METILINOSITOL ISOLADO DE Magonia Glabrata PROTEGEM

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

CHALCONAS ISOLADAS DE Myracrodruon urundeuva e 2-O- METILINOSITOL ISOLADO DE Magonia glabrata PROTEGEM NEURÔNIOS DE DANOS OXIDATIVOS E APOPTOSE INDUZIDA POR 6-HIDROXIDOPAMINA (6-OHDA): ESTUDO EM CULTURA PRIMÁRIA DE CÉLULAS MESENCEFÁLICAS DE RATOS.

HÉLIO VITORIANO NOBRE JÚNIOR

Fortaleza-CE 2005 ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

HÉLIO VITORIANO NOBRE JÚNIOR

Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito para obtenção do título de Doutor em Farmacologia

Orientadora: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha

Fortaleza-CE 2005 iii

Esta tese foi submetida como parte integrante dos requisitos necessários a obtenção do Grau de Doutor em Farmacologia, outorgado pela Universidade Federal do Ceará e encontra-se a disposição dos interessados na biblioteca da Faculdade de Medicina da referiada universidade.

A citação de qualquer trecho desta tese é permitida, desde que seja feita de conformidade com as normas da ética.

Hélio Vitoriano Nobre Júnior

Tese aprovada em: 11/08/2005

Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha (orientadora) Universidade Federal do Ceará

Prof. Dr. Manuel Odorico de Moraes (co-orientador) Universidade Federal do Ceará

Profa. Dra. Maria da Graça Naffah-Mazzacoratti Universidade Federal de São Paulo

Prof. Dr. John Fontenele Araujo Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana Universidade Federal do Ceará

O BAMBU CHINÊS (autor desconhecido)

Depois de plantada a semente deste incrível arbusto, não se vê nada por aproximadamente 5 anos, exceto um lento desabrochar de um diminuto broto a partir do bulbo.

Durante 5 anos, todo o crescimento é subterrâneo, invisível a olho nu, mas... uma maciça e fibrosa estrutura de raiz que se estende vertical e horizontalmente pela terra está sendo construída. Então, no final do 5º ano, o bambu chinês cresce até atingir a altura de 25 metros.

O escritor Stephen Covey escreveu:

"Muitas coisas na vida pessoal e profissional são iguais ao bambu chinês. Você trabalha, investe tempo, esforço, faz tudo o que pode para nutrir seu crescimento, e às vezes não vê nada por semanas, meses ou anos. Mas se tiver paciência para continuar trabalhando, persistindo e nutrindo, o seu 5.º ano chegará, e com ele virão um crescimento e mudanças que você jamais esperava..."

O bambu chinês nos ensina que não devemos facilmente desistir de nossos projetos e de nossos sonhos... Em nosso trabalho especialmente, que é um projeto fabuloso que envolve mudanças de comportamento, de pensamento, de cultura e de sensibilização, devemos sempre lembrar do bambu chinês para não desistirmos facilmente diante das dificuldades que surgirão.

Procure cultivar sempre dois bons hábitos em sua vida: a Persistência e a Paciência, pois você merece alcançar todos os seus sonhos..!!!

"É preciso muita fibra para chegar às alturas e, ao mesmo tempo, muita flexibilidade para se curvar ao chão."

Aos meus amados pais, Hélio e Jandira, incentivadores e amigos de todas as horas.

Agradecimentos

A Deus, por se fazer sempre muito presente, dando-me forças para enfrentar todos os momentos dessa caminhada e iluminado-me nos momentos obscuros da vida .

Aos Meus pais, Hélio Vitoriano Nobre e Josefa Jandira de Queiroz Magalhães

Nobre, por terem me dado a vida, não tão somente ela mas tudo de bom que aprendi foi por seus ensinamentos, conselhos e amor; e com ela pude chegar até onde estou hoje, sempre com muito carinho, dedicação e atenção.

Às minhas irmãs queridas, Rafaela de Queiroz Magahães Vitoriano Nobre e Fabricia de Queiroz Magahães Vitoriano Nobre, por serem além de irmãs grandes amigas.

Ao meu irmão, Paulo de Queiroz Magalhães Vitoriano Nobre, pelo incentivo de amigo e por tudo que fez durante minha vida.

Á toda minha família, em especial aos meus avós Paulo Solon e Dedece por sempre estarem participando das minhas conquistas, sempre presentes em tudo que conquistava, mesmo nos momentos de dificuldades tive o apoio de todos.

Ás minhas tias Fátima de Queiroz, Eliana de Queiroz, Tamires, Isomar e Basinha que pelo seu apoio permitiram que pudesse chegar até onde estou hoje, minha eterna gratidão.

À minha namorada Denise, pela paciência nos momentos de ausência, apoio e incentivo nos momentos mais difíceis.

À minha incontestável, inestimável, amiga, e querida Orientadora Dra. Geanne

Matos de Andrade Cunha, a qual além de apoiar-me na construção do saber científico, através de seus ensinamentos, mostrou também ser de uma professora dedicada e atenciosa mostrou-me que ser inteligente, correta e digna faz parte de sua vida. vii

Ao meu grande amigo e Co-orientador Prof. Dr. Manoel Odorico de Mores Filho, pelos ensinamentos transmitidos mesmo quando a distância, pela oportunidade que sempre depositou em mim, quero sempre ser grato por sua existência.

A Professora Claudia do Ó Pessoa, por seus incentivos e principalmente, por sua vontade em transmitir seus conhecimentos a qual me levou ao LOE, no qual teve início a tudo hoje conquistado.

À profa. Glauce Socorro Barros Viana, pela recepção em seu laboratório e pelas importantes discussões que em muito contribuíram para a realização desta tese.

Ao grande amigo sábio Prof Vietla Satyanaraiana Rao, por estar sempre presente ajudando e incentivando, mostrando que nos caminhos tortuosos sempre existe uma saída sábia, compartilhando de toda sua sabedoria e inteligência conosco, além de sua grandiosa humildade que faz com que tenhamos um enorme carinho pelo seu trabalho científico;

Aos Professores do Curso de Pós-Graduação, por terem transmitido com muita dignidade seus conhecimentos, os quais adquiriram com muito esforço e dedicação;

À Dra. Mary Anne, do Departamento de Farmácia da Faculdade de Farmácia,

Odontologia e Enfermagem, por sua colaboração em não só ceder a fração enriquecida de chalconas como também pela inestimável ajuda e incentivo para a realização deste trabalho.

À Dra. Telma, do Departamento de Química Orgânica da UFC por ceder o composto 2-

O-metiloinositol e também pelo seu apoio incondicional e paciência.

Aos Amigos do Laboratório de Oncologia Experimental(LOE), Hemerson Yuri, Patricia

Bonavides, Patrícia Marcal, Alessandra, Bruno, Diego, Fernanda, Ivana, Karla,

Márcio (macaco), Raquel Montenegro, Marne, Rômulo (gavião), Gardênia, Paulinha, meu agradecimento a todos vocês e tantos outros que por aqui passaram como é o caso do meu amigo Sérgio (cobra) por terem colaborado na minha pesquisa científica, fazendo do trabalho diário um ambiente mais ameno e alegre. Em especial a duas grandes amigas do viii laboratório de LOE , Silvana e Fátima, por toda sua paciência e amizade , não somente comigo, mas com todos que ali trabalham, pois além de tudo merece o mérito de minha tese.

Aos Colegas da Pós-Graduação, por termos juntos vencidos tantas disciplinas, apresentações de artigos relatórios e provas com um saldo maravilhoso, que um ambiente solidário de paz e amizade é necessário para que cresçamos juntos em tudo;

Às minhas grandes amigas Kaline e Regilane, dos Laboratórios de Neurofarmacologia e

Farmacologia de Produtos Naturais que sempre me ajudaram em o que precisava, e pelo apoio amigo, além dos momentos de descontração por qual passamos juntos;

Aos meus amigos Flávio Damaceno Maia e Rivelilson Mendes de Freitas pela essencial colaboração na realização das análises bioquímicas que nos levaram a alguns trabalhos em congressos e publicações;

À meu grande amigo Iri Sandro Pampolha Lima e sua esposa Érica por além de uma amizade que conquistamos, transpomos todos esses anos juntos lutando pelos nossos sonhos, sonhos estes que hoje me faz acreditar que além de um amigo tenho um irmão.

Ao meu grande amigo Ricardo Araujo de Oliveira por ajudar-me durante toda esta tese, sempre com sua sabedoria, honestidade e humildade que carrega, e por mostrar que

é no trabalho que encontramos a sabedoria, e que não basta ser amigo, tem que participar;

A Bolsista do LOE, Marcelle, pela ajuda no desenvolvimento dos experimentos, que em muito contribuíram nas horas difíceis e pelo apoio amigo;

Aos amigos do HEMOCE, Marcos, Ana Cláudia e Eunice, por incentivo e apoio.

A Unidade de Farmacologia Clínica (UNIFAC) na pessoa da Profa. Dra. Maria Elisabete

Amaral de Moraes, pela disponibilidade da estrutura e apoio incondicional na realização das análises necessárias. ix

As Secretárias do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Aura, Marta, Joana e Rejane que sempre estiveram dispostas a nos ajudar no que fosse preciso. E também a

Rose, que sempre organizada soube guiar-me quando precisava de algo.

A Capes/CNPq e Funcap, por ter colaborado financeiramente durante todo o desenvolvimento da pesquisa.

SUMÁRIO

Lista de Figuras...... xv Lista de Abreviaturas...... xx Resumo...... xxii Abstract...... xxiii

1. INTRODUÇÃO 25 1.1 Doença de Parkinson – Epidemiologia e Fatores de risco 25 1.2 Patogênese 26 1.3 Dopamina e Doença de Parkinson 28 1.4 Complexos Mitocondriais e Doença de Parkinson 33 1.5 Estresse Oxidativo e Doença de Parkinson 34 1.6 Apoptose 38 1.7 Modelo da Doença de Parkinson 43 1.8 Plantas medicinais 45 1.9 Flavonóides 49 1.10 Aroeira-do-Sertão (Myracrodruon urundeuva Allemão) 61 1.11 Inositois 65 1.12 Tingui de Bola (Magonia glabrata St Hill). 67 1.13 Relevância e Justificativa 69

2. OBJETIVOS 71 2.1 Objetivo geral 71 2.2 Objetivos Específicos 71

3. MATERIAIS E MÉTODOS 73 3.1 Drogas 73 3.2 Isolamento da fração enriquecida de chalconas (FEC) obtido de 73 Myracrodruon urundeuva 3.3 Isolamento do 2-O-Metil-Inositol (MI-TE) obtido de Magonia Glabrata 74

3.4 Animais 75 3.5 Culturas de células mesencefálicas de rato 75 3.6 Neuroprevenção e Neuroresgate 75 3.7 Ensaio de neurotoxicidade - Teste do MTT 77 3.8 Determinação do Nitrito 77 3.9 Determinação da peroxidação lipídica pela medição de substâncias 78 tiobarbitúricas ácido-reativas (TBARS). 3.10 Avaliação do padrão de morte celular por laranja de acridina / brometo 79 de etídio. 3.11 Imuno-histoquímica para tirosina hidroxilase 80 3.12 Análise Estatísca 80

4. RESULTADOS 82 4.1 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) Deferoxamina (DEF) 82 sobre percentual de células dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de rato expostas à 6-OHDA. Protocolo de Neuroprevenção e de Neuroresgate.

4.2 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre percentual de células 86 dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de rato quando expostas à 6-OHDA. Protocolo de Neuroprevenção e de Neuroresgate.

4.3 Efeito citotóxico da 6-OHDA sobre a viabilidade de células 91 mesencefálicas de rato.

4.4 Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalconas (FEC) 91 isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos exposta à 6-OHDA 40µM.

4.5 Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalconas (FEC) 94 isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos exposta à 6-OHDA 200 µM.

4.6 Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada 96 de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM.

4.7 Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada 96 de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM.

4.8 Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do 99 fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM.

4.9 Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do 99 fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200 µM.

4.10 Efeito de neuroresgate do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do 102 fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40 µM.

4.11 Efeito de neuroresgate do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do 102 fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200 µM.

4.12 Efeito da 6-OHDA sobre a produção de nitrito em cultura de células 105 mesencefálicas de rato.

4.13 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de 105 Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (Protocolo de Neuroprevenção).

4.14 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células 108 mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

4.15 Efeito da fração enriquecida de chalconas FEC isolada de 110 Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células xii

mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (Protocolo de Neuroresgate).

4.16 Efeito da fração enriquecida de chalconas FEC isolada de 110 Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM (Protocolo de Neuroresgate).

4.17 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia 113 glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40 µM (Protocolo de Neuroprevenção).

4.18 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia 113 glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM (Protocolo de Neuroprevenção).

4.19 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia 116 glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (Protocolo de Neuroresgate).

4.20 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia 116 glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

4.21 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de 119 Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostass à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

4.22 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolado de 121 Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate). 4.23 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia 123 glabrata sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos a 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

xiii

4.24 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia 125 glabrata sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostass à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

4.25 Efeito neuropreventivo da Deferoxamina (DEF) em células 127 mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA.

4.26 Efeito de neuroresgate da Deferoxamina (DEF) em células 127 mesencefálicas de ratos expostas a 6-OHDA.

4.27 Efeito da DEF sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de 129 ratos exposta à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

4.28 Efeito do DEF sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de 129 ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

4.29 Efeito da deferoxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em células 131 mesencefálicas de ratos exposta à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

4.30 Efeito da DEF sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de 131 ratos exposta à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

4.31 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e Deferoxamina (DEF) 133 sobre o padrão apoptótico em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). 4.32 Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e Deferoxamina (DEF) 136 sobre o padrão apoptótico em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

4.33 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em células 139 mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

4.34 Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em células 142 mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

xiv

5. DISCUSSÃO 146 6. CONCLUSÕES 165 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 167

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Vias dopaminérgicas no SNC. 28

Figura 2- Corte transversal de mesencéfalo. 30

Figura 3- Corpos de Lewy em coloração por HE/Imunoperoxidase. 31

Figura 4- Formação de radicais livres. 35

Figura 5- Cascata da apoptose 43

Figura 6- As neurotoxinas utilizadas em modelos de doença de Parkinson 45

Figura 7- Núcleo fundamental dos flavonóides 50

Figura 8- Núcleo fundamental das chalconas 57

Figura 9- Aroeira do Sertão 62

Figura 10- Representação estrutural da fração enriquecida de chalcona. 64

Figura 11- Tingui de Bola 67

Figura 12- Representação estrutural do 2-O-metilinositol (MIT). 68

Figura 13- Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF) 83 sobre a morfologia das células mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina hidroxilase (TH+) expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 14- Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF) 84 sobre a morfologia das células mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina hidroxilase (TH+) expostas a 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

Figura 15- Efeito da FEC sobre o percentual de células dopaminérgicas em em cultura 85 de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. xvi

Figura 16- Efeito do do 2-O-metilinositol (MIT) sobre a morfologia das células 87 mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina hidroxilase (TH+) expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 17- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre a morfologia das células 88 mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina hidroxilase (TH+) expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

Figura 18- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o percentual de células 89 dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA.

Figura 19- Efeito da deferoxamina (DEF) sobre o percentual de células 90 dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA.

Figura 20- Efeito da 6-OHDA sobre a viabilidade de células mesencefálicas de rato. 92

Efeito de neuroprevenção da fração enriquecida de chalconas (FEC) 93 Figura 21- isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM.

Figura 22- Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalcona (FEC) isolada da 95 Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6- OHDA 200µM.

Figura 23- Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada 97 da Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM.

Figura 24- Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada 98 de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM. Figura 25- Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do 100 fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM.

Figura 26- Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do 101 fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM. xvii

Figura 27- Efeito de neuroresgate do MIT isolado da casca do fruto de Magonia 103 glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM.

Figura 28- Efeito de neuroresgate do MIT isolado da casca do fruto de Magonia 104 glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM. Figura 29- feito da 6-OHDA sobre os níveis de nitrito em células mesencefálicas de 106 rato.

Figura 30- Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon 107 urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 31- Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon 109 urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 32- Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon 111 urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (Protocolo de Neuroresgate).

Figura 33- Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon 112 urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM (Protocolo de Neuroresgate).

Figura 34- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia 114 glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 35- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia 115 glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 36- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia 117 glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (Protocolo de Neuroresgate).

xviii

Figura 37- Efeito do 2-O-metilinositol MIT isolado da casca do fruto de Magonia 118 glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM (Protocolo de Neuroresgate).

Figura 38- Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon 120 urundeuva sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de rato expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 39- Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de 122 Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de TBARS em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

Figura 40- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia 124 glabrata sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de rato expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 41- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia 126 glabrata sobre os níveis de TBARS em cultura de células mesencefálicas de ratos exposta à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

Figura 42- Efeito neuropreventivo da deferoxamina (DEF) em células 128 mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA.

Figura 43- Efeito de neuroresgate da DEF em células mesencefálicas de ratos 128 exposta à 6-OHDA.

Figura 44- Efeito da deferoxamina (DEF) sobre a formação de nitrito em cultura de 130 células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 45- Efeito da DEF sobre a formação de nitrito em cultura de células 130 mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

Figura 46- Efeito da deferoxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em células 132 mesencefálicas de rato expostas a 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 47- Efeito da deferoaxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em cultura de 132 células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate). xix

Figura 48- Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) sobre o padrão 134 apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6- OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 49- Efeito da fração enriquecidada de chalconas (FEC) sobre o padrão 135 apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6- OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 50- Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) sobre o padrão 137 apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6- OHDA (Protocolo de Neuroresgate). Figura 51- Efeito da fração enriquecidada de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF) 138 sobre o padrão apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas, à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

Figura 52- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de 140 células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 53- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de 141 células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

Figura 54- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de 143 células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

Figura 55- Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de 144 células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HT- serotonina 6-OHDA- 6-hidroxidopamina ANOVA- análise de variância Apaf-1- fator ativador de proteases pró-apoptóticos 1 Apaf-3- fator ativador de proteases pró-apoptóticos 3 BE- brometo de etídio BHE- barreira hemato-encefálica BSA- albumina de soro bovino CAM- moléculas de adesão celular CARD- ou domínio de recrutamento de caspases COMT- catecol-O-metil transferase DA- dopamina DED- contendo domínio efetor de morte DEF- deferoxamina DOPAC- ácido 3,4 dihidroxifenilacético DP – doença de Parkinson EAE- extrato etilacetato EGCG- epigalocatequina-3-galato EPM- erro padrão da média EROS- espécies reativas de oxigênio FEC- fração enriquecida de chalconas fMLP/CB- formil-Met-Leu-Phe/citochalasina B GSH- glutationa reduzida HD- doença de Huntington HPLC-cromatografia líquida de alta performance xxi

HVA- ácido homovanílico ICAM-1- moléculas de adesão intercelular LA- laranja de acridina LDL- lipoproteínas de baixa densidade LPS- lipopolissacarídeo MAPK- mitogen-activated protein kinases MDA- malonil di-aldeído MEM- Meio Essencial de Eagle MIT- 2-O-metilinositol MPTP- 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina MTT- 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium brometo NF-Kapa B- fator nuclear Kapa B NI- nitrito SNC-sistema nervoso central SOD- superóxido dismutase TBARS - substâncias tiobarbituricas ácido-reativas TH- tirosina hidroxilase TNF- fator de necrose tumoral TNF-α- fator de necrose tumoral alfa TPA- tetradecanoilforbol xxii

RESUMO

Chalconas isolada de Myracrodruoun urundeuva e 2-O-metilinositol isolado de Magonia glabrata protegem neurônios de danos oxidativos e apoptose induzida por 6-hidroxidopamina (6-OHDA): estudo em cultura primária de células mesencefálicas de ratos. HÉLIO VITORIANO NOBRE JUNIOR. Orientadora: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha. Tese de Doutorado. Curso de Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2005.

No presente trabalho, estudou-se o efeito citoprotetor da fração enriquecida de chalconas (FEC) e do 2-O-metilinositol (MIT) em cultura primária de células mesencefálicas de ratos expostas à neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA). A FEC foi isolada de Myracrodruoun urundeuva, planta medicinal brasileira comumente utilizada como antiinflamatório do trato genital feminino. Nesta fração estão presentes as chalconas diméricas urundeuvinas A, B e C. Outro composto estudado foi o MIT, isolado de Magonia glabrata, uma planta popularmente conhecida como “Tingui de Bola”, cujas cascas de suas raízes são usadas como “veneno” para facilitar a pesca nos lagos e rios. O MIT é um monossacarideo com um único anel da estrutura poli-hidroxilada. Apesar de relatos da toxicidade desta planta, o composto estudado não apresentou toxicidade. As células foram cultivadas durante quatro dias e após este tempo foram pré-incubadas com FEC ou MIT três horas antes (Protocolo de neuroprevenção) ou três horas após (Protocolo de neuroresgate) a adição da 6-OHDA. A imunohistoquímica para tirosina hidroxilase revelou um percentual de células dopaminérgicas em torno de 2%. A 6-OHDA (40 e 200 µM), promoveu uma diminuição na viabilidade celular em torno de 37,65% e 63,44% para células não dopaminérgicas (TH-) e (79,78% e 93,75%) para células dopaminérgicas (TH+) e aumentou os níveis de nitrito para 551,9% e 721,3% respectivamente em relação ao controle. Além disso induziu uma grande peroxidação lipídica (aumento de 166,84%) como observados pelos ensaios MTT, nitrito e TBARS, respectivamente. Na concentração de 200µM a 6- OHDA induziu uma grande morte celular, com aumento de células em apoptose tardia e necrose. Os resultados mostraram que a FEC (1; 10 e 100 µg/mL) reduziu significativamente e de maneira dose- dependente (p<0,05) a morte celular induzida pela 6-OHDA (40 e 200 µM). Além disso preveniu o aumento de nitrito e a peroxidação lipídica. A FEC demonstrou atividade antiapoptótica e preveniu a necrose causada pela 6-OHDA (200 µM) (nos dois Protocolos estudados). O MIT (1, 10 e 100 µg/mL) protegeu tanto as células TH- quanto TH+ do dano induzido pela 6-OHDA (40 e 200µM) (em ambos os Protocolos), reduzindo os níveis de nitrito e a peroxidação lípidica. Também demonstrou uma potente atividade antiapoptótica. Estes resultados demonstram que a neuroproteção dos compostos estudados, FEC e MIT, se deva as ações antioxidante, além de uma proteção a nível mitocondrial destes polifenois, no caso do MIT também não se podendo descartar uma ação a nível de segundo mensageiro, via formação de inositol trifosfato e ativação de PKC. Os achados podem ter uma futura importância clínica em doenças neurodegenerativas tais como na Doença de Parkinson.

Palavras-chaves: culturas de célula mesencefálicas; 6-hidroxidopamina; peroxidação lipídica; neuroprevenção; neuroresgate; Myracrodruoun urundeuva; Magonia glabrata; chalconas; urundeuvinas; 2-O-metilinositol.

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ABSTRACT

Chalcones isolated from Myracrodruon urundeuva and 2-methyl-inositol isolated from Magonia glabrata protect neurons from 6-hydroxydopamine-induced oxidative injury and apoptose: study in rat mesencephalic cell cultures. HÉLIO VITORIANO NOBRE JUNIOR. Orientadora: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha. Tese de Doutorado. Curso de Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2005

The present work evaluated the cytoprotective effect of chalcone-enriched fraction (CEF) and 2- methyl-inositol (MIT) in primary rat mesencephalic cell culture exposed to the neurotoxin 6- hydroxydopamine (6-OHDA). The CEF was obtained from Myracrodruon urundeuva, a Brazilian medicinal plant used as an antiinflamatory and wound healing agent.in female genital tract. In this fraction there are the dimerics chalcones urundeuvinas A, B e C The other compound was the MIT isolated from Magonia glabrata, a plant popularly known as “Tingui de Bola”, which bark from its root is used as poison to catch the fishes from lakes and rivers. The immunohistochemical assay for tyrosine hydroxylase revealed that the percentage of dopaminergic cells in our cultures is approximately 2%. After exposition to 6-OHDA (40 and 200 µM) the cellular viability was reduced to 88,81% and 35,45% respectively. The mitochondrial activity was reduced to 88,8 and 35,4%, the nitrite levels was increased to 551,9% and 721,3% respectively and the lipid peroxidation was increased to 166,84% in the concentration of 200 µM, as observed in the MTT, nitrite and TBARS assays respectively. The results show that the exposition to CEF (100 µg/mL) before 6-OHDA (neuroprevention experiment) or after 6-OHDA (neurorescue experiment) reduced significantly the cell death caused by 6-OHDA (40 e 200 µM). The CEF prevented significantly the increase in nitrite levels induced by 6-OHDA (40 and 200 µM) (in both experiments), except in the neurorescue experiment in which the CEF failed to revert the increase in nitrite levels generated by 6-OHDA (200 µM). The CEF inhibited the lipid peroxidation induced by 6-OHDA (200 µM) in both experiments, and also showed antiapoptotic activity against 6-OHDA (40 and 200 µM) in both experiments. The MIT protected significantly TH- and TH+ cells from injury induced by 6-OHDA (40 and 200 µM) in both experiments. It showed a reduction in the nitrite levels generated by 6-OHDA in both experiments. The MIT also reverted the lipid peroxidation generated by 6-OHDA (200µM) and showed antiapoptotic activity against 6-OHDA (40 and 200µM) in both experiments. These results suggest that the neuroprotective action these compounds, CEF and MIT are due to antioxidant, besides a possible mitochondrial protection of these polyphenols. In related to MIT not must be discarded the idea of a second messenger action through the production of inositol triphosphate and protein kinase C activation. The findings may have a clinical importance in neurodegenerative conditions like Parkinson’s disease.

Key-words: mesencephalic cell culture; 6-hydroxydopamine; lipid peroxidation; neuroprevention; neurorescue; Myracrodruoun urundeuva, Magonia glabrata; chalcone-enriched fraction; urundeuvine, 2-O-metilinositol.

INTRODUÇÃO 25

1. INTRODUÇÃO

1.1. Doença de Parkinson – Epidemiologia e Fatores de risco

O aumento da expectativa de vida da população mundial trouxe consigo os problemas que acometem principalmente a velhice. A intensa busca do desenvolvimento de drogas que modifiquem o curso das doenças neurodegenerativas representa um avanço. Assim este trabalho explora o conceito de neuroproteção no contexto da Doença de Parkinson (DP) e resume os avanços recentes nesta área, em particular, o papel dos antioxidantes agindo como agentes modificadores da doença (TANNER ; GOLDMAN,1996).

A Doença de Parkinson é a desordem do movimento mais comum, afetando 1% da população na faixa etária de 65 anos e aumentando para 4- 5% na população acima de 85 anos (ERIKSEN, 2003). Trata-se da segunda principal doença neurológica degenerativa depois do mal de Alzheimer e ainda será preciso muita pesquisa para que a ciência descubra sua origem e tratamentos para evitar a degeneração progressiva causada por esta doença. Adolf Hitler, Saddam Hussein, o ex-presidente norte americano Harry Truman e mais recentemente o Papa João Paulo II popularizaram a doença, que já faz parte do cotidiano de muitos brasileiros.

A DP é um dos distúrbios neurológicos mais comuns na prática médica. Diversos estudos encontraram incidências anuais que variam aproximadamente de 16 a 20 casos por 100.000 habitantes, e prevalência média de 120 por 100.000 habitantes. Em todos os estudos epidemiológicos foram detectados aumentos significativos na prevalência com o avanço da idade. Outros fatores de risco observados foram o sexo (com maior prevalência da DP nos homens, sendo a média das taxas homem para mulher aproximadamente igual a 1,5), raça (uma maior prevalência foi observada na América do Norte e Europa em relação a encontrada no Japão, China e África), predisposição genética, infecções, trauma e estresse emocional (TANNER ; GOLDMAN,1996).

Existem diferente fatores etiológicos para DP. Estes incluem reconhecidamente fatores genéticos e ambientais e hipoteticamente interações entre estes. Um destes é a geração de radicais livres, os quais têm sido implicados na toxicidade de muitos agentes químicos, como o safrole, o paration, entre outros e na patogênese de muitas doenças inflamatórias, tais como DP, Doença de Alzheimer, fibrose pulmonar idiopática, nefrose autoimune, na catarata, esclerose múltipla, porfiria, aterosclerose e câncer (KEHRER, 1993 ; REITER et al., 1999).

Um componente genético de DP foi considerado por Gowers quando observou que a desordem se manifestava mais comumente nas famílias de doentes. Isto foi confirmado por inúmeros estudos de casos-controle estimando que parentes de primeiro grau de pacientes com DP têm 2 ou 5 vezes mais riscos para o desenvolvimento da doença (DUVOISIN et al.,1969; MARTIN et al.,1973; ALONSO et al.,1986; BUTTERFIELD et al.,1993; MARTTILA; RINNE,1976; VIEREGGE ; HEVERLIN,1992; SEMCHUK et al.,1993; PAYAMI et al.,1994; BONIFATI et al.,1995; VIEREGGE ; HEVERLIN,1995; DEMICHELE et al.,1996; MARDER et al.,1996; LAZZARINI et al.,1994; GASSER,1998).

Estudos em gêmeos têm tradicional significado como estimativa da contribuição genética para uma desordem. O aumento da freqüência da doença em gêmeos monozigóticos em oposição aos dizigóticos é um indicativo de contribuição genética significante. Em associação os estudos de caso-controle, os recentes estudos de gêmeos confirmam que a contribuição genética para a etiologia da DP a qual é provavelmente mais significativa em pacientes jovens. Inevitavelmente devido a heterogeneidade da etiologia da DP, um componente genético será mais importante em alguns pacientes que em outros (YOUNG et al., 1999).

1.2. Patogênese

A doença de Parkinson - ou parkinsonismo primário - foi descrita pela primeira vez por James Parkinson em 1817. O Dr. Parkinson (1755-1824) era membro do colégio real de

27 cirurgiões da Inglaterra. Inicialmente a doença foi descrita como "paralisia agitante". A DP é uma doença neurodegenerativa caracterizada por tremor involuntário (mesmo quando em repouso), acinesia, rigidez, anormalidades na postura e episódios de interrupção motora (BARBOSA et al.,1997;YOUNG et al.,1999).

Anormalidades adicionais na substância negra de pacientes com DP incluem evidências da produção de citocinas inflamatórias, provavelmente microglia reativa (MCGEER et al., 1988; HIRSCH et al.,1998; BENVENISTE et al.,1992; HOPKINS et al.,1995). Tais mudanças não são específicas para DP e podem ser vistas em outras doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer e doença de Huntington (HD), embora em lugares diferentes que a substancia negra. Portanto, mudanças inflamatórias são provavelmente secundárias embora possam contribuir para a patogênese.

Existem ramificações glutamatérgicas provenientes do núcleo subtalâmico para a substância negra. Isto cria a oportunidade para um dano celular mediado por excitotoxinas. Em suporte a isso existem evidências de resíduos protéicos nitrotirosinas em corpos de Lewy (GIASSON et al., 2000). Contudo, o dano promovido pela nitrotirosina em proteínas também pode ser mediado pela liberação de óxido nítrico (NO) dos neurônios da glia produtores de NO.

Além dos sintomas motores, que são os mais importantes, também estão associadas à DP, em menor freqüências, sintomas como demência, depressão e disfunção autonômica (BARBOSA et al., 1997). Esses sintomas estão associados principalmente ao déficit de dopamina nos gânglios da base, mas os mecanismos fisiopatológicos de como isso se processa ainda não estão bem esclarecidos (BARBOSA et al.,1997; OLEH,1998). A DP compromete severamente a qualidade de vida do paciente, que pode ter dificuldade para ler, escrever e dirigir. Num estágio avançado da doença, os pacientes freqüentemente não conseguem sequer realizar as atividades básicas do cotidiano, resultando em perda do emprego e da autonomia do paciente (YOUNG et al.,1999) .

1.3. Dopamina e Doença de Parkinson

O neurotransmissor dopamina está presente na maioria das regiões do SNC, originando- se de longos axônios que partem da substância negra e área tegumentar ventral e inervam os núcleos da base, partes do sistema límbico e o córtex frontal (figura 1) (CONN, 1994).

Figura 1– Vias dopaminérgicas no SNC.

Neurônios dopaminérgicos produzem dopamina (DA) a partir do aminoácido tirosina, obtido através da dieta. A tirosina é transportada para dentro do neurônio dopaminérgico onde posteriormente sofre ação enzimática (COOPER, 1991). As enzimas que catalisam esta síntese são produzidas e estocadas no corpo celular dos neurônios. A primeira enzima que atua na síntese de DA é a tirosina hidroxilase (TH). Essa é inibida pelo produto final da via de biossíntese, a DA, constituindo o mecanismo de regulação contínua da velocidade de síntese (etapa limitante). É encontrada no citoplasma e cataliza a conversão da tirosina para o

29 aminoácido L-Dopa (1-3,4-diidroxifenilalanina) que sofre a ação rápida de outra enzima a dopa descarboxilase produzindo a DA (COOPER, 1991).

Os neurônios, então, estocam DA em vesículas nos terminais de seus axônios. Quando um neurônio dopaminérgico é ativado, a mudança resultante nas cargas elétricas em ambos os lados da membrana celular (despolarização) induz a liberação de DA na fenda sináptica através de um processo denominado exocitose. Para terminar o processo sinalizador, os neurônios recaptam DA através de um sistema carreador específico localizado na membrana celular (COOPER, 1991).

Para afetar as células alvo, a DA interage com moléculas receptoras específicas na superfície de células alvo. Os subtipos de receptores dopaminérgicos se dividem em duas famílias: a família D1-símile, a qual inclui os subtipos D1 e D5 e a família D2-símile, que inclui os subtipos D2, D3 e D4. Esses receptores realizam suas ações por se acoplarem e ativarem diferentes complexos de proteínas G. Os receptores D1-símile interagem com o complexo de proteínas Gs, resultando em ativação da adenilil ciclase e aumento nos níveis de AMPc intracelular. Os receptores D2-símile interagem com um complexo de proteínas Gi com conseqüente inibição da produção de AMPc (COOPER,1991; DE KEYSER,1993; CIVELLI, 1993).

Os neurônios dopaminérgicos têm origem em três grupos celulares localizados no cérebro. Estes são classificados em A8, A9 e A10 (DAHLSTROM; FUXE,1964; LINDVALL et al.,1984), correspondendo às regiões cerebrais denominadas campo retrorubral (A8), substância negra pars compacta (A9) e área tegumentar ventral (A10). Os axônios dos neurônios dopaminérgicos provenientes destes grupos celulares se estendem para regiões do mesencéfalo, formando três sistemas neuronais, sistema nigroestriatal, o sistema mesolímbico e o sistema mesocortical.

A degradação metabólica da DA é feita no SNC principalmente por duas enzimas: a monoamina oxidase (MAO) e a catecol-O-metil transferase (COMT). A MAO existe em duas formas moleculares semelhantes, codificadas por genes separados (MAO- tipo A e tipo B). A MAO-A possui preferência de substrato para a serotonina. A MAO-B possui preferência de substrato para a feniletilamina. Ambas as isoformas atuam sobre a dopamina. Assim, a degradação da dopamina é feita pela MAO que converte a DA em DOPAC (ácido 3,4 dihidroxifenilacético) a nível neuronal e pela COMT (catecol-O-metil transferase) que converte DA em HVA (ácido homovanílico) dentro do terminal sináptico (COOPER, 1991). O HVA é o principal produto do metabolismo da DA nos seres humanos, enquanto DOPAC é o principal em roedores (COOPER, 1991).

Em 1958, Arvid Carlsson identificou a dopamina como um neurotransmissor independente. Entre as anormalidades nos neurotransmissores encontradas em cérebros autopsiados de pacientes com DP, a perda de dopamina (DA) no striatum (núcleo caudado e putamen) destaca-se como o achado bioquímico mais proeminente, e que está intimamente relacionado a desordem motora da DP (Figura 2).

Mesencéfalo/ corte transversal

(a) (b)

FIGURA 2– Corte transversal de mesencéfalo mostrando: (a) mesencéfalo de individuo com Parkinson onde podemos observar claramente a redução da população de neurônios dopaminérgicos da substância negra (b) mesencéfalo de indivíduo normal onde podemos observar a integridade da substância negra. Fonte - medlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html

Em estágios avançados da doença, a perda de DA no striatum excede os 80%, estando os níveis de DA no putamen consideravelmente mais reduzidos que no núcleo caudado (OLEH et al., 1998). Essa perda da dopamina está associada a degeneração de neurônios que contêm melanina e o aparecimento de corpúsculos de Lewy (fig. 3) principalmente na pars compacta da substância negra, mas também em outras estruturas do tronco encefálico e basais (BARBOSA et al., 1997). Outros neurotransmissores, como a noradrenalina (NA) e 5- hidroxitriptamina (5-HT), estão moderadamente reduzidos em áreas específicas do cérebro na DP. Embora anormalidades da NA e da 5-HT não estejam relacionadas a distúrbios motores, elas podem estar envolvidas em alguns sintomas cognitivos e psiquiátricos comumente vistos na DP (BARBOSA,1997; OLEH et al.,1998).

a b

FIGURA 3– Corpos de Lewy são encontrados em neurônios nas áreas de degeneração. Corpos de Lewy em coloração por HE (a)/Imunoperoxidase (b). Fonte - medlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html

A α-sinucleina foi inicialmente caracterizada como um componente não amilóide das placas senis presentes na doença de Alzheimer, sendo uma proteína abundante no cérebro (UEDA et al., 1993). É sintetizada em ribossomos citosólicos e, entre outros eventos, transportada através dos axônios para os terminais sinápticos onde é armazenada nas vesículas (UEDA et al.,1993; MAROTEAUX et al.,1988; MAROTEAUX et al.,1991). A função precisa da α-sinucleina é desconhecida. Camundongos knockout que não produzem α-sinucleina não têm características fenotípicas óbvias ou patológicas e expressam somente uma pequena

32 mudança na liberação dos neurotransmissores em resposta a estimulação repetitiva (ABELIOVICH et al.,2000; CONWAY et al.,1998). A relevância da α-sinucleina para a grande maioria dos pacientes com PD está no fato de ela estar presente nos chamados corpos Lewy na DP idiopática (SPILLANITINI et al., 1997).

A partir dessa observação tem se sugerido que a agregação e a acumulação de α- sinucleina pode interferir na função proteossomal e resultar em uma disfunção celular relacionada com o acúmulo dos corpos de Lewy (SHERMAN et al., 2001). Além de esta hipótese parecer atrativa existem também evidências de que agregados protéicos são uma resposta protetora ao metabolismo anormal da α-sinucleina. Os radicais livres também parecem ser um alvo específico para a nitração (GIASSON et al., 2000) o que aumentaria o dano das α- sinucleinas (KANDA et al.,2000; HASHIMOTO et al.,1999).

Consequentemente estudos recentes sugeriram que mutações na α-sinucleina podem aumentar a expressão de radicais livres ou prejudicar a atividade mitocondrial (HSU, 2000). A superexpressão de α-sinucleina humana em células de mesencéfalo de rato resulta em aumento da morte celular (ZHOU et al.,2000; FORLONI et al.,2000).

