Tabla 3.1. Principales características macroscópicas descritas en los ejemplares de macromicetos frescos. Característica Descripción PILEO Tamaño, color, cambios de color, superficie, margen Contexto Tamaño, cambios de color HIMENOFORO Lamelas Unión al estípite, color, espaciamiento, margen, lamélulas. ESTIPITE Longitud, diámetro, posición con respecto al píleo, cambios de coloración, color del interior, color del exterior, forma, superficie, estructura, contexto o interior del estípite, forma de unión al sustrato. ANILLO Posición, adherencia, textura, color, persistencia. VOLVA Forma, textura HABITO DE CRECIMIENTO Solitario, gregario SUSTRATO Madera, hojarasca, suelo REACCIONES KOH, Olor, sabor COLOR DE LA ESPORADA Blanca, café, etc.

3.2.2. Montaje del ensayo de inoculación de plántulas

Con los ejemplares que se recolectaron durante los primeros meses de visitas de campo se establecieron cultivos para producir algunos inóculos que permitieran establecer el ensayo de inoculación con plántulas.

El medio básico que se utilizó fue el agar-extracto de malta como promotor de crecimiento, con adición de vitaminas y antibióticos. Algunos hongos producen sus propias vitaminas pero otros tienen deficiencias parciales o totales, cuando crecen en medios artificiales. Por esto se adicionó tiamina (B1) y biotina (B7). Además, para prevenir contaminación se adicionó Estreptomicina que tiene efecto sobre un amplio espectro de bacterias y no afecta el crecimiento del hongo (Brundrett et al. 1996). Los medios se esterilizaron en autoclave y posteriormente se sirvieron dentro de una cámara de flujo laminar horizontal, en platos petri o en tubos de ensayo estériles. Después de que los medios se enfriaban se procedió a sembrar los ejemplares seleccionados. Estos se inocularon con un pequeño trozo de píleo tomado directamente del interior del material fresco para garantizar su completa esterilidad y se sellaron y marcaron adecuadamente. Dichos cultivos se evaluaron y resembraron periódicamente para purificar el aislado (Brundrett et al. 1996).

La selección de inóculos de supuestas ectomicorrizas no pudo ser muy amplia puesto que al momento de la instalación del ensayo apenas se estaba empezando la colección de macromicetos y la

30 identificación era todavía muy precaria. Además, algunos de los cultivos que se hicieron no crecieron suficientemente o se contaminaron. El inóculo se preparó mediante la combinación del micelio que crecía sobre el agar. Se extrajo cuidadosamente el micelio y se diluyó en solución salina al 85 % (NaCl) con agua destilada; luego se. homogenizó en vórtex duranto algunos minutos. Esta solución se vertió sobre el sustrato antes de sembrar la plántula. Para los demás pasos en el establecimiento del ensayo se siguieron los protocolos ya explicados en las secciones 2.2.3 a 2.2.5.

El ensayo se condujo de acuerdo con un diseño completamente al azar. Se establecieron 4 tratamientos y cada tratamiento tuvo cinco repeticiones. Cada repetición correspondió a una plántula. Los tratamientos establecidos fueron: T1. Testigo (plántulas sin inóculo); T2: Plántulas inoculadas con Protubera jamaicensis,; T3: Plántulas inoculadas con Hygrocybe sp1 y T4: Plántulas inoculadas con Psilocybe caerulescens

3.3. Resultados y discusión

3.3.1. Colección de macromicetes asociados a bosques de pino romerón

Durante las visitas de campo se colectaron un total de 95 morfoespecies de macromicetes de las cuales 41 aún se encuentran indeterminadas. Las 54 especies o géneros determinados se encuentran distribuidos en 39 géneros y 22 familias;las familias más diversas son Tricholomataceae con 9 especies e Hygrophoraceae con 7 especies, ambas del orden Agaricales. El listado de los taxones colectados y que se determinaron hasta el género o especie se presentan en la Tabla 2.2.

La identificación de las especies de hongos presenta grandes dificultades pues aún no se ha definido exactamente qué es un individuo y frecuentemente presentan ciclos de vida complejos con diversidad de formas (Peterson y Hughes, 1999). La taxonomía de los macromicetes (Ascomycetes y Basidiomycetes) se ha basado casi exclusivamente en caracteres macro y micro morfológicos de los cuerpos fructíferos; lo cual corresponde solamente a una parte del ciclo reproductivo de estos hongos aunque se apoya en la actualidad en algunos estudios de tipo molecular. Por todo lo anterior, para la identificación de los hongos se requiere de personal especializado. Pero a pesar de esto las colecciones por si mismas son valiosas pues permiten tener material y adecuada información de campo que facilite su posterior identificación por un especialista en el grupo al que corresponden.

