Wolne Rodniki W Chemii, Biologii I Medycynie

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Wolne rodniki w chemii, biologii i medycynie

Halina Kaczmarek Alina Sionkowska

UMK Toruń 2013

1 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Halina Kaczmarek

CZ ĘŚĆ I. WOLNE RODNIKI W CHEMII

1. Poj ęcie i rodzaje rodników

Rodniki, wolne rodniki (termin angielski – radicals, free radicals ) według definicji Mi ędzynarodowej Unii Chemii Czystej i Stosowanej (IUPAC - International Union of Pure • and Applied Chemistry ) są to indywidua chemiczne (atomy lub cz ąsteczki), na przyklad CH 3, • • • • • SnH 3, NO, NO 2, Cl , H zawieraj ące niesparowane elektrony, tj. układy o spinie elektronowym ró Ŝnym od 0 (IUPAC Gold Book, http://goldbook.iupac.org/R05066.html ). Najprostszym rodnikiem jest atom wodoru. Słowo „rodnik”, pochodz ące od łaci ńskiego „radix”, oznaczaj ącego korze ń, funkcjonuje od około 200 lat [1-3]. Rodniki maj ą du Ŝy wpływ na nasze Ŝycie i zdrowie. S ą obecne w przyrodzie - powstaj ą w atmosferze ziemskiej pod wpływem promieniowania słonecznego, podczas procesów spalania, znajduj ą si ę równie Ŝ w dymie od papierosów (oszacowana liczba rodników w dymie papierosowym z jednego wydechu wynosi 10 14 !) Przyczyniaj ą si ę do starzenia organizmów Ŝywych i rozkładu Ŝywno ści ale wykorzystujemy je te Ŝ w wielu syntezach organicznych, np. do produkcji lub modyfikacji tworzyw sztucznych. Dawniej powszechnie stosowano termin „wolne rodniki” poniewa Ŝ „rodniki” były jednocze śnie synonimem podstawników zwi ązanych z cz ąsteczk ą zwi ązku chemicznego za pomoc ą wi ąza ń kowalencyjnych. Chcia Ŝ zgodnie z zaleceniami nomenklaturowymi, nie jest konieczne stosowanie okre ślenia „wolne” przed słowem „rodniki”, to jednak w aktualnej literaturze naukowej funkcjonuj ą obydwa terminy. Wyraz „wolny” u Ŝywa si ę te Ŝ w celu podkre ślenia braku wyst ępowania par rodnikowych. Pary rodników (ang. radical pair, geminate pair ) mog ą wyst ępowa ć dzi ęki efektowi „klatki” np. w rozpuszczalnikach. Atom z niesparowanym elektronem zwany jest centrum rodnikowym lub centrum aktywnym . W niektórych układach rodnikowych np. aromatycznych niesparowany elektron jest zdelokalizowany, co przyczynia si ę do jego znacznej trwało ści [4-8]. Rodniki powstaj ą łatwo ze zwi ązków chemicznych zawieraj ących nietrwałe wi ązania kowalencyjne, przykładem których mog ą by ć nadtlenki alkilowe zawieraj ące słabe ugrupowanie nadtlenkowe ulegaj ące p ękaniu zarówno pod wpływem ciepła jak i światła:

∆ lub h ν • • R1–O–O–R2 R1–O + R 2–O (1) Innymi czynnikami wywołuj ącymi reakcje tworzenia rodników s ą: promieniowanie radiacyjne, wyładowania elektryczne, ultrad źwi ęki, siły mechaniczne, a tak Ŝe zwi ązki chemiczne lub biologiczne (np. enzymy). Rodniki powstaj ące wskutek homolitycznego rozpadu wi ąza ń chemicznych s ą zazwyczaj bardzo nietrwałe i reaktywne (np. rodniki metylowe, fenylowe) ale znane s ą te Ŝ układy o wyj ątkowo du Ŝej stabilności, np. 2,2 -difenylo-1-pikrylohydrazyl (DPPH):

2 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

O2N

N N NO2

O2N DPPH (2) Pierwsze wolne rodniki zostały otrzymane i opisane na przełomie XIX i XX wieku. Historyczne znaczenie miało odkrycie wzgl ędnie trwałego rodnika trifenylometanowego powstaj ącego w reakcji trifenylochlorometanu ze srebrem metalicznym:

C Cl + Ag + AgCl

(3) Rodnik trifenylometanowy nie jest struktur ą płask ą (pier ścienie le Ŝą w płaszczyznach odchylonych od siebie o ok. 30 °). Ze wzgl ędu na przeszkody steryczne, w reakcji rekombinacji (dimeryzacji) ulega on jednocze śnie przegrupowaniu. Rodniki, w których niesparowany elektron zajmuje orbital s lub p są nazywane rodnikami typu σ lub π. W zale Ŝno ści od rodzaju atomu, na którym zlokalizowany jest elektron, mówimy o rodnikach w ęglowych, tlenowych lub rodnikach innych pierwiastków. Ogólnie mo Ŝna podzieli ć rodniki na nieorganiczne i organiczne. • Najprostszy rodnik organiczny – metylowy ( CH 3) ma budow ę płask ą (4), co wynika z 2 hybrydyzacji sp atomu w ęgla, przy czym niezhybrydyzowany orbital 2p z z pojedy ńczym elektronem jest prostopadły do płaszczyzny, w której le Ŝą atomy wodoru i w ęgla [5, 7]. Podstawienie atomu wodoru przez elektroujemny atom (np. chlorowiec) lub grup ę elektronodonorow ą (np. -OH, -NH 2) powoduje przekształcenie struktury płaskiej w piramidaln ą (5).

H C H (4) C (5) H F F F Elektron w rodnikach opisywany jest przez pojedy ńczo zaj ęty orbital molekularny SOMO (ang. Singly Occupied Molecular Orbital ), którego energia le Ŝy pomi ędzy orbitalami HOMO ( Highest-energy Occupied Molecular Orbital ) i LUMO ( Lowest-energy Unoccupied Molecular Orbital ).

Rodniki mo Ŝna te Ŝ podzieli ć na rodniki o charakterze nukleofilowym i elektrofilowym. Te wła ściwo ści zale Ŝą od oddziaływa ń z drugim substratem.

3 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Podstawniki o charakterze elektronoakceptorowym s ąsiaduj ące z atomem rodnikowym obni Ŝaj ą, podczas gdy podstawniki elektronodonorowe podwy Ŝszaj ą energi ę SOMO. Ma to wpływ na oddziaływania z cz ąsteczkami nierodnikowymi drugiego substratu, czyli jego orbitalami HOMO i LUMO (Rys. 1). Energia rodników elektrofilowych jest bli Ŝsza energii HOMO, st ąd tworzenie orbitali molekularnych przedstawionych na rys. 1a. W wyniku reakcji chemicznej rodników o charakterze nukleofilowym (o wy Ŝszej energii SOMO) z innymi cz ąsteczkami dominuj ą oddziaływania z LUMO (rys. 1b). Ten sam rodnik mo Ŝe odgrywa ć rol ę czynnika nukleofilowego lub elektrofilowego w zale Ŝno ści od charakteru drugiego reagenta. Oddziaływania elektrofilowe i nukleofilowe rodników wzrastaj ą gdy energia mi ędzy odpowiednimi orbitalami maleje [5,7].

(a) oddziaływania elektrofilowe (b) oddziaływania nukleofilowe

Rys. 1. Schemat poziomów energetycznych oraz oddziaływania orbitalu SOMO i HOMO (a), SOMO i LUMO (b) [5]

Rodniki maj ą wła ściwo ści paramagnetyczne (niezerowy moment magnetyczny, dzi ęki któremu zachodzi porz ądkowanie si ę spinów elektronów zgodnie z liniami zewn ętrznego pola magnetycznego) w odró Ŝnieniu od diamagnetyków, których wszystkie elektrony s ą sparowane. Przenikalno ść magnetyczna ( ) paramagnetyków jest nieco większa od jedno ści (w przypadku ferromagnetyków >> 1). Znane s ą te Ŝ układy, w których wyst ępuj ą dwa centra rodnikowe (tj. dwa niesparowane elektrony), które nie reaguj ą nawzajem ze sob ą. Nazywane s ą birodnikami (biradicals ). W przypadku wyst ępowania niesparowanych elektronów w dwóch stanach o ró Ŝnej multipletowo ści stosuje si ę termin dirodnik ( diradical ). Odkrycie i pierwsze syntezy stabilnych birodników zawdzi ęczamy Wilhelmowi Schlenklowi (1879 – 1943, niemiecki chemik) i Mosesowi Gombergowi (1879 – 1943, prof. University of Michigan, pochodzenia rosyjskiego). Były to struktury trifenylometanowe (6, 7), nazywane te Ŝ w ęglowodorami Schlenka-Braunsa ( Schlenk-Brauns hydrocarbons ):

4 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

(6) (7)

Inne birodniki o znaczeniu historycznym zostały zsyntezowane przez Tschitschibabina (8) w 1907r., Yanga (9) w 1960r. i Coppingera (10) w 1962r.

O O O

O O O (8) (9) (10)

Szczególnym przypadkiem birodników s ą karbeny i nitreny.

Karbeny (ang. carbenes ) o wzorze ogólnym :CR 1R2 (np. :CH 2, :CCl 2) są cz ąsteczkami, w których atom w ęgla tworzy dwa wi ązania kowalencyjne z s ąsiednimi atomami. S ą bardzo reaktywnymi zwi ązkami organicznymi (cz ęsto s ą zwi ązkami przej ściowymi, które mo Ŝna otrzyma ć w bardzo niskich temperaturach) wyst ępuj ącymi w stanie singletowym lub trypletowym. Karben w stanie trypletowym jest birodnikiem o hybrydyzacji sp, natomiast w stanie singletowym - sp 2. Znane s ą równie Ŝ karbeny cykliczne (np. cykloheksylidenowy), acylowe, iminowe, winylowe: R R R R R CC C R N O R R R (11) (12) (13) (14)

Przykładem trwałego trypletowego karbenu jest bis(2,4,6-tribromofenylo)karben, którego wzór strukturalny przedstawiono poni Ŝej: Br Br

Br C Br

Br Br (15) 5 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Nitreny (ang. n itrenes , synonimy: aminylenes, aminediyls, imidogens, azenes ) :N–H,

:N–R (np. CH 3N: metylonitren) s ą oboj ętnymi cz ąsteczkami zawieraj ącymi jedno wi ązanie kowalencyjne azot-wodór lub azot-węgiel. Podobnie jak karbeny mog ą wystepowa ć w stanie singletowym lub trypletowym. Innym rodzajem rodników s ą układy obdarzone dodatkowo ładunkiem, czyli jonorodniki: kationorodniki, anionorodniki (ang. radical ions , radical anions, radical .+ cations ). Przykładami takich jonorodników mog ą by ć kationorodniki benzenu C6H6 lub .− anionorodniki benzofenonu (C 6H5)2C–O . Cz ęsto, ale nie zawsze, niesparowany elektron i ładunek wyst ępuj ą przy tym samym atomie. Wolne rodniki łatwo ulegaj ą reakcji rekombinacji ( radical combination, colligation ), w wyniku której tworzy si ę wi ązanie kowalencyjne np.

• • C2H5 + OH C 2H5OH (16)

Ta samorzutna reakcja nie wymaga energii i jest kontrolowana dyfuzyjnie. Utrudnieniem w rekombinacji mog ą by ć przeszkody steryczne; mo Ŝna j ą te Ŝ zahamowa ć obni Ŝaj ąc temperatur ę (w stanie zamro Ŝonym ruchliwo ść cz ąsteczek jest ograniczona). Innym mechanizmem dezaktywacji rodników jest dysproporcjonowanie zwi ązane z przeniesieniem atomu wodoru z jednego rodnika na drugi. W przypadku rodników węglowodorowych prowadzi to do utworzenia alkanu i alkenu: • • C2H5 + C2H5 C2H6 + C 2H4 (17) etan eten

2. Nomenklatura rodników

Zalecenia nomenklaturowe (wg recomendacji IUPAC: Revised Nomenclature for Radicals, Ions, Radical Ions and Related Species, IUPAC Recommendations 1993, RC-81 Radicals, http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/ions/RC811.html#p1) opublikowano w czasopi śmie Pure and Applied Chemistry, 65, 1993, 1375-1455, a wersj ę polskoj ęzyczn ą w Wiadomo ściach Chemicznych (T. Sokołowska, A. Wi śniewski, Skorygowana nomenklatura rodników, jonów, jonorodników i podobnych indywiduów chemicznych, Wydawnictwo Uniwersytetu Wrocławskiego, Wrocław, 2001).

IUPAC dopuszcza stosowanie nazw zwyczajowych, powszechnie stosowanych w literaturze naukowej (a tak Ŝe skróconych i opisowych). Nazwy rodników zlokalizowanych na atomach w ęgla, powstałych przez oderwanie atomu (rodnika) wodoru od cz ąsteczki, pochodz ą od nazw macierzystych zwi ązków organicznych z ko ńcówk ą -yl , -il np.: • CH 3 – metyl

6 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

. CH 3–CH 2–CH 2 – propyl . CH 3–CH–CH 3 – 1-metyletyl, propan-2-yl, izopropyl

H2C CH – cyklobutyl H CCH 2 2 . CH 2=CH – winyl . CH 2=CH-CH 2 – allil . C6H5-CH=CH – styryl Podobnie nazywamy rodniki powstałe ze zwi ązków aromatycznych: fenyl naftyl, antryl, fenantryl. Inne przykłady: furyl, piridyl, piperidyl, quinolyl, izoquinolyl, tienyl czy hydrazyl,

– 1,1'-bifenyl-3-yl

– 1H -fenalen-4-yl

Nazwy rodników, w których wolny elektron znajduje si ę na atomach innych ni Ŝ węgiel, na ogół równie Ŝ pochodz ą od nazw wyj ściowych zwi ązków. Ilustruj ą to poni Ŝsze przykłady: • NH 2 – azanyl (bo nazwa systematyczna amoniaku to azan), aminyl •SH – sulfanyl (zwyczajowo: merkapto) • BH 2 – boranyl –O• – oksyl HO • – hydroksyl • HO 2 – hydroperoksyl (rodnik nadtlenkowy) • PbH 3 – plumbyl (bo PbH 4 – plumban) • SiH 3 – silyl (bo SiH 4 – silan) . SiH 3–SiH–Si 3 – trisilan-2-yl . CH 3–N=N–N– CH 3 – 1,3-dimetyltriaz-2-en-1-yl 3 2 1 . CH 3–S–S(CH 3)2 – 1,1,2-trimetyl-disulfan-1-yl 7 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Poni Ŝej wymieniono nazwy popularnych rodników zawieraj ących charakterystyczne grupy funkcyjne: . CH 3–C=O – acetyl, acetylium •COOH – karboksyl :C=O – karbonyl R–O• – alkoksyl • CH 3-O – metoksyl R–O–O• – alkildioksyl • CH 3CO-O – acetoksyl • Cl-CH 2-CO-O – chloroacetoksyl OS : – sulfinyl

O2S: – sulfonyl OSe : – seleninyl •ClO – chlorozyl • ClO 2 – chloryl • ClO 3 – perchloryl Równie Ŝ w przypadku jonorodników, nazwa wywodzi si ę od oboj ętnej cz ąsteczki z odpowiedni ą ko ńcówk ą (-ium, -iumyl ), np.: •+ H2C – kation metylu, metylium, karbenium •+ H4Si – silaniumyl •+ [C 6H6] – kation fenylu, benzeniumyl •+ (CH 3)3N – trimetylammoniumyl, trimetyloazaniumyl Jonorodniki zawieraj ące tlen nazywamy: • O - – anionorodnik tlenku(1-) •- O2 – anionorodnik ditlenku(1-), anionorodnik ponadtlenkowy •- O3 – anionorodnik tritlenku(1-)

3. Powstawanie rodników

Mo Ŝna wyró Ŝni ć kilka metod otrzymywania wolnych rodników. Najwa Ŝniejszymi s ą: metoda termiczna (pirolityczna), radiacyjna, fotochemiczna i elektrochemiczna (tu wolne rodniki powstaj ą podczas elektrolizy w pobli Ŝu elektrod np. wodór in statu nascendi na katodzie). Pod wpływem ogrzewania substancji chemicznych w wysokich temperaturach (rz ędu od kilkutset do kilku tysi ęcy °C) zachodzi rozkład cz ąsteczek na rodniki lub atomy, które w fazie gazowej znajduj ą si ę w równowadze termodynamicznej z wyj ściowymi cz ąsteczkami. Dysocjacja homolityczna cz ąsteczek wodoru do atomów wodoru pod ci śnieniem 1 atmosfery zaczyna si ę w temperaturze 300 °C. • • H2 H + H (18)

8 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Dysocjacja gazowego chlorowodoru zachodzi w temperaturze jeszcze ni Ŝszej (nieco powy Ŝej 200 °C): HCl H • + Cl • (19) Stosunkowo łatwo, bo ju Ŝ w temperaturze 500-600 °C, na atomy dysocjuj ą te Ŝ metale alkaliczne, co jest wykorzystywane do otrzymywania innych rodników np. organicznych (R •) lub chlorowców (X •): Na • + RCl NaCl + R • (20) • • Na + X 2 NaX + X (21) Wiele zwi ązków organicznych rozkłada si ę w temperaturze nieznaczne przekraczaj ącej 200 °C. Jak stwierdzono, cz ąsteczka bromowodoru mo Ŝe ulega ć homolizie nawet w temperaturze pokojowej. Stwierdzono to badaj ąc reakcje przył ączania bromowodoru do izobutenu. Mechanizm tej addycji jest ró Ŝny w zale Ŝno ści od tego czy reakcja przebiega w obecno ści nadtlenków (22, 23), czy bez ich udziału (24). HBr H • + Br • (22) Br Br + + Br (23)

bromek izobutylu bromek tert-butylu (91%) (6%) W obecno ści nadtlenków, które wyj ątkowo łatwo rozkładaj ą si ę inicjuj ąc ła ńcuch reakcji rodnikowych, dominuj ącym produktem jest bromek izobutylu. Bez inicjatora nadtlenkowego mechanizm reakcji zmienia si ę na jonowy, co prowadzi do powstania głównie bromku tert -butylu:

HBr + + Br Br (24)

Przebieg tej regioselektywnej reakcji wyja śnił Morris Karasch w latach 30-tych ubiegłego wieku. Wzbudzanie atomów w płomieniu i mo Ŝliwo ść pomiaru intensywno ści emitowanego przez nie promieniowania wykorzystuje si ę w fotometrii płomieniowej i absorpcyjnej spektroskopii atomowej (ASA), które s ą bardzo przydatne w ilo ściowej analizie ró Ŝnych metali.

Fotochemiczna metoda generowania wolnych rodników wi ąŜ e si ę z wzbudzeniem cz ąsteczek promieniowaniem elektromagnetycznym z zakresu nadfioletu (UV), a czasami nawet z zakresu widzialnego (Vis). Warunkiem reakcji fotochemicznej jest absorpcja kwantu promieniowania, co prowadzi do przej ścia elektronu ze stanu podstawowego do stanu wzbudzonego o wy Ŝszej energii (singletowego lub trypletowego). Aby zaszedł rozpad homolityczny, energia kwantu promieniowania musi być równa lub przekracza ć energi ę dysocjacji wi ązania chemicznego (Tabela 1). 9 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Tabela 1. Warto ści energii wybranych wi ąza ń chemicznych [4].

Wi ązanie X–Y Energia Wi ązanie X–Y Energia wi ązania, kJ/mol wi ązania, kJ/mol H–OH 498 H–Cl 431 Ph-H 464 H–Br 366 H3C–H 435 CH 3–Cl 349 CH 3CH 2–H 423 Cl –Cl 243 (CH 3)2CH –H 410 Br -Br 192 (CH 3)3C–H 397 I–I 151 H3C–OH 383 HO–OH 213 PhCH 2–H 372 H3CO–OCH 3 151 H3C–CH 3 368 CH 3–Cl 349

Energia promieniowania (E) jest odwrotnie proporcjonalna do długo ści fali ( λ), co wyra Ŝa wzór Plancka: c E = hν = h (25) λ gdzie h jest stał ą Plancka (h = 6,626·10 –34 J·s = 4,136·10 –15 eV·s), a ν – cz ęsto ści ą promieniowania. Kwanty promieniowania widzialnego nios ą energi ę zdoln ą do rozerwania najsłabszych wiąza ń chemicznych ( ∼160-300 kJ/mol), podczas gdy energia promieniowania UV powoduje rozerwanie równie Ŝ wi ąza ń trwałych (przykładowo kwant promieniowania o długo ści fali 200 nm ma energi ę ok. 590 kJ/mol). Nie zawsze energia wzbudzenia jest wykorzystana do rozerwania wi ązania chemicznego z utworzeniem rodników. Wzbudzone cz ąsteczki mog ą ulega ć przej ściom promienistym (fluorescencji, fosforescencji), konwersji wewn ętrznej, relaksacji oscylacyjnej, czy przeniesieniu energii, które nie prowadz ą do aktów chemicznych. Szczególnie podatne na rozkład pod wpływem światła s ą chlorowce:

hν • Cl 2 2 Cl (26) Zalet ą metody fotochemicznego generowania rodników jest selektywno ść wzbudzania okre ślonych chromoforów w cz ąsteczkach w zale Ŝno ści od ich zdolno ści absorpcyjnych. Najcz ęś ciej stosuje si ę promieniowanie elektromagnetyczne z zakresu nadfioletu (200-380 nm) wykorzystuj ąc lampy kwarcowe lub lasery emituj ące promieniowanie monochromatyczne o du Ŝej intensywno ści. Dobór promieniowania o odpowiedniej energii pozwala na rozerwanie okre ślonych wi ąza ń chemicznych. W przypadku konieczno ści u Ŝycia promieniowania o niezbyt du Ŝej energii w celu zapobiegania zbyt gwałtownym procesom degradacyjnym zwi ązków organicznych korzystne jest stosowanie fotosensybilizatorów (fotouczulaczy). Ich działanie polega na zaabsorbowaniu energii promieniowania i przeniesieniu energii wzbudzenia na cz ąsteczki nieabsorbuj ące w

10 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki danym zakresie, co pozwala na wywołanie reakcji fotochemicznej w tym zwi ązku, podczas gdy cz ąsteczka fotosensybilizatora wraca do stanu podstawowego bez zmiany struktury chemicznej [9] . Przykładem reakcji sensybilizowanej fotolizy mo Ŝe by ć rozkład wodoru lub tlenu cz ąsteczkowego na atomy pod wpływem par rt ęci, która ulega wzbudzeniu podczas działania promieniowania o długo ści fali 254 nm: hν Hg Hg* (27) • Hg* + H 2 Hg + 2 H (28) • Hg* + O 2 Hg + 2 O (29)

Słabe wi ązania chemiczne, podatne na homoliz ę, oprócz nadtlenków organicznych, zawieraj ą te Ŝ zwi ązki azowe (np. 2,2 ′-dimetylo-2,2 ′-azodipropiononitryl, AIBN, reakcja 30) i organometaliczne (np. rt ęcioorganiczne – reakcja 31, 32):

CN NCN 66-72oC (30) NC N 2 + N2 AIBN

R–Hg–R R • + •Hg–R (31) o R–Hg–H + R • 20 20 C R–Hg • + HR (32) Stosowanym dawniej w motoryzacji zwi ązkiem metaloorganicznym dostarczaj ącym wolnych rodników był tetraetylołów, czteroetylek ołowiu(IV), (C 2H5)4Pb. Ulega on w podwy Ŝszonej temperaturze (ok. 120°C) rozkładowi z wydzieleniem ołowiu metalicznego i czterech rodników etylowych (33), które przyczyniają si ę do łagodnego, niewybuchowego spalania benzyny. Dlatego stosowany był jako dodatek przeciwstukowy do paliwa samochodowego. Obecnie jest zast ępowany innymi substancjami nie zawieraj ącymi ołowiu. • (C 2H5)4Pb 4 C2H5 + Pb (33) Oprócz homolitycznego p ękania słabych wi ąza ń chemicznych mo Ŝna wymieni ć inne reakcje tworzenia rodników w zwi ązkach organicznych. S ą to reakcje odrywania atomów (najcz ęś ciej wodoru) przez ju Ŝ istniej ące w środowisku reakcyjnym rodniki (np. reakcja 34), czy przeniesienie elektronu (35): R-O + H-Br R-OH + Br (34) R R1 + e 1 C=O C-O R R2 2 (35) Równie Ŝ reakcje przył ączania rodników (atomów) do wi ąza ń podwójnych prowadz ą do tworzenia produktów rodnikowych (np. przył ączenie atomów bromu do alkenów, reakcja 36).

11 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Br Br + (36)

Metoda radiacyjna polega na tworzeniu wolnych rodników, jonów i cz ąsteczek wzbudzonych wskutek działania na materi ę wysokoenergetycznego (jonizuj ącego) promieniowania elektromagnetycznego X lub γ, a tak Ŝe korpuskularnego [10]. Promieniowanie rentgenowskie (X), o długo ściach fal w zakresie od 20 do 0,05 Å , powstaje w wyniku oddziaływania szybkich elektronów z atomami o środka (np. wolframu), przy czym jego energia zale Ŝy zarówno od energii kinetycznej elektronów oraz rodzaju atomów. Źródłem promieniowania γ o długo ści fal od 1,0 do 0,01Å (energia kwantu > 50 keV) s ą naturalne lub sztuczne pierwiastki promieniotwórcze, z których najcz ęś ciej stosowany jest izotop kobaltu 60 Co emituj ący kwanty o energii 1,173 i 1,332 MeV. Izotop ten jest stosowany w technice, medycynie i innych dziedzinach (np. do sterylizacji artykułów Ŝywno ściowych). Drugi typ promieniowania jonizuj ącego to promieniowanie korpuskularne: α i β emitowane przez izotopy promieniotwórcze (strumienie j ąder helu, elektronów, protonów, neutronów). Oddziaływanie promieniowania jonizuj ącego z materi ą składa si ę z trzech etapów: 1. Pierwszym jest bardzo krótki fizyczny proces wymiany energii mi ędzy cz ąstkami promieniowania a cz ąsteczkami napromienianego materiału w zderzeniach spr ęŜ ystych i niespr ęŜ ystych (t<10 -15 s); 2. Drugi to etap fizykochemiczny, który polega na wytwarzaniu struktur chemicznych o ró Ŝnym stopniu wzbudzenia, jonizacji i rozpadu rodnikowego (t ~10 -12 s); 3. Etap chemiczny, podczas którego zachodzi dyfuzja i reakcje powstałych indywiduów chemicznych; mo Ŝe on trwa ć znacznie dłu Ŝej ni Ŝ etap 1 i 2 (t ~10 -8s do kilku dni lub nawet miesi ęcy).

