Functional Analysis of Two Prunus Dulcis Cbfs by Overexpression in A. Thaliana and Analysis of Seasonal Expression in Field Plants
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UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL FUNCTIONAL ANALYSIS OF TWO PRUNUS DULCIS CBFS BY OVEREXPRESSION IN A. THALIANA AND ANALYSIS OF SEASONAL EXPRESSION IN FIELD PLANTS Nuno Miguel Loureiro Gonçalves Mestrado em Biologia Celular e Biotecnologia 2011 b UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL FUNCTIONAL ANALYSIS OF TWO PRUNUS DULCIS CBFS BY OVEREXPRESSION IN A. THALIANA AND ANALYSIS OF SEASONAL EXPRESSION IN FIELD PLANTS Nuno Miguel Loureiro Gonçalves Orientador Externo: Prof. Doutora Maria Margarida Oliveira (Laboratório de Genómica de Plantas em Stress - GPlantS, Instituto de Tecnologia Química e Biológica - ITQB). Orientador Interno: Prof. Doutora Helena Trindade (Centro de Biotecnologia Vegetal - IBB, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa). Mestrado em Biologia Celular e Biotecnologia 2011 Agradecimentos Os últimos anos têm sido de revoltas mudanças no meu percurso profissional, incluindo uma desistência forçada e depois revogada, e o trabalho efectuado durante a duração deste estágio foi crucial para o delineamento de novos caminhos a seguir. Com a convicção, conhecimento e humildade que ele me proporcionou para meu futuro no conturbado e aliciante mundo da investigação científica. Em primeiro lugar tenho de agradecer profundamente à Professora Margarida Oliveira por me ter recebido no seu laboratório, mesmo numa altura em que não estavam a ser aceites alunos de mestrado. Durante o ano curricular defini para mim próprio que esta seria a área que mais prazer me daria em ser integrado e dificilmente encontraria em Portugal um melhor laboratório para tal. Por isso um muito obrigado pela confiança depositada e por permitir que eu, absolutamente inexperiente, me fosse desenvolvendo gradualmente até chegar agora a um ponto em que me sinto preparado para enfrentar todos os desafios que aí virão. Em segundo lugar, quero fazer uma vénia de duração embaraçosa ao Pedro Barros, o meu mentor absoluto durante este quase ano e meio. Por tudo. Pela paciência demonstrada desde o início, quando até os problemas mais básicos eram inultrapassáveis, até à elaboração desta tese, processo longo e também ele minado de inseguranças e falhas. Por confiar sempre em mim num trabalho que também era dele, mesmo quando eu próprio tinha duvidas das minhas capacidades. Por me informar cada dia de coisas que nunca soube descobrir anteriormente. Finalizando, por me acompanhar com rigor e amizade em todos os passos que fui dando e ter sido imensurávelmente determinante no desenvolvimento do discernimento científico. A todos os restantes membros do GPlantS outro agradecimento crucial. Todos conhecemos histórias de terror sobre picardias entre colegas de laboratório, mas se fosse este o meu único exemplo juraria que tal era impensável. O ambiente de companheirismo e entre- ajuda criado foi essencial para que eu cometesse erros e soubesse lidar com eles, para ultrapassar os problemas que inevitavelmente surgiam com uma perspectiva não auto- destrutiva. Porque sempre que precisava havia alguém disposto a socorrer-me de imediato, actos de raro altruísmo neste meio. E para além disso a amizade e galhofa nos tempos devidos que mantiveram sempre a vontade do regresso no dia seguinte. Um abraço e beijo particulares ao Duarte e à Mafalda por me ajudarem até antes do início. i Uma 'beijufa' gargantuana à Inês Trindade, fada-madrinha e orientadora muito responsável pelo meu caminho académico desde o relvado do C8 em 2003 até agora. 8 anos. Nem dá para acreditar Obrigado a ela, pelos cafés, jantares e muitas outras ocasiões de aconselhamento profissional e psicológico, e também à Mara Alves, por me ajudarem em tempos de indecisões, sempre em estado de profundo pânico. Na FCUL um obrigado à Professora Helena Trindade, que me acompanhou desde o inicio da licenciatura, por ter aceite ser a minha orientadora interna e por sempre se mostrar interessada pelo trabalho que estava a desenvolver. Um grande abraço a todos os meus colegas de mestrado da FCUL com particular ênfase ao André, ao Nuno e à Susana, e, ainda mais forte, à Ana Margarida, outro inesgotável exemplo de bondade e amizade. E à Twig também, não me posso esquecer dela, especialmente a escorregar de botas de salto alto por essas ruas de Lisboa abaixo. Um beijo enorme. To PJ. Tudo o que eu possa escrever é insignificante e insuficiente. Ajudaste a definir quem sou hoje de formas inimagináveis e indescritíveis e sei que me tornei numa pessoa completa, confiante e esperançosa, totalmente graças a isso. Obrigado. Muito obrigado. Agora. E até ao fim. 