31 Los hongos encontrados en este estudio son principalmente saprofíticos y aunque el proyecto está enfocado a la búsqueda hongos micorrícicos, se considera de gran importancia la colección de macromicetos asociados a esta estos ecosistemas. La diversidad de hongos es un componente muy importante de la biodiversidad de nuestros bosque pues este grupo comprende cerca del 4% de todas las especies de seres vivos del planeta conocidas y el 8% de las especies estimadas (Hammond 1992). Los hongos intervienen en el proceso de descomposición de la hojarasca y de la madera, garantizando un adecuado reciclaje de nutrientes en el bosque; así mismo influyen en la formación y estructuración del suelo (Rayner 1995). Igual mente su estudio es importante porque de ellos se pueden obtener metabolitos secundarios (Hawksworth et al, 1997).

Particularmente el reporte del Gasteromycete Protubera jamaicensis en el presente estudio, se considera de especial interés para la biogeografía de este grupo de macromicetes. Los ejemplares colectados fueron identificados por Michel A. Castellano (Forest Mycology Team, USDA Forest Service, PNW Research Station), quien es el especialista en el grupo. Este es sin duda un hallazgo notable pues es una especie bastante rara y es el primer reporte del género y de la especie para Colombia. El género Protubera tiene muchas especies en Australia y Nueva Zelandia, donde también existe mayor diversidad de Podocarpaceae. Otros Gasteromycetes que se encontraron en el área de estudio fueron Morganella fuliginea y Phallus rubicundus.

La ocurrencia de cada una de las especies en los meses muestreados se presenta en la Tabla 2.3. aunque esta tabla fue elaborada únicamente con los individuos identificados hasta género o especie. Los meses con mayor diversidad representada por el número de colecciones fueron octubre de 2003, noviembre de 2003 y febrero de 2004, encontrándose 27, 25 y 24 especies respectivamente. Una observación importante es la notable disminución de las especies colectadas en el mes de agosto, pues se obtuvieron únicamente ocho colecciones.

Las fotos de algunas de algunos de los especímenes colectados durante las visitas al área de estudio aparecen en la Figura 3.2.

3.3.2. Desarrollo de las plántulas

A pesar de que se evaluaron muchas variables en el desarrollo de las plántulas, en ninguna de ellas se obtuvieron diferencias significativas con el tratamiento testigo. Esto pudo deberse a que

32 definitivamente el pino romerón no establece relaciones ectomicorrícicas como parece indicar la filogenia de la especie, pues como se mencionó anteriormente las Podocarpaceae establecieron relaciones con hongos micorrizo-arbusculares desde el inicio de su evolución en el Jurásico y no con hongos ectomicórricicos que desarrollaron las Pinaceae.

Otra posible explicación a que no se halla producido respuesta a la inoculación es que no se hayan aislado los hongos específicos que establecen relación simbiótica con el pino romerón, pues se conoce que la ectomicorrícica es una relación más específica que la micorriza-arbuscular (Halling 2001). Sin embargo, en este estudio se hizo un barrido muy amplio de los macromicetes que crecen asociados al pino romerón y se encontraron principalmente grupos saprofíticos , lo cual hace presumir que esta especie, que es la dominante en el bosque, no tiene este tipo de relación. La flora fúngica de estos bosques contrasta con la de los bosques de roble de tierra fría (Quercus humboldtii) donde predominan las especies de hongos ectomicorrícicos asociados a esta especie arbórea la cual es dominante en aquel ecosistema, como son las familias Amanitaceae y Boletaceae, entre otros (Franco et al. 2000)..

33

Tabla 3.2. Listado de géneros y especies colectados en el área de estudio

Orden Familia Genero o especie Modo de vida Basidiomicetes Agaricales Strophariaceae Psilocybe caerulescens Murill. Saprofíticos Hypholoma subviridae (Berk. & Curt.) Dennis Coprinaceae Psathyrella sp. Saprofíticos Hygrophoraceae Hygrocybe conica K(Scop. ex Fr) Kummer. Principalmente saprofíticos. Algunas Hygrocybe sp1 especies de Hygrocybe están reportadas Hygrocybe sp2 como micorrícicos Hygrocybe sp3 Hygrocybe sp4 Hydropus sp. Camarophyllus sp. Agaricaceae Agaricus sp1 Saprofíticos Agaricus sp2 Leucoagaricus rubrotinctus (Peck) Sing Tricholomataceae Gymnopus sp Saprofíticos Collybia sp Oudemansiella canarii (Jun.) Höhnel Collybia biformis (Peck) Singer Xerula steffenii (Rick) Sing Pseudohiatula sp. Mycena sp. Hohenbuhelia nigra (Schwein.) Singer Xeromphalina tenuipes (Schwein) Lepiotaceae Lepiota sp1 Saprofíticos. Lepiota sp2. Entolomataceae Entoloma sp. Algunas especies de Entoloma están reportadas como micorrícicos Cortinariaceae Galerina nana (Petri) Kühner Saprofíticos Galerina sp. Crepidotaceae Crepidotus sp. Saprofíticos Symocybe sp.

34

Tabla 3.2. Continuación. Listado de géneros y especies colectados en el área de estudio.