A segunda mutação associada com DP foi identificada em grupos de pacientes jovens autossômicos recessivos no Japão. O locus responsável pela mutação nestas famílias foi encontrado no cromossomo 6 e foi posteriormente caracterizado por deleções como um gene que codifica um proteína desconhecida, posteriormente denominada parquina (MATSUMINE et al., 1997; KITADA et al., 1998; HATTORI et al., 1998). Em contraste com as mutações na α-sinucleina, as quais muito raramente causam DP, mutações na parquina têm sido descritas em uma alta proporção de pacientes jovens com DP (<20 anos) e em pequenos grupos familiares que apresentam padrões autossômicos recessivos de herança (LUCKING et al., 2000). Assim, mutações na parquina podem responder por uma proporção significante (se bem que não a maioria) de casos de DP juvenil. A função da parquina não é conhecida, embora alguns estudos recentes tenham reforçado possíveis ações potenciais no desenvolvimento da DP (SHIMURA et al., 2000)

1.4. Complexos Mitocondriais e Doença de Parkinson

Apesar de a causa de apoptose de células da substância negra não estar completamente definida, a ocorrência de dano mitocondrial e estresse oxidativo tem sido repetidamente encontrado em protocolos experimentais e estudos clínicos (FAHN ; COHEN, 1992). Diminuição da atividade do complexo mitocondrial I tem sido encontrado em tecidos neuronais e extra-neuronais e em células circulantes. Linhagens de células cultivadas utilizando-se DNA mitocondrial de pacientes com doença de Parkinson exibiram deficiência do complexo I e produção aumentada de espécies reativas de oxigênio (SWERDLOW et al., 1996).

Recentemente, o papel do oxido nítrico (NO) na doença de Parkinson tem ganhado importância pelo achado de 3-nitrotirosina no centro de corpúsculos de Lewy, o marcador patológico dessa distúrbio neurodegenerativo (GOOD et al., 1998), e da super-expressão de NO sintase (NOS) no cérebro de pacientes com doença de Parkinson (EVE et al., 1998). Da mesma forma, foram observados 3-nitrotirosina e super-expressão da enzima em neutrófilos circulantes de pacientes com DP, sugerindo uma desrregulação generalizada do gene da NOS (GATTO et al., 2000). A presença de nitrotirosina, um marcador da formação de peroxinitrito também foi observada em mitocôndrias de ratos em modelos experimentais de DP induzidos por MPTP, que foi prevenida pela administração prévia de 7-nitroindasole, um inibidor relativamente inespecífico da NOS. Em células de neuroblastoma SH-SYS5Y, o MPTP e seu produto ativo MPP+ aumentaram a produção mitocondrial de NO, sugerindo um efeito ativador na NOS mitocondrial associado ao aumento do Bax (uma proteína apoptótica), liberação de citocromo c e ativação das caspases (KINDLER et al., 2003). Enquanto a NOS mitocondrial de 144kDa (variante neuronal) é aumentada em estágios iniciais do desenvolvimento, em paralelo ao curso da plasticidade estrutural do cérebro e cerebelo, a expressão de NOS mitocondrial no cérebro adulto é consideravelmente menor que em neonatos (RIOBÓ et al., 2002). Aumento patológico da atividade desta enzima mitocondrial pode contribuir para neurodegeneração. Evidências indicam que um nível de óxido nítrico aumentado na matriz, secundário à super- - expressão de NO sintase nuclear ou ativação da NOS, leva ao aumento na produção de O2 e

34 alteração do complexo I, e transforma a sinalização celular normal à condição apoptótica. De fato, o estresse oxidativo induzido pela inibição do complexo I pelo MPP+ ativa a quinase pró- apoptótica c-Jun N-terminal (JNK) ativada por estresse e a transcrição precoce do NF-Kapa B em células SH-SY5Yde neuroblastoma (CASSARINO et al., 2000).

Não está claro porque a substância negra é particularmente susceptível aos efeitos tóxicos do NO, como ocorre na doença de Parkinson, levando à neurodegeneração de células dopaminérgicas/catecolaminérgicas. A substância negra apresenta concentrações de 6-OHDA que prontamente reage com NO levando a formação de dopamina semiquinona e aumento da - - formação de de O2 e ONOO (RIOBÓ et al., 2001).

1.5. Estresse Oxidativo e Doença de Parkinson.

Radicais livres são moléculas que possuem um ou mais elétrons desemparelhados. Em geral, são instáveis e têm vida muito curta devido à natureza livre de seus elétrons que os tornam hábeis a reagir com diversos compostos ou alvos celulares, de modo a obter uma maior estabilidade química conferida pelo emparelhamento de elétrons (HALLIWELL, 1994). Essas moléculas causam danos teciduais por interagirem com carboidratos, DNA, lipídios e proteínas com formaçãode radicais livres. Os seres humanos estão constantemente expostass a radicais livres e espécies reativas do oxigênio geradas por radiações ionizantes, agentes tóxicos, poluentes ambientais, etc (fig. 4). Porém, as células também são capazes de produzir espécies reativas do oxigênio, tais como: o peróxido de hidrogênio e os radicais superóxido, hidroxila e óxido nítrico.

FIGURA 4– Formação de radicais livres. www.webpath.com

O estresse oxidativo tem sido discutido como um importante contribuinte na patologia das doenças neurodegenerativas (SKOUMALOVA et al., 2003). Uma das idéias relacionadas à patogênese da DP baseia-se na formação de espécies reativas de oxigênio e conseqüente início de estresse oxidativo, levando à lesão oxidativa na substância negra pars compacta (BARBOSA et al., 1997). As evidências que dão suporte ao envolvimento do estresse oxidativo na patogênese da DP incluem alterações na quantidade de ferro no cérebro, que medeia a formação de espécies reativas de oxigênio quando está numa forma reativa; deficiência no funcionamento mitocondrial, particularmente no complexo I da cadeia respiratória; alterações nos sistemas protetores antioxidantes do cérebro, notadamente na superóxido dismutase (SOD) e glutationa reduzida (GSH) e evidências de dano oxidativo a lipídeos, proteínas e DNA (KNEKT et al., 1996).

O ferro pode induzir estresse oxidativo e injeções intranigrais podem induzir um modelo de parkinsonismo progressivo. A perda de GSH, que está associada à doença de corpúsculo de Lewy, representa um dos sinais iniciais da perda de células da substância negra, podendo aumentar a suscetibilidade a exposições à tóxicos ou radicais livres. A natureza das espécies de radicais livres responsáveis pela morte celular na DP não está bem definida, mas acredita-se no envolvimento de radicais hidroxila (OH-), peroxinitrito e oxido nítrico (HSIEH et al., 2000).

Os radicais livres mais destrutivos gerados no organismo derivam do oxigênio (O2). Portanto, a molécula mais importante para a manutenção da vida pode também provocar danos celulares, levando à destruição de órgãos e do próprio organismo. Outro radical de grande relevância é o radical superóxido (O2-), produto da adição de um elétron a uma molécula de oxigênio (HALLIWELL ; GUTTERIDGE, 1986). Muitas outras moléculas biológicas reagem 2- com o O2 convertendo-o em O , como por exemplo a hemoglobina (MISRA ; FRIDOVICH, 1972a), miogobina (GOTOH ; SHIKAMA, 1976), catecolaminas (MISRA ; FRIDOVICH, 1972b) e alguns constituintes dos sistemas de transporte de elétrons mitocondriais (TURRENS et al.,1985) e microssômicos (JAKOBY ; ZIEGLEr, 1990). Fagócitos ativados (neutrófilos, monócitos, macrófagos e eosinófilos) podem ainda gerar O2- em grande quantidade, com o objetivo de destruir microorganismos estranhos ao organismo. Tal mecanismo de proteção natural pode tornar-se nocivo nos processos de inflamação crônica (HALLIWELl et al., 1988).

A espécie de oxigênio mais reativa em sistemas biológicos é o radical hidroxila (OH•) este, age rapidamente no local em que é produzido, sendo capaz de causar alterações nas bases purínicas e pirimidínicas, levando a inativação ou a mutação do DNA, inibir diversas proteínas (constituintes das membranas celulares e enzimas) através da oxidação dos seus grupamentos sulfidrila (-SH) a pontes dissulfeto (-SS) e iniciar a peroxidação de lipídeos, especialmente ácidos graxos poliinsaturados de membranas e lipoproteínas (HALLIWELL ; GUTTERIDGE, 1986). Este é gerado nos sistemas biológicos principalmente por radiações ionizantes e através da reação que envolve um metal de transição, o radical superóxido e o peróxido de hidrogênio.

Devido ao alto teor de água das células, sua exposição às radiações ionizantes (raios X e gama), pode resultar na formação do radical hidroxila, através do processo de radiólise da água (HALLIWELL et al., 1994). Os íons metálicos (de ferro ou cobre) possuem a habilidade de mover elétrons, o que constitui a base para a iniciação e propagação de muitas das reações de radicais livres mais nocivas. Assim, o OH• é formado pela interação entre um íon metálico 3+ 2- (Fe ), o O e o H2O2. O H2O2, só apresenta toxicidade quando presente em altas concentrações nas células, outra característica dessa molécula é que ela possui a capacidade de se difundir rapidamente através das membranas celulares podendo então se distribuir por sítios distantes dos quais ela foi gerada. Além disso, na presença de metais de transição, mais comumente o Fe2+, mas também o Cu+, o peróxido de hidrogênio é reduzido à radical hidroxil (OH•) via reações de Haber-Weiss ou Fenton (REITER et al., 1998). 3+ - 2+ Fe + O2 Fe + O2

3+ - • H2O2 Fe + OH + OH (reação de Fenton)

Embora a via de produção do OH• esteja bem estabelecida e seu papel patológico não esteja bem determinado, a existência de proteínas de transporte para o ferro e o cobre, utilizadas pelas células para minimizar a presença de íons metálicos livres indicam que tais reações podem ser prejudiciais para os sistemas biológicos (LIOCHEV ; FRIDOVICH, 1994).

Um mensageiro intracelular de produção endógena que desempenha um papel em praticamente todos os sistemas do organismo é o óxido nítrico (NO) (EISERICH et al., 1998), embora exerça diversas funções fisiológicas úteis, em excesso pode ser nocivo. Em - determinadas condições o NO e o O2 podem interagir, resultando em um produto muito tóxico, o peroxinitrito (ONOO-). O ONOO- é capaz de reagir prontamente com diversas moléculas: proteínas, lipídeos, carboidratos e ácidos nucléicos, danificando-as. Além disso, seus prováveis produtos de decomposição, OH•, dióxido de nitrogênio e outros, possuem semelhante potencial

38 deletério, conseqüentemente, a toxicidade do NO pode ser explicada, pelo menos em parte, por - sua reação com o O2 (DEMIRYUREK, 1998 e EISERICH et al.,1998).

A peroxidação lipídica é um processo envolvendo a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados, os quais são componentes básicos de membranas biológicas. Compostos reativo eletrofílicos são formados durante a peroxidação lipídica, principalmente aldeídos α e β-não-saturados. Estes compostos geram ligações com o DNA, e entre elas, propeno e propano substituído e deoxiguanosina como malondialdeido (MDA), acroleína, crotonaldeido e eteno, resultantes de reações de bases de DNA com epoxi aldeidos, são um importantíssimo grupo de complexos. Os epoxi aldeidos são mais reativos para DNA do que aldeídos saturados. Os compostos resultantes da peroxidação lipídica reagem principalmente com DNA mostrando ação genotóxica e mutagênica; entre eles, 4-hidroxinonenal é o mais genotóxico, enquanto MDA é o mais mutagênico (LUCZAJ et al., 2003).

1.6. Apoptose

A apoptose foi identificada em 1972 por Kerr. O nome foi sugerido devido às mudanças morfológicas que levam à morte celular, por um processo claramente distinto da necrose, estando sob controle genético, o que a diferencia da necrose celular. A apoptose é um processo não patológico, sem perda inicial do controle osmótico, em contraposição à necrose, que é um processo patológico, não fisiológico, com ruptura da membrana celular e liberação do conteúdo citoplasmático e nuclear, desencadeando, assim, o processo inflamatório (DIVE et al., 1992).

A apoptose é fundamental para o desenvolvimento normal e sua desregulação pode levar a um espectro de efeitos. A seqüência de eventos que leva a apoptose não está completamente entendida, entretanto, as células encolhem-se e perdem o contato intercelular e subseqüentemente exibem cromatina densa, fragmentação nuclear e corpos apoptóticos dentro da célula, os quais são rapidamente fagocitados (BOOBIS et al., 1990). O processo de

39 apoptose, além de relevância nos processos biológicos como, diferenciação, desenvolvimento, maturação celular e função imunológica, é fundamental para o controle da lesão celular induzida por agentes químicos e fisiológicos (DOSEFF, 2004). O balanço entre proliferação celular e apoptose é crucial para o desenvolvimento normal e homeostasia tecidual no adulto.

A família Bcl-2 um grupo de proteínas que estão envolvidas no processo apoptótico pode ser dividida em duas classes: inibidoras da apoptose (anti-apoptóticas), tais como: Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Bfl-1, Mcl-1, A1, E1B19K, LMW5-HL e EBV BHRF1; e promotoras da apoptose (pró-apoptóticas): Bax, Bak, Bcl-xs, Bad, Bid, Bik, Hrk, Bim e Bok (EVAN, 2001).

Outra proteína que também está envolvida na apoptose é a p53 que nas células normais tem a função de bloquear a divisão celular quando há injúrias no genoma, fazendo com que o dano seja reparado; se o dano persistir, este atua como mediador da apoptose. Na apoptose, o p53 atua diminuindo a transcrição de Bcl-2 e aumentando a de Bax (MONTENARH, 1992).

O mecanismo que desencadeia a apoptose até agora elucidado é através da liberação do citocromo c. Este normalmente reside nas membranas internas e externas da mitocôndria. Quando há um estímulo apoptótico, o citocromo c é liberado para citossol onde se apresenta como um dos principais ativadores da atividade proteolítica da caspase 3 por ativação da caspase 9. Neste mecanismo, o citocromo c forma um complexo com duas proteínas citossólicas, Apaf-1 e Apaf-3 (apoptotic protease-activating factor), e o complexo formado ativa a caspase 3, que ao final, leva à apoptose (EVAN, 2001). O oncogene Bcl-2 e Bcl-xL encontra-se na membrana externa da mitocôndria para suprimir a apoptose, bloqueando a liberação do citocromo c e ligando-se a Apaf-1 para prevenir a ativação da caspase 9 (EVAN, 2001).

Outro mecanismo provável no qual o Bcl-2 possa estar suprimindo a apoptose advém da observação de que sua expressão afeta o balanço de cálcio intracelular (homeostase). A alteração na concentração de cálcio possui influencia no processo de apoptose. É possível que o

Bcl-2 atue diretamente modulando os canais de cálcio ou atue protegendo as membranas lipídicas da ação danosa de radicais peróxidos os quais são conhecidos como deturpadores da homeostase do cálcio (EVAN, 2001).

As deficiências nos processos de apoptose são responsáveis pelas proliferações de células tumorais, sendo responsáveis pelo comprometimento da homeostasia adequada do indivíduo. Ao contrário disso, a exarcebação destes mecanismos apoptóticos levam a condições patológicas graves a serem consideradas (doenças autoimunes de forma geral): doenças neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson, Esclerose Amiotrófica Lateral, Esclerose Múltipla dentre muitas outras. (FADEEL, 1999).

O mecanismo celular da apoptose é marcado por alterações na permeabilidade celular (transição da permeabilidade mitocondrial, TPM )– onde há formação de um canal de alta condutância com perda do potencial para fosforilação oxidativa; há extravasamento de citocromo c para o meio intracitoplasmático; ativação de uma série de substâncias cisteíno- aspartato-proteases como caspases (realizam clivagem protéica), transglutaminases (entrecruzamento de proteínas), endonucleases (clivagem nuclear) e fosfatidilserina / trombospondina (marcadores da membrana externa dos corpúsculos apoptóticos com indução da fagocitose). O processo implica na fragmentação da cromatina e das organelas com posterior clivagem das mesmas. Corpúsculos apoptóticos são fagocitados por macrófagos, que reconhecem suas sinalizações. O sistema imunológico não desencadeia uma resposta inflamatória, não havendo lesão de células periféricas (ZUZARTE-LUIS, 2002).

Os mecanismos de iniciação do processo de apoptose são eficientemente regulados por uma série de inter-relações de múltiplos fatores. Uma seqüência de sinais extracelulares induzem a morte celular programada como por exemplo, a ligação de fatores em receptores transmembrânicos, defeito no reparo do DNA celular, drogas citotóxicas ou irradiações. Muito do nosso atual conhecimento sobre a apoptose advém de estudos em Clostridium elegans onde uma série de genes foi identificado e atribuído uma função neste complexo

41 mecanismo da apoptose. A apoptose no C. elegans é parcialmente devida a ativação de uma cisteína-protease ced-3 mediada pela sua oligomerização e ativando (em “cascata”) a proteína ced-4. A atividade do complexo ced-3/ced-4 é contra-regulado pelo inibidor da apoptose ced-9 e seu indutor egl-1, ambos membros da família Bcl-2. Estudos em mamíferos e pássaros nos revelaram que o ced-3 é membro da família das cisteínas-proteases, das caspases, e o ced-4 corresponderia ao Apaf-1 (fator ativador de proteases pró-apoptóticos 1), fator determinante na ativação das caspases (ZUZARTE-LUIS, 2002).

Nas células, as caspases são sintetizadas a partir de zimógenos inativos, denominadas pró-caspases. As pró-caspases são proteoliticamente processadas entre subunidades pequenas e grandes resultando em subunidades pequenas e grandes, conseqüentemente. As caspases pró- apoptóticas são divididas em grupos iniciadores da apoptose incluindo caspases 2, 8, 9 e 10 e no grupo de executadores da apoptose, incluindo as caspases 3, 6 e 7. De forma geral as caspases iniciadoras, como a 8 e a 10, possuem domínios longos, contendo domínio efetor de morte (DED) ou domínio de recrutamento de caspases (CARD) como no caso das caspases 9 e 2. A via de morte da apoptose pode ser induzida por vias extrínsecas de estímulos, como ligantes de superfície celular, ou por via intrínseca, com sinais originados no interior da célula (DENAULT, 2002). Na via extrínseca da ativação da apoptose, a pró-caspase 8 é recrutada pela DED e induzem o sinal de morte através do complexo (DISC), o ligante pode ser o fator de necrose tumoral (TNF). A via intrínseca de apoptose envolve a ativação da pró-caspase 9 a qual é ativada por eventos de transição da permeabilidade mitocondrial (TPM) como já discutido anteriormente, com liberação de citocromo c para o meio intracitoplasmático (SALVESEN, 2002). Neste caso de ativação da caspase 9, há interação com o fator de ativação das proteases pró-apoptóticas 1 (Apaf-1). Uma vez ativada, a caspase 9 ativa uma série de outras pró- caspases como por exemplo a caspase 3, 6 e 7 subseqüentemente, clivando estas pró-caspases em substratos menores, resultando numa amplificação do sinal de morte. Neste momento poderíamos observar alterações bioquímicas e morfológicas nas células, agora, em apoptose (EARNSHAW, 1999).

A via extrínseca da apoptose é mediada pelos chamados “receptores de morte” os quais encontram-se nas superfícies celulares, transmitindo um sinal de morte para o interior da célula. Receptores de morte incluem o gene da superfamília de receptores para o fator de necrose tumoral (RTNF), incluindo RTNF-1, Fas (CD95), DR-4 e DR-5 (receptores TRAIL) (ASHKENAZI, 2002). Todos os membros da família do RTNF possuem domínios extracelulares ricos em cisteína o que pode dar orige a trimerização e ativação de seus repectivos receptores de morte. Subseqüentemente o sinal é transduzido para o interior do citoplasma sendo reconhecido pelo domínio de morte do receptor (DD). Moléculas adaptadores do tipo FADD ou TRADD possuem DDs os quais recrutam e ativam os complexos indutores dos domínios de morte, reconhecidos como DISC. Em adição aos DDs, os adaptadores FADD contém os domínios efetores de morte (DED), os quais interagem formando um complexo DED-DED seqüestrando pró-caspases 8 para o complexo DISC (SCAFFIDI, 1998).

O papel das mitocôndrias na apoptose tem se tornado um foco para o desenvolvimento de agentes neuroprotetores e de neuroresgete. De particular interesse é a possível associação entre anormalidades bioquímicas na substância negra de paciente com DP, incluindo defeitos no complexo I e geração de radicais. Isto iria, com efeito, diminuir o limiar para a apoptose e poderia explicar o porque de uma proporção relativamente alta de celulas apoptóticas ser encontrada em exames de cérebros de pacientes com DP (ANGLADE et al., 1997). As anormalidades bioquímicas envolvidas na patogênese podem causar um decréscimo no potencial de ação em uma proporção de células e uma conseqüente diminuição no limiar para apoptose.

Essas vias de resposta convergem na mitocôndria, freqüentemente através da ativação de um membro pro-apoptótico da família Bcl-2. Ao contrário do Bcl-2, que parece passar a maior parte senão toda sua vida acoplado a membranas intracelulares, muitos membros do grupo II e grupo III, incluindo Bax, Bad, Bim e Bid, podem mover-se entre citosol e organelas. Durante a apoptose há liberação de citocromo c pela mitocôndria. Uma vez liberado, o citocromo c se associa com a proteína APAF 1 (apoptotic protease-activating factor 1) e a procaspase-9 para

43 formar o apoptosomo. Na presença de ATP, a caspase 9 é ativada, ativando outros efetores, incluindo a caspase 3, que finalmente leva a apoptose. Proteínas antiapoptóticas tais com Bcl-2 residem na mitochondria e bloqueiam a liberação do citocromo c, possivelmente pelo sequestro de Bax (figura 5) (MICHEL, 2000).

FIGURA 5– Cascata da apoptose (MICHEL, 2000)

1.7. Modelo da Doença de Parkinson

Modelos de experimentação em animais são importantes ferramentas que auxiliam o estudo tanto dos mecanismos patogênicos quanto os princípios terapêuticos na doença de Parkinson. Os mais importantes são o modelo de depleção de monoaminas pela reserpina, catalepsia induzida por neurolépticos, lesão com 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e 1-metil-4- fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP). Os modelos in vitro mais usados são intoxicação por rotenona e paraquat, degeneração nigro-estriatal induzida por 6-OHDA e MPTP (GERLACH

44 et al., 1996; VON BOHLEN ; HALBACH et al., 2004). Hipóteses que explicam os mecanismos de como agem estas neurotoxinas, principalmente 6-OHDA e MPTP, foram relacionados com a patogênese da morte de células da substância negra na doença de Parkinson (GERLACH et al., 1996).

A 6-OHDA foi encontrada como produto endógeno em pacientes com DP. Isso sugere que ela pode desempenhar um papel na patogênese dessa doença (GLINKA et al.,1997; JELLINGER et al., 1995). A 6-OHDA forma radicais livres e é um potente inibidor dos complexos I e IV da cadeia respiratória mitocondrial (GLINKA et al., 1997). Quando injetada na substância negra de ratos, a 6-OHDA produz uma perda acentuada dos neurônios dopaminérgicos nigro-estriatais, e uma infusão estriatal contínua pode produzir uma axotomia terminal de neurônios dopaminérgicos topograficamente limitada e uma prolongada debilidade comportamental podendo ser evideniciada por mudanças unilaterais que levam a uma assimetria funcional a qual é quantificada utilizando-se um teste rotacional induzido por agonistas dopaminérgicos diretos (apomorfina) e indiretos (anfetamina) (PRZEDBORSKI et al.,1995).

O MPTP é convertido pela monoamina oxidase B (MAO B) a MPP+. Como a 6-OHDA, o MPP+ é captado por transportadores de dopamina e depois acumula-se na mitocôndria, levando à inibição do complexo I mitocondrial. Ao contrário da 6-OHDA, o MPP+ pode ser captado por vesículas de transporte de monoaminas, o que reduz sua toxicidade. O paraquat e a rotenona também inibem o complexo I mitocondrial e o maneb inibe o complexo III (VON BOHLEN UND HALBACH et al., 2004) (Figura 6).

A 6-OHDA atua possivelmente induzindo lesão dopaminérgica nigro-estriatal por geração de peróxido de hidrogênio e seus radicais hidroxila derivados, (SACHS et al., 1975), presumivelmente iniciado por um metal de transição tal com o ferro. A prevenção parcial ou até completa dos efeitos da 6-OHDA e do ferro por uma prévia administração de agentes quelantes de ferro (BEN-SHACHAR et al., 1991a), vitamina E (CADET et al., 1989) e

45 inibidores da MAO-B como a selegilina (KNOLL et al., 1986), pode explicar o mecanismo de proteção destes compostos.

Evidências demonstram que a 6-OHDA gera espécies reativas de oxigênio, induzindo apoptose de células dopaminergicas na substância negra de ratos (COHEN et al., 1974; WALKINSHAW et al., 1994; HE et al., 2000), embora seu mecanismo molecular não esteja bem evidenciado, estudos recentes sugerem o envolvimento de mecanismos de estresse oxidativo que facilitam a conversão da 6-OHDA em uma quinona com a formação de H2O2, iniciando assim uma sinalização de morte celular específica por ativação de fatores de transcrição tais como caspase-3, NFkB, P53 e C-Jun (DEL RIO ; VELEZ-PARDO, 2002).

FIGURA 6– As neurotoxinas utilizadas em modelos de doença de Parkinson (VON BOHLEN UND HALBACH et al., 2004).

1.8. Plantas Medicinais

Apesar do uso de produtos derivados de plantas e animais ter sido bem documentado por séculos, suas ações bioquímicas não foram observadas e analisadas cientificamente até os

46 meados dos séculos XVIII e XIX, particularmente no início de 1800 quando um importante número de substâncias com ações farmacológicas foram identificadas (CLARK et al., 1996).

Segundo estimativa da Organização Mundial de Saúde, 80% da população mundial usa os recursos das medicinas populares para suprir as necessidades de assistência médica primária (FARNSWORTH et al., 1985). A medicina tradicional, baseada no uso de produtos obtidos a partir de plantas, vem sendo responsável por aproximadamente 85% dos medicamentos utilizados em países desenvolvidos (BUDD et al.,1983). No Brasil, o uso de plantas medicinais e preparações caseiras assumem fundamental importância no tratamento das doenças que afetam as populações de baixa renda, tendo em vista a deficiência da assistência médica, a influência dos hábitos culturais e a disponibilidade da flora (MATOS et al.,1989).

No Brasil, 20% da população é responsável pelo consumo de 63% de medicamentos industrializados, o restante encontra nos produtos de origem natural, especialmente as plantas medicinais, a única fonte de recursos terapêuticos (DI STASI, 1996). Esta alternativa é utilizada tanto dentro de um contexto cultural, na medicina popular, quanto na forma de fitoterápicos.

As plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de fármacos. (GUERRA ; NODARI, 2000). A espetacular diversidade molecular de padrões estruturais pode ser encontrada nas distintas classes de produtos naturais, como flavonóides, isoflavonóides, lignanas, neolignanas, glicosídeos, cumarinas, cromonas, isocromonas, quinonas, alcalóides, entre outras, as quais representam uma fonte inesgotável de modelos originais de arquitetura enantiopura (BARREIRO ; FRAGA, 2001b).

A magnitude da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão tal a sua complexidade, estimando-se a existência de mais de dois milhões de espécies distintas de plantas, animais e microorganismos. O Brasil é o país com maior diversidade genética vegetal

47 do mundo, contando com mais de 55000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350000 e 550000. Mais da metade dessas espécies encontra-se nas florestas tropicais, cuja área corresponde a apenas 7% da superfície da terra (SOEJARTO, 1996).

Só a floresta tropical amazônica brasileira abriga 17% da biodiversidade do país. Já a floresta atlântica contém aproximadamente 35% das Angiospermas do mundo, e mais de 8% das Pteridófitas (SUFFREDINI et al., 2004). O maior número de espécies encontra-se nas regiões equatoriais da América do Sul, da África e da Ásia e o máximo de diversidade global encontra-se na flora da Colômbia, Equador e Peru. Em todo o território dos Estados Unidos e Canadá, a magnitude da diversidade genética vegetal nativa limita-se a 700 espécies.

Apenas 8% das espécies vegetais da flora brasileira foi estudada em busca de compostos bioativos e 1100 espécies foram avaliadas em suas propriedades medicinais. Destas, 590 plantas foram registradas no Ministério da Saúde para comercialização (GUERRA ; NODARI, 2000).

Até o ano de 2015, entre 4 e 8% de todas as espécies vivas presentes nas florestas tropicais podem desaparecer. A América do Sul detém 52% destas florestas e somente na década de 80, o Brasil respondeu por 28% das perdas das florestas tropicais e por 14% dos outros tipos de florestas. As principais causas da perda da diversidade genética têm sido associadas à destruição e à fragmentação dos ecossistemas e aos estresses ambientais como a poluição e as mudanças climáticas globais (JUTRO, 1991). Entretanto, a exploração de plantas de uso medicinal da flora nativa através da extração direta nos ecossistemas tropicais tem levado a reduções drásticas das populações naturais dessas espécies, seja pelo processo predatório de exploração, seja pelo desconhecimento dos mecanismos de perpetuação das mesmas.

Um aspecto menos discutido na questão da devastação das florestas tropicais refere-se à perda do conhecimento, acumulado por milênios, sobre o uso medicinal tradicional das plantas

48 destas florestas pelas populações a elas associadas. Esta devastação provoca a migração destas comunidades, normalmente para centros urbanos, provocando o rompimento do fluxo de conhecimento adquirido e acumulado ao longo do tempo. Os fitoterápicos têm sido, no caso do Brasil e de muitos países, o suporte da indústria farmacêutica genuinamente nacional de pequeno e médio porte. Segundo um estudo realizado pela OMS, o mercado mundial de todos os medicamentos no mundo é de cerca de US$ 480 bilhões. Já o mercado de fitomedicamentos está na ordem de US$ 20 bilhões anuais, com cerca de US$ 400 milhões no Brasil, e vem apresentando taxas de crescimento internas da ordem de 15%, contra apenas 4% dos medicamentos sintéticos (ALVES, 2004). No Canadá, as vendas crescem 15% ao ano, enquanto nos Estados Unidos esse número chega a 20 %. No Brasil, estima-se que 25% dos US$ 8 bilhões de faturamento, em 1996, da indústria farmacêutica nacional tenham sido originados de medicamentos derivados de plantas (ALVES, 2004).

Dois fatores podem explicar esse crescimento. O primeiro é o desejo de encontrar uma alternativa aos medicamentos sintéticos, em geral muito caros e carregados de efeitos colaterais. O segundo e o mais importante é o respaldo cada vez mais sólido que a ciência está oferecendo às drogas a base de plantas. A partir da constatação de que muitas vezes a sabedoria popular de fato tem fundamento, diversos pesquisadores deixaram de lado o preconceito e partiram para a pesquisa sobre o poder medicinal das plantas (DI STASI, 1996).

As potencialidades de uso das plantas medicinais encontram-se longe de estarem esgotadas. A tarefa de desenvolver, a partir de plantas medicinais, produtos com constância de composição e propriedades terapêuticas reprodutíveis, como se exige dos demais medicamentos, ainda é muito complexa. A transformação de uma planta medicinal em um medicamento é, portanto, uma tarefa que apresenta problemas diferenciados daqueles que caracterizam a busca de protótipos para novos fármacos. Desta forma, é necessário um esforço conjunto entre botânicos, químicos, fisiologistas, toxicologistas e farmacologistas, para validar o uso empírico de produtos vegetais pela população e livrar os países em desenvolvimento da dependência externa.

Além destas prerrogativas, faz-se necessário buscar urgentemente novas parcerias entre governo, indústrias e universidades, no sentido de encontrar alternativas de investimento para os programas de saúde pública, tanto na geração de recursos direcionados à produção, bem como à pesquisa e formação de recursos humanos especializados, para atuarem junto às comunidades a fim de proporcionar a melhoria da qualidade de vida de nosso povo.

1.9. Flavonóides

Os flavonóides, assim como outros metabólitos secundários, são produzidos pelas plantas a partir dos metabólitos primários através de rotas biossintéticas diversas e freqüentemente desconhecidas, às custas de energia. Esses pigmentos representam um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem natural. Essa classe de compostos é amplamente distribuída no reino vegetal, principalmente entre os vegetais superiores, sobretudo em partes aéreas: folhas, flores e frutos. São raros em algas, briófitas, fungos e pteridófitas. Todavia, estão presentes em abundância em angiospermas, apresentando neste grupo grande diversidade estrutural (ZUANAZZI, 2000).

O núcleo fundamental dos flavonóides, dois anéis aromáticos conectados por uma cadeia de três átomos de carbono (C6 – C3 – C6), resulta de rotas biossintéticas distintas: a do ácido chiquímico e a do acetato, via ácido malônico. A primeira origina fenilalanina, o precursor do ácido cinâmico, responsável por um dos anéis aromáticos (anel B) e a ponte de três carbonos. A segunda, resulta no outro anel aromático (anel A) do núcleo fundamental dos flavonóides (DOS SANTOS, 2000) (Figura 7). Os flavonóides de origem natural apresentam-se freqüentemente oxigenados e um grande número ocorre conjugado com açúcares (heterósides) ou sob a forma dos respectivos compostos aglicônicos livres.

Nas plantas, diversas funções são atribuídas aos flavonóides. Entre elas podemos citar: a) proteção dos vegetais contra os raios UV e visível, além de proteção contra insetos, fungos,

50 vírus e bactérias; b) atraentes de animais com finalidade de polinização; c) antioxidantes; d) controle da ação de hormônios vegetais; e e) inibição de enzimas (ZUANAZZI, 2000; HARBORNE e WILLIAMS, 1999).

5' 6' 4' 8 B O 3' 7 A C 2 2' 6 3 5 O

FIGURA 7– Núcleo fundamental dos flavonóides.

São conhecidos mais de 8000 flavonóides, sendo que o número de novas estruturas identificadas praticamente dobrou nos últimos vinte anos (PIETTA, 2000). Os flavonóides e derivados constituem uma das mais importantes classes de compostos biologicamente ativos, sendo por vezes denominados “bioflavonóides”, por apresentarem um largo espectro de atividade biológica, além da multiplicidade de ações observadas em alguns membros do grupo.

Primariamente reconhecidas como pigmentos responsáveis pela coloração de flores e frutos (TIMBERLAKE ; HENRY., 1986; BROUILLARD ; CHEMINANT., 1988), os flavonóides são encontrados em frutos, vegetais, hervas, flores, especiarias, troncos, sementes, bem como em chás e vinhos tinto. Eles são componentes proeminentes de frutas cítricas (CHANDLER ; KEFFORD, 1966) e são consumidos regularmente na dieta humana. Dentre os principais flavonóides, destacamos o flavanol (chá verde, chá preto e vinho tinto), flavanona (casca de frutas cítricas, frutas cítricas), flavonol (alho-porró, uva, chá preto, cebola, alface, brócolis, casca de maçã, azeitona, vinho tinto), flavona (casca de frutas, aipo, salsa), antocianidinas (uva roxa, vinho tinto, framboesa, cereja, morango e casca de frutas coloridas)

(WILHELM et al., 2001). Essas substâncias de baixo peso molecular, encontradas em todas as plantas vasculares, são fenilbenzoil-pironas (fenilcromonas) com um sortimento de estruturas baseadas em um núcleo comum formado por três anéis. Eles são usualmente subdivididos de acordo com seus substituintes.

Flavonóides e tocoferol (vitamina E) mostram uma estrutura em comum isto é um anel cromona. Tem sido realizados grandes esforços para quantificar os diferentes flavonóides em plantas de consumo alimentar (RICE-EVANS ; PACKER ., 1998) .

Os componentes estruturais da molécula, incluem dois anéis benzênicos de cada lado de um anel de 3 carbonos. Combinações múltiplas de grupos hidroxilas, açucares, oxigênio, e grupos metilas ligados a essas estruturas dão origem as várias classes de flavonóides a saber: flavanóis, flavanonas, flavonas, flavan-3-ois (catequinas), antocianinas e isoflavonas. Vários estudos mostraram que os flavonóides são potentes antioxidantes, capazes de seqüestrar radicais hidroxilas, ânions superóxidos e radicais peroxilipídicos. Dois estudos epidemiológicos recentes (HERTOG et al., 1993; KNEKT et al.,1996) revelaram uma correlação inversa entre os flavonóides da dieta e a mortalidade por doenças cardíacas. Um desses estudos realizado na Finlândia com 5133 homens e mulheres encontrou que aqueles indivíduos com conteúdo alto de flavonóides na dieta apresentaram um risco menor para doenças coronárias.

Alguns trabalhos têm documentado os benefícios de uma dieta rica em frutas, vegetais, azeite de oliva, vinho e chás para as doenças cardiovasculares (GIUGLIANO, 2000). Em muitos países o elevado consumo de gorduras saturadas está fortemente relacionado com a alta mortalidade por doenças coronarianas. No entanto, este não é o caso de algumas regiões da França, onde a taxa de mortalidade por doenças coronarianas é aproximadamente 50 % menor que aquelas de outros países da Europa e dos Estados Unidos (ROSENKRANZ et al., 2002, HARBORNE e WILLIAMS, 1999). Este fenômeno chamado French paradox pode ser explicado pelo consumo regular de vinho na dieta, particularmente de vinho tinto, visto que

52 estudos epidemiológicos mostram que este consumo reduz o índice de mortalidade e morbidade por doenças cardíacas coronarianas (DAS et al., 1990; ROSENKRANZ et al., 2002). Existem estudos que relatam os benefícios do azeite puro de oliva em patologias como câncer, especialmente de mama, estômago, cólon, endométrio e ovário, patologias gastrointestinais como úlceras pépticas, colelitíase e mobilidade gástrica. O óleo de oliva diminui ainda o risco de artrite reumatóide e melhora a sua evolução. Em indivíduos com diabetes melitus, o azeite de oliva aumenta a sensibilidade à insulina, diminui a pressão sangüínea e reduz os níveis das lipoproteínas aterogênicas (ZAMORA-ARDOY et al., 2004).

Estudos recentes demonstraram que o azeite de oliva extravirgem contém em abundância compostos fenólicos antioxidantes como fenóis simples (hidroxitirosol, tirosol), flavonóides, secoiridóides aldeídicos e lignanas (acetoxipinoresinol, pinoresinol). Todas estas substâncias fenólicas são potentes inibidores do ataque de espécies reativas de oxigênio (EROS). Existem evidências que as ERO estão envolvidas na etiologia de neoplasias ligadas à gordura como o câncer de mama e colorretal (OWEN et al., 2000). Este estudo, usando uma metodologia mais acurada de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) para quantificação de EROS, demonstrou que os compostos fenólicos antioxidantes presentes no azeite de oliva extravirgem são potentes inibidores da geração de radicais livres pela matriz fecal. Estes achados indicam que o estudo da inter-relação entre EROS e antioxidantes da dieta é uma área muito promissora para elucidação dos mecanismos envolvidos na carcinogênese colorretal e para futuras estratégias de prevenção deste tipo de câncer (OWEN et al., 2000).

SEERAM e cols. (2001) demonstraram que a cianidina, um flavonóide presente nas cerejas, possui uma significante atividade inibitória das enzimas COX-1 e COX-2 com valores de IC50 de 90 e 60 µM respectivamente, quando comparadas a IC50 de 1050 µM para aspirina em ambos os testes. A inibição preferencial deste flavonóide pela COX-2 pode ser útil para pacientes em uso crônico de drogas antiinflamatórias não-esteroidais cujos efeitos adversos são atribuídos em grande parte à inibição da COX-1.

