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 M. Alley, USA Bouzayen M, France Matthew J. W. Cock, Switzerland ዐࡔ౫ᄽ੔ბ David A. Andow, USA John Bower, South Africa Nick Costa, Australia R. Appels, Australia Kenneth G. Cassman, USA Thomas Crenshaw, USA ׃ Jill Shore Auburn, USA Chen Xian-ming, USA Zhanao Deng, USA Bing Yang, USA Chen Z X, USA C. Robert Dove, USA ශ SCIENTIA AGRICULTURA SINICA  Bas Bouman, IRRI Michael T. Clegg, USA Lester E. Ehler, USA Ḹᣀ࠯ʻḹ ്  ࣼ ᎃ ᣣ ᦉ  त ೺ 4 ڼ!!!ਝ :5 ڼ ׃ ᴢѥ䳲 ͉ ˞ ҝ ˞ ͉ ߛᭆॶ ೠ  Ϙာᎃᣣ ᡎ

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Wpm/5:!!!!!Op/4 Ё೑ݰϮ⾥ᄺ Scientia Agricultura Sinica Ḹञ᳜ߞˈ1960 ᑈ߯ߞḹ (Semimonthly, Started in 1960) 2016 ᑈ 2 ᳜ 1 ᮹ ㄀ 49 ो㄀ 3 ᳳ Vol.49 No.3 February 1, 2016 йˉᦉ Superintended by Ministry of Agriculture, P. R. Chinaڍክ ˖ӧ̠ඞР֖ ˞ йˉመߥᬒ Sponsored by Chinese Academy of Agricultural Sciencesڍ˖ Ҩ ˞ йߥ͗ Chinese Association of Agricultural Science Societiesڍ˖ йˉመߥǒᎃᣣᦉ Published by Editorial Department of Scientia Agricultura Sinicaڍ˖ᎃᣣѢྟ Ǒ ӑ̚˖СెӮܷᛣ 12 Ձ Address No.12 South Street, Zhongguancun, Beijing ڦ ڠ ᥪஊᎃᆉ 100081 Postcode 100081 ႂ ព 010-82109808 82106281 Telephone 010-82109808 82106281 ͛ ᄽ 010-82106247 Fax 010-82106247 http://www.ChinaAgriSci.com Website http://www.ChinaAgriSci.com ڦ Ꭹ ႂߔᥪ͇ [email protected] E-mail [email protected] Ӿ҄ᜈᝠ ӑ̚ӑౣӾ҄ԇ Issued by Beijing Newspapers and Periodicals Distribution Office ЮԦᛠ ӑ̚ઐѮԦᛠࡌ Subscription Domestic Post Officeڍ ,ᥪႂࡌ Issued Abroad by International Book Trading CorporationڠՉڍК ܪᝠ᠓ ᠞௛঳МՂ P.O.Box 399, Beijing, P.R. China˹ڎᬄڍڍ˖ Ԧᛠܰڍ  م Ḹӑ̚ 399 ζ኷ḹ Abroad Issued No.BM43 µ Ю߿͈ 49.50 Њ/య 1188.00 Њ/ࣱ Price US$ 49.50 / Issue US$ 1188.00 / year ၊ڍ ੊ ЮܰМधԦᛠ ዐࡔ౫ᄽ੔ბᇾڍ ISSN 0578-1752 ᥪԦ̼ՁṊ2-138 ୕ ዷӸ ՁṊBM43 ࣸնፂᖸ᝴Ժ᝼Ṋ̚๑ࢹ׷ࣸߙኃ 0178 Ձ ዐࡔ౫ბ̼ࣷܰڍ CN 11-1328/S

中国农业科学2016 3 2016.1.28, 2:53 PM

中 国 农 业 科 学

ZHONGGUO NONGYE KEXUE 2016 年第 49 卷第 3 期

目 次

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

407 水稻茎秆性状与抗倒性的关系及配合力分析 陈桂华 邓化冰 张桂莲 唐文帮 黄 璜

418 高抗白粉病小麦-山羊草新种质 TA002 的创制和遗传研究 王玉海 何 方 鲍印广 明东风 董 磊 韩庆典 李莹莹 王洪刚

429 玉米种胚内质网胁迫相关基因对人工老化处理的响应 曹广灿 林一欣 薛梅真 邢芦蔓 吕伟增 杨伟飞 陈军营

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

443 玉米秸秆低温高效降解复合菌系 GF-20 的菌种组成及降解稳定性研究 青格尔 高聚林 于晓芳 胡树平 王志刚 王 振 闹干朝鲁 455 薯/豆套作模式下不同熟期大豆品种的生长补偿效应 陈光荣 杨文钰 张国宏 王立明 杨如萍 雍太文 刘卫国 468 半干旱区全膜覆盖垄沟间作种植马铃薯和豆科作物的水热及产量效应 张绪成 王红丽 于显枫 侯慧芝 方彦杰 马一凡

植物保护

482 水稻 NBS-LRR 类抗稻瘟病蛋白 Pik-h 的互作蛋白筛选 王加峰 刘 浩 王 慧 陈志强 491 干涉丹参 SmORA1 对植物抗病和丹参酮类次生代谢的影响 化文平 刘文超 王喆之 李翠芹

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

503 氮循环与中国农业氮管理 王敬国 林 杉 李保国 518 控释氮肥与尿素混施对连作春玉米产量、氮素吸收和氮素平衡的影响 王 寅 冯国忠 张天山 茹铁军 袁 勇 高 强

园艺·贮藏·保鲜·加工

529 基于花青素苷合成和呈色机理的观赏植物花色改良分子育种 戴思兰 洪 艳 543 核桃青皮的强抗氧化活性成分及其抗氧化稳定性 田平平 李仁宙 简永健 李健明 王 杰 554 冰温贮藏对宰后肌肉成熟进程的影响 李培迪 李 欣 李 铮 陈 丽 李仲文 陈立娟 田建文 张德权

- I -

中 国 农 业 科 学 2016 年第 49 卷第 3 期

畜牧·兽医·资源昆虫

563 鸡生殖干细胞中 Piwi 基因的干涉效率 李志腾 常国斌 徐 璐 马 腾 陈 静 陈 蓉 王洪志 刘 璐 徐 琪 陈国宏 573 豆粕与发酵豆粕中主要抗营养因子调查分析 杨玉娟 姚怡莎 秦玉昌 邱 静 李军国 李 俊 谷 旭 581 利用 Bac-to-Bac 杆状病毒系统超量表达家蚕 let-7 簇 microRNAs 何 婷 尹 权 王 伟 黄亚玺 吴小燕 夏庆友 刘仕平

研究简报

593 中国西南地区甘薯主要育种亲本的遗传多样性及群体结构分析 罗 凯 卢会翔 吴正丹 吴雪莉 尹 旺 唐道彬 王季春 张 凯

- II -

SCIENTIA AGRICULTURA SINICA 2016 49 (3)

CONTENTS

CROP GENETICS & BREEDING·GERMPLASM RESOURCES·MOLECULAR GENETICS

407 The Correlation of Stem Characters and Lodging Resistance and CHEN Gui-hua, DENG Hua-bing, ZHANG Combining Ability Analysis in Rice Gui-lian, TANG Wen-bang, HUANG Huang

418 Development and Genetic Analysis of a Novel Wheat-Aegilops WANG Yu-hai, HE Fang, BAO Yin-guang, Germplasm TA002 Resistant to Powdery Mildew MING Dong-feng, DONG Lei, HAN Qing-dian, LI Ying-ying, WANG Hong-gang

429 Responses of Endoplasmic Reticulum Stress-Related Genes in Maize CAO Guang-can, LIN Yi-xin, XUE Mei-zhen, Embryo to Artificial Aging Treatment XING Lu-man, LÜ Wei-zeng, YANG Wei-fei, CHEN Jun-ying TILLAGE & CULTIVATION·PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY·AGRICULTURE INFORMATION TECHNOLOGY

443 Function and Composition Stability of a Composite Microbial System Qingge-er, GAO Ju-lin, YU Xiao-fang, HU GF-20 with Efficient Corn Stalk Decomposition Under Low Shu-ping, WANG Zhi-gang, WANG Zhen, Temperature Naoganchaolu BORJIGIN

455 Compensation Effect of Different Soybean Varieties in Potato/ CHEN Guang-rong, YANG Wen-yu, ZHANG Soybean Intercropping Systems Guo-hong, WANG Li-ming, YANG Ru-ping, YONG Tai-wen, LIU Wei-guo

468 The Study on the Effect of Potato and Beans Intercropping with ZHANG Xu-cheng, WANG Hong-li, YU Whole Field Plastics Mulching and Ridge-Furrow Planting on Soil Xian-feng, HOU Hui-zhi, FANG Yan-jie, MA Thermal-Moisture Status and Crop Yield on Semi-Arid Area Yi-fan PLANT PROTECTION

482 Screening of Putative Proteins That are Interacted with NBS-LRR WANG Jia-feng, LIU Hao, WANG Hui, CHEN Protein Pik-h by the Yeast Two-Hybrid System Zhi-qiang

491 Effect of RNAi of SmORA1 on Disease Resistance and Tanshinones HUA Wen-ping, LIU Wen-chao, WANG Secondary Metabolism in Salvia miltiorrhiza Zhe-zhi, LI Cui-qin SOIL & FERTILIZER·WATER-SAVING IRRIGATION·AGROECOLOGY & ENVIRONMENT

503 Nitrogen Cycling and Management Strategies in Chinese Agriculture WANG Jing-guo, LIN Shan, LI Bao-guo

518 Effects of Mixed Application of Controlled-Release N Fertilizer and WANG Yin, FENG Guo-zhong, ZHANG Common Urea on Grain Yield, N Uptake and Soil N Balance in Tian-shan, RU Tie-jun, YUAN Yong, GAO Continuous Spring Maize Production Qiang HORTICULTURE·STORAGE·FRESH-KEEPING·PROCESSING

529 Molecular Breeding for Flower Colors Modification on Ornamental DAI Si-lan, HONG Yan Plants Based on the Mechanism of Anthocyanins Biosynthesis and Coloration

- III -

SCIENTIA AGRICULTURA SINICA 2016 49(3)

543 Analysis of Antioxidative Functional Components from Walnut Green TIAN Ping-ping, LI Ren-zhou, JIAN Yong-jian, Rind and Its Antioxidation Stability LI Jian-ming, WANG Jie

554 Effects of Controlled Freezing Point Storage on Aging from Muscle to LI Pei-di, LI Xin, LI Zheng, CHEN Li, LI Meat Zhong-wen, CHEN Li-juan, TIAN Jian-wen, ZHANG De-quan ANIMAL SCIENCE·VETERINARY SCIENCE·RESOURCE INSECT

563 Interference Efficiency of Piwi Gene Expression in the Chicken Germ LI Zhi-teng, CHANG Guo-bin, XU Lu, MA Stem Cells Teng, CHEN Jing, CHEN Rong, WANG Hong-zhi, LIU Lu, XU Qi, CHEN Guo-hong

573 Investigation and Analysis of Main AFN in Soybean Meal and YANG Yu-juan, YAO Yi-sha, QIN Yu-chang, Fermented Soybean Meal QIU Jing, LI Jun-guo, LI Jun, GU Xu

581 Bac-to-Bac Baculovirus System Facilitates Overexpression of let-7 HE Ting, YIN Quan, WANG Wei, HUANG Cluster MicroRNAs of Silkworm (Bombyx mori) Ya-xi, WU Xiao-yan, XIA Qing-you, LIU Shi-ping

RESEARCH NOTES

593 Genetic Diversity and Population Structure Analysis of Main Sweet LUO Kai, LU Hui-xiang, WU Zheng-dan, WU Potato Breeding Parents in Southwest China Xue-li, YIN Wang, TANG Dao-bin, WANG Ji-chun, ZHANG Kai

- IV - 中国农业科学 2016,49(3):407-417 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.001

水稻茎秆性状与抗倒性的关系及配合力分析

陈桂华 1,2，邓化冰 1,2，张桂莲 1,2，唐文帮 1,2，黄 璜 1,2

（1 湖南农业大学农学院，长沙 410128；2 南方粮油作物协同创新中心，长沙 410128）

摘要：【目的】研究水稻茎秆形态性状、化学成分含量和茎秆解剖结构与抗倒性的关系，分析抗倒伏相关性 状的配合力，为抗倒伏高产水稻品种的选育提供依据。【方法】2014 年，以 3 个水稻新两用核不育系和 5 个恢复 系按不完全双列杂交所配的 15 个组合为材料，2015 年，以 4 个水稻新两用核不育系和 3 个恢复系按不完全双列 杂交所配的 12 个组合为材料，以单茎抗推力作为抗倒性的评价指标，研究水稻茎秆形态、化学成分含量、茎秆解 剖结构与抗倒伏能力的关系及相关性状的配合力方差和亲本的一般配合力。【结果】2014 年的相关分析表明，单 茎抗推力与秆长、单茎鲜重、弯曲力矩、粗纤维含量、硅含量和小维管束数目呈显著正相关；2015 年的相关分析 表明，单茎抗推力与秆长、茎粗、单茎鲜重、弯曲力矩、粗纤维含量、钾含量、硅含量、大维管束数目和小维管 束数目呈显著正相关。其中秆长、单茎鲜重、弯曲力矩、粗纤维含量、硅含量和小维管束数目与单茎抗推力的相 关性在 2 年的试验中均达显著水平。2014 年的逐步回归分析表明，弯曲力矩、硅含量和小维管束数目对单茎抗推 力具有正向作用；2015 年的逐步回归分析表明，秆长、茎粗、粗纤维含量和小维管束数目对单茎抗推力具有正向 作用。2 年均入选回归方程的性状有小维管束数目。单茎抗推力的不育系×恢复系特殊配合力方差和不育系的一 般配合力方差两年均达到显著水平，且单茎抗推力的不育系一般配合力方差明显大于恢复系的一般配合力方差和 杂交组合的特殊配合力方差。水稻不育系 075S 和 023S，水稻恢复系 R276、R964、R527 和 R389 的单茎抗推力的 一般配合力较高。【结论】秆长、单茎鲜重、弯曲力矩、粗纤维含量、硅含量和小维管束数目是影响水稻抗倒伏能 力的主要因素。单茎抗推力的遗传由加性基因和非加性基因共同控制，不育系的基因加性效应对杂交组合的抗倒 能力影响较大。不育系 075S 和 023S 及恢复系 R276、R964、R527 和 R389 的单茎抗推力的一般配合力较高，可用 于抗倒伏杂交水稻组合的配制。 关键词：水稻；抗倒伏；配合力；形态性状；化学成分

The Correlation of Stem Characters and Lodging Resistance and Combining Ability Analysis in Rice

CHEN Gui-hua1,2, DENG Hua-bing1,2, ZHANG Gui-lian1,2, TANG Wen-bang1,2, HUANG Huang1,2

(1 College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha 410128; 2Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Changsha 410128)

Abstract: 【Objective】 Lodging is one of the main constraints to the yield of rice. This study investigated the relationships among stem morphological index, chemical constituents and anatomical structure with lodging resistance. The combining ability of lodging related traits were analyzed. Results of the study will provide a theoretical basis for breeding of high yield rice varieties with lodging resistance.【Method】Three new rice dual-purpose genic male sterile lines and 5 restorer lines were crossed using incomplete diallel crosses and 15 hybrid combinations as materials in 2014. Four new rice dual-purpose genic male sterile lines and 3 restorer lines were crossed using incomplete diallel crosses and 12 hybrid combinations as materials in 2015. The

收稿日期：2015-10-20；接受日期：2015-12-01 基金项目：湖南省自然科学基金（13JJ8011）、湖南省科技计划项目（2014NK3006）、湖南省教育厅重点项目（13A042） 联系方式：陈桂华，E-mail：[email protected]。通信作者邓化冰，Tel：0731-84618625；E-mail：[email protected]

408 中 国 农 业 科 学 49卷 anti-thrust per stem was used as the lodging resistance index. The correlation of stem morphological index and chemical constituents and anatomical structure with lodging resistance and the combining ability variance analysis of lodging resistance of tested combinations and the general combining ability of parents were studied. 【Result】The anti-thrust per stem was positively correlated with stem length, fresh weight per stem, bending moment, crude fiber content, silicon content and the number of small vascular bundles in both 2014 and 2015. Stepwise regression analysis in 2014 showed that bending moment and silicon content and the number of small vascular bundles had a positive effect on the anti-thrust per stem. Stepwise regression analysis in 2015 showed that stem length and stem diameter and crude fiber content and the number of small vascular bundles had a positive effect on the anti-thrust per stem. The number of small vascular bundles was included in the regression equation in two years of testing. The variance of special combining ability and general combining ability of sterile lines of the anti-thrust per stem all reached significant level in two years. Further analysis showed that the variance of general combining ability of sterile lines was larger than the variance of general combining ability of restorer lines and special combining ability of the trait. The anti-thrust per stem of sterile lines 075S and 023S, and that of restorer lines R276, R964, R527 and R389 had higher general combining ability. 【Conclusion】Stem length, fresh weight per stem, bending moment, crude fiber content and silicon content of stem, the number of small vascular bundles were main influencing factors of lodging resistance of rice. The anti-thrust per stem was controlled by both additive and non-additive gene. The additive gene effect of sterile lines had great influence on lodging resistance of hybridized combination. The anti-thrust per stem of sterile lines 075S and 023S and that of restorer lines R276, R964, R527 and R389 had higher general combining ability. The six parents could be used as parents of hybrid rice combinations for lodging resistance. Key words: rice; lodging resistance; combining ability; physical traits; chemical constituents

稻科学研究所 6 个新育成且综合性状好的两用核不育 0 引言 系、7 个常用恢复系配制的 27 个杂交组合为材料，用 【研究意义】倒伏已成为目前水稻高产栽培中普 单茎抗推力作为抗倒性的评价指标，探讨水稻茎秆形 遍面临的问题[1-3]。水稻倒伏后光合作用和籽粒灌浆停 态性状、化学成分含量和茎秆解剖结构与抗倒性的关 止，最终导致稻米品质变劣，产量降低[4]。随着农村 系，以期明确影响水稻抗倒伏性能的主要因素。同时 劳动力的缺乏，机械化和规模化是水稻生产的发展趋 对水稻抗倒伏相关性状进行配合力分析，为选育抗倒 势，而易倒伏的水稻品种不利于机械化收割，也就没 伏高产水稻品种提供理论支持。 有利用价值，因此，研究水稻茎秆抗倒伏能力的机理 1 材料与方法 及其配合力，对指导抗倒伏水稻新品种选育具有重要 意义。【前人研究进展】水稻倒伏有茎倒伏和根倒伏 1.1 试验材料 2 种情况，其中，中国移栽稻主要为茎倒伏，茎倒伏 6 个水稻新两用核不育系：075S、089S、耘 9S、 多发生在茎秆基部第 1—3 节[3,5-7]。引起水稻倒伏的因 023S、044S 和 C815S。7 个恢复系：黄软占、粤综占、 素很多，包括遗传因素、生理因素以及耕作制度和环 R518、R276、R964、R527 和 R389。以上材料均由湖 境因素[8]。前人的研究表明，水稻品种的倒伏与其自 南农业大学水稻科学研究所提供。 身的农艺性状如株高、重心高度、基部节间长度、节 1.2 田间种植 间粗度、茎壁厚度、茎秆干重，茎秆机械强度、茎 试验于 2013—2015 年在湖南农业大学试验田进 秆抗折力、茎秆弹性模量、茎秆弯曲应力等密切相 行。2013 年夏季用 3 个水稻新两用核不育系 075S、 关[3,5-7,9-12]；还与茎秆的化学成分含量如纤维素、木质 089S、耘 9S 和 5 个恢复系黄软占、粤综占、R518、 素、可溶性糖、氮、钾、硅、钙、铜等有关 [13-16]。【 本 R276、R964 按不完全双列杂交，获得 15 个组合。2014 研究切入点】虽然水稻抗倒伏能力受多种因素影响， 年夏季，15 个组合于 5 月 30 日播种，6 月 20 日移栽， 但其中哪些是主导因子尚不清楚，且有关水稻抗倒伏 株行距为 19.8 cm×26.4 cm，单本植，每小区种植 150 相关性状配合力研究的报道较少。已有研究也主要以 株，随机区组排列，3 次重复，肥水管理同一般大田。 茎秆节间的抗折力和倒伏指数为抗倒性的评价指标， 2014 年夏季用 4 个水稻新两用核不育系耘 9S、 这两个性状在评价水稻的倒伏性能上均存在一定的缺 C815S、044S、023S 和 3 个恢复 R518、R527、R389 陷。【拟解决的关键问题】本研究以湖南农业大学水 按不完全双列杂交，获得 12 个组合。2015 年夏季，

3 期 陈桂华等：水稻茎秆性状与抗倒性的关系及配合力分析 409

12 个组合于 5 月 25 日播种，6 月 15 日移栽，株行距 切片（厚度 10—12 μm）、展片、番红、固绿复染、 为 19.8 cm×26.4 cm，单本植，每小区种植 150 株， 中性树胶封片，制成石蜡切片，在光学显微镜下观察、 随机区组排列，3 次重复，肥水管理同一般大田。于 拍照。在显微镜下观察统计大维管束数、小维管束数； 抽穗期每小区挂牌标记小区中间的抽穗期一致的 20 用显微测微尺测算维管束的长径和短径及茎壁组织厚 个植株，分别在齐穗后 20 d 取 10 个植株进行各项指 度[19]。 标的测定。 1.4 数据分析 1.3 测定项目及方法 试验原始数据使用 Microsoft Excel 2003 进行处 1.3.1 茎秆形态指标及抗折力测定 理，方差分析、相关分析、回归分析及配合力分析使 株高：田间实测从泥土处到主穗顶部的长度。 用 DPS 7.55 数据处理软件处理，显著性测验采用 SSR 秆长：用直尺测量水稻主茎基部至穗基部长即秆 法。 长。 2 结果 茎粗：选用主茎第二伸长节间作为茎粗的考察对 象。用游标卡尺测量基部第二伸长节间中部最大的直 2.1 供试组合茎秆形态指标、抗倒伏能力和产量间的 径和最小的直径，取平均数，即，茎粗 d=（最长直径 差异 +最短直径）/2[17]。 供试组合间在株高、秆长、茎粗、单茎鲜重、弯 单茎鲜重：取标记了的 10 株植株称量地上部的鲜 曲力矩、秆型指数、单茎抗推力和产量上存在极显著 重为单株鲜重，数计其茎蘖数，单株鲜重除以茎蘖数 差异（表 1）。其中，2014 年的供试组合于 8 月 21 为单茎鲜重，计算 10 株的平均单茎鲜重。 日—8 月 26 日齐穗，平均株高为 106.12 cm，平均秆 单茎抗推力：取被标记的 10 株植株，在稻株距地 长为 71.33 cm，平均茎粗为 5.53 mm，平均单茎鲜重 面 20 cm 处，采用植物倒伏测试仪（YD-1，浙江托普 为 12.89 g，平均弯曲力矩为 1 370.23 cm·g，平均秆型 仪公司）垂直于稻株茎秆向前推压，将稻茎压弯至 45 指数为 0.7746%，平均单茎抗推力为 0.6916 kPa/茎， ℃倾角处（用量角器测定），此时，植物倒伏测试仪 平均产量为 9 052.34 kg·hm-2（表 2）。其中，075S 所 自动记录最大的压力值，即水稻单株承受最大推压阻 配的 5 个组合的平均株高低于 089S 和耘 9S 所配组合 力，每小区随机测中间的 10 株[18]，确定植株后，数 的平均值，而单茎鲜重、弯曲力矩、单茎抗推力的平 计其茎蘖数，将其周围的植株割掉后再测最大推压阻 均值却高于 089S 和耘 9S 所配组合的平均值。供试组 力，最大推压阻力除以茎蘖数为单茎抗推力；计算 10 合中 075S/964、075S/276、089S/964 和 089S/276 植株 株的平均单茎抗推力。 的抗推能力较强，089S/黄软占、耘 9S/276 和耘 9S/518 弯曲力矩：株高（cm）×单茎鲜重（g）。 的产量较高。 秆型指数：为茎粗（长短直径的平均值 cm）/秆 2015 年的供试组合于 8 月 14 日—8 月 18 日齐穗。 长（cm）×100。 由表 2 可知，2015 年供试组合的平均株高为 116.78 1.3.2 产量考查 收割各小区中间没有缺兜的 80 株 cm，平均秆长为 79.46 cm，平均茎粗为 6.73 mm，平 的谷粒，晒干扬净后，测定水分后折算成含水量为 14% 均单茎鲜重为 15.88 g，平均弯曲力矩为 1 857.80 的稻谷重量，计算实际产量。 cm·g，平均秆型指数为 0.8025%，平均单茎抗推力为 1.3.3 茎秆化学成分测定 0.6792 kPa/茎，平均产量为 7 660.70 kg·hm-2。其中， 茎秆粗纤维含量：采用酸碱消煮法测定主茎茎秆 023S 和 C815S 所配组合的平均单茎抗推力高于 044S 粗纤维含量。 和耘 9S 所配组合，044S 和 C815S 所配组合的平均产 茎秆钾含量：采用原子吸收分光光度计火焰光度 量较高。 法测定主茎茎秆钾含量。 2.2 供试组合茎秆化学成分间的差异 茎秆硅含量：采用原子吸收分光光度计火焰光度 各组合间的粗纤维、钾含量、硅含量均具有显著 法测定主茎茎秆硅含量。 差异（表 1）。2014 年，供试组合的平均粗纤维为 1.3.4 茎秆解剖结构观察 取主茎第二节间中部 1.5 41.44%，平均钾含量为 9.39 μg·mL-1，平均硅含量为 cm，用 FAA 溶液固定。徒手切片，番红-固绿染色， 13.67%（表 3）。其中，075S 所配的 5 个组合的平均 然后按下列步骤：软化、脱水、透明、浸蜡、包埋、 硅含量高于 089S 和耘 9S 所配组合的平均值。供试组

410 中 国 农 业 科 学 49卷

表 1 供试组合茎秆主要理化特性的配合力方差分析 Table 1 Combining ability variance analysis of some stem physical and chemical characteristics of tested combinations 年份 性状 变异来源 Source Year Characters 区组间 组合间 不育系 恢复系 不育系×恢复系 随机误差 Block Groups Sterile line Restorer line Sterile line× Error Restorer line 2014 株高 Plant height (cm) 4.108 26.82** 7.774 70.84** 9.569** 2.054

秆长 Stem length (cm) 0.7681 18.97** 4.114 45.77* 9.283** 1.854

茎粗 Stem diameter (mm) 0.0054 0.4011** 0.0970 0.8688 0.2433** 0.0133

单茎鲜重 Fresh weight per stem (g) 0.1490 10.85** 8.744 18.84 7.377** 0.1068

弯曲力矩 Bending moment (cm·g) 2.184×103 1.469×105** 7.939×104 2.787×105 9.781×104** 1.547×103

秆型指数 Stem index (%) 0.0339 0.0395** 0.0440 0.0394 0.0384** 0.0038

单茎抗推力 Anti-thrust per stem (kPa/stem) 0.0000 0.0719** 0.3097** 0.0773** 0.0098** 0.0003

粗纤维含量 Crude fiber content (%) 1.375 8.160 ** 15.83* 14.06* 3.292 1.925

钾含量 Potassium content (μg·mL-1) 0.3984* 2.253** 0.4964 1.786 2.925** 0.0660

硅含量 Silicon content (%) 0.1612 17.67** 17.08 32.28 10.52** 0.0962

大维管束数目 Big vascular bundles No. 0.2000 2.258 1.696 0.9531 3.051 1.346

大维管束面积 0.0000 0.0006** 0.0001 0.0015* 0.0003** 0.0000 Big vascular bundles area (mm2/singer area) 小维管束数目 Small vascular bundles No. 0.3728 1.744 1.662 1.216 2.029 1.627

小维管束面积 0.0000 0.0001** 0.0001* 0.0002** 0.0000** 0.0000 Small vascular bundles area (mm2/singer area) 茎壁厚度 Culm wall thickness (μm) 1.542 2.169×105** 4.109×104 4.339×105 1.523×105** 16.92

2015 株高 Plant height (cm) 0.4225 70.91** 157.7** 111.1** 14.12** 1.067

秆长 Stem length (cm) 1.621 53.91** 119.8 19.97 32.25** 1.343

茎粗 Stem diameter (mm) 0.0459 1.877** 4.793 0.0668 1.023** 0.0914

单茎鲜重 Fresh weight per stem (g) 0.0141 2.702** 6.905* 0.3915 1.371** 0.1636

弯曲力矩 Bending moment (cm·g) 687.5 9.098 ×104** 2.462 ×105* 3.679×104 3.145×104** 1.528×103

秆型指数 Stem index (%) 0.0014 0.0287** 0.0512 0.0077 0.0245** 0.0012

单茎抗推力 Anti-thrust per stem (kPa/stem) 0.0001 0.0204** 0.0676** 0.0057 0.0017** 0.0002

粗纤维含量 Crude fiber content (%) 1.237 22.90** 75.65** 0.5085 2.685** 0.7623

钾含量 Potassium content (μg·mL-1) 0.073 2.318** 5.589* 2.033 0.7776** 0.0549

硅含量 Silicon content (%) 0.2092 5.753** 17.04* 0.2114 1.956** 0.1431

大维管束数目 Big vascular bundles No. 0.2807 12.21** 36.58** 5.101 2.400** 0.3084

大维管束面积 0.0000 0.0002** 0.0005* 0.0002 0.0001* 0.0000 Big vascular bundles area (mm2/singer area) 小维管束数目 Small vascular bundles No. 0.2623 5.528** 16.57* 0.0708 1.829** 0.2457

小维管束面积 0.0000 0.0001** 0.0002 0.0000 0.0001** 0.0000 Small vascular bundles area (mm2/singer area) 茎壁厚度 Culm wall thickness (μm) 3.681×103 9.520×104** 2.268×105* 7.801×104 3.513×104** 4.795×103

*、**分别表示在 P＜0.05 和 P＜0.01 水平差异达显著和极显著水平。下同 *,**significantly correlated at 0.05 level or 0.01 level, respectively. The same as below

3 期 陈桂华等：水稻茎秆性状与抗倒性的关系及配合力分析 411

表 2 供试组合茎秆形态指标、抗倒伏能力和产量的统计特征值 Table 2 Characteristic of descriptive statistics for stem morphological index and lodging resistance and yield of tested combinations 年份 特征值 株高 秆长 茎粗 单茎鲜重 弯曲力矩 秆型指数 单茎抗推力 产量 Year Descriptive statistics Plant height Stem length Stem diameter Fresh weight Bending Stem index Anti-thrust per Yield (cm) (cm) (mm) per stem (g) moment (cm·g) (%) stem (kPa/stem) (kg·hm-2) 2014 均值 Mean 106.1 71.33 5.526 12.89 1.370×103 0.7746 0.6916 9.052×103

变异系数 CV (%) 2.818 3.525 6.618 14.75 16.150 4.716 22.390 6.178

2015 均值 Mean 116.8 79.46 6.731 15.88 1.858×103 0.8025 0.6792 7.661×103

变异系数 CV (%) 4.163 5.335 12.420 5.975 9.374 12.190 12.140 13.210

表 3 供试组合茎秆化学成分和解剖结构的统计特征值 Table 3 Characteristic of descriptive statistics for chemical constituents and anatomical structure of stem between tested combinations 年份 特征值 粗纤维含量 钾含量 硅含量 大维管束数目 大维管束面积 小维管束数目 小维管束面积 茎壁厚度 Year Descriptive statistics Crude fiber Potassium Silicon Big vascular Big vascular bundles Small vascular Small vascular Culm wall content (%) content content bundles No. area (mm2/singer bundles No. bundles area thickness (μg·mL-1) (%) area) (mm2/singer area) (μm) 2014 均值 Mean 41.44 9.395 13.67 29.93 0.0925 29.30 0.0215 1.815×103

变异系数 CV (%) 3.980 11.300 17.750 2.898 15.320 2.603 23.360 14.810

2015 均值 Mean 42.55 9.317 14.11 31.22 0.0880 29.68 0.0209 1.910×103

变异系数 CV (%) 6.392 9.435 9.811 6.463 9.716 4.574 26.770 9.327

合中 089S/粤综占、089S/276、075S/518、075S/964、 大维管束面积和小维管束面积最大，茎壁厚度也最厚， 089S/964 和 089S/518 的粗纤维含量较高，相互之间无 其所配组合的平均单茎抗折力也最高。 显著性差异。耘 9S/粤综占、耘 9S/276 和耘 9S/黄软占 2.4 供试组合茎秆主要理化特性与单茎抗推力的相 茎秆中钾含量较高，075S/276 茎秆中硅含量最高，耘 关性分析 9S/518 次之。 从表 4 可以看出，2014 年，供试组合各性状间的 2015 年，供试组合的平均粗纤维为 42.55%，平 相关性表现为单茎抗推力与秆长、单茎鲜重、弯曲力矩、 均钾含量为 9.32 μg·mL-1，平均硅含量为 14.11%。其 粗纤维含量、硅含量和小维管束数目呈显著正相关。 中，耘 9S 所配的 3 个组合的平均粗纤维含量、钾含 2015 年，供试组合各性状间的相关性表现为单茎抗推 量和硅含量最低，023S 所配组合的平均粗纤维含量、 力与秆长、茎粗、单茎鲜重、弯曲力矩、粗纤维含量、 钾含量和硅含量最高，其所配组合的平均单茎抗折力 钾含量、硅含量、大维管束数目和小维管束数目呈显著 也最高（表 3）。 正相关。两年试验中均表现与单茎抗推力的相关性达显 2.3 供试组合茎秆解剖结构的差异 著水平的性状有：秆长、单茎鲜重、弯曲力矩、粗纤维 从表 3 中可以看出，各组合间大小维管束数目、 含量、硅含量和小维管束数目，说明地上部鲜重越大， 大小维管束面积和茎壁厚度上均存在显著差异。2014 茎秆粗纤维含量和硅含量越高，茎秆的充实度较好，维 年，供试组合的平均大维管束数目为 29.93 个，平均 管束数目越多，其植株的抗倒能力就越强。 大维管束面积为 0.0925 mm2/个，平均小维管束数目为 2.5 供试组合茎秆主要理化特性与单茎抗推力间的 29.30 个，平均小维管束面积为 0.0215 mm2/个，平均 逐步回归分析 茎壁厚度为 1 815.41 μm（表 3）。供试组合中 075S/964 以单茎抗推力为因变量，分别以形态指标（株高

的大小维管束数目多，其单茎抗推力也强。 （X1）、秆长（X2）、茎粗（X3）、单茎鲜重（X4）、

2015 年，供试组合的平均大维管束数目为 31.22 弯曲力矩（X5）、秆型指数（X6））、化学成分（粗 2 个，平均大维管束面积为 0.0880 mm /个，平均小维管 纤维含量（X7）、钾含量（X8）、硅含量（X9））和 2 束数目为 29.68 个，平均小维管束面积为 0.0209 mm / 解剖结构（大维管束数目（X10）、大维管束面积（X11）、

个，平均茎壁厚度为 1 909.86 μm（表 3）。其中，023S 小维管束数目（X12）、小维管束面积（X13）和茎壁厚

所配组合的平均大维管束数目和小维管束数目最多， 度（X14））为自变量，进行逐步回归分析（表 5）。

412 中 国 农 业 科 学 49卷

表 4 供试组合茎秆主要理化特性与单茎抗推力的相关关系 Table 4 Correlation coefficients of some physical and chemical characteristics and anti-thrust per stem of tested combinations 茎秆理化特性 单茎抗推力 Anti-thrust per stem (kPa/stem) Stem physical and chemical characteristics 2014 2015

株高 Plant height (cm) 0.3114 0.4546

秆长 Stem length (cm) 0.5564* 0.6476*

茎粗 Stem diameter (mm) 0.2260 0.7829**

单茎鲜重 Fresh weight per stem (g) 0.5921* 0.6631*

弯曲力矩 Bending moment (cm·g) 0.5964* 0.6073*

秆型指数 Stem index (%) -0.1117 0.5296

粗纤维含量 Crude fiber content (%) 0.5454* 0.8299**

钾含量 Potassium content (μg·mL-1) -0.1596 0.7362**

硅含量 Silicon content (%) 0.5915* 0.7757**

大维管束数目 Big vascular bundles No. 0.4172 0.5920*

大维管束面积 Big vascular bundles area (mm2/singer area) 0.1331 0.4842

小维管束数目 Small vascular bundles No. 0.5445* 0.6481*

小维管束面积 Small vascular bundles area (mm2/singer area) 0.4075 0.3534

茎壁厚度 Culm wall thickness (μm) 0.1888 0.5524

结果表明，2014 年，弯曲力矩（X5）、硅含量（X9） 2.6 供试组合茎秆主要理化特性的配合力分析

和小维管束数目（X12）入选回归方程，偏回归系数 2.6.1 供试组合茎秆主要理化特性的配合力方差分 分别为 0.5963、0.5916 和 0.5445，说明弯曲力矩硅 析 对供试的 2014 年 15 个组合和 2015 年 12 个组合 含量和小维管束数目对单茎抗推力具有正向作用。 的 15 个性状考查数据进行方差分析（表 1），结果表

2015 年，秆长（X2）、茎 粗（ X3）、粗纤维含量（X7） 明，2014 年，除大维管束数目和小维管束数目外的其

和小维管束数目（X12）入选回归方程，偏回归系数 他性状组合间的遗传差异均达到极显著水平。对除大 分别为 0.6992、0.8113、0.8297 和 0.6477，说明秆 维管束数目和小维管束数目外的 13 个性状组合间的 长、茎粗、粗纤维含量和小维管束数目对单茎抗推 遗传差异进一步分解可知，除粗纤维含量外的 12 个性 力具有正向作用。两年均入选回归方程的性状有小 状的不育系×恢复系特殊配合力方差达到了极显著水 维管束数目，说明这个性状对单茎抗推力的影响较 平。此外，单茎抗推力、粗纤维含量、小维管束面积 大。 3 个性状不育系的一般配合力方差达到显著水平。株

表 5 供试组合茎秆主要理化特性与单茎抗推力间的逐步回归分析 Table 5 Stepwise regression of some physical and chemical characteristics and anti-thrust per stem of tested combinations 年份 因变量（Y） 自变量（X） 回归方程 偏回归系数 决定系数 Year Dependent variable Independent variable Regression equation Partial regression Determination coefficient coefficient

2014 单茎抗推力 X1、X2、X3、X4、X5、X6 Y=0.1236+0.0004X5 B(X5)=0.5963* 0.3556* Anti-thrust per stem X7、X8、X9 Y=0.1789+0.0374X9 B(X9)=0.5916* 0.3450* (kPa/stem)

X10、X11、X12、X13、X14 Y=-2.5196+0.1096X12 B(X12)=0.5445* 0.2965*

2015 单茎抗推力 X1、X2、X3、X4、X5、X6 Y=-0.4568+0.0089X2+0.0676X3 B(X2)=0.6992* 0.8015**

Anti-thrust per stem B(X3)=0.8113*

(kPa/stem) X7、X8、X9 Y=-0.3913+0.0252X7 B(X7)=0.8297 ** 0.6885**

X10、X11、X12、X13、X14 Y=-0.4884+0.0393X12 B(X7)=0.6477 * 0.4195*

3 期 陈桂华等：水稻茎秆性状与抗倒性的关系及配合力分析 413

高、秆长、单茎抗推力、粗纤维含量、大维管束面积、 系一般配合力方差显著大于恢复系一般配合力方差和 小维管束面积 6 个性状恢复系的一般配合力方差达到 组合特殊配合力方差，说明杂交组合的抗倒能力既受 显著水平。表明除粗纤维含量外所有性状均受非加性 不育系基因加性效应的影响又受非加性效应的影响， 基因的控制，株高、秆长和大维管束面积 3 个性状受 其中受不育系的影响较大。 恢复系基因加性效应的影响，单茎抗推力、粗纤维含 2.6.2 亲本一般配合力效应分析 2014 年 8 个亲 量、小维管束面积 3 个性状既受不育系基因加性效应 本的一般配合力分析结果表明（表 6），不育系和 的影响又受恢复系基因加性效应的影响；单茎抗推力 恢复系在株高等 13 个性状上的一般配合力都存在 的不育系一般配合力方差显著大于恢复系一般配合力 较大差异。比较不育系各性状的一般配合力可知， 方差和组合特殊配合力方差。 075S 抗倒性相关性状的一般配合力表现最好，它在 2015 年，15 个性状组合间的遗传差异均达到极显 单茎鲜重、弯曲力矩、单茎抗推力、硅含量和茎壁 著水平。对 15 个性状组合间的遗传差异进一步分解可 厚度 5 个性状上的一般配合力效应值表现为正效 知，15 个性状的不育系×恢复系特殊配合力方差均达 应，且数值最大；恢复系中 276 和 964 的抗倒性相 到了显著水平。此外，除秆长、茎粗、秆型指数和小 关性状的一般配合力表现最好，它们在秆长、茎粗、 维管束面积外的 11 个性状的不育系的一般配合力方 单茎鲜重、弯曲力矩、秆型指数、单茎抗推力、粗 差达到显著水平。株高的恢复系的一般配合力方差达 纤维含量、大维管束面积、小维管束面积和茎壁厚 到显著水平。表明 15 个性状均受非加性基因的控制， 度 10 个性状上的一般配合力效应值表现为正效应， 除秆长、茎粗、秆型指数和小维管束面积外的 11 个性 且数值较大。 状受不育系基因加性效应的影响，株高既受不育系基 2015 年 7 个亲本的一般配合力分析结果表明（表 因加性效应的影响又受恢复系基因加性效应的影响， 7），023S 抗倒性相关性状的一般配合力表现最好， 单茎抗推力的不育系一般配合力方差显著大于恢复系 它在除株高外的 14 个性状上的一般配合力效应值表 一般配合力方差和组合特殊配合力方差。 现为正效应，023S 和 C815S 的单茎抗推力的一般配合 综上所述，单茎抗推力的组合特殊配合力方差和 力效应值表现为正效应，恢复系中 R527 和 R389 的单 不育系一般配合力方差两年均达极显著水平，且不育 茎抗推力的一般配合力效应值表现为正效应。

表 6 亲本茎秆主要理化特性的一般配合力相对效应值（2014 年） Table 6 The relative effects of general combining ability of stem some physical and chemical characteristics of parents (2014）

性状 亲本名称 Parents Characters 075S 089S 耘 9S R276 R518 R964 黄软占 粤综占 Yun9S Huangruanzhan Yuezongzhan 株高 Plant height (cm) -0.6934 0.6624 0.0310 -1.135 -0.4197 3.755 -3.334 1.133

秆长 Stem length (cm) 0.3524 0.4916 -0.8440 2.801 -2.618 2.454 -4.128 1.491

茎粗 Stem diameter (mm) -0.0764 -1.416 1.492 4.705 -5.912 5.691 -5.912 1.428

单茎鲜重 Fresh weight per stem (g) 6.796 -4.052 -2.744 9.229 -3.147 14.141 -8.663 -11.56

弯曲力矩 Bending moment (cm·g) 6.116 -3.422 -2.695 7.825 -3.750 18.271 -11.859 -10.49

秆型指数 Stem index (%) -0.4923 -1.926 2.418 1.902 -3.376 3.260 -1.878 0.0917

单茎抗推力 Anti-thrust per stem (kPa/Plant) 16.61 6.691 -23.30 13.57 1.500 11.14 -18.77 -7.442

粗纤维含量 Crude fiber content (%) -0.7763 2.774 -1.998 1.179 1.666 1.512 -5.376 1.019

钾含量 Potassium content (μg·mL-1) -2.148 -0.396 2.545 2.462 -3.676 -8.342 4.95 0 4.605

硅含量 Silicon content (%) 8.444 -1.493 -6.951 12.742 12.96 -1.173 -20.49 -4.041

大维管束面积 -3.482 2.477 1.005 4.697 -13.85 19.58 -12.29 1.869 Big vascular bundles area (mm2/singer area) 小维管束面积 -8.950 14.43 -5.483 22.99 -12.93 20.43 -14.94 -15.55 Small vascular bundles area (mm2/singer area) 茎壁厚度 Culm wall thickness (μm) 2.049 -3.297 1.248 4.928 -4.760 16.57 -16.23 -0.5023

414 中 国 农 业 科 学 49卷

表 7 亲本茎秆主要理化特性的一般配合力相对效应值（2015 年） Table 7 The relative effects of general combining ability of stem some physical and chemical characteristics of parents (2015) 性状 亲本名称 Parents characters 023S 044S C815S 耘 9S Yun9S R389 R518 R527

株高 Plant height (cm) -0.0904 3.287 1.765 -4.962 -2.640 0.0714 2.569

秆长 Stem length (cm) 2.014 3.958 0.6013 -6.573 0.2867 -1.748 1.461

茎粗 Stem diameter (mm) 13.53 -4.447 4.098 -13.18 0.0218 1.159 -1.182

单茎鲜重 Fresh weight per stem (g) 1.898 4.745 1.318 -7.961 0.5754 -1.310 0.7345

弯曲力矩 Bending moment (cm·g) 1.597 8.183 2.870 -12.65 -2.138 -1.267 3.404

秆型指数 Stem index (%) 11.63 -8.103 3.601 -7.130 -0.4053 3.330 -2.924

单茎抗推力 Anti-thrust per stem (kPa/Plant) 13.95 -2.775 4.980 -16.16 1.555 -3.701 2.146

粗纤维含量 Crude fiber content (%) 9.044 0.0294 -1.678 -7.395 -0.4498 -0.0620 0.5118

钾含量 Potassium content (μg·mL-1) 10.21 -0.8974 1.106 -10.41 3.950 0.8199 -4.770

硅含量 Silicon content (%) 10.47 3.190 -0.8325 -12.83 -0.6731 -0.4015 1.075

大维管束数目 Big vascular bundles No. 9.638 -3.585 -3.756 -2.297 1.588 -2.366 0.7786

大维管束面积 13.11 -4.822 -5.490 -2.800 -0.0221 4.392 -4.369 Big vascular bundles area (mm2/singer area) 小维管束数目 Small vascular bundles No. 6.854 -2.472 -2.165 -2.217 0.2827 -0.2256 -0.0571

小维管束面积 34.66 -13.61 -20.59 -0.4657 1.198 3.274 -4.471 Small vascular bundles area (mm2/singer area) 茎壁厚度 Culm wall thickness (μm) 11.46 0.3307 -7.680 -4.108 -0.1667 -4.136 4.302

3.2 影响水稻抗倒伏能力的主要因素 3 讨论 水稻自身的抗倒伏能力受茎秆特性决定[7,22]。杨 3.1 水稻抗倒性评价指标 志远等[21]研究表明，水稻植株从穗下第 5 节发生倒伏 目前，国内外评价水稻倒伏性能的指标主要有弯 的可能性最高。基部节间的抗折力反映了茎秆的硬性 曲力矩、抗折力和倒伏指数[20]，其中，倒伏指数是 和韧性，是表示茎秆强度的指标；抗折力越大，茎秆 最常用的指标。抗折力的测定，前人主要采用测定 抗倒伏的能力就越强 [7,23]。许多研究认为，株高是引 节间抗折力的方法，通常采用的测定方法是固定基 起倒伏的主要原因[3,24-26]。本研究结果表明，供试组合 部节间两支点的距离，将节间水平放置在两支点上， 的单茎抗推力与秆长、地上部鲜重、弯曲力矩和小维 在节间中点施力使其折断，力的大小即为该节间抗 管束数目呈显著正相关。逐步回归分析表明，秆长、 折力[3,21]。倒伏指数为弯曲力矩/节间抗折力。用节 茎粗、弯曲力矩和小维管束数目对单茎抗推力具有正 间抗折力和倒伏指数来评价水稻的倒伏性能均存在 向作用。但株高与单茎抗推力的相关性未达显著水平， 一定的缺陷，主要是由于节间抗折力的测定将茎秆 这可能是由于相对株高而言，秆长与水稻植株抗倒性 的不同节间取下来测定，不能代表其在田间的实际 的关系更密切，因为株高与秆长的区别是穗部的长短， 抗折能力，而倒伏指数只考虑了基部节间抗折力和 由于穗部成熟后会弯曲下垂，其长度可能对水稻植株 承受的负载（株高和鲜重），而未将弹性模量等影 抗倒性的影响不大。而单茎鲜重、弯曲力矩和小维管 响倒伏的重要因子考虑在内[17]，也没有将植株作为 束数目对水稻倒伏的影响较大，其原因可能是弯曲力 一个整体来考虑。本研究以单茎抗推力来评价水稻 矩是株高与地上部鲜重的乘积，弯曲力矩大说明地上 的倒伏性能，其中，单茎抗推力是植株在田间正常 部生长量大，基部节间所需支撑的重量也就大，因此 生长情况下来测定（见材料与方法部分），综合了 茎秆容易倒伏。但同时地上部鲜重大，其茎秆基部的 单株鲜重、茎秆弹性等影响因素，反映的是田间植 生物量也大，基部节间的充实度也就较好，茎壁大维 株倒伏需受到的外力大小，同时又考虑了茎蘖数的 管束和小维管束数目多，从而使单茎抗推力增大。李 影响，较能反映生产实际。 国辉等[17]研究也表明节间充实度越好，水稻抗倒伏能

3 期 陈桂华等：水稻茎秆性状与抗倒性的关系及配合力分析 415

力越强。 单茎抗推力的遗传既受不育系基因加性效应的影 水稻茎秆的化学成分也影响水稻的抗倒伏能 响又受非加性效应的影响，单茎抗推力的不育系一般 力，纤维素是构成细胞壁的主要成分，单位体积纤 配合力方差明显大于其恢复系一般配合力方差和组合 维素含量的多少关系到机械组织是否发达[14]，硅对 特殊配合力方差，说明不育系的基因加性效应对杂交 促进水稻茎秆的健壮生长发育和茎秆细胞壁硅质 组合抗倒能力的影响较大。 化，增强茎秆的抗倒伏能力有着重要的作用[27]。本 研究表明，单茎抗推力与茎秆粗纤维含量和硅含量 References 呈显著正相关。逐步回归分析表明，粗纤维含量和 [1] Kashiwagi T, Ishimaru K. Identification and functional analysis of a 硅含量对单茎抗推力具有正向作用，说明茎秆中硅 locus for improvement of lodging resistance in rice. Plant Physiology, 的含量对茎秆的抗倒性影响较大，因此，在栽培过 2004, 134(2): 676-683. 程中应注意增施硅肥。 [2] Sakata I, Sakai M, Imbe T. The correlation of the resistance to root 3.3 水稻抗倒伏相关性状的配合力 lodging with growth angle, diameter and pulling strength of grown 邹德堂等[28]研究表明水稻倒伏指数的遗传以加 roots in rice seedlings. Japanese Journal of Crop Science, 2003, 72: 性效应为主，倒伏指数的一般配合力在早期世代间较 56-61. 稳定，而特殊配合力变化较大。本研究两年的试验结 [3] 李国辉, 钟旭华, 田卡, 黄农荣, 潘俊峰, 何庭蕙. 施氮对水稻茎 果表明，单茎抗推力的不育系×恢复系特殊配合力方 秆抗倒伏能力的影响及其形态和力学机理. 中国农业科学, 2013, 差和不育系一般配合力方差两年均达到极显著水平， 46(7): 1323-1334. 说明单茎抗推力的遗传既受不育系基因加性效应的影 Li G H, Zhong X H, Tian K, Huang N R, Pan J F, He T H. Effect of 响又受非加性效应的影响，且不育系一般配合力方差 nitrogen application on stem lodging resistance of rice and its 显著大于恢复系一般配合力方差和组合特殊配合力方 morphological and mechanical mechanisms. Scientia Agricultura 差，说明不育系的基因加性效应对杂交组合抗倒能力 Sinica, 2013, 46(7): 1323-1334. (in Chinese) 的影响较大。 [4] Kwon S W, ChoY C, Lee J H, Suh J P, Kim J J, Kim M K, Choi I S, 彭侯华等[29]研究表明特殊配合力优良的组合一 Hwang H G, Koh H J, Kim Y G. Identification of quantitative trait 般都有一个一般配合力高的亲本。而翟虎渠等[30]则认 loci associated with rice eating quality traits using a population of 为一般配合力与特殊配合力之间没有明显的对应关 recombinant inbred lines derived from a cross between two temperate 系，2 个一般配合力高的亲本所配的杂交组合的特殊 japonica cultivars. Molecules and Cells, 2011, 31(5): 437-445. 配合力不一定高。本研究结果表明，不育系 075S 和 [5] 张丰转, 金正勋, 马国辉, 万宜珍, 刘海英, 徐美兰. 水稻抗倒性 023S 单茎抗推力的一般配合力效应值表现为正效应， 与茎秆形态性状和化学成分含量间相关分析. 作物杂志, 2010, 且数值较大；恢复系 R276、R964、R527 和 R389 单 137(4): 15-19. 茎抗推力的一般配合力效应值表现为正效应，且数值 Zhang F Z, Jin Z X, Ma G H, Wan Y Z, Liu H Y, Xu M L. 较大。组合 075S/R964、075S/R276、023S/R389、 Correlation analysis between lodging resistance and morphological 023S/R527 的单茎抗推力较大。因此，在抗倒伏杂交 characters of physical and chemical components in rice’s culms. 水稻组合亲本选配时，应选择抗倒性一般配合力高的 Crops, 2010, 137(4): 15-19. (in Chinese) 不育系和恢复系配组，尤其要重点考虑不育系抗倒性 [6] 王秀凤, 党立华, 都华, 郭玉华, 苗雨佳. 水稻茎秆抗倒性构成因 的一般配合力。 素的研究. 北方水稻, 2008, 38(2): 16-21, 39. Wang X F, Dang L H, Du H, Guo Y H, Miao Y J. Studies on the 4 结论 composition of lodging resistance in rice. North Rice, 2008, 38(2): 单茎抗推力与秆长、地上部鲜重、弯曲力矩、粗 16-21, 39. (in Chinese) 纤维含量、硅含量和小维管束数目呈显著正相关，说 [7] 申广勒, 石英尧, 黄艳玲, 石扬娟, 王维刚, 张从合, 陈多璞. 水稻 明地上部鲜重越大，茎秆粗纤维含量越高，茎秆的充 抗倒伏特性及其与茎秆性状的相关性研究. 中国农学通报, 2007, 实度就越好，大维管束和小维管束数目也就越多，其 23(12): 58-62. 植株的抗倒能力就越强；在栽培过程中应注意增加茎 Shen G L, Shi Y Y, Huang Y L, Shi Y J, Wang W G, Zhang C H, 秆硅的积累。 Chen D P. Study on rice lodging resistance character and correlation

416 中 国 农 业 科 学 49卷

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中国农业科学 2016,49(3):418-428 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.002

高抗白粉病小麦-山羊草新种质 TA002 的创制和遗传研究

王玉海 1，何 方 2，鲍印广 2，明东风 1，董 磊 1，韩庆典 3，李莹莹 1，王洪刚 2

（1 枣庄学院，山东枣庄 277160；2 山东农业大学农学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018；3 临沂大学，山东临沂 276000）

摘要：【目的】小麦白粉病是世界范围内对小麦危害最严重的病害之一。培育和推广抗病品种是防治小麦白粉病最 经济、有效、安全的途径。偏凸山羊草和柱穗山羊草是普通小麦的近缘物种，蕴藏着丰富的抗病、抗虫、抗逆和优质 等优异基因。利用远缘杂交途径，将偏凸山羊草和柱穗山羊草的抗白粉病基因导入普通小麦，培育抗白粉病小麦新种 质，为小麦白粉病抗性遗传改良提供新抗源。【方法】通过细胞学分析和结实率调查，明确 TA002 及其与普通小麦杂种 的细胞学稳定性和育性特点。利用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳（odium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（acid polyacrylamide gel electrophoresis，A-PAGE） 方法，分析 TA002 的高分子量麦谷蛋白亚基（high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS）、低分子量麦谷蛋 白亚基（low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS）及醇溶蛋白亚基组成；通过白粉病菌分小种接种鉴定， 明确 TA002 对小麦白粉病的抗性及其遗传特点；利用基因组原位杂交（genomic in situ hybridization，GISH）、多 色原位杂交（multicolor genomic in situ hybridization，mc-GISH）、多色荧光原位杂交（multicolor fluorescence in situ hybridization，mc-FISH）及分子标记技术，分析明确 TA002 的染色体组成特点。【结果】TA002 染色体数目

为 42 条，它及其与普通小麦的杂种 F1 减数第一次分裂中期细胞（pollen mother cells at metaphase I，PMCs MI） 均含有 21 个二价体，减数第一次分裂后期细胞（pollen mother cells at anaphase I，PMCs AI）中的染色体分离均 衡，结实率正常。在成株期，TA002、SDAU18 及其双亲偏凸山羊草和柱穗山羊草对白粉病均具有良好抗性，而烟农 15

对白粉病表现髙感。TA002/辉县红 F1、TA002/铭贤 169F1 对白粉病菌种 E09 表现免疫，F2 单株对 E09 的抗感分离比例符 合3﹕1。种子贮藏蛋白分析结果表明，在 TA002 的醇溶蛋白和谷蛋白中均含有 SDAU18 的特有亚基，其醇溶蛋白还含有 双亲没有的新型亚基。分别以单芒山羊草和尾状山羊草的基因组总 DNA 为探针，烟农 15 的基因组总 DNA 为封阻，对 TA002 的根尖细胞染色体进行基因组原位杂交，均未检测到杂交信号。同时以不同荧光素标记的乌拉尔图小麦和粗山羊草基 因组总 DNA 为探针，拟斯卑尔脱山羊草基因组总 DNA 为封阻，对 TA002 的根尖细胞染色体进行 mc-GISH，并利用以不同 荧光素标记的寡核苷酸 pSc119.2 和 pTa535 对 TA002 的根尖细胞染色体进行 mc-FISH，发现 TA002 具有完整的 A、B 和 D 基因组，但其 4A、5A、6B、7B 和 5D 染色体在 FISH 带型上与亲本烟农 15 的对应染色体具有显著差异。分子标记检测 结果表明，TA002 含有来源于偏凸山羊草和柱穗山羊草的遗传物质。【结论】TA002 是一个细胞学稳定、农艺性状和育 性良好的小麦-山羊草渐渗系，它含有偏凸-柱穗山羊草双二倍体特有的贮藏蛋白亚基及其双亲没有的新亚基，且高抗小 麦白粉病，其白粉病抗性受显性单基因控制，该基因可能是来自偏凸山羊草或柱穗山羊草的一个新的白粉病抗性基因。 关键词：小麦；山羊草；白粉病；种质系；鉴定

Development and Genetic Analysis of a Novel Wheat-Aegilops Germplasm TA002 Resistant to Powdery Mildew WANG Yu-hai1, HE Fang2, BAO Yin-guang2, MING Dong-feng1, DONG Lei1, HAN Qing-dian3, LI Ying-ying1, WANG Hong-gang2

(1Zaozhuang University, Zaozhuang 277160, Shandong; 2 College of Agronomy, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong; 3 Linyi University, Linyi 276000, Shandong)

收稿日期：2015-11-02；接受日期：2015-12-11 基金项目：山东省博士基金（BS2011SW053）、国家自然科学基金（31301397）、植物细胞与染色体工程国家重点实验室开放课题（PCCE-KF-2014-01）、 作物生物学国家重点实验室开放课题（2015KF06）、山东省高等学校科技计划（J13LF11） 联系方式：王玉海，E-mail：[email protected]。何方，E-mail：[email protected]。鲍印广，E-mail：[email protected]。王玉海、何方和鲍 印广为同等贡献作者。通信作者王洪刚，E-mail：[email protected]

3 期 王玉海等：高抗白粉病小麦-山羊草新种质 TA002 的创制和遗传研究 419

Abstract: 【Objective】 Powdery mildew is one of the most devastating diseases of wheat. It is widely accepted that the most economic, efficient and safest way to control powdery mildew is breeding and planting powdery mildew resistant cultivars. Aegilops ventricosa and Aegilops cylindrica, which possess many favorable characters and good qualities such as resistance to diseases, tolerance to environmental stresses, are close-related relatives of wheat. The objective of this study was to develop novel powdery mildew resistant germplasm line via wide hybridization between common wheat and Aegilops ventricosa and/or Aegilops cylindrica for genetic improvement. 【Method】 Improved fuchsin squash and seed set examination were used to determine the cytogenetic stability and fertility of TA002. Acid polyacrylamide gel electrophoresis (A-PAGE) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) were used to analyze the subunit composition of gliadin, high and low molecular weight glutenin (HMW-GS and LMW-GS) respectively. Genomic in situ hybridization (GISH), multicolor genomic in situ hybridization (mc-GISH), multicolor fluorescence in situ hybridization (mc-FISH) and molecular markers were employed to detect the genetic nature of TA002. Respective inoculation of powdery mildew isolates was performed to detect the reaction of TA002 to powdery mildew.【Result】 TA002 (2n = 42) showed equivalent seed set to that of common wheat. Both TA002 and its hybrid F1 with common wheat Mingxian169 housed 21 bivalents in the pollen mother cells observed at metaphase I (PMCs MI) and took on chromosomal segregation of 21 to 21 in pollen mother cells examined at anaphase I (PMCs AI). Contrast to wheat parent Yannong15 highly susceptible to powdery mildew, TA002, similar to SDAU18 and its parents Aegilops ventricosa and Aegilops cylindrica, was highly resistant to powdery mildew. Immunization and resistant-susceptible segregation of 3﹕1 was observed respectively in F1 and F2 of the crosses between TA002 and common wheats susceptible to powdery mildew. The analysis of seed storage proteins of TA002 and its parents revealed that TA002 not only had new glutenin and gliadin subunits specific to SDAU18, but also possessed a novel gliadin subunit derived from its neither parents. When probed respectively by genomic DNA of Aegilops uniaristata and Aegilops caudata in root tip cell chromosomes of TA002, no probe signals were detected. Multicolor genomic in situ hybridization (mc-GISH) and multicolor fluorescence in situ hybridization (mc-FISH) indicated that TA002 had three complete genomes (A, B and D) although five pairs of chromosomes 4A, 5A,6B, 7B and 5D in it showed significantly different FISH pattern from that of corresponding ones in Yannong15. Mc-GISH was carried out simultaneously using genomic DNA of Triticum uratu and that of Aegilops tauschii labeled with different fluoresceins as probes, and with genomic DNA of Aegilops speltoides as blocker. Mc-FISH was performed with two oligonucleotides pSc119.2 and pTa-535 fluorescing differently. Molecular marker analysis revealed TA002 housed alien genetic materials not only from Aegilops ventricosa but also from Aegilops cylindrica. 【Conclusion】TA002, derived from Aegilops ventricosa or Aegilops cylindrica with high powdery mildew resistance controlled by a single dominant gene, was found as a novel wheat-Aegilops introgression line of cytogenetic stability and good fertility. In addition, TA002 possessed novel seed storage protein subunits either specific to Aegilops ventricosa -Aegilops cylindrica amphiploid or in neither parents. Key words: Triticum aestivum; Aegilops; powdery mildew; germplasm line; introgression line

然已鉴定了许多白粉病抗性基因，但只有少数基因在 0 引言 小麦生产中得到广泛应用。随着新的病原小种的产生， 【研究意义】小麦白粉病是由小麦白粉病菌 许多白粉病抗性基因丧失了抗性[1,8-12]，不断发掘、鉴 （Blumeria graminis DC f. sp. tritici Em. Marchal，Bgt） 定新的白粉病抗性基因，创造新的抗病种质，增加抗 引起的真菌性病害，是中国乃至世界范围内对小麦危 病基因的多样性，对于小麦白粉病抗性育种具有重要 害最严重的病害之一[1]。尤 其 是 20 世纪 70 年代以来， 意义。【前人研究进展】迄今，正式命名的小麦白粉 随着矮秆、半矮秆小麦推广面积的扩大和氮肥施用量 病抗性基因至少已有 71 个，即 Pm1—Pm54。其中 的增加，白粉病的危害日趋严重[2]，成为影响和限制 Pm1a、Pm1b、Pm1c (Pm18)、Pm1d、Pm1e (Pm22)、 小麦高产、稳产的一个巨大障碍[3]。据统计，小麦白 Pm3a—Pm3j、Pm4a—Pm4b、Pm4c (Pm23)、Pm4d、 粉病引起的产量损失一般为 5%—10%，严重发生时可 Pm5a—Pm5e 、 Pm6 、 Pm9—Pm11 、 Pm14—Pm16 、 高达 50%，甚至绝产，如在 1990 年，中国小麦白粉 Pm24—Pm28、Pm30—Pm31、Pm33、Pm36—Pm39、 病危害面积超过 1 200 万公顷，产量损失达 14.38×108 Pm41—Pm42、Pm44—Pm50、Pm52 和 Pm54 共计 54 kg[4]。利用化学杀菌剂虽然可以防止小麦白粉病的发 个来自小麦属；Pm7—Pm8、Pm17 和 Pm20 4个来自 生和蔓延，但会造成环境污染，并且增加小麦的生产 黑麦属；Pm40 和 Pm43 来自中间偃麦草；Pm21 来自 成本，因此，培育和推广抗病品种已被公认为是防治 簇毛麦；Pm51 来自十倍体长穗偃麦草。来自山羊草 小麦白粉病最经济、有效、安全的途径[5-7]。目前，虽 属的白粉病抗性基因有 9 个，其中 Pm2、Pm19、Pm34

420 中 国 农 业 科 学 49卷

和 Pm35 来自粗山羊草，Pm12、Pm32 和 Pm53 来自 研究所李洪杰研究员提供，E11 和 E18 由中国科学院 拟斯卑尔脱山羊草，Pm13 来自高大山羊草，Pm29 来 遗传研究所王道文研究员提供。 自卵穗山羊草[13-16]。此外，还有至少 18 个白粉病基因 1.2 分子细胞遗传学的鉴定 被暂时命名[15]。【本研究切入点】偏凸山羊草（Aegilops 参照 Bao 等[25]方法进行减数第一分裂中期（pollen ventricosa，2n= 28，DVDVNN）和柱穗山羊草（Aegilops mother cells at metaphase I，PMCs MI）染色体构型观 cylindrica，2n=28，DCDCCC）均为山羊草属的四倍体 察，参照 Kato 等[26]方法进行染色体的制备及多色 种，蕴藏着丰富的抗病、抗虫、抗逆和优质等优异基 FISH，核型分析参照 Tang 等[27]的标准进行，参照 Fu 因，在小麦的遗传改良中具有重要利用价值[17-23]。偏 等[28]方法进行 GISH 和多色 GISH。结实率（%）=最 凸山羊草和柱穗山羊草均含有 D 基因组，并且偏凸山 外侧小花结实数/最外侧小花数×100。 羊草还含有来自单芒山羊草（Aegilops uniaristata Vis， 2 种探针分别为 6-FAM（6-carboxyfluorescein） 2n=14，NN）的 N 基组，柱穗山羊草含有来自尾状山 标记的寡核苷酸 pSc119.2 和 Tamra （ 6- 羊草（Aegilops caudata L.，2n=14，CC）的 C 基组[24]。 carboxytetramethylrhodamine ）标记的寡核苷酸 迄今为止，在已鉴定的白粉病抗性基因中，尚未见有 pTa535。GISH 的探针分别为荧光素 488-5-dUTP 标记 来自偏凸山羊草或柱穗山羊草的研究报道。山东农业 的单芒山羊草和尾状山羊草的基因组总 DNA，封阻为 大学小麦染色体工程育种实验室在前期研究过程中， 烟农 15 的基因组总 DNA。多色 GISH 的 2 种探针分 利用偏凸-柱穗山羊草双二倍体与普通小麦烟农 15 杂 别为荧光素 488-5-dUTP 标记的乌拉尔图小麦基因组 交，从其杂种后代中选育了一个高抗白粉病的种质系 总 DNA 和荧光素 TEXAS RED-5-dCTP 标记的粗山羊 TA002。【拟解决的关键问题】本研究拟利用 GISH、 草基因组总 DNA，封阻为拟斯卑尔脱山羊草基因组总 多色 GISH、FISH、A-PAGE、SDS-PAGE、SSR 分子 DNA。 标记及抗性接种鉴定等多种技术相结合的方法对 1.3 成株期白粉病抗性鉴定 TA002 的染色体和种子贮藏蛋白构成、白粉病抗性遗 白粉病抗性鉴定参照郝元峰[8]方法进行。侵染型 传特点等进行了鉴定，为其在小麦遗传改良中的有效 （ITs）按 0—4 级标准记载，0、0;、1、2、3 和 4 分 利用提供参考依据。 别代表免疫、近免疫、高抗、中抗、中感和高感。 使用的白粉菌生理小种为 E09、E11、E15 和 E18。 1 材料与方法 对 E09 和 E15 的抗性鉴定分别于 2008 年和 2009 年在 1.1 试验材料 山东农业大学校内温室和实验农场完成。对 E11 和 植物材料为小麦-山羊草种质系 TA002 及其双亲 E18 的抗性鉴定分别于 2012 年和 2013 年在枣庄学院 普通小麦品种烟农 15 和偏凸-柱穗山羊草双二倍体 的校内温室和生物园完成。对 TA002 白粉病抗性遗传 SDAU18，偏凸山羊草、柱穗山羊草、单芒山羊草、 特点分析于 2014 年在枣庄学院进行。 尾状山羊草、拟斯卑尔脱山羊草（基因组为 BB）、 1.4 种子储藏蛋白和分子标记分析 粗山羊草（基因组为 DD）和乌拉尔图小麦（基因组 参照 Ahmadpoor 等[29]和 Yan 等[30]方法分别进行 为 AA），普通小麦品种辉县红、铭贤 169、中国春 醇溶蛋白和谷蛋白分析。参照 Zhao 等[31]方法进行分 （CS）、4072、烟农 19、Bobwhite、Redriver68 和 子标记分析。 小偃 54。其中，TA002 是利用感染白粉病的烟农 15 2 结果 与高抗白粉病的偏凸-柱穗山羊草双二倍体 SDAU18

杂交并以烟农 15 为轮回亲本进行回交，从其 BC2F3 2.1 TA002 及其与普通小麦杂种的 PMCs MI 染色体构 中选育的高抗白粉病种质系；辉县红和铭贤 169 是白 型和育性 粉病的感病对照，CS、4072、烟农 19、Bobwhite、 利用改良卡宝品红压片法对 TA002、普通小麦铭

Redriver68 和小偃 54 用作种子贮藏蛋白分析的对照。 贤 169 及其杂种 F1 的 PMCs MI 的染色体构型进行了 上述材料由山东农业大学小麦染色体工程育种实验 分析，并对其各自的自交结实率进行了统计（表 1）。

室创制或保存。 TA002 及其与铭贤 169 杂种 F1 的 PMCs MI 均有 21 个 使用的白粉病生理小种分别为 E09、E11、E15 和 二价体（图 1-A），其结实率与普通小麦铭贤 169 相 E18，其中，E09 和 E15 由中国农业科学院作物科学 当，说明 TA002 在细胞学上已非常稳定。

3 期 王玉海等：高抗白粉病小麦-山羊草新种质 TA002 的创制和遗传研究 421

A B C

D E F

G 1 2 3 4 5 6 7

ATA002

AYN15

BTA002

BYN15

DTA002

DYN15

A：TA002/铭贤 169F1 的 PMCs MI 染色体构型，2n=42=21II；B：TA002 根尖细胞染色体的 GISH 分析，探针为尾状山羊草的 DNA，未检测到探针 信号；C：TA002 根尖细胞染色体的 mc-GISH 分析，其中 A 组染色体 14 条（绿色），B 组染色体 14 条（蓝/灰色），D 组染色体 14 条（粉红色）； D：TA002 同一个细胞的 mc-FISH 分析，红色信号为 pTa535，绿色信号为 pSc119.2；E：烟农 15 根尖细胞染色体的 mc-GISH 分析，其中，A 组染色 体 14 条（绿色），B 组染色体 14 条（灰色），D 组染色体 14 条（红色）；F：烟农 15 同一个细胞的 mc-FISH 分析，红色信号为 pTa535，绿色信

号为 pSc119.2；G：TA002 和烟农 15 的 mc-FISH 核型比较，二者分别由图 1-D 和图 1-F 的染色体排列而成，ATA002、BTA002、DTA002 和 AYN15、BYN15、 DYN15 分别表示 TA002 和烟农 15 的 A、B 和 D 基因组，数字 1—7 分别表示 TA002 和烟农 15 的 7 个同源群，相同颜色的箭头指示 TA002 与烟农 15 对应染色体的 FISH 带型差异 A: Chromosome configuration in PMCs MI of TA002/Mingxian169F1, 2n = 42 = 21II; B: GISG analysis of chromosomes in root tip cell (RTC) of TA002, genomic DNA of Ae. caudata were used as probe, and no probe signals were detected; C: mc-GISG analysis of chromosomes in RTC of TA002, fourteen chromosomes were observed in A (green), B (blue/gray) and D (red) genomes respectively; D: mc-FISG analysis of chromosomes in same RTC of TA002, pTa535 presents red signals, pSc119.2 presents green signals; E: mc-GISG analysis of chromosomes in RTC of Yannong15, fourteen chromosomes were observed in A (green), B(blue/gray) and D (red) genomes respectively; F: mc-FISG analysis of chromosomes in same RTC of Yannong15, pTa535 presents red signals, pSc119.2 presents green signals; G: karyotype comparison between TA002 and Yannong15. This picture is made by the rearrangement of chromosomes in “D”and “F”, ATA002, BTA002, DTA002 and AYN15, BYN15, DYN15 represent A, B, D genomes of TA002 and Yannong15 respectively, numbers of 1 to 7 represent homoeologous groups 1 to 7 of TA002 and Yannong15 respectively, arrows of same color identify the difference of FISH patterns on counter chromosomes in TA002 and Yannong15, respectively

图 1 TA002、烟农 15 及 TA002/铭贤 169F1 的染色体分析

Fig. 1 Analysis of the chromosomes in TA002, Yannong15 and the hybrid F1 of TA002/Mingxian169

422 中 国 农 业 科 学 49卷

表 1 TA002、铭贤 169 及其杂种的 PMCs MI/AI 染色体构型和结实率 Table 1 Chromosome configuration in PMCs MI/AI and seed set of TA002, Mingxian169 and their hybrid 材料 染色体数目 统计株数 统计细胞数 二价体数目 后期Ⅰ的染色体分离 结实率 Materials Chromosome Plants Cells Bivalents Chromosome segregation at Seed set number examined observed per cell PMC AI (%) TA002 42 5 40 21.0 21/21 91.0

铭贤 169 Mingxian169 42 3 22 21.0 21/21 87.0

铭贤 169/TA002 F1 42 9 70 21.0 21/21 91.0

Mingxian169/TA002 F1

2.2 TA002 的染色体构成 了明显差异（绿色箭头所示）。以上结果表明，TA002 分别以单芒山羊草（Aegilops uniaristata，基因组 中没有来自 N 和 C 基组外源染色体及其较大染色体 NN）和尾状山羊草（Aegilops caudata，基因组 CC） 片段，但可能含有来自偏凸山羊草或（和）柱穗山羊 的基因组 DNA 为探针，烟农 15 的基因组 DNA 为封 草的小片段遗传物质。 阻，对 TA002 的根尖细胞染色体进行 GISH 分析。结 2.3 TA002 及其亲本的的 SSR 分析 果表明，无论以单芒山羊草的基因组 DNA 为探针， 利用 203 对 SSR 引物和 165 对 EST-SSR 引物对 还是以尾状山羊草的基因组 DNA 为探针，在 TA002 普通小麦烟农 15、TA002、SDAU18、偏凸山羊草 的根尖细胞染色体上均未检测到明显的探针信号， 和柱穗山羊草的基因组进行了分析。在 368 对引物 说明 TA002 的基因组中没有来自 N 或 C 基组的外 中，共有 4 对 SSR 引物在 TA002 中扩增出 SDAU18 源染色体及大的染色体片段（图 1-B）。分别以乌 特有的条带（图 2）。其中，2 对引物在 TA002、 拉尔图小麦和粗山羊草的基因组 DNA 为探针，拟斯 SDAU18 和偏凸山羊草中扩增出相同的带型，1 对 卑尔脱山羊草的基因组 DNA 为封阻，对 TA002 和 引物在 TA002、SDAU18 和柱穗山羊草中扩增出相 烟农 15 的根尖细胞染色体进行多色原位杂交（图 同的带型。说明 TA002 中既含有偏凸山羊草的遗传 1-C 和图 1-E）。结果表明，TA002 与其亲本烟农 15 物质又含有柱穗山羊草的遗传物质。此外，还有 1 一样含有 A、B 和 D 3 个基因组，每个基因组均含有 对引物在 TA002 中扩增出 SDAU18 特有条带，但该 14 个染色体，在 3 个基因组之间未发现明显的染色 条带为偏凸山羊草和柱穗山羊草均不具有的新谱 体易位。在多色原位杂交的基础上，利用 2 种荧光标 带。 记的寡核苷酸序列 pSc119.2 和 pTa535 为探针，对烟 2.4 TA002 及其亲本的的种子贮藏蛋白分析 农 15 和 TA002 的同一张染色体制片进行第二次杂交 以普通小麦中国春（7+8, 2+12）、4072（1, 13+16, （荧光原位杂交，FISH），结果（图 1-D 和图 1-F） 5+10）、烟农 19（1, 17+18, 5+10）、Bobwhite（2*, 7+9, 表明，在 TA002 和烟农 15 的不同基因组内均没有检 5+10）、Redriver68（1, 7OE+8, 5+10）和小偃 54（1, 14+15, 测到组内易位染色体。烟农 15 与 TA002 FISH 带型 2+12）为对照，对 TA002 及其双亲的谷蛋白亚基组 比对结果表明，TA002 的 4A、5A、6B、7B 和 5D 染 成进行分析（图 3）。在高分子谷蛋白亚基区，TA002 色体的带型与烟农 15 对应染色体具有显著差异（图 共有 3 个亚基，其中，2 个（o 和 p）为 SDAU18 和 1-G，箭头所示）。烟农 15 4A 染色体长臂末端具有 烟农 15 所共有，1 个（q）与烟农 15 的 12 亚基的 pSc119.2 所产生的显著绿色信号，而 TA002 对应染 迁移率相对应。在低分子量亚基区，除了有一条谱 色体的长臂末端未检测到 pSc119.2 的信号（白色箭 带与 SDAU18 相同以外（箭头所示），其余谱带均 头所示）；pSc119.2 和 pTa535 在烟农 15 5A 染色体 与烟农 15 相同。以中国春为对照，对 TA002 及其 长臂中部均产生了强烈的荧光信号，而在 TA002 的 双亲的醇溶蛋白组成进行分析，结果（图 4）表明， 对应染色体部位未表现出明显的荧光信号（黄色箭头 在 γ 和 ε 2个区，TA002 共有 5 条带，除了一条为 所示）；TA002 的 6B 和 7B 染色体的长臂末端 双亲所没有的新谱带外（星号所示），其余均与烟 pSc119.2 的信号分布与烟农 15 的对应染色体部位相 农 15 相同。在 α 和 β 2个区，除了有一条谱带与 比也表现出显著差异（红色和粉色箭头所示）。TA002 SDAU18 相同以外（箭头所示），其余谱带均与烟农 和烟农 15 的 5D 染色体长臂在 FISH 带型上也表现出 15 相同。上述结果进一步证明了 TA002 含有 SDAU18

3 期 王玉海等：高抗白粉病小麦-山羊草新种质 TA002 的创制和遗传研究 423

M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

600 bp

500 bp

400 bp

300 bp

BE398500 BM138339 BE425968 BF485469 M： DNA ladder marker；1：烟农 15；2：TA002；3：SDAU18；4：偏凸山羊草；5：柱穗山羊草；箭头指示 SDAU18 专化的条带 M: DNA ladder marker; 1: Yannong15; 2: TA002; 3: SDAU18; 4: Ae. ventricosa; 5: Ae. cylindrica; Arrows identify bands specific to SDAU18

图 2 TA002 及其亲本的分子标记分析 Fig. 2 Molecular marker analysis of TA002 and its parents

1 234 567 8 9101112131415

1 1 1 1 1 2 a 2* o 5 o 2 2 5 5 o 5 o 5 o o 7 b p p p 14 HMW-GS 7 13 7 p p p 7 17 7OE 8 c 16 15 d 18 8 8 12 9 9 q 13 e 12 q 10 q 10 q 10 q 12 q 12

LMW-GS

泳道 1、泳道 15：CS；泳道 2：SDAU18；泳道 3、泳道 6、泳道 8、泳道 10、泳道 12 和泳道 14：TA002 的 6 个不同籽粒；泳道 4：烟农 15；泳道 5：4072；泳道 7：烟农 19；泳道 9：Bobwhite；泳道 11：Redriver68；泳道 13：小偃 54，箭头指示 SDAU18 转化的亚基，图上的数字和字母表示高 分子量谷蛋白亚基编号 Lanes 1, 15: CS; Lanes 2: SDAU18; Lanes 3, 6, 8, 10, 12 and 14: Six seeds harvested from six plants of TA002; Lane 4: Yannong15; Lane 5: 4072; Lane 7: Yannong19; Lane 9: Bobwhite; Lane 11: Redriver68; Lane 13: Xiaoyan54, arrows identify subunits specific to SDAU18, numbers and letters on the drawing indicate the codes for HMW-GSs

图 3 TA002 及其亲本的麦谷蛋白分析 Fig. 3 Analysis of the glutenin in TA002 and their parents

424 中 国 农 业 科 学 49卷

1 23 4567 8910111213

ε

＊ γ

β

α

1：CS；2：烟农 15；3：TA002；4：SDAU18；5—13：TA002 的 9 个不同籽粒。箭头指示 SDAU18 专化的亚基，星号指示 TA002 中双亲没有的新 亚基 1: CS; 2: Yannong15; 3: TA002; 4: SDAU18; 5-13: Nine seeds of TA002. Arrows identify subunit specific to SDAU18, asterisk identifies novel subunit in TA002 which couldn’t be detected in both parents

图 4 TA002 及其亲本的醇溶蛋白分析 Fig. 4 Analysis of the gliadin in TA002 and their parents

的遗传物质。此外，还可以看出 TA002 的不同籽粒 及其亲本 SDAU18、普通小麦品种烟农 15、偏凸山羊 之间，醇溶蛋白的带型完全一致，表明 TA002 在遗 草和柱穗山羊草对 E09、E11、E15 和 E18 4 个白粉病 传上已完全稳定。 生理小种的成株期抗性反应进行了鉴定（表 2）。无 2.5 TA002 的白粉病抗性 论在温室还是在田间，TA002、偏凸-柱穗山羊草双二 以感病品种铭贤 169 和辉县红为对照，对 TA002 倍体 SDAU18、偏凸山羊草和柱穗山羊草对 4 个白粉

表 2 TA002 及其亲本和对照小麦品种对白粉病的抗性反应 Table 2 Reaction of TA002, its parents and the controls to powdery mildew 鉴定的材料 白粉病小种 Bgt isolates Plant materials inoculated E09（温室/田间） E11（温室/田间） E15（温室/田间） E18（温室/田间） （Green house/Field） （Green house/Field） （Green house/Field） （Green house/Field） 偏凸山羊草 Aegilops ventricosa –/0 –/0 –/1 –/0

柱穗山羊草 Aegilops cylindrica –/0 –/0 –/0 –/0

SDAU18 0/0 0/0 1/1 0/0

TA002 0/0 0/0 2/2 0/0 烟农 15Yannong15 4/4 4/4 4/4 4/4 铭贤 169 Mingxian169 4/4 4/4 4/4 4/4 辉县红 Huixianhong 4/4 4/4 4/4 4/4

“–”代表未调查 Means no determination

3 期 王玉海等：高抗白粉病小麦-山羊草新种质 TA002 的创制和遗传研究 425

病生理小种均表现免疫或高抗，而烟农 15 和 2 个感病 红/TA002F1 和 F2 的成株期白粉病抗性进行了鉴定分 对照品种一样，对 4 个生理小种均表现高度感染。说 析（表 3）。对照品种全部高度感病，在所调查的所

明 TA002 对小麦白粉病的抗性来自 SDAU18，即来自 有 TA002 及其与铭贤 169 和辉县红的 F1 单株中，均

偏凸山羊草或柱穗山羊草。 对 E09 表现良好抗性。铭贤 169/TA002 F2 和辉县红

2.6 TA002 白粉病抗性的遗传特点 /TA002 F2 对 E09 的抗性均发生分离，抗病单株与感病 以铭贤 169 和辉县红为对照，以 E09 为接种小种， 单株的比例均符合 3﹕1。表明 TA002 对白粉病的抗

在温室内对 TA002、铭 贤 169/TA002F1 和 F2 以及辉县 性受显性单基因控制。

表 3 TA002、铭贤 169、辉县红及其杂种在温室内对白粉病小种 E09 的抗性反应 Table 3 Reaction of TA002, Mingxian169, Huixianhong and their hybrids to Bgt isolate E09 材料 鉴定植株 Plants inoculated 预期抗/感分离比 χ2 值 P 值 Materials Expected segregation of R﹕S χ 2 value P value 总数 Total 抗 Resistant 感 Susceptive

TA002 12 12 0 12﹕0 — —

铭贤 169/ TA002F1 22 22 0 22﹕0 — —

Mingxian169/ TA002F1

辉县红/ TA002F1 11 11 0 11﹕0 — —

Huixianhong/ TA002F1

铭贤 169/ TA002F2 108 78 30 3﹕1 0.444 0.50—0.95

Mingxian169/ TA002F2

辉县红/TA002F2 55 43 12 3﹕1 0.297 0.50—0.95

Huixianhong/ TA002F2 铭贤 169 Mingxian169 20 0 20 0﹕20 — —

辉县红 Huixianhong 17 0 17 0﹕17 — —

在χ2 表中，当 P=0.05 时，自由度为 1 时，对应的χ2 值为 3.84；“–”表示无数据；R﹕S 表示抗﹕感 The value of χ2 in χ2 table is 3.84 when P=0.05 and df=1; “–” means no data; R﹕S means Resistant﹕Susceptive

赘，便于后续育种利用。同时，mc-GISH 和 mc-FISH 3 讨论 结果也表明 TA002 的 3 个基因组之间以及每个基因组 3.1 TA002 与烟农 15 FISH 核型差异 内部均未发生染色体易位。但是，TA002 在 FISH 核 在小麦的众多外源种中，山羊草属与小麦的亲缘 型上与其小麦亲本烟农 15 具有明显差异，这可能是由 关系最近[24]。偏凸山羊草（DVDVNN）、柱穗山羊草 于山羊草属与小麦属的亲缘关系较近，来自偏凸山羊 （DCDCCC）以及普通小麦（AABBDD）均含有来自 草或（/和）柱穗山羊草的小片段遗传物质渗入小麦亲 粗山羊草的 D 基组，因此，DV 和 DC 与普通小麦的 D 本烟农 15 的基因组所致，分子标记结果也证明了 组之间可通过同源重组的途径以小片段渗入形式实现 TA002 中确实含有偏凸山羊草和柱穗山羊草的遗传物 基因重组。此外，由于偏凸山羊草和柱穗山羊草与普 质。说明 TA002 可能是一个山羊草遗传物质的渐渗 通小麦的亲缘关系较近，其 N 和 C 基组与普通小麦的 系。 基因组具有较高的部分同源性，因此，N、C 基组与 3.2 TA002 的利用价值 小麦的 A、B 和 D 基组之间也可以通过部分同源联会 偏凸山羊草和柱穗山羊草中蕴藏着丰富的抗病、 的途径实现小片段 DNA 交换。结果表明，部分同源 抗虫、抗逆（耐盐、耐旱及耐寒等）和优质等优异基 配对在小麦与山羊草的远缘杂种中广泛存在[32]。在本 因，在小麦的遗传改良中具有重要利用价值[17-23,33-35]。 研究中，利用单芒山羊草和尾状山羊草的基因组 DNA 前人已利用普通小麦分别于偏凸山羊草和柱穗山羊草 为探针对 TA002 的根尖细胞染色体进行原位杂交，均 杂交，选育出了一系列种质材料[36]。迄今为止，这些 未检测到探针信号，这表明 TA002 中没有来自 N 或 C 材料主要是双二倍体、异附加系和异代换系。虽然这些 基因组的较大染色体片段，可能存在较小的 N 或 C 基 种质系各自具有不同的优良性状，但由于携带的遗传累 因组染色体片段渗入，携带较少的山羊草不利基因累 赘太多，农艺性状差，很难在小麦育种上直接利用。

426 中 国 农 业 科 学 49卷

迄今，已至少有 7 个来自偏凸山羊草的抗病、抗 powdery mildew resistance and fingerprint mapping of wheat [D]. 虫基因被转入普通小麦，如抗锈病基因 Yr17、Lr37 和 Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2000. (in Chinese) Sr38，抗眼斑病基因 Pch1，抗禾谷孢囊线虫基因 Cre2、 [4] 刘万才, 邵振润. 我国小麦白粉病大区流行的气候因素分析. 植保 Cre5 和 Cre6[33]。利用偏凸山羊草与普通小麦杂交育 技术与推广, 1998, 18(1): 3-5. 成的法国小麦种质 VPM1 同时携带 Yr17、Lr37、Sr38、 Liu W C, Shao Z R. Analysis on climatic factor for epidemiology of Cre5 和 Pch1 等 5 个基因，在全世界小麦遗传改良中 wheat powdery mildew in China. Plant Protection Technology and 得到了广泛应用[33, 37-38]。利用柱穗山羊草对小麦进行 Extension, 1998, 18(1): 3-5. (in Chinese) 遗传改良的研究较少。Singh 等[39]、Babaiants 等[40]和 [5] 解超杰, 杨作民, 孙其信. 小麦抗白粉病基因的分子标记. 中国农 Babaiants 等[41]分别将来自柱穗山羊草的抗叶锈基因 业大学学报, 2003, 8(1): 1-6. LrX、抗腥黑穗基因及 2 个秆锈抗性基因 SrAc1 和 Xie C J, Yang Z M, Sun Q X. The molecular markers of powdery SrAc2 导入普通小麦。但利用偏凸山羊草和柱穗山羊 mildew resistance genes in wheat. Journal of China Agricultural 草向普通小麦转移白粉病抗性基因和品质相关基因的 University, 2003, 8(1): 1-6. (in Chinese) 研究尚未见报道。 [6] Huang X Q, Hsam S L K, Mohler V, Röder M S, Zeller F J. Genetic TA002 是通过普通小麦与偏凸-柱穗山羊草双二 mapping of three alleles at the Pm3 locus conferring powdery mildew 倍体杂交选育的山羊草遗传物质的渐渗系，细胞学稳 resistance in common wheat (Triticum aestivum L.). Genome, 2004, 定、育性高、农艺性状较好，含有新的谷蛋白和醇溶 47: 1130-1136. 蛋白亚基，且对多个白粉病生理小种具有良好抗性， [7] Qiu Y C, Zhou R H, Kong X Y, Zhang S S, Jia J Z. Microsatellite 含有来自偏凸山羊草或柱穗山羊草的白粉病抗性新基 mapping of a Triticum urartu Tum. derived powdery mildew 因，丰富了小麦白粉病抗源，在小麦的遗传改良研究 resistance gene transferred to common wheat (Triticum aestivum L.). 中具有重要利用价值。目前，笔者正利用已构建的 Theoretical and Applied Genetics, 2005, 111: 1524-1531.

