These De Doctorat Genie Chimique

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO ECOLE SUPERIEURE POLYTECHNIQUE

DEPARTEMENT GENIE CHIMIQUE

THESE DE DOCTORAT GENIE CHIMIQUE

CONTRIBUTION A L’ETUDE CHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DE Millettia richardiana Baill. (FABACEAE)

Présenté par : Manitriniaina RAJEMIARIMIRAHO

Soutenue le 29 Juin 2011

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

ECOLE SUPERIEURE POLYTECHNIQUE

DEPARTEMENT GENIE CHIMIQUE

THESE DE DOCTORAT GENIE CHIMIQUE

CONTRIBUTION A L’ETUDE CHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DE Millettia richardiana Baill. (FABACEAE)

Présenté par : Manitriniaina RAJEMIARIMIRAHO

Soutenue le 29 Juin 2011

Membres du Jury

Président : Philippe ANDRIANARY Professeur Titulaire

Co-Directeur de thèse : Roger RANDRIANJA Professeur Titulaire

Co-Directeur de thèse et Rapporteur externe : Amélie RAHARISOLOLALAO Professeur Emérite

Rapporteur interne : Gabriel RANAIVONIARIVO Professeur

Examinateurs : Etienne RAKOTOMARIA Professeur Emérite

Benjamin RANDRIANOELINA Professeur titulaire

REMERCIEMENTS

Nous avons eu la chance et le plaisir d’effectuer une partie de ce travail de recherche dans le Laboratoire de Chimie des Hétérocycles et des Glucides de l’Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Clermont Ferrand sous la direction de professeur Yves TROIN. Tout d’abord, nous tenons particulièrement à remercier Monsieur le Professeur Yves TROIN pour nous avoir accueillis au sein du Laboratoire de CHG, pour nous avoir fait confiance tout en nous laissant une grande liberté. Pour son soutien et sa grande générosité, qu’il soit assuré de notre profonde gratitude. Nous aimerons remercier Monsieur le Professeur Titulaire Philippe Antoine ANDRIANARY, Directeur de l’Ecole Supérieure Polytechnique d’Antananarivo, pour la confiance qu’il nous a faite en soutenant notre projet de thèse et de formation à l’étranger, et d’avoir bien vouloir accepter de présider le Jury de notre soutenance de thèse. Nous adressons également nos remerciements à Monsieur le Professeur Titulaire Roger RANDRIANJA, Enseignant-Chercheur à l’Ecole Supérieure Polytechnique d’Antananarivo, pour avoir accepté d’être directeur de thèse. Ainsi que pour nous avoir accordé sa confiance, pour nous avoir guidé dans notre travail tout au long de ces années. Nous souhaitons remercier Madame le Professeur Emérite Amélie RAHARISOLOLALAO, Enseignant- Chercheur au Faculté des Sciences d’Antananarivo, une grande spécialiste des substances naturelles, pour avoir accepté d’être co-directeur de thèse et rapporteur externe ainsi que pour son soutien et sa confiance. Nous aimerons remercier Monsieur le Professeur Emérite Etienne RAKOTOMARIA de l’Ecole Supérieure Polytechnique d’Antananarivo pour nous avoir fait l’honneur de juger notre travail de thèse. Nous aimerons aussi remercier Monsieur le Professeur Gabriel RANAIVONIARIVO de l’Ecole Supérieure Polytechnique d’Antananarivo pour avoir accepté de faire partie de notre jury de thèse en tant que rapporteur interne. Nous adressons nos remerciements à Monsieur le Professeur titulaire Benjamin RANDRIANOELINA de l’Ecole Supérieure Polytechnique d’Antananarivo pour avoir bien voulu accepter de juger notre travail. Nous remercions l’équipe du projet MADES qui nous a sélectionnés pour être parmi les bénéficières des bourses de recherche par alternance du gouvernement Français. Nous remercions aussi l’ambassade de France, à travers le service de coopération et d’association culturel, pour le financement de ce projet et la facilitation des démarches administratives afférentes à la préparation de nos séjours en France. Je voudrais exprimer ma reconnaissance au Docteur Jean Théophile BANZOUZI, directeur de recherche de l'organisation Médecins d'Afrique, pour m’avoir proposé ce sujet de thèse très original qui fait partie d’un projet interinstitutionnel en vue de "valoriser les Millettia de Madagascar ", ainsi que pour son soutien et ses conseils au long de ces années. Nous tenons à remercier à l’équipe du Centre National d’Application des Recherches Pharmaceutiques, dirigé par le Docteur Michèle RATSIMBASON, pour la confiance qu’ils nous ont fait en soutenant notre projet de formation à l’étranger. Nous remercions sincèrement Monsieur le Docteur Pierre CHALARD, responsable de la filière Chimie Organique à l’ENSCCF, qu’il trouve ici l’expression de notre profonde reconnaissance tant pour nous avoir accordé sa confiance que pour nous avoir guidé dans notre travail tout au long de nos stages. Ses conseils et ses commentaires mais aussi sa bienveillance auront été fort utiles. Nos remerciements vont également à l’équipe du Laboratoire de Chimie des Hétérocycles et des Glucides pour nous avoir chaleureusement accueillis au sein de l’équipe de recherche. Nous remercions toutes les personnes qui ont contribué d’une façon ou d’une autre à l’aboutissement de ce travail : Monsieur Stéphane RAKOTONANDRASANA, chercheur-enseignant au Département Ethnobotanique et Botanique du Centre National d'Application des Recherches Pharmaceutiques, pour l’accomplissement de la récolte et l’identification de la plante, Monsieur Régis EGROT, technicien RMN à l’ENSCCF, pour la réalisation des nombreuses expériences en RMN 1H, Docteur Gilles FIGUEREDO, responsable du laboratoire LEXVA Analytique à l’ENSCCF, pour la réalisation de quelques spectres de masse en mode EI, Monsieur Bertrand LEGERET, Ingénieur d'Etudes CNRS, laboratoire SEESIB, UMR6504, pour la réalisation des spectres de masse en mode ESI, Docteur Léa Herilala RASOANAIVO, enseignant-chercheur à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, pour nous avoir aidés à l’interprétation des spectres RMN. Enfin, pour leur soutien sans faille et permanent, je tiens à remercier de tout cœur: mes parents, ma femme, mes deux enfants, mes frères et mes soeurs. A toute ma famille qui ont soutenu durant nos études.

TABLES DE MATIERE

INTRODUCTION……………………………………………………………... 1

CHAPITREI : GENERALITES…………………………………………… 4 I.1 Généralités sur la plante………………………………………………… 5 I.1.1 Famille des Fabaceae………………………………………………………... 5 I.1.2 Tribu des Millettieae. ………………………………………………………. 5 I.1.3 Genre Millettia……………………………………………………...... 6 I.1.4 Espèce Millettia richardiana………………………………………………… 6 I.2 Travaux chimiques antérieurs………………………………………… 10 I.3 Travaux biologiques antérieurs………………………………………... 13 I.4 Familles chimiques...... 15 I.4.1 Les lipides…………………………………………………………………… 15 I.4.1.1 Définition…………………………………………………………………… 15 I.4.1.2 Biogénèse des acides gras………………………………………………….. 16 I.4.1.3 Biogénèse des triglycérides………………………………………………… 18 I.4.2 Les coumarines……………………………………………………………… 19 I.4.2.1 Définition…………………………………………………………………… 19 I.4.2.2 Biosynthèse des pyranocoumarines linéaires……………………………… 20 I.4.3 Les Triterpènes……………………………………………………………… 21 I.4.3.1 Définition…………………………………………………………………… 21 I.4.3.2 Biogénèse de Triterpènes…………………………………………………… 22 I.5 Détermination de structure…………………………………………….. 23 I.5.1 La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)……………………………... 23 I.5.1.1 RMN à 1-D…………………………………………………………………. 24 I.5.1.2 RMN à 2-D…………………………………………………………………. 24 1.5.1.3 Applications………………………………………………………………... 25 I.5.2 Spectrométrie de Masse…………………………………………………….. 33

I.6 Activités biologiques……………………………………………………… 34 I.6.1 Activité antiparasitaire……………………………………………………… 34 I.6.1.1 Activité antipaludique………………………………………………………. 34 I.6.1.2 Activité antitrypanosomiase………………………………………………… 34 I.6.1.3 Activités antileishmanioses…………………………………………………. 35 I.6.2 Activités antifongique……………………………………………………….. 36 I.6.3 Cytotoxicités…………………………………………………………………. 36 CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES…………...... 37 II.1 Matériels……………………………………………………………………. 38 II.1.1 Matériel végétal…………………………………………………………….. 38 II.1.2 Matériel technique…………………………………………………………. 38

II.2 Méthodes…………………………………………………………………… 40 II.2.1 Extraction…………………………………………………………………… 40 II.2.1.1 La macération……………………………………………………………… 41 II.2.1.2 L’extraction par partage liquide-liquide………………………………….. 41 II.2.1.3 L’extraction à reflux………………………………………………………. 43 II.2.2 Criblage phytochimique…………………………………………………… 44 II.2.2.1 Criblage des alcaloïdes……………………………………………………. 44 II.2.2.2 Criblage des coumarines…………………………………………………… 44 II.2.2.3 Criblage des flavonoïdes…………………………………………………... 44 II.2.2.4 Criblage des triterpènoïdes………………………………………………… 44 II.2.2.5 Criblage des saponines…………………………………………………….. 44 II.2.3 Activités biologiques……………………………………………………….. 45 II.2.3.1 Activité antiparasitaire…………………………………………………….. 45 II.2.3.2 Activité antifongique……………………………………………………… 46 II.2.3.3 Activité cytotoxique……………………………………………………….. 46 II.2.4 Fractionnement et isolement………………………………………………. 47 II.2.4.1 Chromatographie sur couche mince (CCM)………………………………. 47 II.2.4.2 Chromatographie sur colonne……………………………………………… 47 II.2.5 Enregistrement des spectres……………………………………………….. 49 CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION…………………… 52

III.1 Résultats…………………………………………………………………... 53 III.1.1 Extractions………………………………………………………………… 53 III.1.2 Criblage phytochimique………………………………………………….. 54 III.1.3 Tests biologiques………………………………………………………….. 55 III.1.3.1 Activité antiparasitaire…………………………………………………… 55 III.1.3.2 Activité antifongique……………………………………………………… 56 III.1.3.3 Activité cytotoxicité………………………………………………………. 56 III.1.4 Fractionnement et isolement. …………………………………………….. 57 III.1.4.1 Fractionnement de l’extrait dichlorométhanique E2…………………….. 57 III.1.4.2.2 Purification de la fraction E2A…………………………………………. 57 III.1.4.3 Purification de la fraction E2B……………………………………………. 58 III.1.4.4 Fractionnement de la fraction E2C……………………………………….. 59 II.1.4.5 Fractionnement de la fraction E2DE………………………………………. 61 III.1.5 Caractéristiques des produits obtenus à identifier……………………… 63

III.2 Détermination de structure…………………………………………... 64

III.2.1 Détermination de structure des acides gras……………………. 64 III.2.1.1 Identification de E2A3 noté composé 1………………………………….. 64 III.2.1.2 Identification de E2DE7A2……………………………………………….. 71

III.2.2 Détermination structurale des triterpènes………………………………. 80 III.2.2.1 Identification du composé E2C5B noté composé 5……………………… 80 III.2.2.2 Identification de E2C1D…………………………………………...... 91 III.2.3 Détermination structurale des pyranocoumarines……………………… 98 III. 2.3.1 Identification de E2B4H noté composé 2………………………………... 98 III.2.3.2 Identification de E2DE7A8 noté composé 9……………………………… 110 CONCLUSION………………………………………………………………… 119 REFERENCES …………………………………………………………………… 122 ANNEXES ……………………………………………………………………… 134 Publication ………………………………………………………………………... 135 Spectres RMN 1H élargis du composé 1…………………………………………. 136 Spectres RMN 13C-Jmod élargis du composé 1………………………………… 138 Spectres RMN 1H élargis du composé 2…………………………………………. 139 Spectres RMN 13C-Jmod élargis du composé 2…………………………………. 140 Spectre RMN 13C-Jmod élargi du composé 9…………………………………… 141 Données spectrales des composés obtenus ……………………………………… 142

Liste des abréviations

AcOEt : acétate d’éthyle AGMI : acide gras mono insaturé AGPI : acide gras polyinsaturé AGS : acide gras saturé BB : Broad Band decoupling C : carbone 13C : carbone-13 CC : chromatographie sur colonne CCM : chromatographie sur couches minces

CH2Cl2 : dichlorométhane

CHCl3 : chloroforme cm : centimètre COSY : COrrelation SpectroscopY Cyclo : Cyclohexane °C : degré Celsius δ : déplacement chimique d : doublet EtOH : éthanol ν : fréquence GC-SM : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse g : gramme h : constante de Planck H : hydrogène 1H : proton

H2O : eau

HgCl2 : chlorure mercurique HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation HMQC : Heteronuclear Multiple Quantum Coherence HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence Hz : Hertz NH4OH : Hydroxyde d’ammoniaque I : Spin nucléaire

I2 : iode IK : iodure de potassium J : constante de couplage K : degré Kelvin LC-SM : Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse l : litre m : mètre m : multiplet m/z : rapport de masse ionique par la charge ionique MeOH : méthanol mg : milligramme Mg : magnésium min : minute ml : millilitre mm : millimètre μg : microgramme μl : microlitre mol : mole MPLC : Moyen Pressur Liquid Cνhromatography NOESY : Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY O : oxygène ppm : partie par million RMN : résonance Magnétique Nucléaire RMN-1D : RMN à une dimension RMN-2D : RMN à deux dimensions RMN-1H : RMN de proton RMN-13C : RMN de carbone 13 s : singulet t : triplet uma : unité de masse atomique UV : Ultra Violet Liste des diagrammes

Diagramme 1 : Protocole d’obtention des différentes extraits de Millettia richardiana. Diagramme 2 : Protocole d’obtention de l’extrait aqueux lyophilisé E6 de Millettia richardiana Diagramme 3 : Résultats de la purification de E2A Diagramme 4 : Fractionnement de E2B Diagramme 5 : Purification de E2B4 Diagramme 6 : Résultats du fractionnement de E2C Diagramme 7 : Purification de la fraction E2C1 Diagramme 8 : Purification de la fraction E2C5 Diagramme 9 : Fractionnement de E2DE Diagramme 10 : Fractionnement de E2DE7 Diagramme 11 : Purification de E2DE7A

Liste des figures

Figure 1 : Planche de Millettia richardiana Figure 2 : Photo de Millettia richardiana Figure 3 : Structure des coumarines, d’alcaloïde, de triterpène, de stéroïde et des flavonoïdes des espèces du genre Millettia. Figure 4 : Structure des isoflavonoïdes isolés des espèces du genre Millettia Figure 5 : Structure des molécules actives des espèces du genre Millettia Figure 6 : Structure d’un triacylglycérol, le palmitoylstéaryloleylglycérol. Figure 7 : Structures d’un phosphoglycéride, le palmitoyloleylphosphatidylcholine. Figure 8 : Structure de coumarine. Figure 9 : Structure de dicoumarol. Figure 10 : Structure d’ombelliférone. Figure 11 : Structure de psoralène et d’angélicine. Figure 12 : Structure de xanthylétine et de seseline. Figure 13 : Corrélation entre proton et carbone porteur. Figure 14 : Protons géminés et vicinaux. Figure 15 : Corrélations entre protons et carbones voisins. Figure 16 : Spectre RMN 1H de tristéarylglycérol. Figure 17 : Spectre de RMN-1H de l’huile d’olive vierge. Figure 18 : Triterpène du type oléanane (oléa-12-ène). Figure 19 : Triterpène type lupéol. Figure 20 : 3-arylpyranocoumarine linéaire et angulaire. Figure 21 : Appareil de flash chromatography SpotII Ultimate Figure 22 : Spectrophotomètre de masse. Figure 23 : Spectrophotomètre de RMN Avance AC400 BRÜKER Figure 24 : Icône RMN de l’ordinateur. Figure 25 : Passeur des tubes RMN. Figure 26 : Spectre de RMN-1H du composé 1. Figure 27 : Spectre RMN-13C J-modulé du composé 1. Figure 28 : Spectre de RMN HSQC du composé 1. Figure 29 : Spectre de COSY du composé 1. Figure 30 : Séquence de base du composé 1. Figure 31 : Hypothèse de structure du composé 1. Figure 32 : Structure du composé 1. Figure 33 : Chromatogramme GC/MS de l’extrait E2DE7A2 Figure 34 : Spectre de RMN-1H de E2DE7A2. Figure 35 : Spectre de RMN-13C-JMOD de E2DE7A2. Figure 36 : Spectre de masse EI du composé 6. Figure 37 : Structure du composé 6. Figure 38 : Spectre de masse EI du composé 8. Figure 39 : Structure du composé 8. Figure 40 : Spectre de masse EI du composé 7. Figure 41 : Structure du composé 7. Figure 42 : Structure de E2DE7A2 mélange d’acide palmitique, d’acide stéarique et d’acide linoléique. Figure 43 : Spectre de proton du composé 5. Figure 44 : Spectre HMBC élargi du composé 5. Figure 45 : Structure d’un triterpène pentacyclique à noyau E cyclopentanique. Figure 46 : Spectre de RMN 13C-Jmod du composé 5. Figure 47 : Spectre HSQC du composé 5. Figure 48 : Spectre COSY du composé 5. Figure 49 : Structure du composé 5. Figure 50 : Chromatogramme GC/MS de E2C1D. Figure 51 : Spectre de masse en EI du composé 3. Figure 52 : Spectre de masse en EI du composé 4. Figure 53 : Spectre de proton de E2C1D. Figure 54 : Spectre RMN 13C-Jmod de E2C1D. Figure 55 : Structure de E2C1D mélange de β-amyrine et lupéol. Figure 56 : Spectre RMN 1H du composé 2. Figure 57 : Spectre de masse ESI- du composé 2. Figure 58 : Spectre RMN 13C-Jmod du composé 2. Figure 59 : Spectre HSQC du composé 2. Figure 60 : Spectre Cosy du composé 2. Figure 61 : Spectre HMBC du composé 2. Figure 62 : Corrélations COSY et HMBC du composé 2. Figure 63 : Structure du composé 2. Figure 64 : Spectre RMN de proton du composé 9. Figure 65 : Spectre RMN 13C-Jmod du composé 9. Figure 66 : Spectre HSQC du composé 9. Figure 67 : Spectre COSY du composé 9. Figure 68 : Spectre HMBC du composé 9. Figure 69 : Les corrélations COSY et HMBC observées sur le composé 9. Figure 70 : Structure du composé 9.

Liste des schémas

Schéma 1 : Biogénèse des acides gras. Schéma 2 : Biogénèse des triglycérides. Schéma 3 : Biosynthèse des pyranocoumarines linéaires. Schéma 4 : Biogénèse des triterpènes pentacycliques. Schéma 5 : Fragmentation du composé 6 en spectrométrie de masse en EI. Schéma 6 : Fragments des ions caractéristiques du composé 3. Schéma 7 : Fragmentation donnant les ions caractéristiques du composé 4.

Liste des tableaux

Tableau I : Molécules isolés dans différentes parties des Millettia Tableau II : activités biologiques du genre Millettia Tableau III : Attribution des signaux du spectre de proton de l’huile d’olive vierge. Tableau IV : Rendement des extractions de la poudre d’écorce des tiges de Millettia richardiana. Tableau V : Résultat du criblage phytochimique sur les extraits semi-bruts de l’écorce des tiges de Millettia richardiana. Tableau VI : activités biologiques des extraits de Millettia richardiana. Tableau VII : Les résultats du fractionnement de l’extrait dichlorométhane de l’écorce des tiges de Millettia richardiana. Tableau VIII : Caractéristiques des produits obtenus à identifier. Tableau IX : Données spectrales en RMN du composé 1. Tableau X : Données spectrale du composé 1 et du α-palmityl-β,α’-dilinoléylglycérol. Tableau XI : Données spectrales du composé 5. Tableau XII : Données spectrales en RMN du composé 2. Tableau XIII : Données spectrales en RMN du composé 9.

