Capsicum Spp.) NATIVOS DEL ESTADO DE CAMPECHE

DIVERSIDAD GENÉTICA Y VARIACIÓN MORFOLÓGICA DE ECOTIPOS DE CHILE (Capsicum spp.) NATIVOS DEL ESTADO DE CAMPECHE

TESIS

Que presenta: Lucero del Carmen López Castilla

Como requisito parcial para obtener el grado de: Maestra en Ciencias en Horticultura Tropical

Director de tesis: Dr. Rubén Humberto Andueza Noh

Conkal, Yucatán, México Noviembre, 2018

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por otorgarme el apoyo económico para realizar mis estudios de posgrado.

Al Instituto Tecnológico de Conkal por aceptarme como alumna de la maestría, y a todos los profesores que me impartieron materias por ayudarme a reafirmar y expandir mis conocimientos.

Al Colegio de Posgraduados (COLPOS) campus Campeche por permitirme el acceso a las instalaciones de la institución para el desarrollo de mi tesis.

Al Dr. Rubén Andueza Noh por aceptar ser mi tutor y director de tesis, por el apoyo durante mis estudios de posgrado y por tenerme paciencia y confianza durante el desarrollo de la tesis.

Al Dr. Crescencio Castillo Aguilar por su asesoría y por toda la ayuda brindada durante el desarrollo de los experimentos, las revisiones y el desarrollo de la tesis.

Al Dr. René Garruña Hernández por sus consejos y asesoría durante el desarrollo de la tesis.

A la Dra. Aida Martínez y los MC. Elmi Cen Cen y Christian Pech Chuc de COLPOS campus Campeche, por compartir sus conocimientos y apoyarme en el laboratorio.

A la Sr. Socorro Calderón y Eduardo Cetina por siempre estar al pendiente de mi durante mi estadía en Conkal.

A mis compañeros de generación por todos los momentos y experiencias compartidas. DEDICATORIA

A mis padres Guadalupe Castilla Medina y Héctor López Vargas, gracias por su amor, confianza y apoyo incondicional en cada uno de los pasos que doy. Los quiero mucho.

A mi hermano Héctor López Castilla, mi roomie, Jaime y compañero de debate favorito.

A mi hermana Lilia López Castilla porque sus locas ideas me ayudan a pensar fuera de la caja y tener una mente abierta.

A mi hermoso y revoltoso sobrino Iker porque sus juegos y travesuras mantienen viva mi niña interior.

A mi abuelita Aida Medina por enseñarme a tener fe y por su ayuda en todo momento.

A Dios y/o cualquier fuerza superior que me permite seguir con vida, y que me brinda energía y salud para cumplir con mis propósitos.

ÍNDICE DE CONTENIDO

PÁGINA ÍNDICE DE FIGURAS ...... iii ÍNDICE DE CUADROS ...... v CAPITULO 1 ...... 6 1.1 INTRODUCCIÓN ...... 6 1.2 ANTECEDENTES ...... 7 1.2.1 Importancia del género Capsicum ...... 7 1.2.2 Propiedades de Capsicum spp...... 7 1.2.3 Taxonomía ...... 8 1.2.4 Origen y distribución geográfica del género Capsicum...... 9 1.2.5 Diversidad genética, erosión genética y conservación ...... 11 1.2.6 Marcadores genéticos ...... 13 1.2.7 Marcadores morfológicos ...... 13 1.2.8 Marcadores bioquímicos ...... 13 1.2.9 Marcadores moleculares ...... 14 1.2.10 Marcadores ISSR ...... 15 1.2.11 Estudios de diversidad genética y morfológica en chile Capsicum spp...... 16 1.3 HIPÓTESIS ...... 18 1.4 OBJETIVOS ...... 19 1.4.1 Objetivo general ...... 19 1.4.2 Objetivos específicos ...... 19 1.5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ...... 20 1.6 BIBLIOGRAFÍA ...... 21

CAPÍTULO 2 ...... 27 MORPHOLOGICAL EX SITU DIVERSITY OF CHILI PEPPER LANDRACES (Capsicum spp.) NATIVE TO CAMPECHE STATE ...... 27 2.1 Abstract ...... 27 2.2 Introduction ...... 27 2.3 Materials and methods ...... 29 2.3.1 Plant material and location of the study area ...... 29 2.3.2 Variables evaluated ...... 30

2.3.3 Statistical analysis ...... 32 2.4 Results and discussion ...... 32 2.4.1 Quantitative data ...... 32 2.4.2 Analysis of qualitative data...... 35 2.5 Conclusion ...... 40 2.6 References ...... 40

CAPÍTULO 3 ...... 43 ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD GENÉTICA DE ECOTIPOS DE CHILE (Capsicum spp.) NATIVOS DEL ESTADO DE CAMPECHE ...... 43 3.1 RESUMEN ...... 43 3.2 INTRODUCCIÓN ...... 44 3.3 MATERIALES Y MÉTODOS ...... 46 3.3.1 Material vegetal ...... 46 3.3.2 Extracción de ADN y amplificación ISSR ...... 46 3.3.3 Análisis de datos ...... 47 3.4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 50 3.4.1 Organización de la estructura genética de nueve ecotipos de Capsicum ssp, cultivados en el estado de Campeche...... 50 3.4.2 Análisis de varianza molecular ...... 51 3.4.3 Relaciones genéticas ...... 52 3.4.4 Diversidad genética...... 56 3.5 CONCLUSIONES ...... 57 3.6 LITERATURA CITADA ...... 59 CONCLUSIONES GENERALES ...... 64

ÍNDICE DE FIGURAS PÁGINA CAPÍTULO I

Figura 1. Especies del género Capsicum y su clasificación basada en el color de la flor (McLeod et al., 1979a, 1982, 1983; Heiser y Smith, 1958; Eshbaugh, 1975, 1982)...... 9

Figura 2. Centro de origen del género Capsicum propuesto por McLeod et al. (1982; 1983)...... 10

Figura 3. Especiación de Capsicum. Nombres de las especies abreviados ann = C. annuum, bac = C. baccatum, cam = C. campylopodium, car = C. cardenasii, cha = C. chacoense, chi = C. chinense, cor = C. cornutum, exi = C. eximium, fle = C. flexuosum, fri = C. friburgense, fru = C. frutescens, gal = C. galapagoense, lan = C. lanceolatum, mir = C. mirabile, par = C. parvifolium, per = C. pereirae, pra = C. praetermissum, pub = C. pubescens, rec = C. recurvatum, rho = C. rhomboideum, sch = C. schottianum, tov = C. tovarii, vil = C. villosum (Moscone et al., 2007; Perry et al., 2007)...... 11

CAPÍTULO 2

Fig. 1 Identification of groups of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche, based on the main components 1 and 2 obtained via principal component analysis of 15 quantitative variables ...... 34

Fig. 2 Grouping of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche, based on 15 quantitative variables ...... 35

Fig. 3 Distribution of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche based on main components 1 and 2 obtained with the correlation matrix of 39 qualitative variables ...... 39

Fig. 4 Grouping of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche, based on 39 quantitative variables ...... 39

CAPÍTULO 3 Figura 1. Estimación del número de subpoblaciones generadas a partir de nueve ecotipos de Capsicum spp., usando valores de delta K en un rango de 2 a 9 grupos, mediante el método propuesto por Evanno et al. (2005)...... 50 iii

Figura 2. Inferencia bayesiana basada en modelos (STRUCTURE 2.3.4) de la estructura poblacional que muestra los niveles y patrones de mezcla/ascendencia compartida entre nueve ecotipos de Capsicum spp. Cada muestra está representada por una barra vertical...... 51

Figura 3. Agrupamiento generado de nueve ecotipos de Capsicum spp. nativos del estado de Campeche, mediante el método UPGMA basado en cuatro primers ISSR...... 54

Figura 4. Análisis de coordenadas principales de nueve ecotipos de Capsicum spp. nativos del estado de Campeche...... 55

ÍNDICE DE CUADROS PÁGINA CAPÍTULO I

Cuadro 1. Clasificación taxonómica del género Capsicum...... 8

CAPÍTULO 2

Table 1. Ecotypes of Capsicum spp., collected in five regions of the state of Campeche ...... 29

Table 2 Variables evaluated in the morphological characterization of Capsicum spp. ecotypes native to the state of Campeche ...... 30

Table 3 Proportions of variance explained and accumulated, and correlation values obtained for the first three main components of 15 quantitative variables of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche...... 33

Table 4 Proportion of variance explained and accumulated, and correlation values obtained in the first four main components of 39 qualitative variables of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche ...... 36

CAPÍTULO 3

Cuadro 1. Análisis de varianza molecular (AMOVA) realizado a ecotipos de Capsicum spp. nativos del estado de Campeche, usando cuatro primers ISSR...... 52

Cuadro 2. Patrones de diversidad genética estimados en nueve ecotipos de Capsicum spp. nativos del estado de Campeche, usando cuatro primers ISSR...... 56

Cuadro 3. Patrones de diversidad genética estimados en tres grupos de Capsicum spp. nativos del estado de Campeche, usando cuatro primers ISSR...... 57

CAPITULO 1

1.1 INTRODUCCIÓN

Los chiles pertenecen a la familia Solanaceae y representan una de las principales hortalizas cultivadas a nivel mundial. Además de contener altos niveles de vitamina C, son buena fuente de vitaminas A, B, E y K (Djian-Caporalino et al., 2007). Otro de los componentes químicos presentes en los chiles son los capsaicinoides los cuales le confieren su pungencia por lo que son utilizados desde la preparación de salsas hasta la elaboración de cosméticos y productos farmacéuticos (Aguirre y Muñoz, 2015).

El género Capsicum es originario de América y está compuesto de 38 especies, de las cuales cinco han sido domesticadas y son ampliamente cultivadas en todo el mundo. México ha sido reconocido como un centro de diversidad de chiles en el que además de encontrar cuatro de las especies domesticadas (C. annuum, C. chinense, C. frutescens, C. pubescens) es hábitat de especies silvestres que pueden ser utilizadas como recursos genéticos en programas de mejoramiento genético (Bosland y Votava, 2012).

En la península de Yucatán, Campeche es un estado que aún conserva parte de su diversidad de chiles criollos o nativos de la región; sin embargo, el crecimiento de la mancha urbana, los cambios climáticos, las plagas y enfermedades, entre otros problemas, hacen que la diversidad de chiles criollos de la región disminuya, ocasionando erosión genética. La erosión y la diversidad genética pueden ser estimadas mediante el uso de marcadores genéticos, los cuales son herramientas que permiten detectar una variación ya sea, fenotípica o genotípica (IPGRI y Cornell University, 2003). En la actualidad, muchos estudios concluyen que para tener una adecuada estimación de la diversidad genética dentro del género Capsicum, es necesaria la asociación entre los datos agronómicos, morfológicos y moleculares (Costa et al., 2009; Campos et al., 2016).

Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la diversidad genética y la variación morfológica de nueve ecotipos del género Capsicum pertenecientes al estado de Campeche, mediante el uso de marcadores ISSR (Inter Secuencias Simples Repetidas) y descriptores morfológicos.

1.2 ANTECEDENTES

1.2.1 Importancia del género Capsicum

El género Capsicum pertenece a la familia Solanaceae, posee alrededor de 38 especies, dentro de las cuales destacan C. annuum L., C. frutescens L., C. pubescens Ruíz & Pavón, C. chinense Jacq. y C. baccatum L., como las especies cultivadas de mayor importancia (USDA-ARS, 2011). El género es originario de Sudamérica, pero actualmente se distribuye en regiones tropicales y templadas en todo el mundo (Nascimento et al., 2015).

El cultivo del chile (Capsicum spp.) se ubica entre las siete hortalizas más cultivadas en el mundo, con una producción mundial estimada en 32 millones de toneladas, con China, Turquía y México como los principales países productores (FAOSTAT, 2014).

A escala internacional México es el segundo productor de chiles, con más de 98 mil hectáreas dedicadas al cultivo de este fruto, las principales variedades que se cultivan son: jalapeño, serrano, poblano, morrón y habanero. El chile es el 8° cultivo con mayor valor generado en la agricultura nacional, alcanzando alrededor de 18 millones de pesos anualmente, con un volumen de producción promedio de 2.6 millones de toneladas, de las cuales se exportan cerca de 880 mil toneladas de chiles frescos, secos y en preparaciones (SIAP, 2016).

1.2.2 Propiedades de Capsicum spp.

Una de las características que definen a los vegetales es la existencia de ciertas cadenas de reacciones químicas llamadas rutas metabólicas distintas a las del metabolismo primario, que es común en todos los seres vivos. Por medio de estas rutas denominadas “metabolismo secundario” se fabrican ciertos compuestos químicos, generalmente restringidos a un grupo taxonómico o incluso a una especie concreta.

Los compuestos característicos de algunos frutos del género Capsicum son los ya mencionados capsaicinoides, responsables de su picor. Los principales capsaicinoides encontrados en este género son la nornorcapsaicina, norcapsaicina, capsaicina, homocapsaicina, nornordihidrocapsaicina, nordihidrocapsaicina, dihidrocapsaicina y homodihidrocapsaicina. La capsaicina (CAP, N-[(4hidroxi-3-methoxifenil)methil]-8-

metill(-6-nonenamida) y la dihidrocapsaicina (DH, N-[(4-hidroxi-3-metoxifenil)metil]-8- metilnonanamida) son los responsables en más del 90 % del picor de los chiles (Betts 1999; Manirakiza et al., 2003).

No obstante, los frutos también aportan vitaminas C y E, provitamina A, proteínas, minerales, polifenoles, carotenoides y una serie de compuestos bioactivos con alta capacidad antioxidante y son evaluados como agentes preventivos contra cáncer, anemia, diabetes y enfermedades cardiovasculares (Ghasemnezhad et al., 2011; Clark y Le, 2016).

1.2.3 Taxonomía

La taxonomía del género Capsicum es compleja, debido a la gran variabilidad de tipos existentes en las formas cultivadas y a la diversidad de criterios utilizados en su clasificación, de manera general una clasificación ampliamente aceptada se presenta en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Clasificación taxonómica del género Capsicum.

Reino Plantae División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Orden Solanales Familia Solanaceae Género Capsicum

Actualmente, se reconocen 31 especies en el género Capsicum (Hunziker, 1979; Eshbaugh, 1980a, 1993; Pickersgill, 1984; Moscone et al., 2007) con un número de cromosomas básico de n=12, excepto por C. campylopodium, C. cornutum, C. lanceolatum, C. mirabile, C. rhomboideum, C. schottianum, C. villosum, C. pereirae y C. recurvatum y C. friburgense que reportan un número básico de n=13 (Pickergill, 1977b; 1991; Tong y Bosland, 2003; Toniolo y Schifino-Wittmann, 2006; Moscone et al., 2007)

Los chiles domesticados y sus parientes silvestres forman un grupo conocido como “chiles verdaderos", que de manera informal son divididos en dos grandes grupos:

1) el grupo de flores blancas y 2) el grupo de flores púrpura, cuyos híbridos no se producen fácilmente y representan dos linajes evolutivos diferentes.

Dentro del grupo de flores blancas podemos encontrar el complejo Capsicum annuum en el cual se encuentran las especies domesticadas C. annuum, C. chinense y C. frutescens. Dentro de este grupo también podemos encontrar al complejo C. baccatum, el cual se caracteriza por presentar flores blancas con manchas amarillas, al interior de este grupo se localizan la especie domesticada C. baccatum var. pendulum y, dos variedades silvestres (McLeod et al., 1979a, 1982, 1983). La relación entre C. chacoense y C. galapagoense con las especies de flores blancas es desconocida. En el grupo de flores purpuras se encuentra el complejo C. pubescens en este se encuentran las especies C. cardenasii, C. eximium y la especie domesticada C. pubescens la cual no tiene forma silvestre conocida, pero que es capaz de cruzarse con las otras dos especies de este complejo y formar híbridos fértiles (Heiser y Smith, 1958; Eshbaugh, 1975, 1982) (Figura 1).

Figura 1. Especies del género Capsicum y su clasificación basada en el color de la flor (McLeod et al., 1979a, 1982, 1983; Heiser y Smith, 1958; Eshbaugh, 1975, 1982).

1.2.4 Origen y distribución geográfica del género Capsicum.

Todas las especies del género Capsicum son originarias de América. Es probable que antes de la llegada de Colón la distribución de este género se extendiera desde el borde 9

meridional de los Estados Unidos hasta la zona templada cálida del sur de Sudamérica (Heiser, 1964). McLeod et al. (1982; 1983) sugieren una de las hipótesis más aceptadas sobre el origen del género, esta se basa en información geográfica y datos de electroforesis de la enzima glutamato oxalacetato transaminasa (GOT), la hipótesis indica que el género se originó en un “área nuclear” en Bolivia subcentral (Figura 2), donde un antepasado de C. chacoense pudo haberse diferenciado primero. Las subsecuentes migraciones, acompañadas por la radiación y la especiación pudieron haber llevado a la actual distribución de Capsicum.

Figura 2. Centro de origen del género Capsicum propuesto por McLeod et al. (1982; 1983).

En cuanto a la distribución de las especies, Moscone et al. (2007) suponen que una primera migración hacia las regiones selváticas bajas del norte de Bolivia y oeste de Brasil dio origen a C. annuum, la cual se puede encontrar de manera silvestre en esa zona. A partir de allí, podría haber llegado al norte de Sudamérica y subsecuentemente a Centro América y México, donde se encuentra la mayor diversidad de esta especie. McLeod et al. (1982) proponen que el sistema de ríos en el “área nuclear” que desembocan en la cuenca del Amazonas, pudo haber favorecido a la dispersión de otros miembros del complejo C. annuum, como son C. chinense y C. frutescens dentro de la Amazonia. Perry et al. (2007) suponen que C. parvifolium pudo haber surgido de su ancestro C. frutescens en el nordeste de Brasil o bien que tuvo su origen directo de la zona de “área nuclear”. 10

Es probable que C. annuum dio origen a la especie endémica C. galapagoense y, en el noroeste de América del Sur a C. rhomboideum y esta última originar a C. lanceolatum en América Central. Una segunda migración temprana a las regiones subtropicales de Bolivia originó a C. baccatum y más tarde al “grupo de flores purpura” (C. eximium, C. cardenasii, C. pubescens y C. tovarii) en las regiones secas occidentales de los Andes. También se sugiere que un ancestro de C. baccatum se extendió a las zonas subtropicales del este y sureste donde se generaron C. praetermissum y C. flexuosum, respectivamente. Por último, un ancestro de C. flexuosum pudo haber migrado hacia las selvas costeras del este de Brasil donde se diversifico en el grupo de 2n=26 (C. campylopodium, C. cornutum, C. friburgense, C. mirabile, C. pereirae, C. recurvatum, C. schottianum y C. villosum) (Moscone et al., 2007; Figura, 3).

1.2.5 Diversidad genética, erosión genética y conservación

La diversidad genética se refiere a la variación de los genes de las especies, es decir, a la variación hereditaria dentro y entre poblaciones de organismos (IPGRI y Cornell University, 2003). La variabilidad genética entre individuos o poblaciones es la base de la adaptación y evolución, y juega un rol importante en la tolerancia a los diferentes tipos de estrés bióticos y abióticos (Crawford y Whitney, 2010).

La pérdida de la diversidad genética por una población o especie se denomina erosión genética. La erosión genética tiene dos efectos importantes en la población: 1) puede dar lugar a la pérdida de alelos potencialmente útiles dentro del conjunto de genes, reduciendo la capacidad de la población para adaptarse a las condiciones ambientales cambiantes e incrementando el riesgo de extinción; 2) la reducción de los niveles de heterocigosis. A nivel población una reducción en los niveles de heterocigosis se reflejará en el aumento del número de homocigotos para un locus dado. A nivel individual se producirá una disminución del número de loci heterocigotos en el genotipo de la planta. La pérdida de heterocigosis es una consecuencia de un tamaño poblacional reducido provocado por diversos factores (Eguiarte et al., 2006).

Brown y Brubaker (2002) señalaron que en el siglo XX se produjo una transición grande sobre la apreciación de la diversidad genética vegetal; esto se inició con el redescubrimiento de las leyes de Mendel y los conceptos de Johanssen que contribuyeron al desarrollo del mejoramiento de plantas, lo cual se sumó a una visión del mundo postdarwiniano de que había suficiente variabilidad genética y que ésta no estaba en riesgo.

Entre 1920 y 1930 Vavilov y Harlan indicaron una pérdida mundial de variedades tradicionales que eran conservadas por los agricultores en sus campos de cultivo (Scaracia-Mugnozza y Perrino, 2002). Esto creó la necesidad de desarrollar estrategias para empezar a conservar los recursos genéticos, debido a que éstos, constituyen la materia prima para el desarrollo de nuevas variedades, las cuales son indispensables para satisfacer las demandas del crecimiento de la población y las impuestas por nuevas limitantes derivadas de la presión de las plagas, enfermedades y condiciones ambientales cambiantes (Rice, 2007). Las actividades para la conservación del germoplasma comprenden el mantenimiento, caracterización y evaluación de la diversidad genética dentro de una especie. En la actualidad, una de las estrategias que ha demostrado ser muy útil en estudios de conservación en especies cultivadas, ha sido el uso de marcadores genéticos.