TA002 与髙感白粉病的普通小麦杂种 F2 及 BC1 群体筛 [8] 郝元峰. 小麦抗白粉病基因的分子标记定位及标记辅助选择[D]. 选与 TA002 中抗白粉病基因紧密连锁的分子标记，对 泰安: 山东农业大学, 2008. 其白粉病抗性基因进行染色体定位。 Hao Y F. Location of wheat powdery mildew resistance genes with molecular marker and marker-assisted selection [D]. Tai’an: Shandong 4 结论 Agricultural University, 2008. (in Chinese) 从普通小麦品种烟农 15 与偏凸-柱穗山羊草双二 [9] Huang X Q, Röder M S. Molecular mapping of powdery mildew 倍体 SDAU18 的杂种后代选育的种质 TA002，是一个 resistance genes in wheat: A review. Euphytica, 2004, 137: 203-223. 小麦-山羊草遗传物质的渐渗系。它细胞学稳定，育性 [10] Luo P G, Luo H Y, Chang Z J, Zhang H Y, Zhang M, Ren Z L. 正常，农艺性状较好，对小麦白粉病具有良好抗性， Characterization and chromosomal location of Pm40 in common 含有来自偏凸山羊草或柱穗山羊草的白粉病抗性新基 wheat: A new gene for resistance to powdery mildew derived from 因和新的贮藏蛋白亚基。 Elytrigia intermedium. Theoretical and Applied Genetics, 2009, 118: 1059-1064. References [11] Hua W, Liu Z J, Zhu J, Xie C J, Yang T M, Zhou Y L, Duan X Y, Sun [1] Li G Q, Fang T L, Zhang H T, Xie C J, Li H J, Yang T M, Nevo E, Q X, Liu Z Y. Identification and genetic mapping of pm42, a new

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中国农业科学 2016,49(3):429-442 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.003

玉米种胚内质网胁迫相关基因对人工老化处理的响应

曹广灿，林一欣，薛梅真，邢芦蔓，吕伟增，杨伟飞，陈军营

（河南农业大学农学院，郑州 450002）

摘要：【目的】在植物中，内质网胁迫（endoplasmic reticulum stress，ERS）和未折叠蛋白应答（unfolded protein response，UPR）参与环境胁迫响应过程，然而，玉米种子老化过程中内质网胁迫相关基因表达情况尚未 见报道。文章利用基因数字表达谱技术探究玉米种子老化过程中内质网胁迫相关基因表达规律，以期为揭示种子 衰老的分子机制提供理论依据。【方法】以玉米杂交种郑单 958 种子为材料，采用高温（45℃）高湿（相对湿度 100%）的方法进行人工老化处理。分别提取未老化处理（对照）和老化处理 3 d的玉米种胚总 RNA，利用 Illumina HiSeqTM 2000平台进行高通量测序。去除原始数据中的接头序列、包含模糊碱基的序列以及低质量序列，获得 Clean reads，利用短序列比对软件 SOAPaligner/ SOAP2 将 Clean Reads 分别比对到玉米参考基因组和参考基因序列， 采用 RPKM（reads per kb per million reads）方法计算基因的表达量，根据 FDR（false discovery rate）＜ 0.001 和|log2 ratio(T/CK)|≥1的标准筛选差异表达的基因，对获得的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）进行 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库功能注释分析，筛选出响应人工 老化的内质网胁迫相关差异表达基因。利用 qRT-PCR 技术定量分析内质网胁迫相关基因在不同人工老化时间内的 表达特性。【结果】基因数字表达谱鉴定结果表明，有 104 个差异表达基因在人工老化过程中参与内质网蛋白质加 工（protein processing in endoplasmic reticulum）通路，其中内质网胁迫相关基因有 97 个（81 个上调表达， 16 个下调表达）。对差异表达基因功能注释分析表明，内质网胁迫的标志性蛋白基因 BiP 以及分子伴侣蛋白基因 CRT、CNT 和 GRP94 等显著上调表达。参与内质网相关性降解（endoplasmic reticulum-associated degradation， ERAD）途径的有83个差异表达基因（70个上调，13个下调），其中启动ERAD途径的关键酶基因EDEM （ER degradation enhancing mannosidase I-like protein）下调，参与蛋白泛素化的 E2 泛素结合酶基因 UbcH5、E3 泛素连接酶基 因 Hrd1 和 Doa10 等也发生显著的表达变化。qRT-PCR 结果表明，内质网胁迫相关基因在不同人工老化时间内表现 表达多样性和复杂性。【结论】人工老化处理能造成玉米种胚细胞发生内质网胁迫。细胞通过上调分子伴侣基因表 达和诱导 ERAD 途径响应内质网胁迫，但 ERAD 途径受阻可能引起错误折叠蛋白聚集，从而进一步加剧细胞损伤， 最终导致种子活力降低甚至丧失。 关键词：玉米；种子老化；差异表达基因；内质网胁迫；内质网相关性降解

Responses of Endoplasmic Reticulum Stress-Related Genes in Maize Embryo to Artificial Aging Treatment

CAO Guang-can, LIN Yi-xin, XUE Mei-zhen, XING Lu-man, LÜ Wei-zeng, YANG Wei-fei, CHEN Jun-ying

(College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002)

Abstract: 【Objective】 Endoplasmic reticulum (ER) stress and unfolded protein response (UPR) are involved in plant responses to environmental stresses. However, the expression of ER stress-related genes during maize seed aging has not been reported. In this study, the expression of ER stress-related genes during maize seed aging was investigated by Digital Gene

收稿日期：2015-07-23；接受日期：2015-10-22 基金项目：国家自然科学基金（31571761） 联系方式：曹广灿，E-mail：[email protected]。通信作者陈军营，E-mail：[email protected]

430 中 国 农 业 科 学 49卷

Expression Profile (DGE) to provide theoretical support for clarifying the molecular mechanism of seed deterioration.【Method】 Hybrid maize (Zea mays L.) cultivar Zhengdan 958 seeds were used as experimental material and treated by artificial aging treatment (45℃, 100% relative humidity). DGE analysis was carried out on the Illumina Hiseq 2000 platform using total RNA extracted from 3 d artificial aging treatment and the untreated embryos (CK) of maize seeds. The reads with adaptor and ambiguous sequences, and the low-quality reads were filtered out to obtain the high quality clean reads. Clean reads were mapped to the maize reference genome and genes database using SOAPaligner/SOAP2. The gene expression level was calculated by the RPKM (Reads Per kb per million reads) method. A combination of FDR ＜0.001 and the absolute value of |log2 ratio (T/CK)|≥1 was used as the threshold to determine the significance of gene expression difference. All differentially expressed genes (DEGs) were assigned to the pathways in KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) database and searched for the differentially expressed genes related to ER stress. Quantitative real-time PCR was performed to analyze the expression patterns of ER stress-related genes in the different artificial aging times.【Result】 Analysis of the DEG revealed that 104 DEGs were relevant to the protein processing in ER during the process of artificial aging treatment. A total of 97 DEGs related to ER stress including 81 and 16 genes respectively up- and down-regulated were screened out. The expression levels of ER stress marker BiP gene, as well as ER chaperones, such as CRT, CNT, GRP94 genes were considered to be significantly up-regulated. In particular, 83 DEGs were involved in ER-associated degradation (ERAD) pathway, including 70 up-regulated and 13 down-regulated DEGs. Among them, gene encoding EDEM (ER degradation enhancing mannosidase I-like protein) which is a rate-limiting enzyme of ERAD pathway was down-regulated. Genes involved in protein ubiquitination were altered in expression, including E2 ubiquitin-conjugating enzyme UbcH5, E3 ubiquitin-ligases Hrd1 and Doa10. The results of qRT-PCR analysis validated the diversity and complexity of ER stress-related genes expression in different artificial aging times.【Conclusion】 Artificial aging treatment can cause endoplasmic reticulum stress in maize embryo. The cell can respond to ER stress by inducing up-regulation of ER chaperones genes and activation of the ERAD pathway. Inhibition of ERAD pathway resulted in the accumulation of misfolded proteins in the ER with these leading to further cell damage and subsequently accelerating the loss of seed vigor. Key words: maize; seed aging; differential expressed genes; ER stress; ERAD

导致种子蛋白的破坏和酶功能的丧失，从而造成种 0 引言 子活力降低。ROS 可以直接攻击维持蛋白折叠酶活 【研究意义】种子衰老是一个复杂的过程，即使 性所需要的游离巯基，进而诱导蛋白折叠酶或分子 在最佳的贮藏条件下，衰老也不可避免。种子衰老导 伴侣的功能异常而抑制蛋白的正确折叠，产生内质 致种子生活力和活力下降，给农业生产造成严重损失。 网胁迫[7]。已有研究报道豌豆种子在人工老化过程 因此，阐明种子衰老机理，对发展延长种质资源以及 中发生内质网胁迫[8]。内质网通过激活未折叠蛋白 良种的储藏技术具有重要意义。【前人研究进展】内 应答（unfolded protein response，UPR）功能维持细 质网（endoplasmic reticulum，ER）是调节蛋白质合成 胞的正常功能[1,9-10]。当发生长时间的内质网胁迫时， 和折叠加工的场所。在正常生理或者病理条件下，细 内环境不能及时恢复稳定，还会导致细胞凋亡[11]。植 胞蛋白质异常糖基化、钙离子平衡紊乱及氧化还原状 物在非生物胁迫条件下会诱导 ERS，UPR 在缓解胁迫 态改变等会引起未折叠和错误折叠蛋白在内质网聚 过程中发挥关键作用[12-13]，表明 ERS 和 UPR 参与植 集。当超出内质网的“折叠处理能力”时，内质网的 物环境胁迫的响应。内质网相关性降解（ER-associated 正常生理功能就会受到影响，导致内质网胁迫 degradation，ERAD）是清除内质网上错误折叠蛋白的 （endoplasmic reticulum stress，ERS）的发生[1-3]。细 主要途径和缓解内质网胁迫的重要机制[14]。在酵母 胞代谢过程中产生的 ROS 是引起或加剧种子老化的 和哺乳动物细胞中，ERAD 参与生物体的抗病及抗 主要原因，人工老化处理和长时间自然存放都会引起 胁迫过程[15-16]。植物细胞中的某些底物蛋白通过 种子产生氧化应激。蛋白质是最重要的氧化（破坏） ERAD 途径降解[17-18]，说明 ERAD 途径在植物中也 目标[4]，蛋白中氨基酸的氧化损伤导致蛋白的错误折 确实存在。完整的 ERAD 途径在植物盐胁迫的耐受 叠、功能丧失和对裂解酶敏感性的改变[5]。Rajjou 等[6] 性以及植物激素油菜素内酯介导的植物耐逆性中发 研究表明，控制劣变处理（controlled deterioration test， 挥关键作用[19-20]。自然条件下，影响种子老化的因素 CDT）能引起种子中 ROS 积累，加剧了蛋白的氧化， 很多且时间较长，因此，在研究种子老化机理等相关

3 期 曹广灿等：玉米种胚内质网胁迫相关基因对人工老化处理的响应 431

理论问题时，短时间内很难得到不同老化程度的种子 明提取高质量 RNA，并 用 Nanodrop2000 仪器对 RNA 作为试验材料。人工加速老化方法是从影响种子活力 进行质量检测。数字基因表达谱（Digital Gene 的 2 个关键因素（温度和相对湿度）入手，采用高温 Expression Profiling，DGE）测序由华大基因公司完成。 高湿条件处理种子，加速种子衰老进程[21]，是研究种 样本完成文库构建并质控合格后，使用 Illumina 子劣变机理的有效手段。董国军等[22]通过对 56 份水 HiSeqTM 2000 系统对质控合格的文库进行测序[28]。 稻材料的人工老化指数和自然老化指数研究表明，水 测序仪产生的原始图像数据经 Base Calling 转化为原 稻人工老化技术能较好地与种子的自然老化吻合，人 始序列数据，然后去除原始序列中接头序列、含 N 比 工老化和自然老化在种子耐储性的研究中有着类同的 例大于 10%序列和低质量序列（质量值 Q≤5 的碱基 效果。Rajjou 等[6]研究证明人工控制老化处理的拟南 数占整个 read 的 50%以上），得到 Clean Reads。根 芥种子表现出和种子自然老化过程中相似的分子生化 据玉米参考基因数据库（http://ftp.maizesequence.org/ 特性，可以利用该技术研究自然老化过程中的物质代 current/filtered-set/ ）和基因组数据库（http://ftp. 谢及其调控。吕伟增[23]和张景龙等[24]研究表明，随着 maizesequence.org/current/assembly/），利用短序列比 人工老化处理时间的延长，玉米种子活力表现出明显 对软件 SOAPaligner/SOAP2 将 Clean Reads 分别比对 下降趋势。【本研究切入点】在植物中，内质网胁迫 到参考基因组和参考基因序列。根据 RPKM（Reads Per 和未折叠蛋白应答参与环境胁迫响应过程，然而，在 Kb per Million reads）方法计算基因的表达量。 玉米种子老化过程中，细胞是否发生 ERS 以及如何通 1.3.2 内质网胁迫相关差异基因的筛选和功能注释 过 UPR 处理未折叠和错误折叠蛋白等方面的研究未 通过比较不同样本间的数据筛选出差异表达基因，对 见报道。【拟解决的关键问题】本研究利用基因数字 差异检验的 P 值作多重假设检验校正，通过控制 FDR 表达谱技术研究玉米种胚响应老化的内质网胁迫相关 （false discovery rate）来决定 P 值的域值，按照 FDR 差异表达基因及其表达特性，以期为揭示种子衰老的 ≤0.001 且倍数差异不低于 2 倍的基因为差异表达基 分子机理提供依据。 因[29]。Pathway 显著性富集分析能够确定差异表达基 因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径，有助 1 材料与方法 于进一步了解基因的生物学功能。通过将所有差异表 1.1 材料及处理 达基因向 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and 以玉米杂交种郑单 958 种子为材料，人工老化处 genomes）数据库的各个 Pathway 映射，计算每个 理参照 Basak 等[25]的方法，略有改动。取形状大小整 Pathway 的基因数目，并应用超几何检验，找出差异 齐一致的完整种子置于老化网上，分散均匀，于人工 表达基因中显著富集的 Pathway，从而获得该基因的 老化箱中高温（45℃）、高湿（相对湿度 100%）处 Pathway 功能分类注释。以 P≤0.05 为阈值，满足此 理 1—5 d，然后取出并在室内风干（种子水分达到与 条件的 Pathway 定义为在差异表达基因中显著富集的 处理前基本一致），以正常条件下未老化处理的种子 Pathway[30]。通过对生物学代谢通路结果的分析，筛 为对照。 选种子老化过程中内质网胁迫相关的差异表达基因并 1.2 生理指标测定 进行功能注释分析。 分别剥取人工老化处理 0—5 d 玉米种子的种胚。 1.4 内质网胁迫相关基因的 qRT-PCR 分析 按照 Jana 等[26]的方法，测定各处理种胚中过氧化氢 以玉米基因 Actin1（NM_001155179.1）为内参，

（H2O2）含量。利用硫代巴比妥酸法测定各处理种胚 利用实时荧光定量 PCR 技术分析筛选到的部分内质 中丙二醛（MDA）含 量 [27]，采用并改进分光光度法测 网胁迫相关基因在不同人工老化时间内的表达模式。 定各处理种胚中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶 分别取每个样品 1 μg 的总 RNA 反转录为 cDNA 模板， （POD）和过氧化氢酶（CAT）活性[27]。以上每组试 稀释 10 倍备用。使用 Thermo Scientific Maxima SYBR 验重复测定 3 次。 Green qPCR Master Mix（2×），ROX Solution provided 1.3 内质网胁迫相关基因的筛选和功能注释 试剂盒的反应体系，采用荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad） 1.3.1 玉米种胚总 RNA 提取与数字基因表达谱测序 进行扩增反应。PCR 条件为 95℃ 3 min；95℃ 30 s， 分别以未老化处理和老化处理 3 d 的玉米种胚为材料， 59℃ 30 s，72℃ 30 s，40 个循环；72℃ 4 min，22℃ 按 TransZol Plant 试剂盒（全式金公司，北京）使用说 保存。采用 2-ΔΔCT 法进行定量计算分析，用 SPSS 18.0

432 中 国 农 业 科 学 49卷

软件对数据进行差异显著性分析，每组样品重复 3 次， ＜ 为差异显著。

P 0.05 FW) -1 2 结果

2.1 人工老化处理中玉米种胚 H2O2 的产生及其对膜 丙二醛含量 系统的损伤 MDA content (µmol·g H2O2 在细胞的氧化损伤和信号传导中具有重要作

用，低浓度的 H2O2 具有促进种子萌发的作用，而高浓 度则会对细胞造成氧化胁迫，降低细胞活性。在 0—3 d

时，随着人工老化时间的延长，H2O2 含量呈现出先增 加后降低的趋势，老化处理 3 d 时达到峰值（图 1）。 图 2 人工老化处理对种胚 MDA 含量的影响 Fig. 2 Effects of artificial aging treatment on MDA content of seed embryos

FW) -1 长对细胞膜造成的伤害越严重。 2.2 人工老化处理对玉米种胚抗氧化酶活性的影响 SOD、POD 和CAT 等是植物体内活性氧的清除剂， 过氧化氢含量 content (µmol·g 2

O 它们共同作用使活性氧维持在正常水平，从而防止活性 2 H 氧对细胞造成的损伤。人工老化过程中玉米种胚 SOD、 POD 和 CAT 活性整体呈下降趋势（图 3）。种胚 SOD、 POD 活性在老化 1—2 d 时逐渐降低，老化 3 d 时， SOD、POD 的活性均呈小幅上升，随后又逐渐降低；

图 1 人工老化处理对种胚 H2O2 含量的影响 种胚 CAT 活性呈下降趋势，且在老化 3 d 时降幅较大。

Fig. 1 Effects of artificial aging treatment on H2O2 content of 说明随着老化时间的延长，玉米种胚细胞内 SOD、POD seed embryos 和 CAT 活性下降，清除活性氧的能力降低。 2.3 人工老化处理对内质网胁迫相关基因表达的影响 MDA 是膜脂过氧化的主要产物之一，其含量是 利用数字基因表达谱技术研究了人工老化处理 衡量细胞脂质过氧化水平和生物膜损伤程度的重要标 对玉米种胚差异基因表达的影响，结果表明，人工老 志。在人工老化过程中，种胚中 MDA 含量呈现逐渐 化处理 3 d 后，玉米种胚中有 4 713 个基因差异表达 增加的趋势，且在老化 5 d 时增幅最大（图 2）。说明 （上调 2 874 个，下调 1 839 个）。利用 KEGG 分析 人工老化处理导致膜脂过氧化程度加深，老化时间越 方法对差异表达基因进行功能注释和分类，结果表明，

FW) FW) -1 -1 FW) -1 ·min ·min -1 -1 过氧化物酶活性 过氧化氢酶活性 超氧化物歧化酶活性 SOD activity (U·g POD activity (U·g CAT activity (U·g

图 3 人工老化处理对种胚抗氧化酶活性的影响 Fig. 3 Effects of artificial aging treatment on antioxidant enzyme activity of seed embryos

3 期 曹广灿等：玉米种胚内质网胁迫相关基因对人工老化处理的响应 433

KEGG 数据库注释的差异表达基因有 2 470 个， 通路的有 104 个（4.21%）差异表达基因（表 1），说 Pathway 显著性富集分析发现这些基因参与了 288 条 明人工老化处理导致内质网的正常生理功能受到影 生物学代谢通路（pathway），其中，参与内质网中蛋 响。差异表达基因在内质网上参与蛋白质修饰、折叠、 白质加工（protein processing in endoplasmic reticulum） 运输和错误折叠蛋白降解等过程（图 4）。

表 1 参与内质网蛋白质加工过程的差异表达基因功能注释 Table 1 Function of differentially expressed genes relevant to protein processing in endoplasmic reticulum

基因 ID log2 比值 FDR 值 基因注释

Gene ID log2 ratio FDR value Gene annotation GRMZM2G149946 2.686 2.24E-37 寡糖转移酶 Oligosaccharyl transferase

GRMZM2G044096 1.696 4.55E-18 寡糖转移酶 Oligosaccharyl transferase

GRMZM2G163129 2.322 7.60E-36 葡萄糖苷酶 Glucosidase

GRMZM2G134668 1.748 4.90E-32 钙联接蛋白 Calnexin

GRMZM2G074687 2.249 7.60E-13 钙网织蛋白 Calreticulin

GRMZM2G358059 1.758 7.11E-31 钙网织蛋白 Calreticulin

GRMZM2G077295 1.440 1.48E-05 蛋白质转运蛋白 Protein transport protein

GRMZM2G143725 1.182 8.67E-07 蛋白质转运蛋白 Protein transport protein

GRMZM2G081745 1.186 2.49E-05 蛋白质转运蛋白 Protein transport protein

GRMZM2G019236 -1.525 4.13E-11 蛋白质转运蛋白 Protein transport protein

GRMZM2G114793 1.473 1.39E-32 结合蛋白 Binding protein

GRMZM2G112626 1.865 2.06E-05 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G086964 1.658 7.86E-09 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G170307 1.404 1.01E-15 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G072300 1.579 2.99E-23 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G141931 1.410 1.78E-27 葡萄糖调节蛋白 94 Glucose regulatory proteins 94

GRMZM2G033671 -1.698 1.08E-16 肽链内切酶 Endopeptidase

GRMZM5G807616 -3.737 5.56E-06 内质网甘露糖苷酶Ⅰ型类蛋白 ER mannosidase I-like protein

GRMZM2G150201 1.048 2.31E-17 内质网甘露糖苷酶Ⅰ型蛋白 ER mannosidase I protein

GRMZM2G007385 1.381 2.40 E-04 蛋白质二硫键异构酶 Protein disulfide-isomerase

GRMZM2G073628 1.232 5.31E-06 蛋白质二硫键异构酶 Protein disulfide-isomerase

GRMZM2G033198 -1.669 3.41E-12 蛋白质二硫键异构酶 Protein disulfide-isomerase

GRMZM2G163421 -1.226 3.88E-09 蛋白质二硫键异构酶 Protein disulfide-isomerase

GRMZM2G137704 2.314 5.62E-11 内质网膜蛋白 Bap31 ER membrane protein Bap31

GRMZM2G140582 1.685 8.56E-05 内质网膜蛋白 Bap31 ER membrane protein Bap31

GRMZM2G082976 1.097 1.82E-07 内质网膜蛋白 Derlin-1 ER membrane protein Derlin-1

GRMZM2G056980 11.914 1.58E-05 热休克蛋白 70 Heat shock 70kD protein

GRMZM5G802801 5.873 0 热休克蛋白 70 Heat shock 70kD protein

GRMZM2G428391 4.786 0 热休克蛋白 70 Heat shock 70kD protein

GRMZM2G106429 4.268 5.21E-29 热休克蛋白 70 Heat shock 70kD protein

GRMZM2G111475 2.950 0 热休克蛋白 70 Heat shock 70kD protein

GRMZM2G310431 2.879 0 热休克蛋白 70 Heat shock 70kD protein

AC209784.3_FG007 2.756 0 热休克蛋白 70 Heat shock 70kD protein

GRMZM2G024718 2.173 0 热休克蛋白 70 Heat shock 70kD protein

434 中 国 农 业 科 学 49卷

续表 1 Continued table 1

基因 ID log2 比值 FDR 值 基因注释

Gene ID log2 ratio FDR value Gene annotation GRMZM2G366532 1.687 0 热休克蛋白 70 Heat shock 70kD protein

GRMZM2G079668 1.720 8.74E-147 热休克蛋白 70 Heat shock 70kD protein

GRMZM5G833699 5.250 0 热休克蛋白 90 Heat shock 90kD protein

GRMZM2G024668 3.003 0 热休克蛋白 90 Heat shock 90kD protein

GRMZM2G069651 1.614 0 热休克蛋白 90 Heat shock 90kD protein

GRMZM2G012631 1.463 1.08E-254 热休克蛋白 90 Heat shock 90kD protein

GRMZM2G354746 10.234 1.16E-09 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G028218 2.458 7.66E-143 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G144997 2.165 5.83 E-04 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G434839 2.111 9.78E-04 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G134917 1.160 1.05E-154 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G118731 1.244 6.78E-50 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G159720 1.242 3.08E-07 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

AC235541.1_FG002 1.162 2.22E-08 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G140070 -2.689 1.74E-04 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G364069 -1.378 0 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G134980 -1.140 1.89E-89 热休克蛋白 40 Heat shock 40kD protein

GRMZM2G150201 1.048 2.31E-17 热休克蛋白 110 Heat shock 110kD protein

GRMZM2G481605 8.838 5.63E-257 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G049767 8.192 2.04E-162 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G306679 7.370 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G479260 6.715 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G375517 6.705 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM5G858128 6.525 1.83E-219 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G306714 6.277 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G335242 5.965 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G346839 5.966 5.89E-64 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G080724 5.608 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G012455 5.193 1.34E-132 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G311710 4.985 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G333635 4.484 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G158232 4.332 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G034157 4.271 8.22E-21 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G331701 4.311 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM5G849535 4.303 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G083810 4.185 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G085934 3.880 4.36E-09 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G404274 3.882 3.16E-195 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G332512 3.943 1.22E-68 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G149647 3.521 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

3 期 曹广灿等：玉米种胚内质网胁迫相关基因对人工老化处理的响应 435

续表 1 Continued table 1

基因 ID log2 比值 FDR 值 基因注释

Gene ID log2 ratio FDR value Gene annotation GRMZM2G098167 3.486 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM2G046382 3.228 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

AC208204.3_FG006 3.105 0 热休克蛋白 20 Heat shock 20kD protein

GRMZM5G839014 1.364 1.15E-04 泛素硫酯酶 Ubiquitin thioesterase

GRMZM2G021598 -1.445 2.36E-07 泛素硫酯酶 Ubiquitin thioesterase

GRMZM2G022627 8.819 6.68E-05 磷脂酶 A-2 活化蛋白 Phospholipase A-2-activating protein

GRMZM2G315264 1.122 7.58E-05 内质网腺苷三磷酸酶 P97 Endoplasmic reticulum ATPase P97

GRMZM2G037094 -1.122 6.89E-04 辐射敏感蛋白 23 Radiation sensitive protein 23

GRMZM2G148115 -1.537 7.47E-06 去泛素化酶 Deubiquitinating enzyme

GRMZM2G053574 1.669 1.57E-41 泛素融合降解蛋白 1 Ubiquitin fusion degradation protein 1

GRMZM2G114220 -1.419 2.25E-20 泛素融合降解蛋白 1 Ubiquitin fusion degradation protein 1

GRMZM2G113619 1.998 1.23E-15 E3 泛素连接酶 Doa10 E3 ubiquitin-protein ligase Doa10

GRMZM2G103755 -1.752 2.89E-04 E3 泛素连接酶 Doa10 E3 ubiquitin-protein ligase Doa10

GRMZM2G020814 1.051 5.24E-09 E3 泛素连接酶 Hrd1 E3 ubiquitin-protein ligase Hrd1

GRMZM2G098637 -1.537 4.09 E-04 E3 泛素连接酶 Hrd1 E3 ubiquitin-protein ligase Hrd1

GRMZM2G119930 -1.241 4.30E-37 E3 泛素连接酶 Hrd1 E3 ubiquitin-protein ligase Hrd1

GRMZM2G393349 -1.192 2.21 E-04 E3 泛素连接酶 Hrd1 E3 ubiquitin-protein ligase Hrd1

GRMZM2G133016 1.437 5.16E-14 跨膜蛋白 Transmembrane Protein

GRMZM2G040803 2.506 2.91E-213 E3 泛素连接酶 RMA1 E3 ubiquitin-protein ligase RMA1

GRMZM2G169994 1.363 2.31E-05 E3 泛素连接酶 RMA1 E3 ubiquitin-protein ligase RMA1

GRMZM2G069215 1.240 8.97E-08 E3 泛素连接酶 RMA1 E3 ubiquitin-protein ligase RMA1

GRMZM2G102471 2.968 0 E2 泛素结合酶 UbcH5 E2 ubiquitin-conjugating enzyme UbcH5

GRMZM2G156517 2.156 4.34E-32 E2 泛素结合酶 UbcH5 E2 ubiquitin-conjugating enzyme UbcH5

GRMZM2G152857 5.618 4.61E-49 E3 泛素连接酶 CHIP E3 ubiquitin-protein ligase CHIP

GRMZM2G073310 3.563 1.87E-13 E3 泛素连接酶 CHIP E3 ubiquitin-protein ligase CHIP

GRMZM2G059042 2.387 2.27 E-04 E3 泛素连接酶 CHIP E3 ubiquitin-protein ligase CHIP

GRMZM5G891990 1.183 4.11E-07 E3 泛素连接酶 CHIP E3 ubiquitin-protein ligase CHIP

GRMZM2G025214 1.208 1.04E-08 E3 泛素连接酶 CHIP E3 ubiquitin-protein ligase CHIP

GRMZM2G166089 -1.213 7.29E-18 蛋白复合体骨架蛋白 Protein complex skeleton protein

GRMZM2G109725 2.165 2.68E-07 S 期激酶相关蛋白 S-phase kinase-associated protein

结合蛋白 BiP（binding protein）是一类重要的分 能注释和分析，发现 97 个内质网胁迫相关基因（81 子伴侣蛋白，又称葡萄糖调节蛋白 78 （glucose- 个上调，16 个下调）。 regulated protein 78，GRP78），是热休克蛋白 70 家族 内质网胁迫相关差异表达基因中，1 个钙联接蛋白 的成员之一。通常在内质网胁迫条件下，BiP/GRP78 （Calnexin，CNX）基因（GRMZM2G134668）和 2 个 的上调表达明显，所以 BiP/GRP78 的诱导表达被广泛 钙网织蛋白（Calreticulin，CRT）基因（GRMZM2G074687 认为是内质网胁迫的标志[31]。如表 1 和图 4 所示，BiP 和 GRMZM2G358059）显著上调表达。编码发挥分子 在人工老化处理条件下显著上调表达，说明玉米种子 伴侣功能的葡萄糖调节蛋白 94 基因 GRP94 老化过程中发生了内质网胁迫，并暗示该过程中未折 （GRMZM2G141931）也表现为上调。同时可以看出， 叠和错误折叠蛋白增多。通过对差异表达基因进行功 差异表达基因主要集中在内质网相关性降解（ERAD）

436 中 国 农 业 科 学 49卷

途径（图 4）。在种子人工老化过程中共检测到 83 个 不显著。 差异表达基因（70 个上调，13 个下调）参与 ERAD 热休克蛋白属于分子伴侣蛋白家族，可以结合未 途径中底物蛋白的识别、转运和泛素化后被蛋白酶体 折叠或错误折叠蛋白质，促进新生蛋白质的正确折叠。 降解 3 个过程。其中 1 个 ERManl（GRMZM2G150201） 除 BiP 外，还有 10 个 Hsp70（GRMZM2G137704 等） 上调表达，1 个 EDEM（GRMZM5G807616）下调表 显著上调表达。其他热休克蛋白家族基因中，4 个 达。在转运的过程中促进底物释放的 Derlin Hsp90（GRMZM5G833699 等）显著上调表达；Hsp40 （GRMZM2G134668）上调表达，将底物蛋白传递给 中有 12 个基因（GRMZM2G354746 等）显著上调表 泛素酶复合体的相关酶基因 OS-9 和 XTP3-B 表达差异 达，最大上调倍数约为 10 倍（GRMZM2G354746），

上调基因用红色标注，下调基因用绿色标注，2 种颜色都标注的基因可能有不同的亚型 Red boxes refer to genes whose associated differentially expressed genes(s) was up-regulated in the artificial aging treated seed embryo cells. Green boxes refer to genes whose associated differentially expressed genes(s) was down-regulated. Boxes with both red and green colors indicate genes that might have isoforms

图 4 参与内质网蛋白质加工过程的差异表达基因 Fig. 4 Identification of differentially expressed genes relevant to protein processing in endoplasmic reticulum

3 个显著下调基因中，最大下调倍数约为 3 倍 达，3 个基因（GRMZM2G098637、GRMZM2G119930 （GRMZM2G140070）；25 个 Hsp20 家族基因全部上 和 GRMZM2G393349 ）表现为下调。1 个 Sel1L 调表达。 （GRMZM2G133016）显著上调表达，跨膜蛋白 SEL1 在泛素酶复合体组分的差异表达基因中，2 个 E2 是 HRD3 的同系物，能与 HRD1 相互作用而发挥其 泛素结合酶基因 UbcH5 （ GRMZM2G102471 和 功能[32]。DOA10 泛素酶复合体核心组件的泛素连接 GRMZM2G156517）分别上调 3.3 倍和 2.2 倍。4 个 酶基因 DOA10 有 1 个上调（GRMZM2G113619）和 HRD1/HRD3 泛素酶复合体中的核心组件 HRD1 泛素连 1 个下调表达（GRMZM2G103755），且上调倍数 接酶基因，其中 1 个基因（GRMZM2G020814）上调表 大于下调倍数。还检测到 3 个保守泛素连接酶基因

3 期 曹广灿等：玉米种胚内质网胁迫相关基因对人工老化处理的响应 437

RMA1（GRMZM2G040803、GRMZM2G169994 和 以上结果表明，玉米种子人工老化过程中，种胚 GRMZM2G069215）上调表达。2 个内质网膜蛋白基 细胞产生内质网胁迫。内质网胁迫相关基因的差异表 因 Bap31（GRMZM2G137704 和 GRMZM2G140582） 达（如分子伴侣蛋白基因上调表达）和 ERAD 途径积 上调表达，Bap31 蛋白能与 RMA1 蛋白、Derlin-1 蛋 极响应内质网胁迫。未折叠和错误折叠蛋白产生和积 白发生相互作用，并参与对内质网内膜蛋白的分选工 累影响蛋白质的正常功能，从而对细胞造成伤害，导 作[33]。5 个泛素连接酶基因 CHIP（GRMZM2G152857 致种子活力降低。 等）上调表达，最大上调 5.6 倍。在泛素化修饰的底 2.4 内质网胁迫相关基因的表达特征分析 物蛋白从内质网膜上脱离过程中发挥作用的 1 个 P97 以玉米 Actin1（NM_001155179.1）为内参，设计 和 2 个 Ufd1 发生差异表达。1 个编码辐射敏感蛋白 12 个内质网胁迫相关基因特异的 qRT-PCR 引物，扩 RAD23 的基因（GRMZM2G037094）下调表达，RAD23 增片段为 86—200 bp（表 2）。qRT-PCR 结果（图 5） 能促使泛素化修饰的底物蛋白进入 26S 蛋白酶体被降 表明，BiP 从老化第 1 天到第 4 天表现出逐渐上调表 解[34]。 达，说明随着老化程度的加深，种子可能遭受持续性

表 2 内质网胁迫相关基因表达分析所用引物 Table 2 Primers for expression analysis of ERS related genes 基因 ID 号 引物序列 退火温度 产物长度 Gene ID Primer sequences (5′-3′) Annealing temperature (℃) Product size (bp) NM_001155179.1 F：GTATGAGCAAGGAGATCAC 58.9 194 （ ） Actin1 R：TTAGAAGCACTTCATGTGG 59.0

GRMZM2G114793 F：TGTATGCGAGTGAGTCTAT 59.1 155 （ ） Bip R：TTGAACCAATCACGGATG 59.1

GRMZM2G134668 F：TATGGCTAGTCTCCACATT 59.0 135 （ ） CNX R：CAATGATCCTCTGTTCGTTA 59.0

GRMZM2G358059 F：GTGCTGAATCTAATTCTTGTG 59.0 86 （ ） CRT R：CAATGCCAATGTACTTCAAG 59.0

GRMZM5G807616 F：CTGTATGATGATTCATTCTTGAG 59.0 200 （ ） EDEM R：AACTAATCTGAAGACATTACTCA 59.0

GRMZM2G150201 F：GGTGTTAGAGCATATACATACA 59.0 132 （ ） ERManI R：CTGTGAAGATAATCCATGTAATG 59.0

GRMZM2G007385 F：CAAGAAGAAGGCATGGTT 59.0 177 （ ） PDI R：TTACGAACACATAGTCATAGAG 59.0

GRMZM2G082976 F：TTCTCTACTTCCGCAAGA 59.0 130 （ ） Derlin R：AACAAGCATCCTCTACAAC 59.0

GRMZM5G802801 F：TCCGTTCAGAGTGATATGA 59.0 152 （ ） Hsp70 R：GCGATCTCCTTCATCTTG 59.0

GRMZM2G113619 F：GATGAAGATGACGACGAC 59.0 163 （ ） Doa10 R：GATGTAGAACGGAAGCAG 58.9

GRMZM2G020814 F：TACCTCAAGTAATTGATGTATGT 59.0 193 （ ） Hrd1 R：TCAGATAGATACGCACTCA 58.8

GRMZM2G133016 F：ATACGATTAGGACATAATGCTT 59.0 108 （SellL） R：GTCAATGCCAACACTGTA 59.0

GRMZM2G102471 F：TTCATCTCTTCTTGTATGGC 59.0 134 （UbcH5） R：GCATTCTATGTGACGAGG 59.0

438 中 国 农 业 科 学 49卷 相对表达量 Relative expression Relative 相对表达量 Relative expression 相对表达量 Relative expression 相对表达量 Relative expression

柱状图上的不同字母表示差异达到 5%显著水平 Different letters on each column are significantly different at 5% level

图 5 内质网胁迫相关基因在不同人工老化时间内的表达 Fig. 5 Expression patterns of ER stress-related genes in different artificial aging treatment times

的内质网胁迫，而到老化处理第 5 天又下调表达，可 在不同老化处理时间内有不同的表达模式，可能和内 能是由于其本身也受到了氧化损伤。UbcH5 表现出类 质网胁迫的发生和缓解紧密相连。 似的表达模式，但在老化处理第 5 天表达水平低于对 3 讨论 照表达量。EDEM 在老化初期表现为下调表达，随后 又逐渐上调表达。Hsp70、ERManI 和 Hrd1 随着老化 3.1 种子老化过程中抗氧化酶体系遭到破坏,导致细 时间的增加逐渐上调表达，其中 Hsp70 相对表达量最 胞清除 ROS 能力下降 高，说明 Hsp70 在老化过程中能够大量合成。CNX 和 ROS 被认为是种子活力丧失活力的导火索[35-37]。

Doa10 的表达模式有高度的相似性，在老化 4 d 时表 H2O2 作为 ROS 中的重要成员之一，不仅可以直接氧 达量最高。CRT、PDI、Derlin 和 Sel1L 在老化 3 d 时 化附近的脂类、核酸和蛋白质，甚至可以自由穿过细 表达量最高，其中 CRT 在老化处理第 4 天和第 5 天逐 胞膜，游离到附近位置导致相关物质的氧化修饰，还 渐下调，PDI 和 Derlin 在老化处理第 4 天和第 5 天的 可以利用 Fenton 反应生成羟自由基（·OH），并通过 相对表达水平差别不大，Sel1L 则在第 4 天表现为下 多种途径诱导细胞凋亡[38-39]。抗氧化酶系统在维护种 调，而在第 5 天又表现为上调。内质网胁迫相关基因 子活力和调节植物的生长和发育中起重要作用，研究

3 期 曹广灿等：玉米种胚内质网胁迫相关基因对人工老化处理的响应 439

表明植物种子老化和抗氧化系统的各种酶活性降低存 一种内质网胁迫产生的相关 ROS 和线粒体功能紊乱 在密切关系，抗氧化能力的降低导致 ROS 积累并造成 潜在的信号机制[49]。因此，推测在种子老化过程中， 氧化损伤[40-42] 。本研究发现玉米种胚中抗氧化酶 ROS 的产生和积累改变了内质网的氧化还原环境导 （SOD、POD、CAT）活性随着老化程度的加剧均呈 致内质网胁迫的发生，内质网在促进未折叠和错误折 现出下降的趋势，表明细胞的抗氧化酶系统在人工老 叠蛋白形成正确的二硫键过程中又可能产生大量的 化处理过程中遭到破坏，造成清除 ROS 的能力下降。 ROS。内质网胁迫信号作用于线粒体，进一步加剧了

人工老化处理 3 d，玉米种胚中 H2O2 含量达到最大值， 线粒体 ROS 的产生，导致细胞中 ROS 水平升高，进 说明 ROS 在种子老化初期大量产生和积累。到老化后 而对细胞造成严重损伤。 期，随着种子代谢水平降低和死亡，ROS 含量逐渐降 3.3 ERAD 途径受阻可能是种子活力丧失的关键环节 低。玉米种胚 MDA 含量随着老化时间的延长不断增 之一 加，且在人工老化处理 3 d 后增幅明显，表明人工老 ERAD 是内质网上特定的泛素/26S 蛋白酶体系 化过程中加剧了细胞膜的脂质过氧化。 统，研究表明，ERAD 和酵母中的各种胁迫反应紧密 3.2 内质网胁迫可能导致玉米种胚细胞内 ROS 水平 相关[16,50-51]。通过基因组序列和芯片试验证实拟南芥 进一步升高 中的 ERAD 组分和酵母以及哺乳动物相似，拟南芥可 内质网是细胞的蛋白质加工厂，只有形成正确结 以通过上调潜在的与酵母/哺乳动物同源的 ERAD 组 构的蛋白质才能发挥生物学功能。Chen 等[8]发现豌豆 分来缓解内质网胁迫[52-53]。盐胁迫处理条件下，未折 种子在人工老化处理 12 d 后，内质网胁迫的标志性蛋 叠蛋白在内质网积累并诱发内质网胁迫，ERAD 通路 白 BiP2 上调，表明老化能够引起豌豆种子细胞发生内 中 HRD1/HRD3 复合物中 HRD3A 的缺失导致未折叠 质网胁迫。本研究检测到 BiP（GRMZM2G114793） 蛋白应答的改变，增加了植物对盐胁迫的敏感性，导 在玉米种子老化 3 d 后显著上调表达，说明玉米种胚 致大量 ERAD 底物在植物细胞中积累，说明 ERAD 对 细胞在老化过程发生了内质网胁迫，内质网正常的蛋 植物抵抗盐胁迫也是非常必要[19]。UBC32 是一个定位 白折叠功能受到损伤。二硫键的正确形成是保证蛋白 于内质网的具有生化活性的泛素结合酶，是植物 质成熟和稳定性的关键，非天然二硫键的形成和半胱 DOA10 复合体中不可缺少的组分，DOA10-UBC32 参 氨酸残基的错配都将导致蛋白质的错误折叠或者无法 与了植物激素油菜素内酯（BR）介导的植物耐盐性[20]。 形成天然构象[43]。真核细胞中，蛋白质二硫键异构酶 本研究发现玉米种子人工老化过程中 E2 泛素结合酶 （PDI）、内质网蛋白 p72（ERp72）等内质网氧化还 基因 UbcH5、E3 泛素连接酶基因 Hrd1 和 Doa10 等发 原酶家族能够催化蛋白质的氧化折叠，其中 PDI 是具 生显著的表达变化，表明 ERAD 途径能够响应人工老 有酶活性的分子伴侣[44]。内质网氧化物蛋白（ERO-1） 化处理。 能将还原态的折叠酶重新氧化并利用活性氧作为最后 ERAD 清除错误折叠蛋白的过程需要大量不同功 的电子受体，电子从蛋白巯基转移到分子氧的过程中 能的蛋白质参与，内质网甘露糖苷酶Ⅰ型蛋白 产生 ROS[45]。研究表明形成非天然二硫键的蛋白质巯 （ERManl）和甘露糖苷酶Ⅰ型类蛋白（EDEM）在底 基被谷胱甘肽（GSH）还原后和 ERO-1、PDI 等相互 物识别过程发挥重要作用。EDEM 是定位于内质网的 作用被重新氧化，二硫键断裂和形成的循环产生更多 跨膜蛋白并作为蛋白受体和被糖基化的寡糖基结合， 的 ROS[46]。本研究检测到 4 个差异表达的 PDI，说明 使错误折叠的蛋白从 Calnexin/Calreticulin 循环释放 在种子老化过程中，蛋白质二硫键的形成过程受到调 并被降解[54-55]。有研究表明 EDEM 是启动 ERAD 途 控。蛋白质在内质网上的折叠和重折叠是高耗能过程， 径的限速步骤之一。EDEM 可以通过促进底物释放来 蛋白质的错误折叠大量消耗 ATP 可能刺激线粒体的 加速 ERAD 途径[56]。细胞内 EDEM 的水平降低导致 氧化磷酸化，增加 ATP 和 ROS 的产生[47]。未折叠蛋 错误折叠蛋白在内质网中的大量积累，从而影响了内 白在内质网的积累能促进 Ca2+从内质网释放进入细胞 质网中正常蛋白的折叠装配效率[57]。Molinari 等[58] 质，也增加了线粒体上 ROS 的产生[47]。通过干扰线 研究发现过表达 EDEM 能加速膜结合和可溶性的 粒体的呼吸作用时能够显著减少未折叠蛋白引发的 ERAD 底物降解，而 EDEM 下调则造成 ERAD 底物 ROS 积累[48]。线粒体产生的 ROS 可能反过来加强内 的降解速率减慢。本研究检测到种子老化过程中 质网胁迫反应，从而增强线粒体 ROS 的积累，这也是 EDEM（GRMZM5G807616）下调表达，EDEM 下调

440 中 国 农 业 科 学 49卷

可能延缓了错误折叠蛋白从 Calnexin/Calreticulin 循 [2] Zhao L H, Ackerman S L. Endoplasmic reticulum stress in health and 环中释放，导致 ERAD 途径受到抑制，错误折叠蛋 disease. Current Opinion in Cell Biology, 2006, 18: 444-452. 白在内质网上堆积并对细胞造成伤害，导致种子活 [3] Xu C Y, Bailly-Maitre B, Reed J C. Endoplasmic reticulum stress: 力下降。本研究发现 2 个泛素蛋白结合酶 UbcH5 Cell life and death decisions. The Journal of Clinical Investigation, （GRMZM2G102471，GRMZM2G156517）显著上调 2005, 115: 2656-2664. 表达，但 UbcH5 是何种 ERAD 复合体的主要组分还 [4] Davies M J. The oxidative environment and protein damage. 需要进一步研究。泛素连接酶 HRD3A 和 HRD1 是植 Biochimica et Biophysica Acta, 2005, 1703: 93-109. 物中 ERAD 的重要组成部分，负责 bri1-5 和 bri1-9 蛋 [5] Berlett B S, Stadtman E R. Protein oxidation in ageing, disease, and 白的降解[19,59]，本研究结果显示 4 个 Hrd1 发生表达 oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(33): 变化，表明 HRD1 复合体在种子老化过程中参与蛋白 20313-20316. 泛素化过程。2 个 DOA10 发生差异表达说明 DOA10 [6] Rajjou L, Lovigny Y, Groot S P, Belghazi M, Job C, Job D. 泛素复合体可能也在促进底物蛋白泛素化过程中发挥 Proteome-wide characterization of seed aging in Arabidopsis: A 功能。ATP 酶 P97 在泛素蛋白融合降解蛋白 1（Ufd1） comparison between artificial and natural aging protocols. Plant 和核定位蛋白 4（Npl4）等辅助因子的共同作用下使 Physiology, 2008, 148: 620-641. 底物蛋白被泛素化修饰并从内质网膜结构上解离下 [7] Rabek J P, Boylston W H, Papaconstantinou J. Carbonylation of ER 来，泛素化的蛋白会在辐射敏感蛋白 RAD23 和 Dsk2 chaperone proteins in aged mouse liver. Biochemical and Biophysical 蛋白的作用下被转运至蛋白酶体[60-61]。本研究检测到 Research Communications, 2003, 305: 566-572. P97（GRMZM2G315264）上调表达，表明错误蛋白 [8] Chen H, Osuna D, Colville L, Lorenzo O, Graeber K, Küster H, 在转运和释放过程中需要的能量有可能提高，RAD23 Leubner-Metzger G, Kranner I. Transcriptome-wide mapping of pea （GRMZM2G037094）下调影响了底物蛋白进入 26S seed ageing reveals a pivotal role for genes related to oxidative stress 蛋白酶体的过程。 and programmed cell death. PLoS ONE, 2013, 8(10): e78471. 综上所述，在种子老化过程中，大量差异基因表 [9] Schröder M, Kaufman R J. The mammalian unfolded protein response. 达参与了错误折叠蛋白质的识别、转运和降解 3 个过 Annual Review of Biochemistry, 2005, 74: 739-789. 程。虽然 ERAD 途径积极响应内质网胁迫，但关键基 [10] Yoshida H. ER stress and diseases. FEBS Journal, 2007, 274(3): 因 EDEM 下调可能降低了ERAD 途径对错误折叠蛋白 630-658. 的降解速率，导致错误折叠蛋白积聚从而对细胞造成 [11] Rao R V, Ellerby H M, Bredesen D E. Coupling endoplasmic 伤害。由此推测 ERAD 途径受阻可能是种子活力丧失 reticulum stress to the cell death program. Cell Death and 的关键环节之一，该结论还需要试验进一步验证。 Differentiation, 2004, 11: 372-380. [12] Fujita M, Mizukado S, Fujita Y, Ichikawa T, Nakazawa M, Seki M, 4 结论 Matsui M, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Identification of 利用数字基因表达谱技术检测到玉米种胚的 97 stress-tolerance-related transcription-factor genes via mini-scale 个内质网胁迫相关基因响应人工老化处理，差异基因 full-length cDNA Over-expressor (FOX) gene hunting system. 的表达涉及蛋白折叠和降解等过程。玉米种子老化过 Biochemical and Biophysical Research Communication, 2007, 364: 程中抗氧化酶体系遭到破坏，导致细胞清除 ROS 的能 250-257. 力降低。玉米种胚细胞在老化过程中发生内质网胁迫， [13] Jia X Y, Xu C Y, Jing R L, Li R Z, Mao X G, Wang J P, Chang X P. 细胞通过上调分子伴侣基因表达和诱导 ERAD 途径响 Molecular cloning and characterization of wheat calreticulin (CRT) 应内质网胁迫。ERAD 途径受阻可能引起错误折叠蛋 gene involved in drought-stressed responses. Journal of Experimental 白聚集从而造成细胞损伤，最终导致种子活力降低甚 Botany, 2008, 59(4): 739-751. 至丧失。 [14] Ruggiano A, Foresti O, Carvalho P. ER-associated degradation: Protein quality control and beyond. The Journal of Cell Biology, 2014, References 204(6): 869-879. [1] Schröder M, Kaufman R J. ER stress and the unfolded protein [15] Meusser B, Hirsch C, Jarosch E, Sommer T. ERAD: The long road to

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玉米秸秆低温高效降解复合菌系 GF-20 的菌种组成 及降解稳定性研究

青格尔，高聚林，于晓芳，胡树平，王志刚，王 振，闹干朝鲁

（内蒙古农业大学农学院，呼和浩特 010019）

摘要：【目的】探索不同温度及 pH 条件对玉米秸秆低温高效降解复合菌系的玉米秸秆分解稳定性及菌群结构 稳定性的影响，完善菌系培养方法，促进其应用开发利用。【方法】以低温高效降解复合菌系 GF-20 为研究对象， 在 10℃条件下连续继代培养 45 代、不同温度和 pH 条件下连续继代培养 15 代，分别获得多组不同代数（F）、不 同温度（T）和 pH（P）条件下的菌系。测定各复合菌系发酵液 pH、玉米秸秆降解率及纤维素酶活，评价复合菌系 的玉米秸秆分解稳定性；利用 PCR-DGGE 技术结合主成分分析法对菌群组成结构的稳定性进行研究。【结果】在 10℃条件下经连续继代培养 40 代和在温度 4—30℃、pH 6.0—9.0 条件下继代培养获得的不同复合菌系发酵液 pH 均随发酵时间的延长趋近中性；玉米秸秆降解率在 27.59%—32.53%，除 F40 显著高于 F5 外，其余无显著差 异；纤维素酶活性呈高代菌系大于低代菌系，温度 4—10℃和 pH 6.0—9.0 条件下，对复合菌系产酶有促进作 用，纤维素酶活为 1.34—1.84 IU·mL-1；复合菌系的纤维素酶在较低的温度和较宽的 pH 范围内具有良好的温度 和 pH 稳定性，酶促反应温度 15—30℃和 pH 4.0—9.0 内仍保持 80%以上的纤维素酶活力；复合菌系 F5—F45、 T4—T30 和 P6.0—P9.0 的 DGGE 条带差异不显著，表明菌系的菌种组成稳定；而在偏酸（pH=4、5）和偏碱性（pH=10） 条件下继代培养，复合菌系秸秆降解率和纤维素酶活均显著降低，菌种组成发生变化，进而影响性质与功能稳定 性。PCR-DGGE 共检测到 18 个条带，其中关键菌株分别为 Bacillus licheniformis、Azonexus hydrophilusd、 Azospira oryzae、Arobacter cloacae、Cellvibrio mixtus subsp. Mixtus、Bacillus tequilensis、Clostridium populeti 和 Clostridium xylanolyticum。【结论】复合菌系 GF-20 在温度 4—30℃、pH 6.0—9.0 条件下经过多 代继代培养，仍然保持了较高的玉米秸秆分解活性和菌种组成稳定性，具有良好的应用前景。 关键词：玉米秸秆降解；复合菌系 GF-20；低温；纤维素酶活性；菌种组成稳定性

Function and Composition Stability of a Composite Microbial System GF-20 with Efficient Corn Stalk Decomposition Under Low Temperature

Qingge-er, GAO Ju-lin, YU Xiao-fang, HU Shu-ping, WANG Zhi-gang, WANG Zhen, Naoganchaolu BORJIGIN

(College of Agriculture, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019)

Abstract: 【Objective】 In order to improve the culturing methodology of corn stalk decomposing microbes and promote its utilization, the present study evaluated the impact of different culturing conditions on the community composition of a composite microbial system GF-20 and on its decomposing activity of corn stalk.【Method】 Composite microbial system GF-20 was continuously sub-cultured to the 45th generation under 10℃ and to 15th generation under different temperatures and pH conditions to obtain different microbial communities (F, T, P). Then the dynamics of fermenting pH, corn stalk decomposing ratio and cellulose

收稿日期：2015-06-10；接受日期：2015-10-18 基金项目：国家科技支撑计划（2011BAD16B13，2012BAD04B04，2013BAD07B04，2011BAD16B14）、国家玉米产业技术体系（CARS-02-63） 联系方式：青格尔，E-mail：[email protected]。通信作者高聚林，E-mail：[email protected]；通信作者于晓芳，E-mail：[email protected]

444 中 国 农 业 科 学 49卷 enzyme activities were determined, so as to estimate the corn stalk decomposing activity of the composite microbial system. Furthermore, the community composition stability was analyzed by PCR-DGGE technique combined with a principal component analysis.【Result】 The results showed that the pH value tended to be neutral over the fermentation time, and the straw degradation rate ranged in 27.59%-32.53%, in which no difference was shown among the successive 40-generation sub-cultured communities except F40 and F5, neither among the sub-cultured communities under temperature of 4-30℃ and under pH of 6.0-9.0. Cellulose enzyme activity of high generation was higher than that of low generation, and the enzyme production of the microbial community could be promoted under temperature of 4-10℃ and pH of 6.0-9.0, cellulase activity ranged in 1.34-1.84 IU·mL-1. Cellulase activity of composite microbes showed good stability under lower temperature and in a wide pH range, enzymatic reaction temperature within 15-30℃ and pH within 4.0-9.0 could keep more than 80% of enzyme activity. Furthermore, DGGE bands of F5-F45, T4-T30 and P6-P9 showed no significant differences indicated that the strains composition maintained good stability. However, under acidic (pH=4, 5) or alkaline (pH=10) subculture conditions, the corn stalk degradation rate and cellulase activity significantly decreased, and community composition also changed remarkably, thereby affected the property and functional stability. According to PCR-DGGE profiles, a total of 18 strains were detected, the key strains of which were Bacillus licheniformis, Azonexus hydrophilusd, Azospira oryzae, Arobacter cloacae, Cellvibrio mixtus subsp. Mixtus., Bacillus tequilensis, Clostridium populeti and Clostridium xylanolyticum, respectively. 【 Conclusion 】 Composite microbial community GF-20 sub-cultured under different conditions (temperature 4-30℃, pH 6.0-9.0) kept efficient corn stalk decomposing activity and stable community composition structure, a good application prospect should be anticipated. Key words: decomposition of corn stalk; composite microbial community GF-20; low temperature; cellulose enzyme activity; composition stability

菌系，但是，应用于高寒地区低温（4—10℃）高效降 0 引言 解玉米秸秆复合菌系的相关研究未见报道。且前人报 【研究意义】木质纤维素占地球光合产物的 60% 道的复合菌系均是在限定的条件下发挥秸秆分解功 以上，是土壤有机质的重要来源[1]。但是秸秆中的木 能，所筛选的菌系不具有广适性，应用于多变的生态 质纤维素难以快速分解是限制秸秆物质生物转化的关 环境时受到限制。【拟解决的关键问题】本研究以筛 键难题[2-4]。因此，人工加速分解木质纤维素不仅可及 选出的低温高效玉米秸秆降解复合菌系 GF-20 为试验 时处理农业秸秆有机物，补充土壤有机质，而且对环 材料，分别在不同培养温度及 pH 条件下继代培养， 境治理和秸秆生物质资源的开发利用具有重要意义。 通过考察各复合菌系玉米秸秆分解能力和菌群结构特 【前人研究进展】作物秸秆被认为是重要的生物质能 性，明确该复合菌系的稳定性，探索其应用最适温度 源，但由于其组成成分很难被单一微生物分解，因此 及 pH 条件，为开发利用提供理论依据和技术支持， 如何利用复合微生物降解秸秆成为研究的热点。目前 对其他高效降解菌系的鉴定选育和利用具有一定的借 已报道了多组从不同环境中筛选出具有良好纤维素分 鉴意义。 解活性的菌群[5-10]。其中，复合菌系的稳定性是其具 1 材料与方法 有利用价值的重要前提之一，而温度及 pH 是影响复 合菌系中微生物生长和生物活性，进而影响到微生物 1.1 试验时间、地点 菌群结构和功能的主要条件，因此前人对温度和 pH 试验于 2013—2014 年在内蒙古农业大学玉米中 对复合菌系的稳定性的研究非常重视[11-12]。复合系 心微生物实验室（内蒙古包头市萨拉齐镇）进行。 WSC-6 经过多代继代培养、不同起始 pH 以及高温处 1.2 供试材料 理，复合菌系的纤维素分解能力基本相同，具有良好 供试复合菌系 GF-20 为本实验室筛选驯化出的玉 的稳定性[13]；Lü [14-15]研究表明，在不同温度条件下富 米秸秆低温高效降解复合菌系，主要菌种组成为 集培养，可显著影响复合菌系的秸秆降解率及菌种组 Cellvibrio mixtus subsp.，Azospira oryzae，Clostridium 成；复合菌系 ADS3 在不同温度条件下秸秆降解率存 populeti，Paludibacter propionicigenes，Bacillus sp.等。 在显著差异，温度越高，微生物活性越大，但微生物 玉米秸秆取自内蒙古农业大学蒙西试验站（内蒙古包 组成没有发生变化[16]。【本研究切入点】大量资料表 头市土右旗萨拉齐镇）试验田收获的玉米秸秆（C/N 为 明，前人已研究出适宜于高温和中温条件的秸秆降解 48.98，纤维素、半纤维素和木质素含量分别为 51.24%、

3 期 青格尔等：玉米秸秆低温高效降解复合菌系 GF-20 的菌种组成及降解稳定性研究 445

-1 -1 32.72% 和 9.15%，全氮 6.67 g·kg ，全磷 2.78 g·kg ， 震荡培养 12 d，测定内切-1,4-β-葡聚糖酶（CX），每 全钾 11.48 g·kg-1），洗净烘干后剪成 1—2 cm 短节。 处理 4 次重复，参照国际理论与应用化学联合会 1.3 培养条件 （IUPAC）推荐的方法测定。 基础培养基：奥梅梁斯基培养基 [17]；玉米秸秆培 葡萄糖标准曲线绘制：取 9 支刻度试管，分别吸 养基：玉米秸秆 2.0 g，营养液 30 mL。营养液： 取 1 mg·mL-1 葡萄糖溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、

(NH4)2SO4 6.0 g、尿素 3.0 g、蛋白胨 3.0 g、CaCl2 0.1 g、 1.2、1.4 和 1.6 mL 于刻度试管中，同时分别加入蒸馏

MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 1.0 g、NaCl 0.1 g、 水 2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6 和 0.4 mL，

FeS04·7H2O 0.05 g、MnSO4·7H2O 0.016 g、ZnSO4·7H2O 各试管中加入 3.0 mL 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

0.014 g、CoCl2 0.02 g、蒸馏水 1 000 mL，自然 pH； 摇匀后，沸水浴 10 min，立即用流水冷却后移至 25

液体产酶培养基：玉米秸秆 2.0 g、蛋白胨 0.5 g、(NH4)2 mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，混匀后，以空白溶

SO4 2.0 g、K2HPO4 1.0 g、尿素 0.6 g、MgSO4·7H2O 0.05 液调零，540 nm 测 OD 值。以葡萄糖浓度为横坐标， g、MnSO4·7H2O 0.016 g、ZnSO4·7H2O 0.017 g、CaCl2 OD 值为纵坐标绘制标准曲线。 0.02 g、NaCl 0.2 g、蒸馏水 1 000 mL，自然 pH。 内切-1,4-β-葡聚糖酶活性（Cx）测定方法：取 4 支 以上培养基均于 121℃、0.1 MPa 条件下灭菌 30 min； 试管，测定管加 0.2 mL 酶液和 1.8 mL 羧甲基纤维素 接种量为 10%（v/v）置于 10℃的恒温箱中静置培养。 （质量分数 1%），空白管加高温灭活的酶液 0.2 mL 1.4 试验设计 和 pH 为 4.8 的柠檬酸钠缓冲液 1.8 mL。随后置 以基础培养基为继代培养基，复合菌系 GF-20 在 （50±0.5）℃恒温水浴锅 30 min 后分别加入 DNS 10℃条件下，连续继代培养 45 代，获得不同代数的菌 显色液 3 mL，沸水浴 10 min，冷却后移至 25 mL 容 系，编号为 F；将复合菌系 GF-20 培养在不同温度条 量瓶中，加蒸馏水至刻度。以空白溶液调零，540 nm 件（4、10、15、20、25、30℃）下，连续继代培养 测 OD 值，每个处理重复 4 次。一个酶活力单位（IU） 15 代以上，获得不同温度的菌系，编号为 T；将复合 定义：每分钟释放 1 μmol 葡萄糖所需酶量。 菌系 GF-20 培养在不同 pH 条件（4.0、5.0、6.0、6.5、 1.5.4 复合菌系纤维素酶活稳定性测定 将不同条 7.0、7.5、8.0、9.0、10.0）下，连续继代培养 15 代以 件下获得的复合菌系分别接入液体发酵培养基中，在 上，获得不同 pH 的菌系，编号为 P。不同代数菌系选 对应条件下震荡培养，于培养第 10 天测定，每处理 4 择第 5、15、20、25、30、40 代分析降解稳定性，选 次重复。 择第 5、10、15、20、25、30、35、40、45 代分析组 不同温度复合菌系，将酶促反应温度分别设为 4、 成稳定性；不同温度和 pH 菌系选择第 15 代分析降解 10、15、20、25、30℃，不同 pH 复合菌系，将酶促 和组成稳定性，每处理均 3 次重复。将以上获得的复 反应缓冲液 pH 设为 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、

合菌系于 20%（v/v）甘油保存于-80℃冰箱。 9.0、10.0，测定内切-1,4-β-葡聚糖酶（CX），考察不 1.5 分析方法 同的温度和 pH 对纤维素酶活稳定性的影响。以 50℃、 1.5.1 复合菌系玉米秸秆降解率的测定 将菌系接 缓冲液 pH 为 4.8 时的酶促反应酶活作为 100%。 入 2 g 玉米秸秆为唯一碳源的玉米秸秆培养基中 10℃ 1.5.5 复合菌系菌种组成稳定性检测 利用 恒温培养 15 d 后分别测定玉米秸秆降解率，5 次重复， PCR-DGGE 方法对不同培养条件下的菌系进行结构 采用失重法。 多样性分析。将-80℃保存的不同复合菌系于基础培养

秸秆降解率（%）=（W0-W1）/W0×100% 。式中： 基中活化 1 代后，吸取培养液 5 mL，在 4℃、10 000

W0 表示接种前培养基中的秸秆重（g），W1 表示培养 ×g 条件下离心 5 min，吸净上清液，采用 CTAB 法 结束烘干后降解剩余物重（g）。 提取复合菌系 DNA[18]，每处理 3 次重复。PCR 扩增 1.5.2 复合菌系培养液 pH 的测定 将菌系接入玉米 采用巢式 PCR 法。第一轮 PCR 引物为 27F（5′-AGAG 秸秆培养基中 10℃恒温培养，于接种后每隔 24 h 取培 TTTGATCCTGGCTCAG-3′）[19] 和 1492R（5′-TACCT 养液，5 次重复，用微量 pH 计测定（HORIBA B-712， TGTTACGACTT-3′）[20]；反应体系：总体系为 50 μL， Japan）。 其中 25 μL Premix taq（Ex taq，TAKARA），稀释模 1.5.3 复合菌系纤维素酶活性的测定 将不同条件 板 DNA 1.0 μL，正反向引物各 1 μL，无菌水 22 μL。 下获得的复合菌系分别接入液体发酵培养基中，10℃ PCR 反应程序：95℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，

446 中 国 农 业 科 学 49卷

52℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 35 次循环，72℃ component analysis，PCA）。 延伸 10 min。第二轮引物为 341F-GC（40-bp GCcalmp， 2 结果 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）[21]和 907R（ 5′-CCG TCAATTCCTTTRAGTTT-3′）[22]；反应体系：总体系 2.1 复合菌系玉米秸秆降解率的稳定性分析 为 50 μL，其中 25 μL Premix taq（Ex taq，TAKARA）， 将复合菌系 GF-20 在不同培养条件下连续继代培 稀释第一轮 PCR 产物为模板 DNA 1.0 μL，正反向引 养，测定玉米秸秆降解率。由图 1 可知，不同培养代 物各 1 μL，无 菌 水 22 μL。PCR 反应程序：95℃预变 数复合菌系间玉米秸秆降解率除 F40 显著高于 F5 外， 性 5 min，94℃变性 30 s，55℃退火 1 min 30 s，72℃ 其余代数间无显著差异，分别为 27.59%、27.69%、 延伸 45 s，共 35 次循环，72℃延伸 10 min。变性梯 27.75%、28.42%、29.80%、31.97%。复合菌系 T4—T30 度凝胶电泳（DGGE）采用 DcodeTM 通用突变检测系 间玉米秸秆降解率无显著差异，分别为 29.46%、 统（Bio-Rad, USA）[19]。PCR 产物用 DGGE 凝胶电 29.54%、29.75%、28.64%、28.68%、29.17%。复合菌 泳分离，聚丙烯酰胺凝胶浓度为 6%，变性剂梯度为 系 P6.0—P9.0 间玉米秸秆降解率亦无显著差异，降解 45%—60%，电泳条件为 75V，温度 60℃，16 h。采 率分别为 29.94%、31.53%、32.53%、31.11%、31.66% 用 SYBR Green I （Molecular Probes，Eugene，OR， 和 27.76% ； P10.0 降解率为 24.79% ，显著低于 U.S.A.）染色，UV Gel imaging system（Bio-Rad，Gel P6.0—P8.0 菌系，与 P9.0 差异不显著；P4.0 和 P5.0 DOCTM XR，U.S.A.）拍照[23]。将切胶产物回收，经 秸秆降解率分别为 17.68%、20.50%，二者差异不显著， 341F（无 GC-clamp）和 907R 引物用上述方法扩增 但显著低于其他 pH 处理的复合菌系。 纯化。采用 pMD-19 Cloning Kit（大连宝生物）将目 由此可知，连续继代培养 40 代，温度 4—30℃， 的片段与载体连接转化，挑取阳性克隆子，进行菌落 pH 6.0—9.0 条件下继代培养，复合菌系的秸秆分解功 PCR 扩增重组后送测序公司（北京擎科）测序。根据 能没有退化，即秸秆纤维素分解关键菌没有因连续继 16S rDNA 序列，查询互联网数据库 BLAST 进行检索， 代培养和不同温度、pH 条件变化而消失。 分析亲缘关系及相似性。 2.2 复合菌系发酵液 pH 动态 1.6 统计方法 各复合菌系发酵液 pH 值变化趋势见图 2，复合菌 数据处理采用 Excel，DGGE 图片使用凝胶分析 系 F 和 T 的发酵液 pH 均呈先下降后升高，最终趋近 软件 Quantity One 4.6.1 进行分析，图谱数据利用统 于中性。经过 2 d 的发酵，发酵液 pH 下降至 6.8 左右， 计软件 SPSS statistics18.0 进行主成分分析（Principal 显著低于（P＜0.05）培养前，5 d 后 pH 值回升到 7.9

35 a a a a a a ab a a a ab a a a ab 30 b ab ab b 25 c 20 c

15

10 Corn stalk degradation ratio (%) 5

0 F5 F15 F20 F25 F30 F40 T4 T10 T15 T20 T25 T30 P4.0 P5.0 P6.0 P6.5 P7.0 P7.5 P8.0 P9.0 P10.0 玉米秸秆降解率 代数 Generation 温度 Temperature pH 处理 Treatments

不同小写字母表示在 0.05 水平差异显著 Different small letters indicate significant at the 0.05 level

图 1 不同条件下继代培养复合菌系玉米秸秆降解率 Fig. 1 Corn stalk degradation ratio of different sub-cultured microbial communities

3 期 青格尔等：玉米秸秆低温高效降解复合菌系 GF-20 的菌种组成及降解稳定性研究 447 pH pH pH

图 2 不同条件下继代培养复合菌系发酵液 pH 变化 Fig. 2 Characteristics of change of pH in the process of microbial community degraded corn stalk

左右，13 d 时 pH 值稳定在 8.1 左右，整体上发酵液 活在 1.39—1.75 IU·mL-1 范围，其中 F30 和 F40 显著高于 的 pH 在 6.6—8.7 浮动。结合上节结果，GF-20 在 其他代数菌系，酶活分别为 1.75 和 1.74 IU·mL-1；复合菌 pH6.0—9.0 间具有较好的秸秆降解活性，说明复合菌 系 T 酶活在 1.43—1.78 IU·mL-1，其中 T4 和 T10 显著高 系 GF-20 具有良好的 pH 自我调节能力及稳定性。复 于其他温度的菌系，酶活为 1.78 和 1.66 IU·mL-1；复合菌 合菌系 P 发酵液 pH 变化规律为由起始值趋向中性或 系 P 酶活在 0.95—1.84 IU·mL-1，其 中 P6.0—P9.0 的酶活 近中性，复合菌系 P4.0 和 P5.0 分别在第 7 天和 3 天， 范围在 1.34—1.84 IU·mL-1，P8.0 显著高于其他菌系，酶 发酵液 pH 才上升至 6.0，另外，复合菌系 P10.0 的 pH 活为 1.84 IU·mL-1，P4.0 显著低于其他菌系，酶活为 0.95 虽然在第一天即降到 9.0 以下，但最终 pH 在 8.5 左右， IU·mL-1。综合各菌系纤维素酶活性总体表现，不同继代 其玉米秸秆降解率显著低于 P6.0—P8.0，说明 pH 培养复合菌系、不同温度及不同 pH（6.0—9.0）继代培 6.0—9.0 区间，复合菌系的秸秆分解能力稳定，是复 养复合菌系的酶活性均较高，说明在不同条件下继代培 合菌系 GF-20 的适宜酸碱度。 养，复合菌系 GF-20 仍然保持了稳定的纤维素酶活力， 2.3 复合菌系纤维素酶活性动态 具有良好的稳定性。此外，从分析结果可知，酶活性高 各复合菌系在培养过程中产生的纤维素酶活性变化 代菌系（F25、F30、F40）高于低代菌系（F5、F15、F20）， 趋势见图 3。各复合菌系纤维素酶活性呈先升高后下降 低温菌系（T4、T10）高于中温菌系（T15、T20、T25、 的单峰曲线变化，在第 10 天达到最高值。复合菌系 F 酶 T30），P6.5—9.0 菌系＞P5.0、P6.0、P10.0＞P4.0。

448 中 国 农 业 科 学 49卷 ) -1 Endoglucanases Endoglucanases (IU·mL 内切酶

图 3 不同条件下继代培养复合菌系内切酶酶活性变化 Fig. 3 Characteristics of endoglucanases in the process of different microbial communities degrade corn stalk

2.4 复合菌系纤维素酶活的稳定性分析 以上的酶活，无显著差异，当 pH 为 9.0 时，保持 85.89% 各复合菌系不同温度和 pH 酶促反应条件下相对 的酶活，pH 为 10.0 时，保持 70.91%的酶活，显著低 纤维素酶活见图 4。随着酶促反应温度的升高，纤维 于其他 pH 处理。由此可知，复合菌系在酶促反应温 素酶活逐渐升高，酶促反应温度为 4℃和 10℃时，保 度 15℃—30℃和 pH4.0—9.0 条件下仍可保持较高的 持 54.25%和 67.34%酶活，显著低于其他温度处理； 纤维素酶活力，说明不同条件下继代培养复合菌系的 温度为 15℃—30℃时酶活无显著差异，均保持 80%以 纤维素酶在较低的温度和较宽的 pH 范围内具有良好 上的酶活。酶促反应 pH 在 4.0—8.0 时，可保持 95% 的温度和 pH 稳定性。

相对酶活 Relative enzyme activity (%)

图 4 不同温度和 pH 条件对复合菌系相对酶活的影响 Fig. 4 Effect of different temperature and pH on relative endoglucanases activity

2.5 复合菌系 DNA 提取及 PCR 扩增结果 没有显著变化，说明各复合菌系的菌种组成在连续继代 复合菌系 DNA 及 PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶中 培养过程中稳定存在。检测到共有条带 18 条（图 6-b）， 进行电泳，图 5 所示，条带明亮单一，符合预期片段 GenBank 数据库同源性比对结果见表 1。其中条带 5、 大小，适用于 DGGE 分析。 13、15、16、18 为主要条带，代表菌株分别为 Bacillus 2.6 复合菌系菌群结构分析 licheniformis、Azonexus hydrophilusd、Azospira oryzae、 利用 PCR-DGGE 方法比较来源于不同复合菌系 Arobacter cloacae、Cellvibrio mixtus subsp. Mixtus；木质 的 16SrDNA 条带，分析菌种组成的变化，如图 6-a 所 纤维素分解功能菌株为 Bacillus tequilensis（条带 4）、 示。不同条件下（继代 5—45、温度 4℃—30℃， Bacillus licheniformis（条带 5）、Clostridium populeti pH6.0—9.0）各复合菌系的主要条带数目、亮度及位置 （条带 10）、Clostridium xylanolyticum（条带 11）、

3 期 青格尔等：玉米秸秆低温高效降解复合菌系 GF-20 的菌种组成及降解稳定性研究 449

abc

（a）DNA 电泳图；（b）第一轮 PCR 扩增电泳图；（c）第二轮 PCR 扩增电泳图 (a) Electrophoresis fig of DNA extraction; (b) Electrophoresis fig of first step PCR amplification; (c) Electrophoresis fig of second step PCR amplification

图 5 复合菌系 DNA 及 16SrDNA 扩增电泳图 Fig. 5 Electrophoresis fig of DNA extraction and 16SrDNA amplification from microbial community

F5 F10 F15 F20 F25 F30 F35 F40 F45 T4 T10 T15 T20 T25 T30 P4 P5 P6 P6.5 P7 P7.5 P8 P9 P10

a

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5

6 6 7 7

8 8 9 9

10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17

18 18 F45 F20 F40 F15 F35 F30 F25 T4 T25 F5 T20 T30 T10 F10 P7 T15 P8 P6 P6.5 P7.5 P5 P9 P10 P4 100.0% 87.2% 87.1% 85.8% 84.6% 81.1% 77.6% 70.9% 69.7% 68.6% 68.4% 68.2% 68.0% 67.1% 65.1% 64.5% 63.5% 62.0% 61.8% 61.2% 60.8% 60.3% 57.8% 44.6% b

图 6 DGGE 分析复合菌系菌群结构变化 Fig. 6 Community composition structures analysis by DGGE

450 中 国 农 业 科 学 49卷

表 1 DGGE 回收条带近缘种序列特征 Table 1 The blast characters of band sequence extracted from DGGE gel 条带编号 近缘种 GenBank 登录号 相似度 Band No. Discription of closest relatives GenBank accession No. Similarity (%) Band1 Pedobacter agri PB92T AJLG01000244 99.39

Band2 Paludibacter propionicigenes WB4 T CP002345 97.40

Band3 Sphingobacterim cladoniae NO.6 T FJ868219 99.89

Band4 Bacillus tequilensis KCTC 13622 T AYTO01000043 99.29

Band5 Bacillus licheniformis ATCC14580 T AE017333 99.56

Band6 Hydrogenophaga caeni EMB71(T) DQ372983 99.15

Band7 Uncultured bacterium clone GU291607 98.80

Band8 Planococcus antarcticus DSM14505 T AJYB01000131 98.84

Band9 Terribacillus saccarophilus 002-048 T AB243845 99.56

Band10 Clostridium populeti ATCC T X71853 96.10

Band11 Clostridium xylanolyticum ATCC49623 T X71855 96.26

Band12 Rhodococcus qingshengii djl-6 T DQ090961 99.79

Band13 Azonexus hydrophilusd8-1 T EF158390 98.33

Band14 Variovorax boronicumulans BAM-48 T AB300597 99.17

Band15 Azospira oryzae 6a T AF011347 99.86

Band16 Arobacter cloacae SW28-13 T HE565360 99.11

Band17 Pseudomonas fuscovaginae ICMP5940 T BATG01000120 97.92

Band18 Cellvibrio mixtus subsp. MixtusACM2601 T AF448515 99.86

Cellvibrio mixtus subsp. Mixtus（条带 18）。其中，P4.0 降解纤维素物质 [26-29]；Clostridium xylanolyticum 可降 菌系未检测到条带 10、11、12、16，代表菌株为 解木质素[30-31]；Cellvibrio mixtus subsp 具有分解纤维 Clostridium populeti 、 Clostridium xylanolyticum 、 素的功能[32]；Bacillus sp.能产纤维素酶，促进纤维素 Rhodococcus qingshengii、Arobacter cloacae；P5.0 菌 的分解[33-34]。由此可知，复合菌系 GF-20 是由具有木 系未检测到条带 10、11；P10.0 未检测到条带 15，代 质纤维素分解功能的菌种和其他菌种组成，协同促进 表菌株为 Azospira oryzae；它们与 F45 的相似系数分 玉米秸秆的分解，缺少任何菌株都会影响秸秆分解活 别为 44.6%、60.8%和 57.8%。 性与功能。 利用 PCA 分析方法，对 DGGE 图像进行分析， 微生物群体的性质和组成稳定性是保证其功能持 结果表明（图 7），各复合菌系在不同培养条件下菌 续稳定的关键，如果稳定性不能保持，就失去了其研 群结构有所不同。复合菌系 F5、F10、T4、P4.0 和 P5.0 究和应用价值。DGGE 图谱证明，复合菌系的主要菌 菌群结构具有显著差异，而其他菌系菌群结构的变化 种组成没有因连续继代培养而发生变化，说明复合菌 较小，表明菌群结构在培养过程中较为稳定。 系 GF-20 不仅组成稳定，其中各个菌株的稳定性也高。 根据 PCR-DGGE 条带回收，P4.0 菌系未检测到条带 10、 3 讨论 11、12、16，P5.0 菌系未检测到条带 10、11，P10.0 未 Zhang 等[24]和 Wu 等[25]研究表明纤维素是在多种 检测到条带 15。表明 P4.0 和 P5.0 菌系组成中缺少厌氧 细菌和真菌协同作用下降解的。本研究中的复合菌系 梭菌 Clostridium populeti 和Clostridium xylanolyticum 等 GF-20主要由Cellvibrio mixtus subsp.、Azospira oryzae、 功能菌株，这些菌株的缺失致使玉米秸秆降解率及纤维 Arcobacter defluyii、Azonexus hydrophilus、Clostridium 素酶活显著降低；红球菌 Rhodococcus qingshengii[35] sp.、Paludibacter propionicigenes、Bacillus sp.等组成。 的最适生长 pH 为 7.0—8.0，P4.0 菌系长期在偏酸性 其中 Clostridium populeti 可产纤维素和半纤维素酶， 条件下继代，发酵液 pH 在第 7 天才上升至 6，致 使

3 期 青格尔等：玉米秸秆低温高效降解复合菌系 GF-20 的菌种组成及降解稳定性研究 451

1.0 1.0 F10

F5 T4 0.5 0.5

F30 F25 T20 T15 0.0 F35 0.0 T10 F20 T25 F15 T30

-0.5 F40 F45 -0.5

-1.0 -1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 成分1 Component 1 成分1 Component 1

1.0 P5 P4

0.5

P8 P7.5 0.0 P10 P6 P7 P9 P6.5 -0.5

-1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 成分1 Component 1

图 7 PCA 分析复合菌系菌群结构变化 Fig. 7 Changes of community structure analysis by PCA

Rhodococcus qingshengii 菌株消失；菌株 Azospira 从长年玉米秸秆还田土壤和牛羊粪混合材料中筛选驯 oryzae[36-37]和 Arobacter cloacae[38]可分泌多种酶类， 化的，可见，从应用环境中筛选功能菌群，对高效菌 促进底物分解，协同降解玉米秸秆及调节复合菌系发 群的建立具有重要的帮助。 酵液 pH；P4.0、P5.0 和 P10.0 与 F45 的相似系数分 在复合菌系实际应用中，土壤温度及 pH 是变 别为 44.6%、60.8%和 57.8%，说明在偏酸性或偏碱 化的，目前学者偏重于在恒定的培养条件下筛选菌 性的环境中，菌系不能稳定的继代，菌种组成发生了 系[42-44]，这样菌系的应用具有局限性。本试验筛选的 变化导致菌系秸秆分解功能的衰退。由此可知，良好 菌系在较大温度和 pH 范围内稳定继代并发挥功能， 的菌群结构更有利于菌株对纤维素成分的分解利用， 具有很好的应用前景，这和以往对秸秆降解菌的研究 而菌群结构的不稳定直接导致菌群功能的不稳定，菌 有显著的区别。随着人们对秸秆降解菌研究的深入， 群中菌株的稳定决定着复合菌系的秸秆分解功能的 降解菌必将在环境保护、能源和资源的开发、饲料等 稳定性。 各个领域发挥越来越大的作用，但如何使实验室理论 王伟东等[13]指出发酵液中 pH 的不稳定是抑制纤 研究走向生产开发实践是当务之急。本文在实验室条 维素底物分解活性的主要原因之一。不同的温度和 pH 件下，对复合菌系的稳定性进行了研究，探索菌系的 环境显著影响复合菌系的分解功能[39]与酶活性[40-41]。 适应性，以使理论研究更加贴近实际生产。 本研究中复合菌系 GF-20 在不同温度（4—30℃）和 4 结论 pH（6.0—9.0）条件下，发酵液 pH 变化稳定，对玉米 秸秆的分解能力及纤维素酶活无显著差异， 综合分析不同复合菌系的秸秆降解率、纤维素酶 PCR-DGGE 分析结果证明菌种组成仍然稳定，具有优 活性、pH 变化以及菌群组成变化，发现复合菌系 良的抗自然环境变化冲击的能力。复合菌系 GF-20 是 GF-20 在 4—30℃、pH6.0—9.0 的条件下可稳定继代

452 中 国 农 业 科 学 49卷

培养并保持性质、功能、组成的稳定性。而在偏酸 Ecology, 2004, 51(1): 133-142. （pH=4.0、5.0）和偏碱性（pH=10.0）条件下，复合 [9] Kato S, Haruta S, Cui Z J, Ishii M, Igarashi Y. Stable coexistence of 菌系菌群结构发生变化，进而影响其性质与功能。在 five bacterial strains as a cellulose degrading community. Applied and 自然环境下，因复合菌系施用地点的不同，土壤温度 Environmental Microbiology, 2005, 71(11): 7099-7106. 及 pH 是变化的，需要菌剂具有广泛的温度和 pH 适应 [10] 萨如拉, 高聚林, 于晓芳, 胡树平. 玉米秸秆低温降解复合菌系的 性。复合菌系 GF-20 是本实验室经过长期的驯化筛选 筛选. 中国农业科学, 2013, 46(19): 4082-4090. 得到的，微生物间存在协同关系，其功能与组成在较 Sarula, Gao J L, Yu X F, Hu S P. Screening of low temperature maize 宽的温度和 pH 范围内具有较高的稳定性，为进一步 stalk decomposition microorganism. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 开发秸秆还田促腐菌剂提供保障。 46(19): 4082-4090. (in Chinese) [11] Panswad T, Doungchai A, Anotai J. Temperature effect on microbial References community of enhanced biological phosphorus removal system. Water [1] 汪维云, 朱金华, 吴守一. 纤维素科学及纤维素酶的研究进展. 江 Research, 2003, 37(2): 409-415.

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21 (124) : 243-254. Scientia Agricultura Sinica, 2010, 43(21): 4437-4446. (in Chinese)

[42] 温博婷, 袁旭峰, 华彬彬, 尹永焕, 王小芬, 钟萼蓉, 崔宗均. 纤维 [44] 盛铭浩, 徐凤花, 代欢, 张晴. 低温纤维素降解复合菌系的选育及

素分解菌系 WSD-5 常温产酶高温糖化小麦秸秆研究. 中国农业大 性能分析. 湖北农业科学, 2013, 52(8): 1814-1816.