Orden Familia Genero o especie Modo de vida Phragmobasidiomicetes Tremellales Exidiaceae Pseudohydnum gelatinosum (scop.: Fr) Karst. Saprofíticos Thelephoraceae Thelephora cervicornis Corner Saprofíticos Auriculariaceae Auricularia delicata (Fr.) Henn Saprofíticos Gasteromicetes Geastrales Geastraceae Geastrum sp. Saprofíticos Lycoperdales Lycoperdaceae Morganella fuliginea (B. & C.) Kreisel & Dring Saprofíticos Calvatia sp Phallales Protopallaceae Protubera jamaicensis (Murrill) Zeller Sapróticos sobre hojarasca Phallaceae Phallus rubicundus (Bosc. Fr) Saprofíticos Aphyllophorales Poriales Lentinaceae Lentinus sp Saprofíticos Trametes sp Saprofíticos Coriolaceae Hynopolyporus palmatus (Hook) O. Fidalgo Saprofíticos Polyporaceae Polyporus tricholoma Mont. Parasiticos y saprofíticos sobre madera Polyporus arcularius Batsch:Fr. Polyporus sp1. Polyporus sp2. Bjerkandera sp. Antrodia sp. Sarcoscyphaceae Phillipsia sp. Saprofíticos Ascomicetes Pezizales Sarcosomataceae Sarcosoma sp. Saprofíticos sobre madera y hojarasca. Xylariales Xylariaceae Xylaria polimorfa (Pers. Ex Mérat.) Dumortier Saprofíticos y parásitos, principalmente Xylaria arbuscula Sacc sobre madera Xylaria telfairii (Berk) Fries. Xylaria sp Isaria sp.

35 Tabla 3.3. Ocurrencia de géneros y especies identificados a lo largo del año de muestreo en el área de estudio.

Género o especie Mr Ab My Jn Jl Ag Sp Oc Nv Dc En Fb Agaricus sp1 Agaricus sp2 Antrodia sp1. Auricularia delicata (Fr.) Henn Bjerkandera sp. Calvatia sp1. Camarophyllus sp1. Collybia biformis (Peck) Singer Collybia sp1 Crepidotus sp. Entoloma sp1.. Galerina nana (Petri) Kühner Galerina sp. Geastrum fimbriatum (Fries) Gerronema sp1 Gymnopus sp1 Gymnopus macropcarpus Hydropolyporus palmatus (Hook) O. Fidalgo Hohenbuhelia nigra (Schwein.) Singer Hydropus sp. Hygrocybe conica K(Scop. ex Fr) Kummer. Hygrocybe sp1 Hygrocybe sp2 Hygrocybe sp3 Hygrocybe sp4 Hygrocybe mineatus Hypholoma subviridae (Berk.&Curt.) Dennis Hypholoma sublateritium Isaria sp 1 Isaria sp2 Lentinus swartzii. Lepiota lepiota Lepiota sp1. Lepiota sp2. Leucoagaricus rubrotinctus (Peck) Sing Marasmius sp1 Marasmius sp2 Mycena sp1. Mycena sp2. Morganella fuliginea (B.&C.)Kreisel & Dring Oudemansiella canarii (Jun.) Höhnel Phallus rubicundus (Bosc. Fr) Phillipsia sp1. Polyporus sp1. Polyporus sp2 Plyporus sp3 Polyporus arcularius Batsch:Fr. Polyporus tricholoma Protubera jamaicensis (Murrill) Zeller Psathyrella sp. Pseudohiatula sp1. Pseudohydnum gelatinosum (scop. Fr) arst Psilocybe caerulescens Murrill. Ramaria sp1 Sarcosoma sp1. Symocybe sp. Thelephora cervicornis Corner Trametes sp1. Xeromphalina tenuipes (Schwein) Xerula steffenii (Rick) Sing Xylaria arbuscula Sacc Xylaria polimorfa (Pers.Ex Mérat.) Dumortier Xylaria telfairii (Berk) Fries. Xylaria sp

36 4. Evaluación de organismos fijadores de nitrógeno asociados al pino romerón

4.1. Reportes de organismos fijadores de N asociados a Podocarpaceae

Algunos autores consideran a las especies de Podocarpaceae con potencial para ser utilizadas en restauración de ecosistemas, basándose únicamente en la presencia de nódulos que aparentan contener organismos fijadores de N2, pero no presentan pruebas concluyentes al respecto (Redell & Milnes 1992, Rondón 1987).

Por el contrario, los ensayos que se han realizado sobre la fijación de N2 en los nódulos de las Podocarpaceae, han concluido que no se presenta este proceso. Las pruebas de reducción de acetileno en nódulos de seis especies de Podocarpus en China no mostraron actividad (Laboratory of Nitrogen Fixation SIPP 1977). Los ensayos de reducción de acetileno en varias especies de Podocarpus y Dacrydium de Nueva Zelanda, concluyeron que solo se produce reducción cuando las raíces se encuentran rodeadas de suelo, por efecto de las bacterias libres, pero no se presenta fijación en los nódulos de las raíces cuya superficie ha sido desinfectada. Por esto, se descartó la presencia de organismos endofíticos fijadores de nitrógeno (Silvester & Bennett 1972). Específicamente en Podocarpus rospigliosii, las pruebas realizadas con 15 espectrometría de masa para N , mostraron que no se presenta fijación de N2 (Furman 1970).

