Đề Tài: “ Nghiên Cứu Đánh Giá Và Xây Dựng Quy Trình Nhân Giống Cho Loài Sâm Núi Dành (Callerya Speciosa (Champ.Ex Benth) Schot) Phân Bố Trên Địa Bàn Tỉnh Bắc Giang”

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------

Nguyễn Thanh Loan

ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH (CALLERYA SPECIOSA (CHAMP.EX BENTH) SCHOT) PHÂN BỐ TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG”

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------

Nguyễn Thanh Loan

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : Hướng dẫn 1: TS. Đồng Thị Kim Cúc Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Thanh Hương

Hà Nội - 2019

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác. Các số liệu chưa từng được công bố trong luận án, luận văn nào trước đây.

Mọi dữ liệu trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Tác giả

Nguyễn Thanh Loan

Lời cảm ơn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô và các cán bộ công tác tại Học viện Khoa học và Công nghệ đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Học viện.

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đồng Thị Kim Cúc và TS. Nguyễn Thị Thanh Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cho tôi trong quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể các cán bộ, anh chị em, bạn bè, đồng nghiệp trong Trung Tâm thực nghiệm Sinh học Nông nghiệp Công nghệ cao thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.

Luận văn này được thực hiện bởi sự cho phép của Viện Di truyền Nông nghiệp, Trung tâm Thực nghiệm sinh học Nông nghiệp Công nghệ cao và được thực hiện từ nguồn kinh phí đề tài “Nghiên cứu đánh giá, bảo tồn nguồn gen cây Sâm Núi Dành phân bố trên địa bàn Tỉnh Bắc Giang”

Luận văn có sự động viên và giúp đỡ của gia đình tôi.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 9 tháng 10 năm 2019

Tác giả

Nguyễn Thanh Loan

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Viết tắt Viết đầy đủ DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) Cs Cộng sự BA Benzyladenine (6-Benzyladenine) CT Công thức ĐC Đối chứng Ki Kinetin IBA Indole-3-butyric acid MS Murashige và Skoog (1962) NAA Naphthaleneacetic acid TB Trung bình TN Thí nghiệm CV% Hệ số biến động (Correlation ò Variance)

LSD0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0,05 (Leant Significant Difference) MTN Môi trường nền L lít Mg miligram

iii

MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...... 1 1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ...... 1 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI ...... 2 3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI ...... 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...... 3 1.1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH ...... 3 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA ... 5 1.3.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC VẬT DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ ...... 6 1.3.1. Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật ...... 6 1.3.2. Bộ gene lục lạp ...... 7 1.3.3. Các trình tự bảo tồn ở bộ gene trong nhân ...... 7 1.3.4. Kết quả nghiên cứu ADN mã vạch trong kiểm định giống nhân sâm. .. 9 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRÊN CÂY SÂM NGỌC LINH ...... 10 1.5. TÌNH HÌNH NHÂN GIỐNG LOÀI CELLERYA SPECIOSA CHAMP ... 11 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...... 11 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ...... 12 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 14 2.1.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THƠI GIAN NGHIÊN CỨU . 14 2.1.1.Đối tượng ...... 14 2.1.2.Vật liệu nghiên cứu ...... 14 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...... 14 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...... 14 2.2.1. Nội dung 1: Thu thập, lấy mẫu và phân loại chính xác loài Sâm Núi Dành bằng marker phân tử trong số các mẫu Sâm thu thập được trên địa bàn tỉnh Bắc Giang...... 14 2.2.2. Nội dung 2: Phân tích định tính một số nhóm chất trong củ Sâm Núi Dành 15 2.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và phương pháp nuôi cấy in- vitro 15 2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 15 2.3.1.Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu ngoài thực địa ...... 15 2.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các giống/loài bằng các marker đặc trưng-Barcode ...... 16

2.3.3. Phương pháp phân tích định tính một số nhóm hoạt chất có dược tính trong loài Sâm Núi Dành ...... 19 2.3.4. Phương pháp nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành ...... 20 2.3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm ...... 25 2.3.6.Phương pháp xử lý số liệu ...... 25 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...... 26 3.1. THU THẬP, LẤY MẪU VÀ PHÂN LOẠI CHÍNH XÁC LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ TRONG SỐ CÁC MẪU SÂM THU THẬP ĐƯỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG...... 26 3.1.1. Thu thập, lấy mẫu một số loài Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang ...... 26 3.1.2. Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành...... 28 3.2. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ NHÓM CHẤT TRONG CỦ SÂM NÚI DÀNH ...... 32 3.3. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIÂM HOM VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN-VITRO..36 3.3.1. Phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại vùng bản địa bằng các phương pháp giâm hom ...... 36 3.3.2. Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro ...... 40 3.3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sâm Núi Dành in-vitro ngoài vườn ươm ...... 51 CHƯƠNG 4 . KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...... 54 4.1. KẾT LUẬN ...... 54 4.2. KIẾN NGHỊ ...... 55

DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1. Danh sách các mồi ITS ...... 14

Bảng 3.1. Danh sách kí hiệu 4 mẫu Sâm ...... 28 Bảng 3.2. Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu Sâm nghiên cứu ...... 30 Bảng 3. 3. Hệ số tương đồng giữa các mẫu Sâm nghiên cứu ...... 31 Bảng 3.4 . Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành dưới 3 năm tuổi .... 32 Bảng 3.5. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành từ 3-5 năm tuổi ...... 33 Bảng 3.6. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành trên 5 năm tuổi ...... 33 Bảng 3.7. Một số hình ảnh của phản ứng định tính một số nhóm chất ...... 34 Bảng 3. 8. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng hình thành rễ hom giâm ...... 36 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây hom Sâm Núi Dành...... 37 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch bệnh ...... 40 Bảng 3. 11. Ảnh hưởng của Ki đến khả năng tái sinh chồi...... 42 Bảng 3. 12. Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm Núi Dành ...... 45 Bảng 3. 13. Ảnh hưởng của MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ ...... 46 Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của ½MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ ...... 46 Bảng 3. 15. Ảnh hưởng của môi trường MS và IBA đến sự hình thành rễ ...... 47 Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của môi trường ½MS và IBA đến sự hình thành rễ ...... 48 Bảng 3. 17. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới chất lượng bộ rễ ...... 50 Bảng 3. 18. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây Sâm Núi Dành in-vitro .... 51 Bảng 3.19. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S1 trong NCBI ...... 64 Bảng 3.20. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S2 trong NCBI ...... 65 Bảng 3.21. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S3 trong NCBI ...... 66 Bảng 3.22. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S4 trong NCBI ...... 67

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. a) Cây Sâm Núi Dành , b) Cây Sâm Đắng ...... 26 Hình 3.2. Củ Sâm Núi Dành và củ Sâm Ngọt (Sâm Nam) ...... 27 Hình 3.3. Các dạng lá Sâm thu tại tỉnh Bắc Giang ...... 27 Hình 3.4. a) Quả Sâm Núi Dành b) Quả Sâm Đắng ...... 27 Hình 3. 5. Hom Sâm Núi Dành được xử lý qua các công thức thí nghiệm ...... 37 Hình 3.6. Động thái tăng trưởng số chồi/hom ...... 38 Hình 3.7. Động thái tăng trưởng chiều dài của chồi hom giâm ...... 39 Hình 3.8. Động thái tăng trưởng số lá/chồi ...... 39 Hình 3. 9. Mẫu Sâm Núi Dành sau 2 tuần trên môi trường tái sinh ...... 42 Hình 3. 10. Chồi Sâm Núi Dành trên các CT môi trường nhân nhanh ...... 44 Hình 3. 11. Ảnh hưởng của môi trường và nồng độ các hoocmon tăng trưởng đến khả năng hình thành rễ ...... 49 Hình 3. 12. Chồi Sâm ra rễ trên môi trường có bổ sung 1 mg/l IBA + 0,4 mg/l THT ...... 50 Hình 3. 13. Cây Sâm Núi Dành in-vitro hoàn chỉnh ...... 51 Hình 3.14. Cây Sâm Núi Dành in-vitro ra cây trên các công thức giá thể ...... 52

vii

MỞ ĐẦU 1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ở Việt Nam, trong tổng số 3.948 loài cây thuốc có khoảng 87,1% là các loài mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu ở các quần xã rừng, số còn lại là cây trồng. Mỗi năm ngành Y dược tiêu thụ 30-50 tấn dược liệu các loại phục vụ chữa bệnh hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong số đó, trên 2/3 lượng dược liệu được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên hoặc trồng trong nước, vì thế nhu cầu cây thuốc trong nước là rất lớn. Năm 2016, Viện Dược liệu đã công bố tổng số 5117 loài cây thuốc đã được phát hiện [1]. Sâm Núi Dành là một loài cây thuốc phân bố ở chân Núi dành thuộc huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang. Hiện nay cho thấy do nhu cầu sử dụng dược liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây nên Sâm Núi Dành bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên cạn kiệt. Theo Sách đỏ Việt Nam (2007), loài này được xếp ở mức độ sẽ bị nguy cấp bởi nơi cư trú của chúng bị thu hẹp do rừng thường xuyên bị chặt phá; loài bị khai thác nhiều để làm thuốc có thể dẫn đến cạn kiệt [2]. Một nguyên nhân khác dẫn đến sự cạn kiệt nguồn gen quý này là do cây Sâm Núi Dành rất khó nhân giống. Hạt nảy mầm rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vùng phân bố của Sâm không đa dạng. Việc bảo tồn loài sâm quý này đang ở mức báo động, cần sự chung tay góp sức của các cấp, ngành và người dân địa phương. Một trong những mục tiêu quan trọng của đề tài là nhân giống vô tính được loài Sâm Núi Dành nhằm lưu giữ, bảo tồn nguồn gen quý của loài Sâm này do nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác ồ ạt. Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống Sâm Núi Dành có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách. Nguồn cung cấp cây giống hiện nay chủ yếu bằng phương pháp nhân giống truyền thống: giâm cành, gieo hạt nhưng hệ số nhân giống đạt rất thấp, hạt gần như không nảy mầm ngoài tự nhiên. Để cải thiện hệ số nhân giống cây Sâm này, chúng tôi đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm thiết lập quy trình nhân giống vô tính loài Sâm Núi Dành có nguồn gốc từ tỉnh Bắc Giang. Nuôi cấy

1 mô tế bào thực vật là một trong những công cụ hữu hiệu cho việc nhân giống và bảo tồn này. Nó cho phép trong thời gian ngắn nhất, nhân nhanh với quy mô lớn và cây có độ đồng đều cao, sạch bệnh và giữ được đặc tính di truyền của bố mẹ. Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu, đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành (Callerya speciosa (Champ. ex Benth) Schot) phân bố trên địa bàn tỉnh Bắc Giang”. 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Nghiên cứu, điều tra, thu thập các mẫu Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang. Xác định chính xác tên loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp sinh học phân tử và xác định thành phần một số hoạt chất trong củ Sâm Núi Dành ở các độ tuổi khác nhau. - Xây dựng được quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và công nghệ in-vitro. 3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI - Đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học bước đầu về nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành. - Các kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là tài liệu tham khảo trong việc nghiên cứu, giảng dạy có giá trị cho lĩnh vực công nghệ sinh học và nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH Sâm Núi Dành là một đối tượng chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam và trên thế giới. Vì vậy, việc tiếp cận các kết quả nghiên cứu còn hạn chế, việc định hướng các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước cũng khó khăn. Sâm Núi dành được biết đến qua một số bài báo của tác giả Trần Đình Dũng, Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang. Theo bài viết của tác giả, trong sách “Đại Nam nhất thống chí”, có ghi: “Tên nỏ sản xuất tại Yên Thế. Sâm Nam sẵn ở đỉnh núi Chung Sơn. Cỏ thi cũng có ở Chung Sơn”. Núi Chung Sơn được nhắc tới đó là Núi Dành, nay phần lớn thuộc xã Liên Chung và phần còn lại thuộc địa phận xã Việt Lập, huyện Tân Yên. Những câu chuyện quanh loài Sâm quý này được người dân sinh sống dưới chân Núi dành kể lại. Theo ông Nguyễn Văn Được, 72 tuổi ở thôn Hậu, nhà ngay dưới chân Núi dành cho biết: “Núi dành xưa kia toàn cây de với giàng giàng, mỗi lần Lý trưởng kiếm được củ sâm thì mừng lắm, hiện ở góc vườn nhà tôi còn một khóm sâm, mỗi năm nó chỉ ra một đốt từ đó mọc rễ và ra củ nên củ không lớn, tôi cũng đã từng nhân thử giống Sâm Núi dành nhưng không thành công, và cũng đã nhiều lần thử du nhập những giống sâm khác về trồng nhưng không sống được có lẽ do thời tiết và thổ nhưỡng không hợp”. Ông Nguyên Khắc Lư, 62 tuổi, ở thôn Hậu, xã Liên Chung tâm sự, gần hai chục năm trước ông nhận đất trồng rừng ở chân Núi dành. Trong một lần cuốc đất thấy bật lên những củ nhỏ, mùi thơm, nếm thử thấy ngọt mát, vốn gia đình có nghề làm thuốc Đông y nên ông Lư biết mình gặp may khi tìm thấy gốc Sâm Núi dành và ông giữ gìn từ đó cho tới bây giờ. Theo ông Lư, loại sâm này phải trên 10 năm tuổi dùng mới hữu dụng. Những căn bệnh thông thường như ho cảm sốt, đau đầu, nhất là đối với trẻ nhỏ dùng chút ít là khỏi [3]. Bằng phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, các tác giả Đồng Thị Kim Cúc và cộng sự, đã xác định được Sâm Núi Dành thuộc họ đậu (Fabaceae), chi Callerya có tên khoa học Callerya speciosa (Champ.) Schot., [4].

Đặc điểm nông sinh học: Thân: Sâm Núi Dành thuộc dạng cây dây leo hoặc trườn, thường dài 4 - 5 m hoặc hơn, cành non có lông màu bạc; Rễ củ nạc, có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi thơm dịu và vị ngọt mát. Lá kép lông chim lẻ, trục chính của lá dài 6-15 cm, mang 3-7 lá chét; lá chét hình bầu dục dài hay trái xoan, cỡ 3-8 x 1-3 cm, 2 mặt có lông tơ màu trắng, gân bên có 5-6, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới lá xanh nhạt. Hoa: Cụm hoa chùm, mọc ở đầu cành hay nách lá, dài đến 30 cm, cuống hoa và đài đều có lông nhung trắng. Hoa to, mọc đơn độc trên đốt trục cụm hoa, dài 2,5-3 cm. Đài hình chuông, 5 mảnh dính với nhau, cỡ 9 x 12 cm, mặt ngoài có lông, mép có 4 răng; tràng 5 cánh không đều nhau, tiền khai hoa cờ: cánh cờ (ở trên) lớn nhất, có màu sắc đẹp hơn và ở ngoài cùng, 2 cánh bên nhỏ hơn, trong cùng là 2 cánh thìa dính lại với nhau ở đáy tạo thành cấu trúc tương tự như cái thuyền con mang kèm nhị và nhụy. Cánh hoa màu trắng ngà, cánh cờ không có lông, 2 bên gốc có cục chai. Nhị 10, 9 chiếc dính lại với nhau ở phần chỉ nhị thành 1 bó bao quanh nhụy, 1 chiếc rời. Bầu nhụy lớn, 1 ô, mang 2 dãy noãn, khi phát triển được sẽ tạo ra quả. Bầu hình thuôn, dài bằng nhị. Quả đậu, dẹp, cỡ 9-18 x 1,2-1,6 x 0,7-0,8 cm, có lông nâu phủ dầy. Hạt 2-3, hình trứng, cỡ 1 cm. Củ sâm có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi thơm dịu và có vị hơi ngọt. Sinh học, sinh thái: Mùa ra hoa tháng 6-8, quả tháng 9-12 [4]. Giá trị sử dụng: Rễ củ được đào ở những cây trên 1 năm tuổi, phơi khô, thái mỏng, tẩm nước gừng hoặc mật ong, sao vàng dùng làm thuốc; có tác dụng trị đau vùng lưng, khớp, thông kinh hoạt lạc, bổ nhuận phế, chữa cơ thể suy nhược, kém ăn, ho nhiều đờm, nhức đầu, bí tiểu tiện [5].

