UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR ÁREA DE CONOCIMIENTOS DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA

TESIS: EVALUACIÓN DEL POTENCIAL DE Sargassum lapazeanum Setchell & N.L. Gardner (Ochrophyta: Fucales, Phaeophyceae) COMO FUENTE DE COMPUESTOS ANTIBACTERIANOS, ANTIOXIDANTES Y ANTICOAGULANTES.

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: BIÓLOGA MARINA

PRESENTA: VALERIA ALEXANDRA VILLEGAS SILVA

DIRECTOR: DR. MAURICIO MUÑOZ OCHOA

LA PAZ, B.C.S., MÉXICO. JUNIO DE 2014

Agradecimientos

Este proyecto se realizó en las instalaciones del Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Mauricio Muñoz Ochoa, financiado por el proyecto "Sargassum lapazeanum como fuente de compuestos bioactivos” IPN-SIP20131037”.

Al Dr. Mauricio Muñoz Ochoa por su incondicional apoyo y paciencia, así como por su orientación y guía en laboratorio durante las pruebas realizadas incluso en momentos de desesperación académica. Gracias por enseñarme las bases de la química de productos naturales, motivándome siempre a seguir adelante.

A la Dra. Gabriela Andrade Sorcia, por la agradable lección de botánica y la identificación taxonómica del alga. A mi comité de tesis Dr. Rafael Riosmena Rodríguez, Dr. Juan Manuel López Vivas, Dra. Gabriela Andrade Sorcia y Dr. Jesús Iván Murillo Álvarez por sus acertados comentarios y observaciones, así como el tiempo y dedicación a la hora de aclarar dudas.

A las M. en C. Yoloxochitl Elizabeth Rodríguez Montesinos y Dora Luz Arvizu Higuera por el apoyo, la confianza y las facilidades que me permitieron disponer del laboratorio hasta altas horas de la noche. Asimismo agradezco a mis compañeros de laboratorio de química de algas por hacer del tiempo trabajando algo más ameno.

Finalmente a aquellas personas que me apoyaron y confiaron en mí durante la realización de este proyecto, principalmente mis hermanos y amigos por escucharme cuando más lo necesite y acompañarme a lo largo de este proceso, muchas gracias.

“... pero sus estridentes ladridos sólo son señal de que cabalgamos.”

(Goethe, 1808).

RESUMEN

La península de Baja California cuenta con una gran variedad de hábitats y condiciones climáticas, por lo que alberga una enorme riqueza de algas marinas destacando la presencia de las algas pertenecientes al género Sargassum por su alta dominancia en biomasa. (Suárez Castillo et al., 2013). Se seleccionó la especie Sargassum lapazeanum, para el estudio de su potencial actividad biológica como fuente de compuestos con actividad antibacteriana, antioxidante y anticoagulante. Los resultados obtenidos indican que el extracto etanólico de S. lapazeanum, así como sus diferentes fracciones presentan una actividad selectiva contra bacterias del género Vibrio como V. harveyi y V. parahaemolyticus, además de actividad secuestrante de radicales libres en la -1 mayoría de los extractos analizados, obteniendo la menor EC50=39.96 µg mL a partir de F6. Por su parte el fucoidan crudo y sus fracciones mostraron valores comparables a los observados por la heparina a concentraciones de 10 µgmL-1. Finalmente el análisis estructural del fucoidan demostró que se trata de un heterofucano con sustituciones de grupos sulfato en posición C4 mayoritariamente.

Palabras clave: actividad biológica, algas pardas, caracterización, proximal, fucoidan.

ÍNDICE

Páginas

LISTA DE FIGURAS I LISTA DE TABLAS III LISTA DE ABREVIACIONES IV GLOSARIO V

I. INTRODUCCIÓN 1

II. ANTECEDENTES 2 1. Análisis del potencial antibacteriano 3 1.1. Antibacterianos y su clasificación 4 1.2. El género Sargassum como fuente de compuestos con 5 actividad antibacteriana.

2. Análisis del potencial antioxidante 6 2.1. Radical libre DPPH 6 2.2. Algas del género Sargassum como fuente de compuestos 7 antioxidantes

3. Análisis del potencial anticoagulante 9 3.1. Polisacáridos sulfatados: Fucoidan y actividad anticoagulante 9 en phaeophytas 3.2. Mecanismos de coagulación sanguínea 12 3.3. Evaluación de la actividad anticoagulante 16 III. JUSTIFICACIÓN 18 IV. OBJETIVOS 21 V. MATERIAL Y MÉTODOS 22 1. Recolección e identificación taxonómica 22 2. Análisis proximal del alga S. lapazeanum 23 3. Obtención del extracto 23 3.1. Obtención del extracto etanólico 23 3.2. Obtención del extracto acuoso: Fucoidan 23

4.1. Fraccionamiento por gradiente de polaridad 26 4.2. Fraccionamiento de F2 en columna cromatográfica 26 4.3 Purificación parcial del fucoidan 26 5. Pruebas de actividad biológica 26 5.1. Evaluación de la actividad secuestrante de radicales libres 26 (DPPH): análisis del potencial antioxidante 5.2. Evaluación de la actividad antibacteriana por medio del método 28 de difusión en agar con discos

5.3. Análisis de la actividad anticoagulante 28 6. Caracterización parcial del fucoidan 29 VI. RESULTADOS 30 1. Análisis proximal 30 2. Análisis de la actividad biológica 30 2.1. Actividad antibacteriana 32 2.2. Actividad secuestrante de radicales libres 34 2.3 Actividad anticoagulante 35 VII. DISCUSIÓN

1. Análisis proximal 36 2. Análisis de la actividad antibacteriana 37 3. Análisis de la actividad antioxidante 41 4. Análisis de la actividad anticoagulante 44 4.1 Caracterización parcial del fucoidan 44 4.2. Ensayo de actividad anticoagulante. 46 VIII. CONCLUSIONES 50 IX. BIBLIOGRAFÍA 51 X. ANEXOS 64

LISTA DE FIGURAS

Páginas

Figura 1. Estructura química del dioctil ftalato 5 Figura 2. Difenilpicrilhidracilo (radical libre). 7 Figura 3. Difenilpicrilhidracina. 7 Figura 4. Estructura de algunos compuestos químicos aislados a partir de especies del género Sargassum: A) sargothunbergol-A, B y C) 8 Tetrapreniltoluquinoles, D Y E) monogalactosil-diacilgliceroles.

Figura 5. Estructura química promedio del fucoidan. 10 Figura 6. Diagrama que muestra la cascada de coagulación. Imagen 13 tomada de Martínez-Murillo (2003). Figura 7. Vía afectada por la prueba de tiempo de protrombina. Imagen 17 tomada de Kitchen et al. (2010). Figura 8. Mapa que muestra la zona de recolecta del alga S. lapazeanum en San Juan de la Costa, Bahía de La Paz B.C.S, México. 22 Modificado a partir de NOAA: http://www.ngdc.noaa.gov/mgg/ shorelines/shorelines.html. Figura 9. Obtención del extracto crudo (EC) y fraccionamiento del alga S. 24 lapazeanum. Figura 10. Esquema que muestra el proceso de obtención y 25 fraccionamiento del fucoidan. Figura 11. Cromatografía en placa fina que muestra la actividad antioxidante de S. lapazeanum por el método bioautográfico, 32 revelada con una solución de DPPH al 0.4%. E.E.C= Extracto crudo.

Figura 12. Gráfica comparativa de los valores obtenidos para las EC50 en . las fracciones obtenidas por gradiente de polaridad a partir de 32 S. lapazeanum. 1= Menor polaridad, 7= Mayor polaridad E.EC.= Extracto Crudo.

I

Figura 13. Curva dosis efecto la fracción F6 de S. lapazeanum, donde se observa el porcentaje de reducción del DPPH (%) en relación a la concentración del extracto (µg mL-1). En negro: línea de 33 tendencia y desviación estándar. En rojo: concentración efectiva

media (EC50). Figura 14. Curva dosis efecto del ácido ascórbico (AA), utilizada como blanco de comparación, donde se observa el porcentaje de reducción del DPPH (%) en relación a la concentración del AA 33 (µg mL-1). En negro: línea de tendencia y desviación estándar. -1 EC50, obteniendo por extrapolación= 1.5 µg mL Figura 15. Gráfico que muestra la relación entre la concentración de los extractos obtenidos a partir de la precipitación fraccionada del 35 Fucoidan (FC) de S. lapazeanum y su efecto sobre el tiempo normal de coagulación según el ensayo de TTPA36 Figura 16. Espectros de FTIR-ATR de las fracciones obtenidos por precipitación fraccionada del extracto acuoso (Fucoidan) de S. 44 lapazeanum: FC1, FC2 y FC3 en la región de los 500-1800cm-1.

II

LISTA DE TABLAS

Páginas

Tabla I. Estudios realizados con el alga Sargassum lapazeanum 4 Tabla II. Listado de algunas especies del género Sargassum que han 12 presentado actividad anticoagulante. Tabla III. Nombre y función de los diferentes factores y cofactores que 14 actúan en las diferentes etapas de la cascada de coagulación15 Tabla IV. Resultados de análisis proximal del alga S. lapazeanum. 30 Tabla V. Resultados de la prueba de difusión en agar con discos [2 mg/disco] del extracto crudo y las fracciones obtenidas a partir de 31 S. lapazeanum. Se reporta el promedio del halo de inhibición en milímetros ± sd, n = 2. Tabla VI. Resultados de la prueba de difusión en agar con discos [2 mg/disco] del fraccionamiento del extracto F2 obtenido a partir de 31 S. lapazeanum. Se reporta el promedio del halo de inhibición en milímetros ± sd, n = 2. Tabla VII. Actividad anticoagulante de los extractos obtenidos por 34 precipitación fraccionada a partir de S. lapazeanum Tabla VIII. Comparación de actividad de los extractos acuosos obtenidos a

partir de Sargassum lapazeanum en el ensayo de tiempo de 46 protrombina (TP)47 Tabla IX. Listado de algunos valores de TP y TPPA reportados para algas 47 del género Sargassum

III

LISTA DE ABREVIACIONES

CH2Cl2 Diclorometano

BHA Butil-hiroxi-anisol

BHT Butil-hidroxi-tolueno

DPPH 2,2-difenil-1-pricilhidracilo

ECV Enfermedades Cardio Vasculares

ELN Extracto libre de Nitrógeno

ERO Especies Reactivas de Oxígeno

EtOH Etanol

IR Espectroscopia de infrarrojo

H2O Agua

MEtOH Metanol

TIH Trombocitopenia inducida por heparina

TLC Cromatografía en placa fina, del inglés: Thin Layer Cromatography.

TTPA Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada

TP Tiempo de Protrombina

PS Polisacáridos sulfatados

IV

GLOSARIO

Absorbancia Medida de la fracción de luz que es absorbida por una muestra.

Aerocistos Estructuras vegetativas que contienen gas nitrógeno y contribuyen a la flotación del alga.

Antibacteriano Químicos que ayudan a eliminar bacterias patógenas para los organismo.

Anticoagulante Sustancia que prolonga el tiempo de coagulación de la sangre.

Antioxidante Cualquier sustancia, ya sea sintética o natural, que al encontrarse concentraciones menores en relación a las del sustrato oxidable retrasará o inhibirá de manera significativa la oxidación de éste.

Cininógeno Proteína plasmática que existe normalmente en el plasma.

Estipe Eje principal cilíndrico y ramificado que le proporciona flexibilidad y rigidez al talo.

Espectroscopia Técnica analítica experimental que se basa en detectar la

absorción de la radiación electromagnética, y relacionarla con

los niveles de energía implicados en la transición cuántica

Extrínseca Vía dependiente del factor tisular (FT).

Filoides Estructuras fotosintéticas con apariencia de hojas.

Hemodiálisis Paso de la sangre a través de membranas semipermeables para liberarla de productos nocivos de bajo peso molecular, como la urea.

V

Hemostasia Fenómeno fisiológico que detiene el sangrado.

Hirudina Polipéptido de 65 residuos aislado de las glándulas salivales de las sanguijuelas. Es un inhibidor específico de la trombina.

Intrínseca La vía intrínseca recibió este nombre debido a que todos los componentes necesarios se encontraban presentes en la sangre.

Precalicreína Proteína plasmática precursora de la calicreína, enzima que a su vez activa el factor FXII, su ausencia en plasma produce anormalidades en la formación de tromboplastina y en la generación de cinina.