Dada la alta nodulación de Retrophyllum rospigliosii, se quería evaluar la existencia de microorganismos asociados que estimularan la formación de dichos nódulos. Por las características del sistema radical del pino romerón en el campo, con abundancia de raíces superficiales y la forma y coloración de los nódulos, se planteó la hipótesis de que se asociaba con la bacteria filamentosa Frankia sp.

Frankia sp. es un procariote gram-positivo con hifas o filamentos septados. Posee la morfología de un organismo complejo, con crecimiento pleomórfico y, como la mayoría de los actinomicetos, las hifas se diferencian en esporangios. Los esporangios contienen en su interior gran cantidad de esporas en estado latente que germinan para formar hifas cuando encuentran condiciones ambientales adecuadas. Todavía no se sabe con precisión cuáles son los factores que influyen en la formación de esporangios ni en la germinación de las esporas (Blom 1982). Para aislar Frankia de los nódulos, se colocan en medio líquido o en medio sólido. En ocasiones, después de un mes de incubación, se logra obtener una colonia de unos milímetros; a veces el período de incubación puede ser de 6 meses. Muy pocas cepas de Frankia son

37 cultivables; aquellas que pueden cultivarse son las más saprofíticas o con requerimientos nutricionales menos estrictos. La mayoría de las cepas de Frankia no son cultivables y su crecimiento es extremadamente lento; su tiempo de generación varía considerablemente en función de las condiciones de cultivo. Se ha logrado una apreciable disminución en el tiempo de crecimiento cuando se cultivan en agitación magnética a 200 rpm. Otro problema que se presenta para el aislamiento de este microorganismo es que generalmente se recomiendan medios de cultivo líquidos, los cuales no excluyen la posibilidad de obtener un co-cultivo y puede ser complicado manejarlos como cultivos puros. Las fuentes de carbono utilizadas por Frankia para su crecimiento y desarrollo generalmente son diversas (Burggraaf 1984).

Las plantas hospederas del Frankia son arbustos o árboles que habitan en muy diversos ecosistemas y se adaptan a condiciones ambientales extremas como suelos salinos, terrenos pantanosos y ambientes degradados. Todas estas plantas tienen en común que son de rápido crecimiento, muestran una gran capacidad de crecer en suelos de baja fertilidad y son frecuentemente las pioneras en el desarrollo de la sucesión de la comunidad vegetal .

El objetivo del plan de trabajo fue aislar el microorganismo asociado (posible Frankia) a las raíces del Retrophyllum rospigliosii, para producir plántulas en invernadero previamente inoculadas con el microorganismo aislado.

4.2. Métodos

4.2.1. Recolección de nódulos en el campo

Se seleccionaron 10 árboles de pino romerón que presentaban un buen desarrollo y crecimiento (diámetro mayor de 30 cm). Algunos de ellos correspondían a los mismos individuos del programa de árboles semilleros de CORANTIOQUIA por lo cual ya poseen una marca visible con un código pintado sobre el fuste. A los otros individuos se les asignó un código y se marcaron con pequeñas placas de aluminio.

Se excavó el sistema radical de los árboles, siguiendo las raíces principales hasta las raíces más finas. Se seleccionaron algunas de ellas teniendo cuidado de excluir raíces de otras especies que estuvieran mezcladas. Se desprendieron cuidadosamente los nódulos y se lavaron con alcohol al 70% y con hipoclorito de sodio al 1% utilizando un frasco a presión. Los nódulos se almacenaron en tubos de ensayo de tapa rosca a los cuales se les ha puesto una capa de sílica gel

38 granulada en el fondo y sobre ésta una mota de algodón. Los tubos se pusieron en bolsas plásticas de cierre hermético, marcadas con códigos de identificación. Los nódulos se mantuvieron a baja temperatura en una nevera de icopor con bolsas de hielo azul, hasta su procesamiento en el Laboratorio de Microbiología del Suelo de la Escuela de Geociencias de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín.

Se recogieron muestras de suelo cercano a las raíces de algunos individuos de pino romerón e igualmente se llevaron al laboratorio para análisis microbiológicos.

4.2.2. Procesamiento de las muestras en el laboratorio

Se utilizaron protocolos adaptados de Burggraaf, 1984, y otros desarrollados por el Laboratorio de Microbiología del Suelo.

Los nódulos se hidrataron durante una hora en cajas de petri con agua destilada. Las cajas estaban marcadas con el código del árbol del que se extrajeron los nódulos. Se lavaron con Etanol al 70% durante 2 minutos. Para esto se puso cada grupo de nódulos en una caja petri y se agregaron 2 ml de alcohol hasta cubrirlos. Se hicieron cuatro lavadas con agua destilada, poniendo los nódulos en un cedazo No. 35 (500 μm). Se lavaron los nódulos con Cloramina-T al 0.1% durante 2 min. Para esto se puso cada grupo de nódulos en una caja petri y se agregaron 2 ml de Cloramina -T hasta cubrirlos. Se hicieron cuatro lavadas con agua destilada, con ayuda del cedazo.