A natureza tem sido uma fonte contínua de moléculas farmacologicamente ativas e as plantas medicinais têm sido usadas por incontáveis gerações. Apesar disso, surpreendentemente poucas plantas têm demonstrado atividade neuroativa. Existem evidências experimentais de que a kava e os extratos de Ginkgo biloba possuem atividade neuroprotetora (BASTIANETTO ; QUIRION, 2002; ASSEMI, 2001; OYAMA et al., 1994).

Evidências substanciais sugerem que o acúmulo de peptídeos derivados da proteína beta-amilóide e em menor extensão radicais livres, podem contribuir para etiologia e progressão da doença de Alzheimer. BASTIANETTO e cols. (2000) demonstraram que o extrato de Ginkgo biloba, rico em flavonóides e terpenos, bloqueia completamente os eventos induzidos pelo peptídio beta-amilóide como, acumulação de EROs e apoptose em cultura de células de hipocampo.

O perfil antioxidante dos flavonóides provavelmente é a base para a suas atividades neuroprotetoras cerebrais. Sua biodisponibilidade e particularmente sua presença no cérebro in vivo parece ter um papel importante na expressão da sua capacidade neuroprotetora. É sabido que transformações metabólicas como glicuronidação, metilação e outras reações, são a regra e uma pequena quantidade de flavonóides livres como agliconas estão presentes no sangue (AZUMA et al., 2002). Entretanto, as barreiras cerebrais parecem ser um obstáculo adicional para a penetração dos flavonóides no cérebro.

A quercetina é a molécula mais representativa do grupo dos flavonóides e está presente em vegetais e frutas, com consumo diário de cerca de 25 mg/dia na dieta humana (DAJAS et al., 2003a). COSTA e cols. (2001) demonstraram que a quercetina atravessa pobremente a barreira hemato-encefálica (BHE). Em um estudo posterior DAJAS e cols. (2002) demonstraram que a mistura da quercetina com a lecitina gera uma preparação lipossômica que aumenta a possibilidade deste flavonóide de atravessar a BHE. Por conseguinte, o complexo quercetina/lecitina, diminuiu o volume da lesão isquêmica em 56%, mostrando que esta mistura

54 atravessa eficazmente a BHE. Esta diminuição no volume da lesão foi similar àquela obtida com o uso de bloqueadores de canal de cálcio (O’NEILL et al., 2001).

Dentre as poucas investigações do efeito de flavonóides no cérebro in vivo, SHUTENKO e cols. (1999) caracterizaram mudanças nos níveis de NO em um modelo de isquemia global com reperfusão, na presença de quercetina. Estas mudanças foram atribuídas à ação deste flavonóide como varredor de radicais livres. Também foi descrito o efeito benéfico da quercetina no choque endotóxico, explicado pela inibição da lipoperoxidação, através do aumento da atividade da glutationa peroxidase (ABDEL-GAWAD ; CALIFA, 2001).

A capacidade dos flavonóides de inibir a ação de diversas enzimas pode ativar mecanismos sinalizadores de sobrevivência, exercendo um efeito antioxidante indireto em adição a um efeito direto de varredor de EROs. É importante mencionar ainda que os flavonóides também exercem seus efeitos ao nível de glia e vasos cerebrais. Ao nível de microvasculatura, a atividade antioxidante e antiinflamatória pode ser adicionada à vasodilatação, melhorando o fluxo sangüíneo e o processo isquêmico (DAJAS et al., 2003b).

Além dos efeitos neuroprotetores há ainda estudos que mostram que os flavonóides podem ser usados como ansiolíticos e antidepressivos (WOLFMAN et al., 1994; VIOLA et al., 1995; BUTTERWECK et al., 2000).

Muitas outras atividades farmacológicas são descritas para os flavonóides, dentre estas estão a anticancerígena. Embora muitos estudos confirmem que concentrações significativas de flavonóides estejam presentes em vegetais como cebola, couve galega, brócolis e feijões; em frutas como maçã e tomate; e em bebidas como vinho e chás, não existem estudos conclusivos que mostrem o potencial anticancerígeno destes constituintes alimentares. Contudo, três estudos foram feitos com flavonóides presentes na dieta, no tratamento de cânceres humanos.

O primeiro estudo mostrou que a genisteína, um flavonóide com atividade estrogênica, presente nos grãos de soja, é capaz de bloquear a ação do fator transcripcional conhecido como fator ligante de CCAAT, neutralisando-o antes que o início da leitura seja ativado, dessa forma a mesma faz com que a célula cancerígena definhe, feneça e morra (COGHLAN, 1998). A genisteína não produz efeitos danosos sobre células normais. Portanto, este flavonóide, comumente consumido na dieta, é capaz de estabilizar o crescimento de células cancerígenas, assim como parar o processo angiogênico.

Os outros dois estudos foram feitos com flavonóides, especialmente as catequinas (flavan-3-ois), presentes em concentrações elevadas no chá. Cânceres humanos necessitam de enzimas proteolíticas, como a uroquinase, para invadir células e formar metástases. A inibição da uroquinase pela epigalocatequina-3-galato (EGCG) em camundongos, diminui o tamanho do tumor e pode levá-lo até mesmo a remissão completa. A EGCG age ligando-se a uroquinase, bloqueando a histidina 57 e a serina 195 no seu sítio catalítico (JANKUN et al., 1997).

O segundo estudo feito com a EGCG mostrou que a mesma é capaz de suprimir a angiogênese, um processo chave requerido para o crescimento de novos vasos sanguíneos necessários para alimentar o tumor, fazendo com que o mesmo cresça e se metastize (CAO ; CAO, 1999). Portanto, a EGCG pode ser um importante constituinte da dieta agindo como preventivo para o crescimento de muitos tipos de câncer no homem.

Os flavonóides são capazes de agir através de vários mecanismos sobre os componentes sangüíneos, como plaquetas, lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e músculo liso. As plaquetas são participantes chave na aterogênese e como mediadores pró-inflamatórios, visto que o TXA2 e o PAF são produzidos pelas mesmas. Os flavonóides podem inibir a agregação, a adesão e a secreção plaquetária (HARBORNE ; WILLIAMS, 1999).

Diversos flavonóides têm sido referidos como agentes hepatoprotetores. O extrato metanólico das folhas de Combretum quadrangulare, rico em flavonas apresentou significante

56 atividade hepatoprotetora na morte celular induzida por D-galactosamina/TNF-α em cultura de hepatócitos de camundongos (BANSKOTA et al., 2000). Os flavonóides isolados de Apocynum venetum também mostraram potente atividade hepatoprotetora, inibindo a morte celular induzida por TNF-α (XIONG et al., 2000). A propriedade antiviral dos flavonóides tem sido reconhecida por aproximadamente 40 anos, mas somente nos últimos anos com o surgimento de novos vírus, tem-se desenvolvido algumas modificações estruturais para melhorar a atividade e perfil farmacocinético destes compostos, além de tentar eliminar ou diminuir sua toxicidade e mutagenicidade quando as mesmas existem (SELWAY, 1986). Alguns derivados flavônicos como as chalconas e flavonas, podem apresentar atividade antiviral, inibindo seletivamente diferentes sorotipos de rinovírus (BAUER et al., 1981).

Recentemente muitos flavonóides tiveram suas atividades avaliadas contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) e alguns destes flavonóides parecem ter atividade inibitória direta sobre este vírus. Este parece ser o caso da baicalina, uma flavona isolada de Scutellaria baicalensis (LI et al., 1997). Outros flavonóides são inibidores das enzimas responsáveis pela replicação viral. Por exemplo, as biflavonas robustaflavona e hinokiflavona são ativos contra transcriptase reversa do HIV-1 (LIN et al., 1997). Já a quercetina, isolada da Acer okamatoanum é inibidora da integrase do HIV-l (KIM et al., 1998).

Além da atividade antiviral, diversos flavonóides podem apresentar atividade antimicrobiana. Por exemplo, a quercitrina, isolada de Euphorbia hirta (Euphorbiaceae) e a cirsimarina, isolada de Microtea debilis (Phytolaccaceae) são usadas para tratar vários tipos de infecções bacterianas, especialmente diarréias infecciosas (HARBORNE ; WILLIAMS, 1999). Além destas, o flavonóide 5,7,2’,6’-tetrahidroxi-6-prenil-8-lavandulil-4’-metoxiflavanona inibe completamente o crescimento de Staphylococcus aureus com concentrações inibitórias entre 1,56 e 6,25 µg mL−1 (IINUMA et al., 1994). Esta flavona é particularmente ativa contra cepas

57 de S. aureus resistentes a antibióticos, podendo ser útil no tratamento de pacientes hospitalizados durante longos períodos, onde a infecção por este patógeno é comum.

Flavonóides obtidos de plantas em geral são bem conhecidos antioxidantes e, além destas propriedades, tem também sido relatadas ações queladores de metal e antiinflamatórias (BRAVO et al., 1998 e MIDDLETON et al., 2000). Portanto, a natureza multifuncional destes compostos os torna fortes candidatos para a terapia contra a DP. Recentemente, o chá verde que contém vários componentes polifenólicos demonstrou atenuar a morte celular in vitro induzida pela 6-OHDA em feocromocitoma e neuroblastoma. (LEVITES et al., 2002).

O termo chalcona é utilizado para caracterizar uma família de compostos que possuem como núcleo fundamental o 1,3-diarilpropano, modificado pela presença de uma ligação olefínica, de um grupamento cetona e/ou de um grupamento hidroxila (Figura 8). As chalconas são compostos precursores da via de biossíntese dos flavonóides. Uma característica importante neste grupo é a pigmentação amarela apresentada pelos mesmos, que passa a vermelha em meio alcalino. Essas substâncias têm um papel importante em sistemas ecológicos em função das cores que produzem nos vegetais e são encontradas em diferentes órgãos, sobretudo nas flores. As cores estão implicadas especialmente na polinização como atraentes de insetos e/ou pássaros. Apresentam uma grande variedade de atividades biológicas, sendo as mais comuns edulcorantes ou protetores contra a luz e calor (BRAVO et al., 1988). 5

B β 3 4' 2' A β' α 6' O

FIGURA 8– Núcleo fundamental das chalconas.

Além do papel sobre sistemas ecológicos e das atividades biológicas, as chalconas têm despertado grande interesse farmacológico. Nos últimos anos, têm sido documentadas as atividades: antiinflamatória, antinociceptiva (VIANA et al., 2003), antitumoral, antimicrobiana (RAFI et al., 2000) e antioxidante para várias chalconas e seus derivados sintéticos (LEBEAU et al., 2000).

Dentre as várias chalconas com atividade antiinflamatória e antinociceptiva podemos citar as chalconas presentes na fração isolada de Miracrodruon urundeuva (VIANA et al., 2003b), a 3,4-diclorochalcona, com potente efeito na dor inflamatória (CORREA et al., 2001), as chalconas derivadas de 2’-hidroxi e 2’,5’-dihidroxichalcona que exibiram efeito antiinflamatório através da inibição da liberação de beta-glicuronidase e lisozima a partir de neutrófilos estimulados com formil-Met-Leu-Phe/citochalasina B (fMLP/CB) e uma forte atividade inibitória sobre a degranulação de mastócitos e formação de NO a partir de células microgliais murinas estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS) (HSIEH et al., 2000) e ainda as chalconas dimetilamino-chalcona e 3,4,5-trimetoxi-4’-fluorochalcona, que exercem seus efeitos antiinflamatórios através da inibição da NOS indutível (iNOS) (ROJAS et al., 2002; ROJAS et al., 2003).

Foi demonstrado que a 4-dimetilamino-3’,4’-dimetoxichalcona, além de apresentar efeito inibitório sobre o edema de pata induzido por carragenina, também inibiu a migração e a liberação de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e eicosanóides em bolsa de ar subcutânea estimulada com zimosan em camundongos (HERENCIA et al., 2001).

A inibição da expressão de moléculas de adesão celular (CAM), incluindo as intercelular CAM-1 (ICAM-1), vascular CAM-1 (VCAM-1), e E-selectina é um passo importante no controle de diversos processos inflamatórios. Estas proteínas de adesão celular são induzidas por várias citocinas inflamatórias como TNF-α, IL-1 e LPS bacteriano. O processo de indução acontece primariamente ao nível transcripcional, onde o fator nuclear kappa B (NF-kB) tem o

59 papel principal. MADAN e cols. (2000) demonstraram que a 2’-hidroxichalcona inibe a adesão de neutrófilos periféricos à monocamadas de células endoteliais através da inibição da expressão da ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina. A 2’-hidroxichalcona também inibe a indução dos níveis basais de transcrição de ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina pelo TNF-α, e ainda a ativação do NF-kB, maior fator transcripcional envolvido na expressão de CAM (HERENCIA et al., 2001).

Muitos trabalhos têm demonstrado a atividade antimicrobiana das chalconas. Dentre estas podemos citar a retrochalcona licochalcona C, com atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus com concentração inibitória mínima de 6,25 µg mL−1 (HARAGUCHI et al., 1998). Essa chalcona estrogênica possui ativividade antitumoral e antiapoptótica, através da modulação da proteína bcl-2 (RAFI et al., 2000).

Existem muitos exemplos de flavonóides com atividade antifúngica, não só contra patógenos humanos, mas também contra aqueles que parasitam plantas. É o caso de duas chalconas: 2’-4’-dihidroxi-6’-metoxi-3’-5’-dimetilchalcona e a 2’-4’-dihidroxi-6’-metoxi-5’- metilchalcona, presentes nas folhas de Myrica cerrata que são inibidoras do crescimento de Cladosporium cucumerinum (GAFNER et al., 1996).

Existem relatos de que algumas chalconas podem apresentar atividade antiprotozoária. Os protozoários do gênero Trypanosoma causam um grande espectro de doenças em hospedeiros humanos. O Trypanosoma brucei brucei, transmitido pela mosca tsetse, causa uma doença responsável por um importante problema de ordem econômica em algumas partes da África. Algumas chalconas ativas in vitro e in vivo contra Plasmodium falciparum, também foram testadas no crescimento de formas sangüíneas do T. b. brucei em cultura de células e em modelo murino de tripanossomíase, para investigar sua habilidade em inibir a tripanopaina-TB, a principal cisteína proteinase do T. b. brucei (TROEBERG et al., 2000). Os resultados deste trabalho demonstraram que muitas chalconas inibiram o crescimento in vitro e in vivo do T. b. brucei, sugerindo que as mesmas são promissores agentes quimioterápicos antitripanossomíase.

Dos frutos de Neoraputia magnifica var. magnifica, foram isoladas duas novas chalconas, e várias chalconas de estrutura já conhecida. Todas essas substâncias foram testadas e mostraram-se ativas como inibidores da enzima glicossomal gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase do Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas (TOMAZELA et al., 2000).

Dentre os flavonóides, as chalconas têm sido relatadas como compostos atraentes com propriedades quimioprotetoras e antitumorais. As chalconas 4,2’,6’-trihidroxi-4’- metoxidihidrochalcona, 2’,6’-dihidroxi-4’-metoxidihidrochalcona, e 2’,4’-diacetoxichalcona, isoladas das partes aéreas de Ononis natrix ssp. ramosissima (Leguminosae), apresentam moderada atividade citotóxica contra P-388 (leucemia murina), A-549 (carcinoma de pulmão de não-pequenas células humano) e HT-29 (câncer de colon humano). Entretanto, o composto mais potente, a 2’,6’-diacetoxi-4,4’-dimetoxidihidrochalcona, mostrou atividade seletiva pela linhagem de células P-388 (FOREJTNIKOVA et al., 2005; KIMURA, 2005).

A chalcona 3,4,3’,4’,5’-pentametoxichalcona é um potente agente citotóxico, que atua ligando-se à tubulina, impedindo a montagem dos microtúbulos (LAWRENCE et al., 2000). A chalcona pedicina (2’,5’-dihidroxi-3’,4’,6’-trimetoxichalcona) isolada das folhas de Fissistigma languinosum (Annonaceae), também age a nível de tubulina, interrompendo a montagem destas subunidades em microtúbulos (ALIAS et al., 1995). Nesta mesma planta foram descobertas duas novas chalconas condensadas, fissistina e isofissistina, citotóxicas contra células KB (ALIAS et al., 1995).

Com base em sua descoberta de que a licochalcona A isolada de Xin-jiang licorice possui atividade antiinflamatória e antitumorigênica, SHIBATA (1994) sintetizou e estudou a atividade antimutoral in vitro e in vivo de 40 chalconas derivadas da licochalcona A. Os resultados obtidos demonstraram que muitos destes compostos possuem uma grande potência em inibir a tumorigênese. Dentre estes estão a 3’-metil-3-hidroxichalcona e a 4’-metil-3-

61 hidroxichalcona, que além de inibir a fosforilação de fosfolipídeos promovida pelo acetato de tetradecanoilforbol (TPA) em células HeLa in vitro, o crescimento de tumores em pele de camundongos iniciados com dimetilbenz[a]-antraceno e promovido por TPA também apresentam uma marcante atividade inibitória sobre a proliferação de células HGC-27 (câncer gástrico humano).

Evidências epidemiológicas sugerem claramente uma relação inversa entre a ingestão de flavonóides e risco cardiovascular. LEBEAU e cols. (2000) demonstraram que vários flavonóides possuem forte atividade antioxidante e que dentre estes as chalconas apresentam melhor atividade, com doses efetivas (ED50) menores que as da vitamina E e da quercetina. As chalconas encontradas no lúpulo também apresentam atividade inibitória sobre a oxidação de LDL humanas. Este efeito é bem maior que aquele apresentado pela vitamina E e pela genisteína (MIRANDA et al., 2000).

Há ainda chalconas com atividade antiplaquetária. TAWATA e cols. (1992) demonstraram a ação antiagregante plaquetária da isoliquiritigenina, uma inibidora da aldose redutase, purificada de Glycyrrhizae radix (licorice). Este agente inibe a agregação de plaquetas in vitro, não só pela inibição da atividade da enzima cicloxigenase (COX) como também da lipoxigenase (LOX) ou peroxidase em plaquetas. A isoliquiritigenina também apresenta ação antiplaquetária in vivo.

1.10. Aroeira-do-Sertão (Myracrodruon urundeuva Allemão)

A aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva Allemão), Anacardiaceae, é uma árvore encontrada no Brasil, principalmente na vegetação semi-árida do Nordeste, nas matas secas e subúmidas, mais comumente nas encostas de serras. Ocorre também do México a Argentina, atingindo a Bolívia e o Paraguai (BANDEIRA et al., 1993) (figura 9). As excicatas da planta estão disponíveis no herbário Prisco Bezerra da Universidade Federal do Ceará com registro n°14.999.

Myracrodruon urundeuva Allemão (Aroeira do Sertão)

FIGURA 9– Aroeira do Sertão

Estudos de fracionamento químico revelaram que o extrato acetato de etila contém duas frações principais, as primeiras com predomínio de compostos chalconicos e a segunda com predominância de taninos catéquicos e pirogalicos (BANDEIRA et al., 1993).

Estudos etnofarmacológicos referem o uso da casca do tronco da Aroeira-do-sertão desprovida de súber, ou seja, a entrecasca, como um dos remédios vegetais de uso ginecológico mais freqüente e mais antigos em medicina popular do Nordeste do Brasil. Citam ainda seu emprego no tratamento por via oral de doenças do aparelho respiratório, do aparelho urinário, nas hemoptises e diarréias, sob a forma de infuso ou decocto (VIANA et al., 1995). A planta tem excelente reputação popular no tratamento caseiro das seqüelas pós-partum, e de ferimento da pele e na boca, usando-se concomitantemente, por via oral e por via tópica (BANDEIRA et al., 1993).

Outro uso da planta seria no tratamento de úlcera péptica, utilizando as preparações farmacotécnicas na forma de elixir de aroeira (MATOS et al., 1998 ; BANDEIRA et al.,1993). Para complementar estes estudos foram realizados também, ensaios de toxicologia clínica e laboratorial da preparação fitoterápica elixir de aroeira (BANDEIRA et al., 1993 ; VIANA et al., 1995).

Estudos de farmacologia pré-clínica tem mostrado um potencial antiinflamatório, cicatrizante e antiúlcera dos extratos hidroalcoólico e aquoso da entrecasca, bem como ausência de toxicidade com auxílio de vários modelos experimentais (MATOS et al., 1998; VIANA et al., 1995).

A aroeira-do-sertão, é hoje uma espécie ameaçada de extinção na categoria vulnerável de tão escassa que é em todas as áreas de ocorrência, por causa da exploração extrativista estimulada por suas qualidades madeireiras e pelo uso medicinal da sua entrecasca. Por isso foi

64 incluída na lista oficial de plantas da flora brasileira ameaçadas de extinção, conforme estabelece a portaria do IBAMA de Nº 37–N de 03/04/92 no seu artigo primeiro (VIANA et al.,1995).

No nosso estudo foi utilizado uma fração enriquecida de chalconas isolada da entrecasca de Myracrodruon urundeuva Allemão contendo as chalconas diméricas urundeuvina A, urundeuvina B, urundeuvina C (figura 10) as quais foram conhecidas apenas recentemente e poucos estudos foram feitos até agora explorando o potencial farmacológico destes compostos, principalmente no que se refere à suas ações no SNC (BANDEIRA, 2002).

FIGURA 10– Representação estrutural da fração enriquecida de chalcona (BANDEIRA, 2000).

Características fisicoquímicas das urundeuvinas.

Urundeuvina A: Fórmula molecular: C30H22O9; PM:526 Da; Ponto de fusão: 183,7°- 185,8°C; solubilidade: Acetato de etila, Acetona, Éter, Metanol.

Urundeuvina B: Fórmula molecular: C30H20O10; PM:524 Da; Ponto de fusão: 185°- 189°C; solubilidade: Acetato de etila, Acetona, Metanol.

Urundeuvina C: Fórmula molecular: C30H22O10; PM:542 Da; Ponto de fusão: 220°- 222°C; solubilidade: Acetato de etila, Acetona, Metanol.

Com base nos trabalhos mostrando que as chalconas por suas atividade antioxidantes são neuroprotetoras, resolvemos investigar uma possível ação citoprotetora da fração enriquecida de chalconas isolada da M. urundeuva, usando um modelo in vitro que simula algumas das anormalidades bioquímicas, como o aumento da peroxidação lipídica, encontrados na DP.

1.11. Inositois

Embora os inositois tenham sido identificados há mais de 100 anos na urina de pacientes diabéticos, o papel desta substância na nutrição animal não foi estudado até 1951, quando se descobriu que eles têm ação lipotrópica (BEST et al., 1951) e hepatoprotetora (GARGINI, 1951). O papel nutricional foi descoberto mais tarde quando se descobriu que era essencial para o crescimento celular. O inositol é um poliálcool cíclico contendo um anel de seis átomos de carbono e seis grupos OH (cicloexanopoliol), sendo um importante constituinte celular, estando envolvido em diferentes processos bioquímicos. Em mamíferos o inositol existe principalmente sob a forma de derivados fosforilados, os quais participam da comunicação celular. Podem ser arranjados em nove estereoisômeros: scilo, mio, neo, epi, D e L quiro, cis, muco e allo. Dentre estes, o mio-inositol é o mais abundante na natureza, sendo produzido a partir da glicose (COHEN et al., 1986). A fonte do inositol da dieta vem de frutos e grãos de cereais, na forma de ácido fítico (mio-inositol hexafosfato). O inositol é absorvido no trato gastrintestinal e metabolizado em glicose, sendo a concentração no plasma humano em torno de 28 µM (5mg/L), com altas concentrações no músculo cardíaco, cérebro e músculos esqueléticos. A urina contém baixas concentrações, mas aumenta em pacientes diabéticos devido provavelmente à competição entre o inositol e a glicose pela absorção no túbulo renal (MARCUS; COULSTON, 1996).

O inositol é um intermediário chave no ciclo do fosfatidil-inositol. O controle da hidrólise do PI(4,5)P2 é agora reconhecido por ser um dos mecanismos fundamentais na comunicação intercelular. Um grande número de neurotransmissores e hormônios. utilizam este

mecanismo de transdução/amplificação para provocar as respostas celulares. O Ins(1,4,5)P3, hidrossolúvel, liga-se a um receptor intracelular específico e mobiliza o Ca2+ presente no retículo endoplasmático de um grande número de sistemas celulares diferentes. Existe um certo número de substâncias que podem bloquear estes receptores e o mais poderoso já identificado é a heparina (NISHIZUKA et al., 1988). O Ins(1,4,5)P3 é responsável pela regulagem de numerosos processos celulares, como a secreção, o metabolismo, a contração e a proliferação. O sn-1,2-diacilglicerol fica na membrana plasmática e age ativando a proteína quinase C (PKC). Esta enzima estimula a fosforilação de numerosas proteínas intracelulares (NISHIZUKA et al., 1988; WOOTEN et al., 1984).

O mioinositol pode ser usado como marcador das demências corticais, especialmente nos casos de Alzheimer, quando sua elevação é associada com redução do n-acetil-aspartato (HUANG et al., 2001), além disso altos níveis de mioinositol tem sido observado em casos de neoplasias gliais (KIM et al., 2005) e níveis reduzido em casos de encefalopatia hepática (SHAWCROSS et al., 2004).

Além das ações fisiológicas relacionados ao mioinositol, outros compostos derivados do inositol, encontrados em plantas também demonstram ações farmacológicas. O D-chiroinositol é estruturalmente relacionado ao fosfatidiinositol fosfato que participa das vias que sinalizam para liberação de insulina e estimula o transporte de glicose (HOLMAN; KASUGA, 1997). O D-pinitol (1D-3-O-metil-chiroinositol), um 3-methoxy análogo do D-chiroinositol e princípio ativo da tradicional planta anti-diabética Bougainvillea spectabilis, tem sido identificado como um participante ativo, sendo responsável por reduzir a concentração de glicose em ratos diabéticos (HOLMAN ; KASUGA, 1997) e possui ações antiinflamatórias (BATES et al., 2000). Além disso, o ácido fítico demonstrou potente atividade antioxidante ( MURAOKA; MIURA, 2004) e ações contra alguns tipos de câncer como o pancreático (SOMASUNDER et al., 2005).

1.12. Tingui de Bola (Magonia glabrata St Hill).

A família Sapindaceae compreende 140 gêneros e cerca de 2.000 espécies distribuídas predominantemente nos trópicos e subtrópicos. O gênero Magonia apresenta somente duas espécies existentes no Brasil e Bolívia, a Magonia glabrata St Hill (Fig.11), conhecida popularmente como “Tingui de Bola”, é uma pequena árvore muito conhecida pelo homem do campo por suas características tóxicas. A infusão da casca das raízes é empregada para “tinguijar” os peixes nas lagoas e rios (BRAGA, 1976).

Magonia glabrata St. Hill (Tingui de Bola)

FIGURA 11– Tingui de Bola

O levantamento bibliográfico sobre a espécie Magonia glabrata relata a presença de duas substâncias o 2-O-metilinositol conhecido popularmente por quebrachitol e uma proantocianidina (ARAUJO, 1994).

A espécie Magonia glabrata St Hill, objeto do nosso estudo, foi coletada no Cerradão da Chapada do Araripe, riacho do Meio, município de Barbalha Estado do Ceará e identificada pelo Professor Afrânio Gomes Fernandes Departamento de Biologia de Universidade Federal do Ceará (UFC) sua excicata (n°15.198) encontra-se arquivada no herbário Prisco Bezerra de UFC.

A análise cromatográfica do extrato etanólico dos frutos de Magonia glabrata promoveu o isolarmento de três constituintes químicos fixos, o 2-O-metilinositol (figura 12), uma mistura dos esteroides β -sitosterol e estigmasterol e uma cumarina.

FIGURA 12– Representação estrutural do 2-O- metilinositol (MIT).PM: 194; PF: 192-194°

O D-chiroinositol é estruturalmente relacionado ao fosfatidiinositol fosfato que participa das vias que sinalizam para liberação de insulina e estimula o transporte de glicose (HOLMAN ; KASUGA, 1997). O D-pinitol (1D-3-O-metil-chiroinositol), um 3-methoxy análogo do D- chiroinositol e princípio ativo da tradicional planta anti-diabética Bougainvillea spectabilis,

69 tem sido identificado como um participante ativo, sendo responsável por reduzir a concentração de glicose em ratos diabéticos (HOLMAN ; KASUGA, 1997).

1.13. Relevância e Justificativa

O desenvolvimento de drogas neuroprotetoras é dependente do conhecimento dos fatores etiológicos e patogenéticos que contribuem para a disfunção e morte neuronal na substância negra. Várias anormalidades bioquímicas foram identificadas na substância negra de pacientes com DP, existindo claras evidências do aumento na produção de radicais livres, dano oxidativo em lipídios e proteínas, incluindo o DNA, disfunção mitocondrial e um aumento de citocinas inflamatórias. Deste modo, a busca de compostos com ação antioxidante nos levou a investigar um possível efeito neuroprotetor de dois compostos, um isolado de M urundeuva, uma mistura de chalconas diméricas, e o outro um derivado do inositol, o 2-O-metilinositol, isolado da casca do fruto de Magonia glabrata, que futuramente poderiam ser usados no tratamento de doenças neurodegenerativas, como na DP, o que justificaria a importância deste estudo

OBJETIVOS

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Estudar a atividade neuroprotetora das chalconas isolada de Myracrodruoun urundeuva e 2-O-metilinositol isolado de Magonia glabrata em modelo de degeneração celular induzido pela 6-OHDA em cultura primária de células mesencefálicas de rato.

2.2. Objetivos Específicos

Determinar o percentual de células dopaminérgicas, na cultura primária de células mesencefálicas de fetos de rato na presença e na ausência de 6-OHDA e os efeitos da fração enriquecida de chalconas (FEC) e do 2-O-metilinositol (MIT) nestes percentuais através das técnicas de imunohistoquímica para a tirosina hidroxilase. Estudar os efeitos de neuroprevenção e de neuroresgate da FEC e do MIT em protocolo de morte neuronal induzida pela 6-OHDA em cultura primária de células mesencefálicas de fetos de ratos. Verificar a ação da FEC e MIT sobre os níveis de nitrito produzidos pela 6-OHDA em cultura primária de células mesencefálicas de fetos de ratos. Avaliar a ação da FEC e do MIT sobre os níveis de TBARS produzidos pela 6-OHDA em cultura primária de células mesencefálicas de fetos de ratos. Avaliar o padrão apoptótico induzido pela 6-OHDA em cultura primária de células mesencefálicas através de técnica de fluorescência com brometo de etídio/laranja de acridina e os efeitos da FEC e do MIT nesse padrão.

MATERIAIS E MÉTODOS

3. MATERIAS E MÉTODOS

3.1. Drogas Fração enriquecida de chalconas (FEC), 2-O-metilinositol (MIT), 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]- 2,5-difeniltetrazolio (MTT), naftiletilenodiamina e ácido tiobarbiturico, poli-lisina e sulfanilamida foram adquiridos da marca Sigma, St. Louis, MO, USA. Meio essencial mínimo de Eagle (MEM) e soro de cavalo foram obtidos da Gibco BRL. Bromidrato de 6- Hidroxidopamina (Sigma-USA), Deferoxamina mesilato (Sigma-USA), N-(1-naftil)- etilenodiamina diidrocloreto (Merck-USA), anticorpo primário anti-tirosina hidroxilase (CHEMICON), anticorpo secundário (reagente amarelo ou LINK – DAKO Cytomation), Streptavidina peroxidase (reagente vermelho – DAKO Cytomation), DAB (DAKO Cytomation), laranja de acridina (Sigma-USA), brometo de etídio (Sigma-USA), Paraformaldeido (Sigma-USA). Os demais reagentes utilizados foram de grau analítico.

3.2. Isolamento da fração enriquecida de chalconas (FEC) obtido da Myracrodruon urundeuva. O isolamento e estudo fitoquímico das chalconas diméricas foi realizado no Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará, sob a orientação da professora Dra. Mary Anne Bandeira de acordo com método previamente descrito (BANDEIRA, 2002).

O estudo químico foi realizado à partir do extrato acetato de etila, obtido da entrecasca após desengurduramento com hexano, em Aparelho de Sohxlet. O extrato acetato de etila foi purificado em sílica-gel com auxílio de pressão utilizando como eluente uma mistura de clorofórmio/ acetona em polaridade crescente. Esse procedimento resultou na obtenção de uma fração codificada como F(8-13) com 8% de rendimento. Nesta fração, após purificação e isolamento dos seus componentes através de técnicas cromatográficas inéditas, inovadoras e econômicas utilizando o amido de milho como adsorvente, foram identificadas as chalconas dimérica urundeuvinas A, B e C. (BANDEIRA, 2002).

Extrato Acetato de Etila ENTRECASCA

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 (F 8-13) (F 18)

Urundeuvinas A, B, C

3.3. Isolamento do 2-O-metilinositol.

O 2-O-metilinositol foi isolado de acordo com método previamente descrito (ARAUJO, 1994) no Departamento de Química Orgânica pela professora Telma Lemos A análise cromatográfica do extrato etanólico dos frutos de Magonia glabrata promoveu o identificação de três frações: fração hexanica, fração acetato de etila e fração metanólica. A partir da purificação, precipitação e recristalização obteve-se o constituinte químico polihidrixilado 2-O- metilinositol. As cascas do fruto de Magonia glabrata (2,5 Kg) foram secas, trituradas e extraídas a temperatura ambiente com álccol etílico. Após concentração parcial (sob vácuo) do extrato etanólico, separou-se uma alíquota (1/3 do volume obtido) e adicionou-se AcOEt. Verificou-se a precipitação de um sólido branco que, após filtração e lavagem com acetona forneceu 1,8g de 2-O-metilinositol (rendimenteo de 7,2%).

CASCA DO FRUTO

F hex F AcOEt F MeOH

2-O-metilinositol

3.4. Animais

Foram utilizadas ratas Wistar grávidas, (200 – 240g) provenientes do biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Ceará. Os animais foram mantidos a 23-25 °C com ciclo claro/escuro, e alimentados com uma dieta padrão e água ad libitum. Vale destacar que o estudo foi submetido ao Comitê de Ética e Pesquisa Animal (COMEPE), sendo aprovado pelo mesmo.

3.5. Culturas de células mesencefálicas de rato

Os animais foram levemente anestesiados com éter e mortos por deslocamento cervical e sua área abdominal foi aberta para a retirada dos embriões. As culturas de células mesencefálicas contendo células neuronais e gliais foram obtidas de mesencéfalo de embriões de rato Wistar de 17-20 dias de gravidez como descrito por CHOI e cols., (1987). As células mesencefálicas foram então dissecadas mecanicamente e suspensas em Meio Essencial de Eagle (MEM) completado com soro de cavalo 10%, estreptomicina (100 mg/ml), penicilina (1000 UI/ml), actinomicina C (2.5 mg/ml), bicarbonato de sódio (24 mM) e glicose (11 mM). A suspensão de células foi contada, sendo antes a viabilidaade avaliada por Azul de Tripam sendo postariormente estas célluas plaqueadas em placas multi-well de 96 poços e 6 poços preveamente tratadas com poly-lisina com uma concentração de 5 x 10 4 células/poço. As culturas foram mantidas a 37 °C em estufa a 5% CO2. Quatro dias depois do plaqueamento, as culturas foram utilizadas para experimentação.

3.6. Neuroprevenção e Neuroresgate

"Neuroprevenção" e "neuroresgate" são termos que podem ser interpretados de várias maneiras. No contexto do nosso trabalho é provavelmente melhor defini-los em termos bioquímicos e funcionais. Neuroprevenção pode ser definida como proteção das células neuronais da morte induzida por várias anormalidades bioquímicas associadas com a 6-OHDA.

Neuroresgate pode ser definido como o retorno de algumas ou todas as funções bioquímicas e restauração da função neuronal normal das células danificadas. (SCHAPIRA, 1999).

Em se tratando do mannuseio da 6-OHDA esta foi preperada na hora de ser incubada nas células sob o risco de se perder a atividade, visto que se trata de uma substância extremamente fotossensível e termossensível. Daí tanto na pesagem quanto no processo de incubação a luz esteve apagada e na sala de cultura de células deixando somente luz de fundo. Quanto a dissolução, esta toxina foi dissolvida em PBS gelado. Logo após a incubação as placas foram

incubadas em estufa com 5% de CO2.

Protocolo de neuroprevenção

a a .... a a 4 a 1 2 3 5 Cultura primária Troca do meio e adição 24h. Determinação dos de células da FEC e MIT níveis de nitrito mesencefálicas TBARS, e ensaio de 3h viabilidade celular pelo Adição da MTT Adição de meio 6-OHDA 40 µM

e 200µM

Protocolo de neuroresgate

a a .... a 4a a 1 2 3 5 Cultura primária 24h. Determinação dos de células Troca do meio e adição níveis de nitrito mesencefálicas da 6-OHDA 40 µM e TBARS, e ensaio de 3h viabilidade celular pelo 200µM Adição da FEC e MIT MTT

Adição de meio

3.7. Ensaio de neurotoxicidade - teste do MTT

A neurotoxicidade foi avaliada usando o ensaio MTT (MOSMANN , 1983), que se baseia no fato do 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) ser reduzido pelas enzimas mitocôndriais das células viáveis a um sal (sal de Formazan), sendo a quantidade deste sal um indicativo da viabilidade celular. Decorridos 4 dias de cultura, foram utilizados 2 protocolos experimentais. No primeiro, as FEC e o MIT foram usados nas concentrações de 0,1, 1, 10 e 100 µg/ml e deferoxamina (40 µM) (usada como controle positivo) foram adicionados a cultura, 3 h antes da 6-OHDA (200 µM) (protocolo de neuroprevenção). No segundo ensaio, os compostos foram adcionadas a cultura 3 h depois da 6-OHDA (protocolo de neuroresgate). Decorridas 24h de incubação 100µL do meio foi retirado para a dosagem dos níveis de nitrito, os outros 100µL meio foi descartado e incubado um novo meio (200µL) contendo 10% de 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium brometo (MTT), na concentração de 5mg/mL em cada poço, onde estas células foram incubadas por mais 3h. Após este período, descartou-se o sobrenadante e adicionou-se então 150 µL de DMSO puro para a lise das células e solubilização do formazan as placas foram agitadas em agitador de placas, decorridos 15 min de agitação, a absorbância foi medida em leitor de microplacas a 540 nm. A inibição da redução do MTT indica a diminuição da viabilidade celular. Os experimentos foram realizados em sextuplicata e repetidos em três diferentes dias.

3.8. Determinação de Nitrito

Após o período de incubação, a concentração de nitrito foi determinada segundo o método de GREEN e cols (1981), que se baseia em revelar a presença de nitrito em uma amostra (urina, plasma, homogenato tecidual e sobrenadante celular) por uma reação de diazotização que forma um cromóforo de côr rósea, com pico de absorbância de 560 nm. Para esta experiência 100 µL do reativo de Griess (sulfanilamida a 1%/ cloridrato de N-(1-naftil)-

etilenediamina 0.1% / H3PO4 em 1% / água destilada, na proporção de 1:1:1:1) foi adicionado à 100 µL do sobrenadante da cultura de célula e incubado a temperatura ambiente por 10 min. A curva padrão foi elaborada com várias concentrações de NaNO2 (variando de 0,75 à 100 µM) sob as mesmas condições.Os brancos foram preparados pela adição de 100 µL do reativo de Griess à 100 µL do meio de cultura e a absorbância foi medida em leitor de microplacas em 560 nm.

