Ocorrência Dos Ovos De Monogenea Em Diversos Substratos De Fixação Em Pisciculturas De Tanques De Terra: Uma Estratégia De Prevenção

MARIA CAROLINA TEIXEIRA DIAS

OCORRÊNCIA DOS OVOS DE MONOGENEA EM DIVERSOS SUBSTRATOS DE FIXAÇÃO EM PISCICULTURAS DE TANQUES DE TERRA: UMA ESTRATÉGIA DE PREVENÇÃO

Orientador: Prof. Doutora Ana Maria Duque de Araújo Munhoz

Co-Orientador: Doutora Florbela Maria Benjamim Soares

Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias

Faculdade de Medicina Veterinária

Lisboa

2020

MARIA CAROLINA TEIXEIRA DIAS

OCORRÊNCIA DOS OVOS DE MONOGENEA EM DIVERSOS SUBSTRATOS DE FIXAÇÃO EM PISCICULTURAS DE TANQUES DE TERRA: UMA ESTRATÉGIA DE PREVENÇÃO

Dissertação defendida para obtenção do Grau de Mestre em Medicina Veterinária no curso de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária conferido pela Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, perante o Despacho de Nomeação Nº. 10/2020, no dia 27 de Fevereiro, com a seguinte composição de júri:

Presidente: Professora Doutora Laurentina Pedroso

Arguente: Professor Doutor Fernando Afonso

Orientadora: Professora Doutora Ana Maria Duque de Araújo Munhoz

Co-Orientador: Doutora Florbela Maria Benjamim Soares

Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias

Faculdade de Medicina Veterinária

Lisboa

2020

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Agradecimentos

Em primeiro lugar, tenho a agradecer aos meus pais por sempre me proporcionarem o melhor que conseguem e por toda a sua ajuda e apoio que me deram e sempre me irão dar. Um muito obrigado também à minha família, porque sem o apoio deles, nada disto teria sido possível.

À Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, na pessoa da sua Diretora, Professora Doutora Laurentina Pedroso, pela possibilidade de realização desta Dissertação de Mestrado.

Ao Dr. Pedro Pousão pela possibilidade e oportunidade de ter realizado o estágio na EPPO, à Dra. Florbela por ter aceite orientar-me, por todo o seu conhecimento partilhado e por toda a disponibilidade em ajudar-me sempre que necessitei, ao Márcio por toda a sua paciência e ajuda, ao Gabriel pela disponibilidade em ajudar-me nos tanques de terra sempre que precisei, à Elsa por trazer sempre consigo a sua boa disposição e ao restante pessoal da EPPO que me ajudou e fez parte deste bonito percurso.

À Professora Ana Maria por me acompanhar no meu estudo e pela disponibilidade em ajudar-me sempre que necessitei.

A todos os meus amigos e colegas que me acompanharam neste percurso: à Diana Lopes, à Inês Ferrão, à Catarina Arraes, à Catarina Nunes, à Matilde Almeida, à Rafaela Soares, à Joana Oliveira, à Raquel Miranda, à Margarida Martins, à Rita Bruno, à Beatriz Bilhastre, à Carla Lourenço, à Filipa Lúcio e à Sofia Fonseca. Um obrigada também à Margarida, Madalena, Inês e às duas Ritas pelos bons momentos partilhados durante os cinco anos naquela casa.

Ao Pedro, um grande e especial obrigada pelo apoio incondicional que me prestou durante todos estes anos e por toda a ajuda que me proporcionou.

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Resumo

Em aquacultura, tanto a nível mundial como nacional, a ocorrência de parasitoses externas é relativamente frequente e causa perdas significativas para os aquacultores. Os organismos pertencentes à classe Monogenea (Filo Platyhelminte), que afetam normalmente as brânquias e pele dos hospedeiros, são dos mais comumente encontrados.

Neste estudo, avaliaram-se diversos factores na adesão dos ovos dos monogéneos tais como, os substratos utilizados, fio controlo de algodão, plástico, policloreto de vinilo (PVC), madeira e macroalga (Ulva spp.), o tempo de imersão dos substratos, o efeito das diferentes operações de aquacultura e a densidade de produção nos tanques em cultivo. Foram realizados três ensaios: no primeiro, comparou-se o efeito de cinco e dez dias de imersão dos substratos no mesmo tanque de terra; no segundo, avaliou-se o efeito de duas operações de aquacultura (pesca e remoção/manipulação de ostras) e no terceiro comparou-se a adesão dos ovos de monogéneos entre os tanques com diferentes densidades de produção. Também foram estudados em todos os ensaios, quais os substratos que promoviam a maior e menor adesão de ovos.

De acordo com os resultados, o factor tempo (cinco e dez dias) não influenciou o número de ovos aderidos aos substratos. Nos tanques de terra onde decorreram operações de aquacultura verificou-se um menor número de adesão dos ovos e no tanque com maior densidade de produção houve uma maior adesão dos ovos. Concluiu- se que os substratos que tiveram a maior adesão de ovos de monogéneos foi o plástico e aquele com menor adesão foi a macroalga.

Palavras-chave: parasitas; ovos de Monogenea; tanques de terra; peixe; operações de aquacultura; densidade de peixes; substratos

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Abstract

External parasitosis causes a lot of losses to aquacultures globally and in Portugal. Monogenea class (Phylum Platyhelminth) organisms that usually affects hosts’ gills and skin are one of the most commonly found in aquaculture.

This study analyses how the adhesion varies due to different factors such as the substrates, control, plastic, polyvinyl chloride (PVC), wood and macroalgae (Ulva spp.), exposure time, effect of different aquaculture operations and fish production density. Three different assays were performed: in the first one the effect of five and ten days for different substrates in the same pond was compared; in the second, the effect of two aquaculture operations (fishery and removal/manipulation oysters) was evaluated and in the third the eggs adhesion between ponds with different production densities was studied. Furthermore, in every assay it was checked which substrate had a major and minor adhesion.

According to the results, exposure time (five and ten days) doesn’t influence the number of eggs in the substrates. There was a smaller number of eggs in the earth ponds with aquaculture operations and in the pond with highest production density there was a higher egg adhesion. It was also found that plastic and macroalgae were the two substrates with biggest and smallest number of monogeneans eggs.

Keywords: parasites; Monogenea eggs; earth ponds; fish; exposure time; aquaculture operations; fish density; substrate

iii

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Lista de Abreviaturas

ANOVA: Análise de variância

DGAV: Direção-Geral de Alimentação e Veterinária

DP: Desvio-padrão

ECFR: Egg Cell Forming Region

EPPO: Estação Piloto de Piscicultura de Olhão

FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations

FDA: U.S. Food and Drug Administration

IMTA: Integrated Multi-Trophic Aquaculture

INE: Instituto Nacional de Estatística

IPMA: Instituto Português do Mar e da Atmosfera

MS-222: Metanosulfonato de tricaína

OE: Óleos essenciais

OIE: World Organization for Animal Health

PCR: Polymerase Chain Reaction ppm: Partes por milhão

PVC: Policloreto de Vinil

PZQ: Praziquantel t: Tempo em dias

TT: Tanque de terra do EPPO

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TR: Tanque de reprodutores do EPPO

VCM: Volume corpuscular médio

ºC: Temperatura em graus Celsius

ºF: Temperatura em graus Fahrenheit

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Índice

Agradecimentos ...... i

Resumo ...... ii

Abstract ...... iii

Lista de Abreviaturas ...... iv

Índice ...... vi

Índice de Tabelas ...... viii

Índice de Figuras ...... ix

Índice de Gráficos ...... xi

Capítulo I – Estágio Curricular ...... 1

Capítulo II - Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção ...... 4

1. Introdução ...... 4

1.1. Perspetiva geral de Aquacultura ...... 4

1.2 Aquacultura em Portugal ...... 4

1.3 Impacto de doenças em peixes produzidos em aquacultura ...... 6

1.4 Caraterização da Classe Monogenea ...... 7

1.4.1 Taxonomia e Hospedeiros ...... 7

1.4.2 Morfologia ...... 9

1.4.3 Reprodução/Ciclos de vida ...... 14

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1.5 Sinais clínicos ...... 18

1.6 Diagnóstico ...... 21

1.7 Tratamento ...... 22

1.8 Controlo e Profilaxia ...... 26

2. Objetivos ...... 27

3. Materiais e Métodos ...... 27

3.1 Análise estatística ...... 34

4 Resultados ...... 35

4.1 Ensaio preliminar ...... 35

4.2 Ensaio 1 ...... 35

4.3 Ensaio 2 ...... 37

4.4 Ensaio 3 ...... 40

4.5 Substratos com maior e menor deposição de ovos de Monogenea . 41

5. Discussão ...... 42

6. Conclusão ...... 45

7. Bibliografia ...... 47

vii

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Índice de Tabelas

Tabela 1 - Principais diferenças entre as duas subclasses da Monogenea ...... 12

Tabela 2 - Condições apresentadas pelo TR1, TR4, TR6 e TR7 durante os três dias do ensaio preliminar...... 31

Tabela 3 - Condições apresentadas pelos tanques de terra durante os meses de ensaios...... 32

Tabela 4 - Ensaio preliminar: nº total de ovos de Monogenea recolhidos nos tanques TR1, TR4, TR6 e TR7 durante 1,3 e 5 dias (t1, t3, t5 respetivamente)...... 35

Tabela 5 - Média e desvio-padrão (DP) dos resultados obtidos nos diferentes substratos...... 42

viii

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Índice de Figuras

Figura 1 - Estação Piloto de Piscicultura em Olhão, situada no Parque Natural da Ria Formosa ...... 1

Figura 2 - Haptors representativos de adultos e larvas de espécies do género Dendromonocotyle (Monocotylidae, Monopisthocotylea) e Zeuxapata seriolae (Heteraxinidae, Polyopisthocotylea)...... 10

Figura 3A e 3B - A) Representação esquemática de uma vista ventral de Benedenia rohdei n. sp. (Capsalidae, Monopisthocotylea). B) Representação esquemática de uma vista ventral de Pauciconfibula pogoniae (Microcotylidae, Polyopisthocotylea) ...... 13

Figura 4 - Ciclo de vida de monogéneos ovíparos ...... 14

Figura 5 - “Boneca-russa”: Gyrodactylus salaris contendo dois embriões no seu interior ...... 16

Figura 6 - Microfotografia de Gyrodactylus salaris onde é visível o desenvolvimento embrionário durante o ciclo de vida ...... 16

Figura 7 - Fotografias de alguns dos ovos dos monogéneos mais encontrados em aquacultura ...... 17

Figura 8A e 8B - A) Dois indivíduos de Diplectanum aequans aderidos a um filamento branquial de um robalo (Dicentrarchus labrax), hiperparasitado com Trichodina spp. B) Brânquias de robalo (Dicentrarchus labrax) infestado com Diplectanum aequans...... 20

Figura 9 - Lesões provocadas pelo Dactylogyrus spp. num acára-disco (Symphsodon discus)...... 21

Figura 10 - Fotografia do sistema de esferovite utilizado, composto pelos diferentes materiais: macroalgas, madeira, plástico, PVC e fios de algodão de controlo (segundo a ordem da imagem)...... 28

Figura 11 - Fotografia do sistema de esferovite utilizado com a rede de plástico com 1cm...... 29

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Figura 12 - Localização do sistema utilizado na região da comporta de saída do tanque de terra...... 29

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Índice de Gráficos

Gráfico 1 - Captura total em Portugal ...... 5

Gráfico 2 - Produção total de aquacultura...... 6

Gráfico 3 – Número médio de ovos de Monogenea recolhidos em diferentes substratos do tanque de terra nº 8 (TT8) durante cinco dias ...... 36

Gráfico 4 - Número médio de ovos de Monogenea recolhidos em diferentes substratos do tanque de terra nº 8 (TT8) durante dez dias...... 37

Gráfico 5 - Efeito da pesca no tanque 13 durante o mês de dezembro num período de cinco dias ...... 38

Gráfico 6 - Efeito da pesca no tanque 13 durante os meses de fevereiro-março num período de cinco dias ...... 39

Gráfico 7 - Efeito da remoção das ostras no tanque 13 durante o mês de dezembro num período de cinco dias ...... 39

Gráfico 8 -1ª amostragem feita nos meses de novembro e dezembro com o tanque 8 e 11, respetivamente...... 40

Gráfico 9 - 2 ª amostragem feita nos meses de janeiro e março com o tanque 8 e 11, respetivamente...... 41

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Capítulo I – Estágio Curricular

O estágio curricular foi desenvolvido no âmbito da área de aquacultura e teve a duração de cinco meses, tendo tido início a 5 de novembro e fim a 29 de março.

