Molekulargenetische Charakterisierung Konstitutioneller Chromosomaler Translokationen Zur Positionsklonierung Krankheitsverursachender Gene

Molekulargenetische Charakterisierung konstitutioneller chromosomaler Translokationen zur Positionsklonierung krankheitsverursachender Gene

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von Michael Kraft

aus Forchheim

Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 20.02.2013

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. J. Barth

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Reis

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Slany

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...... 1

1.1 Positionsklonierung krankheitsverursachender Gene ...... 1 1.1.1 Methoden der Positionsklonierung ...... 2 1.1.2 Positionsklonierung unter Verwendung Phänotyp-assoziierter, balancierter Translokationen ...... 3 1.2 Zielsetzung ...... 6

2 Material und Methoden ...... 7

2.1 Patienten ...... 7 2.1.1 Patient 46,XY,t(10;13) – Noonan-Syndrome-Like ...... 8 2.1.2 Patientin 46,XX,t(1;8) – Adipositas & Hypogonadismus ...... 11 2.1.3 Patientin 46,XX,t(5;14) – Schwere Mentale Retardierung ...... 14 2.1.4 Patientin 47,XXX,t(7;11) – DiGeorge-Syndrome-Like ...... 16

2.2 Methoden ...... 18 2.2.1 Biologisches Material ...... 18 2.2.2 Amplifikation gesamtgenomischer DNA (Whole Genome Amplification) .....18 2.2.3 Gelelektrophorese ...... 18 2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...... 19 2.2.5 Sequenzierung ...... 23 2.2.6 Bruchpunkt-Sequenzierung ...... 24 2.2.7 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ...... 25 2.2.8 Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ...... 29 2.2.9 Quantitative “Real-Time” PCR (qPCR) ...... 30 2.2.10 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) ...... 35 2.2.11 Expressions-Array ...... 36 2.2.12 Array-basierte molekulare Karyoptypisierung ...... 37 2.2.13 Zellkultur ...... 37 2.2.14 Histonacetylierungs-Assay ...... 40 2.2.15 Western-Blot ...... 40 2.2.16 ChIP-on-chip ...... 42 2.2.17 Gene ontology- (GO) und Signalweg-Analysen ...... 44

2.3 Material ...... 45 2.3.1 Verbrauchsmaterialien ...... 45 2.3.2 Chemikalien ...... 45 2.3.3 Antikörper ...... 47 2.3.4 Lösungen ...... 47 2.3.5 Kits ...... 51

Inhaltsverzeichnis

2.3.6 TaqMan-Sonden (pre-designed) ...... 51 2.3.7 Selbstentworfene TaqMan-Sonden ...... 52 2.3.8 Oligonukleotide ...... 52 2.3.9 MLPA-Sonden-Oligonukleotide ...... 59 2.3.10 BAC-Klone ...... 60 2.3.11 Arrays ...... 60 2.3.12 Software und Datenbanken ...... 61 2.3.13 Geräte ...... 62

3 Ergebnisse ...... 64

3.1 Ergebnisse Patient 46,XY,t(10;13) – Noonan-Syndrome-like ...... 64 3.1.1 Ausgangslage ...... 64 3.1.2 MYST4-Knockdown in Zellmodellsystemen ...... 64 3.1.3 Analyse der Histon H3- und H4-Acetylierung ...... 65 3.1.4 Isformspezifisches Expressionsmuster von MYST4 ...... 66 3.1.5 Expressionsanalysen auf Proteinebene mittels Westernblot ...... 68 3.1.6 Genomweite Expressionsanalysen ...... 70 3.1.7 Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP-on-chip) ...... 75 3.1.8 Kombinierte Analyse der Ergebnisse aus der genomweiten Expressionsanalyse mit denen aus der ChIP-on-chip ...... 77 3.1.9 Phosphorylierungsstatus wichtiger Komponenten des MAP-Kinase- Signalwegs ...... 79 3.1.10 Mutations-Screening ...... 81

3.2 Ergebnisse Patientin 46,XX,t(1;8) – Adipositas & Hypogonadismus ..... 82 3.2.1 Bruchpunktsequenzierung ...... 82 3.2.2 Analyse der Bruchpunkte und der umgebenden genomischen Region ...... 83 3.2.3 Expressionsanalysen mittels TaqMan-basierter qPCR ...... 87 3.2.4 Molekulare Karyotypisierung ...... 88

3.3 Ergebnisse Patientin 46,XX,t(5;14) – Schwere mentale Retardierung .. 90 3.3.1 Bruchpunktsequenzierung ...... 90 3.3.2 Molekulare Karyotypisierung ...... 91 3.3.3 Untersuchung der bruchpunktumgebenden genomischen Region und Identifikation des Kandidatengens FOXG1 ...... 91 3.3.4 Nachweis einer FOXG1-Defizienz ...... 93

3.4 Ergebnisse Patientin 47,XXX,t(7;11) – DiGeorge-Syndrome-Like ...... 94 3.4.1 Bruchpunkteingrenzung und Sequenzierung ...... 94 3.4.2 Bruchpunktanalysen ...... 96 3.4.3 Expressionsanalysen von Kandidatengenen im Bereich der Bruchpunktregionen ...... 98 3.4.4 Molekulare Karyotypisierung ...... 99

Inhaltsverzeichnis

4 Diskussion ...... 101

4.1 Diskussion Patient 46,XY,t(10;13) – Noonan-Syndrome-like ...... 101 4.1.1 Phänotyp des Patienten und Identifikation des Kandidatengens ...... 101 4.1.2 Die Histon-Acetyltransferase MYST4 ...... 101 4.1.3 Nachweis einer kausalen MYST4-Haploinsuffizienz ...... 103 4.1.4 Isoformspezifische Expression von MYST4 korreliert mit dem murinen und humanen Phänotyp ...... 104 4.1.5 MYST4-abhängige Expressionsregulation ...... 104 4.1.6 Identifizierung des MAP-Kinase-Signalwegs als ein Hauptziel MYST4- vermittelter Regulation ...... 105 4.1.7 MYST4-Haploinsuffizienz stellt eine seltene Ursache für Erkrankungen des Noonan-Syndrome-Like Spektrums dar ...... 106

4.2 Diskussion Patientin 46,XX,t(1;8) – Adipositas & Hypogonadismus ... 108 4.2.1 Phänotyp der Patientin ...... 108 4.2.2 Bruchpunktkartierung ...... 108 4.2.3 Kandidatengene in den Bruchpunktregionen ...... 109 4.2.4 Translokationsunabhängige genomische Imbalance ...... 112 4.2.5 Zusammenfassende Genotyp-Phänotyp-Korrelation ...... 113

4.3 Diskussion Patientin 46,XX,t(5;14) – Schwere mentale Retardierung 115 4.3.1 Phänotyp der Patientin ...... 115 4.3.2 Bruchpunktkartierung ...... 115 4.3.3 Identifikation von FOXG1 als Kandidatengen und Bestätigung eines auf dessen Haploinsuffizienz basierenden Pathomechanismus...... 115

4.4 Diskussion Patientin 47,XXX,t(7;11) – DiGeorge-Syndrome-Like ...... 118 4.4.1 Phänotyp der Patientin ...... 118 4.4.2 Bruchpunktkartierung und Sequenzierung ...... 118 4.4.3 Ausschluss des direkten Bruches eines phänotypisch relevanten Gens durch die Translokation ...... 118 4.4.4 Ausschluss der Kausalität von Kandidatengenen in den Bruchpunkt- umgebenden Regionen ...... 119 4.4.5 Ausschluss der Kausalität von translokationsunabhängigen genomischen Imbalancen ...... 119 4.4.6 Postulierung einer zufälligen Koinzidenz ...... 119 4.5 Zusammenfassende Ergebnisdiskussion...... 121

5 Zusammenfassung ...... 123

6 Summary ...... 126

7 Literaturverzeichnis ...... 128

8 Anhang ...... 134

III

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Herangehensweisen zur Identifikation krankheitsverursachender Gene...... 1

Abb. 2 Überblick: Strukturelle Chromosomenaberrationen ...... 2

Abb. 3 Patient 46,XY,t(10;13) im Alter von 6 Jahren ...... 8

Abb. 4 46,XY,t(10;13): Der Bruchpunkt rupturiert das Gen MYST4...... 10

Abb. 5 46,XY,t(10;13): Expressionsanalyse von MYST4 und TUPGCP3 in nativen Lymphozyten des Patienten ...... 10

Abb. 6 46,XY,t(10;13): Verlauf der Histon-Acetylierungs-Aktivität in der Patienten- Zelllinie ...... 10

Abb. 7 Patientin 46,XX,t(1;8) im Alter von 18 Jahren ...... 11

Abb. 8 46,XY,t(10;13): Relativen Expression von MYST4 in HEK293 und HeLa nach Transfektion mit gegen MYST4 gerichteten siRNAs ...... 65

Abb. 9 46,XY,t(10;13): Messung der globalen Histon-H3- und Histon-H4-Acetylierung für die Zelllinie des Patienten sowie für transfizierte HEK293- und HeLa-Zellen mit siRNA vermitteltem MYST4-Knockdown ...... 66

Abb. 10 Analyse des Expressionsmusters der MYST4 Isoformen in fetalen und adulten humanen Geweben, sowie in humanen Gehirnarealen unter Verwendung isoformspezifischer Sonden ...... 67

Abb. 11 Abb. 1146,XY,t(10;13): Westernblot-Analyse von MYST4 für die Zelllinie des Patienten sowie für transfizierte HEK293- und HeLa-Zellen mit siRNA vermitteltem MYST4-Knockdown...... 69

Abb. 12 46,XY,t(10;13): Chromosomale Lokalisation der im humanen Modell differentiell exprimiert gefundenen Gene, Heatmap-Darstellung der Expressionsänderung ...... 71

Abb. 13 46,XY,t(10;13): Zusammenfassung der Gene Ontology-Analysen ...... 73

Abb. 14 46,XY,t(10;13): Nachweis der generellen Funktionalität der ChIP-Methode und des dabei verwendeten MYST4-Antikörpers ...... 76

Abb. 15 46,XY,t(10;13): Gewebebezogene Expressionsverteilung der durch ChIP mit einem gegen MYST4 gerichteten Antikörper signifikant angereichert gefundenen Gene ...... 77

Abb. 16 46,XY,t(10;13): Quantitative Westernblotanalyse der Phosphorylierungslevel von wichtigen Signalweg-Komponenten (MEK, ERK und AKT) in lymphoblastoiden Zelllinien im Rahmen einer Kooperation ...... 80

Abb. 17 46,XX,t(1;8): spezifisches Bruchpunkt-überspannendes LR-PCR-Produkt .....82

Abb. 18 46,XX,t(1;8): Bruchpunkt-überspannende Sequenz ...... 83

Abb. 19 46,XX,t(1;8): Darstellung der umgebenden genomischen Region für den Bruchpunkt auf Chromosom 1 und Chromosom 8 ...... 84

Abbildungsverzeichnis

Abb. 20 46,XX,t(1;8): Direkte Rupturierung des Gens FGFR1 durch das chromosomale Rearrangement ...... 84

Abb. 21 46,XX,t(1;8): Unmittelbare genomische Umgebung des Bruchpunktes auf Chromosom 1 ...... 185

Abb. 22 Exonstruktur des alternativen Transkripts NUDCß im Vergleich zu der des annotierten Gens NUDC ...... 86

Abb. 23 46,XX,t(1;8): Expressionsanalysen zur Messung der relativen Expression der Gene FGFR1, LETM2, NR0B2, NUDC sowie dessen Variante NUDCß und GPATCH3 in nativen Lymphozyten bzw. lymphoblastoiden Zellmaterial der Patientin ...... 87

Abb. 24 46,XX,t(1;8): Molekulare Karyotypisierung ...... 89

Abb. 25 46,XX,t(5;14): Überblick über die vorrausgegangene Bruchpunkt-Eingrenzung mittels FISH und Mini-FISH ...... 90

Abb. 26 46,XX,t(5;14): Darstellung der umgebenden genomischen Region des Bruchpunktbereichs auf Chromosom 5 und Chromosom 14...... 92

Abb. 27 46,XX,t(5;14): Relative FOXG1-Proteinexpression der Patientin ...... 93

Abb. 28 47,XXX,t(7;11): Identifikation der Bruchpunkt-überspannenden BAC-Klone. 94

Abb. 29 47,XXX,t(7;11): Feinkartierung der Bruchpunkte mittels Mini-FISH ...... 95

Abb. 30 47,XXX,t(7;11): Bruchpunkt-überspannende Sequenzen ...... 96

Abb. 31 47,XXX,t(7;11): Darstellung der genomischen Region im Bereich der Bruchpunkte ...... 97

Abb. 32 47,XXX,t(7;11): Expressionsanalysen zur Messung der relativen Expression der Kandidatengene ST5, CTR9, ZNF143, HOXA3 und WEE1 in nativen Lymphozyten der Patientin ...... 99

Abb. 33 47,XXX,t(7;11): Molekulare Karyotypisierung ...... 100

Abb. 34 Domänenstruktur der 3 Isoformen von MYST4...... 103

Abb. 35 46,XX,t(1;8): Überblick über die Bruchpunkteingrenzung und anschließende Sequenzierung ...... 108

Abb. 36 46,XX,t(5;14): Darstellung der umgebenden genomischen Region um den Bruchpunktbereich auf Chromosom 14 ...... 116

1 Einleitung

1.1 Positionsklonierung krankheitsverursachender Gene

Bis in die frühen 90er Jahre des letzten Jahrhunderts war es der Methode der funktionellen Klonierung zu verdanken, dass schon mehrere hundert krankheitsverursachende Gene im Menschen identifiziert werden konnten. Diese Herangehensweise setzt jedoch ein Wissen über den der Erkrankung zu Grunde liegenden biochemischen Defekt voraus. Da aber ein solches Wissen in der Mehrzahl der Fälle nicht gegeben ist, stellt dies eine Limitierung dieser Anwendung dar [4]. Eine neue Strategie, welche keinerlei funktionelle Information benötigte, erlangte ihren Durchbruch im Jahre 1986, als das Gen für die X-gebundene, chronische Granulomatose von Royer-Pokora et al. alleinig über dessen genomische Position identifiziert werden konnte [5]. Die Strategie über Kartierung des relevanten Bereiches für eine monogene Erkrankung das ursächliche Gen zu identifizieren, und erst im Anschluss dessen Funktion zu ergründen, erhielt die Bezeichnung Positionsklonierung und gewann in den darauf folgenden Jahren zusehends an Bedeutung. Hierbei spielte im Besonderen auch die rasante Zunahme der Information über das Genom und damit einer an Vollständigkeit gewinnenden Genkarte, insbesondere durch das Human Genome Project, eine große Rolle [4,6].

Abb. 1 Gegenläufige Herangehensweisen zur Identifikation krankheitsverursachender Gene. Für die funktionelle Klonierung ist die Verfügbarkeit von Information über die Funktion des verantwortlichen Gens notwendig, die Kartierung folgt auf eine gelungene Klonierung. Positionsklonierung funktioniert entgegengesetzt (daher auch: Reverse Genetics): Über die Kartierung des verantwortlichen genomischen Bereichs wird das krankheitsverursachende Gen identifiziert. Eine Bestimmung der Genfunktion ist sekundär. Nach [4].

Einleitung

1.1.1 Methoden der Positionsklonierung

Die bekanntesten Methoden zur Identifikation und Eingrenzung des für eine Krankheit relevanten chromosomalen Bereichs bis hin zum kausalen Gen, stellen Kopplungsanalysen (Linkage) und die Charakterisierung von chromosomalen Aberrationen dar. Kopplungsanalysen untersuchen die Vererbung genetischer Marker zusammen mit dem beobachteten Phänotyp (Kopplung) innerhalb einer Familie. Die Eingrenzung des relevanten Bereiches hängt dabei aber stark von der Größe des Stammbaumes und im Besonderen der darin enthaltenen informativen Meiosen ab, zudem ist die Untersuchung einer Vielzahl an polymorphen Markern für eine solche Analyse notwendig. Die Positionsklonierung mittels konstitutioneller, chromosomaler Aberrationen hingegen benötigt im günstigsten Fall lediglich ein betroffenes Individuum mit einer phänotypischen Auffälligkeit in Kombination mit einer strukturellen Chromosomenaberration (Abb. 2). Unter Ausschluss weiterer potentieller Ursachen kann hier entsprechend eine Assoziation postuliert werden. Über die Charakterisierung der chromosomalen Aberration wird bei dieser Herangehensweise die Kartierung der betroffenen genomischen Loci, und darüber die Positionsklonierung eines darin enthaltenen krankheitsverursachenden Gens verfolgt. Die erste über einen vergleichbaren Ansatz überhaupt erfolgreich kartierte Erkrankung stellte die Duchenne Muskeldystrophie auf den Lokus Xp21 durch Lindenbaum et al. im Jahr 1979 dar [7,8]. Ausgehend von diesem Zeitpunkt gewann die Charakterisierung chromosomaler Aberrationen zur Kartierung krankheitsrelevanter Genomloci für die anschließende Identifikation von krankheitsrelevanten Genen rapide an wissenschaftlichem Interesse, und wurde zunehmend der Schlüssel für eine schnelle Isolierung von Krankheitsgenen [9].

Abb. 2 Strukturelle Chromosomenaberrationen definieren sich durch Deletion (unbalanciert), Duplikation (unbalanciert) oder Austausch von chromosomalem Material (potentiell balanciert) innerhalb eines Chromosoms (intrachromosomal) oder zwischen zwei verschiedenen Chromosomen (interchromosomal). Nach [10].

Einleitung

1.1.2 Positionsklonierung unter Verwendung Phänotyp-assoziierter, balancierter Translokationen

Innerhalb der konstitutionellen, strukturellen Chromosomenaberrationen, die sich mit einem auffälligen Phänotyp präsentieren, sind besonders die balancierten Translokationen, also Rearrangements bei denen genomisches Material ohne erkennbaren Zugewinn (gain) oder Verlust (loss) zwischen Chromosomen reziprok ausgetauscht wurde, geeignet für eine zügige und einfache Positionsklonierung.

1.1.2.1 Häufigkeiten balancierter Rearrangements und Risiko assoziiert auftretender aberranter Phänotypen

Grundsätzlich finden sich strukturelle Veränderungen der Chromosomen bei ca. 0,5% der Neugeborenen [11], dabei machen die scheinbar balancierten Rearrangements, welche reziproke Translokationen sowie Inversionen einschließen, mit einer Häufigkeit von 0,2% in der Gesamtbevölkerung einen beträchtlichen Anteil aus [12]. Die Mehrzahl der balancierten Aberrationen findet sich dabei vererbt, und es wird geschätzt, dass nur ca. 0,03% der Gesamtbevölkerung Träger eines de novo entstandenen, balancierten Rearrangements sind. Speziell in Bezug auf die darin enthaltenen de novo reziproken Translokationen wurde dabei ein Risiko von 6,1% für das Auftreten assoziierter, schwerer, kongenitaler Erkrankungen festgestellt. In der Hälfte der Fälle handelt es sich dabei um mentale Retardierung, welche isoliert aber auch als Teil eines Syndroms gefunden werden kann, als zweithäufigster Phänotyp wurde eine Infertilität der Betroffenen festgestellt [13-15]. Bei den meisten Trägern einer balancierten Translokation findet sich jedoch begründet durch die Konsistenz der Menge an genetischen Materials kein auffälliger Phänotyp. Bei diesen besteht grundsätzlich nur in Bezug auf Reproduktion ein erhöhtes Risiko für das Auftreten von Komplikationen (männliche Infertilität, spontane Aborte, Nachkommen mit chromosomalen Imbalancen) [16].

1.1.2.2 Zufällige Entstehung von Translokationen

Die für die Entstehung von Translokationen verantwortlichen Doppelstrangbrüche im Genom stellen, bis auf wenige Ausnahmen, grundsätzlich über das gesamte Genom zufällig verteilte Ereignisse dar. Sie können durch exogene Faktoren, wie z.B. ionisierende Strahlung oder Chemikalien, aber auch durch endogen generierte Sauerstoffradikale oder mechanischen Stress auf die Chromosome generiert werden. Meist werden diese über Reparatursysteme wie zB. die homologe Rekombination fehlerfrei behoben, jedoch können auch in einigen Fällen über das fehleranfällige Reparatursystem der Nonhomologous End Joining (NHEJ) Translokationen de novo entstehen [16].

Einleitung

1.1.2.3 Phänotypenassoziation und Erklärung einer möglichen Kausalität

Bei den 6,1% der Fälle, bei denen eine de novo entstandene, reziproke Translokation zusammen mit einem aberranten Phänotyp unter Ausschluss weiterer potentieller Ursachen auftritt, wird von Assoziation ausgegangen. Dies begründet sich darauf, dass Phänotyp-assoziierte balancierte Rearrangements in zytogenetischen Kollektiven 6x häufiger als in der generellen Bevölkerung zu finden sind, sodass ein kausaler Zusammenhang in den meisten Fällen zu erwarten ist [14,15]. Die grundlegend dabei angenommene These ist, dass durch einen der Chromosomenbrüche ein für den Phänotyp kausales Gen direkt rupturiert wird, oder in Hinblick auf Positionseffekte von cis-regulatorischen Elementen getrennt, bzw. in eine neue regulatorische Umgebung gebracht wird. Ein daraus resultierender Ausfall des von der Translokation betroffenen Allels führt damit zu Haploinsuffizienz im Falle eines dominanten Gens. Gleichzeitig ist aber auch die Demaskierung einer Mutation im nicht betroffenen Allel im Rahmen einer rezessiven Erkrankung möglich, aber auch die Demaskierung eines von Imprinting betroffenen Gens ist denkbar [17]. Dieser These folgend, konnten über die Charakterisierung chromosomaler Bruchpunkte eine Vielzahl von Krankheitsgenen identifiziert werden. Auf Grund der hohen Wahrscheinlichkeit für Kausalität und der grundsätzlich möglichen, scharfen Eingrenzung der betroffenen genomischen Bereiche wurde die Charakterisierung krankheitsassoziierter, balancierter Rearrangements zu einer klassischen Herangehensweise für die Phänotyp-Genotyp-Korrelation [15].

1.1.2.4 Notwendige Abklärung der Möglichkeit von zusätzlich auftretenden, kryptischen Aberrationen

Entgegen der in der These gestellten Annahme der Beeinträchtigung eines Dosis- sensitiven Gens durch einen der Translokationsbruchpunkte, kann die Möglichkeit von zusätzlich auftretenden, kryptischen Aberrationen, welche für den Phänotyp zusätzlich oder alleinig kausal sein können, nicht ausgeschlossen werden. Mikrodeletionen oder Mikroduplikationen, die im Bereich der Translokationsbruchpunkte, aber auch an unabhängiger Stelle in Genom zusätzlich auftreten können, lassen bei der Beschreibung des Genotyps auf zytogenetischer Ebene nur die Annahme eines balancierten Rearrangements zu. Entsprechend sind zusätzliche molekulare, genomweite Analysen notwendig, um eventuell auftretende submikroskopische Imbalancen in die Phänotyp- Genotyp-Korrelation mit einzubeziehen [17-19].

1.1.2.5 Weitere mögliche Auswirkungen balancierter, reziproker Translokationen

Des Weiteren muss bei der Positionsklonierung an Hand balancierter Translokationen grundsätzlich bedacht werden, dass natürlich auch die Möglichkeit von zufälliger

Einleitung

Koinzidenz mit dem Phänotyp besteht, und die eigentliche Ursache eine kryptische Mutation an unabhängiger Stelle im Genom darstellt. Außerdem ist über ein Rearrangement auch die Generierung neuartiger genetischer Situationen möglich, die z.B. zur Expression von Fusionsproteinen führen können. Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen, relativ lokalen genetischen Änderungen in der unmittelbaren Bruchpunktumgebung, sind des Weiteren durch Rearrangements auch Expressionänderungen denkbar, die das gesamte Genom betreffen können. Die Ursache hierfür stellt die Möglichkeit einer veränderten räumlichen Chromosomenorganisation im Nukleus als Folge aberranter Chromosomen dar. Man geht davon aus, dass die damit verbundene Zerrüttung der klar definierten Chromosomenterritorien zu einer Beeinträchtigung der Transkription einer Vielzahl von Genen führen kann [20,21].

1.1.2.6 Bedeutung für die wissenschaftliche Forschung allgemein und für Betroffene im Speziellen

Unter Beachtung des oben beschriebenen, breiten Spektrums der möglichen Auswirkungen behalten Phänotyp-assoziierte, balancierte Translokationen auch nach Fertigstellung des humanen Genomprojekts und in einer Zeit rasant steigender Genominformation ihre Bedeutung für die Identifikation von krankheitsverursachenden Genen. Die Suche nach solchen hat, besonders in Hinblick auf klinisch schwerwiegende Phänotypen, wie z.B. Entwicklungsverzögerung oder mentale Retardierung, weiterhin einen hohen Stellenwert in der wissenschaftlichen Forschung. Die Aufklärung der zu Grunde liegenden Genetik kann, im Fall von bisher nicht charakterisierten Ursachen, das Verständnis des Pathomechanismus begründen und so die Grundlage für neue Therapieansätze liefern. Für Patienten konkret erweist sich die genetische Aufklärung als hilfreich in Bezug auf die Erstellung von Prognosen und einer möglichst adäquaten Symptombehandlung, auch wenn meist keine direkte Heilung in Aussicht gestellt werden kann. Des Weiteren profitieren Patienten und deren Familien oft psychisch in Bezug auf die Akzeptanz der Erkrankung, und können in Bezug auf ihre Familienplanung eine individuelle Risikoberatung erfahren [22,23].

Einleitung

1.2 Zielsetzung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Positionsklonierung krankheitsverursachender Gene unter Verwendung Phänotyp-assoziierter balancierter Translokationen für die Identifikation und nähere Charakterisierung von bisher unbekannten genetischen Ursachen. Hierzu sollte für vier Patienten (vgl. 2.1), die sich mit verschiedenen, auffälligen Phänotypen in Kombination mit dem zytogenetischen Befund einer als balanciert angenommenen, de novo Translokation präsentierten, eine genetische Aufklärung erfolgen. Über die Charakterisierung der Translokationsbruchpunkte, mittels Feinkartierung über FISH- und Mini-FISH-Analysen sowie anschließender Bruchpunkt-überspannender Sequenzierung, sollte die Identifikation von Kandidatengenen in den Bruchpunktregionen verfolgt werden. Unter Einbezug der Ergebnisse aus einer zusätzlichen molekularen Karyotypisierung sollte dann die Kausalität der ermittelten Kandidatengene für den entsprechenden Phänotyp an Hand von Expressionsanalysen und gegebenenfalls weiterführenden funktionellen Analysen bestätigt und gegebenenfalls der Pathomechanismus aufgeklärt werden.

2 Material und Methoden

2.1 Patienten

Die vier auf den folgenden Seiten vorgestellten Patienten präsentierten sich mit unterschiedlichen, auffälligen Phänotypen in Kombination mit einer als balanciert angenommenen, de novo Translokation, und stellten somit die Grundlage für die in dieser Arbeit verfolgte Positionsklonierung krankheitsverursachender Gene an Hand balancierter Translokationen dar. Im Folgenden findet sich eine detaillierte Beschreibung des jeweiligen Phänotyps, sowie der schon im Vorfeld durchgeführten Analysen.

Material & Methoden

2.1.1 Patient 46,XY,t(10;13) – Noonan-Syndrome-Like

2.1.1.1 Patientenbeschreibung

Bei einem Patienten, der klinischen Auffälligkeiten vergleichbar mit denen des Noonan-Syndroms (NS, MIM #163950) aufwies, wurde eine möglicherweise mit dem Phänotyp assoziierte balancierte chromosomale Translokation festgestellt. Der Patient war das zweite Kind gesunder, nicht blutsverwandter Eltern europäischer Herkunft. Er wurde nach unauffälliger Schwangerschaft termingerecht mit einem normalen Körpergewicht von 3500 g (-0,28 SDS) sowie einer normalen Körperlänge von 52 cm (-0,25 SDS) geboren. Doch im Verlauf der frühen Kindheit fielen die Werte für Wachstum und Gewicht unter die 3. Perzentile, und im Alter von 6,2 Jahren wurde ein proportionierter Kleinwuchs festgestellt. Der Patient wies zu diesem Abb. 3 Zeitpunkt eine Körpergröße von 101 cm (-4,2 SDS) Patient im Alter von 6 Jahren bei einem Gewicht von 14 kg (BMI 13,7) und einem

Kopfumfang von 49 cm (-2,44 SDS) auf. Eine endokrinologische Untersuchung lieferte Hinweise auf eine Wachstumshormon-Defizienz, weitere Analysen hierzu wurden allerdings von der Mutter des Patienten abgelehnt. In anderweitigen Untersuchungen wurden ein deutlich verzögertes Knochenalter sowie eine Gelenküberstreckbarkeit festgestellt. In Bezug auf seine kognitiven Leistungen wurden beim Patienten eine Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS; MIM #143465) einhergehend mit einer Lernschwäche erkannt, der IQ-Wert des Patienten wurde dabei zwischen 75-80 eingeordnet. Eine zerebraler Magnetresonanzuntersuchung, die im Alter von 5,3 Jahren durchgeführt wurde, war ohne Auffälligkeiten. Weiterhin zeigte der Patient spezielle Gesichtscharakteristika, die in Kombination mit den bisher genannten Auffälligkeiten zu einer Zuordnung zum Noonan-Syndrome-Like-Spektrum führten. So zeigte der Patient eine Blepharophimosis, eine Ptosis, die im Alter von 5 und 6 Jahren operativ behandelt wurde, und hoch gewölbte Augenbrauen. Die Ohren zeigten einen niedrigen Ansatz, überfaltete Helices und fleischige Ohrläppchen. Außerdem waren ein glattes Philtrum, ein hoher Gaumen und eine Retrognathie auffällig. Zusammenfassend erfüllte der Patient durch seine fazialen Auffälligkeiten, den Kleinwuchs in Kombination mit einem breiten Thorax und der milden mentalen Retardierung die anerkannten van der Burgt Kriterien für Noonan-Syndrom [24], auch ohne das Auftreten von kardiologischen Anomalien. Defekte in den bis dahin bekannten Noonan-Syndrom-Genen PTPN11, SOS1, KRAS,

Material & Methoden

RAF1, SHOC2, NRAS, BRAF und MEK1 wurden durch Sequenzierung der kodierenden Sequenzen unter Leitung von Dr. med. Martin Zenker ausgeschlossen.

2.1.1.2 Karyotypisierung und Bruchpunktsequenzierung

Eine routinediagnostische Karyotypisierung des Patienten und dessen Eltern wurde durch das zytogenetische Labor des Hauses unter Leitung von Dr. rer. nat. Udo Trautmann durchgeführt. Hierbei wurde die GTG-Bänderungstechnik mit einer Auflösung von 500 Banden pro haploiden Karyotyp angewandt und dabei eine später als balanciert erkannte de novo Translokation 46,XY,t(10;13)(q22.3;q34) beim Patienten aufgedeckt. Die reziproke Translokation zwischen den beiden langen Armen der Chromosomen 10 und 13 wurde im Rahmen mehrerer Praktika mit Hilfe der FISH-Methode (vgl. 2.2.7) bestätigt und die auftretenden Bruchpunktbereiche durch Verwendung geeigneter BAC-Sonden weiter eingegrenzt. Dabei konnte für Chromosom 10 der Bruchpunkt-überspannende BAC-Klon RP11-668A2 (Lokalisation bei ca. 76 Mb; hg18) identifiziert werden, der zu einer Eingrenzung auf ca. 192 kb führte. Auf Chromosom 13 fand eine Eingrenzung auf den ca. 369 kb umfassenden Bereich (Lokalisation bei ca. 112 Mb; hg18) der beiden BAC-Klone RP11-480K16 und RP11-88E10 statt. Eine verfeinerte Kartierung erfolgte unter Verwendung der Mini-FISH-Sonden 480K16-F6 und 668A2-F5 (vgl. 2.2.7.3), und über die anschließende Generierung eines Bruchpunkt-überspannenden Long-range-PCR- Produkts (vgl. 2.2.4.3) war eine Sequenzierung des Bruchpunktes auf die Base genau möglich. Über zusätzliche molekulare Karyotypisierung basierend auf einem Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0 (vgl. 2.2.12) konnten genomweit kryptische Kopienzahländerungen ausgeschlossen werden.

2.1.1.3 Bruchpunktuntersuchung und erste funktionelle Analysen

Erste Analysen der Bruchpunkte wurden von Mitarbeitern des Hauses unter Leitung von PD Dr. med. Anita Rauch durchgeführt. Diese zeigten, dass der chromosomale Bruch auf 10q22.3 das für eine Histon-Acetyltransferase kodierende Gen MYST4 (MYST histone acetyltransferase (monocytic leukemia) 4) im dritten Intron, und damit nach seinem ersten kodierenden Exon, rupturierte (Abb. 4).

Material & Methoden

Abb. 4 Der Bruchpunkt (rot gestrichelte Linie) rupturiert das Gen MYST4 in dessen 3. Intron. Aus [2].

TaqMan basierte qPCR-Analysen (vgl. 2.2.9.1) an Leukozyten des Patienten ergaben eine daraus resultierende Expressionsreduktion von MYST4 um 50% auf mRNA-Ebene. Im Gegensatz dazu war durch den Bruchpunkt auf 13q34 kein Gen direkt betroffen, und auch das 17,2 kb downstream gelegene Gen TUBGCP3 wurde durch den Nachweis einer normalen Expression mittels TaqMan-basierter qPCR als Kandidat ausgeschlossen (Abb. 5). Durch Sequenzierung (vgl. 2.2.5) der kodierenden Sequenz von MYST4 wurden zursätzlich zum Bruch auftretende Mutationen ausgeschlossen und führten zur These eines auf Haploinsuffizienz basierenden Pathomechanismus. Erste funktionelle Analysen bezüglich dieser These waren vor Beginn meiner Arbeit abgeschlossen worden. In diesen wurde unter Verwendung eines EpiQuik HAT Activity/Inhibition Assay Kits eine extreme Abnahme der globalen Histon-Acetylierungs-Aktivität in der lymphoblastoiden Zelllinie des Patienten aufgezeigt (Abb. 6).

Abb. 5 Abb. 6 Expressionsanalyse mittels TaqMan- Verlauf der Histon-Acetylierungs- basierter qPCR zur Messung der Aktivität in der Zelllinie des Patienten relativen Expression der Gene MYST4 gegen Zelllinien von Kontrollen (Ctrls). und TUBGCP3 in nativen Aus [2]. Lymphozyten des Patienten (P) gegen 3 gesunde Kontrollen (C1-3) entsprechenden Alters. Aus [2].

Material & Methoden

2.1.2 Patientin 46,XX,t(1;8) – Adipositas & Hypogonadismus

2.1.2.1 Patientenbeschreibung

Bei einer Patientin, die durch die Manifestation einer Adipositas (MIM #601665) in Kombination mit einem hypogonadotropen Hypogonadismus (MIM #146110) auffällig wurde, wurde eine mögliche Assoziation des Phänotyps mit dem Auftreten einer balancierten chromosomalen Translokation festgestellt. Die Patientin wurde in der Endokrinologie der Kinder- und Jugendklinik des UK Erlangen unter Leitung von Prof. Dr. med. Helmuth-Günther Dörr vorstellig. Die Patientin ist das erste Kind gesunder, nicht blutsverwandter Eltern kaukasicher Herkunft. Bei der nach unauffälliger Schwangerschaft erfolgten Geburt per Zange lag die Körperlänge bei 46 cm, das Gewicht bei 3160 g und der Kopfumfang bei 34 cm. Sie zeigte eine normale psychomotorische Entwicklung mit Sitzen im Alter von 7 Monaten und Laufen im Alter von 12 Monaten. Im Alter von 2 Jahren war bei normaler Körperlänge von 86 cm (50.

Perzentile) ein zu hohes Gewicht von 15,4 kg (97. Abb. 7 Perzentile) und daraus resultierend ein zu hoher Body-Mass- Patientin im Alter von 18 Jahren. Index (BMI) von 20,8 kg/m2 (+2,73 SDS) auffällig. Bei einem weiterhin normal verlaufenden Längenwachstum kam es zu einer weiteren Zunahme des BMI, sodass im Alter von 10 Jahren ein BMI von 33,2 kg/m2 (+3.1 SDS) festgestellt wurde. Ein Einsetzten der Pubertät (Tannerstadium B2) konnte im Alter von 11 Jahren erkannt werden. Bei einer Neuvorstellung im Alter von 18 Jahren wurde ein Körpergewicht von 122 kg bei einer Körperhöhe von 162,4 cm (-0,9 SDS) gemessen. Der daraus resultierende BMI von 46,5 kg/m2 (+4,26 SDS) führte zur Feststellung einer Adipositas permagna mit einer homogenen Verteilung des Fettgewebes und ohne Auftreten deutlicher Dehnungsstreifen. Die Familienanamnese war unauffällig, der BMI des 15 Jahre alten Bruders betrug 21,5 kg/m2, der BMI der Mutter 28,7 kg/m2 und der BMI des Vaters 24,5 kg/m2. Eine Untersuchung in der Psychiatrischen und Psychotherapeutischen Klinik des UK Erlangen unter Leitung von Frau Prof. Dr. med. Martina de Zwaan ergab keinen eindeutigen Hinweis auf eine klassische Essverhaltensstörung. Über routinediagnostische Untersuchungen konnte das Prader- Willi-Syndrom als Ursache ausgeschlossen werden, und auch Untersuchungen zu dem mit Adipositas assoziierten Trp64Arg-Polymorphismus im ß3-adreneger Rezeptor (ADRB3) waren ohne pathologischen Befund.

Material & Methoden

Zusätzlich zur Adipositas litt die Patientin, obwohl das 5. Tannerstadium der pubertären Entwicklung erreicht war, an einer primären Amenorrhoe. Die dazu gemessenen Laborwerte zeigten einen erniedrigten Wert an Estradiol im Serum (10 pg/ml), normale Werte an FSH (4,7 mU/ml) und LH (4.2 mU/ml), sowie überhöhte Werte für DHEAS (5232 ng/ml) und Testosteron (0,72 ng/ml) und führten so zur Feststellung eines hypogonadotropen Hypogonadismus (MIM #146110). Eine kongenitale adrenale Hyperplasie als Folge einer CYP21A2 Mutation bzw. Kopienzahländerung wurde routinediagnostisch ausgeschlossen. Des Weiteren litt die Patientin an wiederholten Infekten der oberen Atemwege sowie der kleinen Hautgefäße. In Bezug auf ihre kognitiven Fähigkeiten wurde im Alter von 16,5 Jahren ein HAWIK Test durchgeführt, welcher der Patientin einen IQ im unteren Normalbereich mit einem Wert von 83 ausstellte (operativer IQ: 89; verbaler IQ: 82). Die Patientin zeigte keine fazialen Auffälligkeiten, allerdings wurden leicht aufsteigende Lidachsen und ein etwas kleiner Mund festgestellt.

2.1.2.2 Karyotypisierung und Bruchpunkteingrenzung

Eine routinediagnostische Karyotypisierung der Patientin und deren Eltern wurde durch das zytogenetische Labor des Hauses unter Leitung von Dr. rer. nat. Udo Trautmann durchgeführt. Hierbei wurde die GTG-Bänderungstechnik mit einer Auflösung von 500 Banden pro haploiden Karyotyp angewandt und dabei eine später als balanciert erkannte de novo Translokation 46,XX,t(1;8)(p35.2;p11.2) bei der Patientin aufgedeckt. Die reziproke Translokation zwischen den beiden kurzen Armen der Chromosomen 1 und 8 wurde im Rahmen einer Diplomarbeit mit Hilfe der FISH-Methode (vgl. 2.2.7) bestätigt und die auftretenden Bruchpunktbereiche durch Verwendung geeigneter BAC-Sonden weiter eingegrenzt. Dabei konnten die beiden Bruchpunkt-überspannenden BAC-Klone, RP11-344H11 auf Chromosom 1 (Lokalisation bei ca. 27 Mb; hg18) und RP11-350N15 auf Chromosom 8 (Lokalisation bei ca. 38 Mb; hg18), identifiziert werden. Die damit erfolgte Eingrenzung auf 140 kb bzw. 163 kb wurde unter Anwendung der Mini-FISH- Methode (vgl. 2.2.7.3) weiter verfeinert, sodass die Bruchpunktregionen auf die Bereiche zwischen den erstellten Sonden 1_132-140 und 2_124-132 auf Chromosom 1 und den Sonden 1_101-109 und 6_619-699 auf Chromosom 8 eingegrenzt werden konnten. Zu Beginn meiner Arbeit waren somit die Bruchpunkte der Translokation auf eine 4-6 kb große Region auf Chromosom 1 (chr1:27,098,300-27,104,500 bp; hg18) und eine 100 kb große Region auf Chromosom 8 (chr8:38,322,500-38,422,000 bp; hg18) eingegrenzt.

Material & Methoden

2.1.2.3 Erste weiterführende Analysen der eingegrenzten Bruchpunktbereiche

Im Rahmen der oben genannten Diplomarbeit wurden erste Untersuchungen der eingegrenzten Bruchpunktbereiche durchgeführt. Dabei wurden in einem 4 Mb großen Bereich um die Bruchpunktregionen Kandidaten-Gene durch Literatur- und Datenbankrecherche ermittelt und anschließend deren Expression in nativen Lymphozyten der Patientin sowie 6 gesunden Kontrollindividuen unter Verwendung von 2 endogenen Kontrollen untersucht. qPCR-Analysen basierend auf SYBR Green (vgl. 2.2.9.2) ergaben dabei eine reduzierte Expression des mittig und komplett im Bruchpunktbereich auf Chromosom 8 lokalisierten, aber kaum charakterisierten Gens LETM2 (leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2). Weiterhin ergab sich ein Hinweis darauf, dass das mit dem Bruchpunktbereich teilweise überlappende Gen FGFR1 (fibroblast growth factor receptor 1), welches sich in der Literatur als Kandidat für den hypogonadotropen Hypogonadismus präsentierte [25] [26], tendenziell reduziert exprimiert sein könnte. Als Kandidaten-Gen für die Adipositas wurde das Gen NR0B2 (nuclear receptor subfamily 0, group B, member 2) in der Bruchpunktregion auf Chromosom 1 erkannt [27] [28] [29]. Für dieses konnte eine signifikant reduzierte Expression bei der Patientin, unter Berücksichtigung der auftretenden tageszeitlichen bzw. nahrungsaufnahmebedingten Expressionsschwankungen, mit Hilfe einer TaqMan- basierten qPCR (vgl. 2.2.9.1) nachgewiesen werden.

Material & Methoden

2.1.3 Patientin 46,XX,t(5;14) – Schwere Mentale Retardierung

2.1.3.1 Patientenbeschreibung

Bei einer Patientin, die sich mit einem dem Cri-du-Chat-Syndrom (MIM #123450) ähnlichen Phänotyp präsentierte, wurde eine mögliche Assoziation des Phänotyps mit dem Auftreten einer balancierten chromosomalen Translokation festgestellt. Die Patientin wurde am Institut für Humangenetik des UK Essen bei PD Dr. med. Dagmar Wieczorek mit einem Alter von 5 Jahren vorstellig, und war das Kind gesunder, nicht blutsverwandter Eltern. Bei der Patientin wurde eine Mikrozephalie, eine partielle Agenesie des Corpus callosum sowie eine Temporallappenhypoplasie festgestellt. Des Weiteren zeigte die Patientin eine verzögerte Myelinisierung. Zusätzlich waren eine Arachnoidalzyste der mittleren Schädelgrube sowie das Auftreten von Krampfanfällen ab dem 15. Lebensmonat auffällig. Die Patientin präsentierte sich mit einer schweren mentalen Retardierung zusammen mit einer ausgeprägten Entwicklungsstörung, die auch eine Sprachverzögerung beinhaltete. Darüber hinaus zeigte die Patientin in Bezug auf faziale Auffälligkeiten einen Hypertelorismus, einen Epikanthus sowie eine kurze Nase und einfach geformte Ohren. Zusammen mit den bisher genannten Symptomen war dadurch eine starke Ähnlichkeit mit dem Phänotyp des Cri-du-Chat-Syndroms gegeben, obwohl die für dieses Syndrom verantwortliche Region auf dem kurzen Arm von Chromosom 5 nachweislich nicht deletiert war.

2.1.3.2 Karyotypisierung und Bruchpunkteingrenzung

Eine routinediagnostische Karyotypisierung der Patientin und deren Eltern war zunächst im zytogenetischen Labor des UK Essen durchgeführt worden. Zur genaueren Charakterisierung wurde die Analyse bei der Patientin durch das zytogenetische Labor des Hauses unter Leitung von Dr. rer. nat. Udo Trautmann wiederholt. Hierbei wurde die GTG-Bänderungstechnik mit einer Auflösung von 500 Banden pro haploiden Karyotyp angewandt und dabei eine später als balanciert erkannte de novo Translokation 46,XX,t(5;14)(p15.3;q13.1) bei der Patientin definiert. Die reziproke Translokation zwischen dem kurzen Arm von Chromosom 5 mit dem langen Arm von Chromosom 14 wurde im Rahmen von Diplomarbeiten mit Hilfe der FISH-Methode (vgl. 2.2.7) bestätigt und die auftretenden Bruchpunktbereiche durch Verwendung geeigneter BAC-Sonden weiter eingegrenzt. Dabei konnten die beiden Bruchpunkt-überspannenden BAC-Klone identifiziert werden. Es stellte sich heraus, dass der BAC-Klon RP11-367F9 den Bruchpunkt auf Chromosom 5 (Lokalisation bei ca. 4 Mb; hg18) und R-562L8 den Bruchpunkt auf Chromosom 14 (Lokalisation bei ca. 29 MB; hg18) überspannte. Eine weitere Eingrenzung der 172 kb bzw. 180 kb großen Bereiche wurde mit Hilfe der Mini- FISH-Methode (vgl. 2.2.7.3) erreicht.

Material & Methoden

Zu Beginn meiner Arbeit waren somit die Bruchpunkte auf einen 27,4 kb großen Bereich auf Chromosom 5 (chr5:3,788,245-3,815,688 bp; hg18) zwischen den Sonden 367F9_1 und 367F9_2 und einen 38 kb großen Bereich auf Chromosom 14 (chr14:28,771,220-28,809,412 bp; hg18) zwischen den Sonden 562_3 und 154-162 eingegrenzt. Dies führte zur Korrektur der Translokationsformel zu 46,XX,t(5;14)(p15.33;q12). Vorrausgegangene Versuche der Generierung eines Bruchpunkt-überspannenden Long range-PCR-Produkts sowie weitere Bruchpunkteingrenzungen über Southernblot-Analysen waren ohne Erfolg.

2.1.3.3 Erste weiterführende Analysen der eingegrenzten Bruchpunktbereiche

Im Rahmen der oben genannten Diplomarbeiten wurden erste Untersuchungen der eingegrenzten Bruchpunktbereiche durchgeführt. Dabei wurden im Bereich von 4 Mb um die Bruchpunktregionen Kandidaten-Gene durch Literatur- und Datenbankrecherche, mit dem Kriterium einer möglichen Genfunktion in Nervenzellen, ermittelt. Eine mögliche differentielle Expression dieser Gene wurde anschließend in nativen Lymphozyten der Patientin im Vergleich zu mind. 4 gesunden Kontrollindividuen und unter Verwendung von 2 endogenen Kontrollen mittels qPCR-Analysen untersucht. SYBR Green-basierte qPCR (vgl. 2.2.9.2) zeigte dabei eine deutlich reduzierte Expression der auf 5p15.3 lokalisierten Gene CEP72 und PAPD7, während über TaqMan-basierte qPCR (vgl. 2.2.9.1) die starke Expressionsreduktion des ebenfalls auf 5p15.3 lokalisierten Gens TPPP festgestellt werden konnte. Da es sich hierbei ausschließlich um Gene mit Bedeutung für den Zellzyklus handelte, wurde unter Verwendung eines Human Cell Cycle RT2 Profiler PCR Arrays (Bioscience Corporation) nachgewiesen, dass 31 der in diesem Array untersuchten 84 Zellzyklus-Gene eine verminderte Expression zeigten (siehe 8.4). Daher wurde zu Beginn meiner Arbeit davon ausgegangen, dass der dem Phänotyp der Patientin zu Grunde liegende Pathomechanismus auf einer Dysregulation des Zellzyklus beruht. Die These war hierbei, dass diese Dysregulation durch eine über den chromosomalen Bruch auf Chromosom 5 vermittelte differentielle Expression der Zellzyklus-Gene CEP72, POLS und TPPP verursacht worden war.

Material & Methoden

2.1.4 Patientin 47,XXX,t(7;11) – DiGeorge-Syndrome-Like

2.1.4.1 Patientenbeschreibung

Bei einer Patientin, die einen Phänotyp ähnlich dem des DiGeorge-Syndroms (MIM #188400) zeigte, wurde, unter Berücksichtigung des bei ihr nachgewiesenen Triple-X- Syndroms, eine mögliche Assoziation des Phänotyps mit dem Auftreten einer balancierten chromosomalen Translokation festgestellt. Die Patientin war das zweite Kind körperlich gesunder, nicht blutsverwandter Eltern. Auffälligkeiten zeigten sich ausschließlich in der mütterlichen Linie, insofern, dass die Mutter der Patientin an Schizophrenie, und deren Mutter an psychischen Problemen litt. Außerdem war auffällig, dass der Neffe der Mutter eine Förderschule besuchte. Die Patientin wurde nach unauffälliger Schwangerschaft termingerecht und ohne Komplikationen geboren, allerdings bestanden nach Geburt Atemanpassungs- Schwierigkeiten. In einem Alter von 5 Tagen wurde ein Herzfehler, genauer ein Vorhof- und Ventrikel-Septumdefekt (ASD + VSD), festgestellt. Dieser wurde im Alter von 5 Monaten operativ korrigiert. Folglich trat eine Besserung der anfänglichen Ernährungs- und Gedeihstörungen (Körpergewicht im Alter von 5 Monaten 370g; < 3. Perzentile) auf, wobei aber eine grundsätzlich verzögerte Entwicklung der Patientin erkannt wurde. Sitzen war ihr erst mit 12 Monaten und freies Laufen mit 22 Monaten möglich, und auch die Entwicklung ihrer Sprache war verzögert. Erste Worte wurden im Alter von 3 Jahren gesprochen, und eine Schwäche des Wortschatzes und der Sprachbildung wurde, trotz vorausgehender entsprechender Förderung, im Alter von 6 Jahren diagnostiziert. Im non- verbalen Bereich wurde ihr ein IQ von 94 attestiert. Des Weiteren zeigte sie Schwächen im Bereich der sensomotorischen Basiswahrnehmungen und litt zusätzlich ab dem Alter von 5 Jahren an einer juvenilen myoklonischen Epilepsie. Insgesamt wurde ihr somit ein unklares Retardierungssyndrom attestiert. Ihr Körpergewicht sowie Körperhöhe und Kopfumfang waren, in Übereinstimmung mit ihrem familiären Hintergrund, im unteren Normbereich angesiedelt. Die Patientin zeigte, in Bezug auf äußerliche Auffälligkeiten, eine kurze Mundspalte, einen relativ breiten Nasenrücken, eine nasal klingende Sprache, eine Ohrmuscheldysplasie sowie relativ lange, schlanke Finger. Im Zusammenhang mit dem oben genannten Herzfehler führte dies zu einem Verdacht auf DiGeorge-Syndrom und damit zu einem primären Verdacht auf Monosomie 22q11.2. Bei der Analyse des mit diesem Syndrom einhergehenden Parathormondefektes wurde ein latenter Vitamin-D- Mangel festgestellt.

Material & Methoden

2.1.4.2 Karyotypisierung und DiGeorge-Syndrom-Diagnostik

Eine FISH-Analyse (vgl. 2.2.7) auf Monosomie in der DiGeorge-relevanten Region 22q11.2 bei Patientin und Mutter sowie eine routinediagnostische Karyotypisierung der Patientin und beider Eltern, basierend auf der GTG-Bänderungstechnik (500 Banden pro haploiden Karyotyp), wurden durch das zytogenetische Labor des Hauses unter Leitung von Dr. rer. nat. Udo Trautmann durchgeführt. Eine Monosomie 22q11.2 wurde dabei ausgeschlossen, und auch eine anschließende Sequenzierung (vgl. 2.2.5) des in diesem Bereich gelegenen DiGeorge-Syndrom-Gens TBX1 (T-box 1) war ohne pathologischen Befund. Allerdings zeigte der für die Patientin auffällige Karyotyp 47,XXX,t(7;11)(p15.3;p15.3) das Vorliegen einer Triple-X-Konstitution, sowie einer später als balanciert erkannten de novo Translokation zwischen den kurzen Armen von Chromosom 7 und 11. Da das Triple-X-Syndrom nicht mit derartigen Dysmorphien oder Auftreten von Herzfehlbildungen assoziiert ist, wurde an dieser Stelle von einer möglichen Assoziation des DiGeorge-ähnlichen Phänotyps mit der balancierten Translokation ausgegangen. Für die zur Untersuchung dieser These nötige Bruchpunktcharakterisierung war vor Beginn meiner Arbeit nur der Bruchpunktbereich auf Chromosom 11 mittels FISH auf einen 2 Mb großen Bereich (chr11:9,233,343-11,075,367 bp; hg18) voreingegrenzt worden.

Material & Methoden

2.2 Methoden

2.2.1 Biologisches Material

2.2.1.1 DNA-Isolation aus humanem Blut

Die Isolation von DNA aus peripheren Blut-Leukozyten von Patienten wurde routinemäßig durch das Gen-Diagnostiklabor des Hauses unter Leitung von Dr. rer. nat. C. Kraus durchgeführt. Die DNA-Konzentration und Reinheit wurde am Infinite 200 NanoQuant (Tecan) bestimmt.

2.2.1.2 RNA-Isolation aus humanem Blut

Die Isolation von RNA aus Blutproben von Patienten erfolgte unter Verwendung von PAXgene Blood RNA tubes (Becton Dickinson) in Kombination mit dem PAXgene Blood RNA Kit v2 (Becton Dickinson) nach Angaben des Herstellers durch Mitarbeiter des Hauses. Die RNA-Konzentration und Reinheit wurde am Infinite 200 NanoQuant (Tecan) bestimmt.

2.2.2 Amplifikation gesamtgenomischer DNA (Whole Genome Amplification)

Dem Problem, dass zu analysierendes DNA-Material oftmals in seiner Menge begrenzt ist, kann mit Hilfe der Methode der Whole Genome Amplification (WGA) begegnet werden. Mit dieser, auf der Enzymreaktion von Phi29-Polymerase beruhenden Methode ist es möglich, genomische DNA ab einer Menge von 10 ng bis auf 4-7 µg zu amplifizieren. Hierfür wurde das illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit von GE Healthcare nach Angaben des Herstellers verwendet. Um mögliche Artefakte der Reaktion auszuschliessen, wurden an WGA-DNA erhaltene Ergebnisse stets an Original-DNA validiert.

2.2.3 Gelelektrophorese

Die Gelelektrophorese stellt eine Standardmethode zum Auftrennen, Sichtbarmachen und darüber hinaus zur Aufreinigung von Nukleinsäuren dar. Nukleinsäure-Moleküle wandern auf Grund ihrer negativen Ladung bei Anlegen einer Spannung in Richtung der positiven Elektrode. In der Gelelektrophorese durchlaufen sie dabei ein molekulares Sieb bestehend aus einem Agarose-Gel bestimmter Konzentration. Abhängig von der Molekülgröße werden die sich im elektrischen Feld bewegenden Nukleinsäuren unterschiedlich stark von der Gelmatrix in ihrer Wanderung behindert, sodass eine Auftrennung nach Molekülgröße stattfindet. Bei einer erwarteten Molekülgröße von bis zu 1 kb Länge wurde ein 1,5 % Agarose-Gel verwendet. Zur Auftrennung größerer

Material & Methoden

Fragmente wurde ein 1% Agarose-Gel hergestellt. Dazu wurde eine Tris-Borat-EDTA- Puffer (TBE) verwendet, der auch als Laufpuffer diente. Zur späteren Sichtbarmachung der Nukleinsäuren wurde dem Gel 0,01 µg/ml Ethidiumbromid zugegeben. Die elektrophoretische Auftrennung der mit ½ Vol DNA-Ladepuffer versetzten Proben erfolgte bei 80-120 V für 30 min und zur Größenbestimmung wurden verschiedene Molekulargewichtsstandards mitgeführt. Für die Visualisierung der Fragmente wurde das in die Nukleinsäuren interkalierte Ethidiumbromid unter einem UV-Transilluminator zur Fluoreszenz angeregt und mit einer Kamera dokumentiert (BioDocAnalyze, Biometra).

2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase-Kettenreaktion stellt eine grundlegende Methode in der molekularen Biologie dar. Sie ermöglicht das unkomplizierte, exponentielle Vervielfachen (Amplifikation) eines spezifischen DNA-Abschnittes (Amplikon) aus einer gegebenen DNA-Sequenz (Template) durch thermostabile DNA-Polymerasen in vitro. Der DNA- Abschnitt und die Spezifität seiner Amplifikation werden dabei durch die Wahl der eingesetzten Primer bestimmt, die als Startpunkte der Polymerase-Kettenreaktion dienen.

2.2.4.1 Primerdesign

In dieser Arbeit wurden die Primer unter Verwendung des Programms Primer3 [30] entworfen. Ihre Spezifität und Lage wurde durch Verwendung des Programms Human BLAT Search (UCSC Genome Bioinformatics) kontrolliert. Hierbei wurde darauf geachtet, dass im Bereich der Primer weder SNPs (Single Nuclear Polymorphisms) noch repetitive Sequenzabschnitte vorkamen. Die Parameter für Standardprimer wurden so gesetzt, dass bei einer Oligonukleotidlänge von 18-25 bp eine Schmelztemperatur von 56-63°C und ein GC-Gehalt von 20-80% eingehalten wurden. Für optimale Polymerase- Initiationsbedingungen wurde ein am 3´ Ende gelegenes GC-Basenpaar (GC-clamp) favorisiert aber nicht forciert. Primer wurden von der Firma Thermo Scientific bezogen.

2.2.4.2 Standard-PCR

Die PCR wurde standardmäßig in 15 µl Ansätzen, mit der in Tab. 1 gezeigten Zusammensetzung, durchgeführt. Als Template wurden 20 – 80 ng DNA eingesetzt und als Standard-Enzym wurde die Taq DNA Polymerase von Invitrogen verwendet. Tabelle Tab. 2 zeigt das mit einem MBS SATELLITE 0.2G Thermal Cylcer (Thermo Scientifc) oder Eppendorf vapo.protect Mastercycler pro (Eppendorf) standardmäßig verwendete Touchdown-PCR-Programm, welches durch seinen Annealing-Temperatur-Gradienten für die meisten verwendeten Primer-Kombinationen funktional war. Abhängig von Template

Material & Methoden und verwendeten Primer-Paaren waren Variationen der Amplifikationsbedingungen durch Verwendung alternativer PCR-Programme (z.B. Tab. 4, Tab. 5) oder verschiedener Taq-Polymerasen (vgl. 2.3.2) notwendig. Für besonders schwierige Templates, die sich meist durch hohen Gehalt an Guanin- und Cytosin-Basen (GC-rich) auszeichneten, wurde das GC-RICH PCR System von Roche nach Angaben des Herstellers mit dem in Tab. 3 dargestellten Programm verwendet. Zur Überprüfung der Amplifikation wurde 4µl des PCR-Ansatzes gelelektrophoretisch aufgetrennt (vgl. 2.2.3).

Tab. 1 PCR-Ansatz

HPLC-Wasser 6,5 µl Betain (50 mM) 3 µl 10x TaqReaction buffer 1,5 µl dNTP (10 pmol/µl) 1 µl DMSO 0,75 µl MgCl2 (50mM) 0,45 µl Taq DNA Polymerase 0,12 µl (Invitrogen) Template (20-100 ng) 1 µl F-Primer (10 pmol/µl) 0,5 µl R-Primer (10 pmol/µl) 0,5 µl Gesamt ~15 µl

Tab. 2 PCR-Programm: Cx32

Temperatur Zeit Zyklenzahl 94°C 3 min

94°C 20 sek 65°C - 1°C/Zyklus 1 min x 9 68°C 1 min

94°C 20 sek 55°C 1 min x 29 68°C 1 min 68°C 10 min

15°C 5 min

Tab. 3 PCR-Programm: GCRICH_60_1kb

Temperatur Zeit Zyklenzahl 95°C 3 min

95°C 30 sek 60°C 30 sek x 11 68°C 45 sek

95°C 30 sek 60°C 30 sek + 5 sek/Zyklus x 25 68°C 45 sek + 5 sek/Zyklus 68°C 10 min

4°C 1 min

Material & Methoden

Tab. 4 PCR-Programm: TD_65-55-72

Temperatur Zeit Zyklenzahl 94°C 2 min

94°C 45 sek 65°C - 0,5°C/Zyklus 45 sek x 21 72°C 105 sek

94°C 45 sek 55°C 45 sek x 20 72°C 105 sek 72°C 10 min

15°C 10 min

Tab. 5 PCR-Programm: Touch_65-57

Temperatur Zeit Zyklenzahl 94°C 2 min

94°C 20 sek 65°C - 0,5°C/Zyklus 1 min x 16 72°C 1 min

94°C 20 sek 57°C 1 min x 25 72°C 1 min 72°C 10 min

15°C 5 min

2.2.4.3 Long-Range-PCR (LR-PCR)

Die Long-Range-PCR (LR-PCR) ist eine speziell für die Amplifikation von großen DNA- Fragmenten optimierte Form der Polymerase-Kettenreaktion. Mit ihr sind Amplifikate mit einer Länge von über 20 kb möglich, wohingegen mit einem Standard-PCR-Ansatz auch bei entsprechender Verlängerung der Elongationszeiten nur wenige kb erreichbar sind. Die in dieser Arbeit dafür verwendeten Kits Expand 20 kbPLUS PCR System (Roche) und Expand Long Range (Roche) nutzten hierfür einen speziellen Enzym-Mix aus thermostabiler Taq DNA Polymerase und einer thermostabiler DNA Polymerase. Dabei wurde ausgenutzt, dass die DNA Polymerase durch ihre 3´-5´ Exonuklease-Aktivität befähigt ist Polymerase-Fehler zu neutralisieren (Proofreading), die sonst zu einem verfrühten Abbruch der Polymerase-Reaktion in einer darauffolgenden Amplifikationsrunde führen würden. Dadurch ermöglicht diese Proofreading-Funktion ein Amplifikat von maximaler Länge. Für diese spezielle Form der PCR war es notwendig die Parameter für das Entwerfen von Primern zu modifizieren (vgl. Primerdesign). Primer wurden so gewählt, dass bei einer Oligonukleotidlänge von 25-30 bp eine Schmelztemperatur von 60-70°C mit einem Optimum bei 66°C und ein GC-Gehalt von

Material & Methoden

45-65% eingehalten wurden. Bei der Verwendung beider Kits wurde standardmäßig in 12 µl Ansätzen und auf Eis gearbeitet. Die Reaktion wurde in beiden Fällen direkt nach Zugabe des Enzyms gestartet. Für das Expand Long Range Kit hatte der Ansatz dabei die in Tab. 6 gezeigte Zusammensetzung. Bei Verwendung des Expand 20 kbPLUS PCR System Kits wurde zunächst ein Mastermix mit der in Tab. 7 gezeigten Zusammensetzung hergestellt, verteilt und je Ansatz mit 0,25 µl Forward- und 0,25 µl Reverse-Primer ergänzt. Direkt vor Reaktionsstart wurde ein zweiter Enzym- beinhaltender Mastermix (Tab. 8) auf die Ansätze verteilt. Für alle Long-Range-PCR- Ansätze wurden das in Tab. 9 dargestellte Programm Expand_20KBPlus_62_12µl in Verbindung mit einem MBS SATELLITE 0.2G Thermal Cylcer (Thermo Scientifc) benutzt.

Tab. 6 Ansatz Expand Long Range

HPLC-Wasser 7,3 µl 5x Buffer + MgCl2 2,5 µl dNTP-Mix 0,63 µl DMSO 0,63 µl Template 0,5 µl Enzyme mix 0,2 µl F-Primer 0,25 µl R-Primer 0,25 µl GESAMT ~ 12 µl

Tab. 7 20_kbPLUS Mastermix 1

Nukleotide Mix 0,625 µl Template 0,5 µl HPLC-Wasser 4,625 µl GESAMT 5,75 µl

Tab. 8 20_kbPLUS Mastermix 2

Reactionbuffer 1,25 µl HPLC-Wasser 4,75 µl Enzyme mix 0,25 µl GESAMT 6,25 µl

Tab. 9 LR-PCR-Programm

Temperatur Zeit Zyklenzahl 92°C 2 min

92°C 10 sek 62°C 30 sek x 10 68°C 23 min

92°C 10 sek 62°C 30 sek x 35 68°C 23 min + 10 sek/Zyklus 68°C 7 min

15°C 5 min

Material & Methoden

2.2.4.4 Aufreinigung von PCR Produkten

Um für nachfolgende Reaktionen die in der PCR-Reaktion noch enthaltenen überschüssigen dNTPs, Primer und Salze zu entfernen, sind verschiedene Aufreinigungen möglich.

2.2.4.5 Ampure-Aufreinigung

Standardmäßig wurde die PCR-Aufreinigung unter Verwendung eines Biomek NX Pipettier-Roboters (Beckman Coulter) in Kombination mit dem AMPure Kit (Agencourt) durchgeführt. Diese Aufreinigung basiert auf der reversiblen Bindung von PCR-Produkt an magnetischen Kügelchen (magnetic beads). Das gebundene PCR-Produkt wird so über Magnetwirkung während der Waschung mit Ethanol im PCR-Gefäß zurückgehalten und kann anschließend eluiert werden.

2.2.4.6 Exonuklease-Phosphatase-Verdau

Alternativ kann PCR-Produkt durch Exonuklease-Phosphatase-Verdau enzymatisch von dNTPs und Primer befreit und so für eine anschließende Sequenzierung vorbereitet werden. Ein entscheidender Vorteil dieser Methode besteht darin, dass kein Verlust an PCR-Produkt stattfindet, was besonders bei schwachen Produkten entscheidend ist. Das Enzym Exonuklease I degradiert dabei überschüssige Primer der PCR-Reaktion, während die Hydrolyse von dNTPs durch antarktische Phosphatase vermittelt wird. Hierzu wurden auf einen 15 µl PCR-Ansatz 0,15 µl Exonuklease I (NEB), 0,3 µl antarktische Phosphatase (NEB) sowie 4,55 µl HPLC-Wasser gegeben. Es folgte eine Inkubation von 15 min bei 37°C mit einer anschließenden Hitzeinaktivierung der Enzyme durch 15 min 80°C. Die aufgereinigte PCR wurde standardmäßig für eine nachfolgende Sequenzierreaktion mit 50 µl HPLC-Wasser verdünnt.

2.2.5 Sequenzierung

2.2.5.1 Sequenzier-Reaktion

Die angewandte Methode zur automatisierten DNA-Sequenzierung aufgereinigter (vgl. 2.2.4.4) PCR-Produkte beruhte auf dem Kettenabbruch-Verfahren nach Sanger et al. (1977) [31] unter Verwendung fluoreszierender Didesoxynukleotide nach Lee et al. (1992) [32]. Hierzu wurde das BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) verwendet. Die Sequenzierreaktion wurde standardmäßig in 10 µl Ansätzen, mit der in Tab. 10 gezeigten Zusammensetzung durchgeführt. Tabelle Tab. 11 zeigt das mit einem MBS SATELLITE 0.2G Thermal Cylcer (Thermo Scientifc) oder Eppendorf vapo.protect Mastercycler pro (Eppendorf) durchgeführte Sequenzier-Programm.

Material & Methoden

Tab. 10 Ansatz Sequenzierung

HPLC-Wasser 2,5 µl BigDye Sequencing Buffer 2 µl BigDye 0,25 µl F- oder R-Primer (10 pmol/µl) 0,25 µl PCR Produkt (aufgereinigt) 5 µl Gesamt 10 µl

Tab. 11 Programm Sequenzierung

Temperatur Zeit Zyklenzahl 96°C 10 sek 55°C 10 sek x25 60°C 2 min 15°C 10 min

2.2.5.2 Aufreinigung der Sequenzierreaktion

Im Anschluss zur Sequenzierreaktion wurde eine Aufreinigung unter Verwendung eines Biomek NX Pipettierroboters (Beckman Coulter) in Kombination mit dem CleanSEQ Kit (Agencourt) durchgeführt. Es handelt sich dabei um eine auf Magnetismus beruhende Aufreinigung vergleichbar mit der von PCR-Produkten durch das AMPure Kit (Agencourt) (vgl. 2.2.4.5).

2.2.5.3 Analyse und Auswertung der Sequenzierung

Zur automatisierten Sequenzanalyse wurde ein ABI Genetic Analyzer 3730 (Applied Biosystems) verwendet, und die erhaltenen Rohdaten wurden mittels der Sequencing Analysis 5.1 Software (Applied Biosystems) ausgewertet. Für weiterführende Untersuchungen wurden zudem die Programme SeqPilot 3.2.1. (JSI Medical Systems), SeqManII 5.03 (DNA Star Inc.) und EditSeq 5.03 (DNA Star Inc.) benutzt. Für einen Abgleich der erhaltenen Sequenzen mit den Genom-Annotationen NCBI36/hg18 und GRCh37/hg19 wurden die Online-Programme Human BLAT Search (UCSC Genome Bioinformatics) und BLAST (NCBI) verwendet.

2.2.6 Bruchpunkt-Sequenzierung

Bei einer reziproken, balancierten Translokation findet ein gegenseitiger Austausch von Chromosomenabschnitten zwischen den beteiligten Chromomen statt ohne Verlust oder Zugewinn genetischen Materials. Die dabei entstehenden derivativen Chromosomen setzten sich folglich aus Chromosomenteile zusammen, welche von unterschiedlichen ursprünglichen Chromosomen stammen.

Material & Methoden

Ziel der Bruchpunkt-Sequenzierung war das Basen-genaue Lokalisieren der Bruchpunkte von reziproken, balancierten Translokationen. Hierzu wurden auf den derivativen Chromosomen die Übergänge zwischen den Chromosomenabschnitten unterschiedlichen Ursprungs sequenziert. Voraussetzung hierfür war ein über LR-PCR (vgl. 2.2.4.3) generiertes Bruchpunkt-überspannendes PCR-Produkt. Um dieses herzustellen, wurden Primer in den durch FISH (vgl. 2.2.7) und Mini-FISH (vgl. 2.2.7.3) grob eingegrenzten Bruchpunktbereichen entworfen (vgl. 2.2.4.1). Die Primer wurden so konzipiert, dass die Forward-Primer im Bruchpunktbereich des einen beteiligten Chromosoms und die Reverse-Primer im Bruchpunktbereich des anderen beteiligten Chromosoms hybridisierten. Um die eingegrenzten aber oft noch etliche Kilobasen großen Bruchpunktbereiche komplett in die Analyse einzubeziehen, wurden Primer in Abständen von 5 kb über den gesamten relevanten Bereich entworfen. In der auf Grund der zu erwartenden Produktgrößen notwendigen, sich anschließenden LR-PCR wurden eine Vielzahl von Kombinationen zwischen Forward- und Reverse-Primern ausgetestet, auch unter Verwendung verschiedener Kit-Systeme. Sich in der Gelelektropherese (vgl. 2.2.3) als spezifisch darstellende Produkte wurden anschließend zur Überprüfung sequenziert (vgl. 2.2.5). Hierzu wurden zunächst die für die Long-Range-PCR verwendeten Primer genutzt. Bei Verdachtserhärtung eines Bruchpunkt-überspannenden Produkts wurden weitere interne Primer entworfen und in die Sequenzierung des LR-PCR-Produkts eingesetzt (Nested PCR), bis eine Bruchpunkt-überspannende Sequenz erhalten wurde. Daraus ergab sich der Rückschluss auf die basengenaue Position des Bruches in Bezug auf die ursprünglichen Chromosomen.

2.2.7 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Die Hybridisierung spezifischer Fluoreszenz-markierter DNA-Sonden mit genomischer DNA in situ ermöglicht die direkte Visualisierung der Sondenpositionen auf chromosomaler Ebene mittels Fluoreszenz-Mikroskopie. Durch diese Technik ist es daher möglich genetische Veränderungen, wie Imbalancen oder Translokationen, anzuzeigen und den Lokus der dabei auftretenden chromosomalen Bruchpunkte näher einzugrenzen. Die FISH bietet somit eine Ergänzung zur konventionellen Chromosomendarstellung durch eine routinediagnostische Karyotypisierung basierend auf der GTG- Bänderungstechnik.

2.2.7.1 Herstellung von FISH-Sonden

. BAC-Präparation

Als BAC-Klone (bacterial artificial chromosome) werden Klone von E.coli-Bakterien bezeichnet, die spezifische, bis ca. 300 kb große Sequenzabschnitte des humanen Genoms auf ihren, vom bakteriellen Fertilitäts-Plasmid abstammenden Low-Copy-

Material & Methoden

Plasmiden tragen. Für die mit FISH zu untersuchenden, genomischen Bereiche wurden BAC-Klone zur Generierung von Sonden unter Verwendung des NCBI- und UCSC- Browsers ausgewählt und von CHORI-BACPAC Resources (Children´s Hospital Oakland Research Institute, CA, USA) bezogen. Die in dieser Arbeit verwendeten BAC-Klone sind in Tabelle (Liste BAC-Klone) gelistet. Die gentechnisch veränderten Bakterien wurden auf Agar-Platten mit Antibiotikum (8 µg/l Chloramphenicol bzw. 50 ng/l Kanamycin) entsprechend ihrer Resistenz ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne Klone wurden dann in einer Vorkultur in 5 ml LB-Medium und 80 ng Chloramphenicol bzw. 250 pg Kanamycin für 7 Stunden bei 37°C unter Schütteln bei 200 rpm bebrütet. 425 µl dieser Vorkultur wurden unter Zugabe von 80 µl Glycerin, sofortigem mischen und wegfrieren bei -80°C zur Reserve aufbewahrt. 400 µl der Vorkultur wurden in 200 ml LB, versetzt mit 3,2 µg Chloramphenicol bzw. 10 ng Kanamycin, überführt. Die Inkubation der Hauptkultur fand bei 37°C unter Schütteln bei 200 rpm über Nacht statt. Die anschließende Isolierung der Low-Copy-Plasmide wurde unter Verwendung des QIAGEN Plasmid Midi Kits unter Abänderung des Herstellerprotokolls durchgeführt. Die Kultur wurde mit 2820 g bei 4°C für 15min zentrifugiert und das Pellet in 10ml RNase- versetzten P1-Puffer resuspendiert. Für die folgende Lyse wurden 10 ml P2 zugegeben, 5x invertiert und 5 min bei RT inkubiert. Es folgte die Neutralisation mit 10 ml eiskaltem P3-Puffer und anschließender Inkubation auf Eis mit mehrmaligen Invertieren in 5 minütigem Abstand. Anschließend wurde bei 19400 rcf für 30 min bei 4°C zentrifugiert und der erhaltene Überstand mit einem einfachen, vorbefeuchteten Filter filtriert. Die QIAGEN-Säule wurde mit 4 ml QBT equilibriert, anschließend mit dem Filtrat beladen, 3x mit 10 ml QC gewaschen und mit 5x 1ml QF (60°C) eluiert. Die erhaltene DNA wurde mit 3,5 ml Isopropanol unter starkem Schütteln gefällt. Nach Zentrifugation bei 13810 rcf bei 4°C für 30 min wurde das Pellet in 500 µl 70% Ethanol gewaschen und der Überstand nicht sofort verworfen, sondern zur Maximierung der Ausbeute nochmals für 3 min bei 1550 g zentrifugiert und durch Absaugen auf 500µl Restvolumen reduziert. Nach kurzem Resuspendieren wurde dieses Restvolumen zum gewaschenen Pellet gegeben. Nach Zentrifugation mit 15700 rcf für 15 min wurde der Überstand verworfen und der restliche Alkohol bei RT verdampft. Das erhaltene Plasmid-Pellet wurde in 30µl TE 10/1 über Nacht unter Schütteln bei 500 rpm gelöst. Die DNA-Konzentration und Reinheit wurde am Infinite 200 NanoQuant (Tecan) bestimmt.

. Fluoreszenzmarkierung von DNA mittels Nick-Translation

Bei der Sondenherstellung durch Nick-Translation werden durch das Enzym DNAse I Einzelstrangbrüche („Nicks“) an zufälliger Position in der zu markierenden DNA generiert. Die dabei entstehenden 3´Enden dienen als Ansatzpunkt für die E.coli-DNA- Polymerase I, die sowohl eine 5´-3´-Exonuklease-Aktivität als auch eine 5´-3´- Polymerase-Aktivität besitzt. Ausgehend von solchen „Nicks“ ersetzt dieses Enzym den

Material & Methoden

Einzelstrang in 3´-Richtung, wobei hierbei vorher zugegebene, fluoreszenzmarkierte Nukleotide verbaut werden. Somit wird die gesamt DNA durch eine neusynthethisierte, markierte DNA ersetzt. Die Durchführung der Methode erfolgte nach dem Protokoll von Roche. In die Reaktion wurde 1 µg der isolierten Plasmid-DNA eingesetzt und diese mit Ampuva-Wasser auf 12 µl Gesamtvolumen eingestellt. Nach Zugabe von 4 μl Nick- Translation-Enzym-Mix wurden 4 μ l des 5x konzentrierten Cy3-Mix zugeben, welcher neben den Standardnukleotiden dATP, dTTP, dGTP auch Cy3-markiertes dCTP enthielt. Der Ansatz wurde gemischt, abzentrifugiert und für 2 h bei 15°C inkubiert. Der Abbruch der Reaktion erfolgte durch Zugabe von 20 µl des Stop-Mixes. Die Sonden-DNA wurde anschließend mit 60 µl TE 10/1 verdünnt und über eine Sephadexsäule aufgereinigt. Die Säulen dazu wurden selbst hergestellt, indem 1 ml-Einwegspritzen bis zur Markierung 0,1 ml mit Glaswollen gestopft, danach mit Sephadex befüllt und für anschließende Schritte in Reagenzgläser gestellt wurden. Nach Zentrifugation mit 1550 rcf für 3 min wurde wieder mit Sephadex aufgefüllt und nochmal bei gleichen Parametern zentrifugiert. Anschließend wurde zum Spülen auf das in der Säule stehende Sephadex 100 µl TE 10/1 gegeben und wiederrum bei 1550 rcf für 3 min zentrifugiert. Die fertigen Säulen wurden in deckellose Eppendorf-Gefäße zum späteren Auffangen des Eluats gestellt und bei 4°C aufbewahrt. Nach Zugabe der Sonden-DNA wurde die Säule für 6 min bei 1550 rcf zentrifugiert und das Eluat zu einer Mischung bestehend aus 500 µl 100% Ethanol, sowie 2 µl HTD (Heringssperma-DNA) und 2 µl Cot-1-DNA (humane Plazenta-DNA) gegeben. Es handelt sich hierbei um „Kompetitions-DNA“, die repetitive Sequenzen auf der Sonden- DNA blockieren soll, um einer späteren, unspezifischen Hybridisierung der Sonde entgegenzuwirken. Zum vollständigen Fällen der Sonden-DNA wurde bei -80°C für 1 h oder bei -20°C über Nacht inkubiert. Nach Zentrifugation bei 15700 rcf bei 4°C für 30 min wurde der Überstand verworfen und das Pellet in 500 µl 70% Ethanol vorsichtig gewaschen. Nach einer weiteren Zentrifugation bei 15700 rcf für 5 min wurde der Überstand abgenommen und das Pellet unter Verwendung einer SpeedVac vakuumgetrocknet und in 30 µl Dextransulfat (20%) resuspendiert. Die fertige, konzentrierte Sonde wurde 1:10 mit Dextransulfat (20%) für den Einsatz in der FISH verdünnt und bei -20°C gelagert.

2.2.7.2 FISH Durchführung

. Herstellung der Chromosomenpräparate

Objektträger wurden über Nacht in Pril-Wasser eingelegt, danach mehrmals mit destilliertem Wasser gespült und bis zu ihrer Verwendung in OT-Lagerungsgemisch aufbewahrt. Bei Gebrauch wurden Objektträger mehrfach mit Aqua dest. gespült und anschließend mit einer Gummilippe trocken gezogen. Im Folgenden wurden Metaphase- Suspensionen aus Lymphozyten bzw. lymphoblastoiden Zell-Linien von Patienten,

Material & Methoden hergestellt durch das zytogenetische Labor des Hauses nach Standardprotokoll mit anschließender Lagerung in 3:1-Methanol-Eisessig-Gemisch, verwendet. 50 µl gut gemischter Zellsuspension wurde langsam aus ca. 2 cm Höhe aufgetropft und durch kreisförmiges Schwenken verteilt. Nach Eintrocknen der Suspension wurde die Aufspreitung der Mitosen unter dem Lichtmikroskop geprüft.

. Vorbehandlung

Die Objektträger mit der aufgespreiteten Zellsuspension wurden 5 min in 1x PBS (RT) unter Schütteln gespült und dann genau 8 min bei 37°C in vorgewärmter Pepsin-Lösung (0,005%) zum Verdau von Proteinen inkubiert. Dieser Schritt ist notwendig, um die chromosomale DNA für die spätere Hybridisierung mit Sonden besser zugänglich zu machen. Zum Inaktivieren des Pepsins wurden die Objektträger in 1x PBS/MgCl2 für 5 min bei RT geschüttelt. Die Fixierung mit 1% Formaldehyd-Lösung fand unter Schütteln für 10 min bei RT statt. Nach 5 minütiges Spülen in 1x PBS unter Schütteln und einer Dehydrierung durch eine aufsteigenden Ethanolreihe (70%, 90%, 100% je 5 min, RT) wurden die Objektträger zum Trocknen gestellt.