3.9. Determinação da peroxidação lipídica pela medição de substâncias tiobarbitúricas ácido-reativas (TBARS).

A peroxidação lipídica foi avaliada pela mensuração de substâncias tiobarbitúricas ácido-reativas (TBARS) (DRAPER et al.,1990). A peroxidação lipídica é uma das mais importantes expressões orgânicas do estresse oxidativo induzido pela reatividade dos radicais livres de oxigênio. O método mais empregado para determinação do MDA em amostras biológicas é baseado na sua reação com ácido tiobarbitúrico (TBA). Nesta reação, duas moléculas de TBA reagem estequiometricamente com uma molécula de MDA para formar um pigmento róseo, que tem absorbância máxima em solução ácida em 532 a 535 nm. O coeficiente de extinção deste pigmento num comprimento de onda de 535 nm, pH 1,0, é 1,53 x 10-5 M-1. Após o período de incubação, o sobrenadante foi descartado e as células foram lisadas com 1mL de Triton X 100. Então, 250 µL do homogenato foi adicionado a tubos de vidro, e incubados em banho-maria a 37 °C por 1 h, seguido por adição de 400 µL de ácido perclórico 35% para precipitar proteínas. A mistura foi centrifugada a 1400 g por 10 min. e 600 µL do sobrenadante foi adicionado à 200 µL de uma solução de ácido tiobarbitúrico a 1,2%. A mistura foi levada a banho-maria e aquecida a 95 °C por 30 min. Após resfriada, a absorbância foi medida em um leitor de microplacas a 535 nm.

3.10. Avaliação do padrão de morte celular por laranja de acridina / brometo de etídio.

Objetivando a determinação do padrão de morte celular (apoptose/necrose), as células foram incubadas em placas com densidade celular de 5 x 10 4 células/lamínulas, sendo estas lamínulas pré-tratadas com polilisina e, após o período de incubação, as células foram lavadas com PBS e incubadas com a solução de laranja de acridina e brometo de etídio (LA/BE) (2µL de LA; 8µL de PBS; 10µL de BE) durante 01 minuto, sendo em seguida visualizadas em microscópio de fluorescência OLYMPUS Bx 41. O método (MCGAHON et al., 1995) consiste em revelar as células (controle e tratadas) com a solução LA/BE , sendo a leitura realizada em microscópio de fluorescência. A LA que tem por propriedade atravessar a membrana celular, mesmo esta estando intacta, intercala-se em seguida ao DNA emitindo fluorescência verde ao mesmo. O BE somente é incorporado por células não viáveis (com instabilidade de membrana), intercalando-se ao DNA emitindo fluorescência laranja; ligando-se fracamente ao RNA, que aparecerá em vermelho. As células viáveis, que possuem membrana intacta, apresentam núcleo uniforme emitindo fluorescência verde pela LA, mas o núcleo não é marcado pelo BE visto que este não atravessa a membrana quando intacta. As células em apoptose inicial (membrana ainda intacta) apresentam fluorescência verde brilhante no núcleo (condensação da cromatina) e não são marcadas por BE; morfologicamente observa-se alterações da membrana em decorrência da formação de corpúsculos apoptóticos. As células em apoptose tardia (instabilidade da membrana) apresentam manchas laranjas (condensação da cromatina) e morfologicamente alterações da membrana (corpos apoptóticos), citoplasma vermelho (RNA). As células em necrose (lesão de membrana) apresentam cor uniformemente laranja- avermelhada, não havendo formação de corpos apoptóticos. Acredita-se que as membranas plasmáticas permanecem intactas durante a apoptose até os últimos estágios quando se tornam permeáveis aos solutos normalmente retidos (COTRAN et al., 2000). Os experimentos foram realizados em três dias diferêntes e foram contadas 200 células por lâmina.

3.11. Imuno-histoquímica para tirosina hidroxilase.

Com a finalidade de determinarmos o percentual de células dopaminérgicas em nossa cultura de células mesencefálicas, utilizamos a imuno-histoquímica para tirosina hidroxilase. As células forma incubadas em placas com lamínulas e, após o período de incubação, as células foram fixadas em solução de paraformaldeído à 4% por 15 minutos, e posteriormente lavadas com PBS 3 vezes, sendo adicionado em seguida peróxido de hidrogênio a 3% (em PBS). Logo após, foi adicionado o anticorpo primário anti-tirosina hidroxilase (CHEMICON) (overnight) em câmara fria na diluição 1:200 em sol. tampão Tris 0,05M, pH 7,2-7,6, contendo 1% de BSA (albumina de soro bovino). No dia seguinte, as lâminas foram lavadas com PBS (2 vezes), sendo logo em seguida adicionado o anticorpo secundário (reagente amarelo ou LINK – DAKO Cytomation) durante 1 hora. Após esse período as lâminas foram lavadas com PBS, e adicionada Streptavidina peroxidase (reagente vermelho – DAKO Cytomation) por 40 minutos. As lâminas foram novamente lavadas e, em seguida, aplicada solução de DAB preparada de acordo com o fabricante (DAKO Cytomation) durante 30 segundos. Posteriormente as lâminas foram lavadas c/ água destilada e montadas em meio livre de xilol. Os experimentos foram realizados em três dias diferentes nos quais as células não dopaminérgicas (TH-) foram contadas em 4 campos diferentes sendo realizado em seguida a média dessa contagem, posteriormente ainda utilizando as mesmas lâminas fez-se a contagem das células dopaminérgicas (TH+) em toda a extensão das lâminas.

3.12 Análise Estatística

A análise estatística foi feita utilizando o programa Graph Pad prism 4.0 Para comparação entre as médias foi feita uma análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Turkey, as diferenças foram consideradas estatisticamente significaticativas quando P<0,05. Os valores foram expressos como Média ± EPM.

RESULTADOS

4. RESULTADOS

4.1. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF) sobre percentual de células dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de rato expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção e de Neuroresgate).

A figura 13 mostra a imunoreatividade para tirosina hidroxilase (TH+) na presença ou na ausência de 6-OHDA (40 e 200µM) no Protocolo de Neuroprevenção. Podemos observar nos campos de contraste microscópico b e c, que a 6-OHDA (40 e 200µM) produziu uma progressiva perda de neuritos e imunoreatividade para TH+. A FEC (100 µg/mL) (campo e, f) e DEF (100 µg/mL) (campo h, i) reduziram o dano celular induzido por 6-OHDA (40 e 200µM), o que pode ser observado pela preservação da integridade dos neuritos e do restabelecimento da imunoreatividade para TH+. No Protocolo de Neuroresgate (figura 14), podemos observar que A FEC e DEF apesar de manterem a imunoreatividade para TH nas células dopaminérgicas, a integridade dos neuritos não foi mais preservada, apesar do soma neuronal ainda estar íntegro. A figura 15 mostra que a 6-OHDA (40 e 200µM) diminuiu significativamente e de maneira dose-dependente, a percentagem de células dopaminérgicas (TH+= 18,63 e 4,16%) e em menor proproção as de células não dopaminérgicas (TH-= 71,01 e 40,71%) respectivamente, em relação ao controle. A FEC conferiu uma citoproteção aos dois grupos de células tanto no protocolo de neuroprevenção (TH+= 72,41 % e 59,31 %) (TH-= 92,84% e 89,83%) respectivamente, quanto no de neuroresgate (TH+= 61,90 % e 64,07 %) (TH-= 85,34% e 83,71%) respectivamente.

a b c Controle 6-OHDA 40 6-OHDA 200

d e f FEC 100 + 6-OHDA 200 FEC 100 FEC 100 + 6-OHDA 40

g h i DEF 100 DEF 100 + 6-OHDA 40 DEF 100 + 6-OHDA 200

FIGURA 13 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF)

sobre a morfologia das células mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina

hidroxilase (TH+) expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). A incubação

com 6-OHDA (40 e 200 µM) revelou alterações na morfologia das células TH+

(campo b-seta larga fechada) e perda total dos neuritos (campo c- seta larga aberta). A

FEC (e, f) e DEF (h, i) reduziram a perda de neuritos induzida pela 6-OHDA. As

células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC e DEF (100µg/ml) foram adicionadas 3h antes da 6-OHDA (40X).

a b c Controle 6-OHDA 40 6-OHDA 50

d e f FEC 100 6-OHDA 40 + FEC 100 6-OHDA 200 + FEC 100

g h i

DEF 100 6-OHDA 40 + DEF 100 6-OHDA 200 + DEF 100

FIGURA 14 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF) sobre a morfologia das células mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina hidroxilase (TH+) expostas a 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate). A incubação com 6-OHDA (40 e 200 µM) induziu alterações na morfologia das células TH+ (campo b- seta larga fechada) e perda total dos neuritos (campo c- seta larga aberta). A FEC (e, f) e DEF (h, i) (seta fina fechada) não conseguiram reduzir a perda de neurônios, induzidas pela 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC e DEF (100µg/ml) foram adicionadas 3h após à 6-OHDA (40 X).

100 neurônios TH- + c d neurônios TH 75 a d c

50 a

25 b b 0

Células viáveis (% do controle) 0 0 0 0 0 20 10 20 EC EC A 4 F F C DA 4 DA H DA + + H FE H 0 -OHD -O 6 6 A 4 6-O + 6-O C + C -OHD FE E 6 F 6-OHDA 200 protocolo de protocolo de neuroproteção neuroresgate

FIGURA 15 – Efeito da FEC sobre o percentual de células dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (100µg/ml) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA (40 e 200 µM) (Modelo de Neuroprevenção) ou 3h após à 6-OHDA (40 e 200 µM) (Protocolo de Neuroresgate). Após 24h do tratamento o percentual de células dopaminérgicas foi determinado. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle (TH-), b vs controle (TH+), c vs 6-OHDA 40µM (TH-), d vs 6-OHDA 40µM (TH +), e vs 6-OHDA 200µM (TH-), f vs 6-OHDA 200µM (TH +), (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

86 4.2. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre percentual de células dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de rato quando expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção e de Neuroresgate). A figura 16 mostra a imunoreatividade para tirosina hidroxilase (TH+) na presença ou na ausência de 6-OHDA (40 e 200µM) no protocolo de neuroresgate. Podemos observar nos campos de contraste microscópico b e c, que a 6-OHDA (40 e 200µM) produziu uma progressiva perda de neuritos. O MIT (100 µg/mL)(campos e e f) reduziu o dano celular induzido por 6-OHDA (40 e 200µM) o que pode ser observado pela preservação da integridade dos neuritos e da imunoreatividade para TH+.

No Protocolo de Neuroresgate (figura 17), podemos observar que o MIT reduziu o dano celular induzido por 6-OHDA (40 e 200µM) o que pode ser observado pela preservação da integridade dos neuritos e da imunoreatividade para TH+.

A figura 18 mostra que a 6-OHDA (40 e 200µM) diminuiu a percentagem de células dopaminérgicas (TH+ = 18,63 e 4,16%) e não dopamnnérgicas (TH- = 71,01 e 40,71%) respectivamente, em relação ao controle, o MIT (100 µgmL) mostrou um efeito citoprotetor a estas células tendo no protocolo de neuroprevenção (TH+ = 61,10 % e 59,70 %) (TH- = 88,77% e 83,73%), respectivamente, quando no Protocolo de Neuroresgare (TH+ = 44,43 % e 41,67 %) (TH- = 86,40% e 81,79%).

A figura 19 mostra que DEF (100 µgmL) também demonstrou citoproteção conrta a citotoxicidade da 6-OHDA (40 e 200 µM) no protocolo de neuroprevenção (TH+= 65,27 % e 59,70 %) e (TH-= 99,91% e 88,01%), e no protocolo de neuroresgate (TH+= 56,93 % e 40,27 %) ; (TH- = 86,12% e 85,01%), respectivamente.

a b c

Controle 6-OHDA 40 6-OHDA 200

d e f MIT 100 MIT 100 + 6-OHDA 40 MIT 100 + 6-OHDA 200

FIGURA 16– Efeito do 2-O-metilinositol (MIT ) sobre a morfologia das células mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina hidroxilase (TH+) expostas à 6-

OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). A incubação com 6-OHDA (40 e 200 µM)

induziu alterações na morfologia das células TH+ (campo b- seta larga fechada) e

perda total dos neuritos (campo c- seta larga aberta). O MIT (e e f) reduziu a perda de

neuritos induzida pela 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT

(100µg/ml) foi adicionado 3h antes da 6-OHDA (40X).

a b c

6-OHDA 40 6-OHDA 200 Controle

d e f MIT 100 6-OHDA 40 + MIT 100 6-OHDA 200 + MIT 100

FIGURA 17 – Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre a morfologia das células mesencefálicas de rato imunoreativas para a tirosina hidroxilase (TH+) expostas à 6-OHDA

(Protocolo de Neuroresgate). A incubação com 6-OHDA (40 e 200 µM) induziu alterações na morfologia das células TH+ (campo b- seta larga fechada) e perda total dos neuritos (campo c- seta larga aberta). O MIT (e e f) reduziu a perda de neuritos induzid a pela 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (100µg/ml) foi adicionado 3h após à 6-OHDA

(40X).

100 - c eec neurônos TH nerônios TH+ d 75 a f

50 a d f

25 b b

Células viáveisdo (% controle) 0 0 40 20 IT 100 M 40 + MIT 6-OHDA 40 6-OHDA A 6-OHDA 200 6-OHDA HD T + + I T -O M I 6 M 6-OHDA 200 + MIT protocolo de protocolo de neuroprevenção neuroresgate

FIGURA 18 – Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o percentual de células dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (100µg/ml) foi adicionado 3h antes (Protocolo de Neuroprevenção) e 3h após (Protocolo de Neuroresgate) à 6-OHDA (40 e 200 µM). Após o tratamento o percentual de células dopaminérgicas foi determinado. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle (TH-), b vs controle (TH+), c vs 6-OHDA 40µM (TH-), d vs 6-OHDA 40µM (TH +), e vs 6-OHDA 200µM (TH-), f vs 6- OHDA 200µM (TH +), (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

100 neurônios TH- + c c neurônios TH 75 a d

50 a d

25 b b

Células viáveis (% do controle) do (% viáveis Células 0 0 0 40 00 F 4 2 E A 1 D D A EF D + D 0 4 00 + DEF 6-OH -OHDA 200 -OH A 2 6 A + 6 HD D EF + 6-OHDA -O D 6 DEF 6-OH protocolo de protocolo de Neuroprevenção Neuroresgate

FIGURA 19 – Efeito da deferoxamina (DEF) sobre o percentual de células dopaminérgicas em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A DEF (100µg/ml) foi adicionada 3h (Protocolo de Neuroprevenção) e 3h após à 6-OHDA (40 e 200 µM) (Protocolo de Neuroresgate). Após o tratamento o percentual de células dopaminérgicas foi determinado. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle (TH-), b vs controle (TH+), c vs 6-OHDA 40µM (TH-), d vs 6-OHDA 40µM (TH +), e vs 6-OHDA 200µM (TH-), f vs 6-OHDA 200µM (TH +), (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

4.3. Efeito citotóxico da 6-OHDA sobre a viabilidade de células mesencefálicas de rato.

A figura 20 mostra o efeito da 6-OHDA nas concentrações de 40 e 200 µM, equivalente a 10 e 50 µg/mL sobre a viabilidade celular. Os resultados mostram que a 6-OHDA na concentração de 40 µM e 200µM diminui a viabilidade celular para 77,87% e 35,45% respectivamente, demonstrando um efeito tóxico significativo na concentração (p< 0,05) de 200µM.

4.4. Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada da Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM. A figura 21 mostra que a FEC quando adicionada 3h antes da 6-OHDA 40µM, mostra um efeito preventivo sobre a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato. Os resultados mostram que a adição de 40 µM da neurotoxina diminuiu para 76,63% a viabilidade celular (absorbância do MTT: controle = 0,2302 ± 0,009; 6-OHDA 40 µM = 0,1778 ± 0,0131). A FEC nas concentrações de 100µg/ml preveniu significativamente (p<0,05, ANOVA e teste de Turkey) a toxicidade induzida pela 6-OHDA (absorbância pelo MTT: FEC 1 + 6-OHDA = 0,1835 ± 0,014 (aumento da viabilidade em relação a 6-OHDA 40 µM) = (3,08%); FEC 10 + 6-OHDA = 0,1983 ± 0,009 (9,51%); FEC 100 + 6-OHDA = 0,226 ± 0,012 (21,84%).

100

50 Viabilidade celular (% em relaçãoao controle) 0

200

HDA 6-OHDA 40 -O 6

FIGURA 20- Efeito da 6-OHDA sobre a viabilidade de células mesencefálicas de rato. As células foram cultivadas durante 4 dias, após este período foram incubadas com 6-OHDA (40 e 200µM) durante 24 horas. Após o tratamento a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

0.3 b

0.2 a 540 nm) 540 0.1 MTT (Absorbânciaem

0.0 A A A D D D DA 40 H 6-OH 6-OH 6-OH -O 6 + CONTROLE 0 C 1+ 10 FE C FEC 10 + FE

FIGURA 21– Efeito de neuroprevenção da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (1; 10 e 100 µg/ml) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA (40µM). Após 24 horas, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs control, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

4.5. Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos exposta à 6-OHDA 200 µM.

A figura 22 mostra que a FEC quando adicionada 3h antes da 6-OHDA, mostra um efeito preventivo sobre a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato. Os resultados mostram que a adição de 200 µM da neurotoxina diminuiu para 56,32% a viabilidade celular (absorbância do MTT: controle = 0,087 ± 0,003; 6-OHDA 200 µM = 0,049 ± 0,001). A FEC isoladamente, nas concentrações de 0,1; 1; 10 e 100 µg/ml, não alterou a viabilidade celular (absorbância do MTT: Controle = 0,087 ± 0,003; FEC 0,1 = 0,086 ± 0,001; FEC 1 = 0,083 ± 0,003; FEC 10 = 0,082 ± 0,002; FEC 100 = 0,085 ± 0,001. A FEC nas concentrações de 0,1; 1; 10 e 100µg/ml preveniu significativamente (p<0,05, ANOVA e teste de Turkey) a toxicidade induzida pela 6-OHDA (absorbância pelo MTT: 6-OHDA 200 µM = 0,049 ± 0,001; FEC 0,1 + 6-OHDA = 0,059 ± 0,001 (aumento da viabilidade em relação a 6- OHDA 200 µM = 11,49 % ; FEC 1 + 6-OHDA = 0,060 ± 0,002 (12,64%); FEC 10 + 6- OHDA = 0,063 ± 0,003 (16,09%); FEC 100 + 6-OHDA = 0,077 ± 0,002 (32,18%).

0.100 b 0.075 b b b a 0.050 540 nm).

0.025

MTT (Absorbânciaem 0.000

A A A 200 C 1 100 D E F C H FEC 0,1 FEC 10 -OHD O -OHD FE 6 6 + + CONTROLE6-OHDA ,1 0 0 0 1 C FEC 1+ 6- C FEC 10+ 6-OHDA FE FE

FIGURA 22 – Efeito neuropreventivo da fração enriquecida de chalcona (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (0,1; 1; 10 e 100 µg/ml) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA (200µM). Após 24 horas, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

4.6. Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM.

A FEC quando adicionada 3h após a 6-OHDA, mostra um efeito de neuroresgate sobre a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato (figura 23). A adição de 40 µM da neurotoxina diminuiu para 77,88% a viabilidade celular (absorbância do MTT: controle = 0,217 ± 0,015; 6-OHDA 200 µM = 0,169 ± 0,012). A FEC na concentração de 100µg/mL preveniu significativamente (p<0,05) a toxicidade induzida pela OHDA (absorbância do MTT: 6-OHDA + FEC 1 = 0,194 ± 0,009 (aumento da viabilidade em relação a 6-OHDA 40 µM = 11,52% ; 6-OHDA + FEC 10 = 0,192 ± 0,011 (10,59%); 6-OHDA + FEC 100 = 0,217 ± 0,012 (22,12%).

4.7. Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM.

A FEC quando adicionada 3h após a 6-OHDA, mostra um efeito de neuroresgate sobre a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato (figura 24). A adição de 200 µM da neurotoxina diminuiu para 54,76% a viabilidade celular (absorbância pelo MTT: controle = 0,084 ± 0,001; 6-OHDA 200 µM = 0,046 ± 0,001). A FEC não demonstrou efeito citotóxico nas concentrações de 0,1; 1; 10 e 100 µg/mL, (absorbância pelo MTT: Controle = 0,084 ± 0,001; FEC 0,1 = 0,086 ± 0,001; FEC 1 = 0,083 ± 0,003; FEC 10 = 0,082 ± 0,002; FEC 100 = 0,085 ± 0,001. A FEC nas concentrações de 10 e 100µg/mL preveniu significativamente (p<0,05) a toxicidade induzida pela OHDA (absorbância do MTT: 6-OHDA 200 µM = 0,046 ± 0,001; 6-OHDA + FEC 0,1 = 0,049± 0,002; (aumento da viabilidade em relação a 6-OHDA 200 µM = 3,57% ; 6-OHDA + FEC 1 = 0,054 ± 0,001 (9,52%); 6-OHDA + FEC 10 = 0,058 ± 0,002 (14,28%); 6-OHDA + FEC 100 = 0,079 ± 0,002 (39,28%).

0.3

b 0.2 a 540 nm). 0.1 MTT (Absorbânciaem

0.0 1 0 0 40 C A C 1 10 D E C H F + FE + ONTROLE A + FE C 6-O A HD D A -O HD 6 OH 6- O 6-

FIGURA 23 – Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (1; 10 100µg/mL) foi adicionada 3h após à 6-OHDA 40µM. Após 24h o tratamento, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

0.100 b 0.075 b

0.050 a MTT Abs. MTT

0.025

0.000 0 1 0 1 0 0 1 00 C 1 1 C E C 0, F EC C E F EC 10 F FE F + FEC 1 A + CONTROLE6-OHDA 20 D A H D H 6-OHDAO + FE 6- -O 6-OHDA + FEC 0,1 6

FIGURA 24 – Efeito de neuroresgate da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (0,1; 1; 10 100µg/mL) foi adicionada 3h após à 6-OHDA 200µM. Após 24 horas, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p<0,05, ANOVA e teste de Turkey).

4.8. Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM. A figura 25, mostra um efeito preventivo do MIT sobre a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA 40µM em células mesencefálicas de rato. A adição de 40µM da neurotoxina diminuiu para 77,88% a viabilidade celular (absorbância do MTT: controle = 0,217 ± 0,015; 6- OHDA 200 µM = 0,169 ± 0,012). O MIT nas concentrações de 10 e 100µg/mL preveniu significativamente, atingindo os níveis do controle na maior concentração, a toxicidade induzida pela OHDA (absorbância do MTT: MIT 1 + 6-OHDA = 0,202± 0,009) (aumento da viabilidade em relação à 6-OHDA=15,20%); MIT 10 + 6-OHDA = 0,212 ± 0,013 (19,81%); MIT 100 + 6-OHDA = 0,221 ± 0,010 (23,96%).

4.9. Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200 µM.

A figura 26, mostra um efeito preventivo do MIT sobre a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato. A adição de 200 µM da neurotoxina diminuiu para 34,63% a viabilidade celular (absorbância do MTT: controle = 0,205 ± 0,011; 6-OHDA 200 µM = 0,071 ± 0,010). O MIT não apresentou neurotoxicidade, nas concentrações de 0,1; 1; 10 e 100 µg/mL, (absorbância do MTT: Controle = 0,205 ± 0,011; MIT 0,1 = 0,199 ± 0,006; MIT 1 = 0,205 ± 0,008; MIT 10 = 0,201 ± 0,008; MIT 100 = 0,226 ± 0,009. O MIT nas concentrações de 0,1; 1; 10 e 100µg/mL preveniu significativamente e de maneira dose- dependente, atingindo os níveis do controle na maior concentração, a toxicidade induzida pela OHDA (absorbância do MTT: 6-OHDA 200 µM = 0,071 ± 0,010; MIT 0,1 + 6-OHDA = 0,169 ± 0,004; (aumento da viabilidade em relação à 6-OHDA = 47,80%); MIT 1 + 6-OHDA = 0,185 ± 0,003 (53,66%); MIT 10 + 6-OHDA = 0,169 ± 0,003 (61,46%); MIT 100 + 6-OHDA = 0,210 ± 0,003 (67,80%).

100

0.3

b b 0.2 a 540 nm). 0.1 MTT (Absorbância em

0.0

A A A 40 D D D -OH -OH -OHDA + 6 CONTROLE 6-OH 0+ 6 0+ 6 IT 1 10 M IT 1 T M MI

FIGURA 25 – Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas

à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (1; 10 e 100µg/mL) foi adicionado 3h antes da 6-OHDA 40µM. Após 24h do tratamento, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

101

0.3

b b b 0.2 b 540 nm). 0.1 a MTT (Absorbânciaem

0.0

E 0 A L 00 MIT 1 HDA MIT 10 OHD MIT 0,1 MIT 10 6- NTRO HDA 2 + 6-O 6-O ,1 0 + CO 1 T MIT 1 + 6-OHDA MI MIT 0 MIT 100 + 6-OHDA

FIGURA 26 – Efeito neuropreventivo do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas

à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (0,1; 1; 10 100µg/mL) foi adicionado 3h antes da 6-OHDA 200µM. Após 24h do tratamento, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

102

4.10. Efeito de neuroresgate do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40 µM.

O MIT quando adicionado 3h após a 6-OHDA, mostra um efeito de neuroresgate sobre a toxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato. A adição de 40 µM da neurotoxina diminuiu para 77,88% a viabilidade celular (absorbância pelo MTT: controle = 0,217 ± 0,015; 6-OHDA = 0,169 ± 0,012). O MIT na concentração de 100µg/ml preveniu significativamente a toxicidade induzida pela 6-OHDA (absorbância pelo MTT: 6-OHDA + MIT 1 = 0,199 ± 0,102 (aumento da viabilidade em relação à 6-OHDA 40 µM = 13,82%); 6- OHDA + MIT 10 = 0,197± 0,014 (12,90%); 6-OHDA + MIT 100 = 0,219 ± 0,010 (23,04%) (figura 27).

4.11. Efeito de neuroresgate do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200 µM.

O MIT quando adicionado 3h após a 6-OHDA, mostra um efeito de neuroresgate sobre a toxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato. A adição de 200 µM da neurotoxina diminuiu para 34,63% a viabilidade celular (absorbância pelo MTT: controle = 0,205 ± 0,011; 6-OHDA 200 µM = 0,071 ± 0,010). O MIT não foi tóxico para as células (absorbância MTT: Controle = 0,205 ± 0,011; MIT 0,1 = 0,199 ± 0,006; MIT 1 = 0,205 ± 0,008; MIT 10 = 0,201 ± 0,008; MIT 100 = 0,226 ± 0,009. O MIT nas concentrações de 0,1; 1; 10 e 100µg/ml preveniu significativamente a toxicidade induzida pela OHDA (absorbância pelo MTT: 6-OHDA 200 µM = 0,071 ± 0,010; 6-OHDA + MIT 0,1 = 0,106 ± 0,002 (aumento da viabilidade em relação à 6-OHDA 200 µM = 17,07%); 6-OHDA + MIT 1 = 0,115 ± 0,003 (21,46%); 6-OHDA + MIT 10 = 0,139 ± 0,009 (33,17%); 6-OHDA + MIT 100 = 0,208 ± 0,002 (66,83%) (figura 28).

103

0.3

b 0.2 a

540 nm). 0.1

MTT (Absorbânciaem

0.0 1 0 LE T 1 O T R MI T + MI MIT 100 N A + A O 6-OHDA 40 A + C D H 6-OHD -OHD 6 -O 6

FIGURA 27 – Efeito de neuroresgate do MIT isolado da casca do fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (1; 10 e 100µg/mL) foi adicionado 3h após a 6-OHDA 40µM. Após 24h do tratamento, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

104

0.3

b 0.2 b b b 540 nm).540 0.1 a MTT (Absorbânciaem

0.0

0 ,1 0 0 ,1 0 0 E 1 IT 1 T M IT 1 MI IT 10 MIT 0 MIT 10 M NTROL M -OHDA 20 CO 6 HDA +DA + H -OHDA6-OHDA + MIT 0 + MIT 1 6 6-O -O 6

FIGURA 28 – Efeito de neuroresgate do MIT isolado da casca do fruto de Magonia glabrata em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (0,1; 1; 10 e 100µg/mL) foi adicionado 3h após a 6-OHDA 200µM. Após 24h do tratamento, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ±

EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

105

4.12. Efeito da 6-OHDA sobre a produção de nitrito em cultura de células mesencefálicas de rato. A figura 29 mostra que a 6-OHDA promoveu um aumento dose-dependente as concentrações de nitrito quando comparado com o controle (6-OHDA 40µM = 551,9%; 6- OHDA 200µM =721,3% (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

4.13. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada da Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6- OHDA 40µM (Protocolo de Neuroprevenção).

A figura 30 mostra que a 6-OHDA 40µM elevou as concentrações de nitrito quando comparado com o controle (controle = 9,18 ± 1,20; 6-OHDA 40µM= 33,61 ± 3,582µM (aumento do níveis de nitrito em relação ao controle = 266,44%). A FEC na maior concentração conseguiu reverter os níveis de nitrito produzidos pela adição de 6-OHDA (FEC 1 + 6-OHDA = 31,67 ± 1,820 (redução dos níveis de nitrito em relação a 6-OHDA 40 µM = 5,85%) ; FEC 10 + 6-OHDA = 25,37 ± 2,912 (24,58%); FEC 100 + 6-OHDA = 14,05 ± 3,013µM (58,23%).

106

900

750

600

450

controle) 300

150 Nitrito (%em relaçãoao 0 0 0 4 0 2 DA A H D H 6-O -O 6

FIGURA 29 – Efeito da 6-OHDA sobre os níveis de nitrito em células mesencefálicas de rato. As células foram cultivadas durante 4 dias, após este período foram incubadas com 6- OHDA (40 e 200µM) durante 24 horas. Após 24h os níveis de nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

107

40 a

30 M) µ

20 b Nitrito ( 10

E 0 A L 4 D A H RO T -O N O 6-OHD + 6-OHDA + 6 0 0 C 0 1 FEC1+ 6-OHDA FEC1 EC F FIGURA 30 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (1; 10 e 100µg/mL) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA 40µM. Após 24h os níveis de nitrito foram determinados . Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

108

4.14. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6- OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

A figura 31 mostra que a FEC (0,1; 1; 10 e 100µg/mL) quando adicionada isoladamente, não alterou as concentrações de nitrito quando comparado com o controle (controle = 8,393 ± 0,333; FEC 0,1 = 7,306 ± 0,477; FEC 1 = 6,635 ± 0,497; FEC 10 = 7,176 ± 0,352; FEC 100 = 6,986 ± 0,323µM. A FEC nas maiores concentrações conseguiu reverter os níveis de nitrito produzidos pela adição de 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 59,38 ± 2,242; FEC 0,1 + 6-OHDA = 53,21 ± 4,191; (redução dos níveis de nitrito em relação a 6-OHDA) = (10,39%); FEC 1 + 6- OHDA = 30,95 ± 1,063 (47,87%); FEC 10 + 6-OHDA = 25,30 ± 0,636 (57,39%); FEC 100 + 6-OHDA = 23,76 ± 2,431µM (59,98%).

109

70 a 60

50 M) µ 40 b 30 b b Nitrito ( 20

00 0,1 100 A 2 EC FEC 1 F FEC 10EC -OHDA -OHDA OHDA F 6 6 6- + 1+ 6-OHDA + + 6-OHD CONTROLE 10 EC C 0,1 F C E F FE FEC 100

FIGURA 31– Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (0,1;

1; 10 e 100µg/mL) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA 200µM. Após 24h os níveis de nitrito foram determinados . Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

110

4.15. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6- OHDA 40µM (Protocolo de Neuroresgate).

A figura 32 mostra que a 6-OHDA 40µM elevou as concentrações de nitrito quando comparado com o controle (controle = 9,187 ± 1,202; 6-OHDA 40 µM = 33,61 ± 3,582µM) (aumento do níveis de nitrito em relação ao controle = 365,84%). A FEC, na concentração de 100µg/ml conseguiu reverter significativamente este aumento nos níveis de nitrito (6-OHDA + FEC 1 = 30,75 ± 1,969 (redução dos níveis de nitrito em relação a 6-OHDA 40 µM = 8,50%); 6-OHDA + FEC 10 = 28,81 ± 1,692(14,28%); 6-OHDA + FEC 100 = 18,34 ± 2,902 µM(45,43%).

4.16. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6- OHDA (Protocolo de Neuroresgate) 200µM.

A figura 33 mostra que a FEC (0,1; 1; 10 e 100µg/ml), não alterou as concentrações de nitrito quando comparado com o controle (controle = 1,494 ± 0,130; FEC 0,1 = 1,494 ± 0,132; FEC 1 = 1,821 ± 0,214; FEC 10 = 2,206 ± 0,309; FEC 100 = 1,760 ± 0,245µM. A FEC em associação com a 6-OHDA, nas concentrações (0,1; 1; 10 e 100µg/ml) não conseguiu reverter o aumento nos níveis de nitrito gerados pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 27,32 ± 0,708; 6- OHDA + FEC 0,1 = 26,71 ± 0,6541; 6-OHDA + FEC 1 = 26,87 ± 0,443; 6-OHDA + FEC 10 = 28,73 ± 0,297; 6-OHDA + FEC 100 = 31,83± 0,820µM.

111

40 a

M) µ b 20

Nitrito ( 10

0 0 1 0 E 4 1 C ROL E T HDA -O A + FEC + F 6 D CON DA 6-OH -OH 6 6-OHDA + FEC 100

FIGURA 32 - Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (protocolo de neuroresgate). As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (1; 10 e 100µg/ml) foi adicionada 3h após a 6-OHDA (40µM). Após 24h do tratamento os níveis de nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle; b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

112

30 a M) µ

20 Nitrito ( 10

0 1 1 1 1 10 0, C 100 0, C 100 OLE 200 C 10 A FE E EC R EC F EC F EC F F FEC F + ONT A + DA + FEA + C 6-OHD D H A OH 6-O 6-OHD 6- 6-OHD

FIGURA 33 - Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM (protocolo de neuroresgate).

As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (0,1; 1; 10 e 100µg/ml) foi adicionada 3h após a 6-OHDA (200µM). Após 24h do tratamento os níveis de nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

113

4.17. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40 µM (Protocolo de Neuroprevenção). A figura 34 mostra que a 6-OHDA 40 µM elevou as concentrações de nitrito quando comparado com o controle (controle = 9,187 ± 1,202; 6-OHDA 40 µM = 33,61 ± 3,582µM). O MIT conseguiu prevenir significativamente (p<0,05) o aumento nos níveis de nitrito produzidos pela adição de 6-OHDA (MIT 1 + 6-OHDA = 29,50 ± 1,978 (redução dos níveis de nitrito em relação à 6-OHDA = 12,22%; MIT 10 + 6-OHDA = 24,37 ± 2,781 (27,49%); MIT 100 + 6-OHDA = 14,24 ± 1,248µM (57,63%).

4.18. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 200µM (Protocolo de Neuroprevenção).

A figura 35 mostra que o MIT (0,1; 1; 10 e 100µg/ml), não alterou as concentrações de nitrito quando comparado com o controle (controle = 8,393 ± 0,333; MIT 0,1 = 9,666 ± 0,841; MIT 1 = 9,515 ± 0,432; MIT 10 = 10,03 ± 0,634; MIT 100 = 9,743 ± 0,726µM). O MIT conseguiu reverter significativamente (p<0,05) o aumento nos níveis de nitrito produzidos pela adição de 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 59,38 ± 2,242; MIT 0,1 + 6-OHDA = 49,54 ± 3,453 (redução dos níveis de nitrito em relação a 6-OHDA (200 µM) = (16,57%); MIT 1 + 6-OHDA = 37,93 ± 1,447 (36,12%); MIT 10 + 6-OHDA = 32,27 ± 2,970 (45,65%); MIT 100 + 6- OHDA = 21,10 ± 0,621µM (64,46%).

114

40 a M) µ 30

Nitrito ( b

40 A A DA -OH -OHD 6 6 -OHD 6 + 1+ 0 CONTROLE 0 1 MIT T MIT 10 + 6-OHDA MI

FIGURA 34 – Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (protocolo de neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (1; 10 e 100µg/mL) foi adicionado 3h antes da 6-OHDA (40µM). Após 24h do tratamento os níveis de nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

115

70 a 60 b 50 M) µ b 40 b 30

Nitrito ( b 20

0 1 1 0 E , 1 00 L 0 1 DA DA 200 H H O A T MIT T R MIT -O -O MI MI 6 6 + 6-OHDA + 6-OHDA CONT 6-OHD ,1 1 + 0 + 0 T 10 0 T 1 MI MI IT MIT M

FIGURA 35 – Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (0,1;

1; 10 e 100µg/mL) foi adicionado 3h antes da 6-OHDA (200µM). Após

24h do tratamento os níveis de nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p<

0,05, ANOVA e teste de Turkey).

116

4.19. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (Protocolo de Neuroresgate)

O MIT na concentração de 100µg/mL diminuiu significativamente o aumento nos níveis de nitrito gerados pela 6-OHDA 40µM = 33,61 ± 3,582 (6-OHDA + MIT 1 = 32,34 ± 0,761(redução dos níveis de nitrito em relação a 6-OHDA 40 µM) = (3,77%); 6-OHDA + MIT 10 = 26,93 ± 0,871µM (19,87%); 6-OHDA + MIT 100 = 17,81± 2,754 µM (47%)(figura 36).

4.20. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate)

A figura 37 mostra que a MIT (0,1; 1; 10 e 100µg/ml), não alterou as concentrações de nitrito quando comparado com controle (controle = 8,393 ± 0,333; MIT 0,1 = 9,666 ± 0,841; MIT 1 = 9,515 ± 0,432; MIT 10 = 10,03 ± 0,634; MIT 100 = 9,743 ± 0,726µM). A FEC em associação com a 6-OHDA, nas concentrações (10 e 100µg/mL) diminuiu significativamente o aumento nos níveis de nitrito gerados pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 59,38 ± 2,242; 6-OHDA + MIT 0,1 = 55,28 ± 2,147(redução dos níveis de nitrito em relação a 6-OHDA 200 µM) (6,90%); 6-OHDA + MIT 1 = 53,90 ± 0,888 (9,22%); 6-OHDA + MIT 10 = 51,28 ± 0,751µM (13,64%); 6-OHDA + MIT 100 = 20,43± 0,718 µM (65,59%).

117

40 a M) µ 30 b 20 Nitrito (

0 1 0 LE T 10 0 O 1 R MI T T + MI A + 6-OHDA 40 D CON H A -O 6 6-OHDA + MIT-OHD 6

FIGURA 36 - Efeito do 2-O-metilinositol MIT isolado da casca do fruto de

Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA 40µM (protocolo de neuroresgate).