Foi realizado no Instituto Português do Mar e da Atmosfera (IPMA), nas instalações da Estação Piloto de Piscicultura de Olhão (EPPO), situadas no Parque Natural da Ria Formosa, em Olhão.

Esta unidade tem cerca de sete hectares e está dividida por diversas zonas: a zona de maternidade composta por nove espécies de peixes-marinhos reprodutores: Dourada (Sparus aurata), Sargo-Legítimo (Diplodus sargus), Sargo-safia (Diplodus vulgaris), Mero, (Epinephalus marginatus), Corvina (Argyrosomos regius) robalo (Dicentrarchus labrax), tainha, (Mugil cephalus), linguado-legítimo (Solea solea), e lírio (Seriola dumerili).

A zona da pré-engorda é o local para apoio aos cultivos em terra e mar aberto e também possui uma área de engorda nos tanques de terra (17 tanques). Além destas duas áreas, possui ainda uma jaula de sistema offshore para cultivo de peixes em mar aberto (Instituto Português do Mar e Atmosfera, 2018).

Figura 1 - Estação Piloto de Piscicultura em Olhão, situada no Parque Natural da Ria Formosa. Fotografia gentilmente cedida pela EPPO. 1

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Na EPPO realizam-se ainda diversas investigações e demonstrações experimentais, bem como, ensaios de reprodução, desenvolvimento larvar e engorda de inúmeras espécies, em particular da dourada, robalo, sargo, mero, linguado e corvina. Para além disto, outros estudos também são feitos a nível da nutrição, fisiologia e patologia, e ensaios de engorda de diversas espécies de peixes em policultivo e em sistemas multitróficos (ostras e peixes) (IPMA, 2018). Não menos importante, a EPPO contribui ainda para instituições de caridade doando diversos produtos lá produzidos, produtos estes que cumprem todos os requisitos de qualidade e de segurança alimentar (Teixeira, 2016).

Durante o estágio, foram realizadas diversas atividades, desde o trabalho prático que foi desempenhado como tema da dissertação que incluiu a realização e colheita manual das amostras para o estudo, a leitura das amostras na lupa eletrónica Nikon SMZ1000, até à participação em workshops realizados pela EPPO. Para além disto, foram realizadas também amostragens rotineiras para identificação e quantificação de parasitas em peixes presentes nos tanques de terra da estação. Este processo de amostragem era constituído por diversas etapas. Primeiro realizava-se a insensibilização, através de anestesia do animal selecionado, seguidamente procedia-se o abate por golpe cervical e posterior dissecção dos arcos branquiais (de ambos os lados), para verificação dos parasitas. Os parasitas depois de localizados, eram vistos ao microscópio (UOP UB202i) para identificação e quantificação de espécies e registados em tabelas de Excel, devidamente identificados (espécie, número de parasitas encontrados, arco branquial onde foi localizado, tanque de terra).

Para além do referido, foram realizadas ainda participações em quatro workshops referentes à área de aquacultura. O primeiro, realizado em dezembro, incidiu no “Aumento da qualidade dos produtos de aquacultura: uma aposta no bem-estar animal”, em que a parte teórica foi direcionada ao bem-estar animal em aquacultura, algumas patologias associadas à ausência de bem-estar e o impacto do bem-estar na qualidade do pescado. Na parte teórico- prática foi abordado o tema de anestesia em peixes marinhos, onde se adicionou um anestésico MS-222 (metanosulfonato de tricaína) a um balde com água. O objetivo foi avaliar o tempo e a reação em cada fase anestésica em dois peixes de diferentes tamanhos e comparar os valores obtidos. O segundo workshop, realizado em janeiro, teve como tema “Meio Ambiente e Aspetos Sociais e de Regulamentação do Integrated Multi-Trophic Aquaculture (IMTA)”, onde se falou da implementação do IMTA em Portugal e em países europeus do arco atlântico, e onde o principal objetivo foi contribuir para o estabelecimento das bases do conceito de boas práticas no IMTA em Portugal, respeitando o meio ambiente e cumprindo com a regulamentação. O terceiro workshop, realizado em fevereiro, incidiu 2

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção sobre o tema de bacteriologia, onde inicialmente foi descrito, teoricamente, quais as principais bactérias que afectam os peixes marinhos em aquacultura seguido de uma parte prática onde se identificaram, através de métodos bioquímicos, as bactérias. Na segunda parte do workshop houve também uma componente teórico-prática onde se falou de outro método identificação de bactérias, através de métodos moleculares. Por último, em março, foi realizado outro workshop sobre acondicionamento e transporte de animais marinhos vivos, onde se abordaram diversos aspetos teóricos sobre a forma ideal de acondicionar e transportar animais vivos (peixes e polvos), da avaliação fisiológica da corvina e da dourada durante o transporte e por fim, terminando numa parte prática onde se demonstrou como se deve preparar o transporte de animais juvenis.

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Capítulo II - Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção

1. Introdução 1.1. Perspetiva geral de Aquacultura

Segundo a Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) (1988), a aquacultura consiste na produção de diversos organismos aquáticos, como peixes, moluscos, crustáceos e plantas. É possivelmente considerada a produção do setor alimentar mais rápida, em que 50% dos peixes são usados para alimentação (FAO, 2018).

Este sistema de produção pode ser subdivido em três tipos de regime: intensivo, extensivo e semi-intensivo.

O sistema extensivo é o tipo de sistema em que todos os recursos provêm da natureza e em que as espécies a serem produzidas são capturadas no meio natural e a sua alimentação é, igual e exclusivamente, natural (Portal do Estado Ambiente, 2019).

No sistema de produção semi-intensivo a obtenção de ovos e formas juvenis é feita através de reprodução artificial, sendo que também se efetuam regularmente amostragens e calibragens de modo a otimizar o crescimento e rendimento da produção. A alimentação utilizada neste caso consiste em alimento natural e suplementos alimentares artificiais quando necessários (Portal do estado do Ambiente, 2019). Quanto ao sistema intensivo, a alimentação é exclusivamente artificial e todos os parâmetros de produção são controlados (Portal do Estado do Ambiente, 2019). Neste tipo de sistema, ocorrem diversos problemas devido à elevada densidade de peixes presentes. Um dos obstáculos mais frequentes com que o aquacultor se depara, consequente da elevada densidade animal, é a presença de agentes patogénicos, mais especificamente de parasitas (Schlag, 2010).

1.2 Aquacultura em Portugal

Na época de 1980, em Portugal, a aquacultura baseava-se na produção de trutas de água doce e bivalves nos estuários dos rios. Uns anos depois, por volta de 1990, a produção 4

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção marinha apresentou um aumento seguido de uma ligeira flutuação (FAO, 2005). Em 2015, a produção total rondou as 9300 toneladas e foram principalmente produzidos bivalves marinhos e marisco de água salgada (FAO, 2005). A Política Comum de Pescas, “conjunto de regras que se aplicam à gestão das frotas de pesca europeias e à conservação das unidades populacionais de peixes” (Comissão Europeia, 2018), entidade responsável, foca- se em aumentar a produção e diversidade de produtos como também aumentar a sua qualidade (FAO, 2005).

A pesca em Portugal tem um pequeno contributo a nível económico, mas apresenta uma grande importância cultural e social, em particular em certas regiões. É considerado o terceiro país com maior consumo de peixe per capita na Europa sendo que as espécies mais consumidas são a sardinha (Sardina pilchardus) e o carapau (Trachurus trachurus). Quanto à importação de peixe, Portugal importa largas quantidades de bacalhau, mais uma vez devido à grande importância cultural e social (FAO, 2005).

A captura e a produção total em aquacultura em Portugal, de 1980 a 2017, estão representadas nos Gráficos 1 e 2. A aquacultura apresenta um aumento nos últimos anos, contrariamente à captura de peixes.

Gráfico 1 - Captura total em Portugal. Fonte: FAO FishStat. Adaptado de FAO (2005).

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Gráfico 2 - Produção total de aquacultura. Fonte: FAO FishStat. Adaptado de FAO (2005).

De 2015 a 2016 a produção total de espécies aumentou em cerca de 17,8% e 11,5% de 2016 para 2017, sendo a produção em águas salobras e marinhas a mais importante e representando cerca de 94% da produção total no ano de 2016 e de 94,4 % no ano de 2017 (Instituto Nacional de Estatística, 2017, 2018).

Os locais de produção de moluscos bivalves centram-se na Ria Formosa, no Algarve. A truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) foi a espécie mais produzida em água doce, já em águas salobras e marinhas foram o pregado (Scophthalmus maximus), a dourada e o robalo (por ordem), a amêijoa e o mexilhão (INE, 2018).

1.3 Impacto de doenças em peixes produzidos em aquacultura

Tal como acontece nos outros ecossistemas, no oceano as doenças também são ocorrências naturais. Em meios de produção, como é o caso da aquacultura, estas causam uma elevada perda económica (Lafferty et al., 2015). Existem inúmeras doenças, provocadas por diferentes tipos de agentes patogénicos, que afetam os peixes neste tipo de produção. Agentes estes que podem ser vírus, bactérias e parasitas (Luis et al., 2017).

De todos os agentes patogénicos que afetam a aquacultura, são as parasitoses a principal causa de perdas diretas na produção, como também custos a longo prazo no controlo e maneio das infeções (Shinn et al., 2015).

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Em aquacultura, mais em particular nos sistemas semi-intensivo e intensivo, existe um maior risco de ocorrência de doenças. Isto acontece devido a diversos fatores como o stress, que leva a um défice imunitário e consequentemente ao aparecimento de patologias, a uma elevada densidade nos tanques que torna a propagação mais rápida de hospedeiro para hospedeiro, entre muitos outros fatores ambientais, tais como a qualidade da água, que é de extrema importância (Ogawa, 2015).

Relativamente às parasitoses, alguns parasitas podem ser previsíveis e ocorrerem regularmente, porém nem todos agem desta forma. Alguns são imprevisíveis e crescem esporadicamente (Shinn et al., 2015). Relativamente aos monogéneos, estes, podem afetar um baixo número de peixes, provocando pouca sintomatologia (Ogawa, 2015). Contudo, parasitas com um ciclo de vida direto ou com uma forma infetante que infecta por via da água, tendem a dominar a aquacultura, como é o caso dos monogéneos, protistas e copépodes. Para além destes, outros microorganismos como myxozoários e digéneos, podem causar epidemias em larga escala neste tipo de produção (Paladini et al., 2017).

1.4 Caraterização da Classe Monogenea 1.4.1 Taxonomia e Hospedeiros

Monogenea, ou Monogeneoidea, é a classe mais comum de ectoparasitas que afetam peixes marinhos, de água doce e água salobra (Whittington & Chisholm, 2008).