. Denaturierung und Hybridisierung

Auf den vollständig trockenen Objektträger aus der Vorbehandlung wurden standardmäßig 1,5 - 2 µl der 1:10 verdünnten Sonde gegeben. Die Möglichkeit ein Präparat mit mehreren verschiedenen Sonden zu versehen wurde ebenfalls genutzt. Nach Auflegen des Deckglases wurde die Sonde falls nötig durch leichten Druck verteilt. Der Deckglasrand wurde mit Fixogum-Masse abgedichtet. Die Denaturierung erfolgte durch Auflegen des Objektträgers auf eine 75°C heiße Metallplatte für 5 min. Zur Hybridisierung wurde der Objektträger für 2 Nächte in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert.

. Posthybridisierungswaschung

Nach der Inkubation wurde das Fixogum vorsichtig entfernt, sowie das Deckglas vorsichtig seitlich abgeschoben. Es folgte die Posthybridisierungswaschung mit dem Ziel ungebundene Sonden zu entfernen. Der Objektträger wurde für 2 min in 72°C heißen 0,4x SSC-HCl-Puffer gewaschen und anschließend in 4x SSC/0,2% Tween kurz gespült. Für die Gegenfärbung der Chromosomen wurden 50 µl DAPI-Lösung auf den Objektträger pipettiert, mit einem Deckglas bedeckt und abgedunkelt für 4 min inkubiert. Nach Abschütteln des Deckglases und kurzem Spülen mit Aqua dest. wurde der Objektträger trocken geföhnt. Danach wurden 20 μl Antifade perlenschnurartig aufpipettiert und nach Aufbringen eines Deckglases durch leichtes Aufdrücken mit einer Pinzettenspitze verteilt. Das fertige Präparat wurde bei -20°C gelagert.

Material & Methoden

. Fluoreszenzmikroskopie

Zur Ergebnisbetrachtung der FISH wurde ein Zeiss Axioplan2-Fluoreszenzmikroskop verwendet. Durch Anregung der Cy3-fluoreszenzmarkierten Sonden bzw. von DAPI mit Licht entsprechender Wellenlänge (maximale Anregung bei 552 bzw. 355 nm Wellenlänge) und unter Verwendung geeigneter optischer Filter für das dabei emittierte Lichtsignal (maximale Emission bei 565 bzw. 460 nm Wellenlänge) wurden die Sonden mikroskopisch sichtbar. Zur Aufnahme wurde die Videokamera IMAC-CCD S30 verwendet. Die Auswertung geschah über das Programm Isis 3 von MetaSystems.

2.2.7.3 Mini-FISH

FISH-Sonden basieren auf Low-Copy-Plasmid-DNA aus BAC-Klonen mit einer durchschnittlichen Länge von ca. 150 kb. Da die Auflösung der durch FISH erhaltenen Ergebnisse direkt von der Größe der Sonden abhängig ist, kann für eine genauere Analyse eines durch BAC-Sonden identifizierten Genombereichs die Methode der Mini- FISH angewandt werden. Diese Methode basiert auf wesentlich kleineren Sonden und ermöglicht so eine weitere Eingrenzung des durch BAC-FISH ermittelten Bereiches. Für die Synthese solcher Mini-FISH-Sonden wurden mittels Long-Range-PCR (vgl. 2.2.4.3) 5- 15 kb große Fragmente der BAC-DNA amplifiziert. Nach anschließender Aufgereinigung (vgl. 2.2.4.5) wurde das Produkt mittels Nick-Translation (vgl. 2.2.7.1) mit leichten Abänderungen zum Standardprotokoll markiert: Die Inkubationszeit wurde auf 30 min 15°C verkürzt und es wurde auf den Einsatz von Cot-1-DNA verzichtet. Die unverdünnte Mini-FISH-Sonde wurde direkt in die FISH nach Standardprotokoll eingesetzt.

2.2.8 Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

Die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion dient im Wesentlichen der Untersuchung des Transkriptoms. Der wichtige Unterschied zu einer Standard-PCR (vgl PCR) ist dabei, dass als Template nicht DNA sondern cDNA (complementary DNA) eingesetzt wird. cDNA ist dabei eine durch das Enzym Reverse Transkriptase aus RNA hergestellte komplementäre DNA, durch die es ermöglicht wird eine PCR indirekt an einem RNA-Template durchzuführen, und dieses über indirekte Amplifikation nachzuweisen. In der Regel werden hierzu für mRNA-Untersuchungen die Primer in unterschiedliche Exons des Transkripts gelegt. Dadurch verhindert der auf genomischer Ebene zwischen diesen Exons liegende Intronbereich eine ungewollte Amplifikation basierend auf Kontamination durch genomische DNA, oder ermöglicht zumindest eine größenabhängige Abgrenzung zum auf cDNA basierenden Produkt.

Material & Methoden

2.2.8.1 Aufreinigung von RNA durch DNaseI-Verdau

Verunreinigungen von RNA mit genomischer DNA wurden durch DNaseI-Verdau entfernt, um eine Verschleppung in die nachfolgende cDNA-Synthese (cDNA-Synthese) zu vermeiden. Dies erfolgte unter Verwendung eines QIAcube-Gerätes (Qiagen) in Kombination mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) und dem RNase-Free DNase Set (Qiagen) nach Angaben des Herstellers.

2.2.8.2 cDNA Synthese

Für die Reverse Transkription von RNA zu cDNA wurde ein auf SuperScript II Reverse Transkriptase basierendes Kit (Invitrogen) verwendet. Standardmäßig wurden hierbei zufällige Oligonukleotid-Hexamere, sogenannte Random Primer (Invitrogen) verwendet, die einen unvoreingenommenen Einbezug der kompletten RNA in die Reaktion gewährleisteten. Alternativ bestand die Option spezifisch nur mRNA über deren Poly-A Schwanz unter Verwendung von Oligo (dT) Primer (Invitrogen) revers zu transkribieren. Zu Beginn der Methode wurden 1ng –5 μg RNA in 10µl HPLC-Wasser für 5 min bei 80°C zum Aufschmelzen von Sekundärstrukturen denaturiert und anschließend sofort auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 10 µl des Mastermixes, mit der in Tab. 12 dargestellten Zusammensetzung, wurde das Gemisch für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Hybridisierung der Primer an die RNA zu ermöglichen. Die Synthesereaktion erfolgte bei 37°C für 2 h und wurde durch Hitzeinaktivierung des Enzyms durch 3 min Inkubation bei 94°C mit anschließendem Abkühlen bei 4°C für 10 min beendet. Die erhaltene cDNA wurde standardmäßig mit 50 µl HPLC-Wasser verdünnt. Zum Einsatz in eine PCR- Reaktion (vgl. 2.2.4) wurde 1 µl dieses über Reverse Transkriptase hergestellten Templates verwendet (RT-PCR).

Tab. 12 Ansatz cDNA-Synthese

5x First-Strand Buffer 4 µl dNTP Mix 1 µl 200ng Random Primers 1 µl 0,1M DTT 2 µl Enzym SuperScript II R.T. 1 µl RNaseOut (40U/µl) 0,6 µl HPLC-Wasser 0,4 µl GESAMT 10 µl

2.2.9 Quantitative “Real-Time” PCR (qPCR)

Die “Real-Time” PCR stellt eine hochsensitive Methode zur relativen Quantifizierung von DNA- bzw. cDNA-Sequenzen (Targets) dar. Im Gegensatz zur konventionellen PCR, bei der es sich um eine Endpunkt-Messung handelt, wird bei der „Real-Time“ PCR die Menge

Material & Methoden des entstehenden PCR-Produkts über den gesamten Zeitraum der Amplifikation in Echtzeit (real-time) gemessen und quantifiziert. Ermöglicht wird dies über spezielle Thermo-Cycler-Geräte, die Fluoreszenz-abhängig die generierte Produktmenge zu jedem einzelnen Zyklus der Reaktion detektieren können. So wird ermöglicht, unter Analyse der erreichten Produktmengen zur Zeit der aussagekräftigen exponentiellen Phase der PCR, verschiedene Ansätze quantitativ zu vergleichen und somit eine relative Aussage über die ursprüngliche Menge der der Amplifikation zu Grunde liegenden DNA-Sequenz (Target) zu treffen. Die Methode erlaubt damit sowohl eine relative Quantifizierung der Kopienzahl (Copy Number) eines genomischen Bereichs, sowie über cDNA eine indirekte Quantifizierung der relativen Expressionsstärke eines Transkripts.

2.2.9.1 qPCR basierend auf TaqMan-Sonden

Das Prinzip der TaqMan-qPCR basiert auf Ausnutzung der 5´-3´-Exonukleaseaktivität der in die PCR eingesetzten Taq-Polymerase zur Hydrolyse und damit Fluoreszenz- Aktivierung spezifischer TaqMan-Sonden. Diese TaqMan-Sonden hybridisieren spezifisch mit einem intern gelegenen Bereich des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts und tragen an ihrem 5´-Ende ein fluoreszierendes Reportermolekül, dem am 3´-Ende ein sogenanntes Quencher-Molekül gegenübergestellt ist. Über 3´-Phosphatreste wird ausgeschlossen, dass die Sonden selbst als Primer dienen können. Im Ausgangszustand wird die Fluoreszenz des Reporters durch die räumliche Nähe zum Quencher über den sogenannten Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) unterdrückt. In der Annealing-Phase der PCR-Reaktion hybridisieren Primer und Sonde sequenzspezifisch an die komplementäre Matrize. Bei der darauffolgenden Elongation synthetisiert die Taq- Polymerase einen neuen DNA-Strang und hydrolisiert dabei die mit dem Template hybridisierte Sonde durch ihre der 5´-3´-Exonukleaseaktivität. Durch die folgende räumliche Trennung von Reporter und Quencher wird der FRET aufgehoben und der Reporter fluoresziert unter Anregung mit Licht spezifischer Wellenlänge. Das emittierte Fluoreszenzsignal ist direkt proportional mit der Menge hydrolisierter Sonde und damit der Menge gebildeten Produkts. Die Messung des Fluoreszenzsignals findet über den gesamten Verlauf der PCR statt. Das mitführen des Fluoreszenzfarbstoffes ROX dient der passiven Referenz, zum Ausgleich von PCR-unabhängigen Fluoreszenzvariationen.

. TaqMan-qPCR: Durchführung

Für die Durchführung der qPCR wurden kommerzielle, vorgeprüfte Sonden mit den dazugehörigen Primer-Paaren von Applied Biosystems verwendet. Darüber hinaus war es nötig für bestimmte Fragestellungen eigene Sonden zu entwerfen. Hierzu wurden Primer und Sonden unter Verwendung des Programms Primer Express (Applied Biosystems) nach den von Applied Biosystems vorgeschlagenen Parametern entworfen. Die PCR- Reaktion erfolgte in 384-Well-Platten in 20 µl Ansätzen und es wurden pro Ansatz vier

Material & Methoden technische Replikate erstellt. Pro Ansatz wurden dazu jeweils 0,625µM Forward- und Reverse-Primer, 0,25 µM Sonde, 10 µl TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) und entsprechend HPLC-Wasser für ein Endvolumen von 20 µl eingesetzt. Bei vorgefertigten Sonden von Applied Biosystems wurde 1 µl des Sonden-Primer- Gemisches eingesetzt. Für die relative Quantifizierung wurden neben den Ziel-Sonden immer mindestens 3 endogene Sonden mitgeführt, über welche die Expression von Housekeeping-Genen, sogenannten endogenen Kontrollen, gemessen wurde, um in der nachfolgenden Auswertung die ursprünglich eingesetzten Template-Mengen in Verhältnis setzten zu können. Für jede Sonde wurde ein Mastermix für 4 technische Replikate mal der Anzahl der zu untersuchenden cDNAs (Samples) erstellt und anschließend durch 5 Sekunden vortexen gründlich gemischt. Zu jeweils 90 µl des Mastermixes wurden dann 10 µl cDNA (∼ 25 ng/µ) auf einer 96-Well-Platte gegeben und durch 30-faches auf und ab Pipettieren gründlich gemischt. Von diesen 100 µl 5x Ansatz wurden dann je 20 µl auf 4 Wells in einer 384-Well-Platte übertragen, kurz anzentrifugiert und mit einer optischen Folie verschlossen. Die PCR mit zeitgleicher Detektion wurde in einem im ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System von Applied Biosystems mit dem in Tab. 13 gezeigten Programm durchgeführt.

Tab. 13 PCR-Programm: TaqMan-qPCR

Temperatur Zeit Zyklenzahl 50°C 2 min

95°C 10 min

95°C 15 sek x50 60°C 1 min

. TaqMan-qPCR: Auswertung

Für die Auswertung wurde die Software SDS V2.1 (Applied Biosystems) herangezogen. In der semilogarithmischen Darstellung der Amplifikationskurven wurde zunächst vom Programm automatisch ein Schwellenwert (Y-Achse) in die lineare Phase der zu vergleichenden Ansätze gelegt. Der PCR-Zykluswert (X-Achse) bei dem die Amplifikationskurve diese Schwelle erreicht ergibt den CT-Wert (Threshold Cycle). Dieser ist Ausgangspunkt für die relative Quantifizierung mittels der ΔΔCT-Methode (vgl. Applied Biosystems, 1997). Das Programm mittelte dabei selbstständig die CT-Werte der 4 Replikate zu einem Average-CT und nahm diesen als Grundlage für das Errechnen des ΔCT-Wertes, was den ersten Schritt der ΔΔCT-Methode darstellt: ΔCT = CT (Ziel- Sonde) - CT (Endogene Sonde). Der bei gleichem Sample erhaltene CT-Wert für eine endogene Sonde diente hierbei der Normalisierung. Durch diesen Schritt wurden Abweichungen durch den Einsatz unterschiedlicher Mengen an cDNA ausgeglichen. Die Verwendung von mindestens drei endogenen Kontrollen und die manuelle Mittelung der

Material & Methoden erhaltenen ΔCT-Werte zu einem Average-ΔCT-Wert wirkten Kontrollen-abhängigen Schwankungen der Normalisierung entgegen. Als Standardabweichung wurde der höchste Wert der vom Programm zu den individuellen ΔCT-Werten ausgegebenen ΔCT- SD (Standard Deviation) übernommen. Der zweite Schritt war die Generierung des ΔΔCT-Wertes, um die ΔCT-Werte der verschiedenen Samples in Bezug zu setzen: ΔΔCT = ΔCT - ΔCT (Kalibrator). Als Kalibrator konnte hierbei der ΔCT-Wert eines beliebigen Samples gewählt werden, meist wurde jedoch der Mittelwert der ΔCT-Werte aller mitgeführten Kontroll-Samples eingesetzt. Der finale Schritt ist die Berechnung des RQ- Wertes (Relative Quantification), die auf der idealisierten Annahme beruht, dass jeder PCR-Zyklus zu einer Verdoppelung des PCR-Produktes führt: RQ = 2−(ΔΔCT). Der Kalibrator erhält dadurch den RQ-Wert = 1 (≙ 100%) und alle Samples werden zum Kalibrator in Bezug gesetzt. Die Standardabweichung nach oben und unten wurde mit den Formeln RQ(+SD) = 2−(ΔΔCT + ΔCT-SD) bzw. RQ(-SD) = 2−(ΔΔCT - ΔCT-SD) berechnet.

. TaqMan-qPCR: Signifikanzberechnung

Bei der Signifikanzberechnung wurden die CT-Werte der Replikate nicht zu einem Average-CT gemittelt, sondern einzeln nach der ΔΔCT-Methode berechnet, sodass pro Sample 4 RQ Werte für 4 technische Replikate zur Verfügung standen. Die RQ-Werte des zu untersuchenden Samples wurden anschließend den RQ-Werten der Kontroll-Samples in einem Wilcoxon Two Sample Test (http://www.fon.hum.uva.nl/Service/Statistics.html) (vgl. 2.3.12) gegenübergestellt.

2.2.9.2 qPCR basierend auf SYBR Green-Sonden

Die qPCR basierend auf dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green I stellt eine Alternative zur qPCR mit TaqMan-Sonden dar. Da hier keine Target-spezifischen, doppelt markierten Sonden benötigt werden, ist die Durchführung kostengünstiger, zeigt aber dafür keine vergleichbar hohe Spezifität. Dies beruht darauf, dass SYBR Green I jede doppelsträngige DNA bindet und im gebundenen Zustand grün fluoresziert (Emissionsmaximum bei 521 nm), wenn es mit Licht entsprechender Wellenlänge (Exzitationsmaximum bei 494 nm) angeregt wird. Bei Verwendung in einer PCR-Reaktion wird das entstehende Produkt so direkt durch SYBR Green I gebunden und die folglich auftretende Fluoreszenz-Zunahme steht in direkter Proportionalität zur Menge gebildeten Produkts. Da auch unspezifische Produkte ein Fluoreszenzsignal auslösen, muss die Spezifität durch Design geeigneter Primer gesichert werden. Zusätzlich wurde bei dem in dieser Arbeit von Qiagen verwendeten QuantiTect SYBR Green PCR Kit die Spezifität durch die Verwendung einer Hot-start DNA-Polymerase erhöht, durch die die Bildung unspezifischer Produkte vor Reaktionsstart ausgeschlossen werden konnten. Das mitführen des Fluoreszenzfarbstoffes ROX dient auch hier der passiven Referenz, zum Ausgleich von PCR-unabhängigen Fluoreszenzvariationen.

Material & Methoden

. SYBR Green-qPCR : Durchführung

Primer wurden entsprechend einer Standard-PCR (2.2.4.2) mit folgenden speziellen Parametern entworfen: Bei einem GC-Gehalt von 30-60%, sollten die Primer ein Amplikon mit der Optimallänge von 80-120 bp flankieren. Zur Sicherung der Spezifität der Methode wurde darauf geachtet, dass Primer- und Amplikon-Sequenz keine Tendenz zur Sekundärstrukturausbildung zeigten und die Primer nicht mit sich selbst oder untereinander komplementäre Bereiche aufwiesen. Die PCR-Reaktion erfolgte in 384- Well-Platten in 20 µl Ansätzen und es wurden pro Ansatz vier technische Replikate erstellt. Unter Verwendung des QuantiTect SYBR Green PCR Kits (Qiagen) wurden pro Ansatz 10 µl 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 0,3 µM Forward-Primer, 0,3 µM Reverse-Primer und entsprechend HPLC-Wasser für ein Gesamtvolumen von 20 µl pipettiert. Vergleichbar mit der TaqMan-qPCR (2.2.9.1) wurde auch hier für jedes untersuchte Amplikon ein Mastermix für 4 technische Replikate mal der Anzahl der zu untersuchenden cDNAs (Samples) erstellt und anschließend durch 5 Sekunden vortexen gründlich gemischt. Zu jeweils 72 µl des Mastermixes wurden dann 18 µl DNA (∼ 25 ng/µ) auf einer 96-Well-Platte gegeben und durch 30-faches auf und ab Pipettieren gründlich gemischt. Von diesen 90 µl Ansatz wurden dann je 20 µl auf 4 Wells in einer 384-Well- Platte übertragen, kurz anzentrifugiert und mit einer optischen Folie verschlossen. Die PCR mit zeitgleicher Detektion wurde in einem im ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System von Applied Biosystems mit dem in Tab. 14 gezeigten Programm durchgeführt, wobei die Datenerfassung nur in den Elongationsschritten erfolgte. Zur Analyse der Spezifität der Reaktion folgte dem Programm die Erstellung einer Schmelzkurve.

Tab. 14 PCR-Programm: SYBR Green-qPCR

Temperatur Zeit Zyklenzahl 95°C 15 min

94°C 15 sek 60°C 30 sek x50 72°C 30 sek

. SYBR Green-qPCR : Auswertung

Die Auswertung erfolgte entsprechend der Auswertung der TaqMan-qPCR (vgl. 2.2.9.1). Im Falle einer Quantifizierung ohne Normalisierung über endogene Kontrollen wurden die individuellen CT-Werte exportiert und manuell verarbeitet unter Wegfall des ΔCT- Berechnungsschrittes. Zunächst wurden dazu die CT-Werte der 4 Replikate zu einem Average-CT gemittelt und die Standardabweichung berechnet. Durch Wegfall der Normalisierung folgte direkt die Wahl eines geeigneten Kalibrators, über den alle Samples

Material & Methoden miteinander in Bezug gesetzt wurden. Vergleichbar mit der Berechnung des RQ-Wertes in der relativen Quantifizierung (vgl. 2.2.9.1) wurde hier die Quantität mit der Formel Q = 2−(AverageCT[Sample]–AverageCT[Kalibrator]) berechnet. Die Standardabweichung noch oben und unten wurde mit den Formeln Q(+SD) = 2−((AverageCT[Sample]–AverageCT[Kalibrator]) +SD) bzw. Q(-SD) = 2−((AverageCT[Sample]–AverageCT[Kalibrator]) -SD) berechnet.

2.2.10 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)

Die Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) stellt eine Multiplex-PCR- Methode zur Detektion von relativer Kopienzahländerung (Copy Number Change) eines genomischen Bereichs oder Transkripts dar. Da es sich bei dieser Methode wie bei einer Standard-PCR und anders als bei der qPCR (vgl. 2.2.9) um eine Endpunktmessung der amplifizierten Produkte handelt, ist diese Methode weniger sensitiv, was aber unter dem Gesichtspunkt der Änderung ganzer Kopienzahlen nicht ins Gewicht fällt. Mit der MLPA können bis zu 50 verschiedene Targets parallel in einem Ansatz unter Verwendung eines universellen Primerpaares analysiert werden [33]. Bei Durchführung der Methode wird zu Beginn das Template denaturiert, sodass über Nacht pro Target zwei spezifische Oligonukleotide hybridisieren können, die zusätzlich zu ihrem komplementären Bereich terminal Sequenzen für jeweils einen der beiden Universal-Primer tragen. Beide Oligonukleotide sind dabei so entworfen, dass sie direkt nebeneinander am Template hybridisieren und anschließend miteinander ligiert werden können, um eine komplette MLPA-Sonde zu bilden. Die Menge so entstandener kompletter MLPA-Sonden entspricht dabei direkt der Menge an Target-Sequenzen. In der auf die Ligation folgenden PCR- Reaktion werden dann durch Verwendung von einem Fluoreszenz-markierten Universal- Primerpaar die MLPA-Sonden der unterschiedlichen Targets gemeinsam amplifiziert. Nicht ligierte Oligonukleotide können dabei nicht als Template für die PCR-Reaktion dienen und werden von der Amplifikation ausgeschlossen. Durch die Wahl unterschiedlicher MLPA- Sondenlängen für die verschiedenen Targets, können die Amplifikationsprodukte verschiedener Sonden auf Grund ihrer Größe in der anschließenden Kapillarelektrophorese unterschieden werden. Anhand der dabei für eine Sonde erhaltenen Signalhöhen (Peaks) kann dann nach Normalisierung gegen mitgeführte endogene Sonden die Target-Menge relativ quantifiziert werden.

2.2.10.1 MLPA Sonden-Design

In den hier verwendeten MLPA-Ansätzen wurden 12 Sonden in Kombination verwendet. Zur Größenunterscheidung der Produkte unterschieden sich diese in ihrer Länge um 4 Basen und deckten so den Größenbereich von 88-136 Basen Länge ab. Die Sonden wurden nach dem Manual Designing synthetic MLPA probes, Version 10 von MRC Holland und unter Verwendung des Programms Raw (MRC Holland) entworfen. Dabei wurde unter

Material & Methoden

Verwendung von Human BLAT Search (UCSC Genome Bioinformatics) darauf geachtet, dass die Sonden nicht im Bereich von SNPs oder repetitiven Regionen lagen. Nach Möglichkeit wurden hochkonservierten Bereiche bevorzugt ausgewählt. Für eine Kombination aus 12 Sonden wurden 0,8 pmol aller 24 Oligonukleotide mit TE zu einem 600 µl Gesamtvolumen umfassenden Probemix aufgefüllt.

2.2.10.2 MLPA Durchführung

Zu untersuchende DNAs wurden im Vorfeld mit dem QIAamp DNA Micro Kit (Quiagen) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt und mit einem Infinite 200 NanoQuant (Tecan) vermessen. Für die anschließende MLPA-Reaktion wurden SALSA MLPA EK5- Reagenzien (MRC Holland) nach Protokoll des Herstellers (General MLPA Protocol for DNA Detection & Quantification Version 29) verwendet. Dabei wurden maximal 200 ng DNA eingesetzt. Die Fragment-Analyse fand an einem ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) statt.

2.2.10.3 MLPA Auswertung

Die Analyse der generierten Daten erfolgte mit der Software SeqPilot 3.2.1. (JSI Medical Systems). Mitgeführte Kontroll-Sonden dienten dabei der Normalisierung und ließen eine anschließende Berechnung der relativen Quantität der Proben in Vergleich zu Kontroll- Proben zu. Bei Auffälligkeiten waren die Grenzwerte zur Angabe von Deletionen oder Duplikationen mit dem Faktor 0,75 bzw. 1,25 definiert.

2.2.11 Expressions-Array

2.2.11.1 Durchführung

Zur genomweiten Expressionsanalyse wurde die Arraytechnik basierend auf dem GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array von Affymetrix angewandt, mit dem über 47.000 Transkripte auf ihre Expression hin vermessen werden können. Die Durchführung erfolgte hierbei in der hauseigenen Chip-Facility unter Leitung von Dr. rer. nat. A. Ekici nach Protokoll des Herstellers. Zu analysierende RNA-Proben (vgl. 2.2.13.6) wurden hierfür von Mitarbeitern des Hauses auf ausreichende Qualität hin mit einem Agilent Bioanalyzer (Agilant) vermessen. Die anschließende Sonden-Synthese, Hybridisierung, sowie die initiale Expressionsanalyse und Qualitätskontrollen erfolgten nach dem von Affymetrix empfohlenen Protokoll. Für einen Ansatz wurden standardmäßig 3 eigenständige, experimentelle Wiederholungen durchgeführt und auf separaten Arrays hybridisiert.

Material & Methoden

2.2.11.2 Analyse

Die Daten-Normalisierung und -Auswertung fand unter Verwendung des Partek genomic suite software package (Partek Incorporated) statt. Hierbei wurde für jedes Gen eine two-way ANOVA berechnet. Für den Vergleich und eine Anpassung der Ergebnisse aus verschiedenen Geweben bzw. Zelllinien wurde ein F-test durchgeführt.

2.2.12 Array-basierte molekulare Karyoptypisierung

Array-basierte molekulare Karyotypisierung zur genomweiten Analyse von Kopienzahländerungen (CNV, Copy Number Variation) wurden unter Verwendung des Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0 (Affymetrix), welcher das Genom durch mehr als 1.852.600 Marker abdeckt, in der hauseigenen Chip-Facility unter Leitung von Dr. rer. nat. A. Ekici nach Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Datenanalyse erfolgte durch Mitarbeiter des Hauses nach standarddiagnostischen Parametern mittels der Genotyping Console Software (Version 3.0.2) (Affymetrix) und unter Berücksichtigung von Aberrationen mit einer Mindestgröße von 100 kb. Eine genauere Analyse der Bruchpunktbereiche chromosomaler Translokationen erfolgte mit einer Auflösung von 10kb. Alternativ wurde der Cytogenetics Whole-Genome 2.7M Array (Affymetrix) mit einer genomischen Abdeckung durch 2,7 Millionen Markern verwendet. Die Durchführung und Auswertung erfolgte hierzu am Institut für medizinische Genetik der Universität Zürich unter Leitung von Prof. Dr. med. Anita Rauch und unter Verwendung der Chromosome Analysis Suite (ChAS) Software (Affymetrix).

2.2.13 Zellkultur

Für das Arbeiten mit eukaryotischen Zellkulturen sind sterilen Bedingungen zur Vermeidung bakterieller oder sonstiger Kontaminationen notwendig. Hierzu wurde unter speziell dafür vorgesehenen Sterilwerkbänken (HA 2472 GS, Heraeus), und unter Verwendung gammabestrahlter Verbrauchsmaterialen gearbeitet.

2.2.13.1 Kultur von humanen Zelllinien

Kulturen von adhärent wachsenden HEK293- [34] und HeLa-Zellen [35], sowie von humanen lymphoblastoiden Zelllinien (LCL) wurden bei 37°C, 5 % CO2-Atmosphäre und 91 % Luftfeuchtigkeit in einem BBD 6220 CO2 Incubator (Heraeus) gehalten. Humanen LCL-Zelllinien wurden von Mitarbeitern des zytogenetischen Labors nach Standardprotokol aus Patientenproben hergestellt. Für HEK293- und HeLa-Zellen diente hierbei DMEM/HAM`s F12 (Gibco), versetzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS) (Gibco) und 1% Penicillin/Streptomycin (10.000U/10.000µg/ml)

Material & Methoden

(Gibco) als Standardmedium. LCL-Kulturen wurden in RPMI 1640 (Gibco), versetzt mit 20 % hitzeinaktiviertem FCS, 1% L-Glutamin (200 mM) (Gibco) und 1% Penicillin/Streptomycin gehalten.

2.2.13.2 Passagieren von Zellen

Standardmäßig wurden adhärent wachsende Zellkulturen bei Erreichen einer annähernden Konfluenz von 100 % gesplittet. Dazu wurde das Medium abgenommen und die Zellen zweimal mit 1x PBS gewaschen und zum Ablösen der Zellen mit 1 ml Trypsin/EDTA (Gibco) für 5 min bei 37°C inkubiert. Zum Abstoppen der Trypsinierung wurden die Zellen in serumhaltigem Medium aufgenommen und ein Zehntel der Zellen in frisches Medium überführt. Bei nicht adhärent wachsenden LCL-Kulturen wurde direkt ein Bruchteil der Kultur in frisches Medium überführt.

2.2.13.3 Herstellen und Auftauen von Kryostocks

Für die längerfristige Aufbewahrung wurden von den Zellen sogenannte Kryostocks durch Einfrieren unter Einsatz von Gefriermittel hergestellt. Hierzu wurden die Zellen trypsiniert und durch eine anschließende Zentrifugation bei 1000 rcf für 5 min pelletiert. Das Pellet wurde dann in 2 ml Standardmedium der Kultur, versetzt mit 10 % steril-filtriertem DMSO, resuspendiert und für die Herstellung von 2 Kryostocks aufgeteilt. Nach einer Inkubation auf Eis für 1 h wurden die Kulturen bei -80°C tiefgefroren. Zur Reaktivierung einer Kultur wurde ein Kryostock zügig durch Zugabe von 1 ml vorgewärmten Mediums angetaut und sofort in eine Zellkulturflasche mit vorgelegtem warmem Medium überführt.

2.2.13.4 Transfektion humaner Zelllinien mit siRNA

Die Transfektion humaner Zelllinien mit sogenannter short interfering RNA (siRNA) diente der gezielten Expressionsreduzierung (Silencing) spezifischer Transkripte, unter Ausnutzung des sogenannten RNA interference-Mechanismus (RNAi). Dieser beruht darauf, dass doppelsträngige RNA-Moleküle in der Zelle durch das Enzym Dicer in kurze Fragmente, den siRNAs, gespalten werden. Die entstandene siRNA wird anschließend in den sogenannten RNA-induced silencing complex (RISC) eingebaut, über welchen dann die Zerstörung siRNA-homologer mRNA und damit eine post-transkriptionelle Expressionsreduzierung eines spezifischen Gens vermittelt wird [36]. Hierzu wurden Stealth RNAi siRNAs von Invitrogen nach den Hersteller-Protokollen Transfecting Stealth RNAi or siRNA into HeLa Cells Using Lipofectamine 2000 und Transfecting Stealth RNAi or siRNA into HEK293 Cells Using Lipofectamine 2000 durch Transfektion in humane Zelllinien eingebracht. Das Medium wurde dabei 12 Stunden vor Transfektion durch Antibiotika-freies Medium ersetzt und die Zellen so gesplittet dass für HeLa- und

Material & Methoden

HEK293-Zellen zum Zeitpunkt der Transfektion eine optimale Konfluenz von 80-90 % bzw. von 70-80% vorlag. Bei Transfektion von HeLa-Zellen wurden 1 µg/ml Lipofectamine 2000 (Invitrogen) und 50 nM StealthRNAi, und bei Transfektion von HEK293-Zellen 2 µg/ml Lipofectamine 2000 und 200 nM StealthRNAi eingesetzt. Das Transfektionsmedium wurde nach 12 h durch frisches Antibiotika-freies Medium ersetzt, und die Ernte der Zellen fand standardmäßig 51,75 h nach Beginn der Transfektion statt. Als Negativkontrolle diente eine jeweils parallel geführte Transfektion mit einer sogenannten Scrambled Stealth RNAi, für die in humanen Zellen kein spezifisches Ziel vorliegt.

2.2.13.5 Ernte von Zellen

Für die Ernte adhärenter Zellen wurde das Medium abgenommen, die Zellen zweimal mit 1x PBS gewaschen und zum Ablösen der Zellen mit 1 ml Trypsin/EDTA (Gibco) für 5 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in 1x PBS aufgenommen, die Zellzahl unter Verwendung einer Neubauer-Zählkammer (Brand) bestimmt und in den nachfolgenden Schritten auf Eis weiter bearbeitet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1000 rcf für 5 min bei 4°C pelletiert und nach Verwerfen des Überstandes in 2ml 1x PBS resuspendiert, sowie in 2ml Eppendorf-Gefäße überführt. Die Zellen wurden bei 300 rcf für 5 min bei 4°C nochmals pelletiert, und nach Verwerfen des Überstandes konnten die Zellen in dem für die anschließende Methode notwendigen Puffer resuspendiert werden. Die Ernte von nicht adhärent wachsenden Zellen erfolgte entsprechend ohne Trypsinierung ab dem Schritt der Zellzahl-Bestimmung.

2.2.13.6 RNA-Isolierung aus Zellen

RNA aus humanen Zellen wurde unter Verwendung eines QIAcube-Gerätes (Qiagen) in Kombination mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen), QIAshredder-Kit (Qiagen) und dem RNase-Free DNase Set (Qiagen) nach Angaben des Herstellers isoliert und dabei von genomischer DNA mittels DNaseI-Verdau befreit.

2.2.13.7 Proteinlysat-Herstellung aus Zellen

Für die Herstellung von Proteinlysat wurden die geernteten und pelletierten Zellen für mindestens 1 h bei -70°C eingefroren und das anschließende Auftauen erfolgte langsam durch Inkubation auf Eis. Standardmäßig wurde für eine Zellmenge, entsprechend der Erntemenge einer halben 100 % konfluenten 75 cm²-Zellkulturflasche, 500 µl Lysis- Puffer bzw. spezieller Lysispuffer mit Phosphatase-Inhibitoren zur Resuspendierung eingesetzt. Nach anschließender Inkubation bei 4°C für 20 min wurde die chromosomale DNA durch langsames 10x auf und ab Pipettieren mit einer 20-Gauge-Kanüle geschert.

Material & Methoden

Zelltrümmer wurden bei 15000 rcf für 2 min abzentrifugiert, der Überstand in ein frisches Eppendorfgefäß überführt und zur Lagerung bei -70°C tiefgefroren.

2.2.14 Histonacetylierungs-Assay

Zur Extraktion und Messung der globalen Histon-H3- bzw. Histon-H4-Acetylierung humaner Zellen wurden die Kits EpiQuik Global Histone H3 Acetylation Assay Kit (Epigentek) bzw. EpiQuik Global Histone H4 Acetylation Assay Kit (Epigentek) nach Protokoll des Herstellers in Kombination mit einem Tecan GENios Microplate Reader (Tecan) verwendet. Ausgangspunkt waren hierbei pelletierte, bei -70°C tiefgefrorerene Zellen (vgl. 2.2.13.5). Die anschließende Datenanalyse erfolgte ebenfalls nach Herstellerprotokoll.

2.2.15 Western-Blot

Der Western-Blot stellt eine grundlegende Protein-Analysemethode dar und gliederte sich in der hier durchgeführten Form grob in drei Schritte: Der erste Schritt umfasste die Gelelektrophorese basierend auf einem Polyacrylamid-Gel zur Auftrennung der Proteine. Hierzu wurde ein nicht-natives System basierend auf Proteindenaturierung durch Sodium-Dodecyl-Sulfat (SDS) verwendet. Negativ geladenes SDS lagert sich hierfür an Proteine an, denaturiert diese und überdeckt deren Eigenladung. Die Menge angelagertem SDS und damit der eingebrachten negativen Ladung entspricht der Moleküllänge des Proteins, sodass in einem elektrischen Feld eine Auftrennung nach Molekülgröße stattfindet [37]. Im zweiten Schritt wurden die aufgetrennten Proteine mittels senkrechter Elektrophorese auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen (Blotting). Die Gesamtheit der Proteine konnte dann mittels Ponceau-Färbung sichtbar gemacht werden. In einem dritten Schritt fand die Detektion versuchsrelevanter Proteine über Verwendung spezifischer Antikörper und entsprechender Sekundär-Antikörper mit Reporterfunktion statt.

2.2.15.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Ausgangspunkt war auf Eis aufgetautes Proteinlysat gewonnen aus humanen Zelllinien (vgl. 2.2.13.7). Die maximal mögliche Menge von 27,5 µl Lysat wurde unter Verwendung des NuPage Novex Systems (Invitrogen) nach Protokoll des Herstellers in Kombination mit einer NuPAGE X-Cell Sure Lock-Apparatur (Invitrogen) unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt. Hierzu wurde ein 1,5 mm dickes 3-8% Tris-Acetat Gel (Invitrogen) und ein selbsthergestellter Tris-Acetat-Laufpuffer, versetzt mit NuPAGE Antioxidant (Invitrogen), verwendet. Als Größenstandard wurden 5 µl SeeBlue Plus2 Pre- Stained Standard (Invitrogen) bzw. 5 µl HiMark Pre-Stained High Molecular Weight Protein Standard (Invitrogen) mitgeführt.

Material & Methoden

2.2.15.2 Proteintransfer

Für den Transfer der aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran mit 0,2 µm Porengröße wurde ein X-Cell II Blot Modul (Invitrogen) nach Anleitung des Herstellers zusammen mit einem selbsthergestellten Transfer-Puffer und darin äquilibrierten Schaumstoffpads und Whatmann-Papiere verwendet. Die senkrechte Elektrophorese wurde für 1,3 h bei 30 V durchgeführt und für die anschließende Ponceau-Färbung wurde die Membran mit destilliertem Wasser gespült in Ponceau S-Lösung wenige Minuten bis zum Erscheinen eines Bandenmusters geschwenkt. Zur Dokumentation wurde die Membran in Folie eingepackt und an einem Fotokopierer gescannt. Die Membran wurde dann durch ausgiebiges Spülen in destilliertem Wasser entfärbt.

2.2.15.3 Antikörperreaktion

Zur Vermeidung unspezifischer Antikörperbindungen wurde die Membran durch Schwenken in einer 5 % Magermilch-Lösung in TBS(T) für 4 h bei Raumtemperatur blockiert. Ein für das relevante Protein spezifischer Primär-Antikörper wurde in geeigneter Verdünnung in 5ml 5 % Magermilch/TBS(T)-Lösung eingesetzt und zur blockierten Membran gegeben. Für alle nachfolgenden Inkubations- und Wasch-Schritte wurde die Membran in einem 50 ml Reaktionsgefäß gerollt. Die Primär-Antikörper- Inkubation fand über Nacht bei 4°C statt. Anschließend wurde die Membran 4 x 5 min in 25 ml TBS(T) gewaschen und mit einem Meerrettich-Peroxidase (HRP) tragenden Sekundär-Antikörper (HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (Biorad)), verdünnt in 5 ml 5% Magermilch/TBS(T)-Lösung, für 1,5 h inkubiert. Nach weiteren 4 x 5 min Waschschritten in 25 ml TBS(T) folgte die Detektion der Aktivität der am Sekundär- Antikörper gebundenen HRP durch Substrat-abhängige Chemolumineszenz. Hierzu wurde die Membran mit den Substraten SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity- Substrate (Thermo Scientific) oder Roti-Lumin (Roth) nach Angaben der Hersteller für 5 min bzw. 1 min inkubiert. Anschließend wurde die Membran in Klarsichtfolie faltenfrei verpackt und in einer lichtdichten Kassette fixiert. Unter Lichtausschluss wurde ein Röntgenfilm (Hyperfilm ECL) aufgelegt, und entsprechend der Stärke der Chemilumineszenz wenige Sekunden bis mehrere Minuten lang durch diese belichtet. Der Röntgenfilm wurde dann in ein Entwicklerbad (Dental X-Ray Monobah, Kodak) bis Eintreten einer Schwärzung geschwenkt, dann sofort in ein Bad mit destilliertem Wasser, versetzt mit etwas Essigsäure, gewaschen und schließlich für 1 min fixiert (Roentogen Zahnfilm Superfix, Tetenal). Nach Trocknung des Röntgenfilms konnten auf diesen die auf der Membran sichtbaren farbigen Banden des Protein-Standards mit Folienstift übertragen werden. Die Membran wurde nach weiteren 4 x 5min Waschschritten in TBS(T) bei 4°C in TBS(T) aufbewahrt. Für semi-quantitative Analysen wurde dem Primär- Antikörper ein gegen Beta-Aktin gerichtete Antikörper ab8227 (Abcam) in einer 1:5000

Material & Methoden

Verdünnung zugemischt. Die resultierenden Signale dienten als Ladekontrolle und ließen über Vermessen der Intensitäten über das BioDocAnalyzer 2.0-System eine relative Quantifizierung verschiedener Samples zu.

2.2.16 ChIP-on-chip

Die Methode der Chromatin-Immuopräzipitation (ChIP) dient der Analyse spezifischer Protein-Chromatin-Interaktionen und ermöglicht dadurch Untersuchungen zu Chromatin- Struktur und Dynamik. Das breite Anwendungsspektrum basiert dabei immer auf einer spezifischen Antikörper-Reaktion zur Anreicherung Protein-assoziierter chromosomaler Loci [38]. Bei der Durchführung ist dabei standardmäßig zunächst eine Fixierung der zu untersuchenden Zellen notwendig, um eine stabile Bindung (Cross-Linking) zwischen Chromatin und Chromatin-gebundenen Proteinen zu schaffen. Nach einer anschließenden effizienten Scherung des fixierten Chromatins, werden in der folgenden Immunreaktion diejenigen Chromatin-Fragmente unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers angereichert, die mit dem spezifischen Zielprotein (Antigen) direkt oder indirekt assoziiert sind. Die angereicherten chromosomalen Bereiche können dann nach DNA- Aufreinigung mit einer Reihe verschiedener Methoden analysiert werden. Üblich ist hierbei die Analyse mittels qPCR (vgl. 2.2.9), aber auch die Verwendung eines Arrays ist möglich, und man spricht in diesem Zusammenhang von der ChIP-on-chip. Alternativ nutzen neuere Entwicklungen die Next-Generation-Sequencing-Technologie für eine sogenannte ChIP-Seq. Die in der Analyse angereichert gefundenen Sequenzen - im Vergleich zu einer parallel geführten Kontrolle (Input-Sample), die ohne Antikörper- Reaktion erstellt wurde - erlauben dann den Rückschluss auf die chromosomalen Loci, die mit dem Zielprotein in vivo assoziiert sind.

2.2.16.1 ChIP

Für die Durchführung der ChIP, ausgehend von transfizierten humanen HeLa- und HEK293-Zellen (vgl. 2.2.13.4) wurde das LowCell ChIP-Kit der Firma Diagenode nach Angabe des Herstellers für Histone-ChIPs unter Mitführen geeigneter Positiv- und Negativ-Kontrollen verwendet. Vorbehandlung und Ernte der Zellen wurde gemäß dem Protokoll durchgeführt, die Zellzahlbestimmung erfolgte unter Verwendung einer Neubauer-Zählkammer (Brand). Pro Immnopräzipitations (IP)-Ansatz wurden 10.000 Zellen eingesetzt, die restlichen Zellen wurden einer RNA-Extraktion (vgl. 2.2.13.6) zur Überprüfung des Transfektions-Resultats durch qPCR (vgl. 2.2.9) zugeführt. Das Cross- Linking erfolgte durch Fixierung mit 36,5% Formaldehyd, und die Scherung des Chromatins wurde unter Verwendung eines Bioruptor-Ultraschallgerät (Diagenode) durchgeführt. Jeweils 2 µg der für die Immunreaktion notwendigen Antikörper wurden an magnetische Kügelchen (Magnetic Beads) gebunden und dienten in dieser Form

Material & Methoden anschließend in einer magnetischen Immunopräzipitation. Die über spezifische Antikörperwirkung an die Magnetic Beads gebundenen Chromatinfragmente wurden schließlich magnetisch aufgereinigt.

2.2.16.2 qPCR-Analyse der ChIP

Zur Analyse der Funktionalität der ChIP-Methode und der versuchsrelevanten Antikörper wurde eine qPCR basierend auf SYBR Green durchgeführt (vgl. 2.2.9.2). Hierfür wurde die erwartete Anreicherung spezifischer Chromatinfragmente, deren Assoziation mit dem entsprechenden Antigen bekannt war, kontrolliert. Die Quantifizierung der Anreicherung erfolgte in Relation zu einem sogenannten Input-Sample. Es handelte sich hierbei um einen parallel mitgeführten Kontroll-Ansatz, bei dem der eigentliche Schritt der Präzipitation übersprungen wurde und somit die Gesamtmenge an Chromatinfragmenten erhalten blieb. Der Hintergrund an unspezifisch präzipitiertem Chromatin wurde über eine Negativ-Kontrolle basierend auf einem Negative Ctrl IgG from rabbit-Antikörper (Diagenode) vermessen. Als Positivkontrolle wurde ein IP-Ansatz unter Verwendung eines Anti-acetyl-histone H3-Antikörpers (Epigentek) verwendet.

2.2.16.3 Array-Analyse der ChIP (ChIP-on-chip)

. Whole Genome Amplification von ChIP-Material

Für eine genomweite Analyse der ChIP-vermittelten Anreicherung auf einem Array war zunächst eine gesamt-genomische Amplifikation (Whole Genome Amplification, WGA) des aus der ChIP erhaltenen Materials notwendig. Um keine Verfälschungen der Mengenverhältnisse durch die Amplifikation zu generieren, wurde mit dem GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA2) Kit (Sigma-Aldrich) eine spezielle Form der WGA angewandt. Bei dieser wurden zunächst alle DNA-Fragmente durch universelle Sequenzen erweitert, sodass bei der anschließenden Amplifikation mit den entsprechenden universellen Primern von einer gleichmäßigen Mengenzunahme ausgegangen werden konnte. Die Durchführung erfolgte entsprechend dem Whole Genome Amplification Protocol for ChIP-chip von Farnham lab, welches eine modifizierte Form des Herstellerprotokolls darstellt. Hierzu wurden 20 ng ChIP-Material in einem Volumen von 10 µl zu 2µl 1x Library Preparation Buffer gegeben. Nach Zugabe von 1 µl Library Stabilization Solution wurde gevortext, anzentrifugiert und für 2 min bei 95°C inkubiert. Die Proben wurden sofort auf Eis abgekühlt, mit 1 µl Library Preparation Enzyme ergänzt, gevortext und anzentrifugiert. Anschließend wurde für je 20 min bei 16°C, 24°C und 37°C inkubiert. Nach einer abschließenden Inkubation bei 75°C für 5 min wurden die Proben auf 4°C gekühlt und bei -20°C nicht länger als 3 Tage aufbewahrt. Für den folgenden Amplifikationsschritt wurden zu jeder Probe ein Mix aus 7,5 µl 10x Amplification Master Mix, 47,5 µl HPLC-Wasser und 5 µl WGA DNA Polymerase pipettiert

Material & Methoden und gevortext. Für die Amplifikation wurde das in Tab. 15 gezeigte Programm verwendet. Die amplifizierte DNA wurde anschließend mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt und an einem Infinite 200 NanoQuant (Tecan) vermessen. In eine zweite Amplifikationsrunde wurden 15 ng des Produktes aus der ersten Amplifikation, verdünnt in 15 µl HPLC-Wasser, eingesetzt und anschließend ebenfalls aufgereinigt und vermessen.

Tab. 15 PCR-Programm: WGA

Temperatur Zeit Zyklenzahl 95°C 3 min

94°C 15 sek x14 65°C 5 min 4°C Hold

. Array-Analyse von amplifiziertem ChIP-Material

Die genomweite Analyse der Anreicherung erfolgte mit einem für ChIP-Experimente entwickelten GeneChip Human Promoter 1.0R Array [Hs_PromPR_v02] von Affymetrix. Dieser Array umfasst 4,6 Millionen Sonden (25-mer), die den Bereich von über 25.500 humanen Promotor-Regionen mit einer mittleren Auflösung von 35 bp abdecken. Bei jedem einzelnen Promotor werden dabei mindestens 7,5 kb upstream und 2,45 kb downstream des Transkriptionsstartpunktes einbezogen. Außerdem werden 59% der annotierten CpG-Inseln (NCBI human genome assembly, Build 34) durch Sonden abgedeckt. Das amplifizierte ChIP-Material, darunter auch die Input-Samples, wurde in Triplikaten auf separaten Arrays nach Anleitung der Herstellers in der hauseigenen Chip- Facility unter Leitung von Dr. rer. nat. A. Ekici hybridisiert.

. Auswertung der Array-Analyse von amplifiziertem ChIP-Material

Die aus dem Array erhaltenen Daten zur Anreicherung gegenüber der Negativkontrolle in Bezug auf das Input-Sample wurden mit der Partek genomic suite software (Partek) unter Verwendung des darin enthaltenen MAT Algorithmus berechnet. Anschließend wurden den erhaltenen MAT-Regionen, die einen MAT score P-Wert (p-value) von unter 0,05 erzielten, RefSeq-Gene (NCBI) zugewiesen.

2.2.17 Gene ontology- (GO) und Signalweg-Analysen

Analysen zu Gene Ontology (GO) sowie zu Signalwegen (KEGG pathways; [39]) wurden unter Verwendung der Software DAVID functional annotation tool [3] und Pathway- Express, einer Software von Onto-Tools [40], durchgeführt. Hierbei wurde als Parameter für die Signifikanz ein p-value bzw. corrected gamma p-value von < 0,05 gewählt.

Material & Methoden

2.3 Material

2.3.1 Verbrauchsmaterialien

Alufolie Alio Autoklavierbeutel Roth Deckgläschen rund (Durchmesser 10 mm) Peske Deckgläser (24 x 24 cm) Roth Deckgläser (24 x 60 mm) Roth Desinfektionsspray Apesin Fixogum Marabu Frischhaltefolie Saran Glaswolle Serva Handschuhe: Digitil N Hartmann Handschuhe: Flexam CardinalHealth Handschuhe: Safeskin Satin Plus Kimberly-Clark Handschuhe: Sempercare Nitrile Sempermed Nitrocellulosemembran 0,2 µm Porengröße Invitrogen Objektträger Roth Optical Adhesive Covers Applied Biosystems Papierfilter Machery-Nagel Parafilm Pechiney Plastic Packaging Pasteurpipetten Roth PAXgene Blood RNA tubes Becton Dickinson Petrischalen Peske Pipettenspitzen 10 µl Biozym Pipettenspitzen 200µl, 1000 µl Sarstedt Pipettenspitzen mit Filter 10µl, 20µl, 200µl, 1000 µl Biozym Pipettenspitzen: 5, 10, 20 ml TPP Platten: 96 Well Aufreinigungsplatten Millipore Platten: 96 Well PCR-Platten Corning Platten: 96 Well Sequenzier-Platten Greiner, Applied Biosystems Platten: 384 Well Optical Reaction Plate Applied Biosystems Reaktionsgefäß 0,2 ml Peqlab, Peske Reaktionsgefäß 0,5 ml Peske Reaktionsgefäß 1,5 ml mit/ohne Deckel Greiner, Eppendorf, Peske Reaktionsgefäß 15 ml, 50 ml TPP, Greiner, Nunc Reaktionsgefäß 2 ml Greiner, Eppendorf, Peske Spritzen 1 ml, 2 ml BD Biosciences, Braun Whatman-Papier 3 MM Whatman Laboratory Zellkulturflaschen 25 cm2, 75 cm2 TPP Zellkulturtestplatten 24 Loch TPP Zellkulturtestplatten 6 Loch TPP

2.3.2 Chemikalien

10x TaqReactionbuffer Invitrogen Acetone Roth Agar-Agar Merck Agarose Sigma Ampuva Fresenius Kabi Antarktische Phosphatase I (5U/µl) New England BioLabs Antarktische Phosphatase Reaktionspuffer (10x) New England Biolabs Betain (5 M) Sigma Bromphenolblau Sigma BSA Sigma

Material & Methoden

Calciumchlorid (CaCl2; 50mM) Sigma Chloramphenicol (20 µg/ml) Sigma Chloroform Merck, Roth Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Cot-1-DNA Sigma Cy3-dCTP Amersham Biosciences Dapi Serva Dental X-Ray Monobah, Kodak Kodak Desoxynucleotid-Triphosphate (dNTPs) Roche Dextranblau Sigma Dextransulfat Sigma dHCl VWR Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 x 2 H20) Merck Dithiotreitol (DTT) Roth, Invitrogen DNAseI, RNAse-free (10U/µl) Roche Dulbecco′s modified minimal essential medium (DMEM) Gibco, Biochrom Essigsäure Roth Ethanol Roth Ethidiumbromid (10 mg/ml) Roth Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Fluka Exonuclease I (20U/µl) New England BioLabs Formaldehyd VWR, Roth Formamid VWR, Sigma Fötales Kälberserum (FCS) Gibco GeneScan 500 ROX Size Standard Applied Biosystems Glycerin Roth Hämatoxilin Sigma Hefeextrakt Merck Hexanukleotid Mixtur (500 mM) Boehringer HPLC-Wasser Merck HTD Sigma Isopropanol Roth Kaliumchlorid (KCl) Merck, Roth Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck LE Agarose Biozym L-Glutamin Biochrom Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen Loading Puffer (6 x) PeqLab Magermilchpulver Saliter Magnesiumchlorid (MgCl2) Invitrogen, VWR Medium RPMI 1640 Gibco Methanol Roth NaCitrat Roth Natrium-Butyrat 98% Sigma-Aldrich Natriumchlorid (NaCl) Merck, VWR Natriumhydroxid-Plätzchen (NaOH) Merck Natriumphosphatdihydrat VWR Natriumphosphatmonohydrat VWR Nick-Translation-Enzym-Mix Roche Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich Invitrogen Novex Bis-Tris MES Running Buffer (20x) Invitrogen Novex Transfer Buffer (20x) Invitrogen Novex Tris-Acetate SDS Running Buffer (20x) Invitrogen NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Gel Invitrogen NuPAGE Antioxidant Invitrogen NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) Invitrogen Oligo (dT) Primer Invitrogen

Material & Methoden

Optimem Invitrogen Paraformaldehyd Merck. Sigma Penicillin-Streptomycin (10.000U/10.000µg/ml) Biochrom, Fluka Pepsin Sigma Pepton Merck Platinum Taq DNA Polymerase Invitrogen Ponceau S Solution Sigma Random Hexamer Primer Invitrogen Random Primer Invitrogen Rinderserum-Albumin (BSA) New England Biolabs, Sigma RNase A Roche RNase Inhibitor (40U/µl) Roche RNaseOUT Ribonuclease Inhibitor (40 U/ml) Invitrogen Roentogen Zahnfilm-Entwickler Tetenal Roentogen Zahnfilm-Superfix Tetenal Röntgenfilm (Hyperfilm ECL) Hyperfilm ECL Roti-Lumin (Roth) Roth Sephadex_ G-50 Fine Amersham Biosciences SOC-Medium Invitrogen Sodiumdodecylsulfat (SDS) Fluka, Sigma, Merck Standard: 1 kb Invitrogen Standard: 1 kb-Ladder New England BioLabs Standard: 100 bp-Ladder Invitrogen Standard: GeneRuler 1kb Fermentas Standard: GeneRuler 1kb Plus Fermentas Standard: HiMark Pre-Stained HMW Protein Standard Invitrogen Standard: pUC-mix 8 Fermentas Standard: SeeBlue 2 Pre-Stained HMW Protein Standard Invitrogen Stealth RNAi Scrambled Negative Control Stealth RNA Invitrogen Stealth RNAi siRNA (MYST4) HSS118879, HSS118880, Invitrogen HSS118881 SuperScript II Reverse Transkriptase Kit Invitrogen SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo Scientific Taq-DNA-Polyermase Invitrogen TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems Trihydroxymethylaminomethan (TRIS) Roth Trihydroxymethylaminomethan Hydrochlorid (TRIS-HCl) Roth Triton X 100 Fluka TRIzol Reagent Invitrogen Trypsin/EDTA (0.25%) Gibco Tween 20 Sigma, VWR Vectashield (Antifade) Linaris

2.3.3 Antikörper

(2°-Antibody) HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody Bio-Rad Anti-MYST4 antibody HPA006104 (0,02 µg/µl) Sigma-Aldrich Beta actin antibody ab8227 (Ladekontrolle) Abcam MYST4 (KAT6B/MORF) antibody ab58823 (1 µg/µl) Abcam Negative Ctrl IgG from rabbit (1 µg/µl) Diagenode Positive Ctrl Anti-acetyl-histone H3 (1 µg/µl) Epigentek Rabbit polyclonal to Histone H3(acetyl K14) ab61232 (1 µg/µl) Abcam

2.3.4 Lösungen

10x TBE (Tris-Borat-EDTA-Puffer) 1,0 M Tris 0,83 M Borat

Material & Methoden

0,01 M EDTA ph 8.0  Mit A.dest auffüllen

DNA-Ladepuffer 50% Glycerin 0,01% Bromphenolblau 0,01% Xylencyanol

Ethanol-HCl-Lagerungslösung (Eisessig) 350 ml Ethanol (100%) 10 ml HCl 640 ml A. dest.

0,4x SSC-HCl 2 ml 20xSSC 98 ml A.dest. 2 Tropf. HCl 1M

4x SSC/0,2% Tween 100 ml 20xSSC 400 ml A.dest. 1 ml Tween

DAPI-Lösung 1 ml 4xSSC/0,2% Tween 1 µl DAPI  Auf 4 ml mit A.dest. auffüllen

OT-Lagerungsgemisch 640 ml A.dest. 350 ml Ethanol 10 ml HCl (konz.)

20xSSC: 525,9 g NaCl 264,6 g NaCitrat  Auf 3 l mit A.dest. auffüllen  pH 7,0 mit HCl einstellen  Autoklavieren

10xPBS 80 g NaCl 2 g KCl

11,5 g Na2HPO4 2 g KH2PO4  Auf 1 l mit A.dest. auffüllen  pH 7,0 mit NaOH einstellen  Autoklavieren

1M MgCl2 20,33 g MgCl2  Auf 100 ml mit A.dest. auffüllen  Autoklavieren

TE 10/1 1 ml 1M Tris HCl pH 7,5 20 µl 0,5M EDTA 98,98 ml A.dest.  Autoklavieren

Pepsin-Lösung (0,005%) 1 ml 1M HCl 99 ml A.dest  37°C  50 µl Pepsin (-20°C) vor Gebrauch zugeben

10% Pepsin 10 g Pepsin  Auf 100 ml mit A.dest auffüllen  Lagerung bei -20°C

Material & Methoden

Dextransulfat 2 g Dextransulfat  in 10 ml 50% Formamid lösen  3 h, 70°C Wasserbad  Lagerung bei -20°C

Stopmix 20 mg (0,1%) Bromphenolblau 100 mg (0,5%) Dextranblau 400 µl (0,1 M) 5M NaCl 800 µl (20 mM) 0,5M EDTA 400 µl (20 mM) 1M TrisHCl pH 7,5  Auf 20 ml mit A.dest. auffüllen

Sephadex 8 g Sephadex in 100 ml TE10/1 lösen  1h 60°C Wasserbad + ü.N. RT

HTD 50 µl-Aliquots 15min Ultraschallbad beschallen  Lagerung bei -20 ◦C

5x Cy3-Mix 5 µl dATP (2,5mM) 5 µl dTTP (2,5mM) 5 µl dGTP (2,5mM) 4 µl Cy3-dCTP (1mM) 31 µl Ampuva  Lagerung bei -20 ◦C

1xPBS/ MgCl2 7,9 ml 1M MgCl2 150 ml 1xPBS

1% Formaldehyd-Lösung 50 ml 1xPBS/ MgCl2 2 x 675 µl Formaldehyd (filtriert)

PBS 140 mM NaCl 10 mM KCl 6,4 mM Na2HPO4 2 mM KH2PO4

TE Puffer 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA

Lysispuffer 0,01 M Tris 0,15 M NaCl 1% Triton-X, pH 7,5  1 Tablette „Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets“ je 10ml Puffer lösen

Spezieller Lysispuffer (+Protease-Inhib.) 50 mM Tris/HCl pH 7.5 100 mM NaCl 2 mM MgCl2 1% Igepal CA-630 10% Glycerol 20 mM Beta-glycerolphosphate

1 mM Na3VO4 (Sodium orthovanadate)  1 Tablette „Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets“ je 10ml Puffer lösen

Material & Methoden

20x Tris-Acetat-Puffer 500ml 89,5 g Tricine 60,5 g Tris Base 10,0 g SDS  Auf 0,5 l mit A.bidest. auffüllen

20x Transfer-Puffer 125ml 10,2 g Bicine 13,08 g Bis-Tris 0,75 g EDTA  Auf 125 ml mit A.bidest. auffüllen

10x TBS 25 mM Tris 1,37 M NaCl, pH 7,6 27 mM KCl  Auf 1 l mit A.bidest. auffüllen

TBS(T) 1x TBS 0,1% Tween 20

LB-Medium 10 g Pepton 5 g Hefe-Extrakt 10 g NaCl 0,2 g NaOH-Plätzchen  Auf 1 l mit A.bidest. auffüllen  Autoklavieren

Chloramphenicol 20 g Chloramphenicol 1 ml 100% Ethanol  Lagerung bei -20°C

Kanamycin 1,25 g Kanamycin  Auf 50 ml mit A.bidest. auffüllen  Steril filtrieren  Lagerung bei -20°C

Chloramphenicol- Agarplatten 250 ml LB-Medium 3,5 g Agar  Autoklavieren und auf 60 ◦C abkühlen lassen  100 µl Chloramphenicol zugeben  Platten gießen  Mit Parafilm verschliessen, Lagerung 4°C

Kanamycin-Agarplatten 250ml LB-Medium 3,5 g Agar  Autoklavieren und auf 60 ◦C abkühlen lassen  100 µl Kanamycin zugeben  Platten gießen  Mit Parafilm verschliessen, Lagerung 4°C

Tris-HCl 1M pH 7,5 121,14 g HCl  Auf 1 l mit A. bidest. auffüllen  pH 7,5 einstellen  Autoklavieren

Agarose-Gel 1,5% 1,5 g Agarose  Auf 100 ml mit 1xTBE auffüllen  Aufkochen für mehrere Minuten  1 µl Ethidiumbromid zugeben  Gel gießen

Material & Methoden

2.3.5 Kits

AMPure Kit Agencourt BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems BLOCK-iT Transfection Optimization Kit Invitrogen CleanSEQ Kit Agencourt DIG-Nick-Translation Kit Roche DNA Sequencing Kit BigDye-Terminator Cycle Sequencing Applied Biosystems ready Reaction EpiQuik Global Histone H3 Acetylation Assay Kit Epigentek EpiQuik Global Histone H4 Acetylation Assay Kit Epigentek EpiQuik HAT Activity/Inhibition Assay Kit Epigentek Expand 20kbPlus PCR System, dNTPack Roche Expand Long Range dNTPack Roche GC-Rich PCR-System Roche GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA2) Sigma-Aldrich Human Adult Normal Tissue cDNA Panel Neural 2 [C8234504] BioChain Human Fetal Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel [636747] Clontech Human Fetal Normal cDNA Panel Tissue Neural [C8244525] BioChain Human Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel I [636742] Clontech Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit GE Healthcare LowCell ChIP Kit Diagenode MycoSCOUT Biontex PAXgene Blood RNA Kit v2 Becton Dickinson QIAGEN Fast Cycling PCR Kit Qiagen QIAGEN Plasmid Midi Kit Qiagen QIAGEN RNeasy Mini Kit Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit Quiagen QIAquick PCR Purification Kit Qiagen QIAshredder Qiagen QuantiTect SYBR Green PCR Kit Qiagen RNase-Free DNase Set Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen RT2 Profiler PCR Array: Human Cell Cycle Bioscience Corporation SALSA MLPA reagents EK5 MRC-Holland

2.3.6 TaqMan-Sonden (pre-designed)

ADRB3 (Hs00609046_m1) Applied Biosystems AKT2 (Hs01086102_m1) Applied Biosystems CTR9 (Hs00206060_m1) Applied Biosystems DUSP2 (Hs00358879_m1) Applied Biosystems ELK1 (Hs00428286_g1) Applied Biosystems FGFR1 ( Hs00241111_m1) Applied Biosystems FGFR1 (Hs00241111_m1) Applied Biosystems GPATCH3 (Hs00222968_m1) Applied Biosystems HOXA3 (Hs00601076_m1) Applied Biosystems Human ACTB Endogeneous Control Applied Biosystems Human ACTB Endogeneous Control Applied Biosystems Human B2M Endogeneous Control Applied Biosystems Human HPRT1 Endogeneous Control Applied Biosystems Human PGK1 Endogeneous Control Applied Biosystems Human PPIA Endogeneous Control Applied Biosystems Human RPLP0 Endogeneous Control Applied Biosystems Human TBP Endogeneous Control Applied Biosystems LETM2 (Hs00332557_m1) Applied Biosystems MAP2K3 (Hs00177127_m1) Applied Biosystems MAX (Hs00231142_m1) Applied Biosystems

Material & Methoden

MRAS (Hs00171926_m1) Applied Biosystems MYST4 (hs00202463_m1) Applied Biosystems NR0B2 (Hs00222677_m1) Applied Biosystems NTRK1 (Hs01021011_m1) Applied Biosystems NUDC (Hs00702452_s1) Applied Biosystems PPP3CB (Hs00184176_m1) Applied Biosystems PRKX (Hs00746337_s1) Applied Biosystems RPII (Hs00172187m1) Applied Biosystems SMAD4 (Hs00929647_m1) Applied Biosystems SRF (Hs00182371_m1) Applied Biosystems ST5 (Hs00373572_m1) Applied Biosystems WEE1 (Hs01119388_m1) Applied Biosystems ZNF143 (Hs00366181_m1) Applied Biosystems

2.3.7 Selbstentworfene TaqMan-Sonden

Gen / Isoform Oligo-Typ Sequenz MORF Forward TGTCTGTAACCAGTGATGAAGGA MORF Probe 6FAM-TCACCTGATACTGAAATAA MORF alpha Forward AAAAAGGTCTCTCAGAAACAGTCATG MORF alpha Probe 6FAM-TGTTGGCTACAGATACTGAA MORF beta Forward GAGCTTGACAGACGGAAGGATT MORF beta Probe 6FAM-CAGGATGATGATACTGAAATA MORF alle Isoformen Reverse CATCTGCACTTTCTTGTTTGATGTT NUDC alpha Forward CATGGCTCAGCAGCACGA NUDC alpha Probe 6FAM-TGCAGGAGCTTGTGAAC NUDC alpha Reverse CTGTTTTGCGTCGAAGGAAG NUDC beta Forward GCAGTGAACTTGTCTGTTTCAATTC NUDC beta Probe 6FAM-ACTGTGCTTGTGAACAC NUDC beta Reverse GTTTTGCGTCGAAGGAAGCT

2.3.8 Oligonukleotide

Gen / Projekt Oligo-Bezeichnung Sequenz AK057379 RT-PCR AK057379_LR_F TTTACACGAACGCCCTTCCAGGACT AK057379 RT-PCR AK057379_LR_R ATGCATCAGACACTGCTAAGTACTGTTAGG BC1311744 Sequenzierung BC131744e1_F TTTCAATAGGATAGCAAAAGAGGA BC1311744 Sequenzierung BC131744e1_R ATATTCAGGCCCATCTCTCC BC1311744 Sequenzierung BC131744e2_F1 GTGGGAAGTATCAGAGAAAACAGG BC1311744 Sequenzierung BC131744e2_R1 AGCCTCTCCCCATGTATCAG BC1311744 Sequenzierung BC131744e2_F2 CTGGTCTGAGGCATCTCATC BC1311744 Sequenzierung BC131744e2_R2 TTCCACTATAGACAGGCAAAGG BC1311744 Sequenzierung BC131744e2_F3 CTGTGTTCCAAAACCCAGTG BC1311744 Sequenzierung BC131744e2_R3 TGAGGAAGCTATCCTTAAAATTCC BC131744 RT-PCR BC131744_F AAGGAGCAACAGAGGTAACAATC BC131744 RT-PCR BC131744_R GGAGAACAGGTGCTCACAAC CDK6-Promoter SYBR-Green CDK6PromF4 GTCCTTCCGCTCCAGCTT CDK6-Promoter SYBR-Green CDK6PromR4 TAAGCCGTGACATTGACGTG C-Fos-Promoter SYBR-Green c-fos-promoter primers Diagenode, LowCell ChIP Kit chr7_13.81 RT-PCR chr7_13.81_RT_R GTGTGCAGTCCCAGAGAGG chr7_13.81 RT-PCR chr7_13.81_RT_R2 GGATATCATCACTGCCCAGAC CTNND2 RT-PCR CTNND2e7F AGCAGTACAGCAAGCACTCG CTNND2 RT-PCR CTNND2e8R GGCTGAGACTCCTCATAGGG CTNND2 RT-PCR CTNND2e9F CGACAGCTGCAGTATTGTCC CTNND2 RT-PCR CTNND2e12R ATGATTGGCATTTTGAGTGC CTR9 RT-PCR CTR9_RT_F ATGGGTCATTGCTTTGTGAA

Material & Methoden

CTR9 RT-PCR CTR9_RT_R GCTCTGGAAAGAAGCTGGAC DA691079 RT_PCR DA691079_F CTTTATTCTGCTCACGCTCAG DA691079 RT_PCR DA691079_R TATAAAGGATCTGTTTCCAGTCTCC DA691079 RT_PCR DA691079_R2 ACTTTCTTCTTTCAATATATAAAGGATCTGTTTC FOXG1 RT-PCR FOXG1Be1dF GCAACAACCACTCCTTCTCC FOXG1 RT-PCR FOXG1Be1dR CTCGCTGACACTCCACACC GPATCH3 RT-PCR GPATCH3_F1 CTCCGTAGGTAGCCGAAGTC GPATCH3 RT-PCR GPATCH3_F2 CAGGTAAACTGTCGCCTCCT HOXA1 RT-PCR HOXA1_RT_F TCCCAAAACAGGGAAAGTTG HOXA1 RT-PCR HOXA1_RT_R CGAAGAGCTGGACTTCTCTG HOXA1 RT-PCR HOXA1_RT_F2 CGGCTACCTACCAGACTTCC HOXA1 RT-PCR HOXA1_RT_R2 TCTTCACTTGGGTCTCGTTG HOXA3 RT-PCR HOXA3_RT_F AGTGGCCAAACAAATCTTCC HOXA3 RT-PCR HOXA3_RT_R AGCGTGCGGGTCATAGTC HOXA3 RT-PCR HOXA3_RT_F2 CTCAGAATGCCAGCAACAAC HOXA3 RT-PCR HOXA3_RT_R2 CACAGGTAGCGGTTGAAGTG MIR148A RT-PCR MIR148A_F GGCAAAGTTCTGAGACACTCC MIR148A RT-PCR MIR148A_R CAAAGTTCTGTAGTGCACTGACTTCTA MYST4 Sequenzierung Myst4e1F ATGAGACTCCATTGGGCTGT MYST4 Sequenzierung Myst4e1R GTCGCAAGCCCCTGAATC MYST4 Sequenzierung Myst4e2F CTGTTTGTCTTGAATGGTTGTGG MYST4 Sequenzierung Myst4e2R CAGCCCACAAATCTTTACCC MYST4 Sequenzierung Myst4e3f1F GCCTGTCATTACTTCTTGTGGTC MYST4 Sequenzierung Myst4e3f1R CAAGGCCTTTGTTGGTGACT MYST4 Sequenzierung Myst4e3f2F GAAGAGAGAATCTGCCATGC MYST4 Sequenzierung Myst4e3f2R ACAGTAGTGAGAATGCACGAAC MYST4 Sequenzierung Myst4e3f3F AAACCAGGCACTTTTCCTAAGTC MYST4 Sequenzierung Myst4e3f3R TGCTCTAAGGCAAAACATTCAA MYST4 Sequenzierung Myst4e4F CGTTATTTAGCAGTTTTTCTTTGTT MYST4 Sequenzierung Myst4e4R TGCTATTACCATATAACTGCCTTAAA MYST4 Sequenzierung Myst4e5F GTTCTCAAAGGCTTCAGATTGG MYST4 Sequenzierung Myst4e5R TAAGGAAAGTGCACCAAGATCC MYST4 Sequenzierung Myst4e6F CTGTAAGTATGGCTCCCGTAATC MYST4 Sequenzierung Myst4e6R CTCCTCTATTCACAACCTGTGCT MYST4 Sequenzierung Myst4e7F AGTTCAGCATACAGGCATCCTT MYST4 Sequenzierung Myst4e7R GTAGGCTGAATGACTGTTTCCA MYST4 Sequenzierung Myst4e8f1F CAGTTCTTAAGTTTAAGCCCATTGA MYST4 Sequenzierung Myst4e8f1R TATGAGAAAGCCCATCAAAGAGT MYST4 Sequenzierung Myst4e8f2F GTTGGCTACAGGTACCACACAAA MYST4 Sequenzierung Myst4e8f2R GTTTGGTTGGAGCTTTGACCTT MYST4 Sequenzierung Myst4e8f3F GCTCACTTCAAGCGAACAACT MYST4 Sequenzierung Myst4e8f3R GGGACTACAAAGCCATAAGCAA MYST4 Sequenzierung Myst4e9F AGGATACTGCTGGATCTATGAGC MYST4 Sequenzierung Myst4e9R GAGACCAGCTGAGTCCATACCTA MYST4 Sequenzierung Myst4e10F CTTAGGGTATTCGTTTGCTGTG MYST4 Sequenzierung Myst4e10R GCCCATGTAACTAAGGAGCATA MYST4 Sequenzierung Myst4e11F CACCCAGCCTCCAATGTTATT MYST4 Sequenzierung Myst4e11R GGGATTCTTCATCAGTCTAAATGGT MYST4 Sequenzierung Myst4e12F CTTTACTAGTGGTTTGGCCCTTC MYST4 Sequenzierung Myst4e12R AGCTCTGAACAAGAACCTGAGC MYST4 Sequenzierung Myst4e13F CATGTCAGAGTCGATGGTTTGT MYST4 Sequenzierung Myst4e13R CTGCCGAGAGATCTAGTCTCAAT MYST4 Sequenzierung Myst4e14F GGAAGAGGCTACATTCCTAAAGC MYST4 Sequenzierung Myst4e14R AGGGAACCTCAGTCTTTAACTGG MYST4 Sequenzierung Myst4e15F GTGCTAGCATATGTCCGTATGTG MYST4 Sequenzierung Myst4e15R TGTCTTACCATGCAACCTCAGT MYST4 Sequenzierung Myst4e16F GAACCGACTTAGAGACACTTTGC MYST4 Sequenzierung Myst4e16R CGGGACTGGGTACACATAAACTA MYST4 Sequenzierung Myst4e17F CTCAGACACGCGTTCAGTACAT

Material & Methoden

MYST4 Sequenzierung Myst4e17R GAAGGGAGAGAAGCTTGTAAGGA MYST4 Sequenzierung Myst4e18f1F CTCTCCCAGGCCTAGGTTATTTA MYST4 Sequenzierung Myst4e18f1R CCTCTTCCTCAGGTTTGATGAG MYST4 Sequenzierung Myst4e18f2F AGCAGGTAACAGTGGAAGAACAG MYST4 Sequenzierung Myst4e18f2R AGTCCATTAAGACCTCTGGGTTC MYST4 Sequenzierung Myst4e18f3F GATGACAGCCACATGGAGTCT MYST4 Sequenzierung Myst4e18f3R GATGAAACTGGGCTACTGTGGT MYST4 Sequenzierung Myst4e18f4F GAACAGCAAGGAAGTCGATACAG MYST4 Sequenzierung Myst4e18f4R ATAGGAGCAGCTGTTCTGTGAAG MYST4 Sequenzierung Myst4e18f5F ACAGCAAGTCGTAGACAGTGGAT MYST4 Sequenzierung Myst4e18f5R CAAAGAGGCACTGTTTGCATAG MYST4 Sequenzierung Myst4e18f6F CAAGTCTCCTCAAGGCTGTGT MYST4 Sequenzierung Myst4e18f6R GCCCATAGATTTGTGACTGATG MYST4 Sequenzierung Myst4e18f7F CAACCTGACTCCTCCTCCAAT MYST4 Sequenzierung Myst4e18f7R TGTAGGAGCCATTGAGAGACTGT MYST4 Sequenzierung Myst4e18f8F CAGCCTACAATGTCAACTCTGTG MYST4 Sequenzierung Myst4e18f8R TGGCTGCCTCCAAATTGT MYST4 Sequenzierung MYST4e1Fneu AGAGTGGTTAGTGAGTGGGTGAC MYST4 Sequenzierung MYST4e1Rneu AACCCTCACTAGTCTTCCTCACAC NT_007819.516 RT-PCR NT_007819.516_RT_F CTGCACAAGGGGACTAACTG NT_007819.516 RT-PCR NT_007819.516_RT_R AATTGGGGTGGAGAAGACAG NT_007819.516 RT-PCR NT_007819.516_RT_F2 TAGCTGAGAGGCACACCATC NT_007819.516 RT-PCR NT_007819.516_RT_R2 CCATGACCAGACATGAGGAC NUDC RT-PCR NUDC_alt1_F GGAATTAGGGCAGAGTTAGGAG NUDC RT-PCR NUDC_alt1_F2 GATGCCGGTAGTGGAAACAG NUDC RT-PCR NUDC_alt1-2_F TCACTACCAGCTTCCCGAAC NUDC RT-PCR NUDC_E6_R GAGCTCTCCTCCACCTTCAC NUDC RT-PCR NUDCgamma_alt1-E2_F ACCAGCTTGTGAACACCTTC NUDC RT-PCR NUDC_alt1_F3 CGGAACTGGCTAAAATAGCTC NUDC RT-PCR NUDCbeta_alt1-2_F2 TACCGCTCACTACCAGCTTC NUDC RT-PCR NUDC_E9_R AAGACCCAGCCTTTCTCCTG NUDC RT-PCR NUDC_E1_R GACTCTAGTCGTCCGCCTTC NUDC RT-PCR NUDC_E2_R TCCCTTCTTCTCCTCCAATG NUDC RT-PCR NUDC_E3_R GTGGTGGCTGAAAGTCTGTG NUDC RT-PCR NUDC_E1_F TAGAGAGCGCGGGACTAGAG NUDC RT-PCR NUDC_E8_R ATGGACTTCTGTCGCTGGTC NUDC RT-PCR NUDC_E9_R AAGACCCAGCCTTTCTCCTG t(1;8) LR-PCR 8_2F ACTATGTCCAACTGTTCTCTGCATACCC t(1;8) LR-PCR 8_18R CACTGAGTCTCTTAGGGTGAACAAATGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_1F AAGGGTTAATGAGACTCTGCCTTAGTGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_2F TCTTCTGTTGTAGCTGGGTACTGAAAGC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_3F GTTAACAAGCATGGACCAACTACACAGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_4F CAGTATATGGGTTTGGTAGGGTGAAACC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_5F GGGTGTTACTGTCATCTCTCACATAAGC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_6F CCTTGACTCTTGCCCTATACTTCACTGC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_7F CTACCACCAAAGCAATACCAGCTAAACC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_8F ACTGAGAGGATGTTGCCATTTAGGTAGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_9F CTGAGGTTTAGACGATGCTTACTGTTCG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_10F CTCGAACAAGGTAAGCATTGGAGTTACC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_11F AGTCAGCCAGGCAATACAGTACTTCACC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_12F TCCCCAGTACCTAATATGGTAGATGTGC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_13F AGAGCCTCAACACCTTGTAGAAGAAAGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_14F CATCTTCCTTGCGTTATAGGAGCTTACC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_15F AGTAGTTGGACCAATGTGACTTGAGAGC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_16F ATGATAAGTCACAGGCTGGAAGACTAGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_17F AGTGATGGGAGAGTCCGATAGAGTTACC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_18F GTCTACTTTTTACGGTAGCTGCTCATGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_19F CAGGTATGCTCTGTCCTATCCCTTTACC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_20F CATCATACATCCAGAGTCCAGCTTTACC