学学报, 2014, 19(2): 36-42. Sheng M H, Xu F H, Dai H, Zhang Q. Breeding and properties

Wen B T, Yuan X F, Hua B B, Yin Y H, Wang X F, Zhong E R, Cui Z J. analysis of low temperature cellulose degrading strains. Hubei

Enzymatic digestibility by the composite microbial system of WSD-5 Agriculture Sciences, 2013, 52(8): 1814-1816. (in Chinese) enzyme production at room temperature and saccharification at high temperature. Journal of China Agricultural University, 2014, 19(2): （责任编辑 杨鑫浩）

中国农业科学 2016,49(3):455-467 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.005

薯/豆套作模式下不同熟期大豆品种的生长补偿效应

陈光荣 1,2，杨文钰 1，张国宏 2，王立明 2，杨如萍 2，雍太文 1，刘卫国 1

（1 四川农业大学农学院/农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室，成都 611130；2 甘肃省农业科学院旱地农业研究所/农业部西北作物

抗旱栽培与耕作重点实验室，兰州 730070）

摘要：【目的】探讨马铃薯/大豆套作复合群体品种搭配原则，为马铃薯/大豆套作高产高效提供理论和技术 依据。【方法】以当前西北一熟制灌区生产中广泛种植且间套优势明显的早熟马铃薯/大豆间套作方式为研究对象， 通过两年田间试验，以大豆品种中黄 30（早熟）、冀豆 17（中熟）和齐黄 34（晚熟）单作为对照，分析套作马 铃薯收获前后大豆叶面积指数、干物质积累、光合速率的变化及对产量构成因素的影响，评价不同熟期大豆品种 的生长补偿效应。【结果】（1）相对于单作，套作条件下各大豆品种的开花期延迟 7 d左右，但不影响全生育期， 套作大豆营养生长期延长而生殖生长期相对缩短。马铃薯与大豆各品种间的共生期差异不显著，但其生殖生长共 生期差异显著（齐黄 34 为 12 d，冀豆 17 为 35.5 d，中黄 30 为 41.5 d）。（2）在马铃薯/大豆共生期间，套作 大豆 LAI 上升慢于单作，晚熟大豆 LAI 慢于早熟和中熟大豆品种，在马铃薯收获后，中、晚熟大豆品种可保持较 大叶面积指数并持续较长的时间，尤其是晚熟品种。（3）单作大豆在出苗后 60 d 内干物质积累较快，而同期套 作大豆平均干物质积累为单作大豆的 44.27%。不同品种间单作大豆净光合速率高于套作，其中，晚熟品种显著高 于中、早熟品种（P＜0.05）；出苗后 100 d（套作马铃薯已经收获）单作大豆干物质积累相对变缓，套作大豆生 长加快，尤其是晚熟品种增幅显著，此时套作大豆 Pn 相对于单作上升幅度大，中、晚熟品种 Pn 接近于单作大豆。 （4）较单作模式，套作模式下不同大豆品种的有效荚数、单株粒数及每荚粒数均有所降低，其中早熟品种下降显 著（P＜0.05），分别下降了 24.15%、22.14%、18.92%，而中、晚熟品种下降不显著，尤其是晚熟品种，套作模 式较单作模式仅仅下降了 6.34%、8.3%、1.71%。套作模式下，中、晚熟大豆品种的产量较早熟品种分别提高了 79.85% 和 145.08%，LER 分别达到了 1.77 和 1.83。【结论】中、晚熟大豆品种与马铃薯组合套作优势更强，其生育期较 长，营养生长期相对延长导致生殖生长共生期缩短，使大豆叶面积指数、光合速率均保持在较高水平，从而为马

铃薯收获后进行光合补偿生长提供物质和能量基础，保证了套作大豆较高产量。 关键词：马铃薯；大豆；套作；光合速率；产量；补偿效应

Compensation Effect of Different Soybean Varieties in Potato/Soybean Intercropping Systems

CHEN Guang-rong1, 2, YANG Wen-yu1, ZHANG Guo-hong2, WANG Li-ming2, YANG Ru-ping2, YONG Tai-wen1, LIU Wei-guo1

(1College of Agriculture, Sichuan Agriculture University/Key Laboratory of Crop Ecophysiology and Farming System in Southwest China, Ministry of Agriculture, Chengdu 611130; 2Institute of Dryland Agriculture, Gansu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Northwest Drought Crop Cultivation, Ministry of Agriculture, Lanzhou 730070)

Abstract: 【Objective】To explore the mechanism of a high yield and an optimum spatial-temporal configuration management in potato-soybean intercropping system. 【Method】 This study takes a potato-soybean intercropping system with wildly-used and an

收稿日期：2015-06-03；接受日期：2015-10-29 基金项目：国家大豆现代产业技术体系建设专项（CARS-04-PS19，CARS-04-CES17） 联系方式：陈光荣，E-mail：[email protected]。通信作者杨文钰，E-mail：[email protected]

456 中 国 农 业 科 学 49卷 apparent yield advantage in Northwest irrigation districts as the research object, a field experiment was conducted in two consecutive seasons (2012-2013), the potato-soybean intercropping trials using three soybean varieties including Zhonghuang 30 (early-maturing variety), Jidou 17 (mid maturing variety ) and Qihuang 34 (late maturing variety ) with the sole cropping potato as the control were carried out to determine the dynamic changes of growth stages of soybean, leaf area index, accumulation of dry matter, photosynthetic characteristics, yield components and yield in order to optimize the reasonable group configuration. 【Result】In comparison with the sole cropping, intercropping system led to a delayed reproductive growth stage of soybean but did not change the whole growth period, the duration from planting to flowering was extended, but the duration from flowering to maturing was shortened. The co-growth stage of different soybean varieties was not affected by intercropping, but the reproductive co-growth stage (from flowering to maturing) was remarkable (P＜0.05, late maturing variety was 12 days, middle-maturing variety was 36 days, early-maturing variety was 42 days).There was a lower increase under intercropping than under sole cropping, the LAI of the late-maturing variety was lower than the mid-maturing and early maturing varieties, significantly (P＜0.05) during earlier growing stage but higher after the potato had been harvested. There was a significant difference in dry matter accumulation between intercropping and sole cropping during the earlier growing stage, dry matter accumulation of inter-soybean relative to the sole soybean was decreased by 55.73% at 60 days after soybean sowing. The Pn varied considerably by different potato-soybean intercropping systems, and lower than the sole soybean, which the late-maturing variety was higher than the mid-maturing and early maturing varieties significantly (P＜0.05).When the potato had been harvested (100 days after soybean sowing), the dry matter accumulation and Pn of soybean in all intercropping systems increased, especially mid-maturing and late-maturing varieties, which became much closer to the sole cropping. Compared with sole cropping, the pods per plant, seeds per plant, and seeds per pod of early-maturing soybean in the intercropping system decreased by 24.15%, 22.14% and 18.92%, respectively (P＜0.05). However, effective pods per plant, seeds per plant, and seeds per pod of the late-maturing soybean decreased by 5.66%, 7.64% and 2.11%, respectively. Finally, the yield of the mid-maturing and late-maturing varieties in intercropping systems are higher than the early-maturing, which increased by 79.85% and 145.08%, with the land equivalent ratio (LER) of 1.77 and 1.83, respectively. 【Conclusion】Mid-maturing and late-maturing varieties were a suitable plant type configuration, the whole growth period was longer, the duration from planting to flowering was extended, but the duration from flowering to maturing was shortened, which could improve the leaf area index, photosynthetic efficiency for compensatory growth when the potato had been harvested, showing the stronger intercropping superiority. Key words: potato; soybean; intercropping; photosynthetic characteristics; yield; compensation effect

特性的影响，初步揭示了弱势作物在间套作系统中对 0 引言 光能高效利用的机理。间套作模式下弱势作物光合指 【研究意义】间套作种植能够有效提高资源利用 标、干物质及产量构成因素的变化归根结底是优势作 率[1-2]，增强水土保持能力[3-4]，改善土壤肥力[5-8]，同 物竞争力强所致。在许多间套作体系中，早收作物收 时能够抑制病虫草害的发生[9-11]，是生态农业与可持 获后，晚收作物的生长和水肥吸收会出现一个较为迅 续农业发展的主要方向之一。近年来，西北地区马铃 速的增长过程。张福锁和李隆将这种迅速增长的过程 薯/大豆种植模式逐渐被应用，该栽培模式既能促进西 称之为弱竞争作物后期的恢复补偿作用，并在国际上 北地区主要粮食作物马铃薯高产，又能增种一季大 首次提出间套作系统的“竞争-恢复生产的原理”[23]。 豆，是一种提高土地生产率和农民收入的高效种植体 【本研究切入点】在马铃薯/大豆的模式中，两作物共 系[12]。【前人研究进展】国内外学者对间套作的研究 同生长期种间相互作用表现为强烈的竞争作用，马铃 主要集中在光、热、水、养分等资源的分配、利用和 薯的竞争力始终强于大豆，当马铃薯成熟收获后，套 竞争等方面，许多研究结果表明，间套作中弱势作物 作大豆就会表现出恢复补偿作用。然而，不同品种大 在共生期净光合速率、蒸腾速率、气孔导度下降[13-17]， 豆生育特性差异较大，关于不同品种大豆与马铃薯套 叶绿素含量呈上升趋势[8, 17-18]。崔亮等[19]对玉豆套作 作种间竞争及恢复补偿的研究还未见报道。【拟解决 体系研究发现，光照不足，套作大豆光合指标下降， 的关键问题】本试验利用不同熟期的大豆品种与马铃 干物质积累减少，单株荚数、单株粒数、单株粒重较 薯组合套作，研究马铃薯收获前后，套作大豆光合特 单作显著下降。王竹等[20-21]和宋艳霞等[22]通过调控栽 性及干物质积累的变化特点，揭示不同品种大豆恢复 培措施，研究不同品种大豆复合群体结构对大豆光合 生长能力的差异，进一步阐明品种搭配与间套作优势

3 期 陈光荣等：薯/豆套作模式下不同熟期大豆品种的生长补偿效应 457

的关系，以期寻求恢复补偿效果显著、复合群体产量 作，平地种植。另设马铃薯单作，带幅 150 cm，马铃 高的大豆品种，为生产上的推广和应用提供理论和实 薯幅宽 100 cm，起垄覆膜种植 2 行马铃薯，大豆带不 践依据。 种作物。所有小区采用南北行向种植，小区面积 6.0 m ×9.0 m。2012 和 2013 年马铃薯播种期均为 3 月 20 1 材料与方法 日，套作及单作密度均为 47 625 穴/hm2，行 距 45 cm， 1.1 试验材料 穴距 33 cm。2012 年和 2013 年大豆播种期分别为 4 马铃薯（Solanum tubersum L.）品种选用黑龙江 月 18 日和 4 月 15 日，套作及单作密度均为 150 000 省农业科学院马铃薯研究所选育的克新 4 号，大豆 株/hm2，行距均为 40 cm。株距分别为 9 cm、17 cm。 （Glycine max (L.) Merrill）品种选用中国农业科学院 马铃薯带与大豆带间距为 32.5 cm。各处理 3 次重复， 作物研究所选育的中黄 30，河北省农林科学院粮油作 随机区组设计，肥水及大田管理同当地生产条件。图 物研究所育成的冀豆 17，山东省农业科学院作物研究 1 为马铃薯、大豆套作和单作田间种植示意图。 所选育的齐黄 34（表 1）。 1.4 测定指标 1.2 试验地概况 1.4.1 叶面积指数（LAI）的测定 在大豆出苗后每 试验于 2012—2013 年在甘肃省会宁县郭城镇进 20 d 选取长势均匀的植株 15 株，用打孔法测量叶面 行，地处 35°37′N、105°13′E，海拔 1 630 m, 年平均 积，并采用如下公式进行 LAI 的计算[19]。 气温 6.7℃，年均降雨量 263.1 mm，≥10℃的有效积 叶面积指数（LAI）＝Al/As 温 3 244℃。试验地肥力相对均匀，2012 和 2013 年播 式中，Al 为测点内植株的总叶面积，As 为测点所占 前根层土壤基础肥力分别为有机质 11.17 g·kg-1、14.04 土地面积。 g·kg-1，全氮 1.43 g·kg-1、1.13 g·kg-1，全磷 1.79 g·kg-1、 1.4.2 光合参数测定 2012 年采用美国 LI-COR 公 1.42 g·kg-1，全钾 12.47 g·kg-1、14.21 g·kg-1，碱解氮 89.5 司生产的 LI-6400 便携式光合测定系统分别于大豆出苗 mg·kg-1、62.47 mg·kg-1，有效磷 15.79 mg·kg-1、19.82 后 20 d、60 d、100 d 测定，时间为上午 9：30—11：30。 mg·kg-1，速效钾 179.24 mg·kg-1、164.27 mg·kg-1，pH 每个小区选 15 株有代表性植株测定其主茎上全展叶 为 8.01、7.84。 片净光和速率（Pn）。 1.3 田间试验设计及种植规格 1.4.3 干物质测定 自出苗后 20 d 开始取样，生育 试验设中黄 30 套作（IPZ）、冀 豆 17 套作（IPJ）、 期间每 20 d 取一次测定干物质，上述测定均在 105℃ 齐黄 34 套作（IPQ）、中黄 30 单作（SPZ）、冀豆 下杀青，85℃下烘干称重，每处理取具有代表性植株 17 单作（SPJ）、齐黄 34 单作（SPQ）6 个处理。马 15 株，3 次重复。 铃薯/大豆套作，带宽 150 cm，其中马铃薯幅宽 100 cm， 1.4.4 套作优势 参照 Al-Dalain 的方法[24]，LER= 起垄覆膜种植 2 行马铃薯，起垄时，垄高 30 cm，垄 LERs（potato）+LERs（soybean），LERs=YP/YM。 面呈弧形；大豆幅宽 50 cm，平地种植 2 行；大豆单 式中，LER 为总土地当量比（land equivalent ratio，

表 1 供试马铃薯、大豆品种特性 Table 1 Characteristics of different plant varieties of potato and soybean 作物 品种 熟期组 株型 株高 叶型 结荚习性 活动积温 生育期 Crop Cultivar Maturity group Plant-type Plant height Leaflet shape Stem termination Accumulated Growth (cm) temperature (℃) period (d) 马铃薯 克新 4 号 早熟 直立型 60—65 心脏型 1350 90 Potato Kexin 4 Early-maturing Erect branch Heart-shaped 大豆 中黄 30 MGIII 早熟品种 收敛型 65—75 圆叶 有限 2751 133 Soybean Zhonghuang 30 Early-maturing in MGIII Erect branch Round ovate leaves Determinate 冀豆 17 MGIII 中熟品种 收敛性 85—95 卵圆叶 亚有限 2832 145 Jidou 17 Mid-maturing in MGIII Erect branch Pointed ovate leaves Semi-determinate 齐黄 34 MGIII 晚熟品种 半开张 75—85 卵圆叶 有限 2948 165 Qihuang 34 Late-maturing in MGIII Semi-Erect branch Pointed ovate leaves Determinate

458 中 国 农 业 科 学 49卷

45 40

100 50 200 大豆 Soybean

马铃薯单作 Potato sole 大豆单作 Soybean sole 马铃薯 Potato

45 40

100 50

150 套作 Intercropping

图 1 马铃薯、大豆单作及套作田间布置示意图 Fig. 1 Patterns of intercropping and sole cropping experimental plots

LER）；LERs（potato）、LERs（soybean）分别为马 差异显著，齐黄 34 最短，为 12 d，其次是冀豆 17， 铃薯和大豆的相对土地当量比；YP 为套作作物产量； 为 35.5 d，中黄 30 最长，为 41.5 d。 YM 为单作作物产量。套作大豆和套作马铃薯产量 2.2 不同大豆品种 LAI 的变化 均按每个小区的实际收获量除以小区总面积来计 在不同群体条件下，不同熟期大豆品种的叶面积 算。LER＞1，表明套作具有优势，LER＜1 则为套 指数均在结荚期达到高峰，之后开始下降（表 3）。 作劣势[24-25]。 大豆出苗后 80 d 内（马铃薯-大豆共生期间），除出 1.5 数据处理 苗后 20 d 外，其他时期套作大豆 LAI 上升慢于单作， 本试验数据均用 Microsoft Excel 和 DPS 统计软件 晚熟大豆 LAI 慢于早熟和中熟大豆品种，IPZ 比 SPZ 进行试验数据汇总与统计分析。 低 1.54%—14.51%，IPJ 比 SPJ 低 1.04%—10.2%，IPQ 比 SPQ 低 2.64%—17.19%；IPQ 叶面积指数相对于 IPZ 2 结果 和 IPJ 分别降低了 2.37%—7.01%和 12.38%—18.33%， 2.1 生育期结构分析 套作降低了大豆 LAI。在大豆出苗 100 d 后（马铃薯 生育期是大豆重要的生态性状，生育期结构包 收获），套作及单作大豆 LAI 呈下降趋势，但套作大 括生育期的长短和各个生育时期占全生育期的比 豆 LAI 下降幅度低于单作，此时晚熟大豆 LAI 高于早 例。栽培条件不同，品种的生育期结构也会随之发 熟和中熟大豆品种，具体表现为，出苗后 100 d，IPQ 生变化[26-27]。由表 2 可知，在套作条件下，各大豆品 叶面积指数相对于 IPZ 和 IPJ 分别上升了 8.91%和 种相对于单作开花期延迟 7 d 左右，但对于全生育期 1.89%；出苗后 120 d 显著上升了 46.02%和 17.81%； 影响不大，表明套作大豆营养生长期延长而生殖生长 出苗后 140 d 极显著上升了 250.45%和 79.83%。以上 期相对缩短。在套作条件下，各大豆品种营养生长期 结果表明，在马铃薯/大豆模式下，中晚熟大豆品种在 长短不同，晚熟品种齐黄 34 最长，其次是中熟品种冀 马铃薯收获后可保持较大的叶面积指数，并持续较长 豆 17，早熟品种中黄 30 最短。3 个大豆品种全生育期 的时间，尤其是是晚熟品种。 也不同，齐黄 34 的最长为 165 d，开花期和收获期最 2.3 干物质积累动态变化 迟；其次是冀豆 17，生育期是 145 d，开花期和收获 随着生育期的推进，套作大豆与单作大豆干物质 期居中；中黄 30 生育期最短为 133 d，开花和收获期 积累特点明显不同（表 4），首先，单作大豆在出苗 最早。从马铃薯与大豆的共生期分析，品种间无差异， 后 60 d 内干物质积累最快，而同期套作大豆生长缓 但从马铃薯与大豆的生殖生长共生期分析，各品种间 慢，平均不足单作大豆的一半，出现这种现象的主要

3 期 陈光荣等：薯/豆套作模式下不同熟期大豆品种的生长补偿效应 459

表 2 马铃薯/大豆套作群体中大豆的生育期结构 Table 2 Components of growth period of soybean in potato/soybean intercropping systems 年份 处理 播种日期 出苗日期 始花日期 成熟日期 大豆与马铃薯共生天数 大豆生殖生长期与马铃薯共生天数 Year Treatment Sowing Emergence date Beginning bloom Maturity date Days of potato-soybean Days of soybean reproductive growth (Month/day) (Month/day) date (Month/day) (Month/day) co-existence (d) co-existed with potato (d) 2012 Potato 3/20 4/25 5/20 8/02 IPZ 4/18 5/05 6/21 9/15 89.00a 42.00a IPJ 4/18 5/03 6/27 9/27 91.00a 36.00b

IPQ 4/18 5/07 7/21 10/16 87.00a 12.00c

SPZ 4/18 5/02 6/17 9/14

SPJ 4/18 5/01 6/22 9/25

SPQ 4/18 5/04 7/11 10/15

2013 Potato 3/20 4/23 5/14 7/27 IPZ 4/15 5/04 6/17 9/13 84.00a 40.00a IPJ 4/15 5/05 6/23 9/25 83.00a 35.00b

IPQ 4/15 5/08 7/16 10/21 80.00a 12.00c

SPZ 4/15 5/03 6/13 9/12

SPJ 4/15 5/04 6/17 9/21

SPQ 4/15 5/06 7/11 10/16

IPZ：中黄 30 套作；IPJ：冀豆 17 套作；IPQ：齐黄 34 套作；SPZ：中黄 30 单作；SPJ：冀豆 17 单作；SPQ：齐黄 34 单作。同列不同字母表示处理 间差异显著（P＜0.05）。下同 IPZ: Intercropping Zhonghuang30; IPJ: Intercropping Jidou17; IPQ: Intercropping Qihuang34; SPZ: Sole cropping Zhonghuang30; SPJ: Sole cropping Jidou17; SPQ: Sole cropping Qihuang34. Values within a column followed by different letters are significantly different at P＜0.05. The same as below

表 3 单作及套作下不同大豆品种叶面积指数的变化 Table 3 Characteristics of LAI of different soybean varieties under sole cropping and intercropping 年份 处理 出苗后天数 Days after emergency (d) Year Treatment 20 40 60 80 100 120 140

2012 IPZ 0.86ab 2.10bc 3.76c 5.16cd 5.06d 3.64e 1.16e

IPJ 0.89a 2.20b 4.10b 5.53ab 5.37bc 4.52c 2.61b

IPQ 0.72c 1.95c 3.72c 5.03d 5.55ab 5.22b 4.67a

SPZ 0.87a 2.27ab 4.40a 5.24cd 4.89d 3.25f 0.87f

SPJ 0.87a 2.45a 4.23ab 5.54a 5.28c 4.06d 2.28c

SPQ 0.73bc 2.13bc 4.05b 5.31bc 5.64a 5.52a 4.44a

2013 IPZ 0.76ab 2.04cd 3.55c 4.96d 4.75b 3.49d 1.39c

IPJ 0.75abc 2.13bc 3.77b 5.37ab 5.12a 4.32b 2.71b

IPQ 0.66c 1.90d 3.42c 5.11c 5.12a 5.18a 4.27a

SPZ 0.71abc 2.26ab 4.14a 4.93d 4.64b 3.17e 1.12c

SPJ 0.78a 2.34a 4.30a 5.43a 5.13a 3.95c 2.50b

SPQ 0.67bc 2.10bc 4.13a 5.25bc 5.30a 5.23a 4.23a

原因是两种作物共生期马铃薯的竞争能力强，迫使大 加快，最终干物质接近单作大豆，说明马铃薯收获后， 豆处于劣势地位，生长缓慢；其次，在大豆生长后期， 套作大豆的干物质积累和产量由于马铃薯竞争导致的 特别是 8 月份马铃薯收获后，单作大豆干物质积累相 损失在很大程度上得到了补偿。 对变缓，而套作大豆此时生长加快，干物质积累进程 在大豆出苗后 60 d 内，单作大豆及套作大豆干物

460 中 国 农 业 科 学 49卷

质积累进程品种间差异不显著，随着生育期的推进， 而 SPJ 与 SPZ 差异不显著，具体表现为出苗后 80 d， 各品种表现出不同的变化特点，出苗后 80—100 d，单 SPQ 干物质积累量相对于 SPZ 和 SPJ 提高了 65.56% 作大豆干物质积累表现 SPQ（晚熟）＞SPJ（中熟） 和 35.54%，出苗后 100 d 分别提高了 70.81%和 59.22% ＞SPZ（早熟），SPQ 与 SPJ 和 SPZ 差异达到显著水 （2012 和 2013 两年平均值）；出苗后 120 d，晚熟品 平，而 SPJ 与 SPZ 差异不显著，具体表现为，出苗后 种及中熟品种套作大豆干物质进程加快，尤其是晚熟 80 d，SPQ 干物质积累量相对于 SPZ 和 SPJ 提高了 品种。单作大豆与套作大豆干物质积累品种间差异均 30.82%和 32.10%，出苗后 100 d 分别提高了 47.07% 达到显著水平，晚熟品种最高，早熟品种最低；出苗 和 42.20%（2012 和 2013 两年平均值）；套作大豆干 后 140 d，晚熟品种及中熟品种套作大豆干物质最终接 物质积累表现为 IPQ（晚熟）＞IPJ（中熟）＞IPZ（早 近于单作大豆，差异不显著，但早熟品种套作及单作 熟），同样，SPQ 与 SPJ、SPZ 差异达到显著水平， 干物质差异显著。

表 4 单作及套作下不同大豆品种干物质积累动态变化 Table 4 Characteristics of dry matter accumulation of different soybean varieties under sole cropping and intercropping 年份 处理 出苗后天数 Days after emergency (d) Year Treatment 20 40 60 80 100 120 140

2012 IPZ 1.39c 6.47cd 10.65b 15.12d 25.60c 30.66e 25.92c

IPJ 1.59bc 5.43d 9.48b 17.46d 28.65c 38.32d 39.99b

IPQ 2.06b 7.04bcd 11.70b 24.77c 43.73b 69.77b 88.18a

SPZ 2.93a 10.38a 26.08a 31.36b 40.38b 45.24cd 40.23b

SPJ 2.84a 8.64abc 24.31a 28.55bc 37.56b 50.01c 44.38b

SPQ 3.07a 9.91ab 26.65a 39.60a 60.20a 81.99a 89.93a

2013 IPZ 1.29c 5.95b 9.88e 14.08e 23.36d 28.66f 26.89d

IPJ 1.58c 5.73b 11.89d 18.21d 24.20d 35.52e 39.41c

IPQ 1.44c 6.59b 10.75de 23.57c 39.89c 65.54b 78.17a

SPZ 2.26b 10.60a 23.66c 31.05b 37.98c 41.65d 38.54c

SPJ 2.71a 9.41a 26.03b 33.25b 43.49b 46.48c 43.58b

SPQ 2.93a 10.31a 28.21a 42.04a 55.04a 75.65a 80.31a

2.4 光合速率（Pn） 不同熟期大豆品种在各生育时期 Pn 表现不同， 由图 2 可知，随生育进程的推进，单作大豆及套 在出苗后 20 d，单作及套作 Pn 的表现为早熟＞晚熟 作大豆光合速率（Pn）均呈现上升趋势，在大豆出苗 ＞中熟，早、中、晚熟品种间差异不显著；出苗后 60 后 20 d，单作大豆 Pn 显著高于套作，表明套作对大 d，单作及套作 Pn 的表现为晚熟＞中熟＞早熟，单作 豆苗期产生了不利的影响，主要是由于马铃薯对套作 大豆早、中、晚熟品种间差异达到显著水平，套作大 大豆的遮蔽作用造成的； IPZ、IPJ、IPQ 出苗后 60 d 豆中、晚熟与早熟间差异显著，中、晚熟品种间差异 较出苗后 20 d 的 Pn 分别上升了 40.92%、75.56%、 不显著；出苗后 100 d，单作大豆 Pn 表现为 SPQ＞SPZ 80.99%，SPZ、SPJ、SPQ 分别上升了 32.08%、44.75%、 ＞SPJ，SPQ 与 SPZ 、SPJ 差异达到显著水平，SPZ 与 73.04%，套作大豆较单作大豆 Pn 上升速度加快；IPZ、 SPJ 差异不显著，套作大豆 Pn 表现为 IPQ＞IPJ＞IPZ， IPJ、IPQ 出苗后 100 d 较出苗后 60 d 的 Pn 分别上升了 各品种间差异达到显著水平。中晚熟品种在单作及套 27.75%、31.1%、42.1%，SPZ、SPJ、SPQ 分别上升了 作下 Pn 差异不显著，而早熟品种在单作及套作下 Pn 19.15%、11.79%、9.64%，同样，套作大豆较单作大 差异显著，表明套作不同熟期大豆品种，在马铃薯收 豆 Pn 上升速率加快，表明套作大豆在马铃薯生育后 获后恢复作用不同，中晚熟品种较早熟品种后期补偿 期，尤其是马铃薯收获后，光合速率补偿效应显著。 效果显著。

3 期 陈光荣等：薯/豆套作模式下不同熟期大豆品种的生长补偿效应 461 ) -1 mol·s μ Photosynthetic rate ( 光合速率

每个值为平均值±标准误，柱上不同字母表示差异显著（P＜0.5） Values are mean ±SE of three replicates. Bars superscripted different letters are significantly different among treatments at P＜0.05

图 2 单作和套作对不同大豆品种光合速率的影响 Fig. 2 Effect on net photosynthetic rate (Pn) in different soybeans under intercropping and sole cropping

2.5 产量构成及土地当量 两年平均值）。各大豆品种在单作及套作模式下百粒 2.5.1 产量构成 由表 5 可知，马铃薯/大豆模式下 重无显著差异，但各个品种间差异显著。套作及单作 不同大豆品种有效荚数、单株粒数及每荚粒数均低于 模式下单株粒重均表现为晚熟＞中熟＞早熟，且不同 单作模式。早熟品种的有效荚数、单株粒数及每荚粒 品种间差异性均达到显著水平。 数差异性达到显著水平（P＜0.05），套作模式较单作 2.5.2 土地当量比 与单作相比，套作大豆籽粒产量 模式分别下降了 24.15%、22.14%、18.92%；而中晚熟 降低，大豆早、中、晚熟品种籽粒产量分别降低了 品种下降不显著，尤其是晚熟品种，套作模式较单作 41.49%、17.18%和 9.89%（表 6），中、晚熟品种降 模式仅仅下降了 6.34%、8.3%、1.71%（2012 和 2013 幅低于早熟品种，套作对早熟品种产量的影响大于中、

表 5 单作及套作下大豆产量构成因素 Table 5 Yield components of different soybeans under intercropping and sole cropping 年份 处理 有效荚数 单株粒数 每荚粒数 单株粒重 百粒重 Year Treatment Effective pods per plant Seeds per plant Seeds per pod Yield per plant (g) 100-seeds weight (g) 2012 IPZ 35.36d 54.09c 1.53b 9.74e 18.03c

IPJ 47.44c 82.90b 1.74a 18.57cd 22.44b

IPQ 57.47ab 106.52a 1.85a 27.84b 26.14a

SPZ 45.53c 84.30b 1.85a 16.18d 19.19c

SPJ 50.01bc 95.39b 1.91a 21.92c 23.01b

SPQ 60.92a 115.32a 1.89a 31.81a 27.59a

2013 IPZ 31.35d 52.19e 1.42c 8.94e 17.44e

IPJ 43.32c 79.46d 1.59b 17.24d 21.69cd IPQ 54.48ab 103.09b 1.79a 26.86b 26.05ab SPZ 42.43c 89.40c 1.78a 16.63d 18.62d SPJ 51.56b 95.09bc 1.75a 22.21c 22.07c SPQ 58.61a 113.27a 1.81a 30.22a 26.68a

462 中 国 农 业 科 学 49卷

表 6 马铃薯/大豆对产量与土地当量比的影响 Table 6 Effect of potato/soybean intercropping on yield and equivalent rations (LER) 年份 处理 产量 Yield (kg·hm-2) 土地当量比 LER Year Treatment 马铃薯 大豆 马铃薯 大豆 马铃薯+大豆 Potato Soybean Potato Soybean Potato+ Soybean 2012 Potato 43806.86a — 1.00 — 1.00

IPZ 40361.55b 1355.56d 0.92 0.60 1.52

SPZ — 2247.65c — 1.00 1.00

IPJ 41410.90ab 2607.47bc 0.95 0.86 1.81

SPJ — 3031.26b — 1.00 1.00

IPQ 41511.25ab 3570.79a 0.95 0.89 1.84

SPQ — 4020.39a — 1.00 1.00

2013 Potato 42199.35a — 1.00 — 1.00

IPZ 38486.75b 1416.60e 0.91 0.57 1.48

SPZ — 2497.25d — 1.00 1.00

IPJ 39310.60b 2378.20d 0.93 0.80 1.73

SPJ — 2987.00c — 1.00 1.00

IPQ 38143.20b 3223.20b 0.90 0.91 1.82

SPQ — 3526.45a — 1.00 1.00

晚熟品种。马铃薯/大豆的 LER 均大于 1，表 明 马 铃 豆出苗后 20—60 d 干物质积累与产量及产量构成因素 薯/大豆可提高土地复种指数，提高土地利用率，具 之间呈正相关，但相关性不显著；出苗后 80 d 干物质 有良好的产出效果。中、晚熟大豆品种的套作产量 积累与每荚粒数和单株粒数呈显著正相关，出苗后 较早熟品种套作产量分别提高了 79.85%和 145.08%， 100 d 干物质积累与有效荚数、每荚粒数、单株粒数、 LER 分别达到了 1.77 和 1.83，说明中、晚熟品种套 单株粒重、百粒重及产量均呈现显著正相关；出苗后 作优势更强，其优势主要来源于大豆（LER 为 0.83 120—140 d 干物质积累与有效荚数、每荚粒数、单株 和 0.91），原因是中、晚熟大豆品种生育期较长， 粒重、百粒重及产量达到极显著正相关。由表 9 可知， 能够减缓前期生长的荫蔽伤害，使大豆叶面积指数、 大豆光合速率与产量及产量构成因素之间呈现正相 光合速率均保持在较高水平，从而为马铃薯收获后 关，大豆出苗后 20 d 相关性不显著，出苗后 60 d 相关 进行光合补偿生长提供物质和能量基础，保证了套 系数由大到小依次为每荚粒数（0.83*）＞产量（0.81*） 作大豆较高产量。 ＞有效荚数（0.80*）＞单株粒重（0.80*）＞单株粒数 2.5.3 叶面积指数、干物质积累、光合速率与产量的 （0.77*）＞百粒重（0.67）；出苗后 100 d 相关系数 关系 由表 7 可以看出，在大豆出苗后 20—80 d LAI 从小到大依次为单株粒重（0.87*）＞有效荚数（0.86*） 与大豆产量及产量构成因素之间相关性不显著；大豆 ＞每荚粒数（0.86*）＞产量（0.85*）＞单株粒数（0.83*） 出苗后 100—140 d LAI 与有效荚数、单株粒重、百粒 ＞百粒重（0.81*）。以上结果表明，大豆与马铃薯非 重及产量呈显著正相关关系，大豆出苗 100 d LAI 正 共生期长短与大豆叶面积指数、干物质积累量及产量 相关系数由大到小依次为百粒重（0.94**）＞单株粒 构成因子呈显著相关关系。 重（0.85*）＞有效荚数（0.82*）＞产量（0.82*）， 3 讨论 大豆出苗后 120 d 相关系数由大到小依次为百粒重 （0.95**）＞单株粒重（0.86*）＞有效荚数（0.82*） 生育期长短是选择大豆品种时应考虑的主要因素 ＞产量（0.81*）；大豆出苗后 140 d 相关系数由大到 之一，生育期过长会导致霜冻或影响下茬作物播种； 小依次为百粒重（0.97**）＞单株粒重（0.90**）＞有 生育期过短将难以充分利用生长季节，影响产量。在 效荚数（0.87*）＞产量（0.85*）。由表 8 可知，在大 间套作模式中要兼顾各季作物的良性生长，获得全年

3 期 陈光荣等：薯/豆套作模式下不同熟期大豆品种的生长补偿效应 463

表 7 不同生育时期大豆叶面积指数与产量及其构成因素的相关系数 Table 7 LAI and simple correlation coefficient of yield and yield components in different growth period of soybean LAI LAI LAI LAI LAI LAI LAI 有效荚数 每荚粒数 单株粒数 单株粒重 百粒重 产量 20 d 40 d 60 d 80 d 100 d 120 d 140 d Effective pods Seeds per Seeds per Yield per 100-seeds Yield per plant pod plant plant weight LAI 20 d 1 LAI 40 d 0.59 1 LAI 60 d 0.25 0.92** 1 LAI 80 d 0.28 0.45 0.50 1 LAI 100 d -0.65 -0.43 -0.15 0.46 1 LAI 120 d -0.80* -0.61 -0.32 0.18 0.95** 1 LAI 140 d -0.85* -0.62 -0.31 0.15 0.94** 0.99** 1

有效荚数 -0.82* -0.20 0.17 0.27 0.82* 0.82* 0.87* 1 Effective pods per plant 每荚粒数 -0.79* -0.08 0.29 0.24 0.72 0.72 0.78* 0.99** 1 Seeds per pod 单株粒数 -0.59 0.20 0.53 0.23 0.44 0.41 0.50 0.85* 0.92** 1 Seeds per plant 单株粒重 -0.86* -0.27 0.11 0.23 0.85* 0.86* 0.90** 0.99** 0.97** 0.81* 1 Yield per plant 百粒重 -0.84* -0.43 -0.08 0.25 0.94** 0.95** 0.97** 0.95** 0.89** 0.66 0.97** 1 100-seeds weight 产量 Yield -0.80* -0.17 0.20 0.30 0.82* 0.81* 0.85* 0.99** 0.97** 0.86* 0.97** 0.95** 1

* P＜0.05，** P＜0.01。下同 The same as below

表 8 不同生育时期大豆干物质积累与产量及其构成因素的相关系数 Table 8 Dry matter accumulation(DMA) and simple correlation coefficient of yield and yield components in different growth period of soybean DMA DMA DMA DMA DMA DMA DMA 有效荚数 每荚粒数 单株粒数 单株粒重 百粒重 产量 20 d 40 d 60 d 80 d 100 d 120 d 140 d Effective pods Seeds per Seeds per Yield per 100-seeds Yield per plant pod plant plant weight DMA 20 d 1 DMA 40 d 0.93** 1 DMA 60 d 0.98** 0.96** 1 DMA 80 d 0.96** 0.90** 0.92** 1 DMA 100 d 0.82* 0.75 0.75 0.94** 1

DMA 120 d 0.56 0.45 0.44 0.76* 0.92** 1

DMA 140 d 0.37 0.26 0.23 0.60 0.82* 0.97** 1

有效荚数 0.34 0.25 0.21 0.58 0.81* 0.97** 0.99** 1 Effective pods per plant 每荚粒数 0.61 0.41 0.46 0.74 0.86* 0.94** 0.91** 0.86* 1 Seeds per pod 单株粒数 0.69 0.53 0.56 0.81* 0.89** 0.92** 0.87* 0.81* 0.97** 1 Seeds per plant 单株粒重 0.79* 0.69 0.69 0.83* 0.81* 0.74 0.66 0.57 0.85* 0.92** 1 Yield per plant 百粒重 0.58 0.38 0.43 0.73 0.87* 0.96** 0.94** 0.90** 0.96** 0.97** 0.81* 1 100-seeds weight 产量 Yield 0.38 0.16 0.22 0.56 0.76* 0.92** 0.94** 0.98** 0.95** 0.89** 0.96 0.97** 1

464 中 国 农 业 科 学 49卷

表 9 不同生育时期大豆光合速率与产量及其构成因素的相关系数 Table 9 Photosynthesis and simple correlation coefficient of yield and yield components in different growth period of soybean Pn 20 d Pn 60 d Pn100 d 有效荚数 每荚粒数 单株粒数 单株粒重 百粒重 产量 Effect pods per plant Seeds per pod Seeds per plant Yield per plant 100-seeds weight Yield Pn 20 d 1

Pn 60 d 0.73 1

Pn 100 d 0.29 0.80* 1

有效荚数 0.27 0.80* 0.86* 1 Effective pods per plant 每荚粒数 0.39 0.83* 0.86* 0.99** 1 Seeds per pod 单株粒数 0.57 0.77* 0.83* 0.86* 0.93** 1 Seeds per plant 单株粒重 0.25 0.80* 0.87* 0.97** 0.99** 0.82* 1 Yield per plant 百粒重 0.03 0.67 0.81* 0.95** 0.89** 0.67 0.97** 1 100-seeds weight 产量 Yield 0.29 0.81* 0.85* 0.99** 0.99** 0.87* 0.99** 0.95** 1

高产，对品种的选择就更加严格。大豆生育期结构与 充分满足条件下选择生育期较长的大豆品种，在玉米 产量存在相关关系[28]。韩天富等[26]研究表明，延长生 收获后，大豆进行一段时间的恢复生长，光合特性明 育前期长度明显增加大豆单株粒数和产量，而延长生 显提高，干物质积累量呈上升趋势，套作大豆生殖生 育后期长度不利于单株粒数和产量的提高，但有利于 长不受影响，表现出超补偿效应。本研究与前人研究 增加百粒重。陈学珍等[29]对夏播大豆生育期研究认为 结果一致，在作物生长前期，套作大豆较单作大豆 生育前期所占比例越大，分化的花芽数越多，单株荚 LAI、干物质积累量、净光合速率等指标降低，差异 数、单株粒数越多，单株产量越高。栽培条件不同， 达到显著水平；在马铃薯收获后，套作大豆 LAI、干 品种的生育期结构也会随之发生变化。张正翼等[30]对 物质积累量、光合速率上升速率加快，套作与单作差 套作大豆研究表明营养生长期延长，有利于增叶增花， 异逐渐缩小，但不同熟期品种表现不同。 积累光合产物，从而更好地进行生殖生长。本研究结 间套作中优势作物前期的竞争作用和弱势作物后 论与其基本一致，各套作大豆品种相对于单作开花期 期的恢复补偿作用是两作物共同高产的前提和基础， 延迟 7 d 左右，但对于全生育期影响不大，表明套作 而恢复补偿作用的发挥与复合群体品种的合理搭配是 大豆营养生长期延长而生殖生长期相对缩短。 密切相关的[23]。唐劲驰等[41]研究发现，在不同品种玉 在间套作模式中，作物在共生期受到一定的水 米与小麦间套作的比较试验中，生育期短的玉米品种， 分[31-32]、光 温 [33-34]以及土壤养分胁迫[6, 8]，通常会在形 生殖生长期与小麦共生期长，受小麦影响较大，产量 态和生理上发生相应的改变；前茬作物收获后，后茬 低。相反，生育期长的品种，生殖生长期与小麦共生 作物还有一段独立生长期，可进行补偿生长，以缓解 期短，受小麦影响小，产量较高。王竹等[20-21]通过对 前期竞争造成的损失。Mushagalusa[35]和黄承建等[36] 玉米大豆复合系统的研究发现，大豆与玉米非共生期 认为，套作玉米苗期受马铃薯荫蔽处于受光劣势，LAI 长短与大豆产量呈极显著正相关，而大豆和玉米的生 显著降低，生育后期马铃薯收获后，套作玉米 LAI 与 殖生长共生期长短与大豆产量呈极显著负相关。由此 单作差异逐渐缩小，但降低的趋势并没有改变。李隆 可见，生殖生长共生期的长短是影响套作大豆产量的 等[23, 37]对西北灌区小麦间作大豆和玉米间作大豆种 主要原因之一。本研究中，从马铃薯与大豆的共生期 间营养竞争的研究表明，作物共生期，间套作大豆和 分析，不同熟期大豆品种间无差异，但从马铃薯与大 玉米养分含量和吸收量低于单作，小麦收获后，间套 豆生殖生长共生期分析，大豆品种间差异达到显著水 作大豆和玉米地上部养分吸收速率加快，植株干物质 平；早熟大豆品种与马铃薯的生殖生长共生期较长， 积累量直线上升，至成熟时已接近或超过相应的单作。 套作大豆有效荚数、每荚粒数、单株粒数、单株粒重 杨文钰等[38-40]研究认为，玉米-大豆套作体系中，水肥 较单作显著下降，最终产量低；而中、晚熟大豆品种

3 期 陈光荣等：薯/豆套作模式下不同熟期大豆品种的生长补偿效应 465

与马铃薯的生殖生长共生期较短，有利于开花结荚和 at late growth stages. Soil Science and Plant Nutrition, 2011, 57(1): 籽粒的形成，最终产量较高，这与前人的研究基本一 61-67. 致[30]。 [8] Zuo Y M, Zhang F S, Li X L, Cao Y P. Studies on the improvement in iron nutrition of peanut by intercropping with maize on a calcareous 4 结论 soil. Plant Soil, 2000, 220(1): 13-25. 在马铃薯/大豆套作模式中，马铃薯是核心作 [9] Kathiresan R M. Integration of elements of a farming system for 物，在两作物共生期处于竞争优势，而大豆处于竞 sustainable weed and pest management in the tropics. Crop Protection, 争弱势，对于弱势作物的恢复生长能力可以通过不 2007, 26(3): 424-429. 同熟期品种合理搭配来调控。不同大豆品种生育期 [10] Bilalis D, Papastylianou P, Konstantas A, Patsiali S, Karkanis A, 结构的差异，导致了后期恢复生长能力的不同。本 Efthimiadou A. Weed-suppressive effects of maize-legume intercropping 试验条件下中、晚熟大豆品种与马铃薯组合套作优 in organic farming. International Journal of Pest Management, 2010, 势更强，其生育期较长，营养生长期相对延长，导 56(2): 173-181. 致生殖生长共生期缩短，使大豆叶面积指数、光合 [11] Olorunmaiye P M. Weed control potential of five legume cover crops 速率均保持在较高水平，从而为马铃薯收获后进行 in maize/cassava intercrop in a southern Guinea savanna ecosystem of 光合补偿生长提供物质和能量基础，保证了套作大 Nigeria. Australian Journal of Crop Science, 2010, 4(5): 324-329. 豆较高产量。 [12] 陈光荣, 张国宏, 王立明, 杨如萍. 西北沿黄灌区不同作物间套作 大豆产出效果分析, 大豆科学, 2013(5): 614-619. References Chen G R, Zhang G H, Wang L M, Yang R P. Quantitative evaluation [1] Zhang L, Werf W, Zhang S, Li B, Spiertz J H J. Growth, yield and and analysis on different cropping patterns of soybean in Northwest

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半干旱区全膜覆盖垄沟间作种植马铃薯和 豆科作物的水热及产量效应

张绪成，王红丽，于显枫，侯慧芝，方彦杰，马一凡

（甘肃省农业科学院旱地农业研究所/甘肃省旱作区水资源高效利用重点实验室，兰州 730070）

摘要：【目的】间套作是克服马铃薯连作障碍、提高降水利用效率和农田生产力的有效途径，但在半干旱旱 作区发展间套作，必须选择基于水分承载力的模式。【方法】依托 4 年大田定位试验，测定全膜覆盖垄沟种植马铃 薯单作（PM）、马铃薯蚕豆间作（PF）、马铃薯豌豆间作（PS）和马铃薯扁豆间作（PH）的土壤温度、土壤贮水量、 作物产量等指标，计算耗水量、经济收益和水分经济收益率，明确其产量和水分效应，并评价其农田水分持续性。 【结果】间作有利于缓解 6—7 月份的高温胁迫，在 2012—2014 年，PF、PS 和 PH 处理在该时期 0—25 cm 土层的 土壤温度较 PM 处理下降 0.8—3.6℃、0.4—2.8℃和 0.8—1.8℃。间作促进作物利用深层土壤水分，在干旱和平 水年的耗水深度达 200 cm。与马铃薯单作相比，PF 处理使花前耗水增加 41.6—131.7 mm，而使干旱（2011）和 平水年份（2012）的花后耗水分别减少 48.6 mm 和 34.3 mm；PH 同样增加了花前耗水，但花后耗水量和单作处理 无显著差异；PS 的花前花后耗水量介于二者之间。PH 的经济收益和水分经济收益率最高，分别较马铃薯单作增加 了 29.8%—51.4%和 19.8%—24.0%。4 个处理 0—200 cm 土层土壤贮水量在 4 年期间增加了 100 mm 以上，表明全 膜覆盖条件下马铃薯和豆科作物间作种植，对土壤水分的年际平衡无显著负影响。【结论】PH 能够降低 6—7 月高 温期间 0—25 cm土层的土壤温度，增加马铃薯花后耗水量，增产效果显著，并对土壤水分持续性无明显负面影响， 可作为西北黄土高原半干旱区较为理想的间作模式推广应用。 关键词：半干旱区；全膜覆盖垄沟种植；马铃薯；豆科；间作；土壤水热；经济收益

The Study on the Effect of Potato and Beans Intercropping with Whole Field Plastics Mulching and Ridge-Furrow Planting on Soil Thermal-Moisture Status and Crop Yield on Semi-Arid Area

ZHANG Xu-cheng, WANG Hong-li, YU Xian-feng, HOU Hui-zhi, FANG Yan-jie, MA Yi-fan

(Institute of Dryland Farming, Gansu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of High Water Utilization on Dryland of Gansu Province, Lanzhou 730070)

Abstract: 【Objective】Intercropping is one of the main technologies to solve the potato continuous cropping obstacles, and increase crop productivity. However, it is very important to consider the local soil water capacity before developing a potato intercropping system in the semiarid area.【Method】A 4-year field experiment was carried out from 2011 to 2014 with four treatments: (1) mono-potato (PM), (2) potato and faba bean intercropping (PF), (3) potato and soybean intercropping (PS), and (4) potato and haricot bean intercropping (PH). The soil temperature, soil water content and crop yield had been investigated; the crop water consumption, economic returns and water economic yield were calculated, to understand the effects of different intercropping models on crop productivity and soil moisture. In addition, soil water sustainability was appraised under intercropping system on semiarid area. 【Result】The intercropping relieved the heat stress from June to July, the soil temperature

收稿日期：2015-07-09；接受日期：2015-10-14 基金项目：国家科技支撑计划（2015BAD22B04）、农业部公益性行业科研专项（201203031） 联系方式：张绪成，E-mail：[email protected]

3 期 张绪成等：半干旱区全膜覆盖垄沟间作种植马铃薯和豆科作物的水热及产量效应 469 in 0-25 cm profile of PF, PS and PH decreased by 0.8-3.6℃, 0.4-2.8℃ and 0.8-1.8℃ from 2012 to 2014 respectively, as compared with PM, this may advantage to the potato growth. The soil water content decreased, especially, the deeper soil water depleted in intercropping treatments as compared with mono-potato treatment, the depth of soil water depletion reached to 200 cm in the intercropping treatment, compared with PM, the soil water depletion of PF increased by 41.6-131.7 mm in potato pre-flowering period, and decreased by 48.6 mm and 34.3 mm in dry year (2011) and normal year (2012) in post-flowering period respectively. Although the soil water depletion of PH treatment increased in pre-flowering period, but not decreased in post-flowering period significantly, as compared with PM. The variation of soil water depletion in pre- and post-flowering period in PS was between PF and PH. The economic returns and water economic yield of PH was highest, increased by 29.8%-51.4% and 19.8%-24.0% than PM, respectively. The soil water storage in 0-200 cm profile increased more than 100 mm through the 4 experimental years, indicated that there were no adverse effect on soil water sustainability in potato and beans intercropping, when the whole field plastics mulching and ridge-furrow planting technology used in semiarid area. 【Conclusion】Potato and haricot bean intercropping decreased the soil temperature in the hot season (i.e. June and July), increased potato water consumption in post-flowering period, resulted in significant increment of incomes, and had no risk on the annual soil water balance, which could be widely applied in the rain-fed semi-arid area of northwest Loess Plateau. Key words: semi-arid area; whole field plastics mulching and ridge-furrow planting; potato; beans; intercropping; soil thermal- moisture status; income

玉米马铃薯间作改变了根际微生物群落结构组成，提 0 引言 高了根际微生物群落功能多样性，是维持土壤生态系 【研究意义】马铃薯具有抗旱、高产、耐瘠薄等 统稳定性与可持续发展的重要措施[16]。马铃薯蚕豆 优势，需水规律和西北半干旱区降水格局基本吻合， 间作能够改善马铃薯品质[17]，并能显著提高农田产 是该区着力发展的特色优势作物之一[1]。近年来，马 出和经济收益[12,18-20]。全膜覆盖垄沟种植技术能够显 铃薯的播种面积迅速增加，以西北旱作马铃薯主产区 著改善土壤的水分状况[5-6,21-22]，使土壤贮水量尤其是 ——甘肃省定西市为例，2012 年超过 21.3 万 hm2， 作物生育前期的土壤贮水量逐年增加，为旱作区发展 占总耕地面积的 19%以上，占粮食作物播种面积的 马铃薯间套作创造了可能的水分条件，但目前对全面 47.2%[2]，成为农业增产和农民增收的重点产业[3-6]。 覆盖垄沟种植条件下，马铃薯间作体系的水分和产量 马铃薯播种面积的扩大导致连作面积和年限逐年增 效应无系统研究报道。【本研究切入点】间套作和轮 加，使马铃薯病害大面积发生；另外，全膜覆盖垄沟 作等栽培途径是目前解决马铃薯连作障碍最为有效 种植使 7—8 月的高温雨季土壤贮水量和温度增加， 的途径之一，而全膜覆盖垄沟种植技术的应用为发展 这是马铃薯病害大面积发生的另一个重要诱因[7]。 马铃薯间作创造了水分条件。选择不同耗水量的用养 2013 年甘肃省晚疫病发病面积达到 53.3 万 hm2，占 地作物——豆科作物为间作对象，在全膜覆盖垄沟种 马铃薯总播种面积的 78.13%[8]。因此，克服西北半 植条件下研究不同间作模式的产量和水分效应，建立 干旱区连作障碍和关键生育期高温高湿生境障碍对 基于水分安全的间作模式，在缓解马铃薯连作障碍和 马铃薯生产的制约，成为西北旱作马铃薯主产区面 伏期高温高湿胁迫的基础上，实现半干旱区马铃薯生 临的重大问题。而通过合理间作改善土壤生物环境、 产高效和生态安全的目标。【拟解决的关键问题】在 降低连作障碍风险[9]，并调控土壤的水分和温度过 4 年大田定位试验的基础上，选择高耗水高秆豆科作 程[10-12]，以降低雨季高温高湿的生境胁迫，是解决这 物蚕豆、低耗水中矮秆豆科作物豌豆和高抗旱低杆作 一问题的根本途径。【前人研究进展】克服连作障 物扁豆与马铃薯间作，在全膜覆盖垄沟种植条件下， 碍，可通过应用改善土壤微生境的生物菌肥来实现， 持续观测土壤温度、湿度的变化，测定马铃薯产量， 但目前就生物菌肥克服连作障碍的途径仅处于研究 并计算作物经济收益和水分经济收益率等指标，来判 阶段[12-13]，在生产上缺乏有支撑力的产品。马铃薯和 定不同间作模式对作物体系生产经济效益的影响，评 蚕豆间作能增加农田生态系统的稳定性，有效地降 价间作种植对半干旱区农田间作高产种植的土壤水 低作物病害的严重程度[14]，降低根际土壤真菌的数 分持续性，为区域马铃薯高产高效持续技术的创新提 量[15]，使病虫害发生几率和程度显著低于单作地块。 供理论支撑。

470 中 国 农 业 科 学 49卷

铃薯与蚕豆间作（PF）、马铃薯和豌豆间作（PS）、 1 材料与方法 马铃薯和扁豆间作（PH），每个处理 3 次重复。试验 1.1 试验地概况 采用全膜覆盖垄沟种植，垄宽 60 cm，沟 宽 40 cm，带 试验于 2011—2014 年在甘肃省农业科学院定西试 宽 100 cm。马铃薯种植在垄的两侧，豆科作物种植在 验站（104°36′ E，35°35′ N）进行。该区海拔 1 970 m， 沟内，全地面地膜覆盖。各处理马铃薯密度为 4.95 万 年平均气温 6.2℃，年辐射总量 5 898 MJ·m-2，年日 株/hm2，蚕豆密度 4.95 万株/hm2，豌豆密度 21.0 万株 照时数 2 500 h，≥10℃积温 2 075.1℃，无霜期 140 d， /hm2，扁豆密度 54.0 万株/hm2；蚕豆和豌豆每沟种植 属中温带半干旱气候。作物一年一熟，为典型旱地雨 2 行，扁豆种植 3 行，单作与间作的种植密度相同。 养农业区。年均降水量 415 mm，6—9 月降水量占年 供试马铃薯品种为新大坪，蚕豆品种为临蚕 131，豌 降水量的 68%，降水相对变率为 24%，400 mm 降水 豆品种为陇碗 1 号，扁豆为当地品种。小区面积 45 m2 保证率为 48%。试验区土壤为黄绵土，0—30 cm 土层 （6 m×7.5 m）。单作马铃薯小区大小同间作，种植 平均容重 1.25 g·cm-3，田间持水量为 21.18%，永久凋 方式见图 1。各处理施肥量均为有机肥 30 t·hm-2（速 -1 萎系数为 7.2%。 效 NPK 的养分含量分别为 5.0、3.5、4.0 g·kg ），P2O5 -2 -2 1.2 试验设计 60 kg·hm ，K2O 22.5 kg·hm ，全部作为基肥；N 90 试验设 4 个处理，分别是马铃薯单作（PM）、马 kg·hm-2，其中 60%作基肥，40%作马铃薯花期追肥。

图 1 全膜覆盖垄沟间作马铃薯-豆科作物示意图 Fig. 1 Intercropping model of potato and bean in ridges and furrows with plastic mulching

1.3 试验区 2011—2014 降雨量及平均气温 ℃，平均气温为 6.33℃；2013 年最低温为-13.6℃，最 根据甘肃省农业科学院定西试验站气象资料统计 高温为 21.4℃，平均气温为 7.19℃；2014 年最低温为 （甘肃省定西市安定区团结镇唐家堡村，104°36′ E， -11.9℃，最高温为 23.6℃，平均气温为 6.96℃。 35°35′ N），2011 年试验区全年降雨量为 346.4 mm， 1.4 测定指标与方法 豆科作物生育期降雨量为 144 mm，马铃薯生育期降雨 1.4.1 土壤温度 参考 Cook 等[21]的方法，于 2012 量为 232.8 mm，属于严重的欠水年份（图 2）；2012 —2014 年在马铃薯生长的全生育期用地温计进行 0— 年试验区全年降雨量为 484.4 mm，豆科作物生育期降 25 cm 地温测定，每 5 cm 为一个测定层，每小区在垄 雨量为 222 mm，马铃薯生育期降雨量为 394.6 mm，属 上两穴马铃薯中间选择一个位点定点测定。每 10—15 d 于平水年份；2013 年试验区全年降雨量为 551.9 mm， 在 8：00、14：00、20：00 各测定一次。 豆科作物生育期降雨量为 370.9 mm，马铃薯生育期降 1.4.2 土壤贮水量 根据土壤容重和土壤含水量计 雨量为 445.1 mm，属于丰水年份；2014 年试验区全年 算，用土钻法取各小区 0—200 cm 土样，测定步长为 降雨量为 482.2 mm，豆科作物生育期降雨量为 237.2 20 cm，用烘干称重法测定土壤含水量。分别在豆科作 mm，马铃薯生育期降雨量为 355.3 mm，属于平水年份， 物播期、苗期、分枝期、开花期、结荚期和成熟期， 但季节分配不均。因此，试验执行期 2011—2014 年降 马铃薯播期、苗期、分枝期、开花期、盛花期、块茎 雨量年际间变率较大，年内季节分配不均，对豆科作物 膨大期和收获期测定，其中马铃薯播期和豆科作物分 和马铃薯的生长造成一定影响，导致产量极不稳定。 枝期、马铃薯苗期和豆科作物开花期、马铃薯花期和 2011 年最低温为-16.4℃，最高温为 23.6℃，平均 豆科作物成熟期重合。单作处理在作物种植行间取样 气温为 6.6℃；2012 年最低温为-19.8℃，最高温为 21.6 测定土壤水分；间作区在马铃薯带、豆科作物带、交

3 期 张绪成等：半干旱区全膜覆盖垄沟间作种植马铃薯和豆科作物的水热及产量效应 471

80 50 降雨量 Precipitation 平均气温 Average air temperature 2011年

60 30

40 10

20 -10

0 -30

80 50 2012年

60 30

40 10 ) ℃ 20 -10

0 -30

80 50 Precipitation (mm) 2013年 Average temperature ( air Average 降雨量 60 30 平均气温

40 10

20 -10

0 -30

80 50 2014年

60 30

40 10

20 -10

0 -30 1 31 61 91 121 151 181 211 241 271 301 331 361 时间（天） Time (day)

图 2 2011—2014 年试验区降水分布和平均气温变化 Fig. 2 Precipitation and average air temperature in test areas from 2011 to 2014

472 中 国 农 业 科 学 49卷

错带分别设 1 个测定点，分析时取其平均值。2011— 量影响（图 4）。在干旱的 2011 年，间作后土壤贮 2014 年马铃薯播期、现蕾期、盛花期、块茎膨大期和 水量随作物生育期推进显著下降，并在豆科作物收 收获期分别在 4 月下旬、6 月中旬、7 月下旬、8 月下 获后达到显著差异，下降了 51.9—119.8 mm，平均为 旬和 9 月中下旬。 89.3 mm；在 2012 年，间作后土壤水分在豆科作物开 1.4.3 生育期耗水量计算 生育期耗水量（mm）= 花后显著低于单作处理，下降了 46.7—122.1 mm，平 生育期前土壤贮水量（mm）-生育期后土壤贮水量 均为 96.8 mm；PF 的土壤含水量低于 PH 和 PS，并在 （mm）+本生育期降水量（mm）[22]。 豆科作物收获后达到显著差异，PH 和 PS 的土壤贮水

1.4.4 耗水深度的计算 根据经验当（SWSi-SWSb） 量分别较 PF 平均高 52.2 和 13.7 mm；除 2013 年马铃

/SWSb＜5%时，认为该土层土壤水分没有被耗散。式 薯现蕾期和 2014 年马铃薯播种期外，单作处理和间作

中，SWSi 为某一土层土壤含水量（%）；SWSb 为播前 处理之间的土壤贮水量无显著差异。因此，间作降低了 对应土层土壤含水量（%）。 土壤贮水量，以 PF 的下降幅度最大，在干旱和平水年 1.4.5 经济收益 成熟期按小区收获计产，间作处理 份，间作尤其是 PF 可能会加剧阶段性干旱危害程度。 2 种作物分别收获。按当地市场价格，马铃薯 0.8 元/kg， 2.3 间作对作物关键生育期土壤水分分布的影响 蚕豆 6.0 元/kg，豌豆 7.0 元/kg，扁豆 8.0 元/kg。间作 间作对不同降水年型的土壤水分垂直分布有明显 处理的经济收益等于两种作物的经济收益之和。 影响（图 5）。在干旱年份（2011 年），间作后土壤 1.4.6 作物水分经济收益率 参考汤永禄等[23]的方 耗水深度随作物发育进程而增加，在豆科作物花期， 法并作改进，EWUE=E／ET，式中，E 为不同处理的 耗水深度为 80 cm，马铃薯花期达到 120 cm，马铃薯 经济收益，ET 为每公顷的总耗水量。ET（t）=（播前 膨大期达到 160 cm；在平水年（2012 和 2014 年）， 土壤贮水量（mm）-收获后土壤贮水量（mm）+生育 上述三个生育期的耗水深度分别达到 60、180 和 200 期内降雨量（mm））×10 000（m2）/1000。计算间作 cm。在 2011 和 2012 年，PF 的耗水深度和不同土层 区 ET 时，播前土壤贮水量为间作豆科作物播前的土壤 的耗水量最大。在丰水年（2013 年），虽然不同间作 贮水量，收后土壤贮水量指间作马铃薯收获后的贮水 模式的耗水深度和在不同土层的耗水量有不同，但与 量，降雨量为豆科作物播种到马铃薯收获期降雨量。 单作仍有较明显差别，尤其在豆科作物花期，间作处 1.5 数据处理与分析 理的耗水深度达 120 cm，与单作达到显著差异。 用 Excel 2003 和 DPS 统计分析软件处理数据， 间作处理间，耗水深度和不同土层的耗水量以 PF Tukey 法检验处理间的差异显著性。 最高，尤其在 2012 年马铃薯花期和块茎膨大期，PF 在 0—60 cm 土层、120—200 cm 土层的土壤贮水量分 2 结果 别显著低于 PS 和 PH。PS 在 0—200 cm 土层土壤贮水 2.1 间作对土壤温度的影响 量在豆科作物花期和马铃薯花期低于 PH，但二者无显 在马铃薯不同生育期，间作对土壤温度的影响不 著差异。在马铃薯块茎膨大期，PH 在 0—60 cm 土层 同（图 3）。在气温上升的 4—6 月份，间作和单作的 的土壤贮水量显著低于马铃薯单作，但与 PS 和 PF 无 土壤温度无明显差异；在温度较高的 6—7 月份，间作 显著差异。 降低了土壤温度，2012 年 PF、PS 和 PH 分别较 PM 2.4 间作对马铃薯花前花后耗水量的影响 降温 3.6、2.8 和 1.8℃；2013 年同期的降水高于 2012 间作使马铃薯花前的耗水量显著增加（图 6）。 年，分别降温 0.8、0.9 和 0.8℃；2014 年 6 月初到 7 在 2011 和 2012 年，间作处理马铃薯花前的耗水量显 月初降水 20.9 mm，分别降温 1.3、0.4 和 1.1℃。在马 著高于单作，分别增加了 98.5—131.7 mm、58.3—116.4 铃薯块茎增长期，由于豆科作物收获，间作和单作间 mm；而在 2013 年和 2014 年，间作花前的耗水量较 的土壤温度无显著差异。间作处理间的土壤温度不同， 单作增加了 36.4—46.7 mm、16.1—49.9 mm，差异不 高温时段以 PH 处理为高，但处理间无显著差异。因 显著。2011 和 2012 年单作花后耗水量显著高于 PF 和 此，间作能够降低高温时段的土壤温度，伏期较低的 PS，但与 PH 无显著差异；2013 年间作处理的花后耗 土壤温度会更利于马铃薯生长。 水量显著高于单作，而在 2014 年间作和单作无显著差 2.2 间作对 0—200 cm 土层土壤贮水量的影响 异。除 2011 年 PH 的花后耗水量显著高于 PF 和 PS 间作降低了土壤贮水量，其变化幅度显著受降水 外，其余年份间作处理间的花后耗水量无显著差异。

3 期 张绪成等：半干旱区全膜覆盖垄沟间作种植马铃薯和豆科作物的水热及产量效应 473

40 PM PF PS PH 2012

30

20

10

0 3-20 4-6 4-19 5-4 5-16 5-29 6-6 6-18 6-30 7-8 7-24 8-9 8-20 9-3 9-15 40

2013

) 30 ℃

20 Soil temperature ( Soil temperature

10 土壤温度

0 3-23 4-13 4-24 5-9 5-20 6-4 6-18 6-28 7-17 8-12 9-11 40 2014

30

20

10

0 3-20 4-5 4-20 5-10 5-25 6-14 6-30 7-10 7-23 8-15 9-1 9-18 月-日 Month-Day

图 3 间作对马铃薯生育期土壤温度的影响 Fig. 3 Effects of intercropping on soil temperature

2.5 间作对农田土壤水分平衡的影响 2011 年播前，土壤水分得以恢复。因此，马铃薯间 不同处理播前土壤贮水量无显著差异（图 7）。 作对 0—200 cm 土层的土壤水分持续性无不利影 4 年的降水量为 1 864.9 mm，年均 466.2 mm，采用 响。 全膜覆盖垄沟 4 年种植马铃薯使土壤贮水量逐年增 无论是间作还是单作，地膜覆盖垄沟种植马铃薯 加，PM、PF、PS 和 PH 分别增加了 141.5、101.6、 改善了土壤水分（图 8）。与 2011 年播前相比，连续 109.6 和 126.6 mm。虽 然 2011 年马铃薯生育期耗散 种植 4 年马铃薯后 0—200 cm 土层的土壤水分均得以 了土壤水分，但 2012 年播前土壤水分含量明显高于 提高，尤其 0—120 cm 土层土壤贮水量显著增加。与

474 中 国 农 业 科 学 49卷

750.0 PM PF PS PH 2011

500.0

250.0

0.0 3-20 4-22 5-20 6-6 6-22 7-20 8-3 8-22 9-20 750.0 2012

500.0

250.0

0.0 3-18 4-23 5-15 6-6 6-20 7-25 8-3 8-20 9-15

750.0

Soil water storage (mm) 2013

500.0 土壤贮水量

250.0

0.0 3-21 4-11 4-30 5-18 6-18 7-16 8-15 9-16 750.0 2014

500.0

250.0

0.0 3-23 4-30 5-16 6-16 7-7 7-26 8-15 9-20 月-日 Month-Day

图 4 间作对土壤贮水量的影响 Fig. 4 Effects of intercropping on soil water storage

3 期 张绪成等：半干旱区全膜覆盖垄沟间作种植马铃薯和豆科作物的水热及产量效应 475

贮水量 Soil water storage (mm) 10 30 50 70 10 30 50 70 10 30 50 70 0 0 0 豆科花期 马铃薯花期 块茎膨大期 20 Bean flowering 20 Potato flowering 20 Tuber expending 40 40 40 PM 2011 60 PF 60 60 80 PS 80 80 100 PH 100 100 120 120 120 140 140 140 160 160 160 180 180 180 200 200 200 220 220 220 10 30 50 70 10 30 50 70 10 30 50 70 0 0 0 20 20 20 2012 40 40 40 60 60 60 80 80 80 100 100 100 120 120 120 140 140 140 160 160 160 180 180 180 200 200 200 220 220 220 10 30 50 70 10 30 50 70 10 30 50 70 0 0 0 20 20 20 2013 40 40 40 60 60 60 80 80 80 100 100 100 120 120 120 140 140 140 160 160 160 180 180 180 200 200 200 220 220 220 10 30 50 70 10 30 50 70 10 30 50 70 0 0 0 20 20 20 2014 40 40 40 60 60 60 80 80 80 100 100 100 120 120 120 140 140 140 160 160 160 180 180 180 200 200 200 220 220 220

图 5 间作对作物关键生育期土壤水分垂直分布的影响 Fig. 5 Effects of intercropping on soil water vertical distribution in key crop growth periods

476 中 国 农 业 科 学 49卷 ET (mm) 耗水量

图 6 间作对马铃薯花前花后耗水量的影响 Fig. 6 Effects of intercropping on soil water depletion in potato pre- and post-flowering periods

750 播前 Pre-sowing 收获后 Post-harvest

500

250

0 PM PF PS PH PM PF PS PH PM PF PS PH PM PF PS PH 2011 2012 2013 2014 降雨量 Precipitation 降雨 Precipitation 降雨 Precipitation 降雨 Precipitation 346.4 mm 484.4 mm 551.9 mm 482.2 mm

图 7 不同处理作物播种前和收获后的土壤贮水量 Fig. 7 The soil water storage in crop pre-sowing and post-harvest stages of different treatments

PM、PS 和 PH 相比，PF 耗散了更多的土壤水分，在 PH 经济收益最高，显著高于 PF 和 PM，但 与 PS 无显 60—100 cm 土层达到显著差异。 著差异；PF 的经济收益较 PM 降低了 21.3%，达到显 2.6 间作对经济收益、耗水量和水分经济收益率的影 著差异。 响 耗水量受降水量和降水分布的明显影响，间作均 处理间的经济收益有显著差异（图 9）。2011 年， 能提高作物耗水量（图 9）。2011 间作的耗水量之间 PS 和 PH 的经济收益显著高于 PM 和 PF，PS 和 PH 无显著差异，但显著高于 PM；2012 年 PF 显著高于 间无显著差异。2012 年 3 种间作模式的经济收益无显 PM，但两者与 PS 和 PH 间差异不显著；2013 年 PF、 著差异，但显著高于 PM；PF、PS 和 PH 分别较 PM PH 和 PS 的耗水量之间无显著差异，但显著高于 PM； 增加了 32.4%、30.8%和 42.1%。2013 年 PH 的经济收 2014 年处理间耗水量无显著差异。 益较 PM 增加了 41.7%，较 PF 增加了 21.9%，处理间 虽然经济收益和耗水量在不同年型差异较大，但 达到显著差异，但 PH 和 PS 间无显著差异；2014 年 4 年 PF 的水分经济收益率较低，并在 2011 年和 2014

3 期 张绪成等：半干旱区全膜覆盖垄沟间作种植马铃薯和豆科作物的水热及产量效应 477

不足和降水分布的影响，间作的增产增效功能可能受 到水分不足和季节性干旱的限制。试验结果表明，间 作使土壤贮水量较单作下降，尤其在干旱的 2011 年达 到显著差异。间作不仅增加了土壤耗水，而且对土壤 水分分布有明显影响，间作后对深层水分的耗散增强， 这一效果在干旱年份尤为明显；耗水深度的增加一方 面证明间作能够利用深层水分，另外，也表明间作后 对马铃薯的水分利用造成一定的负面影响。 调控作物花前花后水分和养分利用是优化作物资 源利用特性和提高产量的主要途径之一[28-31]。间作由

Soil depths (cm) 于降低了土壤贮水量尤其是浅层土壤贮水量，因而对 马铃薯花前花后的耗水有显著调节作用，这一作用在

土层深度 降水较少的年份尤为明显，而且不同间作模式对花前 花后耗水的调节效果不同。PF 显著增加马铃薯花前耗 水量和降低花后耗水量，所以作物体系经济收益在 2011 和 2014 较单作下降，并在 2014 年达到显著差异； 水分经济收益率则在 2011 和 2014 年显著低于单作。 PS 较 PM 显著增加了花前耗水、降低了花后耗水，但 花后耗水量的下降幅度较 PF 低，所以尽管 PS 处理的 马铃薯产量下降，但豌豆获得较高产量，因而作物体 BF，2011 年播前；PM、PF、PS、PH 分别指马铃薯单作、马铃薯蚕豆 间作、马铃薯豌豆间作和马铃薯扁豆间作 2014 年收后的土壤贮水量 系的经济收益增加，并在 2011、2013 和 2014 年显著 BF is pre-sowing in 2011; PM, PF, PS and PH are the soil water storage in post-harvesting of mono-potato, potato and fababean intercropping, potato 高于马铃薯单作。PH 增加了花前耗水，且花后耗水与 and soybean intercropping and potato and hyacinth bean intercropping, respectively in 2014 马铃薯单作无显著差异，作物体系的经济收益较单作 显著增加。因此，PH 通过适度增加马铃薯花前的水分 图 8 不同处理 2011 年播前和 2014 年收后土壤贮水量垂直 种间竞争，来调节马铃薯花前花后耗水；在获得较高 分布 扁豆产量的同时，促进马铃薯花后耗水，维持了相对 Fig. 8 The soil water vertical distribution in pre-sowing of 较高的马铃薯产量，从而使作物体系的经济收益较单 2011 and post-harvest stage of 2014 of different 作显著增加。PH 不仅经济收益较单作显著增加，而且 treatments 水分经济收益率明显升高，这主要是由于相比较于马 铃薯，虽然扁豆的水分利用效率较低[32]，但其价格很 年显著低于其他 3 个处理，表明在半干旱区采用马 高，所以总体的水分经济收益率大幅度增加。 铃薯和蚕豆间作模式，对作物生产的水分经济收益 在 2011—2014 年，除 2011 年为欠水年外，2012 率有负面影响。PH 的水分经济收益率最高，其次为 和 2014 年为平水年，2013 年为丰水年。采用地膜覆 PS，2014 年 PS 显著低于 PH，下降了 10.1%；其他 盖垄沟种植使土壤贮水量在 4 年期间显著增加，虽然 年份二者差异不显著，但 PH 在 4 年均显著高于 PM。 2011 年收获后土壤贮水量低于播前，但 2012 年播前 证明半干旱区采用 PH 的间作模式不仅能够显著提 土壤贮水量较 2011 年显著增加。表明采用全膜覆盖 高作物生产的经济收益，而且使水分生产收益率明 垄沟种植技术进行马铃薯和豆科作物间作，对土壤水 显增加。 分的年际平衡无显著负面影响。作物间作能够显著提 高农田生产力和资源利用效率[10-12]，而且在防治病虫 3 讨论 害和改善耕地质量方面具有至关重要的作用[9,15-19]， 间作通过提高根际微生物活性和养分有效性，以 但由于间作增加了劳动力投入，可能会导致生产收益下 及激发种间竞争和互作，来提高农田生产力和水分利 降。本试验条件下，间作处理较单作增加了豆科作物播 用效率[24-27]。但在半干旱雨养农业区，由于降水总量 种和收获 2 项劳力支出，增加投入约 3 600 元/公顷；

478 中 国 农 业 科 学 49卷

50000 PM PF PS PH

a a

) 40000 2

b 30000 a a a c a a a Income (yuan/hm b a 20000 b c b b

经济收益 10000

0 2011 2012 2013 2014 7500

a ab a )

-2 5000 b a a a a ab a a ab ab a b

ET (t·hm b

耗水量 2500

0 2011 2012 2013 2014 15 ·t)) 2

a 10 b c

EWUE (yuan/(hm EWUE ab a b ab d a a 5 ab a b b c b 水分利用经济收益

0 2011 2012 2013 2014 不同小写字母在 0.05 水平差异显著 Different small letters indicate significant at the 0.05 level

图 9 不同处理的经济收益、耗水量和水分经济收益率 Fig. 9 The income, evapotranspiration and water income efficiency of different treatments

以马铃薯扁豆间作为例，4 年平均马铃薯年减收 2 250 获得更高的经济收益。综上所述，由于 PH 能够改善 元/公顷，扁豆年增收 11 550 元/公顷，合计马铃薯扁 6—7 月高温期间 0—25 cm 土层的温度，并维持相对 豆间作较马铃薯单作年均增收 5 700 元/公顷，增产增 较高的土壤贮水量，调节了马铃薯花前花后耗水量， 收效果显著，而且目前已有间套作农业机械的研发应 因而经济收益显著增加，而且通过 4 年种植使 0—200 用，并取得了良好的增收节支效果[33-34]。因此，随着 cm 土层土壤贮水量有显著增加。因此，PH 能够显著 未来农业机械的广泛推广应用，马铃薯扁豆间作将能 提高半干旱区土地生产力，显著增加农业生产收益，

3 期 张绪成等：半干旱区全膜覆盖垄沟间作种植马铃薯和豆科作物的水热及产量效应 479

并利用间作优势降低马铃薯连作障碍风险，是适宜于 of potato in hilly and humid area of Gansu province. Chinese Potato 该地区推广的一项间作模式。 Journal, 2004, 18(4): 207-210. (in Chinese) [5] 高世铭, 张绪成, 王亚宏. 旱地不同覆盖沟垄种植方式对马铃薯土 4 结论 壤水分和产量的影响. 水土保持学报, 2010, 24(1): 249-256. 采用全膜覆盖垄沟进行马铃薯和豆科作物间作使 Gao S M, Zhang X C, Wang Y H. Influence of different mulching and 0—200 cm 土层土壤水分在 4 年试验期增加了 100 mm furrow-ridge planting methods on soil moisture and yield of potato on 以上，证明这一种植模式对土壤水分的年际平衡无显 dryland. Journal of Soil and Water Conservation, 2010, 24(1): 著负面影响。与马铃薯单作相比，间作较单作能降低 249-256. (in Chinese) 土壤温度 2.0℃以上，这一效果在干旱年份（2011 年） [6] 王颖慧, 蒙美莲, 陈有君, 张静, 王朝霞, 崔成龙. 覆膜方式对旱作 尤其突出。间作使土壤贮水量显著下降，干旱的 2011 马铃薯产量和土壤水分的影响. 中国农学通报, 2013, 29(3): 147-152. 年和平水的 2012 年分别下降了 89.3 mm 和 96.8 mm， Wang Y H, Meng M L, Chen Y J, Zhang J, Wang Z X, Cui C L. 尤以马铃薯与蚕豆间作的下降幅度最大，马铃薯和扁 Effect of different film-covering modes on the yield and soil moisture 豆间作最小，因此间作尤其是马铃薯与蚕豆间作可能 of dry land tillage potato. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2013, 加剧在干旱和平水年份的阶段性干旱危害程度；马铃 29(3): 147-152. (in Chinese) 薯和扁豆间作的耗水深度低于马铃薯与蚕豆间作和马 [7] 姚玉璧, 张存杰, 万信, 张秀云, 石界. 气候变化对马铃薯晚疫病 铃薯和豌豆间作，但花后耗水量则高于马铃薯与蚕豆 发生发展的影响——以甘肃省定西市为例. 干旱区资源与环境, 间作和马铃薯和豌豆间作，并在干旱年份达到显著水 2010, 24(1): 173-178. 平。因此，由于马铃薯和扁豆间作降低了高温阶段的 Yao Y B, Zhang C J, Wan X, Zhang X Y, Shi J. Climatic changes and 土壤温度，增加了花后耗水，所以表现最高的经济收 its influence on the development of potato late blight-A case study on 益，较马铃薯单作、马铃薯与蚕豆间作和马铃薯和豌 Dingxi of Gansu province. Journal of Arid Land Resources and 豆间作分别增加了 29%—51.4%、7.3%—64.9%和 5.0% Environment, 2010, 24(1): 173-178. (in Chinese) —12.8%，水分经济收益率分别增加了 19.8%—24.0%、 [8] 甘肃经济日报. 今年甘肃省马铃薯晚疫病发生面积或超 800 万亩. 14.1%—73.7%和 2.0%—11.7%。 2013-07-17. http://gsjjb.gansudaily.com.cn/system/2013/07/17/014500123. shtml. References Gansu Economic Daily. Occurrence area of phytophthorainfestans is [1] 张世福. 定西市发展马铃薯产业的综合优势分析. 农学学报, 2011, over 8000,000 Mus in Gansu in 2013. 2013-07-17. http://gsjjb.