INTRODUCTION

L’utilisation des remèdes traditionnels et des plantes médicinales reste courante à la majorité de la population mondiale, plus particulièrement dans les pays en voie de développement. Cette pratique est favorisée dans la mesure où l’accès aux médicaments prescrits par la médicine moderne est de plus en plus difficile pour ces pays et ces plantes ont souvent une réelle efficacité.

L’industrie pharmaceutique moderne, s’appuie largement sur la diversité des métabolites secondaires végétaux pour trouver de nouvelles molécules aux propriétés biologiques inédite. Dans les pays développés, 50% des médicaments utilisés sont des produits naturels dont 25% proviennent de la plantes.

Le recueil des données ethnobotaniques a montré les vertus thérapeutiques des espèces de Millettia d’Afrique telles que antitumoral, anti-inflamatory, antiviral, bactéricide, insecticide et antiparasitaire (J. T. Banzouzi et coll., 2008). Et depuis quelques années, de nombreuses études menées dans le domaine de l'ethnopharmacologie ont essayé de prouver leurs utilisations traditionnelles et de chercher leurs autres propriétés biologiques. Ainsi, les espèces Africains possèdent des propriétés biologiques intéressantes et elles sont riches en diverses familles chimiques biologiquement actives, en particulier les flavonoïdes et les terpènoïdes.

Madagascar, située dans l’Océan Indien, présente tous les caractères d’un petit continent doté d’une nature extraordinairement variée. Notre flore présente, selon les botanistes du Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza, 10000 espèces dont la plupart d’entre elles, plus de 80%, sont endémiques. Parmi ces espèces endémiques, huit espèces appartiennent au genre Millettia.

Dans le cadre de la valorisation des substances naturelles d’origine végétale et compte tenu des résultats obtenus sur les autres espèces, l’étude phytochimique des espèces endémiques Malagasy, du genre Millettia est cruciale. L’étude phytochimique de Millettia richardiana fait l’objet de cette thèse dont la partie chimique a été réalisée au Centre National d’Application des Recherches Pharmaceutiques d’Antananarivo et au Laboratoire de Chimie d’Hétérocycle et de Glucide de Clermont Ferrand, et la partie biologique a été fait en collaboration avec d’autres Laboratoires internationaux.

Le présent manuscrit comportera trois chapitres :

. Le premier parlera des généralités sur l’espèce Millettia richardiana appartenant à la famille des Fabacées, sur les différentes familles de composés isolés au cours de notre étude et sur les méthodes d’analyses chimiques, physiques et biologiques utilisées.

. Le second présentera les techniques d’isolement et d’analyse utilisées au cours de ce travail. Nous exposerons ensuite les méthodes utilisé pour l’extraction, le criblage phytochimique, les tests biologiques et l’isolement.

. La troisième rapportera les résultats obtenus, suivis d’une discussion et d’une conclusion.

CHAPITRE I GENERALITES

I.1 Généralités sur la plante.

I.1.1 Famille des Fabaceae [5, 18].

Les Fabaceae représentent une grande famille constituée de plantes ligneuses (zones tropicales) et herbacées (zones tempérées) avec quelques arbres et arbustes qui regroupe environ 12000 espèces réparties en 400 à 500 genres. Cette famille se divise en plusieurs tribus dans lesquelles les genres sont groupés selon le port de la plante, la forme des feuilles et le degré de fusion des étamines.

Les différentes tribus qui composent cette famille sont :

Abreae Dalbergieae Mimoseae Adesmieae Desmodieae Mirbelieae Acacieae Detarieae Mimozygantheae Aeschynomeneae Dipterygeae Parkieae Amorpheae Euchresteae Phaseoleae Bossiaeeae Galegeae Podalyrieae Brongniartieae Genisteae Psoraleeae Caesalpinieae Hedysareae Robinieae Carmichaelieae Indigofereae Sophoreae Cassieae Ingeae Swartzieae Cercideae Liparieae Thermopsideae Cicereae Loteae Trifolieae Crotalarieae- Millettieae Vicieae

I.1.2 Tribu des Millettieae [85].

La tribu des Millettieae est composée essentiellement de plantes ligneuses aux feuilles pennées avec 5 ou plusieurs paires de folioles. Les fruits monospermes sont indéhiscents et à paroi sèche ou charnue. Ces plantes se retrouvent en particulier dans les régions intertropicales. La tribu des Millettieae est composée d’une vingtaine de genres : Afgekia, Aganope, Antheroporum, Callerya, Chadsia, Craibia, Craspedolobium, Cyclolobium, Dahlstedtia, Deguelia, Derris, Fordia, Hesperothamnus, Lonchocarpus, Millettia, Mundulea,

Piscidia, Platycyamus, Platysepalum, Poecilanthe, Pongamia, Sarcodum, Tephrosia et Wisteria.

I.1.3 Genre Millettia [22, 79].

Les Millettia présentent des feuilles alternes, imparipennées et ailées. Les fleurs sont généralement plus longues que 1cm de couleur violette, rose, bleu. Les fruits sont sous forme de gousses obové à oblongues et aplaties.

Le genre Millettia de la famille des Fabaceaes est représenté à Madagascar par huit espèces : M. aurea, M. capuronii, M. hitsika, M. lenneoides, M. nathaliae, M. orientalis, M. richardiana, et M. taolanaroensis, toutes endémiques.

I.1.4 Espèce Millettia richardiana [22, 47].

 Noms vernaculaires.

Millettia richardiana, représenté par les figures 1 et 2, est connu sous plusieurs noms vernaculaires : Hararandrato (SW), Lovanjafy (W), Mararybotry, Mararytoloha, Manaryboraka (NW), Taintsidambo, Tankindambo (W, NW, N), Tsimahamasabary (W).

 Description botanique.

Ce sont des buissons à grands arbres de hauteur de 3 à 15m, décidus, fleurs apparues sur les nouvelles tiges pendant que les feuilles sont encore très jeunes; tige dépassant 30cm de diamètre ; écorce gris clair, glabrescente, sans lenticelles, présentant des restes de bourgeons arrondis, sans stipelles.

Les feuilles sont alternes, avec stipules petites, composées imparipennées, avec 9 à 25 paires de folioles ; rachis jaunâtre ou couvert de poils roux ; folioles oblong- elliptiques ou étroitement oblongues, généralement 15x40-15x15mm, arrondies à obtus aussi bien à l’extremité qu’à la base, mucroné, devenu subcoriace avec de bord révoluté, pubescent ou glabrescent et gris verdâtre, mate au dessus, gris clair généralement avec de pubescence jaunâtre ou roux spécialement sur les nervures au dessous.

Les inflorescences sont disposés en cymes axillaires, en pseudoracèmes apparaissant en même temps que le rameaux végétatif, constitué de 2-4 fleurs, pédoncule court de 1-5mm de long ; pédicelle avec deux bractéoles filiformes, 3-5mm de long.

Les fleurs sont de longueur de 14 à 18mm, de couleur rose à violet. Calice 4-6 mm de long, finement pubescent, pourpre, constitué de 5 sépales soudés à la base en forme de coupe terminé par 3 dents inférieures de même longueur ou plus court que le tube et 2 dents supérieurs plus courtes. 5 pétales organisés en formant un étendard supérieur, 2 ailes latéraux et les deux le plus bas soudé en formant la carène. Etendard de 12-16x14-16mm, arrondi au sommet finement pubescent; ailes plus longues que les carènes, tous glabres, carène recourbé. 10 étamines, les filets 9 d’entre elles soudés sur plus de la moitié de leur longueur en une couronne staminale, la 10e libre à la base, anthère dorsifixe à déhiscence longitudinale. Ovaire supère, sessile, aplati, constitué d’une loge contenant 2 ovules, terminé par un style long et grêle fortement recourbé à l’apex, stigmate ponctué.

Le fruit est une gousse obovée à oblongue, aplati, 50-105x15-25mm, effilé à la base, sommet recourbé, couvert de poils velouté jaunâtre ou roux ; 1 à 2 graines aplaties, rectangulaire à elliptique, marron foncé.

 Ethnobotanique.

Le bois est utilisé localement pour la fabrication de meubles, de poteaux dans les bâtiments, d’ustensile et de manches d’outils.

Aucune utilisation en médecine traditionnelle n’a été enregistrée pour le Millettia richardiana.

Figure 1 : Planche de Millettia richardiana.

Figure 2 : Photo de Millettia richardiana.

I.2 Travaux chimiques antérieurs.

Toutes les parties des nombreuses espèces du genre Millettia ont fait l’objet d’études chimiques. Les chimistes ont ainsi isolé des molécules provenant des feuilles, des graines, des écorces de tige, des branches, des écorces de la racine des espèces de ce genre. Ces molécules ainsi isolées appartiennent aux grandes familles des alcaloïdes, des coumarines, des flavonoïdes, des terpènes et stéroïdes.

Parmi ces molécules, les isoflavonoïdes sont de loin les plus nombreux.

Quelques exemples de ces molécules sont répertoriés dans le tableau I.

Tableau I : Molécules isolés dans différentes parties des Millettia.

Partie Espèce Famille chimique Molécules Réf. Feuilles M. brandisiana Flavonoïdes Brandisianin A [44] M. pachycarpa Millewanin G [35] M. pulchra (-)-Sophoranone [7] M. ichthyochtona Jamaicin [41] M. versicolor Stéroïde Stigmastérol [66] Graines M. griffoniana Flavonoïdes Griffonianone E [37] M. pachycarpa Pomiferin [84] M. dura Milletone [107] M. laurentii Alcaloïde Mullaurine A [61, 62] M. thonningii Coumarine Acide robustique [70] Cosse des graines M. dura Flavonoïde Durallone [108] Cœur du bois M. pendula Flavonoïde Millettilone [91] Racines M. pachycarpa Flavonoïde Rotenone [83] Ecorce des M. griffoniana Coumarines 3-phénylcoumarine [60, 103] racines M. pervilleana Pervilleanine [67] racines Tiges M. nitida var h. Flavonoïdes Hirsutissimiside A [15] M. racemosa 3R(+)-millinol [46] Ecorce des tiges M. erythocalyx Flavonoïdes Millettocalyxine A [86] M. leucantha Karanjin [71] M. usaramensis Barbigerone [106] M. conraui Terpène β-amyrine [93, 28] Branches M. duchesnei Flavonoïde Elliptol [63] Caulis M. speciosa Phénolique Millettiaspecoside [110] A

Les structures de ces composés sont représentées dans les figures 3 et 4.

Figure 3 : Structure des coumarines, d’alcaloïde, de triterpène, de stéroïde et des flavonoïdes des espèces du genre Millettia.

Figure 4 : Structure des isoflavonoïdes isolés des espèces du genre Millettia.

I.3 Travaux biologiques antérieurs.

Les résultats d’études biologiques effectuées sur certaines espèces du genre Millettia ont montré diverses propriétés biologiques intéressantes.

Quelques exemples de ces résultats sont répertoriés dans le tableau II. Et la structure des molécules responsables des ces activités sont répertoriés dans la figure 5.

Tableau II : activités biologiques du genre Millettia.

Espèce Activités Extraits/composés actifs Références Millettia brandisiana Anticancereuse Brandisiana D (isoflavone) [44]

Millettia griffoniana Anti- Griffonianone D, E [60, 105] inflammatoire, (isoflavone) Antiparasite Millettia taiwaniana Antitumeure Auriculasine (isoflavone) [37] Millettia pervilleana Anticancereuse Pervilleanone (isoflavanone) [67]

Millettia pachycarpa Antioestrogénique Acétonique [35]

Millettia thonningii Larvicide, Aqueuse, Chloroformique [23, 69, 70] Molluscicide Millettia conraui Inhibiteur de α- 7-O-geranyl-6-methoxy- [93] gliucosidase pseudobaptigenine (isoflavone) Millettia dura Larvicide Chloroformique/ Degueline [107] (rotenone) Millettia pendula leishmanicidal Pendulone (isoflavane) [91]

Millettia leucantha Cytotoxique 2’,4’-dimethoxy-3,4- [71] methylenedioxychalcone

anti-HSV Dihydromilletenone methyl ether (chalcone)

Desmethoxykanudin (flavone) anti-imflammatoire

Millettia usaramensis antiplasmodial Diclorométhanique [106]

Millettia racemosa Insecticide 3R(+)-millinol (isoflavane) [46]

Figure 5 : Structure des molécules actives des espèces du genre Millettia.

I.4 Familles chimiques.

I.4.1 Les lipides. [12]

I.4.1.1 Définition.

Les lipides, appelés corps gras, sont des substances naturelles insoluble dans l’eau, mais soluble dans les solvants organiques. Les cellules vivantes produisent un grand nombre de ces composés, dont la plupart contiennent des acides gras ou des dérivés d’acides gras.

On distingue deux types de lipides (N. E. Velosaotsy, 2005) :

 les lipides simples : ces sont des esters d’acides gras et d’un glycérol pour former le triglycéride ou d’un alcool aliphatique de masse moléculaire élevée dans le cas des cérides. Les acides gras peuvent être saturés ou insaturés selon la figure 6.

Figure 6 : structure d’un triacylglycérol, le palmitoylstéaryloleylglycérol.

 les lipides complexes : ils sont constitués par des lipides simples liés à des molécules de sucre, d’acides aminés ou des groupements contenant du phosphore ou du soufre selon la figure 7.

Figure 7 : structures d’un phosphoglycéride, le palmitoyloleylphosphatidylcholine.

I.4.1.2 Biogénèse des acides gras. [111]

La biogénèse des acides gras se déroule dans le cytosol jusqu’au niveau de l’acide palmitique. Elle est faite en trois étapes à partir de l’acétyl-CoA selon le schéma 1.

 Activation.

C’est la carboxylation de l’acétyl-CoA en malonyl-CoA.

 Elongation.

L’augmentation de la chaîne des acides gras est faite, en premier lieu, par une séquence récurrente de quatre réactions, à savoir la condensation, la réduction par le NADPH, la déshydratation et la réduction par le NADPH. Le deuxième cycle et les suivants permettent l’allongement de la chaîne par la condensation de butyryl-ACP avec une molécule de malonyl-ACP.

 Terminaison.

Après quelques cycles d’élongation, on aboutit à la formation de l’acide gras-enzyme. L’action d’une thioestérase permet la libération de l’acide gras à C ≤ 16.

Schéma 1 : Biogénèse des acides gras.

Ce cycle se poursuit jusqu’au niveau du palmitol-ACP. L’élongation ultérieure est faite à l’intérieur des mitochondries et des chromosomes par un cycle analogue au cycle d’élongation du cytosol.

I.4.1.3 Biogénèse des triglycérides. [111]

Elle a lieu dans le réticulum endoplasmique. Les précurseurs des lipides sont l’acétyl- CoA et le L-glycérol qui provient de la réduction de la 3-phosphodihydroxyacétone. La biogénèse comprend trois étapes selon le schéma 2 : formation de l’acide phosphatidique, déphosphorylation de ce dernier en diglycéride et estérification de la dernière fonction alcool du glycérol.

Schéma 2 : Biogénèse des triglycérides.

I.4.2 Les coumarines.

I.4.2.1 Définition. [12]

Les coumarines tirent leur nom de « coumarou », nom vernaculaire sud américain de Dipteryx odorata ou fève tonka (Dipteryx odorata Willd., Fabaceae) d’où fut isolée en 1820 la première coumarine (figure 8) [57].

Figure 8 : Structure de coumarine.

Les coumarines ont été retrouvées à l’état libre ou sous forme de glucoside de l’acide mélilotique (hydroxycoumarine), chez divers végétaux (Flouve odorante, Aspérule odorante, Mélilot) auxquels elles communiquent leur odeur agréable. Dans le mélilot pourri a été isolé le dicoumarol (figure 9) qui a des propriétés anti-vitaminique K (anticoagulant).

Figure 9 : Structure de dicoumarol.

La plupart des coumarines sont substituées par un groupement hydroxyle en C-7, comme l’ombelliférone (figure 10) qui est isolé des produits de distillation des résines d’ombellifères.

Figure 10 : Structure d’ombelliférone.

Les coumarines ont un spectre UV caractéristique, fortement influencé par la nature et la position des substituants, profondement modifié en milieu alcalin (KOH, NaOCH3). Examinées en lumière UV, les CCM de drogues à coumarines présentent des taches dont la

19 coloration, exaltée en présence de l’hydroxyde d’ammoniaque, varie du bleu au jaune et au pourpe.

Du point de vue structural, on distingue quatre grandes classes de coumarines :

- les coumarines simples (coumarine).

- les dimères de coumarines (dicoumarol).

- les furocoumarines (figure 11) linéaires (psoralène) ou angulaires (angélicine).

- les pyranocoumarines (figure 12) linéaires (xanthylétine) ou angulaire (seseline).

Figure 11 : Structure de psoralène et d’angélicine.

Figure 12 : Structure de xanthylétine et de seseline.

Parmi les classes de coumarines citées ci-dessous, nous nous intéressons plus particulièrement à celle des pyranocoumarines linéaires.

I.4.2.2 Biosynthèse des pyranocoumarines linéaires. [10]

Comme toutes les coumarines, les pyranocoumarines sont bio synthétisées via phénylpropanoide. Les pyranocoumarines linéaires ont un noyau de base du xanthylétine dont

20 le précurseur est constitué de l’ombelliférone. En effet, la prénylation du noyau benzénique en 6 d’un ombélliférone est à l’origine des pyranocoumarines linéaires.

Schéma 3. Biosynthèse des pyranocoumarines linéaires.

I.4.3 Les Triterpènes.

I.4.3.1 Définition. [12]

Les terpènes sont les métabolites secondaires largement répandus dans le règne végétal. Leur particularité structurale la plus importante est la présence dans leur squelette d’une unité isoprénique à 5 atomes de carbone (C5H8) reconnue par WALLACH des 1887. RUZICKA (1953) a transformé cette hypothèse en une règle, chaque groupe de terpènes est issu de la condensation tête-à-queue d’un nombre variable d’unités isopréniques : 2-méthylbuta-1,4-diène. Les triterpènes sont des composés à 6 unités d’isoprènes.

I.4.3.2 Biogénèse de Triterpènes. [17]

Le 2,3-époxydo-squalène est le précurseur biologique de la plupart des triterpènoides. Sous l’action d’une enzyme de surface, il se présente sous forme de 2 conformations stables : la conformation chaise-bateau-chaise-bateau et la conformation chaise-chaise-chaise-bateau. Sa cyclisation en milieu acide fait suite à l’ouverture du noyau époxyde conduisant à des composés polycycliques différents.

La cyclisation de la conformation chaise-bateau-chaise-bateau conduit à un carbocation donnant la formation des triterpènes tétracycliques et des stéroïdes. Quant à la conformation chaise-chaise-chaise-bateau, un carbocation dammarne est formé et une cyclisation supplémentaire conduit à des triterpènes pentacycliques tel que le lupéol et le β- amyrine, selon le schéma 4.

Schéma 4 : Biogénèse des triterpènes pentacycliques.

I.5 Détermination de structure.

I.5.1 La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). [31, 33, 82]

La RMN est une méthode courante dans la détermination de structure des molécules organiques en particulier. Elle est basée sur les propriétés mécanique et magnétique du noyau ayant un spin non nul, dans un champ magnétique et sous l’action de la radiofréquence. Plusieurs noyaux ont un nombre de spin I de ½ et une distribution de charge sphérique uniforme.

Parmi eux, ceux que l’on utilise le plus en spectroscopie RMN sont le 1H et le 13C. Dans le champ magnétique, il y a dégénérescence des niveaux d’énergie, c'est-à-dire, orientation par rapport à la direction du champ, parallèle ou antiparallèle du spin. Sous l’action de la radiofréquence, des noyaux peuvent passer d’un niveau d’énergie vers un autre niveau plus élevé par absorption de photon hν.