W metodzie radiacyjnej powstaje wiele ró Ŝnorodnych produktów. Du Ŝa energia krótkofalowego promieniowania X lub γ prowadzi nie tylko do homolitycznej dysocjacji wi ąza ń chemicznych ale te Ŝ do jonizacji cz ąsteczek, która jest tu procesem dominuj ącym. Czas Ŝycia radiacyjnie generowanych cz ąsteczek wzbudzonych, rodników i pierwotnych jonów jest bardzo krótki (10 -15 -10 -12 s). W cieczach polarnych podczas radiolizy powstają solwatowane elektrony, które wywołuj ą kolejne wtórne reakcje. Badania rodników wytworzonych metod ą radiacyjn ą wymagaj ą stosowania technik pozwalaj ących na detekcj ę krótko Ŝyj ących produktów aktywnych, do których nale Ŝy np. radioliza impulsowa (opisana w cz ęś ci II). Do najwa Ŝniejszych reakcji radiacyjnych nale Ŝy radioliza wody pod wpływem promieniowania γ (reakcje 37-45), zaobserwowana ju Ŝ przez Mari ę Curie-Skłodowsk ą. •+ − H2O + hv → H 2O + e (37) * • • H2O + hv → H 2O → H + OH (38) •+ + • H2O + H 2O → H 3O + OH (39) − − • − H2O + e → H 2O → H + OH (40)

12 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

•+ − * • • H2O + e → H 2O → H + OH (41) • • • • • • H + OH → H 2O, OH + OH → H 2O2 oraz H + H → H 2 (42) • • H2O2 + OH → H 2O + HO 2 (43) • • OH + HO 2 → H 2O + O 2 (44) • • H2O2 + HO 2 → H 2O + O 2 + OH (45) * gdzie H 2O oznacza wzbudzon ą cz ąsteczk ę wody.

Wolne rodniki mog ą równie Ŝ powstawa ć pod wpływem ultrad źwi ęków. Ta metoda generowania rodników nosi nazw ę sonolizy (ang. sonolysis ). Działanie ultrad źwi ęków na • • wod ę powoduje tworzenie rodnika hydroksylowego (HO ), ponadtlenkowego (HO 2 ) i atomów wodoru, które szybko rekombinuj ą. Podczas sonolizy chloroformu dominuje p ękanie wi ązania C-Cl. Stwarza to mo Ŝliwo ść usuwania z roztworów zanieczyszcze ń w postaci zwi ązków halogenoorganicznych ultrad źwi ękami. Źródłem wielu rodników jest te Ŝ plazma, która stanowi mieszanin ę atomów, jonów, rodników i jonorodników oraz cz ąsteczek w stanie wzbudzonym [11]. Nale Ŝy doda ć, Ŝe wolne rodniki w ró Ŝnych substancjach chemicznych mog ą równie Ŝ powstawa ć pod wpływem sił mechanicznych, które prowadz ą do rozrywania wi ąza ń chemicznych. Szczególnie materiały poddane obróbce mechanicznej takiej jak rozdrabnianie, mielenie, ci ęcie, mog ą zawiera ć rodniki (głównie na powierzchni), które ulegaj ą dezaktywacji np. rekombinacji lub reakcji z tlenem atmosferycznym.

4. Trwało ść i charakter rodników

Wolne rodniki mo Ŝna podzieli ć na trzy typy: a) bardzo reaktywne o połowicznych czasach Ŝycia krótszych od 10 -3 s; b) rodniki stabilne o połowicznych czasach Ŝycia dłu Ŝszych od 10 -3 s; c) rodniki trwałe, persystentne (ang. persistent radicals ).

Trwało ść rodników mo Ŝna rozwa Ŝać w aspekcie termodynamicznym i kinetycznym. Stabilno ść termodynamiczna jest zale Ŝna od energii potrzebnej do dysocjacji wi ązania chemicznego lub energii wydzielonej w wyniku rekombinacji rodników. Wpływ na ni ą maj ą efekty koniugacji, hiperkoniugacji i mezomeria. Stabilno ść kinetyczna jest uwarunkowana zatłoczeniem przestrzennym wokół centrum rodnikowego. Im wi ększa jest energia p ękaj ącego wi ązania chemicznego, tym wi ększa energia rodników i wi ększa ich niestabilno ść (tj. krótszy czas Ŝycia).

Wzrost energii p ękaj ącego wi ązania

Wzrost trwało ści powstaj ącego rodnika

Wzrost czasu Ŝycia rodnika

13 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Uszeregowanie rodników wg stabilno ści pokrywa si ę z analogicznym szeregiem trwało ści karbokationów. Energia wi ązania C-H zale Ŝy od rz ędowo ści atomów w ęgla. Trzeciorz ędowy, rodnikowy atom w ęgla jest bardziej stabilny ni Ŝ drugorz ędowy, a ten z kolei jest trwalszy ni Ŝ pierwszorz ędowy: CH CH CH3 3 3 > > > CH3 CH CH CH3 H HH 3 3 (46) (47) (48) (49) Wzrost stabilno ści rodników ze wzrostem rz ędowo ści atomu w ęgla, na którym zlokalizowany jest niesparowany elektron jest wywołany przez coraz wi ększe zawady przestrzenne oraz efekt hiperkoniugacji, czyli oddziaływanie pojedy ńczo obsadzonego orbitalu p z sąsiaduj ącymi orbitalami molekularnymi wi ąza ń sigma C-H. Słabymi wi ązaniami chemicznymi s ą te, które s ą skoniugowane z grupami allilowymi lub benzylowymi, st ąd wi ększa trwało ść rodników (50) i (51) w porównaniu z rodnikami alkilowymi:

(50) (51)

W rodnikach z wi ązaniami nienasyconymi obserwuje si ę stabilizacj ę spowodowan ą efektem rezonansowym: CH2-CH=CH2 CH2=CH-CH2 (52) Natomiast rozkład homolityczny silnych wi ąza ń C-H w alkenach, alkinach i arenach prowadzi do otrzymania mało stabilnych rodników np. winylowych (53), alkinowych (54), czy fenylowych (55):

(53) (54) (55)

Obecno ść s ąsiaduj ących grup funkcyjnych osłabia wi ązanie C-H, co przyczynia si ę do stabilizacji tworz ących si ę rodników (56-59): O

C N OC2H5 O (56) (57) (58) (59) Równie Ŝ struktura przestrzenna ma du Ŝy wpływ na stabilno ść rodników. Zwi ązki organiczne zawieraj ące du Ŝe podstawniki, stanowi ące przeszkody steryczne, pozwalaj ą na uzyskanie trwalszych, mniej reaktywnych rodników:

14 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

CH3 O CH3 H3C CH3 CH3 H3C H3CCH3 N H3CCH3 O

H3C CH3 CH (60) 3 (61) Rodniki 2,2,6,6-tetrametylo-1-oksopiperydyny, oznaczane skrótem TEMPO (60) oraz ich pochodne, stabilizowane przez grupy metylowe (61), s ą stosowane w syntezie organicznej oraz kontrolowanej polimeryzacji rodnikowej. Rodniki nitroksylowe (R-NO •) s ą te Ŝ wykorzystywane jako znaczniki spinowe w spektroskopii EPR. Z efektem sterycznym mamy do czynienia w rodniku trifenylometanowym, powstaj ącym w reakcji (3).

5. Przykłady reakcji z udziałem wolnych rodników

Reakcje rodnikowe s ą reakcjami ła ńcuchowymi, w których mo Ŝna wyró Ŝni ć etap inicjowania, propagacji (wzrostu ła ńcucha kinetycznego reakcji) i terminacji czyli zako ńczenia. Typowymi inicjatorami reakcji wolnorodnikowych s ą nadtlenki nieorganiczne i organiczne (np. H 2O2, R-OO-R), czy zwi ązki azowe (np. AIBN). Wśród reakcji z udziałem wolnych rodników, które prowadz ą do powstawania nowych centrów aktywnych nale Ŝy wymieni ć reakcje addycji (23), fragmentacji, podstawienia i przegrupowania [1,5,7,12]. Szczególnym przypadkiem addycji jest wewn ątrzcz ąsteczkowe przył ączanie do wi ąza ń podwójnych, prowadz ące do cyklizacji:

(62)

Podstawienie polega na oderwaniu atomu b ądź grupy atomów z cz ąsteczki przez atakuj ący rodnik. Przebieg reakcji zale Ŝy od typu rodnika, co ilustruje poni Ŝsza reakcja estrów:

R1-CH2-C-O-CH2-R2 R O RO (63)

R1-CH2-C-O-CH-R2 R1-CH-C-O-CH2-R2 O O + RH + ROH Elektrofilowy rodnik alkoksylowy (RO •) odrywa atom wodoru z grupy alkilowej estru, natomiast nukleofilowy rodnik alkilowy (R •) odrywa atom wodoru z grupy acylowej.

15 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Niektóre rodniki ulegaj ą fragmentacji z utworzeniem nowej nierodnikowej cz ąsteczki i innego rodnika. Z nadtlenku benzoilu powstaj ą rodniki oksybenzoilowe, które nast ępnie rozpadaj ą si ę na rodniki fenylowe i cz ąsteczki ditlenku w ęgla:

O O O C 2 C 2 + 2 CO C O 2 O (64) O Trzeciorz ędowy rodnik alkilowy mo Ŝe ulega ć fragmentacji z oderwaniem rodnika metylowego:

CH 3 H3C H3COC C O + CH3 H3C CH3 (65) Powy Ŝsze reakcje (64, 65) s ą zaliczane do typu β-pękania wi ązania (s ąsiedniego w stosunku centrum rodnikowego). Innym typem reakcji jest α-pękanie wi ązania zachodz ące np. podczas rozpadu rodnika acylowego: • R-C=O R • + C=O (66) Znane s ą te Ŝ reakcje przegrupowania prowadz ące do izomeryzacji rodników. S ą one efektem reakcji wewn ątrzcz ąsteczkowych przebiegaj ących cz ęsto przez przej ściowy stan cykliczny: R H CH CH 2 (67) R-(CH2)4-CH2 R-CH-(CH2)3-CH3 H2C CH2 CH 2 R R (68)

Reakcja fotochemicznego przegrupowania estru o-nitrobenzylowego prowadzi do powstania kwasu nitroniowego ( nitronic acid ) o stosunkowo długim czasie trwania, który dalej rozkłada si ę do kwasu karboksylowego i estru:

16 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

R R R 1 O 2 1 O R2 R1 O R2 C C C C C C H hν O O O N=O N-OH N-OH O O O

R R1 1 O C O R2 C=O + R2-C C OH N O OH N=O (69) O Innymi znanymi reakcjami przegrupowania s ą reakcje foto-Friesa, którym ulegaj ą podstawione zwi ązki aromatyczne: O R C OH O hν O C R O (70) C R

OH Reakcjami prowadz ącymi do zaniku wolnych rodników, tj. utworzenia produktów diamagnetycznych, s ą reakcje rekombinacji (np. 16), dysproporcjonowania (17) lub przeniesienia pojedy ńczego elektronu. Terminacj ę mo Ŝna wywoła ć stosuj ąc odpowiednie inhibitory (np. hydrochinon lub difenyloamin ę), które łatwo reaguj ą z rodnikami obecnymi w środowisku reakcji. Wi ększo ść nietrwałych rodników rekombinuje z bardzo du Ŝą szybko ści ą (stałe szybko ści w fazie gazowej s ą rz ędu 10 9 mol -1 l s-1). W fazie ciekłej szybko ść rekombinacji zale Ŝy od dyfuzji rodników. Dysproporcjonowanie jest procesem wolniejszym ni Ŝ rekombinacja ale stałe szybko ści tego procesu zale Ŝą od struktury rodników.

Rodniki mog ą te Ŝ ulega ć reakcjom redoks z kationami metali d-elektronowych takich jak Fe 3+ , Cu 2+ , Cr 3+ , Mn 3+ .

- R-CH2-CH2 + FeCl3 R-CH2-CH2 + FeCl2 + Cl (71)

R-CH2-CH2Cl lub R-CH2=CH2 + HCl W powy Ŝszej reakcji zachodzi przeniesienie elektronu z rodnika alkilowego na jon Ŝelaza(III), czego efektem jest powstanie karbokationu i chlorku Ŝelaza(II). Stabilizacja karbokationu jest mo Ŝliwa wskutek przył ączenia jonu chlorkowego lub oderwania protonu. Kwasy karboksylowe w obecno ści soli metali na swoich wy Ŝszych stopniach utlenienia takich jak Ce 4+ , Pb 4+ , Co 3+ ulegaj ą rozkładowi utleniaj ącemu:

17 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

RCOOH + Me n+ RCOO • + Me n-1 + H + (72)

Natomiast aromatyczne sole dizaoniowe (ArN 2), aromatyczne (Ar-X) i alifatyczne (R-X) chlorki czy chloroaminy ulegaj ą redukcji: + • 2+ ArN 2 + Cu ArN 2 + Cu (73) • ArN 2 Ar + N 2 (74) Ar-X + e - [Ar-X] •- Ar • + X - (75) R-X + e - R• + X - (76) R R + + NH-Cl + Ti3+ NH + Cl- + Ti4+ (77) R R Innym przykładem przeniesienia elektronu (tj. procesu redoks) jest reakcja sodu metalicznego z ketonem prowadz ąca do utworzenia jonorodnika ketylowego:

R1 R1 (78) C=O + Na C-O - + Na+ R2 R2

W literaturze opisano wiele reakcji wolnorodnikowych, którym ulegaj ą zarówno zwi ązki nieorganiczne jak i organiczne [4-8]. Wybrane przykłady opisano poni Ŝej.

6. Nadtlenek wodoru i rodniki hydroksylowe

Nadtlenek wodoru w niewielkich st ęŜ eniach wyst ępuje w naturalnych zbiornikach wodnych oraz w opadach atmosferycznych [13-15]. H2O2 podobnie jak inne nadtlenki zawiera słabe wi ązanie chemiczne O-O o energii ok. 213 kJ/mol, zatem łatwo ulega rozkładowi pod wpływem ciepła i światła. • • H2O2 → HO + OH (79) W zale Ŝno ści od środowiska i obecno ści innych substancji w układzie mog ą zachodzi ć wtórne reakcje wywołane przez rodniki hydroksylowe. Proces fotolizy H 2O2 przebiega stosunkowo wolno w rozcie ńczonych roztworach wodnych, co mo Ŝna wytłumaczy ć efektem klatkowym wywołanym obecno ści ą du Ŝej ilo ści cz ąsteczek rozpuszczalnika otaczaj ących powstaj ące rodniki, które szybko ulegaj ą rekombinacji . Silne wła ściwo ści utleniaj ące st ęŜ onego roztworu (perhydrolu - 30% H 2O2) wynikaj ą z jego rozkładu do wody i tlenu atomowego • H2O2 → H 2O + O (80) Rozkład nadtlenku wodoru katalizuj ą metale (srebro, platyna), tlenek manganu(II) i jony jodkowe. Rodniki hydroksylowe inicjuj ą wiele reakcji w zwi ązkach organicznych, s ą te Ŝ przyczyn ą niekorzystnych procesów w organizmach Ŝywych (starzenie). Mog ą by ć równie Ŝ wykorzystane do utylizacji odpadów lub przekształcania niebezpiecznych zwi ązków organicznych w mniej szkodliwe produkty.

18 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Przykładem wykorzystania rodników HO • jest reakcja z kwasem barbiturowym (malonylomocznik, nazwa systematyczna: pirymidyn-2,4,6-trion), w wyniku której powstaje alloksan (ang. 1,3-diazinane-2,4,5,6-tetrone ) znajduj ący zastosowanie w badaniach biomedycznych (badanie cukrzycy) [16]. W pierwszym etapie reakcji, rodnik HO • odrywa atom wodoru z kwasu barbiturowego (81), nast ępnie HO • ulega przył ączeniu do pier ścienia heterocyklicznego (82). Powstaj ący kwas dialurowy ulega utlenieniu tlenem z powietrza daj ąc w produktach alloksan i rodnik ponadtlenkowy (83). Obecno ść powstaj ących w tej reakcji rodników potwierdzono metod ą spektroskopii EPR.

(81)

kwas barbitu rowy

(82)

kwas dialurowy

(83)

7. Reakcje Fentona

Reakcje z udziałem odczynnika Fentona, czyli reaktywnej mieszaniny jonów Ŝelaza(II) z nadtlenkiem wodoru, polegaj ą na efektywnym utlenianiu zwi ązków organicznych. Jest to spowodowane reakcjami rodnika hydroksylowego powstaj ącego podczas utleniania jonów Ŝelaza(II) do jonów Ŝelaza(III). Oprócz rodnika •OH w tej reakcji powstaje te Ŝ jon wodorotlenowy: 2+ • - 3+ H2O2 + Fe → OH + OH + Fe (84) Potencjał utleniaj ący rodnika hydroksylowego jest wysoki (2,7mV), st ąd jego efektywne działanie utleniaj ące i szereg reakcji ła ńcuchowych: • • OH + RH → R + H 2O (85) + R• + Fe 3+ → R + Fe 2+ (86) 3+ 2+ + H2O2 + Fe → Fe....OOH + H (87) 2+ • 2+ Fe....OOH → HO 2 + Fe (88) 19 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

• • R + O 2 → ROO (89) • • ROO + R 1H → ROOH + R 1 (90) O wydajno ści reakcji Fentona decyduj ą zarówno st ęŜ enia reagentów i temperatura ale te Ŝ obecno ść innych substancji o wła ściwo ściach utleniaj ąco-redukuj ących. Analogiczne reakcje, ró Ŝni ące si ę szybko ści ą, zachodz ą mi ędzy zwi ązkami Ŝelaza(II) i wodoronadtlenkami organicznymi ROOH, które powstaj ą m. in. w reakcji (90). Podobne zło Ŝone reakcje redoks nadtlenków (rodnikowo-jonowe) zachodz ą z jonami innych metali przej ściowych na ni Ŝszych stopniach utlenienia (np. Cu +, Ti 3+ , Cr 2+ , Co 2+ ), które wyst ępuj ą w roztworach wodnych w formie skompleksowanej:

n+ • - n+1 ROOH + M Lm → RO + OH + M Lm (91) gdzie L oznacza ligand. Nale Ŝy doda ć, Ŝe nadtlenek wodoru powstaje w przyrodzie w katalitycznych reakcjach z tlenem atmosferycznym (92-94), st ąd rodniki nadtlenkowe odgrywaj ą du Ŝą rol ę w •- procesach biologicznych. Produktem po średnim jest anionorodnik ponadtlenkowy (O 2 ) n+ n+1 •- M Lm + O 2 → M Lm + O 2 (92) •- + 2O 2 + 2H → H 2O2 + O 2 (93) n+ •- H+ n+1 M Lm + O 2 M Lm + H 2O2 (94) Odczynnik Fentona stosowany jest w chemii organicznej np. w reakcji utleniania alkoholi lub rodnikowej substytucji zwi ązków aromatycznych (przykładem jest reakcja otrzymywania fenolu z benzenu) [17, 18]. 2+ Fe /H 2O2 C6H6 C6H5OH (95) Podczas reakcji odczynnika Fentona ze zwi ązkami organicznymi wydzielaj ą si ę znaczne ilo ści ciepła. Reakcje utleniania odczynnikiem Fentona wykorzystywane s ą w technologiach oczyszczania ścieków przemysłowych, unieszkodliwiania pestycydów, destabilizacji zu Ŝytych emulsji olejowych, usuwania substancji humusowych z wody, a tak Ŝe jako środek dezynfekuj ący w zastosowaniach medycznych. Mo Ŝliwy jest rozkład substancji odpornych na biodegradację, toksycznych, rakotwórczych, które s ą trudne do usuni ęcia tradycyjnymi metodami. Odczynnik Fentona jest te Ŝ proponowany jako środek przyspieszaj ący fotodegradacj ę odpadów polimerowych.

8. Halogenowanie w ęglowodorów

Halogenowanie np. chlorowanie w ęglowodorów alifatycznych jest metod ą otrzymywania ich chlorowcopochodnych. Reakcja mo Ŝe by ć inicjowana termicznie lub fotochemicznie i jest procesem ła ńcuchowym. W pierwszym etapie zachodzi homolityczny rozkład cz ąsteczki chloru na dwa rodnikowe atomy (reakcja inicjowania, 26), które nast ępnie

20 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki reaguj ą z w ęglowodorem (np. metanem, reakcja 96), a powstaj ące rodniki inicjuj ą kolejne reakcje prowadz ące do nowych rodników (etap propagacji, reakcje 96-103) • • CH 4 + Cl → CH 3 + HCl (96) • • CH 3 + Cl 2 → CH 3Cl + Cl (97) • • CH 3Cl + Cl → CH 2Cl + HCl (98) • • CH 2Cl + Cl 2 → CH 2Cl 2 + Cl (99) • • CH 2Cl 2 + Cl → CHCl 2 + HCl (100) • • CHCl 2 + Cl 2 → CHCl 3 + Cl (101) • • CHCl 3 + Cl → CCl 3 + HCl (102) • • CCl 3 + Cl 2 → CCl 4 + Cl (103) Efektem fotochemicznego chlorowania s ą pochodne metanu o ró Ŝnej ilo ści atomów chloru w cz ąsteczkach. Zako ńczenie tego kinetycznego ła ńcucha reakcji jest spowodowane reakcjami rekombinacji dowolnych rodników, co prowadzi do otrzymywania alkanów i chloropochodnych alkanów (104-106). • • CH3 + Cl → CH 3Cl (104) • • CH 3 + CH 3 → C 2H6 (105) • • CHCl 2 + CHCl 2 → Cl 2HC-CHCl 2 itp. (106) Podobne reakcje chlorowania zachodz ą w zwi ązkach alicyklicznych (równie Ŝ z jodem). Natomiast reakcja fotochemicznego chlorowania benzenu prowadzi do powstania heksachlorocykloheksanu, produktu addycji atomów chloru do pier ścienia aromatycznego (107). Cl Cl

Cl Cl (107)

Cl Cl

9. Reakcje w atmosferze

Promieniowanie słoneczne inicjuje rodnikowe reakcje chemiczne gazowych składników atmosfery [19,20]. Skład atmosfery i energia promieniowania w ró Ŝnych warstwach atmosfery zmienia si ę, a wi ęc zmieniaj ą si ę te Ŝ produkty reakcji fotolizy gazów i ich st ęŜ enia. W stratosferze pod wpływem wysokoenergetycznego promieniowania UVC (100-280 nm) z tlenu powstaje ozon: • O2 + hv → 2 O (108) • O2 + O → O 3 (109)

W skład górnych warstw atmosfery, oprócz tlenu i ozonu wchodz ą CO 2, CO, H 2, NO x, SO 2, węglowodory lekkie i ich pochodne. W troposferze znajduj ą si ę ponadto zwi ązki pochodzenia biologicznego (np. CH 4, CS 2, H 2S, HCl) oraz zanieczyszczenia wynikaj ące z działalno ści człowieka. Mog ą one ulega ć fotolizie lub fotojonizacji daj ąc ró Ŝnorodne produkty, 21 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki stanowi ące reaktywne zanieczyszczenia atmosfery ziemskiej. Energia jonizacji cz ąsteczek jest na ogół wy Ŝsza od energii homolitycznej dysocjacji wi ąza ń chemicznych. Najwa Ŝniejsze reakcje tego typu przedstawiaj ą równania (110-115), z których 3 ostatnie prowadz ą do powstania atomów rodnikowych: + - O2 + hv → O 2 + e (110) NO • + hv → NO + + e - (111) • + - NO 2 + hv → NO 2 + e (112) • • • NO 2 + hv → NO + O (113) • N2 + hv → 2 N (114) • O3 + hv → O 2 + O (115) Zarówno rodnikowe atomy, jonorodniki i atomy, b ądź cz ąsteczki wzbudzone w wyniku absorpcji fotonu reaguj ą z innymi składnikami atmosfery. Reakcje opisuj ące powstawanie i rozkład ozonu w atmosferze nazywane są cyklem Chapmana. Ozon absorbuje promieniowanie ultrafioletowe i stanowi naturaln ą warstw ę ochronn ą dla Ŝycia na Ziemi. Jego st ęŜ enie w atmosferze jest zmienne – zale Ŝy od poło Ŝenia geograficznego, strefy klimatycznej i wprowadzonych przez człowieka zanieczyszcze ń. Nadmierny rozkład ozonu prowadzi do naruszenia równowagi w ekosystemie. Za rozkład ozonu odpowiedzialne s ą halogenow ęglowodory (freony), stosowane dawniej jako ciecze chłodnicze lub gazy w aerozolach. S ą one bardzo trwałe w warunkach ziemskich, jednak po przedostaniu si ę do górnych warstw atmosfery ulegaj ą fotolizie pod wpływem promieniowania UV o du Ŝej energii ( λ ≤ 220nm). Najszybciej p ęka wi ązanie C-Cl lub C-Br: • • CCl 2F2 + hv → Cl + CClF 2 (116) • • CBrF 3 + hv → Br + CF 3 (117) Atom chlorowca (X) atakuje ozon, przyczyniaj ąc si ę do destrukcji warstwy ozonowej:

X + O 3 → XO + O2 (118) • 2XO → 2 X + O 2 (119) Reakcje maj ą charakter ła ńcuchowy i biegn ą tak długo a Ŝ atom X ulegnie dezaktywacji np. w reakcji z metanem: • • X + CH 4 → HX + CH 3 (120)

Inne reakcje zachodz ące w atmosferze ilustruj ą równania (121-128): • • H + O 3 → O 2 + HO (121) • • HO + O → O 2 + H (122) • • HO + O 3 → HO 2 + O 2 (123) • • HO 2 + O 3 → 2 O 2 + HO (124) • NO + O 3 → NO 2 + O 2 (125) • • NO 2 + O → NO + O 2 (126) • • Cl + O 3 → ClO + O 2 (127) • • ClO + O → Cl + O 2 (128) 22 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Rodniki hydroksylowe równie Ŝ odgrywaj ą du Ŝą rol ę w procesach zachodz ących w przyrodzie. Szybko ść ich powstawania zale Ŝy głównie od st ęŜ enia ozonu i wody oraz ci śnienia atmosferycznego Nawet je Ŝeli st ęŜ enie produktów w ww. procesach jest niewielkie, maj ą one du Ŝy wpływ na procesy wtórne z innymi składnikami atmosfery. Źródłem rodników hydroksylowych powstaj ących w reakcji z par ą wodn ą mog ą by ć atomy tlenu w stanie wzbudzonym (O *): * • H2O + O → 2 HO (129) W obecno ści wody, tlenki azotu (II) i (IV) znajdują si ę w równowadze z powstaj ącym kwasem azotowym (III), który absorbuje promieniowanie o długo ściach 310-400 nm i ulega fotolizie: NO + NO 2 + H 2O 2HNO 2 (130) • • HNO 2 → HO + NO (133) Podobnym zakresem absorpcji charakteryzuj ą si ę estry kwasu azotowego (III), które rozkładaj ą si ę na rodniki alkoksylowe i monotlenek azotu: RONO → RO • + NO • (134)

Gazowy HNO 3 i azotany (V) absorbuj ą promieniowanie o długo ści fal < 310 nm, które wywołuje ich rozpad: • • HNO 3 → HO + NO 2 (135) • • RCH 2ONO 2 → RCH 2O + NO 2 (136) • Z kolei reakcja tlenku azotu (IV) z ozonem prowadzi do powstania rodnika NO 3 o stosunkowo długim czasie Ŝycia: • NO 2 + O 3 → NO 3 + O 2 (137) • NO 3 tworzy si ę te Ŝ w reakcji dysproporcjonowania pentatlenku diazotu: • N2O5 → NO 3 + NO 2 (138) • Rodniki NO 3 absorbuj ą promieniowanie widzialne (570-670 nm), pod wpływem którego rozkładaj ą si ę bezpo średnio głównie na NO 2 i O (cz ęś ciowo powstaje te Ŝ NO i O 2). Rodniki • NO 3 bior ą udział w procesach atmosferycznego utleniania aldehydów, alkanów, węglowodorów aromatycznych, a tak Ŝe w analogicznych procesach w hydrosferze. Wolne rodniki z atmosfery uczestnicz ą w reakcjach z zanieczyszczeniami tworz ącymi smog. W du Ŝych miastach lub w obszarach przemysłowych atmosfera zawiera lotne produkty spalania bogate w w ęglowodory i ich pochodne, które s ą mało aktywne, zatem akumuluj ą si ę w środowisku. Ulegaj ą one jednak reakcjom utleniania w obecno ści tlenków azotu i rodników HO •.

