Biologie, Ecologie Et Conservation Animales ETUDE ECO-BIOLOGIQUES DES UROPLATE

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ANIMALE

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ANIMALE

Latimeria chalumnae

MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU Diplôme d’Etudes Approfondies (D.E.A.)

Formation Doctorale : Sciences de la vie Option : Biologie, Ecologie et Conservation Animales

ETUDE ECO-BIOLOGIQUES DES UROPLATES

ET IMPLICATION DES ANALYSES PHYLOGENETIQUES

DANS LEUR SYSTEMATIQUE

Présenté par : Melle RATSOAVINA Mihaja Fanomezana

Devant le JURY composé de :

Président : Madame RAMILIJAONA RAVOAHANGIMALALA Olga, Professeur Titulaire Rapporteurs : Madame RAZAFIMAHATRATRA Emilienne, Maître de Conférences Examinateurs: Madame RAZAFINDRAIBE Hanta, Maître de conférences Monsieur EDWARD LOUIS, Doctor of Veterinary Medicine, PhD

Soutenu publiquement le 27 Février 2009 ______Remerciements

REMERCIEMENTS

Cette étude a été réalisée dans le cadre de l’accord de collaboration entre le Département de Biologie Animale, Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo et Henry Doorly Zoo Omaha. Nebraska. USA, dans le cadre du projet Madagascar Biogeography Project (MBP).

Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à:

- Madame RAMILIJAONA RAVOAHANGIMALALA Olga, Professeur Titulaire, Responsable de la formation doctorale, d'avoir accepté de présider ce mémoire et consacré son précieux temps pour la commission de lecture.

- Madame RAZAFIMAHATRATRA Emilienne, Maître de conférences, encadreur et rapporteur qui a accepté de diriger et de corriger ce mémoire. Je la remercie pour ses nombreux conseils.

- Madame RAZAFINDRAIBE Hanta, Maître de conférences, qui a accepté de faire partie de la commission de lecture, de juger ce travail et de figurer parmi les membres du jury.

- Monsieur Edward LOUIS, Doctor of Veterinary Medecine, PhD d’être parmi les membres du jury et qui m’a permis d’avoir intégrer l’équipe de HDZ et de m’avoir inculqué les a priori des travaux de recherche. « Thank you for all the opportunities ».

Je remercie également : - Dr Achille RASELIMANANA, membre de la commission de lecture ; - Dr Rick BRENNEMAN Vice- Principal Investigateur de MBP ; - Tous les enseignants et les personnels techniques et administratifs du Département de Biologie Animale et de la Faculté des Sciences ;

______Remerciements - Tous les techniciens de laboratoire au Center for Conservation and Research (CCR) ; - Le Henry Doorly Zoo, tous les guides, Hubbard Family Foundation, Dr Lee Simmons et Dr Doug Amstrong; - L’équipe Pinus et tous mes amis qui ont investi leur temps et leur efforts pour m’aider à réaliser la présente étude.

Mes chaleureux remerciements s’adressent également à mes sœurs, mes frères, et toute la famille pour leur soutien moral et leurs encouragements permanents.

Pour terminer, je remercie très vivement toutes les personnes qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation de ce mémoire.

______Résumé Résumé Ce travail porte sur une étude éco-biologique et phylogénétique des uroplates dans les forêts humides tropicales de l’Est et du Sud-Est de Madagascar. Les espèces Uroplatus fimbriatus, U. lineatus, U. phantasticus, U. sikorae sikorae et U. sikorae sameiti ont été inventoriées dans la RNI de Betampona (Septembre 2005) et le PN de Ranomafana (Janvier et Mars 2004). 75 individus ont été capturés dans les deux sites. La taille, le poids et le sexe de chaque animal ont été notés. Toutes les mesures concernant la taille montrent des valeurs supérieures à celles trouvées par les chercheurs précédents sauf pour U. s. sameiti qui est de 104,7 mm. Le type de support, la distribution verticale et la période d’activité sont aussi bien collectés pour chaque espèce. La plupart des individus trouvés préfèrent la branche comme perchoir. Mais U. phantasticus est rencontrée aussi bien que sur des feuilles, que des fines branches et des lianes en raison de sa petite taille. Les espèces de grande taille sont souvent trouvées sur les troncs d’arbre et les branches. A Betampona, les individus sont trouvés de 0,5 m à 6 m du sol. A Ranomafana, les animaux évoluent à partir de 0,5 m jusqu’à 8 m du sol. Une large répartition verticale est notée chez U. s. sikorae de 0,5 à 8 m. Une extraction de l’ADN total à partir du tissu caudal, une amplification par PCR de l’ADN cible et son séquençage ont été effectués pour un total de 93 individus d’uroplates et 2 Phelsuma comme groupe externe. 893 paires de bases de l’ADN mitochondrial ont été alignées pour les gènes de la sous-unité 4 de la deshydrogénase-NADH (ND4), l’ARNtHis, l’ARNtSer et l’ARNtLeu . Le logiciel PAUP version 4.0b5. est utilisé pour obtenir des phylogrammes par les méthodes Neighbor-joining et Maximum parcimonie. Le diagramme en réseau a été construit à l’aide du programme Network. La fiabilité de chaque analyse est donnée par un test de Bootstrap avec 1000 répétitions. La monophylie au sein du genre Uroplatus est confirmée par l’analyse. Les individus collectés dans chaque site forment chacun un clade et même étant géographiquement proches, la distance génétique entre les espèces est grande et implique la notation en type. Les espèces déjà décrites sont confirmées par l’analyse. Mais, elle met aussi en cause le statut des taxa puisque la distance génétique entre deux espèces différentes est inférieure à celle entre deux types ou sous-espèces. Même si la description de nouvelle forme dépasse le cadre du présent travail, Il encourage de faire des recherches plus étendues pour avancer dans la connaissance de l’histoire naturelle ainsi que la phylogénie et la conservation du groupe. Mots clés : Uroplatus, Ecologie, ADN mitochondrial, PCR, Séquençage, Phylogénie, Ranomafana, Betampona, Madagascar. iii

______Abstract Abstract This work reports the ecobiology and the phylogenetic study of the genus Uroplatus in East and South-East Rainforest of Madagascar. Uroplatus fimbriatus, U. lineatus, U. phantasticus, U. sikorae sikorae and U. sikorae sameiti are assessed in Natural Reserve Betampona (September 2005) and Ranomafana National Park (January and March 2004). 75 individuals were captured in the two sites. Body length, Weight and sex identification are accomplished for each specimen. Body length recorded go over data from previous study except for U. s. sameiti which is 104.5 mm. Support type, vertical distribution and time of activity are defined; branches are the most used by Uroplatus. But U. phantasticus is observed on leaves, little branches and lianas for its small size. Larger species such as U. fimbriatus are found on the tree trunk and larger branches. In Betampona, individuals are found between 0.5 to 6 m above ground. In Ranomafana, leaftail geckos are seen up to 8 m. U. s. sikorae is found to have the largest vertical distribution; 0.5 to 8 m. A molecular genetics study was conducted for the Uroplatus sampled from the study sites with tissue from the tail used as genetic material. DNA extraction, PCR amplification and sequence data were generated for 93 leaf tailed gecko individuals and 2 specimens of Day geckos (genus Phelsuma) were utilized as outgroup taxa. 893 base pairs from the mitochondrial DNA are aligned, studied fragment are: ND4, tRNA His, tRNA Ser and tRNA Leu. Neighbor-joining and Maximum parsimony trees are obtained by PAUP version 4.0b5 program. Star tree are given by Network program to illustrate the speciation among the population. Bootstrap, probability statistic, was conducted to show the analysis liability with 1000 replications. The monophyly of the genus Uroplatus was confirmed by the present study. Each sample from a specific site is gathered in one clade; even geographically close, huge genetic divergence is found out, thus the nomination as Type. The following study allows confirming described species; also it puts in doubt the state of each species, because genetic distance between two different species is less than found in two subspecies or types. Even describing a new species is beyond this survey, it is recommended to conduct wide and further researches to obtain knowledge on natural history and progress on phylogeny to set better conservation strategy for Uroplatus group.

Keywords: Uroplatus, Ecology, mitochondrial DNA, PCR, Sequencing, Phylogeny, Ranomafana, Betampona, Madagascar.

______Sommaire SOMMAIRE INTRODUCTION ...... 1 CHAPITRE I : PRESENTATION DU GENRE UROPLATUS ...... 3 I.1- Classification du genre Uroplatus ...... 3 I.2- Historique du genre Uroplatus ...... 4 I.3- Morphologie ...... 4 I.4- Biologie ...... 6 I.5- Ethologie ...... 6 I.6- Distribution géographique ...... 7 I.7- Menaces ...... 8 CHAPITRE II : DESCRIPTION DES SITES D’ETUDE ...... 9 II.1- PARC NATIONAL DE RANOMAFANA ...... 9 II.1.1- Caractères physiques ...... 9 II.1.2- Caractères biologiques ...... 11 II.2- RESERVE NATURELLE INTEGRALE DE BETAMPONA ...... 12 II.2.1- Caractères physiques ...... 12 II.2.2- Caractères biologiques ...... 15 CHAPITRE III : MATERIELS ET METHODES ...... 16 III.1- LES ETUDES SUR TERRAIN ...... 16 III.1.1- Périodes d’étude ...... 16 III.1.2- Observation et capture ...... 16 III.1.3- Paramètre écologique ...... 16 III.1.4- Mensuration ...... 17 III.1.5- Prélèvement du matériel pour l’analyse génétique ...... 17 III.2- ETUDES AU LABORATOIRE ...... 18 III.2.1- Extraction de l’ADN total ...... 18 III.2.2- Utilisation de l’ADN ...... 20 III.3- ANALYSE DES DONNEES ...... 32 III.3.1- Statistiques descriptives ...... 32 III.3.2- Données morphométriques ...... 32 III.3.3- Données écologiques ...... 32 III.3.4- Analyses génétiques ...... 33 IV- RESULTATS et INTERPRETATIONS ...... 40 IV.1- CARACTERISTIQUES DES POPULATIONS ...... 40 IV.1.1- Répartition des espèces et leur abondance par site ...... 40 IV.1.2- Sex-ratio ...... 41 IV.1.3- Structure d’âge ...... 43 IV.2- COMPORTEMENT ET UTILISATION DE L’HABITAT ...... 44 IV.3- ETUDE MORPHOMETRIQUE ...... 51 IV.4- ETUDES PHYLOGENETIQUES DES UROPLATES ...... 53 V- DISCUSSION ...... 67 V.1- Biologie, morphométrie et écologie ...... 67 Uroplatus fimbriatus ...... 67 Le complexe Uroplatus sikorae ...... 67 Uroplatus lineatus ...... 68 Uroplatus phantasticus ...... 68 V.2- Apport des analyses phylogénétiques dans la systématique ...... 69 U. sikorae sikorae ...... 70

______Sommaire U. sikorae sameiti ...... 70 Uroplatus fimbriatus ...... 70 V.3- Analyse phylogénétique ...... 71 CONCLUSION ...... 72 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 75 ANNEXES ...... 80

______Liste des figures Liste des figures

Figure 1: Photo d’une femelle de U. phantasticus (à gauche) et d’un mâle U. s. sameiti (à droite) dans la RNI de Betampona ...... 5 Figure 2: Photo de U. s. sameiti montrant la frange dermique (à gauche) et la structure de la terminaison des doigts (à droite) ...... 5 Figure 3: Photo de U. lineatus (à gauche) et U. phantasticus (à droite) imittant la couleur du support ...... 6 Figure 4: Localisation du Parc National Ranomafana ...... 10 Figure 5: Courbe ombrothermique de Ranomafana pour l’année 1999- 2004 ...... 11 Figure 6: Localisation de la RNI Betampona...... 13 Figure 7: Délimitation de la RNI Betampona et les pistes existantes ...... 14 Figure 8: Courbe ombrothermique de la RNI Betampona entre 1991 et 2005 ...... 15 Figure 9: Schéma montrant les mesures prises sur les uroplates ...... 17 Figure 10: Schéma de l’ADN mitochondrial chez les Mammifères et le genre Xenopus ...... 21 Figure 11: Schématisation de la technique d’amplification par PCR ...... 23 Figure 12: Photo du thermocycleur (MBS Satellite 0.2G), machine pour l’amplification automatique d’un fragment d’ADN ...... 24 Figure 13: Photo montrant le montage pour l’électrophorèse sur gel d’agarose ...... 25 Figure 14: Migration de l’ADN sur gel d’agarose visible par imprégnation de bromure d’éthidium et par bombardement de rayons ultraviolets ...... 26 Figure 15: Schéma du cycle de séquençage avec les principales étapes et l’insertion du didésoxyribonucléotide ...... 29 Figure 16: Schéma montrant le mécanisme du séquenceur automatique ABIprism 3100 Genetic Analyzer...... 31 Figure 17: Les phénomènes de transitions et de transversions au niveau des bases ...... 35 Figure 18: Répartition des individus par espèce et par site d’étude ...... 40 Figure 19: Proportion des mâles et femelles à Ranomafana ...... 41 Figure 20: Proportion des mâles et femelles à Betampona ...... 42 Figure 21: Structure d’âge de l’échantillon de Ranomafana ...... 43 Figure 22: Répartition des individus collectés selon l’âge à Betampona ...... 44 Figure 23: Distribution verticale des uroplates collectés à Ranomafana ...... 45 Figure 24: Distribution verticale chez les uroplates collectés à Betampona ...... 46 Figure 25: Comparaison des deux sites pour la distribution verticale de U. phantasticus ...... 46 Figure 26: Comparaison sur la distribution verticale du complexe sikorae dans les deux sites ...... 47 Figure 27: Types de support utilisés par les individus de Ranomafana ...... 48 Figure 28: Types de support utilisés par les individus de Betampona ...... 48 Figure 29: Heure d’activités de U. phantasticus et U. sikorae sikorae à Ranomafana ...... 49 Figure 30: Heure d’activités de U. fimbriatus à Betampona ...... 50 Figure 31: Phylogramme obtenu par Neighbor-joining de la région ND4, ARNt Ser, ARNt His et ARNtLeu de l’ADN mitochondrial des uroplates...... 58 Figure 32: L’arbre le plus parcimonieux du fragment ND4- ARNtLeu de l’ADN mitochondrial du genre Uroplatus...... 62 Figure 33: Diagramme en réseau des haplotypes de Uroplatus par Network Version 4.11. ... 66

______Liste des tableaux Liste des tableaux

Tableau 1: Localisation des holotypes d’uroplates...... 4 Tableau 2: Signification des mensurations prises sur chaque spécimen capturé ...... 17 Tableau 3: Les amorces utilisées pour l’amplification de l’ADN matrice ...... 22 Tableau 4: Durée et température spécifique de chaque étape de la méthode PCR ...... 22 Tableau 5: Les composants de chaque tube avant son emplacement dans le thermocycleur ... 24 Tableau 6: Fluorescence et couleur de chaque Didésoxyribonucleoside-triphosphate ou ddNTP ...... 30 Tableau 7 : Un exemple de site informatif...... 36 Tableau 8: Sex-ratio de l’échantillon de Ranomafana...... 41 Tableau 9: Sex-ratio de l’échantillon de Betampona...... 42 Tableau 10 : Moyenne, minimum et maximum de la longueur tête-tronc chez les uroplates de Ranomafana ...... 51 Tableau 11: Poids moyen (en g) des individus de Ranomafana à queue originale...... 51 Tableau 12: Moyenne, minimum et maximum de la longueur tête-tronc chez les uroplates de Betampona ...... 52 Tableau 13: Poids moyen (en g) des quelques individus de la RNI Betampona ...... 52

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______Liste des annexes Liste des annexes

Annexe 1: Liste des substances chimiques utilisées lors des réalisations expérimentales ...... 80 Annexe 2: Distribution des individus par espèce par site ...... 80 Annexe 3: Répartition des mâles et femelles pour chaque site d’étude ...... 80 Annexe 4: Structure d’âge de l’échantillon à Ranomafana ...... 81 Annexe 5 : Structure d’âge de l’échantillon à Betampona ...... 81 Annexe 6 : Distribution verticale des uroplates de Ranomafana ...... 81 Annexe 7 : Distribution verticale des uroplates de Betampona ...... 81 Annexe 8 : Type de support des individus capturés à Ranomafana ...... 81 Annexe 9 : Type de support des individus capturés dans la RNI de Betampona ...... 82 Annexe 10: Nombre d’individus à queue intacte à Ranomafana ...... 82 Annexe 11: Nombre d’individus à queue intacte à Betampona ...... 82 Annexe 12 : Période d’activité des uroplates à Ranomafana ...... 82 Annexe 13 : Période d’activité des uroplates à Betampona ...... 83 Annexe 14: Distance génétique entre les populations de U. sikorae par le diagramme en réseau...... 83 Annexe 15: Distance génétique entre les populations de U. fimbriatus par le diagramme en réseau...... 83 Annexe 16 : Répartition des espèces séquencées venant d’autres localités...... 84 Annexe 17: Liste des haplotypes par espèce...... 85 Annexe 18: Liste des espèces et les mesures prises sur chaque individu collecté à Betampona...... 87 Annexe 19: Liste des espèces et les mesures prises sur chaque individu collecté à Ranomafana...... 88 Annexe 20: Répartition géographique et abondance des espèces considérées dans l’analyse phylogénétique...... 89 Annexe 21: Différences génétiques entre les populations du / Ü données par le diagramme en réseau Network...... 90 Annexe 22: Différences génétiques entre les populations de U. fimbriatus obtenues par le diagramme en réseau donné par le programme Network ...... 90 Annexe 23: Différences génétiques entre les populations de U. phantasticus données par le diagramme en réseau issu de Network...... 90 Annexe 24 : Type de séquence provenant du séquenceur (fichier.*seq)...... 90 Annexe 25 : Un échantillon d’électrophorégramme obtenu par le séquenceur ABI 3100...... 91 Annexe 26 : Classification CITES Annexe II...... 91 Annexe 27 : Statut National des uroplates...... 91 Annexe 28 : Tableau montrant l’exportation de spécimens de geckos à queue plate entre 2000 et 2006...... 92

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______Liste des abréviations Liste des Abréviations

ADN : Acide Désoxy-Ribonucléique ANGAP: Agence Nationale pour la Gestion des Aires protégées de Madagascar ARN : Acide Ribo-Nucléique CITES : Convention sur le commerce international des espèces végétales et animales en danger MP : Maximum Parcimonie NJ : Neighborg-joining PCR: Polymerase Chain Reaction PN : Parc National RNI : Réserve Naturelle Intégrale PGDRN : Plan de gestion et Du Réseau National des aires protégées

______Introduction INTRODUCTION

Situé à l’Est du continent africain, Madagascar figure parmi les plus grandes îles du monde ; sa faune et flore ont expérimenté une évolution unique (Myers, 2000). Les systèmes topographiques et géologiques complexes de l’île ont abouti à l’un des écosystèmes les plus riches en diversité biologique. Comptant environ 75 % d’espèces endémiques, la biodiversité de Madagascar attire les scientifiques des disciplines variées. Pour le groupe des reptiles, au moins 95 % des 300 espèces déjà décrites sont endémiques (Nussbaum et Raxworthy, 1994) et nombreuses sont les familles monotypiques, ou ne comportant exclusivement que des genres endémiques malgaches, comme le genre Uroplatus spp (Duméril, 1805). Ces espèces sont nocturnes, arboricoles, forestières et colonisent soit les forêts tropicales humides soit celles décidues sèches de Madagascar. Les uroplates forment deux groupes selon leur taille : grande et petite (Glaw et Vences, 1994). La tête est triangulaire et supporte deux énormes yeux. La queue plate, en forme de feuille, est l’un des caractères typiques des uroplates. Par ailleurs ils utilisent le mimétisme pour tromper les prédateurs durant les instants de repos à la lumière du jour. La longévité est environ 4 à 7 ans (Svatek et Van Duin, 2001). La reproduction est généralement annuelle et la ponte comporte 2 à 3 œufs. Les uroplates ont déjà fait l’objet de quelques études comme la distribution altitudinale et les études éco-morphologiques (Mahaviasy, 2004). Une révision systématique initialement établie en 1989 par Bauer et Russell a reconnu les sept espèces suivantes : Uroplatus fimbriatus (Schneider, 1797), U. henkeli (Boehme et Ibisch, 1990), U. sikorae Boettger, 1913, U. lineatus (Duméril et Bibron, 1836), U. ebenaui Boettger, 1878, U. alluaudi Mocquard, 1894 et U. guentheri Mocquard, 1908. Plus tard, de nouvelles espèces ont été ajoutées à la liste: U. phantasticus Bouelenger, 1888; U. malahelo (Nussbaum et Raxworthy, 1994); U. malama, (Nussbaum et Raxworthy, 1995) et U. pietschmanni (Böhle et Shönecker, 2003). D’autres travaux sur le terrain ont permis de scinder l’espèce U. sikorae en deux sous espèces : U. sikorae sikorae (Boettger, 1913) et U. sikorae sameiti (Böhme et Ibisch, 1990) et de décrire très récemment une nouvelle espèce Uroplatus giganteus (Glaw, Kosuch, Henkel, Sound et Böhme, 2006). L’effort entrepris par les chercheurs a permis d’avancer sur l’étude du genre d’où la publication sur la phylogénie des uroplates par Greenbaum et al. ( 2007). La destruction du milieu naturel est une menace perpétuelle qui risque d’entraîner la fragmentation des populations jusqu'à l’extinction des uroplates, aggravée par l’existence d’exportations illicites. Entre 2000 et 2006, 30 000 spécimens d’uroplates ont été exportés à des fins commerciales, chiffre donné par la CITES Madagascar, U. phantasticus tient le 1

______Introduction premier rang avec un taux d’exportation de 24,82 %. L’augmentation du nombre d’exportation et l’insuffisance de données concernant l’aire de distribution de chaque espèce ont conduit à une proposition d’amendement en Annexe II de ce groupe en 2004. L’intégration des uroplates dans la liste CITES permet de mettre en place un système de contrôle et de gestion de la commercialisation de ces animaux. Malgré les nombreuses recherches déjà effectuées sur la taxonomie des uroplates, elle reste encore ambiguë. Aussi, le polymorphisme est relativement important au niveau de la morphologie et de la taille de ce taxon. Par ailleurs, des variations géographiques sont remarquées (Svatek et Van Duin, 2001). L’un des domaines à explorer de façon plus poussée, pour contribuer à apporter plus d’informations serait d’impliquer la génétique moléculaire. La présente étude a comme but de résoudre les problèmes systématiques par le biais de la biologie moléculaire et d’apporter des informations sur les populations en vue de proposer des recommandations sur la conservation des uroplates.