'In my dreams it feels like we are forty stories tall, when you're around we're untouchable'. E finalmente, e sempre em primeiro, aos meus pais. Por sempre me amarem incondicionalmente, apoiarem-me nos piores momentos e se orgulharem de mim nos melhores. Nem nos anos perdidos de deambulação perderam a esperança nas minhas capacidades, que me fez a mim acreditar nelas também. Amo-vos mais do que alguma vez vos conseguirei dizer. ii List of abbreviations #1, #2, #3 Almond field trees + Positive control 5AC 5-aza-2'-deoxycytidine bp Base pairs CBF CRT-binding factor cDNA Complementary DNA CEF Cefotaxime Col-0 Arabidopsis thaliana Columbia ecotype COR Cold-regulated CRT C-repeat responsive element DAG Days after germination DAM Dormancy-associated MADS-box DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid DRE Dehydration responsive element DREB DRE-binding factor g, mg, μg, ng Gram, miligram, microgram, nanogram GA Bioactive gibberellins GA3 Gibberellic acid HA Hemaglutinin tag L, mL, μL Liter, mililitre, microlitre M, mM, μM Molar, milimolar, micromolar MA Arabidopsis thaliana growth medium mA Miliamper MG132 Z-Leu-Leu-Leu-al min Minutes NaCl Sodium Chloride ºC degree Celsius ox Oxidase PCR Polymerase chain reaction PEB Protein extraction buffer PPT Phosphinothricin PVDF Polyvinylidene fluoride QTL Quantitative Trait Loci RdDM RNA-directed DNA methylation RNA Ribonucleic acid RT Room temperature RT-PCR Semi-quantitative reverse transcriptase PCR SD Short-day photoperiod SI Gametophytic self-incompatibility siRNA Small interference RNA T0, T1, T2, T3 Generations of transgenic lines Taq Thermus aquaticus DNA polymerase TF Transcription factor TGS Transgene silencing V Volts vol Volume WT Wild-type iii ABSTRACT Flowering in woody perennials, in opposition to annual/biennial plants, are heavily dependent on cold acclimation, acquired during the dormancy stage of their seasonal development. The ability to endure low temperatures is essential to the chilling requirements required for dormancy break and to resume growth. In temperate fruit trees of the Rosaceae family, the blooming time is crucial for breeders, as premature anthesis exposes flowers to winter frosts thus affecting fruit production. Almond (Prunus dulcis) belongs to the Prunoideae subfamily and is a good model for studies regarding these aspects of dormancy break and blooming as it is the tree of this family that flower earlier. Its close homology to the recently sequenced genome of peach (Prunus persica) also facilitates molecular research focused on these traits, still largely based on the annual plant model Arabidopsis. In this thesis we have investigated the putative involvement of two novel almond genes in the regulation of flowering time. These genes, PrdCBF1 and PrdCBF2, are known to be regulated by low temperatures during dormancy and they belong to a large family of transcription factors known as CBF/DREB1 (C-REPEAT (CRT)/DEHYDRATION RESPONSIVE ELEMENT (DRE)-BINDING FACTORS). They are activated during periods of low temperature induced stress and bind to CRT domains of promoters of cold-regulated (COR) genes, which provide protection against freezing damage. Functional studies were conducted through overexpression of PrdCBF1 and PrdCBF2 in Arabidopsis thaliana, to investigate protein variation and stability under several different treatments, as well as analyzing transcript accumulation of transgenes and endogenous genes involved in cold response (AtCBF1, AtXero2 and AtCOR15a (both COR genes), as well as AtRD29A) or related to the gibberellin growth-induction pathway (AtGA20ox1 and AtGA2ox3). We were able to prove that constitutively expressed PrdCBF2 activates Arabidopsis genes related to cold acclimation and provides enhanced protection against freezing damage in transgenic plants in comparison to non-acclimated plants. Some difficulties encountered when handling the transgenic lines also allowed characterization of the dwarf phenotype obtained and the growth retardation pattern induced by CBF overexpression, as well as the transgene silencing triggered by DNA methylation. Additionally, we studied PrdCBFs expression during seasonal development in field trees, and analyzed the downstream gene PrdDHN1, a COR gene that belongs to the dehydrin protein family, as well as several genes related to flowering and growth induction, such as genes iv encoding MADS-box proteins (PrdMADS1 and PrdMADS3) and gibberellin pathway enzymes (PrdGA20ox and PrdGA2ox). The results obtained provided evidence of the PrdCBFs upregulation during early to mid-winter periods of dormancy and cold acclimation and their downregulation relating to deacclimation after dormancy break. New putative markers (PrdMADS3, PrdGA2ox and PrdGlyc) for dormancy break and transitioning to blooming time also emerged, which may become novel players in a model of regulation of perennial dormancy. Additionally, these markers may further be applied in detection of