1.2.6 Marcadores genéticos

Un marcador genético permite identificar las características fenotípicas o genotípicas en un individuo, es un carácter cuantificable y permite detectar variación en una proteína o en una secuencia de ADN (IPGRI y Cornell University, 2003).

Según Griffiths et al. (1993) un marcador genético es una variante alélica que se utiliza para marcar una estructura biológica o proceso a lo largo de un experimento genético.

De manera general los marcadores genéticos pueden ser clasificados en tres tipos: marcadores morfológicos, marcadores bioquímicos y marcadores moleculares (IPGRI y Cornell University, 2003).

1.2.7 Marcadores morfológicos

Los marcadores morfológicos fueron los primeros marcadores que se utilizaron en estudios de caracterización y evaluación de la diversidad genética, con fines de mejoramiento genético y conservación y se consideran como los caracteres de un individuo que se expresan en un ambiente específico y que el hombre identifica con un objetivo determinado (Nuez y Carrillo, 2000).

Los marcadores morfológicos se han venido utilizando para estudiar la diversidad genética, identificar plantas cultivadas y conservar los recursos genéticos (Yasmin et al., 2006).

Estas medidas tienen la ventaja de no requerir de un equipo sofisticado y son la apreciación más directa de un fenotipo; por consiguiente, están al alcance para uso inmediato, lo que es un atributo importante. Sin embargo, presentan limitantes debido a que su obtención es tardada y se ven influenciados por el ambiente y las diferentes etapas del desarrollo del cultivo (IPGRI y Cornell University, 2003; Yasmin et al., 2006).

1.2.8 Marcadores bioquímicos

Los marcadores bioquímicos, también denominados marcadores proteicos, se basan en las propiedades migratorias de las proteínas (proteínas de reserva) y enzimas (isoenzimas). Estos marcadores se obtienen mediante electroforesis y se detectan mediante tinciones histoquímicas específicas de las enzimas que se quieren analizar (IPGRI y Cornell University, 2003).

Entre las ventajas que presentan estos marcadores es que son un método sólido y reproducible. Además, las isoenzimas son marcadores codominantes y, por tanto, apropiados para calcular todos los parámetros poblacionales y para construir mapas genéticos (IPGRI y Cornell University, 2003). Sus principales desventajas son: 1) que detectan niveles menores de variación y 2) que al ser productos de la expresión génica se ven afectados por modificaciones postranscripcionales o postransduccionales. Para cubrir las desventajas que presentan los marcadores bioquímicos se han desarrollado los marcadores moleculares. Sin embargo, las proteínas de reserva se siguen utilizando en la identificación de variedades, y las isoenzimas en la estimación de parámetros de fecundación y de selección (Pérez, 1997)

1.2.9 Marcadores moleculares

Los marcadores moleculares se definen como un fragmento de ADN genómico que revela variaciones/mutaciones en la secuencia de ADN, que está asociada o ligada a una localización/locus definida dentro del genoma y que puede ser detectada por medio de una tecnología molecular particular y si están genéticamente unidos a un gen de interés, pueden ser utilizados para detectar el polimorfismo entre diferentes alelos o genotipos del gen para una secuencia particular de DNA (Jiang, 2017). Por tanto, un marcador molecular será aquel fragmento de DNA polimórfico (con variaciones) que nos permita distinguir entre diferentes grupos taxonómicos (hasta nivel de especie o subespecie), poblaciones, familias o individuos (Ríos et al., 2009).

Jiang (2017) indica que hay tres métodos básicos utilizados en la detección de marcadores moleculares o polimorfismos: Southern blot, una técnica de hibridación de ácido nuclear (DNA/DNA o RNA/DNA); la secuenciación del DNA; y PCR, una técnica de reacción en cadena de la polimerasa. Por consiguiente, los marcadores moleculares se pueden categorizar en tres clases: 1) marcadores basados en hibridación, por ejemplo, polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP); 2) marcadores basados en secuencias, por ejemplo, polimorfismo de nucleótido simple (SNP); y 3) 14

marcadores basados en PCR, tales como amplificación aleatoria de DNA polimórfico (RAPD), polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP), secuencias simples repetidas (SSR) e inter secuencias simples repetidas (ISSR).

1.2.10 Marcadores ISSR

Los marcadores inter secuencias simples repetidas (ISSR) están basados en la técnica de PCR, reportado por Zetkiewiez et al., (1994) implica la amplificación de segmentos de DNA entre dos regiones idénticas de repetición de microsatélites orientadas en dirección opuesta utilizando oligonucleótidos, usualmente con una longitud de 16-25pb, de di, tri, tetra o penta repeticiones de nucleótidos diseñados a partir de regiones núcleo de microsatélite. (Meyer et al., 1993; Gupta et al., 1994; Wu et al., 1994).

Los marcadores ISSR se categorizan en el grupo de marcadores genéticos dominantes, los cuales no permiten la distinción entre homocigotos y heterocigotos. Estos marcadores, sin embargo, usualmente producen múltiples fragmentos de DNA (cada uno de los cuales es considerado un locus) en una sola reacción, permitiendo la generación de un gran número de loci a través del genoma de cualquier especie sin la necesidad de conocer con anterioridad información de la secuencia del DNA (Paran y Michelmore, 1993).

Los marcadores ISSR han sido usados en numerosos estudios de caracterización de germoplasma (Wolff et al., 1995; Charters y Wikilson, 2000), para estimar la diversidad genética inter e intra-especifica en un amplio rango de cultivos (Salimath et al., 1995; Nagaoka y Ogihara, 1997; Prevost et al., 1998; Joshi et al., 2000; Ajibade et al., 2000), para identificar marcadores de DNA muy relacionados a rasgos agronómicos importantes (Ratnaparkhe et al., 1998; Hussain et al., 2000; Levin et al., 2000), para determinar la distribución de microsatélites en el genoma (Gupta et al., 1994; Nagaoka y Ogihara, 1997; Blair et al., 1999; Pasakinskiene et al., 2000), para probar la hipótesis de especiación (Wolfe et al., 1998) y para estudiar la historia de colonización de comunidades de plantas, para distinguir cultivares y variedades estrechamente relacionadas (Prevost et al., 1999).

1.2.11 Estudios de diversidad genética y morfológica en chile Capsicum spp.

Tanto los marcadores morfológicos como moleculares han sido muy útiles para la evaluación de la diversidad genética y morfológica en chiles. Castellón Martinez et al. (2014) analizaron la variación fenotípica de morfotipos de chile nativos de Oaxaca, en sus resultados reportaron diferencias significativas de variación fenotípica inter e intra morfotipos en todas las variables evaluadas.

Nárez-Jiménez et al. (2014) caracterizaron morfológicamente in situ 43 colectas de chiles en el estado de Tabasco, en sus resultados reportan que los primeros tres componentes principales explicaron 63.14 % de la variación total, y de acuerdo al análisis de conglomerados, observaron que su muestra total se estructuró en tres grupos morfológicos.

Oribiyi et al. (2018) estudiaron la variabilidad agro-morfológica de 148 variedades locales de C. annuum L. colectados en el Noreste de Benin, utilizando 21 descriptores cualitativos y 18 cuantitativos. El análisis de las variables cualitativas mostró la formación de cuatro grupos, mientras que con las variables cuantitativas se obtuvieron nueve grupos, así mismo reportaron amplia variabilidad genética en la muestra total estudiada.

Contreras-Toledo et al. (2011) evaluaron la diversidad genética de variedades locales de chile ‘Poblano’, ‘Loco’, ‘Miahuateco’ y ‘Ancho’, colectadas en el Valle de Tehuacán, Puebla, mediante marcadores microsatélites. Sus resultados indican un mayor polimorfismo y heterocigosidad en las poblaciones locales, lo cual resalta la importancia de establecer estrategias de conservación para las especies locales.

Sangoj et al. (2011) realizaron el perfilaje molecular de 22 accesiones de seis especies de Capsicum en la India, utilizando 27 marcadores RAPD y ocho ISSR, los análisis de agrupamiento revelaron similitudes genéticas en los rangos de 23–88% and 11–96%, respectivamente. El análisis de componentes principales de los datos de ambos marcadores respaldó la similitud genética y las agrupaciones formadas. Estos autores concluyeron que los marcadores moleculares son útiles para delimitar la especificidad de la especie en la colección de Capsicum y para la identificación genética de la colección base de estudio.

Dias et al. (2013) caracterizaron diferentes especies de Capsicum usando marcadores ISSR (C. chinense, C. frutescens, C. annuum y C. baccatum) e incluyeron una accesión

de tomate (Solanum lycopersicon) como grupo control, en total probaron 41 primers de los cuales 26 fueron seleccionados y evaluados por el número de bandas y polimorfismo que generaban. Con base en sus resultados se formaron dos grupos, el primero incluyó accesiones pertenecientes a las especies C. annuum, C. baccatum y C. frutescens, el segundo grupo solo contuvo a C. chinense.

Como se puede observar con la información anterior, tanto los marcadores morfológicos como los moleculares han demostrado su eficiencia en la evaluación y caracterización de la diversidad genética en Capsicum. Actualmente debido a que la información generada por ambos marcadores puede complementarse para tener estimados de la diversidad genética más robusta, Costa et al., (2009) señalan que es necesaria la asociación de datos moleculares, agronómicos y morfológicos para tener una mayor eficiencia en la estimación de la diversidad genética de Capsicum. Esto es corroborado por Campos et al., (2016) quienes al evaluar el perfilado morfológico, agronómico y molecular de 21 accesiones Capsicum spp. del suroeste de Mato Grosso, Brasil, observaron que las accesiones evaluadas presentaron altos niveles de estructura genética al identificar seis grupos bien definidos por sus características agronómicas, morfológicas y moleculares.

1.3 HIPÓTESIS

1. La diversidad genética de los ecotipos de Capsicum spp. está determinada por su origen geográfico y las características morfológicas distintivas de cada especie.

2. Los ecotipos silvestres de Capsicum spp. presentan mayor diversidad que los ecotipos cultivados.

1.4 OBJETIVOS

1.4.1 Objetivo general

Evaluar la diversidad genética y morfológica de nueve ecotipos de Capsicum spp. nativos del estado de Campeche.

1.4.2 Objetivos específicos

 Analizar la variación morfológica de nueve ecotipos de chile bajo condiciones protegidas.

 Evaluar la diversidad y la estructura genética de los ecotipos de chile colectados en el estado de Campeche.