Radicales libres Átomos o moléculas con un electrón impar que es extremadamente reactivo y capaz de participar en cadenas de reacción rápida que desestabilizan otras moléculas y generan la formación de muchos otros radicales libres.

Sujetador Parte del talo que sirve para el anclaje del mismo al sustrato.

Zimógenos Precursores enzimáticos. Durante las diferentes etapas de la coagulación se convierten de pro-enzimas a enzimas activas.

Trombocitopenia inducida por heparina (TIH) Trombosis inducidas por el uso de heparina.

VI

I. INTRODUCCIÓN

Sargassum C. Agardh es un género de algas café (Phaeophyceae) que cuenta con al menos 335 especies aceptadas taxonómicamente (Guiry y Guiry, 2013), lo que lo convierte en el más abundante dentro del orden de los Fucales (Rindi et al., 2012). Éste género se extiende a lo largo de casi todos los océanos del mundo, por lo que incluye especies tropicales, subtropicales y templadas, las cuales suelen formar densos bosques submarinos, constituyendo así un hábitat clave en el suministro y refugio de muchas especies (Suárez Castillo et al., 2013). En el Golfo de California, son consideradas de gran importancia por su alta dominancia en biomasa, así como por su capacidad para la síntesis de metabolitos secundarios, entre los que destacan los terpenoides, florotaninos, polifenoles, hidrocarburos volátiles, polisacáridos sulfatados y productos de origen biogenético mixto. Lo anterior, les proporciona una composición química única y las convierte en un recurso altamente cultivable de potencial uso como fertilizante, forraje, suplemento alimenticio o materia prima para la obtención de ficocoloides y compuestos de interés farmacéutico (Mascheck y Baker, 2008; Echeverría et al.,2009).

Existen 5 especies de Sargassum conformando los bosques submarinos del Golfo de California: S. johnstonii, S. herporhizum, S. sinicola, S. horridum y S. lapazeanum (Suárez Castillo et al., 2013), siendo la gran mayoría de éstas estudiadas para el análisis de su composición química. No obstante, aún no se cuenta con ningún registro de actividad biológica para S. lapazeanum, un alga endémica del Golfo que podría representar un recurso de potencial explotación para la zona (Andrade-sorcia, 2008). Por lo anterior, se seleccionó el alga Sargassum lapazeanum (Anexo I) para el análisis de su actividad biológica como fuente de compuestos antibacterianos, antioxidantes y anticoagulantes.

1

II. ANTECEDENTES

Fue a principios de 1960 que los investigadores comenzaron a concentrarse en los océanos como un novedoso e inexplorado recurso con gran potencial para la obtención de compuestos bioactivos. Como resultado de esto, más de 10,000 metabolitos marinos se han aislado y caracterizado a lo largo de las últimas cinco décadas, demostrando tener diferentes tipos de actividad biológica (Attaway y Zaborsky 1993). Actualmente son muchos los organismos marinos a partir de los cuales se han aislado e identificado compuestos con actividad biológica, sin embargo de entre todos destacan las macroalgas por su capacidad para la síntesis de metabolitos secundarios (Mascheck y Baker, 2008).

La biotecnología con macroalgas comenzó a desarrollarse a mitad del siglo pasado, sin embargo en México no ha avanzado lo suficiente, pues representa el estudio de una comunidad compleja, de alta diversidad biológica en la que aún hace falta una mayor dedicación de esfuerzos e inversión económica (Zertuche- González, 1993). Es probable que lo anterior sea la razón por la cual la mayoría de los trabajos realizados con macroalgas en el País se enfocan principalmente en su ecología, diversidad, variaciones espacio-temporales, su aprovechamiento como bioindicadores, así como su caracterización y descripción taxonómica (ej: Calva et al., 2008; Mateo-Cid et al., 2013; Saad y Riosmena, 2005), siendo aún más escasos los trabajos para la obtención de compuestos bioactivos a partir de éstas. Esto también pudiera deberse a la necesidad de conocer y clasificar adecuadamente los organismos con los que trabajamos, ya que nos permite reconocer con mayor exactitud la procedencia del compuesto aislado, así como comprender parte del ciclo de vida y la ecología química de los organismos estudiados.

Por su parte, las algas café (Phaeophyceae) han sido altamente estudiadas debido a que producen una amplia variedad de metabolitos secundarios. Actualmente se han reportado al menos 1,140 compuestos químicos obtenidos a partir esta clase de algas, los cuales ofrecen un amplio espectro de actividades

2 farmacológicas tales como: antimicrobiana, antioxidante, o anticoagulante (Mascheck y Baker, 2008; Echeverría et al.,2009). No obstante, al menos un tercio de lo que se conoce de la química de éstas algas proviene tan sólo del estudio del género Dictyota, mientras el resto corresponde a estudios en su mayoría con el género Cystoseira, Padina y Sargassum (Mascheck y Baker, 2008).

En ese sentido, los estudios realizados con Sargassum lapazeanum son muy escasos (Tabla I), estos comienzan con su descubrimiento en 1924 (Setchell, W.A. & Gardner, 1924). y han mejorado conforme el avance de la tecnología con estudios de biogeografía (Phillips, 1995), dinámica poblacional (Rivera y Scrosati, 2006), taxonomía (Norris, 2010; Andrade-Sorcia et al. 2008) y capacidad de bioadsorción de cadmio (Patrón-Prado et al., 2011), hasta un replanteamiento actual de su sistemática (Andrade-Sorcia et al., 2013). Cabe destacar que a pesar de los avances tecnológicos, no se ha reportado aún ningún estudio sobre la actividad biológica de ésta alga, no obstante, existen referencias bibliográficas que demuestran la actividad biológica de algas pertenecientes al género Sargassum, lo que hacen del presente estudio un trabajo novedoso que contribuirá al desarrollo del conocimiento sobre la química en las algas pertenecientes a éste género.

1. Potencial de las algas como agentes antibacterianos.

La mayoría de los antibióticos que se utilizan en la actualidad son de origen terrestre, por lo que el análisis se ha enfocado mayoritariamente a este ambiente, lo que sugiere que la probabilidad de encontrar nuevos compuestos antibióticos a partir de ambientes distintos como el mar es mucho mayor (Song et al., 2011). Algunos estudios indican que el potencial antibacteriano de las algas se debe a su capacidad para la síntesis de diterpenos en plantas chlorophytas, terpenos halogenados en rodophytas y metabolitos mixtos de origen terpeno-aromático en las algas phaeophytas (Magallanes et al. 2003).

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Tabla I. Estudios realizados con el alga Sargassum lapazeanum. Año Autor Tipo de estudio

1924 Setchell, W.A. & Gardner Taxonomía

1955 Phillips, N. Biogeografía

2006 Rivera, M. & Scrosati Dinámica Poblacional Andrade-sorcia, G., Riosmena-Rodríguez, R., & Paúl- 2008 Chávez, L. Taxonomía Rivera, M. & Scrosati, R.. Journal of Phycology 44(1): 2008 45-49. Dinámica Poblacional Norris, J.N. Smithsonian Contributions to Botany 94: i-x, 2010 1-276. Taxonomía Patrón-Prado M., Casas-Valdez M., Serviere-Zaragoza 2011 E., Zenteno-Savín T., Lluch-Cota D. B. y L. Méndes- Biotecnología Rodríguez. Water Air Soil Pollution. 221:137 144.

Andrade-sorcia, G., Riosmena-Rodríguez, R., Lee K.M, 2013 Boo G.H., Muniz-Salazar R., Lopez Vivas J. M., G. Biología Molecular González-Barba & S.M. Boo.

1.1. Antibacterianos y su clasificación.

Los agentes antibacterianos son químicos que ayudan a eliminar bacterias patógenas para el paciente que los consume (Sussman y Bates, 2007). De acuerdo a Goering et al. (2012), existen al menos tres modos de clasificar a los agentes antibacteriales, uno es por el efecto que tienen sobre las bacterias (bactericidas y bacteriostáticos). Si el agente antibacteriano elimina las bacterias, entonces se denomina bactericida y es un proceso irreversible. En cambio, los agentes bacteriostáticos producen un efecto reversible, sólo previenen el crecimiento de la población bacteriana. Otro modo de clasificación consiste en identificar su sitio de acción, es decir en qué parte de la célula actúa, ya sea la síntesis de la pared celular, de proteínas, de ácidos nucleicos, en rutas metabólicas o sobre las funciones de la membrana celular. Finalmente, también pueden clasificarse en base a su estructura química, sin embargo no suele ser una clasificación práctica debido a la diversidad de estructuras observadas en éste tipo

4 de compuestos. No obstante el presente estudio se limita a realizar el análisis de la actividad antibacteriana de los extractos analizados y con ello elucidar el posible potencial de estos contra ciertas bacterias marinas como terrestres.

1.2. El género Sargassum como fuente de compuestos con actividad antibacteriana

Son muchos los estudios que demuestran el potencial antibacteriano de algas phaeophytas, entre los que destacan estudios con especies pertenecientes al género Sargassum, como lo son S. tenerrimum (Kumar et al., 2013), S. boveanum (Khan y Qari, 2012), S. oligocystum (Tajbakhsh et al. 2012), S. latifolium (Dashtiannasab et al. 2012) y S. wightii (Vijayabaskar y Shiyamala, 2011). No obstante, son pocos los compuestos antibacterianos que se han logrado aislar y caracterizar a partir de este género de algas, destacando el dioctil ftalato (Figura 1) (Sastry y Rao, 1995) y el sulfoglicerolípido 1-0 palmitoil-3-0 (6’-sulfo-α- quinovopiranosil)-glicerol (Arunkumar et al., 2005), ambos obtenidos a partir del alga Sargassum wightii. Cabe destacar que esta alga presenta un gran potencial en este campo, ya que trabajos como los de Vijayabaskar y Shiyamala (2011) han demostrado que los polifenoles aislados de S. wightii son activos contra al menos 9 patógenos diferentes, pudiendo inhibir cepas de Escherichia coli y Aeromonas hydrophila, unas de las bacterias más patógenas para el hombre.

Figura 1. Estructura química del dioctil ftalato.

En México se ha estudiado el potencial antibacteriano de algas del género Sargassum tales como S. cymosum, S. filipendula y S. vulgare en el Golfo de México y el Caribe Mexicano (Lara-Issasi et al., 1999), S. liebmani en las costas

5 de Oaxaca (Lara-Issasi et al., 1995) y S. filipéndula en las costas de Yucatán (Freile-Pelegrín y Morales, 2004). No obstante la mayoría de los extractos obtenidos a partir de estas algas mostraron un bajo potencial antibacteriano contra cepas de Staphylococcus aeureus, Shygella sonnei, Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecalis y Micrococcus luteus, ya que sólo dos algas mostraron actividad significativa: Sargassum liebmani contra cepas de S. aeureus (Lara- Issasi et al., 1999) y S. pyogenes (Lara-Issasi et al., 1995) y Sargassum filipéndula contra cepas de S. aureus (Lara-Issasi et al., 1999), y Bacillus subtilis (Freile-Pelegrín y Morales, 2004). Finalmente, cabe destacar que los trabajos realizados con algas del género Sargassum en la zona del Golfo de California en México son escasos y sólo estudian las especies S. horridum y S. sinicola, la primera de ellas activa contra Mycobacterium tuberculosis (Pardo-Fuentes, 2012), S. aureus y S. pyogenes (Muñoz-Ochoa, 2010), mientras que la segunda contra Pseudomona aeruginosa, S. aureus y B. subtilis (Castro-Reyes, 1997).

2. Análisis del potencial antioxidante

2.1. Radical Libre DPPH.

La molécula 2,2 Difenil-1-Picrilhidracilo, también conocida como DPPH (Figura 2), es un radical libre estable que se caracteriza por la deslocalización de un electrón libre. Dicha deslocalización provee a la molécula de cierta estabilidad, lo que provoca que esta no se dimerice como es el caso de la mayoría de los otros radicales libres. Esta característica también da lugar al color violeta oscuro del DPPH, sin embargo, cuando una solución de este se mezcla con una sustancia capaz de donar un átomo de hidrógeno, el DPPH se reduce (Figura 3) y suele presentar una coloración amarillo pálido debido al grupo picril que aún se encuentra presente (Molyneux, 2004). De esta manera, los ensayos realizados con DPPH, se basan en el cambio de coloración de la molécula, monitorizando la disminución de la absorbancia en función de la capacidad antioxidante de los extractos a diferentes concentraciones y a un tiempo fijo (Mendiola-León, 2008)

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Figura 2. Difenilpicrilhidracilo (radical libre) Figura 3.Difenilpicrilhidracina

2.2. Algas del género Sargassum como fuente de compuestos antioxidantes

Las algas marinas, al igual que todos los organismos fotosintéticos, se encuentran expuestas a diferentes combinaciones de luz y altas concentraciones de oxígeno que conllevan a la formación de radicales libres y otros agentes oxidantes. Los ácidos grasos poliinsaturados son componentes estructurales de la membrana tilacoide, esto hace que los elementos de los aparatos fotosintéticos se encuentren vulnerables al daño fotodinámico. No obstante, la ausencia de este tipo de daño en las algas, indica que las células de sus aparatos fotosintéticos cuentan con diferentes mecanismos y compuestos antioxidantes protectores, entre los que destacan compuestos terpenoides, especialmente de tipo sesquiterpeno y diterpeno, de los cuales muchos contienen grupos bromofenol (Echeverría et al., 2009; Vadlapudi, 2012).