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水稻 NBS-LRR 类抗稻瘟病蛋白 Pik-h 的互作蛋白筛选

王加峰，刘 浩，王 慧，陈志强

（华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心，广州 510642）

摘要：【目的】利用酵母双杂交系统，以组成抗稻瘟病基因 Pik-h 的 2 个紧密连锁且功能独立的 Pikh-1 和 Pikh-2 蛋白为诱饵，在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白，以便深入研究抗病基因 Pik-h 介导的抗病反应途径。【方 法】以含抗稻瘟病基因 Pik-h 的近等基因系 IRBL8 为材料，取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193 接种 12 和 24 h 后的水稻叶片，等量混合后提取总 RNA，按照酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标 cDNA 文库。利用快速重组克隆的方法构建 pGBKT7-Pikh1 和 pGBKT7-Pikh2 诱饵 载体，并分别将它们转化至酵母菌株 Y2H Gold，提取细胞总蛋白后利用 Western blot 检测 Pikh1 和 Pikh2 的表 达情况，并对这 2 个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取 SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal 筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒，将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株 Y2H Gold，涂布于筛 选平板培养基上进行互作的重复验证，将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定 目的基因，并对这些基因进行 gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】 靶标 cDNA 文库的库容量约为 2.2×106，插入片段长度均大于 400 bp，表明水稻 cDNA 文库质量高。诱饵载体 pGBKT7-Pikh1 和 pGBKT7-Pikh2 均能在酵母细胞中正确表达出对应的 Pikh1 及 Pikh2 蛋白,无自激活活性而且对酵 母无毒性作用，符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株 Y2H Gold与靶标文库菌株 Y187 结合（Mating） 的方式筛选，获得 13 个与 Pikh-1 相互作用的蛋白、5 个与 Pikh-2 相互作用的蛋白，其中有 2 个与 Pikh-1 及 Pikh-2 同时存在相互作用。这些蛋白包括 4 个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3 个 信号蛋白、4 个参与光合作用的叶绿体蛋白、1 个含有 U-BOX 结构域的蛋白及 4 个未知功能蛋白。【结论】成功构 建了适宜于研究抗病基因（R 基因）介导反应途径的酵母双杂交 cDNA 文库，筛选出 Pik-h 的互作蛋白，为进一步 研究 Pik-h 或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。 关键词：水稻；稻瘟病菌；酵母双杂交；互作蛋白；Pik-h；筛选

Screening of Putative Proteins That are Interacted with NBS-LRR Protein Pik-h by the Yeast Two-Hybrid System

WANG Jia-feng, LIU Hao, WANG Hui, CHEN Zhi-qiang

(National Engineering Research Center of Plant Space Breeding, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

Abstract: 【Objective】 To further investigate the signaling pathways activated directly by the resistance proteins Pikh-1 and Pikh-2 from the resistance gene Pik-h, yeast two-hybrid assay was performed to screen a rice leaf cDNA library using Pikh-1 and Pikh-2 as bait, respectively. 【Method】 All rice leaves of IRBL8 (Pik-h NIL) from the time points (12 and 24 h after inoculation with GD0193) were harvested for total RNA preparation. The rice leaf cDNA library was further constructed with the Make Your Own Mate&Plate Library System kit (Clontech). Bait plasmids pGBKT7-Pikh1 and pGBKT7-Pikh2 were constructed using the rapid homologous recombination method. The expression of the two proteins in the Y2H Gold strain was further detected with Western blot and the self-activation and cytotoxicity were also tested. Proteins interacting with the baits Pikh1 and Pikh2 were screened on

收稿日期：2015-09-14；接受日期：2015-10-27 基金项目：国家自然科学基金（31401722）、教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20124404120007） 联系方式：王加峰，E-mail：[email protected]。通信作者陈志强，E-mail：[email protected]

3 期 王加峰等：水稻 NBS-LRR 类抗稻瘟病蛋白 Pik-h 的互作蛋白筛选 483

SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal plates from the rice leaf cDNA library with the mating strategy. Then the plasmids were prepared from the blue interacting clones and retransformed back into Y2H Gold strain with the corresponding bait. The plasmids that passed the reconfirmation were sequenced and the DNA sequences were further used to blast rice genome annotation project database. The functions of the interaction proteins were further analyzed with gene ontology (GO) annotation. 【Result】 The rice leaf cDNA library contained 2.2×106 independent clones. The sizes of most inserts were above 400 bp in the cDNA library. Bait plasmids (pGBKT7-Pikh1 and pGBKT7-Pikh2) expressed the corresponding proteins (BD-Pikh-1 and BD-Pikh-2) well and showed no self-activation and cytotoxicity, and suited to this screen. Thirteen candidate interacting proteins of pGBKT7-Pikh1 and five candidate interacting proteins of pGBKT7-Pikh2 were verified. Function annotation showed that four putative proteins were transcription factors involved in stress response and hormone signaling pathways, three were signaling proteins, four were involved in photosynthesis, one U-BOX containing protein was involved in ubiquitin mediated proteolysis, and four were unknown function proteins. 【Conclusion】 A high quality cDNA library was constructed and 16 proteins interacting with Pik-h proteins were identified, and these results provided good clues for elucidating the Pik-h- or other R-gene-mediated disease-resistant mechanisms in rice. Key words: rice (Oryza sativa); Magnaporthe oryzae; yeast two-hybrid; interacting protein; Pik-h; screening

生理功能的执行者和生命现象的直接体现者，其功能 0 引言 的发挥也不是孤立的，是在纵横交错的网络中通过与 【研究意义】植物抗病反应是一系列基因、信号 其他分子相互作用完成的。利用酵母双杂交系统研究 途径及多基因产物被激活的复杂过程。一般而言，抗 蛋白质间相互作用的网络是较为常用的策略，在植物 病基因是识别无毒基因后激活了下游的防御反应。基 与病原物互作研究中也有着重要作用[9-12]，如在水稻- 于酵母双杂交技术研究抗稻瘟病基因 Pik-h 激活的抗 稻瘟病菌互作过程中发现的几对直接互作的无毒蛋白 病反应途径有利于阐明抗病基因的抗性机理，揭示病 与抗病蛋白（Avr-Pita 与 Pita、Avr-Pik 与 Pik、Avr-Pib 害的发生机制，为培育持久、广谱、高抗稻瘟病的水 与 Pib 等）是利用该技术确认的[13-15]。有研究小组也 稻（Oryza sativa）新品种奠定理论基础。【前人研 曾利用该技术以番茄 Pto 抗性蛋白为核心勾勒出了 究进展】 水稻是世界上重要的粮食作物之一，是全 Pto 抗病信号传导途径的线条[16]，但目前尚未见到对 球约 50%人口的主要食物来源[1-2] 。由稻瘟病菌 水稻某一特定抗稻瘟病基因直接激活信号传导途径 （Magnaporthe oryzae）侵染引起的稻瘟病，是水稻生 研究的报道。【本研究切入点】利用酵母双杂交技术 产上的重要限制因素[3]，它具有传播速度快、发生范 鉴定水稻中直接与抗病蛋白 Pik-h 互作的蛋白，有望 围广、危害严重等特点。流行年份导致水稻减产 10% 揭示抗病蛋白 Pik-h 直接参与的抗病信号途径。Pik-h —20%，严重时达 40%—50%，局部田块甚至颗粒无 抗病基因被 Xu 等[17]首先报道，它与 Pi1、Pik-m、 收，严重威胁着水稻的生产[4]。聚合多个主效抗病基 Pik-p 等同为 Pik 位点上的复等位基因[18-21]，包含 2 因培育水稻新品种是目前防治稻瘟病最为经济有效的 个伴侣基因 Pikh-1 与 Pikh-2。已有的研究发现， 手段[5]，但由于对水稻抗病基因的具体作用机制缺乏 Pikh-1 变化较大，而 Pikh-2 较为保守；Pikh-1 与稻 了解及稻瘟病菌生理小种的多样、易变等原因，通过 瘟病菌的识别有关，而 Pikh-2 可能与下游抗病反应 简单聚合几个抗病基因培育的品种，抗病效果不明显 有关[22-23]。【拟解决的关键问题】分别以 Pikh-1 与 或在田间推广后会很快失去抗性，导致稻瘟病重新暴 Pikh-2 为诱饵蛋白，从水稻叶片的 cDNA 文库中筛 发。目前克隆的抗病基因绝大多数编码 NBS-LRR 结 选互作蛋白以揭示双基因抗性基因 Pik-h 参与的抗 构蛋白[6]。水稻中除 Pid2 与 pi-21 外，其他已经克隆 病反应途径，为下一步的多抗病基因聚合培育广谱 的 20 多个抗稻瘟病基因也都编码 NB-LRR 类抗病蛋 持久高抗的水稻新品种提供理论依据。 白[3]，这些抗病蛋白在抗病反应发生过程中可能参与 1 材料与方法 相同或相似的信号传导途径以激活下游的防御反应。 已有很多研究利用基因芯片、基因表达序列分析等技 试验于 2014 年在华南农业大学国家植物航天育 术分析了植物与病原物互作过程中激活的抗病信号传 种工程技术研究中心完成。 导途径[7-8]，但由于这些技术主要是基于 mRNA 水平 1.1 试验材料 的变化，不能真实地反映蛋白水平的变化。蛋白质是 抗稻瘟病基因（Pik-h）近等基因系 IRBL8 由菲律

484 中 国 农 业 科 学 49卷

宾国际水稻所提供。稻瘟病菌株 GD0193 由广东省农 进行菌落 PCR，进一步根据 PCR 电泳后的结果分析外 业科学院植物保护研究所提供，该菌致病谱较广[24]， 源 DNA 片段插入情况。 因为含有无毒基因 Avr-Pikh 而不能侵染 IRBL8[25]。酵 1.3 诱饵表达载体（pGBKT7-Pikh1、pGBKT7-Pikh2） 母双杂交载体 pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7、 的构建及表达鉴定 pGBKT7-Lam、pGBKT7-P53 及酵母菌株 Y2H Gold 分别根据水稻 Pikh-1、Pikh-2 的 cDNA 全长序列 由香港科技大学梁纯教授实验室提供。酵母双杂交文 及 pGBKT7 的载体序列，设计基因特异性引物（表 1）。 库构建所需载体 pGADT7-Rec 及酵母菌株 Y187 均购 以水稻近等基因系 IRBL8 的 cDNA 为模板，分别扩增 自 Clontech 公司。 Pikh-1、Pikh-2 的 cDNA 全长。利用 Vazyme 公司 1.2 酵母双杂交 cDNA 文库的构建及质量评价 ClonExpress®快速克隆技术将扩增产物分别克隆到诱 取 3—4 叶期水稻，接种稻瘟病菌 GD0193，将接 饵表达载体 pGBKT7 上。利用 PEG/LiAC 介导的酵母 种 12、24 h 后的叶片等量混合提取总 RNA，参照 转化方法分别将诱饵表达载体 pGBKT7-Pikh1 和 Clontech 公司酵母双杂交试剂盒（Make Your Own pGBKT7-Pikh2 分别转入酵母菌株 Y2H Gold 中，涂布 “Mate&Plate” Library System）的要求进行靶标 cDNA 于 SD/-Trp 平板培养基，30℃培养 3—5 d，直至长出 文库的构建。具体方法：首先对提取的叶片总 RNA 单菌落。 进行 mRNA 分离纯化后进行反转录，先后进行 cDNA 为验证诱饵蛋白的表达，各用 5 mL SD/-Trp 液体 第一链及 ds cDNA 的扩增、纯化；将所得的 ds cDNA 培养基分别培养含有 pGBKT7-Pikh1 与 pGBKT7- 与线性化 pGADT7-Rec 载体利用 PEG/LiAC 法共转化 Pikh2 质粒的酵母菌落，然后按照酵母细胞总蛋白提 酵母菌株 Y187，然后将菌液分别涂布在 120 块直径 取试剂盒相关操作说明提取细胞总蛋白后进行 150 mm SD/-Leu 平板培养基上；30℃条件下倒置培养 SDS-PAGE 电泳分离及 Western blot 分析。具体如下： 3—4 d 直至菌落出现；用含终浓度为 20%甘油的 将提取的细胞总蛋白与 2×上样缓冲液等体积混合后 YPDA 液体培养基将阳性克隆从平板培养基洗脱，按 煮沸 5 min 后上样，SDS-PAGE 电泳结束后将 1 mL/管（＞2×107 cells）分装于 1.5 mL 离心管，-80 SDS-PAGE 胶湿转于硝酸纤维素膜上，依次进行以下 ℃保存备用；同时取共转化后的菌液按 1/10、1/100 处理：5%脱脂牛奶封闭 1 h、一抗（鼠单克隆抗体 和 1/1 000 稀释，分别涂 100 μL 稀释液至 SD/-Leu 平 anti-cMyc）孵育 2 h 和二抗（羊抗鼠的辣根过氧化物 板培养基上，对生长的单菌落计数进行库容量计算， 酶复合物）孵育 1 h，最 后 采 用 Pierce 公司的化学发光 并随机挑取 24 个单菌落用 pGADT7-Rec 的通用引物 底物法显色检测杂交信号。

表 1 构建诱饵载体的引物序列 Table 1 The primer sequences used in the construction of bait plasmids 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence (5′-3′) rBD-Pikh1-F CATATGGCCATGGAGGCCGAAATGGAGGCGGCTGCCAT rBD-Pikh1-R GTTATGCTAGTTATGCGGCCGCTAGCTAGTAGTTTCTGTTTGAATTTCA rBD-Pikh2-F CATATGGCCATGGAGGCCGAAATGGAGTTGGTGGTAGGTGCTT rBD-Pikh2-R GTTATGCTAGTTATGCGGCCGTCATGCAGTGACGATGCCATC

1.4 诱饵表达载体（pGBKT7-Pikh1、pGBKT7-Pikh2） 自激活活性。将以上酵母菌分别接种于 50 mL SD/-Trp 的自激活检测和毒性测定 液体培养基中，30℃ 250 r/min 振荡培养 24 h。检测

分别将质粒组合 pGBKT7-Pikh1/pGADT7 、 其菌液的 OD600，若 OD600＜0.8，表明载体对酵母菌 pGBKT7-Pikh2/pGADT7 、 pGBKT7-Lam/pGADT7-T 株具有细胞毒性；若 OD600≥0.8 则表明质粒对菌体不 和 pGBKT7-P53/pGADT7-T 共转化酵母菌株 Y2H 存在细胞毒性。 Gold 中，然后将转化子克隆涂布在含有 SD/-Leu/- 1.5 Pikh-1 与 Pikh-2 互作蛋白的筛选、验证与分析 Trp/X-α-Gal 平板培养基上，30℃培养 3—4 d，观 察 它 将分别含有 pGBKT7-Pikh1、pGBKT7-Pikh2 的酵 们在选择培养基上的生长情况，确定表达载体是否有 母单菌落各自接种于 50 mL SD/-Trp 的液体培养基中，

3 期 王加峰等：水稻 NBS-LRR 类抗稻瘟病蛋白 Pik-h 的互作蛋白筛选 485

培养至 OD600=0.8，1 000×g 离心 5 min 后收集细胞， 些比对出的候选互作蛋白进行 GO Ontology 注释以了 用 4—5 mL SD/-Trp 的液体培养基重悬使细胞浓度＞1 解 Pik-h 互作蛋白在分子功能、细胞组成及生物学过 ×108 cells/mL。将这些菌液分别与 1 mL 文库菌液混 程等方面的分布情况。 合，并添加 45 mL 的 2×YPDA 液体培养基在 30℃摇 2 结果 床进行低速摇菌培养（30—50 r/min），20—24 h 后至 大多数细胞发生融合形成合子（三叶草状），1 000×g 2.1 酵母双杂交 cDNA 文库的构建 离心 10 min 收集细胞，用 50 mL 0.5×YPDA 液体培 提取水稻叶片总 RNA，经凝胶电泳检测，其中 养基重悬沉淀后再次离心（1 000×g 离心 10 min）， 18S RNA 与 28S RNA 2 条带的亮度比接近 1﹕2，经 弃上清后将菌体重悬于 10 mL 0.5×YPDA 液体培养 紫外分光光度计测定，质量浓度为 2 200 mg·L-1，

基中，取 10 μL 菌液稀释 10 000 倍，并分别涂布 100 μL OD260/OD280 为 2.0，说明 RNA 符合下一步 RNA 反转 至 SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp/平板培养基上， 录的质量要求。根据 SD/-Leu 平板培养基上酵母菌落 计算结合效率及杂交克隆数。将剩余未稀释菌液涂于 生长的数量推测，该文库的库容量约为 2.2×106，符 55 块 SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His/X-α-Gal 平板筛选培养基 合文库构建要求。 上，30℃倒置培养 3—5 d。提取平板筛选培养基上呈 进一步随机挑取 24 个文库质粒，用引物（T7F： 蓝色互作克隆的质粒，将其与对应的诱饵载体共转化 5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3′，3′AD： 酵母菌株 Y2H Gold 并涂布在平板筛选培养基上进行 5′-AGATGGTGCACGATGCACAG-3′）进行 PCR 扩 重复验证，对通过重复验证的质粒送上海立菲生物有 增，凝胶电泳结果表明（图 1），插入的 cDNA 片段 限公司测序，将所获得的序列比对水稻基因组数据库 重复性不高，且在 400 bp 以上，可以满足下一步酵母 （rice genome annotation project）进行序列分析。对这 双杂交筛选的需要。

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 bp 10000

3000 2000 1500 1000 750 500 250

M：1 kb DNA ladder marker；1—24：随机挑选的 24 个克隆 Randomly picked 24 library clones

图 1 PCR 检测 cDNA 文库的插入片段 Fig. 1 PCR identification of inserts in the cDNA library

2.2 诱饵载体 pGBKT7-Pikh1 和pGBKT7-Pikh2 的构建 组质粒 pGBKT7-Pikh1、pGBKT7-Pikh2 的酵母细胞总 及表达鉴定 蛋白进行 Western blot 试验，结果表明蛋白表达产物 构建的重组质粒 pGBKT7-Pikh1、pGBKT7-Pikh2 分别与融合蛋白 BD-Pikh1、BD-Pikh2 的实际大小一 分别用引物 rBD-Pikh1-F 与 rBD-Pikh1-R、rBD-Pikh2-F 致（图 3），说 明 Pikh1 及 Pikh2 在酵母细胞中能正常 与 rBD-Pikh2-R 进行 PCR 检测（表 1），结果表明重 表达，可用于后续筛选。 组质粒 pGBKT7-Pikh1、pGBKT7-Pikh2 可以分别扩增 2.3 诱饵载体 pGBKT7-Pikh1 和pGBKT7-Pikh2 的自激 出大小为 3 429 与 3 066 kb 的片段，分别与 Pikh-1、 活及毒性分析 Pikh-2 的 CDS 序列大小一致，进一步测序所得序列与 分别将质粒组合 pGBKT7-Pikh1/pGADT7 、 GenBank 上公布的 Pikh-1（登录号：AET3654）及 Pikh-2 pGBKT7-Pikh2/pGADT7 、 pGBKT7-Lam/pGADT7-T （登录号：AET36550）基因 CDS 序列一致，表明 Pikh-1 和 pGBKT7-P53/pGADT7-T 共转化酵母菌株 Y2H 与 Pikh-2 诱饵载体构建成功（图 2）。分别对含有重 Gold 中，然后将转化子克隆涂布于 SD/-Leu/-Trp/X-α-

486 中 国 农 业 科 学 49卷

pGADT7 pGADT7-T M1 2

pGBKT7-Pikh1

pGBKT7-Pikh2

pGBKT7-Lam

M: 1 kb DNA ladder marker; 1: pGBKT7-Pikh1; 2: pGBKT7-Pikh2

图 2 pGBKT7-Pikh1 与 pGBKT7-Pikh2 表达载体的 PCR 鉴定 pGBKT7-P53 Fig. 2 PCR identification of the expression plasmids pGBKT7- Pikh1 and pGBKT7-Pikh2 图 4 诱饵质粒 pGBKT7-Pikh1 与 pGBKT7-Pikh2 的自激活检

1 2 测 Fig. 4 Self-activation analysis of the two bait plasmids of pGBKT7-Pikh1 and pGBKT7-Pikh2

Leu/-Trp 平板培养基上长出 38 个单克隆，在 SD/-Leu 平板培养基上长出约 103 个菌落，在 SD/-Trp 平板培养 基上长出约 590 个菌落，因此筛选得到的文库克隆总 7 数为 3×10 ，杂交率为 3.7%，满足酵母双杂交文库筛 1: pGBKT7-Pikh1; 2: pGBKT7-Pikh2 选的杂交效率（2%—5%）的要求，将剩余未稀释菌 液涂于 55 块 SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His/X-α-Gal 平板培养 图 3 Western blot 鉴定 Pikh1 及 Pikh2 在酵母细胞中的表达 基上进行筛选，共获得 54 个阳性克隆。提取这 54 个 Fig. 3 Expression of Pikh1 and Pikh2 in yeast cells identified 互作克隆中的质粒，将这些质粒再与对应的诱饵载体 by Western blot 共转化酵母菌株 Y2H Gold 中，涂布在 SD/-Ade/-Leu/ -Trp/-His/X-α-Gal 平板培养基上进行重复验证，对通 Gal 平板培养基上培养 3—4 d 进行观察。结果表明这 过重复验证的质粒进行 DNA 测序分析，将所得的 2 个诱饵载体 pGBKT7-Pikh1 和 pGBKT7-Pikh2 与转化 DNA 序列与水稻的基因组数据库进行序列比对，最终 的阴性对照（pGBKT7-Lam/pGADT7-T）表型一致（图 确定了 13 个与 Pikh-1 互作的蛋白、5 个与 Pikh-2 互 4），菌落都能在 SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal 培养基上正常 作的蛋白，其中有 2 个候选蛋白与 Pikh-1 及 Pikh-2 同 生长，但不显蓝色，表明诱饵载体质粒 pGBKT7- Pikh1 时存在相互作用（表 2）。进一步利用 Uniprot 在线网 和 pGBKT7-Pikh2 在 Y2H Gold 酵母细胞内无自激活 站，对这些筛选出的互作蛋白进行 GO 注释（图 5），

活性。进一步检测培养 24 h 的酵母菌液 OD600，发现 结果表明这些蛋白多具有转录因子活性、催化活性、

OD600 均＞2.0，表 明 BD-Pikh1、BD-Pikh2 诱饵蛋白的 转运活性等功能。 表达对酵母细胞不存在毒性，因此可以用于酵母双杂 交文库的筛选试验。 3 讨论 2.4 Pikh-1、Pikh-2 互作蛋白的筛选及序列分析 已有 20 多个水稻抗稻瘟病基因被报道，除 Pid2 将接合（Mating）后的 10 μL 酵母菌液稀释 1/ 与 pi-21 外，其他已经克隆的 20 多个抗稻瘟病基因也 10 000 后涂 100 μL 至 SD/-Trp 和 SD/-Leu 平板培养基 都编码 NB-LRR 类抗病蛋白[3]，这些抗病蛋白在抗病 上，稀释 1/1 000 后涂 100 μL 至 SD/-Leu/-Trp 平板培 反应发生过程中可能参与相同或相似的信号传导途径 养基上，计算结合效率及杂交克隆数。结果表明在 SD/- 以激活下游的防御反应，但目前的多数研究主要集中

3 期 王加峰等：水稻 NBS-LRR 类抗稻瘟病蛋白 Pik-h 的互作蛋白筛选 487

表 2 酵母双杂交系统筛选出分别与 Pikh-1、Pikh-2 互作的蛋白质 Table 2 Putative proteins interacted with Pikh-1 and Pikh-2 respectively in the yeast two-hybrid system 序列名称 基因座位名称 比对结果 功能分析 诱饵蛋白 Sequence name Gene locus Blast result Function analysis Bait Pikh-1-3 LOC_Os02g06650 DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 假定蛋白 Putative protein Pikh-1

Pikh-1-4 LOC_Os11g25780.1 PB1 domain containing protein 信号蛋白 Signal protein Pikh-1

Pikh-1-22 LOC_Os01g51120.1 Vesicle transport v-SNARE protein 假定蛋白 Putative protein Pikh-1

Pikh-1-36 LOC_Os01g54670.1 Coiled-coil domain-containing protein 25 螺旋结构域蛋白 Pikh-1 Helix domain protein Pikh-1-45 LOC_Os05g0322900 WRKY45 转录因子 Transcription factors Pikh-1

Pikh-1-54 LOC_OsI_13305 COX11 细胞色素 C 氧化酶组装 Pikh-1 Cytochrome C oxidase assembly Pikh-1-60 LOC_Os01g09640.1 Myb transcription factor 转录因子 Transcription factors Pikh-1

Pikh-1-65 LOC_Os03g60080.1 NAC domain-containing protein 67 转录因子 Transcription factors Pikh-1 Pikh-1-67 LOC_Os08g44680.1 Photosystem I reaction center subunit II, chloroplast 光合作用 Photosynthesis Pikh-1 precursor Pikh-1-70 LOC_Os04g37990.1 Transporter family protein 转运蛋白家族蛋白 Pikh-1 Transporter protein family Pikh-1-79 LOC_Os01g56680.2 Photosystem II reaction center W protein, chloroplast 光合作用 Pikh-1 precursor Photosynthesis Pikh-1-21&Pikh-2-11 LOC_Os06g28590.1 Bg55 U-BOX 蛋白 U-BOX protein Pikh-1& Pikh-2 Pikh-1-31&Pikh-2-16 LOC_Os11g07020.1 Fructose-bisphospate aldolase isozyme 光合色素调控 Photosynthetic Pikh-1& Pikh-2 pigment regulation Pikh-2-4 LOC_Os10g34409.1 Transposon protein, CACTA, En/Spm sub-class 假定转座子 Putative transposon Pikh-2 Pikh-2-7 LOC_Os01g56680.2 Photosystem II reaction center W protein, chloroplast 光合作用 Photosynthesis Pikh-2 precursor Pikh-2-19 LOC_Os01g54930.1 One zinc finger protein, putative 转录因子 Transcription factors Pikh-2

A Binding

Catalytic activity 33% 33% Transporter activity

Sequence-specific DNA transcription factor activity

Cytochrome-c oxidase activity 5% 5% 14% Unknown 10%

B C Cellular process 16% Cell part 19% 26% Metabolic process 26% Membrane 3% Single-organism process Organelle 10% Regulation of biological process Membrane part 16% Localization 6% Protein complex 10% 23% Cellular component orgnization or biogenesis 6% Organelle part 13% Unknown 13% 13% Unknown

A：分子功能 Molecular function；B：生物过程 Biological process；C：细胞组成 Cellular component

图 5 Gene ontology 注释 Fig. 5 Gene ontology annotation

488 中 国 农 业 科 学 49卷

在抗病基因的鉴定及其与对应无毒基因的互作方面， 白及相关酶类的共同作用。近年来，越来越多的研究 对抗稻瘟病基因介导抗病反应途径了解很少。本研究 表明，抗病因子质核间的转运在植物先天免疫机制中 运用 SMART 技术构建了高质量的水稻叶片靶标 起着重要的作用[35] 。本研究中发现，Pikh-1 与 cDNA 文库，并分别以 Pikh-1 及 Pikh-2 为诱饵，筛选 LOC_Os11g25780.1（PB1 domain containing protein）、 到了 13 个与 Pikh-1、5 个 Pikh-2 互作的重要蛋白，其 LOC_Os04g37990.1 （ transporter family protein ）、 中有 2 个蛋白还分别与 Pikh-1 及 Pikh-2 有相互作用。 LOC_Os01g54670.1 （ coiled-coil domain-containing 对筛选到候选蛋白通过进一步的生物信息学分析，表 protein 25）、COX11（细胞色素 C 氧化酶组装）等蛋 明这 16 个 Pik-h 互作蛋白包括转录因子类、信号转运 白具有相互作用，而且 bg55（U-BOX 蛋白）可与 Pikh-1 类、光合作用相关类及一些未知功能蛋白。 及 Pikh-2 同时具有相互作用，表明 R 基因介导的抗病 转录因子在植物中参与多种生物学过程，包括植 反应非常复杂，除参与稻瘟病菌效应蛋白的识别外， 物生长、花发育、种子成熟、衰老、光信号、损伤、 还可能借助蛋白转运系统（LOC_Os04g37990.1）传 递 病菌防御以及对各种环境胁迫的响应等。Pikh-1 与 信号分子、借助 bg55（U-BOX 蛋白）调控 Pik-h 与效 WRKY、MYB、NAC 等家族的蛋白存在相互作用， 应蛋白的识别或调控 Pik-h 在细胞内的表达水平以避 表明稻瘟病抗性基因识别效应因子后，进入核内与转 免发生自我免疫甚至死亡的现象、借助抑制 COX11 录因子结合，通过转录调控作用激活免疫应答，这也 过氧化物代谢触发了细胞程序性死亡，使植物产生过 与部分 Pikh-1 定位于细胞核的报道一致[23]。WRKY 敏性坏死反应[36]。 类转录因子在抵御生物胁迫和非生物胁迫、种子的生 本研究中鉴定到与 Pikh-1 互作的蛋白有 13 个， 成和萌发、衰老等过程中都发挥了重要的作用，如 Pb1 而与 Pikh-2 互作的蛋白仅有 5 个，这与 Pikh-1 参与稻 介导的稻瘟病抗性依赖于其与转录因子 WRKY45 的 瘟病菌的识别，Pikh-2 参与下游抗病反应激活[22-23]的 相互作用[26]；大麦抗病蛋白 MLA10 与白粉病菌效应 结果不一致。推测 Pikh-1 除参与识别外，也可能与下 因子 A10 识别后诱导 MLA10 在细胞核内转录因子 游的一些抗病反应途径的发生有关，或者与 Pikh-1 自 WRKY 结合以启动抗病反应[27]。MYB 类转录因子在 身的调控有关，以防止该抗病蛋白可能在未被病原菌 植株中的过表达能够显著提高植物的抗病能力，拟南 诱导而使细胞产生自我免疫的现象[37]；另一方面， 芥的 AS1[28]、烟草的 NSPHAN[29]和玉米的 RS2[30]等 Pikh-2 的激活途径可能相对简单以利于抗病反应迅速 MYB 类转录因子可在茉莉酸（JA）和防卫反应中被 发生以使植物产生抗性。 激活，进而增强植物的抗病性。NAC 家族转录因子的 4 结论 基因在植物抗各种类型病原菌反应中可能也起着至关 重要的作用。Sun 等[31]在水稻中发现了 2 个响应稻瘟 成功构建了高质量的水稻叶片酵母双杂交 cDNA 病菌侵染的 NAC 转录因子（ONAC122 和 ONAC131）。 文库，并筛选得到 16 个与 Pik-h 互作的蛋白，其中 13 Xu 等[32]在马铃薯中鉴定出一个能够被晚疫病菌显著 个蛋白与 Pikh-1、5 个蛋白与 Pikh-2 互作，而且有 2 诱导的转录因子 StNAC2。 个候选蛋白与 Pikh-1、Pikh-2 同时存在相互作用。这 研究中发现了几个与 Pik-h 互作的蛋白为光合作 些蛋白多数参与逆境响应、激素信号转导过程及光合 用相关蛋白。de Torres 等最近的研究证实，光合系统 作用等途径，推测这些蛋白与水稻 Pik-h 识别稻瘟病 II 与植物的基础抗性密切相关，发现 MAMP 可以诱 菌无毒蛋白、介导抗病反应信号传导直至产生抗病性 发光合系统 II 产生 ROS，以抵御病原菌的入侵，而 有密切的关系，这为进一步深入研究水稻-稻瘟病菌互 具体的作用机制目前仍不清楚[33-34]。Pikh-1 与 Pikh-2 作机制及 Pik-h 介导的抗病反应途径打下了基础。 分别与参与光合作用的蛋白 LOC_Os08g44680.1、 LOC_Os01g56680.2 有相互作用，而且它们还同时与 致谢：香港科技大学梁纯教授为试验提供了酵母双杂交 LOC_Os11g07020.1 （ fructose-bisphospate aldolase 系统所需的菌株及质粒,在此表示感谢！ isozyme）具有相互作用，表明抗病基因 Pik-h 可能直 接通过类似 MAMP 的功能作用于光合系统上以诱发 References ROS 的产生，具体作用机制还需进行深入研究。 [1] Khush G S. What it will take to feed 5.0 billion rice consumers in 抗病反应的发生涉及多种生物信号分子、转运蛋 2030. Plant Molecular Biology, 2005, 59(1): 1-6.

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干涉丹参 SmORA1 对植物抗病和丹参酮类次生代谢的影响

化文平 1,2，刘文超 1，王喆之 1，李翠芹 1

（1 陕西师范大学药用资源与天然药物化学教育部重点实验室/西北濒危药材资源开发国家工程实验室/生命科学学院，西安 710062；

2 陕西学前师范学院生物科学与技术系，西安 710061）

摘要：【目的】乙烯响应因子（ethylene response factor，ERF）是植物特有的一类转录因子，普遍参与植 物各类胁迫反应。前期从药用植物丹参（Salvia miltiorrhiza）中筛选得到了一条与长春花（Catharanthus roseus） 中 CrORCA3 高度同源的 ERF 转录因子编码基因（命名为 SmORA1）。论文旨在通过干涉丹参 SmORA1 的表达，进一步 明确 SmORA1 在植物抗病反应与丹参酮合成代谢调控中的作用。【方法】扩增 SmORA1 基因片段，构建 SmORA1 基因 干涉载体 pk-ORAi 并采用农杆菌介导的叶盘转化法转化丹参，经抗生素抗性筛选和 PCR 鉴定获得阳性转基因丹参 植株；采用分光光度法或酶联免疫方法检测立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）侵染后转基因株系中丙氨酸解氨 酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（ superoxide dismutase， SOD）等抗性相关酶活性和还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）、脯氨酸（proline，Pro）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量等抗性相关生理指标的变化；采用 HPLC 法考察干涉 SmORA1 表达对二氢丹参酮、隐丹参酮和丹参酮ⅡA 等丹参酮类次生代谢物含量的影响；采用实时定量 PCR 考察干涉 SmORA1 对丹参株系抗性基因和丹参酮合成相关关 键酶基因表达的影响。【结果】经抗生素和 PCR 筛选获得了 11 个阳性株系，进一步采用实时定量 PCR 分析得到 3 个 SmORA1 表达显著下调的转基因株系（RNAi-11、RNAi-18、RNAi-22），干涉效率达到 80%以上。立枯丝核菌对丹 参植株有明显的致病力，可以有效诱导丹参发病；其侵染后，SmORA1-RNAi 转基因株系病情指数显著高于野生型 （WT）和空载（VK）对照株系，病情更严重；SmORA1-RNAi 转基因株系中的 MDA 含量显著高于 WT 和 VK 对照株系， 说明干涉 SmORA1 的丹参株系抗衰老能力显著下降；植物抗性相关的 PAL、CAT 和 SOD 等酶活性以及 GSH 和 Pro 等 物质含量显著低于对照株系，说明干涉 SmORA1 的丹参株系抗病性也呈现明显减弱；进一步研究发现 SmORA1-RNAi 转基因株系中抗病性相关蛋白编码基因 SmPDF1.2、SmSTH-2 和 SmPR-10 的表达量明显低于对照株系。采用 HPLC 方 法分析发现，丹参 SmORA1 干涉株系中丹参酮ⅡA 和隐丹参酮含量显著下降；同时采用实时定量 PCR 检测分析，发 现丹参 SmORA1 干涉株系中丹参酮合成途径关键酶基因 SmHMGR1、SmHMGR2、SmGPPS、SmGGPPS1 和 SmGGPPS3 等表达 显著下调,说明 SmORA1 可能通过调节 SmHMGR1、SmHMGR2、SmGPPS、SmGGPPS1 和 SmGGPPS3 等丹参酮合成途径关键 酶基因的表达参与丹参酮类化合物的合成调控。【结论】丹参 SmORA1 参与了丹参抗病反应，而且与丹参酮类次生 代谢物质的合成密切相关。 关键词：丹参；乙烯响应因子；抗病性；丹参酮

Effect of RNAi of SmORA1 on Disease Resistance and Tanshinones Secondary Metabolism in Salvia miltiorrhiza

HUA Wen-ping1,2, LIU Wen-chao1, WANG Zhe-zhi1, LI Cui-qin1

(1Key Laboratory of Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry, Ministry of Education/National Engineering Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drugs in Northwest of China/College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062; 2Department of Biological Sciences and Technology, Shaanxi Xueqian Normal University, Xi’an 710061)

收稿日期：2015-08-25；接受日期：2015-10-08 基金项目：“十二五”国家科技支撑计划（2011BA106B06）、中央高校基本科研业务费专项资金（GK201303009）、陕西省自然科学基金（2014JQ3105）、 陕西学前师范学院基金（2014DS010） 联系方式：化文平，E-mail：[email protected]。通信作者李翠芹，E-mail：[email protected]

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Abstract：【Objective】ERF (ethylene responsive factor) are a class of plant-specific transcription factors, which are generally involved in plant stress responses. An ERF gene (named SmORA1) has been screened from medicinal plant Salvia miltiorrhiza, which is highly homologous to CrORCA3 of Catharanthus roseus. The objective of this study is to investigate the effects of SmORA1 on the resistance to disease and on the regulation of tanshinone biosynthesis in S. miltiorrhiza through interference of SmORA1 expression in S. miltiorrhiza by RNAi method.【Method】SmORA1 was cloned and inserted into interference vector, then the constructed vector (pk-ORAi) was transformed into S. miltiorrhiza by Agrobacterium tumefaciens-mediated method and transgenic lines of SmORA1-RNAi were obtained by antibiotic resistance screening and PCR identification. Using the spectrophotometry or enzyme linked immunosorbent assay, the resistance-related enzymes (phenylalnine ammonialyase (PAL), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD)) activities and physiological indexes (glutathione (GSH), proline (Pro) and malondialdehyde (MDA)) in SmORA1-RNAi transgenic lines were detected after infection by Rhizoctonia solani. The concentrations of tanshinones including dihydrotanshinone, cryptotanshinone and tanshinone II A in SmORA1-RNAi transgenic lines were detected using HPLC method. The expression levels of genes related to resistance and involved in tanshinone biosynthesis were investigated by real-time qPCR. 【Result】A total of 11 positive transgenic lines were got after antibiotics and PCR screening, among of which, three lines (RNAi-11, RNAi-18, RNAi-22) with significantly down-regulated expression levels of SmORA1 were obtained after antibiotics and real-time qPCR screening, interference efficiency achieved at 80%. After infection with R. solani, the disease indexes of SmORA1-RNAi lines were significantly higher than those of wild type (WT) and empty vector (VK). The contents of MDA in SmORA1-RNAi lines were also significantly higher than those of control lines, which indicated that the anti-aging ability of transgenic lines was significantly decreased. The activities of SOD, CAT and PAL in SmORA1-RNAi lines were significantly lower than those of the control. The contents of Pro and GSH were also dramatically decreased in SmORA1-RNAi lines. Moreover, the expression levels of SmPDF1.2, SmSTH-2 and SmPR-10 in SmORA1-RNAi lines were down-regulated compared with the control lines. These results implied that SmORA1 play important roles in plant resistance. Furthermore, the expression of SmHMGR1, SmHMGR2, SmGPPS, SmGGPPS1 and SmGGPPS3, encoding key enzymes involved tanshinone biosynthesis, were down-regulated in SmORA1-RNAi lines. Meanwhile, the contents of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone were also reduced in SmORA1-RNAi lines compared with the control lines. So it was speculated that SmORA1 regulated tanshinone biosynthesis throught the regulation of the expression of SmHMGR1, SmHMGR2, SmGPPS, SmGGPPS1 and SmGGPPS3. 【Conclusion】SmORA1 is involved in the resistance response and closely related to the regulation of tanshinone biosynthesis in S. miltiorrhiza. Key words: Salvia miltiorrhiza; ethylene responsive factor (ERF); disease resistance; tanshinone

等在烟草中过表达棉花 GbERF，诱导了烟草病程相关 0 引言 基因的表达，并提高了对致病菌假单胞菌的抵抗能 【研究意义】乙烯响应因子（ethylene response 力[9]；在烟草中表达 GbERF2 可以增强植株抗褐斑病 factor，ERF）属于 AP2/ERF（APETALA2/ ethylene- 的能力[10]。近年来 ERF 蛋白在植物次生代谢物合成中 responsive factor） 转录因子超家族中的 ERF 亚家族， 的调控功能也越来越受到人们的重视。如长春花中分 该家族成员具有由 60—70 个氨基酸序列构成的高度 离得到的 ERF 类转录因子 CrORCA3 可快速响应甲酯 保守的特征性 DNA 结合域（ERF 结构域），是植物 茉莉酸（methyl jasmonate，MeJA）和真菌诱导子等信 所特有的一类转录因子。该类转录因子不仅参与植物 号的诱导，激活长春花碱合成关键酶基因的高效表达， 抗病、抗旱等胁迫反应，还参与植物次生代谢物质的 高效调控长春花碱的合成[11]；青蒿中 AaERF1 和 调控。研究药用模式植物丹参（Salvia miltiorrhiza） AaERF2 可响应 MeJA 的诱导，上调控青蒿素合成关 ERF 基因的功能，可为丹参抗病及次生代谢物质合成 键酶二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS） 调控机制的研究奠定基础。【前人研究进展】研究表 基因的表达，从而上调控青蒿素的合成[12]。拟南芥中 明，ERF 转录因子在调节植物抗旱、抗高盐和抗病原 同时受 MeJA 和乙烯（ethylene，ET）信号诱导的 菌等方面发挥着重要作用[1-6]。如过表达拟南芥 ERF1 AP2/ERF 类转录因子 ORA59 和 ERF1，可激活 PDF1.2 （AtERF92）的转基因株系可有效抵御 Botrytis cinerea 表达进一步激活抗性基因的表达，合成次生代谢产物 和 Plectosphaerella cucumerina 等病菌的侵染[7]；过 表 以响应胁迫[13]。而在烟草中 ORC1 转录因子与 bHLH 达 AtERF14 能提高 ERF1、PDF1.2、ChiB 等抗性基因 转录因子蛋白协同参与调控尼古丁的合成[14]。【本研 的表达，并可以提高拟南芥对镰刀菌的抗性[8]；Qin 究切入点】丹参是中国大宗中药材之一。近年来关于

3 期 化文平等：干涉丹参 SmORA1 对植物抗病和丹参酮类次生代谢的影响 493

丹参基因资源的研究已经蓬勃展开，但对于 ERF 类转 pKANNIBAL 质粒载体均为笔者实验室保存。SmORA1 录因子调控功能的研究尚处于起始阶段。目前丹参抗 cDNA 序列为实验室前期在丹参转录组高通量数据基 病和调控代谢的转录因子研究较少，尤其是关于 ERF 础上依据 Contig2328 扩增获得[18]。 蛋白家族的。仅见少量ERF家族成员克隆的报道[15-17]， 二氢丹参酮（dihydrotanshinone）、丹参酮ⅡA 对各个成员具体功能的研究尚未见报道。笔者实验室 （tanshinoneⅡA）和隐丹参酮（cryptotanshinone）等 前期从丹参转录组数据库[18]中筛选到一条与长春花 对照品均购自中国药品生物制品检定所；2,6-二叔丁 CrORCA3 高度同源的 ERF 类基因（命名为 SmORA1， 基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT） GenBank 登录号：KT359598），该基因可以响应 MeJA、 购自 Sigma-Aldrich 公司；色谱纯甲醇和乙腈购自 乙烯及病原菌等病害信号的诱导，但其在抗病性、次 Fisher Scientific 公司；其他常规试剂采用进口分装或 生代谢物调控等方面的功能尚不清楚。【拟解决的关 国产分析纯。 键问题】通过考察干涉 SmORA1 对丹参中抗性基因、 1.2 SmORA1 干涉载体的构建 生理指标、丹参酮含量等的影响，探讨 SmORA1 在丹 以 SmORA1 基因全长作为 RNAi 目标片段，使用 参抗病和次生代谢物合成调控中的作用。 Primer Premier 5.0 设计两对特异性引物（ORA1-SF 和 ORA1-SR、ORA1-AF 和 ORA1-AR，见表 1）。以实 1 材料与方法 验室保存的含 SmORA1 的质粒为模板，扩增正向和反 试验于 2011 年 12 月至 2014 年 10 月在陕西师范 向干涉片段，扩增产物测序验证正确后依次连入 大学药用资源与天然药物化学教育部重点实验室/西 pKANNIBAL 质粒（GenBank 登录号：AJ311873.1）， 北濒危药材资源开发国家工程实验室完成。 构建干涉中间载体。中间载体经 Not I 单酶切后连入 1.1 植物材料及主要试剂 pART27 载体，经检测验证后获得表达载体 pK-ORAi。 以实验室保存并继代 3 周的丹参无菌苗作为基因 以 pKANNIBAL 质粒 Not I 单酶切产物（含 VK 基因片 转化材料。大肠杆菌 DH5α、农杆菌 EHA105、立枯丝 段）连入 pART27 载体后构建的质粒（VK）为 空 载 对 核菌（Rhizoctonia solani ）、pART27 质粒和 照。

表 1 载体构建及检测所用引物 Table 1 Primers used for vector construction and detection 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence (5′→3′)

ORA1-SF (XhoⅠ) CCGCTCGAGGTAGCACAACAATAGAAATGAAGGA

ORA1-SR (KpnⅠ) CGGGGTACCCTTTTGAGTTTCACCAAGAAGTAGC

ORA1-AF (BamH I) CGGGATCCGTAGCACAACAATAGAAATGAAGGA

ORA1-AR (Hind III) CCCAAGCTTCTTTTGAGTTTCACCAAGAAGTAGC 35S-pF TACAAAGGCGGCAACAAACG 35S-pR GCAATGGAATCCGAGGAGGT

引物中酶切位点以下划线标出 The sites for restriction enzymes in primers were underlined

1.3 丹参转基因植株的获得 Polymerase 扩增程序：95℃预变性；扩增 30 个循环（95 将 pK-ORAi 和 VK 质粒分别转化根癌农杆菌 ℃，变性 10 s；58℃，退火 30 s；72℃，延伸 1 min）； EHA105 后，参照实验室建立的高频转化体系转化丹 最后 72℃延伸 8 min。 参[19]。以卡那霉素为抗性筛选条件，筛选得到转基因 1.4 丹参转基因植株中基因表达量检测 的丹参株系。转化丹参植株 DNA 的提取采用博日 按照 E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit（OMEGA）说明 （Bioer）公司植物 DNA 提取试剂盒进行。以获得转 书进行转基因丹参植株总 RNA 提取。总 RNA 质粒经 化丹参苗提取的 DNA 为模板，以 CaM 35S 启动子为 电泳及 NanoDrop 超微量核酸仪检测合格后，按照 检测目标（引物 35S-pF 和 35S-pR，见表 1），检测载 PrimeScript® RT reagent Kit（TaKaRa）说明书合成第 体片段是否整合进丹参基因组 DNA。扩增体系包括 一链 cDNA。以获得 cDNA 稀释 50 倍后作为模板进行 2 μL DNA 模板、10×LA Taq 缓冲液，LA Taq® 实时定量 PCR 检测转基因株系中目标基因的表达量。

494 中 国 农 业 科 学 49卷

检测引物见表 2。扩增体系包括模板 cDNA 5 μL、5 60℃退火 20 s，扩增 40 个循环。每个样品 3 个技术重 μmol·L-1 上下游基因特异性引物（表 2）各 1 μL、 复及 2 次生物学重复。采用 2-ΔΔCt 的方法[20]进行数据分 2×SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）10 μL，用水补 析，并用 SPSS 16.0 进行单因素方差分析，采用 Tukey 至 20 μL。扩增条件：95℃变性 3 min；95℃变性 10 s， test 分析各样品间基因表达的显著性差异（P＜0.05）。

表 2 定量检测所用引物 Table 2 Primers used for qPCR 引物名称 引物序列 引物名称 引物序列 Primer name Primer sequence (5′→3′) Primer name Primer sequence (5′→3′) qActin-F AGGAACCACCGATCCAGACA qORA1-F AAATGGTCGCTGATTGCTGGTA qActin-R GGTGCCCTGAGGTCCTGTT qORA1-R CGTTCTCCATCCTCGCCTAAAT qSmGPPS-F ACCCCGCCTTGTATCAGCATC qSmDXR-F TGTAGTCACAGGAATTGTTGGATG q SmGPPS-R CGGATCGCTTGAGGTCTATGGTA qSmDXR-R GCAAGAGGAAGGACGAAAGGT qSmHMGR1-F GCAACCATCTACTCTCGTCCCA qSmHMGR2-F GGGTTCAACTACGAGGCCATACTG qSmHMGR1-R GTGCTCCATGAGCTGCATCAG qSmHMGR2-R TGTTTGTGCTCGCCACCAGG qSmHMGR3-F AGTCTCGTGATGTCCCTGCTCG qSmGGPPS1-F GGGGCTATTTTGGGAGGTGGAA qSmHMGR3-R GCCTCAACCTGCTTGGCGTA qSmGGPPS1-R CAGCAGCTTGGGATACGTGGTC qSmGGPPS2-F CGGTCTCCTCTCAACCTCTGTCAA qSmGGPPS3-F GGCCAGTGCTCTGCTGTCTGTG qSmGGPPS2-R CTCCTTCATCTGGACCACTGCCT qSmGGPPS3-R TCGGCCACCTCCATCGCTT qSmDXS1-F TGAGAGCGACTACGACTGCTTTGG qSmDXS2-F GGTCGAGGAACTGGAGGGATTG q SmDXS1-R CCCATCCAGATTGGCAGTAGGC qSmDXS2-R CGTCAGGATTTCGTGCGGATA qSama1-F GCTCCCCAACTCATGTTTTCA qSmPR-10-F TGAGCAAGGTGGAAGCAG qSama1-R CCAGCTCGTCGATCCTATGC qSmPR-10-R GGAAGAAACCAGCAAGAC qSmSTH-2-F AAGGCTTTGGTGACAGAATC qSmPDF2.1F TGAGCAGCTTTTTG AGGTTGTTTG qSmSTH-2-R GGTCGATCTCGTCCACTCTG qSmPDF2.1R GAGTAGATTTAGTTAACAGTGTCTGG

1.5 立枯丝核菌侵染检测 18、RNAi-22）、WT（野生）和 VK（空载对照）株 1.5.1 供试菌制备 挑取继代保存的立枯丝核菌，于 系，经驯化移栽于含蛭石与腐殖质的营养钵内，自然 马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）固体 环境下培养 3 个月。采用叶片喷施方法，将 1.5.1 制备 培养基上 28℃培养 5 d 后，使用打孔器取直径为 6 mm 的立枯丝核菌菌丝悬浮液喷施于各试验植株叶片，每 的菌块作为供试菌块。 株喷施 5 mL（保证所有叶片表面湿润）。每株系设 3 菌丝悬液制备参考文献[21]方法并加以改进：将 组重复，每个重复含 3 株丹参植株。感染的丹参植株 立枯丝核菌于 PDA 固体培养基活化 3 d 后，转入马铃 于人工气候箱中保湿处理 3 d 后，继续自然条件培养 2 薯葡萄糖液体培养基继续培养 3 d，得到菌丝悬液，用 d，观察丹参叶片发病情况，并参照烟草叶部病害病情 双层灭菌纱布过滤后，使用无菌水调制成透光率为 分级方法[22]统计不同株系发病情况。 10%的菌丝悬液（现配现用）。 将立枯丝核菌侵染后 5 d 的丹参植株取出，洗去 1.5.2 立枯丝核菌致病力检测 采用丹参叶片离体 根部土壤残留，滤纸吸干水分，在预先加入液氮的研 接触感染的方法，验证立枯丝核菌的致病力。取培养 钵中研磨，将材料研磨充分，直接用于各项指标检测 5 d 的立枯丝核菌菌块侵染离体的丹参植株叶片，并置 或液氮速冻后置于-80℃冰箱保存备用。 于铺有无菌滤纸的平皿内，封口膜封口后共培养 2 d 1.5.3 病原菌侵染植株抗性蛋白的活性检测 丹参 （丹参无菌苗培养条件），观察叶片枯萎情况。以未 材料中苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase， 接种立枯丝核菌的 PDA 培养基块为对照。 PAL）的活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含 干涉效果明显的 3 个丹参株系（RNAi-11、RNAi- 量的测定采用分光光度法[23]。病原菌侵染的丹参材料

3 期 化文平等：干涉丹参 SmORA1 对植物抗病和丹参酮类次生代谢的影响 495

中脯氨酸（proline，Pro）含量、铜锌-超氧化物歧化 2 结果 酶（Cu/Zn-superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD）、过氧 化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutathione， 2.1 SmORA1 干涉载体的构建及转基因苗的获得 GSH）和过氧化物酶（peroxidase，POD）等活性的检 以丹参 SmORA1 的全长片段作为干涉目标，两端 测按照南京建成生物研究所对应的测定试剂盒说明书 分别引入不同的酶切位点后依次连入 pKANNIBAL 质 进行。 粒，再经 Not I单酶切将构建成功的含 SmORA1 中间 1.5.4 病原菌侵染后丹参株系抗性基因的表达检测 载体片段导入 pART27 表达载体，构建 pK-ORAi 干涉 选取丹参中已知的抗病性相关蛋白基因（丹参病程相 表达载体。pK-ORAi 干涉表达载体分别经菌落 PCR 关蛋白基因 PR-10[24]、SmSTH-2[25]、防御素基因 PDF1.2 及双酶切验证，均得到 648 bp 左右的目标片段，表明 （unigene51147）和丹参变应原基因 Sam a1[26]）为检 干涉载体构建成功（图 1）。 测目标，检测立枯病丝核菌侵染后 SmORA1 干涉植株 抗性基因表达变化。实时荧光定量 PCR 引物见表 2， M12 检测和分析方法参照 1.4 部分进行。 1.6 干涉株系丹参中丹参酮含量的测定 精密称取二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 的 648 bp 对照品 1.0 mg，溶于 75%甲醇溶液（含 1 mg·mL-1 BHT） 并定容于 10 mL，置于 4℃冰箱中保存备用。各对照 品母液稀释成梯度浓度，0.22 μm 微孔滤膜过滤后进 样分析。 M：DNA Marker DL2000；1：Kpn I 和 Xho I 双酶切 Digested by Kpn I and 取丹参材料的根于 40℃烘至恒重，充分研磨后过 Xho I；2：BamH I 和 Hind III 双酶切 Digested by BamH I and Hind III 40 目筛。分别称取样品干燥粉末各 30 mg，置于 1.5 mL 离心管中，加入 500 μL 75%甲醇溶液（含 1 mg·mL-1 图 1 pK-ORAi 干涉载体酶切检测图 BHT），30℃下超声（30 kHz）提取 20 min，提取液 Fig. 1 Detection of the pK-ORAi vector by enzymatic digestion 12 000 r/min 离心 6 min，转移上清至新的离心管；残 渣用上述方法重复提取 2 次，合并 3 次上清液。经 0.22 将 pK-ORAi 质粒转化根癌农杆菌 EHA105 后，参 [19] μm 微孔滤膜过滤后，进行 HPLC 分析。每个样品 3 照实验室建立的高频转化体系转化丹参 。以卡那霉 次重复。 素为抗性筛选条件，筛选得到转基因的丹参株系。以 色谱条件：Phenomenex 硅胶基质 C18 色谱柱（250 干涉片段串联的 CaM 35S 序列为检测片段，初步筛选 mm×4.6 mm×5 μm），柱温 30℃，流动相为甲醇- 得到阳性株系 11 个（图 2）；进一步在 mRNA 水平 水（75﹕25），检测波长 270 nm，流速 1.0 mL·min-1。 的表达进行检测发现，RNAi-11、RNAi-18 和 RNAi-22

M：DNA Marker DL2000；1、2：空白对照 Negative control；3、4：未转化株系 Wild type；5—24：不同的转化株系 Different RNAi lines

图 2 干涉株系 DNA 水平 PCR 检测 Fig. 2 PCR-screening of the RNAi lines

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这 3 个株系中 SmORA1 表达显著降低，干涉效率达到 6 80%以上（相对于野生型植株 WT 和空载对照株系 5 VK）（图 3）。

2.2 立枯丝核菌致病力测定 4 立枯丝核菌接触侵染丹参叶片结果显示，在侵染 3 2 d 后，被侵染丹参叶片与未侵染叶片相比，菌块接触 相对表达量 的叶片部位出现枯黑部位显著增大和失水现象，损伤明 2

显（图 4）。说明立枯丝核菌有明显的致病力，可以有 Relative expression levels 1 ** ** 效诱导丹参发病，作为致病试验菌种用于下游试验。 ** 2.3 立枯丝核菌侵染对转基因株系发病的影响 0 WT VK 11 18 22 侵染 5 d 后，统计植株病害情况，结果显示 转基因株系 SmORA1-RNAi 转基因株系与对照株系相比，植株叶 Transgenic lines of SmORA1-RNAi 片出现明显枯黄和坏死。参考烟草叶部病害病情分级 WT：野生型 Wild type；VK：空载对照 Vector control；11、18、22： 方法[22]确定丹参叶片病情等级（图 5），并计算不同 SmORA1-RNAi 转基因株系 SmORA1-RNAi transgenic lines。下同 The same as below。**表示转基因株系与对照株系比较具有显著差异（P＜ 株系植株的病情指数，RNAi-11、RNAi-18 和 RNAi-22 0.01） ** indicated significant differences at P＜0.01 level between 株系病情指数约分别为 40.8%、36.9%和 35.9%，WT SmORA1-RNAi transgenic and the control lines

株系为 29.2%，VK 株系为 27.2%。WT 与 VK 之间没 图 3 SmORA1 在不同丹参株系中的表达 有显著性差异，干涉株系与对照株系比较，差异显著， Fig. 3 Expression of SmORA1 in different S. miltiorrhiza lines 病情更为严重（图 6）。

A：PDA 培养基 Contacted with PDA medium for 2 d；B：立枯丝核菌 Infected with R. solani for 2 d

图 4 立枯丝核菌接触侵染丹参离体叶片 Fig. 4 The isolated leaves of S. miltiorrhiza infected with R. solani in vitro

0 级 1 级 3 级 5 级 7 级 9 级

图 5 丹参叶片发病病情等级示意图 Fig. 5 The grade of disease on the leaves of S. miltiorrhiza

3 期 化文平等：干涉丹参 SmORA1 对植物抗病和丹参酮类次生代谢的影响 497

50 RNAi-11、RNAi-18 和 RNAi-22 株系中丹参酮ⅡA 的 45 ** 含量分别降低 12.9%、14.5%和 14.2%；隐丹参酮含量 40 * * 分别降低 20.3%、14.7%和 20.1%（图 9）。 35 30 2.7 干涉 SmORA1 对丹参酮合成途径相关基因表达的 25 影响 20 依据实验室获得的丹参萜类主干合成途径关键酶 15 基因[18]，设计引物检测干涉株系（RNAi-11、RNAi-18 10 和 RNAi-22）中萜类物质合成途径上关键酶基因的表 5 0 达。结果显示，萜类合成代谢途径中，MVA 分支途 WT VK 11 18 22 径上的关键酶基因 HMGR 家族的 SmHMGR1 与 转基因株系 Transgenic lines of SmORA1-RNAi SmHMGR2 在干涉株系中均出现了表达量显著下调， 而 SmHMGR3 表达量出现显著上调；MEP 分支途径关 *、**分别表示转基因株系与对照株系在 P＜0.05 和 P＜0.01 水平上差 异显著。下同 *, ** indicated significant differences at P＜0.05 and P＜ 键酶基因 SmDXS1、SmDXS2 表达量均出现上调， 0.01 levels, respectively, between SmORA1-RNAi transgenic and the control lines. The same as below SmDXR 的表达量无显著性差异；萜类下游途径中的关 健酶基因 SmGGPPS2 表达量无显著性变化，但 图 6 丹参感染立枯丝核菌 5 d 后病情指数 SmGPPS、SmGGPPS1、SmGGPPS3 呈现显著性下调 Fig. 6 Disease index of S. miltiorrhiza infected by R. solani in （图 10）。 5 days 3 讨论

2.4 SmORA1 对病原菌感染后植株中抗性指标的影响 ERF 转录因子是植物特有的一类转录因子，普遍 对立枯丝核菌菌丝悬液处理后的 SmORA1 干涉株 参与植物的生长发育、抗胁迫等生理过程。长春花 系中 PAL、SOD、CAT 和 POD 等抗性相关蛋白酶活 CrORCA3 是长春花中长春碱合成的重要调控基因，同 性进行测定，结果显示，各株系中 PAL、CAT、SOD 时也是植物抗性的重要调控基因[11]。笔者实验室高通 和 POD 活性在感染 5 d 后均有所升高，PAL、CAT 和 量转录组数据基础上，筛选并克隆到一条与 CrORCA3 SOD 活性明显低于对照株系（WT 和 VK）；POD 活 高度同源的基因序列（SmORA1），推测 SmORA1 也 性略低于对照株系，但无显著性差异（图 7）。进一 可能如 CrORCA3 一样参与植物的抗逆及次生代谢调 步分析发现，无病原菌侵染时，SmORA1 干涉株系中 控过程。笔者曾试图在丹参中过表达 SmORA1，但 可 MDA、还原型 GSH 和 Pro 等物质含量与对照株系无 能如 AtERF14 等 ERF 转录因子一样在生物体内其功 显著差异；菌感染 5 d 后，干涉株系中的 MDA 含量 能是非冗余的[8]，过表达 SmORA1 的转化体出现变褐 显著高于对照株系；GSH 和 Pro 的含量均显著低于对 发黑死亡（数据未给出），无法获得稳定表达株系。 照株系（图 7）。 因此，本研究通过干涉丹参 SmORA1 的表达，明确 2.5 干涉 SmORA1 对病原菌侵染后植株中抗性基因表 SmORA1 在植物抗病反应与丹参酮合成代谢调控中 达的影响 的作用。ERF 转录因子通过调节下游抗性基因的表达 采用实时荧光定量 PCR 方法检测干涉 SmORA1 进而影响植物的抗性。拟南芥 AtERF1、AtERF2、 株系中抗病相关基因的表达，发现除丹参变应原基因 AaERF1 等转录因子的过表达都可以通过 PLANT Sam a1 表达量上调之外，病程相关蛋白基因 SmPR-10、 DEFENSIN1.2 （PDF1.2）基因表达变化影响植物的抗 SmSTH-2 和防御素基因 SmPDF2.1 表达量均显著下调 性[1,3]。PR10 蛋白在植物抗病中发挥着重要作用，已发 （图 8）。 现其表达受多种 ERF 的调控[27]。如小麦中 ERF 转录因 2.6 干涉 SmORA1 对丹参酮类代谢产物积累的影响 子 TaPIEP1 可激活 PR10 的表达，提高对小麦根腐平脐 HPLC 分析干涉 SmORA1 株系中丹参酮类物质含 蠕孢的抗性。笔者选取丹参中已知的 4 条抗性基因进行 量结果显示，转基因株系 RNAi-11、RNAi-18 和 检测，发现干涉 SmORA1 的丹参株系中 SmPR-10 和 RNAi-22 中丹参酮ⅡA 和隐丹参酮的含量明显下降， PDF1.2 抗性基因表达低于对照株系；同样与病原菌防 二氢丹参酮含量无显著性差异。与对照株系相比， 御相关的 SmSTH-2[25]的表达在干涉 SmORA1 的株系中

498 中 国 农 业 科 学 49卷 ) ) -1 -1 PAL activity (U·g SOD activity (U·g 活性 活性 PAL SOD ) ) -1 -1 POD activity (U·g CAT activity (U·g 活性 活性 CAT POD ) -1 ) -1 g·g mol·g μ μ GSH content ( MDA content ( 浓度 浓度 GSH MDA ) -1 g·g μ Proline content ( 脯氨酸含量

图 7 立枯丝核菌处理前后不同丹参株系的抗性生理指标 Fig. 7 The resistance physiological indexes of different S. miltiorrhiza lines before and after infected by R. solani

3 期 化文平等：干涉丹参 SmORA1 对植物抗病和丹参酮类次生代谢的影响 499

1.6 16 1.4 * 14

Sma1 *

1.2 SmPR-10 12 * 1.0 10 0.8 8

的相对表达量 ** ** 的相对表达量 0.6 6 **

Sma1 0.4 4 0.2 SmPR-10 2 Relative expression levels of 0 0 WT VK 11 18 22 Relative expression levels of WT VK 11 18 22 6 8 7 5 SmSTH-2 SmPDF1.2 6 * * 4 * 5 3 4 的相对表达量 的相对表达量 ** ion levels of ** ** 3 2 2 SmSTH-2 SmPDF1.2 1 1

0 Relative express 0 Relative expressionof levels WT VK 11 18 22 WT VK 11 18 22 转基因株系 Transgenic lines of SmORA1-RNAi 转基因株系 Transgenic lines of SmORA1-RNAi

图 8 丹参 SmORA1-RNAi 转基因株系和对照株系中抗病相关基因的表达情况 Fig. 8 Relative expression levels of some disease resistance genes between SmORA1-RNAi transgenic and control lines

dry weight) -1 Content (mg·g Content 浓度

图 9 丹参 SmORA1-RNAi 转基因株系和对照株系丹参酮含量 Fig. 9 The contents of tanshinones between SmORA1-RNAi transgenic and the control lines

也明显低于对照株系，说明 SmPR10、PDF1.2 和 植株对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力明显下降。 SmSTH-2 的表达受到 SmORA1 的调控。但丹参病程相 同时，作为植物重要抗氧化能力指标的 MDA 含量在 关蛋白 Sam a1 的表达明显上调，可能是因为 Sam a1 SmORA1-RNAi 转基因株系中也明显高于对照株系， 不受 SmORA1 介导的调控，但受菌侵染信号的诱导。 说明转基因株系抗衰老的能力也明显下降。此外，立 脯氨酸具有较强的水合能力，可辅助蛋白质束缚 枯丝核菌处理后，SmORA1-RNAi 干涉植株中抗性相 水分，防止渗透胁迫条件下脱水，在植物的渗透调节 关的 PAL、CAT 和 SOD 等酶的活性也明显低于对照 中起重要作用[28]。在干涉 SmORA1 的丹参植株中，Pro 植株，说明 SmORA1-RNAi 转基因丹参植株抗病性明 含量明显低于对照株系，说明 SmORA1-RNAi 转基因 显减弱。

500 中 国 农 业 科 学 49卷

10 5.0 9 4.5 8 4.0 7 3.5 6 3.0 5 ** 2.5 ** 4 ** 2.0 ** 3 1.5 ** ** 2 1.0 1 0.5 0 0 WT VK 11 18 22 WT VK 11 18 22 2.2 7.0 * * * * 2.0 6.5 * 6.0 1.8 * 5.5 1.6 5.0 1.4 4.5 1.2 4.0 3.5 1.0 3.0 0.8 2.5 0.6 2.0 WT VK 11 18 22 WT VK 11 18 22 9.0 6.5 * 8.5 6.0 8.0 * 5.5 7.5 * 7.0 5.0 6.5 4.5 6.0 4.0 5.5 3.5 5.0 4.5 3.0 4.0 2.5 WT VK 11 18 22 WT VK 11 18 22 2.5 5.5

2.0 5.0

1.5 4.5 ** ** ** 1.0 4.0 * * * 0.5 3.5

0.0 3.0 WT VK 11 18 22 WT VK 11 18 22 9.0 9.0

8.5 8.0

8.0 7.0

7.5 6.0

7.0 5.0 ** ** ** 6.5 4.0

6.0 3.0 WT VK 11 18 22 WT VK 11 18 22 转基因株系 转基因株系 Transgenic lines of SmORA1-RNAi Transgenic lines of SmORA1-RNAi

图 10 丹参 SmORA1-RNAi 转基因株系和对照株系中丹参酮合成途径中相关基因的表达情况 Fig. 10 Relative expression levels of genes involved in tanshinones biosynthesis between SmORA1-RNAi transgenic and the control lines

3 期 化文平等：干涉丹参 SmORA1 对植物抗病和丹参酮类次生代谢的影响 501

Kai 等研究表明，SmHMGR1、SmDXS2、SmFPPS、 [3] Lu X, Zhang L, Zhang F Y, Jiang W M, Shen Q, Zhang L D, Lv Z Y, SmGGPPS 和 SmCPS 在丹参酮合成中可能具有关键限 Wang G F, Tang K X. AaORA, a trichome-specific AP2/ERF 速作用[29] ，分别过表达 SmGGPPS 、SmHMGR 或 transcription factor of Artemisia annua, is a positive regulator in the SmDXS 都可显著提高丹参酮含量[30-31]。干 涉 SmORA1 artemisinin biosynthetic pathway and in disease resistance to Botrytis 的丹参株系中，萜类成分中丹参酮ⅡA 和隐丹参酮含 cinerea. New Phytologist, 2013, 198(4): 1191-1202. 量与对照相比显著降低；同时，萜类合成途径的 [4] Zhang Z J, Huang R F. Enhanced tolerance to freezing in tobacco and SmHMGR1/2、SmGPPS 和 SmGGPPS1/3 关键酶基因的 tomato overexpressing transcription factor TERF2/LeERF2 is 表达下调。笔者推测 SmORA1 调节上述基因的表达， modulated by ethylene biosynthesis. Plant Molecular Biology, 2010, 进而调控丹参酮的含量。此外，DXS 基因家族的 73(3): 241-249. （DXS1/2）和 SmHMGR3 的表达上调，这可能是因为 [5] Zhang H W, Liu W, Wan L Y, Li F, Dai L Y, Li D J, Zhang Z J, Huang 萜类物质是植物生长所必需的物质（如叶绿素、类胡 R F. Functional analyses of ethylene response factor JERF3 with the 萝卜素和赤霉素等），部分萜类合成途径的同工酶基 aim of improving tolerance to drought and osmotic stress in transgenic 因为合成必需的萜类物质而进行的补偿性表达。 rice. Transgenic Research, 2010, 19(5): 809-818. [6] Jin T C, Chang Q, Li W F, Yin D X, Li Z J, Wang D, Liu B, Liu L X. 4 结论 Stress-inducible expression of GmDREB1 conferred salt tolerance in 立枯丝核菌侵染后 SmORA1-RNAi 转基因株系的 transgenic alfalfa. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2010, 100(2): 病情比野生型和空载对照株系病情更严重，植物抗性 219-227. 相关的 PAL、CAT 和 SOD 等酶活性以及 GSH 和 Pro [7] Berrocal-Lobo M, Molina A, Solano R. Constitutive expression of 等物质含量显著低于对照株系； SmPDF1.2、SmSTH-2 ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 in Arabidopsis confers resistance 和 SmPR-10 等抗性相关基因的表达也显著低于对照株 to several necrotrophic fungi. The Plant Journal, 2002, 29(1): 23-32. 系，说明干涉 SmORA1 影响了丹参植株的抗病性； [8] Onate-Sanchez L, Anderson J P, Young J, Singh K B. AtERF14, a SmORA1-RNAi 转基因株系中的 MDA 含量显著高于 member of the ERF family of transcription factors, plays a nonredundant 对照株系，说明干涉 SmORA1 的丹参株系抗衰老能力 role in plant defense. Plant Physiology, 2007, 143(1): 400-409. 显著下降。以上结果表明，SmORA1 在植物抗性反应 [9] Qin J, Zuo K J, Zhao J Y, Ling H, Cao Y F, Qiu C X, Li F P, Sun X F, 中发挥着重要作用。 Tang K X. Overexpression of GbERF confers alteration of ethylene- 丹参 SmORA1 干涉株系中丹参酮合成途径关键酶 responsive gene expression and enhanced resistance to Pseudomonas 基因 SmHMGR1、SmHMGR2、SmGPPS、SmGGPPS1 syringae in transgenic tobacco. Journal of Biosciences, 2006, 31(2): 和 SmGGPPS3 等的表达显著下调，丹参 SmORA1 干 255-263. 涉株系中丹参酮ⅡA 和隐丹参酮含量显著下降，表明 [10] Zuo K J, Qin J, Zhao J Y, Ling H, Zhang L D, Cao Y F, Tang K X. SmORA1 可能通过调节上述丹参酮合成途径关键酶基 Over-expression GbERF2 transcription factor in tobacco enhances 因的表达参与丹参酮类化合物的合成调控。因此， brown spots disease resistance by activating expression of SmORA1 在丹参抗性反应，尤其是抗病害方面发挥着 downstream genes. Gene, 2007, 391(1): 80-90. 重要的作用，同时也调节着丹参酮等成分的合成。 [11] van der Fits L, Memelink J. ORCA3, a jasmonate-responsive transcriptional regulator of plant primary and secondary metabolism. References Science, 2000, 289(5477): 295-297. [1] Thirugnanasambantham K, Durairaj S, Saravanan S, Karikalan K, [12] Yu Z X, Li J X, Yang C Q, Hu W L, Wang L J, Chen X Y. The

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中国农业科学 2016,49(3):503-517 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.009

氮循环与中国农业氮管理

王敬国，林 杉，李保国

（中国农业大学资源与环境学院/植物-土壤相互作用教育部重点实验室，北京 100193）

摘要：作为全球活性氮制造量和氮肥消费量均最大的国家，中国农业生态系统的氮平衡问题受到了国内 外广泛的关注。普遍认为中国农田施氮过量问题突出，并产生了严重的环境污染。为全面了解中国农业生态 系统氮的来源和去向，找出引起氮肥消费量高的原因，本研究运用氮循环基本原理，以 2010 年为例，根据近 年来发表的文献和国家统计资料，详细讨论了不同空间尺度上中国农业生态系统的氮输出和输入，重点分析 了作物-土壤系统氮循环与氮平衡的特征。2010 年中国农业生态系统氮投入总体上过量，其数量基本上相当 于经生物地球化学循环返回作物–土壤系统的氮量，大致在 5 Tg N 左右。在全国水平上，2010 年化肥和有 机肥带入农田的氮量，相等于作物吸氮量和农田氮损失量之和；由于化学氮肥流向的多样化，如林、牧、渔 业和城市绿化等的氮肥消耗，以及部分经济作物包括果树和蔬菜，特别是设施蔬菜的高量施氮，总体上粮食 作物过量施氮的问题并不十分突出。在耕地资源有限（占全球 8%的耕地面积，养活 20%的世界人口）、有机废 弃物中氮养分循环利用率低于 30%、豆科作物播种面积较少且生物固氮占农田总氮投入不足 15%的情况下，中 国的农业生产只有依靠氮肥。然而，中国氮肥消费存在着很大的地区差异，在土地生产力水平较高的黄淮海、 长江中下游和珠江三角洲地区，单位农作物播种面积的施氮量显著高于全国平均水平。这些地区氮肥消费量 较大与粮食单产高、复种指数高和豆科作物种植比例低有密切关系。因此，为保证人们不断增长的食物需求 和膳食结构的改善，加之土壤基础肥力相对较低，农田化学氮肥投入较高具有一定的合理性。然而，农业生 产过程中发生的氮损失，既浪费了资源，也污染了环境。损失进入大气和水中活性氮以及环境中新产生的活 性氮，经生物地球化学循环过程以大气沉降和灌溉水返回农田，已经成为作物-土壤系统氮的重要投入项。由 于农业生态系统中氮素转化过程的多样性和生物地球化学循环的复杂性，循环过程中的氮损失不可避免。只 有通过在不同空间尺度上对氮素进行优化管理，才能将氮损失降低到最低。在保证粮食安全的基础上，尽可 能地降低农田施氮的环境风险，需要多学科、多部门的协作与共同努力，在不同空间尺度上实现氮优化管理、 达到降低农业生态系统氮肥投入的目的。 关键词：农业生态系统；氮生物地球化学循环；氮平衡；氮损失；氮管理

Nitrogen Cycling and Management Strategies in Chinese Agriculture

WANG Jing-guo, LIN Shan, LI Bao-guo

(College of Resources and Environmental Sciences, China Agricultural University/Key Laboratory of Plant-Soil Interactions, Ministry of Education, Beijing 100193)

Abstract: It is in general thought that nitrogen (N) fertilizer is overused in Chinese croplands and that the overuse has resulted in severe environmental problems. As the biggest reactive nitrogen producer and N fertilizer consumer in the world, China is facing a great challenge to reduce nitrogen consumption in agriculture. The objectives of this review are to examine the sources and fate of reactive nitrogen in agroecosystems, to find out why N fertilizer consumption reaches such a high level, and provide with suggestions for better N management practices. To understand the current agricultural use of reactive N in China, principles of biogeochemical N

收稿日期：2015-08-17；接受日期：2015-10-14 基金项目：国家自然科学基金重点项目（41230856，51139006）、国家科技支撑计划（2012BAD15B01） 联系方式：王敬国，Tel：010-62732198；E-mail：[email protected]

504 中 国 农 业 科 学 49卷 cycling are used to discuss N flows in the agroecosystems in the year 2010, with focus on N input/output and balances in crop-soil systems. At the national level, input of reactive N to croplands was excessive in 2010, and the surplus was approximately equal to the quantity of the reactive N recycled back to crop fields by atmospheric N deposition and irrigation with N-polluted water, about 5 Tg N. Generally speaking, the use of N fertilizer in cereal crops is not extraordinarily high since N fertilizer is also distributed for other uses: Forestation, feeding livestock and fishes, and application to the green fields in urban areas. It is common and significant that there are much higher N application rates to fruit tree plantations and vegetable production, especially to the greenhouse vegetable growing system, in comparison with that applied to cereal crops. With the facts of the limited arable lands, low recycling rates of organic wastes, and low input of biological fixed N, crop production has to depend heavily on the use of N fertilizer in China. There is a low acreage of arable land per capita, with 8% of global arable land feeding 20% of the world population. Recycled rate of nutrient N in the organic wastes are lower than 30% and input of biological N fixation to croplands is less than 15%. Therefore, to meet the demands of Chinese population for both food and improving diets under the condition of the predominance of the croplands with medium to low productivities, high N fertilizer input is understandable. However, N fertilizer consumption is much higher than the national average in some highly productive regions, including the Huang-Huai-Hai Plain, the Yangtze Basin, and Zhujiang Delta (Guangdong) regions, and is closely connected with higher crop yields/multiple cropping indices, and smaller proportion of legume crops to the total cropping area. It is clear that the N losses from food production-processing-consumption chain have resulted in resource wasting and environmental risks. On the other hand, part of the environment received reactive N from the losses of croplands and the other pollution sources, returns to the fields via atmospheric deposition and the irrigations with polluted waters, and becomes an important source of N input to croplands. Due to the complexity of N transformation in agroecosystems and biogeochemical N cycling, N losses are unavoidable. Therefore, the best management practices at various spatial levels should be taken as the options to reduce the fertilizer use in croplands to the minimum. Integrated measures, including multi-disciplinary researches and the cooperation of various social sectors, have been suggested to optimize N management practices at each spatial level, in order to reach the fundamental goals of maintaining/improving soil fertility, securing food, reducing nitrogen fertilizer use, and minimizing environmental risks. Key words: agroecosystem; biogeochemical nitrogen cycling; nitrogen balance; nitrogen losses; nitrogen management

氮肥在保障中国粮食安全方面具有不可替代的作 于生产肥料，其余作为工业原料。化石和生物质燃烧

用。20 世纪 70 年代末以后，中国粮食产量大幅度提 过程中，N2 与 O2 发生热解反应形成氮氧化物（NOx，

高，除农村政策调整、品种更新、农田水利建设等因 通常指 NO 和 NO2）。其中，化石燃烧每年向大气排放 [1] 素外，化肥投入，特别是氮肥投入持续大量增加，是 25 Tg N 以上 NOx，生物质燃烧每年释放有 9.6 Tg N 。

一个关键因素。而且，高产品种对氮肥的依赖性更强。 除此之外，生物质燃烧还产生 NH3 挥发。

然而，氮肥使用也带来了一系列严重的环境问题。这 不同形态的活性氮之间以及活性氮和 N2 之间的 些环境问题的产生，是人为制造的这部分活性氮参与 相互转化，以及活性氮在不同储库（Pool）之间的交 自然界氮生物地球化学循环的必然结果。 换，构成了氮循环的基本过程。自然界主导氮转化的

自然界的氮虽有多种形态，但主要以惰性的 N2、 是微生物，因而从土壤微域环境到全球范围的各个尺 + 最低氧化态的氨（包括 NH3、NH4 、R-NH2）和最高 度上，氮都具有循环特征。各种尺度的氮循环以及氮 - 氧化态的 NO3 存在。除 N2 之外，其他所有结合态氮 在各分系统（储库）之间的交换，构成了极为复杂的 统称为活性氮（reactive nitrogen，Nr）。 全球氮循环[3]。氮循环深受人类活动的干扰，而且， 地球表面的活性氮，来自于光电固氮和生物固氮 由于它在各圈层间不断进行的交换及长距离传输，使 等自然过程，以及工业合成氨过程和化石燃烧等人为 得这种干扰的影响范围很大。例如，农田施氮不仅影 过程。全球范围内，光电每年固氮量介于 2—10 Tg N， 响着周围的大气和水体环境，而且也对全球气候变化、 常取 5 Tg N（1 Tg = 1×1012 g，百万 t），主要发生在 臭氧层破坏和自然生态系统的退化产生了重要影响。 热带[1] 。陆地生态系统的生物固氮量每年估计在 工业革命之后全球新增活性氮的绝大部分进入了 120—140 Tg N，其中农田生物固氮的最新估计值介于 农业生态系统，包括氮肥和农田生物固氮总量每年约 40—100 Tg N，平均 60 Tg N 左右[1-2]。利用工业合成 有 160 Tg N 的氮[1]，主要流向农田。占全球陆地总面 氨技术，全球每年固定 120 Tg N，其中约 100 Tg N 用 积 11%的耕地，承载了全球陆地活性氮总负荷的 50%

3 期 王敬国等：氮循环与中国农业氮管理 505

以上。中国相应的数量为 33.6 Tg N[4]，占全球的 21%， 活动中，氮循环相对封闭（图 1）。作物所需氮来源 由于耕地占全球耕地面积不足 8%，单位面积氮投入 于还田的有机废弃物和轮作的豆科作物。随着城市化 远高于世界平均水平。中国是活性氮制造量最大、氮 进程，养殖业逐渐实现集约化，并在很大程度上与种 肥使用量最高的国家[5-6]，由于氮循环对全球生态环境 植业分离。由于各种原因，有机养分资源还田比例大 的重要影响，以及普遍认为中国农田过量施氮[6]引起 幅度降低。在豆科轮作面积很低的情况下，为了补充 了严重的环境问题[5]，农业生态系统氮平衡问题受到 作物需要的氮，只能靠不断施用大量氮肥（图 1）， 了广泛关注。为全面了解中国农业生态系统的来源和 以满足不断增长的食物需求。 去向，找出引起农田氮肥消费量高的原因，本研究根 全球粮食安全的保证，得益于 20 世纪初德国人发 据生物地球化学原理，对中国农业氮肥使用和氮在作 明并实现了规模化生产的工业合成氨技术（又称 物生产-动物生产-食品加工-消费链传输过程及氮损失 Haber-Bosch 工艺）。二战以后，全球开始大规模利用 进行深入分析，特别是作物-土壤系统氮循环与氮平衡 该技术生产化学氮肥。氮肥消费量保障了全球 48%人 的特征，从而为氮素的优化管理提供科学依据，以实 口的食物需求[7]，中国依靠氮肥养活的人口比例达 现既满足人们不断增长的食物需求，又有效控制氮环 56%[6]。 境污染的目的。 中国 20 世纪 20 年代开始施氮肥，但到 1949 年消 费量仅有 0.006 Tg N，1957、1965 和 1975 年消费量 1 农业生态系统的氮循环与氮损失 分别增加到 0.3、1.2 和 3.6 Tg N，占农田氮总投入的 1.1 农业生态系统的氮循环 11%、28%和 46%[7]。以有机肥为主的传统养分投入模 在需要以施肥方式补充的植物养分中，氮需求量 式，不足以平衡氮输出和高产品种的氮需求，1975 年 最大且最普遍。在种养结合的典型农户水平上的生产 土壤氮亏缺 1.9 Tg N，1980 年盈余 0.2 Tg N[8]。

大气 Atmosphere NO、N2O、N2 NH3 NH3、NO、N2O、HONO N2

化肥氮 Fertilizer N2 N2O N2

灌溉水带入 Input from irrigation N2O NO 大气沉降 Deposition NO 固氮微生物 Diazotrophs NO2- - 农产品 NO2 Farm produces 城镇消费 作物 Urban Crops consumption NO3- - 农户消费 有机废弃物 NO3 Farm Wastes consumption 有机肥 Manure 家畜 有机废弃物 - NO2- Farm animals Wastes NO2

饲料 NH 或 Feeds 集约化养殖 3 土壤生物 NH + NH3 Animal 4 Soil biota production 水体 Water bodies

左边为种养结合农户水平上的氮循环模式 N cycle in individual farm level showed in the left side

图 1 现代农业生态系统氮流向简图 Fig. 1 Nitrogen cascade in modern agroecosystem

506 中 国 农 业 科 学 49卷

1.2 食物生产-消费链的氮损失 和陆地生态系统的污染负荷。 氮肥在保证粮食安全的同时，引起了一系列环 食物生产-消费过程中发生氮损失的数量与生物

境问题，如 N2O 排放量增加和大气二次气溶胶的形 吸收与利用效率、环境条件及其对氮形态转化和损失 成，部分地区水体氮严重污染等。此外，农业土壤 途径的影响等有关。农田氮的损失途径包括氨挥发、 也是大气污染物 HONO 主要来源之一[9]。农业氮投 硝酸盐和可溶性有机氮（Dissolved organic nitrogen, 入引起环境污染的主要原因，是农产品生产-加工- DON）淋洗、土壤侵蚀带走的各种形态氮、硝化-反硝 消费过程中，发生了各种方式、程度不同的氮损失， 化的气态氮损失等。此外，作物地上部分与大气之间 这种损失在很大程度上是一种不可避免的漏失。从 气态氮的交换，也表现出氮的净损失[11]。根据欧洲氮

环境角度，除反硝化和厌氧氨氧化释放的 N2 外，其 评价研究资料汇总，在不过量施氮情况下，西北欧地 他活性氮组分的损失，就是氮的非点源污染。人们 区典型作物生产体系肥料氮损失大约为 45%（表 1）， 最终消费各种食物中所含氮量，平均仅占生产体系 与中国氮肥损失率的估计值（45%[12]）相同。西欧地 氮投入总量的 17%[10]。经过食物生产链的传递，绝 区农田休闲期长且冬季多雨，使得硝酸盐和 DON 淋 大部分氮发生损失，其中相当比例的氮，成为水体 洗成为氮损失的主要途径，且较难避免。

表 1 欧洲不同农业生产体系氮的损失比较 Table 1 Nitrogen losses in two agricultural production systems in Europe 农业生产类型 总投入 产品 总损失 损失 Type of agricultural production Total N input (kg N·hm-2·a-1) N in products (kg N·hm-2·a-1) N losses (kg N·hm-2·a-1) Losses (%) 大田作物 Field crops 187 99 84 45

种养结合 Combined crop and pig production

猪养殖 Pig production 4451) 87 2283) 66

作物生产 Crop production 1842) 82 103 554)

根据 Jarvis [13]文中 Figure10.12 和 Figure 10.13 的相关数据整理，其中大田作物的数据来自西北欧地区的典型种植体系，种养结合体系的数据来自丹 麦。1)包括饲料产生过程氮损失（0.45 损失率）在内的虚拟氮投入总量；2)其中 129 kg N 来自猪粪；3)包括氮虚拟损失量在内的全部损失量；4) 施用 猪粪后大田氮的损失率 Extracted numbers from Figure 10.12 and Figure 10.13 in Jarvis [13], based on authors, the numbers for field crops were from the northwest Europe and the numbers from combined crop and pig production were from Denmark. 1) N losses during feed production was included in the total N input; 2) 129 kg N of the total N input was from application of pig manure; 3) Virtual N losses during feed production was included; 4) Percentage of N losses after pig manure application

动物饲料生产和养殖过程，以及废弃物堆放期间 动物尿中的尿素、脲酸易水解，产生的 NH3 很快 和还田之后，均可能发生氮损失。即使在种养结合的 发生挥发。粪便在堆置期间也发生氮矿化和硝化等过 农场，动物粪便及时还田虽有效减少了堆放期间氮的 程（图 1）。氮矿化形成的氨易于挥发，特别是在高 损失，但施入田间后，由于有机肥中氨挥发和反硝化 温发酵的情况下；硝化过程产生的硝酸盐，在条件适

氮损失增大，总损失量增加了 10 个百分点（表 1）。 宜时发生反硝化并产生 N2O 和 N2。养殖场氮损失的 家畜动物对植物氮的吸收、转化并形成动物蛋 另一个途径是渗出液流出。 白的比例为 5%—45%，未吸收的氮以废弃物形式排 食品加工和消费环节也有氮的损失。在没有废弃 出[13]。放养家畜的排泄物中的氮会发生氨挥发和径 物循环利用情况下，食品加工、储运过程，氮损失可 流损失。在圈养情况下，损失途径多、数量大。从 占植物可食部分氮的 30%以上，占动物粗产品氮的 动物粪便排出到农田利用前，氮损失高达 10%— 40%以上[15]。 50%。加上施入田间后的损失，损失可达 20%— 总之，随着城市化发展和城乡膳食结构改善，生 70%[14]。一般而言，在种养分离的情况下，即使动 产-加工-消费链延长，损失氮增多。以肉牛生产为例， 物排泄物能够还田，由于堆储时间较长，氮损失也 投入 100 kg 肥料氮用于饲料生产，在 40%动物排泄物 比种养结合体系大。而且，饲料跨区域生产所造成 氮还田前提下，移出农田且无法归还的氮有 76 kg[15]。 生态系统养分链断裂现象，更易诱导氮污染问题的 在合理施氮条件下，终端消费者食用玉米摄入的氮占 发生且降低资源利用效率。 农田施氮量 40%左右，而食用肉类，摄入的氮则只有

3 期 王敬国等：氮循环与中国农业氮管理 507

10%[15]。也就是说，消费相同数量的动物蛋白至少多 等）转化为二次气溶胶或细颗粒物之后，可随大气环 消耗 4 倍以上的氮。由于农业部门规定农田禁用城市 流长距离迁移，对全球环境变化有重要贡献。 生活污泥，且城市人口消耗了更多的富含蛋白质食物， 农业生态系统的活性氮可直接通过径流或淋洗， 因此占全国人口一半以上人类排泄物氮无法返回农 或间接通过大气沉降方式进入水体。一般认为，农田 田。因为膳食结构的改变和城市化进程，不仅大量增 径流对地表水体氮污染贡献不大[12]；而第一次全国污 加了化肥氮的消费，而且氮循环回来的比例降低。例 染源普查表明，养殖业成为中国地面水体最重要的污 如，大量畜产品从自然草地生态系统的输出，已造成 染源[24]。农田氮的淋洗则是华北地区地下水硝酸盐污 内蒙古典型草原氮循环和平衡过程被严重打破，氮已 染的来源[25]。进入水体的大部分活性氮，通过反硝化 成为除水分外影响牧草生长的重要限制因子[16-18]。 返回大气，少量会随灌溉水返回农田。 从生产和消费链损失的氮，大部分以活性氮进入 生产-加工-消费损失的氮不仅来自中国的农产

大气和水体。全球尺度上，通过生物反硝化以 N2 返回 品，也有进口农产品。例如，从 20 世纪 90 年代末 大气的氮，占农田氮投入的 10—40%[19]。中国经反硝 开始，中国进口大豆数量逐年增加，2010 年增加至

化以 N2 形式返回大气的氮占陆地生态系统氮投入的 55 Tg，仅大豆净进口，就带来 2.8 Tg N 输入，这些 20%[4]。从农业生态系统直接进入大气的活性氮主要 氮主要用作动物饲料。而按照 Gu 等估算[5]，中国 是氨，以及部分有机氮[20]。以地（市）级为单位估算， 2010 年饲料氮进口总量为 5.7 Tg N。这些氮的大部 黄淮海平原地区 2004 年氨挥发总量为 3.1 Tg N，其中 分也损失掉了。 1.6 Tg N 来自于农田[21]。农业是中国大气沉降氮的主 2 作物-土壤系统氮平衡 要来源，与 20 世纪 80 年代相比，至 2010 年全国大气 [22] 氮沉降增加了 60% 。NHx 和 NOy 大气滞留时间较 由于基础资料缺乏，全国尺度上农田氮平衡的估 短[1]，因而，气态活性氮主要沉降在其来源地区。例 计有很大不确定性，已发表的在全国尺度上估算中国 如，施氮量较高且集约化养殖业较为发达的中国东部 作物-土壤系统的氮平衡资料不多，其中代表性的 2 个 [23] 地区，大气氮沉降量很高 。但是气态氮（NH3 和 NO2 研究结果总结在表 2。

表 2 中国作物-土壤系统的氮平衡 Table 2 Nitrogen input/output in Chinese croplands 输入 Input (Tg N·a-1) 输出 Output (Tg N·a-1)

1978 1998 2010 1978 1998 2010

化学氮肥 N fertilizer 7.6 24.8 29 收获物移走 Crop removal 6.6 15.3 17

有机肥 Organic fertilizer 6.5 5.4 9.6 化肥氮损失 Fertilizer N loss — 11.2 —

生物固氮 Biological N fixation 4.5 3.5 4.6 有机肥损失 N loss from manure — 0.81 —

土壤氮损失 N loss from soil — 0.30 —

大气沉降 Atmospheric deposition 1.3 1.5 4.0 淋洗 N leaching 0.4 0.50 1.1

灌溉水 Irrigation 0.5 0.6 径流损失 Runoff loss of N 0.7 1.24 1.9

种子 Seeds 0.2 0.4 0.2 反硝化损失 Denitrification loss 4.5 — 10.5

氨挥发损失 NH3 volatilization 1.8 — 3.0

合计 Sum 20.6 35.6 48.0 合计 Sum 14.1 29.4 33.6

平衡＝输入-输出 1978：6.5 Tg N； 1998：6.2 Tg N； 2010：14.4 Tg N Balance＝Input-Output Tg =1012g；1998 年的所有数据直接来自于 Zhu and Chen [12]，1978 年和 2010 年的氮输入和收获物移走数据，直接来自于 Cui [4]，有机肥包括秸秆氮； 其余氮输出数是据根据 Cui[4]补充资料给出的参数计算得出（Cui et al. www.pnas.org/cgi/content/short/1221638110）。其中，氮肥氨挥发系数 0.10，有

机肥氨挥发系数 0.20，淋洗 0.028，径流 0.05，反硝化的 N2O 排放因子 0.0095 和 N2O /(N2+N2O)为 3.9% Tg =1012g; all of the numbers in 1998 came directly from Zhu and Chen [12]; N input and the output with crop removal in both 1978 and 2010 were directly from Cui[4], N in plant residues was included in organic fertilizer; the rest numbers of N output was calcauled by the parameters given by Cui[4] in supplementary information (Cui et al. www.pnas.org/cgi/content/short/1221638110). The factor for NH3 volatilization from chemical N fertilizer 0.10, NH3 volatilization from organic fertilizer 0.20, leaching 0.20, runoff 0.05, denitrification losses was calculated by multiplying the total N input with N2O emission factor (0.0095) and divided by product ratio (N2O /(N2+N2O)=3.9%)

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2.1 作物-土壤系统的氮投入 并不算太高（表 3）。而且，豆科作物并非完全不 2.1.1 氮肥投入 2010 年化肥氮（复合肥氮按总 施氮肥。 养分的 30%计算）消耗量 28.9 Tg N[26]。农作物总播 化学氮肥流向的多样性以及区域和作物之间分配 种面积为 1.61 亿 hm2，果园和茶园面积分别为 0.12 的不平衡，是中国氮肥总体消费高的重要原因。农业 亿 hm2 和 0.02 亿 hm2。单位面积（播种面积＋种植 上除大田作物和种植园外，氮肥还有其他投向。2010 园面积）平均施氮量为 166 kg N·hm-2；除豆科作物 年氨化秸秆就直接消耗了 1.9 Tg N，人工草场施肥、 （豆类和花生分别为 0.11 亿和 0.05 亿 hm2）外，平 水产养殖和城市绿化分别消耗了 0.7、0.4 和 0.2 Tg 均施氮量 183 kg N·hm-2。如无其他氮来源仅依靠化 N[6]。减去这些消耗，大田（豆科作物除外）和种植园 肥供氮，全国大田作物单位种植面积平均氮投入量 年消耗总量为 25.7 Tg N，每季平均施氮 163 kgN·hm-2。