1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA Ting Yin và cộng sự đã phân lập được flavonoid millettiaspecoside A, millettiaspecoside B, millettiaspecoside C, millettiaspecoside D, khaephuoside B, seguinoside K, ablbrissinoside B từ phân đoạn n-butanol của dịch chiết cồn củ Callerya speciosa (Champ.) [6], [7]. Zong XK và cộng sự đã phân lập được thêm 5 chất từ dịch chiết cồn 95o củ Callerya speciosa: Isoliquitigenin, maackiain, pterocarpin, medicarpin, homopterocapain [8]. Ping Ding và cộng sự đã phân lập được thêm 13 chất từ phân đoạn ether và ethyl acetat dịch chiết củ M. speciosa: docosanoic acid, tetracosane, octadecane, hexacosanoic acid, β-sitosterol acetate, β-sitosterol, syringin, maackiain, ormononetin, ψ-baptigenin, rotundic acid, pedunculoside và daucosterol. Trong đó có β-sitosterol acetate, syringin, ψ-baptigenin, rotundic acid và pedunculoside là những chất lần đầu tiên được công bố có mặt trong cây [9]. Wang Cheng – wen đã định lượng được hàm lượng flavonoid tổng trong dịch chiết chloroform rễ củ Millettia speciosa lên đến 5,52 mg/g dược liệu [10]. Jun Cheno và cộng sự đã phân lập được 3 isoflavon glycosid từ thân loài Callerya nitida (Millettia nitida var. hirsutissima) gồm: formononetin 7- O-b-D-(6-ethylmalonyl)- glucopyranoside (hirsutissimiside A); 5- Omethylgenistein 7-O-a-L- rhamnopyranosyl-(1→6)-b-D-glucopyranoside (hirsutissimiside B); retusin 7,8-di- O-b-Dglucopyranoside (hirsutissimiside C) [11]. Ito Chihiro và cộng sự đã phân lập được các isoflavonoid từ dịch chiết aceton của thân và hạt loài Callerya atropurpurea (Millettia atropurpurea) gồm: isoformonotein, sayanedine, prunetin, formonotein, auriculasin, millepurone, vestitol và millepurpan [12]. Fang Song-Chwan và cộng sự đã phân lập được 6 flavonoid từ thân loài Callerya reticulata var. reticulata (Millettia reticulata Benth.) gồm: (-) epicatechin; narigenin; 5,7,3’,5’- tetrahydroxy flavone; formononetin;

5 isoliquirtigenin và genistein [13]. Theo Đỗ Tất Lợi, loài M. speciosa có chứa tinh bột và alkaloid [14] 1.3.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC VẬT DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ 1.3.1. Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của thế giới sinh vật. Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loại mang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa. Sự xuất hiện và phát triển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa – PCR [15] đã hình thành nên một lượng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA. Nhiều dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã được ứng dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở thực vật. Các thực vật bậc cao mang trong nó ba bộ gene: bộ gene trong nhân, bộ gene ty thể và bộ gene lạp thể. Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở các bộ gene này xảy ra không đồng đều. Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở mỗi bộ gene đã được đánh giá thông qua việc quan sát các thay thế nucleotide ở hàng loạt thực vật một và hai lá mầm [16]. Bộ gene ty thể có mức độ thay thế nucleotide thấp nhất, trung bình khoảng (0,2 - 1,1) × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm. Bộ gene lạp thể có mức độ thay thế nhanh hợn chút ít, khoảng (1,1 – 2,9) × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm. Trái lại, bộ gene trong nhân có tỷ lệ thay thế nucleotide nhanh hơn gấp 150 lần so với bộ gene ty thể (đến 31,5 × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm. Nghiên cứu đánh giá về tỷ lệ thay thế nucleotide dựa trên các dữ liệu trình tự từ lúa và ngô cũng cho kết quả tương tự như Wolfe và cộng sự. Tỷ lệ thay thế nucleotide ở những cây này khác về căn bản so với sự tiến hóa nhanh chóng của các phân tử ty thể ở động vật. Trong lịch sử tương đối ngắn của hệ thống học phân tử, lúc đầu các nhà nghiên cứu tập trung tương đối nhiều vào bộ gene lục lạp, tuy nhiên điều đó

đã thay đổi khi các khảo sát về sau đã chuyển hướng sang các trình tự gene trong nhân [17]. 1.3.2. Bộ gene lục lạp Bộ gene lục lạp của đa số các thực vật trên cạn thông thường được đặc trưng bởi phân tử dạng vòng. Bộ gene này bé nhất trong số ba bộ gene, khoảng 135-160kb [18] với hai phân đoạn lặp đảo [inverted repeat (IR) segments] chia phần phân tử còn lại thành một vùng LSC (large single-copy region) và một vùng SSC (small single-copy region). Thành phần, kích thước, cấu trúc và trình tự của bộ gene lục lạp đã được xác định là có mức độ bảo tồn cao trong các nghiên cứu về tiến hóa [19]. Tính bảo tồn cao này chỉ ra rằng bất kỳ thay đổi nào về cấu trúc, cách sắp xếp hay thành phần đều liên quan mạnh mẽ đến quan hệ phát sinh. Các phần khác nhau của bộ gene tiến hóa theo các tỷ lệ khác nhau và tương đối chậm ở mức độ trình tự nucleotide. Những vùng không mã hóa của bộ gene lục lạp tiến hóa nhanh hơn những vùng mã hóa [16]. Các đột biến ở DNA lục lạp thường là các thay thế nucleotide hay sự sắp xếp lại. Các đột biến tăng đoạn hay mất đoạn tích lũy trong vùng không mang mã xảy ra với tỷ lệ ngang với sự thay thế nucleotide và chính kiểu đột biến này làm tăng cường tính đa dạng của các vùng không mang mã. Phần lớn các gene lục lạp là loại gene đơn bản trong khi các gene trong nhân là thành viên của những họ đa gene. Tính bảo tồn cao của DNA lục lạp thực sự là ưu thế khi sử dụng nó để xây dựng lại mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở các mức độ từ loài đến chi và đến họ thực vật [20],[17]. Có thể thấy những gene mã hóa và không mã hóa ở lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu quan hệ phát sinh như sau: 1.3.3. Các trình tự bảo tồn ở bộ gene trong nhân Bộ gene trong nhân có kích thước lớn nhất trong số ba bộ gene ở thực vật (1.1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao gồm rất nhiều gene. Phần lớn các nổ

7 lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự DNA ribosome trong nhân. Cấu trúc căn bản của DNA ribosome là một đơn vị lặp đơn, mỗi đơn vị như thế có thể lặp lại đến hàng ngàn lần trong bộ gene. Bộ gene trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao gồm khoảng trống bên ngoài vùng sao mã (ETS), tiếp theo là gene 18S mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ và gene 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một gene nhỏ hơn là 5,8S. Các khoảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách rời những gene vừa đề cập. Chiều dài của ba vùng mang mã là giống nhau ở các thực vật: gene 18S là khoảng 1800bp, 26S là khoảng 3300bp và gene 5,8S là khoảng 160bp. Ngược lại, chiều dài của các khoảng trống giữa các gene biến động từ 1 đến 8kb. Họ gene rDNA chứa các vùng bảo tồn cao như 18S, 26S có thể sử dụng để suy luận các quan hệ phát sinh ở các mức độ phân loại cao. Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong so sánh các loài và những chi gần nhau, thậm chí là so ở mức độ các quần thể. Các trình tự 18S rDNA thường được sử dụng rộng rãi hơn các trình tự 26S. Cho dù cả hai vùng cùng được có dải ứng dụng rộng như nhau nhưng kích thước trên 3000bp của 26S rDNA đã cản trở các nhà nghiên cứu, đặc biệt là trong việc giải trình tự toàn bộ gene. Trái lại, kích thước của 18S rDNA khoảng 1800bp giúp cho nó được ưu tiên lựa chọn hơn để khuếch đại bằng PCR và giải trình tự. Thực tế cho thấy hình thể cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự 18S rDNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự rbcL ở nhiều mức độ phân loại ở thực vật hạt kín. Cho dù rất có tiềm năng trong việc xây dựng cây quan hệ phát sinh ở thực vật, vùng 18S rDNA vẫn chưa được tận dụng trong hệ thống học thực vật hạt kín [17]. Gene 26S rDNA thường được lưu ý là ứng viên cho việc thay thế gene 18S rDNA. Khi so sánh có thể nhận thấy toàn bộ gene 26S rDNA tiến hóa nhanh gấp từ 1,6 đến 2,2 lần và cung cấp các đặc điểm mang tính thông tin nhiều hơn 3 lần so với 18S rDNA.

Gene 5,8S rDNA dễ dàng được khuếch đại và giải trình tự khi sử dụng các mồi định vị trên các gene 18S và 26S rDNA. Gene 5,8S rDNA hiếm khi được sử dụng để suy luận quan hệ phát sinh bởi tính bảo tồn cao và kích thước bé (164-165bp). Tỷ lệ các vị trí mang thông tin tiềm năng cho phân tích quan hệ phát sinh ở thực vật có hạt cũng tương đương với gene 18S rDNA. Vùng ITS: ITS1 phân cách gene 18S rDNA với gene 5,8S rDNA còn ITS 2 phân cách gene 5,8S rDNA với gene 26S rDNA. Vùng ITS hiện hữu một cách rộng rãi dưới 700bp ở các thực vật có hoa [21]. Vùng ITS chứa các trình tự bảo tồn cao nên rất nhiều mồi tổng thể được thiết kế cho việc khuếch đại và giải trình tự đã được mô tả. Các trình tự ITS1 và ITS2 vốn giàu GC làm cho việc giải trình tự trở nên khó khăn. Khó khăn trong việc giải trình tự biến động theo các nhóm thực vật và việc cho thêm DMSO hay BSA vào PCR hay phản ứng giải trình tự là việc bổ sung mang lại hiệu quả cao [22]. Việc căn trình tự ITS từ nhiều họ thực vật hạt kín chỉ ra rằng các trình tự ITS1 và ITS2 đa dạng hơn trình tự của các gene rDNA. Các trình tự ITS biến động một cách hiệu quả cho phép giải quyết những câu hỏi về quan hệ phát sinh ở những taxon có quan hệ họ hàng gần. Theo đó, rất nhiều các bài báo thể hiện sự thành công trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa sử dụng các trình tự ITS [23],[24]. Hơn nữa, vùng ITS được di truyền theo kiểu từ cả cha và mẹ khiến cho nó cũng có thể được sử dụng để thăm dò sự lai chéo [25]. 1.3.4. Kết quả nghiên cứu ADN mã vạch trong kiểm định giống nhân sâm. Tại Hàn Quốc, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại chi Panax đã được triển khai nhiều và đạt được nhiều kết quả mang tính ứng dụng cao. Trường đại học tổng hợp Hàn Quốc. Thư viện BAC (bacterial artificial chromosome) gồm 106.368 dòng với chiều dài trung bình khoảng 98,61kb[26]. Từ thư viện BAC các nhà khoa học đã thiết kế các chỉ thị phân tử SSR và thành công trong việc xác định chỉ thị phân tử đặc hiệu trong phân biệt các giống sâm của Hàn Quốc và trên thế giới. Trường đại học Chung Ang Hàn Quốc đã nghiên cứu sự khác nhau giữa các loài nhân sâm bằng chỉ thị phân tử RAPD. Kết quả mồi OP-5A cho băng đơn ADN với các mẫu nhân.

Mồi chỉ thị RAPD13B chỉ sự khác nhau giữa các loài sâm [27]. Trường đại học William & Mary của Mỹ đã nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm Mỹ và nghiên cứu chọn giống Sâm bằng chỉ thị phân tử [28]. Năm 2011, Lee và cộng sự đã phát triển một chỉ thị SCAR dẫn xuất từ ISSR để nhận dạng các chủng sâm P.ginseng có đặc tính tốt phục vụ cho chọn giống. 34 trong số 85 mồi ISR hình thành locus đa hình. Các mồi UBC-821, UBC-868 và UBC-878 làm nảy sinh các băng đa hình giữa các chủng P.ginseng và cho phép phân biệt chúng với các mẫu P.quinquefolius và P.notoginseng [29]. Tác giả Hongtao Wang – Trung tâm nghiên cứu và sản xuất Sâm của Hàn Quốc đã nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử đặc hiệu phân biệt giống sâm Chunpoong với các giống Sâm khác. Giống sâm Chunpoong là một giống nhập nội chất lượng cao và chất lượng cao trong số chín giống nhân sâm Hàn Quốc. Trung tâm đã nghiên cứu quy trình kiểm định giống Chunpoong bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự ADN của ty lạp thể (COX2) trên vị trí intron I và intron II. Chỉ thị phân tử SNP đặc hiệu đã được nghiên cứu dùng phân biệt giống nhân sâm Chunpoong với các giống nhân sâm khác một cách đơn giản và chính xác [30]. Từ năm 2012 đến nay Trung tâm Ươm tạo và Hỗ trợ doanh nghiệp Khoa học công nghệ đã hợp tác nghiên cứu giải trình tự hệ gen lục lạp của Sâm Ngọc Linh với Trường đại học Quốc gia Seuol Hàn Quốc. Cuối năm 2015 tác giả Nguyễn Văn Binh, cán bộ của Trung tâm đã nghiên cứu giải trình tự hoàn thiện genome lục lạp trên Sâm Ngọc Linh [31]. Kết quả này đóng vai trò rất quan trọng trong việc nghiên cứu mối quan hệ di truyền của Sâm Ngọc Linh với các loài khác trong họ Araliaceae và là cơ sở dữ liệu cho việc thiết kế các chỉ thị phân tử đặc trưng cho loài. 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRÊN CÂY SÂM NGỌC LINH Nguyễn Ngọc Dung là một trong những tác giả đầu tiên nghiên cứu nhân giống vô tính Sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh học thông qua tái sinh từ mô sẹo [32]. Năm 2010, Dương Tấn Nhật và cộng sự cũng tiến hành

10 nhân giống vô tính cây Sâm Ngọc Linh thông qua con đường phát sinh cơ quan [33]. Mô sẹo được cảm ứng ở các mẫu củ Sâm Ngọc Linh cắt mỏng trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4D và 0,2 mg/l TDZ trong điều kiện chiếu sáng 16h/ngày. Môi trường tốt nhất cho tỷ lệ tăng sinh khối mô sẹo là môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4D và 0,2 mg/l TDZ. Số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao nhất trên môi trường Sh bổ sung1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA và 2,0 g/l thanh hoạt tính. Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, môi trường ½MS đực bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA, 50 g/l sucrose và 2 g/l thanh hoạt tính. Nguyễn Bảo Triệu và công sự cũng đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro Sâm Ngọc Linh trên môi trường MS bổ sung 1,0mg/l 2,4D, 0,2 mg/l TDZ và trên môi trường SH bổ sung 1.0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA. Mai Trường và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tạo và nhân giống phôi sôma Sâm Ngọc Linh trong môi trường lỏng [34]. Hoàng Xuân Chiến và cộng sự đã thử nghiệm khả năng tạo củ in vitro và xác định hàm lượng saponin ở các cây trồng thử nghiệm 17 tháng tuổi [35]. Các hệ phức hợp của GA/ABA và auxin/cytokinin trong quá trình hình thành củ cũng được tác giả khảo sát.

Nồng độ ABA thích hợp nhất cho quá trình tạo củ là 3,0 mg/l. GA3 ức chế khả năng tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh. Các chồi cây Sâm Ngọc Linh được cảm ứng để tạo củ thành công trên môt trường SH có bổ sung 1,0 mg/l NAA và 2,0 mg/l BA trong điều kiện chiếu sáng 16h/ngày. Nồng độ đường sucrose tốt nhất cho quá trình tạo củ là 50 g/l. Hàm lượng saponin trong củ của những cây 17 tháng tuổi nuôi trồng ngoài tự nhiên cũng đã được xác định là G-Rb1 (0,21%), G-Rg1 (0,17%) MR2 (0,77%) [35]. 1.5. TÌNH HÌNH NHÂN GIỐNG LOÀI CELLERYA SPECIOSA CHAMP 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Năm 2008, Huang và cs đã nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy mô Millettia speciosa Champ. (tên gọi khác của Cellerya speciosa Champ.): Họ đã tìm được môi trường nền là MS + 1,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA kết quả cho tỷ lệ cảm ứng tạo chồi có thể đạt 100%. Sau khi cấy 20 ngày, các chồi nách bắt đầu nảy mầm và phát triển bình thường. Với môi trường nhân nhanh là MS + 2,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA, sau nuôi cấy 30 ngày cho hệ số nhân đạt 7,0, sự sinh trưởng và phát triển của chồi là bình thường. Môi trường tạo

