CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO A.C.

Caracterización del saco embrionario y estudio de Ca2+

citosólico en el proceso de doble fertilización de Agave

TESIS

PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE

MAESTRO EN CIENCIAS EN INNOVACIÓN BIOTECNOLÓGICA

PRESENTA

IBT. Ángel Martín Barranco Guzmán

COMITÉ TUTORAL

Director de Tesis: Dr. Benjamín Rodríguez Garay

Dr. Nutan Prasad Rout Dr. Jorge Alberto Verdín Ramos Co- director Asesor

Asesor

Zapopán, Jalisco, México. Diciembre de 2018

LIBERACIÓN DEL SÍNODO

Zapopan, Jalisco, 20 de noviembre de 2018

Mtra. Fátima Ordoñez de la Cruz Coordinador Académico de la Maestría en Ciencias en Innovación tecnológica Guadalajara, Jalisco

Los que suscriben integrantes del jurado de exámen de grado del estudiante ÁNGEL MARTÍN BARRANCO GUZMÁN, una vez leída y revisada la tesis titulada “Caracterización del saco embrionario y estudio de Ca2+ citosólico en el proceso de doble fertilización de Agave” aceptamos que la referida tesis revisada y corregida sea presentada por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencias en Innovación Biotecnológica durante el exámen correspondiente.

Y para que así conste firmamos la presente a los 20 días del mes de noviembre del año 2018.

Dr. Benjamín Rodríguez Garay Dr. Nutan Prasad Rout

Dr. Jorge Alberto Verdín Ramos

Zapopan, Jalisco, 20 de noviembre de 2018

CONSEJO INSTITUCIONAL DE POSGRADO DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A.C.

PRESENTE

Los que suscriben miembros del comité tutorial del estudiante ÁNGEL MARTÍN BARRANCO GUZMÁN, una vez leída y revisada la tesis titulada “Caracterización del saco embrionario y estudio de Ca2+ citosólico en el proceso de doble fertilización de Agave” aceptamos que la referida tesis revisada y corregida sea presentada por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencias en Innovación Biotecnológica durante el examen correspondiente.

Y para que así conste firmamos la presente a los veinte días del mes de noviembre del año dos mil dieciocho.

Dr. Benjamín Rodríguez Garay Dr. Nutan Prasad Rout Director Co-director

Dr. Jorge Alberto Verdín Ramos Asesor

Zapopan, Jalisco, 20 de noviembre de 2018

CONSEJO INSTITUCIONAL DE POSGRADO DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A.C.

PRESENTE

Los que suscriben miembros del jurado del Exámen de Grado del estudiante ÁNGEL MARTíN BARRANCO GUZMÁN “Caracterización del saco embrionario y estudio de Ca2+ citosólico en el proceso de doble fertilización de Agave” aceptamos que la referida tesis revisada y corregida sea presentada por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencias en Innovación Biotecnológica durante el examen correspondiente.

Y para que así conste firmamos la presente a los veintiséis del mes de noviembre del año dos mil dieciocho.

Dra. Antonia Gutierrez Mora. Dr. Jorge Alberto Verdín Ramos Presidente Secretario

Dr. Nutan Prasad Rout Vocal

La presente tesis de maestría se llevó a cabo gracias a la beca otorgada por el CONACYT

al IBT. Ángel Martín Barranco Guzmán.

Esta investigación se llevó a cabo con el apoyo del Programa Fronteras de la Ciencia del

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT-México), Proyecto 544.

AGRADECIMIENTOS

A Dios

Primeramente, agradezco a Dios, por ayudarme a alcanzar una meta más, por la vida y tiempo que me dio, además de brindarme la capacidad, voluntad e inteligencia para lograr este objetivo.

A mi Familia

Por el apoyo y los ánimos durante el día a día, y ser la fuente de inspiración para mi superación.

Al Dr. Benjamín Rodríguez Garay

Mi director de tesis por aceptarme como su alumno, por ser una guía, y sobre todo por apoyar y fomentar el espíritu científico, y de superación en el ámbito de la investigación en mí.

Al Dr. Nutan Prasad Rout y al Dr. Jorge Verdín

Por las aportaciones de conocimientos y sus valiosas sugerencias que contribuyeron directamente a la realización de este trabajo y porque siempre tuvieron tiempo y paciencia para ayudarme a resolver mis dudas.

Al CIATEJ

Por abrirme las puertas para realizar un posgrado y brindarme sus instalaciones para desarrollar mis estudios.

ÍNDICE INTRODUCCIÓN GENERAL ...... 1 CAPÍTULO I ...... 3 CARACTERIZACIÓN DEL GAMETOFITO FEMENINO DE AGAVE COLIMANA SUBGÉNERO LITTAEA ...... 3 RESUMEN ...... 3 ABSTRACT ...... 4 1. INTRODUCCIÓN ...... 5 2. ANTECEDENTES ...... 8 2. 1. TAXONOMÍA DEL GÉNERO AGAVE ...... 8 2.2. TAXONOMÍA DE AGAVE COLIMANA ...... 9 2.3. REPRODUCCIÓN SEXUAL ...... 10 2.4. FORMACIÓN DEL GAMETOFITO FEMENINO EN ANGIOSPERMAS ...... 11 2.4.1. Megasporogénesis ...... 12 2.4.2. Megagametogénesis ...... 13 2.5. LA FORMACIÓN DEL GAMETOFITO FEMENINO EN ASPARAGACEAE (ANTERIORMENTE AGAVACEAE) ...... 15 2.5.1. Desarrollo del gametofito femenino en Agave tequilana weber ...... 15 3. JUSTIFICACIÓN ...... 16 4. HIPÓTESIS ...... 17 5. OBJETIVOS ...... 17 5.1. OBJETIVO GENERAL ...... 17 5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 17 6. METODOLOGÍA ...... 18 6.1. MATERIAL VEGETAL ...... 18 6.2. CARACTERIZACIÓN DEL GAMETOFITO FEMENINO ...... 18 6.2.1. Fijación de los óvulos ...... 18 6.2.2. Tinción de los óvulos ...... 19 6.2.3. Deshidratación de los óvulos ...... 19 6.2.4. Clarificación de los óvulos y estudio microscopia ...... 19 7. RESULTADOS ...... 20 7.2. MEGASPOROGÉNESIS ...... 21 7.3. MEGAGAMETOGÉNESIS ...... 23 8. DISCUSIÓN ...... 26 9. CONCLUSIÓN ...... 28 10. PERSPECTIVAS ...... 28 11. REFERENCIAS ...... 29 CAPITULO II ...... 35 DISTRIBUCIÓN Y LOCALIZACIÓN DE CALCIO CITOSÓLICO DURANTE LA DOBLE FERTILIZACIÓN DEL GÉNERO AGAVE ...... 35 RESUMEN ...... 35

ABSTRACT ...... 36 1. INTRODUCCIÓN ...... 37 2. ANTECEDENTES ...... 40 2.1. EL CALCIO EN LA GERMINACIÓN Y ELONGACIÓN DE TUBO POLÍNICO ...... 40 2.2. CALCIO EN EL SACO EMBRIONARIO ...... 42 2.3. EL CALCIO EN LA DOBLE FERTILIZACIÓN ...... 44 3. JUSTIFICACIÓN ...... 47 4. HIPÓTESIS ...... 49 5. OBJETIVOS ...... 49 5.1. OBJETIVO GENERAL ...... 49 5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 49 6. MATERIALES Y MÉTODOS ...... 50 6.1. MATERIAL VEGETAL ...... 50 6.2. MOMENTO DE DOBLE FERTILIZACIÓN ...... 50 6.3. DETECCIÓN DE CALCIO CITOSÓLICO DURANTE DUBLÉ FERTILIZACIÓN ...... 51 6.4. CUANTIFICACIÓN DE CALCIO EN SACO EMBRIONARIO ...... 52 6.4.1. Análisis estadístico ...... 53 6.4.2. Ubicación del calcio en el desarrollo temprano del endospermo ...... 53 7. RESULTADOS ...... 54 7.1. LA DOBLE FERTILIZACIÓN ...... 54 7.2. DETECCIÓN DE CALCIO CITOSÓLICO DURANTE DOBLE FERTILIZACIÓN ...... 57 7.3. CUANTIFICACIÓN DE CALCIO EN SACO EMBRIONARIO ...... 61 7.3.1. Ubicación del calcio en el desarrollo temprano del endospermo ...... 63 8. DISCUSIÓN ...... 66 8.1. EL MOMENTO DE LA DOBLE FERTILIZACIÓN ...... 66 8.2. DETECCIÓN DE CALCIO DURANTE LA DOBLE FERTILIZACIÓN ...... 67 8.2.1 Calcio en el micrópilo de óvulo ...... 68 8.2.2 El calcio en las células sinérgidas ...... 68 8.2.3 Calcio en la fusión de gametos ...... 70 8.3. CALCIO EN LA FORMACIÓN DEL ENDOSPERMO ...... 71 8.3.1 El papel del calcio en la mitosis nuclear ...... 72 8.3.2 Ubicación del calcio en el desarrollo temprano del endospermo ...... 75 9. CONCLUSIÓN ...... 78 10. PERSPECTIVAS ...... 79 11. REFERENCIAS ...... 80

INTRODUCCIÓN GENERAL

En el ciclo de la vida de las plantas angiospermas; la formación del gametofito femenino y el proceso de la doble fertilización son una parte esencial para la reproducción sexual. En los últimos años, se han realizado un gran número de investigaciones en el área de la biología del desarrollo vegetal, en plantas modelos como Arabidopsis thaliana y Zea maíz que han generado un gran número de información molecular, fisiológica, epigenética, genómica, genética y morfológica, incluyendo información sobre el desarrollo del saco embrionario (SE) y el proceso de la doble fertilización.

El conocimiento de los aspectos de la formación del saco embrionario (meiosis femenina) resulta importante en el proceso de reproducción sexual, debido a que, durante el desarrollo del gametofito femenino se pueden detectar errores que resultan ser los responsables de una baja o nula fertilidad de las plantas. Este conocimiento básico es útil en actividades de propagación por semilla y propósitos de mejoramiento genético.

Una semilla está formada morfológicamente por dos elementos fundamentales: el embrión y el endospermo, los cuales son producto del proceso conocido como doble fertilización.

Este proceso implica dos pasos principales: 1) un espermatozoide haploide (n) se fusiona con la célula de huevo haploide (n) para formar un embrión diploide (2n). 2) El segundo espermatozoide haploide (n) se fusiona con dos núcleos haploides (n + 2n) para formar un endospermo triploide (3n). Las células espermáticas son transportadas a través del tubo polínico hasta el ovulo donde ocurre la doble fertilización. Hasta la fecha no hay suficiente

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información disponible sobre la gran cantidad de factores involucrados en el proceso de doble fertilización en las plantas con flores. Entre estos factores, el calcio es un elemento importante que actúa como mensajero secundario en todas las células vivas y probablemente sea responsable de la coordinación y regulación de diferentes procesos durante la doble fertilización.

Es evidente la participación del calcio en algunos procesos fisiológicos tales como; la germinación de polen en el estigma, polarización del tubo polínico, crecimiento y desarrollo del tubo polínico, atracción del tubo polínico, apoptosis en las células sinérgidas, fusión del núcleo espermático y el núcleo de la célula huevo. Pero aun el conocimiento que se tiene acerca de la participación del calcio citosólico en el proceso de la doble fertilización es escaso. Por esta razón, es de gran interés estudiar la implicación de calcio citosólico en el proceso de la doble fertilización, debido a su acción como mensajero secundario que abre cascadas de señalización intracelulares.

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CAPÍTULO I

Caracterización del gametofito femenino de Agave colimana subgénero Littaea

RESUMEN

Agave colimana es una planta silvestre que pertenece al subgénero Littaea del cual se desconoce información debido a que no tiene uso comercial; sin embargo, recientemente se consideró dentro de la flora suculenta ornamental debido a su arquitectura floral y vegetal.