Pour atteindre ce but, les principales étapes sont les suivantes: • Donner des informations bio-écologiques et morphométriques pour vérifier et confirmer les divergences génétiques ; • Générer des données moléculaires à partir des échantillons de tissus pour toutes les espèces d’uroplates particulièrement celles de l’Est ; • Déterminer les vraies espèces en se basant sur les distances génétiques obtenues par l’analyse de l’ADN mitochondrial ; • Déterminer les relations phylogénétiques et la raison des variabilités génétiques entre les espèces d’uroplates pour une révision systématique.

Les cinq grands chapitres suivants vont être traités dans ce mémoire. Dans le premier chapitre, la présentation du genre Uroplatus est donnée, suivie de la description des deux sites d’étude : PN Ranomafana et RNI Betampona dans le deuxième chapitre. La méthodologie, comportant les méthodes de collecte, les travaux de laboratoire et les analyses de données, vient en troisième partie. Quatrièmement, les résultats écologiques et génétiques vont être présentés ainsi que leurs interprétations. En cinquième partie, les informations obtenues lors de cette étude vont être discutées et comparées avec celles des autres auteurs connus dans le domaine ainsi que des recommandations concernant la conservation des uroplates.

______Présentation du genre Uroplatus CHAPITRE I : PRESENTATION DU GENRE UROPLATUS

I.1- Classification du genre Uroplatus

La position systématique du genre ci-dessous a été donnée par Myers et ses collaborateurs en 2008 dans La Diversité Animale (Myers et al. 2007) Règne ANIMALIA Phylum CHORDATA Sous-phylum VERTEBRATA Classe REPTILIA Ordre SQUAMATA Sous-ordre SCLEROGLOSSA Famille GEKKONIDAE Genre Uroplatus sp (Duméril, 1805)

Le genre Uroplatus compte 12 espèces avec 2 sous-espèces, le nom, l’auteur et l’année de découverte sont affichés ci-dessous.

Uroplatus fimbriatus Schneider, 1797 Uroplatus lineatus Duméril et Bibron, 1836 Uroplatus ebenaui Boettger, 1878 Uroplatus phantasticus Boulenger, 1888 Uroplatus alluaudi Mocquard, 1894 Uroplatus guentheri Mocquard, 1908 Uroplatus sikorae Boettger, 1913 Uroplatus sameiti Boehme et Ibisch, 1990 Uroplatus henkeli (Boehme et Ibisch), 1990 Uroplatus malahelo (Nussbaum et Raxworthy), 1994 Uroplatus malama (Nussbaum et Raxworthy), 1995 Uroplatus pietschmanni Böhle et Shönecker, 2003 Uroplatus giganteus Glaw, Kosuch, Henkel, Sound et Böhme, 2006 Noms vernaculaires : - Malgache: Tanafisaka, Tahafisaka, Tandrekitra. - Français : Uroplate, gecko à queue plate. - Anglais: Madagascar leaf-tailed gecko.

______Présentation du genre Uroplatus I.2- Historique du genre Uroplatus

Le genre Uroplatus a été découvert pour la première fois en 1658, par le pionnier Français Flacourt. Celui-ci a rapporté l’existence d’un animal étrange appelé par la communauté locale « Famonkatratra » (ce qui veut dire celui qui saute sur la poitrine des hommes). Ce n’est qu’en 1805 que le nom du genre a été attribué par Duméril. Les uroplates sont endémiques de Madagascar malgré les caractères en commun avec les autres geckos africains. Le tableau 1 ci-dessous, présente les holotypes d’uroplates et leur terre typique d’après leur première description.

Tableau 1: Localisation des holotypes d’uroplates

Espèce Auteur, Année Terre typique 1 Uroplatus alluaudi Mocquard, 1894 Montagne d'Ambre 2 Uroplatus ebenaui Boettger, 1878 Nosy be, Lokobe 3 Uroplatus fimbriatus Schneider, 1797 Nosy Mangabe 4 Uroplatus guentheri Mocquard, 1908 Ankarafantsika 5 Uroplatus henkeli Boehme et Ibisch, 1990 Lokobe Cote Est entre Toamasina et Maroantsetra 6 Uroplatus lineatus Duméril et Bibron, 1836 et Sainte Marie Nussbaum et Raxworthy, Montagne d’Ambatorongorongo, Fort 7 Uroplatus malahelo 1994 dauphin Nussbaum et Raxworthy, 8 Uroplatus malama Ampamakiesiny, Fort dauphin 1995 9 Uroplatus phantasticus Boulenger, 1888 Forêt de Manjakandriana à Andasibe 10 Uroplatus pietschmanni Böhle et Shönecker, 2003 Zahamena 11 Uroplatus sikorae sikorae Boettger, 1913 Haut plateau d'Andrangoloaka 12 Uroplatus sikorae sameiti Boehme et Ibisch, 1990 Sainte Marie Glaw, Kosuch, Henkel, 13 Uroplatus giganteus Montagne d’Ambre Sound et Böhme, 2006

I.3- Morphologie

Les uroplates sont caractérisés par des yeux larges à pupille verticale, une tête triangulaire et une queue très particulière en forme de feuille. La longueur totale des individus varie de 60 mm à plus de 300 mm. Le corps présente une compression latérale chez les formes petites par exemple U. ebenaui, alors qu’elle est dorso-ventrale chez les individus de grandes tailles comme U. fimbriatus. Il n’y a pas de dimorphisme sexuel net pour la plupart des espèces sauf pour U. phantasticus, où la bordure de la queue est perforée chez les mâles.

______Présentation du genre Uroplatus La couleur se rapproche de celle des lichens chez les U. fimbriatus et U. sikorae (figure 1 à droite) et de celles des feuilles mortes pour les espèces de petites tailles (Figure 1 à gauche), telles que U. malama, U. phantasticus et U. ebenaui.

Figure 1: Photo d’une femelle U. phantasticus (à gauche) et d’un mâle U. s. sameiti (à droite) dans la RNI de Betampona (source : Koraleski, Randrianasolo, Ratsoavina. Année 2005)

Figure 2: Photo de U. s. sameiti montrant la frange dermique (à gauche) et la structure de la terminaison des doigts (à droite) (source : Koraleski, Randrianasolo, Ratsoavina. Année 2005)

Certaines espèces, en particulier celles qui ont une grande taille, sont pourvues de frange dermique le long de la face latéro-ventrale du corps, de la tête et des membres. Cette membrane dermique permet à l’animal de se camoufler en l’étendant intimement sur le support lorsqu’il se repose pendant le jour. L’extrémité des doigts et des orteils est très dilatée en forme d’éventail et pourvue d’une forte griffe courbée. La face ventrale porte des rangées de lamelles formant un disque adhésif qui joue le rôle de ventouse capable de s’agripper fortement au support. Il s’agit en effet d’une adaptation à la vie arboricole.

______Présentation du genre Uroplatus I.4- Biologie

Toutes les espèces du genre Uroplatus sont nocturnes. Elles ont colonisé différentes niches écologiques. Néanmoins elles sont très sensibles au changement de leur habitat en raison de leur relation étroite avec le milieu naturel. Effectivement, la plupart des espèces ont une spécificité écologique remarquable. Se nourrissant d’insectes en captivité, ces geckos ont une longévité de 4 à 7 ans. les femelles sont ovipares et pondent généralement deux à trois œufs qui éclosent après 30 à 60 jours. La durée de l’incubation varie selon les paramètres climatiques tels que la température et l’humidité du milieu (Svatek et Van Duin, 2001). Selon Raxworthy (1988), la plupart des espèces sont actives dans les strates arbustives de la forêt. Jusqu’à maintenant, aucun phénomène d’hibernation n’a été signalé, mais la période d’activité se déroule pendant la saison humide et chaude, c’est-à-dire entre le mois de Novembre et Mars.

I.5- Ethologie

Les geckos à queue plate sont réputés pour leur excellent camouflage dans la nature. Au repos, deux stratégies de camouflage peuvent être distinguées suivant la taille de l’espèce. Pour les espèces larges, la frange dermique et l’imitation de la couleur du support leur permet de rester invisible dans leur habitat pour échapper à d’éventuels prédateurs. Les espèces de petite taille imitent la couleur et la position des feuilles mortes sur des branches (figure 3, à droite). Ce phénomène est appelé phytomimétisme. Puisque le régime alimentaire est à base d’insectes, les uroplates sont des chasseurs à vue. Les proies, pouvant avoir la taille d’un moustique à celle d’un coléoptère, sont avalées sans être mâchées.

Figure 3: Photo de U. lineatus (à gauche) et U. phantasticus (à droite) imitant la couleur du support (source : Koraleski, Randrianasolo, Ratsoavina. Année 2005)

______Présentation du genre Uroplatus I.6- Distribution géographique

La répartition géographique dépend de l’affinité écologique de l’espèce. Il y a celles qui fréquentent les forêts denses humides donc elles se trouvent surtout sur la côte Est, Nord et Nord-Est et Sud-Est. Par ailleurs, certaines préfèrent les forêts décidues, alors elles se rencontrent dans la partie Ouest et Nord-Ouest de la Grande île. L’aire de distribution des espèces est présentée ci-dessous (Glaw et Vences, 2007).

1 : U. henkeli, 2 : Le complexe U. sikorae, 3 : U. alluaudi, 4 : U. malahelo, 5 : U. guentheri,

6 : U. ebenaui, 7 : U. phantasticus, 8 : U. malama, 9 : U. lineatus, 10 : U. pietschmanni,

11 : U. fimbriatus, 12 : U. giganteus.

Figure 4: Distribution des espèces de uroplates à Madagascar

______Présentation du genre Uroplatus I.7- Menaces

La perte et la fragmentation des habitats sont les principales menaces pour les populations d’Uroplatus. Toutes les espèces sont forestières et arboricoles. Ainsi leur mode de vie dépend entièrement du milieu naturel. Le commerce international, pour certaines espèces, concerne des milliers de spécimens. Il pourrait nuire à la densité de la population. L’augmentation incessante de l’exportation pourrait alors porter préjudice à certaines espèces, parce que les formes nouvelles peuvent disparaître sans avoir été découvertes. Néanmoins, la réglementation par la CITES contrôle le commerce des uroplates par la fixation d’un quota annuel par l’Organe de Gestion et les Autorités scientifiques à Madagascar.

______Description des sites d’étude CHAPITRE II : DESCRIPTION DES SITES D’ETUDE Avant toute descente sur le terrain, des études bibliographiques ont été effectuées pour le choix des sites. Ces derniers sont tous classés dans le réseau des aires protégées de Madagascar et sont formés de forêt dense humide.

II.1- PARC NATIONAL DE RANOMAFANA

Le PN Ranomafana est le quatrième parc national de Madagascar depuis son inauguration le 31 Mai 1991. Situé dans la partie Sud-Est de Madagascar, il se situe entre 47° 18’ – 47° 37’ longitude E et 21° 02 – 21° 25’ latitude S. Le parc se trouve à 60 km de la ville de Fianarantsoa et à 400 km au Sud-Est de la capitale. Comme il est montré sur la Figure 4, , il est subdivisé en trois parcelles, la superficie totale du parc est de 41 601 ha (-PGDRN, 2001). Le parc est compris dans la juridiction administrative de la Région Vatovavy Fitovinany. Il est traversé par les RN 45 et RN 25 qui relient Ambohimahasoa à Farafangana. La présente étude s’est entièrement déroulée à Talatakely (parcelle 1), qui est une zone du parc composée par plusieurs pistes d’une altitude autour de 900 m et est considérée comme l’endroit le plus fréquenté.

II.1.1- Caractères physiques Pédologie Les sols noirâtres sont généralement les plus fréquents et assez profonds dans les zones forestières. Dans les zones dénudées ou dégradées, ils sont ferralitiques, peu profonds et de couleur rouge-jaune ou parfois bruns. Ces sols reposent sur un socle précambrien et les principales roches mères rencontrées sont des gneiss et orthogneiss calco-alcalins (Ségalen, 1951). Pour les caractéristiques du sol, le pH est très acide et elle varie de 3,6 à 5,0 , les ions aluminium, calcium, magnésium et potassium sont en grande quantité par contre les ions phosphore et sodium sont en état de traces (Balko, 1998).

Hydrologie La rivière « Namorona » traverse le parc et constitue le plus grand réservoir d’eau du Sud-Est de Madagascar. Elle assure le ravitaillement en eau de la ville de Fianarantsoa et ses environs. Par ailleurs, une centrale hydroélectrique y constitue la source d’énergie électrique du moyen Sud-Est.

______Description des sites d’étude

Figure 5: Localisation du Parc National Ranomafana (Source : ANGAP Ranomafana, Année 2004)

Climat Le climat du PN Ranomafana est associé à celui des forêts tropicales humides. Les températures moyennes varient de 14°C à 23°C avec un minimum et un maximum respectivement de –1°C et 37°C. Les précipitations annuelles varient en moyenne de 2300 mm à 4000 mm mais elles sont extrêmement variables d’une année à une autre en fonction

______Description des sites d’étude des dépressions tropicales et des cyclones. La période du mois de décembre jusqu’au mois de mars est la plus arrosée avec une moyenne mensuelle de 400 mm, le présent travail a été effectué durant cette période. La précipitation est faible avec une moyenne de 90 mm du mois de mai au novembre. La courbe ombrothermique montre les moyennes des températures et des précipitations enregistrées dans le parc, de 1999 à 2004. Suivant les variations de la précipitation, la région est caractérisée par deux saisons bien distinctes. Elle est maximale entre le mois de janvier et mars. Tandis que, le minimum se trouve entre le mois de septembre et de novembre si pour la température, il est entre juin et août.

Figure 6: Courbe ombrothermique de Ranomafana pour l’année 1999- 2004 (source: ANGAP Ranomafana)

II.1.2- Caractères biologiques Végétation La forêt appartient au type dense humide orientale à dominance des Apocynaceae, Monimiaceae (Tambourissa sp.), Cunoniaceae (Weinmania sp.) et Steculiaceae (Nicoll et Langrand, 1989). Toutefois, des variations de formations peuvent s’y rencontrer du fait des différentes perturbations (humaines ou non). Il y a les formations primaires qui sont considérées comme plus ou moins intactes ou à faible degré de perturbation. Les grands arbres de hauteur 20 m à 25 m dominent encore, la canopée est plus ou moins fermée et le sous-bois est plus ou moins dense. Les formations secondaires sont composées surtout par des Myrtaceae et Rubiaceae. La canopée dans cette partie est ouverte et le tapis herbacé pousse en grande quantité, dominé par des graminées. Dans ce type d’habitat, les bambous, les fougères 11

______Description des sites d’étude arborescentes, les orchidées, ainsi que les lianes abondent. La présente étude a été effectuée dans ce dernier type de formation végétale.

Herpétofaune Le PN Ranomafana comporte plusieurs espèces de faune rares et uniques. Ceci est prouvé par la découverte du gentil lémurien doré mangeur de bambou ou Hapalemur simus, dans l’enceinte du parc. Pour le cas de l’herpétofaune, un inventaire biologique en 1995 a abouti à une totalité de 117 espèces d’Amphibiens et de Reptiles. Cette valeur se divise en 64 espèces de grenouilles, 23 espèces de serpents, 12 espèces de caméléons et 18 autres types de lézards (Plan de gestion, 1995). Pour les uroplates, trois espèces sont recensées dans le parc : U. fimbriatus, U. sikorae sikorae et U. phantasticus (Glaw et Vences, 2007).

II.2- RESERVE NATURELLE INTEGRALE DE BETAMPONA

La Réserve naturelle Intégrale de Betampona se trouve à 40 km à vol d’oiseau au Nord de la ville de Toamasina, dans la sous-préfecture de Toamasina II, entre la commune rurale de Sahambala et la commune d’Ambodiriana, Région Antsinanana. Elle s’étend entre 17°51’ à 17°55’ latitude S et 049°10’ à 049°16’ longitude E. L’altitude est comprise entre 175 et 590m. Elle est entourée par 6 fokontany (Ambodiriana au Sud-Est, Analamangahazo au Nord Nord Est, Ambodirafia au Sud-Ouest, Fontsimavo et Sahambala au Sud). La réserve occupe une surface de 2228 ha et présente une zone de protection dont la superficie est de 1700 ha. La Figure 7 en page 14 représente les pistes existant dans la réserve. La totalité des observations nocturnes a été effectuée dans la station de Sahabefoza suivant les pistes préétablies.

II.2.1- Caractères physiques Pédologie L’étage supérieur de la forêt est riche en humus et la minéralisation se fait facilement en passant dans la couche sous-jacente. Le sol rouge sur roche acide à humifère est dominant. Les sols ferralitiques jaunes de la région sont parfois riches en concrétions et en résidus d’altération gypsique pouvant être attribuée à des variations climatiques anciennes (Cornet, 1974).

______Description des sites d’étude

Figure 7: Localisation de la RNI Betampona (Source: Ranjanaharisoa (2007) modifiée par Ratsoavina (2008)).

______Description des sites d’étude

Figure 8: Délimitation de la RNI Betampona et les pistes existantes (Source: BD 500, FTM, 2004.).

Hydrologie La forêt de Betampona constitue un réservoir d’eau important qui irrigue et alimente toutes les zones périphériques. De nombreux cours d’eau, ruisseaux, rivières et fleuves sont observés. La direction de ces cours d’eau se subdivise en deux. Sur le versant Nord, ils convergent vers la rivière de Sahambendrana qui est l’origine d’Ifotsy. Sur la partie Sud, les ruisseaux de Fotsimavo, Tsahasarotra, Sahindrana, Betakona, Sahabefoza et Sahamoniana se déversent dans la rivière d’Ivoloina qui suit une direction Est pour déboucher dans la mer.

Climat La région de Betampona bénéficie d’un climat tropical humide, type bioclimatique perhumide (Cornet, 1974). Le graphe (Figure 9) montre les moyennes de températures et de précipitations enregistrées à Toamasina (station la plus proche de la réserve) de 1991 à 2005. Les deux saisons humides et sèches sont bien distinctes sur la courbe ombrothermique. La précipitation est maximale au mois de février mais elle est faible au mois de septembre, octobre et novembre, période où la collecte des données pour la présente investigation a été réalisée. La température est plus ou moins constante au cours de l’année.

______Description des sites d’étude

Figure 9: Courbe ombrothermique de la RNI Betampona entre 1991 et 2005 (Source: Service météorologique d’Antananarivo)

II.2.2- Caractères biologiques

Végétation La réserve de Betampona fait partie du domaine de l’Est (Humbert et Cours Darne, 1965). Elle appartient à la zone écofloristique orientale de basse altitude (Faramalala, 1988) et à l’écorégion humide. La structure étagée comprend trois strates (Iambana, 2003). La strate supérieure est formée de grands arbres à troncs droits et entremêlés de lianes de la famille des Apocynaceae, Menispermaceae ou des bambous–lianes du genre Cephalostachyum. La strate moyenne est composée d’arbres plus petits appartenant en général, aux mêmes espèces que celles de la strate supérieure ; la richesse en plantes du genre Dracaena et Pandanus est remarquable, avec une grande diversité aussi bien au niveau spécifique que variétale. La strate inférieure est disjointe et occupée par les herbacées. Les espèces qui constituent cette strate sont peu abondantes. Les plantes basses sont représentées par des individus isolés ou sous formes de petites colonies. Herpétofaune Cette forêt possède une faune particulièrement riche par l’existence d’espèce endémique de la région telle Paroedura masobe. Quatre espèces d’Uroplatus : U. phantasticus, U. lineatus, U. sikorae sameiti et U. fimbriatus ont été inventoriées par Ranjanaharisoa, (2007) et le travail a qualifié la famille Gekkonidae comme la plus abondante.

______Matériels et méthodes CHAPITRE III : MATERIELS ET METHODES

III.1- ETUDES SUR TERRAIN

III.1.1- Périodes d’étude Ci-dessous sont listées les périodes de descente sur le terrain. • 11 janvier 2004 au 28 janvier 2004 : Première descente dans le Parc National de Ranomafana- Site Talatakely ; • 1 mars 2004 au 30 mars 2004 : Deuxième descente dans le Parc National de Ranomafana - Site Talatakely ; Ces deux périodes font partie des mois où la précipitation est très élevée, donc de la saison pluvieuse. • 29 septembre au 10 octobre 2005 : Descente dans la Réserve Naturelle Intégrale de Betampona, réalisée en pleine saison sèche où une diminution de la température et de la précipitation ont été détectées.

