Untersuchungen zur Einsatzmöglichkeit der Dreikantmuschel Dreissena polymorpha als biologischer Filter und Wasserhygienemonitor

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

vorgelegt der Fakultät für Mathematik und Naturwissenschaften Technische Universität Dresden

von Dipl.-Biol. Ute Schröter-Bobsin geboren am 13.02.1971 in Dresden

Gutachter: 1. Prof. Dr. rer. nat. Isolde Röske, TU Dresden 2. Prof. Dr. med. Enno Jacobs, TU Dresden 3. PD Dr. rer. nat. Juan López-Pila, UBA Berlin

Eingereicht am: 28.01.2005 Tag der Verteidigung: 25.04.2005

INHALTSVERZEICHNIS

Inhaltsverzeichnis I

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV

VERZEICHNUNG DER TABELLEN VI

VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN X

1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 1

1.1 Wasser als Ressource, Abwasserreinigung, Wasseraufbereitung 1 1.2 Dreissena polymorpha (Pallas 1771) 3 1.3 Konventionelle, bakterielle Hygieneindikatoren und Legionellen 6 1.4 Bakteriophagen 11 1.5 Enterale Viren 16 1.5.1 Enterovirus (Picornaviridae) 17 1.5.2 Adenovirus (Adenoviridae) 17 1.6 Cryptosporidien und Giardien (Protozoa) 18 1.7 Zielstellung der Arbeit 20

2 MATERIAL UND METHODEN 22

2.1 Untersuchungsgewässer, Probenentnahme und -transport 22 2.2 Präparation der Dreikantmuscheln 23 2.3 Übersicht der mikrobiologischen Untersuchungen 24 2.4 Methodenentwicklungen und kulturelle Nachweise 25 2.4.1 Übersicht der verwendeten Organismen 25 2.4.2 Übersicht der mikrobiologischen Kulturverfahren 26 2.4.3 Elution der Mikroorganismen aus dem Muschelfleisch 28 2.4.3.1 Auswahl des geeigneten Elutionspuffers 28 2.4.3.2 Einfluss der Adsorptionszeit und der Zentrifugation auf die Elution der am Muschelfleisch adsorbierten Mikroorganismen 29 2.4.3.3 Wiederfindung der Bakterien und Phagen aus dem Muschelfleisch (Elutionseffizienz) 29 2.4.4 Hygienemonitoring (in situ) der Muscheln und Wasserproben 30 2.4.5 Akkumulationsverhalten und Eliminationsleistung von Dreissena polymorpha gegenüber Mikroorganismen im Batchversuch (in vitro) 31 2.4.6 Untersuchungen zur Sedimentbelastung unter dem Muschelbett (in situ) 33

I INHALTSVERZEICHNIS

2.5 Molekularbiologische Analysen- und Nachweismethoden 35 2.5.1 Nachweis der Nukleinsäuren 35 2.5.1.1 DNA Extraktion 35 2.5.1.2 DNA Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) 36 2.5.1.3 Reverse - Transkriptase - PCR (RT - PCR) 37 2.5.1.4 Aufreinigung der PCR – Produkte 38 2.5.1.5 Gelelektrophorese 39 2.5.1.6 DNA – Sequenzierung 39 2.5.2 Nukleinsäureanalytik 40 2.5.2.1 16S rDNA Genbanken von Muscheln und Wasserproben 40 2.5.2.2 Nachweis von Legionellen in Muscheleluat- und Wasserproben 42 2.5.2.3 Nachweis Stx-Gen tragender Bakteriophagen in Muscheleluaten und in Wasserproben 43 2.5.2.4 Nachweis enteraler Viren in Muscheleluat- und Wasserproben 45 2.5.2.5 Nachweis von Cryptosporidien und Giardien in Muscheleluaten und Wasserproben 47

3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 51

3.1 Kulturelle Analytik 51 3.1.1 Entwicklung eines effizienten Elutionsverfahrens für die mit dem Muschelgewebe assoziierten Mikroorganismen 51 3.1.1.1 Auswahl des geeigneten Elutionspuffers 51 3.1.1.2 Einfluss der Zentrifugalkraft und der Adsorptionszeit auf die Elution der Mikroorganismen vom Muschelfleisch 52 3.1.1.3 Wiederfindung der Bakterien und Phagen aus dem Muschelfleisch 54 3.1.2 Hygienemonitoring (in situ) mit der Dreikantmuschel und dem Umgebungswasser 56 3.1.2.1 Hygienemonitoring in der Elbe 56 3.1.2.2 Hygienemonitoring in der KA Reichenau Teich 1 63 3.1.2.3 Hygienemonitoring in der KA Reichenau Teich 2 67 3.1.2.4 Korrelationen zwischen dem Nachweis mikrobieller Indikatoren im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Umgebungswasser 69 3.1.3 Eliminations- und Akkumulationsverhalten der Muscheln im Batchversuch (in vitro) 70 3.1.3.1 Entwicklung der Intestinalen Enterokken mit und ohne Filtrationstätigkeit der Muscheln 71

II INHALTSVERZEICHNIS

3.1.3.2 Entwicklung der PhiX 174 Coliphagen mit und ohne Filtrationstätigkeit der Muscheln 73 3.1.4 Untersuchungen zur Sedimentbelastung unter dem Muschelfilter (in situ) 76 3.2 Molekularbiologische Analytik 78 3.2.1 16S rDNA Klonbank vom Verdauungstrakt der Muscheln und dem korrespondierenden Wasser 78 3.2.2 Nachweis von Legionellen in Muscheln und Wasser 81 3.2.2.1 PCR - Nachweis der Legionellen in Muscheleluaten der Monitoringproben 81 3.2.2.2 Vergleichsstudie zum Nachweis der Legionellen (PCR) in Muscheleluaten und in konzentrierten Wasserproben 83 3.2.2.3 16S rDNA Klonbank für den Genus Legionellacea von Muscheleluat- und Wasserkonzentratproben 85 3.2.3 Nachweis Stx - Gen tragender Bakteriophagen in Muscheln und Wasser 87 3.2.4 Nachweis von enteralen Viren (Adenoviridae, Picornaviridae) in Muscheln und Wasser 91 3.2.4.1 Die Gattung Mastadenovirus 91 3.2.4.2 Die Gattung Enterovirus 92 3.2.4.3 Vergleich des Bakteriophagenmonitoring mit dem Vorkommen enteraler Viren 95 3.2.5 Nachweis von Giardien und Cryptosporidien in der Muschel und im Wasser 97 3.2.5.1 Monitoring in der Elbe 98 3.2.5.2 Monitoring im Schönungsteich 1 der KA Reichenau 99 3.2.5.3 Monitoring im Schönungsteich 2 der KA Reichenau 100 3.2.5.4 Monitoring im Waldbad Langebrück 101 3.2.5.5 Vergleich des Parasitennachweises mit bakteriellen und virologischen Indikatoren in Muscheln und Wasser 103

4 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 105

5 LITERATURVERZEICHNIS 108

TABELLENANHANG XIII

PUBLIKATIONEN

DANKSAGUNG

III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abkürzungsverzeichnis AdV Adenovirus AFDW Aschefreie Trockenmasse (ashfree dry weight) ATCC American Type Culture Collection AZV Abwasserzweckverband BGM Buffalo Green Monkey bp Basenpaar CPE Cytopathischer Effekt DEV Deutsche Einheitsverfahren DGL Deutsche Gesellschaft für Limnologie DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynucleosidtriphosphat DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen EDTA Ethylendiamintetraacetat EWG Einwohnergleichwert EV Enterovirus FL-Zellinie humane Amnionzellinie nach Fogh /Lund HAV Hepatitis A Virus HPLC High Performance Liquid Chromatography IKSE Internationale Kommission zum Schutz der Elbe ISO International Organization for Standardization KA Kläranlage kb Kilobasen(paare) KBE Kolonie bildende Einheiten MPN Most probable number MW Mittelwert n.b. nicht bewertbar NWG Nachweisgrenze O. D. Optische Dichte (photometrisch) PBS Phosphat – gepufferte Kochsalzlösung PEG Polyethylenglykol PFU Plaque forming units

IV ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

PP Polypropylen Rei T 1 (Kläranlage) Reichenau Zufluss Schönungsteich 1 Rei T 2 (Kläranlage) Reichenau Abfluss Schönungsteich 2 RKI Robert Koch Institut RNA Ribonukleinsäure Rt Raumtemperatur SBK Säurebindungskapazität Stabw Standardabweichung TS Trockensubstanz ü. N. über Nacht UpM Umdrehungen pro Minute # kein Messwert

V TABELLENVERZEICHNIS

Tabellen Textteil

Tabelle 1: Mikroorganismen und Krankheitssymptome sogenannter "neuer Erreger" wasserbürtiger Krankheitsfälle (nach KÖSTER ET AL., 2002) 7

Tabelle 2: Übersicht zu Konzentrationen von Bakteriophagen in verschiedenen Wasserressourcen 15

Tabelle 3: Verwendetete Referenzstämme in den Bakterienuntersuchungen 25

Tabelle 4: Verwendete Referenzstämme in den Bakteriophagenuntersuchungen 26

Tabelle 5: Verwendete Referenzstämme in den Parasitenuntersuchungen 26

Tabelle 6: Kulturelle Nachweismethoden 27

Tabelle 7: DNA - Extraktionsmethoden 35

Tabelle 8: Erfassung der durschnittlichen Anreicherungsfaktoren in Dreissena polymorpha im Vergleich zum Wasser der Elbe 63

Tabelle 9: Erfassung der durchschnittlichen Anreicherungsfaktoren in Dreissena polymorpha im Vergleich zum Wasser der KA Rei T 1 66

Tabelle 10: Erfassung der durchschnittlichen Anreicherungsfaktoren in Dreissena polymorpha im Vergleich zum Wasser der KA Rei T2 68

Tabelle 11: Akkumulationsfaktoren für Enterokokken in Dreissena polymorpha unter verschiedenen Temperaturbedingungen 73

Tabelle 12: Akkumulationsfaktoren für somatische Coliphagen in Dreissena polymorpha unter verschiedenen Temperaturbedingungen 75

Tabelle 13: PCR - Nachweis von Legionellen im Muscheleluat und Umgebungswasser 83

Tabelle 14: Screening Stx- Gen tragender Coliphagen 89

Tabelle 15: Anteil der Adenoviren in den Muschelproben 91

Tabelle 16: Anteil der Enteroviren in Muscheln und Wasser 93

Tabelle 17: PCR Nachweis von Giardia sp. und Cryptosporidium sp. aus Muschel- und Wasserproben der Elbe (REICHARDT, 2003, modifiziert) 98

VI TABELLENVERZEICHNIS

Tabelle 18: PCR Nachweis von Giardia sp. und Cryptosporidium sp. aus Muschel- und Wasserproben des Schönungsteiches 1 der KA Reichenau (REICHARDT, 2003, modifiziert) 99

Tabelle 19: PCR Nachweis von Giardia sp. und Cryptosporidium sp. aus Muschel- und Wasserproben des Schönungsteiches 2 der KA Reichenau (REICHARDT, 2003, modifiziert) 100

Tabelle 20: PCR Nachweis von Giardia sp. und Cryptosporidium sp. aus Muschel- und Wasserproben des Waldbades Langebrück (REICHARDT, 2003, modifiziert) 101

Tabelle 21: Erfassung des Parasitenanteils im Vergleich zu mikrobiellen Indikatoren aus Dreissena polymorpha und ihrem Umgebungswasser (REICHARDT, 2003, modifiziert) 103

Tabellen Anhang

Tabelle A 1: Kurzcharakteristik der Untersuchungsgewässer XIII

Tabelle A 2: Übersicht der verwendeten Primer XIV

Tabelle A 3: Übersicht der verwendeten PCR - Protokolle XVII

Tabelle A 4: Übersicht RT-PCR Protokoll XIX

Tabelle A 5: Vergleich der Elutionsmittel bezüglich ihrer Kapazität zur Elution der Indikatororganismen (n = 3) XX

TabelleA 6: Einfluss der Zentrifugalkraft auf denNachweis von Mikroorganismen aus dem Muschelfleischeluat XXI

Tabelle A 7: Einfluss der Adsorptionszeit auf die Elution von Mikroorgansimen vom Muschelfleisch XXII

Tabelle A 8: Erfassung der prozentualen Wiederfindungsrate für Bakterien und Phagen aus dem Muschelfleisch (n = 3) XXIII

Tabelle A 9: Hygienemonitoring im Wasser der Elbe (Bakterien und Phagen) XXIV

VII TABELLENVERZEICHNIS

Tabelle A 10: Hygienemonitoring mit Dreissena polymorpha aus der Elbe (Bakterien) XXV

Tabelle A 11: Hygienemonitoring mit Dreissena polymorpha aus der Elbe (Phagen) XXVI

Tabelle A 12: Charakterisierung der Wasserbeschaffenheit der Elbe, Neustädter Hafen XXVII

Tabelle A 13: Charakterisierung der Wasserbeschaffenheit des Schönungsteiches 1 der KA Reichenau XXVIII

Tabelle A 14: Hygienemonitoring im Wasser der KA Reichenau Teich 1 (Bakterien und Phagen) XXIX

Tabelle A 15: Hygienemonitoring mit Dreissena polymorpha in der KA Reichenau Teich 1 (Bakterien) XXX

Tabelle A 16: Hygienemonitoring mit Dreissena polymorpha in der KA Reichenau Teich 1 (Phagen) XXXI

Tabelle A 17: Charakterisierung der Wasserbeschaffenheit des Schönungsteiches 2 der KA Reichenau XXXII

Tabelle A 18: Hygienemonitoring im Wasser der KA Reichenau Teich 2 (Bakterien und Phagen) XXXIII

Tabelle A 19: Hygienemonitoring mit Dreissena polymorpha in der KA Reichenau Teich 2 (Bakterien) XXXIV

Tabelle A 20: Hygienemonitoring mit Dreissena polymorpha in der KA Reichenau Teich 2 (Phagen) XXXV

Tabelle A 21: Auswertung der Korrelationskoeffizienten für den Nachweis ausgewählter Mikroorganismen in Dreissena polymorpha und dem Umgebungswasser XXXVI

Tabelle A 22: Elimination von Enterokokken in Batchversuchen bei 20°C XXXVII

Tabelle A 23: Elimination von Enterokokken in Batchversuchen bei 6°C XXXVIII

Tabelle A 24: Elimination von somatischen Coliphagen in Batchversuchen bei 20°C XXXIX

Tabelle A 25: Elimination von somatischen Coliphagen in Batchversuchen bei 6°C XL

Tabelle A 26: Konzentration der Enterokokken im Muschel- und Kontrollsediment in situ (Elbe) XLI VIII TABELLENVERZEICHNIS

Tabelle A 27: Konzentration der somatischen Coliphagen im Muschel- und Kontrollsediment in situ (Elbe) XLI

Tabelle A 28: Konzentration der FRNA Phagen im Muschel- und Kontrollsediment in situ (Elbe) XLI

Tabelle A 29: 16S rRNA Klonierung Muschel I (n = 102) XLII

Tabelle A 30: 16S rRNA Klonierung Muschel II (n = 90) XLVIII

Tabelle A 31: 16S rRNA Klonierung Wasser (n = 88) LIV

Tabelle A 32: PCR Nachweis von Legionellen aus Muscheleluaten des Monitoringprogrammes LXII

Tabelle A 33: Klonierung eines legionellenspezifischen PCR Produktes von Dreissena polymorpha aus Teich 2 der KA Reichenau LXIII

Tabelle A 34: Klonierung eines legionellenspezifischen PCR Produktes aus dem Wasser von Teich 2 der KA Reichenau LXV

Tabelle A 35: Nachweis von Stx - Gen tragenden Coliphagen aus Muscheleluaten LXVII

Tabelle A 36: Nachweis Stx - Gen tragender Coliphagen im Wasser der Elbe LXVIII

Tabelle A 37: Nachweis Stx Gen tragender Coliphagen in Zu- und Ablaufproben der KA Reichenau LXIX

Tabelle A 38: Nachweis und Sequenzierung von Adenoviren aus nativen und verdünnten Muscheleluaten LXX

Tabelle A 39: Enterovirusnachweis in Muscheln und Wasser der KA Reichenau LXXI

Tabelle A 40: Enterovirusnachweis in Muscheln und Wasser aus der Elbe LXXII

Tabelle A 41: Nachweis von Bakteriophagen und enteralen Viren in der Elbe - eine Gegenüberstellung LXXIII

Tabelle A 42: Nachweis von Bakteriophagen und enteralen Viren in der KA Reichenau T1 - eine Gegenüberstellung LXXIV

Tabelle A 43: Nachweis von Bakteriophagen und enteralen Viren in der KA Reichenau T2 - eine Gegenüberstellung LXXIV

IX ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abbildungen

Abbildung 1: Filtrierende Dreikantmuschel; Foto: KUSSEROW, R. ; modifiziert (IS: Ingestionsipho, ES: Egestionsipho, F: Faeces, PF: Pseudofaeces)...... 5

Abbildung 2: Exposition von Dreissena polymorpha; Foto: KUSSEROW, R...... 22

Abbildung 3: Das mikrobiologische Untersuchungsprogramm dieser Arbeit im Überblick ...... 24

Abbildung 4: Versuchsaufbau: Untersuchungen zur Akkumulation und Elimination von Mikroorganismen in 24 h durch Dreissena polymorpha ...... 32

Abbildung 5: Versuchsaufbau für die mikrobiologische Sedimentanalyse in situ mit Imhoff - Sedimentiertrichtern ...... 34

Abbildung 6: Klonierungsstrategie ...... 40

Abbildung 7: Arbeitsstrategie zum Stx 1, 2 Nachweis...... 44

Abbildung 8: Schlauchpumpenanlage für die Parasitenkonzentration (REICHARDT, 2003) ...... 47

Abbildung 10: Einfluss der Zentrifugalkraft auf die Bakterien- und Virenelution aus dem Muschelgewebe ( Rindfleischextrakt pH 7,5; n = 3) ...... 53

Abbildung 11: Einfluss der Adsorptionszeit auf die Elution der Mikroorganismen (Rindfleischextrakt 10%, pH 7,5; Zentrifugalkraft 200 x g; n = 3) ...... 54

Abbildung 12: Wiederfindung (%) von zudosierten Mikroorganismen aus dem Muschelfleisch (Rindfleischextrakt 10%, pH7,5; Zentrifugalkraft 200 x g; Adsorptionsphase10 min., n = 3)...... 55

Abbildung 13: Monitoring ausgewählter Indikatorbakterien im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der Elbe...... 57

Abbildung 14: Monitoring ausgewählter Bakteriophagen im Wasser der Elbe ...... 60

Abbildung 15: Monitoring ausgewählter Bakteriophagen im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der Elbe...... 61

Abbildung 16: Monitoring ausgewählter Bakterien im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der KA Rei Teich 1...... 64

Abbildung 17: Monitoring ausgewählter Bakteriophagen im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der KA Rei Teich 1 ...... 65 X ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abbildung 18: Monitoring ausgewählter Bakterien im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der KA Rei Teich 2...... 67

Abbildung 19: Monitoring ausgewählter Bakteriophagen im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der KA Rei Teich 2 ...... 69

Abbildung 20: Entwicklung der intestinalen Enterokokken in den Muscheln, im Umgebungswasser und von abfiltrierbaren Partikeln (n = 11) innerhalb 24 h ...... 71

Abbildung 21: Entwicklung der somatischen Coliphagen (PhiX 174) in den Muscheln, im Umgebungswasser und von den abfiltrierbaren Partikeln (n = 9) ...... 74

Abbildung 22: Enterokokkenbelastung von Elbesedimenten mit und ohne Muscheleinfluss (n = 6) ...... 76

Abbildung 23: Konzentration der somatischer Bakteriophagen in Elbesedimenten mit und ohne Muscheleinfluss (n = 6)...... 77

Abbildung 24: Phylogenetische Einordnung der 16S rDNA Sequenzen korrespondierender Muschel- und Wasserproben ...... 80

Abbildung 25: Anteil der Legionellen Amplifikate in den Muscheleluaten des Monitoring ...... 82

Abbildung 26: Gelelektrophorese zur Bestimmung der Sensitivitätsgrenzen der 1. PCR und nested PCR von Legionellen ...... 84

Abbildung 27: 16S rDNA Klonbanken für den Genus Legionella...... 86

Abbildung 28: Nachweis des Stx1 und Stx2 Genes in E. coli O157:H7 EDL 933 (Positivkontrolle) ...... 87

Abbildung 29: Stx1, 2 nested PCR Nachweis in Phagen von Wasserproben ...... 88

Abbildung 30: Verteilung der Stx- Gene in den Coliphagen auf E. coli O157:H7...... 90

Abbildung 31: Untersuchung zum Einfluss inhibierender Stoffe auf die RNA Extraktion und die PCR - NWG von Enteroviren im Muscheleluat und PBS ...... 95

Abbildung 32: PCR - Produkte von C.parvum (A) und G. liamblia (B) aus Muschel- und Wasserproben des Waldbades Langebrück (Foto REICHARDT, K. modifiziert) ...... 97

XI

EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

1 Einleitung und Zielsetzung

1.1 Wasser als Ressource, Abwasserreinigung, Wasseraufbereitung

Wasser ist wie kein anderes Schutzgut eine knappe, essentielle und endliche Ressource. Besonders die geringen Süßwasserreserven werden schon heute für die weltweite Entwicklung als Problem erkannt und als globale Süßwasserkrise bewertet

(WISSENSCHAFTLICHER BEIRAT DER BUNDESREGIERUNG GLOBALE UMWELTVERÄNDERUNG, 2003). Die Wasserqualität ist ein wichtiger Teilbereich dieser Thematik. Es haben nach wie vor 1.1 Milliarden Menschen weltweit keinen ausreichenden Zugang zu sicherem

Trinkwasser (YOUNES UND BARTAM, 2001) und etwa die Hälfte der Weltbevölkerung leidet gegenwärtig an wasserassoziierten Erkrankungen (WISSENSCHAFTLICHER BEIRAT DER

BUNDESREGIERUNG GLOBALE UMWELTVERÄNDERUNG, 2003). Für die Verringerung der Ausbreitung von wasserbürtigen Mikroorganismen stellt die geregelte Wasserver- und Abwasserentsorgung eine der wichtigsten Maßnahmen dar. Neben den erforderlichen Technologien zur Wasseraufbereitung ist dabei eine kontinuierliche Qualitätsüberwachung grundlegend. Monitoringprogramme bieten die Möglichkeit sowohl den Zustand des Gewässers zu bewerten, als auch die Auswirkung von Maßnahmen zu überwachen. Von der Technologieforschung sind hierbei Lösungen gefordert, die innovativ, kostenoptimiert und nachhaltig mit den natürlichen Ressourcen umgehen.

Das Abwasser gilt als Ausgangspunkt für den Eintrag von Krankheitserregern in den Wasserkreislauf. In kommunalen Kläranlagen wird Abwasser durch physikalische, chemische und biologische Verfahren gereinigt. Die Kläranlagen können keinen keimfreien Ablauf der Wässer liefern und stellen aus seuchenhygienischer Sicht eine

Kontaminationsquelle für Oberflächengewässer dar (DIZER ET AL., 1994). Besonders in kleineren Kläranlagen bietet sich im Anschluss an die konventionelle Abwasserreinigung die Möglichkeit einer nachgeschalteten Reinigungsstufe. Der Abfluss wird dazu in Schönungsteiche eingeleitet. Man erhofft sich so von der Einleitung des gereinigten Abwassers in kleine, durchflussschwache Vorfluter eine zusätzliche Sedimentation von Schwebstoffen, einen weiteren Abbau organischer Restbelastung und eine Verbesserung der hygienischen Situation. Neben der Sedimentation gelten die UV Strahlung, Algentoxine, die Anwesenheit von Fraßfeinden, verbunden mit der längeren Aufenthaltszeit als maßgebliche Faktoren beim Abbau von Krankheitserregern. 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Untersuchungen von CAMPOS ET AL., (2002) hinsichtlich der bakteriellen und viralen Reduktionsraten eines Schönungsteichsystems ergaben Abbauraten zwischen 63% und 64% bzw. zwischen 25% und 79%. Die Qualitätsverbesserung kann jedoch nicht kontinuierlich gewährleistet werden. Sie ist von jahreszeitlichen und witterungsbedingten Einflüssen abhängig. So kann der Kläranlagenablauf auf Grund der verlängerten Verweilzeit im Schönungsteich, verbunden mit dem hohen Nährstoffgehalt, z. B. eine

Sekundärverschmutzung durch Algenblüten erfahren (WETZEL, 1969; MÄHLMANN ET AL., 1996). Eine weitere Technologie zur seuchenhygienischen Stabilisierung von Kläranlagen- abläufen ist die Mikrofiltration. Dieses Verfahren ermöglicht eine umfangreiche Reduktion von Bakterien, Viren und Chemikalien (z. B Orthophosphat) aus dem gereinigtem Abwasser, dem jedoch nach wie vor erhöhte Energiekosten für die Installierung,

Unterhaltung und Regeneration der Filter gegenüber stehen (DIZER ET AL., 1994; DITTRICH

ET AL., 1996; KRUGER, 2000).

Filtrierende Organismen übernehmen, im Gegensatz zu technischen Lösungen, die

Aufgabe der biologische Feinfiltration im Wasser (UHLMANN, 1988). Neben dem Zooplankton haben benthische Filtrierer einen signifikanten Einfluss auf die

Planktonentwicklung im Gewässer (ASMUS UND ASMUS, 1991; BASTVIKEN ET AL., 1998;

RUIZ, 1999; DESCY ET AL., 2003). Ihre direkte und indirekte Einflussnahme auf die physikalische, chemische und biologische Selbstreinigung von Gewässern wurde durch

OSTROUMOV (1998) zusammen gefasst: - Abnahme der suspendierten Partikel, - Zunahme der Transparenz in der Wassersäule, - Verstärkung des Einfalls von UV-Strahlen den Wasserkörper, - Regulation der Planktonzusammensetzung, - Beschleunigung der Sedimentation und Akkumulation von partikulärer organischer Substanz am Gewässerboden - Pelletierung der Faeces und Pseudofaeces (Biodeposition), - Zunahme der Belüftung der Wassersäule.

2 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Aus ökologischer Sicht „arbeitet“ die Natur mit einer Methode, die ohne hohen technischen Aufwand und mit geringen Kosten zur Verbesserung der Wasserqualität führt. Die Prüfung der biotechnologischen Umsetzung eines solchen Filtersystems ist vor dem Hintergrund der beschriebenen Gesamtsituation auf dem Wassersektor von besonderem Interesse.

1.2 Dreissena polymorpha (Pallas 1771)

Die Dreikantmuschel (Dreissena polymorpha) ist eine sessile Brack- und Süßwassermuschel, die in den amerikanischen und in vielen europäischen Breiten als klassischer Vertreter der Neozoa bezeichnet ist. Ausgehend von ihren ursprünglichen Habitaten, der Schwarzmeerregion und dem Kaspischen Meer hat sich die Muschelfamilie Dreissenidae über natürliche und neu gebaute Wasserwege, sowie mit dem Ballastwasser von Tankern, über Zentral- und Westeuropa bis nach Nordamerika ausgebreitet (MACKIE,

1991; NEUMANN UND JENNER, 1992; ACKERMAN, 1994). Das Ausmaß der damit verbundenen biologischen und ökonomischen Konsequenzen wird in der Literatur umfassend diskutiert. Die Invasion der Zebramuscheln in neue Habitate beeinflusst auf Grund ihrer hohen Reproduktions- und Filtrationsrate die bestehenden Nahrungsnetze und damit die gesamte Populationsdynamik (RAMCHARAN ET AL., 1992; LAVRENTYEV ET AL., 1995). Authochton vorkommende Makroinvertebraten (z.B. Uniodidae) werden zurückgedrängt, indem sich die Dreikantmuscheln auf ihren Schalen anheften und dadurch deren Öffnung behindern (MACISAAC, 1994; RICCIARDI ET AL., 1997). Die Befähigung der Muscheln zur Ausbildung dichter Bestände auf festen Oberflächen führt in kommunalen, industriellen und privaten Wassersystemen zu erheblichen wirtschaftlichen Beeinträchtigungen. Die US-Industrie kostet dieser Umstand über 100 Millionen $ pro Jahr

(REICHHARDT, 2002). Neben den negativen Aspekten gilt es an dieser Stelle jedoch die Vorteile des Vorkommens von Dreissena polymorpha in Gewässersystemen zu diskutieren. Im Vordergrund dabei steht die hohe Filtrationsleistung dieser Art. Die Filtrationsrate für

Schwebstoffe im Wasser beträgt nach FANSLOW ET AL. (1995) 16,2 ml/mg AFDW/h. Deren Resultat, die Partikelreduktion, aus der Freiwasserzone und eine damit verbundenen Verbesserung der Wasserqualität, wurde durch die Literatur bereits vielfach zitiert

(REEDERS UND BIJ DE VAATE, 1992; BUNT ET AL., 1993; MACISAAC, 1994;HORGAN UND

MILLS, 1997). 3 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Dreissena polymorpha filtert Partikel im Größenbereich von 0,7 µm – 450 µm, mit einem

Kapazitätsmaximum im Bereich von 5µm – 35 µm, aus dem Wasser (SPRUNG UND ROSE,

1988; JORGENSEN ET AL., 1984). Neben den Algen gehören zu diesem Spektrum Bakterien, Rotatorien, Crustaceaen und Protozoen. Die Akkumulation von Bakterien, insbesondere hygienisch relevanten Spezies, durch Muscheln (z. B. Austern, Miesmuscheln) ist in der Literatur vorrangig durch ernährungsbedingte Infektionen und Krankheitsausbrüche dokumentiert (PRIEUR UND

MEVEL, 1990; DE MESQUITA ET AL., 1991; LEGNANI ET AL., 1998; CHUNG ET AL., 1998;

CAVALLO UND STABILI, 2002). Hierbei kam es durch den Verzehr mit Krankheitserregern kontaminierter Muscheln zu viralen (z. B. durch HAV), zu bakteriologischen (z. B. durch Salmonellen) und parasitologischen Erkrankungen (z. B. durch Giardien). Die Nutzung der Dreikantmuscheln zur Verbesserung der Wasserqualität könnte im Rahmen eines Biomonitorings zusätzlich die Möglichkeit bieten, den Gewässerzustand in situ zu überwachen. Die ersten Untersuchungen hinsichtlich chemischer Belastungen wurden mit Muscheln (Mytilus edulis) in marinen Ökosystemen durchgeführt (SMOLDERS

ET AL., 2002). Im Süßwasserbereich zeichnet sich Dreissena durch einfache Exposition und Handhabung, Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserinhaltsstoffen und ein hohes Bioakkumulationspotential aus. Sie wurde vorrangig im ökotoxikologischen Bereich eingesetzt (RODITI ET AL., 2000; BERNY ET AL., 2002; SMOLDERS ET AL., 2002; SIPIA ET AL.,

2002; KWAN ET AL., 2003). Studien über den Einsatz von Dreissena polymorpha zur hygienischen Bewertung von Gewässern (Hygienemonitor) liegen dagegen nur in vergleichbar geringerem Umfang vor (SELEGEAN ET AL., 2001). Die Aufnahme (Ingestion), Selektion und der Transport von Nahrungspartikeln wird durch die Kiemenanatomie und –physiologie der Muschel bestimmt (BAKER ET AL., 2000). Einer der beeinflussenden Filtrationsfaktoren ist die Futterpartikelgröße. So konnten

SELEGEAN ET AL. (2001) zeigen, dass die Muscheln Bakterien (E. coli) schnell aufnehmen (Aufnahmemaximum nach 4,5 h) und für 2 - 3 Tage akkumulieren können. Auch humanpathogene Parasiten (Cryptosporidium parvum und Giardia lamblia) gehören nachweislich zum Futterspektrum der Dreikantmuschel. Es wurde resümiert, dass Dreissena zum Monitoring bakterieller und parasitärer Kontaminationen in Fließgewässern geeignet sind (SELEGEAN ET AL., 2001; GRACZYK ET AL., 2002). Muscheluntersuchungen erbrachten hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen der Filtrationsrate und der Bakteriengröße signifikante Korrelationen, d. h. mit Abnahme der Bakteriengröße wurde

4 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

auch die Filtrationsrate geringer (FRISCHER ET AL., 2000). Unter diesem Gesichtspunkt ist die Virenanreicherung in Muscheln bemerkenswert, welche durch zahlreiche Krankheitsausbrüche im Zusammenhang mit dem Verzehr kontaminierter Schalentiere

(LANDRY ET AL., 1983; BURKHARDT UND CALCI, 2000; LEES, 2000; POTASMAN ET AL., 2002) belegt wird. Eine direkte Aufnahme viraler Partikel durch die Muschel ist auf Grund der Kleinheit (z. B. Enteroviren ∅ ca. 0,025 μm (DIZER ET AL., 1994)) nur unter bestimmten Voraussetzungen möglich. Dazu gehört das Bestreben der Viren an

Schwebstoffe zu adsorbieren (GOYAL UND GERBA, 1979; LOVELAND ET AL., 1996). Diese Aggregate haben einerseits eine protektive Wirkung für die Viren und stellen andererseits auch eine relevante Partikelgröße für Muschelfilter dar. LANDRY ET AL. (1983) zeigten am Beispiel von Austern, dass eine signifikante Bioakkumulation nur bei dem Vorkommen von partikelgebundenen Viren in der Wassersäule eintrat und auch METCALF ET AL. (1980) zitiert in BOSCH ET AL. (1995) wiesen nach, dass in Gegenwart von partikulären Material (als Adsorptionsfläche) die Virusaufnahme durch die Muschel gesteigert wurde. Die Muscheln leisten einen großen Beitrag bei der natürlichen Biodeposition, da ihre Verdauungsreste (Faeces) und die nicht verwertbaren Partikelanteile (Pseudofaeces) komprimiert abgesetzt werden (Abbildung 1) und am Gewässerboden sedimentieren.

Abbildung 1: Filtrierende Dreikantmuschel; Foto: KUSSEROW, R. ; modifiziert (IS: Ingestionsipho, ES: Egestionsipho, F: Faeces, PF: Pseudofaeces)

5 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Als potentielle Einsatzgebiete für die Anwendung von Dreissena als biologischer Indikator und Biofilter würden sich Oberflächengewässer (z. B. Rohwasser für die Trinkwasserauf- bereitung, Schönungsteiche in der weitergehenden Abwasserreinigung und Badegewässer) anbieten. Die Muscheln können trägergebunden in den Wasserkörper eingesetzt werden und durch ihre Filteraktivität zur Verringerung des Schwebstoffgehaltes, einschließlich der Fäkalkeime und Parasiten, sowie zum Monitoring von Indikatorkeimen, ökotechnologisch genutzt werden.

1.3 Konventionelle, bakterielle Hygieneindikatoren und Legionellen

Die mikrobiologische Qualitätskontrolle von Wasser wird nach dem Indikatorkonzept durchgeführt. Man sucht dabei nicht nach Krankheitserregern, sondern geht davon aus, dass die Erreger von kranken Menschen oder Tieren zusammen mit Darmbakterien (Indikatoren) über die Fäkalien ausgeschieden und mit dem Wasser verbreitet werden

(KÖSTER ET AL., 2002). Eine mögliche Kontamination des Wassers mit Fäkalien wird durch die Bestimmung von Indikatororganismen angezeigt. Die Indikatoren sollten nach der WHO folgende Kriterien erfüllen:

- Ausscheidung durch den Wirt,

- stete Präsenz, wenn pathogene Organismen vorhanden sind,

- spezifisches Vorkommen in Fäkalien,

- höhere Resistenz gegenüber Umweltstress und Desinfektion als die Erreger,

- leichte und schnelle Nachweisbarkeit,

- Apathogenität (KÖSTER ET AL., 2002).

Zu den heute weltweit verwendeten Standartindikatoren zählen E. coli, Enterokokken, sulfitreduzierende Clostridien und Coliphagen. In den letzten Jahrzehnten häuften sich so genannte „neue“ Krankheitserreger im Zusammenhang mit wasserbürtigen Krankheitsfällen. In der Tabelle 1 sind eine Auswahl von Pathogenen und dadurch mögliche Erkrankungen aufgeführt.

6 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Tabelle 1: Mikroorganismen und Krankheitssymptome sogenannter "neuer Erreger" wasserbürtiger Krankheitsfälle (nach KÖSTER ET AL., 2002) Pathogen Krankheitssymptome Bakterien pathogene E. coli (EHEC) Dyspepsie, (schwerer) Durchfall Pseudomonas aeruginosa Haut- und Ohrenentzündungen Legionella pneumophila Lungenentzündungen, Pontiac - Fieber Aeromonas hydrophila u. a. Durchfall, Wundentzündungen Campylobacter jeuni u. a. Darminfektionen, Durchfall Yersinia enterocolitica Enteritits, evtl. Arthritis Chlamydia Augenentzündungen Viren Caliciviren grippale Infekte, Halsschmerzen Rotaviren Schwere Durchfälle Hepatitis A Infektöse Gelbsucht Norwalkvirus Darminfektionen Parasiten Cryptosporidium parvum Durchfall Giardia intestinalis Durchfall

Die im Folgenden beschriebenen Mikroorganismen wurden für die Hygieneunter- suchungen in Dreissena und dem Umgebungswasser ausgewählt. Das Spektrum der bewährten Indikatorkeime wurde durch Erreger, wie z. B. den Legionellen, enteraler Viren und Parasiten erweitert, um den aktuellen Anforderungen der Wasserhygiene zu entsprechen.

E. coli und Coliforme: 1885 beschrieb der deutsche Kinderarzt Theodor Escherich (1857-1911) erstmalig ein

"Bakterium coli communale"(ESCHERICH, 1989; historischer Artikel). Die später nach ihm benannte Gattung Escherichia aus der Familie der Enterobacteriaceae umfasst neben dem bekanntesten Vertreter Escherichia coli noch weitere Arten wie E. hermanni, E. vulneris, E. fergusoni, E. adecarboxylata und E. blattae. E. coli ist ein Bewohner des menschlichen und tierischen Darmtraktes und fakultativ pathogen. Außerhalb des Darmtraktes gilt E. coli als Indikatorbakterium für eine fäkale Verunreinigung von Wasser und Lebensmitteln. E. coli ist streng Habitat gebunden (Verdauungstrakt Säuger) und kommt dort in einer

7 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

7 9 Konzentration von 10 – 10 KBE/g Faeces vor (KÖSTER ET AL., 2002). Neben der permanenten Präsenz von E. coli, kommen noch Citrobacter, Klebsiella und Enterobacter instationär im Darm vor (LECLERC ET AL., 2001). E. coli kann sich in Gewässern nicht oder nur sehr schwer vermehren (LECLERC ET AL., 2001). Die Charakterisierung der Art erfolgt hauptsächlich über biochemische Eigenschaften. E. coli ist der „Pionier“ unter den

Indikatorbakterien und im Gegensatz zu vielen anderen Keimen nach LECLERC ET AL. (2001) in der Lage sowohl als Index-(Anzeige eines Gesundheitsrisikos) als auch als Indikatororganismus (Prozessüberwachung) zu fungieren. Die Identifizierung von verschiedenen Virulenzfaktoren bei E. coli hat zu einer Unterteilung der pathogenen E. coli in gegenwärtig fünf verschiedene Gruppen geführt: enterotoxische E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), enteropathogene E. coli (EPEC), enteroadhärente E. coli (EAEC) und enterohemorrhagische E. coli (EHEC)

(COCOLIN ET AL., 2000). EHEC sind eine Untergruppe der Shiga-Toxin-bildenden E. coli

STEC (GEUE ET AL., 1999). 1982 wurde STEC in den USA durch das Center for Disease Control als Ursache einer Nahrungsmittelinfektion festgestellt .Dabei wurde erstmalig das

Serovar Escherichia coli O157:H7 mit einer humanen Erkrankung assoziiert (RILEY, 1983 in PERNA ET AL., 2001). Shigatoxine (Stx) definieren als Hauptvirulenzfaktoren die Charakteristik von STEC. Sie können beim Menschen verschiedene Krankheiten verursachen, zum Beispiel eine hämorrhagische Colitis (HC) mit schweren blutigen Durchfällen, oft verbunden mit Bauchkrämpfen, Erbrechen und Fieber oder das hämolytisch - urämische Syndrom (HUS) hervorrufen, das zu akutem Nierenversagen führen kann. Bei STEC handelt es sich um die bislang einzigste Gruppe darmpathogener E. coli, für die ein Zoonosecharakter nachgewiesen wurde (Übertragung vom Tier zum

Mensch und umgekehrt; GEUE ET AL., 1999). Hauptübertragungswege für humane

Infektionen sind kontaminierte Lebensmittel und Trinkwasser (FRIEDRICH, 2002). Unter der Bezeichnung „coliforme Bakterien“ wird eine heterogene Gruppe von Enterobakterien zusammengefasst. Der Nachweis von Coliformen hat eine lange Tradition in der mikrobiologischen Wasser- und Abwasserüberwachung (TRYLAND UND FIKSDAL, 1998). Die Zusammensetzung dieser Gruppe jedoch veränderte sich im Zuge der Diagnostikentwicklung. Herkömmlich wurden die Gattungen Escherichia, Klebsiella, Enterobacter und Citrobacter den Coliformen zu geordnet. Neuerdings werden Bakterien, die das β-Galaktosidase Gen (lacZ Gen) enthalten, zur Gruppe der coliformen Bakterien gezählt. Diese Charakterisierung ist nicht unumstritten, denn die Definition über ein

8 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Enzym kann gerade im Umweltbereich, zu falsch - positiven Ergebnissen durch

„nontarget“ Bakterien (z. B. Aeromonaden) führen (TRYLAND UND FIKSDAL, 1998). Generell gilt zu berücksichtigen, dass Coliforme auch Bakterien einschließen, die nicht fäkalen Ursprungs sind. Daher darf bei ihrer Anwesenheit eine fäkale Verunreinigung von

Wasser nur vermutet und nicht als gegeben bewertet werden (LECLERC ET AL., 2001).

Intestinale Enterokokken: Die früher als „Fäkalstreptokokken“ benannte Bakteriengruppe umfasst eine Vielzahl verschiedener Streptokokkenarten mit dem Lancefield-Gruppen-Antigen D (LECLERC ET

AL., 1996). Heute fasst man die Arten E. hirae, E. durans, E. faecalis und E. faecium zu einer Gattung Enterococcus zusammen und bezeichnet sie als Intestinale Enterokokken

(FEUERPFEIL ET AL., 2002). Sie definieren sich durch folgende physiologische und biochemische Leistungen: Gram-positiv, Reduktion von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid zu Formazan und Hydrolyse von Äsculin bei 44°C (ISO 7899-2, 2000). Enterokokken 5 6 kommen häufig in den Faeces von Mensch und Tier vor (10 – 10 KBE/g Faeces; KÖSTER

ET AL., 2002). Im Abwasser können sich die Bakterien nur schwer vermehren und sie persistieren länger als E.coli und Coliforme (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1993). In jüngeren Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Nachweis von Enterokokken im Wasser stärker mit gastrointestinalen Erkrankungen assoziiert ist als der Nachweis von E. coli

(BARRELL ET AL., 2000). Aufgrund dieser Befunde und ihrer hohen Resistenz gegenüber Wasseraufbereitungsmaßnahmen und Austrocknung werden sie vorrangig bei der Wasser- und Abwasserüberwachung als Indikatoren für eine fäkale Verschmutzung eingesetzt.

Sulfitreduzierende Clostridien: Clostridien (Bacillaceae) sind ubiquitär vorkommende, strikt anaerobe, Gram-positive und sporulierende Bakterien, die häufig im Zusammenhang mit Nahrungsmittel - assoziierten

Infektionen erwähnt werden (MEYER UND THOLOZAN, 1999; EISGRUBER, 2001). Eine besondere Rolle dabei spielt Clostridium perfringens, einer der Erreger des Gasbrandes. Er gehört auch zur Normalflora des Darmtraktes von Mensch und Tier, jedoch in geringerer 6 7 Anzahl als E. coli (10 – 10 KBE/g Faeces; KÖSTER ET AL., 2002). Die eigentliche Indikatorfunktion leisten hierbei die Clostridiensporen, da sie länger im Wasser überleben als coliforme Bakterien (ISO 6461-2, 1986; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1993).

9 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Clostridium perfringens sollen ähnlich umwelt- und chlorresistent wie z. B. Parasitendauerformen sein und sind deshalb als Indikatoren in die Trinkwasserverordnung

2001 aufgenommen worden (FEUERPFEIL ET AL., 2002). Beim Nachweis von Clostridiensporen kann aufgrund ihrer Resistenzeigenschaften davon ausgegangen werden, dass die Kontamination bereits länger zurückliegt (FEUERPFEIL ET AL., 2002). Der Nachweis der Sporen erfolgt nach Abtötung der vegetativen Bakterienzellen durch die Reduktion des im Differenzialmedium enthaltenen Natriumsulfits.

Legionellen: Legionellen sind typische opportunistische Erreger. Natürlicherweise kommen sie als intrazelluläre Parasiten von Protozoen (Amöben) im Süßwasser vor. Die Bakterien sind so vor einer Reihe von äußeren Faktoren (Temperatur, Grazing, UV-Licht, Desinfektion) besser geschützt als im freilebenden Zustand. Die Entdeckung der Erreger der Legionellose erfolgte erst nach Ausbruch von Pneumonien bei Teilnehmern eines Treffens von

Legionären in den 70iger Jahren (KRAMER UND FORD, 1994; WINIECKA-KRUSNELL UND

LINDER, 1999; STEINERT ET AL., 2002). Legionellosen zeigen eine Vielzahl klinischer Krankheitsbilder, dazu gehören neben Pneumonien und dem Pontiacfieber (Infekt der

Atemwege, selbstheilend) in selteneren Fällen auch Darm- und Wundinfektionen (KRAMER

UND FORD, 1994). Für alle Infektionen stellt das Wasser den einzigen Übertragungsweg dar. Legionellen – Infektionen erfolgen nicht durch eine Übertragung von Mensch zu

Mensch, sondern ausschließlich aus der Umwelt (ROBERT KOCH - INSTITUT, 2003). Die bisher höchste Erkrankungsrate in Europa wurde 1999 mit 32 Ausbrüchen und 2136 Fällen der Legionärskrankheit beschrieben, wobei 193 Menschen verstarben (MARRE ET AL., 2002). In Deutschland wurde im Jahr 2002 eine Zunahme der Erkrankungsrate um 25,5% registriert, das entspricht einem in Fallzahlanstieg von 329 (Jahr 2001) auf 413

Erkrankungsfälle (ROBERT KOCH - INSTITUT, 2003). Ein besonders hohes Infektionsrisiko besteht für Patienten mit Lungenerkrankungen, immunsupprimierte Patienten, alte Menschen und starke Raucher. Betrachtet man die häufigsten Infektionsquellen, wie Warmwasserpumpen und -verteilungsanlagen, Kühltürme, Whirlpools, Klimaanlagen und allgemein Aerosole, dann wird die seuchen-hygienische Relevanz der Legionellen, sowohl für den nichtnosokomialen als auch für den klinischen Bereich ersichtlich. Das Temperaturoptimum für die Vermehrung von Legionellen liegt zwischen 32°C und 45°C. Zwischen 45°C und 55°C können sie überleben, ab 60 °C werden sie abgetötet

10 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

(KRAMER UND FORD, 1994). Mit dieser hohen Temperaturtoleranz liegen sie weit über den

Optima anderer Bakterien im Wasser und haben so einen Selektionsvorteil. DICK VAN DER

KOOIJ ET AL. zitiert in MARRE ET AL. (2002) beschreibt eine Vermehrungstemperatur im Bereich von 25°C bis 45°C bei der Besiedlung von Biofilmen und Sedimenten. Kenntnisse über ökologische Faktoren, wie z.B. weitere Besiedlungsnischen in Gewässersystemen, neben den Amöben, sind von besonderem Interesse. Zur Unterdrückung des Legionelloserisikos könnte die Erkennung und Bekämpfung weiterer Transmissionsquellen der Umwelt eine mögliche Präventivmaßnahme darstellen. Die kulturelle Anzucht ist durch die hohen Nährstoff- und Supplementansprüche, sowie langen Inkubationszeiten limitiert (LÜCK UND LIEBSCHER, 2003). Parallel stehen Antigen- Nachweissysteme und molekularbiologische Methoden (PCR, DNA-Sonden) zu Verfügung.