1.5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Procedimiento experimental

Fase 1 Fase 2 Caracterización Caracterización morfológica molecular

1. Trasplante de 1. Colecta de plántulas muestras

2. Evaluación de variables 2. Molienda de las morfológicas y muestras fenológicas

3. Extracción y cuantificación del 3. Análisis de datos DNA

4. Ejecución de las PCR y electroforesis

5. Análisis de datos

1.6 BIBLIOGRAFÍA

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1 CAPÍTULO 2

2 MORPHOLOGICAL EX SITU DIVERSITY OF CHILI PEPPER LANDRACES

3 (Capsicum spp.) NATIVE TO CAMPECHE STATE

4 5 2.1 Abstract

6 The morphological characterization of plant resources is an important part of the evaluation of their diversity

7 and conservation. Thus, the objective of this research was to characterize morphologically ex situ nine chili

8 pepper ecotypes of the state of Campeche. The ecotypes were 'Xcat'ik' (Capsicum annuum), 'Bobo' (C. annuum),

9 'Dulce' (C. annuum), 'Pico Paloma' (C. frutescens), 'Bolita', 'Maax' (C. annuum var. aviculare), 'Verde' (C.

10 annuum) and 'Rosita' (C. chinense). The characterization was performed from May to December 2017 in a

11 greenhouse using a randomized complete block design with three repetitions. Fifteen quantitative and 39

12 qualitative variables were measured, using as a guide the IPGRI Descriptors for Capsicum. For the quantitative

13 variables, 84.4% of the total variability was explained by plant height and width, stem length, filament length,

14 fruit length and width, seed diameter, and leaf length and width. For the qualitative variables, 77.35% of the

15 variation was due to the leaf blade margin, corolla spot color, filament color, pedicel attachment to fruit, seed

16 color, seed size and number of seeds per fruit. The results demonstrated the morphological variation and genetic

17 diversity of the genus Capsicum in the state of Campeche.

18 Keywords: genetic diversity; ecotype genetic resources; genus Capsicum; Morphology.

20 2.2 Introduction

21 Chilies belong to the Solanaceae family and represent one of the main vegetables cultivated worldwide (Ortiz

22 et al. 2010). Chili fruits are sources of vitamins (A, B, C, E and K), proteins, lipids, carbohydrates, fiber and

23 minerals (Bhadragoudar and Patil, 2011), along with components such as capsaicinoids and carotenoids, which

24 are responsible for their pungency and pigmentation. Depending on their characteristics, their uses vary,

25 including spices and seasonings in food preparation, consumption with strawberries, production of dyes for the

26 food and cosmetics industries, and medicinal uses (Aguirre and Muñoz, 2015).

27 The genus Capsicum is native to America and consists of 30 species, of which five have been domesticated

28 (Bosland and Votava, 2012). In Mexico, four of the five domesticated species are present: C. annuum , C.

29 chinense, C. frutescens. and C. pubescens. In addition, wild populations of C. annuum, C. frutescens, C. ciliatum

30 and C. lanceolatum are distributed throughout the country and have great morphological and genetic variability

31 (Hernández, 2011); thus, they represent potential plant genetic resources. However, due to factors such as the

32 presence of pests and diseases, the migration and abandonment of cultivation in the Mexican countryside, the

33 introduction of improved varieties and changes in land use, the diversity of chilies has diminished (Aguilar et

34 al. 2006).

35 Genetic variation is the basis of the survival and evolution of species. Characterization of the variation in wild

36 and native populations of Capsicum spp. is useful to determine their genetic diversity and their potential for

37 genetic improvement and, thus, to promote their conservation (Rodriguez et al. 2007). Morphological

38 characterization is the first step in the study of diversity, as it allows the description of each species and the

39 identification and differentiation of genetic groups (Carvalho et al. 2014).

40 In the Yucatan Peninsula, the culture and tradition of the indigenous communities informs the management of

41 agrobiodiversity. Farmers make use of the surrounding vegetation and perform agricultural practices such as

42 the milpa system and family orchards and plots to obtain food for personal consumption. At the same time,

43 these farmers are active agents of wild and native species conservation, and they intervene in the generation of

44 new varieties (Jiménez et al. 1999; Cauich et al. 2014). Such practices still persist in the state of Campeche,

45 which combines a high level of biological diversity with the still-present Mayan culture (Villalobos and

46 Mendoza, 2010). Laborde and Pozo (1982) reported the presence in the state of Campeche of the species C.

47 annuum, C. chinense and C. frutescens. However, there are no studies on the diversity of domesticated,

48 semidomesticated and wild species in this region, which leads to limited knowledge about their variability and

49 distribution. Therefore, the objective of this work was to characterize the morphological diversity of chili pepper

50 ecotypes collected in the state of Campeche.

52 2.3 Materials and methods

53 2.3.1 Plant material and location of the study area

54 The collection of chili ecotypes was carried out in four different regions of the state of Campeche (Calkiní,

55 Champotón, Campeche and Palizada) where farmers still collect and cultivate wild materials and chili peppers

56 within their farming system. The plant material consisted of nine ecotypes of chili; seven belonged to the species

57 C. annuum, one to the species C. frutescens and one to the species C. chinense (Table 1).

59 Table 1. Ecotypes of Capsicum spp., collected in five regions of the state of Campeche

Ecotipo Especie Nombre local Municipio Localidad 1 C. annuum var. aviculare 'Maax' or 'Maaxito' Candelaria El Cerrito 2 C. annuum 'Xcat’ik 1' Calkiní Tankunché 3 C. annuum 'Xcat’ik 2' Calkiní Nunkiní 4 C. annuum 'Bolita' Champotón El Cerrito 5 C. annuum 'Verde' Calkiní Calkiní 6 C. annuum 'Dulce' Campeche 7 C. annuum 'Bobo' Calkiní Bacabché 8 C. frutescens 'Pico Paloma' Champotón El Cerrito 9 C. chinense 'Rosita' Palizada Palizada 60

61 The experimental work was carried out from May to December 2017 at the Campeche Campus of the

62 Postgraduate College, located in the town of Sihochac, in the municipality of Champotón, Campeche, at an

63 altitude of 15 m.a.s.l, 19° 29' 56.3" NL, 90° 32' 44.5" WL. To obtain seedlings, the seeds were planted under

64 standard production practices in polystyrene trays of 200 pots, with Canadian peat moss as substrate.

65 Transplanting was performed under greenhouse conditions, and fertigation was performed 55 days after sowing.

66 The separation between rows was 1.5 m, and plants were spaced at 0.25 m. During the whole experiment, the

67 plants were subjected to agronomic management that consisted of irrigation, fertilization, weed control and

68 control of pests and diseases, according to Soria et al. (2002).

70 2.3.2 Variables evaluated

71 For the morphological evaluation of the ecotypes, the Descriptors for Capsicum (Capsicum spp.) Guide of the

72 International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI, 1995) was used. A total of 54 variables were measured,

73 15 quantitative and 39 qualitative, which included characteristics of the seedling, plant, flower, fruit and seed

74 (Table 2).

75 Table 2 Variables evaluated in the morphological characterization of Capsicum spp. ecotypes native to the

76 state of Campeche

Variables Measurement form

Quantitative Cotyledon length (cm) Measured in fully developed cotyledons Cotyledon width (cm) Measured in fully developed cotyledons, at the widest point Stem height (cm) Measured when the first fruit begins to mature in 50% of the plants

Stem width (cm) Measured after the first harvest, at the widest point Stem length (cm) Measured until the first bifurcation, immediately after the first harvest Mature leaf length (cm) Measured from the apex to the base of the leaf Mature leaf width (cm) Measured at the widest part of the leaf Anther length (mm) Measured immediately after anthesis Filament length (mm) Measured immediately after anthesis Fruit length (cm) Measured in mature fruits of the second harvest, from the union of the fruit with the pedicel to the fruit apex Fruit width (cm) Measured in mature fruits of the second harvest, at the widest point Fruit weight (g) Grams Fruit pedicel length (cm) Measured from the point of union of the pedicel with the fruit to the end of the pedicel

Fruit wall thickness (mm) Measured in ripe fruit of the second harvest, at the widest point of the pericarp Seed diameter (mm) Measured at the widest point of the seed Qualitative Hypocotyl color Ordinal: 1 = white; 2 = green; 3 = purple Hypocotyl pubescence Ordinal: 3 = scarce; 5 = intermediate; 7 = dense Cotyledon shape Ordinal: 1 = deltoid; 2 = oval; 3 = lanceolate; 4 = elongated-deltoid Stem color Ordinal: 1 = green; 2 = green with purple stripes; 3 = purple; 4 = other Nodal anthocyanin Ordinal: 1 = green; 3 = light purple; 5 = purple; 7 = dark purple Stem shape Ordinal: 1 = cylindrical; 2 = angular; 3 = flattened Stem pubescence Ordinal: 3 = scarce; 5 = intermediate; 7 = dense Plant growth habit Ordinal: 3 = prostrate; 5 = intermediate; 7 = erect; 9 = other Branching habit Ordinal: 3 = scarce; 5 = intermediate; 7 = dense Tillering Ordinal: 3 = scarce; 5 = intermediate; 7 = dense

77 78 Table 2 Continuation

Variables Measurement form

Leaf density Ordinal: 3 = scarce; 5 = intermediate; 7 = dense Leaf color Ordinal: 1 = yellow; 2 = light green; 3 = green; 4 = dark green; 5 = light purple; 6 = purple; 7 = variegated Leaf shape Ordinal: 1 = deltoid; 2 = oval; 3 = lanceolate Leaf blade margin Ordinal: 1 = integer; 2 = wavy; 3 = ciliate Leaf pubescence Ordinal: 3 = scarce; 5 = intermediate; 7 = dense Number of flowers per axil Ordinal: 1 = one; 2 = two; 3 = three or more; 4 = many flowers in clusters, but each one in an individual axil; 5 = other Flower position Ordinal: 3 = pending; 5 = intermediate; 7 = erect Corolla color Ordinal: 1 = white; 2 = light yellow; 3 = yellow; 4 = yellow- green; 5 = purple with purple base; 6 = white with purple base; 7 = white with purple margin; 8 = purple Corolla spot color Ordinal: 1 = white; 2 = yellow; 3 = yellow-green; 4 = green; 5 = purple; 6 = other Corolla length Coded: 1 = <1.5; 2 = 1.5-2.5; 3 = >2.5 Anther color Ordinal: 1 = white; 2 = yellow; 3 = pale blue; 4 = blue; 5 = purple; 6 = other Filament color Ordinal: 1 = white; 2 = yellow; 3 = green; 4 = blue; 5 = light purple; 6 = purple; 7 = other Stigma exsertion Ordinal: 3 = inserted; 5 = at the same level; 7 = exerted Calyx margin Ordinal: 1 = integral (smooth); 2 = intermediate; 3 = toothed; 4 = other Fruit set Ordinal: 3 = low; 5 = intermediate; 7 = high Fruit color at the intermediate stage Ordinal: 1 = white; 2 = yellow; 3 = green; 4 = orange; 5 = purple; 6 = dark purple; 7 = other Fruit color at the mature stage Ordinal: 1 = white; 2 = lemon-yellow; 3 = pale yellow-orange; 4 = yellow-orange; 5 = pale orange; 6 = orange; 7 = light red; 8 = red; 9 = dark red; 10 = purple; 11 = brown; 12 = black; 13 = other Fruit shape Ordinal: 1 = elongated; 2 = almost round; 3 = triangular; 4 = campanulate; 5 = blocky bell-shaped; 6 = other Fruit shape at pedicel attachment Ordinal: 1 = acute; 2 = obtuse; 3 = truncated; 4 = rounded; 5 = lobed Fruit shape at blossom end Ordinal: 1 = peak ; 2 = dull; 3 = sunken ; 4 = sunken and peak ; 5 = other Fruit blossom end appendage Ordinal: 0 = absent; 1 = present Transverse fruit corrugation Ordinal: 3 = slightly corrugated; 5 = intermediate; 7 = very corrugated Number of locules Numeric Fruit surface Ordinal: 1 = smooth; 2 = semi rough; 3 = rough Pedicel attachment to fruit Ordinal: 3 = deciduous; 5 = intermediate; 7 = persistent Pedicel attachment to stem Ordinal: 3 = deciduous; 5 = intermediate; 7 = persistent Seed color Ordinal: 1 = dark yellow; 2 = brown; 3 = black; 4 = other Seed surface Ordinal: 1 = smooth; 2 = rough; 3 = wrinkled Seed size Ordinal: 3 = small; 5 = intermediate; 7 = large Number of seeds per fruit Numeric 79

81 2.3.3 Statistical analysis

82 The experimental design was a randomized complete block with three repetitions. The experimental unit

83 consisted of 13 plants, of which 10 constituted the useful plot.