El conocimiento sobre aspectos de la formación del saco embrionario (SE) es esencial para su proceso de reproducción sexual, que es un elemento importante para la propagación por semilla. En este trabajo, la megagametogénesis y la megasporogénesis de A. colimana se estudiaron mediante tinción de Feulgen con microscopía confocal. En la megagametogénesis se observó la formación de una tétrada lineal con la célula funcional situada en el extremo calazal del SE. Por otro lado, la megasporogénesis se inicia a partir de la célula funcional seguida de tres divisiones mitóticas que generan un SE con ocho núcleos: dos células sinérgidas (haploides), una célula huevo (haploide), tres células antípodas (haploides) y una célula central (diploide). Al llevarse a cabo la celularización se producen siete células. En el presente trabajo se descubrió que el SE de Agave colimana es monospórico del tipo-Polygonum considerado como típico en la mayoría de las plantas angiospermas. Además, se observaron sacos embrionarios anormales, resultado de posibles errores durante la meiosis.

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ABSTRACT

Agave colimana is a wild plant that belongs to the subgenus Littaea from which little is known because it has no commercial use, however, recently it was considered within the ornamental succulent flora because of its floral and plant architecture. The knowledge about aspects of the formation of the embryo sac is essential for the comprehension of its sexual reproduction process, which is an important element for propagation activities by seed and for breeding purposes. Megagametogenesis and megasporogenesis were studied by Feulgen staining under confocal microscopy. In megagametogenesis the formation of a linear tetrad was observed with the functional cell located at the chalazal end. On the other hand, megasporogenesis was generated from the functional cell followed by three mitotic divisions generating an embryo sac with seven nuclei: two synergid cells (haploids), one egg cell (haploid), three antipodal cells (haploids) and one central cell (diploid). The embryo sac of Agave colimana was found to be monosporic of the Polygonum-type considered as typical in the majority of angiosperm plants. Also, abnormal embryo sacs were observed, probably due to errors during meiosis.

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1. INTRODUCCIÓN

Los agaves pertenecen a la subfamilia Agavoidea de la familia Asparagaceae. El género

Agave, según el tipo de su inflorescencia, se divide en dos subgéneros: el subgénero Agave que tiene una inflorescencia con varias panículas y el subgénero Littaea que tiene una inflorescencia con forma de espiga. Agave colimana pertenece al grupo Filiferae dentro del subgénero Littaea, representado por plantas con filamentos fibrosos generados a partir de los márgenes de las hojas. Particularmente, A. colimana se distingue por sus hojas alargadas

(Gentry 1982; Rodríguez-Garay 2017), y crece en los estados mexicanos de Jalisco,

Michoacán y Colima, en la costa del Pacífico de México. Además de ser una planta suculenta endémica, se le considera desconocida, ya que no existen estudios probablemente debido a que hasta la fecha no tiene uso comercial. Sin embargo, A. colimana podría considerarse como una planta con potencial ornamental debido a su arquitectura floral y hojas brillantes. (Acevedo-Rosas y Cházaro-Basáñez 2014).

El estudio del saco embrionario (SE) en cada una de las especies de las plantas angiospermas es crucial, debido a que tienen muchos aspectos desconocidos durante su desarrollo y el órgano (SE) es inaccesible por su localización dentro del ovario de la flor

(Sundaresan y Alandete-Saez 2010). Por lo tanto, conocer el desarrollo del SE resulta ser uno de los primeros pasos esenciales para conocer más acerca de A. colimana y su proceso de reproducción sexual, ya que se considera un elemento de conocimiento fundamental para las actividades centradas en la propagación por semillas.

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Las plantas angiospermas son el grupo más grande del reino vegetal. Tienen flores y producen frutos con semillas. Una de las principales características de las angiospermas es que tienen semillas encerradas dentro de una fruta derivada del ovario de las flores (Li y

Ma 2002). Otra característica principal de las angiospermas es que presentan alternancia de generaciones en su ciclo de vida, que se divide en dos fases: una fase diploide dominante, que se denomina esporofítica y una fase haploide que se conoce como gametofítica

(McCormick 2004; Pagnussat y col. 2005; Rodríguez-Garay y col. 2000). La fase gametofítica (polen o saco embrionario) se origina por medio de meiosis a partir de una célula diploide.

El ciclo reproductivo de las plantas con flores comienza con el cambio en el crecimiento de un meristemo apical de una manera vegetativa indeterminada a un modo de floración particular que conduce a la producción de frutas y semillas. El proceso de reproducción sexual en las plantas requiere de dos gametofitos: el masculino (polen) y el femenino (saco embrionario). El gametofito femenino en las plantas angiospermas se forma dentro del

óvulo, que a su vez se encuentra dentro del ovario de la flor (Yang y col. 2010). Diferentes estudios del desarrollo de gametófitos femeninos han demostrado que existen diferentes patrones de formación de los sacos embrionarios, por ejemplo, Arabidopsis thaliana es monospórico del tipo-Polygonum, que está presente en el 70% de las angiospermas

(Coimbra y col. 2007).

Existen estudios sobre la caracterización morfológica del gametófito femenino en una amplia variedad de plantas de angiospermas, con un SE maduro de 8 núcleos, formado a partir de tres divisiones nucleares sucesivas de una única megaspora (Maheshwari 1937).

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Hay algunos informes con descripciones de sacos embrionarios en especies pertenecientes al subgénero Agave y un antiguo informe sobre el subgénero Littaea (Grove 1941). Estos estudios sobre la formación del gametofito femenino en varias especies agrupadas en el subgénero Agave han revelado diferentes hallazgos: el tipo-Polygonum monospórico

(Escobar-Guzmán y col. 2008; González-Gutiérrez y col. 2014) y bispórico, tipo Allium

(Piven y col. 2001). El objetivo del presente trabajo fue caracterizar los patrones de formación del SE de A. colimana y ayudar a aclarar las diferencias entre los patrones bispórico y monospórico encontrados en estudios previos en el subgénero Agave.

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2. ANTECEDENTES

2. 1. Taxonomía del género Agave

El “Angiosperm Phylogeny Group” (APG III 2009) propuso que el orden Asparagales abarcara catorce familias, dentro de las cuales se encuentran cinco que son ricas en especies

(Orchidaceae con 25,000 especies, Amaryllidaceae con 1,600 especies, Asparagaceae con

2,500 especies, Iridaceae con 1,900 especies y Xanthorrhoeaceae con 850 especies) (Pires y col. 2006). Además, cabe señalar que es el segundo orden económicamente más importante dentro de las monocotiledóneas e incluye plantas como yuca, agave, aloe, nardo, ajo, iris, puerro, cebolla y vainilla entre otras (Kuhl y col. 2004).

Los Agaves pertenecen a la familia Asparagaceae sub-familia Agavoidea. El género Agave, según el tipo de inflorescencia que presenta, se divide en dos subgéneros; el subgénero

Agave que tiene una inflorescencia en panícula, en el cual se encuentran las especies de importancia económica tales como Agave tequilana, Agave fourcroydes, Agave. angustifolia, y, por otra parte, el subgénero Littaea que presenta una inflorescencia en forma de espiga (Irish 2000). A. colimana pertenece al subgénero Littaea. Las características del subgénero Littaea de acuerdo con (Gentry 1982) se caracteriza, entre otros aspectos, por incluir plantas con rosetas solitarias o cespitosas, que pueden formar conjuntos grandes por ramificación axilar, hojas lineales, estriadas, angostas, algo carnosas, con márgenes escabrosos, la espina terminal pungente, pero débil; flores principalmente geminadas, cilíndricas o infundibuliformes, tubo de igual o mayor longitud que los tépalos o en ocasiones más corto y el ovario sin cuello.

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2.2. Taxonomía de Agave colimana

A. colimana pertenece al subgénero Littaea, que a su vez se encuentra dentro del grupo

Filifera, representado por plantas con filamentos fibrosos generados a partir de los márgenes foliares. Particularmente, A. colimana (Fig. 1) se distingue por sus hojas y flores alargadas (Gentry 1982) y crece en los estados de Jalisco, Michoacán y Colima, perteneciente a la costa del Pacífico, en el centro de México (Acevedo y Cházaro 2014).

División: Angiospermae Clase: Monocotyledonae Orden: Asparagales Familia: Asparagaceae Subfamilia: Agavoidea Género: Agave Subgénero: Littaea Especie: Agave colimana

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Figura 1. Población de Agave colimana ubicada en Tenacatita, Jalisco, México.

2.3. Reproducción sexual

En plantas con flores, el ciclo de vida reproductivo inicia con el cambio en el crecimiento del meristemo de un modo vegetativo indeterminado a un modo de floración determinado que lleva a la producción de frutos y semillas (Koltunow y col. 2002). El botón floral es uno de los órganos más complicados en las plantas, y muchos procesos morfológicos y bioquímicos son únicos en este órgano reproductivo (Lim y col. 1996), los cuales son necesarios para la propagación por semilla y la generación de diversidad genética.

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Al principio de su evolución, las plantas adquirieron un ciclo de vida que alterna entre un organismo pluricelular haploide, el gametofito, y un organismo diploide multicelular, el esporofito. Las angiospermas tienen ambos gametofitos: femenino y masculino. El gametofito femenino es fundamental para muchas etapas del proceso reproductivo de las angiospermas, incluyendo la orientación del tubo polínico, la doble fertilización, el papel de la fertilización sobre el desarrollo de la semilla y el control materno del desarrollo de la semilla después de la fertilización. A partir de estudios relativamente recientes, se están empezando a comprender las redes de regulación implicadas en el desarrollo y la función del gametofito femenino (Yadegari y Drews 2004).

Los gametofitos y esporofitos difieren morfológica y funcionalmente. La función principal del esporofito diploide es la generación de esporas haploides, que son los productos de la meiosis. Las esporas pasan por un proceso de proliferación y diferenciación celular durante el desarrollo del gametofito. La función principal de la generación del gametofito es producir gametos haploides. La fusión de la célula huevo y un esperma da origen al cigoto, que es el principio de la generación del esporofito diploide, completando así el ciclo de vida

(Gifford y Foster 1989).

2.4. Formación del gametofito femenino en angiospermas

Los tipos de patrones de desarrollo del gametofito femenino en angiospermas, como por ejemplo en A. thaliana es del tipo-Polygonum el cual está presente en el 70% de las angiospermas (Coimbra y col. 2007).

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Durante el ciclo de vida de las angiospermas, el esporofito produce dos tipos de esporas, microsporas y megasporas, las cuales dan lugar a los gametofitos masculino y femenino respectivamente. Los gametofitos de las angiospermas se desarrollan dentro de los tejidos esporofíticos que constituyen los órganos sexuales de la flor. El gametofito masculino, también referido como el grano de polen o microgametofito, se desarrolla dentro de la antera y se compone de dos células generativas y una vegetativa (McCormick 2004) y el gametofito femenino, también conocido como saco embrionario o megagametofito, el cual se desarrolla en el óvulo, que se encuentra dentro del ovario.

Existen dos fases durante la formación del saco embrionario (SE):

2.4.1. Megasporogénesis

En esta etapa, la célula madre (diploide) de la megaspora se divide meióticamente y da lugar a cuatro megasporas haploides (Fig. 2). Dentro de los tres principales patrones de reproducción de las angiospermas, estos difieren en la formación de los núcleos celulares que se producen después de las divisiones meióticas, determinando así el número de productos meióticos que contribuyen a la formación del gametofito femenino. En el patrón monospórico cada óvulo contiene una célula madre de la megaspora, la cual al final de la división meiótica produce una hilera de cuatro células haploides. En la mayoría de plantas angiospermas tres de estas células se degeneran, sobreviviendo solo la más cercana al extremo calazal (Maheshwari 1950).

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En el patrón bispórico, la célula calazal de la diada divide pronto su núcleo, completando así la segunda división meiótica. De este modo se forman dos células y a partir de estos dos núcleos se formará el SE. En el patrón tetraspórico participan las 4 megásporas en la formación del SE, por lo tanto, estos tres patrones dan lugar a una o más megasporas funcionales que según el número de células que contengan se considera monospórico (una celula), bispórico (dos células), o tetraspórico (cuatro células). El patrón monospórico es la forma más común (Fig. 2) y está representado dentro del tipo-Polygonum (Maheshwari

1950; Van Went y Willemse 1984; Huang y Russell 1992).

Figura 2. Megasporogénesis. Desarrollo del saco embrionario monospórico.