On peut classer la RMN en deux catégories : la RMN classique à une dimension (RMN 1D) et la RMN à deux dimensions (RMN 2D).

La RMN monodimensionnelle est obtenue par la succession des séquences de préparation, d’impulsion et d’acquisition.

La RMN bidimensionnelle est obtenue par introduction de temps d’impulsion et de période d’évolution dans les séquences précédentes. Il existe plusieurs expériences 2D mais quatre sont couramment utilisées dans les analyses de détermination structurales des produits naturels, à savoir les COSY (COrrelation SpectroscopY), HMQC (Heteronuclear Multiple- Quantum Coherence), HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Coherence) et NOESY (NOE SpectroscopY).

Chaque spectre nous donne des informations spécifiques sur le squelette, sur les fonctions et leurs positions, sur la stéréochimie, sur le nombre d’hydrogènes ou de carbones. La comparaison de ces informations avec d’autres données spectrales de molécules proches nous permet de déterminer la structure de la molécule.

I.5.1.1 RMN à 1-D.

 Spectre RMN du proton.

Le spectre RMN-1H permet d’attribuer à chaque signal le déplacement chimique δ des sites protonés. Elle donne une idée sur la nature de ces sites en fonction de la zone d’apparition de leurs déplacements chimiques (0,5 <  < 13 ppm). La courbe d’intégration tracée au-dessus de chaque signal permet de connaître le nombre d’hydrogènes correspondant (par calcul d’aires).

Si le pic est bien distinct, sa multiplicité donne des informations sur le nombre de protons qui lui sont voisins. D’autre part, la valeur des constantes de couplage « J » permet de déterminer la position des protons les uns par rapport aux autres.

 Spectre RMN du carbone.

La RMN du 13C découplé 1H (BB : large bande) est un spectre ne comportant que des singulets sous forme de pics très fins correspondant chacun à un carbone de la molécule. Ainsi, le nombre total des pics équivaut au nombre total de carbones constituant le composé, sauf si elle présente une symétrie.

Certaines valeurs de  en ppm sont caractéristiques de quelques groupements fonctionnels. Par exemple, les groupements méthyles sortent vers 10-20 ppm ; les carbonyles entre  150 ppm et  215 ppm.

Le spectre 13C - J modulé enregistré dans deux phases inverses, met dans deux côtés opposés, les carbones à nombre pair de protons (quaternaires et les méthylènes d’une part) et ceux à nombre impair de protons (méthynes et méthyles d’autre part).

I.5.1.2 RMN à 2-D.

 Le spectre HMQC montre les corrélations, selon la figure 13, entre protons et carbones qui les portent. Il comporte deux échelles de  ppm : l’un montrant le spectre 1H (axe horizontal), l’autre rapporte le spectre 13C. Les taches de corrélations permettent de déduire le nombre de carbones protonés et d’attribuer les protons correspondant à chaque carbone. Ainsi, les protons géminés non équivalents sont mis en évidence très facilement (Deux protons pour une seule valeur de carbone).

Figure 13 : Corrélation entre proton et carbone porteur.

 La technique de COSY repose sur les couplages 1H-1H. Il s’agit également d’un spectre à deux dimensions dont les axes sont constitués par le spectre 1H. Les couplages détectables ne s’étendent qu’à travers deux liaisons (protons géminés) et trois liaisons (protons vicinaux) selon la figure 14. Par conséquent, les sites protonés voisins sont facilement repérés.

Figure 14 : Protons géminés et vicinaux.

 Le spectre HMBC est obtenu de la même manière que le spectre HMQC. Ils se différencient seulement par la nature des noyaux considérés. Dans ce cas, on tient compte des corrélations, selon la figure 15, entre 1H et carbones voisins qui lui sont distants de deux à trois liaisons. Lorsque des transferts d’électrons ou des délocalisations d’électrons seraient possibles, la corrélation entre 1H et 13C peut s’étendre jusqu’à quatre.

Figure 15. Corrélations entre protons et carbones voisins.

Les informations recueillies en exploitant ce spectre aboutissent petit à petit aux enchaînements de chaque groupement jusqu’à édification complète de la structure.

1.5.1.3 Applications.

 Détermination de structure des acides gras. [56, 73]

L’analyse du spectre RMN 1H permet d’identifier le type d’un composé lipidique.

Ainsi, un triacylglycérol est caractérisé par la présence d’un massif à environ 5.25 ppm attribué au proton du site β et de deux doublets dédoublés entre 4.10 et 4.40 ppm

25 assignés aux protons géminés des sites α et α’ selon le spectre RMN 1H de tristéarylglycérol présenté dans la figure 16 [49,92].

Figure 16 : Spectre RMN 1H de tristéarylglycérol.

Le type des acides gras du triacylgycérols peut être déterminé par l’interprétation des intensités des signaux entre 0.8 et 3.0 ppm. Cette méthode consiste à déterminer les taux relatifs en AGPI (acide gras polyinsaturé), en AGMI (acide gras mono insaturé) et en AGS (acide gras saturé) contenu dans le composé à étudier.

On peut également utiliser cette méthode pour identifier la composition d’un mélange des acides gras libre.

La figure 17 montre le spectre de RMN-1H de l’huile d’olive vierge [78]. Le spectre montre un massif intense centré à 5.4 ppm attribué aux protons éthyléniques, un autre massif centré à 5.27 ppm assigné au proton du site β d’un triglycéride, deux doublets dédoublés entre 4.10 et 4.40 ppm caractéristiques des protons géminés des sites α et α’ d’un triglycéride, six signaux entre 0.8 et 2.90 ppm.

Figure 17 : Spectre de RMN-1H de l’huile d’olive vierge.

Les déplacements chimiques des signaux du spectre de proton de l’huile d’olive vierge et leur attribution sont présentés dans le tableau III.

Tableau III : Attribution des signaux du spectre de proton de l’huile d’olive vierge.

Pic δ en ppm Attribution Proton Composé 2 5.39 CH=CH Acides gras insaturés 3 5.28 CH-O-COR Triacylglycérol

4 4.10 - 4.40 CH2-O-COR Triacylglycérol

5 A 2.79 C=C-CH2-C=C Linoléyl, linolényl

6 B 2.31 CH2-COOR Chaînes alkyl

7 C 2.02 CH2-C=C Acides gras insaturés

8 D 1.65 CH2-C-COOR Chaînes alkyl

9 1.3 (CH2)n Chaînes alkyl

10 E 0.95 C=C-C-CH3 Linolényl

11 F 0.85 C-C-C-CH3 Tous les acides gras sauf le linolényl

La nomenclature utilisée pour déterminer les teneurs des acides gras est la nomenclature des physiologistes et des nutritionnistes de type "n-x", où n est le nombre d’atomes de carbone de l’acide gras et x est le nombre d’atomes de carbone entre la première double liaison rencontrée en partant du méthyle terminale et ce dernier . Ainsi, (n-6) et (n-3) indiquent respectivement que la première double liaison de l’acide linoléique et de l’acide linolénique en partant du méthyle terminale se trouve au carbone 6 et 3 [12, 113]. En se basant sur l’intensité (mesurée par la courbe d’intégration ou par la surface occupée par le signal) du signal (F) des méthyles à 0.85 ppm, la somme des teneurs en AGS, en AGMI et (n-6) linoléique peut être déterminée relativement à celle du (n-3) linolénique mesurée sur la base du signal caractéristique de son méthyle (E) à 0.95 ppm.

(n-3) linolénique est proportionnel à la teneur du méthyle du linolenyl et à celle des méthyles des AG totaux :

(n-3) linolénique = E/(E+F) (1)

La teneur en AG autres que linolénique est alors :

AGS + AGMI + (n-6) linolénique = F/(E+F) (2)

Le taux relatif en AGMI et en acide linoléique peut être déterminé en se référant au signal des protons allyliques à 1.98 ppm (C) et au signal des deux protons portés par le carbone n°2 de toutes les chaînes grasses observé vers 2.23 ppm (B) :

AGMI + (n -3) linolénique + (n-6) linoléique = C/2B (3)

AGMI + (n-6) linoléique = (C/2B) – [E/(E+F)] (4)

En outre, la teneur en (n-6) linoléique peut être déterminée en soustrayant des protons diallyliques à 2.72 ppm (A) la teneur relative en (n-3) linolénique calculé selon (1) :

(n-6) linoléique = 2A – [E/2(E+F)] (5)

D’où : AGMI = {(C/2B) – [E/2(E+F)]} – {2A – [E/2(E+F)]} (6)

A partir de l’équation (2), on obtient :

AGS = [F/(E+F)] – [C/2B] – [E/(E+F)]

Ensuite, par interprétation concertée des spectres de RMN de 13C, 1H et 2D, une détermination de structure peut être possible.

 Détermination de structure des triterpènes. [74]

Par suite des réactions de cyclisation de leur précurseur commun "le squalène", les triterpènes et les stéroïdes ont des groupements méthyles angulaires ou non angulaires comme dans la chaîne latérale des stéroïdes, des groupements méthylènes et méthynes. Les nombres des groupements méthyles peuvent être un diagnostic pour l’élaboration du squelette de base. L’on peut même les distinguer en spectre RMN.

Les triterpènes du type oléanane, exemple oléa-12-ène selon la figure 17, possèdent 8 groupements méthyles dont 4 angulaires et 4 non angulaires, 9 groupements méthylènes et 6 groupements méthynes.

Figure 18 : Triterpène du type oléanane (oléa-12-ène).

Les triterpènes du type ursane, exemple le lupéol suivant la figure 18, possèdent 7 groupements méthyles dont 4angulaires et 3 non angulaires, 10 groupements méthylènes et 6 groupements méthynes.

Par considération des groupements méthyles même à champ élevé (400 MHz), un composé stéroidique ou triterpénique a un spectre de RMN du proton très complexe dans lequel la plupart des protons présentent des signaux qui se superposent : enveloppe des méthylènes, empêchant ainsi une analyse détaillée du spectre.

Figure 19 : Triterpène type lupéol.

L’attribution des déplacements chimiques du carbone sur le spectre RMN 13C s’effectue par comparaison avec les valeurs usuelles. Toutefois l’utilisation des spectres RMN bidimensionnelle rend facile l’attribution des déplacements chimiques et l’élucidation d’une structure des stéroides ou des triterpènoides. En particulier, dans le spectre de corrélation 1H- 13C HMBC, les protons d’un groupement méthyle présentent des taches de corrélations caractéristiques : grosse tache par rapport aux autres taches de corrélation avec les carbones en position α ou β de ce groupement.

En général, les protons d’un groupement méthyle d’un triterpène ont 4 carbones de corrélations caractéristiques.

Si les protons d’un groupement méthyle ont 3 carbones de corrélation, le groupement méthyle peut être en α d’un carbone éthylénique (déplacement chimique élevé) ou d’un groupement méthyle non angulaire ou le carbone en α du groupement méthyle est lié à un hétéroatome (δ élevé).

Deux groupements méthyles sont géminés si les protons de chaque méthyle ont 3 carbones de corrélation communs. Le 4ème carbone de corrélation non commun des protons de chaque méthyle est le carbone porteur des protons de l’autre groupement et vice versa.

Deux groupements méthyles sont vicinaux si les protons de chaque groupement méthyle ont 2 carbones de corrélation identiques.

Ensuite, par considération des séquences obtenues ci-décrites et par interprétation concertée des spectres de RMN de 13C, 1H et 2D, une détermination de structure peut être possible.

 Détermination de structure des pyranocoumarines. [89, 95]

Les 3-arylpyranocoumarines, selon la figure 19, peuvent être identifié par leurs signaux caractéristiques sur le spectre RMN 1H :

 un singulet à environ 7.50 ppm attribué au proton H-4,

 deux doublets (J = 10 Hz) à environ 5.5 et 6.5 ppm correspondant aux protons H-3’ et H-4’, et un singulet à environ 1.50 ppm attribué aux protons géminés H-5’,

 des signaux entre 7 et 7.5 ppm assignés aux protons aromatiques H-2" à H-6".

Figure 20 : 3-arylpyranocoumarine linéaire et angulaire.

Une substitution d’un groupement C-prényl est indiquée par l’existence d’un triplet à

δH 5.25 ppm (1H, J = 7 Hz), d’un doublet à δH 3.39 ppm (2H, J = 6.8 Hz) et de deux singulets

à δH 1.63 ppm et 1.76 ppm (3H chacun).

Par ailleurs, une substitution d‘un groupement méthoxyle est signalée par la présence d’un singulet à environ 3.90 ppm.

Le spectre RMN 13C, pour sa part, permet de confirmer la structure des 3- arylpyranocoumarines par leurs signaux caractéristiques fortement déblindés dûs au

32 groupement carbonylé (C=O), aux carbones hydroxylés (C-O), aux carbones aromatiques et aux carbones éthyléniques.

La différence entre les pyranocoumarines linéaires et les pyranocoumarines angulaires n’est observée que sur le spectre HMBC.

Et enfin, par considération de toutes ces informations et par interprétation concertée des spectres de RMN de 13C, 1H et 2D, une détermination de structure peut être possible.

I.5.2 Spectrométrie de Masse. [33, 82]

La spectrométrie de masse est une méthode physico-chimique complémentaire à la spectroscopie RMN dans la détermination structurale des composés organiques. Elle repose sur l’ionisation et la fragmentation des molécules. Par conséquent, elle permet d’accéder à la masse moléculaire d’une substance et apporte des informations structurales.

La spectrométrie de masse peut être mise à profit, en couplant avec une chromatographie, pour caractériser rapidement sans séparation chimique les éléments d’un mélange de composés naturels pour savoir s’ils sont connus ou non. Elle permet alors de savoir la pureté d’un produit sur le chromatogramme développé. Pour cela, on fait précéder le spectromètre de masse par un analyseur chromatographique de gaz (GC-SM) ou de liquide (LC-SM).

Pour le couplage GC-SM, la méthode d’ionisation utilisée est l’impact électronique (EI). Il permet d’analyser les composés volatils ou volatilisables par élévation de la température.

Pour le couplage LC-SM, nous avons utilisé la méthode d’ionisation par éléctrospray (ESI). Quant à lui, on l’utilise pour analyser les composés non volatils, polaires et thermolabiles.

I.6 Activités biologiques.

Les activités biologiques ont porté sur l’étude de l’activité antiparasitaire, antifongique et de la cytotoxicité des extraits méthanoliques de l’écorce des tiges de Millettia richardiana.

I.6.1 Activité antiparasitaire.

L’étude a été faite sur l’activité antipaludique, antitrypanosomiase et antileishmaniose.

I.6.1.1 Activité antipaludique. [99]

Les antipaludiques sont largement utilisés pour lutter contre le paludisme, le chef de file restant la chloroquine (Nivaquine).

Le paludisme (du latin paludis, « marais »), aussi appelé malaria (de l'italien mal'aria, mauvais air »), est une parasitose due à un hématozoaire du genre Plasmodium, transmise à l’homme par la piqûre des moustiques du genre Anophèles au moment de son repas sanguin.

Chaque année, plusieurs centaines de millions d’accès palustres surviennent à travers le monde, entraînant la mort de un et trois millions de personne. Le paludisme demeure la parasitose la plus importante et concerne environ 40% de la population des pays les plus pauvres du monde (J. Breman, 2001).

Cinq espèces de Plasmodium sont retrouvées en pathologie humaine : Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium falciparum et Plasmodium knowlesi. Le Plasmodium falciparum est le plus largement répandu à travers le monde, et est responsable des formes cliniques mortelles (K. Mendis et coll., 2001).

I.6.1.2 Activité antitrypanosomiase. [101]

Les trypanosomiases (appelée encore trypanosomose) est une maladie parasitaire endémique touchant de nombreux pays de l’Afrique subsaharienne, dues aux parasites du genre Trypanosome et transmise à l’homme par un arthropode vecteur hématophage : la glossine ou mouche tsé-tsé.

On a répertorié une vingtaine d’espèces de Trypanosoma parmi lesquelles le Trypanosoma brucei comportant trois sous espèces: T. b. brucei, T. b. gambiense et T. b. rhodosiense.

Le Trypanosome brucei brucei n’infecte que les animaux. Cependant, il est utilisé comme un modèle pour les infections humaines dans le laboratoire et les études des animaux. [72, 94]

L’Organisation Mondiale de la Santé estime que 55 millions de personnes vivent dans des régions rurales exposées aux mouches tsé-tsé. Chaque année, 250 000 à 300 000 personnes sont touchées par la trypanosomiase africaine. En l’absence de soins, la mort s’avère inéluctable. [100, 39]

I.6.1.3 Activités antileishmanioses. [20]

Les leishmanioses sont des parasitoses dont l’agent pathogène est un protozoaire flagellé du genre Leishmania. Il s’agit d’une zoonose transmise à l'Homme par un moucheron hématophage, le phlébotome. Les leishmanioses incluent des formes viscérales, des formes cutanées localisées ou diffuse et de forme cutanéomuqueuses (E. Handman, 2001).

Parmi les vingtaines espèces du genre Leishmania distribuées le long des régions tropicales et subtropicales sur 88 pays de quatre continents, le Leishmania donovani touche particulièrement l’Inde et l’Est de l’Afrique et est un agent de la leishmaniose viscérale (WHO, 2000).

Selon les données statistiques de l’Organisation Mondiale de la Santé, dans les régions endémiques 350 millions d’individus sont exposés au risque de la maladie, 12 millions de personnes sont atteintes. Chaque année, le nombre de nouveaux cas est estimé entre 1,5 à 2 millions. Les formes cutanées de cette maladie atteignent environ 1 à 1,5 millions de personnes chaque année et la forme viscérale 0,5 millions d’individus (WHO, 2002).

I.6.2 Activités antifongique. [66, 114]

Les antifongiques, appelés également fongicides sont utilisés pour lutter contre les infections locales ou profondes aux champignons microscopiques.

Les champignons microscopiques sont responsables également des infections appelées mycoses qui siègent avec prédilection au niveau de la peau, des cheveux et des ongles.

L’étude des activités fongiques a été réalisée sur des champignons du genre Candida : Candida albicans, de Candida glabrata, de Candida parapsilosis.

Selon les statistiques et les études menées dans le monde entier, l'infection chronique par Candida frappe entre 70% et 80% de la population mondiale. Dans les derniers 15-20 ans on a pu observer une remarquable augmentation de beaucoup de pathologies psychosomatiques, et de plus en plus de manifestations de l'infection par Candida.

I.6.3 Cytotoxicités. [113]

La cytotoxicité est la propriété qu'a un agent chimique ou biologique d'altérer des cellules, éventuellement jusqu'à les détruire.

Le test de cytotoxicité permet de vérifier que la plante agit seulement sur les cellules parasitaires et ne présente pas d’activité toxique pour les cellules saines.

Ce test a été réalisé sur des cellules cancéreuses KB (Human epidermoid carcinoma), Vero (African green monkey kidney) et MRC5 (Normal Human Fetal Lung Fibroblast).

CHAPITRE II MATERIELS ET METHODES

II.1 Matériels.

II.1.1 Matériel végétal.

Millettia richardiana Baill. a été récolté par Stéphane RAKOTONANDRASANA et Andriamalala RAKOTONDRAFARA en juin 2008 à Sahafary district rural d’Andrafiabe dans la région de Diana dans la province d’Antsiranana.

Les écorces de tiges de la plante ont été séchées dans un séchoir à la température de 40°C puis réduites en poudre par broyage mécanique.

II.1.2 Matériel technique.

Des ampoules à décanter munies de robinet à la partie inférieure ont été utilisées pour l’extraction par partage liquide-liquide.

Des tubes de verre cylindrique munis de robinet à la partie inférieure ont été utilisés pour la chromatographie sur colonne à moyenne pression.

Des colonnes plastiques près à employer ont été utilisées sur un appareil de flash chromatography SpotII Ultimate (Interchim) (figure 21) pour la chromatographie sur colonne à basse pression.