84 The variation patterns were analyzed with descriptive statistics. Principal component analysis (PCA) was

85 performed with the averages and the statistical modes for the quantitative and qualitative variables, respectively,

86 with the software SPSS version 20 (SPSS Inc. 2011). Hierarchical cluster conglomerate analyses were

87 performed, determined by the average linkage method (UPGMA), where the differences between the elements

88 were calculated using the Euclidean distance with the PAST program (Hammer et al. 2001).

90 2.4 Results and discussion

91 2.4.1 Quantitative data

92 In the PCA performed with the quantitative variables, the first three main components (PC) were selected as

93 significant factors for presenting eigenvalues > 1. These components explained 86.77% of the total variability,

94 enough to identify quantitative characteristics that can differentiate native ecotypes of Campeche chili. The first

95 principal component (PC1) provided the greatest variation, with 58.90% of the total variance explained, and

96 was associated with the variables plant height and width, stem length, filament length, fruit length, fruit wall

97 thickness and seed diameter. The observed total variability of 17.15% in the second main component (CP2)

98 was influenced mainly by the mature leaf length and width variables. The third main component (CP3)

99 explained 10.71% of the variation and was related to the variables cotyledon width and fruit width. The results

100 obtained are similar to those reported by Cruz-Lázaro et al. (2017), who indicated that plant and leaf descriptors

101 (leaf length, leaf width, plant height, plant width and stem diameter) were the traits with the greatest variation.

102 In the same way, the results coincide with those of Narez-Jiménez et al. (2014), who found the greatest

103 variability in fruit and leaf characteristics. In contrast, the filament length variable is not considered to be highly

104 discriminating for species differentiation (IPGRI, 1995); however, the results obtained in this study coincide

105 with those found by Alonso et al. (2008), who evaluated wild chili populations in the state of Chiapas and found

106 that filament length contributed variation in their studies. The variation found in filament length can be

107 attributed to the size of the flower, since the larger flowers had longer filaments than those of the small flowers

108 (Table 3).

109 Table 3 Proportions of variance explained and accumulated, and correlation values obtained for the first three

110 main components of 15 quantitative variables of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche

Main components PC1 PC2 PC3

Eigenvalue 8.83 2.57 1.60 Proportion of variance explained (%) 58.90 17.15 10.71 Proportion of cumulative variance (%) 58.90 76.05 86.77

Variables evaluated Correlation values

Cotyledon length 0.758 -0.232 0.503 Cotyledon width 0.603 -0.124 0.615 Plant height -0.947 0.055 0.071 Stem width -0.889 0.257 0.142 Stem length -0.895 -0.142 -0.041 Mature leaf length -0.424 0.848 0.195 Mature leaf width -0.458 0.810 0.136 Anther length 0.771 0.015 0.264 Filament length 0.864 -0.179 -0.235 Fruit length 0.917 0.061 0.306 Fruit width 0.601 0.498 -0.587 Fruit weight 0.770 0.340 -0.395 Fruit pedicel length 0.283 0.725 0.388 Fruit wall thickness 0.950 0.245 -0.148 Seed diameter 0.950 0.233 -0.048 111

112 The graphic representation of PCA results on the first two PCs indicates the formation of two groups with

113 76.05% of the cumulative total variation (Fig. 1). This value indicates that the graphical representation of the

114 first two main components is appropriate to visualize the relationships between groups and between ecotypes

115 within the same group. The first group (I) was the most diverse; it was formed by ecotypes 'Rosita', 'Bobo',

116 'Dulce', 'Xcat'ik 1', 'Xcat'ik 2' and 'Verde' and included plants of intermediate size with medium to large fruits.

117 The second group (II) was formed by the ecotypes 'Maax', 'Bolita' and 'Pico Paloma', tall plants with very small

118 fruits. The separation of the ecotypes into two different groups coincides with a result reported by Carvalho et

119 al. (2014), who indicated that, in their studies, the species with wild characteristics were grouped separately

120 from the domesticated species.

121

122

123 Fig. 1 Identification of groups of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche, based on the 124 main components 1 and 2 obtained via principal component analysis of 15 quantitative variables 125

126 The dendrogram constructed with the UPGMA method supported what was observed in the PCA (Figs. 1 and

127 2) by identifying two well-defined groups with bootstrap values of 90% and 86%, respectively. Group I included

128 the ecotypes 'Rosita', 'Bobo', 'Xcat'ik 2', 'Dulce', 'Xcat'ik 1', and 'Verde'. Group II included the ecotypes 'Bolita',

129 'Pico Paloma' and 'Maax'.

130 The UPGMA results, in addition to corroborating the grouping topology observed in the PCA with 100%

131 similarity, allowed observation of the closest relationships among the evaluated chili ecotypes. Ecotype 'Rosita'

132 was the most morphologically distant in group I, because this ecotype belongs to the species C. chinense, while

133 the rest of the ecotypes within this group belong to the species C. annuum. It was also observed that the 'Bobo'

134 ecotype is related to the ecotypes 'Xcat'ik 2' and 'Dulce', which is because it is the result of a natural cross

135 between these ecotypes of chili, both belonging to the species C. annuum. Within group II, the ecotype 'Maax'

136 was the most distant, while the ecotypes 'Bolita' and 'Pico Paloma' were closely related. This result can be

137 attributed to the genetic origin of these ecotypes: the 'Maax' ecotype belongs to the species C. annuum var.

138 aviculare and, although the ecotypes 'Bolita' and 'Pico Paloma' belong to different species (C. annuum and C.

139 frutescens) respectively, their morphological characteristics are very similar, since both are wild chilies (Fig.

140 2).

141

142 Fig. 2 Grouping of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche, based on 15 quantitative 143 variables 144

145 2.4.2 Analysis of qualitative data

146 Among the qualitative variables, 77.35% of the total observed variation was explained by the first four main

147 components. CP1 contributed 33.51% of the total variability observed, and the variables that contributed the

148 greatest variation to CP1 were hypocotyl pubescence, leaf blade margin, corolla spot color, filament color,

149 pedicel attachment to fruit, seed color, seed size and number of seeds per fruit. The variability observed in CP2

150 (18.34%) was influenced by the variables stem shape, plant growth habit, number of flowers per axil and

151 transverse corrugation. The main components CP3 and CP4 contributed 13.73% and 11.76% of the total

152 variability observed, respectively. For CP3, the variable that provided the greatest variability was mature fruit

153 color, and, for CP4, it was anther color (Table 4).

154 Table 4 Proportion of variance explained and accumulated, and correlation values obtained in the first four

155 main components of 39 qualitative variables of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche

Main components

PC1 PC2 PC3 PC4

Eigenvalue 13.07 7.15 5.35 4.58 Proportion of variance explained (%) 33.51 18.34 13.73 11.76 Proportion of cumulative variance (%) 33.51 51.85 65.59 77.35

Variables evaluated Correlation values

Hypocotyl color 0.226 0.529 0.488 -0.206 Hypocotyl pubescence -0.820 -0.024 -0.316 0.169 Cotyledon shape 0.399 -0.367 0.367 -0.664 Stem color 0.430 -0.019 -0.297 -0.203 Nodal anthocyanin 0.781 0.101 -0.466 -0.027 Stem shape 0.332 -0.880 0.283 -0.078 Stem pubescence 0.159 -0.007 0.542 -0.285 Plant growth habit 0.322 -0.880 0.283 -0.078 Branching habit -0.627 -0.607 0.415 0.229 Tillering -0.703 -0.570 -0.088 0.294 Leaf density -0.607 -0.504 0.547 -0.088 Leaf color 0.500 -0.367 -0.230 0.653 Leaf shape 0.344 -0.170 -0.172 0.650 Leaf blade margin -0.870 0.283 -0.077 -0.328 Leaf pubescence -0.456 0.128 0.660 0.051 Number of flowers per axil -0.322 0.880 -0.283 0.078 Flower position -0.595 0.047 -0.466 0.129 Corolla color -0.641 0.718 -0.224 -0.110 Corolla spot color -0.878 0.096 -0.015 -0.379 Corolla length 0.581 0.142 0.532 -0.083 Anther color 0.205 0.395 0.203 -0.800 Filament color -0.880 0.176 -0.042 -0.360 156

157

158

159 160 Table 4 Continuation 161

Variables evaluated Correlation values

Stigma exertion -0.331 0.136 0.534 0.239 Calyx margin 0.376 0.397 -0.334 -0.132 Fruit set 0.624 0.026 -0.662 -0.100 Fruit color at the mature stage -0.315 -0.181 0.703 0.193 Fruit shape -0.404 0.249 0.140 0.778 Fruit shape at pedicel attachment 0.669 0.477 0.168 0.346 Fruit shape at blossom end -0.482 0.336 0.145 0.585 Fruit blossom end appendage 0.282 0.239 0.554 0.363 Fruit cross-sectional corrugation -0.031 0.846 0.205 0.333 Number of locules 0.325 0.572 0.652 0.263 Fruit surface -0.036 0.513 0.186 0.147 Pedicel attachment to fruit 0.850 0.371 0.133 -0.006 Pedicel attachment to stem 0.560 -0.180 -0.138 -0.175 Seed color 0.931 -0.223 0.114 0.200 Seed surface -0.725 0.264 0.270 -0.491 Seed size 0.850 0.344 0.319 -0.108 Number of seeds per fruit 0.926 0.282 0.121 -0.185 162

163 Of the 39 qualitative variables evaluated, the IPGRI (1995) reports that 14 of these are highly discriminating.

164 However, in this study, only four variables (seed color, number of flowers per axil, number of seeds per fruit

165 and plant growth habit) coincided with those indicated in the descriptor guide. The variable margin of the leaf

166 blade in this study allowed us to observe variation among the evaluated ecotypes; this result coincides with that

167 indicated by Oribiyi et al. (2018). In contrast, Narez-Jiménez et al. (2014) reported that the variables leaf blade

168 margin and seed color did not provide any variation. With respect to the rest of the variables, although they

169 have not been reported in other studies as variables that provide variation, in the present work, they were

170 important in the formation of the groups.

