Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Determinação da idade fetal em asininos da raça Mirandesa e Zamorano-Leonesa através de ultrassonografia transretal

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária

Ana Filipa Colaço Freire

Orientador: Doutor Miguel Nuno Pinheiro Quaresma

Vila Real, 2020

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Determinação da idade fetal em asininos da raça Mirandesa e Zamorano-Leonesa através de ultrassonografia transretal

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária

Ana Filipa Colaço Freire

Orientador: Doutor Miguel Nuno Pinheiro Quaresma

Composição do Júri:

➢ Doutora Ana Patrícia Antunes Lopes ➢ Doutor Mário Manuel Dinis Ginja ➢ Doutor Miguel Fernandes Nóvoa ➢ Doutor Miguel Nuno Pinheiro Quaresma

Vila Real, 2020

iii

iv DECLARAÇÃO

NOME: Ana Filipa Colaço Freire

C.C.: 14779036

CORREIO ELECTRÓNICO: [email protected]

DESIGNAÇÃO DO MESTRADO: Mestrado Integrado em Medicina Veterinária

TÍTULO DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA: Determinação da idade fetal em asininos da raça Mirandesa e Zamorano-Leonesa através de ultrassonografia transretal

ORIENTADOR: Doutor Miguel Nuno Pinheiro Quaresma

ANO DE CONCLUSÃO: 2020

Declaro que esta dissertação de mestrado é resultado da minha pesquisa pessoal e da orientação do meu supervisor. O seu conteúdo é original e todas as fontes consultadas estão devidamente mencionadas no texto e na bibliografia final. Declaro ainda que este trabalho não foi apresentado em nenhuma outra instituição para obtenção de qualquer grau académico.

Vila Real, 06 de maio de 2020

Ana Filipa Colaço Freire

v

vi

‘‘Alto céu, alta luz, alta pureza.

Ascensão da granítica aspereza

Dos homens e do chão.

Guiada pela mão

Da fome insatisfeita,

A teimosa charrua da vontade

Lavra e semeia as fragas da planura.

Mas a grande colheita

É de serenidade:

A paz azul em cada criatura.’’

(Miguel Torga, Miranda do Douro 1976)

vii

viii Agradecimentos

À Mui Nobre Academia, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, a todos os professores e auxiliares com quem me fui cruzando, o meu muito obrigada. Obrigada pela partilha de conhecimentos e entrega de ferramentas fundamentais para o meu futuro profissional.

Ao meu orientador, Doutor Miguel Quaresma, por todo o apoio, disponibilidade, paciência e amizade. Agradeço-lhe por ter confiado em mim este tema, apesar de todas as dificuldades. Obrigada por me transmitir a paixão pelo Burro de Miranda, pelo Planalto Mirandês e por me dar a conhecer as melhores ‘‘febras do mundo’’.

Ao Dr. Jesús Pérez, pela preciosa ajuda neste trabalho ao abrir as portas da sua exploração e pelo contributo que tem tido na preservação da Raça Zamorano-Leonesa. Obrigada por toda a disponibilidade e por toda a simpatia.

Ao Professor Doutor Severiano Silva, por todo o contributo prestado no presente trabalho e ao longo dos anos como docente. Agradeço-lhe a sua disponibilidade, amabilidade com que me recebeu e paciência que teve para responder a todas as minhas dúvidas.

A todos os que tive oportunidade de conhecer ao longo dos meus estágios curriculares, tanto em Portalegre como na ilha Terceira. Um agradecimento a toda a equipa da Vetal e da UNICOL, a todos os Médicos Veterinários, Enfermeiros Veterinários, técnicos e produtores que conheci, pela oportunidade que me disponibilizaram e por todos os ensinamentos que me transmitiram durante os meus 6 meses de estágio. Obrigada à Mariana, Toscano e Raso, as minhas preciosas companheiras de estágio. Sem vocês não teria sido a mesma coisa.

A todas as pessoas que me acolheram como se fosse parte da sua família durante o meu período de estágio: Joaquina, Pedro, Miguel e Emiliana. Obrigada pelo carinho e amizade que criamos. Tenho-vos no coração e nunca esquecerei tudo o que fizeram por mim.

À AEPGA, pela disponibilização dos animais que entraram neste estudo, por me terem permitido e apoiado na realização deste meu trabalho. Obrigada a todas as pessoas que tive a felicidade de conhecer ao longo destes anos como voluntária burriqueira. Um agradecimento muito especial às incríveis Belén e Daniela, ao Aníbal, Daniel e Ricardo e à minha querida Carolina. Obrigada pela vossa amizade e carinho, estou-vos eternamente grata por todos os

ix momentos inesquecíveis que partilhamos e por tudo o que me ensinaram. Burriqueira uma vez, burriqueira sempre!

À família que construí em Vila Real ao longo destes 6 anos. São tantos os que fizeram este percurso ser inesquecível por isso peço já desculpa se não conseguir mencionar todos.

Aos de sempre e para sempre: meus compinchas Bia, Jorge e Carla; meus pequenos rebentos, Remoaldo, Daniel e Will. À minha madrinha de coração, Pilão, por todo o seu apoio incondicional. Um obrigada especial os meus rapazes Carlos e Zé. Obrigada por todos os momentos de diversão e, vá, alguns de estudo. Sem vocês não tinha a mesma piada.

Às minhas companheiras de vida, viagens e sonhos: as minhas Catarina, Margarida, Sara, Vilaça e Water. Por estarem sempre perto de mim quando preciso, por me apoiarem em tudo e por me transmitirem tanto carinho. Pela amizade, partilha de gargalhadas e lágrimas. Por fazerem de mim uma pessoa melhor. Desculpem lá qualquer coisinha!

Ao meu irmão Pedro, por me fazer querer ser uma melhor pessoa, filha, neta e irmã. Por tudo o que partilhamos e ainda iremos partilhar. Por seres o meu orgulho.

À minha mãe e ao meu pai, por serem quem são e por me tornarem aquilo que sou hoje. Não há palavras suficientes para vos agradecer todo o vosso carinho, por terem acreditado sempre em mim e por me tornarem mais forte. Devo-vos tudo aquilo que sou e têm todo o meu amor. Esta conquista é também vossa.

Aos meus queridos avós, Mira, Neca, Gena e Colaço, os meus pilares, os meus exemplos de vida e os meus melhores amigos. Obrigada por todo o vosso amor, por todos os conselhos e raspanetes. Obrigada por fazerem a minha vida ter sentido.

x Resumo

A população de asininos a nível mundial tem aumentado ao longo das últimas décadas apesar de no continente europeu as populações de burros terem sofrido um declínio muito acentuado. São aqui várias as raças asininas consideradas em risco de extinção, como é o caso da Raça Asinina de Miranda (raça autóctone portuguesa) e da Raça Zamorano-Leonesa (raça autóctone espanhola). A falta de um bom protocolo de reprodução e de uma seleção cuidada dos reprodutores pode levar a consequências graves em termos de preservação genética da espécie asinina e de algumas raças europeias em especial. Em termos reprodutivos, a ultrassonografia transretal é a principal técnica utilizada para avaliar o estado gestacional das fêmeas, sendo um procedimento rápido e fácil de executar em contexto de campo. Com esta técnica é possível visualizar a órbita fetal e, através da sua medição, avaliar o crescimento fetal, determinar a idade gestacional e prever com uma boa margem de segurança quantos dias faltam para o parto. Neste trabalho procedeu-se à examinação de 47 ultrassonografias transretais de 22 fêmeas gestantes pertencentes às duas raças autóctones asininas Ibéricas referidas, durante cerca de dois anos, em Atenor (Portugal) e Villardondiego (Espanha). O principal objetivo do estudo caracterizou-se pela medição e registo do comprimento e largura das órbitas fetais durante o período gestacional de forma a determinar a idade fetal. Foi igualmente alvo de estudo a descrição da influência de diversos fatores maternos, paternos e fetais na medição ocular fetal e na duração de gestação. Com base na análise estatística efetuada para a Raça Asinina de Miranda foi possível identificar que ambos os modelos de regressão linear aplicados (modelo de regressão linear simples e modelo de regressão polinomial de grau dois) indicaram significância estatística na associação entre as variáveis testadas (p < 0,0001). Para as variáveis dependentes analisadas (dias após conceção e dias até ao parto) o modelo que melhor se ajustou à amostra e obteve menor desvio padrão residual foi o modelo polinomial de grau dois. Com base nos três parâmetros fetais testados (comprimento, largura e área ocular), a medição do comprimento ocular revelou ser a variável que melhor previu a idade fetal [idade fetal = 6,43 + 100,05*comprimento (cm) + 9,44*(comprimento (cm)-1,86)²] e os dias até ao parto [DAP = 366,16 - 102,67*comprimento (cm) - 9,46*(comprimento (cm) - 2,01)2] seguindo-se as variáveis da área ocular e a largura ocular.

xi Para a raça Zamorano-Leonesa foi possível obter um modelo estatístico - árvore de regressão - para determinação dos dias que faltam até ao parto em nove fêmeas gestantes. Este estudo apresenta informações novas sobre como estimar a idade gestacional e prever a data do parto em asininos, contribuindo assim, para a promoção do estudo reprodutivo destas duas raças autóctones em perigo de extinção e dos asininos em geral.

Palavras-chave: asininos, gestação, ultrassonografia transretal, medição ocular, idade fetal

xii Abstract

The estimate world donkey population has increased over the last decades, although donkey populations have declined sharply on the European continent. There are several donkey breeds considered to be at risk of extinction, such as the Portuguese donkey breed, Asinina de Miranda, and the Spanish donkey breed, Zamorano-Leones. The lack of a good breeding protocol and breeder selection can lead to serious consequences for the genetic preservation of donkeys, particularly in some European breeds.

In reproductive terms, transrectal ultrasonography is the main technique used to assess the gestational status of females, being a quick and easy procedure to perform in the field context. With this technique it is possible to visualize fetal orbit and, through its measurement, evaluate fetal growth, determine gestational age and estimate, with a good margin of safety, how many days are missing in foaling.

In this work, 47 transrectal ultrasonographic examinations were performed in 22 pregnant females belonging to the two indigenous Iberian donkey breeds referred, for about two years, were examined in Atenor (Portugal) and Villardondiego (Spain). The main objective of the study was to measure and record the length and width of fetal orbits during the gestational period to determine fetal age. A description of the influence of several maternal, paternal and fetal factors on fetal eye measurement and gestation duration was also studied.

Based on the statistical analysis performed for the breed Asinina de Miranda, it was possible to identify that both linear regression models applied (simple linear regression model and second order polynomial regression model) indicated statistical significance in the association between the tested variables (p < 0.0001). For the dependent variables analyzed (days after conception and days before parturition) the model that best fit the sample and obtained the lowest residual standard deviation was the second order polynomial regression model. Based on the three fetal parameters tested (length, width and eye area), the measurement of eye length was the variable that best predicted fetal age [fetal age = 6,43 + 100,05 * length (cm) + 9,44 * (length (cm) -1,86)2] and the days before parturition [DBP = 366,16 – 102,67 * length (cm) – 9,46 * (length (cm) - 2,01)2] followed by eye area and eye width variables.

For the Zamorano-Leones breed it was possible to obtain a regression tree model for estimating days before parturition in nine pregnant jennies.

xiii This study provides new information on how to estimate gestational age and predict days before parturition in donkeys, thus contributing to the promotion of reproductive study of these two endangered breeds and for the donkeys in general.

Key words: donkeys, pregnancy, transrectal ultrasonography, eye measurement, fetal age

xiv Índice Geral

1. Introdução ...... 1

1.1 Objetivos do trabalho ...... 2

2. Revisão Bibliográfica ...... 3

2.1 Origem do burro doméstico ...... 3

2.2 Caracterização da população de asininos ...... 4

2.2.1 A nível mundial ...... 4

2.2.2 Na Europa ...... 6

2.3 A Raça Asinina de Miranda ...... 10

2.4 A Raça Zamorana-Leonesa ...... 13

2.5 Ciclo éstrico e comportamento reprodutivo da fêmea asinina ...... 16

2.6 Gestação em asininos ...... 19

2.6.1 Placenta ...... 20

2.6.2 Endocrinologia na gestação ...... 21

2.7 Ultrassonografia na gestação ...... 24

2.7.1 Desenvolvimento do embrião ...... 26

2.7.2 Desenvolvimento e determinação da idade fetal ...... 29

3. Material e Métodos ...... 39

3.1 Descrição da área de estudo ...... 39

3.2 Caracterização da população em estudo ...... 42

3.3 Recolha de dados ...... 43

3.4 Tratamento estatístico ...... 46

4. Resultados e Discussão ...... 49

4.1 Avaliação reprodutiva geral ...... 49

4.2 Comparação de parâmetros reprodutivos ...... 52

4.2.1 Raça Asinina Portuguesa ...... 54

xv 4.2.2 Raça Asinina Espanhola ...... 56

4.3 Análise das medições oculares fetais ...... 58

4.3.1 Sucesso na obtenção das medições oculares ...... 58

4.3.2 Influências no desenvolvimento ocular fetal ...... 60

4.3.3 Previsão da idade fetal ...... 62

4.3.4 Previsão do dia do parto ...... 67

5. Conclusões ...... 73

6. Bibliografia ...... 75

xvi Índice de Figuras

Figura 1 - Produção mundial de asininos no ano de 2017, adaptado de (FAOSTAT, 2019). .. 5 Figura 2 – Exemplares adultos da Raça Asinina de Miranda (fotografia de autor)...... 11 Figura 3 - Exemplares adultos de asininos da Raça Zamorano-Leonesa (fotografia de autor)...... 15 Figura 4 - Realização de ultrassonografia transretal em fêmea da Raça Asinina de Miranda em contexto de campo (fotografia de autor)...... 25 Figura 5 - Imagens ultrassonográficas do olho fetal de uma cria da Raça Asinina de Miranda aos 205 dias (A), 245 dias (B), 275 dias (C) e 311 dias (D) de idade; (imagens de autor)...... 31 Figura 6 - Representação esquemática dos locais de recolha de dados para a realização do presente estudo: Atenor (Portugal) e Villardondiego (Espanha)...... 39 Figura 7 - Aparelhos ultrassonográficos portáteis utilizados para a recolha de imagens: (A) em Atenor, para a Raça Asinina de Miranda; (B) em Villardondiego, para a Raça Zamorano- Leonesa, com câmara de vídeo acoplada (fotografias de autor)...... 44 Figura 8 - O comprimento ocular (C) é determinado pela distância compreendida entre os dois polos oculares, dentro do corpo vítreo. A largura ocular (L), perpendicular a (C) e realizando uma bissetriz com o cristalino, é medida pela distância entre a córnea e a retina (imagem de autor)...... 45 Figura 9 - Crias nascidas durante o período de estudo: (A) e (D) pertencentes à raça Asinina de Miranda, (B) e (C) pertencentes à raça Zamorano-Leonesa (fotografias gentilmente cedidas pela Dra. Bélen Leiva e Dr. Jesús Pérez)...... 50 Figura 10 - Representação esquemática das 22 gestações observadas durante o presente estudo...... 51 Figura 11 - Imagem ultrassonográfica da órbita ocular fetal. A medição ocular era realizada com a presença de córnea (a), câmara anterior (b), cristalino (c) e corpo vítreo (d) visíveis (imagem de autor)...... 59 Figura 12 – Modelo de regressão em árvore para a determinação dos dias até ao parto na Raça Zamorano-Leonesa...... 71

xvii

xviii Índice de Tabelas

Tabela 1 - Número de burros na Europa: diferença entre o número registado de animais como sendo de raça pura (direita) e o número total de asininos em cada país (esquerda), adaptado de (Camillo et al., 2017)...... 7 Tabela 2 - Comparação estatística entre determinados parâmetros reprodutivos nas duas raças analisadas...... 53 Tabela 3 – Associação estatística entre a duração de gestação e determinadas variáveis testadas...... 55 Tabela 4 - Determinação da idade fetal para a Raça Zamorano-Leonesa com base no estudo realizado por Galisteo et al. (2010)...... 56 Tabela 5 - Correlações ente medições oculares fetais e alguns parâmetros materno-paterno- fetais na Raça Asinina de Miranda (n = 36)...... 61 Tabela 6 - Comparação entre o modelo de regressão linear simples e polinomial de grau dois através de coeficientes de determinação e de raízes dos erros quadráticos médios para os dias após conceção...... 64 Tabela 7 - Escala de referência para a prática clínica com base nos resultados obtidos no presente estudo na Raça Asinina de Miranda: determinação da idade fetal com base no comprimento ocular...... 66 Tabela 8 – Comparação entre o modelo de regressão linear simples e polinomial de grau dois através de coeficientes de determinação e de raízes dos erros quadráticos médios para dias até ao parto...... 68

xix

xx Índice de Gráficos

Gráfico 1 - Número total de asininos a nível mundial desde o ano de 1997 até 2017, adaptado de (FAOSTAT, 2019)...... 4 Gráfico 2 - Comparação dos perfis séricos de eCG através de medições semanais em: (A) burras gestantes de fetos da sua própria espécie, (B) burras gestantes de um cruzamento interespécie; adaptado de (Stewart et al., 1976)...... 23 Gráfico 3 - Regressão linear entre o diâmetro da vesícula embrionária e a idade gestacional durante os primeiros três meses de gestação em asininos, adaptado de (Nervo et al., 2019). . 28 Gráfico 4 - Comparação gráfica entre dois modelos de regressão linear: simples (B, D, F) e polinomial de grau 2 (A, C, E); A variável dependente utilizada foi “dias após conceção” e a independente foram as várias medições oculares: comprimento (A e B), largura (C e D) e área ocular (E e F)...... 63 Gráfico 5 - Comparação gráfica entre dois modelos de regressão linear: simples (B, D, F) e polinomial de grau 2 (A, C, E). A variável dependente utilizada foi “dias até ao parto” e independente foram as várias medições oculares: comprimento (A e B), largura (C e D) e área ocular (E e F)...... 69

xxi

xxii Lista de abreviaturas/símbolos/acrónimos

% - Percentagem FAOSTAT - Food and Agriculture Organization Corporate Statistical Database AEPGA - Associação Para O Estudo E Proteção Do Gado Asinino FSH - Hormona folículo-estimulante

ASZAL - Asociación Nacional de FHR - Frequência cardíaca fetal Criadores de la Raza Asnal Zamorano- LH - Hormona luteinizante Leonesa kg – Quilograma bpm - Batimentos cardíacos por minuto µg - Micrograma CCC - Comprimento crânio-caudal Mhz - Megahertz cm - centímetros mm - Milímetros CTUP - Espessura combinada do útero e placenta ng/mL - Nanogramas por mililitro

DAD-IS - Domestic Animal Diversity p - Probabilidade de significância Information System PGF2α - Prostaglandina F2 alfa

DBP - Diâmetro biparietal r² - coeficiente de determinação RMSE - raiz do erro quadrático médio eCG - Gonadotrofina coriónica equina (desvio padrão residual) FAO - Food and Agriculture Organization USG - Ultrassonografia of the United Nations

xxiii

xxiv 1. Introdução A população de asininos (Equus asinus), a nível mundial, tem sofrido um aumento gradual principalmente devido ao crescimento do número de burros em regiões específicas do globo: região da África subsariana, norte do subcontinente indiano e em determinadas regiões da América Latina (Starkey & Starkey, 2000).

