UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR ÁREA DE CONOCIMIENTOS DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA TESIS: EVALUACIÓN DEL POTENCIAL DE Sargassum lapazeanum Setchell & N.L. Gardner (Ochrophyta: Fucales, Phaeophyceae) COMO FUENTE DE COMPUESTOS ANTIBACTERIANOS, ANTIOXIDANTES Y ANTICOAGULANTES. QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: BIÓLOGA MARINA PRESENTA: VALERIA ALEXANDRA VILLEGAS SILVA DIRECTOR: DR. MAURICIO MUÑOZ OCHOA LA PAZ, B.C.S., MÉXICO. JUNIO DE 2014 Agradecimientos Este proyecto se realizó en las instalaciones del Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Mauricio Muñoz Ochoa, financiado por el proyecto "Sargassum lapazeanum como fuente de compuestos bioactivos” IPN-SIP20131037”. Al Dr. Mauricio Muñoz Ochoa por su incondicional apoyo y paciencia, así como por su orientación y guía en laboratorio durante las pruebas realizadas incluso en momentos de desesperación académica. Gracias por enseñarme las bases de la química de productos naturales, motivándome siempre a seguir adelante. A la Dra. Gabriela Andrade Sorcia, por la agradable lección de botánica y la identificación taxonómica del alga. A mi comité de tesis Dr. Rafael Riosmena Rodríguez, Dr. Juan Manuel López Vivas, Dra. Gabriela Andrade Sorcia y Dr. Jesús Iván Murillo Álvarez por sus acertados comentarios y observaciones, así como el tiempo y dedicación a la hora de aclarar dudas. A las M. en C. Yoloxochitl Elizabeth Rodríguez Montesinos y Dora Luz Arvizu Higuera por el apoyo, la confianza y las facilidades que me permitieron disponer del laboratorio hasta altas horas de la noche. Asimismo agradezco a mis compañeros de laboratorio de química de algas por hacer del tiempo trabajando algo más ameno. Finalmente a aquellas personas que me apoyaron y confiaron en mí durante la realización de este proyecto, principalmente mis hermanos y amigos por escucharme cuando más lo necesite y acompañarme a lo largo de este proceso, muchas gracias. “... pero sus estridentes ladridos sólo son señal de que cabalgamos.” (Goethe, 1808). RESUMEN La península de Baja California cuenta con una gran variedad de hábitats y condiciones climáticas, por lo que alberga una enorme riqueza de algas marinas destacando la presencia de las algas pertenecientes al género Sargassum por su alta dominancia en biomasa. (Suárez Castillo et al., 2013). Se seleccionó la especie Sargassum lapazeanum, para el estudio de su potencial actividad biológica como fuente de compuestos con actividad antibacteriana, antioxidante y anticoagulante. Los resultados obtenidos indican que el extracto etanólico de S. lapazeanum, así como sus diferentes fracciones presentan una actividad selectiva contra bacterias del género Vibrio como V. harveyi y V. parahaemolyticus, además de actividad secuestrante de radicales libres en la -1 mayoría de los extractos analizados, obteniendo la menor EC50=39.96 µg mL a partir de F6. Por su parte el fucoidan crudo y sus fracciones mostraron valores comparables a los observados por la heparina a concentraciones de 10 µgmL-1. Finalmente el análisis estructural del fucoidan demostró que se trata de un heterofucano con sustituciones de grupos sulfato en posición C4 mayoritariamente. Palabras clave: actividad biológica, algas pardas, caracterización, proximal, fucoidan. ÍNDICE Páginas LISTA DE FIGURAS I LISTA DE TABLAS III LISTA DE ABREVIACIONES IV GLOSARIO V I. INTRODUCCIÓN 1 II. ANTECEDENTES 2 1. Análisis del potencial antibacteriano 3 1.1. Antibacterianos y su clasificación 4 1.2. El género Sargassum como fuente de compuestos con 5 actividad antibacteriana. 2. Análisis del potencial antioxidante 6 2.1. Radical libre DPPH 6 2.2. Algas del género Sargassum como fuente de compuestos 7 antioxidantes 3. Análisis del potencial anticoagulante 9 3.1. Polisacáridos sulfatados: Fucoidan y actividad anticoagulante 9 en phaeophytas 3.2. Mecanismos de coagulación sanguínea 12 3.3. Evaluación de la actividad anticoagulante 16 III. JUSTIFICACIÓN 18 IV. OBJETIVOS 21 V. MATERIAL Y MÉTODOS 22 1. Recolección e identificación taxonómica 22 2. Análisis proximal del alga S. lapazeanum 23 3. Obtención del extracto 23 3.1. Obtención del extracto etanólico 23 3.2. Obtención del extracto acuoso: Fucoidan 23 4.1. Fraccionamiento por gradiente de polaridad 26 4.2. Fraccionamiento de F2 en columna cromatográfica 26 4.3 Purificación parcial del fucoidan 26 5. Pruebas de actividad biológica 26 5.1. Evaluación de la actividad secuestrante de radicales libres 26 (DPPH): análisis del potencial antioxidante 5.2. Evaluación de la actividad antibacteriana por medio del método 28 de difusión en agar con discos 5.3. Análisis de la actividad anticoagulante 28 6. Caracterización parcial del fucoidan 29 VI. RESULTADOS 30 1. Análisis proximal 30 2. Análisis de la actividad biológica 30 2.1. Actividad antibacteriana 32 2.2. Actividad secuestrante de radicales libres 34 2.3 Actividad anticoagulante 35 VII. DISCUSIÓN 1. Análisis proximal 36 2. Análisis de la actividad antibacteriana 37 3. Análisis de la actividad antioxidante 41 4. Análisis de la actividad anticoagulante 44 4.1 Caracterización parcial del fucoidan 44 4.2. Ensayo de actividad anticoagulante. 46 VIII. CONCLUSIONES 50 IX. BIBLIOGRAFÍA 51 X. ANEXOS 64 LISTA DE FIGURAS Páginas Figura 1. Estructura química del dioctil ftalato 5 Figura 2. Difenilpicrilhidracilo (radical libre). 7 Figura 3. Difenilpicrilhidracina. 7 Figura 4. Estructura de algunos compuestos químicos aislados a partir de especies del género Sargassum: A) sargothunbergol-A, B y C) 8 Tetrapreniltoluquinoles, D Y E) monogalactosil-diacilgliceroles. Figura 5. Estructura química promedio del fucoidan. 10 Figura 6. Diagrama que muestra la cascada de coagulación. Imagen 13 tomada de Martínez-Murillo (2003). Figura 7. Vía afectada por la prueba de tiempo de protrombina. Imagen 17 tomada de Kitchen et al. (2010). Figura 8. Mapa que muestra la zona de recolecta del alga S. lapazeanum en San Juan de la Costa, Bahía de La Paz B.C.S, México. 22 Modificado a partir de NOAA: http://www.ngdc.noaa.gov/mgg/ shorelines/shorelines.html. Figura 9. Obtención del extracto crudo (EC) y fraccionamiento del alga S. 24 lapazeanum. Figura 10. Esquema que muestra el proceso de obtención y 25 fraccionamiento del fucoidan. Figura 11. Cromatografía en placa fina que muestra la actividad antioxidante de S. lapazeanum por el método bioautográfico, 32 revelada con una solución de DPPH al 0.4%. E.E.C= Extracto crudo. Figura 12. Gráfica comparativa de los valores obtenidos para las EC50 en . las fracciones obtenidas por gradiente de polaridad a partir de 32 S. lapazeanum. 1= Menor polaridad, 7= Mayor polaridad E.EC.= Extracto Crudo. I Figura 13. Curva dosis efecto la fracción F6 de S. lapazeanum, donde se observa el porcentaje de reducción del DPPH (%) en relación a la concentración del extracto (µg mL-1). En negro: línea de 33 tendencia y desviación estándar. En rojo: concentración efectiva media (EC50). Figura 14. Curva dosis efecto del ácido ascórbico (AA), utilizada como blanco de comparación, donde se observa el porcentaje de reducción del DPPH (%) en relación a la concentración del AA 33 (µg mL-1). En negro: línea de tendencia y desviación estándar. -1 EC50, obteniendo por extrapolación= 1.5 µg mL Figura 15. Gráfico que muestra la relación entre la concentración de los extractos obtenidos a partir de la precipitación fraccionada del 35 Fucoidan (FC) de S. lapazeanum y su efecto sobre el tiempo normal de coagulación según el ensayo de TTPA36 Figura 16. Espectros de FTIR-ATR de las fracciones obtenidos por precipitación fraccionada del extracto acuoso (Fucoidan) de S. 44 lapazeanum: FC1, FC2 y FC3 en la región de los 500-1800cm-1. II LISTA DE TABLAS Páginas Tabla I. Estudios realizados con el alga Sargassum lapazeanum 4 Tabla II. Listado de algunas especies del género Sargassum que han 12 presentado actividad anticoagulante. Tabla III. Nombre y función de los diferentes factores y cofactores que 14 actúan en las diferentes etapas de la cascada de coagulación15 Tabla IV. Resultados de análisis proximal del alga S. lapazeanum. 30 Tabla V. Resultados de la prueba de difusión en agar con discos [2 mg/disco] del extracto crudo y las fracciones obtenidas a partir de 31 S. lapazeanum. Se reporta el promedio del halo de inhibición en milímetros ± sd, n = 2. Tabla VI. Resultados de la prueba de difusión en agar con discos [2 mg/disco] del fraccionamiento del extracto F2 obtenido a partir de 31 S. lapazeanum. Se reporta el promedio del halo de inhibición en milímetros ± sd, n = 2. Tabla VII. Actividad anticoagulante de los extractos obtenidos por 34 precipitación fraccionada a partir de S. lapazeanum Tabla VIII. Comparación de actividad de los extractos acuosos obtenidos a partir de Sargassum lapazeanum en el ensayo de tiempo de 46 protrombina (TP)47 Tabla IX. Listado de algunos valores de TP y TPPA reportados para algas 47 del género Sargassum III LISTA DE ABREVIACIONES CH2Cl2 Diclorometano BHA Butil-hiroxi-anisol BHT Butil-hidroxi-tolueno DPPH 2,2-difenil-1-pricilhidracilo ECV Enfermedades Cardio Vasculares ELN Extracto libre de Nitrógeno ERO Especies Reactivas de Oxígeno EtOH Etanol IR Espectroscopia de infrarrojo H2O Agua MEtOH Metanol TIH Trombocitopenia inducida por heparina TLC Cromatografía en placa fina, del inglés: Thin Layer Cromatography. TTPA Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada TP Tiempo de Protrombina PS Polisacáridos sulfatados IV GLOSARIO Absorbancia Medida de la fracción de luz que es absorbida por una muestra. Aerocistos Estructuras vegetativas