Les chromatographies sur couche mince (CCM) ont été effectuées sur des plaques de silice sur support feuille aluminium ou verre préfabriquées en gel de silice 60F254 d’épaisseur 0.2mm.

Les chromatogrammes ont été visionnés sous la lampe de WOOD type CAUTION aux longueurs d’onde λ=254nm et λ=365nm.

Les points de fusion ont été mesurés dans des tubes capillaires sur un appareil électrothermique Büchi B-540.

Les spectres de masse ont été enregistrés sur le spectrophotomètre Agilent 5975 pour le mode d’ionisation Impact électronique et sur Waters 2995/2996-Micromass Q-Tof micro (figure 22) pour l’électrospray.

Figure 21 : appareil de flash chromatography SpotII Ultimate

Figure 22 : Spectrophotomètre de masse.

Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) ont été enregistrés avec un appareil Avance AC400 BRÜKER (figure 23) en utilisant le deuteriochloroforme ou le pyridinne deuterié comme solvant et comme référence le tétraméthylsilane.

Figure 23 : Spectrophotomètre de RMN Avance AC400 BRÜKER

II.2 Méthodes.

II.2.1 Extraction.

Les méthodes d’extraction permettent de transférer un ou plusieurs solutés contenus dans une phase solide ou liquide, vers une autre phase liquide non miscible au premier milieu, ou solide.

Le phénomène ou les procédés d’extraction varient selon les méthodes utilisés mais elles sont basées sur la règle de similitude, c'est-à-dire les solutés sont dissous dans le solvant quand ils présentent une analogie structurale (affinité).

On rencontre dans la littérature plusieurs méthodes utilisées pour extraire les principes actifs d’une plante : la macération, l’extraction liquide-liquide, l’extraction à soxhlet et l’extraction à reflux.

Dans notre travail, nous avons utilisé, d’une part, la macération suivie des extractions par partage liquide-liquide successives et, d’autre part, l’extraction à reflux pour l’extraction à chaud.

II.2.1.1 La macération.

Elle consiste à maintenir des broyats du matériel végétal en contact prolongé avec un solvant. C’est une extraction qui se fait à température ambiante. De plus, la macération permet d’effectuer l’extraction jusqu’à épuisement des substances naturelles si la durée d’extraction est élevée.

1000g de poudre d’écorce des tiges de Millettia richardiana ont été macérées dans le méthanol, à température ambiante pendant 48 heures. Après filtration, le marc est de nouveau macéré dans le méthanol comme précédemment. Cette opération a été répétée 3 fois. Les solutions méthanoliques réunies ont été évaporées sous pression réduite pour constituer l’extrait brut méthanolique E1.

II.2.1.2 L’extraction par partage liquide-liquide.

Elle est basée sur la différence de solubilité des solutés à séparer dans deux phases liquides non miscible. En général, on utilise une phase aqueuse et une phase organique. Elle peut être mise à profit pour fractionner en différentes polarités un extrait. Comme la macération, elle permet aussi d’effectuer l’extraction jusqu’à épuisement des substances naturelles si la répétition de l’extraction est élevée.

Une partie de l’extrait méthanolique obtenu est dissoute dans de l’eau distillée chaude. Après refroidissement, la solution aqueuse a été extraite successivement au dichlorométhane, à l’acétate d’éthyle et au n-butanol. Quelques grammes de l’extrait butanolique obtenu ont ensuite subi une précipitation dans l’ether après les avoir solubilisé dans le méthanol. L’évaporation sous vide des solvants organiques et aqueux nous a permis d’obtenir un extrait dichlorométhanique E2, un extrait à l’acétate d’éthyle E3, un extrait butanolique E4 et un extrait aqueux E5. L’extrait E4A est obtenu par précipitation de l’extrait butanolique et l’extrait E4B est l’extrait butanolique épuisé par précipitation.

Le protocole d’extraction par partage liquide-liquide de Millettia richardiana est représenté par le diagramme n°1.

Ecorce des tiges séchées broyées Macération à froid pendant 3x48 heures avec de MeOH à 20% (p/v) Filtration Concentration

Extrait méthanoique E1 - Solubilisation dans l’eau distillée chaude à 50°C - Extraction avec du dichlorométhane

Phase aqueuse Extrait dichlorométhanique E2 Extraction avec de l’acétate d’éthyle

Extrait de l’acétate Phase aqueuse

d’éthyle E3 Extraction avec du n-butanol

Phase aqueuse Extrait butanolique E4 Lyophilisation - Solubilisation dans MeOH

- Précipitation dans Et2O

Extrait aqueux E5

E4A E4B Diagramme 1. Protocole d’obtention des différents extraits d’écorce des tiges de Millettia richardiana. .

II.2.1.3 L’extraction à reflux.

L’extraction à reflux ou décoction est une méthode traditionnelle de la préparation des plantes médicinales. Elle consiste à faire bouillir des broyats dans l’eau distillée.

150g de poudre d’écorce des tiges de Millettia richardiana ont été traitée à reflux dans l’eau distillée pendant 10 min. Après repos 4h, la solution aqueuse ainsi obtenue a été filtrée puis lyophilisée pour avoir l’extrait aqueux E6.

Le protocole d’extraction traditionnelle de Millettia richardiana est résumé dans le diagramme 2.

Ecorce des tiges séchées broyées Addition d’eau distillée de proportion 10% A reflux pendant 10 min Repos 4 heures Filtration Lyophilisation

Extrait aqueux lyophilisé E6 Diagramme 2. Protocole d’obtention de l’extrait aqueux lyophilisé E6 d’écorce des tiges de Millettia richardiana.

II.2.2 Criblage phytochimique. [26]

Des réactions chimiques permettent de détecter les différentes familles des composés présents dans la drogue végétale. Elles sont basées sur la formation des complexes insolubles ou colorés.

II.2.2.1 Criblage des alcaloïdes.

Le test de Mayer est utilisé pour détecter la présence des alcaloïdes. L’addition de quelques gouttes du réactif de Mayer (HgCl2 à 10% + I2/IK) dans une solution d’acide chlorhydrique du produit fait apparaitre des précipités blancs indiquant la présence des alcaloïdes.

II.2.2.2 Criblage des coumarines.

En milieu alcalin (NH4OH 10%), elles donnent une fluorescence jaune ou vert ou bleu en lumière UV 365 nm.

II.2.2.3 Criblage des flavonoïdes.

Ils sont décelés par la réaction de Wilstater. C’est une réaction de réduction mettant en jeu le métal Mg et l’acide chlorhydrique concentré et conduisant à des anthocyanidines qui donnent une coloration rouge.

II.2.2.4 Criblage des triterpènoïdes.

Le test de Liebermann Burchard est utilisé pour mettre en évidence la présence des tritepènoides dans un extrait. L’addition de quelques gouttes d’anhydride acétique et d’acide sulfurique concentré dans une solution chloroformique de l’extrait donne une coloration poupre indiquant la présence des triterpènes.

II.2.2.5 Criblage des saponines.

Les saponines ont des propriétés tensio-actives. Ils dissolvent dans l’eau en formant des solutions moussantes.

II.2.3 Activités biologiques.

II.2.3.1 Activité antiparasitaire. [21, 60]

L’activité des extraits à étudier sur le parasite est généralement évaluée sur la base de -1 la concentration inhibitrice 50 (CI50), c'est à dire la concentration en µg.ml d’extrait de plante provoquant l’inhibition à 50% de croissance de la culture parasitaire par rapport aux témoins non traités.

 Tests antipaludiques. [8, 19, 106]

La méthode de marquage radioactif a été mise à profit. Pour cela, un élément radioactif, l’hypoxanthine tritié, est incorporé dans des puits contenant différentes concentrations de mélange d’extrait et de suspension parasitaire. L’hypoxanthine tritié se fixe ainsi au niveau des noyaux des cellules vivantes parasitées. On mesure le taux de la radioactivité de ces cellules vivantes parasitées par rapport à un témoin (suspension parasitaire). La chloroquine a été utilisée comme composé de référence.

 Test antitrypanosomia. [52]

L'activité antitrypanosomia est évaluée par la concentration d’activité minimale (CAM), c'est-à-dire la concentration minimale en µg.ml-1 d’extrait de plante capable d’éliminer tous les parasites.

La méthode décrite par Loiseau et collaborateurs (2000) a été utilisée pour mettre en évidence cette activité. Elle est fondée sur le comptage de nombre de parasites par champ microscopique. Les composés de référence étaient le miltefosine et le pentamidine.

 Test antileishmaniose. [54]

Le test a été réalisé selon la méthode décrite par Okpekon. Cette méthode est basée sur la réduction d’un sel, [3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromure], de coloration jaune en cristaux bleus de formazan par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes parasitées. La solution bleue ainsi obtenue est quantifiée par dosage colorimétrique. Le pentamidine a été utilisé comme composé de référence.

II.2.3.2 Activité antifongique. [45,81]

L’activité antifongique des extraits sur les champignons à étudier est estimée sur la base de la concentration minimale inhibitrice (CMI), c'est-à-dire la plus petite concentration en µg.ml-1 d’extrait de plante capable d’inhiber toute culture d’une souche microorganisme. Cette concentration a été déterminée graphiquement en traçant des concentrations des drogues examinées contre le pourcentage d'inhibition.

La méthode de micro dilution indiquée par le NCCLS en 1997 a été utilisée pour déterminer la sensibilité des champignons aux agents antifongiques. Elle est basée sur comptage des microorganismes vivants par spectrophotométrie. Le 5-fluorocytosine a été utilisée comme produit de référence.

II.2.3.3 Activité cytotoxique. [29, 112]

L’activité cytotoxique des extraits sur les cellules saines à étudier est déterminée par le pourcentage d’inhibition (% I) d’une concentration bien déterminée de l’extrait.

La méthode colorimétrique a été mise à profit pour évaluer la cytotoxicité de l’extrait brut ainsi que les fractions obtenues. Pour cela, un sel MTS qui sera réduit en formazan de couleur bleu par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes est introduit dans des puits contenant différentes concentrations de mélange d’extrait et de suspension cellulaire. La solution bleue ainsi obtenue est quantifiée par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 490 nm. Le pourcentage d’inhibition a été calculé par rapport au contrôle. La taxotère a été utilisée comme composé de référence.

Pour la suite de l’étude, nous retenons les extraits qui possèdent une activité biologique intéressante.

II.2.4 Fractionnement et isolement.

La chromatographie est une méthode physique de séparation d’un mélange en ses différents composants. Elle est basée sur les différences d’affinité de ces composants à l’égard de deux phases, l’une stationnaire ou fixe et l’autre mobile ou éluant.

Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successive sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase.

Pour la séparation des constituants des différents extraits, la méthode choisie pour sa sélectivité est la chromatographie d’adsorption sur silice.

II.2.4.1 Chromatographie sur couche mince (CCM). [34]

Cette technique permet d’une façon générale l’analyse des fractions en ayant une idée de la polarité des différents composés en fonction de l’affinité avec les solvants de migration, donc elle est employée pour la recherche du système de solvant avant d'entreprendre une étape de séparation. Elle est également utilisée à chaque étape pour le suivi et le contrôle des purifications, les chromatogrammes sur couche mince permettent de vérifier la présence et l’état de pureté des produits suivis. Les différents extraits obtenus sont analysés par CCM dans des systèmes compatibles avec la nature de l’extrait Les chromatoplaques sont visualisées sous la lumière UV aux longueurs d’onde λ=254ηm et λ=365ηm.

Le réactif à l’anisaldéhyde a été pulvérisé sur la plaque développée suivi d’un chauffage à l’étuve portée à 110°C pendant 10 min.

II.2.4.2 Chromatographie sur colonne. [34]

Elle peut être une méthode préparative. Elle permet en effet la séparation des constituants d’un mélange et leur isolement, à partir d’échantillon dont la masse peut atteindre plusieurs grammes.

Il y a trois différents types de chromatographie sur colonne :

- la chromatographie sur colonne à basse pression dans laquelle l’écoulement de l’éluant traversant la colonne est par gravité.

- la flash chromatographie dont l’écoulement de la phase mobile dans la colonne est provoqué par une pompe.

- la chromatographie à haute pression pour fractionner les produits polaires.

Les extraits actifs subissent une première étape de fractionnement conduisant à l'obtention d'un certain nombre de fractions. Par la suite, les travaux de séparation et de purification nécessitent une ou plusieurs étapes supplémentaires pour les fractions complexes et l’utilisation de différentes techniques chromatographiques (CC et MPLC). A l'issue de chaque colonne chromatographique, les fractions obtenues sont analysées par CCM dans le but de :

- réunir les fractions qui présentent le même profil.

- identifier les fractions pures.

- déterminer un nouveau support chromatographique ainsi qu’un nouveau système de solvant susceptible de mieux séparer les composés.

II.2.5 Enregistrement des spectres.

L’enregistrement des spectres nécessitant le Logiciel Bruker NMR suite 3.0 se fait en deux étapes :

 La programmation de l’expérience.

Avant de programmer l’expérience, il faut aller au "change user" pour ouvrir le compte laboratoire.

La programmation consiste à remplir les informations nécessaires (le nom de l’échantillon, le solvant utilisé, l’expérience RMN à faire et le nombre de scan à utiliser) dans les fenêtres sur la même ligne du premier numéro d’une case disponible (affichage "available") dans l’Icône RMN du PC selon la figure 24.

Si on effectue plusieurs expériences pour un échantillon on cliquera sur le bouton "add" à chaque expérience à ajouter et on remplira l’expérience RMN à faire et le nombre de scan à utiliser.

Après tout, on cliquera sur le numéro de la case correspondant et ensuite sur le bouton "submit" pour lancer l’expérience.

Et à la fin, il faut fermer le compte utilisé en allant au "changer user".

Figure 24 : Icône RMN de l’ordinateur.

 La préparation du tube RMN.

Le tube rempli de solvant jusqu’à 4.5 cm de sa hauteur est introduit dans un spinner après lequel on le calibre par un calibrage de niveau. Ensuite, on met le tube avec spinner calibré dans la case du passeur d’échantillon automatique dont le numéro correspondant à celui de la case de l’Icône RMN du PC qu’on vient de programmer. Ce passeur d’échantillon placé en dessous de l’aimant de l’apparail de RMN contient 60 cases, selon la figure 25, et tourne automatiquement après l’analyse d’un tube pour analyser le tube précédent et ainsi de suite.

Les spectres FID obtenus nécessitent des traitements sur les logiciels MestReC ou MestReNova pour avoir les spectres RMN 1D et RMN 2D.

Figure 25 : Passeur des tubes RMN.

CHAPITRE III RESULTATS ET DISCUSSION

III.1 Résultats.

III.1.1 Extractions.

A partir de 1kg de l’écorce des tiges séchée et broyée, nous avons obtenu 84g d’extrait brut méthanolique (E1).

Le partage liquide-liquide successif de 80g de l’extrait brut méthanolique avec des solvants non miscibles entre eux a fourni 21.8g d’extrait dichlorométhanique (E2), 3.3g d’extrait acétate d’éthyle (E3), 18.7g d’extrait butanolique (E4) et 30.0g d’extrait aqueux (E5).

Sur 14.7g de l’extrait butanolique E4 subit des précipitations, nous avons obtenu 0.5g de précipité E4A et 14.2g de phase liquide E4B.

A partir de 0.15kg de l’écorce des tiges séchée et broyée, nous avons obtenu 15.2g d’extrait décocté (E6)

Les résultats de ces extractions sont rassemblés dans le tableau IV.

Tableau IV : Rendement des extractions de la poudre d’écorce des tiges de Millettia richardiana.

Extrait Masse obtenue (g) Rendement (%) Brut méthanolique E1 84.0 8.4 Dichlorométhanique E2 21.8 27.2 Acétate d’éthyle E3 3.3 4.1 Butanolique E4 18.7 23.4 Précipité E4A 0.5 3.4 Ethéré E4B 14.2 96.6 Aqueux E5 30.0 37.5 Décocté E6 15.2 10.2

III.1.2 Criblage phytochimique.

Le résultat du criblage phytochimique effectué sur les extraits E2, E3, E4, E4A, E4B et E5 est présenté dans le tableau 4 ci-dessous.

Tableau V : Résultat du criblage phytochimique sur les extraits semi-bruts de l’écorce des tiges de Millettia richardiana.

Famille chimique E2 E3 E4 E4A E4B E5 Alcaloïdes + + - - - + Flavonoïdes - - +++ +++ +++ +++ Terpénoïdes +++ ++ - - - - Coumarines +++ - - - - - Tanins - - - - - ++ Saponines - ++ +++ +++ - - (-) : négatif, (+) : faible, (++) : abondante, (+++) : forte

Il nous indique que :

- les alcaloïdes sont présents en petite quantité dans les extraits E2 (extrait dichlorométhanique), E3 (extrait acétate d’éthyle) et E5 (extrait aqueux).

- les extraits E4 (extrait buthanolique), E4A, E4B et E5 (extrait aqueux) sont riches en flavonoïdes.

- les terpénoïdes sont abondants dans l’extrait dichlorométhanique E2 et dans l’extrait acétate d’éthyle E3.

- l’extrait dichlorométhanique est riche en coumarines.

- les tanins sont présents en abondance dans l’extrait aqueux E5.

- les saponines sont présents en grande quantité dans les deux extraits E4 (extrait buthanolique) et E4A et en abondance dans l’extrait à l’acétate d’éthyle E3.

III.1.3 Tests biologiques.

Le tableau VI présente les résultats des tests antiparasitaires, antifongiques et cytotoxicités des extraits de l’écorce des tiges de Millettia richardiana.

Tableau VI : activités biologiques des extraits de Millettia richardiana.

Extraits E1 E2 E3 E4 E4A E4B E5 E6 P. faciparum >10 5.8 >10 >10 >10 >10 >10 >10

FcM29 CI50 (µg/ml) T. brucei brucei 50 12.5 25 >100 50 >100 >100 >100 CAM (µg/ml) L. donovani 50.8 11.8 47.8 >100 25.8 >10 77.5 >100

CI50 (µg/ml) C. albicans >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 CMI (µg/ml) C. glabrata >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 CMI (µg/ml) C. parapsilosis >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 CMI (µg/ml) KB 0 21 0 23 61 0 7 17 % I à 10 µg/ml Vero 0 22 21 14 20 9 3 0 % I à 10 µg/ml MRC5 0 15 12 20 20 0 10 0 % I à 10 µg/ml

III.1.3.1 Activité antiparasitaire.

L’extrait au dichlorométhane E2 montre une activité antiparasitaire intéressante avec un CI50 égal à 5.8µg/ml sur le P. falciparum FcM29, un CAM égal à 12.5µg/ml sur T. brucei brucei et un CI50 égal à 11.8µg/ml sur L. donovani. Pour un extrait semi-brut, ces valeurs démontrent une activité tout à fait encourageante pour les principes actifs qu’il contient, d’autant plus qu’ils sont dilués parmi des centaines d’autres molécules inactives.

Par contre, les autres extraits E3 à E6 ont une valeur de CI50 supérieure à 10µg/ml sur P. falciparum FcM29 et à 20µg/ml sur T. brucei brucei et L. donovani. Ces sept extraits sont alors inactifs sur les trois parasites étudiés.

III.1.3.2 Activité antifongique.

Tous les extraits de l’écorce des tiges de Millettia richardiana ont une CMI supérieure à 10µg/ml sur les trois espèces des champignons étudiés.

Ces résultats montrent que C. albicans, C. glabrata et C. parapsilosis ne sont pas sensibles à la concentration 10µg/ml des extraits testés.

III.1.3.3 Activité cytotoxicité.

L’extrait E4A a une activité modérée sur les cellules KB avec 61% d’inhibition à la concentration 10µg/ml, par contre il présente une cytotoxicité non significative sur les cellules Vero et MRC5 de % d’inhibition égal à 20.

Les autres extraits présentent une cytotoxicité faible sur les cellules KB, Vero et MRC5 avec un % d’inhibition de 0 à 23.