Material & Methoden t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_21F AGGGATTTTTCTACCTGAGAGTGTGTGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_22F GGACAGGAACAGATATTTCCAGCTAAGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_1R AGTTCAGAGACTGGTATGAGAGCTGTGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_2R ACGACTAAAGGTTCAGAACTGAGGAAGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_3R ATCTCAGGGGAGTCAGAGTTAACAAAGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_4R AGACAGTGCTGTTTGTAATCTGGAGAGC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_5R GAGATTCCTGGAGTTGATCTGTGTCTTC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_23F TACCTATAATCTCCCAAGAGGCCTTTCC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_24F TCACTGGAGTACTGATCCAACATACAGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_25F GTGACGACACCTCCTTAAAACCTATTCC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_26F AGCTCTCTTTGTTTGGGAACACTGTAGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_6R TTTACAGGTAGTCTGACCCACAGAAAGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_7R CTATCACCCAGTGTAAAGTGTGAACC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_8R AAGGGTATTCCAGAGAAAGCAGTAGGC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_9R AGAACTAAGCACTCACAGCAAGTCAACC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_10R CTGGAGACATATGATAAACCACCTCAGC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_11R GCCAGCCTCAGTGTTTATGAAGTAAAGG t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_12R CTCAGAGCTGAGGTTCCTGTCTTTACC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_13R AAAACTCACCCCAGTAGACCTCTCTCTC t(1;8) LR-PCR BP_Chr8_14R ACTTAGCATAGGGGACAGCCTTCTAGC t(1;8) LR-PCR 8_1F AGAATGCCTTTGGAATCCTACACTAGCC t(1;8) LR-PCR 8_2F ACTATGTCCAACTGTTCTCTGCATACCC t(1;8) LR-PCR 8_3F GGAGGTCTCCTTTGTTAACTCTGACTCC t(1;8) LR-PCR 8_4F GCCTTATCACTAGCTTGTTTGCCTAACC t(1;8) LR-PCR 8_5F GAGAAGACACAGATCAACTCCAGGAATC t(1;8) LR-PCR 8_1R AAGTTGTAGTCCATTCTGACCACAGACC t(1;8) LR-PCR 8_2R CACAATGCTTCTAGACTCTCACAAGTCC t(1;8) LR-PCR 8_3R TAATGTAGGCATCTTCGGACACCTACTG t(1;8) LR-PCR 8_4R GTGTGAAGAACACCTTACTTCCACATCC t(1;8) LR-PCR 8_5R CTGAAACTGAAGACAACCAAGTGAGTGG t(1;8) LR-PCR 8_6R GCAGTGAAGTATAGGGCAAGAGTCAAGG t(1;8) LR-PCR 8_7R GAGTACCTGCTGAATACGGTCTATTTGC t(1;8) LR-PCR 8_8R ATCCACTAATAGCTGCTCACAGTTGTCC t(1;8) LR-PCR 8_9R CAGAGTATGACGTCTAGCGGTAAAATGG t(1;8) LR-PCR 8_10R TACTCGCTTTACATCTAAGGACCTCACG t(1;8) LR-PCR 8_11R GGAACTTACAGCTGAAATACCCTTCACC t(1;8) LR-PCR 8_12R TTCACGTAGGATGAGAGCTGTGTAGAGG t(1;8) LR-PCR 8_13R AAGAGTACACCAAGTGTTTGTGGAGAGG t(1;8) LR-PCR 8_14R GTAAGCTCCTATAACGCAAGGAAGATGG t(1;8) LR-PCR 8_15R ATCACTGTCCTCACTAAGTGGATTCTGG t(1;8) LR-PCR 8_16R GAAGTGTAAGTGATGCTTCTGTCCTTGC t(1;8) LR-PCR 8_17R GTGCTAAAACTGCTCTGTAGGTCATTGG t(1;8) LR-PCR 8_18R CACTGAGTCTCTTAGGGTGAACAAATGG t(1;8) LR-PCR 8_19R GGTAGCTTTTCTCTTGCTAATGGACACC t(1;8) LR-PCR 8_20R AGTAGGAAGGGAAGAGGGATTCAGTAGG t(1;8) LR-PCR 8_21R CACAAACTTCTAGGAACTGTGAGCTTGG t(1;8) LR-PCR 8_22R GCTTAGCCCTTCCTCACTTTTCTCTAGG t(1;8) LR-PCR BP_derChr1_F1 TGCCATAAAACCCACACTTG t(1;8) LR-PCR BP_derChr1_F2 TACCACCAAGAGCACCTGTC t(1;8) LR-PCR BP_derChr1_R1 TTTGCCAACATAGTGGATGC t(1;8) LR-PCR BP_derChr1_R2 ATAGTGGGTTGCATCTGTGG t(1;8) LR-PCR BP_derChr1_F3 TCACCATCCTGGGCTGTTAC t(1;8) LR-PCR BP_derChr1_F4 CCAAGTCGAGAGAAGGCAAT t(1;8) LR-PCR BP_derChr1_R3 GACCTGCGTGTTTCCTCTTT t(1;8) LR-PCR BP_derChr1_R4 GAGCCCTGGAGTTCAATACC t(1;8) Mini-FISH-Oligos 1_132-140_F GCTGGGGGAAGGAGAGAAGTTTTA t(1;8) Mini-FISH-Oligos 1_132-140_R TGCCAGAACTGGGCATCAGTATAA t(1;8) Mini-FISH-Oligos 2_124-132_F GTAGGCAGACCTGTGTCTGTGCAT t(1;8) Mini-FISH-Oligos 2_124-132_R CCCTTTTTGCCTAACCCTTGAGTC

Material & Methoden t(1;8) Mini-FISH-Oligos 1_101-109_F CAGATATGAAGGTCAGGAAAAGCCTCT t(1;8) Mini-FISH-Oligos 1_101-109_R GAATAATGAAGTGGGGACAGGAACAG t(1;8) Mini-FISH-Oligos 6_619-199_F CCTGTAGACACCACCTTTGCCTCT t(1;8) Mini-FISH-Oligos 6_619-199_R CTCAAAGCAAAGTCCAACTCGTCA t(1;8) RT-PCR ESTs SplEST_F3 CTTCCCGAACTTTGGCTTAC t(1;8) RT-PCR ESTs SplEST_R1 TCTGTGGGAAAGGAACACAG t(1;8) RT-PCR ESTs SplEST_R2 CTCTGTGGGAAAGGAACACA t(1;8) RT-PCR ESTs SplEST_R3 GAAGCCAGCCTATTCTCAGG t(1;8) RT-PCR ESTs SplEST_R4 GTAAGCCAAAGTTCGGGAAG t(1;8) RT-PCR ESTs SplEST_R5 ATCATTCACTTCCCCCATTC t(1;8) RT-PCR ESTs SplEST_R6 CCCGAATTGAAACAGACAAG t(10;13) LR-PCR Chr13_eBP_R4 CTGTAGGGGTTTCCCAAGAATACAGAGG t(10;13) LR-PCR Chr10_eBP_F6 TCCAGATTTGTTTATGCGCGTGTCC t(10;13) Mini-FISH-Oligo 480K16-F6-f AGCATTGTATCCTTAACAAACAGTAGCC t(10;13) Mini-FISH-Oligo 480K16-F6-r TTCAGAGTTTCTAGTTTTTCATCACACG t(10;13) Mini-FISH-Oligo 668A2-F5-f TGCATTTAAGTGCTCAATAGTTTCAGTC t(10;13) Mini-FISH-Oligo 668A2-F5-r TGCTAAGATGCTACGTGTTTAAAGTCAC t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_1F AAAAGCGGTGGAAGAACATAGGAAGC t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_2F GGCTTCTGGTTTCATATACAGCTACTCAGG t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_3F CCTCTGTAATTATAAGATGCCCTGGACTGC t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_4F TGTCTAATATACCTCCTGTTATCAAACAGAAT t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_5F GGTCTGGTACCGTTATTCTCTGTGTCAG t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_6F TCCTCTTCTAAGGCTACAGTGGAAAACC t(5;14) LR-PCR der(14)_7F TAAAGCTAAGACTGGACTCAGGTCTGG t(5;14) LR-PCR der(14)_8F AGCTCCCTAGCAGTCTGAAAGAATTAGC t(5;14) LR-PCR der(14)_9F GCCTCATCTGTTACCTCTTCCTAGATGG t(5;14) LR-PCR der(14)_10F GACTTAAGAAGGGGTAAGCCCTAAATGG t(5;14) LR-PCR der(14)_11F CAAGAGCTCCAGAGACAGTAAATTGTGG t(5;14) LR-PCR der(14)_12F AGGCAGCAGGATATGTATGCTATCTAGG t(5;14) LR-PCR der(14)_13F TGTTCTAGGAGGAGTGAGAAGTGATGTAGG t(5;14) LR-PCR der(14)_14F AGGCTCTGATTAGTTGTATGCCATGACC t(5;14) LR-PCR der(14)_15F CCAAGTATTAAGGGACAAGAGTGGTTGG t(5;14) LR-PCR der(14)_16F GTGAGATGATGTCCACGTTAGCTACTGC t(5;14) LR-PCR der(14)_17F TAAGAGGGTAGGATGGTTCACTGAGAGG t(5;14) LR-PCR der(14)_18F GGGAAATTTGGGTCCTGAGTTTAACAGG t(5;14) LR-PCR der(14)_19F ACTGATTGAACTACAGCACCCTCAGACC t(5;14) LR-PCR der(14)_20F AGTGCTTGGACTCTAAAACTGTGACC t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_1R CACTTCACCTGCTGAAATCAACATCC t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_2R GCTTTATTGCCTAGAGGTTCCTGAAAGG t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_3R GTTGGTTTATCCCCAGCTCTAATCTGC t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_4R GGTTCTAACCTGTGGCTAAAAGATGAGC t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_5R GTGACTCTGTTGAGTTAGGGTCTCTTGC t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_6R GTTGATAATAAGGGGTGGTGGACTGG t(5;14) LR-PCR BP-der(14)_7R AGCAGGTTGTCATGATTTCAGGTTCC t(5;14) LR-PCR der(14)_8R CTCAACCATTGAAAGGAGGAAGTAGAGG t(5;14) LR-PCR der(14)_9R GTCTCCAGAACCTTCCATAACCAGTAGC t(5;14) LR-PCR der(14)_10R ACTTCAGACATTAGTGGCTTGACAGTGG t(5;14) LR-PCR der(14)_11R ATGGAAAGAACAGCTACGAAGAGACAGC t(5;14) LR-PCR der(14)_12R GCGACTGGAAGAAACTCTTTGTACAGG t(5;14) LR-PCR der(14)_13R CATTTTAATCCTGGGTAGTCAGCACAGC t(5;14) LR-PCR der(14)_14R GCCTACTCATTGTTTCATGGTGTGC t(5;14) LR-PCR der(14)_15R CTGATATGTAGGATCTGCAAAGCTCACG t(5;14) LR-PCR der(14)_16R TCCCACTTCTCTTCAGAGTATCACAAGC t(5;14) LR-PCR der(14)_17R CCATGCTGAGAGTTTAGATGTTCTGAGG t(5;14) LR-PCR der(14)_18R CCTGCATCAGACTCATCTCAGTATTTCC t(5;14) LR-PCR der(14)_19R TAAGCCTGTAAAGAGATGGAGCTGAACC t(5;14) LR-PCR Chr14_F1 GGAAAACCATGTTCCAGGAG t(5;14) LR-PCR Chr14_F2 TCCATAGATGGGCTTTCCTC t(5;14) LR-PCR Chr5_R1 TCACAGCAGTTCCTGTGTCC

Material & Methoden t(5;14) LR-PCR Chr5_R2 AGGAGGAGAACCTGGGAGAG t(5;14) LR-PCR Chr5_R3 GGAGGGCTGAAACAAAACAC t(5;14) Mini-FISH-Oligos 367F9_2F CCATTTACACCAATTAGTCAGGCACA t(5;14) Mini-FISH-Oligos 367F9_2R CTCTGACAGGTGTCCTCTTCCAGGTA t(5;14) Mini-FISH-Oligos 367F9_1F TATGTGAGATTCCGTGAAGGTGTGTT t(5;14) Mini-FISH-Oligos 367F9_1R TACATGAATCAGTTGCAAAGTGCTGA t(5;14) Mini-FISH-Oligos 562_3F TGAAGGGTATTGGAATAAGCGTGTCT t(5;14) Mini-FISH-Oligos 562_3R CTGTTGAATGGTGGTGGATCAAATAA t(5;14) Mini-FISH-Oligos 154-162_F GGTGGTCTCCTTGTATGAGTTCAGC t(5;14) Mini-FISH-Oligos 154-162_R CATGAAGCTTAGGGGTTAAAATTCTGG t(7;11) LR-PCR BP_der7_1F AATACACAGTTCTCACTGCAGCCCTTCC t(7;11) LR-PCR BP_der7_2F TTGATCTCTGCCTCATAGAAGGTTAGGC t(7;11) LR-PCR BP_der7_3F CTAGCTCCTCCTTTCACTGTCTCATTGC t(7;11) LR-PCR BP_der7_4F GACAACTCCCTTCTACCTTGACTTCACC t(7;11) LR-PCR BP_der7_5F GGCTGACAGTAGACCATTCAGTTGAAATCC t(7;11) LR-PCR BP_der7_1R CCATCTGCAAGTAGAGAAACCTTGAGC t(7;11) LR-PCR BP_der7_2R CTGGTAGGACAGAAAGAGCATTTACAGG t(7;11) LR-PCR BP_der7_3R GTTATAGCAAGTCTGCAAGTCACTGAGG t(7;11) LR-PCR BP_der7_4R GCCTTCTTGTCTACGTGTTGTAGAGAGC t(7;11) LR-PCR BP_der7_5R GAAGGGATGTTGGAGAGAAGAGTACAGC t(7;11) LR-PCR BP_der11_1F AGCTCAAGGTTTCTCTACTTGCAGATGG t(7;11) LR-PCR BP_der11_2F ACCCTGTAAATGCTCTTTCTGTCCTACC t(7;11) LR-PCR BP_der11_3F GTGGAGCAAGGATCTCTAAAACTGTGC t(7;11) LR-PCR BP_der11_4F TCTACAACACGTAGACAAGAAGGCTTGG t(7;11) LR-PCR BP_der11_5F CTGTGGTTAGAGTTGTTAGTGGACATGG t(7;11) LR-PCR BP_der11_1R TCAAGAAGGGTTTAGTCCCAGGTAATCC t(7;11) LR-PCR BP_der11_2R GTTGGCTTTAGACTCATACCACATCAGG t(7;11) LR-PCR BP_der11_3R AGACAGTGAAAGGAGGAGCTAGTTTTGG t(7;11) LR-PCR BP_der11_4R CATCCTGAAAAGGATTCCCACATTGC t(7;11) LR-PCR BP_der11_5R TTTGGAGGACATATGACAGACTCTCTGG t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_1F CATGCTCCTGAGTGATTTTG t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_2F GGAGGATCACGAGGTTAGGC t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_3F TGCCCAAAGCCATTTACAGA t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_4F CCATTTTGGAAAGCAGTACG t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_5F TTCACAACAGATTAGATGCTATGG t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_6F GAACAGCAAGAGGGAAGAGG t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_1R TCACGGTGTGCAGATAATTG t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_2R ACTGCATAGGGATCCTGACC t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_3R TTAGGCATTCTTTGGCTTGC t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_4R TCTCAAGGTCCTCATCATGC t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_5R TTTGCATCAAGGATGCCTAC t(7;11) LR-PCR BP_der7_LR-int_6R CTTGGCCACAAAAATACCTG t(7;11) LR-PCR BP_der11_6F AGCCATTCACCCTCATTAGC t(7;11) LR-PCR BP_der11_7F AGCTCAAGCTAATGTTTCTCAAC t(7;11) LR-PCR BP_der11_6R CGACGCCTTAATTCCTGTTAC t(7;11) LR-PCR BP_der11_7R TGCAGTCATATTTGCATCTGG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_1_F GAGGAATAACTTTCTCCCGTCTTCTTGG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_1_R CTTCTTGGCATTACCTGTGTGATAGGAG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_2_F AGTCACAGAGTTGTTGGAACTGTGACTG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_2_R ACCCCCTACCCACTTAGTAAATTGATCC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_3_F CACAAATTCCTCCCCTGACCTACTTTAC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_3_R CAAAGGACTGGATTACCAGTTCACAGAG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_4_F CACTATTTGGAGGATGCTTGGTAGTGAG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_4_R CTTCACCTTTAGCTTGGCTTCTCTTAGC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_5_F ACCAGGGATATACACAAAGTGCTCTCAC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_5_R CCACTTGAAAGAGGTAGTGGAGAAAAGC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_6_F CCTGGAGATAGGATTGATGTGTTCTGC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_6_R AGATGACCTAGTCTTACTCCCCACCTTG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_7_F CAGAAAAGCTGATAGGACTGGCTGATAG

Material & Methoden t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_7_R CACAGTTTTAGAGATCCTTGCTCCACAC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_8_F ACATGTCCACTAAATCAGGCCCAAAC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 122P19_MiniFISH_8_R AGTCATCACTCTGAATTGCCCTACTGAC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_1_F AGGCTTTTGGGAGCAAACACTTCTG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_1_R AGACAGTGAAAGGAGGAGCTAGTTTTGG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_2_F GTGCCATAGCAGAAGAACCACTTCTACC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_2_R GTTCAGAGCACACATCTGACACTGC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_3_F TGACAACTCCCTTCTACCTTGACTTCAC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_3_R CAGGTCAGTGGTATGTAGGACCCTTAGC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_4_F CACAGAAACCCACACATAGAAGGACAAC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_4_R AGATTTGTCTCTACCTCAGCATCCTAGTC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_5_F ATGAATGCAACAGAGGACACCTCTAGC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_5_R GCAGGACCCAGGTTCTATGTGTCAG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_6_F AGACTAGGATGCTGAGGTAGAGACAAATC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_6_R CTGTTTCACTGCCTCGTTTTTACCTG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_7_F GTAACGGGGAGTGGGTATCACTGAC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_7_R CAGCCTTTGGAGGTTCCTACTCTTTTC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_8_F GGAGAGAGGGGTGAAGAAATACCATAAC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_8_R CTACTGGCAGGATATGAACTTGGAACAG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_9_F CCTGCACCAACGTAGATAGTATCCAAAC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_9_R GTGGAGCTTGAACACATGCTAAAGAG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_10_F GATAGTCCCATTAGCTAAATCCCCTGTG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_10_R AACAGCTGGCTTGCAGGTACTTAGAG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_11_F ACCACTAGAGGCCACCAAATACTTCATC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_11_R ACATGTACCTTCCATCCCCAGTTTACTC t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_12_F AGCAGAAGTGAAGTACGTGACTGTAGGG t(7;11) Mini-FISH-Oligo 748C4_MiniFISH_12_R AGCATTCCAGACTGCCAATCATTC t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe1F TCCCATTTGGATTTTTCAAAG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe1F2 TTCAGCTGAGAAGACAGGATG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe2F GTATTTTGGCACCTCCAAGG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe2R CTGTGTTTACTGCTGCTTTCC t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe3F GAAGACTGGACCCCCAGAG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe3R TACGCTTCCCAAAGGCTAAC t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe4F ATATCCCATGGCGAGGAAG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe4R CACAACATTCTTGGGTCCTTAG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe5F TGTCCTTTCCTATGGCTGTG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe5R ACCATCAAGCCACAGAATTG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe6F CTGCCTGCTTTGTTTACACG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe6R ATCAAGCCTGGAAAAATTGG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe7F GGTCCTGCAGCTAATCAATG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe7R TGATTAGCTGCAGGACCTTG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe8F CTTTCCTCTGCCTATGTTGC t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe8R GACATGGATGGCAACATAGG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe9F TATGGCCATGTTGTCGAAAG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe9R GAGCCTTTCGACAACATGG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe10F TAGCAGGGGAGACTGGAAAC t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe10R TTCCAGTCTCCCCTGCTAAG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe11F TGTGGGAAGAGCTCCTGTG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe11R GGCTGAAAAAGTTCAATCCTG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe11R2 TTTTCCCTTTATTTATCCAAACATT t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe12R GATGGAGTCTTGCTCTGTCG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe13F TCTTCAGGGGCTAGAACACC t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe13R AGCTCCATGGGTGTTCTAGC t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe14F TCCATGGTAGGAATTTTTGTTC t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe14R CTTCTCAGCCTGGGAGATTC t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe15F GAAGAGTGCAGGGAGGATTC t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe15R ATCAGAACTGGCATCTCACG t(7;11) RT-PCR ESTs MIKEEe16R TGGTTGCTGAGCTCCTACC WDR70 Sequenzierung WDR70e1-2F GCCGCTGTAGCTTGAAGG

Material & Methoden

WDR70 Sequenzierung WDR70e1-2R TGACAGCTCGATCTCCACTC WDR70 Sequenzierung WDR70e1-2F2 GGATGTTATAGAAACTCCAGATACTACTTCT WDR70 Sequenzierung WDR70e1-2R2 GGATCTTCAAACCTCTGCAC WDR70 Sequenzierung WDR70e3F ATTCTCCATTTTGCCTCCCC WDR70 Sequenzierung WDR70e3R GATTACAGGCATGAGCCACC WDR70 Sequenzierung WDR70e4F ACTGTTTTCCAGTGGCTGTG WDR70 Sequenzierung WDR70e4R CAGAGGGCGATAGAGCAAG WDR70 Sequenzierung WDR70e5F TCCAAAGTGTGCTCTTCATTG WDR70 Sequenzierung WDR70e5R CCTCAGTTTTTAAATTGGCTCTTAC WDR70 Sequenzierung WDR70e6F TTTCCTGTGAAATGTGTTGTG WDR70 Sequenzierung WDR70e6R TTTTCCCACACCATAAAAAGC WDR70 Sequenzierung WDR70e7F ACCATCCATTCCTGCTTTTC WDR70 Sequenzierung WDR70e7R AAGCCAACAGCACTGTCTTC WDR70 Sequenzierung WDR70e8F AGAACCCATTTGAGGTTGATG WDR70 Sequenzierung WDR70e8R ATGGAGCAGGACACTGACTG WDR70 Sequenzierung WDR70e9F CCCTTTTGGGGGAACTAAAC WDR70 Sequenzierung WDR70e9R TTCCACTTACTACATTACTGCCAAG WDR70 Sequenzierung WDR70e9F2 TCATTTTCCTCTCCATTTCC WDR70 Sequenzierung WDR70e9R2 CAATCCAAACGTTAAATAAAATACC WDR70 Sequenzierung WDR70e10F ATTTATGTGCCAAAATGGCG WDR70 Sequenzierung WDR70e10R AAAAGTCTCAACGTTTGATCACC WDR70 Sequenzierung AK310901eF TCTACCTTAGAATCCCACTCAGG WDR70 Sequenzierung AK310901eR TAGGGAAAAGGCAAAACAGG WDR70 Sequenzierung WDR70e11F TGCCACAAAACTGTTCTCTTC WDR70 Sequenzierung WDR70e11R CATTTGTGGAGGCTTCAAAC WDR70 Sequenzierung WDR70e12F AAAACATGCTTGTGTGAATCTAGC WDR70 Sequenzierung WDR70e12R AAAGTTCTTGAAGTCTGAGGAATG WDR70 Sequenzierung WDR70e13F GCTGGACTGTTGTGGAGGTC WDR70 Sequenzierung WDR70e13R TGGGTAAGAGGCAAACTTTATG WDR70 Sequenzierung WDR70e14F GGTAAACCATCAGGATGATATTTG WDR70 Sequenzierung WDR70e14R TGGATCTCCATCAAAGTGGG WDR70 Sequenzierung WDR70e15F ACTGAGAGCCCATCTGTTGC WDR70 Sequenzierung WDR70e15R TATGCCTGAATTCTGAGGGC WDR70 Sequenzierung WDR70e16F TGGTCTCAAGCAAAATTGG WDR70 Sequenzierung WDR70e16R AGACAAAGAAGCATCCAGGC WDR70 Sequenzierung WDR70e17F GTCATAAATCTAAGCTGAAAGGATG WDR70 Sequenzierung WDR70e17R TTTAAAGACCATGAGTACCTGGC WDR70 Sequenzierung WDR70e18F TTTTCTTTGCCAGAAGTTTAATG WDR70 Sequenzierung WDR70e18R TTGTTGAATAAAGTTTCCAAATACC WEE1 RT-PCR WEE1_RT_F TGCTTGGACAGCATTCTCAT WEE1 RT-PCR WEE1_RT_R GCCAACTTGCAAAAGGAGAT ZNF143 RT-PCR ZNF143_RT_F TGGTGACAACTTAGAAAATATGGAA ZNF143 RT-PCR ZNF143_RT_R TGAACATAGGCCGCAGAAC

2.3.9 MLPA-Sonden-Oligonukleotide

MLPA-Sonden Oligo Sequenz RASGRP1_ex2F GGGTTCCCTAAGGGTTGGATCCCATCCCAGCTTGGCCCACAT RASGRP1_ex2R CACCCAGTTCCGAATGATGGTGTTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC GAMT_F GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGCAGGAGGCGCCCATTGATGAGCATTG GAMT_R GATCATCGAGTGCAATGACGGCGTCTTTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC WDR70_e6F GGGTTCCCTAAGGGTTGGACCTGTTCACAAGATTCCTGACTCGCATGA WDR70_e6R GATAACGCTGAAGCATGGCACTAAAACAGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC WDR70_e5F GGGTTCCCTAAGGGTTGGACCTCCTTTACCCCCTAAAATGGTAGGAAAAC WDR70_e5R CAGTTAATTTTATGGAGGAAGATATCCTCGGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC BC131744_F GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGCAGCTTTCTAGTTGTGAGCACCTGTTCTCCAT BC131744_R GAACTCTGTCTGACTCCCTGGCTAGCACGTTCTTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC Mef2c_ex2F GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGAACGAATGCAGGAATTTGGGAACTGAGCTGTGCA

Material & Methoden

Mef2c_ex2R AGTGCTGAAGAAGGAGATTTGTTTGGAGGAAACAGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC Mef2c_ex8F GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTCCTTCCGCATGCTCTCAGTCTGAGGATGTCGACCT Mef2c_ex8R GCTTTTGGTAAGTGGTGAGAGCGCTTCCCTCAAATGGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC Mef2c_ex10F GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTGTCTGGGTTTAACACCGCCAGCGCTCTTCACCTTGGT Mef2c_ex10R TCAGTAACTGGCTGGCAACAGCAACACCTACATAACATGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC Mef2c_ex9F GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGATAAATAACTCCCAGTCGGCTCAGTCATTGGCTACCCCAG Mef2c_ex9R TGGTTTCCGTAGCAACTCCTACTTTACCAGGACAAGGAATGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC Mef2c_ex1F GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTGCTCGCAGTCACAGACACTTGAGCACACGCGTACACCCAGA Mef2c_ex1R CATCTTCGGGCTGCTATTGGATTGACTTTGAAGGTTCTGTGTGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC Mef2c_ex4F GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGATCTAATGATCAGCAGGCAAAGATTGTGTGTAAGTACTCAGAAC Mef2c_ex4R ACCCTTCATTTTTTTTACTCTTGATATTTCTCTGAACCTGGCAGGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC Mef2c_i2_ex2F GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGTGCCAAAGAAGAGTTGCAAACTGTGAAGTAACTTCTATGAAGAGAT Mef2c_i2_ex2F GAAGTAAAGAACGGAAGGCAAATGATTGTGGCAGTAAAGAAGTGTATTCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC

2.3.10 BAC-Klone

BAC-Bezeichnung Accession-Number Chromosom R-562L8 14 RP11-109D3 AC010082 7 RP11-122P19 - 7 RP11-152H18 AC091053 11 RP11-168C2 AC015700.8 11 RP11-16F15 AC011979.7 11 RP11-185M5 - 7 RP11-1H15 AC011092.4 11 RP11-299P22 AC009308 7 RP11-321F11 AC105357 11 RP11-344H11 1 RP11-350N15 8 RP11-351I24 AC080023.6 11 RP11-367F9 5 RP11-465D10 - 7 RP11-467K18 AC079296 11 RP11-480K16 AL160033.21 13 RP11-48J22 AC023850 11 RP11-573E11 AC025300 11 RP11-627P22 AC073472.6 7 RP11-668A2 - 10 RP11-682B13 AC055845 11 RP11-685M7 AC116535.9 11 RP11-691A5 AC104360 11 RP11-692K8 AC091800 7 RP11-748C4 AC100763.2 11 RP11-79E12 - 11 RP11-88E10 AL139384.17 13 RP11-99O17 AC018706.3 7 RP5-881H5 AC004007.1 7 RP5-899B21 AC004008.2 7 RP5-978I12 AC003985.2 7

2.3.11 Arrays

Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0 Affymetrix Cytogenetics Whole-Genome 2.7M Array (Affymetrix) Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array Affymetrix GeneChip Human Promoter 1.0R Array [Hs_PromPR_v02] Affymetrix

Material & Methoden

2.3.12 Software und Datenbanken

Software und Datenbanken Hersteller bzw. Internet-Adresse ArrayExpress http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae/ Bioconductor software http://www.bioconductor.org/ Database of Genomic Variants http://projects.tcag.ca/variation/ Endeavour http://homes.esat.kuleuven.be/~bioiuser/endeavour/ Ensembl Variant Effect Predictor http://www.ensembl.org/tools.html ExPASy Translate Tool http://www.expasy.org/tools/dna.html Gene Expression Omnibus GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ Gene Prioritization Portal http://homes.esat.kuleuven.be/~bioiuser/gpp/ GeneDestiller http://www.genedistiller.org/ Human Genome Variation Society http://www.hgvs.org/ ISIS 3 MetaSystems: Isis Metasystems Mutation Taster http://www.mutationtaster.org/ NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ NCBI BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ NCBI Map Viewer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/ NCBI OMIM http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=omim NCBI ORF-Finder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html NCBI PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ NetGene2 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/ Panther Classification System http://www.pantherdb.org/ Partek genomic suite software Partek Pathway-Express (Onto-Tools) http://vortex.cs.wayne.edu/ontoexpress/ Phonetic Sciences Amsterdam, http://www.fon.hum.uva.nl/Service/Statistics.html Statistical tests Polyphen http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/ Polyphen 2 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/ Primer 3 http://frodo.wi.mit.edu/ Primer Express Applied Biosystems RaW-Oligo MRC Holland SeqEdit DNA Star SeqManII DNA Star SIFT http://sift.jcvi.org/ SMART http://smart.embl-heidelberg.de/ SNAP http://www.rostlab.org/services/SNAP/ SNPs3D http://www.snps3d.org/ SpliceView http://zeus2.itb.cnr.it/~webgene/wwwspliceview_ex.html ssSNPTarget http://variome.kobic.re.kr/ssSNPTarget/ SUSPECTS Candidate Gene Search http://www.genetics.med.ed.ac.uk/suspects/ The Human Gene Mutation Database http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php ToppGene Suite http://toppgene.cchmc.org/ UCSC Genome Browser http://genome.ucsc.edu/ UCSC Human BLAT Search http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBLAT Vector NTI Advance 10 Invitrogen VISTA Enhancer Browser http://enhancer.lbl.gov/frnt_page.shtml Wilcoxon Two Sample Test, IFA http://www.fon.hum.uva.nl/Service/Statistics.html Chromosome Analysis Suite (ChAS) Affymetrix ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/ National Institutes of Health, Bethesda ABI PRISM R 7900 HT SDS V2.1.1 Applied Biosystems Human Splicing Finder V. 2.4.1 http://www.umd.be/HSF/ SeqPilot 3.2.1.5 Software JSI medical systems BioDocAnalyze 2.0 Biometra Chromas Version 2.23 Technelysium Genotyping Console V. 3.0.2 Affymetrix Decipher v5.1 http://decipher.sanger.ac.uk/

Material & Methoden

Sequencing Analysis 5.1 Software Applied Biosystems DAVID Bioinformatics Resources 6.7 http://david.abcc.ncifcrf.gov/ STRING 9.0 http://string.embl.de/

2.3.13 Geräte

ABI 3100 Genetic Analyzer Applied Biosystems ABI Genetic Analyzer 3730 Sequenzer Applied Biosystems ABI PRISM 7900 HT Cycler Applied Biosystems Agilent Bioanalyzer Agilent Technologies Autoklaven Melag, Webeco, HMC, Schembera Bioruptor-Ultraschallgerät Diagenode Bunsenbrenner Fireboy Tec No Mara DC300 Kamera Leica Eismaschine Ziegra Elektophoresekammer MWG Biotech Feinwaage CP225D Sartorius Geldokumentationsanlage Gel Print 20001 MWG Biotech Geldokumentationsanlage Ti2 Biometra Gel-Kämme PeqLab Gel-Schiffchen MWG Biotech Heizblock Eppendorf Horizontalschüttler Unimax 1010 Heidolph Hybridisierungsofen Bachofer Inkubator: Bakterieninkubator B 6060 Heraeus Inkubator: Schüttelinkubator Innova 4300 New Brunswick Scientific Inkubator: Zellinkubator BBD 6220 Heraeus Kühl- und Gefrierschränke 4°C. -20°C, -80°C Siemens, Liebherr, Revco Kühlfalle (Refrigerated Condensation Trap RT100) Savant Kühlplatte Microm CP60 Laborwaage MC1 Sartorius Lichtmikroskop (BH-2) Olympus Magnetrührer IKAMAG RH Janke&Kunkel Magnetrührer KMO2 Janke&Kunkel Mikroskop Labovert (Zellkultur) Leitz Mikrowelle Panasonic Nanoquant Infinite 200 Tecan Neubauerzählkammer: Neubauer Improved Brand NuPAGE X-Cell Sure Lock-Apparatur Invitrogen pH-Meter: Digital pH-Meter 646 Knick Pinzette Biochem Pipette 8-Kanal 5-50 µl Capp, Dunn Pipette Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson Pipettierhilfe Easypet Eppendorf Pipettierroboter Biomek NX Beckman Coulter QIAcube Qiagen Rolleninkubator RM5 Assistent Rotationsmischer Heidolph Schüttel-Inkubator Heraeus Spannungsgerät Microcomputer Electrophoresis Power Supply Consort Spannungsgerät Power pac 300 Bio-Rad Spannungsgerät Powersupply PPs 200-1d MWG Biotech Speed Vac (SVC100) Savant Sterilbank (RNA) Prutscher Sterilbank Gelaire BSB6A (Bakterien) Flow laboratories Sterilbank Lamin Air (Zellkultur) Heraeus Tecan GENios Microplate Reader Tecan

Material & Methoden

Thermocycler MBS SATELLITE 0.2G Thermal Cycler Thermo Thermocycler PTC-225 Peltier Thermal Cycler MJ Research Thermocycler vapo.protect Mastercycler pro Eppendorf Thermomixer 5436 Eppendorf Thermomixer compact Eppendorf UV-Gerät BioDocAnalyzer 2.0 Biometra UV-Schirm IBI Vortexer VF 2 Janke&Kunkel Waage Sartorius Wasseraufbereitungsanlage Purelab plus USF-Elga Wasserbäder GFL, Memmert, Julabo, Lauda ecoline Western Blot-Entwicklungskassette (18x24cm) Siemens Westernblot: Xcell Sure Lock Elektrophoresis Cell Invitrogen Westernblot: Xcell II Blot Module Invitrogen Zeiss Axioplan2-Fluoreszenzmikroskop Zeiss +IMAC-CCD S30 Video Camera Module (Fluoreszenzmikroskopie) Zentrifuge Biofuge 22 R Heraeus Zentrifuge Biofuge pico Heraeus Zentrifuge Centrifuge 5415 Eppendorf Zentrifuge Centrifuge 5804 Eppendorf Zentrifuge Centrifuge 5810 Eppendorf Zentrifuge miniSpin Eppendorf Zentrifuge Omnifuge 2.ORS Heraeus, Sepatech

3 Ergebnisse

3.1 Ergebnisse Patient 46,XY,t(10;13) – Noonan-Syndrome-like

3.1.1 Ausgangslage

Zu Beginn meiner Arbeit waren die Bruchpunkte der de novo balancierten Translokation 46,XY,t(10;13)(q22.3;q34) basengenau identifiziert. Dabei wurde gezeigt, dass der Bruch auf Chromosom 10 das Gen MYST4 (MYST histone acetyltransferase (monocytic leukemia) 4), auch bekannt unter MORF oder KAT6B, in seinem Open Reading Frame rupturierte und darüber zu einer deutlichen Expressionsreduktion in diesem Gen führte (vgl. 2.1.1). Unter Ausschluss zusätzlicher Mutationen in MYST4 wurde ein auf Haploinsuffizienz basierender Pathomechanismus für den Noonan-Syndrome-like Phänotyp postuliert. In ersten funktionellen Analysen wurde eine starke Abnahme der globalen Histon-Acetylierungs-Aktivität in der lymphoblastoiden Zelllinie des Patienten nachgewiesen (vgl. Abb. 6; S.10).

3.1.2 MYST4-Knockdown in Zellmodellsystemen

Für weiterführende Analysen der Auswirkungen einer reduzierten Expression von MYST4 wurden mittels Transfektion humaner Zelllinien mit siRNA (vgl. 2.2.13.4) entsprechende Zellmodellsysteme etabliert. In den dazu durchgeführten Transfektionsexperimenten wurden die hierfür parallel verwendeten Zelllinien HEK293 und HeLa in unabhängigen Versuchen mit jeweils 3 verschiedenen gegen MYST4 gerichteten siRNAs transfiziert. Bei der anschließenden Analyse der Expression von MYST4 ca. 58 h nach Transfektionsinitiation mittels TaqMan- basierter qPCR konnte in allen Experimenten ein Knockdown der mRNA-Expression um 60-80% gemessen werden (Abb. 8). Beide Zelllinien zeigten dabei eine vergleichbare Abnahme der Expression von MYST4 in Bezug auf die verschiedenen siRNAs, mit dem stärksten Effekt unter Verwendung der siRNA HSS118880. Material aus damit transfizierten Zellen wurde daher für weiterführende Untersuchungen herangezogen.

Ergebnisse

Abb. 8 Messung der relativen Expression von MYST4 mittels TaqMan-basierter qPCR in den Zelllinien HEK293 und HeLa 57,75 h nach Transfektion mit gegen MYST4 gerichteten siRNAs. Eine signifikante Reduktion der Expression konnte in beiden Zelllinien für Transfektionen mit allen 3 unabhängigen siRNAs nachgewiesen werden (1, HSS118879; 2, HSS118880; 3, HSS118881) (*P < 0.05, t test). Als Negativkontrolle diente die jeweils parallel geführte Transfektion mit einer gegen kein humanes Gen gerichteten siRNA (scrambled siRNA).

3.1.3 Analyse der Histon H3- und H4-Acetylierung

Die direkte Auswirkung einer verminderten Expression der Histon-Acetyltransferase MYST4 wurde über den globalen Acetylierungsstatus der H3- und H4-Histone überprüft (vgl. 2.2.14). Dabei konnte für den Patienten an Hand seiner lymphoblastoiden Zelllinie gezeigt werden, dass während die Histon-H4-Acetylierung keine Veränderung aufwies, die Histon-H3-Acetylierung beim Patienten um 40% stark vermindert vorlag (Abb. 9 A). Die Auswirkungen einer Unterexpression von MYST4 speziell auf die Histon-H3- Acetylierung konnte auch durch die Ergebnisse aus den Zellmodellsystemen HEK293 und HeLa bestätigt werden. Beide Zelllinien zeigten nach Transfektion mit der effektivsten gegen MYST4 gerichteten siRNA (HSS118880) eine starke Abnahme der Histon-H3- Acetylierung gegen die jeweilige Negativkontrolle. Auch hier wurde keine Veränderung der H4-Acetylierung gemessen (Abb. 9 B). Korrelierend mit dem stärkeren Knockdown der MYST4-Expression in beiden Zellmodellsystemen auf ca. 20% Restexpression (vgl. Abb. 8; S.65) im Vergleich zum Expressionslevel des Patienten mit ca. 50% Restexpression (vgl. Abb. 5; S.10) zeigte sich dort auch die stärkere Reduzierung der H3-Acetylierung. Der Effekt war dabei in HEK293 mit einer Reduktion um 98% deutlich stärker ausgeprägt als in HeLa mit 58%.

Ergebnisse

Abb. 9 Messung der globalen Histon-H3- und Histon-H4-Acetylierung für (A) die lymphoblastoide Zelllinie des Patienten gegen 3 gesunde Kontrollen (Ctrl) sowie für (B) transfizierte HEK293- und HeLa- Zellen mit siRNA (HSS118880) vermitteltem MYST4-Knockdown gegen die jeweilige Negativkontrolle. Sowohl im Patienten als auch in den MYST4-Knockdown- Zellmodellsystemen war eine signifikante Abnahme der globalen H3 Acetylierung zu erkennen (*P < 0.05, t test; **P < 0.00001, t test). Die globale H4-Acetylierung war durch die stark verminderte Expression von MYST4 in beiden Fällen nicht beeinträchtigt.

3.1.4 Isformspezifisches Expressionsmuster von MYST4

Für das Genprodukt von MYST4 wurden von Champagne et al. (1999) die drei verschiedenen Isoformen MORF (AF113514.1), MORFα (AF119230) und MORFβ (AF119231) beschrieben, wobei die längste Isoform MORFβ dem annotierten Gen MYST4 (KAT6B: NM_012330.2) entspricht. In Bezug auf die kürzeste codierte Variante MORF wurde dort gezeigt, dass in den Varianten MORFα und MORFβ 109 bzw. 292 Aminosäuren zwischen dem Prolin an Position 372 und der Asparaginsäure an Position 373 eingeschoben sind (vgl. Abb. 34; S.103). Ein in MORF nachgewiesener Aminosäurebereich (AS 361-425) mit negativ regulierender Funktion auf die Histon- Acetyltransferase-Domäne (HAT) ist bei den längeren Varianten durch den Einschub direkt betroffen [41].

Ergebnisse

Da für die verschiedenen Isoformen grundsätzlich verschiedene entwicklungsspezifische sowie auch gewebespezifische Aufgaben denkbar sind, wurde die Expression der einzelnen Isoformen in verschiedenen fetalen und adulten Geweben unter Verwendung speziell dafür entworfener, isoformspezifischer TaqMan-Sonden analysiert (Abb. 10).

Abb. 10 Analyse des Expressionsmusters der MYST4 Isoformen MORF, MORFα und MORFβ in fetalen und adulten humanen Geweben (A), sowie zusätzlich in humanen Gehirnarealen (B), mittels TaqMan-basierter qPCR unter Verwendung isoformspezifischer Sonden. Als Template dienten die Gewebepanels Human Fetal Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel, Human Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel I, Human Fetal Normal cDNA Panel Tissue Neural, Human Adult Normal Tissue cDNA Panel Neural 2. Es wurden die selbst entworfenen isoformspezifischen Sonden (MORF, MORF alpha, MORF beta) verwendet, die Normalisierung erfolgte über mitgeführte endogene Kontrollen B2M und PGK1. (A, B) Additive Darstellung der relativen Expression der einzelnen Isoformen in den verschiedenen Geweben. (C, D) Addition der Expressionen der 3 Isoformen diente der Berechnung der Gesamtexpression von MYST4 (=100%). Daraus ergab sich die prozentuale Darstellung der relativen Isoformenexpression zueinander.

Ergebnisse

Bei den Ergebnissen zeigte sich die Situation im Gehirn am auffälligsten. Die bei weitem stärkste Gesamtexpression von MYST4 wurde im fetalen Gehirn gemessen (Abb. 10 A). Im Vergleich zeigte sich die Expression im adulten Gehirn um mehr als das 7-fache niedriger, aber damit immer noch vergleichbar mit dem Expressionslevel der adulten Gewebe mit der stärksten MYST4-Expression: Skelettmuskel und Pankreas. Zudem fiel beim Vergleich von fetalem und adultem Gehirn auf, dass die im fetalen Gehirn am schwächsten exprimierte, längste Isoform MORFß im adulten Gehirn nicht mehr nachgewiesen werden konnte, und im adultem Gehirn MORF, mit mehr als 75% der Gesamtexpression, die dominant exprimierte Variante darstellte (Abb. 10 C). Analysen bezogen auf funktionelle Teilbereiche des zentralen Nervensystems zeigten, dass entgegen den Ergebnissen zum Gesamtgehirn, für Cortex, Cerebellum sowie Rückenmark eine grob gleichbleibende Isoformenverteilung zu erkennen war mit einer durchwegs vorhandenen, wenn auch niedrigen Expression von MORFß (Abb. 10 B, D). Entgegen dem Ergebnis aus Gesamtgehirn nahm die Expression von MYST4 sowohl im Cortex, als auch im Cerebellum zwischen dem fetalen und adulten Stadium um ein Vielfaches zu (4-fach bzw. 2,5-fach). Die zweithöchste MYST4-Expression innerhalb der untersuchten Gewebe wurde in der fetalen Niere gemessen, und entsprach nur ca. 1/5 der Expression im fetalen Gehirn. Hier zeigte sich ebenfalls eine deutliche Abnahme (4-fach) zum adulten Stadium. Im Skelettmuskel wurde dagegen ein Anstieg der Expression um mehr als das 3-fache zum adulten Stadium gemessen, welches damit die dritthöchste Expression in allen Geweben zeigte. Die längste Isoform MORFß konnte hier nur im adulten Gewebe nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigte sich bei der grundsätzlich schwachen Expression in der Leber interessanterweise im fetalen Stadium fast ausschließlich MORFα exprimiert. In Bezug auf die Expression der einzelnen Isoformen über alle Gewebe war auffällig, dass die längste Isoform MORFβ deutlich die am wenigsten Vertretene darstellte.

3.1.5 Expressionsanalysen auf Proteinebene mittels Westernblot

Zur Analyse der Expression von MYST4 auf Proteinebene wurde ein Westernblot durchgeführt (vgl. 2.2.15). Die unter Verwendung des KAT6B/MORF-Antikörper (ab58823) erhaltenen spezifischen Banden entsprachen der über die Länge der Aminosäureketten geschätzten Massen der Isoformen MORF (1781 AS ~ 196 kDA), MORFα (1890 AS ~ 208 kDa) und MORFβ (2073 AS ~ 228 kDa) (Abb. 11). Der Antikörper zeigte sich somit fähig alle Isoformen von MYST4 spezifisch nachzuweisen.

Ergebnisse

Abb. 11 Westernblot-Analyse von MYST4 für die lymphoblastoide Zelllinie des Patienten gegen eine gesunde Normalkontrolle sowie für transfizierte HEK293- und HeLa-Zellen mit siRNA (HSS118880) vermitteltem MYST4-Knockdown gegen die jeweilige Negativkontrolle. (A) Die über den KAT6B/MORF-Antikörper (ab58823; 1:7500) erhaltenen Signale entsprachen in ihrer Höhe den geschätzten Molekülmassen aller 3 Isoformen von MYST4. Als Ladekontrolle diente ein Antikörper gegen Beta-Aktin (ab8227; 1:5000), für den auf Grund des deutlich stärkeren Signals für Detektion und Darstellung eine kürzere Entwicklung desselben Blots notwendig war. Es zeigte sich ein zelltypspezifisches Expressionsmuster der verschiedenen Isoformen. (B) Normalisierung über Beta-Aktin und Quantifizierung der MYST4- Isoformensignalstärke unter Verwendung des Programms ImageJ zeigte tendenziell niedrigere Proteinexpressionslevel bei den Zelllinien HEK293 und HeLa nach siRNA vermitteltem Knockdown.

Korrelierend mit den in qPCRs auf RNA-Ebene nachgewiesenen, unterschiedlichen gewebespezifischen Isoformexpressionen (vgl. 3.1.4) zeigte sich auch auf Proteinebene zwischen den drei verschiedenen Zelltypen HEK293, HeLa und lymphoblastoide Zellen eine deutlich unterschiedliche Verteilung der einzelnen Isoformen (Abb. 11 A). Während in den lymphoblastoiden Zelllinien hauptsächlich MORFα, kaum MORF und kein MORFβ nachgewiesen werden konnte, zeigte sich in HEK293 MORF als dominante Isoform mit

Ergebnisse einer schwächeren Expression von MORFα und ebenfalls ohne erkennbare Expression von MORFβ. Im Gegensatz zu den anderen beiden Zelllinien war in HeLa MORFß deutlich und vergleichbar hoch wie MORFα exprimiert, wobei hier hingegen keine Expression von MORF nachgewiesen werden konnte. Nach Normalisierung über die Signalstärken der Ladekontrolle war eine quantitative Einschätzung der relativen Proteinexpressionsabnahme bei den MYST4- defizienten Zellen gegen die entsprechenden Kontrollen für HEK293 und HeLa möglich (Abb. 11 B). Eine Expressionsabnahme war hier am deutlichsten in der HEK293-Zelllinie erkennbar, während in HeLa eine deartige Abnahme schwieriger zu erkennen war. Für die lymphoblastoide Zelllinie des Patienten konnte über den Westernblot keine Expressionsabnahme nachgewiesen werden.

3.1.6 Genomweite Expressionsanalysen

Zur Analyse der von der Histonacetyltransferase MYST4 beeinflussten Gene und Signalwege wurde die Auswirkung einer MYST4-Defizienz auf das Transkriptom über genomweite Array-basierte Expressionsanalysen untersucht (vgl. 2.2.11). Hierzu wurden für die humanen HEK293- und HeLa-Zelllinien jeweils 3 unabhängige MYST4-Knockdown-Experimente (siRNA HSS118880) durchgeführt (vgl. 3.1.2). Zusammen mit den parallel geführten Kontrollen wurden diese auf separaten GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays hybridisiert, sodass pro Zelllinie 6 Arrays verwendet wurden. Beim anschließenden kombinierten Abgleich der Ergebnisse aus allen Knockdown-Experimenten gegen ihre jeweiligen Kontrollen wurden Gene mit einer minimalen Änderung ihrer Expression um den Faktor 1,5 (Fold change) bei einer Falschpositivenrate (FDR) mit einem Wert unter 0,05 als von MYST4 reguliert angenommen. Parallel zu den durchgeführten Arrays an den humanen Zelllinien standen Daten aus einer Kooperation zur genomweiten differentiellen Expression in der Myst4- defizienten Querkopf-Maus (Qkfgt/gt) zur Verfügung [42]. Die Defizienz im murinen Modell war durch Homozygotie für ein transgen eingebrachtes, hypomorphes Gene-trap-Allel etabliert und resultierte in einer Myst4-Expressionsreduktion auf ca. 10% verglichen mit dem Transkriptlevel des Wildtyps. Phänotypisch präsentierte sich das Qkfgt/gt-Mausmodell mit Noonan-Syndrom vergleichbaren Merkmalen in Bezug auf typische faziale Auffälligkeiten, der generellen Wachstumsstörung und Anomalien der Gehirnentwicklung [42]. Die zur Verfügung gestellten Daten basierten auf genomweiter Expressionsanalyse zweier muriner Gewebe mittels des Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Arrays. Zum einen wurde adulter dorsaler Cortex und zum anderen fetales dorsales Telencephalon im Embryonalstadium E12.5 der Qkfgt/gt-Maus gegen die entsprechende Wildtyp-Kontrolle analysiert. Pro Genotyp wurden dabei 3 Tiere untersucht, wobei alle Gewebe auf separaten Arrays hybridisiert wurden [2]. Entsprechend dem Vorgehen im humanen

Ergebnisse

Modell wurden auch für die aus der Kooperation erhaltenen Daten solche Gene als von Myst4 reguliert angenommen, die eine minimale Expressionsänderung um den Faktor 1,5 bei einer Falschpositivenrate unter dem Wert 0,05 aufzeigten. Die unter Verwendung der oben genannten Parameter erhaltenen Genlisten für das humane sowie für das murine Modell wurden parallel untersucht. Für Ersteres wurden unter Integration der Ergebnisse beider humaner Zelllinien 689 über das gesamte Genom verteilte, differentiell exprimierte Gene nachgewiesen (Abb. 12), während im murinen Modell sich für den adulten dorsalen Cortex 329 und für das fetale dorsale Telencephalon 619 differentiell exprimierte Gene zeigten (vgl. Anhang 8.6). In beiden Modellsystemen konnte für die differentiell exprimierten Gene ein bis zu ca. 6-facher Fold change der Genexpression festgestellt werden, der Prozentsatz der dabei durch MYST4- Defizienz erniedrigt exprimierten Gene war im humanen Modell 74% und in den Mausgeweben 33% bzw. 56%.

Abb. 12 Chromosomale Lokalisation der im humanen Modell differentiell exprimiert gefundenen Gene mit Heatmap-Darstellung (Partek genomic suite) der Expressionsänderung gegenüber von Kontrollen. Durch siRNA vermittelten Knockdown von MYST4 in HEK293 und HeLa mit anschließender Expressionsarray-Analyse wurden 689 differentiell exprimierte Gene identifiziert, welche eine gleichmäßige Verteilung über das gesamte Genom und überwiegend erniedrigte Expression aufwiesen.

Ergebnisse

Die differentiell exprimiert gefundenen Gene der beiden Modellsysteme wurden anschließend getrennt in weiterführenden Gene Ontology-Analysen untersucht (vgl. 2.2.17). Hierbei wurde am humanen Modell gezeigt, dass mit 30% der größte Anteil dieser Gene eine überwiegende Expression im Gehirn aufwies (Abb. 13 A; vgl. Anhang 8.7.1). Sowohl im humanen Modell als auch in beiden murinen Geweben zeigte sich kongruent, dass die meisten Gene für Proteine kodierten, welchen eine subzelluläre Lokalisation im Cytoplasma (43-44%), im Nukleus (27-29%) und endoplasmatischen Retikulum (6-20%) zugewiesen werden konnte (Abb. 13 B,D,E). Des Weiteren zeigte die Mehrzahl eine grundsätzliche bindende Funktion (40-56%), proteinbindende Funktion (26-27%) und katalytische Aktivität (19-27%) (Abb. 13 C,E,G; vgl. Anhang 8.7.2 - 8.7.7).

Ergebnisse

Abb. 13 Zusammenfassung der Gene Ontology-Analysen basierend auf dem DAVID functional annotation tool [3] für die durch Expressionsarray signifikant differentiell exprimiert gefundenen Gene (p < 0,05) im humanen (A-C) sowie im murinen Modellsystem (D-E; F-G). Gezeigt ist die Verteilung der Genprodukte (>5%) in Bezug auf die gewebespezifische Expression (A), subzelluläre Lokalisation (B, D, F; GO Intracellular Component Categories) sowie molekulare Funktion (C, E, G; GO Molecular Function Categories)

Ergebnisse

Anschließend fand eine Einteilung der differentiell exprimierten Gene in verschiedene molekulare Interaktionsgruppen und Signalwege über die KEGG-Datenbank (Kyoto encyclopedia of genes and genomes) statt [39]. Hierbei zeigten sich nach Abgleich der Ergebnisse aus zwei unabhängigen Programmen (DAVID functional annotation tool [3]; Pathway-Express [40]) für das humane Modell 10 KEGG-Signalwege signifikant (Tab. 16), während im murinen Modell (Qkfgt/gt) für den adulten dorsalen Cortex 4 und für fetales dorsales Telencephalon 7 KEGG-Signalwege angereichert gefunden werden konnten (Tab. 17, Tab. 18)(vgl. Anhang 8.7.8 - 8.7.13). Der MAP-Kinase-Signalweg wurde als einziger Signalweg über alle drei Analysen angereichert nachgewiesen, und wurde daher als Primärziel einer MYST4-abhängigen Regulation angenommen. Im Gegensatz dazu zeigten die Insulin-, Wnt- und GnRH-Signalwege nur Anreicherung in zwei von drei Analysen, alle weiteren gefundenen Signalwege wurden nicht wiederholt gefunden.

Tab. 16 Signifikant angereicherte KEGG-Signalwege für die im humanen Modell (HEK293/HeLa; MYST4 siRNA) differentiell exprimiert gefundenen Gene [p < 0.05; FC < -1.5 or > 1.5]

Tab. 17 Signifikant angereicherte KEGG-Signalwege für die im adulten dorsalen Cortex der Qkfgt/gt-Maus differentiell exprimiert gefundenen Gene [p < 0.05; FC < -1.5 or > 1.5]

Ergebnisse

Tab. 18 Signifikant angereicherte KEGG-Signalwege für die im fetalen (E12.5) dorsalen Telencephalon der Qkfgt/gt-Maus differentiell exprimiert gefundenen Gene [p < 0.05; FC < -1.5 or > 1.5]

3.1.7 Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP-on-chip)

Zur Konkretisierung des Verhältnisses der in den genomweiten Expressionsanalysen (3.1.6) identifizierten MYST4-abhängigen Gene zu MYST4, wurde parallel eine Chromatin- Immunopräzipitation (ChIP) mit einer anschließenden Promoterarray-basierten Analyse (ChIP-on-chip) durchgeführt (vgl. 2.2.16). Die mit einem MYST4-spezifischen Antikörper angereichert gefundenen Promotoren dienten hierbei dem Nachweis der von MYST4 über unmittelbare Interaktion primär regulierten Gene, und damit zur Abgrenzung von den in den Expressionsarrays nicht unterscheidbaren sekundären Effekten. Hierfür wurde zunächst die grundsätzliche Funktionalität der Methode über einen Positivkontrollantikörper in Kombination mit einer etablierten Kontroll-Sonde nachgewiesen (Abb. 14 A) (vgl. 2.2.16.2). Des Weiteren wurde für eine Chromatin- Immunopräzipitation über das MYST4-Protein der schon im Westernblot (3.1.5) verwendete Antikörper, welcher Spezifität für alle 3 Isoformen von MYST4 zeigte, auf Funktionalität in der ChIP getestet. Hierzu wurde die Fähigkeit zur Anreicherung von MYST4-abhängigen Promotoren über die Anreicherung des Promotors von CDK6 (cyclin- dependent kinase 6) nachgewiesen (Abb. 14 B). CDK6 wurde als Kontrollgen ausgewählt, da dieses in den genomweiten Expressionsanalysen von humanen HEK293/HeLa- Zelllinien mit siRNA-vermittelten MYST4-Knockdown eines der am stärksten über MYST4- Defizienz negativ beeinflussten Gene darstellte (FC -2,65; vgl. Anhang 8.6.1) und darüber hinaus eine schon in der Literatur beschriebene Promotorregion besaß (AF332591.1) [43].

Ergebnisse

Abb. 14 Nachweis der generellen Funktionalität der ChIP-Methode und des dabei verwendeten MYST4-Antikörpers. Über SYBR-Green-qPCR wurde die relative ChIP- Anreicherung von Zielpromotorregionen unter Einsatz verschiedener Antikörper gegenüber einer Negativkontrolle (-) ermittelt und in Prozent der Inputkontrolle angegeben. Die Untersuchung wurde an der HEK293 Zelllinie durchgeführt. (A) Unter Verwendung der etablierten ChIP- Kontrollsonde gegen den Promotor des Gens FOS (Human c-fos, Diagenode) wurde eine Anreicherung in der mit dem Positivkontroll- Antikörper geführten Chip nachgewiesen. (B) ChIP mit dem gegen MYST4 gerichteten Antikörper KAT6B/MORF-antibody (ab58823) zeigte Anreicherung der Promotorregion des MYST4- regulierten Gens CDK6.

Im Anschluss an den Nachweis der generellen Funktionalität der Methode und der Eignung des gegen MYST4-gerichteten Antikörpers (ChIP-grade), wurde eine ChIP sowohl für die HEK293- als auch in der HeLa-Zelllinie durchgeführt. Nach spezieller Amplifikation wurden die erhaltenen Proben zur genomweiten Analyse der Anreicherung in Triplikaten auf GeneChip Human Promoter 1.0R Arrays (ChIP-on-chip) hybridisiert. In den mit MAT- Algorithmus (Partek) bei einem korrigierten P-Wert von unter 0,05 (corrected gamma p- value) 9003 signifikant angereichert gefundenen Regionen waren 4540 RefSeq-Einträge (NCBI) lokalisiert (vgl. 2.2.16.3). Für diese wurden, analog zur Analyse der in den genomweiten Expressionsanalysen differentiell exprimiert gefundenen Gene (vgl. 3.1.6), Gene Ontology-Analysen sowie eine Einteilung in molekulare Interaktionsgruppen und Signalwege unter Verwendung von zwei unabhängigen Programmen durchgeführt (DAVID functional annotation tool [3]; Pathway-Express [40]). In Bezug auf die Gewebeexpression der Gene in den angereichert gefundenen Regionen zeigte, vergleichbar mit den Ergebnissen der genomweiten Expressionsanalysen, mit 47% der größte Anteil der Gene eine überwiegende Expression im Gehirn (Abb. 15).

Ergebnisse

Abb. 15 Gewebebezogene Expressionsverteilung (DAVID functional annotation tool [3]) der durch ChIP mit einem gegen MYST4 gerichteten Antikörper signifikant angereichert gefundenen Gene (MAT score p-value < 0.05).

In Bezug auf molekulare Interaktionsgruppen und Signalwege wurden mit Pathway- Express 10 KEGG-Signalwege signifikant nachgewiesen. Der dabei enthaltene MAP- Kinase-Signalweg sowie die Gruppe der für Schilddrüsenkrebs relevanten Gene (thyroid cancer pathway) wurden dabei auch bei der Analyse über das DAVID functional annotation tool als dort einzige signifikante Funde nachgewiesen (Tab. 19) (vgl. Anhang 8.8).

Tab. 19 Signifikant angereicherte KEGG-Signalwege für die in der ChIP-on-chip mit einem gegen MYST4 gerichteten Antikörper angereichert gefundenen Gene (MAT korrigierter P- Wert <0,05)

3.1.8 Kombinierte Analyse der Ergebnisse aus der genomweiten Expressionsanalyse mit denen aus der ChIP-on-chip

Die über genomweite Expressionsanalysen im humanen Modell (HEK293/HeLa; MYST4 siRNA) differentiell exprimiert gefundenen Gene wurden mit den signifikant angereichert gefundenen Genen (HEK293/HeLa; MAT korrigierter P-Wert <0,05) aus der ChIP-on-chip Analyse abgeglichen. Dabei zeigte sich eine Übereinstimmung in 467 Genen (vgl. Anhang 8.9.1), für welche somit anzunehmen war, dass sie Primärziele von MYST4 darstellten. Entsprechend wurde für diese Gene eine vorwiegende Expression im Gehirn (46%) (vgl. Anhang 8.9.2) gefunden, und damit ein mit dem von MYST4 vergleichbares

Ergebnisse

Expressionsmuster. Entsprechend der Annahme einer hauptsächlich aktivierenden Regulation über die Histonacetyltransferase MYST4 zeigten 81% dieser Gene eine Expressionsreduktion als Folge von siRNA vermittelter MYST4-Defizienz. Bei der Analyse dieser Gene in Bezug auf Signalwege und molekulare Interaktionsgruppen fand sich wieder nur der MAP-Kinase-Signalweg sowie die Gruppe der für Schilddrüsenkrebs relevanten Gene über beide Programme signifikant (Tab. 20) (vgl. Anhang 8.9.3 - 8.9.4).

Tab. 20 Signifikant angereicherte KEGG-Signalwege für die Gene mit sowohl signifikanter differentieller Expression (HEK293/HeLa; MYST4 siRNA) als auch signifikanter Anreicherung in der ChIP-on-chip (HEK293/HeLa; MAT korrigierter P-Wert <0,05)

Bei anschließender, genauerer Betrachtung der Gene des MAP-Kinase-Signalweges wurden die Gene, welche sowohl signifikante differentielle Expression als auch signifikante Anreicherung in der ChIP-on-chip Analyse zeigten (vgl. Anhang 8.9.5), mittels Taqman-basierter qPCR validiert. Zusätzlich wurden durch eine für die lymphoblastoide Zellinie des Patienten durchgeführte genomweiten Expressionsarray- Analyse Expressionsveränderungen in diesen Gene auch für den Patienten bestätigt (Tab. 21).

Ergebnisse

Tab. 21 Gene des KEGG MAPK-Signalwegs mit signifikanter differentieller Expression (HEK293/HeLa; MYST4 siRNA) als auch signifikanter Anreicherung in der ChIP-on- chip (HEK293/HeLa; MAT korrigierter P-Wert <0,05), validiert mittels TaqMan-basierter qPCR (endogene Kontrollen: B2M, PGK1, ACTB, TBP; Negativkontrollen: NTRK1, DUSP2). Nachweis der differentiellen Expression in der lymphoblastoiden Zelllinie (LCL) des Patienten, gemessen mit genomweiten Expressionsarray. (Signifikante Werte dick hinterlegt)

3.1.9 Phosphorylierungsstatus wichtiger Komponenten des MAP-Kinase- Signalwegs

Auf Grund der wiederholt gefundenen Ergebnisse, die einen Einfluss der MYST4-Defizienz auf den MAP-Kinase-Signalweg aufzeigen, wurde untersucht, ob MYST4-Haploinsuffizienz in einer Fehlregulation der für diesen Signalweg wichtigen Phosphorylierung von zentralen Komponenten resultiert. Hierzu wurden in einer Kooperation für die lymphoblastoide Zelllinie des Patienten die Phosphorylierungsgrade von MEK1/2 (MAP2K1/2), ERK1/2 (MAPK1/3) und AKT untersucht (Dr. Cirstea, AG Ahmadian, Institute of Biochemistry and Molecular Biology II, Düsseldorf). Für die Zelllinie des Patienten zeigte sich dabei durchwegs eine Hyper- Phosphorylierung dieser Komponenten im Vergleich zu Normalkontrollen. Des Weiteren konnte durch transiente Transfektion der Patientenzelllinie mit MYST4-Wildtypkonstrukt eine Normalisierung der Phosphorylierungslevel nachgewiesen werden (Abb. 16).

Ergebnisse

Abb. 16 Quantitative Westernblotanalyse der Phosphorylierungslevel von wichtigen Signalweg-Komponenten (MEK, ERK und AKT) in lymphoblastoiden Zelllinien im Rahmen einer Kooperation. (A) Lysat aus lymphoblastoiden Zelllinien wurde mit einem Protease-Inhibitor beinhaltenen Lysispuffer hergestellt. Unter Verwendung der Antikörper MEK1/2 (Cell Signaling), ERK1/2 (Cell Signaling), AKT (Cell Signaling), phospho-MEK1/2 (Ser 217/221, Cell Signaling), phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204, Cell Signaling) and phospho-AKT (Ser473, Cell Signaling) zeigte sich für den Patienten (P1) in Relation zu 3 Normalkontrollen (C1-3) eine erhöhte Phosphorylierung der untersuchten Proteine. Die mit dem MYST4-Wildtypkonstukt (SC308942, Origene) transfizierte Zelllinie des Patienten (R) zeigte dagegen normale Phosphorylierungsgrade. (B) Über Normalisierung durch die parallel geführte Aktin-Kontrolle zeigte sich eine signifikant erhöhte Phosphorylierung der Komponenten im Patienten (P < 0,05, T-Test) und normale Phosphorylierungsgrade im Falle der transfizierten Zelllinie.

Ergebnisse

3.1.10 Mutations-Screening

Zur Feststellung der Frequenz von MYST4-Haploinsuffizienz als Ursache für Erkrankungen im Spektrum des Noonan-Syndroms wurden weitere Patienten mit vergleichbarem Phänotyp mit ungeklärter Ursache untersucht. Hierzu wurde für insgesamt 131 Patienten, welche klinische Auffälligkeiten des Noonan-Syndroms aber keine Mutationen in den bisher assoziierten Genen zeigten, die kodierende Sequenz von MYST4 sequenziert. Bei der Analyse wurden keine krankheitsassoziierten Mutationen aufgedeckt, sodass gezeigt wurde, dass intragene Mutationen in MYST4 keine häufige Ursache für das Noonan-Syndrome-like Spektrum darstellen.

Ergebnisse

3.2 Ergebnisse Patientin 46,XX,t(1;8) – Adipositas & Hypogonadismus

3.2.1 Bruchpunktsequenzierung

Zu Beginn meiner Arbeit waren die Bruchpunkte der Translokation 46,XX,t(1;8)(p35.2;p11.2) auf einen 4-6 kb großen Bereich auf Chromosom 1 (chr1:27,098,300-27,104,500 bp; hg18) und einem 100 kb großem Bereich auf Chromosom 8 (chr8:38,322,500-38,422,000 bp; hg18) durch eine Kartierung mittels FISH und Mini-FISH voreingegrenzt. Davon ausgehend war es zunächst Ziel, die Bruchpunkte auf die Base genau mittels Bruchpunktsequenzierung (vgl. 2.2.6), basierend auf Sequenzierung der auf den derivativen Chromosomen vorkommenden Übergängen zwischen den Chromosomenabschnitten unterschiedlichen Ursprungs, zu kartieren. Zur Generierung eines Bruchpunkt-überspannenden Long-range-PCR-Produkts (vgl. 2.2.4.3) wurden eine Vielzahl von Primerkombinationen unter Verwendung verschiedener PCR-Kit-Systeme für beide derivativen Chromosome getestet. Für das derivative Chromosom 8 (der(8)) wurde dabei ein spezifisches Produkt unter Einsatz der Primer 8_2F und 8_18R erhalten (Abb. 17), über dessen anschließende Sequenzierung der Übergang zwischen den Chromosomenabschnitten unterschiedlichen Ursprungs auf die Base genau identifiziert werden konnte (Abb. 18).

Abb. 17 Gelelektrophorese der Produkte einer auf dem derivativen Chromosom 8 basierenden LR-PCR: Einsatz der Primerkombination 8_2F x 8_18R (19) ergab ein spezifisches Bruchpunkt-überspannendes LR-PCR-Produkt, über welches der Bruchpunkt basengenau kartiert werden konnte.

Ergebnisse

Abb. 18 Bruchpunkt-überspannende Sequenz auf dem derivativen Chromosom 8.

Der direkt auf dem Übergang gelegenen Guanin-Base konnten dabei zunächst Positionen auf beiden beteiligten Chromosomen, Chr1:27,099,929 bp (hg18) bzw. Chr.8: 38,407,626 bp (hg18), zugeordnet werden. Durch Vergleich der diese Positionen beidseitig umgebenden Sequenzen konnte aber anschließend gefolgert werden, dass die Guanin-Base dem Chromosom 1 zugeordnet werden muss. Somit wurden die Bruchpunkte der Translokation auf Chromosom 1 auf die Basenposition Chr.1:27,099,929 bp (hg18) und auf Chromosom 8 auf die Position Chr.8:38,407,627 bp (hg18) exakt durch Bruchpunktsequenzierung kartiert. Daraus resultierte eine Korrektur der bisher angegeben Karyotypformel von 46,XX,t(1;8)(p35.2;p11.2) zu 46,XX t(1;8)(p36.11;p12) (hg18). Ein auf dieser Information beruhender Versuch, auch für den Bruchpunkt auf dem dervativen Chromosom 1 ein überspannendes PCR-Produkt für eine anschließende Sequenzierung zu generieren, war nicht erfolgreich.

3.2.2 Analyse der Bruchpunkte und der umgebenden genomischen Region

Untersuchungen der in Abb. 19 dargestellten, umgebenden genomischen Regionen um die beiden Bruchpunkte zeigten, dass durch den Bruch auf Chromosom 8 das Gen FGFR1 (fibroblast growth factor receptor 1) direkt in einem seiner ersten Introns durchbrochen wurde (Abb. 20). Der Bruch lag dabei für alle Isoformen nach dem ersten, bzw. bei Transkriptionsvariante 14 (NM_001174067.1) nach dem zweiten codierenden Exon, und zerstörte somit die offenen Leserahmen (Open Reading Frames) aller bekannten Isoformen von FGFR1 kurz nach dem Translationsstart. Der gefundene Bruch der codierenden Region von FGFR1 korrelierte dabei gut mit dem aus einer Vorarbeit stammenden Hinweis auf eine tendenziell reduzierte Expression dieses Gens (vgl. 2.1.2.3). Die im Rahmen dieser Vorarbeit ebenfalls als reduziert exprimiert gefunden Gene LETM2 (leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2) und NR0B2

Ergebnisse

(nuclear receptor subfamily 0, group B, member 2) lagen, mit einem Abstand von 22,4 kb bzw. 10,6 kb, in direkter Nachbarschaft zu den chromosomalen Brüchen. Das bisher annähernd unbeschriebene Gen GPATCH3 (G patch domain containing 3) wurde auf Grund seiner extremen Nähe zum nur 380 bp entfernten Bruchpunkt auf Chromosom 1 in weiterführenden Analysen ebenfalls einbezogen.

Abb. 19 Darstellung der umgebenden genomischen Region für den Bruchpunkt auf Chromosom 1 (A) und Chromosom 8 (B). Auf Chromosom 8 wurde das Gen FGFR1 durch den Chromosomenbruch direkt rupturiert.

Abb. 20 Direkte Rupturierung des Gens FGFR1 durch das chromosomale Rearrangement. Der Bruchpunkt auf Chromosom 8 lag im Bereich eines der ersten Introns des Gens FGFR1 und rupturierte dadurch die offenen Leserahmen aller bekannten Isoformen kurz nach dem Translationsstart.

Ergebnisse

Im Gegensatz zu dem direkten Bruch von FGFR1 auf Chromosom 8 durch die Translokation, war auf Chromosom 1 an der Position des Bruchpunktes kein Gen annotiert. Jedoch wurde auch die Möglichkeit eines bisher noch nicht annotierten Gens direkt auf dem Lokus des Bruches von Chromosom 1 untersucht. Hierzu wurden in der Region gelegene gespleißte ESTs (spliced Expressed sequence tags) (Abb. 21), welche als Hinweise auf exprimierte Gene verstanden werden können, mittels RT-PCR untersucht.

Abb. 21 Unmittelbare genomische Umgebung des Bruchpunktes auf Chromosom 1 mit Fokus auf die darin annotierten gespleißte Expressed Sequence Tags (ESTs).

Dazu wurden Primer in die Exons des vom Bruchpunkt rupturierten, zum Zeitpunkt der Untersuchung bekannten gespleißten ESTs BQ887571 und dessen kürzerer Variante BU541065 gelegt. Weiterhin wurden Primer in die Exons von GPATCH3 gelegt, zur Untersuchung einer eventuellen Zugehörigkeit dieser ESTs zu GPATCH3 über Nachweis der Existenz eines gemeinsamen Transkripts. RT-PCR-Analysen unter Einsatz verschiedener Primerkombinationen mit anschließender Produkt-Sequenzierung zum Nachweis von gespleißten Transkripten zeigten, dass kein Zusammenhang zwischen den rupturierten gespleißten ESTs und dem Gen GPATCH3 bestand. Dagegen konnte die in

Ergebnisse der UniGene-Datenbank (NCBI) hinterlegte Zuweisung dieser gespleißten ESTs zu dem Gen NUDC (nuclear distribution gene C homolog (A. nidulans)) bestätigt werden, da aus der RT-PCR erhaltene, Intron-überspannende Sequenzen den EST-Datenbankeinträgen entsprachen und gemäß der Annotation Exons von NUDC beinhalteten. Die Bestätigung der NUDC-Zugehörigkeit dieser gespleißten ESTs führte zur Feststellung eines alternativen Transkripts von NUDC, auf welches im Folgenden unter dem Namen NUDCß Bezug genommen wird. Wie aus der Lage der Exons des gespleißten ESTs BQ887571 bzw. BU541065 ableitbar, ist bei NUDCß das den Translationsstart tragende Exon 1 von NUDC durch drei alternative Exons (alt1-3) ersetzt (Abb. 22). Der putative offene Leserahmen (ORF) von NUDCß hat seinen Startpunkt auf dem dritten alternativen Exon (alt3) und codiert für ein putatives Protein, dass sich von dem annotierten NUDC-Protein (NP_0065911.1) insofern unterscheidet, dass die ersten 27 Aminosäuren des 331 AS langen annotierten Polypeptids durch 31 anderweitige ersetzt sind. Im Bezug auf die Translokation wurde NUDCß durch den Bruchpunkt auf Chromosom 1 in seiner 5´UTR zwischen den ersten beiden Exons rupturiert.

Abb. 22 Exonstruktur des auf dem gespleißten EST BQ887571 basierenden, alternativen Transkripts NUDCß im Vergleich zu der des annotierten Gens NUDC. Bei NUDCß ist das den Translationsstart tragende Exon 1 (1) von NUDC durch drei alternative Exons (alt1-3) ersetzt. Der chromosomale Bruch auf Chromosom 1 rupturierte NUDCß in seiner 5´UTR zwischen seinen ersten beiden Exons.

Zusammenfassend wurde somit gezeigt, dass das Gen FGFR1 durch den Bruch auf Chromosom 8 in seinem offenen Leserahmen direkt rupturiert wurde. Auf dem Bruchpunkt von Chromosom 1 war dagegen kein annotiertes Gen lokalisiert, jedoch wurde eine aus gespleißten ESTs abgeleitete Variante von NUDC im Lokus des Bruchpunktes nachgewiesen, deren 5`UTR durch diesen rupturiert wurde.

Ergebnisse

3.2.3 Expressionsanalysen mittels TaqMan-basierter qPCR

Zur Analyse des Einflusses der Translokation auf die direkt auf den Bruchpunkten oder unmittelbar um die Bruchpunkte lokalisierten Gene, wurde diese auf differentielle Expression hin untersucht. Hierzu wurden TaqMan-basierte qPCRs (vgl. 2.2.9.1) grundsätzlich an nativen Lymphozyten der Patientin im Vergleich zu gesunden Normalkontrollen durchgeführt (Abb. 23).

Abb. 23 Expressionsanalysen mittels TaqMan-basierter qPCR zur Messung der relativen Expression der Gene FGFR1, LETM2, NR0B2, NUDC sowie dessen Variante NUDCß und GPATCH3 in nativen Lymphozyten bzw. lymphoblastoiden Zellmaterial (LCL) der Patientin (P) gegen gesunde Kontrollen (C). Die aus mindestens 3 technischen Replikaten generierten Daten wurden über mitgeführte endogene Kontrollen normalisiert (Set für FGFR1 und LETM2: B2M, TBP, RPLPO, HPRT1, PGK1; Set für NUDC und NUDCß: B2M, TBP, PO, PGK1; Set für NR0B2: ACTB, POLR2A; Set für GPATCH3: ACTB, B2M, RPLPO). Der Mittelwert aus den Kontroll- Samples (C) diente als Referenz und wurde daher dem Wert 1 zugewissen und mit der Standardabweichung über alle Kontroll-Samples dargestellt (8 gleichgeschlechtliche Kontroll- Samples für FGFR1, LETM2, NUDC und NUDCß; 6 gemischtgeschlechtliche Kontroll-Samples für NR0B2; 4 gemischtgeschlechtliche Kontroll-Samples für GPATCH3). Die relative Expression der Patientin (P) ist mit der Standardabweichung der technischen Replikate dargestellt. Signifikanz wurde mit einem Wilcoxon Test errechnet: FGFR1, LETM2, NR0B2 und NUDCß zeigten signifikant reduzierte Expression.

Hierbei wurde gezeigt, dass das durch die Translokation in seinem offenen Leserahmen gebrochene FGFR1, für welches schon ein Hinweis auf eine mögliche reduzierte Expression aus einer im Rahmen einer Diplomarbeit durchgeführten SYBR Green-qPCR- Analyse bestand, signifikant in seiner Expression reduziert war. Auch die im Rahmen der erwähnten Arbeit mit SYBR Green-qPCR gefundene reduzierte Expression des 22,4 kb upstream vom Bruchpunkt gelegenen LETM2 konnte mit TaqMan-qPCR unter Verwendung von deutlich mehr endogenen Kontrollen bestätigt werden.

Ergebnisse

Die Rohdaten der in Vorarbeit durchgeführten TaqMan-qPCR zu NR0B2 wurden in der vorliegenden Arbeit wiederholt verrechnet, die signifikante Expressionsreduktion wurde dabei bestätigt. Die übernommenen Rohdaten wurden unter Berücksichtigung der in der Vorarbeit auffälligen tageszeitlichen bzw. nahrungsaufnahmebedingten Expressionsschwankungen von NR0B2 generiert. Die Probenentnahme bei Patientin und Kontrollen geschah hierfür zum Entnahmezeitpunkt 4-5 h nach dem Mittagessen, für den die höchste Expressionskonsistenz nachgewiesen wurde. Bei der Expressionsanalyse des Gens NUDC wurden für das annotierte Transkript (NM_006600.2) und dessen alternativen Transkript NUDCß isoformspezifische TaqMan- Sonden entworfen und eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das vom chromosomalen Bruch rupturierte NUDCß signifikant in seiner Expression reduziert war, während die annotierte Variante keine differentielle Expression aufwies. Eine Expressionsanalyse für das 380 bp upstream vom Bruchpunkt gelegene GPATCH3 an lymphoblastoidem Zellmaterial zeigte keine Änderung, daher wurde auf einen Nachweis in Material aus nativen Lymphozyten verzichtet.

3.2.4 Molekulare Karyotypisierung

Um einen möglichen Verlust (loss) oder Zugewinn (gain) genetischen Materials im Bereich der Bruchpunkte aber auch im restlichen Genom auszuschließen, wurde eine molekulare Karyotypisierung unter Verwendung des Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0 in Auftrag gegeben (vgl. 2.2.12). Dabei wurde im Bereich der Bruchpunkte keine Veränderung festgestellt, allerdings konnte eine Dosiserhöhung im Bereich 15q13.2q13.3 aufgedeckt und mittels qPCR (vgl. 2.2.9) validiert werden, welche mit einem vorbeschriebenen rekurrenten Mikroduplikations-Syndrom einhergeht [44]. Der Array zeigte dabei eine Duplikationsgröße von 2411 kb über 1149 Array-Marker mit den äußersten noch in der Duplikation liegenden Markern CN_685242 (hg18: 28,292,358) und CN_696184 (hg18: 30,702,885). Unter Einbezug der benachbarten, nicht duplizierten Marker resultierte die Beschreibung der Duplikation mit der Formel [Chr15:g.(28,289,575_28,292,358)_(30,702,885_30,712,597)dup NCBI Build 36.1] (Abb. 24).

Ergebnisse

Abb. 24 Molekulare Karyotypisierung mittels Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0. Unter Berücksichtigung von Aberrationen ab einer Größe von 100 kb fand sich bei der Patientin ein Zugewinn von 2,4 Mb des chromosomalen Materials der Banden 15q13.2 bis 15q13.3. Die duplizierte Region wurde mit dem UCSC Genome Browser basierend auf hg18 dargestellt.