表 3 2010 年中国主要粮食作物平均产量和理论需氮量 Table 3 Averaged yields of Chinese cereal crops and demands for N supply in 2010 作物 播种面积 总产 平均产量 籽粒氮 秸秆量 秸秆氮 总吸氮量 理论需氮量 Crop Sowing area Production Yield N in grains Residues N in residues Total N N demands (×103 hm2) (×103 t) (t·hm-2) (kg N·hm-2) (t·hm-2) (kg N·hm-2) (kg N·hm-2) (kg N·hm-2) 水稻 Rice 29873 19576 6.55 74 5.90 47 121 220

小麦 Wheat 24257 11518 4.75 95 4.32 24 119 217

玉米 Maize 32500 17724 5.45 71 4.55 36 108 196

播种面积和粮食总产资料来源于《中国统计年鉴（2011）》[26]；水稻、小麦和玉米籽粒含氮量分别按 1.30%、2.3%和 1.5%估算，籽粒和秸秆的含水 量按 13%估算；作物秸秆的有关参数来源于全国农业技术推广服务中心[27]，水稻、小麦和玉米籽粒/秸秆的比值分别为 0.90、0.91 和 0.83，含氮量分 别为 0.91%、0.65%和 0.62%；需氮量根据作物吸氮量和 Zhu and Chen [12]给出的肥料损失率 45%估算 Data on sowing area and cereal production was from 2011’s Yearbook of Chinese Statistics (2011)[26]; N in grains of cereals was calculated based on the N concentration of 1.30%, 2.3% and 1.5% for rice, wheat and maize respectively, and water content in grains and residues was 13%; The factors for calculation of N in residues were introduced from The National Agro-Tech Extension and Service Center [27] with grain/residue ratios 0.90, 0.91 and 0.83 and N concentrations in residues of 0.91%, 0.65% and 0.62% for rice, wheat and maize respectively; Crop N demands were calculated by total N uptake by crops plus 45% of fertilizer N losses [12]

蔬菜、果树的施氮量远超出平均水平。据多年万 河北和上海，平均氮消费量分别为 197 kg N·hm-2 和 户调查数据，2009 年中国蔬菜、果树用去了氮肥总产 177 kg N·hm-2，高于或接近全国平均水平的 183 kg 量（36.1 Tg N，国际化肥工业学会（IFA）数据）[5]的 N·hm-2。珠三角的广东平均施氮也高达 230 kg N·hm-2。 28%，出口和工业原料分别占用 5%和 10%，种植业消 复种指数高、豆科作物面积小、粮食单产高，可能是 费 26.0 Tg N[5]。该年中国蔬菜播种和果树总面积占总 这些地区过量施氮的主要原因。 施氮面积（不含豆科）的 19%，可得出施氮量是平均 2.1.2 有机肥投入 中国农田长期依靠有机肥补充 值的 2 倍。其中设施菜田的施氮量达 2.4 倍以上[28]。此 作物所需养分，1949 年农田所需氮几乎全部来自于有 外，林、牧、渔等产业消费了 13%的氮肥，而粮食作物 机肥（不考虑生物固氮）。1975 年有机肥氮投入占总 氮消耗量仅占 36%，为 13.0 Tg N[5]，不考虑豆科作物， 氮投入的比重下降 53.8%，到 1995 年只占 21.6%[12]。 其他粮食作物的每季平均施氮量则为 133 kg N·hm-2。 毋容置疑，随着初级生产力提高和进口初级农产 不同地区间氮肥分配差异大。东部黄淮海和长江 品数量增加，有机肥养分资源量应有较大幅度增加。然 中下游地区，氮肥消耗量远高于全国平均水平（表 4）。 而，目前农业利用仅占有机肥养分资源总量的 1/4，其 黄淮海地区（仅含京、津、冀、豫和鲁五省（市）） 中秸秆还田约有 1/3，畜禽粪便的农业利用不足 50%[29]。 和长江中下游地区（沪、苏、皖、鄂四省（市））耕 秸秆还田更重要作用是提高土壤基础肥力，维持生物活 地占两区国土总面积的 38.6%，农田较集中，且多为 性并促进钾、钙、镁等元素的循环利用，直接改善作物 两熟制。两地区的耕地面积占全国的 33.4%，农作物 氮营养的意义不大。饼肥（粕）主要用于动物饲料，少 施氮面积占全国的 36.6%，粮食总产占全国的 45.6%、 量用于园艺作物。而畜禽粪便在还田之前，至少 30% 棉花总产占全国的 47.9%，氮肥消费量占全国的 的氮已经损失掉了。而且，有机肥的主要流向是蔬菜、 44.9%[26]。其中氮肥消耗最高的天津和江苏，平均施 果树等经济作物。例如，每季设施菜田作物依靠有机肥 氮量分别高达 296 kg N·hm-2 和 280 kg N·hm-2；最低的 提供的氮，在 176 kg N·hm-2 到 823 kg N·hm-2 之间[28]，

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表 4 2010 年中国不同区域氮肥消费量及其与种植业结构的关系 Table 4 Consumption of fertilizer and planting structures in various Chinese regions in 2010 地区 播种总面积 粮食 豆科 1) 复种指数 种植园 2) 氮肥总消费量 施氮量(I)3) 施氮量(II)4) 耕地占国土面积 Region Crop sowing Grain Legume Multiple Plantation N fertilizer N application N application Arable land/ total area cropping consumption rate(I) rate(II) land area (×106 hm2) index (×106 hm2) (Tg N) (kg N·hm-2) (%)

黄淮海 5) Huang-Huai-Hai Plain 34.6 23.6 3.1 1.5 2.3 7.45 202 221 41.6

长江中下游 6) Yangtze basin 25.1 16.1 2.0 1.6 1.1 5.55 212 230 34.9

广东 Guangdong 4.5 2.5 0.4 1.6 1.1 1.21 214 230 15.7

东北 The Northeast 21.5 19.1 4.9 1.0 0.4 2.74 125 161 27.1

青藏 Tibet plateau 0.8 0.4 0.0 0.9 0.0 0.07 89 94 0.5

其他 Other regions 68.4 44.9 5.0 1.3 7.6 10.96 144 154 10.1

全国 National 160.7 109.9 15.8 1.3 13.5 28.93 166 183 12.8

资料来源于《中国统计年鉴（2011）》[26]。1) 豆科作物包括豆类和花生；2) 种植园仅指果园和茶园，其中果园面积平均占 85%；3) 指包括农作物播种 总面积和种植园面积在内的平均氮肥施用量；4) 假定豆科作物不施氮情况下的平均施氮量；5) 仅含京、津、冀、鲁、豫五省（市）；6) 包括苏、沪、 皖和鄂四省（市） Data source: 2011’s Yearbook of Chinese Statistics (2011)[26]. 1) Legume crops include beans and peanut; 2) Plantation: Just fruit and tea tree plantation included with 85% of fruit tree plantation in average; 3) N application rate (I) was calculated based on sum of total sowing area of agricultural crops and plantations; 4) N application rate (II) legumes not included in the numerator; 5) Only Beijing, Tianjing, Hebei, Shandong and Henan included; 6) Only Jiangsu, Shanghai, Anhui and Hubei included

按平均 400 kg N·hm-2 施氮量计算，仅全国 335 万 hm2 kg N·hm-2[34]；中国早期应用乙炔还原法估算的 15 设施蔬菜种植面积则用去了 1.2 Tg 有机肥 N。假定果 kg N·hm-2，明显偏高。一般而言，在施氮较高、有机 树有机肥的用量是设施蔬菜的一半，全国 1 154 万 hm2 质含量较低的土壤，自生固氮量很少，可以忽略。除 果园将消耗 2.3 Tg 有机肥 N。此外，还有 1 565 万 hm2 豆科作物外，甘蔗田联合固氮和稻田蓝细菌等固氮较 的露地蔬菜田和 100 多万 hm2 有机农业生产面积。因 为重要，两者的年平均固氮量分别为 25 kg N·hm-2 和 而，7.4 Tg N（不含秸秆氮 1.5 Tg N）的已利用有机肥 33 kg N·hm-2 [34]。然而中国稻田施氮量一般偏高，生物 氮[4-5]，能够用于其他作物的可能不足 2 Tg N。这部分有 固氮量可能低于这一水平。总之，豆科作物种植面积 机肥全部用于粮食作物，平均用量也仅有 20 kg N·hm-2。 小、轮作面积更低且普遍施氮，在很大程度上限制了 有机肥和化学肥料加在一起提供的氮，只能是基本上 生物固氮的贡献。 与粮食作物的需氮量持平。 2.1.4 大气沉降 大气氮沉降是农田氮的另外一个 2.1.3 生物固氮 生物固氮占全球农田氮投入1/3以 重要来源，也是农田氮过量的主要部分。大气活性氮 上[1]，中国则不足 15%（表 2），但豆科作物的固氮 主要来源有：（1）农业生态系统和城镇有机废弃物中 潜力（不施氮且接种根瘤菌下的固氮量）并不比国外 损失的气态活性氮部分，以氨为主；（2）化石和生物 低[30]。豆科作物种植面积小且普遍施氮，普遍度为 质燃烧释放的氮氧化物，以化石燃烧为主要来源。此 74%[29]，会降低固氮量[31]。为保证苗期的氮需求，东 外，大气湿沉降总氮量的 30%是成分复杂的可溶性有 北大豆的推荐施氮量在 26—43 kg N·hm-2 [32]。实践中， 机氮，来源复杂[35-37]，既可能来源于自然过程，也可 为了获得高产，豆科作物的施氮量远高于推荐量，甚 能来源于人类活动[20]，或者是氮在传输过程中发生生 至达到 100 kg N·hm-2 以上[33]。而且，主产区的东北， 物化学和光化学反应的结果[35]。 大豆连作比例较高，既减少了固氮量且所固定氮对非 不同作者对中国化石燃烧产生活性氮的估计值分 豆科作物意义不大。 别为 8.5 Tg N [4]和 6.6 Tg N[5]。另据《中国环境状况公 [38] 尽管相关研究对 2010 年中国农田生物固氮投入 报》 ，2011 年中国 NOx 排放量为 24.0 Tg，相当于 估算比较一致，均为 4.6 Tg N[4-5]，但仍然可能高估。 7.3 Tg N，介于两者之间。三者均缺失生物质燃烧排

由于中国相关研究资料的缺乏，计算所用的有关参数 放的活性氮量。按照中国 NOx 排放量排放占全球 1/4 多来自于国外文献。其中对共生固氮可能高估的原因， 的比例和 Fowler 等[1]给出的全球估算值，中国生物质

是中国豆科作物连作面积大、施氮量较高且更普遍。 燃烧排放了约 2.0 Tg 的 NOx-N。关于农田氨排放的研 自生固氮量一般很低，每年固定氮量通常＜5 究很多，养殖业的数据较缺乏，因此在尺度放大过程

510 中 国 农 业 科 学 49卷

中，由于不同作者所用研究方法和对选取参数的偏好 年中国环境状况公报》[43]，环渤海六省（市）典型农 不同，估算值差距很大，2010 年的估计值分别为 9 Tg 业种植区地下水硝酸盐平均含量为 10.9 mg N·L-1，其 N[39]、10 Tg N[40]、13 Tg N[4]和 17 Tg N [5]，或许取 11 中，蔬菜种植区为 15.6 mg N·L-1。如果平均每季小麦 —13 Tg N 更接近实际。此外，工业用合成氨以及生 灌水量 200 mm，环渤海地区（包括河南）小麦季平 物质燃烧都可能排放氨，但缺乏相应数据。 均带入 22 kg N·hm-2，总氮投入为 0.3 Tg N。而且，在 长三角和环渤海地区是集中农业和工业的发达地 中国设施蔬菜集中种植区，由于灌溉水量大、地下水污 区，化石燃烧排放氮氧化物的一半来自该地区[4]，包 染严重，带入的氮量非常高。例如，在山东寿光蔬菜种 括河南在内，其肥料氮消费占全国 43%。按比例估算， 植的中心区，2004—2007 年，每年由地下水灌溉补充到 化石燃烧和农业分别向大气排放了 4.3 Tg 的活性 N。 土壤的氮达到 174—298 kg N·hm-2[44]。在该蔬菜种植区 假定其返还比例为 70%，每年总计有 6.0 Tg N 沉降在该 的边缘，大水漫灌每年补充的量也有 87 kg N·hm-2[45]。 区域，平均单位国土面积每年氮沉降为 57 kg N·hm-2。 因此，灌溉水带入农田氮总量可能超过 1.0 Tg N。 农田实际沉降量可能低于此估计值，原因是：（1）作 综上所述，在作物-土壤体系不可避免发生氮漏失

物的覆盖度受季节影响，而活性氮（主要是 NOx）排 的情况下，全国尺度上化肥和有机肥带入氮的平均量 放高峰不可能总与植被生长期一致；（2）环渤海地区 与粮食作物需求量之间大体平衡，只是在不同区域和 农田土壤 pH 较高且冬春季土壤含水量偏低，不利于 不同作物上有很大差异。经生物地球化学循环返回作

NH3 吸收。 物-土壤系统的约为 5 Tg N，则基本代表了农田氮投入 大气氮沉降对农田氮投入估计的不确定性很大。 的过量部分。 一般而言，对以湿沉降方式带入作物-土壤系统的氮量 2.2 作物-土壤系统氮输出 没有多少疑议，在华北平原占大气氮总沉降量 40%左 2.2.1 随收获物移出 作物-土壤系统最大的氮输出 右，而干沉降则占 60%[40-42]。以颗粒物形态干沉降的 项是随收获物带走，其估算的不确定性也很大。常用 氮，虽然部分可能来自于气溶胶对气态氮组分的吸附， 的方法是基于统计产量，依据文献中作物收获指数和 但也很可能有相当一部分是近距离搬运，对农田氮投 收获物平均氮含量进行估算。然而，栽培品种不断更 入几乎没有贡献。作物-土壤系统与大气间气态活性氮 新，单产持续提高，虽然作物的总吸氮量增加，但籽 （绝大部分为氨）交换是干沉降氮的主要部分，在总 粒含氮量一般会随着产量的提高而有所降低；与此同 量为近 90 kg N·hm-2 中约占 60% [41-42]。大气与作物-土 时，土壤肥力水平提高和供氮量增加，秸秆含氮量提 壤系统的交界面不是一个几何平面，在植被存在情况 高[22]。例如，全国农业技术推广服务中心给出的 20 下这种交换既可能发生在土-气界面，也可能发生在植 世纪 90 年代籽粒和秸秆氮含量以及收获指数的数据[27] 物-大气界面。土-气界面氨交换平衡点和作物吸收的 （表 3 注释），明显高于常用的早期数据。但综合考 补偿点会随土壤 pH、植被类型、生育期以及气候因素 虑，对随粮食作物移走的氮估算，误差不会太大。 的变化而不同，这为准确定量作物-土壤系统对气态 园艺作物氮带走量难以估算。统计数据中仅给出了 氮化合物的净吸收量带来了极大困难。中国北方地区 总播种面积和总产量，缺乏具体作物的相关数据。而且， 与西欧相比，土壤 pH 较高而土壤含水量通常偏低， 蔬菜作物氮需求量相对较高，且归还比例较低。例如， 引用欧洲氨沉降系数，计算中国大气与作物-土壤间 设施番茄每季的吸氮量一般超过 200 kg N·hm-2[44-45]，而 氨交换量，明显偏高。而且由于布点太少，外推引起 且为了控制土传病害，作物根茎等残体必须移出土壤。 误差更大。 园艺作物消耗了总氮量的 1/3 以上[6]，对这部分氮估计 尽管如此，中国每年进入大气的活性氮总量可能 的可靠性对全国氮平衡有显著影响。 在 20—23 Tg N 之间，假定 70%的大气氮沉降在中国 2.2.2 氮损失 与作物-土壤系统氮平衡其他各项相 陆地表面，其中的 25%沉降在农田，作物-土壤系统每 比，氮损失估算不确定性更大，其主要原因是：（1） 年接收的总量为 3.5—4.0 Tg N。 各种途径氮损失量化的不确定性均很大，即使利用 15N 2.1.5 灌溉水 中国地表和地下水体氮污染较普遍。 标记肥料，由于存在起爆效应和土壤氮内循环，通常 其中地表水体的污染源主要是生活污水和养殖业，地 低估农田氮损失量；（2）基础数据缺乏严重，特别是 下水体的主要污染源则是农业非点源污染[43]。据估 近年的数据很少。 计，地表灌溉水带入农田的氮为 0.6 Tg N[4-5] 。据《2014 估算 1998 年氮损失为施氮量 45%[12]所用的参数，

3 期 王敬国等：氮循环与中国农业氮管理 511

主要来自于《中国土壤氮素》[46]。尽管资料较老，但 20 世纪 70 年代之前，农田土壤长期处于氮耗竭状态。 更全面。北方地区肥料氮损失量可能不足 45%，但南 20 世纪 80 年代到 21 世纪初，随着施氮量增加和初级 方地区，特别是水旱轮作体系，却显著高于此值[47]， 生产力提高，中国主要农业区土壤有机质含量普遍增 在全国尺度上可能更接近实际，因此本文采用此值估 加[52-53]。土壤肥力的提升，对提高单产和生产体系稳 算粮食作物的理论需氮量。 定性，保障中国的粮食安全，十分必要。 近来对 2010 年氮损失量的估算结果差距更大，直 从 1978—1982 年到 2007—2008 年，全国尺度上 接引用国外文献中参数估算的中国作物-土壤系统肥 0—20 cm 土层共增加了 260 Tg C 的有机碳储量[53]； 料氮的损失量明显较低[4]。而利用个别观测点数据， 按照 C/N 为 11 计算，仅表层土壤就积累了近 25 Tg N。 简单进行尺度放大的估计值又过高[5]。例如，利用 由于中国农田土壤 C/N 值有下降的趋势，实际积累量 IPCC 的缺省值 10%估算中国农田肥料氮的氨挥发损 可能更高。施氮量较高的黄淮海平原地区，土壤有机 失[4]，对南方稻田或许适当，但对石灰性土壤明显低 碳积累量显著高于全国平均水平。土壤基础肥力水平 估。。 的提高，是该区成为中国最重要粮棉生产基地的主要 与 20 世纪 80 年代相比，中国的肥料品种、施肥 因素之一。最近研究结果表明，1980—2010 年 30 年 技术和田间管理方式均发生了一些改变，由此可能引 间，中国农田土壤每年有机碳的增加幅度为 14.7— 起氮主要损失途径的变化。20 世纪 80 年代初期，碳 30.9 Tg C[54]，贮存氮为 1.3—2.9 Tg N，相当于或大于 酸氢铵占氮肥总消费量的 60%，2010 年下降至 15%左 秸秆还田带入的氮量（1.5 Tg N）。然而，北方旱地 右[48]；30 年来灌溉面积增加了 32%，水肥一体化技术 土壤剖面中大量无机氮的积累[55]，则存在着很大的环 近年发展很快。加上土壤有机质含量提高、供氮能力 境风险。 增强以及作物品种的变化等。例如，华北地区小麦- 玉米体系，虽然氨挥发仍是主要损失途径，但硝酸盐 3 农业生态系统氮循环研究的几个 淋洗量明显增加，常规施肥灌溉模式下两季作物硝酸 问题 盐的淋洗量占施氮量的 7%[47]。山东寿光漫灌条件下 设施菜田的硝酸盐年淋洗量高达 600—800 kg N·hm-2， 3.1 作物-土壤系统氮损失的量化 占施氮量的 43%—67%[49]。因此，硝酸盐淋洗损失可 氮肥利用效率不高的原因主要有：（1）微观尺度 能要远高于占氮肥施用量 2%的估计值。而且，据有 上，微生物与植物根系对氮的竞争，导致肥料氮的 关研究，中国农田土壤 pH 下降的重要原因是土壤中 生物固持，以及土壤和肥料氮相互交换而引起的假 大量硝酸盐淋洗的结果[50]。 象[56]；（2）肥料氮直接和间接损失，如氨挥发和氮 绝大多数作物-土壤系统氮平衡的研究工作，仅限 淋失；（3）肥料氮在转化过程中发生损失，如反硝化 于计算氮表观平衡，而全面监测氮损失和氮投入，进 引起的气态氮损失。其中，施入土壤后肥料氮发生的 而系统估算作物-土壤系统氮循环的资料很少，且不完 各种方式的损失是最主要原因。因此，深入了解氮损 整。由于研究目的或学科背景的不同，研究者往往只 失途径及其影响因素，以便有针对性地采取措施控制 重视氮循环的某一环节，忽略了其他环节。研究氮损 氮损失，具有十分重要的意义。然而，目前有关氮损 失的，不考虑氮的沉降；而研究氮沉降的，又很少考虑 失的定量测定方法，却存在着许多问题。 氮的损失。例如，在定量大气与作物-土壤的氨交换的 3.1.1 氨挥发 氨挥发的测定方法比较成熟，特别是 干沉降时，只测定某一高度大气氨浓度，通过引入沉降 风洞法和涡度相关法可以准确定量氨挥发损失。然而， 速率系数，计算沉降量。然而，这种交换是一个双向过 中国文献中许多数据是采用简单、易于操作的密闭容 程，未必一定是净吸收，也可能是净排放[51]。因此， 器法测定的。由于密闭容器内水、气、热等条件与自 常常高估氮沉降量。由于各种方法比较繁琐，且有的方 然状态不同，氨挥发损失量估计偏差较大，仅可用于 法不够准确，在研究作物-土壤系统氮循环时，通常无 试验处理间的比较。风洞法是对密闭容器法的改进， 法准确对各输入和输出项分别进行定量。这也是作物- 主要是模拟了空气流动并降低了密闭容器中的温度， 土壤系统氮循环研究中亟待解决的问题。 更接近实际。而涡度相关法虽然能够定量地准确估计 2.3 土壤氮的累积 田间条件下氨挥发量，但要求测定的面积较大（一般 中国农田氮投入的一部分贮藏在土壤有机质中。 不小于 2 hm2）。

512 中 国 农 业 科 学 49卷

作物-土壤系统是一个整体，冠层也在不断地与其 的影响，变异较大。在这些因素中，pH 和可利用有机 周围的大气进行氨的交换。土面氨的排放并不等于氨 碳的数量对产物比有很大影响[63]。如果能够定量摸清 的净损失，有可能被冠层吸收[57]。而且植株本身也排 产物比与影响因子之间的关系，结合田间通量观测和 放氨，欧洲植株氨净排放一般为每季 2—6 kg·hm-2 模型模拟，可能会对土壤反硝化氮损失有一个较为准 [11] -2 [11] NH3-N ，美国小麦植株净排放为 15 kg·hm NH3-N 确的定量。 -2 [58] 左右，玉米则为 7—34 kg·hm NH3-N 。考虑到气象 3.2 有机废弃物的养分资源量和可返还比例 因素，中国的植株氨排放量可能更接近于美国，但研 经过 30 多年的经济快速增长，农业增产、膳食结 究资料很少。作物-土壤系统氨挥发的准确定量，需要 构改变以及品种更新，使得中国有机废弃物的产生量 同时考虑植物冠层与大气间氨的交换平衡。 显著增加。例如，中国粮食总产从 1995 年的 467 Tg， 3.1.2 氮淋洗 土壤氮淋洗包括硝酸盐和 DON 随饱 增加到 2010 年的 546 Tg。同时，由于品种改进和动 和流、优先流、非饱和流以及扩散向下的迁移过程。 物性蛋白摄入比例的增加，有机废弃物中氮的相对含 目前定量氮淋失的方法中，没有一种单独使用能同时 量也会提高，这给正确估计有机废弃物的养分资源量， 监测四种方式的氮迁移。渗滤池（lysimeter）只能监 带来很大的挑战。 测以饱和流和优先流方式向下迁移的氮。然而，由于 全国农业技术推广服务中心估算[64]，20 世纪 90 接收盘与土体间要放置颗粒较粗的砂粒，打破了毛细 年代中期中国有机肥中氮的基本资源量为 20.9 Tg N， 管的连续性，对水分运移影响较大。土壤溶液提取法 其中粪尿类 14.7 Tg N，秸秆类 4.30 Tg N，绿肥类 1.27 可用来监测氮随非饱和流下移，比较适用于通常不形 Tg N，饼肥类 0.18 Tg N。另据估计，2006 年中国有 成饱和流的旱地土壤，但难以完整监测到以优先流方 机肥氮的基本资源量为 32.0 Tg N[29]。 式的迁移量，因而均可能低估氮淋洗。在实测基础上 基本资源量不等于可利用量，其原因是：（1）粪 结合模型，增加模拟氮扩散迁移项，或许能够补充、 尿类肥料中氮的资源量，一般是按单位个体、单位时 完善氮淋洗估算。 间排泄量和新鲜样品中氮含量估算的，由于氮损失的 需要指出的还有，随水向下迁移的氮不仅有硝酸 发生，实际可利用氮量下降幅度很大；（2）缺失良好 盐，也有 DON。自从发现南美温带原始森林中河流 雨污分流系统的城市，粪尿类以及餐厨垃圾等收集和 氮传输的主要形态是 DON 后，人们开始重视 DON 利用极为困难；（3）养殖业集约化导致直接处理、排 淋洗[59]。 放比例较高；（4）各类资源中有重复计算部分，如秸 3.1.3 反硝化 反硝化氮损失定量方法不完善。通常 秆近 1/3 和大部分饼肥用作了动物饲料；（5）秸秆的 说的硝化-反硝化氮损失，实质上是反硝化氮损失，硝 生物质利用等。尽管基本资源量增加，但有机肥氮资 化过程对氮气态损失的贡献很小。常用的乙炔抑制法 源的实际利用率下降明显。结果这些本应成为植物养

低估反硝化氮损失。乙炔虽然能抑制N2O的异化还原， 分重要资源的物质，反而变为了严重的污染源。

从而使反硝化终产物为易于测定的 N2O，但同时它也 总之，城市化进程、食品工业发展、养殖业的集 抑制硝化微生物活性，从而导致底物供应受阻。而且， 约化、废弃物多元化利用等，显著降低了有机废弃物 在能够发生反硝化的氧分压下，乙炔能够加速 NO 的 返回农田比例。这一比例是多少，目前，仍缺乏可靠 氧化。由于能够诱导反硝化发生的 NO 减少，将降低 的估算。 反硝化强度[60]。 3.3 农田系统氮管理的技术模式 15N 直接标记法测定也会低估肥料氮的反硝化损 大量的实践表明，根据作物需氮量和土壤供氮能 失，因为：（1）标记的肥料 15N 与土壤 14N 发生交换， 力进行肥料推荐和精准施肥，可有效减少氮损失和环 （2）反硝化生物对 14N 偏爱引起的同位素分馏[61-62]。 境污染[65]。同样，在摸清氮损失途径的基础上，采取

由于全球变暖问题的日益突出，土壤 N2O 排放 有效措施将氮损失降低到最低限度，并通过增加豆科 引起了广泛重视，积累了大量的监测数据。研究者 轮作面积，增加活性氮来源，减少化肥氮投入，也非

开始利用这些数据，或者简单地用 IPCC 给出的 N2O 常重要。尽管作物生产体系中氮的漏失不可避免，然 排放因子，结合反硝化过程的产物比来定量反硝化 而，通过合理措施可有效降低氮损失，特别是降低氨 [2, 4] 损失 。然而，硝化和反硝化过程均产生 N2O 且产 挥发和淋洗损失，还是有一定可行性的。降低氮损失 物比不同，而且产物比还受多种环境因素和管理方式 不仅是减少资源浪费，而且在农业碳减排方面具有重

3 期 王敬国等：氮循环与中国农业氮管理 513

要作用，因为农田每多消费 1 kg 肥料氮（N），将增 会影响到其他过程的变化。因此，在评价田间管理措 [49] 加 13 kg 的 CO2 当量排放 。 施时，要综合考虑这些措施对作物-土壤系统氮循环的 在农田尺度上，实行水碳氮综合管理是提高氮利 影响，在关注氮农学效益的同时，对氮损失及引起的 用效率、降低氮损失的有效途径之一。旱田土壤水分 生态环境效益进行评价。 含量直接影响经氨挥发氮损失，而且通过影响作物 4 农业氮管理的思考与建议 对养分的吸收、氮的矿化和固持、硝化和反硝化过 程，间接影响其他途径引起的肥料氮损失。在元素 农业生态系统中的氮既参与自然循环过程，也在 生物地球化学循环过程中，碳、氮循环紧密联系。 人为干扰下沿食物生产-消费链进行传输和转化。其 在植物-土壤系统，碳的微生物有效性既影响氮的矿 间，发生着不同空间尺度的氮循环。为了提高氮资源 化与生物固持，也影响氮的反硝化损失，关键是水 的利用效率、减少氮损失和环境污染，需要对氮平衡 分状况。探讨保持和提高土壤基础肥力、满足植物 进行多尺度综合管理。农田尺度的管理体现在技术层 对水分、养分需求的水、碳、氮综合管理的技术模 面上，已在上节进行了初步讨论，而在地区乃至全国 式，是提高利用效率的有效途径。例如，新疆大面 尺度上，需要从以下几个方面予以重视。 积的地膜覆盖和滴灌施肥实践表明，水分和养分综 4.1 合理确定中国的粮食生产量 合管理对提高水资源和养分资源的利用效率，均有 以提高单产、扩大复种指数、增加资源投入为主 良好的效果。此外，在极高氮投入的设施蔬菜，通 要特征的耕地高强度利用，是中国农田施氮过高的最 过水碳氮综合管理，可保持土壤肥力，并大幅度减 重要原因[67]。一般情况下，提高单产需要更高的边 少氮肥投入和氮损失[45]。 际投入，因为随着产量提高，氮肥增产的边际效应下 控制氮损失的单项技术有许多，如脲酶抑制剂、 降[67]。扩大复种指数，意味着增加土壤扰动，易诱发 硝化抑制剂、缓控释肥料等，由于种种原因这些单项 土壤氮矿化的“起爆效应”，在与作物氮吸收不同步 措施没有能够推广开来。近年来，由于硝化抑制剂有 的情况下，导致氮损失量增加。频繁的扰动则使得贮

明显控制 N2O 排放效果，引起国内外的重视。然而， 存在土壤有机形态氮经常处于一种不断形成和分解的 硝化抑制剂减少肥料氮损失效果并不显著，虽然能够 状态[68]，土壤氮周转速率的加快不仅增加了氮损失的 降低氮淋洗和反硝化损失，但促进了氨挥发。常用的 可能性，而且，还难以形成稳定的土壤基础肥力。 硝化抑制剂，作用时间一般较短，实践表明，增产效 严格控制农用地面积减少，从战略上保证中国具 果并不明显。同样，脲酶抑制剂可以显著降低石灰性 有粮食自给自足生产能力，但目前并非一定要生产那 土壤尿素的氨挥发损失，提高氮肥利用率，但对作物 么多粮食，应当通过控制高产地区的持续增产、降低 产量没有显著影响[66]。如何在平衡经济效益和环境效 复种指数，适当调低粮食自给率。粮食的缺口，可通 益，更好地利用脲酶抑制剂、硝化抑制剂和缓控释肥 过减少粮食浪费、消除中低产田的障碍因子以提高单 料等单项技术，还有很多工作要做。 产、减少动物产品出口并辅之于国际市场调节等方式 扩大豆科作物轮作，是减少氮肥投入的另外一个 予以补充。其中，中低产田改良对提高氮利用效率、 重要途径。国外有机农业生产体系，氮基本来源于共 保障粮食安全更具有现实意义。 生固氮，而中国相当比例的有机产品是靠施用有机肥 4.2 适当控制养殖业发展速度和产业布局 或隐形施化肥生产的。生产过程中氮的损失和移走， 为了促进氮的良性循环，应适当降低养殖业的发 自身循环无法满足植物需要，只能从其他地方借用， 展规模和速度。要引导公众意识，降低对动物产品增 氮的总投入量并没有减少。而且，在仅靠有机肥满足 长的需求，同时尽量减少动物产品出口，防止把污染 作物的氮需求情况下，磷的投入量会很大，面临着磷 留在国内。再者，适当增加进口。 污染风险增加和磷资源浪费。总之，找出适合中国不 大中城市周边集约化养殖场的相对集中，加重了 同地区的主栽作物与豆科作物的轮作、间作和混作模 种养分离程度，给动物废弃物养分资源的农业循环利 式，减少化学氮肥的投入应该成为农田氮管理的一个 用带来了很大困难。长远来看，畜牧业生产布局应该 重要措施。 考虑饲料的来源和废弃物消纳地的环境容量，减少能 需要指出的是，作物-土壤系统中各种氮转化和循 量消耗并控制环境污染。此外，还应从源头上控制鸡 环过程交织在一起、相互影响，一种过程发生改变， 粪和猪粪中重金属富集。

514 中 国 农 业 科 学 49卷

4.3 寻求氮循环的区域化最优模式 利益驱动和不合理管理方式下，肥料在作物、区域间 氮循环将农业生态系统与城市生态系统、自然生 分配不平衡所导致的。为了生态安全，中国应当仿照 态系统联结在一起，相互作用、相互影响。因此，实 西方国家的做法，对肥料施用进行立法规范，特别是 现氮循环的区域化最优管理，将为国家尺度上的氮管 对极高投入的经济作物施肥，以及在环境氮、磷污染 理提供重要基础。首先，应在区域内实现种植业、养 负荷过高的地区，应当首先采取控制措施。 殖业相结合和废弃物就近循环利用；其次，延长食品 加工的产业链，就地建立包括食品加工业在内的初级 References 农产品的加工业，将有机废弃物的外运减少到最低限 [1] Fowler D, Coyle M, Skiba U, Sutton M A, Cape J N, Reis S, Sheppard 度；再者，应改造城镇管网，实现雨污分离、工业污 L J, Jenkins A, Grizzetti B, Galloway J N, Vitousek P, Leach A, 水和生活污水的分离，从源头上控制城镇污泥中的重 Bouwman A F, Butterbach-Bahl K, Dentener F, Stevenson D, Amann 金属含量，实现污泥的农业利用。此外，还有种植业 M, Voss M. The global nitrogen cycle in the twenty-first century. 和养殖业结构的优化等。总之，是要根据氮生物地球 Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 2013, 化学循环的原理，通过农林、城建、环保、工业等部 368(1621): 91-97 门的协调合作，实现区域内氮循环的最优化。 [2] Schlesinger W H. On the fate of anthropogenic nitrogen. PNAS, 2009, 对区域氮循环进行定量研究的最小空间尺度应为 106(1): 203-206. 县域，最好扩大到流域尺度。 [3] Galloway J N, Townsend A R, Erisman J W, Bekunda M, Cai Z C, 4.4 支持综合性研究并实现资源共享 Freney J R, Martinelli L A, Seitzinger S P, Sutton M A. 中国有关氮循环的基础数据资源的严重缺乏，在 Transformation of the nitrogen cycle: Recent trends, questions, and 很大程度上与缺少多学科的综合研究有关。单学科的 potential solutions. Science, 2008, 320: 889-892. 研究数据，往往不完整或者片面强调问题的某一方面， [4] Cui S H, Shi Y L, Groffman P M, Schlesinger W H, Zhu Y G. 而忽视另一方面。特别是关于与大气氮沉降的有关问 Centennial-scale analysis of the creation and fate of reactive nitrogen 题，更需要多学科和多部门的协作。大气氮不仅沉降 in China (1910-2010) . PNAS, 2013, 110(6): 2052-2057. 在农田，而且还影响水体环境和生态系统氮平衡，迫 [5] Gu B J, Ju X T, Chang J, Ge Y, Vitousek P M. Integrated reactive 切需要综合性研究。 nitrogen budgets and future trends in China. PNAS, 2015, doi: 在氮循环综合研究方面，欧洲的相关研究工作值 10.1073/pnal. 151021112. 得借鉴。在欧盟第六研究框架等项目的资助下，欧洲 [6] 张卫峰, 马林, 黄高强, 武良, 陈新平, 张福锁. 中国氮肥发展、贡 集中了 200 多位自然和社会科学各相关领域的多学 献和挑战. 中国农业科学, 2013, 46(15): 3161-3171. 科专家，从田间到国家、区域尺度上，对欧洲的氮现 Zhang W F, Ma L, Huang G Q, Wu L, Chen X P, Zhang F S. The 状、生物圈的氮过程、不同空间尺度的氮流向和归宿、 development and contribution of nitrogenous fertilizer in China and 氮管理和政策进行了全面的评估，并就应对未来的挑 challenges faced by the country. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 战提出了管理和政策建议。该评价结果体现在 2011 46(15): 3161-3171. (in Chinese) 年发表的由英国环境专家 Mark Sutton 等主编的 [7] Erisman J W, Sutton M A, Galloway J, Klimont Z , Winiwarter W. 《European Nitrogen Assessment》一书中。中国至少 How a century of ammonia synthesis changed the world. Nature 应该在农业最为集中的东部地区开始，首先进行区域 Geoscience, 2008, 1(10): 636-639. 性的氮评价。 [8] 林葆. 中国肥料结构和肥效的演变、存在问题及对策//李庆逵, 朱 进行综合性的氮循环研究，需要实现数据资源 兆良, 于天仁. 中国农业持续发展中的肥料问题. 南昌：江西科学 共享。国家有关部门对大气、水环境和水资源进行 技术出版社, 1997: 12-27. 了多年监测，获得了大量监测数据，其中与活性氮 Lin B. Changes, problem and management strategies in fertilizer 循环有关的数据应该实现共享。深入分析这些数据， structure and use efficiency// Li Q K, Zhu Z L, Yu T R. Fertilizer 对全面了解中国活性氮的来源和去向具有不可替代 Issues in Chinese Sustainable Agricultural Development. Nanchang: 的作用。 Jiangxi Press of Science and Technology, 1997: 12-27. (in Chinese) 4.5 控制肥料施用的立法规范 [9] Su H, Cheng Y F, Oswald R, Behrendt T, Trebs I, Meixner F X, 中国肥料氮、磷施用方面的突出问题，是在经济 Andreae M O, Cheng P, Zhang Y, Poschl U. Soil nitrite as a source of

3 期 王敬国等：氮循环与中国农业氮管理 515

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中国农业科学 2016,49(3):518-528 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.010

控释氮肥与尿素混施对连作春玉米产量、 氮素吸收和氮素平衡的影响

王 寅 1，冯国忠 1，张天山 2，茹铁军 2，袁 勇 1，高 强 1

（1 吉林农业大学资源与环境学院/吉林省商品粮基地土壤资源可持续利用重点实验室，长春 130118；2 中国-阿拉伯化肥有限公司，

河北秦皇岛，066003）

摘要：【目的】控释氮肥与普通尿素进行掺混施用是行之有效的一次性施肥替代技术。明确控释氮肥与尿素 掺混施用对春玉米产量、氮素吸收利用以及土壤-作物系统氮素平衡的影响，为春玉米氮素养分的科学管理技术提 供参考。【方法】2010 和 2011 年在吉林省中部玉米主产区连续 2 年设置大田定点试验，施肥处理包括：不施氮（N0）、 100%尿素（CRN0%）、15%控释氮肥+85%尿素（CRN15%）、30%控释氮肥+70%尿素（CRN30%）和 45%控释氮肥+55%尿素 （CRN45%），研究控释氮肥与尿素掺混施用对春玉米连作条件下籽粒产量、氮素吸收与利用、土壤无机氮累积与矿 化以及系统氮素平衡的影响，确定适宜的控释氮肥掺混比例。【结果】与尿素一次性全施相比，控释氮肥与尿素掺 混施用显著提高了春玉米地上部干重和产量，不同掺混比例之间差异不显著。两季平均结果显示， CRN30%处理玉 米产量达最高（9.39 t·hm-2），较 CRN0%处理增产 9.0%（0.77 t·hm-2）。施肥是土壤-作物系统主要的氮素输入方式， 占总输入量的 63.5%，播前土壤无机氮和氮素矿化分别占 19.2%和 17.3%。2010 和 2011 年玉米生育期内土壤氮素 的表观净矿化量分别为 34.4 和 66.1 kg·hm-2，两季之间越冬期各施肥处理土壤氮素矿化量为 15.2—26.4 kg·hm-2， 处理间差异不显著。系统的氮素输出以植株吸收带走氮素为主要方式，平均占总输出的 80.7%（68.1%—99.5%）。 随控释氮肥掺混比例的增加，植株氮素吸收量和土壤无机氮残留量均呈持续上升趋势，分别在 CRN30%和 CRN45% 处理达最高，为 234.2 和 108.1 kg·hm-2，较 CRN0%处理分别增加 18.0%和 45.1%。但是，氮素表观损失随控释比例 增加而大幅降低，最终导致氮素表观盈余也呈下降趋势，CRN30%处理降至最低的 114.4 kg·hm-2，较 CRN0%处理减 少 38.4%。控释氮肥与尿素掺混处理表层土壤（0—30 cm）的无机氮含量明显高于 CRN0%处理，而深层土壤（30 —90 cm）则较低，表明其氮素下移趋势较小。两季平均结果表明，氮肥的表观利用率由 CRN0%处理的 50.1%显著 提高至 CRN30%处理的 69.4%，表观残留率在控释氮肥掺混施用后均显著提高，而表观损失率从 CRN0%处理的 37.3% 显著下降至 CRN45%处理的 6.0%。【结论】控释氮肥与尿素掺混施用可促进春玉米获得高产，增加植株氮素吸收， 而且维持了较高的土壤氮素水平并减少损失，从而提高氮肥利用率。当前生产条件下，东北春玉米施氮 185 kgN·hm-2 条件下适宜的控释氮肥掺混比例在 30%左右。 关键词：春玉米；控释氮肥；掺混施用；产量；氮素吸收；氮素平衡

Effects of Mixed Application of Controlled-Release N Fertilizer and Common Urea on Grain Yield, N Uptake and Soil N Balance in Continuous Spring Maize Production

WANG Yin1, FENG Guo-zhong1, ZHANG Tian-shan2, RU Tie-jun2, YUAN Yong1, GAO Qiang1

(1College of Resources and Environmental Sciences, Jilin Agricultural University /Key Laboratory of Sustainable Utilization of Soil Resources in the Commodity Grain Bases in Jilin Province, Changchun 130118; 2Sino-Arab Chemical Fertilizer Company, Qinhuangdao 066003, Hebei)

收稿日期：2015-08-26；接受日期：2015-10-29 基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（201103003）、国家现代农业玉米产业技术体系项目（CARS-02） 联系方式：王寅，E-mail：[email protected]。通信作者高强，E-mail：[email protected]

3 期 王寅等：控释氮肥与尿素混施对连作春玉米产量、氮素吸收和氮素平衡的影响 519

Abstract: 【Objective】The mixed application of CRN and common urea was considered as a good alternative technique for single basal fertilizer application. This study aimed to evaluate the effects of mixed application of CRN and urea on grain yield, N uptake, N balance in a soil-crop system, and to provide reference to scientific N management techniques for spring maize.【Method】 A two-year fixed plot experiment was conducted in the major maize production area in the central Jilin province from 2010 to 2011, including five fertilization treatments, including Treatment I (No N fertilizer, N0), Treatment II (100% urea, CRN0%), Treatment III (15% CRN+85% urea, CRN15%), Treatment IV (30% CRN+70% urea, CRN30%), and Treatment V (45% CRN+55% urea, CRN45%). In this study, grain yield, N uptake, N efficiency of spring maize, soil inorganic N accumulation and mineralization, and N balance in soil-crop system were investigated, and the appropriate mixed ratio of CRN was determined by considering comprehensive performances.【Result】The results showed that mixed application of CRN and urea increased significantly aboveground dry matter and grain yield of spring maize, compared with single basal application of urea, while no differences were found between the various mixed ratios. On an average of two growing seasons, the highest grain yield of 9.39 t·hm-2 was obtained in the CRN30% treatment, which was 9.0% (0.77 t·hm-2) higher than that in the CRN0% treatment. Application of N fertilizer was a major way of N input in soil-crop system, which accounted for 63.5% of the total N input, while the contributions of soil inorganic N prior to sowing and N mineralization were 19.2% and 17.3%, respectively. The net N mineralization during maize growing season was 34.4 kg·hm-2 in 2010 and 66.1 kg·hm-2 in 2011, while that was in the range of 15.2-26.4 kg·hm-2 among treatments during the overwintering stage between two growing seasons. Cropped N uptake by maize plants was a major way of N output and its contribution ranged from 68.1% to 99.5% with an average of 80.7%. With increasing mixed ratio of CRN, both N uptake in plant and residual inorganic N in soil showed continuous increased trends and reached the highest values of 234.2 and 108.1 kg·hm-2 in the CRN30% and CRN45% treatments, respectively, which were 18.0% and 45.1% higher than those in the CRN0% treatment, respectively. Nevertheless, apparent N loss decreased with increasing mixed ratio of CRN, and therefore led to reduced apparent N surplus. The lowest apparent N surplus was 114.4 kg·hm-2 in the CRN30% treatment, which was reduced by 38.4% compared with the CRN0% treatment. In the treatments with mixed application of CRN, inorganic N contents were higher significantly in topsoil (0-30 cm) but lower in subsoil (60-90 cm) than that in the CRN0% treatment, indicating that less N was leaching down when mixed CRN was applied. The average results throughout two growing seasons showed that: Apparent N recovery rate increased significantly from 50.1% in the CRN0% treatment to 69.4% in the CRN30% treatment, and apparent N residual rate increased significantly with mixed application of CRN, while apparent N loss rate decreased significantly from 37.3% in the CRN0% treatment to 6.0% in the CRN45% treatment.【 Conclusion】 The mixed application CRN and urea is not only conducive to improve grain yield and N uptake of spring maize, but also to maintain a higher soil inorganic N content and reduce N loss, therefore resulting in increased N fertilizer use efficiency. Under the current condition, the appropriate mixed ratio of CRN for spring maize production in Northeast China is around 30% when 185 kg N·hm-2 is applied. Key words: spring maize; controlled-release N fertilizer; mixed application; grain yield; N uptake; N balance

技术[6-7]，目的在于调节速效和缓效氮素供应以满足作 0 引言 物不同时期的氮素需求，同时还能节本增效，减少环 【研究意义】控释氮肥具有养分释放与作物吸收 境风险。因而，控释氮肥与普通尿素掺混施用技术的 同步的优点，被认为是促进作物生长、降低氮素损失、 研究与应用对实现中国 2020 年农用化肥的“零增长” 提高产量和氮肥利用率的有效途径[1-3]，也是实现轻简 目标，推动资源节约型和环境友好型绿色农业的发展 化施肥的重要技术产品[4]。但是，目前控释氮肥的价 具有重要意义。【前人研究进展】控释氮肥与普通尿 格偏高，大量施用导致成本增加而经济收益降低[5]， 素掺混施用技术在玉米上已进行了一些研究和应用。 难以被大多数农户接受。而且，控释氮肥的养分释放 衣文平等[8]研究发现，控释氮肥与普通尿素一次性掺 受环境因素影响较大，气候条件不佳时完全施用控释 混施用相比尿素分次施用可提高春玉米花后干物质和 氮肥可能反而对作物或环境造成不利影响，如生育前 氮素的累积比例，掺混比例为 30%时产量、氮素吸收 期发生低温或干旱会导致养分释放速率减慢而影响作 量和氮肥利用效率最高。谢佳贵等[9]通过比较产量、 物生长，并使后期土壤无机氮残留过多而增加生态风 产量构成因素和籽粒品质，认为春玉米的最佳控释氮 险。有研究者提出将控释氮肥与普通尿素按适宜比例 肥掺混比例为 50%。李伟等[10-11]的研究显示，控释氮 进行掺混施用，作为当前普通肥料一次性施用的替代 肥与普通尿素配合施用可有效提高夏玉米的光合性能

520 中 国 农 业 科 学 49卷

和灌浆速率，实现产量、经济效益及氮肥利用率的提 化肥有限公司生产，为水溶性聚合物包膜的控释尿素， 高，而且可维持生育期内较高的土壤硝态氮和铵态氮 含氮 44.5%，氮素释放曲线为 S 型，控释期为 60 d， 含量以满足玉米生长需要，综合考虑确定掺混比例为 28 d 的养分累积释放率约为 60%，普通尿素含氮 50%时施用效果最好。司贤宗等[12]对华北平原冬小麦- 46.4%。所有试验处理的磷、钾、锌肥用量相同，分 -2 夏玉米连作体系的研究表明，采用 100%控释氮肥或 别为 87 kg P2O5·hm （过磷酸钙，含 P2O5 12%）、52.5 -2 80%控释氮肥+20%尿素的施肥方式，更有利于获得两 kg K2O·hm （氯化钾，含 K2O 60% ）和 30 kg -2 季作物产量和氮素利用效率的协同提高。【本研究切 ZnSO4·hm 。所有肥料均于玉米播种前一次性基施， 入点】前人有关控释氮肥与普通尿素掺混施用技术的 除供试肥料和施肥方法外其他田间管理均与当地农民 研究多集中于作物产量、品质和氮素吸收等方面，而 习惯保持一致。 对土壤无机氮的残留、转化和损失状况，尤其是整个 小区面积为 40 m2，重复 3 次，随机区组排列。2 作物-土壤系统氮素平衡的研究则相对较少，适宜掺混 年试验春玉米的种植密度均为 6.0×104 株/hm2。2010 比例的确定也未考虑到对土壤氮素状况及环境影响。 年供试玉米品种为郑单 958，于 5 月 8 日播种，10 月 【拟解决的关键问题】本研究在吉林省中部玉米主产 5 日收获，生育期 150 天；2011 年供试玉米品种为良 区设置连续 2 年的定点大田试验，以普通尿素一次性 玉 11，于 5 月 5 日播种，10 月 10 日收获，生育期 158 基施为对照，研究控释氮肥与普通尿素掺混施用对春 天。2 年大田试验中，田块均未进行人工灌溉。 玉米连作条件下作物产量、干物质累积、氮素吸收利 1.3 测定项目与方法 用、土壤无机氮累积与矿化以及系统氮素平衡的影响， 2010 年试验田施基肥前取 0—20 cm 耕层土壤， 综合考虑产量、氮素利用和氮素平衡而确定适宜的控 按常规法测定土壤基本理化性质[13]。每年玉米播种前 释氮肥掺混比例，为春玉米氮素养分的科学管理提供 和收获后，在每小区选择 5 个位点，采用土钻分别取 参考。 0—30、30—60 和 60—90 cm 土层的新鲜土样，每小 区 5 个样点的土壤等层混合后，放入冰盒迅速带回实 1 材料与方法 -1 验室。新鲜土样过 5 目筛后，采用 0.01 mol·L CaCl2 1.1 试验地概况 溶液进行振荡浸提，采用流动分析仪同时测定土壤硝 本研究于 2010 和 2011 年在吉林省九台市兴隆镇 态氮和铵态氮含量[14]。 进行，试验田块土壤为黑土，0—20 cm 耕层土壤 pH 玉米收获时对每个小区进行单收单打测得产量， 为 5.06，有机质、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾含 并在每小区取代表性植株 5 株，分秸秆和籽粒两部分 -1 -1 -1 量分别为 27.0 g·kg 、1.72 g·kg 、158.2 mg·kg 、21.0 称取干重后粉碎，采用 H2O2-H2SO4 消煮，用凯氏定氮 mg·kg-1 和 135.2 mg·kg-1。 仪测定秸秆和籽粒的含氮量。 试验地区属大陆性季风气候，雨热同期，主要种 参考巨晓棠[15-16]的方法计算以下参数： 植制度为一年一熟的玉米连作。1979—2009 年的 30 生育期土壤氮素净矿化量=不施氮区作物吸氮量 年平均气候状况显示，该地区玉米生育期内平均降水 +不施氮区土壤无机氮残留量-不施氮区土壤起始无机 513 mm，月均气温从 5 月份的 15.6℃升高至 7 月份的 氮累积量； 23.2℃，而后 10 月份降至 7.3℃。相比多年平均气候 生育期土壤氮素表观损失量=（生育期施氮量+土 状况，2010 年降水偏多（574 mm）且分配不均，前 壤起始无机氮累积量+生育期土壤氮素净矿化量）（作- 期升温迅速而后期下降也较快，2011 年降水则整体相 物携出量+收获后土壤无机氮残留量）； 对偏少（443 mm），成熟期气温略高。 氮素盈余量=氮素表观损失量+收获后土壤无机 1.2 试验设计 氮残留量； 田间试验设 5 个处理，分别为不施氮（N0）、 氮肥表观残留率（%）=（施氮区土壤无机氮残留 100%普通尿素（CRN0%）、15%控释氮肥+85%普 量-不施氮区土壤无机氮残留量）/ 施氮量×100； 通尿素（CRN15%）、30%控释氮肥+70%普通尿素 氮肥表观利用率（%）=（施氮区作物吸氮量-不 （ CRN30% ）、45% 控释氮肥+55% 普通尿素 施氮区作物吸氮量）/ 施氮量×100； （CRN45%）。各施氮处理玉米生育期内的施氮量保 氮肥表观损失率（%）= 100%-氮肥表观利用率- 持一致，均为 185 kg N·hm-2。控释氮肥由中国-阿拉伯 氮肥表观残留率。

3 期 王寅等：控释氮肥与尿素混施对连作春玉米产量、氮素吸收和氮素平衡的影响 521

其中，氮肥表观损失率的计算值不同于利用 15N 实测 （0.77 t·hm-2）。 的氮素损失，其实质包括所有未知去向的肥料氮（包 2.2 控释氮肥与尿素混施对春玉米成熟期干物质量 括土壤的生物固定、淋洗、氨挥发等）。 和氮素吸收量的影响 1.4 数据统计与分析 春玉米成熟期地上部干物质量和氮素吸收量在不 所有试验数据采用 Excel 2010 软件计算，用 同年份、不同试验处理间存在显著差异，而且年份和 SPSS17.0 软件进行两因素（施肥处理和年份）方差分 试验处理表现出显著的交互作用（表 1）。春玉米成 析，用 LSD 法比较处理间在 P=0.05 水平上的差异显 熟期地上部干物质量在不同施肥处理之间的差异性与 著性。 产量结果一致。2 年平均数据显示，CRN30%处理的 干物质量最高，达 19.6 t·hm-2，较 CRN0%处理提高 2 结果 6.4%（1.2 t·hm-2）。2 年连作中，成熟期氮素吸收量 2.1 控释氮肥与尿素混施对春玉米产量的影响 均以 N0 处理最低，施氮后显著提高且随控释氮肥掺 表 1 显示，试验年份和试验处理显著影响春玉米 混比例的增加而呈持续上升趋势，控释比例超过 30% 产量，且两者存在显著的交互作用。2010 年春玉米产 后无显著变化。与 CRN0%处理相比，CRN15%处理的 量较 2011 年明显偏低，但 2 年中不同施肥处理之间产 氮素吸收量在 2 年中均无显著差异，而 CRN30%处理 量的差异性表现一致。相比 N0 处理，氮肥施用显著 平均提高 35.6 kg·hm-2（18.0%）。结果表明，适量的 提高了 2 个生育期玉米产量。其中，控释氮肥掺混施 控释氮肥与普通尿素掺混施用可同时促进春玉米干物 用处理的产量较 CRN0%处理均显著提高，而不同掺 质的形成和对氮素的吸收累积。 混比例之间无明显差异。可见，与尿素一次性全施相 2.3 控释氮肥与尿素混施对春玉米连作周期内土壤 比，控释氮肥与普通尿素的掺混施用有助于春玉米获 无机氮含量的影响 得高产。2 年产量平均数据显示，CRN30%处理的玉 2010 年玉米播前土壤无机氮含量随土层加深而 米产量最高，达 9.39 t·hm-2，较 CRN0%处理增产 9.0% 逐渐降低（图 1-A），0—30、30—60 和 60—90 cm 分

表 1 控释氮肥与尿素混施对 2010 和 2011 年春玉米产量、地上部干物质量和氮素吸收量的影响 Table 1 Effects of mixed application of controlled-release N fertilizer and urea on grain yield, aboveground dry mass and N uptake of spring maize 年份 施肥处理 产量 增产率 干物质量 氮素吸收量 Year Fertilization treatment Grain yield (t·hm-2) Increased rate (%) Dry mass (t·hm-2) N uptake (kg·hm-2) 2010 N0 6.33c — 13.9c 116.5c

CRN0% 7.09b 12.1b 15.3b 164.8b

CRN15% 7.51a 18.8a 16.0a 175.3b

CRN30% 7.55a 19.4a 15.9a 196.0a

CRN45% 7.56a 19.6a 16.0a 192.9a

2011 N0 5.53c — 12.1c 94.8c

CRN0% 10.14b 84.0b 21.5b 231.8b

CRN15% 11.21a 102.9a 23.0a 262.7ab

CRN30% 11.23a 103.9a 23.3a 272.5a

CRN45% 11.03a 99.9a 22.8a 274.4a

方差分析 ANOVA

年份（Y） ** ** ** **

施肥处理（F） ** * ** **

年份×施肥处理（Y×F） ** Ns ** **

方差分析结果中，* 表示差异显著（P＜0.05），** 表示差异极显著（P＜0.01），Ns 表示差异不显著。相同年份同一列数值后不同的小写字母表示处 理间达到显著差异（P＜0.05）。下同 In the result of ANOVA, * indicates P < 0.05, ** indicates P < 0.01, and Ns indicates no significance. In the same year, the values followed by different small letters in the same column indicate significant differences between treatments at P < 0.05. The same as below

522 中 国 农 业 科 学 49卷

30 30 A B N0 CRN0% CRN15% CRN30% CRN45% 25 25

20 20 a a a 15 15

b a 10 b 10 ab b a a c a b ab a c 5 5 c b

0 0 0-30 30-60 60-90 0-30 30-60 60-90

30 30 C D

25 25 a 20 a 20 a a

15 15 b b b a ab ab a 10 a 10 b a a ab a a c ab c b a b a ab 5 c 5 b d c 0 0 0-30 30-60 60-90 0-30 30-60 60-90 土层深度 Soil depth (cm)

A：2010 播前 Prior to sowing in 2010；B：2010 收获后 Post-harvesting in 2010；C：2011 播前 Prior to sowing in 2011；D：2011 收获后 Post-harvesting in 2011

图 1 控释氮肥与尿素混施对春玉米连作周期内土壤无机氮含量的影响 Fig. 1 Effects of mixed application of controlled-release N fertilizer and urea on soil inorganic N content during the continuous spring maize cropping seasons

别为 14.9、8.0 和 5.3 mg·kg-1。第 1 季玉米收获后，除 除 60—90 cm 土层的 CRN0%处理外，2011 年玉 0—30 cm 土层的 CRN45%处理、60—90 cm 土层的 米播前各处理所有土层的无机氮含量较 2010 年收获 CRN0%和 CRN15%处理，所有施肥处理各土层的无机 后出现不同程度提高，而处理之间的差异性并无明显 氮含量均比播前降低（图 1-B）。其中，N0 处理 0— 变化（图 1-C）。2011 年玉米收获后，除 0—30 cm 土 30、30—60 和 60—90 cm 土层无机氮含量均大幅下降， 层的 CRN15%处理和 30—60 cm 土层的 CRN45%处 分别降至 2.6、1.5 和 3.3 mg·kg-1，显著低于施氮处理。 理，各处理无机氮含量较播前均有所下降，而且不同 随控释氮肥掺混比例增加，0—30 cm 土层无机氮含量 处理间的差异性也与播前显著不同（图 1-D）。0—30 持续上升并在 CRN45%处理达到最高，其中 CRN30% 和 30—60 cm 土层中，CRN0%处理的无机氮含量显著 和 CRN45%处理显著高于 CRN0%和 CRN15%处理。 低于各控释氮肥掺混施用处理，其中 0—30 cm 土层无 与表层土壤不同，较深层土壤（30—60 和 60—90 cm） 机氮含量随掺混比例增加呈显著的持续上升趋势，而 无机氮含量随掺混比例的增加而持续下降，但总体上 30—60 cm 土层中则无明显变化。60—90 cm 土层中， 掺混比例之间的差异不显著。 各施氮处理的无机氮含量无显著差异。

3 期 王寅等：控释氮肥与尿素混施对连作春玉米产量、氮素吸收和氮素平衡的影响 523

2010 和 2011 年两季玉米收获后，控释氮肥掺混 释氮肥掺混施用处理的土壤无机氮残留量均显著高于 施用处理各土层的无机氮含量趋势接近，而 CRN0% 普通尿素全施处理，且仍以 CRN45%处理最高（112.5 处理则明显不同。相比 2011 年，2010 年收获后 CRN0% kg·hm-2）。相比 CRN0%处理，控释氮肥掺混施用使 处理无机氮表现出明显的由上层土壤向下迁移的趋 两季收获后土壤无机氮残留量平均增加 14.6%— 势，这可能与 2010 年降雨量偏高有关，其 5 月份降雨 45.1%（10.9—33.6 kg·hm-2）。 量达到 2011 年同期的 2 倍。结果表明，相比普通尿素 东北春玉米连作周期内土壤氮素矿化分为两部 一次性全施处理，控释氮肥与普通尿素掺混施用增加 分：玉米生育期内的氮素矿化过程和两生育期间秋末 了表层土壤无机氮的残留，减少了氮素向更深土层的 春初冻融交替作用下的氮素矿化过程（表 2）。2010 淋失。 和 2011 年生育期内土壤氮素的表观净矿化量分别为 2.4 控释氮肥与尿素混施对春玉米连作周期内土壤 34.4 和 66.1 kg·hm-2，第二季较第一季增加近 1 倍。两 无机氮残留和矿化的影响 年连作中越冬期内各施肥处理的土壤氮素矿化量在 2010 和 2011 年玉米收获后，各施肥处理的土壤 15.2—26.4 kg·hm-2，平均为 21.4 kg·hm-2。尽管不同施 无机氮累积量较播前出现不同程度的下降（表 2）。 肥处理的越冬期土壤氮素矿化量无显著差异，但随控 相比 N0 处理，施氮处理的土壤无机氮残留量在两季 释氮肥掺混比例的增加仍有持续上升趋势。结果表明， 玉米收获后显著提高，且随控释氮肥掺混比例增加而 控释氮肥与普通尿素掺混施用有助于维持较高的土壤 持续上升。2010 年土壤无机氮残留量在 CRN45%处理 氮素供应水平，同时对越冬期土壤氮素矿化也有一定 出现显著变化，达最高的 103.8 kg·hm-2；而 2011 年控 促进作用。

表 2 控释氮肥与尿素混施对春玉米连作周期内土壤无机氮累积量和矿化量的影响 Table 2 Effects of mixed application of controlled-release N fertilizer and urea on soil inorganic N accumulation and mineralization during the continuous spring maize cropping seasons 处理 无机氮累积量 Inorganic N accumulation (kg·hm-2) 无机氮矿化量 Inorganic N mineralization (kg·hm-2) Treatment 2010 播前 2010 收获 2011 播前 2011 收获 2010 生育期 2011 生育期 2010/2011 越冬期 Prior to sowing Post-harvesting Prior to sowing Post-harvesting Growing season Growing season Overwintering season in 2010 in 2010 in 2011 in 2011 in 2010 in 2011 between 2010 and 2011 N0 111.9 29.7c 48.9c 20.2c 34.4 66.1 19.2a

CRN0% 111.9 82.1b 97.3b 66.9b 34.4 66.1 15.2a

CRN15% 111.9 83.1b 103.4b 96.4a 34.4 66.1 20.3a

CRN30% 111.9 95.4ab 121.8a 105.8a 34.4 66.1 26.4a

CRN45% 111.9 103.8a 129.8a 112.5a 34.4 66.1 26.0a

2.5 控释氮肥与尿素混施对春玉米连作周期内土壤- 2010 和 2011 年单个玉米生长季内，控释氮肥 作物系统氮素平衡的影响 掺混施用处理的土壤氮素表观盈余均低于 CRN0% 从两季玉米连作的土壤-作物系统氮素平衡状况 处理，但两季间土壤氮素盈余随掺混比例变化的趋 来看（表 3），氮素输入方式以施用氮肥为主，占施 势有所差异（表 3）。这可能是由于氮素表观损失 氮处理氮素总输入量的 63.5%，而播前土壤无机氮量 的不同而导致，2010 年土壤氮素损失在掺混比例为 和氮素矿化量分别占 19.2%和 17.3%。氮素输出项中， 30%时明显降低，而 2011 年控释氮肥掺混施用处理 作物吸收带走氮素为主要方式，平均占氮素总输出量 则均明显低于 CRN0%处理。比较两个生长季土壤 的 80.7%（68.1%—99.5%）。氮素盈余中，土壤无机 氮素平衡状况发现，2011 年玉米生育期内土壤氮素 氮残留量随控释氮肥掺混比例的增加而持续上升，氮 净矿化量的增加带动氮素总输入较 2010 年明显提 素表观损失则持续下降，最终氮素表观盈余呈下降趋 高，同时作物氮素吸收的大幅增加和氮素表观损失 势。CRN15%、CRN30%和 CRN45%处理的氮素表观 的减少使其氮素表观盈余又明显低于 2010 年。分 盈余较 CRN0%处理分别下降 41.3 kg·hm-2（22.2%）、 析其原因可能是 2010 年播种期降雨过多而苗期又 71.3 kg·hm-2（38.4%）和 70.3 kg·hm-2（37.9%）。 发生干旱，不仅增加了基施氮素的损失，还极大影

524 中 国 农 业 科 学 49卷

表 3 控释氮肥与尿素混施对春玉米连作周期内土壤-作物系统氮素平衡的影响 Table 3 Effects of mixed application of controlled-release N fertilizer and urea on N balance in soil-crop system during the continuous spring maize cropping seasons (kg·hm-2) 项目 Item N0 CRN0% CRN15% CRN30% CRN45%

第一季 First season in 2010

氮输入 施氮量 N fertilizer rate 0 185 185 185 185

N input 播前土壤无机氮量 Soil inorganic N prior to sowing 111.9 111.9 111.9 111.9 111.9

氮矿化量 N mineralization 34.4 34.4 34.4 34.4 34.4

总输入量 Total input 146.3 331.3 331.3 331.3 331.3

氮输出 作物吸收 Crop uptake 116.5 165.0 175.3 196.0 192.9

N output 土壤无机氮残留量 Soil residual inorganic N 29.7 82.1 83.1 95.4 103.8

表观损失 Apparent N loss 0.0 84.2 72.9 39.8 34.5

氮素盈余 N surplus 29.7 166.3 156.0 135.2 138.3

第二季 Second season in 2011

氮输入 施氮量 N fertilizer rate 0 185 185 185 185

N input 播前土壤无机氮量 Soil inorganic N prior to sowing 48.9 97.3 103.4 121.8 129.8

氮矿化量 N mineralization 66.1 66.1 66.1 66.1 66.1

总输入量 Total input 115.0 348.4 354.5 373.0 380.9

氮输出 作物吸收 Crop uptake 94.8 231.7 262.7 271.9 274.1

N output 土壤无机氮残留量 Soil residual inorganic N 20.2 66.9 96.4 105.8 112.5

表观损失 Apparent N loss 0.0 49.8 -4.6 -4.7 -5.6

氮素盈余 N surplus 20.2 116.7 91.8 101.0 106.9

两季 Two seasons in 2010 and 2011

氮输入 施氮量 N fertilizer rate 0 370 370 370 370

N input 播前土壤无机氮量 Soil inorganic N prior to sowing 111.9 111.9 111.9 111.9 111.9

氮矿化量 N mineralization 100.5 100.5 100.5 100.5 100.5

总输入量 Total input 212.4 582.4 582.4 582.4 582.4

氮输出 作物吸收 Crop uptake 211.3 396.7 438.0 467.9 467.0

N output 土壤无机氮残留量 Soil residual inorganic N 20.2 66.9 96.4 105.8 112.5

表观损失 Apparent N loss -19.2 118.8 48.0 8.6 2.9

氮素盈余 N surplus 1.0 185.7 144.4 114.4 115.4

响玉米出苗和苗期生长，并限制后期的植株发育和 显较高，而表观损失率则较低，而且控释氮肥掺混 养分吸收。 施用处理还出现了较高的氮素表观增加。 结果表明，控释氮肥掺混施用可减少氮素损失， 相比 CRN0%处理，控释氮肥掺混施用显著提高 降低土壤氮素盈余，而年际间由于气候和作物生长状 玉米的氮肥表观利用率，并随掺混比例的增加而持续 况的变化导致掺混比例的影响趋势有所差异。 提高（表 4）。2010 年表观利用率在掺混比例超过 30% 2.6 控释氮肥与尿素混施对春玉米连作周期内氮肥 后不再显著增加，而 2011 年各控释氮肥掺混施用处理 表观利用、残留和损失的影响 之间无明显差异。随控释氮肥掺混比例增加，氮肥表 试验年份和施肥处理显著影响春玉米的各项氮 观残留率也呈持续上升趋势。相比 CRN0%处理，2010 肥利用效率，但两者间未表现出交互作用。与 2010 年表观残留率在 CRN45%处理出现显著提高，而 2011 年玉米生长季相比，2011 年各处理的氮肥表观利用 年控释氮肥掺混施用处理均显著较高。与表观利用率 率均大幅提高，表观残留率除 CRN0%处理外也均明 和残留率相反，氮肥表观损失率随控释氮肥掺混比例

3 期 王寅等：控释氮肥与尿素混施对连作春玉米产量、氮素吸收和氮素平衡的影响 525

增加而持续下降，在 CRN45%处理降至最低。2010 年 果显示，氮肥的表观利用率由 CRN0%处理的 50.1% CRN30%和 CRN45%处理的表观损失率显著低于 显著提高至 CRN30%处理的 69.4%，表观残留率在控释 CRN0%和 CRN15%处理，而 2011 年控释氮肥掺混施 氮肥掺混施用后均显著提高，而表观损失率从 CRN0% 用处理均显著低于 CRN0%处理。两个生长季连作结 处理的 37.3%显著下降至 CRN45%处理的 6.0%。

表 4 控释氮肥与尿素混施对春玉米连作周期内氮肥表观利用、残留和损失的影响 Table 4 Effects of mixed application rates of controlled-release N fertilizer and common urea on the percentage of soil N balance during the continuous spring maize cropping seasons 处理 氮肥表观利用率 氮肥表观残留率 氮肥表观损失率 Treatment Apparent N recovery rate (%) Apparent N residual rate (%) Apparent N loss rate (%) 2010 2011 2010-2011 2010 2011 2010-2011 2010 2011 2010-2011

CRN0% 26.2c 74.0b 50.1c 28.3b 25.2b 12.6b 45.5a 0.7a 37.3a

CRN15% 31.8b 90.8a 61.3b 28.8b 41.2a 20.6a 39.4a -32.0b 18.1b

CRN30% 43.0a 95.7a 69.4a 35.5ab 46.3a 23.1a 21.5b -42.0bc 7.5c

CRN45% 41.3a 96.9a 69.1a 40.0a 49.9a 24.9a 18.7b -46.8c 6.0c

方差分析 ANOVA

年份 (Y) ** ** **

施肥处理 (F) ** ** **

年份×施肥处理 (Y×F) Ns Ns Ns

期的氮素供应。 3 讨论 氮肥施入土壤-作物体系后的基本去向主要包括 3 本研究表明，相比尿素一次性基施，控释氮肥与 方面：一是被作物吸收，二是在土壤剖面以无机氮形 尿素掺混施用显著提高春玉米的地上部干重和氮素吸 态或有机结合形态残留，三是以氨挥发、硝化-反硝化、 收量，实现产量和氮素利用效率的同步提升，并减 淋洗或径流等各种途径损失至环境[16]。过多的氮素损 少了氮素损失。分析不同指标的响应发现，不同掺 失不仅影响作物生长，降低肥效，还可能引发严重的 混比例之间春玉米的产量和干物质量并无显著差 环境风险[17-20]。因此，除了产量、经济效益和品质等 异，而掺混比例增加至 30%时植株的氮素吸收利用 指标，施肥后植物-土壤系统的氮素平衡状况和氮素去 有显著提高，土壤无机氮供应能力较强，而氮素损 向也应作为评价一项施肥技术措施优劣的重要依据。 失则大幅下降。这表明，控释氮肥掺混比例在 15% 目前，春玉米控释氮肥与尿素掺混施用技术的相关研 以上即有促进植株干物质生产和转运的良好效果， 究主要集中在产量、品质、经济效益和氮素吸收等方 但从作物-土壤系统的氮素平衡状况和氮素损失的角 面，而对土壤氮素转化和平衡方面的探讨还相对较少。 度考虑，掺混比例应提高至 30%。因此，本研究条件 李伟等[11]在山东夏玉米上研究发现，整个生育期内控 下施氮量在 185 kg N·hm-2 时，春玉米适宜的控释氮肥 释氮肥掺混施用较常规施肥在 0—60 cm 土层均保持 与尿素掺混比例为 30%左右。这一掺混比例与衣文平 着更高的硝态氮和铵态氮含量，而李敏等[21]对安徽夏 等[8]在吉林省西部风沙地区的研究结果一致（施氮量 玉米的研究也表明，控释氮肥与尿素掺混进行基施维 为 184 kg N·hm-2），而谢佳贵等[9]在吉林省梨树县的 持了土壤铵态氮含量的稳定，而降低了硝态氮的淋失， 研究显示，施氮量为 150 kg N·hm-2 条件下春玉米在掺 减少了环境风险。本研究对春玉米的研究发现，控释 混比例为 50%时可获得较好的产量、产量构成和品质。 氮肥的掺混施用较尿素全施显著增加了两个生长季的 分析不同研究结果之间的差异，一方面可能是不同研 表层土壤无机氮水平，减少了氮素向深层土壤的淋失。 究区域间气候、土壤等条件的差异所造成，另一方面 土壤无机氮残留过高是导致氮素损失的重要原因，因 可能是由于施氮量的差异导致，总施氮量减少的情况 此其被要求控制在一定范围内以兼顾作物吸收与环境 下为满足春玉米生育期内的氮素需求，应适当提高控 友好[22]。研究显示，中国华北冬小麦-夏玉米轮作区土 释氮肥的掺混比例以增加缓释氮素的数量，保障中后 壤无机氮的残留量不宜超过 150 kg·hm-2[23]，而欧盟国

526 中 国 农 业 科 学 49卷

家一般要求 0—90 cm 土层硝态氮残留应低于 90 放与迁移过程影响的相关研究，探讨不同气候类型条 kg·hm-2[22]。本研究中，尽管控释氮肥掺混施用处理的 件下适宜掺混比例或控释剂型的调整，以调控养分供 无机氮残留相比尿素全施处理较高（两生长季主要分 应，实现与作物吸收在时间和空间上的同步，更好地 布在 83.1—112.5 kg·hm-2），但总体上均处于较合适 促进作物高产和养分高效。 水平，因而不会在收获后造成较大的氮素损失，相反 4 结论 还促进了越冬期冻融交替过程中土壤氮素的矿化。据 巨晓棠等[16]估算，中国旱作生产中氮肥的损失率在 与尿素一次性全施相比，控释氮肥与尿素的掺混 45%左右。中国北方地区玉米种植生育期一般与雨季 施用显著提高春玉米的产量、地上部干重和植株氮素 同步，传统氮素管理模式下速效氮素的大量投入导致 吸收，其中以尿素渗混 30%的控释肥处理表现最好。 流失和淋失严重，司东霞等[24]对夏玉米研究发现，农 控释氮肥与尿素掺混施用显著提高了表层土壤的无 户习惯施肥（普通尿素 250 kg N·hm-2 分次施用）条件 机氮含量，减少了氮素向深层土壤的淋失。土壤-作 下氮肥的表观损失率达 51.1%，而戴明宏等[25]在春玉 物系统的氮素平衡中，氮素输入和输出的主要方式分 米上的研究表明，习惯施肥（普通尿素 240 kg N·hm-2 别是施肥和作物吸收带走。随控释氮肥掺混比例的增 分次施用）的氮肥表观损失率为 42.6%。本研究显示， 加，作物氮素吸收带走和土壤无机氮残留持续上升， 两季连作春玉米在普通尿素一次性全施处理的氮肥表 而氮素表观损失和表观盈余则持续下降。可见，控释 观损失率为 37.3%，而掺混施用控释氮肥后大幅下降， 氮肥与尿素掺混施用有利于维持较高的土壤氮素水 掺混比例为 45%时氮肥的表观损失仅为 6%，较普通 平，促进春玉米生长获得高产，增加氮素吸收，而且 尿素处理下降 30 多个百分点。因此，从土壤-植物系 还减少氮素损失而提高氮肥利用率，因而可作为推荐 统氮素平衡的观点看，控释氮肥掺混施用技术通过减 的一次性施肥替代技术。综合作物产量、氮素利用和 少氮素表观损失，降低土壤氮素盈余，从而增加植株 氮素平衡等指标，当前生产条件下东北春玉米施氮量 氮素吸收，提高了氮肥利用效率。 为 185 kg N·hm-2 时适宜的控释氮肥掺混比例应在 控释氮肥与尿素的掺混施用效果受多方面因素影 30%左右。 响，如作物的养分需求特性、气候状况、土壤条件等。 其中，以气候因素的影响最为强烈，主要原因是温度 References 和水分显著影响控释氮肥的养分释放特征及其在土壤 [1] 樊小林, 刘芳, 廖照源, 郑祥洲, 喻建刚. 中国控释肥料研究的现 中的转化运移过程[26-27]。一般来讲，温度升高会加快 状和展望. 植物营养与肥料学报, 2009, 15(2): 463-473. 控释氮肥养分释放，而土壤含水量增加则有利于养分 Fan X L, Liu F, Liao Z Y, Zheng X Z, Yu J G. The status and outlook 的释放和迁移，因而较高的温度和较大的降水条件下 for the study of controlled-release fertilizers in China. Plant Nutrition 控释氮肥养分的释放和迁移过程也会有所加快。 and Fertilizer Science, 2009, 15(2): 463-473. (in Chinese) Farmaha 和 Sims[7]研究中发现，生长环境极大影响着 [2] 朱兆良, 金继运. 保障中国粮食安全的肥料问题. 植物营养与肥料 控释氮肥与尿素的掺混施用效果，干冷条件下控释氮 学报, 2013, 19(2): 259-273. 素释放的缓慢减少了对作物的养分供应而造成减产。 Zhu Z L, Jin J Y. Fertilizer use and food security in China. Plant 本研究所用控释氮肥采用水溶性聚合物进行包膜，受 Nutrition and Fertilizer Science, 2013, 19(2): 259-273. (in Chinese) 水分变化的影响较为强烈。2010 年播种期间（5 月初）， [3] Azeem B, KuShaari K, Man Z B, Basit A, Thanh T H. Review on 过多的降雨首先造成基施氮肥中速效氮素的较大损 materials & methods to produce controlled release coated urea 失，吐丝期（7 月中旬）是春玉米的氮素吸收高峰期， fertilizer. Journal of Controlled Release, 2014, 181: 11-21. 此时也正值控释氮肥的释放高峰，因而较多的降雨又 [4] 王宜伦, 李潮海, 王瑾, 谭金芳. 缓/控释肥在玉米生产中的应用与 增加了缓释氮素的流失，因此植株的氮素吸收受到较 展望. 中国农学通报, 2009, 25(24): 254-257. 大影响。再加上苗期至拔节期较重的干旱，导致当年 Wang Y L, Li C H, Wang J, Tan J F. Application and prospect of 玉米产量较 2011 年明显偏低。尽管如此，控释氮肥掺 slow/controlled release fertilizers in maize production. Chinese 混施用处理仍较尿素全施处理表现出显著的增产效 Agricultural Science Bulletin, 2009, 25(24): 254-257. (in Chinese) 果，土壤氮素的淋失也相对较低。今后，应加强环境 [5] 闫湘, 金继运, 何萍, 梁鸣早. 提高肥料利用率技术研究进展. 中 气候因素对控释氮肥与尿素掺混施用条件下氮素的释 国农业科学, 2008, 41(2): 450-459.

3 期 王寅等：控释氮肥与尿素混施对连作春玉米产量、氮素吸收和氮素平衡的影响 527

Yan X, Jin J Y, He P, Liang M Z. Recent advances in technology of Si X Z, Han Y L, Wang Y L, Liu M M, Tan J F. Improving nitrogen

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528 中 国 农 业 科 学 49卷

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中国农业科学 2016,49(3):529-542 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.011

基于花青素苷合成和呈色机理的观赏植物花色改良分子育种

戴思兰，洪 艳

（北京林业大学园林学院/花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室，北京 100083）

摘要：花色是观赏植物最重要的品质性状之一，是植物自然进化过程中最具适应意义的表型性状，也是表观 遗传学研究的重要内容。花青素苷是使花朵呈色的重要色素之一，被子植物中约有 80%的科的花朵颜色由花青素 苷决定；迄今从自然界分离和鉴定出的花青素苷多达 600 种，主要由 6 种花青素苷元衍生而来。花青素苷合成途 径是迄今为止研究得最为清楚的植物次生代谢途径之一，它的合成首先取决于类黄酮代谢途径的生成，花青素苷 种类的多样性则源于其不同分支途径的形成，在花青素苷元基本骨架上不同位置取代基的差异形成了多种多样的 花青素苷。在花青素苷生物合成过程中，分支点酶的竞争机制和关键酶的底物特异性使花青素苷的种类及相应的 花色表型具有种属特异性。花青素苷合成后需要转运到液泡中被包裹成色素体，植物细胞中的液泡积累和贮存色 素体的能力是影响花青素苷呈色的重要因素，因此，花青素苷在花瓣中的最终呈色还受液泡 pH、助色素含量以及 金属离子的络合作用等多种细胞内因素的影响。目前，已经在多种植物中获得了与花青素苷合成及呈色相关的结 构基因和调节基因，并解析了其功能，成功获得了一些转基因花卉，但是这些基因调控表达的机制，包括转录水 平和转录后水平的调控、DNA 序列本身的差异和 DNA 甲基化修饰的调控机制等仍不清楚，转基因植株花色改良的 程度也很有限，对于如何将这些机制应用于花色改良的转基因育种也是一个前沿的课题。花青素苷对园艺作物器 官呈色机制的解析有助于对花朵呈色机制的理解，观赏植物中花色形成机理的研究对于园艺作物器官呈色机制的 解析同样具有重要的参考价值。因此，本文以观赏植物为例，从花青素苷合成分支途径形成的机理、花青素苷生 物合成途径的遗传调控机理以及影响花青素苷呈色的主要因素及其遗传调控机理 3 个方面，对影响植物花朵呈色 的机制进行了综述，并对近年来基于花青素苷代谢和呈色机理的花色改良分子设计育种，尤其是国际上广泛关注 的蓝色花育种进行了梳理和总结，以期为定向培育具有新奇花色的观赏植物新品种提供参考。 关键词：观赏植物；花青素苷；生物合成；呈色机理；遗传调控；分子育种

Molecular Breeding for Flower Colors Modification on Ornamental Plants Based on the Mechanism of Anthocyanins Biosynthesis and Coloration

DAI Si-lan, HONG Yan

(College of Landscape and Architecture, Beijing Forestry University/Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation & Molecular Breeding, Beijing 100083)

Abstract: Flower color, one of the most important quality traits for ornamental plants, is of great adaptive significance during the natural evolution process of plants. Moreover, flower color is also an important content for epigenetic researches. Anthocyanins, the most important pigments for flower coloration, designate the flower colors of approximately 80% plant families in angiosperm. Up to date, more than 600 anthocyanins have been isolated and identified from the natural world, which are mainly derived from six anthocyanidins. The biosynthetic pathway of anthocyanins has been well studied, which starts from the flavonoid metabolic pathway.

