Đề Tài: “ Nghiên Cứu Đánh Giá Và Xây Dựng Quy Trình Nhân Giống Cho Loài Sâm Núi Dành (Callerya Speciosa (Champ.Ex Benth) Schot) Phân Bố Trên Địa Bàn Tỉnh Bắc Giang”
Total Page：16
File Type：pdf, Size：1020Kb
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thanh Loan ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH (CALLERYA SPECIOSA (CHAMP.EX BENTH) SCHOT) PHÂN BỐ TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG” LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thanh Loan ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH (CALLERYA SPECIOSA (CHAMP.EX BENTH) SCHOT) PHÂN BỐ TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG” Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : Hướng dẫn 1: TS. Đồng Thị Kim Cúc Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Thanh Hương Hà Nội - 2019 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác. Các số liệu chưa từng được công bố trong luận án, luận văn nào trước đây. Mọi dữ liệu trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên! Tác giả Nguyễn Thanh Loan i Lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô và các cán bộ công tác tại Học viện Khoa học và Công nghệ đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Học viện. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đồng Thị Kim Cúc và TS. Nguyễn Thị Thanh Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cho tôi trong quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể các cán bộ, anh chị em, bạn bè, đồng nghiệp trong Trung Tâm thực nghiệm Sinh học Nông nghiệp Công nghệ cao thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Luận văn này được thực hiện bởi sự cho phép của Viện Di truyền Nông nghiệp, Trung tâm Thực nghiệm sinh học Nông nghiệp Công nghệ cao và được thực hiện từ nguồn kinh phí đề tài “Nghiên cứu đánh giá, bảo tồn nguồn gen cây Sâm Núi Dành phân bố trên địa bàn Tỉnh Bắc Giang” Luận văn có sự động viên và giúp đỡ của gia đình tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 9 tháng 10 năm 2019 Tác giả Nguyễn Thanh Loan ii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Viết tắt Viết đầy đủ DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) Cs Cộng sự BA Benzyladenine (6-Benzyladenine) CT Công thức ĐC Đối chứng Ki Kinetin IBA Indole-3-butyric acid MS Murashige và Skoog (1962) NAA Naphthaleneacetic acid TB Trung bình TN Thí nghiệm CV% Hệ số biến động (Correlation ò Variance) LSD0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0,05 (Leant Significant Difference) MTN Môi trường nền L lít Mg miligram iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................... 1 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI .............................................................................. 2 3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI ................................................................................ 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH ............................. 3 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA ... 5 1.3.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC VẬT DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ ...................................................................... 6 1.3.1. Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật .................... 6 1.3.2. Bộ gene lục lạp ...................................................................................... 7 1.3.3. Các trình tự bảo tồn ở bộ gene trong nhân ............................................ 7 1.3.4. Kết quả nghiên cứu ADN mã vạch trong kiểm định giống nhân sâm. .. 9 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRÊN CÂY SÂM NGỌC LINH .................................................................................................... 10 1.5. TÌNH HÌNH NHÂN GIỐNG LOÀI CELLERYA SPECIOSA CHAMP ... 11 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...................................................... 11 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................ 12 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 14 2.1.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THƠI GIAN NGHIÊN CỨU . 14 2.1.1.Đối tượng .............................................................................................. 14 2.1.2.Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 14 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................ 14 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...................................................................... 14 2.2.1. Nội dung 1: Thu thập, lấy mẫu và phân loại chính xác loài Sâm Núi Dành bằng marker phân tử trong số các mẫu Sâm thu thập được trên địa bàn tỉnh Bắc Giang. ..................................................................................................... 14 2.2.2. Nội dung 2: Phân tích định tính một số nhóm chất trong củ Sâm Núi Dành 15 2.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và phương pháp nuôi cấy in- vitro 15 2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 15 2.3.1.Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu ngoài thực địa ................................. 15 2.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các giống/loài bằng các marker đặc trưng-Barcode .................................................................................... 16 iv 2.3.3. Phương pháp phân tích định tính một số nhóm hoạt chất có dược tính trong loài Sâm Núi Dành ...................................................................................... 19 2.3.4. Phương pháp nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành .................. 20 2.3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................ 25 2.3.6.Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 25 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................... 26 3.1. THU THẬP, LẤY MẪU VÀ PHÂN LOẠI CHÍNH XÁC LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ TRONG SỐ CÁC MẪU SÂM THU THẬP ĐƯỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG. ..................................... 26 3.1.1. Thu thập, lấy mẫu một số loài Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang ........ 26 3.1.2. Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành. ........................ 28 3.2. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ NHÓM CHẤT TRONG CỦ SÂM NÚI DÀNH .............................................................................................................. 32 3.3. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIÂM HOM VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN-VITRO..36 3.3.1. Phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại vùng bản địa bằng các phương pháp giâm hom ........................................................................................ 36 3.3.2. Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro ............................................................................. 40 3.3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sâm Núi Dành in-vitro ngoài vườn ươm ............................................................. 51 CHƯƠNG 4 . KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 54 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................... 54 4.2. KIẾN NGHỊ .............................................................................................. 55 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1. Danh sách các mồi ITS ....................................................................... 14 Bảng 3.1. Danh sách kí hiệu 4 mẫu Sâm ............................................................. 28 Bảng 3.2. Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu Sâm nghiên cứu ........... 30 Bảng 3. 3. Hệ số tương đồng giữa các mẫu Sâm nghiên cứu .............................. 31 Bảng 3.4 . Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành dưới 3 năm tuổi .... 32 Bảng 3.5. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành từ 3-5 năm tuổi ....... 33 Bảng 3.6. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành trên 5 năm tuổi ....... 33 Bảng 3.7. Một số hình ảnh của phản ứng định tính một số nhóm chất ................ 34 Bảng 3. 8. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng hình thành rễ hom giâm ............... 36 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây hom Sâm Núi Dành............ 37 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch bệnh ................................................................................................ 40 Bảng 3. 11. Ảnh hưởng của Ki đến khả năng tái sinh chồi.................................. 42 Bảng 3. 12. Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm Núi Dành ..................................................................................................................... 45 Bảng 3. 13. Ảnh hưởng của MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ ............ 46 Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của ½MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ ........ 46 Bảng 3. 15. Ảnh hưởng của môi trường MS và IBA đến sự hình thành rễ ......... 47 Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của môi trường ½MS và IBA đến sự hình thành rễ ...... 48 Bảng 3. 17. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới chất lượng bộ rễ .......................... 50 Bảng 3. 18. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây Sâm Núi Dành in-vitro .... 51 Bảng 3.19. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S1 trong NCBI .................................................................................................................... 64 Bảng 3.20.