171 Fig. 2 shows a graphical representation of the morphological diversity of the ecotypes evaluated based on the

172 first two main components, which accounted for 51.85% of the total variation observed. The PCA graph showed

173 the formation of three groups: group I included the ecotypes 'Dulce', 'Bobo', 'Xcat'ik 1', 'Xcat'ik 2' and 'Verde',

174 which are characterized by white flowers, white filaments and larger seeds. Group II was formed by the 'Rosita'

175 ecotype, which presented a cylindrical stem, a habit of prostrate growth, an inflorescence with three flowers per

176 axil, a yellow-green corolla, light purple filaments and bell-shaped fruits that were orange when mature. Group

177 III was formed by the ecotypes 'Maax', 'Bolita' and 'Pico Paloma'. These ecotypes were grouped by the shared

178 characteristics of a deciduous attachment of the fruit to the pedicel, less than 15 seeds per fruit and small seeds.

179 The UPGMA conglomerate analysis supported the results obtained in the PCA and showed the formation of

180 three main groups with bootstrap values of 67%, 47% and 68%, respectively (Figs. 3 and 4).

181 The results obtained with both quantitative and qualitative variables were similar. The only ecotype that showed

182 variation with respect to its grouping was 'Rosita' (C. chinense); in the quantitative variables, 'Rosita' was

183 grouped with the ecotypes of the species C. annuum, but in the qualitative variables, it separated, forming an

184 independent group, because it presented qualitative characteristics very different from those of the other

185 ecotypes. Piña-Razo (1982) indicates that one of the characteristics that distinguishes C. chinense from C.

186 annuum is the presence of three to four flowers per axil. Similarly, Smith and Heiser (1957) indicate that the C.

187 chinense species is the only one of the C. annuum complex that has a greenish-yellow corolla. These

188 characteristics could influence the separation of the 'Rosita' ecotype into an independent group when

189 characterized with qualitative variables.

190

191 Fig. 3 Distribution of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche based on main 192 components 1 and 2 obtained with the correlation matrix of 39 qualitative variables 193

194

195 Fig. 4 Grouping of nine ecotypes of Capsicum spp. native to the state of Campeche, based on 39 quantitative 196 variables 197

198 When evaluated with both types of variables (quantitative and qualitative), the ecotypes of the species C.

199 annuum formed a large group within which two subgroups were distinguished; the first was formed by the

200 ecotypes 'Bobo', 'Dulce' and 'Xcat'ik 2'. The formation of this subgroup confirms that the 'Bobo' ecotype comes

201 from a spontaneous cross between 'Xcat'ik' and 'Dulce' (González et al. 2010); the second subgroup was formed

202 by the ecotypes 'Xcat'ik 1' and 'Verde', which presented morphological similarities in their plant and fruit traits.

203 The ecotypes 'Maax', 'Bolita' and 'Pico Paloma' (C. annuum var. aviculare, C. annuum and C. frutescens,

204 respectively), when characterized with quantitative variables as well as with qualitative variables, formed a

205 solid group despite being different taxonomically. These three ecotypes are wild, so they had very similar

206 characteristics that led to the formation of the group. Pickersgill (1971) indicated that wild populations have

207 small, erect, bright red fruits that easily detach from the pedicel (deciduous).

208

209

210 2.5 Conclusion

211 High morphological variability was found among the evaluated chili pepper ecotypes. The greatest variability

212 was observed in the qualitative variables, which showed the formation of three groups. The results obtained

213 indicate the need to implement programs for the conservation and improvement of the ecotypes of chili from

214 the state of Campeche. Because morphological markers are influenced by the environment, the use of

215 biochemical or molecular markers is recommended to obtain a better estimate of the diversity of these ecotypes.

216

217 2.6 References

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279

1 CAPÍTULO 3

2 ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD GENÉTICA DE ECOTIPOS DE CHILE (Capsicum

3 spp.) NATIVOS DEL ESTADO DE CAMPECHE

4 Lucero del C. López-Castilla1; René Garruña2; Crescencio de la C. Castillo-Aguilar3;

5 Rubén H. Andueza-Noh2*

6 1Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Conkal, Av. Tecnológico s/n Conkal,

7 Yucatán. 2CONACYT-Instituto Tecnológico de Conkal, Av. Tecnológico s/n Conkal, Yucatán.

8 3Colegio de Posgraduados, Sihochac, Champotón, Campeche.

9 3.1 RESUMEN

10 La Península de Yucatán conformada por los estados de Campeche, Quintana Roo y Yucatán, se

11 reporta como una región importante de domesticación y diversificación de Capsicum annuum, a

12 pesar de esto son muy pocos los estudios realizados en la región y sólo se han enfocado al estado

13 de Yucatán. En el estado de Campeche se reporta la presencia de las especies de C. annuum, C.

14 chinense y C. frutescens, sin embargo, no se ha realizado ningún estudio que permita conocer la

15 diversidad genética de este género en el estado, por lo que el objetivo de este estudio fue el de

16 analizar la diversidad, estructura y relaciones genéticas de nueve ecotipos de Capsicum spp.

17 colectados en el estado de Campeche, mediante el uso de cuatro marcadores ISSR. El PCoA y

18 dendograma UPGMA generados indicaron la formación de tres grupos genéticamente diferentes.

19 Un análisis de varianza molecular (AMOVA) indicó que el 92% de la diversidad genética total se

20 distribuye entre los ecotipos y solo el 8% dentro de los ecotipos. A nivel total se observó alto

21 porcentaje de loci polimórficos (%P= 88) y alta diversidad genética (I = 0.44; Hbay = 0.0176). Los

1 resultados indican que existe una alta diversidad genética en el estado de Campeche, información

2 útil para programas de conservación y mejoramiento genético.

3 Palabras clave: análisis molecular, ISSR, recursos fitogenéticos, relaciones genéticas.

5 3.2 INTRODUCCIÓN

6 El género Capsicum es originario de América y comprende 38 especies, de las cuales C. annuum

7 L., C. chinense Jaqc., C. frutescens L., C. pubescens Ruiz & Pavon y C. baccatum L. se reportan

8 como domesticadas (USDA-ARS, 2011). Se cree que estas especies provienen de tres diferentes

9 linajes genéticos, C. pubescens y C. baccatum representan dos distintos linajes, mientras el tercer

10 linaje se compone del complejo genético integrado por C. annuum, C. chinense y C. frutescens

11 (Eshbaugh, 1993).

12 Capsicum annuum es la especie más cultivada a nivel mundial y posee su centro de origen y

13 diversidad genética en México. En México se distribuyen un gran número de chiles cultivados y

14 poblaciones silvestres que representan una gran variabilidad morfológica y genética que

15 constituyen un reservorio de genes que pueden ser utilizados para el mejoramiento genético

16 (Rodriguéz et al., 2007; Hernández, 2011).

17 Aguilar-Meléndez et al. (2009) señalan a la Península de Yucatán (Yucatán, Campeche y

18 Quintana Roo) como una región importante de la domesticación y diversificación de Capsicum

19 annuum. A pesar de esto, son muy pocos los estudios realizados para conocer la diversidad de

20 Capsicum en la región y han sido dirigidos para conocer la diversidad presente en el área central

21 de la Península de Yucatán, específicamente en el estado de Yucatán (Latournerie et al., 2001; Ix-

22 Nahuat et al., 2013), dejando aún lado las otras dos regiones que integran la Península y por

1 consiguiente existe un vacío de información sobre la diversidad genética de chiles presente a nivel

2 Península. En Campeche, estado localizado en la región occidente de la Península de Yucatán, se

3 ha reportado la presencia de las especies C. annuum, C. frutescens y C. chinense (Laborde y Pozo,

4 1982), sin embargo, hasta el momento no se han realizado estudios que permitan conocer la

5 diversidad genética que poseen estas especies. Los estudios realizados para conocer la diversidad

6 de Capsicum presente en la Península de Yucatán, han sido desarrollados con base en marcadores

7 morfológicos, sin embargo, estos marcadores presentan el inconveniente de ser influenciados por

8 el ambiente y por tanto las evaluaciones se vuelven complicadas (Rana et al., 2014). El desarrollo

9 de la tecnología basada en el ADN ha revolucionado las estrategias de evaluación de la diversidad

10 genética mediante el empleo de marcadores moleculares (Paterson et al., 1991). Los marcadores

11 conocidos como inter secuencias simples repetidas (ISSR), han demostrado su utilidad en estudios

12 de caracterización de germoplasma y para estimar la diversidad genética inter e intra-especifica en

13 Capsicum spp (Dias et al., 2013; Carvalho et al., 2014; Campos et al., 2016; Martinez et al., 2016).

14 Los ISSR son marcadores dominantes que se basan en la amplificación del ADN mediante el uso

15 de un único primer compuesto de un microsatélite (SSR) y permiten la detección del polimorfismo

16 sin conocimiento previo de las secuencias de ADN (Zietkiewicz et al., 1994). Por lo tanto, el

17 objetivo de este estudio fue evaluar la diversidad y estructura genética de nueve ecotipos de

18 Capsicum spp. colectados en el estado de Campeche mediante el uso de marcadores ISSR.

1 3.3 MATERIALES Y MÉTODOS

3 3.3.1 Material vegetal

4 La colecta de los ecotipos se realizó en cuatro diferentes regiones del estado de Campeche

5 (Calkiní, Campeche, Escárcega y Palizada) donde los agricultores aún siguen cultivando materiales

6 criollos de chile dentro de su sistema de cultivo. El material vegetal consistió de nueve ecotipos de

7 chile, siete pertenecientes a la especie C. annuum (Bobo, Bolita, Dulce, Verde, Xcat’ik 1, Xcat’ik

8 2) y la variedad aviculare (Maax), uno a la especie C. frutescens (Pico paloma) y uno a la especie

9 C. chinense (Rosita).

11 3.3.2 Extracción de ADN y amplificación ISSR

12 El ADN genómico se extrajo de un total de nueve individuos por ecotipo, a partir de hojas

13 jóvenes, libres de plagas y enfermedades y sin daño mecánico. La extracción del ADN se realizó

14 mediante el protocolo CTAB (Doyle y Doyle, 1990) con algunas modificaciones. La calidad del

15 ADN fue verificada mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% en una solución

16 amortiguadora de TBE al 0.5x.