Contrariamente a este aumento, o número de burros na Europa tem sofrido um acentuado declínio. Durante centenas de anos, o burro foi reconhecido como um importante meio de transporte e ferramenta útil na prática da agricultura em países mediterrâneos. Contudo, com o surgimento da revolução industrial, este foi dispensado das suas funções sendo substituído maioritariamente por maquinaria agrícola e meios de transporte mecanizados (Carluccio et al., 2008; Kugler et al, 2008).

A população de burros de cada raça asinina europeia tem vindo a diminuir para níveis preocupantes, encontrando-se muitas delas em risco de extinção (Starkey & Starkey, 2000), tal como é o caso da Raça Asinina de Miranda e da Raça Zamorana-Leonesa, existindo um elevado risco de desaparecimento destas raças num curto espaço de tempo. Para contrariar esta tendência, as possibilidades de utilização destes animais deverão ser reavaliadas. Sendo hoje em dia cada vez mais utilizados para produção de leite, para terapias como a asinoterapia, como animal de companhia ou para a produção mulateira, com o objetivo de realizar trabalho agrícola em locais onde não é permitido o uso de máquinas (Carluccio et al., 2008).

A maioria dos trabalhos de pesquisa realizados nesta espécie tem como base a obtenção de informações o mais detalhadas possível, com o objetivo de aumentar o desempenho e a atividade reprodutiva destes animais (Carluccio et al., 2008). Em termos reprodutivos, a ultrassonografia transretal em equinos é a principal técnica utilizada para avaliar o estado gestacional das fêmeas, sendo um procedimento rápido e fácil de executar em contexto de campo e que se pode aplicar igualmente em asininos. Com esta técnica é possível visualizar a órbita fetal durante quase toda a gestação (Bucca et al., 2005) e, através da sua medição, é possível avaliar o crescimento fetal (Renaudin et al., 2000; Hendriks et al., 2009; Murase et al., 2014) e determinar a sua idade gestacional (Turner et al., 2006; Hartwig et al., 2013).

1 1.1 Objetivos do trabalho

Neste trabalho procedeu-se à examinação através da ultrassonografia transretal de diversas fêmeas gestantes pertencentes a duas raças autóctones asininas (portuguesa - Burro de Miranda; e espanhola - Zamorano-Leonês) consideradas atualmente em risco de extinção.

O presente estudo teve como principais objetivos:

a) Auxiliar na prevenção do contínuo declínio das populações asininas europeias; b) Contribuir com novos conhecimentos para o estudo reprodutivo de duas raças de burros que se encontram em risco de extinção e para a reprodução dos asininos em geral; c) Realizar um acompanhamento gestacional através de ultrassonografia transretal em duas raças asininas ibéricas: Raça Asinina de Miranda e Raça Zamorano-Leonesa; d) Apresentar novas informações sobre como estimar a idade gestacional ou prever a data do parto em asininos; e) Estudar e descrever a influência de diversos fatores materno-paterno-fetais na medição ocular durante o desenvolvimento fetal e na duração de gestação; f) Medir e registar o comprimento e a largura das órbitas fetais durante o período gestacional de forma a caracterizar dois dos principais marcadores de idade fetal.

2 2. Revisão Bibliográfica

2.1 Origem do burro doméstico

O burro doméstico (Equus asinus) é descendente do burro selvagem africano (Equus africanus). O local exato do início da sua domesticação é ainda incerto, mas os achados arqueológicos encontrados no Vale do Nilo, região Egípcia no Norte de África, apontam para que se tenha iniciado nesse local, há aproximadamente 5000 anos por habitantes locais (Beja-Pereira et al., 2004; Rossel et al., 2008; Han et al., 2014). Acredita-se ainda na possibilidade de que a domesticação tenha ocorrido em dois centros distintos que, por sua vez, deram origem a duas subespécies de burros domésticos: uma relacionada com o burro selvagem da Núbia (E. africanus africanus), que possivelmente já se encontra extinto, e outra relacionada com o burro selvagem da Somália (E. africanus somaliensis), encontrando- se este ainda presente na Etiópia e Somália (Beja-Pereira el al., 2004; Grigson, 2012) e que terá dado origem à maioria das raças europeias (Méndez et al., 2003). Os burros tornam-se os únicos ungulados a ser domesticados exclusivamente em África dado que as suas duas linhagens são provenientes do mesmo continente (Beja-Pereira et al., 2004). As semelhanças morfológicas encontradas entre burros (E. asinus) e cavalos (E. caballus) devem-se à partilha de género - Equus (Han et al., 2014).

Os burros são utilizados por diversas populações humanas como animais domésticos. O processo de domesticação do burro, através do seu uso no transporte de pessoas, rebanhos e mercadorias, fez com que fosse possível o desenvolvimento das trocas comerciais, um aproveitamento acrescido do território envolvente e o declínio do estilo de vida sedentário e gregário outrora vivido (Beja-Pereira el al., 2004; Rossel et al., 2008; Han et al., 2014). Este animal teve essencialmente um papel fundamental em regiões áridas e semiáridas (Han et al., 2014), permitindo desta forma que, há aproximadamente 5000-7000 anos, algumas sociedades do Nordeste de África tenham ultrapassado a desertificação do Saara (Beja- Pereira et al., 2004; Rossel et al., 2008) expandindo o seu comércio para a Ásia Ocidental (Rossel et al., 2008). Teve também um papel importante na domesticação de plantas e na alteração dos padrões africanos de produção alimentar (Marshall, 2007).

3 2.2 Caracterização da população de asininos

2.2.1 A nível mundial

De acordo com os últimos dados divulgados pela FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), a população mundial de burros, em 2017, é estimada em cerca de 45 milhões de animais, tendo esta sofrido um aumento desde o ano de 2014 após duas décadas de um crescimento relativamente estável (FAOSTAT, 2019), tal como se encontra representado no Gráfico 1. Segundo esta organização, é na Etiópia que se encontra a maior população de burros (8 milhões), seguindo-se o Paquistão (5 milhões) e a China (4 milhões). No ano de 2017, o continente africano liderou a produção de burros em termos mundiais, 51,9%; seguindo-se a Ásia com 32,6%; a América do Norte e do Sul com 14,6% e a Europa com 0,8% (Figura 1). Relativamente à Oceânia não se encontram registos.

Gráfico 1 - Número total de asininos a nível mundial desde o ano de 1997 até 2017, adaptado de (FAOSTAT, 2019).

A nível mundial, o número de burros tem vindo a aumentar de forma gradual nas últimas décadas, cumprindo as previsões da sua expansão para o início do século XXI. A sua distribuição mundial não é uniforme, concentrando-se principalmente em regiões semiáridas e montanhosas (Starkey & Starkey, 2000). Segundo estes autores, este aumento tem sido registado com maior intensidade em três regiões distintas do globo: na África Subsariana, onde se encontra registado o maior aumento do número de animais; no Norte do Subcontinente Indiano; e nas regiões mais montanhosas da América Latina. Por outro lado, contrariando esta tendência, o declínio da população de burros tem sido bastante acentuado na Turquia, nos países do Sul da Europa e na América do Norte.

4 Na maioria dos países verifica-se que estes animais são utilizados por homens, mulheres e crianças em diversas funções. O papel do burro a nível económico e social varia dependendo do local em que se encontra (The Donkey Sanctuary, 2017), sendo que mais de metade da população mundial de burros é utilizada para trabalho como animal de carga (FAO, 2018), maioritariamente para transporte de pessoas e mercadorias, para puxar carroças, lavrar terrenos, moer cereais, guardar rebanhos de ovelhas, no auxílio na captação de água (Starkey & Starkey, 2000) e no transporte de alimentação animal, carvão e madeira (Hiko et al., 2016).

Número de cabeças

Figura 1 - Produção mundial de asininos no ano de 2017, adaptado de (FAOSTAT, 2019).

Algumas barreiras culturais e desigualdades de género têm vindo a ser mitigadas pela utilização deste animal, uma vez que, com a sua contribuição no transporte de bens e no trabalho agrícola, as mulheres em algumas zonas do Globo têm as suas tarefas mais facilitadas (Bélanger & Pilling, 2019), originando uma nova fonte de rendimento. Um estudo realizado por Fernando et al. (1997) concluiu que quando as mulheres utilizavam o burro no transporte de água em vez de serem elas próprias a carregá-la, ganhariam cerca de 25 horas semanais extra. Com este ganho de tempo poderiam realizar outras tarefas domésticas, comunitárias ou simplesmente descansar. Em alguns países, como Itália e China, o burro pode ser explorado para a utilização da sua carne (Starkey & Starkey, 2000), sendo que na China o consumo da carne desta espécie é considerada uma especialidade tradicional e o preço é altamente inflacionado (The Donkey Sanctuary, 2017). A grande maioria da carne de burro nos países africanos, que é considerada uma fonte de proteína barata e de fácil acesso, é proveniente de animais muito velhos ou

5 incapacitados. Nos últimos anos houve um aumento abrupto na procura e utilização de burros como animal de produção pela sua pele devido ao seu uso pela Medicina Tradicional Chinesa (The Donkey Sanctuary, 2017).

A importância do burro é notória em países que se encontram num processo contínuo de urbanização e industrialização, tal como é o caso do Brasil, visto existir um vasto setor agrícola nos meios rurais que não têm acesso à mecanização do trabalho. Neste país a população de burros permanece estável apesar de muitas vezes ser associada a práticas retrógradas e existir uma pressão social para a sua eliminação e substituição por maquinaria (Starkey & Starkey, 2000).

2.2.2 Na Europa

No final do século XVIII deu-se início à criação de raças asininas no Norte e Centro da Europa resultado do isolamento geográfico e da utilização agrícola por parte das diversas populações europeias. O número de raças asininas nessa época era bastante inferior comparativamente ao número existente nos dias de hoje, apesar do facto do número exato de raças europeias de asininos ser ainda desconhecida. O efetivo de raças já identificadas tem vindo a diminuir e o seu maneio reprodutivo tem sido descuidado (Kugler, 2008). Das 60 raças europeias reportadas no website da Domestic Animal Diversity Information System apenas 28 têm descrições fenotípicas relativamente completas e dados atualizados coerentes de cada raça, distribuídas por sete países: Croácia, Espanha, França, Hungria, Itália, Portugal e Sérvia (Camillo et al., 2017). Para estes investigadores e, segundo os critérios da FAO com base na classificação das raças em relação ao grau de risco de extinção, a situação europeia apresenta-se da seguinte forma: 7 encontram-se em estado crítico, 20 em risco de extinção e apenas uma das 28 raças não se encontra em risco. Segundo a mesma fonte, para uma raça ser considerada em estado crítico tem de possuir número inferior a 500 fêmeas e 5 machos; em estado de risco de extinção tem de ter, no máximo, 1000 fêmeas e 20 machos e, somente ao apresentar números populacionais superiores aos referidos anteriormente, considera-se que a raça não se encontra em perigo de extinção.

6 Os últimos dados fornecidos pelos países europeus indicam-nos que o número de animais reportados como sendo de raça pura é muito inferior ao número total de burros registados a nível nacional (Camillo et al., 2017), tal como se encontra representado na Tabela 1. A falta de um bom protocolo de reprodução e uma seleção cuidada dos reprodutores leva a consequências graves em termos de preservação genética da espécie. Como exemplo temos o caso do burro Arcadian, única raça original da Grécia, que em menos de 5% da sua população é possível identificar as características morfológicas típicas da raça. Este facto é resultado da utilização de machos provenientes de vários países vizinhos nos programas de reprodução, o que levou a uma elevada diversidade fenotípica (Arsenos et al., 2017).

Com a existência de um baixo número de exemplares da mesma raça faz com que o cruzamento entre estes indivíduos aumente os níveis de consanguinidade e diminua os valores fenotípicos médios o que, consequentemente, contribui para a diminuição do número de raças europeias (Kugler et al., 2008).

Tabela 1 - Número de burros na Europa: diferença entre o número registado de animais como sendo de raça pura (esquerda) e o número total de asininos em cada país (direita), adaptado de (Camillo et al., 2017).

País DAD-IS, 2017 FAOSTAT, 2017 Croácia 2740 2153 França 1891 15000 Hungria 354 2000 Itália 8180 24900 Portugal 1480 115000 Espanha 3972 140000 Sérvia 750 -

A sobrevivência das várias raças de burros e o incremento da sua população encontram- se, também, diretamente relacionados com o retorno económico que se pode obter destes animais e dos seus produtos. É essencial conhecer a utilização desta espécie no passado para mudar o paradigma atual. Durante centenas de anos os burros foram utilizados para a produção de mulas, sendo estas utilizadas para trabalhos de lavoura e uso militar no transporte de pessoas e bens nos terrenos acidentados das regiões montanhosas europeias. Na atualidade, a produção mulateira é rara e mais difícil ainda é adquirir uma mula já treinada, sendo possível constatar a sua presença em locais de difícil acesso ou de proibição

7 de uso de meios mecânicos, como é o caso de alguns parques naturais (Camillo et al., 2017). Em alguns países europeus também é possível observar a existência de mulas a serem utilizadas por produtores, sozinhas ou acompanhadas por cães de guarda, na defesa de pequenos ruminantes e cavalos contra predadores, como lobos ou cães assilvestrados, em zonas de pastagem de regiões montanhosas (SAVE Fundation, 2013).

Os burros podem ser utilizados para a manutenção da paisagem devido ao seu comportamento alimentar seletivo que auxilia determinadas espécies de plantas e insetos em risco de extinção. Em algumas regiões de Itália, os burros são usados como substituto de cavalos e bovinos para a manutenção do crescimento da vegetação nos olivais que requerem um pisoteio menos abrasivo, sendo este animal considerado ideal pelo seu peso (Camillo et al., 2017).

O consumo de carne de burro é limitado a alguns países europeus, situados a sudoeste, como é o exemplo de Itália, sendo aqui produzido salame proveniente de animais mais velhos. Acredita-se que o consumo de carne deste animal nos países Mediterrâneos poderá sofrer um aumento devido a uma maior disponibilidade de machos resultados da criação de burras para produção de leite (Camillo et al., 2017). Como nos últimos anos o leite de burra tem sido cada vez mais estudado e têm sido demonstradas as suas qualidades, contribuindo para uma maior aceitação por parte dos consumidores europeus. O leite de burra pode ser comercializado para a alimentação humana de diversas formas, nomeadamente: como líquido inteiro embalado, liofilizado, sob a forma de queijo (SAVE Fundation, 2013) ou associado a chocolate (Le Quartier des Ânes, 2019).

Quando comparado com o leite de cabra, o consumo de leite de burra proporciona um aumento no número de interleucinas e do fator de necrose tumoral; e quando comparado ao leite de vaca, possui valores mais elevados de componentes antiaterogénicos e antitrombogénicos. É recomendado o seu consumo como alimento complementar a indivíduos doentes ou idosos que possuem o sistema imunitário deprimido. É considerado como uma boa alternativa ao leite de vaca ou ao leite humano em indivíduos que possuem doenças alérgicas, atopia ou problemas inflamatórios (Jirillo et al., 2010). O leite de burra tem diversos benefícios para a saúde humana, podendo ser recomendado a crianças que possuem alergia ao leite de vaca (Pilla et al., 2010; Machacova et al., 2013; Polidori & Vincenzetti, 2013). O leite de burra é conhecido há milhares de anos pelas suas propriedades

8 antienvelhecimento, sendo utilizado em produtos de cosmética sob a forma de cremes ou sabonetes (Camillo et al., 2017).

A terapia assistida por asininos tem sido associada ao tratamento de diversas doenças físicas e mentais, com excelentes resultados, auxiliando no desenvolvimento cognitivo de crianças, estimulando a comunicação verbal e não-verbal, contribuindo para o aumento da confiança, promovendo a libertação emocional e o poder de responsabilidade individual (Rose, 2011). A disseminação deste tipo de terapia está muito dependente dos apoios financeiros acordados pelas políticas de cada país. A sua procura tem sofrido um aumento nos últimos tempos e, ao ser comparada com a hipoterapia, apresenta ter mais vantagens, visto que, os animais são tendencialmente mais pequenos, lentos e possuem pelo mais comprido e suave, o que facilita a interação e o contacto para com as pessoas (Camillo et al., 2017).

Apesar de conhecermos bem a espécie ainda temos pouca informação sobre este animal. A informação existente no Sudeste da Europa sobre os burros é diminuta devido à sua má reputação (Kugler et al., 2008). Apesar do aumento do número de animais verificado no Norte e Oeste da Europa, esse valor não é suficiente para equilibrar o declínio observado por todo o continente devido à perda abrupta de animais no Sul e Este europeu (Starkey & Starkey, 2000; SAVE Fundation, 2013; FAOSTAT, 2019). Ao compararmos os dados de 1997 e de 2017, concluímos que o número de asininos na Europa, num período de vinte anos, diminuiu para menos de metade (813257 e 385164 animais, respetivamente) (FAOSTAT, 2019).

9 2.3 A Raça Asinina de Miranda

A Raça Asinina de Miranda, também denominado Burro de Miranda, é uma das seis raças autóctones de equídeos portuguesas. O Burro de Miranda e o Burro da Graciosa são as duas raças de asininos nacionais (Kugler et al., 2008; Dantas & Espadinha, 2014) tendo fenótipos bastante distintos (DGAV, 2019) e encontrando-se ambas em risco de extinção (DAD-IS, 2019).

O padrão da raça é definido por diversas características morfológicas e comportamentais. O Burro de Miranda é descrito por Quaresma et al. (2005) como sendo um animal com boas conformações, acromegalia, grande rusticidade e corpulência. Segundo os autores, a altura recomendável nos adultos é de 1,35 metros. A pelagem é abundante, grossa, comprida, acentuando o seu tamanho em determinadas partes do corpo como nos costados, face, entre- ganachas, bordos das orelhas e extremidades dos membros. Em relação à cor, esta é castanha escura, com gradações mais claras na face inferior do tronco e costados e, também, pelos brancos no focinho e no contorno dos olhos (Figura 2). A cabeça destes animais é volumosa, com perfil reto, fronte larga e ligeiramente côncava na linha mediana, com bastante pelo a cobrir. Os lábios são grossos e fortes e as orelhas são largas na base, arredondadas na ponta e de grandes dimensões, sendo revestidas no seu interior por bastante quantidade de pelo e dirigidas cranialmente. Possui pescoço curto, grosso e garrote baixo. O dorso é tendencialmente horizontal, curto e bem musculado. Tem tórax profundo, quilha saliente, costado encurvado e ventre volumoso. Em relação aos membros, estes são grossos, com articulações volumosas e com bastantes pelo a cobrir os amplos cascos (Quaresma et al., 2005).

O seu andamento é lento e de grande amplitude, conferindo a estes animais uma menor agilidade (Quaresma et al., 2005). Estas particularidades facilitaram a sua adaptação à área geográfica de origem, o Nordeste de Portugal (Quaresma et al., 2016). Em termos de comportamento, este apresenta um temperamento calmo e dócil, facilitando a sua utilização no trabalho agrícola, na produção de leite e na asinoterapia (Quaresma & Payan-Carreira, 2015).