III.1.4 Fractionnement et isolement.

III.1.4.1 Fractionnement de l’extrait dichlorométhanique E2.

18g de l’extrait actif dichlorométhanique ont été soumis à une chromatographie sur une colonne de verre de hauteur 1m et de diamètre de 6.6cm utilisant pour phase stationnaire 160g de gel de silice et comme solvant de migration le mélange dichlorométhane/méthanol en gradient d’élution allant de 0% à 10%. Le volume de chaque fraction est de 50ml. Les fractions qui ont le même profil chromatographique sur CCM ont été regroupées en donnant six fractions E2A, E2B, E2C, E2DE, E2F et E2G. Les résultats de ce fractionnement sont présentés dans le tableau VII.

Tableau VII : Les résultats du fractionnement de l’extrait dichlorométhane de l’écorce des tiges de Millettia richardiana.

Fraction Eluant Masse (g) E2A DCM 3.8 E2B DCM 1.1 E2C DCM 1.6 E2DE DCM/MeOH (97/3) 8.5 E2F DCM/MeOH (95/5) 1.6 E2G DCM/MeOH (90/10) 1.5

III.1.4.2.2 Purification de la fraction E2A.

La purification de E2A a été effectuée sur une colonne de 50cm de long et de 2cm de diamètre, contenant 38g de gel de silice en utilisant comme éluant le cyclohexane en gradient avec l’acétate d’éthyle. L’éluât a été recueilli par fraction de 10ml. Ce fractionnement, après suivi sur CCM, nous a permis d’obtenir six fractions dont les fractions E2A3 et E2A4 sont pures.

Les résultats de la purification de 1.3g de la fraction E2A sont présentés dans le diagramme 3.

E2A (1.3g)

Colonne ouverte d= 2cm, silice m= 38g Solvant : Cyclohexane/AcOEt

Proportion du solvant

99% 98% 90%

E2A1 E2A2 E2A3 E2A4 E2A5 E2A6 25.4mg 258.6mg 35.5mg 209.8mg 22.5mg 50.1mg Diagramme 3 : Les résultats de la purification de E2A.

III.1.4.3 Purification de la fraction E2B.

La fraction E2B a été chromatographiée sur une colonne de 50cm de hauteur et de 2cm de diamètre pour phase stationnaire 25g de gel de silice en utilisant comme solvant, d’abord, l’hexane en gradient d’élution avec le dichlorométhane, puis le mélange diclorométhane/méthanol de proportion 90/10 (v/v). Cette démarche, après contrôle sur CCM, nous a conduit à six fractions E2B1à E2B6.

Les résultats de la purification de 1.1g de la fraction E2B sont présentés dans le diagramme 4.

E2B (1.1g)

Colonne ouverte d= 2cm, Silice m= 25g Solvant : Hex/DCM , DCM /MeOH

Hex/DCM Hex/DCM DCM/MeOH 100% 85% 65% 50% 0% 90%

E2B1 E2B2 E2B3 E2B4 E2B5 E2B6 82mg 170mg 250mg 213mg 76mg 235mg Diagramme 4 : Fractionnement de E2B.

L’étude de 207mg de la fraction E2B4 sur une colonne de 50cm de long et de 1cm de diamètre, contenant 20g de gel de silice en utilisant le cyclohexane en gradient d’élution avec l’acétate d’éthyle nous a permis d’avoir neuf fractions E2B4A à E2B4I dont la fraction E2B4H est pure.

Les résultats de cette purification sont présentés dans le diagramme 5.

E2B4 (207mg)

Colonne ouverte d= 1cm, Silice m= 20g Solvant : Cyclohexane/ AcOEt

Proportion du solvant 100% 95% 92% 91% 85%

E2B4A E2B4B E2B4C E2B4D E2B4E E2B4F E2B4G E2B4H E2B4I 13.5mg 15.7mg 19.4mg 20.6mg 13.4mg 18.2mg 21mg 23.8mg 70.6mg Diagramme 5 : Purification de E2B4.

III.1.4.4 Fractionnement de la fraction E2C.

La fraction E2C a subi une chromatographie sur une colonne de 50cm de hauteur et de 2cm de diamètre, contenant de 33g de gel de silice en utilisant comme solvant de migration l’hexane en gradient avec le dichlorométhane suivi du mélange dichlorométhane/méthanol en deux proportions différentes (94/6 et 80/20). Après contrôle sur CCM, cette première étape de fractionnement nous a permis d’obtenir six fractions E2C1 à E2C6.

E2C (1.4g)

Colonne ouverte d= 2cm, Silice m= 33g Solvant : Hex/DCM, DCM/MeOH

Hex/DCM Hex/DCM DCM/MeOH 75% 50% 25% 25% 94% 80%

E2C1 E2C2 E2C3 E2C4 E2C5 E2C6 319mg 170mg 168mg 61mg 494mg 36mg Diagramme 6: Résultats du fractionnement de E2C.

La fraction E2C1 (310mg) éluée dans une colonne d’EasyVarioFlash D17 (10 g) par le mélange cyclohéxane/acétate d’éthyl en gradient d’élution du flash chromatographie nous a donnés cinq fractions E2C1A à E2C1E (diagramme 7).

E2C1 (310mg)

Colonne EVD17 (10g) Solvant: Cyclo /AcOEt

Proportion du solvant 1% 2% 5%

E2C1A E2C1B E2C1C E2C1D E2C1E 26.2mg 168mg trace 70.3mg 35.5mg Diagramme 7: Purification de la fraction E2C1.

Le flash chromatographie utilisant une colonne de RediSep (12g) avec comme solvant de migration le mélange cyclohexane/acétate d’éthyle en gradient d’élution nous a permis d’obtenir une fraction pure E2C5B et deux autres fractions E2C5A et E2C5C à partir de 490mg de la fraction E2C5 (digramme 8).

E2C5 (490mg)

Colonne RediSep (12g) Solvant: Cyclo/AcOEt

Proportion du solvant 89% 81% 50%

E2C5A E2C5B E2C5C 5mg 79.7mg 92mg Diagramme 8: Purification de la fraction E2C5.

II.1.4.5 Fractionnement de la fraction E2DE.

Sept fractions (E2DE1 à E2DE7) ont été obtenues, sur une colonne de 50cm de long et de 6.5cm de diamètre, contenant 120g de gel de silice en utilisant comme solvant de migration le mélange héxane/dichlorométhane en gradient d’élution suivi du mélange de dichlorométhane/méthanol de proportions 94/6 et 80/20, à partir de 9g de la fraction E2DE.

Les résultats de ce fractionnement sont présentés dans le diagramme 9.

E2DE (9g)

Colonne ouverte d= 6.5cm, Silice m= 120g Solvant : Hex/DCM , DCM /MeOH

Hex/DCM Hex/DCM DCM/MeOH 100% 75% 50% 25% 25% 94% 80%

E2DE1 E2DE2 E2DE3 E2DE4 E2DE5 E2DE6 E2DE7 23mg 519mg 82mg 163mg 50mg 566mg 4769mg Diagramme 9 : Fractionnement de E2DE.

Une colonne de 50cm de long et de 6cm de diamètre a été utilisée pour chromatographier la fraction E2DE7. Après contrôle sur CCM de l’éluât recueilli par 50ml, trois fractions ont été obtenues (diagramme 10).

E2DE7 (3 g)

Colonne ouverte d= 6cm , Silice m= 90g Solvant : DCM / MeOH

Proportion du solvant 100% 90% 80%

E2DE7A E2DE7B E2DE7C 763mg 25.7mg 940mg Diagramme 10 : Fractionnement de E2DE7.

La fraction E2DE7A (760mg) a été purifiée sur une colonne de chromabond 15g (15 bar) du flash chromatographie en utilisant comme solvant le cyclohexane en graduant d’élution avec l’acétate d’éthyle. Deux fractions, E2DE7A3 et E2DE7A8, pures et sept autres fractions ont été obtenues à l’issu de cette purification.

Les résultats de ces purifications sont répertoriés dans le diagramme 11.

E2DE7A (760mg)

Colonne Chromabond (15g) Solvant : Cyclo/AcOEt

Proportion du solvant 100% 97% 90% 80% 70% 60% 55% 50% 15%

E2DE7A1 E2DE7A2 E2DE7A3 E2DE7A4 E2DE7A5 E2DE7A6 E2DE7A7 E2DE7A8 E2DE7A9 21.43mg 40mg 55mg 28.5mg 162.2mg 55.2mg 19mg 9.8mg 8.7mg Diagramme 11 : Purification de E2DE7A.

III.1.5 Caractéristiques des produits obtenus à identifier.

Les caractéristiques des produits obtenus à identifier à l’issue de ces fractionnements et de ces isolements sont résumés dans le tableau VIII.

Tableau VIII : Caractéristiques des produits obtenus à identifier.

N° du composé Dénomination Caractéristiques Masse totale (mg)

1 E2A3 Jaune Huileux 35.5

Poudre jaune

2 E2B4H PF 181-182°C 23.8

coumarine

Poudre blanche

3 et 4 E2C1D Triterpènes 70.3

Solide amorphe blanc

5 E2C5B PF 281-282°C 79.7

Triterpène

6, 7 et 8 E2DE7A2 Huileux 40.0

Poudre jaune

9 E2DE7A8 PF 210-212°C 9.8

Coumarine

III.2 Détermination de structure.

III.2.1 Détermination de structure des acides gras.

III.2.1.1 Identification de E2A3 noté composé 1.

Le composé 1 se présente sous forme huileux de couleur jaune.

 Spectre RMN 1H.

Figure 26 : Spectre de RMN-1H du composé 1.

Le spectre RMN-1H du composé 1 montre un massif entre δ 5.23 et 5.35 ppm intégrant pour huit protons. Il s’agit des protons oléfiniques.

Nous avons aussi identifié deux doublets dédoublés intégrant pour deux protons chacun à δ= 4.08 et 4.24 ppm, et un massif entre δ= 5.23 et 5.28 ppm intégrant pour un

64 proton. Ces valeurs correspondent respectivement aux protons du groupe méthylènoxyle et du groupe méthinoxyle.

Nous pouvons observer également cinq signaux de protons méthylènes : un triplet intégrant pour quatre protons à δ 2.76 ppm, deux triplets à δ 2.30 et 2.31 ppm intégrant respectivement pour quatre et deux protons, un quadruplet intégrant pour huit protons à δ 2.04 ppm, un massif intégrant pour six protons centré à δ 1.60 ppm et un massif intense intégrant pour 52 protons entre 1.16 ppm à 1.32 ppm.

A δ 0.85 ppm se trouve un pic intégrant à neuf protons correspondant au groupe méthyle.

 Spectre RMN 13C J-modulé.

Le spectre RMN-13C (figure 27) du composé 1 a permis de détecter la présence des groupements carboxyliques à δ= 172.81 et 173.25 ppm. L’intensité du signal permet de suggérer un chevauchement de deux pics à δ 173.25 ppm.

Figure 27 : Spectre RMN-13C J-modulé du composé 1.

Le spectre RMN-13C a permis aussi de confirmer la présence :

- de groupe oléfinique à δ 127.88, 128.06, 129.99 et 130.21 ppm.

- de groupe méthylènoxyle -CH2-O- à δ 62.09 ppm et de groupe méthinoxyle –CH-O- à δ 68.89 ppm. L’intensité du signal permet de suggérer aussi qu’on a un chevauchement de deux pics à δ 62.09 ppm.

- de groupe méthyle à δ 14.07 ppm.

 Spectre HSQC et spectre COSY.

Figure 28 : Spectre de RMN HSQC du composé 1.

Figure 29 : Spectre de COSY du composé 1.

L’analyse concertée des spectres de RMN HSQC (figure 28) et de RMN COSY (figure 29) permet de situer les protons et leurs carbones porteurs.

Le massif intégrant pour un proton entre 5.23 ppm à 5.28 ppm est porté par le carbone porteur d’un groupement oxygéné à δ 68.89 ppm.

Les deux doublets dédoublés intégrant chacun pour deux protons à δ = 4.08 et 4.24 ppm sont corrélés avec le carbone porteur d’un groupement oxygéné à δ 62.09 ppm. Ces quatre protons correspondent à des protons géminés non équivalents.

Sur le spectre RMN COSY les protons géminés portés par le carbone à δ 62.09 ppm corrèlent avec le proton porté par le carbone à δ 68.89 ppm.

Ces informations montrent que le composé 1 présente la séquence selon la figure 30.

4.08 H

Ra O 4.24 O 62.09 H 4.24 H O H 68.89 5.25

O Rb 4.08 H 62.09

Rc O

O Figure 30 : Séquence de base du composé 1.

Un autre massif entre δ 5.28 et 5.41 ppm intégrant à huit protons corrèle avec les quatre carbones oléfiniques (à δ 127.88, 128.06, 129.99 et 130.21 ppm). Ce sont les sites caractéristiques de quatre sites éthyléniques.

4x (-CH=CH-)

Les quatre protons méthylènes à δ = 2.76 ppm sont portés par le carbone à δ 25.61 ppm. Ces valeurs de déplacement chimique sont caractéristiques des protons diallyliques.

2x (-C=C-CH2-C=C-)

Les carbones à 34.02 ppm et 34.18 ppm corrèlent respectivement aux protons méthylènes à 2.30 ppm (intégrant pour quatre protons) et 2.31 ppm (intégrant pour deux protons). L’intensité du signal permet de supposer qu’on a un chevauchement de deux pics à δ 2.30 ppm Il s’agit de trois sites en α des fonctions carboxyliques.

3x (-CH2-COO-)

Le carbone porteur des protons méthylènes à δ = 2.04 ppm est à 27.03 ppm. C’est le signal des huit protons allyliques.

4x (CH2-C=C-)

Le carbone à 24.83 ppm corrèle aux protons méthylènes à δ = 1.60 ppm, on note un massif intégrant pour six protons. C’est le signal des sites protoniques en β des fonctions carboxyliques.

3x (-CH2-C-COO-)

Toutes ces interprétations et la comparaison de spectre de RMN-1H du composé 1 (figure 25) à celui de l’huile d’olive vierge permettent d’en déduire qu’il s’agit de composé lipidique.

Sur le spectre RMN-1H, l’absence du signal caractéristique des protons méthylique du linolenyl à 0.95 ppm indique l’inexistence d’acide linolénique dans le composé 1, c’est à dire E = 0

(n-3) linolénique = 0

La teneur en AG autre que linolénique est alors :

AGS + AGMI + (n-6) linoléique = F/ (F+E) = 1

Le taux relatif en AGMI et en acide linoléique serait alors:

(n-6) linoléique = 2A

AGMI = C/2B – 2A

AGS = 1- (C/2B)

Avec A = 0.35 cm; B = 0.58 cm; C = 0.83 cm; D = 0.60 cm

Ce qui donne :

(n-6) linoléique = 2x 0.35 = 0.70

AGMI = (0.83/1.16) – 0.70 = 0.015

AGS = 1- (0.83/1.16) = 0.285

Par conséquent, le composé 1 a des teneurs relatives en acide linoléique et en acide gras saturé de 70% et 30%.

Les carbones à 22.54, 29.18, 29.38, 29.77 et 31.91 ppm corrèlent aux protons à δ entre

1.16 à 1.32ppm. Ce sont les signaux des groupements méthyléniques –CH2- en position : 4 à (n-1) pour l’acide gras saturé, et 4 à 7 et 15 à 17 pour le linoléyl.

Les protons méthyliques à δ = 0.85 ppm sont portés par le carbone à 14.07 ppm. Il s’agit de trois sites méthyliques terminaux des chaînes acyles.

3x (C-CH3)

Toutes ces interprétations conduisent à l’attribution des déplacements chimiques (tableau 7) et à une hypothèse de structure du composé 1 selon la figure 31.

Hb 1 2 3 4 à (n-1) n Ha O H2 H2 C O C C C (CH2)n-4 CH3

O H2 H2 H2 H2 H2 H C O C C C (CH2 )4 C C C C C C C (CH2 )3 CH3 H H H H O H2 H2 H2 H2 H2 C O C C C (CH2 )4 C C C C C C C (CH2 )3 CH3 H H H H Ha 1 2 3 4 à 7 8 9 10 11 12 13 14 15 à 17 18 Hb Figure 31 : Hypothèse de structure du composé 1.

Tableau IX : Données spectrales en RMN du composé 1.

N° site Type du site δH (ppm) δC (ppm) α -O-CH- 5.23 à 5.28 (m, 1H) 68.89

α’ et β -O-CH2- 4.08 (dd, 2H, J 11.90, 5.95 Hz) 61.71 4.24 (dd, 2H, J 11.90, 4.29 Hz)

9b-10b et 12b-13b 127.88, 128.06,

9c-10c et 12c-13c -CH=CH- 5.28 à 5.41 (m, 8H) 129.99; 130.21

11b et 11c -CH2- diallylique 2.76 (t, 2H, J 6.50 Hz) 25.61

2b et 2c -CH2- en α du 2.30 (t, 4H, J 7.59 Hz) 34.02

2a -COO- 2.31 (t, 2H, J 7.56 Hz) 34.18

8b, 8c, 14b, 14c -CH2- allylique 2.04 (q, 8H, J 6.90 Hz) 27.03

3a, 3b, 3c -CH2- en β du 1.60 (m, 6H) 24.83 -COO-

4a à (n-1)a 22.54, 28.79 à

4b à 7b, 15b à 17b -CH2- 1.12 à 1.31 (m, 52H) 29.77, 31.91

4c à 7c, 15c à 17c

16a, 18b et 18c CH3 0.85 (m, 9H) 14.07

Le nombre n de carbone de l’acide gras saturé peut être déterminé en soustrayant le nombre des protons (52H) entre 1.16 à 1.32 ppm par le nombre (28H) des protons de deux linoléyl en position 4 à 7 et 15 à 17. En effet, 2(n-4) = 52-28 et par conséquent, n = 16.

Le composé 1 est alors le α-palmityl-β-linoléyl-α’-linoléyl glycérol selon la figure 32.

Hb 1 2 3 4 à 15 16 Ha O H2 H2 C O C C C (CH2)12 CH3

O H2 H2 H2 H2 H2 H C O C C C (CH2 )4 C C C C C C C (CH2 )3 CH3 H H H H O H2 H2 H2 H2 H2 C O C C C (CH2 )4 C C C C C C C (CH2 )3 CH3 H H H H Ha 1 2 3 4 à 7 8 9 10 11 12 13 14 15 à 17 18 Hb Figure 32 : Structure du composé 1. Les déplacements chimiques en RMN de proton et de carbone du composé 1 sont effectivement en accord avec les données de la littérature du α-palmityl-β-linoléyl-α’-linoléyl glycérol (C. F. Morelli et coll., 2006) et sont présentés dans le tableau X.

Tableau X : Donnés spectrale du composé 1 et du α-palmityl-β,α’-dilinoléylglycérol.

Site δH (ppm) δC (ppm) 1 Lit. 1 Lit. α 5.23 à 5.28 5.27 à 5.30 68.88 68.89 α’, β 4.08 et 4.24 4.16 et 4.31 62.09 62.11

1a _ _ 172.81 172.84

1b et 1c 173.24 173.26

2b et 2c 2.30 2.33 34.02 34.03

2a 2.31 2.34 34.18 34.20

3a, 3b, 3c 1.60 1.62- 1.70 24.83 24.85

4a à 15a 22.54 22.58, 29.18,

4b à 7b, 15b à 17b 1.16 à 1.32 1.27 à 1.46 28.79 à 29.77, 29.19, 29.35,

4c à 7c, 15c à 17c 31.91 29.63 et 31.53

8b, 8c, 14b, 14c 2.04 2.07 27.03 27.20

9b-10b et 12b-13b 5.28 à 5.41 5.31 à 5.43 127.88, 128.06, 127.90, 128.08,

9c-10c et 12c-13c 129.99 et 130.21 130.02 et 130.24

11b et 11c 2.76 2.79 25.61 25.64

16a, 18b et 18c 0.85 0.89 14.07 14.07

III.2.1.2 Identification de E2DE7A2.