Las algas pardas son reconocidas por la producción de una amplia variedad de metabolitos secundarios, todos ellos con una amplia gama de actividades farmacológicas, de entre las que destaca su actividad antioxidante (Echeverría et al., 2009). Un ejemplo de éstos compuestos activos es el sargothunbergol A (Figura 4A) un nuevo cromeno obtenido por Seo et al. en el 2007 a partir del alga Sargassum thunbergii. El sargothunbergol A, los tetrapreniltoluquinoles (Figura 4B y 4C), y los monogalactosil-diacilgliceroles (Figura 4D y Figura 4E) aislados de ésta misma alga (Seo et al., 2006; Kim et al., 2007), funcionan como eliminador de

7 radicales libres por el ensayo de DPPH. Asimismo se han aislado diferentes ácidos grasos, polifenoles y florotaninos a partir de especies pertenecientes a éste género, como lo son S. kjellamanianum y S. siiquastrum (Vadlapudi, 2012).

Figura 4. Estructura de algunos compuestos químicos aislados a partir de especies del género Sargassum: A) sargothunbergol-A, B y C) Tetrapreniltoluquinoles, D Y E) monogalactosil-diacilgliceroles.

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Aunque son pocos los compuestos antioxidantes ya aislados, identificados y caracterizados obtenidos a partir de algas marinas, existen muchos estudios dedicados al análisis de ésta actividad, destacando en México los trabajos realizados por Zubia et al. en el 2007, quienes estudiaron la actividad antioxidante en macroalgas marinas tropicales de la península de Yucatán, México, analizando con ello dos especies de Sargassum, S. pteropleuron y S. ramifolium.

3. Análisis del potencial anticoagulante en algas.

3.1. Polisacáridos sulfatados: Fucoidan y actividad anticoagulante de Phaeophytas.

Los polisacáridos sulfatados (PS) constituyen una clase de macromoléculas biológicas con estructuras diversas en la que algunas unidades de monosacáridos cuentan con grupos semiéster sulfatado (Stewart, 1974). Estos se encuentran en la pared celular y algunas regiones intercelulares de los organismos, por lo que es posible aislarlos a partir de fuentes naturales como los tejidos de animales, plantas superiores, invertebrados marinos, cianobacterias y algas marinas (Senthilkumar et al., 2013). Entre las propiedades más estudiadas de los polisacáridos sulfatados están la actividad anticoagulante y antitrombótica. Autores como Matsubara (2004) han reportado que algunas algas presentan PS con actividad moduladora de la coagulación sanguínea, por lo que su estudio representa una alternativa para el desarrollo de fármacos anticoagulantes más seguros.

Cada división de algas sintetiza su propio tipo característico de polisacáridos, no obstante, existen variaciones importantes en la estructura, composición y secuencia monomérica, peso molecular, configuración anomérica, posición del enlace glucosídico y densidad de cargas, entre cada grupo. Estas diferencias estructurales dependen en gran medida del entorno y la presión ambiental a la que estos organismos se encuentran sometidos, ya que le confieren a los polisacáridos sulfatados distintas propiedades fisicoquímicas responsables de los diferentes tipos de actividad biológica que son la base de sus aplicaciones en medicina y

9 farmacología. De esta manera las plantas marinas del filo Rodophyceae suelen distinguirse por la producción de agar, carragenanos, galactanos, xilanos y porphyran, mientras que las Chlorophytas por presentar estructuras complejas como los arabinanos sulfatados, galactoarabinoxilanos, galactanos sulfatados y el ulvan (Stewart, 1974; Muñoz, 2006).

Por su parte las Ochrophytas del orden Phaeophyceae (también conocidas como algas pardas), se caracterizan por la producción de ácido algínico, laminaran (β- 1,3 glucano), sargassan y principalmente fucanos o fucoidan. Son muchos los estudios que demuestran la presencia de polisacáridos sulfatados con actividad anticoagulante extraídos a partir de éste orden de algas (Athukorala et al., 2007; Gupta y Abu-Ghannam, 2011; Jiao et al., 2011; García-Ríos et al., 2012), destacando el análisis del fucoidan. Éste último (Figura 5) es un heteropolisacárido de L-fucosa sulfatada que se encuentra en la pared celular o matriz extracelular de las phaeophytas pudiendo alcanzar hasta el 40% de su peso seco (Hold y Kraan, 2011). No obstante también se han aislado fucoidanos similares a partir de invertebrados marinos como medusas, huevos de erizos marinos y pepinos de mar (Cumashi et al., 2007).

Figura 5. Estructura química promedio del fucoidan

El término fucoidan, se utiliza para definir a una familia de polisacáridos sulfatados de peso molecular altamente variable. Están compuestos principalmente de L-fucosa, sulfato y ácidos urónicos, con menor contenido de otros azúcares como xilosa, galactosa, arabinosa, manosa, glucosa e incluso en

10 ocasiones puede llegar a contener proteínas. No obstante, a pesar de los estudios sobre su composición y estructura química, aún no ha sido posible definirle completamente. Esto se debe a que tanto su heterogeneidad y complejidad estructural se encuentran condicionadas no sólo a diferencias entre las especies, sino también entre partes de un mismo organismo, por las variaciones estacionales, las condiciones climáticas locales e incluso por el método de extracción empleado (García-Ríos et al., 2012). Por lo anterior, cada que se describe un nuevo fucoidan, se le considera como un compuesto único en cuanto a sus características estructurales y composición química, siendo posible también observar variaciones en la actividad biológica (Gómez-Ordóñez, 2012).

Ya que existe una correlación entre el número y la posición de los grupos sulfato con la actividad biológica de los fucoidanos, es importante el análisis de su estructura. Este análisis se realiza en el laboratorio por medio de espectroscopía de infrarrojo, lo que permite determinar la posición de los grupos sulfato en los polisacáridos, así como la diferenciación de bandas características de sulfatos en posición axial o ecuatorial dentro de la molécula (Li et al., 2008; García-Ríos et al., 2012).

De acuerdo a Shanmugam y Mody, para el año 2000 se habían registrado una mayor cantidad de estudios de actividad anticoagulante en las algas phaeophytas con más de 60 especies reportadas, en comparación con las rodophytas y clorofhytas de las que sólo se tenía registro de 40 y 10 especies respectivamente.

En México los estudios de la actividad anticoagulante son escasos en comparación a los realizados en lugares como Europa, Asia y Estados Unidos. A pesar de ello, se encontraron más referencias de estudios sobre actividad anticoagulante realizados con algas pertenecientes al género Sargassum en México que en otras partes del mundo (Tabla II). No obstante cabe señalar que todos los trabajos consistían únicamente en el registro de actividad.

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Tabla II. Listado de algunas especies del género Sargassum que han presentado actividad anticoagulante.

Especie Área de estudio Referencia bibliográfica

Sargassum cinctum India Shanmugam y Mody, 2000 Sargassum fulvellum Isla Jeju, Korea De Zoysa et al., 2008 Sargassum horneri Isla Jeju, Korea Athukorala et al., 2007 Sargassum coreanum Isla Jeju, Korea Athukorala et al., 2007 Sargassum siliquastrum Isla Jeju, Korea Athukorala et al., 2007 Sargassum thunbergii Isla Jeju, Korea Athukorala et al., 2007 Sargassum stenophyllum Suramérica Duarte et al., 2001 Sargassum hystrix Golfo de México Lara-Issasi y Álvarez- Hernández, 1994 Sargassum cymosum Golfo de México Lara-Issasi y Álvarez- Hernández, 1999 Sargassum filipendula Golfo de México Lara-Issasi y Álvarez- Hernández, 1999 Sargassum pteropleuron Golfo de México Lara-Issasi y Álvarez- Hernández, 1999 Sargassum vulgare Golfo de México Lara-Issasi y Álvarez- Hernández, 1999 Sargassum horridum Golfo de California, Muñoz-Ochoa, 2006 México

3.2. Mecanismo de coagulación sanguínea.

En 1904 Morawitz descubrió que los tejidos vasculares liberan una tromboplastina tisular (Factor III, o Factor Tisular) necesaria para que se inicie el proceso de coagulación y propuso los cuatro componentes principales para la coagulación en plasma: Protrombina, fibrinógeno, calcio y tromboplastina, ideas que prevalecen en la actualidad (Martínez-Murillo, 2003).

Los estudios realizados para la determinación de la actividad anticoagulante se han desarrollado conforme los avances en la investigación hemostática, de manera que actualmente se cuenta con un mejor entendimiento de los diferentes procesos fisiológicos y bioquímicos que dan lugar a la coagulación, descrita en la década de los 60 como un proceso enzimático en cascada, mejor conocido actualmente como “cascada de coagulación” (Figura 6), la cual consta de una

12 serie de cambios bioquímicos y enzimáticos modulados por diferentes factores y zimógenos que participan en las diferentes etapas del mecanismo de coagulación para la formación de trombina. La trombina obtenida, actúa sobre el fibrinógeno liberando fibrina que es el material cementante que genera una red o coágulo que refuerza el tapón hemostático plaquetario, dando lugar a la coagulación (Rosenberg y Rosenberg, 1984; Martínez-Murillo, 2003).

Los zimógenos que participan en la coagulación reciben el nombre de cofactores y son los encargados activar las proteínas plasmáticas denominadas factores de coagulación. Estos últimos se identifican con números romanos de acuerdo al orden en que fueron descubiertos, además se les añade el sufijo “a” después del número romano para indicar la forma activa del factor (Martínez-Murillo, 2003). En la Tabla III se puede consultar una lista de los diferentes cofactores y factores de coagulación, así como sus respectivas funciones.

Figura 6. Diagrama que muestra la cascada de coagulación (Martínez-Murillo, 2003).

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Tabla III. Nombre y función de los diferentes factores y cofactores que actúan en las diferentes etapas de la cascada de coagulación Factores y cofactores Sinónimo Función

FI Fibrinógeno Precursor de fibrina FII Protrombina Zimógeno de proteasa FT (FIII) Factor tisular o Tromboplastina Iniciador, cofactor de FVIIa en activación de FIX y FX. FIV Ca2+ Cofactor pro-coagulante FV Proacelerina o factor lábil Cofactor de Xa en activación de FII FVI -- -- FVII Autoprotrombina Zimógeno de proteasa FVIII Factor antihemofílico Cofactor de los factores Ixa en activación de X. FIX Globulina antihemofílica Zimógeno de proteasa FX Factor de Stuart-Prower Zimógeno de proteasa FXI Antecedente tromboplástico del plasma Zimógeno de proteasa FXII Factor de Hageman Zimógeno de proteasa FXIII protransglutamidasa, fibrinasa o Factor estabilizante de la fibrinoligasa fibrina Precalicreína Factor de Fletcher Cofactor Cininógeno de alto peso Factor de Fitzgerald-Williams-Flaujeauc Cofactor molecular

La coagulación suele ser descrita por dos vías diferentes: intrínseca y extrínseca. El modelo tradicional de cascada de coagulación describe ambas vías como vías independientes para la generación del factor FXaA. La vía intrínseca inicia la coagulación cuando existe un daño en el sistema vascular y las superficies cargadas negativamente interactúan con los zimógenos FXII y precalicreina (PK) y el cofactor denominado cininógeno de alto peso molecular (CAMP) (Martínez- Murillo, 2003).

Por lo tanto la auto-activación del FXII y la PK tienen lugar en el momento en que la sangre entra en contacto con una superficie artificial como lo son los tubos de hemodiálisis. Esta es la razón por la cual la sangre formará coágulos en una jeringa que no contenga ningún agente anticoagulante. Cabe destacar que

14 mientras más negativa sea la carga de la superficie, más rápida será la formación de coágulos. Se habla de una “auto-activación” del FXII y PK ya que éstos zimógenos no son dependientes de calcio por lo que seguirán activándose a pesar de que exista citratro en el anticoagulante (McMichael, 2012).