As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (1; 10 e 100µg/mL) foi adicionado 3h após a 6-OHDA 40µM. Após 24h do tratamento os níveis de nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

118

70 a 60 b 50 M) µ 40

Nitrito ( b 20

10 0,1 OLE 100 MIT 1 MIT MIT MIT 100 + MIT 0,1 + MIT 10MIT ONTR A A C 6-OHDA 200 A + HD D O 6-OHDA + MIT 1 6- 6-OHD-OH 6

FIGURA 37 - Efeito do 2-O-metilinositol MIT isolado da casca do fruto de Magonia glabrata sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de neuroresgate). As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (0,1; 1; 10 e 100µg/mL) foi adcionada 3h após a 6-OHDA 200µM. Após 24h do tratamento os níveis de nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

119 4.21. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostass à 6- OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

A figura 38 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou significativamente (para 166,84%) a peroxidação lipídica demonstrada pelo aumento de TBARS (absorbância do TBARS, controle = 0,187 ± 0,047; 6-OHDA = 0,499 ± 0,062). A FEC isoladamente nas concentrações (0,1; 1; 10 e 100µg/mL) não alterou os níveis de TBARS (FEC 0,1 = 0,176 ± 0,020; FEC 1 = 0,164 ± 0,027; FEC 10 = 0,151 ± 0,024; FEC 100 = 0,137 ± 0,014). A FEC nas concentrações de (10 e 100µg/ml) reverteu significativamente os níveis de TBARS produzidos pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 0,499 ± 0,062; FEC 0,1 + 6-OHDA = 0,487 ± 0,033; FEC 1 + 6-OHDA = 0,451 ± 0,062; FEC 10 + 6-OHDA = 0,293 ± 0,067 (redução dos níveis de TBARS em relação a 6-OHDA 200 µM) (41,28%); FEC 100 + 6-OHDA = 0,219 ± 0,019 =(56,11%).

120

0.7

0.6 a 0.5

0.4 b 0.3 b TBARS Abs 0.2

0.1

0.0 0 1 1 0 E 0 , 0 L 2 C 1 C 0 FE RO E FEC 10 -OHDA F FEC 6 6-OHDA + 6-OHDA+ + -OHDA 1 CONT 6 , C 1 C 0 FE EC 10 FE F FEC 100 + 6-OHDA

FIGURA 38 - Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de

Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de rato. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC

(0,1; 1; 10 e 100µg/mL) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA 200µM (protocolo de neuroprevenção). Após 24h do tratamento, os níveis de TBARS foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

121

4.22. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolado de Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostas à 6- OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

A figura 39 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou significativamente (170,27%) os níveis de TBARS em relação ao controle (absorbância do TBARS, controle = 0,185 ± 0,044; 6-OHDA = 0,500 ± 0,058). A FEC isoladamente nas concentração de (0,1; 1; 10 e 100µg/ml) não alterou os níveis de TBARS (FEC 0,1 = 0,176 ± 0,020; FEC 1 = 0,164 ± 0,027; FEC 10 = 0,151 ± 0,024; FEC 100 = 0,137 ± 0,014). A FEC na concentração de 100µg/mL reverteu significativamente (p<0,05) os níveis de TBARS produzidos pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 0,500 ± 0,058; 6-OHDA + FEC 0,1 = 0,513 ± 0,058; 6-OHDA + FEC 1 = 0,748 ± 0,040; 6-OHDA + FEC 10 = 0,449 ± 0,043; 6-OHDA + FEC 100 = 0,276 ± 0,047 (redução dos níveis de TBARS em relação a 6-OHDA 200 µM) (44,8%).

122

0.7

0.6 a 0.5

0.4 b 0.3

TBARS Abs. TBARS 0.2

0.1

0.0 1 10 100 100 EC ROLE F EC EC 10 T F EC F EC FEC 0,1 F F + FEC 0,1 ON + C A 6-OHDA 200 D A 6-OHDA + FEC 1 6-OHDA + 6-OH 6-OHD

FIGURA 39 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada de

Myracrodruon urundeuva sobre os níveis de TBARS em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A FEC (0,1; 1; 10 e 100µg/mL) foi adicionada 3h após à 6- OHDA (200µM) (protocolo de neuroresgate). Após 24h os níveis de TBARS foram determinados . Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

123

4.23. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

A figura 40 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou significativamente (em 166,84%) os níveis de TBARS em relação ao controle (Absorbância do TBARS, controle = 0,187 ± 0,047; 6-OHDA = 0,499 ± 0,062). A MIT nas concentrações de (0,1; 1; 10 e 100µg/mL) não alterou os níveis de TBARS em relação ao controle (controle = 0,187 ± 0,047; MIT 0,1 = 0,198 ± 0,029; MIT 1 = 0,208 ± 0,016; MIT 10 = 0,177 ± 0,032; MIT 100 = 0,187 ± 0,029. O MIT nas concentrações de (1; 10 e 100µg/mL) reverteu os níveis de TBARS produzidos pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 0,499 ± 0,062; MIT 0,1 + 6-OHDA = 0,427 ± 0,056; MIT 1 + 6-OHDA = 0,252 ± 0,021 (redução dos níveis de TBARS em relação à 6-OHDA 200 µM) = (49,49%); MIT 10 + 6-OHDA = 0,220 ± 0,038 (55,91%); MIT 100 + 6- OHDA = 0,151 ± 0,024 (69,93%).

124

0.7

0.6 a 0.5

0.4

0.3 b b

TBARS Abs. TBARS 0.2 b

0.1

0.0 A A T 1 D D T 10 OLE MI HDA MI O -OH TR MIT 0,1 MIT 100 6 N 6-OH OHDA 200 + O - 0 C 6 00 + 6-OHDA T 1+ 1 T 0,1+MI 6- MI MIT 1 MIT

FIGURA 40 - Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de

Magonia glabrata sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de rato. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (0,1; 1; 10 e

100µg/mL) foi adicionado 3h antes da 6-OHDA (200µM) (protocolo de neuroprevenção). Após 24h do tratamento os níveis de TBARS foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

125

4.24. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

A figura 41 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou significativamente (em 170,27%) os níveis de TBARS em relação ao controle (absorbância do TBARS, controle = 0,185 ± 0,044; 6-OHDA = 0,500 ± 0,058). O MIT nas concentrações de (0,1; 1; 10 e 100µg/mL) não alterou os níveis de TBARS em relação ao controle (controle = 0,185 ± 0,044; MIT 0,1 = 0,198 ± 0,029; MIT 1 = 0,208 ± 0,016; MIT 10 = 0,177 ± 0,032; MIT 100 = 0,187 ± 0,029. O MIT nas concentrações de 10 e 100µg/mL reverteu significativamente (p<0,05) os níveis de TBARS produzidos pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 0,500 ± 0,058; MIT 0,1 + 6-OHDA = 0,458 ± 0,038; MIT 1 + 6-OHDA = 0,412 ± 0,044; MIT 10 + 6-OHDA = 0,311 ± 0,030; (redução dos níveis de TBARS em relação a 6-OHDA = (37,8%); MIT 100 + 6-OHDA = 0,200 ± 0,028 (60,0%).

126

0.7

0.6 a 0.5

0.4 b 0.3 b TBARS Abs. 0.2

0.1

0.0 1 1 1 1 0 00 , 00 , 0 2 0 1 0 0 OLE T 1 1 MIT T R MIT MIT 10 MIT MI MIT + + MI -OHDA A + CONT 6 D A H HDA D 6-OHDAO + MITH 6-O 6- -O 6

FIGURA 41 – Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) isolado da casca do fruto de Magonia glabrata sobre os níveis de TBARS em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. O MIT (0,1; 1; 10 e 100µg/mL) foi adicionado 3h após à 6-

OHDA (200µM) (protocolo de neuroresgate). Após 24h do tratamento os níveis de TBARS foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de

Turkey).

127 4.25. Efeito neuropreventivo da Deferoxamina (DEF) em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA.

A DEF, um quelador de ferro usado como controle do experimento, mostrou um efeito preventivo sobre a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA. Os resultados mostram que a adição de 200 µM da neurotoxina diminuiu em 44% a viabilidade celular (absorbância do MTT: controle = 0,087 ± 0,003; 6-OHDA 200 µM = 0,049 ± 0,001). A DEF, na concentração de 100 µg/mL, não foi citotóxica para as células (absorbância do MTT: DEF 100 = 0,084 ± 0,001 e preveniu significativamente a toxicidade induzida pela 6-OHDA (absorbância pelo MTT: DEF 100 + 6-OHDA = 0,077 ± 0,002 (aumento da viabilidade em relação à 6-OHDA = 55,10%) (figura 42).

4.26. Efeito de neuroresgate da Deferoxamina (DEF) em células mesencefálicas de ratos expostas a 6-OHDA.

A DEF quando adicionada 3h após a 6-OHDA, mostra um efeito de neuroresgate sobre a neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA em células mesencefálicas de rato. Os resultados mostram que a adição de 200 µM da neurotoxina diminuiu em 45,23% a viabilidade celular (absorbância pelo MTT: controle = 0,084 ± 0,001; 6-OHDA 200 mM = 0,046 ± 0,001). A DEF na concentração de 100µg/ml preveniu significativamente a toxicidade induzida pela OHDA (absorbância pelo MTT: 6-OHDA 200 µM = 0,046 ± 0,001; 6-OHDA + DEF 100 = 0,076 ± 0,001. (aumento da viabilidade em relação a 6-OHDA 200 µM = 65,21%) (figura 43).

128

0.100 b 0.075

0.050 a

MTT Abs. 0.025

0.000 E 00 OL 2 100 R A F E D ONT C 6-OHD DEF+ 6-OHDA

FIGURA 42 – Efeito neuropreventivo da deferoxamina (DEF) em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A DEF (100µg/mL) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA (200µM). Após 24 horas, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

0.09 0.08 b 0.07 0.06 0.05 a 0.04

MTT Abs. MTT 0.03 0.02 0.01 0.00

OLE 100 R DEF + NT DEF O C 6-OHDA 200 HDA -O 6 FIGURA 43 – Efeito de neuroresgate da DEF em células mesencefálicas de ratos exposta à 6-OHDA. As células foram cultivadas durante 4 dias. A deferoxamina (DEF) (100µg/ml) foi adicionada 3h após à 6-OHDA (200µM). Após 24 horas, a viabilidade celular foi determinada pelo MTT. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

129

4.27. Efeito da DEF sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

A figura 44 mostra que a DEF (100µg/ml) quando adicionada isoladamente, não alterou as concentrações de nitrito quando comparado com o controle (controle = 1,494 ± 0,130; DEF 100 = 1,492 ± 0,132µM. A DEF não conseguiu reverter o aumento dos níveis de nitrito produzidos pela adição de 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 27,32 ± 0,708; DEF 100 + 6-OHDA = 30,56 ± 0,283µM.

4.28. Efeito do DEF sobre a formação de nitrito em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

A figura 45 mostra que a DEF (100µg/ml), não alterou as concentrações de nitrito. A DEF não promoveu nenhuma alteração no aumento dos níveis de nitrito gerados pela 6-OHDA (controle = 1,494 ± 0,130; DEF 100 = 1,492 ± 0,132µM; 6-OHDA 200 µM = 27,32 ± 0,708; DEF 100 + 6-OHDA = 29,16 ± 0,585µM).

130

30 a 25 M)

µ 20

Nitrito ( 10 5

200 DA DA H DEF 100 6-OH O F+ CONTROLE 6- E D

FIGURA 44 - Efeito da deferoxamina (DEF) sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. A DEF (100µg/mL) foi adicionada 3h antes a 6- OHDA 200µM. Após 24h do tratamento os níveis de nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

30 a

M) 20 µ

10 ( Nitrito

0 0 20 A D DEF 100 ONTROLE 6-OH HDA + DEF C O 6-

FIGURA 45 - Efeito da DEF sobre a formação de nitrito em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de neuroresgate). As células foram cultivadas durante 4 dias. A DEF (100µg/mL) foi adicionada 3h após a 6-OHDA 200µM. Após 24h do tratamento, os níveis de nitrito foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle (p< 0,05, ANOVA e teste de

Turkey).

131

4.29. Efeito da deferoxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção).

A figura 46 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou significativamente (em 166,84%) os níveis de TBARS (absorbância do TBARS, controle = 0,187 ± 0,047; 6- OHDA = 0,499 ± 0,062). A DEF na concentração de 100µg/ml não alterou os níveis de TBARS (DEF 100 = 0,177 ± 0,029). No entanto, a DEF reverteu o aumento dos níveis de TBARS produzidos pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 0,499 ± 0,062; DEF 100 + 6-OHDA = 0,221 ± 0,023) (redução dos níveis de TBARS = 55,55%) .

4.30. Efeito da deferoxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

A figura 47 mostra que a exposição das células à 6-OHDA aumentou significativamente (em 170,27%) os níveis de TBARS em relação ao controle (absorbância do TBARS, controle = 0,185 ± 0,044; 6-OHDA = 0,500 ± 0,058). A DEF reverteu significativo aumento dos níveis de TBARS produzidos pela 6-OHDA (6-OHDA 200 µM = 0,500 ± 0,058; DEF 100 + 6-OHDA = 0,319 ± 0,059 (redução dos níveis de TBARS = 36,2%).

132

0.6 a

0.5 0.4

0.3 b 0.2 Abs. TBARS 0.1 0.0 E 0 DA ROL -OH DEF 10 6 ONT C 6-OHDA 200 DEF + FIGURA 46- Efeito da deferoxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em células mesencefálicas de rato expostas à 6-OHDA (protocolo de Neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. A DEF (100µg/mL) foi adicionada 3h antes da 6-OHDA 200µM. Após 24h do tratamento os níveis de TBARS foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

0.6 a 0.5 0.4 b

0.3 0.2 Abs. TBARS 0.1

0.0 0 0 LE 0 0 O 1 DA 2 H DEF -O CONTR 6 6-OHDA + DEF

FIGURA 47 – Efeito da deferoaxamina (DEF) sobre os níveis de TBARS em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (protocolo de Neuroresgate). As células foram cultivadas durante 4 dias. A DEF (100µg/ml) foi adicionada 3h após à 6-OHDA 200µM. Após 24h do tratamento os níveis de TBARS foram determinados. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

133 4.31. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e Deferoxamina (DEF) sobre o padrão apoptótico em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). A figura 48 mostra o padrão de morte celular das culturas mesencefálicas de rato após a exposição à 6-OHDA. O padrão apoptótico foi evidenciado pela ténica de laranja de acridina/brometo de etídio, o qual revelou após exposição à 6-OHDA (40 e 200µM) corpúsculos apoptoticos (campo b seta larga fechada) e necrose (campo c seta larga aberta), respectivamente. Os campos de contraste microscópico mostraram que a FEC (e, f) e DEF (h, i) inibiram a apoptose e necrose induzida por 6-OHDA (40 e 200µM), respectivamente. Além disso, pode ser observado a presença da integridade dos neuritos, após o tratamento com as drogas neuroprotetoras.

A figura 49 mostra o padrão morfológico da cultura de células mesencefálicas em condições controle (normais- 91,00%, Apoptose Inicial (AI)- 6,875%, Apoptose Tardia (AT)- 1,250%, necrose- 0,8750%) e após a adiminstração da 6-OHDA (40µM). A neurotoxina induziu um padrão de AI em 32,50% AT em 3,12%, necrose em 43,00% e células com morfologia normal em 21,38%. Das células contadas a FEC e a DEF mostraram um efeito antiapoptótico significativo quando adicionadas antes da 6-OHDA 40µM (FEC = normal - 76,00%, AI- 0,50%, AT- 2,50%, necrose- 17,33%), (DEF = normal - 75,00%, AI- 1,33%, AT- 1,66%, necrose- 20,33%). As células tratadas com FEC isoladamente (100 µg/mL) apresentaram os seguintes padrões celulares (normal - 83,00%, AI- 6,00%, AT- 1,66%, necrose- 9,33%). Na concentração de 200µM, a 6-OHDA induziu uma grande morte celular, com aumento de células em apoptose tardia e necrose (normal- 0,25%, AI- 1,75%, AT- 28,38%, necrose- 69,75%), tendo este padrão sido inibido, significativamente à quase normalidade, pela FEC (normais- 84,00%, AI- 1,00%, AT- 2,33%, necrose- 13,17%), e pela DEF (normal - 61,83%, AI- 6,83%, AT- 2,33%, necrose- 29,00%). A DEF isoladamente mostrou um padrão morfológico de células cultivadas em condições controle (normal- 70,50%, AI- 7,83%, AT- 0,50%, necrose- 11,17%).

134

a b c

6-OHDA 40 6-OHDA 200 Controle

d e f

FEC FEC 100+ 6-OHDA 40 FEC 100+ 6-OHDA 200

g h i

DEF DEF 100+ 6-OHDA 40 DEF 100+ 6-OHDA 200

FIGURA 48 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC ) sobre o padrão apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. A 6-

OHDA (40 e 200 µM) foi adicionada 3h antes da FEC e deferoxamina (DEF) (100 µg/ml) . Após 24h do tratamento, o padrão apoptótico foi aval iado pela ténica de laranja de acridina/brometo de etídio. Seta larga fechada: corpúsculos apoptóticos,

seta larga aberta: células necróticas (40X). a 135

100 normais b b apoptose inicial

75 apoptose tardia necrose a 50 a b b 25 a

% do total de células b b 0

0 40 100 DA 10 DA A H a H OHD FEC 6-O 6-O + amin + CONTROLE 6- x b FEC DEF normais Defero apoptose inicial 100 b apoptose tardia b necrose a 75

50 b a

25 b b % do total células de a a b b 0

E 0 0 L 0 0 O DA A 2 H TR D -O N FEC 1 O -OH C 6 oxamina 100 F + 6 r E FEC + 6-OHDAfe D e D

FIGURA 49- Efeito da fração enriquecidada de chalconas (FEC) sobre o padrão apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias e após este tempo foram pré-incubadas com FEC e Deferoxamina (DEF) (100µg/mL) por 3 horas e em seguida foi adicionada 6-OHDA (a-40; b- 200µM) permanecendo em incubação por 24h. O padrão apoptótico foi evidenciado pela técnica de laranja de acridina/brometo de etídio. Os experimentos foram feitos em 3 dias diferentes e foram contadas 200 células por lâmina. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (dentro de cada padrão morfológico) (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

136 4.32. Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) e Deferoxamina (DEF) sobre o padrão apoptótico em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

A figura 50 mostra o padrão de morte celular das culturas mesencefálicas de rato após a exposição à 6-OHDA. O padrão apoptótico foi evidenciado pela técnica de laranja de acridina/brometo de etídio (fluorescência), o qual revelou após exposição à 6-OHDA (40 e 200µM) corpúsculos apoptoticos (campo b - seta larga fechada) e necrose (campo c - seta larga aberta), respectivamente. Os campos de contraste microscópico mostraram que a FEC (e, f) e DEF (h, i) inibiram a apoptose e necrose induzida por 6-OHDA (40 e 200µM) respectivamente. Nas células tratadas com FEC e DEF, apesar da manutenção da integridade do corpo celular, é visível a perda de neuritos, com alteração do padrão morfológico de uma célula cultivada na ausência da neurotoxina (campo f , i seta fina fechada). A figura 51 mostra o padrão morfológico da cultura de células mesencefálicas em condições controle (normais- 91,00%, Apoptose Inicial (AI)- 6,875%, Apoptose Tardia (AT)- 1,250%, necrose- 0,8750%) e após a 6-OHDA (40µM). A neurotoxina induziu um padrão de AI em 32,50%, AT em 3,12%, necrose em 43,00% e células com morfologia normal em 21,38%. Das células a FEC e a DEF mostraram um efeito antiapoptótico significativo quando adicionadas após à 6-OHDA 40µM (FEC = normais- 75,17%, AI- 2,83%, AT- 4,66%, necrose- 17,33%), (DEF = normais- 60,50%, AI- 5,50%, AT- 3,50%, necrose- 30,63%). As células tratadas com FEC isoladamente (100µg/mL) apresentaram os seguintes padrões celulares (normal - 83,00%, AI- 6,00%, AT- 1,66%, necrose- 9,33%). Na concentração de 200µM, a 6- OHDA induziu uma grande morte celular, com aumento de células em apoptose tardia e necrose (normal- 0,25%, AI- 1,75%, AT- 28,38%, necrose- 69,75%), tendo este padrão sido revertido à quase normalidade pela FEC (normais- 78,33%, AI- 4,50%, AT- 3,33%, necrose- 12,17%) e DEF (normais- 52,83%, AI- 1,33%, AT- 3,50%, necrose- 42,33%). A Deferoxamina (DEF) isoladamente produziu o seguinte padrão morfológico (normal- 70,50%, AI- 7,83%, AT- 0,50%, necrose- 11,17%).

137

a b c

6-OHDA 200 Controle 6-OHDA 40

d e f

FEC 6-OHDA 40 + FEC 100 6-OHDA 200 + FEC 100

g h i

DEF 6-OHDA 40 + DEF 100 6-OHDA 200 + DEF 100

FIGURA 50 – Efeito da fração enriquecida de chalconas (FEC) sobre o padrão apoptótico em cultura de células mese ncefálicas de ratos expostas à 6-OHD A (Protocolo de Neuroresgate). As célula s foram cultivadas durante 4 dias. A 6-OHD A

(40 e 200 µM) foi adicionada 3h antes da FEC e DEF (100µg/ml). Após 24h do tratamento o padrão apoptótico foi avaliado pela técnica de laranja de acridina/brometo de etídio. Seta larga fechada: corpúsculos apoptóticos, seta larga aberta: células necróticas, seta fina fechada: células com ausência de neuritos Microscópico fluorescente (40X). a 138 normais apoptose inicial 100 apoptose tardia b b necrose 75

a 50 b a

b 25 a

% do total de% do células b a a b 0 0 0 0 0 10 FEC 1 na NTROLE FEC CO 6-OHDA 4 HDA + O roxami b 6- 6-OHDA + DEF Defe normais apoptose inicial 100 apoptose tardia necrose a b b 75 b

50 a

25 b % do total de células% do a bb b 0 a 0 00 F 2 100 10 C TROLE N HDA FE O amina - x CO 6 o -OHDA + FEC r 6 fe 6-OHDA + DE De

FINGURA 51– Efeito da fração enriquecidada de chalconas (FEC) e deferoxamina (DEF) sobre o padrão apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas, à 6- OHDA (Protocolo de Neuroresgate). As células foram cultivadas durante 4 dias e após este tempo foram pré-incubadas com 6-OHDA (a-40; b-200µM). Decorridas 3h foi adicionada FEC e DEF (100µg/mL) permanecendo em incubação por 24h. O padrão apoptótico foi evidenciado pela técnica de laranja de acridina/brometo de etídio. Os experimentos foram feitos em 3 dias diferentes e foram contadas 200 células por lâmina. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (dentro de cada padrão morfológico) (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

139

4.33. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). A figura 52 mostra o padrão de morte celular das culturas mesencefálicas de rato após a exposição à 6-OHDA. O padrão apoptótico foi evidenciado pela técnica de laranja de acridina/brometo de etídio (fluorescência), o qual revelou após a exposição a 6-OHDA (40 e 200µM) corpúsculos apoptoticos (campo b - seta larga fechada) e necrose (campo c - seta larga aberta), respectivamente. O campo de contraste microscópico mostrou que o MIT (e, f) inibiu a apoptose e necrose induzida pela 6-OHDA (40 e 200µM), respectivamente. Além disso pode ser observado a presença da integridade dos neuritos.

A figura 53 mostra o padrão morfológico da cultura de células mesencefálicas em condições controle (normais- 91,0%, Apoptose Inicial (AI)- 6,8%, Apoptose Tardia (AT)- 1,2%, necrose- 0,8%) e após a adição da 6-OHDA (40µM), que induziu um padrão de AI em 32,5%, AT em 3,12%, necrose em 43,00% e células com morfologia normal em 21,3%. Das cdélulas contadas o MIT e o DEF mostraram um efeito antiapoptótico significativo quando adicionados antes da 6-OHDA 40µM (MIT = normal - 80,83%, AI- 3,00%, AT- 1,66%, necrose- 14,5%). As células tratadas com MIT isoladamente (100 µg/mL) apresentaram os seguintes padrões celulares (normal - 86,3%, AI- 11,00%, AT- 1,50%, necrose- 1,16%). Na concentração de 200µM, a 6-OHDA induziu uma grande morte celular, com aumento de células em apoptose tardia e necrose (normal- 0,25%, AI- 1,75%, AT- 28,38%, necrose- 69,75%), tendo este padrão sido inibido à quase normalidade pelo MIT (normais- 76,83%, AI- 2,00%, AT- 2,50%, necrose- 19,67%).

140

a b c

Controle 6-OHDA 406-OHDA 200

d e f

MIT 100+ 6-OHDA 40 MIT 100+ 6-OHDA 200 MIT 100

FIGURA 52– Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão a poptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias. A 6-OHDA (40 e 200 µM) foi adicionada 3h antes do MIT. Após 24h do tratamento, o padrão apoptótico foi avaliado pela técnica de laranja g de acridina/brometo de etídio.h Seta larga fechada: corpúsculos i apoptóticos, seta larg a aberta: células necróticas Microscópio de fluorescência (40X).

a 141

100 normais apoptose inicial 75 apoptose tardia a necrose 50 a

a 25 b

% do total de células de total do % ab 0

E 0 0 L 0 b HDA 4 MIT 1 ONTRO -O C 6 100 MIT + 6-OHDA normais a b apoptose inicial 75 apoptose tardia necrose 50 a

25 b % do total de células de total do % a a b 0 e 00 rol 2 DA nt DA OH co MIT 100 -OH 6 MIT + 6-

FIGURA 53– Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroprevenção). As células foram cultivadas durante 4 dias e após este tempo foram pré-incubadas com MIT por 3 horas e em seguida foi adicionada 6-OHDA (a- 40 ; b- 200µM) permanecendo em incubação por 24h. O padrão apoptótico foi evidenciado pela técnica de laranja de acridina/brometo de etídio. Os experimentos foram feitos em 3 dias diferentes e foram contadas 200 células por lâmina. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (dentro de cada padrão morfológico) (p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

142

4.34. Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate).

A figura 54 mostra o padrão de morte celular das culturas mesencefálicas de rato após a exposição à 6-OHDA. O padrão apoptótico foi evidenciado pela técnica de laranja de acridina/brometo de etídio, o qual revelou após exposição à 6-OHDA (40 e 200µM) corpúsculos apoptoticos (campo b- seta larga fechada) e necrose (campo c- seta larga aberta), respectivamente. Os campos de contraste microscópico mostraram que o MIT (e, f) inibiu a apoptose e necrose induzida por 6-OHDA (40 e 200µM) respectivamente. Nas células tratadas com MIT apesar da manutenção da integridade do corpo celular é visível a perda de neuritos, com alteração do padrão morfológico de uma célula cultivada na ausência da neurotoxina (campo f - seta fina fechada).

A figura 55 mostra o padrão morfológico da cultura de células mesencefálicas em condições controle (normal- 91,0%, Apoptose Inicial (AI)- 6,87%, Apoptose Tardia (AT)- 1,25%, necrose- 0,8750%) e após a adição da 6-OHDA (40µM), que induziu um padrão de AI em 32,50%, AT em 3,12%, necrose em 43,00% e células com morfologia normal em 21,38%. Das células contadas o MIT mostrou um efetio antiapoptótico significativo quando adicionados após a 6-OHDA 40µM (MIT = normais- 79,17%, AI- 3,66%, AT- 0,83%, necrose- 16,33%). As células tratadas com MIT isoladamente mostraram os seguintes padrões celulares (normal - 83,00%, AI- 6,00%, AT- 1,66%, necrose- 9,33%). Na concentração de 200µM, a 6-OHDA induziu uma grande morte celular, com aumento de células em apoptose tardia e necrose (normal- 0,25%, AI- 1,75%, AT- 28,38%, necrose- 69,75%), tendo este padrão sido revertido à quase normalidade pelo MIT (normais- 76,83%, AI- 3,50%, AT- 2,33%, necrose- 17,67%).

143

a b c Controle 6-OHDA 40 6-OHDA 200

d e f

MIT 100 6-OHDA 40 + MIT 100 6-OHDA 200 + MIT 100

FIGURA 54 – Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate). As células foram cultivadas durante 4 dias. A 6-OHDA (40 e 200 µM) foi adicionada 3h antes do MIT. Após 24h do tratamento o padrão apoptótico foi avaliado pela técnica da laranja de acridina/brometo de etídio. Seta larga fechada: corpúsculos apoptóticos, seta larga aberta: células necróticas, seta fina fechada: células com ausência de neuritos

Microscópio de fluorescência (40X).

a 144

normais 100 apoptose inicial

b apoptose tardia

75 necrose

a 50 a

25 a b

células de total do % b a b 0 IT A 40 TROLE MIT 100 N DA + M b CO 6-OHD 6-OH normais 100 apoptose inicial apoptose tardia a b 75 necrose

50 a

25 b

% do total de células de total do % a b 0 a

E L 00 1 RO IT M NT DA + MIT -OHDA 200 CO 6 H 6-O FIGURA 55– Efeito do 2-O-metilinositol (MIT) sobre o padrão apoptótico em cultura de células mesencefálicas de ratos expostas à 6-OHDA (Protocolo de Neuroresgate). As células foram cultivadas durante 4 dias e após este tempo foram pré-incubadas com 6-OHDA (a- 40 ; b- 200µM). Decorridas 3h foi adicionado MIT permanecendo em incubação por 24h. O padrão apoptótico foi evidenciado pela técnica de laranja de acridina/brometo de etídio. Os experimentos foram feitos em 3 dias diferentes e foram contadas 200 células por lâmina. Os valores estão expressos como média ± EPM, a vs controle, b vs 6-OHDA (dentro de cada padrão morfológico)(p< 0,05, ANOVA e teste de Turkey).

145

DISCUSSÃO

146

5. DISCUSSÃO

A DP é uma doença neurodegenerativa progressiva caracterizada pela perda dos neurônios dopaminérgicos na substância negra pars compacta e um decréscimo no conteúdo de dopamina no striatum (HIRSCH et al., 1997; YOUDIM, RIEDERER, 1997). Até o presente, não existem terapias para a cura da DP, mas somente tratamentos que fornecem substratos para a síntese de dopamina ou inibem sua metabolização, tais como, L-dopa e inibidores da MAO.

A causa da morte crônica de células na DP e os mecanismos envolvidos neste processo permanecem obscuros. O esclarecimento parcial do processo de morte celular é comumente estudado em protocolos que utilizam neurotoxinas tais como 6-OHDA ou MPTP. Hipóteses que explicam os mecanismos de como agem estas neurotoxinas foram relacionados com a patogênese da morte de células da substância negra na DP (GERLACH et al.,1996). Os protocolos in vitro que simulam esta perda dopaminérgica usam cultura primária de células mesencefálicas de ratos, por serem ricas em neurônios dopaminérgicos. Sendo estes protocolos, bastante adequados para o estudo de drogas com ação neuroprotetora.

No nosso trabalho utilizamos esse tipo de cultura usando a 6-OHDA como neurotoxina. A grande dificuldade em se estudar os sinais celulares envolvidos na degeneração dopaminérgica usando este protocolo é devido ao pequeno rendimento desta cultura em termos de células dopaminérgicas, em torno de 1 a 5% (ANDREEVA et al., 1996; BRUGG et al., 1996; AHMADI et al., 2003; NIE et al., 2002 ), além da presença de outros grupos neuronais, tais como células gabaérgicas (DING et al., 2004) e não neuronais, como células da glia, particularmente astrócitos (CHEUNG et al., 1997; ALMADI et al., 2003)

A percentagem de células dopaminérgicas na nossa cultura foi em torno de 2%, suficiente para um estudo adequado de neuroproteção (CHEUNG et al., 1997; MERCER et al., 2005). Com o objetivo de evitarmos a interferência das células gliais na citotoxicidade induzida pela 6-OHDA os experimentos passaram a ter um tempo total de 5 dias já que nesse período,

147 não há tempo suficiente para que a proliferação de células gliais interferira no experimento (MICHEL et al., 1999). Vale também destacar que esse tempo reduzido foi importante para a quantificação mais significativa das células dopaminérgicas, visto que ocorre uma diminuição da viabilidade destas células com o aumento do tempo de cultura (HUMPEL et al., 1994, CHEUNG et al., 1997, NIE et al., 2002)

A 6-OHDA tem sido usada para causar a morte de células dopaminérgicas, entretanto diferente dos protocolos in vivo, os efeitos in vitro mostram não serem restritos para os neurônios dopaminérgicos, os trabalhos de Michel e Hefti (1990) mostram que na concentração de 10 a 100 µM a 6-OHDA mata neurônios dopaminérgicos e gabaérgicos, outros autores também evidenciaram estes achados (KRAMER et al., 1999; LOTHERIUS et al., 1999, DING et al., 2004), o que vem a corroborar nossos achados onde a 6-OHDA (40 e 200µM) promoveu uma diminuição na percentagem de células dopaminérgicas (79,78% e 93,75%) e nas não dopaminérgicas na maior concentração usada (63,44%).

Nos estudos iniciais usando 6-OHDA se pensava que ela era seletiva para neurônios dopaminérgicos devido à necessidade de usar o transportador de dopamina (DAT) para a entrada nos neurônios dopaminérgicos (JONSSON; SACHS, 1970; UNGERSTEDT, 1968; URETSKY; IVERSEN, 1970), posteriormente trabalhos demonstraram que ela pode induzir a morte celular também em neurônios não catecolaminérgicos que não têm DAT (DODEL et al., 1999; SEITZ et al., 2000) e até em células não neuronais (ABAD et al., 1995; BLUM et al., 2000; PUTTONEN et al., 2003).

A descoberta da deficiência no complexo I mitocondrial na substância negra de pacientes com DP promoveu uma ligação direta entre os protocolos tóxicos de MPTP e rotenona e DP (SCHAPIRA et al.,1990). O striatum parece ser um sítio particularmente sensível para a disfunção mitocondrial e o local de maior dano oxidativo. Estes achados provavelmente decorrem da alta atividade metabólica desta região e da dependência da fosforilação oxidativa para a obtenção de energia. A 6-OHDA é uma neurotoxina inibidora do

148 complexo I e IV mitocondrial, e pode causar dano celular semelhante ao que ocorre na DP (JEON et al., 1995). Esta neurotoxina catecolaminergica foi encontrada endogenamente no cérebro (GLINKA ; YOUDIN, 1997) e urina (ANDREW et al., 1993) de pacientes provavelmente via auto-oxidação da dopamina (SLIVKA; COHEN, 1985) a qual aumenta com o envelhecimento e pode levar à toxicidade.

O mecanismo da toxicidade induzida pela 6-OHDA tem sido sumarizado em duas vias, uma é a via de toxicidade extracelular, onde a 6-OHDA gera H2O2 e outras espécies reativas do oxigênio através de auto-oxidação, produzindo dano celular (BLOUM et al., 2000; WU et al., 1996; GASSEN et al., 1998; YAMADA et al., 1997). A outra via está relacionada com a internalização da 6-OHDA por transportadores dopaminérgicos e a conseqüente geração de EROS intracelular (GLINKA et al., 1995) tanto por inibição do complexo I e IV da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial quanto por desaminação enzimática da MAO (GLINKA et al., 1997; SOTO-OTERO et al., 2000 ; WOODGATE et al., 1999; BLOUM et al., 2000; WU et al., 1996).

Esta neurotoxina provoca total colapso da função de células aeróbias e anaeróbias, diferente de outras toxinas mitocondriais como a MPP+, que causam perda específica do metabolismo aeróbico. A toxicidade de 6-OHDA leva à perda do consumo de oxigênio mitocondrial, atividade glicolítica, ATP, gradiente iônico H+, potencial de membrana, bem como acumulação de produtos oxidativos, como o peróxido de hidrogênio. A habilidade da 6- OHDA em manter o citocromo c em sua forma reduzida parece ter relação com o distúrbio mitocondrial. A 6-OHDA altera o estado redox dos citocromos resultando em perda de disponibilidade de substrato e obstrução de eventos de oxidação-redução. As propriedades redutoras do citocromo c são singulares para os neurotransmissores catecolaminérgicos (MAZZIO et al., 2004) e pode ter papel significante na vulnerabilidade seletiva de neurônios dopaminérgicos a agressões mitocondriais. Assim, compostos que possuem atividades antioxidantes e antiinflamatórias podem ser neuroprotetores em protocolos experimentais de

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DP e clinicamente podem ser importantes em parar a progressão da DP e assim melhorar a qualidade de vida destes pacientes.

Neuroproteção e neuroresgate podem ter efeitos muito diferentes na função neuronal daí o uso em nosso trabalho de dois protocolos onde a fração enriquecida de chalconas (FEC) obtida da Myracrodruon urundeuva e também o 2-O-metilinositol (MIT) isolado da Magonia glabrata apresentaram alguns resultados diferentes tanto no protocolo de neuroprevenção como no protocolo de neuroresgate. O motivo principal de termos testado estas substâncias em dois protocolos foi o de primeiramente estudá-las como possíveis drogas citoprotetoras, ou seja, inibindo o estabelecimento do dano celular. No segundo caso avaliaríamos os efeitos dessas substâncias na tentativa de recuperar algumas atividades bioquímicas perdidas pelo efeito da neurotoxina e tentar parar este processo.

A determinação da atividade das enzimas mitocondriais pode ser utilizada como ferramenta para se determinar a viabilidade celular. Dentre elas a medição da clivagem do sal de tetrazólium (MTT) pelas desidrogenases mitocondriais formando um sal de tetrazólium é um ótimo protocolo para se procurar drogas com ação neuroprotetora (GUANGJUN et al., 2002).

Nós mostramos que a FEC protegeu de forma dose-dependente as células mesencefálicas da neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA (40 e 200µM) nos dois protocolos. Além disso, esta neuroproteção envolveu os neurônios TH+ (dopaminérgicos) e os TH- (não dopaminérgicos), demosntrando uma ação protetora inespecífica abrangendo as células neuronais e não neuronais presentes na região mesencefálica. Esta ação pode ser explicada pelo fato de as chalconas (análogos de flavonóides) atuarem reconhecidamente como agentes antioxidantes (ZUANAZZI, 2000) e queladores de ferro, diminuindo assim o estresse oxidativo e a conseqüente morte celular (SIMÕES et al., 2003). Além disso, Pan e cols. (2003) demonstraram que polifenois extraídos do chá verde podem inibir a recaptação de dopamina pelo transportador e protegerem células mesencefálicas do dano celular.

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SHAHIDI e cols. (1991) demonstraram que os O-hidroxiflavonóides são excelentes quelantes de metais. Estudos com a planta Scutellaria baicalensis analisaram o perfil antioxidante dos três principais flavonóides contidos no extrato de suas raízes: wogolina (5,7- dihidroxi-8-metoxiflavona), baicaleína (5,6,7-trihidroxiflavona) e seu 7-glicuronídeo, a baicalina. Este último mostrou a maior atividade antioxidante dos três, devido à presença do grupamento glicuronídeo no C7 de sua estrutura (GABRIELSKA et al., 1997).

A deferoxamina (DEF), um agente quelador de ferro, usado como controle positivo, também mostrou efeito citoprotetor, quando associada com a 6-OHDA. Alguns trabalhos relatam que queladores de ferro, como a deferoxamina, são altamente efetivos em induzir neuroproteção in vivo e in vitro (GUANGJUN et al., 2002). GLINKA e cols. (1996) mostraram que a deferoxamina ativa a NADH desidrogenase (complexo I) até na ausência de 6-OHDA e portanto ela provavelmente atuaria diretamente sobre esta enzima, o que também foi demonstrado por BEM-SHACHAR e cols (1991), o qual mostrou que deferoxamina previne a inibição da NADH desidrogenase pela 6-OHDA e protege ratos da morte induzida por injeção intracerebral de 6-OHDA in vivo..

