Marcelo Dias Catarino Florotaninos Da Alga Fucus Vesiculosus: Extração, Caracterização Estrutural E Efeitos Ao Longo Do Trato Gastrointestinal
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Universidade de Aveiro Departamento de Química 2021 Marcelo Dias Catarino Florotaninos da alga Fucus vesiculosus: Extração, caracterização estrutural e efeitos ao longo do trato gastrointestinal Fucus vesiculosus phlorotannins: Extraction, structural characterization and effects throughout the gastrointestinal tract Universidade de Aveiro Departamento de Química Ano 2021 Marcelo Dias Catarino Florotaninos da alga Fucus Vesiculosus: Extração, caracterização estrutural e efeitos ao longo do trato gastrointestinal Fucus vesiculosus phlorotannins: Extraction, structural characterization and effects throughout the gastrointestinal tract Tese apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Química Sustentável, realizada sob a orientação científica da Doutora Susana Maria Almeida Cardoso, Investigadora Doutorada do Departamento de Química da Universidade de Aveiro, Professor Doutor Artur Manuel Soares da Silva, Professor Catedrático do Departamento de Química da Universidade de Aveiro e do Professor Doutor Nuno Filipe da Cruz Baptista Mateus, Professor Associado do Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Estudo efetuado com apoio financeiro do projeto PTDC/BAA-AGR/31015/2017, suportado pelos orçamentos do Programa Operacional de Competitividade e Internacionalização— POCI, na sua componente FEDER, e da Fundação para a Ciência e a Tecnologia, na sua componente de Orçamento de Estado. A Universidade de Aveiro e a Fundação para a Ciência e para a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (FCT/MCTES) financiaram o Laboratório Associado para a Química Verde (LAQV) da Rede de Química e Tecnologia (REQUIMTE) (UIDB/50006/2020), através de fundos nacionais e, quando aplicável, co-financiado pela FEDER, no âmbito do Portugal 2020. A FCT financiou a bolsa de PhD de Marcelo D. Catarino (PD/BD/114577/2016). Dedico este trabalho à minha família e amigos, pela presença constante. “A person who never made a mistake never tried anything new.” Albert Einstein o júri presidente Prof. Doutor João Carlos de Oliveira Matias Professor Catedrático da Universidade de Aveiro vogais Doutor Victor Armando Pereira Freitas Professor Catedrático da Universidade do Porto Maria Manuela Estevez Pintado Professora Associada da Universidade Católica Portuguesa do Porto Maria Teresa Cruz Rosete Professora Auxiliar da Universidade de Coimbra Diana Cláudia Gouveia Alves Pinto Professora Auxiliar da Universidade de Aveiro Doutora Susana Maria de Almeida Cardoso (Orientadora) Investigadora Doutorada (nível 3) da Universidade de Aveiro agradecimentos Tendo chegado ao final deste longo e intrincado percurso, não posso deixar de dar uma palavra de agradecimento às pessoas que dele fizeram parte. Em primeiro lugar à Doutora Susana Cardoso, orientadora deste trabalho, pela confiança, motivação, apoio e ensinamentos transmitidos. Ao Professor Doutor Artur Silva e Professor Doutor Nuno Mateus, pela disponibilidade e apoio à realização deste trabalho. Agradeço à antiga Unidade de Química Orgânica, Produtos Naturais e Agro- Alimentares (QOPNA) e ao recente Laboratório Associado para a Química Verde da Rede de Química e Tecnologia (LAQV-REQUIMTE) do Departamento de Química da Universidade de Aveiro, por ter disponibilizado todas as condições possíveis para a realização deste trabalho. Agradeço à Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) pelo financiamento através de uma bolsa de doutoramento (PD/BD/114577/2016). Aos meus colegas da FCUP, Iva Fernandes e Hélder Oliveira, pela ajuda preciosa que foram na realização de algumas tarefas. À Professora Doutora Manuela Pintado e restantes membros da equipa, Teresa Bonifácio, Débora Campos e Manuela Machado, pelo acompanhamento e ensinamentos, e por me acolherem na ESB e disponibilizar condições. Também à Professora Doutora Maria Teresa Cruz e restantes membros da equipa, Ana Silva, Cátia Sousa, Myléne Carrascal, Isabel Ferreira, por me terem acolhido no CNC, disponibilizando também condições e tempo para me acompanhar e transmitir ensinamentos. Ao Daniel Ferreira e Adriana Tavares, pela amizade e momentos de boa disposição. Aos atuais e ex-colegas do meu grupo e grupos vizinhos Ana Rita Circuncisão, Andreia Silva, Cátia Oliveira, Élia Maricato, Letícia Costa, Mariana Mesquita, Mariana Vallejo, Pedro Fernandes, Ricardo Ferreira, Rita Bastos, Sofia Queirós, Sónia Ferreira e Soraia Silva pelo convívio e camaradagem. Um especial agradecimento à Catarina Marçal, pelo apoio e colaboração. Aos meus bons amigos Daniel Oliveira, Diogo Carreiras, Gilberto Alkimin, Joana Martins, Luis Santos, Maria Gonçalves, Mariana Pires, Sónia Russo, Patrícia Vasconcelos, Renata