Ergebnisse

3.3 Ergebnisse Patientin 46,XX,t(5;14) – Schwere mentale Retardierung

3.3.1 Bruchpunktsequenzierung

In vorrausgegangenen Untersuchungen der Translokation 46,XX,t(5;14)(p15.33;q12) konnten die Bruchpunktregionen über FISH und Mini-FISH bis auf einen 27,4 kb großen Bereich auf Chromosom 5 (chr5:3,788,245-3,815,688 bp; hg18) und einen 38 kb großen Bereich auf Chromosom 14 (chr14:28,771,220-28,809,412 bp; hg18) voreingegrenzt werden (Abb. 25).

Abb. 25 Überblick über die vorrausgegangene Bruchpunkt-Eingrenzung mittels FISH und Mini-FISH.

Davon ausgehend war es Ziel, die Bruchpunkte basengenau mittels Bruchpunktsequenzierung (vgl. 2.2.6) zu kartieren. Die Generierung eines Bruchpunkt- überspannenden LR-PCR-Produkts für das derivative Chromosom 5 war in den Vorarbeiten ohne Erfolg. Angesichts der Erfahrung, dass oftmals überspannende Produkte für unterschiedliche Bruchpunkte einer Translokation unterschiedlich schwierig zu generieren sind, wurde deshalb im Folgenden der Bruchpunkt auf dem derivativen Chromosom 14 untersucht. Zur Generierung eines Bruchpunkt-überspannenden Long range-PCR-Produkts (vgl. 2.2.4.3) wurde eine Vielzahl von Primerkombinationen unter Verwendung verschiedener PCR-Kit-Systeme getestet. Jedoch konnte auch unter starker Erweiterung des in die Untersuchung einbezogenen Bereichs mit bis zu 40 kb über die

Ergebnisse durch Mini-FISH identifizierte Region hinaus kein spezifisches Produkt erhalten werden. Eine basengenaue Bruchpunktkartierung war somit nicht erfolgreich.

3.3.2 Molekulare Karyotypisierung

Um auszuschließen, dass das Misslingen der Bruchpunktkartierung auf einen Verlust (loss) oder Zugewinn (gain) genetischen Materials im Bereich der Bruchpunkte zurückzuführen war, wurde eine molekulare Karyotypisierung unter Verwendung des Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0 in Auftrag gegeben (vgl. 2.2.12). Hierbei wurde im Bereich der Bruchpunkte keine Veränderung festgestellt, und auch im restlichen Genom wurden keine weiteren relevanten Auffälligkeiten registriert.

3.3.3 Untersuchung der bruchpunktumgebenden genomischen Region und Identifikation des Kandidatengens FOXG1

Die eingegrenzten Bruchpunktbereiche beinhalteten keine annotierten Gene, sodass ein direkter Bruch in einem Gen als Ursache für den Phänotyp ausgeschlossen werden konnte. Im Rahmen einer Diplomarbeit wurden die Gene CEP72, PAPD7 und TPPP in der Bruchpunktumgebung auf Chromosom 5 mit erniedrigter Expression gefunden (Abb. 26 A). Da es sich dabei um Gene des Zellzyklus handelt und auch eine Beeinträchtigung auf weitere Zellzyklusgene nachgewiesen werden konnte (vgl. 2.1.2.3), wurde an dieser Stelle von einem Pathomechanismus basierend auf Dysregulation des Zellzykluses ausgegangen. Als Ursache wurde die Ruptur eines regulatorischen Elements durch den Bruchpunkt angenommen.

Ergebnisse

Abb. 26 Darstellung der umgebenden genomischen Region des Bruchpunkt- bereichs auf Chromosom 5 (A) und Chromosom 14 (B).

Ausgehend von dieser Annahme wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Möglichkeit der Fehlregulation weiterer Gene im Bereich der Bruchpunkte untersucht. Bei der Kandidatensuche war vor allem das in der relativ Gen-armen Region um den Bruchpunkt auf Chromosom 14 gelegene Gen FOXG1 (forkhead box G1; MIM 164874) auffällig, welches 0,5 Mb upstream der Bruchpunktregion lokalisiert war (Abb. 26 B). Im Jahr 2008 wurde von Ariani et al. dessen Kausalität für die kongenitale Variante des autosomal dominanten Rett-Syndroms (MIM 613454) publiziert, welches sich vergleichbar mit dem Phänotyp der Patientin mit postnataler Mikrozephalie, Dysgenesie des Corpus callosum, schwerer mentaler Retardierung und Krampfanfällen präsentierte [45-47]. Bei anschließender Wiedervorstellung der Patientin im Alter von 10 Jahren zeigten sich bei dieser als neues phänotypisches Merkmal die für Rett-Syndrom typischen stereotypen Handbewegungen. Dies begründete eine Neuzuordnung der Patientin zu diesem Syndrom und unterstützte im Weiteren die Annahme eines auf FOXG1- Haploinsuffizienz basierenden Pathomechanismus.

Ergebnisse

3.3.4 Nachweis einer FOXG1-Defizienz

Der Nachweis einer FOXG1-Defizienz wurde durch Analyse der relativen Expression des Gens im Vergleich zu Normalkontrollen geführt. Hierzu wurde eine Expressionsanalyse auf Proteinebene über Westernblot derer auf Transkriptebene vorgezogen, da hierfür auch im Rahmen einer Kooperation (Dr. Kathleen Freson, Prof. Dr. Devriendt, K.U. Leuven) eine schon für andere FOXG1-Haploinsuffizienzfälle etablierte Methode zur Verfügung stand (Abb. 27). Die dabei erhaltenen Ergebnisse zeigten im Fall der Patientin eine deutliche Expressionserniedrigung von über 60% für das FOXG1-Protein, und bestätigten somit einen auf FOXG1-Haploinsuffizienz basierenden Pathomechanismus.

Abb. 27 Relative FOXG1-Proteinexpression der Patientin gegen 2 gesunde Kontrollen. In die im Rahmen einer Kooperation durchgeführten Westernblot- Analyse mit einem FOXG1-spezifischen Antikörper (ab18259, Abcam) wurden 20 µg an Whole Platelet Lysat eingesetzt (Methode nach Freson et al., 2001 [1]). Die Patientin zeigte nach Normalisierung über die Ladekontrolle p38 (#9212, Cell Signaling) eine im Vergleich zu den Kontrollproben (Ctrl1, Ctrl2) um mehr als 60% erniedrigte FOXG1-Expression.

Ergebnisse

3.4 Ergebnisse Patientin 47,XXX,t(7;11) – DiGeorge-Syndrome- Like

3.4.1 Bruchpunkteingrenzung und Sequenzierung

Zu Beginn meiner Arbeit war nur einer der Bruchpunkte der Translokation 47,XXX,t(7;11)(p15.3;p15.3) auf einen 2 Mb großen Bereich auf Chromosom 11 (chr11:9,233,343-11,075,367 bp; hg18) durch eine Kartierung mittels FISH voreingegrenzt. Basierend auf diesem Wissen wurde zunächst eine weitere grobe Eingrenzung des Bruchpunktes auf Chromosom 11 über die FISH-Methode (vgl. 2.2.7) durchgeführt. Hierfür wurden innerhalb des voreingegrenzten Bereiches BAC-Klone für die Herstellung von FISH-Sonden ausgewählt (vgl. 2.2.7.1). Durch die Anwendung dieser Sonden konnte RP11-748C4 als Bruchpunkt-überspannender BAC-Klon identifiziert werden und damit eine Eingrenzung auf eine 173 kb große Region erreicht werden (Abb. 28 A; vgl. Anhang 8.3). Parallel wurden BAC-Klone für eine Bruchpunkteingrenzung auf Chromosom 7 gewählt, welche eine 9,6 Mb große, über den Bereich der zytogenetisch festgestellten Bande 7p15.3 hinausgehende Region abdeckten. Hier fand sich der Klon RP11-122P19 als Bruchpunkt-überspannend, und ermöglichte somit eine Eingrenzung auf eine 150 kb große Region (Abb. 28 A; vgl. Anhang 8.3).

Abb. 28 Identifikation der Bruchpunkt-überspannenden BAC-Klone. (A) Der BAC- Klon RP11-748C4 zeigte bei der Patientin Signale auf Chromosom 11 und beiden derivativen Chromosomen. Dieses sogenannte gesplittete Signal identifizierte diesen als Bruchpunkt- überspannend. (B) Analog wurde der BAC-Klon RP11-122P19 über sein gesplittetes Signal auf Chromosom 7 und den beiden derivativen Chromosomen als Bruchpunkt-überspannend identifiziert.

Ergebnisse

Für eine anschließende feinere Kartierung wurden über den gesamten Bereich der beiden Bruchpunkt-überspannenden BAC-Klone Mini-FISH-Sonden hergestellt (vgl. 2.2.7.3). Bei deren Anwendung zeigte auf Chromosom 7 die Mini-FISH-Sonde 122P19_MiniFISH_8, und auf Chromosom 11 die Mini-FISH-Sonde 748C4_MiniFISH_2 ein gesplittetes Signal. Die Bruchpunkte konnten somit erfolgreich auf eine 12,5 kb, bzw. eine 8,8 kb große Region feinkartiert werden (Abb. 29).

Abb. 29 Feinkartierung der Bruchpunkte mittels Mini-FISH. Die Mini-FISH-Sonden 748C4_MiniFISH_2 (A) und 122P19_MiniFISH_8 (B) zeigten ein gesplittetes Signal und führten dadurch zu einer weiteren Eingrenzung auf ca. 10 kb innerhalb der jeweiligen BAC-Regionen.

Darauffolgend wurde eine basengenaue Kartierung mittels Bruchpunktsequenzierung (vgl. 2.2.6), welche eine Sequenzierung der auf den derivativen Chromosomen vorkommenden Übergänge zwischen den Chromosomenabschnitten unterschiedlichen Ursprungs darstellt, unternommen. Hierbei war die Generierung von Bruchpunkt- überspannenden Long range-PCR-Produkten für beide derivative Chromosomen erfolgreich. Für das derivative Chromosom 7 (der(7)) wurde ein spezifisches Produkt unter Einsatz der Primer BP_der7_5F und BP_der7_1R, und für das derivative Chromosom 11 (der(11)) unter Einsatz der Primer BP_der11_6F und BP_der11_6R erhalten. Eine anschließende Sequenzierung identifizierte die Übergänge der Chromosomenabschnitte unterschiedlichen Ursprungs für beide derivative Chromosomen auf die Base genau (Abb. 30). Dabei zeigte sich, dass die Chromosomenbrüche in nicht konservierten Regionen und innerhalb von kurzen AC-Repeat-Sequenzen auf beiden Chromosomen auftraten. Die kurzen Überschneidungssequenzen, welche beiden Chromosomen zugeordnet werden konnten, führten dabei zu einer Kartierung des Bruchpunktes auf Chromosom 7 auf den Lokus Chr7:25,780,982-25,780,985 bp (hg18) und für Chromosom 11 auf den Lokus Chr11:10,041,976-10,041,982 bp (hg18). Durch Vergleich der diese Positionen umgebenden Sequenzen wurde geschlossen, dass das chromosomale Rearrangement insgesamt zu einem Verlust von

Ergebnisse zwei AC-Repeats an Stelle der Bruchpunkte führte, welche ursprünglich beiden beteiligten Chromosomen zugeordnet werden konnten. Über die basengenaue Kartierung resultierte des Weiteren eine Korrektur der bisher angegebenen Karyotypformel von 47,XXX,t(7;11)(p15.3;p15.3) zu 47,XXX,t(7;11)(p15.2;p15.4) (hg18).

Abb. 30 Bruchpunkt-überspannende Sequenzen auf dem derivativen Chromosom 7 (A) und dem derivativen Chromosom 11 (B). Das chromosomale Rearrangement trat bei beiden Chromosomen innerhalb kurzer AC-Repeats auf. Die kurzen Überschneidungssequenzen (gelb hinterlegt), welche beiden Chromosomen gleichermaßen zugeordnet werden konnten, ergaben im Kontext der umgebenden Sequenz insgesamt den Verlust von zwei AC-Repeats durch die Translokation.

3.4.2 Bruchpunktanalysen

Eine Analyse der in Abb. 31 dargestellten genomischen Situation im Bereich der Bruchpunkte ergab, dass durch den Bruch auf Chromosom 11 das autosomal rezessive Gen SBF2 (SET binding factor 2), welches sich in der Literatur mit der Charcot-Marie- Tooth Typ 4B2-Erkrankung assoziiert fand, rupturiert wurde (Abb. 31 A) [48,49]. Der chromosomale Bruch trat dabei im Intronbereich nach seinem zweiten kodierenden Exon auf, somit wurde für ein Allel der für ein 1127 AS langes Protein (NP_112224.1) kodierende offene Leserahmen nach der 47. AS zerstört.

Ergebnisse

Abb. 31 Darstellung der genomischen Region im Bereich der Bruchpunkte auf Chromosom 7 und Chromosom 11. (A) Das Gen SBF2 auf Chromosom 11 wurde durch das chromosomale Rearrangement nach seinem zweiten kodierenden Exon im Intronbereich durchbrochen. (B) Auf Chromosom 7 war kein annotiertes Gen an der Position des Bruchpunktes, lokalisiert. Es fand sich jedoch 112 kb upstream des Bruches eine annotierte mRNA (AK057379), welche in Kombination mit ebenfalls in der Region auftretenden gespleißten ESTs auf ein möglicherweise bisher nicht annotiertes und vom Bruchpunkt beeinträchtigtes Gen hinwies.

Ergebnisse

Im Gegensatz zu dem direkten Bruch von SBF2 auf Chromosom 11, war am Ort des Bruchpunktes auf Chromosom 7 kein bekanntes Gen lokalisiert (Abb. 31 B). Jedoch wurde in Bezug auf diese Position auch die Möglichkeit eines nicht annotierten, vom Chromosomenbruch möglicherweise beeinflussten Gens untersucht. Hierbei war die 112 kb upstream vom Bruchpunkt lokalisierte mRNA AK057379 interessant, welche zusammen mit der mRNA BX648247 einem hypothetischen Gen LOC646588 zugeordnet war (UniGene-Datenbank: UGID:139456), dessen Eintrag in der NCBI-Datenbank im Zuge von standardmässigen Evaluierungen aus der Genomannotation gelöscht wurde. Innerhalb der diesem Eintrag ebenfalls zugeordneten EST-Sequenzen zeigte sich der gespleißte EST DA691079 (spliced Expressed sequence tag) als genomisch längstes Transkript. Dieser wurde vom Bruchpunkt nach seinem ersten Exon im Intronbereich rupturiert und unterstützte damit zunächst die These eines nicht annotierten, vom Bruchpunkt beeinträchtigten Gens (Abb. 31 B). Jedoch ergaben verschiedene Expressionanalysen zu den in der Region gelegenen gespleißten ESTs mittels RT-PCR an humanen cDNA-Panels sowie in silico-Analysen auf Konservierung, offene Leserahmen und möglichweise darin vorhandenen Motiven und Domänen keinen Anhaltspunkt auf ein funktionales Gen.

3.4.3 Expressionsanalysen von Kandidatengenen im Bereich der Bruchpunktregionen

Im Rahmen einer Literaturrecherche für die in Nachbarschaft zu den Bruchpunkten gelegenen Gene (Abb. 31) wurden Kandidaten identifiziert, welche auf Grund von assoziierten Phänotypen sowie ihrer Funktion mit dem Phänotyp der Patientin in Zusammenhang gebracht werden konnten. Des Weiteren wurden Kandidaten über eine für diese Regionen durchgeführte Genpriorisierung ermittelt, welche auf dem Endevour- Programm unter Verwendung eines Trainings-Gensatzes für das DiGeorge-Syndrom nach Aerts et al. basierte [50]. Anschließend wurde die Möglichkeit einer Dysregulation der ermittelten Kandidatengene als Folge des chromosomalen Rearrangements über TaqMan-basierte qPCR-Analysen (vgl. 2.2.9.1) untersucht. Diese erfolgten an nativen Lymphozyten der Patientin im Vergleich zu gesunden Normalkontrollen (Abb. 32), und zeigten im Falle der Kandidatengene ST5, CTR9, ZNF143 und HOXA3 keine differentielle Expression. Dagegen konnte für das 0,5 Mb upstream des Bruchpunktes auf Chromosom 11 gelegene Gen WEE1 (WEE1 homolog (S. pombe), welches auf Grund der Genpriorisierung als Kandidat erkannt wurde, eine signifikant gesteigerte Expression in der Patientin festgestellt werden.

Ergebnisse

Abb. 32 Expressionsanalysen mittels TaqMan-basierter qPCR zur Messung der relativen Expression der Kandidatengene ST5, CTR9, ZNF143, HOXA3 und WEE1 in nativen Lymphozyten der Patientin (P) gegen gesunde Kontrollen (C). Die aus mindestens 3 technischen Replikaten generierten Daten wurden über mitgeführte endogene Kontrollen normalisiert (Set für ST5, CTR9, ZNF143 und HOXA3: B2M, TBP, PGK1, RPLP0; Set für WEE1: B2M, TBP, PGK1, RPLP0, ACTB, HPRT). Der Mittelwert aus den Kontroll-Samples (C) diente als Referenz und wurde daher dem Wert 1 zugewiesen und mit der Standardabweichung über alle Kontroll- Samples dargestellt (7 gleichgeschlechtliche Kontroll-Samples für ST5; 8 gleichgeschlechtliche Kontroll-Samples für CTR9, ZNF143, HOXA3; 8 gleichgeschlechtliche und 2 männliche Kontroll- Samples für WEE1). Die relative Expression der Patientin ist mit der Standardabweichung der technischen Replikate dargestellt. Signifikanz wurde mit einem Wilcoxon Test errechnet: WEE1 zeigte signifikant erhöhte Expression.

3.4.4 Molekulare Karyotypisierung

Zum Ausschluss möglicher weiterer Veränderungen des Genoms der Patientin, wurde dieses mittels molekularer Karyotypisierung basierend auf dem Cytogenetics Whole- Genome 2.7M Array (vgl. 2.2.12) untersucht. Hierbei wurde eine heterozygote Deletion auf 5p13.2 aufgedeckt, mit einer Größe von 46 kb über 44 Marker im Bereich chr5:37,430,635-37,476,549 (hg18) (Abb. 33). Der deletierte Bereich umfasste dabei Exon 5 und 6 des kaum beschriebenen Gens WDR70 (WD repeat domain 70), sowie eine innerhalb dessen 5. Introns gelegene, unabhängige mRNA BC131744. Ein Abgleich mit der Online-Datenbank Database of Genomic Variants, sowie einer hauseigenen Kontrolldatenbank führte zum Ausschluss eines Polymorphismus. Eine MLPA (vgl. 2.2.10) unter Verwendung von 3 unabhängigen Sonden im Bereich der Deletion zeigte eine Vererbung der Aberration durch den gesunden Vater, und schloss somit eine dominante Aberration weitestgehend aus. Die Möglichkeit einer Compound-Heterozygotie durch Mutationen im nicht von der Deletion betroffenen Allel der Patientin wurde durch Sequenzierung des betroffenen Gens WDR70 und der mRNA BC131744 untersucht, und war ohne pathologischen Befund.

Ergebnisse

Abb. 33 Die molekulare Karyotypisierung mittels Cytogenetics Whole-Genome 2.7M Array deckte bei der Patientin zusätzlich eine 46 kb umfassende, heterozygote Deletion auf 5p13.2 auf.

100

4 Diskussion

4.1 Diskussion Patient 46,XY,t(10;13) – Noonan-Syndrome-like

4.1.1 Phänotyp des Patienten und Identifikation des Kandidatengens

Auf Grund seiner fazialen Auffälligkeiten, dem Kleinwuchs und seiner milden mentalen Retardierung und unter Ausschluß von Defekten in den bisher bekannten Noonan- Syndrom-Genen wurde der Patient dem Noonan-Syndrome-Like-Spektrum zugeordnet. Im Rahmen der zytogenetischen Diagnostik wurde eine scheinbar balancierte, reziproke Translokation 46,XY,t(10;13)(q22.3;q34) aufgedeckt. Da diese de novo entstanden war und die Eltern keinen vergleichbaren Phänotyp aufwiesen, wurde von einer möglichen Assoziation mit dem Phänotyp des Patienten ausgegangen. Im Rahmen der meiner Arbeit vorrausgegangenen Bruchpunktkartierung war eine basengenaue Bruchpunktsequenzierung erfolgreich. Hierbei wurde gezeigt, dass über das chromosomale Rearrangement das auf 10q22.3 gelegene Histon-Acetyltransferase-Gen MYST4 (MYST histone acetyltransferase (monocytic leukemia) 4) nach seinem ersten kodierenden Exon und somit in seinem offenen Leserahmen direkt rupturiert wurde. Die resultierende Expressionsreduktion führte zur Annahme eines auf Haploinsuffizienz basierenden Pathomechanismus, welche über die Messung einer deutlichen Abnahme der globalen Histon-Acetylierungs-Aktivität bekräftigt wurde.

4.1.2 Die Histon-Acetyltransferase MYST4

4.1.2.1 MYST4 als Mitglied der MYST-Histon-Acetyltransferase-Familie

Histon-Acetylierung im Bereich von Promotoren ist Kennzeichen aktiv transkribierter Gene und stellt einen dynamischen Prozess dar, welcher durch Histon-Acetyltransferasen (HATs) und Histon-Deacetylasen (HDACs) vermittelt wird [51,52]. MYST4, auch unter dem Namen KAT6B oder MORF bekannt, ist Mitglied der MYST- Genfamilie, welche die größte Histon-Acetyltransferase-Familie darstellt. Die Mitglieder dieser Familie sind in verschiedensten zellulären Prozessen von Bedeutung und vermitteln häufig eine individuell spezifische Schlüsselfunktion in der Entwicklung. Die Familie definiert sich dabei über eine gemeinsame MYST-Histon-Acetyltransferasedomäne und wurde in allen Eukaryoten nachgewiesen [53]. Speziell in der Klasse der Mammalia finden sich neben MYST4 vier weitere MYST-Histon-Acetyltransferasen: MOZ, MOF, TIP60 und HBO1. MYST4 stellt dabei zusammen mit MOZ auf Grund der hohen, sich über die MYST-Domäne hinaus über das ganze Protein erstreckenden Homologie eine gesonderte

101

Diskussion

Untergruppe dar [53-55]. Beide Proteine dienen alternativ zueinander als katalytische Untereinheit im sogenannten ING5-Tumorsuppressorkomplex, einem tetrameren Komplex aus MOZ/MYST4, ING5, EAF6, BRPF1/2/3, über welchen ihre enzymatische Funktion stimuliert und vermutlich ihre Substratspezifität sowie Affinität reguliert wird [53,56-58]. MYST4 und MOZ sind dabei vertebratenspezifisch [59] und über ihre vermutete Funktion als transkriptionelle Coregulatoren für die embryonale sowie für die postnatale Entwicklung von Bedeutung [41,57,60,61]. Zwischen MYST4 und MOZ besteht jedoch keine funktionelle Redundanz [62], was sich auch in ihrer spezifischen Bedeutung für unterschiedliche Stammzellpopulationen widerspiegelt [53].

4.1.2.2 Spezifische Funktion und Aufbau von MYST4

Für MYST4 wurde, neben Untersuchungen an den Modellsystemen Drosophila melanogaster und Danio rerio, vor allem mit Hilfe des Myst4-defizienten Mausmodells (Qkfgt/gt) eine wesentliche Bedeutung in der Neurogenese des Telencephalon, genauer in der Aufrechterhaltung von undifferenzierten neuronalen Vorläuferzellen, in der Selbsterneuerung von adulten Stammzellen sowie für die Neuronendifferenzierung allgemein, nachgewiesen. Eine zusätzlich gefundene Funktion in der Osteogenese übt MYST4 vermutlich über seine Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor RUNX2 aus [42,61,63]. Studien am bovinen Homolog deuteten zudem auf eine mögliche Beteiligung an der Gametogenese hin [64]. Bezüglich der Domänenstruktur besteht MYST4 grundsätzlich aus 4 Teilen: (I) Einer N-terminalen Region, welche eine H15-Domäne (histones H1- and H5-like domain) sowie 2 tandem geschaltete Zinkfingerdomänen (C4HC3 PHD-zinc fingers (PHD)) umfasst und für diese Proteinklasse untypische transkriptionelle Repression vermittelt, (II) der MYST-Histon-Acetyltransferasedomäne, (III) einer sauren Region im Mittelteil und (IV) einer C-terminalen Serin/Methionin-reichen Aminosäuresequenz mit transkriptionsaktivierender Eigenschaft (Abb. 34). Für MYST4 wurden drei Isoformen, MORF, MORFα und MORFβ beschrieben, wobei die längste Isoform MORFβ dem Genprodukt des annotierten Gens MYST4 (KAT6B: NM_012330.2; NP_036462.2) entspricht. Die Isoformen unterscheiden sich dabei an der Stelle der NRH-Domäne (negative regulator for HAT), für welche eine negativ regulierende Funktion auf die benachbarte katalytische Histon-Acetyltrasferase-Domäne (HAT) nachgewiesen wurde [41,55].

102

Diskussion

Abb. 34 Domänenstruktur der 3 Isoformen von MYST4 (MORF, MORFα, und MORFβ). Die Isoformen unterscheiden sich auf DNA-Ebene in der Länge von Exon 8 mit einer Auswirkung auf Proteinebene an Stelle der NRH-Domäne (negative regulator for HAT). Auf Grund von Homologie findet sich der N-Terminus auch unter der Bezeichnung NEMM-Region (N-terminal part of Enok, MOZ, or MORF). Die rot gezackte Linie zeigt die relative Lage des alle Isoformen betreffenden Translokationsbruchpunktes des Patienten (Exon3/4-Grenze; AS-Position 207). Die dargestellten Aminosäurepositionen sind im Bezug auf MORFß angegeben. Abbildung erstellt basierend auf Informationen aus [41,58,59,61,65].

4.1.3 Nachweis einer kausalen MYST4-Haploinsuffizienz

MYST4 acetyliert als enzymatische Untereinheit im ING5-Komplex H3-, aber keine H4- Histone [56]. Der Nachweis einer beim Patienten vorliegenden MYST4-Haploinsuffizienz wurde daher durch eine reduzierte gefundene globale Histon-H3-Actetylierung bei unveränderter Histon-H4-Acetylierung in dessen lymphoblastoider Zelllinie erbracht. Zusätzliche siRNA-Studien an den humanen Zelllinien HEK293 und HeLa bestätigten den auf MYST4-Defizienz basierenden Effekt und schlossen damit die Möglichkeit einer auf Immortalisierung der Patientenzelllinie beruhenden Ursache für die veränderte Acetylierung aus. Darüber hinaus wurde ein mit der Stärke der MYST4-Defizienz korrelierender Effekt auf die Histon-H3-Acetylierung festgestellt. Unter Ausschluss bekannter Ursachen und durch den Nachweis einer Auswirkung auf die globale Acetylierung wurde somit die vorliegende MYST4-Haploinsuffizienz mit dem Noonan-Syndrome-Like Phänotyp assoziiert gefunden. Der hier geschilderte Patient stellte damit 12 Jahre nach der Erstbeschreibung des Gens MYST4 durch Champagne et al. (1999) den ersten beschriebenen Fall einer humanen Defizienz dar [41].

103

Diskussion

4.1.4 Isoformspezifische Expression von MYST4 korreliert mit dem murinen und humanen Phänotyp

In grundlegenden Untersuchungen zu MYST4, wurde die isoformspezifische Expression seiner 3 beschriebenen Isoformen (MORF, MORFα, MORFβ) an humanen Geweben untersucht. Dabei wurde, zusätzlich zur Bestätigung der grundsätzlich ubiquitären Expression von MYST4 [41,53] in den untersuchten Geweben, auch die in der Literatur für die Maus beschriebene Expressionsdynamik während der Entwicklung nachgewiesen [66]. Diese zeigte sich in deutlichen Änderungen der Expressionsstärke, aber auch in Änderungen der Expressionsanteile der einzelnen Isoformen zueinander bei vergleichender Betrachtung fetaler und adulter Stadien verschiedener Gewebe. Am auffälligsten konnte dies für das Gehirn festgestellt werden (vgl. Abb. 10; S.67). Die im MYST4-defizienten Mausmodell gezeigte Bedeutung für die kortikale Entwicklung des Telencephalons [42], sowie die leichte mentale Retardierung des Patienten spiegelten sich in der mit Abstand am stärksten gefundenen MYST4-Expression im fetalen Gehirn wider. Die drastische Abnahme der Expression zum adulten Stadium hin bestätigte darüber hinaus die besondere Bedeutung von MYST4 in der frühen Gehirnentwicklung. Diese spiegelte auch wider, dass bei gradueller Abnahme der Neurogenese in der Entwicklung zum adulten Gehirn der Maus eine erhöhte Expression dieses Gens zunehmend nur noch auf den mitotisch aktiven Teilbereich der subventrikulären Zone beschränkt gefunden wurde [66].

4.1.5 MYST4-abhängige Expressionsregulation

Entgegen der Möglichkeit von globalen transkriptionsregulierenden Effekten über HAT- vermittelte Histon-Acetylierung zeigte nur ein kleiner Prozentsatz des Genoms (1-3%) in den genomweiten Expressionsanalysen eine MYST4-abhängige Regulation. Diese Spezifität wird vermutlich über die für Histon-Acetyltransferasen typische Einbindung in größere Proteinkomplexe, im Falle von MYST4 in den ING5-Tumorsuppressorkomplex, vermittelt [58,67]. Korrelierend mit der hohen Expression von MYST4 im Gehirn zeigte sich in diesem Gewebe auch die hauptsächliche Expression der meisten MYST4- abhängigen Gene, welche untereinander in subzellulärer Lokalisation und molekularer Funktion über das humane sowie das murine Modellsystem übereinstimmten (vgl. Abb. 13; S.73). Die dabei gefundenen Unterschiede zwischen humanen und den beiden murinen Modellsystemen in Anzahl der differentiell exprimierten Gene, sowie der Prozentsätze an davon erniedrigt exprimierten Gene, kann wahrscheinlich auf die unter Punkt 3.1.4 gezeigten spezifischen Expressionsunterschiede in verschiedenen Geweben bzw. Entwicklungsstadien zurückgeführt werden.

104

Diskussion

4.1.6 Identifizierung des MAP-Kinase-Signalwegs als ein Hauptziel MYST4- vermittelter Regulation

4.1.6.1 Anreicherung des MAP-Kinase-Signalwegs in den in Folge von MYST4- Defizienz differentiell exprimierten Genen

Der MAP-Kinase-Signalweg zeigte sich als einziger über alle drei Ansätze der genomweiten Expressionsanalyse (HEK293/HeLa, siRNA; Qkfgt/gt-Maus, adulter dorsaler Cortex; Qkfgt/gt-Maus, fetales dorsales Telencephalon) angereicherter Signalweg, und identifizierte sich somit als ein Hauptziel der MYST4-vermittelten Regulation. Dieser komplexe Signalweg, in welchem viele evolutionär konservierte Enzyme integriert sind, spielt in fast allen zellulären Prozessen eine wichtige Rolle. So ist er unter anderem für Proliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose von Zellen von Bedeutung, und hat damit Einfluss auf Prozesse in der frühen und späten Entwicklung, u.a. in der Morphologiedetermination, der Organogenese, der synaptische Plastizität und dem Wachstum [68-70]. Die in den oben genannten Expressionsanalysen außerdem wiederholt gefundene Anreicherung der Insulin-, Wnt- und GnRH-Signalwege (HEK293/HeLa, siRNA; Qkfgt/gt-Maus, fetales dorsales Telencephalon) wies darüber hinaus zusätzlich auf die Bedeutung von MYST4 für die embryonale Entwicklung, im Besonderen die des Gehirns, hin [71,72].

4.1.6.2 Anreicherung des MAP-Kinase-Signalwegs in direkt von MYST4 gebundenen Genen

Der MAP-Kinase-Signalweg wurde als Ziel MYST4-vermittelter Regulation auch in einer unabhängigen Methode durch Analyse der über ChIP-on-chip ermittelten angereicherten Regionen bestätigt (HEK293/HeLa). Korrelierend mit den genomweiten Expressionsanalysen und dem Expressionsmuster von MYST4, spiegelte hier zudem auch die Expressionsverteilung der angereicherten Gene (vgl. Abb. 15; S.77) die Bedeutung für das Gehirn wider.

4.1.6.3 Anreicherung des MAP-Kinase-Signalwegs in den primären Zielgenen von MYST4

Eine Untersuchung der übereinstimmenden Ergebnisse aus der ChIP-Anreicherung und der genomweiten Expressionsanalyse, und somit der als Primärziele von MYST4 klassifizierten Gene, bestätigte ebenfalls den MAP-Kinase-Signalweg als Hauptziel von MYST4. Die Feststellung bei dieser kombinierten Analyse, dass nicht alle Gene mit direkter MYST4-Bindung auch eine differentielle Expression aufwiesen, kann dadurch erklärt werden, dass deren Expression neben MYST4 auch durch weitere Transkriptionsfaktoren moduliert wird. Gene, die dagegen eine veränderte Expression,

105

Diskussion aber keine direkte MYST4-Bindung zeigten, wurden als Sekundärziele von MYST4 klassifiziert. Bei diesen wurde von einer indirekten Regulation ausgegangen. Zusammenfassend wurde somit der MAP-Kinase-Signalweg als einziger Signalweg konsequent über alle Expressionsanalysen am humanen und murinen Modellsystem, sowie in der ChIP-Anreicherung am humanen Modell und in der kombinierten Analyse beider Methoden gefunden.

4.1.7 MYST4-Haploinsuffizienz stellt eine seltene Ursache für Erkrankungen des Noonan-Syndrome-Like Spektrums dar

Passend zu der gefundenen spezifischen Bedeutung von MYST4 für den MAP-Kinase- Signalweg, finden sich in ca. 75% der Patienten des Noonan-Spektrums Mutationen in den Genen PTPN11, SOS1, KRAS, NRAS, RAF1, BRAF, SHOC2, MEK1 und CBL des klassischen RAS-MAPK-Signalwegs. Diese Mutationen führen zu einer aberranten Signalweiterleitung innerhalb des Signalwegs und sind dadurch für die Krankheit kausal [70]. Im Falle von NRAS-Mutationen wurde in dieser Hinsicht eine Hyper- Phosphorylierung der im Signalweg downstream gelegenen Komponenten MEK1/2 und ERK publiziert [73]. Diese konnte in vergleichbarer Form auch für den hier beschriebenen Patienten mit MYST4-Defizienz im Rahmen einer Kooperation nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde zusätzlich auch eine Hyper-Phosphorylierung von AKT erkannt, welches eine Komponente des RAS-Effektor-Signalwegs darstellt. MYST4 wurde als Ursache für die anormale Phosphorylierung durch Transfektion der defizienten Patientenzelllinie mit dem Wildtypkonstrukt und einer daraus resultierenden Normalisierung der Phosphorylierungsgrade bestätigt. MYST4 ist folglich essentiell für eine korrekte Signaltransduktion im RAS-MAP-Kinase-Signalweg, und eine durch MYST4- Defizienz ausgelöste Fehlregulation führt über den für Noonan-Syndrom typischen molekularen Mechanismus der Überaktivierung zu einer Erkrankung in dessen Spektrum. MYST4 trägt damit als neuerkannte, seltene Ursache (vgl. 3.1.10) zur genetischen Heterogenität der Erkrankungen des Noonan-Spektrums bei [70,74].

Kurz nach Publikation der hier vorliegenden Ergebnisse von MYST4- Haploinsuffizienz als Ursache für eine Erkrankung im Noonan-Spektrum (Kraft et al., 2011 [2]) wurden interessanterweise dominante, trunkierende Mutationen im distalen Teil von MYST4 als Ursache für die Say-Barber-Biesecker-Variante des Ohdo-Syndroms (SBBYSS; MIM 603736) [75], als auch für das Genitopatellare Syndrom (GPS; MIM 606170) publiziert [76,77]. Beide Syndrome sind in ihrer Schwere zueinander vergleichbar und zeigen zudem gemeinsame phänotypische Auffälligkeiten, wie das Auftreten von schwerer mentaler Retardierung, angeborenen Herzfehlern sowie Anomalitäten der Genitalien und der Patella [78]. Damit unterscheiden diese sich jedoch deutlich von dem vergleichsweise milden Phänotyp des Patienten in der vorliegenden

106

Diskussion

Arbeit, der weiterhin die größte Vergleichbarkeit mit der MYST4-defizienten Qkf-Maus zeigt [75,76]. Als zu Grunde liegende Mechanismen wurden von den Autoren dominant negative, sowie gain-of-function-Effekte, aber auch Haploinsuffizienz allgemein oder Haploinsuffizienz für C-terminale Domänen im Speziellen diskutiert. Jedoch weist der in der vorliegenden Arbeit gezeigte eher milde Phänotyp aus dem Noonan-Spektrum verursacht durch MYST4-Haploinsuffizienz darauf hin, dass die schwereren SBBYSS- und GPS-Phänotypen wahrscheinlich eher auf einem negativ dominanten oder gain-of- function-Mechanismus begründet sind. Dessen Aufklärung könnte in Zukunft weiter zum Verständnis der spezifischen Funktionen der verschiedenen MYST4-Domänen beitragen.

107

Diskussion

4.2 Diskussion Patientin 46,XX,t(1;8) – Adipositas & Hypogonadismus

4.2.1 Phänotyp der Patientin

Bei einer Patientin, die durch die Ausbildung einer Adipositas in Kombination mit einem hypogonadotropen Hypogonadismus auffällig wurde, wurde im Rahmen der zytogenetischen Diagnostik eine scheinbar balancierte, reziproke Translokation 46,XX,t(1;8)(p35.2;p11.2) aufgedeckt. Da die Eltern weder die Translokation noch einen auffälligen Phänotyp zeigten, wurde von einer möglichen Assoziation des Phänotyps der Patientin mit dem Auftreten der de novo entstandenen chromosomalen Translokation ausgegangen.

4.2.2 Bruchpunktkartierung

Im Rahmen der Kartierung der Bruchpunkte konnten vor Beginn meiner Arbeit die Bruchpunktregionen mittels FISH- und Mini-FISH-Analysen auf eine 4-6 kb große Region auf Chromosom 1 und eine 100 kb große Region auf Chromosom 8 eingegrenzt werden. Davon ausgehend konnte über Long range-PCR-basierte Bruchpunkt- Sequenzierung der Bruchpunkt auf dem derivativen Chromosom 8 auf die Base genau identifiziert werden (Abb. 35). Daraus ergab sich eine basengenaue Kartierung der Bruchpunkte, auf Chromosom 1 auf die Position Chr.1:27,099,929 bp (hg18) und auf Chromosom 8 auf die Position Chr.8:38,407,627 bp (hg18), mit einer resultierenden Korrektur der Karyotypformel zu 46,XX t(1;8)(p36.11;p12) (hg18).

Abb. 35 Überblick über die Bruchpunkteingrenzung und anschließende Sequenzierung. Aufbauend auf die in Vorarbeit mittels FISH und Mini-FISH eingegrenzten Bruchpunktbereiche (grau = Signal nicht eindeutig) war es im Rahmen dieser Arbeit möglich, den Bruchpunkt auf dem derivativen Chromosom 8 durch Bruchpunktsequenzierung auf die Base genau zu identifizieren.

108

Diskussion

Der Gegenbeweis über Sequenzierung des Bruchpunktes auf dem derivativen Chromosom 1 konnte nicht geführt werden, da hierfür, vermutlich auf Grund von repetitiven Sequenzen im vermuteten Bruchpunktbereich von Chromosom 1 und 8, kein spezifisches Long range-PCR-Produkt generiert werden konnte. Es ist bekannt, dass Bruchpunkte gehäuft in hochrepetitiven Bereichen auftreten können [79,80]. Entsprechend waren auch für den Bruchpunkt-überspannenden BAC-Klon RP11-350N15 auf Chromosom 8 in NCBI ca. 300 Repeatregionen annotiert, was auch schon in der Vorarbeit als Grund für die Schwierigkeiten bei der weiteren Bruchpunkteingrenzung mittels Mini-FISH unter einen Bereich von 100 kb angenommen wurde. Die Möglichkeit von Mikrodeletionen oder Mikroduplikationen im Bereich des Bruchpunktes als Ursache wurde über molekulare Karyotypisierung basierend auf einem Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0 weitestgehend ausgeschlossen.

4.2.3 Kandidatengene in den Bruchpunktregionen

4.2.3.1 Durch das chromosmale Rearrangment direkt rupturierte Gene

Bei der genauen Kartierung der Bruchpunkte war am auffälligsten, dass der Bruchpunkt auf Chromosom 8 innerhalb eines der ersten Introns des gut charakterisierten Gens FGFR1 (fibroblast growth factor receptor 1) auftrat und dabei die offenen Leserahmen aller seiner Isoformen kurz nach dem Translationsstart rupturierte (vgl. Abb. 20; S.84). Eine resultierende Störung der FGFR1-Expression auf dem von der Translokation betroffenen Allel wurde in einer TaqMan-basierten qPCR bestätigt. FGFR1 ist auf dem reversen Strang von Chromosom 8 innerhalb einer genomischen Sequenz von 58 kb Länge lokalisiert und wird in mindestens 9 verschiedenen Transkriptionsvarianten exprimiert (RefSeq, NCBI). FGFR1 codiert für den ersten der vier Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptoren (FGFR1-4), welche Zelloberflächenrezeptoren aus der Tyrosin-Kinase-Familie darstellen. Der Transmembranrezeptor FGFR1 besteht aus 3 extrazellulären Immunoglobin-ähnlichen Domänen, einer ebenfalls extrazellulären Heparin-Bindedomäne und 2 intrazellulären Tyrosin-Kinase Domänen. Der Rezeptor wird über Ligandenbindungs-abhängige Dimerisierung aktiviert und startet über Autophosphorilierung der Tyrosin-Kinase Domänen eine Signalkaskade, die verschiedene Signalwege beeinflusst. Damit hat FGFR1 Einfluss auf Proliferation, Differenzierung, Überleben und Migration von Zellen mit einer wichtigen Funktion für Gastrulation, Organ-Spezifizierung und Gewebemusterbildung unter anderem auch im Gehirn. Im Speziellen ist FGFR1 auch für die Entwicklung des olfaktorischen Systems sowie der GnRH (gonadotropin-releasing hormone) Ontogenie von Wichtigkeit. Dies zeigt sich vor allem daran, dass FGFR1-Loss-of-Function- Mutationen in einer GnRH-Defizienz resultieren, über welche die FGFR1- Haploinsuffizienz (MIM #136350) entweder zum normosmischen idiopathischen

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Diskussion hypogonadotropen Hypogoandismus (nIHH; MIM #146110), oder zur autosomal dominanten Form des Kallmann-Syndroms (KAL2; #MIM 147950) führt, welches durch ein zusätzliches Auftreten einer Anosmie gekennzeichnet ist [81-83]. In Bezug auf nIHH stellt FGFR1-Haploinsuffizienz dabei mit eine der häufigsten Ursachen dar und ist zusammen mit Mutationen in KAL1 und GNRHR allein für bis zu 20% aller Fälle verantwortlich [82]. Folglich konnte der bei der Patientin aufgetretene Teilphänotyp nIHH über die durch den chromosomalen Bruch verursachte Haploinsuffizienz von FGFR1 erklärt werden. Ein Zusammenhang mit der zusätzlich auftretenden Adipositas oder den Lernschwierigkeiten wurde über Phänotypenvergleich zu bisher beschriebenen Fällen von FGFR1-Haploinsuffizienz [25], sowie über Vergleich mit einer 2005 von Kim et al. beschriebenen Translokation t(7;8) [26], bei der FGFR1 im gleichen Intronbereich rupturiert wurde, ausgeschlossen. Im Gegensatz zu der Situation am Bruchpunkt von Chromosom 8, trat der Bruch von Chromosom 1 in keinem bisher annotierten Gen auf. Jedoch wurde gezeigt, dass ein über dem Bruchpunkt gelegener gespleißter EST (BQ887571) rupturiert wurde, dessen Zugehörigkeit zum 21 kb downstream auf dem Forward-Strang gelegenen Gen NUDC (nuclear distribution gene C homolog (A. nidulans)) laut UniGene-Datenbank (NCBI) bestätigt werden konnte. Daraus ergab sich die Beschreibung einer neuen Transkriptionsvariante von NUDC, die NUDCß benannt wurde (vgl. Abb. 22; S.86) und die im Gegensatz zum annotierten Transkript (NM_006600.2) durch den Chromosomenbruch rupturiert wurde. Dieser trat dabei in der 5´UTR von NUDCß auf, und die daraus resultierende, nur dieses Transkript von NUDC betreffende Expressionsstörung wurde mittels isoformspezifischer TaqMan-basierter qPCR nachgewiesen. NUDC stellt ein hochkonserviertes Gen aus der Nud (Nuclear distribution)-Familie dar, dessen Relevanz zunächst im Zusammenhang mit der Mikrotubuli-abhängigen Mobilität des Nucleus beschrieben wurde [84,85]. Mittlerweile wird NUDC in Bezug auf eine Vielzahl Cytokinese-verwandter Prozesse diskutiert und dabei mit Hematopoese, Tumorentwicklung sowie Migration und Proliferation von Neuronen in Verbindung gebracht. Darüber hinaus wird auch von einer Funktion in der inflammatorischen Signalgebung ausgegangen [86,87]. Zusammenfassend war aber kein Zusammenhang zu der bei der Patientin gesehenen Adipositas erkennbar, jedoch war ein Zusammenhang zwischen der gestörten NUDCß-Expression und den Lernschwierigkeiten der Patientin denkbar, begründet durch den Einfluss von NUDC auf die neuronale Entwicklung. Die Überlegung einer darüber auch möglichen Relevanz im Bezug auf den gesehenen hypogonadotropen Hypogonadismus schien hierbei unwahrscheinlich, da die bei der Patientin ebenfalls gefundene Haploinsuffizienz von FGFR1 eine gut charakterisierte und diesen Phänotypenteil umfassend erklärende Ursache darstellte. Allerdings wurde von der

110

Diskussion

Möglichkeit eines Zusammenhangs zwischen der Funktion von NUDC in der inflammatorischen Signalgebung mit den häufigen Infekten der oberen Atemwege sowie der kleinen Hautgefäße der Patientin ausgegangen.

4.2.3.2 Über Positionseffekt indirekt von der Translokation betroffene Gene

Da weder über den direkten Bruch von FGFR1 noch über den einer Transkriptionsvariante von NUDC die Adipositas der Patientin geklärt werden konnte, wurden Gene in der Bruchpunkt-umgebenden Region auf mögliche über Positionseffekt vermittelte Dysregulation mittels TaqMan-basierter qPCR untersucht.

. Gene im Bruchpunktbereich von Chromosom 1

Es konnte gezeigt werden, dass das nur 380 bp upstream vom Bruchpunkt auf Chromosom 1 gelegene, größtenteils uncharakterisierte Gen GPATCH3 (G patch domain containing 3) nicht in seiner Expression beeinträchtigt war. Wohingegen für das 10,6 kb downstream gelegene Gen NR0B2 (nuclear receptor subfamily 0, group B, member 2), unter Berücksichtigung seiner starken tageszeitlichen bzw. nahrungsaufnahmebedingten Expressionsunterschiede, eine signifikante Erniedrigung der Expression nachgewiesen werden konnte. NR0B2, auch unter dem Namen Small Heterodimer Partner (SHP) geläufig, liegt auf dem reversen Strang von Chromosom 1 und codiert für einen Transkriptionsfaktor aus der Superfamilie der nukleären Rezeptoren (NR). Innerhalb dieser wird das Genprodukt NR0B2 zu der „orphan“-Subfamilie gezählt, da bisher für dieses kein Ligand jedoch eine putative Liganden-Bindedomäne identifiziert werden konnte. Für diese Familie untypisch besitzt NR0B2 keine klassische DNA-Bindedomäne, sondern wird indirekt über Interaktion mit verschiedensten nukleären Rezeptoren an die DNA rekrutiert. Es dient dabei hauptsächlich als pleiotroper transkriptioneller Corepressor und erfüllt damit eine wichtige regulierende Funktion im Cholesterin- und Triglycerid- Metabolismus, bei der Kontrolle der Gluconeogenese sowie der Insulinsekretion. Entsprechend der zentralen Rolle in verschiedenen Metabolismus-Signalwegen wurden Mutationen in NR0B2 beschrieben, die mit einem erhöhten Körpergewicht zum Zeitpunkt der Geburt, frühzeitig einsetzender Adipositas und Ausprägung eines Insulinresistenz- Syndroms assoziiert wurden [28,29,88-90]. Ein von Enya et al. (2008) vorgeschlagener Pathomechanismus bezieht sich dabei auf Expression von NROB2 in ß-Zellen des

Pankreas und seiner Funktion als Inhibitor von HNF-4α. Ein Defekt in NR0B2 könnte hier zu einer erhöhter Aktivität von HNF-4α und weiterer downstream-Komponenten der glykolytischen Signaltransduktion führen, und darüber eine überhöhte Insulinantwort auf Glucose auslösen. Da Insulin einen wichtigen Faktor im fetalen Wachstum darstellt, könnten erhöhte Werte mit einem erhöhten Geburtsgewicht sowie postnataler Adipositas assoziiert sein [89,91-93].

111

Diskussion

In Bezug auf die Translokation der Patientin stellte NR0B2 das nähest an den Bruchpunkten gelegene Kandidatengen für Adipositas dar, und entsprechend zu den beschriebenen NR0B2 Mutationen zeigte unserer Patientin ebenfalls ein frühzeitiges Einsetzen dieser Krankheit. Zusammenfassend wurde daher angenommen, dass die Adipositas der Patientin in der durch Positionseffekt ausgelösten reduzierten Expression von NR0B2 und der daraus resultierenden Fehlregulierung von Metabolismus- Signalwegen begründet war.

. Gene im Bruchpunktbereich von Chromosom 8

Für das 22,4 kb upstream vom Bruchpunkt auf Chromosom 8 lokalisierte Gen LETM2 (leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2), welches einen unmittelbaren Nachbarn des gebrochenen Gen FGFR1 darstellt, konnte ebenfalls eine signifikant reduzierte Expression bestätigt werden. Bisher wurde dem kaum erforschten Gen LETM2, welches hauptsächlich in den männlichen Geschlechtszellen exprimiert ist, nur eine Rolle in der Organisation von mitochondriellen Membranen während der Spermatogenese zugesprochen [94]. Folglich konnte hier kein Zusammenhang mit dem Phänotyp der Patientin erkannt werden. Die reduzierte Expression von LETM2 lies jedoch vermuten, dass auch weitere Gene upstream vom Bruch auf Chromosom 8 betroffen sein könnten. Interessanterweise fand sich hier 464 kb upstream das Gen ADRB3 (adrenergic, beta-3-, receptor) (vgl. Abb. 19; S.84), welches ebenfalls ein Kandidatengen für Adipositas darstellt. Wie NR0B2 ist auch ADRB3 in der „Human Obesity Gene Map“-Datenbank gelistet, da in verschiedenen Studien auf eine Assoziation zwischen ADRB3 und Adipositas-Phänotypen geschlossen wurde. Passend dazu wird ADRB3 hauptsächlich im Fettgewebe exprimiert, spielt eine Rolle in der Regulierung der Lipolyse sowie der Thermogenese und scheint grundsätzlich an der Kontrolle des Lipid-Metabolismus beteiligt zu sein [27,95-97]. Da für ADRB3 jedoch keine Expression in Blut und nur eine schwache Expression in Fibroblasten nachgewiesen werden konnte, und von der Patientin Letztere nicht zur Verfügung standen, konnte die Möglichkeit einer differentiellen Expression von ADRB3 und somit ein möglicher Beitrag zur Ausbildung der Adipositas nicht nachverfolgt werden. Allerdings schien auf Grund der beträchtlichen Entfernung und in Hinblick auf Dysregulation von NR0B2 dies als nicht sehr wahrscheinlich.

4.2.4 Translokationsunabhängige genomische Imbalance

Bezüglich der die Bruchpunktcharakterisierung balanciert scheinender reziproker Translokationen zur Identifizierung von krankheitsassoziierten Genen wurde gezeigt, dass zusätzlich zu dem erkannten Rearrangement oftmals kryptische Mikrodeletionen oder Mikroduplikationen vorliegen können. Diese können innerhalb der Bruchpunktregion, jedoch auch völlig unabhängig an anderer Stelle im Genom auftreten und von

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Diskussion phänotypischer Relevanz sein. Daher ist es notwendig zusätzliche gesamtgenomische Analysen durchzuführen [17,18]. Die hier durchgeführte molekulare Karyotypisierung basierend auf einem Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0 deckte dabei die rekurrente Mikroduplikation 15q13.2q13.3 auf. Diese wird in der Literatur als Ursache für einen variablen Phänotyp mit einer unvollständigen Penetranz beschrieben. Der Phänotyp kann dabei Merkmale der Autismus-Spektrum-Störung oder neuropsychiatrische Erkrankungen sowie grundsätzliche Beeinträchtigungen in der kognitiven Leistung aufzeigen [44,98]. Bochukova et al. (2009) zeigte zudem ein vermehrtes Auftreten dieser Duplikation bei Patienten mit Entwicklungsverzögerung in Kombination mit schwerer Adipositas (BMI 3,8 – 4,0)[99]. Ausgehend davon wurde angenommen, dass die unabhängig von der Translokation aufgetretene Mikroduplikation 15q13.2q13.3 mitverantwortlich für die unterdurchschnittlichen kognitiven Leistungen der Patientin war. Im Bezug auf die Adipositas war davon auszugehen, dass diese Mikroduplikation einen zusätzlichen Faktor neben der reduzierten Expression von NR0B2 darstellen könnte.

4.2.5 Zusammenfassende Genotyp-Phänotyp-Korrelation

Zusammenfassend wurde bei der Patientin von einem durch die Bruchpunkte der vermeintlich balancierten de novo Translokation t(1;8)(p36.11;p12) verursachten monogenen Syndrom ausgegangen. Tatsächlich zeigte sich die Translokation assoziiert mit dem Phänotyp, da durch den Bruchpunkt auf Chromosom 8 das Kallmann-Syndrom-Gen FGFR1 rupturiert wurde, dessen resultierende Haploinsuffizienz den hypgonadotropen Hypogonadismus der Patientin klären konnte. Abweichend von der Annahme eines monogenen Syndroms bestand jedoch kein Zusammenhang zu den weiteren Merkmalen des Phänotyps. Die durch den anderen Bruchpunkt auf Chromosom 1 rupturierte Transkriptionsvariante des Gens NUDC, für welches eine Rolle in der neuronalen Entwicklung sowie in den Entzündungs-Signalwegen beschrieben wurde, stellte dabei eine mögliche Ursache für ihre unterdurchschnittlichen kognitiven Leistungen und die wiederholt auftretenden Infektionen bei der Patientin dar. Als zusätzlicher Faktor neben dem Expressionsdefekt der Variante von NUDC war auch die vom Bruchpunkt unabhängige aufgetretene Mikroduplikation 15q13.2q13.3 mit kognitiven Einschränkungen assoziiert. Auch die schwere Adipositas der Patientin schien durch mehrere Faktoren ausgelöst zu werden. Zum einen bestand hier ebenfalls eine Assoziation zur Translokation, da das in Zusammenhang mit Adipositas beschriebene Gen NR0B2 indirekt durch seine Nähe zum Bruch auf Chromosom 1 in seiner Expression gestört wurde, zum

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Diskussion anderen war auch die schon im Zusammenhang mit kognitiven Einschränkungen genannte Mikroduplikation 15q13.2q13.3 mit schwerer Adipositas assoziiert. Insgesamt wurde somit gezeigt, dass der komplexe Phänotyp der Patientin durch veränderte Expression mehrerer Gene an und um den Bruchpunktbereichen der Translokation in Kombination mit einer unabhängig vom Bruchpunkt aufgetretenen chromosomalen Imbalance verursacht wurde. Die hier gefundene genetische Situation bestätigte die Wichtigkeit von zusätzlich durchgeführten gesamtgenomischen Analysen bei balanciert scheinenden chromosomalen Rearrangements. Außerdem wurde gezeigt, dass bei Translokations-Patienten mit untypischen Kombinationen phänotypischer Merkmale eine oligogene Ursache grundsätzlich in Betracht gezogen werden sollte.

114

Diskussion

4.3 Diskussion Patientin 46,XX,t(5;14) – Schwere mentale Retardierung

4.3.1 Phänotyp der Patientin

Die Patientin präsentierte sich mit dem Phänotyp einer schweren mentalen Retardierung und einer ausgeprägten Entwicklungsstörung in Zusammenhang mit Fehlbildungen des Gehirns. Hier sind vor allem die Mikrozephalie und die partielle Agenesie des Corpus callosum zu nennen. Im Rahmen der zytogenetischen Diagnostik wurde bei der Patientin eine scheinbar balancierte, reziproke Translokation 46,XX,t(5;14)(p15.33;q12) aufgedeckt. Da bei den Eltern weder die Translokation noch ein auffälliger Phänotyp gefunden wurde, bestand Grund zur Annahme einer möglichen Assoziation des Phänotyps der Patientin mit dem Auftreten der de novo entstandenen Translokation.

4.3.2 Bruchpunktkartierung

Der über wiederholt gescheiterte Bemühungen der Bruchpunktsequenzierung begründete Verdacht einer möglicherweise kausalen Kopienzahländerung genomischen Materials im Bereich der Bruchpunkte (CNV) konnte über eine Array-Analyse weitestgehend ausgeschlossen werden. Im Hinblick darauf, dass die Bruchpunktbereiche keine Überschneidung mit annotierten Genen zeigten, war eine basengenaue Sequenzierung für die sich anschließende Kandidatengensuche entbehrlich.

4.3.3 Identifikation von FOXG1 als Kandidatengen und Bestätigung eines auf dessen Haploinsuffizienz basierenden Pathomechanismus

Die später revidierte Zuordnung der Patientin zum Cri-du-Chat-Syndrom (CdCS; MIM #123450) begründete sich vermutlich auf der innerhalb der CdCS-relevanten Region auf Chromosom 5 lokalisierten Bruchpunktregion in Kombination mit dem schweren, Mikrozephalie beinhaltenden Phänotyp. Entsprechend konzentrierten sich auch die in Vorarbeit durchgeführten Analysen auf Gene in dieser Region. Eine in der vorliegenden Arbeit durchgeführte und auf aktueller Literatur basierte Neueinschätzung von Kandidaten in der Umgebung der eingegrenzten Bruchpunktbereiche führte zur Identifizierung des auf Chromosom 14 0,5 Mb upstream benachbarten Kandidatengens FOXG1 (forkhead box G1; MIM 164874). Dieses evolutionär konservierte Gen stellt als Mitglied der Forkhead-Familie der Transkriptionsfaktoren primär einen über DNA-Bindung funktionierenden transkriptionellen Repressor dar, und ist speziell in der fetalen, aber auch in der adulten Neurogenese von Bedeutung. Durch seine regulatorische Rolle für Proliferation,

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Diskussion

Differenzierung und Survival neuronaler Vorläuferzellen, spielt FOXG1 dabei eine essentielle Rolle in der Entwicklung des Telencephalons [100-102]. Haploinsuffizienz in diesem Gen wurde 2008 von Ariani et al. als Ursache für die kongenitale Variante des Rett-Syndroms (MIM 613454) erkannt, welches sich durch einen mit dem der Patientin vergleichbar schweren Phänotyp mit übereinstimmenden Schlüsselmerkmalen kennzeichnet (vgl. 2.1.3.1) [45]. Der Phänotyp der bisher 26 in der Literatur beschriebenen Fälle ist dabei weitgehend konsistent und entspricht dem der hier beschriebenen Patientin [45-47,102]. Eine entsprechende Defizienz in FOXG1 wurde über differentielle Expression auf Proteinebene für die Patientin nachgewiesen, außerdem wurde bei der Patientin im Rahmen einer Wiedervorstellung das Auftreten von Rett- Syndrom-typischen stereotypen Handbewegungen diagnostiziert. Zusammenfassend wurde die Patientin folglich der kongenitalen Variante des Rett- Syndroms zugeordnet, als Ursache wurde ein auf FOXG1-Haploinsuffizienz basierender Pathomechanismus aufgedeckt. Es wurde davon ausgegangen, dass die Fehlregulation von FOXG1 indirekt durch den chromosomalen Bruch über Ruptur oder Dissoziation eines regulatorischen Elements verursacht wurde. Entsprechend wurden kürzlich von Kortüm et al. zwei evolutionär konservierte, regulatorische Elemente von FOXG1 funktionell nachgewiesen, deren Verlust durch Translokation oder Deletion mit einer Fehlregulation von FOXG1 mit resultierender Haploinsuffizienz assoziiert wurde [102]. Vergleichbar mit den dort beschriebenen Fällen wird auch durch die Translokation unserer Patientin mindestens eines der beiden putativen regulatorischen Elemente von FOXG1 dissoziiert (Abb. 36).

Abb. 36 Darstellung der umgebenden genomischen Region um den Bruchpunktbereich auf Chromosom 14. Der sichere Bruchpunktbereich war durch den gesplitteten BAC (AL117693.5) definiert, eine weitere Eingrenzung wurde über die Mini-FISH- Methode erzielt. Durch die Translokation wurde mindestens eines seiner beiden von Kortüm et al. beschriebenen regulatorischen Elemente von FOXG1 dissoziiert [102].

116

Diskussion

Die in Vorarbeiten zusätzlich gefundene Fehlregulation einer Vielzahl von Zellzyklusgenen stellte wahrscheinlich einen sekundären Effekt der Defizienz von FOXG1 dar, und kann über dessen Funktion im Zellzyklus als transkriptioneller Repressor verschiedener Zellzyklus-Inhibitorgene, wie z.B. CDKN1A, erklärt werden [103]. Im Speziellen die Fehlregulation der Zellzyklusgene CEP72, PAPD7 und TPPP im Bereich um den Bruchpunkt auf Chromosom 5, innerhalb der Cri-du-Chat-Region, konnten als primäre Ursache des Phänotyps ausgeschlossen werden. Während der Phänotyp der Patientin sehr genau der Erwartung einer FOXG1-Haploinsuffizienz entsprach, waren diese Gene in einem Cri-du-Chat-relevanten Bereich lokalisiert, der weder mit schwerer mentaler Retardierung noch mit Mikrozephalie, sondern alleinig mit Sprachverzögerung assoziiert wurde [104].

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Diskussion

4.4 Diskussion Patientin 47,XXX,t(7;11) – DiGeorge-Syndrome- Like

4.4.1 Phänotyp der Patientin

Bei einer Patientin, die einen Phänotyp ähnlich dem des DiGeorge-Syndroms zeigte, konnten im Rahmen der Diagnostik die dafür typischen genomischen Veränderungen ausgeschlossen werden. Jedoch wurden bei der Patientin ein Triple-X-Syndrom, sowie eine scheinbar balancierte, reziproke Translokation 47,XXX,t(7;11)(p15.3;p15.3) aufgedeckt. Da beide Eltern sowohl genotypisch als auch phänotypisch unauffällig waren, wurde von einer mögliche Assoziation des in seiner Schwere für das Triple-X-Syndrom untypischen Phänotyps der Patientin mit dem Auftreten der de novo entstandenen chromosomalen Translokation ausgegangen.

4.4.2 Bruchpunktkartierung und Sequenzierung

Die Kartierung der Translokationsbruchpunkte erfolgte über Eingrenzung der Bruchpunktregionen mittels FISH- und Mini-FISH. Über die darauf folgende Bruchpunktsequenzierung für beide derivative Chromosomen konnten die Chromosomenbrüche basengenau auf die Loci Chr7:25,780,982-25,780,985 bp (hg18) und Chr11:10,041,976-10,041,982 bp (hg18) lokalisiert werden. Daraus resultierte auch eine Korrektur der Karyotypformel zu 47,XXX,t(7;11)(p15.2;p15.4) (hg18).

4.4.3 Ausschluss des direkten Bruches eines phänotypisch relevanten Gens durch die Translokation

Im Bezug auf die identifizierten Chromosomenbrüche war der direkte Bruch der kodierenden Sequenz des Gens SBF2 (SET binding factor 2) auf Chromosom 11 am auffälligsten. Jedoch wurde dieses Gen in der Literatur als autosomal rezessiv beschrieben und ausschließlich mit der Erkrankung Charcot-Marie-Tooth Typ 4B2 assoziiert gefunden [48,49]. Deren Ausprägung konnte in keiner Weise mit dem Phänotyp der Patientin in Zusammenhang gebracht werden, sodass eine Defizienz in SBF2 als Ursache ausgeschlossen werden konnte. Im Gegensatz zu Chromosom 11 war auf Chromosom 7 kein Gen direkt am Lokus des Bruchpunktes annotiert, und auch eine nähere Untersuchung der für diesen Bereich hinterlegten Transkriptdaten ergab keinen Verdacht auf Ruptur eines funktionalen Gens. Ein zusätzlicher Abgleich der Region mit den in der Decipher-Datenbank (Decipher v5.1) hinterlegten Einträgen, sprach ebenfalls gegen die These eines im Bruchpunktbereich auf Chromosom 7 gelegenen, mit dem Phänotyp der Patientin assoziierbaren Gens. Die 4

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Diskussion dort mit einem Kopieverlust beschriebenen Patienten 2585, 256413, 256892 und 259698 (vgl. Anhang 8.5) zeigten keine Auffälligkeiten am Herzen und präsentierten sich in 3 von 4 Fällen mit einem gänzlich verschiedenen Phänotyp zu dem der Patientin.

4.4.4 Ausschluss der Kausalität von Kandidatengenen in den Bruchpunkt- umgebenden Regionen

Nachdem direkt auf den Bruchpunkten kein mit dem Phänotyp der Patientin in Zusammenhang stehendes Gen identifiziert werden konnte, wurden Kandidatengene in der Bruchpunkt-umgebenden Region ermittelt und auf mögliche über Positionseffekt vermittelte Dysregulation untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass das auf Grund der Genpriorisierung in die Kandidatenliste aufgenommene Gen WEE1 (WEE1 homolog (S. pombe) eine signifikant erhöhte Expression im Falle der Patientin aufwies. Dieses 474 kb upstream des Bruchpunktes lokalisierte Gen kodiert für eine Zellzyklus-Checkpoint-Kinase, welche den Übergang der Zelle aus der Replikation in die Mitose kontrolliert. Über seine negative regulatorische Funktion ist es von wesentlicher Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Genomintegrität [105,106]. Entsprechend wurde eine Überexpression dieses Gens bei verschiedenen Krebserkrankungen beschrieben [107,108]. Ein direkter Zusammenhang mit dem Phänotyp der Patientin war jedoch nicht ersichtlich. Außerdem fanden sich in der Decipher-Datenbank (Decipher v5.1) Patienteneinträge (249297, 255920; vgl. Anhang 8.5), welche einen Zugewinn an genetischem Material (Gain) im Bereich von WEE1 aufwiesen, jedoch keine vergleichbaren phänotypischen Merkmale aufzeigten. Zusammenfassend ergab sich daher kein Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen der WEE1-Überexpression und dem Phänotyp der Patientin.

4.4.5 Ausschluss der Kausalität von translokationsunabhängigen genomischen Imbalancen

Abschließend wurde zusätzlich eine gesamtgenomischen Analyse mittels molekularer Karyotypisierung auf kryptische, möglichweise Phänotyp-assoziierte Imbalancen durchgeführt. Jedoch fand sich die einzig dabei zusätzlich festgestellte Aberration als nicht pathologisch, sodass insgesamt damit auch translokationsunabhängige Imbalancen als Ursache für den Phänotyp der Patientin ausgeschlossen werden konnten.

4.4.6 Postulierung einer zufälligen Koinzidenz

Insgesamt konnte somit, trotz eingehender Analysen der Bruchpunkte und deren umgebenden Bereichen, sowie einer zusätzlich durchgeführten gesamtgenomischen Analyse, die genetische Ursache für den atypischen Phänotyp der Patientin nicht geklärt werden. Eine Assoziation zwischen dem Phänotyp und der Translokation der Patientin

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Diskussion konnte daher nicht bestätigt werden, und folglich wurde von einem zufälligen gemeinsamen Auftreten ausgegangen (Koinzidenz). Entsprechend war anzunehmen, dass eine oder mehrere kryptische Mutationen an translokationsunabhängiger Stelle im Genom die Ursache für den Phänotypen darstellen. Eine Untersuchung hierzu wäre mittels moderner Next-Generation-Sequencing-Methoden grundsätzlich denkbar, wurde aber im Rahmen der vorliegenden Arbeit zur Positionsklonierung krankheitsassoziierter Gene über Translokationen nicht weiter unternommen.

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Diskussion

4.5 Zusammenfassende Ergebnisdiskussion

Die hier untersuchten 4 Patienten eröffneten als Träger von möglicherweise krankheitsassoziierten balancierten de novo Translokationen eine vielversprechende Ausgangssituation zur Positionsklonierung von Phänotyp-assoziierten Genen in Bezug auf 4 unterschiedliche Krankheitsbilder. Ausgangspunkt war jeweils die für diese Art der Positionsklonierung charakteristische These der Beeinträchtigung eines dosissensitiven, phänotyprelevanten Gens über einen durch das Rearrangement vermittelten direkten Bruch oder Positionseffekt. Im Zuge der Charakterisierung der Bruchpunkte, und unter Einbezug einer jeweils parallel verfolgten molekularen Karyotypisierung, konnte in 3 der 4 Fälle die genetische Ursache der Erkrankung aufgedeckt werden. Das gefundene Spektrum an Ergebnissen reichte dabei von monogenen Erkrankungen, entsprechend der Ausgangsthese, bis hin zu oligogenen Ursachen, welche sich zum Teil auch translokationsunabhängig fanden: Der Ausgangsthese folgend, konnte bei den Translokationen 46,XY,t(10;13) und 46,XX,t(5;14) jeweils die Defizienz in einem einzigen Gen als Folge des balancierten Rearrangements für den Phänotyp als kausal gefunden werden. Im Falle des direkten Bruchs von MYST4 konnte so ein neues ursächliches Gen für Erkrankungen im Noonan- Syndrome-Like-Spektrum aufgedeckt und über weiterführende funktionelle Analysen der verantwortliche Pathomechanismus gezeigt werden. Im Gegensatz zu dem direkten Bruch eines kausalen Gens, fand sich dagegen in der Patientin mit schwerer mentaler Retardierung eine über einen translokationsabhängigen Positionseffekt verursachte FOXG1-Defizienz als Ursache. In diesem Fall wurde zwar kein neues Krankheitsgen aufgedeckt, jedoch war das Erkennen der genetischen Ursache für eine korrekte Einordnung der phänotypischen Merkmale der Patientin in das Rett-Like-Spektrum dienlich. Die Translokation 46,XX,t(1;8) mit ihrer untypischen Kombination phänotypischer Merkmale hingegen zeigte die Möglichkeit auch von komplexeren zu Grunde liegenden genetischen Situationen, die von der grundsätzlich angenommenen These einer monogenen Erkrankung abweichen. Hier fanden sich an beiden Bruchpunkten bekannte, mit Teilphänotypen assoziierte Gene mit sowohl über direkten Bruch als auch über Positionseffekt gestörter Expression. Das zusätzliche Auftreten einer translokationsunabhängigen, krankheitsassoziierten Imbalance bestätigte die schon früher beschriebene grundsätzliche Notwendigkeit von zusätzlich durchzuführenden molekularen Karyotypisierungen [18,19]. Die Translokation 47,XXX,t(7;11), die trotz eingehender Bruchpunktuntersuchungen nicht für den ungeklärten Phänotyp der Patientin verantwortlich gemacht werden konnte, wies schließlich auf die im Rahmen von

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Diskussion

Positionsklonierungen an Hand chromosomaler Aberrationen ebenfalls nicht auszuschließende Möglichkeit einer rein zufälligen Koinzidenz hin. Insgesamt zeigten somit die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse ein breites Spektrum an genetischen Auswirkungen balancierter Translokationen ab und dienten der Positionsklonierung und funktionellen Charakterisierung eines neuen krankheitsverursachenden Gens.

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5 Zusammenfassung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Positionsklonierung krankheitsverursachender Gene unter Verwendung Phänotyp-assoziierter balancierter Translokationen, für die Identifizierung und nähere Charakterisierung von bisher unbekannten genetischen Ursachen. Die Grundlage hierfür stellten 4 Translokationspatienten dar, die sich bei ungeklärter genetischer Ursache mit den unterschiedlichen Krankheitsbildern Noonan- Like, Cri-du-Chat-Like, Adipositas kombiniert mit hypogonadotropem Hypogonadismus und DiGeorge-Like präsentierten. Ausgehend von der grundsätzlichen These eines monogenen, über die Translokationsbruchpunkte direkt durch Ruptur eines Gens oder indirekt über Positionseffekt vermittelten Defekts, erfolgte die Charakterisierung der Translokationsbruchpunkte. Diese umfasste deren Feinkartierung mittels FISH und Mini- FISH-Analysen, sowie eine sich anschließende basengenaue Bruchpunktbestimmung über Sequenzierung von Bruchpunkt-überspannenden Fragmenten. Die Kausalität der im Bereich der Bruchpunkte ermittelten Kandidatengene für den entsprechenden Phänotyp, auf Grund von Defizienz, wurde an Hand von Expressionsanalysen untersucht und gegebenenfalls durch weiterführende funktionelle Analysen bestätigt. Der Möglichkeit zusätzlich auftretender, kryptischer und für den Phänotyp relevanter Aberrationen wurde mittels molekularer Karyotypisierung nachgegangen.

Im Fall des Patienten mit dem Noonan-Syndrom-ähnlichen Phänotyp konnte so die balancierte Translokation t(10;13)(q22.3;q34) als Ursache bestätigt, und in diesem Zuge ein neues krankheitsverursachendes Gen aufgedeckt werden. Entsprechend der These fand sich hier das Gen MYST4 direkt durch den Bruchpunkt auf Chromosom 10 rupturiert und zeigte eine daraus resultierende Expressionsreduktion. Ausgehend von der in weiterführenden Experimenten gezeigten Abnahme der globalen Histon- Acetyltransferaseaktivität, wurde eine spezifisch verminderte Acetylierung der H3-Histone im Patienten nachgewiesen und an zwei humanen Zelllinien über siRNA-Knockdown- Experimente bestätigt. Für eine weitere Charakterisierung wurde zudem die spezifische Expression der drei Isoformen dieses Gens in einer Vielzahl von fetalen und adulten Geweben analysiert. Zur Identifizierung von Zielgenen des Transkriptionsfaktors MYST4 wurden Expressions-Arrays für Patient und Knock-Down-Zelllinien durchgeführt, wobei ergänzend Daten von Expressions-Arrays für die MYST4-Knockdown-Maus aus einer Kooperation zur Verfügung standen. Außerdem erfolgte ein ChIP-on-Chip-Experiment mit einem durch Westernblot getesteten Antikörper gegen MYST4 am humanen Zellmodellsystem. Die Ergebnisse aus den Expressionsanalysen und der ChIP-

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Zusammenfassung

Anreicherung ließen dabei einen spezifischen Einfluss von MYST4 auf Gene des MAPK- Signalweges erkennen. Entsprechend konnte im Rahmen einer weiteren Kooperation, durch die Analyse der Phosphorylierungszustände integraler Komponenten dieses Signalweges, eine Hyperaktivierung im Patienten gezeigt und über einen Rescue-Versuch die MYST4-Defizienz als tatsächliche Ursache bestätigt werden. Haploinsuffizienz des Histon-Acetyltransferase-Gens MYST4 konnte somit als neue, und im Bezug auf ein parallel geführtes Mutationsscreening seltene, genetische Ursache für Erkrankungen im Spektrum des Noonan-Syndroms erkannt werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass MYST4-Defizienz in dem für dieses Syndrom typischen Pathomechanismus der Hyperaktivierung des RAS-MAP-Kinase-Signalwegs resultiert. Bei einer Patientin mit schwerer mentaler Retardierung, welche anfänglich dem Cri-du-Chat-Syndrom zugeordnet wurde, konnte ebenfalls eine Assoziation mit der balancierten Translokation t(5;14)(p15.33;q12) bestätigt werden. Über die Charakterisierung der Translokationsbruchpunkte konnte hier das über Positionseffekt beeinträchtigte, und im Zusammenhang mit schwerer mentaler Retardierung bereits bekannte Gen FOXG1 als Ursache identifiziert werden. Ein entsprechender Nachweis erfolgte im Rahmen einer Kooperation über die Bestätigung einer Expressionsreduktion auf Proteinebene. Das Erkennen der genetischen Ursache war für eine korrekte Einordnung der phänotypischen Merkmale der Patientin in das mit FOXG1- Haploinsuffizienz assoziierte Rett-Like-Spektrum dienlich. Die Patientin mit der Translokation t(1;8)(p36.11;p12) präsentierte sich mit einem kombinierten Phänotyp aus hypogonadotropem Hypogonadismus und Adipositas. Abweichend von der Ausgangsthese konnten in diesem Fall Expressionsänderungen von verschiedenen Genen im Bereich der Translokationsbruchpunkte in Kombination mit einer unabhängig vom Bruchpunkt auftretenden chromosomalen Imbalance als ursächlich aufgedeckt werden. Kausal für den hypogonadotropen Hypogonadismus wurde hier der direkte Bruch des Gens FGFR1 durch den Bruchpunkt auf Chromosom 8 erkannt. Die Bestätigung der resultierenden, in diesem Zusammenhang schon beschriebenen FGFR1- Haploinsuffizienz erfolgte über Expressionsanalysen. Die Adipositas hingegen konnte sowohl durch eine Expressionserniedrigung des bruchpunktbenachbarten Gens NR0B2, auf Grund von translokationsabhängigen Positionseffekten, als auch durch eine zusätzlich über molekulare Karyotypisierung identifizierte, translokationsunabhängige Mikroduplikation 15q13.2q13.3 erklärt werden. Für beide genetische Ereignisse war separat bereits eine Assoziation mit diesem Phänotyp bekannt. Im Fall der sich mit einem DiGeorge-Syndrom-ähnlichen Phänotyp präsentierenden Patientin wurden sowohl ein Triple-X-Genotyp als auch eine Translokation t(7;11)(p15.2;p15.4) diagnostiziert. Der beobachtete Phänotyp übertraf dabei in seiner Schwere, besonders in Hinblick auf einen kongenitalen Herzdefekt, den vergleichsweise milden, durch Triple-X zu erwartenden Phänotyp. Eine daraus

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Zusammenfassung resultierende Annahme einer Translokationsassoziation wurde jedoch über die vollständige Charakterisierung der Bruchpunkte, sich anschließenden Expressionsanalysen möglicher Kandidatengene und über Vergleich mit in Datenbank hinterlegten Aberrationen widerlegt. Entsprechend wurde eine zufällige Koinzidenz postuliert.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit für drei Translokationspatienten die dem jeweiligen Krankheitsbild zu Grunde liegende Genetik geklärt werden. Insgesamt deckten die erhaltenen Ergebnisse das mögliche Spektrum der genetischen Konsequenzen balancierter Translokationen ab und dienten speziell im Fall des Noonan-Syndrome-Like- Patienten der Positionsklonierung des krankheitsverursachenden Gens MYST4. Dessen Haploinsuffizienz konnte über funktionelle Charakterisierung als bis dahin unbekannte genetische Ursache für Erkrankungen im Noonan-Syndrom-Spektrum nachgewiesen werden.

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Summary

6 Summary

The aim of the present thesis was positional cloning of disease associated genes by using potentially phenotype associated balanced translocations for identification and further characterization of hitherto unknown genetic causes. Therefore four distinct translocation patients were investigated who presented themselves with diverse phenotypes comprising Noonan-like, Cri-du-Chat-like, obesity combined with hypogonadotropic hypogonadism and DiGeorge-like phenotypes of unknown genetic origin. Assuming a monogenic defect caused by direct disruption of a gene by the chromosomal translocation or an indirect posititional effect on a gene proximal to one of the breakpoints, the characterization of the translocation breakpoints was performed. This comprised a fine mapping by FISH and Mini-FISH-analyses and subsequent breakpoint sequencing based on breakpoint-spanning PCR products. Potential candidate genes found on or near the breakpoints and their putative causality for the phenotype through deficiency was investigated by expression analysis and verified by further functional studies. The posibility of additionally occuring cryptic aberrations with relevance for the phenotype was investigated by molecular karyotyping. In the case of a patient with Noonan-like phenotype the balanced translocation t(10;13)(q22.3;q34) was verified to be causative and led to the discovery of a novel disease causing gene. Accordant to the previous assumption the gene MYST4 was found directly disrupted by the breakpoint on chromosome 10 resulting in reduced expression. In further studies a decrease of global histone acetyltransferase activity was found. Consequently a specific decrease in the acetylation of H3 histones was detected in the patient which was comfirmed by siRNA knockdown experiments in two human cell lines. For further characterization the specific expression of each of the three transcript variants of MYST4 was analysed in human fetal and adult tissues. For identification of target genes of the transcription factor MYST4 expression arrays were performed in the patient and the knockdown cell lines. Complementary array data from the MYST4 knockdown mouse was contributed by our cooperation partner. Furthermore a ChIP-on- Chip experiment in the human cell model system was performed using a MYST4 antibody testet by Western blotting. The results of expression analyses combined with those of the ChIP experiment revealed a specific effect of MYST4 on the MAPK signaling pathway. Together with a cooperation partner this was comfirmed through analysis of the phosphorylation levels of integral components of this pathway revealing hyperactivation in the patient. Together with a rescue experiment this proved MYST4 deficiency as disease causing. Haploinsufficiency of the histone acetyltransferase gene MYST4 was therefore shown to be a novel and referring to additional mutation screenings rare

126

Summary genetic cause for disorders in the Noonan syndrome spectrum. MYST4 deficiency was shown to result in the Noonan typical pathomechanism of RAS-MAP kinase pathway hyperactivation. For the second patient who presented with severe mental retardation and who was initially assigned to the Cri-du-Chat syndrome an association with the balanced translocation t(5;14)(p15.33;q12) was also confirmed. The characterization of the translocation breakpoints led to the assumption of a positional effect on the gene FOXG1 which has been previously associated with severe mental retardation. This was verfied by expression analysis performed in cooperation on protein level which showed significant decrease for FOXG1. This result led to a correct classification of the patient´s phenotype to the FOXG1 haploinsufficiency associated Rett-like spectrum. A patient harboring a translocation t(1;8)(p36.11;p12) presented with hypogonadotropic hypogonadism in combination with obesity. Contrary to the initial assumption of a monogenic defect, in this case altered expression in several genes within the breakpoint regions combined with a translocation independent chromosomal imbalance were identified to be causative. Here the direct disruption of the gene FGFR1 by the breakpoint on chromosome 8 was found to underlie the hypogonadotropic hypogonadism. The resulting FGFR1 haploinsufficiency which has been previously associated with this phenotype was verified by expression analysis. Obesity however seemed to be caused by multiple mechanisms including reduced expression of the gene NR0B2 on chromosome 1 via translocation dependent positional effect and an independent microduplication 15q13.2q13.3 found by molecular karyotyping. Separately both genetic features have been previously associated with obesity. In the case of a patient presenting herself with a DiGeorge-like phenotype a triple X genotype as well as a translocation t(7;11)(p15.2;p15.4) was diagnosed. The observed phenotype thereby exceeded in its severeness the comparatively mild phenotype expected for triple X syndrome, especially in respect to the patient´s congenital heart defect. However a consequently stated assumption of association with the translocation was disproved by complete characterization of the breakpoints with subsequent expression analyses of potential candidate genes as well as by database- driven comparison to already known copy number variations. Therefore coincidence was postulated. In summary, within this thesis it was possible to clarify the genetic cause for the aberrant phenotype of three translocation harboring patients. The results thereby comprised the broad spectrum of genetic consequences seen for balanced translocations and served in the case of the Noonan-like patient for the positional cloning of a novel disease causing gene: MYST4. By functional characterization MYST4 haploinsufficiency was proven to be a novel cause for the Noonan-syndrome-like spectrum.