III.1.2- Observation et capture Une observation directe le long d’une ligne de transect a été effectuée pour chercher les animaux. Ainsi, les pistes existantes du site d’étude ont été suivies pour les recherches nocturnes avec une durée moyenne de six (6) heures par nuit. Malgré le camouflage réputé des uroplates, la nuit ils sont remarqués lors de leur déplacement et la réflexion de la lumière par l’œil quand celui ci est illuminé par la torche.

III.1.3- Paramètre écologique Les geckos à queue plate sont trouvés en suivant les pistes à l’intérieur des aires protégées. A la vue d’un animal, une capture à la main a été faite et les informations suivantes ont été collectées: la date, l’heure, les coordonnées géographiques fournies par un Global positionning system (GPS) et la hauteur du perchoir par rapport au sol. Après les prises de mesures, des séries de photographies et de prélèvements pour l’analyse génétique, l’animal a été relâché au même endroit que la capture. Le but de cette procédure est d’éviter la perturbation de l’état naturel de la forêt puis de respecter l’environnement de l’animal.

______Matériels et méthodes III.1.4- Mensuration Pour chaque animal capturé, les mensurations, données dans le tableau 2, ont été prises dans chaque section du corps à l’aide d’un pied à coulisse mécanique de 0,01 mm près Différentes gammes de balance du type Pesola ont été utilisées pour le pesage. Avant d’entamer la prise de tissu caudal, une série de photographies a été réalisée pour aider à résoudre les incertitudes sur l’identification de l’animal ultérieurement.

Tableau 2: Signification des mensurations prises sur chaque spécimen capturé

Mesures Significations SVL Longueur de la tête-tronc en mm. (Snout-Vent-Length) Tail Longueur de la queue en mm. (Tail length) TL Longueur totale du corps incluant la queue en mm. (Total length) W Poids de l’animal en g. (Weight)

Figure 10: Schéma montrant les mesures prises sur les uroplates

III.1.5- Prélèvement du matériel pour l’analyse génétique

III.1.5.1- Prélèvement de tissu

Durant cette étude, la partie terminale de la queue a été coupée. Elle va servir de source d’ADN pour l’analyse moléculaire. Après la prise de mesure, la procédure de prélèvement est faite rapidement pour éviter l’autotomie ou la rupture de la queue par l’animal lui-même. Une lame ou un ciseau fin et une pince tous stérilisés ont été utilisés pour mettre le tissu dans le tube Nunc®. Le contact direct avec l’échantillon est interdit afin d’éviter toute contamination pouvant affecter les études au laboratoire.

______Matériels et méthodes III.1.5.2- Conservation du tissu

Le tissu collecté est immergé dans un tube Nunc® contenant une solution tampon (un mélange chimique de : Na2EDTA 0,1 M, Tris 0,1 M et SDS 2 %) pour conserver l’ADN. Les tubes sont gardés à température ambiante pendant les études sur terrain. Pour une meilleure conservation au laboratoire, ils sont placés dans le congélateur de température strictement inférieure ou égale à – 80 oC.

III.2- ETUDES AU LABORATOIRE

L’analyse génétique fait partie des méthodes minutieuses pour l’étude de la systématique. Elle se base en totalité sur l’utilisation des données moléculaires (séquences nucléotidiques ou d’acides aminés) ayant comme avantage l’universalité, la rapidité et l’objectivité. Récemment, l’ADN mitochondrial est devenu le plus utilisé dans les travaux moléculaires pour la systématique des animaux, en particulier au niveau du rang inférieur (espèce). Ceci est dû à sa facilité d’isolement et d’interprétation (Avise et al. 1987). Puisque l’ADN mitochondrial est capable de montrer une lignée de combinaison plus rapide que l’ADN nucléaire, l’utilisation de ces gènes en phylogénie est probablement plus représentative pour l’organisme que les données des arbres basés sur n’importe quelles séquences d’ADN nucléaires (Moore et al. 1995).

III.2.1- Extraction de l’ADN total L’ADN total est extrait en procédant à une digestion enzymatique et à une précipitation en milieu alcoolique sur une très petite quantité du tissu caudal.

III.2.1.1- Digestion des protéines

Elle consiste à rompre les membranes cytoplasmique, nucléaire et mitochondriale à l’aide d’une enzyme nommée protéinase-K (ISCBioExpress® Part# 0706-100 MG, Kaysville, Utah. USA) afin de libérer les éléments génétiques dont l’ADN mitochondrial. La digestion s’effectue dans chaque tube contenant le mélange de 108 µl de STE, 6 µl de SDS à 20 % et 6 µl de protéinase-K à 20 %. Le tout est incubé dans un bain-marie de 55 ºC pendant une nuit entière. Une solution trouble est obtenue à la fin de cette étape.

III.2.1.2- Extraction de l’ADN par des solvants organiques

Le but de cette partie est de séparer l’ADN des produits lipidiques contenus dans la cellule.

______Matériels et méthodes Principe La purification de l’ADN ou encore la séparation de l’ADN des autres molécules et des restes de la digestion protéinique s’effectue à l’aide des solutions PCI (Phenol Chloroform isoamylalcohol : 25, 25,1) puis de chloroforme suivant la méthode décrite par Hillis et al. (1996). Les produits lipidiques étant solubles dans les solvants organiques, l’ADN sera séparé d’eux. En effet, il s’agit d’une méthode en cascade qui s’effectue par étapes.

Réalisation expérimentale a)- Extraction par PCI Après l’incubation, 120 µl de PCI est ajouté dans le tube contenant l’échantillon. Il est agité pendant 2 minutes et soumis à une centrifugation de 15 000 tours/min durant 5 minutes. Le processus permet une séparation rapide des deux phases: aqueuse (ou surnageant, situé en haut du mélange) et organique (ou résidu). La phase aqueuse sera recueillie dans un nouveau tube pour le deuxième et dernier traitement au PCI. b)- Extraction par chloroforme L’utilisation du chloroforme a pour but d’éliminer toutes traces de PCI dans le mélange. Une quantité de 120µl de chloroforme est additionnée dans la phase aqueuse obtenue après la deuxième opération par PCI. Le mélange est agité pendant 2 minutes, puis soumis à une centrifugation durant 5 minutes à 15 000 tours/mn. Le surnageant est récolté et retraité par la même procédure. Une solution limpide est obtenue à la fin de la purification. Chaque étape a été réalisée deux fois afin d’obtenir une quantité suffisante d’ADN à partir de l’échantillon. Les solvants organiques ne doivent pas rester dans la phase aqueuse parce qu’ils inhibent l’action enzymatique sur l’ADN lors de l’amplification. Il faut ainsi les éliminer. Il est noté qu’à ce stade, le produit final n’est pas encore de l’ADN pur.

III.2.1.3- Séparation de l’ADN des autres substances cellulaires par précipitation

La présente étape sert à enlever toutes traces de solvants organiques et d’autres éléments hydrosolubles dans le produit recueilli après l’extraction.

______Matériels et méthodes Principe Par une réaction de charge, les molécules négatives (ADN) sont attirées par celles chargées positives (Sels). Une précipitation de l’ADN est alors obtenue par addition de sels et d’alcool.

Réalisation expérimentale Une solution d’acétate de Sodium 3 M NaOAc à pH= 5,7 (de volume 0,1 fois de l’ADN) et d’Isopropanol 100% (de volume 2,5 fois de l’ADN) est versée dans la solution aqueuse. Le mélange est centrifugé 30 minutes à une vitesse de 15 000 tours/mn. La partie liquide (mélange acide-alcool) est jetée et le précipité est purifié par l’éthanol 70 %. Le dernier est soumis à une centrifugation pendant 5 minutes. Le produit obtenu est séché (sous vide) par un Speed vacuum (Savant Speed Vac® Inc. Holbrook. N.Y. USA) puis ajouté d’une solution Tris 10 mM de 50µl. Ainsi, la solution d’ADN total est obtenue.

III.2.2- Utilisation de l’ADN Les études phylogénétiques faites auparavant et basées sur l’ADN mitochondrial (ADN mt) ont montré des résultats pertinents en matière systématique et taxonomique. Sites et al. 1996 ont comparé les topologies d’arbre d’une part provenant des données morphologiques et d’autre part des données moléculaires chez les Iguanes. L’étude a montré que le cladogramme obtenu par les séquences de ND4 (sous-unité 4 de la déshydrogénase- NADH) est correcte. Ils ont aussi noté que les résultats obtenus à partir des données de séquences générées par le gène ND4 et les ARN transferts (ARN t) ne présentent aucun conflit. Pour ces raisons, la région formée par le gène codant ND4 et les ARNt Histidine, Serine et Leucine a été choisie pour la présente étude sur Uroplatus.

III.2.2.1- L’ADN mitochondrial

L’ADN mitochondrial est généralement une petite molécule de forme circulaire portant environ 16 000 à 18 000 paires de bases chez les vertébrés. Le génome comporte 13 régions codant pour des protéines, 2 régions pour des ARN ribosomiaux, 22 régions pour des ARN transfert et une région de contrôle (Kimball, 2006). Le fragment d’ADN mitochondrial ciblé, est composé côte à côte par la sous-unité 4 de la déshydrogénase-NADH (ND4), l’ARNtHis, l’ARNtSer et l’ARNtLeu comportant 893 paires de bases. La raison de ce choix repose premièrement sur les caractéristiques de l’ADN mitochondrial de transmettre aux descendants les caractères héréditaires de la mère seulement (c’est-à -dire moins de mutations et de formations compliquées de l’ADN). Deuxièmement, la

______Matériels et méthodes présence de plusieurs copies (Lehtonen, 2002) dans chaque cellule facilite l’extraction. Leur stabilité et leur simplicité sont des avantages pour les manipulations moléculaires La figure 11 ci-dessous montre le schéma du fragment de l’ADN mitochondrial utilisé lors du présent travail.

Fragment d’ADN étudié

Fragment d’ADN étudié :

Figure 11: Schéma de l’ADN mitochondrial chez les Mammifères et le genre Xenopus (Batracien endémique de l’Afrique) Kvist, 2000

III.2.2.2- L’amplification de l’ADN par la méthode de PCR

La méthode de PCR « Polymerase Chain Reaction » ou Amplification en chaîne par polymérisation (Mullis et al. 1989) consiste en une amplification des séquences d’ADN afin de produire une quantité importante d’ADN à partir d’une matrice. L’objectif est d’avoir une quantité d’ADN suffisante pour toutes les manipulations au laboratoire

Principe La PCR est une technique moléculaire biologique pour une réplication in-vitro de l’ADN matrice. Elle consiste en des cycles de réactions thermiques contrôlées qui permettent d'obtenir un facteur de 105 à 106 à partir de la molécule d’ADN initiale (Saiki et al. 1988). Le point de départde l’amplification est constitué par les amorces. La technique PCR est très utile

______Matériels et méthodes pour amplifier une très petite quantité du matériel génétique en large quantité mais conservant la même qualité que l’original. La détermination de la région à amplifier est rendue possible par l’existence des amorces ou « primer » qui sont de petits brins d'ADN ou oligonucléotides d'environ 20 paires de bases, grâce à la complémentarité des bases, sur le brin d'ADN matrice. Puisque l’ADN est un double brin, deux amorces sont alors utilisées : l’une Sens appelée ND4 et l’autre Antisens ou ARNt Leu pour la copie des deux brins complémentaires dans la direction 5’ vers 3’, séquence donnée suivant le Tableau 3.

Tableau 3: Amorces utilisées pour l’amplification de l’ADN matrice

Amorces Séquence de l'amorce direction 5'- 3' Tm Utilisation de l’amorce

ND4 5’- CACCTATGACTACCAAAAGCTCATGTAGAAGC -3’ 50ºC Amplification et séquençage Sens ARNt Leu 5’- CATTACTTTTACTTGGATTTGCACC -3’ 50ºC Amplification Antisens Tm : Température permettant l’hybridation de l’amorce sur les brins d’ADN.

L’amplification se déroule sous l’action d’une enzyme nommée Taq Polymerase, qui n’est autre qu’un ADN polymérase thermorésistant extrait de la bactérie Thermus aquaticus (Chien et al. 1976). Sa présence a permis l'automatisation de la procédure. Sa température optimale d'action est de 80°C et elle est capable de résister à des passages successifs à 95°C. L'astuce consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrice pour les étapes suivantes, au lieu de les séparer afin de ne réutiliser que la matrice originelle. L'amplification obtenue est ainsi exponentielle, schématisée en Figure 12. Un cycle de la technique est une succession de trois (3) phases, chacune caractérisée par une durée et une température bien définies présentées en Tableau 4.

Tableau 4: Durée et température spécifique de chaque étape de la méthode PCR

Phase Action Température Durée Séparation des deux brins d’ADN Dénaturation 92ºC à 95ºC 30 s à 1 mn par la chaleur. Hybridation des amorces sur Hybridation chaque brin d’ADN approprié 55ºC à 60ºC 30 s à 1 mn selon la complémentarité Extension ou Elongation de la séquence d’ADN 70ºC à 72ºC 1 mn à 2 mn Elongation par la Taq polymérase.

______Matériels et méthodes

Matrice

Figure 12: Schématisation de la technique d’amplification par PCR

Réalisation expérimentale Généralement, une PCR se déroule dans un tube placé à l’intérieur d’un appareil programmable nommé thermocycleur de type MBS Satellite 0.2G. Cette machine permet de placer des tubes selon des températures voulues à une durée bien déterminée ainsi que l’automatisation d’un nouveau cycle. Le nombre de cycles est en moyenne 30 à 40 (35 cycles pour le cas de la présente étude). Une fois l’amplification terminée, la machine conserve automatiquement les échantillons à - 4ºC. Pour les manipulations, les composants suivants sont indispensables avec une concentration spécifique, donnée dans le Tableau 5, puisque le volume total pour chaque tube est constant, de 25 µl :

• les deux amorces (sens et antisens), olignonucléotides monobrins; • des désoxynucléotides libres qui sont incorporables pour fournir les nucléotides nécessaires pour la synthèse tels que dATP, dCTP, dGTP, dTTP; • l’enzyme permettant la synthèse d’un néobrin initié par les amorces; il s’agit d’un ADN polymérase thermostable, ici nommé Taq polymerase ;

______Matériels et méthodes

• le Mg Cl2 est une solution donnant au milieu réactionnel (Taq tampon) un pH et une concentration saline optimale pour le fonctionnement de l’enzyme.

Tableau 5: Composants de chaque tube avant son emplacement dans le thermocycleur

Volume Composants Concentration par réaction (µl) ADN matriciel 1 50 ng/ml Amorce ND4 (sens) 0,2 4 pM (10 ng/ml) Amorce ARNt Leu (antisens) 0,2 4 pM (10 ng/ml) 0,8 mM (2,5 µM/µl pour chaque Mélange des 4 nucléotides (dNTP) 0,2 nucléotide) Eau distillée 19,2 - 25 mM Mg Cl2 1,5 1.5 mM Taq tampon 2,5 - Taq polymérase 0,4 500 U.I/µl

Une fois que les tubes sont prêts, ils sont placés directement à l’intérieur du Thermocycleur (Figure 12) pour ne pas dégrader l’action de la Taq polymérase.

Figure 13: Photo du thermocycleur (MBS Satellite 0.2G), machine pour l’amplification automatique d’un fragment d’ADN

______Matériels et méthodes III.2.2.3- Vérification de la réussite de l’amplification

Cette étape consiste à examiner si l’amplification de l’ADN par la méthode PCR a réussi. Une électrophorèse sur gel d’agarose et une imprégnation de bromure d’éthidium sont effectuées.

III.2.2.3.1- Electrophorèse sur gel d’agarose Principe L’électrophorèse sur gel d’agarose sert à vérifier si l’ADN a été dupliqué ou non. Ainsi une partie du produit de l’amplification est étalée sur un champ ionisé en pH neutre permettant la migration de l’ADN vers l’anode.

Réalisation expérimentale La poudre de gel d’agarose est dissoute dans une solution ionisée SB (Annexe 1) jusqu’à une obtention de solution claire et transparente (0,6 g de poudre d’agarose dans 50 ml de solution SB pour un gel de 1,2 %). Après solidification, les produits de PCR (5 µl) sont versés dans chaque puits ainsi qu’un indicateur de migration ou ADN échelle (GeneRulerTM 1Kb DNA Ladder Plus Série # 00000201). La plaque de gel est couverte par la solution SB et le tout est soumis à un champ électrique permettant la migration des ions (Figure 14).

Figure 14: Photo montrant le montage pour l’électrophorèse sur gel d’agarose

______Matériels et méthodes III.2.2.3.2- Lecture par imprégnation de bromure d’éthidium

Principe L’électrophorégramme est révélé par le bromure d’éthidium, ce dernier est une substance contenant un élémentqui s’intercale entre l’empilement des bases (Sharp, 1973). La fixation de la substance sur l’ADN augmente sa teinte. Bombardé de rayons UV, le bromure d’éthidium fixé sur l’ADN montre une coloration très claire. Les autres zones du gel sans ADN restent plus sombres.

Réalisation expérimentale Quand l’ADN échelle a suffisamment migré, la plaque de gel est plongée dans la solution de bromure d’éthidium, elle est rincée abondamment par l’eau, bombardée de rayons UV et prise en photo. L’apparition d’une tache blanche nette signifie que l’ADN a été amplifié. Si une bande faible ou multiple se présente, cela signifie que l’amplification n’a pas réussi, la figure 15 est un exemple de plaque de gel prise en photo. L’ADN échelle à concentration différente permet aussi de visualiser la taille du produit amplifié.

Figure 15: Migration de l’ADN sur gel d’agarose visible par imprégnation de bromure d’éthidium et par bombardement de rayons ultraviolets

III.2.2.4- Purification du produit de la PCR

Après vérification sur gel d’agarose que l’amplification a réussi, le produit de PCR doit être nettoyé des résidus de la réaction tels que les réactants utilisés et les restes de l’ADN non amplifié. Ces molécules peuvent concurrencer l’ADN amplifié pendant le séquençage. Cette étape est alors indispensable dans le but d’obtenir une séquence nette.

______Matériels et méthodes Principe La purification consiste à filtrer le produit du PCR afin de ne retenir que l’ADN amplifié, ceci par l’intermédiaire d’une membrane de silica gel non absorbante et poreuse. En milieu salin, les macromolécules plus larges que les pores de la membrane sont retenues sur le filtre. Par contre, les petites molécules peuvent passer à travers la colonne. Les macromolécules sont ensuite éluées facilement par l’eau.

Réalisation expérimentale Le Kit- Qiaquick PCR Purification (Qiagen, Inc. Part# 28106, Valencia, CA. USA) (Quiaquick® Spin Handbook, 2002) est utilisé en suivant les instructions du fabricant. Le tube à filtre est imbibé de solution PB (Annexe 1) 125 µl avant de verser l’ADN amplifié à l’intérieur. Le tout est placé dans un tube de collecte avant de passer à une centrifugation d’une minute à 15 000 tours/mn. Le tube à filtre est vidé et trempé de 750 µl de solution PE à l’aide du tube de collecte. Les deux sont superposés et centrifugés pendant 1 minute pour 15000 tours. Le contenu du tube de collecte est jeté puis soumis à une centrifugation de vitesse maximale 45000 tours/ mn pour éliminer l’excès de PE. Seul, le tube à filtre est recueilli, rempli de 50 µl d’eau purifiée et centrifugé à une vitesse maximale. Le contenu sera récolté par un tube de microcentrifugation normal de 1,5 ml déjà étiqueté selon l’identification de l’échantillon auparavant. Pour vérifier le produit de la purification, un volume de 5 µl peut être analysé par électrophorèse sur gel d’agarose.

III.2.2.5- Séquençage de l’ADN mitochondrial

Le séquençage de l’ADN consiste à déterminer l’ordre des nucléotides sur la molécule d’ADN. C’est le niveau de résolution le plus élevé pour rechercher la présence de mutations ponctuelles dans un gène.

Principe du séquençage La méthode de Sanger et al. 1977 basée sur des réactions enzymatiques est utilisée pour le séquençage (Sambrook et al. 1989). Elle génère la séparation de populations d’oligonucléotides fluorescents (didésoxyribonucléotides) qui partent d’un certain point et se terminent au hasard par un résidu recombiné. Puisque les bases de l’ADN ont des chances identiques d’être incorporées à la terminaison de la chaîne, alors la position particulière d’une base le long de la chaîne d’ADN originale est facilement repérée. 27

______Matériels et méthodes La détermination de l’ordre des nucléotides est basée sur le blocage de la synthèse d’ADN par incorporation de didésoxynucléotides ou ddNTP (nucléotides particuliers bloquant la synthèse d’ADN). Ceci est possible par l’incapacité d’un nucléotide quelconque de former une liaison phospho-diester après le ddNTP, dû à l’absence du groupement hydroxyle sur le carbone en position 3’ de la chaîne.

Réalisation expérimentale du séquençage a)- Le Cycle séquençage

Le fragment d’ADN utilisé est obtenu par PCR puis additionné des produits suivants : − L’amorce utilisée par l’ADN polymérase − Les 4 désoxynucléotides (dA, dT, dC, dG ou dNTP) − L’ ADN polymerase (BigDye® terminator v 1.1) − les 4 didésoxynucléotides (ddA, ddT, ddC, ddG ou ddNTP) marqués chacun par un fluorochrome distinct. L’ensemble est soumis à une succession de cycles de polymérisation. De choix aléatoire, l’ADN va incorporer soit un désoxynucléotide (dNTP) soit un didésoxynucléotide (ddNTP) sous l’action de l’ADN polymérase (Alcain et Bertrand, 2002). Au cas où un désoxynucléotide est incorporé, la synthèse continue ; mais dans le cas contraire, c’est-à-dire insertion d’un didésoxynucléotide, la synthèse s’arrête. L’étape ci-dessus se déroule dans un tube à l’intérieur du Thermocycleur. Après 3 minutes de dénaturation à 96ºC, il y a 24 cycles successifs avec les conditions suivantes : dénaturation de 30 secondes à 96ºC, hybridation de 45 secondes à 50ºC et 3 minutes d’élongation à 60ºC. b)- Purification par chrom atographie sur colonne de gel Sephadex.