RCH 3 + 2NO + 2O 2 → RCHO + 2NO 2 + H 2O (139) O HO + R-C R-C=O + H2O (140) H O (141) R-C=O + O2 R-C-O-O

23 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

O O (142) R-C-O-O + NO2 R-C-O-O-NO2 Gdy R jest podstawnikiem metylowym, w reakcji 142 powstaje azotan peroksyacetalowy, produkt znaleziony w smogu. Ilo ści metanu wyst ępuj ącego w troposferze s ą znacz ące, st ąd produkty jego utleniania mog ą wywiera ć istotny wpływ na otoczenie. Poni Ŝszy schemat (143) ilustruje mechanizm fotochemicznego utleniania metanu w obecno ści tlenków azotu, inicjowany rodnikami hydroksylowymi [19]. Głównym produktem tego cyklu reakcji jest aldehyd mrówkowy (metanal). Tlenki azotu pełni ą rol ę fotokatalizatora. Rozkład ci ęŜ szych w ęglowodorów i ich pochodnych przebiega ze znacznie wi ększ ą szybko ści ą ni Ŝ przedstawione tu utlenianie metanu.

(143) [19]

Rozkład aldehydów (oprócz reakcji 140) mo Ŝe zachodzi ć bezpo średnio pod wpływem promieniowania z zakresu bliskiego nadfioletu. Mechanizm reakcji na przykładzie aldehydu mrówkowego przedstawia schemat (144).

24 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

(144) [19]

Rozkład aldehydu octowego (etanalu) zale Ŝy od energii promieniowania elektromagnetycznego (145). Pod wpływem promieniowania o długo ści fali z zakresu 290- 320 nm powstaj ą głównie rodniki ró Ŝnego typu; bezpo średni rozkład do tlenku w ęgla i metanu wymaga promieniowania krótkofalowego ( λ ≤ 290nm).

(145) [19]

10. Reakcje polimeryzacji

Jedn ą z wa Ŝnych dziedzin przemysłowych, w których wykorzystuje si ę wolne rodniki jest synteza polimerów słu Ŝą cych do otrzymywania powszechnie stosowanych na wielk ą skal ę tworzyw sztucznych. Polimeryzacja addycyjna, podczas której substrat, czyli monomer, ulega wielokrotnej reakcji przył ączania, mo Ŝe wprawdzie przebiega ć nie tylko według mechanizmu rodnikowego ale i jonowego, jednak ten pierwszy sposób jest najcz ęś ciej stosowany w praktyce. Polimeryzacja rodnikowa jest typow ą reakcj ą ła ńcuchow ą składaj ącą si ę z etapu inicjowania, propagacji (wzrostu) i terminacji (zako ńczenia) [12, 21]. Monomerami s ą nienasycone zwi ązki organiczne (np. etylen, styren, chlorek winylu, metakrylan metylu, butadien), a inicjatorami – nietrwałe nadtlenki organiczne, alifatyczne zwi ązki azowe, nadsiarczan amonu lub potasu, a tak Ŝe nadtlenek wodoru. Do inicjowania stosuje si ę te Ŝ układy redoks: odczynnik Fentona, czy nadsiarczan (146) lub mieszanin ę nadsiarczanu z tiosiarczanem (147):

25 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

2- . - S2O8 → 2SO 4 (146)

2- 2- 2- . - . - S2O8 + S 2O3 → SO 4 + SO 4 + S2O3 (147) . - - . SO 4 + H 2O → HSO 4 + OH (148) . Rozpad inicjatora (I) na rodniki (R ) zachodzi najcz ęś ciej pod wpływem ciepła (inicjowanie termiczne) lub pod wpływem promieniowania elektromagnetycznego (inicjowanie fotochemiczne). ∆ lub h ν . I 2R (149) . Po okre ślonym okresie indukcji, R przyłącza si ę do wi ązania podwójnego monomeru (M) tworz ąc nast ępne centrum rodnikowe: . . R + M → R-M (150) Propagacja, czyli wzrost kinetycznego ła ńcucha polimeryzacji, jest to przył ączanie kolejnych cz ąsteczek monomeru do rosn ącego makrorodnika, co prowadzi do powstania makrocz ąsteczek o bardzo du Ŝych masach cz ąsteczkowych: . . R-M + M → R-M-M i.t.d. (151) . . R-(M) n + M → R-(M) n+1 (152) Reakcj ę polimeryzacji hamuje tlen atmosferyczny, który reaguje zarówno z rodnikami inicjuj ącymi jak i makrorodnikami. . . R-(M) n + O 2 → R-(M) n-O-O (153) Terminacja jest procesem prostej rekombinacji dowolnych rodników (154-156) lub dysproporcjonowania makrorodników (157): . 2R → R-R (154) . 2 R-(M) n → R-(M) 2n -R (155) . . R + R-(M) n → R-(M) n-R (156)

2 CH3-(CH2)n-CH2 CH3-(CH2)n-CH3 + CH3-(CH2)n-1-CH=CH2 (157)

Mo Ŝliwa jest te Ŝ reakcja zako ńczenia polimeryzacji rodnikowej wskutek przeniesienia ła ńcucha kinetycznego na cz ąsteczk ę inn ą ni Ŝ monomer, np. rozpuszczalnik (XS): . . 2 R-(M) n + XS → R-(M) n -X + S (158) Wszystkie trzy reakcje: inicjowanie, propagacja i terminacja przebiegaj ą z ró Ŝną szybko ści ą. Przyjmuje si ę, Ŝe w wi ększo ści procesów polimeryzacji rodnikowej, szybko ści 26 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

. inicjowania i terminacji s ą równe, st ąd st ęŜ enie rosn ących rodników R-(M) n jest stałe. Jest to tzw. zało Ŝenie stanu stacjonarnego. Jednak w niektórych przypadkach obserwuje si ę efekt autokatalityczny polegaj ący na znacznym zmniejszeniu szybko ści zako ńczania z powodu wzrostu lepko ści układu. W rezultacie powoduje to przyspieszenie polimeryzacji. W roztworach o du Ŝej lepko ści makrorodniki maj ą ograniczon ą ruchliwo ść , st ąd trudniej rekombinuj ą, podczas gdy małe cz ąsteczki monomeru s ą wci ąŜ mobilne i reaktywne.

Ze wzgl ędu na tworzenie si ę podczas polimeryzacji makrocz ąsteczek o ró Ŝnych długo ściach, opisuj ąc polimer stosujemy średnie ci ęŜ ary cz ąsteczkowe (np. wagowo lub liczbowo średnie: Mw ,Mn ) lub średnie stopnie polimeryzacji (DP). Polimer otrzymany w polimeryzacji rodnikowej charakteryzuje si ę rozrzutem mas cz ąsteczkowych, czyli polidyspersj ą definiowan ą najcz ęś ciej jako Mw / Mn . Polimer przewa Ŝnie ma struktur ę głowa do ogona (159), która jest uprzywilejowana ze wzgl ędu na mo Ŝliwo ść rezonansu niesparowanego elektronu rosn ącego rodnika z podstawnikiem X oraz z powodów sterycznych. Nieco rzadziej powstaje konfiguracja głowa do głowy (160), stanowi ąca defekt strukturalny. H X H X H X X H (159) (160) C-C-C-C C-C-C-C H H H H H H H H Budowa polimeru zale Ŝy od ilo ści grup funkcyjnych tj. wi ąza ń podwójnych w cz ąsteczce monomeru. Jedno wi ązanie podwójne w monomerze prowadzi do powstawania liniowych cz ąsteczek polimeru, chocia Ŝ reakcje przeniesienia ła ńcucha mog ą by ć przyczyn ą powstawania rozgał ęzie ń. Polimeryzacja monomerów wielofunkcyjnych pozwala na uzyskanie polimeru o bardzo du Ŝym stopniu usieciowania, którego wła ściwo ści s ą odmienne od polimeru liniowego. Przykłady wielofunkcyjnych monomerów akrylanowych przedstawiaj ą struktury 161-163 [22].

O O O O O O O O O O O O OOOH O OH O O O O O O O O O O

(161) (162) (163)

Polimer usieciowany tworzy trójwymiarow ą sie ć (164), wskutek czego staje si ę nierozpuszczalny w typowych rozpuszczalnikach. Zachowuje jednak zdolno ść do p ęcznienia 27 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki dzi ęki znacznej obj ęto ści swobodnej. Wskutek sieciowania na ogół wzrasta jego wytrzymało ść mechaniczna i chemiczna, wad ą jest jednak krucho ść .

(164) [23]

Polimeryzacj ę rodnikow ą mo Ŝna prowadzi ć w masie (tj. bez udziału rozpuszczalnika), w roztworze lub emulsji, co szczegółowo opisuj ą podr ęczniki do chemii polimerów [12,21]. Szczególnym rodzajem polimeryzacji rodnikowej jest proces inicjowany fotochemicznie lub radiacyjnie. Fotoinicjowna polimeryzacja (fotopolimeryzacja) jest procesem bardzo szybkim, zachodzi w temperaturze pokojowej i nie wymaga u Ŝycia rozpuszczalników organicznych szkodliwych dla zdrowia i środowiska [24,25]. Fotopolimeryzacja jest stosowana do otrzymywania powłok ochronnych (utwardzania lakierów), produkcji elementów elektronicznych (fotorezysty), w dentystyce (plomby światłoutwardzalne), w medycynie (chirurgia). Wykorzystanie takich procesów w praktyce wymaga właściwego doboru fotoinicjatora oraz odpowiedniego źródła promieniowania. Fotoinicjatory mo Ŝemy podzieli ć na [26]: - α-dysocjuj ące (ang. α-cleavage ) – np. benzoina i jej pochodne, ketony aromatyczne, aminoketony, ketosulfidy; - β-dysocjuj ące ( β-cleavage ) – ketosulfony, chlorowcopochodne acetofenonu (np. trichloro-(4-tert -butylo)acetofenon); - inne, posiadaj ące w cz ąsteczce słabe wi ązania typu C-S, O-O, S-S (np. aromatyczne nadtlenki i nadestry, organiczne sulfoazozwi ązki), zwi ązki metaloorganiczne (tytanoceny); Osobn ą grup ę stanowi ą inicjatory polimerowe. S ą to inicjatory, w których grupa światłoczuła jest przył ączona do ła ńcucha polimeru. W zale Ŝno ści od budowy grupy promienioczułej, wolne rodniki powstaj ą b ądź to w wyniku dysocjacji homolitycznej, b ądź w wyniku przeniesienia atomu wodoru. Istnieje mo Ŝliwo ść stosowania zło Ŝonych (dwu- lub trójskładnikowych) układów inicjuj ących, w skład których wchodz ą substancje absorbuj ące promieniowanie (cz ęsto s ą to barwniki polimetionowe) oraz koinicjatory [27]. Zalet ą takich układów jest absorpcja promieniowania z zakresu widzialnego (o mniejszej energii ni Ŝ UV), a zatem bardziej bezpiecznego dla człowieka.

Radiacyjna polimeryzacja pozwala na otrzymanie Ŝeli o du Ŝym stopniu usieciowania, które znajduj ą wielorakie zastosowania. Polimer po przekroczeniu dawki Ŝelowania tworzy sie ć przestrzenn ą. śel powstaje je Ŝeli średnio jedno wi ązanie poprzeczne przypada na makrocz ąsteczk ę.

28 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Przykładem zastosowania takich sieci polimerowych otrzymywanych metod ą radiacyjn ą mog ą by ć hydro Ŝele na bazie poli(kwasu akrylowego), poli(alkoholu winylu), poliwinylopirolidonu, poli(glikolu etylenowego) lub ich mieszanin z polimerami pochodzenia naturalnego (agar, pektyna, celuloza, skrobia, chityna). Hydro Ŝele otrzymane z wymienionych polimerów, dzi ęki du Ŝej przepuszczalno ści pary wodnej, stanowi ą now ą generacj ę opatrunków na trudnogoj ące si ę rany. Radiacyjnie usieciowane polimery s ą materiałem do produkcji soczewek kontaktowych, czy implantów zastępuj ących naturalne organy, ponadto są te Ŝ stosowane jako matryce do kontrolowanego uwalniania leków. Dodatkowo mo Ŝliwo ść radiacyjnego otrzymywania nanocz ąstek metali (np. srebra) w matrycach ( Ŝelach) polimerowych nadaje im wła ściwo ści bakteriobójcze. Zaletami technik radiacyjnych jest mo Ŝliwo ść przeprowadzenia reakcji niezale Ŝnie od temperatury (nawet w temperaturach poni Ŝej 0°C), brak konieczno ści stosowania rozpuszczalników organicznych i innych substancji (katalizatorów, stabilizatorów) zanieczyszczaj ących produkt ko ńcowy, równoczesna sterylizacja. Twórc ą nowoczesnej technologii produkcji hydro Ŝelowych opatrunków z wykorzystaniem promieniowania wysokoenergetycznego jest prof. Janusz Rosiak z Instytutu Techniki Radiacyjnej Politechniki Łódzkiej [28,29].

W przypadku u Ŝycia do procesu polimeryzacji dwóch (np. A i B) lub trzech ró Ŝnych monomerów otrzymuje si ę kopolimery lub terpolimery. Do najwa Ŝniejszych typów kopolimerów otrzymywanych w procesach rodnikowych mo Ŝna zaliczy ć kopolimery statystyczne o przypadkowej budowie (165) oraz bardziej uporz ądkowane: naprzemienne (166) i blokowe - zbudowane z długich odcinków jednego typu merów (167). Jeszcze inny typ stanowi ą kopolimery szczepione (168), w których ła ńcuch główny zbudowany jest z jednego typu merów (A), a ła ńcuchy boczne zawieraj ą drugi typ merów (168). A-A-B-A-A-B-B-A-B-A-B-B-B-A-A-B-A-A-A (165) A-B-A-B-A-B-A-B- A-B-A-B-A-B-A-B- A-B (166) A-A-A-A-A-B-B-B-B-B-B-B- A-A-A-A-A-A (167) R A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A (168) R-R R-R-R-R Szczepienie jest metod ą modyfikacji powierzchni polimerów. Dzi ęki zaszczepieniu komonomeru zawieraj ącego grupy polarne na polimerze hydrofobowym mo Ŝna zwi ększy ć jego hydrofilowo ść i poprawi ć wła ściwo ści adhezyjne, czy zdolno ść do drukowania. Z kolei szczepienie cz ąsteczkami o du Ŝej hydrofobowo ści pozwala na otrzymanie tworzyw sztucznych (np. włókien, syntetycznego szkła) odpornych na brud, „samoczyszcz ących si ę”. Mechanizm kopolimeryzacji jest analogiczny do mechanizmu homopolimeryzacji. Na przebieg procesu wpływ ma reaktywno ść rosn ących marorodników, o której decyduje głównie ostatni i przedostatni mer. Struktura kopolimerów, determinuj ąca ich wła ściwo ści, zale Ŝy od wielu czynników takich jak: warunki procesu, budowa chemiczna i stosunek 29 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

k AA k BB rA = (169) rB = (170) k AB k BA gdzie r A - stosunek stałej szybko ści rodnika A z monomerem A do stałej szybko ści rodnika A z monomerem B; r b - stosunek stałej szybko ści rodnika B z monomerem B do stałej szybko ści rodnika B z monomerem A. Mo Ŝemy rozwa Ŝać kilka typowych przypadków kopolimeryzacji: - Je Ŝeli r A · rB = 1 skład powstaj ącego kopolimeru jest proporcjonalny do wyj ściowego składu monomerów; - Je Ŝeli r A = r B = 0, powstaj ą kopolimery naprzemienne; - Je Ŝeli r A < 1 i r B < 1 łatwo otrzymujemy kopolimer, który nie zawiera dłu Ŝszych segmentów jednego monomeru; - Je Ŝeli r A > 1 i r B > 1 otrzymuje si ę mieszanin ę homopolimerów; - Je Ŝeli r A > 1 i r B < 1 kopolimer b ędzie wzbogacony w mery typu A.

11. Reakcje degradacji polimerów

Degradacja polimerów mo Ŝe by ć wywołana działaniem ciepła (wysokiej lub zmiennej temperatury), promieniowania elektromagnetycznego, mikroorganizmów, czynników chemicznych, atmosferycznych lub mechanicznych. W przypadku degradacji inicjowanej promieniowaniem nadfioletowym mówimy o fotodegradacji, a w obecno ści tlenu – o fotodegradacji utleniaj ącej [24,30,31]. Procesy degradacyjne polimerów najcz ęś ciej przebiegaj ą wg mechanizmu rodnikowego. Warunkiem reakcji fotochemicznej jest absorpcja kwantu promieniowania i wzbudzenie cz ąsteczki polimeru. hν PH (PH)* P + H (171) hν P-P (P-P)* P + P (172) gdzie PH i P-P oznaczaj ą cz ąsteczki polimeru, a * stan wzbudzony. Makrocz ąsteczka wzbudzona mo Ŝe znajdowa ć si ę w stanie singletowym lub trypletowym, a reakcje wtórne zachodz ą z obu tych stanów. Nawet je Ŝeli polimer nie posiada w swojej strukturze grup chromoforowych (np. polietylen), to i tak ulega powolnej fotodegradacji (fotostarzeniu) wskutek obecno ści absorbuj ących zanieczyszcze ń, RH, (pozostało ści katalizatorów lub innych substancji z procesu polimeryzacji), a tak Ŝe defektów strukturalnych, do których mo Ŝna zaliczy ć struktury głowa-do głowy , grupy karbonylowe czy nadtlenkowe.

hν R-H R + H (173)

R PH (174) P + RH (lub H2) H W obecno ści sensybilizatorów (S) mo Ŝliwy jest proces przeniesienia energii wzbudzenia:

hν S S* (175) S* + PH S + (PH)* 30 ______(176)

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

. Najwa Ŝniejsze reakcje zachodz ące podczas propagacji to reakcje makrorodników (P ) z tlenem atmosferycznym oraz z nowymi makrocz ąsteczkami P 1H:

P + O2 POO (177) P + P H PH + P (178) 1 . 1 Makrorodnik nadtlenkowy (POO ) mo Ŝe reagowa ć z t ą sam ą lub inn ą cz ąsteczk ą polimeru odrywaj ąc od niej atom wodoru: (179) POO + P1H POOH + P1 Grupy wodoronadtlenkowe powstaj ące w tej reakcji charakteryzuj ą si ę mał ą fotostabilno ści ą i pod wpływem nast ępnych kwantów promieniowania szybko ulegaj ą fotolizie: hν POOH PO + OH (180) hν 2 POOH PO + POO + H2O (181) Głównymi reakcjami zachodz ącymi podczas działania promieniowania UV na polimery i tworzywa sztuczne jest p ękanie ła ńcucha głównego, depolimeryzacja, odrywanie atomów wodoru i grup bocznych, tworzenie wi ąza ń nienasyconych, grup funkcyjnych zawieraj ących atomy tlenu (grupy karbonylowe ró Ŝnego typu), powstawanie rozgał ęzie ń bocznych i poprzecznych wi ąza ń sieciuj ących. Te reakcje powoduj ą zmian ę wła ściwo ści fizykochemicznych i u Ŝytkowych polimerów. Przypadkowe p ękanie ła ńcucha głównego powoduje zmniejszanie średnich ci ęŜ arów cz ąsteczkowych polimeru. Depolimeryzacja zachodz ąca na ko ńcach ła ńcucha ma nieznaczny wpływ na ci ęŜ ar cz ąsteczkowy, a zatem i na wła ściwo ści mechaniczne, lecz wydzielanie i kumulowanie monomeru mo Ŝe by ć bardzo niekorzystne ze wzgl ędu na jego toksyczno ść czy rakotwórczo ść (jak w przypadku styrenu, czy chlorku winylu). Reakcje degradacji wolnorodnikowej polimerów komplikuj ą si ę w przypadku zło Ŝonych układów (polimerów modyfikowanych, mieszanin czy kompozytów polimerowych). W układach niemieszalnych, charakteryzuj ących si ę wyst ępowaniem odr ębnych domen, procesy pierwotne prowadz ące do powstania rodników zachodz ą w obu polimerach ale mo Ŝliwe s ą wzajemne oddziaływania mi ędzy produktami reakcji (zarówno rodnikowymi jak i nierodnikowymi) na granicy faz. Poza tym małe aktywne rodniki s ą zdolne do dyfuzji w fazie drugiego polimeru. Powadzi to do powstania bardzo zło Ŝonej mieszaniny produków fotodegradacji. Fotodegradacja polimerów jest zjawiskiem po Ŝą danym w przypadku produkcji degradowalnych tworzyw jednorazowego u Ŝytku, które po zu Ŝyciu rozkładaj ą si ę samorzutnie pod wpływem światła słonecznego. W celu nadania polimerom degradowalno ści lub przyspieszenia ich powolnego procesu fotostarzenia stosuje si ę promotory degradacji – substancje uaktywniaj ące si ę w okre ślonych warunkach (np. na wysypiskach śmieci). Zwykle fotodegradacj ę ł ączy si ę z biodegradacj ą, co wymaga odpowiedniej modyfikacji struktury makrocz ąsteczek.