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7 Literaturverzeichnis

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8 Anhang

8.1 Abkürzungverzeichnis

Abkürzung Bedeutung °C Grad Celsius 3’-UTR 3’-untranslatierte Region 5’-UTR 5’-untranslatierte Region A Adenin A. bidest. Aqua bidestillata A. dest. Aqua destillatum Abb. Abbildung AS Aminosäure ASD Vorhof-Septum-Defekt BMI Body Mass Index bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise C Cytosin c Zenti (10−2) ca. circa cDNA komplementäre DNA ChIP Chromatin-Immunopräzipitation ChIP-on-chip Chromatin-Immunopräzipitation mit anschließender Array- basierter Analyse CNV Copy Number Variation C-terminal Carboxy-terminal Ctrl Control, Kontrolle ddNTP 2’,3’-Didesoxynucleosid-5’-triphosphat der(n) Derivatives Chromosom n DHEAS Dehydroepiandrosterone sulfate DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP 2’-Desoxynucleosid-5’-triphosphat E.coli Escherichia coli EST Expressed Sequence Tag FC Fold Change, Faktor der Expressionänderung FDR False discovery rate FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung FSH Follicle-stimulating hormone G Guanin g Erdbeschleunigung g Gramm h Stunde HAT Histon Acetyl-Transferase HDAC Histon Deacetylase hg18 Annotation: Human Genome Build 36, 2006 NCBI36, hg18 hg19 Annotation: Human Genome Build 37, 2009 GRCh37, hg19 ID Intellectual disability = Mental retardation IQ Intelligenzquotient k Kilo (103) kb Kilobasenpaare kDa Kilodalton ko Knockout l Liter

134

Anhang

LB Luria Broth LCL Lymphoblastoid Cell Line LH Luteinizing hormone LR-PCR Long-Range-Polymerase-Kettenreaktion M molar m Meter m Milli (10−3) max. maximal Mb Megabasen MIM # OMIM-Nummer (Online Mendelian Inheritance in Man (NCBI)) min Minute mind. mindestens MLPA Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification MR Mentale Retardierung MR Mental retardation = Intellecutal disability MRI Magnetic Resonance Imaging mRNAd Messenger-Ribonukleinsäure n Nano (10−9) NLS Kernlokalisationssequenz N-terminal Amino-terminal OD optische Dichte OMIM Online Mendelian Inheritance in Men ORF Open Reading Frame PBS Phosphate Buffered Saline-Puffer PCR Polymerase Chain Reaction pH negativer dekadischer Logarithmus der H+-Ionen-Konzentration pter P-Terminus, Terminus kurzer Chromosomenarm qPCR quantitative Polymerase Chain Reaction qter Q-Terminus, Terminus langer Chromosomenarm Ref. Referenz im Literaturverzeichnis RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease rpm rounds per minute RT Raumtemperatur RT Reverse Transcription RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction s Sekunde SD Standard Deviation SDS Natriumdodecylsulfat siRNA Small Interfering RNA SNP Single Nucleotide Polymorphism SSC Standard Saline Citrate-Puffer T Thymin Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer Temp. Temperatur U Units (Einheiten Enzym) u. a. unter anderem u. U. unter Umständen UK Universitäts-Klinikum UTR Untranslated region UV Ultraviolett V Volt vgl. vergleiche VSD Ventrikel-Septum-Defekt WT Wildtyp μ Mikro (10−6)

135

Anhang

8.2 Abkürzungen Aminosäuren

Aminosäure Drei-Buchstaben-Code Ein-Buchstaben-Code Alanin Ala A Arginin Arg R Aspartat Asp D Asparagin Asn N Cystein Cys C Glutamat Glu D Glutamin Gln Q Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptophan Trp W Tyrosin Tyr Y Valin Val V

8.3 Ergebnisse der FISH-Analysen zur Bruchpunkteingrenzung der Translokation 47,XXX,t(7;11)

Name Lokus Position (hg18) Signal RP11-16F15 AC011979.7 chr11: 9,549,633- 9,704,628 transloziert RP11-1H15 AC011092.4 chr11: 9,843,998-10,036,315 transloziert RP11-748C4 AC100763.2 chr11:10,011,951-10,184,914 gesplittet RP11-168C2 AC015700.8 chr11:10,078,377-10,257,552 nicht transloziert RP11-79E12 - chr11:10,149,870-10,309,555 nicht transloziert RP11-351I24 AC080023.6 chr11:10,200,312-10,390,197 nicht transloziert RP11-685M7 AC116535.9 chr11:10,645,786-10,838,289 nicht transloziert

RP11-109D3 AC010082 chr7: 18,315,131-18,458,173 transloziert RP11-692K8 AC091800 chr7: 22,699,833-22,724,108 transloziert RP11-299P22 AC009308 chr7: 24,027,113-24,135,294 transloziert RP5-899B21 AC004008.2 chr7: 24,938,532-25,028,920 transloziert RP11-465D10 - chr7: 25,150,088-25,341,840 transloziert RP5-978I12 AC003985.2 chr7: 25,293,512-25,398,003 transloziert RP11-185M5 - chr7: 25,369,206-25,568,086 transloziert RP11-122P19 - chr7: 25,664,042-25,814,004 gesplittet RP11-99O17 AC018706.3 chr7: 25,824,267-25,925,877 nicht transloziert RP11-627P22 AC073472.6 chr7: 26,923,207-27,023,949 nicht transloziert RP5-881H5 AC004007.1 chr7: 27,898,269-27,976,370 nicht transloziert

136

Anhang

8.4 Differentiell exprimierte Zellzyklus-Gene in Patientin mit Translokation 46,XX,t(5;14): Human Cell Cycle RT2 Profiler PCR Arrays (Bioscience Corporation)

Gen Vollständiger Genname Expressionsreduktion ABL1 V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene 1 -6,43 ATM Ataxia telangiectasia mutated -12,61 ATR Ataxia telangiectasia and Rad3 related -18,66 BCCIP BRCA2 and CDKN1A interacting protein -6,83 BIRC5 Baculoviral IAP repeat-containing 5 -7,65 BRCA2 Breast cancer 2, early onset -3,99 CCNC Cyclin C -5,87 CCNE1 Cyclin E1 -4,37 CCNT1 Cyclin T1 -3,43 CCNT2 Cyclin T2 -4,95 CDK2 Cyclin-dependent kinase 2 -4,35 CDKN3 Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 -3,10 CHEK1 CHK1 checkpoint homolog -11,56 CHEK2 CHK2 checkpoint homolog -3,62 CKS1B CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B -3,13 CUL2 Cullin 2 -17,11 DDX11 DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) box polypeptide 11 -3,23 GTF2H1 General transcription factor IIH -3,29 GTSE1 G-2 and S-phase expressed 1 -3,68 HERC5 Hect domain and RLD 5 -6,75 HUS1 HUS1 checkpoint homolog -3,04 KPNA2 Karyopherin alpha 2 -3,95 MCM2 MCM2 minichromosome maintenance deficient 2 -3,97 MK167 Antigen identified by monoclonal antibody Ki-67 -3,34 MRE11A MRE11 meiotic recombination 11 homolog A -5,81 NBN Nibrin -4,63 RAD1 RAD1 homolog -3,65 RAD17 RAD17 homolog -5,72 RAD51 RAD51 homolog -4,35 RB1 Retinoblastoma-like 1 -7,50 RBBP8 Retinoblastoma binding protein 8 -20,72 RBL1 Retinoblastoma-like 1 -3,44

137

Anhang

8.5 Zusammenfassung der Decipher-Datenbankeinträge (Decipher v5.1) mit Relevanz für die Diskussion der Translokation 47,XXX,t(7;11)

Patient 2585 2 Abberations: Loss Chr7:16,959,443-26,246,803 (hg19); de novo Gain Chr8:131,217,167-132,565,229 (hg19); unknown inheritance Phenotypes: Nothing found

Patient 249297 2 Abberations: Gain Chr11:2,087,219-14,340,504 (hg19); de novo Loss Chr8:190,567-4,776,715 (hg19); de novo Phenotypes: Hands, general abnormalities Long feet Tongue, general abnormalities

Patient 255920 1 Abberation: Gain Chr11:9,248,819-9,632,563 (hg19) Familial inherited from normal parent Phenotypes: Nothing found

Patient 256413 1 Abberation: Loss Chr7:24,672,789-29,748,237; de novo Phenotypes: Abnormal placement of anus Dysplastic ears Microphthalmia Ptosis of eyelids Short stature, proportionate Small ears/microtia Urinary reflux

Patient 256892 1 Abberation: Loss Chr7:18,836,861-28,749,226; de novo Phenotypes: Brachydactyly Camptodactyly Club foot, varus Craniosynostosis Enamel abnormalities Epicanthic folds Flat occiput Limited movement of fingers Low-set ears Mental retardation/developmental delay Microcephaly Palpebral fissures slant down Ptosis of eyelids SEIZURES, general abnormalities Short stature, prenatal onset Short stature, proportionate Simple ears Small ears/microtia Small feet

Patient 259698 1 Abberation: Loss Chr7:17,293,837-29,637,360 (hg19); unknown inheritance Phenotypes: Patchy pigment of skin/cafe au lait spots Percepto-motor delay without MR/or clumsiness Skin syndactyly of fingers

138

Anhang

8.6 Über Expressionsarray differentiell exprimiert gefundene Gene in den MYST4-defizienten Modellsystemen

8.6.1 Expressionsarray-Ergebnisse der ANOVA-Kalkulation für siRNA vermittelten MYST4-Knockdown in den humanen Zelllinien HEK293 und HeLa gegen Kontrollen (FDR < 0.05; FC < -1.5 or > 1.5)

FDR- Fold- Entrez Gen Vollständiger Genname Probeset ID adjusted Ratio Change Gene p-value (FC) ARL5A ADP-ribosylation factor-like 5A 26225 226617_at 2.16E-05 0.17 -5.75 ARL5A ADP-ribosylation factor-like 5A 26225 218150_at 7.58E-05 0.26 -3.87 --- Transcribed locus --- 238431_at 2.00E-04 0.28 -3.62 --- Primary neuroblastoma cDNA, clone:Nbla11485 --- 226520_at 1.70E-04 0.32 -3.17 solute carrier family 35 (UDP-glucuronic acid/UDP- SLC35D1 N-acetylgalactosamine dual tra 23169 209712_at 5.37E-05 0.34 -2.96 --- CDNA FLJ30090 fis, clone BNGH41000015 --- 243176_at 2.52E-05 0.34 -2.91 MXD1 MAX dimerization protein 1 4084 226275_at 1.21E-03 0.35 -2.82 LCOR ligand dependent nuclear receptor corepressor 84458 228454_at 1.81E-04 0.36 -2.74 CASP6 caspase 6, apoptosis-related cysteine peptidase 839 209790_s_at 1.75E-03 0.37 -2.71 solute carrier family 35 (UDP-glucuronic acid/UDP- SLC35D1 N-acetylgalactosamine dual tra 23169 209711_at 9.70E-05 0.38 -2.67 CDK6 cyclin-dependent kinase 6 1021 224851_at 4.51E-04 0.38 -2.65 CDK6 cyclin-dependent kinase 6 1021 224847_at 3.11E-04 0.38 -2.65 DNAJC6 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 6 9829 204720_s_at 1.84E-03 0.38 -2.63 --- CDNA FLJ30652 fis, clone DFNES2000011 --- 224811_at 7.60E-05 0.39 -2.56 CDP-diacylglycerol synthase (phosphatidate CDS2 cytidylyltransferase) 2 8760 212864_at 3.52E-04 0.39 -2.56 --- CDNA clone IMAGE:4819084 --- 235456_at 7.26E-05 0.39 -2.53 SWAP70 SWAP-70 protein 23075 209307_at 1.17E-03 0.40 -2.52 CDK6 cyclin-dependent kinase 6 1021 224848_at 5.05E-04 0.40 -2.51 --- Transcribed locus --- 236350_at 2.52E-03 0.41 -2.47 CASP7 caspase 7, apoptosis-related cysteine peptidase 840 207181_s_at 6.37E-04 0.41 -2.45 --- Transcribed locus --- 228479_at 6.93E-03 0.41 -2.44 CENPO centromere protein O 79172 226118_at 5.89E-05 0.41 -2.43 LOC149832 hypothetical protein LOC149832 149832 228456_s_at 8.87E-05 0.41 -2.42 FHL2 four and a half LIM domains 2 2274 202949_s_at 5.14E-05 0.41 -2.42 --- CDNA FLJ33585 fis, clone BRAMY2012163 --- 1556194_a_at 6.87E-04 0.42 -2.40 CUGBP2 CUG triplet repeat, RNA binding protein 2 10659 202156_s_at 6.08E-05 0.42 -2.40 LOC731484 hypothetical LOC731484 730069 242539_at 2.33E-03 0.43 -2.35 --- Transcribed locus --- 230659_at 3.94E-03 0.43 -2.35 UBASH3B ubiquitin associated and SH3 domain containing, B 84959 238462_at 1.42E-02 0.43 -2.34 TMEM64 transmembrane protein 64 169200 225972_at 1.07E-04 0.43 -2.33 HIST1H3H histone cluster 1, H3h 8357 206110_at 9.48E-05 0.43 -2.33 WDR40A WD repeat domain 40A 25853 224789_at 3.12E-05 0.44 -2.29 CETN2 centrin, EF-hand protein, 2 1069 209194_at 6.24E-04 0.44 -2.28 --- CDNA FLJ31919 fis, clone NT2RP7004964 --- 214949_at 1.76E-03 0.44 -2.28 DPY19L2P2 dpy-19-like 2 pseudogene 2 (C. elegans) 349152 215143_at 3.53E-03 0.44 -2.25 ROD1 ROD1 regulator of differentiation 1 (S. pombe) 9991 214697_s_at 6.19E-03 0.44 -2.25 NLGN1 neuroligin 1 22871 205893_at 1.94E-04 0.45 -2.24 TMF1 TATA element modulatory factor 1 7110 214948_s_at 1.12E-03 0.45 -2.23 GOLM1 golgi membrane protein 1 51280 217771_at 5.30E-04 0.45 -2.22 CDK6 cyclin-dependent kinase 6 1021 235287_at 1.08E-02 0.45 -2.22 SAR1A SAR1 gene homolog A (S. cerevisiae) 56681 201542_at 3.47E-04 0.45 -2.21 --- Transcribed locus 84901 229235_at 1.05E-02 0.45 -2.21 CRTAP cartilage associated protein 10491 1555889_a_at 4.38E-03 0.46 -2.20 KIAA0368 KIAA0368 23392 212427_at 3.73E-03 0.46 -2.19 TRIOBP TRIO and F-actin binding protein 11078 210276_s_at 2.32E-04 0.46 -2.18 CDH13 cadherin 13, H-cadherin (heart) 1012 204726_at 1.06E-02 0.46 -2.16 ROD1 ROD1 regulator of differentiation 1 (S. pombe) 9991 224617_at 6.61E-03 0.46 -2.16

139

Anhang

--- Transcribed locus --- 235286_at 5.88E-03 0.46 -2.15 NUPL1 nucleoporin like 1 9818 204435_at 2.10E-02 0.47 -2.14 ROD1 ROD1 regulator of differentiation 1 (S. pombe) 9991 224618_at 4.16E-03 0.47 -2.14 C20orf177 chromosome 20 open reading frame 177 --- 225313_at 1.89E-04 0.47 -2.13 CRTAP cartilage associated protein 10491 1554464_a_at 5.32E-03 0.47 -2.13 LIM domain containing preferred translocation LPP partner in lipoma 4026 202822_at 1.26E-03 0.47 -2.12 SNX1 sorting nexin 1 6642 213364_s_at 1.10E-03 0.47 -2.12 CCNYL1 Cyclin Y-like 1 151195 227280_s_at 1.86E-03 0.47 -2.12 ARHGAP1 Rho GTPase activating protein 1 392 202117_at 3.04E-04 0.47 -2.12 PEX19 peroxisomal biogenesis factor 19 5824 201707_at 2.70E-03 0.47 -2.11 nucleotide binding protein 1 (MinD homolog, E. NUBP1 coli) 4682 203978_at 5.08E-04 0.47 -2.11 DSC3 desmocollin 3 1825 206032_at 9.78E-04 0.47 -2.11 CUGBP2 CUG triplet repeat, RNA binding protein 2 10659 202158_s_at 2.41E-03 0.47 -2.11 TPM1 tropomyosin 1 (alpha) 7168 206117_at 2.93E-04 0.48 -2.10 WDR35 WD repeat domain 35 57539 226889_at 4.48E-04 0.48 -2.09 EPPK1 epiplakin 1 83481 232164_s_at 2.48E-03 0.48 -2.08 HAS2 hyaluronan synthase 2 3037 206432_at 8.32E-03 0.48 -2.07 CRIPT cysteine-rich PDZ-binding protein 9419 218643_s_at 9.91E-04 0.48 -2.07 TMEM64 transmembrane protein 64 169200 225974_at 5.22E-04 0.48 -2.06 nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, NFATC2IP calcineurin-dependent 2 intera 84901 217526_at 4.87E-03 0.49 -2.04 C14orf129 chromosome 14 open reading frame 129 51527 223239_at 2.13E-04 0.49 -2.04 PTGER4 prostaglandin E receptor 4 (subtype EP4) 5734 204897_at 3.72E-02 0.49 -2.04 BPGM 2,3-bisphosphoglycerate mutase 669 203502_at 1.75E-03 0.49 -2.04 --- CDNA clone IMAGE:3462401 --- 228008_at 2.78E-04 0.49 -2.04 CCDC50 coiled-coil domain containing 50 152137 226713_at 4.82E-03 0.49 -2.03 BLCAP bladder cancer associated protein 10904 201032_at 1.02E-05 0.49 -2.03 KDSR 3-ketodihydrosphingosine reductase 2531 229850_at 1.33E-03 0.49 -2.02 ------227921_at 1.26E-03 0.50 -2.02 CASP6 caspase 6, apoptosis-related cysteine peptidase 839 211464_x_at 1.40E-03 0.50 -2.01 SPIN3 spindlin family, member 3 169981 1555882_at 6.66E-03 0.50 -2.01 MGC16275 hypothetical protein MGC16275 85001 1558166_at 4.17E-04 0.50 -2.01 HP1BP3 heterochromatin protein 1, binding protein 3 50809 1554251_at 9.94E-04 0.50 -2.01 CYFIP2 cytoplasmic FMR1 interacting protein 2 26999 220999_s_at 2.59E-02 0.50 -2.01 GRPEL1 GrpE-like 1, mitochondrial (E. coli) 80273 212434_at 9.14E-05 0.50 -2.00 EPPK1 epiplakin 1 83481 232165_at 2.17E-03 0.50 -2.00 --- Transcribed locus --- 227959_at 6.23E-04 0.50 -2.00 DIDO1 death inducer-obliterator 1 11083 227335_at 1.32E-03 0.50 -2.00 RBM17 RNA binding motif protein 17 84991 224780_at 3.24E-04 0.50 -1.99 USP3 ubiquitin specific peptidase 3 9960 226652_at 3.19E-05 0.50 -1.99 LASP1 LIM and SH3 protein 1 3927 200618_at 3.04E-04 0.50 -1.98 ZNF805 zinc finger protein 805 390980 238436_s_at 2.69E-03 0.50 -1.98 --- CDNA FLJ41728 fis --- 227125_at 2.24E-03 0.51 -1.98 FN1 fibronectin 1 2335 211719_x_at 8.75E-03 0.51 -1.98 FBXO9 F-box protein 9 26268 212991_at 1.13E-02 0.51 -1.97 FKBP14 FK506 binding protein 14 55033 235311_at 4.76E-03 0.51 -1.97 C11orf59 chromosome 11 orf 59 55004 223009_at 2.20E-04 0.51 -1.97 IQCE IQ motif containing E 23288 204202_at 2.32E-04 0.51 -1.97 TUBG1 tubulin, gamma 1 7283 201714_at 4.62E-03 0.51 -1.96 TBC1D24 TBC1 domain family, member 24 57465 227908_at 3.26E-05 0.51 -1.96 CCDC117 coiled-coil domain containing 117 150275 225644_at 2.21E-04 0.51 -1.96 GLO1 glyoxalase I 2739 200681_at 1.46E-03 0.51 -1.95 LYPD1 LY6/PLAUR domain containing 1 116372 212909_at 1.27E-02 0.51 -1.95 PLAGL2 pleiomorphic adenoma gene-like 5326 202925_s_at 1.85E-03 0.51 -1.94 MED8 mediator complex subunit 8 112950 213126_at 3.51E-05 0.51 -1.94 HLA-B major histocompatibility complex, class I, B 4277 206247_at 9.22E-04 0.52 -1.94 vesicle transport through interaction with t- VTI1A SNAREs homolog 1A (yeast) 143187 236849_at 2.67E-02 0.52 -1.94 WDR68 WD repeat domain 68 10238 221744_at 4.85E-04 0.52 -1.94 CCDC50 coiled-coil domain containing 50 152137 228693_at 2.39E-03 0.52 -1.93 TPK1 thiamin pyrophosphokinase 1 27010 221218_s_at 5.88E-04 0.52 -1.93 GRHL1 grainyhead-like 1 (Drosophila) 29841 222830_at 2.10E-05 0.52 -1.93

140

Anhang

--- CDNA FLJ42315 fis --- 230300_at 4.32E-03 0.52 -1.93 WDR68 WD repeat domain 68 10238 224748_at 2.06E-04 0.52 -1.92 --- CDNA FLJ37658 fis --- 226485_at 8.32E-05 0.52 -1.92 ACTA2 actin, alpha 2 59 200974_at 5.17E-03 0.52 -1.91 SSFA2 Sperm specific antigen 2 6744 229744_at 3.38E-03 0.52 -1.91 RAB11A RAB11A, member RAS oncogene family 8766 200864_s_at 1.32E-04 0.52 -1.91 --- Transcribed locus --- 241879_at 5.02E-04 0.53 -1.90 C19orf56 chromosome 19 orf 56 51398 217780_at 6.93E-04 0.53 -1.90 CCDC25 coiled-coil domain containing 25 55246 218125_s_at 2.90E-03 0.53 -1.90 NLGN1 Neuroligin 1 22871 231361_at 3.21E-04 0.53 -1.90 C3orf10 chromosome 3 orf 10 55845 224575_at 1.26E-03 0.53 -1.89 CCDC50 coiled-coil domain containing 50 152137 235051_at 8.06E-03 0.53 -1.89 BCR breakpoint cluster region 400892 226602_s_at 7.89E-03 0.53 -1.89 MXD1 MAX dimerization protein 1 4084 228846_at 1.05E-02 0.53 -1.89 C9orf58 chromosome 9 open reading frame 58 83543 223075_s_at 1.09E-03 0.53 -1.89 EDEM1 ER degradation enhancer, mannosidase alpha-like 1 9695 203279_at 8.90E-04 0.53 -1.89 SRI sorcin 6717 208921_s_at 5.81E-04 0.53 -1.89 XRN1 5'-3' exoribonuclease 1 54464 225814_at 2.45E-03 0.53 -1.89 CRTAP cartilage associated protein 10491 201380_at 8.06E-03 0.53 -1.89 LOC149832 Hypothetical protein LOC149832 149832 230502_s_at 4.72E-03 0.53 -1.89 NFATC2IP nuclear factor of activated T-cells 84901 217527_s_at 7.30E-03 0.53 -1.88 --- CDNA clone IMAGE:6208446 --- 221844_x_at 2.77E-03 0.53 -1.88 --- CDNA clone IMAGE:5277883 --- 1558445_at 1.22E-03 0.53 -1.88 FKBP14 FK506 binding protein 14 55033 219390_at 7.32E-05 0.53 -1.88 HIST1H2AC histone cluster 1, H2ac 8334 215071_s_at 1.32E-03 0.53 -1.88 TTC9 tetratricopeptide repeat domain 9 23508 213172_at 7.40E-06 0.53 -1.88 SLC25A14 solute carrier family 25 mem 14 9016 204587_at 4.93E-04 0.53 -1.87 --- Transcribed locus --- 243996_at 3.88E-02 0.53 -1.87 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNA11 alpha 11 2767 213766_x_at 4.17E-04 0.53 -1.87 ZNF738 zinc finger protein 738 148203 229700_at 1.17E-02 0.53 -1.87 FN1 fibronectin 1 2335 210495_x_at 2.19E-02 0.53 -1.87 --- Transcribed locus --- 221973_at 1.11E-02 0.54 -1.87 FBXO9 F-box protein 9 26268 238472_at 3.93E-03 0.54 -1.87 CCNDBP1 cyclin D-type binding-protein 1 23582 223084_s_at 8.75E-04 0.54 -1.86 MAN2A1 mannosidase, alpha, class 2A, member 1 4124 226538_at 9.14E-04 0.54 -1.86 CAMSAP1 calmodulin regulated spectrin-associated protein 1 157922 212711_at 5.58E-04 0.54 -1.86 KDSR 3-ketodihydrosphingosine reductase 2531 1558279_a_at 1.05E-03 0.54 -1.86 ATAD2B ATPase family, AAA domain containing 2B 54454 213387_at 6.36E-04 0.54 -1.86 MDH2 malate dehydrogenase 2, NAD (mitochondrial) 4191 213333_at 4.64E-04 0.54 -1.86 MAN2A1 mannosidase, alpha, class 2A, member 1 4124 235103_at 1.18E-03 0.54 -1.85 ECM2 extracellular matrix protein 2 1842 206101_at 1.90E-02 0.54 -1.85 CUGBP2 CUG triplet repeat, RNA BP 2 10659 202157_s_at 8.66E-03 0.54 -1.85 --- Clone IMAGE:111714 mRNA --- 228466_at 6.70E-03 0.54 -1.85 ARL8B ADP-ribosylation factor-like 8B 55207 217852_s_at 9.57E-06 0.54 -1.85 USP6NL USP6 N-terminal like 9712 238164_at 6.22E-03 0.54 -1.85 ZNF805 zinc finger protein 805 390980 235398_at 1.05E-03 0.54 -1.85 MED8 mediator complex subunit 8 112950 213127_s_at 1.62E-04 0.54 -1.85 GATAD2A GATA zinc finger domain containing 2A 54815 222526_at 2.64E-04 0.54 -1.85 IFRD2 interferon-related developmental regulator 2 7866 209100_at 2.26E-04 0.54 -1.84 PPT1 palmitoyl-protein thioesterase 1 5538 200975_at 3.46E-04 0.54 -1.84 TMEM64 transmembrane protein 64 169200 242338_at 1.54E-02 0.54 -1.84 signal peptidase complex subunit 3 homolog (S. SPCS3 cerevisiae) 60559 218817_at 1.45E-02 0.55 -1.83 FN1 fibronectin 1 2335 216442_x_at 3.40E-02 0.55 -1.83 CKAP4 cytoskeleton-associated protein 4 10970 200999_s_at 4.00E-03 0.55 -1.83 LOC100130 hypothetical protein LOC100130506 --- 236656_s_at 2.17E-03 0.55 -1.82 506 FN1 fibronectin 1 2335 212464_s_at 2.82E-02 0.55 -1.82 SUSD1 sushi domain containing 1 64420 226264_at 1.33E-03 0.55 -1.82 SLC25A37 solute carrier family 25, member 37 51312 226179_at 2.20E-03 0.55 -1.82 RPS15A Ribosomal protein S15a 6210 235309_at 1.28E-03 0.55 -1.82

141

Anhang

BMP2K BMP2 inducible kinase 55589 59644_at 4.21E-02 0.55 -1.82 FIBIN fin bud initiation factor 387758 226769_at 1.41E-02 0.55 -1.82 --- Transcribed locus --- 230728_at 1.08E-04 0.55 -1.81 VANGL1 vang-like 1 81839 219330_at 2.75E-03 0.55 -1.81 UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N- GALNT1 acetylgalactosaminyltransferase 2589 201724_s_at 7.45E-04 0.55 -1.81 ARHGAP26 Rho GTPase activating protein 26 23092 226576_at 1.61E-03 0.55 -1.81 PKD2 polycystic kidney disease 2 5311 203688_at 1.04E-03 0.55 -1.81 ITGB4 integrin, beta 4 3691 204990_s_at 5.95E-03 0.55 -1.81 AHI1 Abelson helper integration site 1 54806 221569_at 1.33E-03 0.55 -1.81 TP53INP1 tumor protein p53 inducible nuclear protein 1 94241 225912_at 6.49E-03 0.55 -1.80 potassium inwardly-rectifying channel, subfamily KCNJ12 J, member 12 3768 207110_at 1.59E-03 0.56 -1.80 BTBD7 BTB (POZ) domain containing 7 55727 224945_at 2.27E-03 0.56 -1.80 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNA11 alpha 11 2767 40562_at 1.94E-03 0.56 -1.80 C12orf44 chromosome 12 orf 44 60673 218214_at 8.84E-05 0.56 -1.80 SHISA2 shisa homolog 2 387914 230493_at 3.35E-02 0.56 -1.80 LPGAT1 lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1 9926 202651_at 8.10E-04 0.56 -1.80 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNG12 gamma 12 55970 212294_at 9.80E-04 0.56 -1.79 CKAP4 cytoskeleton-associated protein 4 10970 200998_s_at 4.02E-02 0.56 -1.79 --- Transcribed locus --- 242486_at 1.19E-02 0.56 -1.79 ALDH6A1 aldehyde dehydrogenase 6 family, member A1 4329 221589_s_at 1.86E-02 0.56 -1.79 --- Transcribed locus --- 230399_at 1.55E-03 0.56 -1.79 NNT nicotinamide nucleotide transhydrogenase 23530 238530_at 2.51E-03 0.56 -1.79 GALNAC4S- B cell RAG associated protein 51363 203066_at 2.68E-04 0.56 -1.79 6ST --- CDNA clone IMAGE:5313062 --- 234998_at 2.83E-04 0.56 -1.78 IDH1 isocitrate dehydrogenase 1 3417 1555037_a_at 1.08E-02 0.56 -1.78 RGS20 regulator of G-protein signaling 8601 210138_at 2.99E-02 0.56 -1.78 --- Transcribed locus --- 228925_at 6.05E-03 0.56 -1.78 CREBL2 cAMP responsive element binding protein-like 2 1389 201990_s_at 4.41E-03 0.56 -1.77 --- CDNA FLJ30652 fis --- 235000_at 4.62E-04 0.56 -1.77 SLU7 SLU7 splicing factor homolog 10569 227990_at 2.46E-04 0.56 -1.77 --- Transcribed locus --- 235685_at 3.82E-03 0.56 -1.77 --- Transcribed locus --- 239292_at 7.96E-03 0.56 -1.77 ------244107_at 2.78E-03 0.56 -1.77 ALMS1 Alstrom syndrome 1 7840 214221_at 7.26E-03 0.57 -1.77 DOCK4 dedicator of cytokinesis 4 9732 205003_at 1.78E-02 0.57 -1.77 potassium inwardly-rectifying channel, subfamily KCNJ12 J, member 12 3768 232289_at 8.90E-03 0.57 -1.77 TRIOBP TRIO and F-actin binding protein 11078 202795_x_at 1.60E-04 0.57 -1.77 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNA11 alpha 11 2767 564_at 1.77E-03 0.57 -1.76 TAF11 RNA polymerase II, TATA box binding protein TAF11 (TBP)-associated factor, 28kDa 6882 1558136_s_at 2.61E-04 0.57 -1.76 RABL2B RAB, member of RAS oncogene family-like 2B 11159 219151_s_at 2.71E-03 0.57 -1.76 EEA1 early endosome antigen 1 8411 225885_at 2.11E-03 0.57 -1.75 HYPK Huntingtin interacting protein K 25764 218680_x_at 3.24E-03 0.57 -1.75 NBPF14 neuroblastoma breakpoint family, member 14 400818 227926_s_at 3.17E-03 0.57 -1.75 SLC6A6 solute carrier family 6, member 6 6533 205920_at 1.03E-02 0.57 -1.75 KCTD12 potassium channel tetramerisation domain cont. 12 115207 212192_at 3.35E-03 0.57 -1.75 H2BFS H2B histone family, member S 54145 208579_x_at 5.41E-03 0.57 -1.75 BTBD7 BTB (POZ) domain containing 7 55727 224943_at 2.88E-03 0.57 -1.75 IDH1 isocitrate dehydrogenase 1 (NADP+), soluble 3417 201193_at 1.79E-02 0.57 -1.75 BCAT2 branched chain aminotransferase 2, mitochondrial 587 203576_at 5.90E-05 0.57 -1.75 HIST1H2AI histone cluster 1, H2ai 8969 207156_at 3.48E-04 0.57 -1.75 CAMSAP1 calmodulin regulated spectrin-associated protein 1 157922 212710_at 3.05E-04 0.57 -1.74 MTF1 metal-regulatory transcription factor 1 4520 227150_at 1.16E-02 0.57 -1.74 CSRP1 cysteine and glycine-rich prot. 1 1465 200621_at 4.94E-03 0.57 -1.74 MARCH5 membrane-associated ring finger (C3HC4) 5 54708 218582_at 3.91E-04 0.57 -1.74 succinate dehydrogenase complex, subunit C, SDHC integral membrane protein, 15kDa 6391 215088_s_at 2.27E-03 0.57 -1.74 --- CDNA FLJ37917 fis --- 229460_at 1.28E-03 0.57 -1.74 SLC47A1 solute carrier family 47, mem. 1 55244 219525_at 1.92E-02 0.57 -1.74 KRT17 keratin 17 3872 205157_s_at 2.80E-02 0.57 -1.74

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Anhang

FAM105B family with sequence similarity 105, member B 90268 229268_at 2.19E-03 0.58 -1.74 SLITRK5 SLIT and NTRK-like family, mem. 5 26050 214930_at 1.88E-03 0.58 -1.74 --- Transcribed locus --- 238700_at 9.96E-04 0.58 -1.74 LOC644617 hypothetical LOC644617 644617 221235_s_at 3.75E-03 0.58 -1.74 XRN1 5'-3' exoribonuclease 1 54464 233632_s_at 1.63E-03 0.58 -1.74 PCBP2 poly(rC) binding protein 2 5094 213263_s_at 1.06E-03 0.58 -1.74 MAGED2 melanoma antigen family D, 2 10916 208682_s_at 2.11E-03 0.58 -1.74 THSD4 thrombospondin, type I, domain containing 4 79875 222835_at 1.32E-02 0.58 -1.74 KIAA0999 KIAA0999 protein 23387 213034_at 2.87E-03 0.58 -1.74 PRKACB protein kinase, cAMP-dependent, catalytic, beta 5567 202742_s_at 1.41E-03 0.58 -1.74 NAV1 neuron navigator 1 89796 224772_at 1.02E-02 0.58 -1.74 C1orf19 chromosome 1 orf 19 116461 225399_at 2.90E-03 0.58 -1.74 ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly ATPAF2 factor 2 91647 213057_at 2.26E-04 0.58 -1.73 SLC25A14 solute carrier family 25, mem. 14 9016 211855_s_at 4.09E-04 0.58 -1.73 CDK6 cyclin-dependent kinase 6 1021 243000_at 2.45E-03 0.58 -1.73 ------228443_s_at 1.09E-02 0.58 -1.73 HIST1H2BK histone cluster 1, H2bk 85236 209806_at 1.27E-03 0.58 -1.73 SPATA18 spermatogenesis associated 18 homolog (rat) 132671 229331_at 7.59E-03 0.58 -1.73 nuclear autoantigenic sperm protein (histone- NASP binding) 4678 201969_at 8.16E-03 0.58 -1.73 TRIOBP TRIO and F-actin binding protein 11078 216210_x_at 6.41E-05 0.58 -1.73 ARGLU1 arginine and glutamate rich 1 55082 227448_at 2.19E-02 0.58 -1.73 GLCE glucuronic acid epimerase 26035 213552_at 2.43E-03 0.58 -1.73 succinate dehydrogenase complex, subunit C, SDHC integral membrane protein, 15kDa 6391 210131_x_at 1.48E-03 0.58 -1.73 EIF2C2 Eukaryotic translation initiation factor 2C, 2 27161 225569_at 4.11E-02 0.58 -1.73 ARID3B AT rich interactive domain 3B 10620 218964_at 7.27E-03 0.58 -1.73 --- CDNA FLJ34899 fis, clone NT2NE2018594 --- 226719_at 2.09E-04 0.58 -1.72 --- Transcribed locus --- 230918_at 1.83E-02 0.58 -1.72 TCTEX1D2 transmembrane 4 L six family member 19 /// Tctex1 /// domain containing 2 255758 228606_at 4.83E-03 0.58 -1.72 TM4SF19 PHKA1 phosphorylase kinase, alpha 1 (muscle) 5255 229876_at 8.18E-03 0.58 -1.72 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNA11 alpha 11 (Gq class) 2767 213944_x_at 4.36E-04 0.58 -1.72 --- CDNA clone IMAGE:6576427 --- 228156_at 1.16E-02 0.58 -1.72 --- CDNA FLJ34038 fis, clone FCBBF2005645 --- 244779_at 1.16E-02 0.58 -1.72 KIAA0999 KIAA0999 protein 23387 204156_at 1.97E-03 0.58 -1.72 calcium/calmodulin-dependent protein kinase II CAMK2N1 inhibitor 1 55450 218309_at 1.08E-02 0.58 -1.72 FAM130A1 family with sequence similarity 130, member A1 81566 221260_s_at 1.53E-03 0.58 -1.72 FAT3 FAT tumor suppressor homolog 3 (Drosophila) 120114 1558964_at 1.90E-02 0.58 -1.72 DUSP6 dual specificity phosphatase 6 1848 208892_s_at 9.10E-03 0.58 -1.72 steroid-5-alpha-reductase, alpha polypeptide 1 (3- SRD5A1 oxo-5 alpha-steroid delta 4-de 6715 204675_at 6.38E-04 0.58 -1.72 ICK intestinal cell (MAK-like) kinase 22858 204569_at 5.18E-03 0.58 -1.71 MAN2A1 mannosidase, alpha, class 2A, member 1 4124 205105_at 1.46E-02 0.58 -1.71 --- CDNA clone IMAGE:3867353 --- 240121_x_at 1.94E-03 0.58 -1.71 DSC3 desmocollin 3 1825 206033_s_at 1.06E-03 0.59 -1.71 TAF8 RNA polymerase II, TATA box binding protein TAF8 (TBP)-associated factor, 43kDa 129685 1556178_x_at 2.22E-04 0.59 -1.71 --- Transcribed locus --- 241826_x_at 1.67E-03 0.59 -1.71 ALDH3B1 aldehyde dehydrogenase 3 family, member B1 221 205640_at 1.61E-02 0.59 -1.71 SAPS2 SAPS domain family, member 2 9701 202792_s_at 5.43E-03 0.59 -1.70 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNA11 alpha 11 (Gq class) 2767 204248_at 8.40E-03 0.59 -1.70 ARID3A AT rich interactive domain 3A (BRIGHT-like) 1820 205865_at 1.60E-03 0.59 -1.70 FASTK Fas-activated serine/threonine kinase 10922 210975_x_at 6.21E-05 0.59 -1.70 vacuolar protein sorting 24 homolog (S. VPS24 cerevisiae) 51652 222437_s_at 1.03E-03 0.59 -1.70 ZNF512 zinc finger protein 512 84450 225050_at 3.70E-04 0.59 -1.70 PRKACB protein kinase, cAMP-dependent, catalytic, beta 5567 202741_at 1.93E-05 0.59 -1.70 ENY2 enhancer of yellow 2 homolog (Drosophila) 56943 226776_at 1.23E-02 0.59 -1.70 ETNK1 ethanolamine kinase 1 55500 225290_at 6.24E-03 0.59 -1.70 ZNF805 zinc finger protein 805 390980 238437_at 8.55E-04 0.59 -1.70 --- Transcribed locus --- 236200_at 6.30E-03 0.59 -1.70 ETNK1 ethanolamine kinase 1 55500 226432_at 6.42E-03 0.59 -1.70

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Anhang

sorting and assembly machinery component 50 SAMM50 homolog 25813 201570_at 8.50E-04 0.59 -1.70 WIBG within bgcn homolog (Drosophila) 84305 242304_at 6.60E-05 0.59 -1.70 LOC100130 Similar to hCG2036711 --- 243871_at 1.17E-02 0.59 -1.70 476 SLC38A9 solute carrier family 38, member 9 153129 235241_at 1.86E-03 0.59 -1.69 protein (peptidylprolyl cis/trans isomerase) NIMA- PIN4 interacting, 4 5303 204572_s_at 3.09E-02 0.59 -1.69 transducin-like enhancer of split 1 (E(sp1) TLE1 homolog, Drosophila) 7088 228284_at 3.85E-03 0.59 -1.69 MACROD1 MACRO domain containing 1 28992 219188_s_at 1.66E-02 0.59 -1.69 SEC14L1 SEC14-like 1 (S. cerevisiae) 6397 202084_s_at 5.48E-03 0.59 -1.69 DVL3 dishevelled, dsh homolog 3 1857 201908_at 8.27E-05 0.59 -1.69 --- Transcribed locus --- 1559067_a_at 7.56E-04 0.59 -1.69 FAM120C family with sequence similarity 120C 54954 229512_at 1.11E-03 0.59 -1.69 WDFY1 WD repeat and FYVE domain containing 1 57590 224800_at 1.44E-04 0.59 -1.69 BTBD7 BTB (POZ) domain containing 7 55727 1556000_s_at 3.30E-03 0.59 -1.69 XK X-linked Kx blood group (McLeod syndrome) 7504 206698_at 5.15E-03 0.59 -1.69 ADAM19 ADAM metallopeptidase domain 19 (meltrin beta) 8728 209765_at 9.77E-03 0.59 -1.69 RQCD1 RCD1 required for cell differentiation1 homolog 9125 213179_at 5.16E-03 0.59 -1.69 ASF1 anti-silencing function 1 homolog B (S. ASF1B cerevisiae) 55723 218115_at 1.93E-03 0.59 -1.69 KIAA0895 KIAA0895 protein 23366 213424_at 1.99E-03 0.59 -1.68 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNB5 beta 5 10681 207124_s_at 2.05E-03 0.59 -1.68 NISCH nischarin 11188 201591_s_at 8.38E-04 0.59 -1.68 sorting and assembly machinery component 50 SAMM50 homolog ( 25813 201569_s_at 1.76E-03 0.59 -1.68 solute carrier family 6 (neurotransmitter SLC6A6 transporter, taurine), member 6 6533 228754_at 8.09E-03 0.59 -1.68 small nuclear ribonucleoprotein D3 polypeptide SNRPD3 18kDa 6634 202567_at 1.11E-03 0.59 -1.68 nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, NFATC2IP calcineurin-dependent 2 intera 84901 212808_at 3.39E-02 0.59 -1.68 succinate dehydrogenase complex, subunit C, SDHC integral membrane protein, 15kDa 6391 202004_x_at 1.75E-03 0.59 -1.68 CTPS CTP synthase 1503 202613_at 2.17E-03 0.60 -1.68 HYPK Huntingtin interacting protein K 25764 233746_x_at 4.17E-03 0.60 -1.68 potassium channel tetramerisation domain KCTD12 containing 12 115207 212188_at 4.45E-02 0.60 -1.68 CALCOCO2 calcium binding and coiled-coil domain 2 10241 210817_s_at 6.41E-03 0.60 -1.68 LYPLA1 lysophospholipase I 10434 203007_x_at 4.95E-03 0.60 -1.68 HDLBP high density lipoprotein binding protein (vigilin) 3069 225012_at 8.07E-03 0.60 -1.68 C9orf125 chromosome 9 open reading frame 125 --- 213386_at 3.93E-04 0.60 -1.68 KIAA0232 KIAA0232 9778 232366_at 1.57E-02 0.60 -1.67 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNB5 beta 5 10681 204000_at 7.39E-03 0.60 -1.67 LOC645722 hypothetical LOC645722 645722 1555216_a_at 3.17E-03 0.60 -1.67 BTBD11 BTB (POZ) domain containing 11 121551 238692_at 3.72E-04 0.60 -1.67 SPIN3 spindlin family, member 3 169981 1555883_s_at 1.17E-03 0.60 -1.67 RBBP6 retinoblastoma binding protein 6 5930 1552329_at 6.73E-03 0.60 -1.67 UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N- GALNT1 acetylgalactosaminyltransferase 2589 201722_s_at 6.75E-04 0.60 -1.66 ERAP1 Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 51752 212580_at 1.31E-02 0.60 -1.66 SETD8 SET domain containing (lysine methyltransferase) 8 387893 225094_at 7.14E-04 0.60 -1.66 PPM1F protein phosphatase 1F (PP2C domain containing) 9647 203063_at 2.05E-04 0.60 -1.66 vacuolar protein sorting 24 homolog (S. VPS24 cerevisiae) 51652 217837_s_at 1.64E-04 0.60 -1.66 WDR68 WD repeat domain 68 10238 224730_at 1.96E-02 0.60 -1.66 --- Transcribed locus --- 214124_x_at 3.27E-03 0.60 -1.66 AKT2 v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2 208 226156_at 6.57E-03 0.60 -1.66 succinate dehydrogenase complex, subunit C, SDHC integral membrane protein, 15kDa /// 642502 216591_s_at 4.59E-02 0.60 -1.66 proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non- PSMD11 ATPase, 11 5717 208776_at 3.24E-02 0.60 -1.65 --- Transcribed locus --- 242965_at 3.98E-02 0.60 -1.65 EGLN3 egl nine homolog 3 (C. elegans) 112399 219232_s_at 1.19E-02 0.61 -1.65 C3orf63 chromosome 3 open reading frame 63 23272 209285_s_at 1.38E-02 0.61 -1.65 SGPL1 sphingosine-1-phosphate lyase 1 --- 212321_at 9.69E-04 0.61 -1.65 --- CDNA FLJ13690 fis, clone PLACE2000097 --- 232667_at 1.02E-04 0.61 -1.65 DYX1C1 dyslexia susceptibility 1 candidate 1 161582 235273_at 2.75E-02 0.61 -1.65 BBS1 Bardet-Biedl syndrome 1 10072 218567_x_at 1.32E-02 0.61 -1.65 potassium inwardly-rectifying channel, subfamily KCNJ12 J, member 12 3768 208567_s_at 2.06E-03 0.61 -1.65

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SDSL serine dehydratase-like 113675 228274_at 1.77E-02 0.61 -1.65 KHDC1 KH homology domain cont. 1 387097 241024_at 1.75E-02 0.61 -1.65 --- CDNA clone IMAGE:6576427 --- 242423_x_at 1.14E-03 0.61 -1.65 PDLIM5 PDZ and LIM domain 5 10611 212412_at 8.09E-04 0.61 -1.65 TAF8 RNA polymerase II, TATA box binding protein TAF8 (TBP)-associated factor, 43kDa 129685 1556176_at 7.31E-04 0.61 -1.65 SEPN1 selenoprotein N, 1 57190 224659_at 2.62E-02 0.61 -1.65 RAP2C RAP2C, member of RAS oncogene family 57826 218669_at 1.27E-02 0.61 -1.65 TOR1AIP1 torsin A interacting protein 1 26092 216100_s_at 6.09E-03 0.61 -1.64 potassium channel tetramerisation domain KCTD16 containing 16 57528 233234_at 2.64E-02 0.61 -1.64 --- CDNA FLJ13202 fis, clone NT2RP3004503 --- 239050_s_at 4.52E-02 0.61 -1.64 RBM8A RNA binding motif protein 8A 9939 213852_at 3.47E-03 0.61 -1.64 Similar to FRAS1 related extracellular matrix LOC650794 protein 2 650794 236837_x_at 3.93E-03 0.61 -1.64 SIPA1L1 Signal-induced proliferation-associated 1 like 1 26037 202254_at 4.40E-03 0.61 -1.64 CUGBP2 CUG triplet repeat, RNA binding protein 2 10659 227178_at 3.31E-03 0.61 -1.64 RUNX3 runt-related transcription factor 3 864 204197_s_at 4.99E-03 0.61 -1.64 PCGF2 polycomb group ring finger 2 7703 214239_x_at 2.26E-03 0.61 -1.64 ORAOV1 oral cancer overexpressed 1 220064 243531_at 1.02E-03 0.61 -1.64 CSNK1G1 casein kinase 1, gamma 1 53944 226888_at 4.17E-03 0.61 -1.64 sterol regulatory element binding transcription SREBF2 factor 2 --- 201247_at 1.75E-02 0.61 -1.64 CCDC50 coiled-coil domain containing 50 152137 236831_at 1.13E-02 0.61 -1.63 PCBP2 poly(rC) binding protein 2 5094 213264_at 4.45E-03 0.61 -1.63 --- CDNA FLJ41633 fis, clone FCBBF3003435 --- 238782_at 6.42E-03 0.61 -1.63 ELAV (embryonic lethal, abnormal vision, ELAVL1 Drosophila)-like 1 (Hu antigen R) 1994 227746_at 6.11E-04 0.61 -1.63 HIST3H2A histone cluster 3, H2a 92815 221582_at 6.42E-03 0.61 -1.63 RBM8A RNA binding motif protein 8A 9939 217856_at 8.88E-03 0.61 -1.63 PKP4 plakophilin 4 8502 214874_at 1.03E-04 0.61 -1.63 DCLK1 doublecortin-like kinase 1 9201 205399_at 1.50E-02 0.61 -1.63 MED19 mediator complex subunit 19 219541 226293_at 7.77E-04 0.61 -1.63 YIPF6 Yip1 domain family, member 6 286451 212342_at 2.19E-04 0.61 -1.63 --- CDNA FLJ13202 fis --- 233068_at 1.24E-02 0.62 -1.63 STX4 syntaxin 4 6810 229395_at 2.97E-04 0.62 -1.63 CNOT6 CCR4-NOT transcription complex, subunit 6 57472 217970_s_at 2.41E-04 0.62 -1.62 --- Transcribed locus --- 228254_at 9.68E-03 0.62 -1.62 --- CDNA FLJ42287 fis, clone TLIVE2005866 --- 235924_at 3.94E-03 0.62 -1.62 --- Transcribed locus --- 230570_at 2.66E-03 0.62 -1.62 --- Transcribed locus --- 242051_at 3.96E-02 0.62 -1.62 DAZAP2 DAZ associated protein 2 9802 200794_x_at 7.14E-04 0.62 -1.62 FASTK Fas-activated serine/threonine kinase 10922 214114_x_at 9.49E-04 0.62 -1.62 --- CDNA FLJ38461 fis, clone FEBRA2020977 --- 243735_at 4.63E-02 0.62 -1.62 NNT nicotinamide nucleotide transhydrogenase 23530 202784_s_at 1.03E-03 0.62 -1.62 similar to olfactory receptor, family 7, subfamily LOC441453 A, member 17 441453 217551_at 8.43E-03 0.62 -1.62 TAF11 RNA polymerase II, TATA box binding protein TAF11 (TBP)-associated factor, 28kDa 6882 209358_at 9.76E-04 0.62 -1.62 C8orf32 chromosome 8 open reading frame 32 55093 219060_at 6.56E-03 0.62 -1.62 MIB2 mindbomb homolog 2 (Drosophila) 142678 226644_at 2.11E-03 0.62 -1.62 MEX3D mex-3 homolog D (C. elegans) 399664 91816_f_at 8.20E-03 0.62 -1.62 TSPYL4 TSPY-like 4 23270 212928_at 1.31E-02 0.62 -1.62 SOCS2 suppressor of cytokine signaling 2 8835 203373_at 2.33E-03 0.62 -1.62 C18orf56 chromosome 18 open reading frame 56 494514 228989_at 2.34E-02 0.62 -1.62 SRI sorcin 6717 208920_at 2.12E-03 0.62 -1.62 --- Transcribed locus --- 241114_s_at 4.75E-04 0.62 -1.62 TOB2 transducer of ERBB2, 2 10766 222243_s_at 1.22E-02 0.62 -1.62 phosphoribosylformylglycinamidine synthase (FGAR PFAS amidotransferase) 5198 213302_at 7.66E-03 0.62 -1.62 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane LETM1 protein 1 3954 222006_at 4.71E-03 0.62 -1.62 TMCC1 transmembrane and coiled-coil domain family 1 23023 213352_at 4.13E-02 0.62 -1.62 GJA1 gap junction protein, alpha 1, 43kDa 2697 201667_at 4.27E-03 0.62 -1.61 KIAA1632 KIAA1632 57724 228453_at 2.90E-02 0.62 -1.61 HINT3 histidine triad nucleotide binding protein 3 --- 228697_at 3.24E-02 0.62 -1.61 RAP2C RAP2C, member of RAS oncogene family 57826 218668_s_at 1.42E-02 0.62 -1.61 LOC400027 hypothetical gene supported by BC047417 400027 226413_at 2.53E-02 0.62 -1.61

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Anhang

EPPK1 epiplakin 1 83481 208156_x_at 4.43E-03 0.62 -1.61 BTBD2 BTB (POZ) domain containing 2 55643 207722_s_at 3.59E-02 0.62 -1.61 --- Transcribed locus --- 229029_at 2.46E-02 0.62 -1.61 TNFAIP8 tumor necrosis factor, alpha-induced protein 8 25816 210260_s_at 3.31E-04 0.62 -1.61 NNT nicotinamide nucleotide transhydrogenase 23530 202783_at 3.27E-04 0.62 -1.61 CROT carnitine O-octanoyltransferase 54677 231102_at 5.00E-03 0.62 -1.61 PCSK6 proprotein convertase subtilisin/kexin type 6 5046 207414_s_at 7.68E-03 0.62 -1.61 C7orf41 chromosome 7 open reading frame 41 222166 226018_at 3.89E-03 0.62 -1.61 KIAA0101 KIAA0101 9768 202503_s_at 4.89E-03 0.62 -1.61 MAPK14 mitogen-activated protein kinase 14 1432 202530_at 5.15E-04 0.62 -1.61 C21orf51 chromosome 21 open reading frame 51 54065 228239_at 3.63E-03 0.62 -1.61 translocated promoter region (to activated MET TPR oncogene) 7175 228709_at 1.68E-03 0.62 -1.61 phosphoinositide-3-kinase, class 2, beta PIK3C2B polypeptide 5287 204484_at 1.62E-04 0.62 -1.60 C16orf57 chromosome 16 open reading frame 57 79650 1554016_a_at 3.44E-03 0.62 -1.60 MED19 mediator complex subunit 19 219541 226300_at 5.36E-03 0.62 -1.60 FLJ11151 hypothetical protein FLJ11151 55313 218610_s_at 3.17E-02 0.63 -1.60 --- CDNA FLJ11723 fis, clone HEMBA1005314 --- 227498_at 2.03E-02 0.63 -1.60 BUD13 BUD13 homolog (S. cerevisiae) 84811 224504_s_at 6.45E-04 0.63 -1.60 --- CDNA FLJ36977 fis, clone BRACE2006344 --- 241808_at 5.79E-03 0.63 -1.60 programmed cell death 6 /// aryl-hydrocarbon PDCD6 receptor repressor 57491 229354_at 5.01E-03 0.63 -1.60 SH3KBP1 SH3-domain kinase binding protein 1 --- 235692_at 1.35E-02 0.63 -1.60 CRTAP cartilage associated protein 10491 227138_at 7.76E-03 0.63 -1.60 MYADM myeloid-associated differentiation marker 91663 224920_x_at 1.25E-03 0.63 -1.60 protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) PPP1R3E subunit 3E 90673 227412_at 1.75E-02 0.63 -1.60 SMAD6 SMAD family member 6 4091 207069_s_at 2.37E-02 0.63 -1.60 metastasis associated lung adenocarcinoma MALAT1 transcript 1 (non-protein coding) 378938 224558_s_at 4.88E-02 0.63 -1.59 OSBPL3 oxysterol binding protein-like 3 26031 209627_s_at 1.25E-02 0.63 -1.59 EXT2 exostoses (multiple) 2 2132 202013_s_at 1.19E-03 0.63 -1.59 IFI44 interferon-induced protein 44 10561 214453_s_at 4.21E-02 0.63 -1.59 HAS2 Hyaluronan synthase 2 --- 230372_at 1.60E-02 0.63 -1.59 NADSYN1 NAD synthetase 1 55191 232946_s_at 1.64E-03 0.63 -1.59 METAP1 methionyl aminopeptidase 1 23173 212673_at 1.02E-03 0.63 -1.59 MAGED2 melanoma antigen family D, 2 10916 213627_at 4.42E-03 0.63 -1.59 USP49 ubiquitin specific peptidase 49 --- 229351_at 4.17E-02 0.63 -1.59 tRNA splicing endonuclease 34 homolog (S. TSEN34 cerevisiae) 79042 218132_s_at 2.76E-03 0.63 -1.59 LNPEP leucyl/cystinyl aminopeptidase 4012 236728_at 1.49E-02 0.63 -1.59 MAML1 mastermind-like 1 (Drosophila) 9794 202360_at 3.72E-04 0.63 -1.59 LOC284356 hypothetical LOC284356 284356 1555842_at 2.60E-03 0.63 -1.59 LOC285535 hypothetical protein LOC285535 285535 229130_at 2.89E-03 0.63 -1.59 WDR68 WD repeat domain 68 10238 221745_at 4.35E-02 0.63 -1.58 KLHL24 kelch-like 24 (Drosophila) 54800 226158_at 4.08E-02 0.63 -1.58 FERMT1 fermitin family homolog 1 (Drosophila) 55612 218796_at 1.09E-02 0.63 -1.58 --- CDNA clone IMAGE:5301910 --- 239503_at 6.96E-03 0.63 -1.58 DUSP6 dual specificity phosphatase 6 1848 208891_at 2.36E-02 0.63 -1.58 --- Transcribed locus --- 239236_at 3.47E-02 0.63 -1.58 SPRYD4 SPRY domain containing 4 283377 225616_at 2.53E-03 0.63 -1.58 SRY (sex determining region Y)-box 9 (campomelic SOX9 dysplasia, autosomal sex-revers 6662 202936_s_at 3.47E-04 0.63 -1.58 TCEA2 transcription elongation factor A (SII), 2 6919 203919_at 4.03E-02 0.63 -1.58 SETD8 SET domain containing (lysine methyltransferase) 8 387893 225118_at 2.33E-04 0.63 -1.58 UNQ1887 signal peptide peptidase 3 121665 224639_at 3.72E-03 0.63 -1.58 LIMK1 LIM domain kinase 1 3984 204357_s_at 9.96E-03 0.63 -1.58 FAM126B family with sequence similarity 126, member B 285172 1554178_a_at 1.92E-02 0.63 -1.58 MRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE --- 1674211 --- 225543_at 7.96E-04 0.63 -1.58 --- CDNA: FLJ22542 fis, clone HSI00196 --- 233820_at 9.62E-03 0.63 -1.58 proteasome (prosome, macropain) activator subunit PSME3 3 (PA28 gamma; Ki) 10197 200988_s_at 2.28E-02 0.63 -1.58 BACE1 beta-site APP-cleaving enzyme 1 23621 217904_s_at 1.61E-03 0.64 -1.57 NADSYN1 NAD synthetase 1 55191 218840_s_at 7.44E-03 0.64 -1.57 TPK1 thiamin pyrophosphokinase 1 27010 223686_at 8.47E-03 0.64 -1.57 translocase of inner mitochondrial membrane 17 TIMM17B homolog B (yeast) 10245 203342_at 2.48E-03 0.64 -1.57

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FAM101B family with sequence similarity 101, member B 359845 226905_at 7.72E-03 0.64 -1.57 OPN3 opsin 3 23596 224392_s_at 1.77E-02 0.64 -1.57 steroid-5-alpha-reductase, alpha polypeptide 1 (3- SRD5A1 oxo-5 alpha-steroid delta 4-de 6715 211056_s_at 2.48E-03 0.64 -1.57 ACTR8 ARP8 actin-related protein 8 homolog (yeast) 93973 218658_s_at 3.03E-03 0.64 -1.57 DOCK5 Dedicator of cytokinesis 5 80005 230207_s_at 3.28E-02 0.64 -1.57 NKX2-2 NK2 homeobox 2 4821 206915_at 4.69E-03 0.64 -1.57 MGC5566 Hypothetical protein LOC100128040 79015 241759_at 4.57E-03 0.64 -1.57 DPY19L1 dpy-19-like 1 (C. elegans) 23333 212792_at 3.65E-03 0.64 -1.57 FOXA1 forkhead box A1 3169 204667_at 2.39E-02 0.64 -1.57 NPTX1 neuronal pentraxin I 4884 204684_at 2.88E-02 0.64 -1.57 PER2 period homolog 2 (Drosophila) 8864 205251_at 7.51E-03 0.64 -1.57 CDCA4 cell division cycle associated 4 55038 218399_s_at 1.82E-03 0.64 -1.57 --- CDNA FLJ30340 fis, clone BRACE2007411 --- 226458_at 3.16E-03 0.64 -1.57 transcription factor AP-2 alpha (activating TFAP2A enhancer binding protein 2 alpha) 7020 204654_s_at 5.95E-03 0.64 -1.57 C9orf116 chromosome 9 open reading frame 116 138162 221946_at 1.28E-02 0.64 -1.56 cleavage and polyadenylation specific factor 4, CPSF4 30kDa 10898 206688_s_at 3.80E-03 0.64 -1.56 ZNF512 zinc finger protein 512 84450 1553218_a_at 1.56E-03 0.64 -1.56 BID BH3 interacting domain death agonist 637 204493_at 3.86E-02 0.64 -1.56 HIST1H2BG histone cluster 1, H2bg 8344 208527_x_at 5.87E-03 0.64 -1.56 HIST1H2BG histone cluster 1, H2bg 8343 208490_x_at 4.93E-03 0.64 -1.56 SAR1A SAR1 gene homolog A 56681 210790_s_at 9.95E-03 0.64 -1.56 ------227943_at 2.57E-02 0.64 -1.56 FLJ37453 hypothetical protein LOC729614 729614 227593_at 2.25E-02 0.64 -1.56 UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N- GALNT4 acetylgalactosaminyltransferase 8693 231832_at 1.37E-02 0.64 -1.56 calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaM CAMK2D kinase) II delta 817 231793_s_at 2.04E-03 0.64 -1.56 --- CDNA clone IMAGE:6576427 --- 238109_at 2.03E-03 0.64 -1.56 ALDH7A1 aldehyde dehydrogenase 7 family, member A1 501 213591_at 1.29E-04 0.64 -1.56 SOCS2 suppressor of cytokine signaling 2 8835 203372_s_at 2.89E-02 0.64 -1.56 MGC4172 short-chain dehydrogenase/reductase 79154 218756_s_at 2.86E-02 0.64 -1.56 FLJ44896 FLJ44896 protein 401166 236046_at 3.05E-02 0.64 -1.56 HOXA3 homeobox A3 3200 235521_at 1.53E-03 0.64 -1.56 CNOT6 CCR4-NOT transcription complex, subunit 6 57472 222476_at 3.83E-04 0.64 -1.56 --- Clone 24583 mRNA sequence --- 213686_at 1.29E-02 0.64 -1.56 DAZAP2 DAZ associated protein 2 9802 214334_x_at 1.55E-03 0.64 -1.56 transcription factor AP-2 alpha (activating TFAP2A enhancer binding protein 2 alpha) 7020 204653_at 6.79E-05 0.64 -1.56 SETD8 SET domain containing (lysine methyltransferase) 8 387893 220200_s_at 6.53E-04 0.64 -1.56 TOR1AIP1 torsin A interacting protein 1 26092 212408_at 3.80E-03 0.64 -1.56 HGSNAT heparan-alpha-glucosaminide N-acetyltransferase 138050 227564_at 7.30E-03 0.64 -1.55 cytochrome b5 type B (outer mitochondrial CYB5B membrane) 80777 238554_at 1.64E-04 0.64 -1.55 --- Transcribed locus --- 241950_at 2.84E-02 0.64 -1.55 FAM134A family with sequence similarity 134, member A 79137 218037_at 3.09E-03 0.64 -1.55 RNFT2 ring finger protein, transmembrane 2 84900 221908_at 6.05E-03 0.64 -1.55 NBPF1 neuroblastoma breakpoint family, member 1 55672 236273_at 2.19E-03 0.64 -1.55 TUB tubby homolog (mouse) 7275 228882_at 2.29E-02 0.64 -1.55 FLJ14213 protor-2 79899 219383_at 1.28E-03 0.64 -1.55 HPS3 Hermansky-Pudlak syndrome 3 84343 231121_at 1.06E-02 0.64 -1.55 PH domain and leucine rich repeat protein PHLPPL phosphatase-like 23035 213407_at 3.13E-02 0.65 -1.55 ZFP36L1 zinc finger protein 36, C3H type-like 1 677 211965_at 1.04E-02 0.65 -1.55 BID BH3 interacting domain death agonist 637 227143_s_at 1.20E-02 0.65 -1.55 PCGF2 polycomb group ring finger 2 7703 213551_x_at 1.86E-03 0.65 -1.55 C1orf151 chromosome 1 open reading frame 151 440574 228096_at 7.42E-03 0.65 -1.55 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNG12 gamma 12 55970 222834_s_at 3.38E-02 0.65 -1.55 C9orf125 chromosome 9 open reading frame 125 84302 224458_at 2.27E-03 0.65 -1.55 PDLIM5 PDZ and LIM domain 5 10611 203243_s_at 1.07E-02 0.65 -1.55 calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaM CAMK2D kinase) II delta 817 228555_at 2.64E-02 0.65 -1.55 LOC728769 hypothetical protein LOC728769 728769 238039_at 4.70E-03 0.65 -1.55 PNPLA4 patatin-like phospholipase domain containing 4 8228 209740_s_at 3.53E-03 0.65 -1.55 IFNAR2 interferon (alpha, beta and omega) receptor 2 3455 204786_s_at 6.35E-03 0.65 -1.55 FAM64A family with sequence similarity 64, member A 54478 221591_s_at 1.35E-02 0.65 -1.55

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Anhang

MRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE --- 898037 677778 228930_at 3.57E-02 0.65 -1.54 pleckstrin homology-like domain, family A, member PHLDA1 1 22822 217996_at 4.78E-02 0.65 -1.54 SFRS14 Splicing factor, arginine/serine-rich 14 10147 212001_at 3.33E-02 0.65 -1.54 BTB and CNC homology 1, basic leucine zipper BACH2 transcription factor 2 60468 221234_s_at 1.02E-02 0.65 -1.54 RUNX3 runt-related transcription factor 3 864 204198_s_at 2.26E-02 0.65 -1.54 MAD2L1BP MAD2L1 binding protein 9587 203094_at 1.65E-04 0.65 -1.54 --- Transcribed locus --- 225356_at 1.27E-03 0.65 -1.54 N4BP1 NEDD4 binding protein 1 9683 221867_at 1.50E-02 0.65 -1.54 --- Transcribed locus --- 235888_at 9.48E-04 0.65 -1.54 HDLBP high density lipoprotein binding protein (vigilin) 3069 222916_s_at 4.81E-03 0.65 -1.54 solute carrier family 36 (proton/amino acid SLC36A1 symporter), member 1 206358 213119_at 5.41E-03 0.65 -1.54 MOB1, Mps One Binder kinase activator-like 1B MOBKL1B (yeast) 55233 214812_s_at 4.03E-03 0.65 -1.54 IKZF4 IKAROS family zinc finger 4 (Eos) 64375 226759_at 3.36E-04 0.65 -1.54 BFSP1 beaded filament structural protein 1, filensin 631 206746_at 1.23E-02 0.65 -1.54 LYPLA1 lysophospholipase I 10434 212449_s_at 5.33E-03 0.65 -1.54 BCL7A B-cell CLL/lymphoma 7A 605 203795_s_at 1.40E-03 0.65 -1.54 FERMT1 fermitin family homolog 1 (Drosophila) 55612 60474_at 2.25E-03 0.65 -1.54 RAB40B RAB40B, member RAS oncogene family 10966 204547_at 9.09E-04 0.65 -1.54 RWDD4A RWD domain containing 4A 201965 225574_at 9.42E-04 0.65 -1.54 ZNF185 zinc finger protein 185 (LIM domain) 7739 203585_at 2.33E-02 0.65 -1.54 IQCG IQ motif containing G 84223 221185_s_at 6.00E-03 0.65 -1.54 solute carrier family 16, member 9 (monocarboxylic SLC16A9 acid transporter 9) 220963 227506_at 1.58E-03 0.65 -1.54 LOC388272 similar to RIKEN cDNA 4921524J17 388272 226608_at 4.14E-03 0.65 -1.53 PPIA peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A) 5478 226336_at 2.68E-03 0.65 -1.53 IGF1R insulin-like growth factor 1 receptor 3480 225330_at 2.66E-02 0.65 -1.53 DUSP6 dual specificity phosphatase 6 1848 208893_s_at 2.42E-02 0.65 -1.53 --- Transcribed locus --- 228955_at 2.30E-02 0.65 -1.53 NAV1 neuron navigator 1 89796 227584_at 4.76E-02 0.65 -1.53 TRIP13 thyroid hormone receptor interactor 13 9319 204033_at 4.26E-03 0.65 -1.53 C20orf11 chromosome 20 open reading frame 11 54994 225376_at 5.69E-03 0.65 -1.53 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 ATP5G2 complex, subunit C2 (subunit 9) 517 208764_s_at 1.77E-03 0.65 -1.53 v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog ETS2 2 (avian) 2114 201328_at 1.09E-03 0.65 -1.53 BBS1 Bardet-Biedl syndrome 1 10072 232510_s_at 2.65E-02 0.65 -1.53 ARHGEF9 Cdc42 guanine nucleotide exchange factor (GEF) 9 23229 203264_s_at 7.34E-03 0.65 -1.53 DOCK5 Dedicator of cytokinesis 5 80005 230263_s_at 3.70E-02 0.65 -1.53 LOC100131 hypothetical LOC100131989 --- 235360_at 3.88E-03 0.65 -1.53 989 FLOT2 flotillin 2 2319 211299_s_at 9.55E-03 0.65 -1.53 JPH2 junctophilin 2 57158 229578_at 3.13E-02 0.66 -1.53 --- Transcribed locus --- 241726_at 2.13E-02 0.66 -1.53 DTX3L deltex 3-like (Drosophila) 151636 225415_at 1.79E-03 0.66 -1.53 C14orf145 chromosome 14 open reading frame 145 145508 1557756_a_at 1.77E-02 0.66 -1.53 AACS acetoacetyl-CoA synthetase 65985 218434_s_at 1.81E-04 0.66 -1.53 --- Transcribed locus --- 241815_at 1.56E-03 0.66 -1.53 FRMD8 FERM domain containing 8 83786 227964_at 3.13E-03 0.66 -1.52 DAZAP2 DAZ associated protein 2 9802 212595_s_at 1.73E-02 0.66 -1.52 HNT neurotrimin 50863 227566_at 3.43E-02 0.66 -1.52 LOC25845 hypothetical LOC25845 25845 225458_at 3.80E-02 0.66 -1.52 LOC388272 Similar to RIKEN cDNA 4921524J17 388272 242555_at 1.48E-02 0.66 -1.52 CARHSP1 calcium regulated heat stable protein 1, 24kDa 23589 224910_at 9.59E-03 0.66 -1.52 CNPY3 canopy 3 homolog (zebrafish) 10695 1556389_at 3.22E-02 0.66 -1.52 --- Transcribed locus --- 239058_at 6.43E-04 0.66 -1.52 UBP1 upstream binding protein 1 (LBP-1a) 7342 218082_s_at 5.23E-03 0.66 -1.52 CANX calnexin 821 238034_at 1.21E-02 0.66 -1.52 amyotrophic lateral sclerosis 2 (juvenile) ALS2CR2 chromosome region, candidate 2 55437 223266_at 6.40E-04 0.66 -1.52 LASS2 LAG1 homolog, ceramide synthase 2 29956 222212_s_at 1.26E-03 0.66 -1.52 LMNB2 lamin B2 84823 216952_s_at 3.83E-03 0.66 -1.52 C3orf64 chromosome 3 open reading frame 64 285203 221935_s_at 1.70E-02 0.66 -1.52 IGSF3 immunoglobulin superfamily, member 3 3321 202421_at 3.39E-02 0.66 -1.52

148

Anhang

guanylate binding protein 1, interferon-inducible, GBP1 67kDa 2633 231577_s_at 4.69E-03 0.66 -1.52 LOC729446 hypothetical LOC729446 729446 238043_at 4.63E-03 0.66 -1.52 TNFAIP8 tumor necrosis factor, alpha-induced protein 8 25816 208296_x_at 1.18E-03 0.66 -1.52 FLOT2 flotillin 2 2319 201350_at 6.75E-04 0.66 -1.52 eukaryotic translation initiation factor 2 alpha EIF2AK4 kinase 4 440275 237145_at 5.84E-03 0.66 -1.52 Signal transducing adaptor molecule (SH3 domain STAM2 and ITAM motif) 2 10254 242569_at 3.69E-02 0.66 -1.52 --- Transcribed locus --- 235015_at 4.42E-03 0.66 -1.52 IQCK IQ motif containing K 124152 213392_at 6.97E-03 0.66 -1.52 calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaM CAMK2D kinase) II delta 817 224994_at 3.55E-02 0.66 -1.52 ZNF599 zinc finger protein 599 148103 243747_at 5.58E-04 0.66 -1.52 --- Transcribed locus --- 235581_at 2.93E-02 0.66 -1.52 SDC1 syndecan 1 6382 201286_at 4.09E-03 0.66 -1.52 POLI polymerase (DNA directed) iota 11201 238992_at 4.59E-02 0.66 -1.52 KIAA0265 KIAA0265 protein 23008 209255_at 4.55E-03 0.66 -1.52 COL4A4 collagen, type IV, alpha 4 1286 214602_at 2.22E-02 0.66 -1.52 OSBPL6 oxysterol binding protein-like 6 --- 236261_at 2.59E-02 0.66 -1.51 --- Transcribed locus --- 230795_at 5.83E-05 0.66 -1.51 RAB38 RAB38, member RAS oncogene family 23682 219412_at 1.11E-02 0.66 -1.51 RFC3 replication factor C (activator 1) 3, 38kDa 5983 204127_at 5.15E-03 0.66 -1.51 HIST1H2BH histone cluster 1, H2bh 8345 208546_x_at 3.56E-03 0.66 -1.51 ABT1 activator of basal transcription 1 29777 218405_at 4.10E-03 0.66 -1.51 HIST1H2AE histone cluster 1, H2ab 3012 214469_at 9.90E-03 0.66 -1.51 SLMAP sarcolemma associated protein 7871 222924_at 1.80E-03 0.66 -1.51 ZNRF1 zinc and ring finger 1 84937 225962_at 1.84E-02 0.66 -1.51 PACS1 phosphofurin acidic cluster sorting protein 1 55690 224658_x_at 1.55E-02 0.66 -1.51 pregnancy-associated plasma protein A, pappalysin PAPPA 1 5069 228128_x_at 1.75E-02 0.66 -1.51 ISG15 ISG15 ubiquitin-like modifier 9636 205483_s_at 7.25E-03 0.66 -1.51 phosphorylase, glycogen; liver (Hers disease, PYGL glycogen storage disease type VI) 5836 202990_at 1.91E-03 0.66 -1.51 IGF1R insulin-like growth factor 1 receptor 3480 203628_at 2.67E-02 0.66 -1.51 FZD6 frizzled homolog 6 (Drosophila) 8323 203987_at 1.35E-02 0.66 -1.51 NETO2 neuropilin (NRP) and tolloid (TLL)-like 2 81831 218888_s_at 8.16E-03 0.66 -1.51 LOC100130 hypothetical protein LOC100130536 80863 230054_at 4.21E-02 0.66 -1.51 536 TEF thyrotrophic embryonic factor 7008 225840_at 2.79E-03 0.66 -1.51 TMEM173 transmembrane protein 173 340061 224929_at 1.12E-02 0.66 -1.51 --- CDNA: FLJ23454 fis, clone HSI06959 --- 232331_at 1.66E-02 0.66 -1.51 --- Transcribed locus --- 243023_at 3.43E-02 0.66 -1.51 WDR19 WD repeat domain 19 57728 232163_at 1.16E-02 0.66 -1.51 PPM1F protein phosphatase 1F (PP2C domain containing) 9647 37384_at 2.42E-06 0.66 -1.51 FAF1 Fas (TNFRSF6) associated factor 1 11124 239749_at 2.16E-02 0.66 -1.51 NADK NAD kinase 65220 208919_s_at 7.92E-04 0.66 -1.51 phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, PAICS phosphoribosylaminoimidazole succinoca 10606 201013_s_at 4.72E-03 0.66 -1.51 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNA11 alpha 11 (Gq class) 2767 214679_x_at 1.35E-04 0.66 -1.51 glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D- Gcom1 aspartate-like 1A 145781 228568_at 2.59E-02 0.66 -1.51 --- Transcribed locus --- 238656_at 4.13E-02 0.66 -1.51 RGMB RGM domain family, member B 285704 227340_s_at 1.89E-02 0.66 -1.51 --- CDNA clone IMAGE:4798227 --- 242086_at 3.26E-04 0.66 -1.51 FASTK Fas-activated serine/threonine kinase 10922 202676_x_at 2.52E-06 0.66 -1.51 --- CDNA FLJ33148 fis, clone UTERU2000238 --- 238492_at 5.71E-04 0.66 -1.51 CALCOCO2 calcium binding and coiled-coil domain 2 10241 235076_at 7.87E-03 0.66 -1.51 C3orf10 chromosome 3 open reading frame 10 55845 224023_s_at 1.50E-03 0.66 -1.51 vacuolar protein sorting 36 homolog (S. VPS36 cerevisiae) 51028 222478_at 2.30E-03 0.66 -1.50 SMC1A structural maintenance of chromosomes 1A 8243 217555_at 9.54E-03 0.66 -1.50 --- CDNA FLJ34018 fis, clone FCBBF2002801 --- 225896_at 2.32E-02 0.66 -1.50 --- CDNA clone IMAGE:5500261 --- 227665_at 1.35E-02 0.66 -1.50 LOC158402 hypothetical protein LOC158402 158402 236769_at 1.57E-03 0.66 -1.50 --- CDNA FLJ33355 fis, clone BRACE2005151 --- 242389_at 3.27E-02 0.67 -1.50 STOX1 storkhead box 1 219736 229378_at 9.22E-04 0.67 -1.50 ARIH2 ariadne homolog 2 (Drosophila) 10425 227932_at 9.60E-04 0.67 -1.50