De cada grupo de nódulos (correspondiente a un árbol con código) se prepararon 2 tubos de macerado. Para esto se esterilizaron tubos de ensayo tapa rosca de 12 cm con 2 ml de agua destilada y se marcaron con el código correspondiente. En cada tubo se agregaron unos cuantos nódulos y se maceraron contra las paredes con una barra de vidrio esterilizada. Los nódulos se observaron al microscopio (Olympus BMX-40) para seleccionar los dos aislados a evaluar. Se diferenciaron entre organismos con esporulación positiva (aislado 1) y esporulación negativa (aislado 2).

Los aislados se sembraron en diferentes medios y bajo diferentes condiciones de temperatura y pH, con cinco repeticiones bajo el esquema que aparece en la Tabla 4.1. Los tres medios sólidos que se utilizaron son los que más comúnmente se emplean para Frankia sp. asociado a raíces del género Alnus. Su composición se muestra en el Anexo 2. El diseño experimental es un factorial

39 3 x 3 x 3 con 5 repeticiones. Esto es, el número de tratamientos resulta de la combinación de los tres medios de cultivo ya mencionados, tres temperaturas (15, 25 y 32 °C) y tres niveles de pH del medio de cultivo (4.5, 6.5 y 7.5). Así, el número de unidades experimentales por aislado es 135 y el número total de unidades experimentales es 270.

Tabla 4.1. Esquema de medios de siembra, temperatura y pH para el cultivo de los aislados de los nódulos de pino romerón.

Medio Temperatura °C pH Caseína 15 4.5, 6.5 y 7.5 25 4.5, 6.5 y 7.5 32 4.5, 6.5 y 7.5 Acido propiónico 15 4.5, 6.5 y 7.5 25 4.5, 6.5 y 7.5 32 4.5, 6.5 y 7.5 Triptona 15 4.5, 6.5 y 7.5 25 4.5, 6.5 y 7.5 32 4.5, 6.5 y 7.5

4.2.3. Montaje de ensayo de inoculación con plántulas

Se estableció un ensayo de inoculación de plántulas, utilizando como inóculo nódulos frescos macerados en agua destilada. Para los demás pasos en el establecimiento del ensayo se siguieron los protocolos ya explicados en las secciones 2.2.3 a 2.2.5.

El ensayo se condujo de acuerdo con un diseño completamente al azar. Se establecieron 3 tratamientos y cada tratamiento tuvo cinco repeticiones. Cada repetición correspondió a una plántula. Los tratamientos establecidos fueron: T1: Testigo (plántulas sin inóculo); T2: Aplicación de nódulos frescos macerados en agua destilada sin aplicar N a la solución nutritiva de las plántulas y T3: Aplicación de nódulos frescos macerados en agua destilada con aplicación de N a la solución nutritiva de las plántulas.

4.3. Resultados y discusión

4.3.1. Crecimiento de colonias

Se obtuvo el crecimiento de dos tipos de microorganismos: Una bacteria gram-positiva esporulada y un actinomiceto, posiblemente del género Streptomices. El tiempo de crecimiento de estas dos colonias fue de cuatro días, por lo cual se descartó categóricamente que se tratará del actinomiceto Frankia sp.. Los cultivos se mantuvieron durante 6 meses, pero no se observaron nuevas colonias. Las poblaciones de Streptomices sp. crecieron rápidamente en los

40 medios de cultivo, especialmente en el de caseína. Sin embargo, no se han detectado colonias en el interior de los nódulos por lo cual puede tratarse de un contaminante del suelo remanente en la superficie de los nódulos.

Además se realizó un análisis microbiológico a las muestras de suelo. Los resultados muestran la presencia de tres colonias de bacterias fijadoras de N, cuatro de bacterias mesófilas y dos de actinomicetos.

4.3.2. Desarrollo de plántulas

El análisis de varianza mostró que se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos para el peso seco de la biomasa aérea, longitud de porción aérea y diámetro del cuello de la raíz. Las demás variables presentaron diferencias no significativas (Tabla 4.2.). En todos los casos el tratamiento de aplicación de nódulos con nitrógeno fue significativamente superior al tratamiento de aplicación de nódulos sin nitrógeno. El tratamiento testigo se ubicó entre los dos anteriores y no presentó diferencias significativas con ninguno de ellos (Tabla 4.3, Figura 4.1).

De los resultados anteriores resulta evidente que no ocurre fijación biológica de nitrógeno, pues el tratamiento de inoculación sin fertilización nitrogenada fue el de menor crecimiento. Por tanto se presume que el nitrógeno está limitando el crecimiento de la biomasa aérea en este tratamiento. No hubo diferencias significativas entre el testigo y el tratamiento de inoculación con aplicación de nitrógeno, los cuales recibieron aplicación de nitrógeno. Este resultado sustenta la conclusión anterior de que el mayor crecimiento en el tratamiento de inoculación se debe principalmente a la aplicación de nitrógeno y no a la acción de los nódulos. Por tanto no se pudo demostrar que los nódulos de romerón mejoren la economía nutricional y el crecimiento de la planta.