O conceito corrente da patogênese da doença de Parkinson é que o evento central seria a formação de espécies reativas de oxigênio e o conseqüente estresse levaria ao dano oxidativo da substancia negra. Estudos post mortem têm provido evidencias que suportam a participação do estresse oxidativo na geração da doença de Parkinson; em particular estes estudos demonstram alterações no conteúdo de ferro no cérebro, deficiência na função mitocondrial, alteração nos sistemas de proteção antioxidantes (especialmente superoxido dismutase e glutationa reduzida-GSH) e dano oxidativo em lipídios, proteínas e DNA. O Ferro pode induzir estresse oxidativo e injeções intranigrais têm demonstrado serem capazes de induzir um protocolo de parkinsonismo progressivo. A perda de GSH é associada com corpos de Lewy incidentais e pode representar o marcador bioquímico inicial de perda de células nigrais

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(JENNER et al.,1996). A depleção isolada de GSH pode não resultar em dano nos neurônios nigrais, mas pode incrementar a susceptibilidade a exposições subseqüentes a radicais livres.

A atividade antioxidante dos flavonóides deriva de sua habilidade em inibir enzimas envolvidas na produção de radicais livres, em atuar como varredores destes radicais (HUSAIN et al., 1987; YUTING et al., 1990) e em agir como quelantes de íons (AFANAS’AV et al., 1989). Outro possível mecanismo para este efeito dos flavonóides seria sua ação estabilizadora de membranas, através da diminuição da fluidez das mesmas (ARORA et al., 2000).

A capacidade dos flavonóides de agirem como antioxidantes in vitro tem sido assunto de diversos estudos nos últimos anos e uma importante relação estrutura-atividade foi bem estabelecida (KUMAMOTO et al., 2001; GUO et al., 1996; CHAO-FANG et al., 2001). DAS e

PEREIRA (1990) demonstraram que uma dupla ligação entre os carbonos C2 e C3, assim como um grupamento carbonila no C4 são importantes características para a potência da ação antioxidante dos flavonóides.

Em relação a fração enriquecida de chalconas (FEC) isolada da Miracrodruon unrudeuva esta é composta pelas seguintes chalconas: urundeuvina A, urundeuvina B, urundeuvina C. A urundeuvina A é possuidora de 7 grupamentos hidroxil assim como a urundeuvina B, ao passo que a urundeuvina C apresenta 8 grupamentos hidroxil. A presença de grupamentos hidroxil é importante na estabilização e consequentemente na potência da molécula devido a um maior número estruturas de ressonância (BANDEIRA, 2000). A presença desses grupamentos são também presentes em outros tipos de chalconas como a buteína e outras 3,4-dihidroxichalconas as quais são mais ativas que suas análogas flavonas devido a sua maior capacidade em deslocar elétrons (DZIEDZIC ; HUDSON, 1983). Da mesma forma as isoflavonas são bem mais potentes que as flavonas devido aos efeitos estabilizadores dos grupamentos 4-carbonil e 5-hidroxil presentes nas mesmas. O fato das urundeuvinas presentes na FEC apresentarem uma dupla entre os carbonos 2 e 3 e o grupamento carbonila as candidata a ter uma ação antioxidante, o que poderia explicar seu

152 efeito citoprotetor. Deste modo, procuramos investigar o efeito da fração na peroxidação lipídica e formação de nitrito induzida pela 6-OHDA.

A natureza dos radicais livres responsáveis pela morte celular na doença de Parkinson permanece desconhecida, mas existem evidências da participação de radicais hidroxila, peroxinitrito e óxido nítrico (JENNER, 2003, BARREIRO et al., 2003). Na última década, diferentes cientistas forneceram evidências da existência da óxido nítrico sintase na mitocôndria (NOSmt) (GHAFOURIFAR ; RICHTER, 1997; GIULIVI et al., 1998), que catalisa a produção mitocondrial de NO. As variações de expressão e atividade da NOSmt possuem importantes efeitos nas funções da mitocôndria, como na captação de O2 e ganho − energético, na produção de O2 e H2O2 e na sinalização celular. O NO produzido em grandes quantidades pela iNOS e seus derivados, tais como peroxinitrito e dióxido de nitrogênio têm um importante papel na inflamação e possivelmente em outros processos patológicos (BARREIRO et al., 2003), daí a importância da busca de produtos fitoquímicos isoladas de variadas plantas como agentes que suprimem a expressão de iNOS.

Efeitos específicos do óxido nítrico (NO) no complexo I têm sido demonstrados nos últimos anos, CLEMENTI e cols. (1998) observaram que o NO em concentrações micromolares e por longos períodos, inibe a respiração e a atividade do complexo I. Assim, − − uma longa exposição ao NO induz a produção de O2 e ONOO nas mitocôndrias cardíacas e hepáticas, resultando em inibição permanente de NADH, enquanto os complexos II e III permanecem sem alterações. Cooperação entre NO e cálcio durante isquemia foi descrita (JEKABSONE et al., 2003), NO e cálcio causaram perda do citocromo c mitocondrial e ativaram a via de apoptose dependente de caspase 3. Considerando que o NO aumenta a − produção mitocondrial de O2 pelos complexos I e III, ainda não se sabe por que o primeiro é mais seletivamente sensível a ONOO−; é possível que o maior acúmulo de ubiquinol no complexo III proteja as proteínas da nitração (SCHÖPFER et al., 2000).

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A reação de Griess é um método de espectrometria para análise de nitritos (NO2-) em soluções aquosas. Nitrito é um produto do metabolismo oxidativo do NO. Assim, é possível relacionar os níveis de nitrito e nitrato nas amostras com os níveis de NO produzidos. Enquanto a produção endógena em níveis satisfatórios de NO pode ser benéfica para o organismo, sua produção excessiva foi implicada na patogenia de muitas doenças envolvendo sistema cardiovascular, imune e sistema nervoso (BARREIRO et al., 2003).

Nossos resultados mostraram que a 6-OHDA induziu a uma grande formação de nitrito, estes resultados já tendo sido demonstrado previamente por nosso grupo (NOBRE JÚNIOR et al., 2003) neste tipo de cultura, por Choi e cols. (2004) em células MN9D, uma linhagem de células dopaminérgicas, e por Singh e cols. (2005) usando modelos experimentais de DP in vivo. A FEC mostrou um efeito preventivo sobre a formação de nitrito induzido pela 6-OHDA, apesar de não ter mostrado efeito quando adicionada após a 6-OHDA, provavelmente o gene da NOS já tinha sido expresso e a síntese da enzima já tenha sido iniciada.

Um recente trabalho (IVON et al., 2005), estudou muitas chalconas sinteticas por seus efeitos inibitórios na ativação de mastócios, neutrófilos, macrófagos e células microgliais. Estes compostos demonstraram atividade inibitória de NO, produto dos macrófagos e células gliais. Alguns deles mostraram potentes efeitos inibitórios sobre a geração de ânions superoxido em neutrófilos de ratos em resposta a fMLP/CB. Alguns derivados de chalcona mostraram atividade inibitória sobre expressão da iNOS e TNF-alfa induzida por LPS, Alcaraz e cols (2004) demonstraram este efeito em macrófagos RAW 2647 estimulados com LPS ao qual atribuíram o efeito sobre a expressão da iNOS à inibição da ativação do NF-Kappa B.

Outros flavonóides como a epigalocatequina (LIN et al., 1997), teaflavina-3,3´-digalato (PAN et al., 2003) e catequina (CUNHA et al., 2003) também demonstraram a capacidade de diminuir a formação de óxido nítrico em outros modelos estudados.

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A apigenina também inibe a produção de NO em macrófagos peritoneais de camundongos em resposta a ativação por lipopolissacarídeos. Algumas características estruturais influenciam nessa atividade: a) o grupo 3-hidroxila diminui a atividade da NOS; b) a dupla ligação entre o carbono C2 e C3 aumenta a atividade antioxidante; c) a glicosilação os torna menos menos ativos que suas agliconas correspondentes; d) a presença do grupo 4’- hidroxila aumenta a atividade das flavonas e dos flavonóis; e) o grupo 5-OH tende a aumentar a atividade (MATSUDA et al., 2003).

O estudo dos radicais livres e antioxidantes na biologia está produzindo uma revolução médica que promete uma nova era para a saúde e o tratamento das doenças. Em relação às reações oxidativas, as espécies reativas de oxigênio (EROS) tem um papel importante em doenças degenerativas crônicas, incluindo câncer, doenças autoimunes, inflamatórias, cardiovasculares e neurodegenerativas (ARUOMA et al., 2003).

Uma superprodução de espécies reativas de oxigênio (EROS) pode aumentar o estresse oxidativo, o qual pode induzir dano neuronal e em última instância, conduzir para morte neuronal por apoptose ou necrose. Muitas evidências indicam que o estresse oxidativo está envolvido na patogenia de várias doenças neurodegenerativas. Vários estudos mostram que antioxidantes nutricionais (principalmente vitamina E e polifenois) podem bloquear a morte neuronal in vitro, e podem ter propriedades terapêuticas em modelos animais que simulam as doenças neurodegenerativas incluindo a DP (MANDEL et al., 2004; YOUDIM et al., 2002; JIANG et al., 2003). Além disso, dados clínicos sugerem que antioxidantes nutricionais podem apresentar algum efeito protetor contra a DP (DI MATTEO et al., 2003).

A proteção contra o stress oxidantativo tanto endógeno como exógeno é proporcionado por vários sistemas enzimáticos, incluindo a catalase, a superóxido dismutase e a glutationa peroxidase. A glutationa e a glutationa peroxidase inativam os radicais livres e os metabólitos do oxigênio derivados das reações oxidativas e do metabolismo (MESSANA et al, 1988), além de afetar a síntese de proteínas e o DNA.

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A quantificação sensível de substâncias tio-barbitúricas ácido-reativas (TBARS) tem feito desta técnica uma escolha para a observação de peroxidação lipídica, um maior indicador de estresse oxidativo (YAGI et al., 1998; ARMSTRONG et al., 1994; LEFERRE et al., 1998). Este ensaio permite uma importante avaliação da atividade dos radicais livres em condições patológicas e tem sido usado para quantificar a atividade antioxidante de vários compostos (VILLA-CABALLERO et al., 2000; HUNNISETT et al., 1995). Embora muitas controversias tenham aparecido na literatura em relação a especificidade do TBARS direcionados a compostos diferentes do malonildiaaldeído (MDA).

Nosso resultado demonstrou que a exposição das células à 6-OHDA aumentou os níveis de TBARS, ação essa que foi revertida pela deferoxamina, o que pode ser explicado pela sua propriedade queladora de metal e seu efeito antioxidante ocasionadas pela sua captação de ferro, tornando-o indisponível para a Reação de Fenton (GLINKA et al.,1996).

A FEC tanto no protocolo de neuroprevenção quanto no protocolo de neuroresgate foi capaz de reverter quase completamente a formação de TBARS induzida por 6-OHDA estando estes dados de acordo com outros autores (BRAVO, 1998; MIDDLETON et al., 2000) que afirmam que flavonoides apresentam ação antioxidante e queladora de metal, diminuindo assim a peroxidação lipídica e a conseqüente formação de TBARS. Como já explicado, a 6-OHDA causa neurotoxicidade por alterar o ciclo redox, levando a um aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e conseqüente lesão oxidativa. Efeitos semelhantes foram demonstrados anteriormente em nosso laboratório (NOBRE-JUNIOR et al., 2003) os quais mostraram que a catequina (derivado flavônico) diminuiu a peroxidação lipídica em cultura de células mesencefálicas de ratos induzidas pela 6-OHDA.

Uma estrutura polihidroxilada é sabidamente relacionada com propriedades varredoras de radicais (BORS et al., 1990; RAICE-EVANS et al ., 1996). Portanto estruturas químicas como as presentes na FEC influenciam sua ação antioxidante. Estudos sugerem que os sítios

156 ativos de polifenóis presentes no chá verde, uma fonte de catequinas, interagem com radicais livres devido a presença de grupamentos hidroxila no anel C (GUO et al.,1996). Grupamentos hidroxila em outras posições, como no anel B não tem este efeito. Também, estes grupamentos hidroxila podem estar relacionados com a atividade inibidora de lipoxigenase, visto que análogos de flavonóides (chalconas) apresentam ação inibidora da 5-lipoxigenase quando grupamentos hidroxila estão presentes em posições comparáveis (SOGAWA et al., 1993).

MIYASE e cols. (1999a) identificaram na planta Lespedeza homoloba (Leguminosae), oito novos compostos fenólicos. Dentre estes, três demonstraram possuir potente atividade antioxidante in vitro em homogenatos de cérebro de ratos. Em uma análise posterior usando também o modelo de peroxidação lipídica em homogenato de cérebro de ratos, MIYASE e cols. (1999b) testaram quinze novos isoflavonóides e concluíram que aqueles compostos que possuíam um grupamento catecol apresentavam maior atividade antioxidante, do que aqueles que não possuíam.

O chá verde contém diversos antioxidantes, entretanto são os polifenóis que contribuem mais profundamente para essa atividade antioxidante e, dos polifenóis, é a epigalatocatequina galato, que é o mais potente e mais abundante antioxidante presente no chá verde. Contra certos radicais livres, especialmente os radicais de oxigênio ativo, o EGCG é superior em cerca de 10 vezes do que as vitaminas E e C. As catequinas presentes no chá verde são poderosas antioxidantes e removedoras de EROS e espécies de nitrogênio em sistemas in vitro (SALAH et al., 1995; NANJO et al., 1996; MOREL et al., 1999). O chá verde e o preto inibiram a peroxidação lipídica induzida por ferro-arcorbato em homogenato de membranas mitocondriais cerebrais (LEVITES et al., 2002).

As ações neuroprotetoras dos polifenois presentes no chá verde podem resultar da habilidade para induzir as defesas antioxidantes. Vários flavonóides e antioxidantes fenólicos ativam a expressão de alguns genes de resposta ao estresse (stress-response genes- SRE), tais como, enzimas metabolizantes de drogas de fase II, glutationa-S-transferase e heme-oxigenase

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I (CHEN et al., 2000). Além disso, durante o estresse oxidativo, a ativação dos SRE, se correlacionam com um aumento na ativação do caminho das MAPK (mitogen-activated protein kinases) (OWUOR ; KONG, 2002; SCROEDER et al., 2002; CHUNG et al., 2003), outros alvos implicados no efeito neuroprotetor dos flavonóides envolvem o controle da homeostase do cálcio (ISHIGE et al., 2001), proteína quinase C (LEVITES et al., 2002b, 2003; MARCEL et al., 2004) e enzimas antioxidantes (CHENG et al.,2000 LEVITES et al., 2001).

A Apoptose é uma forma de morte celular de fundamental importância em vários sistemas biológicos, desempenhando um papel essencial no desenvolvimento dos tecidos e órgãos, na regulação da resposta imune e na eliminação de células senecentes. É identificada por uma série de alterações morfológicas na célula: diminuição do volume celular, perda de contato, condensação da cromatina, fragmentação do DNA e alteração no potencial transmembranico da mitocôndria (WANG et al., 2003; BRADY, 2004). A apoptose pode ser induzida por agentes químicos ou físicos. Quanto à necrose, esta pode ocorrer por uma rápida ação tóxica da droga na célula e é caracterizada pelo aumento do volume celular inicial e perda da integridadde da membrana plasmática (DARZYNKIEWICZ et al., 1992). Acredita-se a Bax, um membro pro-apoptótico da família de proteínas Bcl-2, tenha sua ação primariamente por facilitação da liberação de citocromo c do espaço intermembrana mitocondrial no citosol, levando a ativação de caspases e morte celular (RUVOLO et al., 1998). Devido a alterações na função respiratória, tem sido observado em estudos de pacientes com DP, ativação de caspases e morte celular com aspectos morfológicos compatíveis com apoptose (HARTMANN et al., 2001).

Em relação ao padrão de morte celular estudada neste trabalho, a 6-OHDA (40µM) induziu um aumento no número de células em apoptose inicial e na maior concentração (200µM) pôde ser observado um aumento no número de células em apoptose tardia e necrose. Muitos estudo têm sido conduzidos para determinar se a 6-OHDA mata as células por apoptose ou necrose. Embora a maioria dos estudos concorrem para a apoptose (CADET, 2001; BLUM et al., 2001), outros autores (PUTONEN et al., 2003; WALKINSHAW; WATERS, 1994;

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DODEL et al., 1999) descreveram um efeito bifásico após altas concentrações, tal como os nossos achados. A mudança de apoptose para necrose sendo gradual e dependente do tipo celular e da concentração usada (MAYO et al., 1999)

A FEC mostrou um efeito antiapoptótico tanto quando adicionada antes como depois da 6-OHDA, além de terem protegido da necrose, apesar de neste caso, o efeito tenha se mostrado menos potente, já que foi evidenciado que a perda da integridade morfológica, isto é, a perda dos neuritos não tenha sido inibida.

Liang e colaboradores (2004) mostraram que neurônios dopaminérgicos primarios ou linhagem de células MN9D quando expostas à 6-OHDA, sofrem degeneração tardia e apoptose, com uma elevação da atividade celular das caspases 9 e 3, mas não da caspase-8, indicando que esta via apoptótica predomina na degeneração de neurônios dopaminérgicos e células MN9D.

Os flavonóides podem proteger o cérebro por sua habilidade de modular a sinalização intracelular promotora de sobrevivência celular. Quercetina e flavonoides estruturalmente relacionados (miricetina, fisetina e luteolina) mostram marcante atividade citoprotetora in vitro em condições experimentais de modelos de morte apoptótica, como as induzidas por peróxido de hidrogênio em cultura de células PC12 (DAJAS et al., 2003).

Estudos em células de neuroblastoma (NB SH-SY5Y) demonstram um efeito antiapoptótico da epigalocatequina em baixa concentrações (em torno de 1µM), via down regulation da expressão de genes pro-apopóticos como, Bax, Bad, mdm2, caspase-1, sem afetar a expressão dos genes das proteínas antiapoptóticas, bcl-w, bcl-2 e bcl-xL. (LEVITES et al., 2002; WEINREB et al., 2003b). Dado que a mitocôndria desempenha um grande papel na apoptose induzida pelo estresse oxidativo, se especula que o efeito antiapoptótico da epigalocatequina pode ter como alvo a mitocôndria, por bloqueio da abertura dos mitochondrial permeability transition pore, (mPTP), pois foi demonstrado que os flavonóides se ligam aos

159 sítios de ligação dos receptores GABA-A benzodiazepinicos e receptores da adenosina, que são associados com a mPTP, modulando a liberação de citocromo c mitocondrial (SCHROETER et al., 2002). Secundariamente, os flavonoides podem afetar a integridade mitocondrial por modular a homeostase do cálcio (ISHIGE et al., 2001). Estes dados juntos sugerem que os flavonoides, particularmente a epigalocatequina, podem funcionar como drogas bioenergéticas, tais como o a coenzima Q, que está sendo estudada em ensaios clínicos em pacientes com DP (BEAL, 2003).

Existem evidências de que a família do fator nuclear Kapa B (NF-Kapa B) tem papel importante no controle da resposta apoptótica (PARK et al., 2004). Analises por imunocitoquímica e imunoblotting revelaram que o NF-Kapa B-p65 é translocado após tratamento com 6-OHDA, mas não com MPP+. Uma ativação tempo-dependente do NF-Kapa B induzida pela 6-OHDA também foi demonstrada por eletroforese. Esses dados podem indicar uma ativação droga-específica do NF-Kapa B como um fator determinante da sobrevivência para neurônios dopaminérgicos.

Inúmeras desordens neurodegenerativas tais como esclerose múltipla, doença de Alzheimer e doença de Parkinson são associadas com processos inflamatórios. O processo complexo de neuroinflamação envolve vários componentes do sistema imune e o sistema nervoso central. Particularmente, os astrócitos e células da micróglia geram vários componentes da cascata do complemento (KULKARNI et al, 2004). O sistema complemento apresenta um importante papel na etiologia de muitas das desordens neuroinflamatórias. Para prevenir disfunções relacionadas com o processo inflamatório no sistema nervoso central, podem ser utilizados agentes tais como antiinflamatórios não-esteroidais, esteróides, nitronas, catequinas, inibidores de NO sintetase, flavonóides e inibidores de fosfodiesterase (KULKARNI et al, 2004).

Várias chalconas tem demonstrado atividade antiinflamatória, entre elas a buteína (LEE et al., 2003), que inibe a produção de NO e a indução da expressão do TNF-alfa e COX e

160 ativação do NK-kappaB, a dimetilamino-chalcona (ROJAS et al., 2002) que inibe a produção de NO e PGE(2), sofalcone, que inibe a produção de IL-1 e TNF-alfa (FUJIWARA et al., 2001) e apigenina e kampferol (KOWALSKI et al., 2005), que inibem a expressão do gene da IL-1 beta e TNF alfa.. Assim é possível que o efeito citoprotetor da FEC seja devido em parte a sua ação antioxidante e em parte a uma ação antiinflamatória, prevenindo a ativação de células microglias presentes na cultura e a liberação de citocinas. Além disso, uma ativação tempo- dependente do NF-Kapa B pela 6-OHDA foi demonstrada (GRUNBLATT et al., 2000), que possivelmente é bloqueada pela FEC. Finalmente, uma vez que a 6-OHDA produz uma elevação na atividade das caspases –9 e –3, sem elevar a atividade da caspase-8, nossos resultados sugerem que essa via de sinalização intrínseca pode estar também bloqueada pela FEC.

O outro composto estudado neste trabalho foi o 2-O-metilinositol (MIT) isolado da M. glabrata, pelo grupo da Profa Telma Lemos do Departamento de Química orgânica da UFC. Apesar de relatos da toxicidade desta planta, o composto isolado não apresenta toxicidade, em relato pessoal (não publicado), a profa Telma afirmou que o composto não é tóxico para os peixes, sendo este efeito atribuído a outros compostos presentes na planta. Confirmando estes achados, o composto estudado não apresentou toxicidade para a cultura primária de células mesencefálicas de rato, pelo contrário, na maior concentração, ela promoveu um pequeno aumento na viabilidade celular em relação ao controle.

Quando em associação com a 6-OHDA, o MIT preveniu significativamente a toxicidade induzida pela 6-OHDA no dois protocolos estudados, inclusive mostrando um efeito protetor tanto nas células dopaminérgicas, quanto em outros grupos neuronais presentes na cultura. É também importante destacar que na literatura há poucos trabalhos sobre este composto, nunca tendo sido relatado um efeito citoprotetor deste, no modelo de cultura de células neuronais empregado. O MIT é um monossacarídeo com um único anel da estrutura polihidroxilada, como já citado anteriormente, uma estrutura polihidroxilada está relacionada com propriedades varredoras de radicais (BORS et al., 1990; RAICE-EVANS et al ., 1996), e um efeito

161 antioxidante moderado foi demonstrado para este composto (MACHADO et al., 2004), é possível que estas ações possam explicar os efeitos citoprotetores deste composto. Para uma maior confirmação, resolvemos investigar uma possível ação inibidora do MIT sobre a formação de nitrito e na peroxidação lipídica induzida pela 6-OHDA no modelo de cultura de células mesencefálicas. .

O MIT isoladamente não promoveu nenhuma alteração nos níveis de nitrito ao passo que associado com a 6-OHDA se mostrou até mais potente que a FEC, já que foi efetivo nos dois protocolos revertendo o aumento nos níveis de nitrito induzido pela neurotoxina. Além disso, o MIT conseguiu reverter o aumento dos níveis de TBARS produzidos pela 6-OHDA também nos dois protocolos, comprovando assim um potente efeito antioxidante deste composto.

Trabalhos demonstram que o mioinositol (inibe o dano ao DNA induzido pela formação de superóxidos (xantina oxidase dependente), podendo agir como varredor de radicais hidroxilas (MURAOKA : MIURA, 2004). Com relação a compostos com estruturas relacionados ao MIT, trabalhos relatam um efeito antioxidante para o ácido fítico (mio-inositol hexafosfato) uma molécula muito abundante em plantas, que demonstrou um forte efeito quelador de ferro e inibidor da peroxidação lipídica (MIYAMOTO et al., 2000, 2001; GRAF : EATON, 1990, MURAOKA ; MIURA, 2004). Também, o pinitol um análogo 3-metoxi do D- inositol demonstrou um efeito antiinflamatório em modelos in vivo, além de ação hipoglicemiante, através de um aumento no transporte de glicose, independente de insulina. Finalmente, o mio-inositol 1,2,6-trifosfato Ins(1,2,6)P3 que é um produto obtido pela degradação enzimática do ácido fítico (mio-inositol 1,2,3,4,5,6- hexafosfato) mostrou efeitos farmacológicos importantes em muitas patologias, como por exemplo nas complicações diabéticas secundárias, nas doenças cardiovasculares e nas inflamações crônicas tais como artrite (BATES et al., 2000).

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Com relação ao padrão apoptótico induzido pela 6-OHDA, o MIT inibiu a apoptose das células neuronais e aumentou a viabilidade celular, nos dois protocolos e nas duas concentrações da 6-OHDA estudadas, demonstrando uma grande efeito antiapoptótico.

Apesar de numerosos estudos realizados sobre o papel do Ins(1,4,5)P3 e do sn-1,2- diacilglicerol como segundo-mensageiros no modo de transdução utilizado na cascata dos fosfoinositídeos, nenhum mecanismo de ação ou uma relação estrutura-atividade pode ser 2+ proposto sem ambigüidade. Sabe-se que o Ins(1,4,5)P3 é um mediador na liberação do Ca intracelular, do retículo endoplasmático (RE) para o citoplasma. Ele ativa um receptor situado na membrana externa do RE ligado a um canal de cálcio. Esta ativação provoca a abertura deste último e, assim, a liberação do Ca2+ no citoplasma com consequente ativação de proteína quinase dependente de cálcio (PKC) (STREB et al., 1983). Não podemos é claro descartar o papel da proteína kinase II dependente de calmodulina (CaMKII) a qual é ativada pelo Ca++ liberado pela ação o IP3 nos calcissomas. A CaMKII ativa síntese de catecolaminas, ativa tirosina hidroxilase, fatores de transcrição e é uma das cinases mais envolvidas em fenômenos plásticos daí a sua importância no contexto da DP.

Outro possível mecanismo de ação para o MIT seria a possibilidade deste atuar nas células convertendo-se em segundos mensageiros e assim ativar proteina kinase C. Esta possibilidade decorre do fato dos inositois apresentarem a capacidade de seqüestrar fósforo (ALMEIDA et al., 2003) e que através deste mecanismo teríamos a formação do trifosfato de inositol (um segundo mensageiro). Além disso, Qiao e cols (2000) demonstraram que o MIT (também chamado de quebrachitol) pode ser usado na síntese de fosfatidilinositol polifosfatos. O papel da PKC nas doenças neurodegenerativas, principalmente DP está adquirindo uma maior relevância (MANDEL et al., 2005), o mecanismo pelo qual a ativação da PKC alfa leva à neuroproteção precisa ainda ser definido. Estudos suportam um papel dela como uma BCl-2 quinase que pode suprimir a apoptose , provavelmente através da fosforilação direta ou indireta da Bcl-2 (RUVOLO et al., 1998)

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Estudos têm demonstrado que o mio-inositol, o isômero mais abundante no cérebro, e os inositóis fosfatos podem representar uma via para o tratamento das doenças Maníaco- Depressivas, de Alzheimer e Síndrome de Down (MCLAURIN et al., 2000; SHIMOHAMA et al., 1998; HUANG et al., 1999). Daí a relevância de um estudo mais profundo sobre as ações do MIT isolado de compostos naturais como droga neuroprotetora.

A neurodegeneração na doença de Parkinson, Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas tem se apresentado multifatorial, englobando um complexo de reações tóxicas incluindo inflamação, neurotoxicidade glutamatérgica, aumento de ferro e óxido nítrico, depleção de antioxidantes endógenos, redução da expressão de fatores tróficos e expressão de proteínas pró-apoptóticas que levariam ao dano neuronal (MANDEL et al., 2004). Se a neuroproteção pela FEC e MIT for confirmada em animais e posteriormente em seres humanos com DP, a FEC obtida de M. urundeuva e o MIT isolado de Magonia glabrata poderão ter um importante significado clínico como drogas complementares não somente para terapia da doença de Parkinson mas como fortes candidatos como agentes neuroprotetores na doença.

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CONCLUSÃO

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6. CONCLUSÕES

A cultura de células mesencefálicas de rato revelou um percentual de células dopaminérgicas em torno de 2% após 5 dias de cultura A 6-OHDA (40 e 200 µM), promoveu uma diminuição na viabilidade celular em torno de 37,65% e 63,44% para células não dopaminérgicas (TH-) e (79,78% e 93,75%) para células dopaminérgicas (TH+). A 6-OHDA (40 e 200 µM), induziu a um aumento nos níveis de nitrito e na peroxidação lipídica . Na concentração de 200 µM a 6-OHDA induziu uma grande morte celular, com aumento no número de células apoptóticas e necróticas. A fração enriquecida de chalconas (FEC) nas concentrações de 1; 10 e 100µg/Ml reduziu significativamente e de maneira dose-dependente a morte celular induzida pela 6-OHDA (40 e 200 µM), tanto quando adicionada 3 horas antes (protocolo de neuroprevenção) quanto adicionada 3 horas após a neurotoxina (protocolo de neuroresgate). Além disso a FEC inibiu o aumento de nitrito (somente no protocolo de neuroprevenção) e a peroxidação lipídica (nos dois protocolos) induzida pela 6-OHDA. A FEC demonstrou atividade antiapoptótica e preveniu a necrose causada pela 6-OHDA (200 µM) (nos dois protocolos estudados). O 2-O-metilinositol (MIT) nas concentrações de 1, 10 e 100 µg/Ml protegeu tanto as células TH- quanto TH+ do dano induzido pela 6-OHDA (em ambos os protocolos), O MIT reduziu os níveis de nitrito e a peroxidação lípidica induzida pela 6-OHDA nos dois protocolos estudados. Também demonstrou uma potente atividade antiapoptótica, além de diminuir o número de células necróticas . Apesar de estruturas quimicamente diferentes o mecanismo antiapoptótico e neuroprotetor da FEC e do MIT parece estar relacionado com uma proteção mitocondrial e atividade antioxidante, via interferência no sistema NO; não se podendo estacar uma ação a nível de segundos mensageiros, tais como inositó trifosfatos e PKC.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

167

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABAD, M. J.; BERMEJO, P.; VILLAR, A. The activity of flavonoids extracted from Tanacetum microphyllum DC. (Compositae) on soybean lipoxygenase and prostaglandin synthetase. Gen. Pharmacol., v.26, p.815-819, 1995.

ABDEL-GAWAD, H. M.; CALIFA, A. E. Quercetin, coenzyme Q10 and L-canavanine as protective agents against lipid peroxidation and nitric oxide generation in endotoxin-induced shock in rat brain. Pharmacol. Res., v.43, p.257-263, 2001. ABELIOVICH, A.; SCHMITZ, Y.; FARIÑAS, I. Mice lacking α-synuclein display functional deficits in the nigrostriatal dopamine system. Neuron. v.25, p.239–252, 2000.

AFANAS’AV, I. B.; OSTRACHOVITCH, E. A.; KORKINA, L.G. Effect of rutin its copper complex on superoxide formation and lipid peroxidation in rat liver cromosomes. FEBS Lett., v.425, p.256-258, 1989.

AHMADI, F. A.; LINSEMAN, D. A.; GRAMMATOPOULOS, T. N.; JONES, S. M.; BOUCHARD, R. J.; FREED, C. R.; HEIDENREICH, K. A.; ZAWADA, W. M. The pesticide rotenone induces caspase-3-mediated apoptosis in ventral mesencephalic dopaminergic neurons. J. Neurochem., v.87, p.914-921, 2003.

ALCARAZ, M. J.; VICENTE, A. M.; ARAICO, A.; DOMINGUEZ, J. N.; TERENCIO, M. C.; FERRANDIZ, M. L. Role of nuclear factor-kappaB and heme oxygenase-1 in the mechanism of action of an anti-inflammatory chalcone derivative in RAW 264.7 cells. Br. J. Pharmacol.. v142, p.1191-1199, 2004. ALIAS, Y.; AWANG, K.; HADI, H. A.; THOISON, O.; SÉVENET, T.; PAIS, M. An antimitotic and cytotoxic chalcone from Fissistigma lanuginosum. J. Nat. Prod., v.58, p.1160- 1166, 1995.

168

ALMEIDA, M. V.; SILVA, A. D.; SOUZA, M. V. N.; BENÍCIO, A. A. A. A cascata dos fosfoinositídeos. Quím. Nova, v.26, p.105-111, 2003.

ALONSO, M. E.; OTERO, E.; D’REGULES, R.; FIGUEROA, H.H. Parkinson’s disease: a genetic study. Can. J. Neurol. Sci. v.13, p.248-251, 1986.

ALVES, F. N. R. Desafios para o desenvolvimento de fitomedicamentos no Brasil no contexto da indústria farmacêutica. Dissertação (Mestrado). Escola Nacional de Saúde Pública. Rio de Janeiro, 2004

ANDREEVA, N.; UNGETHUM, U.; HELDT, J.; MARSCHHAUSEN, G.; ALTMANN, T.; ANDERSSON, K.; GROSS, J. Elevated potassium enhances glutamate vulnerability of dopaminergic neurons developing in mesencephalic cell cultures. Exp. Neurol., v.137, p.255- 262, 1996.

ANDREW, R.; WATSON, D. G.; BEST, S. A.; MIDGLEY, J. M.; WENLONG, H.; PETTY, R. K. The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls. Neurochem. Res., v.18, p.1175-1177, 1993.

ANGLADE, P.; VYAS, S.; JOVOY-AGID, F. Apoptosis and autophagy in nigral neurons of patients with Parkinson’s disease. Histol. Histopathol., v.12, p.25-31, 1997.

ARAÚJO, F. W. L.; LEMOS, T. L. 2-O-Metilinositol e Proantocianidina de Magonia glabrata. Química Nova v.2, p.128-136, 1994.

ARMSTRONG, A. M.; CHESTNUTT, J. E.; GORMLEY, M. J.; YOUNG, I. S.; The effect of dietary treatment on lipid peroxidation and antioxidant status in newly diagnosed noninsulin dependent diabetes. Free Radic. Biol. Med.,.v.21, p.719-726, 1996.

169

ARORA, A.; BYREM, T. M.; NAIR, M. G.; STRASBURG, G. M. Modulation of liposomal membrane fluidity by flavonoids and isoflavonoids. Arch. Biochem. Biophy., v.373, p.102- 109, 2000.

ARUOMA, O. I. Methodological considerations for characterizing potential antioxidant actions of bioactive components in plant foods. Mutat. Res., v.20, p.523-524, 2003.

ASSEMI, M. Herbs affecting the central nervous system: ginkgo, kava, St. John’s wort and valerian. Clin. Obstet. Gynecol., v.44, p.824-835, 2001.

ASHKENAZI, A. Targeting death and decoy receptors of the tumor –necrosis factor superfamily. Nat. Ver. Cancer, v.2, p.420-430, 2002.

AZUMA, K.; IPPOUSHI, K.; ITO, H.; HIGASHIO, H.; TERAO, J. Combination of lipids and emulsifiers enhaces the absortion of orally administered quercetin in rats. J. Agric. Food Chem., v.50, p.1706-1712, 2002.

BANDEIRA, M. A. M.; MATOS, F. J. A.; BRAZ-FILHO, R. New chalconoid dimers from Myracrodruon urundeuva. Nat. Prod. Lett., v.4, p.113-120, 1993.

BANDEIRA, M.A.M. Myracrodruon urundeuva Allemão (Aroeira-do-Sertão): constituintes químicos da planta em desenvolvimento e adulta. Tese (Doutorado). Universidade Federal do Ceará. Departamento de Química Orgânica e Inorgânica. Fortaleza, 2002, p174.

BANSKOTA, A. H.; TEZUKA, Y.; ADNYANA, I. K.; XIONG, Q.; HASE, K.; TRAN, K. Q.; TANAKA, K.; SAIKI, I.; KADOTA, S. Hepatoprotective effect of Combretum quadrangulare and its constituents. Biol. Pharm. Bull., v.23, p.456-460, 2000.

170

BARBOSA, E.R.; LIMONGI, J.C.P.; CUMMINGS, J.L. Parkinson’s disease, Psychiatr. Clin. North Am. v.20, p.769-790, 1997.

BARREIRO, E.; GEA, J.; COROMINAS, J.M.; HUSSAIN, S.N. Nitric oxide synthases and protein oxidation in the quadriceps femoris of COPD patients. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. v.29, p.771-778, 2003.

BARREIRO, E. J.; FRAGA, C. A. M. Planejamento racional baseado no mecanismo de ação: fármacos inteligentes. Química medicinal – as bases moleculares da ação dos fármacos. Porto Alegre: Artmed, 2001, cap. 3, p. 83-122.

BASTIANETTO, S.; QUIRION, R. Natural extracts as possible protective agents of brain aging. Neurobiol. Aging, v.23, p.891-897, 2002.

BASTIANETTO, S.; RAMASSAMY, C.; DORE, S.; CHRISTEN, Y. POIRIER, J.; QUIRION, R. The Ginkgo biloba extract (EGb 761) protects hippocampal neurons against cell death induced by beta-amyloid. Eur. J. Neurosci., v.12, p.1882-1890, 2000.

BATES, S. H.; JONES, R. B.; BAILEY, C. J. Insulin-like effect of pinitol. Br. J. Pharmacol., v.130, p.1944-1948, 2000.

BAUER, D. J.; SELWAY, J. W. T.; BATCHELOR, J. F.; TOLDALE, M.; COLDWELL, J. C.; YOUNG, D. A. B. 4’,6-Dichloroflavan (BW 683C), a new anti-rhinovirus compound. Nature, v.292, p.369-370, 1981.

BEAL, M. F. Bioenergetic approaches for neuroprotection in Parkinson's disease. Ann. Neurol. Suppl. v.53, p.39-47, 2003.

171

BEN-SHACHAR, D.; ESHEL, G.; FINBERG, J.P.; YOUDIM, M.B. The iron chelator desferrioxamine (Desferal) retards 6-hydroxydopamine-induced degeneration of nigrostriatal dopamine neurons. J. Neurochem. v.56, p.1441-1444, 1991a.

BENVENISTE, E.N. Inflammatory cytokines within the central nervous system: sources, function, and mechanism of action. Am. J. Physiol. v.263, p.1-16, 1992.

BERRIDGE, M. J.; DAWSON, R. M. C.; DOWNES, C. P.; HESLOP, J. P.; IRVINE, R. F. Changes in the levels of inositol phosphates after agonist-dependent hydrolysis of membrane phosphoinositides. Biochem. J., v.212, p.473-482, 1983.

BEST CH, LUCAS CC, PATTERSON JM, RIDOUT JH.The rates of lipotropic action of choline and inositol under special dietary conditions. J Biochem (Tokyo). V.48, p.452-8, 1951.

BLUM, D.; TORCH, S.; NISSOU, M. F.; BENABID, A. L.; VERNA, J. M. Extracellular toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 cells. Neurosci. Lett. v.283, p.193-196, 2000.