11 cây hoàn chỉnh tốt nhất là 1/2MS + 0,5 mg/l IBA + 0,5 mg/l IAA cho tỷ lệ ra rễ đạt 80%, chất lượng rễ tốt nhất [36]. Năm 2010, Pan và cs đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cây thuốc Millettia speciosa Champ. Kết quả của nghiên cứu: sử dụng các đoạn thân cây của Millettia speciosa Champ. để làm mẫu cấy để khử trùng và kết luận là mẫu cấy khử trùng trong 5 phút với 0,1% HgCl2 là thích hợp nhất. Môi trường cảm ứng tạo mô sẹo cao nhất là môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l αNAA [Error! Reference source not found.]. Các chồi nách ở thân có thể tái sinh tạo chồi trong môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm với 2,0 và 2,5 mg/l 6-BA, nhưng tỷ lệ tái sinh tạo chồi cao nhất chỉ đạt 78,6%. Môi trường tốt nhất cho tái sinh chồi nách là MS + 2,0 mg/l 6-BA + 0,05 mg/l αNAA, hệ số nhân là 4,0 - 5,0 sau khi nuôi cấy trong 30 ngày. Tỷ lệ ra rễ của chồi đạt 66,7% trên môi trường 1/2MS + 2,5 mg/l αNAA + 2,5 mg/l IBA và tỷ lệ sống của cây đạt 85% sau 30 ngày ở giai đoạn vườn ươm khi cây giống cấy mô được trồng trên giá thể là hỗn hợp chất đất và cát ở tỷ lệ (3:1) [37]. 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Năm 2015, Nguyễn Thị Minh Hiền đã nghiên cứu nhân giống in- vitro cây Sâm Nam Núi dành bằng phương pháp tạo callus. Nghiên cứu đã thu được các kết quả: Các chất điều tiết sinh trưởng 2,4-D, αNAA, BA có cảm ứng kích thích lớp mỏng mô lá Sâm Nam Núi dành tạo callus, tạo rễ nhưng không tạo chồi. Bổ sung 3,0 mg/l αNAA là thích hợp nhất cho sự tái sinh tạo callus cũng như tạo củ in vitro từ lớp mỏng mô lá Sâm Nam Núi dành. Nguồn gốc callus tái sinh từ các môi trường khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng của callus khi được cấy chuyển lên các môi trường tái sinh mới. Trong đó, các khối callus trước đó được tái sinh từ lớp mỏng tế bào mô lá Sâm Nam Núi dành trên môi trường (DCR + 3,0 mg/l αNAA) có khả năng sinh trưởng tốt nhất. Nồng độ đường sucrose 30 g/l là thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của callus. Theo nghiên cứu của Hoàng Vũ Thơ đăng trên tạp chí Công nghệ sinh học và Giống cây trồng với nội dung: “Nghiên cứu khả năng ra rễ của Sâm Nam Núi dành (callerya spp.) bằng phương pháp giâm hom”. Thời

12 gian giâm hom vào vụ Xuân, với hom thu từ cây mẹ tuổi 4 cho thấy: 1) Sử dụng IBA nồng độ 750ppm cho tỷ lệ ra rễ đạt 11,11%, số rễ trung bình trên hom là 0,24 rễ, chiều dài rễ trung bình là 3,0cm và chỉ số ra rễ đạt trị số 0,72; 2) Khi sử dụng NAA nồng độ 500ppm cho tỷ lệ ra rễ hom đạt 11,11%, số rễ trung bình trên hom là 0,2 rễ, chiều dài trung bình của rễ là 1,33cm và chỉ số ra rễ là 0,27; 3) Sử dụng TTG giâm hom cho tỷ lệ ra rễ đạt 2,22%, số rễ trung bình trên hom là 0,02, chiều dài trung bình của rễ là 1,5cm và chỉ số ra rễ là 0,03. Khả năng ra rễ của hom chịu ảnh hưởng rõ rệt của nồng độ hoocmone.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THƠI GIAN NGHIÊN CỨU 2.1.1.Đối tượng Đối tượng nghiên cứu của đề tài là loài Sâm Núi Dành, một loại cây dược liệu phân bố trên địa bàn Tỉnh Bắc Giang. 2.1.2.Vật liệu nghiên cứu - Các mẫu Sâm thu thập trên địa bàn tỉnh Bắc Giang - Danh sách các đoạn mồi ITS [38](Bảng 2.1) Bảng 2. 1. Danh sách các mồi ITS

TT Mồi Trình tự Nucelotid ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT TGC GG ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC - Mẫu rễ cây Sâm Núi Dành ở các tuổi khác nhau: mẫu dưới 2 năm, 3 năm, 4 năm, > 5 tuổi và đoạn thân bánh tẻ chứa chồi ngủ cây Sâm Núi Dành có độ tuổi từ 1-1,5 tuổi. 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Thí nghiệm giâm hom được thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp và xã Việt Lập – huyện Tân Yên – Bắc Giang. - Nghiên cứu quy trình nhân giống in-vitro, nghiên cứu các marker đặc trưng để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành được thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp. - Phân tích định tính các thành phần hóa học thực hiện tại Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. - Thời gian nghiên cứu : 2017 – 8/2019 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nội dung 1: Thu thập, lấy mẫu và phân loại chính xác loài

Sâm Núi Dành bằng marker phân tử trong số các mẫu Sâm thu thập được trên địa bàn tỉnh Bắc Giang. - Công việc 1 : Điều tra, thu thập thông tin và lấy mẫu một số loài Sâm phân bố trên địa bàn tỉnh Bắc Giang. - Công việc 2: Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành. 2.2.2. Nội dung 2: Phân tích định tính một số nhóm chất trong củ Sâm Núi Dành - Công việc : Phân tích định tính một số nhóm chất trong loài Sâm Núi Dành 2.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và phương pháp nuôi cấy in-vitro - Công việc 1: Nghiên cứu phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại vùng bản địa bằng các phương pháp giâm hom. - Công việc 2: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro. 2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1.Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu ngoài thực địa Sử dụng phương pháp thu mẫu thực địa theo Nguyễn Nghĩa Thìn (1997, 2007). - Phương pháp thu mẫu: Mẫu vật được thu hái theo danh lục đã phỏng vấn và theo sự chỉ dẫn của các thầy thuốc bản địa. Các mẫu thu được có bộ phận dinh dưỡng và bộ phận sinh sản; trường hợp mẫu thu được không đủ đặc điểm phân loại (do không vào mùa hoa, quả) thì tiến hành thu và thay thế mẫu trong các đợt thu mẫu tiếp theo. Mỗi mẫu đều được gắn nhãn (etyket) ghi số hiệu mẫu, địa điểm và nơi lấy, các đặc điểm quan trọng: cây gỗ hay dây leo; màu sắc lá, hoa, quả; mùi vị đặc trưng (nếu có); có nhựa mủ hay không; môi trường sống...

- Cách xử lý mẫu: Mẫu vật được xử lý ngay sau mỗi đợt thu mẫu, ép tạm thời bằng giấy báo, buộc chặt, cho vào túi nilon và tẩm cồn 70%. - Chụp ảnh: sử dụng máy ảnh để ghi lại hình ảnh của các loài cây thuốc, cách sơ chế, sử dụng và những hoạt động của tập thể trong quá trình nghiên cứu. 2.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các giống/loài bằng các marker đặc trưng-Barcode 2.3.2.1. Tách chiết ADN tổng số Phương pháp sử dụng CTAB có cải tiến. Quy trình: - Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60C. - Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn (mẫu sâm, chày, cối được giữ trước ở - 80C).

- Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS 10%. Thành phần dung dịch đệm chiết: Tris-bazơ 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M, CTAB 2%. - Ủ mẫu ở 65C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút. - Bổ sung Chloroform, lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm 11000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4C. Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới. - Tiếp tục chiết lần 2 bằng Chloroform, thu được dịch chiết chứa ADN. - Tủa ADN bằng isopropanol đã làm lạnh. Để ở -20C trong 1 giờ.

- Ly tâm thu tủa 10500 vòng/phút trong 15 phút ở 4C. - Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE. - Loại ARN: bổ sung RNase vào mẫu ADN và ủ ở 37C trong 1 giờ. Các bước tiếp theo tương tự các bước 5-9. 2.3.2.2. Thành phần của một phản ứng PCR

- Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần:

STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất hai lần khử ion 9 2 Buffer Mg+ 25 Mm 1,5 3 dNTPs 10 Mm 0,3 4 Taq ADN polymerase 5 U/µl 0,2 5 Mồi ITS1 10 µM 1,5 6 Mồi ITS4 10 µM 1,5 7 DNA 1 Tổng thể tích của một phản ứng 15,0 2.3.2.3. Chương trình chạy PCR Phản ứng PCR được tiến hành trong ống eppendorf 0,2 ml và thực hiện trên máy Mastercycler epgradient S theo chu trình sau: Các bước Nhiệt độ(C) Thời gian 1 94 5 phút 2 94 1 phút 3 52 45 giây 3 72 50 giây 5 Lặp lại từ bước 2, 35 lần 6 72 7 phút 7 4 ∞ Sau khi hoàn thành chương trình chạy PCR, sản phẩm PCR được bổ sung 4 µl loading dye rồi tiến hành điện di. 2.3.2.4. Phương pháp điện di trên gel agarose Cân 0,4 g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn. Để nguội 45-50C bổ sung 2,5 l Ethidium Bromide, đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn. Sau 30-60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm. Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 4 l loading dye và tra vào các giếng trên gel.

Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn. Đặt 130V. Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr. 2.3.2.5. Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen 1. Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2ml. 2. Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3 thể tích QG: 1 thể tích gel (100mg ~100μl). 3. Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn. 4. Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu vàng, nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung 10μl sodium acetate 3M, pH 5. 5. Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút. 6. Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa. 7. Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau đó ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút. 8. Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1.5ml sạch. 9. Để hoà tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH 7 – 8.5) vào giữa màng của cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút, thu lượng ADN tinh sạch. 2.3.2.6. Giải trình tự Sản phẩm PCR ITS sau khi được tinh sạch, được giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được được so sánh với các trình tự tương đồng trên NCBI. Sau đó, các trình tự được tập hợp lại và phân tích bằng chương trình MEGA v5.1 để tạo cây phát sinh loài.

2.3.3. Phương pháp phân tích định tính một số nhóm hoạt chất có dược tính trong loài Sâm Núi Dành 2.3.3.1. Phương pháp chiết mẫu Mẫu rễ Sâm Núi Dành được sấy khô, xay nhỏ và ngâm chiết với EtOH ở nhiệt độ phòng, 3 lần, mỗi lần 8 h. Gộp dịch chiết của 3 lần chiết để tiến hành phân tích định tính. 2.3.3.2.Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học a. Định tính saponin: Bằng hiện tượng tạo bọt [39]. Cách tiến hành: cân 1g bột củ Sâm Núi Dành (qua rây số 32), cho vào bình tam giác có thể tích 500ml đã chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đúng 100ml. Lấy 1 ống nghiệm có chiều cao 16 cm và đường kính 16 mm, cho vào ống nghiệm 10ml nước sắc. Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc. Ðể yên 15 phút nếu có bọt xuất hiện thì kết luận trong mẫu có chứa saponin. b. Định tính flavonoid : - Phản ứng với kiềm: Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% vào dịch chiết sẽ thấy xuất hiện tủa vàng. Sau đó, thêm nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ được tăng thêm[40]. - Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda): Ðây là phản ứng khử cũng được sử dụng để tìm sự có mặt của các dẫn chất nhóm flavonoid.

- Phản ứng với dung dịch FeCl3

- Tác dụng với H2SO4 đậm đặc c. Định tính coumarin: - Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm. - Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)

Dựa vào huỳnh quang tăng lên ở môi trường kiềm khi soi dưới ánh đèn tử ngoại. Nguyên nhân sau khi mở vòng lacton bằng kiềm thì coumarin tạo thành dẫn chất hydroxycinnamic ở dạng cis (acid coumarinic). Chất này dưới tác dụng của tia tử ngoại thì chuyển thành dạng trans (acid coumaric) có huỳnh quang sáng hơn [41]. d. Định tính acid hữu cơ:

- Phản ứng với Na2CO3:

Chất hữu cơ nào tác dụng được với muối cacbonat tạo khí CO2 thoát ra thì phân tử chất hữu cơ phải có chứa nhóm chức axit hữu cơ (−COOH). ↑ R-COOH + Na2CO3 → R-COONa + CO2 + H2O e. Định tính acid amin: - Phản ứng với ninhydrin: Dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh-tím sẫm [39]. f. Định tính alkaloid:

Sử dụng thuốc thử Dragendorff (KBiI4 – Kali tetraiodobismutat). Thuốc thử Dragendorff được chuẩn bị từ hai dung dịch sau:

Dung dịch 1: Lấy 0,85 g NaHSO3 hòa tan trong 40 ml nước cất và 10 ml acid acetic. Dung dịch 2: Lấy 8 g KI hòa tan trong 20 ml nước cất. Lấy 2 ml dung dịch 1 trộn với 5 ml dung dịch 2 và thêm 20 ml acid acetic sau đó thêm nước cất đến 100 ml là được thuốc thử Dragendorff. Nếu có mặt alkaloid thì thấy xuất hiện màu da cam sáng. 2.3.4. Phương pháp nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành 2.3.4.1. Nghiên cứu phương pháp nhân giống vô tính bằng giâm hom  Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ hoocmone sinh trưởng đến khả năng ra rễ và nảy chồi của hom Sâm Núi Dành. - Bố trí thí nghiệm: 4 công thức thí nghiệm và 1 công thức đối chứng: + ĐC: Nhúng qua nước cất + CT 1: Dung dịch IBA nồng độ 500ppm, nhúng nhanh trong 5 giây + CT 2: Dung dịch IBA nồng độ 1.000 ppm, nhúng nhanh trong 5 giây + CT 3: Dung dịch IBA nồng độ 1.500 ppm, nhúng nhanh trong 5 giây

+ CT 4: Dung dịch IBA nồng độ 2.000 ppm, nhúng nhanh trong 5 giây Các công thức và đối chứng được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ, 3 lần lặp, số mẫu cho mỗi công thức và đối chứng là 90 hom. -Vật liệu sử dụng: là các đoạn thân bánh tẻ có chứa mắt ngủ. - Phương pháp: Cắt thành các hom có từ 2 – 3 mắt. Sau đó tiến hành nhúng nhanh qua các công thức thí nghiệm. Và giâm hom vào trong khay cát sạch đã được xử lý sạch với nước và đem phơi khô. - Chăm sóc: Sau khi giâm hom được che nắng và giữ ẩm thường xuyên.  Thí nghiệm 2: Xác định giá thể ra cây phù hợp cho cây giâm hom Các mẫu hom đã ra rễ thu được từ kết quả của thí nghiệm 1 được lấy làm vật liệu cho thí nghiệm 2. - Bố trí thí nghiệm: 4 công thức giá thể sau + GT 1: Đất tầng B + GT 2: 50% đất tầng B+ 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa + GT 3: 30% đất tầng B + 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa + GT 4: 40% đất tầng B + 60% bột xơ dừa Chú ý: Đất tầng B- lớp đất thứ 2 từ trên mặt xuống, sau lớp tầng đất mặt hay tầng đất canh tác (đất tầng A), tích tụ các chất rửa trôi từ tầng A xuống, được lấy tại chân Núi Dành - thôn Đồng Sen - xã Việt Lập - huyện Tân Yên. Giá thể được xử lý thuốc chống nấm (Benkona) trước khi sử dụng cho thí nghiệm. Giá thể được đóng trong túi bầu có kích thước 10x10. Mật độ giâm 100 bầu/m2. Bầu được đặt trong bóng dâm có che phủ 1 lớp lưới đen. Tưới nước giữ ẩm 3 lần/ngày trong tháng đầu tiên và 2 lần/ngày từ tháng thứ 2. Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển của hom Sâm ở các công thức thí nghiệm. Các đặc điểm hình thái được theo dõi bằng phương pháp quan sát, đo đếm trực tiếp số cây sống, cây chết.