1.4 Bakteriophagen

Bakteriophagen (Phagen) sind DNA- oder RNA-haltige Viren, die Bakterien befallen. In ihrer Struktur, Größe und ihrem Verhalten sind sie den humanpathogenen Viren sehr ähnlich. Sowohl Phagen als auch humanpathogene Viren können sich nicht eigenständig vermehren und sind auf einen Wirtsstoffwechsel angewiesen. Zwischen Phagen und Wirtszelle besteht oft eine hohe Spezifität, die bis auf Stammebene reichen kann. Es sind jedoch auch Phagen mit breitem Wirtsspektrum bekannt, wie z. B. ΦX174, der Mutanten von Escherichia, Shigella, Salmonella und Citrobacter infizieren kann. Die Wirtsspezifik wird durch Rezeptoren auf der Oberfläche der Wirtszelle determiniert (GRABOW, 1995) und bestimmt auch die enge Verbindung der Phagen zur Umgebung, in der ihre

Wirtsbakterien vorkommen (GRABOW, 1995). Bakterielle Indikatoren besitzen aufgrund erheblicher physiologischer und morphologischer und Differenzen bezüglich der viralen

Belastung eines Gewässers eine unzureichende Aussagekraft (GRABOW, 1995; LECLERC ET

AL., 2002; LEE UND KIM, 2002). In den letzten Jahren wurden deshalb zunehmend Bakteriophagen bei der Qualitätsüberwachung von Wasser und Gewässersystemen getestet und eingesetzt (IAWPRC STUDY GROUP ON HEALTH RELATED WATER MICROBIOLOGY,

1991; GRABOW, 1995; DURAN ET AL., 2003). Phagen bieten in dieser Funktion eine Reihe von Vorteilen (GRABOW, 1995): - das Verhalten und die Widerstandsfähigkeit der Phagen im Wasser ähnelt dem der humanpathogenen Viren, 11 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

- Phagen sind zumeist mindestens genauso widerstandsfähig gegenUmweltbedingungen wie pathogene Darmviren, - Phagen werden permanent in großer Zahl ausgeschieden, 3 7 - die Phagenzahl im belasteten Wasser (10 bis 10 PFU/l; COLE ET AL., 2003) ist größer 0 4 als die Zahl humanpathogener Viren (10 bis 10 PFU/l; WALTER, 1995), - Phagen sind in kurzer Zeit einfach und kostengünstig nachzuweisen, - Phagen sind für Menschen apathogen und stellen daher selbst kein Gesundheitsrisiko dar. Eine gebräuchliche Grobklassifizierung der Bakteriophagen erfolgt nach ihrem Erkennungsmodus der unterschiedlichen Oberflächenstrukturen der Wirtsbakterien. In der Praxis der Wasseruntersuchung haben sich drei Phagengruppen als Indikatoren etabliert und sollen nachfolgend beschrieben werden.

Somatische Coliphagen: Hierbei handelt es sich um Einzel- oder Doppelstrang DNA-Bakteriophagen aus den Familien Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae und Microviridae. Somatische Coliphagen sind virulente Phagen, die an Lipopolysaccharid- oder Proteinrezeptoren der Bakterienzellwand anhaften. Unter optimalen Bedingungen sind sie in der Lage, die

Wirtszelle in 20 – 30 min. zu lysieren (ISO 10705-2, 1998). Natürlicherweise kommen die Phagen in menschlichen Faeces und in Faeces von Rindern, Schweinen, Geflügel und anderen Tieren vor. Die Phagenkonzentration variiert sehr breit (< 101 – 108/g Faeces), wobei die tierischen Exkremente gegenüber den humanen Faeces die höchsten

Konzentrationen enthielten (IAWPRC STUDY GROUP ON HEALTH RELATED WATER

MICROBIOLOGY, 1991). Somatische Coliphagen kommen im Rohabwasser in erwartungsgemäß hohen Zahlen vor (Tabelle 2) und müssen zum Nachweis nicht angereichert werden. In Gewässern muss bei dem Nachweis hoher Phagenzahlen von einer massiven Fäkalverunreinigung ausgegangen werden. Die Wirtsspezifität der somatische Coliphagen geht über E. coli hinaus. Sie infizieren auch andere Enterobacteriaceae, z. B. Klebsiella und Enterobacter, die mit der Vegetation und mit Biofilmen assoziiert vorkommen (LECLERC ET AL., 2000). Die Replikation dieser Phagen ist nach neuesten

Ergebnissen einer Studie von MUNIESA UND JOFRE (2004) unter Umweltbedingungen selten zu erwarten. Für eine Gewässerüberwachung (Indikatorfunktion) gelten die Phagen damit als praktikabel einsetzbar. Parallele Untersuchungen von Phagen und Bakterien im

12 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Oberflächengewässer ließen die Schlussfolgerung zu, dass der Nachweis eines bakteriellen Indikators und der somatischen Coliphagen die Gegenwart von Pathogenen besser repräsentiert, als die Zählung zweier bakterieller Indikatoren (LUCENA ET AL., 2003). In einer Studie von SKRABER ET AL. (2002) präsentierten sich die somatischen Coliphagen deutlich stabiler gegenüber wechselnden Flusswassertemperaturen und -durchflussraten als FRNA-Phagen, Bacteroides fragilis Phagen und die klassischen bakteriellen Indikatoren.

F+ spezifische Coliphagen (FRNA Coliphagen): F+ spezifische Coliphagen unterscheiden sich von den somatischen Coliphagen durch den Besitz eines Rezeptors, der eine Adsorption ausschließlich an den F - Pilus (codiert durch ein F - Plasmid) des Wirtsbakteriums gewährleistet. Da das F - Plasmid durch Transfektion zu anderen Gram – negativen Bakterien übertragen werden kann, ist auch hier die Wirtsspezifität der Phagen eingeschränkt. Im Abwasser können die Phagen ohne

Anreicherung nachgewiesen werden (IAWPRC STUDY GROUP ON HEALTH RELATED

WATER MICROBIOLOGY, 1991; LECLERC ET AL., 2000; BRION ET AL., 2001). Es besteht jedoch eine Diskrepanz zwischen den hohen Zahlen im häuslichen Abwasser (Tabelle 2) und dem fäkalen Ursprung (LECLERC ET AL., 2000). Die Konzentration der Phagen in humanen Faeces ist sehr gering (< 1 PFU/g) und eine Vermehrung der F+ spezifischen Bakteriophagen unter Umweltbedingungen wird nach bisherigen Erkenntnissen ausgeschlossen, da die Wirtsbakterien die Sexfimbrien nicht unter 30 °C ausbilden. Die

Indikatorfunktion dieser Phagengruppe wird in der Literatur kontrovers diskutiert (IAW

PRC STUDY GROUP ON HEALTH RELATED WATER MICROB IOLOGY, 1991; LECLERC ET AL.

2000; GRABOW ET AL., 2001; DURAN ET AL., 2002). Spezifiziert man jedoch die

Serogruppen (I-IV) der Phagen, so bewerteten BRION ET AL. (2001) die Typ III FRNA Phagen als klares Signal für eine frische Fäkalverunreinigung humanen Ursprungs. Betrachtet man die Resistenz gegenüber Desinfektionsmaßnahmen, so werden die FRNA Coliphagen im Gegensatz zu somatische Coliphagen und bakteriellen Indikatoren

übereinstimmend als belastbarer gegenüber Chlor bewertet (JOFRE ET AL., 1995; CALCI ET

AL., 1998; DURAN ET AL., 2003). Versuche hinsichtlich der natürlichen Inaktivierung der Phagen erbrachten besonders für die Sommermonate einen schnellen Abbau. Daraus lässt sich auf eine erhöhte Sensibilität dieser Phagen, im Vergleich zu somatischen Coliphagen und Bacteroides fragilis Phagen, gegenüber Temperaturanstieg und UV-Strahlen schließen

(DURAN ET AL., 2002).

13 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Bacteroides fragilis infizierende Phagen: Diese Phagen infizieren den strikt anaeroben Wirt Bacteroides fragilis und zeichnen sich durch eine hohe Wirtsstammspezifität aus (LECLERC ET AL., 2000). Der Nachweis gelang bisher in allen, mit häuslichem Abfall verunreinigten Gewässertypen, jedoch nicht im sauberen Oberflächenwasser (IAWPRC STUDY GROUP ON HEALTH RELATED WATER

MICROBIOLOGY, 1991). Ihre Konzentration im Abwasser oder in verunreinigten Wässern liegt signifikant unter denen von somatischen und FRNA Coliphagen (Tabelle 2) und durch Modellversuchen unter simulierten Umweltbedingungen konnte bisher keine

Vermehrung beobachtet werden (IAWPRC STUDY GROUP ON HEALTH RELATED WATER

MICROBIOLOGY, 1991; DURAN ET AL., 2002). Mehrere Vergleichsstudien beurteilten ihre

Resistenzeigenschaften als die Umfangreichsten aller drei Phagentypen (IAWPRC STUDY

GROUP ON HEALTH RELATED WATER MICROBIOLOGY, 1991; JOFRE ET AL., 1995); DURAN

ET AL., 2003). Das sind Merkmale, die diesen Phagentyp als attraktiven Indikator auszeichnen. Bacteroides fragilis infizierende Phagen vermehren sich ausschließlich im

Gastrointestinaltrakt von Menschen und werden mit den Faeces ausgeschieden (GRABOW

ET AL., 1995). In einer vergleichenden Studie über Vorkommen und Konzentration von somatischen und Bacteroides fragilis Phagen in humanen Faeces wurden in 68% aller Proben somatische Coliphagen (4,3 x 103 PFU/g) und in 11% Proben Bacteroides fragilis 1 Phagen (7 x 10 PFU/g) nachgewiesen (GANTZER ET AL., 2002). Diese geringe Phagenzahl führt auch nach der fäkalen Verunreinigung eines Gewässers zu niedrigen Konzentrationen

(LECLERC ET AL., 2000; GANTZER ET AL., 2002; SKRABER ET AL.; 2002). Letzteres stellt neben der anaeroben Anzucht zusätzlich erhöhte Anforderungen an die Probenaufarbeitung (evtl. Anreicherung) und schmälert so eine schnelle, einfache Nachweisanalytik. Derzeit werden Bacteroides fragilis infizierende Phagen neben den somatischen Coliphagen als die

Phagengruppe mit potentieller Indikatorfunktion gewertet (DURAN ET AL., 2002). Für alle drei beschriebenen Phagengruppen stehen standardisierte Nachweismethoden zur

Verfügung (ISO 10705-1, 1995; ISO 10705-2, 1998; ISO 10705-4, 2000).

14 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Tabelle 2: Übersicht zu Konzentrationen von Bakteriophagen in verschiedenen Wasserressourcen behandeltes Rohabwasser Oberflächenwasser Phagentyp Abwasser gemittelte Konzentrationen in PFU / 100 ml

Somatische 106 - 107 103 103 - 104 Coliphagen 4 5 2 2 FRNA Phagen 10 - 10 10 10 Bacteroides fragilis 103 - 104 101 100 - 102 infizierende Phagen ARAUJO ET AL. (1997); SKRABER ET AL. (2002); CONTRERAS-COLL Referenzen ET AL. (2002); DURAN ET AL. (2002); LUCENA ET AL. (2003)

Shigatoxin - Gen tragende Phagen (Stx-Phagen):

Diese lysogenen, lambdoiden Bakteriophagen tragen die Strukturgene (Stx1 und Stx2) für die beiden Hauptgruppen der Shigatoxine von E. coli (Shigatoxin 1 und 2) und werden als Prophagen oder Prophagen - ähnliche Elemente in das E. coli Chromosom eingebaut

(NATARO UND KAPER, 1998; PERNA ET AL., 2001). Die Toxine bestehen aus sechs Untereinheiten: Fünf B-Untereinheiten, welche die spezifische Bindung an Rezeptoren eukaryotischer Zellen vermitteln, sowie einer A-Untereinheit mit toxischer Aktivität

(NATARO UND KAPER, 1998). Infolge dieser Aktivität sind STEC in der Lage, die Eiweißsynthese eukaryotischer Zellen zu hemmen und so deren Zelltod herbeizuführen. Die Toxinexpression ist eng an die Phagenreplikation gekoppelt. Antibiotika, wie Makrolide und Quinolone, fördern (negative Beeinflussung) die Toxinexpression bei E. coli O157:H7 (PERNA ET AL., 2001). Das Stx1 von enterohämorrhagischen E. coli ist identisch mit dem Shigatoxin von Salmonella dysenteriae. Das Shigatoxin 2 ist nachweislich assoziiert mit der Ausbildung des HU-Syndromes (BETTELHEIM UND BEUTIN, 2003). EHEC werden durch Nahrungsmittel (Rindfleisch) und Wasser, sowie von Person zu Person übertragen (NATARO UND KAPER, 1998). Eine deutliche Konzentration der Stx2 tragenden Phagen (1-10 PFU/ml) wurde vor allem im Zufluss von Abwasseranlagen festgestellt (TANJI ET AL., 2002). Ihre Bedeutung bei einer Umweltkontamination mit

15 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Abwasser darf daher nicht unterschätzt werden. Der Nachweis von shigatoxingentragenden Phagen in unterschiedlichen Gewässertypen und die Fragestellung, ob diese Phagen durch die Muschel aufgenommen und angereichert werden, soll in der vorliegenden Arbeit untersucht werden.

1.5 Enterale Viren

In dieser Gruppe pathogener, humaner Viren werden Vertreter aus einer Reihe von Virusfamilien zusammengefasst: Adenoviridae, Caliciviridae, Picornaviridae und Reoviridae. Sie alle sind z. T. mit einer Vielzahl humaner Erkrankungen, wie Gastroenteritis, Hepatitis, Myocarditis, respiratorische Infekte und aseptische Meningiten, assoziiert und werden in der Umwelt verbreitet (LEES, 2000; GRIFFIN ET AL., 2003).

Enterale Viren sind hitzestabiler und resistenter gegenüber Chlor als Bakterien (GRIFFIN ET

AL., 2003). Ihre hygienische Relevanz basiert vor allem auf der Tatsache, dass sie in hoher Konzentration im Stuhl (1012/g) und Urin ausgeschieden werden, aber bereits die

Aufnahme geringer Mengen zu einer Erkrankung führen kann (GRABOW, 1995). Als größtes Infektionsrisiko neben dem direkten Personenkontakt gilt die Verbreitung der Viren über abwasserkontaminiertes Trinkwasser, Badegewässer und Nutzwasser von

Schalentierfarmen (LANDRY ET AL., 1983; LEES, 2000; GRIFFIN ET AL., 2003). Muscheln sind aufgrund ihrer filtrierenden Ernährungsweise als besonders prädisponiert zur

Aufnahme und Anreichung von Viren (LEES, 2000; GRIFFIN ET AL., 2003). Abwasserverunreinigungen im Lebensraum von Schalentieren führen so zur viralen

Kontamination von Muscheln. LEES ET AL. (2000) zitiert in POTASMAN ET AL. (2002) formulierten, dass enterale Viren in den letzten Jahren die am meisten durch Schalentiere verbreiteten Pathogene waren. Seit einigen Jahren lässt sich die vermehrte Anwendung von molekularbiologischen Methoden (PCR) feststellen, die neben einer effektiven Handhabung vor allem den Vorteil des Nachweises nicht kultivierbarer Viren erbringt. Für beide Analysenmethoden gilt eine effektive Probenanreicherung und für den PCR-Nachweis eine effiziente Nukleinsäure- extraktion als grundlegend für eine erfolgreiche Virendetektion. Besonders im Trinkwasserbereich wird aufgrund des Hygienerisikos nach standardisierten Richtlinien verlangt.

16 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

1.5.1 Enterovirus (Picornaviridae)

Unter dem Begriff Enteroviren werden die Gattungen Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus und das Hepatitis A Virus erfasst. Allesamt sind sie unverhüllte Positivstrangviren mit nichtsegmentierter, einzelsträngiger RNA. Mit ihrer Replikation sind sie an den Intestinaltrakt der Menschen gebunden. Sie werden daher in großer Anzahl 6 über die Faeces ausgeschieden (bis 10 /g). Im Ablauf von Kläranlagen fanden FLEISCHER

ET AL. (2000) durchschnittlich über 200 infektiöse Partikel / L. Diese Virenfracht stellt ein Infektionsrisiko für Menschen dar und demonstriert den Hauptverbreitungsweg von Enteroviren in der Umwelt. Enteroviren haben eine sehr lange Tradition als Marker viraler

Umweltverunreinigungen (LEES, 2000). Ergebnisse einer Studie von ROMALDE ET AL. (2002) verdeutlichen mit 43,9% EV- positiven Muscheln die Prävalenz dieser Viren in Schalentieren und unterstreichen zusätzlich die unzureichende Funktion bakterieller

Grenzwerte (< 230 E. coli/100 g Schalentierfleisch). Resultate einer Studie von GRABOW

ET AL. (2001) ergaben trotz negativem Bakterien- und Phagennachweis mehrfach einen positiven Nachweis von Enteroviren (in 17% der Proben). Enteroviren lassen sich konventionell mittels Zellkulturen (BGM, Vero, FL u. a.) über einen cytopatischen Effekt (CPE) nachweisen. Jedoch ist keine Zelllinie in der Lage, die Vermehrung aller

Enterovirenspezies zu ermöglichen (LEES, 2000). Zusätzlich erfordert der kulturelle Nachweis einen hohen Zeit- und Materialaufwand. Wie bereits einleitend erwähnt, erfolgt der Nachweis zunehmend durch molekularbiologische Methoden. Hierbei haben PCR Inhibitoren haben als Störfaktoren eine erhebliche Relevanz. So können vor allem organische Substanzen wie Huminsäuren während der PCR Proteine oder Enzyme adsorbieren und dabei chemisch oder sterisch mit ihren aktiven Seiten interferieren (LEWIS

ET AL., 2000). In der Nachweismethodik sollte dieser Umstand unbedingt berücksichtigt werden, damit keine falsch-negativen Ergebnisse resultieren.

1.5.2 Adenovirus (Adenoviridae)

Adenoviren sind Doppelstrang DNA Viren ohne Hüllmembran. Zur Gattung Mastadenovirus gehören die für den Menschen pathogenen Serotypen A – F. Klinische Symptome einer Adenovirusinfektion äußern sich überwiegend gastroenteral mit

Durchfällen und Fieber (LEES, 2000), aber auch Augen – und Atemwegsinfekte sind möglich (VAN HEERDEN ET AL., 2003). Die Virusgruppe ist stark an die Wasserumwelt gebunden. Bei Untersuchungen von VAN HEERDEN ET AL. (2004) wurden 29,8% 17 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Trinkwasser-, 16% Talsperren- und 44% Flusswasserproben positiv auf humane Adenoviren getestet. Darüber hinaus wurde resümiert, dass das Vorkommen der Serotypen 40 und 41 (enterale Adenoviren) vielfach unterrepräsentiert ist, da sich diese Viren kaum in Zellkulturen anzüchten lassen. Neben ihren häufigen Vorkommen in Gewässern sind sie auch außergewöhnlich widerstandsfähig gegenüber Abwasserreinigung und Desinfektion. Die Resistenzeigenschaften basieren auf der doppelsträngigen DNA. Es dienen beide Stränge als Replikationstemplet. Wird einer durch Umweltfaktoren zerstört, kann der andere als Matrize dienen (VAN HEERDEN ET AL., 2003).

1.6 Cryptosporidien und Giardien (Protozoa)

Protozoen sind einzellige, tierische Eukaryonten und unterscheiden sich somit grundlegend von den bereits erwähnten Indikatoren. Besondere medizinische Relevanz haben die einzelligen Parasiten als Erreger zahlreicher Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes. Eine Kontamination der Gewässer mit humanpathogenen Parasiten resultiert hauptsächlich aus dem Eintrag landwirtschaftlicher und kommunaler Abwässer (GRACZYK ET AL. 2002). 3 Im Rohabwasser wurden durch CACCIO ET AL. (2003) Konzentrationen von 2,1 x 10 bis 4,2 x 104 und 2,5 bis 277 Zysten und Oozysten/l gemessen. Hierbei wurde durch die Abwasserbehandlung eine durchschnittliche Reduktion von 87% – 98% für Giardienzysten erzielt. Bei einem massiven, wasserbürtigen Kryptosporidiose - Ausbruch in Milwaukee (USA) zeigte sich trotz negativen Coliformentest ein hohes Infektionsrisiko mit Parasiten

(LECLERC ET AL., 2002). Danach erfolgte ein generelles Umdenken bezüglich der Parasiten in den Wasseraufbereitungstechnologien. Ihre hohe Chlorresistenz, die niedrigen Konzentration im Wasser und einer sehr geringen Infektionsdosis standen als maßgebliche

Kriterien im Vordergrund (FRISCHER, 1999, LECLERC ET AL., 2002; HSU UND YEH, 2003). Nicht mehr die Chlorierung allein erreicht die Reduktion der Parasiten, sondern Kombinationen von physikalischen und chemischen Verfahren (Filter, Chlor, Chlordioxid,

Ozon, UV) sind gefordert (FRISCHER, 1999). Das konventionelle wasserhygienische Indikatorsystem entzieht sich weitestgehend einer Beurteilung der parasitären Belastungssituation im Wasser. Die Nutzung von Dreissena bietet hier einen interessanten Ansatz für den direkten Erregernachweis durch ihre Filtration. Die Befähigung der Dreikantmuscheln zur Aufnahme von Cryptosporidien aus dem Umgebungswasser konnte durch FRISCHER (1999) bereits nachgewiesen werden. 18 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Die nachfolgend beschriebenen Parasiten sind durch Wasser assoziierte Übertragungswege und besondere hygienische Prävalenz gekennzeichnet. Die Nachweismethodik ist durch eine sehr aufwendige Anreicherung charakterisiert. Neben konventionellen Techniken (mikroskopischer oder serologischer Nachweis) stehen zunehmend molekularbiologische

Methoden zur Verfügung. In einer Evaluierungsstudie von MAYER UND PALMER, (1996) konnte eine 100% Korrelation zwischen dem Nachweis von Giardia durch Immunfluoreszens und PCR (70% für Cryptosporidien) erreicht werden.

Giardien: Giardien sind begeißelte, einzellige und ubiquitär verbreitete Parasiten aus der Klasse der Diplomonadida. Giardia lamblia (syn. G. intestinalis, G. duodenalis) ist neben zwei weiteren Spezies, G. agilis und G. muris, die einzige human pathogene Gattung (VESY UND

PETERSON, 1999; ADAM, 2001). Das durch sie geprägte Krankheitsbild der Giardiasis entwickelte sich in den USA zur häufigsten wasserbürtigen Erkrankung beim Menschen in den letzten 30 Jahren (LECLERC ET AL., 2002). Die Übertragung der Parasiten erfolgt hauptsächlich fäkal - oral durch Zysten aus dem Wasser, Schmierinfektionen und infizierte

Nahrungsmittel. Bereits weniger als 10 Zysten können zu einer Infektion führen (MAYER

UND PALMER, 1996). Zwei Entwicklungsformen kennzeichnen den Lebenszyklus, die

Trophozoiden und die Zysten (ADAM, 2001). Während die Trophozoiden vornehmlich das

Duodenum besiedeln, sind die Zysten im Dünn- und Dickdarm präsent (FRISCHER, 1999) und gelangen von dort aus in die Umwelt. Die Giardiasis ist charakterisiert durch akute oder chronische Diarrhö mit Fettresorptionsstörungen, Bauchkrämpfen und Gewichtsverlust, sie kann aber auch asymptomatisch verlaufen, d. h. der Betroffene

überträgt die Zysten ohne Krankheitsfolgen (VESY UND PETERSON, 1999). Giardien- kontaminiertes Wasser ist eine globale und wirtschaftlich unabhängige Problematik, was weltweite Infektionsgeschehen bestätigen (FRISCHER, 1999; ADAM, 2001; VON BONSDORFF

ET AL., 2002; CACCIO ET AL., 2003).

Cryptosporidien: Die Gattung Cryptosporidium gehört zu den Sporentierchen. Alle Spezies der Gattung sind obligate, intrazelluläre Parasiten, die einen komplexen, hauptsächlich endogenen

Entwicklungszyklus durchlaufen (FAYER ET AL., 2000; TZIPORI UND WARD, 2002). Nach der ersten Beschreibung von Cryptosporidum muris durch Tyzzer (1907) wurde eine

19 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Vielzahl von Spezies trivial nach ihren Wirten benannt. In den neunziger Jahren konnten acht validierte Spezies benannt werden, unter anderen Cryptosporidium parvum (EGYED ET

AL., 2003). Im Menschen und anderen Säugetieren wird nur diese Spezies verbreitet. Phylogenetische Analysen zeigen, dass C. parvum nicht monophyletisch, sondern mit vielen Genotypen (Mensch, Rind, Maus, Schwein, Beuteltier, Frettchen und Affen) in der

Umwelt präsent ist (EGYED ET AL., 2003). Die Verbreitung der Oozysten erfolgt fäkal-oral über direkte Kontakte von Mensch zu Mensch, Tier zu Tier, Tier zu Mensch und indirekt wasserbürtig durch kontaminiertes Trink- und Brauchwasser sowie durch verunreinigte

Lebensmittel (FAYER ET AL., 2000). Bereits durch die Aufnahme einer geringen Anzahl (≤ 10 Oocysten) der 4-6 μm großen Oozysten ist ein hohes Risiko für Kryptosporidiose gegeben (TZIPORI UND WARD, 2002). Die Kryptosporidiose äußert sich meist in akuten, selbst limitierenden Durchfallerkrankungen bei immunkompetenten Patienten. Für immundefiziente Personengruppen (HIV-Infektion, Kleinstkinder, ältere Menschen) kann die Erkrankung zur lebensbedrohlichen Situation führen (TZIPORI UND WARD, 2002).

1.7 Zielstellung der Arbeit

Die technologische Nutzung der hervorragenden Filtrationseigenschaften von Dreissena polymorpha als Biofilter für Mikroorganismen soll im Rahmen eines breit angelegten Hygienemonitoring untersucht werden. Dazu werden verschiedene Bakterien, Viren und Parasiten aufgrund ihrer beschriebenen hygienischen Relevanz (Kapitel 1.3 bis 1.6) einbezogen. Die Muschel und ihre potentielle Funktion als gewässerintegrierter Bioindikator soll vornehmlich in anthropogen beeinflussten Wässern (gereinigtes Abwasser, Oberflächenwasser und Badegewässer) vergleichend studiert werden. Die Ergebnisse sind besonders in Hinblick auf das derzeit intensiv und kontrovers diskutierte „Indikatorkeimprinzip“ korrelativ auszuwerten und vor dem Hintergrund einer technologischen Umsetzung auf Praktikabilität zu prüfen. Studien offerieren einen erheblichen Bedarf an Vergleichsdaten zur Beurteilung der Index- und / oder Indikatorfunktion der diskutierten Mikroorganismen (IAWPRC STUDY GROUP

ON HEALTH RELATED WATER MICROBIOLOGY, 1991; LEGNANI ET AL., 1998; GRIFFIN ET

AL., 2000; SKRABER ET AL., 2002). Bakterien, Viren und Parasiten weisen zum Teil deutliche Unterschiede in der Widerstandfähigkeit gegenüber Umwelteinflüssen und Desinfektionsmitteln auf. Eine umfassende Beurteilung der Wasserqualität durch das 20 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

konventionelle (bakterielle) Indikatorkeimkonzept ist daher als limitiert einzuschätzen. Die Daten der vorliegenden Studie sollen auch diesbezüglich miteinander verglichen und beurteilt werden. Versuche im Labormaßstab sind in Lage, wichtige Erkenntnisse zur Beurteilung der mikrobiellen Akkumulation und Eliminationsleistung von Dreissena polymorpha zu vermitteln und Fragestellungen zu einer Verminderung der Keimbelastung durch den Einsatz der Muscheln zu bearbeiten. Hierauf Bezug nehmend sollen Filtrationsversuche mit den Muscheln unter kontrollierten Bedingungen (Batch, 24h) einen Datenpool zur Abschätzung des Muscheleinflusses auf die Mikroflora (Bakterien, Phagen) im Wasser und seinen Schwebstoffen liefern. Der Einsatz molekularbiologischer Methoden (PCR, DNA-Sequenzierung) dient der gezielten Detektion schwer kultivierbarer Mikroorganismen, wie Legionellen, enteralen Viren und pathogenen Protozoen in Muscheln und Wasser. Neben dem Fokus auf ausgewählte Indikatorbakterien untersucht die 16S rRNA-Genanalyse in wie weit die bakterielle Gemeinschaft des Umgebungswassers in der filtrierenden Muschel repräsentiert wird. Mit diesem kulturunabhängigen Ansatz lassen sich komplexe Bakteriozönosen identifizieren und analysieren (BÖTTGER, 1995; AMANN ET AL., 1995; AMANN UND

LUDWIG, 2000). An dieser Stelle soll ein Beitrag zur Erforschung von Grundlagen über die Mikroflora im Verdauungstrakt von Dreissena polymorpha geleistet werden. Die Kombination kultureller und molekularbiologischer Ansätze erlaubt Rückschlüsse auf die Effektivität der Filtration der Muschel hinsichtlich der genannten Erreger (Zusammenstellung siehe Abbildung 3) und deren Verhalten (Anreicherung, Inaktivierung) in den Dreikantnuscheln und im Wasser. Da in dieser Arbeit nur begrenzt Standartnachweismethoden einsetzbar sind ist die Erarbeitung von Präparations- und Analyseprotokollen sowie geeigneter Anreicherungsverfahren als grundlegend für die Muschelgewebe- und Wasseranalysen anzusehen.

21 MATERIAL UND METHODEN

2 Material und Methoden

2.1 Untersuchungsgewässer, Probenentnahme und -transport

Folgende Gewässertypen sind aufgrund ihrer unterschiedlichen Belastung mit hygienerelevanten Mikroorganismen und ihrer unterschiedlichen hydrochemischen Parameter (Tabelle A 1) ausgewählt worden: - gereinigtes Abwasser (Kläranlage Reichenau (Sachsen), Schönungsteich 1 und 2), - Oberflächenwasser (Elbe bei Dresden), - natürliches Badewasser (Waldbad Langebrück (Sachsen)).

Abbildung 2: Exposition von Dreissena polymorpha; Foto: KUSSEROW, R.

2 In alle Gewässer wurden dicht mit Dreissena bewachsene (ca. 75.000 Tiere/m , KUSSEROW

UND RÖSKE, 2004) PP-Aufwuchsträger (Sächsisches Textilforschungsinstitut Chemnitz) exponiert (Abbildung 2, unten). Die Muscheln entstammen einem Hälterungspool aus dem unteren Pumpspeicherbecken Niederwartha (Sachsen). Unter Gewährung weitestgehend natürlicher Umgebungsbedingungen sowie dem Ausschluss eines möglichen Fraßdrucks durch andere Tiere (z. B. Enten, Fische, Krebse) wurden die Aufwuchsträger, in

22 MATERIAL UND METHODEN

Plastikkörben geschützt, in mittlerer Wasserstandshöhe verankert. Die exponierten Muscheln waren durch ein heterogenes Altersgefüge charakterisiert (ersichtlich durch die unterschiedliche Schalenlänge) und repräsentierten so eine natürliche Population. Für die verschiedenen Untersuchungskampagnen wurden entsprechend der gewünschten Muschelanzahl Teile des Aufwuchsträgers vom Pool abgetrennt und bis zur Verarbeitung innerhalb von 24 h trocken und kühl (6°C) gelagert. Parallel zur Muschelentnahme erfolgte die Wasserentnahme in sterile Flaschen direkt aus der unmittelbaren Expositionsumgebung. Die Volumina richteten sich dabei nach den jeweiligen Untersuchungsverfahren.

2.2 Präparation der Dreikantmuscheln

Die Muscheln wurden vorsichtig vom Aufwuchsträger gelöst und unter fließendem, kaltem Leitungswasser oberflächlich gesäubert. Nach der Auswahl von ausschließlich morphologisch intakten Tieren begann die präparative Arbeit. Unter Ausschluss von möglichen externen Kontaminationsquellen (Handschuhe) wurde die Muschel mittels Skalpell geöffnet, indem der Schnitt dorsal beginnend über die Muschelspitze bis zum bauchseitigen Ende (ventral) geführt wurde. Nach dem Aufklappen der Schalen wurde das komplette Gewebe mit Hämolymphe in einem sterilen Gefäß aufgefangen. Sowohl bei Einzelgewebe- als auch bei Sammelpräparationen wurde das Feuchtgewicht als Bezugsgröße bestimmt. Bis zur mikrobiologischen Analyse innerhalb von 24 h wurde das Material unter ständiger Kühlung (6°C) gehalten.

23 MATERIAL UND METHODEN

2.3 Übersicht der mikrobiologischen Untersuchungen

Mikrobiologische Untersuchungen im Gewässer* und in Dreissena polymorpha

Kulturelle Nachweise Molekularbiologische Nachweise

Bakterien Viren Bakterien Viren Parasiten * 1,2,3 (4) * 1,2,3 * 1,2,3,4 * 1,2,3 *1,2,3,4

Kolonie- Somatische Legio- Stx - Crypto- zahl Coliphagen nellen Phagen sporidien (Muschel)

Coliforme/ FRNA Enteroviren Giardien E. coli Phagen

Intestinale Bacteroides Entero- fragilis kokken Phagen

Clostridien

* 1) Elbe; *2) Rei T 1; * 3) Rei T 2; * 4) Waldbad Langebrück;

Abbildung 3: Das mikrobiologische Untersuchungsprogramm dieser Arbeit im Überblick

24 MATERIAL UND METHODEN

2.4 Methodenentwicklungen und kulturelle Nachweise

2.4.1 Übersicht der verwendeten Organismen

Alle in dieser Arbeit eingesetzten Bakterien, Bakteriophagen und Parasiten sind in den folgenden Tabellen 3-5 erfasst und charakterisiert:

Tabelle 3: Verwendetete Referenzstämme in den Bakterienuntersuchungen

Herkunft / Stamm Einsatz/Kapitel Charakteristik

Nachweis der Bacteroides Bacteroides fragilis RYC2056 ATCC, Nr. 700786 fragilis Phagen

2.4.3.1 E. coli DSMZ, Nr. 30083 2.4.3.2 2.4.3.3

Nachweis der somatischen E. coli C ATCC, Nr. 13706 Coliphagen

ATCC 43.888 E. coli O157:H7 1 2.5.2.3 (Stx 1, 2 frei)

2.4.3.1 Enterococcus faecalis DSMZ, Nr. 20478 2.4.3.3

E. coli O157:H7 EDL933 ATCC, Nr. 43895 2.5.2.3 (enthält Stx 1, 2)

Salmonella typhimurium Nachweis der FRNA ATCC, Nr. 700730 (WG49) Phagen

1 freundlicher Weise zur Verfügung gestellt von J. Jofre, Inst. für Mikrobiologie, Universität Barcelona, Spanien

25 MATERIAL UND METHODEN

Tabelle 4: Verwendete Referenzstämme in den Bakteriophagenuntersuchungen

Stamm Herkunft / Charakteristik Einsatz/Kapitel

2.4.3.1 Phi (Φ) X174 ATCC, Nr. 13706-B1 2.4.3.3

2.4.3.1 Bacteriophage infecting ATCC, Nr. 700786-B1 2.4.3.2 Bacteroides fragilis B 56-3 2.4.3.3

MS2 ATCC, Nr. 15597-B1 2.4.3.3

Tabelle 5: Verwendete Referenzstämme in den Parasitenuntersuchungen

Stamm Herkunft / Charakteristik Einsatz/Kapitel

Waterborne™, Inc., New Cryptosporidium parvum Orleans; Oozystenkonzentrat 2.5.2.5 (Oozysten) (106 /4 ml 5% Formalin/PBS und 0,01% Tween) Waterborne™, Inc., New Giardia lamblia H3 Isolat Orleans; Zystenkonzentrat 2.5.2.5 (Zysten) (106 /4 ml 5% Formalin/PBS und 0,01% Tween)

2.4.2 Übersicht der mikrobiologischen Kulturverfahren

Die kulturellen Nachweismethoden für die mikrobiologischen Wasser-, Wasserkonzentrat- und Muscheleluatuntersuchung sind in der Tabelle 6 zusammengestellt. Dabei wurden ausschließlich Verfahren berücksichtigt, die in der Wasserhygiene etabliert und / oder standardisiert sind. Modifikationen für die Verwendung des Muschelfleischeluates wurden angemerkt. 26 MATERIAL UND METHODEN

Tabelle 6: Kulturelle Nachweismethoden

Nachweis Referenz und Anmerkung Gliederungspunkt

Koloniezahl bei 22°C und SCHULZE (1996), 2.4.4 37°C Gussplattenverfahren 2.4.6

FRICKER ET AL. (1997); E. coli und Coliforme FEUERPFEIL ET AL. (2002); 2.4.4 (Colisure®) ColisureTM Test Kit (IDEXX) 2.4.3.1 Mikrobiologisches Handbuch 2.4.3.2 Gesamtcoliforme (VWR), Endo-Agar 2.4.3.3 (Spateltechnik) 2.4.6 2.4.3.1 2.4.3.3 ISO 7899-2 (2000); Intestinale Enterokokken 2.4.4 Muscheleluat: Spateltechnik 2.4.5 2.4.6 Sporen sulfit- ISO 6461-2 (1986); reduzierender Anaerobier 2.4.4 Muscheleluat: Spateltechnik (Clostridien) 2.4.3.1 2.4.3.3 ISO 10705-2 (1998); 2.4.4 somatische Coliphagen auch für Muscheleluat 2.4.5 2.4.6 2.5.2.3 2.4.3.1 F+ spezifische ISO 10705-1 (1995); 2.4.3.3 Coliphagen auch für Muscheleluat 2.4.4 2.4.6 2.4.3.1 2.4.3.2 Bacteroides fragilis ISO 10705-4 (2000), 2.4.3.3 infizierende Phagen auch für Muscheleluat 2.4.4 2.4.6

27 MATERIAL UND METHODEN

2.4.3 Elution der Mikroorganismen aus dem Muschelfleisch

2.4.3.1 Auswahl des geeigneten Elutionspuffers In der Literatur werden eine Vielzahl von Pufferlösungen für eine erfolgreiche Elution adsorbierter Mikroorganismen beschrieben (SPEIRS ET AL., 1987; PAYMENT ET AL., 1988,

DORE ET AL., 2000; MUNIAIN-MUJIKA ET AL., 2002). Eine Auswahl verschiedener Elutionsmittel wurde mit dem Versuchsziel getestet, um ein möglichst breites Mikrobenspektrum mit vergleichbarer Effektivität zu erfassen. Das Fleisch (30 g) von in der Elbe gehälterten Dreissena polymorpha wurde 3 min. bei 9000 UpM mazeriert (Ultra Turrax T25, IKA ® Labortechnik, Dispergierwerkzeug S25N- 10G) und mit E. coli und Enterococcus faecalis (3 x 104 KBE) sowie den Phagen ΦX174 und B56-3 (3 x 104 PFU) versetzt. Nach intensivem Mischen (Vortex) wurde die Probe 10 min. und parallel 60 min. zur Adsorption der Mikroorganismen an die Muschelfleisch- matrix geschüttelt (Vibrax VXR, IKA ® Labortechnik, bei Rt). Der Ansatz wurde in 7 Teile aliquotiert, wovon jeder Teilansatz mit dem dreifachen Volumen (w/v) folgender Elutionsmittel aufgenommen wurde: - 10% Rindfleischextrakt pH 7,5

[Rindfleischextrakt (Difco); 16,75 g Na2HPO4 x 2H2O (VWR); 1,2 g Zitronensäure (VWR) auf 1000 ml Aqua dest. auffüllen, autoklavieren und pH-Wert einstellen]; - 10% Rindfleischextrakt pH 9,0; - 1% Skim-Milk (Difco) pH 7,5; - 1% Skim-Milk pH 9,0; - Peptonwasser (VWR) pH 7,5; - Glyzinpuffer pH 7,5 [0,05 M Glyzin (VWR), 0,14 M NaCl (VWR)]. Als Vergleichsprobe wurde autoklaviertes Elbwasser (30 ml) mit den oben genannten Mikroorganismen versetzt.

Nach der Elutionszeit wurden alle Ansätze bei 200 x g für 5 min. zentrifugiert. Die Überstände wurden vorsichtig gewonnen und kühl verwahrt. Im Fall der basischen Puffer wurde der Überstand umgehend vorsichtig neutralisiert (1 M HCL, VWR). Zur vergleichenden Beurteilung der Konzentration der zudosierten Mikroorganismen im Eluat wurden die Proben mittels kultureller Anzuchtverfahren untersucht (Tabelle 6). Dieser Versuch wurde dreifach wiederholt. 28 MATERIAL UND METHODEN

2.4.3.2 Einfluss der Adsorptionszeit und der Zentrifugation auf die Elution der am Muschelfleisch adsorbierten Mikroorganismen Sowohl der Zeitraum zur Partikelanlagerung als auch die Zentrifugalkraft sind entscheidend für die Effizienz des Nachweisverfahrens. Für die kulturelle Anzucht der Mikroorganismen ist die Abtrennung des störenden Muschelfleisches relevant. Die nachzuweisenden Mikroorganismen sollen dabei im Überstand verbleiben. Die Variation des Adsorptionszeitraumes für Partikel (Bakterien, partikelgebundenen Viren, Schwebstoffe) an die Muschelfleischmatrix untersucht das Adsorbtionsverhalten der eingesetzten Mikroorganismen und hat Einfluss auf die Dauer der Elutionszeit im Verfahren. Dem bereits mazerierten Muschelfleisch wurden die Testorganismen E. coli (3 x 104 KBE, Tabelle 3) und Bacteroides fragilis infizierende Phagen (3 x 104 PFU, Tabelle 4) zugegeben. Nach einer Adsorptionsphase von 10 min. und 60 min. (Schüttler, Rt) erfolgte die Aliquotierung der Probe in 9 x 1,6 g. Drei Proben wurden mit 10% Rindfleischextrakt pH 7,5 eluiert, die restlichen sechs Ansätze wurden zur Wiederholung asserviert (6°C). Von den Elutionsproben wurde ein Ansatz nicht zentrifugiert (0 x g), ein Ansatz bei 200 x g und ein Ansatz bei 500 x g für 10 min. zentrifugiert. Die Konzentrationsbestimmung der zudosierten Mikroorganismen (Tabelle 6) fand in dem nativen Muschelfleisch-Eluat- Gemisch und in den beiden Zentrifugaten vergleichend statt.

2.4.3.3 Wiederfindung der Bakterien und Phagen aus dem Muschelfleisch (Elutionseffizienz) Die Bestimmung der Wiederfindungsraten von Mikroorganismen ist ein wichtiges Qualitätskriterium zur Beurteilung nicht standardisierter Untersuchungsverfahren. Die durch Anwendung der jeweiligen Methode erzielten Ergebnisse können so evaluiert werden. Muschelfleisch (3,8 g, Elbe, mazeriert) wurde mit 11,4 ml (3-fache Volumen w/v) sterilem Elbwasser verdünnt und mit Testorganismen (3 x 104 KBE/PFU) in den Kombinationen:

- Enterococcus faecalis und ΦX174 Phage;

- Enterococcus faecalis und MS2 Phage

- E. coli und Bacteroides fragilis infizierende Phagen (Tabelle 3 und Tabelle 4) versetzt.

29 MATERIAL UND METHODEN

Die Ansätze wurden 10 min. bei Rt geschüttelt (Adsorption der Mikroorganismen) und anschließend zentrifugiert (10 min., 200 x g, 4°C). Alle Überstände (Ü1) wurden vorsichtig dekantiert, die Volumina bestimmt und verwahrt (4°C). Es schloss sich die Elution (10 min., Schüttler, Rt) der verbleibenden Sedimente mit 10% Rindfleischextrakt pH 7,5 (1:4 w/v) an. Nach einer weiteren Zentrifugation (10 min., 200 x g, 4°C) wurden die Eluate (Ü2) ebenfalls unter Berücksichtigung der Volumina bei 4°C zur Weiterbehandlung aufbewahrt. Die verbliebenen Sedimente wurden mit sterilem Elbwasser verdünnt und homogenisiert. Diese Sedimentgemische, hier bezeichnet als Sediment 2 (S2), wurden nativ belassen, gewogen und direkt zur mikrobiellen Untersuchung eingesetzt. Alle drei Teilproben (Ü 1, 2, S2) wurden hinsichtlich der Konzentration der zudosierten Bakterien und Phagen untersucht (Tabelle 6). Die Wiederfindungsrate der einzelnen Mikroorganismen wurde für das vorliegenden Protokoll über die prozentualen Anteile der Gesamtsumme definiert: Ü1 + Ü2 + S2 = 100%.