O maior núcleo de asininos desta raça encontra-se no Planalto Mirandês, localizado a Nordeste de Portugal, mais concretamente nos concelhos de Miranda do Douro, Bragança, Vimioso e Mogadouro. O concelho de Miranda do Douro é o solar da Raça Asinina de Miranda (Quaresma et al., 2005). O seu habitat são os lameiros, pastagens seminaturais de

10 caráter permanente (Pôças et al., 2006) que constituem a base de alimentação para os animais desta região, tanto ruminantes como equídeos domésticos, e encontram-se inteiramente dependentes da sazonalidade climática (Méndez & Aguiar, 2010). Esta região caracteriza-se por ter um clima sub-húmido, com uma grande disparidade ao longo do ano no que toca à disponibilidade de água, carecendo na época de Verão e existindo superabundância no Inverno (Pôças et al., 2006). De modo consequente, estes animais que aqui habitam tornaram-se mais resistentes à escassez hídrica e são capazes de valorizar forragens de menor valor nutricional no período mais seco do ano (Quaresma et al., 2005).

Figura 2 – Exemplares adultos da Raça Asinina de Miranda (fotografia de autor).

Na região de Trás-os-Montes, mais concretamente no concelho de Miranda do Douro, com o intuito de preservar e proteger esta tão valiosa raça foi criada em maio de 2001 a Associação para o Estudo e Proteção do Gado Asinino (AEPGA). Para além de estar encarregue do Livro Genealógico da Raça (Quaresma et al., 2016), esta tem vindo a apoiar os criadores no apuramento genético da raça, promoção da execução de medidas sanitárias e zootécnicas e divulgação/sensibilização desta raça através de diversas passeios turísticos, exibições, concursos e leilões (Barbosa, 2003; Quaresma et al., 2005). Em junho de 2002 foi aprovado o Regulamento do Registo Zootécnico do Burro de Raça Mirandesa, composto pelo Registo de Nascimentos e Registo de Reprodutores. O Registo de Reprodutores é subdividido em dois registos: com ascendência conhecida e sem ascendência conhecida. Este

11 último foi realizado pela AEPGA, com o apoio do Serviço Nacional Coudélico, tendo sido inicialmente registado um total de 255 animais, até ao ano de 2005, todos cumprindo os parâmetros exigidos pelo Padrão da Raça. Cada animal foi fotografado e sujeito a uma recolha de sangue, sendo esta utilizada para a determinação do seu genótipo e criação de um banco de DNA da raça (Quaresma et al., 2005).

Atualmente, em 2019, estão registados 450 criadores, 780 fêmeas e 60 machos no Livro Genealógico sendo o ratio fêmea/macho de 13:1 (SPREGA, 2019). Contudo, apesar da homologação desta raça autóctone e do apoio da associação, o número de asininos tem vindo a diminuir ao longo dos anos. O fator de risco mais importante para a sobrevivência da Raça Asinina de Miranda é o aumento da percentagem de fêmeas a iniciar a vida reprodutiva tardiamente, sendo também identificados outros fatores como: elevada taxa de mortalidade neonatal, envelhecimento dos criadores, falta de fêmeas e machos disponíveis para reprodução, uso repetido dos mesmos machos nos cruzamentos, o facto de cerca de metade das fêmeas não se reproduzirem (Quaresma et al., 2016) e a existência de uma taxa de reprodução geral baixa (Quaresma et al., 2014).

O gado asinino tem sido utilizado no auxílio dos trabalhos agrícolas, mais concretamente na cultura tradicional de minifúndio, para tração, carga a dorso, sela e produção mulateira (Quaresma et al., 2005) tendo atualmente uma elevada importância económica e social para a população idosa em Trás-os-Montes. Com o envelhecimento da população e o êxodo rural, estes animais tornaram-se fundamentais para a realização de diversas tarefas, tais como, carregar compras, deslocações entre aldeias e transporte de lenha. Para isso, é importante que o animal possua temperamento calmo, facilitando o seu maneio, e que tenha porte baixo, para facilitar a subida para o animal, como é o caso desta raça asinina autóctone, comparativamente aos cavalos. Sendo assim, tendo em conta o temperamento, existe uma maior preferência na escolha de fêmeas, seguindo-se os machos castrados (Barbosa, 2003).

12 2.4 A Raça Zamorana-Leonesa

A raça de burros Zamorana-Leonesa é uma das seis raças autóctones de burros espanholas, sendo as restantes: o Asno de las Encartaciones, Balear, Majorena, Andaluza e Catalana (DAD-IS, 2019). A raça do burro Zamorano-Leonês teve origem na região da Cordilheira Cantábrica, entre o rio Órbigo e Cea (Kugler et al., 2008). O seu nome deve-se à localização geográfica onde é predominantemente criada, a província de Zamora, local onde se reuniram condições ambientais e de isolamento propensas ao desenvolvimento destes animais. Acredita-se que a sua existência remonta o século X, mas é só posteriormente, no século XIII, que esta raça asinina é exportada mundialmente (Kugler et al., 2008), tendo contribuído para a formação de diversas raças asininas, como a raça American Mamoth Jackass ou a raça francesa Poitou (García, 2009).

O burro Zamorano-Leonês era utilizado maioritariamente para a criação de mulas (Kugler et al., 2008; García, 2009), na agricultura e em trabalhos domésticos. As mulas, resultado do cruzamento de um burro inteiro com uma égua, tinham muito interesse devido à sua boa conformação, rusticidade, capacidade atlética para trabalhos pesados e temperamento calmo (García, 2009).

No início do século XX, esta raça sofreu as consequências da mecanização (García, 2009). A partir de 1980, o Ministério da Agricultura Espanhol considerou que esta raça autóctone devia ser sujeita a uma proteção extra. Em 1997 é considerada estar em perigo de extinção e, desta forma, os proprietários desde então têm recebido uma ajuda comunitária agroambiental. Para além desta ajuda, a Diputación Provincial de Zamora fornece apoio anual aos criadores com a finalidade de preservar, fomentar a raça e incentivar a venda de animais.

Com base nos censos realizados no final do ano de 2018, existe um total de 1488 animais e 447 criadores em Espanha (Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2019) e cerca de 98% dos animais encontram-se na zona mais oeste de Zamora, principalmente em Aliste e Alba, onde ainda é possível encontrar alguns burros a trabalhar como animais de carga e na agricultura, nomeadamente em hortas e vinha (Yanes & Martínez, 2007). Esta região caracteriza-se por possuir terrenos pobres, propriedades pequenas e orografia acidentada (García, 2009).

13 Um dos principais problemas na conservação desta raça é a idade avançada dos criadores e dos próprios animais, sendo estimado que cerca de 95% dos burros estão ao encargo de agricultores aposentados e cerca de 75% das fêmeas têm problemas reprodutivos tornando- as incapazes de ter crias (Kugler et al., 2008). Esta tendência é contrariada pela venda de animais para particulares e entidades a nível nacional e internacional como animal de companhia, para turismo equestre ou pelo propósito de conservação da raça, havendo uma maior procura por animais jovens e de preferência fêmeas (García, 2009).

O temperamento tranquilo e social destes animais são características benéficas para um bom relacionamento homem-animal (Yanes & Martínez, 2007). O burro Zamorano-Leonês é caracterizado pela sua corpulência, grandes dimensões (Kugler et al., 2008; García, 2009), esqueleto forte, bem conformado, hirsutismo acentuado, acromegalia, perfil côncavo e grande dimorfismo sexual. É um animal com corpo alongado, hipermétrico (García, 2009; Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, 2010) com rosto largo, alongado, narinas desenvolvidas e cabeça volumosa. Apresenta ainda pavilhões auriculares largos com bastante pelo, tal como em redor dos olhos, espaço intermaxilar, dorso, planos costais, ventre e extremidades. A sua pelagem é castanha escura, exceto nos animais mais idosos, sendo esta longa, densa e abundante com algumas tonalidades mais claras em redor do nariz, olhos, axilas, parte inferior do peito e na parte interna das nádegas e ventre (Figura 3). Possui um pescoço reto, curto e musculado, sendo mais fino nas fêmeas. Este apresenta tronco relativamente curto, dorso forte, garupa elevada e peito profundo. De ventre volumoso e descendente, esta raça exibe membros angulosos e grossos com cascos largos e bem desenvolvidos. O peso médio de um macho da raça é de 370 kg, o das fêmeas de 360 kg (García, 2009) e a sua altura média varia entre os 1,40 e os 1,55 metros (Kugler et al., 2008).

Criada em 1995, a ASZAL, Asociación Nacional de Criadores de la Raza Asnal Zamorano-Leonesa, é a associação que une e apoia os criadores, promove a valorização, o registo e a identificação individual dos animais e coordena as atualizações que vão ocorrendo relacionadas com esta raça. É uma entidade colaboradora do Ministério da Agricultura e Pecuária (Comunidade Autónoma de Castela e Leão) estando esta encarregue de realizar o levantamento de animais para o Livro Genológico da Raça (Crespo, 2009; García, 2009), oficializando desta forma o património genético. A associação tem tido um grande trabalho na divulgação da raça, tanto nos meios de comunicação como em livros e trabalhos científicos, contribuindo assim para um maior reconhecimento do valor genético que esta possui (Yanes & Martínez, 2007).

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No estudo realizado em 2000, por Luísa Samões, no Parque Natural do Douro Internacional foram recolhidas diversas informações relativas aos asininos presentes na região do Planalto Mirandês e na sua fronteira com Espanha. Foi possível identificar um conjunto alargado de semelhanças morfológicas entre as duas raças, a Raça Asinina de Miranda e Raça Zamorana-Leonesa, e tal facto deve-se em muito à sua proximidade geográfica (Samões, 2000). Pensa-se que o burro Zamorano-Leonês deverá ter dado origem à raça portuguesa (Yanes, 1999). O desenvolvimento excessivo da pelagem confere à raça espanhola uma característica fisionómica distinta (Kugler et al., 2008), apresentando o Burro de Miranda menor hirsutismo e menor porte (Quaresma et al., 2005).

Figura 3 - Exemplares adultos de asininos da Raça Zamorano-Leonesa (fotografia de autor).

15 2.5 Ciclo éstrico e comportamento reprodutivo da fêmea asinina

Em termos reprodutivos, burras e éguas partilham diversas características em comum. No entanto, as fêmeas asininas apresentam algumas particularidades, nomeadamente, o facto de apresentarem ciclos éstricos mais longos (Ginther et al., 1987; Fielding, 1988; Pugh, 2002), épocas reprodutivas mais prolongadas (Ginther et al., 1987; Blanchard et al., 1999) e uma sazonalidade menos marcada (Blanchard et al., 1999). Dependendo da localização geográfica, as burras apresentam um comportamento reprodutivo distinto. Em regiões temperadas estas são geralmente poliéstricas sazonais, na região dos trópicos apresentam uma maior atividade sexual e na região do equador são capazes de ciclar durante todo o ano (Fielding, 1988).

A duração total do ciclo éstrico das burras é mais longa que a das éguas, assemelhando- se mais com as fêmeas póneis. O ciclo éstrico das burras tem uma duração de 25,7 dias, havendo autores que relatam que pode variar entre os 23-30 dias (Vandeplassche et al., 1981; Fielding, 1988; Blanchard et al., 1999). À semelhança dos restantes equídeos, a duração do estro é de 6,4 dias, podendo variar entre os 6 e 9 dias (Pugh, 2002). Pelo contrário, nas burras o diestro é mais longo (Ginther et al., 1987; Henry et al., 1987; Miera et al., 1995) com uma duração de 19,3 dias (Vandeplassche et al., 1981). Relativamente à duração do intervalo interovulatório das burras, este aparenta ser mais longo que o das éguas, 24,9 e 22,7 dias, respetivamente (Vandeplassche et al., 1981; Ginther et al., 1987; Fielding, 1988) mas semelhante ao das póneis, com duração de 25 dias para esta espécie (Vandeplassche et al., 1981). A condição corporal e a idade são fatores que influenciam a duração do intervalo interovulatório (Quaresma & Payan-Carreira, 2015).

No estudo realizado por Quaresma e Payan-Carreira (2015) foi possível caracterizar o ciclo éstrico das fêmeas do Burro de Miranda na sua época reprodutiva, tendo sido estimada a duração do estro em 6,56 dias e do diestro em 17,9 dias. Estudos efetuados em diferentes raças reportam valores semelhantes para a duração do estro, nomeadamente na raça Zamorano-Leonesa (6,1 dias), Catalã (5,64 dias), Martina Franca (6,7 dias) e raça americana de Mammoth (5,9 dias) (Blanchard et al., 1999; Taberner et al., 2008; Galisteo & Perez- Marin, 2010; Contri et al., 2014; Perez-Marin et al., 2016). Em raças asininas brasileiras e na raça francesa Baudet de Poitou foram determinados valores de duração de estro mais longos, 7,9 e 7,5 dias, respetivamente (Henry et al., 1987; Trimeche & Tainturier, 1995).

16 A prevalência de ovulações múltiplas é elevada nas fêmeas do Burro de Miranda (Vandeplassche et al., 1981; Galisteo & Perez-Marin, 2010; Quaresma & Payan-Carreira, 2015) e, quando presentes, tendem a prolongar a duração do estro (Galisteo & Perez-Marin, 2010). A ovulação ocorre entre o 5º e 6º dia após o início do estro (Vandeplassche et al., 1981; Fielding, 1988). Relativamente à dinâmica folicular, no período que antecede a ovulação, o número de folículos pequenos (< 20 mm) diminui, contrariamente ao que se observa no número de folículos médios (20-24 mm) e grandes (> 25 mm) (Vandeplassche et al., 1981). Segundo estes autores é a partir do sétimo dia precedente à ovulação que se observa uma diminuição dos folículos de menor tamanho e, quatro dias precedentes à ovulação, um aumento do número de folículos médios que evoluem para folículos grandes. O folículo dominante atinge o máximo de diâmetro no dia anterior à ovulação, variando em média entre os 30 e 40 milímetros. Este valor varia dependendo da raça, podendo atingir valores mais elevados como, por exemplo, na raça Catalã na qual o folículo dominante poderá atingir os 46,3 milímetros (Taberner et al., 2008).

As fêmeas asininas atingem a puberdade entre o primeiro e segundo ano de vida (Fielding, 1988; Pugh, 2002). Esta está dependente da ação favorável de diversos fatores, tais como: genótipo, fotoperíodo, maneio nutricional, temperatura e estado de saúde. A idade à primeira cobrição ronda os três anos e está relacionada, tal como a puberdade, com o maneio nutricional (Fielding, 1988).

A atratividade, procetividade e recetividade são os três conceitos que representam o comportamento das fêmeas quando se encontram em estro (Beach, 1976). O comportamento de cio mais conspícuo das burras é o movimento de mascar (abertura e encerramento da boca), podendo ser acompanhado de um movimento de extensão do pescoço, sendo geralmente o primeiro e o último sinal a ser demonstrado (Vandeplassche et al., 1981; Quaresma & Payan-Carreira, 2015). Deste modo, é um indicador bastante útil na deteção do cio. Este comportamento foi igualmente observado em zebras durante o estro e em cavalos e póneis machos jovens na presença de um macho adulto (Vandeplassche et al., 1981). As burras podem demonstrar outros sinais de cio, tais como, eversão rítmica do clitóris, posição de aceitação de monta, afastamento da cauda da zona do períneo, excreção de pequenas quantidades de urina, reflexo de Flehmen e demonstração de interesse pelo macho (Clayton et al., 1981; Pugh, 2002; Quaresma & Payan-Carreira, 2015). Ao contrário das éguas e póneis, os comportamentos homossexuais como montar, perseguir e investigar através do

17 olfato outras fêmeas podem ser observados nas burras (Vandeplassche et al., 1981; Quaresma & Payan-Carreira, 2015).

Durante o diestro, em contraste com o comportamento exibido durante o estro, as burras apresentam falta de interesse pelo macho, afastando-se ou até escoiceando, podendo ser observado um posicionamento da cauda mais próximo do períneo (Quaresma & Payan- Carreira, 2015).

Em termos hormonais, durante o diestro, mais concretamente no terceiro e nono dias após a ovulação, a concentração de hormona folículo-estimulante (FSH) atinge os seus valores mais elevados, diminuindo a sua concentração durante o estro. Por outro lado, a concentração de hormona luteinizante (LH) é mais alta durante o estro, ocorrendo um aumento da sua secreção precedente à ovulação de forma gradual e prolongada, atingindo o seu valor mais elevado no dia posterior à ovulação, obtendo concentrações mais baixas durante o diestro. Este pico de concentração também se verifica noutras espécies de equídeos, tal como éguas e póneis (Vandeplassche et al., 1981).

As alterações do padrão normal de ciclicidade são possíveis de se observar em fêmeas asininas das quais se incluem estros silenciosos, anestros sazonais e persistência de corpo lúteo (Quaresma et al., 2015). Estas alterações poderão estar relacionadas com mudanças climáticas, alterações nutricionais, variação de latitude, número de gestações e idade da fêmea (Ginther et al., 1987; Henry et al., 1987; Lemma et al., 2006).

18 2.6 Gestação em asininos

São diversos os protocolos reprodutivos para conceção em asininos, nomeadamente cobrição natural, inseminação artificial ou transferência embrionária. Tanto os machos como as fêmeas devem ter idealmente uma condição corporal ótima (3, numa escala de 1 até 5 ou 5, numa escala de 1 a 9) de forma a garantir um desenvolvimento normal da gestação (Rodrigues et al., 2008). Em termos práticos, relativamente aos protocolos de cobrição por monta natural, não existe concordância no dia de estro mais apropriado para os realizar, havendo autores que sugerem a concretização da cobrição em dois ou três dias do estro (Fielding, 1988). É necessário ter em conta que existe a possibilidade de a burra mostrar sinais de cio e aceitar a monta mesmo já se encontrando gestante (Means, 1941). A duração da gestação é uma variável fisiológica de extrema importância nas espécies domésticas em termos económicos, dada a necessidade do conhecimento do momento do parto. Qualquer método que possa ser usado para determinar com maior precisão a data do parto tem interesse relevante para os criadores. As vantagens ao prever esse instante são diversas, nomeadamente: diminuição das despesas em trabalho e custos veterinários, tornar os preparativos mais aprimorados para o parto e avaliação do normal desenvolvimento fetal (Satué et al., 2011a). Os equídeos apresentam gestações muito prolongadas, o que faz com que o sucesso reprodutivo se encontre dependente de um desenrolar saudável da gestação (Carluccio et al., 2008).

A duração da gestação nas burras é mais longa que a das éguas (Ginther, 1992), sendo considerados como valores médios estimados para uma gestação normal em asininos 372 a 374 dias (Fielding, 1988; Meira et al., 1998b; Pugh, 2002; Villani et al., 2006; Galisteo & Perez-Marin, 2010; Brown, 2012; Tosi et al., 2013; Carluccio et al., 2015; Nervo et al., 2019), aproximadamente mais 38 dias do que a duração estimada para as éguas (Fielding, 1988). Embora sejam considerados valores médios, alguns autores reportam durações de gestação mais curtas, de 353.4±13 dias, contrariando a tendência dos restantes estudos (Crisci et al., 2014).