Vicente, Sara Vallejo, Telmo Alves e Thomas Martins pelos momentos de convívio e boa disposição, força e motivação. Ao Rui Soares pelo ânimo que me tem dado nesta etapa final. À minha família, por serem a minha pedra basilar. Obrigado a todos! palavras-chave Fucus vesiculosus, florotaninos, extração, propriedades bioativas, antioxidante, anti-inflamatório, antitumoral, prébiotico. resumo Desde a antiguidade que as macroalgas marinhas têm sido tradicionalmente usadas pelos povos de extremo oriente, quer para consumo direto, como fonte de nutrientes, como para fins medicinais. Nos últimos anos estes organismos marinhos têm vindo a ganhar uma crescente popularidade entre as populações ocidentais que começam a estar cada vez mais conscientes do potencial que estas possuem como uma possível fonte de compostos bioativos de grande interesse. De entre os seus compostos destacam-se os florotaninos, um grupo de compostos fenólicos derivados do floroglucinol, reivindicados pelos seus benefícios para a saúde, e cuja ocorrência é exclusiva das macroalgas castanhas. Apesar de várias propriedades bioativas terem já sido demonstradas para estes compostos, existe ainda um longo percurso a percorrer até à compreensão dos mecanismos por detrás destas, sendo isto particularmente verdade no que diz respeito às propriedades anti-inflamatórias e antitumorais dos florotaninos provenientes da macroalga Fucus vesiculosus. Além disso, pouco se sabe acerca do destino destes compostos durante a sua passagem pelo trato gastrointestinal. Neste contexto, neste trabalho pretendeu-se otimizar a extração de florotaninos a partir desta macroalga e elucidar a composição destes extratos através da técnica de UHPLC-DAD-ESI-MSn, bem como clarificar as potencialidades bioativas de extrato bruto ou frações do ponto de vista de atuação ao longo to trato gastrointestinal, nomeadamente os efeitos antioxidante, anti-inflamatório, antitumoral e prébiotico. Recorrendo à técnica de superfície-resposta, as condições determinadas para o máximo de recuperação de florotaninos da alga F. vesiculosus foram: acetona a 67% (v/v) numa proporção de 70 mL/g de farinha de alga a 25 ºC. Após um passo de purificação intermédio, a fração rica em florotaninos (EtOAc) revelou um complexo perfil cromatográfico composto por vários fucóis, fucofloretóis, fualóis e outros derivados de florotaninos. Foram ainda detetados três potenciais novos derivados de florotaninos, nomeadamente o fucofurodifloretol, fucofurotrifloretol e o fucofuropentafloretol. Tanto o extrato bruto como a EtOAc revelaram boa atividade antioxidante, em particular contra o radical de óxido nítrico, um importante interveniente na cascata sinalizadora da inflamação. De facto, uma atividade anti-inflamatória pronunciada foi confirmada em células RAW 264.7 estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS). A partir da EtOAc foram ainda obtidas 9 sub-frações de florotaninos com diferentes pesos moleculares que, após testadas na mesma linha celular, revelaram algumas diferenças ao nível da atividade anti- inflamatória que possivelmente estarão relacionados com a sua complexidade e peso molecular. Um efeito anti-inflamatório bastante marcado foi ainda observado para uma sub-fração em particular, a F2, caracterizada pela presença de um composto derivado de florotaninos com peso molecular de 508 g/mol. Esta fração, a 200 µg/mL, foi capaz de inibir a fosforilação e degradação da proteína IκBα, consequentemente bloqueando a cascata sinalizadora da inflamação ao nível transcricional. A fração EtOAc bem como algumas das posteriores sub-frações, nomeadamente F1 e F5, demostraram ainda propriedades antitumorias promissoras, provocando um efeito citotóxico seletivo apenas contra células tumorais de cancro gástrico (MKN-28) e cancro do colon (Caco-2 e HT-29), não afetando células normais. Das três amostras, a F5, caracterizada pela presença de fucóis, fucofloretóis, um fucofurodifloretol e eckstolonol, foi a que revelou o efeito mais acentuado em todas as linhas celulares tumorais, demonstrando valores de IC50 de 56.3 ± 14.7, 97.4 ± 11.6 e 118.8 ± 19.7 µg/mL para MKN-28, Caco-2 e HT-29, respetivamente. Curiosamente, enquanto a EtOAc exerceu este efeito através do bloqueio do ciclo celular e ativação de mecanismos de morte celular, a sub-fração F1 apenas promoveu o bloqueio do ciclo celular enquanto a sub-fração F5 apenas ativou a morte celular via ativação de mecanismos de apoptose/necrose. Por fim, verificou-se uma boa capacidade inibidora das enzimas digestivas por parte destes compostos, em particular da enzima α-glucosidase cujo IC50 foi 45 a 250 vezes inferior ao da acarbose, revelando potencial terapêutico contra a diabetes do tipo-II. No entanto, à semelhança dos polifenóis das plantas, os florotaninos revelaram-se suscetíveis a degradação e perda de atividade antioxidante