31 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

12. Reakcje jonorodników

Anionorodniki powstaj ą w wyniku aktywacji termicznej lub fotochemicznej w obecno ści donorów elektronów np. metali alkalicznych, czy solwatowanych elektronów. Reakcje anionorodników s ą zestawione na poni Ŝszym schemacie [7]: 2- (MA)2 dimeryzacja

MA2- + MA dysproporcjonowanie (182) MA - M + A- fragmentacja

XY XY - + MA utlenianie

H+ protonowanie MAH Charakterystyczn ą reakcj ą anionorodników jest te Ŝ podstawienie nukleofilowe rodników, które przez analogi ę do S N1, oznacza si ę S RN 1. Oznaczenie to zostało zaproponowane przez Kornbluma w 1966 r dla zwi ązków alifatycznych, a w 1970 r. przez Bunnetta dla zwi ązków aromatycznych. Jest to reakcja ła ńcuchowa zło Ŝona z etapu inicjowania - powstania anionorodnika (183), który nast ępnie rozkłada si ę na anion i rodnik . R (184) ulegaj ący podstawieniu nukleofilowemu (185). W ko ńcowym etapie zachodzi przeniesienie elektronu (186), a w produktach powstaje zwi ązek z podstawionym Nu (w miejscu X). Rozpuszczalniki o charakterze kwa śnym i wodoro-donorowe hamuj ą S RN 1. . - RX + e- → RX (183) . - . - RX → R + X (184) . - . - R + Nu → RNu (185) . - . - RNu + RX → RNu + RX (186) Sumarycznie proces ten przedstawia reakcja: - - RX + Nu → RNu + X (187) Fragmentacja (184) zachodzi łatwo gdy X jest halogenem. Czynnikiem nukleofilowym (Nu) mo Ŝe by ć np. PhO-, PhS-, czy PhSe-. Aktywno ść aromatycznych chlorowcopochodnych w tej reakcji mo Ŝna uszeregowa ć nast ępuj ąco: ArI > ArBr > ArCl > ArF (188) Reakcje przył ączenia s ą mniej zale Ŝne od przeszkód sterycznych ni Ŝ klasyczne reakcje SN2 i mog ą prowadzi ć do produktów rozgał ęzionych. Zawieraj ący dwa centra nukleofilowe

32 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki anion 2-nitropropanu (jon ambidentny) ulega C-alkillowaniu wg S RN 1 i O-alkillowaniu wg SN1 daj ąc dwa ró Ŝne produkty (189) [7]:

O CH2R C N C NO2 C-alkilowanie O (189) RCH X 2 i/lub O O O-alkilowanie C N C N OCH R O 2 Warunkiem reakcji na obu centrach jest mezomeria układu. .- Przykładem znanego anionorodnika jest O 2 powstaj ący przez redukcj ę tlenu cz ąsteczkowego, zaliczany do aktywnych form tlenu. Jest siln ą zasad ą Brönsteda, a w środowisku aprotycznym - silnym czynnikiem nukleofilowym. Charakteryzuje si ę wła ściwo ściami redukuj ącymi b ądź utleniaj ącymi. W wodzie ulega dysproporcjonowaniu:

.- + 2 O 2 + 2 H → O 2 + H 2O2 (190) .- W środowisku wodnym O 2 jest lepszym utleniaczem ni Ŝ O 2.

Kationorodniki tworz ą si ę wskutek oderwania elektronu z cz ąsteczki oboj ętnej przez czynniki utleniaj ące np. (NH 4)2S2O8, st ęŜ ony kwas siarkowy (VI), kwasy Lewisa (AlCl 3, 3+ 3+ 4+ SbCl 3), jony metali: Mn , Co , Ce pod wpływem promieniowania elektromagnetycznego. Kationorodniki, w których niesparowany elektron jest zlokalizowany na tym samym atomie co ładunek dodatni, s ą bardzo nietrwałe. Je Ŝeli ładunek znajduje si ę na innym atomie ni Ŝ centrum rodnikowe, trwało ść takich kationorodników (191) jest znacznie wi ększa: . + . + CH 2-(CH 2)n-CH 2OH 2, CH 2-(CH 2)n-CH 2NH 3 (191) Obecno ść takich jonów potwierdza spektrometria mas. Znaczny wzrost trwało ści niektórych kationorodników jest wywołany delokalizacj ą elektronów dzi ęki obecno ści pier ścieni aromatycznych. Kationorodniki bior ą udział w licznych reakcjach zwi ązków organicznych (192), w których na ogół s ą produktami przej ściowymi.

33 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

R+-R+ dimeryzacja

R + R2+ dysproporcjonowanie

+ fragmentacja R1 + R2 R + + R3 + reakcja redoks (192) R + R3 H-S RH + + S przeniesienie protonu C=C R+-C-C addycja

Nu- R-Nu podstawienie nukleofilowe

13. Metody badania rodników

Niesparowany spin nadaje cz ąsteczkom wła ściwo ści paramagnetyczne, st ąd mo Ŝliwo ść ich badania za pomoc ą spektroskopii spinowego rezonansu magnetycznego (EPR - Electron Paramagnetic Resonance lub ESR - Electron Spin Resonance ) i spektroskopii elektronowej. EPR jest zjawiskiem absorpcji rezonansowej promieniowania mikrofalowego przez cz ąsteczki paramagnetyczne w obecno ści słabego pola magnetycznego (w porównaniu z silnym polem magnetycznym stosowanym w NMR) [32-35]. Pierwszy udany eksperyment EPR został wykonany przez Ewgenija Zawojskiego w 1944 r. dla hydratu chlorku miedzi(II). Ze wzgl ędu na du Ŝą reaktywno ść i nietrwało ść rodników ich st ęŜ enie w medium reakcyjnym jest małe, st ąd konieczno ść prowadzenia bada ń w szczególnych warunkach (w pró Ŝni, w atmosferze beztlenowej, w niskich temperaturach, w stanie zamro Ŝonym, w obecno ści pułapek spinowych). Moment magnetyczny rodnika, ró Ŝny od zera, mo Ŝe mie ć orientacj ę zgodn ą lub przeciwn ą do pola magnetycznego. Efektem tego jest rozszczepienie poziomów magnetycznych rodnika. Jest to tzw. efekt Zeemana (lub rozszczepienie Zeemana). Ró Ŝnica energii mi ędzy poziomami jest wyra Ŝona zale Ŝno ści ą:

E = h ν = g ·B ·B (193) gdzie g – współczynnik rozszczepienia spektroskopowego (zwany te Ŝ współczynnikiem Landego lub współczynnikiem Ŝyromagnetycznym), B - magneton Bohra (jednostka elektronowego momentu magnetycznego) i B - indukcja pola magnetycznego. Jednostk ą pola magnetycznego w układzie SI jest tesla (T) ale cz ęsto wyra Ŝa si ę j ą w gaussach (Gs). 1 T = 10 4 Gs. Współczynnik g dla swobodnego elektronu przyjmuje warto ść równ ą 2,0023, a w rodnikach zale Ŝy od otoczenia niesparowanych spinów.

34 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Działanie promieniowania mikrofalowego o okre ślonej energii (typowe cz ęstotliwo ści – 10GHz dla pola magnetycznego 3500G) powoduje przeniesienie elektronu z poziomu o ni Ŝszej energii (E 1) na poziom o wy Ŝszej energii (E 2). Istniej ą pewne analogie mi ędzy technik ą NMR, w której bada si ę spiny jąder atomowych i EPR (spiny elektronów). W NMR protony, a w EPR elektrony ulegaj ą uporz ądkowania, a ści ślej ich momenty magnetyczne, zgodnie lub przeciwnie do kierunku pola magnetycznego. EPR jest to metoda jako ściowego i ilo ściowego oznaczania wolnych rodników i innych substancji paramagnetycznych takich jak jony metali d-elektronowych, czy pierwiastki ziem rzadkich. Pozwala na wykrywanie defektów w dielektrykach, materiałach w ęglowych oraz elektronów przewodnictwa w metalach i półprzewodnikach. Jest metod ą bardzo czuł ą, mo Ŝna wykrywa ć rodniki o bardzo małym st ęŜ eniu, nawet rz ędu 10 -8 mol/dm 3. Kształt widma EPR mo Ŝna opisa ć funkcj ą Lorentza lub Gaussa. Szeroko ść linii zale Ŝy od oddziaływa ń z s ąsiaduj ącym otoczeniem i czasów relaksacji. Ze wzgl ędu na małe intensywno ści pasm absorpcyjnych, widmo EPR najcz ęś ciej rejestruje si ę w postaci pierwszej pochodnej (Rysunek 2). Zalet ą takiego sposobu rejestracji widm jest mo Ŝliwo ść rozdzielenia nakładaj ących si ę pików.

Absorpcja

I pochodna

Pole magnetyczne

Rys. 2. Kształt widma absorpcyjnego i pierwszej pochodnej absorpcji. Oddziaływanie atomu zawieraj ącego niesparowany elektron z atomami s ąsiednimi o spinie j ądrowym ró Ŝnym od zera powoduje rozszczepienie sygnału EPR na składowe, co pozwala na identyfikacj ę struktury rodnika. Na rysunku 3 przedstawiono widmo EPR rodnika metylowego: 4 linie o stosunku intensywno ści 1:3:3:1 pochodz ą z rozszczepienia sygnału . przez 3 ekwiwalentne atomy wodoru w rodniku CH 3. W ten sposób powstaje struktura subtelna widma.

35 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Rys. 3. Widmo EPR rodnika metylowego [5]. . Rodnik etylowy C2H5 wykazuje struktur ę nadsubteln ą – jego widmo EPR jest zło Ŝone z 12 linii (Rysunek 4). Dwa atomy H z grupy metylenowej (H α) powoduj ą podział sygnału na 3 linie, a atomy H z grupy metylowej (H β) s ą przyczyn ą dodatkowego podziału ka Ŝdej linii na 4 składowe. W opisie widm EPR podaje si ę warto ści rozszczepienia aHα i aHβ w jednostkach indukcji magnetycznej (Gs).

Rys. 4. Widmo EPR rodnika etylowego [5]. Widmo EPR rodników trifenylometylowych (3) teoretycznie powinno si ę składa ć ze 126 linii (jednak ich detekcja zale Ŝy od zdolno ści rozdzielczej aparatu) [35].

36 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

W przypadku zahamowanej rotacji wi ąza ń chemicznych (spowodowanej zarówno czynnikami strukturalnymi jak i nisk ą temperatur ą), warto ści rozszczepienia a są mniejsze. Obowi ązuje tu analogiczna jak w NMR reguła piramidy (trójk ąt Pascala) wskazuj ąca wzgl ędne intensywno ści rozszczepionych sygnałów (Rysunek 5).

n intensywno ści sygnałów

Rys. 5. Trójk ąt Pascala [5].

Wielko ść sygnału EPR (tj. pole powierzchni pasma absorpcyjnego) jest proporcjonalna do liczby wolnych rodników. Oznaczanie ilo ściowe polega przewa Ŝnie na pomiarach wzgl ędem wzorca, którym najcz ęś ciej jest trwały rodnik DPPH (2). Wykonuj ąc pomiar dla nieznanej próbki i wzorca obliczamy ilo ść wolnych rodników:

Px N x = N wz (194) Pwz gdzie N x – liczba rodników w badanej próbce, N wz – liczba rodników we wzorcu, Px i P wz – pole powierzchni sygnału próbki i wzorca. EPR jest metod ą niskoenergetyczn ą, niedestrukcyjn ą, dzi ęki czemu znajduje zastosowanie w materiałoznawstwie (minerały, defekty strukturalne, pochodzenie skał), chemii (kinetyka reakcji rodnikowych, reakcje katalityczne, zwi ązki metaloorganiczne, reakcje redoks, reakcje polimeryzacji) i fizyce ciała stałego (badanie kryształów kowalencyjnych i jonowych, przewodników, półprzewodników, stanów wzbudzonych), naukach biologicznych i biochemicznych (wolne rodniki w tkankach, reakcje enzymatyczne, fotosynteza, wpływ promieniowania na materiały biologiczne). EPR pozwala równie Ŝ na wykrywanie wolnych rodników w systemach biologicznych in vivo . W przemy śle EPR wykorzystuje si ę m. in. w badaniach wpływu domieszek na wła ściwo ści półprzewodników, badaniu procesów korozji, sieciowania polimerów, degradacji farb i lakierów, analizie Ŝywno ści. EPR znajduje te Ŝ zastosowanie w datowaniu obiektów archeologicznych i dzieł sztuki. Pomiar EPR mo Ŝe polega ć na bezpo średniej detekcji rodników lub ich wykrywania metodami po średnimi: za pomoc ą pułapek spinowych ( spin trapping ), czy te Ŝ przez chemiczn ą modyfikacj ę. W sposób bezpo średni wykrywa si ę rodniki semichinonowe, nitroksydowe i in. a metodami po średnimi np. rodniki ponadtlenkowe, hydroksylowe, alkilowe, NO.

Innymi metodami stosowanymi w badaniach rodników, podobnie jak w badaniach nierodnikowych zwi ązków organicznych, s ą metody spektroskopowe (FTIR, UV-Vis), spektrometria mas, radioliza impulsowa (omówiona w cz ęś ci II) . 37 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Widma absorpcyjne rodników w zakresie UV-Vis cz ęsto wykazuj ą znaczne przesuni ęcie batochromowe (tj. w kierunku dłu Ŝszych fal) oraz wi ększe warto ści molowych współczynników absorpcji ( ε) charakterystycznych pasm w stosunku do ich odpowiedników nierodnikowych [7]. Ph Ph NO NO2 2 Ph N Ph N N NO N NO2 2 H NO ( 195) N O 2 (196) 2 W widmie zwi ązku (195) wyst ępuje pasmo absorpcyjne przy λmax = 319 nm o ε = 15 000, które w widmie rodnika DPPH (196) jest przesuni ęte do λmax = 332 nm ( ε = 19 000), dodatkowo pojawia si ę drugie pasmo przy 530 nm ( ε = 14 000). Roztwór zawieraj ący form ę rodnikow ą DPPH staje si ę barwny.

Literatura

1. C. Walling, Forty Years of Free Radicals, w: Organic free Radicals, W. Pryor, ACS Symposium Series,Washinghton, DC, 1978. 2. L. Stolarczyk, U. Stolarczyk, Wolne rodniki, Omega Wiedza Powszechna, Warszawa 1973. 3. R. M. Acheson, The Discovery of Free Radicals, J. Chem. Educ. , 73, 1996, 32. 4. Radical reactions, rozdział 39 (str.1019-1052) w: J. Clayden, N. Greeves, S. Warren, P. Wothers, Organic Chemistry, Oxford University Press, Oxford, 2001. 5. A. F. Parsons, An Introduction to Free Radical Chemistry, Backwell Science, 2000. 6. N.A. Punchard, F.J. Kelly, Free Radicals. A practical Approach, Oxford University Press, Oxford, 1996. 7. J. Fossey, D. Lefort, J. Sorba, Free Radicals in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1995. 8. D. I. Davies, M. J. Parrott, Free radicals in organic synthesis (seria Reactivity and Structure vol. 7) Springer-Verlag, Berlin, 1978. 9. S. Paszyc, Podstawy fotochemii, PWN, Warszawa, 1992. 10. J. Kroh, Wolne rodniki w chemii radiacyjnej, PWN, Warszawa 1967. 11. A. Kordus, Plazma – właściwo ści i zastosowanie w technice, Wydawnictwo Wiedzy Powszechnej Omega, Warszawa 1985. 12. Chemia polimerów, praca zbiorowa pod red. Z. Florjańczyka, S. Penczka, T.I, Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, 1995. 13. F.W.D.B. Bouo, J.K. Kouame, Y. Tchetche, R.N. Kre, M.L. Mousse, P. Assamoi, Chemosphere , 84, 2011, 1617-1629. 14. G. Bartosz, Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie, PWN, Warszawa, 2008. 15. M.M. Halmann Photodegradation of water pollutants, CRC PressBoca Raton 1996. 16. H.J. Brömme, W. Mörke, E. Peschke, J. Pineal Res. 33, 2002, 239-247. 38 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

17. A Masarawa, S. Rachmilovich-Calis, N. Meyerstein, D. Meyerstein, Coord. Chem. Rev. 249, 2005, 1937-1943. 18. S. Wang, Dyes and Pigment, 76, 2008, 714-720. 19. Z. Stasicka, Procesy fotochemiczne w środowisku, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiello ńskiego, Kraków, 2001. 20. G. Wenska, Fotochemia środowiska, Wydawnictwo Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza, Pozna ń, 1997. 21. M.P. Stevens, Polymer Chemistry. An Introduction, Oxford University Press, N. York 1999. 22. H. Kaczmarek, I. Vukovi ć-Kwiatkowska, eXPRESS Poymer Letters, 6, 2012, 78-94. 23. http://homepages.rpi.edu/~plawsky/Research/Processing.htm 24. Fotochemia Polimerów. Teoria i zastosowanie, praca zbiorowa pod red. J. Pączkowskiego, Wydawnictwo UMK, Toru ń, 2003. 25. Radiation Curing in Polymer Science and Technology, praca zbiorowa, red. J.P. Fouassier, J.F. Rabek, Elsevier Applied Science, Essex, 1993. 26. A. Wrzyszczy ński, Organiczne zwi ązki siarki jako inicjatory i koinicjatory fotopolimeryzacji rodnikowej, Wydawnictwo ATR, Bydgoszcz, 2004. 27. J. Kabatc, Mono- i wielokationowe barwniki polimetinowe jako sensybilizatory w dwu- i trójskładnikowych układach fotoinicjuj ących polimeryzacj ę wolnorodnikow ą oraz sondy spektroskopowe, Wydawnictwo UTP, Bydgoszcz, 2012. 28. N.P. Bartoszek, P. Ula ński, J. M. Rosiak, International Journal of Chemical Kinetics 43, 2011, 474–481. 29. A. Henke, S. Kadłubowski, M. Wolszczak, P. Ula ński, V. Boyko, T. Schmidt, A. Karl- Friedrich, J. M. Rosiak, Macromol. Chem. Phys., 212(23), 2011, 2529-2540. 30. J. F. Rabek, Photodegradation of Polymers. Physical Characteristics and Applications Springer, Berlin,1996. 31. H Kaczmarek, Efekty przyspieszania fotochemicznego rozkładu polimerów przez substancje mało- i wielkocz ąsteczkowe, Wydawnictwo UMK, Toru ń, 1998. 32. D. J. E. Ingram, Free radicals as studied by electron spin resonance, Butterworths Scientific Publications, London, 1958. 33. P-O. Kinell, B. Ranby, ESR Applications to Polymer Research, John Wiley & Sons, Chichester, 1973. 34. W. Przygocki, Metody fizyczne badania polimerów, PWN, Warszawa, 1990. 35. C. Walling, Free Radicals in Solution, John Wiley & Sons, London, 1957.

39 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Alina Sionkowska

CZ ĘŚĆ II. WOLNE RODNIKI W BIOLOGII I MEDYCYNIE

14. Źródła wolnych rodników w organizmach Ŝywych i stres oksydacyjny

Wolny rodnik to indywiduum, które ma na zewn ętrznej powłoce elektronowej jeden niesparowany, bardzo aktywny chemicznie elektron. Wolny rodnik z łatwo ści ą utlenia białka, kwasy nukleinowe i lipidy błon komórkowych. W śród wolnych rodników dominuj ą rodniki tlenowe: H 2O2, OH ˙, O 2˙¯ i inne. Powstaj ą one nieustannie w mitochondriach jako produkt odpadowy pozyskiwania energii w szlaku fosforylacji oksydacyjnej. Cz ęsto nazywane s ą reaktywnymi formami tlenu, w skrócie RTF (nazwa angielska: reactive oxygen species ROS ). Reakcja przył ączania wodoru do tlenu w warunkach normalnych przebiega w ten sposób, Ŝe 2 atomy wodoru przenoszone s ą z NADH 2 na O 2 i powstaje H 2O2, czyli woda utleniona. Jest ona szybko neutralizowana przez dysmutaz ę nadtlenkow ą (enzym, który w mitochondriach jest obsługiwany przez mangan, a w cytoplazmie przez cynk lub mied ź):

2 H 2O2 → 2 H 2O + O 2 (1) Jednak niewielka cz ęść wody utlenionej, zanim zostanie rozło Ŝona, mo Ŝe zd ąŜ yć zareagowa ć z jak ąś cz ąsteczk ą i utleni ć j ą, b ądź te Ŝ przej ść w jak ąś inn ą posta ć rodnika tlenowego. Wolne rodniki powstaj ą w organizmie w wielu naturalnych reakcjach chemicznych, s ą zatem integraln ą cz ęś ci ą Ŝycia. Jednym z miejsc, gdzie s ą one generowane celowo w organizmie jest ognisko zapalne, w którym s ą wytwarzane w du Ŝych ilo ściach przez leukocyty w celu niszczenia drobnoustrojów. Nie mo Ŝna wi ęc powiedzie ć, Ŝe działanie wolnych rodników jest tylko i wył ącznie złe [1]. Jednak nadmiar wolnych rodników jest niewskazany, zatem powinny by ć one dezaktywowane w organizmach Ŝywych. Dezaktywowanie wolnego rodnika jest wi ęc nadrz ędnym zadaniem komórki. Mo Ŝe ono zaj ść na dwa sposoby: poprzez dodanie brakuj ącego elektronu (redukcja) albo zabranie nadaktywnego elektronu (utlenianie). Wiele rodników tlenowych powstaje w wyniku naturalnie zachodz ących procesów metabolicznych w organizmach Ŝywych, takich jak oddychanie tlenowe oraz procesy zapalne [1]. Wolne rodniki oddziałuj ą na komórki sygnalizuj ące lub cz ąsteczki przeka źnikowe, co sprawia, Ŝe odgrywaj ą istotn ą rol ę w prawidłowym funkcjonowaniu komórki. Uczestnicz ą w wielu procesach, m.in. w skurczach mi ęś ni, wydzielaniu hormonów, w funkcjonowaniu układu obronnego, regulacji napi ęcia naczyniowego. Warunkuj ą aktywno ść bakteriobójcz ą i bakteriostatyczn ą śliny, a tak Ŝe bior ą udział w usuwaniu leków z ustroju. Działanie destrukcyjne zaczyna si ę dopiero wtedy, kiedy rodniki s ą wytworzone w nadmiarze. Tlenowe zwi ązki reaktywne s ą wytwarzane w mitochondrialnym ła ńcuchu oddechowym przez oksydaz ę NADPH, dysmutaz ę ponadtlenkowa, oksydazy flawoprotein. Reaktywne formy tlenu doprowadzaj ą do zniszczenia kwasów nukleinowych i białek w komórce [1, 2]. W układzie oddechowym istniej ą układy odpowiedzialne za przenoszenie elektronów. Nazywane s ą one kompleksami ła ńcucha oddechowego. Kompleksy ła ńcucha oddechowego (I, III i IV) przenosz ą parzyst ą ilo ść atomów wodoru lub elektronów na tlen (reakcje dwuelektronowe). Te kompleksy to: I – dehydrogenaza NADH, III – kompleks cytochromów 40 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki bc1, IV – oksydaza cytochromowa c [1,3]. Mimo to część z nich opuszcza ła ńcuch oddechowy redukuj ąc tlen na drodze procesu jednoelektrodowego prowadząc do wytworzenia wolnych rodników tlenowych [1,4]. Głównymi kompleksami odpowiedzialnymi za „przeciekanie” elektronów s ą kompleks I oraz ubichinon. Przył ączenie elektronu do cz ąsteczki tlenu przekształca t ę cz ąsteczk ę w anionorodnik ponadtlenkowy, główny przedstawiciel wolnych rodników w organizmie. Przyłączenie drugiego elektronu przyczynia si ę do powstania nadtlenku wodoru, najwa Ŝniejszego prekursora wolnych rodników. Z kolei doł ączenie trzeciego elektronu wytwarza toksyczny rodnik hydroksylowy, natomiast przył ączenie nast ępnego elektronu generuje cz ąsteczk ę wody, czyli zwi ązku niereaktywnego wobec składników komórki. Wytworzony rodnik hydroksylowy wywiera destrukcyjny wpływ na komórk ę, poniewa Ŝ niezb ędne mu elektrony zdobywa ze zwi ązków w niej wyst ępuj ących. W tabeli 1 przedstawiono tlenowe zwi ązki reaktywne i ich prekursory.