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2.4.2. Megagametogénesis

En el proceso de megagametogénesis, la megaspora funcional pasa a través de una o más divisiones mitóticas. Las paredes celulares se forman alrededor de los núcleos que resultan en un SE maduro (Rabiger y Drews 2013).

Figura 3. Megagametogénesis. Desarrollo del saco embrionario tipo-Polygonum.

Los sacos embrionarios pueden presentar una diversidad de vías de desarrollo, sin embargo, el más común es el tipo-Polygonum (Fig. 3), en el que la megáspora funcional pasa a través de tres divisiones mitóticas que producen un SE con 7 células y 8 núcleos haploides

(Chasán y Walbot 1993), los que consisten en tres células antípodas, una célula central cuyo núcleo es formado por dos núcleos polares, y dos células sinérgidas que flanquean a la célula huevo (Kagi y Groß-Hardt 2007; Yang y col. 2010). Las sinérgidas presentan estructuras especiales en sus paredes responsables de la atracción del tubo polínico.

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2.5. La formación del gametofito femenino en Asparagaceae (Anteriormente Agavaceae)

Algunos estudios han caracterizado el gametofito femenino de diferentes especies que pertenecen a la familia Asparagaceae anteriormente Agavaceae (APG III, 2009), donde la mayoría de ellos han sido descritos como monospórico tipo-Polygonum. Entre estas especies están Yucca rupicola (Watkins 1937), Y. aloifolia (Wolf 1940), Y. filamentosa

(Reed 1903); Agave lechuguilla (Grove 1941), A. virginica (Regen 1941), Hesperocallis undulata, Leucocrinum montanum (Cave 1948) y Comospermum yedoense (Rudall 1999).

2.5.1. Desarrollo del gametofito femenino en Agave tequilana weber

Estudios histológicos realizados en el género Agave han demostrado la existencia de dos diferentes tipos de patrones durante el desarrollo del gametofito femenino. En A. tequilana

Weber (González-Gutiérrez y col. 2014; Escobar y col. 2008) reportaron un desarrollo monospórico tipo-Polygonum, ubicando la megaspora funcional en la zona calazal y, por rápidas divisiones mitóticas, da origen al SE. Sin embargo, Piven y col. (2001) en un estudio similar pero realizado en A. fourcroydes y A. angustifolia, reportaron haber encontrado un desarrollo de gametofito femenino bispórico tipo-Allium. Esto es, que el gametofito femenino en henequén se desarrolla directamente de dos megasporas viables.

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3. JUSTIFICACIÓN

A. colimana es una planta endémica y se considera una especie desconocida, ya que no hay estudios, probablemente debido a que no tiene un uso comercial. Sin embargo, recientemente fue considerada con potencial ornamental por su arquitectura floral y hojas brillantes (Acevedo y Cházaro 2014). Actualmente no existen estudios sobre el desarrollo del gametofito femenino de A. colimana y conocer este aspecto es indispensable para entender su reproducción sexual, así como también para propósitos de mejoramiento genético convencional, donde están implicados procedimientos de autofecundación e hibridación. Además, el estudio del SE de A. colimana, por ser una especie perteneciente al subgénero Littaea, ayudará a esclarecer las diferencias encontradas en el subgénero Agave ya que en este subgénero se han reportado dos tipos de desarrollo. el monospórico tipo-

Polygonum y el bispórico tipo-Allium.

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4. HIPÓTESIS

El desarrollo del gametofito femenino en Agave colimana es monospórico tipo-Polygonum.

5. OBJETIVOS

5.1. Objetivo general

Estudiar el proceso de formación del saco embrionario en Agave colimana.

5.2. Objetivos específicos

• Estudiar los patrones de formación, durante el desarrollo del saco embrionario en

Agave colimana mediante técnicas histológicas.

• Ayudar a esclarecer las diferencias en cuanto a los patrones bispórico y monospórico encontradas dentro del subgénero Agave mediante el estudio de una especie del subgénero Littaea.

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6. METODOLOGÍA

6.1. Material vegetal

Las flores de A. colimana fueron recolectadas en el mes de febrero de 2018, en la costa de

Punta Pérula, Jalisco, México, y los análisis se llevaron a cabo en el laboratorio de la

Unidad de Biotecnología Vegetal del CIATEJ.

6.2. Caracterización del gametofito femenino

Para la caracterización de la formación del saco embrionario, las flores se recolectaron en diferentes etapas de desarrollo y se tiñeron con la metodología de Barrell y Grossniklaus

(2005) con algunas modificaciones.

6.2.1. Fijación de los óvulos

Los óvulos se extrajeron de las flores de A. colimana con ayuda de un estereoscopio y se fijaron inmediatamente en una solución FAA (10 formaldehído: 5 ácido acético glacial: 50 etanol: 35 agua destilada) durante 24 horas. Después de la fijación, los óvulos se transfirieron a una solución de etanol al 70% y se almacenaron a 5°C para su posterior tinción.

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6.2.2. Tinción de los óvulos

Los óvulos se manipularon en tubos Eppendorf y tratados a temperatura ambiente con: HCl

1M durante 1.5 h, luego con HCl 5.8M durante 2 h, seguido de HCl 1M por 1 h.

Posteriormente, los óvulos se lavaron tres veces con agua destilada durante 3 minutos y fueron teñidos con reactivo de Schiff's (No. Cat. 3952016, Sigma) durante 3 horas a temperatura ambiente, protegiendo los tubos de la luz.

6.2.3. Deshidratación de los óvulos

Los óvulos fueron deshidratados en una serie de diluciones de etanol, colocándolos durante

30 minutos cada uno en etanol 30, 50, 70, 90, 95%, y dos veces en etanol al 100%.

6.2.4. Clarificación de los óvulos y estudio microscópico

La clarificación se realizó en series de solución de salicilato de metilo-etanol 3:1, 1:1, 1:3 por periodos de una hora en cada serie. En esta última solución las muestras pueden ser almacenadas hasta por un periodo de 2 a 6 meses, a 5°C.

Para la observación, las muestras fueron analizadas con un microscopio confocal Leica

TCS SPE RGBV, con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una emisión entre

640 y 740 nm.

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7. RESULTADOS

La existencia de descripciones previas de gametofitos femeninos del subgénero Agave permite hacer una comparación con el tipo de desarrollo encontrado en Agave colimana

(Fig. 4a), Éste tiene una madurez de flor diferente dependiendo de la posición en el tallo, comenzando la maduración desde la parte inferior hacia la parte superior de la inflorescencia (Fig. 4b). Las flores maduras de A. colimana se producen en pares; cada flor presenta seis anteras con filamentos color púrpura y un pistilo apical externo (Fig. 4c). El ovario de forma trilocular y de tipo axilar, con un desarrollo simultáneo de óvulos anatrópodos dentro del mismo ovario con dos tegumentos (Fig. 4d).

Figura 4. Agave colimana. a) Agave colimana con inflorescencia. b) Inflorescencia en forma de espiga de A. colimana. c) Las flores de A. colimana se encuentran ubicadas en pares. d) Corte transversal del ovario. Ov= óvulos. Barra en b= 5 cm, barra en c= 10 mm, barra en d= 1 mm.

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7.2. Megasporogénesis

La formación del saco embrionario (SE) en A. colimana comienza con la división meiótica de la célula madre megaspora, que tiene una pared celular circular y un núcleo que ocupa un gran volumen en relación con el tejido ovular. En la meiosis I de la célula madre de la megaspora (Fig. 5a), se condensa su ADN, de modo que los cromosomas se pueden observar en forma de filamentos cuando se aparean en la etapa de zigoteno, posteriormente en la anafase I se produce la separación de los cromosomas homólogos moviéndose a polos opuestos (Fig. 5b) para generar una díada de dos células haploides que se crea de forma paralela cuando se definen los extremos micropilar y calazal. Al final de la primera división meiótica, la díada haploide (Fig. 5c) forma una pared celular y adopta una forma rectangular.

La díada haploide se divide nuevamente por mitosis formando una tétrada lineal de células haploides (Fig. 5d). Más tarde, las tres megasporas en el lado micropilar se degeneran por apoptosis y la célula cercana a la calaza sobrevive y se convierte en la megaspora funcional que sufre una expansión y continúa con su desarrollo dando lugar al óvulo (Fig. 6a).

Este tipo de desarrollo observado en A. colimana corresponde a un tipo monospórico, y el orden de degeneración de las tres megasporas parece no tener un patrón definido.

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Figura 5. Megasporogénesis de Agave colimana. a) Célula madre de la megaspora en Cromosomas en Meiosis I (zigoteno). b), Diada haploide sin pared celular c) Diada haploide. d) Degeneración de las tres megasporas en el polo micropilar. Recuadro en b= Meiosis I. Cabezas de flecha= separación de cromosomas, línea de puntos= separación de la díada haploide, c= calaza, dh= díada haploide, m= micrópilo, mf= megaspora funcional, tl= tétrada lineal. Barras en a y d= 20 µm, barras en b y c= 10 µm.

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7.3. Megagametogénesis

Después de la megasporogénesis, los cambios en el óvulo fueron evidentes, comenzando con la megaspora funcional sobreviviente que continua su desarrollo, se alarga (Fig. 6a) y atraviesa por tres divisiones mitóticas que ocurren rápidamente sin citocinesis. La primera división mitótica genera dos núcleos (Fig. 6b) que migran a extremos opuestos, uno hacia el polo calazal y el otro hacia el extremo micropilar. La figura 6c muestra la segunda división mitótica en la que hay cuatro núcleos, dos núcleos cerca del micrópilo y dos cerca de la calaza. En la tercera división mitótica se produjeron ocho núcleos haploides (no mostrada), cuatro núcleos en el extremo micropilar y cuatro en el lado calazal. Más tarde, se produjo la fusión entre dos núcleos polares, uno cerca del micrópilo y el otro de la calaza, generando un núcleo 2n. Este núcleo 2n tenía un tamaño mayor con respecto a los núcleos haploides dentro del SE. Consecutivamente, la formación de las paredes celulares se produjo rápidamente (celularización), donde se generaron cuatro diferentes tipos de células.

La forma del SE fue de tipo-Polygonum (Fig. 6d). La célula binucleada daba lugar a la célula central 2n con el núcleo polarizado hacia la calaza. Los núcleos localizados en el extremo calazal generaron tres células antípodas de menor tamaño en comparación con el resto de las células y éstas permanecieron localizadas en la calaza. Los núcleos cercanos al micrópilo formaron el aparato ovular, que estaba compuesto por la célula huevo y dos células sinérgicas. El tamaño del SE fue de 72.49 ± 6.36 µm (n=85) de ancho y 203.93 ±

9.44 µm (n=85) de largo.

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Figura 6. Megagametogénesis de Agave colimana. a) Célula funcional. b) Primera división mitótica con dos núcleos polares. c) Segunda división mitótica con cuatro núcleos. d) Saco embrionario tipo-Polygonum. ao= aparato ovular, recuadro= zoom del aparato ovular, cabezas de flecha= células antípodas, c= calaza, m= micrópilo, ch= célula de huevo, cs= células sinérgidas, cf= célula funcional, nc= núcleo (s) calazal (es), nm= núcleo (s) micropilar (es), ncc= núcleo de célula central. Barras= 20 µm.

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En algunas flores maduras se observaron sacos embrionarios anormales (Fig. 7a), con células alargadas de un tamaño mayor en comparación con el SE con desarrollo típico. Las células alargadas se localizaron en lo que sería el micrópilo, los sacos embrionarios que no mostraron anormalidades en su formación se fertilizaron y formaron un cigoto (Fig. 7b).

Figura 7. Sacos embrionarios anormales de Agave colimana. a) Saco embrionario anormal con células alargadas en el micrópilo. b) Desarrollo de cigoto en un saco embrionario normal. c= calaza; m= micrópilo; c= cigoto; oval rojo punteado = células alargadas; ca= células alargadas; línea blanca punteada= calaza alargada. Barras= 20 µm.