2.3.4.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro Sâm Núi Dành Vật liệu: Đoạn thân bánh tẻ có chứa mắt ngủ lấy từ cây Sâm Núi Dành 1 -1,5 năm tuổi. Khử trùng sơ bộ dưới vòi nước chảy, rửa bằng chất tẩy nhẹ (xà phòng hoặc nước rửa chén loãng) rồi tráng qua bằng nước cất vô trùng. Sau đó mẫu được đưa vào trong box cấy, khử trùng nhanh bằng cồn 70% trong 20 giây rồi rửa sạch 2 lần bằng nước cất vô trùng. Sau đó thực hiện thí nghiệm khử trùng. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu xác định biện pháp khử trùng tạo mẫu sạch:

- Sử dụng chất khử trùng: HgCl2 0,1% và Javen 6%. - Bố trí thí nghiệm: 8 công thức và 1 đối chứng ĐC: Không sử dụng các chất khử trùng

CT1: Lắc khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong 3 phút

CT2: Lắc khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong 5 phút

CT3: Lắc khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút

CT4: Lắc khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong 9 phút CT5: Lắc khử trùng mẫu bằng Javen 6% trong 10 phút CT6: Lắc khử trùng mẫu bằng Javen 6% trong 12 phút CT7: Lắc khử trùng mẫu bằng Javen 6% trong 14 phút CT8: Lắc khử trùng mẫu bằng Javen 6% trong 16 phút Mẫu cấy sau khi khử trùng được cấy vào môi trường nền MS [42] không chứa hoocmon sinh trưởng. Theo dõi tỷ lệ mẫu sạch bệnh, tỷ lệ mẫu nảy chồi và chất lượng chồi sau khử trùng sau 20 ngày vào mẫu. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi: - Bố trí thí nghiệm: gồm 5 công thức và 1 đối chứng ĐC: MS + 30 g/l Sucrose + 6,5 g/l Agar CT1: ĐC + 0,2 mg/l Ki

CT2: ĐC + 0,4 mg/l Ki CT3: ĐC + 0,6 mg/l Ki CT4: ĐC + 0,8 mg/l Ki CT5: ĐC + 1 mg/l Ki - Sử dụng các mẫu sạch thu được từ phương pháp khử trùng tốt nhất của thí nghiệm 1 cấy trên các công thức môi trường tái sinh. - Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng, tái sinh chồi, chất lượng chồi sau 30 ngày nuôi cấy. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và IBA đến hệ số nhân chồi. Chồi tái sinh được lấy từ môi trường tái sinh tốt nhất, chồi xanh mập đã có lá được cắt thành từng đoạn dài 3-5 cm chứa 1-2 mắt ngủ được chuyển sang môi trường nhân nhanh. - Bố trí thí nghiệm: Sử dụng môi trường: MS + 30 mg/l sucrose + 6,5 mg/l aga có bổ sung BA ở các nồng độ: 2; 2,5; 3 và 3,5 mg/l và IBA ở các nồng độ: 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4 mg/l. Theo dõi hệ số nhân chồi, chiều cao trung bình của chồi và chất lượng chồi sau 60 ngày nuôi cấy. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường tạo rễ cho chồi Sâm Núi Dành in- vitro: + Thí nghiệm 4.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền có bổ sung NAA ở các nồng độ đến khả năng hình thành rễ của chồi Sâm Núi Dành. - Bố trí thí nghiệm: gồm 10 công thức và 2 đối chứng

ĐC1: MS + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l ĐC2: ½ MS + 30 g/l sucrose + 6,5 agar g/l agar CT1: ĐC1 + 0,5 mg/l NAA CT6: ĐC2 + 0,5 mg/l NAA CT2: ĐC1 + 1 mg/l NAA CT7: ĐC2 + 1 mg/l NAA CT3: ĐC1+ 1,5 mg/l NAA CT8: ĐC2+ 1,5 mg/l NAA CT4: ĐC1+ 2 mg/l NAA CT9: ĐC2+ 2 mg/l NAA CT5: ĐC1+ 2,5 mg/l NAA CT10: ĐC2+ 2,5 mg/l NAA

+ Thí nghiệm 4.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền có bổ sung IBA ở các nồng đến khả năng hình thành rễ của chồi Sâm Núi Dành. - Bố trí thí nghiệm: gồm 10 công thức sau:

CT1: ĐC1 + 0,5 mg/l IBA CT6: ĐC2 + 0,5 mg/l IBA CT2: ĐC1 + 1 mg/l IBA CT7: ĐC2 + 1 mg/l IBA CT3: ĐC1+ 1,5 mg/l IBA CT8: ĐC2+ 1,5 mg/l IBA CT4: ĐC1+ 2 mg/l IBA CT9: ĐC2+ 2 mg/l IBA CT5: ĐC1+ 2,5 mg/l IBA CT10: ĐC2+ 2,5 mg/l IBA + Thí nghiệm 4.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến chất lượng rễ. Môi trường ra rễ tối ưu nhất từ kết quả của thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 được bổ sung thêm than hoạt tính với các nồng độ: 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 mg/l. Các thí nghiệm được theo dõi tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình trên mỗi mẫu, chiều dài trung bình của rễ và chỉ số ra rễ sau 90 ngày nuôi cấy. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sâm Núi Dành in-vitro ngoài vườn ươm. Cây Sâm Núi Dành in-vitro hoàn chỉnh được đưa ra vườn trên các loại giá thể khác nhau. Cây in vitro hoàn chỉnh có 2-4 rễ, thân dài 10-15cm, có 3-4 nhánh thân được huấn luyện và trồng trong bầu tại vườn ươm - Bố trí thí nghiệm: gồm 4 công thức giá thể sau: - GT 1: Đất tầng B - GT 2: 50% đât tầng B + 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa - GT 3: 30% đất tầng B+ 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa - GT 4: 40% đất tầng B + 60% bột xơ dừa Giá thể được xử lý thuốc chống nấm (Benkona) trước khi sử dụng cho thí nghiệm. Giá thể được đóng trong túi bầu có kích thước 10x10. Mật độ giâm 80 bầu/m2.

Bầu được đặt trong nhà lưới có che phủ bằng nylon và 1 lớp lưới đen. Tưới nước giữ ẩm 3 lần/ngày trong tháng đầu tiên và 2 lần/ngày từ tháng thứ 2. Theo dõi tỷ lệ cây sống, cây chết, sinh trưởng và phát triển của cây. 2.3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên hoàn toàn (Complete Randomized Design -CRD) với 20 bình, mỗi bình 4 mẫu, lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu theo dõi Số mẫu sạch bệnh  Tỷ lệ mẫu sạch bệnh = x 100% Tổng số mẫu Số mẫu nảy chồi  Tỷ lệ mẫu nảy chồi = x 100% Tổng số mẫu Số mẫu ra chồi (rễ)  Tỷ lệ ra chồi (rễ) = x 100% Tổng số mẫu (rễ)  Số lượng chồi trung bình, số rễ trung bình và chiều dài trung bình chồi trên mỗi mẫu được tính theo công thức: 1 n

X = ∑ Xi n i-n Tổng số chồi (rễ)  Hệ số nhân chồi (rễ) = Tổng số mẫu  Chỉ số ra rễ = Số rễ TB/mẫu x Chiều dài rễ TB/mẫu Điều kiện môi trường và phòng nuôi cấy Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C trong 25 phút. Điều kiện nuôi cấy in vitro: 14h sáng, cường độ ánh sáng 2000 - 2500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C. 2.3.6.Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Excel 2013 và IRRISTAT 5.0.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. THU THẬP, LẤY MẪU VÀ PHÂN LOẠI CHÍNH XÁC LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ TRONG SỐ CÁC MẪU SÂM THU THẬP ĐƯỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG. 3.1.1. Thu thập, lấy mẫu một số loài Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang + Sâm Đắng ở chân núi Yên Tử, huyện Sơn Động - Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông nâu. Lá kép lông chim lẻ, 11-15 lá chét, lá chét dài thon nhọn, mặt phủ lông tơ màu nâu. Hoa màu nâu, có lông tơ màu nâu phủ bên ngoài. Quả đậu, có lông nâu phủ, có 2-3 hạt hình trứng. + Sâm Ngọt (người dân còn gọi là Sâm Nam) thu tại huyện Lạng Giang - Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông bạc. Lá kép lông chim lẻ, 7-11 lá chét, lá chét dài thon nhọn. Hoa màu trắng ngà, có phủ lông nhung trắng. Quả đậu, có phủ lông nâu, có 5-6 hạt hình trứng. + Sâm Núi Dành thu tại xã Việt Lập và xã Liên Chung huyện Tân Yên - Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông bạc. Lá kép lông chim lẻ, 3-7 lá chét, lá chét hình bầu dục, mặt phủ long tơ trắng. Hoa trắng ngà, có phủ lông nhung trắng. Quả đậu, có lông nâu phủ dầy, có 2-3 hạt hình trứng.

a) b) Hình 3.1. a) Cây Sâm Núi Dành , b) Cây Sâm Đắng

Hình 3.2. Củ Sâm Núi Dành và củ Sâm Ngọt (Sâm Nam)

Hình 3.3. Các dạng lá Sâm thu tại tỉnh Bắc Giang

a) b) Hình 3.4. a) Quả Sâm Núi Dành b) Quả Sâm Đắng

3.1.2. Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành. Sử dụng 04 mẫu Sâm đã thu thập được làm nguồn vật liệu để tiến hành nghiên cứu cho thí nghiệm này, từ đó xác định được chính xác loài Sâm Núi Dành làm nguồn vật liệu chuẩn cho những nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.1. Danh sách kí hiệu 4 mẫu Sâm Ký hiệu STT Tên giống Sâm Nơi thu mẫu DNA khu vực chân Núi Dành, xã Việt 1 S1 Sâm Núi Dành Lập, Tân Yên, Bắc Giang khu vực chân Núi Dành, xã Liên 2 S2 Sâm Núi Dành Chung, Tân Yên, Bắc Giang Thu thập tại địa bàn huyện Sơn 3 S3 Sâm Đắng Động Thu thập tại địa bàn huyện Lạng 4 S4 Sâm Ngọt Giang

3.1.2.1. Phân tích các sản phẩm khuếch đại Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại với cặp mồi ITS1/ITS4 và được điện di trên gel agarose 1,5% cho băng đơn hình với kích thước khoảng 700 bp. Kết quả khuếch đại sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành thôi gel, sử dụng cột Sigma GenElute TM Agarose Spin column (USA), nhằm thu được sản phẩm PCR đặc hiệu. 3.1.2.2. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA của các mẫu Sâm - Kích thước đoạn trình tự của các mẫu Sâm nghiên cứu Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 sau khi tinh sạch được phân tích trực tiếp trên máy giải trình tự ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biotech) của công ty Macrogen (Hàn Quốc) và phần mềm MEGA v5.1, kết quả cho ra giản đồ có các đỉnh (peak) với bốn màu sắc khác nhau tương ứng với bốn loại nucleotide và biểu thị dãy trình tự các nucleotide. Kết

28 quả đã thu được 04 đoạn trình tự ITS của 04 mẫu giống Sâm với số nucleotide khác nhau trên từng mẫu giống: Trình tự mẫu S1 (1-640) ATCCCGACCTGAACTGAGGTCTCGTCGTGAGCGTTCGAGGACGCCCGTGGG TCACGGAGGCCGGGTTCGGCAGGGGTCGCGCACGACTGGTCTCGAGCGTC ACTCAACCACCGTCTGTCGTGGCGCGCACCCCGCCGCGGACTCGATTTTCA GCCAACCGAGAGGCACCGGTGCTCACGGGAAGCCACCATCCACCCTGCAC AATTAGAGCACCTATCGCTAGGCAATTGGGCATCGGGCAACGGTCTGTGAC GCCCAGGCAAACGTGCCCTCAACCTAATGGCTTCGGGCGCAACTTGCGTTC AAAGACTCGATGGTTCCCGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCGCATTT CGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCTAGATATCTGTTGCCGAGAGTCA TTCTGTATAGCGTGTCAAGGCGCCGCCCGCCGGACCACCGTCTCCGGGCCG ACGGGGGCGCGCTGAACCAGTTTCAGTTCCTTGGGGCATTTGGCGCCCGGG TTTGTGTTTGGCTCGGCGGGGAACACACTGCGTGGCCCCCCTCCGAGCCCG AGGGAGAGGATGCGGCGCTGAGCACCGCAAGCCAACCCTACCGAGTGGTC AGACAGATTGCCGGTGACTGCTGGCCAGGGC Trình tự mẫu S2 (1-633) CTCCGATCTGAGTCTCGTCGTGAGCGTTCGAGCACGCCCGTGGGTCACG GAGGCCGGGTTCGGCAGGGGTCGCGCACGACTGGTCTCGAGCGTCACT CAACCACCGTCTGTCGTGGCGCGCACCCCGCCGCGGACTCGATTTTCAG CCAACCGAGAGGCACCGGTGCTCACGGGAAGCCACCATCCACCCTGCA CAATTAGAGCACCTATCGCTAGGCAATTGGGCATCGGGCAACGGTCTGT GACGCCCAGGCAAACGTGCCCTCAACCTAATGGCTTCGGGCGCAACTTG CGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTAT CGCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCTAAATATCCGTTGCC GAAAGTCATTCCGTATCGCGTGTCAAGGCGCCGCCCGCCGGACCACCGT CTCCGGGCCAACGGGGGCGCGCTGAACCAGTTTCAGTTCCTTGGCGCAT TCGGCGCCCGGGTTCGTGTTTGGCTCGGCGGGAAACACACTGCGTGGCC CCCCTCCAAGCCCGAGGGAGAGGATGCGGCGCTGAGCACCGCAAGCCA ACCCTACCGAGTGGTCAAACAGATCGCCGGTGGACTGCTGCAGGCCG. Trình tự mẫu S3 (1-490) GGTGATCGAGCTTTCAGCAGTCCACCGGTCGATCTGTTTGACCACTCGG TAGGGTTGGCTTGCGGTGCTCAGCGCCGCATCCTCTCCCTCGGGCTCGG AGGGGGGCCACGCAGTGTGTTCCCCGCCGAGCCAAACACGAACCCGGG CGCCAAATGCGCCAAGGAACTGAAACTGGTTCAGCGCGCCCCCGTCGG

CCCGGAGACGGTGGTCCGGCGGGCGGCGCCTTGACACGCGATACGGAA TGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAG CGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGT CTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGTTGAGGGCACGTCTGCC TGGGCGTCACAGACCGTTGCCCGATGCCCAATTGCCTACGATAGGTGCT CTAATTGGCGGGGGATGGGGCTTCCCGGAAGCCGGGCCTCCGGTTGGTG AAA Trình tự mẫu S4 (1-544) GGTGATCGAGCTTTGCAGCAGTCCACCGGCGATCTGTTTGACCACTCGG TAGGGTTGGCTTGCGGTGCTCAGCGCCGCATCCTCTCCCTCGGGCTCGG AGGGGGGCCACGCAGTGTGTTCCCCGCCGAGCCAAACACGAACCCGGG CGCCGAATGCGCCAAGGAACTGAAACTGGTTCAGCGCGCCCCCGTCGG CCCGGAGACGGTGGTCCGGCGGGCGGCGCCTTGACACGCGATACAGAA TGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAG CGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGT CTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTTAGGTTGAGGGCACGTCTGC CTGGGCGTCACAGACCGTTGCCCGATGCCCAATTGCCTACGATAGGTGC TCTAATTGTGCAGGGTGGATGGTGGCTTCCCGTGAGCACCGGTGCCTCT CGGTTGGTGAAAATCAATCCGCGGCGGGGTGCCCCCACAAAAGGGGTT GATGACCTC. Kết quả phân tích vùng ITS cho thấy trình tự các nucleotide giữa 4 mẫu Sâm có sự khác biệt nhau. Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, các mẫu nghiên cứu có tỷ lệ Guanin và Cytosine cao hơn tỷ lệ Adenine và Thymine hay nói một cách khác là đều có thành phần GC cao hơn thành phần AT. Tỉ lệ thành phần GC trung bình của 4 mẫu Sâm nghiên cứu là 61,7% và tỉ lệ thành phần AT trung bình 38,3%. Bảng 3.2. Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu Sâm nghiên cứu

Mẫu Tỉ lệ (%) giống T(U) C A G GC AT S1 19,1 31,7 18,4 30,8 62,5 37,5 S2 19,7 28,9 19,2 32,2 61,2 38,8 S3 20,0 28,9 19,1 32,0 60,8 39,2 S4 18,5 32,9 19,1 29,5 62,4 37,6 Trung 19,4 30,6 18,9 31,1 61,7 38,3 bình

* Kết quả so sánh các mẫu nghiên cứu trên Blast Theo kết quả Blast (Basic Local Alignmet Search Tool) trong NCBI (National Center for Biotechnology Information), sự tương đồng của trình tự các nucleotid vùng ITS ở mẫu S1 với các nghiên cứu khác trong cùng chi Callerya vào khoảng 88-99%, trong đó tương đồng với loài Callerya speciosa là 99%, cao nhất trong chi Callerya (Bảng 3.3 – Phụ lục 2). Khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS của mẫu S2 với các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động từ 87-99%, trong đó tương đồng với loài Callerya speciosa là 99%, cao nhất trong chi Callerya (Bảng 3.4 – Phụ lục 2). Mẫu S3, khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS với các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động từ 88-93%, tương đồng với loài Callerya speciosa là 88% (Bảng 3.5- Phụ lục 2). Mẫu S6, khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS với các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động từ 88-91%, tương đồng với loài Callerya speciosa là 88% (Bảng 3.6- Phụ lục 2). * Kết quả so sánh trình tự gen ITS giữa các mẫu Sâm nghiên cứu Kết quả so sánh sự sai khác giữa 04 mẫu sâm nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.7. Từ bảng kết quả cho thấy, mức tương đồng di truyền của 04 mẫu Sâm dao động trong khoảng 43,4% đến 98,7%. Hai mẫu (S1-S3) có mức sai khác di truyền lớn nhất (hệ số tương đồng di truyền nhỏ nhất là 0.43). Hai mẫu Sâm S1 và S2 có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất trong 4 mẫu nghiên cứu (có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,975). Mẫu sâm S1 có hệ số tương đồng với mẫu S3 và S4 là 0,434 và 0,43 Bảng 3. 3. Hệ số tương đồng giữa các mẫu Sâm nghiên cứu S1 S2 S3 S4 S1 S2 0.975 S3 0.434 0.43 S4 0.43 0.432 0.857

Như vậy, Hai mẫu S1 và S2 có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất trong 4 mẫu nghiên cứu (có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,975) và đều tương đồng với loài Callerya speciosa là 99%. Như vậy có thể khẳng định chính xác tên loài Sâm Núi Dành là Callerya speciosa (Champ. ex Benth) Schot.) 3.2. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ NHÓM CHẤT TRONG CỦ SÂM NÚI DÀNH Sau khi đã xác định được mẫu Sâm Núi Dành chuẩn, thu các mẫu củ tiến hành phân tích định tính một số nhóm chất quan trọng đặc trưng của Sâm. Từ đó khẳng định được chất lượng và giá trị của Sâm Núi Dành. Các mẫu Sâm được thu và được ký hiệu như sau:

STT Ký hiệu Lượng mẫu Chú thích 1 M2 1kg Sâm Núi Dành <3 năm tuổi

2 M3 1kg Sâm Núi Dành 3-4 năm tuổi 3 M4 0,4kg Sâm Núi Dành 4-5 năm tuổi 4 M5 1 kg Sâm Núi Dành >5 năm tuổi

Đối với phương pháp định tính do lượng mẫu Sâm M4 ít nên đã tiến hành gộp vào mẫu M3. Kết quả được trình bày tại các bảng sau: Bảng 3.4 . Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành dưới 3 năm tuổi TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Nhận xét 1 Saponin - Tạo bọt (++) Có saponin - Phản ứng với kiềm (++) - Phản ứng Cyanidin (+)

- - Phản ứng với FeCl3 (++)

2 Flavonoid -Phản ứng với H2SO4 đậm đặc (+) Có flavonoid - Quan sát dưới đèn tử ngoại ở (-) bước sóng 366nm - Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử (-) 3 Coumarin ngoại khi tác dụng với dung Không có

dịch kiềm coumarin

4 Acid hữu cơ - Phản ứng với Na2CO3 (+++) Có acid hữu cơ 5 Acid amin - Phản ứng với ninhydrin (++) Có acid amin 6 Alkaloid - Hiện bằng thuốc thử (-) Không có Dragendorff alkaloid 7 Saccharid -Sắc ký bản mỏng có so sánh (++) Có saccharid với chất chuẩn Bảng 3.5. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành từ 3-5 năm tuổi TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Nhận xét 1 Saponin - Tạo bọt (+++) Có saponin - Phản ứng với kiềm (++) 2 Flavonoid - Phản ứng Cyanidin (+)

- - Phản ứng với FeCl3 (++) Có flavonoid

-Phản ứng với H2SO4 đậm đặc (+) - Quan sát dưới đèn tử ngoại ở (-) bước sóng 366nm 3 Coumarin - Quan sát huỳnh quang của (-) Không có các vết coumarin dưới ánh coumarin sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm

4 Acid hữu cơ - Phản ứng với Na2CO3 (+++) Có acid hữu cơ 5 Acid amin - Phản ứng với ninhydrin (++) Có acid amin 6 Alkaloid - Hiện bằng thuốc thử (-) Không có Dragendorff alkaloid 7 Saccharid Sắc ký bản mỏng có so sánh (++) Có saccharid với chất chuẩn Bảng 3.6. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành trên 5 năm tuổi TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Nhận xét 1 Saponin - Tạo bọt (+++) Có saponin - Phản ứng với kiềm (+++) 2 Flavonoid - Phản ứng Cyanidin (++) Có flavonoid

- - Phản ứng với FeCl3 (+++)

-Phản ứng với H2SO4 đậm đặc (++)

- Quan sát dưới đèn tử ngoại ở (-) bước sóng 366nm Không có 3 Coumarin - Quan sát huỳnh quang của (-) coumarin các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm

4 Acid hữu cơ - Phản ứng với Na2CO3 (+++) Có acid hữu cơ 5 Acid amin - Phản ứng với ninhydrin (+++) Có acid amin 6 Alkaloid - Hiện bằng thuốc thử (-) Không có Dragendorff alkaloid 7 Saccharid -Sắc ký bản mỏng có so sánh (++) Có saccharid với chất chuẩn Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính; (+): Phản ứng dương tính; (++): Phản ứng rõ; (+++): Phản ứng rất rõ Bảng 3.7. Một số hình ảnh của phản ứng định tính một số nhóm chất Các chất định Cá phản ứng Hình ảnh Chú thích tính thực hiện

Phản ứng tạo Định tính bọt saponin:

1: Dịch chiết mẫu ban đầu 2: Dịch chiết Phản ứng với mẫu sau phản NaOH 10% ứng

Định tính 1 2 flavonoid: 1: Dịch chiết mẫu ban đầu 2: Dịch chiết Phản ứng với mẫu sau phản dung dịch FeCl3 ứng

1 2 Định tính acid Phản ứng với 1: Dịch chiết amin: dung dịch mẫu ban đầu ninhydrin 2: Dịch chiết mẫu sau phản ứng

1 2 1: Chất chuẩn (đường glucose) Hệ dung môi: 2: Dịch chiết mẫu Định tính CH2Cl2 : MeOH 3: Hỗn hợp chất saccharid: : H2O = 3 : 2: 0.15 chuẩn và dịch chiết mẫu

1 2 3

Phản ứng với Định tính thuốc thử alkaloid: Dragendorff

Từ các kết quả nghiên cứu đã thu được có thể thấy được Sâm Núi Dành là một loài Sâm quý bởi củ của nó có chứa các nhóm chất đặc trưng của các loại Sâm quý như: saponin, flavonoid, acid hữu cơ, acid amin, saccharid. - Sau khi đã xác định được chính xác loài Sâm Núi Dành (Callerya speciosa (Champ. Ex Benth) Schot.) và bước đầu đánh giá được chất lượng thông qua việc định tính được một số thành phần hoạt chất quan trọng có trong củ sâm, tiến hành thu mẫu để phục vụ cho nghiên cứu nhân giống vô tính.

3.3. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIÂM HOM VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN-VITRO 3.3.1. Phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại vùng bản địa bằng các phương pháp giâm hom  Ảnh hưởng của nồng độ IBA tới khả năng hình thành rễ và nảy chồi của các hom Sâm Núi Dành. Kết quả giâm hom theo dõi sau 60 ngày thực hiện được trình bày tại bảng sau: Bảng 3. 8. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng hình thành rễ hom giâm TT Công Tỷ lệ hom ra Số rễ TB/hom Chiều dài rễ Chỉ số ra thức rễ (%) (rễ) TB (cm) rễ 1 ĐC 0 0 0 0 2 CT1 0 0 0 0 3 CT2 9,3 1,8b 4,6a 8,3 4 CT3 29,0 2,8a 4,7a 13,2 5 CT4 15,6 1,5b 4,3a 6,5 CV(%) 8,8 6,4

LSD0,05 0,3 0,4 Chú thích : + ĐC: Nhúng qua nước cất + CT 1: Dung dịch IBA nồng độ 500ppm, nhúng nhanh trong 5 giây + CT 2: Dung dịch IBA nồng độ 1.000 ppm, nhúng nhanh trong 5 giây + CT 3: Dung dịch IBA nồng độ 1.500 ppm, nhúng nhanh trong 5 giây + CT 4: Dung dịch IBA nồng độ 2.000 ppm, nhứng nhanh trong 5 giây Từ bảng số liệu trên ta thấy khi xử lý hom qua nước cất và dung dịch IBA có nộng độ 500ppm thì hom không hình thành được rễ. Khi nồng độ IBA tăng lên từ 1000ppm – 2000ppm thì hom có sự hình thành rễ. Công thức CT3 với nồng độ IBA là 1.500ppm cho tỷ lệ cao nhất đạt 29,0% sai khác có ý nghĩa với các công thức còn lại ở mức độ tin cậy 95%. Các công thức còn lại là CT4 có nồng độ IBA cao hơn (2.000ppm) và CT2 có nồng độ IBA thấp hơn (1.000ppm) đều thu được kết quả thấp hơn CT3 (15,6% và 9,3%).

Như vậy là IBA có ảnh hưởng đến sự ra rễ của hom, số rễ trung bình/hom. Nồng độ TBA thấp hay cao sẽ thu được một tỷ lệ hom ra rễ nhất định. Khi sử dụng ở nồng độ thích hợp sẽ kích thích hom Sâm Núi Dành có phản ứng hình thành rễ tốt và chất lượng rễ cũng tốt hơn. (hình 3.7) Kết quả giâm hom Sâm Núi Dành lựa chọn được công thức tốt nhất là khi xử lý hom qua dung dịch có chứa IBA nồng độ 1.500ppm, cho tỷ lệ hom ra rễ là 29%.

Hình 3. 5. Hom Sâm Núi Dành được xử lý qua các công thức thí nghiệm  Xác định giá thể ra cây phù hợp cho cây hom. Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây hom Sâm Núi Dành

STT Công Số cây sống trung Tỷ lệ cây Số chồi Số lá thức bình sống (%) TB/hom TB/hom 1 GT1 19,2c 32 1,4 2,6 2 GT2 30,6b 51 1,6 3,7 3 GT3 46,8a 78 1,8 4,1 4 GT4 35,4b 59 1,7 3,9 CV(%) 9,6 - - -

LSD0,05 2,6 - - - Chú thích: + GT 1: Tầng đất B + GT 2: 50% đất tầng B+ 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa + GT 3: 30% đất tầng B + 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa + GT 4: 40% đất tầng B + 60% bột xơ dừa

Kết quả thí nghiệm cho cây hom Sâm Núi Dành tại thí nghiệm 2 trên 04 giá thể cho thấy: Số cây sống ở công thức GT3 sai khác có nghĩa so với công thức giá thể GT1. Số cây sống trung bình tại các công thức giá thể dao động từ 19,2 – 46,8 cây. Trong đó giá thể GT3: 30% đất + 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa có tỷ lệ cây sống đạt cao nhất đạt 78% tiếp theo là công thức GT4 với 59%; GT2 là 51% và công thức giá thể GT1 có tỷ lệ ra cây sống thấp nhất 32%.

Hình 3.6. Động thái tăng trưởng số chồi/hom Chú thích: SCTH.15: Số chồi hình thành sau 15 ngày SCTH.30: Số chồi hình thành sau 30 ngày SCTH.15: Số chồi hình thành sau 45 ngày SCTH.15: Số chồi hình thành sau 60 ngày SCTH.15: Số chồi hình thành sau 75 ngày SCTH.15: Số chồi hình thành sau 90 ngày Khi hom giâm sau 90 ngày được hình thành rễ đã tiến hành đóng các cành hom giâm vào các túi bầu chứa các giá thể khác nhau và cứ 15 ngày tiến hành theo dõi động thái tăng trưởng. Hình 3.8 kết quả theo dõi số chồi hình thành trên hom giâm. Ta thấy trước 60 ngày trồng vào giá thể ra cây thì tại các hom giâm không có sự thay đổi về số chồi/hom. Sau 60 ngày thì các công thức giá thể mới có sự thay đổi sau 90 ngày theo dõi giá thể GT3 cho số chồi cao nhất tiếp theo là giá thể GT4. Tương tự chỉ tiêu số chồi/hom thì chiều dài chồi cũng được theo dõi 15 ngày 1 lần, kết quả cho thấy các công thức không có sự chênh lệch nhiều về sinh trưởng chiều dài chồi. Giá thể GT3 sau 90 ngày chuyển thì có chiều dài

38 chồi lớn nhất 38,2 cm, tiếp theo là giá thể GT4 với 34,6cm tại GT2 là 35,4 cm và thấp nhất tại giá thể GT1 với 33,4 cm.

Hình 3.7. Động thái tăng trưởng chiều dài của chồi hom giâm Chú thích: CDC: Chiều dài chồi GT1: Giá thể 1 GT2: Giá thể 2 GT3: Giá thể 3 GT4: Giá thể 4

Hình 3.8. Động thái tăng trưởng số lá/chồi Chú thích: SL.15 : Số lá sau 15 ngày SL.30: Số lá sau 30 ngày SL.45: Số lá sau 45 ngày SL.60: Số lá sau 60 ngày SL.75: Số lá sau 75 ngày SL.90: Số lá sau 90 ngày Qua hình 3.10 ta thấy các giá thể ra cây không ảnh hưởng nhiều tới khả năng sinh trưởng phát triển lá mới trên chồi giâm. Sau 60 ngày chuyển vào giá thể ra cây thì cành giâm mới bắt đầu ổn định và phát triển.

Tổng hợp các kết quả thu được từ các thí nghiệm nhân giống cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom: Hom có tỷ lệ ra rễ tốt nhất khi được xử lý qua dung dịch IBA nồng độ 1.500ppm đạt 29% và ra cây trên giá thể có chứa: 30% đất tầng B + 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa cho tỷ lệ cây sống cao nhất (78%). 3.3.2. Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro 3.3.2.1.Nghiên cứu xác định biện pháp khử trùng tạo mẫu sạch. Thí nghiệm sử dụng Javen 6% trong các khoảng thời gian (10, 12, 14 và 16 phút) và HgCl2 0,1% khử trùng trong (3, 5, 7 và 9 phút). Mẫu sau khi khử trùng được nuôi cấy trên trường MS. Sau thời gian theo dõi 20 ngày, kết quả khử trùng tạo mẫu sạch được thể hiện tại bảng 3.10. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch bệnh Loại hóa Thời gian khử Tỷ lệ sạch Tỷ lệ mẫu Đặc điểm mẫu chất trùng (phút) bệnh (%) sống (%) ĐC 0 0 0 Mẫu bị nấm, khuẩn 10 23,3 56,7 Mẫu xanh 12 34,2 48,3 Mẫu hơi ngả vàng Javen 6% 14 54,2 25,8 Mẫu hơi ngả vàng 16 61,7 10,7 Mẫu hơi ngả vàng 3 66,7 26,7 Mẫu xanh 5 95,7 65,8 Mẫu xanh HgCl2 0,1% 7 97,8 21,6 Mẫu hơi ngả vàng 9 99,2 8,3 Mẫu ngả vàng

Phân tích kết quả từ bảng 3.10 cho thấy:  Với chất khử trùng là Javen 6%: Khi khử trùng mẫu bằng Javen 6% có tác dụng diệt khuẩn nhưng nó cũng gây phá hủy thành tế bào cellulose

40 của tế bào thực vật nên khi thời gian khử trùng dài tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao đồng thời tỷ lệ mẫu sống cũng giảm đi. Từ bảng số liệu trên ta thấy, thời gian khử trùng với Javen 6% trong 10 phút cho kết quả mẫu sống cao nhất là 56,7% nhưng tỷ lệ mẫu sạch bệnh lại thấp 23.3%. Khi tăng thời gian khử trùng lên 12 -14 phút thì tỷ lệ mẫu sạch bệnh tăng là 34,2% và 54,2% nhưng tỷ lệ mẫu sống giảm 48,3% và 25,8%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 16 phút thì tỷ lệ mẫu sạch bệnh tiếp tục tăng nhưng tỷ lệ mẫu sống giảm xuống còn 10,7%.

 Với chất khử trùng là HgCl2 0,1%: HgCl2 có khả năng diệt khuẩn diệt nấm mạnh nhưng chúng cũng ngấm qua thành tế bào thực vật gây ngộ độc cho tế bào nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ nhiễm giảm nhưng tỷ lệ sống cũng giảm. Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy, thời gian lắc khử trùng với

HgCl2 0,1% trong 5 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất là 65,8% và tỷ lệ mẫu sạch bệnh là 95,7%. Khi tăng thời gian khử trùng lên 7 phút và 9 phút thì tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao hơn là 97,8% và 99,2% nhưng tỷ lệ mẫu sống cũng giảm đi còn 21,6 % và 8,3 %. Như vậy, thời gian khử trùng và chất khử trùng có ảnh hưởng tới tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ sống của mẫu cấy. Lựa chọn chất khử trùng là HgCl2 0,1% , thời gian khử trùng là 5 phút làm phương pháp khử trùng tốt nhất, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh và tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống của mẫu cao. 3.3.2.2. Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi Sâm Núi Dành Sau 30 ngày nuôi cấy, kết quả đánh giá thí nghiệm được thể hiện tại bảng 3.11.