Tabela 1. Tlenowe zwi ązki reaktywne i ich prekursory [1,3,5] Rodniki Prekursory wolnych rodników Rodnik hydroksylowy OH . Nadtlenoazotyn ONOO -

- Anionorodnik ponadtlenkowy O 2˙ Kwas chlorowy I (in. kwas podchlorawy) HOCl .- Nadtlenek wodoru H O Rodnik wodoronadtlenkowy HO 2 2 2

. 1 Rodnik alkoksylowy RO Tlen singletowy O2

. Rodnik nadtlenkowy ROO Ozon O 3

Endogennymi źródłami wolnych rodników s ą tak Ŝe komórki śródbłonka naczy ń płuc. Dodatkowym źródłem s ą granulocyty kwasochłonne i oboj ętnochłonne, monocyty oraz makrofagi. Wiele rodników tworzy si ę w reakcjach biologicznych, np. w metabolizmie ksenobiotyków jako czynnik naturalnych procesów detoksykacyjnych w ustroju [5]. Wiele czynników zewn ętrznych (egzogennych) mo Ŝe spowodowa ć przyspieszenie ich powstawania w nadmiarze, np. nieprawidłowa dieta, palenie tytoniu i spo Ŝywanie alkoholu. Wzmo Ŝone tempo oddychania podczas wysiłku fizycznego, zanieczyszczenia środowiskowe i przemysłowe, działanie promieniowania jonizuj ącego stanowi dodatkowe źródło wytwarzania znacznej ilo ści wolnych rodników. Pod wpływem działania promieniowania elektromagnetycznego mog ą zaj ść procesy fotobiologiczne i fotoutlenianie. Wi ększo ść komórek w organizmach Ŝywych nie jest jednak zbyt czuła na działanie światła. Wyj ątkiem s ą barwne komórki skóry oraz czopki i pr ęciki w oku, a tak Ŝe komórki odpowiedzialne za fotosyntez ę w ro ślinach i niektórych bakteriach. Jednak obecno ść fotosensybilizatorów, zarówno egzogennych jak i endogennych mo Ŝe indukowa ć zmiany, które mog ą doprowadzi ć do śmierci komórki. Mo Ŝna wymieni ć kilka czynników, które determinuj ą rozmiar uszkodze ń spowodowanych obecno ści ą fotosensybilizatorów: 41 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

a) Łatwo ść wzbudzenia sensybilizatora światłem o ró Ŝnej długo ści fali b) Dost ęp sensybilizatora do komórki c) Wa Ŝno ść uszkodzonego składnika komórkowego dla całej tkanki. Informacje na temat pierwszego z czynników s ą ogólnie znane, ale zarówno zmiany środowiskowe jak i pH, czy te Ŝ polarno ść środowiska mog ą wpływa ć na zachowanie si ę fotosensybilizatorów. Fotosensybilizacja w obecno ści tlenu mo Ŝe by ć podzielona na dwie grupy zale Ŝnie od mechanizmu: pierwszy mechanizm z udziałem tlenu singletowego, oraz drugi mechanizm wolnorodnikowy. Powstaj ące rodniki mog ą by ć oboj ętne, jak równie Ŝ obdarzone ładunkiem. Zale Ŝnie od potencjału redukcyjnego mog ą mie ć wła ściwo ści utleniaj ące lub redukuj ące. W obecno ści sensybilizatorów mo Ŝe równie Ŝ powstawa ć tlen singletowy. Cz ąsteczka tlenu w stanie podstawowym posiada multipletowo ść spinu 3, czyli jest w stanie trypletowym ( 3Σg-). Dwa najni Ŝsze stany wzbudzone tlenu w fazie gazowej to stany singletowe ( 1∆g i 1Σg+). Tlen singletowy mo Ŝe by ć produkowany na drodze rozkładu nadtlenków albo przeniesienia energii. W układach biologicznych najcz ęś ciej powstaje na skutek przeniesienia energii ze wzbudzonej cz ąsteczki sensybilizatora (sens*) do cz ąsteczki tlenu w stanie podstawowym. Niski poziom energetyczny tlenu singletowego O 2(1∆g) (E = 0.98 eV lub 94.5 kJmol -1) oznacza, Ŝe wiele sensybilizatorów posiada wystarczaj ąco wysok ą energi ę w stanie singletowym i trypletowym aby doprowadzić O 2(3Σg-) do stanu wzbudzonego. To oznacza, Ŝe wydajno ść kwantowa powstawania O 2(1∆g) mo Ŝe by ć nawet 2 [6,7]. 1 3 − 3 1 sens* +O 2 ( Σg )→ sens* +O 2 ( ∆g) (2) 3 3 − 1 1 sens* +O 2 ( Σg )→ sens + O2 ( ∆g) (3) Czas Ŝycia stanu singletowego musi by ć wystarczaj ąco długi oraz ró Ŝnica energii pomi ędzy stanen trypletowym i singletowym ( ∆E(S 1-T1)) i E(T 1) musi by ć wy Ŝsza ni Ŝ E(O 2(1∆g)). Dlatego te Ŝ produkcja O 2(1∆g) zachodzi głownie ze stanu trypletowego, gdy Ŝ zwykle ∆E(S 1- 1 T1) jest zbyt mała i czas Ŝycia stanu singletowego jest zbyt krótki. O 2( ∆g) mo Ŝe reagowa ć z wieloma składnikami komórkowymi prowadz ąc do utleniania, ale ze wzgl ędu na krótki czas 3 Ŝycia, je śli reakcja nie zd ąŜ y zaj ść , zanika do stanu podstawowego ( Σg-) albo przez procesy nieradiacyjne albo na drodze emisji światła w regionie 1270 nm (efekt luminescencji). Przy udziale sensybilizatorów mog ą równie Ŝ powstawa ć nadtlenki. Anionorodnik .- ponadtlenkowy (O 2 ) produkowany jest na drodze przeniesienia elektronu. Jest on produktem jednoelektrodowej redukcji tlenu: .+ .- D* + O 2 → D + O 2 (4) gdzie: D* - sensybilizator w stanie singletowym lub trypletowym, Sensybilizator w stanie trypletowym mo Ŝe by ć produkowany na drodze radiolitycznej, fotochemicznie, elektrochemicznie, enzymatycznie (np. oksydazy) oraz w wyniku reakcji z nadtlenkami. W układach biologicznych wzbudzony sensybilizator powstaje z komórek fagocytowych (makrofagi, neutrofile, monocyty) i pomaga im w inaktywacji ciał obcych, takich jak wirusy czy bakterie. Prowadzi to do wzrostu konsumpcji tlenu i redukcji tlenu do 42 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki nadtlenków. Reakcje tego typu s ą katalizowane przez NADPH (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy), przedstawiony na rys.1.

Rys. 1. Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy

+ + .- .NADPH + 2O 2 → NADP + H + O 2 (5) Nadtlenki i anionorodniki ponadtlenkowe mog ą by ć generowane przez mitochondria czy chloroplasty w wyniku przenoszenia elektronów. Głównie zachodzi proces autoutleniania ró Ŝnych biocz ąsteczek, takich jak zredukowana forma cytochromu C czy hemoglobiny. Powstały nadtlenek mo Ŝe reagowa ć z innymi cz ąsteczkami działaj ąc jako czynnik propaguj ący reakcje rodnikowe. W roztworach wodnych i innych polarnych rozpuszczalnikach aniono rodnik nadtlenkowy nie jest zbyt aktywny ze wzgl ędu na jego ujemny ładunek i wysok ą energi ę solwatacji. Jest on . jednak zdysocjowan ą form ą rodnika wodoronadtlenkowego (HO 2 ), który jest słabym kwasem. W warunkach fizjologicznych tylko niewielka ilo ść nadtlenków jest reaktywna. Na . przykład HO 2 mo Ŝe inicjowa ć reakcj ę utleniania polinienasyconych kwasów tłuszczowych

.- . (polyunsaturated fatty acids - PUFA), natomiast nie mo Ŝe dokona ć tego O 2 . .- W roztworach wodnych HO 2 i O 2 mog ą ze sob ą reagowa ć prowadz ąc w ten sposób do powstawania innych rodników, np. bardzo reaktywnych rodników hydroksylowych: . 2HO 2 → H2O2 + O 2 (6) . .- + HO 2 + O 2 + H → H2O2 + O 2 (7) .- + 2O 2 + 2H → H2O2 + O 2 (8) .- . - O2 + H 2O2 → O2 + OH + OH (9)

43 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Wyró Ŝnia si ę dwa mechanizmy fotosensybilizowanego utleniania. Pierwszy mechanizm (typ I) polega na zaanga Ŝowaniu rodników, drugi za ś (typ II) polega na reakcjach z tlenem singletowym. Schematycznie przedstawia te mechanizmy rysunek 2. Mechanizm typu I zachodzi poprzez transfer atomu wodoru z substratu (RH) do stanu trypletowego sensybilizatora ( 3sens*), co prowadzi do powstawania rodnika na atomie węgla . (R ). Taki rodnik na atomie w ęgla mo Ŝe reagowa ć z tlenem prowadz ąc do powstania rodnika . . nadtlenkowego (RO 2 ). Rodniki RO 2 atakuj ą inne cz ąsteczki generuj ąc wi ęcej rodników zlokalizowanych na atomach w ęgla propaguj ąc w ten sposób utlenianie. Jako reakcja uboczna mo Ŝe by ć te Ŝ generowany tlen singletowy. Produktami reakcji przebiegaj ącymi według tego mechanizmu s ą: alkohole, ketony, epoksydy, wodoronadtlenki. W mechanizmie typu II tlen singletowy jest generowany poprzez transfer z 3sens* do stanu podstawowego cz ąsteczki tlenu. W ten sposób tlen singletowy mo Ŝe utlenia ć szereg zwi ązków, np. lipidy, białka, DNA [8]. Najwa Ŝniejszym stałym źródłem wolnych rodników w organizmie jest spalanie wodoru z tlenem. Z ka Ŝdego litra tlenu, który zu Ŝywamy do spalania, 2% ulega niepełnemu spaleniu do wolnego rodnika tlenowego. Drugim wa Ŝnym źródłem wolnych rodników s ą ró Ŝne procesy detoksykacji zachodz ące głównie w w ątrobie, w szczególno ści rozkładanie leków i toksyn. Proces tworzenia wolnych rodników w organizmie jest wi ęc stały i do ść intensywny, wymaga wi ęc ci ągłego ich usuwania. W warunkach prawidłowych istnieje równowaga pomi ędzy powstawaniem wolnych rodników a ich usuwaniem (wymiataniem). Wzrost wytwarzania wolnych rodników, zmniejszenie ilo ści zmiataczy, zmniejszenie aktywno ści systemów enzymatycznych odpowiedzialnych za ich usuwanie i spadek aktywno ści antyoksydacyjnej powoduje, Ŝe nie s ą one skutecznie usuwane przez mechanizmy obronne organizmu. Dochodzi do zachwiania równowagi w kierunku reakcji utleniania, co okre śla si ę mianem stresu oksydacyjnego. Narz ądami szczególnie nara Ŝonymi na stres oksydacyjny s ą: układ oddechowy, układ kr ąŜ enia, mózg i narz ąd wzroku. Do ochrony przed działaniem wolnych rodników organizm wykorzystuje cały szereg mechanizmów stanowiących ochron ę antyoksydacyjn ą organizmu. Mo Ŝna w niej wyró Ŝni ć kilka elementów: - Enzymy antyoksydacyjne: wykorzystywane do usuwania wolnych rodników tlenowych (dysmutaza nadtlenkowa, katalaza oraz peroksydaza glutationowa). - Minerały niezb ędne do pracy powy Ŝszych enzymów: np. dysmutaza nadtlenkowa wymaga cynku, miedzi, manganu, katalaza wymaga Ŝelaza, a peroksydaza glutationowa wymaga selenu. - Naturalne substancje antyoksydacyjne najcz ęś ciej dostarczane s ą z po Ŝywieniem. Mog ą by ć one jednokrotnego u Ŝytku, b ądź te Ŝ organizm mo Ŝe mie ć zdolno ść regeneracji ich postaci zredukowanych. Mo Ŝna w śród nich wyró Ŝni ć: witaminy, koenzym Q10, glutation, kwas alfa- liponowy i inne pochodne tiolowe, oraz najró Ŝnorodniejsze flawonoidy ro ślinne.

44 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

RH O2 R

R ROO ROOH (H ) sens RH TYPE I

hν sens 1sens* ISC 3sens*

O2 sens TYPE II

1 O2 ROOH

RH Rys. 2. Schemat fotosensybilizowanego utleniania: typ I i typ II inicjowania

15. Reakcje rodnikowe w aminokwasach

Wszystkie białka w organizmach Ŝywych s ą zbudowane z aminokwasów. Ogólny wzór aminokwasu przedstawia rysunek 3. W białkach wyst ępuje ponad 20 aminokwasów, które pełni ą ró Ŝne funkcje w organizmie.

Rys. 3. Wzór ogólny aminokwasu. R- grupa boczna, -COOH- grupa kwasowa, NH 2- grupa aminowa

Wolne rodniki i tlen singletowy mog ą atakowa ć aminokwasy i prowadzi ć do utleniania aminokwasów siarkowych, aromatycznycb oraz do powstawania grup karbonylowych. Niektóre aminokwasy mog ą równie Ŝ reagowa ć na drodze fotochemicznej z polinukleotydami prowadz ąc w ten sposób do tworzenia wi ąza ń sieciuj ących pomi ędzy białkami i DNA [5,9]. Kierunek i szybko ść reakcji rodników hydroksylowych z aminokwasami zale Ŝy głównie od budowy aminokwasu (tj. rodzaju, ilo ści i poło Ŝenia grup funkcyjnych w ła ńcuchu bocznym) oraz pH środowiska wodnego.

45 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

. Główne kierunki reakcji rodnika OH z aminokwasami to: - odrywanie atomu wodoru od w ęgla α oraz wodorów z grup funkcyjnych w ła ńcuchu bocznym (np. -SH), - przył ączanie do układów p - lub s - elektronowych grup funkcyjnych. W przypadku aminokwasów alifatycznych, pierwszy kierunek reakcji dominuje w warunkach + . pH < pK a(NH 3 ). Rodnik OH reaguje tutaj głównie przez oderwanie atomu wodoru z ła ńcucha bocznego [9].

. + . + OH + R-CH(COO - )NH 3 → R(-H) – CH(COO-)NH 3 + H 2O (10)

Reakcje te zachodz ą ze stosunkowo niewielkimi szybko ściami. Głównymi produktami . cz ąsteczkowymi reakcji rodnika OH z aminokwasami alifatycznymi w pH zbli Ŝonym do oboj ętnego s ą: amoniak, kwasy karboksylowe i ketokwasy. W niewielkich ilo ściach jest obserwowane równie Ŝ powstawanie dwutlenku w ęgla. Za zachodz ącą pod wpływem . rodników OH deaminacj ę odpowiedzialna jest reakcja dysproporcjonowania:

. + + - + - 2 R(-H) – CH(COO-)NH 3 H2N=CR-COO + H3N-CHR-COO (11) i nast ępuj ąca po niej hydroliza powstałego kwasu α-iminokarboksylowego:

- - H2N=CR-COO + H 2O NH 3 + O=CR-COO (12)

W przypadku aminokwasów czynnych optycznie reakcji dysproporcjonowania towarzyszy racemizacja układu. Jeszcze łatwiejszy jest proces deaminacji w przypadku aminokwasów . zawieraj ących grup ę OH w pozycji β do grupy aminowej. Proces ten zachodzi zgodnie z ogólnym równaniem:

- + - + R – C(OH) – CH(COO )NH 3 R- CO- CH – COO + NH 3 + H (13)

+ Dla pH > pKa(NH 3 ) dla ataku rodnika elektrofilowego dost ępna staje si ę wolna para elektronowa zlokalizowana na azocie grupy aminowej, st ąd wzrost pH powoduje wyra źne . zwi ększenie stałej szybko ści reakcji rodnika OH z aminokwasami. Zwi ększenie wydajno ści dekarboksylacji wraz ze wzrostem pH nie jest obserwowane w aminokwasach alifatycznych, w których grupa karboksylowa i aminowa znajduj ą si ę przy ró Ŝnych atomach w ęgla ( β-alanina, kwasy 3 - i 4 - aminobutylowe). Mechanizm procesu dekarboksylacji zakłada powstawanie adduktu (14), w wyniku ataku rodnika hydroksylowego na woln ą par ę elektronow ą azotu:

46 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

(14) który nast ępnie ulega dekarboksylacji:

(15) Powstaj ące w tej reakcji rodniki α-aminoalkilowe s ą stabilizowane rezonansowo poprzez oddziaływanie z woln ą par ą elektronow ą azotu. Wykazana została tak Ŝe mo Ŝliwo ść , konkurencyjnego do addycji, odrywania atomu wodoru od deprotonowanej grupy aminowej prowadz ąca do powstania rodnika aminylowego:

(16)

Powstaj ące w wyniku tej reakcji rodniki aminylowe najprawdopodobniej zanikaj ą w reakcji mi ędzycz ąsteczkowego przeniesienia protonu, której produktem s ą rodniki z miejscem rodnikowym ulokowanym na jednym z w ęgli w ła ńcuchu alifatycznym aminokwasu. Dalszym etapem reakcji mo Ŝe by ć dekarboksylacja. W wyniku reakcji tlenu singletowego i rodników hydroksylowych mog ą powstawa ć rodniki alkoksylowe. Rodniki alkoksylowe tworz ące si ę przy atomie w ęgla C-3 w alaninie mog ą prowadzi ć do powstania rodnika na w ęglu -α- prowadz ąc do rozerwania ła ńcucha. Je śli R=H wówczas mo Ŝe uwalnia ć si ę formaldehyd (znany jako genotoksyna u zwierz ąt, czynnik kancerogenny).

(17) W wyniku reakcji utleniania leucyny i rozerwania łańcucha z rodnikiem alkoksylowym w pozycji β (β −scission ) powstaje aceton.

47 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

(18)

W aminokwasach aromatycznych (fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan, histydyna) . dominuj ącym kierunkiem reakcji jest przył ączanie rodnika OH do pier ścieni aromatycznych. Są to reakcje bardzo szybkie (z reguły stałe szybko ści s ą o dwa rz ędy wy Ŝsze od stałych szybko ści w aminokwasach alifatycznych) gdy Ŝ powstaj ące addukty OH, o charakterze rodnikowym, s ą stabilizowane przez oddziaływania rezonansowe układu aromatycznego [9,10,11]. Schematy reakcji aminokwasów aromatycznych i powstaj ące produkty reakcji rodnikowych przedstawiono na rysunkach 4-8. W wyniku fotoutleniania fenyloalaniny powstaje tyrozyna, a w wyniku utleniania tyrozyny powstaje dihydroksyfenyloalanina lub dityrozyna.

meta -tyrozyna lub orto -tyrozyna fenyloalamina

Rys.4. Reakcja zachodz ąca w fenyloalaninie z udziałem tlenu singletowego

3,4- dihydroksyfenyloalanina Tyrozyna

di-tyrozyna

Rys .5. Reakcje zachodz ące w tyrozynie z udziałem tlenu singletowego 48 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

histydyna 2-oxo-histydyna

Rys. 6. Reakcja utleniania rodnikowego histydyny

O O CH2-CH-C O O C NH C CH2-CH-C hν, Ο2 C C-H NH N H N H H tryptofan OH O O O O C CH2-CH-C hν C CH2-CH-C NH NH OH C-H - OH C N N H

O O O O C CH2-CH-C OH C CH2-CH-C NH NH hν N C-H N C-H - CO O-H H O N-formylokynureina

O O C CH2-CH-C NH NH2 kynureina Rys. 7. Reakcje fotochemiczne tryptofanu [11]

49 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

NH O NH O CH2-CH-C CH2-CH-C C 1 C O Ο2 hν C H C O N N H H H

NH O NH O CH -CH-C 2 CH2-CH-C C hν O hν C O C O -CO N H N H H H N-formylokynureina kynureina

Rys.8. Reakcje tryptofanu z tlenem singletowym [11]

. Głównym kierunkiem reakcji rodnika OH z aminokwasami zawieraj ącymi atom siarki jest addycja rodnika do układu elektronów p - siarki tioeterowej i tworzenie rodnika hydroksysulfuranylowego. Sposób rozpadu tego rodnika silnie zale Ŝy od pH środowiska, + które decyduje o formie jonowej pozostałych grup funkcyjnych aminokwasu (NH 2/NH 3 , COO -/COOH), a w konsekwencji o ich roli w przemianach rodnikowych. W zakresie niskiego pH, pH < pK a(COOH), rodnik hydroksysulfuranylowy eliminuje wod ę z udziałem . protonów środowiska daj ąc monomeryczny kationorodnik >S +, który jest stabilizowany przez addycj ę do nieutlenionej grupy tioeterowej drugiej cz ąsteczki aminokwasu tworz ąc kationorodnik dimerowy z mi ędzycz ąsteczkowym wi ązaniem trójelektronowym. Kationorodnik dimerowy jest do ść stabilny (czas Ŝycia rz ędu s) i zanika poprzez deprotonacj ę, daj ąc rodniki α-(alkilotio)alkilowe [12]. Z kolei, w miar ę podwy Ŝszania pH, pH > pKa(COOH) rodnik hydroksysulfuranylowy mo Ŝe eliminowa ć wod ę w procesie wewn ątrzcz ąsteczkowym z udziałem protonu z protonowanej grupy aminowej. W konsekwencji, w przypadku metioniny nast ępuje szybkie zamkni ęcie pi ęcioczłonowego pier ścienia prowadz ące do powstania kationorodnika z wewn ątrzcz ąsteczkowym wi ązaniem trójelektronowym S ∴N:

(19) 50 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Sił ą nap ędow ą tego procesu jest stabilno ść wi ązania S ∴N oraz powstawanie uprzywilejowanego przestrzennie pier ścienia pi ęcioczłonowego. Indywiduum to zanika w rezultacie przeniesienia elektronu z grupy karboksylowej do azotu, prowadz ącego do utlenienia grupy karboksylowej i dekarboksylacji.

(20)

Z kolei, sił ą nap ędow ą procesu dekarboksylacji (20) jest powstawanie stabilizowanych rezonansowo, poprzez oddziaływanie z woln ą par ą elektronow ą azotu, rodników α- aminoalkilowych Proces dekarboksylacji zachodzi efektywnie wtedy, gdy grupa karboksylowa aminokwasu jest deprotonowana, pH > pK a(COOH). Pozwala to na przedstawienie drugiego, alternatywnego mechanizmu utleniania metioniny, zakładaj ącego bezpo średni udział zjonizowanej grupy karboksylowej w dehydratacji rodnika hydroksysulfuranylowego. Postuluje si ę zachodz ącą na atomie siarki reakcj ę podstawienia anionu hydroksylowego (OH -) przez -COO - (w procesie mi ędzy lub wewn ątrzcz ąsteczkowym) [12].

(21)

. Ogólny schemat reakcji rodników OH z aminokwasami zawieraj ącymi atom siarki przedstawia rysunek 9.

51 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

. OH R2S . . R2S R 2S(OH) (R 2S) 2(OH) (1) (2) (3)

-H2O

+ -H R2S . .+ - .+ - R2S(- H) R2S + OH (R 2S) 2 + OH

Rys. 9. Ogólny mechanizm utleniania alkilowych związków zawieraj ących atom siarki: (1) zwi ązek zawieraj ący atom siarki; (2) powstawanie rodnika hydroksysulfuranylowego; (3) tworzenie kompleksu z inn ą cz ąsteczk ą tioeteru.

16. Reakcje rodnikowe w białkach

Białka ze wzgl ędu na ich du Ŝe wyst ępowanie w układach biologicznych s ą głównym celem ataku głównych utleniaczy. Dane kinetyczne wskazuj ą, Ŝe stałe szybko ści podstawowych utleniaczy z białkami s ą bardzo du Ŝe. Utlenianie zachodzi zarówno w szkielecie ła ńcucha głównego białka jak równie Ŝ w ła ńcuchach bocznych. Przebieg reakcji utleniania zale Ŝy od wielu czynników. Niektóre utleniacze uszkadzaj ą tylko wybrane miejsca w cz ąsteczce, podczas gdy inne jak np. rodniki hydroksylowe prowadz ą do wielu niespecyficznych reakcji utleniania. W wyniku reakcji utleniania powstaj ą nadtlenki, które równie Ŝ nie s ą oboj ętne dla białka i mog ą prowadzi ć do dalszych reakcji. Szczególnie istotne jest utlenianie metioniny w białkach przez szereg utleniaczy, np. powstaj ący w wyniku utleniania metioniny sulfotlenek metioniny mo Ŝe by ć specyficznym markerem uszkodzenia oksydacyjnego. Reakcje rodnikowe z udziałem aminokwasów wyst ępuj ących w białkach mog ą prowadzi ć do uszkodze ń takich jak: agregacja, sieciowanie, fragmentacja, utrata własno ści enzymatycznych oraz do zmiany konformacji cząsteczek [7-9,13-15]. Degradacja białek zachodzi głównie pod wpływem stresu oksydacyjnego. Zmiany oksydacyjne w białkach s ą nieodł ącznym efektem tlenowego metabolizmu komórkowego i mimo licznych układów ochronnych nie mog ą zosta ć całkowicie wyeliminowane. Gromadzenie si ę utlenionych produktów białkowych upo śledza funkcje komórki i mo Ŝe doprowadzi ć nawet do śmierci komórki [7-9]. Podczas stresu oksydacyjnego dochodzi do utlenienia komórkowych grup -SH .– bezpo średnio przez reaktywne formy tlenu (RFT): aniono rodnik ponadtlenkowy (O 2 ), . nadtlenek wodoru (H 2O2) i rodnik hydroksylowy OH Produktem utlenienia grup –SH s ą .- wówczas rodniki tiylowe RS , które ulegaj ą dimeryzacji do disulfidów. Reakcje te zachodz ą według wzorów [7-9]:

•– + • RSH + O 2 + H → RS + H 2O2 (22) 52 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

• 2RSH + H 2O2 → 2RS + 2H 2O (23) • • RSH + OH → RS + H 2O (24) 2RS • → RSSR (25) Uszkodzenie oksydacyjne grup –SH powoduje szybk ą utrat ę aktywno ści biologicznej białka. Utlenianie grup tiolowych w błonach mo Ŝe doprowadzić do dezintegracji błon i zwi ększenia ich przepuszczalno ści. Reakcje RFT z białkami prowadz ą nie tylko do utleniania białek, ale tak Ŝe do powstawania w białkach grup redukuj ących. Grupy te mog ą redukowa ć cytochrom c i metale. Mog ą one powstawa ć w wyniku uszkodzenia aminokwasów aromatycznych. Szybko ść reakcji nierodnikowych utleniaczy ze szkieletem białka nie jest zbyt du Ŝa i raczej prowadzi do zmian trudnych do zaobserwowania. Inaczej jest z reakcjami rodnikowych utleniaczy, które ze szkieletem białka reaguj ą bardzo szybko, prowadz ąc głównie do oderwania atomu H w pozycji alfa (Rys.10). Rodnik ten jest stabilizowany przez elektrony grupy karbonylowej. Powstałe rodniki na atomie w ęgla alfa mog ą reagowa ć z tlenem lub innymi rodnikami obecnymi w układzie. W reakcji z tlenem powstaj ą rodniki nadtlenkowe . (Rys. 10). Mo Ŝe zaj ść reakcja eliminacji z uwolnieniem HO 2 i powstawaniem iminy, która podlega dalej reakcji hydrolizy prowadz ąc do fragmentacji ła ńcucha. Alternatywnie mo Ŝe nast ąpi ć oderwanie atomu H z innego zwi ązku prowadz ąc do powstawania wodoronadtlenku. Rozkład wodoronadtlenków na rodniki prowadzi do fragmentacji szkieletu białka poprzez rodnik alkoksylowy. R O R O H H N N N N . H H H R O R O + H .

O2 R H O R H O N N RH N N . H H R O R OO O OOH . reduction -HO 2 R O R H O N N N N . H O R H O R O

H2O

R O NH O R H O 2 + N N O . + N O R H O R H

Rys. 10. Reakcje rodnika na atomie w ęgla alfa w ła ńcuchu białka 53 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Wi ększo ść uszkodze ń w białkach jest nie do naprawienia i prowadzi do dalszych konsekwencji zwi ązanych ze zmian ą w strukturze, a co za tym idzie zmian ą wła ściwo ści biologicznych i dezaktywacji białka. Akumulacja utlenionych form białka mo Ŝe prowadzi ć do szeregu patologii w organizmach Ŝywych. Oderwanie atomu wodoru w pozycji alfa mo Ŝe nast ąpi ć w wyniku reakcji z rodnikami .OH. Prowadzi to równie Ŝ do fragmentacji, czyli rozerwania ła ńcucha głównego białka.

