Les Champignons Endophytes Et Ceux Associés

Les champignons endophytes et ceux associés aux caries des arbres et du bois mort de Julbernardia bifoliolata, Desbordesia glaucescens et Scyphocephalium ochocoa dans les forêts du Sud-est du Gabon

Thèse

Inès Nelly Moussavou

Doctorat en sciences forestières Philosophiæ doctor (Ph. D.)

Québec, Canada

© Inès Nelly Moussavou, 2021 Les champignons endophytes et ceux associés aux caries des arbres et du bois mort de Julbernardia bifoliolata, Desbordesia glaucescens et Scyphocephalium ochocoa dans les forêts du Sud — est du Gabon

Thèse

Inès Nelly Moussavou Boussougou

Sous la direction de :

Louis Bernier, directeur de recherche Jean Bérubé, codirecteur de recherche

RÉSUMÉ

Les essences Julbernardia bifoliolata (Cesalpiniaceae), Desbordesia glaucescens (Irvingiaceae) et Scyphocephalium ochocoa (Myristicaceae) de diamètres exploitables sont abondantes dans les peuplements résiduels et abandonnés à cause de la présence de caries. L’étude des champignons de carie du bois est utile compte tenu de leurs rôles dans la dégradation des composés des parois des cellules vivantes du bois et de la matière organique. L’objectif de cette thèse était d’utiliser les techniques moléculaires pour identifier et étudier les champignons associés aux caries des arbres vivants et du bois mort chez ces trois essences forestières. L’identification des champignons polypores associés à la carie des arbres, aux coursons de bois (bois mort), l’évaluation de leurs capacités à dégrader le bois, ainsi que la comparaison de la diversité fongique endophytique des arbres cariés ont été réalisées dans les concessions forestières appartenant à trois sociétés forestières dans la province de l’Ogooué-Lolo au Gabon. Le nombre de polypores responsables des caries n’était pas exhaustif. Les séquences d’ADN correspondant aux espèces de champignons polypores appartenant aux ordres des Hymenochaetales et Polyporales ont été associées aux polypores responsables de la carie des arbres sur pied. Ceux identifiés à l’espèce étaient représentés par Amauroderma subresinosum, Fomitiporia nobilissima, Fuscoporia gilva, Hymenochaete murina, Phellinus noxius, Rigidoporus ulmarius et Tinctoporellus epimiltinus. Les espèces Perenniporia sp. et Inonotus sp., ont été identifiées au niveau du genre. Ces champignons ont été pour la plupart déjà identifiés au Gabon, mais sont nouvellement identifiés chez les essences de notre étude. Les espèces Hymenochaete murina et une nouvelle espèce d’Inonotus sp., font l’objet d’une première mention au Gabon. Par contre, vingt-huit (28) ii

OTUs ont été obtenues sur le bois mort en utilisant les amorces spécifiques aux Basidiomycètes (ITS1F – ITS4B) à partir des basidiomes. Les polypores obtenus sur les coursons de bois étaient répartis au sein de treize (13) familles, appartenant aux ordres des Corticiales, Hymenochaetales, Polyporales, Russulales et Trechisporales. Quatorze sont de nouvelles espèces rapportées et les genres sont connus pour 9 d’entre elles. Parmi les 28 espèces, seules 4 sont connues au Gabon. La diversité en champignons sur les coursons de bois était plus élevée sur les essences de Béli suivi du Sorro et sur les coursons du site de la SEEF suivi de SBL. Les polypores A. subresinosum et F. gilva étaient communs aux arbres debout et aux coursons de bois des trois essences. Le champignon de carie brune P. noxius suivi de A. subresinosum champignon de carie blanche (tous deux de croissance mycélienne rapide) étaient les plus aptes à dégrader le bois tandis que le Sorro (S. ochocoa) était plus résistant face aux champignons lignivores. Les données obtenues avec l’utilisation des carottes de bois couplées à l’utilisation d’amorces universelles pour les champignons (ITS1F–ITS4) lors de l’amplification en chaine par polymérase (PCR), ont montré l’existence d’une diversité relativement élevée en champignons endophytes dans l’aubier sain des arbres cariés et correspondants à 62 Unités Taxonomiques Opérationnelles (OTUs). Les genres Penicillium et Pestalotiopsis étaient les plus abondants et communs aux trois essences. Le Sorro contenait la plus grande diversité en champignons endophytes, tandis que le site de CEB avait la plus grande diversité. Nos recherches ont montré les différentes communautés fongiques associées aux caries des arbres et du bois mort de ces essences forestières dans les forêts du Sud-est du Gabon ainsi que la capacité des champignons lignivores à dégrader le bois.

iii

ABSTRACT

The tree species Julbernardia bifoliolata (Cesalpiniaceae), Desbordesia glaucescens (Irvingiaceae) and Scyphocephalium ochocoa (Myristicaceae) with logging diameters are abundant in residual and abandoned stands because of presence of wood rot. The study of wood decay fungi is useful because of their roles in living wood cells and organic matter decomposition. The aim of this thesis was to use molecular techniques to identify and study fungi associated with decay of living trees and dead wood in these three forest species. Identification of polypore fungi associated with tree decay, logs, assessment of wood degradation capacities, and comparison of endophytic fungal diversity were carried out in forest concessions belonging to three forestry companies of Ogooué- Lolo province in Gabon. Polypores fungi responsible of wood decay were not exhaustive. DNA sequences corresponding to polypore fungal species belonging to Hymenochaetales and Polyporales orders were associated to polypores responsible for decay of trees. Those identified at species level were represented by Amauroderma subresinosum, Fomitiporia nobilissima, Fuscoporia gilva, Hymenochaete murina, Phellinus noxius, Rigidoporus ulmarius and Tinctoporellus epimiltinus. Perenniporia sp. and Inonotus sp. have been identified at the genus level. Most of these fungi have already been identified in Gabon but are newly identified in the tree species of our study. The species Hymenochaete murina and a new species of Inonotus sp. are first mentioned in Gabon. On the other hand, twenty-eight (28) OTUs were obtained from dead wood using primers specific to Basidiomycetes (ITS1F - ITS4B) from basidiocarps. The polypores obtained from logs were distributed within thirteen (13) families, belonging to the orders of Corticiales, Hymenochaetales, Polyporales, Russulales and Trechisporales. Fourteen are new species iv

reported and 9 of them are known at the genus level. Among the 28 species, only 4 are known in Gabon. The diversity of fungi on logs was higher on Béli species followed by Sorro and on logs from the SEEF site followed by SBL. The polypores A. subresinosum and Fuscoporia gilva were common in standing trees and tree species logs. The brown rot fungus Phellinus noxius followed by the white rot fungus Amauroderma subresinosum (both of rapid mycelial growth) were the most agressive to degrade wood while Sorro (S. ochocoa) was more resistant to wood decay fungi. Data obtained from wood cores coupled with the use of fungal universal primers (ITS1F-ITS4) during polymerase chain reaction (PCR) showed a relatively high diversity in endophytic fungi in the healthy sapwood of decayed trees and matched to 62 Operational Taxonomic Units (OTUs). The genera Penicillium and Pestalotiopsis were the most abundant and common to the three species. Sorro exhibited the greatest diversity in endophytic fungi, while the CEB site had the greatest diversity. Research has shown the different fungal communities associated with tree and wood decay of these species in the forests of south-eastern Gabon as well as the ability of wood decay fungi to degrade the wood.

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ ...... ii

ABSTRACT ...... iv

TABLE DES MATIÈRES ...... vi

LISTE DES TABLEAUX ...... xii

LISTE DES FIGURES ...... xiv

LISTE DES ABRÉVIATIONS ...... xvi

REMERCIEMENTS ...... xx

AVANT-PROPOS...... xxvii

INTRODUCTION ...... 1

1. Contexte et problématique ...... 1

2. Cadre de l’étude ...... 8

2.1. Localisation géographique du Gabon ...... 8

2.2. Climat, relief et types de sols ...... 11

2.3. Végétation et essences étudiées ...... 12

2.3.1. Végétation ...... 12

2.3.2. Essences forestières étudiées ...... 15

3. Revue de littérature ...... 16

3.1. Introduction ...... 16

3.2. Les agents abiotiques de dégradation du bois en région tropicale 17

3.3. Les agents biotiques de dégradation du bois en région tropicale . 19

3.4. Les types de caries du bois ...... 22

3.5. Les caries des arbres ...... 23

3.6. Les caries sur les bois immergés ...... 24

3.7. La dégradation des grumes ou du bois mort par les champignons 25 vi

3.8. Les mécanismes enzymatiques déployés par les champignons lignivores ...... 27

3.9. Les facteurs de résistance et mécanismes de défense des arbres 28

3.10. Importance des endophytes des arbres tropicaux ...... 32

3.11. Les principaux pourridiés des régions tropicales rencontrés dans le bassin du Congo et au Gabon ...... 33

4. Objectifs et hypothèses de l’étude ...... 36

5. Approche méthodologique ...... 37

5.1. Localisation du milieu d’étude et caractérisation des sites ...... 37

5.2. Techniques de collecte et traitement des échantillons ...... 39

5.3. Culture des isolats ...... 43

5.4. Les traitements biomoléculaires ...... 43

5.4.1. Extractions d’ADN ...... 44

5.4.2. Amplification génique ...... 45

5.4.3. Séquençage de l’ADN ...... 46

5.5. Analyse des données ...... 46

5.5.1. Traitement des séquences d’ADN et identification ...... 46

5.5.2. Étude de la diversité spécifique ...... 47

5.5.3. Analyses taxonomiques moléculaires ...... 47

5.5.4. Phylogénie moléculaire ...... 48

5.5.5. Analyses statistiques ...... 48

6. Principaux résultats et structure de la thèse ...... 49

6.1 Principaux résultats ...... 49

6.1.1 Analyses granulométriques des sites d’étude ...... 49

6.1.2 Diversité de champignons polypores associés à la carie des arbres de Béli (julbernardia bifoliolata) sur pied ...... 51

6.1.3 Diversité des champignons endophytes chez les essences Julbernardia bifoliolata, Desbordesia glaucescens et Scyphocephalium ochocoa ...... 52

vii

6.1.4 Diversité des champignons polypores associés aux coursons de bois des essences Julbernardia bifoliolata, Desbordesia glaucescens et Scyphocephalium ochocoa ...... 53

6.1.5 Activité de dégradation de quatre champignons de carie sur des blocs de bois de Béli (Julbernardia bifoliolata), d’Alep (Desbordesia glaucescens) et de Sorro (Scyphocephalium ochocoa) 55

6.2 Structure de la thèse ...... 56

7. Bibliographie ...... 56

CHAPITRE 1 Diversité de champignons polypores associés à la carie des arbres de Béli (Julbernardia bifoliolata) sur pied ...... 70

1.1. Résumé ...... 71

1.2. Abstract ...... 71

1.3. Introduction ...... 72

1.4. Matériel et méthodes ...... 77

1.4.1. Collecte des échantillons ...... 77

1.4.2. Isolation, extraction d’ADN, amplification et séquençage ... 80

1.4.3. Analyses phylogénétiques ...... 82

1.5. Résultats ...... 83

1.5.1. Identification des polypores...... 83

1.5.2. Analyses phylogénétiques ...... 88

1.6. Discussion ...... 90

1.7. Conclusion ...... 95

1.8. Remerciements ...... 97

1.9. Références bibliographiques ...... 97

CHAPITRE 2 Diversité des champignons endophytes chez les essences Julbernardia bifoliolata, Desbordesia glaucescens et Scyphocephalium ochocoa dans les forêts du sud-est du Gabon ...... 105

viii

2.1. Résumé ...... 106

2.2. Abstract ...... 106

2.3. Introduction ...... 107

2.4. Matériel et méthodes ...... 111

2.4.1. Sites et collecte des échantillons ...... 111

2.4.2. Isolement, extraction, amplification et séquençage de l’ADN 113

2.4.3. Analyses des séquences ...... 115

2.4.4. Analyses de diversité des champignons ...... 116

2.5. Résultats ...... 117

2.5.1. Identification des champignons endophytes isolés ...... 117

2.5.2. Composition taxonomique et diversité phylogénétique des champignons endophytes ...... 125

2.5.3. Richesse et diversité de champignons endophytes ...... 131

2.5.4. Comparaison de la diversité entre les trois essences forestières et entre les sites échantillonnés ...... 134

2.6. Discussion ...... 138

2.6.1. Richesse et diversité de champignons endophytes ...... 138

2.6.2. Comparaison et composition taxonomique des champignons endophytes ...... 139

2.6.3. Double fonction pour les champignons endophytes des arbres tropicaux ...... 141

2.7. Conclusion ...... 144

2.8. Remerciements ...... 145

2.9. Annexe ...... 146

2.10. Références bibliographiques...... 154

CHAPITRE 3 Diversité de champignons polypores associés aux coursons de bois des essences Julbernardia bifoliolata, Desbordesia glaucescens et Scyphocephalium ochocoa, dans les forêts du Sud-est du Gabon ...... 165 ix

3.1. Résumé ...... 166

3.2. Abstract ...... 167

3.3. Introduction ...... 168

3.4. Matériel et méthodes ...... 171

3.4.1. Sites d’étude et collecte des échantillons ...... 171

3.4.2. Extraction, amplification et séquençage de l’ADN ...... 173

3.4.3. Analyses des séquences ...... 174

3.4.4. Analyses de diversité des champignons ...... 175

3.5. Résultats ...... 176

3.5.1. Distribution des communautés de champignons polypores par type de coursons et selon les sites échantillonnés ...... 176

3.5.2. Diversité de champignons polypores...... 182

3.5.3. Comparaison entre les communautés de champignons polypores des types de coursons et ceux des sites de prélèvement 186

3.6. Discussion ...... 189

3.7. Conclusions ...... 193

3.8. Remerciements ...... 195

3.9. Références bibliographiques ...... 195

CHAPITRE 4 Activité de dégradation de quatre champignons de carie sur des blocs de bois de Béli (Julbernardia bifoliolata), d’Alep (Desbordesia glaucescens) et de Sorro (Scyphocephalium ochocoa) ...... 202

4.1. Résumé ...... 203

4.2. Abstract ...... 203

4.3. Introduction ...... 204

4.4. Matériel et méthodes ...... 210

4.4.1. Collecte des échantillons ...... 210

4.4.2. Isolement des champignons, extraction, amplification et séquençage de l’ADN ...... 211 x

4.4.3. Tests de croissance mycélienne ...... 213

4.4.4. Caractéristiques du bois et perte de masse ...... 213

4.4.5. Caractéristiques du bois, données de perte de masse et analyses statistiques ...... 215

4.5. Résultats ...... 217

4.5.1. Les souches de champignons polypores et croissance moyenne du mycélium...... 217

4.5.2. Propriétés des blocs de bois ...... 219

4.5.3. Perte de masse des blocs de bois ...... 222

4.6. Discussion ...... 229

4.7. Conclusion ...... 234

4.8. Remerciements ...... 235

4.9. Références bibliographiques ...... 236

CONCLUSIONS ...... 246

1. Rappel de la problématique de recherche ...... 246

2. Conclusions générales ...... 247

3. Nouvelles perspectives de recherche ...... 258

4. Références bibliographiques ...... 260

BIBLIOGRAPHIE GÉNÉRALE ...... 263

ANNEXES ...... 298

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. 1 Isolats des champignons polypores utilisés dans cette étude, ayant obtenus une similitude d’au moins 90% et numéros d’accession Genbank...... 84 Tableau 2. 1 Champignons endophytes représentant chacune des OTUs présentes dans le bois sain prélevé de trois essences forestières gabonaises présentant de la carie et le nombre de séquences composant chaque OTU à un seuil de 95%...... 119 Tableau 2. 2 Indices d’abondance et de diversité de l’ensemble des échantillons, par essence forestière et de chacun des sites échantillonnés au seuil de 0,05 ...... 132 Tableau 2. 3 Comparaison des indices de similarités entre les essences forestières et les sites de prélèvement au seuil de similarité 0,05.137 Tableau 3. 1 Unités Taxonomiques Opérationnelles (OTUs) obtenues, identifications probables, nombre et répartition d’isolats de chacune des OTUs par essence hôte au seuil de similarité 95%...... 178 Tableau 3. 2 Comparaison entre les trois essences et les sites de prélèvement au seuil de 0.05 et analyse de variance moléculaire.188 Tableau 4. 1 Isolats de champignons polypores récoltés, identification probable par similitude de séquence dans GenBank, classe fongique et type de carie, numéros d’accession Genbank des isolats utilisés dans cette étude et moyennes de croissance journalière du mycélium à 28 °C sur milieu MEA...... 218 Tableau 4. 2 Caractéristiques physiques des blocs de bois et moyennes de pourcentage de perte de masse après 6 et 12 semaines d’exposition aux champignons lignivores et les blocs témoins non soumis à la dégradation...... 220 Tableau 4. 3 Résultats de l'ANOVA sur les pourcentages de perte de masse avec le test de Dunett (transformation logarithmique) en présence de blocs témoins...... 223 Tableau 4. 4 Résultats de l'ANOVA sur les pourcentages de perte de masse avec le test de Tukey (Transformation logarithmique) en absence de blocs témoins...... 224

xii

Annexes

Tableau A. 1 Endophytes identifiés dans les sites des concessions forestières de SBL, CEB et SEEF dans la province de l’Ogooué-Lolo, chez l’Alep (Desbordesia glaucescens), le Béli (Julbernardia bifoliolata) et le Sorro (Scyphocephalium ochocoa) à partir de l’outil Blastn, leurs pourcentages maximums d’identification et leurs numéros d’accession dans GenBank...... 146 Tableau A. 2 Numéros d’accession des séquences du chapitre 1 : Les champignons associés à la carie du Béli sur pied...... 298 Tableau A. 3 Numéros d’accession des séquences du chapitre 2 : Les champignons endophytes des essences Julbernardia bifoliolata, Desbordesia glaucescens et Scyphocephalium ochocoa...... 301 Tableau A. 4 Numéros d’accession des séquences du chapitre 3 : Les champignons polypores associés aux coursons de bois des essences Julbernardia bifoliolata, Desbordesia glaucescens et Scyphocephalium ochocoa...... 308 Tableau A. 5 Numéros d’accession des séquences du chapitre 4 : Activité de dégradation des champignons de carie sur des blocs de bois de Béli (Julbernardia bifoliolata), d’Alep (Desbordesia glaucescens) et de Sorro (Scyphocephalium ochocoa)...... 311

xiii

LISTE DES FIGURES

Figure 1 Localisation géographique du Gabon...... 10 Figure 2 Classification et phylogénie des Basidiomycètes (Extrait de Hibbett et al. (2007)) : classe des Agaricomycètes ...... 21 Figure 3 Localisation des sites SBL, CEB et SEEF ...... 38 Figure 4 Localisation des coursons des essences forestières...... 40 Figure 5 Localisation des arbres échantillonnés...... 42 Figure 6 Analyses granulométriques du sol (a) dans les sites de SEEF, CEB et SBL et (b) répartition des essences de Béli, d’Alep et de Sorro selon la texture du sol...... 50 Figure 1. 1 Sites d’étude dans la province de l’Ogooué-Lolo, localisée dans le Sud-est du Gabon ...... 79 Figure 1. 2 Analyse phylogénétique des 70 isolats des champignons polypores récoltés sur les arbres de Béli de l’étude ainsi que des séquences de référence d’ITS de l’ADNr provenant de Genbank. La méthode de distance du Neighbor-joining et le modèle de substitution p- distance ont été utilisés, les valeurs de bootstrap affichées (supérieurs ou égales à 70 %) ont été obtenues à partir de 1000 répétitions. Les branches en gras montrent le regroupement des séquences au sein des différents genres...... 89 Figure 2. 1 Localisation des sites et des arbres échantillonnés. .112 Figure 2. 2 Compositions en champignons endophytes chez les essences et les sites échantillonnés (A) et répartition par essence (B) et par site échantillonné (C)...... 123 Figure 2. 3 Relations phylogénétiques de 56 espèces de champignons endophytes représentant chacune des OTUs constituant la richesse totale des essences forestières Desbordesia glaucescens, Julbernardia bifoliolata et Scyphocephalium ochocoa. L’arbre consensus a été généré selon la méthode du Neighbor-Joining à partir de la région ITS des séquences, avec un bootstrap évalué à 1000 répétions. Les branches (valeur du bootstrap supérieure à 70%) épaisses représentent les 14 clades regroupant les espèces par ordre taxonomique...... 129 Figure 2. 4 Nombres cumulés d’OTUs de champignons endophytes en fonction du nombre d’échantillons collectés au seuil de 0.05. Le trait plein représente la courbe d’accumulation des OTUs pour l’ensemble des xiv

échantillons des trois essences et les traits entrecoupés, les courbes d’accumulation des OTUs pour chacune des trois essences de manière individuelle...... 133 Figure 3. 1 Zone d’étude et localisation des coursons de bois d’Alep, de Béli et de Sorro échantillonnés...... 172 Figure 3. 2 Abondances relatives des OTUs des champignons polypores pour les trois essences et les trois sites d’échantillonnage...... 181 Figure 3. 3 Arbre phylogénétique construit selon la méthode du Neighbor-Joining avec les séquences obtenues par amplification de la région ITS (ITS1 - 5.8S - ITS2). L’arbre consensus a été obtenu avec un Bootstrap de 1000 répétitions, les valeurs supérieures ou égales à 70% sont marquées sur les branches et les numéros d’accession des séquences disponibles dans GenBank sont également mentionnés...... 183 Figure 3. 4 Indices de diversité de Shannon (H) (a, b), indices de Simpson (D) (c, d), richesse observée (Sobs) et indice Chao_1 (e, f), par essence, et site échantillonné...... 185 Figure 4. 1 Comparaison des moyennes de pourcentage de perte de masse occasionnée par les champignons de dégradation du bois Amauroderma subresinosum, Fomitiporia nobilissima, Phellinus noxius et Rigidoporus ulmarius sur les blocs de bois après 6 et 12 semaines d’exposition en présence du mycélium, chez le Béli, l’Alep et le Sorro. Les barres d'erreurs représentent les écarts types. Les lettres différentes indiquent des moyennes de perte de masse qui diffèrent de façon significative au seuil de signification 0,05...... 225 Figure 4. 2 Comparaisons des moyennes de perte de masse entre le Béli, l'Alep et le Sorro à 6 et 12 semaines d'incubation en présence du mycélium des champignons polypores de dégradation du bois F. nobilissima, A. subresinosum, P. noxius et R. ulmarius...... 227 Figure 4. 3 Comparaisons de Moyennes des pourcentages de perte de masse occasionnée par les souches de champignons polydore P. noxius, A. subresinosum, F. nobilissima et R. ulmarius chez chacune des essences forestières Béli, Alep et Sorro. Les lettres différentes indiquent des moyennes de perte de masse qui diffèrent de façon significative au seuil de signification 0,05...... 228

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ADN Acide Désoxyribonucléique ADNr ADN ribosomique ANPN Agence Nationale des Parcs Nationaux AMC Affaires Mondiales Canada AMOVA Analyses Moléculaires de Variance ANOVA Analysis of Variance BAD Banque Africaine de Développement BC Indice de dissimilarité de Bray-Curtis BLAST Basic Local Alignment Search Tool CEB Compagnie Équatoriale des Bois CENAREST Centre National de la Recherche Scientifique et Technologique CFL Centre de Foresterie des Laurentides CHUL Centre Hospitalier de l’Université Laval / Centre Hospitalier Universitaire de Libreville CIRMF Centre International de Recherches Médicales de Franceville CODIT Compartmentalization of Decay in Trees COMIFAC Commission des forêts d’Afrique Centrale CTFT Centre Technique Forestier Tropical D Indice de diversité de Simpson EDTA Ethylene-diamine tetra-acetic acid ENEF École Nationale des Eaux et Forêts FDHS Forêt Dense Humide Sempervirente FDHSC Forêt Dense Humide Semi-Caducifoliée FDHSD Forêt Dense Humide Semi-Décidue FFBC Fonds pour les forêts du Bassin du Congo

xvi

FOGRN-BC Formation en Gestion des Ressources Naturelles dans le Bassin du Congo GLM Generalized Linear Model / Modèle Linéaire Généralisé GPS Global Positioning System H Indice de diversité de Shannon IBIS Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes INSAB Institut National Supérieur d’Agronomie et de Biotechnologie IRAF Institut de Recherche en Agronomie Forestière IRET Institut de Recherche en Écologie Tropicale ITS Internal Transcribed Spacer MAECD Ministère des Affaires Étrangères, du Commerce et du Développement Canada MEA Malt Extract Agar MH Indice de dissimilarité de Morisitha-Horn MINEF Ministère des Eaux et Forêts NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction ou amplification en chaine par polymérase PDA Potato Dextrose Agar OIBT Organisation Internationale des Bois Tropicaux OTU Operational Taxonomic Unit ou unité taxonomique opérationnelle PEFOGRN-BC Projet Élargi de Formation en Gestion des Ressources Naturelles dans le Bassin du Congo RIFFEAC Réseau des Institutions de Formation Forestière et Environnementale de l’Afrique Centrale RNCan Ressources Naturelles Canada SAS Statistical Analysis System

xvii

SBL Société des Bois de Lastourville SEEF Société Équatoriale d’Exploitation Forestière s. l. Sensu lato Sobs Richesse Observée TAE Tris Acetate EDTA URES Unité de Recherche en Écologie de la Santé WGS 84 World Geodetic System 1984 W.P. Weight Percent

xviii

En la mémoire de mes proches disparus, qui ont attendu et basculés vers l’au-delà avant l’aboutissement de cette œuvre : Ma mère, feue Élisabeth NGUEBA et mon père, feu Grégoire BOUSSOUGOU qui m’ont inculqué toutes ces valeurs; mon parrain, feu Raphiou WORA KOUMAKPAYI, qui a posé ces jalons ayant permis de tracer le chemin de ma vie, dans lequel j’ai planté des arbres et dont les fruits sont visibles aujourd’hui; feu Serge CORBET, mon conjoint de septembre 2001 au 8 février 2012, pour son amour, son implication financière aux collectes des échantillons et son enthousiasme à l’aboutissement de cette thèse de doctorat ont été déterminants.

xix

REMERCIEMENTS

Cette thèse a été réalisée dans le cadre de la formation des formateurs de l’École Nationale des Eaux et Forêts (ENEF) du Gabon, financée principalement par le Projet d’appui à la Formation des Formateurs en Gestion des Ressources Naturelles dans le Bassin du Congo (FOGRN-BC), exécuté par l’Université Laval. J’adresse ainsi ma profonde gratitude à l’Université Laval, au projet FOGRN-BC et à l’ENEF - Gabon.

Pour intégrer la cohorte des étudiants boursiers du Gabon, feu Professeur Ibrahim Souleymane SAMBO, ancien chef de département sciences fondamentales de l’ENEF ainsi que Monsieur Athanase BOUSSENGUE, ancien directeur général de l’ENEF ont favorisé ma candidature, je leur témoigne ma profonde reconnaissance.

J’adresse toute ma reconnaissance à Suzanne BRAIS, de l’Université du Québec en Abitibi-Témiscamingue, pour la confiance renouvelée en me permettant de m’inscrire en thèse, après ce passage en maîtrise à l’UQAT sous sa direction et dont les échanges ont marqué d’une empreinte indélébile ma carrière dans la recherche scientifique.

L’équipe technique du projet FOGRN/PEFOGRN et le personnel administratif de l’Université Laval, le Pr Damase KHASA directeur du projet, dont la collaboration avec ce dernier remonte à l’année 2003, Gilles COTTERET, Marie-France GÉVRY, Stéphanie DUBÉ-DESROSIERS et Jacynthe LEBLANC, qui continuent d’appuyer les écoles forestières du bassin du Congo. Merci pour la disponibilité et l’encadrement dont vous avez su faire preuve.

Le sujet de recherche développé dans cette thèse, qui s’inscrit en grande partie dans la discipline de pathologie forestière fait partie des spécialités xx

ciblées par le projet FOGRN-BC. La thématique abordée a été inspirée des enseignements reçus au niveau Baccalauréat, plus précisément au cours de botanique — systématique de la section Ingénieur des Techniques des Eaux et Forêts à l’ENEF – Gabon, dispensé par feu Édouard MINTSA et également grâce au concours de Paulin NSO NKA de la Compagnie Équatoriale des Bois (CEB), aujourd’hui CEB – Precious Wood, je leur adresse toute ma reconnaissance.

Mes sincères remerciements à l’Organisation Internationale des Bois Tropicaux (OIBT) qui m’a octroyé une bourse d’études en 2013. Cette bourse (ref 026 - 13 S) m’a permis de financer un voyage au Canada et de réaliser des expériences sur le chapitre 4 de ma thèse, qui nécessitait un approfondissement.

Mes remerciements aux directeurs d’exploitations des sociétés forestières dans lesquelles j’ai effectué ma collecte de données, pour le soutien logistique apporté, il s’agit de messieurs Stéphane BLASCO et de Damien DESPORT de la Société Équatoriale d’Exploitation Forestière (SEEF), de Monsieur Serge MICHEL de la Société des Bois de Lastourville (SBL) et de messieurs Philippe JEANMART et Patrick GEOFFROY de la Compagnie Équatoriale des bois (CEB).

Mes remerciements au directeur général du CIRMF, le Dr Jean-Paul GONZALEZ de m’avoir accepté dans son institution, le Dr Lucas SIKA également du CIRMF et le Dr Christophe PAUPY de leur encadrement au sein de l’Unité de Recherche en Écologie de la Santé (URES) pendant les manipulations de laboratoire. Votre contribution a été capitale pour le succès dans la collecte des échantillons sur le terrain et dans la réussite de cette thèse, je vous en suis très reconnaissante.

xxi

Mes remerciements au Pr Alfred NGOMANDA du CENAREST (Centre National de la Recherche Scientifique et Technologique), ancien directeur de l'Institut de Recherche en Écologie Tropicale (IRET) de son acceptation dans le laboratoire de biologie moléculaire de l’IRET. Au sein de ce laboratoire, la collaboration et la disponibilité du Dr Étienne OKOMO OKOUÉ ont contribué à l’élaboration de cette thèse.

L’aboutissement de ces travaux de thèse n’aurait pas été mené à terme sans le soutien inconditionnel de mes directeurs de thèse à qui j’adresse mes vifs remerciements :

Pr Louis BERNIER, mon Directeur de thèse, de m’avoir accepté dans son équipe de recherche. Vous avez été patient, compréhensif et attentif à l’adaptation à ma nouvelle spécialité : la pathologie forestière malgré le formatage de mes connaissances antérieures à une spécialité acquise à la maîtrise lors de mon passage à l’Université du Québec en Abitibi- Témiscamingue. J’ai su prouver durant mes séjours à Québec, à travers ma volonté et la détermination dans le travail de continuer cette expérience qu’est la thèse de doctorat. À vos côtés, j’ai pu mesurer vos aptitudes à rechercher le travail bien fait, la discipline et la rigueur. L’autonomie que vous savez insuffler aux membres de votre équipe de recherche a contribué largement à ma formation. Je vous témoigne toute mon estime, ma profonde reconnaissance et mon entière admiration.

Dr Jean BÉRUBÉ, codirecteur de thèse, de m’avoir accueilli dans son équipe au Centre de Foresterie des Laurentides (CFL). Dans son laboratoire j’ai acquis toute l’autonomie dont j’ai su faire preuve, lors la collecte des échantillons, durant la période de terrain, ainsi que le succès dans les manipulations de laboratoire lors de mon passage au CIRMF et à l’IRET. Avec vous, j’ai fait mes premiers pas dans la bio-informatique, j’ai xxii

appris à traiter les données de séquences d’ADN et la soumission dans les banques de gène de champignons. Je vous adresse toute ma gratitude et ma profonde reconnaissance.

Pr Auguste NDOUTOUME, codirecteur de thèse, de m’avoir accepté dans son laboratoire à Institut de Recherches Agronomiques et Forestières (IRAF). Les exigences des thèses nord-américaines ont souvent un impact sur la durée de formation des étudiants et vous m’avez fait confiance durant toutes ces années. Vous n’avez ménagé aucun effort pour m’assurer un confort au sein de votre institution, j’ai obtenu des facilités notamment pour les documents administratifs relatifs à la collecte de données. L’accueil chaleureux au sein de l’équipe du Laboratoire de Protection des Végétaux ainsi que les collaborations avec les autres étudiants de masters et de doctorats d’autres disciplines m’ont permis de maintenir la dynamique de recherche rencontrée dans les universités du Nord. Je vous adresse toute ma gratitude et ma profonde estime.

Ma reconnaissance envers Julie DUBÉ du CFL, Ressources naturelles Canada (RNCan), avec qui j’ai appris à flirter avec les techniques de biologie moléculaire et à la culture des champignons polypores. Mes remerciements à Josée DUFOUR et Donna MAZEROLLE, de l’équipe de Louis BERNIER au pavillon Marchand de l’Université Laval, pour la disponibilité et la bonne humeur. Je n’oublie pas Mario BOUTIN, du service de la laverie au 2e étage du pavillon Marchand, qui nous a quitté subitement le 16 juin 2019, pour la promptitude, la serviabilité qu’il a toujours témoignée envers les étudiants.

Ma gratitude au Dr Flore KOUMBA PAMBO, du laboratoire de biotechnologie à l’IRAF qui m’a facilité la collecte des échantillons au

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Gabon en mettant à ma disposition les documents administratifs permettant la sortie des échantillons du territoire national.

Toute ma reconnaissance à tous ceux qui se sont impliqués dans l’aboutissement de ces travaux de thèse, particulièrement dans la collecte des échantillons et les manipulations de laboratoire, il s’agit des techniciens de terrain, MIKOUANGA Sylvestre Espoir de la SEEF, Léonard MBÉLAKOUDOU et Alain NYAMANGOYE de la SBL, Boniface ENGAMBA de la CEB et des techniciens de laboratoire, Boris MAKANGA et Patrick YANGARI du Centre International de Recherche Médicale de Franceville (CIRMF).

Durant ce périple, j’ai partagé des moments enrichissants avec les étudiants, les collègues de travail, le personnel administratif des institutions par lesquels je suis passée à qui j’adresse mes sincères remerciements:

À mes condisciples du laboratoire de pathologie forestière et de l’IBIS au pavillon Marchand de l’Université Laval, Dr Érika SAYURI, Lauriane VARAIN, Jean-François BOURDON, Dr Élie RAHERISON, Dr Atef SALHI, Dr Cindy DASYLVA et les autres pour le soutien mutuel durant ces années de thèse. Les stagiaires Vanessa LOPES et Daniele ARRIEL du Brésil avec qui j’ai pu perfectionner les analyses phylogénétiques. Le stagiaire Postdoctoral André COMEAU, grâce à qui j’ai pu maîtriser le logiciel Mothur pour les analyses de diversité à partir des séquences d’ADN. Ma profonde reconnaissance pour vos contributions diverses dans la qualité de cette thèse.

Aux étudiants des projets FOGRN et PEFOGRN-BC avec qui la collaboration sur le campus de l’Université Laval a contribué à renforcer

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les liens de famille et la convivialité qui sont des valeurs propres à l’Afrique, il s’agit de Elvire JIOTSA, Dr Marie NYANGE NDAMBO, Nelly NGUDIE, Roland Jacks ÉKILA, Dr Jean-Bosco MBAGOU, Armand Yvon MENGOME ANGO, Lambert ONDO NDONG, Dr Papy Claude BOLIALE BOLALUEMBE, Dr Tolérant LUBALEGA, feu Florent KANGUEJA et les autres. Les relations entretenues avec chacun de vous et les multiples marques de sympathie apportées lors des épreuves difficiles ont contribué à façonner la personne que je suis.

À mes condisciples de l’IRAF, Corinne Coretta OYE ANDA, Dr Sandrine Mariella BAYENDI LOUDIT, Myrianne Flore ANDEIME EYENE, Ernest ABAGA OBIANG, Hendrix MBENG, tous du laboratoire de protection des végétaux, à Mireille KOUMBA, épouse MBOUMBA du laboratoire d'hydrobiologie et d'ichtyologie, Natacha EFFOUA TOMO du laboratoire de zootechnie et les autres. La bonne ambiance et les marques de soutien témoignées par les uns et les autres ont contribué à me stimuler dans le travail et à ne pas abandonner, car Dieu seul sait combien de fois l’idée de tout lâcher m’a maintes fois traversé l’esprit, simplement merci.

À mes compatriotes à Québec, Élise EKEMEYONG MEYÉ, Jean Claude NYAMA, Tancrède ROPIVIA, Michel NKA ETOMO, Christian LOUEMBÉ ONGUELÉ, Antona BAKITA, Dr Jacob HOMBAYA, Dr Bernard SEGNA, Dr Grégoire NDOLLY et les autres. Merci pour les moments de convivialité partagés et qui m’ont fait oublier le stress que nous vivions entre les quatre murs des résidences universitaires.

Au staff dirigeant de l’ENEF-Gabon, le Dr NKOUMAKALI Bruno (Directeur Général de l’ENEF), le Dr LIWOUWOU Jean Félicien (Directeur des Études de l’ENEF), NZIENGUI Geovanne Aymar (Chef de Département Sciences

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Fondamentales par Intérim), merci de m’avoir couvert sur le plan administratif, durant le séjour du dépôt de cette thèse.

À mes collègues du MINEF, KOMBILA Marius, MANEMBÉ Serge Morel, MBA ENGONE Claude et MAPAGA Delphin pour les soutiens multiformes apportés et qui ont facilité l’aboutissement de cette recherche.

Mes remerciements à mes amies, avec qui j’ai partagé mes joies et mes malheurs, MANOMBA BOUSSOUGOU épouse IBOUANGA (Gabon), Nirisoa RAHERINAINA (Québec), Véronique POUABOU (Gabon), Nathalie BOULOUDI épouse KIBADI (Gabon), sans votre soutien moral, l’issue n’aurait peut-être pas été celle-là.

À mon grand frère Jules MBOMBÉ SAMAKI, qui m’a épaulé durant mon stage au CIRMF, tes précieux conseils et tes soutiens multiformes ont contribué largement à mon épanouissement, simplement : « diboty di neni1 ».

À Mike Jocelyn Zacharie FOURY NZOUBOU, merci de ton amour inconditionnel, ton soutien moral et financier incessant depuis décembre 2015 car tu as stimulé mon combat pour la finalisation de cette thèse.

Enfin, je viens remercier solennellement tous mes parents pour le soutien continuel, l’amour et les encouragements témoignés au quotidien dans toutes les épreuves traversées tout au long de ma vie.

1 Grand merci en langue punu du Gabon xxvi

AVANT-PROPOS

Cette thèse avec insertions d’articles a été réalisée dans le cadre de la formation des formateurs de l’École Nationale des Eaux et Forêts (ENEF) du Gabon, appuyée par le Réseau des Institutions de Formations Forestières des États de l’Afrique Centrale (RIFFEAC), financée par le Projet d’appui à la Formation des Formateurs en Gestion des Ressources Naturelles dans le Bassin du Congo (FOGRN-BC), exécuté par l’Université Laval et financé lui-même par les Affaires Mondiales Canada (AMC), anciennement Ministère des Affaires Étrangères, du Commerce et du Développement Canada (MAECD Canada).

Le sujet de recherche qui s’inscrit en grande partie dans la discipline de Pathologie Forestière fait partie des spécialités ciblées par le projet FOGRN-BC. La thématique abordée a été inspirée des enseignements reçus au niveau Baccalauréat, plus précisément au cours de Botanique - Systématique de la section Ingénieur des Techniques des Eaux et Forêts à l’ENEF – Gabon. Au cours de ces enseignements, le Professeur MINTSA Edouard rappelait que : « les arbres d’Alep (Desbordesia glaucescens) étaient toujours creux et pourris et que la plupart du temps, les arbres de cette essence n’étaient plus soutenus que par leurs contreforts ». Cette assertion du Professeur MINTSA a été décisive pour le choix de l’étude des champignons de carie. L’association des autres essences à l’étude n’aurait pu se faire sans le concours des techniciens de terrain et de leurs connaissances des écosystèmes forestiers et associations forestières. L’association du Béli (Julbernardia bifoliolata) et du Sorro (Scyphocephalium ochocoa) à l’étude des champignons de caries a été proposée par Paulin NSO NKA de la Compagnie Équatoriale des Bois (CEB)

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à Bambidie. Selon ce dernier, l’Alep, le Sorro et le Béli partagent le même habitat et présentent également des caries apparentes.

Les travaux présentés dans cette thèse ont été réalisés sous la direction de Louis BERNIER, Professeur titulaire au Département des sciences du bois et de la forêt de l’Université Laval. Le Professeur Auguste NDOUTOUME, de l’IRAF et le Docteur Jean BÉRUBÉ du Service Canadien des Forêts ont assuré la codirection.

Cette thèse comporte quatre (4) chapitres qui sont des articles représentant des chapitres rédigés sous forme de manuscrits scientifiques. Ces articles dont je suis l’auteure principale seront soumis dans des revues scientifiques différentes. Les coauteurs dans les quatre (4) articles sont Louis BERNIER, Jean BÉRUBÉ et Auguste NDOUTOUME.

La collecte et le traitement des échantillons (carottes des arbres et basidiomes de champignons), les extractions d’ADN, les analyses biomoléculaires (PCR, électrophorèses, séquençage), le traitement et l’analyse des séquences d’ADN (traitement des séquences sur Mothur, reconstruction des arbres phylogénétiques sur MEGA5, MAGA6 et MEGA X), la soumission des séquences dans GenBank, la culture des champignons sur milieux gélosés, les tests microbiologiques sur les blocs de bois, l’Analyse de variance (ANOVA) sur SAS, l’interprétation des résultats et la rédaction des articles ont été réalisés par Inès Nelly MOUSSAVOU BOUSSOUGOU, sous la supervision de Louis BERNIER, Jean BÉRUBÉ et Auguste NDOUTOUME. Ces derniers ont largement contribué à travers les corrections successives. La caractérisation granulométrique des sols a été faite en utilisant la méthode de la pipette de Robinson par le Dr Maurice OGNALAGA de l’Institut National Supérieur d’Agronomie et de Biotechnologies (INSAB). xxviii

Le premier article (chapitre 1) a fait l’objet d’une première soumission dans Comptes rendus Biologies en juillet 2016. En juillet 2017, n’ayant pas obtenu de réponse de l’éditeur, nous l’avons retiré pour soumission future dans une revue spécialisée. Une version anglaise du chapitre sera proposée à la soumission dans la revue Forest Pathology, sous la référence : MOUSSAVOU BOUSSOUGOU, I. N., BÉRUBÉ, J., NDOUTOUME, A., & BERNIER, L. (2019). Diversity of polypore fungi associated with decay in Beli (Julbernardia bifoliolata) trees in Gabon.

Une version anglaise du deuxième article (chapitre 2) sera soumise à Fungal Ecology, sous la référence : MOUSSAVOU BOUSSOUGOU, I. N., NDOUTOUME, A., BERNIER, L., & BÉRUBÉ J. (2019). Diversity of endophytic fungi of Beli, Alep and Sorro tree species in southeastern forests of Gabon.

Une version anglaise du troisième article (chapitre 3) sera soumise à Fungal Diversity, sous la référence : MOUSSAVOU BOUSSOUGOU, I. N., BÉRUBÉ, J., & NDOUTOUME, A., BERNIER, L., (2019). Diversity of polypore fungi associated with logs of Beli (Julbernardia bifoliolata), Alep (Desbordesia glaucescens) and Sorro (Scyphocephalium ochocoa) in southeastern forests of Gabon.

Une version antérieure du quatrième article (chapitre 4) avait été proposée à la soumission dans International Biodeterioration and Biodegradation (IBB) en 2017 qui a interrompu les échanges pour des raisons inconnues. Une version remaniée sera soumise dans la revue Holzforschung, sous la référence : MOUSSAVOU BOUSSOUGOU, I. N., BERNIER, L., NDOUTOUME, A., BÉRUBÉ J. (2019). Degradation activity of decay fungi on Beli (Julbernardia bifoliolata), Alep (Desbordesia glaucescens) and Sorro (Scyphocephalium ochocoa) wood blocks. xxix

INTRODUCTION

1. Contexte et problématique

Ces travaux de recherche s’inscrivent dans un vaste projet mis en place dans le cadre du Réseau des Institutions de Formation Forestière et Environnementale de l’Afrique Centrale (RIFFEAC). Ce dernier a pour rôle central de mettre en place des pôles régionaux de spécialisation dans le cadre de la formation dans les écoles forestières du Bassin du Congo. Ces orientations proviennent de la Commission des forêts d’Afrique Centrale (COMIFAC) et ont pour but de former des personnels capables de répondre aux nouvelles exigences de la gestion durable des forêts du bassin du Congo. Il s’agit principalement de répondre aux trois (3) axes transversaux du Plan de convergence de la COMIFAC 2015 – 2025 adoptés en conseil des Ministres de la COMIFAC à savoir (COMIFAC 2014) : i) la Formation et renforcement des capacités; ii) la recherche- développement; et iii) la Communication, la sensibilisation, l’information et l’éducation. La formation des formateurs des institutions de formation forestières a été entreprise par le Projet d’appui à la Formation en Gestion des Ressources Naturelles dans le Bassin du Congo (FOGRN-BC) exécuté par l’Université Laval au Canada et financé par Affaires Mondiales Canada (anciennement Ministère des Affaires Étrangères, du Commerce et du Développement Canada). Ce premier projet FOGRN-BC a pris fin en Décembre 2013 et a fait place à un autre appelé projet d’appui au Programme Élargi de Formation en Gestion des Ressources Naturelles dans le Bassin du Congo (PEFOGRN-BC), financé par le Fonds pour les Forêts du Bassin du Congo (FFBC) administré par la Banque Africaine de Développement (BAD). Le projet PEFOGRN-BC a été exécuté par le RIFFEAC de 2011 à 2014 et l’Université ainsi que le

Centre d'enseignement et de recherche en foresterie de Sainte-Foy inc. (CERFO) ont agi comme agences techniques de mise en œuvre du projet respectivement pour les volets universitaire et technique.

Parmi les pôles régionaux de spécialisation, la pathologie forestière avait été retenue dans le cas du Gabon et le Cameroun. Ces recherches s’inscrivent dans cette discipline et traitent des champignons endophytes et ceux associés aux caries2 des arbres et du bois mort de Julbernardia bifoliolata (Béli), Desbordesia glaucescens (Alep) et Scyphocephalium ochocoa (Sorro) dans les Forêts du sud-est du Gabon.

Outre la pathologie forestière, ces travaux intègrent également la mycologie et la microbiologie du bois. La pathologie forestière est une sous-discipline de la phytopathologie; elle étudie les maladies des arbres et les agents qui les causent, dans le but de les contrôler. La mycologie est la science qui étudie les champignons. La microbiologie du bois, quant à elle, désigne l’étude des microorganismes à l’instar des bactéries, des champignons microscopiques, des protistes, etc., en relation avec les maladies et les dégâts causés dans le bois. Dans notre étude, les espèces forestières Béli, Alep et Sorro sont affectées par les caries des arbres. Ces essences avec un diamètre exploitable sont observables en abondance dans les peuplements résiduels après coupe. Aussi, les agents de caries du bois sont en majorité des champignons et, parmi ces derniers, les polypores sont observés de façon récurrente sur les arbres.

2 La carie du bois est une décomposition enzymatique des cellules et tissus du bois causée par les champignons lignivores. Cette décomposition entraine une modification de la texture, couleur et résistance du bois; le bois ainsi carié perd ses propriétés physiques et chimiques ainsi que sa masse. 2

Au Gabon, les recherches sur les caries des essences exotiques en plantations comme l’hévéa ont déjà été entreprises (Guyot, 1997). Les travaux de recherche réalisés sur les champignons en général concernent les travaux de thèses de doctorat sur les champignons comestibles dans le nord du Gabon (Eyi Ndong, 2009) et ceux saprophytes traitant de l'étude de la diversité taxonomique et écologique des polypores (Yombiyeni, 2014). Le domaine de la microbiologie du bois au Gabon est un domaine vierge et des recherches devraient être entreprises compte tenu du secteur de la transformation du bois qui prend de l’ampleur dans ce pays.

L’exploitation du bois au Gabon est l’activité économique la plus importante après celle pétrolière. D’après les informations contenues dans le tableau de bord de l’économie (Direction Générale de l'Économie et de la Politique Fiscale, 2015), la décision gouvernementale du 5 novembre 2009 d’interdire l’exportation du bois sous forme de grumes, a permis d’accroitre le nombre d’entreprises de transformation locales. Ainsi, entre 2011 et 2013, la croissance moyenne annuelle de la production enregistrée par les industries du bois était 11,6 %. En 2014, l’augmentation de la production des industries de transformation du bois a été de 11,1 %, soit 720 654 m3 de bois par rapport à l’année précédente. En 2019, l’activité forestière a été en hausse. La production du bois a augmenté de 5,7% par rapport à l’année précédente (Direction Générale de l'Économie et de la Politique Fiscale, 2019); la production industrielle en 2019 était de 1 134 109 m3. Cette augmentation est due à

la forte consommation du bois d’Okoumé (Aucoumea klaineana Pierre)3 plutôt que le bois divers4 affecté par le trafic scandaleux du Kévazingo (Guibourtia tessmannii)5. Fort de cela, le gouvernement est favorable aux recherches pour améliorer les pratiques en aménagement forestier afin d’assurer la pérennité des ressources forestières. Les recherches en foresterie couramment effectuées concernent la caractérisation écologique des forêts, l’aménagement forestier, ainsi que des études sur la biologie des principales essences forestières exploitées (Chaudhary et al., 2016; Doucet, 2003; Fuhr et al., 1998; Medjibe et al., 2011; Memiaghe et al., 2016; Sasaki et al., 2016). Les études sur les pathologies des arbres ont souvent été limitées à l’essence commerciale principale du Gabon, soit l’Okoumé (Aucoumea klaineana Pierre) (Deval, 1976). Cependant, comme tous les végétaux, les essences forestières sont sujettes aux maladies. Le Gabon possède une soixantaine d’espèces forestières indigènes qui font l’objet d’une exploitation intensive et pour certaines de ces essences, les problèmes de caries ont souvent été rapportés. Les relevés sur les ravageurs des arbres ont été effectués dès 1944 dans le cadre des recherches en sylviculture et amélioration génétique du Centre Technique Forestier Tropical (CTFT) sur les plants d’Okoumé en pépinière et en plantation (Grison, 1979). En milieu naturel,

3 L’Okoumé est l’essence principale exploitée au Gabon à cause de sa régénération rapide. Cette essence est utilisée pour la fabrication du contreplaqué.

4 Bois Divers est un terme qui regroupe toutes les essences commerciales du Gabon autre que l’Okoumé.

5 Kévazingo (Guibourtia Tessmannii) est une essence de la famille des Fabacées de forte densité dont la commercialisation fait l’objet de trafics intenses au Gabon. Le prix du mètre cube de cette essence varie entre 600 et 1800 Euros en fonction de la qualité du bois. 4

aucune étude à proprement parler sur les champignons pathogènes des essences commerciales du Gabon n’a été menée jusque-là.

Lors de l’exploitation du bois, les tiges affectées par la carie sont coupées et abandonnées dans les parterres de coupe, ce qui crée un biais au niveau des volumes estimés par les exploitants forestiers. Les caries sont visibles également sur les souches après abattage sous forme de carie de bois de cœur. Ce phénomène est très fréquent chez l’Alep, où les vieux individus ne sont plus supportés que par les contreforts (White & Abernethy, 1996). Les caries de cœur ont été également observées sur les arbres de Béli de diamètre exploitable. Ces caries constituent une source de pertes économiques (Schwarze & Jeffery, 2004).

Les caries du bois se définissent comme des décompositions enzymatiques des parois des cellules du bois accompagnées de changements plus ou moins prononcés dans les propriétés chimiques et physiques du bois. Il est vrai que la carie détériore une partie de la matière ligneuse potentiellement utilisable, mais c’est un processus essentiel qui contribue au recyclage de la matière organique. Les caries présentes sur les arbres vivants peuvent être occasionnées non seulement par des champignons parasites (pathogènes), mais également par des saprophytes. Ces derniers colonisent les tissus morts du bois, notamment, les cellules du duramen et n’interfèrent pas dans la croissance et le fonctionnement physiologique de l’arbre. Par contre, lorsqu’elles sont causées par des champignons pathogènes lignivores, elles affectent la physiologie de l’arbre en s’attaquant aux cellules du cambium (tissus responsables de la croissance en diamètre) et peuvent entrainer la mort des arbres (Dobbertin et al., 2001; Paolo et al., 2002). La carie causée par des champignons pathogènes lignivores provoque des

réactions dans l’arbre caractéristiques de la présence d’une maladie dans l’hôte et s’accompagne des signes et symptômes. Sur les arbres de Béli debout, nous avons observé la présence de divers basidiomes de champignons polypores. Outre les caries observées sur les arbres debout au niveau du tronc, les arbres de Béli sont souvent impliqués dans les chablis en forêt. Les racines des arbres renversés par le vent sont cariées. Les attaques racinaires des arbres sont généralement l’œuvre des pourridiés. Ces derniers sont causés par des champignons parasites. Toutefois, les basidiomes de champignons étaient difficilement observables sur les essences d’Alep et de Sorro. C’est ainsi que dans le chapitre 1 de cette thèse, nous nous sommes intéressés à la diversité de champignons polypores associés à la carie des arbres de Béli (Julbernardia bifoliolata) sur pied. Cependant, la plupart des champignons de la famille des Polyporacées peuvent vivre à l’intérieur de l’arbre sans produire des carpophores (Annesi et al., 2003). Les champignons sont présents dans l’arbre sous forme d’hyphes et fructifient difficilement. La deuxième méthode utilisée consistait à prélever des carottes de bois sur des arbres présentant des signes de carie pour échantillonner les champignons compte tenu de la rareté des basidiomes chez l’Alep et le Sorro pour l’amplification d’ADN de champignons extrait à l’aide d’amorces universelles de champignons. Cette méthode nous a permis d’obtenir la flore endophytique diversifiée des essences à l’étude constituant ainsi le chapitre 2 de cette thèse. Ce volet de recherche traitait de la diversité de champignons endophytes chez les essences J. bifoliolata, D. glaucescens et S. ochocoa.

L’origine des basidiomes de champignons présents sur le bois abattu peut provenir d’hyphes latents présents dans le bois d’aubier (Boddy, 2001). Selon cette dernière, les champignons présents à l’état de latence 6

peuvent faire partie du premier cortège de champignons une fois les essences abattues. Ainsi, l’identification des champignons polypores a été faite à partir des basidiomes récoltés sur les essences d’arbres debout d’une part et d’autre part sur les grumes (coursons de trois mètres de longueur) coupées et déposées le long des chemins forestiers pour les champignons de carie du bois. Dans ce chapitre 3, il s’est donc agi d’observer la diversité des champignons polypores associés à la décomposition des coursons de bois des essences de Béli, d’Alep et de Sorro.

Par la suite, pour tester la capacité à dégrader les cellules du bois des champignons polypores associés à la carie des arbres sur pied, nous avons observé en laboratoire l’activité de dégradation du bois par des champignons de carie à travers le chapitre 4 : Activité de dégradation de quatre champignons de carie sur des blocs de bois de Béli (J. bifoliolata), d’Alep (D. glaucescens) et de Sorro (S. ochocoa).

L’identification morphologique des espèces chez les champignons forestiers peut se faire par des clés de détermination des espèces développées par des chercheurs et mycologues. Ces dernières font appel à une série de critères descriptifs (Boulet, 2003). Cependant pour les amateurs, les clés d’identification morphologiques peuvent être difficiles à maîtriser et engendrer des erreurs d’identification entre des espèces qui présentent les mêmes caractéristiques. Il existe donc des limites aux techniques d’identification classique. Pour éviter les erreurs, il est possible de coupler l’identification morphologique à l’identification moléculaire. Ainsi, pour éviter les pertes de temps dans nos recherches, les techniques d’identification biomoléculaires ont été adoptées pour la détermination des espèces de champignons. L’identification des champignons

responsables de carie du bois par les méthodes morphologiques nécessite la présence de la fructification du champignon. Or, il n’est pas toujours évident d’observer la présence de basidiomes. Aussi, les outils de biologie moléculaire sont de plus en plus utilisés et permettent une meilleure fiabilité des résultats d’identification.

2. Cadre de l’étude

2.1. Localisation géographique du Gabon

Le Gabon est un petit pays forestier du Bassin du Congo, qui couvre une superficie de 267 667 km². La superficie forestière est estimée à 23,6335 millions d’ha (88,3 %) de la superficie totale du pays (Sannier, 2014). Il est traversé par l’Équateur et est géographiquement localisé entre 8°50' E — 14°50' E et 2° N — 3° 50' 1" S (système WGS 84). Il est bordé par l’océan Atlantique à l’Ouest et possède des frontières communes avec le Cameroun et la Guinée – Équatoriale au Nord, puis le Congo-Brazzaville à l’Est et au Sud (Fig. 1). Il possède plusieurs cours d’eau dont le plus long est le fleuve Ogooué, suivi des fleuves Nyanga, Ivindo, Ngounié et Komo. À cause de la grande diversité floristique et faunique existante au Gabon, le gouvernement a érigé 10 % de la superficie de son territoire en parcs nationaux. Le Gabon possède treize parcs nationaux gérés par l’Agence Nationale des Parcs Nationaux (ANPN). Sur la base de la présentation d'un dossier technique, l’ANPN peut autoriser à l’intérieur des parcs, les activités de recherche scientifique, les activités d'exploitation à des fins touristiques, la circulation d'engins à moteur et l'atterrissage d'aéronefs, l'abattage et la capture d'animaux, la destruction et la collecte de plantes et de minéraux, les travaux de

terrassement ou constructions nécessaires à la gestion d'un parc national ainsi qu'aux activités touristiques, culturelles, d'éducation ou de recherche après étude d'impact environnemental (Direction des Publications Officelles, 2007).

Figure 1 Localisation géographique du Gabon.

2.2. Climat, relief et types de sols

Le climat du Gabon est de type équatorial, il est chaud et humide, avec une moyenne de précipitation de 2 897 mm de pluies et 25,9 °C de moyenne thermique annuelle (Drouineau & Nasi, 1999). On reconnait au Gabon l’existence de quatre saisons distinctes et alternées, dont deux saisons de pluies et deux saisons sèches. La grande saison sèche survient entre juin et septembre, suivie de la petite saison sèche entre décembre et janvier (Doucet, 2003). Toutefois, les rythmes de saisons (saison sèche versus saison des pluies) varient de façon régionale avec des variations spatiales nord, centre et sud-ouest du pays (Drouineau & Nasi, 1999).

On distingue trois grands ensembles géomorphologiques au Gabon, soit les plaines côtières représentées par le bassin sédimentaire côtier, les plateaux représentés par les plateaux du Nord et les plateaux Batékés du Sud-Est et les montagnes qui séparent les deux derniers et représentées par les monts de Cristal au Nord-ouest, le mont Mayombe et Massif du Chaillu au Sud (Drouineau & Nasi, 1999). Le bassin sédimentaire est composé de sédiments côtiers allant du Primaire au Néogène déposé sur un socle Précambrien-Archéen (Drouineau & Nasi, 1999). Les plateaux Batékés, également composés de sédiments, sont constitués de grès et sables continentaux formés au Tertiaire. Les plateaux du Nord situés dans le Woleu-Ntem sont constitués par la formation d’une vaste pénéplaine avec l’affleurement du vieux socle Précambrien-Archéen à l’Est. On retrouve également un dépôt de sédiments du Protérozoïque dans la vallée de l’Ogooué et la Nyanga. Sur le bord Ouest du socle Précambrien- Archéen, on retrouve les reliefs des monts de Cristal. Dans le Sud-ouest, on retrouve le Massif du Chaillu, le mont Mayombe et les monts Ikoukou qui ont un socle de type cristallin ou sédimentaire.

Sur le plan pédologique, le bassin sédimentaire possède des sols sableux, acides et pauvres chimiquement avec des conditions xériques pendant la saison sèche. Sur les plateaux du Nord-est, on retrouve des sols profonds avec une forte teneur en argile, mais qualifiés de pauvres. Sur les plateaux Batékés, la texture du sol est également sableuse. Dans le Sud- ouest, à cause de l’érosion des sols des monts Ikoukou, les sols sont de type sédimentaire schisto-gréseuse. Ces sols sont qualifiés de profonds et fertiles à cause de l’abondance des argiles et des limons fins dus au relief marqué (Drouineau & Nasi, 1999).

2.3. Végétation et essences étudiées

2.3.1. Végétation

Parmi les régions phytogéographiques de l’Afrique décrites par Monod en 1957 et Troupin en 1966, le Gabon est situé dans la région Guinéo- Congolaise, caractérisée par une forêt Ombrophile aux espèces sempervirentes et semi-caducifoliées (De Namur, 1990). Selon ce dernier, cette région est composée de forêts denses avec plusieurs variantes et de savanes. On retrouve la Forêt Dense Humide Sempervirente (FDHS), également qualifiée de Forêt Ombrophile Guinéo- Congolaise Sempervirente Littorale Hygrophile (White, 1986). Cette forêt est dominée par les essences de la famille des Césalpiniacées, une association des essences Saccoglottis gabonensis et Aucoumea klaineana (De Namur, 1990). Outre la FDHS, on trouve la Forêt Dense Humide Semi-Décidue (FDHSD) ou Semi-Caducifoliée (FDHSC) dans le Nord-est du Gabon et ayant comme essences caractéristiques Triplochiton scleroxylon ou Terminalia superba. Ensuite, on rencontre les futaies

claires avec de grands arbres au sous-bois composé de plantes rameuses des familles des Marantacées et des Zingibéracées, la forêt inondée avec des essences aux racines échasses ainsi que des palmiers grimpants appartenant aux genres Ancistrophyllum, Eremospalha et Calamus. Enfin, les formations de savanes qui sont rencontrées dans la zone côtière et dans les forêts sous forme d’enclaves. Cette classification des forêts est proche de celle faite par Maley (1990). Ce dernier reconnait deux grands ensembles, les forêts sempervirentes et les forêts semi-caducifoliées. Cette classification non stricte souffre de l’hétérogénéité des espèces floristiques présentes et, de ce fait, la caractérisation des forêts a été réaménagée et basée sur la dominance des espèces forestières. Selon Maley (1990), on retrouve la forêt sempervirente à Gilbertiodendron dewevrei, la forêt littorale à Lophira alata, la forêt à Okoumé (Aucoumea klaineana), ainsi que les formations forestières clairsemées à Marantaceae et Zingiberaceae.

Les espèces forestières sont reliées à des environnements spécifiques (vallées, montagnes, régions côtières, etc.). Les types forestiers existants au Gabon peuvent être différenciés selon les reliefs (monts de Cristal, mont du Chaillu, etc.). En partant de l’océan atlantique, on reconnait les forêts littorales, orientales et continentales (Senterre, 2005). Selon ce dernier, les grands ensembles forestiers existants sont les forêts littorales, orientales, les forêts sous influence littorale et/ou orientale, les forêts continentales et les forêts submontagnardes.

La forêt gabonaise est placée dans le centre d’endémisme Guinéo- Congolais (White, 1986) et renferme les refuges pour des xérophytes et des orophytes (Reitsma et al., 1992).

La caractérisation des forêts a été également faite sur la base de la dynamique et de l’évolution des forêts dans le temps. Les changements climatiques et les pressions anthropiques provoquent une colonisation des espaces (savanes et jachères) par des essences forestières où on assiste à l’accroissement des espaces boisés (Maley, 1990; White & Abernethy, 1996). Dans l’ouvrage de White et Abernethy (1996), outre les bosquets, les savanes et les forêts-galeries, on distingue trois types de forêts : la forêt jeune, la forêt à Marantacées ou forêt secondaire et la forêt mature. La forêt jeune résulte de la colonisation des espaces ouverts et des savanes. Elle est caractérisée par la présence de jeunes peuplements de trois essences en particulier, soit l’Okoumé (Aucoumea klaineana), l’Azobé (Lophira alata) et l’Ozouga (Sacoglotis gabonensis). La forêt à Marantacées ou forêt Secondaire est caractérisée, quant à elle, par la présence au sol d’une végétation d’herbacées composées principalement des espèces de la famille des Marantacées et de Zingibéracées. Les nouvelles espèces résultant de la colonisation des forêts jeunes permettent le changement du couvert forestier. Enfin, la forêt mature est la résultante du changement du couvert forestier qui se densifie et ayant entrainé la disparition progressive de la végétation herbacée. Elle est caractérisée par un sous-bois clair et une végétation classique de forêt pluviale composée de plusieurs espèces forestières avec un couvert forestier formant des mosaïques. Les arbres sont particulièrement grands et ont de gros diamètres. Par exemple, l’Azobé est une essence qui peut atteindre 60 m de hauteur et 150 cm de diamètre et l’essence Guibourtia tessmannii (Kévazingo) qui fait l’objet de fortes convoitises et vendue au marché noir peut atteindre plus de 2 m de diamètre (White & Abernethy, 1996).

2.3.2. Essences forestières étudiées

Les essences forestières Julbernadia bifoliolata, Desbordesia glaucescens et Scyphocephalium ochocoa ont été largement décrites dans l’ouvrage de White & Abernethy (1996). L’espèce D. glaucescens (Irvingiaceae) est un arbre commun de la forêt à Marantacées. Selon White & Abernethy (1996), ses fruits ailés sont dispersés par le vent, l’écorce est pâle et rugueuse et son houppier est particulièrement coloré. Les arbres de cette espèce peuvent atteindre des hauteurs de 50 mètres et sont pourvus de contreforts spectaculaires et minces. Les grumes servent de buses à cause du cœur attaqué et rongé par les champignons de carie. L’espèce S. ochocoa (Myristicaceae) est un arbre de la forêt mature pouvant atteindre deux mètres de diamètre et 35 mètres de hauteur. Elle est également pourvue de hauts contreforts. Son écorce est rouge foncé et tachetée de lichens pâles, qui se desquame en écailles. L’espèce J. bifoliolata (Cesalpiniaceae) est un grand arbre de la forêt Mature avec des hauteurs de près de 40 mètres. Son écorce mince et lisse est très appréciée des écureuils volants qui s’en nourrissent. Cette espèce est également pourvue de contreforts minces. Le fruit est une gousse déhiscente qui projette des graines à une vingtaine de mètres. Le bois a une couleur jaunâtre pâle avec des grains brun sombre. Les essences de Béli sont dominantes dans la localisation des gites pour les anomalures (Anomalurus spp.) à cause de la présence de carie des arbres (Julliot et al., 1998).

3. Revue de littérature

3.1. Introduction

Le bois possède plusieurs rôles, celui de support ou soutien mécanique de l’arbre, de transport de la sève brute et de stockage des réserves des arbres. Il comprend trois principaux composés qui sont la lignine, la cellulose et les hémicelluloses. C’est le premier composé, la lignine qui confère au bois sa rigidité et qui permet à l’arbre de renforcer sa résistance face aux agents de dégradation du bois. De point de vue chimique, la lignine possède trois unités de monomères, l’Hydroxyphényl, la guaïacyle et la syringyle. La guaïacyle et la syringyle sont les monomères principaux (Higuchi et al., 1977; Ros et al., 2007; Schwarze & Jeffery, 2004). Les conifères contiennent presque exclusivement la lignine guaïacyle tandis que les feuillus contiennent les deux types de lignine guaïacyle et syringyle. La cellulose est le principal composant du bois, c’est un polysaccharide constitué de chaines de glucose. Tout comme la cellulose, les hémicelluloses composent également les parois des cellules du bois, et contiennent d’autres monomères de sucres comme les xyloses, mannoses ou galactoses.

La dégradation du bois est un processus conduisant à un changement non attendu des propriétés physiques et mécaniques du bois. Elle est causée aussi bien par des agents abiotiques (conditions climatiques), que biotiques (microorganismes). Au sein des arbres vivants attaqués par les agents de dégradation, les fonctions physiologiques de l’arbre peuvent se trouver affectées. De même, le bois en tant que matériau devient inutilisable. Par ailleurs, les composés du bois étant dégradés, on assiste souvent à une délignification des tissus du bois.

La délignification est une disparition de la lignine au sein des tissus du bois. C’est un processus qui peut se faire de façon volontaire à l’aide des produits chimiques industriels, par exemple lors de la fabrication des pâtes à papier. Elle peut également se faire de façon naturelle grâce aux enzymes des organismes vivants comme les champignons.

Les régions tropicales sont caractérisées par une grande diversité faunique et floristique. Les champignons qui sont des agents biotiques de dégradation du bois sont abondants dans ces régions. Les conditions climatiques sont également favorables à la dégradation des bois en région tropicale.

3.2. Les agents abiotiques de dégradation du bois en région tropicale

Le bois exposé aux agents atmosphériques subit plusieurs types de dommages, parmi lesquels, la décoloration des bois, la dégradation photochimique, le lessivage des produits solubles du bois et des dommages mécaniques liés à l’humidification et au séchage alterné des bois (Zabel & Morrell, 1992). Ces agents abiotiques sont responsables de la détérioration des grumes et des produits du bois, ils favorisent également la colonisation par les agents de dégradation biotique. La dégradation par les agents abiotiques altère principalement la valeur esthétique des bois, d’où la nécessité de les protéger par des produits de préservation.

Les bois des essences tropicales exposés à la lumière du soleil subissent une dégradation photochimique. Les travaux de recherche des effets de la lumière sur le bois ont montré que la lumière du soleil provoque un changement de couleur du bois (Baar & Gryc, 2012; Tolvaj et al., 2011). La surface des bois exposée à lumière devenait foncée dès les premières heures d’exposition (Baar & Gryc, 2012). La lumière agit également sur la lignine et les extractibles du bois (Sudiyani et al., 2003; Yamauchi et al., 2004). Selon Yamauchi et al. (2004), l’action de la lumière combinée à celle de la pluie provoque une fracture des groupes phényle par la lumière et la lixiviation des produits dépolymérisés.

La température également a une influence sur la dégradation des bois en forêt tropicale. Les travaux de recherche de Chambers et al. (2000) ont montré une forte corrélation entre la température moyenne annuelle et le taux de décomposition des gros débris ligneux des essences tropicales. Toutefois, l’influence de la température dans la détérioration des bois est également reliée à la nécessité de ce facteur dans les processus biologiques.

Les champignons Basidiomycètes utilisent l’oxygène de l’air en milieu terrestre pour dégrader le bois. Par contre dans les bois immergés, saturés en eau il y a peu d’oxygène disponible. Ces bois exposés aux conditions d’humidité sont généralement dégradés par les champignons de caries molles. Les bactéries font également partie des agents qui dégradent le bois saturé en eau.

3.3. Les agents biotiques de dégradation du bois en région tropicale

La dégradation des bois est causée par plusieurs agents, dont les bactéries, les insectes et les champignons. Durant le processus de carie, les champignons cohabitent dans le bois avec les insectes, les nématodes, les bactéries, les protozoaires et même les algues et les mousses (Zabel & Morrell, 1992).

Les attaques par les bactéries ont lieu essentiellement dans les milieux humides ou durant le transport des grumes par voies maritime et fluviale (Singh et al., 1987; Williams & Amburgey, 1987).

Les attaques dues aux insectes en régions tropicales se font aussi bien sur les arbres vivants que sur les grumes ou bois morts. Plusieurs familles d’insectes ont été recensées dans les plantations tropicales africaines. Il s’agit par exemple des Acridiens, Bostryches, Cérambycidés, Coléoptères, Gryllidés, Hémiptères, Lépidoptères, Platypodidés, Psylles, Scolytidés, Ténébrionidés et Termites (Isoptères) (Brunck, 1965). Selon ce dernier, les animaux ne sont pas en reste et participent également dans la dégradation des arbres debout. Parmi les espèces impliquées, on retrouve les antilopes, buffles, éléphants, rongeurs et singes.

Les champignons jouent un rôle majeur et sont considérés comme les agents les plus importants dans le processus de dégradation du bois. Les champignons adoptent deux principales stratégies de nutrition lors de la dégradation des bois, ils sont parasites (ou pathogènes) et/ou saprophytes. Outre ces deux stratégies, les champignons adoptent une attitude symbiotique où le champignon et son hôte tirent des bénéfices mutuels. Les champignons pathogènes (parasites) sont capables

d’attaquer les tissus vivants. Les champignons saprophytes dégradent le bois sur les substrats non vivants comme le bois mort et les bois de duramen composé de cellules mortes.

Dans la classification des champignons, l’embranchement des Basidiomycota (phylum) est très hétérogène, il regroupe des espèces affichant une diversité de formes et de tailles. Les champignons du phylum Basidiomycota impliqués dans la décomposition du bois appartiennent aux ordres des Agaricales (champignons pourvus de chapeaux à lamelles), Aphyllophorales (champignons dépourvus de lames) et Tremellales (champignons globuleux à ellipsoïdes avec des cloisons verticales ou diagonales) (Gilbertson, 1980). Selon ce dernier, les champignons appartenant aux deux premiers ordres sont souvent retrouvés sur les arbres vivants. Parmi les espèces de l’ordre des Aphyllophorales, on retrouve les champignons polypores souvent impliqués dans le processus de carie du bois. Ces champignons dont le nombre est estimé à 25 000 espèces (Zjawiony, 2004) sont répandus sur l’ensemble de la planète (Hawksworth, 2001). Les polypores sont pourvus de pores ou tubes au niveau de l’hyménophore. Ils appartiennent à la classe des Agaricomycètes (Fig. 2) et sont disséminés au sein des ordres des Corticiales, Gloeophyllales, Hymenochaetales, Polyporales, Russulales et Thelephorales (Gibertoni, 2009; Hibbett et al., 2007). Plusieurs études sur les champignons polypores en région tropicale ont été menées. Les travaux de Ryvarden and Johansen (1980) sur les polypores de l’est de l’Afrique ont permis de recenser les polypores appartenant à quatre principales familles à l’instar des Corticiaceae, Ganodermataceae, Hymenochaetaceae et Polyporaceae. Toutefois, très peu d’études sur les espèces appartenant à ces familles ont été réalisées au Gabon et dans le Bassin du Congo. 20

Figure 2 Classification et phylogénie des Basidiomycètes (Extrait de Hibbett et al. (2007)) : classe des Agaricomycètes

3.4. Les types de caries du bois

Il existe trois types de caries du bois causées par les champignons, soit les caries molles, les caries blanches et les caries brunes. Ces caries se distinguent par le type de composé du bois qu’elles affectent et l’aspect qu’elles provoquent sur le bois lors de la dégradation ainsi que par les organismes en cause (notamment leur arsenal d’enzymes capables de dégrader le complexe lignocellulosique).

Les caries molles, observables en milieux humides, sont causées en grande partie par des Deutéromycètes6. Il s’agit des bois en contact direct avec le sol ou des bois immergés. Les champignons de caries molles dégradent plus particulièrement la cellulose du bois et causent de faibles dégradations de la lignine (Schwarze & Jeffery, 2004). Sur le bois, on observe des tunnels de formes angulaires dont les ouvertures sont en forme de V ou de diamant dans le bois (Schwarze & Jeffery, 2004; Worrall et al., 1997).

Les caries blanches, tout comme les caries brunes, sont causées en majorité par les champignons du phylum Basidiomycota. Ceux causant les caries blanches dégradent particulièrement la lignine, tandis que la cellulose et l’hémicellulose sont dégradées faiblement dans les mêmes proportions (Blanchette, 1991; Highley & Dashek, 1998; Tuor et al., 1995). Le bois prend une texture fibreuse et une couleur pâle (Highley & Dashek, 1998). Les caries blanches sont causées également par certains

6 Les Deutéromycètes ne constituent pas un groupe naturel. Il s’agit d’un pseudo- embranchement qui n’est plus reconnu dans la taxonomie moderne. Les données moléculaires démontrent que la majorité des Deutéromycètes sont en fait des Ascomycètes. 22

champignons du phylum Ascomycota comme ceux appartenant à l’ordre des Xylariales (Schwarze & Jeffery, 2004; Worrall et al., 1997). On observe une récurrence de ce type de caries sur les arbres feuillus (Schwarze & Jeffery, 2004; Tuor et al., 1995).

Contrairement aux champignons de caries blanches, ceux de caries brunes dégradent la cellulose et l’hémicellulose en particulier et modifient la structure de la lignine (Green & Highley, 1997; Highley & Dashek, 1998). Cela se traduit par une couleur beaucoup plus foncée du bois accompagnée de perte de masse et de perte prononcée de résistance mécanique du bois (Green & Highley, 1997). Le bois acquiert une texture cubique qui se transforme en une masse pulvérulente brune (Grosclaude, 1993).

3.5. Les caries des arbres

Les caries des arbres changent d’appellation selon les parties de l’arbre carié. On reconnait les caries racinaires, de la tige, de l’aubier et du cœur de l’arbre.

➢ Les caries affectant les grosses racines des arbres : Ce sont des maladies également connues sous le nom de pourridiés des arbres. Celles-ci sont causées par des champignons pathogènes. L’incidence des attaques par les pathogènes responsables de pourridiés conduit à l’affaiblissement de l’hôte et à la mort de l’arbre. ➢ Les caries de la tige ne sont autres que des dégradations du bois situées au niveau de la tige des arbres.

➢ La carie de l’aubier est une carie située au niveau de l’aubier. Ce dernier contient des cellules vivantes et les caries sont généralement causées par des agents pathogènes. ➢ Les caries de cœur, comme leur nom l’indique, sont situées au niveau du duramen. Les cellules du duramen n’étant pas actives, les caries sont causées souvent par des champignons saprophytes.

3.6. Les caries sur les bois immergés

Les bois immergés connaissent également le phénomène de dégradation des bois. En région tropicale, le stockage des grumes dans l’eau et le transport des grumes par voie fluviale sont souvent utilisés. Les agents de caries couramment rencontrés dans ces milieux sont les champignons du phylum Ascomycota (incluant les espèces décrites comme deutéromycètes) et les bactéries (Bucher et al., 2004; Kim & Singh, 2000; Tsui et al., 2000). Les champignons causent des caries molles et tolèrent l’humidité élevée, ainsi que l’absence d’oxygène (Kim & Singh, 2000). Dans les milieux humides, on observe une diversité de champignons marins associée aux caries du bois (Hyde & Goh, 1998; Tsui et al., 2000). Des recherches réalisées en Australie dans les forêts tropicales ont permis de recenser 15 espèces de champignons du phylum Ascomycota, 23 espèces de champignons du phylum Deuteromycota et une espèce appartenant au phylum Basidiomycota (Hyde & Goh, 1998). Selon ces derniers, les espèces dominantes étaient Candelabrum brocchiatum, Trichocladium linderi, Canalisporium pulchrum, Pleurothecium recurvatum et Helicosporium griseum. À Hong-kong, dans la baie de Tai Ho, trente-trois espèces du phylum Ascomycota et vingt-deux espèces du phylum Deutéromycota ont été identifiés, les plus récurrents étaient les

espèces Aniptodera chesapeakensis, Ascosalsum unicaudata, Lignincola laevis, Lophiostoma bipolare et Neptunella longirostris. Plusieurs espèces de champignons marins ont été observées à Singapour sur les essences de palétuviers Avicenia (Tan et al., 1989). Ces derniers ont observé une récurrence des champignons Halosarpheia retorquens, Lignincola laevis, Didymosphaeria enalia, Lulworthia sp., Aigialus parvus, Aniptodera marina et Halocyphina villosa. Les espèces Torula herbarum et Ophioceras dolichostomum ont été rapportées comme étant capables de s’attaquer à la lignine du bois au même titre que les espèces des champignons du phylum Basidiomycota responsables de carie blanche (Bucher et al., 2004).

3.7. La dégradation des grumes ou du bois mort par les champignons

La dégradation du bois ayant commencé sur le bois des arbres debout par les champignons pathogènes et saprophytes, elle continue de se faire sur le bois abattu ou mort (Boddy, 2001). Selon cette dernière, la décomposition du bois mort est initiée par les propagules pré existant dans l’aubier du bois avant abattage ou encore par la colonisation du bois par les spores ou les hyphes de champignons.

Les champignons saprophytes débarrassent la forêt des débris ligneux en collaboration avec d’autres microorganismes (Blanchette, 1991; Frey et al., 2003). Lors de la dégradation des débris ligneux, les éléments minéraux sont recyclés dans le sol (Boddy & Watkinson, 1995). La dégradation des grumes obtenues à partir des arbres fraichement coupés

est semblable à celle du bois mort provenant d’un arbre naturellement mort (Lindhe & Lindelöw, 2004).

La colonisation des grumes pour la dégradation des bois peut dépendre de plusieurs facteurs, dont l’humidité, l’âge ou le stade de décomposition du bois. Le contact direct du bois avec le sol augmente la quantité en eau disponible dans le substrat. L’humidité dans le bois fournit au champignon l’eau dont il a besoin pour sa croissance. Un rondin en contact direct avec le sol est favorable à la colonisation de ce dernier par les champignons saprophytes (Busse, 1994; Lindblad, 1998). Schmit (2005) a observé que des buches de bois plus jeunes étaient colonisées beaucoup plus par des champignons saprophytes par rapport à des buches plus âgées. De même, un bois présentant des caries moins apparentes hébergerait plus d'espèces de champignons qu’un bois ayant des caries avancées (Lindblad, 1998; Schmit, 2005).

Les régions tropicales recèlent une grande diversité d’espèces de champignons polypores impliqués dans le processus de dégradation (Lodge et al., 1995). Les données des études réalisées sur les champignons saprophytes des bois en régions tropicales proviennent notamment du bassin amazonien et des forêts de l’Asie. Ryvarden est l’un des pionniers en matière de recherches sur les champignons saprophytes en Afrique (Ryvarden, 1998; Ryvarden & Iturriaga, 2003; Ryvarden & Johansen, 1980; Ryvarden & Watling, 1996). Des recherches mycologiques ont été focalisées sur les champignons polypores (Dai, 2012; Ryvarden, 1978, 1998; Ryvarden & Iturriaga, 2003; Ryvarden & Johansen, 1980; Ryvarden & Watling, 1996). Au Gabon, les travaux de thèse de Yombiyeni (2014) ont permis d’identifier jusqu’à 105 espèces de champignons appartenant aux familles des Ganodermataceae,

Hymenochaetaceae et Polyporaceae sur tout type de substrat. Dans le chapitre 3 de cette thèse, nous avons utilisé les techniques moléculaires pour étudier la diversité des polypores récoltés sur des coursons de bois (bois mort) des essences forestières J. bifoliolata, D. glaucescens et S. ochocoa. Dans cette étude, les séquences d’ADN étaient reparties au sein de 28 Unités Taxonomiques Opérationnelles (OTUs). Les espèces appartenaient à 13 familles, soient, les Corticiaceae, Fomitopsidaceae, Ganodermataceae, Hericiaceae, Hydnodontaceae, Hymenochaetaceae, Incertyae sedis, Meruliaceae, Phanerochaetaceae, Polyporaceae, Punctulariaceae, Schizoporaceae et Stereaceae.

3.8. Les mécanismes enzymatiques déployés par les champignons lignivores

Les hyphes des champignons pénètrent les tissus du végétal sain soit par le biais de la formation des structures spéciales appelées appressoria7 (Dalman, 2010), ou au moyen des ouvertures comme des blessures causées par des agents biotiques ou abiotiques. Ce sont les composés du bois, la cellulose, hémicellulose et lignine, qui sont la cible des champignons lignivores. Ceux-ci sont pourvus de systèmes enzymatiques leur permettant de contourner les systèmes de défense des arbres et de dégrader le bois.

Les champignons dégradent les composants des parois cellulaires du bois par un processus d’oxydation en déployant des enzymes connues sous le

7 Structures développées par les hyphes des champignons lignivores en exerçant une pression sur la paroi cellulaire de son hôte pour pénétrer dans celle-ci. 27

nom de phénol-oxydases. Ce sont notamment la lignine peroxydase, la manganèse peroxydase et les laccases (Baldrian, 2006; Eggert et al., 1996; Tuor et al., 1995). La lignine peroxydase et la manganèse peroxydase appartiennent au groupe des peroxydases et dégradent moins bien la lignine, tandis que les laccases sont les vrais phénols-oxydases, car elles dépolymérisent plus facilement la lignine (Tuor et al., 1995). Les champignons de carie blanche sont reconnus pour dégrader l’ensemble des composés du bois et plus particulièrement la lignine. Chez ces derniers, on distingue trois groupes de champignons de carie blanche selon les enzymes déployées lors de la dégradation. Ce sont les groupes des Lignine Peroxydase – Manganèse Peroxydase, Lignine Peroxydase – Laccases et Manganèse Peroxydase – Laccases (Hatakka, 1994).

La dégradation de la cellulose et hémicellulose bien que jamais complète, est l’apanage des champignons responsables de la carie brune. La cellulose étant enveloppée par l’hémicellulose, ces champignons commencent par décomposer, grâce aux cellulases, les sucres contenus dans les hémicelluloses (xylose et mannose) avant de s’attaquer aux glucoses contenus dans la cellulose (Kirk & Highley, 1973). Pour dégrader la cellulose du bois, les champignons produisent des cellulases, principalement des glucanases et des cellobiohydrolases (Klyosov, 1990; Schmidhalter & Canevascini, 1992).

3.9. Les facteurs de résistance et mécanismes de défense des arbres

La capacité de résistance face à la dégradation du bois varie d’une essence à l’autre. Elle peut dépendre de facteurs comme la durabilité de l’essence,

de la densité du bois, du contenu en lignine dans le bois et des substances extractibles.

La durabilité est la capacité d’un bois à résister aux attaques des microorganismes. En effet, lors de la croissance de l’arbre, le bois est sans cesse renouvelé et certains tissus assurent la protection du végétal. La croissance secondaire8 du bois dans un arbre est contrôlée par deux types de méristèmes9, l’assise subéro-phellodermique (au niveau de l’écorce) et l’assise libéro-ligneuse (au niveau de l’aubier). Ainsi, la résistance face aux attaques des microorganismes est garantie premièrement par l’écorce de l’arbre qui joue un rôle de barrière protectrice. Elle est également pourvue par les cellules méristématiques du cambium contenu dans l’aubier qui assurent le renouvellement des tissus du bois. Dans l’aubier, les cellules de parenchyme sont encore actives sur le plan métabolique et permettent à celui-ci de réagir facilement aux agressions extérieures par la production de structures et de composés de défense. Il y a par exemple la formation des thylles à l’intérieur des vaisseaux et des cellules des fibres du bois pour empêcher la progression des hyphes de champignons. En revanche, au niveau du duramen les cellules de parenchyme ne sont plus actives, les réactions face aux attaques des pathogènes sont assurées par la présence de substances phénoliques ou extractibles du bois abondant dans cette région du bois.

8 Croissance en diamètre de l’arbre. La croissance primaire étant la croissance en hauteur du végétal.

9 Amas de cellules indifférenciées capables de se diviser (mitoses) puis de se différencier en acquérant une structure et une fonction. 29

Plusieurs théories ont été développées pour expliquer les défenses physiologiques de l’arbre face aux agressions extérieures. Il y a par exemple le concept de circonscription de la carie ou pourriture dans un arbre (Compartimentalization of decay in trees, en abrégé CODIT) développé sous forme de modèle par Alex Shigo (Pearce, 1996; Schwarze & Jeffery, 2004; Shigo, 1984; Shigo & Marx, 1977). D’après ce modèle, la carie serait circonscrite aux moyens de quatre (4) murs. Le premier mur freine la progression longitudinale du pathogène et est assuré par la formation des thylles et des gommes au sein des vaisseaux et ponctuations du bois. Les deuxième et troisième murs concernent les progressions radiales vers l’intérieur du bois et tangentielles ou latérales du pathogène. Le quatrième mur, contrairement aux trois autres murs, se forme après infection; il est localisé dans le même plan que le cambium et assure la continuité de la croissance de l’arbre (Pearce, 1996). Selon ce dernier, d’autres mécanismes dits passifs et micro environnementaux comme le contenu élevé en eau et le faible taux en oxygène dans les vaisseaux de xylème sont capables d’empêcher la progression des pathogènes. D’ailleurs Boddy et Rayner (1983) attribuent les réactions de défense des arbres au contenu en eau dans les tissus et ont remis en cause le modèle CODIT. Pour ces derniers, les caries observées au niveau du duramen s’expliquent par la diminution du contenu en eau entre les tissus de l’aubier et ceux du duramen.

La durabilité du bois est également associée à la densité du bois. Cette dernière est la valeur de la masse sèche du bois divisée par le volume frais de la pièce de bois. Les valeurs de densité du bois sont généralement comprises entre 0 et 1.5 g.cm-³ (Chave et al., 2009). Selon ces derniers, les valeurs de densité sont très variables entre les espèces forestières et selon les parties considérées de l’arbre. Les bois ayant une forte densité 30

affichent une forte résistance face à la carie et ont une valeur financière beaucoup plus élevée que des bois de faible densité (Larjavaara & Muller- Landau, 2010), par exemple les essences Bubinga (Guibourtia tessmannii) et Padouk (Pterocarpus soyauxii) qui sont durables et très durables aux attaques des champignons de carie, ont respectivement des densités moyennes de 0.92 et 0.79, avec des valeurs moyennes de coût du mètre cube d’environ 580 et 350 euros.

Comme nous l’avons mentionné précédemment, la lignine est le composé qui donne au bois sa rigidité. Chez les feuillus, les essences plus riches en lignine guaïacyle sont plus résistantes aux champignons de carie que celles ayant de fortes proportions de lignine syringyle (Syafii et al., 1988).

La présence des produits phénoliques ou extractibles du bois joue un rôle dans la lutte contre la propagation des pathogènes dans le bois (Eslyn et al., 1981; Grosclaude, 1993; Scalbert, 1992; Scheffer, 1966). Selon Scheffer (1966), les produits phénoliques se regroupent au sein des terpènes, des flavonoïdes, des tropolones et des stilbènes ou tannins. Ces extractibles sont à l’origine de la coloration du bois. Selon Chave et al. (2009), les bois colorés seraient plus résistants que les bois clairs. Les études réalisées sur les extractibles des essences tropicales ont révélé l’existence de plusieurs composés provenant des bois tropicaux. Chez Tectona grandis, six composés (deoxylapachol, tectoquinone, 2- hydroxymethylanthraquinone, 3'-OH-deoxyisolapachol, hemitectol et tectol) inhibant les champignons de carie blanche et de carie brune ont été isolés (Sumthong et al., 2008). Les travaux d’Eslyn et al. (1981) ont démontré l’efficacité des composés Obtusaquinone, Obtusastyrène et Lapachol isolés à partir des essences Dalbergia retusa, D. obtusa et

Tabebuia guayacan contre les champignons de carie et testés sur du bois de Pinus ponderosa.

3.10. Importance des endophytes des arbres tropicaux

Les champignons endophytes appartiennent en majorité au phylum Ascomycota. Ce sont des champignons microscopiques présents à l’intérieur des végétaux. Ils accomplissent une partie ou la totalité du cycle de développement de leur vie sans causer de symptômes apparents à leur hôte (Sieber, 2007), avec lequel ils entretiennent une relation symbiotique. Les endophytes sont présents à l’état de latence dans toutes les parties de l’arbre et sont considérés comme les premiers colonisateurs de l’aubier des arbres (Boddy, 2001).

Les endophytes sont connus pour protéger les plantes contre les agents pathogènes. Les champignons des genres Curvularia, Fusarium, Pestalotiopsis, Tolypocladium et Trichoderma ont montré leur capacité à contrecarrer le pathogène Phytophthora palmivora, agent responsable des maladies de pourritures noires des cabosses de cacao (Hanada et al., 2010). Cette protection contre les maladies résulterait de la production de métabolites secondaires ou substances bioactives par les champignons endophytes (Mejía et al., 2008; Wang et al., 2012). Les bénéfices de ces substances sont également étendus aux humains, car ces molécules constituent des substances antibactériennes (Radić & Štrukelj, 2012), à l’instar des antibiotiques naturels dont les forêts tropicales constituent un foyer important (Li et al., 2009).

Les régions tropicales sont reconnues pour abriter la plus grande diversité de ces champignons endophytes (Arnold & Lutzoni, 2007; Debdulal, 32

2011). Cette diversité peut varier en fonction de l’espèce hôte ou de la localisation géographique de prélèvement (Arnold et al., 2000; Raviraja, 2005). Certaines espèces de champignons endophytes semblent toutefois se spécialiser en fonction de la partie de la plante échantillonnée (Wu et al., 2013). L’étude comparative de structure de communauté de champignons endophytes isolés à partir de feuilles ou du bois d’aubier chez l’hévéa (Hevea brasiliensis) a permis de déceler une plus grande richesse de champignons endophytes isolés à partir du bois d’aubier (Gazis & Chaverri, 2010).

L’étude de la diversité des champignons endophytes chez les essences forestières Julbernardia bifoliolata, Desbordesia glaucescens et Scyphocephalium ochocoa dans les forêts du sud-est du Gabon (chapitre 2) a montré une diversité de champignons endophytes et une dominance de la présence des champignons endophytes appartenant aux genres Pestalotiopsis et Penicillium sur les arbres cariés de ces trois essences.

3.11. Les principaux pourridiés des régions tropicales rencontrés dans le bassin du Congo et au Gabon

Les pourridiés encore appelés caries des grosses racines sont des maladies causées par les champignons et qui attaquent le cambium (Laflamme, 2005). Ces pourridiés sont attribués pour la plupart aux champignons polypores et à certains champignons du genre Armillaria. Les caries des racines et des tiges des arbres ont été étudiées en régions tropicales. Les recherches se rapportant aux pourridiés ont été réalisées particulièrement sur les arbres de plantations utilisés pour la production de fibres ligneuses à l’instar des essences d’Eucalyptus sp., d’Acacia

mangium, de Teck (Tectona grandis), l’Hévéa (Hevea brasiliensis) utilisé pour la production du caoutchouc ou encore sur les palmiers à huile (Elaeis guineensis). Les agents de caries des racines et de la tige le plus souvent rapportés en Asie sont les espèces Ganoderma philippii et Phellinus noxius sur Acacia mangium et Eucalyptus pellita (Agustini et al., 2014; Eyles et al., 2008; Irianto et al., 2006). Dans les pays du Bassin du Congo, très peu d’études sur les pourridiés des arbres ont été réalisées. Quelques études sur les attaques cryptogamiques des arbres dues aux agents de carie ont été rapportées sur les essences forestières en plantation, à l’instar de Fomes spp. sur Lophira alata au Cameroun (Brunck, 1965). Les caries sur les arbres d’hévéas sont attribuées à plusieurs espèces de champignons à l’instar de Armillaria spp. et Rigidoporus lignosus (Mallet et al., 1985). En République Démocratique du Congo (Ex Congo belge), les caries dues à Armillaria mellea ont été observées sur les palmiers à huile plantés dans les zones forestières (Wardlaw, 1950).

Au Gabon, les recherches sur les pourridiés concernent celles réalisées sur les hévéas en plantations. Les travaux de Guyot (1997) du Centre d’appui technique à l’hévéaculture font état de Armillaria heimii qui cause des caries des racines sur les arbres d’Hévéa. Ce pathogène a été isolé dans plusieurs sites au Gabon (Mitzic, Bitam, Kango et Koumameyong). Outre l’Armillaire, le champignon R. lignosus a été également isolé (Enjalric & Ngoua Assoumou, 1998; Guyot, 1997). Ce dernier est communément rencontré dans les plantations établies en zone forestière (Geiger et al., 1986), il est le principal pathogène des hévéas établis dans ce type d’écosystème (Tran van, 1985). Les recherches sur les essences forestières ont été réalisées sur Tectona grandis, celles – ci ont permis d’identifier Armillaria mellea comme agent de pourridié (Brunck, 1965). 34

Cependant, on note très peu de relevés des agents de carie sur les arbres en forêt naturelle. Le chapitre 1 de cette thèse traitant de la diversité des champignons polypores associés à la carie des arbres de Béli (J. bifoliolata) sur pied rapporte l’existence de P. noxius comme agent associé à la carie dans les forêts du sud-est du Gabon, un pathogène très récurrent chez les essences forestières en Asie. Ces travaux mentionnent également l’existence de plusieurs autres agents de carie des racines et des tiges dont les ravages ont déjà été également rapportés dans les autres régions tropicales du monde, à l’instar de Amauroderma subresinosum, Fomitiporia nobilissima, Fuscoporia gilva, Hymenochaete murina, Rigidoporus ulmarius et Tinctoporellus epimiltinus.

Les techniques d’aménagement utilisées en régions tropicales, par exemple la coupe sélective, et la diversité de champignons polypores existante dans ces régions sont à l’origine de la diversité d’agents responsables des pourridiés. En effet, les souches des arbres coupés dans un peuplement et colonisées par des spores de champignons constituent des portes d’entrée pour les champignons de carie vers les arbres sains environnants. La propagation du mycélium dans les arbres environnants se fait par le contact des racines des arbres. C’est le cas du champignon R. lignosus qui colonise les hévéas sains par l’entremise des rhizomorphes provenant des souches ou des débris ligneux enfouis dans le sol. La propagation s’effectue également par le contact racinaire d’un arbre d’Hévéa infecté avec les racines d’un arbre sain (Nandris et al., 1987).

4. Objectifs et hypothèses de l’étude

Le but de notre recherche était d’étudier la diversité fongique, plus précisément les endophytes et les champignons polypores (parasites et saprophytes), associée aux caries du bois des essences forestières J. bifoliolata, D. glaucescens et S. ochocoa.

L’objectif principal de cette thèse doctorale était d’utiliser les techniques moléculaires pour identifier et étudier les champignons endophytes et ceux associés aux caries du bois chez les essences forestières J. bifoliolata, D. glaucescens et S. ochocoa. Pour ce faire, nous avons fait appel aux techniques moléculaires basées sur le séquençage de l’ADN. Nous avons identifié et comparé la diversité en champignons endophytes, celle des polypores récoltés sur les arbres debout d’une part et ceux sur le bois mort d’autre part, des trois essences à l’étude. Ensuite, nous avons comparé les pertes de masse occasionnées par les champignons de carie sur les blocs de bois des trois essences en laboratoire.

L’étude des communautés fongiques des endophytes et celles associées aux caries des essences forestières exploitables avaient pour but de :

(i) Identifier les champignons par les techniques moléculaires; (ii) Comparer les diversités fongiques entre les essences forestières et entre les sites de prélèvement; (iii) Évaluer la capacité de dégradation du bois des champignons de carie sur le bois des différentes essences.

5. Approche méthodologique

5.1. Localisation du milieu d’étude et caractérisation des sites

Nos sites d’étude étaient localisés dans la province de l’Ogooué-Lolo et plus précisément proches de la ville de Lastourville (12°43' E de Longitude et 50' S de Latitude). La superficie de la province représente environ 10 % de la superficie totale du pays (25 380 km²). Les forêts de l’Ogooué-Lolo sont de type sempervirent (FDHS) contrairement à celles du Nord qui sont des forêts semi-caducifoliées.

Nous avons échantillonné dans trois sites différents (Fig. 3). Il s’agissait des concessions forestières appartenant à la Société des Bois de Lastourville (SBL), la Compagnie Équatoriale des Bois (CEB) et la Société Équatoriale d’Exploitation Forestière (SEEF). La collecte des échantillons a été faite dans les zones en cours d’exploitation ou les zones récemment exploitées et les arbres prélevés étaient situés dans une bande de 50 mètres de la bordure des routes forestières.

Dans le site de SBL, les basidiomes de champignons ont été collectés dans la zone du chantier 19. Cette zone avait déjà fait l’objet d’exploitation de grumes une vingtaine d’années avant notre passage; il s’agissait d’une forêt secondaire. Par contre, les sites des sociétés CEB et SEEF étaient des forêts matures et vierges n’ayant pas encore fait l’objet d’exploitation du bois.

Figure 3 Localisations des sites SBL, CEB et SEEF 38

5.2. Techniques de collecte et traitement des échantillons

L’identification des champignons a été faite à partir des carottes de bois dans un premier temps, puis à partir des basidiomes récoltés sur les arbres de Béli debout et sur les coursons de bois de trois mètres de longueur appartenant aux trois essences forestières et disposés sur le bord des chemins forestiers dans les trois sites d’étude (Fig. 4).

Les carottes de bois ont été prélevées sur les trois essences forestières (J. bifoliolata, D. glaucescens et S. ochocoa) à l’aide de la sonde de Pressler (HAGLOFS MEK. AB, Mora, Suisse). La sonde était aseptisée à l’alcool et à la flamme avant tout prélèvement. Une fois la carotte obtenue, cette dernière était placée dans un tube stérile de 14 ml, étiqueté et entreposé dans la glacière avant le transfert au congélateur. Les basidiomes de champignons collectés étaient entreposés dans des sacs de papier et étiquetés. Les étiquettes indiquaient le numéro de l’échantillon, le lieu de récolte et le nom de l’essence. Au laboratoire, les carottes de bois et les basidiomes de champignons étaient découpés en petits morceaux, pesés (environ 20 mg) et broyés pour les analyses moléculaires.

Un échantillon unique de sol était prélevé au pied de l’arbre pour l’analyse granulométrique du sol à l’aide d’une tarière de sol Edelman de 25 cm de profondeur. La couche de matière organique était soigneusement enlevée avant de prélever la carotte de sol. Vingt (20) échantillons ont été sélectionnés par essence et par site pour l’analyse. L’analyse granulométrique a été effectuée au laboratoire des sciences des sols de l’Institut National Supérieur d’Agronomie et de Biotechnologies (INSAB).

Figure 4 Localisation des coursons des essences forestières. 40

Le but d’une analyse granulométrique est de révéler la texture d’un sol. Cette analyse est basée sur la loi de Stockes qui repose sur la vitesse de sédimentation des particules séparées et dispersées par destruction de leur ciment tel que : le calcaire, la matière organique et autres particules métalliques. Le fractionnement de ces particules se fait par l'intermédiaire de la pipette de Robinson qui permet la détermination des fractions argileuses et limoneuses fines. Ensuite, les sables fins et grossiers sont mesurés par tamisage, tandis que la détermination des limons grossiers se fait par calcul à partir des résultats obtenus (Baize, 1988).

Les points GPS ont été également prélevés au pied des arbres échantillonnés à l’aide du GPSMAP62ST (Garmin, Schaffhouse, Suisse) pour des fins d’établissement de cartes des sites (Fig. 5).

Figure 5 Localisation des arbres échantillonnés. 42

5.3. Culture des isolats

La culture des champignons polypores a été faite à partir des morceaux de basidiomes frais collectés sur les arbres de Beli en forêt.

En effet, les boites de Petri contenant du milieu gélosé à base de Malt Extract Agar (MEA) à 2% et de Potato Dextrose Agar (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) à 39 g/l, ont été préparées en laboratoire puis acheminées sur le terrain. Ces milieux étaient additionnés d’antibiotiques (chloramphénicol et streptomycine à 30 mg/l) pour éviter les contaminations bactériennes, de Benlate et de Dichloran à 2 mg/l pour favoriser l’isolation des champignons Hyménomycètes dont font partie les polypores (Worrall, 1991). Le mycélium était purifié par repiquage successif dans de nouveaux milieux.

Des tests de croissance du mycélium des isolats obtenus ont été effectués sur un milieu à base de Malt Extract Agar (MEA). Les boites étaient incubées à 28 °C, dans une obscurité constante.

Les expériences de perte de masse ont été guidées par le protocole de standard européen de préservation du bois (BS EN, 1997). Les blocs de bois ont été soumis au mycélium des différents isolats dans des chambres de cultures stériles constituées de pots Mason de 500 ml et contenant 50 ml de milieu MEA et d’antibiotiques (streptomycine et chloramphénicol).

5.4. Les traitements biomoléculaires

La caractérisation des champignons dans nos recherches s’est faite en utilisant les techniques biomoléculaires. Il s’agissait, d’une part, 43

d’extraction d’ADN génomique, d’amplification par la technique de réaction de polymérisation en chaine (PCR) et de séquençage de l’ADN en vue d’identifier les spécimens et, d’autre part, de tests de dégradation du bois en présence du mycélium de champignons.

5.4.1. Extractions d’ADN

Nous avons extrait l’ADN de champignons à partir des carottes de bois et des basidiomes de champignons (Jasalavich et al., 2000; Råberg et al., 2005; Vilgalys & Hester, 1990). L’extraction d’ADN à partir du bois a déjà fait l’objet d’étude chez les essences tropicales (Asif, 2005). Toutefois, les échantillons doivent nécessairement être bien broyés avant l’extraction de l’ADN avec des grains de quartz par exemple (Vainio & Hantula, 2000) ou de l’azote liquide (Asif, 2005). D’autres méthodes requièrent qu’on cultive du mycélium à partir des carottes de bois préalablement stérilisés à la flamme, directement dans les boites de Petri sur un milieu de culture (Johannesson & Stenlid, 1999; Swedjemark & Stenlid, 1993). Ainsi, l’extraction d’ADN peut se faire soit à partir des cultures obtenues par la méthode in vitro ou directement à partir des échantillons biologiques prélevés (Bougnoux & Espinasse, 2003). Ce sont les gènes de l’ADN ribosomique qui sont ciblés. La région ITS de l’ADNr est couramment utilisée dans les études d’écologie moléculaire des champignons (Peay et al., 2008). Cette région est également utilisée en systématique moléculaire pour l’identification des espèces et même à l’intérieur de l’espèce. En effet, la petite sous-unité ribosomique (18S) et la grande sous-unité (28S), étant séparées par une unité intermédiaire de 5.8 S sont intercalées par deux espaceurs géniques appelés ITS1 et ITS2 (Espaceurs Internes Transcrits). Les unités de transcription constituées 44

des séquences 5.8S, 18S, 28S, ITS1 et ITS2 sont, pour leur part, séparées par l’IGS (Espaceur Intergénique). Selon Bougnoux et Espinasse (2003), les séquences nucléotidiques des régions ITS ou IGS de deux espèces appartenant à un même genre ne sont pas strictement identiques; de ce fait, le polymorphisme de ces régions est utilisé pour l’identification des espèces de champignons.

5.4.2. Amplification génique

La PCR permet d’obtenir d’importantes quantités de fragments d’ADN à partir d’une petite quantité de matériel biologique. Au cours de cette phase, l’ADN est répliqué, puis passe par plusieurs étapes, qui sont : la dénaturation, l'hybridation avec des amorces et l'élongation. Les amorces ou marqueurs moléculaires sont spécifiques aux régions ITS qu’on veut amplifier (Bougnoux & Espinasse, 2003; Kumar & Shukla, 2005). Les combinaisons d’amorces ITS1F-ITS4 et ITS1F-ITS4B sont adaptées pour l’identification des champignons en général et également des champignons Basidiomycota (Gardes & Bruns, 1993). Dans nos recherches, nous avons utilisé la combinaison d’amorces ITS1F – ITS4 pour l’ADN extrait à partir des carottes de bois et la combinaison d’amorces ITS1F-ITS4B pour les basidiomes de champignons. Toutefois, l’amplification de l’ADN du matériel végétal vivant à partir de la combinaison d’amorces ITS1F – ITS4 conduit souvent à l’identification des champignons endophytes des végétaux. Les champignons endophytes accomplissent la totalité ou une partie de leur cycle de vie à l'intérieur d'une plante et vivent en symbiose avec la plante hôte.

Les produits PCR ont été révélés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1.5 % coloré au bromure d’éthydium. Les amplicons ont été envoyés à la plateforme d’analyses génomiques de l’Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes de l’Université Laval ou celle du Centre Hospitalier de l’Université Laval (CHUL) pour le séquençage de l’ADN.

5.4.3. Séquençage de l’ADN

Le séquençage permet d’obtenir un enchainement de nucléotides des fragments d’ADN. La technique de séquençage utilisée dans notre étude était la technique Sanger. À l’heure actuelle, plusieurs autres techniques de séquençage permettent d’analyser un grand nombre d’échantillons et d’aller chercher une plus grande diversité, à l’instar du pyroséquençage (Goldberg et al., 2006; Tedersoo et al., 2010) ou du séquençage par synthèse sur plateforme Illumina (Taylor et al., 2016).

5.5. Analyse des données

5.5.1. Traitement des séquences d’ADN et identification

Les séquences provenant du séquençage ont été corrigées, assemblées et éditées à l’aide de plusieurs logiciels dont Sequence Scanner V1 (http://www.bioinfo.ulaval.ca/seq/fr/outilsseq) et BioEdit v. 7.0.9.9 (Hall, 1999). Elles ont été comparées aux séquences existantes dans GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) et interrogées à l’aide de l’algorithme nucléotide BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1990).

Des alignements multiples ont été effectués à l’aide du programme ClustalW (Thompson et al., 1994) avant la construction des arbres phylogénétiques.

5.5.2. Étude de la diversité spécifique

L’étude de diversité consistait à regrouper les espèces entre elles et à les dénombrer. Dans notre étude, nous avons évalué la richesse, la diversité et l’abondance en espèces fongique par essence et par site. La richesse en espèces a été évaluée en utilisant les courbes cumulatives, d’une part, et en calculant l’indice de Chao1, qui est un indice non paramétrique, estimateur de la richesse (Gotelli & Chao, 2013) d’autre part. Les indices de diversité utilisés étaient ceux de Shannon — Weaver et de Simpson. L’abondance en espèces fongique a été comparée entre sites et essences hôtes en utilisant les indices estimés de Bray-Curtis et de Morisita-Horn.

5.5.3. Analyses taxonomiques moléculaires

Les analyses de taxonomie moléculaire ont consisté à regrouper les séquences les plus proches par Unités Taxonomiques Opérationnelles (OTU). Une OTU n’est autre qu’un regroupement des séquences d’ADN du même gène pour une espèce à un niveau taxonomique précis ou niveau de similarité.

Dans notre étude, ce regroupement en OTUs a été réalisé à l’aide de Mothur (Schloss et al., 2009) en se basant sur la délimitation des espèces au seuil de signification de 95 % pour la région ITS de l’ADNr (Arnold & Lutzoni, 2007). 47

5.5.4. Phylogénie moléculaire

Les arbres phylogénétiques ont été construits dans le but d’observer la diversité et l’agencement des séquences. La méthode de construction utilisée dans cette étude était celle du Neighbor – joining. Cette dernière est une méthode basée sur les distances phylogénétiques qui regroupe les séquences d’une OTU en minimisant la longueur des branches à chaque regroupement (Saitou & Nei, 1987). Les analyses phylogénétiques ont été effectuées à l’aide du logiciel MEGA version 5.2 et MEGA X (Tamura et al., 2011; Kumar et al., 2018). La fiabilité des arbres phylogénétiques a été déterminée en déterminant les valeurs de Bootstrap par rééchantillonnage.

5.5.5. Analyses statistiques

Pour les données moléculaires, les tests d’Analyses de Variance Moléculaires (AMOVA) ont été effectués pour comparer les moyennes de diversité des populations des champignons (Anderson, 2001; Excoffier et al., 1992). Ces dernières ont été calculées au seuil de signification 0.05, en utilisa