A raça, a idade da progenitora, a paridade, o sexo da cria e o seu peso à nascença são fatores identificados como possíveis causas influenciadoras da duração da gestação em éguas (Sharp, 1988; Morel et al., 2002; Wilsher & Allen, 2003; Valera et al., 2006; Satué et al., 2011b). Para além destes fatores, a duração da gestação também é influenciada pelo mês de

19 cobrição dentro da época reprodutiva e também pelo mês e ano do parto (Sharp, 1988; Satué et al., 2011a).

Já no caso da espécie asinina, existem autores que afirmam que a duração da gestação poderá ser influenciada pelo sexo da cria, sendo que burras gestantes de um feto macho têm tendencialmente uma duração mais longa do que aquelas que possuem um feto fêmea (Galisteo & Perez-Marin, 2010; Brown, 2012; Crisci et al., 2014; Carluccio et al., 2015; Nervo et al., 2019). Para além deste fator, encontra-se descrita a influência da altura da cobrição dentro da época reprodutiva e, por tal, burras cobertas num período inicial da época reprodutiva (setembro a janeiro) possuem gestações mais prolongadas (Carluccio et al., 2015; Nervo et al., 2019). Este fator está dependente das variações de temperatura, fotoperíodo e disponibilidade nutricional do feto ao longo do tempo, embora o papel desempenhado por estes não se encontra totalmente esclarecido (Galisteo & Perez-Marin, 2010). A raça, idade, mês de nascimento da cria ou mês de ovulação da burra não são fatores que pareçam influenciar a duração da gestação (Galisteo & Perez-Marin, 2010; Carluccio et al., 2015).

2.6.1 Placenta

A placenta é um órgão endócrino, transitório, materno-fetal. O seu papel é fundamental no desenvolvimento do embrião e, posteriormente, do feto para assegurar a sua viabilidade até ao dia do parto (Bauer et al., 1998; Kingdom et al., 2000). Estas funções estão dependentes da sua eficiência funcional e da sua integridade anatómica (Carluccio et al., 2008). A placenta sintetiza, secreta e absorve substâncias imprescindíveis como, por exemplo, fatores de crescimento, proteínas, hidratos de carbono, enzimas e hormonas (Carina et al., 2015). No caso dos equídeos a placenta é caracterizada por ser epiteliocorial microcotiledonária (tendo em conta o contato entre os capilares fetais e as camadas de tecido epitelial) e difusa, devido à presença de vilosidades coriónicas localizadas em todo o tecido materno (Amorim et al., 2010).

No caso dos asininos, a placenta apresenta uma densidade de vascularização mais elevada e uma membrana inter-hamemal com uma espessura mais fina que nas éguas (Saber et al., 2008). O estudo realizado por Villani et al. (2006) comparou a placenta de vários equídeos, nomeadamente as espécies equina e asinina, tendo sido possível concluir a

20 existência de grandes semelhanças anatómicas entre estas espécies. No entanto, no caso dos burros, foram detetadas particularidades relevantes relativamente aos microcotilédones (local onde se realizam as trocas de nutrientes feto-maternas), tendo um padrão de ramificação mais complexo, vilosidades alantocoriónicas mais resistentes, em maior quantidade, e microplacentomas organizados por septos. Visto que a complexidade dos microcotilédones é inversamente proporcional à eficiência placentária, sabe-se assim que, esta é relativamente baixa nas burras. Esta poderá ser uma das justificações da duração de gestação ser superior nesta espécie (Villani et al., 2006). Este estudo veio enriquecer o conhecimento sobre este órgão visto serem escassos os estudos realizados sobre este tema em asininos (Allen & Short, 1997; Leiser & Kaufmann, 1994; Saber et al., 2008).

Sem o normal desenvolvimento ou funcionamento da placenta, o crescimento fetal intrauterino é afetado, podendo ocorrer um atraso na sua evolução levando a nascimentos de crias imaturas, dificultando em termos práticos a medição com precisão de determinados parâmetros anatómicos durante a gestação (Reef et al., 1996).

2.6.2 Endocrinologia na gestação

Nos mamíferos estão presentes em circulação determinadas hormonas comuns a várias espécies, como a progesterona, os esteroides e as gonadotrofinas, estando estas diretamente relacionadas com a manutenção da gestação, o desencadear do parto (Meirelles et al., 2017) e o desenvolvimento fetal. As concentrações destas hormonas são o resultado de uma interdependência eficaz entre endométrio, placenta e feto (Carina et al., 2015). Em contraste com a falta de estudos realizados em burras relativamente à endocrinologia durante a gestação, nas éguas são já diversos os estudos concretizados. A informação sobre este tema em asininos cinge-se maioritariamente às primeiras e últimas fases da gestação, sendo raros os estudos que abrangem todo o período gestacional. Embora se possua pouca informação, são evidentes as semelhanças com as éguas, embora as concentrações ou os perfis de algumas hormonas possam variar (Crisci et al., 2014). Os progestagénios de origem fetal têm como função a manutenção progressiva da gestação, atingindo valores mais elevados nas últimas semanas, sofrendo um declínio abruto no penúltimo e último dia de gestação (Ginther, 1992; Allen et al., 2002). A produção de progesterona tem início no corpo lúteo primário, sendo também mais tarde produzida pelos corpos lúteos acessórios. O pico de concentração de progesterona (22,4 ng/mL) regista-se às

21 doze semanas, sendo que os valores mais baixos (< 5 ng/mL) são registados entre a 30ª e 46ª semana de gestação. Os valores sofrem um aumento na semana anterior ao parto (7,6 ng/mL), seguindo-se uma diminuição na semana do parto (4,7 ng/mL) (Crisci et al., 2014), estimulando desta forma o desenvolvimento da glândula mamária (Rossdale et al., 1991).

A pregnenolona, produzida pelo feto, é precursora da biossíntese dos diferentes progestagénios, sendo posteriormente enviada para a unidade uteroplacentária através da artéria umbilical onde é aqui transformada em progestagénios. Estes são posteriormente excretados de forma direta para a corrente sanguínea da progenitora, sendo que alguns regressam ao feto (Ousey et al., 2003; Ousey, 2004). As mudanças do normal estado clínico do feto ou da placenta podem levar a que as concentrações plasmáticas de progesterona aumentem (Rossdale et al., 1991; Ousey, 2006; Stawicki et al., 2002) sendo um bom indicador para a deteção de doenças feto-placentárias (Stawicki et al., 2002).

O sulfato de estrona, equilenina, 17β-estradiol e equilina, derivados da desidroepiandrosterona, são considerados os principais estrogénios das espécies equinas (Pashen, 1984) e têm como função o aumento do aporte sanguíneo a algumas estruturas, como o endométrio e a placenta, estimulando o miométrio na produção e armazenamento de prostaglandina F2α (Ginther, 1992; Ousey, 2004; Ousey et al., 2003).

O sulfato de estrona é o estrogénio que se encontra em maior quantidade na gestação dos equídeos e a determinação da sua concentração durante este período revela informações relevantes sobre o estado do feto e a sua viabilidade (Ousey, 2006). Entre a 18ª e 33ª semana de gestação a concentração de sulfato de estrona encontra-se com valores superiores a 500 ng/mL. Na fase intermédia da gestação é determinada a concentração mais elevada desta hormona (1799,4 ng/mL), mais precisamente na 24ª semana de gestação, devido ao grande desenvolvimento das gónadas fetais (local onde se sintetiza o precursor dos vários estrogénios). Posteriormente à 33ª semana e até ao momento do parto, a concentração de sulfato de estrona não atinge valores superiores a 100 ng/mL (Crisci et al., 2014).

A gonadotrofina coriónica equina (eCG) é uma glicoproteína de alto peso molecular produzida pelos cálices endometriais. Estes têm como função promover a formação de corpos lúteos secundários e acessórios, aumentando a concentração sérica de progesterona materna (Stewart et al., 1976) e estimulando a formação das interdigitações entre a placenta e o endométrio (Allen & Wilsher, 2009). Os níveis de concentração de eCG variam com o genótipo da progenitora e do feto: uma burra gestante de um feto da espécie asinina produz

22 menos de metade a um terço de eCG do que uma égua gestante de um feto da sua própria espécie. No caso de uma burra gestante de um feto de uma espécie diferente da sua (híbrido resultante de cruzamento interespécies), esta produz o dobro dos níveis de eCG produzidos por éguas gestantes e 3 a 4 vezes mais do que burras gestantes de fetos da sua própria espécie (Allen, 1969), tal como se observa no Gráfico 2.

)

ConcentraConcentraçãoção sérica) de eCG

1

1 - -

Concentração sérica de eCG (IU ml (IU de eCG Concentração sérica Concentração sérica de eCG (IU ml (IU de eCG Concentração sérica

Duração da gestação (semanas) Duração da gestação (semanas)

Gráfico 2 - Comparação dos perfis séricos de eCG através de medições semanais em: (A) burras gestantes de fetos da sua própria espécie, (B) burras gestantes de um cruzamento interespécie; adaptado de (Stewart et al., 1976).

23 2.7 Ultrassonografia na gestação

O parto encontra-se dependente da duração de gestação, própria de cada espécie/raça, em que a ausência de sinais evidentes da chegada desse instante torna-se um momento imprevisível e por vezes crítico (Rossdale & Short, 1967). Desta forma, estimar a data do parto através do uso de determinadas técnicas, como a ultrassonografia, torna-se essencial no maneio reprodutivo de espécies domésticas.

A ultrassonografia é uma técnica não invasiva que permite avaliar tecidos moles, possibilitando a visualização de várias estruturas, nomeadamente das suas formas, posições e tamanhos (Lemma et al., 2006). É uma técnica simples de executar, segura tanto para o animal como para o examinador e possível de se realizar a campo (Figura 4). Para ser bem- sucedida é necessário um conhecimento correto das estruturas anatómicas, de conceitos básicos de biofísica e uma boa técnica de manuseamento do transdutor ultrassonográfico (Lemma et al., 2006).

O conhecimento sobre reprodução em equinos tem sido impulsionado pela utilização da ultrassonografia transretal para a avaliação da dinâmica uterina (Squires et al., 1988). Desde a década de 80 que a ultrassonografia se afirmou como uma ferramenta revolucionária na avaliação da viabilidade do feto e na evolução da gestação em equinos (Palmer & Driiancourt, 1980). Por outro lado, o estudo das diferentes etapas reprodutivas com recurso à ultrassonografia em asininos é ainda muito limitado. A monitorização do período gestacional não era uma prática corrente, nem em países em desenvolvimento nem em países industrializados, uma vez que esta técnica era considerada não rentável em termos económicos (Bessent & Cinther, 1988; Gastal et al., 1993; Meira et al., 1998b; Nell et al., 2005; Lemma & Schwartz, 2006).

A aplicação da ultrassonografia em burras permite detetar de forma direta possíveis alterações morfológicas e anatómicas (Sturion et al., 2010) tanto na progenitora como na cria. A sua realização é de extrema importância, nomeadamente: para a obtenção de um diagnóstico correto e precoce de anormalidades do desenvolvimento no embrião ou feto (Reef et al., 1996) ou irregularidades e patologias ováricas e/ou uterinas; realização de diagnósticos de gestação; previsão e confirmação do exato momento da ovulação; e avaliação de corpos lúteos (Squires et al., 1988; Griffin & Ginther, 1992; Meira et al., 1998a). Com um diagnóstico antecipado de gestação é possível, caso a fêmea não se encontre gestante, voltar a proceder a um protocolo de conceção (Nervo et al., 2019).

24 Comparativamente às éguas, as burras possuem uma maior frequência de ovulações múltiplas (Blanchard et al., 1999; Taberner et al., 2008; Quaresma & Payan-Carreira, 2015) e uma probabilidade acrescida de gestações gemelares. Desta forma, e com um diagnóstico atempado, é possível recorrer à eliminação de uma das vesículas embrionárias (Ginther & Bergfelt, 1988). Caso contrário, poderá ocorrer uma reabsorção espontânea de uma ou das duas vesículas embrionárias (Ginther, 1992) durante o primeiro mês de gestação ou, mais tarde, dada a competição pelo contato com o endométrio materno entre as duas placentas (Sevendsen, 1997; Nervo et al., 2019).

Figura 4 - Realização de ultrassonografia transretal em fêmea da Raça Asinina de Miranda em contexto de campo (fotografia de autor).

Dependendo da estrutura a avaliar, torna-se necessário utilizar um transdutor com uma frequência apropriada. Para a visualização de estruturas de menor tamanho, como os ovários, é recomendado o uso de transdutores de maiores frequências e, para a visualização de estruturas de maiores dimensões, como é o caso de fetos, o uso de transdutores de menores frequências é o sugerido (Ginther & Pierson, 1984; Squires et al., 1988).

A principal técnica utilizada na reprodução em equídeos é a ultrassonografia transretal, como referido anteriormente. É uma técnica importante dada a sua facilidade de manuseamento em contexto de campo e eficiente em termos de tempo (Lanci et al., 2019),

25 sendo esta a técnica eleita pela maioria dos médicos veterinários (Turner et al., 2006; Hartwig et al., 2013).

Para além do acesso transretal, é possível executar a ultrassonografia transabdominal. Com o uso desta técnica foi possível identificar diversos valores-padrão para características maternas e fetais em períodos mais tardios da gestação em éguas (Bucca et al., 2005). A vantagem desta técnica destaca-se na possibilidade de examinar o feto quando este atinge maiores dimensões, encontrando-se mais profundo no abdómen materno (Renaudin et al., 2000). Por outro lado, esta técnica requer maior tempo de preparação do animal (necessária tricotomia de uma grande região abdominal) e equipamento ultrassonográfico específico (Renaudin et al., 2000; Bucca et al., 2005; Turner et al., 2006; Baska-Vincze et al., 2014; Lanci et al., 2019).

2.7.1 Desenvolvimento do embrião

A aparência do embrião e feto através de ultrassonografia nas burras é muito semelhante ao já descrito em éguas (Lemma et al., 2006). Em termos gerais, a deteção da vesícula embrionária em asininos é possível, através da ultrassonografia, a partir do 11º dia de gestação (Gastal et al., 1993; Meira et al., 1998b), sendo a sua deteção mais comum entre o 12º e 13º dia (Carluccio et al., 2008; Brown, 2012; Tosi et al., 2013; Crisci et al., 2014; Nervo et al., 2019). A probabilidade de deteção da vesícula embrionária ao 10º dia de gestação nas burras é bastante inferior à das éguas, havendo apenas uma probabilidade de deteção de 25% (Crisci et al., 2014), embora existam autores que defendem essa possibilidade (Bessent & Cinther, 1988). Esta localiza-se geralmente no corpo do útero ou no segmento caudal dos cornos uterinos, independentemente do lado em que ocorre a ovulação (Bessent & Cinther, 1988; Meira et al., 1998b), podendo também encontrar-se no segmento medial de um corno uterino (Gastal et al., 1993).

A imagem ecográfica da vesícula caracteriza-se pelos dois pontos hiperecogénicos no polo dorsal e ventral da imagem, que auxiliam na sua diferenciação de, por exemplo, um quisto uterino (Gastal et al., 1993). O diâmetro da vesícula embrionária, entre o 16º e 18º dias de gestação varia entre os 21,7 mm e os 22,3 mm (Bessent & Cinther, 1988; Gastal et al., 1993; Meira et al., 1998b). Esta medição pode ser utilizada para determinar o dia de gestação visto que estes parâmetros se encontram positivamente correlacionados (Gastal et

26 al., 1993; Meira et al., 1998b; Brown, 2012; Crisci et al., 2014), tal como representado no Gráfico 3.

A fixação da vesícula embrionária nas burras é mais tardia que nas éguas (Crisci et al., 2014) e que nas póneis (Bessent & Cinther, 1988), ocorrendo geralmente entre os dias 17 e 18 de gestação. Nesta altura também se observa um aumento da tonicidade uterina (Gastal et al., 1993; Meira et al., 1998b).

Numa fase inicial, entre os dias 9 e 15 de gestação, o embrião tem uma alta mobilidade intrauterina (Bessent & Cinther, 1988). Embora o papel deste movimento não seja estudado em burras, na égua concluiu-se que seria necessário para a manutenção da gestação (Sharp et al., 1989), favorecendo as trocas metabólicas entre o embrião e o endométrio (Ginther, 1985). Não é referido haver diferenças na mobilidade da vesícula entre burras e póneis (Bessent & Cinther, 1988).

A taxa de crescimento da vesícula embrionária é semelhante entre equídeos: durante a fase de mobilidade esta tem uma taxa de crescimento muito rápida (cerca de 3,0-3,2 mm por dia); após a fixação da vesícula embrionária o crescimento estabiliza, sendo denominada de ‘fase de plateau’ (cerca de 0,1-0,5 mm por dia) (Meira et al., 1998b; Crisci et al., 2014); entre o dia 34 e 61 de gestação observa-se uma taxa de crescimento moderada (cerca de 2,5 mm por dia). Posteriormente a esta data torna-se inexecutável a sua deteção e medição (Crisci et al., 2014).

Em termos morfológicos a vesícula embrionária apresenta diversas formas durante o seu desenvolvimento, apresentando: uma forma esférica até ao dia 15 e 16 de gestação, tornando- se ovalada entre o 16º e 18º dia, tornando-se posteriormente ainda mais irregular até ao dia 28 de gestação (Meira et al., 1998b). Esta transformação numa forma irregular, fase de plateau, ocorre devido à limitação da expansão da vesícula pelo aumento da tonicidade uterina (Palmer & Driancourt, 1980; Gastal et al., 1993), havendo uma adaptação da própria vesícula embrionária às pregas endometriais irregulares (Ginther, 1983). As alterações de forma poderão dificultar o acompanhamento do seu desenvolvimento através da ultrassonografia (Meira et al., 1998b), embora esta perda do formato regular ocorra durante a terceira semana de gestação (Ginther, 1983; Ginther & Pierson, 1984; Gastal et al., 1993; Meira et al., 1998b; Lemma & Schwartz, 2006; Brown, 2012; Crisci et al., 2014).

A deteção do embrião é possível a partir do 20º dia de gestação sendo o seu diâmetro de cerca de 4 mm. Em termos ultrassonográficos, o embrião apresenta-se sob a forma de um

27 ponto hiperecogénico, geralmente posicionado no hemisfério ventral do saco vitelino (Gastal et al., 1993; Meira et al., 1998b). A migração do embrião dentro da vesícula embrionária ocorre em simultâneo com o desenvolvimento da alantóide e da regressão do saco vitelino (Ginther, 1983; Meira et al., 1998b). O desenvolvimento da alantóide ocorre aproximadamente entre os dias 21 e 38 de gestação, altura em que o embrião migra dorsalmente dentro da própria vesícula em direção ao polo dorsal (Brown, 2012). A vesícula ótica pode ser visualizada a partir do dia 25 de gestação e o desenvolvimento do olho termina, juntamente com a formação completa das pálpebras e pigmentação da retina no dia 38 em equinos (Franciolli et al., 2011).