Pertence ao filo Platelminte e antigamente era referenciada como parte da classe Trematoda, juntamente com a Digenea e Aspidogastrea (Cribb et al., 2002). Divide-se em duas subclasses, Monopisthocotylea e Polyopisthocotylea, com mais de 5500 espécies em mais de 750 géneros de monogéneos (Eiras, 1994; Paladini et al., 2017). A subclasse Monopisthocotylea alberga cinco ordens: Capsalidea, Dactylogyridea, Gyrodactylidea, Monocotylidea e Montchadskyellidea, enquanto que a Polyopisthocotylea inclui quatro ordens, Chimaericolidea, Diclybothriidea, Mazocraeidea e Polystomatidea (Caira & Littlewood, 2013).

As famílias com maior impacto a nível da aquacultura são a Gyrodactylidae, Dactylogyridae, Diplectanidae, Capsalidae, Microcotylidae e Heteraxinidae, sendo que as últimas duas pertencem à subcasse Polyopisthocotylea e as restantes à Monopisthocotylea (Ternengo & Katharios, 2008).

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Segundo Eiras (2016), existem inúmeros monogéneos encontrados em Portugal continental, tanto em meio marinho como em água doce e em cultivo. Em água salgada, entre muitas outras, são encontradas cerca de 180 espécies, tais como Diplectanum aequans, Entobdella soleae, Gyrodactylus elegans, Gyrodactylus spp., Haliotrema balisticus, Lamellodiscus virgula, Lamellodiscus spp., Microcotyle spp., etc. Em água doce, encontram- se cerca de 52 espécies, como por exemplo Pseudodactylogyrus anguillae e Pseudodactyogyrus bini. Nos peixes de aquacultura, o número de parasitas identificados ronda as 22 espécies, como Dactylogyrus spp., Diplectanum aequans, Gyrodactylus elegans, Gyrodactylus spp., Lamellodiscus ignoratus, Lamellodiscus spp., Microcotyle spp., entre outros. Para além dos referidos anteriormente, Ternengo, Agostini, Quilichini, Euzet, & Marchand (2010) relatam que foi encontrado em corvinas de produção, na Córsega, um parasita nunca antes visto nestas condições, Sciaenocotyle pancerii identificado pela primeira vez nas brânquias de um calafate (Umbrina cirrosa), peixe idêntico à corvina. Também em corvinas, outra espécie de parasitas de alguma importância em aquacultura, é a Benedenia sciaenae (Toksen, Buchmann, & Bresciani, 2007).

Os parasitas que estão maioritariamente presentes em aquacultura são Dactylogyrus spp., Diplectanum aequans, Gyrodactylus elegans, Gyrodactylus spp., Lamellodiscus ignoratus, Lamellodiscus spp., Microcotyle spp., e cada um deles tem preferência por certos hospedeiros (Eiras, 2016).

Os genéros Dactylogyrus e Gyrodactylus infestam tanto peixes de água doce, como de água salgada. Afetam douradas, robalos-legítimos e também podem afetar carpas (Cyprinus carpio), causando graves danos e podendo provocar mortalidades significativas (Abidi et al., 2011; RH et al., 2018).

Dactylogyrus spp. afeta comumente ciprinídeos (Paladini et al., 2017). A espécie Gyrodactylus elegans parasita, entre muitos outros, o linguado-legítimo, a brema (Abramis brama) e a carpa-comum (Barzegar et al., 2017; Carvalho-Varela et al., 1981;Eiras, 2016).

Diplectanum aequans afeta maioritariamente o robalo-legitímo, a dourada, a tainha e a corvina (Yardimci & Pekmezci, 2012).

Microcotyle spp. parasita principalmente tainhas e douradas (Paperna & Lahav, 1975; Soares et al., 2018).

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Lamellodiscus spp. afeta corvinas, douradas e sargos-comuns (Baptista, 2013; Soares et al., 2018).

Por fim, a espécie Lamellodiscus ignoratus tem como principais hospedeiros o sargo- comum, sargo-safia, dourada e salema (Sarpa alpa) (Toksen, 2006).

1.4.2 Morfologia

Monogenea é uma classe morfologicamente muito diversificada e a única dos platelmintes onde os organismos possuem uma grande variedade nos órgãos de fixação, utilizados frequentemente para identificação de espécies (Brooks & McLennan, 1993; Kearn, 1994). Os aparelhos de fixação são extremamente importantes no ponto de vista sistemático e podem classificar-se com base na sua localização anatómica. Quando estão presentes na região anterior classificam-se como prohaptor e quando se encontram na região posterior intitulam-se de opisthaptor (Eiras, 1994). Para além disso, outra razão para serem considerados tão importantes, é a forma como o haptor se fixa ao hospedeiro, o que indica o tipo de lesão que é causada (Whittington & Chisholm, 2008).

O aparelho de fixação na subclasse Monopisthocotylea (Figura 2) possui apenas uma unidade de adesão que inclui divisões musculares (septos) dentro do loculi e diversas estruturas esclerotizadas conhecidas como ganchos, hamuli, eslcerites acessórios, pequenos escleritos e esquamodiscos. Por outro lado, a subclasse Polyopisthocotylea apresenta diversas unidades de fixação, a maioria simétrica, porém algumas assimétricas. Estas unidades podem ser ventosas musculares e/ou diversas pinças que possuem um esqueleto de escleritos. As pinças/ventosas podem ser desde três, simetricamente emparelhadas, até centenas, dispostas assimetricamente (Whittington & Chisholm, 2008).

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Figura 2 - Haptors representativos de adultos e larvas de espécies do género Dendromonocotyle (Monocotylidae, Monopisthocotylea) e Zeuxapata seriolae (Heteraxinidae, Polyopisthocotylea). A) Haptor de adulto, Dendromonocotyle torosa, com um único órgão de adesão dividido em loculi (I) por septos (S). Escleritos acessórios assinalados com a seta preta. B) Haptor da larva de Dendromonocotyle spp. com 14 pequenos ganchos e sem hamuli presente. C) Haptor de um organismo adulto, Zeuxapta seriolae, com numerosas pinças individuais (setas pretas) equipadas cada uma delas por um esqueleto esclerotizado. D) Haptor de uma larva de Zeuxapta seriolae com cinco pares de pequenos ganchos e um par com grandes ganchos. Escala: A=500 µm, B, D=10 µm, C=100 µm. Whittington & Chisholm (2008).

Para além do aparelho de fixação, os monogéneos adultos são constituídos por um tegumento, glândulas digestivas, um canal alimentar e possuem diversos sistemas tais como o sensorial, nervoso, muscular, excretor e reprodutivo (Buchmann & Bresciani, 2006).

O sistema digestivo dos monogéneos é composto pela boca, faringe e ceco intestinal. Este último está normalmente emparelhado e pode ser ramificado, não ramificado ou eventualmente em anastomose. Para além disso, são também produzidas e libertadas enzimas pelas células das glândulas associadas à boca, faringe ou ceco. A gastroderme serve para absorver nutrientes e está desenvolvida de acordo com o tipo de alimentação do parasita (Buchmann & Bresciani, 2006). Espécies pertencentes à subclasse Polyopisthocotylea alimentam-se de sangue do hospedeiro enquanto que os organismos da subclasse Monopisthocotylea se alimentam maioritariamente de células epiteliais e muco do hospedeiro, exceptuando espécies pertencentes ao género Amphibdella (Craig, 2005). Para além desta

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção exceção mencionada anteriormente, outra também existente é a presença de um sincício intestinal, nos organismos que pertencem ao género Gyrodactylus (Kritsky et al., 1994).

O sistema sensorial tem vindo a ser estudado ao longo dos anos. Alguns autores provaram que quimiorrecetores, tangorecetores, reocetores e fotorecetores existem e funcionam nos monogéneos. Os oncomiracídeos pertencentes à subclasse Monopisthocotylea possuem dois pares de olhos pigmentados, contendo cristalino, contrariamente às espécies pertencentes à Polyopisthocotylea, que possuem apenas um par e sem cristalino (Smyth & Halton citado em Buchmann & Bresciani, 2006). Para além disso, apresentam também inúmeras papilas com nervos com a função de se aderirem ao hospedeiro (Buchmann & Bresciani, 2006). O sistema nervoso dos monogéneos é muito idêntico ao dos outros platelmintes, sendo composto por um par de gânglios cefálicos, de onde partem diversos nervos, gânglios estes que estão conectados por uma comissura dorsal formando um anel periesofágico e um plexo submuscular. O opisthaptor é bastante enervado internamente e apresenta papilas externas que funcionam como mecanorecetores (Drago & Núñez, 2017).

Os músculos nos monogéneos estão organizados por baixo da sua superfície corporal, o que lhes permite movimentarem-se. Para além disso, estão presentes também no opisthaptor com os seus ganchos, ventosas e pinças, na faringe e nos órgãos copulatórios masculinos (Buchmann & Bresciani, 2006).

O aparelho excretor apresenta um sistema protonefridial com a principal função de osmorregulação e é composto por dois tubos coletores principais que distalmente formam uma vesícula contrátil e desembocam no exterior através de um par de poros excretores laterais (Drago, 2017).

Por último, o sistema reprodutor destes organismos é composto por ovários e testículos. A vitelária, o oótipo e o recetáculo seminal podem também estar presentes, juntamente com estruturas esclerotinizadas como o pénis e a vagina (Buchmann & Bresciani, 2006).

Na Figura 3A e 3B está representada esquematicamente a morfologia de dois organismos pertencentes às duas subclasses da classe Monogenea.

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Tabela 1 - Principais diferenças entre as duas subclasses da Monogenea. Adaptado de Whittington & Chisholm (2008).

Monopisthocotylea Polyopisthocotylea Tipo de Agnatha (peixes sem mandibula, Chondrichthyes, Dipnoi (ex: hospedeiro ex: mixinas), Chondrichthyes celacanto), Teleostei (peixes cartilagíneos, ex: tubarões, raias), Teleostei (peixes ósseos, a maioria de água doce, salgada e salobra)

Local de adesão Brânquias, pele, barbatanas, câmaras Brânquias, câmaras branquiais (do mais para o branquiais, cavidade oral, tecido incluindo o interior do opérculo, menos comum) nasal, superfície ocular, sistema cavidade bucal urogenital (cloaca e glândula retal nos Chondrichthyes; ureteres, rins, oviductos), sistema digestivo, miocárdio, veias

Tipo de nutrição Células epiteliais e por vezes muco Sangue

Mobilidade Bastante móveis na sua maioria Maioritariamente sedentários

Estruturas de Única unidade de adesão; Várias unidades de adesão adesão/Haptor simétrico; Presença de pequenos incluindo ventosas e múltiplas ganchos, hamuli, escleritos pinças; Presença de pinças e acessórios e esquamodiscos ventosas

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Figura 3A e 3B - A) Representação esquemática de uma vista ventral de Benedenia rohdei n. sp. (Capsalidae, Monopisthocotylea). Legenda: a- esclerito acessório, aa- órgão de adesão anterior, ah- hamulus anterior, b- bexiga excretória, c- abertura genital comum, g- germarium, gG- glândulas de goto, h- haptor, he- músculos extrínsecos do haptor, m- válvula marginal, mh- pequenos ganchos, o- oótipo, p- faringe, ph- hamulus posterior, s- pénis, t- testis, te-tendão, v- vagina, vf- folículos vitelinos. Escala= 500 µm. Adaptado de Whittington, Kearn, & Beverley-Burton (1994). B) Representação esquemática de uma vista ventral de Pauciconfibula pogoniae (Microcotylidae, Polyopisthocotylea). Escala= 2 mm. Adaptado de Hendrix (1994).

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1.4.3 Reprodução/Ciclos de vida

Os ciclos de vida dos monogéneos são relativamente simples, comparando com outros platelmintes, como os céstodes e os digéneos (Kearn, 1986). O ciclo de vida dos digéneos envolve dois ou três hospedeiros, tal como o dos céstodes (Ogawa, 2015), enquanto que os monogéneos não necessitam de nenhum hospedeiro intermediário, tendo assim um ciclo de vida direto (Grano-Maldonado, Moreno-Navas, & Rodriguez-Santiago, 2018). Contudo, existem duas espécies de monogéneos, Gotocotyla acanthura e Pricea multae, que utilizam, eventualmente, hospedeiros intermediários opcionais (Paladini et al., 2017).

Estes platelmintes são hermafroditas (Hutson, Brazenor, Vaughan, & Trujillo- González, 2018). Ambos possuem um órgão copulatório feminino e masculino. A maioria são ovíparos, fazem postura de ovos, como por exemplo, o género Dactylogyrus e Pseudodactylogyrus. Porém, alguns são vivíparos como acontece no género Gyrodactylus (Buchmann & Bresciani, 2006).

Segundo Eiras (1994), os ciclos de vida dos monogéneos podem ser divididos em três tipos. No ciclo de vida mais simples, representado na Figura 4, os monogéneos depositam os ovos na água durante um longo período de tempo, fazendo com que o oncomiracídeo atinja o novo hospedeiro, adira ao mesmo e, posteriormente, se desenvolva até à forma adulta, rapidamente, tal como acontece com espécies pertencentes à família Dactylogyridae (Eiras, 1994; Longshaw & Feist, 2001).

Figura 4 - Ciclo de vida de monogéneos ovíparos. Adaptado de Noga (2010).

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Os ovos são maioritária e continuamente depositados durante a noite (Craig, 2005). A sua eclosão pode ser influenciada por diversos factores, tanto bióticos como abióticos, sendo que os abióticos têm maior influência (Whittington & Kearn, 2011). Como factores abióticos entende-se: a temperatura, salinidade e fotoperíodo (Craig, 2005). Segundo Paladini et al., (2017), a temperatura é o factor abiótico mais importante na postura, eclosão e desenvolvimento dos ovos dos monogéneos. Tal como referiu Whittington & Kearn (2011), a maioria dos trabalhos experimentais feitos em ritmos de eclosões dos ovos destes parasitas consistiram na exposição artificial a diferentes ciclos de iluminação com mudanças abruptas.

A maioria das espécies dos monogéneos deposita menos de 100 ovos (por parasita) durante um dia, enquanto que existem outras espécies que depositam menos de 25 ovos por dia (Tinsley,1983). Estes podem apresentar diversos formatos: esféricos, ovais, ovóides, esferóides, fusiformes ou tetraédricos e podem encontrar-se sozinhos ou aglomerados (em cadeia ou em corda). Para além disso, podem ser operculados ou não operculados e possuir processos polares ou filamentos na periferia (Kearn, 1986).

Segundo Kearn (1986), os ovos pertencentes ao género Dactylogyrus (Figura 7A) apresentam formas esferóides e tetraédricas. Porém, uma nova espécie descoberta apresenta ovos com um formato oval (Tripathi et al., 2016). Os ovos do género Diplectanum apresentam um formato oval (Figura 7B) (Katharios, 2018), os de Sciaenocotyle e de Microcotyle (Figura 7C e 7D, respetivamente) apresentam, de um modo geral, um formato fusiforme (Merella et al., 2009; Ayadi et al., 2017) e os de Lamellodiscus apresentam um formato tetraédrico (Figura 7E) (Kearn, 1986).

Posteriormente, o ovo evolui para o estadio seguinte, onde se passa a chamar de oncomiracídeo. Por norma, este sobrevive menos de 24 horas (Noga, 2010) e é foto- dependente (Buchmann & Bresciani, 2006).

Para além do ciclo de vida descrito anteriormente, Eiras (1994), considera ainda um segundo tipo, como é o caso do parasita Diplozoon paradoxum, em que existe uma diminuição do período de produção dos ovos. Por último, o terceiro tipo de reprodução pertence ao género Gyrodactylus, única exceção da classe dos monogéneos onde ocorre retenção in utero de

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção embriões maturos até que os mesmos contenham embriões no seu interior (Bakke et al., 2007). A este estilo reprodutivo os autores intitularam de “Bonecas-Russas” (Figuras 5 e 6).

Figura 5 - “Boneca-russa”: Gyrodactylus salaris contendo dois embriões no seu interior. (G. Robertsen, upublished citado In Bakke et al., 2007). Escala=50µm.

Figura 6 - Microfotografia de Gyrodactylus salaris onde é visível o desenvolvimento embrionário durante o ciclo de vida. (a) Após o nascimento (recém-nascido, 1º filho e 2º filho), os hamuli das gerações seguintes são visíveis para o axis posterior do embrião F1 fechar a ECFR (Egg Cell Forming Region) dos parentes. (b) O hamuli do embrião da geração F2 no pólo anterior do útero parental onde o esclerito do embrião de F1, no pólo posterior, estão totalmente desenvolvidos em adultos. (c) Útero contraído contém duas células em divisão que se originaram a partir de uma única célula que entrou no útero a partir da ECFR. (d) Embrião da F1 sem evidência de desenvolvimento de esclerito. (e) Presença de um anel marginal primordial de ganchos e evidência de hamuli primordial no embrião F1. (f) Ganchos marginais estão separados, a estrutura anelar anteriormente presente já não é visível e a curvatura do hamuli aparece no haptor do F1. Adaptado de Bakke et al. (2007)

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A B

C D

Figura 7 - Fotografias de alguns dos ovos dos monogéneos mais encontrados em aquacultura. A: Ovos de Dactylogyrus spp.; B: Diplectanum spp.; C: Ovos de Microcotyle spp. (A, B, C Originais do autor). Escalas nas ditas fotografias. D: Ovos de Sciaenocotyle pancerii. Adaptado de Merella et al. (2009). E: Ovos de Lamellodiscus spp. (Adaptado de Oliver (1987) citado em Domingues, 2004). Escala: D=200 µm.

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1.5 Sinais clínicos

Os sinais clínicos causados por estes parasitas são muito diversificados. Podem ser devidos a outros agentes patogénicos (víricos, bacterianos, fúngicos) ou até mesmo a problemas de maneio que causem hipóxia (diminuição da quantidade de oxigénio, toxicidade da amónia e dos nitritos) (Mayer & Donnelly, 2013).

A maioria das espécies não é patogénica, porém algumas são específicas das brânquias e da pele do hospedeiro. Muitas delas demonstram uma especificidade por um nicho, parasitando regiões específicas do hospedeiro ou certos hospedeiros de idades específicas. A especificidade pode ser influenciada por diversos fatores, como por exemplo, os requisitos nutricionais do parasita (Baker, 2007). As espécies mais significativas que ocorrem em condições de cativeiro são: Benedenia seriolae, Cichlidogyrus spp., Dactylogyrus spp., Diplectanum aequans, Diplozoon spp., Gyrodactylus spp., Lamellodiscus spp., Microcotyle spp., Neobenedenia melleni, Sparicotyle chrysophrii, Zeuxapta seriolae entre outras (Paladini et al., 2017).

Conforme o local onde o parasita está alojado, os sinais clínicos vão ser mais específicos. Por norma, tendem a alojar-se nas brânquias, na pele, nas barbatanas, na cavidade nasal e nas narinas do hospedeiro (Buchmann & Bresciani, 2006; Chaudhary, Verma, Shobna, & Singh, 2013). Para além disto, a sintomatologia apresentada também depende da sublcasse a que pertencem (Monopisthocotylea ou Polyopisthocotylea) (Rubio- Godoy, 2007).

Segundo Ogawa (2015) as espécies mais patogénicas em maricultura pertencem às famílias Capsalidae, Diplectanidae, Anoplodiscidae, Ancyrocephalidae, Gyrodactylidae, Microcotylidae, Heteraxinidae e Diclidophoridae.

Os monogéneos pertencentes à subclasse Monopisthocotylea, quando aderidos, em grande número e com grande tamanho, à pele e às brânquias do hospedeiro, causam lesões a nível do epitélio celular (Buchmann & Bresciani, 2006; Craig, 2005). Os hospedeiros apresentam lesões cutâneas irritativas por se esfregarem em superfícies duras (tanque, gaiola ou sedimento presente no fundo), das quais originam lesões progressivas e danos a nível da pele apresentando-se mais escura devido à atividade alimentar do parasita). Para além disto, os hospedeiros têm uma excessiva secreção de muco, perdem escamas e têm problemas osmóticos (Craig, 2005). Os monogéneos de menor tamanho causam uma extensa

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção hiperplasia e reação do tecido no local onde se encontram fixados ao hospedeiro (Buchmann & Bresciani, 2006). Nas brânquias, o parasita fica incorporado fazendo com que haja uma diminuição da superfície respiratória e, consequentemente, aumento da mortalidade devido à hipóxia (Buchmann & Bresciani, 2006). No local da brânquia onde o hamuli se fixa, ocorre hiperplasia epitelial, edema e pode-se observar hemorragia com atrofia dos capilares e das lamelas branquiais. Muitas vezes, a elevada carga parasitária da população de Monopisthocotylea está associada a mortalidade em peixes de cativeiro. Contudo, os danos causados são uma entrada para infecções secundárias e eventualmente, a entrada de vírus, bactérias e outros microorganismos que causam a morte do hospedeiro (Craig, 2005).

Os organismos pertencentes à Polyopisthocotylea não são tão patogénicos como os da Monopisthocotylea, mas têm uma elevada especificidade de hospedeiros. Grandes infestações destes organismos podem causar alguns sinais clínicos, porém os efeitos subletais não estão bem estudados (Craig, 2005; Rubio-Godoy, 2007; Noga, 2010). No entanto, por possuírem ganchos, agarram-se ao tecido do hospedeiro, podem causar anemia e, potencialmente, a sua morte (Rubio-Godoy, 2007). Nestes casos, os hospedeiros apresentam um painel analítico com número de eritrócitos, valores de hemoglobina e volume corpuscular médio (VCM) mais baixos que o normal. Para além disso, apresentam-se letárgicos, anoréticos, com a pele mais escura e com o músculo, brânquias, rim e fígado pálidos. O nível de proteínas no soro sanguíneo apresenta-se baixo, apresentando também reduzida atividade enzimática e elevados níveis de ureia e creatinina (Kaur, Singh & Bharti, 2018).

Segundo Craig (2005), os monogéneos desta subclasse são benignos para hospedeiros selvagens. A única exceção é o Neoheterobothrium affine, pertencente à família Diclidophoridae.

Cada espécie de parasita tem sinais clínicos específicos. Tendo em conta os mais presentes em peixes de aquacultura, os sinais clínicos mais frequentemente encontrados são referidos de seguida.

Na espécie Diplectanum aequans as lesões mais frequentes são a nível das brânquias, onde há uma hiperplasia do epitélio, fusão das lamelas branquiais e presença de focos inflamatórios e hemorrágicos com infiltração leucocitária. (Figuras 8A e 8B) Tal acontece, quando o parasita penetra na membrana basal e no tecido conjuntivo da lamela primária

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção causando destruição da lamela secundária (Gonzáles-Lanza et al., 1991; Yardimci & Pekmezci, 2012).

Quanto ao local de adesão do parasita, este tem preferência pelo primeiro arco branquial e afeta principalmente as regiões dorsais e mediais dos mesmos (Saraiva et al., 2015).

Figura 8A e 8B - A) Dois indivíduos de Diplectanum aequans aderidos a um filamento branquial de um robalo (Dicentrarchus labrax), hiperparasitado com Trichodina spp. Escala =400 μm. Adaptado de Colorni & Diamant (2005). B) Brânquias de robalo (Dicentrarchus labrax) infestado com Diplectanum aequans. Escala= 0:1 mm. (Ogawa, 2015).

Merella et al. (2009) afirmam que Sciaenocotyle pancerii causa palidez das brânquias associada a uma hipersecreção de muco. Os órgãos viscerais em particular o fígado, coração e baço apresentam-se pálidos, demonstrando assim o estado anémico do hospedeiro.

O género Microcotyle pode causar anemia severa nas brânquias, diminuição do crescimento, perda de apetite e mortalidade (Faisal & Imam, 1990; Ramasamy et al., 1995)

As lesões histológicas mais frequentemente encontradas nos hospedeiros, causadas pelos parasitas do género Dactylogyrus, são a perda de eritrócitos, aposição lamelar e vacuolização, tal como mostra a Figura 9 (Yandi et al., 2017).

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Figura 9 - Lesões provocadas pelo Dactylogyrus spp. num acára-disco (Symphsodon discus). A: Aposição lamelar (seta preta) com hiperplasia representada por hp na imagem. B: Perda de sangue das lamelas. Eritrócitos representados com a letra (e). C: Seção longitudinal do Dactylogyrus spp. D: Seção longitudinal e transversal do Dactylogyrus spp. Escala= 400 μm (Yandi et al., 2017).

Os parasitas do genéro Lamellodiscus tendem a causar no hospedeiro uma diminuição do crescimento e danos a nível branquial devido a uma extensa hiperplasia e proliferação das lamelas secundárias (Rigos & Katharios, 2010).

1.6 Diagnóstico

O diagnóstico deve começar com um historial completo dos diversos fatores químicos da água (temperatura, salinidade, pH, amónia, nitratos, nitritos, alcalinidade, oxigénio dissolvido) e uma avaliação pormenorizada do ambiente. Deve ser feita também uma observação direta do peixe no seu habitat (tanque/aquário/gaiola) e um exame físico completo (Mayer & Donnelly, 2013).

Os monogéneos podem ser microscopicamente identificados usando porções molhadas de pele e brânquias do hospedeiro e com base na sua morfologia do órgão anexo

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção posterior (opisthaptor), modo de reprodução e presença/ausência de eyespots (Mayer & Donnelly, 2013; Noga, 2010).

A anatomia destes parasitas pode ser observada por diversos meios. O método aplicado depende do tipo de estrutura que se pretende estudar. Todos os parasitas conseguem ser previamente examinados vivos usando duas lâminas de vidro antes de se fazer qualquer tipo de coloração como hematoxilina ou carmim para se visualizar a anatomia interna (Justine, 2007; Paladini et al., 2017).

O diagnóstico laboratorial baseia-se no corte e raspagem de vários filamentos branquiais. As amostras devem ser colocadas numa lâmina com uma gota de água e observadas ao microscópio com ampliações de 45-125 vezes. Por vezes, nos peixes mortos, esta técnica já não funciona porque alguns dos parasitas saem do hospedeiro rapidamente (Crespo & Crespo, 2003; Flores-Crespo, 1991; Flores-Crespo & Flores, 1993).

Existem também métodos moleculares de identificação, onde se amplificam e sequenciam-se regiões informativas do genoma dos parasitas (Paladini et al., 2017). Para além das diferentes formas de diagnóstico enumeradas, existe ainda a possibilidade de se fazer histopatologia, apesar de não ser a técnica de eleição habitual. Secções de monogéneos podem ser vistos em amostras histopatológicas de pele e brânquias (Paladini et al., 2017).

1.7 Tratamento

Em aquacultura, tal como em outros meios de produção, as substâncias mais frequentemente utilizadas são os desinfetantes, biocidas e antibióticos (Cabello, 2006; Rico & Van den Brink, 2014). No grupo dos biocidas, os princípios ativos que mais se utilizam são o praziquantel, mebendazol, formol (formalina) e triclorofórmio (Bader et al., 2018; Buchmann et al., 1993; Schmahl & Mehlhorn, 1985; Wunderlich et al., 2017).

Os objetivos da terapêutica nas parasitoses causadas por monogéneos são melhorar as condições do ambiente e controlar os agentes etiológicos através de banhos com soluções de compostos químicos (Mayer & Donnelly, 2012; Schmahl, 1991). Também nas infestações por monogéneos, devem-se corrigir as alterações ambientais e remover fatores que causam stress, tais como a baixa qualidade de água. Nos tratamentos das infestações por espécies ovíparas, a temperatura da água pode ser aumentada para acelerar o processo de incubação dos ovos (Mayer & Donnelly, 2012).

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Atualmente, nos Estados Unidos da América, os únicos agentes químicos autorizados para tratar infestações em peixes são preparados à base de formol para diluir em água. Porém, muito recentemente, o peróxido de hidrogénio foi aprovado para este fim, como controlo e tratamento de Gyrodactylus spp. em salmonídeos (U.S. Food & Drug Administration, 2019). Em Portugal, segundo o Regulamento (UE) Nº. 37/2010 da Comissão de 22 de dezembro de 2009, existem diversas substâncias químicas que são permitidas. No entanto, os únicos dois princípios ativos de medicamentos veterinários que estão autorizados para este tipo de tratamento são o formol (380 mg/ml) para o rodovalho (Psetta maxima) e para a dourada e a emamectina para o salmão do atlântico (Salmo salar). O formol a 380 mg/ml é uma solução concentrada para banhos medicamentosos. Para o rodovalho, está indicado no controlo de parasitoses externas causadas por um protozário, Philasterides dicentrarchi. Na dourada, está indicado para tratamento e controlo para parasitoses causadas por um monogéneo, Sparicolyte chrysophrii. Devem ser utilizados 95 g de formol por 1000L de água, equivalentes a 250 ml da substância por 1000L de água, durante uma hora. Na dourada recomenda-se uma única aplicação, enquanto que no rodovalho o banho deverá ser uma vez por semana, não excedendo as três aplicações consecutivas (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária, 2019).

Segundo a FDA (2019), soluções à base de formol podem ser utilizadas em tanques e raceways até uma hora, ou podem ser administradas em tanques de terra indefinidamente. As concentrações recomendadas para tanques e raceways, para salmões e trutas são: até 170 partes por milhão (ppm) (acima de 50ºF) e até 250 ppm (abaixo dos 50ºF). Para as outras espécies utilizam-se até 250 ppm. Em tanques de terra, utilizam-se concentrações entre 15- 25 ppm (até 50ºF) para salmões e trutas e a mesma concentração para outras espécies. Para além disso, os únicos géneros de parasitas que estão aprovados para este tratamento são o Cleidodiscus, Dactylogyrus e Gyrodactylus (FDA, 2019). Apesar da sua eficácia, apresenta diversos efeitos secundários podendo causar lesões nos olhos, brânquias e na pele (Bader et al., 2018). Para além disto, quando a temperatura da água é bastante baixa, aumenta a conversação do formaldeído em paraformaldeído que é mais tóxico para os peixes (Rucker et al., 1963).

Embora não seja autorizado para tratamento de infestações em aquacultura, alguns estudos provam que o praziquantel (PZQ) é eficaz contra alguns monogéneos (Bader et al., 2018). Apesar da sua eficácia, outros autores sugerem que é ineficaz contra os ovos, mas o mais eficaz contra as formas adultas (Bader et al., 2018; Morales-Serna et al., 2018). A concentração recomendada para monogéneos marinhos e de água doce é de 2 ppm, mas até

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10 ppm é seguro quando utilizado em peixes ornamentais (Austin & Newaj-Fyzul, 2017). Os banhos recomendados variam entre 2 a 200 mg/ml e são aplicados durante 24-48h (Bader et al., 2018).

Apesar da eficácia apresentada pelo PZQ, existem alguns efeitos secundários que foram observados. Alguns estudos provaram que o PZQ causava reações físicas adversas em peixes, tal como foi descrito num estudo em que um grupo de carpas prateadas (Hypophthalmichthys molitrix) que foram expostas a um banho de praziquantel de 100 mg/ml durante 18 minutos e apresentaram-se a nadar de cabeça para baixo (Bader et al., 2018).

Existem ainda outros tratamentos químicos possíveis, para além da formalina e do praziquantel, porém não tão eficazes como este último. Organofosfatos, como o triclorofórmio, podem ser eficazes contra monogéneos e a concentração recomendada é de 0,25-0,75 mg/L (ppm) (Mayer & Donnelly, 2012). Outra possível escolha é o permanganato de potássio que pode ser administrado através de banhos de longa duração na concentração de 2 mg/L. Também o mebendazol na concentração de 1 mg/L e tratamentos de cobre a 0,2 mg/L podem ser usados como controlo destes parasitas apenas em sistemas marinhos (Mayer & Donnelly, 2012).

Para além dos convencionais tratamentos, existem ainda outros métodos alternativos, como a fitoterapia que pode servir como método de tratamento alternativo, contribuindo para a redução do uso de biocidas quimioterápicos, promovendo uma grande sustentabilidade na produção de peixe com um baixo risco ambiental. Para além disso, trata as patologias, evita a mortalidade e perdas económicas (Valladão et al., 2015). Certos autores pretendem mostrar as vantagens da utilização de extratos de plantas como uma alternativa contra parasitas em aquacultura como por exemplo, protozoários, mixozoários e monogéneos. Para além da terapêutica, indicam as desvantagens e possíveis impactos ambientais negativos causados pelos tratamentos convencionais utilizados neste tipo de produção (Wunderlich et. al., 2017).

Para além da fitoterapia, recentemente têm sido feitos diversos estudos in vitro em que vieram a confirmar que a utilização de óleos essenciais (OE) também resulta no controlo de parasitas em peixes, particularmente em monogéneos (Tavares-Dias, 2018). Depois dos estudos in vitro, diversos testes utilizando banhos terapêuticos têm sido realizados para encontrar produtos com atividade antiparasitária, avaliar a sua eficácia e confirmar se podem ou não ser utilizados em pisciculturas.

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As intervenções terapêuticas podem ser feitas de diversas formas, através de banhos de longa duração (horas a dias) ou banhos de curta duração (minutos a horas), utilizando os OE para tratar as infestações por diversos ectoparasitas, como por exemplo de monogéneos (Tavares-Dias, 2018). Muitas destas terapias têm sido eficazmente usadas como controlo de infestações de monogéneos. Contudo, importa perceber que cada espécie, e até cada população, diferem na sensibilidade aos tratamentos, devendo cada uma delas ser adaptada a cada situação em particular (Noga, 2010). Como tal, irão ser agora adaptados e especificados, se possível e existentes, para cada espécie e géneros maioritariamente presentes em aquacultura (Microcotyle spp., Diplectanum aequans, Dactylogyrus spp., Lamellodiscus spp., Sciaenocotyle pancerii e Gyrodactylus spp.).

Devido à eficácia apresentada pela formalina, Katharios et al. (2006) concluem, no seu estudo, que o tratamento com este produto foi bastante eficaz na remoção dos parasitas do género Microcotyle das brânquias de pargos-legítimos (Pagrus pagrus) infestados, quando aplicados banhos com 200 ppm, durante uma hora. Para além disso, os autores referem também que o mebendazole tem sido bastante eficiente no controlo de microcotilídeos quando administrado juntamente com a comida.

Num outro estudo, realizado por Toksen & Degirmenci (2013), os autores comprovaram que o número de organismos de Diplectanum aequans, diminuía com o tratamento oral do fármaco azametifós, na concentração de 2 mg/kg.

Quanto ao género Dactylogyrus, o tratamento que demonstrou ser mais eficaz foi o formol (formalina), quando administrad através de banhos de longa ou curta duração (Thoney & Hargis,1991). Estes banhos necessitam de ser cautelosamente monitorizados, porque os peixes doentes não toleram bem o formol (Klinger & Floyd 2013). Contudo, o tratamento pode não resultar tão bem quando a qualidade da água é má e quando existe uma elevada densidade de peixes no tanque (Zhu et al., 2014).

Os autores Katharios et al. (2006) consideram que o tratamento mais adequado ao género Lamellodiscus é o formol (formalina).

Segundo Rach et al. (2000), o tratamento mais recomendado para infestações causadas por Gyrodactylus spp. é o peróxido de hidrogénio.

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1.8 Controlo e Profilaxia

Até aos dias de hoje, não há nenhum método efetivo para prevenir infestações por monogéneos em sistemas abertos de aquacultura (Jana et al., 2018). Uma das formas é evitar a introdução de parasitas num novo sistema, seguindo um protocolo de quarentena (Reed et al., 2012). Outra hipótese, é reduzir a população de peixes de modo a diminuir a transmissão de oncomiracídeos a novos hospedeiros (Noga, 2010) e promover qualidade ambiental e da água (Mayer & Donnelly, 2012).

Quando não é possível realizar uma quarentena, pode-se minimizar a introdução dos monogéneos e de outros ectoparasitas, imergindo os peixes em água doce/salgada dependendo de cada espécie (peixes de água doce mergulhados em água salgada e vice- versa). Independentemente da concentração de sal utilizada, o tempo mínimo deverá ser de 10 minutos. No entanto, se o animal apresentar sinais de desequilíbrio antes dos 10 minutos, deve ser imediatamente removido do banho (Reed et al., 2012).

Contudo, um dos grandes problemas existentes é a elevada resistência dos ovos dos monogéneos aos tratamentos, inclusive às mudanças de salinidade. Devem ser realizadas no mínimo 4 semanas de quarentena antes de introduzir os peixes no novo sistema (Mayer & Donnelly, 2012; Reed et al., 2012).

1.9 Importância económica

As doenças parasitárias causam mortalidade ou retardam o crescimento dos peixes, levando a significativas perdas económicas (Dash et al., 2014). Também os custos com o tratamento e profilaxia quando a doença já está instalada, como também a nível da prevenção e maneio (Shinn et al., 2015). Como se sabe, a diplectanose causada pelo Diplectanum aequans, é uma das doenças ectoparasíticas mais significativas na produção de robalo. Este parasita está presente nos robalos selvagens, apesar de só causar patogenicidade quando o mesmo é cultivado (Whittington & Chisholm, 2008). Apesar de não haver certezas se Gyrodactylus salaris é a espécie mais importante a nível económico, é a única da classe Monogenea que é notificada pela World Organization For Animal Health (OIE) (Whittington & Chisholm, 2008).

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2. Objetivos

O presente estudo compreendeu os seguintes objetivos:

1. Avaliar o fator tempo na deposição de ovos 2. Avaliar o efeito da variável “operações de aquacultura” no resultado da deposição de ovos 3. Avaliar o fator densidade de peixes na deposição de ovos 4. Estudar quais os substratos com maior e menor deposição de ovos de monogéneos

3. Materiais e Métodos

O estudo foi realizado nas instalações da EPPO, pertencente ao IPMA, durante o período de tempo compreendido entre 5 de novembro de 2018 e 29 de março de 2019.

Na EPPO, tendo por base todos os registos de parasitas que eram realizados aquando das amostragens, comprovou-se que os géneros de monogéneos que estavam presentes nos diversos tanques de terra da estação eram Dactylogyrus, Lamellodiscus, Diplectanum, Sciaenocotyle e Microcotyle. Os que foram observados em maior número foram Diplectanum, que afeta principalmente corvinas e Dactylogyrus que afeta maioritariamente douradas, mas também alguns sargos-comuns. Quanto aos restantes géneros que foram observados em menor número foi Sciaenocotyle que afeta consideravelmente as corvinas, porém também foi encontrado em douradas e robalos. Microcotyle que parasita tanto a corvina como a dourada, o sargo e também o robalo. Por último, com menor número de parasitas encontrados nas amostragens, foi Lamellodiscus que ocorre principalmente em douradas e sargos-comuns.

Para este estudo realizaram-se diversos ensaios. Primeiramente, um ensaio preliminar, realizado nos tanques interiores de peixes reprodutores (TR1, TR4, TR6 e TR7), na EPPO, onde se utilizaram fios de algodão como controlo por estes apresentarem uma boa adesão dos ovos. Posteriormente foram realizados três ensaios nos tanques de terra (TT) da EPPO, mais concretamente nos TT8, TT11 e TT13. Selecionaram-se estes três tanques por serem os três com peixes da mesma idade e com situações distintas de cultivo. As condições, dimensões e dados referentes aos mesmos tanques foram referidos mais abaixo.

Nestes três ensaios foram utilizados três substrato não biológicos (madeira, plástico, PVC) e um substrato biológico (macroalga), que estavam abundamente presentes dentro dos

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção mesmos tanques de terra. Como controlo, foram utilizados os fios de algodão utilizados no ensaio preliminar. Todos os substratos apresentavam as mesmas dimensões, 7 cm de comprimento por 1 cm de largura.

O sistema utilizado nos três ensaios, em tanques de terra, consistia na colocação de três amostras de cada substrato, presas num fio de nylon, agrupadas três a três e separadas por pequenos nós de modo a não contactarem umas com as outras (Figura 10). Por sua vez, este fio encontrava-se fixado a uma barra de esferovite de modo a permitir ao sistema flutuar dentro do tanque. Todas as amostras estavam presas à mesma altura, sendo que os substratos de madeira, por apresentarem elevada flutuabilidade, necessitaram de um apetrecho formado por pequenas chumbadas para ficarem submersos ao mesmo nível que os restantes substratos. De forma a não serem perdidas as amostras das macroalgas, foi colocado envolta de todo o sistema uma rede de plástico com 1 cm, impedindo assim a passagem dos peixes para o seu interior e a sua destruição (Figura 11).

Figura 10 - Fotografia do sistema de esferovite utilizado, composto pelos diferentes materiais: macroalgas, madeira, plástico, PVC e fios de algodão de controlo (segundo a ordem da imagem). Original do autor.

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Figura 11 - Fotografia do sistema de esferovite utilizado com a rede de plástico com 1cm. Original do autor.

O mesmo sistema foi colocado na zona da comporta de saída, ficando preso por um cabo vertical, com um comprimento adequado, de modo a permitir às amostras ficarem todas devidamente submersas à mesma altura (Figura 12). Este método foi igualmente replicado para cada amostragem feita durante o estudo.

Figura 12 - Localização do sistema utilizado na região da comporta de saída do tanque de terra. Original do autor.

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Em todos os ensaios, exceto no ensaio preliminar, o procedimento decorreu da mesma forma. Os substratos foram colocados dentro de água e ao final de cinco ou dez dias (dependendo do tipo de ensaio) foram recolhidos e colocados de imediato, um a um, dentro de caixas de Petri devidamente identificadas (data, tanque, tempo, nº amostra, material) onde posteriormente foi adicionada uma solução salina estéril, de modo a permitir a conservação da amostra. As amostras foram enviadas ao laboratório e analisadas à lupa eletrónica, Nikon SMZ1000, onde foi feita a contagem dos ovos dos monogéneos. À lupa estava acoplada uma câmara fotográfica com a qual se tiraram fotografias em diversas ampliações (desde 20x até 80x). Todas as contagens foram anotadas numa página de Excel.

Ensaio preliminar:

O ensaio preliminar foi realizado no mês de novembro e teve como objetivo definir qual o melhor timing para a contagem dos ovos dos monogéneos.

Este consistiu na colocação de três fios de algodão (fios controlo) em quatro tanques diferentes de peixes reprodutores (TR1, TR4, TR6, TR7: douradas, sargos-legítimos, meros e corvinas, respetivamente), sendo que cada fio correspondia a um timing diferente: t1, t3 e t5 (1,3 e 5 dias respetivamente). Foram colocados nos dias 6, 8 e 10 de novembro, sendo que cada um correspondia, respetivamente ao t1, t3 e t5.

O TR1 albergava 18 douradas, o TR4 32 indivíduos de sargos-legítimos, o TR6 continha 26 meros e, por fim, o TR7 apresentava 17 indivíduos de corvina. O volume do TR1 e o TR7 era de 8 m3 e o do TR4 e TR6 era de 12 m3.

As condições de saturação, concentração de oxigénio e temperaturas apresentadas pelos tanques dos reprodutores durante os três dias do ensaio preliminar encontram-se representadas na Tabela 2:

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Tabela 2 - Condições apresentadas pelo TR1, TR4, TR6 e TR7 durante os três dias do ensaio preliminar. Legenda: TR- Tanques de reprodutores.

Tempo (t) em TR %O2 [O2] TºC dias t1 98 6,8 17,3

TR1 t3 80 6,2 18,1 (dourada)

t5 85 6,4 19,2 t1 96 7,6 16,2

TR4(sargo- t3 94 7,4 17,0 legítimo)

t5 90 7,0 18,4 t1 93 7,4 16,2

TR6 (mero) t3 93 7,3 16,8

t5 93 7,3 17 t1 88 7,1 15,8

TR7 t3 91 7,2 16,8 (corvina)

t5 83 6,6 16,9

Posteriormente foram feitos três ensaios que decorreram nos tanques de terra da EPPO. O TT8 apresenta as seguintes dimensões: 55 m de comprimento por 38 m de largura num total de 2500 m3 de volume. O TT11 e o TT13 apresentam 38 m de comprimento por 18 metros de largura e com um volume de 750 m3. As densidades rondavam os 1,4 kg/ m3 para o TT8 e 1,6 kg/ m3 para o TT11 e TT13.

Estes tanques funcionavam em regime semi-intensivo e apresentam diferentes espécies cultivadas. No TT8 as espécies existentes eram douradas (500 indivíduos) e corvinas (7.790 indivíduos). O TT11 e o TT13 apresentavam as mesmas espécies de peixes: corvinas (2.600 indivíduos), sargos-legítimos (500 indivíduos) e tainhas (150 indivíduos). Para além disto, estes dois últimos tanques também possuíam caixas de plástico com ostras no seu interior (cerca de 24.000). Na Tabela 3 encontram-se os valores médios dos parâmetros apresentados pelos tanques de terra durante os meses do ensaio.

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Tabela 3 - Condições apresentadas pelos tanques de terra durante os meses de ensaios. Legenda: TT: Tanque de terra.

TT Mês %O2 [O2] TºC

Novembro 75,0 5,6 16,8

Dezembro 73,6 5,4 14,7 TT8 Janeiro 81,3 7,95 14,5

Março 79,5 6,1 17,6

Dezembro 76,1 5,8 15,0 TT11 Março 68,9 5,3 15,2

Dezembro 81,8 6,1 15,0 TT13 Fevereiro 86,8 7,0 14,7

Ensaio 1:

Neste ensaio pretendeu-se, para o mesmo tanque (TT8), estudar a variação da adesão dos ovos dos monogéneos com o tempo de imersão dos substratos (cinco e dez dias). Foram efetuadas três amostragens para cada timing, tendo sido realizadas nos meses de novembro, janeiro e março para os cinco dias e em dezembro, janeiro e março para os dez dias.

Ensaio 2:

Neste ensaio pretendeu-se avaliar a adesão dos ovos dos monogéneos, entre dois tanques com as mesmas condições (TT11 e TT13), porém com diferentes operações de aquacultura. As duas operações são “pesca” que foi realizada pela arte de emalhar e “ostras” que consiste na remoção/manipulação das ostras. O TT11 foi considerado o controlo (não manipulável) e o TT13 o tanque manipulável onde ocorreram as operações de aquacultura (pesca e remoção/manipulação das ostras). Para verificar o efeito destas duas operações, as

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção amostras foram colocadas imediatamente após cada uma das operações para posteriormente se avaliar o seu efeito na contagem do número de ovos.

Ensaio 3:

No terceiro ensaio, foi avaliada a quantidade de ovos de monogéneos entre dois tanques de terra (TT8 e TT11) com diferentes densidades durante cinco dias. Foram feitas três amostragens no TT8, nos meses de novembro, janeiro e março e duas amostragens no TT11, nos meses de dezembro e março. O ideal seria terem sido feitas três amostragens para os dois tanques, contudo não foi possível, dado a baixa densidade de peixe presente no TT11.

Eclosão dos ovos de monogéneos:

Em paralelo com o estudo a decorrer, embora não fosse o objetivo primário deste estudo, também se realizou a eclosão dos ovos de monogéneos com o objetivo de visualizar os diferentes estadios larvares destes parasitas. Neste processo utilizou-se a mesma metodologia descrita acima e com o mesmo material de controlo (fios de algodão).

Foram colocados dois fios em cada tanque de reprodutores, dourada (TR1), sargo- legítimo, (TR4), sargo-safia (TR2), mero (TR6) e corvina (TR7), e ao final dos cincos dias foram recolhidos e introduzidos de imediato dentro de caixas de Petri com uma solução de água salgada estéril e foram devidamente identificados (data, material, tanque e tempo). Os fios foram cortados de modo a que perfizessem 7 cm de comprimento para serem observados na lupa eletrónica Nikon SMZ1000. Foram observados, um a um, e com o auxílio de uma pinça e uma tesoura, cortaram-se as porções dos fios onde estavam aderidos e isolados os ovos dos monogéneos. De seguida, colocaram-se essas mesmas porções nos poços individuais de uma placa de cultura devidamente identificadas (tanque, espécie, nº amostra) juntamente com o seu sobrenadante. Depois de 24h as amostras foram recolhidas dos poços, colocadas de novo nas placas de Petri e analisadas à lupa, porém sem resultados positivos. As amostras foram observadas diariamente, durante quatro dias e não foi observado nenhum estadio larvar para além dos ovos, sendo que alguns deles até já estavam inviáveis. Repetiu- se novamente o processo, sendo que desta vez as porções retiradas e colocadas nos poços, foram encubadas em estufa a 25ºC para verificar se a temperatura tinha efeito na eclosão. Após 24h as amostras foram retiradas da estufa e colocadas em placas de Petri para serem vistas à lupa, onde se visualizaram poucas larvas. As amostras foram de novo colocadas na estufa por mais 24h e posteriormente observadas. Como já havia um número razoável de larvas, foram retiradas porções do líquido sobrenadante com uma pipeta de Pasteur e 33

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção colocadas em lâminas de microscópio para serem observadas e fotografadas as diversas formas larvares presentes.

3.1 Análise estatística

As amostras foram anotadas numa folha de Excel, onde se produziu a análise estatística descritiva. Foram calculadas as médias e os respetivos desvios-padrões de cada substrato de cada ensaio.

A estatística inferencial foi realizada recorrendo ao programa Rstudio versão 1.2.1578, onde se programou em R, utilizando o tipo de teste estatístico de análise de variância (ANOVA). Este teste permite determinar a existência de diferenças entre as médias das variáveis em estudo, contudo, não permite identificar entre que variáveis se encontra esta diferença. O Tukey test compara as médias dentro das diferentes variáveis, conseguindo por isso identificar onde se encontram as diferenças estatisticamente significativas.

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4 Resultados

4.1 Ensaio preliminar

Tal como se comprova na Tabela 4, o t5 (cinco dias), obteve maior número de ovos aderidos do que o t1 e t3, à exceção nas douradas.

Como tal, pode-se concluir através dos resultados obtidos, que quanto mais prolongado for o tempo de imersão do substrato, maior adesão dos ovos.

Tabela 4 - Ensaio preliminar: nº total de ovos de Monogenea recolhidos nos tanques TR1, TR4, TR6 e TR7 durante 1,3 e 5 dias (t1, t3, t5 respetivamente); TR1- tanque de reprodutores com douradas (Sparus aurata), TR4- tanque de reprodutores com sargos-legítimos (Diplodus sargus), TR6- tanque de reprodutores com corvinas (Argyrosomus regius), TR7- tanque de reprodutores com meros (Epinephalus marginatus).

Total de ovos de monogéneos recolhidos em tanques de reprodutores de diferentes espécies marinhas

Tempo (em dias) Douradas Sargos-Legítimos Corvinas Meros

t1 10 >100 4 13

t3 100 >300 17 26

t5 85 - 28 70

4.2 Ensaio 1

Os Gráficos 3 e 4 representam, respetivamente, o número de ovos de monogéneos recolhidos nos diferentes substratos testados após cinco e dez dias de colocação.

Interpretando os dois gráficos (Gráfico 3 e 4) pode-se inferir que não há uma grande variação nos resultados obtidos entre os cinco e os dez dias. No entanto, consegue-se avaliar uma maior e menor deposição entre os diferentes substratos.

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No Gráfico 3 (cinco dias), os substratos com maior e menor adesão foram, respetivamente, o plástico e a macroalga.

No Gráfico 4 (dez dias), a madeira foi o substrato que teve maior adesão e a macroalga foi o substrato com menor adesão.

De acordo com a análise estatística confirmou-se que a variável “tempo” não é significativa, mas sim a variável “substrato”, tendo em conta o p-value obtido (0.0216) com o teste ANOVA, no programa Rstudio. Posto isto, foi realizado o Tukey Test para a variável “substrato”, onde se verificou que o único par de substratos significativamente diferentes foi “macroalga-controlo”.

TT8 t5 8

1 Nº médio ovos de Monogenea de

0 Controlo Madeira PVC Plástico Macroalga

Novembro Janeiro Março

Gráfico 3 – Número médio de ovos de Monogenea recolhidos em diferentes substratos do tanque de terra nº 8 (TT8) durante cinco dias. Legenda: Eixo das abcissas- número médio de ovos de Monogenea; Eixo das ordenadas- substratos utilizados no ensaio.

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TT8 t10 8

Nº médio ovos de Monogenea de 1

0 Controlo Madeira PVC Plástico Macroalga

Dezembro Janeiro Março

Gráfico 4 - Número médio de ovos de Monogenea recolhidos em diferentes substratos do tanque de terra nº 8 (TT8) durante dez dias. Eixo das abcissas- número médio de ovos de Monogenea; Eixo das ordenadas- substratos utilizados no ensaio.

4.3 Ensaio 2

Os Gráficos 5 e 6 representam os resultados obtidos das amostragens referentes à operação “pesca” e o Gráfico 7 representa os resultados da operação “ostras”. No Gráfico 5, referente à amostragem do mês de dezembro, o substrato que teve maior adesão dos ovos dos monogéneos foi o plástico. Por outro lado, o que teve menor número de ovos foi o controlo, no TT11 (não manipulável), e a macroalga no TT13. Na segunda amostragem representada no Gráfico 6 o plástico e o controlo foram os substratos onde o número de ovos foi superior no TT11 e TT13, respetivamente, e a macroalga foi a que apresentou menores resultados em ambos os tanques. Por fim, pode-se concluir que com a pesca (TT13), a deposição dos ovos dos monogéneos aos substratos estudados foi menor comparativamente ao tanque não manipulável (TT11), à exceção do controlo e da macroalga na amostragem de fevereiro- março. Relativamente à outra variável em estudo, a remoção/manipulação das ostras dos tanques, Gráfico 7, os resultados obtidos foram concordantes com os anteriormente apresentados, com menor adesão no TT13 relativamente ao TT11. Os substratos com maior

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção adesão foram o plástico e o controlo no TT11 e TT13, respetivamente, e os com menor adesão foram o controlo e a macroalga no TT11 e TT13, respetivamente. Com base na análise estatística, concluiu-se que a variável “operações de aquacultura” foi significativa (p-value=0,0000269), assim como o substrato (p-value=0,00313). Posto isto, foi realizado o Tukey Test em função destas duas variáveis. Com este teste, observou-se que existem diferenças estatisticamente significativas entre os pares de operações “pesca-tanque controlo” e “pesca-ostra” contrariamente ao que se observou com a variável “ostra-tanque controlo”. Relativamente aos substratos, o par que apresenta diferenças estatisticamente significativas é “macroalga-controlo”.

1ª amostragem 14

2 Nº médio ovos de Monogenea de 0 Controlo Madeira PVC Plástico Macroalga

TT11 TT13Pesca

Gráfico 5 - Efeito da pesca no tanque 13 durante o mês de dezembro num período de cinco dias. Eixo das abcissas- número médio de ovos de Monogenea; Eixo das ordenadas- substratos utilizados no ensaio

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2ª amostragem 6

1 Nº médio ovos de Monogenea de 0 Controlo Madeira PVC Plástico Macroalga

TT11 TT13Pesca

Gráfico 6 - Efeito da pesca no tanque 13 durante os meses de fevereiro-março num período de cinco dias. Eixo das abcissas- número médio de ovos de Monogenea; Eixo das ordenadas- substratos utilizados no ensaio.

1ª amostragem 14

2 Nº médio ovos de Monogenea de 0 Controlo Madeira PVC Plástico Macroalga

TT11 TT13Ostras

Gráfico 7 - Efeito da remoção das ostras no tanque 13 durante o mês de dezembro num período de cinco dias. Eixo das abcissas- número médio de ovos de Monogenea; Eixo das ordenadas- substratos utilizados no ensaio.

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4.4 Ensaio 3

Os Gráficos 8 e 9 comparam os resultados obtidos entre os dois tanques estudados, TT8 e TT11, com diferentes densidades, nas duas amostragens realizadas.

Na 1ª amostragem (Gráfico 8) o controlo e o plástico foram os substratos com maior adesão no TT8 e TT11, respetivamente. Nesta mesma amostragem, os substratos onde se verificaram menor adesão foram o PVC e o controlo, nos TT8 e TT11, respetivamente. No Gráfico 9, correspondente à 2ª amostragem, verifica-se que o plástico foi o substrato que em ambos os tanques teve maior adesão dos ovos dos parasitas. Por outro lado, o substrato com menor número foi a macroalga, também em ambos os tanques.

Como se pode ver nos Gráficos 8 e 9, o TT11 (tanque com maior densidade) apresenta resultados superiores aos do TT8 (tanque com menor densidade), à exceção do plástico e da macroalga, na segunda amostragem.

Realizou-se também o teste ANOVA no programa Rstudio, em que se confirmou que de facto a densidade é um fator significativo (p-value=0.00485) nos resultados obtidos, mas o substrato não. Depois deste teste, realizou-se ainda o Tukey Test para a variável “densidade”, onde se verificaram diferenças estatisticamente significativas entre as duas densidades.

1ª amostragem 14

2 Nº médio ovos de Monogenea de 0 Controlo Madeira PVC Plástico Macroalga

TT8 TT11

Gráfico 8 -1ª amostragem feita nos meses de novembro e dezembro com o tanque 8 e 11, respetivamente. Eixo das abcissas- número médio de ovos de Monogenea; Eixo das ordenadas- substratos utilizados no ensaio.

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2ª amostragem

10 9 8 7 6 5 4 3 2

1 Nº médio Nºmédio ovos Monogenea de de 0 Controlo Madeira PVC Plástico Macroalga

TT8 TT11

Gráfico 9 - 2 ª amostragem feita nos meses de janeiro e março com o tanque 8 e 11, respetivamente. Eixo das abcissas- número médio de ovos de Monogenea; Eixo das ordenadas- substratos utilizados no ensaio.

4.5 Substratos com maior e menor deposição de ovos de Monogenea

Como mostra a Tabela 5, o plástico e a macroalga foram respetivamente os substratos com maior e menor média do número de ovos.

Para além de ter sido calculada a média e o desvio-padrão, aplicou-se também para esta situação, um teste estatístico ANOVA, no programa Rstudio, de modo a verificar a significância dos resultados. De fato, segundo a estatística, o substrato é muito significativo nos resultados pois apresenta um p-value de 0.000289 (<0,005). Fez-se também um Tukey Test onde se comprova que se encontram diferenças significativas entre “macroalga- controlo” e “plástico-macroalga”. Estes resultados são comprovados pelos valores apresentadas na Tabela 5, onde se pode verificar que a média da macroalga é substancialmente mais baixa do que a dos restantes substratos.

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Tabela 5 - Média e desvio-padrão (DP) dos resultados obtidos nos diferentes substratos.

Controlo Madeira PVC Plástico Macroalga

Média 2,89 1,71 1,92 2,83 0,75

Desvio- 2,32 2,08 2,44 2,66 1,30 padrão

5. Discussão

Este estudo foi pioneiro a averiguar que tipos de substratos teriam uma maior e menor adesão dos ovos de monogéneos, apesar de já existir informação relativamente ao uso de diferentes substratos para recolherem ovos destes parasitas.

De acordo com os resultados obtidos no Ensaio 1, pode-se dizer que o tempo de permanência dos substratos, cinco ou dez dias, não interferiu nos resultados conseguidos, mas por outro lado o substrato utilizado foi significativo. Para além disso, segundo o Tukey test realizado, o único par de substratos estatisticamente significativos foi “macroalga- controlo”. Seria de esperar que com o aumento do tempo de imersão dos mesmos dentro do tanque, o número de ovos aderidos seria maior, tal como aconteceu no ensaio preliminar em que aos cinco dias houve um maior número de adesão dos ovos do que no primeiro e aos três dias (Tabela 4). É possível que o tempo tenha sido excessivo e que os ovos possam ter eclodido. Dado que segundo Reed et al., (2012), os ovos dos monogéneos levam entre alguns dias até cerca de cinco/seis meses, dependendo da temperatura do meio onde estão inseridos, a maturarem até ao estadio de adultos.

Relativamente aos resultados obtidos no Ensaio 2, onde foram realizadas duas operações de aquacultura, pesca e remoção/viragem das ostras no tanque TT13, em ambas se destacou uma menor média do número de ovos, comparativamente ao tanque controlo (TT11) (Gráficos 5, 6 e 7). Suportando também estes resultados, a estatística realizada confirma que ambas as variáveis em estudo “operações de aquacultura” e substrato foram significativas. Posto isto, realizou-se o Tukey Test em função destas duas variáveis onde se verificou que de fato existem diferenças estatisticamente significativas entre os pares de operações “pesca-tanque controlo” e “pesca-ostra” contrariamente ao que se observou com a variável “ostra-tanque controlo”. Relativamente aos substratos, o par que apresentou diferenças estatisticamente significativas foi “macroalga-controlo”.

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Pode-se dizer que durante o processo da pesca existe uma maior agitação das águas causando por sua vez uma maior turbidez da mesma. Esta agitação, pode impedir que os ovos se consigam aderir aos substratos, fazendo com que haja um menor número dos mesmos. Para além disso, o fato de ter havido duas pescas consecutivas, fez com que o número de peixes fosse diminuindo o que poderia levar a um menor número de parasitas.

Por outro lado, e contrariamente aos resultados obtidos, pode-se pensar que de certo modo, um aumento de turbidez leva a uma diminuição da qualidade da água e por sua vez poderia causar um aumento do número de parasitas. Segundo Martins (2004), a turbidez caracteriza-se pela quantidade de diferentes materiais que estão presentes em suspensão na água, tais como: minerais, microorganismos, fito e zooplâncton. Martins (2004) refere ainda que quanto maior for a sua quantidade em suspensão, menor será a transparência da água. Ojwala et al. (2018) afirmam que a turbidez em sistemas de águas que são planos, como por exemplo os tanques de terra, resultam de partículas sólidas em suspensão que levam a que a água fique turva e consequentemente seja prejudicial para os peixes, aumentando assim as hipóteses de infestações parasitárias. Esta hipótese valida os resultados, uma vez que demonstra que os parasitas ficam em suspensão na água devido à agitação causada pelas operações de aquacultura, dificultando a sua adesão aos substratos.

Quanto ao processo da remoção/manipulação das ostras, também ocorre uma ligeira agitação da água, porém não comparável com o processo anterior (tal como apoia a estatística). No entanto, o efeito mais provável nesta situação que levou a um menor número dos ovos aderidos, comparativamente ao TT11, poderia ser devido ao fato de as ostras serem organismos filtradores, removendo da água vários tipos de organismos, como por exemplo, estadios larvares de parasitas.

Segundo Oliveira et al. (2014), as ostras conseguem absorver diversos tipo de substâncias que se encontram presentes na água como toxinas, poluentes químicos, metais e para além disso, microorganismos.

No Ensaio 3, o TT11 (tanque com uma maior densidade de peixes) apresentou a média do número de ovos maior que a do TT8 (tanque com menor densidade de peixes). Para além disso, a estatística confirmou ainda que de fato a densidade foi um factor significativo, porém o substrato não foi significativo. Realizou-se ainda o Tukey Test para a variável “densidade”, onde se verificaram diferenças estatisticamente significativas entre as duas densidades.

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Com isto, pode-se inferir que os tanques com maiores densidades apresentaram uma maior carga parasitária. Existem diversas hipóteses para explicar esta teoria, o facto de haver mais peixes, implica que os mesmos estejam mais próximos uns dos outros, o que por sua vez irá facilitar a transmissão de parasitas e consequentemente irá dar origem a mais patologias. Para além disso, maiores densidades de indivíduos, levam a que ocorra um comprometimento do bem-estar animal o que faz com que haja maior suscetibilidade dos indivíduos de contraírem patologias, nomeadamente parasitárias.

Confirmando as hipóteses acima sugeridas, Patterson & Ruckstuhl (2013), referem que a transmissão parasitária está proporcionalmente ligada à densidade da população de hospedeiros. O aumento da densidade de indivíduos leva a condições de stress, o que por sua vez resulta em comportamentos agressivos, que promovem a ocorrência de lesões na pele, barbatanas e nas brânquias pelo contato direto entre eles. Estas lesões podem ser posteriormente colonizadas por agentes patogénicos primários e secundários, o que faz com que haja um aumento do risco de infeção representando assim um problema a nível de bem- estar (Barber, 2007; Ellis et al., 2002; Torud & Hastein, 2008).

Por último, os dois substratos que mais se destacaram com uma maior e menor média de adesão dos ovos de monogéneos foram, respetivamente, o plástico e a macroalga. Segundo a estatística, o substrato foi muito significativo nos resultados obtidos e o Tukey test mostrou que os pares estatisticamente significativos foram “macroalga-controlo” e “plástico- macroalga”.

Diversos autores defendem a utilização de macroalgas em tratamentos contra inúmeros microorganismos, tais como bactérias, protozoários, parasitas e outros microorganismos (Falkenberg et al., 2018; Jana et al., 2018).

É possível que a macroalga tenha tido menor adesão de ovos relativamente aos restantes substratos porque, tal como explica Hutson et al. (2012), os extratos retirados das algas, inibem o desenvolvimento dos ovos dos parasitas, atrasam o tempo da primeira até à ultima eclosão e reduzem a taxa de eclosão dos monogéneos.

Até aos dias de hoje, não há informações que provem que o plástico seja um material promotor destes parasitas nem de vírus (Dang et al., 2008; Tufenkji, 2007). Por outro lado, existem fontes que indicam que este substrato facilita o transporte de algumas bactérias (Amaral-Zettler et al., 2015; Harrison et al., 2014; Zettler et al., 2013).

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Este estudo procurou reproduzir as condições ideais em aquacultura, onde os fatores abióticos podem ter uma grande influência nos resultados. As principais limitações encontradas foram:

- A duração do estudo (cinco meses) que levou à impossibilidade de confirmar os resultados obtidos;

- O fato do estudo ter decorrido em condições externas, onde existem fatores climáticos não controláveis como as condições atmosféricas adversas (vento e chuva) que prejudicaram as amostras, quebrando-as e não permitindo a leitura daquelas que ficaram destruídas e também por terem sido inicialmente comidas pelos peixes, obrigando a repetir todo o ensaio.

6. Conclusão

Com base nos resultados conseguidos, concluiu-se que:

- O factor tempo não teve qualquer influência no número de ovos dos parasitas que se aderiram aos substratos;

- As operações de aquacultura dentro dos tanques promoveram uma menor adesão de ovos dos monogéneos possivelmente por haver uma maior agitação das águas e pelas ostras apresentarem um papel de depurador biológico;

- Em tanques com elevadas densidades de peixe, existe uma maior adesão dos ovos;

- O plástico e a macroalga foram os dois substratos que se destacaram, com maior e menor número dos ovos de Monogenea, respetivamente.

Como recomendações, aplicando os resultados obtidos numa perspetiva para o aquacultor, e tendo em conta as conclusões retiradas deste estudo, pode-se dizer que o plástico não seria um bom material, ou pelo menos o mais indicado, a utilizar na construção/revestimento de tanques para produção de peixe assim como um dos materiais utilizados na manutenção dos tanques, em aquacultura. Tal como foi demonstrado, de todos os substratos não biológicos utilizados, foi o plástico que obteve uma maior média do número de ovos de monogéneos aderidos. Contudo, devido à pouca existência de estudos feitos nesta vertente, outros estudos deveriam ser realizados para consolidar estes resultados. Seria interessante realizar um estudo onde se revestissem os tanques com diversos materiais 45

Maria Carolina Teixeira Dias | Ocorrência dos ovos de Monogenea em diversos substratos de fixação em pisciculturas de tanques de terra: uma estratégia de prevenção sintéticos, entre eles o plástico, e se observasse se realmente haveria diferenças quanto ao parasitismo dentro desses tanques.

Pode-se também sugerir aos produtores que não mantenham densidades de peixes muito elevadas nos tanques. Como já foi comprovado no decorrer do estudo e também segundo diversos autores, com densidades maiores irá haver maior parasitismo e também um comprometimento do bem-estar animal. Para além disto, seria também indicado para o aquacultor, integrar as macroalgas no sistema de cultivo de peixes ou de outras espécies para beneficiar de ambas as fontes (Chopin et al., 2001; Troell, 2009; Mata et al., 2010).

Para um melhor rendimento a nível da produção, outro fator seria minimizar a poluição dentro da exploração, controlando a entrada/presença de substratos não biológicos nos tanques, como por exemplo, materiais utilizados durante as pescas ou até mesmo na manutenção dos tanques, que poderiam aumentar o número de parasitas e consequemente aumentar o risco dos peixes contraírem doenças.

Seria também necessário que em futuros estudos fosse analisado o factor turbidez, sendo esta medida para avaliar a sua influência no aparecimento de ovos dos monogéneos e também a realização de estudos com maior duração.

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