Bảng 3. 11. Ảnh hưởng của Ki đến khả năng tái sinh chồi

Công thức Tỷ lệ nảy chồi Chiều dài TB chồi Đặc điểm của chồi thí nghiệm (%) (cm) ĐC 68,5 7,83d Chồi sinh trưởng chậm Chồi sinh trưởng tốt, chồi CT1 90,8 10,27b xanh, mập Chồi sinh trưởng tốt, chồi CT2 97,5 10,53a xanh, mập Chồi sinh trưởng tốt, chồi CT3 100 10,7a xanh, mập Chồi sinh trưởng tốt, chồi CT4 96,7 10,2b xanh, mập Chồi sinh trưởng chậm CT5 90 9,63c hơn, xuất hiện callus ở gốc. CV% 0,8

LSD0,05 0,14 Chú thích: ĐC: MS + 30 g/l Sucrose + 6,5 g/l Agar CT1: ĐC + 0,2 mg/l Ki CT2: ĐC + 0,4 mg/l Ki CT3: ĐC + 0,6 mg/l Ki CT4: ĐC + 0,8 mg/l Ki CT5: ĐC + 1 mg/l Ki

Hình 3. 9. Mẫu Sâm Núi Dành sau 2 tuần trên môi trường tái sinh a) Môi trường có bổ sung 0,6mg/l Ki b) Môi trường có bổ sung 1 mg/l Ki Sau 1 tuần thì Sâm Núi Dành bắt đầu phản ứng tái sinh chồi trên môi trường có bổ sung Ki. Ở môi trường đối chứng, sau 2 tuần Sâm Núi Dành mới

42 có phản ứng tái sinh chồi, chồi sinh trưởng chậm hơn so với các môi trường có bổ sung Ki. Từ bảng 3.11 cho thấy Ki có ảnh hưởng đến sự tái sinh chồi của Sâm Núi Dành. Số chồi tái sinh cao nhất (100%), chồi sinh trưởng tốt, chồi xanh và mập ở công thức môi trường có bổ sung 0,6 mg/l Ki. Khi bổ sung nồng độ Ki cao (1mg/l) chồi sinh trưởng chậm hơn và xuất hiện callus ở gốc. Như vậy môi trường MS + 30g/l sucrose + 6,5g/l agar + 0,6 mg/l Ki được chọn là môi trường tái sinh chồi Sâm Núi Dành tốt nhất. 3.3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và IBA đến hệ số nhân chồi Sâm Núi Dành Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của BA và IBA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Sâm Núi Dành sau 60 ngày được thể hiện tại bảng 3.12. Phân tích bảng kết quả (bảng 3.12) cho thấy sự kết hợp giữa BA và IBA trong môi trường nhân nhanh có ảnh hưởng đến kết quả nhân nhanh chồi của Sâm Núi Dành nhưng lại không ảnh hưởng nhiều đến chiều cao trung bình của chồi. Khi sử dụng BA và IBA ở những nồng độ khác nhau thì cho kết quả khác nhau. Môi trường có bổ sung: 3 mg/l BA + 0,4 mg/l IBA cho kết quả tốt nhất, hệ số nhân chồi đạt cao nhất (6,52 lần), chiều cao đạt 10,2cm và chất lượng chồi cũng tốt nhất, chồi xanh và nhiều lá. Ở các công thức kết hợp khác giữa nồng độ BA là (2; 2,5; 3,5; 4 mg/l) và IBA là (0,2; 0,6 và 0,8 mg/l) đều thu được kết quả thấp hơn, giao động từ 3,25 – 6,37 lần. Hệ số nhân chồi giả m, chồi ngắn, các chồi phát triển chậm, có ít hoặc không có lá và sùi ở gốc hình thành callus (hình 3.10). Như vậy, môi trường MS + 30 g/l đường sucrose + 6,5 g/l agar + 3 mg/l BA + 0,4 mg/l IBA được lựa chọn là môi trường nhân nhanh chồi Sâm Núi Dành tốt nhất.

a b

c d

Hình 3. 10. Chồi Sâm Núi Dành trên các CT môi trường nhân nhanh a) Chồi Sâm nhân nhanh trên môi trường có bổ sung: 4 mg/l BA+0,8 mg/l IBA b) Chồi Sâm nhân nhanh trên môi trường có bổ sung: 3 mg/l BA+0,4 mg/l IBA c) Chồi Sâm nhân nhanh trên môi trường có bổ sung 3 mg/l BA + 0,8 mg/l IBA d) Chồi Sâm nhân nhanh trên môi trường có bổ sung 4 mg/l BA + 0,4 mg/l IBA

Bảng 3. 12. Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm Núi Dành

IBA 0,2 0,4 0,6 0,8

(mg/l) Chiều Chiều Chiều Chiều Hệ số Chất Hệ số Chất Hệ số Chất Hệ số Chất BA cao TB cao TB cao TB cao TB nhân lượng nhân lượng nhân lượng nhân lượng (mg/l) chồi chồi chồi chồi chồi chồi chồi chồi chồi chồi chồi chồi (cm) (cm) (cm) (cm)

2 3,25 9,4 ++ 3,39 9,5 ++ 3,28 9,6 ++ 3,31 9,7 ++

2,5 5,14 9,8 +++ 5,32 9,6 +++ 4,8 9,7 +++ 4,64 9,7 +++

3 6,15 10,1 +++ 6,72 10,2 +++ 6,37 10,1 ++ 6,18 9,9 ++

3,5 6,02 10 ++ 5,62 9,8 ++ 5,3 9,9 ++ 5,86 9,7 +

4 5,16 9,7 + 5,14 9,6 + 5,1 9,6 + 5,06 9,5 + CV(%) 1,3 1,5 1,3 1,9 0,7 1,5 1 2,1

LSD0,05 0,12 0,27 0,1 0,3 0,64 0,27 0,093 0,375

Ghi chú: +: chồi sinh trưởng kém; ++: chồi sinh trưởng trung bình; +++: chồi sinh trưởng tốt

3.3.2.4. Nghiên cứu môi trường tạo rễ cho chồi Sâm Núi Dành in-vitro.  Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền và nồng độ NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi Sâm Núi Dành. Thời gian cảm ứng hình thành rễ sau khoảng 2-3 tuần. Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của 2 môi trường (MS, ½ MS) và các nồng độ NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi Sâm Núi Dành được thể hiện ở bảng 3.13 và bảng 3.14. Bảng 3. 13. Ảnh hưởng của MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ Công thức thí Tỷ lệ mẫu Số rễ Chiều dài Chỉ số Đặc điểm của nghiệm ra rễ (%) TB/mẫu (rễ) TB rễ (cm) ra rễ rễ ĐC1 0 0 0 0 CT1 15,8 0,82d 2,5d 0,8 Rễ tơ nhỏ CT2 17,5 1,47c 2,7c 1,3 Rễ tơ nhỏ CT3 28,3 1,61b 2,9a 1,8 Rễ tơ CT4 41,7 1,75a 2,9a 2,2 Rễ tơ CT5 29,2 1,57b 2,8b 1,6 Rễ tơ CV% - 1,4 0,8 - LSD0,05 0,04 0,05 Chú thích: ĐC1: MS + 30g/l sucrose + 6,5 g/l agar = MTN1 CT1: MTN1 + 0,5 mg/l NAA CT4: MTN1 + 2 mg/l NAA CT2: MTN1 + 1 mg/l NAA CT5: MTN1 + 2,5 mg/l NAA CT3: MTN1 + 1,5 mg/l NAA Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của ½MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ Công thức thí Tỷ lệ mẫu Số rễ Chiều dài Chỉ số Đặc điểm của nghiệm ra rễ (%) TB/mẫu (rễ) TB rễ (cm) ra rễ rễ ĐC2 0 0 0 0 CT6 35 0,94 2,33 2,1 Rễ tơ nhỏ CT7 55 1,21c 2,55b 3,1 Rễ củ nhỏ CT8 65 1,91a 2,82a 5,4 Rễ củ nhỏ CT9 57,5 1,23b 2,43c 2,9 Rễ củ nhỏ CT10 42,5 1,15d 1,94d 2,2 Rễ củ nhỏ CV% - 0,8 0,6 - LSD0,05 - 0,016 0,028 - Chú thích: ĐC1: ½ MS + 30g/l sucrose + 6,5 g/l agar = MTN2 CT6: MTN2 + 0,5 mg/l NAA CT9: MTN2 + 2 mg/l NAA CT7: MTN2 + 1 mg/l NAA CT10: MTN2 + 2,5 mg/l NAA CT8: MTN2 + 1,5 mg/l NAA

Từ kết quả thu được cho thấy, NAA có ảnh hưởng đến sự hình thành rễ của chồi Sâm Núi Dành. Trên môi trường MS và ½ MS không có NAA, ko có sự hình thành rễ. NAA ở các nồng độ khác nhau thì tỷ lệ hình thành rễ và số rễ trung bình/mẫu khác nhau. Cụ thể, ở bảng 3.13: Tỷ lệ mẫu ra rễ dao động từ 15,8 – 41,7%, số rễ trung bình từ 0,82 – 1,75 rễ/chồi. Tỷ lệ mẫu ra rễ cao nhất trên môi trường CT4 (đạt 41,7%), chỉ số ra rễ là 2,2, số rễ trung bình 0,75 rễ/mẫu. Rễ hình thành là rễ tơ. Khi nồng độ NAA thấp (0,5 – 1,5 mg/l) hoặc tăng lên 2,5 mg/l thì tỷ lệ mẫu ra rễ giảm và số rễ TB/mẫu cũng giảm và rễ ngắn hơn. Với cùng các nồng độ NAA sử dụng trên môi trường MS, trên môi trường ½ MS cho kết quả tốt hơn đó là có sự hình thành rễ củ nhỏ. Tỷ lệ ra rễ dao động từ 35 -65%, số rễ trung bình từ 0,94 – 1,91 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình từ 1,94 – 3,82cm. Ở môi trường CT8 có tỷ lệ ra rễ cao nhất 65%, chỉ số ra rễ là 5,4, số rễ trung bình và chiều dài của rễ cũng lớn nhất (1,91 rễ/chồi và 3,82cm). Ở các công thức môi trường có nồng độ NAA khác kết quả thu được đều thấp hơn (bảng 3.14).  Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền và nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi Sâm Núi Dành. Bảng 3. 15. Ảnh hưởng của môi trường MS và IBA đến sự hình thành rễ Công thức thí Tỷ lệ mẫu Số rễ Chiều dài Chỉ số Đặc điểm nghiệm ra rễ (%) TB/mẫu (rễ) TB rễ (cm) ra rễ của rễ CT1 28,3 1,47e 2,15d 3,2 Rễ tơ nhỏ CT2 32,9 1.68c 2,23b 3,7 Rễ tơ nhỏ CT3 55,8 2,09a 2,65a 5,5 Rễ củ nhỏ CT4 39,6 1,72b 2,34b 4,0 Rễ củ nhỏ CT5 34,2 1,63d 2,17c 3,5 Rễ củ nhỏ CV% - 1,7 2,9 -

LSD0,05 - 0,02 0,11 - Chú thích: ĐC1: MS + 30g/l sucrose + 6,5 g/l agar = MTN1 CT1: MTN1 + 0,5 mg/l IBA CT4: MTN1 + 2 mg/l IBA CT2: MTN1 + 1 mg/l IBA CT5: MTN1 + 2,5 mg/l IBA CT3: MTN1 + 1,5 mg/l IBA

Kết quả từ bảng 3.15 cho thấy: Trên nền môi trường MS có bổ sung IBA ở các nồng độ (1,5; 2 và 2,5 mg/l) đã hình thành được rễ củ. Ở CT1 và CT2 chỉ tạo thành rễ tơ. Tỷ lệ ra rễ cao nhất đạt 55,8%, chỉ số ra rễ là 5,5 ở môi trường CT3. Số rễ trung bình (2,09 rễ/mẫu) và chiều dài trung bình của rễ (2,65 cm) cũng lớn nhất tại môi trường này, ở các nồng độ khác các chỉ tiêu đều thấp hơn. Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của môi trường ½MS và IBA đến sự hình thành rễ Công thức thí Tỷ lệ mẫu Số rễ Chiều dài Chỉ số Đặc điểm nghiệm ra rễ (%) TB/mẫu (rễ) TB rễ (cm) ra rễ của rễ CT6 40,4 1,54b 4,13c 6,3 Rễ củ nhỏ CT7 90,8 2,64a 4,54a 11,9 Rễ củ to, dài CT8 75,8 2,15a 3,96b 8,5 Rễ củ to,dài CT9 60,5 1,64b 3,54b 5,8 Rễ củ nhỏ CT10 57,3 1,27b 3,44b 4,4 Rễ củ nhỏ CV% - 1,1 0,7 -

LSD0,05 - 0,04 0,05 - Chú thích: ĐC2: ½ MS + 30g/l sucrose + 6,5 g/l agar = MTN2 CT6: MTN2 + 0,5 mg/l IBA CT9: MTN2 + 2 mg/l IBA CT7: MTN2 + 1 mg/l IBA CT10: MTN2 + 2,5 mg/l IBA CT8: MTN2 + 1,5 mg/l IBA Phân tích kết quả từ bảng 3.16 cho thấy: Kết quả tốt nhất ở môi trường CT7 với tỷ lệ ra rễ cao nhất đạt 90,8%, chỉ số ra rễ là 11,7. Số rễ trung bình và chiều dài rễ cũng lớn nhất tại môi trường này, đạt trung bình là 2,64 rễ/mẫu và chiều dài trung bình là 4,54 cm. Các rễ tạo ra có chất lượng tốt, rễ mập và dài. Các môi trường khác đều cho các chỉ tiêu này thấp hơn, tỷ lệ ra rễ giao động từ 40,4 % - 75,8%, số rễ trung bình dao động từ 1,27-2,15 rễ/chồi, chiều dài trung bình của rễ dao động từ 3,44 - 4,13 cm, rễ nhỏ và ngắn hơn. So sánh tổng hợp kết quả của các thí nghiệm sử dụng 2 môi trường MS và ½ MS ảnh hưởng đến khả năng hình thành rễ của chồi Sâm Núi Dành cho thấy, môi trường ½ MS sử dụng làm môi trường ra rễ cho kết quả tốt hơn môi trường MS.

So sánh giữa môi trường nuôi cấy có bổ sung NAA và IBA ở các nồng độ tương tự nhau, kết quả cho thấy các môi trường bổ sung IBA đều cho kết quả (tỷ lệ ra rễ, chỉ số ra rễ, số lượng rễ TB/chồi, chiều dài TB rễ) cao hơn so với bổ sung NAA. Sử dụng IBA ở nồng độ thích hợp hình thành được rễ củ, trong khi sử dụng NAA, rễ hình thành là rễ tơ. Điều này chứng tỏ IBA là chất kích thích tạo rễ thích hợp để nuôi cấy tạo rễ cho chồi Sâm Núi Dành. Như vậy, từ các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường và các hoocmon sinh trưởng đến khả năng hình thành rễ của chồi Sâm Núi Dành thấy rằng công thức môi trường tốt nhất cho phương pháp ra rễ là: ½ MS + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l agar + 1 mg/l IBA cho tỷ lệ ra rễ cao nhất, rễ hình thành là rễ củ, rễ to mập (hình 3.13).

Hình 3. 11. Ảnh hưởng của môi trường và nồng độ các hoocmon tăng trưởng đến khả năng hình thành rễ  Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính tới chất lượng bộ rễ của chồi Sâm Núi Dành

Mặc dù IBA và NAA có tác dụng kích thích tạo rễ cho chồi Sâm Núi Dành, tuy nhiên các rễ xốp và dễ gãy khi chuyển ra thích nghi ngoài vườn ươm. Để làm tăng chất lượng bộ rễ, tiến hành thí nghiệm bổ sung than hoạt tính (THT) với nồng độ 0,2 - 0,8 mg/l vào môi trường ½ MS + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l agar + 1 mg/l IBA. Kết quả sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy, chất lượng bộ rễ Sâm Núi Dành đã được cải thiện đáng kể, các rễ có màu trắng, khỏe mạnh, sinh trưởng tốt. Tuy nhiên khi bổ sung nồng độ THT cao (0,8 mg/l) lại ức chế sự tạo rễ của chồi Sâm Núi Dành. Nồng độ THT thích hợp nhất trong quá trình tạo rễ là 0,4 mg/l, cho số rễ/chồi, chiều dài rễ và chất lượng rễ tốt nhất. Kết quả thể hiện qua bảng sau: Bảng 3. 17. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới chất lượng bộ rễ THT Tỷ lệ ch ồi Số rễ Chiều dài Chỉ số Đặc điểm của rễ (mg/l) ra rễ (%) TB/chồi (rễ) TB rễ (cm) ra rễ 0,2 90 3a 4,56b 13,7 Rễ mập, dài, phát triển mạnh 0,4 95 3,2a 5,02a 16,1 Rễ mập, dài, phát triển mạnh Rễ mập, dài, phát triển bình 0,6 85 2,8b 4,14b 11,6 thường. 0,8 80 2,4b 3,98c 9,6 Rễ mập, phát triển chậm CV (%) 0,8 0,6

LSD0,05 0,36 0,44

Hình 3. 12. Chồi Sâm ra rễ trên môi trường có bổ sung 1 mg/l IBA + 0,4 mg/l than hoạt tính

3.3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sâm Núi Dành in-vitro ngoài vườn ươm Cây Sâm Núi Dành in vitro hoàn chỉnh đã có 1-3 rễ, thân dài từ 10-15cm, có 3-6 cành, lá đầy đủ được luyện và đưa ra ngoài vườn ươm (hình 3.13) Thí nghiệm trên các công thức giá thể khác nhau. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi công thức giá thể 60 cây. Sau 60 ngày chăm sóc, kết quả được trình bày tại bảng 3.18

Hình 3. 13. Cây Sâm Núi Dành in-vitro hoàn chỉnh Bảng 3. 18. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây Sâm Núi Dành in-vitro STT Công Số cây sống trung Tỷ lệ cây sống thức bình (%) 1 GT1 15,8c 23 2 GT2 41b 68,3 3 GT3 50,0a 83,3 4 GT4 36 b 60 CV(%) 9,6 -

LSD0,05 2,6 - Chú thích: + GT1: Đất tầng B + GT2: 50% đất tầng B + 20% trấu hun + 30 % bột sơ dừa + GT3: 30 % đất tầng B + 20% trấu hun + 50% bột sơ dừa. + GT4: 40% đất tầng B + 60 % bột sơ dừa

Kết quả thu được từ thí nghiệm cho thấy: Sau 60 ngày chăm sóc thích nghi cây Sâm Núi Dành in-vitro trong nhà lưới, số cây sống trung bình tại các công thức giá thể dao động từ 15,8 – 50,0 cây. Trong đó giá thể GT1 là đất tầng B được lấy tại chân Núi Dành có tỷ lệ ra cây sống thấp nhất 33%, cây in vitro sinh trưởng kém nhất. Giá thể GT2 cho tỷ lệ sống 68,3%, do GT2 có bổ sung thêm trấu hun và bột sơ dừa giúp cho giá thể tơi xốp tạo được không gian thông thoáng cho rễ phát triển. Ở công thức GT4 tỷ lệ cây sống là 60% chứa 40% đất cát pha + 60% bột xơ dừa tạo độ tơi xốp, thoát nước tốt, giúp hệ rễ cây con phát triển dễ hơn. Tuy nhiên GT3 mới là giá thể tốt nhất, cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 83,3%, cây sinh trưởng mạnh nhất so với các giá thể khác. Giá thể GT3 gồm 30% đất + 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa, ngoài thành phần hữu cơ không chỉ nhẹ, tơi xốp thoát nước tốt, giúp hệ rễ cây phát triển mạnh, cây in vitro sau khi thích nghi với môi trường cũng cần một lượng đất để hấp thụ dần chất dinh dưỡng và tự nuôi cây. Như vậy giá thể được chọn để ra cây Sâm Núi Dành in vitro là giá thể GT3 với thành phần: 30% đất tầng B + 20% trấu hun + 50% bột xơ dừa.