Tabla 4.2. Resultados del análisis de varianza para los diferentes tratamientos de inoculación de plántulas de pino romerón con nódulos macerados. Variable Grados de Cuadrado Grados de Cuadrado F Nivel de libertad medio libertad medio significancia tratamientos tratamientos error error (P) Peso seco biomasa aérea 2 0,42500 9 0,041944 5,781457 0,024278 Longitud porción aérea 2 31,64583 9 2,376111 13,31833 0,002044 Diámetro cuello de la raíz 2 2,25333 9 0,412222 5,466307 0,027929 Número de ramas 2 1,08333 9 0,750000 1,444444 0,285730 Peso seco raíces totales 2 0,09043 9 0,083324 1,308669 0,317038 Promedio nódulos por planta 2 17,81482 9 7,237654 2,461407 0,140385 Fósforo total biomasa aérea 2 0,05028 9 0,072425 0,694178 0,524361

41 Tabla 4.3. Resultados de la prueba de Tukey para las variables que tuvieron diferencias significativas. Nodu-sin: Nódulos sin aplicación de nitrógeno; Nodu-con: Nódulos con aplicación de nitrógeno

Peso seco biomasa aérea Longitud porción aérea Diámetro del cuello (cm) (g/planta) (cm/planta) Tratamiento Promedio Tratamiento Promedio Tratamiento Promedio Nodu-sin {3} 1,200 a Nodu-sin {3} 21,650 a Nodu-sin {3}} 2,950 a Testigo {1} 1,550 ab Testigo {1} 24,525 ab Testigo {1} 3,650 ab Nodu-con {2} 1,675 b Nodu-con {2} 27,275 b Nodu-con {2} 4,450 b En una columna las medias con distinta letra son diferentes a un nivel de significancia de 0.05 según la prueba de rangos múltiples de Tukey

4.3.3. Comparación entre los mejores tratamientos de aplicación de esporas y de nódulos

Puesto que tanto los ensayos de aplicación de esporas de hongos como los de aplicación de nódulos se establecieron simultáneamente y recibieron idéntico tratamiento experimental, es válida la comparación entre ambos experimentos. En este caso se seleccionaron los mejores tratamientos de cada uno para realizar la comparación entre las variables asociadas con el crecimiento y desarrollo de las plántulas de cada grupo que más han respondido a los tratamientos. Las variables evaluadas fueron el peso seco de la biomasa aérea, longitud de la porción aérea, diámetro del cuello y fósforo total en la biomasa aérea. Los tratamientos escogidos para el análisis fueron testigo, aplicación de nódulos con N, inoculación con hongo MA de espora ámbar, inoculación con hongo MA de espora amarilla e inoculación con E. colombiana.

2,0 29

28 1,8 ±Std. Dev. 27 ±Std. Err. 26 Mean 1,6 25

24 1,4 23

1,2 22

21

1,0 20 Testigo Nod. con N Nod. sin N Testigo NoduCON NoduSIN TRATAMIENTOS TRATAMIENTOS a.. Peso seco de biomasa aérea (g/planta) b. Longitud de la porción aérea (cm/planta)

5,2

4,8

4,4

4,0

3,6

3,2

2,8

2,4 Testigo NoduCON NoduSIN TRATAMIENTOS c. Diámetro del cuello (cm) Figura 4.1. Resultados del análisis estadístico del ensayo de aplicación de nódulos a plántulas de pino romerón

42 En todos los casos las diferencias fueron significativas (Tabla 4.4). Para todas las variables estudiadas los promedios más altos se obtuvieron bajo los tratamientos de aplicación de esporas de hongos, los cuales presentaron valores muy cercanos entre sí. Los valores más bajos fueron para el tratamiento testigo seguido por el tratamiento aplicación de nódulos con fertilización nitrogenada (Tabla 4.5 y Figura 4.2).

Tabla 4.4. Análisis de varianza para los diferentes tratamientos de inoculación de plántulas de pino romerón con hongos micorrizo-arbusculares. Variable G .L. C. M. G. L. C. M. F Nivel de tratamientos tratamientos error error significancia (P) Peso seco biomasa aérea 4 1,716250 15 0,196833 8,719306 0,000762 Longitud porción aérea 4 60,15800 15 5,668000 10,61362 0,000276 Diámetro cuello de la raíz 4 3,172500 15 0,412500 7,690909 0,001406 Fósforo total biomasa aérea 4 0,023367 15 0,006878 3,397475 0,036185 Las variables con diferencias significativas entre los tratamientos aparecen resaltadas en gris.

Por ejemplo, las diferencias entre el mejor tratamiento y el tratamiento de inoculación con aplicación de N equivalen al 73% para e peso seco de la biomasa aérea, 23% para la longitud de la porción aérea, 26% para el diámetro del cuello de la raíz, y 43% para el contenido total de fósforo en la biomasa aérea.

