UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA
FACULTAD DE VETERINARIA
INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA
TESIS DOCTORAL
Estudio de microorganismos de la Clase Mollicutes
en organismos marinos.
Orestes Manuel Vega-Orellana
LAS PALMAS DE GRAN CANARIA
2014
I. APITULO I
I.
Índices
II. ÍNDICE GENERAL
I . ÍNDICE GENERAL ...... I II . ÍNDICE DE TABLAS ...... VII III. ÍNDICE DE FIGURAS ...... X IV. AGRADECIMIENTOS ...... XV V. RESUMEN ...... XVII VI. ABSTRACT...... XIX VII.ABREVIATURAS ...... XXI
I. CAPÍTULO I: Introducción, Objetivos y Revisión Bibliográfica ...... 1
I.1 INTRODUCCIÓN...... 1 I.2 OBJETIVOS ...... 4 I.2.1 OBJETIVO GENERAL ...... 4 I.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...... 4
I.3 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...... 5 I.3.1 MOLLICUTES ...... 5 I.3.1.1 Características generales ...... 5 I.3.1.2 Taxonomía y filogenia ...... 7 I.3.1.3 Características ultraestructurales ...... 13 I.3.1.3.1 Estructura celular y cápsula ...... 14 I.3.1.3.2 Membrana celular y estructura antigénica ...... 15 I.3.2 TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MOLLICUTES ...... 16 I.3.2.1 Procedimientos preliminares (Tully y Whitcomb, 1995; Ramírez, 1999) ...... 16 I.3.2.1.1 Cultivo puro ...... 16 I.3.2.1.2 Ausencia de pared celular ...... 17 I.3.2.1.3 Detección de formas L bacterianas ...... 17 I.3.2.1.4 Morfología de las colonias ...... 17 I.3.2.1.5 Requerimientos de esteroles ...... 18 I.3.2.2 Métodos bioquímicos y enzimáticos ...... 18 I.3.2.2.1 Hidrólisis de la urea ...... 19 I.3.2.2.2 Hidrólisis de azúcares ...... 19 I.3.2.2.3 Hidrólisis de la arginina ...... 22 I.3.2.2.4 Actividad de la fosfatasa ...... 23
i
Índices
I.3.2.2.5 Reducción del Tetrazolium ...... 23 I.3.2.2.6 Formación de películas y cristales ...... 24 I.3.2.3 Perfiles de proteínas totales ...... 25 I.3.2.4 Métodos serológicos ...... 25 I.3.2.4.1 Inhibición de crecimiento ...... 25 I.3.2.4.2 Inhibición del metabolismo ...... 25 I.3.2.5 Inmunofluorescencia ...... 26 I.3.2.6 Inmunohistoquímica ...... 27 I.3.2.7 Métodos de biología molecular ...... 27 I.3.2.7.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa – PCR ...... 27 I.3.2.7.2 Secuenciación de ADN ...... 28 I.3.2.7.3 PCR a tiempo real ...... 30 I.3.2.7.4 DGGE...... 30 I.3.2.7.5 Microarrays ...... 31 I.3.2.7.6 Tipificación ...... 32 I.3.3 HÁBITATS Y ENFERMEDADES...... 36 I.3.3.1 Patogenicidad y factores de virulencia ...... 39 I.3.3.2 Enfermedades más importantes producidas por mollicutes ...... 40 I.3.4 MOLLICUTES Y ORGANISMOS ACUÁTICOS ...... 45 I.3.4.1 Invertebrados ...... 45 I.3.4.2 Peces ...... 50 I.3.4.2.1 Mycoplasma mobile ...... 53 I.3.4.3 Mamíferos marinos ...... 58
II. CAPITULO II: Estudio metodológico – Evaluación de la sensibilidad y especificidad de seis pares de cebadores utilizados en la detección e identificación de microorganismos de la Clase Mollicutes ...... 65
II.1 ANTECEDENTES ...... 65
II.2 MATERIALES Y MÉTODOS ...... 70 II.2.1 ORGANISMOS Y CONDICIONES DE CULTIVO ...... 70 II.2.2 EXTRACCIÓN Y MEDICIÓN DE ADN ...... 70 II.2.3 CONFIRMACIÓN DE LA IDENTIDAD DEL ADN ...... 74 II.2.4 COMPARACIÓN DE SEIS PARES DE CEBADORES (PCR’S)...... 75 II.2.5 PRUEBAS DE ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE LAS PCR’S ...... 75 ii
Índices
II.2.5.1 Pruebas de especificidad...... 75 II.2.5.2 Pruebas de sensibilidad ...... 76 II.2.6 PCR A TIEMPO REAL ...... 77 II.3 RESULTADOS ...... 78 II.3.1 ORGANISMOS Y ADN ...... 78 II.3.2 ESPECIFICIDAD...... 78 II.3.2.1 Mollicutes ...... 78 II.3.2.2 Bacterias no-mollicutes ...... 79 II.3.3 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ...... 81 II.3.4 CÁLCULO DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD ...... 82 II.4 DISCUSIÓN ...... 84 II.4.1 CEBADORES .. ………………………………………………………………………………...85 II.4.2 ES