GT1 GT2

GT2 GT3 GT4

Hình 3.14. Cây Sâm Núi Dành in-vitro ra cây trên các công thức giá thể

 Quy trình nhân giống vô tính Sâm Núi Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro: Đoạn thân bánh tẻ dài 1-3cm. có chứa 1 mắt ngủ, lấy từ cây 1-1,5 năm tuổi.

Khử trùng HgCl2 0,1% trong 5 phút

Môi trường tái sinh chồi MS + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l agar + 0,6 mg/l Ki (Nuôi cấy trong 30 ngày) )

Môi trường nhân nhanh MS + 30 mg/l sucrose + 6,5 g/l agar + 3 mg/l BA + 0,4 mg/l IBA ( Nuôi cấy trong 60 ngày)

Môi trường ra rễ ½ MS + 30 mg/l sucrose + 6,5 g/l agar + 1 mg/l IBA + 0,4 mg/l Than hoạt tính ( Nuôi cấy trong 90 ngày)

Thích nghi vư ờn ươm Cây Sâm Núi Dành in -vitro hoàn chỉnh được trồng vào giá thể: 30% đất tầng B + 20% tấu hun + 50% bột sơ dừa. ( Chăm sóc trong 60 ngày)

CHƯƠNG 4 . KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN 1. Thu thập được 4 mẫu Sâm trên đại bàn tỉnh Bắc Giang là: Sâm Đắng, Sâm Ngọt và 2 mẫu Sâm Núi Dành. 2. Xác định được 2 mẫu Sâm Núi Dành đều tương đồng với loài Callerya speciosa là 99%. Như vậy có thể khẳng định chính xác tên loài Sâm Núi Dành là Callerya speciosa (Champ. ex Benth) Schot.) 3. Đã định tính được một số nhóm chất trong mẫu Sâm Núi Dành ở 4 độ tuổi khác nhau cho thấy chúng đều có chứa các nhóm chất là: saponin, flavonoid, acid hữu cơ, acid amin, saccharid. 4. Đã nhân giống được Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom. 5. Đã xây dựng được quy trình nhân giống in-vitro cho cây Sâm Núi Dành. Quy trình tạo ra cây Sâm Núi Dành in-vitro hoàn chỉnh gồm các bước:

+ Khử trùng tạo mẫu sạch sử dụng chất khử trùng là HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất, số mẫu sạch bệnh và tỷ lệ mẫu sống cao nhất + Môi trường tái sinh chồi tốt nhất là: MS + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l agar + 0,6 mg/l Ki + Môi trường nhân nhanh: MS + 30 g/l đường sucrose + 6,5 g/l agar + 3 mg/l BA + 0,4 mg/l IBA được lựa chọn là môi trường nhân nhanh chồi Sâm Núi Dành tối ưu nhất + Môi trường để tạo rễ là: ½ MS + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l agar + 1 mg/l IBA.+ 0,4mg/l than hoạt tính, cho tỷ lệ ra rễ cao, rễ mập, dài, phát triển mạnh. + Giá thể ra cây thích hợp cho cây Sâm Núi Dành in vitro là: 30% đất + 20% trấu hun + 50% bột xơ dừa.

4.2. KIẾN NGHỊ - Cần có những nghiên cứu thêm về định lượng các hoạt chất và hoạt tính sinh học của Sâm Núi Dành, để khẳng định được giá trị và chất lượng của loài Sâm quý này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên

Nguyễn Thanh Loan

Hướng dẫn 1 Hướng dẫn 2

TS. Đồng Thị Kim Cúc TS. Nguyễn Thị Thanh Hương

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hội thảo “Đánh giá nhu cầu sử dụng và công tác phát triển dược liệu thuốc y học cổ truyền giai đoạn 2012 – 2015”, Cục Quản lý Y dược cổ truyền - Bộ Y tế. 2. Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2007, Sách Đỏ Việt Nam, Phần II-Thực vật. Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, tr. 191-192. 3. Kim Sa (2012). Săn lùng sâm quý tiến vua, Phóng sự trên báo An ninh Thủ Đô, ngày 30/8/2012. 4. Đồng Thị Kim Cúc, Lê Thanh Nhuận, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Phan Thanh Phương và cs, 2017. Mô tả, đạnh danh và dược tính của nguồn gen Sâm Núi Dành phân bố trên địa bàn tỉnh Bắc Giang. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, số 3(76)/2017,tr.54-58. 5. Võ Văn Chi, 2012, Từ điển cây thuốc Việt Nam (A dictional of the medicinal plants of Vientnam), 1. NXB. Y học, Hà Nội, tr. 352-353. 6. Ting Yin et al. (2007), “Three new phenolic glycosides from the caulis of Millettia speciosa”, Magnetic resonance in chemistry, 46: 387- 391. 7. Ting Yin et al. (2010), “A new flavonol glycoside from Millettia speciosa”, Fitoterapia, 81: 274-275. 8. Zong XK et al. (2009), “Studies on chemical constituents of root of Millettia speciosa”, Journal of Chinese medicinal materials, 32 (4):520-521. 9. Ping Ding, Jin-ying Qiu, Ge Ying, Lei Dai (2013), “Chemical constituents of Millettia speciosa”, Chinese Herbal Medicines, 6(4): 332-334. 10. Wang Cheng-wen et al. (2013), “Study on extraction process of total flavonoids and antioxidant activities of extracts of Millettia speciosa roots”, Chemical research and application, 25, 5: 713-717. 11. Jun Cheno et al. (2005), “Flavonoids from Millettia nitida var. hirsutissima”, Chem. Pharm. Bul, 53(4): 419-421.

12. Ito Chihiro et al. (1999), “Anti-tumor-promoting effects of isoflavonoids on Epstein-Barr virus activation and two-stage skin carcinohenesis”, Cancer letters, 152: 187-192. 13. Fang Song-Chwan et al. (2010), “Anticancer effects of flavonoid derivatives isolated from Millettia reticulata Benth in SK-Hep-1 human hepatocellular carcinoma cells”, Journal of agricultural and food chemistry, 58: 814-820. 14. Đỗ Tất Lợi (2002), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội. 15. Mullis K.B. and Faloona F. A., 1987. Specific synthesis of DNA in invitro via a polymerase catalyse chain reaction. Methods Enzymol. 155: 335-350 16. Wolfe K. H. and Sharp P. M., 1998. Identification of functional open reading frames in chloroplast genomes. Gene 66:215-222 17. Soltis D. E. and Soltis P. S., 1998. Choosing an approach anf an appropriate gene for phylogenetic analysis. In Soltis D. E., Soltis P. S. and Doyle J. J. (eds.), Molecular systematic of plants II. DNA sequencing. Kluwer Academy Publications: Boston. 18. Judd W. S., Campbell C. S., Kellogg E. A. and Steven P.F., 1999. Plant Systematics. A phylogenetic Approach. Sinauer Associates, Inc. USA. 19. Palmer J. D., 1991. Plastid chromosomes: structure and evolution. In Bogorad L. and Vasil I.K. (eds.). Cell culture and Somatic Cell Genetics in Plants. 7: 5-53. The Molecular Biology og Plastids. Academic Press: New York 20. Downie S. R. and Palmer J. D., 1992. Use of chloroplast DNA rearrangements in reconstructing plant phylogeny. In In Soltis D. E., Soltis P. S. and Doyle J. J. (eds.), Molecular systematic of plants. Chapman &Hall, New York. 21. Baldwin B. G., Sanderson M. J., Porter J. M., Wojciechowski M. F., Campbell C.S. and Donoghue M.J., 1995. The ITS region of nuclear

ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny. Ann. Missouri Bot. Gard. 82: 247-277 22. Bult C. J., Kallersjo M. and Suh Y., 1992. Amplification and sequencing of 16/18S rDNA from gel-purified total plant DNA. Plant Mol. Bio. Rep. 10: 273-284. 23. Linder C.R,, Moore L.A. and Jackson R. B., 2000. A universal molecular method for identifying underground plant parts to species. Mol. Ecol. 9: 1549-1559 24. Bellarosa R., Simeone M. C., Papini A. and Schirone ., 2005. Utility of ITS sequence data for phylogenetic reconstruction of Italian Quescus soo. Plant Phyl. Evol. 34: 355-370. 25. Whittall J., Liston A., Gisler S. and Meinke R. J., 2000. Detecting nucleotide additivity from direct sequences is a SNAP: an example from Sidalcea (Malvaceae). Plant Biol. 2: 1-7. 26. Hong C.P., Lee S.J., Park J. Y., Plaha P., Park Y.S., Lee Y.K., Choi J.E., Kim K. Y., Lee J.H., Lee J., Jin H., Choi S.R., Lim Y.P. ,2004, Construction of a BAC library of Korean ginseng and initial analysis of BAC –end sequences. Mol Gen Genomics. 271: 709-716. 27. Shim Y.H., Choi.J.H., Park C.D., Cho J.H., and Kim H.J., 2003, Molecular Diferentialtion of Panax Species by RAPD Analysis Arch Pharm Res Vol 26, No8, 601-605. 28. Holly J.G. & Matha A.C., 2004, Allozyme variation in American ginseng (Panax quinquefolius L.) Variation, breeding system, and implications for current convervation practice. Conservation Genetics 5: 13-23. 29. Lee J.W., Kim Y.C., Jo I.H., Seo A.Y., Lee J.H., Kim O.T., Huyn D.Y., Cha S.W., Bang K.H. and Cho J.H., 2011, Development of an ISSR-Derived SCAR marker in Korean Ginseng Cultivars (Panax ginseng C.A. Meyer). J. Ginseng Res. Vol.35(1): 52-59.

30. Hongtao.W., Yan D.C., 2010, a PCR-based SNP marker for specific authentication of Korean ginseng (panax ginseng) cultivar “Chunpoong” Mol Biol Rep 37: 1053-1057. 31. Ha T.D., Grushvitzky I.V., 1985, Tạp chí thực vật, 70: 518-522. 32. Nguyễn Ngọc Dung, 1995, Nhân giống sâm Ngọc Linh (panax vietnamensis) bằng con đường sinh học, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 33. Dương Tấn Nhựt, 2007, Công nghệ sinh học thực vật – Tập 1, NXB Nông nghiệp TP.HCM. 34. Mai Trường, Trần Thị Ngọc Hà, Trần Trọng Tuấn, Phan Trường Lộc, Đỗ Đăng Giáp, Bùi Đình Thạch, Nguyễn Thị Ngọc Hân, Phamh Đức Trí, Lê Tấn Đức, Nguyễn Đức Minh Hùng…,2014, “Tạo và nhân nuôi phôi soma sâm Ngọc Linh (panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường lỏng”, Tạp trí Khoa học và phát triển, 12(7): 1085-1095. 35. Hoàng Xuân Chiến, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Trực, Trần Xuân Tình, Lâm Bích Thảo, Trần Công Luận, Dương Tuấn Nhựt, 2011, “Nghiên cứu một số yếu tố tạo củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro và xác định hàm lượng saponin trong cây tạo từ củ trồng thử nghiệm ở núi Ngọc Linh”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 9(3): 325-339. 36. Huang, B. et al. (2008). Study on Tissue Culture Techniques for Stem Segment of Millettia speciosa Champ., Journal of Anhui Agricultural Sciences, 32. 37. Pan, Y., Zhang, X., Meng, P., Yu, W., Chen, S., Tang, J., Huang, S. and Zou, Y., 2010. Tissue culture of medicinal plant Millettia speciosa Champ., Biotechnology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China, 06. 38. White et al.,1990, The Internal Transcribed Spacer (ITS) regions of fungal ribosomal DNA (rDNA) are highly….ITS1, ITS2, ITS3 and ITS4. 39. Ngô Văn Thu, 1988, Bài giảng dược liệu, tập 1, Trung tâm thông tin – Thư viện Đại học Dược Hà Nội.

40. Nguyễn Viết Thân, 2010, Thực tập dược liệu (phần kiểm nghiệm bằng phương pháp hiển vi và hóa học), Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội. 41. Clausen A.M., Spooner D.M.,1998. Molecular support for the hybrid origin of the wild potato species Solanum × rechei. Crop Science 38, pp. 858–865 42. Murashige T., Plant propagation through tissue cultures, Annu. Rev. Plant Physiol., 25, pp. 135-166, 1974.

PHỤ LỤC 1

MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM CỦA ĐỀ TÀI

Phòng muôi cấy mô tại Viện Di truyền Nông nghiệp

Thí nghiệm nhân nhanh Sâm Núi Dành (MT: MS + 3 mg/l BA + 0,4 mg/l IBA)

Thí nghiệm ra rễ Sâm Núi Dành (MT: 1/2MS + 1mg/l IBA + 0,4 mg/l THT)

Cây Sâm Núi Dành in-vitro ra cây sau 2 tháng a) GT4 b) GT2 c) GT 3

Thí nghiệm giâm hom Sâm Núi Dành a b c

d e f

Thí nghiệm các môi trường ra rễ khác nhau a) MT: 1/2MS + 1 IBA b) MT: 1/2MS + 2 IBA c) MT: MS + 1,5IBA d) MT: MS + 2 NAA e) MT: 1/2MS + 1,5 NAA f) MT: MS + 0,5NAA

PHỤ LỤC 2

Bảng 3.19. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S1 trong NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Ma Quer x Total E Iden Accession Description y scor score value t cover e Callerya speciosa voucher KC441034 YC_11211269_MT01 internal 623 623 54% 0.0 99% .1 transcribed spacer 2, partial sequence Callerya reticulata voucher Tang Shaoqing 201152906 (GNU) internal transcribed spacer 1, partial sequence; KF294872 5.8S ribosomal RNA gene and 819 819 96% 0.0 91% .1 internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Callerya eurybotrya voucher Tang Shaoqing 201161501(GNU) internal transcribed spacer 1, partial sequence; KF294868 5.8S ribosomal RNA gene and 808 808 96% 0.0 90% .1 internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Callerya reticulata specimen-voucher Liston 877 (OSC) small subunit ribosomal RNA gene, partial AF467031 sequence; internal transcribed spacer 721 721 96% 0.0 89% .1 1, 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Callery a eurybotrya specimen- voucher Tao 578 (KUN) small subunit ribosomal RNA gene, partial AF467027 sequence; internal transcribed spacer 688 688 96% 0.0 88% .1 1, 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Bảng 3.20. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S2 trong NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Max Total Query E Accession Description Ident score score cover value Callerya speciosa voucher YC_11211269_MT01 internal KC441034.1 608 608 53% 0.0 99% transcribed spacer 2, partial sequence Callerya reticulata voucher Tang Shaoqing 201152906 (GNU) internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S KF294872.1 ribosomal RNA gene and 817 817 97% 0.0 90% internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Callerya eurybotrya voucher Tang Shaoqing 201161501(GNU) internal transcribed spacer 1, partial KF294868.1 sequence; 5.8S ribosomal RNA 806 806 97% 0.0 90% gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Callerya reticulata specimen- voucher Liston 877 (OSC) small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal AF467031.1 transcribed spacer 1, 5.8S 719 719 97% 0.0 88% ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene,

partial sequence

Callerya eurybotrya specimen- voucher Tao 578 (KUN) small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S AF467027.1 686 686 97% 0.0 87% ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Bảng 3.21. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S3 trong NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Tot Quer Accessio Max al E Iden Description y n score scor value t cover e Callerya speciosa specimen-voucher Yu-Xi Team 1029 (KUN) small AF46703 subunit ribosomal RNA gene, partial 477 477 84% 0.0 88% 3.1 sequence; internal transcribed spacer 1, 5 Callerya reticulata voucher Tang Shaoqing 201152906 (GNU) internal transcribed spacer 1, partial sequence; KF29487 8e- 5.8S ribosomal RNA gene and 627 627 91% 92% 2.1 176 internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Callerya eurybotrya voucher Tang Shaoqing 201161501(GNU) internal KF29486 transcribed spacer 1, partial sequence; 4e- 621 621 91% 91% 8.1 5.8S ribosomal RNA gene and 174 internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 26S ribosomal RNA

gene, partial sequence

Callerya reticulata specimen-voucher Liston 877 (OSC) small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; AF46703 internal transcribed spacer 1, 5.8S 2e- 582 582 84% 93% 1.1 ribosomal RNA gene and internal 162 transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Callerya eurybotrya specimen- voucher Tao 578 (KUN) small subunit ribosomal RNA gene, partial AF46702 sequence; internal transcribed spacer 2e- 566 566 84% 92% 7.1 1, 5.8S ribosomal RNA gene and 157 internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