Por su parte, la vía extrínseca se activa cuando se daña algún tejido diferente al vascular, provocando la liberación del factor tisular (FT). El FT inmediatamente se une al FVIIa en plasma, formándose el complejo FT/FVII, mientras que la autoconversión catalítica del FVII a FVIIa amplifica la respuesta hemostática, generando así más complejos FT/FVIIa. El complejo FVIIa/FT actúa como iniciador de la coagulación activando a los factores FIX y FX en una etapa inicial de activación. Como resultado de esto se obtienen los factores FIXa y FXa. El primero es necesario para que exista suficiente producción de trombina, mientras que el segundo es requerido en la activación plaquetaria. El FXa actúa activando a la protrombina en presencia del factor FVa, fosfolípidos y calcio (complejo protrombinasa). El resultado de esta reacción es la formulación de la trombina, la cual al estar presente en la superficie celular, activa otros procesos enzimáticos como lo son los factores FV, FVIII, FXI y las plaquetas, que a su vez dan como resultado la formación de fibrina. Cuando el complejo FT/FVIIa da lugar al factor FX, se activa un inhibidor de la coagulación mediante la vía de inhibición del FT (IVFT), por lo que se requiere de una vía alterna para producir cantidades suficientes de trombina (Martínez-Murillo, 2003). Para explicar esto, actualmente se cuenta con otros modelos de coagulación como es el modelo celular, el cual describe la coagulación por etapas. Ya que durante la etapa de iniciación la trombina producida es escasa por la presencia del factor de inhibición (IVFT), mientras que en las fases de amplificación y propagación se produce una mayor cantidad debido a la participación de los factores FXI, FVIII y FIX (Díaz- Concepción y Almagro-Vázquez, 2001)

En la actualidad, se sabe que los sistemas intrínseco y extrínseco de la coagulación no pueden funcionar de manera independiente uno del otro, ya que todos los factores de coagulación se interrelacionan entre sí. Además se ha

15 descubierto que algunos pro-coagulantes son realmente cofactores y no poseen actividad enzimática, como es el caso de los cofactores FV y FVIII (Martínez- Murillo, 2003; McMichael, 2012). Por lo anterior, los modelos originales en cascada han sido subsecuentemente modificados para incluir nuevos conceptos y observaciones, sin embargo ninguno logra explicar el modelo real de la coagulación in vivo. No obstante, el conocimiento actual del mecanismo de coagulación sanguínea nos permite comprender de mejor manera el inicio de la coagulación sin la necesidad de dividir el sistema en vías separadas, sino en una sola vía que inicia con diferentes factores de coagulación los cuales actúan entre sí para realizar de manera adecuada el sistema de coagulación sanguínea (McMichael, 2012).

3.3. Evaluación de la actividad anticoagulante

A pesar de que el modelo de cascada de coagulación no explique completamente el sistema de coagulación sanguínea, el esquema sigue siendo útil para explicar las pruebas de laboratorio empleadas para el monitoreo de la hemostasia, o su prevención. Siendo ésta última de importancia particular para el presente trabajo. Esto se debe a la posibilidad de simular la cascada de coagulación en condiciones de laboratorio por medio de dos ensayos: Tiempo de protrombina (TP) para la vía extrínseca y tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) para la intrínseca (Quintana-González, 2002).

El ensayo de TP es sensible a los factores FV, FVII y FX y en menor medida al FII (Protrombina). El reactivo utilizado en éste ensayo, a menudo denominado tromboplastina, contiene factor tisular y fosfolípidos. La figura 7 muestra la vía que mide el tiempo de protrombina, ésta se basa en las reacciones para generar el activador del FX, el activador de protrombina, la generación de trombina y el paso de fibrógeno a fibrina donde intervienen los factores antes mencionados. El tiempo normal en plasma humano para este ensayo suele variar dependiendo del reactivo utilizado y las condiciones en que se realiza el ensayo, no obstante el tiempo para este ensayo suele encontrase entre los 11 y 14 segundos. En las condiciones de la mayoría de las pruebas de TP, la activación del factor X es tan potente, que el

16 ensayo no resulta sensible a la deficiencia de los factores IX u VIII (Kitchen et al., 2010).

Por su parte la prueba de TTPA consiste en un análisis no específico de la vía intrínseca. Aunque al utilizarse con otras pruebas resulta eficiente para la detección en la deficiencia de los factores FVIII, FIX, FXI y FXII. Por si sola, ésta prueba puede detectar la presencia de anticoagulantes si el tiempo normal para plasma humano, que suele oscilar entre los 35 y 45 segundos, se ve prolongado (Kitchen et al., 2010).

Cabe destacar que ambas pruebas se verán alteradas y los tiempos de coagulación prolongados dependiendo no sólo de los aumentos o deficiencias en factores de coagulación, sino también de la presencia de inhibidores de la coagulación como lo son los anticoagulantes (Kitchen et al., 2010).

Figura 7. Vía afectada por la prueba de tiempo de protrombina. Imagen tomada de Kitchen et al. 2010.

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III. JUSTIFICACIÓN

Muchos de los tratamientos actuales para los padecimientos trombóticos, infecciosos y crónico degenerativos son muy efectivos, no obstante con el uso prolongado suelen generar efectos secundarios nocivos para la salud. Un ejemplo de esto es la heparina, utilizada para el tratamiento de enfermedades trombóticas, que si bien es efectiva, su uso por largos periodos de tiempo puede llegar a causar problemas de infección, así como trombocitopenia, osteoporosis y hemorragias (Muñoz, 2010). Otro ejemplo son los antioxidantes sintéticos como el Butil-hiroxi- anisol (BHA), Butil-hidroxi-tolueno (BHT), α-tocoferol y galato de propilo, utilizados para la reducción de los daños oxidativos en el cuerpo humano, los cuales pueden provocar diversos efectos secundarios tales como daño hepático y carcinogénesis (Lee et al. 2010). Además, el uso indiscriminado, así como la prescripción incorrecta de antibióticos han contribuido al problema de la resistencia bacteriana, que si bien corresponde a un proceso natural, estos factores lo han acelerado, conduciendo así al uso de tratamientos que son cada vez más agresivos, de mayor costo y además pueden generar peligrosos efectos secundarios como lo son arritmias, hepatotoxicidad o insuficiencia renal aguda (Granowitz y Brown, 2008; Muñoz, 2010).

El daño celular producido por las ERO puede generar una serie de enfermedades crónico degenerativas, entre las que destacan enfermedades coronarias, ateroesclerosis, cáncer, diabetes mellitus, envejecimiento prematuro y enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer (Dorado-Martínez et al. 2003; Li et al. 2007). Este tipo de enfermedades son responsables de la muerte de más de 36 millones de personas cada año (OMS a, 2013), siendo causa de mortalidad en todas las edades y constituyendo más de la mitad de la carga mundial de morbilidad, provocando muchas veces invalidez y deterioro de la vida de las personas (Castillo-Guzmán et al. 2008). Además la secretaría de Salud (INEGI 2011) declaró que estas enfermedades representan uno de los más importantes problemas de salud en México, causando la mayor cantidad de muertes al año principalmente con padecimientos como enfermedades cardiovasculares (ECV) y

18 diabetes mellitus, siendo las ECV consideradas la principal causa de muerte en todo el mundo. Se calcula que en 2008 murieron por esta causa 17,3 millones de personas, lo que representa un 30% del total de muertes registradas en el mundo, de las cuales 7,3 millones de se debieron a la cardiopatía coronaria, y 6,2 millones a los accidentes vascular cerebral (AVC) los cuales pueden ser ocasionados por hemorragias de los vasos cerebrales o coágulos de sangre (OMS b, 2013).

Lo anterior ha despertado el interés de los investigadores por la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos de origen natural como una alternativa para el tratamiento de éstos padecimientos. Las algas, al tratarse de organismos fotoautróficos expuestos a una mayor cantidad de estrés, han desarrollado sistemas de defensa eficientes, como lo son la síntesis de metabolitos secundarios protectores (Mascheck y Baker, 2008), lo que las ha convertido en una de las principales fuentes de compuestos bioactivos con un amplio espectro de actividades biológicas de potencial uso en el tratamiento de enfermedades trombóticas, infecciosas y crónico degenerativas. Es por ello que en la actualidad los estudios dirigidos al aislamiento de nuevos compuestos biológicamente activos a partir de macroalgas han incrementado en diferentes partes del mundo (Frikha et al., 2011). Utilizando estrategia principal la búsqueda de actividad y el fraccionamiento guiado por bioensayo (Murillo-Álvarez et al., 2001).

México presenta una gran riqueza y diversidad de macroalgas, a pesar de ello los estudios de su uso para la obtención de compuestos activos con actividad biológica aún son muy escasos, desaprovechando así la diversidad de este recurso en el País (Zubia, 2007). La península de Baja California cuenta con una gran variedad de hábitats y condiciones climáticas, por lo que alberga una enorme riqueza de algas marinas (Suárez Castillo et al., 2013), destacando la presencia de los algas pertenecientes al género Sargassum debido a la alta dominancia en biomasa. No obstante, de las 5 especies de Sargassum que se encuentran conformando los bosques submarinos del Golfo de California, sólo S. horridum y S. sinicola cuentan con registros de estudios para el análisis de su actividad biológica. Por lo anterior, impulsados por la falta de documentación sobre las

19 propiedades químicas de S. lapazeanum, se seleccionó la especie para el estudio de su actividad biológica como fuente de compuestos antibacterianos, antioxidantes y anticoagulantes. Éstos estudios no sólo son esenciales para el entendimiento de la forma de vida del organismo y su interacción con el medio (Amsler, 2008), sino que también contribuyen al conocimiento de las algas pertenecientes al género Sargassum y el futuro desarrollo de nuevos fármacos o productos funcionales como cosméticos y suplementos alimenticios a partir de las mismas (Querellou et al., 2010).

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IV. OBJETIVOS

1. Objetivo general

Evaluar el potencial de Sargassum lapazeanum como fuente de compuestos con actividad antioxidante, antibacteriana y anticoagulante.

2. Objetivos particulares

1) Obtener y fraccionar el extracto por medio de distintas técnicas cromatográficas. 2) Evaluar la actividad antibacteriana por medio del método de difusión en agar con discos. 3) Evaluar la actividad antioxidante, utilizando el radical libre estable 2,2- difenil-1-picrilhidracilo (DPPH). 4) Obtener el fucoidan y evaluar su la actividad anticoagulante por medio de los ensayos de tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA)

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V. MATERIAL Y MÉTODOS

1. Recolección e identificación taxonómica.

El alga Sargassum lapazeanum se recolectó manualmente a una profundidad máxima de un metro, en la zona intermareal de San Juan de la Costa (La Paz, B.C.S) (Figura 8). Posteriormente fue lavada con agua corriente para eliminar los epífitos y restos de sedimento presentes, y se dejó secar al sol para facilitar su maceración y tamizado.

La identificación taxonómica se realizó en el laboratorio de botánica marina de la Universidad Autónoma de Baja California Sur, con el apoyo de la Dra. Gabriela Andrade Sorcia.

Figura 8. Mapa que muestra la zona de recolecta del alga S. lapazeanum en San Juan de la Costa, Bahía de La Paz B.C.S, México. Modificado a partir de NOAA. http://www.ngdc.noaa.gov/mgg/shorelines/shorelines.html.

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2. Análisis proximal del alga S. lapazeanum.

El análisis proximal del alga se realizó por medio de servicio externo, determinando el porcentaje de humedad por diferencia de peso, calentando a 105°C durante 4 hrs y el de cenizas por diferencia de peso y calcinación a 600°C durante 5 hrs. Para la determinación de proteínas se utilizó el método de Dumas (equipo LECO FP528), mientras que el cálculo del extracto etéreo se realizó por el método Soxtec-Avanti 2050 (TECATOR) y el contenido de fibra cruda por medio de hidrólisis sucesiva (ácido/base). Finalmente el extracto libre de Nitrógeno (ELN) y la energía (cal/g) se calcularon utilizando un calorímetro.

3. Obtención del extracto 3.1. Obtención del extracto etanólico

Se maceraron trescientos gramos del alga previamente seca y molida con EtOH 100 %, realizando recambios cada tercer día durante dos semanas. La mezcla se separó por filtración y la solución obtenida fue concentrada a sequedad a 40 °C y presión reducida en un rotavapor Yamato. Finalmente el extracto crudo (12-009- EC) resultante, fue sometido a un fraccionamiento sólido-líquido (Figura 9).