2.4.4 Hygienemonitoring (in situ) der Muscheln und Wasserproben

Im Zeitraum von 05.03.2002 bis 17.03.2003 wurde ein kontinuierliches Monitoring hygienerelevanter Mikroorganismen in den Gewässern Elbe, KA Rei T 1 und T 2 mit alternierender Probennahme durchgeführt. Die parallele Entnahme von Muscheln und Umgebungswasser gestattete dabei eine vergleichende Analyse der mikrobiellen Belastung beider Probenarten. Das Gewebe von ca. 50 Muscheln (ca. 10 g) wurde präpariert, gewogen und mit 10% Rindfleischextrakt pH 7,5 (1:4 w/v; Zentrifugation 200 x g; 10 min.) eluiert. Die Feuchtgewichte des Muschelfleisches und die Volumina der Eluate stellten die rechnerischen Bezugsgrößen für die Konzentrationsbestimmung der untersuchten Mikroorganismen (KBE / ml bzw. g und PFU / ml bzw. g) dar. Die Wasserprobe wurde vor der Untersuchung auf Zimmertemperatur kontrolliert und ohne Anreicherung eingesetzt. Die mikrobielle Analyse (Doppelansatz) im Monitoring erfolgte ausschließlich durch kulturelle Verfahren: - Koloniezahl 22°C und 37°C, - Coliforme und E. coli, - Enterokokken, - Clostridien,

30 MATERIAL UND METHODEN

- somatische Coliphagen, - FRNA-Phagen, - Bacteroides fragilis infizierende Phagen (Tabelle 6).

Die Muscheleluate und Wasserproben wurden gegebenenfalls bis 10-3 verdünnt. Alle bakteriellen und virologischen Konzentrationen im Wasser errechneten sich aus den in der jeweiligen Verdünnungsstufe gezählten (abgelesenen) KBE bzw. MPN und PFU pro ml Wasser (Mittelwert zweier Kulturplatten) und der Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor. Für die Konzentrationsermittlung im Muschelfleisch wurde zusätzlich das Eluatvolumen als Faktor einbezogen und das Ergebnis durch die Muschelfeuchtmasse (g) dividiert. An allen Expositionsorten wurden Anreicherungsfaktoren der Mikroorganismen in der Muschel gegenüber dem Wasser ermittelt. Es wird von einer Anreicherung in der Muschel ausgegangen, wenn der Faktor >1 ist. Der Faktor 0 beschreibt, dass weder in der Muschel noch im Wasser Mikroorganismen nachgewiesen wurden. Im Fall der somatischen und FRNA - Bakteriophagen wurden bei negativen Befund (Wasser) das Ergebnis durch 0,1 PFU/ml ersetzt, bei den Bacteroides fragilis Phagen entsprechend mit 0,5 PFU/ml. Beide Werte entsprechen der theoretischen NWG des Ansatzes und ermöglichen die Faktorberechnung. Die NWG variiert durch den Einsatz von großen Kulturschalen (Ø 145 mm, Probevolumen 5 ml) im Fall der somatischen und FRNA – Bakteriophagen. Das Ergebnis ist als Mindestfaktor zu bewerten und kann durchaus höher sein. Alle Konzentrationen wurden vergleichend ausgewertet, saisonale Unterschiede erfasst und Korrelationsanalysen durchgeführt.

2.4.5 Akkumulationsverhalten und Eliminationsleistung von Dreissena polymorpha gegenüber Mikroorganismen im Batchversuch (in vitro)

Die Beurteilung in wie weit die Dreikantmuscheln Indikatororganismen aufnehmen und eventuell inaktivieren können, ist mit einer quantitativen Datenerhebung in Batchversuchen möglich. Insgesamt vier Glasbecken wurden in 2 x 2 Versuchsansätze zur Inkubation bei unterschiedlichen Temperaturen (4°C und 20°C) aufgeteilt. Je zwei Ansätze bestanden aus einem Becken mit Dreissena - Besatz (8 Tiere, ca. 15 mm) und einem Blindbecken ohne Muscheln (Abbildung 4).

31 MATERIAL UND METHODEN

Temperatur 20°C Temperatur 6°C

Becken mit Becken ohne Becken mit Becken ohne Muscheln Muscheln Muscheln Muscheln

1,5 l angereichertes Wasser 1,5 l angereichertes Wasser

Abbildung 4: Versuchsaufbau: Untersuchungen zur Akkumulation und Elimination von Mikroorganismen in 24 h durch Dreissena polymorpha

Die Muscheln und das Hälterungswasser stammen aus der Elbe und wurden an die jeweilige Versuchstemperatur adaptiert. Für eine ausreichende Konzentration im Wasser wurden intestinale Enterokokken und somatische Coliphagen (Tabelle 3 und Tabelle 4) zudosiert (angereichertes Wasser): Enterococcus faecalis: 1,8 x 106 KBE: ca. 600 KBE/ml ϕX 174 Phage: 6,0 x 105 PFU: ca. 200 PFU/ml Nach einer Durchmischungszeit von einer Stunde wurde das angereicherte Elbewasser auf die Versuchsbecken verteilt und die Muscheln eingesetzt. Gleichzeitig zum Besatz wurde eine Muschelcharge des Probenpools (8 größengleiche Tiere) und eine Hälterungs- wasserprobe (10 ml) für den Versuchsbasiswert (Belastung t = 0 h) entnommen. Die Muscheln wurden sofort präpariert, eluiert und kulturell auf ihre Ausgangsbelastung mit Enterokokken und somatischen Coliphagen untersucht (Tabelle 6). Während der 24 stündigen Versuchsdauer wurden die Sauerstoffkonzentration und die Temperatur des Hälterungswassers kontinuierlich überwacht, so dass eine für die Muscheln limitierende Situation ausgeschlossen wurde. Zum Versuchsende (t = 24 h) erfolgte die Entnahme der Muscheln aus den bei 6°C und 20° inkubierten Muschelbecken und der Wasserproben aus allen Becken. Das restliche Wasservolumen der Becken wurde filtriert (PP Filter mit, Porenweite 30 μm, Millipore). Der Filter wurde vorher mit 10% Rindfleischextrakt gespült, um ein adsorbieren der Phagen zu vermeiden. Die im Filterrückstand 32 MATERIAL UND METHODEN

zusammengefassten Sedimente (filtrierbare Schwebstoffe, Faeces / Pseudofaeces von Dreissena polymorpha) wurden mittels 10% Rindfleischextrakt (pH 7,5; 10 ml) vorsichtig von dem Filterpapier eluiert (1 h, schüttelnd). Das Material wurde zentrifugiert (200 x g, 5 min.) und das Eluat unter Berücksichtigung des Volumens gewonnen. Die mikrobiologische Aufarbeitung der Muscheln, der Wasserproben und des Sedimenteluates (Tabelle 6) erfolgte innerhalb von 4 h. Die Strategie der Versuchsauswertung war die Bilanzierung der mikrobiellen Entwicklung von Versuchsbeginn (t = 0 h) bis zum Abbruch nach 24 h in den Probenkompartimenten: Muschelfiltrat (Konzentration der Mikroorganismen im Gewebe x Eluatvolumen / Wasservolumen nach 24 h [KBE oder PFU/ml]), dem Umgebungswasser und den Schwebstoffpartikeln einschließlich der Muschelfaeces und Pseudofaeces. Dafür wurden die Enterokokken- und Coliphagenkonzentrationen des Muscheleluates, des Wassers und des Eluates des Filtersückstandes der einzelnen Ansätze (n = 11) nach 24 h summiert (Σ t24). Die Summen der Konzentrationen wurden mit dem Ausgangswert ins Verhältnis

t 24 gesetzt: ∑ t 0 und eine prozentuale Elimination für die einzelnen Kompartimente ermittelt: − tt 0 ∑ 24 ×100 t0 (Tabelle A 22 bis Tabelle A 25).

Die Akkumulationsleistung der Muschel wurde durch die Faktorenbildung aus der

Bakterien- bzw. Phagenkonzentration im Muscheleluat zu Versuchsbeginn und der t 24 Konzentrationen nach 24 h berechnet: Akkumulationsfaktor = . t 0

2.4.6 Untersuchungen zur Sedimentbelastung unter dem Muschelbett (in situ)

Der Einfluss der Dreikantmuscheln auf die Biodepositon von Gewässern wurde bereits in der Einleitung erwähnt. Hierbei spielt neben der Faecesproduktion (Verdauung) vor allem der Prozess der Pseudofaecesproduktion (Kiemenreinigung, Partikelselektion) eine maßgebliche Rolle. Die seuchenhygienische Bewertung der Sedimente unter dem Einfluss von Dreissena ist gerade in Hinblick auf Sedimentrücklösungsprozesse und einer eventuell resultierenden Wiederverkeimung sehr bedeutsam.

33 MATERIAL UND METHODEN

Hierbei sollten Sedimente mit und ohne Muschelbeeinflussung unter natürlichen Bedingungen hinsichtlich der Konzentrationen bakterieller und virologischer Indikatoren vergleichend untersucht werden. Es wurden vier Imhofftrichter in der Elbe (Hafen Dresden) exponiert, wovon zwei mit Dreissena polymorpha bestückt wurden und ein paralleler Blindansatz ohne Muscheln zur Erfassung der natürlichen Sedimentfracht diente (Abbildung 5).

Abbildung 5: Versuchsaufbau für die mikrobiologische Sedimentanalyse in situ mit Imhoff - Sedimentiertrichtern

Die Versuchsdauer betrug insgesamt 48 h. Zum Versuchsende erfolgte die Sedimententnahme aus dem Muschel- und Blindtrichter. Die Muschelträger wurden gespült (15-maliges Eintauchen in das Trichterwasser) und aus dem Trichter entfernt. Um ein Absetzen der sedimentierfähigen Partikel zu ermöglichen, wurde eine 30-minütige Wartezeit eingehalten. Das Gesamtvolumen und die Feuchtgewichte der Sedimentproben wurden als Bezugsgrößen bestimmt. Nach Zentrifugation (2000 x g, 10 min.) und Elution des Sedimentes (1:4 v/w 10% Rindfleischextrakt pH 7,5; 1 h schüttelnd) wurden die am Sediment adsorbierten Mikroorganismen nachgewiesen. Das Volumen des Überstandes (Ü 1) wurde bestimmt. Der Elutionsansatz wurde wiederum zentrifugiert (2000 x g,

34 MATERIAL UND METHODEN

10 min.) und der resultierende Überstand (Ü 2) zur mikrobiologischen Untersuchung eingesetzt. In den Überstände 1 und 2 wurden die Konzentration der Enterokokken, der somatischen Coliphagen und der FRNA Phagen (Tabelle 6) bestimmt.

2.5 Molekularbiologische Analysen- und Nachweismethoden

2.5.1 Nachweis der Nukleinsäuren

2.5.1.1 DNA Extraktion Die im Folgenden aufgeführten Methoden (Tabelle 7) dienten der Gewinnung von DNA aus den Muscheleluaten und den Wasserproben für die analytische Weiterverarbeitung.

Tabelle 7: DNA - Extraktionsmethoden

Methode und Lösungen Kurzcharakteristik

QIAamp® DNA Mini Kit Präparation aus Flüssigkeiten: - dem jeweiligen Verwendungszweck wurden die DNA– Eluatvolumina variiert und angepasst - „Blood & Body Fluid Spin Protocol“ (QIAGEN) Abweichungen vom Protokoll wurden im entsprechenden Kapitel vermerkt.

Kombinationsmethode Probenaufschluss und Extraktion aus dem Muschelgewebe nach BLEUL (2004) (ca. 25 mg): - 500 µl Lysepuffer und 12,5 µl Proteinase K (QIAmp® Lysepuffer: DNA-Mini-Kit); - 50 mM Tris-HCl - 500 µl Zirkoniumbeads (Ø 0,1mm; Roth) und 500µl pH 8,0 Phenol - 10 mM NaCl - Beatbeater (MM2000, Retsch), 12 min, - 10 mM EDTA pH 8 max. Frequenz: 1560/min.); - 10% SDS DNA – Fällung: steril filtrieren - Puffer AL (QIAmp® DNA-Mini-Kit) und 96%iger Ethanol (J.T. Baker) DNA – Waschung und Elution: - „Blood & Body Fluid Spin Protocol“(QIAGEN).

35 MATERIAL UND METHODEN

2.5.1.2 DNA Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) Die Vervielfältigung von Nukleinsäuresequenzen ist Voraussetzung für die in der Einleitung unter der in Abbildung 3 aufgeführten molekularbiologischen Nachweis- methoden. Die PCR dient der selektiven Amplifizierung von DNA – Sequenzen. Neben dem DNA – Templet sind zwei geeignete Primer (Oligonucleotide) erforderlich. Durch die Erhitzung des DNA – Doppelstranges (Denaturierung) wird einzelsträngige DNA – Sequenzen erzielt. Die Primer lagern sich beidseits der Zielsequenz an (Priming) und bestimmen so deren Fragmentlänge. Eine thermostabile DNA – Polymerase (Taq – Polymerase) synthetisiert nun komplementäre Stränge (Synthese) zu den DNA – Matrizen. Dieser Zyklus aus Denaturierung, Priming und Synthese wird vielfach wiederholt und resultiert in einer exponentiellen Vermehrung der entsprechenden Produkte. Die PCR wurde in verschiedenen Thermocyclern (Mastercycler Personal, Eppendorf und GeneAmp® PCR-System 9700, Applied Biosystems) nach den jeweiligen im Anhang aufgeführten Protokollen durchgeführt. Alle in dieser Arbeit eingesetzten Primer (Oligonukleotide) sind in der Tabelle A 2 aufgeführt. Die Primer wurden durch die Hersteller MWG Biotech und Thermo Bio Sciences GmbH synthetisiert. PCR – Ansatz mit einem Gesamtvolumen von 25 μl: Volumen Komponenten

2,5 µl 10 x PCR-Puffer (15 mM MgCl2; Applied Biosystems) 2,5 µl 10 mM dNTP’s (Endkonzentration je dNTP 200 µM; Promega) 0, 5 µl 10 pmol forward Primer (Endkonzentration 0, 2 pmol/µl) 0,5 µl 10 pmol reverse Primer (Endkonzentration 0,2 pmol/µl) 0,125 µl Taq-Polymerase (AmpliTaq GoldTM 5 U/µl; Applied Biosystems) 2,5 µl Template 16,375 µl HPLC -Wasser

Nested- und Seminested PCR: Diese Techniken erhöhen die Sensitivität und Spezifität einer PCR. Ein mit dem ersten Primerpaar erzeugtes DNA - Produkt dient als Matrize für ein zweites innerhalb des ersten Paares liegendes Primerpaar (nested PCR). Verwendet man nur einen zusätzlichen Primer (forward oder reverse) handelt es sich um eine seminested PCR. In beiden Fällen entsteht ein PCR – Produkt, das innerhalb des ersten liegt.

36 MATERIAL UND METHODEN

Nested – und seminested PCR – Ansatz mit einem Gesamtvolumen von 25 μl: Volumen Komponenten

2,5 µl 10 x PCR-Puffer (15 mM MgCl2; Applied Biosystems) 2,5 µl 10 mM dNTP's (Endkonzentration je dNTP 200 µM; Promega) 0,5 µl 10 pmol forward Primer (Endkonzentration 0,2 pmol/µl) 0,5 µl 10 pmol reverse Primer (Endkonzentration 0,2 pmol/µl) 0,125 µl Taq-Polymerase (AmpliTaq Gold 5 U/µl, Applied Biosystems) 1,0 µl Template (Produkt der ersten PCR) 17,875 µl HPLC - Wasser

Multiplex PCR: Im Unterschied zur Standard PCR, die mit einem Primerpaar durchgeführt wird, werden bei dieser PCR mehrere Primerpaare zur gleichzeitigen Amplifizierung von verschiedenen Zielsequenzen in einem PCR – Ansatz verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde diese

Reaktion zum Nachweis der Stx1,2 Gensequenzen im Muscheleluat und Wasser (Kapitel 3.2.3) eingesetzt. Ansatz mit zwei Primerpaaren und einem Gesamtvolumen von 25 μl: Volumen Komponenten

2,5 µl 10 x PCR-Puffer (15 mM MgCl2; Applied Biosystems) 2,5 µl 10 mM dNTP’s (Endkonzentration je dNTP 200 µM; Promega) 0,5 µl 10 pmol Primer 1 forward (Endkonzentration 0,2 pmol/µl) 0,5 µl 10 pmol Primer 1 reverse (Endkonzentration 0,2 pmol/µl) 0,5 µl 10 pmol Primer 2 forward (Endkonzentration 0,2 pmol/µl) 0,5 µl 10 pmol Primer 2 reverse (Endkonzentration 0,2 pmol/µl) 0,125 µl Taq-Polymerase (AmpliTaq Gold 5 U/µl, Applied Biosystems) 1,0 µl Template (bzw. „gepicktes“ Plaque - Material) 16,875 µl HPLC - Wasser

2.5.1.3 Reverse - Transkriptase - PCR (RT - PCR) Das aus einem RNA – Transkript gewonnene PCR – Produkt ist die cDNA. Die RNA wird dabei durch das Enzym Reverse Transkriptase umgeschrieben. Für die Synthese des ersten cDNA – Stranges werden Oligo(dT) – Primer eingesetzt. Das cDNA – Produkt wird dann mit gewöhnlichen PCR – Primern amplifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde die RT –

37 MATERIAL UND METHODEN

PCR für den Nachweis der RNA - Viren mittels OneStep RT – PCR Kit (QIAGEN®) durchgeführt. Die Herstellung des Mastermix und die Cyclerkonditionen erfolgten nach den Protokollangaben des Herstellers (QIAGEN® OneStep RT-PCR Kit Handbook). One Step Reaktionsansatz mit einem Gesamtvolumen von 25 µl: Volumen Komponenten

5,0 µl 5 x RT - PCR-Puffer (12,5 mM MgCl2) 1,0 µl 10 mM dNTP Mix 1,0 µl One Step Enzyme Mix (2 µl/Reaktion) 3,0 µl 10 pmol forward Primer 3,0 µl 10 pmol reverse Primer 9,5 µl RNase freies Wasser 2,5 µl RNA – Template

2.5.1.4 Aufreinigung der PCR – Produkte Für die erfolgreiche Analyse der DNA (z. B. Sequenzierung, Klonierung) ist die Aufreinigung der Amplifikate grundlegend.

Verwendung von QIAquick® PCR-Purification Kit (QIAGEN® ): Hierbei wird die DNA an eine Silikatgelmembran selektiv gebunden und in mehreren Waschschritten gereinigt und schließlich durch einen Elutionspuffer eluiert. Der Arbeits- gang erfolgt nach den Herstellerangaben. In dieser Arbeit wurde diese Methode vor allem für DNA Klonierungen angewandt.

Verwendung von Enzymen: Mit Hilfe von zwei Enzymen wird einzelsträngige DNA abgebaut (Exonuclease I) und überschüssige dNTP's hydrolisiert (Alkalische Phosphatase). In der Arbeit wurden Enzyme ausschließlich für die Behandlung der PCR – Produkte vor der Sequenzierung eingesetzt. Gebrauchslösung: 1 μl Exonuclease I (20 U/μl BioLabs Inc.) verdünnt mit 19 μl Puffer (USB) wird mit der Alkalischen Phosphatase (S AP, 1 U/µl; USB) 1:1 (v/v) gemischt, aliquotiert und bei -30°C gelagert.

38 MATERIAL UND METHODEN

Gebrauchsansatz auf Eis: Volumen Komponenten 2,0 µl PCR – Produkt 0,8 µl Gebrauchslösung Die Proben wurden im Thermocycler 30 min bei 37°C und 15 min bei 80°C inkubiert.

2.5.1.5 Gelelektrophorese Die gelelektrophoretische Auftrennung der DNA – Moleküle erfolgte durch ein 1,5%iges (w/v) Agarosegel (SeaKem®, LE Agarose, Bio Whittaker Molekular Applications) in einer Elektrophoresekammer mit 1 x TBE – Puffer und einer Stromstärke von 180 mA. Die DNA-Proben (6 – 8 µl) wurden mit Ladepuffer (1 µl) versetzt und unter Mitführung eines Größenstandards (5 µl; Smart Ladder SF 1 kb-Leiter Eurogentec) in die Geltaschen pipettiert. Zur Visualisierung wurde das Gel ca. 25 min in ein Ethidiumbromidbad gelegt. Unter einem Transilluminator (Geldoc 2000; BIORAD) wurden die DNA-Banden detektiert und dokumentiert (Programm Quantity One 4.1.1.; BIORAD). 10 x TBE-Puffer: 108,9 g Tris (Roth) 55,7 g Borsäure (VWR) 9,3 g EDTA (Sigma) mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen; pH 8,3 mit 1 N NaOH bzw. 1 N HCl einstellen.

Ladepuffer: 0,25% Bromphenolblau (Laborchemie Apolda) 0,25% Xylencyanol FF (Sigma) 15% Ficoll (Sigma) in Aqua bidest. lösen

2.5.1.6 DNA – Sequenzierung Die Sequenzierung der PCR-Amplifikate erfolgt über eine modifizierte Didesoxyketten- terminationsmethode nach Sanger. Dabei werden unter Verwendung des BigDye® RR Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) zyklische Sequenzierungen mit einem automatischen Sequenziersystem (ABI PRISM System 377; Perkin Elmer; Applied Biosystems) durchgeführt. Im Reaktionsgemisch enthaltene fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide A, C, G, T (dNTP’s – BigDye Terminatoren) tragen am 5’-Ende keine OH- Gruppe und führen so zum Abbruch der Kette an der eingebauten Stelle. Es entstehen verschieden lange Kettenabschnitte, die in einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt werden.

39 MATERIAL UND METHODEN

Sequenzier-PCR Ansatz mit einem Gesamtvolumen von 10 µl: Volumen Komponenten 2,0 µl BigDye® Terminator (Applied Biosystems) 5,0 µl bzw. 5,5 µl HPLC – Wasser 1,0 µl 10 pmol Primer (Thermo Hybaid) 1,5 µl bzw. 2,0 µl gereinigtes PCR- Produkt Die Durchführung erfolgte in den unter Kapitel 2.5.1.2 aufgeführten Thermocyclern nach den im Anhang aufgeführten Sequenzierprotokollen.

2.5.2 Nukleinsäureanalytik

2.5.2.1 16S rDNA Genbanken von Muscheln und Wasserproben

Zur Untersuchung der Bakterienflora aus Klonbankerstellung: dem Verdauungstrakt von Dreissena polymorpha wurde eine Genbank mit dem Muscheleluat Wasser gepoolt gepoolt Ziel, ein möglichst breites bakterielles Spektrum zu erfassen, nach folgendem DNA - Extraktion Arbeitsschema (Abbildung 6) erstellt: Die Dreikantmuscheln wurden in der Elbe Amplifikation der bakteriellen 16S rRNA Gene (universelle Eubakterien – PCR) (Hafen) über 7 Tage exponiert (April 2003). Parallel wurde täglich eine Probe des Klonierung in E. coli Umgebungswassers entnommen und konserviert (-20°C). Aus dem Magen-Darm- Amplifikation des Inserts (M13 PCR) Trakt von sieben Muscheln (ca. 25 mg) wurde die DNA präpariert (Kit, QIAGEN). Sequenzierung des Insertamplifikates Zwei Alliquots (1. und 2. Wochenhälfte) wurden getrennt zur Klonierung eingesetzt. Datenbankabgleich der Sequenzen (BLAST) Die Wasserproben wurden zu einer

Identifikation / Phyllum Sammelprobe vereint. 200 µl des Probenpools wurden zur DNA-Präparation Abbildung 6: Klonierungsstrategie 40 MATERIAL UND METHODEN

(QIAGEN) eingesetzt. Die DNA Proben wurden verdünnt (Destilled Water, Gibco) und eine universelle 16S rDNA - PCR durchgeführt (Tabelle A 3, Nr. 1). Das Primerpaar TPU1/RTU4 (Tabelle A 2) flankiert eine Sequenz im Bereich des 16S rRNA-Gens. Die entstehenden PCR – Amplifikate besaßen eine Länge von 773 bp. Zur Klonierung wurde die DNA der Verdünnungsstufe 10-2 ausgewählt und aufgereinigt (QIAquick® PCR-Purification Kit, 2.5.1.4). Es wurden 2 µl der aufgereinigten DNA mit dem TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen, Niederlande) nach Herstellerangaben verarbeitet.

Das PCR – Produkt (Insert) wurde in das Plasmid pCR® 2.1 (Vektor) integriert und in E. coli Zellen (TOP10F´One Shot® Competent Cells, Invitrogen, Niederlande) transformiert. Das Insert integrierte in das lacZ Gen. Die Selektion auf positive Transformanden erfolgte auf IPTG und X-Gal supplementierten LB-Ampicillin-Platten. Positive Transformanden (weiße Kolonien) wurden mittels sterilen Zahnstochern gepickt und vereinzelt. Ausgehend von den Einzelkolonien wurden die Plasmidinserts mit dem Primerpaar M13f24 / M13r22 (Tabelle A 2) und dem PCR – Protokoll Nr. 2 (Tabelle A 3) vervielfältigt. Die Gelelektrophorese (2.5.1.5) der M13 – Produkte mit einer Fragmentlänge von 1021 bp (248 bp Plasmidsequenz und 773 bp Insert) bestätigte den Klonierungserfolg. Im Anschluss wurden die Insertamplifikate aufgereinigt und unter Verwendung des Primers TPU 1 eine Sequenzier - PCR nach Protokoll Nr. 3 (Tabelle A 3) angeschlossen. Die resultierenden DNA - Sequenzen wurden nochmals aufgereinigt und schließlich sequenziert (2.5.1.6). Die vergleichende Analyse der 16S rRNA-Genbanken beider Muschelproben und der Wasserprobe erfolgte mit dem Computerprogramm HUSAR 3.0 (Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources, DKFZ Heidelberg), basierend auf GCG-Programmen (Genetic Computer Group, DEVEREUX et al. 1984). Datenbankvergleiche wurden weiterhin mit EMBL- (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg) und mit dem BLAST - Algorithmus der NCBI Datenbank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/] durchgeführt.

Die Identifizierung der Bakterien einer Art (Spezies) erfolgte ab einer Sequenzhomologie

≥ 96% (STACKEBRANDT, 2003), bei geringeren Sequenzhomologien (≥ 80%) fand die Einordnung auf der Stammesebene (Phylum)statt.

41 MATERIAL UND METHODEN

2.5.2.2 Nachweis von Legionellen in Muscheleluat- und Wasserproben Die Untersuchungen von Muscheleluat- und Wasserproben auf Legionellen erfolgten in inhaltlich und zeitlich unterschiedlichen Untersuchungskampagnen. Eine Studie umfasste den molekularbiologischen Nachweis von Legionellen in den Muscheleluatproben des Hygienemonitoring – Programms und der Badesaison des Waldbades Langebrück (vgl. 2.4.4 und Tabelle A 32). Weitere Untersuchungen im Seston und in korrespondierenden Muschelproben zielten auf die Fragestellung nach der Häufigkeit und dem parallelen Vorkommen von Legionellen in beiden Untersuchungsmaterialien. Darüber hinaus wurden Klonbanken erstellt, die Auskunft über die taxonomische Einordnung von Legionellaceae aus Dreissena polymorpha und des Wassers geben sollen.

PCR - Nachweis der Legionellen im Muscheleluat: Die DNA von Dreissena polymorpha - Eluaten wurde extrahiert (QIAGEN, Tabelle 7) und mit dem Primerpaar 16S-225/16S-858 (Tabelle A 2) in die PCR eingesetzt. Die erste Amplifikation erfolgte nach dem PCR Protokoll Nr. 6 (Tabelle A 3) und ergab ein DNA Fragment von 654 bp. Die anschließende seminested PCR unter Einsatz des Primerpaares 16S-448/16S-858 (Tabelle A 2 und Protokoll Nr. 7 in Tabelle A 3) amplifizierte einen Genabschnitt von 430 bp. Alle auf Legionellaceae positiv getesteten Proben wurden durch die Sequenzierung der Amplifikate (Primer 16S-858, Protokoll Nr. 3 in Tabelle A 3) verifiziert.

Vergleichender Nachweis von Legionellen in Muscheleluaten und konzentrierten Wasserproben und Bestimmung der Legionellen PCR – Nachweisgrenze (NWG): Im Zeitraum von vier Monaten wurden vergleichende Untersuchungen zum qualitativen Nachweis von Legionellen in Dreissena polymorpha und angereicherten Umgebungs- wasserproben durchgeführt. Für die Aufkonzentrierung des Wassers (Seston) wurden 200 ml Probe zentrifugiert (4300 rpm, 30 min., 4°C) und der Überstand dekantiert. Das Pellet wurde in 2 ml Überstandslösung resuspendiert und bis zur Weiterverarbeitung eingefroren (-20°C). Die DNA aus dem Muscheleluate und des Wasserkonzentrates wurde anschließend mittels dem QIAGEN Kit extrahiert (50 µl/Probe). Die Amplifikation der Legionellen - spezifischen Nukleinsäure erfolgte nach dem bereits beschriebenen PCR - Protokoll.

42 MATERIAL UND METHODEN

Ausgehend von einer auf KBE bezogenen Legionellen – Verdünnungsreihe (Kolonieabschwemmung, DNA Extraktion) wurde die Nachweisempfindlichkeit für die angewandten PCR Bedingungen untersucht. Die Ausgangssuspension entsprach ca. 1,6 x 106 Zellen. Jede Verdünnungsstufe bis 10-6 KBE wurde spezifisch amplifiziert. Sowohl nach der ersten, als auch nach der seminested PCR konnte eine Nachweisgrenze (letzte detektierbare Fragmentbande) festgelegt werden. Die Ergebnisse ermöglichen eine grobe Einschätzung der Legionellenkonzentration (bezogen auf KBE) für die Erstamplifikation und die seminested PCR der Untersuchungsproben.

16S rDNA Klonbank von Muscheleluat- und Wasserkonzentratproben spezifisch für den Legionellen – Genus: Die aufgereinigte, zu klonierende DNA entstammt aus PCR - Amplifikaten (16S-225/16S- 858) einer Muscheleluat- und Wasserkonzentratprobe aus Rei T 1 vom 19.05.03. Die Klonierungsreaktion und Amplifikation des Inserts erfolgte analog zu dem bereits in Kapitel 2.5.2.1 beschriebenen Prozedere. Die Produkte der M13 PCR hatten eine Fragmentlänge von 902 bp (248 bp Plasmidsequenz und 654 bp Insert). Die Sequenzierung der Insertamplifikate wurde mit dem Primer M13f24 (Tabelle A 2) und dem Sequenzierprotokoll Nr. 9 (Tabelle A 3) durchgeführt. Die Analyse und der Vergleich beider Klonbanken wurde mit dem BLAST - Algorithmus der NCBI Datenbank vorgenommen.

2.5.2.3 Nachweis Stx-Gen tragender Bakteriophagen in Muscheleluaten und in Wasserproben Im Zeitraum von Oktober 2002 bis Februar 2003 (Tabelle A 35 ,Tabelle A 36, Tabelle A 37) wurden Wasserproben und Muscheleluate auf das Vorkommen von Phagen, die das

Stx1 und Stx2 Gen tragen, untersucht. Im Bereich der KA Reichenau wurden Rohabwasserproben (Zulauf KA) und Proben des Zulaufes in den Schönungsteich 1 (Ablauf KA) eingesetzt. Der Untersuchungsgang bestand aus einer Kombination kultureller und molekularbiologischer Nachweise.

Schematischer Arbeitsablauf: Abbildung 7

43 MATERIAL UND METHODEN

Wasserkonzentrat bzw. Muscheleluat

Plaqueassay PFU/ml bzw. g Wirt: E. coli C Wirt: E. coli 43.888

Plaque „pick“

Multiplex – PCR, 1. Amplifikation

nested PCR, Stx 1 und 2 Primer

Stx 1 und Stx2 Sequenzierung und Datenbankabgleich

Abbildung 7: Arbeitsstrategie zum Stx 1, 2 Nachweis

Untersuchungsvoraussetzung für die Wasserprobe war die Aufkonzentrierung durch Ultrazentrifugation (40.000 U/min bzw. 146.000 x g, 4 h, 4°C; Beckman-Ultrazentrifuge Optima). Die Muscheleluate wurden direkt eingesetzt. Von beiden Probenmaterialien wurde ein Phagen - Plaquetest (Tabelle 6) parallel mit dem Nachweiswirt E. coli C (Tabelle 3) und dem Wirt E. coli O157:H7 ATCC 43.888 (Tabelle 3) durchgeführt. Nach der Erfassung der Phagenkonzentrationen wurden alle Plaques (n ≤ 50) auf dem Wirt E. coli 43.888 mittels sterilen Zahnstochern einzeln in einen Multiplex – PCR – Ansatz (2.5.1.2) überführt. Mit den Primerpaaren Stx1f/Stx1r und Stx2f/Stx2r (Tabelle A 2) wurden die entsprechenden Gensequenzen (Fragmentlängen: 572 bp und 378 bp) amplifiziert (Protokoll Nr. 4, Tabelle A 3). Für die positive Kontrolle wurde DNA aus dem

Stamm E. coli O157:H7 EDL933 (enthält sowohl das Stx1 als auch das Stx2 Gen) extrahiert (QIAGEN) und bei jeder PCR mitgeführt. Alle Reaktionen der ersten PCR wurden separat mit der jeweiligen nested PCR (Protokoll Nr. 5, Tabelle A 3) mit den Primern Stx1nf/Stx1nr bzw. Stx2nf/Stx2nr (Tabelle A 2) vervielfältigt. Die Fragmentlängen der resultierenden Produkte betrugen 329 bp für Stx1 und 166 bp für Stx2. Die Primer für den 44 MATERIAL UND METHODEN

Nachweis der Stx1 Gene wurden aus der veröffentlichten Sequenz (EMBL Accession Nr.

M19473) der Untereinheit A der Stx1 Gene abgeleitet. Die PCR Ergebnisse wurden durch eine Sequenzierung (Primer Stx1nf bzw. Stx2nf, Protokoll Nr. 8 Tabelle A 3) mit Datenbankabgleich bestätigt.

2.5.2.4 Nachweis enteraler Viren in Muscheleluat- und Wasserproben Probengewinnung und -konzentration: Insgesamt 21 parallele Muschel- und Wasserkonzentratproben wurden für dieses Untersuchungsprogramm präpariert (Tabelle A 39, Tabelle A 40). Zwischen 4,0 und 7,6 l

Wasser wurden je Probe filtriert (DUMKE, 1998). Hierbei wurde das Wasser über eine Pumpe durch zwei MDS Flachfilter (142 mm) mit Vorfilter (AP 15, Millipore) mit einer Filtrationsrate von 200-300 ml/min. gepumpt. Die Viren adsorbieren an die Filtermatrix elektrostatisch. Die Elution der adsorbierten Viren erfolgte direkt im Filterhalter mit ca. 50 ml Rindfleischextrakt (3%, 0,05 M Glycin, pH 9,3) und einer zweimaligen Elution von 3 – 4 min. Das Eluat wurde in sterilen Gefäßen aufgefangen, neutralisiert und das Endvolumen bestimmt (26 ml - 73 ml). Dem ersten Konzentrationsschritt schloss sich eine Sekundärkonzentration an. Die Eluate wurden mit PEG 8000 (SIGMA®) entsprechend einer Endkonzentration von 8% versetzt. Unter Rühren (1,5-2,0 h; Rt, Magnetplatte) adsorbierten die Viren an das PEG. Die Ansätze wurden anschließend zentrifugiert (10.000 x g, 20 min.) und der Überstand dekantiert. Das Pellet wurde mit 3 ml des Überstandes resuspendiert und nochmals zentrifugiert (10.300 rpm, 20 min.). Das Finalpellet wurde separiert, in 0,5 ml PBS aufgenommen und eingefroren (-20°C). Damit wurde die Wasserprobe rund um das 104 fache aufkonzentriert.

DNA Präparation und AdV Nachweis: Die DNA (50 μl) für den Nachweis der Adenoviren wurden aus den oben genannten Muscheleluaten extrahiert (QIAGEN, Tabelle 7). Aufgrund der RNA Extraktion aus den Wasserkonzentraten (komplettes Volumen) stand für diesen Nachweisparameter kein Material der korrespondierenden Wasserprobe zur Verfügung. Unter Mitführung einer Positivkontrolle, die aus einer Umweltprobe (von Herrn Dr. Dumke freundlicherweise zur Verfügung gestellt) extrahiert wurde, erfolgte die Targetvervielfältigung über die Primer

45 MATERIAL UND METHODEN

ADV1/2 (1. Amplifikation) und ADV3/4 (nested PCR). Die resultierenden Produkte waren 329 bp bzw. 252 bp lang (Tabelle A 2, Tabelle A 3). Alle PCR - Produkte wurden sequenziert (PCR 50 Tabelle A 3).

RNA Präparation und EV Nachweis: Der Genus Enterovirus vereint ausschließlich RNA - haltige Viren. Die RNA der Muscheleluate und der Wasserkonzentrate wurde mit dem QIAamp® Viral RNA Mini Kit extrahiert. Das dem Testkit zu Grunde liegende Verfahrensprinzip und das entsprechende Prozedere nach dem QIAamp® Viral RNA Mini Kit Handbook soll nachfolgend kurz beschrieben werden. Zuerst wurde die Probe lysiert und die RNasen inaktiviert. Eine im Lysepuffer (AVL) befindliche Carrier - RNA bewirkte die optimale Bindung von viraler RNA an die QIAamp Membran (Silikongel). Anschließende Waschschritte mit verschiedenen Puffern (AW1 und AW2) garantierten eine hohe Qualität der RNA. Zur RNA - Elution wurde die gebundene Virennukleinsäure durch den Puffer AVE von der Membran rückgelöst. Die RNA wurde mit 60 µl Eluatpuffer aufgenommen. Die Gewinnung der cDNA aus den RNA Extrakten der Muscheleluat- und Wasserproben (1:10) erfolgte unter Einsatz der Primerpaare Coxprim1/2. Als nested PCR Primer wurden Coxprim3/4 (Tabelle A 2) verwendet. Es resultierten Fragmentlängen von 494 bp für die cDNA und 298 bp in der nested PCR. Die PCR – Bedingungen wurden in der Tabelle A 3 (Rt PCR EV, PCR Nr. 15) zusammengefasst. Alle positiven EV PCR – Produkte wurden mit dem Coxprim4 nach Protokoll Nr. 8 sequenziert (Tabelle A 2, Tabelle A 3).

Nukleinsäureinhibierungstest für Muscheleluate: Um eine mögliche Hemmung der PCR – Reaktion durch in der Probe befindliche Substanzen (z. B. Bestandteile des Rindfleischextraktes, Umweltagenzien) auszuschließen, wurde ein Inhibierungstest durchgeführt. Dafür wurden parallel 190 µl Enterovirus negatives Muscheleluat (Rindfleischextrakt als Elutionspuffer) und 190 µl PBS Puffer mit 10 µl Echovirus RNA (Zellkulturlysat, Dr. Dumke) versetzt. Von beiden Proben wurde eine Verdünnungsreihe bis 10-5 mit anschließender RNA Extraktion (QIAamp® Viral RNA Mini Kit) aller 12 Ansätze angefertigt. Die Nukleinsäureamplifikation und die anschließende Detektion erfolgten wie beschrieben.

46 MATERIAL UND METHODEN

2.5.2.5 Nachweis von Cryptosporidien und Giardien in Muscheleluaten und Wasserproben Probengewinnung: Die Untersuchungen fanden in den Gewässern Elbe, KA Rei T1, 2 und im Waldbad Langebrück statt. Im Fall der ersten drei Gewässer wurden die Dreissena – Aufwuchsträger aus Niederwartha (Referenzprobe t = 0) am 21.03.03 und in Langebrück am 13.05.03 exponiert. Mit einer alternierenden Beprobung wurden alle Gewässer von April 2003 bis August 2003 kontinuierlich untersucht.

Probenkonzentration: Für einen erfolgreichen Nachweis der Parasiten ist die Anreicherung des Probenmaterials verbunden mit einer effizienten Zystenseparation eine wichtige Voraussetzung. Die Gewinnung der Wasserproben erfolgte durch Filtration zeitlich korrespondierend zur Muschelprobenentnahme. Mittels einer Schlauchpumpenanlage (Abbildung 8) wurde ein Wasservolumen zwischen 50 l und 100 l durch eine spezielle Filterpatrone (Envirochek™, Pall Gelman Laboratory, Porenweite 1 µm) mit einer Leistung von 700 – 800 ml/min. gepumpt.

Filter-Patrone

Ausliterung Schlauchpumpe (Masterflex) Manometer console drive 18 - 1800 ml/min Druckminderer bis 2,7 bar (0 - 4 bar)

Silikonschlauch (ø6,3 x ø 11,2)

Sieb (0,8mm MW) (ca. 10cm tief)

Abbildung 8: Schlauchpumpenanlage für die Parasitenkonzentration (REICHARDT, 2003)

47 MATERIAL UND METHODEN

Bei Verringerung der Förderleistung unter 200 ml/min und einer Fördermenge unter 50 l pro Filterpatrone aufgrund eines hohen Schwebstoffanteils im Wasser wurde eine zweite Filterpatrone eingesetzt. Nach Abschluss der Filtration wurden die Filterpatronen senkrecht entsprechend der Vorschrift (REICHARDT, 2003, EPA 1623) bis zur Weiterverarbeitung innerhalb von 24 h kühl (4°C) gelagert. Die Ablösung der Zysten erfolgte durch einen zweifachen Elutionsvorgang, bei dem zuerst die Filterpatrone mit 125 ml Elutionspuffer befüllt und intensiv geschüttelt (30 min., Vibrax VXR; Janke & Kunkel; IKA® Labortechnik) wurde. Das Eluat wurde steril aufgefangen und verwahrt. Der Eluationsschritt wurde wiederholt (5 min, 125 ml Elutionspuffer) und beide Eluate vereint. Durch Zentrifugationen (30 min bei 1277 x g, 4°C) wurden die Proben auf ein Volumen von ca. 5 ml eingeengt. Die Verarbeitung der Zystenkonzentrate erfolgte innerhalb von 24 h (4°C).

Elutionspuffer: 0,5 g Laureth 12 (Gelman Laboratory) 5,0 ml Tris 1M (Roth) 1,0 ml EDTA 0,5M (Sigma) 75 µl Antifoam A (Sigma) Laureth 12 in 50 ml Aqua dest. bis zur Lösung erhitzen, Zugabe der anderen Substanzen, auffüllen mit Aqua dest. auf 500 ml

Tris 1M: 17,3 g Tris in 100 ml Aqua dest. lösen, Sterilfiltration (0,2 µm); pH-Wert Einstellung auf pH 7,4 mit 1N NaOH oder 1N HCl

EDTA 0,5M: 11,63 g EDTA in 50 ml Aqua dest. lösen, pH Wert Einstellung auf pH 8,0

Das Muschelfleisch (10 g) wurde 1:4 (w/v) mit sterilem Wasser aufgenommen, homogenisiert und zur Weiterverarbeitung bei 4°C gelagert (maximal 24 h).

48 MATERIAL UND METHODEN

Zysten und Oozystenseparation: Für die Separation von Cryptosporidium parvum und Giardia lamblia aus dem präparierten Muschelfleisch und dem Wasserkonzentrat wurden immunomagnetische Beads (Dynabeads®, GC-Combo Prod. No. 730.12, Dynal Biotech) verwendet. Die an den Beads immobilisierten Cryptosporidien und Giardien - Antikörper binden selektiv die entsprechenden Zysten und / oder Oozysten. Der Bead – Liganden - Komplex wird über einen Magneten (Dynal MPC®) konzentriert und separiert. Anschließend dissoziierten die Zysten und Oozysten in 0,1 N HCl von den Beads und wurden neutralisiert. Beide Ausgangsproben wurden auf ein Volumen von 10 ml eingestellt und mit 100 µl Dynabeads® versetzt. Alle weiteren Arbeitsschritte wurden nach den Herstellerangaben ® (Dynabeads GC-Combo instructions) bzw. wie in der Arbeit von REICHARDT (2003) beschrieben durchgeführt.

DNA – Präparation: Die Nukleinsäurepräparation erfolgte nach einer umfangreichen Evaluierung durch

REICHARDT (2003) durch eine Extraktionsmethode mit Ethanolfällung. Hierbei wurden die Zysten nach der Separation enzymatisch und mechanisch aufgeschlossen. Anschließend wurde die DNA in Kombination mit Puffern aus dem Qiagen DNA – Mini – Kit gewaschen und eluiert.

Herstellung von DNA – Positivkontrollen: Ein Gesamtansatz aus 1500 µl Oozysten- bzw. Zystenkonzentrat (106/4 ml 5% Formalin, Waterborne™, Inc., New Orleans) wurde mit 4500 µl steriler PBS-Lösung versetzt und gemischt. Die Verdünnungen wurden in 100 µl Aliquots aufgeteilt und bei –20°C für die DNA-Präparation aufbewahrt. Durch die Verdünnung der Oozysten- bzw. Zystenkonzentrate befanden sich theoretisch 2500 Oozysten bzw. Zysten in jedem Aliquot. Ein Aliquot für die Giardia lamblia Kontrolle wurde unmittelbar zur DNA – Extraktion (wie oben beschrieben) eingesetzt. Die Giardia – Nukleinsäure wurde unverdünnt als Positivkontrolle verwendet. Die DNA - Gewinnung der Cryptosporidien Oozysten erfolgte nach dem „Blood & Body Fluid Spin Protocol“ des QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) mit vorgeschalteten zweifachen Frier-Tau-Zyklus (30 min bei –80°C; 30 min bei RT). Zur Erhöhung der DNA-Ausbeute wurden die Proben eine Stunde mit Proteinase K

49 MATERIAL UND METHODEN

(QIAGEN Protease) bei 56°C inkubiert. Die Elution der DNA mit 100 µl HPLC-Wasser nach einer Inkubation von 10 min bei Raumtemperatur. Die DNA wurde in einer 1:10 Verdünnung als Positivkontrolle eingesetzt. spezifischer Nukleinsäurenachweis:

In der Arbeit von REICHARDT (2003) wurden verschiedene Primersysteme zum PCR - Nachweis von Giardien und Cryptosporidien sowohl einer Sensitivitätstestung, als auch einer Wiederfindungsanalyse unterzogen. Als praktikabel erwiesen sich die Primerpaare GGL/GGR (Doppel - PCR) und GGLF1/GGL (seminested PCR) für Giardia spp. mit einer Nachweisgrenze von 5 Giardia – Zysten. Die Primerpaare CPF/CPR (1. Amplifikation) und CPF1n/CPRn (nested) sowie zusätzlich LaxA/LaxB (1. Amplifikation), LaxB/LaxC (seminested) wurden erfolgreich mit einer Sensitivität von 10 bzw. 1 Oozyste für C. parvum etabliert. Die resultierenden Amplifikate ergaben Produktlängen von 171 bp (GGL/GGR, 1./2. Amplifikation) und 144 bp (GGLF1/GGL, seminested PCR) für Giardia spp. sowie 358 bp (CPF/CPR, 1. Amplifikation), 202 bp (CPF1n/CPRn, nested) und 210 bp (LaxA/LaxB, 1.Amplifikation), 176 bp (LaxB/LaxC, seminested) für C. parvum. Alle Primer und die entsprechenden PCR – Protokolle (12, 13 und 14) sind in der Tabelle A 2 und Tabelle A 3 aufgeführt. Die Sequenzierung positiver PCR - Produkte für C. parvum erfolgte mit dem Primer LaxB und für Giardia spp. mit dem Primer GGLF1, sowie den entsprechenden Protokollen Nr. 3 und 9 (Tabelle A 3).