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Anhang

PRDM16 PR domain containing 16 63976 232424_at 6.72E-03 0.67 -1.50 proline-serine-threonine phosphatase interacting PSTPIP2 protein 2 9050 219938_s_at 1.83E-03 0.67 -1.50 BCAN brevican 63827 223632_s_at 1.20E-02 0.67 -1.50 --- CDNA FLJ33407 fis, clone BRACE2010535 --- 205316_at 5.87E-03 0.67 -1.50 COL21A1 collagen, type XXI, alpha 1 81578 208096_s_at 3.32E-03 1.50 1.50 --- CDNA clone IMAGE:5298411 --- 232242_at 5.60E-02 1.50 1.50 COP9 constitutive photomorphogenic homolog subunit COPS8 8 (Arabidopsis) 10920 214260_at 6.28E-02 1.51 1.51 STK38L serine/threonine kinase 38 like 23012 212572_at 7.16E-02 1.51 1.51 MAP2K6 mitogen-activated protein kinase kinase 6 5608 205699_at 3.36E-02 1.51 1.51 AP1S3 adaptor-related protein complex 1, sigma 3 subunit 130340 1555731_a_at 2.77E-01 1.51 1.51 RBM47 RNA binding motif protein 47 54502 218035_s_at 3.76E-02 1.51 1.51 CSNK1A1 casein kinase 1, alpha 1 1452 206562_s_at 1.86E-02 1.51 1.51 MCAM melanoma cell adhesion molecule 4162 209087_x_at 1.91E-03 1.51 1.51 DCBLD1 discoidin, CUB and LCCL domain containing 1 285761 226609_at 6.47E-02 1.51 1.51 serine palmitoyltransferase, long chain base SPTLC1 subunit 1 10558 202277_at 2.31E-04 1.51 1.51 --- Transcribed locus --- 241404_at 1.24E-01 1.51 1.51 RHEB Ras homolog enriched in brain 6009 201453_x_at 3.10E-02 1.52 1.52 RCAN2 regulator of calcineurin 2 10231 203498_at 1.94E-03 1.52 1.52 TMEM65 transmembrane protein 65 157378 241342_at 3.18E-03 1.52 1.52 CAP-GLY domain containing linker protein family, CLIP4 member 4 79745 226425_at 4.65E-02 1.52 1.52 FAM18B family with sequence similarity 18, member B 51030 218446_s_at 1.29E-05 1.52 1.52 PCGF5 polycomb group ring finger 5 84333 229194_at 2.48E-02 1.52 1.52 ANKRD40 ankyrin repeat domain 40 91369 227064_at 6.71E-03 1.52 1.52 MANEA mannosidase, endo-alpha 79694 219003_s_at 1.11E-02 1.52 1.52 transmembrane and tetratricopeptide repeat TMTC2 containing 2 160335 235775_at 2.68E-02 1.52 1.52 serine palmitoyltransferase, long chain base SPTLC1 subunit 1 10558 202278_s_at 7.04E-03 1.52 1.52 SCD stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase) 6319 211708_s_at 1.63E-01 1.52 1.52 FAM44A family with sequence similarity 44, member A 259282 235009_at 4.39E-01 1.52 1.52 CLASP2 cytoplasmic linker associated protein 2 23122 212308_at 1.89E-02 1.53 1.53 FAM73A family with sequence similarity 73, member A 374986 235125_x_at 5.08E-04 1.53 1.53 LRP12 low density lipoprotein-related protein 12 29967 220254_at 3.32E-02 1.53 1.53 KIAA0256 KIAA0256 gene product 9728 212450_at 2.25E-03 1.53 1.53 protein phosphatase 2 (formerly 2A), catalytic PPP2CB subunit, beta isoform 5516 201375_s_at 2.21E-02 1.53 1.53 ZNF529 Zinc finger protein 529 57711 215307_at 4.58E-02 1.53 1.53 RDH11 retinol dehydrogenase 11 (all-trans/9-cis/11-cis) 51109 217775_s_at 4.42E-03 1.53 1.53 --- Transcribed locus --- 228084_at 1.93E-02 1.53 1.53 --- CDNA FLJ33091 fis, clone TRACH2000660 --- 232687_at 4.07E-02 1.53 1.53 DICER1 dicer 1, ribonuclease type III 23405 206061_s_at 8.17E-02 1.53 1.53 GPM6B glycoprotein M6B 2824 209167_at 2.69E-01 1.53 1.53 solute carrier family 2 (facilitated glucose SLC2A13 transporter), member 13 114134 1552695_a_at 1.73E-01 1.53 1.53 FAM152A family with sequence similarity 152, member A 51029 222936_s_at 1.29E-02 1.54 1.54 CYBRD1 cytochrome b reductase 1 79901 222453_at 9.60E-03 1.54 1.54 ------237571_at 3.57E-03 1.54 1.54 RHEB Ras homolog enriched in brain 6009 213404_s_at 3.66E-02 1.54 1.54 NEU1 sialidase 1 (lysosomal sialidase) 4758 208926_at 7.03E-03 1.54 1.54 PNRC2 proline-rich nuclear receptor coactivator 2 55629 217779_s_at 4.55E-03 1.54 1.54 heat shock 70kDa protein 5 (glucose-regulated HSPA5 protein, 78kDa) 3309 230031_at 2.88E-03 1.54 1.54 NMD3 NMD3 homolog (S. cerevisiae) 51068 218036_x_at 8.52E-04 1.54 1.54 MCAM melanoma cell adhesion molecule 4162 211340_s_at 1.20E-04 1.54 1.54 IFRD1 interferon-related developmental regulator 1 3475 202147_s_at 4.40E-02 1.54 1.54 KLHL2 kelch-like 2, Mayven (Drosophila) 11275 219157_at 7.83E-04 1.55 1.55 MAP2K6 mitogen-activated protein kinase kinase 6 5608 205698_s_at 3.91E-02 1.55 1.55 Transmembrane and tetratricopeptide repeat TMTC2 containing 2 160335 228574_at 5.95E-04 1.55 1.55 RWDD2B RWD domain containing 2B 10069 222614_at 6.16E-03 1.55 1.55 SEC24 related gene family, member A (S. SEC24A cerevisiae) 10802 212900_at 9.92E-03 1.55 1.55 LCP1 lymphocyte cytosolic protein 1 (L-plastin) 3936 208885_at 3.61E-02 1.55 1.55 RC3H2 ring finger and CCCH-type zinc finger domains 2 54542 238421_at 3.13E-02 1.55 1.55 FILIP1 filamin A interacting protein 1 27145 231945_at 5.54E-04 1.56 1.56

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Anhang

TMEM100 transmembrane protein 100 55273 219230_at 8.07E-03 1.56 1.56 SMPDL3A sphingomyelin phosphodiesterase, acid-like 3A 10924 213624_at 7.84E-04 1.56 1.56 CSNK1A1 casein kinase 1, alpha 1 1452 213086_s_at 5.40E-03 1.56 1.56 RPAP3 RNA polymerase II associated protein 3 79657 1557984_s_at 3.23E-02 1.56 1.56 --- Transcribed locus --- 225950_at 4.13E-02 1.56 1.56 DLAT dihydrolipoamide S-acetyltransferase 1737 213149_at 2.37E-02 1.56 1.56 LOC387763 hypothetical LOC387763 387763 227099_s_at 6.90E-02 1.56 1.56 HK2 hexokinase 2 3099 202934_at 7.35E-02 1.56 1.56 BMP2K BMP2 inducible kinase 55589 226853_at 3.88E-02 1.56 1.56 Transmembrane emp24 protein transport domain TMED5 containing 5 50999 242263_at 6.19E-03 1.56 1.56 MBNL2 muscleblind-like 2 (Drosophila) 10150 205018_s_at 5.48E-02 1.56 1.56 FGD6 FYVE, RhoGEF and PH domain containing 6 55785 219901_at 3.83E-02 1.56 1.56 EIF5A2 eukaryotic translation initiation factor 5A2 56648 235296_at 4.43E-02 1.57 1.57 ZBTB41 zinc finger and BTB domain containing 41 360023 226962_at 5.28E-03 1.57 1.57 KCNK1 potassium channel, subfamily K, member 1 3775 204679_at 2.54E-02 1.57 1.57 MCAM melanoma cell adhesion molecule 4162 210869_s_at 5.37E-02 1.57 1.57 --- CDNA FLJ39602 fis, clone SKNSH2005061 --- 226550_at 1.80E-03 1.57 1.57 RC3H2 ring finger and CCCH-type zinc finger domains 2 54542 225813_at 2.58E-04 1.57 1.57 CDH1 cadherin 1, type 1, E-cadherin (epithelial) 999 201131_s_at 3.91E-02 1.58 1.58 CLNS1A chloride channel, nucleotide-sensitive, 1A 1207 209143_s_at 9.38E-02 1.58 1.58 LRP12 low density lipoprotein-related protein 12 29967 220253_s_at 4.79E-03 1.58 1.58 Protein geranylgeranyltransferase type I, beta PGGT1B subunit 5229 242844_at 1.02E-02 1.58 1.58 TK1 thymidine kinase 1, soluble 7083 202338_at 1.71E-03 1.58 1.58 PDK4 pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4 5166 225207_at 2.10E-01 1.58 1.58 IL1RAP interleukin 1 receptor accessory protein 3556 205227_at 2.30E-02 1.58 1.58 ERO1LB ERO1-like beta (S. cerevisiae) 56605 231944_at 1.77E-02 1.58 1.58 KLHL28 kelch-like 28 (Drosophila) 54813 235727_at 2.73E-03 1.58 1.58 GABRB1 gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, beta 1 2560 207010_at 4.22E-02 1.59 1.59 glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2 GPD2 (mitochondrial) 2820 225447_at 9.07E-02 1.59 1.59 small glutamine-rich tetratricopeptide repeat SGTB (TPR)-containing, beta 54557 228745_at 9.11E-04 1.59 1.59 solute carrier family 7, (cationic amino acid SLC7A11 transporter, y+ system) member 11 23657 209921_at 1.32E-01 1.59 1.59 UNKL unkempt homolog (Drosophila)-like 64718 229908_s_at 1.46E-02 1.59 1.59 MAPK8 mitogen-activated protein kinase 8 5599 226048_at 1.57E-02 1.59 1.59 SCD stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase) 6319 211162_x_at 1.17E-01 1.59 1.59 --- Transcribed locus --- 241699_at 1.93E-02 1.59 1.59 solute carrier family 40 (iron-regulated SLC40A1 transporter), member 1 30061 223044_at 6.89E-02 1.59 1.59 EGF epidermal growth factor (beta-urogastrone) 1950 206254_at 8.48E-04 1.60 1.60 SFTPH surfactant associated protein H 253970 228979_at 8.24E-02 1.60 1.60 --- CDNA FLJ39602 fis, clone SKNSH2005061 --- 1558105_a_at 8.79E-03 1.60 1.60 SPPL2A signal peptide peptidase-like 2A 84888 226353_at 2.24E-04 1.60 1.60 TK1 thymidine kinase 1, soluble 7083 1554408_a_at 1.17E-02 1.61 1.61 RNF13 ring finger protein 13 11342 201779_s_at 3.13E-04 1.61 1.61 GCLM glutamate-cysteine ligase, modifier subunit 2730 236140_at 6.37E-03 1.61 1.61 FGF7 fibroblast growth factor 7 2252 1554741_s_at 2.66E-03 1.61 1.61 STK38L serine/threonine kinase 38 like 23012 212565_at 4.05E-02 1.61 1.61 SEC24 related gene family, member A (S. SEC24A cerevisiae) 10802 244841_at 1.15E-02 1.61 1.61 RDH11 retinol dehydrogenase 11 (all-trans/9-cis/11-cis) 51109 217776_at 4.48E-03 1.61 1.61 FGF2 fibroblast growth factor 2 (basic) 2247 204422_s_at 2.46E-02 1.61 1.61 KCNK1 potassium channel, subfamily K, member 1 3775 204678_s_at 4.19E-02 1.61 1.61 --- Transcribed locus --- 228603_at 6.14E-03 1.62 1.62 RHEB Ras homolog enriched in brain 6009 201452_at 1.25E-01 1.62 1.62 INHBE inhibin, beta E 83729 210587_at 2.41E-01 1.62 1.62 synaptosomal-associated protein, 91kDa homolog SNAP91 (mouse) 9892 204953_at 7.02E-03 1.62 1.62 MIPOL1 mirror-image polydactyly 1 145282 244246_at 4.67E-02 1.62 1.62 solute carrier family 4, sodium bicarbonate SLC4A4 cotransporter, member 4 8671 203908_at 1.16E-01 1.62 1.62 --- CDNA FLJ30669 fis, clone FCBBF1000684 --- 230764_at 2.23E-02 1.62 1.62 RNF13 ring finger protein 13 11342 201780_s_at 1.10E-03 1.62 1.62 MBNL2 muscleblind-like 2 (Drosophila) 10150 203640_at 1.64E-03 1.63 1.63 ANKRD43 ankyrin repeat domain 43 134548 230238_at 1.03E-02 1.63 1.63

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Anhang

solute carrier family 4, sodium bicarbonate SLC4A7 cotransporter, member 7 9497 207604_s_at 3.40E-02 1.63 1.63 ANXA1 annexin A1 301 201012_at 1.54E-02 1.63 1.63 --- Transcribed locus --- 235585_at 3.31E-04 1.63 1.63 SPTBN1 spectrin, beta, non-erythrocytic 1 6711 226342_at 4.95E-03 1.64 1.64 FAM3C family with sequence similarity 3, member C 10447 201889_at 2.42E-04 1.64 1.64 --- Clone 25028 mRNA sequence --- 227027_at 8.66E-03 1.64 1.64 C6orf120 chromosome 6 open reading frame 120 387263 221786_at 1.06E-02 1.64 1.64 TDG thymine-DNA glycosylase 6996 203743_s_at 2.12E-02 1.64 1.64 cytochrome P450, family 4, subfamily X, CYP4X1 polypeptide 1 260293 227702_at 6.96E-03 1.65 1.65 tissue factor pathway inhibitor (lipoprotein- TFPI associated coagulation inhibitor) 7035 210664_s_at 5.56E-02 1.65 1.65 elongation of very long chain fatty acids ELOVL4 (FEN1/Elo2, SUR4/Elo3, yeast)-like 4 6785 219532_at 6.89E-06 1.65 1.65 ENOPH1 enolase-phosphatase 1 58478 217956_s_at 1.72E-03 1.66 1.66 RABGAP1L RAB GTPase activating protein 1-like 9910 213982_s_at 7.51E-02 1.66 1.66 PURA purine-rich element binding protein A 5813 204020_at 7.05E-03 1.66 1.66 DICER1 dicer 1, ribonuclease type III 23405 212888_at 9.57E-03 1.67 1.67 tissue factor pathway inhibitor (lipoprotein- TFPI associated coagulation inhibitor) 7035 210665_at 3.69E-02 1.67 1.67 LONRF1 LON peptidase N-terminal domain and ring finger 1 91694 226038_at 2.06E-02 1.67 1.67 LOC492311 similar to bovine IgA regulatory protein 492311 226977_at 3.27E-02 1.67 1.67 PPID Peptidylprolyl isomerase D (cyclophilin D) 5481 228469_at 9.44E-02 1.68 1.68 ANK3 ankyrin 3, node of Ranvier (ankyrin G) 288 206385_s_at 1.73E-03 1.68 1.68 HSPB8 heat shock 22kDa protein 8 26353 221667_s_at 1.03E-02 1.68 1.68 COP9 constitutive photomorphogenic homolog subunit COPS8 8 (Arabidopsis) 10920 202142_at 3.74E-02 1.68 1.68 SLMO2 slowmo homolog 2 (Drosophila) 51012 217851_s_at 3.86E-02 1.68 1.68 cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 CRIM1 (chordin-like) 51232 202551_s_at 2.11E-03 1.69 1.69 MOXD1 monooxygenase, DBH-like 1 26002 1554474_a_at 6.48E-02 1.69 1.69 solute carrier family 7, (cationic amino acid SLC7A11 transporter, y+ system) member 11 23657 207528_s_at 2.37E-02 1.69 1.69 MAGT1 magnesium transporter 1 --- 210596_at 5.04E-02 1.69 1.69 killer cell lectin-like receptor subfamily C, KLRC1 member 1 3821 206785_s_at 8.60E-04 1.69 1.69 NCOA2 nuclear receptor coactivator 2 10499 205732_s_at 2.46E-04 1.69 1.69 COP9 constitutive photomorphogenic homolog subunit COPS8 8 (Arabidopsis) 10920 202141_s_at 5.63E-02 1.69 1.69 NAP1L1 nucleosome assembly protein 1-like 1 4673 208753_s_at 1.66E-02 1.70 1.70 protein phosphatase 3 (formerly 2B), catalytic PPP3CB subunit, beta isoform 5532 209817_at 1.05E-03 1.70 1.70 CSNK1A1 casein kinase 1, alpha 1 1452 208866_at 3.36E-04 1.70 1.70 transforming, acidic coiled-coil containing TACC1 protein 1 6867 1554690_a_at 3.72E-03 1.70 1.70 TCEAL7 transcription elongation factor A (SII)-like 7 56849 227705_at 2.65E-02 1.71 1.71 transmembrane emp24 protein transport domain TMED5 containing 5 50999 202194_at 8.93E-03 1.71 1.71 UBA3 ubiquitin-like modifier activating enzyme 3 9039 209115_at 8.52E-03 1.71 1.71 KIAA0256 KIAA0256 gene product 9728 212451_at 3.70E-02 1.71 1.71 C10orf46 chromosome 10 open reading frame 46 143384 227257_s_at 6.82E-02 1.71 1.71 MAGT1 magnesium transporter 1 728866 221553_at 4.14E-03 1.72 1.72 cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 CRIM1 (chordin-like) 51232 202552_s_at 6.82E-05 1.72 1.72 RAB21 RAB21, member RAS oncogene family 23011 203885_at 9.05E-03 1.72 1.72 RHEB Ras homolog enriched in brain 6009 1555780_a_at 1.54E-02 1.72 1.72 ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S. cerevisiae) 55102 226684_at 1.44E-02 1.72 1.72 H2AFY H2A histone family, member Y 9555 214500_at 2.43E-04 1.73 1.73 ELL2 elongation factor, RNA polymerase II, 2 22936 226982_at 1.73E-02 1.73 1.73 BCAT1 branched chain aminotransferase 1, cytosolic 586 214452_at 7.38E-02 1.73 1.73 C10orf46 chromosome 10 open reading frame 46 143384 225192_at 1.86E-02 1.73 1.73 CSNK1A1 casein kinase 1, alpha 1 1452 208867_s_at 2.08E-03 1.73 1.73 PHTF2 putative homeodomain transcription factor 2 57157 217097_s_at 3.97E-02 1.74 1.74 DEF8 differentially expressed in FDCP 8 homolog (mouse) 54849 219646_at 7.82E-03 1.74 1.74 SYTL5 synaptotagmin-like 5 --- 242093_at 3.43E-03 1.74 1.74 Cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 CRIM1 (chordin-like) 51232 228496_s_at 4.66E-04 1.75 1.75 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNB4 beta polypeptide 4 59345 223487_x_at 9.92E-03 1.75 1.75 CLDND1 claudin domain containing 1 56650 1554149_at 3.78E-03 1.75 1.75 solute carrier family 39 (zinc transporter), SLC39A10 member 10 57181 225295_at 2.49E-03 1.75 1.75 ASPH aspartate beta-hydroxylase 444 209135_at 7.76E-03 1.76 1.76

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Anhang

LOC221710 Hypothetical protein LOC221710 221710 227124_at 1.24E-03 1.77 1.77 RHEB Ras homolog enriched in brain 6009 213409_s_at 5.90E-03 1.78 1.78 UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4- B4GALT4 galactosyltransferase, polypeptide 4 8702 210540_s_at 1.03E-03 1.78 1.78 LOC493869 similar to RIKEN cDNA 2310016C16 493869 227628_at 8.65E-03 1.78 1.78 C21orf91 chromosome 21 open reading frame 91 54149 226109_at 3.63E-03 1.78 1.78 CSNK1A1 casein kinase 1, alpha 1 1452 208865_at 9.02E-03 1.78 1.78 SFXN4 sideroflexin 4 119559 229236_s_at 8.14E-03 1.79 1.79 serpin peptidase inhibitor, clade F (alpha-2 SERPINF1 antiplasmin, pigment epithelium der 5176 202283_at 1.76E-02 1.79 1.79 --- CDNA clone IMAGE:5296106 --- 1556834_at 1.95E-02 1.79 1.79 ZNF238 zinc finger protein 238 10472 212774_at 1.03E-02 1.80 1.80 guanine nucleotide binding protein (G protein), GNB4 beta polypeptide 4 59345 225710_at 3.98E-03 1.80 1.80 --- Transcribed locus --- 234986_at 2.41E-04 1.80 1.80 MAPK8 mitogen-activated protein kinase 8 5599 226046_at 2.20E-02 1.81 1.81 KLHL28 kelch-like 28 (Drosophila) 54813 228328_at 1.68E-04 1.81 1.81 MEGF10 multiple EGF-like-domains 10 84466 232523_at 1.26E-03 1.82 1.82 --- CDNA: FLJ22522 fis, clone HRC12491 --- 227095_at 3.36E-03 1.82 1.82 ZMAT3 zinc finger, matrin type 3 64393 1555609_a_at 6.54E-02 1.82 1.82 LOC493869 Similar to RIKEN cDNA 2310016C16 493869 228141_at 4.46E-04 1.82 1.82 CLDND1 claudin domain containing 1 56650 208925_at 1.02E-02 1.84 1.84 CHRNA9 cholinergic receptor, nicotinic, alpha 9 55584 221107_at 1.86E-03 1.85 1.85 NTS neurotensin 4922 206291_at 3.33E-04 1.85 1.85 SFXN4 sideroflexin 4 119559 225143_at 1.45E-02 1.86 1.86 RAB8B RAB8B, member RAS oncogene family 51762 222846_at 8.11E-02 1.87 1.87 RAB21 RAB21, member RAS oncogene family 23011 226268_at 3.76E-02 1.88 1.88 Transcribed locus, weakly similar to NP_608540.1 --- CG2839 CG2839-PA [Drosophila me --- 239329_at 2.56E-02 1.89 1.89 FAM49B family with sequence similarity 49, member B 51571 217916_s_at 1.24E-02 1.90 1.90 v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene KRAS homolog 3845 214352_s_at 2.11E-02 1.92 1.92 RAB8B RAB8B, member RAS oncogene family 51762 226633_at 2.15E-02 1.93 1.93 F2RL2 coagulation factor II (thrombin) receptor-like 2 2151 230147_at 7.60E-02 1.93 1.93 RBM24 RNA binding motif protein 24 221662 235004_at 2.86E-03 1.95 1.95 CLCN4 chloride channel 4 1183 214769_at 2.19E-03 1.96 1.96 CCL20 chemokine (C-C motif) ligand 20 6364 205476_at 5.72E-02 1.98 1.98 C8orf4 chromosome 8 open reading frame 4 56892 218541_s_at 2.32E-03 1.98 1.98 v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene KRAS homolog 3845 204009_s_at 5.43E-03 2.00 2.00 --- Transcribed locus --- 229167_at 3.34E-03 2.00 2.00 tumor necrosis factor receptor superfamily, member TNFRSF9 9 3604 207536_s_at 2.59E-02 2.01 2.01 transforming, acidic coiled-coil containing TACC1 protein 1 6867 217437_s_at 1.51E-03 2.01 2.01 KLHL15 kelch-like 15 (Drosophila) 80311 226370_at 1.99E-03 2.02 2.02 SELT selenoprotein T 51714 217811_at 1.37E-04 2.03 2.03 PHTF2 putative homeodomain transcription factor 2 57157 209780_at 8.30E-03 2.03 2.03 solute carrier family 4, sodium bicarbonate SLC4A7 cotransporter, member 7 9497 210286_s_at 6.15E-02 2.03 2.03 ADAM9 ADAM metallopeptidase domain 9 (meltrin gamma) 8754 202381_at 1.59E-02 2.04 2.04 UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N- GALNT7 acetylgalactosaminyltransferase 51809 218313_s_at 1.26E-02 2.05 2.05 NHLRC3 NHL repeat containing 3 387921 227040_at 4.78E-04 2.05 2.05 IMPACT Impact homolog (mouse) 55364 218637_at 3.81E-02 2.11 2.11 Alport syndrome, mental retardation, midface AMMECR1 hypoplasia and elliptocytosis chrom 9949 1553219_a_at 2.07E-03 2.11 2.11 tissue factor pathway inhibitor (lipoprotein- TFPI associated coagulation inhibitor) 7035 209676_at 1.26E-02 2.12 2.12 Alport syndrome, mental retardation, midface AMMECR1 hypoplasia and elliptocytosis chrom 9949 204976_s_at 3.61E-03 2.12 2.12 ASPH aspartate beta-hydroxylase 444 210896_s_at 6.45E-03 2.16 2.16 transforming, acidic coiled-coil containing TACC1 protein 1 6867 200911_s_at 1.89E-04 2.17 2.17 solute carrier family 4, sodium bicarbonate SLC4A7 cotransporter, member 7 9497 209884_s_at 2.99E-03 2.18 2.18 UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N- GALNT7 acetylgalactosaminyltransferase 51809 222587_s_at 2.38E-02 2.20 2.20 HMOX1 heme oxygenase (decycling) 1 3162 203665_at 3.73E-02 2.21 2.21 ZMAT3 zinc finger, matrin type 3 64393 219628_at 2.37E-02 2.21 2.21 ADAM9 ADAM metallopeptidase domain 9 (meltrin gamma) 8754 1555326_a_at 2.47E-02 2.22 2.22 --- CDNA clone IMAGE:5261213 --- 225725_at 2.00E-02 2.22 2.22 pentraxin-related gene, rapidly induced by IL-1 PTX3 beta 5806 206157_at 1.06E-01 2.22 2.22

153

Anhang

tissue factor pathway inhibitor (lipoprotein- TFPI associated coagulation inhibitor) 7035 213258_at 1.54E-03 2.28 2.28 --- CDNA clone IMAGE:5261213 --- 227221_at 1.95E-02 2.34 2.34 ADP-ribosylation factor-like 6 interacting protein ARL6IP1 1 23204 211935_at 1.62E-02 2.47 2.47 Alport syndrome, mental retardation, midface AMMECR1 hypoplasia and elliptocytosis chrom 9949 226421_at 1.86E-03 2.48 2.48 LUM lumican 4060 201744_s_at 1.95E-05 2.57 2.57 REEP3 receptor accessory protein 3 221035 225785_at 1.50E-04 2.68 2.68 REEP3 receptor accessory protein 3 221035 235016_at 3.28E-03 2.73 2.73 --- CDNA clone IMAGE:5261213 --- 228315_at 3.51E-02 2.75 2.75 TAC1 tachykinin, precursor 1 6863 206552_s_at 2.33E-04 2.94 2.94

8.6.2 Expressionsarray-Ergebnisse der ANOVA-Kalkulation für adulten dorsalen Cortex der Myst4-defizienten Qkfgt/gt-Maus gegen Wildtyp (p < 0.05; FC < - 1.5 or > 1.5)

FDR- Fold- Entrez Gen Vollständiger Genname Probeset ID adjusted Ratio Change Gene p-value (FC) ------1447258_at 3.52E-07 1.59E-03 -5.82 MYST histone acetyltransferase Myst4 monocytic leukemia 4 54169 1423508_at 1.01E-08 1.14E-04 -5.54 DNA segment, Chr 14, ERATO Doi 725, D14Ertd725e expressed 52524 1439980_at 2.94E-07 1.48E-03 -4.91 Ctxn3 cortexin 3 629147 1438059_at 6.79E-09 1.02E-04 -3.68 Myl1 myosin, light polypeptide 1 17901 1452651_a_at 2.12E-05 4.35E-02 -2.66 aminolevulinic acid synthase 2, Alas2 erythroid 11656 1451675_a_at 3.85E-02 1.00E+00 -2.52 6030427F01Rik RIKEN cDNA 6030427F01 gene 97411 1458931_at 3.63E-02 1.00E+00 -2.38 Ugt8a UDP galactosyltransferase 8A 22239 1419064_a_at 2.87E-03 9.66E-01 -2.31 Gpr103 G protein-coupled receptor 103 229214 1457048_at 1.27E-05 2.72E-02 -2.31 9030218A15Rik RIKEN cDNA 9030218A15 gene 77662 1432790_at 2.89E-02 1.00E+00 -2.28 Rab40c Rab40c, member RAS oncogene family 224624 1424332_at 1.58E-02 1.00E+00 -2.22 leucine-rich repeat LGI family, Lgi3 member 3 213469 1436238_at 1.46E-03 6.84E-01 -2.14 Cd24a CD24a antigen 12484 1416034_at 2.62E-03 9.61E-01 -2.08 Rorb RAR-related orphan receptor beta 225998 1425162_at 4.24E-02 1.00E+00 -2.03 4931433A01Rik RIKEN cDNA 4931433A01 gene 78933 1438158_at 3.48E-04 2.75E-01 -2.00 2900073C17Rik RIKEN cDNA 2900073C17 gene 73020 1454301_at 4.80E-03 1.00E+00 -1.98 gamma-aminobutyric acid (GABA-A) Gabra3 receptor, subunit alpha 3 14396 1421263_at 1.07E-03 5.62E-01 -1.98 6430550H21Rik RIKEN cDNA 6430550H21 gene 245386 1437137_at 2.43E-02 1.00E+00 -1.97 potassium voltage-gated channel, Kcna2 shaker-related subfamily, member 2 16490 1422197_at 2.67E-04 2.33E-01 -1.97 Hrasls HRAS-like suppressor 27281 1422919_at 2.36E-02 1.00E+00 -1.95 4833410I11Rik RIKEN cDNA 4833410I11 gene 74612 1432836_at 9.32E-05 1.26E-01 -1.92 Transcribed locus, weakly similar to --- XP_001474741.1 PREDICTED: --- 1446809_at 8.38E-05 1.18E-01 -1.91 hypothetical prot --- Transcribed locus --- 1447473_at 4.92E-02 1.00E+00 -1.90 Etv5 ets variant gene 5 104156 1420998_at 8.42E-03 1.00E+00 -1.89 EGF-like repeats and discoidin I- Edil3 like domains 3 13612 1425622_at 6.23E-03 1.00E+00 -1.87 glial cell line derived neurotrophic Gfra2 factor family receptor alpha 2 14586 1423007_a_at 1.05E-04 1.32E-01 -1.86 interferon induced with helicase C Ifih1 domain 1 71586 1426276_at 4.55E-03 1.00E+00 -1.86 --- Transcribed locus --- 1457137_at 1.57E-06 5.43E-03 -1.84 Olfml1 olfactomedin-like 1 244198 1455663_at 9.70E-03 1.00E+00 -1.84 Opa1 optic atrophy 1 homolog (human) 100046 1418768_at 1.18E-02 1.00E+00 -1.83 zinc finger and BTB domain Zbtb43 containing 43 71834 1431127_at 6.90E-03 1.00E+00 -1.81 Foxn3 forkhead box N3 71375 1453094_at 3.07E-03 9.87E-01 -1.80 Pde10a phosphodiesterase 10A 23984 1419389_at 1.02E-02 1.00E+00 -1.77 --- Transcribed locus --- 1443268_at 1.25E-04 1.49E-01 -1.77 transforming, acidic coiled-coil Tacc1 containing protein 1 320165 1429591_at 4.91E-02 1.00E+00 -1.77 potassium voltage-gated channel, Kcnab1 shaker-related subfamily, beta 16497 1454043_a_at 2.57E-02 1.00E+00 -1.76 member 1 Metal response element binding Mtf2 transcription factor 2 17765 1445151_at 2.20E-04 2.06E-01 -1.76

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Anhang

Rnf39 Ring finger protein 39 386454 1441793_at 1.19E-02 1.00E+00 -1.76 Coro1c coronin, actin binding protein 1C 23790 1417752_at 1.72E-02 1.00E+00 -1.75 Pcnx pecanex homolog (Drosophila) 54604 1419049_at 3.26E-03 1.00E+00 -1.74 Syt1 synaptotagmin I 20979 1421990_at 4.94E-02 1.00E+00 -1.74 similar to T-cell receptor beta-2 LOC665506 chain C region 665506 1425854_x_at 1.25E-05 2.72E-02 -1.74 myelin-associated oligodendrocytic Mobp basic protein 17433 1450088_a_at 4.13E-02 1.00E+00 -1.73 collagen, type IV, alpha 3 Col4a3bp (Goodpasture antigen) binding 68018 1420383_a_at 1.71E-02 1.00E+00 -1.71 protein Il12a interleukin 12a 16159 1425454_a_at 1.15E-04 1.40E-01 -1.70 Transcribed locus, strongly similar --- to NP_080291.1 zinc finger, matrin --- 1436141_at 5.61E-04 3.72E-01 -1.69 type 5 [M B930006L02Rik RIKEN cDNA B930006L02 gene 319604 1454950_at 4.19E-05 6.99E-02 -1.68 PRP40 pre-mRNA processing factor 40 Prpf40a homolog A (yeast) 56194 1420917_at 1.34E-02 1.00E+00 -1.68 proteoglycan 4 (megakaryocyte Prg4 stimulating factor, articular 96875 1449824_at 3.17E-02 1.00E+00 -1.67 superficial zone pro Tnnt2 troponin T2, cardiac 21956 1424967_x_at 1.47E-02 1.00E+00 -1.67 E130009J12Rik RIKEN cDNA E130009J12 gene 381107 1439575_at 4.90E-04 3.40E-01 -1.67 Slc25a27 solute carrier family 25, member 27 74011 1454230_a_at 1.39E-02 1.00E+00 -1.65 protein phosphatase 3, regulatory Ppp3r1 subunit B, alpha isoform 19058 1450368_a_at 1.66E-02 1.00E+00 -1.64 (calcineurin B, type nuclear factor, erythroid derived 2, Nfe2l3 like 3 18025 1417520_at 9.46E-03 1.00E+00 -1.64 Ufsp1 UFM1-specific peptidase 1 70240 1447822_x_at 3.74E-04 2.81E-01 -1.63 inner membrane protein, Immt mitochondrial 76614 1429533_at 1.42E-02 1.00E+00 -1.63 transmembrane and tetratricopeptide Tmtc4 repeat containing 4 70551 1432360_a_at 1.90E-02 1.00E+00 -1.63 Pxmp4 peroxisomal membrane protein 4 59038 1422780_at 3.29E-02 1.00E+00 -1.63 Cd24a CD24a antigen 12484 1448182_a_at 2.46E-02 1.00E+00 -1.63 myosin, heavy polypeptide 1, Myh1 skeletal muscle, adult 17879 1427520_a_at 3.55E-02 1.00E+00 -1.63 5730414N17Rik RIKEN cDNA 5730414N17 gene 70524 1429899_at 2.03E-03 8.56E-01 -1.62 Pcdh9 protocadherin 9 211712 1458269_at 1.07E-02 1.00E+00 -1.62 prostaglandin E receptor 3 (subtype Ptger3 EP3) 19218 1450344_a_at 9.32E-03 1.00E+00 -1.62 calcium regulated heat stable Carhsp1 protein 1 100046 1415976_a_at 1.01E-02 1.00E+00 -1.62 Klhdc8a kelch domain containing 8A 213417 1441940_x_at 6.96E-03 1.00E+00 -1.61 progesterone immunomodulatory Pibf1 binding factor 1 52023 1430698_a_at 2.75E-02 1.00E+00 -1.61 pyridoxal-dependent decarboxylase Pdxdc1 domain containing 1 94184 1436372_a_at 1.81E-02 1.00E+00 -1.61 mitogen-activated protein kinase Map2k5 kinase 5 23938 1453712_a_at 3.79E-02 1.00E+00 -1.60 --- Transcribed locus --- 1456781_at 4.77E-02 1.00E+00 -1.60 --- Transcribed locus --- 1444238_at 1.36E-04 1.56E-01 -1.60 Ranbp3l RAN binding protein 3-like 223332 1455707_at 2.44E-02 1.00E+00 -1.60 Epb4.1l2 erythrocyte protein band 4.1-like 2 13822 1433492_at 5.39E-04 3.68E-01 -1.60 Sprn shadow of prion protein 212518 1459019_at 2.63E-02 1.00E+00 -1.59 pleckstrin homology domain Plekha7 containing, family A member 7 233765 1455343_at 3.60E-02 1.00E+00 -1.59 Frmd4b FERM domain containing 4B 232288 1426594_at 2.95E-02 1.00E+00 -1.59 tumor necrosis factor (ligand) Tnfsf12 superfamily, member 12 100048 1452440_at 1.82E-06 5.87E-03 -1.59 Zfp296 zinc finger protein 296 63872 1449231_at 4.19E-07 1.72E-03 -1.58 Ifngr2 interferon gamma receptor 2 15980 1423557_at 2.97E-02 1.00E+00 -1.58 leukotriene B4 12- Ltb4dh hydroxydehydrogenase 67103 1417777_at 4.90E-02 1.00E+00 -1.58 ------1459834_x_at 1.40E-02 1.00E+00 -1.58 major histocompatibility complex, Mr1 class I-related 15064 1421899_a_at 2.25E-02 1.00E+00 -1.57 ------1449781_at 2.14E-03 8.66E-01 -1.57 Serinc1 serine incorporator 1 56442 1437513_a_at 4.09E-02 1.00E+00 -1.57 Dtna dystrobrevin alpha 13527 1419223_a_at 1.65E-02 1.00E+00 -1.56 transducin-like enhancer of split 6, Tle6 homolog of Drosophila E(spl) 114606 1448727_at 7.93E-03 1.00E+00 -1.56 ------1457847_at 3.60E-02 1.00E+00 -1.55 Gm967 gene model 967, (NCBI) 381217 1447475_at 8.99E-03 1.00E+00 -1.55 Rab3c RAB3C, member RAS oncogene family 100044 1449494_at 1.14E-02 1.00E+00 -1.55 potassium voltage-gated channel, Kcnq3 subfamily Q, member 3 110862 1458421_at 2.12E-03 8.66E-01 -1.54 4930429B21Rik RIKEN cDNA 4930429B21 gene 67576 1420580_at 2.71E-03 9.65E-01 -1.54 1110051M20Rik RIKEN cDNA 1110051M20 gene 228356 1447229_x_at 1.12E-02 1.00E+00 -1.54

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Anhang

cholinergic receptor, nicotinic, Chrna6 alpha polypeptide 6 11440 1450427_at 2.23E-04 2.06E-01 -1.53 ------1457483_at 1.05E-02 1.00E+00 -1.52 CDC14 cell division cycle 14 homolog Cdc14a A (S. cerevisiae) 229776 1436913_at 3.62E-02 1.00E+00 -1.52 Nkrf NF-kappaB repressing factor 77286 1441325_at 1.34E-02 1.00E+00 -1.52 --- Transcribed locus --- 1440550_at 1.92E-03 8.25E-01 -1.52 progesterone immunomodulatory Pibf1 binding factor 1 52023 1431618_a_at 9.99E-03 1.00E+00 -1.52 RAS-like, estrogen-regulated, Rerg growth-inhibitor 232441 1451236_at 1.50E-02 1.00E+00 -1.51 EG331480 predicted gene, EG331480 331480 1440060_at 4.27E-03 1.00E+00 -1.51 Apol11b apolipoprotein L 11b 328563 1457307_at 2.01E-02 1.00E+00 -1.51 Cenpa centromere protein A 12615 1450842_a_at 1.03E-02 1.00E+00 -1.51 solute carrier family 39 (metal ion Slc39a6 transporter), member 6 106957 1447893_x_at 3.89E-02 1.00E+00 -1.51 protein phosphatase 1D magnesium- Ppm1d dependent, delta isoform 53892 1449092_at 4.34E-02 1.00E+00 -1.51 transcription elongation factor A Tcea2 (SII), 2 21400 1440791_x_at 1.07E-02 1.00E+00 -1.51 Cln8 ceroid-lipofuscinosis, neuronal 8 26889 1455745_at 9.16E-03 1.00E+00 -1.50 Ankrd10 ankyrin repeat domain 10 102334 1429304_at 2.28E-02 1.00E+00 -1.49 4930524O07Rik RIKEN cDNA 4930524O07 gene 406209 1439134_s_at 1.72E-04 1.85E-01 -1.49 Numbl numb-like 18223 1416491_at 3.52E-03 1.00E+00 1.50 bone morphogenetic protein receptor, Bmpr1a type 1A 12166 1425493_at 9.54E-02 1.00E+00 1.50 Padi2 peptidyl arginine deiminase, type II 18600 1418252_at 4.54E-02 1.00E+00 1.50 --- Transcribed locus --- 1438880_at 3.91E-03 1.00E+00 1.50 wingless related MMTV integration Wnt10a site 10a 22409 1460657_at 1.69E-02 1.00E+00 1.50 St5 suppression of tumorigenicity 5 76954 1428372_at 4.76E-02 1.00E+00 1.50 --- Transcribed locus --- 1439678_at 2.78E-02 1.00E+00 1.50 --- Transcribed locus --- 1444069_at 1.81E-02 1.00E+00 1.50 interferon (alpha and beta) receptor Ifnar2 2 15976 1440169_x_at 9.00E-03 1.00E+00 1.50 --- Transcribed locus --- 1443075_at 2.36E-02 1.00E+00 1.50 OTTMUSG000000 predicted gene, OTTMUSG00000010657 666532 1451477_at 1.69E-04 1.85E-01 1.50 10657 Gigyf2 GRB10 interacting GYF protein 2 227331 1451397_at 4.64E-02 1.00E+00 1.50 actin binding LIM protein family, Ablim3 member 3 319713 1434013_at 4.15E-02 1.00E+00 1.51 ------1446504_at 4.27E-02 1.00E+00 1.51 A230071A22Rik RIKEN cDNA A230071A22 gene 320380 1442168_at 2.43E-02 1.00E+00 1.51 Gpc6 glypican 6 23888 1441438_at 2.13E-03 8.66E-01 1.51 Rho guanine nucleotide exchange Arhgef1 factor (GEF) 1 16801 1421164_a_at 7.32E-02 1.00E+00 1.51 SPARC related modular calcium Smoc2 binding 2 64074 1415935_at 6.52E-02 1.00E+00 1.51 cystathionase (cystathionine gamma- Cth lyase) 107869 1426243_at 3.34E-02 1.00E+00 1.51 --- Transcribed locus --- 1440563_at 1.03E-01 1.00E+00 1.51 ------1440650_at 5.84E-02 1.00E+00 1.51 --- Transcribed locus --- 1435858_at 3.63E-02 1.00E+00 1.51 Transcribed locus, strongly similar --- to NP_002237.1 potassium channel, --- 1456813_at 9.22E-03 1.00E+00 1.51 subfamily protein tyrosine phosphatase, non- Ptpn11 receptor type 11 19247 1427699_a_at 3.66E-02 1.00E+00 1.52 Spag5 sperm associated antigen 5 54141 1433892_at 1.06E-02 1.00E+00 1.52 --- Transcribed locus --- 1456979_at 1.01E-01 1.00E+00 1.52 Hr hairless 15460 1435950_at 2.92E-02 1.00E+00 1.52 ------1459388_at 1.17E-02 1.00E+00 1.52 glutamate receptor, ionotropic, Grin2c NMDA2C (epsilon 3) 14813 1449245_at 4.26E-02 1.00E+00 1.52 glucocorticoid modulatory element Gmeb2 binding protein 2 229004 1454818_at 6.39E-02 1.00E+00 1.52 Klhl20 kelch-like 20 (Drosophila) 226541 1454994_at 1.50E-02 1.00E+00 1.52 Plxnb2 plexin B2 140570 1416683_at 3.34E-03 1.00E+00 1.52 SPARC related modular calcium Smoc2 binding 2 64074 1431362_a_at 3.35E-02 1.00E+00 1.53 Morn1 MORN repeat containing 1 76866 1433180_at 6.42E-02 1.00E+00 1.53 thyrotropin releasing hormone Trhr receptor 22045 1449571_at 7.41E-02 1.00E+00 1.53 Jun Jun oncogene 16476 1417409_at 3.84E-02 1.00E+00 1.53 2900076A13Rik RIKEN cDNA 2900076A13 gene 73002 1458869_at 4.94E-02 1.00E+00 1.53 --- Transcribed locus --- 1445204_at 5.03E-02 1.00E+00 1.53 Tekt1 tektin 1 21689 1432075_a_at 1.97E-02 1.00E+00 1.53

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potassium voltage-gated channel, Kcna6 shaker-related, subfamily, member 6 16494 1456954_at 6.39E-02 1.00E+00 1.53 dishevelled associated activator of Daam2 morphogenesis 2 76441 1430247_at 2.21E-03 8.80E-01 1.53 Ckap4 cytoskeleton-associated protein 4 216197 1452181_at 2.47E-03 9.34E-01 1.53 Cbp/p300-interacting transactivator, Cited2 with Glu/Asp-rich carboxy-terminal 17684 1421267_a_at 2.51E-02 1.00E+00 1.53 domain, N4bp2 NEDD4 binding protein 2 333789 1434394_at 4.19E-02 1.00E+00 1.53 Actin related protein 2/3 complex, Arpc2 subunit 2 76709 1442295_at 4.72E-02 1.00E+00 1.54 Sh3rf1 SH3 domain containing ring finger 1 59009 1421271_at 3.27E-02 1.00E+00 1.54 Tuba8 tubulin, alpha 8 53857 1446771_at 7.64E-02 1.00E+00 1.54 1300012G16Rik RIKEN cDNA 1300012G16 gene 71772 1423426_at 1.85E-02 1.00E+00 1.54 --- Transcribed locus --- 1440621_at 2.78E-02 1.00E+00 1.54 activated leukocyte cell adhesion Alcam molecule 11658 1443086_at 6.94E-02 1.00E+00 1.54 Itch itchy, E3 ubiquitin protein ligase 16396 1431316_at 2.78E-02 1.00E+00 1.54 Cgnl1 cingulin-like 1 68178 1452309_at 6.24E-02 1.00E+00 1.54 Vps39 vacuolar protein sorting 39 (yeast) 269338 1425474_a_at 9.46E-05 1.26E-01 1.54 Bat2 HLA-B associated transcript 2 53761 1422799_at 7.02E-03 1.00E+00 1.55 6030400A10Rik RIKEN cDNA 6030400A10 gene 77069 1433203_at 4.26E-02 1.00E+00 1.55 ------1456717_at 9.67E-02 1.00E+00 1.55 Itgb5 integrin beta 5 16419 1417533_a_at 6.56E-03 1.00E+00 1.55 Flt1 FMS-like tyrosine kinase 1 14254 1440926_at 7.39E-02 1.00E+00 1.55 disabled homolog 2 (Drosophila) Dab2ip interacting protein 69601 1441170_a_at 7.04E-03 1.00E+00 1.55 N-acylsphingosine amidohydrolase 3- Asah3l like 230379 1451355_at 2.32E-02 1.00E+00 1.55 ------1445338_at 5.63E-02 1.00E+00 1.56 --- Transcribed locus --- 1442622_at 4.83E-02 1.00E+00 1.56 pre B-cell leukemia transcription Pbx2 factor 2 18515 1418894_s_at 1.83E-02 1.00E+00 1.56 Gpr153 G protein-coupled receptor 153 100129 1426973_at 2.78E-03 9.65E-01 1.56 --- Transcribed locus --- 1443095_at 6.81E-02 1.00E+00 1.56 2610024B07Rik RIKEN cDNA 2610024B07 gene 269987 1429556_at 4.87E-02 1.00E+00 1.56 Zmym6 zinc finger, MYM-type 6 100177 1434193_at 3.48E-03 1.00E+00 1.57 --- Transcribed locus --- 1439236_at 4.40E-02 1.00E+00 1.57 Cdc2-related kinase, Crkrs arginine/serine-rich 69131 1438831_at 5.86E-03 1.00E+00 1.57 Scel sciellin 64929 1422837_at 1.42E-02 1.00E+00 1.57 D930050J11 hypothetical D930050J11 414326 1457484_at 5.90E-04 3.85E-01 1.57 --- Transcribed locus --- 1455624_at 9.81E-02 1.00E+00 1.58 Bcl2l11 BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) 12125 1456005_a_at 5.28E-02 1.00E+00 1.58 Unc5a unc-5 homolog A (C. elegans) 107448 1434095_at 3.20E-02 1.00E+00 1.58 C79242 expressed sequence C79242 98068 1442494_at 7.85E-02 1.00E+00 1.58 Nav2 neuron navigator 2 78286 1441353_at 1.35E-02 1.00E+00 1.58 ------1442593_at 8.11E-03 1.00E+00 1.58 glutamate receptor, ionotropic, Grid2 delta 2 14804 1421436_at 6.82E-03 1.00E+00 1.59 Flt1 FMS-like tyrosine kinase 1 14254 1454037_a_at 3.19E-02 1.00E+00 1.59 Zfhx4 zinc finger homeodomain 4 80892 1421433_at 1.00E-01 1.00E+00 1.59 Transcribed locus, strongly similar --- to NP_009049.2 triple functional --- 1446593_at 4.74E-02 1.00E+00 1.59 domain (PTP Pcdhb15 protocadherin beta 15 93886 1443421_s_at 4.37E-03 1.00E+00 1.60 ------1447204_at ? 1.23E-07 1.60 v-maf musculoaponeurotic Mafg fibrosarcoma oncogene family, 17134 1448916_at 2.06E-04 2.06E-01 1.60 protein G (avian) eukaryotic elongation factor-2 Eef2k kinase 13631 1449013_at 1.58E-02 1.00E+00 1.60 phorbol-12-myristate-13-acetate- Pmaip1 induced protein 1 58801 1418203_at 6.64E-03 1.00E+00 1.60 cytochrome c oxidase, subunit VI a, Cox6a2 polypeptide 2 12862 1417607_at 9.88E-04 5.44E-01 1.60 Col23a1 collagen, type XXIII, alpha 1 237759 1440911_at 1.60E-02 1.00E+00 1.60 ------X00686_M_at 8.89E-02 1.00E+00 1.60 membrane-associated ring finger March2 (C3HC4) 2 224703 1439540_at 1.46E-02 1.00E+00 1.61 6430537K16Rik RIKEN cDNA 6430537K16 gene 320480 1438878_at 7.66E-02 1.00E+00 1.61 ENSMUSG000000 100038 predicted gene, ENSMUSG00000074462 1444174_at 2.27E-02 1.00E+00 1.61 74462 748 Rad18 RAD18 homolog (S. cerevisiae) 58186 1443954_at 3.85E-02 1.00E+00 1.61 Pik3r6 phosphoinositide-3-kinase, 104709 1437956_at 4.10E-03 1.00E+00 1.61

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Anhang

regulatory subunit 6 Flna filamin, alpha 192176 1426677_at 1.65E-02 1.00E+00 1.61 Neurl neuralized-like homolog (Drosophila) 18011 1456854_at 4.53E-02 1.00E+00 1.61 Dpp6 dipeptidylpeptidase 6 13483 1439748_at 6.60E-02 1.00E+00 1.61 Rhoc ras homolog gene family, member C 11853 1448605_at 4.54E-02 1.00E+00 1.61 solute carrier family 4 (anion Slc4a2 exchanger), member 2 20535 1416637_at 3.16E-02 1.00E+00 1.62 AI853363 expressed sequence AI853363 98471 1442887_at 4.15E-03 1.00E+00 1.62 Mapt microtubule-associated protein tau 17762 1455028_at 7.94E-02 1.00E+00 1.62 adaptor-related protein complex 1, Ap1s2 sigma 2 subunit 108012 1460036_at 2.24E-02 1.00E+00 1.62 guanine nucleotide binding protein Gnb4 (G protein), beta 4 14696 1419469_at 1.57E-02 1.00E+00 1.62 ------1443335_at 6.88E-06 1.83E-02 1.62 ------1440033_at 5.38E-02 1.00E+00 1.62 Epb4.1 erythrocyte protein band 4.1 269587 1444150_at 1.99E-02 1.00E+00 1.62 5-hydroxytryptamine (serotonin) Htr7 receptor 7 15566 1435332_at 2.01E-02 1.00E+00 1.62 Coro1a coronin, actin binding protein 1A 12721 1435288_at 1.46E-03 6.84E-01 1.63 Doc2b double C2, beta 13447 1420667_at 4.68E-02 1.00E+00 1.63 Wdr90 WD repeat domain 90 106618 1426767_at 3.13E-02 1.00E+00 1.63 Rgs6 regulator of G-protein signaling 6 50779 1452399_at 1.88E-02 1.00E+00 1.63 Tuba8 tubulin, alpha 8 53857 1419518_at 2.18E-02 1.00E+00 1.63 Tbc1d1 TBC1 domain family, member 1 57915 1447016_at 8.31E-02 1.00E+00 1.63 inositol polyphosphate-5-phosphatase Inpp5a A 212111 1433605_at 1.38E-03 6.78E-01 1.63 calcium channel, voltage-dependent, Cacna2d1 alpha2/delta subunit 1 12293 1441608_at 8.16E-02 1.00E+00 1.64 Plxna3 plexin A3 18846 1420996_at 2.14E-02 1.00E+00 1.64 A630057N01Rik RIKEN cDNA A630057N01 gene 320057 1456345_at 9.40E-02 1.00E+00 1.65 ------1440052_at 2.40E-02 1.00E+00 1.65 glutamate receptor, ionotropic, Grik5 kainate 5 (gamma 2) 14809 1418784_at 1.89E-02 1.00E+00 1.65 Transcribed locus, moderately --- similar to NP_571986.1 acidic --- 1441666_at 7.31E-07 2.75E-03 1.65 nuclear phosphoprote Zfp438 zinc finger protein 438 240186 1457059_at 4.38E-02 1.00E+00 1.65 --- Transcribed locus --- 1446150_at 9.40E-02 1.00E+00 1.65 ------1447580_at 2.07E-02 1.00E+00 1.65 Sfmbt2 Scm-like with four mbt domains 2 353282 1434353_at 1.17E-02 1.00E+00 1.66 phosphatidylinositol-4-phosphate 5- Pip5k1b kinase, type 1 beta 18719 1421834_at 5.59E-02 1.00E+00 1.66 Antxr1 anthrax toxin receptor 1 69538 1431995_at 2.73E-04 2.33E-01 1.66 special AT-rich sequence binding Satb1 protein 1 20230 1439449_at 1.07E-02 1.00E+00 1.66 Lmna lamin A 16905 1457670_s_at 2.47E-02 1.00E+00 1.66 D430042O09Rik RIKEN cDNA D430042O09 gene 233865 1435366_at 5.31E-02 1.00E+00 1.67 4932441J04Rik RIKEN cDNA 4932441J04 gene 319216 1436563_at 2.61E-02 1.00E+00 1.67 Tln1 talin 1 21894 1457782_at 5.00E-02 1.00E+00 1.67 ------1447706_at 5.63E-02 1.00E+00 1.67 Rrm1 ribonucleotide reductase M1 20133 1415878_at 7.12E-04 4.34E-01 1.68 Oplah 5-oxoprolinase (ATP-hydrolysing) 75475 1424359_at 4.49E-02 1.00E+00 1.68 Figf C-fos induced growth factor 14205 1438954_x_at 1.89E-02 1.00E+00 1.68 ------1457022_at 4.64E-02 1.00E+00 1.68 Gpr56 G protein-coupled receptor 56 14766 1433485_x_at 5.07E-03 1.00E+00 1.68 --- Transcribed locus --- 1456864_at 4.69E-02 1.00E+00 1.69 --- Transcribed locus --- 1443325_at 3.28E-02 1.00E+00 1.69 Hrh1 histamine receptor H1 15465 1438494_at 3.54E-03 1.00E+00 1.70 --- Transcribed locus --- 1445032_at 9.28E-02 1.00E+00 1.70 Ctr9, Paf1/RNA polymerase II complex Ctr9 component, homolog (S. cerevisiae) 22083 1442240_at 3.90E-02 1.00E+00 1.70 Oaf OAF homolog (Drosophila) 102644 1424086_at 1.87E-04 1.94E-01 1.71 --- Transcribed locus --- 1442224_at 1.67E-02 1.00E+00 1.71 Rgs16 regulator of G-protein signaling 16 19734 1426037_a_at 4.07E-02 1.00E+00 1.72 RP23-143A14.5 candidate tumor suppressor OVCA2 246257 1437350_at 1.61E-03 7.23E-01 1.72 Tcap titin-cap 21393 1423145_a_at 8.95E-06 2.24E-02 1.72 5730411F24Rik RIKEN cDNA 5730411F24 gene 70507 1430470_at 2.20E-04 2.06E-01 1.73 ------1447454_at 3.38E-02 1.00E+00 1.73 Ras association (RalGDS/AF-6) domain Rassf3 family member 3 192678 1448546_at 7.10E-02 1.00E+00 1.73 --- Transcribed locus --- 1457279_at 5.09E-03 1.00E+00 1.74

158

Anhang

F-box and leucine-rich repeat Fbxl11 protein 11 225876 1435329_at 7.55E-02 1.00E+00 1.74 ------1441498_at 3.90E-02 1.00E+00 1.74 Triple functional domain (PTPRF Trio interacting) 223435 1457492_at 8.55E-03 1.00E+00 1.74 B930096F20Rik RIKEN cDNA B930096F20 gene 319332 1442418_at 7.93E-03 1.00E+00 1.74 2610018G03Rik RIKEN cDNA 2610018G03 gene 70415 1419033_at 2.16E-02 1.00E+00 1.74 leucine rich repeat and fibronectin Lrfn1 type III domain containing 1 80749 1444669_at 5.08E-05 7.91E-02 1.75 ------1446641_at 4.18E-02 1.00E+00 1.75 transient receptor potential cation Trpm3 channel, subfamily M, member 3 226025 1456923_at 8.03E-02 1.00E+00 1.75 tensin like C1 domain-containing Tenc1 phosphatase 209039 1452264_at 9.61E-02 1.00E+00 1.75 A330043J11Rik RIKEN cDNA A330043J11 gene 320261 1440018_at 8.11E-03 1.00E+00 1.75 Pde4a phosphodiesterase 4A, cAMP specific 18577 1421535_a_at 1.87E-02 1.00E+00 1.76 leucine rich repeat containing G Lgr5 protein coupled receptor 5 14160 1450988_at 5.52E-04 3.71E-01 1.76 Myo5c myosin VC 208943 1424933_at 1.15E-03 5.97E-01 1.76 Fgf22 fibroblast growth factor 22 67112 1460296_a_at 1.51E-02 1.00E+00 1.77 TRAF-interacting protein with Tifa forkhead-associated domain 637082 1426501_a_at 8.53E-02 1.00E+00 1.77 Pcdh21 protocadherin 21 170677 1418304_at 1.07E-02 1.00E+00 1.77 Microtubule-actin crosslinking Macf1 factor 1 11426 1439582_at 4.02E-03 1.00E+00 1.78 AU018740 expressed sequence AU018740 98528 1441354_at 3.90E-03 1.00E+00 1.79 Fanconi anemia, complementation Fancd2 group D2 211651 1438339_at 5.60E-06 1.69E-02 1.79 ------1441437_at 3.35E-03 1.00E+00 1.79 Dtx1 deltex 1 homolog (Drosophila) 14357 1458643_at 6.23E-03 1.00E+00 1.79 calcium channel, voltage-dependent, Cacna1b N type, alpha 1B subunit 12287 1425812_a_at 3.58E-04 2.78E-01 1.79 ------1445200_at 2.34E-02 1.00E+00 1.80 Mxra7 matrix-remodelling associated 7 67622 1440975_at 1.58E-07 8.91E-04 1.80 --- Transcribed locus --- 1445689_at 5.92E-02 1.00E+00 1.80 C130051F05Rik RIKEN cDNA C130051F05 gene 320348 1459433_at 1.84E-02 1.00E+00 1.80 6330406I15Rik RIKEN cDNA 6330406I15 gene 70717 1426937_at 1.36E-02 1.00E+00 1.80 chromatin licensing and DNA Cdt1 replication factor 1 67177 1424143_a_at 1.91E-02 1.00E+00 1.81 solute carrier family 14 (urea Slc14a1 transporter), member 1 108052 1428114_at 1.44E-03 6.84E-01 1.81 Rap guanine nucleotide exchange Rapgef3 factor (GEF) 3 223864 1438590_at 2.90E-03 9.68E-01 1.81 LOC552902 hypothetical LOC552902 552902 1456659_at 6.70E-06 1.83E-02 1.81 Hhatl hedgehog acyltransferase-like 74770 1424553_at 7.00E-04 4.32E-01 1.82 wingless-related MMTV integration Wnt7a site 7A 22421 1423367_at 8.49E-04 4.97E-01 1.84 ------1457317_at 2.42E-03 9.34E-01 1.84 brain expressed, associated with Bean Nedd4 65115 1452451_at 7.84E-03 1.00E+00 1.85 Hspa8 heat shock protein 8 666031 1431182_at 1.57E-02 1.00E+00 1.85 Oprk1 opioid receptor, kappa 1 18387 1451813_at 6.60E-03 1.00E+00 1.86 --- Transcribed locus --- 1447612_x_at 2.01E-02 1.00E+00 1.89 ------1446943_at 6.01E-03 1.00E+00 1.90 Tor1b torsin family 1, member B 30934 1417819_at 1.24E-03 6.30E-01 1.91 Col11a1 collagen, type XI, alpha 1 12814 1449154_at 1.57E-02 1.00E+00 1.91 Pth2r parathyroid hormone 2 receptor 213527 1452129_at 6.14E-04 3.90E-01 1.92 CWF19-like 2, cell cycle control (S. Cwf19l2 pombe) 244672 1453688_at 2.36E-02 1.00E+00 1.93 Zfhx4 zinc finger homeodomain 4 80892 1437556_at 8.30E-03 1.00E+00 1.94 Extl1 exostoses (multiple)-like 1 56219 1423305_at 1.02E-03 5.54E-01 1.95 myosin, heavy chain 7B, cardiac Myh7b muscle, beta 668940 1444305_at 7.82E-04 4.70E-01 1.95 sema domain, immunoglobulin domain Sema7a (Ig), and GPI membrane anchor, 20361 1422040_at 1.82E-02 1.00E+00 1.97 (semaphorin) 7 4930546H06Rik RIKEN cDNA 4930546H06 gene 75202 1453713_s_at 5.74E-03 1.00E+00 1.99 a disintegrin and metallopeptidase Adam33 domain 33 110751 1451904_a_at 8.38E-05 1.18E-01 2.01 --- Transcribed locus --- 1446514_at 6.83E-04 4.28E-01 2.02 --- Transcribed locus --- 1439632_at 3.21E-02 1.00E+00 2.03 Spryd3 SPRY domain containing 3 223918 1452323_at 8.71E-02 1.00E+00 2.03 Vps54 vacuolar protein sorting 54 (yeast) 245944 1456810_at 2.74E-04 2.33E-01 2.05 Sgce sarcoglycan, epsilon 20392 1443518_at 4.41E-02 1.00E+00 2.07 Npas1 neuronal PAS domain protein 1 18142 1420801_at 1.86E-02 1.00E+00 2.07 sema domain, immunoglobulin domain Sema4f (Ig), TM domain, and short 20355 1419328_at 3.40E-05 6.39E-02 2.08

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Anhang

cytoplasmic domain superkiller viralicidic activity 2- Skiv2l2 like 2 (S. cerevisiae) 72198 1447517_at 9.55E-02 1.00E+00 2.09 Pctk1 PCTAIRE-motif protein kinase 1 18555 1443296_at 2.46E-03 9.34E-01 2.10 Gh growth hormone 14599 1437522_x_at 4.90E-02 1.00E+00 2.20 Col11a1 collagen, type XI, alpha 1 12814 1418599_at 5.17E-03 1.00E+00 2.33 2310047B19Rik RIKEN cDNA 2310047B19 gene 66962 1452201_at 7.49E-02 1.00E+00 2.35 6330514A18Rik RIKEN cDNA 6330514A18 gene 216166 1434984_at 7.23E-05 1.09E-01 2.41 Gh growth hormone 14599 1460613_x_at 9.66E-02 1.00E+00 2.46 novel protein similar to odorant RP23-296G23.1 binding protein Ib Obp1b 236874 1449597_at 1.02E-01 1.00E+00 2.49 immunoglobulin kappa chain, constant Igk-C region 628498 1427660_x_at 7.36E-02 1.00E+00 2.50 Gh growth hormone 14599 1456595_x_at 6.47E-02 1.00E+00 2.57 Ngp neutrophilic granule protein 18054 1418722_at 7.18E-02 1.00E+00 2.83 Cartpt CART prepropeptide 27220 1422825_at 4.66E-05 7.50E-02 3.10 --- Transcribed locus --- 1456053_at 3.44E-04 2.75E-01 3.60 S100 calcium binding protein A8 S100a8 (calgranulin A) 20201 1419394_s_at 6.23E-02 1.00E+00 3.90 S100 calcium binding protein A9 S100a9 (calgranulin B) 20202 1448756_at 8.18E-02 1.00E+00 4.11

8.6.3 Expressionsarray-Ergebnisse der ANOVA-Kalkulation für fetales (E12.5) dorsales Telencephalon der Myst4-defizienten Qkfgt/gt-Maus gegen Wildtyp (p < 0.05; FC < -1.5 or > 1.5)

FDR- Fold- Entrez Gen Vollständiger Genname Probeset ID adjusted Ratio Change Gene p-value (FC) MYST histone acetyltransferase Myst4 monocytic leukemia 4 54169 1447758_x_at 5.83E-09 3.76E-05 -5.17 janus kinase and microtubule Jakmip1 interacting protein 1 76071 1441317_x_at 2.10E-07 4.12E-04 -4.25 --- Transcribed locus --- 1455528_at 1.19E-08 5.53E-05 -3.85 --- Transcribed locus --- 1436633_at 6.57E-08 1.74E-04 -2.88 --- Transcribed locus --- 1441670_at 2.47E-02 8.91E-01 -2.81 Tmod3 Tropomodulin 3 50875 1455708_at 4.90E-07 7.13E-04 -2.55 ------1459322_at 3.65E-06 3.10E-03 -2.46 Transcribed locus, weakly similar to --- XP_851502.1 PREDICTED: similar to --- 1447014_at 6.16E-06 4.41E-03 -2.42 Retroviru Nrk Nik related kinase 27206 1450079_at 6.41E-06 4.52E-03 -2.35 glutamate receptor, ionotropic, AMPA3 Gria3 (alpha 3) 53623 1434728_at 1.29E-05 7.99E-03 -2.34 Gpr123 G protein-coupled receptor 123 52389 1459750_s_at 3.15E-03 3.24E-01 -2.28 --- Transcribed locus --- 1444530_at 2.65E-03 2.90E-01 -2.23 calcium channel, voltage-dependent, N Cacna1b type, alpha 1B subunit 12287 1439612_at 5.95E-04 1.16E-01 -2.21 3110006E14Rik RIKEN cDNA 3110006E14 gene 76980 1452779_at 3.49E-08 1.12E-04 -2.21 Kif20b kinesin family member 20B 240641 1449612_x_at 7.75E-04 1.37E-01 -2.20 Ccdc80 coiled-coil domain containing 80 67896 1424186_at 5.00E-03 4.28E-01 -2.19 Ppbp pro-platelet basic protein 57349 1418480_at 3.72E-02 1.00E+00 -2.16 cell adhesion molecule with homology Chl1 to L1CAM 12661 1435190_at 2.81E-04 7.05E-02 -2.15 Tbx18 T-box18 76365 1449871_at 1.23E-08 5.53E-05 -2.14 Otx2 orthodenticle homolog 2 (Drosophila) 18424 1425926_a_at 2.86E-02 9.32E-01 -2.12 Mgll monoglyceride lipase 23945 1453836_a_at 4.36E-08 1.31E-04 -2.11 --- Transcribed locus --- 1420287_at 5.75E-05 2.18E-02 -2.09 Fbxo32 F-box protein 32 67731 1448747_at 4.67E-02 1.00E+00 -2.08 9130024F11Rik RIKEN cDNA 9130024F11 gene 78900 1453245_at 9.38E-03 5.94E-01 -2.07 ------1457041_at 8.06E-03 5.47E-01 -2.05 2900046L07Rik RIKEN cDNA 2900046L07 gene 73027 1432944_at 9.36E-03 5.94E-01 -2.05 Cyb5d2 cytochrome b5 domain containing 2 192986 1444065_at 2.30E-04 6.12E-02 -2.05 Transcribed locus, moderately similar --- to NP_891550.1 ADAM metallopeptidase --- 1446346_at 1.49E-03 2.05E-01 -2.03 with 4632404H22Rik RIKEN cDNA 4632404H22 gene 78755 1452682_at 2.51E-05 1.27E-02 -2.02 Uck2 uridine-cytidine kinase 2 80914 1439741_x_at 3.29E-07 5.94E-04 -2.02

160

Anhang

2810442I21Rik RIKEN cDNA 2810442I21 gene 72735 1439112_at 5.37E-06 4.03E-03 -1.99 thyroid hormone responsive SPOT14 Thrsp homolog (Rattus) 21835 1422973_a_at 1.53E-03 2.07E-01 -1.99 Huwe1 HECT, UBA and WWE domain containing 1 59026 1448056_at 1.18E-04 3.71E-02 -1.98 Cntnap2 contactin associated protein-like 2 66797 1437782_at 1.36E-02 7.06E-01 -1.98 Lmo7 LIM domain only 7 380928 1455056_at 5.07E-06 3.95E-03 -1.97 calcium channel, voltage-dependent, L Cacna1d type, alpha 1D subunit 12289 1427974_s_at 3.43E-05 1.56E-02 -1.96 --- Transcribed locus --- 1457743_at 1.73E-04 5.03E-02 -1.96 Fzd6 frizzled homolog 6 (Drosophila) 14368 1417301_at 1.04E-02 6.24E-01 -1.95 ------1457533_at 1.39E-05 8.25E-03 -1.95 ribonuclease L (2', 5'- Rnasel oligoisoadenylate synthetase- 24014 1426603_at 2.46E-02 8.90E-01 -1.95 dependent) --- Transcribed locus --- 1458298_at 8.31E-03 5.58E-01 -1.95 UDP-glucose ceramide Ugcg glucosyltransferase 22234 1439863_at 2.72E-04 6.90E-02 -1.94 5730410E15Rik RIKEN cDNA 5730410E15 gene 319613 1438667_at 3.71E-06 3.10E-03 -1.93 Prkce protein kinase C, epsilon 18754 1449956_at 8.47E-03 5.66E-01 -1.93 Socs6 suppressor of cytokine signaling 6 54607 1452764_at 1.44E-02 7.20E-01 -1.93 ------1459017_at 2.18E-02 8.57E-01 -1.92 proline rich Gla (G-carboxyglutamic Prrg1 acid) 1 546336 1441441_at 1.87E-04 5.25E-02 -1.92 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, Dnaja4 member 4 58233 1418592_at 1.81E-04 5.18E-02 -1.92 protein kinase, cAMP dependent Prkar1b regulatory, type I beta 19085 1434325_x_at 1.88E-07 3.86E-04 -1.92 Rhobtb3 Rho-related BTB domain containing 3 73296 1429661_at 7.02E-03 5.12E-01 -1.92 Plcb1 phospholipase C, beta 1 18795 1425781_a_at 4.47E-02 1.00E+00 -1.91 Htra1 HtrA serine peptidase 1 56213 1416749_at 2.06E-02 8.32E-01 -1.91 ------1446318_at 1.10E-02 6.40E-01 -1.91 Ndrg1 N-myc downstream regulated gene 1 17988 1456174_x_at 3.13E-02 9.71E-01 -1.91 Smtn smoothelin 29856 1452469_a_at 6.70E-05 2.40E-02 -1.91 human immunodeficiency virus type I Hivep3 enhancer binding protein 3 16656 1458802_at 1.20E-02 6.66E-01 -1.90 Psd pleckstrin and Sec7 domain containing 73728 1435780_at 1.15E-02 6.55E-01 -1.90 ------1445892_at 9.82E-07 1.30E-03 -1.90 --- Transcribed locus --- 1458555_at 2.34E-02 8.77E-01 -1.90 A830039N20Rik RIKEN cDNA A830039N20 gene 268723 1455554_at 8.07E-04 1.39E-01 -1.89 --- Transcribed locus --- 1434025_at 1.93E-02 8.05E-01 -1.88 6720454L07Rik RIKEN cDNA 6720454L07 gene 77887 1454557_at 7.20E-05 2.50E-02 -1.87 Lpar2 lysophosphatidic acid receptor 2 53978 1420576_at 3.91E-02 1.00E+00 -1.87 --- Transcribed locus --- 1442867_at 4.83E-02 1.00E+00 -1.87 Snrpn small nuclear ribonucleoprotein N 20646 1455890_x_at 2.36E-04 6.19E-02 -1.87 cyclic AMP-regulated phosphoprotein, Arpp21 21 74100 1442121_at 5.54E-04 1.12E-01 -1.86 potassium voltage-gated channel, Kcnq2 subfamily Q, member 2 16536 1451595_a_at 6.74E-06 4.60E-03 -1.86 2810030E01Rik RIKEN cDNA 2810030E01 gene 72668 1430580_at 2.90E-04 7.17E-02 -1.86 --- Transcribed locus --- 1444384_at 1.68E-02 7.66E-01 -1.86 Dsp desmoplakin 109620 1435494_s_at 1.70E-04 5.02E-02 -1.86 --- Transcribed locus --- 1457104_at 1.00E-05 6.54E-03 -1.85 --- Transcribed locus --- 1437896_at 3.49E-07 6.05E-04 -1.85 ------1456570_at 1.17E-02 6.58E-01 -1.85 Sox7 SRY-box containing gene 7 20680 1416564_at 6.43E-04 1.20E-01 -1.85 sine oculis-related homeobox 4 homolog Six4 (Drosophila) 20474 1425767_a_at 2.35E-03 2.72E-01 -1.85 --- Transcribed locus --- 1447609_at 4.29E-05 1.78E-02 -1.85 Rai14 Retinoic acid induced 14 75646 1444777_at 2.51E-02 8.97E-01 -1.85 Gpr155 G protein-coupled receptor 155 68526 1452353_at 1.48E-05 8.56E-03 -1.84 Ppnr per-pentamer repeat gene 26930 1420747_at 6.75E-04 1.24E-01 -1.84 2900083I11Rik RIKEN cDNA 2900083I11 gene 58212 1421472_at 9.91E-03 6.10E-01 -1.84 solute carrier family 25 Slc25a24 (mitochondrial carrier, phosphate 229731 1427483_at 1.17E-05 7.40E-03 -1.83 carrier), member 24 anterior pharynx defective 1b homolog Aph1b (C. elegans) 208117 1435793_at 3.23E-03 3.27E-01 -1.83 PIF1 5'-to-3' DNA helicase homolog (S. Pif1 cerevisiae) 208084 1438149_at 1.13E-07 2.68E-04 -1.83 potassium channel tetramerisation Kctd4 domain containing 4 67516 1420537_at 2.46E-02 8.90E-01 -1.83

161

Anhang

Syngr1 synaptogyrin 1 20972 1434661_at 7.99E-03 5.44E-01 -1.82 V-set and transmembrane domain Vstm2a containing 2A 211739 1452065_at 1.57E-03 2.09E-01 -1.82 Gpc6 glypican 6 23888 1419688_at 1.95E-04 5.43E-02 -1.82 1110018F16Rik RIKEN cDNA 1110018F16 gene 68594 1429468_at 9.33E-03 5.94E-01 -1.82 SH3-domain GRB2-like (endophilin) Sgip1 interacting protein 1 73094 1425181_at 2.44E-03 2.78E-01 -1.82 Rtn4ip1 reticulon 4 interacting protein 1 170728 1417668_at 7.88E-03 5.37E-01 -1.81 avian musculoaponeurotic fibrosarcoma Maf (v-maf) AS42 oncogene homolog 17132 1447849_s_at 4.48E-03 3.95E-01 -1.81 ATP-binding cassette, sub-family B Abcb7 (MDR/TAP), member 7 11306 1419931_at 1.16E-02 6.56E-01 -1.80 ------1440651_at 8.90E-05 3.00E-02 -1.80 solute carrier family 6 Slc6a17 (neurotransmitter transporter), member 229706 1436137_at 2.18E-02 8.59E-01 -1.80 17 --- Transcribed locus --- 1443364_at 9.61E-03 6.00E-01 -1.80 Pfkp Phosphofructokinase, platelet 56421 1437759_at 1.03E-02 6.23E-01 -1.79 ELOVL family member 7, elongation of Elovl7 long chain fatty acids (yeast) 74559 1441891_x_at 2.92E-02 9.39E-01 -1.79 RP23-100C5.8 ProSAPiP1 protein 241638 1441963_at 1.18E-02 6.63E-01 -1.79 ------1443312_at 1.06E-03 1.68E-01 -1.78 --- Transcribed locus --- 1436844_at 1.25E-04 3.88E-02 -1.78 potassium channel, subfamily T, member Kcnt1 1 227632 1439486_at 9.65E-03 6.00E-01 -1.78 Zfp69 zinc finger protein 69 381549 1458274_at 2.30E-05 1.22E-02 -1.78 gamma-aminobutyric acid (GABA-A) Gabrb2 receptor, subunit beta 2 14401 1428205_x_at 5.72E-04 1.13E-01 -1.78 5530601H04Rik RIKEN cDNA 5530601H04 gene 71445 1438893_at 1.99E-04 5.49E-02 -1.78 --- Transcribed locus --- 1445638_at 1.88E-02 7.94E-01 -1.77 ------1456900_at 2.71E-04 6.90E-02 -1.77 ------1459608_at 1.63E-05 8.88E-03 -1.77 human immunodeficiency virus type I Hivep2 enhancer binding protein 2 15273 1422018_at 1.03E-02 6.22E-01 -1.77 Thada thyroid adenoma associated 240174 1443884_at 8.09E-07 1.11E-03 -1.77 --- Transcribed locus --- 1444136_at 2.36E-04 6.19E-02 -1.76 Arg2 arginase type II 11847 1418847_at 4.70E-02 1.00E+00 -1.76 integrin alpha 5 (fibronectin receptor Itga5 alpha) 16402 1423267_s_at 8.51E-03 5.67E-01 -1.76 aldehyde dehydrogenase 1 family, Aldh1l2 member L2 216188 1436119_at 7.39E-03 5.20E-01 -1.76 adaptor-related protein complex 3, mu Ap3m2 2 subunit 64933 1448751_at 7.14E-03 5.15E-01 -1.76 Gatad2a GATA zinc finger domain containing 2A 234366 1445239_at 2.26E-02 8.67E-01 -1.75 Ilf3 interleukin enhancer binding factor 3 16201 1422546_at 1.81E-06 1.90E-03 -1.75 --- Transcribed locus --- 1440655_at 1.36E-02 7.06E-01 -1.75 v-crk sarcoma virus CT10 oncogene Crkl homolog (avian)-like 12929 1421954_at 2.07E-02 8.32E-01 -1.75 aryl hydrocarbon receptor nuclear Arnt translocator 11863 1437042_at 1.21E-02 6.66E-01 -1.74 Csnk2a1 casein kinase 2, alpha 1 polypeptide 12995 1419035_s_at 3.55E-02 1.00E+00 -1.74 ------1441547_at 3.64E-02 1.00E+00 -1.74 --- Transcribed locus --- 1457883_at 6.92E-03 5.09E-01 -1.74 Cdc7 cell division cycle 7 (S. cerevisiae) 12545 1426021_a_at 1.13E-03 1.73E-01 -1.74 tetratricopeptide repeat, ankyrin Tanc2 repeat and coiled-coil containing 2 77097 1443123_at 3.64E-02 1.00E+00 -1.73 tubulin tyrosine ligase-like family, Ttll4 member 4 67534 1436249_at 4.91E-04 1.04E-01 -1.73 Sult4a1 sulfotransferase family 4A, member 1 29859 1433714_at 1.54E-03 2.07E-01 -1.72 phosphoinositide-3-kinase interacting Pik3ip1 protein 1 216505 1428332_at 9.58E-03 6.00E-01 -1.72 Zfp804a zinc finger protein 804A 241514 1443036_at 7.51E-04 1.34E-01 -1.72 resistance to inhibitors of Ric3 cholinesterase 3 homolog (C. elegans) 320360 1445553_at 5.12E-03 4.34E-01 -1.72 C330019G07Rik RIKEN cDNA C330019G07 gene 215476 1434218_at 1.09E-02 6.38E-01 -1.71 Transcribed locus, strongly similar to --- XP_222254.4 PREDICTED: similar to --- 1434029_at 1.93E-03 2.39E-01 -1.71 autism Pskh1 protein serine kinase H1 244631 1433522_at 3.15E-05 1.47E-02 -1.71 Cyr61 cysteine rich protein 61 16007 1416039_x_at 2.20E-03 2.60E-01 -1.71 solute carrier family 29 (nucleoside Slc29a2 transporters), member 2 13340 1447748_x_at 3.49E-02 1.00E+00 -1.70 Itga1 integrin alpha 1 109700 1455251_at 3.67E-05 1.61E-02 -1.70 anterior pharynx defective 1b homolog Aph1b (C. elegans) 208117 1456500_at 3.69E-05 1.61E-02 -1.70 ------1459485_at 4.27E-02 1.00E+00 -1.70