Les molécules formées par le cycle de polymérisation sont placées dans un système de gel d’électrophorèse, gel de sephadex (SIGMA: G-50-50 Amersham Part#: 17-0041-01. St Louis. MO. USA), dans le but d’éliminer les excès de fluorescents (ddNTP) et de désoxynucléotides (dNTP) non utilisés par la réaction précédente. Le Sephadex, rehydraté au moins une nuit à température ambiante (2,5 g de Sephadex poudre dans 40 ml d’eau purifiée), est versé sur une plaque à filtre (Unifilter whatman® Série #

______Matériels et méthodes 7700- 1804). La plaque est tournée à 1840 rotations pendant 3 minutes par la centrifugeuse Sorvall (Sorvall Rc 5C plus Part# 9803016. Newtown. CT. USA) pour éliminer l’excès d’eau.

Figure 16: Schéma du cycle de séquençage avec les principales étapes et l’insertion du didésoxyribonucléotide (Source : Etienne Moret, www.sesep.uvsq.fr,2006)

Les produits de la réaction de polymérisation sont placés en haut et au milieu de chaque colonne. Les petites molécules sont retenues avec l’eau dans le grain de Sephadex. Les macromolécules (produit du cycle séquençage) sont recueillies dans la microplaque à 96 puits (sequencing plate ISC BioExpress® Part# T-3179-1. Kaysville. Utah. USA).

______Matériels et méthodes c)- Préparation de l’échantillon avant le séquençage

Avant l’introduction dans le séquenceur automatique, la microplaque déjà chargée est séchée et stockée dans le congélateur à -20°C. Un composant appelé DiF (Hi-DiTM Formamide. AppliedBIosystem. Série # 4311320. Foster City. CA. USA) est ajouté à l’échantillon avant d’être dénaturé par la chaleur. Le DiF évite la reformation en double hélice puisque le séquenceur ne peut lire qu’un seul brin d’ADN.

Le séquenceur ABIprism 3100 Genetic Analyzer (Sequencer machine 3100 Genetic Analyzer Série # 628-0030. Foster City. CA. USA) est le séquenceur utilisé pour la présente étude.

a)- Principe du séquenceur autom atique

Le séquenceur possède un système d’électrophorèse dont le substrat est une solution de polymère appelée POP ou Performance Optimizer Polymer (ABI PRISM® POP-4TM polymer Série # 4363752. Foster City. CA.USA). Il est équipé d’un laser qui va stimuler les fluorochromes portés par les didésoxynucléotides à la terminaison de chaque fragment néosynthétisé. Le rang de chaque nucléotide est déterminé en commençant par le fragment le plus court (un nucléotide) jusqu’au plus long. La longueur d’onde émise par la stimulation se traduit par une succession de pics qui vont être décodés suivant la nature du fluorochrome donnée par le tableau 6 ci-dessous. La séquence de l’ADN matrice est affichée à l’aide du logiciel contenu dans le séquenceur.

Tableau 6: Fluorescence et couleur de chaque Didésoxyribonucleoside-triphosphate ou ddNTP

Didésoxyribonucleoside-triphosphate Fluorescence Couleur ddGTP R110 Noir ddTTP* TAMRA Rouge ddATP R6G Verte

ddCTP ROX Bleue

______Matériels et méthodes b)- M écanism e du séquenceur

Le cycle ci-dessous se réalise pour chaque microplaque à 96 puits introduite dans le séquenceur.

Figure 17: Schéma montrant le mécanisme du séquenceur automatique ABIprism 3100 Genetic Analyzer.

1. Le rang de 16 capillaires est ramené au niveau du réservoir par l’autosampler. 2. Les capillaires se remplissent de POP-4 qui va séparer les fragments d’ADN selon leur taille. 3. L’autosampler positionne les capillaires au-dessus de la plaque contenant les échantillons déjà dénaturés. 4. Les ADN portant les fluorescents sont aspirés dans les capillaires pour une période très courte qu’on appelle Injection électrocinétique. L’extérieur des capillaires est ensuite rincé avec de l’eau purifiée pour enlever toutes traces de l’échantillon. 5. L’autosampler transporte le réservoir à tampon en dessous des capillaires pour l’électrophorèse. 6. Les fragments d’ADN sont séparés selon leur taille pendant le remplissage des capillaires par la solution polymère POP-4. En traversant la fenêtre de détection, le laser excite la terminaison du fragment d’ADN entraînant sa fluorescence. Cette dernière sera prise par le système photographique à l’intérieur du séquenceur qui

______Matériels et méthodes transforme la longueur d’onde en courbe d’électrophorégramme (Annexe 24) qui affiche la séquence originale de l’ADN. Les séquences sont disponibles en tant que fichier « *.txt » pour faciliter l’utilisation et l’analyse par d’autres logiciels.

III.3- ANALYSE DES DONNEES

III.3.1- Analyses descriptives Effectif de l’échantillon Une description globale de l’échantillon collecté dans les sites d’études et une présentation du nombre d’individus par espèce sont effectuées.

Sex-ratio C’est le rapport entre la proportion d’individus mâles et femelles dans une population. Les femelles sont identifiées facilement des mâles qui sont pourvus d’hémipénis. Il s'agit d'un double pénis, chacun étant dans un logement à la base de la queue, près du cloaque.

Structure d’âge Une répartition des individus selon l’âge est présentée et pour cela un pourcentage des animaux adultes et juvéniles est énuméré pour chaque site.

III.3.2- Données morphométriques Elles concernent les moyennes de la longueur tête-tronc et le Poids. La longueur de la queue est exclue car l’animal présente une autotomie et la plupart des échantillons ont déjà perdu la queue originale.

III.3.3- Données écologiques Des démarches statistiques simples telles que le calcul de la moyenne et du pourcentage ont été utilisées pour analyser les données concernant l’habitat des uroplates dans le PN Ranomafana et RNI de Betampona. La moyenne est le quotient d’une somme de valeurs par leur nombre.

______Matériels et méthodes III.3.3.1- Distribution verticale

La distribution verticale est définie par la hauteur du point où l’animal se trouve par rapport au sol lors de la capture. Les valeurs minimales et maximales sont alors représentées sur un graphe afin de voir quelle strate végétale l’espèce fréquente. L’occupation de la strate forestière est de trois types (Mahaviasy, 2004) : - Strate basse: si l’animal se trouve entre 0 et 1 m de hauteur à partir du sol, - Strate moyenne: si l’espèce se place entre 1 à 3 m du sol, - Strate élevée: si l’individu préfère les formations végétales à plus de 3 m.

III.3.3.2- Type de support

Le type de support est noté au moment de la capture, il pourrait être une branche, une feuille ou une liane. La proportion des individus utilisant le même genre de support a été définie afin de voir la préférence de l’espèce selon la disponibilité de l’habitat.

III.3.3.3- Période d’activités

Pour chaque spécimen, l’heure et la date de collecte sont enregistrées. La moyenne, la médiane et le mode sont aussi calculées afin d’avoir le maximum d’informations concernant les activités des uroplates. Les heures où les animaux ont été capturés correspondent à la période d’activité donnée par intervalle de 1 heure, déterminée de 18 à 01 heures.

III.3.4- Analyses génétiques Les échantillons collectés dans les sites d’études sont analysés avec des individus provenant d’autres localités (Annexe 16). Les quatre principales étapes suivantes ont été suivies pour l’étude phylogénétique : 1. – L’alignement des séquences 2. – La détermination d’un modèle de substitution selon la variation de la séquence 3. – La construction de l’arbre phylogénétique 4. – L’évaluation de l’arbre phylogénétique

III.3.4.1- Alignement des séquences d’ADN

Les séquences venant du séquenceur sont exportées en tant que format texte (*.seq) traitable par tous les logiciels utilisés pour l’alignement. Elles sont ensuite importées dans un ordinateur. Avant de les aligner une par une, des modifications sont apportées pour éviter d’éventuelles erreurs pouvant modifier l’analyse. Pour cela les séquences sont traitées

______Matériels et méthodes (modelées) à l’aide d’un logiciel appelé MacVector 7.2.2, ce dernier facilite la conversion des séquences en cas de complémentarité et de séquences inverses.

III.3.4.2-Détermination d’un modèle de substitution selon l’état de la séquence

III.3.4.2.1- Phylogénie et arbre phylogénétique REFERENCES La phylogénie est l’analyse de la relation de différents organismes suivant leur lien de parenté. Son étude est fondée sur la comparaison d’un élément de chaque individu pour aboutir à un arbre phylogénétique. Ce dernier est par définition, une représentation des relations de parenté entre des entités supposées avoir un ancêtre commun. Il est constitué de nœuds reliés par des branches. Sur la terminaison de ces dernières, il y a le taxon étudié appelé UTO (Unité Taxonomique Opérationnelle) pouvant être des organismes vivants ou éteints (fossiles). Les nœuds internes représentent les ancêtres hypothétiques ou UTH (Unité Taxonomique Hypothétique) à partir desquels ont eu lieu des événements de spéciation. Les branches représentent les lignées évolutives (c’est-à-dire des séries de transformations). Les études phylogénétiques se concentrent sur les caractères homologues. Le partage de ces derniers reflète les parentés entre les groupes d’organismes qui permettent de retracer leur histoire évolutive. Deux catégories de méthodes sont appliquées pour construire un arbre phylogénétique : - les méthodes de distance génétique, les séquences sont prises deux par deux et les substitutions de nucléotides sont considérées. - les méthodes basées sur les caractères ou sur les nombres de mutations (substitutions, insertions et délétions) qui affectent la position des séquences dans l’arbre.

III.3.4.2.2- Les méthodes d’inférence phylogénétique

a)- Les m éthodes de distance

Les méthodes de distance sont les plus convenables et disponibles pour analyser certains types de données telles les distances (nombre de changement) entre les acides nucléiques. La méthode Neighbor-joining (NJ) a été utilisée dans la présente étude, elle permet d’intégrer des modèles de changements évolutifs qui ne sont pas compatibles avec d’autres programmes. Développée par Saitou et Nei en 1987, elle compare les séquences deux à deux et calcule d’abord les longueurs des branches et en déduit la longueur de l’arbre par l’intermédiaire d’un algorithme de distance.

______Matériels et méthodes b)- M odèle de correction utilisé

Si le temps de divergence entre deux séquences augmente, la probabilité d'avoir une seconde mutation à un site augmente également. Ceci fait que le simple comptage des différences entre deux séquences n'est pas le reflet exact de la réalité mais sous-estime le nombre d'évènements mutationnels. Ici le modèle de correction choisi est celui de deux paramètres de Kimura qui est spécialisé pour les gènes codant (par exemple ND4). Il analyse que tous les sites sont équivalents (c’est-à-dire que tous les changements ont une probabilité égale mais elle varie au cours du temps), qu’il n’y a pas de biais dans la direction du changement et qu’il n’y a eu ni insertions ni délétions.

Transitions : A <-> G, C <-> T Transversions : A <-> C, A <-> T, G <-> C, G <-> T

Figure 18: Phénomènes de transitions et de transversions au niveau des bases

Mais le taux de transition est différent de celui de transversion. Ce modèle a été développé suite à l'observation que les transitions sont beaucoup plus fréquentes que les transversions, c’est-à-dire que les évènements de transitions se réalisent plus facilement.

c) -Les m éthodes basées sur les caractères.

La méthode de parcimonie ou MP

Principe: Elle consiste à rechercher toutes les topologies possibles afin de trouver l’arbre optimal. Aussi, elle considère le plus petit nombre de pas (mutation, substitution ou délétion impliquant une évolution) pour passer d’une séquence à une autre. Cette dernière est supposée être une suite de caractères non ordonnés. Ainsi, chaque site (position) évolue indépendamment les uns des autres à une vitesse lente et constante au cours du temps. L’arbre phylogénétique est alors construit de manière à impliquer le minimum d’événements évolutifs qui est défini par des sites variables ou informatifs. Un site est dit informatif lorsqu’il y a au moins deux types de nucléotides présents dans la position et si chacun d’eux est représenté

______Matériels et méthodes dans au moins deux des séquences comparées. Par exemple les positions 5, 7 et 9 du Tableau 7 ci-après ( * ).

Tableau 7 : Exemple de site informatif.

Position Séquence 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 A A G A G T G C A 2 A G C C G T G C G 3 A G A T A T C C A 4 A G A A A T C C G 5 A G A A T T G C A * * *

Procédure d'analyse par la méthode de parcimonie - Identification des sites informatifs - Inférence de toutes les topologies d'arbres possibles pour les séquences données. - Calcul du nombre minimum de substitutions pour chaque site informatif. - Calcul de la somme de changements pour chaque arbre. - Choix de la topologie de l'arbre qui nécessite le moins de changements ou l’arbre le plus court.

III.3.4.3- Construction de l’arbre phylogénétique

III.3.4.3.1- Utilisation du programme phylogénétique PAUP Les séquences d’ADN sont traitées pour être exécutables par le logiciel PAUP Version 4.0b5 (Swofford et al. 2001). Les caractéristiques des données et des informations concernant l’arbre sont récapitulées par les paramètres suivants : - Nombre de caractères traités : le nombre de sites traités - Nombre de caractères constants : le nombre de sites constants - Nombre de réplications : la répétition du processus d’analyse par le programme - Nombre d’arbres obtenus par l’analyse - Indice de cohérence ou Consistency Index (CI): Pour un caractère donné, l'indice de cohérence est égal au nombre minimum M de changements possibles du caractère (c'est- à-dire le nombre total des états du caractère moins un) divisé par le nombre de

______Matériels et méthodes changements observés. Pour un arbre donné, l'indice de cohérence est obtenu par la formule suivante.

CI = M / S,

Où M : nombre de changements possibles S : nombre de changements observés pour tous les caractères. Plus la valeur de CI est proche de 1 plus l’arbre est dépourvu d’homoplasies (Darlu et Tassy, 1993). - Indice des homoplasies (HI, homoplasy index) HI = 1 – CI les caractères homoplasiques par opposition aux caractères homologues, vont présenter des similitudes de forme ou de fonction, mais en étant issus d’événements évolutifs différents. Les caractères homologues partagent une origine évolutive commune (i.e. s’ils sont issus d’un même événement évolutif), sans présumer de leur forme ou de leur fonction (Neve, 2006) - Recherche heuristique: les méthodes heuristiques sont utilisées lorsque la matrice des données est trop importante pour l'utilisation d'algorithmes exacts (nombre élevé de taxa et de caractères). La méthode générale consiste à construire un arbre initial qui est ensuite réarrangé de manière à diminuer sa longueur.

III.3.4.3.2- Utilisation du logiciel Network La structure de l’évolution des séquences est estimée par le programme Network version 4.11 (Bandelt et al. 1999 et Gonzales et al. 1998) et Arlequin, version 2.0 (Shneider et al. 2000). Le but de cet algorithme de contraction en étoile est d’identifier le groupement des séquences en une forme étoilée dans une matrice de séquences données. Le programme Network représente mieux les liens (relations) entre les séquences pour les populations dans lesquelles plusieurs séquences pourraient dériver d’une même lignée de génotype. Le logiciel Network essaie de visualiser le regroupement des haplotypes dans une population biologique. Les tirets perpendiculaires à la ligne reliant les haplotypes marquent le nombre de substitutions de nucléotides entre eux. Les chiffres en-dessus des lignes mentionnent la distance génétique entre les haplotypes, elle est affichée lorsque la valeur est supérieure à 1. Un haplotype est par définition une séquence type que quelques individus ont en commun. Ainsi une population peut en avoir plusieurs. Chaque point coloré du diagramme en étoile

______Matériels et méthodes représente un, dont la grandeur dépend du nombre d’individus qu’il renferme (plus le nombre d’individus ayant un haplotype commun est élevé, plus le cercle est volumineux).

III.3.4.4- M éthode d’évaluation de l’arbre phylogénétique

L’évaluation d’un arbre phylogénétique se fait par un modèle attribuant un pourcentage de fiabilité pour qu’une branche existe à un endroit précis de l’arbre. La présente étude a choisi le bootstrap qui consiste à tester la fiabilité des branches dans l’arbre phylogénétique (Efron, 1979). Il suppose que les caractères évoluent de manière indépendante. Principe : les procédures de calcul se font comme suit : à chaque réplication correspond un nouvel alignement "artificiel" qui sera utilisé pour construire un arbre "artificiel" (Biani, 2005). Pour chaque branche interne, un calcul du pourcentage des arbres "artificiels" est effectué. Le programme accomplit trois étapes réalisées au moins 100 fois pour tester la fiabilité d’un arbre phylogénétique. - Etape 1 : Réalisation d’un pseudo alignement A´ à partir des séquences d’origine en prenant arbitrairement n colonnes (avec remplacements) de l’alignement d’origine. - Etape 2 : Estimation de l’arbre obtenu T´ - Etape 3 : Comparaison des arbres T et T´ : chaque sous-arbre de T est regardé s’il est présent dans T´. Le nombre de fois que le sous-arbre de T est présent dans T´ constitue la fréquence qui sera la valeur de bootstrap. Si cette analyse affiche une valeur maximale de 100 %, cela signifie que la place d’une certaine branche à une position précise est fiable.

III.3.4.5- Composants de l’arbre phylogénétique

L’arbre phylogénétique est constitué par les éléments suivants : nœud, branche et taxa ou UTO. Le regroupement de ce dernier forme un clade. - Les nœuds représentent l'ancêtre commun des descendants mais ils peuvent être hypothétiques. - Sur les branches sont placées des chiffres qui indiquent le nombre de changements pour passer d’un groupe ou d’un taxa vers un autre. - Un clade (étymologiquement, du mot grec clados, signifiant «branche») est une partie d'un cladogramme c’est-à-dire une branche contenant l’ancêtre et tous ses descendants. Dans le présent cas, la notion « Type » est introduite parce que le même nom spécifique est attribué aux spécimens au moment de la capture mais d’après les analyses

______Matériels et méthodes moléculaires effectuées, une grande différence est remarquée. Un Type pourrait-être une sous- population ou une divergence des espèces des unes des autres ou encore une nouvelle espèce ou sous-espèce. Après avoir été isolée par des grandes rivières, des barrières écologiques ou géographiques, une population pourrait acquérir de nouveaux caractères pour s’adapter à son habitat, cet isolement empêcherait l’échange de gènes d’où la voie vers la spéciation.

______Résultats et interprétations IV- RESULTATS et INTERPRETATIONS Les résultats sont regroupés en quatre grandes parties. La première rapporte les caractéristiques de la population, suivie des études morphométriques puis celles du comportement et l’utilisation de l’habitat. La dernière partie est relative aux études phylogénétiques.

IV.1- CARACTERISTIQUES DES POPULATIONS

IV.1.1- Répartition des espèces et leur abondance par site Un total de 75 individus a été collecté au cours de cette étude dont 45 à Ranomafana et 30 à Betampona. Les abondances par espèces sont données dans le tableau de l’annexe 2. Ces individus se répartissent en cinq espèces qui sont U. phantasticus, U. sikorae sikorae, U. sikorae sameiti, U. fimbriatus et U. lineatus. La figure 18 montre la distribution des espèces et leur abondance par site, en abscisse il ya les espèces recensées et les ordonnées le nombre d’individus pour chaque espèce.

Figure 19: Répartition des individus par espèce et par site d’étude

A Ranomafana, deux espèces ont été inventoriées : U. phantasticus et U. s. sikorae Une forte dominance de U. phantasticus (33 individus) est observée. A Betampona, quatre espèces ont été recensées : U. phantasticus, U. sikorae sameiti, U. fimbriatus et U. lineatus. Cette dernière est la plus abondante dans l’échantillon avec 15 individus. Le reste des espèces possède à peu près le même effectif aux environs de 5 individus.

______Résultats et interprétations Seule U. phantasticus est l’espèce commune aux 2 sites. Apparemment, U. sikorae des deux sites sont deux sous-espèces différentes, U. sikorae sikorae à Ranomafana et U. sikorae sameiti à Betampona. Les différences entre le nombre des espèces recensées et leurs abondances pourraient s’expliquer pour de nombreuses raisons concernant les caractères des deux aires protégées : situation géographique, dimension (superficie), climat et période de collecte. De plus, à Ranomafana qui est une aire protégée très vaste, la collecte a été seulement réalisée à Talatakely. Alors qu’à Betampona presque la totalité de la réserve a été inspectée.

IV.1.2- Sex-ratio C’est le rapport entre le nombre de mâles sur celui des femelles adultes. Les histogrammes suivants ainsi que l’annexe 3 illustrent le nombre d’individus mâles et femelles ainsi que le sex- ratio de chaque espèce dans chaque site.

A Ranomafana Dans le cas des deux espèces inventoriées dans ce site, les mâles sont très abondants par rapport aux femelles (Figure 20 etTableau 8). Le graphe ci-dessous montre en abscisse les espèces inventoriées dans le site et en ordonnées le nombre d’individus suivant le sexe.