L’analyse concertée du chromatogramme GC/MS (figure 33) et du spectre de RMN- 1H (figure 34) permet d’en déduire que E2DE7A2 est un mélange de trois acides gras libres.

En effet, le chromatogramme GC/MS fait apparaitre trois composés dont les temps de rétention respectifs sont de 5.929 noté composé 6, 6.276 noté composé 7 et 6.331 min noté composé 8.

Figure 33 : Chromatogramme GC/MS de l’extrait E2DE7A2

Figure 34 : Spectre de RMN-1H de E2DE7A2.

 Spectre RMN 1H.

Les intensités des signaux du spectre de RMN-1H, à savoir A = 0.15, B = 0.47, C = 0.30, D = 0.48, E = 0 et F = 0.70, nous a permis de savoir la teneur des acides gras présents dans ce mélange. En effet,

- la teneur en acide linolénique définie par la formule (n-3) linolénique = E/(E+F) est de 0%, alors l’acide linolénique n’existe pas dans ce mélange.

- la teneur en acide linoléique, telle que (n-6) linoléique = 2A – [E/2(E+F)], est de 30%, cela entraine que l’acide linoléique représente le tiers de ce mélange.

- la teneur en acide gras mono insaturé AGMI donnée par la formule

AGMI = {(C/2B) – [E/2(E+F)]} – {2A – [E/2(E+F)]} est de 0.02%, ce mélange ne contient pas donc des acides mono insaturé.

- la teneur en acide gras saturé AGS, avec AGS = [F/(E+F)] – [C/2B] – [E/(E+F)], est de 68%, les acides gras saturés représentent alors les deux tiers de ce mélange.

Par ailleurs, le spectre de RMN-1H du mélange nous a permis d’identifier par similarité avec celui de E2A3 : les protons éthyléniques (CH=CH) à δH 5.33 ppm intégrant pour quatre protons, le groupe diallylique (C=C-CH2-C=C) à δH 2.76 ppm intégrant pour deux protons, le groupe méthylène en α du groupement carboxylique (CH2-COOR) à δH 2.34 ppm intégrant pour six protons, les protons allyliques (CH2-C=C) à δH 2.04 ppm intégrant pour quatre protons, les protons méthyléniques en β du groupement carboxylique (CH2-C-COOR)

à δH 1.62 ppm intégrant pour six protons, les protons méthyléniques [(CH2)n] à δH compris entre 1.19 et 1.39 ppm et le groupement méthyle (CH3-) à δH centré à 0.86 ppm.

Toutefois, le spectre RMN de proton du mélange montre une différence par rapport à celui de E2A3. En effet, on observe la disparition des trois signaux à δ 4.08, 4.24 et entre 5.23 à 5.28 ppm appartenant respectivement aux protons du groupement méthylènoxyle du site α, α’ et du groupement méthinoxyle du site β du triglycéride. Ces informations confirment que E2DE7A2 est un mélange d’un acide linoléique et de deux acides gras saturés.

 Spectre RMN 13C J-modulé.

Le spectre de RMN-13C-JMOD de E2DE7A2 (figure 35) a permis de confirmer la présence : d’un groupe carboxylique à δC 179.96 ppm et deux autres groupes carboxyliques

équivalents à δC 180.01 ppm, des carbones éthyléniques à δC 128.11, 128.28, 130.34 et

130.44 ppm, du groupement méthyle à δC 14.08 ppm.

Figure 35 : Spectre de RMN-13C-JMOD de E2DE7A2.

Afin de déterminer les structures des 3 composés du mélange E2DE7A2, les spectres de masses de chaque composé ont été enrégistrés.

 Spectre de masse du composé 6.

L’analyse de spectre de masse en EI du composé 6 (figure 36) permet d’observer la présence de deux séries de pics résultants du clivage à chaque liaison C-C avec rétention de la charge soit sur le fragment contenant l’atome d’oxygène (m/z 43, 57, 71, 85, …) soit sur le fragment alkyle (m/z 45, 59, 73, ….) et d’un pic à m/z 60 dû à un réarrangement de

McLafferty. Les deux séries de pics sont distants d’entre eux de 14 unités de masse (CH2). Cette fragmentation est caractéristique des acides à longues chaînes.

On a aussi observé un ion moléculaire à m/z 256 [M]°+ indiquant une formule brute + de C16H32O2 et un ion à m/z 239 [M-17] qui résulte de la perte du groupe (OH).

Figure 36 : Spectre de masse EI du composé 6.

La fragmentation du composé 6 est résumée dans le schéma 5.

Schéma 5 : Fragmentation du composé 6 en spectrométrie de masse en EI.

Le pic moléculaire et la fragmentation permettent d’identifier que le composé 6 s’agit d’un acide palmitique selon la figure 37. Ces informations sont en accord avec les données publiées dans la littérature (C. Cheseaux, 1988).

Figure 37 : Structure du composé 6.

 Spectre de masse du composé 8.

Le pic moléculaire du composé 8 (figure 38) est à m/z 284. La fragmentation de ce composé est similaire à celle du composé 6. Mais le composé 8 représente deux autres pics à m/z 241 et 255 en plus que de ceux du composé 6. Ces deux composés sont distants entre eux par 2x14 uma. Par conséquent, le composé 8 correspond à l’acide stéarique de formule brute

C18H36O2 selon la figure38.

La fragmentation du composé 8 est en accord avec celle de l’acide stéarique qu’on a trouvé dans la littérature (A. B. R. Ralaivao, 2007).

Figure 38 : Spectre de masse EI du composé 8.

Figure 39 : Structure du composé 8.  Spectre de masse du composé 7. Le pic moléculaire du composé 7 (figure 40) est à m/z 280. La fragmentation de ce composé est similaire à celle des hydrocarbures insaturés. En effet, on observe des pics à m/z 41et 55 caractéristique des hydrocarbures éthyléniques. En comparant avec celui du composé 8, il a perdu 4 uma qui correspondent à quatre atomes d’hydrogène. Cette perte est due à la formation de deux doubles liaisons.

Le composé 7 correspond alors à l’acide linoléique (figure 41) de formule brute

C18H32O2.

La fragmentation du composé 7 est en accord avec celle de l’acide linoléique qu’on a trouvé dans la littérature (A. B. R. Ralaivao, 2007).

Figure 40 : Spectre de masse EI du composé 7.

Figure 41 : Structure du composé 7.

Ainsi, E2DE7A2 est un mélange d’acide palmitique, d’acide stéarique et d’acide linoléique selon la figure 42.

Figure 42 : Structure de E2DE7A2 mélange d’acide palmitique, d’acide stéarique et d’acide linoléique.

III.2.2 Détermination structurale des triterpènes.

III.2.2.1 Identification du composé E2C5B noté composé 5.

Le composé 5 se présente sous forme d’un solide blanc amorphe. Le virage de la coloration en rouge pourpre en présence du réactif de Liebermann-Burchard indique que le composé 5 est un triterpène. Son point de fusion est de 281-282°C.

L’étude concertée des spectres RMN de 1H (figure 43), 13C-Jmod (figure 46), COSY (figure 48), HSQC (figure 47) et HMBC (figure 44) permet d’attribuer les déplacements chimiques des protons et des carbones de la molécule.

Figure 43 : Spectre de proton du composé 5.

Le spectre de proton du composé 5 montre qu’il contient 6 groupements méthyles dont l’un à champ fort (δH = 1.81 ppm) est un méthyle en position α d’un carbone éthylénique selon la séquence a.

Le spectre HMBC (figure 44) présente la corrélation des protons de ce méthyle avec les carbones de δ 48.13, 110.32 et 151.69 ppm.

Séquence a.

Figure 44 : Spectre HMBC élargi du composé 5.

L’examen du spectre de RMN 13C-Jmod (figure 46) montre la présence de 30 atomes de carbone dont l’un est un groupement carboxylique (δ 179.23 ppm) indiquant une structure de triterpène. L’absence des carbones éthyléniques à δ 111 et 112 ppm attribués à C-12 et C- 13 et la considération de la "séquence a" font que les 27 carbones donneraient l’hypothèse de structure d’un pentacyclique avec un noyau E cyclopentanique selon la figure 45.

Figure 45 : Structure d’un triterpène pentacyclique à noyau E cyclopentanique.

Le méthyle à 1.81 est donc en position 29. Les carbones à 48.13 ppm, 110.32 ppm, 151.69 sont respectivement en position 19, 30, 20.

Figure 46 : Spectre de RMN 13C-Jmod du composé 5.

Le spectre HMBC d’un triterpénoide donne des informations supplémentaires sur la corrélation des protons du méthyle avec les carbones en position α ou β de ces méthyles.

Ainsi les protons des méthyles à δ 1.03 ppm (s) et 1.25 ppm (s) corrèlent respectivement aux carbones à δ 29.02 ppm (CH3) et 16.71 ppm (CH3) ensuite ils ont des carbones de corrélation communs à δ 39.88 ppm (Cq), 56.27 ppm (CH) et 78.47 ppm (CH) où ce dernier est un carbone lié à l’oxygène. Ces 2 méthyles sont alors géminés. Le spectre HSQC (figure 47) confirme que les protons des méthyles à δ 1.03 ppm et 1.25 ppm sont portés respectivement par les carbones à 16.71 ppm et 29.02 ppm. Ce sont les 2 groupements méthyles en position 23 et 24 qui sont portés par le carbone quaternaire à δ 39.88 ppm, selon la séquence b.

Séquence b.

Figure 47 : Spectre HSQC du composé 5.

Les protons du méthyle à δ 0.84 ppm (à δC 16.78 ppm) corrèlent avec les carbones à

37.94 ppm (Cq), 39.63 ppm (CH2), 51.30 ppm (CH), 56.27 ppm (CH). Ce méthyle est alors en position 25 et le carbone quaternaire à δ 37.87 ppm est en position 10. Les carbones à 39.63 ppm, 51.30 ppm et 56.27 ppm sont respectivement attribués à C-1, C-9 et C-5 selon la séquence c.

Séquence c.

En associant la séquence b et la séquence c, il reste la position 2 à déterminer selon la séquence d.

Séquence d.

Les protons du méthyle à 1.08 ppm porté par le carbone à δ 16.78 ppm corrèlent avec les carbones à δ 35.18 ppm (CH2), 41.46 ppm (Cq), 51.30 ppm (CH), 43.20 ppm (Cq).

Le groupement méthyle à δ 1.09 ppm (à δC 15.25 ppm) corrèle avec les carbones à δ

30.63 ppm (CH2), 38.96 ppm (CH), 41.46 ppm (Cq), 43.20 ppm.

Ces deux groupements méthyles (à δ 1.08 et 1.09 ppm) ont 2 carbones de corrélation identiques, ils sont alors vicinaux. Ainsi, le groupement méthyle à 1.08 ppm qui est en position β par rapport à C-9 (51.30 ppm) est le méthyle en position 26. Le méthyle à 1.09 ppm est donc en position 27. Les carbones méthyléniques à δ 30.63 ppm et 35.18 ppm sont

85 respectivement attribué à C-15 et C-7. Le carbone du méthine à 38.96 ppm est assigné à C-13. Ces attributions conduisent à la séquence e.

Séquence e.

Le proton à 1.78 ppm porté le carbone à δ 50.11 ppm corrèle avec les carbones à 38.96 ppm (C-13), 48.13 ppm (C-19), 56.98 ppm (Cq), 151.69 ppm (C-20), 179.23 ppm (COOH).

Le spectre de Cosy (figure 16) montre que le proton à 1.78 ppm porté par le carbone à

50.11 ppm corrèle avec les protons à δ 2.76 (δC 38.96, C-13) et à δ 3.56 (δC 48.13, C-19). Ce dernier corrèle aussi avec les protons à δ 1.54 et 2.26 portés par le carbone à 31.56 ppm. Ce groupement méthylène est ensuite corrélé avec les protons à δ 1.60 et 2.27 portés par le carbone à 37.87 ppm.

Le méthine à 1.78 ppm (δC 50.11) est en position 18 tandis que les deux carbones méthylènes à 31.56 ppm et à 37.87 ppm sont respectivement en position 21 et 22. Le carbone quaternaire à 57.89 ppm et le groupement carboxyliques correspondent aux carbones en position respectif 17 et 28.

D’où la séquence f :

Séquence f.

Figure 48 : Spectre COSY du composé 5.

Avec les séquences a, d, e, f, on a la séquence g :

Séquence g. : Corrélation Cosy : Corrélation HMBC

L’analyse conjointe des spectres COSY et HSQC permet d’assigner les déplacements chimiques des protons et des carbones restants : C-2, C-6, C-11, C-12, C-16.

Les protons à 1.87 ppm portés par le carbone à 28.67 ppm corrèlent en COSY avec les deux protons à 1.01 ppm, 1.70 ppm portés par le carbone à 39.63 ppm (C-1) et le proton à 3.48 ppm portés par le carbone porteur de l’oxygène à 78.47 ppm (C-3). Le carbone à 28.67 ppm n’est autre que le carbone en position 2.

Le proton à 0.84 ppm porté par C-5 (56.27 ppm) corrèle en COSY avec les protons à 1.42 ppm, 1.58 ppm portés par le carbone à 19.14 ppm qui est alors en position 6.

Les protons à δ 1.23 et 1.46 portés par le carbone à 21. 56 ppm corrèlent en COSY avec les protons à 1.22 ppm, 1.95 ppm portés par le carbone à δ 26.46 et ceux-ci montrent des

88 taches de corrélation avec le proton à 2.76 ppm (δC 38.96) (C-13). Le carbone à 21. 56 ppm et le carbone à δ 26.46 sont alors en positions respectives 11 et 12.

Les protons à 1.29 ppm, 1.88 ppm portés par le carbone à 30.63 ppm (C-15) présentent une tache de corrélation avec les protons à 1.59 ppm, 1.66 ppm portés par le carbone à 33.23 ppm. Ce dernier est donc en position 16.

En tenant compte de la séquence g et des attributions des protons et des carbones établies précédemment, la structure du composé 5 est donnée dans la figure 49.

Cette structure du composé 5 correspond à l’acide betulinique.

Figure 49 : Structure du composé 5.

Les informations et attributions du composé 5, l’acide betulinique sont rassemblés dans le tableau XI. Ses déplacements chimiques des carbones sont décalés de 0.3 ppm par rapport à ceux de la littérature. Cela est dû probablement par la valeur prise du déplacement chimique de la pyridine lors du calibrage du spectre 13C-Jmod. Cependant, les δ 1H sont parfaitement en accord avec ceux de la littérature (E. Bisoli et al., 2008).

Tableau XI : Données spectrales du composé 5.

Position δH (ppm) δC (ppm) HMBC Cosy δH ; δC (ppm), lit 1 1.01/1.70 39.63 - 2 39.3 2 1.87 28.67 - 1, 3 28.3 3 3.48 78.47 - 2 3.47 ; 78.2 4 - 39.88 - - 39.6 5 0.84 56.27 - 6 56.0 6 1.42/1.58 19.14 - 5, 7 18.8 7 1.44 35.18 - 6 34.9 8 - 41.46 - - 41.2 9 1.40 51.30 - - 51.0 10 - 37.94 - - 37.6 11 1.23/1.46 21.56 - 12 21.3 12 1.22/1.95 26.46 - 11, 13 26.2 13 2.76 38.96 - 12, 18 38.7 14 - 43.20 - - 42.9 15 1.29/1.88 30.63 - 16 31.3 16 1.59/2.66 33.23 - 15 32.9 17 - 56.98 - - 56.7 18 1.78 50.11 13, 17, 19, 13, 19 49.8 20, 28 19 3.56 48.13 - 18, 21, 29 3.55 ; 47.8 20 - 151.69 - 19, 22 152.5 21 1.54/2.26 31.56 - - 31.66 22 1.60/2.27 37.87 - - 37.6 23 1.25 29.02 4, 3, 5, 24 - 1.24 ; 28.7 24 1.03 16.71 4, 3, 5, 23 - 1.02 ; 16.4 25 0.84 16.78 10, 1, 5, 9 - 0.83 ; 16.5 26 1.08 16.78 8, 7, 9, 14 - 1.07 ; 16.5 27 1.09 15.25 14, 8, 13, 15 - 1.08 ; 15.0 28 - 179.23 - - 178.9 29 1.81 19.82 20, 19, 30 - 1.80 ; 19.5 30 4.79/4.97 110.32 - - 4.78/4.96 ; 110.0

III.2.2.2 Identification de E2C1D.

Le chromatogramme GC/MS (figure 50) fait apparaitre deux composés dont le temps de rétention respectif est de 35.835 noté composé 3 et 36.188 min noté composé 4.

Figure 50 : Chromatogramme GC/MS de E2C1D.

 Analyse du spectre de masse du composé 3.

Figure 51 : Spectre de masse en EI du composé 3.

Sur le spectre de masse en impact électronique (EI) en mode positif du composé 3 (figure 51), nous observons l’ion moléculaire M°+ à m/z 426. Le spectre présente, en plus du pic moléculaire, les principaux ions à m/z 218 (100%) et 203 (50%) qui sont caractéristiques des triterpènes pentacycliques possédant une insaturation en position 12-13 (H. Budzikiewicz et coll., 1963). L’abondance à 50% du pic à m/z 203 nous laisse penser qu’il s’agit d’un triterpène pentacyclique de type oléan-12-ène (V. F. C. Ishida et coll., 2011). Les fragments des ions caractéristiques sont illustrés au schéma 6.

La réaction de clivage rétro-Diels-Alder du cycle C de l’ion moléculaire à m/z 426 donne l’ion à m/z 218. Cet ion est accompagné d’ion à m/z 189 constitué par migration d’un atome d’hydrogène de C-15 et de C-21 vers C-17 suivit de rupture de la liaison entre C-17 et C-18 et d’ion à m/z 203 formé par la perte du groupement méthyle en C-17. L’ion à m/z 203 est ensuite accompagné par décomposition du cycle E d’un ion stable à m/z 133.

Le transfert d’un atome d’hydrogène de C-26 vers C-11 suivit de rupture de la liaison entre C-8 et C-14 de l’ion moléculaire à m/z 426 conduit à l’ion à m/z 207 (9%). La perte d’une molécule d’eau de ce dernier indique que les cycles A et B portent un groupement hydroxyle, très probablement en position 3 pour des raisons biogénétiques et donne l’ion à m/z 189.

On peut ainsi supposer la formule brute C30H50O pour le composé 3, soit 6 le nombre d’insaturation ou/et cycle, compatible avec un triterpène pentacyclique.

Schéma 6 : Fragments des ions caractéristiques du composé 3.

 Analyse du spectre de masse du composé 4.

L’analyse du spectre de masse en ionisation impact électronique (EI) en mode positif (figure 52) montre un ion moléculaire M°+ à m/z 426 qui correspond à la formule brute

C30H50O.

Figure 52 : Spectre de masse en EI du composé 4.

Le spectre du composé 4 présente également des ions résultant de la fragmentation de la molécule et notamment l’ion à m/z 207(93%) qui est caractéristique des cycles A et B d’un triterpène (H. Budzikiewicz et coll., 1963) ; la perte par cet ion d’une molécule d’eau donne l’ion à m/z 189 (100%) et indique que les cycles A et B portent un groupement hydroxyle, très probablement en position 3 pour des raisons biogénétiques. L’abondance de ces ions permet de proposer à ce composé la structure d’un triterpène pentacyclique type lupane (A. N. Assimopoulou et coll., 2004). Les fragments des ions caractéristiques sont résumés au schéma 7.

Schéma 7 : Fragmentation donnant les ions caractéristiques du composé 4.

 Spectre RMN 1H de E2CID.

Le spectre RMN 1H de E2CID (figure 53) présente une forêt de pics dans la zone compris entre 0.6 ppm et 2.1 ppm confirmant la structure de triterpène du mélange. Nous observons également la présence du signal d’un groupement hydroxyle à δ 3.17 et les pics oléfiniques à 4.55 ppm, 4.66 ppm indiquant la présence de triterpène type lupéol et à 5.16 ppm désignant la présence de triterpène type oléa-12-ène ou urs-12-ène.