Tabla 4.5. Resultados de la prueba de Tukey para las variables que tuvieron diferencias significativas

Peso seco biomasa aérea (g/planta) Longitud porción aérea (cm/planta) Tratamiento Promedio Tratamiento Promedio Testigo {1} 1,550 a Testigo {1} 24,525 a Nódulos con N {2} 1,675 a Nódulos con N {2} 27,275 ab Espora amarilla {4} 2,725 b Entrophospora colombiana {5} 32,175 bc Entrophospora colombiana {5} 2,775 b Espora ámbar {3} 32,475 c Espora ámbar {3} 2,900 b Espora amarilla {4} 33,450 c Diámetro del cuello (cm) Fósforo total en la biomasa aérea (g/planta) Tratamiento Promedio Tratamiento Promedio Testigo {1} 3,6500 a Testigo {1} ,1245 a Nódulos con N {2} 4,4500 ab Nódulos con N {2} ,2158 ab Entrophospora colombiana {5} 5,5750 b Entrophospora colombiana {5} ,2861 ab Espora amarilla {4} 5,6000 b Espora ámbar {3} ,2922 ab Espora ámbar {3} 5,6000 b Espora amarilla {4} ,3089 b En una columna las medias con distinta letra son diferentes a un nivel de significancia de 0.05 según la prueba de rangos múltiples de Tukey

Estos resultados sugieren que la aplicación de cualquiera de las esporas de los hongos mencionados dos párrafos atrás, supera ampliamente no sólo la aplicación de nódulos, sino también la fertilización nitrogenada. Es decir, en términos de crecimiento de la porción aérea, desarrollo del cuello de la raíz y contenido total de fósforo en la biomasa, la aplicación de esporas superó incluso la fertilización artificial. Este resultado es de notoria importancia, pues la aplicación de esporas es mucho menos costosa que la aplicación de fertilizantes químicos. No

43 obstante, sólo ensayos posteriores bajo condiciones normales de plantación en campo, permitirán evaluar si las tendencias observadas en este estudio piloto de invernadero se mantienen.

3,8 38

3,4 36

34 3,0 32

2,6 30

2,2 28

26 1,8 ±Std. Dev. 24 1,4 ±Std. Err. Mean 22

1,0 20 Testigo Nod. con N Esp. ámbar Esp. amarilla E. colombiana Testigo Nod. con N Esp. ámbar Esp. amarilla E. colombiana TRATAMIENTOS TRATAMAIENTOS a.. Peso seco de biomasa aérea (g/planta) b. Longitud de la porción aérea (cm/planta)

7 0,5

6 0,4

5 0,3

4 0,2

3 ±Std. Dev. 0,1 ±Std. Err. Mean 2 0,0 Testigo Nod. con N Esp. ámbar Esp. amarilla E. colombiana Testigo Nod. con N Esp. ámbar Esp. amarilla E. colombiana TRATAMIENTOS TRATAMIENTOS c. Diámetro del cuello (cm) d. Fósforo total en la biomasa aérea (g/planta)

Figura 4.2. Resultados del análisis estadístico del ensayo aplicación de nódulos a plántulas de pino romerón

44

Conclusiones generales

El pino romerón poseen nódulos esféricos, en filas a lo largo de las raíces. Estos nódulos son una característica constitutiva de la raíz y no son originados por organismos simbiontes fijadores de nitrógeno. Los nódulos se originan en el periciclo de la raíz, adyacente al polo de xilema, con un patrón similar al de la formación de raíces laterales. Son nódulos blanquecinos con una epidermis suave cuando están recién formados y toman una coloración anaranjada a marrón claro cuando están maduros. Tienen un tamaño de 0.8 a 1.0 mm de diámetro.

Las observaciones realizadas, tanto en raíces de plántulas como de individuos adultos de pino romerón, muestran las presencia de hongos micorrizo-arbusculares. En general la colonización es menor en los nódulos blanquecinos jóvenes de las plántulas recién germinadas, pero aumenta en las raíces y nódulos más viejos de los brinzales y de los árboles adultos. Las hifas de estos hongos presentan cambios irregulares de grosor y ensortijamientos, especialmente en los nódulos. Las vesículas son frecuentes y abundantes, y su forma es entre globosa y ovalada, con algunas de ellas colapsadas. No se observaron arbúsculos.

Los ensayos de inoculación de plántulas con hongos micorrizo-arbusculares en condiciones de invernadero, mostraron diferencias significativas entre los tratamientos en cuanto a la longitud de la porción aérea de las plántulas, la biomasa aérea, el diámetro del cuello y el P total contenido en la biomasa aérea. Los mejores resultados se obtuvieron mediante la inoculación con hongo MA de espora ámbar, la inoculación con hongo MA de espora amarilla y la inoculación con Entrophospora colombiana.

Durante las visitas de campo se colectaron un total de 95 morfoespecies de macromicetes. Se determinaron 54 especies o géneros, los cuales se encuentran distribuidos en 39 géneros y 22 familias. Las familias más diversas son Tricholomataceae con 9 especies e Hygrophoraceae con 7 especies, ambas del orden Agaricales. Los meses con mayor diversidad representada por el número de colecciones fueron octubre de 2003, noviembre de 2003 y febrero de 2004, encontrándose 27, 25 y 24 especies respectivamente.

Los hongos encontrados en este estudio son principalmente saprofíticos lo cual hace presumir que esta especie, que es la dominante en el bosque, no tiene asociaciones ectomicorrícicas.