BLUM, D.; TORCH, S.; LAMBENG, N.; NISSOU, M.; BENABID, A. L.; SADOUL, R.; VERNA, J. M. Molecular pathways involved in the neurotoxicity of 6-OHDA, dopamine and MPTP: contribution to the apoptotic theory in Parkinson's disease. Prog. Neurobiol., v.65, p.135-172, 2001.

BONIFATI, V.; FABRIZIO, E.; VANACORE, N.; D.E. MARI, M.; MECO, G. Familial Parkinson’s disease: a clinical genetic analysis. Can. J. Neurol. Sci. v.22, p.272-279, 1995.

BOOBIS, A.R.; FAWTHROP, D.J.; DAVIES, D.S.; Mechanisms of cell toxicity. Curr Opin Cell Biol. v.2, p.231-237, 1990.

172

BORS, W.; HELLER, W.; MICHEL, C.; SARAN, M., Flavonoids as anti-oxidants: determination of radical-scavenging efficiencies. Methods Enzymol. v.186, p.343-355, 1990.

BRAVO, L. Polyphenols: chemistry, dietry sources, metabolism and nutritional significance. Nutr. Ver., v.56, p.317-333, 1998.

BRADY, H. J. M. Apoptosis Methods and Protocols. Humana Press: Totowa, New Jersey. 2004.

BRAGA, R. Plantas do Nordeste, especialmente do Ceará. 3a ed., Fortaleza: Escola Superior de Agricultura de Mossoró, 1976, p. 356-359, 459-460 (Coleção Mossoroense, v.11).

BRATTON, S. B.; MACFARLANE, M.; CAIN, K.; COHEN, G. M. Protein complexes activate distinct caspase cascades in death receptor and stress-induced apoptosis. Exp. Cell Res. v.256, p.27-33, 2000.

BROUILLARD, R.; CHEMINAT, A. Flavonoids and plant color. Prog. Clin. Biol. Res., v.280, p.93-106, 1988.

BROWN, J. M.; YAMAMOTO, B. K. Effects of amphetamines on mitochondrial function: role of free radicals and oxidative stress. Pharmacol. Ther., v.99, p.45-53, 2003.

BRUGG, B.; MICHEL, P. P.; AGID, Y.; RUBERG, M. Ceramide induces apoptosis in cultured mesencephalic neurons. J. Neurochem., v.66, p.733-739, 1996.

BUDD, G. T.; WBESTER, K. D.; LIVINGSTON, K. B. Treatment of advanced cancer with cisplatin, actriamycin, and cyclophosphamide effect of treatment and incidence of intracranial metastases. J. Surg. Oncol., v.24, p.192-195, 1983.

173

BUTTERFIELD, P. G.; VALANIS, B. G.; SPENCER, P. S. Environmental antecedents of young-onset Parkinson’s disease. Neurology v.43, p.1150-1158, 1993.

BUTTERWECK, V.; JURGENLIEMK, G.; NAHRSTEDT, A.; WINTERHOFF, H. Flavonoids from Hypericum perforatum show antidepressant activity in forced swimming test. Planta Med., v.66, p.3-6, 2000.

CADET, J. L.; KATZ, M.; JACKSON-LEWIS, V.; FAHN, S. Vitamin E attenuates the toxic effects of intrastriatal injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in rats: behavioral and biochemical evidence. Brain Res., v.476, p.10-15, 1989.

CAO Y, CAO R. Angiogenesis inhibited by drinking tea. Nature, v.398, p.381, 1999.

CARLSSON, A.; LINDQVIST, M.; MAGNUSSON, T.; WALDECK, B. On the presence of 3- hydroxytyramine in brain. Science, v.127, p.471, 1958.

CASSARINO, D. S.; HALVORSEN, E. M.; SWERDLOW, R. H.; ABRAMOVA, N. N.; PARKER, W. D. JR.; STURGILL, T. W.; BENNETT, J.P. JR. Interaction among mitochondria, mitogen-activated protein kinases, and nuclear factor-kappaB in cellular models of Parkinson's disease. J. Neurochem. v.74, p.1384-1392, 2000.

CEBALLOS, I.; LAFON, M.; JAVOY-AGID, F., HIRSCH, E.; NICOLE, A.; SINET, P. M.; AGID, Y. Superoxide dismutase and Parkinson’s disease. Lancet, v.335, p.1035-1036, 1990.

CHANDLER, B. V.; KEFFORD, J. F. Chemical assay of limonin, the bitter principle of oranges. J. Sci. Food Agric. v.17, p.193-197, 1966.

174

CHEN, Y.; YANG, L.; LEE, T. J. Oroxyllin A inhibition of lipopolysaccharide-induced iNOS and COX-2 gene expression via suppression of nuclear factor-kappaB activation. Biochem. Pharmacol., v.59, p.1445-1457, 2000.

CHENG, I. F.; BREEN, K. On the ability of four flavonoids, baicilein, luteolin, naringenin, and quercetin, to suppress the Fenton reaction of the iron-ATP complex. Biometals, v.13, p.77-83, 2000.

CHEUNG, N. S.; HICKLING, Y. M.; BEART, P. M. Development and survival of rat embryonic mesencephalic dopaminergic neurones in serum-free, antioxidant-rich primary cultures. Neurosci. Lett.,. v.233, p.13-16, 1997.

CHOI, D. W.; MAULUCCI-GEDDE, M.; KRIEGSTEIN, A. R. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. J. Neurosci., v.7, p.357-368, 1987.

CHOI, W. S.; EOM, D. S.; HAN, B. S.; KIM, W. K.; HAN, B. H.; CHOI, E. J.; OH, T. H.; MARKELONIS, G. J.; CHO, J. W.; OH, Y. J. Phosphorylation of p38 MAPK induced by oxidative stress is linked to activation of both caspase-8- and -9-mediated apoptotic pathways in dopaminergic neurons. J. Biol. Chem., v.279, p.20451-20460, 2004.

CHUN, J.; KWON, T.; KIM, D. J.; PARK, I.; CHUNG, G.; LEE, E. J.; HONG, S. K.; CHANG, S. I.; KIM, H. Y.; KANG, S. S. Inhibition of mitogen-activated kinase kinase kinase 3 activity through phosphorylation by the serum- and glucocorticoid-induced kinase 1. J. Biochem., v.133, p.103-108, 2003.

CIVELLI, O.; BUNZOW, J. R.; GRANDY, D. K. Molecular diversity of the dopamine receptors. Rev. Pharmacol. Toxicol. v.32, p.281-307, 1993.

175

CLARK, A. M. Natural Products as a Resource for New Drugs. Pharm. Res., v.13 , p.1133- 1144, 1996.

CLAXSON, A.; MORRIS, C.; BLAKE, D.; SIREN, M.; HALLIWELL, B.; GUSTAFSSON, T.; LOFKVIST, B.; BERGELIN, I. The anti-inflammatory effects of D-myo-inositol-1.2.6- trisphosphate (PP56) on animal models of inflammation. Agents Actions, v.29, p.68-70, 1990.

CLEMENTI, E.; BROWN, G. C.; FEELISCH, M.; MONCADA, S. Persistent inhibition of cell respiration by nitric oxide: crucial role of S-nitrosylation of mitochondrial complex I and protective action of glutathione. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v.95, p.7631-7636, 1998.

COHEN, G.; HEIKKILA, R. The generation of hydrogen peroxide, superoxide radical, and hydroxyl radical by 6-hydroxydopamine, dialuric acid, andrelated cytotoxic agents. J. Biol. Chem., v.249, p.2447-2452, 1974.

COGHLAN, A. Cancer killer, a hormone in soya beans starves tumor cells to death. New Sci., v.14, p.14, 1998.

CONN, M.P. Neuroscience in Medicine. Filadelfia: J.B. Lippincott Company. 1994.

CONWAY, K.A.; HARPER, J.D.; LANSBURY, P.T. Accelerated in vitro fibril formation by a mutant alpha-synuclein linked to early onset Parkinson’s disease. Nature Med. v.4, p.1318- 1320, 1998.

COOPER, J. R.; BLOOM, F. E.; ROTH, R. H. The Biochemical Basis of Neuropharmacology, 6th ed. New York: Oxford University Press, 1991.

176

CORREA, R.; PEREIRA, M. A.; BUFFON, D.; DOS-SANTOS, L.; CECHINELL-FILHO, V.; SANTOS, A. R.; NUNES, R. J. Antinociceptive properties of chalcones. Structure-activity relationships. Arch. Pharm. (Weinheim), v.334, p.332-334, 2001. 0 COSTA, G.; ABIN, J. A.; DAJAS, F. Nicotine prevents striatal dopamine loss produced by 6- hydroxydopamine and hypoxia-reoxygenation. Brain Res., v.888, p.336-342, 2001.

COTRAN, R. S.; KUMAR, V. ROBBINS, S. L. Robbins Patologia Estrutural e Funcional. 6a ed., Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000.

CUNHA, G.M.; FONTENELE, J.B.; NOBRE-JUNIOR, H.V.; DE SOUSA, F.C.; SILVEIRA, E.R.; NOGUEIRA, N.A.; MORAES, M.O.; VIANA, G.S.B.; COSTA–LOFUTO, L.V. Cytotoxic activity of chalcones isolated from Lonchocarpus sericeus (Poir.) Kunth Phytother. Res. v.17, p.155-159, 2003.

DAHLSTROM, A.; FUXE, K. Localization of monoamines in the lower brain stem. Experientia, v.20, p.398-399, 1964.

DAJAS, F.; RIVERA, F.; BLASINA, F.; ARREDONDO, F.; ECHEVERRY, C.; LAFON, L.; MORQUIO, A.; HEIZEN, H. Cell culture protection and in vivo neuroprotective capacity of flavonoids. Neurotox. Res., v.5, p.425-432, 2003a.

DAJAS, F.; RIVERA-MEGRE, F.; BLASTINA, F.; ARREDONDO, F.; ABIN- CARRIQUIRY, J. A.; COSTA, G.; ECHEVERRY, C.; LAFON, L.; HEIZEN, H.; FERREIRA, M.; MORQUIO, A. Neuroprotection by flavonoids Braz. J. Med. Biol. Res., v.36, p.1613- 1620, 2003b.

DAJAS, F.; RIVERA, F.; BLASINA, F.; URBANAVICIUS, J.; ARREDONDO, F.; LAFON, L.; COSTA, G.; ECHEVERRY, C.; FERREIRA, M.; MORQUIO, A. Mechanims of

177 neuroprotection. The contribution of quercetin in focal ischemia and cell culture. XVII REUNIÃO ANUAL DA FEDERAÇÃO DE SOCIEDADES BRASILEIRAS DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL – FESBE, 17; 2002, Salvador, BA.

DARZYNKIEWICZ, Z.; BRUNO, S.; DEL BINO, G.; GORCZYCA, W.; HOTZ, M. A.; LASSOTA, P.; TRAGANOS, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry, v.13, p.795-808, 1992.

DAS, N. P.; PEREIRA, T. A. Effects of flavonoids on thermal autoxidation of palm oil: structure activity relationships. J. Am. Oil Chem. Soc., v.67, p.255-258, 1990.

DEL RIO, M. J.; VELEZ-PARDO, C. Monoamine neurotoxins-induced apoptosis in lymphocytes by a common oxidative stress mechanism: involvement of hydrogen peroxde

(H2O2), caspase-3, ad nuclear factor kappa-B (NF-kappaB), p53, c-Jun transcription factors. Biochem. Pharmacol., v.63, p.677-688, 2002.

DEMICHELE, G.; FILLA, A.; VOLPE, G. et al. Environmental and genetic risk factors in Parkinson’s disease: a case control study in southern Italy. Mov. Disord. v.11, p.17-23, 1996.

DEMIRYUREK, A.T.; CAKICI, I.; KANZIK, I. Peroxynitrite: a putative cytotoxin. Parmacol. Toxicol. v.82, p.113-117, 1998.

DENAULT, J.B.; SALVESEN, G.S. Caspases: keys in the ignition of cell death. Chem. Rev. v.102, p.4489-500, 2002.

DESTEE, A. Neuroprotection and neurodegenerative parkinsonian syndromes. Rev. Neurol. (Paris). v.159, p.3S93-104, 2003.

178

DEXTER, D.; CARTER, C.; AGID, F. et al. Lipid peroxidation as cause of nigral death in Parkinson’s disease. Lancet, v.2, p.639-640, 1986.

DEXTER, D. T.; CARAYON, A.; VIDAILHET, M. et al. Decreased ferritin levels in brain in Parkinson’s disease. J. Neurochem., v.55, p.16-20, 1990.

DEXTER, D. T.; WELLS, F. R.; AGID, F. et al. Increased nigral iron content in post-mortem parkinsonian brain. Lancet, v.2, p.1219-1220, 1987. DIVE, C.; EVANS, C. A.; WHETTON, A. D. Induction of apoptosis--new targets for cancer chemotherapy. Semin. Cancer Biol., v.3, p.417-427, 1992.

DI MATTEO, V.; ESPOSITO, E. Biochemical and therapeutic effects of antioxidants in the treatment of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and amyotrophic lateral sclerosis. Curr. Drug Target CNS Neurol. Disord. v.2, p.95-107, 2003.

DING, Y. M.; JAUMOTTE, J. D.; SIGNORE, A. P.; ZIGMOND, M. J. Effects of 6- hydroxydopamine on primary cultures of substantia nigra: specific damage to dopamine neurons and the impact of glial cell line-derived neurotrophic factor. J. Neurochem., v.89, p.776-787, 2004.

DI STASI, L. C. Plantas medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. São Paulo: UNESP, 1996, p. 230.

DODEL, R. C.; DU, Y.; BALES, K. R.; LING, Z.; CARVEY, P. M.; PAUL, S. M.. Caspase-3- like proteases and 6-hydroxydopamine induced neuronal cell death. Brain Res. Mol. Brain Res., v.64, p.141-148, 1999.

DOS SANTOS, R. I. Metabolismo básico e origem dos metabólitos secundários. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; PALLAZO-DE-MELLO, J. C.; MENTZ, L.

179

A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2a ed. Porto Alegre/Florianópolis, Ed. UFSC, 2000, cap. 16, p. 323-354.

DOSEFF, A. I. Apoptosis: the sculptor of development. Stem Cells Dev., v.13, p.473-483, 2004.

DRAPER, H. H.; HADLEY, M. Malondialdehyde determination as an index of lipid peroxidation. Methods Enzymol., v.186, p.421-431, 1990.

DUVOISIN, R. C.; GEARING, I. R.; SCHWEITZER, M. R.; YAHR, M. D. A family study of parkinsonism. In: Barbeau A, Brunette JR, eds. Progress in Neurogenetics. Amsterdam: Excerpta Medica Foundation,: p.492–496. 1969.

DZIEDZIC, S. Z.; HUDSON, B. J. F. Hydroxyisoflavones as antioxidants for edible oils. Food Chem. v.11, p.161-166, 1983.

EARNSHAW, W. C.; MARTINS, L. M.; KAUFMANN, S. H. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Ann. Rev. Biochem., v.68, p.383-424, 1999.

EISERICH, J. P.; PATEL, R. P.; O’DONNELL, V. B. Pathophysiology of nitric oxide and related species: free radical reactions and modification of biomolecules. Mol. Aspects Med. v.19, p.221-357, 1998.

ERIKSEN, J. L.; DAWSON, T. M.; DICKSON, D.W.; PETRUCELLI, L. Minireview Caught in the Act:Synuclein Is the Culprit in Parkinson’s Disease. Neuron v.40, p.453-456, 2003.

EVAN, G. I.; VOUSDEN, K. H. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. Nature, v.411, p.342-348, 2001.

180

EVE, D. J.; NISBET, A. P.; KINGSBURY, A. E.; HEWSON, E. L.; DANIEL, S. E.; LEES, A. J., MARSDEN, C. D.; FORSTER, O. J. Basal ganglia neuronal nitric oxide synthase mRNA expression in Parkinson's disease. Brain Res. Mol. Biol. v.63, p.62-71, 1998.

FADEEL, B.; ORRENIUS, S.; ZHIVOTOVSKY, B. Apoptosis in human disease: a new skin for the old ceremony? Biochem. Biophys. Res. Commun., v.266, p.699-717, 1999.

FADEEL, B.; GLEISS, B.; HOGSTRAND, K.; CHANDRA, J.; WIEDMER, T.; SIMS, P. J.; HENTER, J. I.; ORRENIUS, S.; SAMALI, A. Phosphatidylserine exposure during apoptosis is a cell type-specific event and does not correlate with plasma membrane phospholipid scramblase expression. Biochem. Biophys. Res. Commun. v.266, p.504-511, 1999.

FAHN, S; COHEN, G. The oxidative stress hypothesis in Parkinson's disease: evidence supporting it. Ann. Neurol. v.32, p.804-812, 1992. FARNSWORTH, N. R. Medicinal Plants In Therapy. Bulletin of the WHO, v.63, p.965-981, 1985.

FOREJTNIKOVA, H.; LUNEROVA, K.; KUBINOVA, R.; JANKOVSKA, D.; MAREK, R.; KARES, R.; SUCHY, V.; VONDRACEK, J.; MACHALA, M. Chemoprotective and toxic potentials of synthetic and natural chalcones and dihydrochalcones in vitro. Toxicology, v.208, p.81-93, 2005.

FORLONI, G.; BERTANI, H.; CALELLA, A.M.; THALER, F.; INVERNIZZI, R. α-synuclein and Parkinson’s disease: selective neurodegenerative effect of α-synuclein fragment on dopaminergic neurons in vitro and in vivo. Ann. Neurol. v.47, p.632-640, 2000.

FUJIWARA, Y.; HIGUCHI, K.; FUKUDA, T.; WATANABE, T.; TOMINAGA, K.; ARAKAWA, T. Inhibitory effect of sofalcone on tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1

181 beta production in human monocytes stimulated by Helicobacter pylori water extract. Drugs Exp. Clin. Res., v.27, p.103-106, 2001.

GABRIELSKA, J.; OSZMIANSKI, J.; ZYLKA, R.; KOMOROWSKA, M. Antioxidant activity of flavones from Scutellalia baicalensis in lecithin liposomes. Zeitschrift für Naturforschung. v.52, p.817-823, 1997.

GAFNER, S.; WOLFENDER, J. L.; MAVI, S.; HOSTETTMANN, K. Antifungal and antibacterial chalcones from Myrica serrata. Planta Med., v.62, p.67-69, 1996.

GASSEN, M.; GROSS, A.; YOUDIM, M. B. Apomorphine enantiomers protect cultured pheochromocytoma (PC12) cells from oxidative stress induced by H2 O2 and 6- hydroxydopamine. Mov. Disord., v.13, p.661–667, 1998.

GARDNER-MEDWIN, A. R. Analysis of potassium dynamics in mammalian brain tissue. J. Physiol., v.335, p.393-426, 1983.

GARGINI G Comparative experimental research on the lipotropic and hepatoprotective action of inositol, amino acids and lipocaic.Riv Crit Clin Med. v.51, p.195-214, 1951.

GASSER, T. Genetics of Parkinson’s disease. Ann. Neurol. v.44 (suppl 1), p.53–57, 1998.

GATÉ, L.; PAUL, J.; NGUYEN, B. A.; TEW, K. D.; TAPIERO, H. Oxidative stress induced in pathologies: the role of oxidants. Biomed. Pharmacother. v.53, p.169-180, 1999.

GATTO, E. M., RIOBO, N. A., CARRERAS, M. C., CHERNAVSKY, A., RUBIO, A., SATZ, M. L., PODEROSO, J. J. Overexpression of neutrophil neuronal nitric oxide synthase in Parkinson's disease. Nitric Oxide v.4, p.534-539, 2000.

182

GERLACH, M.; RIEDERER, P. Animal models of Parkinson's disease: an empirical comparison with the phenomenology of the disease in man. J. Neural Transm. v.103, p.987- 1041, 1996.

GERLOFF BJ, HERDT TH, EMERY RS, WELLS WW. Inositol as a lipotropic agent in dairy cattle diets. J Anim Sci. v.59; p.806-12,1984.

GHAFOURIFAR, P.; RICHTER, C. Nitric oxide synthase activity in mitochondria FEBS Lett., v.418, p.291-296, 1997.

GIASSON, B. I.; DUDA, J. E.; MURRA, I. V. J. et al. Oxidative damage linked to neurodegeneration by selective α-synuclein nitration in synucleinopathy lesions. Science v.290, p.985-989, 2000.

GIUGLIANO, D. Dietary antioxidants for cardiovascular prevention. Nutr. Metab. Carviovasc. Dis. v.10, p.38-44, 2000.

GIULIVI, C. Functional implications of nitric oxide produced by mitochondria in mitochondrial metabolism. Biochem. J., v.332, p.673-679, 1998.

GLINKA, Y.; GASSEN, M.; YOUDIN, M. B. H. Mechanism of 6-hydroxydopamine neurotoxicity. J. Neural Transm., v.50, p.55-66, 1997.

GLINKA, Y.; TIPTON, K. F.; YOUDIM, M. B. Nature of inhibition of mitochondrial respiratory complex I by 6-Hydroxydopamine. J. Neurochem. v.66, p.2004-2010, 1996.

GLINKA, Y. Y.; YOUDIM, M. B. Inhibition of mitochondrial complexes 1 and IV by 6- hydroxydopamine. Eur. J. Pharmacol., v.292, p.329-332, 1995.

183

GOOD, P. F., HSU, A., WERNER, P., PERL, D. P.; OLANOW, C. W. Protein nitration in Parkinson's disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. v.57, p.338-342, 1998.

GOTOH, T.; SHIKAMA, K. Generation of the superoxide radical during the autoxidation of oxymioglobin. J. Biol. Chem. v.80, p.397-399, 1976.

GOWERS, W. R. A Manual of Diseases of the Nervous System. 2nd ed. Philadelphia: Blakiston, 1903. GRAF, E.; EATON, J. W. Antioxidant functions of phytic acid. Free Radic. Biol. Med.; v.8, p.61-69, 1990.

GREEN, L. C. TANNENBAUM, S. R.; GOLDMAN, P. Nitrate synthesis in the germfree and conventional rat. Science, v.212, p.56-58, 1981.

GRUNBLATT, E.; MANDEL, S.; YOUDIM, M. B. Neuroprotective strategies in Parkinson's disease using the models of 6-hydroxydopamine and MPTP. Ann. N. Y. Acad. Sci., v.899, p.262-273, 2000.

GUANGJUN, N.; CHAOFANG, J.; YUANLIN, C.; SHENGRONG, S.; BAOLU, Z. Distinct Effects of Tea Catechins on 6-Hydroxydopamine-Induced Apoptosis in PC12 Cells. Arch. Biochem. Biophys., v.397, p.84-90, 2002.

GUERRA, M. P.; NODARI, R. O. Biodiversidade: aspectos biológicos, geográficos, legais e éticos. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; PALLAZO-DE-MELLO, J. C.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2a ed., Porto Alegre/Florianópolis: Ed. Universidade-UFRGS, Ed. UFSC, 2000; cap. 1, p. 11-24.

184

GUO Q., ZHAO B., LI MEIFEN,. SHEN S., XIN W. Studies on protective mechanisms of four compoenets of green tea polyphenols against lipid peroxidation in synaptosomes. Biochemical et Biophysica Acta. v.1304, p. 210-222, 1996.

HARAGUCHI, H.; TANIMOTO, K.; TAMURA, Y.; MIZUTANI, K.; KINOSHITO, T. Mode of antibacterial action of retrochalcones from Glycyrrhiza inflata. Phytochemistry v.48, p.125- 129, 1998.

HARBONE, J.B.; WILLIAMS, C.A. Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry, v.55, p.481-504, 2000.

HARTMANN, A., MICHEL, P. P., TROADEC, J. D., MOUATT-PRIGENT, A., FAUCHEUX, B. A., RUBERG, M., AGID, Y., HIRSCH, E. C. Is Bax a mitochondrial mediator in apoptotic death of dopaminergic neurons in Parkinson's disease? J. Neurochem. v.76, p.1785-1793, 2001.

HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. Oxigen free radicals and iron in relation to biology and medicine: some problems and concepts. Arch. Biochem. Biophys. v.246, p.501-514, 1986.

HALLIWELL, B. Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause or consequence? Lancet v.344, p.721-724, 1994.

HALLIWELL, B.; HOULT, J. R.; BLACKE, D. R. Oxidants, inflammation and antiinflammatory drugs. FASEB J. v.2, p.2867-2873, 1988.

HARBORNE, J. B.; WILLIAMS, C. A. Advances in flavonoid research since. Phytochemistry v.55, p.481-504, 2000.

185

HASHIMOTO, M.; HSU, L. J.; XIA, Y. et al. Oxidative stress induces amyloid-like aggregate formation of NACP-alpha-synuclein in vitro. Neuroreport v.106, p.717-721, 1999.

HATTORI, N.; KITADA, T.; MATSUMINE, H. et al. Molecular genetic analysis of a novel parkin gene in Japanese families with autosomal recessive juvenile parkinsonism: evidence for variable homozygous deletions in the parkin gene in affected individuals. Ann. Neurol. v.44, p.935-941, 1998. HE, Y.; LEE, T.; LEONG, S. K. 6-hydroxydopamne-induced apoptosis of dopaminergic in the rat substancia nigra. Brain. Res., v.858, p.163-166, 2000.

HERENCIA, F.; FERRANDIZ, M. L.; UBEDA, A.; GUILLEN, I.; DOMINGUEZ, J. N.; CHARRIS, J. E.; LOBO, G. M.; ALACARAZ, M. J. 4-dimethylamino-3',4'- dimethoxychalcone downregulates iNOS expression and exerts anti-inflammatory effects. Free Radic. Biol. Med., v.30, p.43-50, 2001.

HERTOG, M. G.; FESKENS, E. J.; HOLLMAN, P. C. et al. Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen elderly study. Lancet, v.342, p.1007-1011, 1993.

HIRSCH, E. C.; BRANDEL, J. P.; GALLE, P. et al. Iron and aluminum increase in the substantia nigra of patients with Parkinson’s disease: an x-ray microanalysis. J. Neurochem. v.56, p.446-451, 1991.

HIRSCH, E. C.; GRAYBIEL, A. M.; AGID, Y. Selective vulnerability of pigmented dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Acta Neurol. Scand., v.26, p.19–22, 1989.

HIRSCH, E. C.; HERRERO, M. T. Neurochemical correlates of parkinsonism. Role of dopaminergic lesions. Adv. Neurol., v.74, p.119-126, 1997.

186

HOLMAN, G. D.; KASUGA, M. From receptor to transporter: insulin signalling to glucose transport. Diabetologia. v.40, p.991-1003, 1997.

HOPKINS, S. J.; ROTHWELL, N. J. Cytokines and the nervous system I: expression and recognition. Trends Neurosci. v.18, p.83-88, 1995.

HSIEH, H. K.; TSAO, L. T.; WANG, J. P.; LIN, C. N. Synthesis and anti-inflammatory effects of chalcones. J. Pharm. Pharmacol., v.52, p.163-171, 2000.

HSU, L. J.; SAGARA, Y.; ARROYO, A. et al. α-synuclein promotes mitochondrial deficit and oxidative stress. Am. J. Pathol. v.157, p.401-410, 2000.

HUANG, W.; ALEXANDER, G. E.; DALY, E. M.; SHETTY, H. U.; KRASUSKI, J. S.; RAPOPORT, S. I.; SCHAPIRO, M. B.; MARK B. High Brain myo-Inositol Levels in the Predementia Phase of Alzheimer's Disease in Adults With Down's Syndrome: A 1H MRS Study Am. J. Psychiatry v.156, p.1879-1886, 1999.

HUANG W, ALEXANDER GE, CHANG L, SHETTY HU, KRASUSKI JS, RAPOPORT SI, SCHAPIRO MB. Brain metabolite concentration and dementia severity in Alzheimer's disease: a H MRS study. Neurology. v.57, p.626-32, 2001.

HUMPEL, C.; JOHANSSON, M.; MARKSTEINER, J.; SARIA, A.; STROMBERG, I. Mesencephalic grafts increase preprotachykinin-1 mRNA expression in striatal grafts in na in oculo co-graft model. Regul. Pept., v.56, p.9-17, 1995.

HUNNISETT, A.; DAVIES, S.; MCLAREN-HOWARD, J.; GRAVETT, P.; FINN, M.; GUERET-WARDLE, D. Lipoperoxides as an index of free radical activity in bone marrow transplant recipients. Preliminary observations. Biol. Trace Elem. Res., v.47, p.125-132, 1995.

187

HUSAIN, S. R.; CILLARD, J.; CILLARD. P. Hydroxyl radical scavenging activity of flavonoids. Phytochemistry, v.26, p.2489-2491, 1987.

IINUMA, M.; TSUCHIYA, H.; SATO, M.; YOKOYAMA, J.; OHYAMA, M.; OHKAWA, Y.; TANAKA, T.; FUJIWARA, S.; FUJII, T. Flavanonas with antibacterial activity against Staphylococcus aureus. J. Pharm. Pharmacol., v.46, p.892-895, 1994.

ISHIGE, K.; SCHUBERT, D.; SAGARA, Y. Flavonoids protect neuronal cells from oxidative stress by three distinct mechanisms. Free Radic. Biol. Med. v.30, p.433-446, 2001.

JAKOBY, W. B.; ZIEGLER, D. M. The enzymes of detoxication. J. Biol. Chem. v.265, p.20715-20718, 1990.

JANKUN, J.; SELMAN, S. H.; SWIEROZ, R.; JANKUN, E. S. Why drinking green tea could prevent cancer. Nature, v.387, p.561, 1997.

JELLINGER, K.; KIENZL, E.; RUMPELMAIR, G. et al. Iron-melanin complex in substantia nigra of parkinsonian brains: an x-ray microanalysis. J. Neurochem., v.59, p.1168-1171, 1992.

JELLINGER, K.; LINERT, L.; KIENZL, E.; HERLINGER, E.; YOUDIM, M. B. Chemical evidence for 6-hydroxydopamine to be na endogenous toxic factor in the pathogenesis of Parkinson’s disease. J. Neural Transm. Suppl., v.46, p.297-314, 1995.

JELLINGER, K.; PAULUS, W.; GRUNDKE-IQBAL, I. et al. Iron-melanin complex in substantia nigra of parkinsonian brains: an x-ray microanalysis. J. Neural Transm., v.2, p.327- 340, 1990.

188

JEKABSONE, A.; IVANOVIENE, L.; BROWN, G. C.; BORUTAITE, V. Nitric oxide and calcium together inactivate mitochondrial complex I and induce cytochrome c release. J. Mol. Cell Cardiol., v.35, p.803-809, 2003.

JENNER, P. Oxidative stress as a cause of Parkinson’s disease. Acta Neurol. Scand., v.84, p.6-15, 1991.

JENNER, P. Oxidative stress in Parkinson's disease. Ann. Neurol. Suppl., v.53, p.26-36, 2003.

JENNER, P.; OLANOW, C. W. Oxidative stress and the pathogenesis of Parkinson’s disease. Neurology, v.47, p.161-170, 1996.

JEON, B. S.; JACKSON-LEWIS, V.; BURKE, R. E. 6-Hydroxydopamine lesion of the rat substantia nigra: time course and morphology of cell death. Neurodegeneration. v.4, p.131-137, 1995.

JIANG F, DUSTING G. Natural phenolic compounds as cardiovascular therapeutics: potential role of their anti-inflammatory effects. Curr Vasc Pharm.v.1, p.135-56, 2003.

JONSSON, G., SACHS, C. Effects of 6-hydroxydopamine on the uptake and storage of noradrenaline in sympathetic adrenergic neurons. Eur. J. Pharmacol. v.9, p.141–155, 1970.

JUTRO, P. R. Biological diversity, ecology, and global climate change. Environ. Health Perspect., v.96, p.167-170, 1991.

KATAYAMA T.Hypolipidemic action of phytic acid (IP6): prevention of fatty liver. Anticancer Res. v.19, p.3695-8, 1999.

189

KERR, J. F.; WYLLIE, A. H.; CURRIE, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer., v.26, p.239-257, 1972.

KHATAMI M. Carrier-dependent and carrier-independent uptake of myo-inositol in cultured retinal pigment epithelial cells: activation by heat and concentration. Biochem Cell Biol. v.66, p.942-50, 1988.

KIM, H. J.; WOOD, E. R.; SHIN, C. G.; PARK, H. A new flavonol gallate ester from Acer and its inhibitory activity against HIV-1 integrace. J. Nat. Prod., v.61, p.145-148, 1998.

KIM, Y. S.; JOO, W. S.; JIN, B. K.; CHO, Y. H.; BAIK, H. H.; PARK, C. W. Melatonin protects against 6-OHDA-induced neuronal death of nigrostriatal dopaminergic system. Neuroreport v.9, p.2387-2390, 1998.

KIM JP, LENTZ MR, WESTMORELAND SV, GRECO JB, RATAI EM, HALPERN E, LACKNER AA, MASLIAH E, GONZALEZ RG. Relationships between astrogliosis and 1H MR spectroscopic measures of brain choline/creatine and myo-inositol/creatine in a primate model. Am J Neuroradiol. v.26, p.752-9, 2005.

KIMURA, Y. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation of the antitumor and antimetastatic actions of various compounds isolated from medicinal plants. In Vivo, v.19, p.37-60, 2005.

KINDLER, D. D.; THIFFAULT, C.; SOLENSKI, N. J.; DENNIS, J.; KOSTECKI, V.; JENKINS, R.; KEENEY, P. M.; BENNETT, J. P. JR. Neurotoxic nitric oxide rapidly depolarizes and permeabilizes mitochondria by dynamically opening the mitochondrial transition pore. Mol. Cell Neurosci. v.23, p.559-73, 2003.

190

KULKARNI, A. P.; KELLAWAY, L. A.; LAHIRI, D. K.; KOTWAL, G. J. Neuroprotection from complement-mediated inflammatory damage. Ann. N. Y. Acad. Sci. v.1035, p.147-164, 2004.

KUMAMOTO, M.; SONDA, T.; NAGAYAMA, K.; TABATA, M. Effects of pH and metal ions on antioxidative activities of catechins. Biosci. Biotechnol. Biochem., v.65, p.126-132, 2001.

KANDA, S.; BISHOP, J. F.; EGLITIS, M. A.; YANG, Y.; MOURADIAN, M. M. Enhanced vulnerability to oxidative stress by alpha-synuclein mutations and C-terminal truncation. Neurosci. v.97, p.279-284, 2000.

KEHRER, J. P. Free radicals as mediators of tissue injury and disease. Crit. Rev. Toxicol. v.23, p.21-48, 1993.

KISH, S. J.; MORITO, C.; HORNYKIEWICZ, O. Glutathione peroxidase activity in Parkinson’s disease. Neurosci. Lett.. v.58, p.343-346, 1985.

KITADA, T.; ASAKAWA, S.; HATTORI, N. et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature v.392, p.605-608, 1998.

KOZIKOWSKI, A. P.; POWIS, G.; FAUQ, A. H.; TUCKMANTEL, W.; GALLEGOS, A. Synthesis and Biological Activity of the D-3-Deoxy-3-fluoro and D-3-Chloro-3-deoxy Analogs of Phosphatidylinositol. J. Org. Chem. v.59, p.963-971, 1994.

KOWALSKI, J.; SAMOJEDNY, A.; PAUL, M.; PIETSZ, G.; WILCZOK, T. Effect of apigenin, kaempferol and resveratrol on the expression of interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha genes in J774.2 macrophages. Pharmacol. Rep., v.57, p.390-394, 2005.

191

KNEKT, P.; JARVINEN, R.; REUNANEN, A.; MAATELA, J. Flavonoid intake and coronary mortality in Finland: a cohort study. BMJ, v.312, p.478-481, 1996.

KNOLL, J. The pharmacology of (-)deprenyl. J. Neural Transm. Suppl., v.22, p.75-89, 1986.

KRAMER, B. C.; GOLDMAN, A. D.; MYTILINEOU, C. Glial cell line derived neurotrophic factor promotes the recovery of dopamine neurons damaged by 6-hydroxydopamine in vitro. Brain Res. 1999 Dec 18;851(1-2):221-7.

LAWRENCE, N. J.; MCGROWN, A. T.; DUCKI, S.; HADFIELD, J. A. The interactions of chalcones with tubulin. Anticancer Drug Des., v.15, p.135-141, 2000.

LAZZARINI, A. M.; MYERS, R. H.; ZIMMERMAN, T. R. J. R. A clinical genetic study of Parkinson’s disease: evidence for dominant transmission. Neurology v.44, p.499-506, 1994.

LEBEAU, J.; FURMAN, C.; BERNIER, J.; DURIEZ, P.; TEISSIER, E.; COTELLE, N. Antioxidant properties of di-tert-butylhydroxylated flavonoids. Free Radic. Biol. Med., v.29, p.900-912, 2000. LEE, H.; KIM, Y. O.; KIM, H.; KIM, S. Y.; NOH, H. S.; KANG, S. S.; CHO, G. J.; CHOI, W. S.; SUK, K. Flavonoid wogonin from medicinal herb is neuroprotective by inhibiting inflammatory activation of microglia. FASEB J. v.17, p.1943-1944, 2003.

LIANG, Q.; LIOU, A. K.; DING, Y.; CAO, G.; XIAO, X.; PEREZ, R.G.; CHEN, J. 6- Hydroxydopamine induces dopaminergic cell degeneration via a caspase-9-mediated apoptotic pathway that is attenuated by caspase-9dn expression. J. Neurosci. Res., v.77, p.747-761, 2004.

LI, B. Q.; FU, T.; YAN, Y. D.; BAYLOR, N. W.; RUSCETTI, F. W.; KUNG, H. F. Inhibition of HIV by baicalin. Cell. Mol. Biol. Res., v.39, p.119-124, 1997.

192

LIN, Y. M.; ANDERSON, H.; FLAVIN, M. T.; PAI, Y. H. S. In vitro anti-HIV activity of biflavonoids from Rhus succedanea. J. Nat. Prod., v.60, p.884-888, 1997.

LINDVALL, O.; BJORKLUND, A.; SKAGERBERG, G. Selective histochemical demonstration of dopamine terminal systems in rat di- and telencephalon: new evidence for dopaminergic innervation of hypothalamic neurosecretory nuclei. Brain Res. v.306, p.19-30, 1984.

LEBEAU, J.; FURMAN, C.; BERNIER, J.; DURIEZ, P.; TEISSIER, E.; COTELLE, N.: Antioxidant properties of di-tert-butylhydroxylated flavonoids. Free Radic. Biol. Med. v.29, p.900-912, 2000.

LEVITES, Y.; WEINREB, O.; MAOR, G.; YOUDIM, M. B.; MANDEL, S. Green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate prevents N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine-induced dopaminergic neurodegeneration. J. Neurochem. v.78, p.1073- 1082, 2001.

LEVITES, Y.; YOUDIM, M. B. H.; MAOR, G.; MANDEL, S. Attenuation of 6- hydroxydopamne (6-OHDA)-induced nuclear factor-kappaB (NF-kB) activation and cell death by tea extracts in neuronal cultures. Biochem. Pharmacol., v.63, p.21-29, 2002.

LIOCHEV, S. I.; FRIDOVICH, I. The role of O2- in the production of OH in vitro and in vivo. Free Radic. Biol. Med. v.16, p.29-33, 1994.

