Mollusca, Gastropoda) Mit Hilfe Molekularer Methoden
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Rekonstruktion der Phylogenie der Opisthobranchia (Mollusca, Gastropoda) mit Hilfe molekularer Methoden Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum angefertigt am Lehrstuhl für Spezielle Zoologie vorgelegt von Verena Vonnemann aus Essen Bochum, 2005 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Die Systematik 1 1.2 Die phylogenetische Systematik 3 1.3 Die molekulare Phylogenetik 3 1.4 Die Gastropoda 4 1.5 Die Opisthobranchia 6 1.6 Bisherige Erkenntnisse über die Phylogenie der Opisthobranchia 12 1.7 Molekulare Marker 15 1.8 Ziele der vorliegenden Arbeit 18 2 Material und Methoden 23 2.1 Untersuchte Taxa und Herkunft des Tiermaterials 23 2.2 Untersuchte Gene 29 2.3 Labormethoden 32 2.3.1 Fixierung des Tiermaterials 32 2.3.2 DNA-Isolierung 32 2.3.3 Die Polymerase-Kettenreaktion 33 2.3.4 Aufreinigung von PCR-Produkten 36 2.3.5 Klonierung von PCR-Fragmenten 36 2.3.6 Aufreinigung der Plasmid-DNA 37 2.3.7 DNA-Sequenzierung 38 2.4 Methoden der Auswertung 42 2.4.1 Erstellen einer Konsensussequenz 42 2.4.2 Kontrolle der erzeugten Sequenzen 42 2.4.3 Alinierung der DNA-Sequenzen 43 2.4.4 Verfahren zur Erstellung von Dendrogrammen 44 2.4.4.1 Distanzmethoden 44 2.4.4.2 Maximum Parsimonie-Verfahren 47 2.4.4.3 maximum likelihood-Verfahren 48 2.4.4.4 Bayes’sche Verfahren 49 2.5 bootstrap-Verfahren 50 2.6 Prüfung der Plausibilität von Dendrogrammen 51 2.6.1 Vergleich mit Dendrogrammen auf der Basis alternativer Daten 51 2.6.2 Vergleich mit Fossilfunden 51 2.6.3 Vergleich mit biologischen Daten 52 2.7 Statistische Tests 52 2.7.1 Analyse der Basenzusammensetzung 52 2.7.2 Berechnung der Substitutionssättigung 52 2.7.3 Der relative rate test 53 2.8 Phylogenetisches Signal 53 3 Ergebnisse 55 3.1 Alinierungsergebnisse 55 3.2 Statistische Tests 57 3.2.1 Sequenzlängen, Basenzusammensetzung und X2-Test 57 3.2.2 Berechnung der Substitutionssättigung 64 3.2.3 relative rate test 69 3.3 Phylogenetisches Signal 71 3.4 Intragenomische Variabilität 73 3.5 Phylogenie der Opisthobranchia 74 3.5.1 18S rDNA 74 3.5.1.1 Maximum Parsimonie-Analyse 74 3.5.1.2 Distanzanalyse 75 3.5.1.3 maximum likelihood-Analyse 80 3.5.1.4 Bayes’sche Analyse 80 3.5.1.5 Zusammenfassung 18S rDNA 80 3.5.2 28S rDNA 81 3.5.2.1 Maximum Parsimonie-Analyse 81 3.5.2.2 Distanzanalyse 81 3.5.2.3 maximum likelihood-Analyse 82 3.5.2.4 Bayes’sche Analyse 82 3.5.2.5 Zusammenfassung 88 3.5.3 16S rDNA 88 3.5.3.1 Maximum Parsimonie-Analyse 88 3.5.3.2 Distanzanalyse 89 3.5.3.3 maximum likelihood-Analyse 89 3.5.3.4 Bayes’sche Analyse 90 3.5.3.5 Zusammenfassung 16S rDNA 90 3.6 Phylogenie der Anaspidea (inklusive Pteropoda) 96 3.6.1 18S rDNA 96 3.6.1.1 Maximum Parsimonie-Analyse 96 3.6.1.2 Distanzanalyse 96 3.6.1.3 maximum likelihood-Analyse 101 3.6.1.4 Bayes’sche Analyse 101 3.6.1.5 Zusammenfassung 101 3.6.2 ITS1-5.8S-ITS2 102 3.6.2.1 Maximum Parsimonie-Analyse 102 3.6.2.2 Distanzanalyse 102 3.6.2.3 maximum likelihood-Analyse 102 3.6.2.4 Bayes’sche Analyse 102 3.2.6.5 Zusammenfassung 104 3.7 Phylogenie von Phyllodesmium 104 3.8 Umbraculum 107 4 Diskussion 108 4.1 Auswahl der Taxa 108 4.2 Untersuchte Gene 109 4.3 Maximum Parsimonie-Analysen 114 4.4 Distanzanalysen 115 4.5 maximum likelihood-Analysen 116 4.6 Bayes’sche Analysen 117 4.7 Statistische Tests 118 4.8 Phylogenetisches Signal 119 4.9 Phylogenie der Opisthobranchia 119 4.9.1 Wahl der Außengruppe 119 4.9.2 Status der Opisthobranchia, Pulmonata und Euthyneura 120 4.9.3 Pulmonata 121 4.9.4 Pyramidellidae 125 4.9.5 Opisthobranchia 126 4.9.5.1 Nudibranchia 126 4.9.5.2 Pleurobranchoidea 127 4.9.5.3 Nudipleura 129 4.9.5.4 Tylodinoidea 130 4.9.5.5 Acteonoidea 132 4.9.5.6 Anaspidea und Pteropoda 134 4.9.5.7 Cephalaspidea s.str. 136 4.9.5.8 Cephalaspidea und Anaspidea 138 4.9.5.9 Sacoglossa 139 4.9.5.10 Acochlidiacea 141 4.10 Prüfung der Plausibilität der rekonstruierten Verwandtschaftshypothesen 142 4.10.1 Vergleich mit Fossilfunden 142 4.10.2 Ernährungsweise 145 4.10.3 Chromosomenzahlen 152 4.11 Phylogenie der Anaspidea 153 4.12 Phylogenie von Phyllodesmium 156 4.13 Umbraculum 158 4.14 Zusammenfassung, Schlusswort und Ausblick 158 Literaturverzeichnis 162 Danksagung 184 Lebenslauf 185 Anhang 186 I Abkürzungen und Symbole 186 II Chemikalien, Lösungen, Medien, Geräte und Kits 187 Chemikalien 187 Rezepte für Lösungen und Medien 187 Kits 188 Geräte 189 III relative rate test 189 Opisthobranchia-Datensatz (18S rDNA) 189 Opisthobranchia-Datensatz (28S rDNA) 217 Opisthobranchia-Datensatz (16S rDNA) 229 Anaspidea-Datensatz (18S rDNA) 240 Anaspidea-Datensatz (ITS1-5.8S-ITS2) 242 Aeolidoidea-Datensatz (18S rDNA) 243 IV Distanzen 247 Opisthobranchia-Datensatz (18S rDNA) 247 Opisthobranchia-Datensatz (16S rDNA) 258 Opisthobranchia-Datensatz (28S rDNA) 262 Anaspidea-Datensatz (18S rDNA) 264 Anaspidea-Datensatz (ITS1-5.8S-ITS2) 264 Aeolidoidea-Datensatz (18S rDNA) 265 V Chromosomenzahlen 266 1 Einleitung 1.1 Die Systematik Überall in unserem Alltag begegnen uns die verschiedensten systematischen Klassifikationen, z.B. bei der Anordnung der Produkte in einem Supermarkt oder der Bücher in einer Bibliothek. Diese Klassifikationen sind nicht nur nützliche, sondern essentielle Werkzeuge, um sich in unserer komplexen Umwelt zurechtfinden zu können. Dabei können durchaus verschiedene, sich überschneidende Ordnungen nebeneinander existieren, die je nach Situationen herangezogen werden. Der Ausgangspunkt für das Errichten solcher Ordnungen ist die systematische Klassifikation der Sinneseindrücke, denen unterschiedliche Konzepte von Dingen gegenübergestellt werden. Zu den Methoden für die Erstellung von Begriffs- konzeptionen gehören das Beobachten und Vergleichen, sowie das Erkennen und Beschreiben. Als zentrales Prinzip zur Klassifikation dient dabei die wahrgenommene Ähnlichkeit. Das Ziel einer Klassifikation ist das Erstellen einer allgemeinen und natürlichen Ordnung der Dinge. Sie beinhaltet im Idealfall eine komplette Auflistung aller natürlichen Klassen von Dingen und darüber hinaus alle Wechselbeziehungen der Dinge untereinander. Die Systematik in der Biologie hat sich den Versuch einer Klassifikation auf der Grundlage der phylogenetischen Beziehungen aller Organismen zur Aufgabe gestellt. Dabei stellt die Systematik eine historische Wissenschaft dar, da man die Stammesgeschichte der Organismen ohne Zeitmaschine nicht beobachten, sondern nur rekonstruieren kann. Daher werden alle Verwandtschaftshypothesen immer Hypothesen bleiben. Die Geschichte der Systematik entstand wohl mit Beginn der Menschheitsgeschichte selbst, durch die Fähigkeit des Menschen, im Gedächtnis Gespeichertes willentlich und spontan abrufen zu können. Nur wenn man sich daran erinnern kann etwas Ähnliches bereits wahrgenommen zu haben, kann man auf die Idee kommen, es handele sich um Vertreter des gleichen Typs von Wahrnehmung und sich so einen Begriff davon machen. Vielleicht bildete aber auch erst die Entstehung der Sprache das notwendige Werkzeug für die Entwicklung der Systematik. Erste Überlieferungen biologischer Klassifikationen stammen aus der Antike, von Aristoteles. Er teilte die ihm bekannten Lebewesen auf der Grundlage von vergleichenden Untersuchungen in „Bluttiere“ (Fische, Amphibien, Säuger, Vögel) einerseits und „blutlose Tiere“ (Schalen-, Krusten-, Weichtiere) andererseits und nahm damit bereits die auch heute noch gültige Unterscheidung von Vertebraten und Invertebraten vorweg. Mit dem Zusammenbruch der griechisch-römischen Kultur allerdings sollte die Beobachtung und der empirische Vergleich nicht länger als Basis für die Klassifikation dienen. Während des Mittelalters wurde nicht zwischen Beobachtung, Dokument und Fabel unterschieden. Verfasser von Enzyklopädien verließen sich nicht auf ihre eigene Augen sondern stützten sich auf Erzählungen und Werke 1 anderer Autoren. Berichte von seltsamen Tieren und Fabelwesen wurden als beobachtete Fakten behandelt. Darüber hinaus galt ein grundlegend anderes Verständnis von Natur. Man war beispielsweise der Auffassung, dass Lebewesen Markierungen besitzen, die Aussagen über dessen Wesen und Eigenschaften machen, z.B. herzförmige Blätter – Einfluss auf das menschliche Herz, oder dass Verwandtschaft sich in räumlicher Nähe ausdrückt. Aus diesen „Geschichten der Natur“ wurde in der Mitte des 17. Jahrhunderts durch Jan Jonston und seine „Historia naturalis de quadripedibus libri“ die Naturgeschichte. Beobachtung, Dokument und Fabel waren von da an klar voneinander getrennt, es ging um die eindeutige Benennung des Sichtbaren. Dies war auch die Geburtsstunde der großen Zeit biologischer Klassifikationen, z.B. von Carl von Linné und Georges Louis de Buffon. Das Ziel war die Entwicklung einer Art „Primärsprache“, durch die Beobachtung und Beschreibung vom jeweiligen Beobachter unabhängig werden sollen. Damit war der Begriff der Struktur geboren, der zwischen Wahrnehmung und Sprache vermitteln sollte. Die Theorie des taxonomischen Merkmals entstand. Ein solches Merkmal beschreibt gleichzeitig das Einzelwesen und seine Stellung im System aller Lebewesen. Das Binomen wurde als Artbezeichnung eingeführt. Nicht alle Strukturen können naturgemäß als taxonomisches Merkmal dienen. Die Schwierigkeit besteht darin, die geeigneten unter einer unermesslichen Zahl von möglichen Merkmalen auszuwählen. Wegen der klaren und häufig sehr stabilen Formen der Pflanzen kam es zu einem „Boom“ der Botanik zu dieser Zeit. Mit Hilfe der Naturgeschichte sollte der göttliche Schöpfungsplan aufgedeckt werden, der Evolutionsgedanke war zu dieser Zeit noch nicht gedacht. Durch eine Wende in der Philosophie durch Kant Ende des 18. Jahrhunderts rückte die Zoologie in den Mittelpunkt der Klassifikationsforschung. Anfang des 19. Jahrhunderts kam der Begriff der Organisation auf, er bezeichnete den inneren Körperbau eines Lebewesens. Der Begriff der Funktion erhielt eine zentrale Bedeutung, da durch ihn eine Wertung der Merkmale in wichtige und weniger wichtige möglich wurde. Lamarck trennte schließlich die Nomenklatur von der Klassifikation, d.h. die Stellung im künstlichen Ordnungssystem von der natürlichen Stellung im „System des Lebens“.