50 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

3 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Kulturelle Analytik

3.1.1 Entwicklung eines effizienten Elutionsverfahrens für die mit dem Muschelgewebe assoziierten Mikroorganismen

Die erfolgreiche mikrobiologische Untersuchung von Muscheln setzt ein Herauslösen der Erreger aus dem Gewebe voraus. In diesem Zusammenhang mussten das geeignete Lösungsmittel (Elutionsmittel) und die optimalen Lösungsbedingungen gefunden werden. Im Hinblick auf eine effektive Elution unter Praxisbedingungen sollte darüber hinaus möglichst ein einheitliches Verfahren für alle interessierenden Mikroorganismen einzusetzen sein. Die nachfolgenden Teilergebnisse (Kapitel 3.1.1.1 und 3.1.1.2 ) sind methodische Grundlagen für die Beurteilung der Wiederfindungsrate in Kapitel 3.1.1.3.

3.1.1.1 Auswahl des geeigneten Elutionspuffers Die Elutionsmittel differierten erheblich bezüglich ihrer Rücklösungseffizienz für die untersuchten Bakterien (Abbildung 9). Im Vergleich der eingesetzten Elutionspuffer

5,E+02 E. coli 5,E+02 4,E+02 4,E+02 4,E+02 Intestinale 3,E+02 Enterokokken 3,E+02 2,E+02 B. fragilis 2,E+02 Phagen 2,E+02 KBE oder PFU/m oder KBE 1,E+02 8,E+01 Coliphage Phi 4,E+01 X174 0,E+00 5 ,5 ,0 ,5 ,0 ,5 7, er 7 9 7 9 7 h ss H H H H H p a p p p p p r w t t lk lk er fe lb ak ak i i ss uf E tr tr -M -M a p es ex ex m m w in il f f i i on yz er e e Sk Sk t l t Be Be ep G S P Elutionspuffer

Abbildung 9: Vergleich des Rücklösungsvermögen zudosierter Mikroorganismen aus dem Muschelgewebe durch verschiedene Elutionsmittel (n = 3) 51 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

erreichte der Rindfleischextrakt mit pH 7,5 (10%) die höchsten Wiederfindungen, die jedoch z. T. mit hohen Standardabweichungen behaftet waren. Ausschlaggebend für diese Einschätzung waren die deutlichen höheren Elutionskapazitäten bei E. coli, die besonders im Vergleich zur Blindprobe (steriles Elbwasser) hervortreten. Im Fall der Enterokokken unterschieden sich die einzelnen Elutionsmittel nur gering von einander. Im Vergleich zur bakteriellen Rücklösung ergab die Elution der beiden Bakteriophagenspezies ein niedrigeres Niveau. Das lässt den Schluss zu, dass das Adsorptionsverhalten beider Organismengruppen an die Muschelmatrix sehr unterschiedlich ist. Es wäre zu diskutieren, in wie weit die Menge der am Muschelgewebe adsorbierten Keime für die besprochenen Rücklösungsunterschiede zwischen Bakterien und Phagen ursächlich ist. (Wenn nicht viel gebunden ist, kann auch nur wenig rückgelöst werden.) So könnten im vorliegenden Fall deutlich weniger Bakteriophagen adsorbiert wurden sein. Der Vorgang der Bakterienanheftung an partikuläres Material ist maßgeblich abhängig von physikalisch – chemischen Umgebungsfaktoren, von der Motilität der Bakterien und ihren spezifischen Zellwandeigenschaften (BECKER ET AL., 2004). Die Beschaffenheit von mazeriertem Muschelfleisch in den Versuchsreihen muss als sehr schwankend, besonders in Hinblick auf die Umgebungswassereigenschaften, eingeschätzt werden. Mit dem Ziel ein gemeinsames Elutionsmittel für Bakterien und Viren zu etablieren, war die Akzeptanz der beschriebenen Standardabweichungen bei der Entscheidung für das Elutionsmittel Beefextrakt pH 7,5 notwendig.

3.1.1.2 Einfluss der Zentrifugalkraft und der Adsorptionszeit auf die Elution der Mikroorganismen vom Muschelfleisch Die rückgelösten Mikroorganismen wurden in der weiteren Präparation zur Abtrennung des Muschelfleisches einer Zentrifugation ausgesetzt. Die Zentrifugalkraft hat einen nachweislich großen Einfluss auf die Wiederfindung von Mikroorganismen (DOS SANTOS

FURTADO UND CASPER, 2000). Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen diese Feststellung. Die nachgewiesenen Bakterienkonzentrationen zeigten bei unterschiedlichen Zentrifugalkräften erhebliche Unterschiede (Abbildung 10).

52 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

600 550 500

l 450 nicht 400 ze ntrifugie rt 350 300 200 x g 250 200 500 x g KBE bzw. PFU/m KBE bzw. 150 100 50 0 E. coli B. fragilis Phagen Mikroorganismen

Abbildung 10: Einfluss der Zentrifugalkraft auf die Bakterien- und Virenelution aus dem Muschelgewebe ( Rindfleischextrakt pH 7,5; n = 3)

So ergab die Zentrifugation bei 200 x g im Gegensatz zur Probe ohne Zentrifugation eine um das Vierfache erhöhte E. coli Konzentration im Eluat. Dagegen nahm die Bakterienzahl bei weiterer Erhöhung der Zentrifugalkraft (500 x g) drastisch ab. Die Bakterien werden auf Grund ihres Eigengewichtes bereits wieder in das Sediment zurück gedrängt. Bei den Phagen ist dagegen die Einflussnahme der Zentrifugationsbeschleunigung weniger deutlich. Mit steigender Zentrifugalkraft blieb die Konzentration der B. fragilis Phagen konstant. Bakteriophagen sind im Größenvergleich ca. tausendfach kleiner als Bakterien, so dass unter den genannten Bedingungen nicht mit einer Rückdrängung zu rechnen war. Der Fokus verblieb daher bei den Bakterien und die Zentrifugalbeschleunigung im Elutionsprozess wurde auf 200 x g festgelegt.

Für die Beurteilung der Wiederfindungsrate im anschließenden Kapitel 3.1.1.3 wurden ausgewählte Mikroorganismen zudosiert, die sich während einer Adsorptionsphase (vgl. 2.4.3.3) an die Muschelfleischmatrix binden sollen. Damit sollte eine natürliche Keimbelastung des Gewebes simuliert werden, um den Einfluss der Kontaktdauer zwischen Mikroorganismen und Muschelfleisch auf den Elutionsprozess abzuklären.

53 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Die Abbildung 11 zeigt einen Konzentrationsunterschied zwischen E. coli und Bacteroides fragilis infizierenden Phagen (53 KBE/ml und 31 PFU/ml) nach einer Adsorptionszeit von 10 min bzw. 60 min.

9,E+01 8,E+01 7,E+01 l 6,E+01 5,E+01 4,E+01 3,E+01

KBE/ml bzw. PFu/m bzw. KBE/ml 2,E+01 1,E+01 0,E+00

E. coli (10 min.) E. coli (60 min.) B. fragilis infiz. Phagen (10 min.) B. fragilis infiz. Phagen (60 min.)

Abbildung 11: Einfluss der Adsorptionszeit auf die Elution der Mikroorganismen (Rindfleischextrakt 10%, pH 7,5; Zentrifugalkraft 200 x g; n = 3)

Parallel dazu wird nach einer Stunde nahezu die gleiche Menge beider Mikroorganismen eluiert. Vergleicht man die beiden Organismen untereinander, so nahm die Konzentration Bakterien im Eluat nach 60 min. von 53 PFU/ml auf 43 PFU/ml ab und der Phagenumfang erhöhte sich von 31 PFU/ml auf 44 PFU/ml. Es lässt sich schlussfolgern, dass mit einer Verlängerung der adsorptiven Phase der Elutionsertrag bei den Bakterien nicht mehr gesteigert werden konnte. Mit dem Fokus auf die Etablierung einer praktikablen und zeitsparenden Methodik wurde die Adsorptionphase auf 10 min. festgelegt.

3.1.1.3 Wiederfindung der Bakterien und Phagen aus dem Muschelfleisch Die quantitative Bewertung der Leistungsfähigkeit ist bei der Etablierung einer Methode von großer Wichtigkeit. Bezogen auf den durchgeführten Elutionsprozess sollten diese Versuche die Lösungseffizienz für Bakterien und Phagen aus dem Gewebe von Dreissena

54 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

erfassen. Nach der Summierung der einzelnen Teilkonzentrationen (Ü1, Ü2 und S2) wurde der erfassbare Anteil der Mikroorganismen prozentual für die einzelnen Verfahrensschritte ermittelt (Tabelle A 8). Bereits durch die erste Zentrifugation, zur Abtrennung der Muschelmatrix, konnte mit 80% (gemittelt) der größte Phagenanteil und mit 67% (gemittelt) die höchste Bakterienanzahl aus dem Gewebe gelöst werden (Abbildung 12). Das lässt vermuten, dass beide Organismengruppen, vor allem aber die Phagen, nur gering am Muschelfleisch adsorbiert waren.

1% 100% 4% 3% 9% 10% 11% 17% Sediment 2 80% 34% 19% 19%

60% Überstand 2 (Eluat) 90% 87% Anteile 40% 70% 62% 64%

20% Überstand 1

0% PhiX 174- B. fragilis- MS2-Phage Coliforme Intest. Phagen Phagen Enterokokken Mikroorganismen

Abbildung 12: Wiederfindung (%) von zudosierten Mikroorganismen aus dem Muschelfleisch (Rindfleischextrakt 10%, pH7,5; Zentrifugalkraft 200 x g; Adsorptionsphase10 min., n = 3)

Durch den Einsatz von Rindfleischextrakt 10%, pH 7,5 wurden weitere 9% bis 34% der Bakteriophagen und 19% der Bakterien aus dem verbliebenen Sediment eluiert. Der Phagenanteil liegt mit 21,5% (gemittelt) im Bereich der Bakterienrücklösung. Dieser Anteil umfasst die adsorptiv gebundenen Keime. Auffallend sind die Differenzen zwischen den einzelnen Phagenspezies. Die somatischen Coliphagen zeigen einen deutlich höheren adsorptiven Charakter, als die FRNA – Phagen und die Bacteroides fragilis Phagen. Im Restsediment (S2) verblieben rund 3% der Bakteriophagen und 14% der Bakterien. Dieser Anteil muss bei der Wiederfindungsbeurteilung als Verlustgröße gewertet werden, da das Sediment S2 bei den Untersuchungsproben verworfen wird. Die Auswertung lässt zwei Strategien zu.

55 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Eine Möglichkeit zur Berechnung der Wiederfindungsrate bezieht nur den adsorbtiv gebundenen Anteil (Ü2) und die Wirkung des Elutionsmittels ein. Daraus resultieren Wiederfindungsraten, die den bereits diskutierten Elutionsraten entsprechen (21,5% für Phagen und 19% für Bakterien). Bezieht man andererseits den Anteil des ersten Zentrifugationsschrittes (Ü1) mit in die Berechnung ein (Ü1 + Ü2), resultiert eine Wiederfindungsrate von 86% für Bakterien und eine Rate von 97% für Bakteriophagen. Diese zweite Variante bestätigt der Elutionsmethode im beschriebenen Umfang eine sehr gute Leistungsfähigkeit. Eine in der Verfahrensweise vergleichbare Studie konnte durch die Literaturrecherche nicht ermittelt werden. Prinzipiell wurde aber der Rindfleischextrakt als Elutionsmittel in mehreren Vergleichstudien als effizientes Elutionsmittel beschrieben

(ALBERT ET AL., 1995; LASOBRAS ET AL., 1999; MIGNOTTE ET AL., 1999). Alle weiteren Untersuchungen der vorliegenden Arbeit wurden auf der Basis des gewonnenen Muschelfleischeluates durchgeführt. Damit stand eine gemeinsame Matrix für alle mikrobiologischen Analysen (siehe Abbildung 3) zu Verfügung.

3.1.2 Hygienemonitoring (in situ) mit der Dreikantmuschel und dem Umgebungswasser

Durch die kontinuierliche Untersuchung von Dreissena polymorpha und ihrem Umgebungswasser war es möglich, die Filtrations- und Akkumulationskapazitäten der Muschel über ein ganzes Jahr unter wechselnden Einfluss von saisonalen Umweltfaktoren (Klima, Nährstoffe, Verunreinigungen etc.) aus hygienisch – mikrobiologischer Sicht zu studieren. Bezüglich der Bioakkumulation in der Muschel ist zu berücksichtigen, dass es sich um eine Summe sehr komplexer Prozesse (Aufnahmeeffektivität, Inaktivierung in der

Muschel) handelt (LUCENA ET AL., 1994). Die gewählten Expositionsorte (Tabelle A 1) gestatteten auf Grund ihres unterschiedlichen Charakters einen allgemeinen Einblick in den mikrobiologischen Zustand von natürlichen Oberflächengewässern (Elbe) und von Kläranlagenabläufen bzw. Schönungsteichen (KA Rei T1 und T2).

3.1.2.1 Hygienemonitoring in der Elbe Bakterien im Wasser und in Dreissena - Eluaten:

Die Elbe wurde in der Arbeit von KUSSEROW (2004) als Positivkontrolle der Expositi- onsorte gewertet, da sie die für die Kondition der Muschel maßgeblichen Beschaffenheits- parameter erfüllt (0,3 ± 0,2 NH4-N[mg/L]; pH 7,8 ± 0,5; TS 10,0 ± 0,2 [mg/L]; 56 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

SBK 1,7 ± 0,2 [mmol/L]) und somit von einer leistungsfähigen Muschelpopulation ausgegangen werden kann. In der Abbildung 13 sind die Konzentration der Indikatorbakterien im Wasser und in der Muschel im Verlauf eines Jahres dargestellt. Die Elbe zeigt sehr deutliche Schwankungen in ihrer bakteriologischen Beschaffenheit. Ignoriert man an dieser Stelle die Coliformen in den Muschelproben in der Abbildung 13, dann zeigt sich ein deutliches Maximum bei allen Bakterienkonzentrationen in den Wintermonaten (Oktober bis Februar, vgl. Tabelle A 9). Sporen von sulfitreduzierenden Anaerobiern konnten nur an der Nachweisgrenze detektiert werden. Alle Bakterienkonzentrationen (gemittelt) sind mit den Studienresultaten

(SKRABER ET AL., 2002; LUCENA ET AL., 2003) von Fließgewässern in Europa vergleichbar.

Basierend auf Untersuchungsergebnissen von FRICKER ET AL. (1997) wurden in der vorliegenden Untersuchung die MPN/ml Daten (Coliforme und E. coli) mit der direkten Angabe in KBE/ml (Literatur) verglichen.

3,E+02 4,E+02 6,E+02 4,E+02 5,E+02 8,E+02 25 3,E+02 l 2,E+02 20 2,E+02 2,E+02 15 2,E+02 1,E+02 10

9,E+01 Temperatur (°C) 6,E+01 5 KBE bzw. MPN /g oder m oder MPN /g KBE bzw. 3,E+01 0,E+00 0 Jul. 02 Jul. 02 Sep. 02 Jan. 03 Jan. 03 Feb. 03 Jun. 02 Dez. 02 Apr. 02 Apr. 02 Okt. 02 Mai. 02 Mai. 02 Mrz. 02 Nov. 02 Mrz. 03 Probennahme Muschel Intest. Enterokokken Wasser Intest. Enterokokken Muschel Clostridien Wasser Clostridien Muschel Coliforme Wasser Coliforme Muschel E.coli Was se r E.coli mittle re Te mpe ratur

Abbildung 13: Monitoring ausgewählter Indikatorbakterien im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der Elbe

Die Ursachen der Konzentrationsschwankungen von Bakterien in Fließgewässern müssen multifaktoriell diskutiert werden. Einflussgrößen wie Wassertemperatur, UV - Licht,

Durchflussrate, Turbulenz, Leitfähigkeit und pH Werte wurden in der Studie von SKRABER

57 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

ET AL., (2002) bewertet. Dabei wurden vor allem die Wassertemperatur und die Durchflussrate als die stärksten Einflussfaktoren auf das Verhalten von Mikroorganismen im Flusswasser hervorgehoben. Temperaturen zwischen 3,6°C und 9,5°C und eine hohe Durchflussrate (z. B. Mischwassereinleitung, Hochwasser) konnten als Stabilitätsfaktoren für die untersuchten Bakterien und Phagen eingeschätzt werden. Die Messung von höheren Bakterienkonzentrationen bei niedrigen Wassertemperaturen (vgl. Tabelle A 12) und die extremen Pegelstände der Elbe bei Dresden (zwischen ca. 0,12 m und 9 m)2 im Untersuchungszeitraum bestätigen die Stabilitätsfaktoren auch für die Elbe. Im Sommer hingegen sind Bakterien einer höheren UV – Strahlung, einem gesteigerten Fraßdruck anderer Organismen, insbesondere das Grazing durch Zooflagellaten (HARTKE ET AL., 2002) und einem allgemein erhöhten Stoffumsatz in der Nahrungskette ausgeliefert. Indirekt temperaturabhängig differiert auch der Bakterieneintrag in Fließgewässern. Hier dominiert der anthropogene Einfluss (z. B. schwankenden Beschaffenheit von Kläranlagenabläufen).

Bei Betrachtung der Bakterienkonzentrationen in Dreissena und der Wasserprobe (Abbildung 13) wird eine durchgehend höhere Konzentration der Keime in den Muscheln ersichtlich. In den frühen Sommermonaten zeigt die bereits erwähnte hohe Coliformenanzahl (Abbildung 13, Max.: 632,3 MPN/g) im Muschelgewebe einen besonders deutlichen Unterschied zur Wasserprobe (Max.: 47,9 MPN/ml). Dagegen wurden die Enterokokken nur gering oder gar nicht in der Muschel angereichert. SINTON

ET AL. (1999) fanden heraus, dass die Inaktivierung von Enterokokken im Sommer signifikant schneller abläuft als im Winter. Aufgrund der schnellen Inaktivierung konnte es möglich sein, dass die Enterokokken für die Muschel als Nahrungspartikel nur in geringen Umfang zur Verfügung standen. Die Umgebungstemperatur hat einen signifikanten

Einfluss auf die physiologische Aktivität der Schalentiere (PRIEUR UND MEVEL, 1990; LEI

ET AL., 1995). Die Autoren WOOD (1957); CABELLI UND HEFFERNAN (1971); LEUNG ET AL.

(1973) zitiert in PRIEUR UND MEVEL (1990) zeigten, dass die Indikatorkeimkonzentrationen in Muscheln im Sommer höher waren als im Winter und begründeten dies mit einer höheren Filtrationsaktivität. Dass Bakterien von Muscheln aufgenommen und verdaut werden, ist in mehreren Studien demonstriert worden (PRIEUR UND MEVEL, 1990; DE

MESQUITA ET AL., 1991; LEI ET AL., 1995). Fütterungsstudien von FRISCHER ET AL. (2000)

2 Quelle: www.wetteronline.de/pegel/Elbe/Magdeburg.htm 58 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

zeigten, dass Dreissena polymorpha die Bakterien auch als alleinige Nahrung nutzen. In Hinblick auf die bereits angesprochene hohe Akkumulation der coliformen Keime in den Muscheln während der Sommerperiode, könnte hierin eine mögliche Erklärung liegen. Bei E. coli und den Enterokokken stiegen die Konzentrationen in den Muscheln, ähnlich wie in den Wasserproben, in der kühlen Jahreszeit an. Die in der Tabelle 8 aufgeführten Anreicherungsfaktoren der Elbe-Muscheln erreichten minimal das Fünffache (E. coli) und maximal das 124-fache gegenüber der Wasserprobe (Koloniezahl 22°C, gemittelt). Zur Einschätzung der Akkumulationsleistung (max. Faktor 36) der Dreikantmuscheln kann man die gemessene E. coli Konzentration (9,1 MPN/g gemittelt) dem gültigen

Hygienerichtwert zum Verzehr von Schalentieren: <2,3 KBE E. coli/g Fleisch (DORE ET

AL., 1998) gegenüberstellen. Die Angaben der Koloniezahl (22°C und 37°C) wurden aus Skalierungsgründen in den Graphiken des Monitorings nicht berücksichtigt. Sie waren ein wichtiges Kriterium zur Monitoringüberwachung, da durch den Vergleich der Keimbelastung im Wasser mit der Konzentration im Muscheleluat auch die Fitness der Dreikantmuscheln überwacht werden konnte. (Tabelle A 9). Es ist davon auszugehen, dass die Koloniezahl bei 22°C Keime umfasst, die zur authochtonen Keimflora der Muscheln gehören. Im Gegensatz dazu erfasst die Koloniezahl bei 37 °C auch Bakterien, deren Temperaturoptimum an die Körpertemperatur von Warmblütern adaptiert ist und daher eher ein Indiz für einen Fäkaleintrag sind. Aufgrund der geringen Sporenanzahl von Clostridien im Wasser konnte bereits von einer geringen Akkumulation durch die Muscheln ausgegangen werden. Die Annahme wurde bestätigt, die Belastung der Muschel mit Clostridiensporen war sehr gering. Der in der Tabelle 8 aufgeführte Faktor (71) ergab sich durch den einmalig hohen Wert im März 2003 und wurde nicht verallgemeinernd bewertet.

Bakteriophagen im Wasser und in Dreissena - Eluaten: In den Wasserproben wurden während des gesamten Zeitraumes nur geringe Phagenkonzentrationen gemessen. Es dominierten die somatischen Coliphagen mit Konzentrationen bis 1,2 PFU/ml, gefolgt von den FRNA – Phagen bis 1,0 PFU/ml. Aufgrund der erheblichen Konzentrationsunterschiede zeigt die Abbildung 14 die Phagensituation im Wasser ohne direkten Vergleich zum Muschelgewebe, damit die Werte visuell noch erkennbar bleiben.

59 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

1,4E+00

1,2E+00

1,0E+00

8,0E-01

PFU/ml 6,0E-01

4,0E-01

2,0E-01

0,0E+00 Jul. 02 Jul. 02 Sep. 02 Jan. 03 Jan. 03 Dez. 02 Jun. 02 Okt. 02 Feb. 03 Apr. 02 Apr. 02 Mai. 02 Mai. 02 Mai. Mrz. 03 Mrz. 02 Nov. 02 Probennahme Wasser, somatische Coliphagen Wasser, FRNA-Phagen Wasser, B. fragilis Phagen

Abbildung 14: Monitoring ausgewählter Bakteriophagen im Wasser der Elbe

Die Phagenresultate liegen um mehr als eine Zehnerpotenz unter den für Oberflächen- gewässer publizierten Angaben (HAVELAAR ET AL., 1993; SKRABER ET AL., 2002; DURAN

ET AL., 2002; LUCENA ET AL., 2003). Dagegen wurde durch die IAWPRC STUDY GROUP ON

HEALTH RELATED WATER MICROBIOLOGY (1991) die Abhängigkeit des Vorkommens somatischer Coliphagen vom Verunreinigungsgrad des Wassers diskutiert. Danach lassen sich die vorliegenden Werte der somatische Coliphagen durchaus in den Verun- reinigungsgrad 2 für Süßwasser nach Kriterien von ZAISS (1982) zitiert in IAWPRC

STUDY GROUP ON HEALTH RELATED WATER MICROBIOLOGY (19919 einordnen. Aktuell wird die Elbe in die Gewässergüteklasse II – III (Tabelle A 1) eingegliedert. Die Daten des Zitates basieren auf dem Phagennachweis mit den Wirten E. coli K12, B, C, sowie HfrH und sind so mit den vorliegenden Daten vergleichbar. Neben dem in der ISO 10705-2 (1998) standardisierten Wirtstamm E. coli C (ATCC, Nr. 13706, auch in dieser

Arbeit eingesetzt) werden in vielen Arbeitsgruppen (LECLERC ET AL., 2000; SKRABER ET

AL., 2002; DURAN ET AL., 2002) weitere Wirte verwendet, so z. B. E. coli WG5 (ATCC, Nr. 700078). In Verbindung zu Untersuchungen aus einem anderen Arbeitsschwerpunkt (Daten in dieser Arbeit nicht präsentiert) zeigte sich eine zehnfache Konzentrations- differenz zwischen Phagen auf E. coli C und dem Wirt E. coli WG5. Konzentrations- und

60 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Bewertungsdifferenzen sollten demnach beim Vergleich der Ergebnisse auch methodisch kritisch geprüft werden. Es erscheint sinnvoll, den Vergleich von Daten auf der Basis eines gemeinsamen Wirtsbakteriums durchzuführen. Bacteroides fragilis infizierenden Phagen wurden im unangereicherten Elbwasser nicht nachgewiesen (Tabelle A 9). Ergebnisse unterhalb der Nachweisgrenze wurden auch in

Arbeiten von CHUNG ET AL. (1998), LUCENA ET AL. (2003) und SKRABER ET AL. (2002) beschrieben und diskutiert. Schlussfolgernd ist es ratsam, für dieses Testsystem die Untersuchungsproben anzureichern. Im Rahmen eines Routine – Monitorings sind die Bacteroides fragilis infizierenden Phagen daher nur bedingt geeignet. In der Abbildung 15 wurden die Phagenkonzentrationen in der Muschel mit Vergleich zur Wasserprobe dargestellt. Der Temperatureinfluss des Wassers und die damit verbundene Ausprägung saisonaler Effekte werden auch bei den Phagen ersichtlich. Sowohl im Muscheleluat als auch im Wasser waren die Phagenkonzentrationen in den Wintermonaten am höchsten. Hier zeigt sich ein Unterschied zur bakteriellen Belastung in Muscheleluaten, die bereits schon im Sommer hohe Werte erreichte.

25 5,E+02

4,E+02 20 4,E+02 l

3,E+02 15 3,E+02 2,E+02 10

PFU/g bzw. m bzw. PFU/g 2,E+02 Temperatur (°C) Temperatur 1,E+02 5 5,E+01 0,E+00 0 Jul. 02 Jul. 02 Jul. Jun. 02 Jun. 02 Sep. 03 Jan. 03 Jan. Apr. 02 Apr. 02 Apr. Dez. 02 03 Feb. Okt. 02 Okt. Mai. 02 Mai. 02 02 Nov. Mrz. 02 Mrz. 03 Mrz. Probennahme Muschel, somatische Coliphagen Wasser, somatische Coliphagen Muschel, FRNA-Phagen Wasse r, FRNA-Phage n Muschel, B. fragilis Phagen Wasser, B. fragilis Phagen mittlere Temperatur

Abbildung 15: Monitoring ausgewählter Bakteriophagen im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der Elbe

61 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Studien von BURKHARDT UND CALCI (2000) und DORE ET AL. (2000) ergaben bei den Indikatoren E. coli und FRNA - Phagen einen mit den vorliegenden Daten vergleichbaren Jahresverlauf. Die geringen Phagenkonzentrationen im Wasser (im Mittel an der NWG) traten gegenüber den Resultaten in den Muscheln (somatische Coliphagen: 113 PFU/g, FRNA – Phagen: 27 PFU/g, Bacteroides fragilis Phagen: 1 PFU/g gemittelt) in den Hintergrund. Spitzenwerte in einem Gramm Muschelfleisch betrugen dagegen das Tausendfache der Konzentration von einem Milliliter Elbewasser (vgl. somatische Coliphagen von Muschel und Wasser im November 2002, Tabelle A 9 und Tabelle A 11). Weitere Hinweise auf eine Phagenakkumulation in den Muscheln geben die mehrfach positiven Nachweise von somatischen Coliphagen und FRNA Phagen im Gewebe der Dreikantmuscheln, denen negative Befunde im Wasser gegenüber standen (Tabelle A 9 und Tabelle A 11). Die Höhe der erreichten Akkumulationsfaktoren (Tabelle 8) überraschte gerade auch in Hinblick auf die zu vermutende indirekte Aufnahme der Phagen durch die Muscheln. Werden die Phagen in den Muscheln verzögert abgebaut oder finden sie ökologische Nischen? In der

Studie von DORE UND LEES (1995) fand man große Unterschiede zwischen den Reduktionszeiten von E. coli (6,5 h) und FRNA Phagen (ca. 58 h) in Schalentieren. Beide Indikatoren wurden hauptsächlich im Verdauungstrakt nachgewiesen. Dort wurde E. coli vollständig abgebaut, die Phagen im Vergleich nur auf 30% der Ausgangskonzentration. Vieles deutet auf eine Unempfindlichkeit der Phagen gegenüber dem Verdauungsprozess der Muscheln hin. Aber auch die Aufspaltung von Phagenaggregaten bzw. die Desorption der Phagen von Partikeln beim Verdauungsprozess könnte eine Rolle spielen. Bacteroides fragilis Phagen konnten auch im Muschelgewebe nur sporadisch (vgl. Tabelle A 11 im März, Mai, Juli und September 2002) oder gar nicht nachgewiesen werden. Beim Vergleich mit anderen Hygieneindikatoren fiel auf, dass genau zu diesen Zeitpunkten die Enterokokken deutlich nachweisbar waren. Beide Indikatoren gelten als sehr resistent gegenüber Umwelteinflüssen (DE MESQUITA ET AL., 1991; DURAN ET AL., 2002).

62 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Tabelle 8: Erfassung der durschnittlichen Anreicherungsfaktoren in Dreissena polymorpha im Vergleich zum Wasser der Elbe

Bakterien- und Elbe (n=16) Anreicherung Muschel: Phagennachweis Stabw Minimum Maximum Wasser (gemittelt) Koloniezahl bei 22°C 124 136 9 453 Koloniezahl bei 37°C 69 50 14 221 Enterokokken 11 16 0 53 Clostridien 71 273 0 1.058 Coliforme 28 39 1 143 E. coli 5 9 0 36 somatische Coliphagen 395 355 0 1.298 FRNA-Phagen 147 190 0 614 B. fragilis Phagen 3 8 0 32

Zusammenfassend kann für den Einsatz der Dreikantmuschel als Hygienemonitor in der Elbe ein positives Fazit gezogen werden. Die exponierte Muschelpopulation zeigte eine stabile physiologische Fitness (Daten in KUSSEROW UND RÖSKE, 2004) über den gesamten Jahresverlauf und war damit auch ein zuverlässiger Biofilter. Die bakteriellen Indikatoren E. coli, Coliforme und die somatischen Coliphagen und FRNA Phagen konnten in 91% aller Untersuchungen im Muschelgewebe nachgewiesen werden, was im Falle der korrespondierenden Wasserprobe nur in 69% der Ansätze möglich war. Die Muscheln repräsentierten damit einen zeitlich integrierten Hygienezustand des Fließgewässers und boten eine erweiterte Aussage („Hygienegedächtnis“) als die übliche Stichpunktprobe aus dem Wasser (Momentanzustand).

3.1.2.2 Hygienemonitoring in der KA Reichenau Teich 1 Bakterien im Wasser und in Dreissena – Eluaten: Hydrologisch und hydrochemisch stellt der Schönungsteich 1 im Vergleich zur Elbe eine vollkommen andere Umgebungssituation für die Muscheln dar. Die Bedingungen waren besonders in Hinblick auf die (Nähr-)stoff- und Sauerstoffsituationen als teilweise extrem stressig für die Muscheln einzuschätzen. Eine Grenzsituation für die Muschelphysiologie war vor allem die stark erhöhte Sauerstoffzehrung im Juni/Juli 2002 durch den Zusammenbruch der Belebtschlamm - Biologie in der KA nach Überbeladung mit einer Zuckerlösung und die massenhafte Bedeckung des Teiches mit Wasserlinsen (Lemna) im August bis November (vgl. Tabelle A 13).

63 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

5,E+03 6,E+03 5,E+03 5,E+03 1,E+04 3,E+03 25 3,E+03

l 2,E+03 20 2,E+03 2,E+03 15 2,E+03 1,E+03 10

9,E+02 (°C) Temperatur 6,E+02 5 KBE bzw. MPN/g oder m oder MPN/g KBE bzw. 3,E+02 0,E+00 0 Jul. 02 Jul. Jan. 03 Jan. Jun. 02 Jun. 02 Sep. Apr. 02 Apr. Dez. 02 03 Feb. 03 Feb. Okt. 02 Okt. 02 Okt. Mai. 02Mai. Aug. 02 02 Nov. Mrz. 02 Mrz. 03 Mrz. Probennahme Muschel Intest. Enterokokken Wasser Intest. Enterokokken M uschel Clostridien Wasser Clostridien Muschel Coliforme Wasser Coliforme Muschel E.coli Wasser E.coli mittlere Temperatur

Abbildung 16: Monitoring ausgewählter Bakterien im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der KA Rei Teich 1

Das typische saisonale Schwankungsbild der Bakterienkonzentrationen ist im Wasser der KA im Vergleich mit der Elbe schwächer ausgebildet (Abbildung 16). Es gab im Frühjahr und auch im Sommer (August) stoßweise, wahrscheinlich resultierend aus dem KA - Zulauf, hohe Konzentrationen an coliformen Keimen (Tabelle A 14). In den Wintermonaten zeigte sich, wie schon bei der Elbe beschrieben, ein Konzentrationsanstieg der Bakterien im Wasser. Die Enterokokken ließen sich im Zulauf T 1 mit einem Bereich von 0 bis 22,1 KBE/ml, die Coliformen zwischen 4,2 und >2149,2 MPN/ml und E. coli zwischen 0,2 und 1.553,1 MPN/ml im Jahresverlauf nachweisen. Im Vergleich zur Elbe wurde der Muschel damit eine um das vier- bis zehnfach erhöhte Konzentration hygienerelevanter Keime im Umgebungswasser präsentiert. Die Größenordnungen der Zulaufbelastung des Schönungsteiches sind mit Konzentrationen der KA - Abläufe vergleichbar, die in anderen Studien gemessen wurden (TURNER UND LEWIS, 1994,

FLEISCHER ET AL., 2000). Die im Zulaufbereich exponierten Muscheln filtrierten trotz der oftmals ungünstigen Wasserbedingungen und erreichten sehr hohe Anreicherungsfaktoren (Tabelle 9 und Tabelle A 15). Unter einer fast vollständigen Lemna - Bedeckung des Teiches war die Muschelfitness beeinträchtigt, gleichzeitig wurden in den Wasserproben (Juli 2002 – September 2002) erhöhte E. coli und Coliformenwerte gemessen (Max.: 13,7 MPN/ml und >241,9 MPN/ml). In dieser Phase sind vermutlich die Folgen der

64 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

massiven Beeinträchtigung des gesamten biologischen Gefüges im Teich, einschließlich der Einschränkungen der Muschelfilteraktivität (Fitness) zu erkennen. So zeigten die erhöhte Letalität (KUSSEROW, 2004) sowie eine geringere Schalengröße und –festigkeit, im Vergleich zu Muscheln aus der Elbe, dass die Wasserbedingungen nicht optimal waren. Trotzdem wurde kein kompletter Ausfall des Muschelfilters registriert. Im Gegenteil: alle bakteriellen Anreichungsfaktoren konnten im Vergleich zur Elbe um den Faktor 4,5 (gemittelt) gesteigert werden (Tabelle 9). Die Monitoringergebnisse lassen schlussfolgern, dass Dreissena polymorpha mit der Erhöhung des Nährstoffangebotes die Akkumulation von Bakterien steigert und einen hohen Toleranzbereich für ungünstige Umweltbedingungen besitzt.

Bakteriophagen im Wasser und in Dreissena – Eluaten: Die Phagenwerte im Wasser lagen im Bereich der NWG und 2,1 PFU/ml für somatische Coliphagen, bis 4,3 PFU/ml für FRNA - Phagen und bis 0,5 PFU/ml für die Bacteroides fragilis infizierenden Phagen (Tabelle A 14). Das sind Größenordnungen, die auch für diesen Gewässertyp um das Zehn- bis Hundertfache unter den publizierten Daten

(FLEISCHER ET AL., 2000; CAMPOS ET AL., 2002) liegen. Abbildung 17 zeigt die Phagenkonzentrationen in den Muscheln und im Wasser.

1,E+03 9,E+02 4,E+02 25

4,E+02 20 3,E+02 l 3,E+02 15 2,E+02

2,E+02 10 PFU/g bzw. m bzw. PFU/g Temperatur (°C) 1,E+02 5 5,E+01

0,E+00 0 Jul. 02 Jul. Jun. 02 Jun. 02 Sep. 03 Jan. Apr. 02 Okt. 02 Okt. 02 Dez. 02 Mai. 02Mai. 03 Feb. 03 Feb. Mrz. 02 Mrz. Mrz. 03 Mrz. Aug. 02 Aug. Nov. 02 Probennahme M uschel, somatische Coliphagen Wasser, somatische Coliphagen Muschel, FRNA-Phagen Wasser, FRNA-Phagen M uschel, B. fragilis Phagen Wasser, B. fragilis Phagen mittlere Temperatur

Abbildung 17: Monitoring ausgewählter Bakteriophagen im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der KA Rei Teich 1 65 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Der Vergleich lässt auch unter den Bedingungen des Schönungsteiches ein enormes Anreicherungspotential für Phagen durch die Muschel erkennen. Es wurden mittlere Faktoren von 517 für somatische Coliphagen und 368 für FRNA Phagen erreicht. Die Akkumulation von Bacteroides fragilis Phagen war geringfügig, da die Konzentrationen im Wasser kaum über der NWG lagen. Der Nachweis von Bacteroides fragilis infizierenden Phagen im Muscheleluat gestaltet sich aus mehreren Gründen als schwierig. Einmal bedingt die geringe Konzentration dieser Phagen im Wasser eine geringe Aufnahme durch die Muschel. Darüber hinaus hat das geringe Bindungsvermögen der Phagen an Schwebstoffe (vgl. Kapitel 3.1.1.3) einen zusätzlich negativen Einfluss für den Nachweis. Es stellt sich die Frage nach einer konzentrationsabhängigen Akkumulation durch die Muscheln. Da die Größe der untersuchten Phagen als ähnlich bewertet werden kann, gilt die unterschiedliche Konzentration der Phagenarten im Wasser als differierender Faktor im Monitoring. Die Konzentration der Bacteroides fragilis Phagen im Wasser ist sehr gering und liegt wahrscheinlich unterhalb der Sensibilitätsgrenze der Muschel. Die Konzentrationen der somatischen Coliphagen und der FRNA – Phagen im Wasser lagen im Möglichkeitsbereich der Muschelakkumulation. Laborversuche im Rahmen einer

Diplomarbeit zu Dreissena polymorpha (BOBSIN, 2000) führten bereits zu Ergebnissen, in denen eine Virenelimination durch Muschelfilteraktivität erst bei höheren Phagenkonzentrationen im Versuchswasser messbar war.

Tabelle 9: Erfassung der durchschnittlichen Anreicherungsfaktoren in Dreissena polymorpha im Vergleich zum Wasser der KA Rei T 1

Bakterien- und KA Zulauf T1 (n=15) Anreicherung Muschel: Phagennachweis Stabw Minimum Maximum Wasser (gemittelt) Koloniezahl bei 22°C 280 511 0 1.795 Koloniezahl bei 37°C 264 668 0 2.402 Enterokokken 164 593 0 2.306 Clostridien 0 0 0 0 Coliforme 51 104 1 357 E. coli 20 58 0 229 somatische Coliphagen 517 860 19 2.719 FRNA-Phagen 368 873 0 3.355 B. fragilis Phagen 1 3 0 9

66 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

3.1.2.3 Hygienemonitoring in der KA Reichenau Teich 2 Bakterien im Wasser und in Dreissena - Eluaten: Im Ablauf der nachgeschalteten Reinigungsstufe zeigte sich eine deutlich Reduktion der Bakterienbelastung um 57% (gemittelt) gegenüber dem Zulauf, die vergleichbar ist mit

Reduktionswerten aus der Studie von CAMPOS ET AL. (2002). Die Gewässerverhältnisse ähnelten dem Teich 1, mit der Einschränkung, dass das Lemna – Wachstum schon im März begann und damit die Sauerstoffverhältnisse, verbunden mit dem anschließenden Störfall (Zuckerlösung) der KA, sehr zeitig zum limitierenden Faktor für die Makrofauna des Teiches wurden (Tabelle A 17). In der Abbildung 18 fallen in diesem Zusammenhang die periodisch hohen Coliformenzahlen in der Muschel und im Wasser auf, die keiner saisonalen Charakteristik mehr folgen. Nur in Wintermonaten war ein dem natürlichen Verlauf entsprechender Anstieg der Bakterien erkennbar. Die überwiegend gesunkenen Indikatorbakterienkonzentrationen im Wasser von Teich 2 im Vergleich zu Teich 1 (Coliforme: Faktor 2, E. coli: Faktor 5, Tabelle A 18) resultierten in einer Abnahme der bakteriellen Anreicherung (Coliforme und E. coli) in der Muschel (vgl. Tabelle 9 mit Tabelle 10). Dreissena zeigt so eine den Umgebungsverhältnissen angepasste Akkumulation von Bakterien. Eine Eigenschaft, die besonders für Verlaufskontrollen (Biomonitoring) sehr wichtig ist.

1,E+03 1,E+03 6,E+03 4,E+03 1,E+03 1,E+03 20 9,E+02 8,E+02 15 7,E+02 6,E+02 5,E+02 10 4,E+02

3,E+02 (°C) Temperatur 5 2,E+02

KBE bzw. MPN/g oder ml 1,E+02 0,E+00 0 Jul. 02 Jul. Jun. 02 Jun. 02 Sep. 03 Jan. Okt. 02 Dez. 02 Apr. 02 Mai. 02Mai. 03 Feb. Mrz. 03 Mrz. Mrz. 02 Mrz. 02 Mrz. Nov. 02 Nov. 02 Probennahme

Muschel Intest. Enterokokken Wasser Intest. Enterokokken Muschel Clostridien Wasser Clostridien Muschel Coliforme Wasser Coliforme Muschel E.coli Wasse r E.coli mittle re Te mpe ratur

Abbildung 18: Monitoring ausgewählter Bakterien im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der KA Rei Teich 2 67 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Bakteriophagen im Wasser und in Dreissena - Eluaten: Die Phagenfracht des Schönungsteichablaufes nahm im Vergleich zum Zulauf T 1 um die Hälfte ab. Dabei schwankten die Konzentrationen, wie schon im ersten Teich, um die Nachweisgrenze (Max.: 0,4 PFU/ml; Tabelle A 18). Eine objektive Reduktions- einschätzung lässt sich daher schwer realisieren.

Tabelle 10: Erfassung der durchschnittlichen Anreicherungsfaktoren in Dreissena polymorpha im Vergleich zum Wasser der KA Rei T2 KA Zulauf T2 (n=14) Bakterien- und Anreicherung Muschel: Phagennachweis Stabw Minimum Maximum Wasser (gemittelt) Koloniezahl bei 22°C 177 235 8 724 Koloniezahl bei 37°C 30 33 33 133 Enterokokken 22 35 34 134 Clostridien 0 0 0 0 Coliforme 16 13 13 47 E. coli 6 6 6 21 somatische Coliphagen 1.228 1.941 1.912 7.324 FRNA-Phagen 437 598 13 1.918 B. fragilis Phagen 3 5 3 19

Die Darstellung des Konzentrationsvergleiches der Phagen in Muschel und Wasser (Abbildung 19) zeigt erwartungsgemäß wesentlich höhere Werte im Muschelfleisch. Aufgrund der hohen Konzentrationsdifferenz sind die Ergebnisse der Wasserproben aus der Tabelle A 18 zu entnehmen. Am Expositionsort KA Rei T2 wurden die höchsten Anreicherungsfaktoren der drei Expositionsorte des Monitorings (Tabelle A 20 und Tabelle 10) erreicht. Im Unterschied zur Akkumulation der Bakterien wurden die Phagenwerte im Muschelfleisch trotz der niedrigen Konzentrationen in den Wasserproben gesteigert (Hyperakkumulation). Die Phagenakkumulation erfolgte in diesem Fall unverhältnismäßig zu den Umgebungswerten. Zu einem vergleichbaren Ergebnis im

Rahmen von Untersuchungen an FRNA Phagen kamen BURKHARDT UND CALCI (2000). Möglichkeiten zur Erklärung dieses Phänomens wurden schon unter Punkt 3.1.2.1 diskutiert.

68 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

2,E+03 9,E+02 20

8,E+02

7,E+02 15

l 6,E+02

5,E+02 10 4,E+02 PFU/g bzw. m bzw. PFU/g

3,E+02 Temperatur (°C) 5 2,E+02

1,E+02

0,E+00 0 Jul. 02 Jul. Jun. 02 Jun. 02 Sep. Jan. 03 Jan. Apr. 02 Apr. Dez. 02 Dez. 03 Feb. Okt. 02 Okt. Mai. 02 Nov. 02 Nov. 02 Nov. Mrz. 02 Mrz. 02 Mrz. 03 Probennahme Muschel, somatische Coliphagen Wasser, somatische Coliphagen Muschel, FRNA-Phagen Wasser, FRNA-Phagen Muschel, B. fragilis Phagen Wasser, B. fragilis Phagen mittlere Temperatur

Abbildung 19: Monitoring ausgewählter Bakteriophagen im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Wasser der KA Rei Teich 2

3.1.2.4 Korrelationen zwischen dem Nachweis mikrobieller Indikatoren im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha und im Umgebungswasser Aus praktikablen Gründen spielte die Frage nach gemeinsamen mikrobiellen Indikatoren für die Muschel- und Wasserproben eine wichtige Rolle. Die Anwendung des Hygienemonitors kann und sollte nicht auf dem in der Arbeit zugrunde liegenden breiten Nachweisspektrum, sondern nur auf wenigen, ausgewählten Indikatorkeimen basieren. Die Kriterien für die Beurteilung der Fäkalindikatoren wurden in der Einleitung eingehend beschrieben. Besonders E. coli, Intestinale Enterokokken, somatische Coliphagen und FRNA - Phagen erfüllen die Anforderungen an einen zuverlässigen Indikator. Die vorliegenden signifikanten Korrelationen (Tabelle A 21) beziehen sich auf die Zusammenhänge zwischen dem Vorkommen eines Mikroorganismus in der Muschel und im Wasser und dienen zur Beantwortung der Frage, ob der Hygieneindikator zuverlässig durch die Muschel angezeigt wird. Es wurden lineare Zusammenhänge mit dem Pearsonschen Korrelationskoeffizient (r) berechnet. Bei allen drei Expositionsorten waren

69 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

E. coli und Coliforme in Muschel und Wasser zuverlässig korreliert (r = 0,8). In der Elbe korrelierten zusätzlich noch die Enterokokkennachweise (r = 0,9). Der Nachweis der somatischen Coliphagen zeigten eine signifikante Korrelation (r = 0,8) zwischen Muschel und Wasser der KA Rei T 2. Für unsere spezielle Fragestellung kämen demnach E. coli, Coliforme, Enterokokken und die somatischen Coliphagen in Betracht. Das Keimspektrum entspricht den in der Studie von MARINO ET AL. (1995) empfohlenen mikrobiellen Nachweisen zur Beurteilung für Wasser- assoziierte Gesundheitsrisiken.