Posteriormente à migração do embrião dentro da vesícula embrionária, o feto inicia uma descida em direção ao polo ventral da vesícula (altura em que se forma o cordão umbilical) (Brown, 2012) sendo que o feto alcança uma posição ventral ao dia 44 de gestação (Gastal et al., 1993; Ginther, 1983; Meira et al., 1998b).

A possibilidade de determinar a idade do embrião numa fase inicial da gestação e avaliar o seu grau de desenvolvimento é possível graças à relação linear positiva entre o diâmetro da vesícula embrionária e o comprimento longitudinal do embrião com o dia de gestação (Dascanio, 2014; Nervo et al., 2019) Em éguas, a correlação entre o tamanho relativo do saco vitelino e o desenvolvimento da alantóide é também utilizadas para determinar a idade do embrião/feto entre os dias 20 e 45 de gestação (Dascanio, 2014).

y = 0,884x + 7,128

r2 = 0,8304

Diâmetro da vesícula Regressão linear (diâmetro

vesicular) Diâmetrovesícula da embrionária (mm)

Gráfico 3 - Regressão linear entre o diâmetro da vesícula embrionária e a idade gestacional durante Duração da gestação (dias) os primeiros três meses de gestação em asininos, adaptado de (Nervo et al., 2019).

28 2.7.2 Desenvolvimento e determinação da idade fetal

Estima-se que a fase fetal tenha início no dia 40 de gestação em éguas (Ginther, 1992), embora nos asininos se considere o dia 50 de gestação (Brown, 2012). Os fatores como a raça, idade e paridade das fêmeas devem ser tidos em conta aquando da determinação da idade fetal em equídeos. Foi relatado que em éguas com idade superior a 15 anos, os resultados da medição do diâmetro da raiz aórtica fetal é inferior quando comparado com os resultados de éguas mais novas. Relativamente à paridade, éguas multíparas apresentam medições oculares fetais mais baixas do que em éguas primíparas (Dascanio, 2014).

Em medicina veterinária o uso de morfometria com vista a determinar a idade e avaliar o desenvolvimento fetal é vantajoso para a previsão do momento do parto (Lanci et al., 2019). A determinação da idade fetal pode ser realizada através da medição de diversas estruturas anatómicas do feto ao longo do seu crescimento, estando esta inteiramente dependentes da posição do feto em relação à sonda ecográfica e da própria qualidade do transdutor (Nervo et al., 2019).

Vários estudos foram já realizados sobre esta temática em éguas. O diâmetro ocular, o diâmetro biparietal, o diâmetro da raiz aórtica, o comprimento femoral, o diâmetro torácico e a frequência cardíaca são alguns dos parâmetros possíveis de serem utilizados para prever a idade fetal em equinos (Dascanio, 2014). No caso da espécie asinina, os estudos realizados são extremamente diminutos comparativamente ao da espécie equina, tendo sido apenas abordados, até à data, os seguintes parâmetros:

2.7.2.1 Comprimento crânio-caudal e largura fetal

A medição do comprimento crânio-caudal (CCC) é realizada através da medição da distância entre o osso occipital e a vértebra sacral (Franciolli et al., 2011). A identificação do feto e medição da sua largura e comprimento é realizado a partir do dia 24 (Brown, 2012), sendo os valores de largura e comprimento crânio-caudal identificados em asininos aos dias 20, 30, 40, 50 e 60 de gestação de 3 x 4, 8 x 12, 11 x 17, 13 x 32 e 19 x 47 mm, respetivamente (Gastal et al., 1993).

A partir do dia 70 torna-se impraticável esta medição dada as elevadas dimensões fetais e não ser possível englobá-lo numa imagem ecográfica única. A taxa de crescimento do embrião e, posteriormente, do feto durante os primeiros 70 dias de gestação não difere entre

29 burras fenotipicamente diferentes (standard vs. miniatura), embora se observe uma ligeira discrepância entre fetos fêmeas e machos (Brown, 2012).

2.7.2.2 Diâmetro biparietal

A determinação do crescimento fetal através da medição do diâmetro biparietal (DBP) em asininos, baseada no comprimento entre os ossos parietais do crânio num plano longitudinal e simétrico (Abreu et al., 2007), é efetuada entre o dia 35 e o dia 156 de gestação. Posteriormente deixa de ser possível a sua realização até ao final da gestação devido às elevadas dimensões do feto e às suas alterações de posição durante o exame ecográfico (Brown, 2012). Estudos realizados em ovinos e caprinos demonstram a importância da medição deste parâmetro visto ser de elevada fiabilidade e, em termos ecográficos, ser das estruturas mais facilmente identificadas (Abreu et al., 2007; Petrujkić et al., 2016).

2.7.2.3 Medição do olho fetal

As dimensões da órbita fetal estão diretamente correlacionadas com a idade fetal em burras (Crisci et al., 2014; Nervo et al., 2019) e em éguas (Renaudin et al., 2000; Bucca et al., 2005; Murase et al., 2014). Comparativamente a outros parâmetros, a medição da órbita fetal é a melhor forma para se determinar a idade fetal. Esta medição é a mais fiável (Nervo et al., 2019), tendo a vantagem de poder ser analisada ao longo de quase todo o período gestacional (Figura 5). A medição ultrassonográfica da órbita torna-se o melhor indicador de crescimento fetal (Bucca et al., 2005; McKinnon et al.,1988; Renaudin et al., 2000), podendo ser abordada por ultrassonografia transretal ou transabdominal (Bucca et al., 2005; Paolucci et al., 2012).

A medição e identificação da órbita fetal em asininos é efetuada a partir do dia 67, embora alguns autores relatem a identificação ocular apenas a partir do dia 70-71 de gestação (Crisci et al., 2014; Nervo et al., 2019). Os valores resultantes da mensuração ocular encontram-se compreendidos entre os 0,92 e os 3,2 cm do dia 100 até ao dia 351 de gestação (Nervo et al., 2019).

Na prática clínica esta medição, visto estar intimamente correlacionada com a idade fetal, torna-se uma ferramenta muito útil para a identificação da data de cobrição quando esta é

30 desconhecida e, igualmente, na previsão da data do parto (Nervo et al., 2019). A correlação entre o diâmetro ocular, a condição corporal (Turner et al., 2006) e o peso da progenitora não foi detetada, sendo este valor independente dos restantes (Brown, 2012; Nervo et al., 2019).

(A) (B)

(C) (D)

Figura 5 - Imagens ultrassonográficas do olho fetal de uma cria da Raça Asinina de Miranda aos 205 dias (A), 245 dias (B), 275 dias (C) e 311 dias (D) de idade; (imagens de autor).

A influência da paridade das fêmeas sobre o tamanho da órbita fetal é um fator importante relatado em estudos realizados em éguas, dado que, poldros nascidos de fêmeas primíparas possuem dimensões oculares superiores quando comparadas com fêmeas multíparas (Hendriks et al., 2009). Este resultado vem contrariar a ideia de que éguas primíparas geralmente produzem crias mais leves e de menores dimensões do que éguas multíparas (Allen et al., 2002; Turner et al., 2006). Os estudos efetuados em póneis relatam não existir influência da paridade nas dimensões oculares (Turner et al., 2006).

A medição ocular poderá ser realizada com base na medida única do diâmetro longitudinal (Hartwig et al., 2013; Turner et al., 2006), do diâmetro transverso e longitudinal

31 (Bucca et al., 2005; Murase et al., 2014; Lanci et al., 2019), da circunferência ou área do corpo vítreo (Hendriks et al., 2009; Paolucci et al., 2012). A medição do diâmetro longitudinal é realizada através da distância entre os dois polos laterais do corpo vítreo e o diâmetro transverso ocular é a medida determinada pela distância entre a córnea e a retina (realizando uma bissetriz com o cristalino), formando um ângulo de 90º com o diâmetro longitudinal ocular (Lanci et al., 2019). O cristalino e as margens internas do corpo vítreo são os pontos de referência utilizadas durante a medição da órbita fetal, não sendo consensual a inclusão da câmara anterior na medição transversa ocular (Renaudin et al., 2000; Valentini et al., 2014; Lanci et al., 2019).

O comprimento, largura e área são três medidas úteis na avaliação deste parâmetro de crescimento fetal (Hendriks et al., 2009), sendo que somente o diâmetro não avalia de forma precisa o crescimento de uma estrutura esférica (Löfstedt & Ireland, 2000). As medições ultrassonográficas biométricas realizadas em éguas relatam a importância da medição do olho fetal dado que este valor é distinto dentro da própria espécie e o formato ocular é uma característica intrínseca de cada raça (McMullen & Gilger, 2006; Barsotti et al., 2010).

2.7.2.4 Diâmetro do tórax

A relação linear positiva entre a medição do tórax fetal e os dias de gestação em asininos (Crisci et al., 2014; Nervo et al., 2019) e em éguas (Renaudin et al., 2000) foi já descrita. A localização do tórax é auxiliada pela visualização das costelas, que ultrassonograficamente apresentam-se hiperecogénicas, e pela presença do movimento cardíaco. A medição do diâmetro torácico na espécie asinina é realizada com base nos pontos de maior amplitude torácica, entre o 2º e 6º mês de gestação, tendo sido determinada a partir do dia 52 de gestação (Nervo et al., 2019).

2.7.2.5 Frequência cardíaca fetal

O batimento cardíaco embrionário é detetado, através da ultrassonografia, a partir dos dias 22-23 de gestação em asininos (Gastal et al., 1993; Meira et al., 1998b; Nervo et al., 2019). A medição do ritmo cardíaco pode ser realizada ao 2º mês e entre o 4º e 7º mês de gestação. A frequência cardíaca fetal (FHR), expressa em batimentos cardíacos por minuto

32 (bpm), pode ser avaliada por ecocardiografia Doppler (Nervo et al., 2019) e encontra-se dependente da atividade fetal (Hendriks et al., 2009).

Em todas as espécies, na fase inicial do desenvolvimento fetal, a frequência cardíaca encontra-se muito elevada (219,67±36,11 bpm, no caso dos burros), diminuindo com o evoluir da gestação, chegando mesmo a ser registado valores muito semelhantes à frequência cardíaca materna (Nervo et al., 2019). Na semana anterior ao parto é possível observa-se um ligeiro aumento (Reef et al., 1995; Bucca et al., 2005; Crisci et al., 2014).

Estudos recentes efetuados em asininos e equinos, onde foi avaliada a frequência cardíaca para a determinação da idade fetal, descrevem não haver uma relação linear positiva entre este parâmetro e os dias de gestação (Renaudin et al., 2000; Crisci et al., 2014; Nervo et al., 2019), sendo necessário um estudo mais aprofundado sobre o tema.

2.7.2.6 Diâmetro aórtico e cardíaco fetal

O diâmetro da aorta foi considerado o parâmetro que melhor estima o peso da cria ao nascimento em éguas (Reef et al., 1995) e, tal como a órbita fetal, é possível de ser identificada ao longo de todo o período gestacional. Como desvantagem comparativamente ao uso do diâmetro ocular, a aorta fetal é somente visualizada através do uso de ultrassonografia transabdominal (Bucca et al., 2005; Crisci et al., 2014). Para tal é necessário equipamento especializado com baixa frequência (2,5 Mhz) para se poder atingir uma maior profundidade de penetração ecográfica (Lanci et al., 2019).

A localização da aorta fetal em asininos é realizada através da visualização de um plano longitudinal do tórax do feto. A sua distinção com a veia cava é facilitada pela avaliação da transmissão da pulsação da aorta (Hendriks et al., 2009). A sua medição é feita a partir do dia 79 de gestação (Crisci et al., 2014) preferencialmente durante a fase de sístole cardíaca (Renaudin et al., 2000).

A taxa de crescimento cardíaca fetal foi avaliada em asininos tendo por base as medições do comprimento e largura deste órgão. As medições cardíacas foram efetuadas entre os dias 31 e 254 de gestação tendo sido calculada posteriormente a sua área através da fórmula: área = (comprimento x 0,5) x (largura x 0,5) x 3,14 (Brown, 2012).

33 2.7.2.7 Diâmetro do estômago

A aparência do estômago do feto através da ultrassonografia toma uma forma semelhante à de um “feijão” e, devido ao seu conteúdo gasoso, apresenta-se como uma estrutura anecogénica e com alguma mobilidade. A medição do estômago é feita através do seu diâmetro maior e pode ser efetuada desde os dois meses até ao sétimo mês de gestação (Nervo et al., 2019). Em asininos é possível ser identificado a partir dos dia 51 de gestação, embora estudos realizados sobre o mesmo tema tenham reportado uma identificação mais tardia, entre os dias 60-71 de gestação (Brown, 2012; Crisci et al., 2014).

Apesar de ser uma estrutura útil e simples de identificar, como a janela de observação é mais curta comparativamente a outras estruturas, tal como a órbita fetal, não é considerado o melhor parâmetro para a determinação da idade do feto (Bucca et al., 2005; Crisci et al., 2014; Nervo et al., 2019).

2.7.2.8 Diâmetro do abdómen

A primeira medição do diâmetro abdominal fetal em asininos foi realizada por Nervo et al. (2019) tendo esta já sido anteriormente reportado em éguas (Renaudin et al., 2000). O abdómen é localizado pela visualização de dois pontos de referência: o estômago e os intestinos. O seu diâmetro é calculado, entre o 2º e 6º mês de gestação, pela distância máxima observada, caudalmente ao estômago (Nervo et al., 2019).

2.7.2.9 Gónadas fetais

As gónadas fetais são estruturas anatómicas localizadas ventro-caudalmente no abdómen, próximo aos rins e com aparência oval. Após a sua localização através de ultrassonografia é possível medir o tamanho através do seu diâmetro máximo e visualizar a irrigação sanguínea com o auxílio de ultrassonografia Doppler (Nervo et al., 2019). A identificação das gónadas fetais pode ser utilizada para a determinação da idade fetal, tal como na sexagem fetal (Renaudin et al., 2000; Bucca et al., 2005; Nervo et al., 2019).

A sexagem fetal apenas é realizada com sucesso quando, no momento do exame, alguns dos fatores envolvidos na sua determinação decorrem de forma facilitadora e simultânea, sendo estes: iluminação ambiente favorável, animal devidamente contido, imobilização tanto da progenitora como do feto, feto com tamanho relativamente pequeno, utilização de

34 equipamento ultrassonográfico com uma sonda de excelente qualidade, possibilidade de utilização de Doppler e apresentação fetal favorável (apresentação posterior) (Nervo et al., 2019).

No último trimestre de gestação de equídeos o feto apresenta uma posição anterior (Bucca et al., 2005) embora, nos burros, se descreva a possibilidade de o feto alcançar a apresentação final após o 9º mês de gestação (Crisci et al., 2014). A ocorrência conjunta de várias das condições auxilia a que a determinação da sexagem seja realizada durante uma janela de tempo superior. O tamanho fetal de asininos é inferior ao de fetos equinos o que torna a sexagem facilitada nesta espécie (Nervo et al., 2019).

A determinação da sexagem fetal em asininos é realizada pela identificação do tubérculo genital e/ou da observação das gónadas fetais (Brown, 2012). Esta pode ser realizada entre o 4º e 7º mês de gestação sendo que a janela temporal para a sua realização varia consoante os autores: entre os dias 96 e 210 de gestação (Nervo et al., 2019), entre os dias 100 e 150 de gestação (Mancuso et al., 2007) e entre os dias 240 e 265 de gestação (Crisci et al., 2014). O quinto mês é considerada a melhor altura para se realizar a sexagem fetal visto que a probabilidade de deteção neste período (cerca de 60%) apresenta ser superior aos restantes meses. Com o decorrer da gestação a observação da genitália externa e da glândula mamária torna-se possível, auxiliando na confirmação do sexo do feto (Nervo et al., 2019).

2.7.2.10 Fluxometria da artéria umbilical

O cordão umbilical é a estrutura anatómica que faz a comunicação entre placenta e feto e por onde se realizam as trocas sanguíneas. Nos asininos é constituído por duas porções, a porção amniótica proximal e a porção alantóica distal (Shaker & Gammal, 2018), sendo a porção amniótica composta por quatro estruturas: duas artérias umbilicais, uma veia umbilical e o úraco (Whitwell & Jeffcott, 1975; Schlafer, 2004). As artérias umbilicais são vasos pertencentes à circulação fetal muito utilizados na obtenção de perfis de velocidades de fluxo sanguíneo (Shaker & Gammal, 2018). Para a sua localização ser possível é necessário identificar a tríade vascular ao nível do cordão umbilical e seguir o seu curso (Nervo et al., 2019).

Na prática clínica em humanos é habitual a utilização do fluxo de sangue na artéria umbilical, fornecendo com precisão dados relevantes sobre a idade fetal, estado de saúde do

35 feto e avaliação do estado da placenta (Gudmundsson et al., 2017). Em asininos, a determinação da frequência arterial umbilical é realizada a partir do dia 125 de gestação e, com o auxílio da fluxometria Doppler, é possível determinar o valor do fluxo das artérias umbilicais entre o 5º e 7º mês de gestação (Nervo et al., 2019).

Em equinos foi descrita dificuldade na obtenção de valores precisos de fluxo das artérias umbilicais devido à diminuição da resistência ao fluxo sanguíneo e ao seu trajeto sinuoso, dificultando o posicionamento da sonda na direção do fluxo sanguíneo (Bollwein et al., 2004). Desta forma, em asininos, não foi descrita uma relação linear positiva entre este parâmetro e a idade fetal e, apesar das dificuldades técnicas encontradas, os autores aconselham a verificação deste critério (Nervo et al., 2019).

2.7.2.11 Espessura combinada do útero e placenta

Nos equídeos a placenta atinge o máximo do seu desenvolvimento no dia 150 de gestação. Devido a esta particularidade, alguns autores apenas realizam a medição da espessura combinada do útero e placenta (CTUP) a partir desta data, mais concretamente, a parir do dia 154 de gestação (Crisci et al., 2014). Todavia, outros autores optam por efetuar a medição a partir do momento em que estas estruturas se tornam visíveis através de ultrassonografia (dia 94 de gestação) (Nervo et al., 2019).

A medição poderá ser efetuada através de ultrassonografia transretal ou transabdominal, apesar dos valores obtidos através da técnica transretal revelarem ser bastante inferiores comparativamente à técnica transabdominal (Crisci et al., 2014). Utilizando a artéria uterina como ponto de referência, a medição da CTUP é realizada, próximo à cérvix, na porção caudal do corpo uterino (Renaudin et al., 1997; Renaudin et al., 2003; Nervo et al., 2019).

Durante a gestação não se observa uma variação tão significativa nas medidas de CTUP de asininos quando comparado à dos equinos, apesar de poderem ser detetadas zonas edematosas em determinadas doenças quando esta se encontra muito elevada (Crisci et al., 2014; Nervo et al., 2019). Valores aumentos de CTUP, com áreas de separação da placenta e sinais clínicos associados apresentam ser bons indicadores de placentite em equinos (Canisso et al., 2015). Devido a algumas diferenças morfológicas da placenta entre as duas espécies e a duração de gestação ser superior nas burras (Carluccio et al., 2016) não é

36 possível realizar uma comparação direta dos valores de referência da espécie equina para a espécie asinina (Nervo et al., 2019).