17 Para la amplificación por PCR de un total de 10 iniciadores ISSR que han demostrado buenos

18 resultados de amplificación y altos niveles de polimorfismo en Capsicum (Yao et al. 2008, Dias et

19 al., 2013), cuatro fueron seleccionados (CTC(GT)8, (GC)2CGCCGCCGCC, TACA(GCA)3G y

20 UBC 823). Las amplificaciones por PCR, se realizaron siguiendo la metodología de Dias et al.,

21 (2013), Tul et al., (2012) y Yao et al., (2008), en un volumen total de 20 µL conteniendo: 10µL de

22 iTaqTM Universal SYBR®Green Supermix (Bio-Rad), 2µL de iniciador ISSR, 1µL de muestra de

23 ADN, suspendido en 7µL de agua ultra pura. Los ciclos de amplificación fueron corridos en un

1 termociclador BioRad (C1000 Touch) programado para 4 min. a 94 ºC de desnaturalización inicial,

2 seguido de 35 ciclos a 94ºC durante 2 min, 1.5 min., de alineamiento con el rango de temperaturas

3 de 54 a 52 °C dependiendo del iniciador usado, 1 min., a 72ºC y un periodo de extensión final de

4 7 min. a 12ºC.

5 Los productos de las amplificaciones fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa

6 al 1.5%, teñidos con 1µL de buffer de reacción (Uview 6X loading dye de la marca BioRad), en

7 una solución amortiguadora TBE al 1X. Se utilizó una cámara de electroforesis horizontal a 110

8 volts constante durante 45 min., y un marcador de peso molecular de un 1 kb como referencia para

9 las lecturas. La visualización de los fragmentos se realizó en un fotodocumentador Gel Doc EZ

10 Imager, de la marca BioRad.

12 3.3.3 Análisis de datos

13 Para la interpretación de los resultados cada banda ISSR fue considerada como un locus

14 independiente y las bandas polimórficas (alelos) fueron registradas como presencia (1) o ausencia

15 (0) para todas las muestras. Solo se consideraron las bandas claras y reproducibles, sin embargo,

16 las diferencias en intensidad de banda no se consideraron, para evitar sesgos.

18 3.3.3.1 Análisis de estructura genética.

19 La estructura genética fue analizada con base en dos métodos: Primero se realizó una prueba de

20 asignación de individuos con el programa STRUTURE 2.3.4 (Pritchard et al., 2000) este programa

21 utiliza un enfoque de agrupamiento bayesiano para asignar genotipos individuales a un número

22 predefinido de K poblaciones, cada uno caracterizado por un conjunto de frecuencias alélicas en

1 cada locus, de esta manera los individuos son asignados probabilísticamente a una población o

2 simultáneamente a dos o más poblaciones en caso de que sus genotipos indiquen que son individuos

3 mezclados. Para inferir el número de K poblaciones, se utilizó el modelo de ancestría mezclado

4 con frecuencias alélicas correlacionadas. Para cada valor de K (K=2 a 9) un total de 10

5 simulaciones independientes fueron corridas, cada simulación consistió de un período de

6 calentamiento de 100,000 iteraciones y una longitud de corrida de 1,000,000 de interacciones

7 siguiendo el modelo de las cadenas de Marcov Monte Carlo (MCMC). El valor óptimo de K se

8 determinó de acuerdo con Evanno et al. (2005) usando el programa Structure Harvester version

9 0.6.94 (Earl and VonHoldt, 2012). Por último, se generaron las gráficas de ancestría para el valor

10 óptimo de K usando STRUCTURE. El segundo método que se utilizó para evaluar la estructura

11 genética fue en un análisis de varianza molecular (AMOVA) considerando tres niveles jerárquicos:

12 total (incluyendo a todos los individuos) entre ecotipos y dentro de ecotipos.

14 3.3.3.2 Análisis de relaciones genéticas

15 Las relaciones genéticas entre los diferentes ecotipos de Capsicum spp estudiados, fueron

16 analizadas mediante la construcción de un dendrograma usando el método UPGMA y la distancia

17 euclidiana. Para darle soporte a la topología del árbol generado se aplicaron 1000 repeticiones

18 bootstrap, con el programa PAST (Hammer et al., 2001). Para dar soporte a los resultados

19 observados con el UPGMA se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) usando el

20 método de covarianza no estandarizado con el programa GenAlEx 6.503 (Peakall and Smouse

21 2006).

1 3.3.3.3 Análisis de diversidad genética

2 La diversidad genética fue evaluada a nivel de ecotipos y de grupos observados, mediante los

3 índices de riqueza alélica porcentaje de loci polimórficos (%P), numero de alelos observados (na),

4 numero de alelos efectivos (ne) e índices de diversidad genética más adecuados para datos

5 generados con marcadores dominantes, índice de Shannon (I) y La heterocigosidad promedio,

6 mediante el cálculo de la H bayesiana (HBay). Los índices de riqueza alélica e índice de Shannon

7 fueron obtenidos con el programa POPGENE (versión 1.31) (Yeh et al., 1999). La heterocigosidad

8 promedio (Hbay) se determinó con el software AFLP SURV ver. 1.0 (Vekemans 2002).

1 3.4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

2 3.4.1 Organización de la estructura genética de nueve ecotipos de Capsicum ssp, cultivados

3 en el estado de Campeche.

4 STRUCTURE utiliza un enfoque de agrupamiento bayesiano para asignar genotipos

5 individuales a un número predefinido de K poblaciones, cada uno caracterizado por un conjunto

6 de frecuencias alélicas en cada locus, de esta manera los individuos son asignados

7 probabilísticamente a una población o simultáneamente a dos o más poblaciones en caso de que

8 sus genotipos indiquen que son individuos mezclados. La figura 1 muestra que de las 10

9 simulaciones corridas con valores de K = 2 a 9, el pico más alto se dio cuando K fue 3, lo cual

10 indica la existencia de tres grupos genéticamente diferenciados.

12 Figura 1. Estimación del número de subpoblaciones generadas a partir de nueve ecotipos de 13 Capsicum spp., usando valores de delta K en un rango de 2 a 9 grupos, mediante 14 el método propuesto por Evanno et al. (2005).

1 El gráfico de barras (Fig.2) muestra los coeficientes de ancestría de las 72 muestras analizadas

2 en los nueve ecotipos estudiados, en el que se puede apreciar la formación de tres grupos

3 genéticamente diferenciados. Los ecotipos Bobo, Dulce, Maax, Verde, Xcat’ik 1 e Xcat’ik 2

4 formaron el primer grupo identificado en color azul, los ecotipos Bolita y Pico paloma formaron

5 un segundo grupo identificado en color rojo y el ecotipo Rosita se separó formando un tercer grupo

6 identificado en color verde (Figura 2). Esto indica que los coeficientes de ancestría para cada

7 individuo fueron consistentes con la especie a la que pertenecían, indicando, por consiguiente, el

8 bajo o nulo flujo génico entre los ecotipos.

10 Figura 2. Inferencia bayesiana basada en modelos (STRUCTURE 2.3.4) de la estructura 11 poblacional que muestra los niveles y patrones de mezcla/ascendencia compartida 12 entre nueve ecotipos de Capsicum spp. Cada muestra está representada por una 13 barra vertical.

15 3.4.2 Análisis de varianza molecular

16 El análisis de varianza molecular (AMOVA) indicó que el 92% de la diversidad genética total

17 se distribuye entre los ecotipos y solo el 8% dentro de los ecotipos (Cuadro 1). Debido a que los

18 ecotipos pertenecen a diferentes especies era de esperarse este comportamiento en la estructura de

19 la diversidad genética. El bajo porcentaje de variación observado intra ecotipos, puede atribuirse

20 al bajo número de individuos evaluados por ecotipo. Este resultado indica que la estructura genética

1 es alta a nivel de ecotipos y da soporte a los tres grupos observado en el análisis bayesiano (Figura

2 2) donde la diferenciación de los grupos se generó con base en la especie a la que pertenece cada

3 ecotipo. Los resultados obtenidos presentan similitud con Albrecht et al. (2012) quienes al estudiar

4 variedades de C. baccatum (var. baccatum, var. pendulum, var. praetermissum, var. umbilicatum)

5 reportan que la mayor variación se dio entre las poblaciones (75%) y no al interior de las

6 poblaciones (25%), lo cual indica que a pesar de que las poblaciones son de la misma especie es

7 posible encontrar una alta variación entre estas. Por otra parte, Hernández et al. (2006) y Oyama et

8 al. (2006) al estudiar la diversidad y estructura genética en poblaciones silvestres (Capsicum

9 annuum var. glabriusculum) y cultivadas (C. annuum var. annuum) del noreste de México reportan

10 que la variación genética fue igualmente distribuida entre y dentro de ambos grupos genéticos.

11 Cuadro 1. Análisis de varianza molecular (AMOVA) realizado a ecotipos de Capsicum spp. 12 nativos del estado de Campeche, usando cuatro primers ISSR.

Fuente df SC CM Variación % estándar Entre poblaciones 8 416.972 52.122 6.449 92 Dentro de las poblaciones 63 33.375 0.530 0.530 8 Total 71 450.347 6.979 100 13

14 3.4.3 Relaciones genéticas

15 La figura 3 muestra un patrón de agrupamiento general basado principalmente en la constitución

16 genética de la especie a la que pertenece cada ecotipo, se observa la conformación de tres grupos

17 principales. El grupo 1 quedó integrado por el ecotipo Rosita perteneciente a la especie Capsicum

18 chinense Jacq., el cual fue el más divergente de los ecotipos. El segundo grupo lo conformaron los

19 ecotipos Bolita y Pico paloma, los cuales pertenecen a dos diferentes especies (Capsicum annuum

1 y Capsicum frutescens, respectivamente), ambos fueron colectados en la misma región geográfica,

2 razón que podría explicar la alta similitud entre estos. El tercer grupo se integró con seis ecotipos

3 de la especie Capsicum annuum, dentro de este grupo se puede observar la formación de dos

4 subgrupos, el primer subgrupo quedo formado por los ecotipos Xcat’ik 2, Dulce y Bobo y, el

5 segundo subgrupo quedo integrado por los ecotipos Verde, Xcat’ik 1 y Maax.