Figure 53 : Spectre de proton de E2C1D.

 Spectre RMN 13C-Jmod de EC1D.

L’analyse du spectre RMN 13C-Jmod (figure 54) indique la présence de pic à 79.23 ppm confirmant la présence de groupement hydroxyle. Nous avons identifié aussi les carbones en position 30 à 109.54 ppm et 12 à 121.93 ppm caractéristiques respectif aux types lupéol et β-amyrine.

Toutes ces interprétations confirment que E2C1D est un mélange de lupéol et β- amyrine (figure 55). Les données spectroscopiques du mélange est conforme aux données de la littérature (A. K. Jamal et coll., 2008).

Figure 54 : Spectre RMN 13C-Jmod de E2C1D.

Figure 55 : Structure de E2C1D mélange de β-amyrine et lupéol.

III.2.3 Détermination structurale des pyranocoumarines.

III. 2.3.1 Identification de E2B4H noté composé 2.

Le composé 2 se présente sous forme de poudre jaune. Il donne une fluorescence bleue en présence de l’ammoniaque sous la lumière UV à 365 ηm indiquant la structure d’une coumarine.

 Spectre RMN de proton du composé 2.

Figure 56: Spectre RMN 1H du composé 2.

L’analyse du spectre RMN 1H (figure 56) indique la présence de deux doublets intégrant chacun pour 2H à 6.95 ppm (J = 8.8 Hz) et 7.47 ppm (J = 8.8 Hz) correspondant aux protons en position ortho l’un par rapport à l’autre d’un aryl para disubstitués.

Nous avons aussi identifié deux autres doublets chacun intégrant pour 1H à 5.76 ppm (J = 10.0 Hz) et à 6.50 ppm (J = 10.0 Hz) correspondant aux protons oléfiniques en position 3’ et 4’ du noyau pyranosyle.

Nous pouvons observer également quatre pics de protons d’un groupement C-prényle : un triplet à 5.21 ppp (1H, J = 7.3 Hz), un doublet à 3.47 ppm (2H, J = 7.4 Hz) et de deux singulets à 1.66 ppm et 1.83 ppm.

Le spectre montre aussi un singulet intégrant pour 1H à 10.03 ppm indiquant la présence d’un groupement hydroxyle, deux singulets intégrant chacun pour 3H à 3.81 ppm et 3.93 ppm correspondant à deux groupements méthoxyles et un singulet intégrant pour 6H à 1.46 ppm correspondant aux protons de deux groupements méthyles en position 2’ du noyau pyranosyle.

Ces informations supposent que le composé 2 est une pyranocoumarine qui est substitué par un C-prényle, un méthoxyle, un hydroxyle et un aryl en para disubstitué.

 Spectre de masse du composé 2.

Figure 57 : Spectre de masse ESI- du composé 2.

L’analyse du spectre de masse en electrospray en mode positif du composé 2 (figure 57) permet d’observé un ion pseudo moléculaire à m/z 449 [M+H]+ suggérant une masse atomique 448 uma. L’ion observé à m/z 897 correspond au dimère [2M+H]+ du composé formé par la source.

 Spectre de RMN 13C-Jmod du composé 2.

Figure 58 : Spectre RMN 13C-Jmod du composé 2.

Le spectre RMN du 13C (figure 58) enregistré en J-modulé indique la présence de 27 atomes de carbones dont 13 carbones quaternaires, 7 méthines (CH), un méthylène (CH2) et 6 méthyles (CH3).

Sur le spectre nous avons identifié la présence d’un groupement carbonyle à 162.68 ppm, de quatre carbones méthines aromatiques deux à deux équivalents à 113.72 ppm et 132.01 ppm, de trois carbones méthines éthyléniques à 115.65 ppm, 121.37 ppm et 131.39 ppm, d’un carbone quaternaire porteur d’un oxygène à 77.46 ppm. Nous pouvons aussi confirmer la présence de deux groupes méthoxyles à 55.47 ppm et 64.55 ppm, de deux carbones méthyliques équivalent à 28.10 ppm, de deux autres carbones méthyliques à 18.17 ppm et 25.58 ppm et d’un carbone méthylénique à 22.06 ppm.

Ces données permettent de proposer pour le composé 2 la formule brute de C27H28O6 avec un nombre d’insaturation ou/et cycle de 14. Cette formule brute est parfaitement en accord avec la masse atomique 448 uma.

100

 Spectre HSQC du composé 2.

Figure 59 : Spectre HSQC du composé 2.

L’interprétation de ce spectre (figure 59) permet d’attribuer les protons aux carbones correspondants. Ainsi, les protons à δ 7.47, 5.76, 5.21, 6.50, 6.95, 3.93, 3.81, 1.46, 1.66, 3.47 et 1.83 ppm sont portés respectivement par les carbones à δ 132.01, 131.39, 121.37, 115.65, 113.72, 64.55, 55.47, 28.10, 25.98, 22.06 et 18.27 ppm.

101

 Spectre COSY du composé 2.

Figure 60 : Spectre Cosy du composé 2.

L’analyse du spectre COSY (figure 60) indique que les protons du noyau aryl para- disubstitué à 6.95 (δC 113.72) et 7.47 ppm (δC 132.02) corrèlent entre eux avec une valeur de J = 8.8 Hz. Ce qui implique qu’ils sont placés en position ortho l’un par rapport à l’autre (séquence 1) d’après leurs valeurs de J.

Séquence 1.

Les deux protons éthyléniques à 5.76 (δC 115.65 ppm) et 6.50 ppm (δC 131.39 ppm) corrèlent entre eux avec une valeur de J = 10 Hz. Ces deux protons sont alors en position cis selon la séquence 2.

102

Séquence 2.

Le proton du méthine à δ 5.21 ppm (δC 121.37 ppm) corrèle avec les protons du groupement méthylène à δ 3.47 ppm (δC 22.06 ppm), d’où la séquence 3 :

Séquence 3.

 Spectre HMBC du composé 2.

Figure 61: Spectre HMBC du composé 2.

103

Le spectre HMBC (figure 61) donne plus d’informations permettant de construire morceau par morceau la structure de la molécule.

Ainsi, les protons aromatiques à δ 7.47 ppm portés par le carbone à δ 132.01 ppm corrèlent au carbone quaternaire à 103.93 ppm et au carbone quaternaire lié à un oxygène à δ 159.04 ppm.

Les autres protons aromatiques à δ 6.95 ppm (δC 113.72 ppm) corrèlent au carbone protoné à δ 113.72 ppm, au carbone quaternaire à δ 123.82 ppm et au carbone quaternaire lié à un oxygène à δ 159.04 ppm.

La grosseur des taches de corrélation permet de suggérer que les protons à δ 7.47 ppm

(δC 132.01 ppm) sont en ortho du carbone à δ 159.04 ppm (petite tache) et en méta par rapport au carbone à δ 123.82 ppm (grosse tache) tandis que les protons à δ 6.95 ppm (δC 113.72 ppm) sont en méta du carbone à δ 159.04 ppm (grosse tache) et en ortho par rapport au carbone à δ 123.82 ppm (petite tache).

Le proton du groupement hydroxyle à δ 10.03 ppm corrèle avec les carbones quaternaires à δ 101.71, 103.93 ppm et le carbone quaternaire lié à un oxygène à δ 160.64 ppm.

Les protons méthyliques à δ 3.81 ppm portés par le carbone à δ 55.47 ppm corrèlent au carbone à δ 159.04 ppm.

En considérant la séquence 1 et les données précédentes, nous avons la séquence 4.

Séquence 4. : Corrélation COSY, : Corrélation HMBC

104

Les protons de deux groupements méthyles à δ 1.46 ppm (δC 28.10 ppm) corrèlent aux carbones méthyliques à δ 28.10 ppm, au carbone quaternaire porteur d’un oxygène à δ 77.46 ppm et au carbone protoné éthylénique à δ 131.39 ppm. Ces deux méthyles sont géminés et sortent sous forme de singulet, ils sont alors en α du carbone quaternaire porteur d’un oxygène à δ 77.46 ppm et en β du carbone protoné éthylénique à δ 131.39 ppm.

Le proton éthylénique à δ 5.76 ppm porté par le carbone à δ 131.39 ppm corrèle aux deux carbones méthyléniques à δ 28.10 ppm, au carbone quaternaire porteur d’un oxygène à δ 77.46 ppm et au carbone quaternaire éthylénique à δ 110.58 ppm. Le proton éthylénique à δ 6.50 ppm porté par le carbone à δ 115.65 ppm corrèle au carbone quaternaire porteur d’un oxygène à δ 77.46 ppm, au carbone quaternaire éthylénique à δ 110.58 ppm et aux carbones quaternaires éthyléniques liés à un atome d’oxygène à δ 150.18 et 154.67 ppm.

Comme ces deux protons éthyléniques sont vicinaux, le carbone quaternaire éthylénique à δ 110.58 ppm est alors en β de celui qui raisonne à δ 5.76 ppm et en α de l’autre. Les carbones quaternaires éthyléniques liés à un atome d’oxygène à δ 150.18 et 154.67 ppm sont ensuite en β du carbone éthylénique protoné à δ 115.65 ppm. Les carbones à δ 77.46, 110.58, 115.65, 131.39 et 154.67 forment avec un atome d’oxygène le noyau pyranosyle.

Les protons méthyliques à δ 3.93 ppm portés par le carbone à δ 64.55 ppm corrèlent au carbone à δ 150.18 ppm.

Toutes ces données et la séquence 2 conduisent à la séquence 5.

Séquence 5. : Corrélation COSY : Corrélation HMBC

105

Les protons du méthyle à 1.66 ppm portés par le carbone 25.98 ppm corrèlent au carbone méthylique à δ 18.27 ppm, au carbone méthinique à δ 121.37 ppm et au carbone quaternaire éthylénique à 132.53 ppm.

Les protons du méthyle à 1.83 ppm portés par le carbone 18.27 ppm corrèlent au carbone méthylique à δ 25.98 ppm, au carbone méthinique à δ 121.37 ppm et au carbone quaternaire éthylénique à 132.53 ppm.

Ces deux méthyles sortent sous forme singulet, il sont alors en α du carbone quaternaire éthylénique à δ 132.53 ppm et en β du carbone méthinique à δ 121.37 ppm. Ce sont deux méthyles géminés.

Les protons du méthylène à δ 3.47 ppm portés par le carbone à δ 22.06 ppm corrèlent au carbone quaternaire à δ 114.95 ppm, au carbone méthinique à δ 121.37 ppm, au carbone quaternaire éthylénique à 132.53 ppm et aux carbones quaternaires à δ 151.52 et 154.67 ppm. Ces deux derniers carbones sont probablement liés chacun à un oxygène. La multiplicité du pic de ce méthylène et la grosseur des taches de corrélation laisse penser qu’il est en α (grosse tache) du carbone méthinique à δ 121.37 ppm et du carbone éthylénique quaternaire à δ 114.95 ppm et en β (petite tache) des carbones éthyléniques quaternaires à δ 132.53, 151.52 et 154.67 ppm. Avec toutes ces attributions et la séquence 3, on a la séquence 6.

Séquence 6. : Corrélation COSY : Corrélation HMBC

La molécule est presque déterminée grâce aux séquence 5 et 6. Il reste les positions 3, 4 et 4a selon la séquence 7.

106

Séquence 7. : Corrélation COSY : Corrélation HMBC

Or le proton du groupement hydroxyle ne corrèle pas avec le carbone quaternaire à δ 162.68 ppm, il doit être distant de ce dernier qu’au moins de quatre liaisons. Ce qui positionne le groupement hydroxyle en 4 et l’aryl en 3. D’où la structure du composé 2 est celle du lonchocarpenine isolé de l’espèce Derris scandes en 1969 (C. P. Falshaw et coll., 1969) selon les a figures 62 et 63.

107

Figure 62 : Corrélations COSY et HMBC du composé 2. : Corrélation COSY : Corrélation HMBC

Figure 63 : Structure du composé 2.

108

Les informations et attributions du composé 2, la lonchocarpenine sont rassemblés dans le tableau XII.

Tableau XII : Données spectrales en RMN du composé 2.

Position δH (H, m, J) δC HMBC Cosy 2 - 162.68 - - 3 - 103.93 - - 4 - 160.64 - - 4a - 101.71 - - 5 - 150.18 - - 6 - 110.58 - - 7 - 154.67 - - 8 - 114.95 - - 8a - 151.52 - - 2’ - 77.46 - - 3’ 5.76, 1H, d, 10 Hz 131.39 2’, 5’, 6 4’ 4’ 6.50, 1H, d, 10 Hz 115.65 2’, 5’, 5, 6, 7 3’ 5’ 1.46, 6H, s 28.10 2’, 3’, 5’ - 1" 3.47, 2H, d, 7.4Hz 22.06 7, 8, 8a, 2", 3" 2" 2" 5.21, 1H, t, 7.3 Hz 121.37 - 1" 3" - 132.53 - - 4" 1.66, s 25.98 2", 3", 4" - 5" 1.83, s 18.27 2", 3", 5" - 1’" - 123.82 - - 2’" et 6’" 7.47, 2H, d, 8.8 Hz 132.01 3, 2’", 3’", 4’" 3’" 3’" et 5’" 6.95, 2H, d, 8.8 Hz 113.72 1’", 2’", 4’" 2’" 4’" - 159.04 - 5-OMe 3.93, s 64.55 5 4-OH 10.03, s - 4 4’"-OMe 3.81, s 55.47 4’"

109

III.2.3.2 Identification de E2DE7A8 noté composé 9.

Le composé 9 se présente sous la forme d’une poudre jaune. L’apparition des fluorescences en milieu alcalin nous indique que ce composé appartient à la famille des coumarines.

 Spectre RMN -1H du composé 9.

Figure 64 : Spectre RMN de proton du composé 9.

Le spectre RMN -1H (figure 64) nous a permis d’identifier par similarité avec le spectre du composé 2 les quatre protons du phényl para-disubstitué (δH à 6.99 et 7.46 ppm) ainsi que les deux protons éthyléniques en position 3’ (δH 5.74 ppm) et 4’ (δH 6.52 ppm) et le proton éthylénique en position 2" (δH 5.28 ppm). De plus nous avons aussi retrouvé les deux méthyles géminés à δ 1.45 ppm placés en position 2’, les deux autres groupements méthyles à δ 1.66 et 1.85ppm placés respectivement en position 4" et 5", le groupement méthylène en position 1" (δH à 3.50 ppm) et le groupement méthoxyle à δ 3.88 ppm situé en position 5.

Toutefois, le spectre proton du composé 9 montre une différence par rapport à celui du composé 2. En effet, on observe la disparition des deux signaux appartenant respectivement aux protons du groupement méthoxyle du phényl para-disubstitué (δH à 3.93 ppm) et au

110 groupe hydroxyle à δH 10.03 ppm, et l’apparition d’un massif à δH 4.18 ppm correspondant au groupe des hydroxyles.

 Spectre RMN 13C-Jmod du composé 9.

Figure 65 : Spectre RMN 13C-Jmod du composé 9.

Sur le spectre de RMN 13C-Jmod (figure 65), nous avons pu distinguer par analogie avec le spectre du composé 2, les neuf atomes de carbone du noyau coumarine à δ 163.23 (C- 2), 104.48 (C-3), 161.34 (C-4a), 151.58 (C-5), 11.30 (C-6), 154.95 (C-7), 114.96 (C-8) et 151.82 ppm (C-8a), le noyau pyranosyle par la présence des carbones 77.87 (C-2’), 131.64 (C-3’), 116.34 (C-4’) et 28.23 ppm (C-5’).

Nous avons aussi confirmé la présence du phényl para disubstitué due aux carbones à δ 122.96 (C-1’’’), 132.79 (C-2’’’ et C-6’’’), 116.12 (C-3’’’ et C-5’’’) et 158.15 ppm (C-4’’’) et du groupement C-prényl par la présence des carbones à δ 22.49 (C-1’’), 122.11 (C-2’’), 132.91 (C-3’’), 26.47 (C-4’’) et 18.58 ppm (C-5’’). Un groupement méthoxyle est observé à δ 64.94 ppm.

111

 Spectre HSQC du composé 9.

Figure 66 : Spectre HSQC du composé 9.

Le spectre HSQC (figure 66) nous a permis d’assigner les signaux de carbones porteurs de protons. Ainsi, les protons à δ 1.45, 1.65, 1.85, 3.50, 3.87, 5.28, 5.74, 6.52, 7.00 et 7.47 ppm sont portés respectivement par les carbones à δ 28.23, 26.47, 18.58, 22.49, 64.94, 122.11, 131.64, 116.34, 116.12 et 132.79 ppm.

112

 Spectre COSY du composé 9.

Figure 67 : Spectre COSY du composé 9.

Nous observons que le spectre Cosy (figure 67) du composé 9 est tout à fait similaire à celui obtenu pour le composé 2. En effet, on retrouve les corrélations entre les protons à δ 7.00 et 7.47 ppm du phényl para disubstitué, entre les protons éthyléniques à δ 5.74 et 6.52 ppm du noyau pyranosyle et entre les protons à δ 3.50 et 5.28 ppm du groupement C-prényle.

113

 Spectre HMBC du composé 9.

Figure 68 : Spectre HMBC du composé 9.

Le spectre HMBC (figure 68) nous a permis de retrouver les corrélations existantes entre les protons et les carbones du phényl para disubstitué : d’une part les protons à δ 7.00 ppm (2H, d, J = 8.8 Hz, δC 116.12 ppm) corrèlent avec les carbones à δ 122.96 (=Cq, tache intense) et 158.15 ppm (=Cq), et d’autre part les protons à δ 7.47 ppm (2H, d, J = 8.8 Hz, δC 132.96 ppm) corrèlent aux carbones à δ 104.48 (=Cq), 132.57 (=CH) et 158.15 ppm (=Cq, tache intense). La valeur δ déblindé de ce dernier laisse supposer qu’il est lié à un groupement hydroxyle. Cela nous permet d’attribuer les protons et les carbones appartenant à ce noyau selon la séquence 1’.

114

Séquence 1’. : Corrélation COSY : Corrélation HMBC

Nous avons observé les corrélations entre les protons géminés à δ 1.45 ppm (6H, s, δC 28.23 ppm) et les carbones à δ 77.87 (Cq-O) et 131.64 ppm (=CH). Nous retrouvons aussi les corrélations observés entre les protons et les carbones du noyau pyranosyle : les protons à δ

5.74 ppm (1H, d, J = 10.0 Hz, δC 131.64 ppm) corrèlent aux carbones à δ 77.87 (Cq-O),

151.58 (=Cq-O) et 154.95 ppm (=Cq-O), et les protons à δ 6.52 ppm (1H, d, J = 10.0 Hz, δC 116.34 ppm) corrèlent aux carbones à δ 77.87 (Cq-O) et 111.30 ppm (Cq=). De plus, nous avons aussi distingué la corrélation du groupement méthyle à δ 3.87 ppm (3H, s, δC 64.94 ppm) avec le carbone à δ 151.58 ppm (=Cq-O). D’où la séquence 2’ :

Séquence 2’. : Corrélation COSY : Corrélation HMBC

Nous avons pu retrouver les corrélations entre les protons et les carbones du groupement C-prényle. En effet, les protons à δ 3.50 ppm (2H, d, J = 7.4 Hz, δC 22.49 ppm) corrèlent avec les carbones à δ 114.96 (=Cq), 122.11 (=CH), 132.91 (=Cq), 151.82 (=C-O) et 154.95 ppm (=C-O). La séquence 3’ montre les corrélations de ce groupement.