. Bảng 3.22 Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S4 trong NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Max Total Query E Accession Description Ident score score cover value Callerya speciosa specimen- voucher Yu-Xi Team 1029 (KUN) small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed AF467033.1 488 488 77% 0.0 88% spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence Callerya reticulata voucher KF294872.1 Tang Shaoqing 201152906 676 676 95% 0.0 90% (GNU) internal transcribed

spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Callerya eurybotrya voucher Tang Shaoqing 201161501(GNU) internal transcribed spacer 1, partial KF294868.1 sequence; 5.8S ribosomal 660 660 95% 0.0 89% RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Callerya reticulata specimen- voucher Liston 877 (OSC) small subunit ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S 7e- AF467031.1 597 597 98% 87% ribosomal RNA gene and 167 internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence

Callerya eurybotrya specimen- voucher Tao 578 (KUN) small subunit ribosomal RNA gene, 3e- AF467027.1 566 566 77% 91% partial sequence; internal 157 transcribed spacer 1, 5.8S riboso

S1 T T T C A C C A A C C G G A G G C C C G G C T C A C G G S2 T T T C A C C A A C C G G A G G C C C G G C T T C C G G S3 T T T C A C C A A C C G G A G G C C C G G C T C A C G G S4 T T T C A C C A A C C G G A G G C C C G G C T C A C G G

S1 A C G G T C T G T G A C G C C C A G G C A A A C G T G C S2 A C G G T C T G T G A C G C C C A G G C A G A C G T G C S3 A C G G T C T G T G A C G C C C A G G C A G A C G T G C S4 A C G G T C T G T G A C G C C C A G G C A A A C G T G C

S1 C C T C A A C T A A T G G C T T C G G G C G C A A C T T S2 C C T C A A C T A A T G G C T T C G G G C G C A A C T T S3 C C T C A A C T A A A G G C T T C G G G C G C A A C T T S4 C C T C A A C T A A T G G C T T C G G G C G C A A C T T

S1 G C G T T C A A A G A C T C G A T G G T T C C C G G G A S2 G C G T T C A A A G A C T C G A T G G T T C A C G G G A S3 G C G T T C A A A G A C T C G A T G G T T C A C G G G A S4 G C G T T C A A A G A C T C G A T G G T T C A C G G G A

S1 C T A G A T A T C T G T T G C C G A G A G T C A T T C T S2 C T A G A T A T C C G T T G C C G A G A G T C A T T C C S3 C T A G A T A T C C G T T G C C G A G A G T C A T T C T S4 C T A A A T A T C C G T T G C C G A A A G T C A T T C C

S1 G T A T A G C G T G T C A A G G C G C C G C C C G C C G S2 G T A T C G C G T G T C A A G G C G C C G C C C G C C G S3 G T A T C G C G T G T C A A G G C G C C G C C C G C C G S4 G T A T C G C G T G T C A A G G C G C C G C C C G C C G

S1 G A C C A C C G T C T C C G G G C C G A C G G G G G C G S2 G A C C A C C G T C T C C G G G C C G A C G G G G G C G S3 G A C C A C C G T C T C C G G G C C G A C G G G G G C G S4 G A C C A C C G T C T C C G G G C C A A C G G G G G C G

S1 G G C G G G G A A C A C A C T G C G T G G C C C C C C T S2 G G C G G G G A A C A C A C T G C G T G G C C C C C C T S3 G G C G G G G A A C A C A C T G C G T G G C C C C C C T S4 G G C G G G A A A C A C A C T G C G T G G C C C C C C T

S1 C C G A G C C C G A G G G A G A G G A T G C G G C G C T S2 C C G A G C C C G A G G G A G A G G A T G C G G C G C T S3 C C G A G C C C G A G G G A G A G G A T G C G G C G C T S4 C C A A G C C C G A G G G A G A G G A T G C G G C G C T

S1 G T C A G A C A G A T T G C C G G T G A C T G C T G C A S2 G T C A A A C A G A T C G C C G G T G A C T G C T G A A S3 G T C A A A C A G A T C G C C G G T G A C T G C T G A A S4 G T C A A A C A G A T C G C C G G T G A C T G C T G C A Hình 1. Đoạn so sánh trình tự nucleotide của vùng ITS trên các mẫu Sâm

PHỤ LỤC 3 KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU BẰNG PHẦN MỀM IRRISTAT 5.0

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTBC FILE BB315 30/8/19 23:22 ------:PAGE 1 ANH HUONG CUA KI DEN KHA NANG TAI SINH CHOI

VARIATE V003 CDTBC

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 KI$ 4 1.99333 .498333 83.06 0.000 2 * RESIDUAL 10 .600000E-01 .600000E-02 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 2.05333 .146667 ------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BB315 30/8/19 23:22 ------:PAGE 2 ANH HUONG CUA KI DEN KHA NANG TAI SINH CHOI

MEANS FOR EFFECT KI$ ------

KI$ NOS CDTBC KI0.2 3 10.2667 KI0.4 3 10.5333 KI0.6 3 10.7000 KI0.8 3 10.2000 KI1 3 9.63333

SE(N= 3) 0.447214E-01 5%LSD 10DF 0.140919 ------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BB315 30/8/19 23:22 ------:PAGE 3 ANH HUONG CUA KI DEN KHA NANG TAI SINH CHOI

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE BB318A 7/9/19 23:40 ------:PAGE 1 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHAN CHOI

VARIATE V004 HSNC

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 BA$ 4 16.1008 4.02519 875.02 0.000 4 * RESIDUAL 10 .460009E-01 .460009E-02 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 16.1468 1.15334 ------

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCTB FILE BB318A 7/9/19 23:40 ------:PAGE 2 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHAN CHOI

VARIATE V005 CCTB

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN ======1 BA$ 4 .450666 .112667 4.97 0.018 4 * RESIDUAL 10 .226666 .226666E-01 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 .677332 .483809E-01 ------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BB318A 7/9/19 23:40 ------:PAGE 3 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHAN CHOI

MEANS FOR EFFECT BA$ ------

BA$ NOS HSNC CCTB BA2 3 3.25000 9.46667 BA2.5 3 5.14000 9.80000 BA3 3 6.15000 10.0000 BA3.5 3 6.02000 9.80000 BA4 3 5.16000 9.70000

SE(N= 3) 0.391582E-01 0.869226E-01 5%LSD 10DF 0.123389 0.273896 ------

MEANS FOR EFFECT IBA$ ------

IBA$ NOS HSNC CCTB IBA.0.2 15 5.14400 9.75333

SE(N= 15) 0.000000 0.000000 5%LSD 0DF 0.000000 0.000000 ------

MEANS FOR EFFECT BA$*IBA$ ------

BA$ IBA$ NOS HSNC CCTB BA2 IBA.0.2 3 3.25000 9.46667 BA2.5 IBA.0.2 3 5.14000 9.80000 BA3 IBA.0.2 3 6.15000 10.0000 BA3.5 IBA.0.2 3 6.02000 9.80000 BA4 IBA.0.2 3 5.16000 9.70000

SE(N= 3) 0.000000 0.000000 5%LSD 0DF 0.000000 0.000000 ------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BB318A 7/9/19 23:40 ------:PAGE 4 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHAN CHOI

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE BB318B 7/10/19 23:45 ------:PAGE 1 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHANH CHOI

VARIATE V004 HSNC

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN

======1 BA$ 4 15.6556 3.91391 ****** 0.000 4 * RESIDUAL 10 .345326E-01 .345326E-02 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 15.6902 1.12073 ------

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCTB FILE BB318B 7/9/19 23:45 ------:PAGE 2 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHANH CHOI

VARIATE V005 CCTB

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 BA$ 4 1.45733 .364333 10.51 0.001 4 * RESIDUAL 10 .346667 .346667E-01 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 1.80400 .128857 ------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BB318B 7/9/19 23:45 ------:PAGE 3 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHANH CHOI

MEANS FOR EFFECT BA$ ------

BA$ NOS HSNC CCTB BA2 3 3.39000 9.53333 BA2.5 3 5.32000 9.60000 BA3 3 6.54000 10.3667 BA3.5 3 4.62333 9.96667 BA4 3 5.10333 9.63333

SE(N= 3) 0.339277E-01 0.107497 5%LSD 10DF 0.106907 0.338726 ------

MEANS FOR EFFECT IBA$ ------

IBA$ NOS HSNC CCTB IBA.0.4 15 4.99533 9.82000

SE(N= 15) 0.000000 0.000000 5%LSD 0DF 0.000000 0.000000 ------

MEANS FOR EFFECT BA$*IBA$ ------

BA$ IBA$ NOS HSNC CCTB BA2 IBA.0.4 3 3.39000 9.53333 BA2.5 IBA.0.4 3 5.32000 9.60000 BA3 IBA.0.4 3 6.54000 10.3667 BA3.5 IBA.0.4 3 4.62333 9.96667 BA4 IBA.0.4 3 5.10333 9.63333

SE(N= 3) 0.000000 0.000000 5%LSD 0DF 0.000000 0.000000 ------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BB318B 7/9/19 23:45 ------:PAGE 4 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHANH CHOI

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

OBS. TOTAL SS RESID SS | | | | HSNC 15 4.9953 1.0586 0.58764E-01 1.2 0.0000 0.0000 0.0000 CCTB 15 9.8200 0.35897 0.18619 1.9 0.0015 0.0000 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE BB318C 7/9/19 23:52 ------:PAGE 1 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHANH CHOI

VARIATE V004 HSNC

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 BA$ 4 14.8282 3.70704 ****** 0.000 4 * RESIDUAL 10 .124668E-01 .124668E-02 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 14.8406 1.06005 ------

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCTB FILE BB318C 7/9/19 23:52 ------:PAGE 2 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHANH CHOI

VARIATE V005 CCTB

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 BA$ 4 .642667 .160667 7.09 0.006 4 * RESIDUAL 10 .226667 .226667E-01 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 .869333 .620952E-01 ------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BB318C 7/9/19 23:52 ------:PAGE 3 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHANH CHOI

MEANS FOR EFFECT BA$ ------

BA$ NOS HSNC CCTB BA2 3 3.28333 9.63333 BA2.5 3 4.80000 9.73333 BA3 3 6.36667 10.2000 BA3.5 3 5.30333 9.73333 BA4 3 5.05667 9.66667

SE(N= 3) 0.203853E-01 0.869227E-01 5%LSD 10DF 0.642348E-01 0.273896 ------

MEANS FOR EFFECT IBA$ ------IBA$ NOS HSNC CCTB IBA.0.6 15 4.96200 9.79333

SE(N= 15) 0.000000 0.000000 5%LSD 0DF 0.000000 0.000000 ------

MEANS FOR EFFECT BA$*IBA$ ------BA$ IBA$ NOS HSNC CCTB BA2 IBA.0.6 3 3.28333 9.63333 BA2.5 IBA.0.6 3 4.80000 9.73333 BA3 IBA.0.6 3 6.36667 10.2000 BA3.5 IBA.0.6 3 5.30333 9.73333 BA4 IBA.0.6 3 5.05667 9.66667

SE(N= 3) 0.000000 0.000000 5%LSD 0DF 0.000000 0.000000 ------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BB318C 7/9/19 23:52 ------:PAGE 4 ANH HUONG CUA BA VA IBA DEN NHAN NHANH CHOI

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SRTB FILE BB318A 11/9/19 16:12 ------:PAGE 1 ANH HUONG CUA MT VA IBA DEN RA RE

VARIATE V003 SRTB

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 CT$ 4 .266227 .665567E-01 525.45 0.000 2 * RESIDUAL 10 .126667E-02 .126667E-03 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 .267493 .191067E-01 ------

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTB FILE BB318A 11/9/19 16:12 ------:PAGE 2 ANH HUONG CUA MT VA IBA DEN RA RE

VARIATE V004 CDTB

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 CT$ 4 .924760 .231190 62.82 0.000 2 * RESIDUAL 10 .368000E-01 .368000E-02 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 .961560 .686829E-01 ------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BB318A 11/9/19 16:12 ------:PAGE 3 ANH HUONG CUA MT VA IBA DEN RA RE

MEANS FOR EFFECT CT$ ------

CT$ NOS SRTB CDTB MS0.5IBA 3 0.473333 1.72333 MS1IBA 3 0.680000 2.22000 MS1.5IBA 3 0.883333 2.45000 MS2IBA 3 0.723333 2.14333 MS2.5IBA 3 0.626667 1.93333

SE(N= 3) 0.649787E-02 0.350238E-01 5%LSD 10DF 0.204750E-01 0.110361 ------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BB318A 11/9/19 16:12 ------:PAGE 4 ANH HUONG CUA MT VA IBA DEN RA RE

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) ------SD/MEAN | |

NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SRTB 15 0.67733 0.13823 0.11255E-01 1.7 0.0000 CDTB 15 2.0940 0.26207 0.60663E-01 2.9 0.0000

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SRTB FILE BB318B 11/9/19 16:32 ------:PAGE 1 ANH HUONG CUA MT VA IBA DEN RA RE

VARIATE V003 SRTB

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 CT$ 4 3.54487 .886217 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 .446679E-02 .446679E-03 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 3.54933 .253524 ------BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTB FILE BB318B 11/9/19 16:32 ------:PAGE 2 ANH HUONG CUA MT VA IBA DEN RA RE

VARIATE V004 CDTB

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 CT$ 4 2.39684 .599210 889.91 0.000 2 * RESIDUAL 10 .673335E-02 .673335E-03 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 2.40357 .171684 ------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BB318B 11/9/19 16:32 ------:PAGE 3 ANH HUONG CUA MT VA IBA DEN RA RE

MEANS FOR EFFECT CT$ ------

CT$ NOS SRTB CDTB 1/2MS0.5IBA 3 1.53667 4.12667 1/2MS1IBA 3 2.63667 4.54333 1/2MS1.5IBA 3 2.14667 3.96333 1/2MS2IBA 3 1.64000 3.54333 1/2MS2.5IBA 3 1.27333 3.44667

SE(N= 3) 0.122022E-01 0.149815E-01 5%LSD 10DF 0.384495E-01 0.472072E-01 ------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BB318B 11/9/19 16:32 ------:PAGE 4 ANH HUONG CUA MT VA IBA DEN RA RE

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SRTB FILE BB317 11/9/19 1:37 ------:PAGE 1 ANH HUONG CUA NAA DEN KHA NANG RA RE

VARIATE V003 SRTB

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN ======1 CT$ 4 .313373 .783433E-01 135.07 0.000 2 * RESIDUAL 10 .580003E-02 .580003E-03 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 .319173 .227981E-01 ------

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTB FILE BB317 11/9/19 1:37 ------:PAGE 2 ANH HUONG CUA NAA DEN KHA NANG RA RE

VARIATE V004 CDTB

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 CT$ 4 .602973 .150743 196.62 0.000 2 * RESIDUAL 10 .766671E-02 .766671E-03 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 .610640 .436171E-01 ------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BB317 11/9/19 1:37 ------:PAGE 3 ANH HUONG CUA NAA DEN KHA NANG RA RE

MEANS FOR EFFECT CT$ ------

CT$ NOS SRTB CDTB MS0.5NAA 3 0.320000 1.54333 MS1NAA 3 0.470000 1.72333 MS1.5NAA 3 0.606667 1.94667 MS2NAA 3 0.753333 2.13667 MS2.5NAA 3 0.576667 1.84000

SE(N= 3) 0.139045E-01 0.159861E-01 5%LSD 10DF 0.438135E-01 0.503729E-01 ------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BB317 11/9/19 1:37 ------:PAGE 4 ANH HUONG CUA NAA DEN KHA NANG RA RE

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

BALANCED ANOVA FOR VARIATE SRTB FILE BB318 11/9/19 15:39 ------:PAGE 1 ANH HUONG CUA MT VA NAA DEN RA RE

VARIATE V003 SRTB

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 CT$ 4 2.90677 .726693 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 .800004E-03 .800004E-04 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 2.90757 .207684 ------

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTB FILE BB318 11/9/19 15:39 ------:PAGE 2 ANH HUONG CUA MT VA NAA DEN RA RE

VARIATE V004 CDTB

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ======1 CT$ 4 6.04077 1.51019 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 .240042E-02 .240042E-03 ------* TOTAL (CORRECTED) 14 6.04317 .431655 ------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BB318 11/9/19 15:39 ------:PAGE 3 ANH HUONG CUA MT VA NAA DEN RA RE

MEANS FOR EFFECT CT$ ------

CT$ NOS SRTB CDTB 1/2MS0.5NAA 3 0.643333 2.32667 1/2MS1NAA 3 1.21000 2.54667 1/2MS1.5NAA 3 1.91667 3.81333 1/2MS2NAA 3 1.22667 2.43000 1/2MS2.5NAA 3 0.810000 1.94000

SE(N= 3) 0.516399E-02 0.894506E-02 5%LSD 10DF 0.162719E-01 0.281862E-01 ------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BB318 11/9/19 15:39 ------:PAGE 4 ANH HUONG CUA MT VA NAA DEN RA RE

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1