Figure 20: Proportion des mâles et femelles à Ranomafana

Tableau 8: Sex-ratio de l’échantillon de Ranomafana

Espèce Sex-ratio

U. sikorae sikorae 11,0

U. phantasticus 3,3

______Résultats et interprétations Ainsi donc, la valeur du sex-ratio est très élevée particulièrement pour U. s. sikorae (11,0). La période pendant laquelle l’étude a été effectuée, le mode de vie de l’animal en question ainsi que le choix de la zone d’observation des individus (Talatakely) pourraient-être à l’origine de cette dominance des individus mâles ainsi que la saison dont la collecte a été réalisée.

A Betampona La figure 21 est une représentation graphique du nombre de mâles et femelles capturés ainsi que le sex-ratio de chaque espèce qui est donné en Tableau 9.

Figure 21: Proportion des mâles et femelles à Betampona

Tableau 9: Sex-ratio de l’échantillon de Betampona

Espèce Sex-ratio U. sikorae sameiti 0,5 U. phantasticus 0,7 U. lineatus 1,0 U. fimbriatus 0,3

La figure ci-dessus montre que les femelles sont les plus abondantes et leur effectif dépasse ou tout au moins est égal à celui des individus mâles. La valeur du sex-ratio à Betampona selon le tableau n’excède pas 1, alors qu’à Ranomafana elle est très élevée.

En résumé La même méthodologie a été réalisée pour les deux sites, l’explication plausible de cette différence entre le sex-ratio pourrait-être les périodes durant lesquelles les travaux de terrain ont été effectuées. En Janvier et Mars, à Ranomafana, la saison de collecte

______Résultats et interprétations correspondrait à la période de la reproduction et de la ponte. Dans ce cas, la plupart des femelles descendraient au sol pour pondre, rendant leur détection plus délicate. Par contre en Septembre, à Betampona, les femelles sont les plus nombreuses puisqu’elles sont en phase préparatoire de la prochaine période de reproduction. Se nourrir par la chasse est alors la seule préoccupation.

IV.1.3- Structure d’âge Pour cette étude, les individus collectés se répartissent dans trois catégories d’âge. Les juvéniles qui sont des individus récemment éclos, les subadultes sont ceux qui n’atteignent pas encore la maturité mais dont le sexe peut ou ne peut pas être déterminé (l’âge est autour de 3 mois à 1 an). Les adultes sont les individus matures.

A Ranomafana En janvier et mars, la classe des adultes domine chez les deux espèces. Ceci est représenté dans la Figure 22 ci- dessous. Chez U. s. sikorae, la classe juvénile est absente, de même pour la classe subadulte chez U. phantasticus (Annexe 4). Les individus juvéniles ou subadultes chez les deux espèces ne représentent que le 1/10ème de l’échantillon. Il est alors supposé qu’aux mois de janvier et mars, les subadultes seraient devenus des adultes et les juvéniles représenteraient les nouvelles recrues de la prochaine saison.

Figure 22: Structure d’âge de l’échantillon de Ranomafana

A Betampona Les trois répartitions d’âge ont été observées dans chaque espèce sauf chez U. phantasticus, qui n’est représentée que par des adultes (Figure 22 et annexe 5). L’échantillon de U. lineatus, l’espèce la mieux représentée, est caractérisé par l’abondance des individus

______Résultats et interprétations adultes et subadultes. Pour U. s. sameiti et U. fimbritatus, l’effectif est de 5 individus et il y a autant d’adultes que de subadultes dans l’échantillon. En saison de pré-reproduction (septembre), la période d’éclosion serait déjà largement dépassée, ce qui expliquerait chez U. phantasticus l’absence de subadultes et de juvéniles et une faible représentation de cette dernière classe chez les autres espèces.

Figure 23: Répartition des individus collectés selon l’âge à Betampona

En résumé Une dominance des individus adultes est observée dans les deux sites d’étude. La différence entre la structure de la population est duement causée par la période d’étude. Les 3 juvéniles observés à Ranomafana sont issus d’une éclosion précoce. Tandis qu’à Betampona, la présence de 10 subadultes marque que la saison de ponte est dépassée. Mais la présence des individus juvéniles peut s’interpréter par une éclosion tardive qui peut être d’origine biologique ou climatique. Même si définir la durée des différentes catégories d’âge ne serait pas possible, par cette étude, il est avancé que la période d’éclosion se trouve entre les mois de Mars et de Mai.

IV.2- COMPORTEMENT ET UTILISATION DE L’HABITAT

IV.2.1- Distribution verticale

Les valeurs minimales et maximales de la hauteur par rapport au sol (en m) des uroplates au moment de la capture sont figurées dans les graphes suivants Figure 23 et 24 (Annexe 6 et annexe 7). A Ranomafana 44

______Résultats et interprétations La figure 24 ci-dessous montre la zone d’occupation de l’étage forestier par les uroplates, avec lahauteur par rapport au sol en abscisse et les espèces en ordonné.

Figure 24: Distribution verticale des uroplates collectés à Ranomafana

Les uroplates de Ranomafana sont généralement localisés entre 0,5 m à 7 m du sol. U. sikorae sikorae occupe le plus large espace vertical (allant jusqu’à 7 m). Le résultat peut s’interpréter par le fait que les strates utilisées par les individus sont les plus adéquates pour leur mode de vie. U. s. sikorae est une espèce de grande taille et peut se déplacer sur le tronc des grands arbres d’où sa répartition verticale jusqu’à 7 m. U. phantasticus a une répartition verticale basse (0,5 à 5 m) et plus restreinte par rapport à U. s. sikorae. Ce comportement est dû à sa petite taille et à la structure des disques digitaux qui est moins développée.

A Betampona Une superposition de la hauteur du perchoir est constatée pour les quatre espèces collectées dans ce site d’étude.

______Résultats et interprétations

Figure 25: Distribution verticale chez les uroplates collectés à Betampona

L’espèce U. lineatus présente la plus large distribution verticale allant de 0,5 à 6 m. tandis que les trois autres espèces se trouvent à une hauteur plus élevée du sol. U. fimbriatus et U. phantasticus ont presque la même distribution. U. sikorae sameiti est l’espèce la plus hautement perchée de toutes les espèces. La comparaison de la distribution verticale des U. phantasticus dans les deux sites montre une certaine similarité (Figures 25 et 26), mais l’observation montre que les individus de Betampona montent un peu plus haut dans la strate mais la hauteur maximale se trouve à un niveau plus bas qu’à Ranomafana. Ceci peut s’expliquer par la structure végétale ainsi que la hauteur élevée et plus ou moins fermée de la canopée à Ranomafana. Entre autres, l’abondance du tapis herbacé à Ranomafana (voir page 11) regorge beaucoup plus d’insectes proies, incite U. phantasticus à descendre plus près du sol (0,9 m).

Figure 26: Comparaison des deux sites pour la distribution verticale de U. phantasticus

______Résultats et interprétations

Figure 27: Comparaison sur la distribution verticale du complexe sikorae dans les deux sites

En résumé La différence sur la structure écologique entre les deux sous-espèces de sikorae est plus ou moins nette suivant la figure 27 ci-dessus. Il est noté que U. s. sameiti se situe à un étage plus élevé de la forêt c’est-à-dire entre 2 à 6 m, alors qu’à Ranomafana U. s. sikorae utilise un espace plus élargi qui va de 0,5 m à plus de 7 m. La même justification que celle de U. phantasticus peut-être avancée pour l’espèce U. s. sikorae. La formation végétale, le tapis herbacé bien fourni et le caractère de la canopée offrent un grand espace vertical aux uroplates.

IV.2.2- Type de support

Les types de perchoirs sur lesquels les uroplates ont été collectés sont de quatre types: liane, feuille, tronc et branche d’arbre.

A Ranomafana Trois types de support sont employés par les animaux: liane, feuille et branche d’arbre, comme montré sur la Figure 28 et Annexe 8.

______Résultats et interprétations

15 feuille branche 10 liane 5

0 U. phantasticus U. sikorae sikorae

Figure 28: Types de support utilisés par les individus de Ranomafana

La majorité des individus U. phantasticus se sert des branches comme support mais à cause de leur petite taille, ils montrent une grande aisance dans l’utilisation des deux autres supports tels que les lianes et les feuilles. Par contre, U. sikorae sikorae aurait une préférence sur les lianes et branches à grand diamètre.

A Betampona La figure 28 montre que les individus préfèrent les branches comme support, seulement quelques uns utilisent les feuilles et le tronc. Il y a même les individus d’une espèce strictement observés sur des branches au moment de la capture, cas de U. s. sameiti et U. phantasticus (Annexe 9).

8 feuille 6 branche tronc 4

0 U. U. sikorae U. fimbriatus U. lineatus phantasticus sameiti

Figure 29: Types de support utilisés par les individus de Betampona

______Résultats et interprétations Cette préférence pour les branches est liée aux caractéristiques de l’habitat, qui est dégagé dans la partie inférieure de la végétation et puis la hauteur de la canopée est peu élevée, à moins de 10 m. Donc les branches sont un milieu de recherche de nourriture et d’abris contre les prédateurs. Il est noté que la plupart des feuilles utilisées par U. lineatus est celle de Ravinala (Ravenala madagascariensis). Le tronc d’arbre est typiquement utilisé par les espèces de grande taille comme U. fimbriatus.

En résumé Les deux graphes ci-dessus traduisent le fait qu’à chaque espèce correspond un ou des supports préférés selon le site. Cette adaptation est liée à la qualité de l’habitat. Puisque Talatakely- Ranomafana fait partie d’une formation secondaire du parc, les grands arbres ne sont plus fréquents mais les bambous, les fougères arborescentes, les orchidées, ainsi que les lianes abondent (voir page 11). Ceci peut expliquer l’utilisation assez fréquente des lianes et des branches.

IV.2.3- Période d’activité

La période d’activités des animaux est tranchée par intervalle de 1 heure à partir de 18 jusqu’à 01 h (tableau en annexe 12).

A Ranomafana Elle est définie entre 19 à 00h. La Figure 29 ci-dessous présente le nombre d’individus observés par classe d’heures.

Figure 30: Heure d’activités de U. phantasticus et de U. sikorae sikorae à Ranomafana

L’activité de U. phantasticus est notée entre 18 à 01h. La figure 30 montre que le maximum d’activité est entre 20 à 22h puisque 5 à 7 individus ont été trouvés.

______Résultats et interprétations U. sikorae sikorae sont trouvés très actifs de 21 à 22h. Pour la période d’activités, elle commence aussi à 18h mais elle se termine une heure plus tôt (00h) que celle de U. phantasticus. Une différence entre la période d’activités maximales est observée chez les 2 espèces. Elle pourrait être liée à la disponibilité des proies que chaque espèce préfère ou même au mode de vie.

A Betampona Durant 9 jours de recherches nocturnes dans la réserve, 30 uroplates ont été capturés. La figure 31 présente le nombre d’individus capturés par tranche d’une heure. Quatre espèces ont été collectées dans la réserve à partir de 19 à 01h.

Figure 31: Heure d’activités de U. fimbriatus à Betampona

U. phantasticus est capturée entre 19 à 01h, période plus étendue par rapport aux autres espèces de la réserve. Le peu de spécimens capturé ne permet pas de déterminer l’activité maximale absolue mais relativement elle se trouve de 21 à 22h. U. sikorae sameiti n’est observé qu’entre 20 à 21h et 22 à 23h. L’activité de cette espèce est très restreinte. U. fimbriatus n’est observée qu’entre 21à 01h, ceci peut s’expliquer par le mouvement tardif de cette espèce ou encore elle occupe la strate élevée près de la canopée et rend l’observation difficile avant cet intervalle de temps. U. lineatus est active entre 19 à 22h mais la plupart des individus sont collectés avant 21h. La période d’activité est très tôt, juste après le coucher du soleil, elle est aussi restreinte puisqu’elle ne va pas au-delà de 23h.

______Résultats et interprétations En résumé Entre les deux sites d’étude, il y a une différence concernant l’activité des espèces. En premier lieu, elle peut être d’origine saisonnière, puisque l’étude a été effectuée pendant la saison pluvieuse à Ranomafana ce qui coïncide avec la période de reproduction. Une activité est alors observée dès 18h, ce n’est pas le cas de Betampona où elle ne commence qu’à 19h seulement pour U. lineatus. L’activité diminue à cause de la température qui descend aussi vite à la tombée de la nuit. En deuxième lieu, le nombre d’individus collectés par espèce n’est pas équitable, ne permettant pas ainsi une comparaison de l’activité des espèces selon le site.

IV.3- ETUDES MORPHOMETRIQUES

Cette étude est une occasion de traiter un grand nombre de spécimens d’uroplates. Les études précédentes se limitent à peu de spécimens et les données suivantes seraient de nouvelles informations pour la biologie des Uroplatus. La présente analyse morphométrique concerne deux paramètres qui sont le poids et la longueur du corps (tête-tronc), ils sont pris sur des individus adultes. La valeur minimale, maximale ainsi que la moyenne sont données par des tableaux. Pour le pesage, seuls les individus adultes possédant une queue intacte (queue non régénérée, voir l’effectif par espèce en annexe 10 et 11) sont considérés. A Ranomafana Les résultats partagent U. s. sikorae et U. phantasticus en deux groupes morphologiques différents. Les tableaux 10 et 11 ci-dessous montrent que l’écart-type ne dépasse pas la moyenne des mesures.

Tableau 10 : Moyenne, minimum et maximum de la longueur tête-tronc chez les uroplates de Ranomafana

PN Ranomafana Moyenne Espèce Minimum (mm) Maximum Ecart-type U. sikorae sikorae 98,5 113,9 121,9 7,1 U. phantasticus 59,0 70,1 89,6 7,6

Tableau 11: Poids moyen (en g) des individus de Ranomafana à queue originale.

PN Ranomafana Espèce Minimum Poids moyen ( g ) Maximum Ecart-type U. sikorae sikorae 18 30,0 30 6,74 U. phantasticus 5 7,6 10 1,22

______Résultats et interprétations Pour 30 adultes capturés, la taille de U. phantasticus est comprise entre 59,0 à 89,6 mm. Il est noté que l’effectif de l’échantillon est plus ou moins représentatif de la population ainsi l’analyse peut être considérée de fiable d’où la taille moyenne de l’adulte à 70,1 mm ( + 7,6 mm). Les individus (au nombre de 22, Annexe 10) pèsent en moyenne 7,6 g. Vu le nombre de spécimens pris en compte dans le calcul, cette valeur est aussi représentative. La taille de l’espèce U. s. sikorae varie de 98,5 à 121,9 mm sur les 11 individus adultes inventoriés, la moyenne est de 115 mm (+ 7,1 mm). Comparée à la taille de l’espèce phantasticus, cette valeur confirme l’appartenance de cette espèce au groupe des uroplates de grande taille. Pour 8 individus, un poids moyen de 30 g, ce qui confirme encore l’appartenance de cette espèce à la catégorie des individus de grande taille.

A Betampona Les mesures collectées vues en tableau 12 vont de 59,6 à 133, 4 mm. Pour chaque espèce capturée, le nombre d’individus adultes collectés n’est pas équitable, s’il est inférieur à 15 chez U. lineatus, pour les trois autres : U. phantasticus, U. fimbriatus et U. s. sameiti, il est inférieur à 5. Pour le poids, le nombre d’individus à queue intacte est listé en Annexe 11 pour chaque espèce.

Tableau 12: Moyenne, minimum et maximum de la longueur tête-tronc chez les uroplates de Betampona

RNI Betampona Moyenne Espèce Minimum (mm) Maximum Ecart-type U. sikorae sameiti 99,8 104,7 121,9 6,4 U. phantasticus 59,6 67,7 77,0 2,8 U. fimbriatus 102,3 146,0 185,0 8,0 U. lineatus 103,4 120,8 133,1 10,4

Tableau 13: Poids moyen (en g) des quelques individus de la RNI Betampona

RNI Betampona

Espèce Minimum Poids moyen (g) Maximum Ecart-type

U. sikorae sameiti 17 21 27 5,29 U. phantasticus 1,8 4,3 6,5 2,29 U. fimbriatus 80,1 81,6 83,0 2,05 U. lineatus 10 15,5 26 7,17

______Résultats et interprétations U. phantasticus a une longueur tête-tronc de 59,6 à 77,0 mm (+.2,8 mm) ce qui vérifie son appartenance aux individus de petite taille suivant la subdivision morphologique. La moyenne du poids est 4,3 g, valeur donnée par 4 individus. U. s. sameiti a une taille et poids moyen respectivement 104,7 mm (+ 6,4 mm) et 21 g.

La moyenne de la taille chez U. lineatus est 120,8 mm (+ 10,4 mm) avec un poids de 15,5 g. L’espèce U. fimbriatus, qui est de grande taille, présente la longueur du corps et poids maximum de 146 mm ( + 8,0 mm) et 81,6 g. Pour la mesure du corps, elle ne présente pas une très grande déviation (écart-type) puisqu’elle varie de 146 à 67,7 mm chez les 3 espèces. Par contre, le poids est très varié s’il est de 81,6 g chez U. fimbriatus, il est de 21g et 15,5 g respectivement chez U. s. sameiti et U. lineatus. U. phantasticus est de très petite taille comparée à U. fimbriatus. Même si peu de spécimens pour certaines espèces ont été disponibles pour la mensuration, les valeurs de déviation des données sont nettement inférieures à la moyenne.

En résumé Les mesures prises sur U. phantasticus, espèce commune aux deux sites, montrent une différence (2,4 mm et 3,3 g). Pour vérifier ceci, une analyse statistique plus avancée est utile mais la présente répartition des données ne permet pas de l’effectuer. Des suppositions comme la différence entre la période où les études ont été faites et le cycle de vie de l’animal en question sont avancées pour expliquer cette variation des données morphométriques entre les deux sites d’études. Pour le complexe U. sikorae, une variation des mesures est aussi constatée et evaluée à 9,2 mm pour la mesure du corps et 9 g pour le poids. Cette différence non négligeable permet de confirmer la subdivision en deux sous-espèces. Celle de Ranomafana est plus grande avec une taille moyenne de 113,9 mm pour 30 g.

IV.4- ETUDES PHYLOGENETIQUES DES UROPLATES

Un effectif de 52 parmi les 75 individus collectés à Ranomafana et Betampona ont pu être analysé par l’approche moléculaire. L’annexe 20 montre la répartition des espèces étudiées et leur nombre. Au total, 97 individus ont été analysés avec les programmes d’analyse phylogénétique PAUP et Network. 56 (dont 4 par les études préliminaires) spécimens proviennent des études sur le terrain tandis que 41 sont déjà disponibles au laboratoire d’accueil (liste en annexe 16). La totalité de l’échantillon renferme les 7 espèces

______Résultats et interprétations suivantes: Uroplatus phantasticus, U. lineatus, U. sikorae sikorae, U. sikorae sameiti, U. fimbriatus, U. henkeli, et U. pietschmanni. 2 individus du genre Phelsuma ont été choisis comme extragroupe ou « outgroup » pour enraciner l’arbre. Les séquences de 97 spécimens sont alignées puis analysées par Neighbor-joining, et Maximum parcimonie, les phylogrammes sont présentés respectivement sur la figure 31, page 58 et la figure 32, page 62 (légende en page 59). Les chiffres au-dessus de chaque branche indique le nombre de changements d’un groupe ou d’un taxa à un autre ; ils forment la distance entre les différentes unités taxonomiques opérationnelles (UTO). La valeur encerclée en-dessous d’une branche constitue la probabilité pour que celle-ci se place à cet endroit précis, elle est donnée par l’analyse statistique bootstrap et est affichée si elle dépasse 50%. La relation entre les populations est donnée par l’intermédiaire du diagramme en réseau par le programme Network montré en Figure 34. Les valeurs sur les lignes indiquent aussi une distance génétique.