收稿日期：2015-09-06；接受日期：2015-10-29 基金项目：国家自然科学基金（31272192，31071823） 联系方式：戴思兰，Tel：010-62336252；E-mail：[email protected]

530 中 国 农 业 科 学 49卷

Different branch pathways result in the diversity of anthocyanins, mainly due to the differences of substituent groups that are located on the basic skeleton of various anthocyanidins. During the biosynthetic process of anthocyanins, the competition forces of enzymes which are located on the branch nodes and the substrate specificity of some key enzymes result in the genus and species specificity of anthocyanins and the corresponding flower color phenotypes. Anthocyanins are transferred to vacuole and are packaged as chromatophore after being biosynthesized. The accumulation and conserve abilities on the chromatophore of vacuole affect the coloration of anthocyanins to a large extent. Therefore, many intracellular factors, such as the pH value of vacuole, the content of co-pigments and the complexation of metal ion, jointly affect the final coloration of anthocyanins in the petals. At present, some structural and regulatory genes that are related to the anthocyanins biosynthesis and coloration have been isolated, whose functions also have been well revealed. Based on these genes, some transgenic flowers have been successfully bred out. However, the mechanisms of gene regulating expression, including the regulation mechanisms on the transcriptional and post-transcriptional levels, and the differences of DNA sequences and the DNA methylation, still remain elusive. Moreover, the present modifications on the flower colors are still very limited. Therefore, how to apply these mechanisms on the transgenic breeding of flower color modification is a frontier topic. Revealing the organ coloration mechanisms based on anthocyanins in horticultural crops is conducive to the understanding of coloration mechanisms of flowers; studies on the mechanisms of flower color in ornamental plants is of important reference value for the reveal of the organ coloration mechanisms in horticultural crops. Therefore, in this paper, we reviewed the mechanisms of flower coloration in ornamental plants from three aspects, including the mechanisms of the branch pathways generation, the genetic regulation mechanisms of anthocyanins biosynthetic pathway, and the main factors affecting the anthocyanins coloration and the corresponding genetic regulation mechanisms. Finally, we summarized the successes of molecular design breeding on flower color modification based on these mechanisms, especially the international-concerned molecular breeding for blue flowers, aiming at providing references for the directive breeding of ornamental plants with novel flower colors. Key words: ornamental plant; anthocyanin; biosynthesis; coloration mechanism; genetic regulation; molecular breeding

花色是观赏植物最重要的品质性状之一。花青素 物新品种提供借鉴。 苷（anthocyanin）是使花朵呈色的重要色素，其生物 1 花青素苷合成分支途径形成的机理 合成由一系列酶催化而成[1]，其基本骨架上不同位置 取代基的差异形成了多种多样的花青素苷，从而使植 花青素苷种类的多样性是其呈色丰富的根本原 物器官呈现出红色、紫色、蓝紫色和蓝色等不同颜色。 因，而其代谢分支途径的物种特异性决定了其种类的 花青素苷的种类源于不同的代谢分支途径[2]；其在花 多样性。 朵中最终的呈色还受液泡的 pH 值、助色素的含量以 1.1 花青素苷化学结构的多样性及其合成途径的复杂 及金属离子的络合作用等多种细胞内因素的影响[3]。 性 此外，花青素苷的合成及呈色还受外界环境条件的影 广义的花青素苷包括花青素苷元（anthocyanidin） 响和植物自身发育状况的调节[4-5]。 和花青素苷（anthocyanin），活体植物中主要以花青 1988 年，Van der Krol 等[6]首次将花青素苷合成 素苷的形式存在于细胞中，花青素苷由花青素苷元衍 途径上游的 CHS 反义导入矮牵牛（Petunia× 生而来。花青素苷元由 2 个芳香环（A 环和 B 环）和 hybrida）中，抑制了花青素苷前体物质柚皮素等的 1 个杂环（C 环）相连而成。花青素苷在自然界中存 合成，导致花色变浅。此后，通过分子育种途径改 在广泛的结构变异，它们的结构差异主要体现在环上 良花色的理论研究和育种实践获得了极大成功[7-8]。 羟基的数目、糖基的数量和糖的结构以及与糖苷相连 随着转基因蓝色香石竹（Dianthus caryophyllus）和 的有机酸的位置[9-10]。迄今，自然界中已有多达 600 蓝色月季（Rosa chinensis）的市场化，利用基因工 种花青素苷被分离和鉴定，主要从 6 种花青素苷元衍 程改良花色日益成为观赏植物育种者极为关注的课 生而来，分布比例如下：矢车菊素苷元（Cyanidin） 题。本文结合花青素苷合成和呈色分子机理的研究 50%、飞燕草素苷元（Delphinidin）12%、天竺葵素苷 进展，全面梳理利用基因工程改良花色的研究成果， 元（Pelargonidin）12%、芍药花素苷元（Peonidin）12%、 探讨基于花青素苷合成与呈色机理改良花色的分子 矮牵牛素苷元（Petunidin）7%和锦葵素苷元（Malvidin） 设计思路，以期为定向培育具有新奇花色的观赏植 7%[9]。

3 期 戴思兰等：基于花青素苷合成和呈色机理的观赏植物花色改良分子育种 531

花青素苷合成始于苯丙氨酸，途经多步酶促反应 例如，拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的黄烷酮 3-羟 （图 1）。该通路上存在 2 个重要的基因群，即上游 化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）被 EBGs 协同调 基因群（early biosynthetic genes，EBGs）和下游基因 控，但在金鱼草（Antirrhinum majus）中则被 LBGs 调 群（late biosynthetic genes，LBGs）[11-12]。EBGs（包 控[15-17]。 括 CHS 和 CHI 等基因）通常编码通路起始位点上的参 查尔酮合酶（chalcone synthase，CHS）是花青素 与黄酮、黄酮醇和糅红合成的相关酶，这些上游步骤甚 苷合成途径的核心酶，其活性决定花青素苷的有无。 至在低等的苔藓植物中都有发现[13]；LBGs（包括 DFR、 花青素苷代谢通路上的柚皮素（naringenin，NAR）和 ANS、GT、AT 和 MT 等基因）的表达模式则与 EBGs 二氢山奈酚（dihydrochaemferol，DHK）是两个关键 明显不同，主要编码合成花青素苷和原花青素苷 的分支节点（图 1），节点上的关键酶具有不同的竞争 （proanthocyanidin）的酶，造成这种差异的主要原因 机制，并且分支途径的下游酶往往具有底物特异性[7]， 是类黄酮的功能具有物种和组织特异性[14]。F3H、 这是导致不同观赏植物中花青素苷合成途径复杂性的 F3′H 和 F3′5′H 因物种而异被划分在不同的基因群中。 两个主要原因。

ρ-香豆酰辅酶A 3×丙二酰辅酶A ρ-coumaroyl-CoA 3×malnoyl-CoA CHS

查尔酮 chalcone CHI F3′H F3′5′H 柚皮素 naringenin F3H

二氢槲皮素 F3′HFLS二氢山奈酚 F3′5′H 二氢杨梅素 黄酮醇 dihydroqueretin dihydrokaempferol dihydromyricetin Flavonols

DFRDFR DFR

无色矢车菊素苷元 无色天竺葵素苷元 无色飞燕草素苷元 LAR leucocyanidin leucopelargonidin leucodelphinidin

无色花青素苷元 Leucoanthocyanidins ANS ANS ANS

矢车菊素苷元 天竺葵素苷元 飞燕草素苷元 ANR cyanidin pelargonidin delphinidin

花青素苷元 Anthocyandins GT, AT, MT 花青素苷 Anthocyanins 原花青素 Proanthocyanins

CHS：查尔酮合成酶 chalcone synthase；CHI：查尔酮-黄烷酮异构酶 chalcone isomerase；F3′5′H：类黄酮-3′5′-羟基化酶 flavonoid-3′5′-hydroxylase； F3′H：类黄酮-3′-羟基化酶 flavonoid-3′-hydroxylase；F3H：黄烷酮-3-羟基化酶 flavanone 3-hydroxylase；FLS：黄酮醇合成酶 flavonol synthase；DFR： 二氢黄酮醇-4-还原酶 dihydroflavonol 4-reductase；ANS：花青素苷合成酶 anthocyanin synthase；ANR：花青素还原酶 anthocyanidin reductase；GT： 葡萄糖基转移酶 glycosyl transferases；AT：酰基转移酶 acyl transferase；MT：甲基转移酶 methyl transferase

图 1 花青素苷的生物合成途径及关键节点 Fig. 1 The biosynthetic pathway of anthocyanins and key nodes

1.2 花青素苷生物合成的主要分支途径 不同物种研究发现，CHS 具有多个家族成员，不同成 1.2.1 CHS 活性决定花青素苷代谢途径的形成 员具有与花青素苷合成和花发育相关的多种功能，因 CHS 催化花青素苷合成途径的第一步酶促反应，是花 此分离 CHS 基因家族不同成员并鉴定其功能是有效 青素苷合成的关键酶，其活性缺失会导致花青素苷和 实现花色改良的前提。目前已在矮牵牛中发现了 8— 其他黄酮类物质缺失，从而产生白花突变体[18-20]。对 10 个 CHS 成员，其中只有两个成员（CHS-A 和 CHS-J）

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与花瓣呈色相关[21-22]。在非洲菊（Gerbera hybrida）中 tuberosum）DFR 的研究表明，积累天竺葵素苷的红 共克隆得到 3 个 CHS 序列，其中 GCHS1 与花序的呈 色马铃薯的 DFR 可以还原 DHK 和 DHM，而积累飞 色相关，而 GCHS4 可能参与了其他器官的呈色过程[23]。 燕草素苷的蓝紫色马铃薯的 DFR 却只能还原 1.2.2 关键酶的竞争机制 NAR 是花青素苷合成的 DHM[39]。因此，DFR 底物特异性对于天竺葵素苷分 第一个关键分支点，涉及 3 个关键酶。其中，F3H 是 支途径的维持具有重要作用[40-41]。 合成天竺葵素的关键酶，而在矢车菊素及飞燕草素的 花青素苷合成途径中，下游通路的修饰过程同样 合成过程中，还分别需要黄烷酮 3′-羟化酶（flavanone 具有很强的种特异性，不稳定的无色花青素苷元合成 3′-hydroxylase，F3′H）及黄烷酮 3′,5′-羟化酶（flavanone 为稳定的花青素苷元后，需要在糖基转移酶 3′,5′-hydroxylase，F3′5′H）参与[24]。对于大部分植物 （glucosyltransferase，GT）的催化下经糖苷化作用进 而言，F3′5′H 缺失是不能形成蓝色花的主要原因，如 一步转变成稳定的花青素苷。绝大部分花青素苷都在 市场上热销的月季、香石竹、菊花（Chrysanthemum 3 位碳原子（3GT）羟基进行糖苷化，也有部分糖苷 ×morifolium）和百合（Lilium brownii）等，因此，F3′5′H 键出现在 5 位碳原子（5GT）。花青素苷在相关酶的 一度被称为“蓝色基因”[25-26]。 作用下可以发生二次糖苷化、乙酰化、甲氧基化和异 自然突变体和转基因研究都证明，在这一关键节 戊烯化，修饰形成其他多种形式的花青素苷[42]。有研 点上，3 个酶的竞争导致了不同分支途径的产生。在 究表明，GT 具有很强的时空表达特异性，且具有很 龙胆属（Gentiana）植物的 2 个株系中，不同转座子 强的底物特异性。例如，紫苏（Perilla frutescens）和 插入 F3′5′H 序列中导致其表达量降低，从而向矢车菊 马鞭草（Verbena officinalis）的 5GT 蛋白还可以催化 素途径转变[27]。在非洲紫苣苔属（Saintpaulia）植物 乙酰化的 3-O-花青素苷发生二次糖苷反应，显示出比 中，在启动子区域中插入或缺失与转座子相关的片段， 较宽的底物范围；而矮牵牛的 5GT 只能选择 3-O-花青 同样影响了 F3′5′H 的转录水平，改变了花青素苷合成 素苷乙酰芸香苷作为催化底物[43] 。又如，龙胆 的分支途径[28]。在香石竹中共表达矮牵牛细胞色素 b5 （Gentiana scabra）中 3、5 和 3′位置的糖苷化也由不 和 F3′5′H，大大提高了 F3′5′H 的竞争力，使转基因株 同 GT 催化完成[44-46]；在大岩桐（Sinningia cardinalis） 系的飞燕草素苷含量明显增加[29]。另外，在一些研究 中分离得到的 ScUGT5 仅能催化花青素苷 3-葡糖苷， 中还发现，菊科（Asteraceae）植物 F3′5′H 更倾向于 而不能催化其他类黄酮物质[47]。另外，对于甲基转移 被聚类到 CYP75B 亚家族[2,30]，可能是因为它具有更 酶（methyltransferase，MT）的底物特异性研究也正 强的 3′羟基化功能。目前，F3′H 与 F3′5′H 在菊科植物 在逐步展开[48] 。Du 等 [49] 的研究表明，虽然芍药 中的竞争关系尚未得到明确解析[31-32]。 （Paeonia lactiflora）中的 2 个重组蛋白 PsAOMT 和 DHK 是花青素苷代谢第二个分支点。二氢黄酮醇 PtAOMT 对于花青素苷具有相同的底物选择特性，但 是合成黄酮醇的前体物质，在二氢黄酮醇 4-还原酶 PsAOMT 的甲基化活性比 PtAOMT 高 60 倍，它们催 （dihydroflavonol 4-reductase，DFR）作用下，二氢黄 化活性间的差异由位点 87 处的单个氨基酸残基替换 酮醇被还原为无色花青素苷元。黄酮醇合成酶 导致。因此，对下游酶的底物特异性进行研究将为阐 （flavonol synthase，FLS）和 DFR 之间竞争会影响花 明花青素苷合成分支途径调控机理提供新证据。 朵的最终呈色和黄酮醇的生成量[33-36]。 2 花青素苷生物合成途径的遗传调控 1.2.3 关键酶的底物特异性 除了分支节点上酶的 竞争机制，DFR 的底物特异性也是决定分支类型产生 2.1 转录水平的调控 的关键。很多植物的 DFR 可以高效地识别 DHK、二 2.1.1 转录复合体对分支途径的精确调控 由于转 氢槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氢杨梅素 录因子能够激活或阻遏多个下游功能基因的表达，研 （dihydromyricetin，DHM）。虽然月季、香石竹和 究转录因子与花青素苷合成途径结构基因之间的调控 菊花中因没有 F3′5′H 而不能生成 DHM，但体外酶活 与互作关系就成了花朵呈色机理研究的核心和关键。 试验表明这些物种的 DFR 都可以催化 DHM[24]。相 目前，MYB 类、bHLH 类和 WD40 类是调节花青素苷 反，在矮牵牛[37]和大花蕙兰（Cymbidium hybrida）[38] 合成的主要转录因子，大部分植物花青素苷的合成均 中，DFR 不能将 DHM 作为底物，但其可以高效催化 是由这 3 类转录因子组成的蛋白复合体（MBW）结 合 DHQ 而产生飞燕草素苷。对马铃薯（Solanum 到结构基因的启动子上进行调控的[1, 50]。MBW 转录复

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合体对不同代谢通路上结构基因的表达调控是十分精 2.2 转录后水平的调控 确的。例如，拟南芥中的 TT2（R2R3-MYB）-TT8 花青素苷生物合成途径的转录后水平调控主要 （bHLH1）-TTG1（WDR）转录复合体可以激活原花 包括蛋白质泛素化，microRNA（miRNA）以及小干 青素苷合成途径上 DFR、ANS、BANYULS 和 TT19 等 扰 siRNA（small interfering RNAs）介导的转录后基 基因的表达[51]，PAP1-TT8/GL3-TTG1 转录复合体也 因沉默 3 个方面。泛素/26S 蛋白酶体系统（ubiquitin/ 可以激活花青素苷合成途径结构基因的表达[52-53]。另 26S proteasome system，UPS）通过降解相关蛋白，参 外，PAP2、MYB113 和 MYB114 等 3 个 R2R3-MYB 与某些生长发育过程转录后水平的调控。苹果 COP1 蛋白可以与花青素苷合成通路上的 TT8/GL3-TTG1 结 （constitutively photomorphogenic1）可与 MYB 互作， 合成为转录复合体[53]。 参与暗条件下 MYB 的泛素化及降解，从而调控光介导 研究者还发现，不同物种中的 MYB 对 EBGs 和 的花青素苷合成[66]。在拟南芥中还发现，COP1 和 SPA LBGs 的调节模式并不相同。例如，龙胆 GtMYB3 能够 （suppressor of PHYA-105）通过靶向结合多个花青素 有效激活 GtF3′5′H 和 Gt5AT 的启动子，推测其靶基因 苷合成的关键活性因子如 PAP1、PAP2、HY5 及其同 为 LBGs[54]；后续研究分离得到的 GtMYBP3 能够激活 源物 HYH，协调抑制光诱导的花青素苷生物合成[67]。 龙胆 EBGs 和 F3′H[55]。葡萄（Vitis vinifera）VvMYBA miRNA 由呈发夹结构的单链 RNA 前体经过 Dicer 仅能够激活 VvUFGT 的启动子[56-57]。在矮牵牛中，MYB 酶加工后生成，它与靶基因 RNA 的序列互补引起靶 基因家族成员 AN2 与 JAF13 互作可激活花青素苷代谢 基因 RNA 的切割或抑制其翻译，从而对植物的生长 途径中 DRF-A 及其下游基因[50]。 发育进行转录后水平调控。Yang 等[68]利用 miR828 过 2.1.2 转录复合体的组织特异性调控 MBW 转录 表达载体转化拟南芥，证实 miR828/TAS4-siR81(-)能 复合体对结构基因的表达调控具有组织特异性。矮牵 通过抑制花青素苷正调控因子 PAP1、PAP2、MYB113 牛的花瓣和花粉囊中的花青素苷合成由 2 个不同的 的表达进而负调控花青素苷积累。Gou 等[69]研究了 MBW 蛋白复合物调控，其中，AN11（WD40）-AN1 miR156 靶向定位的 SPL（squamosa promoter binding （bHLH）-AN2（R2R3-MYB）转录复合体调控花瓣 proteinlike）转录因子对花青素苷合成的负调控作用， 内花青素苷合成，而 AN11-AN1-AN4 则调控花粉囊 发现负调节因子 SPL9 可使 MBW 转录复合体变得不 发育[58]。苹果（Malus×domestica）MdMYB10 在 bHLH 稳定，最终影响花青素苷的生物合成途径；miR156 蛋白 MdbHLH3 和 MdbHLH33 参与下能诱导苹果子 活性的提高能促进花青素苷的积累，其活性较低时则 叶、果肉和果皮合成红色花青素苷[59]，而与 MdMYB10 促进黄酮醇的积累。 来自同一基因位点的 MdMYBA 和 MdMYB1 仅能诱 siRNA 来源于双链 RNA 前体，通过互补配对降 导果皮中红色花青素苷合成[60]。 解靶标转录本。Gasciolli 等[70]对拟南芥突变体 dcl1 和 2.1.3 转录因子对花青素苷合成的负调控作用 目 dcl4研究发现，花青素苷积累量增加很可能与miRNAs 前在高等植物中分离的MYB类转录因子的数量最多， 以及 siRNAs 参与的调控有关。在大丽花（Dahlia 其中 R2R3-MYB 转录因子在花青素苷生物合成的遗 variabilis）中发现，siRNA 介导的 CHS 转录后基因沉 传调控中的作用最为显著，已经从 21 个属的植物中分 默，是导致大丽花出现纯白色花色表型的原因[71]。对 离得到了 34 个特异调节花青素苷合成的 R2R3-MYB 双色矮牵牛研究发现，在花瓣中两个不同颜色区域都 转录因子[61]。在植物花青素苷生物合成过程中，大多 能够检测到 CHS-A 的 mRNA 前体，但是在白色组织 数 MYB 类转录因子具有正调控作用[62]，少数具有抑 中却检测不到成熟 mRNA；同时检测到了来源于 制花青素苷合成的作用。草莓（Fragaria×ananassa） CHS-A 第 2 外显子区域的具有 21 个核苷酸的 siRNA， 变种 Elsanta 的 FaMYBl 能在红色的果实中特异性表 推测双色花的花色表型由 CHS-A 转录后基因沉默导 达，编码短的 MYB 蛋白，FaMYB1 在烟草（Nicotiana 致[72]。 tabacum）中过量表达会导致编码催化酶基因表达量明 2.3 序列差异对花青素苷呈色的调控机制 显下降，从而抑制花朵与雄蕊中花青素苷积累[63]。此 编码关键酶基因的启动子序列甚至基因序列发生 外，花青素苷合成的 MYB 类抑制因子还有拟南芥 变化会影响基因的表达，从而调控花青素苷的合成。 AtMYBL2 和矮牵牛 PhMYB27，序列分析发现这些负调 对苹果的研究发现，MdMYB1 启动子 1 个单核苷酸突 控转录因子的 C 端都包含有 EAR 和L2R 抑制基序[64-65]。 变导致花青素苷不能正常合成[50]，而在 MdMYB10 启

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动子上 1 个微卫星序列的插入导致其产生自调控位 作者进行了 2 个调控模式的推测：（1）负向调节类黄 点，从而增加了 MYB10 转录水平，最终导致苹果的花 酮途径的转录因子 MYB4 的表达抑制了 H3K9ac，从 和果实都积累了大量花青素苷[73]。 而抑制正向调节转录因子 MYB12 的表达，进而抑制了 转座子插入是另一种序列变化类型，也是导致花 整个途径；（2）MYB4 和其他转录因子激活了 HDAC 色突变体产生的重要原因。Kobayashi 等[74]发现红皮 （histone deacetylase）而 去 除 了 H3K9ac，从而抑制了 和白皮葡萄的差异是因为在白皮葡萄的 VvMYBA1 启 基因的表达。该研究为组蛋白的乙酰化和去乙酰化等 动子区域插入了一个长度为 10 422 bp 的反转录转座 修饰作用调控花青素苷生物合成基因的转录机制的研 子，导致该基因无法正常转录。圆叶牵牛（Ipomoea 究提供了重要参考。 purpurea）花冠不同 CHS-D 等位基因 5′上游区域发现 siRNA 诱导的基因沉默最早只被认为发生在细胞 有大量转座子插入元件累积[75]。血 橙（ Citrus sinensis） 质内的转录后水平的调控过程中，随着 siRNA 指导 不同品种中积累飞燕草素苷含量的差异是由于控制 DNA 甲基化现象的发现，现已证实 siRNA 可以通过 花青素苷合成的 MYB 类基因 Ruby 中出现了一个 指导基因组表观修饰引起转录水平基因沉默。然而， LTR 型反转录转座子，其能够发生自身剪切和合并， siRNA 介导的 DNA 甲基化对植物花青素苷生物合成 使不同品种的 Ruby 基因表达量不同，其表达水平与 的影响还鲜见报道。 不同品种积累飞燕草素苷的含量呈正相关关系[76]。 2.4 花青素苷代谢途径的表观遗传调控 3 影响花青素苷呈色的主要因素及其 在花青素苷合成过程中，DNA 甲基化可使器官颜 遗传调控机理 色发生明显改变，甚至会出现不规则条纹表型。例如， P1-wr 启动子序列发生超甲基化使玉米（Zea mays） 3.1 共着色作用 的颜色发生变化，并且 Pl 等位基因的 3′非编码区发生 与花青素苷共同着色的色素种类及含量可直接影 超甲基化使玉米产生红色斑点[77-78]。MdMYB10 启动子 响植物花色。FLS 既可通过底物竞争方式影响花青素 序列中发生超甲基化也会导致苹果‘Honey Crisp’的 苷合成，也能够通过影响助色素合成改变花色。在矮 果皮出现条纹[79]；研究还发现，有条纹苹果‘Ralls’ 牵牛中，FLS 改变了黄酮醇与花青素苷的比例，最终 果皮中，MdMYB1 启动子区域 DNA 甲基化程度远远 使花色发生改变[85]。Holton 等[86]从矮牵牛中克隆并过 高于其红色芽变品种[80]。在文心兰属（Oncidium）中 表达 FLS，使转基因株系花色变深，反义表达则使花 发现，OgCHS 启动子 5′区域甲基化会导致该基因表达 色明显变淡。 量降低，从而降低花青素苷积累[81]。此外，在梨（Pyrus 3.2 液泡 pH communis）的研究中发现，红色果皮中 PcMYB10 启 液泡 pH 逐渐升高可使花青素苷呈现由红色向蓝 动子超甲基化与其绿色果皮表现型密切相关[82]；在梨 色转变，如深红色月季花瓣中液泡的 pH 值为 4 左右[24]。 的红色芽变品种‘Zaosu Red’和有条纹芽变品种 虽然天竺葵（Pelargonium hortorum ）和凤仙花 ‘Zaosu Red’中，PyMYB10 启动子在富含花青素苷 （Impatiens balsamina）花瓣中含有飞燕草素苷，但由 的组织中甲基化程度很低，说明在花青素苷合成过程 于液泡 pH 较低而无法呈现蓝色[24]。野生型牵牛花的 中发生了去甲基化现象[83]。Liu 等[81]研究了文心兰有 颜色从紫色到蓝色变化是由于在开花前钠离子和钾离 色斑品种‘Gower Ramsey’和无色斑品种‘Honey 子反向转运体蛋白的作用使液泡内 pH 由 6.6 升至 Dollp’后，发现其主要差异是基因 OgCHS 在‘ Honey 7.7[87-89]。Verweij 等[90]在矮牵牛中分离得到基因 PH5， Dollp’中无表达，而且不表达是由上游启动子区域甲 序列分析发现其属于 P 型 ATP 酶 3A 亚家族 基化引起的；有色斑品种‘Gower Ramsey’的 OgCHS （P3AATPases），PH5 突变会导致花瓣液泡酸化程度 启动子无甲基化。由此可见花色素催化酶基因的甲基 降低，从而使花朵变为蓝色，因此推测 PH5 可能控制 化也可以导致表达效率显著下降，从而形成花斑。组 了花瓣液泡酸化。Faraco 等[91]报道了矮牵牛 PH1 自身 蛋白修饰也与基因表达调控关系密切，其能够改变核 没有 H+转运的活性，但其可与 PH5 共同作用控制矮 小体形态或引起染色质重塑，影响蛋白-DNA 互作。 牵牛花瓣液泡酸化，最终决定花朵呈色。 例如，Schenke 等[84]的研究表明，H3K9ac（histone 3 3.3 金属离子的络合作用 lysine 9 acetylation）是基因转录激活的原因而非结果， 一些紫色花瓣郁金香（Tulipa gesneriana）品种的

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花被下部呈现蓝色，其蓝色和紫色区域具有相同的花 抑制花青素苷代谢途径上游基因（如 CHS）封闭 青素苷（飞燕草素 3-芸香苷）和黄酮醇，液泡内 pH 了整个类黄酮合成途径，可使转基因株系不含类黄酮。 值也很相似，但是蓝色区域 Fe3+浓度高于紫色区域 25 然而由于类黄酮在抵御紫外线、提高植物对逆境的抗 倍[92]。这一发现使人们逐渐认识到金属离子对花青素 性以及信号转导方面发挥着重要作用，通过抑制 CHS 苷的生物合成也有很大的影响。试验发现，位于液泡 获得白色花对转基因植株后代综合性状的影响较大， 膜上的 Fe3+转运体蛋白（TgVit1）与蓝色花呈色相关， 当人们发现关键酶的底物特异性后，开始抑制下游基 该转运体蛋白基因在紫色郁金香花瓣中瞬间表达导致 因（ 如 DFR 或 ANS 等）。Tsuda 等[36]在矮牵牛中反义 一些细胞变为蓝色[93]。促进 TgVit1 表达并且抑制 抑制 DFR，转基因株系花色由紫色变为浅粉色；在蓝 Tgfer1（一种 Fe3+储存蛋白基因）表达从而导致紫色 猪耳（Torenia hybrida）中分别抑制 DFR 和 ANS，花 郁金香花被下部呈现蓝色[94]。蓝色矢车菊（Centaurea 色也由深紫色变为白色[99-101]。Nakatsuka 等[102]使用 cyanus）花瓣呈色也与 Fe3+转运基因 CcVIT 相关[95]。 RNAi 技术对龙胆中 F3′5′H 和 5/3′AT 进行反义抑制， 还有研究发现，八仙花（Hydrangea macrophylla）花 转基因株系花色由蓝色变为浅蓝色。Chen 等[103]对蝴 色改变与 Al3+相关：在红、蓝两色共存的八仙花品种 蝶兰（Phalaenopsis aphrodite）UFGT 进行抑制，同样 中，蓝色花瓣细胞中 Al3+含量高于红色花瓣 40 倍[96]。 使红色蝴蝶兰变为白色。这种分子改良策略虽被认为 是创造浅色花的有效途径，但其只能抑制或关闭竞争 4 基于花青素苷呈色机理的观赏植物 性分支代谢途径，并没有打通目的花青素苷合成分支 花色改良分子设计育种 途径实现色素种类的人工改良。因此，近年来研究者 将着眼点放在分支节点关键酶的人工调控。 综上，高等植物器官内的花青素苷合成途径依据 4.2 利用关键酶的竞争机制改良花色 不同酶的竞争关系和底物特异性分为 3 种类型，即天 对观赏植物的花色表型、色素成分以及相关基因 竺葵素苷、矢车菊素苷和飞燕草素苷。在转录水平上， 的表达情况进行研究，分析其欠缺的花色表型、色素 由 MYB、bHLH 和 WD40 等 3 类转录因子组成的转录 成分和导致这种欠缺的原因，导入其缺少的外源基因， 复合体与结构基因的启动子相结合，对结构基因的表 从而对分支途径进行干预或改良的方法更为积极，近 达进行精确调控；转录结束后，蛋白质泛素化、miRNA 年来已有许多成功案例。例如，Okinaka 等[104]将风铃 以及siRNA通过影响基因转录本的表达量甚至使其无 草（Campanula medium）F3′5′H 导入烟草，转基因 法完成转录过程来调控花青素苷的生物合成量；在完 株系积累了飞燕草素苷，由原来的粉色变为紫色。 成生物合成后，液泡 pH、金属离子和助色素等还会影 Mori 等[105]将蔓长春花（Vinca major）的 F3′5′H 导入 响花青素苷最终的呈色效应。近年来，人们基于这些 矮牵牛，同样获得了积累飞燕草素苷的转基因株系。 分子机理尝试利用单基因或者多基因导入过表达外源 但是，花青素苷生物合成途径涉及的酶促反应众多， 基因，或者抑制内源基因表达和基因删除等分子设计手 仅采用单一酶在受体物种中异源表达，其花色表型的 段对花青素苷合成不同分支途径进行人为干预，以改变 变化是有限的。 最终的花青素苷种类或含量来实现花色表型的改良。 除了导入花青素苷合成途径关键基因外，类黄酮 4.1 通过抑制关键酶的活性获得浅色花 其他分支途径上编码关键酶基因的异源表达同样会对 CHS 是类黄酮合成通路的核心酶，对大量白花突 花青素苷含量产生影响从而改变花色。例如，Han 等[106] 变体研究发现 CHS 缺失导致花青素苷缺失，因此认为 将苹果原花青素苷合成途径中 ANR 导入烟草，发现转 抑制内源 CHS 是浅色花和白色花的分子育种策略[97]。 基因株系花青素苷合成相关基因 CHI 和 DFR 表达量明 1988 年，Van der Krol 等[6]采用反义导入方法抑制矮牵 显下降，花青素苷含量减少最终导致花朵褪色，说明类 牛内源 CHS，获得白色花植株。此后，Dare 等[98]采用 黄酮代谢其他分支途径对花青素苷代谢分支途径也有 RNAi 技术对苹果中 CHS 进行沉默，在转基因株系中 竞争性[107] 。 Zhou 等 [108] 过表达山茶花（Camellia 没有检测到花青素苷，而查尔酮和黄酮类含量显著减 nitidissima）CnFLS1 使烟草花瓣变为白色或浅黄色。分 少。Deng 等[23]采用病毒介导的基因沉默技术（virus- 析表明，转基因植株中黄酮类物质含量和花青素苷含量 induced gene silencing，VIGS）敲除非洲菊中 GCHS1， 分别显著升高和降低，说明该基因对于器官呈现黄色 获得花色变浅的转基因株系。 至关重要，为山茶花花色改良的基因工程奠定了基础。

536 中 国 农 业 科 学 49卷

4.3 利用花青素苷代谢分支途径重建机制改良花色 的技术。例如，在烟草中过表达 AtMYB12，其叶片变 植物花色的形成非常复杂，单纯抑制或导入一个 为灰白色[115] ；龙胆中的 GtMYBP3 、 GtMYBP4 、 基因或一类基因很难有效干预分支途径。而对于体内 GtMYB1R1 和 GtMYB1R9 等转录因子也抑制了烟草花 本就缺少某一分支途径的植物，试图重建某一分支途 瓣中的花青素苷生成[55,116]。此外，近年有多项研究使 径需要进行良好的分子设计。近年来，已经成功在内 用新型的反义抑制技术在不同物种中对调节基因进 源不具有飞燕草素苷分支途径的香石竹、月季和菊花 行了有效的内源抑制。Nakatsuka 等[117]使用嵌合阻 中实现了分支途径的重建工作。例如，矮牵牛细胞色 遏基因沉默技术（chimeric repressor gene-silencing 素 b5 通过特异调节细胞色素 P450 家族成员而参与蓝 technology，CRES-T）对龙胆的 GtMYB3 进行内源抑 色花的形成，该基因失活后降低了 F3′5′H 酶的活性， 制，花青素苷合成下游基因 F3H、F3′5′H、DFR 和 ANS 也大大降低了花朵中 5′羟基化的类黄酮含量[109]。在月 的表达量明显降低，转基因株系花色变浅。 季中同时导入三色堇（Viola tricolor）F3′H 和鸢尾（Iris Aguilar-Barragán 和 Ochoa-Alejo[118]使用 VIGS 技术对 tectorum）DFR，并同时抑制内源 DFR 的表达，得到 辣椒（Capsicum eximium）果实中的 MYB 和 WD40 进 部分转基因植株中飞燕草色素含量达到了 90%以上， 行内源抑制，也获得了颜色变浅的转基因株系。 产生了蓝紫色新异花色[110]。Brugliera 等[111]利用 RNAi 5 展望 技术抑制菊花内源 F3′H，并通过构建大载体将月季 CHS花部特异性启动子与三色堇的F3′5′H编码区连接 目前对于花青素苷生物合成和呈色的分子机理研 导入菊花中，获得蓝色花转基因株系。 究已经获得了许多进展，但由于通过基因工程手段改良 此外，对于天竺葵素分支途径的重建也取得了较 观赏植物的花色有赖于优质的基因资源，因此，还需要 好的成果。例如，Tsuda 等[36]对矮牵牛内源 F3′H 进行 对花青素苷生物合成和呈色的分子机理展开更为深入 RNAi 抑制，同时过表达月季 DFR，以积累矢车菊素 的研究。 苷为主的红色矮牵牛变成了以积累天竺葵素苷为主的 首先，仍然缺乏花青素苷生物合成途径物种特异 橙色矮牵牛。在蓝目菊（Arctotis stoechadifoli var. 性的研究资料。花青素苷种类决定于其合成后的修饰 grandis）中对内源 F3′5′H 进行 RNAi 抑制，同时过表达 过程，并且在不同物种间存在显著差异，这与花青素 非洲菊 DFR，在转基因株系中检测到天竺葵素苷，花色 苷生物合成途径及调控机理的保守性完全不同。对于 由洋红色转变为浅红色[112]。在蓝猪耳中抑制内源 F3′H 这一问题，今后应在不断挖掘新基因的同时，着重加 和 F3′5′H，并过表达月季 DFR，在转基因株系中检测到 强不同植物间的特异性和共性分析，找出花青素苷代 了天竺葵素苷的生成，花色由蓝紫色变为粉色[101]。 谢的共性规律和物种特异性产生的原因。第二，对于 4.4 利用转录水平调控机理改良花色 花青素苷生物合成途径的转录调控研究还只局限于直 基于分支途径重建的分子设计可以使目标植物产 接的 MBW 调控复合物，而对于各种酶如何感知发育 生原本不能合成的色素，但是多基因导入的方法效率 和环境信号还知之甚少。加强与各类转录因子关联的 较低；尽管从目前来看，导入转录因子并不能获得直 基因表达与这些信号之间关系的研究，可为人工调控 接合成新色素的转基因株系，但随着调控机理的深入 观赏植物中花青素苷的生物合成提供新的理论依据。 研究，这可能会成为通过控制花青素苷的种类而改变 此外，各种因子不仅影响观赏植物花青素苷合成，还 花色的高效方法。目前的许多研究都表明，控制单个 与其他代谢密切相关，对此尚缺乏深入研究。有研究 转录因子比控制多个结构基因更能有效地促进色素的 者已经发现多种植物激素对花青素苷具有一定的调控 合成和积累。例如，在转基因拟南芥和烟草中过表 作用。将花青素苷代谢与其他次生代谢途径相结合进 达 PAP1 可以使花色出现极为显著的变化，并且使 行研究将更加有助于揭示花朵呈色的机理，对于花色 转基因植株中色素积累量显著提高，此后该基因被 改良也具有实际意义。此外，人们对于花青素苷表观 广泛用于许多物种的转基因研究以提高花青素苷生成 遗传修饰的认知还处于初级阶段，除在模式植物拟南 量。过表达 PAP1 不仅能够促进花青素苷合成，还可 芥中有较系统的研究之外，在各类观赏植物中的研究 以促进矮牵牛和月季花瓣中挥发物质合成[113-114]。此 还很少。解析各种表观遗传修饰现象对理解花青素苷 外，随着负调控转录因子的发现，浅色花的花色改 代谢及呈色的作用机制具有十分重要的意义。另外， 良工作不再需要构建 RNAi 载体等基因干扰和抑制 转座子插入对花青素苷生物合成的影响机制也不明

3 期 戴思兰等：基于花青素苷合成和呈色机理的观赏植物花色改良分子育种 537

确，通过转座子标签技术开发转座子标记，寻找转座 的不断涌现，观赏植物花色素形成及其呈色机理的研 子插入位点并对目标序列进行基因组定位，是解决这 究正在向纵深方向发展，不断挖掘新基因并对其功能 一问题的有效途径。迄今对于细胞内环境的诸多因素 和表达调控机制进行研究，将会为观赏植物花色改良 如何协同调控花青素苷呈色的分子机制仍不清楚。在 和育种工作的开展奠定更为坚实的理论和技术基础。 化学层面解析的基础上，还需要挖掘与之相关的基因 资源，进而解析花青素苷呈色的分子机制。最后，对 References 花青素苷转运机制已有相关研究[119]，但是如何利用基 [1] Tanaka Y, Ohmiya A. Seeing is believing: engineering anthocyanin 因工程技术控制其转运和积累从而改良花色却未见报 and carotenoid biosynthetic pathways. Current Opinion in 道。因此，利用花青素苷转运机制中相关基因进行花 Biotechnology, 2008, 19(2): 190-197. 色改良也是很好的研究策略。 [2] Tanaka Y, Brugliera F. Flower colour and cytochromes P450. 通过分析已有的利用基因工程进行花色改良的研 Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences, 究发现，天竺葵素苷和矢车菊素苷的合成需要具有较 2013, 5(2/3): 283-291. 高活性的 F3′H 和可以催化 DHK 底物的 DFR，而 [3] Yoshida K, Mori M, Kondo T. Blue flower color development by F3′5′H 以及 DFR 对于飞燕草素苷分支途径是必需的。 anthocyanins: from chemical structure to cell physiology. Natural 此外，对于蓝色花的分子育种，转基因受体植物的花 Product Reports, 2009, 26(7): 884-915. 瓣还需要具有较高的液泡 pH 和助色素含量等适宜的 [4] 胡可, 韩科厅, 戴思兰. 环境因子调控植物花青素苷合成及呈色的 条件，这些因素在已获成功的蓝色香石竹、月季和菊 机理. 植物学报, 2010, 45(3): 307-317. 花的基因工程育种的分子设计中都被充分考虑，这些 Hu K, Han K T, Dai S L. Regulation of plant anthocyanin synthesis 研究进展为其他不含有飞燕草素苷的观赏植物（如牡 and pigmentation by environmental factors. Chinese Bulletin of 丹等）的蓝色花育种提供了基本的设计思路。此外， Botany, 2010, 45(3): 307-317. (in Chinese) 值得一提的是，随着对基因功能及其调控机制的深入 [5] Hong Y, Tang X J, Huang H, Zhang Y, Dai S L. Transcriptomic 研究，如果能够获得合适的启动子，再加上理想的分 analyses reveal species-specific light-induced anthocyanin biosynthesis 子设计，将不仅改变花朵的颜色，甚至能够有效调控 in chrysanthemum. BMC Genomics, 2015, 16: 202. 花瓣上花斑和条纹的形成。 [6] Van der Krol A R, Lenting P E, Veenstra J, van der Meer I M, Koes R 在 3′和 7 位上具有不同芳香酰基基团的花青素苷 E, Gerats A G, Mol J N, Stuitje A R. An anti-sense chalcone synthase 往往比非酰化的花青素苷表现出更稳定的蓝色。在飞 gene in transgenic plants inhibits flower pigmentation. Nature, 1988, 燕草（Delphinium grandiflorum）蓝紫色花青素苷合成 333: 866-869. 的过程中伴随着液泡中发生的基于葡糖基和酰基的 7- [7] Nishihara M, Nakatsuka T. Genetic engineering of flavonoid pigments 聚酰化作用，这一发现为培育花瓣中仅积累聚酰化飞 to modify flower color in floricultural plants. Biotechnology Letters, 燕草素苷的真正蓝色花的转基因育种研究提供了很好 2011, 33(3): 433-441. 的突破口。目前，已经获得参与修饰 3′和 7 位花青素 [8] Chandler S F, Sanchez C. Genetic modification; the development of 苷的许多编码关键酶（如 UAGTs、GH1-GTs、BAHD- transgenic ornamental plant varieties. Plant Biotechnology Journal, AATs 和 SCPL-ATs）的基因。因此，对自身具有 F3′5′H 2012, 10: 891-903. 却不表现出蓝色的观赏植物（如紫薇、山茶、荷花等）， [9] Kong J M, Chia S, Goh N K, Chia T F, Brouillard R. Analysis and 通过基因工程手段改良花青素苷途径，使花瓣细胞的 biological activities of anthocyanins. Phytochemistry, 2003, 64(5): 液泡中能够积累 3′和 7-聚酰化的飞燕草素苷是获得真 923-933. 正意义上蓝色花的有效途径。在矮牵牛中获得的 pH [10] Castañeda-Ovando A, de Lourdes Pacheco-Hernández M, 相关基因 PH5 和 PH1 以及在郁金香中获得的与 Fe3+ Páez-Hernández M E, Rodríguez J A, Galán-Vidal C A. Chemical 转运相关的基因 TgVit1 均为基于花青素苷在液泡中呈 studies of anthocyanins: a review. Food Chemistry, 2009, 113(4): 色机理进行花色改良，特别是为蓝色花育种的分子设 859-871. 计提供了很好的基因资源。 [11] Pelletier M K, Murrell J R, Shirley B W. Characterization of flavonol 随着模式植物功能基因组学、代谢组学、蛋白组 synthase and leucoanthocyanidin dioxygenase genes in Arabidopsis 学和表观遗传学等研究的不断深入，新技术和新方法 (further evidence for differential regulation of “early” and “late”

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中国农业科学 2016,49(3):543-553 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.012

核桃青皮的强抗氧化活性成分及其抗氧化稳定性

田平平，李仁宙，简永健，李健明，王 杰

（华南农业大学食品学院，广州 510642）

摘要：【目的】以大孔树脂纯化的核桃青皮抗氧化成分为对象，对其组分进行鉴定，并研究其抗氧化稳定性， 为核桃青皮的开发和有效利用提供理论依据。【方法】以 DPPH 自由基清除能力为指标，采用 D101 型的大孔树脂纯 化核桃青皮粗提取物，浓缩冷冻干燥后，采用超高压液相色谱-高分辨质谱联用仪（UPLC-MS）对具有较强抗氧化

活性部分的核桃青皮纯化物进行成分分析，并通过分析 pH、温度、光照、金属离子、氧化剂 H2O2、还原剂 Na2SO3 和防腐剂山梨酸钾 7 种因素对核桃青皮抗氧化物质清除 DPPH 自由基的影响，研究其抗氧化性能的稳定性。【结果】 UPLC-MS 结果表明，核桃青皮中具有强抗氧化活性的主要成分为绿原酸、短叶苏木酚羧酸、花靛-葡萄糖/半乳糖、 鞣花、槲皮素-阿拉伯糖、表儿茶素或儿茶素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等 7 种。核桃青皮抗氧化成分稳定性研究结 果表明：随着 pH 的增大，核桃青皮抗氧化物质对 DPPH 自由基清除率逐渐减小，当pH为12时，抗氧化物质对 DPPH 自由基的消除率几乎为 0；抗氧化物质对 DPPH 自由基清除率能力随着放置时间的延长而下降；在室内、光照和避 光 3 种处理下，核桃青皮抗氧化物质溶液的DPPH 自由基消除率在 0-2 h内逐渐下降，且三者之间无显著性差异（P ＞0.05）。在放置 2-5 h内，光照处理的消除率均低于同期的室内和避光处理；在 4、37、70 和 90℃ 4 种处理下， 核桃青皮抗氧化物质溶液对 DPPH 自由基的消除率总体呈下降的趋势，而在 50℃处理下则呈先下降后上升再下降 的趋势；Fe3+能使抗氧化物质维持较高的抗氧化活性，而 Cu2+ 、Mg2+、K+、Al3+则使核桃青皮抗氧化物质的抗氧化能

力降低。亚硫酸钠使核桃青皮抗氧化物质的抗氧化能力维持较低水平；浓度为 0.10%和 0.05%的 H2O2 能提高核桃青 皮抗氧化物质的抗氧化能力，此后抗氧化能力随着其浓度的增加而下降；防腐剂山梨酸钾溶液能显著降低（P<0.05） 核桃青皮抗氧化物质的抗氧化能力，二者呈负相关关系。【结论】核桃青皮提取物具有较强的抗氧化活性，其抗氧 化组分主要为 7 种多酚类活性物质。环境因子对核桃青皮活性物质的抗氧化稳定性具有一定的影响。 关键词：核桃青皮；抗氧化活性成分；鉴定；抗氧化稳定性

Analysis of Antioxidative Functional Components from Walnut Green Rind and Its Antioxidation Stability

TIAN Ping-ping, LI Ren-zhou, JIAN Yong-jian, LI Jian-ming, WANG Jie

(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

Abstract: 【Objective】This research was conducted to study the analysis and antioxidation stability of antioxidative functional components from walnut green rind (AFCsWGR) which were purified by macroporous resin chromatography, which could provide a theoretical basis for the exploitation and effective utilization of walnut green rinds. 【Method】The crude extract was purified by D101 macroporous resin combined with DPPH free radical scavenging ability, and then concentrated and freeze-dried. Ultra high pressure liquid chromatography high resolution mass spectrometry (UPLC-MS) was used to analyze the AFCsWGR with strong antioxidative activity. The antioxidation stability of AFCsWGR was studied by analyzing the effect of pH, temperature, light, metal ions, oxygenant, reducer and preservative on antioxidation stability.【Result】The results showed that a total of seven antioxidative functional components in walnut green rinds were found, which included chlorogenic acid, brevifolin carboxylic acid, indigo flower-

收稿日期：2015-06-29；接受日期：2015-10-12 基金项目：新疆维吾尔自治区科技支疆项目（201291158） 联系方式：田平平，E-mail：[email protected]。通信作者王杰，E-mail：[email protected]

544 中 国 农 业 科 学 49卷 glucose/galactose, ellagic acid, quercetin arabinoside, epicatechin/catechin, quercetin-3-O-glucoside. The results of antioxidation stability of AFCsWGR showed that with the increase of pH value, the DPPH free radical scavenging rate of AFCsWGR decreased. The DPPH free radical scavenging rate was almost zero when the pH value was 12. The DPPH free radical scavenging rate of AFCsWGR could effectively be declined with the extension of storage time. The antioxidant capacity of AFCsWGR was gradually declined under indoor, light and avoiding light treatments, but there was no significant difference among them (P＞0.05). The DPPH free radical scavenging rate of light treatment was lower than the other treatments during 2-5 h. The DPPH free radical scavenging rate of AFCsWGR treated at 4, 37, 70 and 90℃ was presented as a decreasing trend, but with the change trend of increasing first and decreasing thereafter was observed in 50℃ treatment. Fe3+ could maintain a higher antioxidant activity of AFCsWGR. However, Al3+, K+, Cu2+ and Mg2+ could effectively reduce the antioxidant activity of AFCsWGR. Sodium sulfite solution could reduce antioxidant ability of AFCsWGR. 0.10% and 0.05% H2O2 could improve the antioxidant ability of AFCsWGR, thereafter, the antioxidant ability decreased with the increase of the concentration of H2O2. Potassium sorbate solution could significantly reduce the antioxidant capacity of AFCsWGR (P＜0.05), which exhibited a negative correlation between the antioxidant capacity of AFCsWGR and the contents of potassium sorbate solution.【Conclusion】The walnut green rind extract had a strong antioxidant activity. The main antioxidative functional components in the walnut green rinds were seven polyphenol active substances. Environmental factors could affect the antioxidation stability of AFCsWGR. Key words: walnut green rind; antioxidative functional components; identification; antioxidation stability

行分离纯化，对具有较强抗氧化活性的纯化物进行成 0 引言 分分析，并对其抗氧化性能的稳定性进行研究，为生 【研究意义】植物源天然抗氧化剂的研究与开 产中更有效地利用核桃青皮制备植物源高效抗氧化剂 发已成为当今功能食品与添加剂领域的重要发展方 提供理论依据。 向[1]。核桃青皮为核桃外部未成熟的绿色果皮，富含 1 材料与方法 多种活性物质，具有显著的抗氧化功效[2-3]。但在核桃 生产中多作为废弃物扔掉，造成环境污染和资源的极 试验于 2014 年在华南农业大学食品学院进行。 大浪费。而抗氧化剂应用于食品、化妆品和药品过 1.1 材料与试剂 程中，其抗氧化性能的稳定性直接影响着抗氧化的 试验所用核桃品种为‘新丰’，采摘自新疆阿克 功效[4-5]。因此，分离纯化核桃青皮抗氧化活性物质， 苏市乌什县，采收于 9 月份，对核桃鲜果进行手工剥 鉴定其活性成分组成，明确其抗氧化性能稳定的条件， 皮，将剥皮得到的核桃青皮自然晒干后粉碎过 40 目 可为核桃青皮的开发和有效利用提供理论依据。【前 筛，粉末置于棕色广口瓶中密封保存。 人研究进展】研究表明核桃青皮粗提取物对菜籽油有 没食子酸标准品、福林酚购于美国 Sigma 公司； 一定的抗氧化作用，且其抗氧化效果随提取物添加量 无水乙醇、盐酸、亚硫酸钠、山梨酸钾、过氧化氢、 的增大而增强[6]。赵国建等[7]的研究也验证了核桃青皮 无水碳酸钠、氢氧化钠、氯化钠、氯化镁、硫酸铜、 体外抗氧化性能与其粗提物浓度的相关性。万正敏[8] 氯化钾、氯化铁等均购于广州天河精科化玻仪器批发 发现核桃中的抗氧化物质主要集中在青皮、种皮部分； 部。 核桃青皮中的化学成分主要为酮类 、酚类、肟类、醇 1.2 仪器与设备 类、呋喃类、酯类等 6 大类化合物，以倍半萜类为 UV2310Ⅱ紫外分光光度计，广州市深华生物技 主[9]。【本研究切入点】已有文献报道核桃青皮的抗 术有限公司；Centrifuge 5804R 高速冷冻离心机，艾 氧化功效，但目前对核桃青皮抗氧化性能的研究均使 本德中国有限公司；Eyela FDU-1200 冷冻干燥机， 用核桃青皮粗提物，未进行分离纯化去除蛋白质和糖 Tokyo Rikakikai，Japan；BS-100A 自动部分收集器， 分等杂质，也未分析核桃青皮抗氧化活性物质的组成 上海青浦沪西仪器厂；HL-2B 数显恒流泵，上海沪 与结构。此外，作为功能性添加剂，不同的使用条件 西分析仪器厂有限公司；Agilent1290/maXis impact 超 会影响抗氧化剂的稳定性，进而影响抗氧化功效。因 高压液相色谱-高分辨质谱联用仪，德国 Bruker 公司。 此，有必要系统分析核桃青皮具有抗氧化活性的成分， 1.3 试验方法 明确其具备高抗氧化功效的环境条件。【拟解决的关 1.3.1 核桃青皮抗氧化提取物的制备 干制后粉碎 键问题】本研究以抗氧化活性为指标，对核桃青皮进 的核桃青皮样品，由 30%的乙醇以 1﹕40 的质量体积

3 期 田平平等：核桃青皮的强抗氧化活性成分及其抗氧化稳定性 545

比，在 50℃水浴中浸提 1 h，得到核桃青皮粗提取物， 除率，3 次重复。 其抗氧化成分质量分数为 9.33%。以 DPPH 自由基清 1.3.3.4 光照对核桃青皮抗氧化物质抗氧化稳定性 除能力为指标，采用 D101 型的大孔树脂纯化核桃青 的影响 将样品溶液分装于透光性良好的具塞试管 皮粗提取物，纯化条件：25℃，上样浓度 1.5 mg·mL-1、 中，试管平均分成 3 组，第 1 组置于气候模拟箱中， 上样 pH 4.0、洗脱剂乙醇浓度 40%、上样流速 2 光线直射；第 2 组置于室内，避免阳光直射；第 3 组 mL·min-1、洗脱流速 1 mL·min-1、最佳洗脱体积 55 mL。 置于黑暗处，避免与光源接触。每隔 1 h 分别测定各 收集抗氧化活性最强的样品，在 40℃条件下旋转蒸发 试管中样品溶液对 DPPH 自由基的清除率，连续测定 减压浓缩，再经真空令冻干燥机冻干成粉，干燥后的 5 h，3 次重复。 粉末样品溶于甲醇中，过 0.4 μm 滤膜后进行超高压液 1.3.3.5 温度对核桃青皮抗氧化物质抗氧化稳定性 质联用分析。 的影响 取 0.01 mol·L-1 样品溶液 10 mL 置于 5 支具塞 1.3.2 桃核青皮抗氧化活性成分分析 UPLC 条件： 试管中，分别在 4、37、50、70 和 90℃水浴中保温 1、 色谱柱 Agilent 1290 UPLC Zorbax Rrhd SB-C18（1.8 2、3、4 和 5 h 后，迅速冷却至室温，测定样品溶液对 μm×2.1 mm×50 mm）；以甲醇为流动相 A，以 0.1% DPPH 自由基的清除率，3 次重复。 甲酸水溶液为流动相 B；梯度洗脱：0.0—1.0 min，5% 1.3.3.6 金属离子对核桃青皮抗氧化物质抗氧化稳 A，1.0—3.0 min，5%—25% A，3.0—6.0 min，25%— 定性的影响[11] 向 7 支试管中加入 6 mL 样品溶液，并 50% A，6.0—8.0 min，50%—95% A，8.0—10.0 min， 分别加入浓度为 0.05 mg·mL-1 的 K+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、 95%—5%，10.0—12.0 min，5% A；流 速 0.2 mL·min-1； Al3+溶液 6 mL，振荡溶解后，置于 37℃恒水浴锅中， 样品室温度 25℃，色谱柱温度 35℃。 每隔 0.5 h 测定不同离子溶液对 DPPH 自由基的清除率， 质谱条件：脱溶剂气（N2）流速 3 L·min-1，锥孔 连续测定 2 h，3 次重复。 气（N2）流速 0.3 Bar 电喷雾电离源（ESI），毛细管 1.3.3.7 还原剂对核桃青皮抗氧化物质抗氧化稳 电压为负离子模式下 2.5 kV，离子源温度 180℃，质 定性的影响 先将一定体积样品溶液 pH 调至 10， 量扫描范围 50—1 000 m/z。 之后取 5 支具塞试管，分别加入 6 mL 核桃青皮纯化 1.3.3 核桃青皮抗氧化物质抗氧化性能稳定性研究 提取液，再分别加入浓度为 0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、 1.3.3.1 样品溶液的制备 将 1.3.1 中真空冷冻干燥 0.4%、0.5%的亚硫酸钠溶液，摇匀，静置 15 min， 的提取物，用蒸馏水配成试验所需适宜浓度的溶液。 然后测定样品溶液对 DPPH 自由基的清除率，3 次 1.3.3.2 样品 DPPH 自由基清除能力的测定 参照 重复。 Kumaran 等[10]方法，取一定浓度提取液样品溶液 2 mL 1.3.3.8 氧化剂对核桃青皮抗氧化物质抗氧化稳 于 10 mL 的棕色容量瓶中，加入甲醇 1 mL，0.1 mol·L-1 定性的影响 向 5 支试管中加入 6 mL 样品溶液， 的 DPPH 自由基甲醇溶液 3 mL，摇匀，并置于室温避 并分别加入 2 mL 体积分数为 0.05%、0.10%、0.15%、

光条件下，光反应 30 min，用 1 cm 的比色皿在 517 nm 0.2%的 H2O2 溶液，以加入 2 mL 蒸馏水作为对照， 波长处测定样液的吸光值，以蒸馏水代替待测液作为 摇匀，在室温下避光放置；每隔 10 min 测定样品溶 空白对照。样品对 DPPH 自由基的清除能力用下式计 液对 DPPH 自由基的清除率，连续测定 50 min，3 Ai - Aj 次重复。 算，3 次平行求清除率的平均值，清除率 S=1- 。 A0 1.3.3.9 防腐剂对核桃青皮抗氧化物质抗氧化稳定

式中，A0 表示 1 mL 水和 3 mL DPPH 自由基反应液的 性的影响 分别取 9 mL 样品溶液加入到 6 支具塞试 吸光值；Ai 表示 1 mL 样品和 3 mL DPPH 自由基反 管中，再分别加入浓度为 0.0%、0.1% 、0.2%、0.3%、 应液的吸光值；Aj 表示 1 mL 样品和 3 mL 甲醇的吸 0.4%、0.5%的山梨酸钾溶液，室温下放置 0、2、4 和 光值。 6 h 后，测定样品溶液对 DPPH 自由基的清除率，3 次 1.3.3.3 pH 对核桃青皮抗氧化物质抗氧化稳定性 重复。 的影响 取 0.01 mol·L-1 样品溶液 4 mL 于 6 支具塞 1.4 数据统计 试管中，分别加入 4 mL pH 为 2.0、4.0、6.0、8.0、 所有数据均平行测定 3 次，采用 SPSS 17.0 软件 10.0 和 12.0 的磷酸缓冲溶液。摇匀，置于 37℃恒 对所有数据进行方差分析（ANOVA），利用邓肯多 温水浴，2 h 后测定样品溶液对 DPPH 自由基的清 重比较法对数据进行差异显著分析，并用 Origin 8.0

546 中 国 农 业 科 学 49卷

软件绘制作图。 根据研究所得色谱峰的保留时间、分子离子峰， 与已报道的成分结构[12-19]进行对比，结果如表 1 所示。 2 结果 鉴定出核桃青皮抗氧化活性成分中有 7 种主要活性成 2.1 核桃青皮的抗氧化活性成分 分物质，分别为：绿原酸、短叶苏木酚羧酸、花靛- 核桃青皮抗氧化活性成分的 UPLC 图及其质谱图 葡萄糖/半乳糖、鞣花、槲皮素-阿拉伯糖、表儿茶素 见图 1、2。 或儿茶、槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

3 150313-06_P1-F-9_01_3789.d: BPC-AII MS 6

5

5 4

3 8 Intens. ×10 Intens.

2

2 1 4 1 5 6 7 0 246810 时间 Time (min)

图 1 核桃青皮抗氧化活性成分 UPLC 色谱图 Fig. 1 UPLC chromatogram of purified AFCsWGR extracts

表 1 核桃青皮抗氧化活性成分定性分析结果 Table 1 Analysis of purified AFCsWGR extracts by UPLC-MS 峰号 保留时间 分子离子峰 相对分子量 推测化合物 No. Retention time (min) [M-H+]-MS (m/z) Relative molecular mass Compound 1 0.72 291.0137 292.0137 绿原酸 Chlorogenic acid

353.0866 354.0866 短叶苏木酚羧酸 Brevifolin carboxylic acid

2 5.10 291.0134 292.0134 绿原酸 Chlorogenic acid

417.1123 418.1123 花靛-葡萄糖/半乳糖苷 Indigo flower-glucose/galactose

3 5.56 281.1388 282.1388 未知 Uncertainty

563.2846 564.2846 未知 Uncertainty

4 6.20 300.9999 301.9999 鞣花酸 Ellagic acid

5 6.61 433.0782 434.0782 槲皮素-阿拉伯糖苷 Quercetin arabinoside

300.9999 301.9999 鞣花酸 Ellagic acid

6 7.10 287.1483 288.1483 未知 Uncertainty

289.1085 290.1085 表儿茶素或儿茶素 Epicatechin/catechin

7 7.65 469.2299 470.2299 未知 Uncertainty

8 9.21 535.3845 534.3845 未知 Uncertainty

549.3995 550.3995 槲皮素-3-O-葡萄糖苷 Quercetin-3-O-glucoside

3 期 田平平等：核桃青皮的强抗氧化活性成分及其抗氧化稳定性 547 5 4 Intens. ×10 Intens. ×10 4 6 Intens. ×10 Intens. Intens. ×10 5 4 Intens. ×10 Intens. ×10 4 5 Intens. ×10 Intens. Intens. ×10

图 2 峰 1—8 的质谱图 Fig. 2 Mass spectra of peak 1 to 8

2.2 影响核桃青皮抗氧化物质抗氧化稳定性的因素 核桃青皮抗氧化物质溶液对 DPPH 自由基的消除率 2.2.1 pH 不同 pH 对核桃青皮抗氧化物质 DPPH. 为 0.717%，而当溶液的 pH 为 12 时，核桃青皮抗氧 自由基清除能力的影响见图 3。由图 3 可知，核桃 化物质溶液对 DPPH 自由基的消除率几乎为 0。由 青皮抗氧化物质溶液对 DPPH 自由基的消除率随溶 此可知，酸性条件有利于提高核桃青皮抗氧化物质 液 pH 的增大而呈现下降的趋势。当溶液 pH 为 2 时， 溶液的抗氧化性。

548 中 国 农 业 科 学 49卷

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

自由基消除率 0.4

0.3 DPPH

DPPH scavenging effect (%) effect DPPH scavenging 0.2

0.1

0.0 2 4 6 8 10 12 pH

图 3 pH 对核桃青皮抗氧化物质 DPPH 自由基清除能力的影响 Fig. 3 Effects of pH on DPPH free radical scavenging ability of purified AFCsWGR extracts

2.2.2 光照 不同光照处理对核桃青皮抗氧化物质 渐下降。其他 4 种处理下的核桃青皮抗氧化物质溶液 DPPH 自由基清除能力的影响见图 4。由图 4 可知， 对 DPPH 自由基消除率则总体上呈下降趋势。1—2 h 在室内、光照和避光 3 种处理下，核桃青皮抗氧化物 内，90℃处理的 DPPH 自由基消除率下降幅度最大， 质溶液对 DPPH 自由基清除率变化相似，总体呈下降 4℃处理的下降幅度最小；在 2—3 h 内，4℃、37℃和 趋势。其中，在放置 0—2 h 内，3 种处理的消除率逐 90℃处理的消除率呈上升趋势；放置 4 h 后，37℃、 渐下降，且三者之间无显著性（P＞0.05）差异。放置 50℃和 90℃处理均出现下降趋势，而 4℃和 70℃处理 2—5 h，光照处理的消除率低于同期的室内和避光两 核桃青皮抗氧化物质溶液对 DPPH 自由基消除率则呈 种处理。这表明，光照能够降低核桃青皮抗氧化物质 上升趋势。由此看出，温度对核桃青皮抗氧化物质的 对 DPPH 自由基的清除能力。 抗氧化性的稳定性影响较明显，温度越高，核桃青皮 2.2.3 温度 如图 5 所示，50℃处理下，核桃青皮抗 抗氧化物质的抗氧化能力越低。 氧化物质溶液对 DPPH 自由基的消除率呈现先下降后 2.2.4 金属离子 由图 6 可以看出，Fe3+处理下核桃 上升再下降的趋势。放置 2 h 后，消除率下降到最低 青皮抗氧化物质溶液对 DPPH 自由基消除率呈上升的 值，放置 3 h 时，消除率达到最大值 58.35%，之后逐 趋势，且其消除率均高于同期其他金属离子处理，而

自由基消除率 DPPH DPPH scavenging effect (%) effect DPPH scavenging

图 4 光照对核桃青皮抗氧化物质 DPPH 自由基清除能力的影响 Fig. 4 Effects of light on DPPH free radical scavenging ability of purified AFCsWGR extracts

3 期 田平平等：核桃青皮的强抗氧化活性成分及其抗氧化稳定性 549

90.0 4℃ 37℃ 50℃ 70℃ 90℃ 80.0

70.0

60.0

50.0

自由基消除率 40.0

30.0 DPPH DPPH

DPPH scavenging effect effect (%) DPPH scavenging 20.0

10.0

0.0 12345 时间 Time (h)

图 5 温度对核桃青皮抗氧化物质 DPPH 自由基清除能力的影响 Fig. 5 Effects of temperature on DPPH free radical scavenging ability of purified AFCsWGR extracts

60.0 Cu2+ K+ Al3+ Fe3+ Mg2+ 55.0

50.0

45.0

40.0 自由基消除率 35.0

DPPH 30.0 DPPH scavenging effect (%) effect scavenging DPPH 25.0

20.0 0 0.5 1.0 1.5 2.0 时间 Time (h)

图 6 金属离子对对核桃青皮抗氧化物质 DPPH 自由基清除能力的影响 Fig. 6 Effects of metal ions on DPPH free radical scavenging ability of purified AFCsWGR extracts

3+ Al 处理在整个过程中，其消除率呈下降的趋势，在 2.2.6 氧化剂 如图 8 所示，0.15% H2O2 处理下核 放置 1.5 h 后消除率最低。而 Cu2+ 、Mg2+和 K+这 3 种 桃青皮抗氧化物质溶液对 DPPH 自由基消除率呈锯齿

处理的消除率总体上则呈现先上升后下降再上升的趋 “W”型上下波动趋势。0.20% H2O2 处理的消除率则 势。五种金属离子中，Fe3+处理下核桃青皮抗氧化物 呈现上升的趋势，在 10—40 min 内，其上升幅度较小， 质溶液的抗氧化活性稳定性较好。 在 40—50 min 内，其消除率由 30.13%急剧增加到

2.2.5 还原剂 如图 7 所示，当核桃青皮抗氧化 75.93%。在 10—30 min 内，对照、0.05% H2O2 和 0.10%

物质溶液中加入 0.1%亚硫酸钠溶液后，核桃青皮 H2O2 这 3 种处理的消除率变化趋势一致，均无明显变

抗氧化物质溶液对 DPPH 自由基消除率下降到 化（ P＞0.05），在 30—40 min 内，对照和 0.05% H2O2

8.0%，之后随着亚硫酸钠溶液浓度的增大，其消除 处理的消除率均有一定的下降，0.10% H2O2 处理呈上 率一直在 8.0%附近波动。由此看来，亚硫酸钠在 升的趋势。 一定程度上降低了核桃青皮抗氧化物质对 DPPH 2.2.7 防腐剂 由图 9 可以看出，随着放置时间的延 自由基的清除能力，但此后浓度的增加对其清除率 长，核桃青皮抗氧化物质在 0.1%和 0.4%山梨酸钾处 无显著影响。 理下对 DPPH 自由基的消除率呈现先上升后下降的趋

550 中 国 农 业 科 学 49卷

25.0

20.0

15.0

自由基消除率 10.0 DPPH

DPPH scavenging effect (%) 5.0

0.0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 亚硫酸钠浓度 Sodium sulfite solution (%)

图 7 亚硫酸钠对核桃青皮抗氧化物质 DPPH 自由基清除能力的影响 Fig. 7 Effects of sodium sulfite solution on DPPH free radical scavenging ability of purified AFCsWGR extracts

自由基消除率 DPPH DPPH scavenging effect (%)

图 8 H2O2 对核桃青皮抗氧化物质 DPPH 自由基清除能力的影响

Fig. 8 Effects of H2O2 on DPPH free radical scavenging ability of purified AFCsWGR extracts

0% 0.1% 0.2% 0.3% 0.4% 0.5% 60.0

50.0

40.0

30.0

20.0

10.0

0.0 0246 时间 Time (h)

图 9 山梨酸钾对核桃青抗氧化物质 DPPH 自由基清除能力的影响 Fig. 9 Effects of potassium sorbate solution on DPPH free radical scavenging ability of purified AFCsWGR extracts

3 期 田平平等：核桃青皮的强抗氧化活性成分及其抗氧化稳定性 551

势，而在另外 3 种浓度下其消除率则总体上呈现下降 抗氧化活性物质的抗氧化活性对热不稳定，可能是 的趋势。而且，核桃青皮抗氧化物质对 DPPH 自由基 由于其里面的活性组分大都含有 2 个以上酚羟基， 的消除率与山梨酸钾溶液的浓度呈负相关关系。对照 具有很强的还原性，在受热情况下极易氧化，且温 处理的消除率均高于其他 5 种处理。 度越高，其氧化速度越快[26-28]。本研究的结果显示， Fe3+能使抗氧化活性物质维持较高的抗氧化活性，而 3 讨论 Cu2+、Mg2+、K+、Al3+使抗氧化活性物质的抗氧化能 核桃青皮的生物活性由其所含的功能性物质成 力降低，该类物质在金属离子催化作用下很容易发 分决定。已有文献对核桃青皮中化学成分进行了研 生聚合，从而使其抗氧化能力下降。这与 Anna 等[24] 究。李秀凤[20]、杨金枝等[21]报道，核桃青皮内含有 得出的研究结果一致，不同金属离子及其浓度对活 核桃酚类、胡桃甙、α-氢化胡桃-4-葡萄糖甙、金丝 性物质抗氧化活性的影响不同。 桃苷、扁蓄苷、鞣质、没食子酸、丹宁、四氢萘酮 4 结论 以及维生素 B 和维生素 C 等。王淑萍等[9]的研究结 果表明，核桃青皮中的化学成分主要为酮类、酚类、 （1）超高压液相色谱-高分辨质谱联用仪（UPLC- 肟类、醇类、呋喃类、酯类等 6 大类化合物，以倍 MS）鉴定结果表明，核桃青皮中含有的强抗氧化活性 半萜类为主。而万正敏[8]采用 HPLC 法从美国黑核桃 物质为绿原酸、短叶苏木酚羧酸、花靛-葡萄糖/半乳 青皮中鉴定出其主要化学成分为食子酸、绿原酸、 糖、鞣花、槲皮素-阿拉伯糖、表儿茶素或儿茶、槲皮 咖啡酸、对羟基苯甲酸、香豆酸和阿魏酸 6 种酚酸 素-3-O-葡萄糖苷。 物质和芦丁、槲皮素、桑色素 3 种黄酮类物质。本 （2）纯化得到的核桃青皮抗氧化活性物质随 pH 文采用 UPLC-MS 对核桃青皮中具有强抗氧化活性 增大和贮藏时间的增加，对 DPPH 自由基清除率逐 的组分进行了初步鉴定，结果表明，核桃青皮中具 渐减小；光照能够降低核桃青皮抗氧化物质的抗氧 有强抗氧化活性的 7 种主要成分为绿原酸、短叶苏 化能力；核桃青皮抗氧化物质的抗氧化活性对热不 木酚羧酸、花靛-葡萄糖/半乳糖、鞣花、槲皮素-阿 稳定；Fe3+能使核桃青皮抗氧化物质维持较高的抗 拉伯糖、表儿茶素或儿茶素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷。 氧化活性，而 Cu2+、Mg2+、K+、Al3+则使核桃青皮 这与葡萄中表儿茶素等成分具有较强的抗氧化活性 抗氧化物质的抗氧化能力降低。亚硫酸钠使核桃青 的研究结果相似[22-23]。然而核桃青皮中还有其他一 皮抗氧化物质的抗氧化能力维持较低水平；山梨酸 些具有抗氧化活性的成分需要进一步纯化制备单体 钾溶液浓度与核桃青皮抗氧化物质的抗氧化能力呈 组分，再结合其他方法如核磁共振做进一步的化合 负相关关系。 物结构确定。 抗氧化剂广泛应用于食品、化妆品和药品中， References 不同的使用环境条件会影响抗氧化剂的稳定性，进 [1] 辛清武, 黄勤楼, 郑嫩珠, 朱志明, 缪中纬, 李丽, 张丹青. 食品添 而影响着抗氧化的功效。本文研究了 pH、温度、光 加剂研究概况及发展趋势. 农业开发与装备, 2015(4): 28-29. 照等 7 种因素对核桃青皮抗氧化活性物质清除 Xin Q W, Huang Q L, Zheng N Z, Zhu Z M, Miu Z W, Li L, Zhang DPPH 自由基的影响。结果表明，pH 对核桃青皮抗 D Q. Current status and development trend of research of food 氧化活性物质的抗氧化活性影响较大，随着 pH 的增 additives. Agricultural Development & Equipments, 2015(4): 28-29. 大，其对 DPPH 自由基清除率逐渐下降，当 pH 为 (in Chinese) 12 时，其对 DPPH 自由基的消除率几乎为零。 [2] 张卫星, 何开泽, 蒲蔷. 核桃青皮提取物的抗菌和抗氧化活性. 应 Anna[24]、袁 歆 贻 [25]等的研究结果也表明，pH 能显著 用与环境生物学报, 2014, 20(1): 87-92. 影响多酚类物质的抗氧化活性。其原因可能为在碱 Zhang W X, He K Z, Pu Q. Antimicrobial and antioxidant activities of 性条件下抗氧化活性物质易氧化生成醌类物质，清 extracts from walnut green husks Antimicrobial and antioxidant 除 DPPH 自由基的能力大大减弱。当放置时间较长， activities of extracts from walnut green husks.Chinese Journal of 抗氧化活性物质溶液对 DPPH 自由基清除率能力下 Applied and Environmental Biology, 2014, 20(1): 87-92. (in Chinese) 降，且温度和光照均能够影响其抗氧化能力，其原 [3] 陆俊, 赵安琪, 成策, 单齐冀, 李忠海, 袁列江. 核桃营养成分与 因可能是由于光照对抗氧化活性物质含量的影响。 生理活性及开发利用. 食品与机械, 2014, 30(6): 238-242.

552 中 国 农 业 科 学 49卷

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中国农业科学 2016,49(3):554-562 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.013

冰温贮藏对宰后肌肉成熟进程的影响

李培迪 1,2，李 欣 1，李 铮 1，陈 丽 1，李仲文 1，陈立娟 1，田建文 2，张德权 1

（1 中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工重点实验室，北京 100193；2 宁夏大学农学院，银川 750021）

摘要：【目的】动物被屠宰后，经过僵直、成熟等一系列复杂的生理生化反应完成从肌肉到食用肉的转变。 温度对这一过程和肉品品质具有重要影响，成熟与肉质也存在密切关系。本试验以探究冰温条件下肌肉成熟进 程为目标，确定冰温对成熟进程的影响，为调控肌肉成熟进程提供理论基础。【方法】选取无角陶赛特公羊背最 长肌在冰温和冷藏条件下成熟，采用试剂盒测定糖酵解产物、糖酵解关键酶活力，采用酪蛋白酶源分析法测定 钙蛋白酶活力，并结合肌原纤维小片化指数分析肌原纤维蛋白降解的变化规律。【结果】宰后 pH 达到极限值后 逐渐增加，冷藏组（2—4℃）、冰温组（-1—-2℃）分别于宰后 3 d、7 d 达到极限 pH，两组极限 pH 差异不显 著。肌糖原含量先降低后稳定，成熟过程中冷藏组与冰温组肌糖原含量差异不显著。乳酸含量先蓄积后稳定最 后降解，宰后 2、6、12 和 24 h 冷藏组乳酸含量显著高于冰温组。丙酮酸激酶活力先降低后稳定，宰后 2 h、 24 h 冰温组丙酮酸激酶活力显著高于冷藏组。乳酸脱氢酶活力先增加后降低最后稳定，宰后 6 h、12 h、24 h 和 5 d 冷藏组乳酸脱氢酶活力显著高于冰温组。μ-钙蛋白酶活力先增加后降低，宰后 12 h、24 h、5 d、7 d 冰温组 μ-钙蛋白酶活力显著高于冷藏组。宰后肌原纤维小片化指数逐渐增加，宰后 6 h、12 h、3 d、5 d、7 d 和 9 d 冷藏组肌原纤维小片化指数显著高于冰温组。【结论】与冷藏相比，冰温对肌糖原含量和极限 pH 影响不 显著，但可以使肌糖原达到最低值的时间延长 2 d 左右，乳酸达到最高值的时间延长 1 d 左右；冰温可上调丙 酮酸激酶活力，下调乳酸脱氢酶活力，显著延长μ-钙蛋白酶存活时间。冰温可延缓宰后肌肉糖酵解进程 1—2 d， 延迟肌肉成熟。 关键词：肌肉；冰温；成熟；钙蛋白酶

Effects of Controlled Freezing Point Storage on Aging from Muscle to Meat

LI Pei-di1,2, LI Xin1, LI Zheng1, CHEN Li1, LI Zhong-wen1, CHEN Li-juan1, TIAN Jian-wen2, ZHANG De-quan1

(1Institute of Food Science and Technology , Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100193; 2Agricultural College, Ningxia University, Yinchuan 750021)

Abstract:【Objective】The conversion from muscle to meat after slaughter includes rigor, aging and a series of complicated changes. Temperature is very important for this process and the quality of meat. Aging process also affects meat quality. The objective of this study was to investigate the process of glycolysis in controlled freezing point storage and provide theoretical basis for regulating the speed of aging. 【Method】The longissimus of Poll Dorset rams were stored at controlled freezing point (-1--2℃ ) and refrigeration (2-4℃ ) for 9 days. The products of glycolysis and glycolytic activity of key enzyme were analyzed by the corresponding kit. The degradation of myofibrillar protein during post-mortem were analyzed by myofibrillar fragmentation index, combining with the activity of calpain which were analyzed by casein enzyme analysis. 【Result】 The pH value of the refrigeration and controlled freezing point groups were decreased to the minimum value at 3 d and 7 d, respectively, and then increased gradually. The difference of the minimum value of the two groups were not significant. The content of glycogen decreased and then had no

收稿日期：2015-06-18；接受日期：2015-11-23 基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（201303083）、内蒙古自治区科技重大专项、国家农业科技创新工程 联系方式：李培迪，Tel：010-62816474；E-mail：[email protected]。通信作者张德权，Tel：010-62818740；E-mail：[email protected]

3 期 李培迪等：冰温贮藏对宰后肌肉成熟进程的影响 555 significant changes. There were no significant difference between the two groups during post-mortem. The contents of lactic acid were increased and then became stable, followed by degradation, and the lactic acid content of refrigeration was significantly higher than controlled freezing point at 2 h, 6 h, 12 h, 24 h post-mortem. Pyruvate kinase activity reduced before they were stable, and the pyruvate kinase activity of controlled freezing point was significantly higher than refrigeration at 2 h, 24 h post-mortem. Lactate dehydrogenase activity was first increased and then decreased before becoming stable. The lactate dehydrogenase activity of samples in refrigeration was significantly higher than in controlled freezing point storage at 6 h, 12 h, 24 h, 5 d post-mortem. The activity of μ-calpain was increased first and then decreased, μ-calpain activity of controlled freezing point was significantly higher than refrigeration at 12 h, 24 h, 5 d, 7 d post-mortem. Myofibrillar fragmentation index increased gradually, and myofibrillar fragmentation index of refrigeration was significantly higher than controlled freezing point at 6 h, 12 h, 3 d, 5 d, 7 d, 9 d post-mortem. 【Conclusion】Compared with refrigeration, there was no significant difference in glycolysis content and minimum pH value between the two groups, but the controlled freezing point delayed the glycogen degradation about 2 d and the lactic acid accumulation about 1 d. Controlled freezing point could impact the decrease of pyruvate kinase activity and the increase of lactic dehydrogenase activity. In addition, controlled freezing point could also weaken the inactivation of μ-calpain. Controlled freeing point could delay glycolysis process about 1-2 days, so it can delay the aging of muscle. Key words: muscle; controlled freezing point; aging; calpain

0 引言 1 材料与方法

【研究意义】动物被屠宰后，经过僵直、成熟 试验于 2014 年 11 月至 2015 年 1 月在中国农业科 等一系列复杂的生理生化反应完成从肌肉到食用肉 学院农产品加工研究所（农业部农产品加工重点实验 的转变。糖酵解是宰后机体内的主要供能方式。冰 室）进行。 温是指冰点以上 0℃以下的温度区域，是机体冻结 1.1 试验材料 前的最低温度带，在该温度区域下可使机体的生理 选取 5 只 65 kg 左右的无角陶赛特公羊，所有试 活性降到最低程度，又能维持其正常的新陈代谢[1]。 验羊集中规模饲养，统一管理，同群且补饲条件相 研究发现，温度对肌肉的成熟进程和肉品质有重要 同，宰前静养 1 h 以消除应激，按伊斯兰屠宰方式 影响[2-3]，宰后成熟温度越低，肉品最终感官品质和 屠宰。宰后 30 min 内迅速取下两侧背最长肌，测定 卫生指标越好[4]。因此，研究冰温条件下肌肉的成 宰后 0.5 h 的 pH，在冰块上降温并快速剔除表面筋 熟进程，能够为调控肌肉成熟进程和肉品品质提供 膜、脂肪。同一只羊的两侧背最长肌随机分配到冷 理论基础。【前人研究进展】调控宰后糖酵解的方 藏组（对照）和冰温组，将每个处理组的背最长肌 式主要有电刺激、改变成熟温度等。Rhee 等[5]研究 样品平均分成大小相近的 9 块，每份重量约 40 g， 发现低压电刺激可以加快宰后糖酵解速率。Marsh[6] 使用食品级保鲜膜包裹后放入-18℃冰箱进行降温。 等报道提高肌肉温度可以加快代谢速率。冰温作为 冷藏组（对照）：待肉块中心温度降至 4℃时将冷 贮藏保鲜技术主要集中于果蔬、水产品及延长肉品 藏组肉样取出，放入冷藏环境（2—4℃）贮存；冰 货架期上。Liu[7]等报道冰温可以显著抑制鲤鱼贮藏 温组：待肉块中心温度降至 0℃时将冰温组肉样取 过程中微生物增长、脂肪氧化及蛋白质降解。Duun 出放入冰温箱（-1—-2℃）贮存。分别在宰后 0.5 h、 等[8]研究发现真空包装的烤猪肉在冰温环境下货架 2 h、6 h、12 h、24 h、3 d、5 d、7 d、9 d 取出一块 期长到 16 周，具有较好的感官品质。【本研究切入 肉样，测定 pH，而后用液氮速冻，保存于-80℃。 点】目前，冰温在肉品中的研究主要集中在延长产 1.2 测定指标 品货架期，而关于冰温对宰后肌肉成熟进程的影响 1.2.1 蛋白质浓度 采用美国 Thermo 公司的 BCA 仍不清楚。【拟解决的关键问题】以无角陶赛特公 试剂盒测定蛋白质浓度。准确称取 1 g 肉样，加入 9 mL 羊背最长肌为试验材料，研究冰温贮藏对肌肉成熟 生理盐水，经匀浆（匀浆时间 10 s/次，间隔 30 s，连 过程中糖酵解关键酶活力、糖酵解产物及肌原纤维 续 3 次）、离心（4℃，2 000×g，15 min），取上清 蛋白降解的影响，明确冰温对宰后肌肉成熟的影响， 液制备成 10%的组织匀浆液。该组织液用超纯水稀释 为冰温调控宰后肌肉成熟进程提供理论依据。 5 倍后吸取 10 μL 于酶标板中，加入 200 μL 工作液，

556 中 国 农 业 科 学 49卷

置于 37℃的恒温培养箱中反应 30 min，在 562 nm 测 巯基乙醇，pH 8.3）匀浆，匀浆液于 4℃、10 000×g 吸光度，根据标准曲线计算蛋白浓度。 离心 35 min 后取上清液，采用 BCA 法测定蛋白浓度， 1.2.2 丙酮酸激酶活力 将制备好的 10%组织匀浆 调整蛋白浓度至 6 μg·μL-1，上样量为 50 μg。采用 12.5% 液用生理盐水稀释 200 倍，采用丙酮酸激酶（PK） 分离胶和 4%浓缩胶在 4℃层析柜中进行活性电泳实 测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京）测 验，100 V 恒压 7 h，电泳结束后经孵育、考马斯亮蓝 定羊肉 PK 活力，使用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。 染色、脱色完成实验，使用凝胶成像系统照相，Phoretix PK 活力定义为每 g 组织蛋白每 min 将 1 μmol 的磷 1D 软件进行条带分析。 酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸为一个酶活力单位， 1.2.8 肌原纤维小片化指数（MFI） 参照 Culler[11] 单位为 U·gpro-1。 的方法并稍作调整。准确称取 1.00 g 样品，加入 10 mL 1.2.3 乳酸脱氢酶活力 将制备好的 10%组织匀浆 预冷（4℃）的 MFI 缓冲液（100 mmol·L-1 KCl，20 -1 -1 -1 液用生理盐水稀释 1 000 倍，取 0.01%组织匀浆液 mmol·L K2HPO4 ，1 mmol·L EDTA，1 mmol·L -1 100 μL，采用乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（南 MgCl2，1 mmol·L NaN3，pH 7.1），高速均浆 3 次， 京建成生物工程研究所，南京）测定羊肉乳酸脱氢 每次 30 s，中间间隔 1 min。匀浆后 4℃、3 000×g 离 酶活力，使用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。LDH 活 心 15 min，弃去上清，将沉淀用 10 mL 预冷的 MFI 力定义为每 g 组织蛋白与基质作用 15 min 后反应 缓冲液悬浮，4℃、3 000×g 离心 15 min。弃去上清， 体系中产生 1 μmol 丙酮酸为一个酶活力单位，单 用 2.5 mL 预冷后的 MFI 缓冲液将沉淀充分悬浮后过 位为 U·gpro-1。 20 目纱布除去结缔组织，再加 2.5 mL MFI 缓冲液清 1.2.4 肌糖原含量 采用蒽酮比色法测定羊肉肌 洗离心管，使肌原纤维通过筛孔。用双缩脲法测定该 糖原含量。肉样经 0.86%生理盐水漂洗去除血水后 悬浮液蛋白浓度，然后用 MFI 缓冲液调整悬浮液蛋白 用滤纸吸干，直至滤纸上无印迹为止，准确称量 85 浓度为（0.5±0.05）mg·mL-1，在 540 nm 测吸光度，将 mg 肉样（避免脂肪）于玻璃试管中，加入 255 μL 所得结果乘以 200 即为 MFI 值。 NaOH 溶液，煮沸 20 min 后用流水冷却制成糖原水 1.3 数据处理 解液，再在该试管中加入 1.36 mL 双蒸水稀释得到 试验结果用 SPSS19.0 和 Excel 进行处理，不同 5%肌糖原检测液。空白管中加入 1 mL 双蒸水，2 mL 处理组间采用独立样本 T 检验进行差异显著性分 显色液；标准管中加入 0.01 mg·mL-1 葡萄糖标准液， 析，同一处理组的不同时间点之间采用 F 检验进行 2 mL 显色液；测定管中加入 0.9 mL 双蒸水，0.1 mL 差异显著性分析，采用邓肯式多重比较法进行多重 的 5%糖原检测液，2 mL 显色液。各管混匀后用沸 比较分析，显著水平为 P＜0.05。结果以平均值±标 水煮沸 5 min，冷却后于 620 nm 波长测定各管 OD 准差表示。 值即可。 2 结果 1.2.5 乳酸含量 将羊肉样品在预冷的生理盐水中 漂洗，去除肉样中的血液，用滤纸吸干血水，准确称 2.1 不同贮藏温度对肌肉糖酵解的影响 取 0.5 g 肉样，加入 4.5 mL 的 0.86%生理盐水后匀浆， 2.1.1 对pH值的影响 宰后成熟过程中 pH 逐渐降 制得 10%的组织匀浆液待用，将此组织液稀释 2 倍后 低，在达到极限 pH 后，pH 逐渐增加（图 1）。宰 采用乳酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，南 后 6 h、3 d、5 d 冰温组 pH 显著高于冷藏组（P＜ 京）测定羊肉乳酸含量，使用 BCA 试剂盒测定蛋白 0.05），宰后 7 d 冷藏组 pH 显著高于冰温组（P＜ 浓度。 0.05）。冷藏组 pH 于宰后 3 d 内显著降低，3—5 d 1.2.6 pH 使用便携式 pH 计（Testo 205，德图，德 时 pH 差异不显著，3 d 达到极限 pH 值 5.63；冰温 国）进行测定，探头插入深度为 2 cm，连续测定 3 次， 组于宰后 7 d 达到极限 pH 5.79，两组极限 pH 差异 结果取平均值。 不显著（P＞0.05）。 1.2.7 μ-/m-钙蛋白酶活力 参照 Kadee[9]、黄峰[10] 2.1.2 对肌糖原含量的影响 宰后成熟过程中肌糖 等的方法，钙蛋白酶活力的测定采用酪蛋白酶底物酶 原含量逐渐降低后趋于稳定（图 2）。宰后成熟过程 原分析方法。准确称取 1.00 g 肉样加入 3 mL 抽提液 中冷藏组与冰温组肌糖原含量差异不显著。冷藏组肌 （100 mmol·L-1 Tris base，10 mmol·L-1 EDTA，0.05% β- 糖原含量于宰后 0.5—12 h 内显著降低，宰后 12—24 h

3 期 李培迪等：冰温贮藏对宰后肌肉成熟进程的影响 557

6.8 a 肌糖原含量差异不显著，宰后 肌糖原含量显著低 冷藏组 Refrigeration 3 d b 6.6 冰温组 Controlled freezing point 于 24 h，5 d 后肌糖原含量趋于稳定。冰温组肌糖原含 A * 6.4 c 量于宰后 0.5—12 h 显著降低，12—24 h 肌糖原含量差 6.2 B 异不显著，之后 5 d 内肌糖原含量显著降低，7 d 后肌 d * 6.0 * * E E C de ef ef 糖原含量趋于稳定。 5.8 D 2.1.3 对乳酸含量的影响 宰后成熟过程中乳酸含 5.6 E ef F f 量先蓄积后稳定最后降解（图 ）。宰后 、 、 F 3 2 h 6 h 12 5.4 0.5 h 2 h 6 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d 9 d h、24 h 冷藏组乳酸含量显著高于冰温组，宰后 9 d 冰 贮藏时间 Storage time 温组乳酸含量显著高于冷藏组。冷藏组宰后 6 h 内乳 酸含量显著增加，6—24 h 乳酸含量差异不显著，3 d 图中不同大写字母表示冷藏组不同成熟时间点的结果差异显著（P＜ 0.05），不同小写字母表示冰温组不同成熟时间点的结果差异显著(P＜ 时乳酸含量显著低于 24 h，3—5 d 乳酸含量差异不显 0.05)。图中*表示宰后同一成熟时间点冰温组与冷藏组的结果差异显著 （P＜0.05）。下同 著，之后乳酸含量显著降低。冰温组宰后 2 h 乳酸含 Values with different capital letters show significant difference in the results 量显著低于 0.5 h，2—24 h 乳酸含量显著增加，24 h—5 of different mature time of refrigeration group (P＜0.05), while values with different lowercases show significant difference in the results of different d 乳酸含量差异不显著，之后乳酸含量显著降低。 mature time of controlled freezing point group (P ＜ 0.05). *shows significant difference in the results between controlled freezing point group 2.1.4 对丙酮酸激酶活力的影响 不同贮藏温度处 and refrigeration group at the same time of post-mortem (P＜0.05). The 理组宰后成熟过程中丙酮酸激酶活力先降低后稳定 same as below （图 4）。宰后 2 h、24 h 冰温组丙酮酸激酶活力显著 图 1 不同贮藏温度对肌肉 pH 的影响 高于冷藏组（P＜0.05）。冷藏组丙酮酸激酶活力在宰 Fig. 1 Changes of muscle pH at post-mortem at different 后 12 h 内显著降低（P＜0.05），从宰后 12 h 起趋于 storage temperature 稳定。冰温组丙酮酸激酶活力在宰后 6 h 内显著降低，

) -1 Glycogen content of muscle (mg·g 肌糖原含量

图 2 不同贮藏温度对肌肉肌糖原含量的影响 Fig. 2 Glycogen content of muscle at post-mortem in different storage temperature

宰后 6—24 h 差异不显著（P＞0.05），于宰后 3 d 起 宰后 12 h 内显著增加（P＜0.05），在宰后 12 h 达到 趋于稳定（P＜0.05）。 最高活力，于 24 h 之后乳酸脱氢酶活力逐渐降低，宰 2.1.5 对乳酸脱氢酶活力的影响 宰后成熟过程中 后 7 d 起乳酸脱氢酶活力趋于稳定。冰温组乳酸脱氢 乳酸脱氢酶活力先增加后降低最后趋于稳定（图 5）。 酶活力逐渐增加，在宰后 12 h 达到最大活力，之后在 宰后 6 h、12 h、24 h、5 d，冷藏组乳酸脱氢酶活力显 宰后 3 d 内逐渐降低，宰后 5 d 乳酸脱氢酶活力显著高 著高于冰温组（P＜0.05）。冷藏组乳酸脱氢酶活力于 于宰后 3 d，宰后 7 d 起乳酸脱氢酶活力趋于稳定。