R R O O H HO . H N N N N . H H H R O R O (26) Reakcje rodnikowe w ła ńcuchach bocznych białka mog ą prowadzi ć do: - oderwania atomu wodoru, głównie z ła ńcuchów alifatycznych, - addycji, głównie z udziałem pier ścieni aromatycznych, powstaj ą zmienione ła ńcuchy boczne (reakcje te zostały omówione wcze śniej dla poszczególnych aminokwasów aromatycznych), - powstawania rodników nadtlenkowych w obecno ści tlenu. Powstaj ący rodnik na atomie w ęgla reaguje szybko z O 2 daj ąc rodniki nadtlenkowe. W warunkach bez udziału tlenu tworz ą si ę dimery.

• • • • R + O 2 → ROO lub R + R → R-R (27)

Dalsze reakcje rodników nadtlenkowych: – Reakcja z innymi rodnikami nadtlenkowymi do ROO-OOX (X = R, H). – Oderwanie atomu wodoru – prowadzi do wodoronadtlenków:

ROO • + XH → X• + ROOH → ROH + zwi ązki karbonylowe (28)

Reakcje eliminacji zachodz ą głównie w przypadku seryny (Ser) i treoniny (Thr) oraz niektórych innych aminokwasów.

-C-OO • → -C=O + HOO • (29) OH

Głównymi produktami reakcji rodnikowych w ła ńcuchach bocznych s ą: nadtlenki, alkohole i zwi ązki karbonylowe.

CH O 3 CH 3 O CH 2OH O H HO H H C + 3 H 3C H 3C NH NH NH

Rys. 11. Schemat utleniania przez wolne rodniki w ła ńcuchu bocznym waliny 54 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Czynniki redukuj ące, takie jak uwodniony elektron czy inne silne reduktory mog ą prowadzi ć do przył ączenia elektronu do grupy karbonylowej wi ązania peptydowego. Trwałe i nietrwałe produkty utleniania aminokwasów, peptydów i białek przedstawia tabela 2 i 3.

Tabela 2. Trwałe i nietrwałe produkty utleniania aminokwasów alifatycznych i aminokwasów zawieraj ących atom siarki w ła ńcuchu bocznym [7] Aminokwas Produkt Kwas glutaminowy Wodoronadtlenki (nietrwałe) Leucyna Wodoronadtlenki (nietrwałe), alkohole alfa-ketokwasy. zwi ązki karbonylowe Glicyna Kwas aminomalonowy Valina Wodoronadtlenki (nietrwałe) Lizyna Alkohole, zwi ązki karbonylowe Prolina Wodoronadtlenki (nietrwałe), alkohole Kwas hydroksyaminowalerianowy Zwi ązki karbonylowe Metionina Sulfotlenki metioniny, sulfony mietioniny Cysteina Cystyna (disiarczek cysteiny), oksokwasy, sulfonamidy

Tabela 3. Trwałe i nietrwałe produkty utleniania aminokwasów aromatycznych [7] Aminokwas Produkt

Fenyloalanina Orto-tyrozyna i meta-tyrozyna Tyrozyna Tyrozyna 3,4-dihydroksyfenyloalanina (DOPA) (nietrwały) Dityrozyna (dimer C-C i dimer (C-O) Nitrotyrozyna Alkohole Tryptofan N-formylokynureina Kynureina 5-hydroksytryptofan alkohol Histydyna 2-oksohistydyna Hydronadtlenki Alkohole zwi ązki karbonylowe

55 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Obecnie jest wiele dowodów naukowych na to, Ŝe uszkodzenia rodnikowe w białkach mog ą by ć przenoszone do innych układów biologicznych. Szczególnie dotyczy to reakcji z udziałem metioniny [8,16]. Rodniki tiolowe s ą zdolne do oderwania atomu wodoru przy węglu alfa. Doniesienia naukowe wskazuj ą równie Ŝ na przeniesienie uszkodze ń z jednego ła ńcucha bocznego do innego, szczególnie dotyczy to układów łatwo ulegaj ących reakcji oksydacji, np. Trp, Tyr, His, Cys i Met. Pocz ątkowa oksydacja metioniny poprzez rodniki hydroksylowe prowadzi do fragmentacji N-ko ńcowych reszt seryny Ser i treoniny Thr w wyniku mi ędzycz ąsteczkowego przeniesienia atomu wodoru. Reakcje utleniania w białkach prowadz ą do szeregu konsekwencji: • Fragmentacja i dimeryzacja • Agregacja Sieciowanie zachodzi poprzez rodnikow ą dimeryzacj ę rodników tyrozylowych (fenoksylowe rodniki tyrozyny).

Zmiany konformacyjne w białkach Reakcje utleniania w białkach mog ą prowadzi ć do zmian konformacyjnych, które w konsekwencji sprawi ą, Ŝe białko nie b ędzie w stanie pełni ć swoich funkcji biologicznych. Je Ŝeli zmiany zachodz ą w ła ńcuchach bocznych mo Ŝe dodatkowo dodatkowo doj ść do hydrofobizacji białka, np. deaminacji reszt lizyny. Dodatkowo utworzone grupy hydrofilowe w wyniku utleniania mog ą prowadzi ć do nadmiernego oddziaływania mi ędzy nimi, co w rezultacie doprowadzi do zmiany konformacji białka. Rodnikowe zmiany w strukturze kolagenu oraz sieciowanie kolagenu przedstawia rysunek 12 i 13.

Wzrost temperatury topnienia usieciowanego kolagenu

Rys. 12. Rodnikowe sieciowanie kolagenu

56 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Rys.13. Fotochemiczna degradacja kolagenu: a) potrójna helisa kolagenowa utrzymywana poprzez wi ązania wodorowe; b) zniszczone cz ęś ciowo wi ązania wodorowe i pocz ątek zwijania si ę struktury; c) powstawanie wolnych rodników i dalsze niszczenie wi ąza ń wodorowych; d) rozrywanie wi ąza ń peptydowych prowadz ące do degradacji ła ńcuchów kolagenu

Zmiany konformacyjne w kolagenie manifestowane s ą poprzez spadek lepko ści roztworów kolagenowych, poprzez obni Ŝenie temperatury denaturacji i poprzez zmian ę skr ęcalno ści optycznej. W wyniku degradacji rodnikowej zmienia si ę równie Ŝ masa cz ąsteczkowa kolagenu. Sieciowanie kolagenu przejawia si ę wzrostem temperatury denaturacji oraz zmniejszeniem si ę rozpuszczalno ści białka.

17. Reakcje rodnikowe w kwasach nukleinowych

Kwas nukleinowy jest biopolimerem, w którym jednostk ą powtarzaj ącą si ę jest nukleotyd. Ka Ŝdy nukleotyd zbudowany z kwasu fosforowego (P), cukru rybozy lub dezoksyrybozy (R), zasady pirymidynowej: tyminy (T), cytozyny (C) lub uracylu (U) oraz zasady purynowej: guaniny (G) lub adeniny (A). Struktury zasad purynowych i pirymidynowych przedstawia rysunek 14. Nukleotydy poł ączone s ą ze sob ą w długi ła ńcuch polinukleotydowy. 57 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Kwas fosforowy z cukrem tworz ą ła ńcuch, w którym zasada jest bocznym podstawnikiem. Te trzy składniki tworz ą nukleotyd. Nukleotydy ł ącz ą si ę ze sob ą tworz ąc ła ńcuch polinukleotydowy (Rys. 15). Dwa takie ła ńcuchy biegn ące równolegle tworz ą struktur ę spiraln ą (tzw. podwójna spirala), któr ą utrzymuj ą wi ązania wodorowe mi ędzy wyst ępuj ącymi w obu ła ńcuchach zasadami purynow ą i pirymidynow ą.

HO H OH O HO O H CC-CH -OH O=P-OH OH HO 2 C H HO C-CH2-OH OH H C C H C C kwas H H H H fosforowy ryboza dezoksyryboza O O NH 2 H C H H C CH3 C H N1 C N C N C

C2 3 C H C C H C C H O N O N O N H H H uracyl tymina cytozyna

O NH2 H C N C N N C N C C-H C-H C C N C C H2N N H N N H H guanina adenina O H C N CH H O C CH O O N C OH HO C-CH2O-P-O- H C C OH H H nukleotyd

Rys. 14. Struktura chemiczna zasad azotowych wchodzących w skład kwasów nukleinowych oraz struktura przykładowego nukleotydu

58 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

O O P OH O O H CH2 O H C N H C C N C=O H H CC polinukleotyd C C H CH3 O OH

O P OH H C N O H-N C NH2 CH 2 O H CC H CCH H N N C C C H O OH O P OH

Rys. 15. Struktura polinukleotydu

Najsilniejszymi chromoforami s ą w kwasach nukleinowych zasady pirymidowe. Maksimum ich absorpcji wyst ępuje przy 260-265 nm. Najwa Ŝniejsz ą reakcj ą fotochemiczn ą w DNA jest dimeryzacja reszt tyminy poprzez atomy węgla 5, 6 oraz tworzenie trwałych adduktów poprzez 6 i 4 atom C. OO CH CH C 3 3C H N 5C C 5' N H

O C 6C C 6' C O N O N HH

fotodimer H C CH3 N C hν 2 C C H O O N CH C 3 CH3 H N 5C C C O C 6C C 4 N + H O N 2 H NC O fotoaddukt Rys. 16. Dimeryzacja reszt tyminy spowodowana promieniowaniem UV

59 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Reszta cytozyny tworzy podobny addukt. Mo Ŝe te Ŝ przył ącza ć cz ąsteczk ę wody, któr ą traci w ciemno ści ale te Ŝ w obecno ści wody ulega deaminacji, a po utracie wody przyjmuje budow ę uracylu. Przemiana ta prowadzi do mutacji w DNA. Uracyl bowiem w DNA nie wyst ępuje. Jest to zasada wchodz ąca w skład RNA.

O O NH 2 NH2 C OH H C H C H C OH H N C N C N C N C hν, Η2Ο H H2O H H H - H O C C C C , H O C C -NH C C 2 O H O H 2 O 3 O N H N N N H

reszta cytozyny reszta uracylu

hν

O O H2N NH2 HH H H C C C C N C C N 2 H O H N C C N H 2 O C C C C O - 2NH3 O C C C C O N N N N H H H H

fotodimer reszt cytozyny fotodimer reszt uracylu Rys. 17. Dimeryzacja reszt cytozyny spowodowana promieniowaniem UV

Reszty cytozyny mog ą dimeryzowa ć. Powstały dimer jest nietrwały. W obecno ści wody ulega deaminacji i przekształca si ę w fotodimer reszt uracylowych. Reszty uracylu po wzbudzeniu fotochemicznym ulegaj ą fotohydratacji i dimeryzacji. O H C H N C H hν, C C H O O N OH Η2Ο H C H N C

C C H O N hν O O O λ>290nm H H C C H C H H N C C N H hν N C λ = 254 nm 2 O C C C C O C C H N N O N H H

Rys. 18. Dimeryzacja i fotohydratacja reszt cytozyny spowodowana promieniowaniem UV 60 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Fotodimery reszt uracylu i tyminy s ą zwi ązkami stabilnymi ale pod wpływem promieniowania o λ = 254 nm rozpadaj ą si ę na wyj ściowe monomery. Wzbudzone reszty zasad purynowych w minimalnym stopniu bior ą udział w wy Ŝej przedstawionych przemianach fotochemicznych. W zwi ązku z tym nie maj ą wi ększego znaczenia biologicznego [19-21]. Wi ększo ść głównych uszkodze ń rodnikowych w DNA jest przenoszona i naprawiana, jednak niektóre zmiany mog ą akumulowa ć si ę w komórkach prowadz ąc do uszkodze ń i zmian genetycznych [21].

18. Reakcje rodnikowe w polisacharydach

Do jednych z bardziej rozpowszechnionych w przyrodzie polisacharydów nale Ŝą skrobia, glikogen i celuloza gromadzone odpowiednio w nasionach, w ątrobie i wyst ępuj ące w drewnie. Zbudowane s ą z β-D(+) glukozy, której cz ąsteczki ł ącz ą si ę wi ązaniami glikozydowymi powstaj ącymi pomi ędzy 1 i 4 atomem w ęgla kolejnych jednostek monomerycznych polimeru. Ró Ŝni ą si ę mas ą cz ąsteczkow ą, długo ści ą ła ńcucha i jego kształtem. S ą to ła ńcuchy proste jak w celulozie i cz ęś ci skrobi – amylozie oraz rozgał ęzione jak w amylopektynie (wchodz ącej w skład skrobi) i glikogenie. Struktur ę celulozy przedstawia rysunek 19.

Rys. 19. Struktura celulozy

Niektóre polisacharydy zawieraj ą w strukturze równie Ŝ grupy aminowe, jak np. chitina i chitozan (Rys. 20). Wi ązania glikozydowe i grupy acetalowe absorbuj ą promieniowanie o λ ∼ 260 nm. Zaabsorbowane promieniowanie mo Ŝe prowadzi ć do powstawania wolnych rodników i post ępuj ącej fotodegradacji. Wydajno ść tego procesu zale Ŝy od warunków takich jak obecno ść powietrza, wilgoci, czy zanieczyszcze ń. W czasie fotodegradacji ulegaj ą

61 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki rozerwaniu wi ązania glikozydowe, mo Ŝe te Ŝ zachodzi ć dehydrogenacja, dehydroksylacja przy 2, 3 lub 6 atomie w ęgla lub dehydroksymetylacja z rozerwaniem wi ązania mi ędzy 5 i 6 atomem w ęgla, a tak Ŝe rozerwanie pier ścienia glukozy mi ędzy 2 i 3 atomem w ęgla. W • • • wyniku wy Ŝej wymienionych reakcji powstaj ą rodniki H , OH, CH 2OH i makrorodniki o ró Ŝnej budowie. W reakcjach wtórnych makrorodniki ulegaj ą rekombinacji, a przy dost ępie powietrza mog ą tworzy ć makrorodniki nadtlenkowe, które poprzez hydroksynadtlenki i ich rozkład prowadz ą do fotodegradacji oksydacyjnej. W obecno ści wilgoci proces ten zachodzi z wi ększ ą wydajno ści ą, gdy Ŝ wpływa ona (w semikrystalicznej strukturze celulozy) na zmian ę stosunku fazy krystalicznej do amorficznej, na korzy ść tej ostatniej. Jest ona, w przeciwie ństwie do fazy krystalicznej, dost ępna i łatwiej przenikalna dla promieniowania UV jak te Ŝ i tlenu. Równie Ŝ drobne zanieczyszczenia oraz produkty utlenienia tego polisacharydu maj ą wpływ na przebieg procesów fotodegradacyjnych celulozy [11,22].

Rys. 20. Struktura chityny i chitozanu

Przebieg rodnikowej degradacji chitozanu przedstawiono na rysunku 21. W czasie fotodegradacji ulegaj ą rozerwaniu wi ązania glikozydowe. Mo Ŝe te Ŝ zachodzi ć dehydrogenacja lub dehydroksylacja. Mog ą powstawa ć ruchliwe rodniki wodorowe i hydroksylowe. W obecno ści tlenu zachodzi reakcja fotochemicznego utleniania (Rys. 22).

62 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

CH 2OH O O H H OH H H

H NH 2

CH 2OH CH 2OH CH 2OH O O O H H H H H hννν H O O C O OH H OH H OH H H H H

H NH 2 H NH 2 H NH 2

CH 2OH CH 2OH O O H H H H C O O H OH H OH H + H

H NH 2 H NH 2

hννν

CH 2OH CH 2OH O O H H H H C O OH H OH H H H

H NH 2 H NH 2

CH 2OH O CO H H H H O O CH OH OH H OH H + 2 H H

H NH 2 H NH 2

CH OH 2 CH 2OH CH 2OH CH 2OH O O O O H H H H H H hννν H H O O O O OH OH H OH H H OH H + H H H H H NH H NH H NH 2 2 2 H NH 2

Rys. 21. Mechanizm fotodegradacji chitozanu pod wpływem promieniowania UV [23]

63 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

O CH 2OH CH 2OH O CO O CO H H H H H H O H H O O 2 O O OH H OH H OH H OH H H H H H

H NH 2 H NH 2 H NH 2 H NH 2

O CH 2OH O CO H H H hννν O O OH H OH H H H

H NH 2 H NH 2

O CH 2OH O CO H H H O O OH H OH H H H H NH 2 H NH 2 Rys. 22. Mechanizm fotodegradacji chitozanu w obecno ści tlenu [23]

19. Reakcje rodnikowe w lipidach

Lipidy to du Ŝa grupa zwi ązków nierozpuszczalnych w wodzie, ale rozpuszczalnych w zwi ązkach o charakterze hydrofobowym. Najbardziej rozpowszechnionymi w tej grupie zwi ązków s ą triglicerydy, czyli estry gliceryny z kwasami tłuszczowymi, nasyconymi lub nienasyconymi. Wyst ępuj ą do ść licznie w organizmach Ŝywych, zatem s ą nara Ŝone na działanie wolnych rodników. Szczególnie duŜe znaczenie przypisuje si ę wolnym rodnikom w procesie peroksydacji lipidów ( lipid peroxidation LPO ). Jest to wolnorodnikowy proces utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych lub innych lipidów, w którym powstaj ą nadtlenki tych zwi ązków [24]. Peroksydacja lipidów przebiega w trzech etapach: – inicjacji, – propagacji, – terminacji. Inicjacja peroksydacji lipidów polega na oderwaniu atomu wodoru od cz ąsteczki wielonienasyconego kwasu tłuszczowego lub reszty tego kwasu wchodz ącej w skład fosfolipidu, głównego składnika budulcowego błon komórkowych. Zawarte w błonach komórkowych nienasycone kwasy tłuszczowe łatwo poddaj ą si ę atakowi wolnych rodników.

64 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

. Peroksydacja lipidów mo Ŝe by ć zapocz ątkowana przez rodnik hydroksylowy ( OH), oraz rodniki: nadtlenkowy (LOO •), alkoksylowy (LO •) lub alkilowy (L •) [24]. Peroksydacja lipidów mo Ŝe te Ŝ by ć zainicjowana przez ozon, tlenek i dwutlenek azotu, a tak Ŝe dwutlenki siarki i chloran (I). Podczas reakcji propagacji wolne rodniki alkilowe (L •) reaguj ą z tlenem i tworz ą wolne rodniki nadtlenkowe LOO • (reakcja 30). Te z kolei mog ą odrywa ć atomy wodoru od kolejnych cz ąsteczek wielonienasyconych kwasów tłuszczowych LH (reakcja 31). W tej reakcji wolny rodnik nie ginie, ale reaguje z nast ępn ą cz ąsteczk ę kwasu tłuszczowego:

• • L + O 2 → LOO (30) LOO • + LH → LOOH + L • (31)

Cykl ten powtarza si ę wielokrotnie, do momentu reakcji terminacji. Reakcja ta mo Ŝe zachodzi ć pomi ędzy dwoma wolnymi rodnikami alkilowymi, nadtlenkowymi czy dwoma ró Ŝnymi rodnikami, które wyst ępuj ą w tym układzie. Produktami reakcji w błonach biologicznych s ą najcz ęś ciej dimery fosfolipidów. Peroksydacja lipidów w komórce nast ępuje w błonach zawieraj ących równie Ŝ białka, a wolne rodniki powstaj ące podczas peroksydacji mog ą te Ŝ reagowa ć z tymi białkami. Wolne rodniki białkowe uczestniczą w reakcjach terminacji i tworz ą poł ączenia białkowo- lipidowe. Dalsze przemiany produktów utleniania lipidów zachodz ą m.in. na drodze eliminacji, co prowadzi do rozpadu reszt wielonienasyconych kwasów tłuszczowych i powstania mniejszych fragmentów. Jednym z produktów degradacji utleniaj ącej lipidów jest dialdehyd malonowy. Poza tym zwi ązkiem powstaj ą równie Ŝ inne aldehydy i hydroksyaldehydy (4-hydroksyalkenale, 2-alkenale, hepta- 2,4-dienal, 5-hydroksyoktanal). St ęŜ enie aldehydów w tkankach ro śnie pod wpływem zwi ększonego wytwarzania reaktywnych form tlenu RFT. Aldehydy, które powstaj ą podczas peroksydacji lipidów mog ą powodowa ć fragmentacj ę ła ńcucha DNA, s ą cytotoksyczne, działaj ą mutagennie i kancerogennie [25]. Produkty utleniania lipidów modyfikuj ą wła ściwo ści fizyczne błon komórkowych prowadz ąc do zwi ększonej przepuszczalno ści błon dla jonów H + i polarnych substancji. Zmniejsza si ę ró Ŝnica potencjałów elektrycznych po obydwu stronach dwuwarstwy lipidowej. Peroksydacja lipidów powoduje równie Ŝ zahamowanie aktywno ści niektórych enzymów błonowych i białek transportuj ących. Etapy reakcji rodnikowych w wielonienasyconych kwasach tłuszczowych mo Ŝna przedstawi ć nast ępuj ąco: (1) Inicjacja w wielonienasyconych kwasach tłuszczowych (polyunsaturated fatty acid . . - PUFA) poprzez rodnik ła ńcucha R , RO 2 lub O 2(1∆g), prowadzi do powstania rodnika lipidu, który dalej mo Ŝe reagowa ć z tlenem: . . R + PUFA → RH + PUFA (32) . . PUFA + O 2 → PUFAO 2 (33) (2) Propagacja; czyli powstały rodnik nadtlenkowy generuje oderwanie atomu wodoru od innej cz ąsteczki wielonienasyconego kwasu tłuszczoqego: . . PUFAO 2 + PUFA → PUFAOOH + PUFA (34) 65 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

. Powstały rodnik PUFA mo Ŝe reagowa ć z tlenem prowadz ąc do kumulacji zmian oraz do nierodnikowych produktów (NRP). (3) Terminacja; . 2PUFAO 2 → NRP (35) . . PUFA + PUFAO 2 → NRP (36) . 2PUFA → NRP (37)

20. Fotostarzenie i produkty promieniochronne

Starzenie si ę jest naturalnym, fizjologicznym procesem charakteryzuj ącym wszystkie Ŝywe organizmy. Jest to proces nieunikniony i w du Ŝej mierze zaprogramowany genetycznie. Ze wzgl ędu na to, Ŝe 60-70% masy ciała to woda, to wła śnie zmiana jej zawarto ści wpływa na proces starzenia. Starzenie si ę to zmniejszenie zawarto ści wody w tkankach organizmu, ich odwodnienie, osłabienie komórkowej przemiany materii, prowadz ące do stopniowego obumierania komórek. Plazma komórkowa młodego człowieka jest bardzo uwodniona, ma płynn ą konsystencj ę. W procesie starzenia nast ępuje jej zag ęszczenie, przybiera form ę kleistego Ŝelu trac ącego wła ściwo ści wodochłonne. Zwalnia si ę proces przemiany materii na skutek osłabienia wymiany mi ędzykomórkowej polegaj ącej na pobieraniu substancji pokarmowych i wydalaniu zb ędnych produktów powstałych w wyniku metabolizmu. Krew dociera z wi ększ ą trudno ści ą do tkanek, dostarczaj ąc mniej substancji od Ŝywczych, co prowadzi do ich zwyrodnienia. Zaburzenia kr ąŜ enia krwi powoduj ą zaburzenia regulacji cieplnej i ochronnej, osłabiona jest naturalna odporno ść organizmu. Czynniki przyspieszaj ące proces starzenia Wszystkie szkodliwe zmiany spowodowane zarówno przez czynniki endo- jak i egzogenne mog ą wpływa ć na struktur ę DNA i funkcjonowanie komórki. Do szkodliwych czynników zalicza si ę: a) wolne rodniki, b) tlen singletowy. Zgodnie z rodnikow ą teori ą starzenia czynniki te przyczyniaj ą si ę do: • powstawania zmarszczek • wysychania skóry • zmniejszenia j ędrno ści skóry. Proces naturalnego starzenia przy śpiesza szkodliwe działanie promieni słonecznych. Naturaln ą ochron ę przed promieniowaniem UV zapewnia skórze naturalny pigment, melanina. Im wi ększa zawarto ść melaniny w skórze, tym wi ększa ochrona przed szkodliwym promieniowaniem słonecznym, a wła ściwie przed jego szkodliwym składnikiem, promieniowaniem nadfioletowym. Światło nadfioletowe (ultrafioletowe, UV) stanowi część energii słonecznej o znacznej energii i długo ści fali w zakresie od około 220 do 400 nm, które jest progiem zakresu długo ści fal dla światła widzialnego.. Słoneczne spektrum UV jest podzielone na trzy regiony: region UVA od 320 do 400 nm, UVB od 290 do 320 nm oraz UVC (<290 nm). Energia promieniowania nadfioletowego pochodz ącego ze sło ńca powoduje symptomy poparze ń słonecznych, w śród których mo Ŝna wymieni ć zaczerwienienia, ból, pora Ŝenia, p ęcherze,

66 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki opuchni ęcia, i ewentualnie łuszczenie skóry. Energia promieniowania UV mo Ŝe generowa ć nowotwory skóry i fotostarzenie si ę skóry oraz zmiany w kolorze i strukturze włosów. Skóra i włosy powinny by ć chronione przed szkodliwym działaniem promieniowania słonecznego. Szczególnie skóra powinna by ć chroniona przed poparzeniami słonecznymi nazywanymi erythema (aczkolwiek erythema jest tylko „zaczerwienionym” składnikiem poparzenia słonecznego). Promieniowanie słoneczne zawiera wi ęcej promieniowania UVA ni Ŝ UVB. Jednak krótsza długo ść fali promieniowania UVB (290–320 nm) powoduje znacznie wi ększe uszkodzenia ni Ŝ UVA o falach dłu Ŝszych (320–400 nm) [26]. Składniki środków przeciwsłonecznych Składnikami środków przeciwsłonecznych s ą zwi ązki chemiczne, które absorbuj ą lub rozpraszaj ą padaj ące promieniowanie. W ten sposób energia jest osłabiana zanim zacznie penetrowa ć skór ę. U Ŝycie zwi ązków chemicznych w preparatach przeciwsłonecznych podlega odpowiednim regulacjom. Wiadomo, Ŝe absorpcja promieniowania zale Ŝy od struktury chemicznej zwi ązku. Z tego wzgl ędu składniki czułe na działanie UV mog ą absorbowa ć tylko okre ślone długo ści fali promieniowania.