162

Anhang

------1446897_at 3.75E-02 1.00E+00 -1.69 2810043O03Rik RIKEN cDNA 2810043O03 gene 72697 1430195_at 6.42E-04 1.20E-01 -1.69 D430015B01Rik RIKEN cDNA D430015B01 gene 58909 1456611_at 1.17E-02 6.58E-01 -1.69 ------1439412_at 9.66E-03 6.00E-01 -1.69 --- Transcribed locus --- 1444143_at 3.82E-02 1.00E+00 -1.69 Dclk3 doublecortin-like kinase 3 245038 1436532_at 2.95E-05 1.43E-02 -1.69 ST3 beta-galactoside alpha-2,3- St3gal2 sialyltransferase 2 20444 1421892_at 4.74E-02 1.00E+00 -1.69 signal recognition particle receptor, Srprb B subunit 20818 1421012_at 2.91E-04 7.17E-02 -1.69 Structural maintenance of chromosomes Smc2 2 14211 1458479_at 1.96E-02 8.13E-01 -1.69 NCK interacting protein with SH3 Nckipsd domain 80987 1418975_at 2.40E-02 8.82E-01 -1.69 Sh2b2 SH2B adaptor protein 2 23921 1450718_at 1.46E-02 7.23E-01 -1.69 endothelial differentiation, Edg5 sphingolipid G-protein-coupled 14739 1428176_at 9.27E-06 6.15E-03 -1.68 receptor, 5 nerve growth factor receptor (TNFR Ngfr superfamily, member 16) 18053 1454903_at 4.53E-02 1.00E+00 -1.68 --- Transcribed locus --- 1438310_at 6.12E-03 4.76E-01 -1.68 --- Transcribed locus --- 1436463_at 1.83E-02 7.91E-01 -1.68 cAMP responsive element binding Creb1 protein 1 12912 1423402_at 4.33E-03 3.89E-01 -1.68 Tyms Thymidylate synthase 22171 1438690_at 2.02E-03 2.46E-01 -1.68 --- Transcribed locus --- 1440371_at 3.29E-06 2.97E-03 -1.68 von Willebrand factor A domain Vwa1 containing 1 246228 1426399_at 1.19E-02 6.64E-01 -1.68 carnitine deficiency-associated gene Cdv3 expressed in ventricle 3 321022 1440332_at 2.73E-03 2.97E-01 -1.68 --- Transcribed locus --- 1440946_at 5.87E-03 4.63E-01 -1.68 protein kinase, cAMP dependent Prkar2a regulatory, type II alpha 19087 1427414_at 2.31E-04 6.12E-02 -1.68 potassium voltage gated channel, Shaw- Kcnc1 related subfamily, member 1 16502 1456944_at 3.88E-06 3.18E-03 -1.68 ------1440570_at 4.72E-02 1.00E+00 -1.68 Arhgap6 Rho GTPase activating protein 6 11856 1451867_x_at 4.80E-02 1.00E+00 -1.68 Klhl5 kelch-like 5 (Drosophila) 71778 1444486_at 5.34E-06 4.03E-03 -1.68 Klf15 Kruppel-like factor 15 66277 1448181_at 3.38E-02 9.94E-01 -1.67 Glutamate receptor, ionotropic, AMPA4 Gria4 (alpha 4) 14802 1436772_at 9.99E-03 6.11E-01 -1.67 ------1430605_at 3.09E-03 3.20E-01 -1.67 Cntn1 contactin 1 12805 1449563_at 7.53E-04 1.34E-01 -1.67 regulator of G-protein signalling 7 Rgs7bp binding protein 52882 1436876_at 3.63E-04 8.35E-02 -1.66 Letmd1 LETM1 domain containing 1 68614 1437116_at 1.92E-03 2.39E-01 -1.66 Tmem25 transmembrane protein 25 71687 1436644_x_at 2.52E-02 8.98E-01 -1.66 4930525F21Rik RIKEN cDNA 4930525F21 gene 75823 1438642_at 1.53E-02 7.38E-01 -1.66 Mmp15 matrix metallopeptidase 15 17388 1422597_at 3.56E-03 3.46E-01 -1.66 E030016H06Rik RIKEN cDNA E030016H06 gene 402722 1440443_at 1.02E-02 6.17E-01 -1.66 Cplx2 complexin 2 12890 1421477_at 2.17E-04 5.96E-02 -1.66 Cplx1 complexin 1 12889 1448832_a_at 3.09E-05 1.47E-02 -1.65 Mta3 metastasis associated 3 116871 1421402_at 1.64E-03 2.14E-01 -1.65 Fcho1 FCH domain only 1 74015 1428575_at 7.23E-03 5.17E-01 -1.65 Sdf4 stromal cell derived factor 4 20318 1448367_at 1.05E-02 6.24E-01 -1.65 Clstn2 calsyntenin 2 64085 1422158_at 3.34E-02 9.88E-01 -1.65 Btbd7 BTB (POZ) domain containing 7 238386 1442061_at 1.40E-06 1.65E-03 -1.64 Rho guanine nucleotide exchange factor Arhgef17 (GEF) 17 207212 1433682_at 1.19E-02 6.64E-01 -1.64 Zcchc11 zinc finger, CCHC domain containing 11 230594 1439631_at 8.07E-04 1.39E-01 -1.64 Slitrk4 SLIT and NTRK-like family, member 4 245446 1437744_at 1.61E-02 7.56E-01 -1.64 Sh3gl2 SH3-domain GRB2-like 2 20404 1418792_at 3.46E-02 1.00E+00 -1.64 serine/threonine kinase 36 (fused Stk36 homolog, Drosophila) 269209 1434733_at 7.49E-03 5.24E-01 -1.64 C77370 expressed sequence C77370 245555 1440910_at 1.63E-05 8.88E-03 -1.64 Abhd6 abhydrolase domain containing 6 66082 1419104_at 2.57E-02 9.06E-01 -1.64 Tcf12 Transcription factor 12 21406 1446294_at 1.31E-03 1.90E-01 -1.64 --- Transcribed locus --- 1436260_at 3.91E-03 3.64E-01 -1.64 ------1444005_at 1.52E-03 2.07E-01 -1.64 cholinergic receptor, nicotinic, alpha Chrna7 polypeptide 7 11441 1440681_at 3.61E-02 1.00E+00 -1.64

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Anhang

enhancer of zeste homolog 1 Ezh1 (Drosophila) 14055 1449023_a_at 7.51E-04 1.34E-01 -1.63 solute carrier family 35 (UDP- Slc35a2 galactose transporter), member A2 22232 1457024_x_at 4.61E-07 6.92E-04 -1.63 Kcnip4 Kv channel interacting protein 4 80334 1437631_at 2.98E-04 7.26E-02 -1.63 phosphatidylinositol transfer protein, Pitpna alpha 18738 1423282_at 2.34E-05 1.22E-02 -1.63 2610204M08Rik RIKEN cDNA 2610204M08 gene 70435 1436216_s_at 2.12E-02 8.43E-01 -1.63 nuclear receptor subfamily 3, group C, Nr3c1 member 1 14815 1457635_s_at 1.64E-02 7.63E-01 -1.63 protein tyrosine phosphatase, receptor Ptprj type, J 19271 1425452_s_at 5.58E-03 4.53E-01 -1.63 --- Transcribed locus --- 1445575_at 1.49E-02 7.30E-01 -1.62 proteasome (prosome, macropain) Psma1 subunit, alpha type 1 26440 1436769_at 1.46E-03 2.02E-01 -1.62 Cadm2 cell adhesion molecule 2 239857 1435146_s_at 2.14E-02 8.45E-01 -1.62 Ttc9c tetratricopeptide repeat domain 9C 70387 1432245_s_at 1.31E-02 6.89E-01 -1.61 calcium/calmodulin-dependent protein Camk1d kinase ID 227541 1452050_at 4.96E-04 1.04E-01 -1.61 integrin beta 3 binding protein Itgb3bp (beta3-endonexin) 67733 1449953_at 3.60E-03 3.46E-01 -1.61 Protein phosphatase 1, regulatory Ppp1r14b (inhibitor) subunit 14B 18938 1436716_at 4.01E-06 3.23E-03 -1.61 alkB, alkylation repair homolog 2 (E. Alkbh2 coli) 231642 1455673_at 2.24E-02 8.65E-01 -1.60 Josd3 Josephin domain containing 3 75316 1442289_at 1.56E-02 7.44E-01 -1.60 --- Transcribed locus --- 1439596_at 1.14E-02 6.51E-01 -1.60 beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl B4galnt1 transferase 1 14421 1418655_at 3.82E-02 1.00E+00 -1.60 sodium channel, voltage-gated, type Scn2b II, beta 72821 1436134_at 8.20E-03 5.53E-01 -1.60 Guf1 GUF1 GTPase homolog (S. cerevisiae) 231279 1455163_at 8.46E-03 5.66E-01 -1.60 Fgf1 fibroblast growth factor 1 14164 1423136_at 1.20E-03 1.79E-01 -1.60 Epha10 Eph receptor A10 230735 1436093_at 5.53E-03 4.50E-01 -1.60 growth factor receptor bound protein Grb14 14 50915 1417673_at 4.83E-05 1.96E-02 -1.60 protein phosphatase 1, regulatory Ppp1r1b (inhibitor) subunit 1B 19049 1451331_at 4.49E-03 3.95E-01 -1.60 aldehyde dehydrogenase 16 family, Aldh16a1 member A1 69748 1447372_at 2.84E-02 9.30E-01 -1.60 Gfm1 G elongation factor, mitochondrial 1 28030 1448381_at 9.73E-04 1.58E-01 -1.59 D230040A04Rik RIKEN cDNA D230040A04 gene 414113 1442151_at 6.87E-03 5.09E-01 -1.59 ------1440123_at 7.73E-08 1.94E-04 -1.59 C77805 expressed sequence C77805 97592 1445490_at 3.12E-02 9.70E-01 -1.59 ------1440701_at 4.38E-04 9.59E-02 -1.59 Zswim4 zinc finger, SWIM domain containing 4 212168 1436710_at 3.99E-02 1.00E+00 -1.59 Usp32 ubiquitin specific peptidase 32 237898 1459857_at 1.24E-02 6.69E-01 -1.59 potassium voltage gated channel, Shab- Kcnb1 related subfamily, member 1 16500 1423180_at 4.04E-03 3.72E-01 -1.59 Ank3 ankyrin 3, epithelial 11735 1425202_a_at 1.54E-03 2.07E-01 -1.59 --- Transcribed locus --- 1447279_at 3.61E-04 8.35E-02 -1.59 Ifnar2 interferon (alpha and beta) receptor 2 15976 1440169_x_at 2.52E-03 2.82E-01 -1.59 Abi1 abl-interactor 1 11308 1438506_s_at 4.52E-03 3.95E-01 -1.59 Usp14 Ubiquitin specific peptidase 14 59025 1437714_x_at 2.10E-02 8.39E-01 -1.59 Pcdh8 protocadherin 8 18530 1447825_x_at 7.23E-03 5.17E-01 -1.59 Transcribed locus, strongly similar to --- NP_081035.1 mitochondrial ribosomal --- 1459856_at 1.72E-02 7.73E-01 -1.59 prote Bcor Bcl6 interacting corepressor 71458 1452910_at 6.22E-05 2.31E-02 -1.59 a disintegrin-like and Adamts3 metallopeptidase (reprolysin type) 330119 1441693_at 9.70E-03 6.01E-01 -1.58 with thrombospondin ty Rab32 RAB32, member RAS oncogene family 67844 1416527_at 6.84E-03 5.08E-01 -1.58 mucosa associated lymphoid tissue Malt1 lymphoma translocation gene 1 240354 1456429_at 3.80E-02 1.00E+00 -1.58 Gpr85 G protein-coupled receptor 85 64450 1424897_at 1.37E-04 4.21E-02 -1.58 Rtn4rl2 reticulon 4 receptor-like 2 269295 1439573_at 3.26E-02 9.84E-01 -1.58 ------1447136_at 2.61E-02 9.09E-01 -1.58 solute carrier organic anion Slco3a1 transporter family, member 3a1 108116 1418030_at 1.96E-02 8.13E-01 -1.58 CCR4-NOT transcription complex, Cnot6l subunit 6-like 231464 1451723_at 3.88E-04 8.75E-02 -1.58 Chst11 carbohydrate sulfotransferase 11 218194 1456606_a_at 6.96E-03 5.09E-01 -1.58 brain-specific angiogenesis inhibitor Baiap2 1-associated protein 2 108100 1435128_at 3.25E-03 3.28E-01 -1.58 Dtl denticleless homolog (Drosophila) 76843 1443864_at 1.20E-02 6.66E-01 -1.58 Pla2g4c phospholipase A2, group IVC 232889 1436712_at 3.24E-03 3.27E-01 -1.58

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(cytosolic, calcium-independent) Polymerase (DNA-directed), delta 3, Pold3 accessory subunit 67967 1459647_at 1.54E-02 7.38E-01 -1.57 polymerase (DNA directed), epsilon 2 Pole2 (p59 subunit) 18974 1431440_at 2.76E-02 9.21E-01 -1.57 transducin-like enhancer of split 2, Tle2 homolog of Drosophila E(spl) 21886 1436244_a_at 3.50E-02 1.00E+00 -1.57 Lysophosphatidylglycerol Lpgat1 acyltransferase 1 226856 1457961_at 1.06E-03 1.68E-01 -1.57 Transcribed locus, strongly similar to --- XP_001480950.1 PREDICTED: similar to --- 1458629_at 7.82E-03 5.34E-01 -1.57 ribo Wdr33 WD repeat domain 33 74320 1453322_at 3.30E-02 9.84E-01 -1.57 5830474E16Rik RIKEN cDNA 5830474E16 gene 76094 1433110_at 1.13E-02 6.49E-01 -1.57 glutamate receptor, ionotropic, AMPA4 Gria4 (alpha 4) 14802 1440891_at 2.89E-02 9.38E-01 -1.57 AU021128 expressed sequence AU021128 99209 1457575_at 3.39E-04 7.97E-02 -1.57 N-ethylmaleimide sensitive fusion Napb protein attachment protein beta 17957 1423173_at 1.52E-05 8.67E-03 -1.56 solute carrier family 9 Slc9a3r2 (sodium/hydrogen exchanger), member 3 65962 1428954_at 3.28E-02 9.84E-01 -1.56 regulator 2 membrane-associated ring finger March7 (C3HC4) 7 57438 1458690_at 1.25E-02 6.71E-01 -1.56 ------1446107_at 1.95E-03 2.41E-01 -1.56 C-type lectin domain family 14, member Clec14a a 66864 1419468_at 1.50E-02 7.30E-01 -1.56 3110001A13Rik RIKEN cDNA 3110001A13 gene 66540 1416893_at 2.29E-03 2.67E-01 -1.56 Cplx1 complexin 1 12889 1417746_at 8.04E-03 5.46E-01 -1.56 ------1442375_at 1.42E-02 7.13E-01 -1.56 Agbl5 ATP/GTP binding protein-like 5 231093 1439465_x_at 1.93E-02 8.06E-01 -1.56 Potassium channel, subfamily T, member Kcnt2 2 240776 1459971_at 1.18E-02 6.63E-01 -1.56 Kpnb1 karyopherin (importin) beta 1 16211 1451967_x_at 6.21E-03 4.80E-01 -1.56 BC062127 cDNA sequence BC062127 331188 1445274_at 2.44E-02 8.89E-01 -1.56 tubulin tyrosine ligase-like family, Ttll11 member 11 74410 1430064_at 6.19E-03 4.80E-01 -1.55 ------1446461_at 2.98E-03 3.16E-01 -1.55 Rnf11 ring finger protein 11 29864 1426405_at 2.67E-02 9.18E-01 -1.55 glucosaminyl (N-acetyl) transferase 2, Gcnt2 I-branching enzyme 14538 1425503_at 2.11E-02 8.40E-01 -1.55 4933417O08Rik RIKEN cDNA 4933417O08 gene 71146 1439546_at 4.37E-02 1.00E+00 -1.55 2610020C07Rik RIKEN cDNA 2610020C07 gene 69918 1430618_at 2.23E-04 5.98E-02 -1.55 Vldlr very low density lipoprotein receptor 22359 1438258_at 1.22E-02 6.66E-01 -1.55 Aak1 AP2 associated kinase 1 269774 1435038_s_at 1.10E-03 1.72E-01 -1.55 --- Transcribed locus --- 1448037_at 1.35E-03 1.94E-01 -1.55 Zfp57 zinc finger protein 57 22715 1450929_at 2.61E-02 9.09E-01 -1.55 Cntnap2 contactin associated protein-like 2 66797 1450758_at 2.45E-02 8.89E-01 -1.55 Rai14 retinoic acid induced 14 75646 1417401_at 2.80E-02 9.24E-01 -1.55 ------1446094_at 2.38E-02 8.81E-01 -1.55 --- Transcribed locus --- 1439621_at 2.00E-02 8.19E-01 -1.55 E26 avian leukemia oncogene 2, 3' Ets2 domain 23872 1416268_at 1.79E-02 7.89E-01 -1.55 Transcribed locus, weakly similar to --- NP_001041402.1 hypothetical protein --- 1440628_at 1.61E-03 2.12E-01 -1.55 LOC4991 3110039C02Rik RIKEN cDNA 3110039C02 gene 73127 1430952_at 1.78E-02 7.87E-01 -1.54 --- Transcribed locus --- 1446200_at 3.92E-03 3.64E-01 -1.54 Wdr22 WD repeat domain 22 320808 1455702_at 4.95E-02 1.00E+00 -1.54 solute carrier family 7 (cationic Slc7a11 amino acid transporter, y+ system), 26570 1443536_at 2.77E-02 9.22E-01 -1.54 member 11 Wapal wings apart-like homolog (Drosophila) 218914 1442426_at 3.91E-03 3.64E-01 -1.54 2610012C04Rik RIKEN cDNA 2610012C04 gene 70299 1432606_at 1.52E-02 7.35E-01 -1.54 Akap13 A kinase (PRKA) anchor protein 13 75547 1430185_at 3.47E-02 1.00E+00 -1.54 Mybl2 myeloblastosis oncogene-like 2 17865 1454946_at 1.54E-03 2.07E-01 -1.54 Ccdc18 coiled-coil domain containing 18 73254 1453600_at 1.22E-02 6.66E-01 -1.54 Transcribed locus, moderately similar --- to XP_001234258.1 PREDICTED: similar --- 1445679_at 5.93E-03 4.67E-01 -1.54 to ba Rai14 retinoic acid induced 14 75646 1441030_at 1.84E-02 7.92E-01 -1.54 solute carrier family 40 (iron- Slc40a1 regulated transporter), member 1 53945 1417061_at 1.42E-02 7.13E-01 -1.53 C730026J16 hypothetical protein C730026J16 331006 1434687_at 1.05E-02 6.24E-01 -1.53 Ccnjl cyclin J-like 380694 1456168_at 1.54E-02 7.38E-01 -1.53

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Anhang

BC010304 cDNA sequence BC010304 218236 1439120_at 1.57E-03 2.09E-01 -1.53 tRNA-yW synthesizing protein 1 homolog Tyw1 (S. cerevisiae) 100929 1426781_at 2.71E-02 9.18E-01 -1.53 BC032203 cDNA sequence BC032203 210982 1435545_at 1.44E-02 7.18E-01 -1.53 Transcribed locus, moderately similar --- to XP_001479965.1 PREDICTED: --- 1442605_at 1.18E-02 6.63E-01 -1.53 hypothetical Foxd1 forkhead box D1 15229 1418876_at 3.09E-02 9.65E-01 -1.53 Prkca protein kinase C, alpha 18750 1450945_at 3.23E-02 9.79E-01 -1.53 --- Transcribed locus --- 1441334_at 5.60E-03 4.54E-01 -1.53 Hspbap1 Hspb associated protein 1 66667 1441900_x_at 6.53E-03 4.94E-01 -1.53 38231 septin 4 18952 1455422_x_at 1.08E-02 6.34E-01 -1.53 Heterogeneous nuclear Hnrph1 ribonucleoprotein H1 59013 1437267_x_at 1.54E-03 2.07E-01 -1.53 8430436O14Rik RIKEN cDNA 8430436O14 gene 71506 1452761_a_at 2.07E-02 8.32E-01 -1.53 Sox21 SRY-box containing gene 21 223227 1451835_at 3.01E-05 1.44E-02 -1.53 C78704 expressed sequence C78704 97868 1458862_at 4.96E-02 1.00E+00 -1.53 AW413774 expressed sequence AW413774 106046 1435576_at 6.10E-04 1.17E-01 -1.53 ------1458382_a_at 3.32E-02 9.84E-01 -1.52 wingless-related MMTV integration site Wnt5b 5B 22419 1439373_x_at 1.71E-03 2.18E-01 -1.52 human immunodeficiency virus type I Hivep3 enhancer binding protein 3 16656 1439660_at 6.41E-03 4.87E-01 -1.52 solute carrier family 12 Slc12a9 (potassium/chloride transporters), 83704 1442599_at 2.62E-02 9.09E-01 -1.52 member 9 0610037D15Rik RIKEN cDNA 0610037D15 gene 68394 1453639_s_at 1.27E-02 6.76E-01 -1.52 translocase of inner mitochondrial Timm22 membrane 22 homolog (yeast) 56322 1448518_at 4.09E-02 1.00E+00 -1.52 Efs Embryonal Fyn-associated substrate 13644 1438114_x_at 3.77E-02 1.00E+00 -1.52 Rimbp2 RIMS binding protein 2 231760 1441625_at 1.28E-02 6.80E-01 -1.52 mirror-image polydactyly gene 1 Mipol1 homolog (human) 73490 1435671_at 5.54E-04 1.12E-01 -1.52 6430514L14Rik RIKEN cDNA 6430514L14 gene 76886 1425213_at 3.83E-02 1.00E+00 -1.52 Coro1c Coronin, actin binding protein 1C 23790 1419911_at 1.32E-02 6.90E-01 -1.51 --- Transcribed locus --- 1442996_x_at 3.38E-03 3.34E-01 -1.51 Rho guanine nucleotide exchange factor Arhgef3 (GEF) 3 71704 1424250_a_at 4.11E-02 1.00E+00 -1.51 Kap kidney androgen regulated protein 16483 1415968_a_at 1.40E-02 7.10E-01 -1.51 ------1454454_at 4.68E-02 1.00E+00 -1.51 Neurl neuralized-like homolog (Drosophila) 18011 1460343_at 3.31E-02 9.84E-01 -1.51 4930506M07Rik RIKEN cDNA 4930506M07 gene 71653 1429055_at 4.41E-02 1.00E+00 -1.51 PIF1 5'-to-3' DNA helicase homolog (S. Pif1 cerevisiae) 208084 1436738_at 4.28E-03 3.85E-01 -1.51 2010317E24Rik RIKEN cDNA 2010317E24 gene 72080 1438615_x_at 2.73E-02 9.18E-01 -1.51 Tmem209 Transmembrane protein 209 72649 1445660_at 1.75E-02 7.78E-01 -1.51 Dleu2 deleted in lymphocytic leukemia, 2 328425 1427411_s_at 1.06E-02 6.30E-01 -1.51 Ralyl RALY RNA binding protein-like 76897 1454715_at 1.82E-02 7.91E-01 -1.51 Sfmbt1 Scm-like with four mbt domains 1 54650 1455412_at 1.34E-05 8.08E-03 -1.51 myosin VIIA and Rab interacting Myrip protein 245049 1460601_at 1.12E-02 6.47E-01 -1.50 cyclic AMP-regulated phosphoprotein, Arpp21 21 74100 1424248_at 1.78E-03 2.25E-01 -1.50 ------1446732_at 1.72E-02 7.73E-01 -1.50 Unkl unkempt-like (Drosophila) 74154 1428565_at 5.47E-05 2.13E-02 -1.50 DNA segment, Chr 3, ERATO Doi 751, D3Ertd751e expressed 73852 1454225_s_at 2.10E-02 8.39E-01 -1.50 Terf1 (TRF1)-interacting nuclear Tinf2 factor 2 28113 1437166_at 9.35E-04 1.53E-01 -1.50 gamma-aminobutyric acid (GABA-A) Gabrb3 receptor, subunit beta 3 14402 1435021_at 3.52E-06 3.05E-03 -1.50 ------1447257_at 3.28E-02 9.84E-01 -1.50 non-POU-domain-containing, octamer Nono binding protein 53610 1447160_at 4.53E-02 1.00E+00 -1.50 Lyst lysosomal trafficking regulator 17101 1421384_at 4.83E-02 1.00E+00 1.50 Inha inhibin alpha 16322 1422728_at 1.67E-02 7.66E-01 1.50 2310061C15Rik RIKEN cDNA 2310061C15 gene 66531 1427922_at 5.24E-04 1.07E-01 1.50 Tep1 telomerase associated protein 1 21745 1418196_at 1.26E-03 1.85E-01 1.50 ------1446570_at 2.11E-02 8.40E-01 1.50 MAP kinase-interacting Mknk1 serine/threonine kinase 1 17346 1417631_at 7.03E-03 5.12E-01 1.51 Gm2a GM2 ganglioside activator protein 14667 1416188_at 3.69E-02 1.00E+00 1.51 Nfya nuclear transcription factor-Y alpha 18044 1422082_a_at 3.08E-02 9.63E-01 1.51

166

Anhang

eukaryotic translation initiation Eif4ebp1 factor 4E binding protein 1 13685 1417562_at 1.15E-02 6.55E-01 1.51 ------1460144_at 3.85E-02 1.00E+00 1.51 a disintegrin and metallopeptidase Adam17 domain 17 11491 1421857_at 1.19E-02 6.64E-01 1.51 ------1440650_at 4.72E-02 1.00E+00 1.52 dual specificity phosphatase 26 Dusp26 (putative) 66959 1425848_a_at 3.64E-03 3.48E-01 1.52 ------1441177_at 2.71E-02 9.18E-01 1.52 Nid2 nidogen 2 18074 1423516_a_at 4.07E-03 3.73E-01 1.52 Prdm5 PR domain containing 5 70779 1442740_at 1.88E-02 7.94E-01 1.52 Kif2c kinesin family member 2C 73804 1454221_a_at 2.61E-03 2.87E-01 1.52 Rad18 RAD18 homolog (S. cerevisiae) 58186 1423318_at 2.36E-02 8.78E-01 1.52 Ccdc24 coiled-coil domain containing 24 381546 1456905_at 3.71E-04 8.50E-02 1.53 Tmpo thymopoietin 21917 1421237_at 4.02E-05 1.68E-02 1.53 sterile alpha motif domain containing Samd8 8 67630 1434402_at 2.53E-06 2.48E-03 1.53 Pml promyelocytic leukemia 18854 1448757_at 4.13E-02 1.00E+00 1.53 2810004I08Rik RIKEN cDNA 2810004I08 gene 69932 1453534_at 3.16E-05 1.47E-02 1.53 sortilin-related VPS10 domain Sorcs2 containing receptor 2 81840 1419358_at 2.41E-02 8.85E-01 1.54 Serf1 small EDRK-rich factor 1 20365 1449509_at 5.19E-04 1.07E-01 1.54 2310068G24Rik RIKEN cDNA 2310068G24 gene 70185 1433023_at 5.82E-03 4.62E-01 1.54 perlecan (heparan sulfate proteoglycan Hspg2 2) 15530 1418670_s_at 2.24E-02 8.65E-01 1.54 Mmp11 matrix metallopeptidase 11 17385 1417234_at 1.22E-02 6.66E-01 1.54 --- Transcribed locus --- 1445612_at 3.78E-02 1.00E+00 1.54 epidermal growth factor-containing Efemp1 fibulin-like extracellular matrix 216616 1427183_at 3.51E-03 3.44E-01 1.54 protein 1 Tpbg trophoblast glycoprotein 21983 1423312_at 2.97E-02 9.48E-01 1.54 Gstm1 glutathione S-transferase, mu 1 14862 1425627_x_at 6.85E-03 5.08E-01 1.54 Igf1r insulin-like growth factor I receptor 16001 1452108_at 5.80E-03 4.61E-01 1.54 Ctsh cathepsin H 13036 1418365_at 6.63E-03 4.98E-01 1.54 Tgm2 transglutaminase 2, C polypeptide 21817 1417500_a_at 8.95E-03 5.84E-01 1.55 Mamdc4 MAM domain containing 4 381352 1440333_at 1.20E-06 1.51E-03 1.55 regulating synaptic membrane Rims1 exocytosis 1 116837 1438305_at 1.86E-02 7.94E-01 1.55 Adora1 adenosine A1 receptor 11539 1435495_at 1.38E-02 7.07E-01 1.55 tumor necrosis factor receptor Tnfrsf19 superfamily, member 19 29820 1425212_a_at 1.04E-02 6.24E-01 1.55 C79407 expressed sequence C79407 217653 1443668_x_at 6.87E-05 2.43E-02 1.55 --- Transcribed locus --- 1444761_at 1.14E-03 1.73E-01 1.55 Rybp RING1 and YY1 binding protein 56353 1421111_at 4.29E-02 1.00E+00 1.55 Anxa6 annexin A6 11749 1415818_at 1.92E-02 8.03E-01 1.55 --- Transcribed locus --- 1440675_at 3.84E-02 1.00E+00 1.55 Klf9 Kruppel-like factor 9 16601 1422264_s_at 3.39E-02 9.94E-01 1.55 --- Transcribed locus --- 1446121_at 9.10E-05 3.03E-02 1.56 Lyrm1 LYR motif containing 1 73919 1431774_a_at 2.72E-02 9.18E-01 1.56 Rps17 Ribosomal protein S17 20068 1438501_at 7.29E-05 2.51E-02 1.56 C330023M02Rik RIKEN cDNA C330023M02 gene 231713 1433766_at 3.26E-02 9.84E-01 1.56 ATPase family, AAA domain containing Atad2b 2B 320817 1446719_at 7.45E-04 1.34E-01 1.56 Lepre1 leprecan 1 56401 1452752_at 6.94E-09 3.91E-05 1.56 tumor necrosis factor (ligand) Tnfsf12 superfamily, member 12 619441 1452440_at 1.44E-06 1.65E-03 1.56 Abhd6 abhydrolase domain containing 6 66082 1419103_a_at 3.18E-04 7.63E-02 1.56 Zfp64 zinc finger protein 64 22722 1430117_a_at 3.90E-02 1.00E+00 1.56 Reep4 receptor accessory protein 4 72549 1428478_at 1.07E-03 1.69E-01 1.56 Nup160 nucleoporin 160 59015 1444892_at 3.57E-03 3.46E-01 1.57 Slc35b2 solute carrier family 35, member B2 73836 1423927_at 4.83E-02 1.00E+00 1.57 DNA segment, Chr 3, Wayne State D3Wsu106e University 106, expressed 28011 1457626_at 2.17E-02 8.56E-01 1.57 Rdh18 retinol dehydrogenase 18 380674 1445728_at 1.88E-02 7.94E-01 1.57 Exosc5 exosome component 5 27998 1417167_at 2.22E-04 5.98E-02 1.57 serine (or cysteine) peptidase Serpinf1 inhibitor, clade F, member 1 20317 1416168_at 8.84E-03 5.80E-01 1.58 Endod1 endonuclease domain containing 1 71946 1426540_at 4.49E-02 1.00E+00 1.58 --- Transcribed locus --- 1443307_at 2.89E-03 3.11E-01 1.58

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Anhang

--- Transcribed locus --- 1441628_at 3.08E-03 3.19E-01 1.58 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, type Bdh2 2 69772 1453011_at 1.24E-02 6.69E-01 1.58 Fa2h fatty acid 2-hydroxylase 338521 1426960_a_at 3.10E-04 7.47E-02 1.58 sterile alpha motif domain containing Samd8 8 67630 1458408_at 2.29E-02 8.67E-01 1.59 Psrc1 proline/serine-rich coiled-coil 1 56742 1425416_s_at 3.31E-02 9.84E-01 1.59 ------1440958_at 8.40E-04 1.41E-01 1.59 ------1459563_x_at 2.49E-04 6.49E-02 1.59 Clcn6 chloride channel 6 26372 1422314_at 3.77E-02 1.00E+00 1.59 serine/threonine kinase 3 (Ste20, Stk3 yeast homolog) 56274 1418513_at 1.37E-02 7.06E-01 1.59 calcium/calmodulin-dependent protein Camk1 kinase I 52163 1417605_s_at 3.21E-02 9.78E-01 1.59 ------1447119_at 3.78E-03 3.58E-01 1.59 Ttc9 tetratricopeptide repeat domain 9 69480 1455649_at 1.88E-02 7.94E-01 1.59 phosphatidylinositol transfer protein, Pitpnm2 membrane-associated 2 19679 1419757_at 4.64E-03 4.03E-01 1.59 receptor (TNFRSF)-interacting serine- Ripk1 threonine kinase 1 19766 1439273_at 3.56E-03 3.46E-01 1.59 6330500D04Rik RIKEN cDNA 6330500D04 gene 193385 1458202_at 2.70E-02 9.18E-01 1.59 Ccdc49 coiled-coil domain containing 49 67480 1428759_s_at 1.08E-02 6.34E-01 1.59 protein tyrosine phosphatase, receptor Ptprd type, D 19266 1444492_at 3.12E-02 9.70E-01 1.60 Adenomatosis polyposis coli down- Apcdd1 regulated 1 494504 1443639_at 1.64E-02 7.63E-01 1.60 Small nucleolar RNA host gene (non- Snhg7 protein coding) 7 72091 1447484_x_at 7.17E-03 5.15E-01 1.60 zinc finger with KRAB and SCAN domains Zkscan1 1 74570 1447944_at 1.52E-06 1.67E-03 1.60 cAMP responsive element binding Creb3l4 protein 3-like 4 78284 1424218_a_at 3.11E-02 9.69E-01 1.60 9030624J02Rik RIKEN cDNA 9030624J02 gene 71517 1432304_a_at 1.77E-02 7.86E-01 1.60 Fhl2 four and a half LIM domains 2 14200 1419184_a_at 2.99E-02 9.52E-01 1.60 Cpne8 copine VIII 66871 1430520_at 1.63E-03 2.13E-01 1.61 Odz2 odd Oz/ten-m homolog 2 (Drosophila) 23964 1420718_at 1.31E-02 6.89E-01 1.61 glycine amidinotransferase (L- Gatm arginine:glycine amidinotransferase) 67092 1423569_at 3.73E-02 1.00E+00 1.61 Qars glutaminyl-tRNA synthetase 97541 1456213_x_at 2.05E-02 8.31E-01 1.61 Ifi35 interferon-induced protein 35 70110 1459151_x_at 3.20E-03 3.26E-01 1.62 Na+/K+ transporting ATPase interacting Nkain1 1 67149 1419651_at 1.12E-03 1.73E-01 1.62 nuclear factor of kappa light Nfkbil2 polypeptide gene enhancer in B-cells 72749 1428661_at 1.60E-05 8.88E-03 1.62 inhibitor-lik EG328825 ribosomal protein L11 1000405 1448773_at 3.52E-02 1.00E+00 1.62 solute carrier family 2 (facilitated Slc2a4 glucose transporter), member 4 20528 1415958_at 3.88E-02 1.00E+00 1.62 Gimap4 GTPase, IMAP family member 4 107526 1424375_s_at 4.77E-02 1.00E+00 1.62 1700027J05Rik RIKEN cDNA 1700027J05 gene 69440 1436140_at 4.17E-02 1.00E+00 1.63 ------1443191_at 7.89E-03 5.37E-01 1.63 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate Papss2 synthase 2 23972 1434510_at 2.83E-03 3.06E-01 1.63 Foxj1 forkhead box J1 15223 1425291_at 2.56E-02 9.04E-01 1.63 Cblb Casitas B-lineage lymphoma b 208650 1437304_at 8.52E-03 5.67E-01 1.64 --- Transcribed locus --- 1435409_at 4.24E-02 1.00E+00 1.64 Zbed3 zinc finger, BED domain containing 3 72114 1452088_at 3.16E-02 9.71E-01 1.64 Nhedc2 Na+/H+ exchanger domain containing 2 97086 1439995_at 2.49E-02 8.95E-01 1.65 5830405M20Rik RIKEN cDNA 5830405M20 gene 74749 1431221_at 1.04E-04 3.39E-02 1.65 Troap trophinin associated protein 78733 1453370_at 5.34E-05 2.11E-02 1.65 0610037L13Rik RIKEN cDNA 0610037L13 gene 74098 1429879_at 3.02E-03 3.16E-01 1.65 solute carrier family 39 (metal ion Slc39a6 transporter), member 6 106957 1424675_at 2.01E-02 8.24E-01 1.65 --- Transcribed locus --- 1458640_at 4.60E-04 1.00E-01 1.65 Olfml1 olfactomedin-like 1 244198 1455663_at 2.24E-02 8.65E-01 1.65

LOC674761 myosin, heavy polypeptide 7, cardiac 140781 1448553_at 3.19E-02 9.75E-01 1.66 Myh7 muscle, beta 674761 Cep250 centrosomal protein 250 16328 1421512_at 1.92E-02 8.03E-01 1.66 Atp13a4 ATPase type 13A4 224079 1438707_at 2.10E-02 8.38E-01 1.67 Jmjd4 jumonji domain containing 4 194952 1435915_at 1.38E-02 7.07E-01 1.67 1700012H17Rik RIKEN cDNA 1700012H17 gene 242297 1440359_at 1.44E-02 7.19E-01 1.67 Heatr6 HEAT repeat containing 6 217026 1424687_at 3.24E-04 7.74E-02 1.67

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Anhang

Nalcn sodium leak channel, non-selective 675405 1448083_at 3.78E-05 1.64E-02 1.67 Zdhhc14 zinc finger, DHHC domain containing 14 224454 1438151_x_at 1.45E-03 2.02E-01 1.67 THAP domain containing, apoptosis Thap2 associated protein 2 66816 1421177_at 1.24E-03 1.84E-01 1.68 Frzb frizzled-related protein 20378 1448424_at 2.73E-02 9.18E-01 1.68 cold shock domain containing C2, RNA Csdc2 binding 105859 1437841_x_at 1.39E-03 1.97E-01 1.68 cytochrome P450, family 20, subfamily Cyp20a1 A, polypeptide 1 77951 1430452_at 3.93E-03 3.64E-01 1.68 Unc13c unc-13 homolog C (C. elegans) 208898 1455304_at 4.90E-04 1.04E-01 1.68 Rad18 RAD18 homolog (S. cerevisiae) 58186 1451928_a_at 6.62E-05 2.40E-02 1.68 Etnk1 ethanolamine kinase 1 75320 1433515_s_at 1.17E-02 6.58E-01 1.68 1-acylglycerol-3-phosphate O- Agpat3 acyltransferase 3 28169 1433818_at 5.35E-03 4.43E-01 1.68 amyloid beta (A4) precursor protein Apba1 binding, family A, member 1 319924 1455369_at 8.56E-03 5.68E-01 1.68 sodium channel, voltage-gated, type Scn2a1 II, alpha 1 110876 1445259_at 2.26E-03 2.65E-01 1.69 Zfp64 zinc finger protein 64 22722 1438140_a_at 3.73E-03 3.55E-01 1.69 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 2 Atp1a2 polypeptide 98660 1452308_a_at 5.08E-04 1.06E-01 1.69 Atf6 activating transcription factor 6 226641 1456021_at 1.71E-03 2.18E-01 1.69 Plp1 proteolipid protein (myelin) 1 18823 1425467_a_at 3.76E-02 1.00E+00 1.69 Ephb4 Eph receptor B4 13846 1449845_a_at 2.54E-02 9.01E-01 1.69 Sae1 SUMO1 activating enzyme subunit 1 56459 1430022_at 6.35E-07 8.95E-04 1.70 Hic1 hypermethylated in cancer 1 15248 1449226_at 2.82E-02 9.26E-01 1.70 Cpne8 copine VIII 66871 1430521_s_at 3.54E-04 8.28E-02 1.70 ------1440425_at 1.68E-02 7.66E-01 1.70 Spata6 spermatogenesis associated 6 67946 1418650_at 1.39E-04 4.23E-02 1.70 --- Transcribed locus --- 1443626_at 1.06E-03 1.68E-01 1.70 Col6a2 collagen, type VI, alpha 2 12834 1426947_x_at 4.40E-03 3.91E-01 1.70 Dlg7 discs, large homolog 7 (Drosophila) 218977 1438811_at 7.67E-04 1.36E-01 1.70 C-type lectin domain family 1, member Clec1b b 56760 1421182_at 2.29E-02 8.67E-01 1.71 4833424O15Rik RIKEN cDNA 4833424O15 gene 75769 1429249_at 6.94E-03 5.09E-01 1.71 Klhl25 kelch-like 25 (Drosophila) 207952 1425192_at 9.19E-03 5.91E-01 1.71 Rad51l1 RAD51-like 1 (S. cerevisiae) 19363 1421430_at 1.48E-03 2.04E-01 1.71 EG544888 predicted gene, EG544888 544888 1436685_at 5.11E-04 1.06E-01 1.72 --- Transcribed locus --- 1456952_at 6.77E-04 1.24E-01 1.72 ATP-binding cassette, sub-family C Abcc4 (CFTR/MRP), member 4 239273 1443870_at 5.46E-03 4.47E-01 1.72 6330416G13Rik RIKEN cDNA 6330416G13 gene 230279 1426315_a_at 7.48E-03 5.24E-01 1.72 Osbpl3 oxysterol binding protein-like 3 71720 1438724_at 9.33E-03 5.94E-01 1.72 Rnf20 ring finger protein 20 109331 1452361_at 1.95E-08 8.00E-05 1.72 --- Transcribed locus --- 1440374_at 1.49E-02 7.30E-01 1.72 S100a1 S100 calcium binding protein A1 20193 1419814_s_at 6.21E-04 1.18E-01 1.72 A230106D06Rik RIKEN cDNA A230106D06 gene 232785 1434857_at 5.45E-03 4.47E-01 1.73 ankyrin repeat domain 13 family, Ankrd13d member D 68423 1452965_at 3.25E-02 9.83E-01 1.73 Nfasc neurofascin 269116 1456068_at 1.24E-02 6.69E-01 1.73 Man1c1 mannosidase, alpha, class 1C, member 1 230815 1436193_at 1.42E-04 4.28E-02 1.73 --- Transcribed locus --- 1458669_at 2.92E-02 9.39E-01 1.73 9130005N14Rik RIKEN cDNA 9130005N14 gene 68303 1448648_at 1.13E-03 1.73E-01 1.74 DNA segment, Chr 4, Wayne State D4Wsu114e University 114, expressed 28010 1417120_at 6.24E-03 4.81E-01 1.74 --- Transcribed locus --- 1459747_at 4.50E-02 1.00E+00 1.74 --- CDNA clone IMAGE:5029795 --- 1427600_at 1.66E-03 2.16E-01 1.74 transformation related protein 53 Trp53rk regulating kinase 381406 1419682_a_at 2.92E-02 9.39E-01 1.74 BB187676 expressed sequence BB187676 103517 1455716_at 5.17E-03 4.37E-01 1.74 glutamine fructose-6-phosphate Gfpt2 transaminase 2 14584 1418753_at 7.73E-03 5.30E-01 1.74 2810003C17Rik RIKEN cDNA 2810003C17 gene 108897 1424263_at 2.60E-03 2.87E-01 1.74 signal-induced proliferation- Sipa1l1 associated 1 like 1 217692 1440647_at 3.29E-03 3.29E-01 1.75 Emp2 epithelial membrane protein 2 13731 1433670_at 1.49E-02 7.30E-01 1.75 Cd59a CD59a antigen 12509 1429830_a_at 2.23E-02 8.65E-01 1.75 Cryl1 crystallin, lambda 1 68631 1447112_s_at 1.21E-02 6.66E-01 1.75 Rai1 retinoic acid induced 1 19377 1420454_at 4.30E-04 9.50E-02 1.75

169

Anhang

ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 2 Atp1a2 polypeptide 98660 1427465_at 1.58E-02 7.47E-01 1.75 DNA segment, Chr 11, Brigham & Women's D11Bwg0517e Genetics 0517 expressed 52897 1456149_at 5.46E-03 4.47E-01 1.75 2310061F22Rik RIKEN cDNA 2310061F22 gene 234839 1428350_at 7.73E-03 5.30E-01 1.75 potassium voltage-gated channel, Kcna4 shaker-related subfamily, member 4 16492 1438613_at 6.60E-06 4.58E-03 1.76 --- Transcribed locus --- 1419836_at 4.67E-02 1.00E+00 1.76 achaete-scute complex homolog 1 Ascl1 (Drosophila) 17172 1450164_at 2.18E-03 2.59E-01 1.76 Rhesus blood group-associated C Rhcg glycoprotein 56315 1417362_at 3.03E-03 3.16E-01 1.76 Kif20b kinesin family member 20B 240641 1440924_at 8.07E-04 1.39E-01 1.76 Etv5 ets variant gene 5 104156 1428142_at 2.45E-02 8.90E-01 1.77 4931406H21Rik RIKEN cDNA 4931406H21 gene 77592 1432572_at 4.89E-04 1.04E-01 1.77 Wif1 Wnt inhibitory factor 1 24117 1425425_a_at 2.96E-03 3.15E-01 1.77 Etv1 ets variant gene 1 14009 1450684_at 1.77E-02 7.84E-01 1.78 Coro7 coronin 7 78885 1428150_at 1.32E-02 6.92E-01 1.78 Lpar4 lysophosphatidic acid receptor 4 78134 1452424_at 2.51E-03 2.82E-01 1.78 Apex2 apurinic/apyrimidinic endonuclease 2 77622 1425954_a_at 1.45E-02 7.22E-01 1.78 Gm1060 gene model 1060, (NCBI) 381738 1455279_at 1.84E-04 5.21E-02 1.78 Cotl1 coactosin-like 1 (Dictyostelium) 72042 1416001_a_at 4.91E-03 4.22E-01 1.79 Dach2 dachshund 2 (Drosophila) 93837 1449823_at 5.62E-03 4.55E-01 1.79 Trf transferrin 22041 1425546_a_at 1.48E-02 7.28E-01 1.79 Rasgrp1 RAS guanyl releasing protein 1 19419 1434295_at 4.59E-02 1.00E+00 1.79 1190002F15Rik RIKEN cDNA 1190002F15 gene 381822 1441757_at 2.13E-08 8.00E-05 1.80 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, Dnajc1 member 1 13418 1420501_at 1.14E-03 1.73E-01 1.80 Syt5 synaptotagmin V 53420 1422531_at 1.20E-03 1.79E-01 1.80 signal transducer and activator of Stat4 transcription 4 20849 1448713_at 2.03E-03 2.47E-01 1.80 leucine-rich repeat LGI family, member Lgi4 4 243914 1434121_at 7.31E-03 5.18E-01 1.81 Bnc2 basonuclin 2 242509 1438861_at 3.08E-02 9.63E-01 1.81 Cd248 CD248 antigen, endosialin 70445 1417439_at 4.02E-04 8.97E-02 1.82 guanine nucleotide binding protein, Gna12 alpha 12 14673 1421026_at 2.08E-02 8.33E-01 1.83 Nfia Nuclear factor I/A 18027 1446742_at 7.16E-04 1.30E-01 1.83 ankyrin repeat and LEM domain Ankle1 containing 1 234396 1443978_at 1.46E-03 2.02E-01 1.83 Ankrd34a ankyrin repeat domain 34A 545554 1435809_at 2.35E-05 1.22E-02 1.84 Ftl2 ferritin light chain 2 14325 1422301_at 5.88E-04 1.15E-01 1.85 Adk adenosine kinase 11534 1449641_at 5.64E-05 2.16E-02 1.86 C-type lectin domain family 14, member Clec14a a 66864 1419467_at 7.98E-04 1.39E-01 1.86 minichromosome maintenance deficient Mcm5 5, cell division cycle 46 (S. 17218 1459658_at 1.61E-03 2.12E-01 1.87 cerevisiae) solute carrier family 13 (sodium- Slc13a3 dependent dicarboxylate transporter), 114644 1438377_x_at 1.32E-04 4.07E-02 1.87 member 3 AA407175 expressed sequence AA407175 105070 1459578_at 3.65E-02 1.00E+00 1.88 pleckstrin homology domain containing, Plekha8 family A (phosphoinositide binding 231999 1436128_at 2.80E-06 2.58E-03 1.88 specif cytochrome P450, family 2, subfamily Cyp2j9 j, polypeptide 9 74519 1424677_at 1.54E-03 2.07E-01 1.88 Xaf1 XIAP associated factor 1 327959 1443621_at 7.36E-03 5.20E-01 1.89 Omg oligodendrocyte myelin glycoprotein 18377 1418212_at 6.50E-08 1.74E-04 1.89 --- Transcribed locus --- 1444052_at 1.62E-03 2.12E-01 1.89 Nptx2 neuronal pentraxin 2 53324 1420720_at 5.04E-04 1.06E-01 1.90 Lmcd1 LIM and cysteine-rich domains 1 30937 1424596_s_at 4.61E-03 4.02E-01 1.90 nuclear factor of activated T-cells, Nfatc4 cytoplasmic, calcineurin-dependent 4 73181 1454369_a_at 3.50E-02 1.00E+00 1.91 2810039B14Rik RIKEN cDNA 2810039B14 gene 72665 1453248_at 6.70E-05 2.40E-02 1.91 1110065P19Rik RIKEN cDNA 1110065P19 gene 68919 1452893_s_at 4.68E-03 4.06E-01 1.91 E2f4 E2F transcription factor 4 104394 1451480_at 3.47E-02 1.00E+00 1.92 Ccnjl cyclin J-like 380694 1459978_x_at 2.15E-03 2.58E-01 1.92 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 2 Atp1a2 polypeptide 98660 1434893_at 6.00E-03 4.71E-01 1.93 glutamyl-tRNA synthetase 2 Ears2 (mitochondrial)(putative) 67417 1451471_at 4.29E-04 9.50E-02 1.94 hypoxia inducible factor 3, alpha Hif3a subunit 53417 1425428_at 2.52E-06 2.48E-03 1.94 Rab3a RAB3A, member RAS oncogene family 19339 1459980_x_at 1.01E-03 1.64E-01 1.94

170

Anhang

6330406I15Rik RIKEN cDNA 6330406I15 gene 70717 1452244_at 5.52E-05 2.13E-02 1.95 Epb4.1 erythrocyte protein band 4.1 269587 1430369_at 5.55E-06 4.10E-03 1.96 synuclein, alpha interacting protein Sncaip (synphilin) 67847 1430463_a_at 1.26E-06 1.54E-03 1.96 Sox3 SRY-box containing gene 3 20675 1450485_at 3.49E-03 3.43E-01 1.97 2610016C23Rik RIKEN cDNA 2610016C23 gene 71804 1432013_a_at 3.03E-03 3.16E-01 1.98 Rps6kl1 ribosomal protein S6 kinase-like 1 238323 1426466_s_at 1.16E-02 6.56E-01 2.00 Rps17 ribosomal protein S17 665772 1438502_x_at 2.77E-06 2.58E-03 2.00 2900075N08Rik RIKEN cDNA 2900075N08 gene 72991 1453756_at 1.93E-03 2.39E-01 2.00 phosphatidylinositol membrane- Pitpnm1 associated 1 18739 1438854_x_at 8.55E-04 1.43E-01 2.01 EG666892 predicted gene, EG666892 666892 1447550_at 4.23E-03 3.83E-01 2.02 Inhba inhibin beta-A 16323 1422053_at 3.38E-04 7.97E-02 2.04 ubiquitously transcribed Uty tetratricopeptide repeat gene, Y 22290 1422247_a_at 3.17E-02 9.73E-01 2.04 chromosome A930037G23Rik RIKEN cDNA A930037G23 gene 320678 1454628_at 1.20E-03 1.79E-01 2.05 Myristoylated alanine rich protein Marcks kinase C substrate 17118 1430311_at 1.07E-04 3.49E-02 2.05 Rap guanine nucleotide exchange factor Rapgef3 (GEF) 3 223864 1424471_at 2.67E-05 1.33E-02 2.05 Msrb3 methionine sulfoxide reductase B3 320183 1439151_at 1.72E-04 5.02E-02 2.05 glutamate receptor, ionotropic, AMPA4 Gria4 (alpha 4) 14802 1435722_at 4.02E-05 1.68E-02 2.07 high density lipoprotein (HDL) binding Hdlbp protein 110611 1415988_at 1.86E-02 7.94E-01 2.08 Bmp7 bone morphogenetic protein 7 12162 1432410_a_at 1.81E-04 5.18E-02 2.10 Etv5 ets variant gene 5 104156 1450082_s_at 4.50E-03 3.95E-01 2.11 Tmem179b transmembrane protein 179B 67706 1455874_at 6.14E-04 1.17E-01 2.11 peptidylprolyl isomerase (cyclophilin) Ppil5 like 5 69706 1427506_at 1.12E-04 3.57E-02 2.14 3300002P09Rik RIKEN cDNA 3300002P09 gene 70246 1453863_at 8.72E-05 2.96E-02 2.16 RNA pseudouridylate synthase domain Rpusd2 containing 2 271842 1453138_at 1.06E-05 6.84E-03 2.16 ------1459817_at 1.04E-06 1.34E-03 2.19 Fgf17 fibroblast growth factor 17 14171 1421523_at 2.59E-02 9.09E-01 2.20 ------1458823_at 1.09E-04 3.50E-02 2.20 Fkrp fukutin related protein 243853 1437536_at 1.98E-02 8.15E-01 2.22 --- Transcribed locus --- 1459072_at 1.42E-02 7.13E-01 2.22 Arsg arylsulfatase G 74008 1452277_at 6.13E-03 4.76E-01 2.24 mitogen-activated protein kinase 8 Mapk8ip3 interacting protein 3 30957 1416437_a_at 8.24E-04 1.40E-01 2.24 catechol-O-methyltransferase domain Comtd1 containing 1 69156 1428635_at 4.00E-07 6.44E-04 2.25 GTP binding protein (gene Gem overexpressed in skeletal muscle) 14579 1426063_a_at 1.79E-06 1.90E-03 2.27 --- Transcribed locus --- 1446982_at 5.99E-04 1.16E-01 2.28 Grm1 glutamate receptor, metabotropic 1 14816 1425700_at 5.85E-06 4.26E-03 2.31 Tekt2 tektin 2 24084 1418484_at 2.95E-04 7.24E-02 2.31 Ccnb1 Cyclin B1 268697 1419944_at 6.07E-04 1.17E-01 2.40 --- Transcribed locus --- 1456820_at 4.66E-04 1.01E-01 2.48 zinc binding alcohol dehydrogenase, Zadh1 domain containing 1 77219 1429474_at 4.58E-05 1.88E-02 2.48 Zfp618 zinc fingerprotein 618 72701 1453247_at 1.43E-05 8.37E-03 2.52 Troap trophinin associated protein 78733 1433790_at 1.31E-03 1.90E-01 2.56 hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, Hsd3b2 3 beta- and steroid delta-isomerase 2 15497 1460232_s_at 2.31E-06 2.37E-03 2.57 Transcribed locus, weakly similar to --- NP_001034645.1 RAD54 homolog B [Mus --- 1447488_at 3.49E-05 1.57E-02 2.62 musculu Ptk7 PTK7 protein tyrosine kinase 7 71461 1452589_at 5.95E-04 1.16E-01 2.62 growth factor receptor bound protein Grb10 10 14783 1425457_a_at 5.26E-05 2.11E-02 2.78 Ipo7 importin 7 233726 1458165_at 3.02E-08 1.05E-04 2.85 solute carrier family 16 Slc16a3 (monocarboxylic acid transporters), 80879 1449005_at 2.81E-05 1.38E-02 2.91 member 3 Nelf nasal embryonic LHRH factor 56876 1439398_x_at 3.63E-07 6.07E-04 3.06 2610021K21Rik RIKEN cDNA 2610021K21 gene 78767 1431667_s_at 4.41E-07 6.85E-04 3.06 Gfap glial fibrillary acidic protein 14580 1426508_at 3.40E-06 3.01E-03 3.62 Ptchd1 patched domain containing 1 211612 1457649_x_at 1.51E-07 3.25E-04 5.86

171

Anhang

8.7 Gene Ontology-Analysen der in MYST4-defizienten Modellsystemen über Expressionsarray differentiell exprimiert gefundenen Gene

8.7.1 Gewebespezifische Expression von signifikant differentiell exprimierten Genen im humanen MYST4-defizienten Modellsystem (HEK293/HeLa MYST4 siRNA [FC < -1.5 oder > 1.5])

Uniprot-Term Observed genes % p-value* Benjamini* Brain 227 29.7 6.20E-08 4.60E-05 Placenta 108 14.1 8.70E-06 3.30E-03 Epithelium 79 10.3 5.30E-05 1.30E-02 Liver 58 7.6 1.50E-02 7.10E-01 Skin 57 7.5 3.00E-03 3.60E-01 Kidney 48 6.3 6.50E-03 5.00E-01 Bone marrow 34 4.5 5.80E-05 1.10E-02 Pancreas 33 4.3 1.40E-02 7.20E-01 Muscle 27 3.5 4.10E-02 8.30E-01 Skeletal muscle 21 2.7 1.50E-02 6.40E-01 Other: T-cell 14 1.8 2.70E-02 7.50E-01 Platelet 14 1.8 3.70E-02 8.30E-01 Fetal kidney 10 1.3 6.20E-03 5.40E-01 Fibroblast 8 1.0 2.40E-02 7.60E-01 Urinary bladder 8 1.0 4.60E-02 8.50E-01 Foreskin 6 0.8 1.50E-02 6.70E-01 Aortic endothelium 4 0.5 2.00E-02 7.20E-01 Endometrial tumor 4 0.5 2.50E-02 7.50E-01 Uterus endothel 4 0.5 3.90E-02 8.30E-01 *p-values and Benjamini-Hochberg p-values were caclulated using the DAVID funtional annotation of Uniprot tissue expression

8.7.2 Subzelluläre Lokalisation (GO) der Genprodukte der signifikant differentiell exprimierten Gene im humanen MYST4-defizienten Modellsystem (HEK293/HeLa MYST4 siRNA [FC < -1.5 oder > 1.5])

GO-Term Observed genes % p-value* Benjamini* Cytoplasm 238 43.0 2,0E-7 5,7E-5 Nucleus 160 28.9 1,6E-2 4,3E-1 Endoplasmic reticulum 47 8.5 2,6E-5 2,5E-3 Golgi apparatus 31 5.6 9,9E-3 3,1E-1 Chromosome 23 4.2 2,4E-3 9,9E-2 Chromatin 16 2.9 6,4E-4 3,6E-2 Nucleosome 14 2.5 1,5E-7 6,7E-5 Actin cytoskeleton 12 2.2 1,6E-2 9,5E-2 Endosome 12 2.2 3,1E-2 6,3E-1 *p-values and Benjamini-Hochberg p-values were caclulated using the DAVID funtional annotation of GO Molecular Function Catagories

172

Anhang

8.7.3 Molekulare Funktion (GO) der Genprodukte der signifikant differentiell exprimierten Gene im humanen MYST4-defizienten Modellsystem (HEK293/HeLa MYST4 siRNA [FC < -1.5 oder > 1.5])

GO-Term Observed genes % p-value* Benjamini* Binding 403 40.8 1.00E-06 1.50E-03 Protein binding 256 25.9 1.10E-07 3.00E-04 Catalytic activity 184 18.6 4.50E-02 1.00E+00 Phosphotransferase activity 32 3.2 4.30E-02 1.00E+00 Transcription factor binding 32 3.2 4.60E-02 1.00E+00 Protein kinase activity 28 2.8 4.30E-02 1.00E+00 Serine/threonine kinase activity 21 2.1 2.60E-02 1.00E+00 GTPase activity 13 1.3 1.50E-02 1.00E+00 Ligase activity 12 1.2 4.60E-02 1.00E+00 Protein binding, bridging 7 0.7 3.50E-02 1.00E+00 *p-values and Benjamini-Hochberg p-values were caclulated using the DAVID funtional annotation of GO Molecular Function Catagories

8.7.4 Subzelluläre Lokalisation (GO) der Genprodukte der signifikant differentiell exprimierten Gene im murinem Qkfgt/gt-Modell: Adulter dorsaler Cortex [FC < -1.5 oder > 1.5]

GO-Term Observed genes % p-value* Benjamini* Cytoplasm 104 43.7 1.05E-06 2.06E-04 Nucleus 63 26.5 6.37E-02 8.73E-01 Endoplasmic reticulum 47 19.7 2,6E-5 2,5E-3 Golgi apparatus 13 5.5 6.90E-02 8.74E-01 Actin cytoskeleton 5 2.1 2.90E-01 9.99E-01 Chromosome 2 0.8 9.89E-01 1.00 Chromatin 2 0.8 8.88E-01 1.00 Endosome 2 0.8 8.88E-01 1.00 *p-values and Benjamini-Hochberg p-values were caclulated using the DAVID funtional annotation of GO Molecular Function Catagories

8.7.5 Molekulare Funktion (GO) der Genprodukte der signifikant differentiell exprimierten Gene im murinem Qkfgt/gt-Modell: Adulter dorsaler Cortex [FC < - 1.5 oder > 1.5]

GO-Term Observed genes % p-value* Benjamini* Binding 39 40.2 1.9E-6 5,0E-3 Protein binding 26 26.8 1.3E-4 1,6E-1 Metal ion binding 16 16.5 1.9E-2 1,0E0 Ion binding 16 16.5 2.3E-2 1,0E0 *p-values and Benjamini-Hochberg p-values were caclulated using the DAVID funtional annotation of GO Molecular Function Catagories

173

Anhang

8.7.6 Subzelluläre Lokalisation (GO) der Genprodukte der signifikant differentiell exprimierten Gene im murinem Qkfgt/gt-Modell: E12.5 dorsales Telencephalon [FC < -1.5 oder > 1.5]

GO-Term Observed genes % p-value* Benjamini* Cytoplasm 114 43.7 2.76E-02 9.13E-01 Nucleus 96 26.5 1.30E-03 6.41E-01 Golgi apparatus 15 19.7 1.51E-01 9.96E-01 Endoplasmic reticulum 14 5.5 5.06E-01 1.00E+00 Extracellular matrix 11 2.1 3.67E-02 9.13E-01 Chromosome 10 0.8 1.64E-01 1.00 Endosome 5 0.8 3.54E-01 1.00 Actin cytoskeleton 4 7.32E-01 1.00 Chromatin 4 0.8 5.81E-01 1.00 *p-values and Benjamini-Hochberg p-values were caclulated using the DAVID funtional annotation of GO Molecular Function Catagories

8.7.7 Molekulare Funktion (GO) der Genprodukte der signifikant differentiell exprimierten Gene im murinem Qkfgt/gt-Modell: E12.5 dorsales Telencephalon [FC < -1.5 oder > 1.5]

GO-Term Observed genes % p-value* Benjamini* Binding 337 56.1 3.45E-07 6.21E-06 Catalytic activity 161 26.8 3.51E-02 1.49E-01 Transporter activity 53 8.8 2.00E-03 1.78E-02 Transcription regulator activity 50 8.3 2.54E-03 1.51E-02 *p-values and Benjamini-Hochberg p-values were caclulated using the DAVID funtional annotation of GO Molecular Function Catagories

174

Anhang

8.7.8 Über Pathway Express signifikant angereichert gefundene KEGG-Signalwege (Top 20) für die im humanen Modell (HEK293/HeLa; MYST4 siRNA) differentiell exprimierten Gene [p < 0.05; FC < -1.5 or > 1.5]

Impact No. genes No. input genes % Pathwaygenes p-value KEGG pathway name Rank factor in pathway in pathway in input uncorrected corrected gamma corrected gamma Phosphatidylinositol signaling system* 1 48.9 77 2 2.6 4.63E-02 4.63E-02 2.81E-20 2.81E-20 Circadian rhythm* 2 22.8 13 1 7.7 5.64E-02 5.64E-02 2.95E-09 2.95E-09 Insulin signaling pathway* 3 20.3 138 9 6.5 9.71E-09 9.71E-09 3.20E-08 3.20E-08 MAPK signaling pathway* 4 19.9 265 11 4.2 2.49E-08 2.49E-08 4.94E-08 4.94E-08 Wnt signaling pathway* 5 19.4 148 9 6.1 1.81E-08 1.81E-08 7.56E-08 7.56E-08 Melanoma* 6 19.3 71 7 9.9 2.90E-08 2.90E-08 8.82E-08 8.82E-08 Apoptosis* 7 18.0 84 7 8.3 9.43E-08 9.43E-08 2.93E-07 2.93E-07 Regulation of actin cytoskeleton* 8 17.1 211 9 4.3 3.47E-07 3.47E-07 6.94E-07 6.94E-07 GnRH signaling pathway* 9 16.8 97 7 7.2 2.55E-07 2.55E-07 9.11E-07 9.11E-07 Glioma* 10 16.1 64 6 9.4 4.03E-07 4.03E-07 1.71E-06 1.71E-06 Glycan structures - biosynthesis 1* 11 14.6 122 7 5.7 1.22E-06 1.22E-06 6.90E-06 6.90E-06 Colorectal cancer* 12 14.4 84 6 7.1 2.03E-06 2.03E-06 8.74E-06 8.74E-06 Gap junction* 13 14.2 96 5 5.2 6.30E-05 6.30E-05 1.06E-05 1.06E-05 Cell Communication* 14 14.2 138 7 5.1 1.96E-06 1.96E-06 1.08E-05 1.08E-05 Adherens junction* 15 13.8 75 2 2.7 4.41E-02 4.41E-02 1.51E-05 1.51E-05 Pancreatic cancer* 16 12.5 73 5 6.8 1.86E-05 1.86E-05 5.17E-05 5.17E-05 Focal adhesion* 17 12.5 199 7 3.5 2.85E-05 2.85E-05 5.22E-05 5.22E-05 Fc epsilon RI signaling pathway* 18 12.4 77 5 6.5 2.26E-05 2.26E-05 5.31E-05 5.31E-05 ErbB signaling pathway* 19 12.1 87 5 5.7 4.35E-05 4.35E-05 7.11E-05 7.11E-05 Endometrial cancer* 20 11.8 52 4 7.7 8.47E-05 8.47E-05 9.89E-05 9.89E-05

175

Anhang

8.7.9 Über DAVID functional annotation signifikant angereichert gefundene KEGG-Signalwege für die im humanen Modell (HEK293/HeLa; MYST4 siRNA) differentiell exprimierten Gene [p < 0.05; FC < -1.5 or > 1.5]

KEGG pathway name p-value Fold enrichment Melanoma* 2.75E-03 4.86 Insulin signaling pathway* 5.98E-03 3.22 Apoptosis* 7.30E-03 3.99 Glioma* 7.48E-03 4.79 Wnt signaling pathway* 1.20E-02 2.85 GnRH signaling pathway* 1.24E-02 3.57 Colorectal cancer* 3.01E-02 3.38 Regulation of actin cytoskeleton* 3.11E-02 2.24 Glycan structures - biosynthesis 1* 3.65E-02 2.79 MAPK signaling pathway* 3.92E-02 2.03

176

Anhang

8.7.10 Über Pathway Express signifikant angereicherte KEGG-Signalwege (Top 20) für die im adulten dorsalen Cortex der Qkfgt/gt-Maus differentiell exprimiert gefundenen Gene [p < 0.05; FC < -1.5 or > 1.5]

Impact No. genes No. input genes % Pathwaygenes p-value KEGG pathway name Rank factor in pathway in pathway in input uncorrected corrected gamma corrected gamma Neuroactive ligand-receptor interaction* 1 27.1 256 11 4.3 5.80E-12 5.80E-12 4.93E-11 4.93E-11 MAPK signaling pathway* 2 21.5 258 9 3.5 9.84E-09 9.84E-09 1.08E-08 1.08E-08 Calcium signaling pathway* 3 17.9 185 7 3.8 1.71E-07 1.71E-07 3.10E-07 3.10E-07 Axon guidance* 4 17.0 128 6 4.7 6.12E-07 6.12E-07 7.58E-07 7.58E-07 Focal adhesion* 5 15.8 192 6 3.1 5.72E-06 5.72E-06 2.34E-06 2.34E-06 Cytokine-cytokine receptor interaction* 6 12.1 242 6 2.5 1.66E-05 1.66E-05 7.29E-05 7.29E-05 Jak-STAT signaling pathway* 7 11.9 151 5 3.3 2.06E-05 2.06E-05 9.04E-05 9.04E-05 Long-term potentiation* 8 11.2 66 3 4.5 5.35E-04 5.35E-04 1.65E-04 1.65E-04 Natural killer cell mediated cytotoxicity* 9 10.4 127 4 3.2 1.66E-04 1.66E-04 3.40E-04 3.40E-04 Wnt signaling pathway* 10 10.3 145 4 2.8 4.18E-04 4.18E-04 3.71E-04 3.71E-04 Renal cell carcinoma* 11 8.7 69 3 4.3 6.10E-04 6.10E-04 1.60E-03 1.60E-03 Basal cell carcinoma* 12 8.6 55 1 1.8 1.26E-01 1.26E-01 1.74E-03 1.74E-03 Type II diabetes mellitus* 13 8.3 46 1 2.2 1.04E-01 1.04E-01 2.32E-03 2.32E-03 Toll-like receptor signaling pathway* 14 7.9 101 3 3.0 1.61E-03 1.61E-03 3.33E-03 3.33E-03 Melanoma* 15 7.8 71 1 1.4 1.57E-01 1.57E-01 3.46E-03 3.46E-03 Tight junction* 16 7.7 135 3 2.2 3.75E-03 3.75E-03 4.03E-03 4.03E-03 Notch signaling pathway* 17 7.2 47 2 4.3 4.93E-03 4.93E-03 6.24E-03 6.24E-03 Regulation of actin cytoskeleton* 18 6.7 206 3 1.5 1.23E-02 1.23E-02 9.36E-03 9.36E-03 ECM-receptor interaction* 19 6.0 84 2 2.4 1.63E-02 1.63E-02 1.79E-02 1.79E-02 B cell receptor signaling pathway* 20 5.9 66 2 3.0 1.13E-02 1.13E-02 1.88E-02 1.88E-02

177

Anhang

8.7.11 Über DAVID functional annotation signifikant angereicherte KEGG-Signalwege für die im adulten dorsalen Cortex der Qkfgt/gt-Maus differentiell exprimiert gefundenen Gene [p < 0.05; FC < -1.5 or > 1.5]

KEGG pathway name p-value Fold enrichment Neuroactive ligand-receptor interaction* 4.45E-03 3.01 Axon guidance* 2.12E-02 3.66 Calcium signaling pathway* 2.21E-02 3.10 MAPK signaling pathway* 3.90E-02 2.44

178

Anhang

8.7.12 Über Pathway Express signifikant angereicherte KEGG-Signalwege (Top 45) für die im fetalen (E12.5) dorsalen Telencephalon der Qkfgt/gt-Maus differentiell exprimiert gefundenen Gene [p < 0.05; FC < -1.5 or > 1.5]

Impact No. genes No. input genes % Pathwaygenes p-value KEGG pathway name Rank factor in pathway in pathway in input uncorrected corrected gamma corrected gamma Phosphatidylinositol signaling system* 1 21.9 70 2 2.9 3.06E-02 3.06E-02 6.92E-09 6.92E-09 MAPK signaling pathway* 2 21.7 258 11 4.3 4.37E-09 4.37E-09 8.70E-09 8.70E-09 Insulin signaling pathway* 3 21.0 137 9 6.6 2.68E-09 2.68E-09 1.60E-08 1.60E-08 Adherens junction* 4 17.1 74 4 5.4 1.92E-04 1.92E-04 6.77E-07 6.77E-07 Melanogenesis* 5 14.9 98 6 6.1 2.34E-06 2.34E-06 5.35E-06 5.35E-06 Type II diabetes mellitus* 6 13.7 46 4 8.7 2.85E-05 2.85E-05 1.62E-05 1.62E-05 Wnt signaling pathway* 7 13.6 145 6 4.1 2.15E-05 2.15E-05 1.77E-05 1.77E-05 Focal adhesion* 8 11.3 192 6 3.1 8.70E-05 8.70E-05 1.59E-04 1.59E-04 Long-term depression* 9 11.1 76 4 5.3 2.13E-04 2.13E-04 1.83E-04 1.83E-04 Regulation of actin cytoskeleton* 10 10.6 206 6 2.9 1.23E-04 1.23E-04 2.83E-04 2.83E-04 Basal cell carcinoma* 11 10.5 55 3 5.5 1.30E-03 1.30E-03 3.13E-04 3.13E-04 Long-term potentiation* 12 10.0 66 3 4.5 2.11E-03 2.11E-03 5.11E-04 5.11E-04 Neurodegenerative Diseases* 13 9.9 29 3 10.3 1.95E-04 1.95E-04 5.69E-04 5.69E-04 Cytokine-cytokine receptor interaction* 14 9.6 242 6 2.5 2.41E-04 2.41E-04 7.30E-04 7.30E-04 Calcium signaling pathway* 15 9.5 185 5 2.7 5.28E-04 5.28E-04 8.12E-04 8.12E-04 T cell receptor signaling pathway* 16 9.4 105 4 3.8 4.85E-04 4.85E-04 8.57E-04 8.57E-04 Tight junction* 17 9.3 135 4 3.0 1.60E-03 1.60E-03 9.28E-04 9.28E-04 Base excision repair* 18 9.2 36 3 8.3 2.62E-04 2.62E-04 1.06E-03 1.06E-03 ErbB signaling pathway* 19 9.1 87 4 4.6 3.44E-04 3.44E-04 1.10E-03 1.10E-03 DNA replication* 20 9.0 34 3 8.8 3.15E-04 3.15E-04 1.23E-03 1.23E-03 Melanoma* 21 8.6 71 3 4.2 2.60E-03 2.60E-03 1.82E-03 1.82E-03 Cell cycle* 22 8.2 109 4 3.7 8.51E-04 8.51E-04 2.56E-03 2.56E-03 Hedgehog signaling pathway* 23 7.8 53 3 5.7 1.11E-03 1.11E-03 3.62E-03 3.62E-03 TGF-beta signaling pathway* 24 7.5 89 3 3.4 4.50E-03 4.50E-03 4.65E-03 4.65E-03 GnRH signaling pathway* 25 7.5 95 3 3.2 5.96E-03 5.96E-03 4.78E-03 4.78E-03

179

Anhang

Glycan structures - biosynthesis 2* 26 7.5 58 3 5.2 1.44E-03 1.44E-03 4.90E-03 4.90E-03 Gap junction* 27 7.4 92 2 2.2 4.46E-02 4.46E-02 4.99E-03 4.99E-03 Apoptosis* 28 7.4 81 3 3.7 3.93E-03 3.93E-03 5.24E-03 5.24E-03 Ubiquitin mediated proteolysis* 29 7.4 132 4 3.0 1.64E-03 1.64E-03 5.24E-03 5.24E-03 Neuroactive ligand-receptor interaction* 30 7.2 256 5 2.0 1.93E-03 1.93E-03 5.88E-03 5.88E-03 Prostate cancer* 31 7.1 88 3 3.4 4.96E-03 4.96E-03 6.87E-03 6.87E-03 ECM-receptor interaction* 32 6.9 84 3 3.6 3.80E-03 3.80E-03 8.22E-03 8.22E-03 Jak-STAT signaling pathway* 33 6.5 151 3 2.0 1.65E-02 1.65E-02 1.12E-02 1.12E-02 Hematopoietic cell lineage* 34 6.5 85 3 3.5 4.21E-03 4.21E-03 1.18E-02 1.18E-02 Natural killer cell mediated cytotoxicity* 35 6.3 127 3 2.4 9.88E-03 9.88E-03 1.29E-02 1.29E-02 Homologous recombination* 36 6.3 26 2 7.7 4.61E-03 4.61E-03 1.33E-02 1.33E-02 Taste transduction* 37 6.2 60 2 3.3 5.71E-03 5.71E-03 1.41E-02 1.41E-02 Huntington''s disease* 38 6.2 28 2 7.1 5.33E-03 5.33E-03 1.46E-02 1.46E-02 Renal cell carcinoma* 39 6.0 69 2 2.9 2.91E-02 2.91E-02 1.74E-02 1.74E-02 VEGF signaling pathway* 40 5.7 72 2 2.8 3.23E-02 3.23E-02 2.20E-02 2.20E-02 Glioma* 41 5.7 65 2 3.1 2.52E-02 2.52E-02 2.32E-02 2.32E-02 Cell adhesion molecules (CAMs)* 42 5.6 157 3 1.9 1.38E-02 1.38E-02 2.42E-02 2.42E-02 Dentatorubropallidoluysian atrophy (DRPLA)* 43 5.5 15 1 6.7 5.70E-02 5.70E-02 2.58E-02 2.58E-02 Nucleotide excision repair* 44 5.4 41 2 4.9 1.12E-02 1.12E-02 2.94E-02 2.94E-02 Acute myeloid leukemia* 45 5.3 58 2 3.4 2.09E-02 2.09E-02 3.14E-02 3.14E-02

180

Anhang

8.7.13 Über DAVID functional annotation signifikant angereicherte KEGG-Signalwege für die im fetalen (E12.5) dorsalen Telencephalon der Qkfgt/gt-Maus differentiell exprimiert gefundenen Gene [p < 0.05; FC < -1.5 or > 1.5]

KEGG pathway name p-value Fold enrichment MAPK signaling pathway* 3.15E-04 1.77 Insulin signaling pathway* 2.18E-03 1.94 Type II diabetes mellitus* 7.64E-03 2.59 Pancreatic cancer* 1.43E-02 2.08 Glycolysis / Gluconeogenesis* 1.81E-02 2.29 Colorectal cancer* 1.96E-02 1.94 Wnt signaling pathway* 2.28E-02 1.65 Acute myeloid leukemia* 3.27E-02 2.09 Fc epsilon RI signaling pathway* 3.91E-02 1.88 Cell cycle* 3.91E-02 1.69 GnRH signaling pathway* 3.97E-02 1.77

181

Anhang

8.8 Gene Ontology-Analysen der im humanen Modellsystem über ChIP mit einen gegen MYST4 gerichteten Antikörper angereichert gefundenen Gene

8.8.1 Über Pathway Express signifikant angereicherte KEGG-Signalwege für die im humanen Modell (HEK293/HeLa) über ChIP mit einen gegen MYST4 gerichteten Antikörper angereichert gefundenen Gene (MAT korrigierter P-Wert <0,05)

Impact No. genes % Pathwaygenes p-value KEGG pathway name Rank factor in pathway in input uncorrected corrected gamma corrected gamma Phosphatidylinositol signaling system* 1 37.6 77 2.6 4.16E-01 4.16E-01 1.75E-15 1.75E-15 Circadian rhythm* 2 27.2 13 7.7 2.15E-01 2.15E-01 4.18E-11 4.18E-11 Gap junction* 3 6.6 96 2.1 5.19E-01 5.19E-01 1.00E-02 1.00E-02 Basal cell carcinoma* 4 6.4 55 5.5 7.72E-02 7.72E-02 1.23E-02 1.23E-02 Thyroid cancer* 5 6.1 29 6.9 9.91E-02 9.91E-02 1.62E-02 1.62E-02 mTOR signaling pathway* 6 5.6 51 7.8 1.25E-02 1.25E-02 2.46E-02 2.46E-02 MAPK signaling pathway* 7 5.5 265 3.0 1.14E-01 1.14E-01 2.69E-02 2.69E-02 Regulation of actin cytoskeleton* 8 5.1 211 1.9 5.27E-01 5.27E-01 3.80E-02 3.80E-02 Long-term depression* 9 5.1 76 1.3 7.57E-01 7.57E-01 3.85E-02 3.85E-02 Focal adhesion* 10 5.0 199 3.0 1.57E-01 1.57E-01 4.13E-02 4.13E-02

8.8.2 Über DAVID functional annotation signifikant angereicherte KEGG-Signalwege für die im humanen Modell (HEK293/HeLa) über ChIP mit einen gegen MYST4 gerichteten Antikörper angereichert gefundenen Gene (MAT korrigierter P- Wert <0,05)

KEGG pathway name p-value Fold enrichment Thyroid cancer* 4.21E-03 11.78 MAPK signaling pathway* 3.81E-02 2.46

182

Anhang

8.9 Kombinierte Analyse der Ergebnisse aus der genomweiten Expressionsanalyse mit denen aus der ChIP-on-chip

8.9.1 Die über genomweite Expressionsanalysen im humanen Modell (HEK293/HeLa; MYST4 siRNA) differentiell exprimiert gefundenen Gene verglichen mit den signifikant angereichert gefundenen Genen (HEK293/HeLa; MAT korrigierter P-Wert <0,05) aus der ChIP-on-chip mit einem gegen MYST4 gerichteten Antikörper

ChIP-on-CHIP enriched region Expression Gene Probes MAT- Fold symbol Gene Name Chromosome region Length(bps) in region p-value score change p-value ------chr19:63521299-63522196 898 20 2.72E-02 10.24 -1.43 5.48E-04 --- Transcribed locus chr9:3479548-3480181 634 18 4.59E-02 8.82 1.33 2.29E-03 --- Transcribed locus chr16:28864493-28864984 492 15 1.17E-02 12.60 -2.21 1.05E-02 --- Homo sapiens, clone IMAGE:5479947, mRNA chr8:145085116-145085724 609 17 2.58E-02 10.38 -1.11 1.43E-02 --- CDNA clone IMAGE:4332981 chr12:47603351-47604092 742 21 2.60E-02 10.37 -1.23 3.96E-02 --- Transcribed locus chr2:112529429-112530022 594 17 4.91E-02 8.65 1.42 4.06E-02 ABCB8 ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), chr7:150376929-150377531 603 18 4.00E-02 9.21 -1.38 4.88E-02 member 8 ABCC5 ATP-binding cassette, sub-family C chr3:185212808-185213413 606 13 4.75E-02 8.74 -1.47 8.75E-03 (CFTR/MRP), member 5 ABCF1 ATP-binding cassette, sub-family F (GCN20), chr6:30647281-30647924 644 18 4.24E-02 9.04 -1.20 1.73E-02 member 1 ACTR3 ARP3 actin-related protein 3 homolog (yeast) chr2:114362478-114362934 457 14 2.61E-02 10.35 1.14 3.68E-03 AES amino-terminal enhancer of split chr19:3009424-3010085 662 14 1.41E-02 12.10 -1.20 2.11E-02 AKAP10 A kinase (PRKA) anchor protein 10 chr17:19821926-19822573 648 18 2.79E-02 10.18 1.12 4.73E-02 AKT2 v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2 chr19:45477316-45477991 676 17 3.55E-02 9.50 -1.66 6.57E-03 ALAS1 aminolevulinate, delta-, synthase 1 chr3:52204906-52205313 408 12 4.10E-02 9.13 1.20 6.60E-03 ALDH3B1 aldehyde dehydrogenase 3 family, member B1 chr11:67530404-67531257 854 22 1.78E-02 11.47 -1.71 1.61E-02 ALDH9A1 aldehyde dehydrogenase 9 family, member A1 chr1:163936862-163937734 873 21 9.00E-03 13.44 -1.27 2.18E-03 ALOX12B arachidonate 12-lipoxygenase, 12R type chr17:7933112-7933835 724 21 2.54E-02 10.44 -1.18 3.26E-02 ALPK1 alpha-kinase 1 chr4:113513483-113514005 523 15 1.61E-02 11.73 1.13 1.72E-02