37

38 3. Material e Métodos

3.1 Descrição da área de estudo

Para a realização da presente Dissertação de Mestrado foram recolhidos dados em dois locais distintos, em Portugal e Espanha (Figura 6). O estudo foi conduzido num período de 18 meses, de novembro de 2017 até abril de 2019, tendo sido recolhidas imagens ultrassonográficas de duas raças asininas distintas: Raça Asinina de Miranda e Raça Zamorana-Leonesa.

Figura 6 - Representação esquemática dos locais de recolha de dados para a realização do presente estudo: Atenor (Portugal) e Villardondiego (Espanha).

A recolha de dados referentes às burras de Raça Asinina de Miranda foi efetuada no Centro de Valorização do Burro de Miranda da AEPGA situado na aldeia de Atenor no concelho de Miranda do Douro (41°42’N, 06°48’O). Este centro de reprodução e recria contemplava um espaço com uma área total de sete hectares, incluindo um lameiro de pasto com cerca de um hectare e um abrigo para os animais pernoitarem (em regime de semi- estabulação). Neste centro existiam, à data, 27 fêmeas, 32 machos castrados e 1 macho

39 inteiro desta raça autóctone, sendo utilizados para diversos projetos, tanto de melhoramento genético, criação e manutenção desta raça autóctone, assim como para a sua divulgação.

O maneio dos animais no centro era ajustado às necessidades observadas pelos tratadores e médicos veterinários assistentes. O regime alimentar podia alterar-se consoante a condição corporal e o estado reprodutivo dos animais: os burros com uma condição corporal mais baixa e as fêmeas reprodutoras alimentavam-se com feno, aveia e suplementados com ração duas vezes por dia, enquanto que, os burros com uma condição corporal mais elevada alimentavam-se somente de feno duas vezes por dia, a horas estipuladas. Todos os animais tinham acesso a água ad libitum.

O maneio reprodutivo na AEPGA baseava-se, na medida do possível para animais em cativeiro, no comportamento natural dos asininos, tanto a nível social como sexual. Considerava-se que a partir dos 3 ou 4 anos de idade os animais estavam aptos para reprodução. Devido ao comportamento territorial perante outros machos e fêmeas, o macho inteiro encontrava-se num local separado dos restantes animais. Após a deteção de comportamento de cio nas burras, estas eram sinalizadas e separadas dos restantes animais sendo posteriormente encaminhadas para o local onde se encontrava o macho inteiro e posteriormente, realizava-se a “monta à mão”. Após a cobrição natural era realizado o diagnóstico de gestação ao 15º dia através de ultrassonografia transretal e era descartada a possibilidade de gestação gemelar. Caso se comprovasse a existência de duas vesículas embrionárias era realizada a eliminação da vesícula de maiores dimensões por esmagamento manual. Entre o 30º e 45º dias após a cobrição era realizada uma reavaliação ultrassonográfica. De forma a minimizar o stress no parto e aumentar os níveis de vigilância da futura mãe, aproximadamente dois meses antes da data prevista para o parto, as burras gestantes eram colocadas num local isolado, designado de maternidade.

Para a recolha de dados relativos à raça asinina espanhola Zamorano-Leonesa, o secretário técnico da ASZAL (Asociación Nacional de Criadores de la Raza Asnal Zamorano-Leonesa) e médico veterinário, Dr. Jesús Pérez, gentilmente cedeu as instalações da sua exploração para o estudo da raça. A exploração situa-se em Villardondiego (41° 35' 04" N 5° 22' 36" O), pertencente à província de Zamora (Espanha). Os animais encontravam- se, igualmente, num regime de semi-estabulação, com um local apropriado para a sua recolha durante a noite, como o encontrado no centro português. Na exploração encontravam-se, há data, 180 animais, coabitando 161 burros da raça em estudo (60 burras reprodutoras, 90

40 animais jovens até aos três anos de idade, 10 burros castrados e um burro inteiro) juntamente com 20 outros equídeos (nomeadamente éguas e mulas). Os animais nesta exploração eram mantidos sob condições de reprodução e interação de forma natural, sem a intervenção humana e sem uma examinação rotineira do estado reprodutivo dos animais. Estes eram utilizados para fins reprodutivos, com o intuito de criação e manutenção desta raça asinina autóctone espanhola e produção mulateira. Todo o efetivo da exploração partilhava o mesmo local, realizando-se monta natural ‘‘a campo’’; inviabilizando, assim, a obtenção de informação precisa relativo ao dia de cobrição das burras, contrariamente ao centro português.

A disponibilidade alimentar era igual para todos os animais da exploração, baseando-se em feno e alfafa duas vezes ao dia e água ad libitum. No espaço encontrava-se também uma sala de ordenha inativada, cuja finalidade era a produção e venda de leite de burra, outrora realizado.

Nos dois locais onde ocorreram a recolha de imagens, todos os animais cumpriam um plano de vacinação e desparasitação regular, sendo vacinados contra o vírus da influenza equina e tétano anualmente e desparasitados de seis em seis meses com 200 µg de Ivermectina em pasta oral por kg de peso corporal.

41 3.2 Caracterização da população em estudo

O critério de seleção dos animais para este estudo baseou-se no seu estado reprodutivo: foram analisadas todas as burras que se encontravam gestantes durante o período de recolha de dados. Neste estudo foram utilizadas 22 fêmeas asininas gestantes de duas raças distintas: 11 fêmeas da Raça Asinina de Miranda e 11 fêmeas da Raça Zamorana-Leonesa. Todas as burras foram previamente examinadas e consideradas saudáveis.

As burras da Raça Asinina de Miranda em estudo apresentavam idades compreendidas entre os 4 e os 17 anos (9,19±3,79 anos), uma condição corporal entre 3 e 3,5 (3,09±0,20) numa escala de 5 níveis (1-mínimo e 5-máximo), uma paridade (número de partos) compreendida entre 0 e 5 partos (2,27±1,62 partos) e um peso variável entre os 297 e os 425 kg (341±55 kg). O peso foi obtido através da pesagem dos animais numa balança gentilmente cedida pela Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro – UTAD. Como ao longo do ano era selecionado um burro inteiro distinto para a realização das cobrições das fêmeas no centro, durante o estudo foram utilizados um total de 6 garanhões com idades compreendidas entre 3 e 15 anos (9±4,31 anos).

As 11 burras Zamorano-Leonesas utilizadas no estudo apresentavam idades compreendidas entre os 5 e os 16 anos (8,36±3,41 anos), apresentando uma condição corporal variável entre 1,5 e 4 (3,09±0,77) e o número de partos entre 1 e 8 partos (3,27±2,15 partos).

As idades de todas as 22 fêmeas intervenientes no presente estudo (tanto da Raça Asinina de Miranda como da Raça Zamorano-Leonesa) estavam compreendidas entre 4 e 17 anos (8,77±3,54 anos), a condição corporal compreendida entre 1,5 e 4 (3,09±0,55) e número de partos a variar entre 0 e 8 (2,77±1,93 partos).

42 3.3 Recolha de dados

Por limitações de disponibilidade de agenda foi variável a periodicidade do acompanhamento ecográfico das burras selecionadas para este estudo, não tendo sido possível seguir uma sequência cronológica restrita de observações. Considerou-se o primeiro período de observação, ou seja, a primeira visita onde o animal foi observado, como ponto de partida para o estudo com base na fase reprodutiva da burra na situação em que se encontrava no momento. Por tal, existiu variabilidade na primeira observação: algumas burras foram examinadas pela primeira vez numa fase inicial da gestação, contrariamente a outras, encontrando-se já numa fase mais avançada.

O protocolo de examinações neste estudo de campo, que teve por base 12 visitas às explorações, locais onde se encontravam os animais selecionados, foi o seguinte:

a) Previamente a serem examinadas, as burras foram contidas com a devida segurança para a realização do exame transretal. Todas as burras foram contidas com o auxílio de uma cabeçada e encaminhadas para um tronco de contenção, restringindo o seu movimento durante o exame. Em nenhum dos animais foi necessária administração de sedação dado que todas elas toleravam bem os procedimentos; b) Após a contenção dos animais, descrita anteriormente, o examinador equipou-se devidamente para o exame do trato reprodutor através de palpação transretal, colocando uma luva de palpação limpa e aplicando quantidades apropriadas de lubrificante. O reto da burra foi seguidamente esvaziado por remoção manual das fezes. O útero foi localizado e palpado manualmente, obtendo assim informações quanto à tonicidade, tamanho e forma do mesmo; c) Para a realização dos exames ultrassonográficos foram utilizados dois aparelhos distintos: nas burras da Raça Asinina de Miranda foi utilizado um da marca Welld Ultrasound Scanner®, modelo Wed-9618v (Shenzhen, China), representado na Figura 7-(A); enquanto que o aparelho utilizado nas burras da Raça Zamorana- Leonesa foi o SonoScape® (Shenzhen, China), representado na Figura 7-(B). Os dois aparelhos foram igualmente equipados com uma sonda linear transretal de 6,5 Mhz sendo que todos os exames foram realizados no modo B. Uma câmara de vídeo [DCR – HC96E, Sony®, Figura 7-(B)], encontrava-se acoplada aos aparelhos e todos os exames foram gravados para posterior análise;

43 (A) (B)

Figura 7 - Aparelhos ultrassonográficos portáteis utilizados para a recolha de imagens: (A) em Atenor, para a Raça Asinina de Miranda; (B) em Villardondiego, para a Raça Zamorano-Leonesa, com câmara de vídeo acoplada (fotografias de autor).

d) A sonda ultrassonográfica foi introduzida no reto e o conteúdo uterino examinado. A sonda foi manuseada de forma a realizar um varrimento no sentido esquerda- direita sobre o útero, iniciando-se a nível da cérvix, prosseguindo gradualmente em sentido cranial, até ao momento em que a órbita fetal foi identificada; e) Quando ocorria a identificação do olho do feto, procedia-se à obtenção de uma imagem, de forma a que fosse possível visualizar tanto o comprimento longitudinal (da esclera medial à esclera lateral) como da largura transversa (da retina à córnea) do corpo vítreo; f) Na análise dos dados após o exame ultrassonográfico transretal foi realizada a medição ocular fetal. Cada medição tinha por base três capturas de ecrã realizadas através dos vídeos obtidos em campo, utilizando o programa de imagem ImageJ®. As medições do comprimento e largura do corpo vítreo utilizadas no estudo foram obtidas, assim, pela média do conjunto das três medidas de comprimento e largura de cada olho fetal; g) De forma a padronizar o plano de emissão do feixe, o cristalino foi incluído na imagem em estudo. A obtenção das medidas oculares, representada pela Figura 8, foi adquirida com base nos seguintes critérios: a largura do corpo vítreo foi obtida pela medida em linha reta, dividindo o cristalino em duas partes iguais, entre a córnea (incluindo a câmara anterior) e a retina; e o comprimento ocular foi obtido pela medida em linha reta, perpendicular à linha de largura ocular, entre os dois polos

44 oculares. Todas as medições foram realizadas pelo mesmo operador, embora um operador diferente daquele que realizou os exames ultrassonográficos.

L

C

Figura 8 - O comprimento ocular (C) é determinado pela distância compreendida entre os dois polos oculares, dentro do corpo vítreo. A largura ocular (L), perpendicular a (C) e realizando uma bissetriz com o cristalino, é medida pela distância entre a córnea e a retina (imagem de autor).

45 3.4 Tratamento estatístico

Os dados recolhidos no âmbito do presente trabalho foram registados numa folha de cálculo do programa informático Microsoft Office Excel® (Microsoft, USA, 2019). Considerou-se efeito não significativo (ns) quando a probabilidade de significância (p) foi p ≥ 0,05, efeito significativo para p < 0,05, efeito muito significativo para p < 0,01 e efeito altamente significativo para p < 0,001. Foram calculados os intervalos de confiança de 95%. Todas as análises foram realizadas recorrendo ao programa JMP versão 14 (SAS Institute, Cary, NC, USA).

No estudo do desenvolvimento ocular fetal foram medidos o comprimento, largura e área do olho. A área do olho foi calculada através dos dados obtidos de comprimento e largura e utilizando a fórmula: área = (comprimento x 0,5) x (largura x 0,5) x 3,14. O comprimento e largura ocular foram expressos em centímetros e a área foi expressa em centímetros quadrados. A fórmula utilizada na determinação da área ocular foi baseada no estudo realizado por Brown (2012) em asininos.

Para estudar a relação entre as medições oculares fetais e alguns parâmetros materno- paterno-fetais foi realizada uma análise de correlação de Pearson (r). O valor de r varia entre -1 e 1, pelo que valores aproximados de -1 correspondem a uma relação negativa forte e valores próximos de 1 correspondem a uma relação positiva forte.

A análise estatística, através do uso de análise de regressão, foi aplicada aos parâmetros oculares fetais medidos ao longo da recolha de dados através das várias ultrassonografias transretais. Dois modelos de regressão linear foram avaliados: o modelo de regressão linear simples e o modelo de regressão linear polinomial de grau dois, tanto para dias após conceção como para dias até ao parto. Para tal, os dias após conceção foram considerados a variável dependente e a medição ocular (comprimento, largura e área) as variáveis independentes. Os valores de r2 (coeficiente de determinação) e de RMSE (desvio padrão residual - raiz do erro quadrático médio) foram utilizados para avaliar a capacidade de predição dos modelos resultantes das análises de regressão.

A realização da árvore de regressão foi baseada no estudo efetuado por Lanci et al. (2019). Segundo os autores, a árvore de regressão é um modelo estatístico que tem por base a criação de algoritmos e onde toda a amostra é subdividida em grupos de menor dimensão, gerando os nós. Em cada passo deste procedimento e, com base num critério de

46 homogeneidade, os nós gerados foram divididos de acordo com os valores das covariáveis a analisar e, no fim do procedimento, as unidades são disponibilizadas em nós terminais. A cada nó estava associado uma medida de incerteza dando a ideia da variabilidade associada na previsão dos dias até ao parto. O critério de homogeneidade fez com que as unidades colocadas no mesmo nó possuam valores semelhantes para a mesma variável de interesse e a determinação do percurso do nó terminal foi realizado pelas covariáveis. Visto que cada nó foi determinado pela regressão gerada e, como a distribuição das observações precedentes são possível de ser visualizadas na árvore, a média do valor de cada nó foi utilizada na predição dos dias até ao parto.

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48 4. Resultados e Discussão O presente estudo, com duração de cerca de 2 anos, apresenta uma amostra relativamente reduzida (11 fêmeas da Raça Asinina de Miranda e 11 fêmeas da Raça Zamorana-Leonesa). São várias as possíveis justificações para este número, nomeadamente: devido ao facto de ambas as raças possuírem um efetivo populacional reduzido; serem ambas raças autóctones com localização geográfica do efetivo bem definida; devido ao seu baixo índice reprodutivo; devido ao período de gestação prolongado, cerca de um ano (facto intrínseco da espécie). Por tal, é difícil que numa janela de tempo de aproximadamente 2 anos de pesquisa se obtenham dados de mais do que uma gestação no mesmo animal ou acompanhar simultaneamente um considerável número de burras gestantes.

4.1 Avaliação reprodutiva geral

No presente estudo um total de 55 ultrassonografias transretais foram efetuadas desde o dia 13 até ao dia 375 após conceção em 22 fêmeas asininas das duas raças referidas anteriormente. Nas 22 gestações avaliadas, em 21 foi registada o seu término durante o período observacional; destas, 18 terminaram com o nascimento de crias vivas (85,7 %), através de parto ‘‘natural’’ (de forma espontânea), Figura 9-(C), e 3 terminaram em morte fetal (14, 3 %), tal como representado na Figura 10.

Segundo a bibliografia, a duração média de gestação em asininos é de aproximadamente 372-374 dias (Fielding, 1988). A duração média de gestação na totalidade das burras estudadas (n = 22) não pode ser determinada, uma vez que apenas nas burras da Raça Asinina de Miranda se obteve os dados precisos da data de cobrição e data do parto. Para as 8 fêmeas desta raça onde se observou o término da gestação sem morte fetal durante o presente estudo, o tempo médio de gestação foi de 368,9±8 dias (intervalo compreendido entre 354 a 379 dias). Segundo a bibliografia consultada, este valor não é absoluto, visto que não é conhecido o momento exato de ovulação, devendo assim, ser considerado um erro de 48 horas no tempo indicado como médio para a gestação (Nervo et al., 2019).

49 O valor obtido de duração de gestação médio veio confirmar os estudos realizados anteriormente em asininos (Pugh, 2002; Villani et al., 2006; Carluccio et al., 2008; Galisteo & Perez-Marin, 2010; Veronesi et al., 2011; Brown, 2012; Contri et al., 2014; Carluccio et al., 2015-, Nervo et al., 2019), confirmando de igual forma que a duração de gestação em burras é superior à duração de gestação reportada em éguas (Morel et al., 2002).

(A) (B)

(C) (D)

Figura 9 - Crias nascidas durante o período de estudo: (A) e (D) pertencentes à raça Asinina de Miranda, (B) e (C) pertencentes à raça Zamorano-Leonesa (fotografias gentilmente cedidas pela Dra. Bélen Leiva e Dr. Jesús Pérez).

A duração média de gestação das 3 burras que sofreram uma interrupção da gestação durante o estudo não foi possível ser determinada: duas das burras em questão (Gaivota e Gaiata) abortaram sem a deteção pelos médicos veterinários ou funcionários, tendo sido as perdas de gestação apenas detetadas nas ecografias de rotina, aos 7 e 5 meses de gestação, respetivamente; uma das burras (Borboleta) foi eutanasiada devido a um grave trauma, tendo falecido juntamente com a cria já próximo do final da gestação (idade fetal de 386 dias, ±48 horas), não tendo sido realizada a sua necropsia, desconhecendo-se assim, o sexo da cria. A causa da ocorrência dos abortos fica por esclarecer, visto que, análises bacteriológicas ou víricas não foram efetuadas. Segundo Nervo et al. (2019), existe hipótese de existência de uma ligação entre a sazonalidade e a ocorrência de abortos: visto que esta espécie se encontra muito bem adaptada a climas áridos e a regiões desertas, as burras gestantes, ao serem

50 expostas a invernos rigorosos e a temperaturas muito baixas, poderão sofrer abortos devido a este fator de stress. Esta hipótese não deverá explicar os abortos das burras Gaiata e Gaivota visto que os abortos ocorreram nos meses de maio (de 2019) e junho (de 2018), respetivamente, já durante a estação primaveril.

18 crias nasceram 1 cria eutanasiada com vida após nascimento 21 gestações cujo término ocorreu durante o estudo 3 interupções de 22 gestações gestação observadas 1 gestação não parto previsto para terminou durante o 2020 período de estudo

Figura 10 - Representação esquemática das 22 gestações observadas durante o presente estudo.