6 Las especies C. annuum, C. chinense y C. frutescens pertenecen a un mismo complejo genético,

7 a pesar de esto, los resultados generados por el dendograma en este estudio demuestran una clara

8 diferenciación entre estas especies pertenecientes a este complejo genético. Resultados similares

9 son reportados por Jarret et al. (2008) al estudiar la variación de ocho intrones de ADN de

10 cloroplasto (cpDNA) en siete especies de Capsicum, donde reportan la diferenciación genética

11 intraespecífica del complejo C. annuum y las otras especies estudiadas. Por otro lado, Yumnam et

12 al. (2012), en un estudio realizado en accesiones de Capsicum spp. en el noreste de la India con el

13 uso de marcadores SSR y SNP no lograron observar la diferenciación genética entre las especies

14 C. annuum y C. chinense y sugieren la necesidad de utilizar un marcador específico para la especie.

15 Las discrepancias observadas entre los resultados de Yumnam et al. (2012) y los resultados de este

16 estudio con respecto al nivel de diferenciación entre las especies C. annuum y C. chinense pueden

17 ser explicadas por las diferencias entre los marcadores utilizados y el grado de domesticación de la

18 especie bajo estudio como ha sido reportado por Camacho-Pérez et al. (2018) y Martínez-Castillo

19 et al. (2008) en variedades cultivadas de Frijol Lima, quienes indican que los marcadores ISSR

20 presentan mayor nivel de polimorfismo en comparación a los marcadores SSR cuando son

21 aplicados en variedades cultivadas.

chinense

annuum

frutescens

C. C.

C. C.annuum

2 Figura 3. Agrupamiento generado de nueve ecotipos de Capsicum spp. nativos del estado de 3 Campeche, mediante el método UPGMA basado en cuatro primers ISSR.

5 El PCoA indicó que las tres primeras coordenadas principales explicaron el 82.13% de la

6 variación total acumulada. La primera coordenada principal (PCoA 1) explicó 42.82% de la

7 variación, mientras que la segunda PCoA 2 explicó el 21.81% (Fig. 4). El resultado obtenido en el

8 PCoA da soporte al dendograma UPGMA (Fig. 3) al generar la formación de tres grupos

9 principales con un 100% de similitud de correspondencia a la topología del UPGMA. La formación

10 del subgrupo “Bobo”, “Dulce” e “Xcat’ik 2” en ambos análisis confirma que el ecotipo “Bobo”

11 proviene de una cruza espontánea entre el chile Xcat’ik y Dulce (González et al., 2010).

12 C. annuum presenta su centro de domesticación y diversidad en México, y se señala a la

13 Península de Yucatán como un área importante de la domesticación y diversificación de esta

14 especie, esto puede explicar que el número de colectas de C. annuum sea mayor con respecto a las

15 otras especies. Por otra parte, el ecotipo Rosita (C. chinense) a pesar de haberse separado del resto,

1 mostró una mayor cercanía con el ecotipo Pico paloma (C. frutescens) que con el resto de los

2 ecotipos de la especie C. annuum (Fig. 3 y 4). Eshbaugh et al. (1983), sugirieron a C. frutescens

3 como el pariente primitivo y antecesor de C. chinense, sin embargo, Baral y Bosland, (2004),

4 determinaron que estas especies representan dos especies aisladas y distintas entre sí. A pesar de

5 esto, diversos estudios indican una relación cercana entre C. chinense y C. frutescens (Ince et al.

6 2010; Carvalho et al. 2014). A diferencia del resto de las especies, C. chinense no presenta formas

7 silvestres en México, se cree que su centro de origen y diversificación es la región del Amazonas

8 (Eshbaugh, 1993), y este fue introducido a la Península de Yucatán proveniente de Cuba (Soria et

9 al. 2002). De igual manera, el origen de C. frutescens se remonta a Sudamérica (Pickersgill, 1969),

10 y se pueden encontrar formas silvestres y domesticadas de C. frutescens distribuidas a lo largo de

11 México.

13 Figura 4. Análisis de coordenadas principales de nueve ecotipos de Capsicum spp. nativos del 14 estado de Campeche.

1 3.4.4 Diversidad genética

2 Los cuatro primers ISSR evaluados, generaron un total de 42 loci, de los cuales 37 fueron

3 polimórficos y cinco monomórficos. La diversidad genética fue analizada a nivel de ecotipo y a

4 nivel de grupos genéticos según lo indicado por el enfoque bayesiano. A nivel ecotipo (Cuadro 2),

5 Pico paloma fue el que obtuvo los valores más altos de porcentaje de loci polimórficos y diversidad

6 genética (%P = 14.29 y I= 0.088; Hbay=0.077), mientras que en los ecotipos Xcat’ik 1 y Rosita el

7 marcador no permitió la presencia de alelos polimórficos y por consiguiente su diversidad genética

8 fue la más baja. A nivel total se observó alto porcentaje de loci polimórficos (%P= 88) y alta

9 diversidad genética (I = 0.44; Hbay = 0.0176).

10 Cuadro 2. Patrones de diversidad genética estimados en nueve ecotipos de Capsicum spp. 11 nativos del estado de Campeche, usando cuatro primers ISSR.

Población # de muestras %P na ne I HBay

Bobo 8 4.76 1.0476 1.0476 0.0330 0.02009 Dulce 8 7.14 1.0714 1.0601 0.0464 0.01758 Maax 8 4.76 1.0476 1.0271 0.0222 0.01590 Verde 8 2.38 1.0238 1.0211 0.0158 0.00666 Xcat’ik 1 8 0.00 1.000 1.000 0.000 0.00000 Xcat’ik 2 8 4.76 1.0476 1.0401 0.0309 0.01172 Bolita 8 4.76 1.0476 1.0401 0.0309 0.01172 Pico Paloma 8 14.29 1.1429 1.1100 0.0887 0.07701 Rosita 8 0.00 1.000 1.000 0.000 0.00000 Total 72 88.10 1.8810 1.5107 0.4402 0.0176 12 %P: porcentaje de loci polimórficos; na: número de alelos observados; ne: número de alelos

13 efectivos; I: índice de diversidad de Shannon-Weaver; HBay: heterocigocidad promedio

1 A nivel de grupos genéticos (Cuadro 3), el grupo 1 conformado por especies de C. annuum

2 (ecotipos: Xcat’ik 2, Dulce, Bobo, Verde, Xcat’ik 1 y Maax) fue el que presentó el mayor

3 porcentaje de loci polimórfico (%P = 54.76) y diversidad genética (I = 0.29 y Hbay = 0.19). El grupo

4 dos conformado por las especies Capsicum annuum y Capsicum frutescens (ecotipos: Bolita y Pico

5 paloma) presentó: %P = 38, I = 0.23 y Hbay = 0.17. Es importante resaltar que el ecotipo rosita

6 perteneciente a la especie C. chinense, en todos los análisis se separó del resto de los ecotipos

7 formando un grupo independiente (Grupo tres) y su nivel de polimorfismo y diversidad genética

8 fue la más baja (%P = 0.00; I = 0.00 y Hbay = 0.00). El hecho de no observar diversidad genética

9 en el ecotipo rosita puede deberse al pequeño número de individuos involucrados en el estudio lo

10 cual pudo generar que no se obtuviera una muestra representativa de la diversidad presente en el

11 ecotipo bolita o que los individuos muestreados resultaron ser monomórficos para los iniciadores

12 evaluados.

13 Cuadro 3. Patrones de diversidad genética estimados en tres grupos de Capsicum spp. nativos 14 del estado de Campeche, usando cuatro primers ISSR.

Grupo # de muestras %P na ne I HBay 1 48 54.76 1.5476 1.3614 0.2935 0.19991 2 16 38.10 1.3810 1.3078 0.2376 0.17590 3 8 0.00 1.000 1.000 0.000 0.00000 Total 72 88.10 1.8810 1.5107 0.4402 0.0179 15 %P: porcentaje de loci polimórficos; na: número de alelos observados; ne: número de alelos

16 efectivos; I: índice de diversidad de Shannon-Weaver; HBay: heterocigocidad promedio

18 3.5 CONCLUSIONES

19 Los resultados obtenidos permiten concluir que la colección base de ecotipos de Capsicum spp.,

20 colectados en el estado de Campeche presenta altos niveles de diversidad genética. La estructura

1 genética poblacional de los ecotipos estudiados está constituida principalmente por tres grupos

2 genéticos definidos por la especie a la que pertenece cada ecotipo y no por su origen geográfico.

3 La diversidad genética se distribuye principalmente entre ecotipos. El ecotipo Pico paloma presentó

4 el mayor nivel de diversidad genética. El ecotipo rosita presentó la menor diversidad genética

5 aspecto que pone en riesgo de erosión genética a este ecotipo. Los marcadores ISSR detectaron un

6 alto nivel de polimorfismo y permitieron la diferenciación genética del complejo C. annuum. Los

7 resultados obtenidos indican que los ecotipos colectados en el estado de Campeche constituyen un

8 recurso genético valioso que puede ser utilizado en la implementación de programas de

9 mejoramiento genético y conservación tanto ex situ como in situ.

1 3.6 LITERATURA CITADA

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10 Variability in Capsicum Species Based on ISSR and RAPD Markers. Mol Biotechnol 51: 137–

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12 USDA-ARS. 2011. Grin species records of Capsicum. National Germplasm Resources Laboratory,

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14 Vekemans, X. 2002. AFLP-SURV version 1.0. Distributed by the author. Laboratoire de Génétique

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16 Yao, H., Y. Zhao, D. F. Chen, J. K. Chen, T. S. Zhou. 2008. ISSR primer screening and preliminary

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19 Yeh, F. C., T. J. Boyle .1999. POPGENE v. 1.31. Microsoft Windows-based freeware for

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2 of chilli landraces from North Eastern India based on morphology, SSR markers and the Pun1

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4 Zietkiewicz, E., A. Rafalski and D. Labuda. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence

5 repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176-183

CONCLUSIONES GENERALES

Los ecotipos de Capsicum evaluados exhibieron un amplio grado de variabilidad morfológica en variables cuantitativas (altura y ancho de planta, longitud del tallo, longitud del filamento, longitud del fruto, diámetro de la semilla, largo y ancho de la hoja y ancho del fruto); y variables cualitativas (margen de la lámina foliar, color de la mancha de la corola, color del filamento, unión del pedicelo con el fruto, color de semilla, tamaño de semilla y numero de semillas por fruto).

La alta variación morfológica coincide con la alta diversidad genética encontrada con marcadores ISSR.

La colección base de Capsicum spp., estudiada presentó altos niveles de estructura genética integrada por tres grupos principales definidos por sus características morfológicas y genéticas.

La diversidad genética de los ecotipos de Capsicum spp., está determinada principalmente por las características morfológicas y genéticas distintivas de cada especie y no por su origen geográfico.

Los ecotipos silvestres de Capsicum spp., presentaron la mayor diversidad genética.

Finalmente, los marcadores morfológicos y moleculares demostraron su eficiencia en la evaluación y caracterización de la diversidad genética de ecotipos de Capsicum spp., nativos del estado de Campeche.