558 中 国 农 业 科 学 49卷

3.0 冷藏组 Refrigeration * * * 冰温组 Control freezing point A A A 2.5 b a a B a * B C c C 2.0 D d * e g f 1.5 E Lactic acid content

1.0 乳酸含量 0.5

0 0.5 h 2 h 6 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d 9 d 贮藏时间 Storage time

图 3 不同贮藏温度对肌肉乳酸含量的影响 Fig. 3 Lactic acid content of muscle at post-mortem in different storage temperature

7000 冷藏组 Refrigeration A a 冰温组 Control freezing point 6000

5000 * b 4000 B C c Pyruvate kinase activity 3000 *c D c 2000 D D D D D D d d d 1000 d

丙酮酸激酶活力 0 0.5 h 2 h 6 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d 9 d 贮藏时间 Storage time

图 4 不同贮藏温度对肌肉丙酮酸激酶活力的影响 Fig. 4 Pyruvate kinase activity of muscle at post-mortem at different storage temperature

Lactic dehydrogenase activity 乳酸脱氢酶活力

图 5 不同贮藏温度对肌肉乳酸脱氢酶活力的影响 Fig. 5 Lactic dehydrogenase activity of muscle at post-mortem in different storage temperature

3 期 李培迪等：冰温贮藏对宰后肌肉成熟进程的影响 559

2.2 不同贮藏温度对肌肉肌原纤维蛋白降解的影响 高于冰温组（P＜0.05），宰后 12 h、24 h、5 d、7 2.2.1 对肌肉μ-/m-钙蛋白酶活力的影响 宰后 d 冰温组 μ-钙蛋白酶活力显著高于冷藏组（P＜ 成熟过程中 μ-钙蛋白酶活力先增加后降低（图 6、 0.05）。成熟过程中，冷藏组 m-钙蛋白酶在宰后第 7）。冷藏组宰后 6 h 内 μ-钙蛋白酶活力显著升高， 9 天发生了降解，冰温组 m-钙蛋白酶活力没有发生 之后活力快速下降，宰后 9 d 时失去活力。冰温组 显著变化（图 6）。 宰后 12 h 内 μ-钙蛋白酶活力显著升高，之后活力 2.2.2 对肌肉 MFI 的影响 宰后成熟过程中 MFI 逐 逐渐降低，在宰后 9 d 仍有活力。冷藏组、冰温组 渐增加（图 8）。宰后 6 h、12 h、3 d、5 d、7 d、9 d μ-钙蛋白酶分别于宰后 6 h、12 h 达到最大活力， 冷藏组 MFI 值显著高于冰温组（P＜0.05）。冷藏组 两组 μ-钙蛋白酶相对最大活力差异不显著（图 7， MFI 于宰后 6 h、5 d、9 d 显著增加，冰温组 MFI 于 P＞0.05）。宰后 2 h 冷藏组 μ-钙蛋白酶活力显著 宰后 5 d、9 d 显著增加。

图 6 不同贮藏温度下肌肉钙蛋白酶活性电泳图 Fig. 6 Casein zymograph profiles showing the activity of calpain of mutton at post-mortem in different storage temperature

-calpain relative activity μ 钙蛋白酶活力 - μ

图 7 不同贮藏温度对肌肉 μ-钙蛋白酶活力的影响 Fig. 7 μ-calpain relative activity of muscle at post-mortem in different storage temperature

径，肌糖原作为糖酵解底物，含量逐渐下降直至糖 3 讨论 原磷酸化酶失活。肌糖原含量的变化受遗传和环境 3.1 不同贮藏温度对宰后肌肉糖酵解的影响 多种因素的影响，如肌纤维类型、环境温度等。冷 动物被屠宰后，糖酵解成为胴体的主要代谢途 藏组肌糖原含量从宰后 5 d 开始保持不变，冰温组

560 中 国 农 业 科 学 49卷

* 80 冷藏组 Refrigeration A 冰温组 Control freezing point * 75 * B B 70 a

65

60 b * C * 55 C C C bc cd cde 50 D e de D e e 45

40 0.5 h 2 h 6 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d 9 d 贮藏时间 Storage time

图 8 不同贮藏温度对肌肉肌原纤维小片化指数的影响 Fig. 8 Myofibrillar fragmentation index of muscle at post-mortem in different storage temperature

延缓至宰后 7 d 糖原含量维持不变，表明冰温贮藏 酸含量于宰后 6 h 积累到最大值，冰温组乳酸含量 可以减缓肌糖原的消耗速率。哺乳动物宰后初始肌 持续增加至宰后 24 h 达到最大值，表明冰温贮藏可 糖原含量不低于 6 mg·g-1 才能达到正常的极限 pH。 以延迟宰后乳酸的积累。宰后僵直期间乳酸的积累 本研究中宰后 0.5 h 羊背最长肌中肌糖原含量达到 会对肉品质产生消极影响[20]，乳酸大量生成会造成 6.48 mg·g-1，两处理组极限 pH 差异不显著，表明冰 冷却肉保水性下降，本研究中宰后 2 h、6 h、12 h、 温虽然会减缓肌糖原的分解，但并未引起极限 pH 24 h 冰温组乳酸含量显著低于冷藏组，表明冰温贮 的变化。pH 是判断成熟进程的重要指标之一，当达 藏可能有利于增加肉的保水性。LDH 催化丙酮酸生 到极限 pH 时，胴体进入宰后僵直最大化阶段[12]。 成乳酸的反应是可逆的，随着乳酸含量的增加，会 本研究中，冷藏组在宰后 3 d 达到极限 pH，冰温组 负反馈抑制 LDH 活力[21]，这可能是 LDH 活力在宰 则延缓至宰后 7 d，表明冰温贮藏对成熟进程有延迟 后 24 h 开始下降的原因之一[22]。在糖酵解过程中， 作用。 冷藏组肌糖原的消耗速率和乳酸的累积都比冰温组 随着糖酵解的进行，乳酸含量逐渐积累后趋于 快，这说明温度可以影响肌肉糖酵解进程。综合结 稳定，导致 pH 逐渐降低后趋于稳定[13]。温度能够 果分析，在本试验条件下，冰温贮藏延迟宰后成熟 通过调节糖酵解酶活力影响宰后肌肉糖酵解[14]，主 进程 2 d 左右。 要涉及酶活性的增减、酶浓度或分泌量的变化、酶 3.2 不同贮藏温度对宰后肌肉肌原纤维蛋白降解的 的表达类型及细胞内环境和组成的改变等[15]。丙酮 影响 酸激酶（PK）催化磷酸烯醇式丙酮酸和 ADP 转化 肌肉成熟过程中，钙蛋白酶降解肌原纤维蛋白能 为 ATP 和丙酮酸，是糖酵解的限速酶之一，丙酮酸 改善嫩度 [23]，钙蛋白酶活力与肌原纤维小片化指数 激酶活力反映总的代谢能力[16]。乳酸脱氢酶（LDH） （MFI）呈正相关[24]。Rhee 等[5]研究环境温度对宰后 催化丙酮酸生成乳酸，作为糖酵解过程的最后调控 早期糖酵解速率和钙蛋白酶活力的影响，结果表明成 酶，其活力的大小反映无氧代谢能力的强弱[17]。本 熟温度升高会加快糖酵解的速率和钙蛋白酶活力的变 研究中，乳酸含量呈现先蓄积后稳定最后降低，这 化。Whipple 等[25]报道指出宰后相对较高的胴体温度 与 Blixt 等[18]的研究结果一致。LDH 催化丙酮酸生 和低的 pH 会促进肌浆中钙离子的释放，进而提高钙 成乳酸，宰后早期 LDH 活力快速增高[19]，使乳酸 蛋白酶活力。Taylor 等[26]研究发现 MFI 反映了肌节 I 含量也相应增加。宰后 6 h、12 h、24 h、5 d 冷藏组 带附近关键细胞骨架蛋白的降解程度。MFI 越大，表 LDH 活力显著高于冰温组，相应地，宰后 6 h、12 h、 明肌原纤维内部结构完整性破坏的程度就越大。冷藏 24 h 冷藏组乳酸含量也显著高于冰温组。冷藏组乳 组宰后 pH 快速下降，激活 μ-钙蛋白酶，其发生自溶

3 期 李培迪等：冰温贮藏对宰后肌肉成熟进程的影响 561

后具有水解肌原纤维蛋白的活力，μ-钙蛋白酶活力的 [6] Marsh B B, Lochner J V, Takahashi G, Kragness D D. Effects of early 下降表明其在水解蛋白质中起作用。冰温组 μ-钙蛋白 post-mortem pH and temperature on beef tenderness. Meat Science, 酶的激活及失活均慢于冷藏组，这与 MFI 的变化相对 1981, 5(6): 479-483. 应，说明冰温能够延长 μ-钙蛋白酶存活时间，有助于 [7] Liu Q, Kong B, Han J, Chen Q, He X. Effects of superchilling and 延缓肉品开始出现腐败的时间。在成熟后期冷藏组的 cryoprotectants on the quality of common carp (Cyprinus carpio) MFI 显著高于冰温组，这可能是因为冷藏组肌肉 pH surimi: Microbial growth, oxidation, and physiochemical properties. 低于冰温组，促使肌浆网中释放大量的钙离子，激活 LWT - Food Science and Technology, 2014, 57(1): 165-171. 并提高 μ-钙蛋白酶活力使冷藏组的嫩化早于冰温组。 [8] Duun A S, Hemmingsen A K T, Haugland A, Rustad T. Quality 冰温组 m-钙蛋白酶的活力在宰后成熟过程中没有发 changes during superchilled storage of pork roast. LWT - Food 生显著变化，说明 m-钙蛋白酶仍保持着结构完整性， Science and Technology, 2008, 41(10): 2136-2143. 冷藏组 m-钙蛋白酶于宰后第 9 天发生降解，这可能是 [9] Kadee A P J R, Kevin K W W. Casein Zymography: A method to 因为在宰后 9 d 冷藏组羊肉中蓄积了足够多的钙离子 study μ-Calpain, m-Calpain, and their inhibitory agents. Archives of 使 m-钙蛋白酶发生了自溶并降低了活力[27]。 Biochemistry and Biophysics, 1995, 319(1): 211-216. [10] 黄峰. 细胞凋亡效应酶在牛肉成熟过程中的作用机制研究[D]. 南 4 结论 京: 南京农业大学, 2012. 冰温处理不会造成肌糖原含量和极限 pH 的显著 Huang F. The role of effector caspases during postmortem aging of 变化，但可以延缓宰后肌糖原的消耗和乳酸的积累。 beef muscle [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2012. (in 与冷藏组相比，肌糖原的消耗延长 2 d 左右，乳酸最 Chinese) 大积累量的到来延长 1 d 左右。冰温减缓丙酮酸激酶 [11] Culler R D, Smith G C, Cross H R. Relationship of myofibril 和乳酸脱氢酶活力的变化，进而延缓糖酵解进程。冰 fragmentation index to certain chemical, physical and sensory 温可以延缓宰后肌肉糖酵解速率 1—2 d，冰温组成熟 characteristics of bovine longissimus muscle. Journal of Food Science, 9 d 内 μ-钙蛋白酶一直具有活性。因此，冰温贮藏可 1978, 43:1177-1180. 以延迟宰后肌肉成熟进程 1—2 d。 [12] 南庆贤. 肉类工业手册. 北京: 中国轻工业出版社, 2009: 141-143. Nan Q X. The Meat Industry Handbook. Beijing: Chinese Light References Industry Press, 2009: 141-143. (in Chinese) [1] 孙天利. 冰温保鲜技术对牛肉品质的影响研究[D]. 沈阳: 沈阳农 [13] Ryu Y C, Choi Y M, Kim B C. Variations in metabolite contents and

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562 中 国 农 业 科 学 49卷

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中国农业科学 2016,49(3):563-572 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.014

鸡生殖干细胞中 Piwi 基因的干涉效率

李志腾，常国斌，徐 璐，马 腾，陈 静，陈 蓉，王洪志，刘 璐，徐 琪，陈国宏

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009）

摘要：【目的】针对禽类干细胞研究中，存在转染效率与干涉效率低下的问题，通过比较不同干涉方式对鸡原 始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）中 Piwi 基因的干涉效果，探讨提高禽类生殖干细胞干涉效率的有效 方法。为进一步研究 Piwi 基因参与干细胞自我更新、RNA 沉默以及转录后调控过程等生物学功能研究奠定基础。【方 法】根据已建立的原代细胞分离技术，分别从健康鸡群的 10 日龄和 4 日龄鸡胚中分离成纤维细胞（chicken embryo fibroblast, CEF）与生殖脊，其中 CEF 作为 PGCs 细胞的饲养层，生殖脊经 Trypsin-EDTA 室温下消化获得 PGCs 细 胞，并通过形态学、化学方法（PAS 糖原染色、AKP 活性检测）和免疫学方法（TERT 抗体、SSEA-1 抗体）对其进行 鉴定。根据 Genbank 公布的鸡 Piwi 基因的 mRNA 序列（NM_001098852），利用在线软件分别靶向不同位点设计合成得 到 3 个小片段的 stealth siRNAs，并将通用无义序列 BLOCK-iTTM Alexa Fluor® Red Fluorescent Oligo 作为荧光 素标记的阴性对照 siRNA。同时，在线设计三条干扰序列和一条非特异性阴性对照序列，将其插入线性化空载体 pRNA-U6.1，构建不同的 shRNA 干涉载体。分别采用不同类型的转染试剂将构建好的 siRNA 和 shRNA 转染 PGCs 细胞。 首先利用通用无义 siRNA 以及仅带有 GFP 荧光标记基因的 shRNA 载体作为阴性对照，检测 siRNA 和 shRNA 转染效率， 确定最佳转染条件。其次，将试验组 siRNA 和 shRNA 在优化条件下转染 PGCs 细胞，分别收集转染了 24、48、72 和 144 h 这 4 个时间点的细胞，提取各个时间段的总 RNA，采用实时荧光定量 PCR 技术检测 Piwi 基因 mRNA 表达水平， 并用 SPSS 软件分析不同处理组的差异。【结果】在对原代分离的 PGCs 细胞进行了形态学、化学以及免疫学方法鉴定 后，确认其所获得的细胞为 PGCs 细胞且状态良好。根据不同的转染试剂量与 siRNA 或 shRNA 载体量的配比，得出 siRNA 转染最优条件为 siRNA﹕LipofectamineTM 2000=50 pmol﹕2 μL; shRNA 转染最优条件为 shRNA﹕X-Treme GENE HP DNA Transfection Reagent=500 ng﹕1.5 μL。在以上最优转染条件下，将试验组 siRNA 和 shRNA 分别转染第二代 PGCs 细胞。发现在 siRNA 干涉组中，阴性 siRNA 组和空白组相比，Piwi 基因表达量在 24、48、72 和 144 h 差异均不显著 （P＞0.05）；而 3 个试验组 siRNA 与阴性对照组相比，在 24、48 和 72 h 的 Piwi 基因表达量均呈现显著下降（P＜ 0.05），但在 144 h 时表达差异不显著（P＞0.05）。在 shRNA 干涉组中，空白组和阴性对照组相比，Piwi 基因表达量 在 4 个时间点上差异均不显著（P＞0.05）；而 3 个试验组与阴性对照组相比，Piwi 基因表达量在 4 个时间点上均显 著下降（P＜0.05）。与siRNA 干涉试验组相比，shRNA 载体表现出更强及更长时间的稳定抑制 Piwi 基因的效果。【结 论】siRNA 与 shRNA 均能较好抑制目的基因的 mRNA 表达，不同干涉效果表明采用 shRNA 载体具有更好及更长时间的 抑制作用，这为 RNAi 技术在家禽生殖干细胞中的应用研究提供基础资料。 关键词：Piwi 基因；siRNA；shRNA；PGCs；RNAi

Interference Efficiency of Piwi Gene Expression in the Chicken Germ Stem Cells

LI Zhi-teng, CHANG Guo-bin, XU Lu, MA Teng, CHEN Jing, CHEN Rong, WANG Hong-zhi, LIU Lu, XU Qi, CHEN Guo-hong

(College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu)

收稿日期：2015-06-05；接受日期：2015-12-29 基金项目：国家自然科学基金（31372297，31301966）、国家科技支撑计划项目（2015BAD03B03） 联系方式：李志腾，E-mail：[email protected]。通信作者常国斌，E-mail：[email protected]；通信作者陈国宏，E-mail：[email protected]

564 中 国 农 业 科 学 49卷

Abstract: 【Objective】Solving the low transfection efficiency and interference efficiency in poultry stem cell is a big challenge so far. This study was designed to compare the interference effects on Piwi gene expression in chicken primordial germ cells (PGCs) using different ways, aiming to explore effective methods to interfere the poultry stem cells, which is a fundamental work for the study of the self-renewal of stem cell, RNA silencing and post-transcriptional regulation. 【Method】According to the techniques of the separation of primary germ cell, the authors selected 10th and 4th days fertilized eggs post incubation to separate the chicken embryo fibroblast cells(CEF) and germinal ridge, respectively; Herein, the CEF cells were taken as a feeder layer and the PGCs cells were treated by Trypsin-EDTA. The PGCs cells were further identified by the morphology, chemical method and immunology assay. According to the mRNA sequence of chicken Piwi gene published by Genbank (NM_001098852), three positive siRNAs were chemically synthesized and the BLOCK-iT™ Alexa Fluor® Red Fluorescent Oligo was as a negative control. Simultaneously, three interfering vectors of shRNA were constructed using the free carrier of pRNA-U6.1, and an empty vector with GFP fluorophore was as a negative control. Afterwards, the transfection efficiency was detected by the siRNA and shRNA negative control using different types of transfection reagent to optimize the condition, and extracted the RNA of PGCs cells at 24, 48, 72 and 144 h post transfection and analyzed differential expressions of Piwi gene with RT-PCR techniques. All data were analyzed by the SPSS software.【Result】 With the premise of well identification of the PGCs cells, siRNA and shRNA were successfully transfected into the cells under the optimized conditions with 50 pmol siRNA and 2 μL Lipofectamine TM 2000 for siRNA transfection group and 500 ng shRNA and 1.5 μL X-Treme GENE HP DNA Transfection Reagent for shRNA transfection group. Compared to the blank group, the Piwi expressions of the negative control had no significant difference at the four time points (24,48,72 and 144 h) in siRNA and shRNA intervention group (P＞0.05); Compared to the negative control and the blank group, Piwi gene expressions were significantly down-regulated in experimental groups at the first three time points in siRNA intervention group, while were significantly down-regulated at all of time points in the shRNA intervention group (P＜0.05).【Conclusion】Collectively, the interference effects on Piwi gene expression in chicken PGCs were compared by siRNA and shRNA RNAi technology, and indicated that the shRNA vector had higher and more stable interference efficiency, which help to provide some basic information for future research of RNAi technology. Key words: Piwi gene; siRNA; shRNA; PGCs; RNAi

基因，均造成精子形成受阻，表现为雄性不育[8-9]。Gao 0 引言 等研究发现 Piwil1、Piwil3、Piwil4 基因与结肠癌的发 【研究意义】Piwi 基因是 Argonaute 家族的一个 生、发展显著相关，且 Piwil1 基因有望成为结肠癌预 亚家族，参与干细胞自我更新、RNA 沉默以及转录后 后的重要分子标记物[10]。RNAi 在自然界中广泛存在， 调控过程[1]。Piwi 基因在原始生殖细胞（primordial 目前已经在植物、真菌、囊虫、果蝇、线虫、鼠早期 germ cell，PGCs）中为特异性表达，且容易体外获得 胚胎细胞、家蚕等不同种属的生物体中得到证实[11-13]。 与培养，在生殖干细胞的维持和精子发生方面发挥着 由于 RNAi 可以作为一种简单、有效的代替基因剔除 重要作用[2]。鸡 PGCs 具有发育的多潜能性，在体外 的遗传工具，正在功能基因组学领域掀起一场真正的 可以诱导成多种类型的细胞，在转基因、家禽育种以 革命[14-15]。【本研究切入点】在家禽干细胞研究中， 及胚胎发育基础研究等方面具有广阔的应用前景[3-4]。 普遍存在转染效率与干涉效率低下的问题，如何提高 RNA 干涉（RNA interference，RNAi）是一种由双链 禽类生殖干细胞干涉效率成为困扰禽类生殖相关基因 RNA 引发的序列特异性的转录后基因沉默，它是沉默 功能研究的瓶颈。【拟解决的关键问题】本研究分别 基因表达的一种有效手段[5]。本研究通过比较两种干 通过化学合成 siRNA 以及构建 shRNA 载体，比较 涉方式，特异性沉默 Piwi 基因，为探索 Piwi 基因在 siRNA 与 shRNA 载体对鸡原始生殖细胞（PGCS）中 家禽生殖干细胞中的功能奠定基础。【前人研究进展】 Piwi 基因的干涉效果，以期为 Piwi 基因功能的研究以 Piwi 基因是由 Lin 等首先在果蝇的生殖干细胞（GSCs） 及 RNAi 干涉技术在家禽生殖干细胞中的应用研究提 中发现的，对 GSCs 的自我更新具有重要作用[6]。在 供新的依据。 果蝇卵巢中，Piwi 基因同时表达于干细胞和体细胞中， 1 材料与方法 具有内源性调节和外源性调节的双重功能[7]。有研究 表明，在 Piwi 突变体中，生殖细胞的维持和分化异常， 1.1 试验材料与试剂 导致了雄性不育；敲除小鼠的 Miwi、Mili 或 Miwi2 受精蛋取自中国农业科学院家禽研究所如皋黄鸡

3 期 李志腾等：鸡生殖干细胞中 Piwi 基因的干涉效率 565

第四世代鸡群，在温度为 38℃、相对湿度为 60% 条 表 1）。通用无义序列 BLOCK-iTTM Alexa Fluor® Red 件下孵化。孵化分期按 Hambugrer 等 [16-17]建立的方法 Fluorescent Oligo 为荧光素标记的阴性对照 siRNA，该 划分。本试验均在动物遗传繁育与分子设计江苏省重 序列与任何已知基因均不同源。 点实验室完成。 1.2.2 shRNAs 的设计与合成 根据 Genbank 中 IgM-FITC 羊抗鼠二抗购自 Santa Cruz 公司；兔端 Piwi 基因的 mRNA 序列，依据 shRNA 设计原则， 粒酶 TRET 抗体、IgG(H+L)-CY3 羊抗兔二抗购自北 设计 3 条干涉序列和 1 条非特异性阴性对照序列。 京博奥森生物技术有限公司；碱性磷酸酶染液购自碧 shRNA 插入表达的片段由互补的寡核苷酸链退火生 云天生物技术公司；BLOCK-iTTM Alexa Fluor® Red 成，通过 Hind III 以及 BamH I 双酶切的线性化空载 Fluorescent Oligo、LipfectamineTM 2000、Opti-MEM® 体 pRNA-U6.1/Neo 连接，经测序与 PCR 鉴定正确 I Reduced Serum Medium 购自 Invitrogen 公司。 后，得到 3 种不同的干涉载体（由上海闪晶分子生 1.2 siRNA 与 shRNA 的合成 物科技有限公司合成），如表 2。选用的 siRNA 表 1.2.1 siRNAs 的设计与合成 根据 Genbank 中鸡 达载体 pRNA—U6.1/Neo 含 neo 基因和 GFP 荧光标 Piwi 基因的 mRNA 序列（NM_001098852）分别靶向 记基因，可使 shRNA 稳定表达，并可对转染效率进 设计得到 3 个 stealth siRNAs（Invitrogen 公司合成， 行观测。

表 1 Stealth siRNAs 序列 Table 1 Sequences of Stealth siRNAs 名称 Name 正义链/反义链 Sense/ Anti-sense 序列 Sequence (5′-3′) siR-1 S CAAUCCUCAGUUUGCUGAUUGGUCA

A UGACCAAUCAGCAAACUGAGGAUUG siR-2 S CAGUGCGUGGUUGCUCGUACUUUAA

A UUAAAGUACGAGCAACCACGCACUG siR-3 S GGGAAUGGUUCAAGUGGAAUAAGUA

A UACUUAUUCCACUUGAACCAUUCCC

表 2 shRNA 序列插入片段 Table 2 Insert sequence of the shRNA 名称 Name 长度 Length (bp) 序列 Sequence (5′-3′)

ShR-1 45 CUGUCUUUAGCAGAUAGGGCUCUUGACCCUAUAUGCUAAAGACAG

ShR-2 45 CAUACAGAGUUGAUGACAUUCAAGAGAUGUCAUCAACUCUGUAUG

ShR-3 45 AUUGUGGAUGGGCUCAAAGUCAAGAGCUUUGAGCCCAUCCACAAU

ShR-NC 49 GUUCUCCGAACGUGUCACGUUUCAAGAGAACGUGACACGUUCGGAGAAC

1.3 鸡 PGCs 的分离、培养与鉴定 接种至饲养层上，2%鸡血清培养基常规培养 24 h 后 1.3.1 饲养层的制备 使用胰酶连续消化法制备鸡 换培养液，之后根据生长情况进行换液。PGCs 原代 胚成纤维细胞。选取生长良好的第三代鸡胚胎成纤维 培养 3—5 d 后可形成典型的 EG 样细胞集落。因此， 细胞（chicken embryonic fibroblast，CEF），加入含 在接种后的 5—7 d 进行 PGCs 的传代。待 PGCs 培养 有 10 μg·mL-1 丝裂霉素 C 的 2%鸡血清培养基培养液， 到第二代时，进行糖原染色、碱性磷酸酶活性检测， 置 37℃培养箱中温育 2 h，以 3×104 个/cm2 密度接种 胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA-1）检测。试剂盒 12 孔板中，培养 24 h 后，作饲养层细胞备用。 均购自南京建成科技有限公司，严格按照说明书进行 1.3.2 鸡 PGCs 的分离、培养 EDTA-胰蛋白酶法分离 操作。 PGCs 孵化至 4 d 的受精卵，取下鸡胚生殖脊，经过 1.4 细胞转染 Trypsin-EDTA 室温下消化后，调整细胞密度到 105个/mL 在转染前 24 h 时，将第二代生长状态良好的 PGCs

566 中 国 农 业 科 学 49卷

细胞以 2×105 个/cm2 的密度接种到含有饲养层的 12 的鸡原始生殖细胞，Trizol 法提取总 RNA，采用 孔细胞培养板中，更换不含抗生素的完全培养基。 RT-PCR 法，进行常规 PCR，检测目的片段条带。 1.4.1 siRNAs 的转染 转染条件及转染过程。用 1.6 Real-Time qPCR 检测 LipofectamineTM 2000 和 RNAiMax 转染试剂进行 收集转染 siRNA 以及 shRNA 质粒后 24、48、72 siRNA 的转染。采用不同的 siRNA 浓度以及不同的转 和 144 h 的细胞提取总 RNA，采用 Real-Time qPCR 染试剂量分别进行转染，siRNA 浓度梯度为 0、20、 技术检测 PGCs 中 Piwi 的表达并筛选出干涉效果最佳 50 和 80 pmol，转染试剂浓度梯度为 1、2 和 3 μL。具 的时间点以及沉默效率最高的序列。 体操作如下：将 siRNA 和转染试剂分别加入到 100 μL 1.7 数据分析 的 Opti-MEM® I Reduced Serum Medium 中，轻轻混 荧光定量 PCR 数据运用 2-∆∆Ct 法进行计算，采 匀，室温静置 15 min。混合上述两种液体，混匀，静 用 SPSS16.0 统计软件进行分析。计量资料采用均数 置 15 min，得到转染复合物。更换无血清培养基后加 ±标准差（ X ±SD）表示，采用 ANOVA 单因素方差

入混合液，轻轻混匀。置于含 5% CO2、37℃的细胞 分析，利用 LSD 法进行两两比较，显著性水准 培养箱中培养。 α=0.05。 转染效率的检测。用 BLOCK-iTTM Alexa Fluor® 2 结果 Red Fluorescent Oligo 阴性对照 siRNA 转染 PGCs 细 胞，选取 3 个视野，荧光显微镜下观察，分别对阳性 2.1 shRNAs 质粒的 PCR 检测 细胞（即红色荧光）和阴性细胞进行计数，共 100 个。 构建的载体经 PCR 后经 2%琼脂糖凝胶检测，其 转染效率=阳性细胞数/总细胞数×100%。 目的片段均在 300 bp 左右，与预期的结果相符，表明 靶向 Piwi 的 siRNA 转染。根据上述优化条件及转 插入片段正确（图 1）。 染步骤，转染同期培养（第二代）的 PGCs 细胞，设立

空白对照组（siR-BC）、阴性对照组（si-RC）和特异 M shR-1shR-2 shR-3shR-4 性干涉组（siR-1、siR-2、siR-3），每组 4 个孔，置于 bp 细胞培养箱中。分别收集 24、48、72 和 144 h 的细胞。 1000 700 1.4.2 Piwi-shRNA 干涉序列的转染 转染条件与转 500 400 300 染过程。采用转染试剂为罗氏公司的 X-Treme GENE 200 HP DNA Transfection Reagent。将提取的 shRNA 质粒， 100 进行去内毒素处理，调整载体浓度约为 1 μg·μL-1。转 染试剂梯度为：0.5、1、1.5 和 2 μL。具体操作步骤如 下：将不同量的 shRNA 和相应的转染试剂加入到 200 μL optimem 无血清培养基中，温和混匀，室温孵育 20 图 1 shRNA 载体的 PCR 鉴定 min。将转染混合物逐滴加入细胞培养板中，温和混匀， Fig. 1 The appraisal of the vector of shRNA by PCR 置于培养箱内培养 16 h，更换培养基，继续培养。 转染效率的检测。由于 shRNA 干涉载体带有 GFP 2.2 PGCs 的分离和鉴定 标记，故可在荧光显微镜下观察转染 PGCs 的情况。 单个的 PGCs 呈圆形或椭圆形，直径约为 15—25 计算转染效率的方法与 siRNA 类同。 µm，其体积较大，能与 CEF 细胞区分开（图 2）。在 靶向 Piwi 的 shRNA 转染。根据上述优化条件及 体外培养 3—5 d，出现克隆的 PGCs，呈集落状生长， 转染步骤，转染同期培养（第二代）的 PGCs 细胞， 边缘折光性强，细胞界限不明显。 设立空白对照组（sh-BC）、阴性对照组（sh-NC）和 2.2.1 PAS 糖原染色 由于 PGC 细胞中存在着糖原 特异性干涉组（shR-1、shR-2、shR-3），每组设立 4 颗粒，经糖原试剂染色后，细胞被染成暗红色，其细 个孔，置于细胞培养箱中。分别收集 24、48、72 和 胞质中出现颗粒或弥散状红色（图 3）。 144 h 的细胞。 2.2.2 AKP 活性检测 由于未分化的 PGC 具有较高 1.5 CEF 与 PGCs 目的片段常规 PCR 的扩增 的碱性磷酸酶（AKP）活性，经 AKP 试剂染色后，细 取体外分离的第三代鸡胚成纤维细胞，以及传代 胞被染成深棕色，其饲养层呈灰色或不着色（图 4）。

3 期 李志腾等：鸡生殖干细胞中 Piwi 基因的干涉效率 567

AB

A.克隆的 PGCs（400×）；B.单个的 PGCs（400×） A. The cloned of PGCs; B. A single PGCs

图 2 PGCs 的形态学鉴定 Fig. 2 The identification of PGCs morphology

图 3 PGCs 的 PAS 鉴定（200×，400×） Fig. 3 The identification of PAS in PGCs

AB

图 4 PGCs 的 AKP 鉴定（400×，400×） Fig. 4 The identification of AKP in chicken PGCs

2.2.3 TERT 抗体鉴定 由于 PGC 细胞的端粒酶活性 2.3 CEF 与 PGCs 目的基因扩增 较高，经 TERT 抗体检测细胞表面抗原，荧光显微镜 取分离的 CEF 细胞和 percoll 密度梯度离心纯化 下观察到 PGC 细胞为深红色（图 5，A 为暗场，B 为 后的 PGCs 细胞进行常规 PCR，检 测 Piwi 基因的表 明场）。 达情况。如图 7，PGCs 细胞特异性表达，大小约为 2.2.4 SSEA-1 抗体鉴定 以 SSEAs 单克隆抗体为一 2.6 kb。而在 CEF 细胞中未检测到，PCR 结果呈阴 抗，以 FITC 标记的羊抗鼠抗体为二抗，经间接免疫 性。 荧光鉴定，荧光显微镜下 PGC 细胞表面呈绿色荧光 2.4 siRNA 转染效率的检测 （图 6，A 为暗场，B 为明场）。 每孔观察 3 个视野，每个视野 100 个细胞，计数

568 中 国 农 业 科 学 49卷

AB

图 5 PGCs 的 TERT 抗体鉴定（400×） Fig. 5 The identification of TERT(Telomerase reverse transcriptase) in chicken PGCs

图 6 SSEA-1 抗体鉴定（400×） Fig. 6 The identification of SSEA-1(stage-specific embryonic antigens-1) in chicken PGCs

M PGCS PGCS CEF CEF 细胞，计算转染效率。观察发现 X-Treme GENE HP 5000 3000 2000 DNA Transfection Reagent为 1.5 μL 时发绿色荧光细胞 1500 1000 750 数最多，效率接近 21.3%。如图 9，A 为正常视野下 500 的第二代 PGCs；B 为转染后暗视野下的 PGCs。

250 2.6 siRNA 靶向抑制 Piwi 的表达 PGCs 在转染 siRNA 后，利用 Real-Time qPCR 检 100 测 Piwi 基因表达量，处理结果如图 10 所示。阴性对 M Piwi β-actin piwi β-actin 照组（siR-BC）与空白组（siR-NC）相 比，在 24、48、 72 和 144 h 差异不显著（P＞0.05）。3 个试验组（siR-1、 图 7 Piwi 基因特异性检测 siR-2、siR-3）与阴性对照组相比，在 24、48 和 72 h Fig. 7 The detection of Piwi gene specifically 时，Piwi 基因的 mRNA 表达量呈显著降低（P＜0.05）， 表明 3 个特异性 siRNAs 干涉序列均有明显的干涉作 红色荧光细胞，计算转染效率。经观察后发现用 用，但 144 h 干涉作用不显著（P＞0.05）。 LipofectamineTM 2000 转染试剂优于 RNAiMax 试剂。 2.7 shRNA 抑制 Piwi 的表达 就 12 孔板而言，siRNA 为 50 pmol、LipofectamineTM 在转染 shRNA 载体后，收集 24，48，72 和 144 h 2000 为 2 μL 时的转染效率相对较高[18]（图 8-B，C），大 的 PGCs 细胞，提取总 RNA，利用荧光定量 PCR 对 于 80%。在随后 RNA 干涉试验中采用了 LipofectamineTM Piwi 基因的 mRNA 水平进行检测（图 11）。阴性对 2000 的转染试剂。 照组（shRNA-BC）与空白组（shRNA-NC）相比，在 2.5 shRNA 转染效率的检测 各个时间点差异均不显著（P＞0.05）。3 个试验组 利用 shRNA 干涉载体上带有的 GFP 标记，荧光 （shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3）与阴性对照组相比， 显微镜下观察，每孔观察 3 个视野，每个视野 100 个 Piwi 基因的 mRNA 表达量在 4 个时间点上均显著降低

3 期 李志腾等：鸡生殖干细胞中 Piwi 基因的干涉效率 569

A：对照组 PGCs（100×）；B：暗场中转染的 PGCs（100×）；C：混合场中转染的 PGCs（100×） A:PGCs of control group (100×); B: PGCs after tansfected in dark field (100×); C: PGCs after tansfected in mix field (100×)

图 8 LipofectamineTM 2000 试剂转染 PGCs Fig. 8 LipofectamineTM 2000 transfect PGCs

图 9 PGCs 第二代细胞与转染效率检测（100×） Fig. 9 The second generation of PGCs cells and the detection of transfection efficiency

siR-NC siR-BC siR-1 siR-2 siR-3 1.2 a a a a a a a a a a a 1.0

0.8

0.6 b b b

基因相对表达 b b b 0.4 b b Piwi b

Piwi gene relative expression relative gene Piwi 0.2

0 2448 72 144 时间 Time (h) 同组数据后所标字母相异表示差异显著（P＜0.05）。下同 Different letters in the same group represent significant difference between the treatments (P＜0.05). The same as below

图 10 siRNA 干涉后 PGCs 细胞中 Piwi 基因的 mRNA 表达 Fig. 10 mRNA expression of Piwi gene after siRNA interference by q-PCR in PGCs cells

570 中 国 农 业 科 学 49卷

shRNA-1 shRNA-2 shRNA-3 shRNA-NC shRNA-BC 1.5

a a a a a a a a 1.0 b

b

基因相对表达 b 0.5 b b b Piwi b c b

Piwi gene relative expression relative gene Piwi b b c 0 2448 72 144 时间 Time (h)

图 11 shRNA 干涉后 PGCs 细胞中 Piwi 基因 mRNA 的表达 Fig. 11 mRNA expression of Piwi gene after shRNA interference by q-PCR in PGCs cells

（P＜0.05），表明 3 个特异性 shRNAs 干涉序列均有 作用，通过改变转染试剂量和 siRNA 浓度之间的比例 明显的干涉作用。 来优化转染条件。在本试验中，LipofectamineTM 2000﹕siRNA=2 μL﹕50 pmol 时的转染效率较高。本 3 讨论 试验中所合成的 siRNA 均为靶向 Piwi 基因设计的 Piwi 基因首次在果蝇上被发现，在维持睾丸和卵 Stealth siRNA，此类型 siRNAs 是经过化学修饰的长度 巢发育方面扮演重要的角色[2, 19]。本研究以鸡原始生 为 25 bp 的平末端双链 RNA，可以有效地消除在使用 殖细胞为试验对象，通过 RNAi 技术，特异性的沉默 传统 siRNA 的试验中存在着的多种潜在问题，具有稳 Piwi 基因，进一步研究 Piwi 基因在生殖细胞配子形成 定性高、特异性高、基因沉默效率高的特点，且仅有 以及精子发育等方面提供理论基础。 反义链能引起基因沉默，避免了正义链引起的脱靶效 RNA 干扰是 dsRNA 介导的特异性基因表达沉默 应。本研究显示，3 个不同靶向的 Stealth siRNA 均具 现象，其简单、高效的特性已被广泛用于基因功能研 有一定的抑制作用，其中 siR-3 效果更明显。有研究 究。然而，转染效率的高低是直接决定 siRNAs 干扰 表明，RNA 干涉作用一般发生在转染 24 h 后，其沉 效果的前提。目前常用的转染的载体包括病毒性载体 默效果和时间与 siRNA 浓度、细胞率寿命以及靶蛋白 和非病毒性载体两大类。RNAi 技术分为瞬时转染和 的降解率有关[22]。在本研究中，转染 24 h 后出现明显 稳定转染，瞬时转染短暂性影响基因表达，不会造成 抑制作用，48 h 达到高峰，72 h 后开始减弱，144 h 基因的永久缺失，恢复后不影响基因的生理功能[20-21]。 丧失抑制作用，这可能与瞬时转染本身稳定性欠佳， 本研究采用的是非病毒载体进行瞬时转染的。其对基 siRNA 容易在体内降解有关。抑制效应随时间的延长 因的影响是短暂的，不会永久缺失，之后不影响生理 会逐渐衰减，所以不利于进行细胞生物学特性方面的 功能。 检测。因此，需要构建能够稳定抑制目的基因的 本研究中，化学合成的 siRNA 转染所用的转染试 shRNA 质粒表达载体进行进一步研究。 剂为 Invitrogen 公司的阳离子脂质体 Lipofectamine shRNA 是一种用来抑制基因表达的 dsRNA 分子 2000，目前已广泛应用于基因的转染并被大量的试验 或 siRNA 的替代物。它是单链 RNA，借着反向重复 证实对包括干细胞在内的多数细胞类型具有较高的转 序列的特点，在分子内碱基配对，shRNA 一旦形成， 染效率，且在本试验中达到 80%以上的转染效率，充 就被 Dicer 酶加工，随后能够参与基因沉默，与 siRNA 分保证了 siRNA 能有效抑制靶基因的前提条件。然而 情况相似[23]。与 siRNA 类似，shRNA 沉默效率受培 保证脂质体高效转染还需受到一些因素的制约。比如 养基的组成、细胞类型、细胞生长状态、细胞密度以 细胞类型和细胞生长状态，培养基的组成，适宜的密 及针对 Piwi 基因的 shRNAs 靶向设计的序列位置、插 度以及 siRNAs 本身的纯度。过低的脂质体和 siRNAs 入序列大小、shRNAs 本身的纯度等有关。本研究所 浓度会降低转染效果，而浓度过高会对细胞产生毒性 采用的转染试剂是 X-Treme GENE HP DNA

3 期 李志腾等：鸡生殖干细胞中 Piwi 基因的干涉效率 571

Transfection Reagent 非脂质体，具有高效转染、低细 activity modulates the number and division rate of gremlins stem cells. 胞毒性、最小脱靶效应等优点。在考虑上述因素的前 Development, 2000, 127(3):503-514. 提下，对转染试剂量与 shRNA 浓度的比例进行优化。 [3] 李碧春, 施青青, 孙敏. 鸡生殖干细胞研究现状与展望. 中国家禽, 有研究显示，用此转染试剂将 pEGFP-N3 基因转染到 2011, 33(11):1-6. 鸡 PGCs 细胞中，效率最高达 16%[24]。本研究的转染 Li B C, Shi Q Q, Sun M. The current status and prospects in germline 试剂均经过 0.2 μm 孔径的膜过滤，无动物来源成分。 stem cell. China Poultry, 2011, 33(11):1-6.(in Chinese) 对 shRNA 与转染试剂的比例进行了梯度试验，确定了 [4] 陈胜锋, 王丙云, 计慧琴.鸡胚胎干细胞及其应用研究进展.动物医 最优转染条件。在转染 48 h 后，其转染效率可达 学进展, 2006, 27(1):9-13. 21.3%。本研究显示，3 组特异性 shRNA 均具有一定 Chen S F, Wang B Y, Ji H Q. Applications and advances in chicken 的抑制作用，其中 shRNA-2 抑制效果更明显；转染 embryonic stem cells. Progress in Veterinary Medicine, 2006, 27(1): 24 h 后出明显抑制作用，48 h 达到高峰，72、144 h 9-13.(in Chinese) 虽有降低但仍然保持较好程度的抑制效果，这可能与 [5] Peters L, Meister G. Argonaute proteins: mediators of RNA silencing. shRNA 可以整合到基因组中有关，进一步表明 Molecular Cell, 2007, 26(5):611-623. shRNAs 载体具有稳定的干涉效果。 [6] Seto A G, Robert E, Lau N C. The coming of age for Piwi proteins. 在采用构建的 shRNA 转染细胞时，尽管笔者对 Molecular Cell, 2007, 26(8):603-609. 转染条件进行了优化，但只得到了 21.3%的转染效 [7] 谢小燕, 裴雪涛. Piwi 家族:干细胞分裂中的重要调控基因.生理科 率。这可能是与选用的转染载体片段较大有关。有 学进展, 2003, 34(2):139-141. 相关研究证实，载体的片段越大，同一条件下，转 Xie X Y, Pei X T. Piwi family: An important gene regulate the stem 染的效果也相对降低[25]。与此同时，得到 21.3%转 cell division. Progress of Physiological Sciences, 2003, 34(2): 染效率是根据转染后发绿色荧光的 PGCs 细胞数与 139-141. (in Chinese). 总的 PGCs 的比值得出的。由于构建的载体是带有 [8] Kuramochi-miyagawa S, Kimura T, Ljirit W, Isobe T, Asada N, Fujita GFP 的标记，其发绿色荧光强度不及 EGFP 的效果， Y, Ikawa M, Iwai N, Okabe M, Deng W, Lin H, Matsuda Y, Nakano T. 所以通过肉眼观测带 GFP 标记的 shRNA 转染的细 Mili, a mammalian member of Piwi family gene, is essential for 胞中发绿色荧光比值可能有一定的偏差，这可能需 spermatogenesis. Development, 2004, 131:839-849. 要使用流式细胞仪进行筛选，才能得出较为精确的 [9] Deng W, Lin H. miwi, a murine homolog of Piwi, encodes a 转染率。通过对两种方法比较，shRNA 比 siRNA 干 cytoplasmic protein essential for spermatogenesis. Developmental 涉效率高且稳定性好，这为研究 Piwi 基因功能以及 Cell, 2002, 2(6):819-830. RNAi 干涉技术在家禽生殖干细胞中的应用提供新 [10] Shen X Y, Liu Y X, Chen H, Zhu S, Zhong X. Correlation between 的资料。 PIWI proteins and prognosis of Colon cancer. Chinese Journal of Gastrointestinal Surgery, 2013, 18(9):530-535. 4 结论 [11] Paddison P J, CaudyA, Hannon G J. Stable suppression of gene （1）建立了 siRNA 和 shRNA 转染禽类胚胎干细 expression by RNAi in mammalian cells. Science, 2002, 99(3): 胞体系。 1443-1448. （2）siRNA 与 shRNA 均具有抑制目的基因的效 [12] Elbashir S M, Martinez J, Pakaniowska A, Lendeckel W, Tuschl T. 果，且 shRNA 抑制时间较 siRNA 时间长。 Functional anatomy of siRNA for mediating efficient RNAi in （3）采用 shRNA 载体可能具有更强且更稳定的 Drosophila Melanogaster embryolysate. Embo Journal, 2001, 20: 抑制作用。 6877-6888. [13] Holen T, Amarzguioui M A, Wiiger M T, Babaie E, Prydz H . References Postional effect of short interferencing RNAs targetingthe human [1] Cox D N, Chao A, Baker J, Chang L, Qiao D, Lin H. A novel class of coagulation trigger tissue factor. Nucleic Acid Research, 2002, 30(8):

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中国农业科学 2016,49(3):573-580 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.015

豆粕与发酵豆粕中主要抗营养因子调查分析

杨玉娟 1,2, 姚怡莎 1, 秦玉昌 2, 邱 静 3, 李军国 1, 李 俊 1, 谷 旭 1

(1 中国农业科学院饲料研究所，北京 100081；2 农业部食物与营养发展研究所，北京 100081；

3 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

摘要：【目的】豆粕是动物饲料的主要原料，但其含多种抗营养因子（anti-nutritional factors, ANF）， 阻碍营养成分的消化、吸收和利用，从而影响动物的生长发育和健康。研究表明豆粕经微生物发酵可有效地降低 抗营养因子含量。但由于发酵工艺、发酵菌种、豆粕本身的因素，不同生产厂家的豆粕及发酵豆粕中各抗营养因 子含量差别较大，现有研究中也少有关于二者中抗营养因子水平的研究报道。为此，抽取了市售的 65 批次豆粕和 54 批次发酵豆粕，对 6 抗营养因子：大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水苏糖、脲酶 进行分析测定，以了解饲料行业使用的豆粕及发酵豆粕中的抗营养因子含量。【方法】用ELISA 法（enzyme-linked immuno sorbent assay）对样品中的大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子含量进行测定，其分析方 法和操作要求均与所购 ELISA 试剂盒的说明相一致，主要过程为：样品前处理、加样、洗板、加酶标试剂、显色、 终止。棉籽糖和水苏糖的检测采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）检测微波 提取的棉籽糖和水苏糖。脲酶分析参照国标方法：加入尿素缓冲液后恒温水浴，一定时间后加入盐酸溶液停止反 应后冷却，清洗试管内容物，以氢氧化钠标准溶液滴定至 pH4.7 后根据体积计算得出脲酶活性。【结果】调查分析 后发现：豆粕和发酵豆粕中的大豆球蛋白平均含量分别为 129.3、54.7 mg·g-1，发酵后大豆球蛋白平均含量降低了

57.7%，根据百分位数法对数据进行统计分析，得出豆粕和发酵豆粕中的大豆球蛋白正常值范围分别为 58.9—P90

-1 -1 -1 （177.3 mg·g ）、ND—P90（109.4 mg·g ）。豆粕中的β-伴大豆球蛋白平均含量为 102.2 mg·g ，而发酵豆粕中的 β- 伴大豆球蛋白为 37.6 mg·g-1，相比豆粕降低了 63.2%，使用相同的数据统计方法判定二者中β-伴大豆球蛋白含量

-1 -1 正常值范围分别为 42.8—P85（147.2 mg·g ）和 ND—P85（61.8 mg·g ）。胰蛋白酶抑制因子在豆粕和发酵豆粕中平 均含量分别为 18.4 mg·g-1 和7.5 mg·g-1，发酵处理使其含量下降了 59.1%，同时得出豆粕及发酵豆粕胰蛋白抑制因

-1 -1 子含量正常值范围分别在 ND—P80（28.6 mg·g ）、ND—P80（9.9 mg·g ）之间。豆粕和发酵豆粕中的棉籽糖平均含 量分别为 11.02、1.93 mg·g-1，发酵豆粕比豆粕减少了 82.5%，豆粕和发酵豆粕中棉籽糖的正常值范围分别在 ND

-1 -1 -1 —P90 （13.79 mg·g ）、ND—P90（4.65 mg·g ）之间。豆粕中水苏糖的平均含量为 29.70 mg·g ，而发酵豆粕中水苏

-1 糖的平均含量为 5.19 mg·g ，发酵后水苏糖含量降低了 82.5%，同时水苏糖的正常值范围分别在 ND—P85 （33.29

-1 -1 -1 mg·g ）、ND—P85（11.58 mg·g ）之间；豆粕中脲酶含量正常值范围为 ND—P97（0.40 U·g ），发酵豆粕脲酶未检出。 综上得出，发酵豆粕的抗营养因子含量与豆粕相比有不同程度的减少。【结论】在分析调查的基础上得出了现行市 售豆粕及发酵豆粕主要抗营养因子的含量范围。本调查分析为饲料加工工艺的进一步优化提供数据支撑，同时能 够对养殖企业选择豆粕及发酵豆粕作为饲料原材料起到一定的理论指导作用。 关键词：豆粕；发酵豆粕；大豆抗营养因子

Investigation and Analysis of Main AFN in Soybean Meal and Fermented Soybean Meal

YANG Yu-juan1,2, YAO Yi-sha1, QIN Yu-chang2, QIU Jing3, LI Jun-guo1, LI Jun1, GU Xu1

收稿日期：2015-01-07；接受日期：2015-12-23 基金项目：国家自然科学基金（21407176）、国家公益性行业（农业）科研专项（201203015）、现代农业产业技术体系北京市家禽创新团队专项资金 项目（CZ1108） 联系方式：杨玉娟，E-mail：[email protected]。姚怡莎：E-mail：[email protected]。杨玉娟和姚怡莎为同等贡献作者。通信作者谷旭， Tel：010-82106069；E-mail：[email protected]

574 中 国 农 业 科 学 49卷

(1Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100081; 2Institute of Food and Nutrition Development, Ministry of Agriculture, Beijing 100081; 3Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

Abstract:【Objective】Soybean meal is the main raw material of feed. However, various anti-nutritional factors (ANF) in soybean meal hinder the digestion, absorption and utilization for nutrients, which would have negative effects on animal growth and health. Studies have shown that soybean meal fermented by microorganism could decrease the undesirable effect of ANF. While, fermentation strains, soybean species, and manufacturers may have an effect in fermentation process. Moreover, seldom reports referred to the levels of ANF in soybean meal and fermented soybean meal. Based on this, 65 batches of available soybean meal and 54 batches of fermented soybean meal were collected in this study, followed by analysis of 6 kinds of ANF, including glycinin, β-conglycinin, trypsin inhibitors, raffinose, stachyose and urease, in order to investigate the actual levels of ANF in soybean meal and fermented soybean meal.【Method】In this study, glycinin, β-conglycinin and trypsin inhibitors were analyzed by Enzyme-link Immunosorbent Assay (ELISA) method. Experimental procedures were conducted according to instructions which were sample pretreatment, plus, washing, adding enzymatic reagent, color reaction, and termination. The analysis method of raffinose and stachyose was HPLC after extracted by microwave. Analysis of urease refers to GB/T 8622-2006, and titration was utilized for analysis of urease activity.【Result】The average concentration of glycinin in soybean meal (129.3 mg·g-1) is 57.7% higher than fermented soybean meal (54.7 mg·g-1). The percentile method was used for analysis. The normal values in soybean meal and fermented soybean were 58.9-177.3 mg·g-1 and ND (Not Detected)-109.4 mg·g-1, respectively. Moreover, the fermented soybean meal (37.6 mg·g-1) is 63.2% lower than the concentration of β-conglycinin in soybean meal (102.2 mg·g-1). The normal values in soybean meal and fermented soybean were 42.8-147.2 mg·g-1 and ND-61.8 mg·g-1, respectively. The average concentration of trypsin inhibitors in soybean meal (18.4 mg·g-1) is 59.1% higher than fermented soybean meal (7.5 mg·g-1). In addition, the normal values of trypsin inhibitor in soybean meal and fermented soybean meal were ND-28.9 mg·g-1 and ND-9.9 mg·g-1. The average concentration of raffinose in soybean meal and fermented soybean meal were 11.02 mg·g-1 and 1.93 mg·g-1, with the former is 80% higher. The normal values of raffinose in soybean meal and fermented soybean meal were ND-13.79 mg·g-1 and ND-4.65 mg·g-1. The average value of stachyose average in soybean meal (29.70 mg·g-1) is higher than in fermented soybean meal (5.19 mg·g-1). The normal values of stachyose are ND-33.29 mg·g-1, ND-11.58 mg·g-1, respectively. The normal values of urease in soybean meal was in the range of ND to 0.40 U·g-1, while the activity value of urease of fermented soybean meal was under the detection limit. It was concluded that the concentrations of ANF in fermented soybean meal have decreased differently compared with soybean meal. 【Conclusion】This research provided data support for further optimization of feed processing, and could act as a guide for breeding companies to choose higher quality of soybean meal and fermented soybean meal as feed raw materials. Key words: soybean meal; fermented soybean meal; AFN

良莠不齐[6, 9-10]。基于此，有必要对现行市场上流通的 0 引言 豆粕和发酵豆粕中的抗营养因子水平进行调查分析， 【研究意义】豆粕是大豆加工副产品[1]，富含多 为其在饲料中的合理使用提供数据依据。【前人研究 种营养物质，其中蛋白质含量为 40%—50%，脂肪为 进展】目前研究发现发酵可明显降低豆粕中胰蛋白酶 1%—2%，碳水化合物约为 10%—15%[2]，且较鱼粉价 抑制因子、植酸、大豆凝集素、寡糖、抗原蛋白、脲 格低，是目前最广泛使用的植物性蛋白质饲料原料[3]。 酶的含量[11]。Hirabayashi 等使用宇佐美曲霉发酵豆 但豆粕中存在多种抗营养因子如胰蛋白酶抑制因子、 粕，发现发酵后豆粕中的植酸全部被降解[12]。Feng 等 抗原蛋白、寡糖等，会造成畜禽生产性能和饲料利用 使用产蛋白酶菌—米曲霉发酵豆粕，可完全消除豆粕 率降低[3]。目前消除豆粕中抗营养因子的主要方法包 中胰蛋白酶抑制因子[13]。此外发酵还可以提高粗蛋白 括物理法、化学法、微生物发酵法及添加酶制剂法[4]， 质、氨基酸、多种活性物质的含量，同时产生特殊气 其中微生物发酵法安全、健康、高效，可最大限度地 味，提高动物适口性[14-15]。【本研究切入点】本研究 降解豆粕中的抗营养因子，并产生乳酸、维生素、益 分析了 6 种对动物健康和发育有较大影响的抗营养因 生菌等活性物质[5-8]。然而由于发酵菌种、发酵工艺及 子，包括热不稳定性的胰蛋白酶抑制因子、脲酶和热 豆粕本身特性的差异，目前市场上发酵豆粕产品质量 稳定性大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、棉籽糖以及水

3 期 杨玉娟等：豆粕与发酵豆粕中主要抗营养因子调查分析 575

苏糖。其中脲酶活性是评价豆粕营养价值的主要指标； 涡旋仪（Vortex-Genie 2 美国 Scientific Industries 公 胰蛋白酶抑制因子受其分析方法的限制少有人检测， 司 ）、旋 转 蒸 发 仪（ RE-2000，上海亚荣生化仪器厂）、 往往是通过脲酶活性对其进行间接评价[16]。本研究发 酸度计（ORION Star A211 Thermo 德国）、水浴锅 现脲酶含量并不能客观反映胰蛋白酶抑制因子的变 （DSHZ-300 江苏太仓市实验设备厂）、酶标仪（Power 化。棉籽糖和水苏糖占低聚糖总量的 90%[17]，具有热 Wave Xs2 美国 BioTek 公司）。 稳定性，加热不能使其失活，同时不同的发酵工艺对两 大豆胰蛋白酶抑制因子定量检测试剂盒、大豆球 种低聚糖的消除情况也不尽相同；大豆球蛋白、β-伴大 蛋白定量检测试剂盒、β-伴大豆球蛋白定量检测试剂 豆球蛋白是两种主要的抗原蛋白，不能通过简单的加热 盒，购自北京龙科方舟生物工程技术有限公司。 使其钝化。因此有必要对市场流通的豆粕及发酵豆粕中 棉籽糖和水苏糖标准品（纯度 99.5%）购自 上述 6 种抗营养因子的含量水平进行调查分析。【拟解 Dr.Ehrenstorfer，乙醇水溶液（浓度为 70%），试验用 决的关键问题】采用 HPLC 测定棉籽糖和水苏糖含量， 水为 Millipore 纯水系统（美国 Millipore 公司）制得 应用 ELISA 法对 β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、胰蛋 的高纯水，乙腈为 HPLC 纯；尿素缓冲液 pH 7.0±0.1 白酶抑制因子的含量进行测定，而脲酶采用国标方法进 （称取 8.95 g 磷酸氢二钠，3.4 g 磷酸二氢钾溶于水， 行测定。比较豆粕与发酵豆粕中主要抗营养因子含量， 再将 30 g 尿素溶在此缓冲液中）、盐酸溶液 C（HCl） 总结二者中抗营养因子含量的正常值范围，对当前市场 =0.1 mol·L-1（称取 8.3 mL 盐酸用水稀释至 1 000 mL）、 上的豆粕及发酵豆粕质量进行分析。 氢氧化钠标准溶液 C（NaOH）=0.1 mol·L-1（称取 4 g NaOH 用水稀释至 1 000 mL）。 1 材料与方法 1.2 样品来源 试验于 2014 年 7 月在中国农业科学院饲料研究所 样品来源：山东、河南、天津、北京、辽宁、黑 完成。 龙江、河北、江苏、浙江、重庆 10 个省（市、自治区） 1.1 仪器与试剂 经营和使用环节的 65 批次豆粕；山东、河南、广东、 高效液相色谱仪（LC-15C SHIMAZU，日本，配 北京、浙江、江西、江苏、湖北、上海、天津、辽宁、 备 RID-10A 示差检测器）、高速离心机（Hitachi 公 四川、福建 13 个省（市、自治区）经营和使用环节的 司，日本）、高速离心机（D-37520 Thermo 德国）、 54 批次发酵豆粕。取样地区和数量见表 1。

表 1 取样地区和样品数量 Table 1 Sampling region and sample quantity 豆粕取样地区 数量 发酵豆粕取样地区 数量 Sampling region of soybean meal The number Sampling region of fermented soybean meal The number 山东 Shandong 25 山东 Shandong 10

河南 Henan 8 广东 Guangdong 5

天津 Tianjin 9 北京 Beijing 5

北京 Beijing 7 浙江 Zhejiang 4

辽宁 Liaoning 3 湖北 Hubei 4

河北 Hebei 1 四川 Sichuan 4

江苏 Jiangsu 1 河南 Henan 3

浙江 Zhejiang 1 天津 Tianjin 3

重庆 Chongqing 1 上海 Shanghai 3 黑龙江 Heilongjiang 1 福建 Fujian 4 其他 Other 8 江西 Jiangxi 2 合计 Total 65 辽宁 Liaoning 2 江苏 Jiangsu 1 其他 Other 4 合计 Total 54

576 中 国 农 业 科 学 49卷

1.3 样品测定方法 较于豆粕降低了 63.2%。图 1-b 揭示了豆粕和发酵豆 1.3.1 棉籽糖和水苏糖的测定 参考文献[18]并进 粕中 β-伴大豆球蛋白含量聚集范围及变化趋势，所调 行单因素试验，对提取方法、料液比、提取液浓度进 查的 65 批次豆粕中 β-伴大豆球蛋白含量主要集中在 行优化，最终确定试验方案。该试验的优化及试验方 42.8—150 mg·g-1 范围内，含量百分比约 85%，而 54 案另文撰写。 批次的发酵豆粕中的 β-伴大豆球蛋白含量主要聚集在 1.3.2 脲酶的测定 参照 GB/T8622-2006《饲料用大 0—60 mg·g-1 范围内，所占百分比为 83%。采用百分 豆制品中脲酶活性的测定》测定豆粕和发酵豆粕中的 位数法对数据进行统计分析，得出豆粕中 β-伴大豆球 [19] -1 脲酶 。 蛋白百分位数值 P85 是 147.2 mg·g ，而发酵豆粕中 β- -1 1.3.3 大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白，胰蛋白酶抑 伴大豆球蛋白百分位数值 P85 是 53.8 mg·g ，由这些数 制因子的测定 ELISA 测定过程参照产品说明书进 据可以判断豆粕及发酵豆粕中 β-伴大豆球蛋白含量正 -1 行。具体过程如下：称取取一定质量样品（抗原蛋白 常值范围分别为 42.8—P85（147.2 mg·g ）和 ND—P85 0.300 g，胰蛋白酶抑制因子 0.100 g，均精确到 0.001 g） （61.8 mg·g-1）。 于 50 mL 离心管中，加入 30 mL 提取液，于 25℃振荡 2.3 豆粕和发酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子的含量分 16 h，静置 2 min 后，离心 5 min（4 000 r/min），取 析 上清液并稀释 70 倍。将样品盒标准品对应微孔按序编 胰蛋白抑制因子平均含量在发酵豆粕中比在豆粕 号，每个样品和标准液平行测定两次，记录校准孔和 中降低了 59.1%（表 2），此结果与陈斌[2]在微生物发 样品孔所在的位置，经过加样、洗板、加酶标试剂、 酵对豆粕中抗营养因子及营养价值的影响中的胰蛋白 显色，加终止液后于 450/630 nm 双波下读取吸光度 酶抑制因子下降了 50.4%的结果相近。从图 1-c 中可 值。按照下列公式计算吸光率： 以看出发酵豆粕和豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量变化

百分吸光率(%)=B/B0×100% 趋势及主要集中范围，二者均较低且主要分布在 0— -1 其中，B 为校准品或样品的平均吸光度值，B0 是标准 40 mg·g 范围内，但发酵豆粕中的胰蛋白酶抑制因子 品 1 的平均吸光度值。 比豆粕中的胰蛋白酶抑制因子低，其中 80%的发酵豆 校准曲线的绘制：以校准品百分吸光率为纵坐标， 粕中胰蛋白酶抑制因子含量在 0—10 mg·g-1，而 80% 以校准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。 豆粕胰蛋白酶抑制因子的含量主要聚集在 0—30 -1 -1 1.4 数据分析 mg·g ，豆粕中胰蛋白酶抑制因子 P80 为 28.6 mg·g ， -1 试验数据采用 Excel 2012 进行统计并采用百分位 发酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子 P80 为 9.9 mg·g ，采用 数法进行分析。 百分位数法分析进一步表明发酵豆粕中的胰蛋白酶抑 制因子含量降低，豆粕及发酵豆粕胰蛋白抑制因子含 2 结果 -1 量正常值范围应为 ND—P80（28.6 mg·g ）、ND—P80 2.1 豆粕和发酵豆粕中大豆球蛋白的含量分析 （9.9 mg·g-1）。 利用 ELISA 试剂盒分析豆粕和发酵豆粕中大豆 2.4 豆粕和发酵豆粕中低聚糖的含量分析 球蛋白，结果见表 2。发酵豆粕中大豆球蛋白平均含 液相色谱检测低聚糖方法最小检出限为 0.01 量比豆粕减少 57.7%。从 图 1-a 可明显看出，90%的豆 mg·g-1，发酵豆粕中棉籽糖平均含量比豆粕减少了 粕中大豆球蛋白含量聚集在 60—180 mg·g-1 范围内， 82.5%、水苏糖平均含量降低了 82.5%（表 2）。从图 而 90%的发酵豆粕中的大豆球蛋白含量主要集中在 0 1-d 中可以看出 90%的发酵豆粕中棉籽糖含量在 0—6 —120 mg·g-1。采用百分位数法对数据进行分析，得出 mg·g-1 范围内，而 90%豆粕中棉籽糖的含量在 6—15 -1 -1 豆粕 P90（90%的检测值小于 P90）是 177.3 mg·g ，发 mg·g 范围内。86%的豆粕中水苏糖含量在 21—42 -1 酵豆粕中大豆球蛋白含量的百分位数值 P90 是 109.4 mg·g 范围内，而 87%的发酵豆粕中水苏糖含量在 0 mg·g-1。可以推断出豆粕中的大豆球蛋白含量正常值 —14 mg·g-1 范围内。采用百分位数法对这一结果进行 -1 -1 范围在 58.9—P90（177.3 mg·g ）之间，发酵豆粕中大 分析，豆粕中的棉籽糖含量 P90 为 13.79 mg·g ，而棉 -1 -1 豆球蛋白含量正常值范围为 ND—P90（109.4 mg·g ）。 籽糖在发酵豆粕的含量 P90 为 4.65 mg·g 。豆粕 P85 2.2 豆粕和发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白的含量分析 中的水苏糖含量为 33.29 mg·g-1，发酵豆粕中水苏糖含 -1 结合表 2 发酵豆粕中 β-伴大豆球蛋白平均含量相 量 P85 为 11.58 mg·g ，以上数据充分说明了发酵豆粕中

3 期 杨玉娟等：豆粕与发酵豆粕中主要抗营养因子调查分析 577

40 37.04 35.38 发酵豆粕 Fermented soybean meal (%) a 豆粕 Soybean meal (%)

24.07 24.62 18.52 20 16.92 12.96 12.31

5.56 4.62 3.07 1.54 1.85 1.54 0 000 0 0-30 30-60 60-90 90-120 120-150 150-180 180-210 210-240 240-270 60 53.7 b

40 33.85 29.63

21.54 20 13.84 16.92 12.31 7.41 5.56 0 1.85 1.85 0 1.54 0 0-30 30-60 60-90 90-120 120-150 150-180 180-210 90 81.48 c

60

33.85 29.23 30 18.46 15.38 9.26 7.41 1.85 000 1.54 0 1.54 0 0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 90 79.63 d

60 52.31

30 23.08 18.46 12.97 1.54 4.61 001.85 1.85 1.85 1.85 000 0 0-3 3-6 6-9 9-12 12-15 15-18 18-21 21-24 80 74.07 e

60

41.54 40 30.77

20 12.97 13.85 10.77 7.41 3.7 3.07 00 1.85 00 0 0-7 7-14 14-21 21-28 28-35 35-42 42-49 -1 含量 Content (mg·g )

图 1 豆粕及发酵豆粕中抗营养因子含量百分比（大豆球蛋白：a；β-伴大豆球蛋白：b；胰蛋白酶抑制因子：c；棉籽糖：d； 水苏糖：e） Fig. 1 The content percentage of AFN in soybean meal and fermented soybean meal (glycinin: a; β-conglycinin: b; trypsin inhibitors: c; raffinose: d; stachyose: e)

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表 2 豆粕及发酵豆粕中抗营养因子含量 Table 2 The content of AFN in soybean meal and fermented soybean meal 抗营养因子 豆粕 Soybean meal 发酵豆粕 Fermented soybean meal AFN 测定值范围 平均值 中位数 测定值范围 平均数 中位数 The range of Average value Median The range of Average value Median measured value measured value 大豆球蛋白 Glycinin (mg·g-1) 58.9-204.3 129.3±40.0 120.50 NDa-158.0 54.7±42.5 50.1

β-伴大豆球蛋白 β-Conglycinin (mg·g-1) 42.8-185.8 102.2±37.8 94.20 0.1-154.3 37.6±35.8 28.3

胰蛋白酶抑制因子 Trypsin inhibitors (mg·g-1) 2.2-61.6 18.4±11.9 15.2 NDa-34.1 7.5±7.6 4.9

棉籽糖 Raffinose (mg·g-1) 6.41-21.65 11.02±3.08 10.45 NDa-15.71 1.93±3.27 0.63

水苏糖 Stachyose (mg·g-1) 16.59-48.67 29.70±6.34 29.81 NDa-32.73 5.19±7.83 1.38

脲酶 Urease (U·g-1) NDa-1.16 0.07±0.18 0.01 NDa NDa NDa a 未检出 Not detected

低聚糖含量普遍低于豆粕。豆粕和发酵豆粕中棉籽糖 常值范围为≤28.6 mg·g-1，与胰蛋白酶抑制因子在豆粕 -1 [21] 含量正常值范围为 ND—P90（13.79 mg·g ）、ND—P90 中的含量为 2%左右 一致。豆粕中棉籽糖含量正常值 -1 -1 [13] （4.65 mg·g ），水苏糖的含量正常值范围为 ND—P85 范围为≤13.79 mg·g ，接近 1% ，豆粕中水苏糖含量 -1 -1 -1 [16] （33.29 mg·g ）、ND—P85（11.58 mg·g ）。 正常值范围≤33.29 mg·g 与文献报道基本一致 ，发 2.5 豆粕和发酵豆粕中脲酶的活性分析 酵豆粕的棉籽糖含量正常值范围为≤4.65 mg·g-1，发 采用百分位数法对数据进行统计分析，得出豆粕 酵豆粕中水苏糖含量正常值范围为≤11.58 mg·g-1，合 -1 -1 -1 [13] 中脲酶百分位数值 P90 是 0.19 U·g ，P97 是 0.40 U·g ， 计为≤16.23 mg·g ，与现有报道中＜0.9% 有一定的 符合国家标准规定的饲用豆粕的脲酶含量为 0.02— 出入。豆粕中脲酶活性范围≤0.40 U·g-1，发酵之后脲 0.45 U·g-1[20]，由这些数据可以判定，豆粕中脲酶含量 酶活性未检出，则说明发酵之后脲酶完全降解，该结 -1 正常值范围应在 ND—P97（0.40 U·g ）之间。发酵豆 果与现有研究中关于黑曲霉发酵豆粕中脲酶全部被降 粕中的脲酶未检出，结果表明发酵可以显著降低脲酶 解的结果相一致[22]。根据研究结果，豆粕中抗营养因 活性。 子含量基本与现有研究结果相符，但发酵豆粕中抗原 蛋白的含量居高，表明现在的发酵工艺对胰蛋白酶抑 3 讨论 制因子、低聚糖、脲酶的钝化水平高于对抗原蛋白的 本次调查抽取的 65 批次豆粕和 54 批次发酵豆粕 消除水平。此外，不同的发酵豆粕中同种抗营养因子 经检测分析表明发酵豆粕所含的不同种类的抗营养因 含量差异较大，部分产品的抗营养因子含量与豆粕相 子的量比豆粕低，但不乏部分发酵豆粕中抗营养因子 当，因此发酵工艺，豆粕质量是影响发酵后抗营养因 含量居高的现象，可能是加工程度、发酵工艺、大豆 子钝化程度的重要原因。 品种的问题。 3.2 抗营养因子钝化情况的比较 3.1 与现有报道中抗营养因子的含量比较 抗营养因子在发酵过程中钝化机理不同导致其消 本抽样调查的 65 批次豆粕中大豆球蛋白含量正 除程度也会有差异。大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和 常值范围为 58.9—177.3 mg·g-1，小于文献总结的豆粕 胰蛋白酶抑制因子含量降低的程度趋于一致，分别为 中的含量 400 mg·g-1[13]，而 54 批次的发酵豆粕中大豆 57.71%、63.2%、59.08%。这可能是由于豆粕中的蛋 球蛋白含量正常值范围为≤109.34 mg·g-1，超出了文 白质经微生物发酵分解，使抗原蛋白和胰蛋白酶抑制 献中的含量范围＜0.02 mg·g-1[13]，说明现行市场中的 因子含量下降。 发酵豆粕中大豆球蛋白含量普遍居高。豆粕中 β-伴大 3.3 抗营养因子之间的含量比较 豆球蛋白含量正常值范围是 42.8—185.8 mg·g-1，89% 研究结果发现，在豆粕和发酵豆粕中，6 种抗营 的豆粕在≤155 mg·g-1[13]范围内，而其在发酵豆粕中的 养因子含量排序均为大豆球蛋白＞β-伴大豆球蛋白＞ 含量正常值范围为≤61.8 mg·g-1，超过了文献中的的 胰蛋白酶抑制因子＞水苏糖＞棉籽糖＞脲酶，与现有 含量范围≤0.01 mg·g-1[13]。胰蛋白酶抑制因子含量正 研究报道相一致。有研究表明，仔猪肠道对日粮抗原

3 期 杨玉娟等：豆粕与发酵豆粕中主要抗营养因子调查分析 579

过敏，从而导致肠道损伤，是仔猪断奶后腹泻和生长 the effect of nutritional value. Henan Journal of Animal Husbandry 发育受阻的一项主要原因[23]。胰蛋白酶抑制因子的抗 and Veterinary Medicine, 2014, 35(4): 8-10. (in Chinese) 营养作用主要表现在抑制动物生长，降低胰蛋白酶、 [4] 周红蕾, 李春玲, 王贵平, 侯加法. 大豆中抗营养因子及其去除方 胰凝乳蛋白酶活性[24]，影响营养物质的消化，并造成 法概述. 饲料工业, 2006, 27(3): 23-26. 胰腺肿大等方面[13]，但目前豆粕的质量评价只通过测 Zhou H L, Li C L, Wang G P, Hou J F. Brief introduction of soybean 定脲酶活性间接反映胰蛋白酶抑制因子的含量，但脲 antinutritional factors and the way of getting rid of it. Feed Industry, 酶活性是豆粕中起最低抗营养作用的因素且在发酵过 2006, 27(3): 23-26. (in Chinese) 程中脲酶可基本全部降解，不能准确反映胰蛋白酶抑 [5] 鲍宇茹, 魏雪芹. 大豆抗营养因子研究概况. 中国食物与营养, 制因子钝化情况。此外，过量的大豆寡糖，易引起动物 2010(9): 20-23. 腹鸣、腹胀、腹泻[25]，虽然含量低于前 3 个抗营养因 Bao Y R, Wei X Q. Advancement of soybean anti-nutritional factors. 子，但其抗营养效应显著为保证动物健康。综上，有必 Food and Nutrition in China, 2010(9): 20-23. (in Chinese) 要对这 6 种抗营养因子进行钝化并对其含量进行测定。 [6] 朱长生, 尹荣华, 赵艳平. 发酵豆粕的生产工艺与产品品质关系的 研究进展. 广东饲料, 2014, 23(5): 35-37. 4 结论 Zhu C S, Yin R H, Zhao Y P. Production technology of fermented 本研究调查分析了市场中的 65 批次豆粕和 54 批 soybean meal and the research progress of relationship between the 次的发酵豆粕，其中主要抗营养因子进行了含量分析。 product quality. Guangdong Feed, 2014, 23(5): 35-37. (in Chinese) 结果表明，发酵豆粕中的抗营养因子含量低于豆粕， [7] Hong K J, Lee C H, Kim S W. Aspergillus oryzae GB-107 由于不同厂家使用菌种种类、菌种数目、加工工艺的 fermentation of food soybeans and feed soybean meal. Journal Med 不同其含量不完全相同，建议对豆粕质量评价指标中 Food, 2004, 7: 430-435. 加入对动物影响较大的大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、 [8] Lyman. J. The effect of raw soybean meal and trypsin inhibitordiets 胰蛋白酶抑制因子等抗营养因子的含量分析，更全面 ontheintesinal and pancreatic nitrogen in the rat. Nutrition, 1957, 62: 地测定并反映豆粕及发酵豆粕的质量。同时本研究中 26. 推断出抗营养因子的含量正常值范围，有助于了解现 [9] 付亭亭, 李爱科, 梁新晓, 贠婷婷, 王勇伟, 綦文涛. 豆粕中抗营 行市场的豆粕和发酵豆粕的抗营养因子含量水平，并 养因子检测技术研究进展. 粮油食品科技, 2014, 22(1): 85-90. 对饲料企业和养殖行业对豆粕及发酵豆粕的选择有指 Fu T T, Li A K, Liang X X, Yuan T T, Wang Y W, Qi W T. Progress in 导意义。 detection technology of AFNin soybean meal. Science and Technology of Cereal, Soils, Foods, 2014, 22(1): 85-90. (in Chinese) References [10] 陈广信, 曹赞, 高振华. 不同发酵豆粕营养价值及应用. 中国畜牧 [1] 熊智辉, 过玉英, 陈丽玲, 徐淑玲. 微生物发酵处理对豆粕抗营养 兽医, 2014, 41(2): 111-114.

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中国农业科学 2016,49(3):581-592 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.016

利用 Bac-to-Bac 杆状病毒系统超量表达家蚕 let-7 簇 microRNAs

何 婷 1,2，尹 权 1,2，王 伟 1，黄亚玺 1，吴小燕 1，夏庆友 1,2，刘仕平 1,2

（1 西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716；2 西南大学生物技术学院，重庆 400716）

摘要：【目的】利用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统超量表达家蚕（Bombyx mori）let-7 簇（cluster）microRNAs： bmo-let-7、bmo-miR-100和 bmo-miR-2795，为研究家蚕microRNA 的功能提供参考。【方法】克隆家蚕let-7 miRNA 簇（bmo-let-7 cluster，bmo-let-7-C）上各 miRNA 前体(pri-let-7、pri-miR-100 与 pri-miR-2795)和 bmo-let-7-C 全长序列，以红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)基因为报告基因，昆虫细胞表达载体 pFastBac1 为 穿梭载体，通过Tn7转座子把目的基因和报告基因转座到杆状病毒A. californica nucleopolyhedrovirus (AcNPV) 基因组上，获得各重组杆状病毒质粒（recombinant baculovirus plasmid，rBacmid）：Bac-let-7、Bac-miR-100、 Bac-miR-2795 和 Bac-let-7-C。将重组 Bacmid 转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系 Sf9，72 h 后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号，荧光定量 PCR 检测 miRNAs 的表达。对转染的 Sf9 细胞进行离心、收集上 清液，获得具感染力的重组病毒，用于侵染新培养的 Sf9 细胞和注射家蚕幼虫个体，72 h 后用荧光显微镜检查红 色荧光蛋白信号，荧光定量PCR 检测 miRNAs 的表达。【结果】成功将bmo-let-7-C 上各 miRNA 前体和 bmo-let-7-C 全长序列构建到杆状病毒基因组上，获得了各 miRNA 及 bmo-let-7-C 的过量表达载体。将各重组过量表达载体分 别转染草地贪夜蛾细胞系 Sf9，72 h后在显微镜下观察到了红色荧光蛋白信号，荧光定量 PCR 检测结果表明各 miRNA 显著过量表达；通过离心收集的各 miRNA 重组过量表达病毒粒子感染新培养的 Sf9 细胞 72 h后检测到了更强的红 色荧光蛋白信号，定量 PCR 结果表明各 miRNA 均显著过量表达。将各 miRNA 的重组病毒注射到家蚕 5 龄 1 d 幼虫 体内后，均能显著超量表达相应 miRNA，但注射 Bac-let-7-C 后只有 miR-2795 显著过量表达，并有明显的组织差 异性，在丝腺中没有过量表达，在脂肪体、血液和中肠中显著过量表达。【结论】利用杆状病毒过量表达系统在草 地贪夜蛾细胞系 Sf9 和家蚕个体中超量表达了家蚕 let-7 簇 miRNAs，为研究家蚕 let-7 簇和其他 miRNAs 的产生 机制和功能提供了参考。 关键词：家蚕；微小 RNA；let-7 簇；杆状病毒表达系统；过量表达

Bac-to-Bac Baculovirus System Facilitates Overexpression of let-7 Cluster MicroRNAs of Silkworm (Bombyx mori)

HE Ting1,2, YIN Quan1,2, WANG Wei1, HUANG Ya-xi1, WU Xiao-yan1, XIA Qing-you1,2, LIU Shi-ping1,2

(1State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716; 2College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716)

Abstract: 【Objective】The objective of this study is to construct the Bac-to-Bac baculovirus system overexpressing bmo-let-7, bmo-miR-100, bmo-miR-2795 of bmo-let-7 cluster (bmo-let-7-C), as such will hopefully contribute the future functional study of microRNAs (miRNAs) in the silkworm (Bombyx mori).【Method】The primary precursor of each microRNA in the bmo-let-7-C (pri-let-7, pri-miR-100, pri-miR-2795) and the whole let-7-C sequence were cloned, respectively. Using the gene of red fluorescent

收稿日期：2015-08-24；接受日期：2015-10-27 基金项目：国家“973”计划（2012CB114602）、国家自然科学基金（31571334，31071136，31530071）、重庆市基础与前沿研究计划（cstc2014jcyjA00025） 联系方式：何婷，E-mail：[email protected]。通信作者刘仕平，E-mail：[email protected]

582 中 国 农 业 科 学 49卷 protein (RFP) as the reporter and pFastBac1 as the shuttle vector, each cloned miRNA precursor and reporter gene were combined into the baculovirus genome through Tn7 transposons, and thus the recombinant baculovirus plasmids (rBacmids) for each miRNA and the whole cluster were obtained. At 72 h post transfection of these recombinant Bacmids into the cell line of Spodoptera frugiperda (Sf9), the signal of red fluorescent protein was examined under the microscope and the expression of miRNA was evaluated by qRT-PCR. To collect the recombinant baculovirus with infection activity, the Sf9 cell culture was centrifuged at 72 h post transfection, and the supernatant containing the viruses was used to infect the newly cultured Sf9 cells or injected into early 5th instar larval B. mori. Also, the signal of red fluorescent protein and the expression of miRNA were examined.【Result】The primary precursor of each miRNA and the whole let-7-C sequence were successfully combined into the baculovirus genome and the overexpressing vectors for each miRNA and the whole cluster were finally obtained. At 72 h post transfection in the Sf9 cell line, a red fluorescent protein was observed under the microscope and the overexpression of microRNAs were confirmed by qRT-PCR. The recombinant baculovirus with infection activity caused the stronger detection signals of red fluorescent protein and significant overexpression of each miRNA in the newly cultured Sf9 cell. After the injection of recombinant baculovirus into newly ecdysed 5th instar larvae of the B. mori, the infection of virus in various B. mori tissues was determined by real-time PCR and bmo-let-7, bmo-miR-100, and bmo-miR-2795 showed significant up-regulation in the B. mori injected with each Bac-miRNA, but only bmo-miR-2795 was dramatically overexpressed in the B. mori infected with Bac-let-7-C. Further examination revealed the tissue-specific infection of the recombinant baculoviruses and the significant overexpression of miR-2795 was confirmed in the hemocyte, midgut, and fat body.【Conclusion】The baculovirus expression system was successfully used to overexpress the cluster miRNAs of B. mori in the cell line of S. frugiperda (Sf9) and in the larval B. mori body, and might be helpful to the mechanical and functional exploration of let-7 cluster and other miRNAs in this species. Key words: silkworm (Bombyx mori); microRNA; bmo-let-7 cluster; baculovirus expression system; overexpression

线虫等多种生物体中均高度保守，但 miR-2795 却为 0 引言 家蚕所特有[15]。Let-7 在家蚕胚胎和 1 龄幼虫期均无 【研究意义】MicroRNAs（miRNAs）是一类长度 表达，在家蚕 1 眠至 3 龄幼虫期低量表达，从 3 眠开 约为 22 个核苷酸的内源性非编码 RNA，广泛分布于 始，经蛹期和成虫阶段都高量表达，其表达的节律性 动物、植物、真菌以及病毒基因组中，大多数具有明 和蜕皮激素滴度变化有明显的关联性，暗示 let-7 在 显的组织特异性和时序性，在生物体生长发育等生命 家蚕变态发育中可能有着重要的调控作用[16-19]。【本 活动过程中有着重要的调控作用[1-5]。家蚕（Bombyx 研究切入点】Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统是一种高 mori）是鳞翅目昆虫的典型代表，不仅具有重要的经 效、快速产生环状双链的重组苜蓿银纹夜蛾 济价值，还是研究生物防治、变态发育、细胞凋亡和 （Autographa californica）核型多角体病毒（AcNPV） 一些疾病的重要遗传模型[6]。研究家蚕 miRNA 的功能 的技术[20]，已被广泛应用于昆虫细胞和幼虫中超量 对于深入揭示家蚕重要生物学性状的分子机制具有十 表达外源基因[21-23]。Huang 等[24]利用 AcNPV 杆状病 分重要的意义。利用高效表达外源基因的杆状病毒表 毒表达载体在昆虫细胞 Sf21 中高效转录家蚕的成熟 达系统[7]，过量表达 bmo-let-7 簇（cluster）上各 miRNA 体 miR-9a。Zhang 等[25]发现 rAcNPV 能够感染 54A 可为研究家蚕 let-7 和其他 miRNAs 的功能提供新的思 品系家蚕不同组织和器官，感染力存在明显的组织差 路。【前人研究进展】Lin-4 是最先发现的 miRNA， 异性，其中在血液中的感染力最强。然而，还未见利 它通过靶基因 lin-14 来控制线虫幼虫早期发育[8]。 用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒表达系统在细胞水 Let-7 是另一个早期发现的 miRNA，在线虫和果蝇的 平和个体水平过量表达整个 miRNA 簇上的所有 幼虫晚期和成虫体内高量表达，控制线虫和果蝇幼虫 miRNAs。【拟解决的关键问题】克隆家蚕 bmo-let-7 晚期和成虫的发育[9-11]。果蝇的 dme-let-7、dme-miR- 簇上各 miRNA 前体，即 pri-let-7、pri-miR-100、pri- 100 和 dme-miR-125 位于基因组相邻位置（800 bp 以 miR-2795 和 bmo-let-7 簇全长序列，构建到 Bac-to-Bac 内），形成一个 miRNA 簇，具有一致的表达模式[12]； 杆状病毒表达载体上，在草地贪夜蛾（Spodoptera 果蝇 let-7 簇响应蜕皮激素应答，参与幼虫到成虫的发 frugiperda）细胞系 Sf9 和家蚕个体上实现过量表达， 育调控[13-14]。家蚕 bmo-let-7、miR-100 和 miR-2795 为深入研究家蚕 let-7-C 上各 miRNA 的功能提供新的 在基因组上形成簇，let-7 和 miR-100 在家蚕、果蝇、 线索。

3 期 何婷等：利用 Bac-to-Bac 杆状病毒系统超量表达家蚕 let-7 簇 microRNAs 583

7-C 全长序列，从 NCBI 数据库（http://www.ncbi. 1 材料与方法 nlm. nih.gov/）下载珊瑚虫红色荧光蛋白 Red 基因序 试验于 2014—2015 年在家蚕基因组生物学国家 列 [28] ，利用 Primer 5.0 软件设计 pri-let-7 、 pri- 重点实验室完成。 miR-100、pri-miR-2795、let-7-C 和 Red 的 PCR 扩增 1.1 材料 引物（表 1）。 家蚕华系二化性大造由西南大学家蚕基因库提 用 EcoR I 和 Spe I 双酶切 Red 基因片段和 供。含 AcNPV 的 E. coli DH10Bac 菌种和草地贪夜蛾 pFastBac1 质粒，取 1 μL pFastBac1 酶切回收产物和 4 细胞 Sf9 均由家蚕基因组生物学国家重点实验室保 μL Red 酶切回收片段，加入 5 μL Solution I，于 16℃ 存，Sf9 细胞培养基为 Grace 昆虫细胞培养基，双抗为 连接 5 h，依次经转化、挑斑、菌液 PCR 和双酶切验 青霉素和链霉素，使用前加入 10%胎牛血清，培养温 证后，送深圳华大基因测序鉴定。 度为 27℃。 以刚化蛾家蚕 cDNA 为模板，用 TaKaRa Ex Taq 1.2 试剂 Kit 扩增各 miRNA 初级前体序列。用 1%琼脂糖凝胶 Ex Taq、pMD19-T simple 载体、Solution I、DNA 电泳检测 PCR 扩增产物，胶回收纯化，连接至 marker、IPTG、X-gal 和限制性内切酶 Nde I、Xho I、 pMD19-T simple 载体，菌液 PCR 及双酶切验证阳性 Kpn I、EcoR I、Spe I 均购自 TaKaRa 公司。质粒提取 重组 T 克隆，送深圳华大基因测序鉴定。用 Xba I 和 试剂盒购自上海百赛生物技术有限公司。胶回收试剂 Kpn I双酶切 pri-let-7、pri-miR-100 和 pri-miR-2795 盒购自上海华舜生物技术有限公司。氨苄青霉素、卡 的 T 质粒和 Red-pFastBac1 载体，用 Not I 和 Xho I 双 那霉素、四环素、庆大霉素均购自 BBI 公司。 酶切 let-7 -C 的 T 质粒和 Red-pFastBac1 载体。16℃ X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 购自 连接 4—5 h。经菌液 PCR 及双酶切验证阳性重组 Roche 公司。总 RNA 提取所用的 TRIzol Reagent 购自 RP-miRNA 克隆后，将阳性克隆送深圳华大基因测序 Ambion 公司。M-MLV 反转录试剂盒购自 Promega 公 鉴定。 司。miRNA 反转录试剂盒miScript II RT Kit和 miScript 1.3.3 miRNA 重 组 Bacmid 的 产 生 提取 Red- SYBR Green Kit 均购自 QIAGEN 公司。 pFastBac1-let-7（Rp-let-7）、Rp-miR-100、RP-miR-2795 1.3 方法 和 RP-let-7-C 质粒，转化 E. coli DH10Bac/AcNPV 感 1.3.1 总 RNA 提取与 cDNA 模板制备 使用 Trizol 试 受态细胞，取 100 μL 细菌悬液涂布在“庆大霉素（7 剂参照文献[26]的方法提取和纯化刚化蛾的华系二化 μg·mL-1）-四环素（10 μg·mL-1）-卡那霉素（50 μg·mL-1） 性大造家蚕总 RNA，用核酸浓度测定仪（NANODROP -IPTG（40 μg·mL-1）-X-gal（100 μg·mL-1）”的 LB 平 2000C）测定 RNA 浓度和纯度，再用 1.2%琼脂糖凝 板上，37℃过夜培养，通过蓝白斑筛选出 Tn7 转座成 胶电泳检测 RNA 质量。利用 M-MLV 反转录试剂盒 功的重组 Bac-miRNA 质粒，即重组 Bacmid，以 M13 将提取的 RNA 反转录成 cDNA。用 BmActin3 检测模 引物 PCR 验证阳性克隆，测序鉴定。 板 cDNA 质量，10 μL PCR 反应体系：10×Ex Taq 1.3.4 重组 Bacmid 转染 Sf9 细胞系与注射家蚕幼虫 buffer 1 μL、dNTP Mixture （2.5 mmol·L-1 each）0.8 μL、 将生长状态良好的 Sf9 细胞均匀铺至 12 孔细胞板，

MgCl2 0.8 μL、BmActin3-F/R 各 0.2 μL、Ex Taq（5 在完全培养基（含有 Grace+10% Gibco FBS+20 个单 U·μL-1）0.1 μL、cDNA 模板 1 μL，高压灭菌的双蒸水 位/L 的青霉素和链霉素）中培养 24 h，吸去完全培 补至 10 μL。PCR 循环参数：94℃预变性 3 min，25 养基，每孔加入 900 μL 无抗、无血清的 Grace 培养 个循环（94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃ 40 s）， 基。配制转染混合液：用 8 μL 的脂质体 X-treme 包 72℃延伸 10 min，4℃保存。用 1%琼脂糖凝胶电泳检 裹 1 μg 的各重组 Bacmid，加入 100 μL 无抗、无血 测 PCR 产物。 清的 Grace 培养基，瞬时离心混匀后于室温静置孵 1.3.2 引物设计和重组 Red-pFastBac1 报告基因载 育 15—20 min。以各重组 Bacmid（Bac-miRNA）为 体构建 从 miRBase（http://www.mirbase.org/）[15]下 试验组，非重组空病毒 Bacmid（AcNPV）为阴性 载 bmo-let-7、bmo-miR-100、bmo-miR-2795 次级前 对照，不加处理的 Sf9 细胞为空白对照（WT）； 体序列，从家蚕基因组数据库 SilkDB（http://silkworm. 缓慢将转染混合液滴入细胞孔中央，轻摇细胞板使 swu.edu.cn/cgi-bin/gbrowse/silkdb/）[27]中获得 bmo-let- 转染混合液均匀分布于细胞板内；在 27℃的培养

584 中 国 农 业 科 学 49卷

表 1 本研究所用引物 Table 1 The primers used in this study 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence (5′-3′)

Bmactin3-F AACACCCCGTCCTGCTCACTG

Bmactin3-R GGGCGAGACGTGTGATTTCCT pri-let-7-F GCTCTAGAGATCACTGAAGTAATAGGTCTGTGG pri-let-7-R GGGGTACCATTTAGTGGTCTTGTGAGGAATGTT pri-miR-100-F GCTCTAGACGCGTGGAAATATTAACACAGAGC pri-miR-100-R GGGGTACCAAACAGATACGCGATCCTTCGTAAT pri-miR-2795-F GCTCTAGATGTGCTGGCGTGTCTTGT pri-miR-2795-R GGGGTACCTGTCGCTTTAGCCTTTCA let-7-C-F ATTTGCGGCCGCAAGGTTTACACTGACGGTCTTCG let-7-C-R CCCTCGAGCCATATAACCTTTCATCTGTCGATA

Red-F GGAATTCATGGTGCGCTCCTCCAAGAAC

Red-R GACTAGTCTACAGGAACAGGTGGTGGCG

M13-F GTTTTCCCAGTCACGAC

M13-R CAGGAAACAGCTATGAC

Qlet-7 CGGTGAGGTAGTAGGTTGTATAG

QmiR-100 AACCCGTAGATCCGAACTTGTG

QmiR-2795 AAGTTTGGTGATACGCGGGC

QU6 CGCAAGGATGACACGCAA

下划线表示引物中的酶切位点 The underlined were the restriction enzyme sites

箱中孵育 6—8 h 后换成完全培养基培养 72 h；用 为染料进行实时 PCR 检测 miRNA 含量。用 miScript OLYMPUS 倒置荧光显微镜观察细胞中的红色荧光 II RT Kit 对各样品的总 RNA 进行反转录，20 μL 反 蛋白信号。 转录体系：5×miScript HiFlex Buffer 4 μL 、 通过离心取上清的方式获取有侵染活性的重组 10×miScript Nucleics Mix 2 μL、miScript Reverse Bacmid 病毒，即在转染 72 h 观察到红色荧光后，将 Transcriptase Mix 2 μL、Total RNA 2 μg、RNase-free 12 孔板上的细胞吹悬浮并转移到 1.5 mL 离心管中， water 补至 20 μL，瞬时离心混匀。反应条件：37℃ 5 000 r/min 离心 5 min。离心后，沉淀为 Sf9 细胞， 孵育 60 min，95℃ 5 min 使酶失活。反应结束后， 上清液含有病毒粒子，即 AcNPV 空载体、Bac-let-7、 加 40 μL RNase-free water 稀释，然后取 2 μL 稀释液 Bac-miR-100、Bac-miR-2795 和 Bac-let-7-C 的重组 用于定量 PCR。用 Applied Biosystems 7500 Fast Bacmid，4℃保存。将获得的各上清重组病毒分别去 Real-Time PCR System 进行荧光定量 PCR 检测。20 感染新培养的 Sf9 细胞。分别注射 5 μL 各上清液至 μL qRT-PCR 体系：2×QuantiTect SYBR Green PCR 家蚕 5 龄 1 d 幼虫，继续用桑叶饲养 5—7 d。在 5 Master Mix 9 μL、10×miScript Universal Primer 1 μL、 龄 7 d 取整蚕和不同组织材料提取总 RNA。 10×miScript Primer 1 μL、cDNA 模板 2 μL、7 μL

1.3.5 定量 PCR 检测 miRNA 用 Trizol 提取 Sf9 细胞 ddH2O；PCR 扩增程序 step1：PCR initial activation 95 和家蚕的总 RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质 ℃ 15 min；step2 PCR 反应 40 个循环：变性 94℃ 15 量。qRT-PCR 检测各 miRNA[29]，采取 poly（A）聚 s、退火 55℃ 30 s、70℃延伸 34 s；melt curve step： 合酶加尾法在成熟体 miRNA 3′端加上一个 poly（A） 94℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 30 s、60℃ 10 s。各组 尾巴，通过 oligo-dT 通用标签逆转录引物反转录成 设 3 个生物学重复。利用公式 2-(CT gene-CT control)计算各 cDNA，然 后 以 miRNA 成熟体序列为 qRT-PCR 的上 miRNA 的相对表达量[30-31] ，再用软件 GraphPad. 游引物，试剂盒提供通用的下游引物，以 SYBR Green Prism 5 进行统计分析，用 Unpaired t 检验进行差异

3 期 何婷等：利用 Bac-to-Bac 杆状病毒系统超量表达家蚕 let-7 簇 microRNAs 585

显著性分析，双尾检测（two-tailed）P＜0.05 表示差 初级前体序列、let-7-C 全长序列和红色荧光蛋白基因 异显著，P＜0.01 表示差异极显著。 Red 序列，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测各 PCR 产物后， 测序鉴定 let-7、miR-100、miR-2795、let-7-C 和 Red 2 结果 大小分别为 351、373、342、2 921 和 680 nt。将 pri-let-7、 2.1 家蚕 miRNA 重组Red-pFastBac1 报告基因载体构 pri-miR-100、pri-miR-2795 和 let-7-C 克隆到 Red- 建 pFastBac1 载体上，经双酶切验证（图 1），获得重组 以华系二化性家蚕刚化蛾时的 cDNA 为模板， 报告基因质粒 Rp-let-7、Rp-miR-100、Rp-miR- 2795 PCR 扩增出 bmo-let-7、bmo-miR-100 和 bmo-miR-2795 和 Rp-let-7-C。

ABCM1 234 5 M1212 M

bp bp bp 5000 8000 5000 6000 2921 bp

bp 750 680 500 373 250 351 342 bp

A：Rp-let-7、Rp-miR-100 重组质粒和 Red-pFastBac1 报告基因载体双酶切验证 The double enzyme digestion of Rp-let-7, Rp-miR-100 recombined plasmids and Red-pFastBac1 vector。1：Rp-let-7 重组质粒 The recombined plasmid of Rp-let-7；2：Rp-miR-100 重组质粒 The recombined plasmid of Rp-miR-100； 3：Rp-let-7 重组质粒双酶切 The double enzyme digestion of Rp-let-7 plasmid by Xba I and Kpn I；4：Rp-miR-100 重组质粒双酶切 The double enzyme digestion of Rp-miR-100 plasmid by Xba I and Kpn I；5：Red-pFastBac1 质粒双酶切 The double enzyme digestion of Red-pFastBac1 vector by EcoR I and Spe I；B：Rp-miR-2795 重组质粒双酶切验证 The double enzyme digestion of Rp-miR-2795 recombined plasmid。1：Rp-miR-2795 重组质粒 The recombined plasmid of Rp-miR-2795；2：Rp-miR-2795 重组质粒双酶切 The double enzyme digestion of Rp-miR-2795 plasmid by Xba I and Kpn I；C：Rp-let-7-C 重 组质粒双酶切验证 The double enzyme digestion of Rp-let-7-C recombined plasmid digest detection。1：Rp-let-7-C 重组质粒 The recombined plasmid of Rp-let-7-C；2：Rp-let-7-C 重组质粒双酶切 The double enzyme digestion of Rp-let-7-C plasmid by Not I and Xho I

图 1 家蚕 miRNA 前体克隆和重组报告基因载体构建 Fig. 1 Cloning of the pri-miRNAs and construction of Red-miRNA-pFastBac1 vector

2.2 重组杆状病毒 miRNA 过量表达载体构建 荧光蛋白信号，发现当 DNA﹕X-treme=1﹕8（μg·μL-1） 分别用重组报告基因质粒 Rp-let-7、Rp-miR-100、 时转染效率最高。各 miRNA 的重组 Bacmid 转染 Sf9 Rp-miR-2795 和 Rp-let-7-C 转化 E. coli DH10Bac/ 细胞 72 h 后，都能检测到红色荧光蛋白信号，但信 AcNPV 感受态细胞。由于 AcNPV 上含有 pFastBac1 载 号都较弱，这说明病毒增殖较缓慢，致使 let-7、 体转座子 Tn7 整合所需的靶位点 mini-attTn7，而 E. coli miR-100、miR-2795 和 let-7-C 过量表达程度较低。 Ac DH10Bac 细胞中含有一个能提供 Tn7 转座蛋白的 通过离心收集上清液的方式，获得各试验组和阴性 辅助质粒，使目的基因能更有效地与 AcNPV 发生重 对照组具有侵染活性的病毒，对新培养的 Sf9 细胞 组[32]。M13（-40）Forward 和 M13 Reverse 序列分别 系进行直接感染，在 72 h 时检测到很强的红色荧光 位于 mini-attTn7 两端的 128 和 145 bp 处（图 2-A、2-B）， 蛋白信号（图 3），说明病毒已大量增殖，let-7、 用引物 M13-F/R 进行菌液 PCR，验证各重组杆状病 miR-100、miR-2795 和 let-7-C 在病毒大量增殖过程 毒 DNA，Red-pFastBac1 载体上 Tn7 之间的片段大小 中可能高量表达。随着时间的延长，病毒的大量复 为 2 430 bp，加上各 miRNA 初级前体和 let-7-C 的长 制导致绝大部分细胞破裂和生长不规则，红色荧光 度，根据 PCR 产物大小可知各 miRNA 的重组 Bacmid 信号也越来越弱。 已构建成功（图 2-C—2-F），经测序进一步确认。 为验证各 miRNA 是否过量表达，提取和纯化了 2.3 bmo-let-7-C 中 miRNAs 过量表达 各试验组（Bac-miRNA）、阴性对照（AcNPV）和 各重组 Bacmid 转染 Sf9 细胞 72 h 后，检测红色 空白对照组（WT）的总 RNA 定量 PCR 检测发现

586 中 国 农 业 科 学 49卷

0 4 SV A m p i c i l l i n

i r o C U P p P H

A：Red-pFastBac1 前体 miRNA 质粒图 Map of Red-pFastBac1-pri-miRNAs plasmid；B：重组杆状病毒 DNA 图 Map of recombinant Bacmid；C：Bac-let-7 菌液 PCR 验证 Verification of Bac-let-7 recombinant by the bacteria liquid PCR。M：TH5000 DNA ladder；1：Bac-let-7 的 PCR 产物 PCR of Bac-let-7； D：Bac-miR-100 菌液 PCR 验证 Verification of Bac-miR-100 recombinant by the bacteria liquid PCR。1：Bac-miR-100 的 PCR 产物 PCR of Bac-miR-100； E：Bac-miR-2795 菌液 PCR 验证 Verification of Bac-miR-2795 recombinant by the bacteria liquid PCR。1：Bac-miR-2795 的 PCR 产物 PCR of Bac-miR-2795；F：Bac-let-7-C 菌液 PCR 验证 Verification of Bac-let-7-C recombinant by the bacteria liquid PCR。M：1 kb Ladder DNA marker（购自 Promega Purchased from Promega）；1：Bac-let-7-C 的 PCR 产物 PCR product of Bac-let-7-C

图 2 miRNA 的重组杆状病毒表达载体的构建 Fig. 2 Construction of the miRNAs’ recombinant Bacmid

Bac-let-7、Bac-miR-100、Bac-miR-2795 和 Bac-let-7-C 为揭示 miRNA 的重组 Bacmid 是否在家蚕体内 这 4 个试验组中的 let-7、miR-100 和 miR-2795 均显著 也能过量表达 miRNA，分别将各重组 Bacmid 转染的 过量表达（图 4），说明各重组 Bacmid 在 Sf9 细胞中 Sf9 细胞离心，收集含重组病毒粒子的上清液，注射 都已大量增殖。在细胞水平，Bac-let-7-C 试验组结果 到家蚕 5 龄 1 d 幼虫体内，继续用桑叶喂养，发现空 显示，簇中各成员即 let-7、miR-100 和 miR-2795 均上 白对照组（WT）正常进食、吐丝和化蛹，但重组病 调表达，这种共表达关系与已报道的 let-7 簇中各成员 毒组（Bac-miRNA）和非重组病毒组（AcNPV）的 的表达模式类似[15]，表明克隆的 bmo-let-7-C 序列中含 幼虫在 5 龄 5 d 时不再进食，5 龄 7 d 时无上蔟和吐 有各 miRNA 前体，在 Sf9 细胞中都能被转录和加工 丝行为，约 90%在 5 d 内都因脂肪体的过度消耗而死 生成相应 miRNA 成熟体。然而，在 Bac-let-7-C 试验 亡。定量 PCR 检测结果表明，试验组 Bac-let-7 和 组中，let-7、miR-100 和 miR-2795 的表达水平存在着 Bac-miR-100 与阴性对照组（AcNPV）相比，let-7 和 较大差异，其中 miR-100 表达量最高（图 4-E），let-7 miR-100 均显著过量表达，但与空白对照组（WT） 表达量最低（图 4-D），这可能暗示病毒基因组或者 相比却没有明显变化（图 5-A、5-B），试验组 Bac- miRNA 簇有调控元件能够影响不同 miRNA 前体的转 miR-2795 中的 miR-2795 与阴性对照组和空白对照组 录或成熟体的积累。 的相比较都极显著过量表达（图 5-C）。Bac-let-7-C

3 期 何婷等：利用 Bac-to-Bac 杆状病毒系统超量表达家蚕 let-7 簇 microRNAs 587

A B

C D

E F

A：未处理的 Sf9 细胞系（WT） The fluorescence detection in non-transfected Sf9 cells with non-recombinant baculovirus DNA (wild type)；B：阴性对照 AcNPV 感染 Sf9 细胞系 The fluorescence detection in AcNPV-transfected Sf9 cells；C—F：重组杆状病毒 Bac-let-7、Bac-miR-100、Bac-miR-2795 和 Bac-let-7-C 上清液分别感染 Sf9 细胞系（各组左为白光，右为红光） The fluorescence detection in Sf9 cells infected with each supernatant containing Bac-let-7, Bac-miR-100, Bac-miR-2795 and Bac-let-7-C, respectively (left: white light, right: red light)

图 3 重组杆状病毒上清液感染 Sf9 细胞后 Red 报告基因信号检测 Fig. 3 The signal of Red reporter gene in Sf9 cells infected with the supernatant containing the recombinant Bacmid

ABCbmo-let-7 bmo-miR-100 bmo-miR-2795 P=0.0003 P=0.0005 P=0.0022 0.06 P=0.0004 0.6 0.8 P=0.0005 P=0.0022 0.05 0.5 0.7 0.6 0.04 0.4 0.5 0.03 0.3 0.4 Relative to U6 0.02 0.2 0.3 0.2 0.01 0.1 P=0.1304 P=0.2054 0.1 P=0.6923

相对表达量 0 0 0 WT AcNPV Bac-let-7 WT AcNPV Bac-miR-100 WT AcNPV Bac-miR-2795

DEFbmo-let-7 bmo-miR-100 bmo-miR-2795 0.05 P=0.0006 0.20 P=0.0060 P=0.0013 0.09 P=0.0056 P=0.0005 0.08 0.04 P=0.0081 0.15 0.07 0.03 0.06

Relative to U6 0.10 0.05 0.02 0.04 0.03 0.05 0.01 0.02 P=0.6335 P=0.0361 P=0.1146 0.01 相对表达量 0 0 0 WT AcNPV Bac-let-7-C WT AcNPV Bac-let-7-C WT AcNPV Bac-let-7-C

A：转染 Bac-let-7 的细胞系 Sf9 中 bmo-let-7 的表达 The bmo-let-7 expression level in Bac-let-7-transfected cell line Sf9；B：转染 Bac-miR-100 的细胞系 sf9 中 bmo-miR-100 的表达 The bmo-miR-100 expression level in Bac-miR-100-transfected cell line Sf9；C：转染 Bac-miR-2795 的细胞系 sf9 中 bmo-miR-2795 的表达 The bmo-miR-2795 expression level in Bac-miR-2795-transfected cell line Sf9；D：转染 Bac-let-7-C 的细胞系 Sf9 中 bmo-let-7 的 表达 The bmo-let-7 expression level in Bac-let-7-C-transfected cell line Sf9；E：转 染 Bac-let-7-C 的细胞系 Sf9 中 bmo-miR-100 的表达 The bmo-miR-100 expression level in Bac-let-7-C-transfected cell line Sf9；F：转染 Bac-let-7-C 的细胞系 Sf9 中 bmo-miR-2795 的表达 The bmo-miR-2795 expression level in Bac-let-7-C-transfected cell line Sf9

图 4 杆状病毒 miRNA 表达载体在细胞水平对 miRNAs 的过量表达 Fig. 4 Overexpression of miRNAs in vitro caused by the baculovirus recombinant miRNA expression vector

588 中 国 农 业 科 学 49卷

ABCbmo-let-7 bmo-miR-100 bmo-miR-2795 P=0.3680 P=0.7065 P＜0.0001 0.16 P=0.0786 0.08 P=0.0887 0.12 P＜0.0001 0.14 0.07 0.10 0.12 0.06 P=0.0091 0.10 0.05 0.08 P=0.0197

Relative to U6 0.08 0.04 0.06 0.06 0.03 0.04 0.04 0.02 P=0.2182 0.02 0.01 0.02 相对表达量 0 0 0 WT AcNPV Bac-let-7 WT AcNPV Bac-miR-100 WT AcNPV Bac-miR-2795

DEFbmo-let-7 bmo-miR-100 bmo-miR-2795 P=0.3153 P＜0.0001 P=0.0409 P=0.0369 0.12 0.050 0.040 P＜0.0001 P=0.0302 0.045 0.035 0.10 0.040 0.030 P=0.0090 0.08 0.035 0.030 0.025

Relative to U6 0.06 0.025 0.020 P=0.2303 0.020 0.015 0.04 0.015 0.010 0.010 0.02 0.005 P=0.0491

相对表达量 0.005 0 0 0 WT AcNPV Bac-let-7-C WT AcNPV Bac-let-7-C WT AcNPV Bac-let-7-C

GHIbmo-miR-100/midgut bmo-miR-100/hemocyte bmo-miR-2795/silk gland P=0.3968 P=0.7763 P=0.8658 P=0.3439 P=0.5238 0.14 0.040 P=0.9246 0.035 P=0.7986 0.12 0.035 0.030 P=0.6221 0.10 0.030 0.025 0.025 P=0.3818 0.08 0.020

Relative to U6 0.020 0.06 0.015 0.015 0.04 0.010 0.010 0.02 0.005 0.005 相对表达量 0 0 0 WT AcNPV Bac-let-7-C WT AcNPV Bac-let-7-C WT AcNPV Bac-let-7-C

JKLbmo-miR-2795/midgut bmo-miR-2795/hemocyte bmo-miR-2795/fat body P=0.0269 P=0.0042 P=0.0209 0.030 0.030 0.020 P=0.0102 P=0.0135 P=0.0477 0.018 0.025 0.025 0.016 0.014 0.020 0.020 0.012 P=0.6973

Relative to U6 0.010 0.015 0.015 0.008 0.010 0.010 P=0.3046 0.006 P=0.0040 0.004 0.005 0.005

相对表达量 0.002 0 0 0 WT AcNPV Bac-let-7-C WT AcNPV Bac-let-7-C WT AcNPV Bac-let-7-C

A：Bac-let-7 个体中 bmo-let-7 的表达 The bmo-let-7 expression level in Bac-let-7；B：Bac-miR-100 个体中 bmo-miR-100 的表达 The bmo-miR-100 expression level in Bac-miR-100；C：Bac-miR-2795 个体中 bmo-miR-2795 的表达 The bmo-miR-2795 expression level in Bac-miR-2795；D：Bac-let-7-C 个体中 bmo-let-7 的表达 The bmo-let-7 expression level in Bac-let-7-C；E：Bac-let-7-C 个体中 bmo-miR-100 的表达 The bmo-miR-100 expression level in Bac-let-7-C；F：Bac-let-7-C 个体中 bmo-miR-2795 的表达 The bmo-miR-2795 expression level in Bac-let-7-C；G：Bac-let-7-C 个体中肠里 bmo-miR-100 的表达 The bmo-miR-100 expression level in the midgut of Bac-let-7-C；H：Bac-let-7-C 个体血液里 bmo-miR-100 的表达 The bmo-miR-100 expression level in the hemocyte of Bac-let-7-C；I：Bac-let-7-C 个体丝腺中 bmo-miR-2795 的表达 The bmo-miR-2795 expression level in the silk gland of Bac-let-7-C； J：Bac-let-7-C 个体中肠里 bmo-miR-2795 的表达 The bmo-miR-2795 expression level in the midgut of Bac-let-7-C；K：Bac-let-7-C 个体血液中 bmo-miR-2795 的表达 The bmo-miR-2795 expression level in the hemocyte of Bac-let-7-C；L：Bac-let-7-C 个体脂肪体中 bmo-miR-2795 的表达 The bmo-miR-2795 expression level in the fat body of Bac-let-7-C

图 5 miRNA 重组 Bacmid 在个体水平对 miRNAs 的过量表达 Fig. 5 Overexpression of miRNAs in vivo caused by the baculovirus recombinant miRNA expression vector

3 期 何婷等：利用 Bac-to-Bac 杆状病毒系统超量表达家蚕 let-7 簇 microRNAs 589

组中 let-7 的表达量和阴性对照组 AcNPV 的相比无明 为出现缺陷[13]。let-7-C 通过抑制转录因子 chinmo 显差异，但和空白对照组 let-7 的表达量有显著差异 以调控幼虫到蛹的转变[37]。已有许多研究表明， （图 5-D），Bac-let-7-C 组 miR-100 的表达量与阴性 let-7 miRNA 在生长发育和生命代谢活动中具有非 对照组的相比显著过量表达，但与空白对照组的没有 常重要的作用，家蚕 let-7 簇 miRNAs 可能也是通过 明显差异（图 5-E）。然而，同样是在 Bac-let-7-C 试 与靶基因或一些激素应答元件相结合来调控家蚕 验组中，miR-2795 与阴性对照组和空白对照组的相比 变态发育。 均为极显著过量表达，这与 let-7 和 miR-100 的表达不 在细胞水平转染 Bac-let-7-C 重组过量表达载体 一致（图 5-F）。另外，rAcNPV 病毒进入家蚕体内后， 后，let-7-C 上的所有 miRNAs 都过量表达（图 4-D— bmo-let-7、miR-100 和 miR-2795 在个体中均下调表达 4-F），但在个体上注射 Bac-let-7-C 重组病毒后， （图 5-A—5-F），这说明在家蚕个体中由于病毒的大 miR-2795 仅在中肠、血液和脂肪体中过量表达（图 量增殖，需要消耗家蚕体内大量营养，破坏了家蚕体 5-J—5-L），而 let-7 和 miR-100 在脂肪体、血液、丝 内不同器官、组织和细胞的正常代谢环境，使这些 腺、和中肠组织中均与野生型（WT）无显著差异。 miRNAs 的表达受到抑制。进一步取 5 龄 6 d 家蚕脂 这暗示杆状病毒在家蚕体内大量繁殖对家蚕本身有较 肪体、丝腺、中肠和血液进行定量 PCR 检测，发现 大影响，改变了家蚕正常的基因表达和新陈代谢，家 bmo-let-7 miRNA 簇中 let-7 和 miR-100 在试验组的被 蚕特有的 miR-2795 虽然与保守的 let-7 和 miR-100 位 检测组织中无明显过量表达（图 5-G、5-H），miR-2795 于同一簇，但它们在细胞系和个体中有不同的表达模 在丝腺中也无过量表达（图 5-I），但在脂肪体、中肠 式，可能与杆状病毒对个体的影响有关，miR-2795 在 和血液中显著过量表达（图 5-J—5-L）。同时，AcNPV 个体中的表达受杆状病毒的影响可能较小，而 let-7 和 在丝腺、中肠等组织中对 miRNA 并没有明显抑制作 miR-100 却受病毒的影响较大，具体机制还不清楚。 用（图 5-G、5-I），但是在血液中对 miR-2795 的表达 AcNPV 感染 Sf9 细胞后，细胞周期会受到影响，细胞 有明显抑制效果（图 5-K），这可能是由于 AcNPV 病 被抑制于 G2/M 期[38]，但 AcNPV 感染家蚕个体后， 毒进入家蚕体内后有选择性地侵入到了一些组织和器 在不同组织和器官中到底如何影响基因的表达还需要 官。 深入研究。Singh 等[39]研究发现，bmnpv-miR-3 是由 BmNPV 编码的 miRNA，调控 DNA 结合蛋白（P6.9） 3 讨论 和 BmNPV 晚期基因，从而帮助 BmNPV 逃脱宿主早 家蚕作为一种完全变态昆虫，其发育过程与 期免疫应答。笔者推测 bmo-let-7-C 上可能存在着能帮 miRNA 的节律性表达和蜕皮激素的变化有着密切 助 AcNPV 摆脱宿主免疫应答的元件，一方面协助 的联系[16,33]。let-7 在家蚕发育过程中的多个阶段均 AcNPV 的大量繁殖，另一方面差别性的反馈调节不同 表达，推测其不仅参与调节家蚕晚期幼虫发育，可 miRNAs。 能还在早期幼虫发育阶段起调控作用[16]，但家蚕 Liu 等[15]发现在家蚕幼虫早期，let-7 簇上 let-7、 let-7 簇 miRNAs 的产生机制和具体功能并不清楚。 miR-100 和 miR-2795 具有一致的表达模式，本研究 miRNA 主要是通过碱基互补配对结合于靶基因，从 利用杆状病毒表达系统在细胞水平上验证了它们具 而促进 mRNA 降解或者抑制靶基因翻译[1,3-4]。线 虫 有一致的表达模式，但在家蚕体内却有较大的差异， lin-4 miRNA 通过部分互补配对方式结合于 lin-14 这可能是由于 miRNA 的组织特异性、病毒对家蚕组 基因 3′UTR，从而下调 lin-14 的表达[34]。在家蚕 5 织细胞感染的选择性以及病毒在组织细胞中不同的 龄时，注射 miR-281 mimic 后 BmEcR-B 蛋白下调 复制效率等多种因素，导致了不同组织中各 miRNA 表达，而注射 miR-281 抑制剂后 BmEcR-B 蛋白上 的表达差异。在胚胎干细胞和肿瘤细胞中，lin-28 调表达，miR-281 是通过结合于蜕皮激素受体 能够通过其 3′UTR 结合于 let-7 前体，阻碍 let-7 加 BmEcR-B 的 3′UTR，抑制 EcR-B 的转录，进而参 工和成熟，而在神经干细胞中 let-7 下调 lin-28 表 与家蚕马氏管的发育调控[35]。在野生型果蝇体内， 达[40-42]。miR-290 簇 miRNAs 调控 lin-28 和 RNA 结 miR-14 能降低果蝇翅原基中 EcR 的蛋白水平[36]。 合蛋白的表达，从而阻碍 let-7 的成熟[43-44]。miRNA 果蝇 let-7-C 受蜕皮激素诱导，删除 let-7-C 上的 ECR 的转录受 RNA 聚合酶 II 的调控[45-46]。同一簇上的 导致 let-7-C 表达水平下降，使成虫肌肉、神经和行 bmo-let-7、bmo-miR-100 和 bmo-miR-2795 在细胞水

590 中 国 农 业 科 学 49卷

平和个体上有相似的表达模式，但在它们的表达量 testes. Nature, 2006, 442(7099): 203-207. 是不同的，bmo-let-7 簇上不同 miRNA 初级前体是 [7] Miller L K. Baculoviruses for foreign gene expression in insect cells. 否具有不同的折叠和剪切方式，产生过程是否存在 Biotechnology, 1988, 10: 457-465. 不同的化学修饰，以及是否与蜕皮激素调节有关， [8] Lee R C, Feinbaum R L, Ambros V. The C. elegans heterochronic 这些都有待进一步探索。 gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 1993, 75(5): 843-854. 4 结论 [9] Reinhart B J, Slack F J, Basson M, Pasquinelli A E, Bettinger J C, 克隆了家蚕 bmo-let-7 miRNA 簇中的 let-7、 Rougvie A E, Horvitz H R, Ruvkun G. The 21-nucleotide let-7 RNA miR-100 和 miR-2795 前体序列以及 bmo-let-7 簇全长 regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature, 序列，构建了 Bac-to-bac 杆状病毒 miRNA 超量表达 2000, 403(6772): 901-906. 系统。利用所构建的超量表达系统，bmo-let-7 簇上各 [10] Pasquinelli A E, Reinhart B J, Slack F, Martindale M Q, Kuroda M I, miRNA 的重组 Bacmid 在 Sf9 细胞中都过量表达了相 Maller B, Hayward D C, Ball E E, Degnan B, Muller P, Spring J, 应 miRNA，bmo-let-7 簇的重组 Bacmid 在 Sf9 中过量 Srinivasan A, Fishman M, Finnerty J, Corbo J, Levine M, Leahy P, 表达了 let-7、miR-100 和 miR-2795。然 而 ，bmo-let-7、 Davidson E, Ruvkun G. Conservation of the sequence and temporal miR-100 和 miR-2795 以及 bmo-let-7 簇的重组 Bacmid expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature, 2000, 在家蚕个体水平实现过量表达 miRNA 的情况却并不 408(6808): 86-89. 一致。Bac-let-7-C 组中只有 miR-2795 在个体上被显著 [11] Grosshans H, Johnson T, Reinert K L, Gerstein M, Slack F J. The 过量表达，并存在明显的器官和组织差异性，即 temporal patterning microRNA let-7 regulates several transcription miR-2795 在血液、中肠和脂肪体中显著过量表达，但 factors at the larval to adult transition in C. elegans. Developmental 在丝腺中没有过量表达，这可能是由于重组 Bacmid Cell, 2005, 8(3): 321-330. 在家蚕体内对不同组织和器官有着不同的浸染力。该 [12] Sempere L F, Sokol N S, Dubrovsky E B, Berger E M, Ambros V. 研究可为深入探索家蚕 let-7 簇 miRNA 中 let-7、 Temporal regulation of microRNA expression in Drosophila miR-100 和 miR-2795 的功能以及产生机理提供新的参 melanogaster mediated by hormonal signals and broad-complex gene 考。 activity. Developmental Biology, 2003, 259(1): 9-18. [13] Chawla G, Sokol N S. Hormonal activation of let-7-C microRNAs via References EcR is required for adult Drosophila melanogaster morphology and [1] Bartel D P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Development, 2012, 139(10): 1788-1797.

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中国西南地区甘薯主要育种亲本的遗传 多样性及群体结构分析

罗 凯 1，卢会翔 1，吴正丹 1，吴雪莉 1，尹 旺 1，唐道彬 1,2，王季春 1,2，张 凯 1,2

（1 西南大学农学与生物科技学院，重庆 400716；2 重庆市甘薯工程技术研究中心，重庆 400716）

摘要：【目的】探究中国西南地区主要甘薯育种亲本材料的遗传多样性和群体结构，为甘薯亲本材料的保存和利用、 甘薯分子标记辅助选择提供参考依据。【方法】利用 61 个 SSR 分子标记、13 个农艺性状和 6 个品质性状，对 82 份中国 西南地区主要甘薯育种亲本材料进行遗传多样性分析。利用 NTSYS-pc 2.10 数据处理软件，分别根据 SSR 分子标记数 据、品质性状、农艺性状计算 82 份亲本材料的 Nei72 遗传距离矩阵。利用 Mega 6.06 数据处理软件，计算 82 份材料 基于 SSR 分子标记、品质性状、农艺性状的平均遗传距离。利用 NTSYS-pc 2.10 软件，对供试材料基于 SSR 标记、品 质性状和农艺性状的遗传距离矩阵进行相关性分析。根据遗传距离矩阵，利用 Mega6.06 软件分别对 82 份亲本材料进 行基于品质性状的类平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）聚类分析、基于 SSR 分子标记的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）聚类分析和基于农艺性状的类平均法（UPGMA）聚类分析。根据 SSR 分子 标记数据，利用 STRUCTURE 2.4 对 82 份供试材料进行群体结构分析。【结果】61 对 SSR 引物共检测出 405 条多态性谱 带，其中，每对引物获得 1—17 条多态性谱带，平均每对引物检测出 6.64 条多态性谱带。82 份亲本材料基于 SSR 分子 标记、品质性状、农艺性状的 Nei 平均遗传距离分别为 0.3499、0.2210 和 0.0270。基于 SSR 分子标记的邻接法（NJ） 聚类分析将 82 份材料聚为 7 个类群。基于农艺性状、品质性状的类平均法（UPGMA）聚类分析均可将 82 份材料划分为 一个较大的类群和三个较小的类群，但基于农艺性状和品质性状的聚类分析结果差异较大。基于 SSR 分子标记、品质 性状和农艺性状的聚类分析均能将供试材料中来自不同地区的材料聚为同一类群，表明不同地理来源的供试材料间没 有明显的遗传差异。遗传距离矩阵之间的相关性分析表明，基于 SSR 标记、品质和农艺性状的遗传距离矩阵间的相关 性很小（r=0.0158），品质性状与农艺性状间呈负相关（r=-0.0411）。群体结构分析表明，当 K 值等于 3 时，ΔK 取得 最大值，说明 82 份材料可以划分为 3 个亚群。其中 53 份（64.63%）供试材料的 Q 值大于或等于 0.6，分属于 3 个亚群。 29 份材料（35.37%）划分为混合亚群。群体结构分析的亚群划分结果与 SSR 聚类分析结果有一定相似性。【结论】供 试亲本材料基因组水平的遗传多样性较为丰富，品质性状有一定差异，农艺性状差异较小。单独利用某一种标记或性 状对亲本材料进行衡量都不全面，建议结合分子标记和多种表型性状，进行深入的遗传多样性和群体结构分析。 关键词：甘薯；遗传多样性；群体结构；农艺性状；SSR；品质性状

Genetic Diversity and Population Structure Analysis of Main Sweet Potato Breeding Parents in Southwest China

LUO Kai1, LU Hui-xiang1, WU Zheng-dan1, WU Xue-li1, YIN Wang1, TANG Dao-bin1,2, WANG Ji-chun1,2, ZHANG Kai1,2

(1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716; 2Chongqing Sweet Potato Engineering Technological Research Center, Chongqing 400716)

收稿日期：2015-08-13；接受日期：2015-11-27 基金项目：国家自然科学基金（31101192）、重庆市应用开发计划项目重点项目（cstc2013yykfB80010）、中央高校基本科研业务费专项资金项目 （XDJK2014B038，XDJK2012C102，2362015xk05）、重庆市社会事业与民生保障科技创新专项（cstc2015shms-ztzx0121，cstc2015shms- ztzx0128）、重庆市自然科学基金重点项目（cstc2012jjB80009，cstc2013jjB80006） 联系方式：罗凯，E-mail：[email protected]。卢会翔，E-mail：[email protected]。罗凯和卢会翔为同等贡献作者。通信作者王季春，E-mail： [email protected]；通信作者张凯，E-mail：[email protected]

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Abstract: 【Objective】 To provide a reference for the conservation and application of breeding parentallines resource, as well as molecular assistant selection (MAS) in sweet potato (Ipomoea batatas), a comprehensive analysis of genetic diversity and population structure analysis of the main sweetpotato breeding parentallines in southwest China was performed. 【Method】 Genetic diversity of 82 main sweet potato breeding parents in southwest China was evaluated by using 61 sample sequence repeats (SSR) markers, 13 agronomic traits and 6 quality traits. The Nei72 genetic distance matrices of 82 tested sweet potato breeding parents were generated based on SSR markers while quality trait and agronomy trait were assessed using NTSYS-pc version 2.10. The mean genetic distance of the tested sweet potato breeding parents based on SSR marker, quality trait and agronomy trait were generated by using Mega version 6.06. Mantel test among genetic distance matrices generated based on SSR marker, quality trait and agronomic trait were conducted by using NTSYS-pc version 2.10. The unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) cluster analysis of 82 sweetpotato breeding parents based on quality trait, Neighbor-Joining (NJ) cluster analysis based on SSR marker and UPGMA cluster analysis based on agronomy trait were performed by using Mega version 6.06. Meanwhile, the population structure of 82 sweet potato genotypes was determined based on polymeric data generated by SSR markers using STRUCTURE version 2.4. 【Result】 405 polymorphic loci were detected using 61 SSR markers with a mean of 6.64 alleles per primer pair. The number of polymorphic loci obtained from each primer pair ranged from 1 to 17. The SSR marker, quality trait and agronomic trait-based mean Nei’s genetic diversity of tested sweet potato breeding parents was 0.35, 0.22 and 0.03, respectively The tested 82 sweet potato genotypes could be divided into 7 subgroups based on NJ clustering using SSR markers. This same sweet potato collection could be divided into 1 major subgroup and 3 minor subgroups based on UPGMA method using either agronomic or quality traits, but the results showed differentiation. Among the tested sweet potato breeding parents, the genotypes with different original resources could be clustered into the same subgroups in the cluster analysis based on SSR marker, quality trait and agronomic trait, indicating there was no significant genetic differentiation among the tested sweet potato genotypes from different original resources. Mantel test detected little correlation among genetic distance matrices generated by using SSR marker, quality trait and agronomic trait (r=0.016), and a negative correlation (r=-0.041) was detected between genetic distance matrices generated by using quality and agronomic trait. The maximum ad hoc quantity ΔK was observed for K=3 in population structure analysis, indicating that the entire collection could be divided into three subpopulations. Using a membership probability threshold of ≥0.60, 53 genotypes (accounting for 64.6% of the tested genotypes) were assigned to the three subpopulations, and 29 (account for 35.4% of tested breeding parents) were retained in the admixed group (AD). The assignment of 82 sweetpotato genotypes determined by structure analysis was similar but not fully consistent with the assignment pattern of NJ clustering based on SSR marker. 【Conclusion】 Our results demonstrated that a wide genetic diversity at the genomic level was found among the tested main sweet potato breeding parental lines in southwest China. Genetic differentiation could be found in their quality traits, but little differentiation could be found in their agronomic traits. Furthermore, there exists a strong limitation in studying genetic diversity by using a single marker system or trait, and comprehensive analysis systems, combining molecular markers and various phenotypic traits should be given priority in further studies of genetic relationships and population structure of sweet potato breeding parental lines. Key words: sweetpotato; genetic diversity; population structure; agronomic trait; SSR; quality trait

的育种亲本和种质资源，并对某些特殊材料进行有效 0 引言 的保护[2-3]。【前人研究进展】针对甘薯的遗传多样性， 【研究意义】中国是世界上最大的甘薯（Ipomoea 前人已做了不少研究，Austin[4]利用表型性状多样性标 batatas）生产国，种植面积大于 600 万公顷，占世界 记对中美洲地区甘薯种质资源开展了进化和遗传多样 甘薯种植总面积的 60%以上，年产量占世界总产的 性研究，最先提出甘薯是三叶裂薯（Ipomoea triloba） [1] 80%以上 。甘薯是一种无性繁殖作物，杂交 F1 代广 和三叶浅裂野牵牛（Ipomoea trifida）杂交后代经染色 [3] 泛分离，选择综合亲本优良性状的 F1 代无性繁殖即能 体加倍后形成的物种这一假说。Zhang 等 利用 AFLP 将杂种优势固定下来，从而育成可直接用于生产的新 标记分析了美洲热带地区甘薯遗传多样性，认为这一 品种。同时，甘薯无性系的变异也可直接选育成新品 地区甘薯的遗传多样性丰富。Sagredo 等[5]利用 RAPD 种。因此，新材料特别是具有某些特殊品质的新品系 标记技术对智利甘薯栽培种的遗传多样性进行研究， 及地方品种、野生材料的发掘和鉴定尤为重要[2]。研 认为智利本土甘薯品种遗传多样性背景狭窄。Zhang 究作物的遗传多样性和群体结构，可以充分利用现存 等[6]利用 ISSR 分子标记分析了中国 240 份甘薯种质资

3 期 罗凯等：中国西南地区甘薯主要育种亲本的遗传多样性及群体结构分析 595

源材料的遗传多样性，发现不同种植区的甘薯种质有 1 材料与方法 一定的遗传差异，但国内甘薯品种的遗传多样性没有 其他地区报道的丰富。贺学勤等[7]利用 RAPD、ISSR 1.1 植物材料 和 AFLP 等技术对中国甘薯地方品种的遗传多样性进 采用中国西南地区甘薯育种的主要育种亲本材料 行了研究，认为广东地方品种遗传背景较为丰富。 共计 82 份。其中包括来自国内多个省份的育成品种/ Karuri 等[8]利用表型性状多样性和 SSR 分子标记对肯 系和农家种 59 份，地方品种 14 份，其中 11 份地方品 尼亚甘薯品种进行了遗传多样性分析。群体结构分析 种来自贵州地区。引自美国、日本、尼日利亚等国的 是运用分子标记数据分析作物自然群体遗传结构的一 引进品种 9 份（表 1）。 种方法，也可以从中发掘新变异，选育新品种[9]。至 1.2 农艺性状调查 今，已有多位学者报道了某些作物的群体遗传结构分 2013 年，在重庆市北碚区歇马镇西南大学薯类作物 析结果，如 Garris 等[10]利用 SSR 分子标记和叶绿体基 研究所试验地种植 82 份供述甘薯材料，4 行区，1.5 m 行 因核苷酸多态性标记，分析了 234 个水稻（Oryza 长，进行田间农艺性状调查。参考张允刚等[17]撰写的《甘 sativa）品种的群体遗传结构和进化关系。Würschum 薯种质资源描述规范和数据标准》，于封垄期调查甘薯 等[11]、Inghelandt 等[12]和 Filippi 等[9]分别利用 SSR 和 基部分枝数、最长茎长和最大茎粗 3 个地上部农艺性状， SNP 标记对小麦（Triticum aestivum）育成品种和玉米 收获时在田间调查单株结薯数、大、中、小薯的个数、 （Zea mays）、向日葵（Helianthus annuus）自交系的 重量，计算大、中、小薯率，共计 10 个地下部农艺性状。 群体结构和遗传多样性进行了分析，认为这两种分 1.3 品质性状测定 子标记是作物遗传多样性分析和群体结构分析的有 在收获期对供试材料的块根干率、淀粉率、直链、 效手段。Adugna 等[13]利用表型性状多样性和 SSR 支链淀粉含量、直链/支链淀粉比例、β-胡萝卜素含量 分子标记，对埃塞俄比亚 3 个生态型高粱栽培品种 6 个品质性状进行测定。根据吕长文等[18]的方法计算 的 160 个单株遗传多样性和群体结构进行了分析。 干率。参照陆国权等[19]和王文质等[20]的方法，采用干 【本研究切入点】由于表型性状多样性标记及 率换算法计算块根淀粉含量，计算公式为：淀粉率（%） AFLP、RAPD、ISSR 这些分子标记可靠性相对较低， =干率（%）×0.86945-6.34507。直链、支链淀粉含量 且 RAPD 标记的可重复性不高[14]，在分析遗传关系 参照黄立飞等[21]的方法测定，根据测定值计算直链、 近的品种时显得乏力。SSR 是当前植物分子生物学 支链淀粉含量比。参照马代夫等[22]方法测定块根 β- 研究中广泛运用的分子标记技术，具有高分辨率、 胡萝卜素含量。 高稳定性、重复性好、共显性遗传和操作简单等特 1.4 DNA 的提取及反应体系的构建 点[15-16]，已经在水稻、小麦、高粱、向日葵等作物 参考 Kim 等[23]的方法，采用 CTAB 法提取甘薯叶 的遗传多样性和群体结构分析中得到了广泛应用。 片总 DNA。PCR 反应体系为 10 µL，包括 1.0 µL 的 但是，采用 SSR 分子标记进行甘薯遗传多样性分析 10×缓冲液（200 mmol·L-1 Tris-HCl pH8.3 、 200 -1 -1 -1 的报道较少，所采用的标记数目较少，得到的多态 mmol·L KCl、100 mmol·L (NH4)2SO4 和 20 mmol·L -1 性位点也不多，而且尚缺乏利用 SSR 分子标记数据 MgSO4）、0.2 µL 的 2.5 mmol·L dNTPs、50 ng DNA、 对甘薯群体结构进行分析的报道。【拟解决的关键 0.5 U EasyTaq 聚合酶（全式金生物技术有限公司，北

问题】西南地区是中国重要的甘薯产区，具有丰富 京）、正和反向引物各 50 ng，加 ddH2O 至 10 µL。PCR 的甘薯育种类型、种质资源和育种亲本。本研究运 在 GeneAmp PCR System 9700（ABI，美国）平台进 用 SSR 分子标记技术，结合农艺性状、品质性状的 行，反应条件为 94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s， 多样性，对 82 份作为中国西南地区主要育种亲本的 72℃ 1 min，35 个循环；72℃ 10 min，4℃保存。扩 材料，包括地方品种、国内育成品种/品系和国外引 增产物用 8%非变性聚丙烯酰胺电泳分离，银染检测。 进品种等进行遗传多样性和群体结构分析，旨在揭 1.5 SSR 引物 示中国西南地区甘薯主要育种亲本的遗传多样性和 利用已公布的甘薯转录组测序数据，设计 150 对 群体结构特征，为甘薯有价值亲本的保存和利用、 SSR 引物。选用表型、淀粉含量差异大的 4 个甘薯品 分子标记辅助选择、育种策略的实施以及关联图谱 种进行引物筛选，筛选后获得的 61 对多态性 SSR 引物 的构建等提供理论依据和实践参考。 （表 2）。引物全部由上海英骏生物技术有限公司合成。

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表 1 82 份供试材料的名称及其地理来源 Table 1 Name and origin of 82 sweetpotato genotypes used in this study 编号 名称 地理来源 材料类型 编号 名称 地理来源 材料类型 Code Name Origin Type Code Name Origin Type 1 01160 中国重庆 育成品系 26 福薯 18 中国福建 育成品种 Chongqing, China Breeding line Fushu18 Fujian, China Variety 2 4-6-24 中国重庆 育成品系 27 贵定黄皮黄心 中国贵州 地方品种 Chongqing, China Breeding line Guidinghuangpihuangxin Guizhou, China Landrace 3 5-12-7 中国重庆 育成品系 28 贵阳红皮苕 中国贵州 地方品种 Chongqing, China Breeding line Guiyanghongpishao Guizhou, China Landrace 4 渝薯 17 中国重庆 育成品种 29 济薯 2 号 中国山东 育成品种 Yushu 17 Chongqing, China Variety Jishu 2 Shandong, China Variety 5 9506-1 中国重庆 育成品系 30 济薯 9 号 中国山东 育成品种 Chongqing, China Breeding line Jishu 9 Shandong, China Variety 6 8128-4-1 中国重庆 育成品系 31 金千贯 日本 日本引进 Chongqing, China Breeding line Koganansangan Japan Introduced variety 7 0409-17 中国重庆 育成品系 32 抗病 1 号 中国贵州 育成品种 Chongqing, China Breeding line Kangbing 1 Guizhou, China Variety 8 0505-5 中国重庆 育成品系 33 栗子香 中国江苏 育成品种 Chongqing, China Breeding line Lizixiang Jiangsu, China Variety 9 0818-5 中国重庆 育成品系 34 鲁薯 10 号 中国山东 育成品种 Chongqing, China Breeding line Lushu 10 Shandong, China Variety 10 2-274 中国重庆 育成品系 35 蔓尖苕 中国四川 育成品种 Chongqing, China Breeding line Manjianshao Sichuan, China Variety 11 2-285 中国重庆 育成品系 36 绵粉 1 号 中国四川 育成品种 Chongqing, China Breeding line Mianfen 1 Sichuan, China Variety 12 2-361 中国重庆 育成品系 37 南薯 007 中国四川 育成品种 Chongqing, China Breeding line Nanshu007 Sichuan, China Variety 13 2-497 中国重庆 育成品系 38 南放 中国江苏 育成品种 Chongqing, China Breeding line Nanfang Jiangsu, China Variety 14 7-S 中国重庆 育成品系 39 南瑞苕 美国 美国引进 Chongqing, China Breeding line Nancy Hall USA Introduced variety 15 南薯 6 号 中国重庆 育成品种 40 南薯 88 中国四川 育成品种 Nanshu 6 Chongqing, China Variety Nanshu88 Sichuan, China Variety 16 D01414 中国重庆 育成品系 41 南薯 99 中国四川 育成品种 Chongqing, China Breeding line Nanshu99 Sichuan, China Variety 17 D01593 中国重庆 育成品种 42 南紫薯 008 中国四川 育成品种 Chongqing, China Variety Nanzishu008 Sichuan, China Variety 18 D-1-018 中国重庆 育成品系 43 尼日利亚 尼日利亚 尼日利亚引进 Chongqing China Breeding line Nigeria Nigeria Introduced variety 19 S1-5 中国重庆 育成品系 44 农富 8 号 中国 育成品种 Chongqing, China Breeding line Nongfu 8 China Variety 20 川薯 27 中国四川 育成品种 45 农林 10 号 日本 日本引进 Chuanshu27 Sichuan, China Variety Norin 10 Japan Introduced variety 21 川薯 34 中国四川 育成品种 46 农林 1 号 日本 日本引进 Chuanshu34 Sichuan, China Variety Norin 1 Japan Introduced variety 22 道真白皮苕 中国贵州 地方品种 47 黔龙红苕 中国贵州 地方品种 Daozhenbaipishao Guizhou, China Landrace Qianlonghongshao Guizhou, China Landrace 23 吊丝红 美国 美国引进 48 日-19 日本 日本引进 Diaosihong USA Introduced variety Ri-19 Japan Introduced variety 24 独山红皮黄心 中国贵州 地方品种 49 三合薯 中国浙江 育成品种 Dushanhongpihuangxin Guizhou, China Landrace Sanheshu Zhejiang, China Variety 25 二郎苕 中国 地方品种 50 山川紫 日本 日本引进

Erlangshao China Landrace Yamakawmurasaki Japan Introduced variety

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续表 1 Continued table 1

编号 名称 地理来源 材料类型 编号 名称 地理来源 材料类型 Code Name Origin Type Code Name Origin Type 51 商丘 52-7 中国河南 育成品种 67 蕹菜种 中国广东 地方品种 Shangqiu52-7 Henan, China Variety Wengcaizhong Guangdong, China Landrace 52 胜利百号 日本 日本引进 68 香苕 中国四川 农家种 Okinawa 100 Japan Introduced variety Xiangshao Sichuan, China Farmer variety 53 苏薯 1 号 中国江苏 育成品种 69 心意红苕 中国 地方品种 Sushu 1 Jiangsu, China Variety Xinyihongshao China Landrace 54 苏薯 8 号 中国江苏 育成品种 70 宿芋 1 号 中国江苏 育成品种 Sushu 8 Jiangsu, China Variety Suyu 1 Jiangsu, China Variety 55 台农 10 号 中国台湾 育成品种 71 徐 26-5 中国江苏 育成品种 Tainong 10 Taiwan, China Variety Xu26-5 Jiangsu, China Variety 56 台农 69 中国台湾 育成品种 72 渝薯 2 号 中国重庆 育成品种 Tainong69 Taiwan, China Variety Yushu 2 Chongqing, China Variety 57 桐梓白皮红心 中国贵州 地方品种 73 渝苏 303 中国重庆 育成品种 Tongzibaipihongxin Guizhou, China Landrace Yusu303 Chongqing, China Variety 58 铜仁隔兜苕 中国贵州 地方品种 74 渝薯 33 中国四川 育成品种 Tongrengedoushao Guizhou, China Landrace Yushu33 Sichuan, China Variety 59 铜仁无藤苕 中国贵州 地方品种 75 渝紫 13 中国重庆 育成品种 Tongrenwutengshao Guizhou, China Landrace Yuzi13 Chongqing, China Variety 60 铜仁一窝红 中国贵州 地方品种 76 豫薯 7 号 中国河南 育成品种 Tongrenyiwohong Guizhou, China Landrace Yushu 7 Henan, China Variety 61 皖薯 4 号 中国安徽 育成品种 77 浙 13 中国浙江 育成品种 Wanshu 4 Anhui China Variety Zhe13 Zhejiang, China Variety 62 万薯 34 中国重庆 育成品种 78 浙 147 中国浙江 育成品种 Wanshu 34 Chongqing, China Variety Zhe147 Zhejiang, China Variety 63 万薯 6 号(611-6) 中国重庆 育成品种 79 浙薯 602-5 中国浙江 育成品种 Wanshu 6 (611-6) Chongqing, China Variety Zheshu602-5 Zhejiang, China Variety 64 万薯 7 号 中国重庆 育成品种 80 浙紫薯 1 号 中国浙江 育成品种 Wanshu 7 Chongqing, China Variety Zhezishu 1 Zhejiang, China Variety 65 万紫 56 中国重庆 育成品种 81 正安红皮苕 中国贵州 育成品种 Wanzi56 Chongqing, China Variety Zhenganhongpishao Guizhou, China Variety 66 瓮安黄心 中国贵州 地方品种 82 自 807 中国重庆 育成品种 Wenganhuangxin Guizhou, China Landrace Zi807 Chongqing, China Variety

1.6 数据处理及聚类分析 分析（mantel tests）用 NTSYS-pc 2.10 数据处理软件 根据田间测定的农艺性状及实验室测定的品质性 进行。 状，利用数据处理软件 NTSYS-pc 2.10[24]计算 82 份材 1.7 群体结构分析 料的 Nei72 遗传距离矩阵。用 Mega 6.06[25]数据处理 参考 Hubize 等[26]的方法，用 STRUCTURE 2.4 数 软件基于遗传距离矩阵进行类平均法（unweighted pair 据处理软件根据 SSR 分子标记数据计算 82 份材料的 group method with arithmetic mean，UPGMA）聚类分 群体结构，设置分析群体数 K（the true number of 析。在 SSR 分析中，用数字 1 和 0 分别表示某一等位 clusters）为 1—10，每个参数运行 10 次，每次运行的 变异有无，有带赋值为 1，无带赋值为 0。根据 SSR burn-in time 设置为 50 000，重复次数为 10 000。 分子标记数据，用 NTSYS-pc 2.10 计算 82 份材料的 Structure 计算结果用 Structure Harvester 网页工具[27] Nei72 遗传距离矩阵，用 Mega 6.06[25]数据处理软件的 （http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester）分 邻接法（Neighbor-Joining，NJ）根据遗传距离矩阵进 析，根据 Ln P(D)或者 ΔK 的值确定群体的亚群数；根 行聚类分析。根据农艺性状、品质性状和 SSR 分子标 据似然值最大的运行结果划分亚群，Q 值大于或等于 记 Nei72 遗传距离矩阵，用 Mega 6.06[25]分别计算 82 0.6 的种质被划分到相应的亚群，小于 0.6 的种质被划 份材料的平均遗传距离。遗传距离矩阵之间的相关性 分到混合群体（admixed group，AD）。

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表 2 61 对 SSR 引物及其序列 Table 2 Nucleotide sequences of the 61 primer pairs used in this study 编号 引物名称 序列 编号 引物名称 序列 No. Primer name Sequences (5′-3′) No. Primer name Sequences (5′-3′) 1 SIP001F CAAAGCTAGGGCAAGGACAG 21 SIP062F AGACTTGAGAGTTGAGAGAGAGCCT

SIP001R AGAGTACGCGGGGAGGTCT SIP062R AGCCAATGCCATAGAACGAG

2 SIP002F GCGCTTCCTTCAACAGAGAG 22 SIP063F TGTTTTCTGGGTTCCCTGTG

SIP002R TTCCTTGTTGCAGTCGATGA SIP063R ATGCTGATCCAATGCAACCT

3 SIP004F CCCAATCAAATCCCCTTCTT 23 SIP067F TATTGGCAAGTTCAGGAGGC

SIP004R CTATTGCTCCATTCCCACTGA SIP067R AAAGCCCATTTCCCAAGAAG

4 SIP005F GAGGAAAGGAGAGAGGGTCG 24 SIP068F CGGAATTGATTACGGCAAAA

SIP005R TGGCTTCAATTCCAATCACTC SIP068R ATACCCACGTGAGCCTTCAG

5 SIP012F AGTTGAAAAGCACCACCACC 25 SIP069F GGATATCCGGCAAGGAATCT

SIP012R GATACCTGGGAGAGGCGTTT SIP069R GGTCGGGGAGAAGGAGGA

6 SIP018F AGCAGTTGGTATCAACGCAGA 26 SIP070F CCAGCTTTTGCTTCAGTTCAA

SIP018R CATGGTAGCTTACTGTTGACTTGC SIP070R TTAAGTCAACAACAAACACTCATTCA

7 SIP019F AAAACGGGATTGTGGTGATG 27 SIP071F CGTGTTAAAGCTCGCAAACA

SIP019R CAACGCAATTGCTGTCTCAG SIP071R CGGCTGACAGATTGGATCA

8 SIP021F CGTGGACGAAGGAAGAAAAA 28 SIP072F ATGCAGAATCAAGATCCCCA

SIP021R TTAATGCTGATGTGGATGCG SIP072R TGATGTCTCCACATACCCTTCA

9 SIP022F GAGCCAAAAAGCTTTCACACA 29 SIP076F TGGACATCTCCCACTGAACA

SIP022R CAATCGCCCAATTCCATAAC SIP076R TCACCTACACCTAAACCTTAGCAAC

10 SIP025F GGAAGGAACAGCAAAATCCA 30 SIP077F AGAAGGGTCATCCGAGGAGT

SIP025R TCGGCCACAATACAAGATCA SIP077R GGAAGAAGAAGAGAACCGCC

11 SIP026F GGTATGGAAAGGGAAATTGGA 31 SIP078F TTTAGCGAGACCCAGACCAC

SIP026R TCACATGGCTTTTAGGGATCA SIP078R CGACCTCCGACCTGTTTCTA

12 SIP028F TCCTCGTCTTCTTTGATCGC 32 SIP079F ATTAGATCCCCCTCCTCCCT

SIP028R CGACCGATCCACTCCTCTCT SIP079R GATGAGAAGCCACAAATGGAA

13 SIP029F GTCCAGACATCGCCAAGAGT 33 SIP081F CCTTTCCTACTTGGCAACCA

SIP029R ACAGCCTCATTGATATGGTTCC SIP081R CCTCGATATTCTTGCGCCT

14 SIP031F ATCAGGTGTGCTTTTGCTCC 34 SIP082F CTTCTCTTGCTCGCCTGTTC

SIP031R CGGCTGAGGTTTGATCATTT SIP082R GATAGTCGGAGGCATCTCCA

15 SIP041F TGAAGATGATGAACAGAGGCTAGA35 SIP084F GGTGGGGGTTGTGTTTGTAA

SIP041R AGTGCAAAAAGGGGAGCTTT SIP084R GCACAGTGGGCACCCTATTA

16 SIP042F TCCACCAACTGCACCTACAA 36 SIP085F CGTTCCTTGGCATTGAAGAT

SIP042R TTCCAAGACTCCCTCTGGTG SIP085R TGGAGTTTGCATTGAACGAA

17 SIP053F AAGCATCGAGTGCGTATCGT 37 SIP087F TCATCGCAAATGCATGAAAG

SIP053R GGCTTAGCGACGGAGTTGTA SIP087R GGCATTCAAAGTTGACCGAA 18 SIP054F TGGTCAAAATTTGCATTATGGAT 38 SIP089F CGCCTTGCTGTGTGTAACAA SIP054R TGAGCTTCGACGACCTCTTT SIP089R TCGCAGCGAGAGTTGGTTAT 19 SIP060F GGAAGCAACGATTTCCAAAA 39 SIP090F AGATCTCCTTCCTCCGGTGT SIP060R CCCCATGTCTTCCTTTCCTT SIP090R TGAAACAGATCTTCAGGTCGC 20 SIP061F CTGATCACACAGCTTGTCCG 40 SIP091F CTGGTGGTTACTGGGCTTGT SIP061R AAACAGAGCCCCTTTCCATC SIP091R GGAGGAGGAGCTGAATTAGGAT

3 期 罗凯等：中国西南地区甘薯主要育种亲本的遗传多样性及群体结构分析 599

续表 2 Continued table 2

编号 引物名称 序列 编号 引物名称 序列 No. Primer name Sequences (5′-3′) No. Primer name Sequences (5′-3′) 41 SIP092F TTGTTGGTTTCCACTCAAAGC 52 SIP110F TCACAATGATTGGACTGACGA

SIP092R CCATGAATTCGGTGGATCAT SIP110R CTATCACCGGAGAGCGGTAA

42 SIP094F GAGGCCCAAGAAGAGCATAAG 53 SIP113F GCAAGATCGAGGGATTCTGA

SIP094R GAGCATCTGGGTTTTTGGTG SIP113R ATGGGCACTAGCATTCAAGG

43 SIP095F ACCTGAAGCCTATTACCGCAT 54 SIP114F CCCCCTGCTCTTTCTCTTTC

SIP095R TGCGACTTTATAAACCAACGG SIP114R TTCACTCGGATTTTCCAACAG

44 SIP097F GAAGACCAACAAGAAGGGGG 55 SIP118F TGGAGGTTGAAGATGATGAACA

SIP097R TGCATGGACTGACGAAACAT SIP118R AGTGCAAAAAGGGGAGCTTT

45 SIP098F TCAGAAGCTCCGATTTCCAG 56 SIP125F CCCGTCTCCCTTTTTCTTTC

SIP098R CCGAACCCATCACTTCTTTG SIP125R CGCCCAAGAAATACAAGCAT

46 SIP100F GCTAGTGAGGACGAAGACGG 57 SIP126F GTTTGAAGATGATGAACAGAGGC

SIP100R CATCGAAGAGGCTGAAAAGC SIP126R AGTGCAAAAAGGGGAGCTTT

47 SIP101F GATCAGAAGCCCTCACAACAA 58 SIP127F GCTTGATCCAAGATCTATCATTCC

SIP101R ACGCTTCGGCATCCATAGTA SIP127R TGGTCCGAGATCAATCCAAT

48 SIP105F GCAAAAACCCCCTCAAAAAT 59 SIP132F TGCCTGTTCAAATACAAGTCCA

SIP105R CAATCTTCATCCTCTCCCCA SIP132R CACTGAACCTGTCCAGAGCA

49 SIP106F TCCCGAAGTACCCGATGTAA 60 SIP137F CCTCGCACAGCTGAAAAACT

SIP106R CCACCCTTTTGGAGTCAAGA SIP137R TGCAACTGGCCGATACAATA

50 SIP107F GTTTTCCGGCCTAATCCCTA 61 SIP141F GTCCAGCTCCTTGTGTTGGT

SIP107R TAGTACATGCATGGCCCACA SIP141R GATGGGCCAAAGCAGAATAA

51 SIP108F GCAGTGGTAATTCAACGGCA

SIP108R TTTTACTCCTCCTGAGACATGGA

成品种/系间的遗传距离为 0.093— 0.634，平均 2 结果 0.359。 2.1 SSR 分子标记的多态性 2.2.2 基于 SSR 分子标记的聚类分析 SSR 聚类分 采用 61 对 SSR 引物，以 82 份材料（表 1）的基 析如图 1-A 所示。在遗传距离 0.25 处，82 份材料可 因组 DNA 为模板进行扩增，每一对引物都能检测出 分成 7 个类群。其中，类群Ⅰ包括南薯 007、济薯 2 丰度不一的多态性条带。61 对引物共检测出 405 条多 号和蔓尖苕 3 个品种；类群Ⅱ包含商丘 52-7、南紫薯 态性谱带，每对引物获得 1—17 条谱带，平均每对引 008 和农林 1 号 3 个品种；类群Ⅲ有吊丝红、尼日利 物获得多态性谱带 6.64 条，其中，引物 SIP101 检测 亚、渝薯 33、道真红皮苕、铜仁白皮红心、瓮安黄心、 获得条带最多，共 17 条多态性条带。 D-1-018、胜利百号和蕹菜种 9 个品种；类群Ⅳ包含了 2.2 聚类分析 万紫 56、浙紫薯 1 号、万薯 34、川薯 27、2-361、南 2.2.1 基于 SSR 分子标记的遗传距离 82 份材料 薯 88 和自 807 共 7 个品种；类群Ⅴ有万薯 7 号、渝薯 的基于 SSR 分子标记的 Nei72 遗传距离为 0.0772— 303、4-6-24、01160、0505-5、农富 8 号、8128-4-1、 0.6342，平均遗传距离为 0.357。其中，国外引进品 福薯 18、抗病 1 号、三合薯、金千贯、渝薯 2 号、0818-5、 种的遗传距离为 0.191—0.457，平均 0.346。地方品 D01414、栗子香、二郎苕、南瑞苕和黔龙红苕 18 个 种的遗传距离为 0.127—0.497，平均 0.346。国内育 品种；类群Ⅵ包括铜仁无藤苕、正安红皮苕、贵定黄

600 中 国 农 业 科 学 49卷

A 7-S S1-5 苏薯1号 Sushu 1 台农10号 Tainong 10 台农69 Tainong 69 心意红苕 Xinyihongshao 独山红皮黄心 Dushanhongpihuangxin 2-274 苏薯8号 Sushu 8 渝薯17 Yushu 17 浙13 Zhe13 万薯6号 Wanshu 6 香苕 Xiangshao 日-19 Ri-19 贵阳红皮苕 Guiyanghongpishao 徐26-5 Xu26-5 南放 Nanfang 川薯34 Chuanshu34 浙薯602-5 Zheshu602-5 5-12-7 南薯6号 Nanshu 6 2-285 2-497 D01593 铜仁无藤苕 Tongrenwutengshao 正安红皮苕 Zhenganhongpishao 贵定黄皮黄心 Guidinghuangpihuangxin 铜仁一窝红 Tongrenyiwohong 南薯99 Nanshu99 9506-1 鲁薯10号 Lushu 10 0409-17 渝紫13 Yuzi13 绵粉1号 Mianfen 1 浙147 Zhe147 山川紫 Yamakawmurasaki 铜仁隔兜苕 Tongrengedoushao 宿芋1号 Suyu 1 豫薯7号 Yushu 7 皖薯4号 Wanshu 4 济薯9号 Jishu 9 农林10号 Norin 10 万薯7号 Wanshu 7 渝苏303 Yusu303 4-6-24 01160 0505-5 农富8号 Nongfu 8 8128-4-1 福薯18 Fushu 18 抗病1号 Kangbing 1 三合薯 Sanheshu 金千贯 Koganansangan 渝薯2号 Yushu 2 0818-5 D01414 栗子香 Lizixiang 二郎苕 Erlangshao 南瑞苕 Nancy Hall 黔龙红苕 Qianlonghongshao 万紫56 Wanzi56 浙紫薯1号 Zhezishu 1 万薯34 Wanshu34 川薯27 Chuanshu27 2-361 南薯88 Nanshu88 自807 Zi807 吊丝红 Diaosihong 尼日利亚 Nigeria 渝薯33 Yushu33 道真白皮苕 Daozhenbaipishao 桐梓白皮红心 Tongzibaipihongxin 瓮安黄心 Wenganhuangxin D-1-018 胜利百号 Okinawa 100 蕹菜种 Wengcaizhong 商丘52-7 Shangqiu 52-7 南紫薯008 Nanzishu 008 农林1号 Norin 1 南薯007 Nanshu 007 济薯2号 Jishu 2 蔓尖苕 Manjianshao

0.05

3 期 罗凯等：中国西南地区甘薯主要育种亲本的遗传多样性及群体结构分析 601

渝薯17 Yushu 17 B 吊丝红 Diaosihong D01414 南薯007 Nanshu 007 渝薯33 Yushu 33 浙147 Zhe 147 豫薯7号 Yushu 7 浙13 Zhe 13 抗病1号 Kangbing 1 渝苏303 Yusu 303 黔龙红苕 Qianlonghongshao 南薯88 Nanshu 88 4-6-24 农富8号 Nongfu 8 山川紫 Yamakawmurasaki 万紫56 Wanzi 56 绵粉1号 Mianfen 1 徐26-5 Xu26-5 农林10号 Norin 10 宿芋1号 Suyu 1 日-19 Ri-19 蕹菜种 Wengcaizhong 自807 Zi807 川薯34 Chuanshu 34 瓮安黄心 Wenganhuangxin 2-497 南薯99 Nanshu 99 济薯9号 Jishu 9 9506-1 铜仁一窝红 Tongrenyiwohong 栗子香 Lizixiang 南瑞苕 Nancy Hall 蔓尖苕 Manjianshao 尼日利亚 Nigeria 渝薯2号 Yushu 2 0505-5 7-S 济薯2号 Jishu 2 0818-5 01160 胜利百号 Okinawa 100 苏薯1号 Sushu 1 桐梓白皮红心 Tongzibaipihongxin 贵定黄皮黄心 Guidinghuangpihuangxin 商丘52-7 Shangqiu 52-7 8128-4-1 台农69 Tainong 69 香苕 Xiangshao 南紫薯008 Nanzishu 008 渝紫13 Yuzi 13 D01593 D-1-018 5-12-7 川薯27 Chuanshu 27 2-361 二郎苕 Erlangshao 苏薯8号 Sushu 8 福薯18 Fushu 18 皖薯4号 Wanshu 4 万薯6号 Wanshu 6 道真白皮苕 Daozhenbaipishao 2-274 南放 Nanfang 浙薯602-5 Zheshu 602-5 农林1号 Norin 1 2-285 万薯7号 Wanshu 7 金千贯 Koganansangan 浙紫薯1号 Zhezishu 1 S1-5 铜仁隔兜苕 Tongrengedoushao 0409-17 贵阳红皮苕 Guiyanghongpishao 铜仁无藤苕 Tongrenwutenshao 正安红皮苕 Zhenganhongpishao 三合薯 Sanheshu 南薯6号 Nanshu 6 台农10号 Tainong 10 心意红苕 Xinyihongshao 独山红皮黄心 Dushanhongpihuangxin 鲁薯10号 Lushu 10 万薯34 Wanshu 34

0.250.20 0.15 0.10 0.05 0

602 中 国 农 业 科 学 49卷

渝薯17 Yushu 17 C 2-285 山川紫 Yamakawmurasaki 徐26-5 Xu26-5 D-1-018 二郎苕 Erlangshao 浙薯602-5 Zheshu602-5 9506-1 济薯9号 Jishu 9 万薯7号 Wanshu 7 S1-5 浙紫薯1号 Zhezishu 1 皖薯4号 Wanshu 4 皖薯34号 Wanshu 34 三合薯 Sanheshu 2-361 道真白皮苕 Daozhenbaipishao 5-12-7 南薯88 Nanshu88 农富8号 Nongfu 8 农林10号 Norin 10 0505-5 日-19 Ri-19 台农69 Tainong69 豫薯7号 Yushu 7 贵阳红皮苕 Guiyanghongpishao 万薯6号 Wanshu 6 南紫薯008 Nanzishu008 0818-5 川薯27 Chuanshu27 桐梓白皮红心 Tongzibaipihongxin 渝紫13 Yuzi13 宿芋1号 Suyu 1 抗病1号 Kangbing 1 栗子香 Lizixiang 台农10号 Tainong 10 渝薯2号Yushu 2 4-6-24 D01593 苏薯1号 Sushu 1 福薯18 Fushu18 吊丝红 Diaosihong 黔龙红苕Qianlonghongshao 独山红皮黄心 Dushanhongpihuangxin 南瑞苕 Nancy Hall 0409-17 南薯007 Nanshu 007 铜仁一窝红 Tongrenyiwohong 南薯6号 Nanshu 6 贵定黄皮黄心 Guidinghuangpihuangxin 铜仁隔兜苕 Tongrengedoushao 自807 Zi807 金千贯 Koganansangan 渝薯33 Yushu33 南薯99 Nanshu99 2-274 蕹菜种 Wengcaizhong 尼日利亚 Nigeria 铜仁无藤苕 Tongrenwutenshao 7-S 香苕 Xiangshao 瓮安黄心 Wenganhuangxin 浙147 Zhe147 川薯34 Chuanshu34 蔓尖苕 Manjianshao 01160 浙13 Zhe13 农林1号 Norin 1 胜利百号 Okinawa 100 心意红苕 Xinyihongshao 南放 Nanfang 渝苏303 Yusu303 鲁薯10号 Lushu 10 2-497 D01414 商丘52-7 Shangqiu52-7 正安红皮苕 Zhenganhongpishao 8128-4-1 绵粉1号 Mianfen 1 济薯2号 Jishu 2 万紫56 Wanzi56 苏薯8号 Sushu 8

0.100.08 0.06 0.04 0.02 0

A：基于 SSR 分子标记的邻接法（NJ）聚类分析；B：基于品质性状的类平均法（UPGMA）聚类分析；C：基于农艺性状的类平均法（UPGMA）聚 类分析 A: Dendrogram of neighbor-joining (NJ) cluster analysis based on SSR marker; B: Dendrogram of UPGMA cluster analysis based on quality trait; C: Dendrogram of UPGMA cluster analysis based on agronomic trait

图 1 82 份亲本材料的聚类分析 Fig. 1 Dendrogram of cluster analysis of 82 sweetpotato breeding parents

3 期 罗凯等：中国西南地区甘薯主要育种亲本的遗传多样性及群体结构分析 603

皮黄心、铜仁一窝红、南薯 99、9501-6、鲁薯 10 号、 其中，品质性状与 SSR 标记、SSR 与农艺性状遗传距 0949-17、渝紫 13、绵粉 1 号、浙 147、山川紫、铜仁 离矩阵间相关系数均较小，分别为 r=0.0411 和 隔兜苕、宿芋 1 号、豫薯 1 号、皖薯 4 号、济薯 9 号 r=0.0055，品质性状与农艺性状呈负相关，r=-0.0411。 和农林 10 号共 18 个品种；其余的 24 个品种/系为类 2.4 群体结构分析与比较 群Ⅶ。在遗传距离 0.20 处，类群Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ又可以分 如图 3-A 所示，当 K=1—10 时，随着 K 值的增 别划分为 2、5 和 4 个亚类群。其中，国外引进品种分 加，Ln P(D)呈上升趋势，没有明显拐点，无法确定 布在除了类群Ⅰ和Ⅳ以外的其他各类，来自贵州的 11 群体的亚群数。因此，参照 Evanno 等[28]的方法，用 个地方品种主要分布在类群Ⅲ和类群Ⅵ，国内育成品 ΔK 确定群体的亚群数，当 K=3 时（图 3-B），ΔK 种/系在每个类群中都有分布。每个类群均聚集了不同 取得最大值，因此，可将 82 份甘薯材料分为 3 个亚 地理来源的材料。 群 S1-S3（图 4）。通过 Q 值分析，发现其中 53 份 2.2.3 基于品质性状的聚类分析 基于品质性状聚 材料的 Q 值大于或等于 0.6，推测遗传组分相对单一， 类分析如图 1-B 所示，在遗传距离为 0.10 处可将 82 属 3 个亚群中的其中一个，其余 29 份材料的 Q 值小 份材料分成 1 个较大的类群和 3 个较小的类群。类群 于 0.6，没有明确的群类归属特性，形成了一个混合 Ⅰ中有 0409-17、福薯 18、铜仁无藤苕、正安红皮苕、 群体（admixed group，AD）。3 个亚群中，S3 亚群 三合薯、南薯 6 号、台农 10 号、心意红苕、独山红皮 最大，包含了 29 个品种/系；S2 亚群最小，包括 7 黄心、鲁薯 10 号和万薯 34 共 11 个品种/系；类群Ⅱ 个品种/系。从材料类型看，S1 亚群主要由地方品种 包括金千贯、浙 147，S1-5 和铜仁隔兜苕 4 个品种； 构成。国外引进品种主要集中在 S2 和 S3 2 个亚群， 类群Ⅲ中有福薯 18、皖薯 4 号、万薯 6 号、道真白皮 遗传组分相对单一。国内育成品种/系在 3 个亚群及 苕、2-274、南放、浙 602-5、农林 1 号、2-285、万薯 混合群体中均有分布，遗传组分复杂。每个类群中均 7 号共 10 个品种；其他 57 个品种/系集中在较大类群 包含不同来源地的材料，类群划分结果与品种的地理 Ⅳ中。 来源没有必然的联系。 通过计算可知，82 份材料基于品质性状的平均遗 群体结构分析与 SSR 聚类分析结果相似，但其类 传距离（Nei72）为 0.2210，且从图 1-B 可知，82 份 /亚群划分结果不一致（图 1 和图 4），群体结构分析 材料遗传距离为 0.0—0.3，表明其品质性状存在一定 与农艺性状、品质性状的聚类结果均没有明显的相关 的差异。同 SSR 聚类分析，不同来源地的材料也可聚 性。 为同一类群。 3 讨论 2.2.4 基于农艺性状的聚类分析 农艺性状聚类分 析如图 1-C 所示。在 0.018 遗传距离处可将 82 份材料 3.1 基于 SSR 的聚类分析表明供试材料中国内育成 分成 1 个较大的类群和 3 个较小的类群。其中，苏薯 品种/系的遗传距离较大 8 号单独为一类；商丘 52-7、正安红皮苕、8128-4-1、 基于 SSR 聚类分析表明，供试亲本材料中国内育 绵粉 1 号、万紫 56 和济薯 2 号 6 个材料聚为类群Ⅱ； 成品种/系的平均遗传距离是 0.359，遗传多样性较为 类群Ⅲ包括 2-497、D01414、鲁薯 10 号 3 个品种/系； 丰富。这可能是由于供试材料数量较多，且其亲本来 其余 72 份材料划分为类群Ⅳ。 源和地理来源较为广泛，能较好地反映中国主要育成 82 份材料基于农艺性状的 Nei72 平均遗传距离 品种/系的遗传多样性。本试验数据表明，国外引进 为 0.0270，且从图 1-C 可知，82 份材料的遗传距离 品种的遗传多样性较国内育成品种/系狭窄，也较李 为 0.00—0.10，说明其农艺性状的差异较小。农艺 强等[29]的报道狭窄，可能是由于供试材料中引进品种 性状聚类结果与供试材料的地理来源也没有必然的 数量相对较少，且来源较为单一造成的，在今后的研 联系。 究中需收集来源更为广泛的引进品种作为育种亲本。 2.3 SSR、农艺性状、品质性状遗传距离矩阵之间的 目前，来自贵州的 11 个地方品种也是中国西南地区常 相关性分析 用的育种亲本。基于 SSR 的聚类分析表明，虽然其地 SSR 与品质性状、农艺性状遗传矩阵的比较如图 理来源较近，但在基因组水平上的遗传差异较大。在 2 所示，数据呈三角形分散在整个二维图中，而不是 育种工作中可多选用地方品种作为亲本，扩大育成品 线性分布，表明矩阵间相关性不显著（r=0.0158）。 种/系的遗传多样性。

604 中 国 农 业 科 学 49卷

0.79

0.59

0.40 sweetpotato based on quality and agronomy traits 基于品质性状、农艺性状的遗传距离矩阵

0.20 Geneticmatrix distance of

0 0.08 0.22 0.36 0.49 0.63 基于SSR分子标记遗传距离矩阵 Genetic distance matrix of sweetpotato based on SSR molecular marker

图 2 SSR、农艺性状和品质性状间遗传距离矩阵的相关性分析 Fig. 2 Mantel tests among genetic distance matrices of tested sweetpotato genotypes generated based on SSR marker, quality trait and agronomy trait

K P(D) Δ Ln

图 3 K 值曲线图 Fig. 3 Curve diagram of K value

3 期 罗凯等：中国西南地区甘薯主要育种亲本的遗传多样性及群体结构分析 605

S1、S2、S3：群体结构划分的 3 个亚群；数字编号为表 1 所示的材料编号 S1, S2, S3: The three subpopulations generated in population structure analysis; the codes correspond to the accessions listed in Table 1

图 4 82 份甘薯育种亲本材料群体结构分析 Fig. 4 Population structure distribution of 82 sweetpotato breeding parents

基于SSR的聚类结果与品种地理来源地没有必然 Karuai 等[8]在甘薯遗传多样性分析和 Hartings 等[36]在 的联系，与 Sagredo 等[5]、Jarret 等[30]的报道一致，说 玉米遗传多样性分析的结果一致。品质性状与农艺性 明不同地区品种间没有明显的遗传差异。这可能是甘 状间呈负相关（r=-0.0411），说明甘薯的生长发育与 薯品种或无性繁殖材料在不同地区间交流，种植过程 品质形成之间存在一定的制约性，与张凯等[37]和崔翠 中产生了基因的交流，或者是选择群体不够大，基因 等[38]的报道一致，使甘薯栽培实践中的生长调控显得 漂移引起的结果[13]。 尤为重要。 3.2 供试育种亲本的农艺性状、品质性状分析 3.4 供试甘薯材料的群体结构分析 农艺性状和品质性状是农艺学研究中 2 种重要的 本研究对中国西南地区主要育种亲本的群体结 表型性状。基于品质性状的聚类分析表明，82 份材料 构分析与 SSR 聚类分析结果有一定相似性，但类/亚 在品质性状上存在一定差异。由于本试验测定的干率、 群划分结果不完全一致，与 Zhang 等[6]在甘薯遗传多 淀粉品质和 β-胡萝卜素含量等品质性状同时受环境型 样性、Ren 等[39]在花生群体结构与遗传多样性的报道 和基因型的影响，但是主要受基因型的控制[31-32]，前 一致。此外，本试验中 29 份材料（35.37%）划分为 述SSR聚类分析表明了试验材料基因组水平上遗传多 混合亚群，可能是由于六倍体甘薯可能是倍性不同的 样性的丰富性，也可能由此造成其品质性状的差异。 多种亲本自然杂交形成的后代[40]，具有高度的杂合 而基于农艺性状的聚类分析表明，供试材料间的农艺 性[3]，在漫长的进化过程中，可能对其群体结构产生 性状差异较小，可能是由于农艺性状容易受环境影响， 影响。 可塑性强，基因型不同的材料在同一地区长时间种植 群体结构分析显示，不同亚群的划分与品种的地 容易发生平行进化[8]引起的结果。 理来源没有必然的联系，本研究结果与 Adugna 等[13] 与 Elameen 等[33]、Yada 等[34]和 Veasey 等[35]的报 关于高粱品种的遗传多样性与群体结构分析的研究和 道一致，本研究基于农艺性状、品质性状的聚类结果 Du 等[41]关于白杨遗传多样性及群体结构分析的报道 与品种的地理来源也没有必然的联系，说明供试材料 一致，表明不同地理来源甘薯在群体结构上没有明显 的地理来源对其农艺性状、品质性状形成并无明显影 的分化。 响。 3.5 群体结构分析与农艺性状、品质性状聚类的比较 3.3 SSR、农艺性状、品质性状的相关性分析 群体结构分析与农艺性状、品质性状聚类结果没 通过遗传距离矩阵的相关性分析可知，SSR、农 有明显的相关性，与 Zhang 等[6]的结论相似。群体结 艺性状、品质性状遗传距离矩阵的相关性很小，与 构分析是基于 SSR 分子标记数据进行的，也是从基因

606 中 国 农 业 科 学 49卷

组水平反映其种群遗传结构的差异，且农艺性状、品 sweetpotato landraces in China. Scientia Agricultura Sinica, 2005, 质性状容易受环境影响，在进化过程中的表现与基因 38(2): 250-257. (in Chinese) 型存在一定的独立性[8]。 [8] Karuri H W, Ateka E M, Amata R, Nyende A B, Muigai A W T, Mwasame E, Gichuki S T. Evaluating diversity among kenyan sweet 4 结论 potato genotypes using morphological and SSR markers. International 82 份材料中具有不同亲本和地理来源的国外引 Journal of Agriculture & Biology, 2010, 12(1): 33-38. 进品种、国内育成品种/系、地方品种之间均没有明显 [9] Filippi C V, Aguirre N, Rivas J G, Zubrzycki J, Puebla A, Cordes D, 的差异，表明在长期的育种实践和生产活动中，不断 Moreno M V, Fusari C M, Alvarez D, Heinz R A, Hopp H E, Paniego 有外来品种的基因融入到中国甘薯基因库中，且国内 N B, Lia V V. Population structure and genetic diversity 各地区间育种亲本和品种的交流也比较密切。 characterization of a sunflower association mapping population using SSR and SNP markers. BMC Plant Biology, 2015, 15(1): 52. References [10] Garris A J, Tai T H, Coburn J, Kresovich S, McCouch S. Genetic [1] 刘庆昌. 甘薯在我国粮食和能源安全中的重要作用. 科技导报, structure and diversity in Oryza sativa L.. Genetics, 2005, 169:

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