3.2 Obtención del extracto acuoso: Fucoidan

Para la extracción del fucoidan se pesaron 100 g del alga previamente seca y molida, a los cuales se les agregó 600mL de agua destilada y se dejó en baño María con agitación continua durante 2 hrs a una temperatura constante de 55ºC, Posteriormente se removió el tejido algal por medio de filtración simple, obteniendo 500 mL de solución la cual fue centrifugada durante media hora. El centrifugado fue recuperado por decantación y precipitado con 40 mL de una solución de Cl2Ca al 10% previamente preparada, con el fin de remover el alginato disuelto, el cual fue removido por centrifugación a 1770 x g durante 30 minutos. La solución clarificada (400 mL) se precipitó con tres volúmenes de EtOH (1200 mL). El precipitado final se recuperó por centrifugación, se dejó secar en una estufa eléctrica a 50ºC durante un día y se etiquetó como 12-009-FC (Figura 10).

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4. Fraccionamiento

4.1 Fraccionamiento por gradiente de polaridad.

Se fraccionaron quince gramos del extracto crudo en una columna cromatográfica empacada con sílica gel fase normal, eluyendo la columna con un gradiente de polaridad compuesto por CH2Cl2 100, CH2Cl2 - EtOH 90:10, CH2Cl2 - EtOH 25:75,

CH2Cl2 - EtOH 50:50, EtOH 100, EtOH:H2O 50:50 y H2O 100%. Los eluatos se compararon analizando la similitud por medio de cromatografía en capa fina (Anexo III) y se concentraron en siete fracciones de la 1-7 respectivamente (Figura 9).

Figura 9. Obtención del extracto crudo (EC) y fraccionamiento del alga S. lapazeanum.

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Figura 10. Esquema que muestra el proceso de obtención y fraccionamiento del fucoidan.

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4.2. Fraccionamiento de F2 en columna cromatográfica.

La fracción más activa en los ensayos de actividad se seleccionó para un segundo fraccionamiento en columna cromatográfica con sílica gel en diclorometano (Figura 9). Para ello se utilizó una relación 1:60 de muestra-sílica, es decir 600 mg de la fracción más activa se disolvieron en diclorometano para ser adsorbido en 36g de sílica gel, utilizando como eluyente una fase móvil en gradiente de polaridad creciente con los siguientes sistemas: CH2Cl2 100%, CH2Cl2:MEtOH

95:5, CH2Cl2:MEtOH 90:10, CH2Cl2:MEtOH 80:20, CH2Cl2:,EtOH 70:30,

CH2Cl2:MEtOH 50:50, EtOH 100% y H2O 100%.

4.3. Purificación parcial del fucoidan.

La purificación parcial del fucoidan (FC) obtenido se realizó por medio de precipitación fraccionada con 3 volúmenes de etanol, recuperando el precipitado entre adición y adición por medio de centrifugación. Los sólidos obtenidos en cada precipitación se secaron en estufa eléctrica a 55ºC y se almacenaron para el posterior análisis de su actividad biológica (Figura 10).

5. Pruebas de Actividad Biológica.

Tanto el extracto etanólico crudo como sus fracciones fueron sometidas a los ensayos de actividad antibacteriana por el método de difusión con discos y al ensayo de actividad secuestrante de radicales libres utilizando el método del radical libre estable 2,2-difenil-1-pricilhidracilo (DPPH).

5.1. Evaluación de la actividad secuestrante de radicales libres (DPPH): Ensayo de actividad antioxidante.

Se evaluó la actividad secuestrante de radicales libres del extracto crudo, así como de las fracciones, utilizando el radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) por medio de dos métodos:1) Bioautográfico y 2) Colorimétrico

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Método bioautográfico

Para este ensayo se siguió la metodología descrita por Choi et al. (1994), que consiste en un análisis cromatográfico de placa fina (TLC), depositando 10 µl de una solución de cada uno de las fracciones a evaluar sobre una placa de sílica gel fase normal, la cual se desarrolló en una cámara de saturación utilizando una solución de diclorometano-metanol a una relación 9:1 como eluyente. Posteriormente se dejó secar la placa y se roció de manera uniforme con una solución metanolica de DPPH al 0.4 %. La placa cromatográfica se dejó reposar en oscuridad durante 30 min. y después de este tiempo se registraron las zonas decoloradas sobre la placa como indicativos de la actividad secuestrante.

Método colorimétrico

Para los ensayos de colorimetría se utilizó una solución de DPPH al 0.02 % en metanol. Se prepararon las fracciones por duplicado en una solución con etanol a concentraciones de 400, 200, 100, 50 y 25 µg mL-1, agregando 4 mL de la solución de DPPH. Además se preparó un blanco con el que se obtuvo el factor de corrección del color. Una vez hecho esto se dejaron en oscuridad durante media hora y posteriormente se realizaron las lecturas en un espectrofotómetro Milton Roy Company SPECTRONIC 20D a una longitud de onda de 517nm. A partir de estos valores se obtuvieron curvas dosis-efecto graficando el porcentaje de reducción del DPPH en relación a la concentración de extracto utilizado. Este porcentaje se obtuvo con la siguiente fórmula:

AB: Absorbancia del Blanco AM: Absorbancia de la muestra corregida (AM= A-FC) A= Absorbancia FC= Factor de corrección de color.

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Además se calculó la concentración efectiva media (EC50) mediante la ecuación de la recta obtenida en las curvas dosis-efecto realizadas para cada uno de los extractos, utilizando ácido ascórbico como estándar de referencia.

5.2. Evaluación de la actividad antibacteriana por medio del método de difusión en agar con discos.

La actividad antibacteriana fue evaluada por el método de difusión en agar con discos Kirby-bauer (Jorgensen y Turnidge, 2007) contra 3 bacterias terrestres y 2 marinas. En base a lo anterior, se prepararon pequeños discos de papel filtro Whatman No.4 de 6.4 mm impregnados con 2mg de las fracciones a probar. Una vez impregnados los discos, estos se colocaron sobre la superficie de placas de agar Mueller-Hinton (Bioxon) preparadas con [NaCl 25%] y sin sal, las cuales fueron previamente inoculadas con una suspensión de los microorganismos de prueba: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Vibrio harveyi y Vibrio parahaemoliticus, a una concentración de 1x10-8 células mL-1.

Para la inoculación se utilizó el método de siembra por estrías, realizando dos replicas para cada extracto. Las placas se incubaron a una temperatura de 37ºC durante 24 h y al término de la incubación se midió el halo de inhibición y se registró el resultado en una tabla (Tabla VI). En base a los resultados obtenidos de este ensayo, se repitió el mismo proceso para las fracciones obtenidas a partir de la fracción F2, las cuales sólo se probaron contra las cepas de bacterias del género Vibrio previamente analizadas (Tabla VII).

5.3. Análisis de la actividad Anticoagulante

La actividad anticoagulante del fucoidan, se evaluó por medio de los ensayos de tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), utilizando plasma sanguíneo obtenido de humanos sanos, siguiendo las instrucciones del fabricante. Todos los extractos fueron ensayados por duplicado. La sangre utilizada en ambas pruebas se obtuvo por venopunción y se mezcló con una solución de citrato de sodio al 3.5% en una proporción de 9 a 1 (v/v). El

28 paquete celular se removió por medio de centrifugación, mientras que el plasma recuperado se almacenó en refrigeración hasta el momento de su utilización.

El ensayo de tiempo de protrombina (TP) consistió en mezclar 100 μL de plasma humano citrado con 10 μL de una solución del extracto de prueba, dejando incubar la mecla por 1 min. a 37°C. Una vez concluido el tiempo de incubación, se agregaron 200 μL del reactivo de TP (Biopool® by Trinity Biotech, plc) preincubado a la misma temperatura (37°C) por 10 min., y se midió el tiempo de formación del coágulo a partir de ese momento.

Por su parte para el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), se mezclaron 100 μL de plasma humano citrado con 10 μL de una solución del extracto crudo de prueba e igualmente se dejó incubar la mezcla por un periodo de 1 min a 37°C. Después del tiempo de incubación, se agregaron 100 μL del reactivo de TTPA (Biopool® by Trinity Biotech, plc), la nueva mezcla se dejó incubar por 3 min a 37°C y se agregaron 100 μL de CaCl2 al 0.25%, midiendo el tiempo de formación del coagulo a partir de ese momento. Finalmente la inspección de la formación del coagulo en ambos ensayos, se realizó de manera visual, registrando los tiempos en una tabla (Tabla VIII)

6. Caracterización parcial del fucoidan.

Las fracciones obtenidas a partir de la purificación del fucoidan, se caracterizaron estructuralmente por medio de espectroscopia de infrarrojo (IR). Además se calculó el contenido de sulfatos por el método de línea base a través de las relaciones del área bajo la curva de las señales a los 1250 y 1040 cm-1 (Lijour et al., 1994).

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VI. RESULTADOS

1. Análisis proximal

El análisis proximal mostró que Sargassum lapazeanum se encuentra conformado principalmente por un alto contenido de material inorgánico y carbohidratos y un bajo contenido de extracto etéreo. Esto se observa en la Tabla IV, donde se presenta que S. lapazeanum cuenta con los valores más elevados para ELN (extracto libre de nitrógeno) y cenizas.

Tabla IV. Resultados de análisis proximal del alga. Humedad Proteína Extracto Fibra Cenizas ELN (%) (%) Etéreo Cruda (%) (%) Energía (%) (%) Cal/g 8.51 8.54 0.28 6.06 30.52 85.12 2522.34 0.03 0.07 0.03 0.15 0.1 - 4.86

2. Análisis de la actividad biológica

2.1. Actividad antibacteriana

Los resultados del ensayo antibacteriano, indican una actividad selectiva sobre bacterias del género Vibrio (Tabla V), donde el extracto crudo (EC) y la fracción 2 (F2) mostraron la mayor actividad con un halo de inhibición de 8.5 ± 0.70 y 8 ± 0 para V. parahaemolyticus, y de 10 ± 0 y 8.5 ± 0.70 para V. harveyi respectivamente. Además las fracciones F6 y F7 presentaron una actividad comparable contra V. harveyi, con halos de inhibición de 8.75 ± 0.35 y 9 ± 0 respectivamente. Las fracciones F3 y 4 F4 también mostraron halos de inhibición aunque menos representativos cuando fueron probados contra V. harveyi, mientras que las fracciones F6 y F7 tuvieron un efecto similar contra V. parahaemolyticus.

En base a lo anterior, considerando la relación entre actividad y rendimiento de la muestra, se seleccionó F2 para su fraccionamiento por cromatografía en columna. Las fracciones obtenidas a partir de F2 mostraron tener una mayor actividad sobre

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V. harveyi (Tabla VI), siendo F2F9 la fracción más activa con un halo de inhibición de 11.75 ± 0.35. Mientras que la fracción F2F8 resultó ser más activa sobre V. parahaemolyticus con un halo de inhibición de 8.5 ± 0.71. Cabe destacar que sólo se probaron aquellas fracciones que contaban con muestra suficiente para la realización de las pruebas antibacterianas.

Tabla V. Resultados de la prueba de difusión en agar con discos [2 mg/disco] del extracto crudo y las fracciones obtenidas a partir de S. lapazeanum. Se reporta el promedio del halo de inhibición en milímetros ± sd, n = 2 . Halos de inhibición (mm) Gram + Gram - Fracciones S. aureus B. subtilis E. coli V. parahaemolitycus V. harveyi F1 - - - - - F2 - - - 8 ± 0 8.5 ± 0.70 F3 - - - - * F4 - - - - * F5 - - - - - F6 - - - * 8.75 ± 0.35 F7 - - - * 9 ± 0 EC - - - 8.5 ± 0.70 10 ± 0 - No Activo, * Ligera actividad

Tabla VI. Resultados de la prueba de difusión en agar con discos [2 mg/disco] del fraccionamiento del extracto F2 obtenido a partir de S. lapazeanum. Se reporta el promedio del halo de inhibición en milímetros ± sd, n = 2 .