45 El reporte del Gasteromycete Protubera jamaicensis en el presente estudio, se considera de especial interés para la biogeografía de este grupo de macromicetes. Este es sin duda un hallazgo notable pues es una especie bastante rara y es el primer reporte del género y de la especie para Colombia.

Los ensayos de inoculación de plántulas con hongos ectomicorrícicos en condiciones de invernadero, no mostraron diferencias significativas entre los tratamientos.

En los cultivos de nódulos de pino romerón macerados no se obtuvo crecimiento de microorganismos fijadores de N, principalmente del actinomiceto Frankia sp. que se presumía podía estar asociado a las raíces de pino romerón.

Los ensayos de inoculación de plántulas de pino romerón con nódulos macerados en condiciones de invernadero, mostraron diferencias significativas entre los tratamientos para el peso seco de la biomasa aérea, la longitud de porción aérea y el diámetro del cuello de la raíz. En todos los casos el tratamiento de aplicación de nódulos con nitrógeno fue significativamente superior al tratamiento de aplicación de nódulos sin nitrógeno. Por esto, resulta evidente que no ocurre fijación biológica de nitrógeno, pues el mayor crecimiento en el tratamiento de inoculación se debe principalmente a la aplicación de nitrógeno y no a la acción de los nódulos.

Al comparar los ensayos de aplicación de esporas de hongos micorrizo-arbusculares con los de aplicación de nódulos, las diferencias fueron significativas. Los promedios más altos se obtuvieron bajo los tratamientos de aplicación de esporas de hongos. Por esto, se puede recomendar la aplicación esporas de los hongo micorrizo-arbusculares en lugar de la aplicación de nódulos macerados y fertilizante nitrogenada. Este resultado es de notoria importancia, pues la aplicación de esporas es mucho menos costosa que la aplicación de fertilizantes químicos. No obstante, sólo ensayos posteriores bajo condiciones normales de plantación en campo, permitirán evaluar si las tendencias observadas en este estudio piloto de invernadero se mantienen.

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49 Anexo 1. Composición química de la solución Norris

REACTIVO STOCK ( g / lt ) ml STOCK /1 lt Medio 1. KCl 29.8 2.50 2. K2HPO4 4.35 2.50 3. MgSO4. 7 H2O 98.6 2.50 4. Micronurtientes CuSO4. H2O 262 0.078 0.50 ZnSO4. 7H2O 0.222 0.50 MnSO4. 4H2O ó (0.117 g/lt de MnSO4. H2O para 0.154 0.50 un lt de stock (NH4)6Mo7O24. 4H2O 0.010. 0.50 H3BO3 1.430 0.50 5. Citrato Férrico (Disolver en agua caliente) 1.795 1.0 6. CaSO4. 2H2O (Disolver y adicionar) 0.0689 g/lt de medio Nota: Completar a 1000 ml cada uno de los seis Stock, con agua destilada. Guardar en nevera

Anexo 2.. Curva de calibración de P

P (mg/L) Abs. 660 nm 00 0,05 0,012 0,1 0,025 0,2 0,045 0,4 0,084 0,6 0,124 0,8 0,159

50 Anexo 3 . Medios de cultivo para actinomicetes.

MEDIO CON CACEINA

Reactivo Cantidad para 1.000 ml de medio en g o ml GLICEROL 10.0 ml CASEINA. (disolver en NaOH de alta concentración, adicionar de último al medio) 2.0 g KH2PO4 0.5 g MgSO4 7 H2O 0.41 g FeSO4 7 H2O 0.018 g NaCl 2.0 g PH : 6.5 – 6.8 AGAR 14 g

MEDIO CON ACIDO PROPIONICO

Reactivo Cantidad para 1.000 ml de medio en g o ml CaCl2. 2H2O 0.1 g MgSO4 .7 H2O 0.2 g NH4Cl 0.1 g FeNa EDTA 0.01 g Biotina 0.002 g

K2HPO4 Buffer que se agrega después de la esterilización por separado 1.0 g NaH2PO4. 2H2O 0.6 g Ácido Propionico 0.5 ml Elementos trazas H3BO3 ( 1 ) 1.5 mg ZnSO4.7H2O ( 2 ) 1.5 mg MnSO4.H2O ( 3 ) 4.5 mg NaMoO4.2H2O ( 4 ) 0.25 mg CuSO4.5H2O ( 5 ) 0.04 mg CoCl ( 6 ) 0.05 mg El pH se ajusta entre 6.8 y 6.9 Primer stock en 100 ml y luego tomar 10 ml del stock Primer stock en 100 ml y luego tomar 0.1 ml del stock 1) 0.15 mg 1) 0.025 mg 2) 0.15 mg 2) 0.004 mg 3) 0.45 mg 3) 0.005 mg

MEDIO CON TRIPTONA

Reactivo Cantidad para 1.000 ml de medio en g o ml Triptona 5.0 g Glucosa 10.0 g K2HPO4 0.3 g NaH2PO4. 2H2O 0.2 g MgSO4 .7 H2O 0.2 g KCl 0.2 g CaCo3 0.1 Agar 10.0 g

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