Das 18 gestações cujo término decorreu ao longo do estudo e se obtiveram crias vivas: 8 crias eram fêmeas (44,4 %) e 10 eram machos (55,6 %), desconhecendo-se o sexo dos fetos dos animais que abortaram (duas burras da Raça Asinina de Miranda), de uma burra eutanasiada durante a gestação (Raça Asinina de Miranda) e de uma burra da Raça Zamorano-Leonesa, cujo parto será em 2020, posteriormente ao término do presente estudo.

Todos as crias nasceram saudáveis, apresentaram reflexos normais, mantiveram-se em pé e amamentaram dentro dos tempos estimados (Figura 9 - (A, B, D), exceto a cria de uma das burras da Raça Asinina de Miranda (Curra). Por decisão médico-veterinária esta cria teve de ser eutanasiada no primeiro dia de vida, pois verificou-se que sofria de uma deformação congénita (fenda do palato). Esta deformação foi considerada incompatível com a vida e, de acordo com as regras de bem-estar animal, foi procedida à sua eutanásia. Em equinos, animais nascidos com defeitos congénitos que envolvam o palato mole, duro e/ou associados a pneumonia por aspiração possuem geralmente menor probabilidade de sobrevivência (Shaw et al., 2015).

51 4.2 Comparação de parâmetros reprodutivos

Como ao longo da presente dissertação foi descrito, a Raça Asinina de Miranda e a Raça Zamorana-Leonesa são próximas em muitos aspetos, para além do facto de que ambas são raças asininas autóctones, portuguesa e espanhola, respetivamente, consideradas em risco de extinção (DAD-IS, 2019). Assim, um dos objetivos da presente dissertação foi comparar alguns dados reprodutivos obtidos nas duas raças durante o período observacional de dois anos, para assim verificar se o conhecimento de um parâmetro reprodutivo de uma das raças pode ser usado como informação-base para a outra.

Na Tabela 2 encontram-se demonstrados os parâmetros reprodutivos estudados nas duas raças asininas separadamente e o seu estudo estatístico comparativo a nível de associação entre ambas (probabilidade de significância – p; IC 95%).

Para os parâmetros condição corporal da fêmea progenitora, idade da fêmea e paridade, a nível estatístico não se verificou uma associação estatisticamente significativa (p > 0,05, IC 95%) para as duas raças asininas estudadas. A condição corporal geral em ambas as raças foi semelhante, sendo a média das 11 burras de cada raça de 3,09 (numa escala de 1 a 5). A idade média da fêmea progenitora foi superior nas burras da Raça Asinina de Miranda (9,18±3,79 anos) em relação às da Raça Zamorana-Leonesa (8,36±3,41 anos). Na paridade, ou número de partos das fêmeas, verifica-se o contrário: este é superior para as burras estudadas da Raça Zamorana-Leonesa (3,27±2,15 partos), enquanto que as fêmeas da Raça Asinina de Miranda têm em média menos um parto (2,27±1,62 partos).

Quando se comparam as percentagens obtidas no parâmetro sexo da cria (macho, fêmea ou desconhecido), não existe igualmente uma associação estatisticamente significativa (p = 0,497; IC 95%). Neste parâmetro, como referido anteriormente, é necessário ter em conta os dados dos fetos de sexo não conhecidos, tais como, o caso da cria que ainda não nasceu (pertencente à Raça Zamorana-Leonesa), da cria que morreu com a mãe ou como das duas burras que abortaram da Raça Asinina de Miranda.

52 Tabela 2- Comparação estatística entre determinados parâmetros reprodutivos nas duas raças analisadas.

Raça Asinina Raça Probabilidade Variável de Miranda Zamorana- de significância (n=11) Leonesa (n=11) (p)

Condição corporal da 3,09±0,20 3.09±0,77 0,0826 progenitora (1-5)

Idade da progenitora (anos) 9,18±3,79 8,36±3,41 0,1730

Paridade 2,27±1,62 3, 27±2,15 0,5654

Idade do macho inteiro 9±4,31 8 0,0026 (anos)

Fêmea 4 (36,36 %) 4 (36,36%) Sexo da cria Macho 4 (36,36 %) 6 (54,55%) 0,4966 n (%) Desconhecido 3 (27,27%) 1 (9,09%)

Peso da progenitora (kg) 341±55 - -

Duração da gestação 368,88 ±7,95 - -

O único parâmetro que estatisticamente apresenta uma associação significativa entre os dados comparados entre as duas raças foi o dado relativo à idade dos machos inteiros (p = 0,003, IC 95%). Na Raça Asinina de Miranda, a idade média dos machos envolvidos na cobrição é de 9±4,31 anos, enquanto que na Raça Zamorana-Leonesa a idade do único macho inteiro utilizado nas cobrições era de 8 anos. Por ser unicamente um animal, a influência deste dado a nível estatístico torna-se inválida.

O peso das fêmeas e a duração da gestação não foram possíveis de ser comparadas entre as duas raças visto ambos os parâmetros só serem conhecidos para a Raça Asinina de Miranda. A duração média da gestação das burras da Raça Asinina de Miranda foi possível de se calcular, uma vez que, para cada uma das 8 burras estudadas desta raça, sabe-se a data de cobrição e data de parto. Para as burras da raça espanhola apenas se sabe a data do parto, logo, não foi possível determinar a duração da gestação. Estes dois parâmetros (duração da gestação e peso da fêmea) não foram assim alvo de estudo estatístico comparativo entre as duas raças.

53 Devido à ausência de bibliografia relativamente aos parâmetros reprodutivos avaliados anteriormente e, dado que a presente amostra é pequena, não foi possível comparar os resultados obtidos com outros estudos.

4.2.1 Raça Asinina Portuguesa

Como referido anteriormente, apenas nesta raça foi possível calcular a duração média da gestação para as 8 burras estudadas, uma vez que, no local de estudo (AEPGA) estes acompanham diariamente os animais e foi possível obter informações como a data da cobrição e a do parto, permitindo assim, ser calculada a duração de gestação (368,88±7,95 dias).

São diversos os parâmetros identificados como fatores influenciadores da duração de gestação em equinos (raça, idade da progenitora, paridade, sexo da cria, peso à nascença, mês de conceção, mês e ano do parto) (Carluccio et al., 2015). Assim, para esta raça em particular, a duração da gestação foi possível de ser calculada com alguma exatidão (tendo em conta o erro de ±48h, já referido anteriormente). Nesta dissertação foi realizado um estudo estatístico com diversas variáveis que, segundo a literatura, podem estar associadas à duração da gestação em cada raça (Carluccio et al., 2015).

Como se pode observar na Tabela 3, foi testada uma variável dependente (isto é, duração da gestação), de forma a saber se há associação entre esta e outras variáveis, tais como: sexo da cria, idade da progenitora, paridade, mês de cobrição, mês do parto e efeito do progenitor. Neste estudo e, com os dados destes 8 animais para esta raça especifica, não se verificou nenhuma associação estatisticamente significativa para nenhum dos emparelhamentos de dados (em todos os casos p > 0,05; IC 95%).

Os resultados obtidos para os parâmetros idade da progenitora, mês de cobrição e mês do parto foi de encontro aos estudos realizados por Carluccio et al. (2015). O resultado obtido neste estudo é também semelhante ao reportado por Galisteo et al. (2010), exceto para o parâmetro mês de cobrição. Segundo este autor, existe uma influência significativa entre a época reprodutiva e a duração de gestação, sendo que, burras cobertas entre setembro e janeiro possuem geralmente durações de gestações mais longas.

Na literatura consultada, o efeito da influência do macho inteiro foi apenas mencionado em equinos, não tendo sido demonstrado um efeito significativo entre este e a duração de gestação (Morel et al., 2002), tal como no presente estudo. De igual forma, a influência da

54 paridade na duração da gestação é apenas referida em estudos efetuados em éguas. Segundo Morel et al. (2002), não existe relação entre estes dois parâmetros embora tenha reportado que a duração de gestação tenha sido influenciada pela paridade: éguas primíparas possuem gestações mais longas (Satué et al., 2011b).

Tabela 3 – Associação estatística entre a duração de gestação e determinadas variáveis testadas.

Probabilidade de Variável dependente: Duração da gestação significância (p)

Sexo da cria 0,3326

Idade da progenitora 0,2745

Paridade 0,2931 Variáveis independentes testadas Mês de cobrição 0,2931

Mês do parto 0,2745

Efeito macho 0,2745

No estudo realizado por Carluccio et al. (2015) é referida uma associação estatisticamente significativa entre o sexo da cria e a duração da gestação. No presente estudo o mesmo não se verificou, podendo esta diferença estar relacionada com o facto de ser uma raça específica pouco estudada até ao momento e a amostra para este estudo ser relativamente reduzida.

Contudo, foi identificada nesta população uma duração de gestação mais longa quando a cria era fêmea [372,5±5,97 dias (intervalo entre 365-379 dias)] e mais curta quando a cria era macho [365,25±8,77 dias (intervalo entre 354-374 dias)]. Este resultado não vai de encontro aos restantes estudos realizados em asininos (Galisteo & Perez-Marin, 2010; Crisci et al., 2014; Carluccio et al., 2015; Nervo et al., 2019) ou equinos (Valera et al., 2006).

A duração da gestação de asininos é aproximadamente de um ano e, no caso da Raça Asinina de Miranda, verificou-se que a média da duração da gestação foi de 368,88±7,95 dias (intervalo entre 354 e 379 dias) e por tal, quando testada a associação entre a duração de gestação destas burras e o mês de cobrição e de parto, a probabilidade de significância não é a mesma. Este facto deve-se a que em algumas das 11 burras o mês de parto não coincidir com o 12º mês de gestação, mas sim, com o 13º.

55 4.2.2 Raça Asinina Espanhola

As 11 burras da Raça Zamorana-Leonesa estudadas apresentam características reprodutivas próprias: idade média de 8,36±3,41 anos, condição corporal média de 3,09±0,77 e uma paridade média de 3,27±2,15 partos.

O maneio destes animais foi realizado a campo e, entre as fêmeas reprodutoras, apenas existia um macho inteiro em liberdade para cobrição (idade do macho = 8 anos), tornando assim difícil a tarefa de observação e anotação da data de cobrição de cada uma das fêmeas. Durante o período de observação deste estudo, sabe-se a data do parto de 10 das 11 fêmeas, desconhecendo apenas a data de uma burra que parirá em 2020, como referido anteriormente.

A determinação da idade fetal, para estes animais, foi calculada com base em valores de referência obtidos na literatura consultada (Tabela 4).

Tabela 4 - Determinação da idade fetal para a Raça Zamorano-Leonesa com base no estudo realizado por Galisteo et al. (2010).

Data da cobrição Idade fetal Progenitora Data do parto estimada* estimada**

Chata 05/06/2019 08/06/2018 316

Galera 17/06/2019 20/06/2018 304

Guinda 21/06/2019 24/06/2018 300

Jacara 24/05/2019 27/05/2018 328

Luelma 29/06/2019 02/07/2018 292

Nevada 22/06/2019 25/06/2018 299

Garruda 16/05/2019 19/05/2018 336

Pilingui 26/05/2019 29/05/2018 326

Prada 30/06/2019 03/07/2018 291

Rucia 29/05/2019 01/06/2018 323

Parto previsto para Cataline - - 2020

* Data de cobrição estimada = Data do parto – 362 dias ** Idade fetal estimada = Dia do exame ecográfico – Data de cobrição estimada

56 Com base no estudo conduzido por Galisteo et al. (2010), que teve em conta as características reprodutivas de três raças asininas espanholas (raça Andaluz, Catalã e Zamorana-Leonesa), foi utilizado como valor de referência a duração média da gestação 362±15,3 dias, não tendo sido identificada uma diferença significativa na duração de gestação entre as três raças. Como tal, a duração de gestação média de 362 dias para as fêmeas da Raça Zamorana-Leonesa foi utilizada na análise dos dados recolhidos relativo à data do parto das fêmeas estudadas, tendo sido possível calcular a data da cobrição estimada das mesmas.

Para as 11 fêmeas desta raça espanhola sabe-se que a proporção de machos (6/10) nascidos é superior à das fêmeas (4/10), todavia não é conhecida a duração da gestação para cada fêmea, impossibilitando assim uma conclusão para qual dos sexos da cria a duração da gestação é mais longa.

57 4.3 Análise das medições oculares fetais

No presente estudo e, como já foi referido anteriormente, os dados reprodutivos obtidos nas burras das duas raças asininas não foram iguais e, por essa razão, os parâmetros oculares recolhidos ao longo do estudo (comprimento e largura ocular) foram alvo de uma análise estatística distinta. No caso das burras da Raça Asinina de Miranda, como se obteve a informação da data precisa de cobrição e do parto, foram aplicados dois modelos de regressão linear com o intuito de determinar, através da criação de fórmulas matemáticas, a idade fetal e calcular os dias para a data do parto. No caso das burras da Raça Zamorana- Leonesa, como só foi possível saber com precisão a data do parto, foi aplicado uma regressão distinta (árvore de regressão) com a finalidade de determinar os dias até à data de parto.

4.3.1 Sucesso na obtenção das medições oculares

Como referido anteriormente, este estudo foi realizado sob condições de campo com burras em regime semi-estabulação e, apesar das condições não serem as ideais, a recolha de dados através de ultrassonografia transretal foi realizada, regra geral, sem dificuldades. As imagens foram gravadas e analisadas posteriormente à data do exame nas duas raças estudadas. As condições de luminosidade inerentes em trabalho de campo não interferiram com a identificação das estruturas durante o procedimento ultrassonográfico.

A recolha de imagens e medição ocular foi realizada com sucesso em 47 das 55 ultrassonografias transretais efetuadas (85,5% de taxa de sucesso), resultando, em média, 2,5 medições oculares por cada gestação. As imagens obtidas das órbitas fetais foram registadas quando a aparência ocular cumpria com os critérios pré-definidos, ou seja, quando a córnea, câmara anterior, cristalino e corpo vítreo se encontravam simultaneamente visíveis na imagem ecográfica. A Figura 11 demonstra como foram obtidas a várias medições oculares fetais, onde é possível identificar as várias estruturas constituintes da órbita fetal.

Por ultrassonografia transretal, a órbita fetal foi possível de ser registada e medida a partir do dia 60 de gestação (considerando o erro de ±48 h), não tendo sido possível realizar nenhuma medição ocular em gestações com uma duração inferior a dois meses. O insucesso na recolha de imagens deve-se, maioritariamente, à posição desfavorável da cabeça do feto (profunda dentro do abdómen materno), à apresentação posterior do feto no momento do

58 exame ultrassonográfico (Turner et al., 2006) ou devido ao excesso de atividade fetal durante o exame (Paolucci et al., 2012).

a

b

c

d

Figura 11 - Imagem ultrassonográfica da órbita ocular fetal. A medição ocular era realizada com a presença de córnea (a), câmara anterior (b), cristalino (c) e corpo vítreo (d) visíveis (imagem de autor).

O primeiro dia de gestação em que se identificou e mediu a órbita fetal foi realizada ligeiramente mais cedo quando comparado com outros estudos realizados em asininos. Estudos efetuados por Brown (2012), Crisci et al. (2014) e Nervo et al. (2019) em burras descreveram a primeira deteção da órbita fetal entre os dias 67 e 71 de gestação. Tal como no estudo realizado por Nervo et al. (2019), foi tida em conta a variabilidade de, pelo menos, 48 horas associada à assistência da cobrição natural dos animais sem o conhecimento do exato momento de ovulação. A deteção precoce da órbita fetal está associada à ocorrência simultânea de diversos acontecimentos, estando dependente de uma correta posição do feto em relação à sonda ecográfica (Brown, 2012; Nervo et al., 2019) e à qualidade do transdutor utilizado permitindo, ou não, a visualização de estruturas de menores dimensões (Nervo et al., 2019).

Apesar da baixa disparidade entre as três medições é recomendada uma medição triplicada em vez de unitária (Turner et al., 2006). Assim, por cada exame foram obtidas 3 medições separadas do olho do feto, tendo sido medido o comprimento e a largura em cada uma delas. Entre estas três medições, realizadas em cada observação, o desvio-padrão variou

59 de 0 a 0,26 cm (média de 0,06 cm), no comprimento, e 0 a 0,28 cm (média de 0,08 cm), para a largura.

Em concordância com Nervo et al. (2019), no último trimestre da gestação a apresentação fetal observada foi sempre a apresentação anterior. Contudo é necessário ter em conta que, devido ao tamanho do feto de asininos ser relativamente reduzido, comparativamente ao de equinos, e possuir uma grande mobilidade intrauterina, a apresentação final poderá ser alcançada apenas a partir do nono mês de gestação (Crisci et al.,2014).

4.3.2 Influências no desenvolvimento ocular fetal

Na Tabela 5 estão descritas as correlações entre o tamanho ocular fetal (comprimento, largura e área) e alguns parâmetros relativos às fêmeas progenitoras (idade, condição corporal, paridade e peso), ao macho progenitor (idade do macho) e do próprio feto (sexo da cria) da Raça Asinina de Miranda.

Foi possível concluir que existia uma correlação positiva entre os vários parâmetros mensurados relativamente ao tamanho ocular e outros avaliados no presente estudo. O comprimento correlacionou-se positivamente com a largura (r = 0,955) e com a área ocular (r = 0,975) e a área ocular correlaciona-se positivamente com a largura (r = 0,997).

Através da Tabela 5 foi possível verificar uma correlação fraca entre os parâmetros de medição ocular fetal e as variáveis maternas, fetais e paternas testadas. Com estes dados é assim possível assumir que a idade, peso, paridade e condição corporal da progenitora não afetaram significativamente, neste estudo, o desenvolvimento fetal. Apesar de se esperar que as fêmeas primíparas produzam crias mais leves e de menores dimensões, comparativamente às multíparas (Hendriks et al., 2009), neste estudo esta tendência não foi visível.

O sexo da cria possui, igualmente, uma correlação fraca com o tamanho ocular, tal como foi descrito em póneis (Turner et al., 2006). Relativamente à correlação com a idade do progenitor, não foi encontrada uma justificação para este resultado visto este ser um dado testado pela primeira vez e não se encontrar referido na bibliografia disponível um resultado comparável.

60 Em concordância com este trabalho, estudos realizados em asininos (Brown, 2012; Crisci et al., 2014; Nervo et al., 2019) e equinos (Hendriks et al., 2009) afirmam que as medições oculares fetais não parecem ser influenciadas pela características da progenitora. Desta forma, o tamanho do olho do feto não depende da progenitora, da idade do macho nem do sexo da cria, sendo o seu crescimento independente destes fatores. Estudos efetuados em asininos, onde foram detetadas gestações anormais no grupo de animais selecionados, foi referido que o tamanho da órbita fetal, nestes animais, não sofreu alteração de tamanho (Crisci et al., 2014).

Tabela 5 - Correlações ente medições oculares fetais e alguns parâmetros materno-paterno-fetais na Raça Asinina de Miranda (n = 36).