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8. DISCUSIÓN

La maduración de las flores de A. colimana es similar a la forma de maduración en otras especies del subgénero Agave. Durante la megasporogénesis, la forma de la tétrada al final de la meiosis fue lineal, como se ha reportado en un gran número de plantas del género

Agave, como A. lechuguilla (Grove 1941), A. tequilana, A. americana (Escobar-Guzmán y col. 2008), A. fourcroydes, A. angustifolia (Piven y col. 2001). No se observaron tétradas en forma de T, como se reportó en A. lechugilla (Grove 1941), que también pertenece al subgénero Littaea. La degradación simultánea de las tres megasporas cercanas al micrópilo ocurrió como las reportadas en A. tequilana por González-Gutiérrez y col. (2014), a diferencia de los informes en Brassica campestris donde la degeneración de la célula micropilar de la díada ocurre antes del inicio de la meiosis II (Sumner y Van Caeseele

1988).

De los tres patrones principales de megasporogénesis (Yadegari y Drews 2004), el encontrado en A. colimana corresponde al tipo monospórico similar al reportado en A. lechuguilla única planta estudiada del subgénero Littaea (Grove 1941). Además, estos resultados fueron similares a los reportados en algunas especies pertenecientes al subgénero

Agave (Escobar-Guzmán y col. 2008; González-Gutiérrez y col. 2014), pero diferentes a lo reportado por Piven y col. (2001) en A. fourcroides y A. angustifolia también incluidas en el subgénero Agave. El tipo monospórico ocurre en la mayoría de las plantas de angiospermas (Maheshwari 1950).

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El desarrollo de óvulos de A. colimana mostró un patrón tipo-Polygonum, que representa la forma más común en aproximadamente el 70% de las angiospermas (Reiser y Fischer

1993). El patrón de tipo-Polygonum ha sido reportado en casi todas las especies del género

Agave estudiadas (Escobar-Guzmán y col. 2008; González-Gutiérrez y col. 2014; Grove

1941; Regen 1941), excepto A. fourcroides y A. angustifolia que mostraron un tipo-Allium

(Piven y col. 2001). El tamaño de los sacos embrionarios en A. colimana fue considerablemente más pequeño (72.49 ± 6.36 µm de ancho y 203.93 ± 9.44 µm de largo) que el reportado para A. tequilana (106.12±7.59 µm de ancho y 247.04 ± 6.87 µm de largo) por González-Gutiérrez y col. (2014).

En cuanto a los sacos embrionarios que presentaron errores durante su desarrollo (Fig. 7a), esta característica fue similar a la reportada por Escobar-Guzmán y col. (2008) en Agave tequilana. Se han documentado errores durante el proceso de meiosis masculina en A. angustifolia (Rodríguez-Garay 2017) y también en la meiosis femenina de A. fourcroides

(Piven y col. 2001). Piven y col. (2001) explicaron que los errores en la meiosis podrían haber resultado en la formación de megasporas abortivas, con un equilibrio cromosómico distorsionado que conduce a la degradación de los núcleos y la aparición de sacos embrionarios no desarrollados (Fig. 7a). Estos errores en la meiosis ocurren más comúnmente en las plantas debido a que el ciclo celular es más tolerante (Wilkins y

Holliday 2009; Zamariola y col. 2014). Por el contrario, los sacos embrionarios que no presentaron estos errores durante el desarrollo fueron capaces de ser fertilizados y formar un cigoto (Fig. 7b) y semilla.

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9. CONCLUSIÓN

La información generada a partir de este trabajo es útil para los procesos de reproducción, evolución, mejora genética y taxonomía. En este estudio, se encontró que A. colimana del subgénero Littaea conserva los patrones de formación y errores del subgénero Agave durante el desarrollo del saco embrionario. Además, A. colimana presentó un saco embrionario de tipo-Polygonum monospórico. Estos resultados contrastaron con el desarrollo tipo-Allium bispórico reportado para otras especies de Agave.

10. PERSPECTIVAS

Estudiar a detalle la etapa o etapas de desarrollo durante la megasporogénesis y megagametogénesis en que se presentan los errores que generan sacos embrionarios inviables. Así como también llevar estos estudios al gametofito masculino.

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CAPITULO II

Distribución y localización de calcio citosólico durante la doble fertilización del género Agave

RESUMEN

El calcio citosólico es un segundo mensajero que juega un papel importante en el proceso reproductivo, tanto en plantas como en animales. Las plantas reconocen las señales de calcio intracelular y según la concentración es la respuesta que generan. La participación del calcio citosólico durante el proceso reproductivo de las plantas no es del todo conocido.

El motivo de este estudio fue conocer la localización y distribución del calcio durante el proceso de la doble fertilización en plantas de Agave. La localización del calcio citosólico se realizó con Fluo-3 AM y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33258. Los óvulos fueron observados por microscopia confocal. En las especies del género Agave estudiadas se detectó una alta concentración de calcio en el micrópilo de los óvulos. Antes de la fertilización una de las células sinérgidas mostró una carga elevada de calcio. Una vez ocurrida la fertilización, el núcleo de la célula central mostró una ligera acumulación de calcio hacia el micrópilo y, durante la formación temprana del endospermo, alrededor de los núcleos 3n se presentó una elevación de la concentración de calcio. Estas señales de calcio están relacionadas con diferentes fenómenos que coadyuvan al proceso de la doble fertilización. Con base en los resultados se propone al calcio citosólico como posible encargado de señalar el lugar de arribo del tubo polínico (TP) en el micrópilo, el sitio de llegada del TP a una de las sinérgidas, además de inducir la expresión de genes cuyas proteínas codificantes están involucradas en la motilidad nuclear del endospermo.

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ABSTRACT

Cytosolic calcium is a second messenger, which plays an important role in the reproductive process, in plants as well as in animals. The plants recognize the signals of intracellular calcium and according to concentration is the response they generate. The participation of cytosolic calcium during the reproductive process of plants is not completely known.

Therefore, the reason for this study was to know the location and distribution of calcium during the process of double fertilization in Agave plants. Calcium localization was performed with Fluo-3 AM, and the nuclei were stained with Hoechst 33258. Ovules were observed by confocal microscopy. In the studied species of the Agave genus, a high concentration of calcium was found in the micropyle of the ovules. In addition, before fertilization, a synergid cell showed a high calcium load, and once the fertilization took place, the nucleus of the central cell showed a slight calcium accumulation towards the micropyle. During the first division of the endosperm, it was observed an elevation of calcium around the 3n nuclei. These calcium signals are related to the different phenomena that contribute to the double fertilization process. Based on these results, cytosolic calcium is proposed as possible messenger that indicates the place of arrival of the pollen tube to the micropyle, the place of arrival of the pollen tube to one of the synergid cells and, also, the expression induction of genes whose codified proteins are involved in the nuclear motility of the endosperm.

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1. INTRODUCCIÓN

Todas las células vivas utilizan una red de vías de transducción de señales para llevar a cabo programas de desarrollo, obtener nutrientes, controlar su metabolismo y hacer frente al entorno en el que se desarrollan (Sanders y col. 1999). La respuesta a un estímulo dado es el resultado de una interacción compleja entre múltiples vías de señalización (Jenkins

1998), donde un número relativamente pequeño de mensajeros ayuda a las células a procesar un conjunto mucho más extenso de estímulos potenciales. Entre los mensajeros utilizados por las vías de señalización en las plantas se encuentran calcio, lípidos, pH y

GMP cíclico (cGMP).

Diversos estudios han demostrado que el calcio tiene la función de ser una molécula de señalización. El incremento de las concentraciones de calcio es un predictor exacto de la fertilidad de las plantas. El calcio está presente en tres formas: (1) calcio enlazado covalentemente, (2) calcio enlazado libremente asociado típicamente con aniones fijos y móviles (unión iónica) y (3) calcio libre citosólico: un mensajero secundario importante en la señalización celular.

La identificación del calcio citosólico en varios procesos de células vegetales ha demostrado que funciona al transmitir información sobre la naturaleza de un estímulo particular que afecta a la célula para dirigir las proteínas que guían la respuesta celular

(Bush 1993). Las células contienen un conjunto de proteínas cuyas propiedades de unión a

Ca2+ les permiten responder a aumentos o disminuciones del elemento. El papel general de

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estas proteínas es decodificar y responder a los aumentos inducidos por el estímulo de calcio citosólico. En el caso de las proteínas del citoesqueleto, regula su polimerización que les permitirá realizar un trabajo (Edel y col. 2017).

En su forma iónica, se sabe que el Ca2+ interactúa directa e indirectamente con la calmodulina para regular otras proteínas a través de vías de transducción de señales como un segundo mensajero y como un factor metabólico o cofactor en diversas actividades celulares (Rudd y Franklin-Tong 1999). Como segundo mensajero, este ión participa en procesos como la fotomorfogénesis (Shacklock y col. 1992), respuestas hipersensibles inducidas por patógenos (Knight y col. 1991), gravitropismo (Sinclair y Trewavas 1997), fototropismo (Harada y Shimazaki 2007) y movimiento de células estomáticas (Blatt 2000), entre muchos otros. El calcio citosólico funciona como un segundo mensajero en una gran variedad de células (Takahashi y col. 1999). Este mensajero está implicado en el proceso reproductivo de las plantas. La participación del calcio comienza con la germinación del TP en el estigma, durante la elongación del TP por el pistilo hacia el ovulo, el calcio en el micrópilo del óvulo ayuda a direccionar al TP hacia el saco embrionario, cuando el TP llega al ovulo el calcio en las células sinérgidas ayudan a direccionar al TP hacia adentro del saco embrionario (SE), el TP descarga las células espermáticas dentro de la célula sinérgida, y posteriormente el calcio interviene nuevamente durante la fusión de gametos masculinos y femeninos en el proceso conocido como doble fertilización (Higashiyama y col. 1997). El papel del Ca2+ en la doble fertilización no está totalmente claro, y su participación post fertilización durante cambios en la estructura de la célula central y formación del endospermo es desconocida.

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La estructura del SE y el proceso de doble fertilización proporcionan la base para el desarrollo del endospermo, la migración nuclear y la posición relativa de los núcleos que se desarrollan en el sincitio antes de la celularización (Grossniklaus y Schneitz 1998).

Aunque hay varias evidencias sobre el papel del calcio en la interacción polen-pistilo

(Franklin-Tong 1999) y la receptividad de la célula sinérgida donde se descargarán los núcleos espermáticos (Ge y col. 2007), la plasmogamia de los núcleos espermáticos con la célula huevo y el núcleo de la célula central (Hamamura y col. 2014), aun no se comprende del todo la participación del calcio. Para estos tipos de estudios existen algunos indicadores fluorescentes que han sido utilizados en muchos tipos de células y hay dos técnicas principales para introducir el indicador en el citoplasma: (1) inyección del indicador a través de una micropipeta a la célula y (2) la adición de acetoximetilo (AM)-éster a la muestra por inmersión y su difusión a través de la superficie de la membrana para generar fluorescencia a cierta longitud de onda.

Varios estudios han demostrado que en la familia Asparagaceae, el SE posee un gran tamaño de alrededor 200 µm (Piven y col. 2001; Escobar-Guzmán y col. 2008; González-

Gutiérrez y col. 2016). Por lo tanto, esta familia facilita el estudio de la dinámica del calcio citosólico durante la doble fertilización, la división y el desplazamiento de los núcleos a través del citoplasma de la célula central. El objetivo de este trabajo fue analizar la presencia y localización de calcio citosólico durante el proceso de la doble fertilización y la formación temprana del endospermo de A. tequilana y A. salmiana.

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2. ANTECEDENTES

2.1. El calcio en la germinación y elongación de tubo polínico

Durante la reproducción sexual de las plantas, la germinación del gametofito masculino (el grano de polen) y el alargamiento adecuado del TP son procesos esenciales. Diferentes actividades y señales están involucradas en guiar a las células espermáticas masculinas hacia su objetivo, la célula huevo haploide y la célula central diploide. En las angiospermas, después de posarse en el estigma, el grano de polen disecado se rehidrata rápidamente y comienza a germinar. Posteriormente, un tubo de polen germina del grano, penetra en el tejido del estigma y comienza a crecer hacia el óvulo (Taylor y Hepler 1997).

La importancia del calcio en la germinación del polen radica en un gran número de experimentos establecidos a nivel in vitro en diferentes especies de plantas. Dichos experimentos han mostrado que se alcanza una mayor tasa de geminación de polen aumentando los niveles de calcio en el medio de cultivo (Brewbaker y Kwack, 1963).

Durante la germinación de granos de polen ocurre una absorción de calcio que se incorpora rápidamente al polen (Bednarska, 1989). Este calcio está presente en las membranas de los granos de polen y se ha asociado a las aperturas de sus terminales durante la hidratación del grano de polen, además, se han mostrado evidencias de incremento de calcio en los poros del grano de polen (Polito 1983). La acumulación de calcio también se demostró en las aperturas del polen del lirio, lo que refleja una polarización del calcio hacia los poros (Reiss

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y Herth 1978). Por otra parte, existen algunos granos de polen que pueden germinar sin la adición de calcio al medio; sin embargo, al analizar estos granos, los resultados mostraron que contenían una gran reserva de calcio en las paredes del grano de polen y que son liberados al medio durante la hidratación del mismo (Heslop-Harrison 1987).

Los tubos de polen crecen rápidamente a un ritmo muy rápido y alcanzan grandes longitudes para llevar a cabo la fertilización durante el proceso de la reproducción de las plantas. El tubo de polen crece exclusivamente en la punta. Fundamental para dicho polarizado es la presencia de gradientes internos y flujos de iones de transmembrana. En consecuencia, las células del tubo de polen vegetativo son un excelente sistema modelo de célula única para investigar los procesos biológicos celulares del transporte de vesículas, la reorganización del citoesqueleto y la regulación del transporte de iones. El segundo mensajero Ca2+ se ha convertido en un modulador central y crucial que no solo regula, sino que también integra la coordinación de cada uno de estos procesos (Steinhorst y Kudla

2013).

El tubo polínico es un componente esencial en el proceso reproductivo de las plantas. Es el encargado de transportar y liberar a las dos células espermáticas dentro de los óvulos, donde toma lugar la fertilización (Barberini y col. 2018). El calcio citosólico es un componente central de las vías de transducción de señales celulares. En las plantas, muchos estímulos externos e internos elevan transitoriamente las concentraciones de calcio en el citosol, iniciando diferentes respuestas durante el desarrollo de la planta. En los tubos de polen, el establecimiento de un gradiente oscilatorio de calcio en la punta es esencial para el crecimiento polarizado (Barberini y Muschietti 2015).

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El crecimiento de la punta del TP es una forma especializada de crecimiento celular asociada con células que dirigen su crecimiento en respuesta a señales internas y externas

(Qin y Yang 2011), como las señales de calcio (Iwano 2009) y de otras proteínas, interactuando para modular el crecimiento de la punta del tubo polínico. Steinhorst y Kudla

(2013) demostraron que el calcio desempeña un papel esencial en el control del crecimiento de la punta del TP, ubicando los gradientes más altos de calcio en la punta de un TP en crecimiento. Así mismo, Michard y col. (2011) bloquearon canales de calcio y observaron la inhibición del crecimiento del TP. Diversos estudios sobre la función del calcio en la membrana plasmática de la punta del TP han demostrado que este es el responsable de controlar y mantener el crecimiento (Frietsch y col. 2007; Song y col. 2009; Michard y col.

2011).

2.2. Calcio en el saco embrionario

El final del crecimiento del TP es al llegar el saco embrionario. En un gran número de estudios se ha observado que el polen ingresa por una de las células sinérgidas. Los primeros trabajos fueron realizados en algodón por Jensen (1965) y analizados con microscopia de campo oscuro, encontrándose grandes cantidades de calcio. A partir de estos estudios se inició el uso de otras técnicas para lograr hacer más preciso el análisis del calcio.

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En las plantas analizadas, los niveles más altos de calcio ocurren en las células sinérgidas y el más alto contenido en la sinérgida receptiva. Los gradientes de calcio con respecto a la distribución dentro del saco, han sido reportados del micrópilo hacia la calaza (Chaubal y

Reger 1992) y de la calaza hacia el micrópilo (He y Yang 1992). Casi todas las plantas contienen dos células sinérgidas, de las cuales una recibe el tubo polínico y las células espermáticas. En otros trabajos se ha observado que las sinérgidas contienen concentraciones de calcio diferentes (Huang and Russell 1992; Tirlapur y col. 1993).

En estudios sobre el contenido de calcio en las células sinérgidas de Nicotiana tabacum,

Huang y Russell (1992) reportaron que la célula sinérgida degenerada por la penetración del TP contenía más calcio que la sinérgida persistente, esta diferencia de calcio entre las dos sinérgidas, comienza horas después de la polinización (Mogensen y Suthar 1978). Se ha estudiado la concentración de calcio antes de la fertilización, y se ha percibido un incremento de calcio dentro de las sinérgidas que han sido polinizadas, estos cambios de concentración han ocurrido cuando el tubo polínico se encuentra cercano a su llegada al SE.

Un ejemplo de esto ocurre en Brasscica napus, el calcio localizado en las células sinérgidas hermanas antes de la polinización es similar, pero aumento 2.4 veces cuando fueron polinizadas (Yu y col. 1998), sin embargo, el calcio disminuye en el aparato ovular una vez que la célula sinérgida es penetrada (Kristóf y col. 1999). Esta característica se ha asociado con la atracción del TP, por lo que se ha propuesto que esta disminución ocasiona que el ovulo ya no atraiga otro TP (Higashiyama y col. 1998).

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2.3. El calcio en la doble fertilización

En plantas con flores, la fertilización es única porque en este fenómeno intervienen dos pares de gametos masculinos y femeninos. Proceso conocido como la doble fertilización

(Berger y col. 2008).

El proceso de la doble fertilización es el único proceso biológico en que un esperma se fusiona con la célula huevo para producir un embrión, mientras que el segundo esperma se fusiona con la célula central para producir el endospermo, un tejido nutritivo necesario para el crecimiento y generación del nuevo individuo. Esta característica agrupa sistemáticamente a las plantas angiospermas (Russell 1992). Desde que se descubrió la doble fertilización en plantas por Nawashin (1898), muchas investigaciones se han realizado con el propósito de comprender la dinámica de los mecanismos que intervienen en la doble fertilización (Hamamura y col. 2012).

El proceso de la doble fertilización en plantas es muy complejo. Se necesita de una comunicación celular en la interacción célula–célula y señales que activen o bloqueen procesos. La complejidad radica desde la germinación, crecimiento, recepción de tubo polínico en una de las sinérgidas del gametofito femenino, hasta la fusión de los espermas con la célula huevo y la célula central (Denninger y col. 2014). Además, una característica que hace único a este proceso radica en el origen de los dos gametos masculinos y femeninos, que provienen de mitosis y no de meiosis (Dresselhaus y col. 2016).

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El calcio es un importante mensajero en el proceso de la fertilización tanto en plantas como animales. Las oscilaciones de calcio intervienen en diferentes etapas del proceso, como la recepción de los espermas por una de las células sinérgidas y la fusión espermática con la célula huevo y con la célula central. Se ha asociado a las señales de calcio en las células sinérgidas con la receptividad del TP, mediante una diferencia de concentración en la sinérgida receptiva y un incremento de calcio en el núcleo de la célula huevo antes de la fusión con el núcleo espermático.

Digonnet y col. (1997) mostraron in vitro la primera evidencia de una elevación transitoria de calcio después de la fusión de los espermas con la célula huevo y la célula central en

óvulos de maíz. Esta técnica se apoyó en el uso de un fluorocromo de unión específica a calcio citosólico (Fluo-3). Ellos observaron minutos después de que ocurrió la fusión de gametos un incremento de calcio que duró algunos minutos.

La fertilización generalmente describe la fusión de gametos haploides para iniciar el desarrollo de un nuevo organismo diploide. En los animales, un huevo o óvulo se funde con un espermatozoide móvil que genera al cigoto diploide, que se desarrolla aún más en un embrión. Por el contrario, en plantas, el gametofito femenino o saco embrionario se desarrolla dentro del órgano materno llamado óvulo después de tres divisiones nucleares mitóticas adicionales de la megaspora funcional. Tras la celularización, se forma un SE de siete células en la mayoría de las angiospermas que contienen dos gametos femeninos y células accesorias en ambos polos del SE (Dresselhaus y col. 2016).

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Durante la recepción del tubo de polen en plantas con flores, las dos células de esperma se liberan hacia la hendidura entre el huevo y la célula central. Luego se produce la fusión celular (plasmogamia), pero sólo después del posicionamiento, la adhesión y la activación exitosos de las células espermáticas. Se han realizado enormes progresos durante los

últimos cinco años para comprender los mecanismos moleculares de la fertilización en las plantas, incluida la fusión de núcleos de gametos (cariogamia) y la prevención de la polispermia evitando la atracción múltiple de tubos polínicos. Después de la llegada del TP al micrópilo del gametofito femenino, este no entra a la célula sinérgida por el aparato filiforme, como anteriormente se conocía (Leshem y col. 2013). Al llegar el TP a la sinérgida receptiva libera los espermas, quedando expuestos dentro del óvulo.

El calcio ha sido propuesto como un elemento de reconocimiento de las células gaméticas para llevar a cabo la fusión (Faure y col. 1994). Para la activación de la célula huevo se necesita un incremento significativo en el nivel de calcio libre citosólico y oscilaciones de la afluencia de calcio dentro del óvulo fertilizado (Tang y col. 2000; Sanders y col. 2002).

Un ejemplo es el alga Fucus serratus que durante la fertilización del óvulo se acompaña de la absorción de calcio del medio externo que parece ser necesario para la activación de la célula huevo (Roberts y Brownlee 1995). Tanto en plantas como en animales hay evidencia de que la fertilización induce eventos, como la apertura de canales de calcio y desencadenando la afluencia de Ca2+ y luego la oscilación y acumulación de calcio, que producen la activación del huevo (Antoine y col. 2001). Estos resultados indican la importancia del calcio en el proceso de la doble fertilización en plantas.

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3. JUSTIFICACIÓN

El calcio es un segundo mensajero intracelular que regula y coordina las respuestas a distintas señales mediante cambios de concentraciones en el citosol. Es un elemento clave de señalización durante el proceso de fertilización tanto en animales como en plantas. En la reproducción sexual de las plantas se conoce que el calcio juega un papel importante, como en la germinación del polen, crecimiento y detención del tubo polínico, polaridad del TP, y en la liberación y fusión de los espermas masculinos (grano de polen). Sin embargo, aún no está completamente claro el papel del calcio durante el proceso de la doble fertilización en plantas.

A pesar de que existe un gran número de investigaciones sobre los elementos que intervienen en el proceso de la doble fertilización y sus funciones, aún no se conoce completamente este proceso. El calcio ha sido uno de los elementos más estudiados y a su vez se han postulado varias hipótesis sobre su posible participación en este proceso, pero las diferentes especies estudiadas han demostrado diferentes formas en las que el calcio participa y, en algunos casos, resultando contradictoria tanto la ubicación como la concentración de calcio durante la doble fertilización. En uno de los casos se ha reportado una alta concentración de calcio en una de las sinérgidas, momentos antes de la llegada del

TP (Tian y Russell 1997) y otros han reportado no haber encontrado diferencias en las concentraciones de calcio (Chaubal y Reger 1992). Después del momento de la doble fertilización se desconoce el papel del calcio y más aún sobre su participación en la formación del endospermo.

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Los estudios propuestos abren las posibilidades de un nuevo campo de conocimiento de los procesos de movimiento de espermas, cariogamia en la fertilización de la célula huevo para la formación del embrión, y del núcleo de la célula central para la formación del endospermo. Todo lo anterior conforma investigación básica y aplicada en las áreas de biología del desarrollo, la reproducción, evolución, mejoramiento genético y taxonomía.

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4. HIPÓTESIS

Los iones de calcio están participando activamente en el proceso de la doble fertilización.

5. OBJETIVOS

5.1. Objetivo general

Estudiar las diferentes concentraciones de calcio como posible coadyuvante durante el proceso de la doble fertilización en Agave tequilana y Agave salmiana.

5.2. Objetivos específicos

• Detectar el calcio citosólico dentro del saco embrionario de Agave tequilana y

Agave salmiana, mediante técnicas de fluorescencia.

• Analizar el calcio citosólico antes y después del proceso de la doble fertilización en

Agave tequilana y Agave salmiana, para conocer el posible papel que juega el calcio durante este proceso.

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6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Material vegetal

Flores maduras e inmaduras de A. tequilana y A. salmiana fueron recolectadas en los municipios de Cuquio y Atemajac de Brizuela localidades pertenecientes al estado de

Jalisco, México.

Las flores de agave fueron emasculadas para evitar polinización no deseada. El polen recolectado se utilizó para realizar polinizaciones manuales siguiendo los procedimientos descritos por Rodríguez-Garay y col. (2018).

6.2. Momento de doble fertilización

Una vez que las flores mostraron estigmas receptivos (con gota de miel sobre el estigma

“pollen drop”), fueron polinizadas. Se colectaron flores cada dos horas después de la polinización (hdp) durante cuatro días con el propósito de conocer el momento del evento de doble fecundación y las primeras divisiones del endospermo. Los ovarios estudiados fueron recolectados y tratados con la metodología de Barrell y Grossniklaus (2005) descrita en el capítulo anterior. Finalmente, los óvulos tratados se observaron con un microscopio

Leica Confocal TCS SPE RGBV, a una longitud de onda de excitación a 488 nm y una de emisión entre 640 y 740 nm.

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6.3. Detección de calcio citosólico durante la doble fertilización

Con base en los resultados de la cinética de polinización, las flores fueron polinizadas y colectadas 48 y 72 hrs después de la doble fertilización. Más tarde, los óvulos se extrajeron con la ayuda de un estereoscopio. Los óvulos aislados se colocaron inmediatamente en una solución de MES 10 mM para evitar la deshidratación. Consecutivamente, se eliminó la solución de MES, los óvulos se permeabilizaron con Triton X100 0,01% durante 10 minutos, y luego se enjuagaron tres veces con buffer MES durante un minuto. Para la detección de núcleos (color azul), se usó Hoechst 33258 (No. Cat. H3569, Molecular

Probes) a una concentración de 1 µg/ml en buffer PBS durante 45 a 60 minutos a temperatura ambiente. La preparación de Hoechst 33258 a una concentración stock de 100

µg/ml se realizó según lo recomendado por el fabricante, y para la detección de calcio citosólico (color verde) se usó Fluo-3 AM (No. Cat. F1242, Molecular Probes). Flou-3 AM es un indicador fluorescente derivado del grupo éster de acetoximetilo, con la capacidad de atravesar las membranas celulares y, uniéndose a la molécula de Ca2+, genera una fluorescencia que permite la visualización de la distribución de calcio en las células

(O'Malley y col. 1999; Meng y col. 2014).

La preparación de Fluo-3 AM se realizó con DMSO a una concentración madre de 0.5 mM

(recomendada por el fabricante). El buffer de carga utilizado fue el recomendado por Li y col. (2015) y los óvulos se tiñeron según la metodología de Zhang y col. (1998) con algunas modificaciones. Los óvulos se cargaron con Fluo-3 AM a 20 µM en buffer MES

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(pH 6.1, KOH 1 M) al 0,2 % de Pluronic F-125 y se incubaron durante la noche (~15 horas) a 4 °C, y luego durante dos horas a temperatura ambiente, bajo condiciones de oscuridad.

Posteriormente, los óvulos se lavaron con buffer MES sin colorante y se colocaron en un portaobjeto con una gota de Medio de Montaje Acuoso Fluoromount (No. Cat. F4680,

Sigma) para la conservación de la fluorescencia.

La observación se realizó con un microscopio confocal Leica TCS SPE RGBV. La fluorescencia de calcio (Fluo-3 AM) se alcanzó a una excitación de 488 nm y una emisión de 515-545 nm y para los núcleos (Hoechst 33258) la excitación fue a 352 nm y emisión a

461nm, las tomas fueron calibradas con muestras sin fluoróforo para evitar autofluorescencia. Las imágenes se capturaron y administraron a través del software de formato X® LAS (Leica Microsystems) con 512x512 o 2048x2048 píxeles.

6.4. Cuantificación de calcio en saco embrionario

La intensidad de fluorescencia en algunos sacos o áreas dentro de los sacos embrionarios, fueron analizadas con el software ImageJ, para determinar si había diferencias en la concentración de calcio.

El software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) es uno de los más usados (Schneider y col.

2012) para la cuantificación de la intensidad de fluorescencia, para lo cual se siguió la metodología de Wang y col. (2016), que consiste en seleccionar las áreas a medir y mediante la generación histogramas se obtienen datos estadísticos como son: la desviación estándar, la media, mediana y moda. Estos resultados se generan a partir de una escala de

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grises que va de 0 a 255 pixeles (cero= blanco y 255=negro) y son determinados por el software.

6.4.1. Análisis estadístico

Se cuantifico la intensidad de florescencia en 20 sacos embrionarios fertilizados y 20 no fertilizados, con el propósito de conocer si había una diferencia significativa con respecto al calcio, y los datos de las medias obtenidas del software ImageJ fueron analizados mediante una prueba t para comparación de dos medias, con el software Statgraphics Centurion XVI.

6.4.2. Ubicación del calcio en el desarrollo temprano del endospermo

Para el análisis estadístico de la intensidad Fluo-3 AM, se utilizó un total de 35 sacos embrionarios que contenían un total de 164 núcleos. De estos, 31 sacos embrionarios (con

135 núcleos) fueron de A. salmiana y 4 sacos embrionarios (con 29 núcleos) fueron muestreados de A. tequilana. La intensidad de fluorescencia se tomó en un área de 20 µm2 alrededor de los núcleos utilizando el software ImageJ. Al mismo tiempo, se realizó el mismo número de mediciones de fluorescencia en el citoplasma donde no había núcleos.

Los datos generados por el software se usaron para realizar un análisis utilizando una prueba t para comparar dos medias con el software Statgraphics Centurion XVI.

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7. RESULTADOS

7.1. La doble fertilización

La técnica de Feulgen (Fig. 1) demostró ser útil para observar el momento en que se llevó a cabo el proceso de doble fertilización. Además, permitió ver los núcleos y las estructuras celulares, como la pared del saco embrionario (SE), los elementos que componen el saco, como el núcleo de la célula central, el aparato ovular y las células antípodas. El uso de la microscopía confocal facilitó la reconstrucción de imágenes 3D para obtener diferentes perspectivas de la misma muestra, así como el uso de salicilato de metilo que ayudó a capturar imágenes limpias y claras eliminando el exceso de colorantes. Se determinó el momento aproximado de la llegada del TP al micrópilo, la descarga del esperma, la doble fertilización y el desarrollo temprano del endospermo en ambas especies del género Agave.

La germinación y el crecimiento del TP a través del pistilo se produjo a las 48 y 72 hrs después de la polinización. Las células espermáticas se ubicaron muy cerca el uno del otro, pero lejos de la punta del TP (Fig. 2). Se encontró que el SE es monospórico de tipo-

Polygonum (Fig. 1 a y b) y el tipo de endospermo helobial en ambas especies. El TP alcanzó al micrópilo en aproximadamente 48 hdp en A. salmiana, mientras que para A. tequilana ocurrió a los 72 hdp. Después de esto se produjo la doble fertilización, dando lugar al cigoto (Fig. 1c) que luego se convertirá en embrión (Fig. 1d). En las siguientes horas, ocurrieron las primeras divisiones nucleares que formaron el endospermo.

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Figura 1. Saco embrionario de Agave salmiana. a-b) Saco embrionario tipo-Polygonum teñido con la técnica de Feulgen, c) Cigoto. d) Embrión con dos células. Cabezas de flecha= células antípodas. ncc= núcleo de célula central, ch= célula de huevo, cs= célula sinérgida, c= cigoto, tp= tubo polínico, ca= célula apical, cb= célula basal. Barra en a, b y d= 20 µm y Barra en c= 10 µm.

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Figura 2. Llegada del TP al saco embrionario de Agave. m= micrópilo, ne= núcleos espermáticos, tp= tubo polínico, se= saco embrionario, cabezas de flecha= núcleos espermáticos, recuadro= núcleos espermáticos. Barra= 20 µm.

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7.2. Detección de calcio citosólico durante la doble fertilización

El análisis estadístico mostró que no existe diferencia significativa entre el contenido de calcio en sacos embrionarios que no habían sufrido la doble fertilización y los fertilizados.

Con intervalos de confianza de un 95% para la media de fluorescencia antes de la fertilización= 12.99 ± 3.79, y después de la fertilización 11.08 ± 2.71. El valor-P =

0.397308 indica que no hay diferencia significativa entre las medias de las dos muestras de datos, con un nivel de confianza del 95%. Igualmente, en la gráfica de medias de intensidad de fluorescencia (Fig. 3) de estos sacos embrionarios se puede observar claramente la similitud entre ellos.

Figura 3. Gráfica de comparación entre la intensidad de fluorescencia de sacos embrionarios fertilizados y no fertilizados.

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Las células del integumento externo del óvulo, que conforman el micrópilo presentaron una abundante concentración de calcio, con respecto a las células del resto en el óvulo, la fluorescencia de calcio se mantuvo antes y después de la fertilización.

En sacos embrionarios que aún no habían sido fertilizados, se detectaron niveles altos de fluorescencia en el aparato de ovular (Fig. 4 a y b), el cual se ubica en el micrópilo.

Además, algunas de las células sinérgidas parecían tener una intensidad de fluorescencia similar (Fig. 4c), con los núcleos polarizados hacia el extremo micropilar (Fig. 4b), mientras que la célula huevo poseía el núcleo polarizado hacia el extremo calazal (Fig. 4b).

Sin embargo, otros aparatos ovulares mostraron tener una intensidad de florescencia diferente entre las células sinérgidas (Fig. 5a). Con respecto a la célula central se observó una mayor intensidad de fluorescencia ubicada alrededor del núcleo (Fig. 4a). En las células antípodas también se detectó calcio y los núcleos se observaron claramente (Fig.

4a).

El tubo polínico arribó por el micrópilo, llegó a una de las células sinérgidas y dejó a la otra célula intacta (Fig. 5b). La polaridad del núcleo de la célula sinérgida hacia el extremo micropilar se mantuvo, así como también la polaridad del núcleo hacia el extremo calazal de la célula huevo. Posteriormente, la célula sinérgida sobreviviente fue degenerada, los núcleos espermáticos fueron liberados y se llevó a cabo el proceso de la doble fertilización, dando origen al cigoto (Fig. 6) y endospermo (Fig. 9). En la figura 6a se observa el núcleo del cigoto polarizado completamente hacia extremo micropilar, a diferencia de la figura 6b que el nucleó se ubica en la parte central.

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Figura 4. Calcio antes de la fertilización en Agave. a) Calcio en el saco embrionario. b) Aparato ovular con núcleos de las cs polarizados hacia el micrópilo y núcleo de la célula huevo polarizado hacia la calaza. c) Calcio en las células sinérgicas. Cabezas de flecha= células antípodas, ncc= núcleo de célula central, cc= célula central, ao= aparato ovular, cs= célula sinérgida. Barras en a y c= 20 µm. Barra en b= 10 µm.

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Figura 5. Calcio en el aparato ovular de Agave. a) Diferentes intensidades de fluorescencia en las células sinérgidas. a1) cs con 0.5 mas de intensidad de fluorescencia de Fluo-3 AM (Calcio) que a2. b) Llegada del tubo polínico a una de las células sinérgidas. cs y *= célula sinérgida, ch= célula huevo, tp= tubo polínico. Barras= 20 µm.

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Figura 6. Calcio en el cigoto de Agave. a) Cigoto con el núcleo aun polarizado hacia el micrópilo. b) Núcleo en el centro del cigoto y el tubo polínico es degenerado. nc= núcleo del cigoto, c= cigoto, tp= tubo polínico. Barras= 20 µm.

7.3. Cuantificación de calcio en saco embrionario

Se observó claramente la fluorescencia y la ubicación del calcio dentro del saco embrionario, así como la posición de los núcleos dentro del saco. El análisis estadístico de las intensidades de fluorescencia Fluo-3 AM y la dinámica del calcio citosólico presente durante las primeras etapas del desarrollo del endospermo de Agave tequilana y Agave salmiana, mostró que había una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de las muestras entre las regiones citoplasmáticas y las nucleares (Fig. 7) durante la formación del endospermo en el SE. Para ambas especies, el análisis estadístico mostró que hay una diferencia estadísticamente significativa entre los promedios de las dos muestras, con un nivel de confianza del 95% y un valor P = 0.0. Para A. salmiana los intervalos de confianza al 95% para el calcio citosólico alrededor del núcleo fueron 38.153 ± 3.1533 y para el calcio citosólico en el citoplasma fueron 8.97871 ± 1.28485, mientras que para A.

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tequilana los intervalos de confianza al 95% para el calcio alrededor de los núcleos fueron

38.1261 ± 4.17627 y para el calcio en el citoplasma 7.49634 ± 1.66795.

Figura 7. Intensidad de fluorescencia (Fluo-3 AM) de calcio citosólico en el endospermo de Agave (ambas especies).

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7.3.1. Ubicación del calcio en el desarrollo temprano del endospermo

Algunos sacos embrionarios de A. salmiana mostraron que el proceso de la doble fertilización ya se había llevado a cabo a las 48 hdp, una vez que el núcleo espermático n

(5.02 ± 0.6 µm de diámetro) se fusionó con el núcleo 2n (11. 56 ± 2. 23 µm de diámetro) de la célula central. Este nuevo núcleo (3n) alcanzó un diámetro promedio de 15.77 ± 1.92 µm y comenzó una división constante en el extremo calazal. La localización del calcio y el proceso del desarrollo temprano del endospermo fueron similares para ambas especies. Por esta razón, solo se muestran las figuras de A. salmiana, comenzando con la figura 8.

El núcleo primario del endospermo comenzó su división mitótica antes que la primera división del cigoto (Fig. 8a-c). También, se encontró calcio citosólico durante la primera división nuclear de la célula central fertilizada (Fig. 8b). Además, se observó una alta intensidad de fluorescencia Fluo-3 AM durante la mitosis del núcleo de la célula central fertilizada. Esta figura también muestra la presencia de las tres células antípodas y los núcleos de estas células (Fig. 8c). Las células antípodas mostraron una intensidad de fluorescencia de calcio inferior (figura 8b). Las siguientes divisiones nucleares del endospermo continuaron en el extremo calazal. Durante este proceso, el calcio se ubicó en la región cercana a la calaza, junto a las constantes divisiones nucleares 3n (Fig. 8d-f).

Posteriormente, la división nuclear continuó y la migración de algunos núcleos de la zona calazal comenzó hacia el extremo micropilar (Fig. 8g-i) hasta que alcanzaron la región del cigoto y lo rodearon. Estos núcleos fueron acompañados por calcio de la misma manera que los presentes en la primera división. Además, a medida que progresaba el desarrollo del endospermo, se observó calcio citosólico en el resto del saco embrionario.

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Figura 8. Calcio citosólico durante el desarrollo del endospermo de Agave. a y c) Primera mitosis del núcleo del endospermo. d y f) Primeras divisiones nucleares del endospermo. g y i) Migración de núcleos acompañados por calcio. n= núcleos, c= calaza, m= micrópilo, Ca2+= calcio citosólico, cabezas de flecha= células antípodas, flecha punteada= muestra la migración de núcleos del extremo calazal hacia el extremo micropilar, áreas punteadas= calcio citosólico. Barras= 20 µm.

En la Figura 9a, se puede observar una gran cantidad de núcleos en el endospermo, y una elevada intensidad de fluorescencia por calcio (Fig. 9b), así como también el endospermo de tipo helobial (Fig. 9 d y f). Estos núcleos luego desarrollarán la pared celular y terminarán formando la masa del endospermo triploide que nutrirá al embrión. Además, se

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pudo observar una alta intensidad de fluorescencia de calcio en el SE y la presencia de células antípodas.

Figura 9. Saco embrionario de agave a 120 hdp. a) Núcleos en el endospermo. b y c) Calcio en el endospermo y citoplasma. d-f) Interacción de calcio y núcleos en endospermo tipo helobial. puntas de flecha= células antípodas, área punteada= calcio citosólico, n= núcleos haploides, 2n= núcleos diploides, 3n= núcleos triploides. Barras= 20 µm.

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8. DISCUSIÓN

8.1. El momento de la doble fertilización

La técnica de Feulgen y el uso de salicilato de metilo ayudaron a observar imágenes limpias y claras al eliminar el exceso de colorantes (Vollbrecht y Hake 1995). El tiempo estimado en que ocurre el proceso de la doble fertilización en el género Agave (A. tequilana y A. salmiana) fue de dos a tres días. Ambas especies presentaron un saco embrionario tipo-

Polygonum, estos resultados son similares a los reportados en algunas especies, pertenecientes al género Agave (Escobar-Guzman y col. 2008; González-Gutiérrez y col.

2014).

No existen estudios en otras especies pertenecientes a este género para comparar el tiempo en que se lleva a cabo la doble fertilización; sin embargo, al comparar con Nicotiana tabacum, los datos son muy similares, ocurriendo entre dos y tres días. Aunque no pertenecen a la misma familia, la longitud promedio (6.3 ± 0.4) del pistilo es similar (Tian y Russel 1997). La diferencia en el tiempo (48 vs 72 h) para el proceso de doble fertilización en las dos especies estudiadas puede ser debido a que pertenecen a grupos taxonómicos completamente diferentes y que también viven en diferentes ambientes. A. tequilana pertenece al grupo Rigidae y vive en el occidente de México con condiciones templadas a cálidas, mientras que A. salmiana pertenece al grupo Salmianae y vive en la parte central de México en clima templado a frío (Gentry 1982).

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8.2. Detección de calcio durante la doble fertilización

Se ha reportado que las elevaciones de calcio durante la fertilización ocurren de manera muy rápida en la célula central. Antoine y col. (2001) reportaron que va de 0.66-2 minutos en Maíz; Hamamura y col. (2014) reportaron en Arabidopsis un rango de 1.8-2.8 minutos.

La rapidez con que ocurren estas afluencias de calcio durante la fusión de los gametos masculinos y femeninos, es probablemente el motivo de que en el análisis no hubiera una diferencia estadísticamente significativa entre los sacos embrionarios que aún no habían sido fertilizados y los fertilizados. Sin embargo, existen suficientes evidencias que ocurren cambios de calcio durante el proceso de reproducción sexual (Digonnet y col. 1997).

Las imágenes ayudan a demostrar la existencia de cambios de calcio, como han informado un gran número de investigaciones, comenzando con una alta concentración de calcio en el micrópilo como atrayente del tubo polínico hacia el ovulo (Tian y Russell 1997), una alta concentración de calcio en el aparato de ovular (Kristóf y col. 1999), con una diferencia de concentración de calcio entre las células sinérgidas, ampliamente relacionada con la llegada del tubo de polen y la descarga de los espermas a una de las células sinérgidas (Hamamura y col. 2014), y como resultado de la fusión de gametos una elevación de Ca2+ en las membranas del cigoto. Todos estos cambios están directamente relacionados con la comunicación celular para el proceso de doble fertilización y la formación del embrión

(Denninger y col. 2014).

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8.2.1 Calcio en el micrópilo del óvulo

El calcio presente en las células del integumento externo que forman el micrópilo ha sido reportado también en Brassica napus y Plumbago zeylanica (Yu y col. 1998; Tian y

Russell 2000). Ge y col. (2007) han relacionado la abundancia de calcio en este sitio con una forma que utilizan las plantas para la atracción del TP. Por otro lado, estas altas concentraciones de calcio en las células cercanas al micrópilo facilitan el crecimiento del

TP cuando llega al micrópilo (Tian y Russell 2000). El crecimiento direccional del TP desde el estigma hasta el SE en los óvulos está regulado por interacciones polen-pistilo basadas en regulación intercelular de calcio (Iwano y col. 2012). Generalmente, un sólo TP es el que penetra al óvulo y el crecimiento de los demás tubos polínicos es detenido a la llegada del primer TP al SE. En ese momento el calcio micropilar sufre un decaimiento que resulta poco atractivo a los demás TP (Ge y col. 2007). Es por lo anterior que el calcio en las células del integumento que conforman el micrópilo de Agave probablemente controla la penetración de los óvulos, lo que previene la polispermia como se ha documentado en animales (Abbott y Ducibella 2001; Kashir y col. 2014).

8.2.2 El calcio en las células sinérgidas

Las células sinérgidas presentaron una intensidad de fluorescencia similar entre ellas, lo que se traduce en una concentración de calcio igual. Las células sinérgidas presentaron una alta concentración de calcio en el citosol comparadas con otras células del gametofito femenino (Higashiyama 2002; Ge y col. 2007). Sin embargo, algunas células sinérgidas

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tenían una concentración diferente de calcio. Está documentado que entre más cerca está la llegada del tubo polínico al micrópilo, una de las células sinérgidas adquiere una mayor concentración de calcio (Chaubal y Reger 1990; 1992). Por otra parte, el incremento de calcio es conocido como firma de calcio y está estrechamente relacionada con el crecimiento del TP y es intercambiable entre las células sinérgidas (Ngo y col. 2014).

Además, análisis fisiológicos in vitro de las células sinérgidas de Torenia fournieri han revelado que funcionan en conjunto con las demás células para lograr la doble fertilización cooperando en la atracción y aceptación del TP (Higashiyama 2002). La acumulación de calcio en las células sinérgidas ocurre en flores polinizadas. Dentro de esta sinérgida una alta concentración de calcio se ubicó alrededor de sus núcleos. Este resultado concuerda con lo reportado en Nicotiana tabacum (Tian y Russell 1997).

El tubo polínico es recibido por una de las células sinérgidas sin entrar por el aparato filiforme como ya se había reportado en Arabidopsis (Leshem y col. 2013). El calcio citosólico, por medio de los radicales libres hidroxilos dentro del TP, puede generar el estallido del TP cuando éste se encuentra en crecimiento dentro de la célula sinérgida

(Leshem y col. 2013; Duan y col. 2014; Li y col. 2015; Dresselhaus y col. 2016). Posterior a este evento, el calcio en las sinérgidas también es responsable de la muerte de ambas

(Iwano y col. 2012; Denninger y col. 2014). La destrucción de la célula sinérgida puede causar una elevación del Ca2+ externo. Además, se ha reportado que la estimulación mecánica puede desencadenar una elevación de calcio citosólico (Haley y col. 1995;

Hamamura y col. 2014).

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El origen del calcio aún se desconoce; sin embargo, se sabe que su aumento comienza en el micrópilo y se extiende hacia el polo calazal, alcanzando su nivel máximo con la ruptura del tubo polínico (Iwano y col. 2012). La presencia de calcio transitorio en gametos femeninos ocurre durante la descarga del esperma del TP (Denninger y col. 2014;

Hamamura y col. 2014), y se logra por el contenido del TP y no directamente por el esperma (Dresselhaus y col. 2016). Esta idea se ha visto reforzada con los estudios en

Drosophila melanogaster que demostraron que el aumento de calcio se debe a la presión durante la oviposición de la mosca hembra (Kaneuchi y col. 2014). De manera similar, el

TP estalla provocando una deformación en los gametos femeninos de la planta y, por lo tanto, podría estimular los canales de Ca2+ (Dresselhaus y col. 2016). La ubicación del calcio en las células se considera de tipo espaciotemporal (Tang y col. 2000) y el calcio en el núcleo de la célula central fertilizada tiene una ligera orientación hacia el extremo micropilar, así como lo que se informó por Yang y col. (2002) en arroz. Ge y col. (2007) han propuesto que el calcio presente en la célula central está relacionado con la estimulación del desarrollo temprano del endospermo.

Estos resultados indican que las oscilaciones de calcio en las células sinérgidas de Agave juegan un papel importante en los mecanismos de orientación del tubo polínico, así como también en la coordinación exitosa del proceso de la doble fertilización.

8.2.3 Calcio en la fusión de gametos

Una vez que el tubo polínico se ha roto y ha liberado su contenido, incluidas las dos células espermáticas, el proceso de fertilización entra en la siguiente etapa, la interacción específica y la fusión de las dos células espermáticas con el huevo y la célula central, respectivamente.