Im Gegensatz zu den Untersuchungen von LEGNANI ET AL. (1998) wurde eine signifikante Korrelation der FRNA Phagen aus den Muscheln zu den bakteriellen Indikatoren im Wasser gefunden. In der Elbe und in der KA Rei T 1 korrelierten die FRNA - Phagen mit E. coli. Die FRNA Phagen gelten auf Grund ihres humanspezifischen Charakters als geeignete Indikatoren für eine fäkale Verunreinigung (PANCORBO UND BARNHART, 1992). Die vorliegende Studie kann diese Feststellung für die genannten Gewässer bestätigen.

Abschließend kann ausgeführt werden, dass mit dem Einsatz der Dreikantmuschel ein integratives Biomonitoring in unterschiedlichen Gewässern zuverlässig durchführbar ist. Die dynamische Belastung der Gewässer mit ausgewählten Mikroorganismen wird durch die Dreikantmuschel mit hoher Sensitivität repräsentiert. E. coli, Coliforme, intestinale Enterokokken und somatischen Coliphagen können im Rahmen der hier nachgewiesenen Mikroorganismen als geeignete Hygieneindikatoren für das Muscheleluat bewertet werden.

3.1.3 Eliminations- und Akkumulationsverhalten der Muscheln im Batchversuch (in vitro)

Die Versuche hatten die Aufgabe, die Ergebnisse des Monitoring im Gewässer unter kontrollierten Laborbedingungen zu evaluieren. Einflussfaktoren, wie Temperatur, Sauerstoff und Wasserbewegung wurden in den Versuchen in stabilen Größenbereichen gehalten, die natürliche Wasserzusammensetzung blieb, außer der Zudosierung von Enterokokken und somatischer Coliphagen, unbeeinflusst. Der Schwerpunkt lag auf der Beurteilung des Muschelfilters und seiner Wirkung auf ausgewählte Mikroorganismen unter Einbeziehung verschiedener Kompartimente (Wasser, Partikel einschließlich Faeces und Pseudofaeces, vgl. Kapitel 2.4.5).

70 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

3.1.3.1 Entwicklung der Intestinalen Enterokken mit und ohne Filtrationstätigkeit der Muscheln Die Bewertung der Enterokokken unter Muschelfiltereinfluss ergab für den Aquarienversuch bei 20°C eine mittlere Reduktion von 77% in 24 h (Abbildung 20). Die geringe Standardabweichung lässt dabei auf einen stabilen und von den äußeren Bedingungen unabhängigen Muscheleinfluss schließen. Im Gegensatz dazu kam es im Muschel- freien Ansatz zu einem erheblichen Anstieg der Bakterien. Als Erklärung dieser Konzentrationssteigerungen muss einerseits die Vermehrung der Bakterien angeführt werden, andererseits ist auch ein Aufbrechen der Kokkenketten während der Analyse denkbar (DE MESQUITA ET AL., 1991). Da aber im vorliegenden Fall die Konzentrations- steigerungen vorrangig in den Wasserproben aus den Becken mit und ohne Muschelbesatz gemessen wurden und diese gleich behandelt wurden, sollte letzterer Effekt vernachlässigbar sein.

1500% v 1250% 1000% 750% 484% 500% 250% 23% 0% -61% -250% -77% Rate) derEnterokokkenkonzentration

Zu - und Abnahme (positive und negati und (positive Abnahme und - Zu -500% Becken mit Muscheln bei 20°C Becken ohne Muscheln bei 20°C Becken mit Muscheln bei 6°C Becken ohne Muscheln bei 6°C

Abbildung 20: Entwicklung der intestinalen Enterokokken in den Muscheln, im Umgebungswasser und von abfiltrierbaren Partikeln (n = 11) innerhalb 24 h

Daten aus anderen Studien über die Untersuchung von Reduktionsprozessen in Teilsystemen (Muschel, Wasser und Partikel) konnten in der vorliegenden Literaturrecherche als Vergleich nicht zu Rate gezogen werden. Die verfügbaren Angaben bezogen sich überwiegend auf die verringerten Konzentrationen im Muschelfleisch 71 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

und/oder im Wasser. So zeigten Untersuchungen von DE MESQUITA ET AL. (1991) bei kontrollierten Selbstreinigungsprozessen von Muscheln (Mytilus edulis), dass die größte bakterielle Reduktion im Muschelfleisch bei 5°C, 10°C und 15°C innerhalb von 24 h stattfindet. Innerhalb von 6,5 h fanden DORE UND LEES (1995) eine Reduktion von E. coli im Muschelfleisch um 90%. Im Vergleich zu diesem nur auf das Muschelfleisch bezogene Ergebnis, kann man von einer plausiblen Reduktionsrate (um 77% nach 24 h) im erfassten Gesamtsystem ausgehen. Die parallele Versuchsdurchführung bei 6°C zeigte ebenfalls eine deutliche Enterokokkenabnahme aus dem Muschelbeckensystem, jedoch um 16% vermindert (Abbildung 20). Auch deuten die geringen Standardabweichungen wiederum auf einen stabilen Muscheleinfluss hin. Die Abnahme ist der verminderten Muschelphysiologie bei 6°C zu zuschreiben, da saisonale Faktoren, vor allem die UV – Strahlung in den

Laborversuchen vernachlässigbar waren. Eine Studie von HERNROTH ET AL. (2002) bestätigt den Zusammenhang zwischen Temperatur und Inaktivierung der Bakterien in Muscheln und erläutert als diesbezügliche Grundlage die Inhibierung der für die Bakterienlyse verantwortlichen Hämozyten bei niedrigen Temperaturen. Die Beziehung zwischen der Temperatur und der Muschelaktivität im Rahmen der Monitoringergebnisse konnte durch die Batchversuche bestätigt werden. Der begleitende Blindansatz bei 6°C ergab, eine wenn auch abgeschwächte, Vermehrung der Kokken. Diese Entwicklung ist begleitet durch eine hohe Standardabweichung, so dass neben dem recht breiten Wachstumsoptimum von Enterokokken bei Temperaturen zwischen 10°C und 45°C (WEBER, 1997) vor allem die unterschiedliche Wasserbeschaffenheit in den Einzelversuchen als Ursache diskutiert werden müßte.

Die Akkumulationsfaktoren mit 278 für 20°C und 38 bei 6°C (Tabelle 11) bestätigen die temperaturabhängige Aufnahme der Bakterien in 24 h. Der gemittelt Wert für beide Temperaturbereiche (158) könnte die Verhältnisse in der warmen und kalten Jahreszeit simulieren und einen Vergleich mit dem Monitoring erlauben, in dem eine Spanne der Akkumulationsfaktoren in der Muschel im Bereich zwischen 11 bis 164 zu beobachten war. Die genannten Anreicherungsfaktoren sind vergleichbar mit Werten aus einer Übersicht in Prieur und Mevel (1990), deren Faktoren für Enterokokken einen Bereich von 125 – 250 umfassen.

72 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Tabelle 11: Akkumulationsfaktoren für Enterokokken in Dreissena polymorpha unter verschiedenen Temperaturbedingungen

Muschel, Muschel, Akku- Muschel, Muschel, Akku- 20°C 20°C mulation 6°C 6°C mulation (KBE/g) (KBE/g) 20°C (KBE/g) (KBE/g) 6°C

Versuchs t=0 t=24 t=24 t=0 t=24 t=24 Nr. 1 90 14 0 60 31 1 2 14 30 2 33 326 10 3 14 30 2 194 30 0 4 112 14 0 104 936 9 5 54 9.938 185 53 637 12 6 14 498 36 50 14.516 288 7 14 2.468 176 14 424 30 8 14 4.368 312 14 397 28 9 14 1.129 81 14 79 6 10 15 15.222 1.027 62 480 8 11 50 62.143 1.232 28 825 30 Mittel- 278 38 wert Stabw. 435 84

3.1.3.2 Entwicklung der PhiX 174 Coliphagen mit und ohne Filtrationstätigkeit der Muscheln Beim Studium der Coliphagen zeigt sich ein von den Enterokokken abweichendes Bild (Abbildung 21). Die Phageninaktivierung durch Selbstreinigung (Blindbecken) bei 20°C war innerhalb von 24 h größer (14%) als die Inaktivierung mit Muschelfiltrationsaktivität (5%). Betrachtet man die Standardabweichungen, so lässt sich ein deutlicher Entwicklungstrend nur hinsichtlich des Anstieges der PhiX 174 Phagen im Blindbecken bei 6°C feststellen. Im Vergleich dazu wurde die Höhe der Phagenpopulation im Muschelbecken (6°C) gebremst und ein Filtrationseffekt der Muschel sichtbar (unterdrückte Vermehrung: 37%). Im Versuch bei Zimmertemperatur wirkt der Muscheleinfluss eliminationsverzögernd.

73 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

100% Becken mit 80% Muscheln, 60% 20°C 39% 40% Becken ohne Muscheln, 20% 20°C 2% 0% Becken mit -5% Muscheln, -20% -14% 6°C

-40% Becken ohne Muscheln, -60% 6°C -80%

Abbildung 21: Entwicklung der somatischen Coliphagen (PhiX 174) in den Muscheln, im Umgebungswasser und von den abfiltrierbaren Partikeln (n = 9)

Der natürliche Phagenabbau ist stark von der Temperatur beeinflusst (TORRELLA ET AL., 2003). Der virale Selbstreinigungsprozess bei wärmeren Temperaturen ist höher als unter kalten Temperaturen. Diese Tatsache wurde bei der Auswertung des Monitoring ersichtlich und bestätigt sich durch die vorliegenden Ergebnisse (Blindbecken). Die Phagenzunahme bei 6°C ist damit nicht erklärbar, da selbst „low temperature“ Phagen keine Vermehrung unter 15°C zeigen (IAWPRC STUDY GROUP ON HEALTH RELATED WATER MICROBIOLOGY, 1991). Auch die in jüngster Zeit veröffentlichte Studie über vermehrungsbeeinflussende

Faktoren bei somatischen Coliphagen von MUNIESA UND JOFRE, 2004 schließt eine Phagenreplikation unter den Bedingungen im Wasser aus. Selbst ein Aufbrechen von Phagenaggregaten ist eher bei höheren Temperaturen als unter den diskutierten Bedingungen zu erwarten. Vergleichbare Phänomene konnten durch eine umfassende Literaturrecherche nicht gefunden bzw. evaluiert werden.

Der geringen Phagenreduktion aus dem System stehen die im Vergleich zu den bakteriellen Werten ca. 8-fach verringerten mittleren Akkumulationsfaktoren für Phagen gegenüber (Tabelle 12). Möglicherweise ist der Zeitraum von 24 h für die Beurteilung der Phagenakkumulation nicht ausreichend.

74 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Tabelle 12: Akkumulationsfaktoren für somatische Coliphagen in Dreissena polymorpha unter verschiedenen Temperaturbedingungen

Muschel, Muschel, Akku- Muschel, Muschel, Akku- 20°C 20°C mulation 6°C 6°C mulation (PFU/g) (PFU/g) 20°C (PFU/g) (PFU/g) 6°C

Versuchs t=0 t=24 t=24 t=0 t=24 t=24 Nr. 1 39 16 0 16 84 5 2 83 52 1 52 215 4 3 40 3.556 89 3.556 11.100 3 6 7 305 42 305 552 2 7 1 294 210 294 136 0 8 69 1.351 20 1.351 1.729 1 9 51 261 5 261 1.105 4 10 86 107 1 107 219 2 11 66 1.952 30 1.952 1.356 1 Mittel- 44 3 wert Stabw. 68 2

Bezug nehmend auf die bereits diskutierte verzögerte Abbaurate von Phagen in Schalentieren (3.1.2.1) könnte das Akkumulationsmaximum erst nach einem längeren Zeitraum erreicht werden und dadurch die hohen Anreicherungswerte des Monitoring erklären.

Die Ergebnisse der im Labor durchgeführten Batchversuche bestätigen die Daten des Monitoring hinsichtlich der Akkumulationsleistung des Muschelfilters für Bakterien am Beispiel der Enterokokken. Die Ansätze konnten darüber hinausgehend eine Elimination der Bakterien unter verschiedenen Temperatureinflüssen zeigen. Dabei bezieht sich die Reduktion der Enterokokken nicht nur auf das betreffende Umgebungswasser, sondern auch auf die Partikelfracht einschließlich der Faeces und Pseudofaeces. Somatische Coliphagen verhalten sich dagegen unter den beschriebenen Bedingungen grundsätzlich anders als Bakterien. Der Umfang der Akkumulation der Phagen war innerhalb von 24 h geringer als der von Bakterien, was vor allem durch eine geringe bzw. verzögerte Eliminationsleistung reflektiert wurde. Die hohen Akkumulationswerte aus den

75 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Feldversuchen des Monitoring konnten unter Laborbedingungen nicht bestätigt werden. Zur Erklärung dieses differierenden Sachverhaltes wären möglicherweise Daten über eine autochthone Phagenpopulation der Muscheln hilfreich.

3.1.4 Untersuchungen zur Sedimentbelastung unter dem Muschelfilter (in situ)

Gewässersedimente werden in besonderem Maße durch den stofflichen Austausch mit dem Freiwasser an der Sediment – Wasser – Kontaktzone charakterisiert. Im Wasser befindliche Schwebstoffe sedimentieren je nach Größe und Form unterschiedlich. Mehrere

Studien, zitiert in SHIARIS ET AL. (1987), berichten, dass bakterielle Fäkalindikatoren in Gezeiten- und Süßwassersedimenten um in 2 – 4 fach höheren Konzentrationen vorkommen als im Freiwasser. Durch ihre hohen Filtrationsraten und der damit verbundenen Pseudofaeces- und Faecesproduktion trägt Dreissena polymorpha zur Deposition partikulären Materials bei und beeinflusst maßgeblich sowohl die

Sedimentationsrate als auch die Sedimentcharakteristik (PRIEUR UND MEVEL, 1990). Die Fragestellung, ob mit der verstärkten Sedimentbildung unter dem Muschelfilter auch eine erhöhte Belastung mit hygienerelevanten Keimen verbunden ist, ist in Hinblick auf eine verfahrenstechnischen Realisierung des Muschelfilters von besonderer Bedeutung.

Die Enterokokkenkonzentrationen im Sedimentrückhalt des Muschelfilters waren im Mittel mehr als doppelt so hoch als im Kontrollsediment (Abbildung 22). Die hohe Standardabweichung deutet jedoch an, dass kein eindeutiger Trend vorliegt. 4,5E+04 4,0E+04

) 3,5E+04 3,0E+04 2,5E+04 2,0E+04 1,5E+04 Enterokokken (KBE/ml Enterokokken 1,0E+04

5,0E+03

0,0E+00 Probenmaterial M uschelsediment Kontrollsediment

Abbildung 22: Enterokokkenbelastung von Elbesedimenten mit und ohne Muscheleinfluss (n = 6) 76 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Mit Blick auf die Einzelergebnisse (Tabelle A 26) ist zu erkennen, dass der Mittelwert des Muschelsediments durch einen Maximalwert von 69.000 KBE/g (30.07.02, Lufttemperatur: 29°C, Wassertemperatur: 24°C!) bestimmt wurde und bei der Hälfte der Vergleichsproben das Kontrollsediment vermehrt mit Enterokokken belastet war.

Der Vorgang der bakteriellen Kolonisation sedimentierter Faeces erfolgt sehr schnell (Max.: < 2 Tage). Durch Bakterien, die den Verdauungsprozess der Muschel überlebt haben und sich weiter vermehren, wird dabei die Besiedlungsgeschwindigkeit beeinflusst

(PRIEUR UND MEVEL, 1990). Findet der passagierte Bakterienanteil anschließend gute Substrat- und Temperaturbedingungen vor (siehe Probe vom 30.07.02) kann eine Vermehrung im oben genannten Umfang eintreten. Die Tendenz der Phagenkonzentrationen zeigt eine geringfügig höhere Präsenz im Muschelsediment (Abbildung 23). Eine objektive Beurteilung der Phagensituation in den Sedimenten wird durch die niedrigen Konzentrationen (Tabelle A 27 und Tabelle A 28) stark eingeschränkt. Die geringen Konzentrationsdifferenzen von 3 bzw. 4 PFU/g zwischen dem Muschel- und Blindsediment können nicht gesichert der Muschelausscheidung zugeordnet werden.

5,E+00 8,E+00

5,E+00 7,E+00 4,E+00 ) 6,E+00 4,E+00 5,E+00 3,E+00 3,E+00 4,E+00

2,E+00 3,E+00 2,E+00 FRNA Phagen (PFU/g Phagen FRNA 2,E+00 1,E+00 somatische Coliphagen (PFU/g) Coliphagen somatische 1,E+00 5,E-01 0,E+00 0,E+00 Probenmaterial Probenmaterial

Muschelsediment Kontrollsediment Muschelsediment Kontrollsediment

Abbildung 23: Konzentration der somatischer Bakteriophagen in Elbesedimenten mit und ohne Muscheleinfluss (n = 6)

In einer Studie von PAYMENT ET AL. (1988) wurden Viren (Phagen) im Flusswasser auf ihre Adsorptionsfähigkeit an Schwebstoffe untersucht. Es wurde festgestellt, dass virale Partikel überwiegend frei oder assoziiert an Partikel mit einem Durchmesser < 0,25 μm

77 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

vorkommen. In der vorliegenden Studie wurden Partikel dieser Größenordnungen wahrscheinlich nicht erfasst. Zusätzlich erschwerend kommt hinzu, dass bereits die Ausgangsbelastung des Elbewassers mit Phagen sehr niedrig war (vgl. Monitoring- ergebnisse der Elbe). Geht man von den sehr hohen Anreicherungsfaktoren in den Muscheln aus, erscheint es ebenfalls möglich, dass die Phagen nicht über die Faeces abgegeben werden. REEDERS UND BIJ DE VAATE (1992) zeigten, dass über 90% des Sedimentes, das von Dreikantmuscheln produziert wurde, aus Pseudofaeces bestand und nur ein geringer Anteil durch echte Faeces beeinflusst war. Phagen sind als Futterpartikel für die Muscheln nicht relevant und könnten daher auch über den Reinigungsprozess der Muscheln (Pseudofaeces) sedimentiert werden. Trotz der Einschränkungen zeigten die Versuchsergebnisse der durch Faeces und Pseudofaeces beeinflussten Sedimente eine erhöhte mikrobielle Belastung. Eine hygienische Relevanz ergibt sich aus der Beschaffenheit des Sedimentes. Aufgrund der feineren und gelockerten Sedimentstruktur unter dem Muschelbett, besteht bei der Aufwirbelung durch Turbulenzen die Gefahr der Wiederverkeimung der Freiwassers. Mittel- und Langfristig wird das reichhaltige organische Material durch Bakterien mineralisiert und steht als Elementarressource für Primärkonsumenten wieder zur Verfügung. Primärkonsumenten im Gewässer sind vorrangig Algen. Da jedoch weder eine

übermäßige Algenblüte (ASMUS UND ASMUS, 1991), noch eine Indikatorkeimmobilisierung in den Gewässern erwünscht sind, sollte ist im Rahmen der technologischen Umsetzung des Muschelfilters eine kontinuierliche Sedimentüberwachung und ggf. -entsorgung realisiert werden.

3.2 Molekularbiologische Analytik

3.2.1 16S rDNA Klonbank vom Verdauungstrakt der Muscheln und dem korrespondierenden Wasser

In einer Vielzahl von Studien, zusammengefasst in PRIEUR UND MEVEL (1990), wurde gezeigt, dass mit der höchsten Konzentration von Bakterien im Verdauungstrakt der Muschel zu rechnen ist. Die Durchführung der Diversitätsstudie erfolgte daher mit Gewebe des Magen – Darmtraktes der Muscheln. Im Vordergrund stand die Fragestellung, in welchen Maße das bakterielle Spektrum über die untersuchten Indikatorkeimgruppen hinausgehen kann und wie sich die jeweiligen Gattungen prozentual verteilen.

78 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Möglicherweise lassen sich zusätzlich Rückschlüsse auf die authochtone Bakterienflora der Muschel treffen. Die 16S rRNA Gene sind Teil eines rrn Operons, welches am 5’ Terminus lokalisiert ist. Spacer separieren die Gene und beinhalten z. T. Gene für die transfer RNA. Während der Translation wird die prä-rRNA in eine Tertiär- und Quartiärstruktur gefaltet. Diese Strukturen sind Voraussetzung für die RNA Reifung. Die RNA und ribosomale Proteine bilden schließlich zwei ribosomale Untereinheiten. Die schmale 30S Untereinheit beinhaltet die 16S rRNA und die Sequenzen für 21 Proteine und die größere 50S Untereinheit umfasst die 23S rRNA, die 5S rRNA und die Sequenz für 32 Proteine

(STACKEBRANDT, 2001). Durch ihre besonderen Eigenschaften gilt die 16S rRNA und ihre Gene als der am besten untersuchteste phylogenetische Marker: - die Gene der 16S rDNA sind in allen zellulären Lebensformen gegenwärtig, - die Primärstruktur ist eine alternierende, unveränderliche Sequenz und die Funktion der Ribosomen hat sich seit 3,8 Billionen Jahren nicht verändert, - konservierte Bereiche in Kombination mit hochvariablen Regionen,

- horizontaler Gentransfer konnte bis jetzt nicht festgestellt werden (STACKEBRANDT, 2001).

Eine Fülle von Biodiversitätsstudien, basierend auf dem RNA Leitbild in verschiedensten Ökosystemen, führte in den letzten Jahren zu einem rasanten Anstieg von potentiell neuen

Spezies (ca. 200 Spezies pro Jahr) in der bakteriellen Systematik (STACKEBRANDT, 2003). Diese Entwicklung wurde in den letzten Jahren zunehmend kritischer betrachtet und insbesondere durch Methodenkombinationen evaluiert. Als Richtlinie für Bakterienstämme einer Art gilt gegenwärtig die DNA : DNA Reassoziation von ≥ 70%, die mit einer mindestens 96%igen Homologie bei der Sequenzanalyse korrespondiert (STACKEBRANDT, 2003). Die Problematik für Sequenzanalysen im Umweltbereich beruht auf dem Primerdesign. Die Oligonukleotide basieren auf einem für umweltrelevante Organismen begrenzten Datenumfang. Beim Sequenzvergleich resultiert daraus ein hoher Anteil von Sequenzhomologien die weniger als 96% erreichen. Die Auswertung der vorliegenden Klonbanken (Tabelle A 29) erfolgte auf der Stammesebene (≥ 80% - 100% Homologie). Damit konnte eine große Klonanzahl in die phylogenetische Verteilung einbezogen werden. Die beiden Muschelklonbanken (Muschel I und II) wurden zusammengefasst und dem Ergebnis der Klonbank des Wassers

79 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

gegenübergestellt (Abbildung 24). Die Diskussion der Ergebnisse erfolgte im Rahmen der gegebenen methodischen Möglichkeiten und mit ihren diskutierten Grenzen. Sie ermöglichen aber in jedem Falle einen Blick auf Tendenzen.

Klonbanken (n = 102 + n = 90), Klonbank (n = 88), Verdauungstrakt von Dreissena polymorpha Umgebungswasser

environmental

1% group 23% Actinobacteria 32% 38% 42% Proteobacteria

14% Firmicutes

15% 1% 10% Bacteroidetes 24%

Abbildung 24: Phylogenetische Einordnung der 16S rDNA Sequenzen korrespondierender Muschel- und Wasserproben

Alle Klone, sowohl der Muscheln als auch des Wassers, konnten in fünf Bakterienstämme eingeordnet werden (Actinobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes „environmental group“). Trotz gleicher Präsenz in Muschel und Wasser differierten die Anteile der Bakterienstämme zwischen Muschel und Wasser zum Teil beträchtlich. Besonders auffallend sind der hohe Bacteroidetes-Anteil im Wasser (38%) im Gegensatz zur Muschel (1%) und die Firmicutes mit 32% in der Muschel und 1% im Wasser. Firmicutes (grampositive Bakterien) konnten im Wasser nur in sehr geringen Umfang nachgewiesen werden. Der hohe Firmicutes-Anteil im Muschelfleisch wurde durch Mycoplasmen (Tabelle A 29) dominiert, die mit ihren zellparasitären Eigenschaften möglicherweise eine Nische in der Muschel nutzen. Die Möglichkeit, dass Mycoplasmen

Schalentiere als alternativen Wirt nutzen wurde bereits durch HARSHBARGER UND CHANG (1977) formuliert. Bisherige Untersuchungen zur Flora der Muscheln basierten zumeist auf kulturellen Nachweismethoden, daher könnten die Firmicutes aufgrund ihrer Kulturansprüche und der umfangreichen Begleitfora in Muscheln unterrepräsentiert sein. Es gibt Reporte über ein vermehrtes Vorkommen Gram-positiver Bakterien auf der Haut und Schleimhaut von Meeressäugern, die die Vermutung der Besiedlung sehr spezifischer 80 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Habitate unterstützt (ORTIGOSA ET AL., 1997). Übereinstimmend mit SUGITA ET AL. (1981) zitiert in PRIEUR UND MEVEL (1990) konnten Bacteroidetes (strikt anaerobe Bakterien) in den Muscheln nur mit einem sehr geringen Anteil nachgewiesen werden.

Diese und weitere Autoren (; KUEH UND CHAN, 1985; PUJALTE ET AL., 1999; ROMERO ET

AL., 2002) benannten durch molekulare und / oder kulturelle Untersuchungen mit Aeromonas, Pseudomonas, Moraxella, Micrococcus und Vibrio fünf aerobe oder fakultativ anaerobe Bakteriengattungen, die in Muscheln dominant vorkommen. Alle Bakterien lassen sich in die auch hier gefundenen Stämme einordnen, wurden aber als Gattung selbst kaum detektiert (Tabelle A 29). An dieser Stelle muss daraufhin gewiesen werden, dass verfügbare Literaturangaben ausschließlich auf marinen Ökosystemen basieren und daher davon ausgegangen werden muss, dass im Süßwasser ein davon differierendes authochtones Bakterienspektrum in der Muschel resultiert. Die bakterielle Flora von Schalentieren wird von der umgebenden Mikroflora beeinflusst

(PRIEUR UND MEVEL, 1990). Mit dem Ergebnis des vorliegenden Klonbankenvergleichs kann dieser Zusammenhang bestätigt werden. Darüber hinaus lassen sich Rückschlüsse über eine authochtone Firmicutes – Flora in Dreissena polymorpha ziehen, die zu Lasten der Bacteroidetes – Arten zu finden sind.

3.2.2 Nachweis von Legionellen in Muscheln und Wasser

Legionellen kommen an aquatischen Standorten und im Boden in großer Artenvielfalt vor

(MUDER UND YU, 2002). Die besondere hygienische Relevanz dieser Gattung führte zur Erweiterung des bakteriellen Nachweisspektrums im Monitoring von Dreissena polymorpha und ihrem Umgebungswassers.

3.2.2.1 PCR - Nachweis der Legionellen in Muscheleluaten der Monitoringproben PCR Produkte von Legionellen wurden an allen Expositionsorten nachgewiesen. Die Detektion erfolgte bei Proben der Elbe und Reichenau T1 überwiegend durch die seminested PCR, in drei Proben von Muscheln aus dem Ablaufbereich des zweiten Teiches und in fünf Proben des Waldbades Langebrück waren bereits die ersten Amplifikate positiv (Tabelle A 32).

81 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

100% 86% Elbe (n=16) 73% 75% 63% 60% KA Rei T1 (n=15)

50% KA Rei T2 (n=14) positive Proben positive 25% Bad Langebrück (n = 11) 0% Expositionsorte

Abbildung 25: Anteil der Legionellen Amplifikate in den Muscheleluaten des Monitoring

Insgesamt waren 70% aller untersuchten Muscheln mit Legionellen kontaminiert. Die Sequenzierung der Amplifikate ergab Homologien von 96% bis 99% und konnte bis auf die Speziesebene erfolgen. Die Muscheln des Teiches 2 in Reichenau zeigten die höchste Kontamination mit 86% im Vergleich zum Waldbad Langebrück (73%), zur Elbe mit 63% und dem Teich 1 mit 60% (Abbildung 25). Besonders in Hinblick auf eine Verbesserung der hygienischen Wasserbeschaffenheit durch Schönungsteiche ist das Ergebnis des qualitativen Belastungsanstieges im Ablaufteich 2 ein Achtungszeichen. Fragen zu ökologischen Faktoren über Vermehrung und Persistenz von Legionellen bekommen einen hohen Stellenwert. Die Gewässercharakteristik des zweiten Schönungsteiches, dominiert durch einen flachen Wasserkörper und einem hohen Schlammanteil (Tabelle A 1), könnte das Risiko zusätzlich begünstigen. Legionellen leben fakultativ intrazellulär in Protozoen. Frei lebende Amöben gelten als wichtigster Faktor bei der Transmission von Legionellen. Sie nutzen vor allem Nahrung in der Sediment – Wasser – Kontaktzone (Bakterien, Pilze,

Algen; ETTINGER ET AL., 2003). Mit seinem Verlandungscharakter stellt der zweite Schönungsteich ideale Bedingungen für die Nahrungsgrundlage (Bakterien) Konsumenten (Protozoen) dar. Ein weiterer begünstigender Faktor für die Protozoen ist ihre Thermotoleranz. Gerade flache Gewässer erwärmen sich im Sommer schnell und die Toleranz der Amöben wird zum Selektionsvorteil für die in ihr lebenden Bakterien (z.B. Legionellen).

82 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Hygienische Relevanz zeigt auch das Ergebnis mit 73% Legionellen-positiver Nachweise im Eluat der im Naturbad Langebrück exponierten Muscheln. Da die Muscheln zum Zeitpunkt des Besatzes nicht mit Legionellen kontaminiert waren (vgl. Tabelle A 32, 13.05.2003) können die positiven Ergebnisse nur durch die Aufnahme von Legionellen durch die Muschel resultieren. Die Aufnahme der Erreger durch den Menschen erfolgt in der Regel durch die Inhalation eines infektiösen Aerosols. Auch eine direkte Aufnahme der

Erreger durch die Atemwege (Mikroaspiration) ist möglich (ROBERT KOCH - INSTITUT,

2003). Sowohl die Entstehung von Aerosolen, als auch das Wasserschlucken durch die Badenden sind während eines Besuches im Freibad nicht auszuschließen. Über die bekannten Infektionsquellen (künstliche Wassersysteme in Hotels, Krankenhäuser) hinausgehend sollten die vorliegenden Ergebnisse aus dem Naturbad auch auf weniger bekannte Erregerquellen aufmerksam machen.

3.2.2.2 Vergleichsstudie zum Nachweis der Legionellen (PCR) in Muscheleluaten und in konzentrierten Wasserproben Legionellen wurden in allen Muscheleluaten und ihren korrespondierenden Wasserproben nachgewiesen (Tabelle 13). Hierbei gingen positive Befunde im Wasser mit positiven Ergebnissen im Muscheleluat einher. Alle Expositionsgewässer waren während des Untersuchungszeitraumes kontinuierlich mit Legionellen belastet. Die Indikatorfunktion der Muschel für Legionellen kann bestätigt werden.

Tabelle 13: PCR - Nachweis von Legionellen im Muscheleluat und Umgebungswasser

1. seminested 1. seminested Datum Ort Amplifikation PCR Amplifikation PCR Muschel Muschel Wasser Wasser 10.04.03 Rei T2 negativ positiv # # 15.04.03 Elbe positiv positiv # # 24.04.03 Rei T1 positiv positiv negativ positiv 02.05.03 Rei T2 negativ positiv # # 08.05.03 Elbe negativ positiv negativ positiv 15.05.03 Rei T1 positiv positiv positiv positiv 19.05.03 Rei T2 positiv positiv positiv positiv 26.05.03 Elbe negativ positiv negativ positiv

83 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

weiter Tabelle 13: PCR - Nachweis von Legionellen im Muscheleluat und Umgebungswasser 1. seminested 1. seminested Datum Ort Amplifikation PCR Amplifikation PCR Muschel Muschel Wasser Wasser 05.06.03 Rei T1 positiv positiv positiv positiv 11.06.03 Rei T2 positiv positiv positiv positiv 19.06.03 Elbe positiv positiv positiv positiv 25.06.03 Rei T1 positiv positiv positiv positiv 02.07.03 Rei T2 positiv positiv positiv positiv 07.07.03 Elbe positiv positiv positiv positiv 16.07.03 Rei T1 positiv positiv positiv positiv 23.07.03 Rei T2 positiv positiv positiv positiv

Die Sensitivitätsgrenzen des PCR – Nachweis für Legionellen sind in der Abbildung 26 dargestellt. Im ersten Teil des Gelbildes wurde das legionellenspezifische PCR - Produkt der 1. Amplifikation bis zur Verdünnungstufe 10-3 nachgewiesen. Die nachfolgenden Verdünnungen blieben negativ.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

bp 1000

500

100

M – 1 kp Marker 5 – 1,6x102 KBE (nested-PCR) 1 – 1,6x106 KBE (1. Amplifikation) 6 – 1,6x101 KBE (nested-PCR) 2 – 1,6x105 KBE (1. Amplifikation) 7 – 1,6x100 KBE (nested-PCR) 3 – 1,6x104 KBE (1. Amplifikation) 8 – Positivkontrolle (L. pneumophila Typ Corby) 4 – 1,6x103 KBE (1. Amplifikation) 9 – H O 2

Abbildung 26: Gelelektrophorese zur Bestimmung der Sensitivitätsgrenzen der 1. PCR und nested PCR von Legionellen

84 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Für die PCR – NWG der 1. Amplifikation entspricht das einer Anzahl von ca. 1,6 x 103 KBE. Die DNA der folgenden Verdünnungen (10-4 – 10-6) wurden in der seminested PCR eingesetzt und markierten im Gel die Positionen 5 bis 7. Die NWG der seminested PCR lag mit dem letzten Signal bei 10-5, was einer Zahl von ca. 16 KBE Legionellen entspricht.

Bezogen auf die Ergebnisse der Vergleichsstudie kann davon ausgegangen werden, dass in 200 μl der Muschel- und Wasserproben ≥ 10 KBE vorhanden waren. Wird die Berechnung unter Einbeziehung des Muschelgewichtes weitergeführt, befanden sich in einer Muschel (Ø 15 mm; 0,2 g) 27 KBE Legionellen bzw. in 1 g Muschelfleisch 135 KBE. Ein Milliliter der unkonzentrierten Wasserprobe wäre unter den gegebenen Daten mit 50 KBE von Legionellen belastet. Die Berechnungstheorie ist sowohl von Seiten der kulturellen Anzucht als auch vom PCR Verfahren einzuschränken und soll nur als Orientierung dienen. Die Erfassung der Legionellen im kulturellen Nachweis wird immer auf Grund spezifischer Nährstoffansprüche, Begleitfora und langer Generationszeiten limitiert sein.

Durch einen Methodenvergleich fanden PALMER ET AL. (1995) in der Anzucht um den Faktor 20 verringerte Werte als im PCR Nachweis. Bei dem PCR – Verfahren gilt zu berücksichtigen, dass möglicherweise auch Nukleinsäure amplifiziert wird, die nicht mit infektiösen Zellen korrespondiert, woraus höhere Ergebnisse resultieren können. Durch inhibierende Stoffe im Ansatz sind im Gegensatz auch falsch – negative Ergebnisse möglich.

3.2.2.3 16S rDNA Klonbank für den Genus Legionellacea von Muscheleluat- und Wasserkonzentratproben Auf Grund der hohen Legionellenbelastung wurden DNA Extrakte aus dem Schönungsteich 2 der KA Reichenau für die phylogenetische Untersuchung ausgewählt. Mit 12 (Muschel) und 10 (Wasser) verschiedenen Legionellen – Arten präsentierte sich ein breites phylogenetisches Spektrum (Tabelle A 33 und Tabelle A 34).

Die Verteilung der Arten im Muschelfleisch und im Umgebungswasser (Abbildung 27) verhielt sich sehr ähnlich und ergab eine Dominanz der Spezies Legionella pneumophila subsp. pascullei (Serogruppe 3) mit 32% und 34%, Legionella donaldsonii mit 18% und 28% sowie Legionella worsleiensis (16% und 12%).

85 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Klonbank Muschel (n=50) Klonbank Wasser (n=50)

2%2% 2% 2% 8% 4% 2% 4% 4% 2% 32% 2% 4% 34% 4%

6%

12%

12%

16% 18% 28%

Legionella pneumophila subsp. pascullei Legionella donaldsonii Legionella worsleiensis Legionella sp. Fluoribacter bozemanae Legionella busanensis Legionella pneumophila Legionella-like amoebal pathogen 2 Legionella rubrilucens Legionella londiniensis Legionella adelaidensis Legionella cincinnatiensis Legionella cherrii uncultured bacterium Legionella lytica

Abbildung 27: 16S rDNA Klonbanken für den Genus Legionella

Nach MUDER UND YU (2002) werden in gleicher Umgebung die Spezies L. pneumophila zusammen mit anderen Legionella – Arten gefunden. Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen diese Gegebenheit sowohl in der Muschel, als auch im Wasser. Das Krankheitsbild der Legionellose ist in über 90% mit dem Erreger Legionella pneumophila assoziiert (DOLEANS ET AL., 2004). Legionella pneumophila wird sowohl in

Klinik-, als auch in Umweltproben am häufigsten nachgewiesen (MUDER UND YU, 2002;

DOLEANS ET AL., 2004). Daneben können auch sogenannte non – pneumophila Legionella Spezies, vor allem für Menschen mit einem defekten Immunstatus, eine Gefährdung darstellen (MUDER UND YU, 2002). Analog zu den Studienergebnisse von PALMER ET AL. (1995), zeigen die vorliegenden Untersuchungen, dass Abwasserbehandlungsanlagen ein Reservoir für Legionella spp. in der Umwelt darstellen.

86 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

3.2.3 Nachweis Stx - Gen tragender Bakteriophagen in Muscheln und Wasser

Stx – Gene wurden direkt von einem Phagenassay ausgehend in einer Multiplex PCR nachgewiesen. Das Probenmaterial (Muscheleluat und angereichertes Wasser) wurde hierbei ohne Vorbehandlung (z. B. Filtration zum entfernen von Bakterien) in den Doppellayer – Ansatz, analog zum Phagennachweises nach ISO eingesetzt. Ein weiterer Vorteil dieser Methode liegt in der Umgehung der Phagenanzucht aus dem Probenmaterial durch eine ü. N. Flüssigkultur, z. B. in der Studie von MUNIESA UND JOFRE (1998). Der Stx Gennachweis in den Phagen des Wirtes E. coli O157:H7 ATCC 43.888 erfolgte unter Mitführung einer Positivkontrolle (E. coli Serovar O157:H7 EDL 933, Abbildung 28) und ergab ein schnelles und zuverlässiges Testergebnis.

M 1 2

bp 1000

500 317 bp 100 166 bp

M: Marker (1kb)

1: Stx1 (Stamm E. coli O157:H7 EDL 933) 2: Stx (Stamm E. coli O157:H7 EDL 933) 2

Abbildung 28: Nachweis des Stx1 und Stx2 Genes in E. coli O157:H7 EDL 933 (Positivkontrolle)

Die im Gelbild der Produkte der nested PCR (Abbildung 29) abgebildeten Banden zeigen exemplarisch für die getesteten Plaques auf E. coli ATCC 43.888 positive Genprodukte in den Untersuchungsproben. Im ersten Bildteil wurden die Proben 3 und 12 positiv für Stx1 und im zweiten Bildteil die Plaques 3, 4, 10 und 12 positiv auf Stx2 getestet. In den Proben 3 und 12 kamen beide Gentypen gleichzeitig vor.

87 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617 M 1 2 3 4 5 6 7 8 91011121314151617

bp

1000 500

Stx 1 Stx 2 (317 bp) (166 bp) M: Marker (1kb) 1: Positivkontrolle (E. coli O157:H7 EDL933) 2 bis 16: PCR Produkte aus Phagen auf E. coli O157:H7 ATCC 43.888

17: Negativkontrolle H2O

Abbildung 29: Stx1, 2 nested PCR Nachweis in Phagen von Wasserproben

Mit den designten Primern konnten beide Stx Gene mit klarer Abtrennung voneinander in einer PCR nachgewiesen werden. Die Sequenzierung der Amplifikate positiver Plaques erfolgte anteilig für 6 von 14 PCR - Produkten (43%) des Stx1 Genes und für 35

Amplifikate von 133 positiv auf das Stx2 Gen getesteten Plaques (26%). Alle Sequenzierergebnisse konnten den Nachweis der Stx – Gene mit einer Homologie von 100% zu bekannten Sequenzen bestätigen (Accession Nr.: M 19473 und X07865, EMBL Genbank).

Die verschiedenen Gewässertypen zeigten unterschiedliche Resultate, besonders hinsichtlich der Konzentrationsverhältnisse von somatischen Coliphagen (Wirt E. coli C) und der Phagen, die E. coli O157:H7 infizieren (Tabelle 14). Die Coliphagen des E. coli Serovar O157:H7 lagen eine bis zwei Zehnerpotenzen unter der Konzentration der somatischen Coliphagen. Dass Stx Gen tragende Coliphagen im Abwasser häufig vorkommen, ist bereits mehrfach beschrieben worden (Muniesa und Jofre, 1998; Tanji et al., 2002; Tanji et al., 2003). Der hohe Anteil der E. coli O157:H7 infizierenden Phagen in der Elbe mit 7,4% (Tabelle 14) war im Vergleich zu den Roh- bzw. gereinigten Abwasserproben erstaunlich.

88 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Tabelle 14: Screening Stx- Gen tragender Coliphagen Anteile (gemittelt) der Stx Mittelwerte Gene in den Phagen von E. coli O157:H7 Verhältnis der Coliphagen auf Expositions- somatische Coliphagen E.coli ort Coliphagen (PFU/ml), O157:H7 zu Stx1 Stx2 Stx 1 + 2 (PFU/ml), E.coli den (%) (%) (%) Wirt E.coli C O157:H7 somatischen Coliphagen (%) Elbe 1,6 0,1 7,4 3,6 7,5 2,1 (n=8) KA Rei Zulauf 1281,8 12,9 1,0 0,7 15,9 0,9 (n=9) KA Rei Ablauf 2,3 0,0 0,5 0,0 4,1 0,0 (n=8)

In einer Studie von MUNIESA ET AL. (1999) wurde ebenfalls ein Fließgewässer untersucht. Das Verhältnis der Phagentypen war ebenfalls durch die Differenz um eine Zehnerpotenz charakterisiert. Der Anteil der E. coli O157:H7 infizierenden Phagen erreichte jedoch nur 1,8% (eigene Berechung aus Daten der Literaturquelle) und liegt deutlich tiefer als das vorliegende Elbe – Ergebnis. Mit 1,2 x 103 PFU/ml lagen die somatischen Coliphagen im Rohabwasser zwei Zehnerpotenzen höher als die E. coli O157:H7 infizierenden Phagen.

Damit ist das Phagenverhältnis mit den Daten von MUNIESA UND JOFRE (1998) vergleichbar. In allen Untersuchungsgewässern dominierte der Nachweis der Stx2 Gene (Abbildung 30). Das Vorkommen dieses Toxins korreliert mit einer möglichen Auslösung der schweren Verlaufsform HUS. Stx1 + 2 Gene in Phagen wurden in der Elbe und im Zulauf der KA Rei nachgewiesen.

89 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

14,0

12,0 Stx1,2

10,0

8,0 Stx2 6,0

4,0 auf E. coli O157:H7 coli E. auf 2,0 Stx1

0,0

Anteile der Stx1, 2 Gene in den Phagen den in 2 Gene Stx1, der Anteile Elbe KA Rei Zulauf KA Rei Ablauf

Proben

Abbildung 30: Verteilung der Stx- Gene in den Coliphagen auf E. coli O157:H7

Die Untersuchung von Muscheleluaten (n = 24) ergab lediglich in einer Probe einen positiven Stx1 + 2 Gennachweis (Tabelle A 35, 02.09.02, KA Ablauf). Wenn man davon ausgeht, dass es bei der Aufnahme der Phagen durch die Muschel keine erheblichen Unterschiede zu anderen Phagentypen (z.B. somatische Coliphagen) gibt, zeigen Coliphagen, die das Stx Gen tragen, möglicherweise eine geringere Widerstandsfähigkeit im Verdauungsprozess der Muschel als andere Coliphagen. Der Einsatz der Muscheln als Indikator für diese speziellen Phagen muss negativ beurteilt werden. Bei dieser Einschätzung sollte der positive Effekt der Filtration von Bakterien (evtl. infiziert mit Stx - Gen tragenden Phagen, EHEC) nicht in den Hintergrund treten. Zukünftige Untersuchungen zum Nachweis von EHEC in Dreissena polymorpha könnten diesen Sachverhalt konkretisieren. Freie Phagen, die E. coli O157:H7 infizieren und Stx Gene tragen, persistieren sehr erfolgreich im Wasser und zeigen sogar eine höhere Resistenz gegenüber Chlorierung und

Wärmebehandlung als ihr Wirtsbakterium (MUNIESA ET AL., 1999). Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen, dass neben dem Abwasser auch Oberflächenwasser ein Reservoir für bakterielle Virulenzfaktoren darstellt.

90 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

3.2.4 Nachweis von enteralen Viren (Adenoviridae, Picornaviridae) in Muscheln und Wasser

Aus der Gruppe der enteraler Viren gelten Adenoviren und Enteroviren in Gewässern als vorherrschend nachweisbar (Lee et al., 2004; Lee und Jeong, 2004). Muscheln akkumulieren die Viren passiv (partikelgebunden) und vorrangig im Verdauungstrakt

(MUNIAIN-MUJIKA ET AL., 2002). Die Autoren BEURET ET AL. (2003) rezensierten Zusammenhänge zwischen der Mucusproduktion und der Virenakkumulation. Demnach ist die erfolgreiche Virenaufnahme an die Ionenbindung zwischen den Viruspartikeln und dem Mucupolysacchararid gebunden. Die Menge der Mucusproduktion ist vom Glycogengehalt des Bindegewebes abhängig. Der Glycogengehalt ist z. B. bei Austern zwischen November und März am höchsten, so dass in diesem Zeitraum, seitens der Muscheln, von einer hohen Virenaufnahme ausgegangen werden kann. Der Probenamezeitraum der vorliegenden Arbeit entsprach dieser Jahreszeit.