Comprimento Largura ocular Área ocular Correlação (r) ocular (cm) (cm) (cm²)

Comprimento ocular 1 - - (cm)

Largura ocular (cm) 0,955** 1 -

Área ocular (cm²) 0,975** 0,997** 1

Idade da progenitora -0,068ns -0,142ns -0,124ns (anos)

Sexo da cria -0,074ns -0,167ns -0,144ns

Paridade 0,017ns -0,074ns -0,051ns

Condição corporal da -0,173ns -0,082ns -0,106ns progenitora (1-5)

Peso da progenitora -0,062ns -0,116ns -0,103ns (kg)

Idade do macho inteiro -0,147ns -0,215ns -0,199ns

ns - valores de r inferiores a 0,330 são não significativos; * valores de r entre 0,331 e 0,424 são significativos para p < 0,05; ** valores de r superiores a 0,424 são significativos para p < 0,01.

61 4.3.3 Previsão da idade fetal

O tamanho do olho fetal aumentou progressivamente com o avançar da gestação (Figura 5) e, através da análise de regressão realizada, foi detetada uma associação muito significativa (p < 0,0001) entre o dia de gestação e o comprimento, largura e área ocular para ambos os modelos estatísticos. Uma correlação estatística significativa foi demonstrada entre estes parâmetros, tal como foi descrito em burras (Brown, 2012; Crisci et al., 2014; Nervo et al., 2019), éguas (McKinnon et al., 1988; Reef et al., 1995; Reef et al., 1996; Renaudin et al., 2000; Bucca et al., 2005; Hendriks et al., 2009; Hartwig et al., 2013), póneis (Turner et al., 2006), mulas (Paolucci et al., 2012) entre outros mamíferos, nomeadamente: alpacas (Ferrer et al., 2013), rinocerontes pretos (Radcliffe et al., 2000), veados (Lenz et al, 1993), bovinos (Somnuk et al., 2017) e ovinos (Petrujkić et al., 2016).

Uma relação linear positiva da regressão simples e polinomial de segundo grau entre o comprimento, largura e área do olho fetal e o dia de gestação (±48 h) foi demonstrada através do Gráfico 4 e Tabela 6. Ambos os modelos indicaram significância estatística na associação entre as variáveis (p < 0,0001) o que tornou os dois modelos passíveis de ser aplicados para estimar a idade fetal.

No Gráfico 4 é possível comparar os dois modelos testados, sendo o que melhor se adequou às medições oculares foi o modelo de regressão polinomial de grau 2. Através da visualização do Gráfico 4 – (A, C, E) foi possível concluir que o crescimento ocular precedente ao dia 100 de gestação foi tendencialmente curvilíneo e a partir do dia 100 de gestação o crescimento foi tendencialmente linear, não existindo uma justificação para esta desigualdade.

62

(A) (B)

(C) (D)

(E) (F)

Gráfico 4 - Comparação gráfica entre dois modelos de regressão linear: simples (B, D, F) e polinomial de grau 2 (A, C, E); A variável dependente utilizada foi “dias após conceção” e a independente foram as várias medições oculares : comprimento (A e B), largura (C e D) e área ocular (E e F).

63 Na Tabela 6 estão descritos os coeficientes de determinação e os erros associados entre os vários parâmetros oculares analisados (comprimento, largura e área) com os dois modelos de regressão avaliados. Pela comparação das várias variáveis e dos modelos estudados foi possível concluir que ambos os modelos expressam um coeficiente de determinação muito elevado entre as medições oculares e idade fetal (r² varia entre 0,883 e 0,912), embora tenham sido obtidos valores mais elevados no modelo polinomial de grau 2 (r² entre 0,894 e 0,912). Este modelo foi considerado o que melhor explicou a relação do crescimento do olho com a idade fetal. O crescimento ocular foi representado de uma melhor forma através de um modelo com base num gráfico curvilíneo do que num com base num crescimento linear, contrariando a suposição inicial de linearidade baseada na bibliografia consultada (Brown, 2012; Crisci et al., 2014; Nervo et al., 2019).

Tabela 6 - Comparação entre o modelo de regressão linear simples e polinomial de grau dois através de coeficientes de determinação e de raízes dos erros quadráticos médios para os dias após conceção.

Variável Modelo Parâmetros Linear Polinomial de Dependente Independente analisados Simples grau 2

r² 0,906 0,912 Comprimento ocular (cm) RMSE 29,489 28,891

r² 0,883 0,894 Dias após Largura ocular conceção (cm) RMSE 32,889 31,770

r² 0,893 0,905 Área ocular (cm²) RMSE 31,404 29,988

Através da Tabela 6 foi possível também verificar que, entre as três variáveis, a medição do comprimento ocular revela ser a variável que melhor prevê a idade fetal pelo seu coeficiente de determinação elevado, tanto no modelo linear simples (r² = 0,906), como no polinomial de grau 2 (r² = 0,912). Apesar do comprimento ser considerado a variável com o coeficiente de determinação mais elevado, a área ocular foi considerada o segundo melhor parâmetro, tanto no modelo linear simples (r² = 0,893) como no modelo polinomial de grau

64 2 (r² = 0,905), e a largura o terceiro melhor parâmetro, com r² = 0,883 no modelo linear simples e r² = 0,894 no modelo polinomial de grau 2.

Através da comparação entre as raízes dos erros quadráticos médios, representado em dias, o modelo que possui valores com menor erro é o modelo polinomial de grau 2. Quando comparado com o modelo de regressão linear simples este apresenta valores de erro inferiores para o comprimento (RMSE de 28,89 e 29,49 dias para os modelos polinomial e linear simples, respetivamente), para a largura (RMSE de 31,77 e 32,89 dias para modelo polinomial e linear simples, respetivamente) e para a área (RMSE de 29,98 e 31,40 dias para modelo polinomial e linear simples, respetivamente). Este parâmetro indica que, em cada gráfico analisado para o modelo polinomial, a medição ocular tende a variar à volta da curva de crescimento cerca de 30,22 dias. Este valor poderá estar influenciado por um processo de crescimento tendencialmente não linear ou influenciado por interferências nas medições ultrassonográficas (Turner et al., 2006).

As equações obtidas através do modelo de regressão linear simples são apresentadas de seguida tendo em conta os três parâmetros oculares:

➢ Comprimento do olho: Dias após conceção = 18,383 + 97,816*Comprimento (cm)

➢ Área do olho: Dias após conceção = 14,854 + 49,427*Área do olho (cm²)

➢ Largura do olho: Dias após conceção = 14,941 + 103,124*Largura (cm)

Tendo em conta tudo o referido, as equações determinadas pelo modelo de regressão polinomial de grau 2 para este estudo que melhor definem os dias após conceção (idade fetal) são as apresentadas em seguida:

➢ Comprimento do olho: Dias após conceção = 6,43 + 100,05*Comprimento (cm) + 9,44*(Comprimento (cm)-1,86)²

➢ Área do olho: Dias após conceção = -4,73 + 51,63*Área do olho (cm2) + 3,55*(Área do olho (cm2)-3,76)²

➢ Largura do olho: Dias após conceção = -3,81 + 107,63*Largura (cm) + 14,73*(Largura (cm)-1,80)²

65 A análise de regressão polinomial grau 2 realizada prevê um modelo de crescimento curvilíneo do olho fetal no Burro de Miranda. Dado que os dias após conceção foram considerados a variável dependente nos modelos utilizados neste estudo, a comparação direta dos resultados obtidos com os resultados reportados em asininos, que usaram dias de gestação como a variável dependente, não foi possível. Contudo, o resultado obtido para o modelo de regressão linear simples vai de encontro aos resultados já descritos em asininos cruzados (Brown, 2012; Nervo et al., 2019) e em burras da raça Amiata (Crisci et al., 2014). O estudo efetuado por Radcliffe et al. (2000), efetuado em duas fêmeas rinocerontes negros, vai de encontro ao resultado obtido para o modelo de regressão polinomial de grau dois descrito no presente estudo.

Os resultados obtidos contribuem para a definição de valores de referência (Tabela 7) para a raça analisada (Raça Asinina de Miranda) e para a própria espécie, permitindo compreender algumas das particularidades que caracterizam a gestação em asininos e que as distinguem dos restantes equídeos.

Tabela 7 - Escala de referência para a prática clínica com base nos resultados obtidos no presente estudo na Raça Asinina de Miranda: determinação da idade fetal com base no comprimento ocular.

Comprimento Idade fetal ocular (cm) (dias) 0,25 56 0,50 74 0,75 93 1,00 113 1,25 135 1,50 158 1,75 182 2,00 207 2,25 233 2,50 260 2,75 289 3,00 319 3,25 350 3,50 382

66 4.3.4 Previsão do dia do parto

O desenvolvimento da glândula mamária, o aparecimento de um precursor do colostro na extremidade dos tetos, a alteração da concentração de cálcio ou do pH nas secreções mamárias são formas úteis de prever o momento do parto quando já se encontra próximo do dia do nascimento (Lanci et al., 2019). De forma a estimar os dias até ao parto (DAP) com maior antecedência foram utilizados dois modelos de regressão: um modelo de regressão linear simples e um polinomial de grau dois para as fêmeas da Raça Asinina de Miranda; e uma regressão em árvore para as fêmeas da Raça Zamorano-Leonesa. A utilização de dois modelos distintos para as duas raças deve-se à diferente informação obtida para cada uma delas, tal como já foi referido anteriormente.

4.3.4.1 Raça Asinina de Miranda

Uma relação linear positiva da regressão simples e polinomial de segundo grau entre o comprimento, largura e área do olho fetal e os dias até ao parto (±48 h) foi observada na Raça Asinina de Miranda. Os dois modelos são possíveis de ser aplicados para estimar os dias até ao parto visto que ambos os modelos são estatisticamente significativos (p < 0,0001).

Na Tabela 8 estão descritos os valores dos coeficientes de determinação e as raízes dos erros quadráticos médios entre os dias até ao parto e os vários parâmetros oculares analisados (comprimento, largura e área) com os dois modelos de regressão.

Através da análise da Tabela 8 é possível concluir que ambos os modelos expressam um coeficiente de determinação elevado entre as medições oculares e os dias até ao parto (r² varia entre 0,843 e 0,883), embora tenham sido obtidos valores mais elevados no modelo polinomial de grau 2 (r² entre 0,852 e 0,883). Este último modelo é desta forma considerado o que melhor prevê quantos dias faltam para o dia do parto. Através da mesma tabela é também possível referir que, dentro das três variáveis analisadas, a medição do comprimento ocular revela ser a variável que melhor prevê os dias até ao parto visto ter o valor de coeficiente de determinação mais elevado, tanto no modelo linear simples (r² = 0,876), como no modelo polinomial de segundo grau (r² = 0,883), tal como referido no estudo de Turner et al. (2006) efetuado em póneis.

A área ocular foi considerada o segundo melhor parâmetro, tanto no modelo linear simples (r² = 0,856) como no modelo polinomial de segundo grau (r² = 0,867), e a largura o

67 terceiro melhor parâmetro, tanto no modelo linear simples (r² = 0,843) como no modelo polinomial de segundo grau (r² = 0,852).

Tabela 8 – Comparação entre o modelo de regressão linear simples e polinomial de grau dois através de coeficientes de determinação e de raízes dos erros quadráticos médios para dias até ao parto.

Variável Modelo Parâmetros

Linear Polinomial Dependente Independente analisados Simples de grau 2

r² 0,876 0,883 Comprimento ocular (cm) RMSE 33,491 33,126

r² 0,843 0,852 Dias até ao Largura ocular parto (cm) RMSE 37,637 37,249

r² 0,856 0,867 Área ocular (cm²) RMSE 36,023 35,260

Através da comparação entre as raízes dos erros quadráticos médios, o modelo que possui os valores de menor erro é o modelo polinomial de grau 2, embora as diferenças entre os dois modelos não sejam muito evidentes. O modelo de regressão polinomial grau 2 apresenta valores de erro inferiores para o comprimento (RMSE de 33,13 e 33,49 dias para modelo polinomial e linear simples, respetivamente), para a largura (RMSE de 37,25 e 37,64 dias para modelo polinomial e linear simples, respetivamente) e para a área (RMSE de 35,26 e 36,02 dias para modelo polinomial e linear simples, respetivamente). A medição ocular tende a variar à volta da curva de crescimento cerca de 35,21 dias, considerando o modelo polinomial, e 35,72 dias, considerando o modelo linear simples.

Segundo Turner et al. (2006), a determinação dos dias até ao parto encontra-se influenciada pelo próprio desenvolvimento do feto tal como pela variação da duração de gestação inerente a cada fêmea. Desta forma, o erro associado na predição dos dias até ao parto é superior quando comparado com a determinação da idade fetal. Apesar desta diferença, em termos práticos, as duas abordagens apresentam igual valor. No Gráfico 5 é possível comparar o resultado obtido através da aplicação dos dois modelos de regressão, sendo o que melhor se adequa às medições oculares é o modelo polinomial de grau 2.

68

(A) (B)

(C) (D)

(E) (F)

Gráfico 5 - Comparação gráfica entre dois modelos de regressão linear: simples (B, D, F) e polinomial de grau 2 (A, C, E). A variável dependente utilizada foi “dias até ao parto” e independente foram as várias medições oculares : comprimento (A e B), largura (C e D) e área ocular (E e F).

69 Tendo em conta os três parâmetros oculares, as equações obtidas através do modelo de regressão linear simples são apresentadas de seguida:

➢ Comprimento do olho: DAP = 350,60 - 99,27*Comprimento (cm)

➢ Área do olho: DAP = 357,47 - 51,44*Área do olho (cm2)

➢ Largura do olho: DAP = 358,02 - 108,15*Largura (cm)

As equações determinadas pelo modelo de regressão polinomial de grau dois para este estudo e que melhor definem os dias até ao parto nas fêmeas da Raça Asinina de Miranda, tendo em conta os três parâmetros oculares utilizados, são as apresentadas de seguida:

➢ Comprimento do olho: DAP = 366,16 - 102,67*Comprimento (cm) - 9,46*(Comprimento (cm)-2,01)2

➢ Área do olho: DAP = 376,44 - 53,04*Área do olho (cm2) - 3,26*(Área do olho (cm2)-4,03)2

➢ Largura do olho: DAP = 373,48 - 109,87*Largura (cm) - 12,73*(Largura (cm)- 1,93)2

4.3.4.2 Raça Zamorano-Leonesa

Para análise estatística da árvore de regressão foram utilizados dados de nove das onze burras da Raça Zamorano-Leonesa. O motivo de exclusão de duas burras da análise estatística deveu-se ao facto de uma das burras possuir parto previsto para 2020 (depois do término do estudo) e uma burra ser considerada outlier. Na análise foram consideradas quatro covariáveis, nomeadamente: paridade (número de partos), idade da progenitora (anos), comprimento ocular (cm) e largura ocular (cm); tendo sido considerado “dias até ao parto” (DAP) como a variável de interesse. A árvore regressão obtida neste estudo é representada na Figura 12.

O modelo de regressão em árvore é um método não paramétrico onde algumas suposições, como a normalidade da variável de resposta e as observações independentes, não

70 são necessárias para a realização da mesma (Lanci et al., 2019), sendo desta forma um modelo de regressão considerado mais simples do que os modelos de regressão linear.

Através da sua análise é possível destacar que ambos os parâmetros oculares (comprimento e largura) são úteis na predição da data para o parto, ao contrário dos parâmetros paridade e idade da progenitora. O modelo de regressão em árvore obtido poderá ser útil para estimar os dias que faltam até à chegada do dia do parto quando o dia de cobrição é desconhecido, apesar de não prever com exatidão o dia do parto, tal como reportado por Lanci et al. (2019).

Figura 12 – Modelo de regressão em árvore para a determinação dos dias até ao parto na Raça Zamorano- Leonesa.

71 A análise de regressão efetuada apresenta ser uma forma simples e visual de determinar, com um erro-padrão associado de 14,6 dias, os dias até ao parto (DAP) nas burras Zamorano- Leonesas apesar do número da amostra ser inferior ao estudo em comparação. Com base nas ramificações e nos valores das covariáveis obtidas, a estrutura gerada poderá ser útil na prática clínica em contexto de campo.

72 5. Conclusões Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que a órbita fetal aumenta progressivamente com o avançar da gestação e o seu desenvolvimento não é influenciado pelas características dos progenitores nem pelo sexo da cria. A aplicação de ultrassonografia transretal na medição ocular fetal é uma técnica útil na determinação da idade fetal em asininos. Através da técnica referida foi possível a visualização desta estrutura anatómica do segundo mês até ao final do período gestacional.

Para as variáveis dependentes analisadas (dias após conceção e dias até ao parto) o modelo que melhor se ajustou à amostra e obteve menor erro foi o modelo de regressão polinomial de grau dois, em comparação com o modelo de regressão linear simples. Com base nos três parâmetros fetais testados (comprimento, largura e área ocular), a medição do comprimento ocular revelou ser a variável que melhor previu a idade fetal e os dias até ao parto, seguindo-se as variáveis: área ocular e a largura ocular. No modelo de regressão em árvore realizado foi possível obter dados relevantes sobre a previsão dos dias até ao parto na raça Zamorano-Leonesa.

Os dados obtidos poderão ser utilizados por médicos veterinários em contexto de campo para avaliar o crescimento fetal, para calcular a idade gestacional quando a data de cobrição/ovulação é desconhecida e prever a data do parto.

Futuramente, para estudos efetuados com base neste tema, podem ser desenvolvidos diversos trabalhos com outras características, tais como:

a) Realização de ultrassonografia transretal desde o momento exato em que ocorre a ovulação até ao dia do parto, com um intervalo de recolha de imagens ultrassonográficas mais curto (semanalmente, de preferência) para diminuir o afastamento temporal entre os dados recolhidos e aumentar a quantidade de dados a analisar. Um procedimento mais regular deverá ser efetuado caso os animais tolerem bem o exame, sendo fundamental dar prioridade ao bem-estar animal; b) Realização de estudos com um maior número de burras gestantes, providenciando uma maior quantidade de dados e, desta forma, tornar a comparação de dados entre raças e entre espécies mais precisa; c) Gravação das imagens ultrassonográficas, tal como efetuado neste trabalho, para aumentar a precisão das medições e não ocorrer influências causadas pelas condições atmosféricas durante o exame em contexto de campo;

73 d) Comparar a aplicação das técnicas de ultrassonografia transretal e transabdominal para um acréscimo de conhecimento destas raças, podendo ser pesquisados diferentes parâmetros para a determinação da idade fetal, tais como, diâmetro biparietal, diâmetro aórtico, diâmetro do tórax, entre outros; e) Pesquisar as possíveis causas de abortos, caso ocorram durante o estudo, através de análises bacteriológicas ou víricas.

Até ao momento este é, tanto quanto é do nosso conhecimento, o primeiro estudo sobre a análise do desenvolvimento fetal em asininos em Portugal e Espanha. Contudo, sendo um tema que requer maior investigação, mais estudos são necessários para contribuir de forma ativa na conservação destas duas raças asininas autóctones em vias de extinção, permitindo assim, um aumento do conhecimento reprodutivo sobre estas e sobre a própria espécie asinina em geral. A preservação destas raças deverá ser considerada prioritária, sendo necessário reajustar o maneio reprodutivo atual, envolver os criadores na partilha de conhecimentos e desenvolver novas estratégias de divulgação e promoção das raças.

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