70

El calcio, a través de una vía de transducción de señales, puede llegar a controlar la liberación de los espermas tal como sucedió en las plantas de Arabidopsis thaliana (Ngo y col. 2014). Además, durante la liberación de los espermas, el calcio en la célula huevo se ha relacionado con la activación de un péptido llamado EC1 (Hamamura y col. 2014). Este péptido tiene la función de ayudar en la activación y fusión de los gametos (Sprunck y col.

2012). Durante la fusión de membranas de los gametos ocurren aperturas de afluencia de calcio citosólico que actúa como mediador en tiempo y espacio durante el proceso (Antoine y col. 2000). Esta característica desencadena un conjunto de eventos conocidos colectivamente como activación de huevos que conducen al desarrollo de un nuevo individuo (Antoine y col. 2001). Igualmente, esto se ha observado en todas las especies animales que se han estudiado y han demostrado al menos un aumento en la concentración citoplasmática de calcio después de la fusión de gametos (Stricker 1999); esta elevación de calcio citosólico la han relacionado con una plasmogamia exitosa (Denninger y col. 2014).

8.3. Calcio en la formación del endospermo

Posterior al proceso de la doble fertilización, se observó una alta intensidad de fluorescencia ubicada alrededor de los núcleos formadores del endospermo. Además, el análisis estadístico mostró una diferencia significativa de concentración de calcio

(intensidad de fluorescencia) entre las áreas con y sin núcleos. Aquí se discute el posible papel del calcio durante las divisiones tempranas del endospermo y la migración nuclear.

71

8.3.1 El papel del calcio en la mitosis nuclear

La división mitótica del núcleo primario del endospermo tiene lugar antes de la primera división del cigoto, característica ampliamente reportada para muchas especies como frijol, canola, trigo, Arabidopsis y arroz, entre otros (XuHan y col. 1994; Van Lammeren y col.

1996; Tianl y col. 1998; Brown y col. 1999; Yang y col. 2002). Por otro lado, la primera mitosis del núcleo del endospermo sin la formación de paredes celulares se produce en un plano transversal con respecto al eje longitudinal del SE de manera similar al maíz (Olsen

2001).

El calcio acumulado alrededor de los núcleos se detectó durante la formación del endospermo, esto concuerda con lo informado por Tian y col. (2000) quienes también reportaron la presencia de calcio en el endospermo de Plumbago zeylanica.

Durante la formación temprana del endospermo, la mitosis consecutiva de los núcleos sin citocinesis (Nguyen y col. 2001) forma un coenocito. En esta etapa del desarrollo, se necesita una participación constante de elementos de señalización que medien el proceso.

Los núcleos que forman el endospermo están rodeados por una capa con dos membranas fosfolipídicas llamada envoltura nuclear (EN), que mantiene aislado el material genético

(Kite 1913). Antes del proceso de mitosis, el núcleo está cubierto por la EN (Hetzer 2010).

La mitosis de los núcleos requiere de la síntesis de algunas proteínas que forman parte de este proceso. Por otro lado, se sabe que el calcio citosólico tiene un papel como segundo mensajero y además se sabe que las concentraciones de calcio en el citosol tienen efectos

72

sobre diferentes proteínas con una alta afinidad a calcio (Allen y Sanders 1997; Taylor y

Hepler 1997; White y Broadley 2003).

Una explicación sobre el origen del calcio alrededor de los núcleos, puede ser que, durante la división nuclear, existe una liberación de calcio almacenado en el espacio perinuclear tras la desintegración de la EN durante la división. Existen evidencias de que la EN puede permitir la difusión de iones de calcio a través de los poros (Bootman y col. 2009), además de funcionar como un almacenamiento de calcio alrededor de los núcleos (Mauger 2012).

Durante la división celular, la liberación de los cromosomas los deja libres de la EN, y sus componentes se disocian en el citoplasma (Puhka y col. 2007). Se conoce que las altas concentraciones de Ca2+ almacenadas en el retículo endoplásmico se difunden a la EN por el lumen que los une (Subramanian y Meyer 1997). Por lo tanto, la degradación de la EN podría liberar calcio almacenado durante la mitosis de los núcleos del endospermo.

Durante la regulación y movilización de calcio localizado alrededor de los núcleos, algunas proteínas como las reticuloplasminas, que son un grupo de proteínas con una alta capacidad y baja afinidad para unir los iones de calcio (Macer y Koch 1988), podrían intervenir. Entre ellas, la calreticulina (CRT) es la reticuloplasmina principal que se une al calcio dentro del lumen del retículo endoplasmático (RE) (Michalak y col. 1992) y con capacidad de secuestrar y movilizar los iones de calcio (Mery y col. 1996). Por otra parte, Nakamura y col. (1993) demostraron que la CRT tiene la capacidad de abandonar el RE y participar activamente en procesos que requieren un alto nivel de Ca2+, como se ha demostrado en el desarrollo del TP, donde se localizó CTR en la punta del TP (Lenartowska y col. 2002). Se sabe que en la punta hay una alta concentración de calcio (Steinhorst y Kudla 2013),

73

además, se ha informado de la presencia de CTR en las células mitóticas durante el huso acromático y en la envoltura nuclear (Denecke y col. 1995). La CTR también podría estar influyendo en el almacenamiento de Ca2+ y la elevación del calcio citosólico (Krause y

Michalak 1997), y participar activamente durante el proceso reproductivo de las plantas de angiospermas según lo propuesto recientemente por Wasąg y col. (2018).

El gran tamaño de los núcleos 3n (15.77 µm) en comparación con los núcleos 2n (6.13 µm) de la periferia del SE es una característica de triploidía y división nuclear (Hetzer 2010). Es posible que la presencia de calcio en la vecindad de los núcleos en la mitosis está involucrada en diversos procesos como la polimerización de microtúbulos, la disipación de la EN, la fabricación del huso mitótico y la condensación de la cromatina (Weisenberg

1972; Hepler 1994). Esto se debe a proteínas como las que forman los microtúbulos que son sensibles al calcio (Zhang y col. 1992). El calcio es esencial para la polimerización de tubulina en microtúbulos y estos son de vital importancia en el proceso de mitosis nuclear ya que generan las fuerzas mecánicas para desmontar la EN (Muhlhausser y Kutay 2007).

Además, permiten la entrada del huso mitótico necesario para el movimiento de los cromosomas durante la división nuclear (Kutay y Hetzer 2008). La presencia de microtúbulos que rodean los núcleos del endospermo fue reportada por Brown y col. (2003) en Arabidopsis.

74

8.3.2 Ubicación del calcio en el desarrollo temprano del endospermo

El núcleo es un organelo dinámico que a menudo se encuentra en movimiento en el citoplasma de la célula (Starr y Han 2003) y su correcto posicionamiento en las células es esencial para los organismos (Foe y Alberts 1983). La mitosis nuclear temprana del endospermo se produce en el extremo calazal del SE, y los núcleos se mueven a través del citoplasma hacia el área micropilar para alcanzar al cigoto y rodearlo, un fenómeno contrario al descrito en Arabidopsis, en la que, los primeros núcleos del endospermo se producen en la cámara micropilar y se mueven hacia el extremo calazal (Brown y col.

1999). Para el desplazamiento y la colocación de un núcleo, se requieren fuerzas mecánicas generadas por microtúbulos y microfilamentos (Bloom 2001). La participación del calcio durante la migración de núcleos desde el extremo calazal hasta el micropilar, podría estar relacionado con los filamentos de actina que están involucrados en la migración nuclear del endospermo (Yuan y col. 2002).

Un estudio reciente sobre la dinámica de la interacción entre el calcio y la actina ha demostrado que existe una íntima correlación entre los gradientes de calcio que controlan la polimerización de actina en las células de musgo en crecimiento (Bascom 2018). Para que el calcio induzca la activación de las proteínas, debe unirse a un receptor que pueda promover la construcción o activación de estas proteínas. Este fenómeno de motilidad nuclear probablemente podría llevarse a cabo por la interacción de Ca2+ con un receptor citosólico como la calmodulina, que a su vez activa una serie de proteínas que incluyen proteínas citoesqueleticas como los microtúbulos y los filamentos de actina.

75

La calmodulina promueve la polimerización de los filamentos de actina, que con ayuda de otras proteínas como los microtúbulos proporcionan el movimiento de los núcleos del endospermo (Brown y col. 2003), así como también sucede en la migración de los núcleos espermáticos del tubo polínico (Kadota y Wada 1995). La F-actina en forma de envoltura localizada alrededor de los núcleos del endospermo ya ha sido documentada, en el endospermo de Arabidopsis (Brown y col. 2003), y los filamentos de actina se han identificado como una de las proteínas clave en el fragmoplasto para el movimiento y soporte de los núcleos. Dado que se sabe que estas proteínas participan en el tráfico intracelular de organelos y vesículas secretoras (Cai y col. 1997). Por otro lado, existe una relación temporal y espacial entre el calcio, la calmodulina y la actina, por lo que es posible que el movimiento de los núcleos del endospermo se lleve a cabo de la manera propuesta, que es similar a lo que Yan (2001) sugirió en la migración de gametos a través de SE. El calcio tiene otra función que es la de indicar el lugar de polimerización y despolimerización de los filamentos de actina según lo reportado por Fan y col. (2004), de modo que el calcio alrededor a los núcleos en migración, podría estar marcando el lugar de polimerización de filamentos de actina y microtúbulos para el movimiento y anclaje de los núcleos. La participación activa de la actina podría estar promoviendo el desplazamiento intracelular del núcleo como sucedió en las células de las raíces de Arabidopsis (Chytilova 2000). Para que un núcleo sufra un movimiento, necesita estar anclado y tener un punto donde se anclará nuevamente (Starr y Han 2003). La actina se podría conectar a los núcleos a través de la EN que se sabe que contiene proteínas como Syne/ANC-1 con dominios CH y con una alta afinidad por unirse a la actina (Gimona y col. 2002). El calcio juega un papel importante en el control de la estructura, la actividad del citoesqueleto y, por lo tanto,

76

contribuye a muchos aspectos del crecimiento y desarrollo dependientes del citoesqueleto en las plantas (Hepler 2016).

En la Figura 6 se puede observar la mitosis continua que ha generado suficientes núcleos para lograr un endospermo casi completo, y hay una presencia abundante de calcio disperso en el endospermo. Además, se sabe que el calcio ayuda a la acumulación de almidón, por lo que esta disponibilidad de calcio podría estar relacionada con el transporte de aminoácidos y el metabolismo de los carbohidratos (Brauer y col. 1990; Ge y col. 2007). A pesar del desarrollo del endospermo en esta figura, aún se perciben células antípodas que tienen una cantidad mínima de calcio a su alrededor en comparación con el calcio en el resto del endospermo; esta baja precipitación de calcio en las células antípodas fue reportada por

Tian y Russell (1997) en Nicotiana tabacum L.

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9. CONCLUSIÓN

El calcio en las células del integumento que conforman el micrópilo de Agave probablemente controla la penetración de los óvulos tal como sucede en otras especies, previniendo la polispermia. Además, estos resultados indican que las oscilaciones de calcio en las células sinérgidas de Agave juegan un papel importante en los mecanismos de orientación, recepción del tubo polínico y descarga de los espermas, así como también en la coordinación exitosa del proceso de la doble fertilización.

El calcio post-fertilización desempeña un papel en la mitosis nuclear y también durante el desplazamiento de los núcleos a lo largo del citoplasma del SE en la familia Asparagaceae.

El calcio citosólico es probablemente un mediador para la síntesis, polimerización y activación de algunas proteínas motoras requeridas durante la migración nuclear.

Aunque las concentraciones de Ca2+ no se determinaron, los resultados de este estudio generan nuevos conocimientos que ayudan a mejorar la comprensión de los mecanismos de calcio implicados en el proceso de la doble fertilización y las primeras etapas del desarrollo del endospermo. Todos estos cambios en la concentración de calcio forman parte de la comunicación celular para el proceso de doble fertilización, la formación del embrión y el endospermo.

78

10. PERSPECTIVAS

La calibración radiométrica del Fluo-3 AM en el saco embrionario de Agave, ayudaría a comprender con exactitud la firma de Ca2+, esto es la concentración de calcio involucrada en la doble fertilización y la motilidad nuclear del endospermo en Agave. Además, el uso de inhibidores de los canales de calcio durante el desarrollo temprano ayudaría a entender de una mejor manera el papel del calcio.

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