Analyse du phylogramme issu de Neighborg-joining La figure 32, page 58 montre l’arbre obtenu par la méthode d’analyse par distance Neighbor-joining. Du bas vers le haut, il y a un branchement à partir de l’extragroupe vers U. pietschmanni qui se trouve en position basale. Les clades suivants vont être analysés un par un: pietschmanni, lineatus, phantasticus, fimbriatus, henkeli et sikorae. Le clade pietschmanni forme un groupe à part avec une distance de 342 changements par rapport au groupe externe. A l’égard du branchement vers les autres espèces du genre, le nombre de changements est de 176. La branche qui le supporte est dépourvue de valeur statistique, ceci est dû au manque d’échantillons, seulement un individu collectés qui pourraient renforcer sa place dans l’arbre. Pendant sa description, Böhle et Shönecker, 2003 l’ont déterminé à partir du complexe sikorae ce qui n’est pas vérifié par le phylogramme puisque le clade est en position externe par rapport au branchement vers U. sikorae. Autrement dit, il y a des caractères que U. pietschmanni n’ont pas en commun avec U. sikorae ainsi que les autres espèces. U. lineatus constitue un groupe frère avec le branchement vers :U. phantasticus, U. sikorae - U. henkeli et U. fimbriatus. Ces derniers sont composés de la même espèce mais collectée dans des sites différents. Le clade lineatus est exclusivement composé d’individus provenant de Betampona et les différences entre chaque individu ne dépassent pas les cinq changements. Il est relié aux groupes U. phantasticus, U. sikorae-henkeli par une distance de 186 et au clade U. pietschmanni par 198. Le point A (en noir) signifie la présence d’un

______Résultats et interprétations ancêtre hypothétique (qui n’est pas un fossile) traduisant ainsi une déviation vers une transformation ou acquisition de caractères. Le clade phantasticus comporte 3 groupes frères formés par la population de Zahamena, Ranomafana et Anjanaharibe-Sud. La somme de 132 changements sépare l’unité taxonomique hypothétique A et C. Comme il a déjà été affirmé auparavant, chaque population se particularise par la présence ou l’absence de certains caractères. La différence entre la population de Zahamena et de Ranomafana s’éleve à plus de 100 unités et ces deux derniers comparés à celle d’Anjanaharibe-Sud montrent un écart de 150 changements. Durant la période de collecte, ces individus ont tous été assignés au même nom scientifique. Pourtant la présente analyse fait voir une distance génétique considérable entre chaque population. Il faut noter que le clade des individus venant du Nord (JAR) est disposé extérieurement par rapport à ceux venant de l’Est et du Sud-Est avec une distance de 189. L’affinité de ces deux derniers s’expliquerait par l’aire de distribution qui est rassemblée dans la même écorégion de Madagascar. La subdivision des individus de Ranomafana en deux parties est bien supportée par bootstrap avec une probabilité de 100 %. Elle est évaluée à une distance de 32 changements et la présence de variétés génétiques dans la population serait une explication à cette divergence dans la population. U. fimbriatus est considéré proche morphologiquement par la grande taille et la présence de franges dermiques latérales au groupe U. sikorae. Néanmoins, il forme un groupe externe par rapport au branchement menant à ce dernier avec une distance de 174 changements. Le groupe fimbriatus renferme deux populations collectées dans la région Est et extrême Nord de Madagascar, l’une est séparée de l’autre par une distance de 79. Ceux de l’Est confirment l’espèce U. fimbriatus, puisque ceci correspond à la terre typique (Nosy Mangabe). Une relation étroite avec la population de Vatovavy et Zahamena est constatée. Une grande subdivision est vue pour ceux du Nord. L’individu UAMB5.55 peut être U. giganteus puisque la répartition coïncide avec le lieu de la première description (Montagne d’Ambre), mais son existence n’est pas vérifiée par bootstrap. Alors que le branchement vers les individus de Marojejy est bien supporté par cette analyse. Cette distance entre ces populations pourrait être le résultat d’une variation géographique au niveau de l’espèce en réponse de l’adaptation aux types d’habitat en plus de l’appartenance à différentes écorégions. Le clade U. henkeli est distant de 248 changements par rapport au nœud C venant du clade U. phantasticus. Il est composé de deux provenant de Mariarano (Mahajanga) et Daraina (près d’Antsiranana). L’écart entre les deux individus est grande alors que la classification de Cornet, 1974 et Schatz, 2000 a rassemblé les deux zones dans une écorégion 55

______Résultats et interprétations similaire, Une séparation assez longtemps des lignées pourrait expliquer cette distance, amenant à une divergence au niveau de l’espèce. Le groupe d’individus de U. sikorae est étroitement lié avec le clade U. henkeli, tout d’abord par la position dans l’arbre (formation d’un groupe frère avec le clade sikorae), puis par la distance entre eux qui est évaluée à 87 changements. Dans le groupe U. sikorae, les individus de Betampona, Zahamena, Mananara-Nord, Kianjavato, Manombo et Andohahela sont définis dans des clades différents. Il est issu d’une unité hypothétique B et comporte deux divisions, en commençant par le haut, l’une inclut les individus de Betampona et Mananara Nord et l’autre par ceux de Ranomafana et ses alentours avec Zahamena. La première division est éloignée du deuxième par 78 changements, ce qui est proche du branchement séparant le clade U. henkeli de U. sikorae. La présence de ces subdivisions est bien supportée par le bootstrap. Par ailleurs, les individus de Betampona sont attendus être plus proches de ceux de Zahamena, pourtant ces derniers forment un groupe à part avec ceux de Ranomafana formant ainsi une distance de 131 changements. Même si la séquence d’un holotype U. sikorae sameiti décrit à Sainte Marie manque, il est supposé que les populations de Mananara Nord et Betampona représentent les vraies U. s. sameiti, la différence entre elles peut être d’origine géographique. En outre l’individu ZAHA4.11 se détache de la population de Zahamena par une différence nucléotidique de 51. Ceci peut s’expliquer par un excès de distance ou d’une fausse manipulation. D’après l’arbre ci-dessous, le complexe sikorae est encore plus diversifié qu’il ne l’a été démontré morphologiquement.

En résumé Le phylogramme obtenu par Neighbor-joining sur la Figure 31, page 58 a permis de distinguer 6 clades. Des distances génétiques ont été discernées entre ces derniers, elle est minime pour deux taxa de même espèce et collectés dans le même site. Par contre, elle est très élevée et bien supportée par bootstrap pour des espèces différentes. Les raisons de cette divergence génétique se résumeraient par les points suivants : • la séparation des populations par des barrières géographiques et écologiques ou encore des fragmentations de la forêt. • La présence de différentes écorégions qui font que chaque population séparée devrait s’adapter au milieu d’où l’acquisition de caractères. • Un début de spéciation du fait de l’absence de flux des gènes.

______Résultats et interprétations Analyse du phylogramme issu de Maximum parcimonie Le phylogramme par Maximum parcimonie sur la Figure 33, page 62 montre aussi une subdivision en 6 clades. Du bas vers le haut de l’arbre, les clades suivants vont être analysés un par un : U. pietschmanni, U. phantasticus, U. lineatus, U. fimbriatus, U. henkeli, et U. sikorae. Le branchement vers le clade U. pietschmanni est en position basale, une distance de 333 changements est observée en partant de l’extragroupe. Il est en position externe par rapport aux autres espèces représentées. Ces dernières sont dérivées de l’unité taxonomique hypothétique A (rond noir) avec une position bien supportée par l’analyse bootstrap. Le clade U. phantasticus est de 237 changements en partant du clade en position basale. Trois groupes frères sont aussi observés, chacun formé par des individus collectés dans le même site. La population du Nord est externe par rapport à celles de l’Est (ZAH) et du Sud-Est (URANO) dont les distances respectives sont de 278 et de 269 changements. Le branchement est entièrement justifié par bootstrap, confirmant ainsi l’existence de diversité génétique à l’intérieur du clade U. phantasticus. Elle pourrait être d’origine écologique puisque ce sont des individus vivant dans le même habitat. Le clade U. lineatus se trouve à l’exterieur du branchement combinant les U. fimbriatus et U. sikorae – U. henkeli avec une distance de 198 changements. A partir du nœud hypothétique A, le clade est placé avec un écart de 191. Ceci peut s’expliquer par l’acquisition de caractères spécifiques que les autres espèces du genre n’ont pas pu avoir, d’où la position externe de l’espèce dans l’arbre. Le clade U. fimbriatus forme un groupe frère avec celui de U. sikorae- U. henkeli avec une distance de 133 changements. Le groupe fimbriatus renferme des individus collectés dans la région Est et extrême Nord de Madagascar. Une subdivision en deux du clade est notée avec une différence de 79 changements. Les spécimens de l’Est confirment l’espèce U. fimbriatus. Ceux du Nord sont divisés en deux : le premier regroupe les individus de Marojejy avec un support bootstrap très élevé, le second pourrait s’identifier comme étant U. giganteus puisque la région de collecte coïncide avec la terre typique de l’espèce, qui est Montagne d’Ambre, mais le branchement n’est pas supporté par l’analyse de fiabilité bootstrap. Le clade U. henkeli montre une étroite relation avec le clade U. sikorae d’une distance de 87 nucléotides. Il comporte deux individus collectés au Nord et à l’Ouest séparés entre eux par 161 changements. Cette divergence à l’intérieur du clade est expliquée par la présence d’une variété chez l’espèce henkeli, même si l’aire de répartition des deux individus se trouve dans une écorégion identique. Il pourrait aussi s’agir d’une nouvelle sous-espèce puisque la distance entre les individus (MAR et DAR) dépasse celle qui sépare le clade sikorae du clade henkeli. 57

______Résultats et interprétations

Figure 32: Phylogramme obtenu par Neighbor-joining de la région ND4, ARNt Ser, ARNt His et ARNtLeu de l’ADN mitochondrial des uroplates.

______Résultats et interprétations Légende pour les deux phylogrammes obtenus par Neighborg-joining et Maximum parcimonie

Légende pour les figures 32, 33 et 34 AND: Andohahela BET: Betampona DAR: Daraina JAR: Anjanaharibe-Sud JEJ: Marojejy KIAN: Kianjavato M: Manombo MAR: Mariarano NARA: Mananara Nord NOSY: Nosy Manga be UAMB: Montagne d'Ambre URANO: Ranomafana VVAT: Vatovavy ZAH: Zahamena

______Résultats et interprétations

Le branchement vers le complexe sikorae renferme des individus de diverses localités (Betampona, Mananara-Nord, Kianjavato, Zahamena, Manombo et Andohahela). Il y a une subdivision en différents clades à partir d’un nœud hypothétique B. Les spécimens collectés dans la région Est : Mananara Nord et Betampona sont groupés avec une distance de 78 changements pour joindre la branche comportant les individus de Zahamena (Est) et Ranomafana (Sud-est). Si un rassemblement de U. s. sameiti provenant de Zahamena est attendu, un rapprochement des individus venant de ces deux dernières localités est observé. Puisque U. s. sameiti a été décrite pour la première fois à Sainte Marie, les spécimens de Mananara Nord et Betampona seraient alors la confirmation de la sous-espèce. Les individus collectés dans la région du Sud–est et Sud forment un groupe bien distinct, c’est la confirmation de la sous-espèce U. s. sikorae malgré les distances génétiques entre chaque branche. Il y a une remarque sur la situation de Ranomafana et Kianjavato, ces deux localités sont très proches géographiquement alors qu’une distance de 73 changements est notée avec une valeur bootstrap élevée. Le clade sikorae constitue un complexe de variation génétique entre les populations de l’Est et de variation géographique comme vue chez les populations du Sud et Sud-est.

Comparaison avec le phylogramme issu de NJ Les branchements respectent toujours le rassemblement des individus selon l’espèce et sa distribution géographique. Comparé à l’arbre Neighbor-joining (Figure 32, page 58), la même topologie est discernée, U. pietschmanni est toujours en position basale chez les deux phylogrammes. Les différences entre les arbres se posent sur la valeur de l’analyse bootstrap par contre les valeurs de changements séparant 2 taxa ou unités évolutives sont très proches et quelque fois similaires. Il y a aussi la place du clade U. lineatus. Si dans l’arbre issu de Neighborg-joining, il est situé à l’extérieur du branchement vers le groupe sikorae- henkeli- fimbriatus d’un coté et phantasticus de l’autre coté. Il a formé un groupe frère avec le premier groupe (sikorae- henkeli- fimbriatus) dans l’arbre le plus parcimonieux sur la Figure 33.

En résumé Le phylogramme issu de l’analyse Maximum parcimonie a confirmé les informations données par Neighborg-joining : • la subdivision en 6 clades et la distance génétique entre eux ; • la diversité génétique à l’intérieur du clade phantasticus ; • la variation géographique chez U. s. sikorae et génétique chez U. s. sameiti ; 60

______Résultats et interprétations • l’absence de support bootstrap pour le clade U. giganteus. La différence entre les deux méthodes se trouve sur le fait que maximum parcimonie montre une affinité entre le groupe fimbriatus, sikorae-henkeli d’un coté et le clade lineatus de l’autre coté. La fragmentation de l’habitat, la présence de barrières écologiques et géographiques et l’absence d’échange de gènes entre les populations seraient toujours considérées les principales raisons des distances génétiques entre les différents taxa d’un même groupe.

Analyse du regroupement par réseau d’haplotypes Le diagramme sur la Figure 34, page 66 illustre la relation entre les haplotypes d’uroplates. Les individus sont regroupés selon l’appartenance à une espèce. Caractérisé par sa forme en étoile, les nœuds ou « median » (cercle rose) correspondent à une séparation entre les populations et les valeurs sont les distances entre les haplotypes. Un taux de différence élevé est observé entre les séquences d’individus provenant de divers sites mais attribués au même nom scientifique. En commençant l’analyse du diagramme de gauche à droite, les populations d’uroplates seront traitées un par un. Le groupement des U. sikorae vient en premier suivi de U. henkeli, U. fimbriatus puis de U. lineatus. En cinquième lieu, la branche vers U. pietschmanni est proche des individus U. phantasticus de Ranomafana et de Zahamena. La population de U. sikorae est formée par 4 différentes subdivisions qui sont celles de 1)- U. s. sikorae venant de Ranomafana, Andohahela, Kianjavato et Manombo., 2)- U. s. sameiti venant de Betampona 3)- U. s. sameiti de Mananara Nord 4)- U. s. sameiti de Zahamena. Le premier point est composé par des individus répartis dans la région du Sud et Sud-est de Madagascar. Pour le site Ranomafana et Zahamena, il y a une dominance d’un seul haplotype, les individus analysés de Kianjavato ont le même haplotype. Pour Andohahela et Betampona, les 3 individus représentent 3 haplotypes. L’Annexe 14 montre les distances entre les populations, la valeur minimale (94 changements) est discernée entre celle de Manombo et Andohahela. En d’autres termes, ces deux populations sont plus proches génétiquement mais la modification du milieu naturel ainsi que la fragmentation de l’habitat ont stoppé le flux génétique entrainant une diversité locale. La distance maximale (301 changements) est observée entre les populations de Ranomafana et de Betampona – Mananara Nord, ce qui est évident puisqu’il s’agit d’une sous-espèce U. sikorae sameiti.

______Résultats et interprétations

Figure 33: L’arbre le plus parcimonieux du fragment ND4- ARNtLeu de l’ADN mitochondrial du genre Uroplatus. Les flêches montrent le nœud de l’ancêtre aboutissant à chaque groupe d’espèces. Indice de consistance CI = 0,4870. Indice d’homoplasie HI = 0,5130 62

______Résultats et interprétations Il est noté que le diagramme n’affiche aucune distance entre les populations de Betampona et de Mananara Nord, il est alors avancé qu’il s’agit de la même espèce. En ce qui concerne la population de Zahamena, elle est écartée de celle de Betampona par une valeur de 170, alors qu’une association des deux a été attendue. Il est aussi suggéré qu’il s’agit d’une autre espèce de U. sikorae mais pas la sous espèce sameiti. Le diagramme montre que les populations ne se mélangent pas, il confirme la validité des deux sous-espèces déjà données par Neighborg-joining (Figure 32) et Maximum parcimonie (Figure 33), la population de Ranomafana et environs est composé de U. s. sikorae et celle de Betampona et Mananara Nord de U. s. sameiti. Aussi, les trois méthodes convergent sur la situation de la population de Zahamena, qui forme un groupe à part de U. s. sameiti et son rapprochement des populations du Sud et Sud-est. La population de U. henkeli est en relation étroite avec celle du complexe U. sikorae, puisque la distance n’est que de 5 qui est nettement inférieure à la distance entre les deux individus analysés, 95 pour Mariarano et 85 pour Daraina. Ces deux régions sont éloignées l’un de l’autre mais les conditions éco-biologiques et climatiques sont similaires. Encore, il est vérifié que les populations ne se mélangent pas et la distance entre les deux haplotypes (Mariarano et Daraina) est le résultat d’une séparation de longue date et aussi de l’absence de flux de gènes. Malheureusement, la différence morphologique ne peut être démontrée. Le même fait est montré par Neighborg-joining et Maximum parcimonie, mais la distance entre le groupe sikorae et henkeli est évaluée à 87 changements. La séparation de la population de U. fimbriatus avec celle des U. sikorae est mise en exergue avec une distance de 197 changements, les distances génétiques entre les populations de Montagne d’Ambre, de Marojejy, de Vatovavy et de Zahamena sont récapitulées dans l’Annexe 15. La valeur maximale se trouve entre Marojejy et Montagne d’Ambre, ce qui est attendue puisqu’il s’agit de deux espèces différentes, information issue d’une récente révision taxonomique de U. fimbriatus. Il est confirmé que l’individu de Montagne d’Ambre est représenté par l’espèce U. giganteus, mais une relation étroite existe entre cette espèce et celle de Marojejy. La minimale distance est vue entre les populations de Zahamena et Vatovavy. Cette subdivision est aussi donnée par les deux phylogrammes obtenus par Neighborg-joining et Maximum parcimonie. La population de U. lineatus est strictement composée d’individus collectés à Betampona. Une distance de 244 est comptée à partir du groupement des sikorae. Par rapport à celui de U. fimbriatus, U. lineatus est situé à une distance de 414 changements. Par rapport aux phylogrammes, le présent diagramme en étoile converge avec celui donné par Maximum parcimonie, ceci par la place de U. lineatus. 63

______Résultats et interprétations Le branchement de U. pietschmanni part de U. lineatus avec un écartement de 322. Il est plus proche de U. phantasticus avec une distance de 276. Cette distinction est confirmée par la particularité morphologique de cette espèce. Les arbres donnés par Neighborg-joining et Maximum parcimonie confirment aussi cette séparation de U. pietschmanni des autres groupes par sa position basale dans les deux phylogrammes. La population de U. phantasticus est connectée au diagramme en réseau par 3 médian, le branchement est à une distance de 276 changements par rapport à celui de U. pietschmanni et 354 par rapport à celui de U. lineatus. Le peuplement de Ranomafana, présente 4 haplotypes dominants, un branchement vers Anjanaharibe-Sud est observé à partir de l’un d’eux avec une distance de 243 changements. Géographiquement, Ranomafana et Zahamena sont très éloignés. Entre eux peuvent se placer des barrières tant écologiques que biologiques entraînant une grande diversité génétique, ici évaluée de 243. Cet écartement s’explique aussi par leur appartenance à deux écorégions différentes et l’absence de flux des gènes depuis longtemps. Le diagramme en réseau confirme la subdivision à l’intérieure de la branche U. phantasticus (rectangle bleu) observée dans les deux phylogrammes (Figure 32 et 33) par la présence de différents haplotypes (gros cercle bleu) dans la population.

En résumé des résultats phylogénétiques Les arbres de la méthode Neighborg-joining et Maximum Parcimonie révèlent au niveau de chaque branche des valeurs semblables, la valeur minimale se situe entre deux individus et la valeur maximale se place entre le groupe Uroplatus et le groupe externe Phelsuma. Même si deux méthodes ont été utilisées pour obtenir l’arbre phylogénétique, le résultat a abouti à des arbres ayant une topologie identique, traduisant ainsi la solidité de la matrice de données établie pour le genre Uroplatus. Les phylogrammes ne suivent pas une subdivision géographique bien définie, par exemple d’Est en Ouest ou du Nord au Sud. Le diagramme en réseau donné par réseau d’haplotypes affirme la diversité figurée dans par, les deux techniques de reconstruction d’arbres phylogénétiques, NJ et MP. La présente analyse moléculaire montre une concordance avec les subdivisions morphologiques faites auparavant, ici les espèces de grandes tailles (U. fimbriatus, U. sikorae et U. henkeli) ayant de frange dermique bien développée sont bien séparées des petites tailles (U. phantasticus). U. lineatus et U. pietschmanni forment un groupe intermédiaire à cause des caractères morphologiques que chacun a en particulier. Les espèces déjà décrites par les analyses morphologiques sont bien confirmées par les trois arbres : U. fimbriatus, U. pietschmanni, U. phantasticus, U. lineatus et U. henkeli, de même pour les deux sous-espèces 64

______Résultats et interprétations de sikorae : U. sikorae sameiti et U. sikorae sikorae. Néanmoins la présence de Type est notée, à cause de la grande distance génétique entre les populations. Cette distance est nettement supérieure à celle qui sépare deux espèces confirmées, comme observé chez U. s. sameiti de Zahamena, U. fimbriatus de Marojejy, U. phantasticus de Zahamena et d’Anjanaharibe-Sud. Les arbres phylogénétiques convergent sur le fait que le genre Uroplatus constitue un groupe monophylétique. Ils ont permis de détecter une diversité génétique ce qui mérite une approche minutieuse pour vérifier si elle a entraîné des différences morphologiques entre les populations. Ils ont aussi donné des informations sur des zones potentielles pour des variétés locales comme Kianjavato et Zahamena, elles peuvent aider à la prise de décision pour de meilleure stratégie dans la conservation de la biodiversité.

Figure 34: Diagramme en réseau d’haplotypes de Uroplatus par Network Version 4.11.

______Discussions V- DISCUSSION L’étude éco-biologique effectuée a la chance de traiter de nombreux individus pour une espèce, les données obtenues à Ranomafana et Betampona seront comparées avec celles des autres auteurs travaillant dans le domaine.

V.1- Biologie, morphométrie et écologie

D’après les résultats obtenus lors des descentes sur le terrain, 3 espèces et 2 sous- espèces ont été inventoriées : U. fimbriatus, U. phantasticus, U. lineatus et U. s. sikorae, U. s. sameiti. Toutes les espèces collectées confirment l’aire de distribution prescrite dans la littérature et dans le modèle de répartition établi par Pearson et al. 2007. Toutes les données récoltées sur le terrain seront discutées dans les paragraphes suivants en parlant de chaque espèce.

Uroplatus fimbriatus La taille moyenne des adultes à Betampona est 102,3 à 185,0 mm. Comparée à la mensuration faite par Glaw et Vences, 1994, celle-ci est comprise dans l’intervalle donné (153 -186 mm) même si le nombre de spécimens n’est que de 5. Dans le complexe de Tsaratanàna, partie Nord de Madagascar, Mahaviasy, 2004 a enregistré une hauteur de 0,3 à 3,5 m. Randrianandianina et al. 2003 ont classé la forêt de Betampona en forêt dense humide, ce qui est différente de l’écorégion du Nord selon Faramalala, 1988. Ainsi, les individus du Nord occupent un large espace vertical par rapport à ceux de Betampona, ceci pourrait dépendre de la qualité de la composition végétale. Cette diversité de l’habitat et la morphologie de l’espèce comme le développement proéminent de la frange dermique, des griffes et de la structure en éventail à la terminaison des pattes expliquent la préférence des animaux d’occuper la strate qui convient le plus à ces activités. Cette espèce utilise les troncs d’arbre, vu que la morphologie du corps est bien adaptée à ce support.