3.2.4.1 Die Gattung Mastadenovirus Adenoviren werden gegenüber anderen enteralen Viren als besonders umweltresistent beurteilt (VAN HEERDEN ET AL., 2003; JIANG UND CHU, 2004) und galten daher für den Nachweis in der Dreikantmuschel als sehr geeignet. Die nested PCR der unverdünnten DNA Proben ergab in drei von sieben der in KA Rei T1 exponierten Muscheln ein positives Ergebnis. In Muscheln der Elbe und im Ablauf von Teich 2 war der Virennachweis negativ (Tabelle 15).

Tabelle 15: Anteil der Adenoviren in den Muschelproben Elbe KA Rei T1 KA Rei T2

(n = 7) (n = 7) (n = 7) Virus - positiver 0 43 0 Probenanteil (%)

Die Sequenzierung der positiven Proben ergab für eine Probe mit den Serotyp 6 (97% Homologie) und in zwei Proben den Serotyp 41 (100% Homologie). Letzterer gilt hauptsächlich als Auslöser von Gastroenteritiden bei Menschen (GRIFFIN ET AL., 2003).

Nach Untersuchungsergebnissen von PINA ET AL. (1998) zeigen Adenoviren (im Gegensatz zu Enteroviren) keine saisonale Verteilung. In den Fluss-, Meer- und Abwasser wurden

91 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

durch das ganze Jahr positive Proben detektiert. Geht man von ähnlichen Verhältnissen in den Expositionsgewässern der Muscheln dieser Arbeit aus, scheint die Virenakkumulation seitens der Muschel von der fäkalen Verunreinigung abhängig zu sein. Die negativen Befunde aus der Elbe und dem zweiten Schönungsteich deuten im Vergleich mit dem Rohablauf der KA auf eine niedrigere Verschmutzung und einer damit verbundenen Sensitivitätsgrenze bei der Aufnahme durch die Muscheln hin. Die eingangs zitierten Autoren untersuchten Muscheln aus unterschiedlich fäkal belasteten Regionen und fanden eine Verschmutzungs- abhängige Kontamination mit enteralen Viren. Eine Beurteilung des Vorkommens von AdV in den Gewässern konnte aufgrund der nicht zur Verfügung stehenden Wasserproben nicht erfolgen. Hinsichtlich der negativen Befunde in Muscheln der Elbe und dem zweiten Schönungsteich ist eine hohe Belastung für den

Untersuchungszeitraum unwahrscheinlich. PINA ET AL. (1998) formulierten eine molekulare Indexfunktion der AdV Amplikons für virale Verunreinigungen in der Umwelt, die sich hauptsächlich auf die Resistenzeigenschaften dieser Viren stützte. Ausgehend davon wurde in dieser Studie mit einer wesentlich höheren Nachweishäufigkeit der AdV in den Muscheln gerechnet. Für den Ausschluss möglicher Hemmsubstanzen wurden zusätzlich alle Muscheleluate zehnfach verdünnt, daraus die DNA isoliert und die gesuchten Sequenzen amplifiziert. Aus den Amplifikaten der ersten und der nested PCR resultierten keine weiteren viruspositiven Proben (Tabelle A 38). Wahrscheinlich wurde mit der Verdünnung die Sensibilitätsgrenze der PCR erreicht. Die Abwägung über den Anschluss einer real – time PCR wurde durch die geringe Nachweisquote in den unverdünnten Muscheleluaten (nested PCR) beeinflusst. Ausgehend von der geringen Nukleinsäurekonzentration in den Eluaten konnte nicht von einem gesicherten quantitativen Ergebnis ausgegangen werden.

3.2.4.2 Die Gattung Enterovirus Enteroviren (Polio-, Coxsackie-, Echo- und Enterovirus) zählen zu den am häufigsten im Zusammenhang mit wasserbürtigen Krankheitsausbrüchen untersuchten enteralen Viren. Im Jahresverlauf wurden vielfach saisonale Häufungen im Vorkommen von Enteroviren im Wasser beobachtet (DUMKE, 1998; LE GUYADER ET AL., 2000). Der vorliegende Untersuchungszeitraum (September - März) entsprach dem vermehrten Nachweis von enteralen Viren in den Wintermonaten. Ursächlich werden zumeist die niedrigen

Umgebungstemperaturen benannt (BLANC UND NASSER, 1996).

92 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Die Gewässeruntersuchungen ergaben mit der PCR einen positiven Enterovirusnachweis in allen Proben der Elbe (100%), in 44% des geklärten Abwassers und in 20% des Ablaufes vom zweiten Schönungsteich der KA Reichenau (Tabelle A 39).

Tabelle 16: Anteil der Enteroviren in Muscheln und Wasser

Virus - positiver Probenanteil (%)

Elbe KA Rei T1 KA Rei T2 (n = 7) (n = 8) (n = 6)

Muschel 29 0 0

Wasser 100 38 33

In einer umfangreichen Studie zur viralen Kontamination der Elbe wurde bereits durch

DUMKE (1998) ein viruspositiver Anteil von 92% durch den Zellkulturnachweis ermittelt. In der Virentypisierung der zitierten Arbeit dominierten, im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit, die Coxsackie – Viren mit 48%. Die Sequenzierung der positiven EV - Amplifikate ergab im Wasser der Elbe überwiegend den Typus Porcine enterovirus 9 und eine Probe mit Human echovirus 6. Porzine Enteroviren sind Erreger die ausschließlich von Schweinen stammen, dort Enzephalitiden auslösen und fäkal oral übertragen werden. Für den Menschen haben die Erreger keine pathogene Relevanz. Ihr Nachweis in der Umwelt ist jedoch nach JIMENEZ-CLAVERO ET AL. (2003) eine sichere Anzeige für eine Kontamination mit Schweinefäkalien. Die vorliegenden Ergebnisse lassen auf eine entsprechende Verunreinigung der Elbe (Neustädter Hafen) im Untersuchungszeitraum schließen. In der KA Ablaufproben wurden ausschließlich humane Coxsackieviren typisiert. Mit nur einer Spezies unterscheidet sich das Ergebnis von anderen Literaturangaben, die

überwiegend ein Typengemisch an Enteroviren fanden (MORRIS UND SHARP, 1984;

DUMKE, 1998; FLEISCHER ET AL., 2000). Die Typisierung der Enteroviren durch den Datenbankabgleich (EMBL, BLAST - Algorithmus) war in einigen Proben durch Überstimmungen der Homologien zu mehreren Virustypen gekennzeichnet. Eine Abgrenzung der Virenspezies mit dem vorliegenden Primersystem und der Sequenzierung

93 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

sollte an dieser Stelle nur eingeschränkt vorgenommen werden. In Isolaten ist die sichere Identifizierung mit einer serologischen Typisierung und / oder durch die Sequenzierung der VP1 – Region durchführbar. Basierend auf einer Datenbank mit den vollständigen Sequenzen des VP1 Kapsidproteins aller bekannten 66 humanen Enterovirenserotypen kann eine weitergehende Sequenzanalyse die phylogenetische Einordnung und Typisierung der Enteroviren ermöglichen (OBERSTE ET AL., 1999).

Im Gegensatz zu den Ergebnissen einer Studie von PINA ET AL. (1998), in der die Kläranlagenabläufe von Enteroviren frei waren, wurden in dieser Arbeit ein Drittel der untersuchten Ablaufwässer von Teich 2 Enterovirus positiv getestet. Im Vergleich zum Zulauf von Teich 1 (KA Ablauf) konnten die Viren im Teich 2 lediglich weiter reduziert, aber nicht eliminiert werden (Tabelle A 39). Im Rohabwasser kommen Viren vorrangig an

Feststoffe adsorbiert bzw. in organische Materialien eingebettet vor (WALTER, 1995). Der daraus resultierende Schutz der Viren und die jeweilige Abbauleistung der KA sind bestimmend für die Virusrate im Ablauf.

Die Untersuchung der korrespondierenden Muschelproben ergab in der Elbe in zwei von sieben Eluaten einen positiven Virusnachweis (Tabelle A 40). Die dabei nachgewiesene Virenspezies (Porcine enterovirus 9) entsprach der im Umgebungswasser detektierten Art. Von einer effizienten Virenakkumulation kann bei einem 29% viruspositiven Anteil (Tabelle 16) nicht ausgegangen werden. In Hinblick auf die höhere Resistenz im Verdauungstrakt von Muscheln gegenüber Bakterien (E. coli) und zahlreichen

Veröffentlichungen über Kontamination von Schalentieren mit Viren (HERNROTH ET AL.,

2002; LEES, 2000) wurde in der vorliegenden Studie mit einem höheren Virusanteil in Dreissena polymorpha gerechnet. Möglicherweise liegt auch hier eine Beziehung zwischen der viralen Belastung des Wassers und der Sensitivitätsschwelle zur Akkumulation durch die Muschel vor.

Die Isolation und Identifizierung von Viren aus Schalentieren gilt trotz großer methodischer Fortschritte als schwierig (SHIEH ET AL., 1999). Die Ursachen beruhen meistens auf einer ineffizienten Anreicherung, einem niedrigen Kontaminationslevel und hohen Konzentrationen von PCR Inhibitoren im Muschelfleisch. Besonders aus letzteren Gründen wurde ein enterovirennegatives Muscheleluat (einschließlich Elutionspuffer) hinsichtlich seiner RNA- und PCR inhibierenden Wirkung getestet.

94 ERGEBNISSE UND DISKUSSION negativ Kontolle negativ Kontolle

RT PCR nested PCR Muscheleluat PBS Muscheleluat PBS

L 1 2 3 44 5 6 7 7 88 9 9 10 10 1112 1112 13 1314 14151617 15 1617 18 1819 19 20 20 212223 21 2223 242526 242526 L L

494 bp 298 bp

1: nativ 7: 14: 10-1 20: 2: 10-1 bis 15: 10-2 bis 3: 10-2 12: dito 16: 10-3 25: dito 4: 10-3 17: 10-4 5: 10-4 18: 10-5 6: 10-5 19: 10-6

Abbildung 31: Untersuchung zum Einfluss inhibierender Stoffe auf die RNA Extraktion und die PCR - NWG von Enteroviren im Muscheleluat und PBS

Als Vergleichsbasis wurde die nested PCR herangezogen, da auch die Ergebnisse der Untersuchungsproben aus dieser Reaktion resultierten. Sowohl die aus der RNA umgeschriebene DNA des Muscheleluates, als auch die aus dem PBS Ansatz stammende DNA ergaben mit der Verdünnungsstufe 10-4 die gleiche NWG (Abbildung 31). Es kann davon ausgegangen werden, dass hemmende Substanzen die Nukleinsäureanalyse der Enteroviren (am Beispiel der Echovirus RNA) nicht beeinflusst haben.

3.2.4.3 Vergleich des Bakteriophagenmonitoring mit dem Vorkommen enteraler Viren Die Gegenüberstellung der quantitativ erfassten Phagen und der qualitativ nachgewiesenen enteralen Viren erfolgte für den Zeitraum September 2002 bis März 2003 in tabellarischer Form (Tabelle A 41, Tabelle A 42 und Tabelle A 43).

95 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Im Fall der Elbe präsentiert sich ein indirekter Zusammenhang zwischen den positiven Enterovirusbefunden im Wasser und der deutlich erhöhten Konzentrationen der somatischen Coliphagen im Gewebeeluat von Dreissena polymorpha. Die direkten Vergleiche spiegeln diese Situation nicht wieder, d.h. es präsentiert sich kein Zusammenhang zwischen den Phagen und den enteralen Viren im Wasser und analog nicht in der Muschel. Bei den Zulaufproben des Schönungsteiches 1 und den Ablaufproben (Teich 2) der KA Reichenau konnten weder direkte noch indirekte Zusammenhänge resümiert werden. Die Nachweise schwankten sowohl in der Konzentration als auch in der Häufigkeit. Das sind Ergebnisse die sicherlich maßgeblich durch die in Qualität und Quantität differierende Bestückungssituation der KA beeinflusst wurden.

Im Gegensatz zu Studienergebnissen von MUNIAIN-MUJIKA ET AL. (2003); CHUNG ET AL.

(1998) und DORE ET AL. (2000) konnte kein direkter Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Bacteroides fragilis Phagen, FRNA Phagen und enteralen Viren im Wasser und in den Muscheln gefunden werden.

Der Nachweis enteraler Viren im Oberfächengewässer und im Ablauf von Abwasserbehandlungsanlagen konnte einerseits das ubiquitäre Vorkommen von Viren in Gewässern und andererseits den Virenoutput durch Kläranlagen, auch mit nachgeschalteter Reinigungsstufe, bestätigen. Der Nachweis humanpathogener, enteraler Viren im Muschelfleisch unterstreicht die Aufnahme und die Vektorfunktion der Muscheln hinsichtlich viraler Partikel, sowie ein damit verbundenes Hygienerisiko. Aufgrund der begrenzten Probenzahl und der unterschiedlichen Nachweishäufigkeit von Adeno- und Enteroviren, kann jedoch nicht von einer kontinuierlichen Virenaufnahme ausgegangen werden. Im Gegensatz zur quantitativen Erfassung der Bakterien und Bakteriophagen darf an dieser Stelle nicht von (Bio)Akkumulation (Anreicherung) gesprochen werden. Die Anreicherung definiert sich als Erhöhung der Konzentration von Stoffen in biologischen Systemen (www.umweltlexikon-online.de). Der Mengenbezug in der Definition gestattet keine Verwendung dieses Begriffes bei den qualitativen Virenergebnissen in dieser Arbeit.

Aus den Ergebnissen der Virusnachweise und der Gegenüberstellung von Bakteriophagen und enteraler Viren resultiert eine verminderte Tauglichkeit der Dreikantmuscheln als Biomonitor für humanpathogene Viren.

96 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

3.2.5 Nachweis von Giardien und Cryptosporidien in der Muschel und im Wasser

In der Arbeit von REICHARDT (2003) gelang es ein sehr sensitives PCR – System für beide Parasitenspezies zu etablieren. Die Nachweisgrenze für G. lamblia in der zweiten Amplifikation lag bei 5 Cysten. Für C. parvum wurde eine Nachweisgrenze mit dem Primerpaar CPFn/CPRn von 10 Oocysten und in der seminested-PCR mit dem Primerpaar

LaxB/LaxC von einer Oocyste erreicht (REICHARDT, 2003). Die Abbildung 32 zeigt eine Elektrophoreseauswertung exemplarisch für die nachfolgenden Monitoring – Ergebnisse. Die positiven PCR – Produkte sind sowohl bei den Muscheleluaten als auch bei den Wassereluatextrakten in deutlichen Banden nachweisbar.

Muschelpräparate Wasserpräparate M N P 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 x 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

A: Untersuchung des Waldbades Langebrück auf C. parvum (Seminested-PCR mit den Primern LaxB/LaxC); M: Marker; N: Negativkontrolle; x: leere Spur; Spur 0 – 10: Proben

Muschelpräparate Wasserpräparate M N P 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 x 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

B: Untersuchung des Waldbades Langebrück auf G. lamblia (Seminested-PCR mit den Primern GGLF1/GGR); M: Marker; N: Negativkontrolle; x: leere Spur; Spur 0 – 10: Proben

Abbildung 32: PCR - Produkte von C.parvum (A) und G. liamblia (B) aus Muschel- und Wasserproben des Waldbades Langebrück (Foto REICHARDT, K. modifiziert)

97 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

3.2.5.1 Monitoring in der Elbe In allen Muschelproben der Elbe konnten G. lamblia detektiert werden. Die entsprechenden Wasserproben wiesen in zwei der untersuchten Proben ein positives PCR- Produkt auf (Tabelle 17). Die Sequenzierung der Giardia - Amplifikate ergab in 99% die Spezies G. lamblia mit einer Sequenzhomologie zwischen 98% und 100%. Bei einem PCR Produkt lag eine Mischsequenz vor, die nicht mit der Datenbank abgleichbar war.

Tabelle 17: PCR Nachweis von Giardia sp. und Cryptosporidium sp. aus Muschel- und Wasserproben der Elbe (REICHARDT, 2003, modifiziert) Nachweis von Nachweis von

Datum Giardia lamblia Cryptosporidium parvum Muschel Wasser Muschel Wasser

15.04.2003 positiv negativ positiv negativ 08.05.2003 positiv negativ positiv negativ 26.05.2003 positiv negativ positiv positiv 19.06.2003 positiv negativ positiv positiv 07.07.2003 positiv positiv positiv negativ 29.07.2003 positiv negativ negativ negativ 21.08.2003 positiv positiv positiv positiv positive Proben 100% 29% 86% 43%

Cryptosporidien ließen sich in 86% der Muscheleluate und in 43% der korrespondierenden Wasserproben nachweisen (Tabelle 17). Von den positiven Amplifikaten der Muschel wurden fünf Proben mit 99% - 100% Homologie auf C. parvum sequenziert. Die verbliebenen zwei Proben ergaben Mischsequenzen. Die Wasserproben wurden in zwei von drei Analysen erfolgreich sequenziert (99% - 100%). Giardien und Cryptosporidien kommen in Oberflächengewässern weit verbreitet vor. Behandelt wird dieses Wasser vielfach als Trinkwasserressource genutzt. Daten aus

Studien von LECHEVALLIER ET AL. (1991) und HORMAN ET AL. (2004) belegen das Hygienerisiko mit positiven Nachweisen in 81% bzw. 14% (Giardia) und 97% bzw. 10% (Cryptosporidium) der untersuchten Wasserproben. Die vorliegenden Ergebnisse der Elbe liegen mit 29% (Giardia) und 43% (Cryptosporidium) in einem vergleichbaren Rahmen.

98 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

In einer Fütterungsstudie (Giardia, Cryptosporidium) von GRACZYK ET AL. (2002) konnte die Befähigung von Dreissena zur Akkumulation von Parasiten gezeigt werden. Die höheren Positivraten in der Muschel gegenüber dem Wasser in der vorliegenden Arbeit bestätigen die Aufnahme durch Dreissena unter natürlichen Bedingungen. Die von den

Autoren GRACZYK ET AL. (2002) diskutierte Möglichkeit der niedrigeren Verdauungs- resistenz und des schnelleren Abbaus von Giardienzysten im Vergleich zu Cryptosporidien kann unter den Versuchsbedingungen der Elbestudie nicht bestätigt werden, denn die Anzahl der Giardia lamblia Nachweise in der Muschel war (trotz geringerem Nachweis im Wasser) höher (100%), als der Cryptosporidienanteil (86%).

3.2.5.2 Monitoring im Schönungsteich 1 der KA Reichenau In 57% der Muschelproben und in 43% der korrespondierenden Wasserproben des Schönungsteiches I konnte G. lamblia nachgewiesen werden (Tabelle 18). Die Sequenzierung der Muschel- und Wasserproben erbrachte bei 6 Proben eine Homologie zwischen 99% und 100% zu G. lamblia. Bei der Muschelprobe vom 15.05.2003 handelte sich um eine Mischsequenz verschiedener Giardien-Spezies, die in der Sequenzierung zu keinem Ergebnis führten.

Tabelle 18: PCR Nachweis von Giardia sp. und Cryptosporidium sp. aus Muschel- und Wasserproben des Schönungsteiches 1 der KA Reichenau (REICHARDT, 2003, modifiziert) Nachweis von Nachweis von

Datum Giardia lamblia Cryptosporidium parvum Muschel Wasser Muschel Wasser

03.04.2003 negativ positiv positiv positiv 24.04.2003 positiv negativ positiv negativ 15.05.2003 positiv negativ positiv negativ 04.06.2003 positiv negativ positiv positiv 24.06.2003 negativ positiv negativ positiv 16.07.2003 positiv negativ positiv negativ 05.08.2003 negativ positiv negativ negativ positive 57% 43% 71% 43% Proben

99 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

C. parvum wurde in fünf der sieben Muschelproben (71%) nachgewiesen. In der korrespondierenden Wasserprobe ergab sich nur in 43% einen positiven Befund (Tabelle 18). Die Sequenzierung der Amplifikate zeigte für beide Untersuchungsproben eine 99%ige - 100%ige Homologie. Die positiven Proben des Ablaufes der KA Reichenau (Zulauf Teich 1) zeigen keine vollständige Elimination dieser Parasiten in der

Abwasserbehandlung. Die Ergebnisse sind Vergleichbar mit Untersuchungen von MAYER

UND PALMER (1996) und CACCIO ET AL. (2003). Auch unter der höheren Schadstoffbelastung im Abwasserteich 1 präsentiert sich Dreissena polymorpha als zuverlässiger Biomonitor für Parasiten.

3.2.5.3 Monitoring im Schönungsteich 2 der KA Reichenau Im Ablaufwasser der KA waren vier von sieben Proben mit Giardien kontaminiert. Die exponierten Muscheln zeigten in fünf von sieben Proben ein positives Ergebnis (Tabelle 19). Alle PCR Produkte konnten positiv für G. lamblia sequenziert werden (Homologien zwischen 97% und 100%).

Tabelle 19: PCR Nachweis von Giardia sp. und Cryptosporidium sp. aus Muschel- und Wasserproben des Schönungsteiches 2 der KA Reichenau (REICHARDT, 2003, modifiziert) Nachweis von Nachweis von

Datum Giardia lamblia Cryptosporidium parvum Muschel Wasser Muschel Wasser

10.04.2003 positiv positiv positiv positiv 02.05.2003 negativ negativ positiv positiv 19.05.2003 positiv negativ positiv negativ 11.06.2003 positiv positiv positiv negativ 02.07.2003 negativ positiv positiv positiv 23.07.2003 positiv positiv positiv positiv 12.08.2003 positiv negativ positiv negativ positive Proben 86% 57% 100% 57%

In allen Muschelproben des Untersuchungszeitraumes wurden Cryptosporidien nachgewiesen. Der parallele Nachweis im Wasser erbrachte in vier von sieben Proben einen positiven Befund (Tabelle 19). 100 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

In der KA Reichenau war der Ablauf des Teiches 2 mit einem Anteil von 57% positiver Proben höher mit Giardien und Cryptosporidien kontaminiert als der primäre Ablauf (43%). Dies könnte auf eine Wiederverkeimung im zweiten Schönungsteich hindeuten, die nicht im Sinne einer nachgeschalteten Reinigungsstufe sein kann. Wir verzeichneten auf diesem Gewässer außerdem ein hohes Aufkommen an Enten im Untersuchungszeitraum. Wasservögel gelten nachweislich als Träger und Ausscheider von Giardien und

Cryptosporidien (KUHN ET AL., 2002). Diese externe Kontaminationsquelle, aber auch das hohe Schlammvolumen als Parasitenreservoir, könnten Ursachen des verzeichneten Anstieges sein und sollten zukünftig bei der Teichpflege berücksichtigt werden.

3.2.5.4 Monitoring im Waldbad Langebrück Die Besonderheit der Beprobung des Badegewässers bestand in der Tatsache, dass die Muscheln kurz vor Saisoneröffnung in das Wasser exponiert wurden und dadurch eine Beurteilung der mikrobiellen Situation vor und während der anthropogenen Nutzung möglich wurde.

Tabelle 20: PCR Nachweis von Giardia sp. und Cryptosporidium sp. aus Muschel- und Wasserproben des Waldbades Langebrück (REICHARDT, 2003, modifiziert) Nachweis von Nachweis von Datum Giardia lamblia Cryptosporidium parvum Muschel Wasser Muschel Wasser

19.05.2003 positiv positiv positiv positiv (t = 0 Belastung) 04.06.2003 positiv positiv positiv negativ 11.06.2003 positiv positiv positiv negativ 24.06.2003 positiv positiv negativ negativ 02.07.2003 positiv negativ negativ negativ 16.07.2003 positiv positiv positiv negativ 23.07.2003 negativ negativ positiv negativ 05.08.2003 positiv negativ negativ negativ 12.08.2003 positiv negativ negativ negativ 21.08.2003 negativ negativ negativ negativ 27.08.2003 negativ negativ positiv negativ positive Proben 70% 40% 50% 0% (ohne t = 0) 101 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Wie in der Probe vom 19.05. 2003 ersichtlich wird (Tabelle 20), waren die frisch exponierten Muscheln sowie das Beckenwasser bereits vor dem Badebetrieb mit Cryptosporidien und Giardien kontaminiert. Insgesamt wurden 70% der Muscheleluate und 40% der Wasserkonzentrate (Tabelle 20) positiv auf G. lamblia getestet (Sequenzhomologien zwischen 98% und 100%). Cryptosporidien wurden in der Hälfte der Muschelproben nachgewiesen, jedoch in keiner der parallelen Wasserproben. Alle parasitenpositiven Proben wurden durch die Sequenzierung mit Homologien zwischen 98% und 100% bestätigt.

In dieser Studie wurden erstmalig Muscheln in einem Freibad als Monitor der parasitären Belastung des Wassers eingesetzt. Trotz der Vorbelastung von Dreissena konnte die kontinuierliche Aufnahme der Parasiten bestätigt werden. Die hohe Diskrepanz zwischen der Häufigkeit des Parasitennachweises in der Muschel im Gegensatz zum Umgebungswasser unterstrich die Befähigung der Muscheln zur Indikation der Erreger. Positive Muschelbefunde mit vorherig negativen Ergebnissen (vgl. 05.08. 2003 für Giardien oder 27.08.2003 für Cryptosporidien Tabelle 20) können nur mit einer erneuten Kontamination der Muschel durch Parasiten aus der Umgebung erklärt werden.

Die qualitative Bewertung der untersuchten Proben ergab zusammengefasst sowohl für G. lamblia mit 78%, als auch für Cryptosporidien mit 77% eine durchschnittlich höhere Nachweisrate in den Muscheln im Vergleich zu den korrespondierenden Wasserproben (42 % und 36%). Die wesentlich höhere Sensibilität der Muscheln als Anzeiger einer parasitären Belastung des Wassers, im Vergleich zur direkten Wasseranalyse konnte im Oberflächenwasser, im gereinigten Abwasser und auch im stark anthropogen genutzten Badegewässer bestätigt werden. Der Nachweis von Parasiten durch die PCR spezifischer Nukleinsäuretargets ist praktikabel und sehr sensitiv. Er hat jedoch den Nachteil, dass keine Aussagen über die Infektiösität der Erreger und des damit verbundenen Gesundheitsrisikos möglich sind. In einer aktuelle Studie von GRACZYK ET AL. (2004) wurde diese Problematik untersucht und ergab in 80% aller in Dreissena gefundenen Parasiten eine Lebensfähigkeit und somit eine potentielle Pathogenität der Organismen. Die DNA von G. lamblia wurde in Muscheln und Wasser aller Expositionsgewässer prozentual häufiger nachgewiesen als die DNA von Cryptosporidien.

102 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

3.2.5.5 Vergleich des Parasitennachweises mit bakteriellen und virologischen Indikatoren in Muscheln und Wasser Die Beurteilung eines Zusammenhanges zwischen traditionellen Indikatoren und dem Nachweis von Parasiten bezüglich einer fäkalen Verunreinigung kann aufgrund des qualitativ geführten Parasitennachweises nicht korrelativ erfolgen. Die Gegenüberstellung der Befunde erlaubt jedoch die Einschätzung von tendenziellen Beziehungen. Die gemittelten Ergebnisse aller Untersuchungsgewässer wurden in der (Tabelle 21) zusammengefasst und lassen erkennen, dass sowohl bei hohen Konzentrationen der herkömmlichen Indikatoren, als auch bei geringen Nachweisen Parasiten in Muscheln und Wasser nachweisbar waren. Lediglich für Cryptosporidien könnte man einen Trend vermuten, denn geringe Coliformen-, E. coli- und Phagenwerte zeigten gleichzeitig einen negativen Befund bei diesem Parasitengenus.

Tabelle 21: Erfassung des Parasitenanteils im Vergleich zu mikrobiellen Indikatoren aus Dreissena polymorpha und ihrem Umgebungswasser (REICHARDT, 2003, modifiziert) Mittelwerte Nachweise Elbe KA Rei T1 KA Rei T2 Bad Langebrück

Muschel Wasser Muschel Wasser Muschel Wasser Muschel Wasser

Giardien 100 29 57 43 86 57 70 40 (%)

Crypto- sporidien 86 43 71 43 100 57 50 0 (%) Coliforme (MPN/g 908 5,9 1245 42,2 1327 41,5 692 2,4 bzw. MPN/ml) E. coli (MPN/g 3 0,5 34 4,4 83 5,6 6 0,4 bzw. MPN/ml) somatische Coliphagen 18,8 0,3 78 0,2 28 0,3 2 0,6 (PFU/g bzw. PFU/ml)

103 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Als besonderes Beispiel wäre die mikrobielle Situation im Waldbad Langebrück hervorzuheben. Hier zeigten die bakteriologischen und virologischen Indikatoren im Wasser Badewasserqualität an, wobei bei den Giardien von einem potentiellen Hygienerisiko ausgegangen werden muss. Deutliche Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen den Hygieneindikatoren und Parasiten lassen sich (gerade bei höherer Abwasserbelastung) nicht ableiten. Das Ergebnis entspricht Korrelationsstudien von BONADONNA ET AL. (2002) und LEMARCHAND UND

LEBARON (2003).

104 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

4 Zusammenfassung und Ausblick

Dreikantmuscheln sind aufgrund ihrer speziellen Ernährungsweise in der Lage, erhebliche Wassermengen unterschiedlichster Qualität sehr effektiv zu filtrieren und dabei zu reinigen. Die Einschätzung des Leistungsumfanges, der Nutzung, aber auch der Grenzen des Muschelfilters in der weitergehenden Abwasserbehandlung, der Gewässerreinigung und im Monitoring waren Zielstellungen der vorliegenden Arbeit.

Die Exposition der auf einem textilen PP – Aufwuchsträger haftenden Muscheln erfolgte in der Elbe am Neustädter Hafen in Dresden (Oberflächengewässer), in dem ersten und zweiten Schönungsteich der Kläranlage Reichenau (Sachsen) und in einem Waldbad in Langebrück (Badegewässer). Mit der Erarbeitung einer wirksamen Elutionsmethode wurde eine wichtige Grundlage geschaffen, um Mikroorganismen (Bakterien, Viren und Parasiten) aus dem Muschelgewebe effizient nachweisen zu können. Die Methodik vereint die Elution (Rindfleischextraktpuffer) adsorptiv gebundener Mikroorganismen, eine behutsame Abtrennung der Muschelgewebeanteile (Zentrifugation) und eine problemlose Weiterverarbeitung des Eluats in den anschließenden Analyseschritten. Die bakterielle Wiederfindungsrate von 86% und eine Wiederfindung von 97% für Bakteriophagen bestätigen die Elutionseffizienz des Verfahrens.

Die Befähigung von Dreissena polymorpha zu einer saisonal beeinflussten Bioakkumula- tion gegenüber dem Umgebungswasser konnte durch ein Monitoring mit einem Anreicherungsfaktor für Bakterien von 87 (gemittelt) und für Bakteriophagen von 261 (gemittelt) eindrucksvoll bestätigt werden. Mehrfach ergaben mikrobielle Nachweise in der Wasserprobe negative Befunde, wo hingegen im Muscheleluat Indikatororganismen nachgewiesen wurden. Die Phagen zeigten vielfach einen hyperakkumulierenden Charakter und sollten bei der Bewertung kritisch eingeschätzt werden. Die effiziente Akkumulation und die Umweltresistenz der Dreikantmuscheln sind hervorragende Eigenschaften, die sich zu einem zuverlässigen Biomonitor mit „Hygienegedächtnis“ und hoher Sensibilität vereinen lassen. Korrelative Auswertungen unterstrichen die Indikator- funktion von E. coli, Coliforme, Intestinale Enterokokken und der somatischen Coliphagen hinsichtlich einer fäkalen Verunreinigung.

105 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

Batchversuche im Labormaßstab bestätigten die im in situ - Monitoring ermittelte Bakterienakkumulation und demonstrieren darüber hinaus eine temperaturabhängige Inaktivierung (Elimination) der Bakterien (Intestinale Enterokokken) durch die Muscheln mit Reduktionsraten von -77% bei 20°C bzw. -61% bei 6°C.

Die umfangreiche Phagenakkumulation in situ konnte nicht bestätigt werden. Es gab unter Muscheleinfluss Eliminationsraten, die die Selbstreinigungsrate im Blindbecken bei 20°C nicht überstiegen. Unter dem Einfluss von niedriger Temperatur (6°C) kam es sogar zu einer Anreicherung der Phagen. Die kritische Einschätzung der Viren(Phagen)anreicherung bei Muscheln wurde bestätigt. Es muss von maßgeblichen Unterschieden zwischen aktiver und passiver Aufnahme sowie bei Verhaltens- und Resistenzeigenschaften von Bakterien und Viren ausgegangen werden.

Nicht alle aufgenommenen Organismen werden durch die Muscheln inaktiviert. Das ergaben die in situ Sedimentuntersuchungen unter dem Muschelfilter. Die Verdopplung der Enterokokken sowie die erhöhten Werte der somatischen Coliphagen im Sediment unter Muschelbesatz charakterisieren dieses Kompartiment als Keimreservoir. Bei der Verfahrenumsetzung sollte dieser Aspekt z.B. durch eine kontinuierliche Sediment- beseitigung berücksichtigt werden.

Die bakterielle Besiedlung des Verdauungstraktes von Dreissena polymorpha wird stark durch die Bakterienzönose des umgebenden Wassers beeinflusst. Sowohl im Wasser als auch im Muschelgewebe dominierten fünf Bakterienstämme (Actinobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, „environmental group“). Eine auffallend hohe Dominanz zeigten die Mycoplasmen (Firmicutes), was auf eine mögliche ökologische Nische für Vertreter dieser Gattung in der Muschel hindeutet.

In allen Muscheleluaten des Monitorings wurden Legionellen nachgewiesen. Die Muscheln des Teiches 2 der KA Reichenau zeigten mit 86% die höchste Kontamination aller Expositionsorte. Legionellenamplifikate im Muscheleluat gingen kontinuierlich mit ebenfalls positiven Befunden im Wasser einher, so dass der Einsatz von Dreissena polymorpha auch im Biomonitoring von Legionellaceae möglich ist.

Erstmalig wurden in der Elbe und im Abwasser der KA Reichenau E. coli O157:H7 infizierenden Phagen und deren Anteile nachgewiesen. Die Elbe lag mit einem E. coli O157:H7 infizierenden Phagenanteil von 7,5% deutlich über dem Rohabwasser (1,0%) und 106 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

dem Zulauf zum ersten Schönungsteich der Kläranlage (0,5%). Stx 2 Gene wurden, unter

Verwendung einer Stx1 und Stx 2 Multiplex – PCR, direkt aus dem Phagenplaque am häufigsten nachgewiesen. Der Stx Gennachweis im Muscheleluat war dagegen nur in einer von 24 Proben erfolgreich. Ein Stx Gen Monitoring mit Dreissena polymorpha ist somit unter den gegebenen Bedingungen nicht durchführbar und zeigt, dass eine Anreicherung viraler Erreger nicht für alle Gruppen angenommen werden kann.

Enterale Viren (AdV, EV) wurden in den Dreikantmuscheln und ihrem Umgebungswasser diskontinuierlich nachgewiesen. Enteroviren wurden im Wasser (57% gemittelt) häufiger als in der parallelen Muschelproben (10%) nachgewiesen. Die Monitoringtauglichkeit des Muschelfilters muss diesbezüglich als eingeschränkt bewertet werden. Mögliche Zusammenhänge zwischen dem Vorkommen der humanpathogenen Viren und korrespon- dierender Bakteriophagenkonzentrationen ließen sich nicht ableiten. Die Einschätzung einer Virenakkumulation durch die Muschel konnte im Rahmen der vorliegenden qualitativen Untersuchungen nicht erfolgen. Perspektivisch könnte die Analyse der Virenkonzentration mit der Etablierung einer Real time PCR erfolgen.

Parasiten (Giardia lamblia und Cryptosporidium parvum) werden durch die exponierten Muscheln aufgenommen, dies bestätigten die qualitativen Testergebnisse. Die Frage der Bioakkumulation von Einzellern in der Muschel kann erst mit einer quantitativen PCR beantwortet werden. Eine wichtige Vorraussetzung dafür wurde in der vorliegenden Studie durch die Erarbeitung und Testung eines zuverlässigen und sensiblen PCR Verfahrens geschaffen. In den Dreikantmuscheln wurde sowohl für G. lamblia (78%), als auch für Cryptosporidien (77%) eine durchschnittlich höhere Nachweisrate im Vergleich zu den korrespondierenden Wasserproben (42% und 36%) ermittelt. Die qualitativen Ergebnisse offerierten einen erheblichen Bedarf an parasitären Untersuchungen in anthropogen genutzten Gewässern. Es zeigte sich, dass herkömmliche Hygieneindikatoren diesbezüg- lich keine genügende Aussage leisten können.

Die Dreikantmuscheln sind als Hygienemonitor für hygienerelevante Bakterien, Bakteriophagen und Parasiten in verschiedenen Gewässertypen einsetzbar. Darüber hinaus tragen die Muscheln als Biofilter aktiv zur Bakterienreduktion im Gewässer bei. Im Vergleich zu technischen Biosensoren zeichnen sich die Muscheln durch eine Multiindikatorfunktion, durch eine gewässerintegrative Langzeitnutzung (keine Verbrauchserscheinungen) mit Selbstreinigungspotential und einem „Indikatorgedächtnis“ aus. 107 LITERATURVERZEICHNIS

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126 ANHANG: TABELLEN

2004),

,

/d, USSEROW 3 2004),

, USSEROW /s, /s, 3 Abwasserbehandlung: mechanisch und biologisch- und mechanisch Abwasserbehandlung: chemisch, Belebung mit aerober Schlammstabilisierung weitergehende Reinigung: Nitrifikation, Denitrifikation und Phosphatelimination, Schlammbehandlung: Bandfilterpresse Fläche: ca. 1.500 m², mittlere 2,5Tiefe: ca. 1.500m, mittlere Fläche: m², (K d 2 Verweilzeit: theoretische 0,5Tiefe: - m, 1,0 ca. 1.000mittlere Fläche: m², Verlandungscharakter; theoretische d (K 1 Verweilzeit: im Hafen (Muschelexposition)im verminderte Fließrate IKSE 2003: IKSE – (EU III II – Gewässergüteklasse 2000/60/EU), Wasserrahmrichtlinie (Freiwasserzone Dresden): 327 mittlerer Abfluss m Größe:EWG, 20.000 Abwasserzufluss:max. 5000 m Tage, 5 Verweilzeit: theoretische Wasserqualität: der die EGAnforderungen - erfüllt Badegewässerrichtlinie

5, 5, Sedimentation Sedimentation Vorfluter, Vorfluter, Trinkwasserversorgung (Uferfiltrat), Schiffsverkehr, landwirtschaftliche Bewässerung Abwasserbehandlung RestReduktion des – BSB RestReduktion des – BSB Badegewässer Gewässertyp Nutzung Charakteristik Charakteristik Nutzung Gewässertyp Oberflächengewässer, 1.Gewässer Ordnung Rohabwasser, Belebtschlamm gereinigtes Abwasserund Schönungsteich Anschluss im das Nachklärbeckenan Schönungsteich Anschluss im 1 Teich an mit Badeteich vorgeschaltetem Beruhigungs ohne (Absetz-)becken Badebetrieb ik der Untersuchungsgewässer Untersuchungsgewässer ik der Gewässername und Gewässername Örtlichkeit – Neustädter Dresden Elbe, Hafen Kläranlage Reichenau Pulsnitztal) (AZV Kläranlage Reichenau Zulauf Teich 1 (Rei T 1) Kläranlage Reichenau Ablauf Teich 2 (Rei T 2) Waldbad Langebrück, Durchfluss und Speisung den „Rotendurch Graben“ Röder)der(Zufluss Großen Tabelle A 1: Kurzcharakterist XIII ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 2: Übersicht der verwendeten Primer

Primer Sequenz (5´ → 3´) Zielsequenz Referenz

TPU1 -AGA GTT TGA TC[C/A] konservierter Bereich des 16S SANDER ET AL. (universell) TGG CTC AG- rRNA-Gens, EC8-27 (1998)

RTU4 -TAC CAG GGT ATC konservierter Bereich der 16S SANDER ET AL. (universell) TAA TCC TGT T- rRNA-Gene, EC781-802 (1998) -CGC CAG GGT TTT CCC M13f24 lacZα-Fragment BLEUL (2004) AGT CAC GAC- -AGC GGA TAA CAA M13r22 lacZα-Fragment BLEUL (2004) TTT CAC ACA GGA- - CAG TTA ATG TGG Stx1f subunit A stx1 diese Arbeit TTG CGA AG- - GAG ATC ATC CAG Stx1r subunit A stx1 diese Arbeit TGT TGT ACG-

- GCG TTT TGA CCA MUNIESA UND Stx2f Stx2 Gen TCT TCG T- JOFRE (1998)

-ACA GGA GCA GTT MUNIESA UND Stx2r Stx2 Gen TCA GAC AG- JOFRE (1998) -AGA CTA TTT CAT Stx1nf subunit A stx1 diese Arbeit CAG GAG GT -AGA AGT AGT CAA Stx1nr subunit A stx1 diese Arbeit CGA ATG G-

-TAA TAC GGC AAC MUNIESA UND Stx2nf Stx2 Gen AAA TAC T JOFRE (1998)

-TGA TGA AAC CAG MUNIESA UND Stx2nr Stx2 Gen TGA GTG A- JOFRE (1998)

-AAG ATT AGC CTG konservierter Bereich der 16S CALVO-BADO ET 16S-225f CGT CCG AT- rRNA-Gene AL. (2003)

XIV ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 2: Übersicht der verwendeten Primer Primer Sequenz (5´ → 3´) Zielsequenz Referenz

-GTC AAC TTA TCG CGT konservierter Bereich der 16S CALVO-BADO ET 16S-858r TTG CT- rRNA-Gene AL. (2003)

-GAG GGT TGA TAG konservierter Bereich der 16S CALVO-BADO ET 16S-448f GTT AAG AGC- rRNA-Gene AL. (2003) 5’ –noncoding region, -ACC TTT GTA CGC CTG KAMMERER ET AL. Coxprim1 hochkonservierter Bereich für TT- (1994) Picornaviren 5’ –noncoding region, -CAC GGA CAC CCA KAMMERER ET AL. Coxprim2 hochkonservierter Bereich für AAG TA- (1994) Picornaviren 5’ –noncoding region, -AAG CAC TTC TGT TTC KAMMERER ET AL. Coxprim3 hochkonservierter Bereich für CC- (1994) Picornaviren 5’ –noncoding region, -ATT CAG GGG CCG KAMMERER ET AL. Coxprim4 hochkonservierter Bereich für GAG GA- (1994) Picornaviren -CAA GAT GGC CAC AdV1 partial Hexon Gen OH ET AL. (2003) CCC CTC G- -CGA TCC AGC ACG AdV2 partial Hexon Gen OH ET AL. (2003) CCG CGG ATG TC- -AAT GGT CTT ACA AdV3 partial Hexon Gen OH ET AL. (2003) TGC ACA T- -ACC CGG TTG TCG AdV4 partial Hexon Gen OH ET AL. (2003) CCC ACG GCC AG-

XV ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 2: Übersicht der verwendeten Primer Primer Sequenz (5´ → 3´) Zielsequenz Referenz

-AAG TGC GTC AAC KAUCNER UND GGL Giardin - Gen GAG CAG CT- STINEAR (1998)

-TTA GTG CTT TGT GAC KAUCNER UND GGR Giardin - Gen CAT CGA- STINEAR (1998)

-CGT CGC CTC GGA REICHARDT GGLF1 Giardin - Gen GAT CC- (2003)

-GCC CAC CTG GAT Sequenz von CpR1 LABERGE ET AL. CPF ATA CAC TTT C- Genfragment (1996)

-TCC CCC TCT CTA GTA Sequenz von CpR1 LABERGE ET AL. CPR CCA ACA GGA- Genfragment (1996)

-CTG CAC TAA AAA internes Fragment von CPF / REICHARDT CPF1n TGA TCG ATG- CPR (2003)

-GTC TTG TGC ACG- internes Fragment von CPF / REICHARDT CPRn AGT CTC C- CPR (2003)

HALLIER-SOULIER -GCG AAG ATG ACC unbekannte genomische LaxA UND GUILLOT TTT TGA TTT G- Region in C. parvum (2000)

HALLIER-SOULIER -AGG ATT TCT TCT TCT unbekannte genomische LaxB UND GUILLOT GAG GTT CC- Region in C. parvum (2000)

-AAG GAG GTT AAT unbekannte genomische REICHARDT LaxC GAA GCA AAC AG- Region in C. parvum (2003)

XVI ANHANG: TABELLEN

Zeit [min]

[°C] [°C] Extension (final) (final) Extension Temp.

[°C] Temp. [min] Zeit

Zeit

[min] Zyklen

[°C] [°C] Temp.

Zeit [min] [min]

Denaturierung Annealing Annealing Denaturierung Anzahl Extension [°C] [°C]

Temp.

Zeit [min] [min]

(Initial) (Initial) # # 96 0,10 60 0,05 60 2 25 # # 95 10 95 1,5 50 1,5 72 50 1,5 95 95 10 10 72 35 2 95 95 10 1 55 1 10 72 72 30 1,5 95 95 10 1 56 1 72 10 72 35 1 95 10 95 95 10 1 50 1 72 10 72 35 1 95 8 95 1 62 1 72 5 40 72 5 72 1 95 8 95 62 1 72 40 5 Denaturierung Denaturierung [°C] Temp.

1 2 3 4 5 6 16S 16S Nr. / M13 PCR PCR Seq 60 Seq Stx nested Legionella universelle universelle Bezeichnung

Stx Multiplex

Tabelle A 3: PCR - Protokolle verwendeten der Übersicht

XVII ANHANG: TABELLEN

Zeit [min] [min]

(final) (final)

Extension [°C] [°C] Temp.

Zeit [min] [min]

[°C] Temp.

Zeit [min] [min] Zyklen

[°C] Temp.

Zeit [min]

[°C] [°C] Temp.

