Halász Júlia
Total Page：16
File Type：pdf, Size：1020Kb
Doktori (PhD) értekezés A KAJSZI ÖNMEDD İSÉGÉT MEGHATÁROZÓ S-ALLÉL-RENDSZER MOLEKULÁRIS HÁTTERE Halász Júlia Témavezet ı: Dr. Pedryc Andrzej, CSc egyetemi docens Budapesti Corvinus Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszék Budapest 2007 A doktori iskola megnevezése: Kertészettudományi Doktori Iskola tudományága : Biológiai tudományok vezet ıje: Dr. Papp János, DSc egyetemi tanár BCE, Kertészettudományi Kar, Gyümölcsterm ı Növények Tanszék Témavezet ı: Dr. Pedryc Andrzej, CSc egyetemi docens BCE, Kertészettudományi Kar Genetika és Növénynemesítés Tanszék A jelölt a Budapesti Corvinus Egyetem Doktori Szabályzatában el ıírt valamennyi feltételnek eleget tett, az értekezés m őhelyvitájában elhangzott észrevételeket és javaslatokat az értekezés átdolgozásakor figyelembe vette, ezért az értekezés nyilvános vitára bocsátható. ........................................................... ........................................................... Dr. Papp János Dr. Pedryc Andrzej Az iskolavezet ı jóváhagyása A témavezet ı jóváhagyása A Budapesti Corvinus Egyetem Élettudományi Területi Doktori Tanács 2007. február 13-i határozatában a nyilvános vita lefolytatására az alábbi bíráló Bizottságot jelölte ki: BÍRÁLÓ BIZOTTSÁG : Elnöke Tóth Magdolna, CSc Tagjai Jenes Barnabás, CSc Palkovics László, DSc Szegedi Ern ı, DSc Opponensek Janda Tibor, CSc Kiss Erzsébet, CSc Titkár Kocsisné Molnár Gitta, PhD „A gyümölcsfák életének legérdekesebb részei azok a jelenségek, amelyek ivaros szaporodásával vannak egybekapcsolva. Nagyon sok gyönyör őséget nyújt e jelenségek megfigyelése és tanulmányozása azoknak, akik szakszer ően és lelkiismeretesen foglalkoznak vele. Viszont nagy tévedés lenne azt hinni, hogy a virágbiológiai jelenségek ismerete csak tudományos érték ő, mert ellenkez ıleg, éppen ezek az ismeretek nyújtják nekünk a legértékesebb útmutatásokat a gyakorlati termesztésben.” (Mohácsy Mátyás, 1954) 1 Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke 5 1. Bevezetés 6 2. Célkit őzés 8 3. Irodalmi áttekintés 9 3.1. Inkompatibilitás a növényvilágban 9 3.2. A Prunus fajok önmedd ıségét meghatározó molekuláris rendszer 10 3.2.1. S-ribonukleáz enzim: a termékenyülést irányító rendszer bibekomponense 12 3.2.2. F-box fehérje: a termékenyülést irányító rendszer pollenkomponense 16 3.2.3. Az S-RN-áz alapú inkompatibilitási rendszer m őködésének molekuláris modellje 18 3.2.4. A gyümölcsfák öntermékenyülési képességének molekuláris háttere 20 3.3. Az S-lókusz az evolúció és kultúrevolúció tükrében 22 3.4. Az S-genotípus vizsgálati módszereinek áttekintése 24 3.4.1. Szabadföldi termékenyülésvizsgálatok 24 3.4.2. A pollentöml ı növekedésének vizsgálata 25 3.4.3. Fehérje-szint ő analízis: izoelektromos fókuszálás 26 3.4.4. DNS-alapú vizsgálatok 28 3.5. A gyümölcsfák S-allél-rendszere 32 3.5.1. Mandula 32 3.5.2. Cseresznye 33 3.5.3. Alma 33 3.5.4. Körte 34 3.5.5. Meggy 34 3.5.6. Szilva 35 3.5.7. İszibarack 36 3.5.8. Japánkajszi 36 3.5.9. Európai kajszi 37 3.5.9.1. Kajszifajták csoportosítása, termékenyülése 37 3.5.9.2. Az inkompatibilitás örökl ıdése 38 2 3.5.9.3. Gyümölcsköt ıdés és pollentöml ı-analízis: a kezdeti vizsgálatok 39 3.5.9.4. Fehérje- és DNS-alapú technikák: nagy hatékonyságú molekuláris vizsgálatok 40 3.5.9.5. A kajszi S-lókuszának szerkezete 41 4. Anyag és módszer 44 4.1. Növényanyag 44 4.2. Szabadföldi tesztkeresztezések 44 4.2.1. Öntermékenyülés-vizsgálat 44 4.2.2. Kompatibilitási vizsgálat 48 4.3. Pollentöml ı növekedésének vizsgálata 48 4.4. Az S-ribonukleáz izoenzimek vizsgálata 49 4.4.1. S-ribonukleáz-aktivitás vizsgálata agaróz diffúziós plate-en 49 4.4.2. A ribonukleáz-aktivitás spektrofotometriás meghatározása 49 4.4.3. Minta-el ıkészítés az izoelektromos fókuszáláshoz 50 4.4.4. Izoelektromos fókuszálás (IEF) és nem egyensúlyi izoelektromos 50 fókuszálás (NEpHGE) 4.4.5. S-ribonukleáz izoenzimek kimutatása specifikus festéssel 50 4.5. DNS-alapú vizsgálatok 51 4.5.1. DNS-kivonás 51 4.5.2. S-PCR-analízis 51 4.5.2.1. Az S-RN-áz gén PCR-vizsgálata 51 4.5.2.2. Az F-box gén PCR-vizsgálata 51 4.5.3. RT-PCR 52 4.5.4. A PCR-termékek fragmentumhossz-analízise, klónozása, szekvenálása és a szekvenciák vizsgálata 53 4.6. Statisztikai analízis 54 5. Eredmények 55 5.1. S-genotípus meghatározása ribonukleáz izoenzimek kimutatásával 55 5.2. S-RN-áz gén alapú, DNS-szint ő genotípus-meghatározás 59 5.3. Az öntermékenyülés molekuláris háttere 67 5.3.1. Az SC- és S8-RN-áz allélok molekuláris analízise 67 5.3.2. Az SFB C- és SFB 8-allélok molekuláris analízise 71 5.4. F-box gén alapú S-genotípus-meghatározás 76 3 5.5. Az S-allélok szerkezete és filogenetikai vizsgálata 79 6. Eredmények megvitatása 82 6.1. S-genotípus meghatározása izoelektromos fókuszálással 82 6.2. S-RN-áz gén alapú, DNS-szintő genotípus-meghatározás 85 6.3. Az öntermékenyülés molekuláris háttere 91 6.4. Az F-box gén alapú S-genotípus-meghatározás 96 6.5. Az S-RN-áz allélok szerkezete és filogenetikai vizsgálata 98 6.5.1. Az S-RN-áz allélok szerkezete 98 6.5.2. Az S-allélok filogenetikai vizsgálata 99 6.5.3. Az S-genotípusok és a kajszi kultúrevolúciója 101 6.6. Új tudományos eredmények 106 7. Összefoglalás 108 8. Summary 110 9. Melléklet 112 M1. Irodalomjegyzék 112 M2. Az NCBI nemzetközi adatbázisba benyújtott szekvenciák 128 Köszönetnyilvánítás 156 4 Rövidítések jegyzéke bp bázispár C1–3 és C5 Az S-RN-áz gén 1–3. és 5. konzervatív régiója cDNS komplementer DNS D dalton, relatív molekulatömeg DEPC dietilpirokarbamát DNS dezoxiribonukleinsav GSI gametofitikus inkompatibilitás (gametophytic self-incompatibility) HVa, HVb A Solanaceae S-RN-ázokra és valamennyi SFB-re jellemz ı variábilis régiók IEF izoelektromos fókuszálás kbp kilobázispár NEpHGE nem egyensúlyi izoelektromos fókuszálás (non-equilibrium pH gradient electrofocusing) ÖM önmedd ı ÖT öntermékenyül ı PCR polimeráz láncreakció pI izoelektromos pont RC4 A Rosaceae S-RN-ázokra jellemz ı 4. konzervatív régió RHV A Rosaceae S-RN-ázokra jellemz ı hipervariábilis régió RNS ribonukleinsav RT reverz transzkripció SFB S-haplotípus-specifikus F-box protein SLF S-lókusz F-box protein SNP pontmutáció SP szignálpeptid S-RN-áz S-ribonukleáz SSR mikroszatellit régió 5 1. BEVEZETÉS A növényvilágban az idegenmegporzás (allogámia) által kialakult genetikai variabilitás szelekciós el ınyt biztosít a növények számára. A zárvaterm ı növények nagy részénél a kétivarú virágokban különféle mechanizmusok alakultak ki az önmegporzás (autogámia) megakadályozására. Ide tartozik a bibe és a porzók térbeni elkülönülése, a szaporítószervek érésének id ıbeli eltolódása, illetve a leghatékonyabb megoldás, a pollen csírázásának vagy a pollentöml ı fejl ıdésének gátlása, az ún. inkompatibilitás. A jelenséget els ı ízben, 1877-ben leíró Darwin a virágos növények törzsfejl ıdésében központi jelent ıséget tulajdonított e mechanizmusnak. Az autoinkompatibilitás tehát azt jelenti, hogy a bibe adott növényegyed saját pollenjével történ ı megporzása nem vezet megtermékenyítéshez. Az összeférhetetlenség genetikailag meghatározott mechanizmusokon alapul. A növények számára evolúciós léptékekben hasznos idegentermékenyülés a sajátos gazdasági célokkal rendelkez ı szakemberek szempontjából kétél ő fegyvernek tekinthet ı. A termesztésben nem kívánatos, gazdasági szempontból hátrányos fiziológiai jelenségként tartják számon, hiszen az önmedd ı fajtákból létesített ültetvényekben elengedhetetlen a megfelel ı pollenadó fák telepítése. E probléma jelent ısége jól látható a cseresznye példáján, ahol az öntermékenyül ı fajták el ıállítása mára az egyik legfontosabb nemesítési követelménnyé vált. A növénynemesít ık számára ugyanakkor az önmedd ıség jelent ıs segítséget nyújthat a tervszer ően megalapozott keresztezések kivitelezéséhez, mert a virágok kasztrálása nem szükséges. Sajnos azokban az esetekben, ahol az önmedd ıség az S-allél-rendszeren alapszik, az önmedd ı anyanövény használata azt is jelenti, hogy az utódok között önmedd ı genotípusok jelenhetnek meg. Ráadásul az azonos S-allélokat hordozó önmedd ı fajták egymást kölcsönösen sem képesek megtermékenyíteni, így közös ültetvénybe telepítve nem adnak elfogadható termésmennyiséget. Az inkompatibilitás biokémiai és molekuláris háttere növénycsaládonként igen eltér ı. Az egyik leginkább tanulmányozott mechanizmus a ribonukleáz enzimek részvételével kialakult gametofitikus önmedd ıség. Ilyen típusú rendszer jellemzi a Rosaceae családot, mely számos gyümölcsterm ı növényt (alma, körte, cseresznye, kajszi, mandula, szilva stb.) foglal magába. Mivel a csonthéjas fajok körében parthenokarp gyümölcsköt ıdés nem fordul el ı, a sikeres megtermékenyülés elengedhetetlen feltétele a gazdasági értéket képvisel ı gyümölcs létrejöttének. Az európai kajszifajták túlnyomó része öntermékenyül ı, míg az ázsiai és észak- amerikai fajták többsége önmedd ı. Az utóbbi évek során a fagyt őrés és a vírusrezisztencia 6 elérése érdekében az ázsiai és észak-amerikai genotípusokat felhasználó keresztezéses nemesítés útján egyre több, széles körben elterjedt, önmedd ı fajtát hoztak létre. A fajtatársítás szempontjából az S-genotípusok ismerete elengedhetetlenné vált. A fajták termékenyülését meghatározó szabadföldi termésköt ıdési vizsgálatokat számos bizonytalanság terheli, hiszen ezeket a környezeti, id ıjárási körülmények jelent ısen befolyásolhatják, továbbá ezen vizsgálatokra csak a term ıkorú fák alkalmasak. A DNS- alapú vizsgálatok, amelyekkel a sterilitást okozó allélok a genomban detektálhatóak, igen nagymértékben segíthetik és gyorsíthatják a nemesítık munkáját azáltal, hogy alkalmazásukkal a növények korai egyedfejl ıdési állapotában meghatározhatók