LIN Y. L. and LIN. J. K. Epigallocatechin-3-gallate blocks the induction of nitric oxide synthase by downregulating lipopolysaccharide-induced activity of transcription factor nuclear factor-κB. Mol. Pharmacol. v.52, p. 465-472, 1997.

193

LIN Y., TSAI S. H., LIN-SHIAU S. Y., HO C. T. And LIN J. K. Theaflavin-3,3’-digallate from black tea blocks the nitric oxide synthase by downregulating the activation of NF-κaβ in macrophages. Eur. J. Pharmacol. v.367, p. 379-388, 1999b

LOTHARIUS, J.; DUGAN, L. L.; O'MALLEY, K. L. Distinct mechanisms underlie neurotoxin-mediated cell death in cultured dopaminergic neurons. J. Neurosci., v.19, p.1284- 1293, 1999.

LUCKING, C. B.; DURR, A.; BONIFATI, V. et al. Association between early-onset Parkinson’s disease and mutations in the parkin gene. N. Engl. J. Med. v.342, p.1560–1567, 2000.

LUCZAJ, W.; SKRZYDLEWSKA, E. The compounds resulting from lipid peroxidation mostly react with DNA showing both genotoxic and mutagenic action; among them, 4- hydroxynonenal is the most genotoxic, while MDA is the most mutagenic DNA damage caused by lipid peroxidation products. Cell Mol. Biol. Lett. v.8, p.391-413, 2003.

MACHADO L. L., FONSECA A. M., OTILIA D.L. PESSOA , TELMA L. G. LEMOS. Atividade antioxidante do 2-O-metilinositol obtido dos frutos da Magonia glacrata St Hill. Abq. 2004.

MADAN, B.; BATRA, S.; GHOSH, B. 2’-Hydroxychalcone inhibits nuclear factor-kappaB and blocks tumor necrosis factor-alpha and lipopolysaccharide-induced adhesion of netrophils to human umbilical vein endothelial cells. Mol. Pharmacol., v.58, p.526-534, 2000.

MANDEL, S.; YOUDIM, M. B. Catechin polyphenols: neurodegeneration and neuroprotection in neurodegenerative diseases. Free Radic. Biol. Med. v.37, p.304-317, 2004.

194

MANDEL, S.; WEINREB, O.; AMIT, T.; YOUDIM, M. B. Mechanism of neuroprotective action of the anti-Parkinson drug rasagiline and its derivatives. Brain Res. Brain Res. Rev.. v.48, p.379-387, 2005.

MANDA, K.; BHATIA, A. L. Melatonin-induced reduction in age-related accumulation of oxidative damage in mice. Biogerontology, v.4, p.133-139, 2003.

MANN, V. M.; COOPER, J. M.; DANIEL, S. E. et al. Complex I, iron and ferritin in Parkinson’s disease substantia nigra. Ann. Neurol., v.36, p.876-881, 1994.

MARCUS, R; COULSTON A.M. Water-soluble vitamins - vitamin B complex and Ascorbic acid. In Goodman & Gilman’s. 1996. The pharmacological basis of therapeutics.9th ed The McGraw-Hill, New York, USA, p 1566-1567.

MARDER, K.; TANG, M. X.; MEJIA, H. et al. Risk of Parkinson’s disease among first-degree relatives: a community-based study. Neurology v.47, p.155-160, 1996.

MAROTEAUX, L.; CAMPANELLI. J. T.; SCHELLER, R. H. Synuclein: a neuron-specific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve terminal. J. Neurosci. v.8, p.2804-2815, 1988.

MAROTEAUX, L.; SCHELLER, R. H. The rat brain synucleins; family of proteins transiently associated with neuronal membrane. Brain Res. Mol. Brain Res. v.11, p.335-343, 1991.

MARTIN, W. E.; YOUNG, W. E.; ANDERSON, V. E. Parkinson’s disease. A genetic study. Brain v.96, p.495-506, 1973.

195

MARTTILA, R. J.; LORENTZ, H.; RINNE, U. K. Oxygen toxicity protecting enzymes in Parkinson’s disease. Increase of superoxide dismutase-like activity in the substantia nigra and basal nucleus. J. Neurol. Sci., v.86, p.321-331, 1988.

MARTTILA, R. J.; RINNE. U. K. Arteriosclerosis, hereditary, and some previous infections in the etiology of Parkinson’s disease. A case-control study. Clin. Neurol. Neurosurg., v.79, p.46-56, 1976.

MATOS, F. J. A. Farmácias Vivas. 3a ed., Fortaleza: Edições UFC, 1998.

MATOS, F.J.A. Plantas Medicinais – Guia de seleção e emprego medicinal de plantas do Nordeste, Fortaleza, IOCE,1989.

MATSUMINE, H.; SAITO, M.; SHIMODO-MATSUBAYASHI, S. et al. Localization of a gene for an autosomal recessive form of juvenile parkinsonism to chromosome 6q25.2–27. Am. J. Hum. Genet. v.60, p.588-596, 1997.

MATSUDA, H.; MORIKAWA, T.; ANDO, S.; TOGUCHIDA, I.; YOSHIKAWA, M. Structural requirements of flavonoids for nitric oxide production inhibitory activity and mechanism of action. Bioorg. Med. Chem. v.11, p.1995-2000, 2003.

MAYO, M. W.; WANG, C. Y.; DROUIN, S. S.; MADRID, L. V.; MARSHALL, A. F.; REED, J. C.; WEISSMAN, B. E.; BALDWIN, A. S. WT1 modulates apoptosis by transcriptionally upregulating the bcl-2 proto-oncogene. EMBO J., v.18, p.3990-4003, 1999.

MAZZIO, E. A.; REAMS, R. R.; SOLIMAN, K. F. The role of oxidative stress, impaired glycolysis and mitochondrial respiratory redox failure in the cytotoxic effects of 6- hydroxydopamine in vitro. Brain Res., v.1004, p.29-44, 2004.

196

MCGAHON, A. J.; MARTIN, S. J.; BISSONNETTE, R. P.; MAHBOUBI, A.; SHI, Y.; MOGIL, R. J.; NISHIOKA, W. K.; GREEN, D. R. The end of the (cell) line: methods for the study of apoptosis in vitro. Methods Cell Biol., v.46, p.153-185, 1995.

MCGEER, P. L.; ITAGAKI, S.; BOYES, B. E.; MCGEER, E. G. Reactive microglia are positive for HLA-DR in the substantia nigra of Parkinson’s and Alzheimer’s disease brains. Neurology v.38, p.1285-1291, 1988.

MCLAURIN, J.; GOLOMB, R.; JUREWICZ, A.; ANTEL, J. P.; FRASER, P. E. Inositol stereoisomers stabilize an oligomeric aggregate of Alzheimer amyloid beta peptide and inhibit abeta -induced toxicity. J. Biol. Chem. v.275, p.18495-18502, 2000.

MERCER, L.D.; KELLY, B.L.; HORNE, M.K.; BEART, P.M. Dietary polyphenols protect dopamine neurons from oxidative insults and apoptosis: investigations in primary rat mesencephalic cultures. Biochem. Pharmacol. v. 69, p.339-45, 2005.

MESSANA, J. M.; CIESLINSKI, D. A.; O'CONNOR, R. P.; HUMES, H. D. Glutathione protects against exogenous oxidant injury to rabbit renal proximal tubules. Am. J. Physiol. v.255, p.874-884, 1988.

MICHAEL O. HENGARTNE. The biochemistry of apoptosis. nature v.407; p. 770-776, 2000.

MICHELL, R. H. Inositol phospholipids and cell surface receptor function. Biochem. Biophys. Acta, v. 81;p.415, 1975.

MIDDLETON, E. JR.; KANDASWAMI, C.; THEOHARIDES, T. C. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol. Ver., v.52, p.673-751, 2000.

197

MILLER, R. H.; SZIGETI, V. Clonal analysis of astrocyte diversity in neonatal rat spinal cord cultures. Development, v.113, p.353-62, 1991.

MIRANDA, C. L.; STEVENS, J. F.; IVANOV, V.; MCCALL, M.; FREI, B.; DEINZER, M. L.; BUHLER, D. R. Antioxidant AND prooxidant actions of prenylated and nonprenylated chalcones and flavonones in vitro. J. Agric. Food Chem., v.48, p.3976-3884, 2000.

MISRA, H. P.; FRIDOVICH, I. The generation of superoxide radical during autoxidation of hemoglobin. J. Biol. Chem. v. 247, p.188-192, 1972a.

MISRA, H. P.; FRIDOVICH, I. The role of anion superoxide in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. J. Biol. Chem. v.247, p.3170-3175, 1972b.

MIYAMOTO, S.; KUWATA, G.; IMAI, M.; NAGAO, A.; TERAO, J. Protective effect of phytic acid hydrolysis products on iron-induced lipid peroxidation of liposomal membranes. Lipids, v.35, p.1411-1413, 2000.

MIYASE, T.; SANO, M.; NAKAI, H.; MURAOKA, M.; NAKAZAWA, M.; SUZUKI, M.; YOSHINO, K.; NISHIHARA, Y.; TANAI, T. Antioxidants from Lespedeza homoloba. (I). Phytochemistry v.52, p.303-310, 1999a.

MIYASE, T.; SANO, M.; YOSHINO, K.; NOKANA, K. Antioxidants from Lespedeza homoloba. (II). Phytochemistry v.52, p.311-319, 1999b. MONTEIRO, H. P.; WINTERBOURN, C. C. 6-Hydroxydopamine releases iron from ferritin and promotes ferritin-dependent lipid peroxidation. Biochem. Pharmacol., v.38, p.4177-4182, 1989.

198

MONTENARH M. Functional implications of the growth-supressor/oncoprotein p53. Int. J. Oncol. v.1, p.37-45, 1992.

MOREL, I.; LESCOAT, G.; COGREL, P.; SERGENT, O.; PASDELOUP, N.; BRISSOT, P.; CILLARD, P.; CILLARD, J. Antioxidant, and iron chelatin activities of the flavonoidscatechin, quercetin, and diosmetin on iron loaded rat hepatocyte cultures. Biochem. Pharmacol. v.45, p.13-19, 1999.

MOSMANN, T. Rapid calorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods v.65, p.55-63, 1983.

MULLER, D. P.; GROSS-SAMPSON, M.A. Neurochemical, neurophysiological and neuropathological studies in vitamin E deficiency. Crit. Rev. Neurobiol. v.5, p.239-247, 1990.

MURAOKA S., MIURA T.; Inhibition of xanthine oxidase by phytic acid and its antioxidative action. Life Sciences. v.74, p.1691–1700, 2004.

NANJO, F.; GOTO, K.; SETO, R.; SUZUKI, M.; SAKAI, M.; HARA, Y. Scavenging effects of tea catechins, and their derivatives on 1,1-dephenyl-2-picrylhydrazil radical. Free Rad. Biol. Med. v.21, p.895-902, 1996.

NIE, G.; JIN, C.; CAO, Y.; SHEN, S.; ZHAO, B. Distinct effects of tea catechins on 6- hydroxydopamne-induced apoptosis in PC12 cells. Arch. Biochem. Biophys., v.397, p.84-90, 2002.

NOBRE JUNIOR, H. V.; CUNHA, G. M.; MAIA, F. D.; OLIVEIRA, R. A.; MORAES, M. O.; RAO, V. S. Catechin attenuates 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-induced cell death in primary cultures of mesencephalic cells. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. v.136, p.175- 80, 2003.

199

OLEH, H. M. D. Biochemical aspects of Parkinson’s disease. Neurology v.51, p.2-9, 1998.

O'NEILL, C.; COWBURN, R. F.; BONKALE, W. L.; OHM, T. G.; FASTBOM, J.; CARMODY, M,; KELLIHER, M. Dysfunctional intracellular calcium homoeostasis: a central cause of neurodegeneration in Alzheimer's disease. Biochem. Soc. Symp., v.67, p.177-194, 2001.

OLSZANECKI, R.; GEBSKA, A.; KOZLOVSKI, V. I.; GRYGLEWSKI, R. J. Flavonoids and nitric oxide synthase. J. Physiol. Pharmacol., v.53, p.571-584, 2002.

OYAMA, T.; KANAI, Y.; OCHIAI, A.; AKIMOTO, S.; ODA, T.; YANAGIHARA, K.; NAGAFUCHI, A.; TSUKITA, S.; SHIBAMOTO, S.; ITO, F. et al. A truncated beta-catenin disrupts the interaction between E-cadherin and alpha-catenin: a cause of loss of intercellular adhesiveness in human cancer cell lines. Cancer Res., v.4, p.6282-6287, 1994.

OWEN, R. W.; GIACOSA, A.; HULL, W. E.; HAUBNER, R.; SPIEGELHALDER, B.; BARTSCH, H. The antioxidant/anticancer potential of phenolic compounds isolated from olive oil. Eur. J. Cancer., v.36, p.1235-1247, 2000.

OWUOR, E. D.; KONG, A. N. Antioxidants and oxidants regulated signal transduction pathways. Biochem. Pharmacol., v.64, p.1547, 2002.

PAN, T.; FEI, J.; ZHOU, X.; JANKOVIC, J.; LE, W. Effects of green tea polyphenols on dopamine uptake and on MPP+ -induced dopamine neuron injury. Life Sci. v.72, p.1073-1083, 2003.

PAN MH, LIN-SHIAU SY, HO CT, LIN JH, LIN JK. Suppression of lipopolysaccharide-induced nuclear factor-kappaB activity by theaflavin-3,3'-

200 digallate from black tea and other polyphenols through down-regulation of IkappaB kinase activity in macrophages. Biochem Pharmacol. Feb v.59, p.357-67, 2000.

PAYAMI, H.; LARSEN, K.; BERNARD, S.; NUTT, J. Increased risk of Parkinson’s disease in parents and siblings of patients. Ann. Neurol. v.36, p.659-661, 1994.

PELTON, E. W.; KIMELBERG, H. K.; SHIPHERD, S. V.; BOURKE, R. S. Dopamine and norepinephrine uptake and metabolism by astroglial cells in culture. Life Sci., v.28, p.1655- 1663, 1981.

PERRY, T. L.; GODIN, D. V.; HANSEN, S. Parkinson’s disease: a disorder due to nigral glutathione deficiency. Neurosci. Lett., v.33, p.305-310, 1982.

PIETTA, P. G. Flavonoids as antioxidants. J. Nat. Prod., v.63, p.1035-1042, 2000.

PONG, K.; DOCTROW, S. R.; BAUDRY, M. Preventive of 1-methyl-4-phenylpyridinium- and 6-hydroxidopamine-induced nitration of tyrosine hydroxylase and neurotoxicity by EUK- 134, a superoxide dismutase and catalase mimetic, in cultured dopaminergic neurons. Brain Res., v.881, p.182-189, 2000.

PRZEDBORSKI, S.; LEVIVIER, M.; JIANG, H.; FERREIRA, M. JACKSON-LEWIS, V.; DONALDSON, D.; TOGASAKI, D. M. Dose-dependent lesions of dopaminergic nigrostriatal pathway induced by intrastriatal injection of 6-hydroxydopamine. Neuroscience, v.67, p.631- 647, 1995.

PUTTONEN, K.A., MA. N AKOV A, S., RAASMAJA, A., M¨ ANNIST O, P.T.,. Increased p53 levels without caspase-3 activity and change of cell viability in 6-hydroxydopamine-treated CV1-P cells. Cell Biol. Toxicol. v.19, p.177–187, 2003.

201

QIAO, L.; HU, Y.; NAN, F.; POWIS, G.; KOZIKOWSKI, A. P.. A versatile approach to PI(3,4)P2, PI(4,5)P2, and PI(3,4,5)P3 from L-(-)-quebrachitol. Org. Lett., v.2, p.115-117, 2000.

RAFI, M. M.; ROSEN, R. T.; VASSIL, A.; HO, C. T.; ZHANG, H.; GHAI, G.; LAMBERT, G.; DiPAOLA, R. S. Modulation of bcl-2 and cytotoxicity by licochalcone-A, a novel estrogenic flavonoid. Anticancer Res., v.20, p.2653-2658, 2000.

REHM, J.; SEMPOS, C. T.; TREVISAN, M. Alcohol and cardiovascular disease – more than one paradox to consider. Average volume of alcohol consumption, patterns of drinking and risk of coronary heart disease – a review. J. Cardiovasc. Risk, v.10, p.15-20, 2003.

REITER, R. J. Cyoprotective properties of melatonin: presumed association with oxidative damage and aging. Nutrition v.14, p.691-696, 1998.

REITER, R. J.; TAN, D. X.; CABRERA, J.; DARPA, D. Melatonin and tryptophan derivatives as free radical scavengers and antioxidants. Adv. Exp. Med. Biol. v.467, p.379-387, 1999.

RICE-EVANS, C.A.; PACKER, L., Flavonoids in Health and Disease. New York: Marcel Dekker Icn., 1998.

RICHTER, C.; GHAFOURIFAR, P.; SCHWEIZER, M.; LAFFRANCHI, R. Nitric oxide and mitochondrial Ca2+. Biochem. Soc. Trans., v.25, p.914-918, 1997.

RIEDERER, P.; SOFIC, E.; RAUSCH, W. D. et al. Transition metals, ferritin, glutathione and ascorbic acid in parkinsonian brains. J. Neurochem., v.52, p.515-520, 1989.

RIOBÓ, N. A.; SCHÖPFER, F. J.; BOVERIS, A. D., CADENAS, E.; PODEROSO, J. J. The reaction of nitric oxide with 6-hydroxydopamine: implications for Parkinson’s disease. Free Radic. Biol. Med. v.32, p.115-121, 2001.

202

RIOBÓ, N.; MELANI, M.; SANJUAN, N.; FISZMAN, M.; GRAVIELLE, M. C.; CARRERAS, M. C.; CADENAS, E.; PODEROSO, J. J. The modulation of mitochondrial nitric-oxide synthase activity in rat brain development. J. Biol. Chem. v.277, p.42447-42455, 2002.

ROJAS, J.; DOMINGUEZ, J. N.; CHARRIS, J. E.; LOBO, G.; PAYA, M.; FERRANDIZ, M. L. Synthesis and inhibitory activity of dimethylamino-chalcone derivatives on the induction of nitric oxide synthase. Eur. J. Med. Chem., v.37, p.699-705, 2002.

ROJAS, J.; PAYA, M.; DEVESA, I.; DOMINGUEZ, J. N.; FERRANDIZ, M. L. Therapeutic administration of 3,4,5-trimethoxy-4’-fluorochalcone, a selective inhibitor of iNOS expression, attenuates the development of adjuvant-induced arthritis in rats. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol., v.368, p.225-233, 2003.

ROSENKRANZ, S.; KNIREL, D.; DIETRICH, H.; FLESCH, M.; ERDMANN, E,; BOHM, M. Inhibition of the PDGF receptor by red wine flavonoids provides a molecular explanation for the “French paradox”. FASEB J., v.16, p.1958-1960, 2002.

ROSS, J. A. Dietary flavonoids and the MLL gene: A pathway to infant leukemia? PNAS., v.97, p.4411-4413, 2000.

RUF, J. C.; CIAVATTI, M.; GUSTAFSSON, T.; RENAUD, S. Effect of D-myo-inositol on platelet function and composition and on cataract development in streptozotocin-induced diabetic rats. Biochem. Med. Metab. Biol., v.48, p.46-55, 1992.

RUSSO, A.; ACQUAVIVA, R.; CAMPISI, A.; SORRENTI, V.; DI GIACOMO, C.; VIRGATA, G.; BARCELLONA, M. L.; VANELLA, A. Bioflavonoids as antiradicals, antioxidants and DNA cleavage protectors. Cell. Biol. Toxicol., v.16, p.91-98, 2000.

203

RUVOLO, P. P.; DENG, X.; CARR, B. K.; MAY, W. S. A functional role for mitochondrial protein kinase Calpha in Bcl2 phosphorylation and suppression of apoptosis. J. Biol. Chem., v.273, p.25436-25442, 1998.

SACHS, C.; JONSSON, G.: Mechanisms of action of 6-hydroxydopamine. Biochem. Pharmacol., v.24, p.1-8, 1975.

SAGGU, H.; COOKSEY, J.; DEXTER, D. A selective increase in particulate superoxide dismutase activity in Parkinson’s substantia nigra. J. Neurochem., v.53, p.692-697, 1989.

SALVESEN, G. S.; DUCKETT, C. S. Apoptosome: the seven-spoked death machine. Dev. Cell. v.2, p.256-257, 2002.

SALAH, N.; MILLER, N. J.; PAGANGA, G.; TIJBURG, L.; BOLWELL, G. P.; RICE- EVANS C. Polyphenolic flavanols as scavengers of aqueous phase radicals and as chain- breaking antioxidants. Arch, Biochem, Biophys., v.322, p.339-346, 1995.

SCHAPIRA, A. H.; COOPER, J. M.; DEXTER, D.; CLARK, J. B.; JENNER, P.; MARSDEN, C. D. Mitochondrial complex I deficiency in Parkinson's disease. J. Neurochem., v.54, p.823- 827, 1990.

SANCHEZ-RAMOS, J.; ÖVERVIK, E.; AMES, B. N. A marker of oxyradical-mediated DNA damage (8-hydroxy-2α-deoxyguanosine) is increased in nigro-striatum of Parkinson’s disease brain. Neurodegeneration, v.3, p.197-204, 1994.

SCHAPIRA, A. H.; COOPER, J. M.; DEXTER, D.; JENNER, P.; CLARK, J. B.; MARSDEN, C. D. Mitochondrial complex I deficiency in Parkinson’s disease. Lancet, v.1, p.1269, 1989.

204

SCHOPFER F, RIOBO N, CARRERAS MC, ALVAREZ B, RADI R, BOVERIS A, CADENAS E, PODEROSO JJ. Oxidation of ubiquinol by peroxynitrite: implications for protection of mitochondria against nitrosative damage. Biochem J. v.349, p.35-42, 2000.

SCHROETER H, BOYD C, SPENCER JP, WILLIAMS RJ, CADENAS E, RICE-EVANS C. MAPK signaling in neurodegeneration: influences of flavonoids and of nitric oxide. Neurobiol Aging. v.23, p.861-80, 2002.

SCAFFIDI, C.; FULDA, S.; SRINIVASAN, A.; FRIESEN, C.; LI, F.; TOMASELLI, K. J.; KRAMMER, P. H.; PETER, M. E. Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways. Embo. J., v.17, p.1675-1687, 1998.

SCHAPIRA, A. H. V. Mitochondrial involvement in Parkinson’s disease, Huntington’s disease, hereditary spastic paraplegia and Friedreich’s ataxia. Biochim. Biophys. Acta v.1410, p.159-170, 1999.

SCHAPIRA, A. H. V. Science, medicine, and the future: Parkinson’s disease. BMJ, v.318, p.311-314, 1999.

SHAWCROSS DL, BALATA S, OLDE DAMINK SW, HAYES PC, WARDLAW J, MARSHALL I, DEUTZ NE, WILLIAMS R, JALAN R. Low myo-inositol and high glutamine levels in brain are associated with neuropsychological deterioration after induced hyperammonemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. v.287, p. 503-9, 2004.

SHIMOHAMA, S.; SAWADA, H.; KITAMURA, Y AND TANIGUCHI, T. Disease model: Parkinson’s disease. Trends Mol. Med. v.9, p.360-365, 2003.

205

SEERAM, N. P.; BOURQUIN, L. D.; NAIR, M. G. Degradation products of cyanidin glycosides from tart cherries and their bioactivities. J. Agric. Food Chem., v.49, p.4924-4929, 2001.

SEITZ G, STEGMANN HB, JAGER HH, SCHLUDE HM, WOLBURG H, ROGINSKY VA, NIETHAMMER D, BRUCHELT G. Neuroblastoma cells expressing the noradrenaline transporter are destroyed more selectively by 6-fluorodopamine than by 6-hydroxydopamine. J Neurochem. v.75, p.511-20, 2000.

SELWAY, J. W. Antiviral activity of flavones and flavans. Prog. Clin. Biol. Res., v.213, p.521-36, 1986.

SELWAY, J. W. T. Antiviral activity of flavones and flavans. In: CODY, V.; MIDDLETON, E.; HARBORNE, J. B. (Eds.). Plant flavonoids in biology and medicine: Biochemical, Pharmacologycal and Structure-Activity Relationship. New York, Ed. Alan R. Liss, 1986, p. 521-536.

SEMCHUK, K. M.; LOVE, E. J.; LEE, R. G. Parkinson’s disease: a test of the multifactorial etiologic hypothesis. Neurology v.43, p.1173-1180, 1993.

SHAHIDI, F.; WANASUNDARA, P.; HONG, C. Antioxidant activity of phenolic compounds in meat model systems. In: Phenolic Compounds in Food and their Effects on Health I: ACS Symposium Series 506. American Chemical Society, Washington DC, 1991, p. 214- 222.

SHERMAN, M. Y.; GOLDBERG, A. L. Cellular defences against unfolded proteins: a cell biologist thinks about neurodegenerative disease. Neuron v.29, p.15-32, 2001.

SHIBATA, S. Anti-tumorigenic chalcones. Stem Cells, v.12, p.44-52, 1994.

206

SHIMOHAMA, S.; TANINO, H.; SUMIDA, Y.; TSUDA, J.; FUJIMOTO, S. Alteration of myo-inositol monophosphatase in Alzheimer's disease brains. Neuroscience Lett. v.245, p.159- 162, 1998.

SHIMURA, H.; HATTORI, N.; KUBO, S. Familial Parkinson disease gene product, parkin, is a ubiquitin-protein ligase. Nature Genet. v.25, p.302-305, 2000.

SHUTENKO, Z.; HENRY, Y.; PINARD, E.; SEYLAZ, J.; POTIER, P.; BERTHET, F.; GIRARD, P.; SERCOMBE, R. Influence of the antioxidant quercetin in vivo on the level of nitric oxide determined by electron paramagnetic resonance in rat brain during global isquemia and reperfusion. Biochem. Pharmacol., v.57, p.199-208, 1999.

SIAN, J.; DEXTER, D. T.; LEES, A. J. et al. Alterations in glutathione levels in Parkinson’s disease and other neurodegenerative disorders affecting basal ganglia. Ann. Neurol., v.36, p.348-355, 1994.

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5a ed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora UFRGS, 2003, cap.23, p 577-614.

SINGH, D.; CHANDER, V.; CHOPRA, K. Protective effect of catechin on ischemia- reperfusion-induced renal injury in rats. Pharmacol. Rep., v.57, p.70-76, 2005.

SINGH, D.; CHOPRA, K. The effect of naringin, a bioflavonoid on ischemia-reperfusion induced renal injury in rats. Pharmacol. Res. v.50, p.187-193, 2004.

207

SKOUMALOVA, A.; ROFINA, J.; SCHWIPPELOVA, Z.; GRUYS, E.; WILHELM, J. The role of free radicals in canine counterpart of senile dementia of the Alzheimer type. Exp. Gerontol. v.38, p.711-719, 2003.

SLIVKA, A., COHEN, G.,. Hydroxyl radical attack on dopamine. J. Biol. Chem., v.260, p.15466–15472, 1985.

SOEJARTO, D. D. Biodiversity prospecting and benefict sharing: perspectives from the field. J. Ethnopharmacol., v.51, p.1-15, 1996.

SOTO-OTERO, R.; MÉNDEZ-ÁLVAREZ, E.; HERMIDA-AMEIJEIRAS, A.; MUÑOZ- PATIÑO, A. M.; LABANDEIRA-GARCIA, J. L. Autoxidation and Neurotoxicity of 6- Hydroxydopamine in the Presence of Some Antioxidants. J. Neurochem., v.74, p.1605–1612, 2000.

SOFIC, E.; PAULUS, W.; JELLINGER, K.; RIEDERER, P.; YOUDIM, M. B. H. Selective increase of iron in substantia nigra zona compacta in parkinsonian brains. J. Neurochem., v.56, p.978-982, 1991.

SOGAWA, S.; NIHRO, Y.; UEDA, H.; IZUMI, A.; MIKI, T., MATSUMOTO, H., SATOH, T. 3,4-Dihydroxychalcones as potent 5-lipoxygenase and cyclooxygenase inhibitors. J. Med. Chem. v.36, p.3904-3909, 1993.

SOMASUNDAR P, RIGGS DR, JACKSON BJ, CUNNINGHAM C, VONA-DAVIS L, MCFADDEN DW. Inositol hexaphosphate (IP6): a novel treatment for pancreatic cancer. J Surg Res. v.126, p.199-203, 2005.

208

SRIVASTAVA, R. C.; HUSAIN, M. M.; HASAN, S. K.; ATAR, M. Green tea polyphenols and tannic acid act as potent inhibitors of phorbol ester-induced nitric oxide generation in rat hepatocytes independent of their antioxidant properties. Cancer Lett., v.153, p.1-5, 2000.

SUFFREDINI, I. B.; SADER, H. S.; GONÇALVES, A. G.; REIS, A. O.; GALES, A. C.; VARELLA, A. D.; YOUNES, R. N. Screening of antibacterial extracts from plants native to the brazilian amazon rain forest. Braz. J. Med. Biol. Res., v.37, p.379-384, 2004.

SWERDLOW, R. H.; PARKS, J. K.; MILLER, S. W.; TUTTLE, J. B.; TRIMMER, P. A.; SHEEHAN, J. P.; BENNETT JR., J. P.; DAVIS, R. E.; PARKER, W. D. Origin and consequences of the complex I defect in Parkinson's disease. Ann. Neurol. v.40, p.663-671, 1996.

TANG, C. M.; ORKAND, R. K. Glutamate depolarization of glial cells in Necturus optic nerve. Neurosci Lett. v.63, p.300-304, 1986.

TANNER, C. M.; GOLDMAN, S. M. Epidemiology of Parkinson’s disease. Neurol. Clin. v.14, p.317-335, 1996.

TAWATA, M.; AINDA, K.; NOGUCHI, T.; OZAKI, Y.; KUME, S.; SASAKI, H.; CHIN, M. ONAYA, T. Anti-platelet action of isoliquiritigenin, an aldose reductase inhibitor in licorice. Eur. J. Pharmacol., v.212, p.87-92, 1992.

TIMBERLAKE, C. F.; HENRY, B.S. Plant pigments as natural food colours. Endeavour., v.10, p.31-36, 1986.

TOMAZELA, D. M.; PUPO, M. T.; PASSADOR, E. A.; DA SILVA, M. F.; VIEIRA, P. C.; FERNANDES, J. B.; FO, E. R.; OLIVA, G.; PIRANI, J. R. Pyrano chalcones and a flavone

209 from Neoraputia magnifica and their Trypanosoma cruzi glycosomal glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase-inhibitory activities. Phytochemistry, v.55, p.643-651, 2000.

TROEBERG, L.; CHEN, X.; FLAHERTY, T. M.; MORTY, R. E.; CHENG, M.; HUA, H.; SPRINGER, C.; McKERROW, J. H.; KENYON, G. L.; LONSDALE-ECCLES, J. D.; COETZER, T. H.; COHEN, F. E. Chalcone, acyl hydrazine, and related amides kill cultured Trypanosoma brucei brucei. Mol. Med., v.6, p.660-669, 2000.

TSAO CW, CHENG JT, SHEN CL, LIN YS. 6-Hydroxydopamine induces thymocyte apoptosis in mice. J Neuroimmunol. v.65, p.91-5, 1996.

TURRENS, J. F.; ALEXANDRE, A.; LEHNINGER, A. L. Ubisemiquinone is the donor for superoxide formation by complex III of heart mitocondria. Arch. Biochem. Biophys. v.237, p.408-414, 1985.

UEDA, K.; FUKUSHIMA, H.; MASLIAH, E. et al. Molecular cloning of cDNA encoding an unrecognized component of amyloid in Alzheimer disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. v.90, p.11281-11286, 1993.

UNGERSTEDT U. EUR. 6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. J Pharmacol. v.5p.107-10, 1968.

URETSKY NJ, IVERSEN LL. Effects of 6-hydroxydopamine on catecholamine containing neurones in the rat brain. J Neurochem. v.17, p.269-78, 1970.

VIANA, G. S.; BANDEIRA, M. A.; MATOS, F. J. Analgesic and anti-inflammatory effects of chalcones isolated from Myracrodruon urundeuva Allemao. Phytomedicine, v.10, p.189-195, 2003.

210

VIANA G. S. B.; MATOS F. J. A.; BANDEIRA M. A. M.; RAO V. S. N. Aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva Fr. All.) Estudo Botânico, Farmacognóstico, Químico e Farmacológico, 2a ed., Fortaleza: Edições UFC, Fortaleza, 1995, p. 160.

VIEREGGE, P.; GLAESE, A.; ULM, G.; KOMPF, D. Familial Parkinson’s disease. Mov. Disord. v.7, p.23-32, 1992.

VIEREGGE, P.; HEBERLEIN, I. Increased risk of Parkinson’s disease in relatives of patients. Ann. Neurol. v.37, p.685, 1995.

VILLA-CABALLERO L, NAVA-OCAMPO AA, FRATI-MUNARI AC, PONCE-MONTER H. Oxidative stress. Should it be measured in the diabetic patient? Gac Med Mex. v.136, p.249-56, 2000.

VIOLA, H.; WASOWSKI, C.; LEVI DE STEIN, M.; WOLFMAN, C.; SILVEIRA, R.; DAJAS, F.; MEDINA, J. H.; PALADINI, A. C. Apigenin, a component of Matricariarecutita flowers, is a central benzodiazepine receptors-ligand with anxiolytic effects. Planta Med., v.61, p.213-216, 1995.

VON BOHLEN UND HALBACH, O.; SCHOBER, A.; KRIEGLSTEIN, K. Genes, proteins, and neurotoxins involved in Parkinson’s disease. Prog. Neurobiol., v.73, p.151-157, 2004.

WALKINSHAW, G.; WATERS, C. M. Neurotoxin-induced cell death in neuronal PC12 cells is mediated by induction of apoptosis. Neurosci., v.63, p.975-987, 1994.

WANG, J. Y.; GENG, C. X.; ZENG, Z. C. Docetaxel inhibits SMMC-7721 human hepatocellular carcinoma cells growth and induces apoptosis. World J. Gastroenterol. v.9, p.696-700, 2003.

211

WANG LD, ZHOU Q, YANG WC, YANG CS. Apoptosis and cell proliferation in esophageal precancerous and cancerous lesions: study of a high-risk population in northern China. Anticancer Res. v.19, p.369-74, 1999.

WEINREB O, MANDEL S, YOUDIM MB. cDNA gene expression profile homology of antioxidants and their antiapoptotic and proapoptotic activities in human neuroblastoma cells. FASEB J. v.17, p.935-7, 2003.

WESTERDUIN, P.; WILLENS, A. M.; VAN BOECKEL, C. A. A. Synthesis of 1,4,5- trissulphated and 1,4,5-trissulphamoylated myo-inositols: Isosteric myo-inositol 1,4,5- trisphosphate analogues. Tetrahedron Lett. v.31, p.6919-6922, 1990.

WILHELM, K. P.; BIEL, S.; SIEGERS, C. P. Role of flavonoids in controlling the phototoxicity of Hypericum perforatum extracts. Phytomedicine, v.8, p.306-309, 2001.

WILLIAMS, C. A.; HARBORNE, J. B.; GEIGER, H.; HOULT, J. R. The flavonoids of Tanacetum parthenium and T. vulgare and their anti-inflammatory properties. Phytochemistry v.51, p.417-423, 1999.

WOLFMAN, C.; VIOLA, H.; PALADÍN, A.; DAJAS, F.; MEDINA, J. H. Possible anxiolytic effects of chrysin, a central benzodiazepine receptor ligand isolated from Passiflora coerulea. Pharmacol Biochem Behav., v.47, p.1-4, 1994.

WOODGATE, A.; MACGIBBON, G.; WALTON, M.; DRAGUNOW, M. The toxicity of 6- hydroxydopamine on PC12 and P19 cells. Brain Res. Mol. Brain Res. v.69, p.84-92, 1999.

WOOTEN, M. W.; WRENN, R. W. Phorbol ester induces intracellular translocation of phospholipid/Ca2+ -dependent protein kinase and stimulates amylase secretion in isolated pancreatic acini. FEBS Lett., v.171, p.183-186, 1984.

212

WU, Y.; BLUM, D.; NISSOU, M. F.; BENABID, A. L.; VERNA, J. M. Unlike MPP+, apoptosis induced by 6-OHDA in PC12 cells is independent of mitochondrial inhibition. Neurosci Lett. v.221, p.69-71, 1996.

XIONG, Q.; FAN, W.; TEZUKA, Y.; ADNYANA, I. K.; STAMPOULIS, P.; HATTORI, M.; NAMBA, T.; KADOTA, S. Hepatoprotective effect of Apocynum venetum and its constituents. Planta Med., v.66, p.127-133, 2000.

YAMADA, K.; HIROYUKI, U.; MAEZAWA, I.; IGUCHI, A.; KAMEYAMA, T.; NABESHIMA, T. Possible involment of catalase in the protective effect of interleukin-6 against 6-hydroxydopamine toxicity in PC12 cells. Brain Res. Bull., v.43, p. 573-577, 1997.

YAGI K. Simple assay for the level of total lipid peroxides in serum or plasma Methods Mol Biol.v.108, p.101-6, 1998.

YOO HG, JUNG SN, HWANG YS, PARK JS, KIM MH, JEONG M, AHN SJ, AHN BW, SHIN BA, PARK RK, JUNG YD. Involvement of NF-kappaB and caspases in silibinin- induced apoptosis of endothelial cells. Int J Mol Med. v.13, p.81-6, 2004

YOUDIM MB, WEINSTOCK M. Molecular basis of neuroprotective activities of rasagiline and the anti-Alzheimer drug TV3326 [(N-propargyl-(3R)aminoindan-5-YL)-ethyl methyl carbamate].Cell Mol Neurobiol. v.21, p.555-73, 2001.

YOUDIM, M. B.; RIEDERER, P. Understanding Parkinson's disease. Sci. Am.. v.276, p.52- 59, 1997.

YOUDIM, K. A.; SPENCER, J. P.; SCHROETER, H.; RICE-EVANS, C. Dietary flavonoids as potential neuroprotectants. Biol. Chem. v.383, p.503-519, 2002.

213

YUTING, C.; RONGLIANG, Z.; ZHONGJIAN, J.; YONG, J. Flavonoids as superoxide scavengers and antioxidants. Free Rad. Biol. Med., v.9, p.19-21, 1990. YOUNG, R. Update on Parkinson’s disease, Am Fam Physician v.59, 1999.

ZAMORA-ARDOY, M. A.; BANEZ-SANCHEZ, C.; ALAMINOS-GARCIA, P. Olive oil: influence and benefits on some pathologies. An. Med. Interna, v.21, p.138-142, 2004.

ZHOU, W. B.; HURLBERT, M. S.; SCHAACK, K.; PRASAD, K. N.; FREED, C. R. Overexpression of human alpha-synuclein causes dopamine neuron death in rat primary culture and immortalized mesencephalon-derived cells. Brain Res. v.866, p.33-43, 2000.

ZUANAZZI, J. A. S. Flavonóides. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; PALLAZO-DE-MELLO, J. C.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2a ed. Porto Alegre/Florianópolis: Ed. UFSC, 2000, cap. 2.

ZUZARTE-LUIS, V.; HURLE, J. M. Programmed cell death in the developing limb. Int. J. Dev. Biol. v.46, p.871-876, 2002