115

Séquence 3’. : Corrélation COSY : Corrélation HMBC

En considérant la valeur δ à 104.48 ppm qui correspond à celle du carbone en position 3, les séquences 1’, 2’ et 3’, nous avons la séquence 4’ :

Séquence 4’. : Corrélation COSY : Corrélation HMBC

Il reste à placer les carbones qaternaires à δ 102.31 et 161.34 ppm. Ce dernier est probablement lié à un hydroxyle à cause de son δ très déblindé. Par conséquent, le carbone quaternaire à δ 102.31 est attribué à C-4a tandis que celui à 161.34 ppm est assigné à C-4. D’où la structure du composé 9 est réconnu comme étant un acide lonchocarpique isolé chez Lonchocarpus sp. en 1934 (H. A. Jones et al., 1934) selon les figures 69 et 70.

116

Figure 69 : Les corrélations COSY et HMBC observées sur le composé 9. : Corrélation COSY : Corrélation HMBC

Figure 70 : Structure du composé 9.

117

Les informations et attributions du composé 9, l’acide lonchocarpique sont rassemblés dans le tableau XIII.

Tableau XIII : Données spectrales en RMN du composé 9.

Position δH (H, m, J) δC HMBC COSY 2 - 163.23 - - 3 - 104.48 - - 4 - 161.34 - - 4a - 102.31 - - 5 - 151.58 - - 6 - 111.30 - - 7 - 154.95 - - 8 - 114.96 - - 8a - 151.82 - - 2’ - 77.87 - - 3’ 5.74, 1H, d, 10 Hz 131.64 2’, 5’ 4’ 4’ 6.52, 1H, d, 10 Hz 116.34 5, 7, 2’, 5’ 3’ 5’ 1.45, 6H, s 28.23 2’, 3’ - 1" 3.50, 2H, d, 7.4Hz 22.49 7, 8, 8a, 2", 3" 2" 2" 5.28, 1H, t, 7.4 Hz 122.11 - 1" 3" - 132.91 - - 4" 1.65, s 26.27 2", 3" - 5" 1.85, s 18.58 2", 3" - 1’" - 122.96 - - 2’" et 6’" 7.47, 2H, d, 8.8 Hz 132.79 3, 2’", 4’" 3’" 3’" et 5’" 7.00, 2H, d, 8.8 Hz 116.12 1’", 4’" 2’" 4’" - 158.15 - 5-OMe 3.87, s 64.94 5

118

CONCLUSION

119

Notre investigation consiste à l’étude chimique et biologique d’une espèce endémique de Madagascar, Millettia richardiana Baill.

Le partage liquide-liquide avec des solvants non miscibles entre eux de l’extrait méthanolique de l’écorce des tiges de Millettia richardiana a aboutit à un extrait E2 antiprotozoaire très prometteuse. Il est actif contre les parasites de P. falciparum Fcm29, de L. donovani et de T. brucei brucei, avec une activité cytotoxique faible sur les lignées cellulaires KB, Vero et MRC5.

Ces résultats soutiennent le potentiel pharmacologique du genre Millettia en tant qu’une plante antiparasitaire et ouvrent un chemin de valorisation d’une plante inconnue en médecine traditionnelle.

L’extrait actif E2 a fait l’objet d’une étude plus approfondies. Il renferme 84g de solutés, ce qui correspond à un rendement d’extraction de 8.4%.

Ainsi, la chromatographie successive de cet extrait dichlorométhanique a conduit :

- à l’isolement d’un α-palmityl-α’,β-linoléyl triglycérols, d’un lonchocarpenine, d’un acide betulinique et d’un acide lonchocarpique,

- à l’identification d’un mélange de β-amyrine et de lupéol, et d’un autre mélange d’acide palmitique, d’acide stéarique et d’acide linoléique.

Les structures de ces composés ont été établies sur la base de techniques spectroscopiques :

- la spectroscopie de masse en mode EI qui a permis de déterminer le poids moléculaire ainsi que la formule brute et d’indiquer la structure,

- la spectroscopie de masse en mode ESI positif qui a permis d’établir le poids moléculaire ainsi que la formule brute,

- les spectres RMN 1H, 13C-Jmod, COSY, HSQC, HMBC.

A part le lupéol et le β-amyrine, ces composés sont isolés pour la première fois dans le genre Millettia.

120

Notre travail a contribué à l’étude biologique et phytochimique d’une plante endémique de Madagascar et à la valorisation des plantes non mentionnées en médecine traditionnelle.

Par la suite, il sera nécessaire de chercher à déterminer les molécules responsables des activités de Millettia richardiana. Pour cela, nous réaliserons des tests d’activités par des méthodes in vitro, d’abord sur les molécules isolées, puis sur les fractions purifiées.

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106- A. Yenesew, S. Derese, J. O. Midiwo, H. A. Oketch-Rabah, J. Lisgarten, R. Palmer, M. Heydenreich, M. G. Peter, H. Akala, J. Wangui, P. Liyala, N. C. Waters, 2003. Anti-plasmodial activities and X-ray crystal structures of rotenoids from Millettia usaramensis subspecies usaramensis. Phytochemistry 64, 773-779.

107- A. Yenesew, S. Derese, J. O. Midiwo, M. Heydenreich, M. G. Peter, 2003. Effect of rotenoids from the seeds of Millettia dura on larvae of Aedes aegypti. Pest Manag Sci 59,1159–1161.

132

108- A. Yenesew, J. O. Midiwo, P. G. Waterman, 1996. Four isoflavones from seed pods of Millettia dura. Phytochemistry 41(3), 951-955.

109- A. Yenesew, J. O. Midiwo, P. G. Waterman, 1998. Rotenoids, isoflavones and chalcones from the steam bark of Millettia usaramensis subspecies usaramensis. Phytochemistry 47(2), 295-300.

110- T. Yin, G. Tu, Q. Zhang, B. Wanga, Y. Zhao, 2008. Three new phenolic glycosides from the caulis of Millettia speciosa. Magnetic Resonance in Chemistry 46, 387- 391.

111- C. Zinsou, 2010. http://calamar.univ-ag.fr/deugsv/Documents/Cours/Bioch- Zinsou/Lipidsynt10.pdf.

112- G. N. Zirihi, L. Mambu, F. Guédé-Guina, B. Bodo, P. Grellier, 2005. In vitro antiplasmodial activity and cytotoxicity of 33 West African plants used for treatment of malaria. Journal of Ethnopharmacology, 98, 281-285.

113- http://fr.wikipedia.org/wiki/Cytotoxicit%C3%A9

114- http://www.herbes-medicinales.ca/proprietes/plante-antifongique.html

115- http://www.sheabutter.com/FrShea/AGNomenclature.htm

133

ANNEXES

134

Publication.

J. T. Banzouzi, A. Prost, M. Rajemiarimiraho, P. Ongoka, 2008. Traditional Uses of the African Millettia species (Fabaceae). International Journal of Botany 4(4), 406-420.

135

Spectres RMN 1H élargis du composé 1.

136

137

Spectres RMN 13C-Jmod élargis du composé 1.

138

Spectres RMN 1H élargis du composé 2.

139

Spectres RMN 13C-Jmod élargis du composé 2.

140

Spectre RMN 13C-Jmod élargi du composé 9.

141

Données spectrales des composés obtenus

Données spectrales du composé 1, α-palmityl-β,α’-dilinoléylglycérol.

1 Liquide jaune huileux. RMN H (400 MHz dans CDCl3), δ ppm : 5.23- 5.28 (1H, m, H-α), 4.24 (2H, dd, J 11.90 et 5.95 Hz, H-β), 4.08 (2H, dd, J 11.90 et 5.95 Hz, H-α’), 5.28-5.41 (8H, m, H-9b,c, H-10b,c, H-12b,c, H-13b,c), 2.76 (2H, t, J 6.50 Hz, H- 11b,c), 2.31 (2H, t, J 7.56 Hz, H-2a), 2.30 (4H, t, J 7.59 Hz, H-

2b,c), 2.04 (8H, q, J 6.90 Hz, H-8b,c, H-14b,c), 1.60 (6H, m, H-3), 1.12-1.31 (52H, m, H-4a à H-15a, H-4b,c à H-7b,c, H-15b,c à H-17b,c), 0.85 (9H, m, H-16a, H-18b,c). 13 RMN C-Jmod (400 MHz dans CDCl3), δ ppm : 173.25 (C-1b,c), 172.81 (C-1a),

130.21 (C-9b,c), 129.99 (C-10b,c), 128.06 (C-12b,c), 127.88 (C-13b,c), 68.88 (C-α),

62.09 (C-α’, C-β), 34.18 (C-2a), 34.02 (C-2b,c), 31.91 (C-4b,c à C-7b,c), 28.79-

29.77 (C-15b,c à C-17b,c), 27.03 (C-8b,c, C-14b,c), 25.61 (C-11b,c), 24.83 (C-3),

22.54 (C-4a à C-15a), 14.07 (C-16a, C-18b,c).

Données spectrales du composé 2, lonchocarpenine.

C 27H28O6, poudre jaune, point de fusion : 181-182. EIMS m/z : 449, 450, 1 471, 451, 897, 898, 899. RMN H (400 MHz dans CDCl3), δ ppm : 10.03 (4- OH), 7.47 (1H, d, J 8.8 Hz, H-2’"), 7.47 (1H, d, J 8.8 Hz, H-6’"), 6.95 (1H, d, J 8.8 Hz, H-3’"), 6.95 (1H, d, J 8.8 Hz, H-5’"), 6.50 (1H, d, J 10 Hz, H-4’), 5.76 (1H, d, J 10 Hz, H-3’), 5.21 (1H, t, J 7.3 Hz, H-2"), 3.93 (3H, s, 5-OMe), 3.81 (3H, s, 4’"-OMe), 3.47 (2H, d, J 7.4 Hz, H-1"), 1.83 (3H, s, H-5"), 1.66 (3H, s, 13 H-4"), 1.46 (6H, s, H-5’). RMN C-Jmod (400 MHz dans CDCl3), δ ppm : 162.68 (C-2), 160.64 (C-4), 159.04 (C-4’"), 154.67 (C-7), 151.52 (C-8a), 150.18 (C-5), 132.53 (C-3"), 132.01 (C-6’"), 132.01 (C-2’"), 131.39 (C-3’), 123.82 (C- 1’"), 121.37 (C-2"), 115.65 (C-4’), 114.95 (C-8), 113.72 (C-3’"), 113.72 (C-5’"), 110.58 (C-6), 103.93 (C-3), 101.71 (C-4a), 77.46 (C-2’), 64.55 (5-OMe), 55.47 (4’"-OMe), 28.10 (C-5’), 25.98 (C-4"), 22.06 (C-1"), 18.27 (C-5").

142

Données spectrales du composé 3, β-amyrine.

C 30H50O, poudre blanche. EIMS m/z : 43, 55, 69, 95, 117, 135, 161, 189, 1 203, 218, 257, 295, 325, 355, 393, 426. RMN H (400 MHz dans CDCl3), δ 13 ppm : 5.16 (H-12), 3.17 (3-OH). RMN C-Jmod (400 MHz dans CDCl3), δ ppm : 121.93 (C-12), 79.23 (C-3).

Données spectrales du composé 4, lupéol.

C 30H50O, poudre blanche. EIMS : 43, 55, 69, 95, 117, 135, 161, 189, 203, 218, 236, 257, 286, 295, 315, 344, 370, 393, 412, 426. RMN 1H (400 MHz dans 13 CDCl3), δ ppm : 4.55 (H-30a), 4.56 (H-30b), 3.17 (3-OH). RMN C-Jmod (400

MHz dans CDCl3), δ ppm : 151.33 (C-20), 109.54 (C-30), 79.23 (C-3).

Données spectrales du composé 5, acide betulinique.

Solide blanc amorphe, Point de fusion : 281-282°C. RMN 1H (400 MHz dans C5D5N), δ ppm : 4.97 (1H, m, H-30a), 4.79 (1H, m, H-30b), 3.56 (1H, m, H-

19), 3.48 (1H, t, J 8 Hz, H-3), 2.76 (1H, m, H-13), 2.66 (1H, m, H-16a), 2.27

(1H, m, H-22a), 2.26 (1H, m, H-21a), 1.95 (1H, m, H-12a), 1.88 (1H, m, H-15a),

1.87 (2H, m, H-2), 1.81 (3H, s, H-29), 1.78 (1H, m, H-18), 1.70 (1H, m, H-1a),

1.60 (1H, m, H-22b), 1.59 (1H, m, H-16b), 1.58 (1H, m, H-6a), 1.54 (1H, m, H-

21b), 1.46 (1H, m, H-11a), 1.44 (2H, m, H-7), 1.40 (1H, m, H-9), 1.42 (1H, m,

H-6b), 1.29 (1H, m, H-15b), 1.25 (3H, s, H-23), 1.23 (1H, m, H-11b), 1.22 (1H, m, H-12b), 1.09 (3H, s, H-27), 1.08 (3H, s, H-26), 1.03 (3H, s, H-24), 1.01 (1H, 13 m, H-1b), 0.84 (1H, m, H-5). RMN C-Jmod (400 MHz dans C5D5N), δ ppm : 179.23 (C-28), 151.69 (C-20), 110.32 (C-30), 78.47 (C-3), 56.98 (C-17), 56.27 (C-5), 51.30 (C-9), 50.11 (C-18), 48.13 (C-19), 43.20 (C-14), 41.46 (C-8), 39.88 (C-4), 39.63 (C-1), 38.96 (C-13), 37.94 (C-10), 37.87 (C-22), 35.18 (C-7), 33.23 (C-16), 31.56 (C-21), 30.63 (C-15), 29.02 (C-23), 28.67 (C-2), 26.46 (C-12), 21.56 (C-11), 19.82 (C-29), 19.14 (C-6), 16.78 (C-25), 16.78 (C-26), 16.71 (C- 24), 15.25 (C-27).

143

Données spectrales du composé 6, acide palmitique.

C16H32O2, liquide jaune huileux. EIMS : 43, 45, 57, 59, 71, 73, 85, 87, 99, 101, 115, 129, 143, 157, 171, 185, 199, 213, 227, 239, 256. RMN 1H (400 MHz dans CDCl3), δ ppm : 2.34 (2H, t, J 6.70 Hz, H-2), 1.62 (2H, m, H-3), 1.19-1.39 13 (24H, m, H-4 à H-15), 0.86 (H-16). RMN C-Jmod (400 MHz dans CDCl3), δ ppm : 180.01 (C-1), 14.08 (C-16).

Données spectrales du composé 7, acide linoléique.

C18H36O2, liquide jaune huileux. EIMS : 41, 55, 67, 81, 95, 109, 123, 136, 150, 164, 173, 182, 196, 207, 220, 256, 264, 280. RMN 1H (400 MHz dans

CDCl3), δ ppm : 5.33 (4H, m, H-9, H-10, H-12, H-13), 2.76 (2H, t, J 6.01 Hz, H-11), 2.34 (2H, t, J 7.20 Hz, H-2), 2.04 (4H, q, J 6.42 Hz, H-8, H-14), 1.62 (2H, m, H-3), 1.19-1.39 (14H, m, H-4 à H-7, H-15 à H-17), 0.86 (H-18). RMN 13 C-Jmod (400 MHz dans CDCl3), δ ppm : 179.96 (C-1), 130.44 (C-9), 130.34 (C-10), 128.28 (C-12), 128.11 (C-13), 14.08 (C-18).

Données spectrales du composé 8, acide stéarique.

C18H32O2, liquide jaune huileux. EIMS : 43, 45, 57, 59, 71, 73, 85, 87, 99, 101, 115, 129, 143, 157, 171, 185, 199, 213, 227, 241, 255, 284. RMN 1H (400

MHz dans CDCl3), δ ppm : 2.34 (H-2), 1.62 (H-3), 1.25 (H-4 à H-15), 0.86 (H- 13 16). RMN C-Jmod (400 MHz dans CDCl3), δ ppm : 180.01 (C-1), 14.08 (C- 16).

Données spectrales du composé 9, acide lonchocarpique.

Poudre jaune, point de fusion : 210-212. RMN 1H (400 MHz dans

C5D5N), δ ppm : 7.47 (1H, d, J 8.8 Hz, H-2’"), 7.47 (1H, d, J 8.8 Hz, H-6’"), 7.00 (1H, d, J 8.8 Hz, H-3’"), 7.00 (1H, d, J 8.8 Hz, H-5’"), 6.52 (1H, d, J 10 Hz, H-4’), 5.74 (1H, d, J 10 Hz, H-3’), 5.28 (1H, t, J 7.4 Hz, H-2"), 3.87 (3H, s, 5-OMe), 3.50 (2H, d, J 7.4 Hz, H-1"), 1.85 (3H, s, H-5"), 1.65 (3H, s, H-4"),

144

13 1.45 (6H, s, H-5’). RMN C-Jmod (400 MHz dans C5D5N), δ ppm : 163.23 (C- 2), 161.34 (C-4), 158.15 (C-4’"), 154.95 (C-7), 151.82 (C-8a), 151.58 (C-5), 132.91 (C-3"), 132.79 (C-6’"), 132.79 (C-2’"), 131.64 (C-3’), 122.96 (C-1’"), 122.11 (C-2"), 116.34 (C-4’), 114.96 (C-8), 116.12 (C-3’"), 116.12 (C-5’"), 111.30 (C-6), 104.48 (C-3), 102.31 (C-4a), 77.87 (C-2’), 64.94 (5-OMe), 28.23 (C-5’), 26.27 (C-4"), 22.49 (C-1"), 18.58 (C-5").

145

Auteur : RAJEMIARIMIRAHO Manitriniaina Titre : CONTRIBUTION A L’ETUDE CHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DE Millettia richardiana Baill. (FABACEAE). Nombre de pages : 145 Nombre de schémas : 7 Nombre de diagrammes : 11 Nombre de tableaux : 13 Nombre de figures : 70 RESUME Mots clés: Fabaceae, Millettia richardiana, antiparasitaires, antifongiques, cytotoxicités, GC-MS, LC-MS, RMN 1D, RMN 2D. Millettia richardiana Baill. (Fabaceae) est une plante endémique de Madagascar et traditionnellement utilisée comme bois d’œuvre. Cependant, les espèces africaines ont montrées de nombreuses propriétés pharmacologiques et diverses structures chimiques. L’étude biologique préliminaire a permis de mettre en évidence les activités antiparasitaires, antifongiques et cytotoxicités in vitro de l’extrait méthanolique de l’écorce des tiges de M. richardiana. A partir de l’extrait dichlorométhanique : α-palmityl-β,α’-dilinoléylglycérol, , lonchocarpenine, acide palmitique, acide stéarique, acide linoléique, acide betulinique, β- amyrine, lupéol et acide lonchocarpique ont été identifiés par l’interprétation des spectres de RMN 1D (1H et 13C-Jmod) et 2D (COSY, HSQC et HMBC) et des spectres de masse. ABSTRACT Key words: Fabaceae, Millettia richardiana, antiparasitic, antifungal, cytotoxicity, GC-MS, LC-MS, NMR 1D, NMR 2D. Millettia richardiana Baill. (Fabaceae) is an endemic plant of Madagascar and used traditionally as wood construction. However, the African species showed large pharmacological properties and various chemical structures. The preliminary biological studies permitted to put in evidence the activities antiparasitic, antifungal and cytotoxicity in vitro of the methanolic extrait of the stems barks of M. richardiana Baill. From dichloromethanic extrait : α-palmitoyl-β-α’-dilinoléylglycérol, lonchocarpenin, palmitic acid, stéaric acid, linoléic acid, betulinic acid, β- amyrine, lupéol and lonchocarpic acid were identified by the interpretation of the spectra of NMR 1D (1H and 13C-Jmod) and 2D (COSY, HSQC and HMBC) and of the mass spectra.

Directeur de thèse : Monsieur RANDRIANJA Roger Professeur Titulaire à l’Ecole Supérieure Polytechnique de l’Université d’Antananarivo Madame RAHARISOLOLALAO Amélie Professeur Emérite à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo

Adresse : AS 357 Ambohipanja Ankadikely Ilafy Email : [email protected] Tél : 00 261 34 64 759 52

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