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Anhang

AMACR alpha-methylacyl-CoA racemase chr5:34020360-34022353 1994 56 5.27E-05 29.56 -1.36 1.84E-02 AMH anti-Mullerian hormone chr19:2192702-2193213 512 14 3.98E-02 9.21 -1.26 2.78E-02 ANG angiogenin, ribonuclease, RNase A family, 5 chr14:20228545-20229508 964 24 3.06E-03 16.68 1.28 3.44E-02 ANK1 ankyrin 1, erythrocytic chr8:41647698-41649099 1402 40 8.79E-06 41.12 -1.16 2.94E-02 AP2A2 adaptor-related protein complex 2, alpha 2 chr11:915038-915635 598 17 4.96E-02 8.62 -1.21 4.18E-02 subunit AP2B1 adaptor-related protein complex 2, beta 1 chr17:31085753-31086520 768 21 3.38E-02 9.64 -1.20 4.32E-02 subunit APOL6 apolipoprotein L, 6 chr22:34371577-34371986 410 12 4.18E-02 9.07 -1.14 3.78E-02 ARMCX3 armadillo repeat containing, X-linked 3 chrX:100763565-100764333 769 20 2.07E-02 11.03 1.24 1.18E-02 ARMCX5 armadillo repeat containing, X-linked 5 chrX:101742631-101743333 703 20 3.78E-02 9.35 -1.29 1.63E-02 ARMCX6 armadillo repeat containing, X-linked 6 chrX:100763565-100764333 769 20 2.07E-02 11.03 1.16 4.26E-02 ARS2 arsenate resistance protein 2 chr7:100321185-100321782 598 16 4.88E-02 8.66 -1.17 4.46E-02 ASPH aspartate beta-hydroxylase chr8:62768744-62769635 892 25 4.25E-02 9.03 1.76 7.76E-03 ATP5SL ATP5S-like chr19:46640298-46640900 603 17 4.42E-02 8.93 -1.19 1.24E-02 ATXN3 ataxin 3 chr14:91046325-91046944 620 14 3.80E-02 9.33 1.30 1.21E-02 BATF2 basic leucine zipper transcription factor, ATF-like chr11:64526945-64527591 647 14 3.62E-02 9.45 -1.17 2.15E-03 2 BBS1 Bardet-Biedl syndrome 1 chr11:66001170-66002216 1047 23 3.67E-02 9.42 -1.65 1.32E-02 BCL7B B-cell CLL/lymphoma 7B chr7:72609968-72610430 463 13 2.57E-02 10.40 -1.23 3.96E-02 BCR breakpoint cluster region chr22:21314999-21316082 1084 30 5.68E-03 14.82 -1.89 7.89E-03 BIRC2 baculoviral IAP repeat-containing 2 chr11:101713286-101714107 822 21 2.61E-02 10.35 -1.39 9.73E-03 BOLA2 PI-3-kinase-related kinase SMG-1 pseudogene chr16:30010897-30011606 710 21 2.57E-02 10.40 -1.39 1.97E-03 BRWD1 bromodomain and WD repeat domain containing chr21:39476423-39477062 640 19 4.02E-02 9.19 1.42 5.20E-03 1 BUB3 BUB3 budding uninhibited by benzimidazoles 3 chr10:124890732-124891580 849 24 1.55E-02 11.83 -1.20 4.74E-02 homolog (yeast) C11orf59 chromosome 11 open reading frame 59 chr11:71496038-71496774 737 20 3.31E-02 9.71 -1.97 2.20E-04 C12orf44 chromosome 12 open reading frame 44 chr12:50746915-50747244 330 10 4.08E-02 9.14 -1.80 8.84E-05 C14orf179 chromosome 14 open reading frame 179 chr14:75517201-75517968 768 21 3.47E-02 9.56 -1.26 6.76E-03 C14orf45 chromosome 14 open reading frame 45 chr14:73620058-73620795 738 20 2.40E-02 10.59 -1.48 1.88E-03 C16orf13 chromosome 16 open reading frame 13 chr16:630613-631244 632 19 3.97E-02 9.22 -1.10 3.01E-02 C16orf14 chromosome 16 open reading frame 14 chr16:630613-631244 632 19 3.97E-02 9.22 -1.26 3.37E-02

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Anhang

C17orf49 chromosome 17 open reading frame 49 chr17:6866071-6866773 703 20 2.15E-02 10.91 -1.24 1.82E-02 C17orf56 chromosome 17 open reading frame 56 chr17:76816170-76816794 625 11 6.38E-03 14.52 -1.26 1.80E-02 C17orf62 chromosome 17 open reading frame 62 chr17:77995382-77996060 679 19 2.65E-02 10.30 -1.21 6.66E-03 C19orf29 chromosome 19 open reading frame 29 chr19:3564582-3565297 716 21 1.80E-02 11.45 -1.35 1.18E-02 C19orf56 chromosome 19 open reading frame 56 chr19:12636672-12637411 740 21 3.62E-02 9.46 -1.90 6.93E-04 C1orf128 chromosome 1 open reading frame 128 chr1:23990487-23992341 1855 52 1.42E-02 12.07 -1.43 2.08E-03 C1orf151 chromosome 1 open reading frame 151 chr1:19795551-19796133 583 17 4.40E-02 8.95 -1.55 7.42E-03 C1orf41 chromosome 1 open reading frame 41 chr1:54187151-54188076 926 26 3.52E-02 9.52 -1.34 2.99E-02 C1orf85 chromosome 1 open reading frame 85 chr1:154575759-154576395 637 18 4.80E-02 8.71 1.26 4.66E-02 C1orf93 chromosome 1 open reading frame 93 chr1:2507581-2508229 649 13 4.55E-02 8.84 -1.35 6.49E-03 C20orf11 chromosome 20 open reading frame 11 chr20:61040111-61041023 913 19 1.03E-02 13.01 -1.53 5.69E-03 C20orf27 chromosome 20 open reading frame 27 chr20:3709279-3710018 740 21 2.52E-02 10.46 -1.24 4.75E-02 C21orf34 chromosome 21 open reading frame 34 chr21:16366745-16367817 1073 27 2.27E-02 10.74 -1.14 1.54E-02 C22orf29 chromosome 22 open reading frame 29 chr22:18219907-18221515 1609 43 1.89E-02 11.32 -1.24 4.64E-02 C2orf46 chromosome 2 open reading frame 46 chr2:8390478-8391324 847 23 4.01E-03 15.86 -1.15 4.34E-02 C3orf64 chromosome 3 open reading frame 64 chr3:69106575-69107162 588 17 2.42E-02 10.57 -1.52 1.70E-02 C7orf20 chromosome 7 open reading frame 20 chr7:884201-884700 500 14 3.63E-02 9.45 -1.19 4.38E-02 C8orf55 chromosome 8 open reading frame 55 chr8:143804973-143805700 728 21 2.91E-02 10.05 -1.19 4.76E-02 C9orf105 chromosome 9 open reading chr9:37772786-37773562 777 22 2.07E-02 11.03 -1.48 7.90E-03 C9orf116 chromosome 9 open reading frame 116 chr9:137538759-137539616 858 19 1.75E-02 11.51 -1.56 1.28E-02 C9orf3 chromosome 9 open reading frame 3 chr9:96525359-96525942 584 15 3.71E-02 9.39 1.15 4.66E-02 CA5B carbonic anhydrase VB, mitochondrial chrX:15676938-15677753 816 21 1.22E-02 12.48 -1.19 1.51E-02 CACNA2D2 calcium channel, voltage-dependent, alpha chr3:50349280-50350005 726 20 2.37E-02 10.62 -1.30 3.65E-02 2/delta subunit 2 CALML4 Calmodulin-like 4 chr15:66288414-66289018 605 15 5.00E-02 8.60 1.17 4.56E-02 CAMK2N1 calcium/calmodulin-dependent protein kinase II chr1:20688719-20689657 939 24 3.95E-02 9.23 -1.72 1.08E-02 inhibitor 1 CAMSAP1 calmodulin regulated spectrin-associated protein chr9:137921384-137922022 639 19 2.08E-02 11.02 -1.86 5.58E-04 1 CARD8 caspase recruitment domain family, member 8 chr19:53236277-53236755 479 14 9.09E-03 13.41 -1.41 1.34E-02 CARHSP1 calcium regulated heat stable protein 1, 24kDa chr16:8859452-8860167 716 15 2.06E-02 11.05 -1.52 9.59E-03 CASP7 caspase 7, apoptosis-related cysteine peptidase chr10:115496691-115497319 629 12 3.37E-02 9.66 -2.45 6.37E-04 CBX5 chromobox homolog 5 (HP1 alpha homolog, chr12:52964079-52965329 1251 34 5.14E-03 15.06 -1.28 3.06E-02

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Anhang

Drosophila) CCDC144A coiled-coil domain containing 144A chr17:18469524-18469960 437 10 4.48E-02 8.90 1.15 6.32E-03 CCDC151 coiled-coil domain containing 151 chr19:11388319-11388799 481 14 3.56E-02 9.49 -1.22 3.04E-02 CCDC21 coiled-coil domain containing 21 chr1:26387639-26388361 723 21 1.20E-02 12.51 -1.41 7.17E-03 CCDC92 coiled-coil domain containing 92 chr12:122993965-122994738 774 18 4.18E-02 9.07 -1.35 2.22E-02 CCPG1 cell cycle progression 1 chr15:53579153-53579773 621 13 2.54E-02 10.44 1.30 5.36E-03 CIRBP cold inducible RNA binding protein chr19:1213533-1214142 610 13 4.72E-02 8.75 -1.30 8.86E-03 CKS1B CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B chr1:153235172-153235507 336 10 3.84E-02 9.30 -1.33 1.88E-02 CLCN4 chloride channel 4 chrX:10082570-10083296 727 14 3.88E-02 9.28 1.96 2.19E-03 CLN6 ceroid-lipofuscinosis, neuronal 6, late infantile, chr15:66288414-66289018 605 15 5.00E-02 8.60 -1.48 1.91E-02 variant CLN8 ceroid-lipofuscinosis, neuronal 8 (epilepsy, chr8:1720507-1721887 1381 39 2.64E-05 31.95 1.42 3.23E-02 progressive with mental retardation COL5A1 collagen, type V, alpha 1 chr9:136667457-136668266 810 20 1.69E-02 11.61 -1.42 4.23E-03 COL7A1 collagen, type VII, alpha 1 (epidermolysis chr3:48575558-48576147 590 10 1.11E-02 12.75 -1.30 5.31E-03 bullosa, dystrophic, dominant and rec CPEB4 cytoplasmic polyadenylation element binding chr5:173242841-173243553 713 20 2.25E-02 10.77 1.32 4.16E-02 protein 4 CPNE2 copine II chr16:55682495-55683490 996 28 1.71E-02 11.56 -1.35 1.83E-02 CPSF1 cleavage and polyadenylation specific factor 1, chr8:145618685-145619351 667 18 3.31E-02 9.71 -1.29 2.07E-02 160kDa CRIM1 cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 chr2:36437937-36438570 634 18 2.74E-02 10.22 1.72 6.82E-05 (chordin-like) CRISPLD2 cysteine-rich secretory protein LCCL domain chr16:83407036-83407630 595 10 4.34E-02 8.98 -1.28 2.70E-02 containing 2 CSK c-src tyrosine kinase chr15:72852306-72853347 1042 29 4.34E-02 8.98 -1.27 3.28E-02 CTDSP1 CTD (carboxy-terminal domain, RNA polymerase chr2:218912808-218913629 822 18 2.27E-02 10.74 -1.25 1.99E-02 II, polypeptide A) small phosphatas CTDSP2 CTD (carboxy-terminal domain, RNA polymerase chr12:56533895-56534239 345 10 4.40E-02 8.95 -1.35 1.33E-02 II, polypeptide A) small phosphatas CUGBP1 CUG triplet repeat, RNA binding protein 1 chr11:47477131-47477758 628 18 3.11E-02 9.87 -1.45 2.87E-03 CYB561D1 cytochrome b-561 domain containing 1 chr1:109832219-109832915 697 20 3.98E-02 9.21 -1.30 2.37E-02 CYFIP2 cytoplasmic FMR1 interacting protein 2 chr5:156667251-156667956 706 19 1.41E-02 12.08 -2.01 2.59E-02 DAZAP1 DAZ associated protein 1 chr19:1350720-1351402 683 19 2.88E-02 10.08 -1.45 8.31E-03 DBNDD1 dysbindin (dystrobrevin binding protein 1) chr16:88625558-88627275 1718 40 1.93E-04 25.48 -1.41 1.81E-02

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Anhang

domain containing 1 DGKZ diacylglycerol kinase, zeta 104kDa chr11:46312509-46312965 457 14 1.16E-02 12.62 -1.42 1.54E-03 DHRS4 dehydrogenase/reductase (SDR family) member chr14:23607994-23608887 894 25 2.36E-02 10.64 -1.33 2.76E-02 4 DHRS9 dehydrogenase/reductase (SDR family) member chr2:169633720-169634333 614 18 4.32E-02 8.99 1.10 2.80E-02 9 DHRSX dehydrogenase/reductase (SDR family) X-linked chrX:2429121-2429928 808 23 5.96E-03 14.69 1.17 4.27E-02 DIDO1 death inducer-obliterator 1 chr20:61040111-61041023 913 19 1.03E-02 13.01 -2.00 1.32E-03 DKFZp434K POM121-like protein chr22:22970633-22971548 916 19 3.41E-03 16.35 1.10 8.32E-03 191 DLG3 discs, large homolog 3 (neuroendocrine-dlg, chrX:69560127-69560719 593 15 4.03E-02 9.18 -1.38 2.68E-02 Drosophila) DLGAP3 discs, large (Drosophila) homolog-associated chr1:35221821-35222627 807 22 6.82E-03 14.30 -1.11 4.77E-02 protein 3 DSC1 desmocollin 1 chr18:27001111-27001506 396 11 4.88E-02 8.66 1.44 4.78E-03 DYNLRB1 dynein, light chain, roadblock-type 1 chr20:32597202-32597568 367 11 3.16E-02 9.82 -1.15 4.15E-02 DYX1C1 dyslexia susceptibility 1 candidate 1 chr15:53579153-53579773 621 13 2.54E-02 10.44 -1.65 2.75E-02 EIF2C2 Eukaryotic translation initiation factor 2C, 2 chr8:141640667-141641604 938 26 2.26E-02 10.76 -1.73 4.11E-02 EIF3F eukaryotic translation initiation factor 3, subunit F chr2:58324176-58325154 979 25 7.06E-03 14.20 -1.25 2.97E-02 ELK1 ELK1, member of ETS oncogene family chrX:47379659-47380243 585 14 4.84E-02 8.68 -1.23 3.72E-02 ELL2 elongation factor, RNA polymerase II, 2 chr5:95322519-95323146 628 18 4.06E-02 9.16 1.73 1.73E-02 EME2 essential meiotic endonuclease 1 homolog 2 (S. chr16:1771029-1771916 888 24 1.21E-02 12.51 -1.20 4.54E-02 pombe) EP400NL EP400 N-terminal like chr12:131130788-131131922 1135 31 4.80E-03 15.30 -1.36 1.80E-02 EPB41 erythrocyte membrane protein band 4.1 chr1:29083808-29084958 1151 24 1.63E-02 11.70 -1.20 3.61E-02 (elliptocytosis 1, RH-linked) EPHA4 EPH receptor A4 chr2:222142938-222144085 1148 25 1.27E-03 19.45 -1.29 1.99E-02 EPOR erythropoietin receptor chr19:11388319-11388799 481 14 3.56E-02 9.49 1.31 3.18E-02 EPPK1 epiplakin 1 chr8:145023818-145024397 580 16 4.72E-02 8.75 -1.61 4.43E-03 EPS8L1 EPS8-like 1 chr19:60282965-60283865 901 18 1.99E-02 11.16 -1.30 5.17E-03 ETHE1 ethylmalonic encephalopathy 1 chr19:48728591-48729301 711 20 2.89E-02 10.07 -1.33 1.36E-02 EXT2 exostoses (multiple) 2 chr11:44085944-44086674 731 20 3.70E-02 9.40 -1.59 1.19E-03 FABP5 fatty acid binding protein 5 chr7:151770436-151771145 710 20 2.06E-02 11.05 -1.39 4.29E-02 FAM111A family with sequence similarity 111, member A chr11:58668736-58669545 810 19 2.90E-02 10.06 -1.44 2.10E-02

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Anhang

FAM120C family with sequence similarity 120C chrX:54225005-54226319 1315 35 6.97E-03 14.24 -1.69 1.11E-03 FAM130A1 family with sequence similarity 130, member A1 chr12:49761995-49763016 1022 29 3.79E-02 9.34 -1.72 1.53E-03 FAM135A family with sequence similarity 135, member A chr6:71333497-71334072 576 17 1.52E-02 11.87 1.38 1.82E-02 FAM26B family with sequence similarity 26, member B chr10:105197126-105197847 722 21 2.18E-02 10.87 -1.22 9.35E-03 FAM41C ribosomal protein L23a pseudogene 7 chr2:114107786-114108391 606 18 1.18E-02 12.56 -1.36 5.00E-02 FAM49B family with sequence similarity 49, member B chr8:130951421-130952038 618 10 1.09E-02 12.80 1.90 1.24E-02 FAM54B family with sequence similarity 54, member B chr1:25998481-25999536 1056 23 2.08E-02 11.01 -1.26 1.64E-02 FAM83H family with sequence similarity 83, member H chr8:144889408-144890269 862 24 6.22E-03 14.60 -1.37 4.13E-03 FAM96B family with sequence similarity 96, member B chr16:65511887-65512495 609 13 4.84E-02 8.69 -1.18 3.38E-02 FBXO4 F-box protein 4 chr5:41958702-41959391 690 17 2.87E-02 10.09 -1.41 3.39E-03 FBXO44 F-box protein 44 chr1:11646630-11647267 638 17 3.05E-02 9.93 -1.28 6.94E-03 FBXO9 F-box protein 9 chr6:53033483-53034247 765 22 2.68E-02 10.27 -1.97 1.13E-02 FHL3 four and a half LIM domains 3 chr1:38237132-38238176 1045 30 2.47E-02 10.52 -1.25 3.38E-02 FKBP7 FK506 binding protein 7 chr2:179058343-179059053 711 20 2.69E-02 10.27 1.47 2.28E-02 FLAD1 FAD1 flavin adenine dinucleotide synthetase chr1:153235172-153235507 336 10 3.84E-02 9.30 -1.36 7.92E-03 homolog (S. cerevisiae) FLJ14213 protor-2 chr11:36427468-36428084 617 14 4.20E-02 9.06 -1.55 1.28E-03 FLJ20323 hypothetical protein FLJ20323 chr7:7570844-7571752 909 24 1.04E-02 12.94 -1.45 3.16E-02 FLJ22795 hypothetical protein FLJ22795 chr15:80590524-80592178 1655 45 1.63E-02 11.71 -1.21 5.21E-03 FLJ40296 FLJ40296 protein chr13:56632612-56633637 1026 28 1.75E-02 11.52 1.22 1.40E-03 FLJ45224 FLJ45224 protein chr9:138999924-139000612 689 19 2.85E-02 10.11 -1.10 5.90E-03 FMNL3 formin-like 3 chr12:48387328-48388141 814 20 4.20E-02 9.06 -1.35 2.17E-03 FNDC3B fibronectin type III domain containing 3B chr3:173307762-173308394 633 18 1.21E-02 12.49 1.44 6.07E-03 FOXP1 forkhead box P1 chr3:71627633-71628246 614 10 4.79E-02 8.71 -1.15 2.68E-02 FRAG1 FGF receptor activating protein 1 chr11:3786962-3787655 694 16 3.37E-02 9.66 -1.20 3.66E-03 FRMPD2 FERM and PDZ domain containing 2 chr10:48481913-48482546 634 16 2.79E-02 10.17 1.09 1.43E-02 FUT10 fucosyltransferase 10 (alpha (1,3) chr8:33449492-33450285 794 23 1.49E-02 11.93 -1.38 4.43E-03 fucosyltransferase) FXYD5 FXYD domain containing ion transport regulator chr19:40316142-40316876 735 21 3.14E-02 9.83 -1.34 4.00E-02 5 FZD8 frizzled homolog 8 (Drosophila) chr10:35970414-35971005 592 16 4.11E-02 9.12 -1.34 4.40E-02 FZR1 fizzy/cell division cycle 20 related 1 (Drosophila) chr19:3473887-3475032 1146 32 1.01E-02 13.05 -1.45 1.76E-02 GALNT4 UDP-N-acetyl-alpha-D- chr12:88441911-88442499 589 17 3.67E-02 9.42 -1.56 1.37E-02

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Anhang

galactosamine:polypeptide N- acetylgalactosaminyltransferase GCHFR GTP cyclohydrolase I feedback regulator chr15:38847179-38848158 980 27 4.16E-02 9.09 -1.23 1.67E-03 GGT1 gamma-glutamyltransferase 1 chr22:22970633-22971548 916 19 3.41E-03 16.35 -1.10 1.75E-02 GLCE glucuronic acid epimerase chr15:67240878-67241760 883 25 3.04E-02 9.94 -1.73 2.43E-03 GLI2 GLI-Kruppel family member GLI2 chr2:121263980-121265182 1203 30 7.83E-03 13.89 -1.29 4.14E-03 GLOD4 glyoxalase domain containing 4 chr17:598746-599975 1230 35 1.93E-04 25.44 -1.19 4.32E-02 GLTPD1 glycolipid transfer protein domain containing 1 chr1:1255119-1255802 684 15 1.61E-02 11.73 -1.25 1.84E-02 GLTSCR2 glioma tumor suppressor candidate region gene chr19:52937741-52938468 728 21 3.72E-02 9.38 -1.27 3.61E-02 2 GNA11 guanine nucleotide binding protein (G protein), chr19:3073208-3073852 645 18 4.44E-02 8.92 -1.87 4.17E-04 alpha 11 (Gq class) GOLGA6 golgi autoantigen, golgin subfamily a, 6 chr15:73410005-73410589 585 17 1.90E-02 11.29 -1.09 3.80E-02 GPHN gephyrin chr14:66043488-66044135 648 18 2.44E-02 10.53 -1.47 7.34E-03 GRHL1 grainyhead-like 1 (Drosophila) chr2:10006148-10006679 532 16 2.41E-02 10.57 -1.93 2.10E-05 GRIK2 glutamate receptor, ionotropic, kainate 2 chr6:101945922-101946827 906 24 1.85E-02 11.36 1.40 3.44E-02 GSTZ1 glutathione transferase zeta 1 chr14:76858171-76858810 640 18 3.42E-02 9.60 -1.37 2.32E-02 (maleylacetoacetate isomerase) GTF2F1 general transcription factor IIF, polypeptide 1, chr19:6331296-6331922 627 18 4.29E-02 9.01 -1.15 4.59E-02 74kDa H2BFS H2B histone family, member S chr6:26308019-26308606 588 17 4.56E-02 8.84 -1.75 5.41E-03 HBA1 hemoglobin, alpha 1 chr16:149514-150672 1159 33 3.73E-03 16.05 -1.33 4.43E-02 HCCA2 HCCA2 protein chr11:1463024-1464509 1486 38 1.09E-02 12.82 -1.24 3.46E-02 HCRTR2 hypocretin (orexin) receptor 2 chr6:55146553-55147261 709 20 4.30E-02 9.00 -1.18 4.10E-02 HDAC3 histone deacetylase 3 chr5:140978477-140979173 697 19 4.03E-02 9.18 -1.32 6.63E-03 HES2 hairy and enhancer of split 2 (Drosophila) chr1:6401463-6402361 899 23 2.93E-02 10.04 -1.20 4.91E-02 HIPK1 homeodomain interacting protein kinase 1 chr1:114318915-114319679 765 22 2.35E-02 10.65 -1.21 2.45E-02 HIST1H2BC histone cluster 1, H2bg chr6:26308019-26308606 588 17 4.56E-02 8.84 -1.56 5.87E-03 HIST1H2BH histone cluster 1, H2bh chr6:26308019-26308606 588 17 4.56E-02 8.84 -1.51 3.56E-03 HLA-DOA major histocompatibility complex, class II, DO chr6:33085180-33085968 789 21 6.64E-03 14.36 1.27 4.85E-02 alpha HLF hepatic leukemia factor chr17:50752704-50753707 1004 27 1.30E-02 12.33 -1.27 1.97E-02 HN1 hematological and neurological expressed 1 chr17:70637652-70638321 670 19 1.92E-02 11.26 -1.41 4.78E-03 HN1L hematological and neurological expressed 1-like chr16:1771029-1771916 888 24 1.21E-02 12.51 -1.22 4.77E-02

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HNRNPA3P NDRG family member 3 chr20:34840873-34841680 808 22 1.58E-02 11.79 -1.29 3.85E-02 2 HNRNPF heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F chr10:43223774-43224383 610 16 3.88E-02 9.27 -1.38 1.26E-02 HOXA3 homeobox A3 chr7:27128586-27129257 672 18 3.46E-02 9.57 -1.56 1.53E-03 HSD17B1 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 1 chr17:37953731-37954366 636 17 3.31E-02 9.70 -1.16 4.46E-02 HSF1 heat shock transcription factor 1 chr8:145480690-145481506 817 23 1.10E-02 12.78 -1.26 7.93E-03 HSPA1A heat shock 70kDa protein 1A chr6:31904789-31905394 606 17 4.72E-02 8.75 1.23 3.92E-02 HSPA4 Heat shock 70kDa protein 4 chr5:132414615-132415282 668 17 4.95E-02 8.62 -1.35 2.99E-02 HYOU1 hypoxia up-regulated 1 chr11:118287230-118288100 871 21 2.36E-02 10.64 -1.31 4.65E-02 HYPK Huntingtin interacting protein K chr15:41875012-41875624 613 12 4.69E-02 8.77 -1.75 3.24E-03 ICK intestinal cell (MAK-like) kinase chr6:52967559-52968234 676 16 2.47E-02 10.51 -1.71 5.18E-03 IDS iduronate 2-sulfatase (Hunter syndrome) chrX:148426001-148427098 1098 27 3.75E-02 9.36 -1.15 3.88E-02 IFNA16 interferon, alpha 16 chr9:21328142-21328734 593 17 4.50E-02 8.88 1.10 4.73E-02 IFRD2 interferon-related developmental regulator 2 chr3:50349280-50350005 726 20 2.37E-02 10.62 -1.84 2.26E-04 IGF2 insulin-like growth factor 2 (somatomedin A) chr11:2123693-2124397 705 19 1.30E-02 12.31 -1.37 4.92E-03 IGHA1 immunoglobulin heavy constant alpha 1 chr14:106190798-106191390 593 17 1.58E-04 26.37 -1.20 1.97E-02 IGSF3 immunoglobulin superfamily, member 3 chr1:117012160-117013103 944 21 7.25E-03 14.12 -1.52 3.39E-02 IHPK1 inositol hexaphosphate kinase 1 chr3:49740434-49740865 432 13 4.73E-02 8.74 -1.27 2.23E-02 IMAA solute carrier family 7 chr16:21443421-21444257 837 24 1.21E-02 12.50 -1.26 2.06E-02 INOC1 INO80 complex homolog 1 (S. cerevisiae) chr15:38834427-38835394 968 24 2.08E-02 11.01 -1.16 4.70E-02 IRX5 iroquois homeobox 5 chr16:53521889-53522936 1048 24 2.73E-02 10.23 -1.17 4.81E-02 ITGB4 integrin, beta 4 chr17:71228920-71229583 664 19 8.70E-03 13.56 -1.81 5.95E-03 JPH2 junctophilin 2 chr20:42248774-42249377 604 16 4.80E-02 8.71 -1.53 3.13E-02 KAP2.1B keratin associated protein 2.1B chr17:36469261-36469990 730 21 3.38E-02 9.64 1.15 1.26E-03 KCNAB2 potassium voltage-gated channel, shaker-related chr1:6017649-6018326 678 19 3.83E-02 9.31 -1.30 1.09E-03 subfamily, beta member 2 KCNJ12 potassium inwardly-rectifying channel, subfamily chr17:21215558-21216694 1137 31 3.92E-02 9.25 -1.80 1.59E-03 J, member 12 KIAA0226 KIAA0226 chr3:198954376-198954954 579 16 2.85E-02 10.12 -1.17 1.04E-02 KIAA0323 KIAA0323 chr14:23970284-23971023 740 20 2.95E-02 10.02 -1.20 4.19E-02 KIAA0515 KIAA0515 chr9:133343651-133344404 754 21 2.31E-02 10.71 -1.39 1.77E-02 KIAA1545 KIAA1545 protein chr12:131649613-131650431 819 23 1.85E-03 18.41 -1.18 4.23E-02 KIAA1920 KIAA1920 protein chr15:81906637-81907723 1087 30 1.35E-02 12.21 -1.12 3.79E-03

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Anhang

KLK8 kallikrein-related peptidase 8 chr19:56195229-56195833 605 14 3.22E-02 9.77 1.19 3.27E-02 KRT17 keratin 17 chr17:37035091-37036189 1099 31 7.18E-03 14.15 -1.74 2.80E-02 LASS3 LAG1 homolog, ceramide synthase 3 chr15:98914126-98916197 2072 54 2.06E-02 11.05 -1.25 5.57E-03 LASS6 LAG1 homolog, ceramide synthase 6 chr2:169018286-169019171 886 25 2.95E-02 10.02 1.44 2.53E-02 LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing chr4:1833808-1834462 655 19 2.48E-02 10.50 -1.62 4.71E-03 transmembrane protein 1 LIN37 lin-37 homolog (C. elegans) chr19:40914258-40915100 843 23 2.95E-02 10.02 1.15 8.68E-03 LIN52 lin-52 homolog (C. elegans) chr14:73620058-73620795 738 20 2.40E-02 10.59 -1.50 7.20E-03 LL22NC03- hypothetical protein FLJ20699 chr22:45070226-45070868 643 17 4.93E-02 8.63 -1.25 1.87E-02 5H6.5 LOC1001305 hypothetical protein LOC100130536 chr6:32231013-32231625 613 12 2.95E-02 10.02 -1.51 4.21E-02 36 LOC1001340 hypothetical protein LOC100134082 chr7:150439809-150440608 800 23 1.32E-02 12.27 1.15 2.14E-02 82 LOC1001343 hypothetical protein LOC100134365 chr2:96350334-96351010 677 14 3.33E-02 9.68 -1.35 3.37E-02 65 LOC116236 hypothetical protein LOC116236 chr17:24923347-24924293 947 26 4.30E-02 9.01 -1.28 4.43E-02 LOC149478 Hypothetical protein LOC149478 chr1:45037848-45038818 971 23 1.32E-02 12.28 -1.29 1.58E-02 LOC165186 similar to RIKEN cDNA 4632412N22 gene chr2:29102890-29103516 627 17 2.58E-02 10.38 -1.24 3.98E-02 LOC257407 hypothetical protein LOC257407 chr2:231625240-231625927 688 19 3.29E-02 9.73 -1.26 5.20E-03 LOC645722 hypothetical LOC645722 chr16:21443421-21444257 837 24 1.21E-02 12.50 -1.67 3.17E-03 LOC90835 hypothetical protein LOC90835 chr16:30680003-30681320 1318 38 1.99E-02 11.16 -1.32 5.50E-03 LOC96610 hypothetical gene LOC96610 chr22:21314999-21316082 1084 30 5.68E-03 14.82 -1.14 3.59E-02 LPHN1 latrophilin 1 chr19:14177197-14177822 626 17 2.77E-02 10.19 -1.34 1.24E-03 LRRC42 leucine rich repeat containing 42 chr1:54187151-54188076 926 26 3.52E-02 9.52 -1.26 1.68E-02 LSM2 LSM2 homolog, U6 small nuclear RNA chr6:31873223-31873813 591 15 1.39E-02 12.13 -1.30 4.45E-03 associated (S. cerevisiae) LSM7 LSM7 homolog, U6 small nuclear RNA chr19:2284096-2284801 706 20 3.59E-02 9.47 -1.29 1.45E-02 associated (S. cerevisiae) LSS lanosterol synthase (2,3-oxidosqualene- chr21:46427939-46428777 839 24 1.85E-02 11.36 -1.27 2.52E-02 lanosterol cyclase) LYRM4 LYR motif containing 4 chr6:5058191-5058805 615 11 1.09E-02 12.81 -1.25 4.54E-02 MAF1 MAF1 homolog (S. cerevisiae) chr8:145236676-145237756 1081 31 1.06E-02 12.91 -1.26 4.99E-02 MAML1 mastermind-like 1 (Drosophila) chr5:179151418-179152044 627 18 2.55E-02 10.42 -1.59 3.72E-04

191

Anhang

MAN1A2 mannosidase, alpha, class 1A, member 2 chr1:117708311-117709028 718 18 3.70E-02 9.40 1.44 1.33E-02 MAP2K3 mitogen-activated protein kinase kinase 3 chr17:21125336-21126121 786 22 1.29E-02 12.35 -1.43 1.41E-02 MARK2 MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 chr11:63361188-63361777 590 17 4.19E-02 9.06 -1.44 2.08E-02 MARVELD1 MARVEL domain containing 1 chr10:99457283-99458063 781 16 4.96E-02 8.62 -1.16 2.67E-02 MAX MYC associated factor X chr14:64638099-64638744 646 17 2.66E-02 10.29 -1.22 4.23E-02 MBD4 methyl-CpG binding domain protein 4 chr3:130605571-130606335 765 19 1.49E-02 11.93 -1.13 2.19E-02 MDFIC MyoD family inhibitor domain containing chr7:114350422-114351021 600 16 3.22E-02 9.77 -1.42 1.73E-02 MED8 mediator complex subunit 8 chr1:43624511-43625205 695 19 2.45E-02 10.53 -1.94 3.51E-05 MEF2A myocyte enhancer factor 2A chr15:97984549-97985224 676 13 4.70E-02 8.76 1.40 6.67E-03 MGC26718 Similar to ankyrin repeat domain 20A chr9:43127294-43127905 612 18 7.43E-03 14.00 -1.37 3.37E-02 MGEA5 meningioma expressed antigen 5 chr10:103527007-103527730 724 20 3.01E-02 9.96 -1.37 2.11E-02 (hyaluronidase) MIER2 mesoderm induction early response 1, family chr19:285785-286849 1065 30 1.81E-02 11.43 -1.16 2.28E-02 member 2 MIPEP mitochondrial intermediate peptidase chr13:23374949-23375551 603 17 3.64E-02 9.44 -1.26 2.71E-02 MLL5 myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 5 chr7:104491675-104492274 600 17 4.97E-02 8.62 -1.28 4.50E-02 (trithorax homolog, Drosophila) MLLT6 myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia chr17:34112617-34113218 602 12 3.91E-02 9.26 -1.42 2.09E-02 (trithorax homolog, Drosophila); tran MMS19 MMS19 nucleotide excision repair homolog (S. chr10:99248522-99249142 621 18 3.92E-02 9.25 -1.30 4.51E-03 cerevisiae) MRAS muscle RAS oncogene homolog chr3:139568666-139569273 608 12 3.98E-02 9.22 -1.13 4.60E-02 MT1P2 metallothionein 1 pseudogene 2 chr16:55208329-55209139 811 23 9.55E-03 13.25 -1.48 4.65E-02 MTCH1 mitochondrial carrier homolog 1 (C. elegans) chr6:37056152-37057270 1119 31 6.52E-03 14.44 -1.29 4.73E-02 MTF1 metal-regulatory transcription factor 1 chr1:38043540-38044329 790 21 2.95E-02 10.02 -1.74 1.16E-02 MTIF3 mitochondrial translational initiation factor 3 chr13:26922013-26922774 762 22 2.70E-02 10.26 -1.27 4.22E-02 MTMR14 myotubularin related protein 14 chr3:9713473-9714562 1090 30 1.35E-02 12.21 -1.42 2.35E-03 NADK NAD kinase chr1:1672800-1673524 725 20 3.81E-02 9.32 -1.51 7.92E-04 NADSYN1 NAD synthetase 1 chr11:70842164-70842873 710 16 1.50E-02 11.92 -1.59 1.64E-03 NAE1 NEDD8 activating enzyme E1 subunit 1 chr16:65396396-65397082 687 14 3.15E-02 9.83 -1.25 1.85E-02 NBEAL2 neurobeachin-like 2 chr3:47019876-47020869 994 28 1.96E-02 11.21 -1.30 1.15E-02 NBL1 neuroblastoma, suppression of tumorigenicity 1 chr1:19854128-19854805 678 19 4.08E-02 9.14 -1.18 3.94E-02 NDUFB6 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta chr9:32544740-32545447 708 16 2.75E-02 10.21 1.20 1.46E-02 subcomplex, 6, 17kDa

192

Anhang

NEU1 sialidase 1 (lysosomal sialidase) chr6:31957923-31958571 649 14 2.43E-02 10.55 1.54 7.03E-03 NF2 neurofibromin 2 (merlin) chr22:28416029-28416944 916 26 1.03E-02 13.01 1.18 4.46E-02 NFATC2IP nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, chr16:28864493-28864984 492 15 1.17E-02 12.60 -2.04 4.87E-03 calcineurin-dependent 2 intera NHP2L1 NHP2 non-histone chromosome protein 2-like 1 chr22:40420241-40421025 785 21 1.17E-02 12.60 -1.27 1.14E-02 (S. cerevisiae) NICN1 nicolin 1 chr3:49431748-49432626 879 24 7.19E-03 14.14 -1.43 8.61E-03 NKAPL NFKB activating protein-like chr6:28343442-28344021 580 11 4.98E-02 8.61 1.15 1.15E-02 NKX2-2 NK2 homeobox 2 chr20:21448581-21449168 588 17 4.53E-02 8.86 -1.57 4.69E-03 NLGN1 neuroligin 1 chr3:174596786-174597597 812 22 4.19E-02 9.07 -2.24 1.94E-04 NOLA3 nucleolar protein family A, member 3 (H/ACA chr15:32428549-32429144 596 11 4.03E-02 9.18 -1.29 1.39E-02 small nucleolar RNPs) NPTX1 neuronal pentraxin I chr17:76063261-76063975 715 21 3.16E-02 9.81 -1.57 2.88E-02 NRBP2 nuclear receptor binding protein 2 chr8:144975741-144976440 700 20 4.28E-02 9.01 -1.36 4.13E-02 NTAN1 N-terminal asparagine amidase chr16:15057646-15058360 715 13 2.96E-02 10.00 -1.33 6.84E-03 NTS neurotensin chr12:84785307-84785959 653 15 4.84E-02 8.68 1.85 3.33E-04 NUBPL nucleotide binding protein-like chr14:31100312-31100984 673 20 3.68E-02 9.41 1.37 2.14E-03 NUP62 nucleoporin 62kDa chr19:55104196-55105310 1115 31 3.80E-03 16.01 -1.22 4.24E-02 NUPL1 nucleoporin like 1 chr13:24772560-24773277 718 21 2.68E-02 10.28 -2.14 2.10E-02 NY-SAR-48 sarcoma antigen NY-SAR-48 chr19:17051260-17052031 772 23 1.41E-02 12.07 -1.28 3.40E-02 P53AIP1 p53-regulated apoptosis-inducing protein 1 chr11:128313396-128314982 1587 39 2.55E-02 10.42 -1.26 3.88E-02 PACS2 phosphofurin acidic cluster sorting protein 2 chr14:104955252-104956344 1093 31 4.22E-02 9.05 -1.25 1.99E-02 PAIP1 poly(A) binding protein interacting protein 1 chr5:43593177-43593578 402 11 2.98E-02 9.98 -1.39 6.95E-03 PALLD palladin, cytoskeletal associated protein chr4:169652048-169652657 610 18 3.55E-02 9.50 1.27 3.75E-02 PAN3 PAN3 polyA specific ribonuclease subunit chr13:27759284-27759992 709 20 1.44E-02 12.03 -1.47 2.65E-03 homolog (S. cerevisiae) PAQR6 progestin and adipoQ receptor family member VI chr1:154487009-154487782 774 21 2.04E-02 11.09 -1.18 3.29E-02 PARC p53-associated parkin-like cytoplasmic protein chr6:43254307-43254904 598 17 4.91E-02 8.65 -1.44 4.41E-02 PARG poly (ADP-ribose) glycohydrolase chr10:51040679-51041426 748 20 2.96E-02 10.00 -1.19 3.93E-02 PARN poly(A)-specific ribonuclease (deadenylation chr16:14634061-14634823 763 20 2.66E-02 10.30 -1.41 2.28E-03 nuclease) PASK PAS domain containing serine/threonine kinase chr2:241696676-241697459 784 19 2.84E-02 10.13 -1.46 2.98E-03 PBX2 pre-B-cell leukemia homeobox 2 chr6:32267659-32268304 646 18 4.34E-02 8.98 -1.34 3.79E-02

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Anhang

PBXIP1 pre-B-cell leukemia homeobox interacting protein chr1:153180437-153181227 791 23 2.00E-02 11.13 1.37 4.43E-04 1 PCDHGA4 protocadherin gamma subfamily A, 4 chr5:140836142-140836762 621 18 2.60E-02 10.36 -1.21 1.40E-02 PCGF2 polycomb group ring finger 2 chr17:34149858-34150241 384 11 3.79E-02 9.34 -1.64 2.26E-03 PDCD6 programmed cell death 6 chr5:496137-497075 939 23 3.82E-02 9.32 -1.60 5.01E-03 PDE4A phosphodiesterase 4A, cAMP-specific chr19:10422186-10423026 841 24 2.82E-02 10.15 -1.45 2.49E-02 (phosphodiesterase E2 dunce homolog, Drosoph PDLIM7 PDZ and LIM domain 7 (enigma) chr5:176856106-176856845 740 20 2.58E-02 10.39 -1.42 4.21E-02 PDXK pyridoxal (pyridoxine, vitamin B6) kinase chr21:43975767-43976452 686 19 1.93E-02 11.24 -1.48 2.46E-03 PER2 period homolog 2 (Drosophila) chr2:238805772-238806708 937 27 1.61E-02 11.73 -1.57 7.51E-03 PGPEP1 pyroglutamyl-peptidase I chr19:18335500-18336115 616 15 1.80E-02 11.44 -1.34 9.50E-03 PHB2 prohibitin 2 chr12:6955515-6955847 333 10 4.72E-02 8.75 -1.39 2.73E-03 PHF15 PHD finger protein 15 chr5:133886247-133886960 714 17 4.19E-02 9.06 -1.34 4.57E-02 PHF19 PHD finger protein 19 chr9:122679739-122680405 667 19 4.16E-02 9.08 -1.32 2.00E-02 PI4KA phosphatidylinositol 4-kinase, catalytic, alpha chr22:19420189-19421470 1282 36 1.99E-02 11.15 -1.24 4.83E-02 PITPNB phosphatidylinositol transfer protein, beta chr22:26530651-26531809 1159 29 1.19E-02 12.54 -1.14 3.90E-02 PKIB protein kinase (cAMP-dependent, catalytic) chr6:122968010-122968655 646 18 2.83E-02 10.14 -1.24 4.96E-02 inhibitor beta PKLR pyruvate kinase, liver and RBC chr1:153544954-153545760 807 24 8.72E-03 13.55 1.27 1.76E-02 PKN2 protein kinase N2 chr1:88921921-88922569 649 17 1.87E-02 11.34 1.37 1.88E-03 PLEKHA8 pleckstrin homology domain containing, family A chr7:30029353-30029697 345 10 3.56E-02 9.50 -1.28 3.89E-02 (phosphoinositide binding specif PLEKHJ1 pleckstrin homology domain containing, family J chr19:2192702-2193213 512 14 3.98E-02 9.21 -1.25 2.16E-02 member 1 PLEKHM1 pleckstrin homology domain containing, family M chr17:40863963-40864831 869 24 9.97E-03 13.10 -1.42 1.33E-03 (with RUN domain) member 1 PLXNA2 plexin A2 chr1:206269955-206270571 617 18 4.67E-02 8.77 -1.34 2.69E-02 PMEPA1 prostate transmembrane protein, androgen chr20:55632837-55633711 875 18 2.46E-02 10.52 1.20 4.89E-02 induced 1 PMF1 polyamine-modulated factor 1 chr1:154480125-154480743 619 17 4.51E-02 8.87 -1.23 4.99E-02 PMP22 peripheral myelin protein 22 chr17:15106972-15107576 605 16 4.18E-02 9.07 1.32 6.97E-03 PMS1 PMS1 postmeiotic segregation increased 1 (S. chr2:190352357-190352799 443 13 2.59E-02 10.37 -1.21 8.21E-03 cerevisiae) POLD1 polymerase (DNA directed), delta 1, catalytic chr19:55612791-55613421 631 17 1.25E-02 12.42 -1.24 1.66E-02 subunit 125kDa

194

Anhang

POMT2 protein-O-mannosyltransferase 2 chr14:76858171-76858810 640 18 3.42E-02 9.60 -1.35 1.80E-03 PPM1G protein phosphatase 1G (formerly 2C), chr2:27454708-27455594 887 25 1.40E-02 12.11 -1.23 4.46E-02 magnesium-dependent, gamma isoform PPP1R16A protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) chr8:145689073-145690100 1028 29 9.03E-03 13.43 -1.38 4.41E-02 subunit 16A PPP1R1A protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) chr12:53267161-53267937 777 22 2.80E-02 10.17 1.38 2.00E-02 subunit 1A PPP1R7 protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) chr2:241773955-241774416 462 13 1.89E-02 11.31 -1.30 3.54E-03 subunit 7 PPP3CB protein phosphatase 3 (formerly 2B), catalytic chr10:74861293-74861781 489 14 4.98E-02 8.61 -1.15 1.05E-03 subunit, beta isoform PRB4 proline-rich protein BstNI subfamily 4 chr12:11315987-11316653 667 17 1.70E-02 11.59 -1.23 8.86E-03 PRKX protein kinase, X-linked chrX:3643072-3643939 868 25 2.88E-02 10.09 -1.37 3.83E-02 PRR3 proline rich 3 chr6:30647281-30647924 644 18 4.24E-02 9.04 -1.25 2.58E-02 PSD4 pleckstrin and Sec7 domain containing 4 chr2:113656853-113657470 618 17 4.58E-02 8.82 -1.27 3.15E-02 PSG6 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 6 chr19:47936219-47936932 714 19 1.12E-02 12.74 -1.24 4.19E-02 PSMF1 proteasome (prosome, macropain) inhibitor chr20:1042710-1043933 1224 26 7.34E-03 14.06 -1.34 3.34E-03 subunit 1 (PI31) PTPN9 protein tyrosine phosphatase, non-receptor type chr15:73658034-73658643 610 17 4.35E-02 8.97 -1.34 1.07E-02 9 PUS1 pseudouridylate synthase 1 chr12:130972616-130973331 716 19 2.09E-02 10.99 -1.43 3.90E-03 RAB11FIP1 RAB11 family interacting protein 1 (class I) chr8:37880028-37880658 631 18 2.34E-02 10.67 -1.33 3.44E-02 RABL2A RAB, member of RAS oncogene family-like 2B chr2:114067514-114068154 641 18 6.79E-03 14.32 -1.76 2.71E-03 RBM34 RNA binding motif protein 34 chr1:233561217-233561978 762 22 2.33E-02 10.68 -1.30 6.19E-03 RBMX RNA binding motif protein, X-linked chr1:89231135-89231729 595 17 8.77E-03 13.52 -1.43 2.54E-03 RET ret proto-oncogene chr10:42882970-42883618 649 19 4.02E-02 9.19 -1.32 2.08E-02 RIC8B resistance to inhibitors of cholinesterase 8 chr12:105690731-105691825 1095 21 2.48E-02 10.50 -1.23 1.30E-02 homolog B (C. elegans) RIMS3 regulating synaptic membrane exocytosis 3 chr1:40906955-40907620 666 13 4.22E-02 9.05 1.28 2.11E-02 RNF130 ring finger protein 130 chr5:179429330-179430298 969 28 1.45E-02 12.01 -1.24 1.03E-02 RNF4 ring finger protein 4 chr4:2434247-2434858 612 11 4.18E-02 9.08 -1.22 4.53E-02 ROGDI rogdi homolog (Drosophila) chr16:4791708-4792452 745 16 2.06E-02 11.05 -1.34 5.73E-03 RPH3AL rabphilin 3A-like (without C2 domains) chr17:205518-206383 866 24 2.35E-02 10.65 -1.37 2.19E-02 RPL23AP7 ribosomal protein L23a pseudogene 7 chr2:114107786-114108391 606 18 1.18E-02 12.56 1.14 3.74E-02

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Anhang

RRAD Ras-related associated with diabetes chr16:65511887-65512495 609 13 4.84E-02 8.69 1.09 3.57E-02 RTKN2 rhotekin 2 chr10:63700883-63701519 637 15 3.33E-02 9.69 -1.25 2.96E-02 RUSC1 RUN and SH3 domain containing 1 chr1:153544954-153545760 807 24 8.72E-03 13.55 -1.22 2.29E-02 S100A2 S100 calcium binding protein A2 chr1:151805027-151805620 594 17 4.36E-02 8.97 -1.28 1.31E-02 S100A6 S100 calcium binding protein A6 chr1:151780267-151780901 635 18 3.67E-02 9.42 -1.24 2.54E-02 SC5DL sterol-C5-desaturase (ERG3 delta-5-desaturase chr11:120671784-120672676 893 22 1.19E-02 12.54 1.23 8.51E-03 homolog, S. cerevisiae)-like SCAMP2 secretory carrier membrane protein 2 chr15:72927060-72927436 377 11 4.54E-02 8.85 -1.40 3.79E-03 SCUBE3 signal peptide, CUB domain, EGF-like 3 chr6:35283668-35284284 617 13 4.87E-02 8.66 1.15 3.36E-02 SEP6 septin 6 chrX:118710317-118711084 768 21 3.70E-02 9.39 -1.20 3.96E-02 SEC24C SEC24 related gene family, member C (S. chr10:75211361-75211997 637 18 4.27E-02 9.02 -1.36 8.40E-03 cerevisiae) SEC31A SEC31 homolog A (S. cerevisiae) chr4:84038500-84038897 398 12 4.16E-02 9.09 -1.49 1.78E-02 SEPN1 selenoprotein N, 1 chr1:25998481-25999536 1056 23 2.08E-02 11.01 -1.65 2.62E-02 SERPINC1 serpin peptidase inhibitor, clade C chr1:172150579-172151126 548 16 1.15E-02 12.64 -1.09 4.97E-02 (antithrombin), member 1 SERPINF1 serpin peptidase inhibitor, clade F (alpha-2 chr17:1617045-1617673 629 13 2.43E-02 10.55 1.79 1.76E-02 antiplasmin, pigment epithelium der SFXN5 sideroflexin 5 chr2:73155884-73156529 646 17 4.11E-02 9.12 -1.27 7.84E-03 SH3GL3 SH3-domain GRB2-like 3 chr15:81906637-81907723 1087 30 1.35E-02 12.21 -1.26 1.96E-02 SHKBP1 SH3KBP1 binding protein 1 chr19:45775297-45776450 1154 25 2.63E-02 10.33 -1.37 1.26E-02 SLC11A1 solute carrier family 11 (proton-coupled divalent chr2:218912808-218913629 822 18 2.27E-02 10.74 -1.11 1.50E-02 metal ion transporters), membe SLC18A2 solute carrier family 18 (vesicular monoamine), chr10:118990614-118991611 998 28 1.95E-02 11.21 1.47 4.31E-02 member 2 SLC25A29 solute carrier family 25, member 29 chr14:99840206-99840823 618 14 4.26E-02 9.03 -1.38 3.23E-02 SLC35C2 solute carrier family 35, member C2 chr20:44418389-44419073 685 19 2.36E-02 10.65 -1.18 3.34E-02 SLC39A7 solute carrier family 39 (zinc transporter), chr6:33282072-33283030 959 27 1.25E-02 12.42 1.16 4.88E-02 member 7 SLC47A1 solute carrier family 47, member 1 chr17:19378654-19379036 383 11 3.87E-02 9.29 -1.74 1.92E-02 SLC47A2 solute carrier family 47, member 2 chr17:19586597-19587223 627 18 1.78E-02 11.47 -1.17 3.39E-02 SMAD4 SMAD family member 4 chr18:46825439-46825879 441 13 2.25E-02 10.77 -1.23 4.19E-02 SMARCB1 SWI/SNF related, matrix associated, actin chr22:22454226-22455278 1053 22 2.61E-02 10.36 -1.38 1.37E-02 dependent regulator of chromatin, subf

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Anhang

SMG5 Smg-5 homolog, nonsense mediated mRNA chr1:154487009-154487782 774 21 2.04E-02 11.09 -1.25 3.50E-02 decay factor (C. elegans) SNAP29 synaptosomal-associated protein, 29kDa chr22:19536882-19538018 1137 28 3.04E-02 9.94 1.14 3.60E-02 SNAPC4 small nuclear RNA activating complex, chr9:138390303-138391225 923 25 2.05E-02 11.07 -1.23 4.39E-02 polypeptide 4, 190kDa SOLH small optic lobes homolog (Drosophila) chr16:513148-513704 557 16 1.75E-02 11.52 -1.19 5.34E-03 SPAG9 sperm associated antigen 9 chr17:46554359-46554974 616 17 2.99E-02 9.97 1.28 8.87E-06 SPPL2A signal peptide peptidase-like 2A chr15:48847262-48847740 479 14 4.67E-02 8.77 1.60 2.24E-04 SPRR2B small proline-rich protein 2B chr1:151283148-151283966 819 20 6.85E-03 14.29 -1.21 2.90E-02 SPTLC2 serine palmitoyltransferase, long chain base chr14:77151995-77152873 879 24 3.71E-02 9.38 1.32 3.46E-02 subunit 2 SRF serum response factor (c-fos serum response chr6:43254307-43254904 598 17 4.91E-02 8.65 -1.35 1.22E-02 element-binding transcription factor SS18L1 synovial sarcoma translocation gene on chr20:60199335-60200021 687 14 3.40E-02 9.62 -1.30 2.54E-02 chromosome 18-like 1 SSH2 slingshot homolog 2 (Drosophila) chr17:24971940-24972524 585 16 3.41E-02 9.61 1.37 2.47E-02 SSNA1 Sjogren syndrome nuclear autoantigen 1 chr9:139198410-139199135 726 16 3.27E-03 16.48 -1.25 4.62E-02 ST13 suppression of tumorigenicity 13 (colon chr7:132416760-132417375 616 17 4.76E-02 8.73 -1.21 3.74E-03 carcinoma) (Hsp70 interacting protein) STAU1 staufen, RNA binding protein, homolog 1 chr19:15431622-15432188 567 17 2.30E-02 10.71 -1.24 2.39E-02 (Drosophila) STK38L serine/threonine kinase 38 like chr12:27287796-27288488 693 15 2.91E-02 10.06 1.61 4.05E-02 STK39 serine threonine kinase 39 (STE20/SPS1 chr2:168705880-168706465 586 10 4.00E-02 9.20 -1.25 2.01E-02 homolog, yeast) STRA6 stimulated by retinoic acid gene 6 homolog chr15:72282238-72282918 681 21 1.59E-02 11.77 -1.29 3.97E-02 (mouse) SUFU suppressor of fused homolog (Drosophila) chr10:104253614-104254402 789 20 8.47E-03 13.65 -1.24 3.82E-02 SWAP70 SWAP-70 protein chr11:9642678-9643364 687 19 4.04E-02 9.17 -2.52 1.17E-03 TACC1 transforming, acidic coiled-coil containing protein chr8:38764731-38765396 666 18 4.16E-02 9.08 2.17 1.89E-04 1 TAF11 TAF11 RNA polymerase II, TATA box binding chr6:34966439-34967042 604 17 4.66E-02 8.78 -1.76 2.61E-04 protein (TBP)-associated factor, 28kDa TAPBP TAP binding protein (tapasin) chr6:33364418-33365021 604 17 3.91E-02 9.25 -1.45 2.19E-02 TAPT1 transmembrane anterior posterior transformation chr4:15836795-15837381 587 11 4.86E-02 8.67 1.19 1.51E-02 1 TBC1D9B TBC1 domain family, member 9B (with GRAM chr5:179230943-179231655 713 19 2.74E-02 10.22 -1.15 3.64E-02

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Anhang

domain) TGFB1I1 transforming growth factor beta 1 induced chr16:31399465-31400083 619 18 3.59E-02 9.47 -1.24 1.26E-02 transcript 1 TIMM22 translocase of inner mitochondrial membrane 22 chr17:842885-843759 875 25 9.67E-05 26.97 -1.37 3.06E-03 homolog (yeast) TINF2 TERF1 (TRF1)-interacting nuclear factor 2 chr14:23770763-23771413 651 18 3.38E-02 9.65 -1.25 2.06E-02 TK1 thymidine kinase 1, soluble chr17:73698536-73699085 550 16 4.05E-02 9.16 1.61 1.17E-02 TLN1 talin 1 chr9:35717827-35718943 1117 32 2.04E-02 11.08 -1.37 1.08E-03 TMBIM1 transmembrane BAX inhibitor motif containing 1 chr2:218848629-218849264 636 18 2.69E-02 10.27 1.28 3.84E-02 TMCO3 transmembrane and coiled-coil domains 3 chr13:113186325-113186964 640 18 3.67E-02 9.42 1.24 1.93E-02 TMED9 transmembrane emp24 protein transport domain chr5:176951293-176951960 668 15 4.26E-02 9.03 1.26 2.47E-02 containing 9 TMEM173 transmembrane protein 173 chr5:138841211-138842141 931 25 1.87E-02 11.34 -1.51 1.12E-02 TMEM65 transmembrane protein 65 chr8:125457617-125458344 728 21 2.41E-02 10.58 1.52 3.18E-03 TMEM97 transmembrane protein 97 chr17:23667778-23668371 594 16 2.74E-02 10.22 -1.24 2.63E-02 TNFAIP1 tumor necrosis factor, alpha-induced protein 1 chr17:23682629-23683276 648 19 3.82E-02 9.31 -1.24 2.26E-02 (endothelial) TNIK TRAF2 and NCK interacting kinase chr3:172660066-172661004 939 26 1.09E-02 12.81 -1.30 2.32E-02 TOM1L2 target of myb1-like 2 (chicken) chr17:17686351-17686891 541 10 4.16E-02 9.09 -1.35 3.38E-03 TOP1MT topoisomerase (DNA) I, mitochondrial chr8:144493117-144494071 955 28 3.87E-04 23.17 -1.35 3.92E-02 TOP3A topoisomerase (DNA) III alpha chr17:18161093-18161866 774 22 2.31E-02 10.70 -1.31 3.81E-02 TPM3 tropomyosin 3 chr1:152437989-152438670 682 20 2.87E-02 10.09 -1.43 1.24E-02 TRAF7 TNF receptor-associated factor 7 chr16:2153924-2155961 2038 41 1.35E-02 12.22 -1.34 2.18E-02 TRIP13 thyroid hormone receptor interactor 13 chr5:935878-936321 444 13 2.03E-02 11.09 -1.53 4.26E-03 TRPV2 transient receptor potential cation channel, chr17:16225806-16226766 961 27 2.91E-03 16.86 1.22 5.83E-03 subfamily V, member 2 TSC2 tuberous sclerosis 2 chr16:2033822-2034521 700 19 4.06E-02 9.16 -1.31 1.19E-02 TSPAN9 tetraspanin 9 chr12:3061426-3062099 674 19 1.74E-02 11.53 1.12 3.51E-02 TST thiosulfate sulfurtransferase (rhodanese) chr22:35751118-35751864 747 19 1.86E-02 11.35 -1.50 1.22E-02 TTLL4 tubulin tyrosine ligase-like family, member 4 chr2:219276437-219277053 617 18 4.83E-02 8.69 -1.16 1.35E-02 TYSND1 trypsin domain containing 1 chr10:71555676-71556508 833 21 4.13E-03 15.76 -1.47 5.31E-03 UBTF upstream binding transcription factor, RNA chr17:39653911-39654711 801 21 4.30E-02 9.01 -1.44 2.49E-03 polymerase I ULK1 unc-51-like kinase 1 (C. elegans) chr12:130972616-130973331 716 19 2.09E-02 10.99 -1.29 3.39E-02

198

Anhang

UNKL unkempt homolog (Drosophila)-like chr16:1423178-1424111 934 26 2.01E-02 11.12 1.59 1.46E-02 USP22 ubiquitin specific peptidase 22 chr17:19586597-19587223 627 18 1.78E-02 11.47 -1.21 2.56E-02 USP32 ubiquitin specific peptidase 32 chr17:4972856-4974634 1779 43 5.06E-03 15.13 1.32 3.15E-02 USP36 Ubiquitin specific peptidase 36 chr17:74347504-74348321 818 22 9.10E-03 13.41 -1.45 2.41E-03 USP6 ubiquitin specific peptidase 6 (Tre-2 oncogene) chr17:4972856-4974634 1779 43 5.06E-03 15.13 1.30 6.05E-03 UXT ubiquitously-expressed transcript chrX:47379659-47380243 585 14 4.84E-02 8.68 -1.27 8.27E-03 VAC14 Vac14 chr16:69391591-69392483 893 19 2.50E-02 10.49 -1.22 5.17E-03 VANGL1 vang-like 1 (van gogh, Drosophila) chr1:115992088-115992703 616 17 2.06E-02 11.05 -1.81 2.75E-03 VEGFB vascular endothelial growth factor B chr11:63766169-63766785 617 14 4.52E-02 8.86 -1.26 5.04E-03 VIL1 villin 1 chr2:218912808-218913629 822 18 2.27E-02 10.74 1.07 2.47E-02 VPS36 vacuolar protein sorting 36 homolog (S. chr13:51877880-51878511 632 16 3.59E-02 9.47 -1.50 2.30E-03 cerevisiae) VPS39 vacuolar protein sorting 39 homolog (S. chr15:40238358-40239008 651 18 2.52E-02 10.46 -1.46 1.96E-03 cerevisiae) VPS53 vacuolar protein sorting 53 homolog (S. chr17:570253-571431 1179 31 4.32E-03 15.62 -1.16 3.03E-03 cerevisiae) VWA3B von Willebrand factor A domain containing 3B chr2:98223803-98224721 919 26 2.89E-02 10.07 -1.12 2.94E-02 WDFY3 WD repeat and FYVE domain containing 3 chr4:85824461-85825032 572 16 4.54E-02 8.85 1.26 4.62E-02 WDR40A WD repeat domain 40A chr9:34123161-34124296 1136 28 4.46E-03 15.53 -2.29 3.12E-05 WDR90 WD repeat domain 90 chr16:668843-669823 981 28 2.85E-02 10.12 -1.32 5.00E-02 WHSC1L1 Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1-like 1 chr8:38252033-38252654 622 17 1.52E-02 11.87 1.19 3.65E-02 WWC3 WWC family member 3 chrX:9937799-9938561 763 22 3.25E-02 9.76 -1.49 3.87E-02 YPEL3 yippee-like 3 (Drosophila) chr16:30010897-30011606 710 21 2.57E-02 10.40 1.49 1.00E-02 YRDC yrdC domain containing (E. coli) chr1:38043540-38044329 790 21 2.95E-02 10.02 -1.24 3.07E-02 ZBTB46 zinc finger and BTB domain containing 46 chr20:61939064-61939688 625 18 1.31E-02 12.30 -1.22 2.52E-02 ZCCHC11 zinc finger, CCHC domain containing 11 chr1:52791972-52792951 980 21 1.43E-02 12.04 -1.22 3.74E-02 ZFP62 zinc finger protein 62 homolog (mouse) chr5:180166655-180167242 588 17 4.13E-02 9.11 -1.28 1.06E-02 ZFYVE20 zinc finger, FYVE domain containing 20 chr3:15114623-15115664 1042 26 1.89E-02 11.29 1.17 4.75E-02 ZMYM6 zinc finger, MYM-type 6 chr1:35221821-35222627 807 22 6.82E-03 14.30 -1.28 2.38E-02 ZMYND19 zinc finger, MYND-type containing 19 chr9:139600149-139600529 381 12 3.33E-02 9.68 -1.39 3.75E-03 ZNF14 zinc finger protein 14 chr19:19710590-19711211 622 15 4.95E-02 8.63 -1.26 3.47E-02 ZNF17 zinc finger protein 17 chr19:62560067-62560690 624 18 2.94E-02 10.03 -1.32 1.40E-02 ZNF179 zinc finger protein 179 chr17:19257280-19257644 365 11 4.60E-02 8.82 -1.12 4.15E-02

199

Anhang

ZNF195 zinc finger protein 195 chr11:3361858-3362874 1017 29 1.76E-05 33.10 -1.24 2.48E-02 ZNF22 zinc finger protein 22 (KOX 15) chr10:44811437-44812134 698 20 2.89E-02 10.07 1.17 2.89E-02 ZNF341 zinc finger protein 341 chr20:31779141-31779703 563 12 1.04E-02 12.96 -1.38 3.94E-02 ZNF367 zinc finger protein 367 chr9:98187198-98187787 590 17 4.57E-02 8.83 -1.28 2.74E-02 ZNF497 zinc finger protein 497 chr19:63571478-63573071 1594 45 5.52E-03 14.87 -1.27 3.85E-03 ZNF512 zinc finger protein 512 chr2:27659376-27660055 680 19 3.31E-02 9.71 -1.70 3.70E-04 ZNF569 zinc finger protein 569 chr19:42655543-42656153 611 17 4.36E-02 8.97 -1.22 4.83E-02 ZNF618 zinc finger protein 618 chr9:115853382-115854466 1085 30 1.39E-02 12.14 -1.42 2.62E-02 ZNF701 zinc finger protein 701 chr19:57748937-57749582 646 18 2.84E-02 10.13 -1.22 3.10E-02 ZNF76 zinc finger protein 76 (expressed in testis) chr6:35368367-35368985 619 17 4.65E-02 8.78 -1.32 2.31E-03 ZSWIM3 zinc finger, SWIM-type containing 3 chr20:43949291-43949833 543 16 3.72E-02 9.38 -1.32 1.73E-03

8.9.2 Expressionsmuster der Gene mit sowohl signifikanter differentieller Expression (HEK293/HeLa; MYST4 siRNA) als auch signifikanter Anreicherung in der ChIP-on-chip (HEK293/HeLa; MAT korrigierter P-Wert <0,05)

Observed Uniprot-Term genes % p-value* Benjamini* Brain 30 45.5 7.00E-04 4.09E-01 Muscle 7 10.6 1.02E-02 9.79E-01 Lymphocyte 3 4.5 1.83E-02 9.90E-01 Spleen 7 10.6 2.09E-02 9.81E-01 Fetal brain 6 9.1 2.63E-02 9.82E-01 Epithelium 11 16.7 2.98E-02 9.77E-01 *p-values and Benjamini-Hochberg p-values were caclulated using the DAVID funtional annotation of Uniprot tissue expression

200

Anhang

8.9.3 Über DAVID functional annotation signifikant angereicherte KEGG-Signalwege für die Gene mit sowohl signifikanter differentieller Expression (HEK293/HeLa; MYST4 siRNA) als auch signifikanter Anreicherung in der ChIP-on-chip (HEK293/HeLa; MAT korrigierter P-Wert <0,05)

KEGG pathway name p-value Fold enrichment Thyroid cancer* 5.73E-03 10.58 MAPK signaling pathway* 2.41E-02 2.48

8.9.4 Über Pathway Express signifikant angereicherte KEGG-Signalwege für die Gene mit sowohl signifikanter differentieller Expression (HEK293/HeLa; MYST4 siRNA) als auch signifikanter Anreicherung in der ChIP-on-chip (HEK293/HeLa; MAT korrigierter P-Wert <0,05)

No. genes % Pathwaygenes p-value KEGG pathway name Rank Impact factor in pathway in input uncorrected corrected gamma corrected gamma Phosphatidylinositol signaling system* 1 42.5 76 1.3 8.34E-01 8.34E-01 1.51E-17 1.51E-17 Circadian rhythm* 2 26.8 13 7.7 2.47E-01 2.47E-01 6.46E-11 6.46E-11 Antigen processing and presentation* 3 25.9 89 5.6 3.72E-02 3.72E-02 1.45E-10 1.45E-10 MAPK signaling pathway* 4 6.0 272 4.0 4.82E-02 4.82E-02 1.72E-02 1.72E-02 Pathways in cancer* 5 6.0 330 3.9 4.39E-02 4.39E-02 1.74E-02 1.74E-02 Basal cell carcinoma* 6 5.9 55 5.5 1.31E-01 1.31E-01 1.90E-02 1.90E-02 Gap junction* 7 5.6 96 2.1 6.42E-01 6.42E-01 2.34E-02 2.34E-02 Thyroid cancer* 8 5.6 29 6.9 1.46E-01 1.46E-01 2.45E-02 2.45E-02 Apoptosis* 9 5.2 89 5.6 5.48E-02 5.48E-02 3.45E-02 3.45E-02 Regulation of actin cytoskeleton* 10 5.1 217 2.8 3.53E-01 3.53E-01 3.73E-02 3.73E-02 Small cell lung cancer* 11 4.8 86 5.8 5.06E-02 5.06E-02 4.60E-02 4.60E-02

201

Anhang

8.9.5 Gene des KEGG MAPK-Signalwegs mit sowohl signifikanter (dick hinterlegt) differentieller Expression (HEK293/HeLa; MYST4 siRNA) als auch signifikanter Anreicherung in der ChIP-on-chip (HEK293/HeLa; MAT korrigierter P-Wert <0,05)

ChIP-on-CHIP enriched region Expression Gene Probes MAT- Fold symbol Gene Name Chromosome region Length(bps) in region p-value score change p-value MAPK11 mitogen-activated protein kinase 11 chr22:49035213-49036046 834 24 1.85E-03 18.40 -1.27 5.42E-02 MAPK12 mitogen-activated protein kinase 12 chr22:49035213-49036046 834 24 1.85E-03 18.40 -1.04 6.87E-01 FLNA filamin A, alpha (actin binding protein 280) chrX:153235798-153237011 1214 33 2.29E-03 17.64 -1.33 5.78E-02 FGF22 fibroblast growth factor 22 chr19:591265-592254 990 23 2.72E-03 17.14 -1.07 5.33E-01 MAP3K6 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 6 chr1:27576823-27577534 712 16 5.71E-03 14.79 -1.25 1.50E-01 CACNA1A calcium channel, voltage-dependent, P/Q type, chr19:13477805-13478560 756 18 9.86E-03 13.13 -1.17 1.44E-01 alpha 1A subunit MAP3K12 mitogen-activated protein kinase kinase kinase chr12:52196249-52197268 1020 29 1.05E-02 12.94 -1.20 1.23E-01 12 CACNG2 calcium channel, voltage-dependent, gamma chr22:35435808-35436315 508 14 1.17E-02 12.60 -1.02 8.57E-01 subunit 2 MAP2K3 mitogen-activated protein kinase kinase 3 chr17:21125336-21126121 786 22 1.29E-02 12.35 -1.43 1.41E-02 HSPA1L heat shock 70kDa protein 1-like chr6:31873223-31873813 591 15 1.39E-02 12.13 1.17 1.74E-01 IKBKG inhibitor of kappa light polypeptide gene chrX:153537304-153537888 585 13 1.65E-02 11.67 -1.15 1.59E-01 enhancer in B-cells, kinase gamma RASGRP2 RAS guanyl releasing protein 2 (calcium and chr11:64235895-64236992 1098 31 1.73E-02 11.55 1.23 2.02E-01 DAG-regulated) NTRK1 neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 1 chr1:155096881-155097821 941 24 1.75E-02 11.51 -1.01 9.34E-01 MKNK2 MAP kinase interacting serine/threonine kinase 2 chr19:2008501-2009234 734 20 1.78E-02 11.47 -1.21 1.82E-01 MAPK8IP3 mitogen-activated protein kinase 8 interacting chr16:1766988-1768014 1027 28 1.84E-02 11.40 -1.10 4.64E-01 protein 3 PTPN7 protein tyrosine phosphatase, non-receptor type chr1:200391831-200392552 722 18 1.90E-02 11.28 1.03 4.91E-01 7 PDGFB platelet-derived growth factor beta polypeptide chr22:37978948-37979686 739 20 1.99E-02 11.15 -1.13 3.52E-01 PLA2G2F phospholipase A2, group IIF chr1:20337136-20337759 624 15 2.09E-02 11.00 -1.04 5.74E-01 DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3 chr12:56205980-56206818 839 24 2.23E-02 10.79 1.07 7.96E-01 SMAD4 SMAD family member 4 chr18:46825439-46825879 441 13 2.25E-02 10.77 -1.23 4.19E-02 CACNA2D2 calcium channel, voltage-dependent, alpha chr3:50349280-50350005 726 20 2.37E-02 10.62 -1.30 3.65E-02

202

Anhang

2/delta subunit 2 JUN jun oncogene chr1:59020523-59021495 973 27 2.54E-02 10.44 1.44 1.81E-01 MAX MYC associated factor X chr14:64638099-64638744 646 17 2.66E-02 10.29 -1.22 4.23E-02 MAPK13 mitogen-activated protein kinase 13 chr6:36198896-36199646 751 21 2.72E-02 10.25 -1.08 3.87E-01 PDGFRB platelet-derived growth factor receptor, beta chr5:149480346-149480990 645 18 2.72E-02 10.24 1.06 5.67E-01 polypeptide CACNG4 calcium channel, voltage-dependent, gamma chr17:62389856-62390809 954 27 2.77E-02 10.19 1.05 5.84E-01 subunit 4 PRKX protein kinase, X-linked chrX:3643072-3643939 868 25 2.88E-02 10.09 -1.37 3.83E-02 MKNK1 MAP kinase interacting serine/threonine kinase 1 chr1:46790394-46791066 673 19 2.91E-02 10.05 -1.07 3.16E-01 FGF1 fibroblast growth factor 1 (acidic) chr5:141986937-141987647 711 20 2.93E-02 10.04 -1.09 1.56E-01 FGF8 fibroblast growth factor 8 (androgen-induced) chr10:103527007-103527730 724 20 3.01E-02 9.96 -1.01 9.39E-01 STMN1 stathmin 1/oncoprotein 18 chr1:26105057-26105706 650 18 3.38E-02 9.65 -1.22 1.22E-01 GNA12 guanine nucleotide binding protein (G protein) chr7:2740139-2740820 682 19 3.39E-02 9.63 1.16 2.73E-01 alpha 12 JUND jun D proto-oncogene chr19:18256743-18257344 602 15 3.42E-02 9.61 1.17 2.68E-01 TGFB3 transforming growth factor, beta 3 chr14:75517201-75517968 768 21 3.47E-02 9.56 1.04 3.71E-01 AKT2 v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2 chr19:45477316-45477991 676 17 3.55E-02 9.50 -1.66 6.57E-03 CACNB4 calcium channel, voltage-dependent, beta 4 chr2:152664408-152665082 675 19 3.57E-02 9.49 -1.02 7.96E-01 subunit PTPN5 protein tyrosine phosphatase, non-receptor type chr11:18706089-18706805 717 20 3.66E-02 9.43 1.09 4.36E-01 5 (striatum-enriched) FGF14 fibroblast growth factor 14 chr13:101850962-101851659 698 19 3.76E-02 9.36 1.01 7.32E-01 CACNA1I calcium channel, voltage-dependent, T type, chr22:38294186-38294777 592 17 3.90E-02 9.26 -1.13 1.81E-01 alpha 1I subunit PTPRR protein tyrosine phosphatase, receptor type, R chr12:69604288-69605016 729 21 3.92E-02 9.25 -1.05 7.42E-01 FGFR4 fibroblast growth factor receptor 4 chr5:176448835-176449531 697 16 3.94E-02 9.24 1.01 7.60E-01 MRAS muscle RAS oncogene homolog chr3:139568666-139569273 608 12 3.98E-02 9.22 -1.13 4.60E-02 CACNA1B calcium channel, voltage-dependent, N type, chr9:139888580-139889214 635 18 4.00E-02 9.20 -1.11 1.48E-01 alpha 1B subunit MAP2K2 mitogen-activated protein kinase kinase 2 chr7:128551685-128552287 603 17 4.13E-02 9.12 -1.19 1.04E-01 DUSP2 dual specificity phosphatase 2 chr2:96178127-96178804 678 16 4.14E-02 9.11 1.48 1.64E-01 FGF11 fibroblast growth factor 11 chr17:7260904-7261636 733 22 4.21E-02 9.06 -1.17 1.08E-01 TAOK2 TAO kinase 2 chr16:29909731-29910337 607 17 4.46E-02 8.91 -1.11 5.15E-01

203

Anhang

NFATC4 nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, chr14:23906236-23906838 603 16 4.52E-02 8.86 -1.09 4.20E-01 calcineurin-dependent 4 HSPA1B heat shock 70kDa protein 1B chr6:31904789-31905394 606 17 4.72E-02 8.75 1.13 2.54E-01 ELK1 ELK1, member of ETS oncogene family chrX:47379659-47380243 585 14 4.84E-02 8.68 -1.23 3.72E-02 HRAS v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene chr11:530259-530861 603 17 4.86E-02 8.67 -1.14 4.43E-01 homolog SRF serum response factor (c-fos serum response chr6:43254307-43254904 598 17 4.91E-02 8.65 -1.35 1.22E-02 element-binding transcription factor) PPP3CB protein phosphatase 3 (formerly 2B), catalytic chr10:74861293-74861781 489 14 4.98E-02 8.61 -1.15 1.05E-03 subunit, beta isoform

204

Anhang

Danksagung

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. André Reis für die freundliche Aufnahme und

Unterstützung am Humangenetischen Institut sowie im Besonderen Frau Prof. Dr. med.

Anita Rauch für die Bereitstellung des Themas, die kompetente Betreuung, freundliche

Unterstützung und Diskussionsbereitschaft, die wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. An dieser Stelle möchte ich mich auch bei allen am Themengebiet beteiligten Ärzten, Mitarbeitern und Kooperationspartnern herzlich für die produktive

Zusammenarbeit bedanken. Auch möchte ich Herrn Prof. Dr. Robert Slany für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens danken.

Mein recht herzlicher Dank geht an alle ehemaligen und aktuellen Mitglieder der AG

Rauch für das freundschaftliche, produktive und äußerst angenehme Arbeitsumfeld.

Hierbei möchte ich für ihre uneingeschränkte Unterstützungsbereitschaft besonders Herr

Dr. med. Christian Thiel und Frau Dr. med. Christiane Zweier danken, die mich in meiner wissenschaftlichen Entwicklung wesentlich unterstützt haben. Für die gegenseitige produktive und heitere Unterstützung im Laboralltag möchte ich Herrn Markus Zweier im

Speziellen danken.

Ich möchte mich bei allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern am Humangenetischen

Institut für eine unvergessliche und von Freundschaft geprägte Zeit danken!

Nicht zuletzt Danke ich meiner lieben Frau Barbara Kraft für die jahrelange Unterstützung in meinen Bemühungen sowie meinen Eltern Rudolf und Babette Henglein, die mir eine akademische Karriere ermöglicht haben.

205

Anhang

Lebenslauf Michael Kraft

Anschrift: Anton-Bruckner Strasse 12 91052 Erlangen

Tel.: 09131 / 6873516 Email: [email protected]

Geboren: 31.03.1982, Forchheim geb. Michael Henglein

Familienstand: verheiratet

 Schulbildung 1992 - 2001 Ehrenbürg-Gymnasium Forchheim Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

 Wehrdienst 07/2001 – 03/2002 Ableistung des Grundwehrdienstes

 Studium 10/2002 – 10/2007 Diplomstudiengang Biologie Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Hauptfach: Genetik Nebenfächer: Molekulare Pflanzenphysiologie Mikrobiologie Tierphysiologie

Diplomarbeit am Humangenetischen Institut bei Prof. Winterpacht zum Thema:

Validierung und erste funktionelle Charakterisierung von potentiellen Komponenten der Chondrozytendifferenzierung

 Promotion ab 11/2007 Promotion am Humangenetischen Institut bei Frau Prof. Rauch zum vorliegenden Thema:

Molekulargenetische Charakterisierung konstitutioneller chromosomaler Translokationen zur Positionsklonierung krankheitsverursachender Gene

Erlangen, 24.05.2012

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Anhang

Publikationen

Die genetische Aufklärung im Falle des Noonan-Syndrome-Like-Patienten über Positionsklonierung des krankheitsverursachenden Gens MYST4, dessen Haploinsuffizienz über funktionelle Charakterisierung als bis dahin unbekannte genetische Ursache für Erkrankungen im Noonan-Syndrom-Spektrum nachgewiesen werden konnte, wurde wie folgt veröffentlicht:

Kraft M., Cirstea I.C., Voss A.K., Thomas T., Goehring I., Sheikh B., Gordon L., Scott H., Smyth G.K., Ahmadian M.R. et al. (2011). Disruption of the histone acetyltransferase MYST4 leads to a Noonan syndrome-like phenotype and hyperactivated MAPK signaling in humans and mice. J Clin Invest.

Eine Veröffentlichung über die genetische Aufklärung im Falle der Patientin 46,XX,t(1;8) mit kombiniertem Phänotyp aus hypogonadotropem Hypogonadismus und Adipositas, welche die Möglichkeit von komplexeren zu Grunde liegenden genetischen Situationen demonstrierte, wird angestrebt und ist beim Fachjournal AJHG eingereicht:

Kraft M., Bauhuber S., Trautmann U., Thiel C.T., Hoyer J., Zweier M., Hofmann K., Ekici A.B., de Zwaan M., Reis A., Dörr H., Rauch A. The complex genetic nature of a syndromic phenotype of severe obesity and hypogonadotropic hypogonadism.

Für die genetische Aufklärung im Falle der Patientin 46,XX,t(5;14) mit schwerer mentaler Retardierung, bei der eine translokationsabhängige FOXG1-Defizienz als Ursache aufgezeigt werden konnte, ist eine Coauthorschaft für die Veröffentlichung im Rahmen einer Kooperation geplant.

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