Halos de inhibición (mm) Fracciones V. harveyi V. parahaemolitycus F2F1 N.P N.P F2F2 N.P N.P F2F3 N.P N.P F2F4 N.P N.P F2F5 - - F2F6 10.75 ± 1.06 7.75 ± 0.35 F2F7 N.P N.P F2F8 11.75 ± 1.06 8.5 ± 0.71 F2F9 11.75 ± 0.35 8 ± 0.71 F2F10 11.5 ± 0.71 7.75 ± 0.35 F2F11 - - F2F12 10 ± 0 * F2F13 N.P N.P F2F14 N.P N.P N.P No se probó, - No Activo, * Ligera actividad.

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2.2. Actividad antioxidante

El método bioautográfico reveló una franja decolorada a lo largo de la placa cromatográfica, indicativo de actividad antiradicalaria en la mayoría de las fracciones (Figura 11). Lo anterior, fue corroborado por medio del método colorimétrico, el cual demostró el potencial de las fracciones, destacando la -1 fracción 6 con la menor EC50 de 39.96 µg mL (Figura 12 y 13), mientras que la -1 más elevada fue la fracción F1 con un EC50 de 394.21 µg mL .

EC F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7

Figura 11. Cromatografía en placa fina que muestra la actividad antioxidante de S. lapazeanum por el método bioautográfico, revelada con una solución de DPPH al 0.4%. EC= Extracto crudo.

400

1]

- 300

200

100 EC50 [µg mL [µg EC50

0 1 2 3 4 5 6 7 E.C. Fracciones de S. lapazeanum

Figura 12. Gráfica comparativa de los valores obtenidos para las EC50 en las fracciones obtenidas por gradiente de polaridad a partir de S. lapazeanum. 1= Menor polaridad, 7= Mayor polaridad E.C.= Extracto Crudo

32

100

80 y = 0.5709x + 27.186 60 R² = 0.9726 39.96

40 DPPH DPPH (%) DPPH 20

0 Porcentaje de reducción del del reducciónde Porcentaje 0 20 40 60 80 100 120 Concentración del extracto [µg mL-1] Figura 13.- Curva dosis efecto la fracción F6 de S. lapazeanum, donde se observa el porcentaje de reducción del DPPH (%) en relación a la concentración del extracto (µg mL - 1). En negro: línea de tendencia y desviación estándar. En rojo: concentración efectiva media (EC50).

85.00 80.00

75.00 y = 23.325x - 14.965 70.00 R² = 0.9823 65.00 DPPH 60.00 Lineal (DPPH)

del DPPH (%) DPPH del 55.00 50.00

Porcentaje de reducciónde Porcentaje 45.00 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 -1 Concentración del extracto [µg mL ] Figura 14.- Curva dosis efecto del ácido ascórbico (AA), utilizada como blanco de comparación, donde se observa el porcentaje de reducción del DPPH (%) en relación a la -1 concentración del AA (µg mL ). En negro: línea de tendencia y desviación estándar. EC50, obteniendo por extrapolación= 1.5 µg mL-1

Finalmente, la curva control realizada con ácido ascórbico presentó una EC50 de 1.5 µg mL-1 (Figura 14); mientras que la fracción más activa de S. lapazeanum

(Figura 13) demostró una actividad 26 veces menor a éste valor, con una EC50 de 39.96 µg mL-1.

33

2.3. Actividad Anticoagulante

A partir del proceso de extracción y precipitación fraccionada del extracto acuoso de Sargassum lapazeanum se obtuvieron un total de 3 extractos (FC1, FC2 y FC3). Como puede observarse en la Tabla VII los extractos obtenidos, así como el extracto acuoso de fucoidan (FC) presentaron una alta actividad en ambas pruebas. Todos los extractos analizados sobrepasaron el tiempo límite de coagulación establecido (300 segundos) para la prueba de TTPA. Mientras que para la prueba de TP, el extracto FC2 fue el que mostró una mayor actividad con un tiempo de coagulación de 41.93 ± 2.49 s.

Tabla VII. Actividad anticoagulante de los extractos obtenidos por precipitación fraccionada a partir de S. lapazeanum.

Extracto TTPA TP Control 33.54 14 FC >300 30.25 ± 0.79 FC1 >300 24.50 ± 1.30 FC2 >300 41.93 ± 2.49 FC3 >300 23.079 ± 1.90

En base a lo anterior, se realizaron curvas dosis-efecto (Figura 15) de los extractos (FC, FC1, FC2 y FC3) las cuales confirmaron el alto potencial anticoagulante de S. lapazeanum, pues la mayoría de los extractos duplicó el tiempo de coagulación establecido por el control (32.84s) incluso a sus concentraciones mínimas.

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250

200

150 TTPA (S) TTPA 100

50

0 0 5 10 15 20 25 30 Concentración del extracto [µg mLˉ¹]

FC1 FC2 FC3 FC Control

Figura 15. Gráfico que muestra la relación entre la concentración de los extractos obtenidos a partir de la precipitación fraccionada del Fucoidan (FC) de S. lapazeanum y su efecto sobre el tiempo normal de coagulación según el ensayo de TTPA.

2.3.1. Caracterización parcial del fucoidan

El análisis del fucoidan por medio de IR indicó la presencia de diferentes bandas de absorción que identifican el fucoidan obtenido como un heterofucano con un contenido de 27.85% de sulfato para el fucoian crudo FC y de 8.10, 47.48 y 12.98 % para las fracciones FC1, FC2, y FC3 obtenidas por medio de precipitación fraccionada.

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VII. DISCUSIÓN

1. Análisis proximal del alga.

Como se puede observar en la Tabla IV, los constituyentes principales de S. lapazeanum fueron el ELN y las cenizas. El ELN obtenido fue de 85.12%, esta porción suele estar conformada principalmente por carbohidratos solubles como almidón y azúcares pero también incluye una considerable cantidad de agar, ácido algínico y polisacáridos sulfatados (Carrillo-Domínguez, 2002;). Estos son de gran importancia en la industria alimenticia ya que carbohidratos como el almidón y laminaran son fácilmente utilizados por los humanos y animales debido a los enlaces que presentan de tipo α-glicosídico 1,4 y 1,6, así como 1,3. Otros polisacáridos como el ácido algínico y el agar sólo pueden ser utilizados por animales que presenten las enzimas específicas para ello. No obstante estos polisacáridos son altamente utilizados en la industria alimentaria y farmacéutica por sus diferentes propiedades gelificantes (Carrillo-Domínguez, 2002). Además el fucoidan obtenido a partir de algas pardas se caracteriza por presentar una gran gama de actividades biológicas de interés en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria (Li et al., 2008), un ejemplo de ello es la comercialización del fucoidan líquido como aditivo inmuno-estimulatorio para camarones (Casas, 2006).

S. lapazeanum presentó además un alto contenido de materia inorgánica, con un porcentaje de cenizas de 30.52 % esto es comparable con lo obtenido por otros estudios en plantas marinas y ocrophytas (Carrillo-Domínguez, 2002; Casas- Valdez, 2006), los cuales indican que los valores elevados en el contenido de materia orgánica se deben a la capacidad de estos organismos para almacenar elementos minerales, los cuales abundan en el ambiente marino.

Los resultados obtenidos mostraron un bajo valor de proteína de 8,54%, sin embargo éste valor sobrepasa lo reportado por Marín (1999), Casas et al. (2002) y Casas et al. (2006) de 7,0, 7,7, y 6.09% respectivamente para algas del género Sargassum. Estas diferencias observadas podrían deberse a factores como la especie y la época de recolecta del alga, ya que estos organismos presentan

36 variaciones estacionales que afectan la concentración de sus constituyentes. A pesar de que el contenido de proteína es reportado en la literatura como “bajo” para algas phaeophytas, cabe destacar que estudios realizados con algas del género Sargassum han demostrado que la calidad de estas proteínas es buena, pues presenta una gran cantidad de aminoácidos esenciales y su digestibilidad es mayor al 70% (Casas, 2006 ).

La cantidad de fibra cruda observada fue del 6.06%,, a pesar de ser un valor bajo, debe considerarse que el método subestima el contenido de fibra dietética, ya que se disuelve gran parte de la hemicelulosa y lignina, así como cantidades variables de celulosa y toda la fibra soluble (Marín, 1999), por lo que se sugiere analizar el contenido de fibra dietética por medio de otras metodologías. Algunos alimentos de consumo humano como cereales y algunos vegetales contienen valores de fibra similares, tal es el caso de la avena 7% y algunas leguminosas como el frijol y el garbanzo con un 5% de fibra cruda (Carrillo-Domínguez, 2002).

La calidad y digestibilidad de las proteínas, así como el bajo contenido energético y de extracto etéreo de S. lapazeanum, le proporcionan al alga un alto valor nutricional en la industria alimentaria. Lo anterior, aunado a su potencial actividad biológica hacen de esta alga un recurso explotable para la elaboración de diferentes tipos de suplementos.

2. Análisis de la actividad antibacteriana

La mayoría de los trabajos realizados con extractos crudos de algas marinas, mencionan una gran actividad contra bacterias gram positivas, considerando S. aureus como una de las especies más susceptibles a los extractos algales (Ríos et al., 2009). Esto probablemente debido a la estructura más compleja de la pared celular en bacterias gram negativas (Demirel et al., 2009). No obstante, el extracto crudo y los extractos obtenidos por medio del fraccionamiento sólido-líquido de S. lapazeanum no fueron activos contra las bacterias gram positivas utilizadas en el ensayo.

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Aunque son más los estudios que demuestran la actividad de las especies pertenecientes al género Sargassum contra bacterias gram positivas, particularmente S. aureus (Lara-Issasi et al., 1995; Castro-Reyes, 1997; Muñoz- Ochoa, 2010; Vijayabaskar y Shiyamala, 2011; Kumar et al., 2013), también hay estudios que reportan una baja o nula actividad contra éste patógeno. En este sentido, nuestros resultados concuerdan con lo observado por investigadores como Lara-Issasi et al., (1999) quienes reportaron que algunas especies de Sargassum del Caribe y Golfo de México (S. cymosum y S. vulgare) no presentaron actividad contra S. aureus, explicando que estas diferencias de actividad podrían no sólo deberse a la especie, sino también a un enmascaramiento en los extractos de los metabolitos secundarios responsables de esta actividad. Por lo anterior, aunque los extractos presentaron una actividad selectiva contra las bacterias del género Vibrio, es probable que al purificar las otras fracciones, éstas incrementen la actividad actual o presenten actividad contra bacterias que no presentaron antes.

Además, especies del género Sargassum han demostrado presentar un alto potencial contra bacterias del género Vibrio, entre ellas destacan Sargassum oligocystum (Nuestro-Baleta et al., 2011) y Sargassum latifolium (Dashtiannasab et al., 2012). En este último estudio se demostró que Sargassum latifolium presenta halos de inhibición de 9±0.7 y 9.2±1.1 contra V. parahaemolyticus y V. harveyi respectivamente a concentraciones de 200 mgl-1. Esto es 10 veces mayor a lo obtenido en el presente estudio. No obstante, estas diferencias de actividad pueden explicarse por diversos factores, tales como la especie, la variación estacional, la variación geográfica e incluso el estado reproductivo del alga (Lara- Issasi et al., 1999).

Algunos estudios demuestran que Vibrio harveyi suele ser más sensible a los ensayos de actividad antibacteriana, presentando en la mayoría de los casos halos de inhibición más definidos que Vibrio parahaemolyticus (Nuestro-Baleta et al. 2011; Dashtiannasab et al., 2012). Lo anterior es similar a lo obtenido en el presente estudio, donde la mayor actividad observada se registró contra Vibrio

38 harveyi (Tabla V y VI) tanto en el extracto crudo (EC) como en la fracción F2 obtenida con diclorometano-etanol (9:1). Esto concuerda con estudios previos, los cuales indican que el uso de solventes orgánicos provee una mayor eficiencia en la extracción de compuestos con actividad antibacteriana comparado a aquellos que utilizan agua (Tüney et al., 2006). Además estudios recientes elaborados por Al-Saif et al. (2014) reportan que las extracciones etanólicas permiten la obtención de compuestos con una mayor actividad antibacteriana, no obstante otros autores como Tüney et al. (2006) sugieren el cloroformo como mejor solvente para la extracción.

La actividad antibacteriana de S. lapazeanum se presentó tanto en fracciones polares como no polares (Tabla V). No obstante, se seleccionó una de las fracciones apolares (F2) para su posterior fraccionamiento debido a que mostró la mayor actividad con un halo de inhibición de 8 ± 0 para V. parahaemolyticus, y 8.5 ± 0.70 para V. harveyi. Por su parte, las fracciones obtenidas por cromatografía en columna a partir de F2, presentaron un incremento en la actividad antibacteriana con halos de inhibición más definidos, siendo F2F9 la fracción más activa contra V. harveyi (11.75 ± 0.35) y F2F8 contra V. parahaemolyticus (8.5 ± 0.71) (Tabla VI). Esto demuestra que el proceso de fraccionamiento fue efectivo, de manera que purificó el extracto incrementando así su actividad.

Los principales compuestos bioactivos producidos por las algas marinas se conforman por una gran variedad de metabolitos secundarios, los cuales según Magallanes et al. (2003), presentan una función específica dentro de su medio, entre las que se encuentran la defensa química contra herbívoros marinos, así como la disminución de epífitos mediante la inhibición de los organismos competidores y patógenos microbianos. Se ha reportado que la actividad antibacteriana en diferentes tipos de plantas y algas marinas se debe a la presencia de metabolitos de tipo terpenoides (sesterpenoides), fenoles, polifenoles, o incluso hidroquinonas. Estudios realizados con especies del orden phaeophyta, demuestran la presencia de compuestos antibacterianos halogenados como los bromofenoles y compuestos lipofílicos conformados de

39

ácidos grasos saturados e insaturados con la predominancia de los ácidos palmítico, mirístico, oleico y eicosapentaenico. Además, este tipo de ácidos grasos ha demostrado ser efectivo contra un amplio espectro de bacterias patogénicas gram positivas y negativas (Al-Saif et al., 2014). Por lo que la actividad antibacteriana observada en los extractos más activos, podría atribuirse a alguno de los compuestos mencionados anteriormente.

No obstante, los resultados obtenidos no permiten identificar qué compuestos o mezcla de compuestos se encuentran dando lugar a esta actividad, por lo cual se sugiere realizar un segundo fraccionamiento con las muestras F2F8 y F2F9. Esto no sólo podría incrementar la actividad registrada, sino que también permitirá determinar si la actividad de S. lapazeanum sobre bacterias del género Vibrio se debe a alguno de los compuestos ya reportados para algas del género, o si se trata efectivamente de un compuesto novedoso.

Los compuestos antibacterianos aislados a partir de algas del género Sargassum son muy escasos, ya que sólo se encontró registro de la obtención del ácido mirístico (Muñoz-Ochoa, 2010), el dioctil ftalato extraído con cloroformo-metanol (2:1) (Sastry y Rao, 1995) y el sulfoglicerolípido 1-0 palmitoil-3-0 (6’-sulfo-α- quinovopiranosil) -glicerol aislado con metanol (Arunkumar et al., 2005), siendo los últimos dos obtenidos a partir del alga Sargassum wightii. Esto sugiere que aún queda mucho por hacer en la investigación de compuestos antibacterianos en algas de este género. Además, se debe considerar que las sustancias contenidas en las algas que presentan propiedades antimicrobianas suelen fluctuar en cantidad a lo largo del año, siendo muy probablemente de naturaleza distinta, ya que se extraen con solventes de diferente polaridad. Por lo que se recomienda elaborar un estudio de la variación estacional de éstos compuestos que complemente los resultados obtenidos.

Finalmente, la actividad selectiva contra bacterias del género Vibrio observada en los ensayos, permite considerar a S. lapazeanum como una alternativa en acuacultura para la obtención de compuestos antibacterianos naturales con aplicaciones en el tratamiento contra la vibriosis, una de las principales causas de

40 enfermedades y pérdidas económicas en granjas acuícolas, que suele afectar principalmente los cultivos de camarón. Esta enfermedad genera lesiones en la cutícula, apéndices y branquias de los camarones, infecciones localizadas en las heridas, perdidas de miembros, así como musculatura blanda, que al no ser tratada adecuadamente puede causar pérdidas de producción aproximados al 100% (Venkateswara, 2008; Limonta y Coffigny, 2012).

3. Análisis de la actividad antioxidante

Los ensayos de actividad secuestrante de radicales libres, demostraron que S. lapazeanum presenta un alto potencial como fuente de compuestos con actividad antioxidante. Esto coincide con diversos estudios que indican el alto potencial de las algas pertenecientes al género Sargassum como fuente de este tipo de compuestos (Anggadiredja y Andyani, 1997; Budhiyanti, 2012; Zhang et al, 2012; Agardh, 2013). Los resultados obtenidos en el presente estudio son similares a aquellos reportados por Zubia y colaboradores (2007) quienes obtuvieron EC50 de 6.64 y 7.14 µg mL−1 para S. ramifolium y S. pteropleuron respectivamente, siendo estos resultados 6.01 y 5.59 veces más activos que el extracto de mayor actividad -1 obtenido en el presente estudio, el cual presentó una EC50 de 39.96 µg mL . Estas variaciones de actividad podrían deberse a la composición química de las algas analizadas, así como a los solventes utilizados durante el método de extracción, ya que estudios recientes demuestran que la actividad secuestrante de radicales libres a partir de extractos de Sargassum se ve afectada por diferentes factores, tales como la especie, la zona y la temporada de colecta, así como el método de extracción utilizado (Budhiyanti, 2012).

Además puede observarse que la actividad antiradicalaria fue mayor en los extractos más polares (Figura 14) lo cual, como sugiere Zubia y colaboradores (2007) podría deberse a la presencia de compuestos polifenólicos ya que éstos han demostrado una correlación significativamente alta entre el contenido fenólico y la actividad antioxidante en extractos de algas marinas, tal es el caso de lo descrito por Wei et al., (2003) quienes demostraron la actividad antioxidante de compuestos fenólicos puros obtenidos a partir de Sargassum kjellmanianum. Es

41 importante destacar que estudios previos realizados con algas del género Sargassum analizan el contenido de polifenoles en relación a las variaciones ambientales, obteniendo variabilidades muy altas en especies como Sargassum furcatum y Sargassum mangarevense; mientras que en otras especies como Sargassum hystrix las variaciones eran menores (González-Batista, 2009; Budhiyanti, 2012).

Todas las fracciones analizadas presentaron una menor EC50 en relación a lo -1 obtenido en la curva control de ácido ascórbico EC50: 1.5 µg mL (Figura 5). No obstante, la fracción más activa de S. lapazeanum resultó 26 veces menor a éste -1 valor, con una EC50 de 36.96 µg mL . En este sentido, es importante considerar que los extractos utilizados son extractos que no han sido purificados, por lo que los compuestos responsables de la actividad observada pudieran incrementar su efectividad una vez fraccionados. Por lo anterior, podría incluso considerarse el ácido ascórbico, como uno de los compuestos relacionados a esta actividad, ya que se ha reportado se encuentra presente en algunas macroalgas (Gonzáles- Batista et al., 2009). Cabe destacar que en la composición química de las algas existen diferentes metabolitos relacionados en mayor o menor medida a su capacidad antioxidante, es por ello que realizar los ensayos de actividad se debe considerar que esta puede atribuirse no sólo a una molécula, sino también al efecto sinérgico entre varias (Gonzáles-Batista et al., 2009).

Generalmente los organismos fotoautróficos se encuentran expuestos a un gran estrés por oxígeno, y se han adaptado a este medio desarrollado diferentes sistemas de protección eficientes contra las especies reactivas de este (ERO). Uno de estos sistemas, constituye en la producción de potentes antioxidantes como lo son polifenoles, carbohidratos y compuestos nitrogenados, fitosteroles, carotenoides, derivados de la clorofila y otros pigmentos fotoprotectores (Gouveia et al., 2008). Además, las algas contienen metales como Se, Zn, Mn y Cu los cuales son componentes fundamentales de enzimas antioxidantes, por lo que podrían contribuir en esta propiedad al ser consumidos por el hombre (González- Batista, 2009).

42

La actividad antioxidante observada, se puede atribuir a tres diferentes tipos de compuestos que se han reportado como responsables de esta actividad en las algas: Liposolubles, hidrosolubles y polisacáridos. Entre los liposolubles se encuentran los carotenoides y la clorofila A. No obstante, no siempre es posible ubicar los metabolitos de acuerdo a su polaridad, ya que Iwashima et al (2005) aislaron 3 plastoquinonas a partir de Sargassum micracathum que presentaban actividad antioxidante, la cual podía atribuirse a la porción polifenólica, el segmento similar al alfa-tocoferol, o ambos, ya que no pudo ser determinado (González-Batista, 2009).

Por su parte, entre los compuestos hidrosolubles destacan los polifenólicos como los flavonoides y los ácidos fenólicos. Estos constituyen uno de los grupos de metabolitos secundarios más numerosos y representativos en las plantas; son de suma importancia ya que forman parte de diferentes eventos fisiológicos y metabólicos. Actualmente se sabe que los compuestos fenólicos son los más efectivos en la mayoría de las algas pardas estudiadas, conformando entre el 20 y el 30% de su peso seco, siendo los florotaninos los polifenoles de mayor presencia, los cuáles sólo se han aislado a partir de diferentes especies de algas pardas, entre las que destacan Sargassum kjellamanianum, Sargassum siliquastrum, y el bifuhalol polimerizado obtenido a partir de Sargassum ringgoldianum (Nakai et al., 2006; González-Batista, 2009; Budhiyanti, 2012). Finalmente, los polisacáridos sulfatados de algunas algas marinas también han demostrado presentar un alto potencial antioxidante en diversos estudios que incluyen el análisis hepatoprotector en modelos de ratón, sin embargo aún es escaso el conocimiento que se tiene de estos compuestos y su relación con la actividad antioxidante (González-Batista, 2009).

43

4. Análisis de la actividad anticoagulante.

4.1 Caracterización parcial del Fucoidan

El espectro de IR de las fracciones presentó un patrón de absorción similar del infrarrojo, sugiriendo que todas las fracciones contienen los mismos grupos funcionales, no obstante presentan variaciones en su composición, las cuales pueden apreciarse por medio de las diferencias de intensidad de los picos de absorción (Figura 16). Las bandas que se encuentran entre 960-970 corresponden a los residuos el grupo metilo de la fucosa (CH3), confirmando la presencia de ésta. Por su parte las bandas entre el 1417-1616 cm-1 corresponden al enlace amida N-H y demuestran la presencia de amino-azúcares o uronatos (Gómez-Ordóñez, 2012), mientras que las bandas ubicadas entre 1210 y 1250 cm−1 corresponden a las vibraciones de estrechamiento del S-O. La banda a 830 cm−1 fue asignada a la vibración del grupo C-O-S. Estas vibraciones indican la presencia del grupo sulfato en posición axial del C4 con sustituciones menores en los carbonos C2 y C3 de la fucosa, dadas por un pico de absorción menos intenso a los 805 cm-1 (Li et al., 2008).

Además, la banda de absorción a los 570 cm-1 confirmó la presencia de un número significativo de grupos sulfato (Muñoz-Ochoa, 2006). No obstante, a parte de las vibraciones C-O-S, en la región de 820-850 cm -1 existen vibraciones dadas por las uniones C-H de la terminación de azúcares reductores, lo cual podría afectar el criterio de la posición del grupo sulfato. En base a lo anterior Li et al., (2008) sugieren comparar y complementar los resultados obtenidos por IR con la estabilidad de los esteres sulfatados por medio de análisis de álcali y de metilación para determinar la posición del grupo sulfato. Es por ello que se recomienda continuar con la investigación y realizar estudios posteriores, no sólo con el fin de investigar la conformación de la estructura química del fucoidan obtenido a partir de S. lapazeanum, sino también para esclarecer los mecanismos de acción de este compuesto.

44

-

S. S.

, FC2 y FC3 en la región losde 400

ATR del extracto acuoso (Fucoidan: FC) de

-

y y las fraccionesfraccionada obtenidos por a partirprecipitación deéste: FC1

.

1

-

lapazeanum 2000cm Figura 16. Principales picos de absorción de los espectros de FTIR 45

En base a lo anterior se describe el fucoidan obtenido a partir de S. lapazeanum como un heterofucano debido a la presencia de ácidos urónicos y azúcares neutros detectados en las banas de IR (Gómez-Ordóñez, 2012). Por lo que se sugiere hacer un análisis de su composición monomérica para la identificación de azúcares como manosa, xilosa o galactosa.

4.2 Ensayo de actividad anticoagulante

El proceso de coagulación se lleva a cabo a través de ciertos factores que permiten detener el flujo sanguíneo en el lugar donde se ha producido daño tisular. En la medida que los anticoagulantes (endógenos o exógenos), interfieren con estos factores de coagulación inactivándolos o limitándolos, la coagulación de la sangre se prolonga o se detiene (Gómez-Ordóñez, 2012). La actividad in vitro del fucoidan y los precipitados obtenidos a partir de este, fue evaluada por medio del tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA). El ensayo de TP sugiere que los heterofucanos obtenidos a partir de S. lapazeanum actúan en la vía extrínseca de la cascada de coagulación ya que todos los extractos probados prolongaron el tiempo de formación del coágulo, siendo este hasta 28 s mayor que el control en FC2 (Tabla VIII).

En base a los resultados observados en los primeros ensayos de TTPA, se realizaron curvas dosis-efecto con cada uno de los extractos para definir las concentraciones a las que se presenta esta actividad. Las curvas obtenidas demostraron el alto potencial anticoagulante de S. lapazeanum, ya que todos los extractos prolongaron el tiempo de formación del coágulo, duplicando el tiempo de coagulación establecido por el control (32.84 s) incluso a concentraciones mínimas de 3.06 µg mL-1 (Figura 15), siendo FC2 el más activo. Las fracciones de fucoidan obtenidas en el presente estudio mostraron una actividad similar a la de la heparina. Ronghua et al., (2003) reportaron que el tiempo de coagulación para la heparina fue de 125 s a concentraciones de 10 µgmL-1, en base a ello es posible decir que FC2 la fracción más activa y de mayor potencial ya que duplicó este tiempo a la misma concentración (Figura 15). Esto concuerda con el potencial observado en otras especies del género, ya que Dore-Guerra et al.,

46

(2013) reportaron que el fucoidan obtenido a partir de Sargassum vulgare resultó ser hasta 10 veces más activo que la heparina.

Tabla VIII. Comparación de actividad de los extractos acuosos obtenidos a partir de Sargassum lapazeanum en el ensayo de tiempo de protrombina (TP). Extracto TP Tiempo prolongado (s) Control 14 comparación al control FC 30.25 ± 0.79 16.25 FC1 24.50 ± 1.30 10.5 FC2 41.93 ± 2.49 27.93 FC3 23.079 ± 1.90 9.079

Por su parte, los ensayos de TTPA mostraron tiempos de coagulación mayores a los 300 s establecidos para el ensayo, siendo este resultado casi 9 veces mayor que lo mostrado por el control (33.54 s) (Tabla VII). Esto coincide con lo observado por diferentes autores (Tabla IX), tales como Athukorala et al. (2007) quienes registraron valores similares a partir de extractos acuosos obtenidos a partir de S. horneri (>300 s) y S. siliquastrum (200 s). Asimismo, Lara-Issasi y Álvarez- Hernández (1999), registraron una menor actividad a partir de algas como S. cymosum, S. filipéndula y S. pteropleuron, así como tiempos igual de elevados (>300 s) a partir de extractos de Sargassum vulgare. Estas diferencias podrían deberse al tipo de especie estudiada y su composición química que, como lo indica García-Ríos et al. (2012), se ve afectada por diversos factores como el clima y la zona geográfica. Sus estudios señalan que existe una correlación entre el contenido de fucoidan y la profundidad de las algas, obteniendo un mayor contenido de este compuesto en aquellas que crecen cerca de la superficie. Lo anterior podría explicar el alto potencial de S. lapazeanum, un alga que habita en la zona intermareal.

47

Tabla IX. Listado de algunos valores de TP y TPPA reportados para algas del género Sargassum. Especie Referencia TP TTPA (s)

Sargassum horneri Athukorala et al., 2007. > 300 Sargassum siliquastrum Athukorala et al., 2007. 200 Sargasum cymosum Lara-Isassi y Álvarez-Hernández, 1999. 90 90 Sargassum filipendula Lara-Isassi y Álvarez-Hernández, 1999. 16 82 Sargassum Lara-Isassi y Álvarez-Hernández, 1999. 60 100 pteropleuron Sargassum vulgare Lara-Isassi y Álvarez-Hernández, 1999. 25 > 300

La actividad observada en los ensayos de TTPA sugiere que los heterofucanos obtenidos también podrían estar actuando en la vía intrínseca o la vía común del FX, factor que es esencial para la formación de la trombina y la subsecuente fibrina. Se ha reportado que los fucoidanos obtenidos a partir de algas pardas pueden, al igual que la heparina, inhibir la actividad de la trombina actuando de manera directa en la enzima o mediante la activación de los inhibidores de trombina, incluyendo la antitrombina III y el cofactor II de la heparina. No obstante algunos activan sólo la antitrombina. La heparina es una biomolécula que contiene glucosaminoglicano altamente sulfatado que junto con las heparinas de bajo peso molecular, representan los anticoagulantes de mayor uso en el mercado (Gómez-Ordóñez, 2012). Sin embargo, se ha registrado que el uso prolongado de estos compuestos puede tener efectos adversos como lo son trombocitopenia, osteoporosis y hemorragias.

Con respecto al grado de sulfatación, el contenido de sulfatos en FC2 (47.48%) fue mucho mayor en comparación a lo observado en las otras fracciones, siendo igualmente la fracción que presentó más actividad (Tabla VII y Figura 15). Esto coincide con estudios previos, los cuales indican el incremento en el contenido de sulfatos como uno de los factores más importantes que definen la actividad anticoagulante, la cual incrementa conforme el grado de sulfatación de los fucanos (Muñoz-Ochoa, 2006). Además se ha reportado que pequeñas diferencias en la proporción y distribución de los residuos de sulfatos en las cadenas del fucoidan,

48 podrían resultar críticas para la interacción de las proteasas, inhibidores y activadores del sistema de coagulación, alterando así el valor observado en los ensayos de actividad anticoagulante (Gurgel-Rodrigues et al., 2011)

Debido al alto potencial anticoagulante del fucoidan obtenido a partir de S. lapazeanum, se sugiere continuar con futuras investigaciones enfocadas en el aislamiento y caracterización de este compuesto que permitan complementar el estudio con métodos como resonancia magnética nuclear (RMN).

49

VIII. CONCLUSIONES

Los ensayos elaborados en el presente estudio demostraron que Sargassum lapazeanum es un alga con un alto potencial como fuente de compuestos con actividad antioxidante, antibacteriana y anticoagulante.

El análisis de la actividad antibacteriana indicó la selectividad de S. Lapazeanum por bacterias del género Vibrio, como V. harveyi y V. parahaemolyticus y V. parahaemoliticus

Los ensayos de actividad secuestrante de radicales libres demostraron que S. lapazeanum es un alga de gran potencial antioxidante con una EC50 = 39.96 µg mL-1 comparable a lo obtenido en otras especies de algas de este género.

Los heterofucanos FC1, FC2 y FC3 obtenidos a partir de la precipitación fraccionada de FC, mostraron una actividad anticoagulante comparable a la de la heparina, siendo FC2 el más activo. Finalmente el análisis estructural del fucoidan demostró que se trata de un heterofucano compuesto por fucosa con sustituciones de grupos sulfato en posición C4 principalmente.

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63

ANEXO I.

Descripción de la especie: Sargassum lapazeanum.

Las especies de Sargassum se caracterizan morfológicamente por presentar un talo (estructura de forma arbustiva), que se divide en sujetador, estipe, filoides y aerocistos. No obstante, las estructuras en éste género suelen verse modificadas debido a variaciones espacio-temporales de distintos factores ambientales, y es precisamente ésta plasticidad morfológica lo que por mucho tiempo complicó la clasificación taxonómica de Sargassum lapazeanum (Andrade-Sorcia, 2005).

Tabla X. Ubicación taxonómica del alga Sargassum lapazeanum.

Taxa Descripción Imperio: Eukaryota Chatton. Reino: Chromista T. Cavalier-Smith. Phylum: Ochrophyta T. Cavalier-Smith. Clase: Phaeophyceae F.R. Kjellman. Orden: Fucales Bory de Saint- Vincent. Familia: Sargassaceae Kützing. Género: Sargassum C. Agardh.

Morfología

Ls talos de S. lapazeanum llegan a medir entre ~10 a ~1.5 m de largo, estos surgen de un sujetador discoidal parenquimatoso y sólido que inicia como un disco hasta formar un cono o hapteros. El estipe es cilíndrico y liso, presenta además numerosas ramas lisas y cilíndricas. Las ramas primarias son delgadas y pueden llegar a presentar ramas secundarias. Los filoides son asimétricos, más amplios en la zona apical del filoide, con pedicelos cortos y miden entre 0.5 – 2.5 cm de largo. Algunos filoides presentan una corona sobre uno de los lados del filoide (no

64 son completamente planos), otros se encuentran torcidos de la mitad basal del margen superior, que es liso y cóncavo. El remanente del filoide es agudo, dentado y con una nervadura de poco evidente a evidente. Los criptostomatas están presentes y evidentes, mientras que los aerocistos son escasos entre los receptáculos que son elípticos. Los aerocistos en su mayoría son similares a la forma de los filoides, tienen el margen modificado con remanencias de filoides, lo que forma una cresta. Los receptáculos se observan en trinchete con algunas espinas, entremezclados receptáculos de anteridios y oogonias, creciendo en ramilletes (Andrade-Sorcia et al., 2013)

Figura 17. Fotografías de Sargassum lapazeanum. © Valeria Villegas ([email protected]).

Hábitat

Los organismos de esta especie crecen sobre rocas a lo largo de la zona intermareal a submareal. Además se ha observado que pueden formar mantos con S. horridum, S. sinicola, y S. johnstonii.

65

Ciclo de vida

No se cuenta con un registro del ciclo de vida de esta especie en particular, no obstante se trata de un alga del género Sargassum, por lo que su reproducción es sexual y asexual. La reproducción sexual se da por medio de la producción de gametos, su fertilización y la fijación de zigotos al sustrato; mientras que la asexual consiste en la regeneración de un nuevo talo a partir de un estolón (talo de años anteriores, menor a 17 cm y con pocos o sin filoides y aerocistos).

Estudios de la dinámica poblacional de S. lapazeanum (Rivera y Scrosati, 2008) indican que presenta sus máximos de crecimiento en primavera (Marzo-Abril tasa de crecimiento máxima) y los mínimos durante el periodo de otoño, con escasez de plantas reproductivas durante Junio-Agosto y la mayor mortalidad en los meses de Agosto y Septiembre.

Distribución

S. lapazeanum fue descrita en 1924 por Setchell y Gardner, con ejemplares de La Paz B.C.S., ya que sólo se tenía registro del alga en esta zona la especie se consideró como endémica de la parte Sur del Golfo por mucho tiempo. Estudios moleculares recientes (Andrade-Sorcia et al., 2013) demuestran que su distribución es aún más amplia, pudiéndose observar en las costas de Sonora, Baja California y Baja California Sur (Figura 18).

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Figura 18. Mapa que muestra la distribución actual de S. lapazeanum. Modificado a partir de NOAA. http://www.ngdc.noaa.gov/mgg/shorelines/shorelines.html.

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ANEXO II.

Tabla XI. Extracto crudo (g) y rendimiento (%) obtenido del alga S.lapazeanum. Peso del Extracto Rendimiento Especie alga (g) crudo (g) (%) S. lapazeanum 300 34.73 11.57

Tabla XII. Peso (g) y rendimiento (%) de las fracciones obtenidas por fraccionamiento sólido líquido a partir de S. lapazeanum. Especie Fracciones obtenidas por extracción sólido-líquido 12-009 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7

Sargassum CH2Cl CH2Cl2- CH2Cl2- CH2Cl2- EtOH EtOH- H2O lapazeanum 2 EtOH EtOH EtOH 100% H2O 100% 100% 90-10% 75-25% 50-50% 50-50% Peso (g) 1.52 0.79 1.54 2.04 0.84 0.46 0.078 Rendimiento(%) 10.13 5.26 10.26 13.6 5.6 3.06 0.52

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ANEXO III.

Figura 19. TLC de los eluatos obtenidos por medio del fraccionamiento sólido-lìquido del extracto crudo E.E.C.

Figura 20. Cromatografìas en placa fina (TLC) de los eluatos obtenidos a partir de la columna cromatográfica realizada con F2.

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ANEXO IV.

Figura 21. Halos de inhibición de los extractos obtenidos a partir de S. lapazeanum en cajas de petri inoculadas con Vibrio harveyi.

Figura 21. Halos de inhibición de los extractos obtenidos a partir de S. lapazeanum en cajas de petri inoculadas con Vibrio parahaemolyticus.

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Figura 23. Halos de inhibición de los extractos obtenidos a partir de F2 en cajas de petri inoculadas con Vibrio harveyi.

Figura 24. Halos de inhibición de los extractos obtenidos a partir de F2 en cajas de petri inoculadas con Vibrio parahaemolyticus.

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