Le complexe Uroplatus sikorae La taille moyenne des individus collectés est comprise dans l’intervalle de mesure 86 – 123 mm, travaux effectués par Glaw et Vences, 1994 ; 98,5 – 121,9 mm pour U. s. sikorae et 99,8 – 121,9 mm pour U. s. sameiti. Aucune différence notable n’est trouvée chez les deux sous-espèces sauf la pigmentation de la cavité buccale. Une large répartition verticale est notée chez U. sikorae sikorae. Cependant, U. sikorae sameiti est plus sélective puisqu’elle est strictement trouvée dans la strate moyenne et 67

______Discussions élevée, le même résultat a été confirmé par Desmod, 2004 chez les uroplates habitant la région du Nord. Le complexe U. sikorae ne peut pas servir des feuilles comme support, il préfère plutôt les branches et les troncs d’arbre qui sont aussi abondants dans les milieux d’étude.

Uroplatus lineatus La taille est de 103,4 à 133,1 mm, elle est comprise dans l’intervalle de chiffre donné par Glaw et Vences, 1994 (108 - 139 mm). Ces auteurs ont aussi classé U. lineatus dans le groupe intermédiaire entre les individus de petite taille d’une part et de grande taille d’autre part, ce qui est vérifié par la présente étude.

Cette espèce est repérée entre 7 à 21h, elle est très tôt comparée à l’heure d’activités des autres espèces à Betampona. Dire qu’elle est crépusculaire n’est pas justifiée, pour cela le suivi de spécimens est nécessaire. Elle est la seule trouvée dans la strate basse à Betampona. Elle montre une très grande aptitude à l’utilisation de différentes strates végétales. De même pour le type de support qui peut être une branche, feuille ou tronc d’arbre.

Uroplatus phantasticus Classée parmi les espèces de petite taille et dans le groupe ebenaui, la taille varie de 55 - 66 mm par Glaw et Vences, 1994. Les descentes sur le terrain faites à Ranomafana et Betampona donnent respectivement 59 – 89,6 mm et 59,6 – 77 mm qui sont supérieures à la fourchette de mesure ci- dessus. Ce dépassement est aussi confirmé par le travail de Wolf en 2005 à Ranomafana pour 26 animaux. Le poids des individus de la partie Est (4,3 g) est inférieur à celui du Sud-est. Tenant compte de l’effectif, l’échantillon de Ranomafana est plus considéré car 23 animaux ont été capturés avec un poids moyen de 7,6 g. Il est aussi possible que la différence entre les périodes de capture (Janvier- Mars à Ranomafana et Septembre- octobre à Betampona) joue un rôle sur le poids de ces animaux. Il y a aussi la disponibilité des ressources alimentaires qui n’est pas la même au cours de l’année entraînant ainsi une variation au niveau du poids de chaque animal. Les individus mâles dominent dans l’échantillon de Ranomafana, par contre les femelles sont les plus capturées à Betampona. L’échantillon de Betampona se concentre dans les strates moyenne et élevée ; alors que ceux de Ranomafana se répartissent dans tous les types de strates. Classé de petite taille, les U. phantasticus montrent une aisance dans l’utilisation des différentes sortes de support à l’exception des troncs d’arbre.

______Discussions La différence d’âge entre les populations est expliquée par l’écart de saison dont les descentes sur le terrain ont été effectuées. L’une est faite en début de période d’activité (fin Septembre) et l’autre s’est déroulée juste à sa fin (Janvier et Mars). L’existence de 3 juvéniles (nouvellement éclos) dans l’échantillon de Ranomafana pourrait-être le fruit d’une éclosion précoce. Les femelles sont encore en période de ponte ou à la recherche d’un endroit tranquille pour les œufs, ce qui explique le grand nombre de mâles capturés. La différence de distribution verticale entre les sites d’étude est expliquée par le type de forêt dans chaque aire protégée. Dans la partie végétation du site d’étude, il est dit que ceci influence la préférence de l’animal en niche écologique. A Betampona, la strate basse est moins riche en végétaux et les insectes n’y sont pas abondants. Par conséquent les uroplates se concentrent dans les strates moyenne et élevée. Ce phénomène n’est pas observé à Ranomafana qui possède un tapis herbacé riche et bien fourni. Cette étude est complémentaire de celle de Desmod, 2004 qui avait collecté 6 formes nouvelles en plus des espèces suivantes : U. ebenaui, U. fimbriatus, U. henkeli, U. lineatus, U. s. sikorae et U. s. sameiti. D’après les études que cet auteur a effectué dans la partie Nord de Madagascar, il stipule que la plupart des Uroplatus se trouve dans la bande 400 m à 800 m d’altitude. Se concentrant sur les individus capturés à Ranomafana, la présente étude démontre que presque tous les individus se localisent entre l’intervalle d’altitude 800 à 1000. Mais pour les échantillons de Betampona les uroplates sont capturés entre 200 à 550 m d’altitude.

V.2- Apport des analyses phylogénétiques dans la systématique

Les 3 systèmes d’analyses ont abouti à la même topologie. Pour certain concept phylogénétique de l’espèce (Phylogenetic Species Concept, PSC), une différence génétique de 10 % entre deux unités évolutives conduit à un changement de statut en une nouvelle espèce. Comparé à l’étude faite sur les Lémuriens (genres Lepilemur et Microcebus) par Louis et al. 2006 et Andriantompohavana et al. 2006, la distance entre les espèces n’excède pas 40 changements. Alors que dans le présent travail, les changements entre les espèces dépassent largement 40, même chez les individus assignés au même nom. Toutefois, la présente étude confirme la grande diversité génétique au sein du genre Uroplatus, ce qui est renforcée par l’existence de nouvelles formes d’après les données morphologiques (Mahaviasy, 2004) et la combinaison avec celles moléculaires par la description de U. giganteus (Glaw et al. 2006).

______Discussions U. sikorae sikorae Une distance génétique de 121 existe entre les haplotypes de Ranomafana- Talatakely et de Kianjavato alors qu’ils sont très proches géographiquement et les spécimens d’Andohahela sont plus avoisinants avec un écart de 94 seulement. Cette étude suggère l’existence de barrières écologiques (habitat non viable pour l’espèce) ou géographiques (grandes rivières que les individus ne peuvent pas traverser) entraînant l’isolement des populations de Ranomafana et de Kianjavato. Cette distance pourrait être un début de spéciation. Malheureusement, aucune donnée morphologique n’est disponible pour ce dernier site, rendant la vérification impossible. Le rapprochement entre les individus de Ranomafana et Andohahela affirme la connexion des deux blocs forestiers, qui a assuré le flux génétique auparavant mais cette liaison a été coupée d’où cette distance génétique (94 changements).

U. sikorae sameiti Un regroupement de sikorae de Betampona avec ceux de Zahamena est espéré mais par surprise une séparation des deux échantillons est donnée par l’arbre en étoile avec une distance génétique de 170 (Tableau de comparaison en Annexe 15). Morphologiquement, ces deux échantillons sont constitués par la sous-espèce sikorae sameiti (Espèce sikorae des basses altitudes). D’après le diagramme en réseau et les arbres phylogénétiques, un grand écartement génétique est constaté entre eux. Ce qui confirme la subdivision morphologique en deux sous-espèces différentes par Böhme et Ibisch, 1990. Le diagramme en réseau montre que les échantillons de Zahamena et Betampona ont une différence semblable à celle qui sépare deux sous-espèces. Ainsi, la question se pose s’il s’agit d’une simple variation de l’espèce ou d’une spéciation évidente ?

Uroplatus fimbriatus Pour le clade fimbriatus, une subdivision en deux parties est observée, d’une part les spécimens collectés dans la partie Est et d’autre part ceux provenant de la partie Nord. Les individus collectés à Montagne d’Ambre peut être U. giganteus puisque la localité affirme le terra typica. Morphologiquement, elle diffère de U. fimbriatus par sa grande taille pouvant atteindre 30 cm et la couleur du pupille beige à rouge marron, le problème ici est que la branche n’est pas supportée par bootstrap et celle qui mène vers la population de Marojejy possède 100 %. La question se pose si l’espèce U. giganteus est une espèce valide ? Par ailleurs, la situation de U. fimbriatus population de Marojejy nécessite une clarification, ce qui est aussi constatée par Glaw et al. 2006 et Greenbaum et al. 2007.

______Discussions Compte tenue de la distance géographique entre les différents sites, la présence des types est justifiée. Cette différence peut se baser sur la théorie que Madagascar est divisé en plusieurs zones biogéographiques Humbert, 1965, Schatz, 2000 ainsi deux endroits à proximité pourraient appartenir à deux différentes zones. Chacune possède une particularité faunistique et floristique. Le fait que l’animal doit y survivre et s’y adapter entraine l’apparition de nouveaux caractères dans le pool génétique d’où la diversité.

V.3- Analyse phylogénétique

La monophylie du genre Uroplatus (Bauer et Russell, 1989, Glaw et al. 2006, Greenbaum et al. 2007) est confirmée par la présente étude. La divergence intraspécifique est frappante d’où la présence de type dans le phylogramme. Ceci est remarqué par Greenbaum et al. 2007 qui ont également noté l’ancienneté de la lignée. La topologie de l’arbre est conforme avec la subdivision morphologique par Glaw et Vences (1994). D’une part, il y a les espèces de grande taille, constituées par les U. fimbriatus, U. henkeli, et U. sikorae et d’autre part les U. phantasticus, espèce de petite taille. U. lineatus constitue un groupe intermédiaire. Les arbres phylogénétiques donnés par la présente étude affirment que U. sikorae et U. henkeli forment un groupe frère. Ce qui est aussi démontré par Greenbaum et al. 2007 ; par contre Glaw et al. 2006 supposent que U. fimbriatus et U. guentheri sont plus proches de U. henkeli. De même, Böhme et Ibish (1990) disaient qu’il y a une grande affinité entre U. fimbriatus et U. henkeli. Pour le groupe Sikorae, notre étude converge avec celle menée par Pearson et al. 2007. Ils ont noté la divergence de ce groupe et ont recommandé de faire d’autres investigations. Même si la description de nouvelle espèce est au-delà du présent travail, il a apporté des informations nécessaires pour les futures études concernant les uroplates.

______Conclusion CONCLUSION Le présent travail a permis de réaliser des études éco-biologiques dans des aires protégées de Madagascar principalement à Betampona (30 individus) et à Ranomafana (45 individus) sur le genre Uroplatus. Les espèces et sous-espèces suivantes : U. fimbriatus, U. sikorae sikorae, U. lineatus, U. sikorae sameiti, et U. phantasticus ont pu être inventoriées. Les données morphométriques ont divisé les individus étudiés par groupe de taille. U. fimbriatus et le complexe U. sikorae constituent les espèces de grande taille. U. lineatus est de taille moyenne. U. phantasticus est de petite taille, pour 23 individus la longueur du corps est 70,1 mm et 7,6g pour le poids. Les uroplates sont des animaux nocturnes. La période d’activité est répartie entre 18 et 01h. A Ranomafana, elle est de 20 à 21h chez U. s. sikorae. Elle est plus étendue chez U. phantasticus avec une maximale entre 20 à 22h. A Betampona, elle est aussi étendue chez U. phantasticus. Elle est maximale entre 19 à 21h chez U. lineatus. Mais elle est restreinte chez U. s. sameiti et U. fimbriatus. Chez cette dernière espèce, elle est tardive de 21h à minuit. Une relation étroite existe entre la formation végétale et l’occupation de l’espace vertical par les uroplates. Plus la structure végétale est fournie, plus les insectes abondent et les uroplates les fréquentent pour se nourrir. U. s. sikorae détient la plus large distribution verticale. U. s. sameiti est plus sélectif et ne fréquente que les strates végétales à hauteur entre 2 à 6 m du sol. Quatre types de support sont employés par les uroplates : liane, feuille, tronc et branche d’arbre qui est la fréquemment utilisée. L’espèce U. phantasticus montre une grande aisance dans l’utilisation de divers supports du fait de sa petite taille. La majorité de U. lineatus est trouvée sur des feuilles de Ravinala, plante abondante dans la réserve de Betampona. Le sex-ratio des adultes dépend de la période d’étude. En phase de pré-reproduction (Septembre-Octobre à Betampona), les femelles sont les plus actives. Pendant la phase de reproduction (Janvier et Mars à Ranomafana), les mâles sont les plus observés. Des données moléculaires sur les espèces et sous-espèces suivantes ont pu être générées : U. phantasticus, U. sikorae sikorae, U. lineatus, U. sikorae sameiti, U. henkeli, U. pietschmanni et U. fimbriatus. Trois méthodes d’analyses phylogénétiques convergent sur l’existence d’une diversité génétique au sein du genre. La subdivision morphologique et la monophylie du genre Uroplatus sont corroborées par les phylogrammes issus de Neighborg- joining et Maximum parcimonie. D’après les distances génétiques, l’étude a permis de confirmer les taxa ci-après en tant qu’espèce valide : U. phantasticus, U. lineatus, U. pietschmanni, U. fimbriatus, U. sikorae sikorae, U. sikorae sameiti et U. henkeli. Ces dernières ont été décrites auparavant par des méthodes morphologiques. La validité de U. giganteus n’est pas supportée par l’analyse bootstrap ainsi l’existence de cette espèce reste à 72

______Conclusion vérifier. La notion de type est introduite puisqu’une distance nettement supérieure à deux espèces différentes existe entre deux populations composées d’une même espèce. Le diagramme en réseau des halotypes fournit des informations concernant les populations d’Uroplatus provenant du Nord, Nord-Est, Est, Sud-est et Sud de Madagascar. Il y a une évidence que les populations ne se mélangent pas, autrement dit, le flux des gènes est absent. Neighborg-joining, Maximum parcimonie et le réseau des haplotypes montrent que U. fimbriatus, U. s. sikorae et U. s. sameiti sont proches. U. pietschmanni et U. henkeli forment des groupes intermédiaires, avec leur apparence particulière. L’appartenance de U. phantasticus dans le groupe des individus de petite taille est aussi supportée par les analyses, et elles convergent sur le fait que la population d’Anjanaharibe-Sud est très distante de celle de Ranomafana et de celle de Zahamena. Il est nécessaire de vérifier la différence entre les types par des données morphologiques, autrement dit confirmer si les distances génétiques ont une conséquence sur le phénotype des populations. Pour cela, une collecte le long de l’axe de variation géographique en réalisant un transect progressif est suggérée. L’intégration de toutes les espèces d’uroplates dans l’Annexe II de la CITES est un bon début pour leur conservation. Néanmoins, l’exportation nécessite un contrôle rigoureux pour les espèces nouvelles, parce qu’elles peuvent disparaître par manque de connaissance sur l’état de la population. Pour une bonne gestion du commerce international et l’exploitation pérenne sans porter préjudice à la biodiversité, une étude de la densité de chaque population d’uroplates est d’une grande nécessité afin de fixer un quota annuel pour tous les opérateurs intéressés par la filière. Certaines espèces d’uroplates sont vues dans la partie secondaire de la forêt et quelque fois dans la partie la plus perturbée et hors des aires protégées. En effet, certaines sont à distribution large mais si les forêts se dégradent, il y a une forte chance que les uroplates disparaissent aussi, puisque leur existence en dépend entièrement. Il est indispensable de faire une étude étendue dans tout Madagascar pour pouvoir préciser l’aire de distribution de chaque espèce, l’information fournie par cette investigation serait utilisable pour la conservation des uroplates. Même si des modèles mathématiques sur la répartition de quelques espèces ont été effectués par Pearson et al. 2007, la vérification sur le terrain et la précision de ces informations sont nécessaires au cas où des formes nouvelles ou d’endémismes régionaux se présentent. Un effort sur la connaissance de l’histoire naturelle de l’animal est aussi nécessaire pour combler les analyses phylogénétiques faites auparavant.

______Conclusion Sachant la biologie, l’écologie et l’aire de distribution de l’espèce, une exploitation durable peut se réaliser pour participer au développement de Madagascar. D’après les approches génétiques effectuées, des zones potentielles comportant de nouvelles formes (pas forcément une nouvelle espèce) sont détectées dans la zone Est et Sud- Est de Madagascar. Cette étude n’est pas complète et déduire des hypothèses concernant la biologie des espèces du genre Uroplatus serait trop hâtive. Par contre les informations obtenues par l’étude phylogénétique sont un grand avantage pour les études futures.

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______Annexes ANNEXES

Annexe 1: Liste des substances chimiques utilisées lors des réalisations expérimentales

Solution Composants Sodium Dodécyl Sulfate 100g SDS 20 % H2 Na Cl saturé Préservation de tissu EDTA 250 mM à pH=7,5 à température ambiante DMSO 20 % NaCl (5M) STE à pH = 7,5 Tris à pH=7,5 (2M) EDTA (0,5M) Guanidine d’hydrochloride PB buffer Isopropanol PE buffer Solution à base d'alcool Tris 98,8 g SB buffer pH = 8,4 pour 2 litres H Cl concentré 25 ml

TM - DiF : Solution DiF ou Hi-Di Formamide est composée de formamide fortement dionisé avec un stabilisateur spécifique à l’injection cinétique dans le système d’électrophorèse du séquenceur. Cette solution intervient aussi dans la resuspension des molécules d’ADN après sa dénaturation.

Annexe 2: Distribution des individus par espèce par site

Espèce PN Ranomafana RNI Betampona U. sikorae sikorae 12 0 U. sikorae sameiti 0 5 U. phantasticus 33 5 U. fimbriatus 0 5 U. lineatus 0 15 45 30

Annexe 3: Répartition des mâles et femelles pour chaque site d’étude

Site RANOMAFANA Espèce Mâle Femelle U. sikorae sikorae 11 1 U. phantasticus 23 7

______Annexes

Site BETAMPONA Espèce Mâle Femelle U. sikorae sameiti 1 2 U. phantasticus 2 3 U. lineatus 7 7 U. fimbriatus 1 3

Annexe 4: Structure d’âge de l’échantillon à Ranomafana RANOMAFANA Espèce Adulte Subadulte Juvénile U. sikorae sikorae 11 1 0 U. phantasticus 30 0 3

Annexe 5 : Structure d’âge de l’échantillon à Betampona BETAMPONA Espèce Adulte Subadulte Juvénile U. sikorae sameiti 2 2 1 U. phantasticus 5 0 0 U. lineatus 8 6 1 U. fimbriatus 2 2 1

Annexe 6 : Distribution verticale des uroplates de Ranomafana Espèce U. sikorae sikorae U. phantasticus Minimum (m) 0,5 0,9 Maximum (m) 7,0 5,0

Annexe 7 : Distribution verticale des uroplates de Betampona Espèce U. sikorae sameiti U. phantasticus U. linetaus U. fimbriatus Minimum (m) 1,9 1,5 0,5 1,6 Maximum (m) 4,0 4,5 6 4,5 Moyenne 3,1 2,5 2,4 2,2

Annexe 8 : Type de support des individus capturés à Ranomafana

Type de support feuille branche liane U. phantasticus 2 22 9 U. sikorae sikorae 0 6 6

______Annexes

Annexe 9 : Type de support des individus capturés dans la RNI de Betampona

Type de support feuille branche Tronc U. phantasticus 0 5 0 U. sikorae sameiti 0 5 0 U. fimbriatus 0 3 2 U. lineatus 3 11 1

Annexe 10: Nombre d’individus à queue intacte à Ranomafana

Nombre d'individu à Espèce queue intacte

U. s. sikorae 8

U. phantasticus 22

Annexe 11: Nombre d’individus à queue intacte à Betampona

Nombre d'individu à queue intacte

U. sikorae sameiti 3

U. phantasticus 4

U. fimbriatus 2

U. lineatus 4

Annexe 12 : Période d’activité des uroplates à Ranomafana

Classe d'heures Espèce [18h-19h[ [19h-20h[ [20h-21h[ [21h-22h[ [22h-23h[ [23h-00h[ [00h-01h[ U. phantasticus 1 5 7 7 5 6 2 U. s. sikorae 1 2 2 4 1 2 0

______Annexes

Annexe 13 : Période d’activité des uroplates à Betampona

Classe d'heures Espèce [18h-19h[ [19h-20h[ [20h-21h[ [21h-22h[ [22h-23h[ [23h-00h[ [00h-01h[ U. phantasticus 0 1 0 2 0 1 1 U. s. sameiti 0 0 2 0 3 0 0 U. lineatus 0 5 5 3 2 0 0 U. fimbriatus 0 0 2 1 0 1 1

Annexe 14: Distance génétique entre les populations de U. sikorae par le diagramme en réseau.

Site Ranomafana Andohahela Kianjavato Manombo Betampona Mananara Nord Zahamena Ranomafana 0 Andohahela 94 0 Kianjavato 121 85 0 Manombo 89 53 80 0 Betampona 301 264 259 259 0 Mananara Nord 301 264 259 259 0 0 Zahamena 264 228 249 223 170 170 0

Annexe 15: Distance génétique entre les populations de U. fimbriatus par le diagramme en réseau.

Site Montagne d'Ambre Marojejy Nosy Mangabe Vatovavy Zahamena Montagne d'Ambre 0 Marojejy 292 0 Nosy Mangabe 180 196 0 Vatovavy 162 178 76 0 Zahamena 149 165 63 45 0

______Annexes

Annexe 16 : Répartition des espèces séquencées venant d’autres localités.