Annealing Denaturierung Extension Anzahl der verwendeten PCR - Protokolle verwendeten der

Zeit [min]

(Initial) (Initial) # # 96 0,10 50 0,05 60 4 25 # # # 25 4 60 0,05 50 25 0,10 2 55 96 # 0,05 55 0,10 96 # 95 8 95 1 72 5 62 1 30 72 5 94 10 94 10 94 2 10 72 2 50 2 40 72 72 1 40 10 0,45 72 94 10 94 1 55 [°C] [°C] Temp. Denaturierung

7 8 9 12 13 Nr. / PCR Seq 50 Seq 55 parvum parvum (1. Ampli.; nested PCR) PCR) nested Legionella seminested Bezeichnung (CPF/CPR, 1. Amplifikation; Amplifikation; Giardia spp.

seminested PCR)

Cryptosporidium Cryptosporidium Weiterführend Tabelle A 3: Übersicht

XVIII ANHANG: TABELLEN

Zeit Zeit [min] [min] [min] (final) (final) Extension [°C] [°C] [°C] [°C] Temp. Temp. Temp. Extension (final) (final) Extension

Zeit [min] [min] Zeit [min] [min] [°C] [°C] Temp. Temp. [°C] [°C] Temp. Zeit [min] [min] Zyklen Zeit [min] [min] Zyklen [°C] [°C] Temp. Temp. [°C] [°C] Temp. Zeit [min] [min] Zeit [min] [min] [°C] [°C] Denaturierung Annealing Annealing Denaturierung Anzahl Extension Temp. Temp. [°C] [°C] Denaturierung Annealing Annealing Anzahl Denaturierung Extension Temp. Zeit [min] [min] Zeit (Initial) (Initial) [min] [min] der verwendeten PCR - Protokolle verwendeten der [°C] [°C] Denaturierung Denaturierung Temp. Temp. (Initial) (Initial) 94 10 94 1 60 0,45 72 1 40 72 10 72 40 72 1 0,45 94 94 10 1 60 94 10 94 0,30 48 0,30 72 0,45 36 72 10 72 36 0,45 72 0,30 48 0,30 94 94 10 [°C] [°C] Denaturierung Denaturierung Temp. Zeit [min] [min]

cDNA

50 30 95 15 94 1 48 1 72 1 40 72 10 10 72 40 1 72 1 48 1 94 15 95 30 50 [°C] [°C] RNA → Umschreibung Umschreibung Temp. Temp. 14 15 Nr. / PCR ADV Bezeichnung

seminested PCR) EV (1. Amplifikation; nested) Amplifikation; (1. Cryptosporidium parv. Cryptosporidium RT-PCR RT-PCR (LaxA/B/C, 1. Amplifikation; Amplifikation; 1. (LaxA/B/C,

Weiterführend Tabelle A 3: Übersicht Tabelle A 4: RT-PCR Protokoll Übersicht

XIX ANHANG: TABELLEN

Standard- abweichung abweichung

Coliphage Phi X174 X174 Phi Coliphage (PFU/ml) (PFU/ml) Mittelwert Mittelwert

Phagen Standard- abweichung abweichung B. fragilis B. fragilis (PFU/ml) Mittelwert Standard- abweichung abweichung Intestinale Intestinale Enterokokken Enterokokken (KBE/ml) (KBE/ml) Mittelwert Kapazität zur Elution der Indikatororganismen (n = 3) = (n Indikatororganismen Elution der zur Kapazität Standard- abweichung abweichung E. coli E. coli 7 4,7 173 30,9 30 8,3 47 6,8 7 30,9 47 8,3 30 4,7 173 40 40 80 21,6 49,7 283 233 74,1 69,4 35 36 4,0 2,9 44 60 1,5 1,8 240 206,1 377 161,1 30 2,9 70 20,5 20,5 70 2,9 30 161,1 377 206,1 240 (KBE/ml) (KBE/ml) Mittelwert Mittelwert

7,5 9,0 Elutionsmittel Elutionsmittel Steriles Elbwasser Elbwasser 4,5 18,9 41 3,1 31 297 53 12,5 Steriles Skim-Milk pH 7,5 pH Skim-Milk 9,0 pH Skim-Milk Glyzinpuffer pH 7,5 127 101,4 257 166,6 38 9,0 46 5,7 46 9,0 38 166,6 257 7,5 101,4 127 pH Glyzinpuffer Peptonwasser pH 7,5 137 145,2 120 108,0 32 4,8 47 21,1 21,1 47 4,8 32 108,0 120 145,2 7,5 137 pH Peptonwasser Rindfleischextrakt pH pH Rindfleischextrakt pH Rindfleischextrakt

Tabelle A 5: bezüglich ihrer Elutionsmittel der Vergleich XX ANHANG: TABELLEN

TabelleA 6: Einfluss der Zentrifugalkraft auf denNachweis von Mikroorganismen aus dem Muschelfleischeluat

Zentrifugalkraft Ansätze E. coli B. fragilis M1 (KBE/0,1 ml) 8 89 M2 (KBE/0,1 ml) 2 86 unzentrifugiert M3 (KBE/0,1 ml) 30 84 Stabw 15 3 Mittelwert KBE/ml 133 86 M1 (KBE/0,1 ml) 42 101 M2 (KBE/0,1 ml) 80 96 zentrifugiert 200g M3 (KBE/0,1 ml) 40 74 Stabw 23 14 Mittelwert KBE/ml 540 90 M1 (KBE/0,1 ml) 0 100 M2 (KBE/0,1 ml) 3 102 zentrifugiert 500g M3 (KBE/0,1 ml) 0 85 Stabw 2 9 Mittelwert KBE/ml 10 96

XXI ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 7: Einfluss der Adsorptionszeit auf die Elution von Mikroorgansimen vom Muschelfleisch

E. coli B. fragilis infiz. Phagen Messungen / Adsorptionszeiten 10 min 60 min 10 min 60 min

7 5 28 36

M1 (KBE/ml bzw. PFU/ml) 0 2 4 1

70 50 28 36

5 8 35 48

M2 (KBE/ml bzw. PFU/ml) 0 0 4 1

50 80 35 48

4 0 29 37

M3 (KBE/ml bzw. PFU/ml) 0 0 5 1

40 0 29 48

Mittelwert 53 43 31 44

Stabw 12,5 33,0 3,1 5,7

XXII ANHANG: TABELLEN

Anteil / Anteil ment (%) Komparti- agen

Ph

B. fragilis infiz.B. fragilis PFU/ml PFU/ml (gemittelt)

Anteil /

ment (%) Komparti-

Phagen FRNA PFU/ml PFU/ml (gemittelt)

agen aus dem Muschelfleisch (n = 3) (n = Muschelfleisch dem aus agen Anteil / gen ment (%) Komparti-

liph o a somatische somatische C PFU/ml PFU/ml

(gemittelt)

ken Anteil / ment (%) Komparti-

ko ero k

Intestinale Intestinale nt E

KBE/ml KBE/ml (gemittelt)

Wiederfindungsrate für für Bakterien und Wiederfindungsrate Ph

Anteil / ment (%)

Komparti-

Coliforme Coliforme 4.073 100 4103 100 478 1.327 100 100 234 100 KBE/ml KBE/ml (gemittelt) S2 697 17 477 12 18 4 37 3 S2 12 3 1 477 17 697 Ü1 87 210 90 1.153 70 297 62 2857 64 2.587 Ü2 790 19 770 19 163 34 137 10 21 9 Summe der Summe der (Ü1+Ü2+S2) Kompartimente Kompartimente Kompartimente Tabelle A 8: prozentualen der Erfassung

XXIII ANHANG: TABELLEN

Phagen B. fragilis

Phagen FRNA -

Phagennachweise somatische somatische Coliphagen Coliphagen E. coli E. coli ) Clostridien Coliforme Coliforme Clostridien Intestinale Intestinale bakterielle Nachweise bakterielle Enterokokken sser der Elbe (Bakterien und Phagen der Elbe sser 37°C 37°C Koloniezahl Koloniezahl 22°C KBE/ml KBE/ml KBE/ml KBE/ml MPN/ml MPN/ml PFU/ml PFU/ml PFU/ml PFU/ml PFU/ml MPN/ml MPN/ml KBE/ml KBE/ml KBE/mlKBE/ml Koloniezahl Koloniezahl Datum 11.03.2002 270,0 08.04.2002 95,0 285,0 160,0 15.04.2002 85,0 175,0 0,6 06.05.2002 125,0 0,0 13.05.2002 225,0 125,0 0,3 0,0 0,1 100,0 95,0 0,2 47,9 0,0 0,0 03.06.2002 279,0 130,0 0,0 0,0 0,1 0,1 6,3 0,2 01.07.2002 242,0 4,3 0,0 0,1 1,1 29.07.2002 80,0 0,1 0,5 0,0 148,0 0,0 23.09.2002 505,0 0,0 0,5 0,0 4,0 0,0 21.10.2002 1.550,0 350,0 0,0 0,1 2,9 0,0 0,0 0,0 1,6 11.11.2002 595,0 1.330,0 0,1 3,0 0,0 0,8 0,7 02.12.2002 1.990,0 490,0 8,2 0,0 0,0 0,0 06.01.2003 >3000 0,0 0,8 0,1 0,0 765,0 3.480,0 6,4 0,0 27.01.2003 235,0 14,1 0,0 0,0 0,0 17.02.2003 510,0 320,0 0,0 0,2 0,0 2,2 0,1 4,1 3,0 0,0 10.03.2003 1.965,0 375,0 86,6 0,0 81,6 0,0 1,4 0,2 17,9 0,0 0,0 430,0 0,1 2,4 0,1 7,3 37,8 0,0 0,2 51,7 0,0 14,1 15,2 0,3 0,0 0,3 13,0 0,4 3,1 10,5 1,2 4,6 0,0 0,0 0,5 0,0 1,1 0,9 0,2 13,3 0,0 0,0 0,3 0,0 0,0 3,3 0,0 0,0 0,0 0,9 1,0 0,0 Mittelwert 573,9 556,3 1,3 0,1 24,3 4,3 0,4 0,1 0,0

Tabelle A 9: Hygienemonitoring im Wa

XXIV ANHANG: TABELLEN

9,1

E. coli coli E. 229,8 1,0 Clostridien Coliforme Coliforme Clostridien 17,1 Intestinale Enterokokken 37°C 24.878,0 Koloniezahl Koloniezahl aus der Elbe (Bakterien) aus der (Bakterien) Elbe 22°C 22°C KBE/g KBE/g KBE/g MPN/g MPN/g KBE/g 35.060,7 Koloniezahl (ml) (ml) Volumina Volumina Dreissena polymorpha Dreissena Begleitwerte Nachweise Feucht- Feucht- gewicht (g) (g) gewicht Muschelfleisch Eluat Eluat Muschelfleisch Datum 11.03.2002 10,6 25,0 34.551,9 24.764,2 11,8 0,0 46,5 3,8 34.551,9 6.041,7 11.03.2002 10,6 0,0 25,0 43.016,7 10.693,5 0,0 08.04.2002 12,0 7,5 164,3 0,0 29,0 4,3 11.911,8 6.393,4 2,4 0,0 0,0 36,7 8,8 0,0 7.540,3 15.04.2002 12,4 34,0 3,7 0,0 21,4 50.382,4 33.139,3 0,2 06.05.2002 10,2 18,0 9.813,0 13,0 13.05.2002 6,1 0,0 428,2 12.226,1 0,0 3,2 03.06.2002 11,5 8.950,8 37,0 0,0 632,3 8.491,8 77.381,0 01.07.2002 12,2 3.754,5 31,0 0,0 28,0 7,1 480,7 26,0 0,0 0,0 361,1 4.227,3 29.07.2002 11,0 0,0 117.000,0 20,0 0,2 31.461,9 15,9 830,4 30,8 23.09.2002 10,5 0,0 129,8 32,5 43.269,2 180,0 35,2 82.309,3 0,0 21.10.2002 11,8 37,5 28.973,0 14,4 29.423,1 11.11.2002 10,4 0,0 47.280,7 34,0 61,4 30,0 8,6 18.882,9 0,0 94,3 12,6 02.12.2002 11,1 32,0 29.121,357.105,3 0,0 11,4 06.01.2003 35,0 16.988,6 0,0 51,8 14.962,9 0,0 2,3 27.01.2003 10,1 291,0 32,5 41.250,0 0,0 2,5 13.443,2 0,0 17.02.2003 11,0 15,9 16,5 32,5 3,5 34.269,2 10.03.2003 10,4 33,0 Mittelwert Mittelwert

Tabelle A 10: Hygienemonitoring mit

XXV ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 11: Hygienemonitoring mit Dreissena polymorpha aus der Elbe (Phagen) Begleitwerte Phagennachweise

somatische FRNA - B. fragilis Muschelfleisch Eluat Datum Coliphagen Phagen Phagen

Feuchtgewicht Volumina PFU/g PFU/g PFU/g (g) (ml) 11.03.2002 10,6 25,0 67,2 37,7 2,4 08.04.2002 12,0 29,0 20,5 1,2 0,0 15.04.2002 12,4 34,0 17,8 4,1 0,0 06.05.2002 10,2 18,0 3,5 0,0 15,9 13.05.2002 6,1 13,0 0,0 20,2 0,0 03.06.2002 11,5 37,0 11,3 0,0 0,0 01.07.2002 12,2 28,0 0,0 1,1 0,0 29.07.2002 11,0 20,0 0,0 0,0 0,9 23.09.2002 10,5 32,5 32,5 4,6 1,5 21.10.2002 11,8 37,5 79,4 25,4 0,0 11.11.2002 10,4 30,0 259,6 135,6 0,0 02.12.2002 11,1 32,0 170,1 23,1 0,0 06.01.2003 11,4 35,0 279,4 122,8 0,0 27.01.2003 10,1 32,5 476,2 22,5 0,0 17.02.2003 11,0 32,5 224,5 1,5 0,0 10.03.2003 10,4 33,0 158,7 28,6 0,0 Mittelwert 112,6 26,8 1,3

XXVI ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 12: Charakterisierung der Wasserbeschaffenheit der Elbe, Neustädter Hafen

Probenahme Parameter (gemittelt) und Charakteristika, freundlicherweise von Herrn R. Kusserow zur Verfügung gestellt 11.03.2002 - Algen mäßig (Fadenalgen); Sichttiefe = 0,89 m; O2 = 14 mg/l 08.04.2002 - Algen gering; Sichttiefe = 0,80 m; O2 = 17 mg/l 15.04.2002 - Algen, O2 und Sichttiefe unverändert; NH4-N = 0,05 mg/l 06.05.2002 - Algenblüte; Sichttiefe = 0,58 m; NH4-N und O2 unverändert

13.05.2002 - Algen gering; Sichttiefe = 1,04 m; NH4-N = 0,3 mg/l, O2 = 9,1 mg/l 03.06.2002 - Algen gering; Sichttiefe = 1,47 m; O2 = 7,9 mg/l 01.07.2002 - Algenblüte; O2 = 19 mg/l; NH4-N = 0,2 mg/l, 29.07.2002 - Algenblüte; Sichttiefe = 0,72 mg/l; pH Wert 8,9; O2 = 18 mg/l; NH4-N = 0,06 mg/l; Temperatur 27°C 23.09.2002 - Algenblüte; Sichttiefe = 0,85 mg/l; pH Wert, O2 und NH4-N unverändert 21.10.2002 - Algen mäßig; Sichttiefe = 0,97 mg/l; Temperatur 5°C 11.11.2002 - Algen gering; Sichttiefe = 0,88 mg/l; Temperatur unverändert 02.12.2002 - Algen gering; Temperatur unverändert; Wind stark 06.01.2003 - Hochwasser; Eis 27.01.2003 - Algenbildung; Temperatur 3°C 17.02.2003 - Algenbildung; Eis; O2 = 11 mg/l 10.03.2003 - Algen mäßig; O2 = 13 mg/l

XXVII ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 13: Charakterisierung der Wasserbeschaffenheit des Schönungsteiches 1 der KA Reichenau

Probenahme Parameter (gemittelt) und Charakteristika (freundlicherweise von Herrn R. Kusserow zur Verfügung gestellt)

- Fadenalgen mäßig; Sichttiefe = 1,80 m; O2 = 7,3 mg/l; 25.03.2002 Temperatur 8°C; Sedimentflotation (weiße Flocken, evtl. Beggiatoa, Thiothrix) 22.04.2002 - Fadenalgenblüte; Sichttiefe unverändert; Temperatur 10°C; pH Wert 6,9; O2 = 10,5 mg/l;

27.05.2002 - Fadenalgen; Sichttiefe = 1,10 m; Temperatur 16°C; - O2 = 6,9 mg/l; NH4-N = 0,1 mg/l

- Fadenalgen; Kahmhaut; Sichttiefe = 1,80 m; O2 = 2,4 mg/l; pH 17.06.2002 Wert 6,8; NH4-N = 1,1 mg/l - stark konzentrierte Zuckerlösung in der Anlage, dadurch mögliche Beeinflussung der Belebtschlammbiologie

15.07.2002 - Fadenalgen; Sichttiefe = 0,95 m; O2 7,4; pH Wert 7,0; Temperatur 20°C; beginnendes Lemna - Wachstum

12.08.2002 - 100% Lemna; Algen vorhanden; O2 = 4,0 mg/l; pH Wert 6,8; - NH4-N = 0,2 mg/l

09.09.2002 - 100% Lemna; Sichttiefe = 1,80 m; O2 = 4,1 mg/l; - pH Wert 6,9;

- 80% Lemna; Sichttiefe unverändert; O2 = 4,3 mg/l; 07.10.2002 - pH Wert 7,0; NH4-N = 0,4 mg/l - hohe Muschelmortalitätsrate 28.10.2002 - 15% Lemna, Algen gering; Sichttiefe unverändert; - O2 = 7,5 mg/l pH Wert unverändert;

18.11.2002 - 50% Lemna; Temperatur 11°C; O2 = 5,4 mg/l; - pH Wert unverändert - Temperatur 4,6°C; 15% Lemna gefroren 09.12.2002 - Algen gering, pH Wert 6,7; - viele Enten (ca. 150) - viele Enten (ca. 150); 13.01.2003 - Temperatur 2,9°C; keine Algen; Sichttiefe 1,4 m; - O2 = 6,2 mg/l; pH Wert 7,0 - keine Algen; keine Lemna; Sichttiefe 1,0 m; Temperatur 4,0°C 03.02.2003 - O2 = 7,4 mg/l; pH Wert 6,9; - NH4- N = 1,5 mg/l - Fadenalgen vorhanden; Sichttiefe und pH Wert unverändert; 24.02.2003 - Temperatur 4,8°C; O2 = 6,9 mg/l - Enten

17.03.2003 - Fadenalgen gering; Temperatur 7,3°C; O2 = 5,6 mg/l; - pH Wert 6,8;

XXVIII ANHANG: TABELLEN

Phagen B. fragilisB. Phagen FRNA - Phagennachweise somatische Coliphagen Coliphagen E. coli Clostridien Coliforme Clostridien bakterielle Nachweise KA Reichenau Teich 1 (Bakterien und Phagen) und Phagen) (Bakterien 1 Teich KA Reichenau Intestinale Enterokokken 37°C Koloniezahl Koloniezahl 22°C KBE/ml KBE/ml KBE/ml MPN/ml PFU/ml MPN/ml KBE/ml PFU/ml PFU/ml Koloniezahl Datum 22.04.2002 3.860,0 5.220,0 13,6 0,1 130,0 48,8 0,2 0,0 48,8 0,2 7,4 866,4 655,0 1,0 0,0 0,0 130,0 5.220,0 1,9 0,1 1.095,0 0,1 13,6 4,1 464,0 2.850,0 1,0 0,0 0,0 3.860,0 7,3 241,9 0,0 0,0 0,0 0,3 0,0 25.03.2002 0,8 0,0 1.553,1 0,1 4.250,0 22.04.2002 2149,2 27.05.2002 360,0 18,5 6,0 10,1 1,6 0,0 0,0 0,0 > 0,8 0,1 435,0 0,0 0,0 4,2 0,2 0,3 0,0 0,0 17.06.2002 1.025,0 160,0 0,3 0,5 13,7 0,4 120,3 4,7 0,0 0,0 430,0 15.07.2002 > # 2.565,0 12.08.2002 0,1 0,0 79,4 0,5 2.900,0 0,1 0,0 77,0 0,5 547,5 198,6 0,0 3,3 4.420,0 09.09.2002 0,1 0,0 0,3 110,6 2.360,0 0,0 22,1 3.800,0 0,0 15,9 410,6 19.450,0 07.10.2002 # 2.810,0 0,0 4,1 28.10.2002 3.925,0 18.11.2002 0,1 0,0 12,6 1,0 1.410,0 335,0 34,4 20,5 7,3 0,4 0,1 0,0 0,9 0,8 0,5 0,0 735,0 09.12.2002 5.800,0 13.01.2003 2,1 0,0 21,4 2,1 500,0 77,0 130,20,5 0,6 0,0 0,0 1,5 325,0 03.02.2003 71,2 8,6 2.788,7227,3 180,0 1,9 4,3 0,0 11,8 0,1 0,1 5,4 340,0 24.02.2003 2.170,6 17.03.2003 Mittelwert

Tabelle A 14: der im Wasser Hygienemonitoring

XXIX ANHANG: TABELLEN

E. coli Clostridien Coliforme Coliforme Clostridien Nachweise Nachweise Intestinale Enterokokken 37°C Koloniezahl Koloniezahl in der KA Reichenau Teich 1 (Bakterien) (Bakterien) 1 der KA Reichenau Teich in 22°C 22°C KBE/g KBE/g KBE/g MPN/g KBE/g MPN/g 155.633,1 39.457,3 42,7 0,0 2.238,2 78,4 Koloniezahl

(ml) (ml) Voumina Dreissena polymorpha Dreissena Begleitwerte bakterielle bakterielle Begleitwerte Muschelfleisch Eluat Feuchtgewicht (g) Feuchtgewicht Datum Datum 25.03.2002 8,1 19,0 49.142,0 5.594,4 11,7 0,0 721,5 73,7 721,5 0,0 42,2 11,7 4.883 5.594,4 61,9 6.24345,9 1.496,2 49.142,0 0,0 69,2 0,0 13,5 19,0 2.392,1 82,4 80,4 930,1 > 25.03.2002 8,1 14.413,3 74.073,4 0,0 0,0 1.895,8 7.635,9 0,0 22.04.2002 10,1 27,3 32,7 0,0 195.779,2 88.807,3 0,0 > 27,1 1.305,6 33.208,2 52.579,4 26,3 882,5 27.05.2002 10,9 22,0 0,0 0,0 116,1 75,0 11,3 262,8 17.06.2002 4,9 242.841,132.100,0 406.168,8106.838,7 4.583,3 15.07.2002 10,7 29,0 0,0 229,2 71.100,022,5 12.08.2002 7,7 743.225,8 7.852,8 22,5 171,0 09.09.2002 7,5 5.012,5 0,0 28,9 30.402,824,0 75.206,6 131,5 07.10.2002 9,3 10.094,7 27,5 0,0 55,0 28.10.2002 9,0 170.661,2 6.027,5 18.11.2002 12,1 340.763,4 35,0 4.998,1 0,0 0,0 22,5 595,8 09.12.2002 13,1 48,0 50.378,8 13.01.2003 13,2 35,0 7.583,3 0,0 0,0 63,4 713,5 682,8 0,0 0,0 03.02.2003 10,4 28,0 56,8 888,5 332,0 35.845,6 24.02.2003 10,2 32,5 17.03.2003. 10,9 33,0 63.426,6 5.706,9 15,1 0,0 5.706,9 22,4 563,1 63.426,6 17.03.2003. 10,9 33,0 Mittelwerte Mittelwerte Tabelle A 15: Hygienemonitoring mit

XXX ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 16: Hygienemonitoring mit Dreissena polymorpha in der KA Reichenau Teich 1 (Phagen)

Begleitwerte Phagennachweise

somatische FRNA - B. fragilis Datum Muschelfleisch Eluat Coliphagen Phagen Phagen

Feuchtgewicht Volumina PFU/g PFU/g PFU/g (g) (ml)

25.03.2002 8,1 19,0 106,7 9,4 2,3

22.04.2002 10,1 27,3 18,9 4,1 0,0

27.05.2002 10,9 22,0 19,2 2,0 0,0

17.06.2002 4,9 11,3 8,1 0,0 0,0

15.07.2002 10,7 29,0 10,8 0,0 0,0

12.08.2002 7,7 22,5 80,4 10,2 0,0

09.09.2002 7,5 22,5 960,0 46,5 1,5

07.10.2002 9,3 24,0 296,8 335,5 1,3

28.10.2002 9,0 27,5 271,9 910,6 4,6

18.11.2002 12,1 35,0 124,4 8,7 0,0

09.12.2002 13,1 48,0 73,3 11,0 0,0

13.01.2003 13,2 35,0 108,7 26,5 0,0

03.02.2003 10,4 28,0 84,8 13,5 0,0

24.02.2003 10,2 32,5 79,7 22,3 0,0

17.03.2003 10,9 33,0 62,1 21,2 0,0

Mittelwerte 153,7 94,8 0,6

XXXI ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 17: Charakterisierung der Wasserbeschaffenheit des Schönungsteiches 2 der KA Reichenau

Parameter (gemittelt) und Charakteristika Probenahme (freundlicherweise von Herrn R. Kusserow zur Verfügung gestellt)

- Fadenalgen; Sedimentflotation (wie in T 1 beschrieben) 05.03.2002 - Temperatur 5,4 °C; O2 = 9,5 mg/l; pH Wert 7,0; - NH4- N = 0,1 mg/l; - Fadenalgen; Sedimentflotation 18.03.2002 - Temperatur 7,8 °C; O2 = 9,3; pH Wert 7,2; - NH4- N = 1,0 mg/l; 29.04.2002 - 20% Lemna; Fadenalgenblüte; Temperatur 11,4 °C; - O2 = 14,8 mg/l; pH Wert unverändert; NH4- N = 0,1 mg/l;

21.05.2002 - Algen mäßig; beginnendes Lemnawachstum - O2 = 9,4 mg/l; pH Wert 7,0; - Nachweislicher Einfluss des verringerten Wirkungsgrades des 24.06.2002 Belebungsbeckens: - Temperatur 18°C; O2 = 0,8 mg/l; pH 6,8; NH4- N = 1,1 mg/l - 90% Lemna; Fadenalgen; 22.07.2002 - 80% Lemna; Fadenalgen vorhanden - pH Wert 7,0; O2 = 3,1 mg/l; H2S Ausgasung;

16.09.2002 - 100% Lemna; Temperatur, O2 und pH Wert unverändert

14.10.2002 - 90% Lemna; Temperatur 10°C; O2 = 3,6 mg/l; pH Wert unverändert;

04.11.2002 - 100% Lemna; Temperatur 9°C; O2 = 4,6 mg/l; pH Wert unverändert

25.11.2002 - 50% Lemna; Temperatur, O2 und pH Wert unverändert

16.12.2002 - Temperatur 3,8°C; Lemna gefroren; 95% Eis; O2 = 5,7 mg/l - pH Wert unverändert

20.01.2003 - Temperatur 3,6°C; O2 = 5,9 mg/l; keine Eisbedeckung; - pH Wert 6,7

10.02.2003 - 50% – 100% Eis; Temperatur 3,4°C; O2 8,8 mg/l; pH Wert 7,2

04.03.2003 Temperatur 5,7°C; pH 6,9; keine Eisbedeckung

XXXII ANHANG: TABELLEN

Phagen

B. fragilis Phagen FRNA - Phagennachweise somatische Coliphagen Coliphagen E. coli Clostridien Coliforme Coliforme Clostridien Intestinale KA Reichenau Teich 2 (Bakterien und Phagen) und Phagen) (Bakterien 2 Teich KA Reichenau bakterielle Nachweise Enterokokken 37°C Koloniezahl Koloniezahl 22°C KBE/ml KBE/ml KBE/ml KBE/ml MPN/ml MPN/ml PFU/ml PFU/ml PFU/ml PFU/ml PFU/ml PFU/ml MPN/ml MPN/ml KBE/ml KBE/ml KBE/ml KBE/ml Koloniezahl Datum Datum 05.03.2002 840,0 840,0 05.03.2002 510,0 1.025,0 18.03.2002 930,0 6,9 7,9 160,0 29.04.2002 0,0 95,0 77,0 0,1 1.470,0 21.05.2002 15,3 1,5 72,7 975,0 1,0 24.06.2002 150,0 7,1 150,0 0,0 0,5 0,2 22.07.2002 495,0 0,1 8,7 21,9 505,0 0,0 0,0 2,4 16.09.2002 1.965,0 0,5 0,0 1.110,0 0,2 0,0 0,1 13,9 14.10.2002 2.780,0 0,0 1.715,0 0,0 120,3 2,5 2,0 26,1 3.100,0 04.11.2002 0,0 15,1 2.200,0 0,2 2,0 1,2 385,0 25.11.2002 0,0 0,0 500,0 0,0 9,6 0,0 0,0 16.12.2002 335,0 6,8 0,0 0,0 14,1 266,0 290,9 20.01.2003 2.150,0 1,5 4,1 0,0 0,0 0,0 1.570,0 4,9 83,0 77,0 365,4 10.02.2003 4.200,0 22,5 0,0 15,1 4.250,0 0,0 0,3 46,1 0,0 22,8 0,7 04.03.2003 710,0 28,0 510,0 6,3 0,2 0,0 0,0 1.405,0 2,4Mittelwert 0,4 0,1 0,5 1.098,6 0,0 130,0 0,0 0,1 0,0 0,3 0,0 0,0 7,8 48,8 290,9 24,8 0,0 112,0 1,5 0,0 2,9 0,0 0,1 0,1 110,6 0,0 0,2 0,0 25,4 0,0 0,5 0,4 1,0 0,1 0,2

Tabelle A 18: der im Wasser Hygienemonitoring

XXXIII ANHANG: TABELLEN

E. coli coli E. Clostridien Coliforme Coliforme Clostridien Nachweise Intestinale Enterokokken 37°C Koloniezahl in der KA Reichenau Teich 2 (Bakterien) (Bakterien) 2 der KA Reichenau Teich in 22°C KBE/g KBE/g KBE/g KBE/g MPN/g MPN/g MPN/g KBE/g KBE/g KBE/g KBE/g 88.226,1 18.389,2 91,9 1,0 1.258,0 77,4 Koloniezahl

(ml) (ml) Volumina Volumina Dreissena polymorpha Dreissena Begleitwerte bakterielle Muschelfleisch Eluat Feuchtgewicht (g) Feuchtgewicht Datum 05.03.2002 10,3 28,0 15.087,4 3.235,0 40,8 05.03.2002 10,3 15.087,4 152,3 21.861,4 0,0 173,2 23,1 1.112,2 28,0 91,1 0,0 18.03.2002 10,1 52.376,2 23,0 2.877,0 22,1 29.04.2002 12,2 74.028,7 0,0 180,6 27,0 8.333,324,3 6,9 392,4 21.05.2002 12,0 12.733,3 1.155,2 63,2 10.357,9 0,0 19.903,2 0,0 1,3 16,0 59,9 0,0 95,4 0,0 486,7 24.06.2002 14,2 77.816,96.094,3 332,0 9,386.147,4 42,5 4.038,9 122,7 0,0 22.07.2002 9,5 24,0 28.534,1 137,3 471,4 0,0 60.857,1 16.09.2002 11,0 1.149,1 40.806,8 34,0 158,4 0,0 14.10.2002 8,8 186.857,1 27,0 10.825,8 26,1 29.518,2 272,5 61,8 26,7 17.333,3 0,0 04.11.2002 0,0 8,4 662,1 26,3 # 24,0 33,0 21.387,6 396,8 13,6 25.11.2002 8,9 242.666,7 40,9 23,5 8.727,3 200,6 698,9 16.12.2002 7,5 245.454,5 84,5 20,0 15.633,8 0,0 15,1 799,8 20.01.2003 8,8 43,5 24,0 19.451,6 0,0 33.802,8 10.02.2003 7,1 20,0 57.774,2 04.03.2003 6,2 18,0 Mittelwerte

Tabelle A 19: Hygienemonitoring mit

XXXIV ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 20: Hygienemonitoring mit Dreissena polymorpha in der KA Reichenau Teich 2 (Phagen)

Begleitwerte Phagennachweise

somatische FRNA - B. fragilis Muschelfleisch Eluat Datum Coliphagen Phagen Phagen

Feuchtgewicht Volumina PFU/g PFU/g PFU/g (g) (ml) 05.03.2002 10,3 28,0 63,9 95,1 9,5 18.03.2002 10,1 23,0 637,6 21,6 4,6 29.04.2002 12,2 27,0 44,3 19,9 0,0 21.05.2002 12,0 16,0 2,7 1,3 0,0 24.06.2002 14,2 42,5 0,0 1,5 0,0 22.07.2002 9,5 24,0 2,5 3,8 1,3 16.09.2002 11,0 34,0 231,8 26,3 0,0 14.10.2002 8,8 27,0 79,8 191,8 1,5 04.11.2002 8,4 24,0 118,6 # 2,9 25.11.2002 8,9 23,5 871,3 158,4 0,0 16.12.2002 7,5 20,0 309,3 133,3 0,0 20.01.2003 8,8 24,0 1.663,6 30,0 2,7 10.02.2003 7,1 20,0 732,4 73,2 0,0 04.03.2003 6,2 18,0 114,7 1,5 0,0 Mittelwerte 348,0 58,3 1,6

XXXV ANHANG: TABELLEN

0,8 0,9 koeffizient

Korrelations-

zum keine <0,8 keine somat. somat. Wasser: Coliforme 0,8 Coliforme korreliert signifikant signifikant Coliphagen Coliphagen KA Rei T2 T2 Rei KA Nachweis im im Nachweis

E. coli E. coli somat. Phagen und dem Umgebungswasser dem Umgebungswasser und polymorpha Dreissena B. fragilis B. fragilis Coliphagen Nachweis in Nachweis der Muschel Muschel der 0,9 FRNA Ph. keine keine Ph. <0,8 0,9 FRNA 0,8 0,9 0,8 Enterokokken keine keine 0,8 Enterokokken <0,8 0,8 koeffizient Korrelations-

zum E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli Phagen Wasser: Wasser: B. fragilis B. fragilis korreliert signifikant signifikant KA Rei T1 T1 Rei KA Nachweis im

E. coli E. coli E. coli somat. Phagen B. fragilis B. fragilis Coliphagen Nachweis in der Muschel Muschel der 0,9 FRNA Ph. 0,9 FRNA 0,9 Enterokokken 0,9 Enterokokken 0,8 ionskoeffizienten für den Nachweis ausgewählter Mikroorganismen in in Mikroorganismen ausgewählter Nachweis den für ionskoeffizienten koeffizient Korrelations- ,

; zum Elbe Elbe keine <0,8keine keine <0,8keine E. coli E. coli E. coli E. coli Wasser: Coliforme korreliert signifikant signifikant Nachweis im im Nachweis Enterokokken, Enterokokken

E. coli E. coli somat. FRNA Phagen Phagen Phagen KZ 22°C 22°C KZ 37°C KZ keine keine <0,8 <0,8 22°C KZ 37°C KZ keine keine <0,8 <0,8 22°C KZ 37°C KZ keine keine <0,8 <0,8 B. fragilis Coliforme Keine <0,8 Coliforme KZ 37°C 0,9 Coliforme keine Coliforme Keine <0,8 <0,8KZ Coliforme Clostridien FRNA Phagen Phagen FRNA Clostridien 0,9 Clostridien keine <0,8 Clostridien Coliphagen Nachweis in Nachweis der Muschel Muschel der Enterokokken Enterokokken

Tabelle A 21: der Korrelat Auswertung XXXVI ANHANG: TABELLEN

x )

0h )/t 12 (%) 100 24h 870 -t 0h Entwicklung: ((t

24h 24h

/ t / 0 h (gerundet) t Verhältnis Verhältnis 20°C 20°C Summe Summe (KBE/ml) (KBE/ml) Blindbecken, t=0 t=24 20°C 20°C (KBE/ml) (KBE/ml) Blindbecken, Blindbecken, x x ) 0h )/t (%) 100 24h -77 484 -32 -t 0h Entwicklung: Entwicklung: ((t

24h 24h / t / 0 h (gerundet) t Verhältnis Verhältnis kken in Batchversuchen bei 20°C 20°C bei in Batchversuchen kken Summe Summe Muschel- (KBE/ml) (KBE/ml) becken, 20°C becken, 20°C Muschel- (KBE/ml) (KBE/ml) becken, 20°C becken, 20°C

1 40 10 4 75 5 6 1 - -4 1 1 6 75 5 5 4 5 10 -9 1 40 1 2 5 40 5 80 82 110 22 7 3 5 5 4 1.080 97 33 33 160 900 99 6 5 -2236 860 121 6 42.281 7 86 0 5.180 508 3.990 10 90 850 213 4 # 1.810 7 1.350 75 # 95 -1811-910 63 21 66.693 0 57.333 0 # 8 2.140 192 3.000 11 91 6.600 100 327 9 4.600 14 10 8.900 379 23 96 9.200 4.800 2 8.900 379 10 9.200 48 23 96 22.752 -168 4.450 0 11 8.600 2 48 8.500 (-1) (-1) Mittelwert Mittelwert Stabw (-1) Versuchs Nr.Versuchs t=0 t=24 Tabelle A 22: Elimination von Enteroko

XXXVII ANHANG: TABELLEN

x )

0h )/t 0 15 23 48 (%) 100 24h

154 -t 0h Entwicklung: ((t

24h 24h

/ t / 0 h (gerundet) t Verhältnis Verhältnis 6°C 6°C Summe (KBE/ml) (KBE/ml) Blindbecken, Blindbecken, 6°C 6°C (KBE/ml) (KBE/ml) Blindbecken, x x ) 0h )/t 100 24h -61 -49 -t 0h Entwicklung: Entwicklung: ((t

(%) t=0 t=24

24h 24h / t / 0 h (gerundet) t Verhältnis Verhältnis Summe Muschel- (KBE/ml) (KBE/ml) becken, 6°C Muschel- (KBE/ml) (KBE/ml) becken, 6°C

3 5 5 1 -2 10 # # # 2 # 5 10 -7 # 1 1 261 10 11 260 -2 95 19 1 10 1 1 764 14 2 270 900 5 -13 1 3 5 891 2 45 542 4 790 990 2 50 501 1.000 2 38 1.321 5 -426 3.737 0 2 58 15 2.480 93 2.130150 710 6 2.230 67 99 5.900 25 # 1.660 55 98 7 # 6.300 108 5.900 # 8 # 7.400 9 10 8400 8.076 324 1 107 26 -30 11 7.700 6.200 99 72 96 10000 5650 2 44 Stabw (-1) (-1) Stabw Versuchs Nr. Versuchs t=0 t=24 Mittelwert (-1) Tabelle A 23: 6°C bei in Batchversuchen von Enterokokken Elimination

XXXVIII ANHANG: TABELLEN

x )

0h )/t -14 -14 -42 -42 100 24h -t 0h Entwicklung: ((t

(%) 24h / t / 0 h (gerundet) t

Verhältnis

C 20°

Summe Summe (PFU/ml) (PFU/ml) Blindbecken, Blindbecken,

20°C 20°C (PFU/ml) (PFU/ml)

Blindbecken,

x ) 0h -5 -5 )/t h -31 100 24 -t

0h t Entwicklung: Entwicklung: ((

(%) t=0 t=24 24h 24h / t / 0 h (gerundet) t Verhältnis Verhältnis Coliphagenin Batchversuchen20°C bei Summe Summe Muschel- (PFU/ml) (PFU/ml) becken, 20°C becken, 20°C Muschel- (PFU/ml) (PFU/ml) becken, 20°C

3 1.800 2.262 1 -26 900 1.478 1 -64 1.478 1 900 1 -26 2.262 1 21 9 7 1 9 2 43 5 2 -52 8 1.800 36 6 9 1 5 2 3 87 4 40 # 51 2 # 85 5 48 1 58 18 76 62 1 19 6 58 -18 59 37 1 2 49 37 7 22 2 38 42 65 27 2 58 8 35 1 39 10 39 53 -35 1 9 39 1 43 10 33 28 1 16 Stabw (-1) (-1) Stabw Versuchs Nr.Versuchs t=0 t=24 Mittelwert (-1) (-1) Mittelwert

Tabelle A 24: Elimination von somatischen XXXIX ANHANG: TABELLEN

) 0h

)/t 38 22 23 80 98 45 24h -t x 100 x 0h ((t Entwicklung:

24h 24h

/ t / 0 h (gerundet) t Verhältnis Verhältnis 6°C 6°C Summe Summe (PFU/ml) (PFU/ml) Blindbecken, 6°C 6°C (PFU/ml) (PFU/ml) Blindbecken,

) 0h )/t 2 39 30 24h -t x 100 x 0h ((t Entwicklung: Entwicklung:

24h 24h / t / 0 h (gerundet) t Verhältnis Verhältnis Coliphagen in Batchversuchen bei 6°C 6°C 6°C Summe becken, Muschel- (PFU/ml) (PFU/ml) 6°C 6°C becken, Muschel- (PFU/ml) (PFU/ml)

1 11 13 1 -16 7 7 1 5 -16 7 7 1 - 1 13 11 36 9 2 1 11 -8 1 6 99 92 2 10 - 1 10 2.820 1 1.400 1 - 22 74 1 3 3.600 82 51 # 1 52 5 43 # -37 4 91 71 1 # - 5 75 1 # 52 # 53 48 # # 27 # - -50 6 38 1 1 # 70 39 7 59 14 45 1 8 30 41 9 47 (-1) (-1) Mittelwert Mittelwert Stabw (-1) (-1) Stabw Versuchs Nr. Nr. Versuchs t=0 t=24 (%) t=0 t=24 (%) Tabelle A 25: Elimination von somatischen

XL ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 26: Konzentration der Enterokokken im Muschel- und Kontrollsediment in situ (Elbe) Ansatz Enterokokken (KBE/g) Muschelsediment Kontrollsediment 30.07.2003 I 8.400 4.600 II 69.000 2.800 06.08.2003 I 1.800 22.000 II 3.100 4.300 13.08.2003 I 4.200 6.100 II 5.700 1.800 Mittelwert 15.367 6.933 Stabw. 26.373 7.530

Tabelle A 27: Konzentration der somatischen Coliphagen im Muschel- und Kontrollsediment in situ (Elbe) Ansatz somatische Coliphagen (PFU/g) Muschelsediment Kontrollsediment 30.07.2003 I 10 1 II 8 0 06.08.2003 I 3 0 II 1 0 13.08.2003 I 4 2 II 0 0 Mittelwert 4 1 Stabw. 4 1

Tabelle A 28: Konzentration der FRNA Phagen im Muschel- und Kontrollsediment in situ (Elbe) Ansatz FRNA Phagen (PFU/g) Muschelsediment Kontrollsediment 30.07.2003 I 14 4 II 15 3 06.08.2003 I 3 0 II 1 1 13.08.2003 I 1 0 II 0 1 Mittelwert 6 2 Stabw. 7 2

XLI ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 29: 16S rRNA Klonierung Muschel I (n = 102) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 1 Mycoplasma gypis AF125589 88% Mycoplasmataceae; Mycoplasma. uncultured 2 AY135874 89% Bacteria; environmental samples. bacterium cellular organisms; Bacteria; uncultured 3 AJ536878 91% unclassified Bacteria; environmental bacteria samples uncultured 4 bacterium GR- AJ296579 92% Bacteria; environmental samples Sh1-209 uncultured Bacteria; Bacteroidetes; 5 AF298766 92% bacterium PL1 environmental samples. uncultured 6 bacterium GR- AJ296579 91% Bacteria; environmental samples Sh1-209 Bacteria; Firmicutes; Bacillales; 7 Bacillus silvestris AY167818 89% Bacillaceae; Bacillus uncultured 8 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 9 AF412986 92% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma uncultured Bacteria; Actinobacteria; 10 AY038742 93% actinobacterium environmental samples uncultured 11 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 12 AJ536878 91% Bacteria; environmental samples bacterium Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 13 AF412986 93% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma uncultured 14 bacterium GR- AJ296579 92% Bacteria; environmental samples Sh1-209 Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 15 AF412975 94% columborale Mycoplasmataceae; Mycoplasma uncultured Bacteria; Actinobacteria; 16 AY038742 93% actinobacterium environmental samples uncultured 17 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 18 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 19 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium

XLII ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 29: 16S rRNA Klonierung Muschel I (n = 102) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. uncultured 20 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 21 AF365480 91% Bacteria; environmental samples. bacterium uncultured Gram- 22 AF289150 96% uncultured Gram-positive bacterium positive bacterium Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 23 Y14581 94% Paenibacillaceae;Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus uncultured 24 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 25 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 26 bacterium GR- AJ296579 92% Bacteria; environmental samples Sh1-209 uncultured 27 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 28 bacterium GR- AJ296579 92% Bacteria; environmental samples Sh1-209 uncultured 29 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 30 bacterium GR- AJ296579 92% Bacteria; environmental samples Sh1-209 uncultured 31 AJ412672 96% Bacteria; environmental samples eubacterium uncultured 32 bacterium GR- AJ296579 92% Bacteria; environmental samples Sh1-209 uncultured 33 AF365480 91% Bacteria; environmental samples bacterium Bacillus sp. Bacteria; Firmicutes; Bacillales; 34 'Smarlab BioMol- AY230764 93% Bacillaceae; Bacillus 2301283' Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 35 AF412975 95% columborale Mycoplasmataceae; Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridium 36 AB045291 96% Clostridiales; Clostridiaceae; perfringens Clostridium Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 37 Y14581 94% Paenibacillaceae;Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus

XLIII ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 29: 16S rRNA Klonierung Muschel I (n = 102) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. uncultured 38 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 39 AF365480 91% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 40 Y14581 94% Paenibacillaceae;Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus uncultured 41 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 42 Y14581 94% Paenibacillaceae;Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus uncultured 43 AF018039 99% Bacteria; environmental samples bacterium O8SA uncultured 44 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 45 AY221045 98% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 46 AF018039 99% Bacteria; environmental samples bacterium O8SA uncultured 47 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 48 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 49 AF018039 99% Bacteria; environmental samples bacterium O8SA uncultured Bacteria; Actinobacteria; 50 AY038742 93% actinobacterium environmental samples uncultured 51 AF018039 99% Bacteria; environmental samples bacterium O8SA Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 52 AF412986 92% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma uncultured 53 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Proteobacteria; Methylobacterium Alphaproteobacteria; Rhizobiales; 54 Z23158 99% sp. PC30.39 Methylobacteriaceae; Methylobacterium uncultured 55 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 56 bacterium GR- AJ296579 92% Bacteria; environmental samples Sh1-209

XLIV ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 29: 16S rRNA Klonierung Muschel I (n = 102) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Weissella Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 57 AB022926 92% halotolerans Weissella Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 58 AF412986 92% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 59 AF412986 92% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 60 AF412986 92% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 61 AF141478 96% Betaproteobacteria; environmental proteobacterium samples Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 62 AF412986 92% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 63 AF141478 96% Betaproteobacteria; environmental proteobacterium samples Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 64 AF412986 92% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 65 AF412986 92% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 66 AF412986 92% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 67 AF141478 97% Betaproteobacteria; environmental proteobacterium samples Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 68 Y14581 94% Paenibacillaceae;Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus Enterococcus Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 69 X55133 94% sulfureus Enterococcaceae; Enterococcus Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 70 AF412986 92% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 71 Y14581 94% Paenibacillaceae;Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus uncultured 72 AF018039 99% Bacteria; environmental samples bacterium O8SA uncultured Bacteria; Actinobacteria; 73 AY038742 94% actinobacterium environmental samples uncultured Bacteria; Actinobacteria; 74 AY038742 93% actinobacterium environmental samples Enterococcus Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 75 X55133 96% sulfureus Enterococcaceae; Enterococcus