Tabela 4. Składniki aktywne preparatów przeciwsłonecznych i ich dozwolone st ęŜ enie w produkcie [7,26] Składnik Maksymalne dozwolone st ęŜ enie [%] Kwas aminobenzoesowy 15 Avobenzon 3 Cinoxate 3 Dioxybenzon 3 Homosalate 15 Metoxycinamonian oktylu 7.5 Salicylan oktylu 5 Oxybenzon 6 Phenylbenzimidazole sulfonic acid 4 Sulisobenzone 10 Ditlenek tytanu 25 Ditlenek cynku 25

W preparatach kosmetycznych chroni ących przed szerokim spektrum promieniowania UV stosuje si ę kombinacj ę kilku czynników aktywnych. Przykłady takich zwi ązków podano poni Ŝej.

67 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

O O O OH

H2N kwas aminobenzoesowy O

Avobenzon H3C O O OH O OH O O CH3 Cinoxate O dioksybenzenon

O O O H3CO OH Homosalate p-metoksycynamonian oktylu

O OH O O

OH salicylan oktylu O oxybenzon

H O OH N O S OH N O O O S O OH

kwas fenylobenzimidazolo sulfonowy Sulisobenzon

Rys. 23. Przykłady zwi ązków chemicznych stosowanych do wyrobu filtrów słonecznych

St ęŜ enie środka przeciwsłonecznego jest regulowane prawnie. Tabela 4 przedstawia przykłady dopuszczonych st ęŜ eń wybranych środków przeciwsłonecznych. 68 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Faktor ochrony przeciwsłonecznej ( Sun protection factor SPF) Faktor ochrony przeciwsłonecznej (SPF) jest stopniem w jakim produkt promieniochronny ochrania skór ę przeciw poparzeniu słonecznemu ( erythema ). SPF jest stosunkiem (współczynnikiem) minimalnej dawki powoduj ącej oparzenia ( minimal erythema dose MED) na skórze ludzkiej chronionej przez filtr przeciwsłoneczny do dawki MED bez obecno ści filtru. Minimalna dawka powoduj ąca oparzenia MED to najmniejsza dawka energii UV powoduj ąca wyra źnie odgraniczone oparzenie. Produkty rynkowe maj ą wartio ść SPF od 2 do co najmniej 60 (SPF stosunek MED z preparatem ochronnym do MED bez preparatu). Na przykład filtr z faktorem 2 przepuszcza 50% energii powoduj ącej oparzenia, natomiast z SPF 15 przepuszcza 6.7%. Filtr z SPF równym 50 tylko 2%. SPF jest głównie miar ą protekcji przeciw UVB, poniewa Ŝ SPF jest miar ą ochrony filtra przeciwsłonecznego przed oparzeniem, a oparzenia s ą powodowane przez UVB. Szacowanie ochrony przed UVA jest problematyczne poniewa Ŝ promieniowanie słoneczne jest zawsze mieszanin ą UVA i UVB. Z tego powodu działanie długofalowego UVA jest maskowane efektami bardziej energetycznego promieniowania UVB.

21. Wolne rodniki jako przyczyny chorób

Aktywne formy tlenu generowane jako produkty uboczne przemian metabolicznych lub pochodz ące ze środowiska (np. w wyniku działania czynników chemicznych czy promieniowania UV) s ą czynnikami bior ącymi udział w wielu schorzeniach, takich jak: arteroskleroza, nowotwory, degeneracja tkanki ł ącznej. Oprócz tego aktywne formy tlenu bior ą udział w procesach starzenia. śywe komórki zaadoptowały si ę do reagowania na stres oksydacyjny poprzez system antyutleniaczy zarówno enzymatycznych (np. dysmutaza nadtlenkowa) jak i nieenzymatycznych (np. glutation). Oprócz tego endogennego systemu ochronnego komórki anga Ŝuj ą do walki ze stresem oksydacyjnym równie Ŝ egzogenne antyutleniacze. Działaj ą one głównie na zasadzie dostarczania atomu wodoru i zdolno ści przechwytywania wolnych rodników (np. witamina C czy E, flawonoidy). W Ŝywych organizmach wolne rodniki mog ą powstawa ć: w wyniku działania czynników zewn ętrznych (np. promieniowania UV, promieniowania jonizuj ącego), w reakcjach obronnych systemu immunologicznego organizmu, a takŜe podczas normalnych procesów fizjologicznych zachodz ących w ró Ŝnych cz ęś ciach komórki. W warunkach fizjologicznych procesy te znajduj ą si ę pod ścisł ą kontrol ą organizmu, jak wspomniano powy Ŝej, w wyniku działania szeregu enzymatycznych i nieenzymatycznych mechanizmów ochronnych. Zaburzenie tych mechanizmów pod wpływem ró Ŝnych czynników chorobotwórczych lub oddziaływa ń zewn ętrznych wywołuje znaczny wzrost st ęŜ enia rodników w organizmie, co w konsekwencji powoduje wyst ępowanie reakcji patologicznych prowadz ących do uszkodzenia komórek i tkanek. Spektrum niszcz ącego oddziaływania rodników jest bardzo szerokie. Działanie to mo Ŝe obejmowa ć praktycznie wszystkie wyst ępuj ące w organizmie biocz ąsteczki wywołuj ąc uszkodzenia na poziomie cz ąsteczkowym oraz na poziomie błon komórkowych. Wolne rodniki wywołuj ą in vitro chemiczne modyfikacje oraz uszkodzenia białek (agregacja i denaturacja), lipidów (peroksydacja), w ęglowodanów i nukleotydów, indukuj ą zmiany w 69 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki strukturze DNA prowadz ące do mutacji lub efektów cytotoksycznych itp. Główn ą rol ę 1 • - • • odgrywaj ą tutaj rodniki pochodzenia tlenowego: O2, O 2 (HO 2 ), OH oraz H 2O2. Ze wzgl ędu na ogromn ą reaktywno ść rodnika •OH szczególnie interesuj ąca jest jego rola w tych procesach. Rodnik ten reaguje z wi ększo ści ą biocz ąsteczek ze stałymi szybko ści k( .OH + A) rz ędu 10 9 - 10 10 dm 3mol -1s-1, st ąd jego czas Ŝycia w matrycy biologicznej jest bardzo krótki (~ 1 ns). Reakcje rodnika •OH polegaj ą z reguły na odrywaniu atomów wodoru od atakowanych cz ąsteczek. Ze wzgl ędu na wspomnian ą du Ŝą reaktywno ść i krótki czas Ŝycia rodniki hydroksylowe nie penetruj ą komórki, a reaguj ą z cz ąsteczkami z najbli Ŝszego sąsiedztwa. W rezultacie tych reakcji powstaj ą wtórne rodniki o zró Ŝnicowanej reaktywno ści chemicznej. Zapocz ątkowany mo Ŝe zosta ć ci ąg przemian rodnikowych prowadz ących do uszkodze ń komórki. Uszkodzenia te powstaj ą w miejscach cz ęsto bardzo odległych od miejsca ataku rodnika hydroksylowego. Oznacza to, Ŝe pierwotnie utworzone centrum rodnikowe zlokalizowane w okre ślonym fragmencie ła ńcucha białkowego ulega przeniesieniu w obr ębie cz ąsteczki. Szczególnie wa Ŝną rol ę odgrywaj ą w tym procesie aminokwasy zawieraj ące w ła ńcuchu bocznym pier ścienie aromatyczne (tryptofan, tyrozyna, histydyna) lub atom siarki (cysteina, metionina). Nast ępstwem stresu oksydacyjnego, przy braku sprawnie działaj ących mechanizmów naprawczych komórki, jest utlenianie błon komórkowych, zmiana struktury oraz modyfikacja funkcji białek, uszkadzanie DNA. Przyczyniaj ą si ę do powstania mutacji, co mo Ŝe inicjowa ć rozwój chorób nowotworowych. Stres oksydacyjny jest wa Ŝnym czynnikiem w patogenezie wielu chorób, m.in. układu kr ąŜ enia, płuc, oczu, zapalenia w ątroby, zapalenia trzustki, cukrzycy, chorób degeneracyjnych układu nerwowego. Reaktywne formy tlenu w istotny sposób przyczyniaj ą si ę do przyspieszenia procesów starzenia, akumulacji produktów oksydacyjnych uszkodze ń, odgrywaj ą istotn ą rol ę w procesach tworzenia si ę nowotworów [27]. Jednym z nast ępstw stresu oksydacyjnego jest zmniejszenie st ęŜ enia ATP w komórce. Prowadzi to do m.in. uszkodzenia mitochondriów, hamowania glikolizy (głównie dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego), zwi ększonego zu Ŝycie ATP. Konsekwencj ą stresu oksydacyjnego jest zmniejszenie st ęŜenia glutationu (GSH), a zwi ększenie st ęŜ enia jego formy utlenionej (GSSG). Wzmo Ŝone uwalnianie GSSG z w ątroby do krwi stanowi wska źnik stresu oksydacyjnego [28]. Nasilone reakcje utleniania przyczyniaj ą si ę do zwi ększenia peroksydacji lipidów, a spadku GSH, co stymuluje wzrost aktywno ści enzymów kaskady przemian kwasu arachidonowego: cyklooksygenazy i lipooksygenazy, jak równie Ŝ powoduj ą napływ jonów wapnia do komórki, co prowadzi do uszkodzenia błony komórkowej i jej receptorów. Nast ępstwem stresu oksydacyjnego jest zwi ększenie przepuszczalno ści błony cytoplazmatycznej oraz uszkodzenie j ądrowego i mitochondrialnego DNA (mtDNA). Jednym z procesów, w którym istotn ą role odgrywaj ą reaktywne formy tlenu (ROS) jest zjawisko apoptozy, czyli programowanej śmierci komórki [28]. ROS powoduj ą uszkodzenie komórki inicjuj ące apoptoz ę lub s ą sygnałem do jej inicjacji – co wynika z obni Ŝenia aktywno ści mechanizmów antyoksydacyjnych. Nast ępstwem apoptozy jest m.in. zwi ększenie przepuszczalno ści wewn ętrznej błony mitochondrialnej i redystrybucja cytochromu c z

70 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki mitochondriów do frakcji cytozolowej [28]. W wyniku stresu oksydacyjnego dochodzi do peroksydacji lipidów, opisanej wcze śniej w tym opracowaniu [28]. Je śli w wyniku działania wolnych rodników i reaktywnych form tlenu dojdzie do powstania komórek nowotworowych, to sytuacja w organizmach Ŝywych jest jeszcze bardziej skomplikowana. Z danych do świadczalnych wynika, Ŝe komórki nowotworowe maj ą znacznie obni Ŝon ą aktywno ść niektórych enzymów antyoksydacyjnych, w porównaniu z komórkami prawidłowymi. Mała aktywno ść dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy mo Ŝe prowadzi ć do stresu oksydacyjnego, którego skutkiem s ą uszkodzenia DNA w komórkach nowotworowych [29]. Wykazano, Ŝe aktywno ść dysmutazy ponadtlenkowej jest zahamowana na skutek reakcji cz ąsteczek białka enzymatycznego z wolnymi rodnikami powstaj ącymi zarówno w czasie metabolizmu etanolu, jak i acetaldehydu. Dotyczy to głównie rodnika hydroksylowego, a tak Ŝe rodnika 1-hydroksyetylowego, których wytwarzanie jest zwi ązane z indukcj ą cytochromu P-450. Szczególnie podatne na działanie wolnych rodników są aminokwasy aromatyczne i siarkowe w białkach, co pokazano w rozdziałach wcze śniejszych. Badania wskazały, Ŝe to wła śnie ocena zawarto ści grup tiolowych jest bardzo dobrym wska źnikiem stresu oksydacyjnego [30]. Nast ępstwem modyfikacji oksydacyjnej jest zmiana aktywności białek. Utlenienie grup tiolowych mo Ŝe prowadzi ć do zmiany struktury trzeciorz ędowej lub agregacji białek. Najcz ęś ciej dochodzi do inaktywacji białka i wszystkich konsekwencji z tym zwi ązanych.

22. Metody bada ń reakcji rodnikowych w makrocz ąsteczkach pochodzenia biologicznego

Badanie reakcji rodnikowych w makrocz ąsteczkach pochodzenia biologicznego nie jest spraw ą prost ą. Wynika to ze skomplikowanej, cz ęsto hierarchicznej budowy wielu białek, kwasów nukleinowych czy polisacharydów. Inaczej bada si ę zmiany w strukturze pierwszorz ędowej białka ni Ŝ w strukturze drugorz ędowej czy strukturach wy Ŝszych rz ędów. Równie Ŝ badanie poziomu stresu oksydacyjnego nie nale Ŝy do prostych [31]. Aby oceni ć aktywno ść przeciwutleniaj ącą (AA – Antioxidant Activity ) produktów zawieraj ących antyutleniacze oznacza si ę całkowit ą aktywno ść antyoksydacyjn ą (TAA – Total Antioxidant Activity ), która jest sum ą aktywno ści poszczególnych składników o charakterze antyoksydacyjnym. Mo Ŝna równie Ŝ oznacza ć aktywno ść czystego składnika oddzielnie. Do oznaczania aktywno ści przeciwutleniaj ącej stosuje sie dwie kategorie metod polegaj ących na: 1) redukcji jonów metali do jonów o ni Ŝszym stopniu utlenienia przez badany antyoksydant, np. metoda FRAP ( ferric reducing ability of plasma) i metoda CUPRAC: a) FRAP – redukcja jonu Fe +3 → Fe +2 b) CUPRAC – redukcja jonu Cu +2 → Cu +1 2) zmiatanie wolnych, stabilnych rodników, np.: metody ABTS + i DPPH: a) ABTS + – wolny rodnik wytwarzany przed analiz ą z soli amonowej kwasu 2,2-azino-bis(3- etylobenzotiazolino- 6-sulfonowego b) DPPH – wolny trwały rodnik, 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl (wzór 2, cz ęść I).

71 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Najcz ęś ciej do bada ń zaabsorbowanego promieniowania stosuje si ę spektrofotometri ę w zakresie UV-Vis oraz fluorescencj ę. Do oceny zmian w strukturze makrocz ąsteczek stosuje si ę spektroskopi ę w podczerwieni, metody mikroskopowe, wiskozymetryczne, chromatograficzne i inne. Najtrudniej bada si ę krótko Ŝyj ące produkty przej ściowe, rodniki i rodnikojony [32]. Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR, ang. Electronic Paramagnetic Resonance ) jest jedyn ą znan ą dotychczas technik ą pomiarow ą pozwalaj ącą bada ć bezpo średnio układy (w tym układy biologiczne) zawieraj ące wolne rodniki. Zjawisko rezonansu paramagnetycznego wyst ępuje w układach zawieraj ących niesparowane elektrony. Niesparowane elektrony wyst ępuj ą w wielu indywiduach chemicznych, m.in. w: • wolnych rodnikach • jonorodnikach • jonach metali przej ściowych 3 • stanach tripletowych wzbudzonych cz ąsteczek, np. O2

• cz ąsteczkach oboj ętnych o niezamkni ętych powłokach elektronowych, takich jak NO czy NO 2. Indywidua takie wyst ępuj ą zarówno w układach nieo Ŝywionych jak i biologicznych. Wyst ępuj ą one zarówno na poziomie biopolimerów: • metaloproteiny • flawoproteiny • melaniny jak i jako po średnie produkty przemian biochemicznych takich jak: • fotosynteza • fosforylacja oksydatywna • metabolizm utleniaj ąco-redukuj ący. Do badania tych wła śnie układów wykorzystuje si ę spektroskopi ę EPR. Technik ę t ę mo Ŝna równie Ŝ stosowa ć do badania układów, w których normalnie nie wyst ępuj ą centra paramagnetyczne. Wymaga to wprowadzenia ich sztucznie w postaci tzw. znaczników spinowych. Jako znaczniki spinowe stosuje si ę niedu Ŝe podstawniki lub cz ąsteczki posiadaj ące trwałe centra paramagnetyczne. Metoda EPR została omówiona w cz ęś ci I. Doskonał ą metod ą do oceny zmian w strukturze białka jest skaningowa kalorymetria ró Ŝnicowa DSC. Pozwala ona oceni ć zmiany w strukturze drugo- i trzeciorz ędowej białka. Inn ą metod ą jest pomiar dichroizmu kołowego w makrocz ąsteczkach. Z wyników otrzymanych t ą metod ą mo Ŝna okre śli ć kształt makrocz ąsteczki. Nowoczesnymi metodami, które s ą stosowane w badaniach czasu Ŝycia krótko Ŝyj ących indywiduów chemicznych, w tym rodników i rodnikojonów s ą fotoliza błyskowa i radioliza impulsowa. Metody te zostały pokrótce opisane w rozdziałach nast ępnych.

23. Fotoliza błyskowa

Fotoliza błyskowa jest jedn ą z metod, które pozwalaj ą bada ć kinetyk ę i mechanizm szybkich reakcji chemicznych, w tym reakcji rodnikowych. Metoda ta polega na inicjowaniu reakcji krótkotrwałymi impulsami laserowymi (mikro-, nano-, piko-, femtosekundy) i badaniu 72 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

(metodami optycznymi, np. absorpcja w zakresie UV-Vis) powstałych, szybko zanikaj ących, produktów przej ściowych. Lasery ( Light amplification by stimulated emission of radiation) daj ą światło spójne, monochromatyczne o du Ŝym nat ęŜ eniu. Energia mo Ŝe by ć równie Ŝ dostarczona w postaci krótkotrwałego błysku światła widzialnego lub ultrafioletowego. W rezultacie pochłoni ęcia przez badany układ pewnej liczby kwantów światła zachodzi ć w nim mog ą ró Ŝnorodne procesy fizyczne i chemiczne, takie jak: wzbudzenie, jonizacja, dysocjacja cz ąsteczek, przegrupowanie wewn ątrzcz ąsteczkowe itp. Powstałe szybko zanikaj ące produkty przej ściowe najcz ęś ciej rejestruje si ę za pomoc ą spektroskopii UV-Vis. Metoda ta pozwala na ustalenie rodzaju indywiduów krótko Ŝyj ących i ocen ę czasu ich Ŝycia, na ustalenie mechanizmów reakcji rodnikowych, krótko Ŝyj ących indywiduów molekularnych (wolne rodniki i rodnikojony) zdolnych do reakcji np. uszkodzenia, tkanek i degradacji materiałów. Słu Ŝy równie Ŝ do badania kinetyki reakcji rodnikowych [33]. Widma absorpcji dla krótko Ŝyj ących indywiduów nazywane s ą widmami przej ściowymi. Wykorzystuj ąc zarejestrowane widma przej ściowe z prawa Lamberta-Beera mo Ŝna wyliczy ć st ęŜ enia odpowiednich zwi ązków pochłaniaj ących światło. Prawo Lamberta-Beera:

A = ε c l (38) gdzie: • A – absorbancja; • ε − molowy współczynnik absorpcji [dm 3mol -1cm -1]; • l – grubo ść warstwy absorbuj ącej [cm]; • c – st ęŜ enie substancji badanej [mol dm -3].

Szybko ść reakcji (v) jest miar ą ilo ści zu Ŝytego substratu lub utworzonego produktu w czasie. Dla wi ększo ści reakcji chemicznych prowadzonych w zamkni ętym układzie mo Ŝna wyrazi ć ją wzorem:

dc v = ± dt (39)

Jest to posta ć ró Ŝniczkowa. Szybko ść reakcji mo Ŝna te Ŝ wyrazi ć za pomoc ą równania kinetycznego danej reakcji:

a b c v = k[A] [B] [C] ... (40) [A], [B], [C] s ą st ęŜ eniami reagentów a współczynniki a, b, c są wyznaczane eksperymentalnie (dla reakcji prostych w przybli Ŝeniu równaj ą si ę współczynnikom stechiometrycznym). Współczynnik proporcjonalno ści k w równaniu kinetycznym przyj ęło nazywa ć si ę stał ą szybko ści reakcji. Sum ę wykładników z równania kinetycznego nazywa si ę rz ędem reakcji.

73 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

n = a + b + c (41)

Zestaw do pomiaru widm absorpcji przedstawia rysunek 24, natomiast zestaw do pomiaru absorpcji przej ściowej przedstawia rysunek 25.

Źródło światła kuweta soczewka

Pryzmat DETEKTOR

Rys. 24. Schemat spektrofotometru do rejestracji widm absorpcji

Laser

kuweta

lampa soczewka soczewka monochromator oscyloskop

komputer

Rys. 25. Schemat zestawu do fotolizy błyskowej

74 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

W fotolizie błyskowej wa Ŝne jest aby impuls lasera był zsynchronizowany czasowo ze światłem analizuj ącym lampy UV. Schemat czasowego zał ączania lasera nanosekundowego i lampy emituj ącej światło analizuj ące przedstawia rysunek 26. Dane otrzymane na ekranie oscyloskopu i komputera pokazuj ą zmiany w intensywno ści światła przepuszczonego po impulsie laserowym. Zmiany absorbancji mog ą by ć obliczone nast ępuj ąco:

I0 Przed impulsem: A1 = log 0 (42) It I0 Po impulsie: A 2 = log x (43) It Gdzie A 1 i A 2 to absorbancja próbki przed impulsem i po impulsie, I 0 to intensywno ść 0 x światła padaj ącego, I t oraz I t są intensywno ściami przed i w konkretnym czasie x po impulsie.

Lamp Pulse (2.5 ms)

Lamp pulsing unit triggered Trace seen on oscilloscope Laser triggered

Widok na oscyloskopie

Rys. 26. Schemat czasowego zał ączania lasera nanosekundowego i lampy emituj ącej światło analizuj ące.

Obliczona ró Ŝnica absorbancji: 0 I0 I0 It ∆A = A 2 − A1 = log x − log 0 = log x (44) It It It Zgodnie z prawem Lamberta-Beer’a:

0 It log x = ∆ε[]M* xl (45) It Gdzie ∆ε jest ró Ŝnic ą pomi ędzy współczynnikiem absorpcji w stanie przej ściowym i dla prekursora, [M*] x – st ęŜ enie w stanie przej ściowym po czasie x, l- droga światła przez próbk ę. 75 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Napi ęcie przy wył ączonej lampie monitoring lamp off

x V0 - V x = I t

0 V V0 = I t

Napi ęcie przy wł ączonej x lampie Impuls lasera t=0

Rys. 27. Typowy przebieg zaniku absorpcji przej ściowej w fotolizie błyskowej

Zmiany na oscyloskopie s ą rejestrowane jako zmiany napi ęcia (rysunek 27), dlatego te Ŝ intensywno ść I t0 jest rejestrowana jako V 0 (V 0 α It0) i jest znacznie wi ększa ni Ŝ V x, która jest proporcjonalna do zmiany intensywno ści światła spowodowanej przez absorpcj ę przej ściow ą. Zmiany absorbancji s ą obliczane nast ępuj ąco:

  V0  ∆A = log = ∆ε[]M* xl (46)  V0 − Vx Otrzymane widma przej ściowe mog ą by ć analizowane pod k ątem kinetyki lub do budowania przej ściowych widm ró Ŝnicowych. Obserwowane widma przej ściowe pochodz ą najcz ęś ciej od stanów wzbudzonych lub wolnych rodników. Pierwszorz ędowa kinetyka zaniku najcz ęś ciej wskazuje na absorpcj ę przej ściow ą stanów wzbudzonych, natomiast drugorz ędowa wskazuje na absorpcj ę przej ściow ą wolnych rodników. W roztworach bez dost ępu tlenu (odpowietrzonych) stany trypletowe zanikają nieradiacyjnie zgodnie z kinetyk ą pierwszego rz ędu:

3 k1 M *  → M (47) d 3M* [ ] 3 t = k M* (48) dt 1[]t 3 3 3 Gdzie k 1 pierwszorz ędowa stała zaniku M*, oraz [ M*] t jest st ęŜ eniem M* po czasie t. To daje dalej:

76 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

ln 3M* = ln 3M* − k t (49) [ ]t [ ]0 1

3 3 Gdzie [ M*] 0 jest pocz ątkowym st ęŜ eniem M*. 3 Zmiana absorbancji ( ∆At) jest proporcjonalna do st ęŜ enia M* , st ąd:

ln ∆At = ln ∆A0 − k1t (50)

Gdzie ∆A0 jest ró Ŝnicą w absorbancji bezpo średnio po impulsie. Zale Ŝno ść ln ∆At od t daje lini ę prost ą ze współczynnikiem kierunkowym -k1. Program komputerowy u Ŝywaj ąc metod ę najmniejszych kwadratów oblicza warto ści k1 i ∆A0 z równania poni Ŝej (przekształcone równanie wcze śniejsze):

− k1t ∆At = ∆A0e + ∆A∞ (51) W przypadku wi ększej liczby widm przej ściowych oblicza si ę sum ę: − ki t ∆At =∑ ∆Aie (52) i Fotoliza błyskowa jest dobr ą metod ą do ustalenia przebiegu reakcji rodnikowych w wielu zwi ązkach. Na podstawie wyników uzyskanych t ą metod ą mo Ŝna ustala ć mechanizmy reakcji rodnikowych oraz wyznacza ć stałe szybko ści reakcji. Za pomoc ą fotolizy błyskowej ustalono mechanizmy reakcji rodnikowych w wielu białkach. Mechanizm reakcji zachodz ących w roztworach wodnych kolagenu przedstawia rysunek poni Ŝej [34]:

Rys. 28. Mechanizm reakcji rodnikowych zachodz ących w roztworze kolagenu w kwasie octowym pod wpływem promieniowania laserowego powoduj ącego fotojonizacj ę [34] 77 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

24. Radioliza impulsowa

Radioliza impulsowa jest technik ą stosowan ą w badaniach wykrywania nietrwałych produktów reakcji, w tym rodników i rodnikojonów. Metoda ta polega na poddaniu badanej próbki krótkotrwałym impulsom promieniowania elektronowego z akceleratora elektronów w celu wygenerowania rodników i rodnikojonów, a nast ępnie detekcji metodami optycznymi (spektroskopia UV-ViS) produktów radiolizy. Pozwala ona na identyfikacj ę krótko Ŝyj ących indywiduów chemicznych i śledzenie reakcji przebiegaj ących w czasie rz ędu nanosekund (10 -9 s) a nawet krótszym [35]. W badaniach metod ą radiolizy impulsowej reaktywne produkty po średnie generowane s ą poprzez napromienienie badanego roztworu impulsem elektronowym wytwarzanym przez liniowy akcelerator elektronów lub poprzez promieniowanie generowane w Synchrotronach. Kuweta zawieraj ąca badany roztwór umieszczana jest w miejscu, w którym wi ązka elektronów przecina si ę z wi ązk ą światła analizuj ącego. Układ do radiolizy impulsowej składa si ę z dwóch głównych podukładów: układu wytwarzaj ącego impuls elektronowy (akcelerator) oraz układu detekcji optycznej. Przedstawia to poni Ŝszy schemat:

Rys. 29. Uproszczony schemat układu do analizy impulsowej (e - - wi ązka przy śpieszonych elektronów, 1- źródło światła analizuj ącego, 2- kuweta z próbk ą, 3- monochromator, 4- fotopowielacz, 5- oscyloskop, 6- komputer)

Źródłem impulsów jonizuj ących jest najcz ęś ciej liniowy akcelerator elektronów. Akcelerator pozwala na formowanie impulsów elektronów o czasie trwania rz ędu kilku ns do kilku s. Przechodz ące przez próbk ę światło analizuj ące kierowane jest za pomoc ą układu soczewek i zwierciadeł na szczelin ę wej ściow ą monochromatora. Źródłem światła analizuj ącego mo Ŝe by ć np. lampa ksenonowa. Przechodz ące przez próbk ę światło analizujące kierowane jest za 78 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki pomoc ą układu soczewek i zwierciadeł na szczelin ę wej ściow ą monochromatora pryzmatycznego. Po wyj ściu z monochromatora światło pada na katod ę fotopowielacza. Sygnał z fotopowielacza rejestrowany jest za pomoc ą oscyloskopu. Do rejestracji i przetwarzania danych pomiarowych wykorzystuje si ę komputer sprz ęŜ ony z oscyloskopem za pomoc ą interfejsu. Program obróbki danych wykonuje operacj ę przeliczania warto ści odczytywanych na absorpcj ę.