Identification Site Spécimen Espèce NOSY Nosy Manga be NOSY U. fimbriatus ZAH Zahamena ZAH132 U. fimbriatus ZAH92 U. s. sameiti ZAH93 U. s. sameiti ZAH146 U. s. sameiti ZAH95 U. s. sameiti ZAH117 U. s. sameiti ZAH121 U. s. sameiti ZAH119 U. s. sameiti ZAH263 U. s. sameiti ZAH94 U. s. sameiti ZAHA4.11 U. s. sameiti ZAH88 U. phantasticus ZAH96 U. phantasticus ZAH118 U. phantasticus ZAH222 U. phantasticus ZAH120 U. phantasticus ZAH220 U. phantasticus ZAH264 U. phantasticus ZAH91 U. phantasticus ZAH265 U. phantasticus ZAH87 U. phantasticus ZAH257 U. phantasticus ZAH219 U. pietschmanni ZAH218 U. fimbriatus VVAT Vatovavy VVAT16 U. fimbriatus JAR Anjanaharibe Sud JAR3.1 U. phantasticus JAR3.2 U. phantasticus BET Betampona BET57 U. lineatus BET22B U. lineatus BET107 U. lineatus NARA Mananara Nord NARA4.22 U. s. sameiti NARA4.21 U. s. sameiti M Manombo M106B U. s. sikorae AND Andohahela AND8 U. s. sikorae AND48 U. s. sikorae AND51 U. s. sikorae JEJ Marojejy JEJ3.15 U. fimbriatus JEJ3.4 U. fimbriatus UAMB Montagne d'Ambre UAMB5.55 U. fimbriatus MAR Mariarano MAR32 U. henkeli DAR Daraina DAR4.32 U. henkeli KIAN Kianjavato KIAN125 U. s. sikorae KIAN144 U. s. sikorae

______Annexes

Annexe 17: Liste des haplotypes par espèce.

Nom de Site Haplotypes l’espèce

URANO4.1, URANO4.2, URANO4.14, URANO4.22, U. phantasticus Ranomafana URANO4.24, URANO4.25, URANO4.35, URANO4.39, URANO4.42

U. phantasticus Ranomafana URANO4.11, URANO4.37

U. phantasticus Ranomafana URANO 4.20, URANO4.40, URANO4.41

U. phantasticus Ranomafana URANO4.6, URANO4.8

U. phantasticus Ranomafana URANO4.19, URANO4.28

U. phantasticus Anjanaharibe- sud JAR3.1, JAR3.2

URANO4.3, URANO4.7, URANO4.33, URANO4.44, U. fimbriatus Ranomafana URANO4.45 U. sikorae Ranomafana URANO4.10, URANO4.36 sikorae U. sikorae Zahamena ZAH117, ZAH121 sameiti U. sikorae Kianjavato KIAN125, KIAN144 sikorae

Annexe 18: Liste des espèces et les mesures prises sur chaque individu collecté à Betampona.

Tête-tronc Queue Hauteur Identification Date Espèce Heures Sexe Age (mm) (mm) Poids (g) Support (m) BET5.1 26-sept-05 Uroplatus sikorae sameiti 20:35 Subadulte Subadulte 57,7 22,6 3,4 branche 3,5 BET5.2 26-sept-05 Uroplatus lineatus 21:35 male Adulte 109,9 94,3 14 branche 1,2 BET5.3 26-sept-05 Uroplatus lineatus 22:00 femelle Subadulte 71,9 56,9 3,5 branche 3 BET5.4 27-sept-05 Uroplatus lineatus 22:00 juvénile juvénile 70,1 40,2 3,9 6 BET5.5 27-sept-05 Uroplatus sikorae sameiti 22:47 male Adulte 102,4 53,2 19 branche 4 BET5.6 27-sept-05 Uroplatus sikorae sameiti 22:47 femelle Adulte 111,9 61,8 27 branche 4 BET5.7 27-sept-05 Uroplatus fimbriatus 23:29 femelle Adulte 102,3 78,1 28 branche 2,5 BET5.8 28-sept-05 Uroplatus fimbriatus 0:28 femelle Adulte 115,4 29,2 24 branche 1,9 BET5.9 28-sept-05 Uroplatus sikorae sameiti 20:20 femelle Adulte 99,8 55,7 17 branche 2 BET5.10 28-sept-05 Uroplatus fimbriatus 21:17 juvénile juvénile 59,8 31,6 4 2 BET5.11 28-sept-05 Uroplatus lineatus 22:06 male Adulte 128,3 59 4,5 feuille 3 BET5.12 29-sept-05 Uroplatus lineatus 19:44 femelle Adulte 118,8 37,7 17 branche 1,6 BET5.13 29-sept-05 Uroplatus lineatus 20:44 male Subadulte 70,7 60,1 4 branche 1,6 BET5.14 29-sept-05 Uroplatus sikorae sameiti 22:53 juvénile juvénile 61,4 34,1 4 branche 1,9 BET5.15 29-sept-05 Uroplatus phantasticus 23:43 femelle Adulte 59,6 35,9 3 branche 4,5 BET5.16 30-sept-05 Uroplatus phantasticus 0:40 femelle Adulte 74,9 45 6 branche 1,8 BET5.17 30-sept-05 Uroplatus fimbriatus 20:58 male Adulte 181,1 119,1 83 branche 1,6 BET5.18 30-sept-05 Uroplatus fimbriatus 20:58 femelle Adulte 185 111 80,1 branche 1,6 BET5.19 30-sept-05 Uroplatus phantasticus 21:48 male Adulte 60,6 38,1 1,8 branche 1,5 BET5.20 01-oct-05 Uroplatus lineatus 19:07 femelle Adulte 117,8 85,2 12,1 branche 1,3 BET5.21 01-oct-05 Uroplatus lineatus 19:35 male Subadulte 76,5 4,2 4 branche 4 BET5.22 01-oct-05 Uroplatus phantasticus 19:52 femelle Adulte 77 4,9 6,8 branche 2,5 BET5.23 01-oct-05 Uroplatus lineatus 20:51 femelle Adulte 103,4 79,5 10 branche 4,5 BET5.24 01-oct-05 Uroplatus phantasticus 21:13 male Adulte 66,5 47,6 6,5 branche 2 BET5.25 02-oct-05 Uroplatus lineatus 19:51 male Subadulte 62,6 54,9 3,9 feuille 0,5 BET5.26 02-oct-05 Uroplatus lineatus 20:05 femelle Adulte 133,1 19,2 3,5 branche 3 BET5.27 05-oct-05 Uroplatus lineatus 20:10 male Adulte 123,8 21,8 17 feuille 2,2 BET5.28 05-oct-05 Uroplatus lineatus 22:05 femelle Subadulte 71,9 57,5 3,9 branche 1,6 BET5.29 06-oct-05 Uroplatus lineatus 19:47 femelle Subadulte 62,8 53,5 3 branche 1,7 BET5.30 06-oct-05 Uroplatus lineatus 20:40 male Adulte 131,3 104,6 26 branche 1,1

Annexe 19: Liste des espèces et les mesures prises sur chaque individu collecté à Ranomafana.

Poids Hauteur Identification Date Espèce Heures Sexe Age Tête-tronc (mm) Queue (mm) (g) Support (m) URANO4.1 12-janv-04 Uroplatus phantasticus 19:10 Male Adulte 80 39,1 8 feuille 3,4 URANO4.2 12-janv-04 Uroplatus phantasticus 20:15 Femelle Adulte 81,8 45,3 8 liane 1,7 URANO4.3 12-janv-04 Uroplatus sikorae sikorae 18:45 Male Adulte 120,9 71,1 35 liane 0,5 URANO4.4 13-janv-04 Uroplatus phantasticus 19:55 Femelle Adulte 65,1 coupée 6 bambou 2,3 URANO4.5 14-janv-04 Uroplatus phantasticus 18:18 Femelle Adulte 67,9 43,3 9 branche 2,3 URANO4.6 14-janv-04 Uroplatus phantasticus 22:00 Male Adulte 65,2 coupée 7 branche 2,5 URANO4.7 15-janv-04 Uroplatus sikorae sikorae 21:10 Male Adulte 115,2 63,4 33 branche 3,2 URANO4.8 15-janv-04 Uroplatus phantasticus 22:50 Male Adulte 65,8 coupée 8 branche 5 URANO4.9 15-janv-04 Uroplatus sikorae sikorae 22:45 Male subadulte 86,1 13,2 10 liane 7 URANO4.10 16-janv-04 Uroplatus sikorae sikorae 20:25 Femelle Adulte 120,1 44,7 33 branche 1,5 URANO4.11 17-janv-04 Uroplatus phantasticus 20:45 Male Adulte 76,1 13,2 7 branche 3 URANO4.12 17-janv-04 Uroplatus phantasticus 23:10 Male Adulte 75,6 45,9 7 branche 1,8 URANO4.13 18-janv-04 Uroplatus sikorae sikorae 19:50 Male Adulte 98,5 65,9 18 branche 5,5 URANO4.14 18-janv-04 Uroplatus phantasticus 20:35 Male Adulte 65,7 45,7 7 liane 1,9 URANO4.15 18-janv-04 Uroplatus phantasticus 23:05 Male Adulte 75,2 45,5 8 branche 2 URANO4.16 20-janv-04 Uroplatus phantasticus 21:15 Male Adulte 59 47,6 7 branche 2,5 URANO4.17 20-janv-04 Uroplatus phantasticus 21:30 Male Adulte 72,4 50,2 10 liane 3 URANO4.18 21-janv-04 Uroplatus phantasticus 0:00 Male Adulte 61,9 51,2 8 branche 2 URANO4.19 21-janv-04 Uroplatus phantasticus 0:45 Male Adulte 66,4 49,7 8 liane 1,8 URANO4.20 24-janv-04 Uroplatus phantasticus 19:48 Male Adulte 64,4 50,9 6 branche 1,5 URANO4.21 24-janv-04 Uroplatus phantasticus 21:33 Male Adulte 60,5 44,2 5 bambou 2,1 URANO4.22 25-janv-04 Uroplatus phantasticus 20:10 Femelle Adulte 68,8 52,1 9 branche 1,5 URANO4.23 25-janv-04 Uroplatus phantasticus 20:35 Femelle Adulte 69,2 52 8 liane 1,25 URANO4.24 25-janv-04 Uroplatus phantasticus 20:52 Male Adulte 59 43,5 5 liane 1,25 URANO4.25 25-janv-04 Uroplatus phantasticus 21:18 Male Adulte 72,2 12,1 7 branche 1,8 URANO4.26 25-janv-04 Uroplatus sikorae sikorae 21:42 Male Adulte 114 47,3 33 branche 1,9 URANO4.27 27-janv-04 Uroplatus phantasticus 22:20 Male Adulte 68,7 57,1 7 branche 2,5 URANO4.28 27-janv-04 Uroplatus phantasticus 23:09 Male Adulte 69,7 47,2 7 liane 4

Poids Hauteur Identification Date Espèce Heures Sexe Age Tête-tronc (mm) Queue (mm) (g) Support (m) URANO4.29 28-janv-04 Uroplatus phantasticus 20:19 Male Adulte 72,7 54,3 8 branche 2,1 URANO4.30 28-janv-04 Uroplatus phantasticus 22:03 Male Adulte 74,1 53,4 8 liane 1,8 URANO4.31 02-mars-04 Uroplatus sikorae sikorae 21:34 male Adulte 121,9 71 35 branche 1,1 URANO4.32 02-mars-04 Uroplatus phantasticus 22:31 male Adulte 74 15,5 7 branche 2,5 URANO4.33 02-mars-04 Uroplatus sikorae sikorae 23:15 male Adulte 115,7 49,1 31 branche 3,5 URANO4.34 03-mars-04 Uroplatus phantasticus 0:02 juvénile juvénile 32,1 20,9 1 feuille 1,8 URANO4.35 03-mars-04 Uroplatus phantasticus 21:05 juvénile juvénile 30,4 18,5 1 branche 1,8 URANO4.36 03-mars-04 Uroplatus sikorae sikorae 21:52 male Adulte 120,4 63,2 29 liane 6 URANO4.37 03-mars-04 Uroplatus phantasticus 22:46 juvénile juvénile 29,2 19 1 branche 2,1 URANO4.38 04-mars-04 Uroplatus phantasticus 23:05 male Adulte 71,4 51,5 8 liane 0,9 URANO4.39 08-mars-04 Uroplatus phantasticus 19:01 male Adulte 67 9 5 branche 1,7 URANO4.40 08-mars-04 Uroplatus phantasticus 19:55 femelle Adulte 89,6 53,2 9 branche 4 URANO4.41 09-mars-04 Uroplatus phantasticus 23:30 femelle Adulte 85,5 48,8 7 branche 1,9 URANO4.42 10-mars-04 Uroplatus phantasticus 21:54 male Adulte 59,8 12,5 5 branche 1,7 URANO4.43 11-mars-04 Uroplatus sikorae sikorae 23:25 male Adulte 117,9 79,7 38 liane 4,5 URANO4.44 26-mars-04 Uroplatus sikorae sikorae 20:22 male Adulte 114,5 58,3 29 liane 6 URANO4.45 27-mars-04 Uroplatus sikorae sikorae 19:44 male Adulte 105,7 61,8 23 liane 1,75

Annexe 20: Répartition géographique et abondance des espèces considérées dans l’analyse phylogénétique.

Nosy Montagne Anjanaharibe Mananara { Daraina Marojejy Mariarano Managa Zahamena Vatovavy Betampona Ranomafana Kianjavato Manombo Andohahela d'Ambre Sud Nord DAR JEJ MAR be ZAH VVAT BET URANO KIAN M AND UAMB JAR NARA 9 NOSY

U. fimbriatus

U. henkeli

U. s. sameiti

U. lineatus

U. s. sikorae

U. phantasticus

U. pietschmanni

______Annexes

Annexe 21: Différences génétiques entre les populations du / Ü données par le diagramme en réseau Network.

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Annexe 22: Distances génétiques entre les populations de U. fimbriatus obtenues par le diagramme en réseau donné par le programme Network a % &! a ' b ' a % ë ' ù a % &! a ' b ' a % # ë ' # $ $# ù #! #" !

Annexe 23: Distances génétiques entre les populations de U. phantasticus données par le diagramme en réseau issu de Network. w ù ! ){ w ù ! +{ $

Annexe 24 : Type de séquence provenant du séquenceur (fichier.*seq). URANO4.33 GTNGGCCGGGTNCCTAATACTTAGCGGCCTTCTACTTAAACTAGGGGGTTACGGACTTATTCGTCTAAGTCCGATACT AG CTACGATTTCCCAGTCCCTCTACTTCGCACCGATAATCTTAGCCCTCTGAGGCATAGTAATAACCAGTTTAATTTGTC TT CGACAAATAGACCTAAAGGCTATTATTGCCTACTCATCTATTAGTCACATGGGGTTGGTTGTTGCTGCCACCCTGATC CA AACCCCATGAAGTATTCCTGGGGCCATAACACTAATAATCGCCCATGGCCTGACGTCATCAATACTCTTCTGCTTAGC CA ATATGCACTATGAGCGCACACACACCCGCACCCTTATTCTCACTCGAGGGTGCTGCATTGCCCTTCCTCTCACTACAG TA TGGTGGTTTTNGNCCACCNNNNAANCNNNNANANNANNANCAANNAATCNNTTANGGGACNANAANNANNNNNGCNCN NN NNNNNNGNNNNNCNANNNCNNNTNNNNNANNGGNCNNANNANNNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNAAANN NN NNNNNNNNGNNANNNNNNCNNNNNNNNNANNNNNNNGNNNNNNNANNNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NN

______Annexes Annexe 25 : Un échantillon d’électrophorégramme obtenu par le séquenceur ABI 3100.

Annexe 26 : Classification CITES Annexe II. L'Annexe II comprend toutes les espèces qui ne sont pas nécessairement menacées d'extinction mais dont le commerce des spécimens doit être réglementé pour éviter une exploitation incompatible avec leur survie. (Spécimens couverts par l'Annexe II). Un permis d'exportation ou un certificat de réexportation délivré par l'organe de gestion du pays d'exportation ou de réexportation est requis. Le permis d'exportation n'est délivré que si le spécimen a été obtenu légalement et si l'exportation ne nuit pas à la survie de l'espèce. Le certificat de réexportation n'est délivré que si le spécimen a été importé conformément aux dispositions de la Convention. Les plantes et les animaux vivants doivent être mis en état et transportés de façon à éviter les risques de blessures, de maladies ou de traitement rigoureux. Un permis d'importation n'est pas nécessaire sauf s'il est requis par la loi nationale. Dans le cas des spécimens d'espèces inscrites à l'Annexe I ou à l'Annexe II introduits en provenance de la mer, un certificat doit être délivré par l'organe de gestion du pays dans lequel entrent les spécimens.

Annexe 27 : Statut National des uroplates. Les uroplates sont classés C1 Cl II dans le statut national des espèces sauvages à Madagascar. • Catégorie 1 : Espèces protégées • Classe II : les espèces peuvent donner lieu à délivrance d’autorisation de chasse ou de capture. Le quota de collecte pour chaque espèce de cette classe est fixé par l’organe de gestion de la CITES sur proposition de l’Autorité Scientifique (AS).

______Annexes Annexe 28 : Tableau montrant l’exportation de spécimens de geckos à queue plate entre 2000 et 2006.

Catégorie Classement Exportation Taux Famille Genre espèce (Statut CITES 2000- 2006 d’exportation national) Gekkonidae Uroplatus ebenaui Annexe II C1 Cl2 5255 17,52 % Gekkonidae Uroplatus fimbriatus Annexe II C1 Cl2 5671 18,90 % Gekkonidae Uroplatus guentheri Annexe II C1 Cl2 40 0,13 % Gekkonidae Uroplatus henkeli Annexe II C1 Cl2 3169 10,56 % Gekkonidae Uroplatus lineatus Annexe II C1 Cl2 3593 11,98 % Gekkonidae Uroplatus malama Annexe II C1 Cl2 42 0,14 % Gekkonidae Uroplatus phantasticus Annexe II C1 Cl2 7445 24,82 % Gekkonidae Uroplatus pietschmanni Annexe II C1 Cl2 337 1,12 % Gekkonidae Uroplatus sikorae Annexe II C1 Cl2 4448 14,83 %

Nom et Prénom : RATSOAVINA Mihaja Fanomezana Titre du mémoire : Etude éco-biologiques des uroplates et implication des analyses phylogénétiques dans leur systématique Pagination : 79 Tableaux : 13 Figures : 33 ______Résumé Ce travail porte sur une étude éco-biologique et phylogénétique des uroplates dans les forêts humides tropicales de l’Est et du Sud-Est de Madagascar. Les espèces Uroplatus fimbriatus, U. lineatus, U. phantasticus, U. sikorae sikorae et U. sikorae sameiti ont été inventoriées dans la RNI de Betampona (Septembre 2005) et le PN de Ranomafana (Janvier et Mars 2004). 75 individus ont été capturés dans les deux sites. La taille, le poids et le sexe de chaque animal ont été notés. Toutes les mesures concernant la taille montrent des valeurs supérieures à celles trouvées par les chercheurs précédents sauf pour U. s. sameiti qui est de 104,7 mm. Le type de support, la distribution verticale et la période d’activité sont aussi bien collectés pour chaque espèce. La plupart des individus trouvés préfèrent la branche comme perchoir. Mais U. phantasticus est rencontrée aussi bien que sur des feuilles, que des fines branches et des lianes en raison de sa petite taille. Les espèces de grande taille sont souvent trouvées sur les troncs d’arbre et les branches. A Betampona, les individus sont trouvés de 0,5 m à 6 m du sol. A Ranomafana, les animaux évoluent à partir de 0,5 m jusqu’à 8 m du sol. Une large répartition verticale est notée chez U. s. sikorae de 0,5 à 8 m. Une extraction de l’ADN total à partir du tissu caudal, une amplification par PCR de l’ADN cible et son séquençage ont été effectués pour un total de 93 individus d’uroplates et 2 Phelsuma comme groupe externe. 893 paires de bases de l’ADN mitochondrial ont été alignées pour les gènes de la sous-unité 4 de la deshydrogénase-NADH (ND4), l’ARNtHis, l’ARNtSer et l’ARNtLeu . Le logiciel PAUP version 4.0b5. est utilisé pour obtenir des phylogrammes par les méthodes Neighbor-joining et Maximum parcimonie. Le diagramme en réseau a été construit à l’aide du programme Network. La fiabilité de chaque analyse est donnée par un test de Bootstrap avec 1000 répétitions. La monophylie au sein du genre Uroplatus est confirmée par l’analyse. Les individus collectés dans chaque site forment chacun un clade et même étant géographiquement proches, la distance génétique entre les espèces est grande et implique la notation en type. Les espèces déjà décrites sont confirmées par l’analyse. Mais, elle met aussi en cause le statut des taxa puisque la distance génétique entre deux espèces différentes est inférieure à celle entre deux types ou sous-espèces. Même si la description de nouvelle forme dépasse le cadre du présent travail, Il encourage de faire des recherches plus étendues pour avancer dans la connaissance de l’histoire naturelle ainsi que la phylogénie et la conservation du groupe. ______Mot clés : Uroplatus, Ecologie, ADN mitochondrial, PCR, Séquençage, Phylogénie, Ranomafana, Betampona, Madagascar. Encadreur : Dr RAZAFIMAHATRATRA Emilienne Lot : Lot IVH 171 C Ambohimanandray Adresse e-mail : [email protected] Téléphone : +261324112588