XLV ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 29: 16S rRNA Klonierung Muschel I (n = 102) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. uncultured 76 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Actinobacteria; Mycobacterium Actinobacteridae; 77 AF547943 99% madagascariense Actinomycetales;Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium Bacteria; Firmicutes; Clostridia; uncultured 78 AB064872 99% Clostridiales; Clostridiaceae; Clostridium sp. Clostridium; environmental samples uncultured 79 AF365480 91% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Proteobacteria; Hyphomicrobium Alphaproteobacteria; Rhizobiales; 80 Y14303 92% hollandicum Hyphomicrobiaceae; Hyphomicrobium Bacteria; Firmicutes; Clostridia; uncultured 81 AB064872 99% Clostridiales; Clostridiaceae; Clostridium sp Clostridium; environmental samples uncultured 82 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Proteobacteria; 83 Ralstonia eutropha AB015605 89% Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Ralstonia Weissella Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 84 AB022926 92% halotolerans Weissella uncultured 85 AY135874 87% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 86 AF371700 95% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 87 Y14581 94% Paenibacillaceae;Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus uncultured 88 AY135874 88% Bacteria; environmental samples bacterium Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 89 U58997 93% hyopharyngis Mycoplasmataceae; Mycoplasma Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 90 AF412975 95% columborale Mycoplasmataceae; Mycoplasma Bacteria; Proteobacteria; uncultured alpha 91 AB089096 97% Alphaproteobacteria; environmental proteobacterium samples alpha Bacteria; Proteobacteria; 92 proteobacterium AF530148 90% Alphaproteobacteria MGP-68

XLVI ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 29: 16S rRNA Klonierung Muschel I (n = 102) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. uncultured 93 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 94 AF365480 91% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 95 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 96 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 97 AY135874 87% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 98 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 99 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 100 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 101 AF412986 92% mustelae Mycoplasmataceae; Mycoplasma uncultured 102 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium

XLVII ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 30: 16S rRNA Klonierung Muschel II (n = 90) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 1 Y14581 94% Paenibacillaceae;Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus Bacteria; Proteobacteria; Anaplasma 2 AF414869 86% Alphaproteobacteria; Rickettsiales; centrale Anaplasmataceae; Anaplasma Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 3 AF412975 95% columborale Mycoplasmataceae; Mycoplasma PAH-contaminated Bacteria; Proteobacteria; 4 sludge bacterium AF441315 86% Betaproteobacteria; Burkholderiales; PB-20 Burkholderiaceae; Rastonia uncultured Bacteria; Actinobacteria; 5 AY038742 93% actinobacterium environmental samples alpha Bacteria; Proteobacteria; 6 proteobacterium AF530148 90% Alphaproteobacteria MGP-68 Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 7 Y14581 94% Paenibacillaceae;Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 8 Lactobacillus iners AY283274 95% Lactobacillaceae; Lactobacillus marine bacterium 9 AF359549 94% Bacteria. SCRIPPS_426 marine bacterium 10 AF359549 94% Bacteria. SCRIPPS_426 uncultured Bacteria; Proteobacteria; 11 AY193164 94% proteobacterium environmental samples uncultured Bacteria; Proteobacteria; 12 AY193164 94% proteobacterium environmental samples Enterococcus Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 13 X55133 97% sulfureus Enterococcaceae; Enterococcus Enterococcus Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 14 X55133 96% sulfureus Enterococcaceae; Enterococcus Bacteria; Proteobacteria; Nitrosospira sp. Betaproteobacteria; 15 AY123796 87% L115 Nitrosomonadales; Nitrosomonadaceae; Nitrosospira Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; Acholeplasma 16 AF412968 96% Acholeplasmatales; axanthum Acholeplasmataceae; Acholeplasma Bacillus sp. Bacteria; Firmicutes; Bacillales; 18 'Smarlab BioMol- AY230764 95% Bacillaceae; Bacillus 2301283'

XLVIII ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 30: 16S rRNA Klonierung Muschel II (n = 90) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Enterococcus Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 19 X55133 95% sulfureus Enterococcaceae; Enterococcus Bacteria; Proteobacteria; Anaplasma Alphaproteobacteria; Rickettsiales; 21 AY281804 86% phagocytophilum Anaplasmataceae; Anaplasma; phagocytophilum group endosymbiont of Acanthamoeba sp. 22 AF215634 91% Bacteria (Hungarian isolate) uncultured Bacteria; Actinobacteria; 23 bacterium ARFS- AJ277698 93% environmental samples 32 uncultured 24 AY081988 99% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Proteobacteria; Anaplasma 25 AF414869 87% Alphaproteobacteria; Rickettsiales; centrale Anaplasmataceae; Anaplasma Bacteria; Proteobacteria; uncultured gamma 26 AF141558 97% Gammaproteobacteria; proteobacterium environmental; samples Bacteria; Proteobacteria; Anaplasma 27 AF414869 87% Alphaproteobacteria; Rickettsiales; centrale Anaplasmataceae; Anaplasma uncultured 28 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 29 AY081988 99% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Proteobacteria; uncultured alpha 30 AF141495 100% Alphaproteobacteria; environmental proteobacterium samples uncultured 31 AF513088 99% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Actinobacteria; Renibacterium Actinobacteridae; Actinomycetales; 32 AF180950 98% salmoninarum Micrococcineae; Micrococcaceae; Renibacterium Terasakiella Bacteria; Proteobacteria; 33 AB006768 91% pusilla Alphaproteobacteria; Terasakiella Bacteria; Firmicutes; Clostridia; uncultured 34 AB064872 99% Clostridiales; Clostridiaceae; Clostridium sp. Clostridium; environmental samples uncultured 36 AF388344 99% Bacteria; environmental samples bacterium

XLIX ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 30: 16S rRNA Klonierung Muschel II (n = 90) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. uncultured 37 AB099796 100% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Proteobacteria; uncultured alpha 38 AF141495 100% Alphaproteobacteria; environmental proteobacterium samples uncultured Bacteria; Actinobacteria; 39 AY038742 94% actinobacterium environmental samples Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridium 40 AJ506120 96% Clostridiales; Clostridiaceae; bowmanii Clostridium; Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 42 AY191226 82% gypsbengalensis Mycoplasmataceae; Mycoplasma Bacteria; Proteobacteria; Anaplasma 43 AF414869 87% Alphaproteobacteria; Rickettsiales; centrale Anaplasmataceae; Anaplasma Bacteria; Proteobacteria; uncultured alpha 44 AF141495 100% Alphaproteobacteria; environmental proteobacterium samples uncultured 45 AY081988 99% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured Bacteria; Actinobacteria; 46 AY038742 93% actinobacterium environmental samples uncultured 47 AY135874 89% Bacteria; environmental samples bacterium Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 48 AF412975 95% columborale Mycoplasmataceae; Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 49 Y14581 94% Paenibacillaceae; Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus uncultured Bacteria; Actinobacteria; 50 AY038742 93% actinobacterium environmental samples Bacteria; Proteobacteria; Anaplasma 51 AF414869 87% Alphaproteobacteria; Rickettsiales; centrale Anaplasmataceae; Anaplasma Bacteria; Proteobacteria; Anaplasma 52 AF414869 87% Alphaproteobacteria; Rickettsiales; centrale Anaplasmataceae; Anaplasma endosymbiont of Acanthamoeba sp. 53 AF215634 93% Bacteria. (Hungarian isolate) Bacteria; Proteobacteria; Ehrlichia sp. 54 AF170727 95% Alphaproteobacteria; Rickettsiales; CATE Anaplasmataceae; Ehrlichia

L ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 30: 16S rRNA Klonierung Muschel II (n = 90) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 55 Y14581 94% Paenibacillaceae; Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus Ehrlichia sp. 56 AF170727 95% Bacteria. CATE Leuconostoc Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 57 AF360736 89% ficulneum Leuconostoc uncultured 58 AY081988 99% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured Bacteria; Actinobacteria; 59 AY038742 93% actinobacterium environmental samples uncultured 60 AJ306761 99% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 61 AF513088 99% Bacteria; environmental samples bacterium Ehrlichia sp. 62 AF170727 95% Bacteria. CATE Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridium 64 AJ506120 96% Clostridiales; Clostridiaceae; bowmanii Clostridium uncultured 65 AF513088 99% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured 66 AY147280 100% Bacteria; environmental samples bacterium Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Oxalophagus 68 Y14581 93% Paenibacillaceae; Aneurinibacillus oxalicus group; Oxalophagus Dolosicoccus Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 69 AJ012666 96% paucivorans Aerococcaceae; Dolosicoccus Ehrlichia sp. 70 AF170727 95% Bacteria. CATE uncultured Bacteria; Actinobacteria; 71 bacterium ARFS- AJ277698 95% environmental samples 32 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridium 72 X73445 97% Clostridiales; Clostridiaceae; paraputrificum Clostridium Bacteria; Proteobacteria; uncultured gamma 73 AF141558 98% Gammaproteobacteria; environmental proteobacterium samples Bacteria; Actinobacteria; Mycobacterium Actinobacteridae; Actinomycetales; 75 AF498656 98% aichiense Corynebacterineae; Mycobacteriaceae; Mycobacterium

LI ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 30: 16S rRNA Klonierung Muschel II (n = 90) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. uncultured 76 AF418956 98% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured Bacteria; Actinobacteria; 78 AY038742 93% actinobacterium environmental samples uncultured 79 AY147280 99% Bacteria; environmental samples bacterium uncultured Gram- 80 AF289150 97% Bacteria; environmental samples positive bacterium Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridium 81 AJ506120 96% Clostridiales; Clostridiaceae; bowmanii Clostridium marine bacterium 82 AF359549 92% Bacteria SCRIPPS_426 uncultured 83 bacterium GR-Sh1- AJ296579 92% Bacteria; environmental samples 209 Bacteria; Actinobacteria; Renibacterium Actinobacteridae; Actinomycetales; 84 AF180950 98% salmoninarum Micrococcineae; Micrococcaceae; Renibacterium Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 85 AF412975 95% columborale Mycoplasmataceae; Mycoplasma Enterococcus Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 86 X55133 96% sulfureus Enterococcaceae; Enterococcus uncultured 87 AY081988 94% Bacteria; environmental samples. bacterium Bacteria; Proteobacteria; Anaplasma 88 AF414869 87% Alphaproteobacteria; Rickettsiales; centrale Anaplasmataceae; Anaplasma Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 89 Weissella kimchii AY244625 92% Weissella Weissella Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 90 AB022926 92% halotolerans Weissella Weissella Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 91 AB022926 92% halotolerans Weissella uncultured Bacteria; Actinobacteria; 92 bacterium ARFS- AJ277698 96% environmental samples 32 uncultured Bacteria; Actinobacteria; 93 bacterium ARFS- AJ277698 95% environmental samples 33 endosymbiont of Acanthamoeba sp. 94 AF215634 93% Bacteria (Hungarian isolate)

LII ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 30: 16S rRNA Klonierung Muschel II (n = 90) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Weissella Bacteria; Firmicutes; Lactobacillales; 95 AB022926 92% halotolerans Weissella Bacteria; Actinobacteria; Renibacterium Actinobacteridae; Actinomycetales; 96 AF180950 97% salmoninarum Micrococcineae; Micrococcaceae; Renibacterium Mycoplasma Bacteria; Firmicutes; Mollicutes; 97 AF412975 95% columborale Mycoplasmataceae; Mycoplasma. Bacteria; Proteobacteria; uncultured alpha 98 AY186195 90% Alphaproteobacteria; environmental proteobacterium samples

LIII ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 31: 16S rRNA Klonierung Wasser (n = 88) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. unidentified 1 AF010082 95% Bacteria; environmental samples eubacterium Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 2 Cytophagales AF141451 99% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 3 Cytophagales AF141451 99% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 4 Cytophagales AF141451 99% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples 5 uncultured bacterium AY135874 91% Bacteria; environmental samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 6 Cytophagales AF141451 99% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples 7 uncultured bacterium AY135874 92% Bacteria; environmental samples uncultured Crater 8 Lake bacterium AF316660 99% Bacteria; environmental samples CL500-17 Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 10 Cytophagales AF289153 93% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 11 Cytophagales AF141451 99% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 12 Cytophagales AF141451 98% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacterium sp. 13 AF493663 96% Flavobacteria; Flavobacteriales; EP328 Flavobacteriaceae; Flavobacterium unidentified 14 AJ009712 95% Bacteria. eubacterium K66

LIV ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 31: 16S rRNA Klonierung Wasser (n = 88) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. uncultured Crater 15 Lake bacterium AF316660 99% Bacteria; environmental samples CL500-17 Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 16 Cytophagales AF289153 93% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples uncultured Bacteria; Bacteroidetes; 17 Bacteroidetes AY038777 98% environmental samples bacterium Bacteria; Proteobacteria; Comamonadaceae Betaproteobacteria; 18 AJ556799 98% bacterium MWH55 Burkholderiales; Comamonadaceae Bacteria; Proteobacteria; uncultured bacterium 19 AJ290030 97% Betaproteobacteria; environmental GKS2-187 samples Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 20 AF141461 99% Betaproteobacteria; proteobacterium environmental; samples Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 21 AF361193 99% Betaproteobacteria; proteobacterium environmental; samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 22 Cytophagales AF141451 98% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 23 AF361193 99% Betaproteobacteria; proteobacterium environmental; samples Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 24 AF141461 99% Betaproteobacteria; proteobacterium environmental; samples 26 uncultured bacterium AY274139 90% Bacteria; environmental samples Bacteria; Proteobacteria; Comamonadaceae Betaproteobacteria; 27 AJ556799 99% bacterium MWH55 Burkholderiales; Comamonadaceae Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 28 AF141461 99% Betaproteobacteria; proteobacterium environmental; samples 29 uncultured bacterium AY135874 92% Bacteria; environmental samples

LV ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 31: 16S rRNA Klonierung Wasser (n = 88) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 30 AF141461 99% Betaproteobacteria; proteobacterium environmental; samples uncultured Bacteria; Firmicutes; Clostridia; 33 Clostridiaceae AB089003 88% Clostridiales; Clostridiaceae; bacterium environmental samoles Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; uncultured bacterium 34 AF107509 99% Pseudonocardineae; SY2-33 Pseudonocardiaceae; Pseudonocardia; environmental samples Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacterium 36 AF433173 96% Flavobacteria; Flavobacteriales; xinjiangense Flavobacteriaceae; Flavobacterium Bacteria; Proteobacteria; beta proteobacterium Betaproteobacteria; 37 AF408397 100% JS666 Burkholderiales; Comamonadaceae Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 38 Cytophagales AF141451 99% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 39 AF361193 99% Betaproteobacteria; environmental proteobacterium samples Bacteria; Proteobacteria; beta proteobacterium Betaproteobacteria; 40 AF408397 100% JS666 Burkholderiales; Comamonadaceae Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 41 AF361201 99% Betaproteobacteria; environmental proteobacterium samples uncultured Bacteria; Actinobacteria; 42 AY193123 100% actinobacterium environmental samples 43 uncultured bacterium AY135874 91% Bacteria; environmental samples Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacterium sp. 44 AF493663 98% Flavobacteria; Flavobacteriales; EP328 Flavobacteriaceae; Flavobacterium

LVI ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 31: 16S rRNA Klonierung Wasser (n = 88) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; uncultured bacterium 45 AF107509 98% Pseudonocardineae; SY2-33 Pseudonocardiaceae; Pseudonocardia; environmental samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 46 Cytophagales AF141451 99% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples uncultured 47 AF010082 95% Bacteria; environmental samples eubacterium Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 48 Cytophagales AF141451 99% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; uncultured bacterium 50 AF107509 99% Pseudonocardineae; SY2-33 Pseudonocardiaceae; Pseudonocardia; environmental samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 52 Cytophagales AF141451 98% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 53 Cytophagales AF141451 99% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples 54 uncultured bacterium AY135874 90% Bacteria; environmental samples Flavobacteriales Bacteria; Bacteroidetes; 55 AY145539 99% bacterium CF-1 Flavobacteria Bacteria; Proteobacteria; Comamonadaceae Betaproteobacteria; 56 AJ556799 98% bacterium MWH55 Burkholderiales; Comamonadaceae Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; 57 Caulobacter henricii AJ227758 96% Caulobacterales; Caulobacteraceae; Caulobacter

LVII ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 31: 16S rRNA Klonierung Wasser (n = 88) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Bacteria; Proteobacteria; Comamonadaceae Betaproteobacteria; 58 AJ556799 98% bacterium MWH55 Burkholderiales; Comamonadaceae Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 59 AF141394 99% Betaproteobacteria; environmental proteobacterium samples 60 uncultured bacterium AF407201 81% Bacteria; environmental samples uncultured Bacteria; Actinobacteria; 62 AY193123 98% actinobacterium environmental samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 63 Cytophagales AF289153 93% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; uncultured bacterium 64 AF107509 99% Pseudonocardineae; SY2-33 Pseudonocardiaceae; Pseudonocardia; environmental samples uncultured Crater 65 Lake bacterium AF316657 99% Bacteria; environmental samples CL120-55 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacterium sp. 66 AF493663 99% Flavobacteria; Flavobacteriales; EP328 Flavobacteriaceae; Flavobacterium Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacterium 67 AF433173 95% Flavobacteria; Flavobacteriales; xinjiangense Flavobacteriaceae; Flavobacterium Bacteria; Actinobacteria; uncultured Actinobacteridae; 68 AF141463 93% actinomycete Actinomycetales; environmental samples Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; uncultured bacterium 69 AF107509 98% Pseudonocardineae; SY2-33 Pseudonocardiaceae; Pseudonocardia; environmental samples

LVIII ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 31: 16S rRNA Klonierung Wasser (n = 88) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 70 Cytophagales AF141451 98% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples CFB group bacterium 72 AJ431335 95% Bacteria; Bacteroidetes ikaite c9 73 uncultured bacterium AY135874 91% Bacteria; environmental samples Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; uncultured bacterium 74 AF107509 98% Pseudonocardineae; SY2-33 Pseudonocardiaceae; Pseudonocardia; environmental samples Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; uncultured bacterium 75 AF107509 99% Pseudonocardineae; SY2-33 Pseudonocardiaceae; Pseudonocardia; environmental samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 76 Cytophagales AF141451 99% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples uncultured 77 AF010082 93% Bacteria; environmental samples eubacterium Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 78 Cytophagales AF141451 100% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacterium sp. 79 AF493663 97% Flavobacteria; Flavobacteriales; EP328 Flavobacteriaceae; Flavobacterium Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 80 Cytophagales AF141451 100% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 81 Cytophagales AF141451 100% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples

LIX ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 31: 16S rRNA Klonierung Wasser (n = 88) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta- 82 AJ404548 96% Betaproteobacteria; environmental proteobacterium B-1 samples CFB group bacterium 83 AJ431335 94% Bacteria; Bacteroidetes ikaite c9 Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta 84 AF141394 99% Betaproteobacteria; environmental proteobacterium samples Bacteria; Proteobacteria; uncultured beta- 86 AJ404548 96% Betaproteobacteria; environmental proteobacterium B-1 samples uncultured 87 AF010082 92% Bacteria; environmental samples eubacterium Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; uncultured bacterium 88 AF107509 98% Pseudonocardineae; SY2-33 Pseudonocardiaceae; Pseudonocardia; environmental samples Bacteria; Actinobacteria; uncultured Actinobacteridae; 90 AF141463 92% actinomycete Actinomycetales; environmental samples Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteria; Flavobacteriales; uncultured 91 AY177766 98% Flavobacteriaceae; Flavobacterium sp. Flavobacterium; environmental samples Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 92 Cytophagales AF141451 99% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples uncultured 93 AF010082 95% Bacteria; environmental samples eubacterium Bacteria; Bacteroidetes; uncultured Sphingobacteria; 94 Cytophagales AF141451 98% Sphingobacteriales; environmental bacterium samples Bacteria; Proteobacteria; Comamonadaceae Betaproteobacteria; 95 AJ556799 96% bacterium MWH55 Burkholderiales; Comamonadaceae

LX ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 31: 16S rRNA Klonierung Wasser (n = 88) Klon- Name/Identität Accession- Homologie Division Nr. Nr. Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteria; Flavobacteriales; uncultured 96 AY177766 98% Flavobacteriaceae; Flavobacterium sp. Flavobacterium; environmental samples 97 uncultured bacterium AY135874 92% Bacteria; environmental samples uncultured Bacteria; Bacteroidetes; 98 Flavobacteria AF534436 97% Flavobacteria; environmental bacterium samples 99 uncultured bacterium AY135874 93% Bacteria; environmental samples

LXI ANHANG: TABELLEN

PCR seminested lexposition am am lexposition 1. Amplifikation Amplifikation 13.05.2003 (Nullwert) (Nullwert) 13.05.2003 Naturbad Langebrück Langebrück Naturbad Bemerkung: Musche Bemerkung: Datum PCR PCR seminested

1. KA Rei T2 T2 Rei KA Amplifikation Amplifikation Datum PCR PCR negativ 18.03.2002 positiv 18.03.2002 negativ positiv positiv 19.05.2003 positiv seminested

1. n.b. KA Rei T1 Rei KA Amplifikation Amplifikation Datum PCR PCR seminested 1. Elbe Elbe Amplifikation Amplifikation Datum 11.03.2002 negativ negativ 11.03.2002 negativ positiv 25.03.2002 negativ positiv 05.03.2002 n.b. 08.04.2002 22.04.2002 negativ positiv 13.05.2003 negativ negativ negativ 15.04.2002 negativ positiv 27.05.2002 29.04.2002 negativ negativ 06.05.2002 n.b. 17.06.2002 negativ positiv n.b. positiv 04.06.2003 positiv negativ negativ 13.05.2002 02.07.2003 negativ 15.07.2002 negativ negativ positiv negativ positiv 21.05.2002 negativ positiv 11.06.2003 24.06.2002 negativ 22.07.2002 n.b. 12.08.2002 n.b. 03.06.2002 n.b. n.b. negativ negativ negativ negativ positiv positiv 01.07.2002 24.06.2003 09.09.2002 positiv negativ pos. negativ 29.07.2002 negativ 16.09.2002 positiv 07.10.2002 positiv positiv 14.10.2002 n.b. positiv positiv 23.07.2003 positiv 23.09.2002 positiv positiv 16.07.2003 positiv n.b. positiv negativ positiv negativ 21.10.2002 28.10.2002 27.08.2003 negativ positiv 18.11.2002 positiv 25.11.2002 n.b. negativ negativ positiv n.b. 16.12.2002 n.b. negativ 09.12.2002 n.b. 11.11.2002 04.11.2002 negativ positiv negativ 05.08.2003 12.08.2003 negativ positiv positiv negativ negativ positiv negativ positiv negativ 02.12.2002 10.02.2003 negativ positiv 13.01.2003 negativ positiv positiv 20.01.2003 positiv 03.02.2003 n.b. 06.01.2003 (Inhib.) negativ negativ 27.01.2003 negativ positiv 24.02.2003 negativ positiv 04.03.2003 negativ 17.02.2003 negativ positiv 17.03.2003. positiv positiv negativ 10.03.2003 positiv

Tabelle A 32: PCR Nachweis des Monitoringprogrammes von Muscheleluaten Legionellen aus LXII ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 33: Klonierung eines legionellenspezifischen PCR Produktes von Dreissena polymorpha aus Teich 2 der KA Reichenau

Klonbank von Dreissena polymorpha Division: Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales; Legionellaceae; Legionella

Accession- Homologie Klon Nr. Name/Identität Nr. (%) 1 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 2 Legionella donaldsonii Z49724 97 3 Legionella worsleiensis Z49739 97 4 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 5 Legionella cincinnatiensis X73407 98 6 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 7 Legionella busanensis AF424887 96 8 Legionella londiniensis Z49728 97 9 Legionella donaldsonii Z49724 97 10 Legionella sp. X97363 97 11 Legionella donaldsonii Z49724 97 12 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 97 13 Legionella donaldsonii Z49724 96 14 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 98 15 Legionella rubrilucens Z32643 96 16 Legionella sp. X97363 97 17 Legionella donaldsonii Z49724 97 18 Legionella worsleiensis Z49739 97 19 Legionella worsleiensis Z49739 97 20 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 97 21 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 22 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 97 23 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 97 24 Legionella busanensis AF424887 96 25 Legionella worsleiensis Z49739 97 26 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 95 27 Legionella donaldsonii Z49724 97 28 Legionella donaldsonii Z49724 98 29 uncultured bacterium, AY050582 96 30 Legionella sp. X97355 98

LXIII ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 33: Klonierung eines legionellenspezifischen PCR Produktes von Dreissena polymorpha aus Teich 2 der KA Reichenau

Klonbank von Dreissena polymorpha Division: Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales; Legionellaceae; Legionella

Accession- Homologie Klon Nr. Name/Identität Nr. (%) 31 Legionella sp. X97359 98 32 Legionella worsleiensis Z49739 98 33 Legionella pneumophila AF129524 97 34 Legionella-like amoebal pathogen 2 U44909 96 35 Legionella donaldsonii Z49724 96 36 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 37 Legionella worsleiensis Z49739 96 38 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 39 Legionella worsleiensis Z49739 96 40 Legionella pneumophila AF129524 97 41 Fluoribacter bozemanae Z49719 96 42 Legionella sp. X97357 96 43 Legionella adelaidensis Z49716 96 44 Legionella donaldsonii Z49724 97 45 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 46 Legionella worsleiensis Z49739 96 47 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 48 Fluoribacter bozemanae Z49719 98 49 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 99 50 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 97 51 Legionella sp. X97357 96

LXIV ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 34: Klonierung eines legionellenspezifischen PCR Produktes aus dem Wasser von Teich 2 der KA Reichenau

Klonbank von Dreissena polymorpha Division: Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales; Legionellaceae; Legionella

Accession- Homologie Klon Nr. Name/Identität Nr. (%) 1 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 98 2 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 3 Legionella donaldsonii Z49724 98 4 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 5 Legionella donaldsonii Z49724 98 6 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 7 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 8 Legionella londiniensis Z49728 97 9 Legionella adelaidensis Z49716 96 10 Legionella worsleiensis Z49739 98 11 Legionella donaldsonii Z49724 97 12 uncultured bacterium AY187375 96 13 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 14 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 15 Legionella adelaidensis Z49716 96 16 Legionella adelaidensis Z49716 96 17 Legionella cherrii X73404 96 18 Legionella donaldsonii Z49724 98 19 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 20 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 21 Legionella sp. X97357 98 22 Legionella donaldsonii Z49724 97 23 Legionella donaldsonii Z49724 98 24 Legionella donaldsonii Z49724 97 25 Legionella sp. X97363 98 26 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 97 27 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 97 28 Legionella donaldsonii Z49724 97 29 Legionella donaldsonii Z49724 98 30 Legionella londiniensis Z49728 98

LXV ANHANG: TABELLEN

Weiterführend Tabelle A 34: Klonierung eines legionellenspezifischen PCR Produktes aus dem Wasser von Teich 2 der KA Reichenau

Klonbank von Dreissena polymorpha Division: Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales; Legionellaceae; Legionella

Accession- Homologie Klon Nr. Name/Identität Nr. (%) 31 Legionella donaldsonii Z49724 98 32 Legionella worsleiensis Z49739 96 33 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 34 Legionella worsleiensis Z49739 97 35 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 36 Legionella donaldsonii Z49724 97 37 uncultured gamma proteobacterium AF141430 99 38 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 97 39 Legionella londiniensis Z49728 96 40 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 41 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 96 42 Legionella worsleiensis Z49739 98 43 Legionella londiniensis Z49728 98 44 Legionella worsleiensis Z49739 97 45 Legionella donaldsonii Z49724 97 46 Legionella pneumophila subsp. pascullei AF122885 97 47 Legionella donaldsonii Z49724 98 48 Legionella lytica Z49741 96 49 Legionella worsleiensis Z49739 98 50 Legionella donaldsonii Z49724 97

LXVI ANHANG: TABELLEN

1,2 (%) Stx

1,2 pos. Stx

2 Stx (%)

2 pos. Stx Nachweis Stx

1 Stx (%)

1 Stx pos.

gepickte gepickte für PCR PCR für Kolonien Kolonien Wirt: Wirt: E.coli E.coli 43.888 43.888 (PFU/g) (PFU/g) C Wirt: Wirt: (PFU/g) (PFU/g) E.coli E.coli Somatische Coliphagen Coliphagen Somatische (ml) (ml) Eluat Eluat (g) - Gen tragenden Coliphagen aus Muscheleluaten aus Muscheleluaten Coliphagen - tragenden Gen Fleisch Fleisch Stx Muscheln / Begleitwerte / Begleitwerte Muscheln Datum Ort Datum 02.09.2002 02.09.2002 T1 Rei KA 18.03.2002 T2 Rei KA 02.09.2002 2,5 T2 Rei KA 09.09.2002 10,1 T1 Rei KA 07.10.2002 2,3 T1 Rei KA 14.10.2002 8,0 23,0 7,5 T2 Rei KA 28.10.2002 9,3 201,9 1.312,0 T1 Rei KA 30,0 18.11.2002 7,6 10,4 Elbe 0,9 8,8 22,5 614,9 T1 Rei KA 11.11.2002 0 # # # # # 24,0 170,1 32,0 25.11.2002 9 12,1 11,1 208,2 Elbe 0,5 27,0 T2 Rei KA 02.12.2002 0,1 960,0 1 0 0 0 0 0 0,0 09.12.2002 296,8 27,5 35,0 8,9 359,2 T1 Rei KA 35,0 16.12.2002 11,4 79,8 Elbe 0,6 0,1 T2 Rei KA 1 06.01.2003 2 0 0 0 0 0 0,4 13,1 119,2 23,5 124,4 0 13.01.2003 0,0 7,5 476,2 T1 Rei KA 32,5 20.01.2003 48,0 10,1 0 Elbe 0 0,1 3,7 T2 Rei KA 27.01.2003 871,3 3 0 0 0 0 0 0 # 13,2 20,0 0,5 0,0 03.02.2003 0 8,8 0 T1 Rei KA # 10.02.2003 36,6 35,0 224,5 Elbe 32,5 2 # # T2 Rei KA 11 17.02.2003 309,3 0,0 0,0 10,4 # 0 # # # # # 24,0 1 0 24.02.2003 0 # 7,1 158,7 T1 Rei 33,0 KA 0 04.03.2003 # 84,8 # 0,0 28,0 10,4 Elbe 1.663,6 0,0 T2 Rei KA 10.03.2003 # 0 # # # # # 0 0 0,0 # 10,2 20,0 0 # 17.03.2003 0 # # 6,2 T1 Rei KA 84,8 0 0,3 32,5 # # 0 0,0 # 732,4 0 1 10,9 # 18,0 0 # # # 100 # # 79,7 0 # 1 0,0 33,0 0 # # 114,7 0,0 0 # # # # # 0 # 0 # 62,1 # 0 # 0,0 0 # 0 0,0 # # # 0 # 0 # # # 0 0,0 0 # # 0 # 0 # 0 # # # # # 0 # # # 0 # # # # # # # # 0 # # # # # # # 0 # # # # # # # # # # # # # # #

Tabelle A 35: von Nachweis

LXVII ANHANG: TABELLEN

1,2 (%) Stx

1,2 pos. pos. Stx

2 Stx (%)

2 pos. pos. Stx Nachweis Stx

1 (%) Stx

1 pos. pos. Stx gepickte gepickte für PCR PCR für Kolonien Kolonien

Wirt: Wirt: E.coli 43.888 (PFU/ml) C Wirt: Wirt: E.coli (PFU/ml) Somatische Coliphagen Coliphagen Somatische (ml) (ml) - Gen tragender Coliphagen im Wasser der Elbe der Coliphagen im Wasser tragender - Gen Anreicherung Anreicherung Stx (ml) (ml) Gesamt- volumina volumina Wasser Elbe Elbe Wasser Datum 23.09.02 75 23.09.02 300 4,5 7,0 11.11.02 0,5 300 0,03 11,5 15 0 1,9 10 6 0,16 02.12.02 0 0 40 0 324 41 4 1,5 21 0,28 53 1 2 9,5 16.12.02 324 15,0 1,2 0,07 06.01.03 324 20 0 1 5 0 2,7 13,0 0,02 27.01.03 324 1 0 0 1,3 12,2 0,09 15 0 0 03.02.03 324 2,1 0,27 17 9,40 17.02.03 6 0 1 1,8 0,03 17 0 0 6 1

Tabelle A 36: Nachweis LXVIII ANHANG: TABELLEN

1,2 (%) Stx

1,2 pos. pos. Stx Stx

2 (%) Stx

2 pos. Stx Nachweis

Stx 1 Stx (%)

1 Stx pos. pos. gepickte gepickte für PCR PCR für Kolonien Kolonien

Wirt: Wirt: E.coli 43.888 (PFU/ml) 0 11,4 48 0 0 14 29 0 11,4 14 0 48 0 12,3 0 27 0 22 0 6 C Wirt: Wirt: E.coli (PFU/ml) (PFU/ml) Somatische Coliphagen Coliphagen Somatische An- (ml) (ml) reicherung reicherung (ml) (ml) Gesamt- volumina volumina Gen tragender Coliphagen in Zu- und Ablaufproben der KA Reichenau KA Reichenau der Ablaufproben in Zu- und Coliphagen tragender Gen Stx KA KA Ablauf Ablauf Zulauf / Wasser / Begleitwerte Begleitwerte / Wasser Reichenau Reichenau Datum 09.09.2002 Zu Zu 84,0 15 3.200,0 50 51 3 6 09.09.20022 4 8 Ab 5,0 50 09.09.2002 Zu 5,0 100 16.09.2002 602,0 3,5 1,7 20 0 8,4 0,0 Zu 10 51 0 13,6 1.628,4 0 0 25 52 0 28.10.2002 0 4 Ab 0 8 0 5,9 75 28.10.2002 4,5 18.11.2002 Zu 0,2 0,0 Ab 275 0 0 9,5 18.11.2002 0 0 25 2,1 0,0 30.09.2002 Zu Ab 6,5 0 0 1.924, 0 75 0 30.09.2002 Zu 4,2 25 25 09.12.2002 0,4 0,0 Ab 540,0 7,5 4,0 297 5,7 10,0 18 0 0 0 09.12.2002 1 0 880, 6 0 0 Zu 0,8 0,0 27 13.01.2003 2 0 Ab 0 444,4 6,0 297 0 21,0 5,6 27 0 10,3 13.01.2003 2 0,1 7 0 Zu 4 0 1.437,0 27 03.02.2003 0 0,6 0 Ab 6,9 243 12,5 4 0 0 03.02.2003 0 2,3 0,0 0 0 0 0

Tabelle A 37: Nachweis LXIX ANHANG: TABELLEN

Tabelle A 38: Nachweis und Sequenzierung von Adenoviren aus nativen und verdünnten Muscheleluaten Adenovirus in Adenovirus in Muscheleluaten (unverdünnt) Muscheleluaten (verdünnt) Sequenz- Sequenz- Datum Ort Nachweis Typ Nachweis Typ homologie homologie Reichenau Human 09.09.2002 positiv 100% adenovirus negativ entfällt entfällt T1; type 41 Reichenau 16.09.2002 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T2; 23.09.2002 Elbe; negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt Reichenau Human 14.10.2002 positiv 100% adenovirus negativ entfällt entfällt T2, type 41 Reichenau 28.10.2002 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T1, 11.11.2002 Elbe, negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt Reichenau 18.11.2002 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T1, Reichenau 25.11.2002 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T2, 02.12.2002 Elbe, negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt Reichenau 09.12.2002 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T1, Reichenau 16.12.2002 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T2, 06.01.2003 Elbe negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt Reichenau 13.01.2003 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T1, Reichenau 20.01.2003 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T2, 27.01.2003 Elbe, negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt Reichenau 03.02.2003 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T1, Reichenau 10.02.2003 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T2, 17.02.2003 Elbe negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt Reichenau 24.02.2003 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T1, Reichenau 04.03.2003 negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt T2, 10.03.2003 Elbe negativ entfällt entfällt negativ entfällt entfällt Reichenau Human 17.03.2003 positiv 97% adenovirus negativ entfällt entfällt T1, type 6

LXX ANHANG: TABELLEN

A5 A1 A1 A1 A1

entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt entfällt Human coxsackievirus Human coxsackievirus Human coxsackievirus Human coxsackievirus Human coxsackievirus Human Enterovirusnachweis T2 negativ entfällt positiv entfällt positiv negativ T2 T1; negativ entfällt positiv entfällt positiv negativ T1; entfällt positiv negativ T2, entfällt positiv negativ T1, entfällt positiv negativ T1,

Datum Expositionsort Muschel Datum Expositionsort Typ Wasser Typ 09.09.2002 Reichenau Reichenau Reichenau 09.09.2002 Reichenau 16.09.2002 T1, negativ 14.10.2002 T1, negativ 28.10.2002 Reichenau entfällt T2, negativ 18.11.2002 Reichenau entfällt negativ T1, negativ 25.11.2002 Reichenau entfällt negativ T2, negativ 09.12.2002 Reichenau entfällt negativ Reichenau 16.12.2002 Reichenau entfällt negativ T2, negativ 13.01.2003 negativ Reichenau 20.01.2003 Reichenau entfällt T2, negativ 03.02.2003 negativ T1, negativ 10.02.2003 Reichenau entfällt T1, negativ 24.02.2003 Reichenau entfällt negativ 17.03.2003 Reichenau entfällt negativ negativ

Tabelle A 39: Reichenau KA der Wasser Muscheln und in Enterovirusnachweis

LXXI ANHANG: TABELLEN

9 9 9 9 9 9 6 Human echovirus Human echovirus Porcine enterovirus Porcine enterovirus Porcine enterovirus Porcine enterovirus Porcine enterovirus Porcine enterovirus positiv positiv

9 9 Porcine enterovirus Porcine enterovirus Muscheln und Wasser aus der Elbe aus der Wasser Muscheln und Enterovirusnachweis Datum Muschel Muschel Datum Typ Wasser Typ 23.09.2002 negativ 11.11.2002 negativ entfällt 02.12.2002 negativ entfällt 06.01.2003 positiv positiv entfällt 27.01.2003 negativ positiv 17.02.2003 positiv positiv entfällt 10.03.2003 negativ positiv entfällt positiv

Tabelle A 40: in Enterovirusnachweis

LXXII ANHANG: TABELLEN

PCR Muschel,

PCR Muschel, Muschel, PCR Wasser, Enterovirus Adenovirus Enterovirus Muschel Muschel (PFU/ml) Phagen B. fragilis B. Wasser eine Gegenüberstellung eine Gegenüberstellung (PFU/ml) Muschel Muschel (PFU/ml) len Viren in der Elbe - Wasser Wasser (PFU/ml) Muschel Muschel (PFU/ml) (PFU/ml)

Wasser (PFU/ml) somatische Coliphagen Coliphagen somatische Phagen FRNA Proben Proben 23.09.2002 0,2 32,5 0,0 4,6 0,0 1,5 positiv negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ positiv positiv negativ negativ 4,632,5 0,0 0,0 1,5 135,6 0,0 0,0 0,2 positiv 259,6 0,3 negativ positiv 23.09.2002 0,2 23,1 0,0 0,0 positiv 170,1 0,3 negativ 11.11.2002 122,8 0,0 0,0 1,1negativ 279,4 0,2 negativ positiv 02.12.2002 positiv 1,2 22,5 0,0 0,0 476,2 0,0 negativ 06.01.2003 positiv 0,5 1,5224,5 0,0 0,0 0,0 positiv 27.01.2003 0,9 28,6 0,0 0,0 158,7 1,0 17.02.2003 0,9 10.03.2003 Tabelle A 41: entera und Bakteriophagen von Nachweis

LXXIII ANHANG: TABELLEN

PCR

Muschel,

PCR Muschel, Muschel,

tiv PCR PCR Wasser, Wasser, PCR Muschel, PCR Muschel, PCR Enterovirus Adenovirus Enterovirus Enterovirus Adenovirus Enterovirus Muschel Muschel (PFU/ml) (PFU/ml) Muschel Muschel (PFU/ml) (PFU/ml) Phagen Phagen - eine Gegenüberstellung Gegenüberstellung - eine B. fragilis B. fragilis Wasser (PFU/ml) Wasser (PFU/ml) Muschel Muschel (PFU/ml) Muschel Muschel (PFU/ml) - eine Gegenüberstellung Gegenüberstellung T2 - ren in der KA Reichenau eine ren in der KA Reichenau T1 ren in der KA Reichenau Wasser Wasser Wasser Wasser (PFU/ml) (PFU/ml) (PFU/ml) Muschel Muschel (PFU/ml) (PFU/ml) Muschel Muschel (PFU/ml) 0,4 960,0 0,3 0,1 271,9 46,5 positiv 0,8 910,6 0,5 0,5 124,4 negativ negativ positiv 0,0 1,5 0,1 negativ 0,3nega 73,3 4,6 0,1 11,0 8,7 negativ 0,0 negativ 1,0 108,7 0,0 0,0 negativ negativ negativ 0,1 0,0 negativ 0,4 84,8 negativ 26,5 negativ 0,1 13,5 negativ positiv 0,0 negativ 0,0 negativ 2,1 79,7 negativ positiv 0,0 2,1 22,3 positiv 0,0 negativ 0,0 negativ 1,9 62,1 0,0 4,3 21,2 negativ 0,0 0,0 Wasser Wasser (PFU/ml) somatische Coliphagen Coliphagen somatische Phagen FRNA somatische Coliphagen FRNA Phagen (PFU/ml) Proben Proben Proben Proben 09.09.2002 28.10.2002 18.11.2002 09.12.2002 13.01.2003 03.02.2003 24.02.2003 17.03.2003 16.09.2002 0,3 231,8 0,4 26,3 0,0 0,0 positiv negativ negativ negativ positiv negativ negativ positiv 26,3 0,0 0,0 positiv 231,8 0,4 negativ 191,8 0,0 1,5 0,3 negativ 79,8 0,1 16.09.2002 0,0 negativ negativ 14.10.2002 negativ 30,0 0,5 2,7 0,7 871,3 1.663,6 0,2 25.11.2002 negativ 0,2 158,4 0,5 309,3 negativ 16.12.2002 73,2 1,02,9 0,0 0,0 negativ 732,4 0,0 0,1 133,3 negativ 0,0 negativ 20.01.2003 0,1 0,0 negativ negativ 0,0 10.02.2003 Tabelle A 43: Vi enteralen und Bakteriophagen von Nachweis Tabelle A 42: Vi enteralen und Bakteriophagen von Nachweis

LXXIV ANHANG

Publikationen

R. Kusserow, U. Schröter-Bobsin, J. Mählmann und I. Röske (2004) Applications of the benthic filter feeder Dreissena polymorpha to filter and monitor fecal pollution. Zur Publikation eingereicht.

R. Dumke, U. Schröter-Bobsin, E. Jacobs und I. Röske (2004). Detektion of phages carrying the Stx1 and Stx2 gene in waste water and river water samples. Zur Publikation eingereicht.

U. Schröter-Bobsin, R. Dumke und I. Röske (2004). Einsatzmöglichkeiten der Dreikantmuschel (Dreissena polymorpha) als biologisches Filter und Wasserhygiene – Monitor, Teil III. Hygienemonitoring. Tagungsbericht 2003 (Köln) der Deutschen Gesellschaft für Limnologie e. V. (DGL) und der Societas Internationalis Limnologiae (SIL), Band II, 529-534.

Posterpräsentationen: Kusserow, R., Schröter-Bobsin, U., Mählmann, J. and Röske, I. (2004). Applications of the benthic filter feeder Dreissena polymorpha to filter and monitor fecal pollution. 6th International Conference on Waste Stabilisation Ponds, 28.-01.10.2004, Avignon.

Schröter-Bobsin, U., Dumke, R. und Röske, I. (2003). Einsatz der Zebramuschel Dreissena polymorpha als in situ Hygienemonitor in Gewässern. Vereinigung für Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie (VAAM) Jahrestagung vom 23.-23.03.2003 in Berlin.

DANKSAGUNG

Mein Dank gilt:

Frau Prof. Dr. I. Röske für die Überlassung des Themas, für die Begutachtung der Arbeit, für Gespräche und die uneingeschränkte Unterstützung in beruflichen und privaten Situationen, die sie zu jeden möglichen Zeitpunkt gab.

Herrn Dr. R. Dumke für nun mehr fast vier Jahre Teamwork in der Phagen- und Muschel – AG. Eine Zeit, in der mir in ungezählten Gesprächen die Facetten der Umweltmikrobiologie, von Spannung und Begeisterung hin zu den Tücken im Detail, näher gebracht wurden. Die vielen praktischen und theoretischen Hinweise, vor allem aber unser freundschaftliches Arbeitsklima hatten einen großen Anteil am gelingen dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. E. Jacobs für die Begutachtung der vorliegenden Arbeit, für die freundliche, unkomplizierte Zusammenarbeit und Unterstützung in den Labors des MTZ.

Herrn R. Kusserow, einem Projektpartner wie man sich ihn wünscht.

Frau M. Junge und Frau I. Schachtschabel, die das „Muschelprojekt“ komplettierten und für einen immensen Probenumfang, für viele technische und praktische Tipps und eine großartige Assistenz bei der Bewältigung der Analytik sorgten.

Allen Mitarbeitern des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, sowie den Kollegen des Instituts für Angewandte Mikrobiologie der TU Dresden.

Allen beteiligten Diplomanden und Praktikanten, insbesondere Frau K. Reichhardt, die mit viel Interesse und Einsatzfreude einen erheblichen inhaltlichen Beitrag zur vorliegenden Arbeit geleistet haben.

Der Förderung des Projektes (BMBF 02WA0177) durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung und damit auch dem Steuerzahler.

Besonders Frank und Sebastian – meiner Familie, ohne ihre moralische und praktische Unterstützung, ihr Verständnis für die oft nicht vermeidbaren Belastungen, wäre diese Arbeit schwer zu realisieren gewesen. Meinen Eltern, für das Vertrauen und die Stütze in all den Jahren.

Die vorliegende Dissertation wurde am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden unter der wissenschaftlichen Betreuung von Frau Prof. Dr. rer. nat. habil. I. Röske und Herrn Dr. rer. nat. R. Dumke angefertigt.

Versicherung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Die Promotionsordnung der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften der TU Dresden wird anerkannt.

Ute Schröter-Bobsin