U0 A = log (53) U0 - ∆U

gdzie: Uo - warto ść napi ęcia b ędącego miar ą pocz ątkowego nat ęŜ enia światła przechodz ącego przez próbk ę. Warto ść absorpcji jest powi ązana z ilo ści ą wygenerowanego produktu znan ą zale Ŝno ści ą Lamberta-Beera (wzór 38).

Znajomo ść poło Ŝenia pasma absorpcji, współczynnika ε oraz zmian absorpcji w czasie pozwala na jako ściow ą i ilo ściow ą interpretacj ę widm. W roztworach wodnych pod wpływem działania wi ązki elektronów czy promieniowania jonizuj ącego zachodzi proces radiolizy wody. Powstaj ą w tym procesie rodniki, rodnikojony oraz uwodnione elektrony. Przedstawia to poni Ŝszy schemat:

Wzbudzenie i jonizacja w wyniku absorpcji promieniowania jonizuj ącego . . - H2O OH , H , eag

+O 2

. .- . OH , O2 , HO 2

Rys. 30. Schemat przedstawiaj ący radioliz ę wody

Powstaj ące rodniki i rodnikojony s ą bardzo reaktywne i prowadz ą do generowania innych rodników w układzie. W roztworach wodnych, gdy st ęŜ enie rozpuszczonych zwi ązków nie jest zbyt du Ŝe (< 1 mol dm -3), powstaj ą takie same rodniki pierwotne jak w czystej wodzie. 79 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Dopiero gdy ułamek molowy rozpuszczonego zwi ązku staje si ę porównywalny z ułamkiem molowym wody, w roztworze pojawiaj ą si ę produkty bezpo średniej radiolizy zwi ązku rozpuszczonego. W wyniku radiolizy wody powstaj ą obok siebie zarówno rodniki o wła ściwo ściach utleniaj ących jak i redukuj ących, dlatego te Ŝ badania prowadzi si ę w obecno ści ró Ŝnego rodzaju zmiataczy, aby zapewni ć środowisko wył ącznie utleniaj ące lub wył ącznie redukuj ące. Na przykład w celu uzyskania środowiska silnie utleniaj ącego stosuje si ę zmiatanie uwodnionego elektronu przez podtlenek azotu w reakcji

- • - eaq + N 2O → OH + N 2 + OH (54)

Metod ą radiolizy impulsowej wykryto na przykład rodniki tyrozynowe w roztworach kolagenu na świetlanych promieniowaniem UV. W przypadku badanych roztworów kolagenowych w środowisku kwa śnym powstaj ące w reakcji fotojonizacji uwodnione elektrony ulegaj ą reakcji z jonami H +, pochodz ącymi z dysocjacji kwasu octowego. Powstałe w wyniku tej reakcji rodniki H • są bardzo ruchliwe i mog ą inicjowa ć szereg dalszych reakcji. Z widm absorpcji przej ściowej kolagenu wynika, Ŝe jako produkty przej ściowe powstaj ą krótko Ŝyj ące rodniki tyrozylowe, natomiast stany trypletowe są wygaszane przez cz ąsteczki tlenu:

3 • + - TyrOH + O 2 → TyrO + H + O 2 (55) 3TyrOH mo Ŝe absorbowa ć kolejny kwant energii: 3 • - + TyrOH + h ν → TyrO + e aq + H (56)

Pod wpływem promieniowania UV w kolagenie mog ą zachodzi ć nast ępuj ące reakcje:

KOL + h ν → 1KOL* (57) 1KOL* → fluorescencja (58)

1 .+ - KOL* → KOL + e aq (59) (KOL- Kolagen)

Metodami radiolizy impulsowej wyznaczono równie Ŝ stałe szybko ści reakcji rodnika •OH z ró Ŝnymi makrocz ąsteczkami. Przedstawia je tabela 5.

80 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Tabela 5. Stałe szybko ści reakcji rodnika •OH z wybranymi makrocz ąsteczkami (pH ok. 7) [8,36].

Zwi ązek chemiczny Stała szybko ści (dm 3 mol −1 s−1 ) DNA 8×10 8 RNA 1×10 9 Kwas hialuronowy 7×10 8 Kwa s linoleinowy 9×10 9 Kolagen 4×10 11 Albumina 8×10 10 Askorbinian 1×10 10 GSH 1.4×10 10 Trolox C (witamina E) 6.9×10 9

25. Zmiatacze wolnych rodników w organizmach Ŝywych. Antyutleniacze

Organizmy maj ące kontakt z tlenem wytworzyły ró Ŝne mechanizmy obronne chroni ące ich integralno ść przed działaniem wolnych rodników. Jednym z elementów takiego systemu jest odpowiednia organizacja strukturalna komórek, która umo Ŝliwia izolacj ę miejsc, w których zachodz ą reakcje z wytwarzaniem rodników jako produktów ubocznych [25]. Wa Ŝną rol ę w ochronie przed rodnikami odgrywaj ą ró Ŝne mechanizmy metaboliczne. Podzielono je nast ępuj ąco [29,37,38]: • Reakcje z udziałem zwi ązków wygaszaj ących wzbudzone cz ąsteczki (karetonoidy, witamina E). • Mechanizmy nieenzymatyczne: ceruloplazmina, transferyna, poliamidy, jony metali przej ściowych, metalotioneiny. • Mechanizmy enzymatyczne: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalazy (CT), peroksydaza glutationowa (GPx), reduktaza glutationowa (GRd), S-transferaza glutationu (GST) oraz grupa fosfolipaz wydzielniczych A2 (sPLA2). • Reakcje z udziałem białek szoku cieplnego (HSP) – białka opieku ńcze i proteazy. Usuwanie wolnych rodników odbywa sie poprzez dwa mechanizmy: 1. System nieenzymatyczny, który tworz ą substancje ochronne, które same przekazują wolnym rodnikom swoje elektrony, czyli przechodz ą w posta ć utlenion ą, która charakteryzuje si ę mał ą reaktywno ści ą i tym samym uniemo Ŝliwiaj ą utlenianie innych składników. Zwi ązki te okre ślamy jako zmiatacze wolnych rodników. Reaguj ą one z wolnymi rodnikami zabezpieczaj ąc komórki przed reakcjami wolnorodnikowymi. W śród nich wyró Ŝniamy zwi ązki egzogenne oraz endogenne. Do zwi ązków egzogennych nale Ŝy m .in: 81 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

– Kwas askorbinowy (witamina C) – zwi ązek rozpuszczalny w wodzie, utleniaj ąc si ę chroni komórki przed atakiem wolnych rodników. Na ilo ść tego antyoksydanta ma wpływ wiele czynników, takich jak: dieta, styl Ŝycia, przebyte choroby, nat ęŜ enie procesów metabolicznych. – α-tokoferol (witamina E) – zwi ązek rozpuszczalny w tłuszczach, chroni przed utlenieniem błony komórkowe, lipidy i lipoproteiny oraz utrzymuje odpowiedni potencjał oksydoredukcyjny. Jego główna rola polega na zmiataniu wolnych rodników organicznych. – Witamina i prowitamina A ( β-karoten) –spełniaj ą podobn ą rol ę ochronn ą jak witamina E. β- karoten wykazuje zdolno ść usuwania tlenu singletowego i nadtlenków lipidów, chroni ąc w ten sposób komórki m.in. przed nowotworami i starzeniem si ę organizmu. – Koenzym Q10 (rozpuszczalny w tłuszczach) - ma zdolno ść regenerowania witaminy E i wzmacniania jej antyoksydacyjnej wydajno ści. – Flawonoidy – zwi ązki wyst ępuj ące w ro ślinach. – Kreatynina, neopteryna, melatonina, antocyjaniny, bilirubina, hormony płciowe (estron, estradiol). CH3 OH CH3 CH3 CH3

H3C O CH3 CH3 CH3 Witamina E

CH3 CH3 OH

CH3 CH3 CH3 Witamina A H3C CH3 CH3 CH3 H3C

CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 β-karoten

HO OH

O O OH OH Witamina C

Rys. 31. Struktury witamin pełni ących funkcj ę antyutleniaczy

82 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Do zwi ązków endogennych nale Ŝy zredukowany glutation (GSH) – tripeptyd zbudowany z kwasu glutaminowego, cysteiny i glicyny. Stanowi podstawowy wewn ątrzkomórkowy mechanizm układu antyoksydacyjnego, chroni ący komórki w ątrobowe przed szkodliwym działaniem nadtlenków, toksyn oraz wolnych rodników. Ochrona odbywa si ę za po średnictwem reakcji nieenzymatycznych lub katalizowanych przez S-transferaz ę glutationow ą. Jedn ą z przyczyn obni Ŝenia st ęŜ enia GSH jest obni Ŝenie jego syntezy. Szybko ść syntezy glutationu zale Ŝy głównie od dost ępno ści jego prekursorów – cysteiny i metioniny oraz aktywno ści enzymów bior ących udział w jego syntezie, m.in. syntetazy glutamylocysteinowej i cystationazy. Oni Ŝona synteza GSH wpływa na funkcjonowanie całego organizmu. Głównym źródłem glutationu dla krwi jest jego synteza w w ątrobie.

Rys. 32. Struktura glutationu

Obni Ŝenie st ęŜ enia GSH mo Ŝe by ć wynikiem jego zu Ŝycia w reakcjach z wolnymi rodnikami, wytworzonymi w nadmiernej ilo ści, czemu towarzyszy wzrost st ęŜ enia utlenionej formy glutationu (GSSG) oraz obni Ŝenie potencjału utleniajacego GSH/GSSG. Za główn ą przyczyn ę obni Ŝenia si ę stosunku GSH/GSSG uwa Ŝa si ę zmiany w aktywnosci enzymów bior ących udział w metabolizmie glutationu [25,29]. System enzymatyczny tworz ą wyspecjalizowane enzymy, które przeprowadzaj ą reakcje usuwaj ące wolne rodniki oraz zapobiegaj ą ich powstawaniu (Rys. 33). Do tych enzymów nale Ŝy m.in.: – dysmutaza ponadtlenkowa - SOD – enzym katalizuj ący reakcje rozkładu anionorodnika ponadtlenkowego do nadtlenku wodoru i tlenu czasteczkowego:

•- 2O 2 + 2H+ SOD → H2O2 + O 2 (60)

SOD jest metaloenzymem i stanowi zasadniczy mechanizm obrony przeciwko toksycznemu oddziaływaniu nadtlenków w komórkach. Wyst ępuje w dwóch postaciach: wewn ątrz- i zewn ątrzkomórkowej. Bierze udział w redukcji nadtlenku wodoru do wody i przekształca zredukowany glutation w jego posta ć utlenion ą, czyli w disulfid glutationu (GSSG):

2GSH + H 2O2 → Gpx GSSG + 2H 2O (61)

Redukuje równie Ŝ nadtlenki organiczne (np. nadtlenki lipidów) do alkoholi:

ROOH + 2GSH → Gpx ROH + GSSG + H 2O (62) 83 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

Aby nie doszło do inaktywacji białek przez powstały GSSG, z peroksydaz ą glutationow ą współdziała reduktaza glutationowa, enzym odtwarzający zredukowan ą form ę glutationu kosztem utleniania NADPH:

GSSG + NADPH + H+ reduktaza glutationowa GSH + NADP+ (63) lub jest on aktywnie usuwany na zewn ątrz komórki kosztem energii zgromadzonej w ATP. H2O

Gpx

SOD .- O2 H2O2 + O 2

CAT

H2O + O 2

Rys. 33. Główne enzymy usuwaj ące reaktywne formy tlenu

Zdolno ści antyoksydacyjne organizmu zale Ŝą równie Ŝ od zawarto ści i działania innych białek o wła ściwo ściach antyoksydacyjnych. Antyoksydanty prewencyjne zapobiegaj ą wytwarzaniu si ę nowych reaktywnych form tlenu i zapobiegaj ą peroksydacji lipidów. W osoczu krwi role tę pełni ą m.in. ceruloplazmina, ferrytyna, transferyna, albumina – białka, które ł ącz ą si ę z uwolnionymi jonami metali przej ściowych, np. miedzi i Ŝelaza zawieraj ącymi niesparowane elektrony, stanowi ąc zabezpieczenie przed reakcjami wolnorodnikowymi. Wła ściwo ści antyoksydacyjne wykazuje tak Ŝe kwas moczowy, który wi ąŜ e jony metali i wychwytuje rodnik hydroksylowy. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza i peroksydaza glutationowa to enzymy katalizuj ące reakcj ę dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego [25]:

.- .- . O2 + O 2 + 2H →→→ H2O2 + O 2 (64)

Dysmutaza ponadtlenkowa wyst ępuje w postaci wewn ątrz- i zewn ątrzkomórkowej. Posta ć wewn ątrzkomórkowa ma form ę mitochondrialn ą z manganem w centrum aktywnym (MnSOD) i cytoplazmatyczn ą z miedzi ą i cynkiem (Cu/Zn SOD). Posta ć

84 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki zewn ątrzkomórkowa (EC-SOD) rozkłada rodnik ponadtlenkowy w przestrzeni pozakomórkowej, dzi ęki czemu chroni powierzchni ę naczy ń przed działaniem rodnika ponadtlenkowego [25]. Istotn ą rol ę w ochronie komórek przed produktami utleniania, czyli w procesie odtruwania organizmu, odgrywaj ą S-transferazy glutationowe (EC 3.1.2.7). Jest to grupa enzymów drugiej fazy metabolizmu, która przeciwdziała procesom powstawania nowotworów. Enzymy te odgrywaj ą znacz ącą rol ę w detoksykacji i redukcji reaktywnych form tlenu oraz ich produktów. Katalizuj ą reakcje sprz ęgania glutationu z ró Ŝnymi zwi ązkami elektrofilowymi (w tym z ksenobiotykami). Inn ą funkcj ą S-transferaz glutationowych w obronie przed reaktywnymi formami tlenu jest katalizowanie reakcji sprz ęgania z glutationem aldehydowych produktów peroksydacji lipidów. Jedna z klas tych enzymów ma silne powinowactwo do 4-hydroksyalkenali [29]. Izoenzymy GST sklasyfikowano, jako alfa, pi oraz teta. Wykazuj ą one ró Ŝną dystrybucj ę i charakterystyk ę w poszczególnych tkankach. S-transferaza glutationu pi (GSTpi) odgrywa wa Ŝną rol ę w procesach detoksykacji, chroni ących komórki przed uszkodzeniem DNA, w tym tak Ŝe komórki nowotworowe przed toksyczno ści ą leków przeciwnowotworowych.

Literatura:

[1] A. Czajka, Wolne rodniki tlenowe a reakcje obronne organizmu, Nowiny Lekarskie 2006; 75: 582-586. [2] C.L. Hawkins, M. J. Davies, Generation and propagation of radical reactions on proteins, Biochimica et Biophysica Acta 2001; 1504: 196-219. [3] G. Bartosz, Druga twarz tlenu. PWN, Warszawa 2003. [4] L. Kłyszejko-Stefanowicz, Mitochondria. Cytobiochemia. PWN, Warszawa 1998, 579– 622. [5] H.A Headlam, M.J. Davies, Beta-scission of side-chain alkoxyl radicals on peptides and proteins results in the loss of side-chains as aldehydes and ketones, Free Radical Biology & Medicine 2002; 32: 1171–1184. [6] N.N. Punchard, F.J. Kelly, free Radicals-practical approach, Oxford University Press 1996, 2-50. [7] M.J. Davies, Singlet oxygen-mediated damage to proteins and its consequences. Biochemical and Biophysical Research Communications 2003; 305:761-770. [8] M.J. Davies, The oxidative environment and protein damage, Biochimica et Biophysica Acta 2005; 1703: 93– 109. [9] M. Gracanin, C.L. Hawkins, D.I. Pattison, M.J. Davies, Singlet-oxygen-mediated amino acid and protein oxidation: Formation of tryptophan peroxides and decomposition products, Free Radical Biology & Medicine 2009; 47: 92-102.

85 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

[10] E.R. Stadtman, Oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins by radiolysis and by metal-catalyzed reactions, Annu. Rev. Biochem 1993; 62: 797-821. [11] J. P ączkowski, (red), Fotochemia polimerów. Teoria i zastosowanie. Wydawnictwo Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu, 2003. [12] K.J.A. Davies, M.E. Delsignore, Protein damage and degradation by oxygen radicals. III. Modification of secondary and tertiary structure. J. Biol. Chem. 1987; 262: 9908-9913. [13] K.J.A. Davies, Intracellular proteolytic systems may function as secondary antioxidant defenses: an hypothesis. Free Rad. Biol. Med. 1986; 2:.155–173. [14] K.J.A. Davies, Protein damage and degradation by oxygen radicals. I General aspect, J. Biol. Chem. 1987; 262: 9895-9901. [15] C.A. Miles, A. Sionkowska, S. L. Hulin, T.J. Sims, N.C. Avery, A.J. Bailey. Identification of an intermediate state in the helix-coil degradation of collagen by ultraviolet light. Journal of Biological Chemistry 2000: 275 (42) 33014-33019. [16] P. Morgan, R.T. Dean, M..J. Davies, Protective mechanisms against peptide and protein peroxides generated by singlet oxygen. Free Radical Biology & Medicine, 2004; 36: 484-496. [17] C.L. Hawkins, M.J. Davies, Oxidative damage to collagen and related substrates by metal ion/hydrogen peroxide systems: random attack or site-specific damage?, Biochim. Biophys. Acta 1997; 1360: 84-96. [18] A. Sionkowska, T. Wess, Mechanical properties of UV irradiated rat tail tendon (RTT) collagen, Intarnational Journal of Biological Macromolecules, 2004; 34: 9-12. [19] L. Celewicz, Reakcje fotochemiczne pochodnych zasad pirymidynowych, Wydawnictwo UAM, Pozna ń, 1999. [20] M. Valko, M. Izakovic, M. Mazur, C. J. Rhodes, J.Telser, Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence, Molecular and Cellular Biochemistry 2004; 266: 37–56. [21] C. Chatgilialoglu, P. O'Neill, Free radicals associated with DNA damage, Experimental Gerontology 2001; 36: 1459-1471. [22] B.C. Gilbert, D.M. King, C.B. Thomas, The oxidation of some polysaccharides by the hydroxyl radical: An e.s.r. investigation . Carbohydrate Research 1984; 125: 217–235. [23] A. Sionkowska, H. Kaczmarek, M. Wi śniewski, J. Skopi ńska, S. Lazare, V. Tokarev, The influence of UV irradiation on the surface of chitosan films. Surface Science 2006; 600: 3775-3779. [24] D.V. Sakharov, E.D.R. Elstak, et al. Prolonged lipid oxidation after photodynamic treatment. Study with oxidation-sensitive probe C11-BODIPY581/591. FEBS Lett., 2005,; 579: 1255-1260. [25] J. Kulbacka, J. Saczko, A. Chwiłkowska, Stres oksydacyjny w procesach uszkodzenia komórek. Pol. Merk. Lek., 2009; XXVII: 157, 44. [26] R. Schueller, P.Romanowski; Multifunctional Cosmetics. Marcel Dekker Inc. New York Basel 2001. [27] A. Augustyniak, E. Skrzydlewska, Zdolnosci antyoksydacyjne w starzej ącym si ę organizmie. Postepy Hig. Med. Dosw. 2004; 58: 194–201. [28] S. Paszyc, Podstawy fotochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1992. [29] B. Halliwell. A super way to kill cancer cells. Nat. Med., 2000; 6: 1105-1106. [30] A. Balcerczyk G. Bartosz. Thiols are main determinants of total antioxidant capacity of cellular homogenates. Free Radic. Res., 2003; 37: 537-541. 86 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

[31] H. Barton,M. Fołta, Z. Zachwieja. Zastosowanie metod FRAP, ABTS i DPPH w badaniu aktywnosci antyoksydacyjnej produktów spoŜywczych, Nowiny Lekarskie 2005; 74: 4: 510–513. [32] J.F. Rabek, Polymer Photodegradation: Mechanisms and experimental methods. Chapman & Hall, London, 1995. ]33] B. Marciniak, (red),Metody badania mechanizmów reakcji fotochemicznych, Wydawnictwo Naukowe UAM, Pozna ń, 1999. [34] A. Sionkowska, Laser flash photolysis and pulse radiolysis study of collagen in acetic acid solution. .J. Photochem. Photobiol. Part B: Biology 2006; 84: 38-45. [35] J. Kroh, Wolne rodniki w chemii radiacyjnej. PWN Warszawa 1967. [36] G. Kciuk, Wpływ grup funkcyjnych aminokwasów na mechanizmy reakcji rodnikowych w peptydach zawieraj ących tyrozyn ę. Rozprawa doktorska, ICHTJ Warszawa 2011. [37] E. Gałecka, M. Mrowicka, K. Malinowksa et al. Wybrane substancje nieenzymatyczne uczestnicz ące w procesie obrony przed nadmiernym wytwarzaniem wolnych rodników. Pol. Merk. Lek., 2008; 25: 147: 269-272. [38] M.J.Davies, R. J.W. Truscott, Photo-oxidation of proteins and its role in cataractogenesis, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 2001; 63: 114–125. [39] B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford University Press inc, New York 2012.

87 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Projekt pn. „ Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych ” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki

SPIS TRE ŚCI

CZ ĘŚĆ I. WOLNE RODNIKI W CHEMII

1. Poj ęcie i rodzaje rodników ...... 2 2. Nomenklatura rodników...... 6 3. Powstawanie rodników...... 8 4. Trwało ść i charakter rodników...... 13 5. Przykłady reakcji z udziałem wolnych rodników...... 15 6. Nadtlenek wodoru i rodniki hydroksylowe...... 18 7. Reakcje Fentona...... 19 8. Halogenowanie w ęglowodorów...... 20 9. Reakcje w atmosferze...... 21 10.Reakcje polimeryzacji...... 25 11.Reakcje degradacji polimerów...... 30 12. Reakcje jonorodników...... 32 13. Metody badania rodników...... 34 Literatura……………………………………………………………………………………38

CZ ĘŚĆ II. WOLNE RODNIKI W BIOLOGII I MEDYCYNIE

14. Źródła wolnych rodników w organizmach Ŝywych i stres oksydacyjny………….….…..40 15. Reakcje rodnikowe w aminokwasach…………………………………….………....…....45 16. Reakcje rodnikowe w białkach………………………………………………………...…52 17. Reakcje rodnikowe w kwasach nukleinowych…………………………………….…..…57 18. Reakcje rodnikowe w polisacharydach………………………………………………...…61 19. Reakcje rodnikowe w lipidach…………………………………………………….…..….64 20. Fotostarzenie i produkty promieniochronne……………………………………………...66 21. Wolne rodniki jako przyczyny chorób………………………………………………..….69 22. Metody bada ń reakcji rodnikowych w makrocz ąsteczkach pochodzenia biologicznego...71 23. Fotoliza błyskowa……………………………………………………………………….. 72 24. Radioliza impulsowa …………………………………………………………………….78 25. Zmiatacze wolnych rodników w organizmach Ŝywych. Antyutleniacze………………...81 Literatura…………………………………………………………………………………….. 85

Spis tre ści ………………………………………………………………….…………………88

88 ______

Projekt współfinansowany przez Uni ę Europejsk ą w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego