UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA

FACULTAD DE VETERINARIA

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA

TESIS DOCTORAL

Estudio de microorganismos de la Clase

en organismos marinos.

Orestes Manuel Vega-Orellana

LAS PALMAS DE GRAN CANARIA

2014

I. APITULO I

I.

Índices

II. ÍNDICE GENERAL

I . ÍNDICE GENERAL ...... I II . ÍNDICE DE TABLAS ...... VII III. ÍNDICE DE FIGURAS ...... X IV. AGRADECIMIENTOS ...... XV V. RESUMEN ...... XVII VI. ABSTRACT...... XIX VII.ABREVIATURAS ...... XXI

I. CAPÍTULO I: Introducción, Objetivos y Revisión Bibliográfica ...... 1

I.1 INTRODUCCIÓN...... 1 I.2 OBJETIVOS ...... 4 I.2.1 OBJETIVO GENERAL ...... 4 I.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...... 4

I.3 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...... 5 I.3.1 MOLLICUTES ...... 5 I.3.1.1 Características generales ...... 5 I.3.1.2 Taxonomía y filogenia ...... 7 I.3.1.3 Características ultraestructurales ...... 13 I.3.1.3.1 Estructura celular y cápsula ...... 14 I.3.1.3.2 Membrana celular y estructura antigénica ...... 15 I.3.2 TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MOLLICUTES ...... 16 I.3.2.1 Procedimientos preliminares (Tully y Whitcomb, 1995; Ramírez, 1999) ...... 16 I.3.2.1.1 Cultivo puro ...... 16 I.3.2.1.2 Ausencia de pared celular ...... 17 I.3.2.1.3 Detección de formas L bacterianas ...... 17 I.3.2.1.4 Morfología de las colonias ...... 17 I.3.2.1.5 Requerimientos de esteroles ...... 18 I.3.2.2 Métodos bioquímicos y enzimáticos ...... 18 I.3.2.2.1 Hidrólisis de la urea ...... 19 I.3.2.2.2 Hidrólisis de azúcares ...... 19 I.3.2.2.3 Hidrólisis de la arginina ...... 22 I.3.2.2.4 Actividad de la fosfatasa ...... 23

i

Índices

I.3.2.2.5 Reducción del Tetrazolium ...... 23 I.3.2.2.6 Formación de películas y cristales ...... 24 I.3.2.3 Perfiles de proteínas totales ...... 25 I.3.2.4 Métodos serológicos ...... 25 I.3.2.4.1 Inhibición de crecimiento ...... 25 I.3.2.4.2 Inhibición del metabolismo ...... 25 I.3.2.5 Inmunofluorescencia ...... 26 I.3.2.6 Inmunohistoquímica ...... 27 I.3.2.7 Métodos de biología molecular ...... 27 I.3.2.7.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa – PCR ...... 27 I.3.2.7.2 Secuenciación de ADN ...... 28 I.3.2.7.3 PCR a tiempo real ...... 30 I.3.2.7.4 DGGE...... 30 I.3.2.7.5 Microarrays ...... 31 I.3.2.7.6 Tipificación ...... 32 I.3.3 HÁBITATS Y ENFERMEDADES...... 36 I.3.3.1 Patogenicidad y factores de virulencia ...... 39 I.3.3.2 Enfermedades más importantes producidas por mollicutes ...... 40 I.3.4 MOLLICUTES Y ORGANISMOS ACUÁTICOS ...... 45 I.3.4.1 Invertebrados ...... 45 I.3.4.2 Peces ...... 50 I.3.4.2.1 mobile ...... 53 I.3.4.3 Mamíferos marinos ...... 58

II. CAPITULO II: Estudio metodológico – Evaluación de la sensibilidad y especificidad de seis pares de cebadores utilizados en la detección e identificación de microorganismos de la Clase Mollicutes ...... 65

II.1 ANTECEDENTES ...... 65

II.2 MATERIALES Y MÉTODOS ...... 70 II.2.1 ORGANISMOS Y CONDICIONES DE CULTIVO ...... 70 II.2.2 EXTRACCIÓN Y MEDICIÓN DE ADN ...... 70 II.2.3 CONFIRMACIÓN DE LA IDENTIDAD DEL ADN ...... 74 II.2.4 COMPARACIÓN DE SEIS PARES DE CEBADORES (PCR’S)...... 75 II.2.5 PRUEBAS DE ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE LAS PCR’S ...... 75 ii

Índices

II.2.5.1 Pruebas de especificidad...... 75 II.2.5.2 Pruebas de sensibilidad ...... 76 II.2.6 PCR A TIEMPO REAL ...... 77 II.3 RESULTADOS ...... 78 II.3.1 ORGANISMOS Y ADN ...... 78 II.3.2 ESPECIFICIDAD...... 78 II.3.2.1 Mollicutes ...... 78 II.3.2.2 no-mollicutes ...... 79 II.3.3 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ...... 81 II.3.4 CÁLCULO DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD ...... 82 II.4 DISCUSIÓN ...... 84 II.4.1 CEBADORES .. ………………………………………………………………………………...85 II.4.2 ES